(57)【要約】【解決手段】guanidine thiocyanateに100mM Tris-HCl (pH9.0)と40mM EDTA を含む溶液中のguanidine thiocyanateの濃度を0.01M以上4M未満の間で調整することによって、常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存及び輸送することができることを特徴とする保存・輸送方法。 様々な生物を含む、環境試料の土壌、汚泥、液体などや生体試料の糞便、唾液、血液などに利用できることを特徴とする保存・輸送方法。タンパク質変性剤を含み、細胞を溶かし培養や感染ができない状態にすることで、感染症検体や臨床検体を輸送の制限がなく、安全に取り扱うことを特徴とする保存・輸送方法。【効果】上記各保存・輸送方法を新規に提供できる。特に、生物群集構造解析及びDNAを用いた様々な分子生物学的手法に利用できる。また、上記いずれかの方法を利用することにより、検体を採取・輸送・保管し得る採取・輸送・保管容器を新規に提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
guanidine thiocyanateに100mM Tris-HCl (pH9.0)と40mM EDTA を含む溶液中のguanidine thiocyanateの濃度を0.01M以上4M未満の間で調整することによって、常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存及び輸送することができることを特徴とする保存・輸送方法。
【請求項２】
様々な生物を含む、環境試料の土壌、汚泥、液体などや生体試料の糞便、唾液、血液などに利用できることを特徴とする請求項１記載の保存・輸送方法。
【請求項３】
タンパク質変性剤を含み、細胞を溶かし培養や感染ができない状態にすることで、感染症検体や臨床検体を輸送の制限がなく、安全に取り扱うことを特徴とする請求項１記載の保存・輸送方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、リアルタイムPCR解析、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析、T-RFLP解析やDGGE解析などの生物群集構造解析及び生物の培養株のDNA塩基配列解析や菌株の識別を行うDNA多型性解析の手法であるRAPD解析、マイクロサテライト解析などのDNAを用いた様々な分子生物学的手法に利用できることを特徴とする保存・輸送方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を採取し得るようにしたことを特徴とする採取容器。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を輸送し得るようにしたことを特徴とする輸送容器。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を保管し得るようにしたことを特徴とする保管容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムPCR解析、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析、T-RFLP解析やDGGE解析などの生物群集構造解析及び生物の培養株のDNA塩基配列解析や菌株の識別を行うDNA多型性解析の手法であるRAPD解析、マイクロサテライト解析などのDNAを用いた様々な分子生物学的手法を用いて解析する際に、採取した検体をタンパク質変性剤を含む水溶液中で、細胞を溶かし培養できない状態にすることで、採取時点の生物群集構造に変化を与えず、生物群集構造や培養株などのDNAを安定的に保存・輸送可能な技術及びこの技術を用いた検体の採取・輸送・保管容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、微生物は地球上に存在する1％程度しか分離できていないとされ、残りの99％は、「生きているけれども培養できない」状態にあることを指すVNC（viable but non-culturable）状態と呼ばれ、培養不能状態、培養不能菌や難培養性微生物として理解されている。このような状態は、未知の生育因子を要求するものなど、純粋培養が不可能もしくはきわめて困難な微生物も多く存在していることになる。そのため、培養を用いないで生物群集構造を解析するために、様々な分子生物学的手法が開発されているが、採取から解析までの保管温度や方法により、生物群集構造が採取時点と異なるといった問題があった。採取した検体をタンパク質変性剤を含む水溶液中で、細胞を溶かし培養できない状態にすることで、採取時点の生物群集構造に変化を与えず、採取時点の生物群集構造のDNAを安定的に保存・輸送することが、生物群集構造を知るうえで重要な課題である。
【０００３】
また、感染症の検体は、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律により、輸送方法・連絡・移動手続きなどに規制があり、感染症菌の同定可能な機関への移動に手間が掛かり、微生物同定までに掛かる期間による感染症菌の特定遅れ、ワクチンなどの選択や開発着手の遅れにおいてパンデミックの発生が懸念され、採取した検体をタンパク質変性剤を含む水溶液中で、細胞を溶かし培養できない状態にすることで、感染を防ぐことができ、DNAを安定的に保存・輸送することが重要な課題である。
【０００４】
従来、生物群集構造解析を実施する際には、検体の採取直後に冷蔵、冷凍する必要があり、冷凍設備の必要性や汚染土壌、糞便などの保管に関する衛生的な問題や輸送時の問題が多かった。
【０００５】
