(57)【要約】【課題】特定の選択培地における生育を指標として、総酸量は親株と比較して大きく変化せず、特定の有機酸の生産比率が変化した酵母を取得することができる酵母の育種方法、及び該育種方法により育種された酵母を提供すること。また、該酵母を用いて酒質のバランスを崩すことなく、酸味の質が変化したアルコール飲料を提供すること。【解決手段】酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地における生育を指標とする有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法などである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地における生育を指標とすることを特徴とする有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法。
【請求項２】
酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地として、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地を用い、
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地で生育せず、かつ前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育することを指標とし、
親株よりも、コハク酸生産比率が減少すること、及び乳酸生産比率が減少することの少なくともいずれかを満たす酵母を育種する請求項１に記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法。
【請求項３】
酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地として、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地を用い、
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地、及び前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地のいずれにおいても生育しないことを指標とし、
親株よりも、コハク酸生産比率が減少すること、乳酸生産比率が減少すること、及びリンゴ酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす酵母を育種する請求項１に記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法。
【請求項４】
酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地として、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地を用い、
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地で生育し、かつ前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育しないことを指標とし、
親株よりも、コハク酸生産比率が減少すること、リンゴ酸生産比率が増加すること、及び酢酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす酵母を育種する請求項１に記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれかに記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法により育種されたことを特徴とする有機酸生産比率が変化した酵母。
【請求項６】
請求項５に記載の有機酸生産比率が変化した酵母を用いることを特徴とするアルコール飲料。
【請求項７】
アルコール飲料が清酒である請求項６に記載のアルコール飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法、該育種方法により育種された有機酸生産比率が変化した酵母、及び該酵母を用いたアルコール飲料に関する。
【背景技術】
【０００２】
清酒中の主な有機酸はリンゴ酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、及び乳酸であり、それらの有機酸の量や割合は清酒の味わいにおいて重要である。もろみ中の有機酸の大半は酵母によって生産されることが知られている（非特許文献１）。これまでに、有機酸の生産比率に特徴のある様々な酵母が育種されてきた。
なお、以降に記載する酸度とは清酒に含まれる有機酸の量を示す単位であり、清酒１０ｍＬを中和するのに必要なＮ／１０  水酸化ナトリウムの量（ｍＬ）である。また、完全培地とは炭素源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの栄養素を豊富に含む培地であり、最少培地とはその微生物の生育に必要な最小限の物質を調製した培地を指す。
【０００３】
特定の有機酸の生産比率が向上した酵母の育種方法の例として、非特許文献２においてシクロヘキシミド耐性によりリンゴ酸高生産酵母が取得されている。非特許文献３においては、ＴＣＡ回路のクエン酸シンターゼの阻害物質であるα−ケトグルタル酸耐性により、リンゴ酸及びコハク酸の高生産酵母を取得している。その他にも、マルトース低資化性を指標とした方法など、有機酸高生産酵母の育種方法は多数報告されている（非特許文献４）。しかし、これらの方法では特定の有機酸が増加するものの、清酒の酸度も大きく増加し、酸味が強くなりすぎるという問題があった。
【０００４】
一方で、特定の有機酸生産比率が低下した酵母の育種については、α−ケトグルタル酸デヒドロゲーナーゼをコードする遺伝子（ＫＧＤ１）を破壊することで、コハク酸が半分に低下することが知られている（非特許文献５）。しかし、本法では清酒の酸度も下がり、味わいが不足する可能性があった。
【０００５】
このように、総酸量は大きく変化せず、特定の有機酸の生産比率が変化した酵母の育種方法について有効なものは未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】豊沢  誠，  米崎  治男，  上田  隆蔵，  林田  正典：  酵工，  ３８，  ３４２（１９６０）
【非特許文献２】吉田清，  稲葉正明，  中村欽一，  野白喜久雄：  醸協，  ８８，  ６４５−６４７  （１９９３）
【非特許文献３】浅野  忠男，  矢野  駿太郎，  高倉  裕，  田村  健一，  黒瀬  直孝，  平松  順一，  高橋  康次郎：醸協，  ９８，  ２１７−２２０（２００３）
