(57)【要約】【課題】本発明の目的は、固相担体表面や固相担体に固定化した物質、及び反応容器内壁への標識物質由来の非特異的反応を効果的に減少させ、更には高感度かつ再現性に優れた免疫測定用の試薬、免疫測定方法を提供することにある。【解決手段】固相担体試薬（Ｂ）と標識試薬（Ｅ）とから構成される免疫測定用試薬であって、前記固相担体試薬（Ｂ）が、固相担体（Ａ０）の表面上に、測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）、及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質（Ｆ）、及びタンパク質（Ｄ２）が固定化された固相担体（Ａ）を含有し、前記標識試薬（Ｅ）が、前記物質（Ｆ）が標識物質（Ｇ）により標識されてなる物質（Ｃ）、及び固定化されていない前記タンパク質（Ｄ１）を含有する免疫測定用試薬を使用する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相担体試薬（Ｂ）と標識試薬（Ｅ）とから構成される免疫測定用試薬であって、
前記固相担体試薬（Ｂ）が、固相担体（Ａ０）の表面上に、測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）、及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質（Ｆ）、及びタンパク質（Ｄ２）が固定化された固相担体（Ａ）を含有し、
前記標識試薬（Ｅ）が、前記物質（Ｆ）が標識物質（Ｇ）により標識されてなる物質（Ｃ）、及び固定化されていないタンパク質（Ｄ１）を含有し、前記タンパク質（Ｄ１）の含有量が前記標識試薬（Ｅ）の重量に対して０．０１〜２重量％である免疫測定用試薬。
【請求項２】
前記タンパク質（Ｄ１）及びタンパク質（Ｄ２）が、ウシ血清アルブミン、ブロックエース、カゼイン、カゼイン加水分解物、スキムミルク、ゼラチン、及びコラーゲンペプチドからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項１に記載の免疫測定用試薬。
【請求項３】
前記固相担体（Ａ０）が磁性シリカ粒子である請求項１又は２に記載の免疫測定用試薬。
【請求項４】
前記標識物質（Ｇ）がペルオキシダーゼであって、前記固相担体試薬（Ｂ）、前記標識試薬（Ｅ）、さらにルミノール発光試薬（Ｈ）、及び過酸化水素液（Ｊ）とから構成される請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫測定用試薬。
【請求項５】
測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）、及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質（Ｆ）、及びタンパク質（Ｄ２）が固相担体（Ａ０）の表面上に固定化された固相担体（Ａ）を含有する固相担体試薬（Ｂ）と、前記物質（Ｆ）が標識物質（Ｇ）により標識されてなる物質（Ｃ）と固定化されていないタンパク質（Ｄ１）を含有する標識試薬（Ｅ）を用いて、測定対象物質（Ｆ１）を測定する免疫測定方法であって、標識試薬（Ｅ）中の前記タンパク質（Ｄ１）の濃度が０．０１〜２重量％である免疫測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物質測定方法及び該方法に用いられる試薬に関する。更に詳しくは、診断の補助、治療効果確認の補助、タンパク質精製時及び細胞分離時の精製度の確認等に用いる測定方法及び試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫測定試薬においては、血清検体を測定する際に、反応容器、固相担体表面、固相担体表面に固定化した物質への検体由来の成分の非特異的な吸着が特定の検体でみられ、これらの非特異反応が正確な測定を行う妨げとなり問題となっている（例えば、非特許文献１）。非特異的反応を防止するため種々の蛋白質、界面活性剤、塩類等を含有させた免疫測定用試薬が提案されている（例えば、特許文献１〜３）。
【０００３】
また免疫測定において、固相の磁性シリカ粒子表面や固相に固定化した物質、及び反応容器内壁への測定対象物を検出するための標識物質が非特異的な結合に起因して正常値と判定されるべき検体が、誤って異常値と判定されることが知られており、標識物質の非特異的吸着が、大きな課題となっている。また、非特異反応が生じると、測定のノイズが上昇し、測定感度が低下することも問題である。特に従来の技術では、固相担体表面や固相担体に固定化した物質、及び反応容器内壁への標識物質の非特異的な結合を抑制するには限界がある。これら非特異的吸着を減少させることは、多数検体同時迅速検査を目的とした自動化免疫測定装置の開発において、ますます重要な課題となっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２，Ｐ２０８−２１３，２０１１
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１１７３４１号公報
【特許文献２】特開２０１０−１２７８２７号公報
【特許文献３】特開２０１０−２１６９７０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、固相担体表面や固相担体に固定化した物質、及び反応容器内壁への標識物質由来の非特異的反応を効果的に減少させ、更には高感度かつ再現性に優れた免疫測定用の試薬、免疫測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討した結果本発明に到達した。即ち本発明は固相担体試薬（Ｂ）と標識試薬（Ｅ）とから構成される免疫測定用試薬であって、
前記固相担体試薬（Ｂ）が、固相担体（Ａ０）の表面上に、測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）、及び測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質（Ｆ）、及びタンパク質（Ｄ２）が固定化された固相担体（Ａ）を含有し、
前記標識試薬（Ｅ）が、前記物質（Ｆ）が標識物質（Ｇ）により標識されてなる物質（Ｃ）、及び固定化されていないタンパク質（Ｄ１）を含有し、前記タンパク質（Ｄ１）の含有量が前記標識試薬（Ｅ）の重量に対して０．０１〜２重量％である免疫測定用試薬；該免疫測定試薬を用いる免疫測定方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の免疫測定は測定のノイズが低く、高感度かつ再現性の極めて高い臨床検査を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１４〜２４、２６と比較例５〜７の感度と同時再現性
【００１０】
【図２】実施例２５と比較例８の感度と同時再現性
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明における固相担体（Ａ０）の表面上に、固定化されていないタンパク質（Ｄ１）としては、通常この分野で使用される固相担体のブロッキングタンパク質を用いることができる。該タンパク質（Ｄ１）の内、非特異反応の低減の観点から好ましいのは、ウシ血清アルブミン、ブロックエース、カゼイン、カゼイン加水分解物、スキムミルク、ゼラチン、コラーゲンペプチド、ラクトアルブミン、ラクトアルブミン加水分解物であり、更に好ましいのはウシ血清アルブミン、ブロックエース、カゼイン、カゼイン加水分解物、スキムミルク、ゼラチン、コラーゲンペプチドである。固定化されたタンパク質（Ｄ２）の例としては、通常この分野で使用される固相担体のブロッキングタンパク質を用いることができる。該タンパク質（Ｄ２）の内、非特異反応の低減の観点から好ましいのは、固定化されていないタンパク質（Ｄ１）とおなじものが挙げられる。
同一の本発明の免疫測定用試薬において、タンパク質（Ｄ１）とタンパク質（Ｄ２）は同じタンパク質でなければいけない。
【００１２】
該タンパク質（Ｄ１）を標識試薬（Ｅ）に含有させる方法は、特に限定されないが、例えば標識された測定対象物質、測定対象物質の類似物質、及び測定対象物質と特異的に結合する物質を溶解させた標識試薬に添加することができる。
【００１３】
該タンパク質（Ｄ１）の含有量として、標識試薬（Ｅ）（２５℃）の重量に対して、０．０１〜２重量％、好ましくは０．０５〜１．５重量％、さらに好ましくは０．１〜１．０重量％である。０．０１重量％未満では非特異反応を抑制する効果は無く、２重量％を超えると免疫反応を阻害して感度が低下するまたはタンパク質（Ｄ１）が標識試薬（Ｅ）に溶解しない傾向にある。
【００１４】
標識試薬（Ｅ）に含有させるタンパク質（Ｄ１）は１種類を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００１５】
