(57)【要約】【課題】熱安定性が高く、汎用性が高い変異型逆転写酵素、その核酸及び変異型逆転写酵素の製造方法、汎用性が高い逆転写反応キット及び検出キット並びに効率よく逆転写反応を行なう逆転写方法を提供すること。【解決手段】野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中の１２４位のアスパラギン酸残基および２８６位のグルタミン酸残基の少なくとも１つに対応するアミノ酸残基が所定のアミノ酸残基に置換され、かつ逆転写酵素活性を示す変異型逆転写酵素、その核酸及び変異型逆転写酵素の製造方法、該酵素を用いる逆転写反応キット及び検出キット並びに逆転写方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、１２４位のアスパラギン酸残基および２８６位のグルタミン酸残基の少なくとも１つに対応するアミノ酸残基の正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、
配列番号：２中のアミノ酸残基：
６９位のグルタミン酸残基、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、３０２位のグルタミン酸残基、３１３位のトリプトファン残基、４３５位のロイシン残基および４５４位のアスパラギン残基
の少なくとも１つの残基が、さらに、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており（ただし、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニン残基への置換を除く）、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。
【請求項２】
配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、
配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換の少なくとも１つの置換を有し、かつ
配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
配列番号：２の６９位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
配列番号：２の３１３位のトリプトファン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
配列番号：２の４５４位のアスパラギン残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項１に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項３】
（Ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ−１）〜（ｃ−１）：
（ａ−１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
（ｂ−１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
（ｃ−１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、または
（ＩＩ）前記（Ｉ）のアミノ酸配列において、（ｄ−１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項１または２に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項４】
前記（Ｉ）または（ＩＩ）のアミノ酸配列において、
（ｅ−１）配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項３に記載の変異型逆転写酵素。
【請求項５】
（Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有するアミノ酸配列、および
（Ｂ）配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が９５％以上であるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項１〜４のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
請求項６に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む、変異型逆転写酵素の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法。
【請求項９】
逆転写反応を行なうためのキットであって、
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット。
【請求項１０】
生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、
請求項１〜５のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異型逆転写酵素に関する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子解析、疾患などの検査などに有用な、変異型逆転写酵素、それをコードする核酸、前記変異型逆転写酵素を用いる逆転写方法、前記変異型逆転写酵素を含有する逆転写反応キットおよび検出キット、ならびに前記変異型逆転写酵素などの核酸関連酵素の熱安定性の向上方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
逆転写酵素は、一般的に、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する活性（以下、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」という）と、ＤＮＡをテンプレートとしてＤＮＡを合成する活性（以下、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」という）と、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を分解する活性（以下、「ＲＮａｓｅ  Ｈ活性」という）を有している。
【０００３】
かかる逆転写酵素は、前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していることから、例えば、生体で発現しているタンパク質のアミノ酸配列を直接反映しているｍＲＮＡの塩基配列の解析、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ＲＴ−ＰＣＲなどの用途に用いられている。かかる用途には、従来、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素が用いられている。
【０００４】
また、ｍＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が前記二次構造によって妨げられることから、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが望まれる。しかしながら、前記モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素野生型逆転写酵素は、熱安定性が低く、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制されるような温度では、失活してしまうことがある。そこで、耐熱性を向上させた逆転写酵素が提案されている（例えば、特許文献１および非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００４−５１１２１１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】バハラム・アレジ（Ｂａｈｒａｍ  Ａｒｅｚｉ）ら、「モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の新たな変異は、テンプレート−プライマーへの強力な結合を介して熱安定性を増加させる（Ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｉｇｈｔｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｐｒｉｍｅｒ）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００９年発行（オンライン公開日２００８年１２月４日）、第３７巻、ｐｐ．４７３−４８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、より高い熱安定性を有し、汎用性の高い逆転写反応を行なうことができる逆転写酵素が求められている。
【０００８】
本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、熱安定性が高く、汎用性が高い変異型逆転写酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる、核酸および前記変異型逆転写酵素の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、汎用性が高い逆転写反応キットおよび検出キットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、核酸関連酵素の熱安定性を大きく向上させることができる核酸関連酵素の熱安定性の向上方法を提供することを目的とする。また、本発明は、汎用性が高く、効率よく逆転写反応を行なうことができる逆転写方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
〔１〕  配列番号：２に示されるアミノ酸配列および前記配列番号：２に示される配列からなる逆転写酵素のオルソログのアミノ酸配列のいずれかからなる野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中の１２４位のアスパラギン酸残基および２８６位のグルタミン酸残基の少なくとも１つに対応するアミノ酸残基の正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基への置換を有しており、
前記ＤＮＡ相互作用領域において、式（Ｉ）：
（＋１×ｋ）＋（＋１×ｒ）＋（−１×ｄ）＋（−１×ｅ）        （Ｉ）
（式中、ｋはリジン残基の数、ｒはアルギニン残基の数、ｄはアスパラギン酸残基の数、およびｅはグルタミン酸残基の数を示す、）
で表される実効電荷の大きさが＋１１〜＋１３であり、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素、
〔２〕  配列番号：２に示されるアミノ酸配列または前記配列番号：２に示される配列からなる逆転写酵素のオルソログのアミノ酸配列において、配列番号：２中のアミノ酸残基：
６９位のグルタミン酸残基、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、３０２位のグルタミン酸残基、３１３位のトリプトファン残基、４３５位のロイシン残基および４５４位のアスパラギン残基
