(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒト大腸癌の検出、診断、治療、及び転移予防等に有用なヒト大腸癌（Ｃｏｌｏ２０５）に関わる新規ＤＮＡアプタマーを提供する。【解決手段】特定の配列又は他の特定の配列で示されるヌクレオチド配列からなり、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー。好ましい態様では、上記ＤＮＡアプタマーは、検出を容易とするために、その５’末端又は３’末端にプライマー認識配列、蛍光標識、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結されていてもよい。【選択図】図１
2016021883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は２で示されるヌクレオチド配列からなり、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
【請求項２】
配列番号１又は２で示されるヌクレオチド配列において、１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有し、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマー。
【請求項３】
ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するＤＮＡアプタマーであって、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有し、ここで、
Ｘは、１）配列番号１又は２で示されるヌクレオチド配列、又は２）配列番号１又は２で示されるヌクレオチド配列において、１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列を有し、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するヌクレオチド配列であり、
Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である、ＤＮＡアプタマー。
【請求項４】
Ｐ１は、配列番号３で示される第１プライマー認識配列であり、及び
Ｐ２は、配列番号４で示される第２プライマー認識配列である、請求項３に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項５】
前記ヒト大腸癌細胞が、Ｃｏｌｏ２０５細胞である、請求項１〜４のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項６】
糖鎖部分での化学的置換、リン酸エステル部分での化学的置換及び核酸塩基部分での化学的置換からなる群より選択される、少なくとも１つの化学修飾を含む、請求項１〜５のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項７】
５’末端又は３’末端に蛍光標識を有する、請求項１〜６のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項８】
前記蛍光標識が、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９から選ばれる一種以上を含む発光波長４２１nmから７１２nmの有機系蛍光団である、請求項７に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーが蛍光発光し得る金属ナノ粒子（量子ドット）表面に吸着されているＤＮＡアプタマー。
【請求項１０】
５’末端または３’末端に蛍光標識を有する請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡアプタマーがラマン散乱活性を有する金属である金、銀、銅、鉄及び珪素から選ばれる一種以上の粒子に吸着されているＤＮＡアプタマー。
【請求項１１】
５’末端又は３’末端が、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結される、請求項１〜６のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマー。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、ヒト大腸癌細胞の検出用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含む、ヒト大腸癌細胞の検出用キット。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを用いることを特徴とする、ヒト大腸癌の検出方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡアプタマーをヒト大腸細胞、大腸組織、血液、血清及び、血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答を観測することによってヒト大腸癌細胞の存在を検出する工程を含む、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記応答が、蛍光応答である、請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の転移予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１８】
ヒト大腸癌の転移予防又は治療用医薬組成物の製造のための請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーの使用。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか１に記載のＤＮＡアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト大腸癌（Ｃｏｌｏ２０５）細胞に対して特異的に結合し得る核酸及びその核酸を含む組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、近年日本人の発症傾向増加が顕著に認められる癌としてその診断・治療に関する研究が急がれている。大腸癌は、２０１５年には現在羅患者数が第一位である肺癌を抜くことが予想されており、２０１２年の統計によると、特に死亡率において男性では、肺癌、肝臓癌に次いで第３位に、女性では既に１位となっている。大腸癌は、早期発見すれば手術により良好な予後が得られることが知られているため、早期癌検診の対象となり、数多くの検査法が開発されてきた。また、大腸癌においては、癌の転移を抑制することが重要とされ様々な研究が行われている。転移の過程には転移性癌細胞と種々の宿主細胞(血小板、リンパ球、内皮細胞)と細胞外マトリックスや基底膜との相互作用が関与していることが知られている。
