(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なヒトＴ細胞の抗原受容体とＣＤ３の複合体を構成するＣＤ３εに結合する抗体又はそのフラグメントを提供する。【解決手段】ＴＣＲ−ＣＤ３複合体の発現低下を誘導し、しかも、Ｔ細胞の増殖反応も活性化（ＩＬ−２の産生）も誘導しない、ヒトＴ細胞の抗原受容体とＣＤ３の複合体を構成するＣＤ３εに結合する抗体又はそのフラグメント。さらに、抗原の感作の有無にかかわらず、すなわちナイーブＴ細胞に対しても、感作Ｔ細胞に対しても不応答性を誘導する性質を有し、臓器移植時の免疫抑制剤として或いは自己免疫疾患の治療剤として有利に使用し得る、前記抗体又はそのフラグメント。【選択図】図９
2016093104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（５）の性質を有する抗ヒトＣＤ３ε抗体又はそのフラグメント：
（１）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞抗原受容体のＣＤ３εに結合する；
（２）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体−ＣＤ３複合体の発現低下を誘導する；
（３）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導しない；
（４）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制活性を有する；
（５）抗原感作の有無にかかわらずヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に不応答性を誘導する。
【請求項２】
抗ヒトＣＤ３ε抗体が、抗ヒトＣＤ３εラット抗体である、請求項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
重鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu（配列番号１２）；
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle（配列番号１３）；
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr（配列番号１４）。
【請求項４】
軽鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr（配列番号３２）；
ＣＤＲ２：ArgAspAsp（配列番号３３）；
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal（配列番号３４）。
【請求項５】
請求項３に記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域並びに請求項４記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】
重鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、ヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu（配列番号１２）；
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle（配列番号１３）；
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr（配列番号１４）。
【請求項７】
軽鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、ヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr（配列番号３２）；
ＣＤＲ２：ArgAspAsp（配列番号３３）；
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal（配列番号３４）。
【請求項８】
請求項６に記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域並びに請求項７に記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメント。
【請求項９】
それぞれ下記アミノ酸配列からなる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター：
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu（配列番号１２）；
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle（配列番号１３）；
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr（配列番号１４）。
【請求項１０】
それぞれ下記アミノ酸配列からなる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター：
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr（配列番号３２）
ＣＤＲ２：ArgAspAsp（配列番号３３）
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal（配列番号３４）
【請求項１１】
請求項９に記載の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに請求項１０に記載の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項８に記載のヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメントを製造する方法であって、(i)請求項９に記載の発現ベクター及び請求項１０に記載の発現ベクターを用いて、或いは、(ii)請求項１１に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を培養して、産生されるヒト化抗体又はそのフラグメントを単離することからなる方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一に記載の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む免疫抑制剤。
【請求項１４】
当該フラグメントがＦ（ａｂ’）２である、請求項１３に記載の免疫抑制剤。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか一に記載の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む自己免疫疾患治療剤。
【請求項１６】
当該フラグメントがＦ（ａｂ’）２である、請求項１５に記載の自己免疫疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞の抗原受容体（Ｔ細胞抗原受容体：ＴＣＲ）とＣＤ３の複合体（以下、「ＴＣＲ−ＣＤ３複合体」という。）を構成するＣＤ３εに結合する抗体又はそのフラグメントに関するものである。本発明の抗体又はそのフラグメントは、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体の発現低下を誘導し、しかも、Ｔ細胞の増殖反応も活性化（ＩＬ−２の産生）も誘導しない。さらに本発明の抗体又はそのフラグメントは、抗原の感作の有無にかかわらず、すなわちナイーブＴ細胞に対しても、感作Ｔ細胞に対しても不応答性を誘導する性質を有することから、臓器移植時の免疫抑制剤として或いは自己免疫疾患の治療剤として有利に使用し得る。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、抗原感作されていないヒトＴ細胞を、in vitroでＢＣ３（ヒトＣＤ３εに結合するマウス抗体）とアロ抗原ＭＨＣで共刺激すると、継続的な抗原特異的不応答が誘導されることが記載されている。しかしながら、ＢＣ３がＴ細胞に不応答を誘導するためには抗原が共存していることが必要であり、また、ＢＣ３は一度抗原で感作されたＴ細胞に対しては不応答を誘導できないと記載されている。特許文献１には、ＯＫＴ３抗体（ヒトＣＤ３εに結合するマウス抗体）のヒト化抗体を、さらにそのＦｃ領域の２３４位及び２３５位のアミノ酸を人工的にアラニンに改変することによって、in vitroの系で、Ｔ細胞の増殖を誘発しないこと及びＴ細胞の活性化がＯＫＴ３抗体の最大活性化の４０％未満程度低減されることが記載されている。しかしながら、Ｆｃ領域を人工的に改変していない抗体で、Ｔ細胞の増殖を誘発せず、またＴ細胞活性化を実質的に抑制する抗体は記載されていない。さらに、特許文献２及び非特許文献２には、ＯＫＴ３抗体やＹＴＨ１２．５抗体（ヒトＣＤ３抗原に特異的なラット抗体）のＦｃ領域を人工的にグリコシル化が起きないようなアミノ酸に置換し、自然界には存在しない、脱グリコシル化した抗体を作製することが記載されている。そしてこの脱グリコシル化ＣＤ３抗体は、Ｆｃ領域への結合能力をある程度残しており、その抗原結合特異性及び免疫抑制活性を保持したまま、in vitroの系ではＴ細胞の活性化を誘導せず、in vivoの系でサイトカインの放出レベルを下げることが記載されている。しかしながら、脱グリコシル化していない抗体で、Ｔ細胞の増殖を誘発せず、またＴ細胞活性化を実質的に抑制する抗体は記載されていない。
【０００３】
Ｔ細胞は、その細胞表面に発現するＣＤ４とＣＤ８のタンパク質によって機能を異にする２つのタイプが存在する。その内、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示された抗原を認識して活性化され、自己のものとは異なる細胞を攻撃してこれを排除する。ＣＤ４＋Ｔ細胞はこのような細胞レベルで異物を排除する機能（細胞性免疫）を有するため、例えば、臓器移植のときには拒絶反応を惹起する問題がある。また、自己免疫疾患においては、自己に反応するＣＤ４＋Ｔ細胞が活性化され、自己の正常な細胞を攻撃して種々の症状を引き起こすといった問題がある。
【０００４】
従来、臓器移植時の急性拒絶反応の抗体治療薬としてＯＫＴ３抗体が唯一認可され、使用されていた。ＯＫＴ３抗体は、ヒトＣＤ３εを認識するマウスモノクローナル抗体である。ＯＫＴ３抗体の投与によりＴ細胞数が減少することや、ＯＫＴ３抗体がヒトＣＤ３ε分子に結合することにより、細胞表面におけるＴＣＲ−ＣＤ３複合体の発現量が一時的に低下することが知られている。しかしながら一方で、ＯＫＴ３抗体は細胞増殖促進物質であることも知られている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1805-1808 (1981)）。そのため、ＯＫＴ３抗体がＴ細胞に結合すると、最初のうちはこの結合によりＴ細胞が活性化され、発熱、筋肉痛、頭痛、関節痛などを惹起する。
【０００５】
また、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制又は制御する抗体として、上記非特許文献１と２及び特許文献１と２に記載されるような抗体が提案されている。
【０００６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、ＣＤ４＋Ｔ細胞表面上のＴＣＲが、ＡＰＣ上の抗原とＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体を認識することにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞に活性化のシグナル（第一シグナル）が伝達される。またこの時、ＴＣＲと抗原とＭＨＣクラスＩＩとの分子間相互作用以外に、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＡＰＣの分子間（例えば、ＣＤ４０とＣＤ４０Ｌ、Ｂ７とＣＤ２８、ＣＤ７２とＣＤ５、ＩＣＡＭ１/２とＬＦＡ１など）で様々な分子間相互作用があり、これら分子間の相互作用もまたＣＤ４＋Ｔ細胞活性化に繋がる重要なシグナル（第二シグナル）をＴ細胞に誘導し伝達することとなる。この第一及び第二シグナルの両方がＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化には必要であり、一方のみではＣＤ４＋Ｔ細胞の正常な活性化は誘導されない。
【０００７】
この第二シグナル伝達を担う分子間の相互作用を阻害することにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制又は制御しようとするアプローチがある（非特許文献３）。また、抗原分子（ペプチド）のアミノ酸を置換することにより、ＴＣＲには認識されるものの正常な第一シグナルが入らないようにしてＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制又は制御する方法も知られている（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平9-501824号公報
【特許文献２】特開2004-249
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】J Exp. Med., 172: 1691-1700 (1990)
【非特許文献２】Eur. J. Immunol., 23: 403-411 (1993)
【非特許文献３】Immunol. Rev., 192: 161-180 (2003)