の少なくとも１つに対応する残基が、さらに、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており（ただし、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニン残基への置換を除く）、かつ
逆転写酵素活性を示す、前記〔１〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔３〕  配列番号：２に示されるアミノ酸配列または前記配列番号：２に示される配列からなる逆転写酵素のオルソログのアミノ酸配列において、
配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換の少なくとも１つの置換を有し、かつ
配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
配列番号：２の６９位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
配列番号：２の３１３位のトリプトファン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
配列番号：２の４５４位のアスパラギン残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、前記〔２〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔４〕  （Ｉ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列または前記配列番号：２に示される配列からなる逆転写酵素のオルソログのアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ−１）〜（ｃ−１）：
（ａ−１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
（ｂ−１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
（ｃ−１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、または
（ＩＩ）前記（Ｉ）のアミノ酸配列において、（ｄ−１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、前記〔３〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔５〕  前記（Ｉ）または（ＩＩ）のアミノ酸配列において、
（ｅ−１）配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、前記〔４〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔６〕  （Ａ）配列番号：２に示されるアミノ酸配列または前記配列番号：２に示される配列からなる逆転写酵素のオルソログのアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有するアミノ酸配列、および
（Ｂ）配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が９５％以上であるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写酵素活性を示す、前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、
〔７〕  前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸、
〔８〕  前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
前記〔７〕に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む、変異型逆転写酵素の製造方法、
〔９〕  前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法、
〔１０〕  逆転写反応を行なうためのキットであって、
前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット、ならびに
〔１１〕  生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、
前記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の変異型逆転写酵素は、熱安定性が高く、汎用性が高いという優れた性質を有する。また、本発明の核酸および本発明の変異型逆転写酵素の製造方法によれば、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる。また、本発明の逆転写反応キットおよび検出キットは、汎用性が高いという優れた性質を有する。さらに、本発明の核酸関連酵素の熱安定性の向上方法によれば、核酸関連酵素の熱安定性を大きく向上させることができる。また、本発明の逆転写方法は、汎用性が高く、当該方法によれば、効率よく逆転写反応を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】製造例２で選択された置換対象のアミノ酸残基の野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素中における局在位置を示すリボンモデル図である。
【図２】試験例１において、アミノ酸残基の置換の種類と残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図３】試験例２において、多重変異体の種類と残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図４】試験例４において、インキュベーション時間とｌｎ［残存活性（％）］との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図５】試験例４において、温度とｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図６】試験例５において、電気泳動を行なった結果を示す図面代用写真である。
【図７】試験例６において、多重変異体の種類とテンプレートプライマー存在下での多重変異体の残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者らは、逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基を導入して導入前の逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも正の実効電荷を大きくすることにより、逆転写酵素の熱安定性が大きく向上することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【００１３】
１．変異型逆転写酵素
本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有しており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴としている。
【００１４】
本発明の変異型逆転写酵素は、前記ＤＮＡ相互作用領域を有するので、高い熱安定性を発現する。そのため、本発明の変異型逆転写酵素によれば、高い反応温度でも逆転写反応を行なうことができるので、ＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合であっても、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。したがって、当該変異型逆転写酵素によれば、汎用性の高い逆転写反応を行なうことができる。
【００１５】
なお、本明細書において、「野生型逆転写酵素」とは、人為的に変異が導入されていない逆転写酵素をいう（以下、「ＷＴＲＴ」ともいう）。前記ＷＴＲＴとしては、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる逆転写酵素などが挙げられる。ここで、「配列番号：２に対応するアミノ酸配列」とは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）および前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる逆転写酵素のオルソログ（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素など）のアミノ酸配列をいう。
【００１６】
また、本明細書において、「変異型逆転写酵素」とは、人為的に変異が導入された逆転写酵素をいう。さらに、「モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素」を、「ＭＭＬＶ逆転写酵素」と表すこともある。
【００１７】
さらに、本明細書において、「ＤＮＡ相互作用領域」とは、逆転写酵素中において、ＤＮＡとの間で相互作用を生じるアミノ酸残基が局在する領域をいう。
【００１８】
また、本明細書において、「野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する」とは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨ６．０〜９．５）において、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域の正の実効電荷よりも大きいことを意味する。
【００１９】
実効電荷の大きさは、例えば、正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「−１」とした場合、ＤＮＡ相互作用領域中のリジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの数に基づいて、式（Ｉ）：
【００２０】
実効電荷の大きさのスコア
＝（＋１×ｋ）＋（＋１×ｒ）＋（−１×ｄ）＋（−１×ｅ）          （Ｉ）
【００２１】
（式中、ｋはリジン残基の数、ｒはアルギニン残基の数、ｄはアスパラギン酸残基の数、およびｅはグルタミン酸残基の数を示す。）
を用いて算出することができる。
【００２２】
本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域には、前記式（Ｉ）を用いて算出された実効電荷の大きさのスコアが野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷のスコア（＋７）よりも大きくなるように、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基が局在していることが望ましい。本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさのスコアは、高い熱安定性を確保し、かつ高い比活性を確保する観点から、通常、＋８〜＋１３、好ましくは＋９〜＋１３、より好ましくは＋１１〜＋１３であればよい。
【００２３】
前記正電荷アミノ酸残基としては、例えば、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基などが挙げられる。これらのなかでは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨ６．０〜９．５）において、正に荷電しており、かかるｐＨ条件下で高い熱安定性を確保することができることから、好ましくはアルギニン残基およびリジン残基である。