【０００３】
ヒト大腸癌細胞の特性や、免疫細胞との相互作用を解析するために、ヒト大腸腺癌患者からいくつかの細胞株が樹立された（例えば、非特許文献１参照）。Ｃｏｌｏ２０５は、ヒト大腸癌患者の腹水から単離された１つの細胞株であり、上皮様の細胞形態を有し、大量のＣＥＡを産生する、悪性の腫瘍細胞株である。また、Ｃｏｌｏ２０５細胞は、増殖駆動性癌遺伝子ＢＲＡＦに変異を有し、その増幅がＭＥＫ１／２阻害薬に対する耐性の獲得に寄与していることも知られている。
【０００４】
ＣＡ５０と称される腫瘍マーカーは、ヒト大腸癌由来培養細胞株Ｃｏｌｏ-２０５をマウスに免疫して作成したモノクローナル抗体Ｃ-５０が認識する糖鎖抗原で、Ｉ型糖鎖に属するルイスＡを抗原決定基にもつ。大腸癌に限らず、膵癌、肝細胞癌、胆道癌、膵・胆道系良性疾患、透析患者、未透析腎不全患者、肝硬変においても上昇し陽性率も低いのでスクリーニングには不適であるものの、治療効果判定や再発腫瘍の発見のモニタリングとして利用される。一方、特許文献１には、変異型のＫＲＡＳ又はＢＲＡＦ遺伝子を含む対象における癌を治療する方法が開示されている。この方法は、ヒト結腸癌細胞系のＣｏｌｏ２０５に対する結合でモノクローナル抗体ＳＣ１０４と競合するような、抗体又はその抗原結合性フラグメントを対象に投与するステップを含む。しかしながら、この抗原結合部位の正確な構造は明らかではない。
【０００５】
Ｃｏｌｏ２０５を含む全ての細胞は、その細胞が産生するタンパク質によりその細胞膜表面が覆われている。これら発現したタンパク質又はそれに結合する糖鎖に対して特定の配列を有する核酸が吸着することは既に多くの文献に紹介されている。（例えば、特許文献２及び３）これら特定のターゲットに対して特異的に吸着しうる核酸配列はアプタマーと呼ばれている。これらアプタマーは化学合成法による製造が可能であることが特徴である。従って、従来病因タンパク質と特異的に吸着するものの代表的存在であった抗体のように、生体内で合成する必要がない。これらアプタマーを診断に用いる場合は蛍光標識を行い蛍光顕微鏡での検出が多く用いられている（例えば、非特許文献３）。
【０００６】
タンパク質や細胞に対して特異的に吸着する新規のアプタマーの探索には試験管内進化法（in vitro selection法）が最も有効な手段として用いられている。特にＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment）法は大きく分けて目的核酸分子の選別と選別されたアプタマーの増幅の２ステップがある。（例えば、特許文献４）この選別と増幅を、選択圧を高めながら繰り返すことにより、高い親和性を有する核酸断片が得られる。さらに、近年では様々な改良が加えられ、より少ないサイクル回数でアプタマーを回収できる、効率・選択性において優れた手法や、低分子やタンパク質だけでなく細胞や組織（正確には、表面に存在する分子）に結合するアプタマーを得る手法（Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法；例えば、非特許文献４）などが報告されている。この手法は従来のＳＥＬＥＸ法に比べ、膜タンパク質の解析が不要であること、細胞表面に存在する様々な膜タンパク質のアプタマーを同時に選別できること、さらに、目的細胞とより特異的に結合するアプタマーを選抜できると言った特徴がある。これらアプタマーは従来診断、治療に用いられてきた抗体の特性でもあるターゲットに対する高親和性や特異性は言うまでも無く、化学的に短時間で合成することが可能であり、さらにその分子修飾も安価に行うことができ、作用機序が単純で、免疫原性もほとんどないという、抗体にはない様々な利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１３−５０９４５１号公報
【特許文献２】特開２００６−１４９３０２号公報
【特許文献３】特開２０１１−９２１３８号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ９１／１９８１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Semple, TU et al., Cancer Research. 38, 1345-1355, 1978
【非特許文献２】Little, AS et al., Sci. Signal., 4, ra17, 2011
【非特許文献３】Yen-An Shieh, Shu-Jyuan Yang, Ming-Feng Wei and Ming-JiumShieh., ACS NANO., Vol.4, No.3, 1433-1442, 2010.
【非特許文献４】Guo,et al.,Int.J.Mol.Sci.,9(4):668,2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のような背景の下に、本発明は、大腸癌の検出、診断、治療、及び転移予防等に有用なヒト大腸癌（Ｃｏｌｏ２０５）に関わる新規ＤＮＡアプタマーを提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法を用いることによってヒト大腸癌Ｃｏｌｏ２０５細胞に対して特異的な結合能を有するヌクレオチド配列を特定し、当該特定の配列を有するＤＮＡがヒト大腸癌Ｃｏｌｏ２０５細胞に対する特異的アプタマーとして機能し得ることを新規に見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、一つの態様において、配列番号１又は２で示されるヌクレオチド配列からなり、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合することを特徴とするＤＮＡアプタマーを提供する。本発明の好ましい態様では、上記ＤＮＡアプタマーは、検出を容易とするために、その５’末端又は３’末端にプライマー認識配列、蛍光標識、ビオチン、アビジン若しくはストレプトアビジン又はその他の特異的結合タグペプチドと連結されていてもよい。