【非特許文献４】The Journal of Immunology, 186 (1): 7-8 (2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＣＤ４＋Ｔ細胞に作用させても、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化したり増殖させたりすることなく、Ｔ細胞の増殖及び活性化を抑制する作用を有する新規な抗体又はそのフラグメントを提供することを課題とする。すなわち、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体の発現低下を誘導し、しかも、Ｔ細胞の増殖反応も活性化（ＩＬ−２の産生）も誘導しない抗体又はそのフラグメントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＴＣＲの発現を低下させることによりＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制又は制御し、その結果としてＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制又は制御する方法について検討した。即ち、ＡＰＣ上の抗原とＭＨＣクラスＩＩとの分子複合体が正常に発現しており、なお且つＣＤ４＋Ｔ細胞とＡＰＣ間の様々な分子間相互作用も正常に保たれていても、第一シグナルを伝達する開始点に相当するＴＣＲの発現を低下させることによりＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制又は制御することができることが予想されることから、ＴＣＲの発現低下を誘導するような抗体を樹立することを目指した。
【００１２】
ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞でラットを免疫してハイブリドーマを作製し、その培養上清について、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲ−ＣＤ３複合体の発現低下を誘導すること、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導しないこと、及びヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制活性を有することを評価することによって、本発明の抗体又はそのフラグメントを選別し、本発明を完成した。
【００１３】
本発明は、即ち以下よりなる。
１．下記の（１）〜（５）の性質を有する抗ヒトＣＤ３ε抗体又はそのフラグメント：
（１）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞抗原受容体のＣＤ３εに結合する；
（２）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体−ＣＤ３複合体の発現低下を誘導する；
（３）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導しない；
（４）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制活性を有する；
（５）抗原感作の有無にかかわらずヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に不応答性を誘導する。
２．抗ヒトＣＤ３ε抗体が、抗ヒトＣＤ３εラット抗体である、前項１に記載の抗体又はそのフラグメント。
３．重鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、前項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu（配列番号１２）；
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle（配列番号１３）；
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr（配列番号１４）。
４．軽鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、前項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr（配列番号３２）；
ＣＤＲ２：ArgAspAsp（配列番号３３）；
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal（配列番号３４）。
５．前項３に記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域並びに前項４記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む、前項１又は２に記載の抗体又はそのフラグメント。
６．重鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、ヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu（配列番号１２）；
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle（配列番号１３）；
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr（配列番号１４）。
７．軽鎖可変領域の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３が、それぞれ下記アミノ酸配列を有する、ヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメント：
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr（配列番号３２）；
ＣＤＲ２：ArgAspAsp（配列番号３３）；
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal（配列番号３４）。
８．前項６に記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域並びに前項７に記載の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域を含む、ヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメント。
９．それぞれ下記アミノ酸配列からなる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター：
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu（配列番号１２）；
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle（配列番号１３）；
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr（配列番号１４）。
１０．それぞれ下記アミノ酸配列からなる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター：
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr（配列番号３２）
ＣＤＲ２：ArgAspAsp（配列番号３３）
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal（配列番号３４）
１１．前項９に記載の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ並びに前項１０に記載の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクター。
１２．前項８に記載のヒトＣＤ３εに結合するヒト化抗体又はそのフラグメントを製造する方法であって、(i)前項９に記載の発現ベクター及び前項１０に記載の発現ベクターを用いて、或いは、(ii)前項１１に記載の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、当該宿主細胞を培養して、産生されるヒト化抗体又はそのフラグメントを単離することからなる方法。
１３．前項１〜８のいずれか一に記載の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む免疫抑制剤。
１４．当該フラグメントがＦ（ａｂ’）２である、前項１３に記載の免疫抑制剤。
１５．前項１〜８のいずれか一に記載の抗体又はそのフラグメントを有効成分として含む自己免疫疾患治療剤。
１６．当該フラグメントがＦ（ａｂ’）２である、前項１５に記載の自己免疫疾患治療剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明からなる抗体又はそのフラグメントは、抗原非存在下でもＴ細胞に不応答を誘導するから、例えば、臓器移植の際、予めレシピアントに本発明抗体を投与して不応答を誘導しておくことができるので、有利に臓器移植を行うことができる。また、本発明の抗体は、感作された或いは感作されつつあるＴ細胞に対しても不応答を誘導することができるので、自己免疫疾患の治療剤として使用することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】目的抗体の一次スクリーニング結果を示し、＃１〜４抗体は、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体の発現を低下させることを確認した。ヒト末梢血から調製した全リンパ球を、評価抗体の存在及び非存在下で、処理し、ＯＫＴ３抗体（抗ヒトＣＤ３ε抗体）との反応性を確認したのが図（ａ）であり、いずれも右側（Ｙと表示）にピークが確認されるのが抗体非存在下であり、左側（Ｘと表示）にピークが見られるのが、抗体存在下である。また、ヒトＴ細胞を、抗体存在及び非存在下で、処理し、抗Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）抗体との反応性を確認したのが図（ｂ）であり、いずれも右側（Ｙと表示）にピークが確認されるのが抗体非存在下であり、左側（Ｘと表示）にピークが見られるのが、抗体存在下である。（実施例１）
【図２】目的抗体の二次スクリーニング結果を示し、＃１〜３抗体は、Ｔ細胞の増殖を誘導せず、Ｔ細胞の活性化を誘導しないことを確認した。ヒト末梢血から調製した全リンパ球をＯＫＴ３抗体（抗ヒトＣＤ３ε抗体）で処理した結果を（ａ）に示し、細胞の増殖誘導が確認された（コントロール）。候補抗体の＃１〜４で処理した結果を（ｂ）に示し、＃１〜３の抗体は、細胞増殖を誘導しなかったが、＃４は細胞増殖を誘導した。（実施例１）
【図３】（ａ）のJurkatと表示の図（左上図）は、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現しているヒトＴ細胞株（Jurkat）のＯＫＴ３抗体（抗ヒトＣＤ３ε抗体）との強い反応性を確認したもので、右側ピーク（Ｐ）が相当する。左側ピーク（Ｏ）は、未染色の場合である。（ａ）のＪ．ＲＴ３−Ｔ３．５と表示の図（右上図）は、ヒトＴ細胞株（Jurkat）の亜株でＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現していない細胞株の結果で、ＯＫＴ３抗体と反応しなかったことをしめす。（ｂ）のJurkatと表示の図（左下図）は、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現しているヒトＴ細胞株（Jurkat）の候補抗体である＃１抗体との強い反応性を確認したもので、右側ピーク（Ｐ）が相当する。左側ピーク（Ｏ）は、未染色の場合である。（ｂ）のＪ．ＲＴ３−Ｔ３．５と表示の図（右下図）は、ヒトＴ細胞株（Jurkat）の亜株でＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現していない細胞株の結果で、＃１抗体と反応しなかったことをしめす。そして、＃１抗体の標的分子が、ＴＣＲ又はＣＤ３分子のいづれかであることが確認された。（実施例２）
【図４】＃１抗体の標的分子が、ヒトＣＤ３ε（ｈＣＤ３ε）であることを示す。図中（ａ）は、マウスＣＤ３εとマウスＣＤ３γの複合体を発現するマウスリンパ腫Ｙａｃ−１、（ｂ）は、マウスＣＤ３εとマウスＣＤ３γの複合体、ヒトＣＤ３εとマウスＣＤ３γの複合体を発現する変異体ｈＣＤ３ε−Ｙａｃ−１細胞について、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体による染色処理の結果及び＃１抗体処理後ＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体による染色の結果をみたもので、（ａ）では、無染色、ＯＫＴ３抗体処理、＃１抗体処理でも同じ反応性（無反応）を示し、（ｂ）では３つの異なるピークからなる反応性が確認され、一番右側ピーク（Ｕ）がＯＫＴ３抗体処理の場合、真中（Ｔ）が、＃１抗体処理での場合、左側（Ｓ）が無染色である。この結果、＃１抗体の標的分子は、ｈＣＤ３εであることが確認できた。（実施例２）
【図５】Ｙａｃ−１細胞（ｈＣＤ３ε無発現）、ｈＣＤ３ε−Ｙａｃ−１細胞（ｈＣＤ３ε発現）、Jurkat細胞（ｈＣＤ３ε発現）について、＃１抗体との反応性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離確認したもの。＃１抗体の標的分子は、ｈＣＤ３εであることが確認できた。（実施例２）