本発明における測定対象物質（Ｆ１）としては、通常この分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えば血清，血液，血漿，尿等の生体体液、リンパ液、血球、各種細胞類等の生体由来の試料中に含まれるタンパク質、脂質タンパク質、核酸、免疫グロブリン、血液凝固関連因子、抗体、酵素、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー及び各種薬物等が代表的なものとして挙げられる。更に具体的には、例えばアルブミン，ヘモグロビン，ミオグロビン，トランスフェリン，プロテインＡ，Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）等のタンパク質、例えば高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ），低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ），超低比重リポ蛋白質等の脂質蛋白質、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸、例えばアルカリ性ホスファターゼ，アミラーゼ，酸性ホスファターゼ，γ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−ＧＴＰ），リパーゼ，クレアチンキナーゼ（ＣＫ），乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ），グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ），グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ），レニン，プロテインキナーゼ（ＰＫ），チロシンキナーゼ等の酵素、例えばＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ等の免疫グロブリン（或はこれらの、例えばＦｃ部，Ｆａｂ部，Ｆ（ａｂ）２部等の断片）、例えばフィブリノーゲン，フィブリン分解産物（ＦＤＰ），プロトロンビン，トロンビン等の血液凝固関連因子、例えば抗ストレプトリジンＯ抗体，抗ヒトH.ピロリ抗体、抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原抗体（抗ＨＢｓ抗原抗体）、抗ヒトB型肝炎コア抗原抗体（抗HBｃ抗体）抗ヒトＣ型肝炎ウイルス抗体、抗リュウマチ因子等の抗体、例えばB型肝炎ウィルス表面抗原（HBsAg）、例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺ホルモン（ＦＴ３，ＦＴ４，Ｔ３，Ｔ４）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、エストラジオール（Ｅ２）、コルチゾール、アルドステロン等のホルモン、例えばα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等の癌マーカー、例えばトロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｎ端フラグメント（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）等の心疾患マーカー、例えば抗てんかん薬、抗生物質、テオフィリン等の薬物等が挙げられる。上記したものの中でも、抗体、ホルモン、癌マーカー、心疾患マーカー等が好ましい。
【００１６】
本発明における測定対象物質の類似物質（アナログ）（Ｆ２）は、測定対象物質と特異的に結合する物質が有する測定対象物質との結合部位と結合し得るもの、言い換えれば、測定対象物質が有する測定対象物質と特異的に結合する物質との結合部位を有するもの、更に言い換えれば、測定対象物質と測定対象物質と特異的に結合する物質との反応時に共存させると該反応と競合し得るものであれば何れでもよい。
【００１７】
本発明における測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）としては、例えば「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「タンパク質」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「タンパク質」−「ペプチド鎖」間反応又は「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応、「ヌクレオチド鎖」−「タンパク質」間反応等の相互反応によって測定対象物質又はその類似物質と結合するもの等が挙げられ、上記各組合せに於いて何れか一方が測定対象物質又はその類似物質である場合、他の一方がこの測定対象物質と特異的に結合する物質である。例えば、測定対象物質又はその類似物質が「抗原」であるときは測定対象物質と特異的に結合する物質は「抗体」であり、測定対象物質又はその類似物質が「抗体」であるときは測定対象物質と特異的に結合する物質は「抗原」である（以下、その他の上記各組合せにおいても同様である）。
【００１８】
具体的には、例えばヌクレオチド鎖（オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖）；染色体；ペプチド鎖（例えばＣ−ペプチド、アンジオテンシンＩ等）、タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ），免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ），免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ），免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ），免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ），β２−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質〕；酵素〔例えばアミラーゼ（例えば膵型，唾液腺型，Ｘ型等）、アルカリホスファターゼ（例えば肝性，骨性，胎盤性，小腸性等）、酸性ホスファターゼ（例えばＰＡＰ等）、γ−グルタミルトランスファラーゼ（例えば腎性，膵性，肝性等）、リパーゼ（例えば膵型，胃型等）、クレアチンキナーゼ（例えばＣＫ−１，ＣＫ−２，ｍＣＫ等）、乳酸脱水素酵素（例えばＬＤＨ１〜ＬＤＨ５等）、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（例えばＡＳＴｍ，ＡＳＴｓ等）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（例えばＡＬＴｍ，ＡＬＴｓ等）、コリンエステラーゼ（例えばＣｈＥ１〜ＣｈＥ５等）、ロイシンアミノペプチダーゼ（例えばＣ−ＬＡＰ，ＡＡ，ＣＡＰ等）、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕及びこれら酵素のインヒビター，ホルモン（例えばＰＴＨ，ＴＳＨ，インシュリン，ＬＨ，ＦＳＨ，プロラクチン等）、レセプター（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等に対するレセプター）；リガンド（例えばエストロゲン，ＴＳＨ等）；例えば細菌（例えば結核菌，肺炎球菌，ジフテリア菌，髄膜炎菌，淋菌，ブドウ球菌，レンサ球菌，腸内細菌，大腸菌，ヘリコバクター・ピロリ等）、ウイルス（例えばルベラウイルス，ヘルペスウイルス，肝炎ウイルス，ＡＴＬウイルス，ＡＩＤＳウイルス，インフルエンザウイルス，アデノウイルス，エンテロウイルス，ポリオウイルス，ＥＢウイルス，ＨＡＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＩＶ，ＨＴＬＶ等）、真菌（例えばカンジダ，クリプトコッカス等）、スピロヘータ（例えばレプトスピラ，梅毒トレポネーマ等）、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物；当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原；気管支喘息，アレルギー性鼻炎，アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン（例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ，ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ，ブタクサ，オオアワガエリ，ハルガヤ，