(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘモペキシン、遊離の非細胞結合胎児性ヘモグロブリン及びα-1-ミクログロブリンの子癇前症のマーカーとしての使用に関する。【解決手段】妊娠雌性体からの血漿サンプル中のヘモペキシン、並びに該当するときにはHO-1及び/又はハプトグロビンのレベルが、参照値の1/1.1より少ない場合、α-1-ミクログロブリンのレベル、並びに該当するときには遊離の非タンパク質結合胎児性ヘモグロブリンのレベル及びヘムのレベルが参照値の1.1倍より多い場合、妊娠雌性体が子癇前症を有するか又は子癇前症を発症するリスクが増大しており、ここで、参照値が、試験サンプルと同じ在胎齢の、子癇前症を患っておらず子癇前症を発症するリスクも増大していない妊娠雌性体において決定されるか、又は試験サンプルの在胎齢と相関するように調整されているバイオマーカーパネルを使用する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ)ヘモペキシン(Hpx)及びα-1-ミクログロブリン(A1M)、
ii)Hpx、A1M及び遊離HbF
から選択される子癇前症のバイオマーカーを含んでなり、必要に応じて、Hp-HbF、Hp、HO-1、ヘムから選択される１又はそれより多いバイオマーカーを更に含んでなるバイオマーカーパネル。
【請求項２】
HO-1及び/又はヘムを子癇前症のバイオマーカーとして含んでなる請求項１に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項３】
Hp-HbF及び/又はハプトグロビンを子癇前症のバイオマーカーとして更に含んでなる請求項１又は２に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項４】
子癇前症の予知又は診断に使用するため、又は子癇前症を発症するリスクを評価するための請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項５】
早発性又は遅発性の子癇前症のマーカーとして使用するための請求項４に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項６】
マーカーが妊娠雌性体の血液、血漿、血清、CSF、尿、胎盤生検、子宮液又は羊水サンプル中で測定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項７】
妊娠雌性体からの血漿サンプル中のヘモペキシン、並びに該当するときにはHO-1及び/又はハプトグロビンのレベルが、参照値の1/1.1より少ない場合、α-1-ミクログロブリンのレベル、並びに該当するときには遊離の非タンパク質結合胎児性ヘモグロブリンのレベル及びヘムのレベルが参照値の1.1倍より多い場合、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか又は子癇前症を発症するリスクが増大しており、ここで、参照値が、試験サンプルと同じ在胎齢の、子癇前症を患っておらず子癇前症を発症するリスクも増大していない妊娠雌性体において決定されるか、又は試験サンプルの在胎齢と相関するように調整されている、請求項６に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項８】
サンプルが在胎齢６〜20週の妊娠雌性体から採取される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項９】
在胎齢６〜20週に採取された妊娠雌性体の血漿サンプル中のヘモペキシンのレベルが1.0mg/mL以下であり、α-1-ミクログロブリンのレベルが15.5μg/mL以上であり、該当するときには遊離のトータル胎児性ヘモグロブリンのレベルが5.6ng/mL以上である場合に、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか又は子癇前症を発症するリスクが増大している、請求項６〜８のいずれか１項に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項１０】
在胎齢６〜20週に採取した妊娠雌性体からの血漿サンプル中のHp-HbFのレベルが0.7μg/mL以上であり、HO-1のレベルが5.0ng/mL以下であり、及び/又はヘムのレベルが60μM以上である場合に、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか又は子癇前症を発症するリスクが増大している、請求項３〜９のいずれか１項に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項１１】
サンプルが在胎齢34〜40週の妊娠雌性体から採取される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項１２】
在胎齢34〜40週に採取した妊娠雌性体からの血漿サンプル中のヘモペキシンのレベルが0.85mg/mL以下であり、α-1-ミクログロブリンのレベルが30μg/mL以上であり、該当するときには遊離の非タンパク質結合胎児性ヘモグロブリンのレベルが6.5ng/mL以上である場合に、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか又は子癇前症を発症するリスクが増大している、請求項１１に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項１３】
Hp-HbF及びHO-1がバイオマーカーとして含まれ、在胎齢34〜40週に採取した妊娠雌性体からの血漿サンプル中のHp-HbFのレベルが0.5μg/mL以下であり、遊離の非タンパク質結合胎児性HO-1のレベルが5.0ng/mL以下であり、ヘムのレベルが68μM以上である場合に、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか又は子癇前症を発症するリスクが増大している、請求項１１又は１２に記載のバイオマーカーパネル。
【請求項１４】
以下の工程：
(ａ)妊娠女性からの生物学的サンプルを取得する工程；
(ｂ)バイオマーカーパネルｉ)及びii)より選択されるバイオマーカーのレベルを測定する工程であって、ｉ)はHpx及びA1Mであり；ii)はHpx、A1M及び遊離HbFであり、ｉ)又はii)は、必要に応じて、以下のバイオマーカー：Hp-HbF、Hp、HO-1、ヘムの１又はそれより多くを更に含んでなる、工程、及び
(ｃ)測定したバイオマーカーのサンプル中のレベルを参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか若しくは有しないか、又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか若しくは増大していないかを決定する工程
を含んでなる、子癇前症を診断するため又は子癇前症の診断を補助するための方法。
【請求項１５】
(ａ)妊娠雌性哺乳動物から単離した第１の生物学的サンプル、例えば血液、尿又は血漿サンプルにおいて、バイオマーカーパネルｉ)及びii)より選択されるバイオマーカーのレベルを測定する工程であって、ｉ)はHpx及びA1Mであり；ii)はHpx、A1M及び遊離HbFであり、ｉ)又はii)は、必要に応じて、以下のバイオマーカー：Hp-HbF、Hp、HO-1、ヘムの１又はそれより多くを更に含んでなる、工程、
(ｂ)該妊娠雌性哺乳動物から後の時点で単離した第２の生物学的サンプル、例えば血液、尿、血清又は血漿サンプルにおいて、(ａ)で選択されたバイオマーカーのレベルを測定する工程；及び
(ｃ)工程(ａ)及び(ｂ)で測定した値を比較する工程であって、
ｉ)第１のサンプル中のレベルに対する、第２のサンプルにおけるA1Mレベル及び該当するときにはHbレベル、Hp-HbFレベル、ヘムレベルの増加、及び/又は
ii)第１のサンプル中のレベルに対する、第２のサンプルにおけるHpxレベル及び該当するときにはHpレベル、HO-1レベルの減少
は子癇前症の進行を示し；上記ｉ)の減少及び/又は上記ii)の増加は子癇前症の退行を示す、工程
を含んでなる、子癇前症の進行又は退行をモニターする方法。
【請求項１６】
Hpがバイオマーカーとして含まれる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
バイオマーカーの組合せが遊離HbFを更に含んでなる、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載のサンプル又は請求項１４に記載の第１のサンプルが少なくとも６週の在胎齢で採取される、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルが６〜20週又は12〜14週に採取される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルが34〜40週に採取される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
未熟の及び/又は帝王切開による出産のための予知マーカーとしての、ヘモペキシン、ハプトグロビン及び/又は遊離の非タンパク質結合胎児性ヘモグロブリン。
【請求項２２】
NICUへの収容のための胎児予知マーカーとしてのヘモペキシン、ハプトグロビン及び/又は遊離の非タンパク質結合胎児性ヘモグロブリン。
【請求項２３】
子癇前症のマーカー又は予知マーカーとして使用するためのヘモペキシン。
【請求項２４】
以下の工程：
(ａ)妊娠女性からの生物学的サンプルを取得する工程；
(ｂ)前記サンプル中のHpxレベルを測定する工程；及び
(ｃ)該サンプル中のHpxレベルを参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか若しくは有しないか、又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか若しくは増大していないかを決定する工程
を含んでなる、子癇前症の診断又は子癇前症の診断の補助のための方法。
【請求項２５】
サンプルが在胎齢６〜20週の妊娠女性から採取される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
以下の工程：
(ａ)在胎齢６〜20週の妊娠女性からび生物学的サンプルを取得する工程；
(ｂ)Hpxレベル及び必要に応じてトータルHbF及び/又はA1Mのバイオマーカーレベルを測定する工程；及び
(ｃ)測定したバイオマーカーのサンプル中のレベルを参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか若しくは有しないか、又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか若しくは増大していないかを決定する工程
を含んでなる、子癇前症の診断又は子癇前症の診断の補助のための方法。
【請求項２７】
(ａ)在胎齢６〜20週の妊娠雌性哺乳動物から単離した第１の生物学的サンプル、例えば血液、尿又は血漿サンプルにおいて、Hpxレベル及び必要に応じてトータルHbF及び/又はA1Mのバイオマーカーレベルを測定する工程
(ｂ)該妊娠雌性哺乳動物から後の時点で単離した第２の生物学的サンプル、例えば血液、尿又は血漿サンプルにおいて、Hpxレベル及び必要に応じてトータルHbF及び/又はA1Mのバイオマーカーレベルを測定する工程；及び
(ｃ)工程(ａ)及び(ｂ)で測定した値を比較する工程であって、
ｉ)第１のサンプル中のトータルHbF及び/又はA1Mレベルに対する、第２のサンプルにおけるトータルHbF及び/又はA1Mレベルの増加、及び/又は
ii)第１のサンプル中のHpxレベルに対する、第２のサンプルにおけるHpxレベルの減少
は子癇前症の進行を示し；上記ｉ)の減少及び/又は上記ii)の増加は子癇前症の退行を示す、子癇前症の進行又は退行をモニターする方法。
【請求項２８】
HpxがHO-1と共にマーカーとして使用される、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
以下の工程：
(ａ)妊娠女性からの生物学的サンプルを取得する工程；
(ｂ)前記サンプル中のA1Mレベルを測定する工程；及び
(ｃ)該サンプル中のA1Mレベルを参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか若しくは有しないか、又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか若しくは増大していないかを決定する工程
を含んでなる、子癇前症の診断又は子癇前症の診断の補助のための方法。
【請求項３０】
サンプルが在胎齢６〜20週又は34〜40週の妊娠女性から採取される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
以下の工程：
(ａ)在胎齢６〜20週の妊娠女性からの生物学的サンプルを取得する工程；
(ｂ)A1Mレベル及び必要に応じてトータルHbF及び/又はHpxのバイオマーカーレベルを測定する工程；及び
(ｃ)測定したバイオマーカーのサンプル中のレベルを参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか若しくは有しないか、又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか若しくは増大していないかを決定する工程
を含んでなる、子癇前症の診断又は子癇前症の診断の補助のための方法。
【請求項３２】
(ａ)在胎齢６〜20週又は34〜40週の妊娠雌性哺乳動物から単離した第１の生物学的サンプル、例えば血液、尿又は血漿サンプルにおいて、A1Mレベル及び必要に応じてトータルHbF及び/又はHpxのバイオマーカーレベルを測定する工程
(ｂ)該妊娠雌性哺乳動物から後の時点で単離した第２の生物学的サンプル、例えば血液、尿又は血漿サンプルにおいて、A1Mレベル及び必要に応じてトータルHbF及び/又はHpxのバイオマーカーレベルを測定する工程；及び
(ｃ)工程(ａ)及び(ｂ)で測定した値を比較する工程であって、
ｉ)第１のサンプル中のトータルHbF及び/又はA1Mレベルに対する、第２のサンプルにおけるトータルHbF及び/又はA1Mレベルの増加、及び/又は
ii)第１のサンプル中のHpxレベルに対する、第２のサンプルにおけるHpxレベルの減少
は子癇前症の進行を示し；上記ｉ)の減少及び/又は上記ii)の増加は子癇前症の退行を示す、子癇前症の進行又は退行をモニターする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、早発性(妊娠34週より前)子癇前症及び遅発性子癇前症のバイオマーカーに関する。更に、子癇前症を患う女性における胎児及び母体の転帰の予知のためのバイオマーカーを特定する。バイオマーカーは、ｉ)ヘモペキシン(Hpx)、Hpxとα-1-ミクログロブリン(A1M)との組合せ、又はiii)HpxとA1M及び遊離の循環性胎児性ヘモグロブリン(遊離HbF)との組合せである。マーカーパネルは、ハプトグロビン-胎児性ヘモグロブリン複合体(Hp-HbF)、ハプトグロビン(Hp)、ヘムオキシゲナーゼ-１(HO-1)及びヘムから選択される他のマーカーを補ってもよい。CD163及びCD163とHpxとの組合せは、胎児の転帰のマーカーであり得る。Hpxのレベル及び活性(後者をHpx-aと記す)の両方を使用してもよい。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
子癇前症(PE)は全妊婦の３〜８％が患い1、妊娠後半に臨床発現する。PEを規定する臨床的特性は、妊娠20週後に現われる高血圧及び蛋白尿である。PEは、治療せずにいると(全身痙攣により特徴付けられる)子癇に至ることがある潜在的には重篤な病状である。関連疾患であるHELLP症候群(溶血、肝臓酵素上昇及び低血小板数)がより迅速に発症し、母体溶血を伴う。妊娠中の種々の形態の高血圧状態の統一的分類は、統一的診断を可能にするために重要である。今日まで、妊娠第一期及び第二期におけるスクリーニングについて幾つかのバイオマーカーが提案されているが、いずれも未だに臨床実務で用いられていない。更に、患者の診断及び取扱いについて医師を支援するバイオマーカーも提案されてはいる。
【０００３】
PEの病因は完全には理解されていないが、最近の研究により、細胞外の胎児性ヘモグロブリン(HbF)の関与が示されている。遺伝子発現マイクロアレイ技法及びプロテオミクスを用いて、Centlowら10は、PE患者胎盤の血管内腔においてHbF遺伝子のアップレギュレーション及び無細胞HbFの蓄積を示した。その後、Olssonら11により、PEと診断された女性は、無細胞HbF及び成体ヘモグロブリン(HbA)の血漿レベルが上昇していることが証明され、Andersonら12により、PEの発症が必至である妊娠個体においては妊娠10週程度の早期にHbF及びA1Mの血清レベルが上昇することが証明された。HbFが反応性酸素種(ROS)の生成を駆動し、そのことにより胎盤への酸化的損傷及びそれに続く母子障壁を超えた漏洩(HbFを含む)が誘導されるという仮説が立てられた。HbFのこの過剰産生及び漏洩により、母体血漿中のHbF濃度の上昇、更にはROS及び炎症の誘導が生じる。結果として、全体的な内皮損傷によりPEのホールマークである高血圧及び蛋白尿が導かれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の説明
血液の主要な構成成分の１つは、タンパク質たるヘモグロブリン(Hb)であり、これは、赤血球中に高密度でパッケージされている酸素輸送タンパク質である。Hbは、各々がその活性中心にヘム基を保有する４つのグロビンサブユニットからなる四量体である。成体では、最も一般的なHbイソフォームはHbAであり、これは、２つのαサブユニット及び２つのβサブユニットからなる四量体(α2β2)である。胎児においては、HbFが優勢であり、これは２つのα鎖及び２つのγ鎖からなる(α2γ2)。更に、ヘムは、遊離酸素(O2)に対して高親和性を有する二価(Fe2+)鉄原子を含有する有機環構造プロトポルフィリンIXからなる。O2に結合した二価鉄HbはoxyHbと呼ばれる。oxyHbの自己酸化は、最終的には三価鉄(Fe3+)Hb(metHb)、四価鉄(Fe4+)Hb、遊離ヘム及び種々のROS(フリーラジカルを含む)の産生に至る自発的な酸化還元反応である。これら化合物は、化学的に非常に反応性であり、生体分子との一電子反応による組織損傷及び細胞破壊を引き起こす潜在能力を有する。
【０００５】
Hbは、通常、赤血球の膜に囲まれて見出される。細胞内oxyHbの自己酸化及びその下流のフリーラジカル生成は、主に、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、カタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ(GPx)により防止される。しかし、健康条件下でさえも相当量のHbが赤血球から逃れ、溶血が関与する病的条件の間には大量のHbが放出されることがある。したがって、血漿中及び血管外の両方で、曝露される組織への無細胞Hbの化学的脅威に対抗するための幾つかの防御機構が進化してきた。
【０００６】
ハプトグロビン(Hp)は、おそらく、最も十分に調べられたHbクリアランス系である。ハプトグロビンは血漿中の無細胞Hbに結合し19,20、マクロファージレセプターCD163への結合21により、生じたHp-Hb複合体を血液から除去する。Hp分子は２つの鎖α及びβからなり、α鎖の２つの対立遺伝子バリアントα1及びα2が存在する。結果として、ヒト集団では３つの表現型バリアントHp 1-1、1-2及び2-2が生じる。血液中の遊離ヘムはヘモペキシン(Hpx)により隔絶され、Hpx-ヘム複合体は肝細胞レセプターCD91により循環から除去される25。細胞内区画では、ヘムオキシゲナーゼ(HO)が最も重要なヘム異化タンパク質であり、これはヘムを遊離鉄、ビリベルジン及び一酸化炭素(CO)に変換する。血漿タンパク質であり血管外タンパク質でもあるα-1-ミクログロブリン(A1M)は、ヘムに結合してこれを分解し、metHbに還元する。A1Mはまた、無細胞Hb及び他の供給源により生成された下流のROS及びラジカルを還元し、共有結合することにより抗酸化剤としても作用する。
【０００７】
