(57)【要約】【課題】  本発明の課題は、表皮角化細胞から発せられるエンドセリン−１の産生を効果的に抑制する素材を提供することである。【解決手段】  活性型ＶＤ３の一つであるタカルシトールに表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生を効果的に抑制する作用を有することを見出した。本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、医薬品、医薬部外品又は美白化粧料として有用である。また、皮膚のシミやそばかす等の色素沈着における作用機序を解明するなどの研究開発目的のための試薬としても有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タカルシトールを有効成分として含有することを特徴とする、表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤。
【請求項２】
表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生抑制効果を有することを特徴とし、表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生を抑制するために用いるものである旨の表示をした、請求項１に記載の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤。
【請求項３】
医薬品、医薬部外品又は化粧品である、請求項１又は２に記載の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤、及びそれを用いた医薬品、医薬部外品、化粧品又は試料に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドセリン−１は、血管内皮細胞内で合成される、２１残基のアミノ酸からなるペプチドである（非特許文献１）。血管内皮細胞から分泌されたエンドセリン−１は、まず平滑筋細胞のエンドセリン受容体に結合し、血管収縮をおこす。他方で、エンドセリン−１は血管内皮細胞自身にあるエンドセリン受容体に結合して、血管収縮を起こす。その結果、プロスタグランジンＩ２、プロスタグランジンＥ１、トロンボキサンＢ２を産生させ、炎症を引き起こす。
【０００３】
一方、エンドセリン−１はまた、血管以外の種々の組織細胞で産生され、様々な生理的役割を担っている。例えば、紫外線が肌にあたると、表皮角化細胞（ケラチノサイト）でＴＮＦ−α及びＩＬ−１が産生され、これがオートクラインに作用してエンドセリン−１が産生されることが報告されている（非特許文献２）。産生されたエンドセリン−１は、表皮色素細胞（メラノサイト） に働きかけ、シミ、そばかすの原因となるメラニンを盛んに合成させる。従って、優れたエンドセリン−１産生抑制作用を示す素材は、優れた抗炎症作用を示す。また、表皮角化細胞からのエンドセリン−１産生量を抑制することができれば、メラニンの過剰な合成を抑え、シミやそばかすなどの色素沈着を治療または予防することができると考えられる。 
これまでに、赤ワイン抽出物に含まれるポリフェノール（ピセアタンノール、デルフィニジンなど）（非特許文献３）、大豆イソフラボン（ゲニステイン）（非特許文献４）、ルテオリンおよびクダモノトケイソウ抽出物（特許文献１）が血管内皮細胞のエンドセリン−１の産生抑制剤として検討されてはいるものの、表皮角化細胞のエンドセリン−１産生を抑制することは報告されていない。
【０００４】
一方、タカルシトールは活性型ＶＤ３の誘導体の一つであり、細胞増殖抑制作用や分化誘導の作用を持つことが報告されており、カルシウム吸収促進作用、血中カルシウム上昇作用、副甲状腺ホルモンの分泌抑制作用、骨形成作用及び表皮細胞増殖抑制作用等の薬理作用を有し、臨床的には慢性腎不全、副甲状腺機能低下症、ビタミンＤ抵抗性クル病、骨粗鬆症、尋常性乾癬及び掌蹠膿疱症の治療に使用されている。
しかしながら、エンドセリン−１の産生を抑制する効果を有することは知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｍ．Ｅｔ  ａｌ. Ｎａｔｕｒｅ. １９８８；３３２： ４１１−４１５.
【非特許文献２】ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ）、（オランダ）、１９９５年、３７１巻、ｐ．１８８−１９０
【非特許文献３】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、（英国）、２００１年、４１４巻、ｐ．８６３−８６４
【非特許文献４】アテロスクレロシス（ＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓＩｓ）、（アイルランド）、２００２年、１６３巻、ｐ．３３９−３４７
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−７５７６６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、表皮角化細胞から発せられるエンドセリン−１の産生を効果的に抑制する素材を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、活性型ＶＤ３の一つであるタカルシトールの作用を検討したところ、タカルシトールは表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生を効果的に抑制する作用を有することを見出した。すなわち本発明は以下の通りである。
（１）タカルシトールを有効成分として含有することを特徴とする表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤。
（２）表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生抑制効果を有することを特徴とし、表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生を抑制するために用いるものである旨の表示をした、請求項１に記載の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤、
（３）医薬品、医薬部外品又は化粧品である、（１）又は（２）に記載の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、エンドセリン−１の産生を抑制し得る新規な剤を提供することが出来る。また、本発明によれば、紫外線や加齢等によるシミ又はそばかすの予防又は治療薬、及び美白化粧料を提供することが出来る。
本発明のタカルシトールを有効成分として含有する表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、直接表皮色素細胞に作用しないため、ヒト皮膚に対して安全に使用することができる。本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、紫外線や加齢等によるシミ又はそばかすの予防又は治療薬、及び美白化粧料としての用途に限られるものではなく、例えば、表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤としての試薬の用途などにおいても好適に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のタカルシトールは、活性型ＶＤ３誘導体の一つであり、別名１α,２４（Ｒ）-ジヒドロキシビタミンＤ３ともいわれる。本発明におけるタカルシトールは市販品を用いることもできるが、合成することもできる。