【非特許文献４】Ａｓａｎｏ，  Ｔ．，  Ｋｕｒｏｓｅ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｔａｒｕｍｉ，  Ｓ．：Ｊ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ９２，  ４２９−４３３（２００１）
【非特許文献５】浅野  忠男，  黒瀬  直孝：醸協，  ９５，  ２２７−２３４（２０００）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、特定の選択培地における生育を指標として、総酸量は親株と比較して大きく変化せず、特定の有機酸の生産比率が変化した酵母を取得することができる酵母の育種方法、及び該育種方法により育種された酵母を提供することを目的とする。さらに、該酵母を用いて、酒質のバランスを崩すことなく、酸味の質が変化したアルコール飲料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決する手段として、本発明者は酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地で生育せず、かつ、酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育する株を選抜することで、親株と比較して該酵母を用いた清酒中のコハク酸生産比率が減少すること、及び乳酸生産比率が減少することの少なくともいずれかを満たす株を得られることを見出した。さらに驚くべきことに、該酵母を用いた清酒の酸度が親株と比較して大きく変化しないことを見出した。さらに鋭意検討した結果、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地、及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地のいずれにおいても生育しない株を選抜することで、親株と比較して該酵母を用いた清酒中のコハク酸生産比率が減少すること、乳酸生産比率が減少すること、及びリンゴ酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす株を得られることを見出した。また、該酵母を用いた清酒の酸度が親株と比較して大きく変化しないことを見出した。さらには、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地では生育し、かつ酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育しない株を選抜することで、親株と比較して該酵母を用いた清酒中のコハク酸生産比率が減少すること、リンゴ酸生産比率が増加すること、及び酢酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす株を得られることを見出した。また、該酵母を用いた清酒の酸度が親株と比較して大きく変化しないことを見出した。以上のように、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地、及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地での生育を指標とすることで、清酒の酸度は親株と比較して大きく変化せず、特定の有機酸の生産比率が変化した株を取得できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜１＞  酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地における生育を指標とすることを特徴とする有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法である。
＜２＞  酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地として、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地を用い、
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地で生育せず、かつ前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育することを指標とし、
親株よりも、コハク酸生産比率が減少すること、及び乳酸生産比率が減少することの少なくともいずれかを満たす酵母を育種する前記＜１＞に記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法である。
＜３＞  酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地として、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地を用い、
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地、及び前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地のいずれにおいても生育しないことを指標とし、
親株よりも、コハク酸生産比率が減少すること、乳酸生産比率が減少すること、及びリンゴ酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす酵母を育種する前記＜１＞に記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法である。
＜４＞  酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地として、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地を用い、
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地で生育し、かつ前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育しないことを指標とし、
親株よりも、コハク酸生産比率が減少すること、リンゴ酸生産比率が増加すること、及び酢酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす酵母を育種する前記＜１＞に記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法である。
＜５＞  前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法により育種されたことを特徴とする有機酸生産比率が変化した酵母である。
＜６＞  前記＜５＞に記載の有機酸生産比率が変化した酵母を用いることを特徴とするアルコール飲料である。
