(57)【要約】【課題】口臭の成分であるメチルメルカプタンの産生を抑え得る口臭抑制剤及び口腔用組成物を提供する。【解決手段】口臭予防組成物は、コウボク及び五倍子から選択される１種以上を含有する。コウボク、五倍子は、メチオニンを分解してメチルメルカプタンを産生する酵素をコードするＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｍｇｌ ｍＲＮＡの発現を抑制する。メチルメルカプタンの産生が抑制されることになるため、口臭を改善することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コウボク及び五倍子から選択される１種以上を含有する、
ことを特徴とする口臭抑制剤。
【請求項２】
請求項１に記載の口臭抑制剤を含有する、
ことを特徴とする口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口臭抑制剤及び口腔用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
口臭は本人、あるいは第三者が不快と感じる呼気の総称と定義され、近年では口臭に悩む人の割合が高まっている。口臭は、主に細菌が剥離上皮細胞、唾液などの分泌液、血漿成分、食物残渣などに含まれるタンパク質が分解される過程で発生する。口臭の臭気物質としては、揮発性硫黄化合物、揮発性窒素化合物、低級脂肪酸などが挙げられる。なかでも、揮発性硫黄化合物である硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルスルフィドが主な口臭成分とされている。
【０００３】
主な口臭成分である揮発性硫黄化合物は、口腔内グラム陰性嫌気性菌によって産生され、歯周炎の進行と関連していると考えられている。特にメチルメルカプタンは歯周炎患者の口腔内で高濃度に検出されている。歯周炎は口腔内の細菌による感染症であり、適切な治療を行うことで口臭は減少するが、簡易的に口臭を抑えるべく、種々の洗口剤、歯磨剤等の口腔用組成物が市場に流通している（特許文献１，２など）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−１２９６０１号公報
【特許文献２】特開平１１−２１７３２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、市場に出回っている口腔用組成物は、産生したメチルメルカプタン等を消臭し、簡易的に清涼感を自覚させることで消臭効果を期待したものであり、口臭の根本的な改善につながらない。
【０００６】
本発明は上記事項に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、口臭の成分であるメチルメルカプタンの産生を抑え得る口臭抑制剤及び口腔用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の観点に係る口臭抑制剤は、
コウボク及び五倍子から選択される１種以上を含有する、
ことを特徴とする。
【０００８】
本発明の第２の観点に係る口腔用組成物は、
本発明の第１の観点に係る口臭抑制剤を含有する、
ことを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る口臭抑制剤は、メチオニンを分解してメチルメルカプタンを産生させる酵素（ＭＥＴａｓｅ）をコードするＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）のｍｇｌ ｍＲＮＡの発現を抑制する。メチルメルカプタンの産生が抑制されることになるため、口臭を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌株間におけるｍｇｌ ｍＲＮＡ発現量の違いを示すグラフである。
【図２】それぞれの生薬におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ３８株のメチルメルカプタン産生能を示すグラフである。
【図３】それぞれの生薬におけるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ Ｗ３８株のｍｇｌ mＲＮＡ発現に対する抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本実施の形態に係る口臭抑制剤は、コウボク及び五倍子から選択される一種以上を含有する。
【００１２】
コウボクは、モクレン科カラホオノキや凹葉ホオノキ、ホオノキの樹皮や根皮を乾燥したものである。また、五倍子とは、ウルシ科ヌルデ属Ｒｈｕｓ樹木の葉の付け根にできる虫こぶを乾燥したものである。
【００１３】
口臭の主要な原因として歯周病が挙げられる。歯周病は細菌感染による感染症であり、歯周病の主な原因菌として、口腔細菌であるＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓが位置づけられている。このＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの遺伝子であるｍｇｌ  ｍＲＮＡがコードしている酵素（ＭＥＴａｓｅ（Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−α−ｄｅａｍｉｎｏ−γ−ｍｅｒｃａｐｔｏｍｅｔｈａｎｅ−ｌｙａｓｅ））によって、口臭ガスの一つであるメチルメルカプタンが産生される。
【００１４】
本願の口臭抑制剤では産生したメチルメルカプタンではなく、メチルメルカプタンの産生自体を抑える。そのメカニズムは不明であるが、コウボク或いは五倍子によって、メチルメルカプタンの産生に必要な酵素をコードする遺伝子ｍｇｌ ｍＲＮＡ自体の発現が抑制される。これにより、メチルメルカプタンの産生が抑えられるので、口臭の改善、予防が可能になる。
【００１５】
また、コウボク、五倍子はいずれも漢方薬に用いられる生薬であるため、口臭抑制剤は副作用等のおそれも低い。
【００１６】
口臭抑制剤は、口腔用組成物として利用される。口腔用組成物として、例えば、練歯磨剤、ジェル剤、液体歯磨剤、洗口剤、スプレー剤、パスタ剤、軟ペースト剤（クリーム状製剤）、軟膏状製剤、錠剤、顆粒剤、チューイングガム剤、キャンディー剤、トローチ剤、タブレット剤、チュアブルタブレット剤、粒カプセル剤、飲料等の形態（剤形）として用いることができる。
【００１７】