ライムギ等の花粉、例えばネコ，イヌ，カニ等の動物、例えば米，卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等）；脂質（例えばリポタンパク質等）；プロテアーゼ（例えばトリプシン，プラスミン，セリンプロテアーゼ等）；腫瘍マーカータンパク抗原（例えばＰＳＡ，ＰＧＩ，ＰＧＩＩ等）；糖鎖抗原〔例えばＡＦＰ（例えばＬ１からＬ３等）、ｈＣＧ（ｈＣＧファミリー）、トランスフェリン、ＩｇＧ、サイログロブリン、Ｄｅｃａｙ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ−ｆａｃｔｏｒ（ＤＡＦ）、癌胎児性抗原（例えばＣＥＡ，ＮＣＡ，ＮＣＡ−２，ＮＦＡ等）、ＣＡ１９−９、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、ＣＡ１２５、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ＡＢＯ糖��抗原等〕；糖鎖（例えばヒアルロン酸、β−グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等）；糖鎖に結合するタンパク質（例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等）；リン脂質（例えばカルジオリピン等）；リポ多糖（例えばエンドトキシン等）；化学物質（例えばＴ３，Ｔ４，例えばトリブチルスズ，ノニルフェノール，４−オクチルフェノール，フタル酸ジ−ｎ−ブチル，フタル酸ジシクロヘキシル，ベンゾフェノン，オクタクロロスチレン，フタル酸ジ−２−エチルヘキシル等の環境ホルモン）；人体に投与・接種される各種薬剤及びこれらの代謝物；アプタマー；核酸結合性物質；およびこれらに対する抗体等が挙げられる。尚、本発明に於いて用いられる抗体には、パパインやペプシン等の蛋白質分解酵素、或いは化学的分解により生じるＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント等の分解産物も包含される。
【００１９】
上記の如き測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）としては、「抗原」−「抗体」間反応或いは「糖鎖−タンパク質」間反応によって測定対象物質又はその類似物質と結合するものが好ましい。具体的には、測定対象物質又はその類似物質に対する抗体、測定対象物質又はその類似物質が結合する抗原、或いは、測定対象物質又はその類似物質に結合するタンパク質が好ましく、測定対象物質又はその類似物質に対する抗体、或いは測定対象物質又はその類似物質に結合するタンパク質が更に好ましい。
【００２０】
測定対象物質と特異的に結合する物質、測定対象物質又はその類似物質等を標識するために用いられる標識物質（Ｇ）としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に於いて用いられるアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ等の酵素類、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）に於いて用いられる９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）に於いて用いられるフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン或いはこれらの誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
これらの内、感度等の観点から、酵素、蛍光性物質が好ましく、更に好ましいのはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはペルオキシダーゼである。
【００２１】
上記した如き標識物質（Ｇ）を測定対象物質と特異的に結合する物質、測定対象物質又はその類似物質等に結合させるには、通常この分野で用いられる方法、例えば自体公知のＥＩＡ、ＲＩＡ或はＦＩＡ等に於いて一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第８巻、山村雄一監修、第１版、中山書店、１９７１；図説  蛍光抗体、川生明著、第１版、（株）ソフトサイエンス社、１９８３；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第２版、医学書院、１９８２等］等を利用すればよい。
【００２２】
標識物質（Ｇ）の使用量は、用いる標識物質の種類により異なるため一概には言えないが、例えばペルオキシダーゼを標識物質として使用する場合には、測定対象物質と特異的に結合する物質と標識物質とを、例えば通常１：１〜２０のモル比、好ましくは１：１〜１０のモル比、更に好ましくは１：１〜２のモル比となるように、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の通常この分野で用いられている緩衝液中に含有させて用いればよい。尚、当該緩衝液としては、通常この分野で用いられている、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられ、そのｐＨは、抗原抗体反応を抑制しない範囲であればよく、通常５〜９である。また、このような緩衝液中には、目的の抗原抗体反応を阻害しないものであれば、例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、ポリエチレングリコール等の安定化剤、界面活性剤、糖類等を含有させておいてもよい。
【００２３】
本発明における固相担体（Ａ０）としては、通常この分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えばガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性シリカ粒子、マイクロプレート、ラテックス等が代表的なものとして挙げられる。具体的には、例えば特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の公知の磁性シリカ粒子が好ましい。
【００２４】
本発明における磁性シリカ粒子は、シリカのマトリックス中に平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を有する金属酸化物を分散されているものである。超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。
【００２５】
平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
【００２６】
酸化鉄としては、公知の種々の酸化鉄を用いることができる。酸化鉄の内、特に化学的な安定性に優れることから、マグネタイト、γ−ヘマタイト、マグネタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄及びγ−ヘマタイト−α−ヘマタイト中間酸化鉄が好ましく、大きな飽和磁化を有し、外部磁場に対する感応性が優れていることから、マグネタイトが更に好ましい。
【００２７】
磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量の下限は、通常６０重量％、好ましくは６５重量％であり、上限は通常９５重量％、好ましくは８０重量％である。超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％未満の場合、得られた磁性シリカ粒子の磁性が十分でないため、実際の用途面における分離操作に時間がかかり、９５重量％を超えるものは合成が困難である。
【００２８】
超常磁性金属酸化物の製造方法は、特に限定されないが、Ｍａｓｓａｒｔにより報告されたものをベースとして水溶性鉄塩及びアンモニアを用いる共沈殿法（Ｒ．Ｍａｓｓａｒｔ，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ．Ｍａｇｎ．１９８１，１７，１２４７）や水溶性鉄塩の水溶液中の酸化反応を用いた方法により合成することができる。
【００２９】
磁性シリカ粒子の平均粒子径は、好ましくは１〜５μｍ、更に好ましくは１〜３μｍである。平均粒子径が１μｍ未満の場合、分離回収の際に時間がかかる傾向にあり、５μｍを超えると、表面積が小さくなり、固定化する物質（対象物質、測定対象物質の類似物質又は測定対象物質と特異的に結合する物質）の結合量が低く結合効率が低下する傾向にある。
【００３０】
本発明における磁性シリカ粒子の平均粒子径は、任意の２００個の磁性シリカ粒子について走査型電子顕微鏡（日本電子株式会社製「ＪＳＭ−７０００Ｆ」）で観察して測定された粒子径の平均値である。
【００３１】
