(57)【要約】【課題】  所望の箇所で任意のタイミングで必要量のＳＯ２ガスを発生させることで、選択的な細胞処理を行うことが可能な光応答性細胞処理剤、細胞培養基材および細胞培養方法を提供する。【解決手段】  本発明の光応答性細胞処理剤は、下記の構造式（１ｃ）および／または構造式（２ｃ）で表される、ジアリールエテン化合物の閉環体からなる光応答性成分を含み、紫外線照射によって選択的にＳＯ２ガスによる細胞処理を行うことを特徴とする。2016093123.tif 000016【選択図】図１
2016093123.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造式（１ｃ）および／または構造式（２ｃ）で表される、ジアリールエテン化合物の閉環体からなる光応答性成分を含み、紫外線照射によって選択的にＳＯ２ガスによる細胞処理を行うことを特徴とする光応答性細胞処理剤。
【化１】
2016093123.tif 000013
構造式（１ｃ）および（２ｃ）において、Ｒ１〜Ｒ６は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、エステル基、ホルミル基、カルボニル基、アリル基、ベンジル基、フッ素原子、塩素原子、または、シアノ基を表す。
【請求項２】
前記ジアリールエテン化合物の閉環体が下記の構造式（３ｃ）で表わされる化合物であることを特徴とする、請求項１記載の光応答性細胞処理剤。
【化２】
2016093123.tif 000014
【請求項３】
前記ジアリールエテン化合物の閉環体が下記の構造式（４ｃ）で表わされる化合物であることを特徴とする、請求項１記載の光応答性細胞処理剤。
【化３】
2016093123.tif 000015
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の光応答性細胞処理剤を含む光応答性表面を有することを特徴とする細胞培養基材。
【請求項５】
高分子媒体に、前記光応答性細胞処理剤を含浸させてなることを特徴とする、請求項４記載の細胞培養基材。
【請求項６】
請求項４または５に記載の細胞培養基材を用いる細胞培養方法であって、
前記細胞培養基材に細胞を播種して培養する培養工程、および、
前記細胞培養基材の所定領域に紫外光を照射して前記所定領域の細胞を処理する細胞処理工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光応答性細胞処理剤、細胞培養基材および細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医学の発展とともに、体外で培養された培養細胞を選択的に回収する方法が検討されている。例えば、細胞播種後の光照射により細胞接着性や細胞増殖性が亢進させられる光応答性表面を細胞培養基材に形成し、所望の領域に光照射することによって、所望の細胞や細胞群のみを選択的に分別回収、あるいは任意のパターンに沿って細胞を培養する技術が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
ところで、ＳＯ２ガスは、ＤＮＡ損傷や脂質の酸化反応に応用され、また、血管拡張性や植物（ツユクサの気孔細胞）のＣａ２＋チャンネルを開ける働きが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２１０９３６号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２，５５，  ｐ５５３−ｐ５５７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記非特許文献１の技術においては、ＳＯ２ガスの発生速度や発生量の制御を局所的に行い、前記特許文献１の技術にあるような選択的な処理を実現することは困難であった。そこで、本発明は、所望の箇所で任意のタイミングで必要量のＳＯ２ガスを発生させることで、選択的な細胞処理を行うことが可能な光応答性細胞処理剤を提供することを目的とする。また、本発明は、前記の細胞処理を行うことが可能な細胞培養基材及び細胞培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を達成するために、本発明の光応答性細胞処理剤は、下記の構造式（１ｃ）および／または構造式（２ｃ）で表される、ジアリールエテン化合物の閉環体からなる光応答性成分を含み、紫外線照射によって選択的にＳＯ２ガスによる細胞処理を行うことを特徴とする。
【化１】
2016093123.tif 000003