無細胞HbFの合成及び蓄積がPE胎盤において増大することが示されている。更に、PEを伴う妊娠の初期及び後期の両方で母体血漿/血清HbF濃度の増大が示されており、このことにより、HbFが病因論におけるステージＩ及びIIに関連する重要な因子であることが示唆される。遊離HbFは胎盤組織損傷及び酸化ストレスを引き起こし、このことが結果的に、血液胎盤関門を超える母体循環中への漏洩を導くことが示されている。Hb並びにその分解代謝物ヘム及び遊離鉄の毒性を防止するために、幾つかの保護性のスカベンジャー系がヒト身体を保護する。Hpは最も十分に記述されたHbスカベンジング系であり、これは遊離Hbに結合し、遊離Hbをマクロファージ及び肝細胞へ輸送し、そこでの取込みはCD 163レセプター媒介エンドサイトーシスにより促進される。細胞内区画、主にマクロファージの細胞内区画において、Hbはリソソームによりヘムに分解され、ヘムは更にHO-1によりビリベルジン、CO及び遊離イオンに異化される。次いで、ビリベルジンはビリルビンに還元され、これは胆管系を介して排出される。COは、血管の平滑筋層を弛緩し、結果的に血圧を低下させるので、血管床に対し拡張効果を有する。
【０００８】
Hpxは循環性血漿糖タンパク質であり、主に肝臓で合成される。Hpxは急性期反応物質として作用し、遊離ヘムに高親和性で結合する。Hpxに対するヘム親和性は、幾つかの因子、例えばpH低下、ヘム鉄原子の還元状態、ヘム鉄原子への一酸化窒素(NO)の結合又は塩化物アニオン及び二価金属イオンの存在により影響を受ける。ナトリウムカチオンはHpxに対するヘム親和性を増大させる。Hpx-ヘム複合体は、LDLレセプター関連タンパク質１(LRP1；CD91としても知られる)を発現する肝細胞及びマクロファージに輸送され、LRP1はHpx-ヘム複合体の取り込みを促進する。事実、Hpxは、マウスモデルにおいて内皮損傷を予防することが示されている。ヘム結合性に加えて、Hpxは血漿における他の活性(Hpx活性)も有する。このような活性としては、単球、内皮細胞及びラット大動脈輪における酵素的セリンプロテアーゼ活性、細胞接着の阻害、炎症の減弱及びアンジオテンシンIIレセプターのダウンレギュレーションが挙げられる。
【０００９】
本明細書に記載した実験で得られた結果に基いて、本発明は次のものを提供する：
i)早発性及び遅発性子癇前症の両方についての子癇前症のマーカーとしてのヘモペキシン及びα-1-ミクログロブリン、
ii)早発性及び遅発性子癇前症の両方についての子癇前症のマーカーとしてのヘモペキシン、α-1-ミクログロブリン及び遊離の非細胞結合胎児性ヘモグロブリン、
iii)早発性及び遅発性子癇前症の両方についての子癇前症のマーカーとしてのヘモペキシン又はA1M、
iv)子癇前症及び遅発性子癇前症のマーカーとしてのハプトグロビン、
v)子癇前症のマーカーとしてのハプトグロビン-胎児性ヘモグロブリン複合体、
vi)子癇前症のマーカーとしてのヘモペキシン及びHO-1(ヘムオキシゲナーゼ)、
vii)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシンとハプトグロビンと遊離胎児性ヘモグロブリンとヘムオキシゲナーゼとの組合せ、
viii)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシンとハプトグロビンと遊離胎児性ヘモグロブリンとヘムオキシゲナーゼとα-1-ミクログロブリンとの組合せ、
ix)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシン及びハプトグロビンの組合せの使用
x)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシンとハプトグロビンとハプトグロビン-胎児性ヘモグロブリンとの組合せの使用、
【００１０】
xi)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシン及びヘムオキシゲナーゼの組合せの使用、
xii)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシンとハプトグロビンと遊離胎児性ヘモグロブリンとヘムオキシゲナーゼとの組合せの使用、
xiii)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシンとハプトグロビンと遊離胎児性ヘモグロブリンとヘムオキシゲナーゼとα-1-ミクログロブリンとの組合せの使用、
xiv)子癇前症のマーカーとしての、ヘモペキシン活性、ヘモペキシンレベル、ハプトグロビン、遊離胎児性ヘモグロブリン、ヘムオキシゲナーゼとα-1-ミクログロブリンとの組合せの使用、
xv)子癇前症のマーカーとしての、i)〜v)のいずれか１つと遊離循環性胎児性ヘモグロブリン及び/又はα-1-ミクログロブリンとの使用、
xvi)子癇前症、早期ステージの子癇前症又は遅発性子癇前症を診断する方法、
xvii)子癇前症の進行又は退行を評価する方法、及び
xviii)子癇前症の治療の有効性を評価する方法、
xix)子癇前症の治療の有効性を評価するための、上記のいずれかと、ａ)胎児性ヘモグロブリン及び/又はｂ)α-1-ミクログロブリンとの使用。
上記の設定のいずれにおいても、ヘムが含まれていてよい。
【００１１】
上記マーカー及びマーカーの組合せは、予知、予後及び/又は診断マーカーとして使用し得る。
本発明はまた、或る種の母体及び胎児の転帰の予知バイオマーカーを提供する：
i)新生児集中治療室(NICU)への収容を予知するための予知マーカーとしての遊離胎児性ヘモグロブリン及び/又はハプトグロビン及び/又はヘモペキシン、
ii)未熟の予知マーカーとしてのヘモペキシン、
iii)NICUへの収容又は未熟を予知するための予知マーカーとしての、i)〜ii)のいずれかとα-1-ミクログロブリンとの使用。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】無細胞HbF-及びHp濃度の相関を示す。
【図２】Hpイソフォーム、無細胞HbF-及びHp-HbF濃度の間の相関を示す。
【図３】Hpx濃度と収縮期/拡張期血圧との相関を示す。
【図４】受信者動作特性(ROC)曲線を示す。
【図５】HbF、Hp、Hpx、A1M及びROSが関与し、PEに至る試案の事象連鎖の概略図を示す。
【図６】受信者動作特性(ROC)曲線を示す。
【図７】受信者動作特性(ROC)曲線を示す。
【図８】Hpx30と拡張期血圧との間の相関を示す。
【図９】ロジスティック回帰分析を示す。
【図１０−１】配列表を示す。
【図１０−２】配列表(続き)を示す。
【図１０−３】配列表(続き)を示す。
【図１０−４】配列表(続き)を示す。
【図１１】異なる在胎齢で対照と比較したA1Mレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書において、他に断らない限り、「a」又は「an」は「１又はそれより多く」を意味する。
ヘモグロブリンＡ(HbA)。幾つかの形態のHbが存在する。成体Hb(HbA)は、１つの酸素分子と可逆的に結合する非ペプチドヘム基を各々含有する２つのαポリペプチド鎖及び２つのβポリペプチド鎖(Hbα、Hbβ)からなる。Hb A2(別の成体Hb成分)は、２つのα鎖及び２つのδ鎖(Hbα、Hbδ)から構成される。
胎児性ヘモグロブリン(HbF)。HbF(胎児性ヘモグロブリン)は２つのα鎖及び２つのγ鎖からなる。用語「胎児性Hb」とは遊離HbF又はHbFの任意のサブユニットをいい、ポリペプチド形態(タンパク質)又は(治療標的として適用される場合を除き)ヌクレオチド形態(RNA)のHbF実体を含む。「HbF」、「fHbF」又は「遊離HbF」とは下記で定義するような遊離胎児性ヘモグロブリンをいう。
【００１４】
用語「遊離Hb」とは、本明細書では、遊離Hb一般をいい、トータル遊離Hb、遊離HbA、遊離HbA2、遊離HbF、任意の遊離Hbサブユニット(例えば、Hbα鎖、Hbβ鎖、Hbδ鎖又はHbγ鎖)又はそれらの任意の組合せを含む。この用語は、更に、ポリペプチド形態(タンパク質)又は(治療標的として適用される場合を除き)ヌクレオチド形態(RNA)のHb実体を含む。用語「遊離」とは、循環の液相(例えば、血漿及び血清など)にある、すなわち、赤血球の外部にある(が内部にはない)の任意のHbをいい、したがって循環中のタンパク質結合Hb(すなわち、細胞に結合していないもの)もまた含む；タンパク質結合Hbの例はHp又はHpxに結合したHbである。更に、この用語にはSTMBに含有されるHbも含まれる。一般に、この用語はインタクトな赤血球に含まれていないHbを包含する。よって、用語「遊離Hb」は、インタクトな赤血球に含まれていない全ての形態のHbを包含する。
【００１５】
本明細書において、用語「遊離」は、表現「遊離Hb」、「遊離胎児性Hb」又は「遊離Hbサブユニット(例えば、Hbα鎖、Hbβ鎖、Hbδ鎖又はHbγ鎖)」中で使用される場合にはとりわけ、(細胞内部に存在する分子をいう)細胞Hbとは対照的に、生物学的流体中を自由に循環しているHb、胎児性Hb又はHbサブユニットをいう。よって、この意味では、用語「遊離」は、主に、遊離Hbを(インタクトな赤血球中に存在する)Hbとは区別するために用いられる。この用語は、STMBに含有されるHbを排除せず、例えばタンパク質に結合しているが、赤血球の外部に依然として存在するHbを排除しない。同じ表記法がHbFにも適用され、その場合、遊離HbFに関し、遊離HbFを(インタクトな赤血球中に存在する)HbFと区別するための用いられる。この用語は、STMBに含有されるHbFを排除せず、例えばタンパク質に結合しているが、赤血球の外部に依然として存在するHbFを排除しない。
【００１６】
用語「マーカー」又は「バイオマーカー」とは、本明細書では、妊娠哺乳動物、好ましくは女性から採取したサンプル中に差分的に存在する生体分子、好ましくはポリペプチド又はタンパク質をいう。
用語「バイオマーカーパネル」は、本明細書では、２つ又はそれより多いバイオマーカーの組合せ(これらは信頼でき再現可能な結果が得られるように測定できなければならない)について用いられる。よって、PE発症のリスクを予知、診断又は評価するためのバイオマーカーパネルは、Hpx及びA1Mの組合せであってもよく、Hpx、A1M及び遊離HbFの組合せであってもよい。このようなバイオマーカーパネルに含まれ得る更なるバイオマーカーは、Hp-HbF、Hp、HO-1及びヘムからなる群より選択されなければならないと考えられる。
【００１７】
用語「妊娠雌性哺乳動物からの生物学的サンプル」、用語「被験体」又はそれらの相当語句は、母体自体からのサンプルを指称するものとされる；したがって、当該サンプルは例えば胎児又は羊水から得られるものではない。用語「胎児又は胎児胎盤循環からのサンプル」とは、胎児、例えば羊水、臍帯及び胎盤内の血管を含む胎児の循環系から採取されたサンプルをいう。
本明細書で使用する場合、胎児性Hb(「HbF」と略される)とは、胎児におけるHbの主要成分であるHbのタイプをいう。胎児性Hbは２つのαポリペプチド鎖及び２つのγポリペプチド鎖(Hbα、Hbγ)を有する。本発明に関しては、HbFは遊離循環性HbF、すなわち細胞の外部にあるHbFである。しかし、HbFは、他の物質(例えば、タンパク質)に結合していてもよく、Hpに結合していてもよく、他のタンパク質に結合していてもよい。
本明細書で使用する場合、α-1-ミクログロブリン(A1M)とは、α-1-ミクログロブリンと名付けられたリポカリンファミリーのメンバーをいう。α-1-ミクログロブリンは、文献中で、A1M、α1m、HI30、プロテインHC及びα-1-ミクロ糖タンパク質とも呼ばれ得る。
【００１８】
以下で、本発明の種々の方法を議論する。個々の項において、例えばサンプルの性質、参照値又は対照値、サンプリング時間、好適なマーカーパネルなどに関する多くの詳細を種々に記載する。１つの標題の下でなされる開示は他の標題についても該当するのであるが、必ずしも繰り返さない。すなわち、仮に、例えばサンプルの性質などについて幾つかの標題の下で言及がない場合であっても、診断局面で包含される主題は、他の局面で言及される状況にも明らかに適用されることを意味する。
【００１９】
子癇前症のバイオマーカー及び子癇前症の診断方法
本発明によれば、以下の工程：
(ａ)妊娠女性からの生物学的サンプル(例えば、血液、血漿、尿、脳脊髄液(CSF)、胎盤生検(CVS)、子宮液及び/又は羊水及び唾液からのサンプル)を取得する工程；
(ｂ)Hp-HbF、Hp、Hpx、HO-1から選択される１又はそれより多いバイオマーカーのレベルと、バイオマーカー遊離HbF及び/又はA1Mのレベルとを測定する工程、又は
Hpx及びHO-1のレベルを測定する工程、又は
Hp-HbF、Hpから選択される１又はそれより多いバイオマーカーのレベルと、ｉ)遊離HbF及び/又はA1M、及び/又はii)Hpx及びHO-1から選択されるバイオマーカーのレベルとを測定する工程
及びHpx活性
及び
(ｃ)測定したバイオマーカーのサンプル中のレベルを参照値と比較して、前記妊娠雌性体がPEを有するか若しくは有しないか、又はPEを発症するリスクが増大しているか若しくは増大していないかを決定する工程
を含んでなる、PEを診断する方法又はPEの診断を補助する方法が提供される。
【００２０】
より具体的には、本発明は、以下の工程：
(ａ)妊娠女性からの生物学的サンプル(例えば、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液(CSF)、胎盤生検(CVS)、子宮液及び/又は羊水及び唾液からのサンプル)を取得する工程；
(ｂ)ｉ)Hpx、ii)Hpx及びA1M、又はiii)Hpx、A1M及び遊離HbFのレベルと、必要に応じてHp、HO-1及びHp-HbFのうちの１又はそれより多くのレベルとを測定する工程、及び
(ｃ)測定したバイオマーカーのサンプル中のレベルを参照値と比較して、前記妊娠雌性体がPEを有するか若しくは有しないか、又はPEを発症するリスクが増大しているか若しくは増大していないかを決定する工程
を含んでなる、PEを診断する方法又はPEの診断を補助する方法を提供する。
幾つかの場合では、(ｂ)は、A1M及び任意にHp、HO-1及びHp-HbFの１又はそれより多くを含ませる(すなわち、Hpxも遊離HbFも使用しない)ように拡張してもよい。
上記のとおり、本発明に従うPE発症リスクの予知又は診断又は評価についての使用に好適なマーカーパネルは、遊離HbF、Hp-HbF、Hp、HO-1のうちの１又はそれより多くを任意に追加されてもよいHpx及びA1Mである。
【００２１】
対照データ又は参照値は、PEを発症していない妊娠女性における上記マーカーのレベルを測定することにより取得する。個々のマーカーのレベルは在胎齢に依存して変化し得るので、対照又は参照値は同じ在胎齢(±１週間)の妊娠女性から取得することが好ましい。図11から理解されるように、正常レベル−並びにPEを発症するリスクを示すレベル−はサンプルを採取した在胎齢に依存して変化する。しかし、仮に、参照値のデータが入手可能でなくとも、対照レベルとリスクレベルとの間の差が経時的に増大することは図11から明らかであり、そのため、20週で採取した試験サンプルを15週で採取した参照値と比較した場合であっても、同じ結果が得られるはずである。
本明細書で言及した方法において、参照値とは問題となっている現実のマーカーをいうことは明白である。
【００２２】
サンプルは任意の在胎齢で採取されてよい。記載した実施例は、サンプルを在胎齢６週〜20週に採取してもよく、在胎齢34週〜40週で採取してもよいことを示している。短い在胎齢で既に信頼できるマーカー又はマーカーパネルを有することの利点は、PE発症リスクを早期に予知することが可能である点及びPEの症状を低減又は回避するように予防的処置を策定し得る点である。更に、実施例から理解されるように、本発明のマーカーパネルにより、早発性又は遅発性のPEが予想されるかどうかの評価が可能になり得る。
生物学的サンプルは、最も入手し易いという理由から、好ましくは、血液サンプル、例えば血漿又は血清サンプルである。
本発明はまた、PE発症リスクの予知、診断、評価を補助するため又はPEの特定の治療的若しくは予防的処置の評価を補助するためのデータを採集する。
【００２３】
所望であれば、サンプルは、バイオマーカーのうちの１又はそれより多くの検出性が増強されるように調製することができる。代表的には、サンプル調製には、サンプルの分画及びバイオマーカーを含有すると判明した画分の採集が含まれる。予備分画方法には、例えば、遠心分離、RNA/DNA抽出、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、タンパク質分画及びタンパク質変性が含まれる
【００２４】
バイオマーカーのレベルを測定する工程は、例えば免疫学的アッセイ(例えば、ELISA又は他の固相ベースのイムノアッセイ、例えばSPRIA又は増幅ELISA(いわゆるIMRAMP))、タンパク質チップアッセイ、定量リアルタイムPCR増幅、表面増強レーザ脱離/イオン化(SELDI)、高速液体クロマトグラフィー、質量分析、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学、化学発光、比濁分析/ターボメトリー(turbometry)、側方流動又は純粋又は偏光蛍光又は電気泳動により達成することができる。しかし、この技法リストが完全ではなく、これら技法のみがバイオマーカーのレベルを測定するために本発明において使用し得る適切な方法ではないことは、当業者に明白である。
【００２５】
本発明の方法において検出及び/又は測定するHbFとしては、Hb鎖(Hbα、Hbβ、Hbδ及びHbγ)のいずれか、又はこれらの任意の組合せが挙げられる。γ鎖はHbFの指標である一方、例えばβ鎖及びδ鎖はHbAの指標である。本明細書中の開示に基いて、当業者はどのHb鎖を測定すべきかを理解する。Hp分子は２つの鎖α及びβからなり、α鎖の２つの対立遺伝子バリアントα1及びα2が存在する。その結果、３つの表現型バリアントHp1-1、Hp1-2及びHp2-2がヒト集団で生じる。用語Hpには３つのバリアント全てが含まれる。A1Mは遊離形態で、並びに他のタンパク質(例えば、IgA、アルブミン、プロトロンビンなど)及び小さな分子及び物質(例えば、ヘム又はラジカルを含む)に結合した複合体形態で存在する。本明細書中の開示に基いて、当業者は、どのA1M形態を測定すべきかを理解する。
【００２６】
本発明によれば、免疫学的アッセイ(イムノアッセイ)を使用して、バイオマーカーのレベルを測定することができる。イムノアッセイは、抗原(例えばHpx)に特異的に結合する抗体を使用するアッセイである。イムノアッセイは、抗原の単離、標的及び/又は定量に特定抗体の特異的結合特性を利用することにより特徴付けられる。よって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特異抗体は、特定タンパク質にバックグランドの少なくとも２倍結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。精製マーカー又はそれらの核酸配列を使用して、マーカー(例えばHpx)に特異的に結合する抗体を、当該分野で公知の任意の適切な方法を用いて作製することができる[例えばColigan35参照]。
【００２７】
バイオマーカーレベルは、例えば免疫学的アッセイを利用して測定してもよい。詳細には、免疫学的アッセイはELISAである。しかし、上記のとおり、他の免疫学的原理を用いてもよい。
遊離HbF(又は別のバイオマーカー)レベルは、遊離HbF(又は別のバイオマーカー)のRNAを測定することにより決定してもよい。詳細には、遊離HbFのメッセンジャーRNA(mRNA)は、リアルタイムPCRを用いて測定する。トータルHbレベルも測定する場合には、このレベルは、例えばリアルタイムPCRを用いて、Hb α鎖mRNAを測定することにより測定してもよい。
【００２８】
一般に、被験体から得られるサンプルを、マーカーに特異的に結合する抗体と接触させることができる。任意に、抗体をサンプルと接触させる前に、抗体を固相支持体(ただし、他の非固相支持体を排除しない)に固定して、洗浄及びその後の複合体の単離を容易にすることができる。固相支持体の例として、例えばマイクロタイタープレート、スティック、ビーズ又はマイクロビーズの形態のガラス又はプラスチックが挙げられる。
サンプルを抗体とインキュベートした後、混合物を洗浄し、形成した抗体-マーカー複合体を検出することができる。検出は、洗浄した混合物を検出試薬とインキュベートすることにより達成可能である。この検出試薬は、例えば、検出標識で標識された第２の抗体であってもよい。例示の検出標識として、磁性ビーズ、蛍光染料、放射性標識、酵素及びチラミドを用いる増幅キット(例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びELISAで一般に用いられるその他のもの)並びに熱量標識(例えばコロイド金)又は着色ガラス若しくはプラスチックビーズが挙げられる。