【００２４】
前記非極性アミノ酸残基としては、例えば、アラニン残基、グリシン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、システイン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基などが挙げられる。これらのなかでは、側鎖のサイズが小さく、かつ置換によりもたらされる形状の変化が小さいと考えられていることから、好ましくはアラニン残基である。
【００２５】
前記逆転写酵素活性は、下記ステップ（１）〜（６）を行なうことによって測定することができる。
（１）  反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15（ｐ（ｄＴ）15換算濃度）、および０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ〕中で逆転写酵素を３７℃でインキュベーションするステップ、
（２）  前記ステップ（１）で得られた産物２０μＬを採取し、ガラスフィルターにスポットするステップ、
（３）  前記ステップ（２）後のガラスフィルターを、冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄する操作を３回繰り返して、前記ガラスフィルター上の産物からポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去するステップ、
（４）  前記ステップ（３）後のガラスフィルターを乾燥させた後、前記ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントするステップ、
（５）  前記ステップ（４）で得られた放射活性に基づいて、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（以下、「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出するステップ、および
（６）  前記ステップ（５）で算出されたｄＴＴＰ取り込み量に基づいて、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量を求めるステップ。
【００２６】
本発明においては、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、ＷＴＲＴが、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなり、ＷＴＲＴのＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が、配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域（以下、「領域T24-P474」ともいう）中に局在するアミノ酸残基であることが好ましい。前記領域T24-P474のなかでは、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、配列番号：２の６０位のセリン残基〜８４位のグルタミン残基に対応する領域（以下、「領域S60-Q84」ともいう）、９５位のアスパラギン残基〜１５７位のシステイン残基に対応する領域（以下、「領域N95-C157」ともいう）、１９０位のグルタミン残基〜１９４位のアスパラギン残基に対応する領域（以下、「領域Q190-N194」ともいう）、２２０位のロイシン残基〜２３３位のグルタミン酸残基に対応する領域（以下、「領域L220-E233」ともいう）、２５７位のリジン残基〜２７５位のグルタミン酸残基に対応する領域（以下、「領域K257-E275」ともいう）、２８０位のロイシン残基〜２８７位のスレオニン残基に対応する領域（以下、「領域L280-T287」ともいう）、３０１位のアルギニン残基〜３３３位のロイシン残基に対応する領域（以下、「領域R301-L333」ともいう）、３５４位のアラニン残基〜３７３位のリジン残基に対応する領域（以下、「領域A354-K373」ともいう）、３９４位のチロシン残基〜４３６位のアラニン残基に対応する領域（以下、「領域Y394-A436」ともいう）および４５３位のセリン残基〜４６２位のアラニン残基に対応する領域（以下、「領域S453-A462」ともいう）が好ましい。
【００２７】
また、本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の目的を妨げない範囲で、
（Ａ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有するアミノ酸配列、および
（Ｂ）配列番号：２の２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写酵素活性を示す酵素であってもよい。
【００２８】
「１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加」は、逆転写酵素活性を示すポリペプチドが得られる範囲の個数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を意味する。「１または数個」とは、具体的には、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜３個をいう。
【００２９】
前記配列同一性は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  １）、Ｅｘｐｅｃｔ  １０、Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ  ３の条件でアラインメントして算出した値として、８０％以上であり、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。
【００３０】
本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を確保する観点から、前記領域T24-P474に局在するアミノ酸残基のうちの負電荷アミノ酸残基の少なくともいずれかが、前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されていることが好ましい。
【００３１】
前記負電荷アミノ酸残基としては、例えば、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基が挙げられる。かかる負電荷アミノ酸残基は、ＷＴＲＴのアミノ酸配列において、当該負電荷アミノ酸残基が前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されたポリペプチドが逆転写酵素活性を発現することができるのであれば、形状の変化をもたらす位置に存在する残基であってもよい。
【００３２】
本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、前記負電荷アミノ酸残基として、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の少なくとも２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基が、前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
【００３３】
また、本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の目的を妨げない範囲で、前記領域T24-P474に局在するアミノ酸残基のうち、２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基以外の負電荷アミノ酸残基および／または他のアミノ酸残基が、前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されていてもよい。本発明の変異型逆転写酵素は、具体的には、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２中のアミノ酸残基：６９位のグルタミン酸残基、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基、３０２位のグルタミン酸残基、３１３位のトリプトファン残基、４３５位のロイシン残基および４５４位のアスパラギン残基の少なくとも１つに対応する残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ逆転写酵素活性を示す酵素であってもよい。なお、この場合、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニンへの置換は、ＷＴＲＴよりも熱安定性を向上させることができるが、より高い熱安定性を確保する観点から、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニンへの置換は除かれる。
【００３４】
本発明の変異型逆転写酵素は、より高い熱安定性を確保する観点から、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ）〜（ｉ）：
（ａ）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
（ｃ）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｄ）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｅ）配列番号：２の６９位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｆ）配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｇ）配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
（ｈ）配列番号：２の３１３位のトリプトファン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｉ）配列番号：２の４５４位のアスパラギン残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
【００３５】
本発明の変異型逆転写酵素は、前記（ａ）〜（ｉ）のアミノ酸残基の置換のなかから選択された１つの変異を有する場合（すなわち、単独変異体である場合）、より高い熱安定性を確保する観点から、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、
（ａ−１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
（ｂ−１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
（ｃ−１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、および
（ｄ−１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
のいずれかを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
【００３６】