磁性シリカ粒子の平均粒子径は、後述の水中油型エマルションを作製する際の混合条件（せん断力等）を調節して水中油型エマルションの粒子径を調整することにより制御することができる。また、磁性シリカ粒子製造時の水洗工程の条件変更や通常の分級等の方法によっても平均粒子径を所望の値とすることができる。
【００３２】
本発明における磁性シリカ粒子は、例えば平均粒子径が１〜１５ｎｍの超常磁性金属酸化物粒子、前記超常磁性金属酸化物粒子の重量に基づいて３０〜５００重量％の（アルキル）アルコキシシラン及び分散剤を含有する分散液と、水、水溶性有機溶媒、非イオン性界面活性剤及び（アルキル）アルコキシシランの加水分解用触媒を含有する溶液とを混合して水中油型エマルションを形成後、（アルキル）アルコキシシランの加水分解反応及び縮合反応を行い、超常磁性金属酸化物がシリカに包含された磁性シリカ粒子の水性分散体が得た後、磁性シリカ粒子の水性分散体を遠心分離及び／又は集磁により固液分離し、水又はメタノール等で洗浄することにより得られる。
上記及び以下において、（アルキル）アルコキシシランとは、アルキルアルコキシシラン又はアルコキシシランを意味する。
【００３３】
磁性シリカ粒子は、超常磁性金属酸化物がシリカに包含され、粒子表面に存在しないことから、多くの測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は測定対象物質と特異的に結合する物質をその表面に固定化することができる。
【００３４】
本発明における固相担体（Ａ０）好ましくは磁性シリカ粒子に、測定対象物質（Ｆ１）、測定対象物質の類似物質（Ｆ２）、又は測定対象物質と特異的に結合する物質（Ｆ３）を固定化する方法としては、上述の（Ａ０）に測定対象物質（Ｆ１）等を物理吸着させる方法が挙げられるが、より効率良く測定対象物質（Ｆ１）等を固定化させる観点から、グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を（Ａ０）表面に結合させ、それらを介して測定対象物質（Ｆ１）等を（Ａ０）に固定化させるのが好ましい。これらの有機化合物の内、特定の測定対象物質（Ｆ１）等を結合させる観点から、官能基を有するアルキルアルコキシシランが更に好ましい。
【００３５】
本発明の免疫測定用試薬は、固相担体好ましくは磁性シリカ粒子の表面上に、測定対象物質、測定対象物質の類似物質、及び測定対象物質と特異的に結合する物質からなる群より選ばれる少なくとも１種の物質が標識物質により標識されてなる物質、及び固定化されていない該タンパク質（Ｄ１）を含有したものである。具体的には、例えば、本発明における標識試薬を含む緩衝液等が挙げられ、該緩衝液としては、免疫測定等に通常用いられる緩衝液が好ましく挙げられ、例えば１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液、ＭＯＰＳ［３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸］／水酸化ナトリウム緩衝液、トリエタノールアミン／塩酸緩衝液及びＰＢＳ（リン酸緩衝液）等が挙げられる。
【００３６】
本発明の免疫測定用試薬は、本発明における標識試薬、及び、固相担体を含有する試薬以外に、化学発光試薬を含んでいてもよく、該化学発光試薬は、上記の標識物質に基づき選択され、例えば、標識物質がペルオキシダーゼである場合、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤を必須構成成分としてなる化学発光試薬第１液と、酸化剤及び水を必須構成成分としてなる化学発光試薬第２液とを含んでなる。
【００３７】
２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物としては、例えば、特開平２−２９１２９９号公報、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩（アルカリ金属塩等）が好ましく、更に好ましいのはルミノール及びその金属塩、特に好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。
【００３８】
化学発光増強剤としては、例えば、特開昭５９−５００２５２号公報、特開昭５９−１７１８３９号公報及び特開平２−２９１２９９号公報等に記載の公知の化学発光増強剤及びこれらの混合物等が使用できる。これらの内、化学発光増強効果等の観点から、フェノールが好ましく、更に好ましいのはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノール、特に好ましいのは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。
【００３９】
化学発光試薬第１液は、液体であることが好ましく、また、酵素の蛍光強度の観点からはアルカリ性であることが好ましい。第１液のｐＨは、７〜１１が好ましく、更に好ましくは８〜１０である。尚、ｐＨは、ＪＩＳ  Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定される（測定温度２５℃）。
【００４０】
化学発光試薬第２液が含有する酸化剤としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の酸化剤等［無機の過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウム等）、有機過酸化物（過酸化ジアルキル及び過酸化アシル等）、ペルオクソ酸化合物（ペルオクソ硫酸及びペルオクソリン酸等）等］の水溶液が挙げられる。
これらの内、保存安定性等の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、更に好ましいのは過酸化水素水溶液である。
【００４１】
本発明の免疫測定法は、上記本発明における固相担体（Ａ０）好ましくは磁性シリカ粒子を用いて行われる以外はこの分野で通常行われる、文献［例えば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドイッチ法、競合法及び特開平６−１３００６３号公報記載の測定法に準じて行えばよい。
【００４２】
サンドイッチ法は、例えば、測定対象物質を含む試料と、測定対象物質と特異的に結合する物質を表面に固定化した磁性シリカ粒子と、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質を接触させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質と標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定することによりなされる。
【００４３】
具体的には例えば、測定対象物質を含む試料と測定対象物質と特異的に結合する物質を表面に固定化した磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子表面に測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質との複合体を形成させ、更に該複合体に、磁性シリカ粒子表面のブロッキング剤として用いるタンパク質を含む標識された測定対象物質と特異的に結合する物質を接触させて、磁性シリカ粒子に固定化された測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質と標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定すればよい。該方法に於いては、測定対象物質と測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化された磁性シリカ粒子とを反応させた後、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質を反応させているが、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質とを反応させた後に測定対象物質と特異的に結合する物質が固定化された磁性シリカ粒子とを反応させても、これら３つを同時に反応させても構わない。
【００４４】
上記サンドイッチ法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との分離を意味し、具体的には、磁性シリカ粒子に固定化された測定対象物質と特異的に結合する物質、磁性シリカ粒子に固定化された測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質との複合体及び上記の標識複合体と、他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分、標識複合体の形成に関与しなかった標識された測定対象物質と特異的に結合する物質）との分離を意味する。