＜７＞  アルコール飲料が清酒である前記＜６＞に記載のアルコール飲料である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、特定の選択培地における生育を指標として、総酸量は親株と比較して大きく変化せず、特定の有機酸の生産比率が変化した酵母を取得することができる酵母の育種方法、及び該育種方法により育種された酵母を提供することができる。さらに、該酵母を用いて、酒質のバランスを崩すことなく、酸味の質が変化したアルコール飲料を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明に係る有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法、該育種方法により育種された有機酸生産比率が変化した酵母、及び該有機酸生産比率が変化した酵母を用いたアルコール飲料の実施形態について、具体的に説明するが、本発明は、これらの実施形態に限定されない。
【００１２】
（有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法、有機酸生産比率が変化した酵母）
本発明の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法は、酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地における生育を指標とする。
本発明の有機酸生産比率が変化した酵母は、本発明の有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法により育種することができる。
【００１３】
＜酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地＞
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地を用いることが好ましい。
【００１４】
−酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地−
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地における炭素源は、酢酸であってもよいし、酢酸の塩であってもよい。
酢酸あるいは酢酸の塩の前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地における濃度はとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）が好ましく、２％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
なお、酢酸を添加した平板培地を作製する際には、ｐＨが低すぎると寒天が固まらないため、ｐＨ４．０〜６．５、好ましくはｐＨ４．５に調整するのがよい。
【００１５】
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地の具体例としては、２％（ｗ／ｖ）  酢酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、及び１％（ｗ／ｖ）  酵母エキスを含む培地が挙げられる。
【００１６】
−酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地−
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地における炭素源は、酢酸であってもよいし、酢酸の塩であってもよい。
酢酸あるいは酢酸の塩の前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地における濃度はとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、０．５％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）が好ましく、２％（ｗ／ｖ）がより好ましい。
【００１７】
前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地の具体例としては、２％（ｗ／ｖ）  酢酸ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ）  硫酸アンモニウム、０．１７％（ｗ／ｖ）  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅを含む培地が挙げられる。
【００１８】
＜育種＞
−親株−
本発明に用いる親株としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、酵母の変異株が挙げられる。
前記酵母の変異株は、物理的変異方法又は化学的変異方法により得られたものであってもよいし、自然変異により得られたものであってもよい。
前記物理的変異方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、紫外線照射、放射線放射などが挙げられる。
前記化学的変異方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エチルメタンスルホネートの添加、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−ニトロソグアニジンの添加などが挙げられる。
前記酵母変異株のうち、酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地に移した後に、平板培地でコロニーを形成させて得た株を親株とすることができる。
【００１９】
−選抜−
本発明では、前記親株の中から、前記酢酸を唯一の炭素源として含有する選択培地における生育を指標として、目的とする株を選抜することができる。
【００２０】
−−指標−−
前記指標として、前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地で生育せず、かつ前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育することを指標とした場合には、親株と比較してコハク酸生産比率が減少すること、及び乳酸生産比率が減少することの少なくともいずれかを満たす酵母を選抜することができる。
【００２１】
前記指標として、前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地、及び前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地のいずれにおいても生育しないことを指標とした場合には、親株と比較してコハク酸生産比率が減少すること、乳酸生産比率が減少すること、及びリンゴ酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす酵母を選抜することができる。
【００２２】
