(57)【要約】【課題】細胞培養実験をリアルタイムで顕微観察できる装置やシステムを提供する。【解決手段】ガラス基板に透明な材料により形成されたチャンバー用連通路部材とチャンバー部材と薄膜と培養液流路部材と加熱シート部材とを積層して接合することにより１ｃｍ四方内に１０行１０列に配列した１００個のウェルが形成された細胞培養デバイス３０を滅菌水を含んだわた材２８と炭酸ガス濃度調整剤２９と共に透明な材料により形成されたケース箱２３とケース蓋とにより密閉収納して細胞培養装置２０を構成する。加熱シート部材に電圧を印加して細胞培養に適した温度とすることにより、ケース越しに１０行１０列に配列するウェルにおける細胞や胚様体などの細胞塊の培養の様子を長時間に亘ってリアルタイムで観察することができる。【選択図】図１
2016021969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍ行Ｎ列に配列する有効直径が１ｍｍ以下の複数のチャンバーを有するチャンバー部と伸縮性を有し上面に細胞非接着処理が施され前記チャンバー部の上面に前記複数のチャンバーを覆うように接合された薄膜部とを有するチャンバー層と、前記チャンバー層の下面に密着するよう配置され前記複数のチャンバーに対して列毎に連通するＮ個の連通路が形成されたチャンバー用連通路層と、前記チャンバー層の上面に密着するよう配置され前記複数のチャンバーの上面の薄膜部に対して行毎に培養液を供給するＭ個の培養液流路が形成された培養液流路層と、を有する細胞培養デバイスを備え、前記Ｎ個の連通路の流体を排出することにより負圧にして前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のチャンバーの前記薄膜部をチャンバー側に伸張させることによりＭ行Ｎ列に配列する複数のウェルを形成し、前記培養液流路層からのＭ個の培養液流路から供給される細胞を前記複数のウェルで培養する細胞培養装置であって、
前記細胞培養デバイスは、透明で電圧を印加すると加熱する材料により形成され、前記培養液流路層の上面を覆うように配置された加熱層を有し、
透明な材料により形成され、前記細胞培養デバイスを、水や炭酸ガス濃度調整剤などの細胞培養に必要な補助剤等と共に密閉収納可能なケースを備える、
細胞培養装置。
【請求項２】
請求項１記載の細胞培養装置であって、
前記ケースは、前記チャンバー用連通路層の前記Ｎ個の連通路の各々に流体を給排するＮ個の流体給排管が取り付けられていると共に、前記加熱層に電圧を印加する電力ラインが取り付けられている、
細胞培養装置。
【請求項３】
請求項１または２記載の細胞培養装置であって、
前記ケースは、前記培養液流路層の前記Ｍ個の培養液流路の各々に培養液を給排する培養液給排管が取り付けられている、
細胞培養装置。
【請求項４】
請求項１または２記載の細胞培養装置であって、
前記培養液流路層の前記Ｍ個の培養液流路の両端の上部に配置され、前記Ｍ個の培養液流路の両端に各々連通するＮ個の培養液給排部を有する一対の培養液給排部材を備え、
前記ケースは、前記一対の培養液給排部材を収納する、
細胞培養装置。
【請求項５】
細胞の培養試験を観察する細胞培養試験観察システムであって、
請求項１ないし４のうちのいずれか１つの請求項に記載された細胞培養装置と、
前記細胞培養装置を載置して前記複数のチャンバーに形成されるウェルを顕微観察する顕微観察装置と、
を備える細胞培養試験観察システム。
【請求項６】
請求項５記載の細胞培養試験観察システムであって、
前記チャンバー用連通路層の前記Ｎ個の連通路に個別に流体を給排する流体給排手段と、
前記培養液流路層の前記Ｍ個の培養液流路に個別に同一の又は異なる培養液を給排する培養液給排手段と、
前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルのうちのｉ行ｊ列に位置するウェルが指定されたときには、前記Ｎ個の連通路のうちのｊ列の連通路に流体を供給してｊ列のウェルの形成を解除すると共に前記Ｍ個の培養液流路のうちのｉ行の培養液流路に培養液を供給するよう前記流体給排手段と前記培養液給排手段とを制御する細胞排出制御と、該細胞排出制御の後に、ｉ行の培養液流路への培養液の供給を停止すると共にｊ列の連通路の流体を排出することによりｊ列のウェルを形成するよう前記流体給排手段と前記培養液給排手段とを制御するウェル再形成制御と、を実行する制御手段と、
を備える細胞培養試験観察システム。
【請求項７】
請求項６記載の細胞培養試験観察システムであって、
前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルを指定するための指定ボタンをマトリックス状に表示した表示画面を用いて前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルのうちの１個または複数個のウェルの指定が可能な指定手段を備え、