【００１２】
本発明の異なる態様では、上記本発明のＤＮＡプライマーを含む、ヒト大腸癌細胞の検出用組成物、検出用キット又は検出方法を提供する。好ましい態様では、前記ＤＮＡアプタマーをヒト大腸細胞、大腸組織、血液、血清及び、血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させる工程、及び当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答を観測することによってヒト大腸癌細胞の存在を検出する工程を含む。
【００１３】
本発明のさらに異なる態様において、ヒト大腸癌細胞の治療用医薬組成物、ヒト大腸癌の治療用医薬組成物の製造のための上記本発明のＤＮＡプライマーの使用、又は本発明のＤＮＡプライマーを含む、ヒト大腸癌の治療用ドラッグデリバリーシステムを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、ヒト大腸癌の発症や転移の検出、癌の予後や悪性度の診断を可能とするために有用な新規な材料としてのＤＮＡアプタマーを提供することができる。すなわち、ヒト大腸癌に特異的に結合しうる新規ＤＮＡアプタマーを提供することにより、ヒト大腸癌における新たな抗原結合部位の探索や、従来の抗体とは親和性の異なるＤＮＡアプタマーを選択することができると考えられる。
【００１５】
また、ＤＮＡアプタマーは、蛍光標識等、検出手段に合わせた化学修飾が容易であるため、癌の検出キットを作製するうえで抗体を利用するよりも有利であり、さらに、抗癌剤等の薬物をコンジュゲートさせることで、当該薬剤をターゲット部位に確実に作用させることが可能である。また、化学合成が容易であることから、抗体のような大がかりな培養装置を必要とせず、製造のための手間やコストを抑制できるという利点もある。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】磁性微粒子を用いた２本鎖ＤＮＡの１本鎖化を示す模式図である。
【図２】配列番号１で示す塩基配列を有するＤＮＡアプタマーで染色したＣｏｌｏ２０５細胞の実像図である。
【図３】配列番号１で示す塩基配列を有するＤＮＡアプタマーで染色したＣｏｌｏ２０５細胞の蛍光イメージング図である。
【図４】配列番号２で示す塩基配列を有するＤＮＡアプタマーで染色したＣｏｌｏ２０５細胞の実像図である。
【図５】配列番号２で示す塩基配列を有するＤＮＡアプタマーで染色したＣｏｌｏ２０５細胞の蛍光イメージング図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
【００１８】
１．ＤＮＡアプタマー
本願において「ＤＮＡアプタマー」とは、ターゲットとなる分子や物質を特異的に認識できる一本鎖オリゴＤＮＡを意味し、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合する機能を有する一本鎖オリゴＤＮＡである。
本発明に係るＤＮＡアプタマーの結合ターゲットとしては、好ましくは大腸癌細胞であり、より好ましくはヒト大腸癌細胞であり、より好ましくはＣｏｌｏ２０５細胞である。Ｃｏｌｏ２０５細胞は、例えば、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）などの生物資源バンクから入手可能であり、あるいは研究用ヒト細胞株として市販されている。典型的な態様において、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、以下に示す配列番号１又は２で表されるヌクレオチド配列を有する。なお、本明細書においては、ヌクレオチド配列は、５’末端から３’末端方向に左から右に記載する。
【００１９】
本明細書において、用語「特異的」とは、Ｃｏｌｏ２０５細胞に対する本発明に係るＤＮＡアプタマーの選択的結合を指す。アプタマーは、Ｃｏｌｏ２０５細胞又はその細胞膜上の適切な抗原に対する結合を、所定の条件下において、無関係の細胞若しくは抗原または抗原混合物に対する結合と比較することによって、結合特異性について試験され得る。本発明に係るＤＮＡアプタマーは、Ｃｏｌｏ２０５細胞又はその細胞膜上の適切な抗原に対して、無関係の細胞若しくは抗原または抗原混合物に対してよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、好ましくは少なくとも１０倍結合する場合に、そのアプタマーは特異的であると考えられる。「無関係の細胞」とは、正常細胞又はヒト大腸癌以外の癌細胞であればよく、その由来、性質及び形態等の少なくとも１つがヒト大腸癌細胞と異なればよい。その細胞膜上の抗原も、必ずしもヒト大腸癌細胞にのみ存在する必要はないが、細胞膜上における発現量や立体構造の違いなど何らかの要因により、ヒト大腸癌細胞膜上に存在する場合に本発明に係るＤＮＡアプタマーと特異的に結合するものであればよい。
本発明のＤＮＡアプタマーは、特定の塩基配列に基づいて特定の立体構造を形成しうることから、一本鎖ＤＮＡによる非特異的な吸着ではなく、ヒト大腸癌細胞、特にＣｏｌｏ２０５細胞に特異的に結合すると考えられる。
【００２０】
＜配列番号１＞
５’−ＣＣＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’
＜配列番号２＞
５’−ＣＧＡＧＴＧＧＧＧＧＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’
【００２１】
本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するという機能を有する限り、上記配列番号１又は２に示す配列における１もしくは複数のヌクレオチドが置換、欠失、又は付加された配列であってもよい。好ましくは、当該置換、欠失、又は付加されるヌクレオチドは、１〜３個であり、より好ましくは１又は２個であり、さらに好ましくは１個である。
【００２２】
