(57)【要約】【課題】時間節約、経済性、正確性と便利性を有する化学発光タンパク質チップ測定方法及びそれに用いられる試薬キットを提供する。【解決手段】タンパク質チップの基質スライドガラスに少なくとも一つの測定サブ領域を含み、一つの前記測定サブ領域が一部血清サンプルを測定する。測定サブ領域内に、設置二つの測定斑区域及び一列の対照斑区域を設定し、その中で一つの測定斑区域に固定αフェトプロテインの特異性抗体により形成された測定斑を有し、その他の測定斑区域に、固定レンズ豆レクチンにより形成された測定斑を有し、前記対照斑区域に固定ウシ血清アルブミンにより形成された対照斑を有する。同じ個測定斑区域内のすべての測定斑が同じ物質濃度を有する。【選択図】図１
2016038375.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清糖タンパク質のフコース指数を測定するのに用いられる化学発光タンパク質チップであって、
基質スライドガラスに少なくとも一つの測定サブ領域を有し、一つの前記測定サブ領域は、一部血清サンプルを測定し、
測定サブ領域内に、二つの測定斑区域及び一列の対照斑区域が設置されており、その中で一つの測定斑区域に固定αフェトプロテインの特異性抗体により形成された測定斑を有し、その他の測定斑区域に、固定レンズ豆レクチンにより形成された測定斑を有し、前記対照斑区域に固定ウシ血清アルブミンにより形成された対照斑を有し、
同じ個測定斑区域内のすべての測定斑が同じ物質濃度を有することを特徴とする化学発光タンパク質チップ。
【請求項２】
一つの前記測定斑区域が少なくとも二つの前記測定斑を含むことを特徴とする請求項１記載の化学発光タンパク質チップ。
【請求項３】
前記αフェトプロテインの特異性抗体がネズミの抗ヒトαフェトプロテイン抗体であることを特徴とする請求項１記載の化学発光タンパク質チップ。
【請求項４】
前記基質スライドガラスに複数の前記測定サブ領域を有し、前記各測定斑区域が１列に配列する四つの測定斑を有し、前記対照斑区域が１列に配列されている四つの対照斑を有し、前記測定斑及び対照斑が平行である三列に配列されていることを特徴とする請求項１記載の化学発光タンパク質チップ。
【請求項５】
前記測定サブ領域の間に物理遮断とする突起が設置されていることを特徴とする請求項４記載の化学発光タンパク質チップ。
【請求項６】
血清糖タンパク質のフコース指数を測定するのに用いられる化学発光試薬キットであって、
請求項１〜４のいずれかに記載の化学発光タンパク質チップを含むことを特徴とする化学発光試薬キット。
【請求項７】
ＡＦＰ標準品、ビオチン標記のＡＦＰマルチクローン抗体、アビジンＨＲＰ及びＨＲＰ化学発光基質液を含み、
前記ビオチン標記のＡＦＰマルチクローン抗体は、ウサギ源抗体であり、前記測定斑の上に固定されたＡＦＰ特異性抗体と比べて、異なる種を源とすることを特徴とする請求項６記載の化学発光試薬キット。
【請求項８】
洗濯及び希釈用一般検査試薬ＰＢＳＴ及びＰＢＳを含むことを特徴とする請求項６記載の化学発光試薬キット。
【請求項９】
αフェトプロテイン及び／又はフコース化αフェトプロテイン及び／又は血清糖タンパク質フコース指数測定面に応用可能である請求項６−８のいずれかに記載の化学発光試薬キット。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化学発光タンパク質チップを使用するフコース化蛋白の定量測定方法であって、
測定待ち血清試料を希釈した後、前記化学発光タンパク質チップの測定サブ領域上に滴加してから、孵化した後、ＰＢＳＴで測定サブ領域を洗って非特異結合物を除去するステップ、
ＰＢＳで希釈されたビオチン標識ＡＦＰ抗体を入れて孵化した後、ＰＢＳＴで洗って非特異結合物を除去するステップ、
ＰＢＳで希釈されたアビジンＨＲＰを入れて孵化した後、ＰＢＳＴで洗って非特異結合物を除去するステップ、および、
ＨＲＰ基質発光液を入れ、化学発光スキャナーでタンパク質チップに対して走査を行い、それぞれ希釈後測定待ち血清試料でのαフェトプロテインの発光画素値及びフコース化タンパク質の発光画素値を得るステップを有するサンプル測定ステップ（１）と、
αフェトプロテイン標準曲線方程式において、ＡＦＰ標準品の勾配濃度値を横座標ｘとし、勾配濃度のＡＦＰ標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ（１）の方法で測定されたαフェトプロテインの発光画素値を縦座標ｙとし、
