(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚の粘弾性を予測し評価するための新しい指標、及びこの指標を用いた皮膚の検査方法を提供する。【解決手段】被験者の皮膚角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層のエノラーゼ１の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたエノラーゼ１の発現量から皮膚粘弾性の指標を求める工程を含む、皮膚粘弾性の評価方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角層のエノラーゼ１の発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法。
【請求項２】
被験者の皮膚角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層のエノラーゼ１の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたエノラーゼ１の発現量から皮膚粘弾性の指標を求める工程を含む皮膚粘弾性の評価方法。
【請求項３】
エノラーゼ１の発現量から皮膚の粘弾性を求める工程が、あらかじめ測定したエノラーゼ１と皮膚粘弾性の指標Ｒ７の相関関係を表す一次回帰式にエノラーゼ１測定値を代入して演算によりＲ７値を求めるものである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚粘弾性のマーカー及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の健康状態は、様々な指標を用いて評価される。例えば、皮膚の「はり」感の有無が健康状態や老化度の評価指標の一つとされる。「はり」は、角層・表皮由来のはりと真皮由来のはりの二つに分けられる。特に真皮由来のはりは、指で皮膚を押すと押し返すような弾力があり、指を離すと速やかに元に戻る状態をいい、物理的には粘弾性ともいう。そして皮膚の示すこの粘弾性は、年齢や紫外線被曝、化学物質への皮膚露出などによっても低下する。このため、皮膚のはりは、皮膚老化の指標ともなり得る。
皮膚を一つの弾性体であるとみなして、皮膚の粘弾性率を測定し、「はり」という官能的な評価方法に代えて用いようとする方法及び測定装置が開発されている。代表的な皮膚粘弾性測定装置としてＣＵＴＯＭＥＴＥＲ・キュートメーター（商品名）（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＆  Ｋｈａｚａｋａ社製）がある。この装置は、皮膚表面を陰圧状態のプローブ開口部に引き込み、開口部に引き込まれた皮膚長をプリズムで測定し、次いで吸引を解除し、解除したときの変位長（戻り）を同様に測定し、この測定結果をパラメータとして粘弾性率を求めるものである（非特許文献１参照）。この装置を用いた粘弾性率を指標として、皮膚の老化度の評価や、化粧料の効果を評価することが化粧品業界や、美容関連医療分野において広く普及している。
特許文献１には、皮膚のたるみを改善させるような美容施術を行ったときの効果を評価する手段としてキュートメーターを使用することが記載されている。
非特許文献２は、グルコシルセラミド含有ビート抽出物の皮膚弾力性に及ぼす影響を、キュートメーターを用いて評価したことが記載されている。このように皮膚粘弾性は皮膚の健康状態を評価するための重要なパラメータであると認識されている。
しかし、キュートメーターによる皮膚粘弾性の測定技術は、測定に用いるプローブや装置が高価であり、また使用にあたっては熟練を要する。このため、より簡便な方法が求められている。
【０００３】
また、皮膚の粘弾性という物理的な指標を、化学的な分析手法で測定する方法も提案されている。
特許文献２には、ヒト前腕を０．１５％の次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し、洗浄前後の酸化タンパク質を蛍光標識して測定すると、酸化タンパク質量が増加し、さらに、前腕部を前記キュートメーターで測定して得られる物理量であるＲ０（最大引っ張り幅）の処理前後の比が増加することが記載されている。そして、この結果に基づき酸化タンパク質を指標として皮膚の柔軟性を評価する方法が、同じく特許文献２に提案されている。
【０００４】
本発明は、エノラーゼ１を皮膚の粘弾性の指標とする発明である。本発明に係るエノラーゼ１は、腎臓の腫瘍マーカー（特許文献３）、肝臓傷害のマーカー（特許文献４）としての利用が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−０５１７１７号公報
【特許文献２】特開２００６−３４９３７２号公報
【特許文献３】ＷＯ２００８／０３２８６８号公報
【特許文献４】特表２００８−５３４９６９号公報
【０００６】
【非特許文献１】皮膚粘弾性測定装置  ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ  ＭＰＡ５８０  マニュアル、２００７．５修正版、株式会社インテグラル