また、Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体の形成後には必須の工程であるが、磁性シリカ粒子表面に測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質との複合体を形成させた後においても実施することができる。
【００４５】
競合法としては、測定対象物質を含む試料、標識物質により標識された測定対象物質と特異的に結合する物質、及び、測定対象物質又は測定対象物質の類似物質をその表面に固定化している磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質又はその類似物質と標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との標識複合体を形成させ、該標識複合体を固定化した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定することによりなされる。
【００４６】
具体的には例えば、測定対象物質を含む試料と、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質と、測定対象物質又はその類似物質を固定化した磁性シリカ粒子とを接触させて、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質に、試料中の測定対象物質と磁性シリカ粒子上の測定対象物質又はその類似物質と競合反応させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質又はその類似物質と標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との標識複合体を形成させ、該標識複合体を固定化した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定すればよい。該方法に於いては、測定対象物質、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質、及び測定対象物質又はその類似物質を固定化した磁性シリカ粒子を同時に競合反応させているが、測定対象物質と測定対象物質又はその類似物質を固定化した磁性シリカ粒子とを接触させた後に、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質を加えて競合反応させても、測定対象物質と標識された測定対象物質と特異的に結合する物質を接触させた後に、測定対象物質又はその類似物質を固定化した磁性シリカ粒子を加えて競合反応させてもよい。
【００４７】
上記競合法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質、及び、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質の複合体の分離を意味し、具体的には、測定対象物質又はその類似物質を固定化した磁性シリカ粒子、及び測定対象物質又はその類似物質を固定化した磁性シリカ粒子と標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との複合体と他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質測定対象物質の複合体等）との分離を意味する。
【００４８】
また、競合法の別の態様としては、測定対象物質を含む試料と、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質と、測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化した磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質と特異的に結合する物質と標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質の標識複合体とを形成させ、該標識複合体を固定化した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定することによりなされる。
【００４９】
具体的には例えば、測定対象物質を含む試料と、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質と、測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上の測定対象物質と特異的に結合する物質に、試料中の測定対象物質と標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質標とを競合反応させて、磁性シリカ粒子上に測定対象物質と特異的に結合する物質質と標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質との標識複合体とを形成させ、該標識複合体を固定化した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定すればよい。該競合法に於いては、測定対象物質、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質、及び測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子を同時に競合反応させているが、測定対象物質と測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子とを接触させた後に、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質を加えて競合反応させても、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質を固定化させた磁性シリカ粒子とを接触させた後に、測定対象物質を加えて競合反応させてもよい。
【００５０】
上記競合法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質との分離を意味し、具体的には、測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子、測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子と測定対象物質との複合体、及び測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子と標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質の複合体と、他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分、標識複合体の形成に関与しなかった標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質等）との分離を意味する。Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体の形成後には必須の工程であるが、測定対象物質と測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子とを接触させた後においても実施することができる。
【００５１】
また、測定対象物質が酵素の場合には、上記サンドイッチ法や競合法以外の酵素活性方法を用いる方法、例えば、測定対象物質を含む試料と、測定対象物質と特異的に結合する物質（例えば、抗体等の酵素と結合し得る物質）を表面に固定化した磁性シリカ粒子とを接触させて、磁性シリカ粒子上に酵素と測定対象物質と特異的に結合する物質との複合体を形成させ、複合体を固定化した磁性シリカ粒子をＢ／Ｆ分離した後、酵素の種類に応じた基質、又は酵素の種類に応じた基質及び発色剤、要すれば更に共役酵素を添加し、その基質の変化又は発色剤の発色結果に基づいて試料中の酵素量を測定する方法により、測定してもよい。尚、基質、発色剤、共役酵素は、公知のものを用いればよく、例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、過酸化水素とルミノール発光試薬等を用いればよい。これらの使用量も通常この分野で用いられる範囲であればよい。上記方法におけるＢ／Ｆ分離とは、測定対象物質と測定対象物質と特異的に結合する物質を固定化させた磁性シリカ粒子との複合体と、その他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分等）との分離を意味する。
【００５２】