フコース化タンパク質標準曲線方程式において、ＡＦＰ−Ｌ３標準品でのＡＦＰ−Ｌ３の勾配濃度値を横座標ｘとし、勾配濃度のＡＦＰ−Ｌ３標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ（１）の方法で測定されたフコース化タンパク質の発光画素値を縦座標ｙとし、前記ＡＦＰ−Ｌ３標準品がフコース基タンパク質（ＡＦＰ）を含む血清であるαフェトプロテインの標準曲線方程及びフコース化タンパク質の標準曲線方程式を得るステップ（２）と、
ステップ（１）での測定待ち血清サンプルのαフェトプロテインの発光画素値を前記αフェトプロテイン標準曲線方程式に代入して算出した希釈後血清のαフェトプロテイン濃に希釈倍数を度掛けることで、測定待ち血清αフェトプロテイン濃度を算出し、ステップ（１）での測定待ち血清サンプルのフコース化タンパク質の発光画素値を前記フコース化タンパク質標準曲線方程式に代入して計算した希釈後の血清フコース化タンパク質濃度に希釈倍数を掛けることで測定待ち血清フコース化タンパク質的濃度を算出し、測定待ち血清フコース化タンパク質の濃度と前記測定待ち血清αフェトプロテイン濃度との比をフコース化指数とするステップ（３）と、を含むことを特徴とするフコース化蛋白の定量測定方法。
【請求項１１】
前記孵化は３７℃の条件の下での３０分間インキュベートすることであることを特徴とする請求項１０記載のフコース化蛋白の定量測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質測定技術に係り、特に一種の血清糖タンパク質フコース指数測定用化学発光タンパク質チップ及び測定方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
原発性肝癌は、肝炎と肝硬変等の良性肝病によるαフェトプロテイン（ａｌｐｈａ  ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ，  ＡＦＰ）と比べて、その糖鎖構造に大きな差異を有し、即ち、良性肝病と比べて、肝癌により発生したＡＦＰのフコース指数が遥かに高い。フコースは、レンズ豆レクチン結合特性を有する。ＡＦＰは、その（フコース残基）のレンズ豆レクチンに対する親和力によって、ＡＦＰ−Ｌ１、ＡＦＰ−Ｌ２及びＡＦＰ−Ｌ３に分けられる。その中で、ＡＦＰ−Ｌ１が主に良性肝疾患に由来し、ＡＦＰ−Ｌ２が主に妊婦から生じ、ＡＦＰ_Ｌ３がαフェトプロテインのフコース化形式であり、主にＨＣＣから生じる。２００５年、ＦＤＡは、ＡＦＰ−Ｌ３を原発性肝癌のバイオマーカーの一つとするよう正式に批准する。ＡＦＰ−Ｌ３は、肝癌の早期診断、鑑別診断、治療効果評価及び予後監視等の面で皆高い特異性と敏感性を有する。
【０００３】
フコースは、メチル化された六炭素糖であり、組織及び血清の幾つかの糖タンパク質糖鎖に存在し、タンパク質結合フコース（ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｏｕｎｄ  ｆｕｃｏｓｅ，  Ｐ−ｂｆ）と称される。ＡＦＰ炭水化物チェーンにフコース残基を有し、このような変異体がフコース化ＡＦＰ（ＦｕｃＡＦＰ）と称され、ＡＦＰ総量に占める百分率がフコース化指数（Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ、  Ｆｕｏｌ）と称される。フコース化指数は、重要な理論的意義及び臨床応用的な意義を有し、肝癌診断及び予後応用に重要な指標としても良い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
伝統的な血清フコースタンパク質分離方法は、交差親和免疫電気泳動技術、親和ブロッティング法、アフィニティークロマトグラフィー、「二つの遺伝子座サンドイッチ」エライザ法とＬｉＢＡＳｙｓ（登録商標）測定機器、μＴＡＳＷａｋｏ・ｉ３０（登録商標）測定システム技術及び熱景生物糖鎖捕獲スパンカラム前処理技術を含む。その中で、植物凝集素親和免疫電気泳動技術及びμＴＡＳＷａｋｏ・ｉ３０測定システムは、技術要求が高く、操作が繁雑であり、それに試薬が非常に高価であるので、プロモーションへの応用が制限された。但し、糖鎖捕獲スパンカラムは、試料処理及び測定を別々に行うので、操作の繁雑性を増加した。
【０００５】