【００２９】
或いは、サンプル中のマーカーは、(例えば、第２の標識抗体を用いて、結合マーカー特異的抗体を検出する)間接アッセイを用いて、及び/又は(例えば、マーカーの別個のエピトープに結合するモノクローナル抗体を混合物と同時にインキュベートする)競合又は阻害アッセイで検出することができる。
抗体-マーカー複合体の量又は存在を測定する方法としては、例えば、蛍光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、屈折率(例えば、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共振ミラー法、ゲーティングカプラ導波法(gating coupler waveguide method)又は干渉分光法)又は放射活性の検出が挙げられる。光学的方法としては、顕微鏡観察(共焦点及び非共焦点の両方)、画像法及び非画像法が挙げられる。電気化学的方法としては、ボルタンメトリー法及びアンペロメトリー法が挙げられる。高周波法としては多極共鳴分光法が挙げられる。
【００３０】
有用なアッセイとしては、当該分野で周知のアッセイタイプが挙げられ、例えば、酵素イムノアッセイ(EIA)(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))、ラジオイムノアッセイ(例えばRIA及びSPRIA)；ウェスタンブロットアッセイ；又はスロットブロットアッセイを含むが、当業者により特定される他の形式を排除するものではない。
バイオマーカーのレベルを測定する工程は、サンプル中のHbポリペプチドをコードする遊離mRNAの検出及び測定により、例えば、上記体液中のバイオマーカー又はそのフラグメントをコードするmRNA配列の検出により、達成することもできる。
サンプル中のバイオマーカーのレベルを参照値と比較する工程において、用語「参照値」は、本発明に関しては、バイオマーカー(すなわち、工程(ｂ)で測定されるバイオマーカーと同種類のもの)の、対照群からのサンプル中で決定されたベースラインレベル又は平均レベルをいう。好ましくは、対照群は、PEと診断されておらず、PEにも他のいかなる妊娠関連合併症(例えば妊娠関連高血圧)にも罹患していない妊娠雌性哺乳動物(好ましくは女性)を含む。
【００３１】
バイオマーカーの正常レベルは妊娠女性の在胎齢により変化するので、使用する対照サンプル又は対照値は、分析するその患者サンプルを代表するものであることが重要である。対照は、PEを有しておらず、PEを発症するリスクにもない妊娠女性から採取されたサンプルであり、類似する在胎齢(すなわち、同じ妊娠週)でサンプリングされたものである。更に、値は適用したアッセイに依存し得る。よって、ELISAアッセイを用いた場合には、例えばラジオイムノアッセイ法を適用したときに得られる値と比較して異なる値が得られる可能性がある。当業者は、試験サンプル及び対照サンプルについて同じ分析法を選択することが困難でないことを理解し、試験サンプル及び対照サンプルについて正確な在胎齢を特定する方法を困難なく理解する。
本明細書の実施例から理解されるように、サンプルを在胎齢34〜40週で採取したとき及びサンプルを在胎齢６〜20週で採取したときの両方で、信頼でき再現可能な結果が得られる。よって、最も重要なことには、本発明は、妊娠の極初期に使用して、PE発症リスクを予知し及び/又はPEを診断することができる信頼できるバイオマーカーを提供する。本明細書に記載した研究IIから理解されるように、サンプルを在胎齢６〜20週に、とりわけ12〜14週に採取したとき、信頼でき再現可能な結果が得られる。結果−特にA1M、Hpx及びHbFに関連する結果−は、サンプルを妊娠34〜40週で採取した研究Ｉで報告した結果と一致している。よって、本発明は、12週(又はそれ以前)〜出産の間のPEの信頼できるマーカーを提供する。
【００３２】
例として、 サンプルが在胎齢34〜40週で試験され、かつHp、Hpxの試験に用いるアッセイがELISAであり、非タンパク質結合A1Mの試験に用いるアッセイがラジオイムノアッセイであるときには、以下の値が正常値とみなされる。以前の特許出願WO 2011116958 A1においてA1Mについて示された正常範囲と比較して、下記に示す値はより高いことに留意すべきである。これは、WO 2011116958 A1に示される値が誤っていることを意味するものではなく、WO 2011116958 A1におけるA1M及び本明細書で報告された値は別々の２つのラジオイムノアッセイ法を使用して得られており、異なる在胎齢で得られたサンプルからの値であるという事実に関連する。このことは、正確な結論を引き出すためには、同じ方法の使用が重要であることを説明している。HbFに関しても、WO 2008098734に見出される値との相違が存在し得る。下記に示す研究Ｉに関しては、非タンパク質結合HbFのみが測定された一方、研究II及びWO 2008098734では、トータルHbF(すなわち、タンパク質に結合したものも含む)が測定された。
【００３３】
対照群を用いる場合、バイオマーカーの参照値の決定は、当該分野において周知の標準的な分析方法を用いて行う。その値は、当然のことながら、例えば、用いるアッセイのタイプ、測定するバイオマーカーの形態、生物学的サンプルの種類及び被験体の群に依存して変化する。例えば、PEと診断されていない妊娠女性の、上記のようなELISA又はラジオイムノアッセイ法で測定した正常な平均血漿レベルは、対照サンプルを在胎齢34〜40週で採取したときには、次のとおりである(サンプルを在胎齢12〜14週で採取したときの対応値を括弧内に示す)：
ｉ)遊離非タンパク質結合HbFについては、メジアンレベル3.85ng/mlの２〜５ng/mLの範囲(メジアン値5.6μg/mLの4.2〜7.4μg/mLの範囲)
ii)Hp-HbFについては、メジアンレベル0.59μg/mLの0.003〜1.18μg/mLの範囲
iii)Hpについては、メジアンレベル1.17mg/mLの1.04〜1.30mg/mLの範囲(メジアン0.971mg/mLの0.915〜1.028mg/mLの範囲)
iv)Hpxについては、メジアンレベル0.93mg/mLの0.88〜0.98mg/mLの範囲(メジアン1.143mg/mLの1.111〜1.175mg/mLの範囲)
v)A1Mについては、メジアンレベル29.93μg/mLの27.89〜31.97μg/mLの範囲(メジアン15.5μg/mLの14.9〜16.1μg/mLの範囲)
vi)HO-1については、メジアンレベル5.29ng/mLの4.69〜5.9ng/mLの範囲
vii)ヘムについては、メジアンレベル59.86μg/mLの52.34〜67.38μg/mLの範囲。
【００３４】
しかし、上記のとおり、サンプルを別の在胎齢で採取したときには他の正常値が予測される。したがって、試験サンプルから得た値を「正常」値と比較するときには、在胎齢に相関する対照値を使用することが好ましい。
本明細書中の研究IIで説明するとおりであるが、本研究に記載したアッセイを用いれば、在胎齢６〜20週に採取した妊娠雌性体からの血漿/血清サンプル中のHpxレベルが1.1mg/mL以下であり、無細胞HbFレベルが5.6μg/mL以上であり、A1Mレベルが15.5μg/mL以上であれば、当該妊娠雌性体はPEを有するか又はPE発症リスクが増大している。メジアン値を用いる場合、在胎齢６〜20週に採取した妊娠雌性体からの血漿/血清サンプル中のHpxレベルが1.06mg/mL以下であり、無細胞HbFレベルが10.8μg/mL以上であり、A1Mレベルが17.3μg/mL以上であれば、当該妊娠雌性体はPEを有するか又はPE発症リスクが増大している。
前記参照(又は正常)値が、対象群からのサンプル中のHp-HbF、HbF、ヘム及び/又はA1Mのレベルである場合、サンプル中のHp-HbF、HbF、ヘム及び/又はA1Mのレベルが参照値より高いことが、当該妊娠雌性体はPEを有するか又はPE発症リスクが増大していることを示す。
【００３５】
参照値が、対照群からのサンプル中のHp、HO-1及び/又はHpxのレベルである場合、サンプル中のHp、HO-1及び/又はHpxのレベルが参照値より低いことが、当該妊娠雌性体はPEを有するか又はPE発症リスクが増大していることを示す。
本明細書の結果から理解されるように、マーカーは、早発性又は遅発性PEを発症するリスクを決定するために使用してもよい。この場合、特に、マーカーとしてHpx活性及び/又は遊離HbFが重要なようである。よって、サンプル中で(対照より)低いHpx活性と高い遊離HbF濃度との組合せは遅発性PEの指標である一方、高い遊離HbF濃度と無変化のHpx活性(と任意に高いHpレベル)との組合せは早発性PEの指標である(表３参照)。
それから、この疾患の進行(又は退行)は、同じ妊娠女性の同じタイプの生物学的サンプルにおける１又はそれより多いバイオマーカーのレベルの頻回測定によって追跡することができる。
【００３６】
妊娠女性がPEのリスクにあるか又は既にPEの兆候を有しているかを判定するために正確な血漿バイオマーカーレベルを調べる別の方法は、血漿/血清レベルを決定するときに行う試験について標準偏差を調べることである。この場合、該当するパラメータは、正常レベル(例えば、血漿中の正常レベル)からの、標準偏差の1.1倍以上の増加/減少であると考えられる。或いは、レベルの変化は、正常値から少なくとも５％でなければならない。
本発明はまた、他の診断方法との組合せでの本明細書に記載の方法の使用を企図する。本発明の方法との組合せで使用することができる診断方法としては、当業者たる医師に公知である子癇前症を診断するため又は子癇前症の診断を補助するための現行の方法が挙げられ、そのような方法の例は、本明細書において前述されている。生物学的サンプルは、最初に、本明細書に記載の方法により分析されてされてもよい。その後、生物学的サンプルは、当該観察を裏付けるために他の方法により試験されてもよい。よって、本発明の診断方法の正確性は、他の診断方法と組み合わせることにより向上させることができる。
前述したとおり、診断の観点で記載した詳細の全てが他の観点で記載された方法にも当てはまる。
【００３７】
子癇前症の進行/退行の評価
本発明の更なる実施形態において、バイオマーカーは、PEの状況(例えば、進行又は退行)を決定するために用いることができる。幾つかのバイオマーカーは、患者の予後予測、すなわちこの疾患の転帰の予知に使用してもよい。例えば、HbF、Hp及び/又はHpxの濃度は、臨床転帰、例えばNICU治療の必要性、未熟及び帝王切開と相関する(ただし、他の臨床徴候を排除するものではない)。
よって、本発明の１つの観点によれば、
(ａ)妊娠雌性哺乳動物から単離した第１の生物学的サンプル、例えば血液、血漿/血清、尿、CSF、胎盤生検、子宮液又は羊水において、Hp-HbF、Hp、Hpx、HO-1から選択される１又はそれより多いバイオマーカーのレベル及びバイオマーカー遊離HbF及び/又はA1Mのレベルを測定する工程；又は
Hpx及びHO-1のレベルを測定する工程；又は
Hp-HbF、Hpから選択される１又はそれより多いバイオマーカーのレベル及びｉ)遊離HbF及び/又はA1M、及び/又はii)Hpx及びHO-1から選択されるバイオマーカーのレベルを測定する工程
(ｂ)該妊娠雌性哺乳動物から後の時点で単離した第２の生物学的サンプル、例えば本明細書で言及するものにおいて、上記(ａ)で選択された同じバイオマーカーのレベルを測定する工程；及び
(ｃ)工程(ａ)及び(ｂ)で測定した値を比較する工程であって、
ｉ)第１のサンプル中のHbF、Hp-HbF及び/又はA1Mレベルに対する、第２のサンプルにおけるHbF、Hp-HbF及び/又はA1Mレベルの増加、及び/又は
ii)第１のサンプル中のHp、HO-1及び/又はHpxレベルに対する、第２のサンプルにおけるHp HO-1及び/又はHpxレベルの減少
はPEの進行を示し；上記ｉ)の減少及び/又は上記ii)の増加はPEの退行を示す、工程
を含んでなる、子癇前症の進行又は退行をモニターするための方法が提供される。
【００３８】
より具体的には、本発明は
(ａ)妊娠雌性哺乳動物から単離した第１の生物学的サンプル、例えば血液、血漿、尿、CSF、胎盤生検、子宮液又は羊水において、ｉ)Hpx、ii)Hpx及びA1M、及び/又はiii)Hpxのレベル、及び任意にHp-HbF、Hp、HO-1の１又はそれより多くのレベルを測定する工程
(ｂ)該妊娠雌性哺乳動物から後の時点で単離した第２の生物学的サンプル、例えば本明細書に記載したものにおいて、上記(ａ)で選択された同じマーカーのレベルを測定する工程；及び
(ｃ)工程(ａ)及び(ｂ)で測定した値を比較する工程であって、
ｉ)第１のサンプル中のレベルに対する、第２のサンプルにおける遊離HbF及び/又はA1Mレベル及び測定したときにはHp-HbFの増加、及び/又は
ii)第１のサンプル中のレベルに対する、第２のサンプルにおけるHpxレベル及び測定したときにはHp及び/又はHO-1レベルの減少
はPEの進行を示し；上記ｉ)の減少及び/又は上記ii)の増加はPEの退行を示す、工程
を含んでなる、PEの進行又は退行をモニターするための方法を提供する。
幾つかの場合では、(ａ)は、A1M及び任意にHp、HO-1及びHp-HbFの１又はそれより多くを含ませる(すなわち、Hpxも遊離HbFも使用しない)ように拡張してもよい。
【００３９】
上記のとおり、本発明に従うPE発症リスクの予知又は診断又は評価についての使用に好適なマーカーパネルは、遊離HbF、Hp-HbF、Hp、HO-1のうちの１又はそれより多くを任意に追加されてもよいHpx及びA1Mである。
標準偏差の1.1倍以上に相当するHbF、Hp-HbF、ヘム及び/又はA1Mレベルの増加或いはHp、HO-1及び/又はHpxレベルの減少は、子癇前症発症リスクの増大及び/又はこの疾患の進行の指標であると企図される。或いは、正常値からの５％の変動は、増加(又は、該当するときには、減少)とみなされる。同様に、標準偏差の1.1倍以上(又は上記のような５％の変動)に相当するHbF、Hp-HbF、ヘム及び/又はA1Mレベルの減少或いはHp、HO-1及び/又はHpxレベルの増加は、PE発症リスクの減少及び/又はこの疾患の退行の指標である。
第１の観点で言及した詳細は、この観点及び以下の観点にも当てはまる。
【００４０】
子癇前症の特定の治療の有効性を評価する方法
上記のバイオマーカー及び方法は、PE治療の効力を評価するために用いることもできる。唯一の相違は、第１のサンプルが治療前(時間t0と呼ぶ)又は治療中(時間t1と呼ぶ)のいずれかで採取される一方、第２のサンプルがt0又はt1(どちらか該当する方)より後の時点で採取される点である。この方法は以下の工程：
(ａ)妊娠雌性哺乳動物の例えば血液、血漿又は尿から治療前又は治療中のいずれかで単離された第１の生物学的サンプルにおいて、Hp-HbF、Hp、Hpx、HO-1から選択される１又はそれより多いバイオマーカーのレベル及びバイオマーカー遊離HbF及び/又はA1Mのレベルを測定する工程；又は
Hpx及びHO-1のレベルを測定する工程；又は
Hp-HbF、Hpから選択される１又はそれより多いバイオマーカーのレベル及びｉ)遊離HbF及び/又はA1M、及び/又はii)Hpx及びHO-1から選択されるバイオマーカーのレベルを測定する工程
(ｂ)該妊娠雌性哺乳動物の例えば血液、血漿/血清又は尿から、第１のサンプルより後の時点で単離された第２の生物学的サンプルにおいて、上記(ａ)で選択された１又はそれより多いバイオマーカーのレベルを測定する工程；
(ｃ)工程(ａ)及び(ｂ)で測定した値を比較する工程であって、
ｉ)第１のサンプル中のHp-HbF、Hp、HO-1、Hpx、遊離HbF及び/又はA1Mレベルに対する、第２のサンプルにおけるHp-HbF 、HbF及び/又はA1Mレベルの増加、及び/又はHp、HO-1及び/又はHpxレベルの減少は、PEが進行するので、当該治療が効果的でないことを示し；上記のようなHp-HbF、HbF及び/又はA1Mレベルの減少、及び/又はHp、HO-1及び/又はHpxレベルの増加はPEが退行するので、当該治療が有効であることを示す、工程
を含んでなる。
【００４１】
より具体的には、この方法は以下の工程：
(ａ)妊娠雌性哺乳動物の例えば血液、血漿/血清又は尿から治療前又は治療中のいずれかで単離された第１の生物学的サンプルにおいて、ｉ)Hpx、ii)Hpx及びA1M、及びiii)Hpx、A1M及び遊離HbFから選択される１又はそれより多いバイオマーカーのレベル、及び任意にHp-HbF、Hp、HO-1の１又はそれより多くのレベルを測定する工程
(ｂ)該妊娠雌性哺乳動物の例えば血液、血漿/血清又は尿から、第１のサンプルより後の時点で単離された第２の生物学的サンプルにおいて、(ａ)で選択された１又はそれより多いバイオマーカーのレベルを測定する工程；
(ｃ)工程(ａ)及び(ｂ)で測定した値を比較する工程であって、
ｉ)第１のサンプル中のレベルに対する、第２のサンプルにおける遊離HbF及び/又はA1Mレベル、及び該当するときにはHp-HbFのレベルの増加、及び/又はHpxレベル、及び該当するときにはHp、HO-1レベルの減少は、PEが進行するので、当該治療が効果的でないことを示し；及び/又は、上記のような、遊離HbF及び/又はA1Mレベル、及び該当するときにはHp-HbFレベルの減少、及び/又はHpxレベル、及び該当するときにはHp、HO-1及び/又はHpxレベルの増加はPEが退行するので、当該治療が有効であることを示す、工程
を含んでなる。
【００４２】
上記方法ｉ)〜ix)のいずれにおいても、マーカー ヘムを含ませてもよい。
上記のとおり、本発明に従うPE発症リスクの予知又は診断又は評価についての使用に好適なマーカーパネルは、遊離HbF、Hp-HbF、Hp、HO-1のうちの１又はそれより多くを任意に追加されてもよいHpx及びA1Mである。
特定の実施形態において、治療の効力は、上記のとおり、標準偏差の1.1倍以上又は正常値からの５％の変動に相当する減少又は増加を決定することにより評価することができることが企図される。
本発明はまた、生物学的サンプル中の個々のマーカーの測定に適切な試薬を含んでなるキットに関する。よって、本キットは、個々のマーカーについての抗体、ELISA又は本明細書に記載した他の方法のいずれかを行なうための手段を含んでいてもよい。
【００４３】
子癇前症の予防及び/又は治療に使用する物質及び組成物
本明細書で報告した知見に従えば、ｉ)遊離Hb(遊離HbF又は任意の他のHb)の生成を阻害する能力、ii)遊離Hb(遊離HbF又は任意の他のHb)に結合する能力、又はiii)遊離循環性Hb(遊離HbF又は任意のHb)の濃度を減少させ、この疾患の進行を減速させる能力を有する任意の物質は、PEの効果的な治療及び/又は予防に関して有望な物質である蓋然性が高い。したがって、Hb結合性因子；ヘム結合性/分解因子：鉄結合性因子；ヘモグロブリン分解、ヘム分解及び/又は鉄隔絶を刺激する因子；及び/又は胎盤性造血を阻害する因子からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーの、PEの治療のための使用が提供される。
よって、本発明の１つの観点では、妊娠女性が本発明の方法により、PEを有するか、PEを発症するリスクを有するかを検査される場合には、PEの予知、PEの診断、PEに罹患するリスクの評価に関する上記観点の各々は、妊娠女性に、以下で言及する物質の１又はそれより多くを投与することを含む治療レジメンを補充されてもよい。
より具体的には、物質は以下：
i)ヘモグロブリンの抗体又はそのフラグメント
ii)ハプトグロビン
iii)CD 163
iv)α-1-ミクログロブリン
v)ヘモペキシン
vi)ヘム-オキシゲナーゼ
vii)アルブミン
viii)トランスフェリン
ix)フェリチン
から選択されることが企図される。
【００４４】
ヘモグロビン結合剤：
抗体
Hbと強力に結合し、Hbのレドックス酵素活性をブロックするモノクローナル抗体を開発することができる。この抗体は、インビボ若しくはインビトロ免疫により産生することができるか、又は既存のライブラリから選択することができる。この抗体は、α-、β-、δ-又はγ-グロビン鎖に対する特異性について選択してもよいし、これらグロビン鎖の共通部分に対する特異性について選択してもよい。この抗体は、ヒトにおける療法に適切となるように改変することができる。すなわち、ヒトイムノグロブリンフレームワークを有して提供することができる。抗体の任意の部分：Fv-、Fab-フラグメント又はイムノグロブリン全体が用いられてよい。
ハプトグロブリン