【図６】＃１抗体が、ＯＫＴ３抗体によるＴ細胞の活性化を抑制することを示す。図中、ＯＫＴ３と表示（Ｆ）は、ヒト末梢血由来全リンパ球をＯＫＴ３抗体処理したときの、細胞増殖結果を示し、ＯＫＴ３＋＃１Ａｂ（Ｇ）とは、ＯＫＴ３抗体と＃１抗体を同時添加処理したときの細胞増殖結果である。（実施例３）
【図７】＃１抗体が、マイトジェンによるＴ細胞の活性化を抑制することを示す。上図中、ＰＨＡと表示（Ｈ）は、ヒト末梢血由来全リンパ球をＰＨＡ処理したときの、細胞増殖結果を示し、ＰＨＡ＋＃１Ａｂ（Ｉ）とは、ＰＨＡと＃１抗体を同時添加処理したときの細胞増殖結果である。下図中、ＰＷＭと表示（Ｈ）は、ヒト末梢血由来全リンパ球をＰＷＭ処理したときの、細胞増殖結果を示し、ＰＷＭ＋＃１Ａｂ（Ｉ）とは、ＰＷＭと＃１抗体を同時添加処理したときの細胞増殖結果である。（実施例３）
【図８】＃１抗体は、in vivoの系で、抑制性サイトカインであるＩＬ−１０の産生が確認できる一方、炎症性サイトカインについてはＯＫＴ３抗体に比べ顕著に低下していることを示す。図中ｍＩｇＧはマウスＩｇＧ２ａ、ＯＫＴ３はＯＫＴ３抗体、ＲａｔＩｇＧはラットＩｇＧ、＃１Ａｂは＃１抗体を被験マウスに静脈内投与したものである。（実施例４）
【図９】＃１抗体が、ＧＶＨＤ発症を抑制することを示す。図中ＲａｔＩｇ（Ｍ）とは、ガンマ線照射マウスにラットＩｇＧを、＃１Ａｂ（Ｎ）とは、ガンマ線照射マウスに＃１抗体を、静脈内投与した場合を示し、２００日まで生存がみられるのが＃１抗体投与群で（Ｎ）ある。（実施例５）
【図１０】＃１抗体は、Ｔ細胞に対して不応答性を誘導することを示す。左図は、ヒト化ＮＯＧマウスに、ラットＩｇＧを静脈内投与して得られた脾臓細胞のＰＨＡ刺激による増殖性を示し、右図は、＃１抗体を投与して得られた脾臓細胞のＰＨＡ刺激が実質的に抑制されていたことを示す。（実施例６）
【図１１】コントロール抗体（ラットＩｇＧ）の静脈内投与が、ＰＨＡ刺激（＋）でＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖誘導を示し（Ｆ）、＃１抗体（＃１Ａｂ）の静脈内投与が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖誘導を実質的に抑制する（Ｇ）ことを示す。（実施例６）
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の抗体又はそのフラグメントを得るために、ＴＣＲの発現を低下させることによりＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制又は制御し、その結果ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を抑制又は制御する抗体又はそのフラグメントについて検討を行った。即ち、ＡＰＣ上の抗原とＭＨＣクラスＩＩとの分子複合体が正常に発現しており、なお且つＣＤ４＋Ｔ細胞とＡＰＣ間の様々な分子間相互作用も正常に保たれていても、第一シグナルを伝達する開始点に相当するＴＣＲの発現を低下させることによりＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を抑制又は制御することができることが予想されることから、ＴＣＲの発現低下を誘導するような抗体を樹立することを目指した。
【００１７】
しかしながら、正常な抗原提示が行なわれＣＤ４＋Ｔ細胞に活性化の第一及び第二シグナルが伝達されると、その後一時的にＴＣＲの発現低下が誘導されることが知られている（Nature, 375,148-151, 1995）。このことから、ＴＣＲの発現低下を誘導する抗体について、さらにＣＤ４＋Ｔ細胞に作用させてもＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化したり増殖したりすることのない抗体を選択することとした。
【００１８】
ＴＣＲは、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ及びＣＤ３δの３分子と複合体を形成しており、ＴＣＲの発現低下時にはこれらＣＤ３の発現も低下することが知られている（J. Exp. Med. 160: 1284-1299, 1984）。そこで、ＴＣＲの発現低下を測定するために、ＣＤ３εの発現を指標として用いた。すなわち、被験抗体でＴ細胞を処理し、次いで当該Ｔ細胞をヒトＣＤ３εに結合する標識ＯＫＴ３抗体で処理し、当該標識抗体によるＴ細胞の標識の程度を測定することによってＴＣＲの発現の程度を測定し、選別することで本発明からなる抗体又はそのフラグメントの達成に成功した。
【００１９】
（抗体又はそのフラグメント）
本発明において、「抗体又はそのフラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を表し、少なくともＣＤ３εと結合できることを要件とする。標的分子又は標的タンパク質と特異的に結合するファージディスプレイを含む技法により選択される免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）のもの、又は免疫グロブリン分子のサブクラスであり得る。本発明における使用に好適な「抗体及びそのフラグメント」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化（特にＣＤＲ移植）抗体、脱免疫化抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリにより産生されるフラグメント、ダイアボディ又はテトラボディ（Holliger P. et al., 1993）、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のもののいずれかのエピトープ結合断片を含むがそれらに限定されない。好適なフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである。
【００２０】
（抗体の由来動物）
本発明において抗体又はそのフラグメントは、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物起源由来であり得る。好ましくは、抗体又はそのフラグメントは、ヒト、サル（例えばチンパンジー、ボノボ、マカク）、げっ歯類（例えばマウス及びラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ又はニワトリの抗体である。抗体又はそのフラグメントがヒト起源又はマウス起源又はラット起源のものであることが特に好ましい。
【００２１】
（抗原との結合性）
本発明の抗体又はそのフラグメントが例えば抗原、例えば標的タンパク質に対して１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、更により好ましくは１００ｎＭ以下、更により好ましくは９０ｎＭ以下、更により好ましくは８０ｎＭ以下、更により好ましくは７０ｎＭ以下、更により好ましくは６０ｎＭ以下、更により好ましくは５０ｎＭ以下、更により好ましくは４０ｎＭ以下、更により好ましくは３０ｎＭ以下、更により好ましくは２０ｎＭ以下、更により好ましくは１０ｎＭ以下の解離定数Ｋｄを有する場合、本発明の抗体又はそのフラグメントは上記抗原又は標的タンパク質と「特異的に結合する」と考える。
【００２２】
（本発明の抗体又はそのフラグメントの特性）
本発明の抗体又はそのフラグメントに関し、その特徴的な性格は以下の（１）〜（５）の特性から特徴づけられ、このような抗体又はそのフラグメントの選択はその反応性等の自体公知の検出法によって特定可能である。
（１）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞抗原受容体のＣＤ３εに結合する。
（２）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体−ＣＤ３複合体の発現低下を誘導する。
（３）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導しない。
（４）ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制活性を有する。
（５）抗原感作の有無にかかわらずヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に不応答性を誘導する。
【００２３】
本発明の抗体の調製に際し、抗原としてのヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を含む生体検体、例えば血液から得ることができる。例えば、健康人の末梢血等からリンパ球を得、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞からなる抗原を調製することができる。当該抗原を、前記抗体の由来動物等に投与して動物を免疫し、当該免疫動物等から脾臓細胞を分取し、常法によりハイブリドーマを得ることができる。
【００２４】
上記（１）のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞抗原受容体のＣＤ３εに結合するとは、ヒトＴ細胞のＣＤ３εに結合することを意味し、既知のＯＫＴ３抗体も保持する機能である。このような特性は、例えば、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現している細胞とＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現していない細胞を用いて評価することができる。これらの細胞を候補抗体で処理し、候補抗体の反応性を見ることで、候補抗体の標的分子がＴＣＲ又はＣＤ３分子であるか否かを確認することができる。ＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現している細胞としては、例えばJurkat細胞が挙げられ、発現していない細胞としてはその亜株が挙げられる。さらに、マウスＣＤ３εとマウスＣＤ３γの複合体を発現する細胞とヒトＣＤ３εとマウスＣＤ３γの複合体を発現する細胞を使い、候補抗体との反応性で、候補抗体の標的分子がヒトＣＤ３εであるか否かを評価することができ、あるいはヒトＣＤ３ε分子を発現する細胞と候補抗体の反応性を生化学的に分析することで評価することができる。これにより、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞抗原受容体のヒトＣＤ３εに結合する抗体を選別することができる。上記（２）のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体−ＣＤ３複合体の発現低下誘導性の評価は、候補抗体の存在又は非存在下でＴ細胞を処理後、標識ＯＫＴ３抗体及び標識ＴＣＲ（Ｔ細胞抗原受容体）抗体を用いてＴ細胞を標識染色することにより、評価することができる。これにより、Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体−ＣＤ３複合体の発現低下をもたらす抗体を選別することができる。上記（３）のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導しないという特性は、ヒト末梢血由来全リンパ球の培養における増殖への影響を培地への抗体の添加により評価することができる。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化の指標としては、例えば、Ｔ細胞によるＩＬ−２の産生が挙げられ、抗体添加後のＩＬ−２の産生を測定することによって評価することができる。これにより、例えば、ＩＬ−２の産生を誘導しない抗体を、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘導しない抗体として選択することができる。上記（４）のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制活性を有するという特性は、ＯＫＴ３抗体と比較して特徴的な機能である。ヒト末梢血由来全リンパ球の培養における増殖への影響を、培地へのＯＫＴ３抗体単独の系とＯＫＴ３抗体と本発明の候補抗体との併用の系での比較、あるいはマイトジェン活性を有する物質単独の系と、マイトジェン活性を有する物質と本発明の候補抗体との併用の系での比較により確認することができる。これにより、例えば、ＯＫＴ３抗体単独の系とＯＫＴ３抗体と候補抗体との併用の系で比較して、併用の系でＴ細胞の増殖が抑制された場合、当該候補抗体をヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖抑制活性を有する抗体として選別することができる。さらに、マイトジェン活性を有する物質単独の系と、マイトジェン活性を有する物質と候補抗体との併用の系とを比較して、併用の系でＴ細胞の増殖が抑制された場合、当該候補抗体を、Ｔ細胞活性化剤によるＴ細胞の増殖をも抑制する抗体として選別することができる。上記、（５）の抗原感作の有無にかかわらずヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に不応答性の誘導能は、例えばヒト化マウスを使い、候補抗体の静脈内投与等をなし、脾臓細胞の機能変化を確認すれば評価可能である。あるいは、ヒトＴ細胞によるＧＶＨＤの発症モデルを用い、候補抗体の静脈内投与によるモデルの生存率評価で判定可能である。これにより、抗原感作の有無にかかわらずヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に不応答性の誘導能を有する抗体を選別することができる。
【００２５】
（抗体をコードする塩基配列等）