前記制御手段は、前記指定されたウェルに対して前記細胞排出制御と前記ウェル再形成制御とを実行する手段である、
細胞培養試験観察システム。
【請求項８】
請求項７記載の細胞培養試験観察システムであって、
前記表示画面は、前記顕微観察装置により観察された前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルの画像を前記指定ボタンに表示する、
細胞培養試験観察システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置およびこれを備える細胞培養試験観察システムに関し、詳しくは、Ｍ行Ｎ列に配列する有効直径が１ｍｍ以下の複数のチャンバーの各々にウェルを形成し、各ウェルで細胞を培養したり、各ウェルに細胞を凝集させて胚様体を形成し、胚様体に対して種々の操作したりするための細胞培養装置や、この細胞培養装置を用いて細胞や胚様体の培養状況を顕微観察する細胞培養試験観察システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、この種の細胞培養装置としては、シャーレの蓋の上面とシャーレの底面にヒータ用の透明プレートを貼り付けたものが提案されている（例えば、特許文献１参照）。この装置では、透明プレートとしては酸化インジウムスズ（Indium Tin Oxide：ＩＴＯ）により形成された透明導電膜が用いられており、シャーレの底面に貼り付けられた透明プレートには、ヒーターと温度センサーとを構成するための回路が構成されている。こうした透明プレートにより、シャーレ内の温度管理を行いながら細胞培養の顕微観察を可能としている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２０１５０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上述の装置では、比較的短時間の顕微観察には適していても、長時間に亘る顕微観察には湿度管理や炭酸ガス濃度管理を十分に行うことができないため、不向きであった。またシャーレでは、幹細胞の３次元幹細胞凝集塊である胚様体製作において、均一胚様体の大量作製や分化誘導，回収などの操作には適していない。
【０００５】
本願の発明者らは、１００個の均一胚様体の同時作製と、最大１０種の試薬の導入実験と、胚様体の選択的回収を可能とする圧力駆動マルチウェルプレート(Pressure Actuated Shapable Microwell Array, PASMA) を開発し、これを用いて、ヒト幹細胞を用いた胚様体作製・分化誘導実験を行い、ヒト脂肪由来幹細胞を用いた均一胚様体を作製し、複数細胞種への分化誘導、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いた胚様体作製に成功している。こうした、胚様体実験には、長時間に亘るリアルタイムの観察が望まれる。
【０００６】
本発明の細胞培養装置およびこれを備える細胞培養試験観察システムは、細胞培養実験をリアルタイムで顕微観察できる装置やシステムを提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の細胞培養装置およびこれを備える細胞培養試験観察システムは、上述の主目的を達成するために以下の手段を採った。
【０００８】
本発明の細胞培養装置は、
Ｍ行Ｎ列に配列する有効直径が１ｍｍ以下の複数のチャンバーを有するチャンバー部と伸縮性を有し上面に細胞非接着処理が施され前記チャンバー部の上面に前記複数のチャンバーを覆うように接合された薄膜部とを有するチャンバー層と、前記チャンバー層の下面に密着するよう配置され前記複数のチャンバーに対して列毎に連通するＮ個の連通路が形成されたチャンバー用連通路層と、前記チャンバー層の上面に密着するよう配置され前記複数のチャンバーの上面の薄膜部に対して行毎に培養液を供給するＭ個の培養液流路が形成された培養液流路層と、を有する細胞培養デバイスを備え、前記Ｎ個の連通路の流体を排出することにより負圧にして前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のチャンバーの前記薄膜部をチャンバー側に伸張させることによりＭ行Ｎ列に配列する複数のウェルを形成し、前記培養液流路層からのＭ個の培養液流路から供給される細胞を前記複数のウェルで培養する細胞培養装置であって、
前記細胞培養デバイスは、透明で電圧を印加すると加熱する材料により形成され、前記培養液流路層の上面を覆うように配置された加熱層を有し、
透明な材料により形成され、前記細胞培養デバイスを、水や炭酸ガス濃度調整剤などの細胞培養に必要な補助剤等と共に密閉収納可能なケースを備える、
ことを要旨とする。
【０００９】