また、かかるヌクレオチドの置換、欠失、又は付加が存在する場合、本発明に係るＤＮＡアプタマーの配列は、上記配列番号１又は２のそれぞれと９０％以上、好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９６％以上の相同性である配列（以下、「相同体」という場合がある。）であることができる。ここで、本明細書で用いる場合、用語「相同性」は、当該技術分野で一般に認められた意味を示す。該用語は、典型的には配列解析プログラムによって（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，ＰＮＡＳ  ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，ＰＮＡＳ  ９０：５８７３−５８７７）または目視検査によって調べたとき、参照核酸配列の同一のヌクレオチドにマッチした主題の核酸配列のヌクレオチドの数をいう。
【００２３】
１もしくは複数のヌクレオチドが置換される場合、当該置換はユニバーサル塩基によってなされることができる。用語「ユニバーサル塩基」は、当該技術分野で一般に認められたその意味を示す。すなわち、該用語は、一般的に、標準ＤＮＡ／ＲＮＡの各塩基とほとんど区別なく塩基対を形成し、細胞内酵素によって認識されるヌクレオチド塩基類似体をいう（例えば、Ｌｏａｋｅｓら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７０：４２６−４３５）。ユニバーサル塩基の非限定的な例としては、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド（ｃａｒｂｏｚａｍｉｄｅ）、ならびにニトロアゾール誘導体（３’−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールなど）が挙げられる（Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：２４３７）。
【００２４】
また、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合するという機能を有する限り、その長さに上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、本実施の形態におけるＤＮＡアプタマーの長さは、上限としては、例えば２００塩基以下、好ましくは１５０塩基以下、より好ましくは１００塩基以下である。
【００２５】
全塩基の数が少ない場合、化学合成及び大量生産がより容易で、かつ費用面における長所も大きい。また、化学修飾も容易で生体内の安全性も高く、毒性も低くなる。下限としては、上記配列番号１又は２における塩基数以上、すなわち３４塩基以上である。ＤＮＡアプタマーは１本鎖（ｓｓＤＮＡ）であることが好ましいが、ヘアピンループ型の構造をとることにより部分的に２本鎖構造を形成する場合であっても、そのＤＮＡアプタマーの長さは１本鎖の長さとして計算するものとする。
【００２６】
好ましい実施態様において、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、上記配列番号１又は２のいずれかの配列、及びその５’及び３’末端側にそれぞれプライマー認識配列よりなるヌクレオチド配列であることができる。すなわち、この場合、当該ＤＮＡアプタマーは、
５’−Ｐ１−Ｘ−Ｐ２−３’
で表されるヌクレオチド配列を有する。ここで、Ｘは、配列番号１又は２で示される配列から選択されるヌクレオチド配列、又はそれらの配列において１〜３個のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を含む配列である。Ｐ１及びＰ２は、ＰＣＲ増幅のために導入された第１及び第２プライマー認識配列である。好ましくは、Ｐ１は、ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴ(配列番号３)であり、及びＰ２は、ＣＧＣＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣ（配列番号４）である。
【００２７】
本発明に係るＤＮＡアプタマーは、生体内における安定性の増大のために、化学修飾されていてもよい。そのような化学修飾の非限定的な例としては、糖鎖部分での化学的置換（例えば、２’−０メチル化）、リン酸エステル部分での化学的置換（例えば、ホスホロチオエート化、アミノ基、低級アルキルアミノ基、アセチル基等）、及び塩基部分での化学的置換が挙げられる。同様に、５’又は３’末端に付加的な塩基を有することもできる。該付加的塩基の長さは通常５塩基以下である。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとアプタマーの安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばｕｇ−３’、ｕｕ−３’、ｔｇ−３’、ｔｔ−３’、ｇｇｇ−３’、ｇｕｕｕ−３’、ｇｔｔｔ−３’、ｔｔｔｔｔ−３’、ｕｕｕｕｕ−３’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
また、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、後述のヒト大腸癌細胞の検出方法又は当該検出用キットにおいて用いるために、例えば５’末端又は３’末端に連結した検出標識を有することができる。かかる検出標識としては、蛍光標識が好ましいが、ラマン散乱標識、酵素標識、さらに赤外線標識を用いてもよい。
【００２９】
蛍光標識は、当該技術分野において慣用されている蛍光標識剤を用いることができるが、例えば、グリーンフルオレセントプロテイン（ＧＦＰ）、蛍光タンパク質、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６−カルボキシフルオロセイン−アミノヘキシル、フルオレセイン誘導体、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ローダミン、６−カルボキシテトラメチルローダミン、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、フィコエリスリン（ＰＥ）、フィコシアニン（ＰＣ）、ＰＣ５、ＰＣ７、Ｃｙ色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴｅｘａｓＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノメチルクマリンアセテート（ＡＭＣＡ）、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、  Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、  ＳＰＲＤ、  テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Ｒ１１０、ｍＣ１Ｂ、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ色素、ＣＦＳＥ、ＪＣ−１、ＰＫＨ、ＤＣＦＨ−ＤＡ、ＤＨＲ、ＦＤＡ、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ、ニトロベンゾオキサジアゾール（ＮＢＤ）基、ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール基、ａｃｒｉｄｉｎｅ（Ａｃｄ）、ｄａｎｓｙｌ（Ｄｎｓ）、７−ジメチルアミノクマリン−４−アセティックアシッド（ＤＭＡＣＡ）、５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホニックアシッド（ＥＤＡＮＳ）、ナフタレン、アントラセン及びプロトポルフィリン９など市販のオリゴヌクレオチド固相合成サービスで導入できる蛍光団が挙げられる。
【００３０】
さらに、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。
【００３１】
酵素標識の例としては、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等が挙げられる。また、発光基質として、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどを標識剤として用いてもよい。
【００３２】
ラマン散乱標識に関しては、前記の蛍光標識されたアプタマーの例えば５’末端又は３’末端に金属表面と結合能を有する置換基として特に限定するものではないが、チオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることにより当該アプタマー吸着金属粒子から発せられる増強ラマン散乱光を検出することで細胞認識を行うものである。この場合、特に限定するものではないが、金属ナノ粒子として、金、銀、銅、鉄、珪素、量子ドットなどを用いることができる。
【００３３】
２．ＤＮＡアプタマーの選別
本発明のＤＮＡアプタマーは、当該技術分野において周知のインビトロセレクション法を用いて選別及び取得することができる。そのような手法の好ましい例として、試験管内進化法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：ＳＥＬＥＸ法）が用いられる。
【００３４】
当該ＳＥＬＥＸ法は、ターゲット物質に結合する核酸リガンド（アプタマー）の選別と、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）による指数関数的な増幅を複数回繰り返すことにより、ターゲット物質に親和性を有する核酸分子（一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ）を得るというものである。
【００３５】
また、その改良手法として、例えばＧｕｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.Ｓｃｉ．，９(４)：６６８，２００８（非特許文献４）に記載されているようなＣｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法を用いることが好ましい。この手法は、ターゲットとして細胞自体を用いることができるため、従来のＳＥＬＥＸ法と比較して、細胞表面に膜タンパク質の解析が不要であること、細胞表面に結合し得る複数のアプタマーを同時に選抜できること、及びターゲット細胞に対してより特異的に結合するアプタマーを選抜できるといった利点を有するものである。
【００３６】
なお、これら以外にも当該技術分野において周知の方法を用いて本発明のＤＮＡアプタマーを選別及び取得することもできる。
【００３７】
上述のとおり、「インビトロセレクション法」は、ランダムなヌクレオチド配列を含む核酸分子のプール（いわゆる、ＤＮＡプール）からターゲットとする分子や細胞に対して親和性を持つアプタマー分子を選択し、親和性を持たない分子を排除する方法である。当該選択されたアプタマー分子のみをＰＣＲ法等で増幅し、さらに親和性による選択をするというサイクルを繰り返すことにより、強い結合能を持つアプタマー分子を濃縮することができるというものである。
【００３８】
具体的には、まず、２０〜３００塩基、好ましくは３０〜１５０、より好ましくは３０〜１００塩基程度のランダムなヌクレオチド配列（塩基配列）領域を含む１本鎖核酸分子、例えば、オリゴＤＮＡを調製する。オリゴＤＮＡは、ＰＣＲ増幅を可能にするために、その両端にプライマーとなるべき塩基配列を有するものを用いることが好ましい。
【００３９】
プライマー認識配列部分は、ＰＣＲ増幅後にプライマー部分を制限酵素によって切除し得るように適当な制限酵素サイトを有するようにしてもよい。用いるプライマー認識配列部分の長さは、特に限定されるものではないが、約２０〜５０、好ましくは２０〜３０塩基程度である。また、ＰＣＲ増幅後の１本鎖ＤＮＡを電気泳動などで分離可能とするために、５’側末端に、放射標識、蛍光標識などによる標識を行ってもよい。
【００４０】
次に、上記で得られたランダムなヌクレオチド配列を有する核酸分子（ライブラリープール）と、ターゲット細胞とを適当な濃度比で混合し、適当な条件下でインキュベートする。インキュベート後、混合物を遠心機にかけて、核酸分子−ターゲット細胞複合体と遊離核酸分子とを分離する。分離溶液の上澄み部分を除去し、得られた核酸分子−ターゲット細胞複合体を用いてＰＣＲ反応を行うことで細胞結合性核酸配列の増幅を行う。この後、ターゲット細胞と複合体を形成している核酸分子を当該技術分野において周知の手法に従って一本鎖化する。そのような手法としては、例えば、ストレプトアビジン固定化磁性粒子とビオチンとの結合を利用する分離が挙げられる。これにより、増幅した核酸二重鎖のうち細胞結合能を有するｓｓＤＮＡを分離することができ、さらにＤＮＡポリメラーゼなどのＰＣＲ反応溶液中に含まれる不要な共存物質を除去することができる。その後、回収されたｓｓＤＮＡをライブラリープールとして用いて同様の操作を行う。
【００４１】