構造式（１ｃ）および（２ｃ）において、Ｒ１〜Ｒ６は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、エステル基、ホルミル基、カルボニル基、アリル基、ベンジル基、フッ素原子、塩素原子、または、シアノ基を表す。
【０００８】
本発明の光応答性細胞処理剤において、前記ジアリールエテン化合物の閉環体が下記の構造式（３ｃ）で表わされる化合物であることが好ましい。
【化２】
2016093123.tif 000004
【０００９】
本発明の光応答性細胞処理剤において、前記ジアリールエテン化合物の閉環体が下記の構造式（４ｃ）で表わされる化合物であることが好ましい。
【化３】
2016093123.tif 000005
【００１０】
また、本発明の細胞培養基材は、前記本発明の光応答性細胞処理剤を含む光応答性表面を有することを特徴とする。
【００１１】
前記本発明の細胞培養基材は、高分子媒体に、前記本発明の光応答性細胞処理剤を含浸させてなることが好ましい。
【００１２】
本発明の細胞培養方法は、前記本発明の細胞培養基材を用いる細胞培養方法であって、前記細胞培養基材に細胞を播種して培養する培養工程、および、前記細胞培養基材の所定領域に紫外光を照射して前記所定領域の細胞を処理する細胞処理工程を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によると、所望の箇所で任意のタイミングで必要量のＳＯ２ガスを発生させることで、選択的な細胞処理を行うことが可能な光応答性細胞処理剤を提供することができる。また、前記の細胞処理を行うことが可能な細胞培養基材及び細胞培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ヘキサン中７０℃におけるジアリールエテン化合物の熱安定性を示す図である。図１右図は、構造式（３ｃ）で示される、ジアリールエテン化合物の閉環体の吸収スペクトルの経時変化を示す図である。図１左図は、構造式（３ｏ）で示される、ジアリールエテン化合物の開環体の吸収スペクトルの経時変化を示す図である。
【図２】図２は、構造式（３ｃ）で示される、ジアリールエテン化合物の閉環体の吸収スペクトル、および、構造式（３ｏ）で示される、ジアリールエテン化合物の開環体の吸収スペクトルであり、紫外線照射の波長領域を示した図である。
【図３】図３は、閉環体３ｃおよび開環体３ｏに紫外線を所定時間照射したときのＳＯ２ガス用検出管の写真である。
【図４】図４は、図３に示したガス検出管によって定量されたＳＯ２ガス検出値をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
つぎに、本発明について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の記載により制限されない。
【００１６】
本発明の光応答性細胞処理剤は、下記構造式（１ｃ）および／または構造式（２ｃ）で表される、ジアリールエテン化合物の閉環体を含むことを特徴とする。
【化４】
2016093123.tif 000006
【００１７】
前記ジアリールエテン化合物は閉環体であるが、可視光の照射により開環体に変換される。また、この開環体は、紫外光の照射により閉環体に変換される。構造式（１ｃ）および（２ｃ）で表される、ジアリールエテン化合物の閉環体の、開環／閉環反応を次式に示す。構造式（１ｏ）の化合物は（１ｃ）の化合物の開環体であり、構造式（２ｏ）の化合物は（２ｃ）の化合物の開環体である。
【化５】
2016093123.tif 000007
【化６】
2016093123.tif 000008
【００１８】
上記一般式において、Ｒ１〜Ｒ６が、例えばフェニル基を含む場合には、ＳＯ２ガスは発生しない。例えば、下記化合物は、開環／閉環反応の繰り返し耐久性があり、ＳＯ２ガスは発生しないことがわかっている（Ｓ．Ｉ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，２００６，ｐ１８８１−１８８３参照）。
【化７】
2016093123.tif 000009
【００１９】
発明者らは、ＳＯ２ガスが発生する現象は共役の長さに依存するものと考え、これを確認するために、共役が短い下記化合物に紫外線照射した。すると、ＳＯ２ガスの発生がみられ、またＳＯ２ガスの発生量も多いことが確認されたことから、ＳＯ２ガスの発生はジアリールエテン化合物における共役の長さに依存することがわかった。
【化８】
2016093123.tif 000010
【００２０】