また、採取時の生物群集構造を反映した解析を行う場合、直ちに解析に取り掛からなければならず、解析の前準備や多検体の処理の対応が困難であった。
【０００６】
さらに、冷蔵、冷凍した検体と採取直後の検体では、変化しやすい菌群などが存在することが判明し、解析精度が少し劣るといった問題もあった。
【０００７】
感染症検体の輸送については、感染症研究やワクチンの開発などで生菌であることが重要で、生菌で輸送するためには都道府県の諸官庁への連絡や三重包装手法などの手間と高コストが必要となる。ただし、感染の拡大によるパンデミックの緊急対策として、感染症菌が「現在までに知られている既存種であるか。」「最も近い既存種が何であるのか。」を把握するための微生物の同定が重要となるため、DNAで郵送可能となれば迅速な対応が可能となるが、細胞を溶かし培養できない状態で感染を防ぎ、安全に保存・輸送する容器が存在しなかった。
【０００８】
従来から協力なタンパク質変性剤として、RNA分解酵素を不活化し健全なメッセンジャーRNAを取得する目的で広く使用されてきた4M guanidine thiocyanateを生物群集構造のDNAを安定的に保存・輸送する目的で、以下に記載の７名が4M guanidine thiocyanateに、100mM Tris-HCl (pH9.0)と40mM EDTA を含む溶液（以下、GTC溶液という）中に浸す方法を提案した（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】長島  浩二（Koji  NAGASHIMA），八十川  大輔（Daisuke YASOKAWA），阿部  健太郎（Kentaro ABE），中川  良二（Ryoji NAKAGAWA），北村  亨（Tooru KITAMURA），三浦  俊治（Toshiharu MIURA），古川  修（Shu KOGAWA）著，「子牛における下痢の発生率と子牛の成長に関連するマイクロフローラの変化によるラクトバシラス種の効果」    （Effect of a Lactobacillus species on incidence of diarrhea in calves and change of the microflora associated with growth），「バイオサイエンスとミクロフローラ」（Bioscience Microflora），日本，公益財団法人日本ビフィズス菌センター，２０１０年，第29(2)巻， p.97-110
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、GTC溶液による生物群集構造の安定化についての具体的な検証データは示されていない。さらには、GTC溶液中のguanidine thiocyanateは濃度が高くコスト高であることや長期保存により析出すること、また、濃度が濃いためにDNAを用いた分子生物学的手法を用いた解析の際のPCR増幅の阻害物質となっていた。さらに、細胞を溶かし培養できない状態にする反面、タンパク質変性剤が高濃度であると、皮膚に接触した場合にタダレなど少なからず人体への影響があった。
【００１１】
このようなことから、GTC溶液中のguanidine thiocyanateの濃度を低くすることで、低価格化、DNAのPCR増幅の効率化及び人体への影響リスクを削減することが望まれていた。
【００１２】
また、感染症検体の輸送については、感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律による輸送の制限に該当しない、安全性を考慮した輸送方法が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、上記のような要望に応えることができるものであって、以下の構成からなる発明である。すなわち、
(1) GTC溶液中のguanidine thiocyanateの濃度を0.01M以上4M未満の間で調整することによって、常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存及び輸送することができることを特徴とする保存・輸送方法である。
(2) 様々な生物を含む、環境試料の土壌、汚泥、液体などや生体試料の糞便、唾液、血液などに利用できることを特徴とする前記(1)記載の保存・輸送方法である。
(3) タンパク質変性剤を含み、細胞を溶かし培養や感染ができない状態にすることで、感染症検体や臨床検体を輸送の制限がなく、安全に取り扱うことを特徴とする前記(1)記載の保存・輸送方法である。
(4) 前記(1)から(3)のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、リアルタイムPCR解析、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析、T-RFLP解析やDGGE解析などの生物群集構造解析及び生物の培養株のDNA塩基配列解析や菌株の識別を行うDNA多型性解析の手法であるRAPD解析、マイクロサテライト解析などのDNAを用いた様々な分子生物学的手法に利用できることを特徴とする保存・輸送方法である。
(5) 前記(1)から(3) のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を採取し得るようにしたことを特徴とする検体の採取容器である。
(6) 前記(1)から(3) のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を輸送し得るようにしたことを特徴とする検体の輸送容器である。
(7) 前記(1)から(3) のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を保管し得るようにしたことを特徴とする検体の保管容器である。