上述の核酸分子とターゲット細胞との混合、ターゲット細胞と結合した核酸分子の分離、ＰＣＲ増幅、増幅された核酸分子を再びターゲット細胞との結合に使用するまでの一連の操作は数ラウンドを行う。ラウンドを繰り返し行うことにより、より特異的にターゲット細胞と結合する核酸分子を選別することができる。得られた核酸分子は、当該技術分野において周知の手法によりその配列解析を行うことができる。
【００４２】
３．癌細胞の検出用組成物、検出方法、及びキット
上述のように、本発明に係るＤＮＡアプタマーは、ヒト大腸癌細胞に対して特異的に結合する機能を有することから、当該ヒト大腸癌細胞の検出において好適に用いることができ、本発明のＤＮＡアプタマーを含む検出用組成物は、ヒト大腸癌に対する腫瘍マーカーとしても用いることができる。
【００４３】
具体的には、本発明のＤＮＡアプタマーを含む検出用組成物をヒト大腸細胞、大腸組織、血液、血清及び血漿よりなる群から選択される生体から採取された試料と接触させ、その後、当該試料とＤＮＡアプタマーとの結合による応答（シグナルの有無）を観測することによってヒト大腸癌細胞の存在を検出する。
【００４４】
当該生体から採取された試料は、動物から採取したものであって、最小侵襲で確保可能な試料または分泌体液、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養液成分試料等であれば、その形態は特に限定されない。
【００４５】
また、大腸細胞の存在を検出するための「応答」は、蛍光応答もしくはラマン散乱応答であることが好ましく、そのため上記で述べたとおり、蛍光応答においてはＤＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端にＴＡＭＲＡ（登録商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させることが好ましい。またラマン散乱応答においてはＤＮＡアプタマーの５’末端又は３’末端にＣｙ３．５（登録商標）、ＴＡＭＲＡ（登録商標）、ＦＩＴＣ等の蛍光標識剤を連結させ、さらに前記のチオール（ＳＨ）基、アルキルアミノ基、芳香族アミノ基、カルボキシル基を導入し、これを例えば、金ナノ粒子表面に吸着させることが好ましい。
【００４６】
また、本発明のヒト大腸癌細胞の検出用組成物は、その簡便性や携帯性を高めるためＤＮＡアプタマーを含むキットとして提供することもできる。当該キットにおいてＤＮＡアプタマーは、通常、適当な濃度となるように溶解された水溶液の態様で、或いは該ＤＮＡアプタマーが固相担体上に固定されたＤＮＡアレイの態様で提供されることができる。
【００４７】
例えば、ＤＮＡアプタマーの末端にビオチンを結合させて複合体を形成し、固相担体の表面にストレプトアビジンを固定化させて、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用によってＤＮＡアプタマーを固相担体表面に固定化することができる。当該キットには、必要に応じて他の試薬等を適宜含んでいても良く、例えば、添加剤として、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。
【００４８】
４．医薬組成物及びＤＤＳ
別の態様において、本発明は、上記ＤＮＡアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の検出、診断、転移予防又は治療用医薬組成物を提供するものである。好ましくは、当該医薬組成物は、ＤＮＡアプタマーに加えて、有効量のヒト大腸癌の検出、診断、転移予防又は治療のための医薬化合物（有効成分）、及び医薬上許容される担体を含むことができる。例えば、本アプタマーを金ナノ粒子に結合したものを用いて、癌の温熱療法用の試薬として利用できる可能性がある。
【００４９】
上記「ヒト大腸癌」は、好ましくはＣｏｌｏ２０５細胞と関連するヒト大腸癌である。「転移予防又は治療」には、癌細胞の遊離、移動、転移、浸潤または増殖の抑制、アポトーシスの誘導が含まれ得る。転移の抑制とは、癌細胞が原発巣から異なる部位に到達し、該部位において癌を二次的に生じることを抑制することを意味する。
【００５０】
本発明の医薬組成物中に含まれる有効成分は、ヒト大腸癌の転移予防又は治療に有効なものであれば、特に限定されるものではないが、好ましくは抗癌剤である。かかる抗癌剤の例としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、化学療法剤、分子標的治療薬、これら以外の他の抗癌剤等が挙げられる。
【００５１】
アルキル化剤としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、クロラムブチル、ジブロモダルシトール、チオテパ、カルムスチン、ブスルファンなどが挙げられる。
【００５２】
代謝拮抗剤としては、６−メルカプトプリン、フルオロウラシル、テガフール、ドキシフルリジン、シタラビン、エノシタビン、メトトレキセートなどが挙げられる。
【００５３】
抗生物質としては、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ペプロマイシン、ドキソルビシン、ＴＨＰ−アドリアマイシン、アクチノマイシンＤなど、その他の抗癌剤としては、塩酸アムルビシン、塩酸イリノテカン、イホスファミド、エトポシドラステット、ゲフィニチブ、シクロホスファミド、シスプラチン、トラスツズマブ、フルオロウラシル、メシル酸イマニチブ、メソトレキサート、リツキサン、アドリアマイシン、カルボプラチン、タモキシフェン、カンプトテシン、メルファラン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセクラトン、シゾフィランなどが挙げられる。
【００５４】
分子標的治療薬の標的は細胞表面抗原、増殖因子・受容体・シグナル伝達系、細胞周期、アポトーシス、テロメア・テロメラーゼ、転移・血管新生などに分類される。
【００５５】
細胞表面抗原を標的とする分子標的治療薬は抗体であることが多い。代表はＲｉｔｕｘｉｍｉｂ（Ｒｉｔｕｘａｎ）、Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  、Ｏｎｃｏｐｈａｇｅ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅなどが挙げられる。
【００５６】
増殖因子・受容体・シグナル伝達系にかかわる分子標的治療薬は特に限定するものではないが、Ｔｒａｓｔｚｕｍａｂやｃ−ｋｉｔおよびＢＣＲ−ＡＢＬチロシンキナーゼ阻害薬、特にEGFRチロシンキナーゼなどが挙げられる。