上記の特性を有する抗体を基礎にして、遺伝子組換え技術の定法により、抗体可変領域の遺伝子情報を得ることができる。つまり、当該モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞から分取したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成し、これを鋳型にしてＰＣＲ産物を得て、これをもとに形質転換体を得、既知イムノグロブリン配列予測ソフトにより相補性決定領域及びフレームワークの部位を特定し、各塩基配列及びアミノ酸配列を決定した抗体を得ることができる。
【００２６】
（ＣＤＲ及びＦＲ）
本発明の抗体又はそのフラグメントに関連する「ＣＤＲ」という用語は、抗体の相補性決定領域のいずれかを表す。抗体の可変（Ｖ）領域には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）が存在する。抗体は通常、重鎖と軽鎖の２種のポリペプチド鎖からなるため、抗原と接触することができる抗原結合領域それぞれに対して約６つの頻度のＣＤＲが存在する（重鎖及び軽鎖それぞれが３つのＣＤＲを含有する）。これらの中でも、ＣＤＲ３は最も大きい可変性を示す。本発明の抗体又はそのフラグメントに関連する「ＦＲ」という用語は、抗体の相補性決定領域以外の比較的変異の少ない部分であるフレームワーク領域を意味する。抗体の可変（Ｖ）領域には、４つのＦＲ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）が存在する。抗体は通常、２種のポリペプチド鎖からなるため、抗原と接触することができる抗原結合領域それぞれに対して約８つの頻度のＦＲが存在する（重鎖及び軽鎖それぞれが４つのＦＲを含有する）。
【００２７】
（抗体又はそのフラグメントの修飾）
本発明の抗体及びそのフラグメントを修飾することで、安定性を高めるとともに、抗原結合を高めることができる。安定性に影響を及ぼす因子には、全Ｉｇ分子の界面に隠れた疎水性残基を定常領域界面へと露出させること；Ｆｖ表面上に疎水性領域を露出させ、分子間相互作用をもたらすこと；及びＦｖβシートの内部における又は重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の通常の界面での親水性残基が含まれるなどが挙げられる（Chowdhuryet al., Engineering scFvs for Improved Stability, p. 237-254 in RecombinantAntibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols, (Eds. Welschof and Krauss)Humana Press, Totowa, New Jersey, 2003.）。また、安定性に影響を与える問題となる残基を置換することにより安定性を高めることができる。かかる修飾は、例えば本発明の抗体又はそのフラグメントのポリペプチド鎖において最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又は最大１０個の単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入、好ましくは最大３つ、最も好ましくは１つの単一置換、欠失、修飾及び／又は挿入を行うことにより達成することができる。問題となる残基を考慮に入れて一本鎖抗体の安定性を高める技法が当該技術分野において既知である（Chowdhury et al., Engineering scFvs for Improved Stability, p.237-254 in Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols,(Eds. Welschof and Krauss) Humana Press, Totowa, New Jersey, 2003.）。
【００２８】
本発明の抗体又はそのフラグメントは、重鎖可変領域を有する重鎖及び／又は軽鎖可変領域を有する軽鎖とを含み、ここで重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域はそれぞれ、以下に示すＣＤＲ１〜３のいずれかのアミノ酸配列を有し、任意に軽鎖及び重鎖は合計で、１つ、２つ又は３つの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む。
【００２９】
一つの態様は、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、以下のアミノ酸配列をもつ抗体又はそのフラグメントである。
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu（配列番号１２）
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle（配列番号１３）
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr（配列番号１４）
【００３０】
別の態様は、軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、以下のアミノ酸配列をもつ抗体又はそのフラグメントである。
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr（配列番号３２）
ＣＤＲ２：ArgAspAsp（配列番号３３）
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal（配列番号３４）
【００３１】
さらに別の態様は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域の各ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、各々配列番号１２、１３、１４と、配列番号３２、３３、３４のアミノ酸配列を保有する抗体である。これらのＣＤＲは、ラット抗体に基づく配列であるが、常法を用いてこれらの配列からヒト化抗体を作製することができる。
本発明の抗体又はそのフラグメントの一つの態様は、上記各重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列の特定に加えて、その性状としてヒトＣＤ３εとの結合性の維持によって特徴づけられる。
【００３２】
加えて、本発明の抗体又はそのフラグメントにおいて「単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入」という語句は一般的に、列挙されるタンパク質又はポリペプチドの修飾型を表し、例えばタンパク質又はポリペプチドの１つのアミノ酸が欠失、挿入、修飾及び／又は置換され得る。そのポリペプチド又はタンパク質が幾つかの単一アミノ酸置換、欠失、修飾及び／又は挿入を含む場合、かかる置換、欠失、修飾及び／又は挿入の総数はそれぞれの場合で示される。上記挿入は元のポリペプチド又はタンパク質への指定数の単一アミノ酸の挿入である。タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸を修飾してもよく、例えば示される総数の修飾で化学的に修飾してもよい。例えば、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸の側鎖又は遊離アミノ末端若しくは遊離カルボキシ末端を、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化、ユビキチン化等により修飾してもよい。化学修飾は当該技術分野で既知のように、in vivoで、例えば宿主細胞（ホスト細胞）において行うこともできる。例えば、タンパク質のアミノ酸配列に存在する好適な化学修飾モチーフ、例えばグリコシル化配列モチーフにより、タンパク質がグリコシル化される。ポリペプチド又はタンパク質が１つ又は複数の単一アミノ酸置換を含む場合、上記置換はそれぞれの場合で独立して、保存的な又は非保存的な置換、好ましくは保存的な置換であり得る。最も好ましい実施形態では、全ての置換が以下で更に規定されるような保存的性質を有する。幾つかの実施形態では、置換には、自然発生的なアミノ酸の非自然発生的なアミノ酸への交換も含まれる。保存的置換には、或るアミノ酸の置換されるアミノ酸と同様の化学特性を有する別のアミノ酸への置換が含まれる。好ましくは、保存的置換は以下からなる群から選択される置換である：
（ｉ）塩基性アミノ酸の別の異なる塩基性アミノ酸への置換、
（ｉｉ）酸性アミノ酸の別の異なる酸性アミノ酸への置換、
（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸の別の異なる芳香族アミノ酸への置換、
（ｉｖ）非極性の脂肪族アミノ酸の別の異なる非極性の脂肪族アミノ酸への置換、及び
（ｖ）極性の非荷電アミノ酸の別の異なる極性の非荷電アミノ酸への置換。
【００３３】
塩基性アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン及びリシンからなる群から選択されるのが好ましい。酸性アミノ酸はアスパラギン酸又はグルタミン酸であるのが好ましい。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンからなる群から選択されるのが好ましい。非極性の脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン及びイソロイシンからなる群から選択されるのが好ましい。極性の非荷電アミノ酸は、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるのが好ましい。保存的アミノ酸置換とは対照的に、非保存的アミノ酸置換は上で概説した保存的置換（ｉ）〜保存的置換（ｖ）に当てはまらない、或るアミノ酸の任意のアミノ酸への交換である。
【００３４】
（ヒト化抗体の調製）
本発明において、ヒト化は、公知の方法（Nature 332, 323-327, 1988、特許第3121823号、特開2003-199594、特許第2912618号（EP239400B1））に従って作製できる。ヒト配列としては、公知のNEW（R.J.J.Biol.Chem.253,585-597(1987)、REI(R.Eur.J.Biochem.45,523-52481974)、CAMPATH-1(The Journal of Immunology 162:3663-3671)などが挙げられる。本発明のラット抗体のＦＲ領域は、重鎖が配列番号１９〜２２の４つ及び軽鎖が配列番号３９〜４２の４つとして以下のように特定され、ＣＤＲ領域は、重鎖が配列番号１２〜１４の３つ及び軽鎖が配列番号３２〜３４の３つとして前記のように特定されたが、この本発明のＣＤＲ領域をヒト抗体配列として公知のNEW、REI、CAMPATH-1等に導入し、少なくともＦＲ領域がヒト型であるアミノ酸配列又はそれと実質的に相同である配列の一又は複数又は全てについて置換することでヒト化が達成できる；
重鎖ＦＲ１（アミノ酸配列）：（配列番号１９）
GluValProLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyArgSerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSer
重鎖ＦＲ２（アミノ酸配列）：  （配列番号２０）
MetAlaTrpValArgHisProProLysLysGlyLeuGluTrpValAlaThr
重鎖ＦＲ３（アミノ酸配列）：  （配列番号２１）
TyrTyrProAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaArgSerSerLeuTyrLeuGlnMetSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaThrTyrTyrCys
重鎖ＦＲ４（アミノ酸配列）：  （配列番号２２）
TrpGlyGlnGlyValMetValThrValSerSerAlaGluThrThr
軽鎖ＦＲ１ （アミノ酸配列）：  （配列番号３９）
GlnPheValLeuThrGlnProAsnSerValSerThrAsnLeuGlySerThrValLysLeuSerCysLysArgSer
軽鎖ＦＲ２ （アミノ酸配列）：  （配列番号４０）
ValAsnTrpTyrGlnGlnHisGluGlyArgSerProThrThrMetIleTyr
軽鎖ＦＲ３ （アミノ酸配列）：  （配列番号４１）
GlyArgProAspGlyValProAspArgPheSerGlySerIleAspArgSerSerAsnSerAlaLeuLeuThrIleLysAsnValGlnSerGluAspGluAlaAspTyrPheCys
軽鎖ＦＲ４ （アミノ酸配列）：  （配列番号４２）
PheGlyGlyGlyThrSerLeuThrValLeuGlyGlnProLysSerThr
【００３５】
（形質転換体）
本発明の抗体又はそのフラグメントは、前記記述に基づき、重鎖及び／又は軽鎖の、少なくともＣＤＲの一もしくは複数もしくは好適には全て及び所望により好適にはＦＲ領域を含めたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるオリゴヌクレオチド鎖を適当なオリゴヌクレオチド鎖と連結させ、発現ベクターにクローニングしてホスト細胞、好適には哺乳類細胞に形質導入して、産生・調製できる。
【００３６】
発現ベクターの態様の一は、少なくとも下記アミノ酸配列からなる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する重鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターである；