この本発明の細胞培養装置では、細胞用デバイスは、Ｍ行Ｎ列に配列する有効直径が１ｍｍ以下の複数のチャンバーを有するチャンバー部と伸縮性を有し上面に細胞非接着処理が施されチャンバー部の上面に複数のチャンバーを覆うように接合された薄膜部とを有するチャンバー層と、チャンバー層の下面に密着するよう配置されて複数のチャンバーに対して列毎に連通するＮ個の連通路が形成されたチャンバー用連通路層と、チャンバー層の上面に密着するよう配置されて複数のチャンバーの上面の薄膜部に対して行毎に培養液を供給するＭ個の培養液流路が形成された培養液流路層とを有し、Ｎ個の連通路の流体を排出することによりＭ行Ｎ列に配列する複数のチャンバーの薄膜部をチャンバー側に伸張させてＭ行Ｎ列に配列する複数のウェルを形成し、培養液流路層からのＭ個の培養液流路から供給される細胞（胚様体などの細胞塊を含む）を複数のウェルで培養することができる。そして、透明で電圧を印加すると加熱する材料により形成され培養液流路層の上面を覆うように加熱層を配置した細胞培養デバイスとし、この細胞培養デバイスを水や炭酸ガス濃度調整剤などの細胞培養に必要な補助剤等と共に透明な材料により形成されたケースに密閉収納する。したがって、細胞培養デバイスの加熱層に適当な電圧を印加することにより、Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルにおける細胞培養に適した温度に調整することができると共に、ケース内の十分な加湿と適切な炭酸ガス濃度の調節を行うことができる。また、加熱層もケースも透明な材料で形成されているから、ケース越しにＭ行Ｎ列に配列する複数のウェルにおける細胞の培養の様子や胚様体などの細胞塊の作成の様子，細胞や細胞塊への試薬に対する変化の様子などを長時間に亘ってリアルタイムで観察することができる。ここで、チャンバー用連通路層のＮ個の連通路に給排する流体としては、空気やオイルなどを用いることができる。流体として空気を用いた場合には、流体の排出は負圧にすることを意味する。流体としてオイルを用いる場合、予め各チャンバーと連通路にオイルを充填しておく必要がある。なお、チャンバー用連通路層やチャンバー層，培養液流路層，加熱層は、単一の部材として形成するものとしてもよいし、その一部または全部を異なる部材として形成して積層するものとしても構わない。補助剤としては、上述の水や炭酸ガス濃度調整剤に限定されず、細胞培養に必要なものであれば如何なるものでもよい。
【００１０】
こうした本発明の細胞培養装置において、前記ケースは、前記チャンバー用連通路層の前記Ｎ個の連通路の各々に流体を給排するＮ個の流体給排管が取り付けられていると共に、前記加熱層に電圧を印加する電力ラインが取り付けられている、ものとすることもできる。また、前記ケースは、前記培養液流路層の前記Ｍ個の培養液流路の各々に培養液を給排する培養液給排管が取り付けられているものとすることもできる。こうすれば、チャンバー用連通路層のＮ個の連通路のうちのＭ行Ｎ列におけるｊ列に相当する連通路に流体を供給することによりｊ列のウェルの形成を解除し、この状態で培養液流路層のＭ個の培養液流路のうちのＭ行Ｎ列におけるｉ行に相当する培養液流路に培養液を流すことにより、Ｍ行Ｎ列におけるｉ行ｊ列に位置するウェルで培養されている細胞や胚様体などの細胞塊（以下、「細胞等」と称する。）を外部に取り出すことができる。そして、細胞等を取り出した後は、培養液流路層のｉ行に相当する培養液流路への培養液の流通を停止し、チャンバー用連通路層のｊ列に相当する連通路を介して流体を排出してｊ列のウェルを形成することにより、ｊ列のウェルで培養されている細胞等のうちｉ行のものを除いてウェルにおける細胞等の培養を継続することができる。即ち、Ｍ行Ｎ列のウェルで培養されている細胞等のうちの所望のｉ行ｊ列の細胞等を取り出し、その後、他のウェルでの細胞等の培養を継続することができるのである。ここで、「細胞等の培養」は、細胞等への試薬の投与も含む意であり、以下同様である。
【００１１】
また、本発明の細胞培養装置において、前記培養液流路層の前記Ｍ個の培養液流路の両端の上部に配置され前記Ｍ個の培養液流路の両端に各々連通するＮ個の培養液給排部を有する一対の培養液給排部材を備え、前記ケースは前記一対の培養液給排部材を収納する、ものとすることもできる。
【００１２】
本発明の細胞培養試験観察システムは、
細胞の培養試験を観察する細胞培養試験観察システムであって、
上述のいずれかの態様の本発明の細胞培養装置と、
前記細胞培養装置を載置して前記複数のチャンバーに形成されるウェルを顕微観察する顕微観察装置と、
を備えることを要旨とする。
【００１３】
この本発明の細胞培養試験観察システムでは、上述のいずれかの態様の本発明の細胞培養装置と顕微観察装置とを備えるから、ケース越しにＭ行Ｎ列に配列する複数のウェルにおける細胞培養の様子や胚様体などの細胞塊の作成の様子，細胞や細胞塊への試薬に対する変化の様子などを長時間に亘ってリアルタイムで顕微観察することができる。
【００１４】