本発明は、血清でのＡＦＰとＡＦＰ−Ｌ３定量測定技術のニーズ及びブランクに基づき、生物サンプルでのαフェトプロテイン及び／又はフコース化αフェトプロテインを定量測定するのに用いられ、血清でのＡＦＰ抗原測定だけでなく、その他のフコース化タンパク質測定に通用性を有し、時間節約、経済性、正確性と便利性を有する化学発光タンパク質チップ測定方法及びそれに用いられる試薬キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明による化学発光タンパク質チップは、血清糖タンパク質のフコース指数を測定するのに用いられる化学発光タンパク質チップであって、基質スライドガラスに少なくとも一つの測定サブ領域を有し、一つの前記測定サブ領域は、一部血清サンプルを測定する。測定サブ領域内に、二つの測定斑区域及び一列の対照斑区域が設置されており、その中で一つの測定斑区域に固定αフェトプロテインの特異性抗体により形成された測定斑を有し、その他の測定斑区域に、固定レンズ豆レクチンにより形成された測定斑を有し、対照斑区域に固定ウシ血清アルブミンにより形成された対照斑を有する。同じ個測定斑区域内のすべての測定斑が同じ物質濃度を有する。
【０００７】
また、一つの測定斑区域が少なくとも二つの前記測定斑を含む。
【０００８】
αフェトプロテインの特異性抗体がネズミの抗ヒトαフェトプロテイン抗体である。
【０００９】
基質スライドガラスに複数の測定サブ領域を有し、各測定斑区域が１列に配列する四つの測定斑を有し、対照斑区域が１列に配列されている四つの対照斑を有し、測定斑及び対照斑が平行である三列に配列されている。
【００１０】
測定サブ領域の間に物理遮断とする突起が設置されている。
【００１１】
血清糖タンパク質のフコース指数を測定するのに用いられる化学発光試薬キットであり、上述の化学発光タンパク質チップを含む。
【００１２】
ＡＦＰ標準品、ビオチン標記のＡＦＰマルチクローン抗体、アビジンＨＲＰ及びＨＲＰ化学発光基質液を含む。
ビオチン標記のＡＦＰマルチクローン抗体は、ウサギ源抗体であり、前記測定斑の上に固定されたＡＦＰ特異性抗体と比べて、異なる種を源とする。
【００１３】
洗濯及び希釈用一般検査試薬ＰＢＳＴ及びＰＢＳを含む．
【００１４】
αフェトプロテイン及び／又はフコース化αフェトプロテイン及び／又は血清糖タンパク質フコース指数測定面に応用可能である。
【００１５】
上述の化学発光タンパク質チップを使用するフコース化蛋白の定量測定方法であって、ステップ（１）〜（３）を含む。
ステップ（１）は、
サンプル測定ステップであり、
測定待ち血清試料を希釈した後、前記化学発光タンパク質チップの測定サブ領域上に滴加してから、孵化した後、ＰＢＳＴで測定サブ領域を洗って非特異結合物を除去するステップ、
ＰＢＳで希釈されたビオチン標識ＡＦＰ抗体を入れて孵化した後、ＰＢＳＴで洗って非特異結合物を除去するステップ、
ＰＢＳで希釈されたアビジンＨＲＰを入れて孵化した後、ＰＢＳＴで洗って非特異結合物を除去するステップ、および、
ＨＲＰ基質発光液を入れ、化学発光スキャナーでタンパク質チップに対して走査を行い、それぞれ希釈後測定待ち血清試料でのαフェトプロテインの発光画素値及びフコース化タンパク質の発光画素値を得るステップを有する。
ステップ（２）は、
αフェトプロテインの標準曲線方程及びフコース化タンパク質の標準曲線方程式を得るステップであり、
αフェトプロテイン標準曲線方程式において、ＡＦＰ標準品の勾配濃度値を横座標ｘとし、勾配濃度のＡＦＰ標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ（１）の方法で測定されたαフェトプロテインの発光画素値を縦座標ｙとし、
フコース化タンパク質標準曲線方程式において、ＡＦＰ−Ｌ３標準品でのＡＦＰ−Ｌ３の勾配濃度値を横座標ｘとし、勾配濃度のＡＦＰ−Ｌ３標準品をシリーズ測定待ちサンプルとし、ステップ（１）の方法で測定されたフコース化タンパク質の発光画素値を縦座標ｙとし、前記ＡＦＰ−Ｌ３標準品がフコース基タンパク質（ＡＦＰ）を含む血清である。
ステップ（３）は、ステップ（１）での測定待ち血清サンプルのαフェトプロテインの発光画素値を前記αフェトプロテイン標準曲線方程式に代入して算出した希釈後血清のαフェトプロテイン濃に希釈倍数を度掛けることで、測定待ち血清αフェトプロテイン濃度を算出し、ステップ（１）での測定待ち血清サンプルのフコース化タンパク質の発光画素値を前記フコース化タンパク質標準曲線方程式に代入して計算した希釈後の血清フコース化タンパク質濃度に希釈倍数を掛けることで測定待ち血清フコース化タンパク質的濃度を算出し、測定待ち血清フコース化タンパク質の濃度と前記測定待ち血清αフェトプロテイン濃度との比をフコース化指数とする。
【００１６】
孵化が３７℃の条件の下での３０分間インキュベートすることである。
【００１７】