したがって、（１ｃ）および（２ｃ）においてＳＯ２ガスを発生させるためには、Ｒ１〜Ｒ６は、共役が長くならない置換基であることが必要である。Ｒ１〜Ｒ６は、各々独立に、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、エステル基、ホルミル基、カルボニル基、アリル基、ベンジル基、フッ素原子、塩素原子、または、シアノ基から選ばれる。
【００２１】
また、構造式（１ｃ）で表されるジアリールエテン化合物の閉環体はＳＯ２部位を１つ有しているのに対して、構造式（２ｃ）で表されるジアリールエテン化合物の閉環体はＳＯ２部位を２つ有している。したがって、構造式（２ｃ）で表されるジアリールエテン化合物の閉環体であると、１分子当たりで発生可能なＳＯ２ガス量を多くすることができる。
【００２２】
ここで、ジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）および（２ｃ）は、熱的に安定である。ジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ），（２ｃ）は、可視光照射により、開環体（１ｏ），（２ｏ）に変換されるが、発明者らは、ジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ），（２ｃ）に紫外光を照射した場合も、一部は開環体（１ｏ），（２ｏ）を経て、ＳＯ２ガスを発生することを見出した。
【００２３】
ジアリールエテン化合物の閉環体としては、下記の構造式（３ｃ）および構造式（４ｃ）で表わされる化合物を好適に用いることができる。各化合物の開環／閉環反応を次式に示す。構造式（３ｏ）の化合物は（３ｃ）の化合物の開環体であり、構造式（４ｏ）の化合物は（４ｃ）の化合物の開環体である。
【化９】
2016093123.tif 000011
【化１０】
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【００２４】
ところで、構造式（３ｃ）の化合物を一例とするジアリールエテン化合物の閉環体（１ｃ）は、上述したとおり熱的に安定である。構造式（３ｃ）の化合物は、暗所においてヘキサン中７０℃で保持したところ、図１右図に示すように、吸収スペクトルの変化は、７日後においてもみられず、（３ｏ）への開環反応は認められなかった。また、ＳＯ２ガスの発生も認められなかった。
【００２５】
一方、構造式（３ｃ）の化合物の開環体である（３ｏ）を同様に観察したところ、図１左図に示すように、吸収スペクトルが変化するとともにＳＯ２ガスが発生した。このように、閉環体は熱的に安定であるが、開環体は熱的に不安定であることがわかった。開環体は、室温でも徐々に分解が進むことが考えられ、ＳＯ２ガス発生の制御が困難であるといえる。
【００２６】
また、構造式（３ｃ）の化合物に、ヘキサン中で可視光線（λ＞４３０ｎｍ）を照射すると、ガスの発生はなく、構造式（３ｏ）の化合物への開環反応のみが観察された。対照的に、構造式（３ｏ）の化合物に、ヘキサン中で紫外線（３００ｎｍ＜λ＜３６５ｎｍ）を照射すると、ガスが検出されて、これと並行して構造式（３ｃ）の化合物への閉環反応が起こる。
【００２７】
なお、発生したガスの同定は、密閉容器に入れた構造式（３ｏ）の化合物のクロロホルム溶液に紫外線（３００ｎｍ＜λ＜３６５ｎｍ）照射したときのＧＣ−ＭＳスペクトルで行ったところ、生成したガスは、ＳＯ２であると同定された。
【００２８】
前記の閉環体を光応答性細胞処理剤として用い、これらを細胞培養基材に用いて、オンデマンドに細胞処理を行うことが可能な培養方法を見出したことが本発明の特徴である。すなわち、構造式（１ｃ）および／または構造式（２ｃ）で表されるジアリールエテン化合物の閉環体は、加熱や可視光線の照射に対しては、安定にＳＯ２ガスを貯蔵する（ＳＯ２ガスを発生しない）。そして、図２に示す吸収スペクトルは、閉環体３ｃも紫外線照射の波長領域において吸収を有していることを示している。したがって、紫外線照射によって閉環体３ｃから開環体３ｏへの開環反応も起こっていることがわかる。前記閉環体は、紫外線照射によって一部で開環反応が起こり、紫外線照射部分で選択的にＳＯ２ガスを発生する光応答性薬剤であることを見出し、前記閉環体を光応答によりＳＯ２ガスによる細胞処理を行う光応答性細胞処理剤としたものである。この光応答性細胞処理剤を細胞培養基材の表面に配置して光応答性表面を形成することで、選択的な細胞処理可能な細胞培養基材を得ることができる。
【００２９】