こうした本発明の細胞培養試験観察システムにおいて、前記チャンバー用連通路層の前記Ｎ個の連通路に個別に流体を給排する流体給排手段と、前記培養液流路層の前記Ｍ個の培養液流路に個別に同一の又は異なる培養液を給排する培養液給排手段と、前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルのうちのｉ行ｊ列に位置するウェルが指定されたときには、前記Ｎ個の連通路のうちのｊ列の連通路に流体を供給してｊ列のウェルの形成を解除すると共に前記Ｍ個の培養液流路のうちのｉ行の培養液流路に培養液を供給するよう前記流体給排手段と前記培養液給排手段とを制御する細胞排出制御と、該細胞排出制御の後に、ｉ行の培養液流路への培養液の供給を停止すると共にｊ列の連通路の流体を排出することによりｊ列のウェルを形成するよう前記流体給排手段と前記培養液給排手段とを制御するウェル再形成制御と、を実行する制御手段と、を備えるものとすることもできる。こうすれば、Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルのうちのｉ行ｊ列に位置するウェルを指定するだけで、ｉ行ｊ列のウェルで培養されている細胞等を取り出し、その後、他のウェルでの細胞等の培養を継続することができる。この態様の本発明の細胞培養試験観察システムにおいて、前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルを指定するための指定ボタンをマトリックス状に表示した表示画面を用いて前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルのうちの１個または複数個のウェルの指定が可能な指定手段を備え、前記制御手段は、前記指定されたウェルに対して前記細胞排出制御と前記ウェル再形成制御とを実行する手段である、ものとすることもできる。こうすれば、取り出すべき細胞等を培養している１個または複数個のウェルを容易に指定して取り出すことができる。この場合、前記表示画面は、前記顕微観察装置により観察された前記Ｍ行Ｎ列に配列する複数のウェルの画像を前記指定ボタンに表示するものとすることもできる。こうすれば、リアルタイムで観察されているＭ行Ｎ列に配列する複数のウェルで培養されている細胞等の画像を見ながら取り出すべき細胞等を指定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施例としての細胞培養装置２０の構成の概略を示す構成図である。
【図２】ケース蓋２１の構成の概略を示す構成図である。
【図３】図１におけるＡ−Ａ断面の一部を拡大して示す部分断面図である。
【図４】チャンバー用連通路部材４０の構成の一例を示す説明図である。
【図５】チャンバー部材５０の構成の一例を示す説明図である。
【図６】培養液流路部材６０の構成の一例を示す説明図である。
【図７】培養液給排部材６５，６６の構成の一例を示す説明図である。
【図８】加熱シート部材７０の構成の概略を示す説明図である。
【図９】加熱シート部材７０における印加された電圧（Ｖ）と温度との関係の一例を示す説明図である。
【図１０】細胞培養装置２０において胚様体（細胞塊）の作成プロセスの各状態を模式的に示す説明図である。
【図１１】細胞培養装置２０において培養されている胚様体の回収プロセスの各状態を模式的に示す説明図である。
【図１２】実施例の細胞培養試験観察システム１２０の構成の概略を示す構成図である。
【図１３】流体給排装置１４０の構成の概略を示す構成図である。
【図１４】培養液給排装置１５０の構成の概略を培養液給排部材６５，６６の給排孔６５ａ〜６５ｊ，６６ａ〜６６ｊと共に示す構成図である。
【図１５】コンピュータ１６０により実行される回収制御ルーチンの一例を示すフローチャートである。
【図１６】ディスプレイ１７０に表示されるウェル指定画面の一例を示す説明図である。
【図１７】変形例のウェル指定画面の一部を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
次に、本発明を実施するための形態を実施例を用いて説明する。
【実施例】
【００１７】
図１は、本発明の一実施例としての細胞培養装置２０の構成の概略を示す構成図であり、図２は、実施例の細胞培養装置２０のケース蓋２１の構成の概略を示す構成図であり、図３は、図１におけるＡ−Ａ断面の一部を拡大して示す部分断面図である。実施例の細胞培養装置２０は、細胞や胚様体などの細胞塊（以下、「細胞等」と称する。）を培養する細胞培養デバイス３０と、滅菌水を含んだわた材２８と、炭酸ガス濃度調整剤２９と、をケース蓋２１とケース箱２３とにより密閉収納して構成される。なお、ケースの外寸は、幅７ｃｍ、奥行き４ｃｍ、高さ１．５ｃｍ程度である。
【００１８】