Hpは血漿/血清中に見出される糖タンパク質である。３つの形態のHpが存在する：Hp1-1、Hp2-1及びHp2-2。全ての形態がHbに結合し、Hp-Hb複合体を形成する。Hb-Hp複合体は、遊離Hbより弱いレドックス酵素活性を有し、したがって酸化的損傷を引き起こすことがより少ない。Hbへの結合は、例えばヘム基からの鉄喪失を防止する。
CD163
CD163は、マクロファージ、単球及び血管を裏打ちする細網内皮系に見出されるスカベンジャーレセプターである。このレセプターはHp-Hb複合体を認識し、エンドサイトーシス及びリソソームへの送達、HO-1による分解(下記参照)及び細胞フェリチンによる遊離鉄の隔絶を媒介する。したがって、CD163はHb誘導酸化ストレスの排除に寄与する。
【００４５】
ヘム結合剤/分解剤：
ヘモペキシン
Hpxは、ヒト血漿/血清中に見出される糖タンパク質(60kDa)であり、遊離ヘムと強力(Kd約１pmol/L)に結合して細網内皮系での分解のためにヘムを肝臓に輸送することにより血漿から遊離ヘムを排除する。
ヘムオキシゲナーゼ
ヘムオキシゲナーゼは、ヘムをビリベルジン、一酸化炭素及び遊離鉄に変換する細胞性のヘム結合性・分解性酵素複合体である。遊離鉄は細胞フェリチンにより隔絶され、ビリベルジンはビリベルジンレダクターゼによりビリルビンに還元される。ビリルビンは最終的には尿中に排出される。構造が非常に異なる３つの形態のヘムオキシゲナーゼ遺伝子HO-1、HO-2及びHO-3が記載されている。HO-1が最も重要である。この遺伝子は、身体中の実質的に全ての細胞において、Hb、遊離ヘム、低酸素、フリーラジカル、ROS及び多くの異なる炎症シグナルによりアップレギュレートされる。HO-1は強力な抗酸化剤である。なぜなら、これはオキシダントたるヘム及び鉄を排除するからであるが、ビリルビン(幾つかのオキシダントに対して抗酸化効果を有する)を産生するからでもある。
アルブミン
アルブミンは、ヘムと結合することができるヒト血漿中の66kDaタンパク質である。アルブミン-ヘム複合体の細胞取込み及び分解の証拠はなく、アルブミンの効果は、おそらく、ヘムの貯蔵庫(depot)として作用し、よってヘムが内皮細胞膜、脈管基底膜などに進入することを防止することである。
【００４６】
α-1-ミクログロブリン
A1Mは、肝臓で高速に合成され、血流に分泌され、血管壁を横切って全ての器官の血管外区画に輸送される。このタンパク質は、より低速ではあるが、他の組織(血液細胞、脳、腎臓、皮膚)でも合成される。小さなサイズに起因して、遊離A1Mは腎臓で血液から迅速に濾過される。A1Mは、一般に、及び遊離Hbの有毒な酸化的分解産物に対しては特に、優れた抗酸化特性を有する；この特性により、A1Mは、酸化ストレスが関与するか又は遊離Hbの存在が疾患若しくは病的状態を誘導するか若しくは悪化させる種々の疾患の治療又は予防における使用に適切とされる。
A1Mは、幾つかの様式で抗酸化を提供する内因性抗酸化剤である。よって、本発明は、酵素的レダクターゼ特性(カテゴリー１)、非酵素的還元特性(カテゴリー２)及びラジカル-スカベンジング特性(カテゴリー３)を組み合わせることが見出されているA1Mに関する。加えて、非酵素的還元機序(カテゴリー２)は、数回の電子供与サイクルで反復して利用することができる。更に、ラジカル-スカベンジャー機序(カテゴリー３)は、電子の正味の生成をもたらし、この電子が該タンパク質の抗酸化能を更に増大させる。換言すれば、このタンパク質は、それ自体が電子補給を有し、細胞代謝から独立し、そして細胞内でも細胞外でも作働することができる。加えて、A1Mは組織成分が被った酸化的損傷を修復することができる(カテゴリー４に割り当てられた独特な性質)。ラジカルスカベンジング機序の詳細な説明については下記も参照。
【００４７】
A1Mは、保存された三次元構造を有するが、非常に多様な機能を有する動物、植物及び細菌由来のタンパク質群たるリポカリンスーパーファミリーのメンバーである。各リポカリンは、疎水性内部を有するβ-バレルポケットに折り畳まれた160〜190アミノ酸鎖からなる。12のヒトリポカリン遺伝子が既知である。ヒトリポカリンのうち、A1Mは、これまでに哺乳動物、鳥類、魚類及びカエルで同定されている26kDaの血漿及び組織タンパク質である。A1Mは、肝臓で高速に合成され、血流に分泌され、迅速(T1/2＝２〜３分)に血管壁を横切って全ての器官の血管外区画に輸送される。このタンパク質は、より低速ではあるが、他の組織(血液細胞、脳、腎臓、皮膚)でも合成される。A1Mは、血中及び間質組織において、遊離の単量体形態で、及びより大きな分子(IgA、アルブミン、プロトロンビン)との共有結合性複合体としての両方で見出される。小さなサイズに起因して、遊離A1Mは腎臓で血液から迅速に濾過される。その後、大部分は再吸収されるが、相当量が尿に排出される。
【００４８】
A1Mの配列及び構造的特性
ヒトA1Mの完全配列は、Kaumeyerら(5)により最初に報告された。このタンパク質は、183アミノ酸残基からなることが見出されている。以来、他の哺乳動物、鳥類、両生類及び魚類から少なくとも50の更なるA1M cDNA及び/又はタンパク質が検出、単離及び/又は配列決定されている。A1Mのペプチド鎖長は、主にＣ末端の変動に起因して、種間で僅かに異なる。異なる推定アミノ酸配列のアラインメント比較により、同一性パーセンテージがげっ歯類又は肉蹄類(ferungulates)とヒトとの間の約75〜80％から魚類と哺乳動物との間の約45％まで変化することが証明される。34位の遊離システイン側鎖は保存されている。この基は、レドックス反応(下記参照)、他の血漿タンパク質との複合体形成及び黄褐色発色団への結合に関与することが示されている。他のリポカリンの既知のＸ線結晶構造に基づくコンピュータ3Dモデルにより、Cys34が溶媒に曝され、リポカリンポケットの開口部付近に位置することが示唆される。補体因子C8γ(別のリポカリン)もまた、活性C8複合体の生成に関与する34位に不対Cysを有する。
【００４９】
本発明に関しては、用語「α-1-ミクログロブリン」は、配列番号１(ヒトA1M)及び配列番号２(ヒト組換えA1M)で同定されるα-1-ミクログロブリン、並びに類似する治療活性を有するそれらのホモログ、フラグメント又はバリアントを包含するものとする。よって、A1Mは、本明細書で用いる場合、配列番号１又は配列番号２と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を意味するものとする。A1Mは、本明細書で用いる場合、配列番号１又は配列番号２と少なくとも90％の配列同一性を有することが好ましい。A1Mは、本明細書で用いる場合、配列番号１又は配列番号２と少なくとも95％、例えば99％又は100％の配列同一性を有することが更により好ましい。１つの好適な観点において、α-1-ミクログロブリンは、本明細書において同定される配列番号１又は２のとおりである。図10に、ヒトA1M及びヒト組換えA1Mのアミノ酸配列(それぞれ配列番号１及び２)並びに対応するヌクレオチド配列(それぞれ配列番号３及び４)の配列表を示す。しかし、下記で特定されるこのタンパク質の重要な部分を有するA1Mのホモログ、バリアント及びフラグメントもまた、本明細書で用いる場合の用語A1Mに含まれる。
上記のとおり、A1Mのホモログもまた、本明細書の説明に従って用いることができる。理論上、これまでに見出された最も原始的なもの(魚類(プレイス)由来のもの)を含む全ての種からのA1Mを用いることができる。A1Mはまた、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、ウシ及びプレイスからの単離形態で入手可能である。
たとえA1M及びビクニンが同じ前駆体を有するとしても、それらは異なるアミノ酸組成を有し、異なる性質を有することに留意することが重要である。A1Mはいわゆるリポカリンファミリーに属する一方、ビクニン(ウリナスタチンとも呼ばれる)はプロテアーゼインヒビタースーパーファミリーに属する。
【００５０】
A1Mのホモログ、バリアント及びフラグメントを考慮して、以下のものが、抗酸化効果に関するこのタンパク質の重要な部分として同定された：
Y22(チロシン、22位、塩基対64〜66)
C34(システイン、34位、塩基対100〜102)
K69(リジン、69位、塩基対205〜207)
K92(リジン、92位、塩基対274〜276)
K118(リジン、118位、塩基対352〜354)
K130(リジン、130位、塩基対388〜390)
Y132(チロシン、132位、塩基対394〜396)
L180(ロイシン、180位、塩基対538〜540)
I181(イソロイシン、181位、塩基対541〜543)
P182(プロリン、182位、塩基対544〜546)
R183(アルギニン、183位、塩基対547〜549)
(本明細書全体を通して、アミノ酸及びヌクレオチドの番号付けは、配列番号１及び３を参照する；他の種由来の他のA1M、A1Mアナログ又はそれらの組換え配列を用いる場合には、当業者は、活性部位又は酵素活性を担う部位のアミノ酸を同定する方法を理解する)。
よって、A1Mが例えば配列番号１又は２と80％(又は90％又は95％)の配列同一性を有する場合は、上記のアミノ酸は当該分子中の適切な場所に存在することが好ましい。
【００５１】
ヒトA1Mは、３つの位置にてオリゴ糖で置換されており、２つは、Asn17及びAsn96に連結したシアリル化複合体タイプ、おそらくは２つの分岐鎖を有する炭水化物であり、１つは、Thr5に連結したより単純なオリゴ糖である。しかし、異なる種からのA1Mタンパク質の炭水化物含量は、ツメガエル(Xenopus leavis)におけるグリコシル化なしから、多種多様なグリコシル化パターンにわたる範囲まで大きく変化する。
A1Mは、血漿又は尿から精製されると黄褐色に着色している。この着色は、主にポケットへの入口に位置する種々のアミノ酸側基に共有結合した異種化合物が原因である。これら修飾物は、おそらくは、インビボでA1Mが共有結合的に捕捉した有機オキシダントの酸化分解産物、例えばヘム、キヌレニン及びチロシルラジカルである(6-8, 10)。
A1Mはまた、電荷的にもサイズ的にも不均質であり、より褐色が強く着色したA1M分子はより負に荷電している。この不均質性のもっともらしい説明は、異なる側基が異なるラジカルで様々な程度に修飾されており、この修飾物がこのタンパク質の正味電荷を変化させるというものである。共有結合的に連結した着色物質は、Cys34並びにLys92、Lys118及びLys130に位置決めされており、100〜300Daの分子質量を有する。トリプトファン代謝産物キヌレニンは、血液透析患者の尿からのA1Mにおいてリジン残基に共有結合していることが見出されており、この場合の当該タンパク質の褐色の供給源であるとみられる(6)。合成ラジカルABTS(2,2'-アジノ-ジ-(3-エチルベンゾチアゾリン)-6-スルホン酸)の酸化フラグメントは、Y22及びY132の側鎖に結合していた(10)。
【００５２】
C34はA1Mの反応中心である(9)。これは非常に電気的に陰性になり、このことは、C34が、K69、K92、K118及びK130の正に荷電した側鎖の近接によって、電子を供与する能力が高いことを意味する(電子の供与は、硫黄原子の酸化の前提条件であるC34チオール基の脱プロトン化を誘導する)。予備的なデータにより、C34は、最も電気陰性である既知の基の１つであることが示されている。
理論的には、A1Mの独特な酵素性及び非酵素性のレドックス特性を特徴付けるアミノ酸(C34、Y22、K92、K118、K130、Y132、L180、I181、P182、R183)(下記でより詳細に説明する)は、別のフレームワーク上、例えば全体が同じように折り畳まれるタンパク質(別のリポカリン)又は完全に人工的な有機若しくは無機分子(例えば、プラスチックポリマー、ナノ粒子又は金属ポリマー)上に、類似する三次元形状に配置させることができる。
したがって、上記の反応中心及びその周囲を含む構造を含んでなるホモログ、フラグメント又はバリアントが好ましい。
本開示のポリペプチドの構造に改変及び変更をなして、該ポリペプチドと類似する特徴を依然として有する分子を生じさせることは可能である(例えば保存的アミノ酸置換)。例えば、配列中で、認識可能な活性喪失なく、或る特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することが可能である。ポリペプチドの生物学的機能活性を規定するのは当該ポリペプチドの相互作用能及び性質であるので、ポリペプチド配列に或る特定のアミノ酸配列置換をなしたにもかかわらず類似する特性を有するポリペプチドを取得することは可能である。
【００５３】
このような変更を行なうときには、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮することができる。相互作用性生物学的機能のポリペプチドへの付与におけるハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野で一般的に理解されている。或る特定のアミノ酸を、類似するハイドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸と置換することが可能であり、当該置換により類似する生物学的活性を依然として有するポリペプチドがもたらされ得ることは公知である。各アミノ酸は、疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシー指数を割り当てられている。これら指数は次のとおりである：イソロイシン(＋4.5)；バリン(＋4.2)；ロイシン(＋3.8)；フェニルアラニン(＋2.8)；システイン/システイン(＋2.5)；メチオニン(＋1.9)；アラニン(＋1.8)；グリシン(−0.4)；トレオニン(−0.7)；セリン(−0.8)；トリプトファン(−0.9)；チロシン(−1.3)；プロリン(−1.6)；ヒスチジン(−3.2)；グルタミン酸(−3.5)；グルタミン(−3.5)；アスパラギン酸(−3.5)；アスパラギン(−3.5)；リジン(−3.9)；及びアルギニン(−4.5)。
アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、次に該構造が該ポリペプチドと他の分子(例えば、酵素、基質、レセプター、抗体、抗原など)との相互作用を規定すると考えられている。アミノ酸を、類似するハイドロパシー指数を有する別のアミノ酸で置換することが可能であり、該置換により、依然として機能的に等価なポリペプチドを取得し得ることは、当該分野で公知である。このような変更において、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸同士の置換が好ましく、±１以内での置換が特に好ましく、±0.5以内での置換が尚更特に好ましい。
【００５４】
類似のアミノ酸同士の置換は、置換により生じた生物学的機能が等価なポリペプチド又はペプチドを免疫学的実施形態に用いることが意図されている場合には特に、親水性に基づいて行うこともできる。以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン(＋3.0)；リジン(＋3.0)；アスパラギン酸(＋3.0±１)；グルタミン酸(＋3.0±１)；セリン(＋0.3)；アスパラギン(＋0.2)；グルタミン(＋0.2)；グリシン(０)；プロリン(−0.5±１)；トレオニン(−0.4)；アラニン(−0.5)；ヒスチジン(−0.5)；システイン(−1.0)；メチオニン(−1.3)；バリン(−1.5)；ロイシン(−1.8)；イソロイシン(−1.8)；チロシン(−2.3)；フェニルアラニン(−2.5)；トリプトファン(−3.4)。アミノ酸を、類似する親水性値を有する別のアミノ酸で置換することが可能であり、該置換により、依然として生物学的に等価なポリペプチド、特に免疫学的に等価なポリペプチドを取得し得ることが理解される。このような変更において、親水性値が±２以内のアミノ酸同士の置換が好ましく、±１以内での置換が特に好ましく、±0.5以内での置換が尚更特に好ましい。
上記で概説したように、アミノ酸置換は、一般的に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。上記特徴の１以上を考慮した例示的置換は、当業者に周知であり、そのような例示的置換としては、以下のものが挙げられるがそれらに限定されない(元の残基：例示的置換)：(Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln1 His)、(Asp：Glu、Cys、Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn、Gln)、(Ile：Leu、Val)、(Leu：Ile、Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Trp：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)及び(Val：Ile、Leu)。よって、本開示の実施形態は、上記のポリペプチドの機能的又は生物学的等価物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態としては、興味対象のポリペプチドに対して約50％、60％、70％、80％、90％及び95％の配列同一性を有するバリアントを挙げることができる。
【００５５】
本発明に関して、２つのアミノ酸配列間又は２つの核酸配列間の相同性は、パラメータ「同一性」により記述される。配列アラインメント及び相同性スコア算出は、タンパク質及びDNAの両方のアラインメントに有用である完全Smith-Watermanアラインメントを用いて行ってよい。デフォルトのスコア付けマトリクスBLOSUM50及び同一性マトリクスを、それぞれタンパク質アラインメント及びDNAアラインメントに用いる。ギャップ中の最初の残基に対するペナルティは、タンパク質については−12、DNAについては−16である一方、ギャップ中の更なる残基に対するペナルティは、タンパク質については−２、DNAについては−４である。アラインメントは、FASTAパッケージバージョンv20u6を用いて行ってもよい。
タンパク質配列の多重アラインメントは、「ClustalW」を用いて行ってもよい。DNA配列の多重アラインメントは、タンパク質アラインメントをテンプレートとして用い、アミノ酸をDNA配列からの対応するコドンで置き換えて行ってもよい。
或いは、アミノ酸配列及びDNA配列を整列させるために異なるソフトウェアを用いることができる。２つのアミノ酸配列のアラインメントは、例えば、EMBOSSパッケージ(http：//emboss.org)バージョン2.8.0.からのNeedleプログラムを用いることにより決定する。Needleプログラムは、記述されているグローバルアラインメントアルゴリズムを実行する。用いる置換マトリクスはBLOSUM62であり、ギャップ開口ペナルティは10であり、ギャップ伸長ペナルティは0.5である。
【００５６】
アミノ酸配列(例えば、配列番号１)と異なるアミノ酸配列(例えば、配列番号２)との間の同一性の程度は、(当該２つの配列のアラインメント中の厳密一致の数)/(「配列番号１」の長さ又は「配列番号２」の長さ[いずれか短い方])として算出する。結果をパーセント同一性で表わす。
厳密一致は、２つの配列が重複部分の同じ位置に同一のアミノ酸残基を有する場合に起こる。
該当する場合、２つのヌクレオチド配列間の同一性の程度は、アイデンティティテーブルと以下の多重アラインメントパラメータ：ギャップペナルティ10及びギャップ長ペナルティ10で、LASER-GENETM MEGALIGNTMソフトウェア(DNASTAR, Inc.、Madison、WI)を用いるWilbur-Lipman法により決定することができる。ペアワイズアラインメントパラメータは、Ktuple=３、ギャップペナルティ=３及びウィンドウ=20である。
１つの特定の実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸配列の、配列番号１のアミノ酸との又は該アミノ酸に対する同一性のパーセンテージは、ｉ)２つのアミノ酸配列を、BLOSUM62置換マトリクス、ギャップ開口ペナルティ10及びギャップ伸長ペナルティ0.5でNeedleプログラムを用いて整列させ、ii)アラインメント中の厳密一致の数を計数し、iii)厳密一致の数を、該２つのアミノ酸配列のうちの短い方の長さで除し、iv) iii)の除算の結果をパーセンテージに変換することにより決定する。本発明の他の配列に対する又は該配列との同一性のパーセンテージは、同様に算出される。