本発明の変異型逆転写酵素は、前記（ａ）〜（ｉ）のアミノ酸残基の置換のなかから選択された複数種の変異を有する場合（すなわち、多重変異体である場合）、より高い熱安定性を確保する観点から、
（Ｉ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ−１）〜（ｃ−１）：
（ａ−１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
（ｂ−１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
（ｃ−１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、または
（ＩＩ）前記（Ｉ）のアミノ酸配列において、（ｄ−１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
【００３７】
なお、逆転写酵素として、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有しない逆転写酵素が望まれる場合、本発明の変異型逆転写酵素は、前記（Ｉ）または（ＩＩ）のアミノ酸配列において、（ｅ−１）配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示すものであればよい。
【００３８】
２．変異型逆転写酵素をコードする核酸
本発明の核酸は、本発明の変異型逆転写酵素をコードする核酸である。本発明の核酸は、前記変異型逆転写酵素をコードしているため、当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる。
【００３９】
核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の核酸は、例えば、ＷＴＲＴをコードする核酸に対して、ＷＴＲＴのＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
【００４１】
核酸への部位特異的変異の導入は、例えば、ＷＴＲＴのＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように設計されたプライマーを用いたＰＣＲなどにより行なうことができる。
【００４２】
３．変異型逆転写酵素の製造方法
本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の核酸を用いて当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより得ることができる。本発明には、かかる変異型逆転写酵素の製造方法も包含される。
【００４３】
本発明の製造方法は、前述した変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（ｉ）  本発明の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（ｉｉ）  前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む方法である。
【００４４】
まず、本発明の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る〔「工程（ｉ）」〕。
【００４５】
前記核酸を保持する細胞は、例えば、前記核酸を含む遺伝子導入用担体を用いて宿主細胞を形質転換することなどにより得られる。
【００４６】
前記宿主細胞としては、例えば、大腸菌などの細菌の細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのなかでは、変異型逆転写酵素の精製が容易であり、変異型逆転写酵素を大量に生産することができることから、好ましくは細菌の細胞、より好ましくは大腸菌の細胞である。前記大腸菌の細胞としては、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００４７】
前記遺伝子導入用担体は、生物担体であってもよく、非生物担体であってもよい。生物担体としては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどのベクターが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、非生物担体としては、例えば、金粒子、デキストラン、リポソームなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる遺伝子導入用担体は、用いられる宿主細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、遺伝子導入用担体として、プラスミドベクターまたはファージベクターを用いることができる。宿主細胞が大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）である場合、ｐＥＴ系プラスミドベクターを用いることができる。この場合、変異型逆転写酵素を大量に発現させることができ、しかも変異型逆転写酵素を容易に精製することができる。
【００４８】
前記ベクターは、変異型逆転写酵素の精製をより容易にするためのエレメント、例えば、細胞外分泌シグナル、Ｈｉｓタグなどを含有していてもよい。
【００４９】
前記遺伝子導入用担体が、前記生物担体であるプラスミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターである場合、当該遺伝子導入用担体は、プラスミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターのクローニングサイトに前記核酸を挿入し、プロモーターの制御下に作動可能に連結させることにより作製することができる。なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、核酸によりコードされるポリペプチドの発現が、プロモーターなどのエレメントによる制御下に生物学的活性を示す状態で発現するように連結されていることを意味する。
【００５０】
一方、前記遺伝子導入用担体が、前記非生物担体である場合、当該遺伝子導入用担体は、必要に応じて、前記核酸を、プロモーターの制御下に作動可能に連結させて得られた核酸構築物を、当該非生物担体に担持させることにより作製することができる。なお、かかる核酸構築物は、複製開始起点、ターミネーターなどの遺伝子の発現に必要なエレメントを適宜含有してもよい。
【００５１】
形質転換は、用いられた遺伝子導入用担体の種類に応じた形質転換法で行なうことができる。かかる形質転換法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、パーティクルガン法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
【００５２】
前記工程（ｉ）において、前記核酸を保持する細胞の培養条件は、用いられた宿主細胞の種類などに応じて適宜設定することができる。前記核酸が誘導可能なプロモーターの制御下に作動可能に連結されている場合、かかるプロモーターの種類に応じた発現誘導条件下に、前記核酸を保持する細胞を培養すればよい。
【００５３】
つぎに、前記工程（ｉ）で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する〔「工程（ｉｉ）」〕。
【００５４】
変異型逆転写酵素が細胞内に蓄積される場合、工程（ｉｉ）において、培養物を遠心分離などに供して細胞を回収し、細胞から変異型逆転写酵素を単離すればよい。この場合、例えば、前記細胞を超音波破砕法、溶菌法、凍結破砕法などによって破砕し、得られた細胞抽出液を遠心分離、超遠心分離、限外濾過、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどに供することにより、変異型逆転写酵素を単離することができる。
【００５５】
一方、変異型逆転写酵素が細胞外に分泌される場合、培養物を遠心分離や濾過などに供して培養上清を回収し、培養上清から変異型逆転写酵素を単離すればよい。
【００５６】
４．逆転写方法
本発明の逆転写方法は、本発明の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴としている。本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素の熱安定性と比べて高い熱安定性を有している。そのため、本発明の逆転写方法によれば、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲で逆転写反応を行なうことができる。したがって、本発明の逆転写方法は、ＲＮＡの種類によらず、逆転写反応を効率よく行なうことができ、汎用性が高い。
【００５７】
本発明の逆転写方法では、前記変異型逆転写酵素と、ＲＮＡと、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを、逆転写反応用緩衝液中でインキュベーションすることにより逆転写反応を行なうことができる。
【００５８】
逆転写反応における反応温度は、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などによって異なるため、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡがＷＴに適した反応温度で二次構造を形成しにくいＲＮＡである場合、３７〜４５℃となるように設定することができる。また、前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡがＷＴに適した反応温度で二次構造を形成しやすいＲＮＡである場合、ＷＴに適した反応温度よりも高い温度、例えば、４５〜６０℃となるように設定することができる。
【００５９】
逆転写反応の際の反応系中における逆転写酵素の濃度は、本発明の逆転写方法の用途に応じて異なるため、前記用途に応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写酵素の濃度は、通常、好ましくは０．００１〜０．１μＭである。
【００６０】
逆転写反応の際の反応系中におけるオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、通常、好ましくは０．１〜１０μＭである。
【００６１】
逆転写反応の際の反応系中における４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて異なるため、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて適宜設定することが好ましい。前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、通常、好ましくは０．０１〜１μＭである。
【００６２】
前記逆転写反応用緩衝液は、用いられる変異型逆転写酵素の種類に応じて、適宜選択することができる。前記逆転写反応用緩衝液は、２価の陽イオン、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどを含有してもよい。また、前記逆転写反応用緩衝液は、本発明の目的を妨げない範囲で、必要に応じて、還元剤（例えば、ジチオスレイトールなど）、安定化剤（例えば、グリセロール、トレハロースなど）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなど）などの成分を含有していてもよい。
【００６３】