本発明は、一種の血清糖タンパク質フコース指数測定用化学発光タンパク質チップを提供し、に抗体抗原抗体サンドイッチ反応原理及び化学発光原理に基づき、これと同時に、αフェトプロテイン特異性抗体及びレンズ豆レクチンを固定し、αフェトプロテイン特異性抗体が結合血清でのすべてのαフェトプロテイン（ＡＦＰ−Ｌ１、ＡＦＰ−Ｌ２及びＡＦＰ−Ｌ３）に使用され、但し、レンズ豆レクチンが結合フコース化αフェトプロテインに使用される。これと同時に、対照斑点が設置されている。絶対に同じである条件の下で測定待ち血清でのαフェトプロテイン総濃度及びフコース化αフェトプロテインの濃度を同時に測定でき、それに血清糖タンパク質フコース指数を取得できる。本発明で提供された化学発光タンパク質チップは、少なくとも一つのサブ測定領域を含み、これで一つの血液サンプルを測定できる。殆どの実施形態の中で、好ましくは、少なくとも二つの測定サブ領域を設置することであり、その中で一つのサブ領域が対照血清測定に使用され、その他のサブ領域が測定待ち血液サンプル測定に使用されることである。更に、ハイスループット測定を実現する為に、好ましくは、三つの、四個、五個、六個、七個、八個、九個又は十個という複数の測定サブ領域とすることであり、これで一枚のチップで複数の血清サンプルを測定し、臨床測定効率を向上し、コストを削減できる。図１で示すように、本発明の一つの好ましい実施形態の中で、一つの前記測定サブ領域内に四つのＡＦＰ特異性抗体が固定された測定斑、四つのレンズ豆レクチンが固定された測定斑及び四つの対照斑を有する。二種の測定斑及び対照斑は、それぞれ平行する三列に配列する。
【００１８】
また、本発明は、血清糖タンパク質のフコース指数を測定する化学発光試薬キットを提供する。その中で含む上記タンパク質チップ、化学発光の一般検査試薬と標準曲線方程データ等を含む。
【００１９】
本発明蛋白質チップの使用に三つの面の優位性を有する。
【００２０】
一、殆ど完全に同じ条件の下で血清でのαフェトプロテイン及びフコース化αフェトプロテインを測定することによって、測定されたフコース化指数が一層正しい且つ信頼的であるのを保証すること。
【００２１】
二、複数のサンプルの同時測定を許可すること。複数の重複するサンプル、又は異なる時間点で取るサンプルで動向指数を取得し、又はそれぞれ異なるサンプルで測定する。要するに、ハイスループット測定を実現する。全体に測定コストを削減し、測定効率を向上する。
【００２２】
三、本発明の蛋白質チップを使用すると、血液サンプル及び抗体の需要量を大きく削減できること。原始血清量２．５ｕｌ〜１０ｕｌだけ要り、但し、ＥＬＩＳＡ方法測定が５０ｕｌの血清を要る。タンパク質チップ板の抗体サンプル付けについて、５ｕｌが少なくとも２０枚のチップにサンプルを付けられ、２００部の血清を測定する場合、抗体需要量がＥＬＩＳＡ方法より遥かに低いので、測定コスト及び費用を大きく削減した。
【００２３】
これと同時に、本発明もまた前記試薬キットを利用してフコース化αフェトプロテインに対して定量測定を行う方法を提供した。まず本発明は、購買されたＡＦＰ抗原標準品を採用して勾配濃度の測定待ちＡＦＰ希釈液を調製し、化学発光測定方法を通じて各勾配に相応しい発光画素値を測定し、勾配濃度を横座標とし、蛍光画素値を縦座標として標準曲線を作成し、それに直線回帰方程式を得る。
【００２４】
本発明で提供された血清糖タンパク質フコース指数測定方法は、上記タンパク質チップの上で、抗体と抗原との特異性結合及びレンズ豆レクチン特異性結合の特徴を利用し、血清又は血漿標本を入れて孵化してから、ビオチン標識ＡＦＰマルチクローン抗体とＨＲＰ標記アビジンを入れた後、最後にＨＲＰ発光基質液を入れ、化学発光スキャナーを使用して発光信号に対して走査量化を行う。得た信号値を予め作成した直線回帰方程式に代入し、サンプルでのフコースタンパク質ＡＦＰ−Ｌ３濃度を得る。
【００２５】
本発明の方法の測定原理は、一般化学発光免疫反応と異なり、通常の化学発光免疫反応Ｅｌｉｓａ反応で「抗体−抗原−ワサビダイコンペルオキシダーゼ標識二次抗体」複合物を形成し、最後にＨＲＰ化学発光基質液を入れて発光値を得ることである。但し、ワサビダイコペルオキシダーゼ自身に糖鎖を有するので、本発明での二次抗体にワサビダイコペルオキシダーゼ標記を使用すると、ワサビダイコペルオキシダーゼの糖鎖がレンズ豆レクチンに結合することによって、測定値に厳しく干渉する。本発明で実施された幾つかの実験によりますと、これで正しいフコース化指数を得られず、仮陽性が非常に高く、正常な血清でも十分高いフコース化指数を測定できる。これに基づき、本発明で提供されたチップ及び方法の原理は下記の通りである。抗ＡＦＰ単クローン抗体及びレンズ豆レクチンを順序よくタンパク質チップに固定し、相次いで測定待ち血清、ビオチン標識ＡＦＰマルチクローン抗体及びアビジンＨＲＰを入れ、それぞれ「ＡＦＰ単クローン抗体−ＡＦＰ−ビオチン標識ＡＦＰ多単クローン抗体−アビジンＨＲＰ複合物」及び「レンズ豆レクチン−ＡＦＰ−Ｌ３−ビオチン標識的ＡＦＰ抗体−アビジンＨＲＰ複合物」を形成し、最後ＨＲＰ化学発光基質液を入れて孵化を行い、化学発光機器で走査して発光画素値を取得し、画素値を標準曲線に相応しい直線回帰方程式に代入し、それぞれＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３の濃度を取得し、これでフコース化αフェトプロテインＡＦＰ−Ｌ３のＡＦＰ総量に占める百分率、即ちフコース指数を取得する。