前記細胞培養基材は、高分子媒体に、前記光応答性細胞処理剤を含浸させて構成することが好ましい。高分子媒体中に光応答性細胞処理剤を含浸させることで、ＳＯ２ガス発生後の分解生成物による汚染を防ぐことができる。前記高分子媒体としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）などのアクリルポリマ類、ポリエステル類、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリメチルペンテンなどのポリオレフィン類、ナイロンなどの縮合ポリマー類、ポリスチレン（ＰＳｔ）などが挙げられるが、ＰＭＭＡ、ＰＳｔ、ポリカーボネート、ポリ酢酸ビニル、シクロオレフィンポリマー等を好ましく用いることができる。
【００３０】
前記細胞培養基材を用いる細胞培養方法は、次のとおりである。まず、前記細胞培養基材に細胞を播種して培養する（培養工程）。ついで、前記細胞培養基材の所定領域に紫外光を照射して前記所定領域の細胞を処理する（細胞処理工程）。細胞の処理は、前記細胞培養基材に含まれる光応答性細胞処理剤に紫外線照射を行うことで発生するＳＯ２ガスによって行われる。ＳＯ２ガスは、紫外線照射された部分において選択的に発生するため、処理の対象としたい細胞が存在する部分のみに紫外線照射を行うことで、所望の細胞を処理することができる。
【実施例】
【００３１】
つぎに、以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。なお、本発明は、下記の実施例によってなんら限定ないし制限されない。
【００３２】
（ジアリールエテン化合物の合成）
構造式（３ｃ）および構造式（３ｏ）の構造をもつジアリールエテン化合物は、文献（Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００６，  ｐ１８８１−１８８３）の記載に従って合成した。
【００３３】
（ＳＯ２ガスの定量）
ＳＯ２ガスの定量は、ガステック社製ガス検知定量吸引ポンプセット（ＧＶ−１００Ｓ）に、ＳＯ２ガス用検出管（Ｎｏ．５Ｌｂ）を用いて行った。１００ｍＬビーカーに、２０ｍｇの構造式（３ｃ）の化合物（閉環体３ｃ）または構造式（３ｏ）の化合物（開環体３ｏ）を５ｍＬのヘキサンに溶解した溶液を入れ、カバーガラスで蓋をして油粘土で密封状態とした。そして、ビーカーの底部から、ＵＶランプ（Ｆｉ−５Ｌ）を用い、紫外線照射を行った。そして、所定の紫外線照射経過時間毎に、前記検出管を装着した吸引ポンプを用い、ビーカー内の気体を前記検出管に導入してＳＯ２ガス量を測定した。吸引ポンプでの吸引は、標準条件としては２回行ったが、濃度が薄く定量が困難な場合は、吸引を４回行い、検出管の測定値を二分の一としたものを検出値とした。また、濃度が濃すぎて定量が困難な場合は、吸引を１回行い、検出管の測定値を二倍としたものを検出値とした。
【００３４】
（紫外線照射時間とＳＯ２ガス発生量との関係）
図３に、閉環体３ｃおよび開環体３ｏに紫外線を所定時間照射したとき（図３中のＭ１〜Ｍ１０）、および、閉環体３ｃに可視光線（λ＞４８０ｎｍ）を所定時間照射したとき（図３中のＭ１１およびＭ１２）のＳＯ２ガス用検出管の写真を示す。写真において、検出管上部の色が変化している部分がＳＯ２ガス検出を示す部分である。また、図３に示したガス検出管によって定量されたＳＯ２ガス検出値をプロットしたグラフ、および、ＮＤ（Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）フィルタを用いて光の強度を下げて、紫外線を前記と同一の所定時間照射したときのＳＯ２ガス検出値をプロットしたグラフを図４に示す。
【００３５】
図３および図４に示すように、紫外線照射時間を長くすると、発生するＳＯ２ガスの量は増加した。これらの結果は、可視光線照射によるＳＯ２ガスの発生は閉環体３ｃではロックされており、開環体３ｏではロックが解除されていることを示している。閉環体３ｃに紫外光を直接照射しても、開環体３ｏを与え、これに紫外線を続けて照射することにより、ロックが解除されて、ＳＯ２ガスが発生した。閉環体３ｃだけではなく開環体３ｏのヘキサン溶液に紫外線照射したときのＳＯ２ガス発生をガス分析計で測定した結果を図４にあわせて示す。これらの結果からは、閉環体３ｃをＳＯ２ガスを貯蔵するための熱的に安定な試剤として用いることが可能であることがわかる。
【００３６】
ＮＤフィルタを用いて光の強度を下げると、閉環体３ｃからのＳＯ２ガス発生量が開環体３ｏの場合よりも抑制された。これは以下の理由による。閉環体３ｃのヘキサン溶液の場合、閉環体３ｃが吸収した最初のフォトンは開環体３ｏへの開環反応に利用される。生成した開環体３ｏはＳＯ２ガスを発生させるが、実験の初期段階では紫外線強度が低いので開環体３ｏの濃度が低い。結果として、最初に開環体３ｏから発生するＳＯ２ガスの量と閉環体３ｃから発生する量との比は、光の強度を低くしたときのほうが大きくなる。