前記逆転写反応用緩衝液中における２価の陽イオンの濃度は、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なるため、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記２価の陽イオンの濃度は、通常、１〜３０ｍＭである。
【００６４】
前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なるため、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、通常、６．０〜９．５である。
【００６５】
５．逆転写反応キット
本発明の逆転写反応キットは、逆転写反応を行なうためのキットであって、本発明の変異型逆転写酵素を含有することを特徴としている。本発明の逆転写反応キットは、高い熱安定性を有する本発明の変異型逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の逆転写反応キットは、ＲＮＡの種類によらず、逆転写反応を効率よく行なうことができるので、汎用性が高い。
【００６６】
本発明の逆転写反応キットは、前記変異型逆転写酵素に加えて、逆転写反応を行なうのに必要な試薬を含有していてもよい。かかる試薬としては、例えば、逆転写反応のテンプレートとして用いられるＲＮＡ、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒などが挙げられる。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
【００６７】
本発明の逆転写反応キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液としては、前記変異型逆転写酵素のｐＨ安定性に応じたｐＨを有する緩衝液が挙げられる。
【００６８】
また、前記逆転写反応を行なうのに必要な試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、前記試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。これにより、ユーザーが、各試薬を逆転写反応に適した量となるように混合する必要がなくなるので、取り扱いが容易である。
【００６９】
６．検出キット
本発明の検出キットは、生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、前記変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴としている。本発明の検出キットは、高い熱安定性を有する前記変異型逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の検出キットは、種々の試料に対して用いることができ、汎用性が高い。
【００７０】
前記マーカーとしては、生体中に含まれるウイルスまたは細菌に特有の塩基配列、疾患に特有の塩基配列を有するＲＮＡなどが挙げられる。なお、本明細書において、「ウイルスまたは細菌に特有の塩基配列」とは、ウイルスまたは細菌には存在するが、生体には存在しない塩基配列をいう。また、「疾患に特有の塩基配列」とは、疾患に罹患した生体には存在するが、疾患に罹患していない正常な生体には存在しない塩基配列をいう。
【００７１】
前記ウイルスとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＰＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ノロウイルス、ウエストナイルウイルスなどが挙げられる。また、前記細菌としては、例えば、食中毒の原因となるバチルス・セレウス、サルモネラ、腸管出血性大腸菌、ビブリオ、カンピロバクター、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などが挙げられる。前記疾患としては、癌、糖尿病、心臓病、高血圧、感染症などが挙げられる。
【００７２】
前記マーカーの検出用試薬としては、例えば、前記マーカーとなるＲＮＡに相補的であり、かつ蛍光物質または放射性物質が結合したプローブ、二本鎖核酸に特異的にインターカレートする蛍光物質（例えば、エチジウムブロマイドなど）などが挙げられる。
【００７３】
本発明の検出キットは、前記変異型逆転写酵素および前記マーカーの検出用試薬に加えて、例えば、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒、陽性標準となるＲＮＡ、陰性標準となるＲＮＡなどを含有していてもよい。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
【００７４】
本発明の検出キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液は、前記逆転写反応キットにおける保存用緩衝液と同様である。
【００７５】
また、前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液などの試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、かかる試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、前記逆転写反応キットの場合と同様の観点から、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。
【００７６】
７．核酸関連酵素の熱安定性の向上方法
本発明の核酸関連酵素の熱安定性の向上方法は、核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有する核酸関連酵素の熱安定性を向上させる方法であって、
野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の前記核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対して、前記核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる変異を導入して、前記野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する核酸相互作用領域を形成させることを特徴としている。
【００７７】
核酸関連酵素は、核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有している。したがって、本発明の変異型逆転写酵素の場合と同様に、核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることが期待される。
【００７８】
前記核酸関連酵素は、核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有する酵素であればよい。前記核酸関連酵素としては、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼなどが挙げられる。なかでも、熱安定性をより一層向上させることができることから、逆転写酵素が好ましい。
【００７９】
野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対する前記変異の導入は、野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように設計されたプライマーを用いたＰＣＲなどにより行なうことができる。
【００８０】
なお、変異の対象となるアミノ酸残基の位置は、核酸関連酵素の種類に応じて異なるが、核酸関連酵素の核酸相互作用領域中において、核酸のリン酸基と近接し、かつ核酸関連酵素の活性を妨げる形状の変化をもたらさないアミノ酸残基の位置、逆転写酵素の負電荷を有するアミノ酸残基と近接し、かつ核酸関連酵素の活性を妨げる形状の変化をもたらさないアミノ酸残基の位置などが挙げられる。
【００８１】
熱安定性が向上した核酸関連酵素は、変異が導入された核酸を用い、前記変異型逆転写酵素の製造方法と同様の手法により製造することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
【００８３】
（製造例１）
野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（以下、単に、「ＷＴ」ともいう）をコードするＤＮＡ（配列番号：１）をｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドに挿入して、発現プラスミドｐＥＴ−ＭＲＴを得た。
【００８４】
得られたプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。得られた細胞を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス中、３０℃で培養して、形質転換細胞を得た。
【００８５】
つぎに、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス３ｍＬに、形質転換細胞を播種し、振盪しながら３０℃で１６時間インキュベーションした。その後、前記形質転換細胞を自動誘導システム〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製、商品名：Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ〕で培養することにより、タンパク質を発現させた。
【００８６】
得られた培養物に、タンパク質精製システム〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＨｉｓＬｉｎｋ  Ｓｐｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ〕に含まれる菌体溶解用試薬〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＦａｓｔＢｒｅａｋ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ〕を添加して前記形質転換細胞を溶解させた。つぎに、得られた溶解物に、前記タンパク質精製システムに含まれるタンパク質精製用レジン〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＨｉｓＬｉｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ〕を添加した。
【００８７】
その後、前記レジンを含む溶解物をカラム〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＨｉｓＬｉｎｋ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ〕に移した。その後、カラム中のレジンを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。つぎに、溶出緩衝液〔組成、１００ｍＭヘペス−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５００ｍＭイミダゾール〕０．２ｍＬを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出し、ＷＴを含む画分を回収した。
【００８８】