【００２６】
実験結果によりますと、本発明の方法が定性測定だけでなく、発光強度を通じてＡＦＰ及びフコース化ＡＦＰに対する定量測定を実施できるのを証明した。ＥＬＩＳＡ方法と比べて、敏感性及び特異性が皆ＥＬＩＳＡ方法より優れ、時間面から比べると、ＥＬＩＳＡ測定が少なくとも３時間を要り、本発明が１．５時間だけ要る。抗体使用量から比べると、本発明の試薬キットでの蛋白質チップで抗体サンプル付けを行うと、５ｕｌ抗体が少なくとも２０枚のチップの抗体サンプル付けを実施でき、２００部の血清を測定する場合、  抗体需要量がＥＬＩＳＡ方法より遥かに低い。血清使用量から比べると、ＥＬＩＳＡ方法測定が５０ｕｌの血清を要り、但し、本発明の試薬キット及び測定方法で一部血清サンプルを測定する場合、２．５ｕｌ〜１０ｕｌの原始血清量だけ要る。したがって、本発明で提供された試薬キット及び測定方法は、高感度、時間節約と経済性等の特徴を有し、血液タンパク質測定のコスト及び時間を大きく削減できる。
【００２７】
要約すると、本発明の方法は、化学発光測定方法、標準曲線及びタンパク質チップ技術の応用を結びつき、試薬キットでＡＦＰ−Ｌ３定量測定を行う結果の高感度、正確性、高効率性及び低コストを確保できる。本発明で提供された測定方法は、一種の実行可能性、信頼性と経済性のある方法で、これと同時に簡単的な且つ時間を節約する方法である。本発明の技術ソリューションは、大規模な且つハイスループットの血清でのフコース化αフェトプロテイン測定に対して、一種の経済的、信頼的な試薬キット及び測定方法を提供した。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのサンプル付けを示す図である。
【図２】ＡＦＰ／レンズ豆レクチン抗体サンドイッチ法蛋白質チップのフローチャートを示す図である。
【図３】ＡＦＰ蛋白質チップ測定ＡＦＰ標準品結果走査図である。タンパク質チップのサンプル付け抗体が異なる濃度のＡＦＰ抗体であり、即ち、Ａ：１ｍｇ／ｍｌ、Ｂ：０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｃ：０．２５ｍｇ／ｍｌであり、測定物がそれぞれ１．８０ｎｇ／ｍｌ、２．４０ｎｇ／ｍｌ、３．２０ｎｇ／ｍｌ、４．１０ｎｇ／ｍｌ、５．５ｎｇ／ｍｌ、６．肝癌血清、７．肝癌血清、８．ブランク対照、９．健康血清と１０．肝癌血清である。
【図４】ＡＦＰ蛋白質チップでのＡＦＰ３測定標準曲線図及び回帰方程式Ａである。
【図５】ＡＦＰ蛋白質チップでのＡＦＰ測定標準品及び血清サンプル走査図である。測定物がそれぞれ（１−５）８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６．肝癌血清、７．肝癌血清、８肝癌血清、９肝癌血清、１０肝癌血清（チップ抗体サンプル付け抗体がＡＦＰ０．５ｍｇ／ｍｌである）である。
【図６】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおけるＡＦＰ−Ｌ３標準品測定結果走査図である。ＡＦＰ抗体およびレンズレンズマメレクチンはスライドに適用した。Ａ：ＡＦＰ抗体、０．５ｍｇ／ｍｌ；Ｂ：レンズレンズマメレクチン４ｍｇ／ｍｌ；血清試料中の濃度の異なるＡＦＰ−Ｌ３が使われました：（１−５）１００ｎｇ／ｍｌ；５０ｎｇ／ｍｌ；２５ｎｇ／ｍｌ；１２．５ｎｇ／ｍｌ；６．２５ｎｇ／ｍｌ；（６−９）１００ｎｇ／ｍｌ；５０ｎｇ／ｍｌ；２５ｎｇ／ｍｌ；１２．５ｎｇ／ｍｌ。（１０）空白対照。
【図７】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおけるＡＦＰ−Ｌ３測定標準曲線図及び回帰方程式Ｂ。