例えば、ポリペプチド配列は、参照配列と同一であってもよいし(すなわち、100％同一)、参照配列と比較したときに或る特定数(整数)までのアミノ酸変更を含んでいてもよい(その結果、％同一性は100％未満である)。このような変更は、少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換(保存的置換及び非保存的置換を含む)又は挿入から選択される。ここで、変更は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位若しくはカルボキシ末端位に又はこれらの末端位間の任意の場所に、参照配列中でアミノ酸の間に個々に散在して又は参照配列内に１以上の近接群で生じてよい。
【００５７】
保存的アミノ酸バリアントは、天然に存在しないアミノ酸残基を含んでなることができる。天然に存在しないアミノ酸としては、限定されないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチル-グリシン、アロ-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニル-アラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込む幾つかの方法が、当該分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異を抑制するインビトロ系を用いることができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法は、当該分野で公知である。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E. coli S30抽出物と市販の酵素とその他の試薬とを含んでなる無細胞系で行なう。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製する。第２の方法では、翻訳は、アフリカツメガエル卵母細胞で、変異mRNA及び化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより行う。第３の方法では、E. coli細胞を、置換される天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の非存在下、所望の天然に存在しないアミノ酸(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン又は4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸が、対応する天然物の代わりにタンパク質に組み込まれる。天然に存在するアミノ酸残基を、インビトロ化学改変により天然に存在しない種に変換することができる。化学改変を部位特異的変異誘発と組み合わせて、置換の範囲を更に拡張することができる。A1Mの抗酸化特性を支持するに十分な三次元構造を提供する代替の化学構造は、他の技術、例えば人工足場、アミノ酸置換などにより提供してもよい。更に、A1Mの上記活性部位を模倣する構造は、A1Mと同じ機能を有すると考えられる。
【００５８】
鉄結合剤：
トランスフェリン
トランスフェリンは最も重要な血液中の鉄の輸送体である。トランスフェリン-鉄複合体は、該複合体を内在化し解離させる細胞レセプターにより認識され結合される。
フェリチン
この多量体タンパク質は、２つのタイプの24サブユニットからなり、遊離鉄の主要な細胞内貯蔵庫である。これは4500鉄原子/フェリチン分子の高い鉄貯蔵能を有する。フェリチンへの結合により、鉄は酸化還元反応がほとんど防止され、よって酸化的損傷を引き起こすことがほとんど防止される。
【００５９】
１つの更なる実施形態では、Hb結合剤は、Hb及び/又はヘムに特異的な抗体である。
具体的実施形態では、医薬調製物は、Hb結合剤及び/又はヘム結合剤及び/又は鉄隔離剤の組合せを含んでなる。
Hb分解及び/又はヘム分解を刺激する薬剤としては、Hp、Hpx及びHOのようなタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
上記の物質の１又はそれより多くを含有する医薬調製物は、「胎盤」動物、例えばヒト、他の霊長類又は食用哺乳動物に投与されてもよい。投与に好適な動物はヒト又は商業的に価値のある動物若しくは家畜である。
投与は、治療する動物、治療を必要とする動物の状態及び治療する特定の適応症に依存して、種々の方法で実行されてもよい。投与経路は、活性物質が胎児環境(例えば、胎児胎盤循環、羊水など)に輸送され得ることを前提として、経口、直腸、非経口、経鼻胃チューブを通じてであってもよい。非経口経路が好ましい。非経口投与経路の例は、静脈内、腹腔内、筋肉内又は皮下注射である。
医薬調製物の製剤化は、活性成分の薬理学的特性だけでなく、その物理化学的特性及び投与経路の種類にも依存して選択しなければならない。医薬調製物を製剤化する種々の方法は、当業者に周知である。
【００６０】
一般に、A1M(又は本明細書で定義するようなA1Mのアナログ、フラグメント若しくはバリアント)又は本明細書で言及する他の物質のいずれかを含んでなる医薬組成物は、i.v.投与用に製剤化されてもよい。したがって、物質は、液体、例えば溶液、分散液、乳液、懸濁液などで製剤化することができる。本明細書の実施例から分かるように、i.v.投与に適切なビヒクルは、10mM Tris-HCl(pH8.0)及び9.125Ｍ NaClから構成されてもよい。
非経口用途のためには、適切な溶媒としては、水、アルコール、脂質、植物油、プロピレングリコール及びこの目的に一般的に認可されている有機溶媒が挙げられる。一般に、当業者は、「Remington's Pharmaceutical Science」Gennaroら編(Mack Publishing Company)、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」Roweら編(PhP Press)及び特定の製剤タイプに適切な賦形剤及び特定の製剤の製造方法に関する公的モノグラフ(例えばPh.Eur.又はUSP)に指針を見出すことができる。適切な賦形剤としては以下：溶媒(例えば、水、水性媒体、アルコール、植物油、脂質、プロピレングリコールのような有機溶媒など)、浸透圧調整剤(例えば、塩化ナトリウム、マンニトールなど)、可溶化剤、pH調整剤、防腐剤(該当する場合)、吸収増強剤などが挙げられる。
【００６１】
物質は、放射性核種治療投薬との関連で単回投薬されてもよいし、複数回投薬されてもよい。好ましくは、各投薬は、単回投薬として、単回投薬とその後の短時間(60分間まで)の緩徐注入として又は60分までの短時間の緩徐注入のみとしてi.v.投与される。追加の投薬を行なうことができる。A1Mを用いる場合、各投薬は、患者の体重に関連する量のA1Mを含む(１〜15mg A1M/kg患者)。
経口組成物に関しては、組成物は固体、半固体又は液体形態であってよい。適切な組成物には、固体剤形(例えば、全ての種類の錠剤を含む錠剤、薬袋(sachet)及びカプセル)、粉剤、顆粒、ペレット、ビーズ、シロップ、混合物、懸濁物、乳剤などが含まれる。
適切な賦形剤としては、例えば、充填剤、バインダー、崩壊剤、潤滑剤など(以上、固体剤形又は固体形態の組成物用)、溶媒、例えば、水、有機溶媒、植物油など(以上、液体又は半固体形態用)が挙げられる。更に、pH調整剤、味覚マスキング剤、香料、安定化剤などのような添加物を添加してもよい。
更に、活性物質を身体の特異部分に標的付ける特異的担体を含ませることができる。例えば、抗体が胎盤エピトープに対する特異性により胎盤に標的付けられている(「ホーミング」)抗体-A1M複合体；胎盤ホーミング特性(例えば、胎盤に特異的なインテグリン-レセプター)及び大量のA1Mを分泌する人工的な若しくは天然の能力を有する幹細胞又は組換え細胞。薬物が胎盤に集中するので治療はより効率的になる。
【００６２】
用語「有効量」とは、本発明に関しては、所与の病的状態及び投与レジメンに治療効果を提供する量をいう。これは、必要とされる添加剤及び希釈剤；すなわち担体、又は投与ビヒクルとの組合せで所望の治療効果を生じると計算される活性物質の所定の量である。更に、これは、ホストの活性及び応答の臨床的に有意な減損を低減するに(最も好適には防止するに)十分な量を意味するものとする。或いは、治療有効量は、ホストにおける臨床的に有意な状態に改善を引き起こすに十分である。当業者により理解されるように、化合物の量は比活性に依存して変化し得る。適切な投薬量は、必要とされる希釈剤；すなわち、担体、又は添加剤との組合せで、所望の治療効果を生じると計算される活性組成物の所定量を含有し得る。更に、投与すべき投薬量は、使用すべき活性主成分、治療すべき患者の年齢、体重などに依存して変化するが、一般には0,001〜1000mg/kg体重/日の範囲内である。更に、用量は投与経路に依存する。
【００６３】
図面の説明
図１．無細胞HbF濃度とHp濃度との相関 − サンプルは正常妊娠個体(対照)及びPEと診断された女性からのものであった。各患者サンプル(対照及びPE)の無細胞HbF血漿濃度をHp血漿濃度に対してプロットした(Ａ)。対照の無細胞HbF血漿濃度をHp血漿濃度に対してプロットした(Ｂ)。PEと診断された女性の無細胞HbF血漿濃度をHp血漿濃度に対してプロットした(Ｃ)。変量間の関連性を線形回帰分析(ピアソン分析)により評価した(研究Ｉ)。
図２．Hpイソフォームと無細胞HbF濃度及びHp-HbF濃度との間の相関 − 血漿中のHp-イソフォーム(1-1、1-2又は2-2)を、「材料及び方法」に記載したように、３人の患者例(Ａ)でSDS-PAGE及び示され抗-Hp抗体を使用するウェスタンブロットを用いて調べた。異なるイソフォームの分布を、Hp 1-1、1-2及び2-2を有する女性の平均パーセンテージとして、それぞれの群について示した(Ｂ)。各Hpイソフォーム(Hp 1-1、1-2及び2-2)を含む患者サンプルにおいて、無細胞HbF(Ｃ)及びHp-HbF(D)の血漿濃度を別々に示す。Ｂにおいては、結果は、それぞれのHpイソフォーム(Hp 1-1、1-2及び2-2)の平均パーセンテージとして表す。Ｃ及びＤにおいては、結果は無細胞HbF及びHp-HbFの平均±SEM血漿濃度として表す(研究Ｉ)。
図３．Hpx濃度と収縮期/拡張期血圧との相関 − 出産前の最後の２週間以内に測定した最高収縮期(Ａ)及び拡張期(Ｂ)血圧(BP)をHpxの血漿濃度に対してプロットした(研究Ｉ)。
図４．受信者動作特性(ROC)曲線 - HbF、A1M及びHpxの組合せ(Ａ)、Hpx及びA1Mの組合せ(Ｂ)、並びにHpx(Ｃ)についての感度及び特異性を示すROC曲線。曲線下面積(AUC)は、HbF、A1M及びHpxの組合せについては0.88、A1M及びHpxの組合せについては0.92、Hpxについては0.87である(研究Ｉ)。
【００６４】
図５．HbF、Hp、Hpx、A1M及びROSが関与し、PEに至る事象連鎖案の概略図 − この図は、胎盤因子の漏洩を引き起こす胎児母体関門機能の障害を有する胎盤を模式的に示す。１：胎盤における初期事象が胎盤HbF遺伝子及びタンパク質並びにROSのアップレギュレーションを誘導する。２：胎児-母体関門の酸化的損傷及び漏洩が、３：母体血漿HbF濃度の上昇をもたらす。過剰のoxyHbは自己酸化反応を受けて、遊離ヘム基を生じ、ROSを生成する。４：Hp、Hpx及びA1Mから構成されるスカベンジャータンパク質の複雑なネットワークはHbF、ヘム及びROSに結合し、これらを阻害し排除する。無細胞HbFは、Hpに結合され、単球及びマクロファージ細胞へのCD163レセプター媒介取込みにより除去される。遊離ヘム基はHpxにより結合され、ヘムは(好ましくはマクロファージ及び肝細胞に発現した)HpxレセプターCD91により除去される。本研究において、PEを有する女性の母体血漿で、正常妊娠個体と比較して、Hp及びHpxの両方の高度に有意な減少が観察された。このことは、細胞外Hb及びヘムの両方のレベル増加の長期存在を示唆した。本研究における血漿A1Mレベルの分析により、PEを有する女性で正常妊娠個体と比較して有意な増加が、おそらくはA1M遺伝子発現の酸化ストレス誘導アップレギュレーションの結果として示された。
【００６５】
図６．受信者動作特性(ROC)曲線 − 全てのPE予知バイオマーカーとしてのHbF、A1M、ヘモペキシン、ハプトグロビン及びこれらバイオマーカーの組合せの受信者動作曲線。具体値が表10に見出される(研究II)。
図７．受信者動作特性(ROC)曲線 − 母体特性及び全てのPEマーカーとしてのバイオマーカーと母体特性との組合せの受信者動作曲線。具体値が表10に見出される(研究II)。
図８．Hpx30と拡張期血圧との間の相関 − 全ての患者におけるHpx30と拡張期血圧との間の相関。具体値が表５に見出される(研究Ｉ)。
図９．ロジスティック回帰分析 − HbF、Hpx活性、Hpx濃度、ヘム及びHO-1の組合せは、10％の偽陽性率(FPR)での84％のDR及び0.93のAUCを示した。
図10．配列表。
図11．異なる在胎齢で対照と比較したA1Mレベル。
【００６６】
結果の考察
本研究において、本発明者らは、モデル疾患としてPEを利用して、溶血が長期に亢進した病的状況における無細胞Hb防御ネットワークの応答を調べた。よって、PEの疾患進行における無細胞HbFの生理学的関連性及び病理生理学的重要性の可能性を調べるために、本発明者らは、無細胞HbF(遊離のもの(HbFと呼ぶ)及びHpとの複合体状態のもの(Hp-HbFと呼ぶ)の両方)の主要なヒト内因性Hbスカベンジング系：Hp、Hpx、A1M及びCD163に対する影響を調べた。このことにより、本発明者らは、PE診断を支援する生化学マーカーとしてのHbF、Hp-HbF、Hb-トータル、A1M、Hp、Hpx及びCD163の可能性を調べることができた。
本研究において、本発明者らは、PEと診断された妊娠女性及び正常妊娠個体(対照)において、妊娠終了時に、無細胞HbF並びに内因性Hb-及びヘム-スカベンジャー系を特徴付けた。以前の結果と一致して、本発明者らは、PEを有する女性におけるHbFの有意な増加を見出した11。更に、Hb-及びヘムスカベンジャー系の血漿レベルは高度に影響を受け、HbスカベンジャーHp及びヘムスカベンジャーHpxのレベルの有意な低下を示した。興味深いことに、そして以前に公開された研究に沿って、血管外ヘム-及びラジカルスカベンジャーA1Mは、PEを有する女性の血漿中で有意に増加した。
本研究において、本発明者らはまた、調べたバイオマーカーの診断的及び臨床的有用性を評価し、これらをPE及び/又はHELLPを有する女性の診断における臨床ツールとして使用できる明確な可能性を見出した。更に、これらバイオマーカーは臨床的有用性を示し、臨床合併症のリスクにある女性及び胎児の同定を可能とした。
【００６７】
溶血及びその後の無細胞Hb及びヘムの放出は、HELLP症候群、輸血反応、マラリア、出血、敗血症及び鎌状赤血球症を含む広範な臨床状態及び疾患において生じる。無細胞Hb及びヘムの放出は、血行力学の不安定性及び組織損傷が主要な傷害を構成する病理生理学的効果を引き起こす。即時効果としては、動脈圧増大を導く強力な血管拡張剤である一酸化窒素(NO)のスカベンジングが挙げられる。更に、無細胞Hb及び遊離ヘムは、血管壁及び器官内に蓄積され、区画化されて、その後の臓器不全を引き起こすと記載されている。重要なことには、無細胞Hb及びヘムへの長期曝露は、NO涸渇、炎症及び酸化ストレスに関連すると記載されている。
一連の最近の刊行物において、無細胞HbF及びその下流代謝物たる遊離ヘム及びROSの、PE関連損傷及び症状の発症における病因論的関与及び重要性が特徴付けられている。二重胎盤灌流系を用いて、Mayらは、胎児循環への無細胞Hbの添加が、灌流圧、細胞外Hbの母体循環中への胎児母体漏洩、及びPEを有する女性の胎盤において観察されるものに類似する形態学的損傷の有意な増加を引き起こすことを示した。妊娠ヒツジPEモデル及び妊娠ウサギモデルを用いて、飢餓は溶血及び細胞外ヘム及びビリルビンの血中量の増加を引き起こすことが示されている。更に、これらモデルにおいて、重篤な胎盤及び腎臓損傷もまた記載されている。この損傷は、溶血の増加、並びにその後のHb放出及びヘムとROSとの生成により引き起こされるものと考えられた。
【００６８】
本明細書において、本発明者らは、以前の研究に沿って、無細胞HbF(HbF及びHp-HbFの両方)がPEと診断された妊娠女性において有意に増加したことを報告する。よって、これら女性は、血圧上昇及び尿中へのタンパク質漏洩を示す(これらは共に、無細胞Hb及びヘムへの病理生理学的曝露のホールマークである)。
細胞外Hb及び遊離ヘムからの防護のために、ヒトは、幾つかのHb-及びヘム-解毒系を進化させてきた。最もよく研究されているHbスカベンジャー系はHpである。Hpは、血液中で細胞外Hbに非常に効率的に結合し、その結果生じるHp-Hb複合体はマクロファージレセプターCD163への結合により血液から除去される。Hpが大量のHb又はHbへの長期曝露の結果として涸渇する場合、過剰のoxyHbが自己酸化反応を受け、遊離ヘム基及びROSを生じる。更に、過剰な非タンパク質結合Hbは腎臓内に蓄積され、腎臓に損傷を引き起こし、その後に尿中へのタンパク質の漏洩をもたらす46。Hpの涸渇、消耗又は抑圧により、oxyHbは、その下流代謝物metHb、遊離ヘム及びROSに分解されるようになる。血流内の主要なヘムスカベンジャーはHpxであり、これは、細胞、血管及び組織をヘム誘導損傷から保護する高度に特異的で豊富な系である。結合後、Hpxはヘムを、好ましくはマクロファージ、肝細胞、ニューロン及び合胞体栄養細胞層に発現するレセプターCD91を介して送達し、そこで、ヘムはレセプター媒介エンドサイトーシスにより内在化され、その後分解される。
【００６９】
本研究において、正常妊娠個体と比較して、Hp及びHpxの両方の高度に有意な減少が、PEを有する女性の母体血漿において観察された。このことは、細胞外Hb及びヘムの両方のレベル増加の長期存在を示唆した。よって、本発明者らは、非常に高いレベルの無細胞HbFを提示しないけれども、妊娠初期からの低レベル又は中レベルへの継続的曝露(例えば、Dolbergらによる研究は妊娠10〜16週の早期における無細胞HbFレベル増加を示唆している)が、内因性血管内Hb-及びヘム保護系(すなわちHp及びHpx)を消耗させることを提案する。加えて、幾らかのPE患者において、本発明者らは、無細胞HbF(非Hp結合)の高度に有意な増加を観察した。非常に興味深いことに、これら患者の全てがHp 2-2イソフォーム型であることが判明した(図2C)。よって、このPE患者亜群は、無細胞Hbに対する生得の防御が低下している可能性があり、事実、高リスク患者群を構成している可能性がある。
本発明者らは、以前に、ラジカルスカベンジャーA1Mがヘムに結合してこれを分解し、細胞及び組織を酸化、ミトコンドリア-、細胞-及び組織構造に対する損傷と細胞死から保護することを示した。更に、本発明者らは、血漿A1M濃度がPEを有する女性において、妊娠満期及び妊娠早期の両方で有意に増加していることを示した。本研究における血漿A1Mレベルの分析により、以前の公開データが確証され、正常妊娠個体と比較して、PEを有する女性でA1M血漿濃度が有意に増加していることが示された。
【００７０】
PE患者において、A1Mレベルが増加する一方で、Hpレベル及びHpxレベルは減少するのは何故か？幾つかのレポートで、Hb、ヘム及びROSのレベル増大に対する応答として、A1M遺伝子発現が肝臓、皮膚、胎盤及び他の器官で迅速にアップレギュレートすることが示されている。これは、該タンパク質の分泌増大に至り、Hb及びROSの負荷量が増大した病的状況下での血漿濃度増加を生じる。更に、A1Mの非特異的レセプター媒介クリアランス系は溶血又は酸化ストレスの間に誘引されることが示されている一方、Hp及びHpxはHb及びヘムへの結合に際して血漿から除去される。結果として、血漿及び血管外液中のA1M濃度は増加する一方、Hp及びHpxは消耗し、よってそれらの血漿濃度は減少する。