【発明の効果】
【００１４】
請求項１記載の発明によれば、GTC溶液中のguanidine thiocyanateの濃度を0.01M以上4M未満の間で調整することによって、常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存及び輸送する方法を新規に提供できる効果がある。
【００１５】
請求項２記載の発明によれば、環境試料の土壌、汚泥、液体などや生体試料の糞便、唾液、血液などに利用できることが可能となり、常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存及び輸送する方法を新規に提供できる効果がある。
【００１６】
請求項３記載の発明によれば、タンパク質変性剤を含み、細胞を溶かし培養や感染できない状態にすることで、感染症検体や臨床検体を輸送の制限がなく、安全に取り扱うことが可能となり、常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存及び輸送する方法を新規に提供できる効果がある。
【００１７】
請求項４記載の発明によれば、請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、リアルタイムPCR解析、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析、T-RFLP解析やDGGE解析などの生物群集構造解析及び生物の培養株のDNA塩基配列解析や菌株の識別を行うDNA多型性解析の手法であるRAPD解析、マイクロサテライト解析などのDNAを用いた様々な分子生物学的手法に利用できる方法を新規に提供できる効果がある。
【００１８】
請求項５記載の発明によれば、請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を採取し得るようにしたことを特徴とする検体の採取容器を、新規に提供できる効果がある。
【００１９】
請求項６記載の発明によれば、請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を輸送し得るようにしたことを特徴とする検体の輸送容器を、新規に提供できる効果がある。
【００２０】
請求項７記載の発明によれば、請求項１〜３のいずれか１項に記載の保存・輸送方法を利用することにより、検体を保管し得るようにしたことを特徴とする検体の保管容器を、新規に提供できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】試験１における「次世代シーケンサーによるメタゲノム解析の一つである16S rRNAアンプリコン解析の類似性比較」の図である。
【図２】試験１における「T-RFLP解析の類似性比較」の図である。
【図３】試験２における「次世代シーケンサーによるメタゲノム解析の一つである16S rRNAアンプリコン解析の類似性比較」の図である。
【図４】試験２における「T-RFLP解析の類似性比較」の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の好ましい実施の形態について、詳細に説明する。
試験１として、生物群集構造解析におけるDNAや生物群集構造などを維持・保存について、糞便混合サンプルをn=3で用意し、採取直後の新鮮便（N）、保管温度による違いとして、部屋温度保管で、6時間保管（RT_6h）・1日保管（RT_1d）・2週間保管（RT_2w）の後、１日間そのまま部屋温度で保管した状態と冷凍-20℃保管（-20F）で保管した状態で、GTC溶液（GTC_4M）の他に、GTC溶液中の4M guanidine thiocyanateの濃度を濃度1M（GTC_1M）・濃度0.4M（GTC_0.4M）・濃度0.1M（GTC_0.1M）・GTC溶液無しとし、それぞれの組み合わせにおいてT-RFLP解析および次世代シーケンサーによるメタゲノム解析の一つである16S rRNAアンプリコン解析による群集構造の変化を解析し、採取直後の新鮮便（N）になるべく近縁となる方法を検討した。ただし、GTC溶液無しについては、部屋温度保管の後の冷凍-20℃保管（-20F）は群集構造が大きく変化することが想定できたので省いた。検討内容を表１．（試験１の検討項目一覧表）に示す。
【００２３】
T-RFLP解析は、糞便中の全細菌DNAを抽出し、16S rRNA領域である大腸菌の配列番号フォワード側516とリバース側1510のプライマーで、フォワード側516のプライマーに蛍光色素をラベル化しPCR増幅を行い、制限酵素BslＩ（ビーエスエルワン）で切断し、キャピラリーシーケンサーで切断された際の塩基配列数と同じ長さで切断された塩基配列数の量により、群集構造を比較する解析方法である。
【００２４】
次世代シーケンサーによるメタゲノム解析の一つである16S rRNAアンプリコン解析は、糞便中の全細菌DNAを抽出し、16S rRNA領域である大腸菌の配列番号フォワード側Pro341Fとリバース側Pro805RのプライマーでPCR増幅を行い、次世代シーケンサーによりDNA塩基配列解析を行い、群集構造を比較する解析方法である。
【００２５】
解析データの比較は、類似度係数により比較した。類似度係数は、値が100％に近ければ近いほど、検体の類似性が高いことを示している。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