【図８Ａ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【図８Ｂ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【図８Ｃ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【図８Ｄ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【図８Ｅ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【図８Ｆ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【図８Ｇ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【図８Ｈ】ＡＦＰ／レンズ豆レクチンのチップへのサンプル付けにおける肝癌及び正常な血清サンプル測定走査図。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
次に、具体的な実施形態に結びついて本発明を更なる詳細説明を行い、ただし、本発明の範囲を制限しない。特殊な説明がないと、次の実施形態で使用する操作が皆一般検査方法であり、采用する試薬が皆市場から購入できる。
主な計測機器
化学発光スキャナー（軍事医学科学院研究開発された）
【００３０】
主な試薬及び源
ネズミ源単クローン抗体ＡＦＰ（深セン菲鵬（Ｆａｐｏｎ（登録商標）））、レンズ豆レクチン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））、アルデヒド基チップ（上海百傲（登録商標））、ビオチン標記的ウサギ源抗体（米国ａｂｃａｍ（登録商標））、アビジン−ＨＲＰ（米国ａｂｃａｍ）、ＨＲＰ化学発光基質Ａ液及びＢ液、１：１の比例で混合し、新鮮に調製する。（米国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））。
【００３１】
（実施形態１：蛋白質チップ製作及び使用フロー）
実験で使用する試薬及び測定機器：ネズミ源単クローン抗体ＡＦＰ（深セン菲鵬）。レンズ豆レクチン（Ｓｉｇｍａ）。アルデヒド基チップ（上海百傲）。ビオチン標識ウサギ源一次抗体（米国ａｂｃａｍ）。アビジンＨＲＰ（米国ａｂｃａｍ）、化学発光スキャナー（軍事医学科学院王啓昇教授実験室で研究開発された）。
ＰＢＳ配合成分：塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）８ｇ、塩素化カリウム（ＫＣｌ）０．２ｇ、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．４４ｇ、
リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）０．２４ｇ、ｐＨ７．４に調節し、１Ｌに定容する。
ＰＢＳＴ配合成分：ＰＢＳ、１Ｌ＋Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｌ
【００３２】
チップを有するデヒド基チップ（上海百傲）であり、各チップが１０個測定格子（測定サブ領域）を含み、各格子が一部の血清を測定し、一回で１０部の血清を測定する。
【００３３】
各測定格子内で、ネズミ源単クローン抗体ＡＦＰ（深セン菲鵬）とレンズ豆レクチン（Ｓｉｇｍａ）を相次いでチップに付け、四回サンプル付け、サンプル付け濃度として、単クローン抗体ＡＦＰｍｇ／ｍｌとレンズ豆レクチン４ｍｇ／ｍｌとし、両列八個の測定斑とサンプル付ける。１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を陰性対照として同様に四回サンプル付けて対照斑とサンプル付ける。
タンパク質チップの操作フロー：
製作された蛋白質チップで健康対照組及び肝癌実験組での動態的な血清標本での腫瘍バイオマーカーを測定する。
【００３４】
血清サンプルを１０ｕｌ（又は２．５ｕｌで４倍希釈する），採用してチップに付け、３７℃の下で３０分間インキュベートし、抗原・抗体結合の特性、及びレンズ豆レクチン・フコース結合の特性を利用することによって、血清でのＡＦＰをチップ上の相応しい（ネズミ源）抗体と特異性結合させ、これで抗原抗体（鼠源）複合物を形成させる。レンズ豆レクチンとフコースとの結合によって、レンズ豆レクチン抗原複合物を形成する。
【００３５】
ＰＢＳＴで四回洗うことによって、非特異性結合を除去してから、ＰＢＳで希釈されたビオチン標識ウサギ源一次抗体を入れた後、３７℃の下で３０分間インキュベートする。ウサギ源抗体と抗原との結合によって、ネズミ源抗体−ＡＦＰ（フコース）−ウサギ源ビオチン標識抗体複合物及びレンズ豆レクチン−（ＡＦＰ）フコース−ウサギ源ビオチン標識抗体複合物を形成する。
【００３６】