ケース箱２３は、透明な樹脂により形成されており、図１に示すように、仕切り壁２４ａ，２４ｂにより、デバイス収納部２５ａと、滅菌水収納部２５ｂと、炭酸ガス濃度調整剤収納部２５ｃとが画成されている。ケース箱２３の図中左側の側面には電力ラインを外部に取り出すための貫通孔２６ａ，２６ｂが形成されている。また、ケース箱２３の図中上側の側面には、ウェル形成解除用の流体の１０本の給排用チューブ４６ａ〜４６ｊが取り付けられている。ケース蓋２１も、ケース箱２３と同様に、透明な樹脂により形成されており、図２に示すように、培養液給排用の略矩形の貫通孔２２ａ，２２ｂが形成されている。
【００１９】
細胞培養デバイス３０は、図３に示すように、下から順に、ガラス基板３２と、チャンバー用連通路部材４０と、チャンバー部材５０と、薄膜５８と、培養液流路部材６０と、絶縁シート６８と、加熱シート部材７０とを接着剤を用いて積層することにより構成されており、その両端の上面には培養液給排部材６５，６６が配置されている。接着剤としては、チャンバー用連通路部材４０やチャンバー部材５０、薄膜５８、培養液流路部材６０の形成に用いられるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いることができる。
【００２０】
図４は、チャンバー用連通路部材４０の構成の一例を示す説明図である。チャンバー用連通路部材４０は、透明な材料、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコンゴムにより板状に形成されており、その上面には、幅が６００μｍの溝状の１０本の連通路４２ａ〜４２ｊが形成されており、図中上側には、連通路４２ａ〜４２ｊに流体を給排するためのチューブ取付部４４ａ〜４４ｊが形成されている。このチューブ取付部４４ａ〜４４ｊは、ケース箱２３に取り付けられた給排用チューブ４６ａ〜４６ｊに接続される。
【００２１】
図５は、チャンバー部材５０の構成の一例を示す説明図である。チャンバー部材５０も、透明な材料、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコンゴムにより板状に形成されており、その中央部の一辺が１ｃｍの正方形範囲に、断面の一辺が６００μｍの正方形の貫通孔として構成された１００個のチャンバー５２ａａ〜５２ｊｊが形成されている。この１００個のチャンバー５２ａａ〜５２ｊｊは、チャンバー用連通路部材４０に重ねたときに１０本の連通路４２ａ〜４２ｊに整合するように１０行１０列に規則的に配列している。このチャンバー部材５０の上面には、チャンバー５２ａａ〜５２ｊｊを覆うように、同じ材料で形成された薄膜５８が接合されており、後述するように、この薄膜５８が各チャンバー５２ａａ〜５２ｊｊ側に伸張することにより、細胞を培養するためのウェル５９ａａ〜５９ｊｊを形成する。なお、薄膜５８の上面には細胞の付着を防止するため、細胞非接着処理が施されている。
【００２２】
図６は、培養液流路部材６０の構成の一例を示す説明図である。培養液流路部材６０も、透明な材料、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコンゴムにより板状に形成されており、その下面には、培養液を流すための幅が６００μｍの溝状の１０本の培養液流路６２ａ〜６２ｊが形成されており、図中左右両側には、培養液流路６２ａ〜６２ｊに連通する連通孔６３ａ〜６３ｊ，６４ａ〜６４ｊが形成されている。培養液流路６２ａ〜６２ｊは、その中央部は、チャンバー部材５０に重ねたときに、１０行１０列に形成されたチャンバー５２ａａ〜５２ｊｊに整合するように調整されており、その両端は、幅広に広がるように形成されている。
【００２３】
図７は、培養液給排部材６５，６６の構成の一例を示す説明図である。培養液給排部材６５，６６も、透明な材料、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコンゴムにより略直方体となるように形成されており、上下方向に貫通する１０個の給排孔６５ａ〜６５ｊ，６６ａ〜６６ｊが形成されている。培養液給排部材６５の給排孔６５ａ〜６５ｊと培養液給排部材６６の給排孔６６ａ〜６６ｊは、培養液給排部材６５，６６を図１に示すように配置すると培養液流路部材６０の連通孔６３ａ〜６３ｊや連通孔６４ａ〜６４ｊに整合するように調整されている。培養液給排部材６５，６６の培養液流路部材６０への接着は、接着剤としてポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて、連通孔６３ａ〜６３ｊ，６４ａ〜６４ｊに給排孔６５ａ〜６５ｊ，６６ａ〜６６ｊが整合するように行なわれる。
【００２４】
絶縁シート６８は、透明な絶縁性材料、例えば、ＰＥＴフィルム（ポリエチレンテレフタレート樹脂により形成された高分子フィルム）により形成されている。
【００２５】
