(57)【要約】【課題】HTLV-1関連疾患の発症に重要な役割を果たすHBZ蛋白質を鋭敏に検出または定量可能な手段を提供する。【解決手段】配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を少なくとも１種含有する、HBZ蛋白質の検出試薬；前記抗体を少なくとも２種含有する、HTLV-1関連疾患の診断薬、ならびに（１）被験者由来の血液試料と、前記抗体とを接触させ、血液試料に含まれるHBZ蛋白質と抗体との複合体を形成させる工程、および（２）工程（１）で形成された複合体中のHBZ蛋白質を検出する工程を含む、HTLV-1関連疾患の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；および
配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体
からなる群より選ばれる抗体を少なくとも１種含有する、HBZ蛋白質の検出試薬。
【請求項２】
該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、請求項１に記載の検出試薬。
【請求項３】
該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、請求項１または２に記載の検出試薬。
【請求項４】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項５】
該抗体を少なくとも２種含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項６】
該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、または
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項７】
該抗体が配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項８】
該抗体が受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項９】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を少なくとも２種含有する、HTLV-1関連疾患の診断薬。
【請求項１０】
HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、請求項９に記載の診断薬。
【請求項１１】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を、少なくとも２種別々の容器に含有してなる、HBZ蛋白質の検出用またはHTLV-1関連疾患の診断用キット。
【請求項１２】
該抗体の１種が固相に固定されてなる、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
該抗体が受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項９もしくは１０に記載の診断薬、または請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマ、受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01969で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項１６】
下記の工程：
（１）被験者由来の血液試料と、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体とを接触させ、血液試料に含まれるHBZ蛋白質と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のHBZ蛋白質を検出する工程；
を含む、HTLV-1関連疾患の検出方法。
【請求項１７】
工程（２）が工程（１）で使用する抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、複合体中のHBZ蛋白質を検出する、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
工程（１）で使用する抗体が固相に固定された捕捉抗体であり、工程（２）で使用する抗体が捕捉抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体であり、工程（２）がサンドイッチ法により複合体中のHBZ蛋白質を検出する、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１９】
工程（２）で使用される抗体が酵素標識されており、工程（２）がサンドイッチELISA法で検出する、請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】
該抗体が受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトT細胞白血病ウイルスHBZ蛋白質の検出方法に関し、成人T細胞白血病およびヒトT細胞白血病ウイルス関連脊髄症の診断の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトT細胞白血病ウイルス１型（Human T-lymphotropic virus 1 type 1：HTLV-1）は、世界ではじめてヒトの疾患との関連が見出されたレトロウイルスであり、感染者の一部にHTLV-1関連脊髄症（HTLV-1-associated myelopathy：HAM）および成人T細胞白血病（Adult T-cell leukemia：ATL）を発症させる。ほとんどのHTLV-1感染者が生涯にわたって未発症の無症候性キャリアとして経過するとはいえ、現在日本には100万人を超える多数のHTLV-1感染者が存在するため、一刻も早いHTLV-1関連疾患の病態解明と発症予防法・新規治療法の開発が待たれている。
【０００３】
HTLV-1プロウイルスのマイナス鎖にコードされる遺伝子HTLV-1 basic leucine zipper factor（HBZ）は、その発現量がHAM患者のプロウイルス量、運動障害度、髄液中炎症マーカー濃度と有意な正の相関を示すこと（非特許文献１）、すべてのATL患者の白血病細胞に発現し、HBZの発現抑制によりATL細胞の増殖を阻止できること（非特許文献２）、HBZトランスジェニックマウスが皮膚、肺へのT細胞浸潤を示し、ATL類似のT細胞リンパ腫を発症すること（非特許文献３）から、HTLV-1感染症発症の原因遺伝子とされている。
【０００４】
HTLV-1関連疾患を診断する技術として、肺癌抑制遺伝子であるTSLC1に対する抗体を用いてATL患者またはHTLV-1感染無症候キャリアを診断するための診断器具が知られている (特許文献１)。また、抗体を用いてHTLV-1抗原を検出する技術として、HTLV-1のコア抗原（p24、p53）を対象とするもの（特許文献２）、HTLV-1のエンベロープタンパク質（gp46）を対象とするもの（特許文献３）およびHTLV-1のエンベロープタンパク質を対象とするもの（特許文献４）が知られている。
【０００５】
本発明者らは、これまでHBZ蛋白質に対するモノクローナル抗体を用いて、HAM患者およびHTLV-1感染無症候キャリアの血漿中に存在する抗HBZ抗体、および末梢血単核球内部のHBZ蛋白質の検出を試みているが、血漿中の抗HBZ抗体および末梢血単核球に含まれるHBZ蛋白質量がいずれもきわめて微量のため、検出することができなかった(非特許文献４)。また、本発明者らは、HBZ蛋白質に対するモノクローナル抗体（マウスB6-15）を作製し、サンドイッチELISA法を構築して、HBZ強制発現細胞株（293T/HBZ-SI）および一部のHTLV-1感染細胞株（SLB-1）などのHBZ高発現細胞を用いてHBZ蛋白質を検出することに成功している（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−３１７２２０
【特許文献２】ＵＳ５１６４２９３Ａ
【特許文献３】ＵＳ５６１４３６６Ａ
【特許文献４】ＵＳ６２７０９５９Ｂ１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Retrovirology 6:19 (2009).
【非特許文献２】Proc Natl Acad Sci USA 103:720-725, (2006).
【非特許文献３】PLoS Pathog 7:e1001274 (2011).
【非特許文献４】Retrovirology, 8 (Suppl 1), A244 (2011).