ＣＤＲ１：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu    （配列番号１２）
ＣＤＲ２：IleSerSerSerGlySerArgIle    （配列番号１３）
ＣＤＲ３：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr  （配列番号１４）
その他の発現ベクターの態様の一は、少なくとも下記アミノ酸配列からなる相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターである；
ＣＤＲ１：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr  （配列番号３２）
ＣＤＲ２：ArgAspAsp  （配列番号３３）
ＣＤＲ３：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal  （配列番号３４）
さらなる発現ベクターの態様の一は  配列番号１２〜１４の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ及び配列番号３２〜３４の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターである。
【００３７】
本発明における発現ベクターは、少なくとも重鎖及び／又は軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列に作働し得るように連結された適切なプロモーターを含む、複製可能な発現ベクターである。また、発現ベクターは、前記可変領域はヒト抗体からのフレームワーク領域及び本発明のＣＤＲを含み、定常領域を含む場合は、ヒト抗体からのものが含まれる。ベクターは、少なくとも重鎖と軽鎖の可変領域を一つの複製可能なベクターに担持してもよく、或いは別々の２つの複製可能なベクターに別々に担持させてもよい。
【００３８】
本発明の発現ベクターの態様の１は、前記配列番号１２〜１４の重鎖可変領域をコードするＤＮＡを担持する発現ベクターと前記配列番号３２〜３４の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを担持する発現ベクターの２つを少なくとも用いるものであり、本発明の発現ベクターのその他の態様は、配列番号１２〜１４の重鎖可変領域をコードするＤＮＡ及び配列番号３２〜３４の軽鎖可変領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いることである。
【００３９】
これら複製可能なベクターを用いて細胞系を形質転換し、該形質転換細胞系を培養して本発明からなる抗体又はそのフラグメントを生成させる。
形質転換される細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系又は、有利にリンパ組織を起源とする、ミエローマ、ハイブリドーマ、トリオーマもしくはクアドローマ細胞系のような不死化哺乳動物細胞系であってもよい。この細胞系には、エプシュタイン・バールウイルス（Epstein-Barr virus）のようなウイルスを用いた形質転換によって不死化される、Ｂ細胞のような正常リンパ球も含まれる。最も好ましくは、不死化細胞系はミエローマ細胞系もしくはそれらの派生体である。本発明による抗体又はそのフラグメントの発現に用いられるＣＨＯ細胞は、ジハイドロフォレートリダクターゼ（dhfr）を欠損し、それ故成長のためにチミジン及びハイポキサンチンに依存するものであればよい（Urlaubら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77, 4216-4220（1980））。
【００４０】
本発明の抗体又はそのフラグメントを産生するために用いられる細胞系は、好ましくは、哺乳動物細胞系ではあるが、細菌細胞系（例えばE. coli 由来細菌株）もしくは酵母細胞系のような他の適切な細胞系も用いることができる。
発現後、本発明の抗体全体、それらのダイマー、個々の軽鎖及び重鎖、又は他の免疫グロブリン形態を取り出し、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当分野の標準的な手順で精製することができる（一般的には、Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y.（1982）を参照）。医薬上の使用には、少なくとも約９０ないし９５％の等質性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８ないし９９％以上の等質性を有していることが最も好ましい。望みのままに、部分的であれ、等質にまでであれ、一旦精製されると、治療に用い、あるいはアッセイ手順の開発及び実施、免疫蛍光染色等に用いることができる（一般的には、Immunological Methods, I及びII巻, Lefkovits and Pernis編, Academic Press, New York, N. Y.（1979及び1981）を参照）。
【００４１】
（抗体又はそのフラグメントの用途）
本発明の抗体及びそのフラグメントは対象の治療又は予防に有用であり、薬剤有効量の化合物又は組成物として投与することが可能である。対象は、臓器移植時における免疫抑制剤あるいは自己免疫疾患の予防・治療であり、自己免疫疾患としてはリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸症候群、及び多発性硬化症に関連付けられる状態の治療又は予防に有用である。
【００４２】
本発明の抗体及びそのフラグメントは、全身的に、たとえば、不活性希釈剤や吸収性食用可能な担体などの薬剤として許容されるビヒクルと組み合わせて経口的に投与することができる。これらの化合物は、ハードシェル又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入し、打錠し、又は患者食の食物に直接組み込むことができる。経口治療投与には、活性化合物を１種又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、頬腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハなどの形で使用することができる。そのような組成物や調製物には、活性化合物を少なくとも０．１％含めるべきである。もちろん、組成物及び調製物の割合は、変化してよく、好都合に所与の単位投与形重量の約２〜約６０％にすることができる。そのような治療上使用可能な組成物の活性化合物量は、有効な用量レベルが得られるような量である。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などには以下：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；及びショ糖、果糖、乳糖、又はアスパルテームなどの甘味剤；ペパーミント、冬緑樹油、サクランボ香味料などの矯味剤を加えることができる。単位投与形をカプセル剤にする場合は、上の種類の物質の他に、これに植物油やポリエチレングリコールなどの液体担体を含めてもよい。コーティングとして、またそうでない場合は、固体単位投与形の物理的形状を改変するために様々な他の物質を含めてよい。たとえば、錠剤、丸剤、カプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラック、糖などによってコートすることができる。シロップ又はエリキシルには、活性化合物、甘味剤としてショ糖や果糖、保存料としてメチルやプロピルパラベン、着色料、及びサクランボ味やオレンジ味などの香味料を含めてもよい。もちろん、どんな単位投与形の調製に使用されるどんな物質も薬剤として許容され、使用量において実質上無毒であるべきである。さらに、活性化合物は、持続放出調製物やデバイスに組み込むこともできる。
【００４３】
本発明の抗体及びそのフラグメントは、注入又は注射によって静脈内又は腹腔内に投与することもできる。本発明の抗体及びそのフラグメント又はその塩の溶液は、水で、場合によっては無害の界面活性剤と混合した水で調製することができる。分散剤もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、それらの混合物、及び油類で調製することができる。通常の保存及び使用条件下では、これらの調製物には、微生物の繁殖を防止するための保存料が含まれる。注射又は注入に適当な薬剤投与形には、滅菌注射溶液、もしくは注入溶液、又は分散剤の適宜の調合に適合している活性成分を含む滅菌水溶液、分散剤、あるいは滅菌粉を含めてもよい。場合によってはリポソームに封入された活性成分を含む分散剤を含めてよい。すべての場合に、最良の剤形は、滅菌液体であり、製造及び保存条件下で安定していなければならない。液体担体又はビヒクルは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（ｐｏｌｙｏｌ）（たとえば、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、液体ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌｓ）など）、植物油、無毒グリセリルエステル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ）、それらの適当な混合物を含む溶媒又は液体分散媒体であってよい。適切な流動性は、たとえば、リポソームの形成よって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、又は界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎｓ）、クロロブタノール（ｃｈｌｏｒｏｂｕｔａｎｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）、ソルビン酸（ｓｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ）、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）などによって防止することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖類、緩衝液、又は塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。組成物に吸収遅延剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）やゼラチンを使用することによって注射組成物を長時間にわたって吸収させることができる。  滅菌注射溶液は、必要とされる先に列挙した他の成分のいくつかを含む適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製する。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、これらの技術によって活性成分に予め滅菌ろ過した溶液中に存在する任意の追加の所望成分を加えた粉がもたらされる。局所投与には、すなわち、化合物が液体のときは、本化合物を純粋形で適用することができる。しかし、一般に、化合物は、皮膚に許容される担体と組み合わせて、皮膚に組成物又は製剤として投与されることが望ましく、この化合物は固体又は液体であってよい。使用可能な固体担体には、タルク、クレイ、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉化固体が含まれる。使用可能な液体担体には、水、ヒドロキシアルキル、グリコール、又は水‐アルコール／グリコールブレンドが含まれ、その場合、本化合物は有効濃度で、場合によっては無毒の界面活性剤を用いて、溶解し、又は分散させることができる。香料や追加の抗菌剤などのアジュバントを加えて、所与の使用に向けた特性を最適化することができる。得られた液体組成物は、吸着パッドから塗布し、絆創膏及び他の包帯剤に含浸するために使用し、又はポンプ型もしくはエアロゾルスプレーを使用し患部上に噴霧することができる。合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪族アルコール、改変セルロース、改変ミネラル物質など、増粘剤を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することもできる。
【００４４】
本発明において使用可能な抗体又はそのフラグメントの用量は、そのin vitro活性と動物モデルでのin vivo活性を比較することによって定量することができる。マウス、及びヒトまでの他の動物の有効な用量の推定方法は当技術分野で公知である。一般に、ローションなどの液体組成物中の本発明の抗体又はそのフラグメントの濃度は、約０．１〜２５ｗｔ％であり、約０．５〜１０ｗｔ％が好ましい。ゲルなどの半固体もしくは固体組成物又は粉での濃度は約０．１〜５ｗｔ％であり、約０．５〜２．５ｗｔ％が好ましい。治療での使用に必要な本発明の抗体又はそのフラグメントの量は、投与経路、治療対象の状態の性質、年齢、及び患者の状態によっても変化し、最終的に担当する内科医又は臨床医の裁量に任せられる。本発明の抗体又はそのフラグメントの用量も標的とする細胞、腫瘍、組織、移植片、又は臓器に応じて変わる。所望用量は、単一用量で、あるいは適切な間隔、たとえば、１日当たり２回、３回、４回以上の副用量で投与する分割用量として好都合に提供することができる。副用量自体、たとえば、散布器からの多数の吸入など、さらに大まかに間隔を空けて分けた数回の投与に分割することができる。