ＰＢＳＴで四回洗うことによって、非特異性結合を除去してから、ＰＢＳで希釈されたアビジンＨＲＰを入れた後、３７℃の下で３０分間インキュベートする。ビオチンとアビジンとの結合によって、「ネズミ源抗体−ＡＦＰ（フコース）−ウサギ源ビオチン標識抗体−アビジンＨＲＰ複合物」及び「レンズ豆レクチン−（ＡＦＰ）フコース−ウサギ源ビオチン標識体−アビジンＨＲＰ複合物」を形成する。
【００３７】
ＰＢＳＴで４回洗うことによって、非特異性結合を除去してから、ＨＲＰ発光基質液を入れた後、３７℃の下で３０分間インキュベートする。これから化学発光スキャナーで走査を行う。
【００３８】
固相担体上の化学発光画素と標本での被験抗原の量とは正の相関関係であり、この時、複合物での画素値を測定すると、測定待ち抗原含有量を確定できる。チップサンプル付け抗体（ネズミ源一次抗体）及び測定用抗体（ウサギ源一次抗体）は、それぞれ異なる種の動物から取られた。図で示すような両抗体サンドイッチ法タンパク質チップフロー図。
【００３９】
（実施形態２：本発明測定方法の確立）
（１）．標準曲線及び回帰方程式Ａ。
購入されたＡＦＰ抗原（米国ａｂｃａｍ）を採用して異なる濃度勾配に設置し、（１−５）８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６．肝癌血清、７．肝癌血清、８ブランク対照、９健康血清、１０肝癌血清（図３、チップ抗体サンプル付け抗体がＡＦＰ２ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌと０．２５ｍｇ／ｍｌ）とする。
【００４０】
実施形態１での操作フロー及び蛋白質チップ測定ＡＦＰ標準品の各濃度勾配を採用し、測定走査結果は図３で示すようである。測定結果を標準曲線図に製図し、標準物の濃度を横座標とし、画素値を縦座標とし、座標紙で標準曲線を描く。サンプルの画素値によって、標準曲線から相応な濃度を調べる。これで希釈倍数を掛ける。又は標準物の濃度とＯＤ値から標準曲線の直線回帰方程式を計算し、サンプルのＯＤ値を方程式に代入してサンプル濃度を計算した後、これで希釈倍数を掛けると、サンプルの実際濃度を得る。標準曲線及び回帰方程式Ａについて図４を参照して下さい。
【００４１】
購入されたＡＦＰ抗原（米国ａｂｃａｍ）を採用して異なる濃度勾配に設置し、（１−５）８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、６．肝癌血清、７．肝癌血清、８肝癌血清、９肝癌血清、１０肝癌血清（図５、チップ抗体のサンプル付け抗体がＡＦＰ０．５ｍｇ／ｍｌである）。
【００４２】
実施形態１での操作フロー及び蛋白質チップ測定ＡＦＰ標準品の各濃度勾配を採用し、測定走査結果は図３で示すようである。測定結果を標準曲線図に製図し、標準物の濃度を横座標とし、画素値を縦座標とし、座標紙で標準曲線を描く。サンプルの画素値によって、標準曲線から相応な濃度を調べる。これで希釈倍数を掛ける。又は標準物の濃度とＯＤ値から標準曲線の直線回帰方程式を計算し、サンプルのＯＤ値を方程式に代入してサンプル濃度を計算した後、これで希釈倍数を掛けると、サンプルの実際濃度を得る。標準曲線及び回帰方程式Ａについて図４を参照して下さい。
（２）．標準曲線及び回帰方程式Ｂ。
【００４３】
既知ＡＦＰ−Ｌ３濃度の血清を採用し、倍加希釈を行うことによって、異なる濃度の勾配に設置し、（１−５）２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、１２．５ｎｇ／ｍｌ、（６−９）２００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ及び１０ブランク対照（図６）とする。
【００４４】
実施形態１での操作フロー及び蛋白質チップで血清（ＡＦＰ−Ｌ３）標準品の各濃度勾配を測定し、測定走査結果は図６で示すようである。測定結果を標準曲線図に製図し、標準物の濃度を横座標とし、画素値を縦座標とし、座標紙で標準曲線を描く。サンプルの画素値によって、標準曲線から相応な濃度を調べる。これで希釈倍数を掛ける。又は標準物の濃度とＯＤ値から標準曲線の直線回帰方程式を計算し、サンプルのＯＤ値を方程式に代入してサンプル濃度を計算した後、これで希釈倍数を掛けると、サンプルの実際濃度を得る。標準曲線及び回帰方程式Ｂについて図７を参照して下さい。
【００４５】
（実施形態３：サンプルで本発明方法の安定性、正確性及び信頼性を測定・検査する）
血清サンプル：
３９部の肝癌血清：首都医科大学附属佑安医院標本プールを源とする。
３２部の正常な健康人血清。
９部のブランク対照（ブランク対照が１×ＰＢＳである）。
測定フローが実施形態１と同じである。
【００４６】