【非特許文献５】第61回日本ウイルス学会学術集会プログラム・抄録集Vol.61st,p.358 (2013.10.29)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、HBZ蛋白質の生体内での発現量は極めて低く、HBZ蛋白質に対する優れた抗体がなかったため、HBZの鋭敏な検出、定量系は存在せず、HBZとHTLV-1関連疾患の発症に関する、特に臨床検体を用いた研究が進まなかった。
本発明の目的は、HTLV-1関連疾患の発症に重要な役割を果たすHBZ蛋白質と高感度に反応するモノクローナル抗体を作製し、HBZ蛋白質を鋭敏に検出または定量可能な手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、HBZ蛋白質のアミノ酸配列をBlast検索にかけてヒトタンパク質と相同性を示す配列領域を避けて候補ペプチドを選択し、抗原性が予測される領域として３つの候補を選定して抗原ペプチドを作製し、抗体を取得した。得られた抗体の中からHBZ蛋白質の検出に特に優れる抗体の組み合わせを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は、以下のものを提供する。
〔１〕  配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；および
配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体
からなる群より選ばれる抗体を少なくとも１種含有する、HBZ蛋白質の検出試薬。
〔２〕  該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、〔１〕に記載の検出試薬。
〔３〕  該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、〔１〕または〔２〕に記載の検出試薬。
〔４〕  該抗体がモノクローナル抗体である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔５〕  該抗体を少なくとも２種含有する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔６〕  該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、または
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔７〕  該抗体が配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔８〕  該抗体が受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔９〕  配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を少なくとも２種含有する、HTLV-1関連疾患の診断薬。
〔１０〕  HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、〔９〕に記載の診断薬。
〔１１〕  配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を、少なくとも２種別々の容器に含有してなる、HBZ蛋白質の検出用またはHTLV-1関連疾患の診断用キット。
〔１２〕  該抗体の１種が固相に固定されてなる、〔１１〕に記載のキット。
〔１３〕  HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、〔１１〕または〔１２〕に記載のキット。
〔１４〕  該抗体が受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、〔９〕もしくは〔１０〕に記載の診断薬、または〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載のキット。
〔１５〕  受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマ、受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01969で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
〔１６〕  下記の工程：
（１）被験者由来の血液試料と、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体とを接触させ、血液試料に含まれるHBZ蛋白質と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のHBZ蛋白質を検出する工程；
を含む、HTLV-1関連疾患の検出方法。
〔１７〕  工程（２）が工程（１）で使用する抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、複合体中のHBZ蛋白質を検出する、〔１６〕に記載の検出方法。
〔１８〕  工程（１）で使用する抗体が固相に固定された捕捉抗体であり、工程（２）で使用する抗体が捕捉抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体であり、工程（２）がサンドイッチ法により複合体中のHBZ蛋白質を検出する、〔１６〕に記載の検出方法。
〔１９〕  工程（２）で使用される抗体が酵素標識されており、工程（２）がサンドイッチELISA法で検出する、〔１８〕に記載の検出方法。
〔２０〕  該抗体が受領番号NITE ABP-01967で表されるハイブリドーマおよび受領番号NITE ABP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、従来不可能であったHBZ蛋白質の鋭敏な定量的検出が可能となり、本発明の成果を臨床検体を用いた研究に適用することで、HTLV-1関連疾患の検査、診断、病態把握への応用が可能になることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】HBZ遺伝子およびそのスプライシングアイソフォームを示す。
【図２】抗HBZモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析の結果を示す。
【図３】抗HBZモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー解析の１例を示す。
【図４】抗HBZモノクローナル抗体を用いた蛍光顕微鏡解析の結果を示す。
【図５】抗HBZモノクローナル抗体の組み合わせによるサンドイッチELISA系（１）を示す。
【図６】サンドイッチELISA系（１）を用いて種々の細胞株で発現するHBZ蛋白質の量を調べた結果を示す。CEM, Jurkat：HTLV-1非感染ヒトT細胞株；C5MJ, HUT102, MT-1, MT-2, MT-4, SLB-1, TLOm1：HTLV-1感染ヒトT細胞株；293T-HA-Mock：陰性コントロール；293T-HA-HBZ：陽性コントロール。
【図７】抗HBZモノクローナル抗体の組み合わせによるサンドイッチELISA系（２）を示す。
【図８】サンドイッチELISA系（２）を用いて種々の細胞株で発現するHBZ蛋白質の量を調べた結果を示す。CEM, Jurkat：HTLV-1非感染ヒトT細胞株；C5MJ, HUT102, MT-1, MT-2, MT-4, SLB-1, TLOm1：HTLV-1感染ヒトT細胞株；293T-HA-Mock：陰性コントロール；293T-HA-HBZ：陽性コントロール。
【図９】サンドイッチELISA系（２）を用いて種々の細胞株および患者末梢血単核球(PBMC)で発現するHBZ蛋白質の量を調べた結果を示す。非感染PBMC-1, 非感染PBMC-2, ATL-1, ATL-2, ATL-3：患者末梢血単核球；CEM, Jurkat：HTLV-1非感染ヒトT細胞株；C5MJ, HUT102, MT-1, MT-2, MT-4, SLB-1, TLOm1, ATL-43Tb, ED：HTLV-1感染ヒトT細胞株；293T-HA-Mock：陰性コントロール；293T-HA-HBZ（3倍希釈）：陽性コントロール。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本発明において、HTLV-1とは、ヒトT細胞白血病ウイルス１型（Human T-lymphotropic virus 1 type 1）であり、ヒトT細胞白血病ウイルス（HTLV-1）関連疾患の病原ウイルスである。
【００１４】
本発明において、HTLV-1関連疾患とは、成人T細胞白血病（Adult T-cell leukemia：ATL）およびHTLV-1関連脊髄症（HTLV-1-associated myelopathy：HAM）をいう。ATLは、HTLV-1感染者の約5%に発症する白血病・リンパ腫の一種であり、急性型、リンパ腫型、慢性型、くすぶり型の４つの病型に分類されている。リンパ節の腫脹、肝脾腫大、皮膚病変、日和見感染症、血清LDHやカルシウム値上昇等の症状や異常がみられる。このような患者がHTLV-1抗体検査で陽性であり、かつ下記のいずれかに該当する場合、ATLと診断される。
1）血液中で増加する異常な細胞がT細胞である場合
2）腫大しているリンパ節や皮膚病変部がT細胞のがん細胞によるものである場合