【実施例】
【００４５】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
【００４６】
（実施例１）本発明抗体の作製及びスクリーニング
（１）抗原の調製
健常人の末梢血（京都大学の倫理委員会を経て提供者から承諾を得て使用）から、リンパ球分離溶液ｄ＝1.077（ナカライテスク社）を用い、そのプロトコールに従って全リンパ球を調製した。次に、当該全リンパ球から、抗ヒトＣＤ４マイクロビーズ（MiltenyiBiotec社）を用い、そのプロトコールに従ってヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（純度９８％以上）を調製した。
【００４７】
（２）免疫処理
上記ヒト ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０６個）を、８週令のウイスターラット（日本ＳＬＣ）の腹腔内に注射して第一回目の免疫を行った。次いで、２週間隔で２×１０６個及び５×１０６個のヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞を腹腔内に注射して、第二回目及び第三回目の免疫を行った。さらに第三回目の免疫から１ヵ月後、上記ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（６×１０６個）を静脈内に注射して第四回目の免疫を行った。
【００４８】
（３）ハイブリドーマの作製
第四回目の免疫から３日経過後、免疫したラットから脾臓を取り出し脾臓細胞を得た。脾臓細胞をRPMI1640培地（インビトロジェン社）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を調製した。次に当該脾臓細胞（２×１０８個）を同数の骨髄腫細胞（P3X63-Ag8-653,ATCC CRL 1580）と混合し、遠心（３６０ｇ，５分間）することにより細胞塊とした。ここにポリエチレングリコール1500（Roche Diagnostics社）５０％溶液を１ｍｌ添加して細胞融合を誘導した。細胞融合操作の後、細胞をハンクス溶液で洗浄し、９６ウェルプレート２０枚に当該細胞を各ウェル当たり１００μｌ播種した。次いで１００μｌのＨＡＴ培地（SIGMA社）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃の条件下で２週間培養して生存細胞（ハイブリドーマ）を選別した。
【００４９】
（４）ＣＤ３の発現低下を誘導する抗体の選択（一次スクリーニング）
96ウェルプレートの各ウェルに、上記（１）と同様にしてヒト末梢血から調製した全リンパ球１００μｌ（５×１０４個）を播種した。次いで上記（３）で作製した各ハイブリドーマの培養上清１００μｌを添加し、３７℃で１時間処理した。その後、リンパ球をハンクス溶液で洗浄した後、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体（抗ヒトＣＤ３ε抗体、eBioscience社、４００倍希釈）を各ウェルに１００μｌ添加し、さらに４℃で２０分間染色処理した。次いで各ウェルのリンパ球をハンクス溶液で洗浄後、FACSCantoII(Becton Dickinson社)にかけて、ＯＫＴ３抗体の染色の程度を測定し、標識量が低下している培養上清を産生するハイブリドーマを選択した。その結果、1920ウェルをスクリーニングして、４ウェルを選択した。
【００５０】
次に、選択した各ウェルに含まれるハイブリドーマを限界希釈法によりクローン化し、同様のスクリーニングを繰り返した。その結果、４つのハイブリドーマをクローン化した。これら４つのハイブリドーマが産生する抗体をそれぞれ＃１Ａｂ〜＃４Ａｂとした。
上記（１）と同様にしてヒト末梢血から調製した全リンパ球１００μｌ（５×１０４個）を、抗体非存在下、３７℃１時間前処理した後、上記と同様にしてＰＥ標識ＯＫＴ３抗体で染色処理したところ、図１（ａ）に示すように全リンパ球中のＴ細胞は強く染色された（Ｙと表示）。一方、＃１Ａｂ〜＃４Ａｂの各ハイブリドーマの培養上清（抗体量として約１μｇ／ｍｌ）１００μｌ（全リンパ球１００μｌに対して培養上清１００μｌ を添加することを、以下、「培養上清を５０％添加する」という。）存在下で全リンパ球を同様に前処理した場合は、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体による染色が著しく低下していた（Ｘと表示）。
【００５１】
また同様にして、Jurkat細胞（ヒトＴ細胞,ATCC TIB-152）を前処理し、抗ＴＣＲ抗体（BDBiosciences社, Cat # 555548）で染色した。その結果、図１（ｂ）に示すように抗体非存在下で前処理した場合は、ＴＣＲの発現を認めた（Ｙと表示）が、＃１Ａｂ〜＃４Ａｂの各ハイブリドーマの培養上清を５０％添加して前処理した場合は、ＴＣＲの発現が低下していた（Ｘと表示）。対照として、細胞を染色しなかった場合がＺ（自家蛍光）で示されている。
これらの結果から、＃１Ａｂ〜＃４Ａｂは、ＴＣＲ−ＣＤ３複合体の発現を低下させる抗体であることが確認された。
【００５２】
（５）Ｔ細胞の増殖誘導作用を示さない抗体の選択（二次スクリーニング）
上記（１）と同様にしてヒト末梢血から調製した全リンパ球１００μｌ（７×１０４個）に抗ヒトＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、eBioscience社）０．００１〜１μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下に２日間培養した。培養期間の最期４時間、３Ｈ−チミジン（NET027X、PerkinElmer社）３７ＭＢｑ／ウェルを添加し、細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、図２（ａ）に示すようにＯＫＴ３抗体の添加によりＴ細胞が活性化され細胞の増殖が誘導されることが確認された。
上記の培養系において、ＯＫＴ３抗体の代わりに＃１Ａｂ〜＃４Ａｂのハイブリドーマの培養上清をそれぞれ５０％（１００μｌ）〜６．２５％（１２．５μｌ）添加する以外は同様にして２日間培養し、細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を測定した。その結果、図２（ｂ）に示すように、＃４ＡｂはＯＫＴ３抗体同様Ｔ細胞の増殖反応を誘導したが、＃１Ａｂ〜＃３ＡｂはＴ細胞の増殖反応を全く誘導しなかった。
以上のことから、＃１Ａｂ〜＃３ＡｂはＴＣＲの発現を低下させ、しかもＴ細胞に増殖反応を誘導しない抗体であることが確認された。
（６）Ｔ細胞の活性化誘導作用の測定
上記（１）と同様にしてヒト末梢血から調製した全リンパ球１００μｌ（７×１０４個）に、ＯＫＴ３抗体（eBioscience社）又は＃１Ａｂ〜＃３Ａｂのハイブリドーマの培養上清５０％（１００μｌ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下に２日間培養した。次いで、各培養液１００μｌについて、ＩＬ−２依存性に増殖するCTLL-2細胞株の細胞増殖を指標として、細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を測定することによって、ＩＬ−２産生量を測定した。表１に示すように、＃１Ａｂ〜＃３ＡｂはＩＬ−２の産生を誘導しなかった。このことから、＃１Ａｂ〜＃３ＡｂはＴ細胞の活性化を誘導しないことが確認された。
【００５３】
【表１】
2016093104.tif 000003
【００５４】
（実施例２）＃１Ａｂの標的分子の決定
（１）J.RT3-T3.5細胞による解析
Jurkat細胞（ヒトＴ細胞株、ATCC TIB152）１００μｌ（１×１０５個）にＰＥ標識ＯＫＴ３抗体（抗ヒトＣＤ３ε抗体、eBioscience社、４００倍希釈）１００μｌを添加し、４℃、２０分間染色処理した。ハンクス溶液で洗浄後、FACSCantoII（Becton Dickinson社）にかけて、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体による標識の程度を測定した。Jurkat細胞はＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現しているので、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体で強く染色された（図３（ａ）の左図、Ｐと表示）。Ｏと表示は未染色を示す。
一方、Jurkat細胞の亜株J.RT3-T3.5（ATCC TIB-153、J. Exp. Med. 160:1284-1299,1984）はＴＣＲ−ＣＤ３複合体を発現していないためＰＥ標識ＯＫＴ３抗体で染色されなかった（図３（ａ）の右図、Ｑと表示）。
次に、これら細胞株を＃１Ａｂの培養上清１００μｌで処理し、洗浄後、ＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体（BDBiosciences社、Cat# 558067）で同様に染色処理したところ、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体と同様の染色パターンを示した（図３（ｂ）、Ｐ及びＱと表示）。この結果は、＃１Ａｂの標的分子がＴＣＲ又はＣＤ３分子のいずれかである可能性を示唆している。
【００５５】
（２）hCD3ε-Yac-1細胞による解析
ＣＤ３ε分子はＣＤ３γ分子と複合体を形成することにより、Ｔ細胞表面に安定に発現する。マウスリンパ腫Yac-1（ATCC TIB-160）はマウスＣＤ３εとマウスＣＤ３γの複合体を発現している。ここにヒトＣＤ３ε分子の遺伝子を導入すると、マウスＣＤ３εとマウスＣＤ３γとの複合体と同時にヒトＣＤ３εとマウスＣＤ３γとの複合体も発現する。そこでヒトＣＤ３ε分子の遺伝子（NM_000733）を電気穿孔法でYac-1細胞に導入し、hCD3ε-Yac-1細胞を作製した。次いで、hCD3ε-Yac-1細胞を上記（１）と同様に、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体によって染色処理又は＃１Ａｂ処理後ＰＥ標識抗ラットＩｇＧ抗体によって染色処理してFACSで標識量を測定した。その結果、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体及び＃１Ａｂは、いずれもYac-1細胞を染色しなかったが、いずれもhCD3ε-Yac-1細胞を染色した（図４（ａ）及び図４（ｂ））。図４中、ＰＥ標識ＯＫＴ３抗体（Ｕ）、＃１Ａｂ（Ｔ）、未染色（Ｓ）を示す。この結果は、＃１Ａｂの標的分子がｈＣＤ３εであることを示している。
【００５６】
（３）生化学的解析
Yac-1細胞（ヒトＣＤ３ε分子を発現していない）、ヒトＣＤ３ε分子を発現させたhCD3ε-Yac-1細胞及びJurkat細胞（元々ヒトＣＤ３ε分子を発現している）をそれぞれ１０％ Tritonにより可溶化し、５×１０５当量をSDS-PAGE（アトー社）で分離し、常法に従いメンブレンに移動して固定し、＃１Ａｂの培養上清３ｍｌで処理し、洗浄後、ＨＲＰ(horseradishperoxidase)標識抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch社、Cat＃212-036-082）を用いて反応させてウエスタンブロッティングを行なった。その結果、＃１Ａｂが認識するバンドが、Yac-1細胞では認められなかったが、ヒトＣＤ３ε分子を含むhCD3ε-Yac-1細胞及びJurkat細胞では認められた（図５中、矢印で示す）。
これらの結果から、＃１Ａｂの標的分子はＣＤ３ε分子であることが確認された。
【００５７】
（実施例３）＃１ＡｂによるＴ細胞活性化誘導抑制作用
（１）ＯＫＴ３抗体によるＴ細胞の活性化誘導抑制作用
抗ヒトＣＤ３ε抗体ＯＫＴ３は、ヒトＴ細胞の活性化を誘導することが知られている（Hum AntibodiesHybridomas. 1994;5(1-2):41-7）。そこで、上記実施例１（１）と同様にしてヒト末梢血から調製した全リンパ球１００μｌ（７×１０４個）にＯＫＴ３抗体（eBioscience社）２５０〜０．００２５ｎｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下に３日間培養した。培養期間の最期４時間、３Ｈ−チミジン（NET027X、PerkinElmer社）３７ＭＢｑ／ウェルを添加し、細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、ＯＫＴ３抗体の添加量に比例して細胞が増殖した。これはＯＫＴ３によりＴ細胞の活性化が誘導され、Ｔ細胞が増殖したことを示している（図６、Ｆ）。
【００５８】
上記の培養系において、さらに＃１Ａｂ  ０．５μｇ／ｍｌを添加して同様に培養し、細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を測定した。その結果、＃１Ａｂを添加することにより、細胞の増殖は実質的に抑制された。これはＯＫＴ３抗体によるＴ細胞の活性化誘導が抑制され、その結果Ｔ細胞の増殖が見られなかったことを示している（図６、Ｇ）。
【００５９】
（２）マイトジェンによるＴ細胞の活性化誘導抑制作用