【００５７】
大腸癌の分子標的治療薬としては、ＶＥＧＦそのものに対する抗体であるＢｅｖａｃｉｚｕｍａｂや、Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ、Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅなどが挙げられる。
【００５８】
大腸癌の分子標的治療薬として現在検討されているものとして１）抗ＶＥＧＦ抗体Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、２）抗ＥＧＦＲ抗体Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ、３）抗ＥＧＦＲ抗体Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂなどが挙げられる。
【００５９】
本発明の医薬組成物中に含まれる医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明の医薬組成物の癌細胞内への導入を促進するために、当該組成物には、さらに核酸導入用試薬を含むこともできる。該核酸導入用試薬としては、アテロコラーゲン、リポソーム、ナノパーティクル、リポフェクチン、リプフェクタミン、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、或いはポリエチレンイミン等の陽イオン性脂質等を用いることが出来る。
【００６１】
本発明の医薬組成物は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、多様な製剤形態、例えば、カプセル剤、錠剤、液剤等の剤形をとることができ、限定はしないが、より一般的には、液剤化され、注射剤とされるか、または、経口剤とされるか、又は徐放剤とされる。
【００６３】
当該注射剤は、当該技術分野における周知の方法より調製することができる。例えば、滅菌水、緩衝液、生理食塩水等の適切な溶媒に溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。
【００６４】
経口剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の剤形に製剤化される。
【００６５】
徐放剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル剤、マイクロカプセル等の剤形に製剤化される。製剤化する場合には、好ましくは、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース、デキストラン、エチレングリコール等の安定化剤が添加され得る。
【００６６】
さらに、本発明の医薬組成物の製剤化においては、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止剤、無痛化剤、等張化剤等の必要な補助添加物を含んでもよい。
【００６７】
液状製剤とした場合は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥剤は、使用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００６８】
また、徐放剤とした場合、徐放用担体として例えば、可溶性コラーゲン又は可溶性コラーゲン誘導体、ゼラチン等の蛋白質、セラミックス多孔体、ポリアミノ酸、ポリ乳酸、キチン又はキチン誘導体、水膨潤性高分子ゲル等を使用することができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、その形態に応じた適切な投与経路により投与され得る。経口的に又は非経口的投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。例えば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内等に投与することができる。また、徐放剤の形態にして生体内、例えば患部、皮下、筋肉内等に埋め込むことにより投与することができる。
【００７０】
投与量及び投与回数等は、投与の目的、投与方法、癌の種類、大きさ、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、基本的には上記有効成分における望ましい投与形態に従う。
【００７１】
また、本発明のＤＮＡアプタマーをリポソームやナノ粒子等の輸送材料の表面に付着もしくは内包させることによって、当該輸送材料中に含まれる医薬成分をヒト大腸癌細胞に選択的に輸送することができる。従って、更なる態様において、本発明は上記ＤＮＡアプタマーを含有する、ヒト大腸癌の転移予防又は治療用ドラッグデリバリーシステムを提供するものである。
【００７２】
当該ドラッグデリバリーシステムによって輸送され得る医薬成分は、典型的には上述の抗癌剤であるが、ヒト大腸癌の転移予防又は治療に有用な物質である限り、それら以外にもトキシン、癌成長阻害遺伝子、自殺遺伝子、又は、ヒト大腸癌の成長及び転移に重要な役割を果たす遺伝子の発現を阻害するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）等であることもできる。
【００７３】
本発明は、プレターゲティングストラテジーを用いて、本発明のＤＮＡアプタマーを標的化可能なコンジュゲートに結合して被験者に投与し、所望により非標的化部位に残存するＤＮＡアプタマーをクリアリングした後、診断物質又は治療物質を標的化部位に結合させることができる。アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチンに基づくプレターゲティングストラテジーは、「Detection and Therapy of Lesions with Biotin/Avidin Conjugates.」と題されたGoldenbergの米国特許第５，５２５，３３８号に記載されるように用いられ得る。アビジン／ストレプトアビジン系は、高度に多用途であり、そしていくつかの構成で用いられている。本発明のＤＮＡアプタマーは、ストレプトアビジンまたはビオチンとカップリングされ得る。この後に、それぞれ、ビオチンとまたはアビジン／ストレプトアビジンとコンジュゲートされている診断物質又は治療物質が投与される。別の構成は、ビオチンコンジュゲートされた本発明のＤＮＡアプタマーを最初に標的化する３ステップアプローチを用いることができ、その後にストレプトアビジン／アビジンによる架橋が続き、次いでビオチンコンジュゲートされた診断剤又は治療剤が与えられる。本発明のＤＮＡアプタマーに対するビオチンおよびアビジン／ストレプトアビジンコンジュゲートの合成方法は、当分野において周知である。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