PEの臨床的予知及び診断におけるバイオマーカーの使用に向けた注目が増大している。幾つかのバイオマーカーがこれまでに提案されているが、臨床状況でバイオマーカーの使用を推奨する利用可能な指針はない。最近、米国産科医・婦人科医会議(American Congress of Obstetricians and Gynecologists；ACOG)は、重篤なPEの定義を提案し、そこでは、蛋白尿を、現時点で血小板(＜100,000/マイクロリットル)、血清クレアチニン(＞1.1mg/dl)及び肝臓トランスアミナーゼ(正常濃度の２倍)を含むバイオマーカーの使用に置き換えている。よって、本発明者らは、PE診断を支援するために、バイオマーカーHbF、A1M及びHpxを臨床的に使用し得ることを示唆するデータを提示する。HbF、Hpx及びA1Mの組合せは診断と最も高い相関を示し(５％偽陽性での検出率69％、AUC=0.88、図4A)、Hpx及びA1Mの組合せも高検出率を示した(５％偽陽性での検出率66％、AUC=0.87、図4B)。よって、HbF、Hpx及びA1Mは、PE診断を支援し得る、可能性のある将来的なマーカーを構成する。
【００７１】
Hpx濃度は、血圧(すなわち、この疾患の重篤度)と有意な負の相関を有することが示された(図３)。以前の研究は、活性なHpxが、インビトロで、血管アンジオテンシンIIレセプター(AT(1))をダウンレギュレートし、血管床の拡張を促進することにより、レニン-アンジオテンシン系(RAS)に影響を及ぼすことができることを示している53,54。子癇前症を有する女性における無細胞HbFレベルの増加は、Hpxの消費及びその結果としてのHpx活性の減少を導き、AT(1)レセプター発現の亢進及び血管床の収縮をもたらすという仮説を立て得る。事実、Bakkerら54により、正常妊娠個体の血漿と比較して子癇前症を有する女性の血漿は単球でのAT(1)レセプター発現が増加していることが示された。これは、NO消費と合わせて、PEで観察される細胞外HbFの上昇により引き起こされる重要な血圧調節効果であり得る。
胎児及び母体転帰の予知が可能であることは、臨床的意義が大きい。なぜならば、出産時期を最適化するという困難な課題において医師を援助することができるからである。本研究において、調べたバイオマーカーと或る範囲の母体及び胎児転帰との間の相関を評価した。結果は、HbF、Hp及びHpxがNICUへの収容と相関付けられることをを示した。更に、Hpxは早産と強く関連付けられた。しかし、このコホートにおいては全ての未熟が子癇前症と関連付けられたので、この強い関連性は、Hpxと未熟自体との相関というよりむしろ、Hpxと子癇前症との間の強力な相関の結果であり得る。
【００７２】
この症例対照研究で用いたコホートは正常分布コホートでない、すなわち、PEを有する女性を過剰に含むものであることに留意することが重要である。したがって、結果として、本研究で報告する検出及び予知の率は、３〜８％のPE症例を含む正常分布コホートのものとは異なり得る。
本研究において、本発明者らは、とりわけ、子癇前症を伴う妊娠個体における無細胞HbF及び内因性Hb-及びヘム-スカベンジャー系を特徴付けた。子癇前症を有する女性において、HbFの血漿レベルは有意に上昇していた一方、Hp及びHpxは有意に低下していた。血管外ヘム-及びラジカルスカベンジャー並びに酸化ストレスのマーカーたるA1Mは、子癇前症患者の血漿において、有意に増加していた。更に、HbF及び関連するスカベンジャータンパク質は、より正確な子癇前症診断の臨床バイオマーカーとして及び産科合併症のリスクが増大した妊娠個体の特定を援助する予知因子として使用され得る可能性を示した。
本研究において、HO-1濃度は、特に遅発性PE群において、有意に低下していた。低濃度のHO-1は、PE全体通してのヘム及びHbFレベルの上昇によるこの系に対する連続的な歪みに起因し得る。HO-1酵素は妊娠を通して緩徐にますます減少し、したがって遅発性PEではより低くなる。
【００７３】
血漿ヘム濃度は早発性PE及び遅発性PEの両方で上昇したが、遅発性PEでのみ有意に上昇した。ヘム濃度は明らかにトータルHb濃度と良好に相関した。以前に公開された研究により、PE妊娠を通してのHbFレベルの上昇が 母体Hb及びヘムスカベンジング系に緩徐に負担をかけ、これら(A1M、ハプトグロビン及びヘモペキシン濃度を含む)を涸渇させることが示されている。胎盤での定常的なHbF過剰生産が、胎盤及び母体内皮に対する損傷を誘導する。母体スカベンジャー及び酵素系の強さが、PEのステージ２において臨床的症状が何時どのように提示されるかを決定する重要な構成的因子であり得る。この系が歪めば歪むほど、及び/又は涸渇すればするほど、臨床的症状はますます重篤になる。
相関分析により、全ての患者でHpx活性と拡張期血圧との間に有意な逆相関が示された。
ヘムオキシゲナーゼ１も、収縮期及び拡張期血圧に逆相関した。より高いヘム負荷量がPE患者でHO-1がより低い理由を説明し得る。HO-1の涸渇が抗炎症特性を低減させ、これが次いで母体内皮症を憎悪させ、したがって血圧が上昇する。更に、HO-1によるヘムの分解が、強力な血管拡張剤であるCOを生じる。HO-1レベルの低下は、結果的に、ヘム分解の減少及びCO産生の低減を導く。これが、PE患者で観察される血管床収縮に加わる。
【００７４】
本研究において、本発明者らは、HbF並びにヘモグロブリン-及びヘムスカベンジャータンパク質及び酵素に基づく一連の有望なバイオマーカーを提示する。組合せでの使用で、これらバイオマーカーは、臨床使用に受け容れ可能な十分な検出レベルを達成する。単一マーカーとしてのHpx活性は、10％のFPRで30％のPE症例を検出することができた。ヘム及びHO-1は類似するDRを示した。しかし、Hpx活性、Hpx、HO-1、ヘム及びHbF濃度は、併せて、10％のFPRで84％のPE症例を検出することができた。これは、最良のPEバイオマーカーに匹敵する。更に、提案したモデルに含まれる幾つかのバイオマーカーは、血圧と、したがってPEの臨床的重篤度と相関する。
有望な診断バイオマーカーとしてHb代謝の成分を測定することで、より正確なPE診断が可能である。
【実施例】
【００７５】
実験
材料及び方法
研究Ｉ − 在胎齢34〜40週でのサンプリング
患者及び個体群統計
本研究には、開始時に、150人の妊娠女性が含まれていた。患者は、現在進行中の前向きコホート研究から遡及的に無作為に選択した。排除基準は妊娠高血圧、本態性高血圧及び妊娠糖尿病であった。前妊娠糖尿病又は妊娠関連糖尿病のために合計５症例を排除し、PEを発症している98人(症例)及び正常妊娠個体(対照)47人の合計145人の患者を本研究に含めた。患者個体群統計を表１及び２に記載する。
【００７６】
サンプル収集
本研究は、ルンド大学(スウェーデン)でのヒト被験者に対する研究について倫理委員会の審査会による許可を受けた。患者は、口頭及び書面による説明を受けた後インフォームドコンセントに署名した。ルンド大学病院(スウェーデン)の産科婦人科に入院していた患者から、出産前に母体静脈血サンプルを採取した。サンプルは、６ml血液としてEDTA Vacuette(登録商標)血漿チューブ(Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster，オーストリア)中に採集し、2000×ｇにて20分間遠心分離した。次いで、血漿を凍結チューブに移し、分析時まで−80℃で保存した。各患者についての妊娠転帰をチャートから遡及的に得た。
子癇前症は、血圧≧140/90mmHg及び蛋白尿≧300mg/24時間が少なくとも４時間離れた２時点で観察される、妊娠20週後の新たな高血圧として定義した。これは妊婦における高血圧研究の国際学会(International Society of the Study of hypertension in Pregnancy)の定義50による。蛋白尿の定量値が無い場合には尿検査を許容した。加えて、PE群を早発性PE(診断≦妊娠34＋０週)又は遅発性PE(診断＞妊娠34＋０週)のサブクラスに更に分類した。診断時期が不明のPEが３症例存在したので、これらは早発性PE及び遅発性PEのサブグループを用いる分析には含めなかった。
【００７７】
試薬及びタンパク質
HbFは、臍帯血から抜き取った新鮮な全血から、以前に記載されたように精製した16。ヒトγ鎖は、Kajitaら55により記載されNoble56により改変された、p-安息香酸水銀(Sigma-Aldrich, St-Louis, MO, USA)での精製HbFの解離及び酸性沈降により調製した。(HbA汚染からの)HbF及び(α鎖及びβ鎖汚染からの)γ鎖の絶対的純粋性は、以前に記載されたとおりに決定した11。ヒトγ鎖に対する(したがってHbFに特異的な)マウス抗体はAgriSera AB (Vannas，スウェーデン)が作製し、精製した。抗HbF抗体を、製造業者が記載したとおりに、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Lightning-Link HRP, Innova Biosciences, Cambridge, UK)に接合した。ヒトA1Mは、尿からAkerstrom57により記載されたとおりに精製した。ウサギポリクローナル抗体をヒトA1Mに対して調製し58、ヒトA1Mに対するマウスモノクローナル抗体59、ヤギ抗ヒトA1M及びヤギ抗ウサギ免疫グロブリンは以前に記載されたように調製した60。
【００７８】
胎児性ヘモグロブリン(HbF)濃度
サンドウィッチELISAを非複合体化HbFの定量に用いた。96ウェルマイクロタイタープレートを抗HbF抗体(マウスモノクローナル、PBS中４μg/ml)で一晩室温(RT)にてコーティングした。第２の工程で、ウェルを、ブロッキング緩衝液(PBS中１％ BSA)を用いて２時間ブロックし、続いてHbFキャリブレータ又は患者サンプルと共に２時間RTにてインキュベートした。第３の工程で、HRP接合抗HbF抗体(マウスモノクローナル；1:5000希釈)を加え、２時間RTにてインキュベートした。最後に、即時使用可能な3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB；Life Technologies, Stockholm，スウェーデン)基質溶液を加えた。20分後に1.0Ｍ HClを用いて反応を停止させ、Wallac 1420 Multilabel Counter(Perkin Elmer Life Sciences, Waltham, MA, USA)を用いて吸光度を450nmで読み取った。
【００７９】
ハプトグロビン-胎児性ヘモグロブリン(Hp-HbF)濃度
サンドウィッチELISAをHp-HbFの定量に用いた。このELISAにより、非複合体化HbFと比較してHp-HbFに対する高度な嗜好性が示される(同じHbFモル含量で、HbFキャリブレータシリーズと比較して、10倍より大きいHp-HbFキャリブレータシリーズの回収率)。96ウェルマイクロタイタープレートを抗Hp-HbF抗体(HbF親和性精製ウサギポリクローナル；PBS中４μg/ml)で一晩RTにてコーティングした。第２の工程で、ウェルを、ブロッキング緩衝液(PBS中１％ BSA)を用いて２時間ブロックし、続いてHp-HbFキャリブレータ又は患者サンプルと共に２時間RTにてインキュベートした。第３の工程で、HRP接合抗Hb抗体(HbA親和性精製ウサギポリクローナル；1:5000希釈)を加え、２時間RTにてインキュベートした。最後に、即時使用可能なTMB(Life Technologies)基質溶液を加え、30分後に1.0Ｍ HClを用いて反応を停止させ、Wallac 1420 Multilabel Counter(Perkin Elmer Life Sciences)を用いて吸光度を450nmで読み取った。
【００８０】
トータルヘモグロブリン(Hb-トータル)濃度
母体血漿中のHb-トータルの濃度は、Genway Biotech Inc.(San Diego, CA, USA)のヒトHb ELISA定量キットを用いて決定した。分析は製造業者の指示に従って行い、吸光度を450nmにてWallac 1420 Multilabel Counterを用いて読み取った。
α-1-ミクログロブリン(A1M)濃度
A1Mの125I(Perkin Elmer Life Sciences)での放射性標識はクロラミンＴ法を用いて行なった。タンパク質結合ヨウ素を、Sephadex G-25カラム(PD10, GE Healthcare, Stockholm，スウェーデン)でのゲルクロマトグラフィーにより遊離ヨウ素から分離した。約0.1〜0.2MBq/μgタンパク質の比活性を得た。ヒトA1Mに対するヤギ抗血清(1:6000希釈)を125I標識A1M(約0.05pg/ml)及び未知の患者サンプル又はA1M濃度キャリブレータと混合することにより、ラジオイムノアッセイ(RIA)を行なった。RTにて一晩のインキュベーションの後、抗体結合抗原を、ウシ血清及び15％ポリエチレングリコールを添加することにより沈降させ、2500rpmにて40分間遠心分離し、その後、ペレットの125I活性をWallac Wizard 1470ガンマカウンタ(Perkin Elmer Life Sciences)で測定した。
【００８１】
ハプトグロビン(Hp)濃度
母体血漿中のHpの濃度を、Genway Biotech Inc.のヒトHp ELISA定量キットを用いて決定した。分析は製造業者の指示に従って行い、吸光度を450nmにてWallac 1420 Multilabel Counterを用いて読み取った。
ヘモペキシン(Hpx)濃度
母体血漿中のHpxの濃度を、Genway Biotech Inc.のヒトHpx ELISAキットを用いて決定した。分析は製造業者の指示に従って行い、吸光度を450nmにてWallac 1420 Multilabel Counterを用いて読み取った。
Hpx活性
血漿Hpx活性は、EDTA血漿サンプルにおいて、Hpx-MCA基質(Pepscan[Lelystad，オランダ]による合成)を用いて測定した。血漿サンプル(40μl)を基質溶液(0.2Ｍ Tris＋0.9％ NaCl pH7.6(基質濃度80μM/L)で1:4希釈し、最終体積を200μlとした。発光を460nmにてVarioskan分光光度計(Thermo Fisher)により37℃で測定した。Hpx活性は０分後、30分後(Hpx30)、60分後(Hpx60)及び24時間後に測定した。測定値は、所与の時点でHpxにより異化されたセリンの総量を表す。値が24時間のインキュベーション後に＜５であれば、活性は、アッセイ又はサンプルに関連する技術的問題に起因して非常に低いとみなし、サンプルを更なる分析から除外した。曲線下面積分析は、Hpx30及びHpx60の測定値に基づくものであった(HpxAUC)。測定値Hpx30、Hpx60及びHpxAUCは互いに似ていたので、Hpx30のみを分析に用いた。以下では、Hpx30をHpx活性と呼ぶ。
【００８２】
分化抗原群163(CD163)濃度
母体血漿中のCD163の濃度を、R&D System(Abingdon, UK)のヒトCD163 Duoセットを用いて決定した。分析は製造業者の指示に従って行い、吸光度を450nmにてWallac 1420 Multilabel Counterを用いて読み取った。
SDS-PAGE及びウェスタンブロット
SDS-PAGEは、Bio-Rad(Hercules, CA, USA)の予め成形された４〜20％ Mini-Protean TGXゲルを用いて行い、還元条件下で分子量標準(precision protein plus dual marker Bio-Rad)を用いて泳動させた。分離したタンパク質をポリビニリデンジフルオリド(PVDF)又は低蛍光(LF)PVDFメンブレン(Bio-Rad)に転写した。次いで、このメンブレンをHpに対する抗体(ポリクローナルウサギ抗ヒトHp、12μg/ml, DAKO, Glostrup，デンマーク)と共にインキュベートした。ウェスタンブロットを、HRP接合二次抗体(DAKO)及び化学発光基質Clarity Western ECL(Bio-Rad)を用いて行った。ChemiDoc XRSユニット(Bio-Rad)内でバンドを検出した。Image Labソフトウェア(Bio-Rad)を用いる濃度測定によりA1Mバンドの相対的定量を行なった。
【００８３】
統計学的分析
アップルコンピュータ(Apple Inc., Cupertino, CA)用の統計学コンピュータソフトウェアStatistical Package for the Social Sciences(SPSS Inc., Chicago, IL)バージョン21及びOrigin 9.0ソフトウェア(OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA)を用いてデータを分析した。
ANOVA検定を用いて、臨床的パラメータ(例えば、年齢、BMI、出産経歴、収縮期血圧、拡張期血圧、蛋白尿、出産時の在胎齢、出生時体重、サンプル採取時の在胎齢及び10分の時点でのAPGARスコアについて群間比較を行なった。
Mann-Whitney検定を用いて、Hpx活性、Hpx、HO-1、ヘム、HbF及びトータルHb濃度をPEと対照との間で比較した。早発性PE及び遅発性PEについてサブグループ分析を行なった。
χ二乗検定を用いて、胎児の性別、陣痛誘発、出産の態様(例えば、吸引分娩、帝王切開又は経膣分娩)、新生児集中治療室(NICU)の必要性及び早期産について群間比較を行なった。
PEを有する女性において調べた変量(以下、バイオマーカーと呼ぶ)の平均濃度を、ノンパラメトリック統計学を用い、対照群と比較して評価した。評価したバイオマーカーについて単変量ロジスティック回帰モデルを開発した。サンプル採取時の在胎齢は、ロジスティック回帰モデルにおいて調整した。有意差を示すバイオマーカーは更に、受信者動作曲線(ROC曲線)を用いてROC曲線下面積(AUC)を分析し、異なる偽陽性レベルでの検出率を算出することにより評価した。調べたバイオマーカー及びそれらの異なる組合せの各々について平行分析を行なった。更に、PEを有する女性のサブグループ分析(すなわち、早発性及び遅発性PE)を、対照群と比較して行った。また、単変量ロジスティック回帰モデルを用いて、更に、胎児の転帰(すなわち、NICUへの収容及び未熟産及び子宮内発育遅延(IUGR))及び出産の態様を見積もった。
【００８４】
相関分析
バイオマーカーと拡張期及び収縮期血圧との間の相関分析(ピアソン相関係数)を行なった。全ての検定において、ｐ≦0.05のｐ値を有意とみなした。
Hpx活性とHpx濃度との間の相関は、ノンパラメトリックケンドール相関係数を用いて算出した。更に、相関分析をHpx活性と母体血圧(出産前24時間以内の最高測定血圧と定義)との間で行なった。
相関分析を無細胞Hb(HbF及びトータルHb)、ヘム、HO-1及びヘモペキシン濃度の間でも行なった。更に、ヘム及びHO-1の両方を収縮期及び拡張期の両方の血圧と相関付けた。
ロジスティック回帰分析
検出率は有望なバイオマーカーHpx、HO-1及びヘムの各々についてROC曲線分析により決定した。検出率は10％及び20％の偽陽性率で得た。バイオマーカーの組合せ検出能は、バイオマーカーのステップワイズロジスティック回帰分析及びROC曲線分析により得た。
【００８５】
結果
患者特徴
本研究に含まれた患者の特徴を表１及び２に示す。PEと診断された女性とPEを併発していない妊娠個体(対照と呼ぶ)との間に、年齢、血圧、蛋白尿、出産経歴、サンプル採取時の在胎齢、出産時の在胎齢及び出生時体重について有意差があった。更に、母体転帰(例えば、誘発剤及び器具分娩を含む出産の態様)及び胎児転帰(例えば、NICUへの収容及び未熟)に関するパラメータについて有意差が観察された。10分APGARスコアの有意差が、対照と早発性PEとの間で観察された(遅発性PEとの間にはなし)。BMI及び胎児の性別に関して群間に有意差はなかった。
【００８６】
表１．PE症例及び正常妊娠個体(対照)の患者個体群統計。値は平均値(95％信頼区間)又は個体数(％)として示す。対照に対する統計学的比較。ｐ値＜0.05を有意とみなす。
NS：有意差なし；*：ｐ≦0.05；**：ｐ≦0.001。
【表１】
2016173366.tif 000002
１  早発性PEは妊娠34＋０週前の診断と定義した。
２  遅発性PEは妊娠週齢＞34＋０週と定義した。
３  出産前２週間以内に記録された最高収縮期血圧。
４  出産前２週間以内に記録された最高拡張期血圧。
５  スウェーデンの定義(絶食時P-グルコース≧7.0mmol/L、又はOGTT２時間値P-グルコース＞12.2mmol/L)による妊娠性糖尿病。
６  １人の妊娠性糖尿病患者についてPE診断時期が不明であった。
７  本態性高血圧は妊娠20週前の又は妊娠前であることが既知の状態での血圧≧140/90と定義した。
８  一方の症例では不明であるが、他方の患者はPergotimeを投薬された。
【００８７】
表２．PE症例及び正常妊娠個体(対照)の患者個体群統計。値は平均値(95％信頼区間)又は個体数(％)として示す。対照に対する統計学的比較。ｐ値＜0.05を有意とみなす。NS：有意差なし；*：ｐ≦0.05；**：ｐ≦0.001。