HAMは、HTLV-1感染者の一部（約0.3%）に発症する慢性進行性の痙性脊髄麻痺を特徴とする神経難病である。臨床症状の中核は、緩徐進行性の歩行障害と排尿困難、頻尿、便秘などの膀胱直腸障害である。ATLと異なり生命予後は良好であるが、進行により約40%の患者が歩行不能となり、日常生活が著しく制限される。神経学的診察により、両下肢の痙性不全麻痺、深部腱反射の亢進、病的反射（バビンスキー徴候）など錐体路障害を示唆する所見を認め、血清（または血漿）および髄液中の抗HTLV-1抗体が陽性であれば、その他のミエロパチーを来す脊髄圧迫病変、脊髄腫瘍、多発性硬化症などの疾患を鑑別した上で、HAMと確定診断される。
【００１５】
HTLV-1 basic leucine zipper factor（HBZ）遺伝子は、HTLV-1プロウイルスのマイナス鎖にコードされる遺伝子であり（図１を参照）、いくつかのスプライシングアイソフォームが知られている。HBZのmRNAまたは蛋白質は細胞の増殖に関与し（Proc Natl Acad Sci USA 103:720-725,2006）、該蛋白質は、キラーT細胞のターゲットになることが報告されている（J Infect Dis 203:529-536, 2011）。HBZのアミノ酸配列およびこれをコードするヌクレオチド配列は、NCBIに以下の通りに登録されている。
HBZのヌクレオチド配列（アクセッション番号DQ273132（バージョンDQ273132.1））（配列番号１）
アミノ酸配列（アクセッション番号ABB89742.1）（配列番号２）
HBZのアンスプライシング（スプライシングされない）アイソフォームは、Retrovirology 2009, 6: 71にその構造およびＮ末端のアミノ酸配列が開示されており、その全アミノ酸配列を配列番号３で示す。
【００１６】
本発明においてHBZ蛋白質のレベルとは、一定量の試料中のHBZ蛋白質の含有量を表す。HBZ蛋白質のレベルは、後述の測定手法に応じて当業者に公知の様式で表すことができ、例えば、HBZ蛋白質の濃度として表現してもよく、また標準試料の測定値を基準とする相対値として表現してもよい。
【００１７】
本発明において抗体とは、免疫グロブリンのすべてのクラスおよびサブクラス、抗体の機能的断片の形態も含む意であり、当該抗体には、天然型抗体の他に、遺伝子組換技術を用いて製造され得る抗体、抗体断片、およびこれらの結合性断片も含まれるが、これらに限定されない。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体が含まれるが、ポリクローナル抗体とは異なるエピトープに対する異なる抗体を含む抗体調製物であり、モノクローナル抗体とは実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（抗体断片を含む）を意味する。また結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab)2、Fab’、Fab、Fv(variable fragment of antibody)、scFv(single chain Fv)、dsFv(disulphide stabilized Fv)、sdAb(single domain antibody)等が挙げられる(Exp. Opin. Ther. Patents, Vol.6, No.5, p.441-456, 1996)。
【００１８】
本発明においてHTLV-1関連疾患の罹患の有無を判定するとは、一定の基準に照らした評価、検査を行なうことを含む意であり、本発明単独で、あるいは別の検査と組み合わせて総合的に判定することも含む。
【００１９】
１．HBZ蛋白質の検出試薬およびHTLV-1関連疾患の診断薬
本発明の検出試薬および診断薬に有効成分として含まれる「抗HBZ抗体」は、HBZ蛋白質を検出可能な抗体である限り特に限定されるものではなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、またはFabフラグメントやFab発現ライブラリーによって生成されるフラグメントなどのように抗原結合性を有する前記抗体の一部が包含される。
【００２０】
本発明の検出試薬および診断薬は、抗HBZ抗体として、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を少なくとも１種含有する。より高感度の検出のためには、前記抗体を少なくとも２種含有することが好ましい。２種または３種含有する場合は、1つの検出試薬または診断薬中に２種または３種含有していてもよく、抗体１種を含有する検出試薬または診断薬の２種または３種の組み合わせであってもよい。
【００２１】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、既知の一般的な製造方法によって製造することができる。例えば、HBZ蛋白質またはその一部を抗原として用い、必要に応じてフロイントアジュバント（Freund's Adjuvant）とともに、哺乳動物、例えばポリクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヤギ、ウマまたはウシ等、好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギに、モノクローナル抗体の場合、マウス、ラット、ハムスターに免疫する。
【００２２】
一実施態様において、例えば、配列番号２のアミノ酸配列またはその一部を含むペプチドをコードするヌクレオチドを、必要により他のタンパク質（例、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（GST）、Hisタグ）をコードするヌクレオチドと連結した発現ベクターを用いて、常法により組換えタンパク質または他のタンパク質との融合タンパク質として宿主で発現させ、精製したものを抗原として用いることができる。HBZ蛋白質を大量に製造する場合、コムギ無細胞タンパク発現系を用いることも望ましい。
【００２３】
本発明者らは、HBZ蛋白質のアミノ酸配列をBlast検索にかけてヒトタンパク質と相同性を示す配列領域を避けて候補ペプチドを選択し、抗原性が予測される領域として３つの候補を選定した。本発明においては下記３種のペプチドを抗原とすることが好ましい。
ペプチド1：LRRGPPGEKAPPRGETHRD（配列番号４）
ペプチド2：KAKQHSARKEKMQELGIDG（配列番号５）
ペプチド3：KEDLMGEVNYWQGRLEAMW（配列番号６）
【００２４】
好ましい態様として、抗HBZ抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である。
【００２５】
好ましい別の態様として、抗HBZ抗体は、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である。
【００２６】
さらに好ましい態様として、抗HBZ抗体は、特定のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。本出願人は、2014年11月19日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号NITE ABP-01967、受領番号NITE ABP-01968および受領番号NITE ABP-01969の３種のハイブリドーマを寄託している。NITE ABP-01967、NITE ABP-01968およびNITE ABP-01969の３種のハイブリドーマは、それぞれ、ペプチド2、ペプチド3およびコムギ無細胞タンパク発現系で製造したHBZ蛋白質を抗原として得られたものであり、これらのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を、それぞれ、pep#2 #20-H12、pep#3 #91-1およびαコムギHBZ＃7-1と称する。本発明においては、バックグラウンドノイズの低さの点から、これらの寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００２７】
ポリクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、抗原をマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ウマまたはウサギ、好ましくはヤギ、ウマまたはウサギ、より好ましくはウサギの皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内あるいは腹腔内に１〜数回注射することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜５回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から血清が取得される。
【００２８】
血清をポリクローナル抗体として用いることも可能であるが、好ましくは、限外ろ過、硫安分画、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（DEAEまたはDE52等）、抗イムノグロブリンカラムもしくはプロテインＡ/Ｇカラム、抗原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより単離および／または精製される。
【００２９】
モノクローナル抗体は、上記免疫感作動物から得た該抗体産生細胞と自己抗体産生能のない骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）からハイブリドーマを調製し、該ハイブリドーマをクローン化し、哺乳動物の免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。
【００３０】