【００７５】
[実施例１] アプタマーの選別
Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法を用いて、３４塩基のランダムな配列を有するＤＮＡプールからＣＯＬＯ２０５大腸がん細胞に対し特異的に結合するアプタマーの選別を行った。Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ法の各工程は以下のとおりである。
用いるランダムＤＮＡは１本鎖であるが、これを以後センス鎖とする。
【００７６】
ＤＮＡプールは、以下の配列を有する全長が７０塩基でランダム配列部分（Ｎ）が３４塩基のオリゴＤＮＡを用いた。
ＤＮＡ  ｐｏｏｌ：Ｒａｎｄｏｍ３４（日本遺伝子研究所社製）
・配列：  ５’−ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＣＴ  ＣＣＴ（Ｎ３４）ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＴＴＧ  ＴＣＴ  ＣＣＣ−３’（配列番号５）
・長さ：  ７０塩基（ランダム配列は中央の３４塩基）
・分子量：  ２１３９１．３  ｇ／ｍｏｌ
・モル吸光係数：  ６３０４７５  Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ
【００７７】
ランダム配列の両末端の塩基配列はＰＣＲの時に用いるプライマー配列である。
１μＭ濃度に調製したＤＮＡプール１００μLを準備する。シャーレ上で培地ＲＰＭＩ−１６４０により培養したＣＯＬＯ２０５細胞（細胞濃度１×１０６セル/mL）をＥＤＴＡ含有０．５％トリプシン溶液ではがし取り、これを再度同培地２００μＬに分散させたものと、準備した１μＭのＤＮＡプール１００μＬとを混合した。その後、３７℃インキュベーター内に１時間放置し、細胞とＤＮＡの相互作用を促した。その後ターゲット結合性ＤＮＡと非結合性ＤＮＡを１５００ｒｐｍ５分間の遠心操作により分離し、上澄み液を取り除いたのち沈降した細胞をリン酸バッファー１ｍＬで洗浄した。この洗浄操作を２度繰り返したのち、細胞に２００ｍＬのリン酸バッファーを添加し、９５℃で１０分加熱し、細胞に吸着したＤＮＡをはがした。終了後細胞を混合せずに１３０００×ｇ、５分間の遠心操作を行い、上澄み液を回収した。
【００７８】
回収した上澄み液には細胞吸着性能を有するセンス鎖ＤＮＡが含まれているので、これを、ＰＣＲ法を用いて増幅した。プライマーは、上記ランダムＤＮＡの共通配列と相補的な１８塩基のプライマ−を用いた。アンチセンス鎖を構成するプライマ−の５’末端側には、後述するように１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）の分離を可能にするためビオチン修飾を施してある。増幅したＤＮＡは２重鎖構造をしているため、この２重鎖から目的とするセンス鎖を、磁性粒子を用いて図１に示した方法により回収した。すなわち、増幅したＤＮＡにストレプトアビジンを加えて磁性微粒子に吸着させ、磁石により磁性微粒子を回収した後上澄みを除去、その後アルカリバッファー変性により上澄み中に磁性微粒子と結合していない１本鎖ＤＮＡを回収した。
この回収した１本鎖ＤＮＡを再びターゲットとする細胞と混合し、上記手順を繰り返した。６サイクルしたところで次世代シークエンサーｉｏｎＰＧＭＴＭを用いて配列解析し、相同鎖１０００本以上見出された配列のＤＮＡのみ５’末端に赤色蛍光色素（ＣＹ３．５）を導入し細胞の認識試験を行った。
実際に用いたＤＮＡの構造は以下のとおりである。
【００７９】
＜配列番号１＞
５’−ＣＣＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＧＴＴＧＴＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’
＜配列番号２＞
５’−ＣＧＡＧＴＧＧＧＧＧＴＡＴＧＣＴＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＣＧＣＣＧ−３’
【００８０】
[実施例２]蛍光標識ＤＮＡアプタマーによる大腸がん細胞ＣＯＬＯ２０５の染色
ＣＯＬＯ２０５細胞を培養シャーレで培養し、細胞数が１０６〜１０７になるまで培養した。これにシークエンサー解析により見出されたＣＯＬＯ２０５細胞に対して親和性のあるＤＮＡアプタマーの５’末端をＣＹ３．５（商標）で修飾したものの１００μＭ溶液を調製した。これを、培養シャーレに分散させながら最終濃度１０μＭになるように添加した。これを３７℃１時間インキュベーターに静置した。その後、HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)で細胞を３回洗浄した後、さらにＨＢＳＳを２ｍＬ添加した状態でオリンパス製の倒立型蛍光顕微鏡ＩＸ５１により観察した。
【００８１】
その結果を図２〜図５に示す。
図２は、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡアプタマーで染色したＣｏｌｏ２０５細胞の実像であり、図３は、その蛍光イメージングを表した図である。
また、図４は、配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡアプタマーで染色したＣｏｌｏ２０５細胞の実像であり、図５は、その蛍光イメージングを表した図である。
これらの結果より明らかなように、ほとんどの細胞において、特に、培養シャーレに接着する細胞で強い蛍光を示すことが分かる。
【図１】
2016021883.tif 000003
【図２】
2016021883.tif 000004
【図３】
2016021883.tif 000005
【図４】
2016021883.tif 000006
【図５】
2016021883.tif 000007
【配列表】
2016021883000001.app