得られたＷＴは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【００８９】
なお、ＷＴのＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさは、正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「−１」とし、前記式（Ｉ）にしたがって算出した場合、＋７である。
【００９０】
（製造例２）
（１）変異のデザイン
ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域）中の負電荷アミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基（リジン残基もしくはアルギニン残基）または非極性アミノ酸残基（アラニン残基）に置換するために、部位特異的変異用プライマーをデザインした。
【００９１】
置換対象のアミノ酸残基（負電荷アミノ酸残基）として、前記領域のｆｉｎｇｅｒｓドメインに局在する７つの残基（Ｇｌｕ６９、Ｇｌｎ８４、Ａｓｐ１０８、Ａｓｐ１１４、Ｇｌｕ１１７、Ｇｌｕ１２３およびＡｓｐ１２４）、ｔｈｕｍｂドメインに局在する３つの残基（Ｇｌｕ２８６、Ｇｌｕ３０２およびＴｒｐ３１３）およびｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎドメインに局在する２つの残基（Ｌｅｕ４３５およびＡｓｎ４５４）を選択した。製造例２で選択された置換対象のアミノ酸残基の野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素中における局在位置を図１に示す。
【００９２】
前記部位特異的変異用プライマーは、表１に示されるアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーである。
【００９３】
【表１】
2016136970.tif 000002
【００９４】
（２）ＭＭＬＶ逆転写酵素の単独変異体の調製
前記ｐＥＴ−ＭＲＴと、部位特異的変異用プライマーと、部位特異的変異用キット〔ストラタジーン(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)社製、商品名：ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅTM  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ〕とを用い、ｐＥＴ−ＭＲＴ上のＷＴをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入した。なお、得られた変異体発現用プラスミドに含まれるＤＮＡに変異が導入されたかどうかを、ＤＮＡシークエンサー〔（株）島津製作所製、商品名：ＤＳＱ−２０００〕によって確認した。
【００９５】
つぎに、製造例１において、ｐＥＴ−ＭＲＴの代わりに、前記変異体発現用プラスミドを用いたことを除き、製造例１と同様の操作を行ない、実験番号：１〜３６の単独変異体を得た。得られた単独変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、いずれも、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【００９６】
（試験例１）
インキュベーション用溶液〔組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００および１０体積％グリセロール〕中、製造例１で得られたＷＴ（１００ｎＭ）または製造例２で得られた単独変異体（１００ｎＭ）を２８μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15の存在下または非存在下に５０℃で１５分間インキュベーションして熱処理を行なった。その後、前記ＷＴまたは前記単独変異体を氷上で３０〜６０分間インキュベーションした。
【００９７】
つぎに、反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕、０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕〕中、１０ｎＭ  ＷＴまたは単独変異体を３７℃でインキュベーションした。
【００９８】
一定時間（２．５、５．０または７．５分間）インキュベーション後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、冷却した５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した。その後、前記ガラスフィルターを、冷却した９５体積％エタノール水溶液で洗浄した。これにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回繰り返した。また、エタノール水溶液による洗浄は１回繰り返した。
【００９９】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいて、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出した。
【０１００】
前記ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて、初期反応速度を算出した。つぎに、熱処理を行なっていない場合の初期反応速度（「初期反応速度Ａ」という）と、熱処理を行なった場合の初期反応速度（「初期反応速度Ｂ」という）とから、残存活性を算出した。前記残存活性は、式（ＩＩ）：
【０１０１】
残存活性（％）＝（初期反応速度Ｂ／初期反応速度Ａ）×１００    （ＩＩ）
【０１０２】
を用いて算出した。
【０１０３】
既知量のウシ血清アルブミンの標品と、タンパク質定量試薬〔ナカライテスク（株）製、商品名：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  ＣＢＢ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ〕とを用いてブラッドフォード法に準じて作成された検量線に基づいて、ＷＴおよび実験番号：１〜３６の単独変異体それぞれの量を調べた。つぎに、熱処理を行なっていない場合のＷＴおよび実験番号：１〜３６の単独変異体それぞれのｄＴＴＰ取り込み量に基づいて、逆転写酵素活性を測定した。なお、逆転写酵素活性における１ユニットは、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量として定義した。その後、ＷＴおよび実験番号：１〜３６の逆転写酵素活性それぞれと、ＷＴおよび実験番号：１〜３６の単独変異体それぞれの量とから、比活性を算出した。
【０１０４】
前記ＷＴおよび実験番号：１〜３６の単独変異体それぞれの残存活性および比活性に基づいて、置換対象のアミノ酸残基が、部位特異的変異を導入することによってＷＴよりも高い熱安定性をもたらす残基であるかどうかを評価した。評価基準を表２に示し、その評価結果を表３に示す。また、試験例１において、アミノ酸残基の置換の種類と残存活性との関係を調べた結果を図２に示す。図２には、ＷＴおよび単独変異体の代表例の残存活性を示す。
【０１０５】
【表２】
2016136970.tif 000003
【０１０６】
【表３】
2016136970.tif 000004
【０１０７】
表３に示された結果から、置換対象のアミノ酸残基のうち、Ｅ６９、Ｄ１０８、Ｅ１１７、Ｄ１２４、Ｅ２８６、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５またはＮ４５４に部位特異的変異が導入された単独変異体の残存活性が、ＷＴの残存活性と比べて高いことがわかる。したがって、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、Ｅ６９、Ｄ１０８、Ｅ１１７、Ｄ１２４、Ｅ２８６、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５またはＮ４５４に対応するアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、ＷＴと比べて、熱安定性を向上させることができることがわかる。
【０１０８】
さらに、図２に示された結果から、Ｅ２８６に部位特異的変異が導入された３種類の単独変異体のうち２つの単独変異体それぞれの残存活性が１５％を超えていることがわかる。また、Ｄ１２４に部位特異的変異が導入された３種類の単独変異体のうち２種類の単独変異体それぞれの残存活性が１５％を超えていることがわかる。
【０１０９】
これらの結果から、ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、アミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる変異を導入することにより、高い熱安定性を確保することができる確率が高いことがわかる。
【０１１０】
（実施例１）
試験例１で評価された置換対象のアミノ酸残基のなかから、評価がＡＡである置換対象のアミノ酸残基を選択した。つぎに、選択されたアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体のなかから、残存活性が高い順に、４種類の変異体（Ｅ３０２Ｋ、Ｌ４３５Ｒ、Ｄ１２４ＲおよびＥ２８６Ｒ）を選択した。
【０１１１】
製造例２において、表１に示されるアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１２】
正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「−１」とし、ＤＮＡ相互作用領域中のリジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの数に基づいて、前記式（Ｉ）を用いて、多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアを算出した。その結果、得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１３であった。
【０１１３】
（実施例２）
実施例１において、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、実施例１で選択された４種類のアミノ酸残基の置換と配列番号：２における５２４位のＡｓｐのＡｌａへの置換（Ｄ５２４Ａ）とが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、配列番号：２における５２４位のＡｓｐは、ＷＴのＲＮａｓｅ  Ｈ反応の活性部位に位置し、触媒活性に必須のアミノ酸残基である。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１４】
得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１３であった。
【０１１５】
（実施例３）
実施例１で選択された４種類のアミノ酸残基の置換のなかから、Ｅ３０２Ｋ、Ｌ４３５ＲおよびＥ２８６Ｒの３種類のアミノ酸残基の置換を選択した。つぎに、実施例１において、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、前記３種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１６】