上記（１）において、ＯＫＴ３抗体の代わりに、マイトジェン活性をもつフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）又はポークウィードマイトジェン（ＰＷＭ）をそれぞれ単独で、或いは、それらと＃１Ａｂとを併用で用いる他は同様にして２日間培養し、細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。その結果、＃１Ａｂを併用しなかったときはＰＨＡ及びＰＷＭにより細胞が増殖した（図７、Ｈ）。これはＰＨＡ及びＰＷＭによりＴ細胞の活性化が誘導され、Ｔ細胞が増殖したことを示している。一方、これらと＃１Ａｂを併用した場合は細胞の増殖は抑制された（図７、Ｉ）。これはマイトジェンによるＴ細胞活性化の誘導が＃１Ａｂによって抑制されたことを示している。
【００６０】
なお、ＰＷＭと＃１Ａｂの併用の場合に、ＰＨＡと＃１Ａｂの併用の場合のように細胞の増殖が実質的に抑制されていないが、これはＰＷＭがＴ細胞の活性化誘導能と同時にＢ細胞の活性化誘導能もあること及び使用した細胞が全リンパ球であったため、細胞の増殖がみられたものと推測される。すなわち、リンパ球中のＢ細胞がＰＷＭで活性化され増殖したためと推測される。
【００６１】
以上（１）及び（２）の結果は、＃１Ａｂは抗体そのものがＴ細胞を活性化しないというだけではなく、Ｔ細胞活性化剤によるＴ細胞の活性化をも抑制することが確認された。またこれらの結果は、ＯＫＴ３抗体と＃１Ａｂが競合することにより＃１ＡｂがＴ細胞の活性化の誘導を抑制し、Ｔ細胞の増殖を抑制しているのではないこと（＃１ＡｂとＯＫＴ３抗体は、異なる作用機序であること）も示している。
【００６２】
（実施例４）＃１Ａｂによるin vivo系におけるサイトカインの産生誘導
＃１ＡｂはＴ細胞に作用する抗体であることから、生体内へ投与した場合の副作用が問題となる可能性がある。そこで＃１Ａｂの生体内での副作用、特にサイトカイン産生を誘導するか否かという点について検討した。生体内での作用を評価するために、ヒト化マウスを用いた。
【００６３】
６週齢のＮＯＧマウス（NOD.Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Sug/Jic）（実験動物中央研究所）の静脈内にヒト造血幹細胞（ヒトＣＤ３４＋細胞、POIETICS社）４００μｌ（１×１０５個）を移入した。その後、ＮＯＧマウス体内でヒトリンパ球が分化してくる２０−３０週を経た時点で、このヒト化ＮＯＧマウスに、マウスＩｇＧ２ａ（BDBiosciences社）（コントロール抗体）２０μｇ、ラットＩｇＧ（BDBiosciences社）（コントロール抗体）２０μｇ、ＯＫＴ３抗体（eBioscience社）（対照抗体）２０μｇ又は＃１Ａｂ２０μｇを静脈内投与した。投与直前（０）、投与後２時間後（２）及び６時間後（６）に採血して、血中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１０の濃度を測定キット（BIO-RAD社, Bio-Plex Pro Assays）を使用して測定した。
【００６４】
その結果、図８に示すように、in vivoの系において＃１Ａｂを投与した場合、制御性のサイトカインであるＩＬ−１０の産生は認められたが、炎症性サイトカインであるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、 ＩＬ−１７、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの産生は、ＯＫＴ３抗体に比べて低かった。
【００６５】
（実施例５）移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症抑制作用
＃１Ａｂはin vitroの系でヒトＴ細胞を活性化することがない（図２）、またＴ細胞の活性化を抑制できる（図６、７）、更にin vivoの系で副作用の可能性が非常に低いこと（図８）が示された。そこで＃１Ａｂの示す免疫抑制作用が、実際にin vivoの系でヒトＴ細胞に対して有効か否か検討した。モデルとしてヒトＴ細胞によるＧＶＨＤの発症モデルを用いた。
【００６６】
６週齢のＮＯＧマウスにガンマ線を２Ｇｙ照射した後、実施例１（１）と同様にしてヒト末梢血から調製したヒト全リンパ球４００μｌ（２×１０６個）を静脈内に移入すると、全リンパ球移入後、約１５〜２０日でＧＶＨＤを発症して死に至る。
このガンマ線照射したマウスに、ヒト全リンパ球移入２日後から、１週間隔で計３回、ラットＩｇＧ（BD Biosciences社）（コントロール）又は＃１Ａｂをそれぞれ静脈内投与（２０μｇ／マウス／回）した。ラットＩｇＧを投与したマウスは１５日でＧＶＨＤ が発症して死亡した（図９、Ｍ）。一方、＃１Ａｂを投与したマウスはＧＶＨＤの発症が抑制され生存が著しく延びた（図９、Ｎ）。
【００６７】
この結果は、＃１Ａｂが生体内でもヒトＴ細胞に対し免疫抑制的に作用することを示している。また、ヒトリンパ球を移入した直後ではなく、移入２日後に＃１Ａｂを投与してもＧＶＨＤの発症を抑えていることから、＃１Ａｂは抗原で感作されたＴ細胞に対しても抑制的に作用することが示された。
【００６８】
（実施例６）＃１ＡｂのＴ細胞に対する不応答性誘導作用の測定
（１）６週齢のＮＯＧマウス（NOD.Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Sug/Jic）（実験動物中央研究所）にガンマ線を２Ｇｙ照射した後、ヒト造血幹細胞（ヒトＣＤ３４＋細胞、POIETICS社）４００μｌ（１×１０５個）を静脈内に移入した。その後、ＮＯＧマウス体内でヒトリンパ球が分化してくる２０−３０週を経た時点で、このヒト化ＮＯＧマウスに、ラットＩｇＧ（BDBiosciences社）（コントロール抗体）１ｍｇ又は＃１Ａｂ１ｍｇを静脈内投与した。その後、２４時間後に脾臓を取り出し脾臓細胞を得た。脾臓細胞をRPMI1640培地（インビトロジェン社）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を調製した。なお、この脾臓細胞にはＣＤ４＋Ｔ細胞（３２．３％）及びＣＤ８＋Ｔ細胞 （１６．９％）が含まれていた。
上記で調製した脾臓細胞浮遊液（図１０、横軸）に、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、SIGMA社）２μｇ／ｍｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２条件下に３日間培養した。対照として、ＰＨＡを添加しなかった以外は同様にして３日間培養した（Ｗ）。培養期間の最期４時間、３Ｈ−チミジン（NET027X、PerkinElmer社）３７ＭＢｑ／ウェルを添加し、細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン量を液体シンチレーションカウンターにて測定した。
その結果、コントロール抗体を投与した場合（Ｕ）は、ＰＨＡ刺激に伴う脾臓細胞の増殖が誘導された（図１０左）。一方、＃１Ａｂを投与した場合（Ｖ）は、ＰＨＡ刺激に伴う脾臓細胞の増殖が実質的に抑制された（図１０右）。
【００６９】
（２）上記（１）と同様に、ＮＯＧマウスにヒト造血幹細胞（ヒトＣＤ３４＋細胞、POIETICS社）４００μｌ（１×１０５個）を静脈内に移入し、２０−３０週を経た時点で、脾臓を取り出し脾臓細胞を得た。この脾臓細胞から上記（１）と同様にして脾臓細胞浮遊液を調製した。この脾臓細胞４００μｌ（２×１０７個）を、予めガンマ線を２Ｇｙ照射した６週齢のＮＯＧマウス（NOD.Cg-Prkdcscid  Il2rgtm1Sug/Jic）（実験動物中央研究所）の静脈内に移入した。その後、ラットＩｇＧ（BD Biosciences社）（コントロール抗体）１ｍｇ又は＃１Ａｂ１ｍｇを静脈内投与した。7日後、当該マウスから脾臓を取り出し脾臓細胞を得た。脾臓細胞をRPMI1640培地（インビトロジェン社）に浮遊させ、脾臓細胞浮遊液を調製した。さらに当該脾臓細胞から抗ヒトＣＤ４マイクロビーズ（MiltenyiBiotec社）を用い、そのプロトコールに従ってヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（純度９８％以上）を調製した。このＣＤ４＋Ｔ細胞を使用して、上記（１）と同様にしてＰＨＡ刺激による培養を行い、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する増殖誘導を測定した。
その結果、コントロール抗体を投与した場合は、ＰＨＡ刺激に伴うヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖が誘導された（図１１Ｆ）。一方、＃１Ａｂを投与した場合は、ＰＨＡ刺激に伴うヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖が実質的に抑制された（図１１Ｇ）。ＤとＥは、ＰＨＡしなかった場合で、Ｄはコントロール抗体、Ｅは＃１Ａｂの結果である。
【００７０】
上記（１）及び（２）の結果は、＃１Ａｂは単にＴ細胞を活性化しない（図２）、Ｔ細胞の活性化を抑制する（図６、図７及び図９）のみならず、生体内でＴ細胞に不応答性を誘導していることを示している。
また、本実施例ではヒト化ＮＯＧマウスには抗体を投与しているのみで、抗原などを同時投与していないが、この条件下でＴ細胞に不応答性が誘導されていることから、＃１Ａｂによる不応答性誘導には抗原の共存を必要とはしないことが示された。
【００７１】
（実施例７）＃１抗体可変領域のアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列
（１）重鎖可変領域の配列決定  
＃１抗体産生ハイブリドーマ細胞（２×１０６個）からRNAiso Plus（タカラバイオ社）を用い、そのプロトコールに従ってトータルＲＮＡを抽出した。このトータルＲＮＡを鋳型として、ラット抗体重鎖特異的なプライマー〔5'-TCCAKAGTTCCA-3'(配列番号１) 〕(K = G or T) を用いて、SMARTerRACE cDNA Amplification Kit (Clontech Cat＃634924) によりｃＤＮＡを合成した。
【００７２】
次に、上記で合成したｃＤＮＡを鋳型として、ラット抗体(ＩｇＧ)重鎖特異的なReverseプライマー 〔5'-GGGAARTARCCCTTGACCAGGCA-3'（配列番号２）及び5'-GGGAARTAGCCTTTGACAAGGCA-3'（配列番号３）を１：１のモル比で混合したもの〕 (R =A or G) 及びForwardプライマー〔5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'（配列番号４）及び5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'（配列番号５）を１：４のモル比で混合したもの〕 を用いて、5'RACEＰＣＲ反応を行った。これらの操作は、当該Kitに付属されているプロトコールに従った。
【００７３】
かくして得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、想定した約700 bpのＰＣＲ産物をゲルから精製した。精製したＰＣＲ産物をpMD20-T vector（タカラバイオ社）にライゲーションし、このライゲーション産物で、大腸菌株ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換した。これをクローニング後、ベクター特異的なプライマー 〔5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'（配列番号６）〕 により配列解析し、塩基配列を決定した。
次いで、決定した塩基配列をIMGT/V-QUEST Search page（URLのホームページ：http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest  livret=0&Option=ratIg)に提供されているイムノグロブリンの配列予測ソフトにて、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の部位を特定した。
【００７４】
重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列（5'-末端側からFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）及びアミノ酸配列（N-末端側からFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）は以下の通りであった。
【００７５】
＃１Ａｂ 重鎖 （塩基配列）（配列番号７）
GAGGTGCCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATCTCATGGCCTGGGTCCGCCATCCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTTCCAGTGGTAGCAGAATTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTATCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAGATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGTGCAAGACATCTCCGGGACGGTGGCTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCAGCTGAAACAACA[GCCCCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGAACTGCTCTCAAAAGTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTACTTCCC]
下線部はＣＤＲ部分を表し、[ ]内は、重鎖定常領域部分を表す。