図８は、加熱シート部材７０の構成の概略を示す説明図である。加熱シート部材７０は、透明で電圧を印加すると加熱する材料（実施例では酸化インジウムスズ（Indium Tin Oxide：ＩＴＯ））により形成され透明導電膜７２と、透明導電膜７２の図中上部と下部に金蒸着により形成した電極７４ａ，７４ｂと、電極７４ａ，７４ｂに取り付けられた電力ライン７６ａ，７６ｂと、により構成されている。図９に、電力ライン７６ａ，７６ｂにより電極７４ａ，７４ｂに印加した電圧（Ｖ）と透明導電膜７２の温度との関係の一例を示す。図示するように、透明導電膜７２は、印加する電圧が高いほど温度が高くなる。したがって、実施例の加熱シート部材７０では、透明導電膜７２の温度を細胞培養に適した温度（例えば、３８℃程度）とするには、５Ｖ弱の電圧を電極７４ａ，７４ｂに印加すれば良いことが解る。
【００２６】
次に、上述した実施例の細胞培養装置２０における胚様体などの細胞塊の作成プロセスや、作成した胚様体などの細胞塊の回収プロセスについて説明する。図１０は、実施例の細胞培養装置２０において胚様体の作成プロセスの各状態を模式的に示す説明図であり、図１１は、実施例の細胞培養装置２０において培養されている胚様体の回収プロセスの各状態を模式的に示す説明図である。胚様体の作成プロセスは、まず、培養液流路部材６０の培養液流路６２ａ〜６２ｊに、培養液に細胞を懸濁状にした細胞懸濁液を流して細胞を播種する（図１０（ａ））。次に、チャンバー用連通路部材４０の連通路４２ａ〜４２ｊの流体を排出し、チャンバー部材５０のチャンバー５２ａａ〜５２ｊｊの薄膜５８をチャンバー側に伸張させて（膨らませて）各チャンバー５２ａａ〜５２ｊｊにウェル５９ａａ〜５９ｊｊを形成する（図１０（ｂ））。連通路４２ａ〜４２ｊの流体としては、例えば空気やオイルなどを用いることができる。空気の場合には、空気の排出は負圧にすることを意味している。この状態でしばらく放置すると、細胞は重力で沈降し、各ウェルで細胞同士が凝集して胚様体（細胞塊）を形成する（図１０（ｃ））。なお、薄膜５８の上面は細胞非接着処理が施されているから、作成された胚様体は薄膜５８に付着することはない。こうして作成された胚様体（細胞塊）に対して、培養液流路部材６０の培養液流路６２ａ〜６２ｊに対して同一の試薬あるいは異なる試薬を流路毎に供給し、胚様体を分化させて目的とする細胞を培養することができる。
【００２７】
胚様体の回収プロセスでは、１０行１０列に配列しているウェル５９ａａ〜５９ｊｊで培養されている胚様体のうちウェル５９ｅｄで培養されている胚様体を回収する場合を一例として説明する。まず、チャンバー用連通路部材４０の連通路４２ｄに流体（例えば空気）を供給してｄ列のウェル５９ａｄ〜５９ｊｄの形成を解除し、ウェル５９ａｄ〜５９ｊｄで培養されていた胚様体を培養液流路部材６０の培養液流路６２ａ〜６２ｊに浮上させる（図１１（ｂ））。次に、培養液流路６２ｅに培養液を供給することにより、培養液流路６２ｅに浮上しているウェル５９ｅｄで培養された胚様体を流して培養液給排部材６６の給排孔６６ｅから回収する（図１１（ｃ））。このとき、培養液流路６２ｅにより培養液が供給されるウェル５９ｅａ〜５９ｅｃ，５９ｅｅ〜５９ｅｊには胚様体が培養されているが、これらの胚様体は培養液流路６２ｅに浮上していないから、培養液流路６２ｅにおける培養液の流速（供給速度）に留意することにより、ウェル５９ｅａ〜５９ｅｃ，５９ｅｅ〜５９ｅｊに残したまま、ウェル５９ｅｄで培養されていた胚様体だけを回収することができる。こうして胚様体を回収すると、培養液流路部材６０の培養液流路６２ｅにおける培養液の供給を停止し（図１１（ｄ））、チャンバー用連通路部材４０の連通路４２ｄに流体を排出してｄ列の１０個のチャンバー５２ａｄ〜５２ｊｄに再びウェル５９ａｄ〜５９ｊｄを形成する（図１１（ｅ））。ウェル５９ａｄ〜５９ｊｄのうちウェル５９ｅｄを除く各ウェルには培養液流路６２ａ〜６２ｄ，６２ｆ〜６２ｊに浮上していた胚様体が沈降し、胚様体の培養が継続される。
【００２８】
以上説明した実施例の細胞培養装置２０によれば、ケース蓋２１やケース箱２３，加熱シート部材７０を透明な材料により形成したので、細胞培養デバイス３０に加熱シート部材７０と培養液給排部材６５，６６とを配置して滅菌水を含んだわた材２８と炭酸ガス濃度調整剤２９と共にケース箱２３およびケース蓋２１により密閉収納し、加熱シート部材７０に電圧を印加して細胞培養に適した温度とすることにより、ケース越しに１０行１０列に配列するウェル５９ａａ〜５９ｊｊにおける細胞等の培養の様子を長時間に亘ってリアルタイムで観察することができる。もとより、１ｃｍ四方内で１０行１０列に配列したウェル５９ａａ〜５９ｊｊで細胞を培養したり胚様体を作成したり作成した胚様体に試薬を供給したりすることができる。
【００２９】
実施例の細胞培養装置２０では、細胞培養デバイス３０として１０行１０列のチャンバー５２ａａ〜５２ｊｊを形成するものとしたが、Ｍ行Ｎ列のチャンバーとするなど、１以上であれば、行数や列数は如何なるものとしてもよい。
【００３０】
実施例の細胞培養装置２０では、チャンバー５２ａａ〜５２ｊｊの形状として断面の一辺が６００μｍの正方形の貫通孔として形成したが、有効直径が１ｍｍ以下であれば、如何なる形状に形成するものとしてもよい。