本発明の免疫測定法において、試料、磁性シリカ粒子、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質等を接触させる方法としては、通常なされる撹拌、混合等の処理により、磁性シリカ粒子が分散されればよい。反応時間は、測定対象物質、用いられる測定対象物質と特異的に結合する物質、サンドイッチ法、競合法等の違いに応じて適宜設定されればよいが、通常１〜２０分、好ましくは３〜１０分である。
【００５３】
本発明の免疫測定法におけるＢ／Ｆ分離は、例えば、磁性シリカ粒子の磁性を利用し、反応槽の外側等から磁石等により磁性シリカ粒子を集めて、反応液を排出し、洗浄液を加えた後、磁石を取り除き、磁性シリカ粒子を混合して分散させ、洗浄することによりなされる。上記操作を１〜３回繰り返してもよい。洗浄液としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定はされない。
【００５４】
標識物質又はその活性の測定方法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ及びＣＬＥＩＡ）が挙げられ、短時間での免疫測定における感度の観点から好ましいのはＥＩＡ、ＣＬＩＡ及びＣＬＥＩＡであり、更に好ましいのはＣＬＥＩＡである。
【００５５】
本願発明における測定方法は、例えばサンドイッチ法でＣＥＡを測定する場合、以下のようにして行えばよい。
【００５６】
即ち、例えばＣＥＡを含む試料１０〜２５μＬと例えば本発明における抗ＣＥＡ抗体を固定化させた磁性シリカ粒子を０．２〜２ｍｇ／ｍＬ含むリン酸緩衝液等の緩衝液（磁性シリカ粒子を含有する試薬）４０〜５０μＬを反応槽に添加し、該反応溶液を攪拌し、磁性シリカ粒子を分散させて、磁性シリカ粒子上に固定化されている抗ＣＥＡ抗体とＣＥＡとを接触、反応させ、複合体を形成させる。次いで、例えば反応槽の外側から磁石等により磁性シリカ粒子を集め、反応液を排出し、生理食塩水等の洗浄液を添加する。その後、磁石を取り除き、該磁性シリカ粒子を分散させて洗浄する。この操作は、１〜３回繰り返してもよい。尚、この洗浄操作は、試料又は磁性シリカ粒子を含有する試薬を残したまま、西洋ワサビ由来等ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略記）標識された抗ＰＳＡ抗体とウシ血清アルブミンを共存させた溶液（以下標識試薬と略記）を添加して反応させる場合には、この洗浄操作を省略しても構わない。その後、例えば牛血清アルブミンを含有した標識試薬を加え、該反応溶液を攪拌し、磁性シリカ粒子を分散させて、ＰＯＤ標識された抗ＣＥＡ抗体と上記複合体とを反応結合させる。次いで、上記の洗浄と同様にして生理食塩水等の洗浄液を加えて分散させて洗浄を行う。最後に例えばルミノール及び過酸化水素を加え、化学発光計にて１秒間の化学発光積算量を測定し、該測定値を基に試料中のＣＥＡ量を算出する。尚、この場合には予め規定のＣＥＡ含有溶液を試料として上記と同様の操作により作られたＣＥＡ量と１秒間の化学発光積算量との関係を示す検量線等を用いることで容易に試料中のＣＥＡ量を算出し得る。
【実施例】
【００５７】
以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において部は重量部を示す。
【００５８】
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬（抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子試薬）、標識試薬（ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体試薬）、化学発光試薬第１液及び化学発光試薬第２液から構成される本発明の試薬（Ｓ１）を得た。下記の実施例１に記載した。
【００５９】
実施例１
磁性シリカ粒子の製造：
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物１８６部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物６８部及び水１２８８部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５％アンモニア水２８０部を１時間かけて滴下し、水中にマグネタイト粒子を得た。得られたマグネタイト粒子に分散剤であるオレイン酸６４部を加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水１０００部で洗浄する操作を３回行い、さらにアセトン１０００部で洗浄する操作を２回行い、４０℃で２日間乾燥させることで、超常磁性金属酸化物粒子を得た。
【００６０】
超常磁性金属酸化物粒子８０部をテトラエトキシシラン２４０部に加えて分散し、分散液（ａ１）を調製した。次に、反応容器に水５０５０部、２５％アンモニア水溶液３５００部、ＮＳＡ−１７（三洋化成工業株式会社製）４００部を加えてクリアミックス（エムテクニック社製）を用いて混合し溶液（ａ２）を得た。５０℃に昇温後、クリアミックスを回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（ａ１）を溶液（ａ２）に１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除き、コア層を得た。
【００６１】
反応容器にコア層８０部、脱イオン水２５００部、２５％アンモニア水溶液２６０部、エタノール２５００部、テトラエトキシシラン１２００部を加えてクリアミックス（エムテクニック社製）を用いて混合し、クリアミックスの回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら２時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除き、磁石を用いて粒子を集磁し上清を除く操作を１０回行った。次に、得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて６００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を２０回行い、続いて得られた固相に水５０００部を加えて粒子を分散させて３００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて除去することで分級を行った。さらに、磁石を用いて粒子を集磁し上清を除く操作を１０回行い、目的とする体積平均粒子径の磁性シリカ粒子を得た。
【００６２】
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製：
１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に製造した磁性シリカ粒子４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を５回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌したのち、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子を抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン社製）１０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、抗ＣＥＡモノクローナル抗体含有リン酸緩衝液を除去した。次いで、磁性シリカ粒子を１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１２時間浸漬させたのち、ネオジウム磁石でシリカ粒子を集磁後、１重量％の牛血清アルブミン含有のリン酸緩衝液を除去した。抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子濃度として１．０ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈し、磁性シリカ粒子を含有する試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６３】
標識試薬の作製：
抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ダコジャパン社製）、西洋ワサビ由来ＰＯＤ（東洋紡製）を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体を調製した。これを０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で、ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体濃度として１００ｎＭの濃度に希釈し、標識試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。