モノクローナル抗体は、具体的には下記のようにして製造することができる。即ち、抗原を、マウス、ラットまたはハムスター（ヒト抗体産生トランスジェニックマウスのような他の動物由来の抗体を産生するように作出されたトランスジェニック動物を含む）の皮下内、筋肉内、静脈内、フッドパッド内もしくは腹腔内に１〜数回注射するか、または移植することにより免疫感作を施す。通常、初回免疫から約１〜１４日毎に１〜４回免疫を行って、最終免疫より約１〜５日後に免疫感作された該哺乳動物から抗体産生細胞を取得する。
【００３１】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ（融合細胞）の調製は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法（Nature, Vol.256, p.495-497, 1975）およびそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。即ち、前述の如く免疫感作された哺乳動物から取得される脾臓、リンパ節、骨髄または扁桃等、好ましくは脾臓に含まれる抗体産生細胞と、好ましくはマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギまたはヒト等の哺乳動物、より好ましくはマウス、ラットまたはヒト由来の自己抗体産生能のないミエローマ細胞との細胞融合により調製される。
【００３２】
細胞融合に用いられるミエローマ細胞としては、例えばマウス由来ミエローマP3/X63-AG8.653（653；ATCC No.CRL1580）、P3/NSI/1-Ag4-1（NS-1）、P3/X63-Ag8.U1（P3U1）、SP2/0-Ag14（Sp2/0、Sp2）、PAI、F0またはBW5147、ラット由来ミエローマ210RCY3-Ag.2.3.、ヒト由来ミエローマU-266AR1、GM1500-6TG-A1-2、UC729-6、CEM-AGR、D1R11またはCEM-T15を使用することができる。
【００３３】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンのスクリーニングは、ハイブリドーマを、例えばマイクロタイタープレート中で培養し、増殖の見られたウェルの培養上清の前述の免疫感作で用いた抗原に対する反応性を、例えばELISA等の酵素免疫測定法によって測定することにより行なうことができる。
【００３４】
前記ハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。モノクローナル抗体は、上述のポリクローナル抗体と同様に、単離および／または精製されることが好ましい。
【００３５】
キメラ抗体は、例えば「実験医学（臨時増刊号）, Vol.6, No.10, 1988」、特公平3-73280号公報等を参考に製造することができる。一本鎖抗体は、前記のようにして得たモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを遺伝子組換え技術により一本鎖抗体として発現するように連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し、産生させることにより得られる。
【００３６】
ファージディスプレイによる抗体作製は、抗体スクリーニング用に作製されたファージライブラリーから、例えば、バイオパニングにより抗原に親和性を有するファージを回収、濃縮することにより、Fab等の抗体等を容易に得ることができる。
【００３７】
F(ab')2およびFab'は、イムノグロブリンを、蛋白分解酵素であるペプシンまたはパパインで処理することによりそれぞれ製造することができる。Fabは、Fab発現ファージライブラリーを上記ファージディスプレイによる抗体作製法と同様にスクリーニングすることにより、製造することができる。
【００３８】
本発明の検出試薬および診断薬は、上記抗体のみからなるものであってもよいし、医薬的に許容される担体を含んでいてもよい。医薬的に許容される担体としては、本発明の診断薬を検出試薬および液剤として調製する場合、製剤素材として慣用されている各種担体、例えば希釈剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤などを含んでいてもよい。さらに抗体の凝集を防ぐために、Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）などの界面活性剤を添加するのが好ましい。
希釈剤としては、水、生理用食塩水などが挙げられる。
溶剤としては、水、生理用食塩水、エタノールなどが挙げられる。
溶解補助剤としては、シクロデキストリン類などが挙げられる。
懸濁化剤としては、アラビアゴム、カルメロースなどが挙げられる。
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの無機塩類、グリセリン、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物などが挙げられる。
緩衝剤としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液などが挙げられる。
これらの担体の配合比は、当業者が適宜決定することができる。
【００３９】
本発明の検出試薬または診断薬を用いて、後述する本発明の検出方法により被験者の血液試料を検査することで、より容易にHTLV-1関連疾患（ATLまたはHAM）の罹患の有無を判定することが可能となる。
【００４０】
２．HBZ蛋白質の検出用キットおよびHTLV-1関連疾患の診断用キット
本発明のキットに含まれる抗HBZ抗体は、「１．HBZ蛋白質の検出試薬およびHTLV-1関連疾患の診断薬」に記載の抗体と同様である。
【００４１】
本発明のキットには、上記抗体に加えて他の抗体または試薬等が含まれていてもよく、これらの抗体または試薬等は、あらかじめ上記抗体と一緒になっていてもよいし、別々の容器に格納されていてもよい。抗体または試薬などとしては、二次抗体、基質剤、標識物質（例、蛍光色素、酵素）、固相、反応容器の他に、処理液や抗体を希釈するための緩衝液、陽性対照（例、組換えHBZ）、陰性対照、プロトコールを記載した指示書などが挙げられる。これらの要素は、必要に応じてあらかじめ混合しておくこともできる。
【００４２】
本発明のキットにおいては、抗体はあらかじめ固相化されていてもよく、該抗体はあらかじめ標識されていてもよい。本発明のキットにおいて用いることができる固相としては特に限定されず、例えば、ポリスチレンなどのポリマー、ガラスビーズ、磁性粒子、マイクロプレート、イムノクロマトグラフィー用濾紙、ガラスフィルターなどの不溶性担体を挙げることができる。好ましくは、サンドイッチELISA法に用いるマイクロプレートである。
【００４３】
本発明のキットの形態も特に限定されないが、簡便に診断を行なうことを目的として、本発明のキットの構成成分が一体となった一体型のキットとすることができる。一体型のキットの形態としては、例えば、イムノクロマトグラフィー法を用いるカセット型が挙げられる。
【００４４】
本発明のキットの使用により、HBZ蛋白質の検出およびHTLV-1関連疾患（ATLまたはHAM）の罹患の有無の判定がより簡便に実施できるようになる。
【００４５】
３．HTLV-1関連疾患の検出方法
本発明のHTLV-1関連疾患の検出方法は、下記工程：
（１）被験者由来の血液試料と抗HBZ抗体とを接触させ、HBZと抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のHBZ蛋白質を検出する（好ましくは定量的に検出する）工程；
を含むことを特徴とする（以下、本発明の検出方法ともいう）。
【００４６】
本発明の検出方法は、上記工程（２）の後に、
（３）工程（２）で検出されたHBZ蛋白質のレベルを基準値と比較する工程；および
（４）工程（３）の比較結果に基づき、被験者がHTLV-1関連疾患に罹患しているか否かを判定する工程；
を含むことが好ましい。
【００４７】
本発明の検出方法における被験者は、HTLV-1の感染が疑われるヒトである。
【００４８】
本発明の検出方法が測定対象とする生体試料は、ヒトから採取可能なものであれば特に限定されるものではなく、血液、リンパ液、尿などの体液試料、リンパ節などの組織のバイオプシーが挙げられる。被験者への負担も小さいことから、好ましくは血液試料であり、血液試料としては、全血、血漿、血清などが挙げられる。
【００４９】
HBZ蛋白質を検出するため、常法に従い、タンパク質を生体試料（末梢血単核球、リンパ節等の臓器から分離した単核球など）から単離することができる。タンパク質を抽出するための一般的な方法が、当技術分野において周知されており、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)など、分子生物学の標準的な教科書に開示されている。なお、製造業者から入手した精製キット、緩衝液セット、およびプロテアーゼインヒビターを用いて、製造業者の指示に従って蛋白質の単離を行うことができる。
【００５０】
被験者由来の生体試料を、抗HBZ抗体と接触させ、HBZ蛋白質と抗体との複合体を形成させる。
【００５１】
前記抗体は、直接的または間接的に標識物質により標識されていてもよい。標識物質としては、蛍光物質（例、ＦＩＴＣ、ローダミン）、放射性物質（例、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、３Ｈ）、酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ）、着色粒子（例、金属コロイド粒子、着色ラテックス）、ビオチンなどが挙げられる。
【００５２】