【非特許文献２】堀未央、米井嘉一他、Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、  ７［１１］１２９−１４２，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、皮膚の粘弾性を予測し、評価するための新しい指標を提供することを課題とする。また、本発明は、この指標を用いた、皮膚の検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記のキュートメーターを用い、皮膚の粘弾性を測定し、粘弾性のパラメータと相関関係を有しているマーカーを探索する過程で、皮膚角層中のエノラーゼ１が粘弾性の指標となりうることを見いだし、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明の構成は、以下のとおりである。
（１）皮膚角層のエノラーゼ１の発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法。
（２）被験者の皮膚角層を採取する採取工程と、前記採取工程で採取された角層のエノラーゼ１の発現量を測定する測定工程と、前記測定工程で測定されたエノラーゼ１の発現量から皮膚粘弾性の指標を求める工程を含む皮膚粘弾性の評価方法。
（３）エノラーゼ１の発現量から皮膚の粘弾性を求める工程が、あらかじめ測定したエノラーゼ１と皮膚粘弾性の指標Ｒ７の相関関係を表す一次回帰式にエノラーゼ１測定値を代入して演算によりＲ７値を求めるものである（２）記載の方法。
（４）皮膚の角層を採取する工程がテープストリッピング法によるものである（３）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法によれば、物理的な指標である皮膚の粘弾性を、生化学的なマーカーである皮膚角層中のエノラーゼ１の測定結果に基づいて得ることができるため、キュートメーターなど専用の測定装置が不要となり、皮膚粘弾性測定が簡便化できる。また皮膚角層はテープストリッピング法によって容易に採取可能であり、郵送等の簡易な手段で輸送できるため、一箇所で大量の被験者の皮膚粘弾性の測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】キュートメーターを操作したときに得られる皮膚の変形を測定したチャートである。
【図２】角層中のエノラーゼ１測定値と皮膚粘弾性パラメータＲ０測定結果の散布図と相関分析結果を示す。
【図３】角層中のエノラーゼ１測定値と皮膚粘弾性パラメータＲ２測定結果の散布図と相関分析結果を示す。
【図４】角層中のエノラーゼ１測定値と皮膚粘弾性パラメータＲ７測定結果の散布図と相関分析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、皮膚角層のエノラーゼ１の発現量を測定することを特徴とする皮膚粘弾性を評価する方法に係る発明である。
【００１３】
従来技術のキュートメーターによる皮膚粘弾性の測定は次のようにして行われている。
標準的には、吸引径６ミリで３００ｍｂの吸引圧にて５秒間吸引し、その後開放したときの変形する皮膚の変位を解析する。キュートメーターで得ることのできる皮膚粘弾性値の測定パラメータとして、前記したとおり一定の吸引圧及び時間で変形する皮膚の変位を解析して求められる戻り弾性比率（Ｕｒ／Ｕｆ）が主として評価に用いられる。キュートメーターによる皮膚の変位量の経時的測定の代表的なチャートを図１に示す。図1において、Ｕｆ：吸引時の皮膚の伸び（図1のＵｆ1に対応）、Ｕｒ：即時的収縮（図1のＵｒ1に対応）、Ｕａ：吸引解放時の皮膚の戻り（図1のＵａ1に対応）である。皮膚の粘弾性指標として用いられるパラメータは、Ｒ０：吸引時の皮膚の伸びた長さ＝波形の振幅幅の最大値、Ｒ２：吸引時の皮膚の伸びた長さに対する吸引開放時の皮膚の戻り率＝皮膚の復元率（Ｒ２＝Ｕａ／Ｕｆ）、Ｒ７：吸引時の皮膚の伸びた長さに対する即時的（瞬間的）な収縮率＝収縮時の弾性率（Ｒ７＝Ｕｒ／Ｕｆ）である。Ｒ０は皮膚の力に対する受動的な反応を示し、数値の大きさが、皮膚の堅さと密接に係っている（堅さを意味する）ことを表している。Ｒ２は全体の弾力を表しており、完全弾性体で１．００、ヒト皮膚は０．３〜０．５である。Ｒ７は戻り弾性比率であり、１に近いほど弾性があり、ヒト皮膚は０．３〜０．５である。
【００１４】
一方、本発明の方法では、皮膚角層試料中のエノラーゼ１の発現量として、遺伝子量または蛋白質量を測定する。ここで、皮膚試料としては、ヒトの表皮角層を含む皮膚試料が好ましく、方法としては、皮膚に粘着性のテープを貼付し、これを剥離する際に、テープに付着してくる角層を試料とするテープストリッピング法を採用することが、患者への負担が少なく望ましい。
【００１５】
皮膚試料中のエノラーゼ１を遺伝子試料として測定する場合には例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。また、エノラーゼ１遺伝子の定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行うことができる。エノラーゼ１蛋白質の測定手段としては、例えば免疫染色等が採用できる。測定に用いる抗エノラーゼ１抗体及びその標識体は市販品を用いることができる。