得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
【０１１７】
（実施例４）
実施例１において、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、実施例３で選択された３種類のアミノ酸残基の置換とＤ５２４Ａとが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１１８】
得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
【０１１９】
（試験例２）
試験例１において、製造例２で得られた単独変異体の代わりに、実施例１〜４で得られた多重変異体を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行ない、残存活性を算出した。試験例２において、多重変異体の種類と残存活性との関係を調べた結果を図３に示す。図中、１は実施例１で得られた多重変異体の残存活性、２は実施例２で得られた多重変異体の残存活性、３は実施例３で得られた多重変異体の残存活性、４は実施例４で得られた多重変異体の残存活性を示す。また、図中、白バーはテンプレートプライマー非存在下での多重変異体の残存活性、黒バーはテンプレートプライマー存在下での多重変異体の残存活性を示す。
【０１２０】
図３に示された結果から、実施例１〜４それぞれで得られた多重変異体は、ＷＴと比べて、熱安定性が著しく高いことがわかる。したがって、ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、少なくともＥ２８６を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
【０１２１】
また、実施例１〜４それぞれで得られた多重変異体の前記領域の実効電荷の大きさのスコアは、＋１１〜＋１３であり、ＷＴの前記領域の実効電荷の大きさのスコア（＋７）よりも大きい。したがって、かかる結果から、ＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさのスコアが、ＷＴのＤＮＡ相互作用領域における実効電荷よりも大きくなるように、ＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換し、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基をＤＮＡ相互作用領域に局在させることにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
【０１２２】
（試験例３）
反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、０〜２５μＭの範囲の濃度のポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕、０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕〕中、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体またはＷＴ（比較例１）（５ｎＭ）を３７℃でインキュベーションした。
【０１２３】
一定時間（２．５、５．０または７．５分間）インキュベーション後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、冷却した５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した。その後、前記ガラスフィルターを、冷却した９５体積％エタノール水溶液で洗浄した。これにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回繰り返した。また、エタノール水溶液による洗浄は１回繰り返した。
【０１２４】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいて、ｄＴＴＰ取り込み量を算出した。前記ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて、初期反応速度を算出した。
【０１２５】
つぎに、基質〔ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〕濃度、初期反応速度およびグラフ作成ソフトウェア〔シナジー・ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）製、商品名：Ｋａｌｅｉｄａ  Ｇｒａｐｈ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５〕を用い、ミカエリス−メンテンの速度式に基づいて非線形最小２乗回帰法にしたがって、ｋcat値、Ｋm値およびｋcat／Ｋm値を算出した。実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴ（比較例１）それぞれのｋcat値、Ｋm値およびｋcat／Ｋm値を表４に示す。
【０１２６】
【表４】
2016136970.tif 000005
【０１２７】
表４に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体のＫm値は、それぞれ、ＷＴのＫm値の３０％および４０％であることがわかる。これらの結果から、テンプレートプライマーに対する実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体の親和性が、テンプレートプライマーに対するＷＴの親和性よりも高いことが示唆される。
【０１２８】
一方、表４に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体のそれぞれのｋcat値は、それぞれ、ＷＴのｋcat値の４０％および５０％であることがわかる。
【０１２９】
さらに、表４に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体のｋcat／Ｋm値は、ＷＴのｋcat／Ｋm値の１７０％および１３０％であることがわかる。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体の触媒効率は、ＷＴの触媒効率よりも高いことが示唆される。
【０１３０】
（試験例４）
インキュベーション用溶液〔組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００、１０体積％グリセロール〕中、実施例３で得られた多重変異体または実施例４で得られた多重変異体（１００ｎＭ）を２８μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15の存在下に５２〜５８℃で一定時間（１、２、５、１０または１５分間）インキュベーションして熱処理を行ない、その後、氷上で３０〜６０分間インキュベーションした。
【０１３１】
一方、前記インキュベーション用溶液中、ＷＴ（比較例１）を２８μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15の存在下に４８〜５２℃で一定時間（１、２、５、１０または１５分間）インキュベーションして熱処理を行ない、その後、氷上で３０〜６０分間インキュベーションした。
【０１３２】
つぎに、反応液［組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕、０．２ｍＭ  ［メチル−3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕］中、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体またはＷＴ（比較例）（１０ｎＭ）を３７℃でインキュベーションした。
【０１３３】
一定時間（２．５、５．０または７．５分間）インキュベーション後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、冷却した５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した。その後、前記ガラスフィルターを、冷却した９５体積％エタノール水溶液で洗浄した。これにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回繰り返した。また、エタノール水溶液による洗浄は１回繰り返した。
【０１３４】
その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ  Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいて、ｄＴＴＰ取り込み量を算出した。
【０１３５】
前記ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて、初期反応速度を算出した。つぎに、熱処理を行なっていない場合の初期反応速度（「初期反応速度ａ」という）と、熱処理を行なった場合の初期反応速度（「初期反応速度ｂ」という）とから、残存活性を算出した。前記残存活性は、式（ＩＩＩ）：
【０１３６】
残存活性（％）＝（初期反応速度ｂ／初期反応速度ａ）×１００  （ＩＩＩ）
【０１３７】
を用いて算出した。つぎに、熱処理におけるインキュベーション時間（熱処理時間）に対する残存活性の対数値をプロットした。つぎに、式（ＩＶ）：
【０１３８】
ｌｎ［Ｂ］＝Ａ−ｋobsｔ        （ＩＶ）
【０１３９】
（式中、Ａは定数項を示し、Ｂは残存活性(%)を示し、ｔは熱処理時間を示す）
に基づいて熱不活性化一次速度定数ｋobsを決定した。
【０１４０】
また、熱処理における温度に対するｋobsの対数値をプロットした。つぎに、式（Ｖ）：
【０１４１】
ｌｎ（ｋobs）＝Ａ−（Ｅa／Ｒ）（ｌ／Ｔ）              （Ｖ）
【０１４２】
（式中、Ａは定数項を示し、Ｒは気体定数（＝８．３１４Ｊ／Ｋ・ｍｏｌ）を示し、Ｔは絶対温度（Ｋ）である）
により、アレニウスプロットを用い、熱不活性化に対する活性化エネルギーＥaを決定した。アレニウスプロットにより、ｋobs値が１０分間で５０％の残存活性を与える温度としてＴ50を推定した。
【０１４３】
試験例４において、インキュベーション時間とｌｎ［残存活性（％）］との関係を調べた結果を図４に示す。なお、図４は、５２℃で熱処理を行なった場合の結果を示す。また、図中、ｌｎ［残存活性（％）］は、残存活性の自然対数値を示す。
【０１４４】
また、試験例４において、温度とｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］との関係を調べた結果を図５に示す。図中、ｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］は、ｋobsの自然対数値を示す。
【０１４５】
図４に示された結果から、ＷＴ（比較例）の残存活性は、５分間のインキュベーションで１０％未満に減少するのに対し、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体それぞれの残存活性は、ほとんど減少しないことがわかる。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体は、ＷＴよりも熱に対して安定であることがわかる。
【０１４６】