【００７６】
＃１Ａｂ 重鎖 （アミノ酸配列） （配列番号８）
GluValProLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyArgSerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerAsnTyrLeuMetAlaTrpValArgHisProProLysLysGlyLeuGluTrpValAlaThrIleSerSerSerGlySerArgIleTyrTyrProAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaArgSerSerLeuTyrLeuGlnMetSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaThrTyrTyrCysAlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyrTrpGlyGlnGlyValMetValThrValSerSerAlaGluThrThr[AlaProSerValTyrProLeuAlaProGlyThrAlaLeuLysSerAsnSerMetValThrLeuGlyCysLeuValLysGlyTyrPhe]
下線部はＣＤＲ部分を表し、[ ]内は、重鎖定常領域部分を表す。
【００７７】
相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の部位の塩基配列及びアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【００７８】
重鎖ＣＤＲ１（塩基配列）：GGATTCACTTTCAGTAATTATCTC  （配列番号９）
重鎖ＣＤＲ２（塩基配列）：ATTAGTTCCAGTGGTAGCAGAATT  （配列番号１０）
重鎖ＣＤＲ３（塩基配列）：GCAAGACATCTCCGGGACGGTGGCTTTGATTAC  （配列番号１１）
【００７９】
重鎖ＣＤＲ１（アミノ酸配列）：GlyPheThrPheSerAsnTyrLeu    （配列番号１２）
重鎖ＣＤＲ２（アミノ酸配列）：IleSerSerSerGlySerArgIle    （配列番号１３）
重鎖ＣＤＲ３（アミノ酸配列）：AlaArgHisLeuArgAspGlyGlyPheAspTyr    （配列番号１４）
【００８０】
重鎖ＦＲ１（塩基配列）：  （配列番号１５）
GAGGTGCCGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCA
重鎖ＦＲ２（塩基配列）：  （配列番号１６）
ATGGCCTGGGTCCGCCATCCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACC
重鎖ＦＲ３（塩基配列）：  （配列番号１７）
TACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTATCTCCAGAGATAATGCAAGAAGCAGCCTATACCTACAGATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGT
重鎖ＦＲ４（塩基配列）：  （配列番号１８）
TGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCAGCTGAAACAACA
【００８１】
重鎖ＦＲ１（アミノ酸配列）：  （配列番号１９）
GluValProLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyArgSerLeuLysLeuSerCysAlaAlaSer
重鎖ＦＲ２（アミノ酸配列）：  （配列番号２０）
MetAlaTrpValArgHisProProLysLysGlyLeuGluTrpValAlaThr
重鎖ＦＲ３（アミノ酸配列）：  （配列番号２１）
TyrTyrProAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaArgSerSerLeuTyrLeuGlnMetSerSerLeuArgSerGluAspThrAlaThrTyrTyrCys
重鎖ＦＲ４（アミノ酸配列）：  （配列番号２２）
TrpGlyGlnGlyValMetValThrValSerSerAlaGluThrThr
【００８２】
（２）軽鎖可変領域の配列決定
＃１抗体産生ハイブリドーマ細胞（１×１０７個）からセパゾール RNA I Super G（ナカライテスク社）のKitを用いてトータルＲＮＡを抽出した。このトータルＲＮＡを鋳型として、Kit付属の5'RACE CDS Primer A (5'-(T)25VN-3')(N= A, C, G or T; V = A, G or C) を用いて、SMARTer RACEcDNAAmplification Kit (Clontech Cat＃634924) によりｃＤＮＡを合成した。
上記で合成したｃＤＮＡを鋳型として、ラット抗体（ＩｇＧ）軽鎖特異的なReverseプライマー〔5'-GTAAAACTGTTGCGAGATCTCCACTGTTC-3'  (配列番号２３)〕及びForwardプライマー〔5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'  （配列番号２４）及び5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'（配列番号２５）を１：４のモル比で混合したもの〕を用いて5'RACEＰＣＲ反応を行った。これらの操作は、当該Kitに付属されているプロトコールに従った。
得られたＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、想定した約700bpの単一バンドであることを確認し、QIAquick PCRpurification kit（QIAGEN社）により精製した。精製したＰＣＲ産物をpCR-BluntII-TOPOvector（インビトロジェン社）にライゲーションし、このライゲーション産物で、大腸菌株ＤＨ５α（タカラバイオ社）を形質転換した。これをクローニング後、ベクター特異的なプライマー〔5'-CAGGAAACAGCTATGAC -3'  (配列番号２６)〕により配列解析し、塩基配列を決定した。
次いで、決定した塩基配列より、IMGT/V-QUESTSearch page（URLのホームページ：http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest  livret=0&Option=ratIg)に提供されているイムノグロブリンの配列予測ソフトにて、相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びにフレームワークＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の部位を特定した。
【００８３】
軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列（5'-末端側からFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）及びアミノ酸配列（N-末端側からFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4）は以下の通りであった。
【００８４】
＃１Ａｂ 軽鎖 （塩基配列）  （配列番号２７）
CAGTTTGTGCTTACTCAGCCAAACTCTGTGTCTACGAATCTCGGAAGCACAGTCAAACTGTCTTGCAAGCGCAGCACTGGTAACATTGGAAGCAATTATGTGAACTGGTACCAACAACATGAGGGAAGATCTCCCACCACTATGATTTATAGGGATGATGGGAGACCAGATGGAGTTCCTGACAGGTTCTCTGGCTCCATTGACAGATCTTCCAACTCAGCCCTCCTGACAATCAAAAATGTGCAGAGTGAAGATGAAGCTGACTACTTCTGTCACTCTCACAGTGGTGGTATTAATGTTTTCGGCGGTGGAACCAGCCTCACTGTCCTAGGTCAGCCCAAGTCCACT[CCCACACTCACAGTATTTCCACCTTCAACTGAGGAGCTCCAGGGAAACAAAGCCACACTGGTGTGTCTGATTTCTGATTTCTACCCGAGTGATGTGGAAGTGGCCTGGAAGGCAAATGGTGCACCTATCTCCCAGGGTGTGGACACTGCAAATCCCACCAAACAGGGCAACAAATACATCGCCAGCAGCTTCTTACGTTTGACAGCAGAACAGTGGAGATCTCGCAACAGTTTTAC]
下線部はＣＤＲ部分を表し、[ ]は、軽鎖定常領域部分を表す。
【００８５】
＃１Ａｂ 軽鎖 （アミノ酸配列）    （配列番号２８）
GlnPheValLeuThrGlnProAsnSerValSerThrAsnLeuGlySerThrValLysLeuSerCysLysArgSerThrGlyAsnIleGlySerAsnTyrValAsnTrpTyrGlnGlnHisGluGlyArgSerProThrThrMetIleTyrArgAspAspGlyArgProAspGlyValProAspArgPheSerGlySerIleAspArgSerSerAsnSerAlaLeuLeuThrIleLysAsnValGlnSerGluAspGluAlaAspTyrPheCysHisSerHisSerGlyGlyIleAsnValPheGlyGlyGlyThrSerLeuThrValLeuGlyGlnProLysSerThr[ProThrLeuThrValPheProProSerThrGluGluLeuGlnGlyAsnLysAlaThrLeuValCysLeuIleSerAspPheTyrProSerAspValGluValAlaTrpLysAlaAsnGlyAlaProIleSerGlnGlyValAspThrAlaAsnProThrLysGlnGlyAsnLysTyrIleAlaSerSerPheLeuArgLeuThrAlaGluGlnTrpArgSerArgAsnSerPhe]
下線部はＣＤＲ部分を表し、[ ]は、軽鎖定常領域部分を表す。
【００８６】
塩基配列及びアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【００８７】
軽鎖ＣＤＲ１ （塩基配列）：ACTGGTAACATTGGAAGCAATTAT    （配列番号２９）
軽鎖ＣＤＲ２ （塩基配列）：AGGGATGAT    （配列番号３０）
軽鎖ＣＤＲ３ （塩基配列）：CACTCTCACAGTGGTGGTATTAATGTT    （配列番号３１）
【００８８】
軽鎖ＣＤＲ１ （アミノ酸配列）：ThrGlyAsnIleGlySerAsnTyr    （配列番号３２）
軽鎖ＣＤＲ２ （アミノ酸配列）：ArgAspAsp    （配列番号３３）
軽鎖ＣＤＲ３ （アミノ酸配列）：HisSerHisSerGlyGlyIleAsnVal    （配列番号３４）
【００８９】
軽鎖ＦＲ１ （塩基配列）：  （配列番号３５）
CAGTTTGTGCTTACTCAGCCAAACTCTGTGTCTACGAATCTCGGAAGCACAGTCAAACTGTCTTGCAAGCGCAGC    
軽鎖ＦＲ２ （塩基配列）：  （配列番号３６）
GTGAACTGGTACCAACAACATGAGGGAAGATCTCCCACCACTATGATTTAT
軽鎖ＦＲ３ （塩基配列）：  （配列番号３７）
GGGAGACCAGATGGAGTTCCTGACAGGTTCTCTGGCTCCATTGACAGATCTTCCAACTCAGCCCTCCTGACAATCAAAAATGTGCAGAGTGAAGATGAAGCTGACTACTTCTGT
軽鎖ＦＲ４ （塩基配列）：  （配列番号３８）
TTCGGCGGTGGAACCAGCCTCACTGTCCTAGGTCAGCCCAAGTCCACT
【００９０】
軽鎖ＦＲ１ （アミノ酸配列）：  （配列番号３９）
GlnPheValLeuThrGlnProAsnSerValSerThrAsnLeuGlySerThrValLysLeuSerCysLysArgSer
軽鎖ＦＲ２ （アミノ酸配列）：  （配列番号４０）
ValAsnTrpTyrGlnGlnHisGluGlyArgSerProThrThrMetIleTyr
軽鎖ＦＲ３ （アミノ酸配列）：  （配列番号４１）
GlyArgProAspGlyValProAspArgPheSerGlySerIleAspArgSerSerAsnSerAlaLeuLeuThrIleLysAsnValGlnSerGluAspGluAlaAspTyrPheCys
軽鎖ＦＲ４ （アミノ酸配列）：  （配列番号４２）
PheGlyGlyGlyThrSerLeuThrValLeuGlyGlnProLysSerThr
【図２】
2016093104.tif 000004
【図１】
2016093104.tif 000005
【図３】
2016093104.tif 000006
【図４】
2016093104.tif 000007
【図５】
2016093104.tif 000008
【図６】
2016093104.tif 000009
【図７】
2016093104.tif 000010
【図８】
2016093104.tif 000011
【図９】
2016093104.tif 000012
【図１０】
2016093104.tif 000013
【図１１】
2016093104.tif 000014
【配列表】
2016093104000001.app