サンプルの画素値を図４の回帰方程式式Ａに代入して試験品ＡＦＰ濃度を計算し、これで希釈倍数を掛けると、サンプルのＡＦＰ総濃度を得る。サンプルの画素値を図７の回帰方程式式Ｂに代入してサンプルＡＦＰ−Ｌ３濃度を計算し、これで希釈倍数を掛けると、サンプルＡＦＰ−Ｌ３の総濃度を得る。
【００４７】
各チップに１０個の測定サブ領域を有し、健康血清サンプル、肝癌血清サンプルとブランク対照を含み、詳細に説明すると、表１〜１６中のチップコード及び測定サブ領域コードである。
サンプル測定結果と走査結果は、図８Ａ〜図８Ｈを参照して下さい。図８Ａ〜図８Ｈに示すように、８枚のチップで、３９部の肝癌血清サンプル、３２部の正常な健康血清サンプル、および９部のブランク対照サンプルを測定した。
【数１】
2016038375.tif 000003
【００４８】
【数２】
2016038375.tif 000004
【００４９】
測定結果は下表１〜１６に示すようである。
表１〜１６は、臨床サンプルの測定結果統括表である。
【表１】
2016038375.tif 000005
【００５０】
【表２】
2016038375.tif 000006
【００５１】
【表３】
2016038375.tif 000007
【００５２】
【表４】
2016038375.tif 000008
【００５３】
【表５】
2016038375.tif 000009
【００５４】
【表６】
2016038375.tif 000010
【００５５】
【表７】
2016038375.tif 000011
【００５６】
【表８】
2016038375.tif 000012
ＨＣＣ：ＨＣＣ  ｓｅｒｕｍ；  Ｎ：ｎｏｒｍａｌ，  ｈｅａｌｔｈｙ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ；  Ｃ：ｂｌａｎｋ．  ＿：ｎｏ  ｓｉｇｎａｌ
【００５７】
【表９】
2016038375.tif 000013
【００５８】
【表１０】
2016038375.tif 000014
【００５９】
【表１１】
2016038375.tif 000015
【００６０】
【表１２】
2016038375.tif 000016
【００６１】
【表１３】
2016038375.tif 000017
【００６２】
【表１４】
2016038375.tif 000018
【００６３】
【表１５】
2016038375.tif 000019
【００６４】
【表１６】
2016038375.tif 000020
（注）ＨＣＣ：肝癌血清。Ｎ：正常な健康人血清。Ｃ：ブランク対照。＿：陽性信号が測定されていない。
【００６５】
【表１７】
2016038375.tif 000021
【００６６】
現在のＡＦＰ測定レベルは、２０ｎｇ／ｍｌを境界線とし、正常な人が２０ｎｇ／ｍｌ以下とする。ＡＦＰ−Ｌ３（％）＞１０〜１５％は、陽性判断指標である。
本チップの測定結果：
ブランク対照：９部にＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３が測定されていないので、本実験で採用されたチップが有効であることを説明する。
健康血清３２部に、ＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３が測定されていないので、本発明で提供されたチップ及び方法の測定仮陽性が０であることを説明する。
【００６７】
肝癌血清３９部：その中で、２６部にＡＦＰ及びＡＦＰ−Ｌ３が測定され、１１部のサンプルにＡＦＰだけ測定され、ＡＦＰ−Ｌ３が測定されていない。２部のサンプルの中で、ＡＦＰとＡＦＰ−Ｌ３が測定されていない。その中で２部の肝癌血清を有し、標本のＡＦＰ含有量が２０ｎｇ／ｍｌ以下とする。２２部の肝癌血清でのサンプルＡＦＰ−Ｌ３／ＡＦＰ比例が１０％以上とし、４部のサンプルのＡＦＰ−Ｌ３／ＡＦＰ比例が１０％以下とする。証明：本発明のチップ及び方法?出率が下記の通りである。（３９−２−２）／３９＝８９．７４％であり、信頼的な臨床応用価値を有する。
上記データによると、本発明のチップ及び方法が良い安定性、正確性及び信頼性を有することを説明する。
【００６８】
測定中、４部のサンプルでのＡＦＰ−Ｌ３／ＡＦＰ比例が１以上になる原因は、サンプルでのＡＦＰ濃度が高すぎて、１６９ｎｇ／ｍｌより遥かに高いことである。当該チップ画素分析の上限度値２５５を超えた。現実血清測定で、高濃度ＡＦＰ血清の倍加希釈を行うことによって、当該血清の実際ＡＦＰ濃度を測定できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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