また、前記抗体は、他に何も結合していない可溶性の状態で用いることも可能であるが、固相に結合していてもよい。「固相」としては、プレート（例、マイクロウェルプレート）、チューブ、ビーズ（例、プラスチックビーズ、磁気ビーズ）、クロマトグラフィー用担体（例、濾紙、ニトロセルロースメンブレンなどの吸水性基材、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、メンブレン（例、ニトロセルロースメンブレン、ＰＶＤＦ膜）、ゲル（例、ポリアクリルアミドゲル）、金属膜（例、金膜）などが挙げられる。なかでも、プレート、ビーズ、クロマトグラフィー用担体およびメンブレンが好ましく用いられ、取り扱いの簡便性からプレートが最も好ましく用いられる。上記結合としては、共有結合、イオン結合、物理的吸着などが挙げられ、特に限定されないが、共有結合および／または物理的吸着が十分な結合強度を得られるため好ましい。また固相への結合は、固相に直接結合してもよいし、自体公知の物質を利用して間接的に固相に結合していてもよい。
【００５３】
また、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や牛ミルク蛋白などのリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記ＢＳＡや牛ミルク蛋白等などでブロッキングすることが一般に行われる。
【００５４】
抗HBZ抗体と被験者由来の生体試料との接触は、これらの抗体と生体試料中のHBZ蛋白質等が相互作用できる方法であれば、態様、順序、具体的方法などは特に限定されない。接触は、例えば抗HBZ抗体が固相化されたプレートに生体試料を添加することでなされ得る。また例えば、生体試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの手段によって分離し、メンブレンに移して固定した後、抗体と接触させることによってもなされ得る。
【００５５】
なお、かかる接触を保つ時間は、前記抗体と、被験者由来の生体試料中に含まれるHBZ蛋白質等とが結合して複合体を形成するのに十分な時間であれば特に限定されないが、通常、数秒〜十数時間である。また、接触を行なう温度条件としては、通常４℃〜５０℃であり、４℃〜３７℃が好ましく、１５℃〜３０℃程度の室温が最も好ましい。さらに、反応を行なうｐＨ条件は、５．０〜９．０が好ましく、特に６．０〜８．０の中性域が好ましい。
【００５６】
工程（２）は、上記工程（１）で形成された複合体中のHBZ蛋白質を検出する工程である。
【００５７】
上記検出には、HBZ蛋白質を検出可能な任意の方法を用いることができ、例えばHBZ蛋白質をその分子量に基づき検出する方法や、抗体を利用して検出する方法を用いる。
【００５８】
HBZ蛋白質をその分子量に基づき検出する方法としては、ゲル電気泳動（例、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなど）、各種の分離精製法（例、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、および質量分析計（例、二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦ  ＭＳ）、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）による測定、並びにそれらを組み合わせる方法などに供し、所定のマーカーペプチドの分子量と比較し、目的とする分子量のバンド、スポット、またはピークを検出することにより行うことができるが、これらに限定されない。
【００５９】
HBZ蛋白質の検出の前に、工程（１）の反応液から上記複合体を単離してもよい。このような単離は、例えばヘパリンとの親和性を利用した単離法、または免疫沈降法などにより行なうことができ、工程（１）で用いる抗体に付加した適当な標識（例えばビオチンなど）を利用してもよい。
【００６０】
上記検出は、複合体が形成された状態で行なってもよい。あるいは、形成された複合体を試料から単離し、該複合体を解離させることによりHBZ蛋白質を遊離させた状態で行なってもよい。
【００６１】
工程（２）でHBZ蛋白質が検出された場合、被験者はHTLV-1関連疾患を罹患している蓋然性が高いと判定することができる。HBZ蛋白質が検出されないか検出限界以下の場合、被験者はHTLV-1関連疾患に罹患していない蓋然性が低いと判定することができる。
【００６２】
HBZ蛋白質を抗体を利用して検出する方法を採用する場合、本発明の工程（２）は、工程（１）で形成された複合体を、複合体のまま、または複合体を解離させHBZ蛋白質が遊離した状態で、抗体と接触させることができる。抗体の標識、HBZ蛋白質との接触方法および接触条件についての説明は、上記工程（１）における抗体の標識、生体試料との接触方法および接触条件ついての対応する記載を適用することができる。
【００６３】
検出は、複合体に含まれるHBZ蛋白質または工程（１）で使用した抗HBZ抗体を検出することによりなされる。このような検出は、複合体のまま、または複合体を解離させHBZ蛋白質が遊離した状態で、行なうことができる。
【００６４】
上記検出は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイなどにより行うことができ、これらの分析方法は当業者に周知である。
【００６５】
工程（２）の検出方法として、ＥＩＡ法を選択した場合、本発明の検出方法を、工程（１）で用いる抗HBZ抗体とHBZ蛋白質を認識する別の抗体とを用いたサンドイッチELISA法により実施することが好ましい。このようなサンドイッチELISA法は、抗原に対する特異性が高いため、本発明の実施に適している。
【００６６】
サンドイッチELISA法に使用する抗体の組み合わせは、以下の態様であり、いずれか一方の抗体を工程（１）において固相化抗体として使用し、他方の抗体を工程（２）において検出抗体として使用する。
1）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、
2）配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、または
3）配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ
【００６７】
好ましい抗体の組み合わせは、pep#3 #21-1(捕捉抗体)とpep#2 #20-H12(検出抗体)である。
【００６８】
サンドイッチELISA法は、例えば次のように行なう。まず、工程（１）の抗体をELISA用プレートのウェル表面に固相化する。次いでウェル表面への非特異的な吸着を防ぐためにブロッキングを行なった後、生体試料を添加し、試料中のHBZ蛋白質を該抗体と接触させて複合体を形成させる。該抗体と結合しなかったタンパク質を洗浄により除去した後、標識した別の抗HBZ抗体をウェルに加え、HBZ蛋白質に接触させて2つの抗体でサンドイッチされた複合体を形成させ、該標識により検出・定量を行なう。
【００６９】
サンドイッチELISA法には酵素標識抗体を使用することができる。標識に利用される酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが例示される。酵素の検出に用いられる基質剤としては、選択した標識酵素に応じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを選択した場合には、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などが使用され、アルカリホスファターゼを選択した場合においては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）などが使用される。また、反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを特に制限なく適宜使用することができる。
【００７０】
サンドイッチELISA法の一種としてアビジン−ビオチン反応を利用した方法が適用可能である。この方法では、例えば試料中のHBZ蛋白質を、固相化した工程（１）で用いる抗HBZ抗体でもって捕捉し、捕捉されたHBZ蛋白質とビオチンで標識した別の抗HBZ抗体との間で抗原抗体反応を行なわせる。次に酵素標識ストレプトアビジンを加えて、アビジン−ビオチン反応を行わせる。次いでこの酵素を検出することで、HBZ蛋白質を検出する。
【００７１】
上記のビオチンで標識した抗HBZ抗体は、ビオチンと、抗HBZ抗体とを自体公知の方法により結合させることにより製造することができる。このような標識は、例えば、市販のビオチン標識化キットを使用して行なうことができる。酵素標識ストレプトアビジンは、市販のものを使用することもできる。
【００７２】
上記の方法の他に、二次抗体を利用した方法も適用可能である。この方法では、工程（１）で用いる抗体と、当該抗体のＩｇドメインを認識する二次抗体との間で複合体を形成させる。二次抗体は酵素標識したものを用い、この酵素を検出することで、複合体中のHBZ蛋白質の存在が判別される。酵素標識二次抗体は、市販のものを使用することができる。このような二次抗体を用いる方法は、本発明の検出方法の感度を増強し得る。
【００７３】
工程（２）の検出方法として、ＦＩＡ法を選択した場合、上記ＥＩＡ法において標識として用いた酵素を蛍光物質と置換することで、上記のサンドイッチELISA法と同様の方法により、HBZ蛋白質の検出を行なうことができる。
蛍光物質としては、ＡＰＣ、ＰＥ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＥＣＤ、ＦＩＴＣ、ＰｅｒＣＰ、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ、フルオレセイン、ローダミンなどの化学物質を好ましく利用することができる。これらの化学物質による標識は、自体公知の方法で行なうことができる。