【００３１】
実施例の細胞培養装置２０では、チャンバー部材５０に薄膜５８を接合するものとしたが、チャンバー部材５０に薄膜５８が接合された状態の単一の部材として形成するものとしてもよい。
【００３２】
実施例の細胞培養装置２０では、チャンバー用連通路部材４０やチャンバー部材５０，薄膜５８，培養液流路部材６０を、いずれもポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコンゴムにより形成するものとしたが、透明な材料であれば他の材料によりこれらを形成するものとしてもよい。この場合、薄膜５８に対しては伸張性を有する材料であることが必要とされる。また、培養液流路部材６０を絶縁性材料で形成する場合には、絶縁シート６８は不要である。
【００３３】
実施例の細胞培養装置２０では、チャンバー用連通路部材４０やチャンバー部材５０，薄膜５８，培養液流路部材６０，絶縁シート６８，加熱シート部材７０をそれぞれ異なる部材として形成したが、チャンバー用連通路層，チャンバー層，培養液流路層，加熱シート層を形成すればよいから、これらの全部または一部を単一の部材として形成するものとしてもよい。
【００３４】
実施例の細胞培養装置２０では、ケース箱２３に仕切り壁２４ａ，２４ｂによりデバイス収納部２５ａと滅菌水収納部２５ｂと炭酸ガス濃度調整剤収納部２５ｃを設け、細胞培養デバイス３０と滅菌水を含んだわた材２８と炭酸ガス濃度調整剤２９とを収納するものとしたが、細胞培養デバイス３０と共に収納するものとして、水や炭酸ガス濃度調整剤に加えて細胞の培養に必要な他の補助剤を収納するものとしたり、水や炭酸ガス濃度調整剤の一方と細胞の培養に必要な他の補助剤を収納するものとしたり、水や炭酸ガス濃度調整剤に代えて細胞の培養に必要な他の補助剤を収納するものとしたりしてもよい。
【００３５】
なお、実施例の細胞培養装置２０では、ケース越しに１０行１０列に配列するウェル５９ａａ〜５９ｊｊにおける細胞等の培養の様子を長時間に亘ってリアルタイムで観察することができるだけでなく、細胞培養装置２０を細胞を搬送するためのものとして利用することも可能である。この場合、細胞を培養した状態で搬送することができる。
【００３６】
次に、実施例の細胞培養装置２０を備える細胞培養試験観察システム１２０について説明する。図１２は、実施例の細胞培養試験観察システム１２０の構成の概略を示す構成図である。実施例の細胞培養試験観察システム１２０は、図示するように、細胞培養装置２０と、この細胞培養装置２０が載置された顕微観察装置１３０と、細胞培養装置２０のケース箱２３に取り付けられた給排用チューブ４６ａ〜４６ｊに接続されてチャンバー用連通路部材４０連通路４２ａ〜４２ｊに流体を給排する流体給排装置１４０と、培養液給排部材６５の給排孔６５ａ〜６５ｊに接続された培養液給排装置１５０と、全体を制御するコンピュータ１６０と、このコンピュータ１６０に接続されたディスプレイ１７０と、を備える。
【００３７】
顕微観察装置１３０は、周知の顕微鏡を用いた装置として構成されており、コンピュータ１６０により、１ｃｍ四方内に１０行１０列に配列した細胞培養デバイス３０のウェル５９ａａ〜５９ｊｊを走査して顕微観察するように制御されている。
【００３８】
図１３は、流体給排装置１４０の構成の概略を示す構成図である。流体給排装置１４０は、真空ポンプ１４１と、真空ポンプ１４１に接続されて１１分岐する分岐管１４２と、分岐管１４２の１１分岐のうちの１０個とケース箱２３に取り付けられた給排用チューブ４６ａ〜４６ｊに接続する接続チューブ１４６ａ〜１４６ｊと、分岐管１４２の真空ポンプ１４１側に取り付けられた電磁弁１４３と、分岐管１４２の１１分岐うち給排用チューブ４６ａ〜４６ｊに接続されていない１個に取り付けられて分岐管１４２を大気開放するための電磁弁１４４と、分岐管１４２の１１分岐のうち給排用チューブ４６ａ〜４６ｊに接続された１０個に取り付けられた電磁弁１４５ａ〜１４５ｊと、を備える。流体給排装置１４０は、電磁弁１４４を閉弁した状態で電磁弁１４３と電磁弁１４５ａ〜１４５ｊを開弁して真空ポンプ１４２を作動させることにより、チャンバー用連通路部材４０の連通路４２ａ〜４２ｊの空気を排出して、各チャンバー５２ａａ〜５２ｊｊにウェル５９ａａ〜５９ｊｊを形成する。電磁弁１４３を閉弁した状態で電磁弁１４４を開弁し、電磁弁１４５ａ〜１４５ｊのうちのいずれか１つまたは複数を開弁することにより、開弁した電磁弁に接続された連通路に空気を供給してウェルの形成を解除する。これらの電磁弁１４３，１４４，１４５ａ〜１４５ｊや真空ポンプ１４２は、コンピュータ１６０により駆動制御される。
【００３９】