【表２】
2016173366.tif 000003
１  早発性PEは妊娠34＋０週前の診断と定義した。
２  遅発性PEは妊娠週齢＞34＋０週と定義した。
３  HELLP症候群(溶血、肝臓酵素上昇、血小板数低下)はミシシッピー分類に従って診断した。
４  子癇はPE存在下で妊娠中及び出産後に起こる痙攣として定義した。
５  超音波検査で正常曲線を下回る成長曲線として定義されたSGA(Small for Gestational Age；在胎齢のわりに小さな胎児)。
5a  SGA及びIUGRの両方と定義された患者。
６  IUGR(胎内発育遅延)は超音波検査で−２×標準偏差(−22％)又は３パーセンタイル未満として定義した。
７  NICU(新生児集中治療室).
８  早期産は妊娠36＋６週(258日)前の分娩として定義した。
９  出生後10分でのAPGAR(皮膚の色、心拍数、刺激反射、筋緊張、呼吸)スコア。
【００８８】
無細胞Hb
無細胞HbF、Hp-HbF及びHb-トータルの濃度を、PEを有する女性及び対照からの全ての血漿サンプルで分析した(表３)。対照と比較してHbF濃度の４倍増加がPE患者において観察された(ｐ値0.01)。PE群を早発性PE及び遅発性PEに分けたときには、対照と比較してHbF濃度のほぼ５倍増加が早発性PE群において観察された(ｐ値0.006)。遅発性PE群では、対照と比較してほぼ４倍増加が観察され、これは統計学的に有意ではなかった(ｐ値0.17)。
対照と比較して、平均Hp-HbF濃度の統計学的に有意な増加がPEを有する女性について観察された(ｐ値0.018)。この差は、早発性PE及び遅発性PEを比較したときには見い出せなかったが、早期PE群において明らかな増加傾向が観察された(ｐ値0.15)。
PEと対照との間(ｐ値0.53)にも早発性PE(ｐ値0.80)及び遅発性PE(ｐ値0.73)と対照との間にもHb-トータル濃度に有意差は観察されなかった。
【００８９】
表３．PE群及び正常妊娠個体(対照)におけるバイオマーカーの平均血漿濃度。対照に対する統計学的比較。有意性はノンパラメトリック統計学(Mann-Whitney)を用いて計算した。値は平均値(95％CI)である。ｐ値＜0.05を有意とみなした。
【表３】
2016173366.tif 000004
１  早発性PEは妊娠34＋０週前の診断と定義した。
２  遅発性PEは妊娠週齢＞34＋０週と定義した。
【００９０】
Hp及びCD163
血漿中のHp濃度の分析により、PE患者でのHbF濃度の増加はHp濃度の低下を伴うことが示された(表３)。結果は、対照と比較して、PEを有する女性の血漿サンプルにおけるHp濃度の高度に有意な減少を示した(ｐ値＜0.0001)。加えて、遅発性PEは、対照と比較して有意な減少を示した(ｐ値0.001)。対照的に、早発性PEは、対照と比較してHp濃度の僅かな(統計学的に有意でない)増加を示した(ｐ値0.067)。
可溶性(脱離した)CD163(Hp-Hb複合体の排除を媒介するマクロファージレセプター)を、血漿において分析した61-63。分析により、対照と比較してPE群における僅かな(有意でない)増加が示された(ｐ値0.37；表３)。PE群を早発性PE及び遅発性PEに分割すると、僅かな(統計学的に有意でない)増加が遅発性PE群において観察された(対照に対してｐ値0.07)一方、僅かな(統計学的に有意でない)減少が早発性PE群において観察された(対照に対してｐ値0.35)。
【００９１】
Hpx
血管内ヘムスカベンジャータンパク質Hpxの分析により、対照と比較して、PEを有する女性の血漿Hpx濃度に高度に有意な減少が示された(ｐ値＜0.0001；表３)。PE群を亜群に分割すると、対照と比較して早発性PE群(ｐ値＜0.0001)及び遅発性PE群(ｐ値＜0.0001)の両方において有意な減少が示された。
血液サンプルをHpx活性についても分析した。血漿Hpx活性は、EDTA血漿サンプルにおいて、Hpx-MCA基質(Pepscan[Lelystad，オランダ]による合成)を用いて測定した。血漿サンプル(40μl)を37℃にて基質溶液(0.2Ｍ Tris＋0.9％ NaCl pH7.6(基質濃度80μM/L))で1:4希釈して最終体積200μlとした。発光を460nmにてVarioskan分光光度計(Thermo Fisher)で、30分間のインキュベーション(37℃)後に測定した。
Hpx活性は以下の時点で分光光度的に測定した：０分、30分(Hpx30)、60分(Hpx60)及び24時間。測定値は、所与の時点でHpxにより切り取られたセリンの総量を表す。値が24時間後に＜５であれば、活性はおそらくはサンプル損傷に起因して極端に低いとみなし、サンプルを更なる分析から除外した。Hpx30及びHpx60に基づく曲線下面積を算出した。
【００９２】
Hpx活性
11のサンプル(８対照及び３ PE)が24時間のインキュベーション後に「極端に低い値」を示したので、これらを分析から除外した。
Hpx活性は、対照群と比較してPE群において30分後(ｐ=0.02)及び60分後(ｐ=0.05)の両方で、そしてHpxAUC(ｐ=0.02)についても有意に低かった(表３)。しかし、PE患者を早発性PE及び遅発性PEに分けると、早発性群においてはHpx30=0.81であり、これは対照群(Hpx30=0.80)と同じであることが明らかとなった(表４)。これに対して、遅発性群は、全てのHpx活性に関して、PE一般より更に顕著なHpx活性の減少を示した(Hpx30=0.54)(表４)。
興味深いことに、Hpx濃度とHpx活性との間の比を用いて、早発性又は遅発性PEの発症リスクを評価することができる。上記表から理解されるように、正常妊娠個体の比は1.16である一方、早発性PEの比は0.85であり、遅発性PEの比は1.28である。よって、比が対照と比較して低い、すなわち１以下であれば、早発性PEの発症リスクが増大している一方、比が1.2以上であれば、遅発性PEの発症リスクが増大している。Hpx活性は、本明細書に記載のとおり、Hpx30として測定する。
【００９３】
Hpxについての結果
表４
【表４】
2016173366.tif 000005
１  本明細書中で前記したとおり。
【００９４】
相関分析
Hpx活性はHpx血漿濃度と相関付けられなかった(Hpx30についてｐ=0.74)。これは早発性群(ｐ=0.17)においても遅発性PE群(ｐ=0.24)においても事実でなかった。
Hpx30は全ての患者において拡張期血圧と有意に相関付けられ(ｐ=0.04)、Hpx60(ｐ=0.1)及びHpxAUC(ｐ=0.06)についても相関する明らかな傾向があった(表４)。早発性患者を分析から除外すると、拡張期血圧と、Hpx30、Hpx60及びHpxAUCの各々との間に明らかな相関が存在した(表５、図８)。更に、収縮期血圧と、Hpx30(ｐ=0.07)、Hpx60(ｐ=0.17)及びHpxAUC(ｐ=0.11)との間にも相関する明らかな傾向が存在した(表５)。
【００９５】
血圧についての結果：
表５
【表５】
2016173366.tif 000006
【００９６】
以前の知見と一致して、本発明者らは、顕性PE患者においてHpx活性の低減を見い出した。しかし、本発明者らは、Hpx活性が遅発性PE患者でのみ減少し、早発性PE患者ではそうでないことを見い出した。これに反して、そして本明細書に記載されるとおり、Hpxタンパク質濃度は、早発性PE及び遅発性PEの両方で統計学的に有意に減少することが示された。相関分析により、全ての患者においてHpx30と拡張期血圧との間に統計学的に有意な逆相関が示され、Hpx60及びHpxAUCについても同じ逆相関を示す傾向が存在した(表５)。対照及び遅発性群でのみ相関を分析すると、全てのHpx活性と拡張期血圧との間に統計学的に有意な相関があり、収縮期血圧とも統計学的に有意な相関を示す傾向があった。
【００９７】
A1M
ヘム-及びラジカルスカベンジャーA1Mの血漿レベルの分析により、対照と比較してPEを有する女性において血漿A1M濃度の有意な増加が示された(ｐ値0.035；表３)。PE群を亜群に分けると、遅発性PE群において統計学的に有意な増加が観察され(ｐ値0.03)、早発性PE群においては明確であるが統計学的に有意でない増加が観察された(ｐ値0.26)。
相関 − 無細胞HbF及びHp
血漿無細胞HbF及びHpレベルの間の相関を評価した。全ての患者(対照及びPEを有する女性)を含ませた場合、負の相関、すなわち、血漿無細胞HbF濃度の増加が血漿Hp濃度の減少を伴うことを見出した(ｒ=−0.335，ｐ値＜0.0001，ｎ=145)(図1A)。特筆すべきことに、対照(図1B)及びPEを有する女性(図1C)における相関を別々に比較すると、PE群については負の相関の増強が観察された(ｒ=−0.437，ｐ値＜0.0001，ｎ=98)一方、対照群では、弱い正の相関が観察された(ｒ=0.142，ｐ値0.33，ｎ=47)。類似する相関がHp対Hp-HbF及びHp対Hb-トータルについて観察されたが、いずれも統計学的有意性には達しなかった(Hp対Hp-HbF ｒ=−0.05，ｐ値0.52；Hp対Hb-トータル ｒ=0.03，ｐ値0.73)。
【００９８】
Hpイソフォームと無細胞HbF、Hpx及びA1Mのレベルとの間の関連性
本発明者らは、患者血漿サンプルにおいて優勢なHpイソフォーム(1-1、1-2又は2-2)を、ウェスタンブロットを用いて同定した(図2A)。図2Bに見られるように、異なるイソフォームの類似する分布が対照及びPEの両方で観察され、Hp 1-1(Ｃ，12％；PE，15％)と比較して、Hp 1-2(Ｃ,45％；PE，41％)及びHp 2-2(Ｃ，43％；PE，44％)が優勢に存在した。PE群を早発性PE及び遅発性PEに分けても、Hp 1-1(早発性，13％；遅発性，15％)、1-2(早発性，45％；遅発性，40％)及び2-2(早発性，42％；遅発性，45％)の類似する分布が示された。更に、Hpイソフォームと無細胞HbF、Hp-HbF、Hb-トータル、Hp、CD163、Hpx及びA1Mの血漿レベルとの間の関連性を分析した(図2C〜2D)。無細胞HbFの濃度の顕著な増加がPEを有する女性のHp 2-2群で観察された(図2C)。Hp 2-2 PE群において、対照と比較して、より小さいが、類似するHp-HbF濃度増加が観察された(図2D)。Hpイソフォームとの更なる有意な関連性は観察されなかった。
バイオマーカーと疾患重篤度との間の相関分析
ピアソン相関係数を用いる相関分析により、Hpxと血圧との間に高度に有意な逆相関が示された(収縮期血圧(ｒ=−0.511，ｐ値＜0.00001，ｎ=145)及び拡張期血圧(ｒ=−0,520，ｐ値＜0.00001，ｎ=145)(図３)。他のバイオマーカーのいずれも、血圧との間に統計学的に有意な相関は観察されなかった。
【００９９】
診断ツール及び臨床予知因子としてのバイオマーカーの評価
ロジスティック回帰モデルを用いて、上記バイオマーカーのPE診断マーカーとしての有用性を評価した。PEを有する女性と対照との比較により、HbF、A1M及びHpxについては有意差が検出された(ｐ値＜0.0001)が、Hp及びCD163については検出されなかった。有意に変化したバイオマーカーの各々はPEを診断することができた(在胎齢について調整した)が、Hpxは高度の有意性並びに偽陽性率５％での診断検出率64％及び0.87のAUCを示した(表６、図4C)。Hpx、A1M及びHbFの組合せは有意でなかった(HbFのｐ値0.08)が、偽陽性率５％での診断検出率69％及び0.88のAUCを示した(表６、図4A)。組合せHpx及びA1Mは有意であり、偽陽性率５％での診断検出率66％及び0.87のAUCを示した(表６、図4B)。
【０１００】
表６．１)HbF、A1M及びHpxの組合せ、２)A1M及びHpxの組合せ、及び３)Hpx単独についての感度及び特異性値。異なる偽陽性率でのPE検出率及びROC曲線のAUC。計算値は全てPE対対照である。
【表６】
2016173366.tif 000007
１  ３つ全てのパラメータを含むロジスティック回帰に基づく。
２  両パラメータを含むロジスティック回帰に基づく。
【０１０１】
胎児及び母体の転帰の予知
PE診断支援のためのバイオマーカー検査に加え、本発明者らは、バイオマーカーが胎児及び母体の或る種の転帰を予知し得るかどうかを調べた。これは、PEモデルに類似するロジスティック回帰モデルを用いて行なった。調べた胎児転帰はNICUへの収容、IUGR及び未熟であった。調べた母体転帰は分娩誘導、帝王切開及び吸引分娩であった。バイオマーカーHbF(ｐ値0.001)、Hpx(ｐ値0.008)及びHp(ｐ値0.03)は各々「NICUへの収容」の予知バイオマーカーとしての見込みを示した。しかし、組合せロジスティック回帰モデルでは、それらは有意でないと判明した。バイオマーカーHpx(ｐ値0.0003，AUC=0.71)及びCD163(ｐ値0.03，AUC=0.61)は未熟のバイオマーカーとしての見込みを示した。組合せでは、これら２つのバイオマーカーは、未熟との僅かにより強力な関連性(ｐ値0.001及びｐ値0.025，AUC 0.72)を有し、有意であると証明された。
いずれのバイオマーカーも、分娩誘導に関しても、吸引分娩に関しても予知的な値を示さなかった。Hpxは帝王切開と有意な関連性を示した(ｐ値0.009，AUC 0.62)。
【０１０２】
表７．胎児転帰(新生児集中治療室(NICU)への収容及び未熟)及び母体転帰(帝王切開のリスク)に関するROC曲線下面積(AUC)。胎児転帰及び母体転帰(分娩誘導及び吸引分娩)は、いずれのバイオマーカーとも有意には関連しなかった。全ての計算値は単変量ロジスティック回帰分析に基づいた。
【表７】
2016173366.tif 000008
【０１０３】
研究II − 妊娠６〜20週でのサンプル採取
患者及びサンプル
本研究は、セントジョージ大学病院(London, UK)の倫理委員会により許可された。全ての参加者が参加前に書面によるインフォームドコンセントに署名した。2006年〜2007年にかけてセントジョージ病院産科(London)に妊婦定期健診に来院する女性を募った。
妊娠期間は最後の月経期から計算し、超音波頭殿長測定により確証した。母体静脈血サンプルを妊娠６〜20週(平均13.7)の時点で、５mlバキュティナーチューブ(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)に添加剤なしで採集した。凝血後、サンプルを2000×ｇで室温にて10分間遠心分離し、血清を分離して、更なる分析まで−80℃で貯蔵した。
全ての妊娠転帰データを主要出産統合データベースから得て、各個の患者について検証した。PEは本明細書の研究Ｉのとおりに定義した。
研究Ｉと同様に、正常妊娠は、正常血圧での妊娠37＋０週以降の出産として定義した。PEを併発していない妊娠(対照)サンプルは、同じ時期に継続症例として募った。
【０１０４】
トータルHb、HbF、A1M、Hp及びHpxの測定
血清サンプル中のHbF(すなわち無細胞HbF)濃度は、研究Ｉに記載したポリクローナル抗体を用いるサンドウィッチELISAで測定した。A1M濃度は、研究Ｉに記載したラジオイムノアッセイにより決定した。血清サンプル中のHb-トータル、Hp及びHpx濃度は、研究Ｉに記載したそれぞれのマーカーについてELISA定量キットを用いて決定した。
【０１０５】
統計学的分析
アップルコンピュータ用SPSS統計学バージョン21.0を統計学ソフトウェアR studio Version(0.98.1062)と共に用いた。全ての分析においてｐ値≦0.05を有意とみなした。バイオマーカーHbF、Hb-トータル、Hp、Hpx及びA1Mについての群間の有意差は、一元配置ANOVAで計算した。在胎齢の差のため、ドップラ超音波をPE群及び対照群において行なったときには、UtADをVelautharら64による平均値に従うメジアン倍数(MoM)値に変換した。
ステップワイズ回帰分析は予知モデルの開発に通常用いられる方法であるが、批判もある65。したがって、本発明者らは、最近開発された２つの統計学的方法Lasso回帰及びboosted tree回帰による予知モデルを開発することで結果を検証し、予知能力に関してこれら方法を比較することを試みた。これら方法をROC曲線下面積により比較した。予知結果を検証するため、データセットを無作為化して、予知モデルの開発に使用するトレーニングコホート(2/3)及び予知能力の試験に使用する試験コホート(1/3)を作成した。
バイオマーカー及び母体特徴の最終モデルをバックワードステップワイズロジスティック回帰に基いて構築した。早発性PE及び遅発性PEについて別々の分析を行なった。全ての回帰パラメータ及び組合せでのパラメータについて、ROC曲線を作成し、異なる偽陽性率(FPR)での予知率(PR)を算出した。最適予知率/FPRは、ROC曲線中で左上隅に最も近い点として定義した。
【０１０６】
結果
個体群統計
合計520人の女性が参加した。そのうち、86人がPEを発症しており(症例)、65人は自然早産(SPTB)であり、７人はIUGRを伴っており、10人が妊娠誘導性高血圧(PIH)を発症し、１人の患者がIUGR及び胎盤剥離を有し、３人が単独の胎盤剥離を有し(PEもIUGRもなし)、２人が本態性高血圧を有していた。合併症を有しない妊娠及び正期産(＞妊娠37週)であった347人の女性を対照として含めた。
母体特徴を表８に示す。PEを発症した86人の女性のうち、28人が妊娠37+０週前に出産した。このうち、17人は妊娠34＋０週前に出産し、対照より有意に低い出生時体重を示した。PEなし本態性高血圧群(ｎ=２)及び剥離群(ｎ=３)は、サンプルサイズが小さいため、以下の分析から排除した。
【０１０７】
【表８】
2016173366.tif 000009
症例群と対照群との間に血清サンプル採取時期に関して統計学的有意差はなかった。
【０１０８】
バイオマーカー
バイオマーカーHbF、Hp、A1M、Hb-トータル、Hp及びHpxの血清レベルを表９に示す。
表９は、生化学的マーカー無細胞HbF、A1M、Hb-トータル、Hp、Hpx濃度及び子宮動脈ドップラ超音波拍動性指数(UtAD PI)メジアン倍数(MoM)の平均値を95％信頼区間と共に示す。ｐ値は、対照群と比較して一元配置ANOVAで算出した。患者群の妊娠誘導性高血圧及びIUGRの分析は、対照群に対する有意差を示さなかった。
【表９】
2016173366.tif 000010
【０１０９】
PE群におけるHbFの平均濃度(10.8μg/ml，ｐ=0.02)は、対照群(5.6μg/ml)より有意に高かった。HbFはトータルHbFであり、研究Ｉに記載された主に非複合体化HbFに匹敵する。平均A1M濃度もまた有意に増加していた(17.3μg/ml対15.5μg/ml，ｐ=0.03)。PE群における平均Hpx濃度(1062μg/ml)は、対照群における1143μg/mlと比較して有意に低かった(p=0.05)。PE群におけるHp濃度(1102μg/ml)は対照群(971μg/ml)と比較して僅かに高い傾向があったが、有意ではなかった(ｐ=0.089)。PIH又はIUGRは対照に匹敵するレベルを示した(データは示さず)。SPTB群は、有意に低いHb-トータルレベル(201μg/ml対297μg/ml，ｐ=0.05)及びHpxレベル(1061μg/ml対1143，ｐ=0.05)を示した。UtAD MoM値は、PE群において、対照より有意に高かった(1.18対0.95，ｐ＜0.0001)。
ロジスティック回帰分析
PEを予知するバイオマーカーの能力をロジスティック回帰モデルで検定した。対応するROC曲線を作成して予知値を視覚化した。全てのバイオマーカーを個々にも組合せでも評価して、最適予知値を見出した。有意な結果の概要を表10に示し、ROC曲線を図６に示す。
【０１１０】
表10．異なるバイオマーカー、UtAD拍動性(PI) MoM値及び母体特徴の各々についての異なる偽陽性率(FPR)での予知率(PR)。全ての予知値は、ステップワイズロジスティック回帰モデルに基いてROC曲線から導出した。
【表１０】
2016173366.tif 000011
【０１１１】
その後にPEを発症する患者において血清HbF濃度は有意に増加していたにもかかわらず、血清HbF濃度は、単独で用いた場合、限定的な予知値を示した(10％のFPRで15％のPR)。A1Mも類似する予知を示した(10％のFPRで19％のPR)。HpxはPEについて最良の個別予知率を示した(10％のFPRで42％のPR)。A1M、HbF及びHpxの組合せにより最適予知率が得られた(10％のFPRで62％のPR)。
母体特徴の全ての尺度を単独及び組合せで、PEと対照とを比較するロジスティック回帰分析を用いて検定した。
母体特徴(出産経歴、糖尿病、前妊娠高血圧)及びバイオマーカー(HbF、A1M及びHpx)の組合せにより、10％のFPRでのPRが62％に増加し(表10、図７)、UtADと母体特徴との組合せも類似する予知率を示した(10％のFPRで57％のPR)。
早発性子癇前症 対 遅発性子癇前症
本発明者らは早発性PE群及び遅発性PE群の両方でHbFレベルの上昇を見出した(表11)。
【０１１２】
表11．早発性PE亜群(定義：診断≦妊娠34＋０週)及び遅発性PE亜群(定義：診断＞妊娠34＋０週)における平均バイオマーカー濃度。ｐ値は一元配置ANOVAで対照群と比較して算出した。
NS：有意差なし
【表１１】
2016173366.tif 000012
【０１１３】
A1Mレベルは遅発性群においてのみ有意に高かった(ｐ=0.01)(表11)。Hpxタンパク質濃度は両群で低かったが、早発性PE群においてのみ有意であった(ｐ=0.04)(表11)。UtAD PI MoMは、特に早発性群において有意に上昇していた(1.63対0.95，ｐ＜0.00001)が、遅発性群においては僅かにのみ上昇しており、この差は統計学的に有意ではなかった(1.06対0.95，ｐ=0.06)。いずれの研究群においてもHb-トータルにもHpにも有意差はなかった。
調べたバイオマーカーについての早発性PE及び遅発性PEのロジスティック回帰モデルは、遅発性PE群においてのみ、HbFについて10％のFPRで23％の予知率を示した。A1Mは遅発性群においてのみ統計学的に有意であり(ｐ=0.01)、Hpxは早発性群においてのみ統計学的に有意であり、10％のFPRで32％のPRを示した。
UtADは、早発性群において、10％のFPRでのPRが57％である最良の性能であったが、遅発性群においてさえも統計学的に有意であった。
いずれのバイオマーカーも、互いの組合せ、母体特徴又はUtADとの組合せで、早発性群又は遅発性群のいずれにおいても統計学的に有意でなかった。
【０１１４】
考察
本研究の目的は、無細胞HbF及びA1Mの血清レベルが妊娠の第１トリメスターにおいて既に上昇していること及びそれらがその後のPE発症についての第１トリメスターの予知バイオマーカーとして有用であることを示唆する以前の知見を検証することであった。本研究におけるコホートサイズはより大きく、PEの通常の発生率をより良好に反映するものである。加えて、本研究はまた、生物学的に関連するヘム-及びHb-スカベンジングタンパク質Hp及びHpxの影響を評価する。
本明細書における主たる知見は、HbF及びA1Mの両方がその後にPEを発症する妊娠女性の血清中で有意に上昇していることを確証する(表９)。血清HbF濃度の増加は、おそらくは、胎盤の酸化ストレスを反映した胎盤造血の欠陥により引き起こされる。データは、HbF及びA1Mは第１トリメスター及び第２トリメスター初期のPE予知バイオマーカーとして有望であることを示している。更に、ヘムスカベンジャーHpxもまた良好な予知値を示し、したがって更なる有望なPEバイオマーカーとして示唆される。UtAD指数は、主に、早発性群において、より高いPI MoM値を示した。このことは、幾つかの研究グループにより以前に発表された結果と完全に一致する。早発性群における高いPIは、(早発性PEのホールマークであり、遅発性PEでは一般的でない)母体脱落膜螺旋動脈の表在性侵襲の結果としての子宮動脈の抵抗増加を反映する。
【０１１５】
興味深いことに、データにより、無細胞Hb-トータル及びHpxが早産の患者において有意に低いことが示された。Hpxの低い酵素活性は、内皮炎症を減弱させることが知られている。したがって、Hpxレベルの低下はPE及び早期産の両方で観察される母体炎症の増加の原因となり得る。未熟におけるHpxの役割をより注意深く解読するために更なる研究が必要である。
有害な妊娠転帰に特異的な第１トリメスタースクリーニングは非常に重要である。なぜならば、これにより、妊娠後期の一般的なスクリーニングプログラムよりむしろ、患者のサーベイランスを目的とし個別化するツールが医師に提供されるからである。高リスク妊娠個体を特定することにより、防止ストラテジ及び予防的処置を開始することが可能になる。現在までの唯一の予防的処置は、低用量のアセチルサリチル酸(ASA)である。この処置が妊娠16週前に開始される場合、早発性PE及び重症PEについては特に、顕著にリスクが低減する(RR=0.47)。特定された高リスク妊娠個体において重症PEを予防するためには、治療に必要な回数(NNT)は７回程度の低い回数であり得る。ASAの使用は安価であり、推奨される低用量(75mg)で投与される場合には副作用も少ない。この予防的処置は、最適効果を発揮する第１トリメスターの終時に開始すべきである。この観点で、第１トリメスターの終時又は第２トリメスター当初に、可能であればダウン症のための他の確立したスクリーニングプログラムとの組合せで、PEを予知できることが好ましい。
【０１１６】
結論：
妊娠の第１トリメスター終時及び第２トリメスター初期に母体血清において測定したHbF、A1M及びHpxは、その後のPE発症についての有望な予知バイオマーカーである。この３つのタンパク質は生理学的に関連性がある。なぜならば、無細胞HbF量の増加は、病因に関与すると記載されており、おそらくは生理学的ヘム-スカベンジングタンパク質を消費するからである。更に、これら３つのバイオマーカーの予知力は、子宮動脈のドップラ超音波及び/又は母体特徴との組合せで増大する。