口腔用組成物は、コウボク、五倍子に加えて、更に、その使用目的、剤型等に応じて適宜他の成分が配合されていてもよい。たとえば、リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム、不溶性メタリン酸ナトリウム、アルミノシリケート、無水ケイ酸、レジン等の研磨剤；長鎖アルキル硫酸ナトリウム、ラウリルスルホ酢酸ナトリウム、ラウリルジエタノールアマイド、ショ糖脂肪酸エステル等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸塩、カラゲナン、アラビアガム、ポリビニルアルコール等の粘結剤；ポリエチレングリコール、ソルビトール、グリセリン、プロピレングリコール等の粘稠剤；サッカリン、ステビオサイド類、グリチルリチン酸、ソーマチン等の甘味剤；デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム等の防腐；メントール、カルボン、オイゲノール、アネトール、ハッカ油、スペアミント油、ペパーミント油、ユーカリ油等の香料；各種色素等、口腔用組成物の製造に通常使用される原料を製品の種類や用途に応じて任意に選択し、常法により製造することができる。
【実施例】
【００１８】
まず、メチルメルカプタン産生能が高いＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌株間におけるｍｇｌ ＲＮＡの発現量について検討した。
【００１９】
（供試菌株および培養法と菌の調整法）
本実施例で用いたＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌株を表１に示す。ＡＴＣＣ３３２７７、ＡＴＣＣ４９４１７、Ｗ８３  ＡＴＣＣ５３９７８、Ｓ２はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し使用した。ＨＷ２４Ｄ１、６／２６は大阪大学歯学部予防歯科  天野敦雄教授から分与を受けて使用した。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ菌株は、−８０℃凍結保存してあるものを血液寒天培地（日本ＢＤ）で前培養して使用した。
【００２０】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの培養は、ＴＳＢＹＥ［１％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ，ＵＳＡ）を添加したＴｒｙｐｔｉｃａｓｅ  ｓｏｙ  ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ、Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］にｈｅｍｉｎ（５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）とＶｉｔａｍｉｎ  Ｋ３（１μｇ／ｍｌ）（片山化学）を添加した液体培地中で３７℃、２日間、嫌気状態で行った。
【００２１】
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの調整は、上記の菌培養液を遠心（５，８００ｘｇ，４℃，１０分間）集菌後、ＰＢＳ（−）で菌体を２回洗浄し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．７）［４０ｍＭリン酸カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）７ｇ／ｌ、５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）３ｇ／ｌ］に懸濁し、細菌密度を吸光度ＯＤ６６０＝１．０に調整した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
調整したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを以下のように培養してｔｏｔａｌ ＲＮＡの精製を行い、ｍｇｌ ｍＲＮＡを定量した。
【００２４】
リン酸緩衝液８７００μｌを含む１５ｍｌの遠沈管の中に、上記のＯＤ６６０＝１．０に調整したそれぞれの菌液１０００μｌ、１ｍＭのＬ−メチオニン３００μｌを添加し、パラフィルムでシール後、３７℃、６０分間培養した。次に反応液を遠心（２０，４００ｘｇ、４℃、５分間）した。
【００２５】
上清を取り除き、菌体を集菌した。ＲＮＡｉｓｏ  Ｐｌｕｓ（タカラバイオ株式会社）５００μｌを加え溶菌後、クロロホルム２００μｌを添加して混和した。
【００２６】
その溶液を遠心（２０，４００ｘｇ、４℃、１５分間）によって３層に分離後、上部の水層をｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ（和光純薬株式会社）３００μｌの入ったチューブに移し、穏やかに転倒混和後、遠心（２０，４００ｘｇ、４℃、１０分間）し、ＲＮＡ沈渣を得た。
【００２７】
これを７５％ｅｔｈａｎｏｌで洗浄、乾燥後、５０μｌのＤＥＰＣ（Ｄｉｅｔｈｙｌｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）水に溶解した。
【００２８】
次に、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ中のＤＮＡ除去のためのＤＮａｓｅ Ｉ処理を行った。ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＤＥＰＣで５０倍希釈し、ＲＮＡ溶液と同量加え３７℃、３０分間、静置した。
【００２９】
フェノール・クロロホルム（和光純薬株式会社）溶液を１００μｌ加え、１０秒間ｖｏｒｔｅｘ後、遠心（２０，４００ｘｇ、４℃、１５分間）を行い２層に分離した。
【００３０】
上部の水層を採取し、エタノール（９９．５％）２５０μｌの入ったチューブに移して混和した後、再び遠心（２０，４００ｘｇ、４℃、１５分間）を行い、ＲＮＡ沈渣を得た。
【００３１】
これを７５％ｅｔｈａｎｏｌで洗浄、乾燥後、５０μｌのＤＥＰＣ水に溶解し−８０℃にて保存した。
【００３２】
精製したｔｏｔａｌ ＲＮＡからＲＮＡ量をＧｅｎｅＱｕａｎｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ）を用いて測定した。