図５に示された結果に基づいて、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴそれぞれの最初の活性を１０分間のインキュベーションで５０％に減少させるのに必要な温度Ｔ50を算出した。また、図５に示された結果に基づいて、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴそれぞれの熱不活性化の活性化エネルギー（Ｅa）を算出した。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体は、ＷＴよりも安定であることがわかる。
【０１４７】
（試験例５）
ＰＣＲ用チューブに、水１２μＬと１０×逆転写酵素緩衝液〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕２μＬと、２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物１μＬと、１０μＭ  ＲＶ−Ｒ２６プライマー水溶液１μＬと、標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）１μＬと、大腸菌ＲＮＡ溶液（１．０μｇ／μＬ）１μＬと、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体またはＷＴ（比較例１）の酵素溶液〔酵素溶液に用いられた溶媒の組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM  Ｘ−１００、１０体積％グリセロール〕２μＬとを入れて混合し、反応混合液２０μＬを調製した。
【０１４８】
なお、標準ＲＮＡは、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）のｃｅｓＡ遺伝子（ジーンバンクアクセッション番号：ＤＱ３６０８２５）のＤＮＡ配列８３５３−９３６６に対応する１０１４ヌクレオチドのＲＮＡをイン・ビトロ転写により調製した。ＲＶ−Ｒ２６プライマーの塩基配列および配列番号を表５に示す。
【０１４９】
【表５】
2016136970.tif 000006
【０１５０】
得られた反応混合液を４６〜６４℃で３０分間インキュベーションし、その後、９５℃で５分間加熱した。つぎに、得られた産物３μＬと、水１８μＬと１０×ＰＣＲ緩衝液〔組成：５００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ塩化マグネシウム〕３μＬと、１０μＭ  Ｆ５プライマー水溶液１μＬと、１０μＭ  ＲＶプライマー水溶液１μＬと、２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物３μＬと、組換Ｔａｑポリメラーゼ溶液〔東洋紡（株）製、１Ｕ／μＬ〕１μＬとを混合して、ＰＣＲ用混合物３０μＬを調製した。得られたＰＣＲ用混合物を用い、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間のインキュベーションの後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なうことにより行なった。Ｆ５プライマーおよびＲＶプライマーそれぞれの塩基配列および配列番号は、表５に示されるとおりである。
【０１５１】
得られた増幅産物を、１．０質量％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド（１μｇ／ｍＬ）で染色した。試験例５において、電気泳動を行なった結果を図６に示す。
【０１５２】
図６に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体がｃＤＮＡ合成活性を示す最も高い温度は、６０℃であり、ＷＴ（比較例１）がｃＤＮＡ合成活性を示す最も高い温度は、５４℃であることがわかる。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体は、ＷＴよりも高い温度でｃＤＮＡ合成活性を示すことがわかる。
【０１５３】
（実施例５）
試験例１における評価がＡＡである置換対象のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体のなかから、Ｅ３０２Ｋを除き、残存活性が高い順に、３種類の変異体（Ｌ４３５Ｒ、Ｄ１２４ＲおよびＥ２８６Ｒ）を選択した。
【０１５４】
製造例２において、表１に示されるアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、選択された３種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、いずれも７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１５５】
得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
【０１５６】
（実施例６）
実施例５において、部位特異的変異用プライマーとして、選択された３種類のアミノ酸残基の置換と、配列番号：２における５２４位のＡｓｐのＡｌａへの置換（Ｄ５２４Ａ）とが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例５と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１５７】
得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
【０１５８】
（実施例７）
実施例５において、部位特異的変異用プライマーとして、Ｌ４３５ＲおよびＥ２８６Ｒの２種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例５と同様に操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１５９】
得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋９であった。
【０１６０】
（実施例８）
実施例５において、部位特異的変異用プライマーとして、実施例７で選択された２種類のアミノ酸残基の置換とＤ５２４Ａとが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例５と同様に操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
【０１６１】
得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋９であった。
【０１６２】
（試験例６）
試験例１において、製造例２で得られた単独変異体の代わりに、実施例５〜８で得られた多重変異体を用いたことを除き、試験例１と同様に操作を行ない、残存活性を算出した。試験例６において、多重変異体の種類とテンプレートプライマー存在下での多重変異体の残存活性との関係を調べた結果を図７に示す。図中、１は実施例５で得られた多重変異体の残存活性、２は実施例６で得られた多重変異体の残存活性、３は実施例７で得られた多重変異体の残存活性、４は実施例８で得られた多重変異体の残存活性を示す。
【０１６３】
図７に示された結果から、実施例５〜８それぞれで得られた多重変異体は、ＷＴと比べて、熱安定性が著しく高いことがわかる。したがって、ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、少なくともＥ２８６を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
【０１６４】
以上の結果から、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素におけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基〜４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、少なくともＥ２８６を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を有する変異型逆転写酵素が得られることがわかる。
【０１６５】
したがって、ＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさのスコアが、ＷＴのＤＮＡ相互作用領域における実効電荷よりも大きくなるように、ＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換し、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基をＤＮＡ相互作用領域に局在させることにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
【０１６６】
かかる変異型逆転写酵素（本発明の変異型逆転写酵素）は、高い熱安定性を有していることから、高い反応温度での反応に用いた場合であっても、高い逆転写酵素活性を発現する。そのため、本発明の変異型逆転写酵素によれば、テンプレートとして用いられるＲＮＡが二次構造を形成しやすい配列を含む場合であっても、逆転写反応の際の反応温度を高い温度に設定することで、二次構造の形成を抑制し、かつ逆転写することができる。
【０１６７】
したがって、本発明の変異型逆転写酵素は、用いられるＲＮＡ含有試料に制限されることのない汎用性の高い分析用試薬（例えば、逆転写反応キット）、ウイルス、細菌、疾患などの検出用試薬（例えば、検出キット）などとして有用であることが示唆される。
【０１６８】
なお、逆転写酵素を含む核酸関連酵素には、核酸と相互作用する核酸相互作用領域（逆転写酵素におけるＤＮＡ相互作用領域）が存在している。したがって、本発明の変異型逆転写酵素の場合と同様に、核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることが期待される。
【０１６９】
処方例
以下、逆転写反応キットおよび検出キットの例を示す。
【０１７０】
（逆転写反応キット）
−  実施例１で得られた変異型逆転写酵素
−  １０×逆転写酵素緩衝液
〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕
−  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
−  １０μＭプライマー水溶液
−  標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）
【０１７１】
（検出キット）
−  実施例１で得られた変異型逆転写酵素
−  １０×逆転写酵素緩衝液
〔組成：２５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕
−  ２．０ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物
−  １０μＭ  ＲＶ−Ｒ２６プライマー水溶液
−  標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）
−  大腸菌ＲＮＡ溶液（１．０μｇ／μＬ）
【配列表フリーテキスト】
【０１７２】
配列番号：３は、ＲＶ−Ｒ２６プライマーの配列である。
【０１７３】
配列番号：４は、Ｆ５プライマーの配列である。
【０１７４】
配列番号：５は、ＲＶプライマーの配列である。
【図３】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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