【００１１】
本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、種々の用途に用いることが出来る。皮膚に対する安全性が良好であるので、皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品）や化粧品に配合することが好ましい。その他、試薬として用いることも可能である。
【００１２】
本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制作用を有するため、例えば、シミやそばかすのなどの色素沈着を予防又は治療するための医薬品、医薬部外品として、また皮膚に塗布される化粧品（特に美白化粧品）として好適に用いることができる。さらに、本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、実験材料としての細胞や実験動物に適用して、表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生を抑制するための試薬としても好適に用いることができる。
【００１３】
本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、それ自体を直接皮膚に適用してもよく、また、公知の方法により製剤化することができ、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状にして、化粧水、乳液、クリーム、パック、軟膏等とし、皮膚に適用することができる。
【００１４】
これら製剤化の際には、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品）や化粧料等に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ｐＨ調整剤等を加えることができる。
【００１５】
本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤を生体に適用する場合、その投与量は、特に限定されるものではなく、例えば、皮膚に直接塗布して用いる場合には、成人１回あたり０．００２〜０．２μｇ／ｃｍ2を１日あたり２回塗布するのが好ましい。また、皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品）、化粧料又は試薬における含有量は、製品あたり２〜２０μｇ/ｇが好ましい。
【００１６】
本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤は、上記したように、皮膚外用剤（医薬品、医薬部外品）、美白化粧料又は試薬として用いることができ、このためには、典型的には皮膚に直接塗布して用いられ、皮膚のシミやそばかすなどの色素沈着がある部分に適量を塗布するのが好ましい。
【００１７】
本発明の表皮角化細胞のエンドセリン−１産生抑制剤を含む製品（医薬品、医薬部外品、化粧品、又は試薬）またはその説明書は、表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生を抑制するために用いられる旨の表示を付したものである。ここで、「製品またはその説明書に表示を付した」とは、製品の本体、容器、包装などに表示を付したこと、あるいは製品の情報を開示する説明書、添付文書、宣伝物、その他の印刷物などに表示を付したことを意味する。また、これら表示においては、表皮角化細胞のエンドセリン−１の産生を抑制に起因する疾患の予防又は治療のために用いられることに関する情報を含むことができる。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１９】
（試験例１）ＴＮＦ−αで刺激したヒト表皮角化細胞のエンドセリン−１産生に対するタカルシトールの作用
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞を増殖用無血清液体培地ＫＧＭにて、２４穴（１穴２ｃｍ２）のプレートを用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃ で培養を開始し（培養開始時の細胞数は１穴あたり２ｘ１０４個） 、１日後に無血清液体培地ＫＢＭに交換した。翌日にプレートの各穴の培地を除去した後、試験物質であるＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−αとタカルシトール含有のＫＢＭ培地に交換し（各群４穴）、再びＣＯ２インキュベータにアッセイプレートを戻した。タカルシトールの濃度は１×１０−６、１０−７、１０−８、１０−９ｍｏｌ／Ｌに設定した。２日後に、ＣＯ２インキュベータからアッセイプレートを取り出し、上清を回収して、これをエンドセリン−１量測定用サンプルとした。また、各穴中の細胞を細胞溶解液で溶解し，それぞれマイクロチューブに入れた。これを、細胞蛋白質量測定用サンプルとした。
エンドセリン−１量測定用サンプルは、ＥＬＩＳＡ法により測定した。その後、アッセイプレート１穴当たりの液量から、各穴当たりのエンドセリン−１量（ｐｇ／穴）を算出した。細胞蛋白質量測定用サンプルは、ＢＣＡ法により測定した。その後、アッセイプレート１穴当たりの液量から、各穴当たりの細胞蛋白質量を算出した。
結果は、１回の試験における，各穴当たりのエンドセリン−１量と細胞蛋白質量から、各穴の細胞蛋白質量１μｇ当たりのエンドセリン−１産生量（ｐｇ／μｇ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）を算出した。この値を用いて、１回の試験における、各群4穴の平均値を算出した。この値を例数１として、繰り返し実施した８回の試験の平均値±標準誤差を算出した。
ＴＮＦ−α（−）群とＴＮＦ−α（＋）群の２群間で、対応のあるｔ検定を行った。その結果、ＴＮＦ−α（−）群に比べ、ＴＮＦ−α（＋）群で有意なエンドセリン−１量の増加を認めたので、試験系が成立したと判断した。次に、ＴＮＦ−α（＋）群とタカルシトール各濃度群の間で２因子実験データの解析、即ち、２元配置多重比較を行った。陽性対照との間に有意な差が認められた場合は* ｐ<０．０５、 *** ｐ<０．００１にて示した。
【００２０】
試験結果：
表皮角化細胞をＴＮＦ−αで刺激した時に産生されるエンドセリン−１量に対するタカルシトールの作用を評価した。その結果、対照ＴＮＦ−α（−）群に対してＴＮＦ−α（＋）群のエンドセリン−１産生量は有意に増加し、この増加に対し、タカルシトール１０−8ｍｏｌ/Ｌから１０−６ｍｏｌ/Ｌ群のＥＴ−１産生量は有意に減少した（表１）。本結果から、タカルシトールは１０−8ｍｏｌ/Ｌから１０−６ｍｏｌ/Ｌ の濃度でエンドセリン−１産生量抑制作用を示すことが明らかになった。
以上の結果から、タカルシトールはＴＮＦ-αで刺激した表皮角化細胞に作用してエンドセリン−１産生を抑制する効果を有することが明らかとなったので、本作用に基づき、タカルシトールは紫外線や加齢等によるしみやそばかすなどの色素沈着を抑制する効果、すなわち皮膚の美白作用を有することが示唆された。
【００２１】
【表１】
2016084296.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００２２】
本発明のタカルシトールは、表皮角化細胞からのエンドセリン‐１産生を抑制する作用を有するため、紫外線や加齢等によるシミやそばかす、エンドセリン−１の発現亢進が見られる色素沈着の予防又は治療薬として医薬品、医薬部外品又は美白化粧料として有用である。また、皮膚のシミやそばかす等の色素沈着における作用機序を解明するなどの研究開発目的のための試薬としても有用である。