【００６４】
化学発光試薬第１液の調製：
ルミノールのナトリウム塩［シグマ  アルドリッチ  ジャパン（株）製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第１液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００６５】
化学発光試薬第２液の調製：
１，０００ｍＬ及び過酸化水素［和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して化学発光試薬第２液を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。
【００６６】
実施例２
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における牛血清アルブミンをブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル（株）製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ２）を得た。
【００６７】
実施例３
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における牛血清アルブミンをカゼインナトリウム（シグマアルドリッチ製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ３）を得た。
【００６８】
実施例４
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における牛血清アルブミンをカゼイン加水分解物（和光純薬工業（株）製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ４）を得た。
【００６９】
実施例５
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における牛血清アルブミンをスキムミルク（和光純薬工業（株）製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ５）を得た。
【００７０】
実施例６
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における牛血清アルブミンをゼラチン（和光純薬工業（株）製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ６）を得た。
【００７１】
実施例７
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における牛血清アルブミンをコラーゲンペプチド（和光純薬工業（株）製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ７）を得た。
【００７２】
実施例８
標識試薬の作製における０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．０１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ８）を得た。
【００７３】
実施例９
標識試薬の作製における０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を２重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ９）を得た。
【００７４】
実施例１０
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製における磁性シリカ粒子をＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０  Ａｍｉｎｅ（（株）ベリタス社製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ１０）を得た。
【００７５】
実施例１１
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製における磁性シリカ粒子を１／８インチガラスビーズに変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ１１）を得た。
【００７６】
実施例１２
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における抗ＣＥＡ抗体を抗ＣＡ１９−９抗体（ダコジャパン社製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ１２）を得た。
【００７７】
実施例１３
磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製における１重量％の牛血清アルブミンを０．５重量％の牛血清アルブミン及び０．５重量％のブロックエースに変更し、標識試薬の作製における０．５重量％の牛血清アルブミンを０．２５重量％の牛血清アルブミン及び０．２５重量％のブロックエースに変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｓ１３）を得た。
【００７８】
実施例１４
得られた試薬（Ｓ１）を用いて、以下の方法により免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００７９】
＜本発明の試薬を用いた免疫測定における感度及び同時再現性の評価方法＞
磁性シリカ粒子を含有する試薬０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。
【００８０】
続いて、０．５重量％の牛血清アルブミン含有した標識試薬０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＥＡ抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＥＡ／ＰＯＤ標識抗ＣＥＡ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン社製「Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７」］で測定した。尚、ＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液の代わりにＣＥＡ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準ＣＥＡ液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。
【００８１】
感度については、ＣＥＡ濃度が１．０ｎｇ／ｍＬと０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の比を測定した。
【００８２】
同時再現性については、ＣＥＡ濃度が０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を用いて免疫測定を行い、それを１０回繰り返し、平均発光量（Ｘ１）と標準偏差（Ｘ２）から以下の計算式で変動係数（ＣＶ）を算出した。
ＣＶ（％）＝（Ｘ２／Ｘ１）×１００
【００８３】
実施例１５
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ２）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００８４】
実施例１６
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ３）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００８５】
実施例１７
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ４）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００８６】
実施例１８
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ５）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００８７】
実施例１９
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ６）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００８８】
実施例２０