免疫染色の場合には、例えば蛍光免疫染色により測定可能である。エノラーゼ１の定量は、例えば蛍光強度を、市販の測定装置とソフトウェアで定量することにより行うことができる。
【００１６】
また、上記の抗エノラーゼ１抗体、その標識体、第２抗体、標識第２抗体などを含有するＥＬＩＳＡキットとすることが好ましい。さらに、分析のための緩衝液等と組み合せた検査キットとすることもできる。
【００１７】
本発明のエノラーゼ１は、前記のキュートメーターで得ることのできる皮膚弾力性のパラメータであるＲ０、Ｒ２、Ｒ７の３指標のうち、Ｒ７と相関関係を示す。したがって、エノラーゼ１を測定することで、キュートメーターを用いずにＲ７の値を得ることができる。この場合、あらかじめ多数の無作為に選別した被験者の肌の粘弾性指標Ｒ７とエノラーゼ１の発現量を測定して得られた一次回帰式にエノラーゼ１の測定値を代入して演算することで、皮膚の粘弾性指標であるＲ７を得ることができる。
【実施例】
【００１８】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００１９】
＜皮膚粘弾性及びエノラーゼ１の測定＞
Ａ．方法
（１）試験対象
健常者女性２０歳〜６９歳（５４名） 
【００２０】
（２）キュートメーターを使用した粘弾性測定
顔面右頬部に測定部位を統一して粘弾性を測定した。測定はキュートメーターＭＰＡ５８０を用いて、付属のプローブを用いて、吸引径６ミリで３００ｍｂの吸引圧を５秒間吸引するモードで行った。
【００２１】
Ｂ．エノラーゼ１の測定
・角層採取
被験者の頬部より２．５ｃｍ×２．５ｃｍの角層チェッカー(アサヒテクノラボ社)1枚を用いてストリッピングを行い、角層を採取した。
・角層抽出方法
ガラスビーズＮｏ.４（三商社/＃８３−０８８８−４）とＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社/＃８９９０１）５００μLを入れた２ｍLプラスチックチューブに、角層採取したシールを入れ、ビーズ式細胞破砕機（トミー精工社/＃ＭＳ−１００Ｒ）にて４５００回転、１２０秒間振盪させて角層細胞を破砕し角層中の角層タンパクをＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ中に抽出した。
・角層中総タンパク量の測定
各サンプルのタンパク量はＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社／ ＃２３２２５)を用いて測定した。測定には角層サンプル１０μｌに ｒｅａｇｅｎｔＡ： ｒｅａｇｅｎｔＢ＝５０：１で混和した液２００μｌを加え、６０℃３０分間インキュベーションしたのち、５６２ｎｍの吸光度で測定した。同時に精製ウシ血清アルブミンを標準品として検量線を作成し、吸光度の値からタンパク量を算出した。
【００２２】
・角層中のエノラーゼ１量の測定
各サンプルのエノラーゼ１発現量は、ＥＬＩＳＡ法によって測定した。
ＥＬＩＳＡには、Ｃａｐｔｕｒｅ ＡｎｔｉｂｏｄｙとしてＡｎｔｉＥＮＯ１ ｍＡｂ(ａｂｎｏｖａ社/Ｈ００００２０２３−Ｍ１０)を、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＡｎｔｉＥＮＯ１ ｍＡｂ（ａｂｎｏｖａ社/Ｈ００００２０２３−Ｍ０１）をビオチンラベル化するためのキット（同仁化学社/＃ＬＫ０３）により添付のプロトコルに従い、ビオチン標識したものを用いた。また、ブロッキングには、Ｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｌｏｃｋｉｎｇ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社／ ＃３７５３９)を用いた。また、エノラーゼ１の精製タンパク(Ａｂｃａｍ社/＃ａｂ８９２４８)を希釈して検量線を作成し、角層中のEnolase-1を定量した。
【００２３】
角層中エノラーゼ１量として、抽出液中の総タンパク量で補正し、単位タンパク量あたりのエノラーゼ１量で表した。
【００２４】
Ｃ．測定結果及び相関分析
粘弾性のパラメータ測定結果とエノラーゼ１の測定結果についてピアソンの単相関分析を行い、単相関回帰式と相関係数を求めた。散布図グラフ及び回帰式を図２〜４に示す。エノラーゼ１の測定値は、Ｒ７の測定値と負の相関を示し、Ｒ０、Ｒ２とは相関関係が認められなかった。
Ｒ７の粘弾性パラメータとエノラーゼ１測定値の寄与率Ｒ２＝０．０８３７（相関係数はｒ＝０．２８８）であり、負の相関を示した。すなわち、この解析結果から皮膚角層のエノラーゼ１測定結果を、一次回帰式のＹに代入し、皮膚弾力性指標であるＲ７を得るか、回帰直線を検量線としてＲ７を得ることができた。
すなわち、皮膚の粘弾性の物理的な測定結果に代えて、エノラーゼ１を測定することで皮膚の粘弾性を評価できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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