前記指標として、前記酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地で生育し、かつ前記酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育しないことを指標とした場合には、親株と比較してコハク酸生産比率が減少すること、リンゴ酸生産比率が増加すること、及び酢酸生産比率が増加することの少なくともいずれかを満たす酵母を選抜することができる。
【００２３】
（アルコール飲料）
本発明のアルコール飲料は、本発明の有機酸生産比率が変化した酵母を用いて得られるアルコール飲料である。
前記アルコール飲料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、清酒が好ましい。
【００２４】
本発明は、有機酸生産比率が変化した酵母を用いたアルコール飲料の製造方法にも関する。
前記アルコール飲料の製造方法としては、本発明の有機酸生産比率が変化した酵母を用いる限り、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができる。
【実施例】
【００２５】
（実施例１：有機酸生産比率が変化した酵母の育種方法）
本発明の有機酸生成比率が変化した酵母の育種方法に用いる親株としては、清酒酵母（白鶴酒造株式会社製）を用いた。
前記親株を３ｍＬのＹＰ５Ｄ液体培地（５％（ｗ／ｖ）  グルコース、２％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）  酵母エキス）にて３０℃で１日培養し、菌体を回収して洗菌した後に０．９％（ｗ／ｖ）  塩化カリウム溶液２０ｍＬに懸濁した。
懸濁液に紫外線を照射して酵母に変異を誘発させた後に集菌し、ＹＰ２Ｄ液体培地（２％（ｗ／ｖ）  グルコース、２％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）  酵母エキス）１０ｍＬに移し、遮光条件下で３０℃、２日静置培養した。
次に集菌を行い、酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地（２％（ｗ／ｖ）  酢酸ナトリウム、０．５％（ｗ／ｖ）  硫酸アンモニウム、０．１７％（ｗ／ｖ）  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）２０ｍＬに移して、３０℃、１２０ｒｐｍで１日振とう培養した。さらに、ＹＰ２Ｄ平板培地（２％（ｗ／ｖ）  グルコース、２％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）  酵母エキス、２％（ｗ／ｖ）  寒天）でコロニーを形成させた。
それぞれのコロニーについて、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地（２％（ｗ／ｖ）  酢酸ナトリウム、２％（ｗ／ｖ）  ポリペプトン、１％（ｗ／ｖ）  酵母エキス）、及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地での生育の有無を確認した。
その結果、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地では生育せず、かつ酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育する株を８株得た（以降、グループＡとする）。また、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地、及び酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地のいずれでも生育しない株を８株得た（以降、グループＢとする）。さらに、酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地では生育し、かつ酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地では生育しない株を３株得た（以降、グループＣとする）。
【００２６】
（試験例１：小スケールでの清酒製造試験）
親株及び取得したグループＡ、Ｂ、Ｃの株について、総米４００ｇの小スケールの清酒製造試験を行った。配合量は、掛米には精米歩合７５％の白米３２８ｇ、麹米には精米歩合７０％の白米７２ｇ、汲水５８５ｍＬ、９０％（ｗ／ｗ）  乳酸  ０．２３ｇで実施した。酵母はＹＰ２Ｄ液体培地１０ｍＬで１日培養した菌体量を添加した。発酵温度は１５℃一定で行い、２３日後に上槽した。製成酒の日本酒度、アルコール度数、及び酸度（以降、一般分析値）及び有機酸濃度について分析した。
製成酒の一般分析値を表１（グループＡ）、表２（グループＢ）、表３（グループＣ）に示す。
【００２７】
【表１】
2016136865.tif 000002
【００２８】
【表２】
2016136865.tif 000003
【００２９】
【表３】
2016136865.tif 000004
【００３０】
表１、２、３の結果から、取得した株の製成酒の酸度は親株とほぼ同程度であった。
【００３１】
製成酒の有機酸濃度を表４（グループＡ）、表５（グループＢ）、表６（グループＣ）に示す。
【００３２】
【表４】
2016136865.tif 000005
【００３３】
【表５】
2016136865.tif 000006
【００３４】
【表６】
2016136865.tif 000007
【００３５】
表４の結果から、グループＡでは親株よりもコハク酸が減少し、最大で１５％減少した。また、乳酸が減少している株も６株見られ、最大で１４％減少した。表５の結果では、グループＢではグループＡよりもさらにコハク酸が減少する傾向であり、親株よりも最大で４０％減少した。また、親株よりも乳酸は減少しリンゴ酸は増加する傾向であり、乳酸は最大で１４％減少し、リンゴ酸は最大で５７％増加した。表６の結果では、グループＣはグループＡよりもさらにコハク酸が減少する傾向であり、親株よりも最大で２９％減少した。リンゴ酸及び酢酸は増加する傾向であり、親株よりもリンゴ酸は最大で７１％、酢酸は最大で１５５％増加した。
【００３６】
以上の結果から、酢酸を唯一の炭素源として含有する最少培地及び酢酸を唯一の炭素源として含有する完全培地での生育を指標にすることで、清酒の酸度は大きく変化せず、特定の有機酸生産比率が異なる複数の株を取得することができた。
【００３７】
次に、親株およびグループＡ、Ｂ、及びＣの株の製成酒についてパネラー１０名で官能評価を行った。官能評価は、５段階の総合評価（良い１−悪い５）と短評で実施した。結果を表７に示す。
【００３８】
【表７】
2016136865.tif 000008
【００３９】
表７より、グループＡの酒質は渋味が少なくすっきりとしており、これは親株よりもコハク酸が減少したことによると予想された。グループＢ及びＣでは親株よりも渋味が少なく、爽やかですっきりした酸味が感じられ、これはコハク酸が減少し、リンゴ酸が増加したことによると予想された。