【００３７】
［実施例１］
（細胞培養基材の作製）
構造式（３ｃ）の構造をもつ、ジアリールエテン化合物の閉環体０．０５ｗｔ％を含有するメタノール溶液（８μＬまたは１０μＬ）を組織培養用ポリスチレン基板上にスピンコーティング（回転速度８００ｒｐｍまたは６００ｒｐｍ）して、中心波長４６０ｎｍの青色光を十分照射して構造式（３ｏ）の構造をもつ、ジアリールエテン化合物の開環体に転化したあと、６０℃で２時間熱処理を行った後室温まで放冷し、細胞培養基材を作製した。
【００３８】
（実施例１−１）
マウス由来の繊維芽細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞を、溶液量８μL、回転数８００ｒｐｍの条件で調製した細胞培養基材上に播種した。２日後、細胞が接着し伸展した後、パターン化された領域に波長３６５ｎｍの紫外線（強度９０ｍＷ／ｃｍ２）を８分間照射した。３時間後、照射された領域においては、接着伸展していた細胞がダメージを受けて丸く変形し、細胞培養基材表面から脱離した。
【００３９】
（実施例１−２）
イヌ腎臓尿細管上皮細胞由来の細胞株であるＭＤＣＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  ｃａｎｉｎｅ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞を、溶液量１０μL、回転数６００ｒｐｍの条件で調製した細胞培養基材上に播種した。翌日、細胞が接着し伸展した後、パターン化された領域に波長３６５ｎｍの紫外線（強度９０ｍＷ／ｃｍ２）を１２分間照射した。２時間後、照射された領域においては、接着伸展していた細胞がダメージを受けて、一部の細胞が細胞培養基材表面から脱離した。細胞培養基材表面に残った細胞を、死滅した細胞のみを染色するＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅで染色した。その結果、照射された領域に残った細胞は、ダメージを受けて死滅したことが示された。
【００４０】
［実施例２］
（細胞培養基材の作製）
構造式（３ｃ）の構造をもつ、ジアリールエテン化合物の閉環体を１ｗｔ％含有するメタノール溶液１３ｍｇと、ＰＭＭＡを５ｗｔ％含有するトリフルオロエタノール溶液２３ｍｇを十分に混合して得られた溶液を、組織培養用ポリスチレン基板上にスピンコーティング（回転速度１５００ｒｐｍ）して、室温で４時間乾燥させて、細胞培養基材を作製した。
【００４１】
得られた細胞培養基材上に、マウス由来の繊維芽細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した。その後、細胞培養基材の中心部に弱い紫外線（３６５ｎｍ、９５ｍＷ／ｃｍ２）を８分間照射した。紫外線照射を止めて２時間後、照射領域の細胞はダメージを受けており、細胞培養基材表面から脱離した。なお、ＳＯ２ガス発生時の副生成物は、ＰＭＭＡマトリクス中に保持されていた。
【００４２】
［比較例１］
ジアリールエテン化合物を含まない以外は、実施例２と同様にして細胞培養基材を作製した。得られた細胞培養基材上に、マウス由来の繊維芽細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３細胞およびＭＤＣＫ細胞を播種し、培養した後に実施例２と同条件で紫外線照射を行ったところ、細胞にダメージは観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明によれば、細胞を播種した後の光照射により、細胞培養基材の光応答性表面の特定の領域に対して、最高１μｍの分解能を有する微細なパターンで、局所選択的に細胞処理を行うことが可能となる。紫外線照射光量によってＳＯ２ガスの発生速度や発生量を制御することができ、かつ紫外線の照射部分でのみ局所的にＳＯ２ガスの発生を行えるため、従来にない細胞処理手段が提供できる。従って、本発明の光応答性細胞処理剤を含む細胞培養基材、および、それを用いた細胞培養方法は、細胞工学分野、再生医療分野、バイオ関連工業分野、組織工学分野などにおいて極めて有用である。
【図２】
2016093123.tif 000017
【図４】
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【図１】
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【図３】
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