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ７）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００８９】
実施例２１
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ８）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００９０】
実施例２２
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ９）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００９１】
実施例２３
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ１０）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００９２】
実施例２４
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ１１）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００９３】
実施例２５
得られた試薬（Ｓ１２）を用いて、以下の方法により免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００９４】
＜本発明の試薬を用いた免疫測定における感度及び同時再現性の評価方法＞
磁性シリカ粒子を含有する試薬０．０２５ｍＬと０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で調製したＣＡ１９−９濃度が１．０Ｕ／ｍＬの標準ＣＡ１９−９液０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＡ１９−９抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＡ１９−９複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。
【００９５】
続いて、０．５重量％の牛血清アルブミン含有した標識試薬０．０２５ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、抗ＣＡ１９−９抗体結合磁性シリカ粒子／ＣＡ１９−９／ＰＯＤ標識抗ＣＡ１９−９抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、化学発光試薬第１液０．０７ｍＬと化学発光試薬第２液０．０７ｍＬとを同時に加え、３７℃で４３秒間発光反応させ、化学発光試薬を添加後４３〜４５秒の平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン社製「Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７」］で測定した。尚、ＣＡ１９−９濃度が１．０Ｕ／ｍＬの標準ＣＡ１９−９液の代わりにＣＡ１９−９濃度が０Ｕ／ｍＬの標準ＣＡ１９−９液を使用して上記と同様の操作を行いバックグラウンドとして用いた。
【００９６】
感度については、ＣＡ１９−９濃度が１．０Ｕ／ｍＬと０Ｕ／ｍＬの標準溶液を用いた免疫測定を行った場合の発光量の比を測定した。
【００９７】
同時再現性については、ＣＡ１９−９濃度が０Ｕ／ｍＬの標準溶液を用いて免疫測定を行い、それを１０回繰り返し、平均発光量（Ｘ３）と標準偏差（Ｘ４）から以下の計算式で変動係数（ＣＶ）を算出した。
ＣＶ（％）＝（Ｘ４／Ｘ３）×１００
【００９８】
実施例２６
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｓ１３）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【００９９】
比較例１
標識試薬の作製における０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）から牛血清アルブミンを除いた０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｈ１）を得た。
【０１００】
比較例２
標識試薬の作製における０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｈ２）を得た。
【０１０１】
比較例３
標識試薬の作製における０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を０．００１重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｈ３）を得た。
【０１０２】
比較例４
標識試薬の作製における０．５重量％の牛血清アルブミン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）から牛血清アルブミンを除いた０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に変更し、磁性シリカ粒子を含有する固相担体試薬の作製及び標識試薬の作製における抗ＣＥＡ抗体を抗ＣＡ１９−９抗体（ダコジャパン社製）に変更した以外は、実施例１と同様にして免疫測定試薬（Ｈ４）を得た。
【０１０３】
比較例５
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｈ１）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【０１０４】
比較例６
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｈ２）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【０１０５】
比較例７
得られた試薬（Ｓ１）を得られた試薬（Ｈ３）に変更した以外は、実施例１４と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【０１０６】
比較例８
得られた試薬（Ｓ１２）を得られた試薬（Ｈ４）に変更した以外は、実施例２５と同様にして免疫測定における感度及び同時再現性を評価した。
【０１０７】
実施例１４〜実施例２４、実施例２６及び比較例５〜比較例７で評価した感度の結果を表１、同時再現性の結果を表２に示す。また、表１及び表２の結果をまとめたものを図１に示す。
【０１０８】
実施例２５及び比較例８で評価した感度の結果を表３、同時再現性の結果を表４に示す。また、表３及び表４の結果をまとめたものを図２に示す。
【０１０９】
【表１】
2016136130.tif 000003
【０１１０】
【表２】
2016136130.tif 000004
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
表１、表２及び図１より本発明の免疫測定用試薬は、比較用の免疫測定用試薬を用いた場合に比べて、標準ＣＥＡ濃度１．０ｎｇ／ｍＬの発光量と標準ＣＥＡ濃度０ｎｇ／ｍＬの発光量の比が大きくなり、感度が向上したことを示す。さらに標準ＣＥＡ濃度０ｎｇ／ｍＬの発光量の変動係数も低下し、同時再現性が向上したことを示す。比較例２は同時再現性が向上したものの感度が低下した。
以上のことから、本発明の免疫測定用試薬は感度と同時再現性がともに向上していることを示す。
【０１１４】
表３、表４及び図２より本発明の免疫測定用試薬は、比較用の免疫測定用試薬を用いた場合に比べて、標準ＣＡ１９−９濃度１．０Ｕ／ｍＬの発光量と標準ＣＡ１９−９濃度０Ｕ／ｍＬの発光量の比が大きくなり感度が大幅に広がった。更に、標準ＣＡ１９−９濃度０Ｕ／ｍＬの発光量の変動係数も低下したことから同時再現性が向上したことを示した。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の磁性シリカ粒子は磁気特性及び集磁後の粒子の再分散性が優れることから、本発明の磁性シリカ粒子を用いた免疫測定方法は、簡便且つ短時間に高感度で測定対象物質を測定することができるため、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び化学発光免疫測定法等の臨床検査に幅広く適用できる。また、本発明の試薬は、上記測定方法に用いるのに適したものであり、同様に、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法及び化学発光免疫測定法等の臨床検査薬として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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