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲは、ｔｏｔａｌ ＲＮＡから１ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｃＤＮＡを合成し、そのｃＤＮＡを鋳型として行うＴｗｏ−ｓｔｅｐ法を用いた。
【００３３】
逆転写反応は、まず、鋳型ＲＮＡ（２μｇ）、１０ｘ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＫＣＬ（ｐＨ８．３）］を２μｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を４μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓを１μｌ、ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ（０．０２ｕｎｉｔｓ／μｌ）を１μｌ、ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（５０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を０．５μｌ、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅを０．２μｌ加え、Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。逆転写反応は４２℃、１時間、９９℃、５分間で行った。
【００３４】
ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲによる定量方法は相対定量法を用いた。相対定量法は目的遺伝子とリファレンス遺伝子を同時に解析し、リファレンス遺伝子に比べ、目的遺伝子がどれだけ発現しているかを相対的に比較するものである。ｃＤＮＡを１μｌ、Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（ｒ） Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）を４μｌ、ｐｒｉｍｅｒを０．５μｌ、滅菌イオン交換水を４．５μｌ、加えた。解析にはＡＢＩ Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍを用いた。本実験で使用したプライマーの塩基配列を表２に示すとともに、ｍｇｌ−Ｆプライマーの塩基配列を配列番号１に、ｍｇｌ−Ｒプライマーの塩基配列を配列番号２に、Ｐｇ１６Ｓ  ｒＲＮＡ−Ｆプライマーの塩基配列を配列番号３に、Ｐｇ１６Ｓ  ｒＲＮＡ−Ｒプライマーの塩基配列を配列番号４に記す。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
それぞれのＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓにおけるｍｇｌ ＲＮＡの発現量を図１に示す。Ｗ８３株のｍｇｌ ｍＲＮＡの発現量が最も多いことがわかる。
【００３７】
続いて、ｍｇｌ ｍＲＮＡの発現量が最も多いＷ８３を使用し、種々の生薬を用いてｍｇｌ ｍＲＮＡ発現、並びに、メチルメルカプタン産生能への影響について検討した。
【００３８】
生薬として、カンゾウ、どくだみ、オウレン、コウボク、麦門冬、カミツレ、ダイオウ、クチナシ、オウゴン、セイキョウ、ミカン、ガジュツ、クジン、ウイキョウ、黄精、枳実、五倍子、ケイヒを用いた。
【００３９】
ＣＨ３ＳＨの産生はＰｅｒｓｓｏｎらの方法（Ｐｅｒｓｓｏｎ Ｓ， Ｅｄｌｕｎｄ ＭＢ．， （１９９０） Ｔｈｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｓｕｌｆｉｄｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌｍｅｒｃａｐｔａｎ ｂｙ ｏｒａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｏｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ， ５： １９５−２０１．）を一部修正して行った。滅菌済み１３ｍｌガラス製試験管のそれぞれにリン酸緩衝液８７０μｌを入れ、更に、ＯＤ６６０＝１．０に調整したＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  Ｗ８３（１００μｌ）、Ｌ−メチオニン（１０ｎｍｏｌ）、それぞれの生薬（１００μｇ）を添加し、パラフィルムでシール後、３７℃に静置し培養した。また、培養時間は６０分間とした。また、参照例として生薬を添加しない以外、上記と同様の培養を行った。
【００４０】
培養後、それぞれの試験管内の上層気体を１ｍｌ気密シリンジ（トップ社、東京）で採取し、０．９ｍｌ廃棄した。そして、ＶＳＣｓに影響を与えないことを確認した空気０．９ｍｌを吸引し、１０倍希釈した。そのうちの０．５ｍｌをオーラルクロマ（エフアイエス株式会社）に注入し、ＣＨ３ＳＨ産生量を測定した。
【００４１】
また、ｍｇｌ ｍＲＮＡの発現量の定量は、上述した手法にて行った。
【００４２】
それぞれの生薬におけるメチルメルカプタン産生能への影響を図２に、また、ｍｇｌ ｍＲＮＡ発現量への影響を図３に示す。
【００４３】
図２を見ると、コウボクでは６９％、五倍子では７６．４％、メチルメルカプタンの産生が有意に抑制されていることがわかる。また、図３を見ると、コウボクでは７８％、ｍｇｌ ｍＲＮＡの発現が有意に抑制されていることがわかる。
【００４４】
以上のように、コウボク、五倍子はＰｇＷ８３によるＣＨ３ＳＨ産生能を抑制していることから、口臭を抑制可能であることを立証した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
上述したように口臭抑制剤は、メチオニンを分解してメチルメルカプタンを産生する酵素をコードするＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓのｍｇｌ ｍＲＮＡの発現を抑制する。メチルメルカプタンの産生が抑制されることになるため、口臭の改善が可能となり、種々の形態の口腔用組成物として利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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