その結果、T-RFLP解析よりも識別感度が高い次世代シーケンサーによるメタゲノム解析の一つである16S rRNAアンプリコン解析において、採取直後の新鮮便（N）と同じクラスターに入る類似度係数 94％を基準とした場合、一部の部屋温度保管後の-20℃、１日保管とRT_6h、RT_1dでの微生物群集構造は採取直後の新鮮便（N）の微生物群集構造とは大きく異なり、それ以外のGTC溶液中の4M guanidine thiocyanate濃度、1M、0.4M及び0.1Mの時、2週間の部屋温度保管の微生物群集構造は、採取直後の新鮮便と類似した微生物群集構造を維持していることが確認できた。T-RFLP解析による結果でも同様な結果が得られた。
【００２８】
従って、GTC溶液中のguanidine thiocyanateの濃度を0.1M以上4M未満の間で調整することによって、-20℃保管が必要なく、常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存できることを確認でき、さらには常温での輸送、様々な生物を含む、環境試料の土壌、汚泥、液体などに、また、生体試料の糞便、唾液、血液などに利用できることを確認できた。
【００２９】
また、生物群集構造を維持・保存できることから、感染症検体や臨床検体の微生物の細胞を溶かし培養や感染ができない状態にすることで、輸送の制限がなく、安全に取り扱うことが可能となり、リアルタイムPCR解析、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析、T-RFLP解析やDGGE解析などの生物群集構造解析及び生物の培養株のDNA塩基配列解析や菌株の識別を行うDNA多型性解析の手法であるRAPD解析、マイクロサテライト解析などのDNAを用いた様々な分子生物学的手法に利用できることも確認できた。
【００３０】
さらに、試験２として、低価格化、DNAのPCR増幅の効率化及び人体への影響リスクを削減のためにGTC溶液中のguanidine thiocyanateの濃度を薄くし、1ヶ月程度の長期保管を目的として、部屋温度保管期間を5週間まで行った際の比較を実施した。糞便混合サンプルをn=3で用意し、採取直後の新鮮便（N）、保管温度による違いとして、部屋温度保管で、3時間保管（RT_3h）、6時間保管（RT_6h）・1日保管（RT_1d）・5週間保管（RT_5w）、GTC溶液（4M）の他に、GTC溶液の4M guanidine thiocyanateの濃度を濃度0.1M・濃度0.01M・濃度0.001M・濃度0Mとし、それぞれの組み合わせで、試験１と同様な解析方法においてT-RFLP解析、次世代シーケンサーにより、採取直後の新鮮便（N）になるべく近縁となる方法を検討した。検討内容を表２．（試験２の検討項目一覧表）に示す。
【００３１】
【表２】
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【００３２】
その結果、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析の一つである16S rRNAアンプリコン解析によると、採取直後の新鮮便（N）と同じクラスターに入る類似度係数 88％を基準とした場合、部屋温度保管において、比較対象では1日以内、濃度0Mでは1日以内、濃度0.01Mと0.001Mでも同様に1日以内での微生物群集構造は、採取直後の新鮮便（N）の微生物群集構造と比較し類似度係数が高いことが確認できるが、部屋温度保管 5週間では、濃度4M、0.1Mと0.01Mのみが採取直後の新鮮便の微生物群集構造と比較し類似していた。しかし、濃度0.001Mでは同じクラスターには入らなかったことより、長期保存や安定性の観点から濃度0.01Mから４Mが最適な濃度であると確認できた。T-RFLP解析による結果では、5週間において濃度0.1M以下の微生物群集構造は、採取直後の新鮮便（N）の微生物群集構造よりも類似度係数が低くなるが、類似度係数 98％以上に入るためにT-RFLP解析においては十分に利用可能範囲にある。
【００３３】
このことから、検体の内容、部屋温度保管期間により、guanidine thiocyanateの濃度0.01M以上4M未満の間で調整することによって、低価格化、DNAのPCR増幅の効率化及び人体への影響リスクを削減でき、かつ常温で長期的にDNAや生物群集構造などを維持・保存できることが確認でき、さらには常温での輸送、様々な生物を含む、環境試料の土壌、汚泥、液体などに、また、生体試料の糞便、唾液、血液などに利用できることが可能となった。
【００３４】
そして、生物群集構造を維持・保存できることから、リアルタイムPCR解析、次世代シーケンサーによるメタゲノム解析、T-RFLP解析やDGGE解析などの生物群集構造解析及び生物の培養株のDNA塩基配列解析や菌株の識別を行うDNA多型性解析の手法であるRAPD解析、マイクロサテライト解析などのDNAを用いた様々な分子生物学的手法に利用できることも確認でき、検体を採取することを可能とする検体の採取容器、検体を輸送することを可能とする検体の輸送容器、検体を保管することを可能とする検体の保管容器などの組み合わせた製品が期待できる。また、感染症検体や臨床検体にも対応可能な製品が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月29日(2015.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
従来から強力なタンパク質変性剤として、RNA分解酵素を不活化し健全なメッセンジャーRNAを取得する目的で広く使用されてきた4M guanidine thiocyanateを生物群集構造のDNAを安定的に保存・輸送する目的で、以下に記載の７名が4M guanidine thiocyanateに、100mM Tris-HCl (pH9.0)と40mM EDTA を含む溶液（以下、GTC溶液という）中に浸す方法を提案した（非特許文献１）。