蛍光は、市販の測定機器、蛍光顕微鏡などを用いて検出することができる。
【００７４】
工程（２）の検出方法として、イムノクロマトグラフィー法を選択した場合、例えば、ニトロセルロースメンブレンなどの吸水性基材にライン状に固相化された工程（２）の抗体、メンブレン上に展開させた生体試料、および標識した工程（１）の抗体の三者間で複合体を形成させる。標識した工程（１）の抗体は、生体試料とあらかじめ混合してもよく、あるいは生体試料が工程（２）で用いる抗体に接触する前に、生体試料と接触するよう、吸水性基材上に供給しておいてもよい。複合体の形成は、標識に応じた手法により検出することができる。例えば、標識として金コロイド粒子を用いる場合、標識した抗体が集積した領域は赤色を呈するため、これにより検出する。
【００７５】
工程（２）の検出方法として、ウエスタンブロット法を選択することもできる。ウエスタンブロット法（イムノブロット法とも呼ばれる）は、試料中の特定の蛋白質を検出する方法である。変性条件下において蛋白質をポリペプチドの長さによって、または非変性条件下において蛋白質の三次元構造によって分離するために、ゲル電気泳動を行なう。次いで蛋白質をメンブレン（典型的にはニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）に移し、固定した後、標的蛋白質を、特異的抗体を使用して検出する。
【００７６】
本発明における検出工程は、HBZ蛋白質を定量的に検出する工程であることが好ましい。定量は、用いた標識に基づき検出した生体試料についてのシグナルを、HBZ蛋白質の標準試料を使用して作成した検量線を利用して数値化することなど、自体公知の方法により行なうことができる。HBZ蛋白質の標準試料は、生体試料から調製したHBZ蛋白質でもよく、またHBZをコードする遺伝子情報に基づき自体公知の遺伝子工学的技術により調製することもできる。
【００７７】
（３）工程（２）で検出されたHBZ蛋白質のレベルから、HTLV-1関連疾患の罹患の有無を判定する工程
検出工程（２）により得られた結果を利用して、工程（２）で検出されたHBZ蛋白質のレベルから、HTLV-1関連疾患の罹患の有無を判定することができる。工程（２）の検出が定性的結果として得られる場合、HBZ陽性をHTLV-1関連疾患に罹患している蓋然性が高いと判定し、HBZ陰性（検出限界以下）をHTLV-1関連疾患に罹患している蓋然性が低いと判定することができる。サンドイッチELISA等により工程（２）の検出が定量的結果として得られる場合、生体試料（血液試料）中のHBZ蛋白質の濃度から、被験者におけるHTLV-1関連疾患の罹患の有無を判定することのみならず、生体試料中に一定レベル以上のHBZ蛋白質濃度を有する被験者は、HTLV-1関連疾患の重篤度を推定することもできる。また同一の被験者について、以前に測定したレベルと比較することもできる。
【００７８】
基準となるHBZ蛋白質レベル（カットオフ値）は、目的に応じて設定される適切な基準である。カットオフ値は、その値を基準として疾患の判定をした場合に、高い診断感度（有病正診率）および高い診断特異度（無病正診率）の両方を満足できる値である。通常、検出限界以下の場合、HTLV-1関連疾患に罹患していないと判断することができる。
【００７９】
イムノクロマト法などの簡易検査を行った場合、目視観察したシグナル（発色等）の有無により、生体試料中のHBZ蛋白質の存否を決定することができる。
【００８０】
被験者の生体試料中のHBZ蛋白質レベルがカットオフ値を上回る場合、被験者は「HTLV-1関連疾患に罹患している」可能性が高いと判定される。カットオフ値以下の場合、被験者は「HTLV-1関連疾患に罹患している」可能性が低いと判定される。
【００８１】
また本発明の方法を用いて、HTLV-1関連疾患を治療中の患者について、治療の効果を評価することもできる。このような患者から、治療前、治療中および／または治療後に生体試料を採取し、HBZ蛋白質の濃度の変化を調べることで治療の効果を知ることができる。例えば、後の生体試料中のHBZ蛋白質の濃度が先の生体試料中のものよりも低ければ、その治療を有効であると評価することができる。
【００８２】
イムノクロマト法などの簡易検査を行った場合、シグナル（発色等）が目視観察により確認された場合、被験者は「HTLV-1関連疾患に罹患している」蓋然性が高いと判定され、さらに他の診断方法を組み合わせて、HTLV-1関連疾患の有無を判断することができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。
【００８４】
実施例１  新規抗HBZモノクローナル抗体の取得
HBZ蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２）から、動物に免疫するペプチド抗原の候補を選択した。すなわち、Homo sapiensのReference Sequence Proteinに対してBlast検索を行い、相同性を示した配列領域を避けて検索した。ターン構造、抗原性が予測される領域から以下に示す３候補ペプチドを選定した。
ペプチド#1：LRRGPPGEKAPPRGETHRD（配列番号４）
ペプチド#2：KAKQHSARKEKMQELGIDG（配列番号５）
ペプチド#3：KEDLMGEVNYWQGRLEAMW（配列番号６）
【００８５】
上記ペプチド1〜3は、Fmoc固相合成法により全自動合成機を用いて化学合成後、酸性条件下にて脱保護・切り出しを行うことでCrudeペプチドを回収し、さらに逆相HPLCを用いて分離・精製した（委託先：シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社）。一方、Ｎ末端His-HBZベクター（横浜市立大学医学部微生物学  梁明秀教授より供与）を用いて、コムギ無細胞蛋白発現系（Proc Natl Acad Sci USA. 97(2):559-64, 2000.）により組換えHBZ蛋白質を大量に合成した。すなわち、コムギ由来の翻訳成分（リボソーム、tRNA、アミノアシル化tRNA合成酵素、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、翻訳終結因子など）を含む無細胞抽出液に対して、アミノ酸、エネルギー分子（ATPとGTP）、エネルギー再生系、塩類（Mg2+ほか）、テンプレートmRNAを添加して、タンパク質を試験管内（in vitro）で合成した（委託先：株式会社 セルフリーサイエンス）。
【００８６】
上記抗原（３種のペプチドおよび組換えHBZ蛋白質）を動物（C/57BL/6マウスおよびWKAラット）に3回免疫した後に、脾細胞とミエローマ細胞（SP2/0）をポリエチレングリコールで融合した。ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン混合培地（hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium: HAT）による選択後にハイブリドーマの培養上清を用いてスクリーニングを行った。陽性コロニーは、限界希釈法によりクローニングした。陽性ハイブリドーマ細胞をマウス腹腔に接種して腹水化させ、ゲル濾過法で免疫グロブリン（immunoglobulin: Ig）を精製した。その結果、以下に示すモノクローナル抗体を新規に取得した。
【００８７】
A.ペプチド#1認識抗体
・pep#1 P6-A7 (Mouse, IgG2b,κ鎖)
・pep#1 P4-E12 (Mouse, IgG2b, κ鎖)
【００８８】
B.ペプチド#2認識抗体
・pep#2 P3-E3 (Mouse, IgM, κ鎖)
・pep#2 P1-A12 (Mouse, IgM, κ鎖)
・pep#2 #20-H12 (Mouse, IgG1)
【００８９】
C.ペプチド#3認識抗体
・pep#3 #21-1 (Rat, IgG2a)
・pep#3 #91-1 (Rat, IgG1)
【００９０】
D.組換えHBZ蛋白質認識抗体
・αコムギHBZ#1-1 (Mouse, IgG2a)
・αコムギHBZ#2-1 (Mouse, IgM)
・αコムギHBZ#5-1 (Mouse, IgM)
・αコムギHBZ#6-1 (Mouse, IgG1)
・αコムギHBZ#7-1 (Mouse, IgG2b)
・αコムギHBZ#8-1 (Mouse, IgM)
・αコムギHBZ#10-1 (Mouse, IgM)
・αコムギHBZ#12-1 (Mouse, IgM)
・αコムギHBZ#14-1 (Mouse, IgM)
【００９１】
得られたハイブリドーマのうち、pep#2 #20-H12株は、2014年11月19日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受領番号NITE ABP-01967で寄託されている。同様に、pep#3 #91-1株は、受領番号NITE ABP-01968で、αコムギHBZ#7-1株は受領番号NITE ABP-01969で寄託されている。
【００９２】
実施例２  新規抗HBZモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析
実施例１で得られたモノクローナル抗体の特異性を、ウエスタンブロッティングにより確認した。293T細胞（ATCC: American Type Culture Collectionから入手）を培養し、HBZ発現ベクターおよびコントロールベクターで形質転換し、それぞれ、293T-HA-HBZ（陽性コントロール）および293T-HA-Mock（陰性コントロール）を得た。