【０１１７】
参考文献
1．Duley L. The global impact of pre-eclampsia and eclampsia. Semin Perinatol. 2009;33(3):130-137.
2．Walker JJ. Pre-eclampsia. Lancet. 2000;356(9237):1260-1265.
3．Redman CW, Sargent IL. Latest advances in understanding preeclampsia. Science. 2005;308(5728):1592-1594.
4．Roberts JM, Hubel CA. The two stage model of preeclampsia: variations on the theme. Placenta. 2009;30 Suppl A:S32-37.
5．Anderson UD, Olsson MG, Kristensen KH, Akerstrom B, Hansson SR. Review: Biochemical markers to predict preeclampsia. Placenta. 2012;33 Suppl:S42-47.
6．Rana S, Karumanchi SA, Lindheimer MD. Angiogenic factors in diagnosis, management, and research in preeclampsia. Hypertension. 2014;63(2):198-202.
7．Hawkins TL, Roberts JM, Mangos GJ, Davis GK, Roberts LM, Brown MA. Plasma uric acid remains a marker of poor outcome in hypertensive pregnancy: a retrospective cohort study. BJOG. 2012;119(4):484-492.
8．Muller-Deile J, Schiffer M. Preeclampsia from a renal point of view: Insides into disease models, biomarkers and therapy. World J Nephrol. 2014;3(4):169-181.
9．Hansson SR, Gram M, Akerstrom B. Fetal hemoglobin in preeclampsia: A new etiological factor, a tool for predicting/diagnosis, and a potential target for therapy. Curr Opin Obstet Gynecol. 2013;Epub ahead of print.
10．Centlow M, Carninci P, Nemeth K, Mezey E, Brownstein M, Hansson SR. Placental expression profiling in preeclampsia: local overproduction of hemoglobin may drive pathological changes. Fertil Steril. 2008;90(5):1834-1843.
11．Olsson MG, Centlow M, Rutardottir S, et al. Increased levels of cell-free hemoglobin, oxidation markers, and the antioxidative heme scavenger a1-microglobulin in preeclampsia. Free Radic Biol Med. 2010;48(2):284-291.
12．Anderson UD, Olsson MG, Rutardottir S, et al. Fetal hemoglobin and a1-microglobulin as first- and early second-trimester predictive biomarkers for preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 2011;204(6):520 e521-525.
13．May K, Rosenlof L, Olsson MG, et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by a1-microglobulin. Placenta. 2011;32(4):323-332.
14．Bunn HF. Hemoglobin. Vol. 1st Installment. Weinhem: VCH; 1992.
15．Faivre B, Menu P, Labrude P, Vigneron C. Hemoglobin autooxidation/oxidation mechanisms and methemoglobin prevention or reduction processes in the bloodstream. Literature review and outline of autooxidation reaction. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol. 1998;26(1):17-26.
16．Winterbourn CC. Oxidative reactions of hemoglobin. Methods Enzymol. 1990;186:265-272.
17．Cimen MY. Free radical metabolism in human erythrocytes. Clin Chim Acta. 2008;390(1-2):1-11.
18．Jozwik M, Szczypka M, Gajewska J, Laskowska-Klita T. Antioxidant defence of red blood cells and plasma in stored human blood. Clin Chim Acta. 1997;267(2):129-142.
19．Schaer DJ, Buehler PW, Alayash AI, Belcher JD, Vercellotti GM. Hemolysis and free hemoglobin revisited: exploring hemoglobin and hemin scavengers as a novel class of therapeutic proteins. Blood. 2013;121(8):1276-1284.
20．Alayash AI. Haptoglobin: Old protein with new functions. Clin Chim Acta. 2011;412(7-8):493-498.
21．Kristiansen M, Graversen JH, Jacobsen C, et al. Identification of the haemoglobin scavenger receptor. Nature. 2001;409(6817):198-201.
22．Polticelli F, Bocedi A, Minervini G, Ascenzi P. Human haptoglobin structure and function--a molecular modelling study. FEBS J. 2008;275(22):5648-5656.
23．Ascenzi P, Bocedi A, Visca P, et al. Hemoglobin and heme scavenging. IUBMB Life. 2005;57(11):749-759.
24．Delanghe JR, Langlois MR. Hemopexin: a review of biological aspects and the role in laboratory medicine. Clin Chim Acta. 2001;312(1-2):13-23.
25．Hvidberg V, Maniecki MB, Jacobsen C, Hojrup P, Moller HJ, Moestrup SK. Identification of the receptor scavenging hemopexin-heme complexes. Blood. 2005;106(7):2572-2579.
26．Tenhunen R, Marver HS, Schmid R. The enzymatic conversion of heme to bilirubin by microsomal heme oxygenase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1968;61(2):748-755.
27．Wagener FA, Eggert A, Boerman OC, et al. Heme is a potent inducer of inflammation in mice and is counteracted by heme oxygenase. Blood. 2001;98(6):1802-1811.
28．Allhorn M, Berggard T, Nordberg J, Olsson ML, Akerstrom B. Processing of the lipocalin a1-microglobulin by hemoglobin induces heme-binding and heme-degradation properties. Blood. 2002;99(6):1894-1901.
29．Larsson J, Allhorn M, Akerstrom B. The lipocalin a1-microglobulin binds heme in different species. Arch Biochem Biophys. 2004;432(2):196-204.
30．Allhorn M, Klapyta A, Akerstrom B. Redox properties of the lipocalin a1-microglobulin: reduction of cytochrome c, hemoglobin, and free iron. Free Radic Biol Med. 2005;38(5):557-567.
31．Akerstrom B, Maghzal GJ, Winterbourn CC, Kettle AJ. The lipocalin a1-microglobulin has radical scavenging activity. J Biol Chem. 2007;282(43):31493-31503.
32．Olsson MG, Olofsson T, Tapper H, Akerstrom B. The lipocalin a1-microglobulin protects erythroid K562 cells against oxidative damage induced by heme and reactive oxygen species. Free Radic Res. 2008;42(8):725-736.
33．Grubb AO, Lopez C, Tejler L, Mendez E. Isolation of human complex-forming glycoprotein, heterogeneous in charge (protein HC), and its IgA complex from plasma. Physiochemical and immunochemical properties, normal plasma concentration. J Biol Chem. 1983;258(23):14698-14707.
34．Berggard T, Thelin N, Falkenberg C, Enghild JJ, Akerstrom B. Prothrombin, albumin and immunoglobulin A form covalent complexes with a1-microglobulin in human plasma. Eur J Biochem. 1997;245(3):676-683.
35．Coligan JE. New York: Wiley-Interscience; 1991.
36．Schaer DJ, Vinchi F, Ingoglia G, Tolosano E, Buehler PW. Haptoglobin, hemopexin, and related defense pathways-basic science, clinical perspectives, and drug development. Front Physiol. 2014;5:415.
37．Baek JH, D'Agnillo F, Vallelian F, et al. Hemoglobin-driven pathophysiology is an in vivo consequence of the red blood cell storage lesion that can be attenuated in guinea pigs by haptoglobin therapy. J Clin Invest. 2012;122(4):1444-1458.
38．Reiter CD, Wang X, Tanus-Santos JE, et al. Cell-free hemoglobin limits nitric oxide bioavailability in sickle-cell disease. Nat Med. 2002;8(12):1383-1389.
39．Minneci PC, Deans KJ, Zhi H, et al. Hemolysis-associated endothelial dysfunction mediated by accelerated NO inactivation by decompartmentalized oxyhemoglobin. J Clin Invest. 2005;115(12):3409-3417.
40．Wester-Rosenlof L, Casslen V, Axelsson J, et al. A1M/alpha-1-microglobulin protects from heme-induced placental and renal damage in a pregnant sheep model of preeclampsia. PLoS One. 2014;9(1):e86353.
41．Sverrisson K, Axelsson J, Rippe A, et al. Extracellular fetal hemoglobin induces increases in glomerular permeability: inhibition with alpha-1-microglobulin and tempol. Am J Physiol Renal Physiol. 2014;306(4):F442-448.
42．Di Santo S, Sager R, Andres AC, Guller S, Schneider H. Dual in vitro perfusion of an isolated cotyledon as a model to study the implication of changes in the third trimester placenta on preeclampsia. Placenta. 2007;28 Suppl A:S23-32.
43．Thatcher CD, Keith JC, Jr. Pregnancy-induced hypertension: development of a model in the pregnant sheep. Am J Obstet Gynecol. 1986;155(1):201-207.
44．Talosi G, Nemeth I, Nagy E, Pinter S. The pathogenetic role of heme in pregnancy-induced hypertension-like disease in ewes. Biochem Mol Med. 1997;62(1):58-64.
45．Laurell CB, Nyman M. Studies on the serum haptoglobin level in hemoglobinemia and its influence on renal excretion of hemoglobin. Blood. 1957;12(6):493-506.
46．Olsson MG, Allhorn M, Bulow L, et al. Pathological conditions involving extracellular hemoglobin: molecular mechanisms, clinical significance, and novel therapeutic opportunities for alpha-1-microglobulin. Antioxid Redox Signal. 2012;17(5):813-846.
47．Allhorn M, Lundqvist K, Schmidtchen A, Akerstrom B. Heme-scavenging role of a1-microglobulin in chronic ulcers. J Invest Dermatol. 2003;121(3):640-646.
48．Olsson MG, Rosenlof LW, Kotarsky H, et al. The radical-binding lipocalin A1M binds to a Complex I subunit and protects mitochondrial structure and function. Antioxid Redox Signal. 2013;18(16):2017-2028.
49．Olsson MG, Allhorn M, Larsson J, et al. Up-regulation of A1M/a1-microglobulin in skin by heme and reactive oxygen species gives protection from oxidative damage. PLoS One. 2011;6(11):e27505.
50．Tranquilli AL, Dekker G, Magee L, et al. The classification, diagnosis and managements of the hypertensive disordes of pregnancy: A revised statement from ISSHP. Pregnancy Hypertens. 2014;4:97-104.
51．Brown MA. Pre-eclampsia: proteinuria in pre-eclampsia-does it matter any more? Nat Rev Nephrol. 2012;8(10):563-565.
52．Gynecologists A-ACoOa. Hypertension in pregnancy; 2013.
53．Krikken JA, Lely AT, Bakker SJ, et al. Hemopexin activity is associated with angiotensin II responsiveness in humans. J Hypertens. 2013;31(3):537-541; discussion 542.
54．Bakker WW, Spaans F, el Bakkali L, et al. Plasma hemopexin as a potential regulator of vascular responsiveness to angiotensin II. Reprod Sci. 2013;20(3):234-237.
55．Kajita A, Taniguchi K, Shukuya R. Isolation and properties of the gamma chain from human fetal hemoglobin. Biochim Biophys Acta. 1969;175(1):41-48.
56．Noble RW. The effect of p-hydroxymercuribenzoate on the reactions of the isolated gamma chains of human hemoglobin with ligands. J Biol Chem. 1971;246(9):2972-2976.
57．Akerstrom B, Bratt T, Enghild JJ. Formation of the alpha-1-microglobulin chromophore in mammalian and insect cells: a novel post-translational mechanism? FEBS Lett. 1995;362(1):50-54.
58．Berggard I, Bearn AG. Isolation and properties of a low molecular weight beta-2-globulin occurring in human biological fluids. J Biol Chem. 1968;243(15):4095-4103.
59．Nilson B, Akerstrom B, Logdberg L. Cross-reacting monoclonal anti-a1-microglobulin antibodies produced by multi-species immunization and using protein G for the screening assay. J Immunol Methods. 1987;99(1):39-45.
60．Bjorck L, Cigen R, Berggard B, Low B, Berggard I. Relationships between beta2-microglobulin and alloantigens coded for by the major histocompatibility complexes of the rabbit and the guinea pig. Scand J Immunol. 1977;6(10):1063-1069.
61．Moller HJ, Peterslund NA, Graversen JH, Moestrup SK. Identification of the hemoglobin scavenger receptor/CD163 as a natural soluble protein in plasma. Blood. 2002;99(1):378-380.
62．Moestrup SK, Moller HJ. CD163: a regulated hemoglobin scavenger receptor with a role in the anti-inflammatory response. Ann Med. 2004;36(5):347-354.
63．Van Gorp H, Delputte PL, Nauwynck HJ. Scavenger receptor CD163, a Jack-of-all-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol. 2010;47(7-8):1650-1660.
64．Velauthar L, Plana MN, Kalidindi M, et al. First-trimester uterine artery Doppler and adverse pregnancy outcome: a meta-analysis involving 55,974 women. Ultrasound Obstet Gynecol. 2014;43(5):500-507.
65．Malek MH, Berger DE, Coburn JW. On the inappropriateness of stepwise regression analysis for model building and testing. Eur J Appl Physiol. 2007;101(2):263-264; author reply 265-266.
【図１】
2016173366.tif 000013
【図３】
2016173366.tif 000014
【図４】
2016173366.tif 000015
【図５】
2016173366.tif 000016
【図９】
2016173366.tif 000017
【図１０−１】
2016173366.tif 000018
【図１０−２】
2016173366.tif 000019
【図１０−３】
2016173366.tif 000020
【図１０−４】
2016173366.tif 000021
【図２】
2016173366.tif 000022
【図６】
2016173366.tif 000023
【図７】
2016173366.tif 000024
【図８】
2016173366.tif 000025
【図１１】
2016173366.tif 000026
【配列表】
2016173366000001.app
【外国語明細書】
2016173366000001.pdf