1×108個の293T-HA-HBZおよび293T-HA-Mockを、プロテインインヒビターを加えたRIPAバッファーで処理して細胞ライセートとした。実施例で得られた抗HBZモノクローナル抗体を用いて、常法によりウエスタンブロットに供した。二次抗体として、抗マウスIgG-HRP(Affinity Purified Secondary Antibodies against Mouse IgG (H&L) adsorbed against Rat, Human, Bovine, and Horse and conjugated to Horseradish Peroxidase: A106PU, American Qualex International, Inc.)または抗ラットIgG-HRP（Affinity Purified antibodies goat anti-rat IgG (H&L) Horseradish Peroxidase Labeled: A103PN, American Qualex International, Inc.）を用いた。結果を図２に示す。
図２より、得られた抗HBZモノクローナル抗体は、HBZ蛋白質を特異的に認識することがわかった。
【００９３】
実施例３  新規抗HBZモノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリー解析
実施例１で得られたモノクローナル抗体および実施例２で作製した293T-HBZおよび293T-Mockを用いてフローサイトメトリー解析を行った。すなわち、細胞を洗浄後、抗HBZモノクローナル抗体を最終濃度1μg/mlで4℃、20分間反応させた。洗浄後、さらに100倍希釈した抗マウスIgG(Fab)2- Alexa488抗体(4408S: Cell Signaling Technology)を4℃、20分間反応させ、洗浄後BD FACSCantoTM II フローサイトメーター（BD Biosciences）で解析した。結果を図３に示す。
図３より、新規抗HBZモノクローナル抗体が、HBZ蛋白質を発現させた細胞内のHBZ蛋白質に特異的に結合し、フローサイトメトリーで検出可能であることがわかった。
【００９４】
実施例４  新規抗HBZモノクローナル抗体を用いた蛍光顕微鏡解析
実施例１で得られたモノクローナル抗体および実施例２に記載の方法で作製したHBZ過剰発現細胞293T-HA-HBZを用いて、HBZの染色を行った。すなわち、細胞を洗浄後、抗HBZモノクローナル抗体を最終濃度1μg/mlで4℃、20分間反応させた。洗浄後、さらに100倍希釈した抗マウスIgG(Fab)2-Alexa488抗体(4408S: Cell Signaling Technology)を4℃、20分間反応させ、洗浄後、蛍光顕微鏡（共焦点レーザスキャン顕微鏡LSM 700：ZEISS）で解析した。結果を図４に示す。
図４より、新規抗HBZモノクローナル抗体が、HBZ蛋白質を発現させた細胞内のHBZ蛋白質に特異的に結合し、蛍光抗体法により蛍光顕微鏡で検出可能であることがわかった。
【００９５】
実施例５  新規抗HBZモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAの構築（１）
抗HBZモノクローナル抗体pep#3 #21-1（捕捉抗体）およびpep#2 #20-H12（検出抗体）を用いて、サンドイッチELISAを構築した。使用した固相は、９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc イムノモジュール マキシソープ：Nunc 467466）であった。
【００９６】
［実験手順］
5μg/mLのpep#3 #21-1（抗原捕捉用抗HBZモノクローナル抗体）を固相化する（室温、1時間）。
↓  洗浄（PBS）
5％スキムミルク/PBS-でブロッキングする。
↓  洗浄（PBS）
希釈した抗原を反応させる（室温、1時間、50μg/well）。
↓  洗浄（PBS）
HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)標識したpep#2 #20-H12（検出抗体）を反応させる（室温、1時間）。
↓  洗浄（PBS）
基質TMB（テトラメチルベンジジン）溶液を加えて発色（3分間、室温、100μL/well）
↓  1NのH2SO4で反応停止
分光光度計（OD450nm）で測定（参考波長としてOD620nm）。
【００９７】
測定に供した細胞は、以下の通りである。
293T-HA-HBZ（陽性コントロール）
293T-HAMock（陰性コントロール）
CEM、Jurkat：HTLV-1非感染ヒトT細胞株
C5MJ、HUT102、MT-1、MT-2、MT-4、SLB-1、TLOm-1：HTLV-1感染ヒトT細胞株
結果を図５および６に示す。
図５および６より、pep#3 #21-1を抗原捕捉用抗体、pep#2 #20-H12を検出抗体として構築したサンドイッチELISA系は、細胞内のHBZ蛋白質を定量的に検出可能であることがわかった。HTLV-1非感染細胞であるCEM細胞およびJurkat細胞の測定値からOD450=0.048をカットオフ値として設定した。測定範囲は40ng/mlから3000ng/mlである。
【００９８】
実施例６  新規抗HBZモノクローナル抗体を用いたサンドイッチELISAの構築（２）
捕捉抗体としてpep#3 #21-1の代わりにpep#3 #91-1を用いること以外は実施例５と同様にして、サンドイッチELISAを構築した。結果を図７〜９に示す。
図７〜９より、pep#3 #91-1-1を抗原捕捉用抗体、pep#2 #20-H12を検出抗体として構築したサンドイッチELISA系は、細胞内のHBZ蛋白質を定量的に検出可能であることがわかった。HTLV-1非感染細胞であるCEM細胞およびJurkat細胞の測定値からOD450=0.060をカットオフ値として設定した。測定範囲は50ng/mlから2500ng/mlである。また、患者末梢血単核球におけるHBZ蛋白質も定量的に検出可能であることから、本サンドイッチELISAを用いて、HTLV-1関連疾患患者検体における病態関連蛋白質HBZの動態を迅速に評価することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明により、従来不可能であったHBZ蛋白質の鋭敏な定量的検出が可能となり、本発明の成果を臨床検体を用いた研究に適用することで、HTLV-1関連疾患の検査、診断、病態把握への応用が可能になることが期待される。
本発明の診断薬および診断キットによれば、HTLV-1関連疾患の罹患の有無を特異的かつ簡便に判定することができる。本発明の検出方法によれば、HTLV-1関連疾患の罹患の有無、治療効果の有無を単独で、あるいは他の診断方法と組み合わせて適切に判定することができる。
【０１００】
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正および変更も、すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
【図１】
2016114360.tif 000002
【図２】
2016114360.tif 000003
【図３】
2016114360.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016114360.tif 000010
【配列表】
2016114360000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月10日(2015.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明は、以下のものを提供する。
〔１〕  配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；および
配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体
からなる群より選ばれる抗体を少なくとも１種含有する、HBZ蛋白質の検出試薬。
〔２〕  該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、〔１〕に記載の検出試薬。
〔３〕  該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、〔１〕または〔２〕に記載の検出試薬。
〔４〕  該抗体がモノクローナル抗体である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔５〕  該抗体を少なくとも２種含有する、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔６〕  該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、または
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔７〕  該抗体が配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔８〕  該抗体が受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の検出試薬。
〔９〕  配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を少なくとも２種含有する、HTLV-1関連疾患の診断薬。
〔１０〕  HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、〔９〕に記載の診断薬。
〔１１〕  配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を、少なくとも２種別々の容器に含有してなる、HBZ蛋白質の検出用またはHTLV-1関連疾患の診断用キット。
〔１２〕  該抗体の１種が固相に固定されてなる、〔１１〕に記載のキット。
〔１３〕  HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、〔１１〕または〔１２〕に記載のキット。
〔１４〕  該抗体が受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、〔９〕もしくは〔１０〕に記載の診断薬、または〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載のキット。
〔１５〕  受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマ、受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01969で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
〔１６〕  下記の工程：
（１）被験者由来の血液試料と、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体とを接触させ、血液試料に含まれるHBZ蛋白質と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のHBZ蛋白質を検出する工程；
を含む、HTLV-1関連疾患の検出方法。
〔１７〕  工程（２）が工程（１）で使用する抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、複合体中のHBZ蛋白質を検出する、〔１６〕に記載の検出方法。
〔１８〕  工程（１）で使用する抗体が固相に固定された捕捉抗体であり、工程（２）で使用する抗体が捕捉抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体であり、工程（２）がサンドイッチ法により複合体中のHBZ蛋白質を検出する、〔１６〕に記載の検出方法。
〔１９〕  工程（２）で使用される抗体が酵素標識されており、工程（２）がサンドイッチELISA法で検出する、〔１８〕に記載の検出方法。
〔２０〕  該抗体が受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、〔１６〕〜〔１９〕のいずれかに記載の検出方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
さらに好ましい態様として、抗HBZ抗体は、特定のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である。本出願人は、2014年11月19日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号NITE BP-01968および受託番号NITE BP-01969の２種のハイブリドーマを寄託し、2015年1月22日に、受託番号NITE BP-01993のハイブリドーマを寄託している。NITE BP-01993、NITE BP-01968およびNITE BP-01969の３種のハイブリドーマは、それぞれ、ペプチド2、ペプチド3およびコムギ無細胞タンパク発現系で製造したHBZ蛋白質を抗原として得られたものであり、これらのハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を、それぞれ、pep#2 #20-H12、pep#3 #91-1およびαコムギHBZ＃7-1と称する。本発明においては、バックグラウンドノイズの低さの点から、これらの寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
得られたハイブリドーマのうち、pep#2 #20-H12株は、2015年1月22日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に、受託番号NITE BP-01993で寄託されている。同様に、pep#3 #91-1株は、2014年11月19日に、受託番号NITE BP-01968で、αコムギHBZ#7-1株は受託番号NITE BP-01969で寄託されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体；および
配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体
からなる群より選ばれる抗体を少なくとも１種含有する、HBZ蛋白質の検出試薬。
【請求項２】
該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、請求項１に記載の検出試薬。
【請求項３】
該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として非ヒト動物に投与して産生された抗体からなる群より選ばれる抗体である、請求項１または２に記載の検出試薬。
【請求項４】
該抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項５】
該抗体を少なくとも２種含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項６】
該抗体が配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせ、または
配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項７】
該抗体が配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体と配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体との組み合わせである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項８】
該抗体が受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の検出試薬。
【請求項９】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を少なくとも２種含有する、HTLV-1関連疾患の診断薬。
【請求項１０】
HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、請求項９に記載の診断薬。
【請求項１１】
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体を、少なくとも２種別々の容器に含有してなる、HBZ蛋白質の検出用またはHTLV-1関連疾患の診断用キット。
【請求項１２】
該抗体の１種が固相に固定されてなる、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
HTLV-1関連疾患が成人T細胞白血病またはHTLV-1関連脊髄症である、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
該抗体が受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項９もしくは１０に記載の診断薬、または請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマ、受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01969で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【請求項１６】
下記の工程：
（１）被験者由来の血液試料と、
配列番号４に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、配列番号５に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体および配列番号６に示すアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体からなる群より選ばれる抗体とを接触させ、血液試料に含まれるHBZ蛋白質と抗体との複合体を形成させる工程；および
（２）工程（１）で形成された複合体中のHBZ蛋白質を検出する工程；
を含む、HTLV-1関連疾患の検出方法。
【請求項１７】
工程（２）が工程（１）で使用する抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、複合体中のHBZ蛋白質を検出する、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１８】
工程（１）で使用する抗体が固相に固定された捕捉抗体であり、工程（２）で使用する抗体が捕捉抗体とは別のペプチドに特異的に結合する抗体であり、工程（２）がサンドイッチ法により複合体中のHBZ蛋白質を検出する、請求項１６に記載の検出方法。
【請求項１９】
工程（２）で使用される抗体が酵素標識されており、工程（２）がサンドイッチELISA法で検出する、請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】
該抗体が受託番号NITE BP-01993で表されるハイブリドーマおよび受託番号NITE BP-01968で表されるハイブリドーマからなる群より選ばれるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の検出方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2016114360.tif 000011