図１４は、培養液給排装置１５０の構成の概略を培養液給排部材６５，６６の給排孔６５ａ〜６５ｊ，６６ａ〜６６ｊと共に示す構成図である。培養液給排装置１５０は、培養液や試薬が充填された１０個のシリンジ１５３ａ〜１５３ｊと、このシリンジ１５３ａ〜１５３ｊのプランジャを駆動するアクチュエータ１５２ａ〜１５２ｊと、シリンジ１５３ａ〜１５３ｊと培養液給排部材６５の給排孔６５ａ〜６５ｊとを接続する接続チューブ１５４ａ〜１５４ｊとを備える。また、培養液給排部材６６の給排孔６６ａ〜６６ｊは、接続チューブ１５５ａ〜１５５ｊにより受け皿１５６ａ〜１５６ｊに接続されている。培養液給排装置１５０は、細胞懸濁液が充填された１０個のシリンジ１５３ａ〜１５３ｊのプランジャを駆動することにより、培養液流路部材６０の培養液流路６２ａ〜６２ｊに細胞懸濁液を供給してウェル５９ａａ〜５９ｊｊに胚様体を形成する。その後、同一または異なる試薬が充填された１０個のシリンジ１５３ａ〜１５３ｊのプランジャを駆動することにより、培養液流路６２ａ〜６２ｊのうちの所望の培養液流路に所望の試薬を供給することができる。アクチュエータ１５２ａ〜１５２ｊとしては、例えば油圧駆動をもちいることができる。なお、アクチュエータ１５２ａ〜１５２ｊは、コンピュータ１６０により駆動制御される。
【００４０】
こうして構成された実施例の細胞培養試験観察システム１２０では、実施例の細胞培養装置２０を用いるから、ケース越しに１０行１０列に配列するウェル５９ａａ〜５９ｊｊにおける細胞等の培養の様子を長時間に亘ってリアルタイムで顕微観察することができる。なお、詳細に説明しないが、顕微観察装置１３０の走査により各ウェル５９ａａ〜５９ｊｊの細胞等の培養の状態を順次ディスプレイ１７０に表示したり、図示しない記憶装置に画像として記憶したりすることができる。
【００４１】
実施例の細胞培養試験観察システム１２０では、コンピュータ１６０により図１５に例示する回収制御ルーチンが実行されることにより、指定したウェルで培養されている細胞等を回収する。回収制御ルーチンが実行されると、コンピュータ１６０は、まず、ディスプレイ１７０にウェル指定画面を表示し（ステップＳ１００）、ウェル指定画面で「実行」ボタンが操作されるまで待つ処理（ステップＳ１１０）を実行する。図１６にウェル指定画面の一例を示す。このウェル指定画面では、ａ〜ｊの１０行１０列のウェル５９ａａ〜５９ｊｊに対応するようマトリックス状に指定ボタンが配置されており、マウスなどの指示デバイスを用いて所望のウェルを１つまたは複数に亘って操作することができるようになっている。また、「実行」ボタンの他に、指定操作済みのウェルの指定操作をキャンセルしていずれのウェルの指定操作もされていない初期状態に戻す「ＡＬＬキャンセル」ボタンも用意されている。
【００４２】
ウェル指定画面により１つ或いは複数のウェルの指定操作がなされた状態で「実行」ボタンが操作されると、細胞等を回収すべきウェルを決定する（ステップＳ１２０）。このウェルの決定は、例えば指定ボタンが操作された順に決定したり、ａ列から順に指定ボタンが操作されているか否かを調べることなどにより行なわれる。いま、ウェルの決定としてａ列から順に調べる手法とし、図１６に示すように、ウェル５９ｃｂとウェル５９ｅｄとが指定されて「実行」ボタンが操作されたときを一例として説明する。この場合、まず、ウェル５９ｃｂが細胞等を回収すべきウェルに決定される。ウェルが決定されると、そのウェルの列であるｂ列に対応するチャンバー用連通路部材４０の連通路４２ｂに空気を供給してｂ列のウェル５９ａｂ〜５９ｊｂのウェルを解除する（ステップＳ１３０）。具体的には、流体給排装置１４０の電磁弁１４４を開弁すると共に電磁弁１４５ｂを開弁することにより行なわれる。続いて、決定したウェルの行であるｃ行に対応する培養液流路部材６０の培養液流路６２ｃに培養液を供給して培養液流路６２ｃに浮上している細胞や胚様体を受け皿１５６ｃに流し出して回収する（ステップＳ１４０）。具体的には、培養液給排装置１５０のアクチュエータ１５２ｃを駆動してシリンジ１５３ｃに充填されている培養液を培養液給排部材６５の給排孔６５ｃに供給することにより行なわれる。
【００４３】
こうして決定したウェルの細胞等を回収すると、アクチュエータ１５２ｃの駆動を停止することにより培養液流路６２ｃへの培養液の供給を停止し（ステップＳ１５０）、電磁弁１４５ｂを開弁した状態で電磁弁１４４を閉弁すると共に電磁弁１４３を開弁し、真空ポンプ１４１で吸引することにより、ｂ列のウェル５９ａｂ〜５９ｊｂを再形成し（ステップＳ１６０）、指定ボタンが操作されたウェルがまだ有るか否かを判定し（ステップＳ１７０）、指定ボタンが操作されたウェルが有る場合には、ステップＳ１２０のウェルの決定に戻る。いま考えている一例ではウェル５９ｅｄが残っているから、ステップＳ１７０では肯定的判定がなされてステップＳ１２０に戻り、ウェル５９ｅｄが細胞等を回収すべきウェルとして決定される。ウェル５９ｅｄに対してもウェル５９ｃｂと同様の処理（ステップＳ１３０〜Ｓ１６０）により細胞等を回収すると共にウェルの再形成を行なってステップＳ１７０に至ると、指定ボタンが操作されたウェルはないと判断され、本ルーチンを終了する。
【００４４】
以上説明した実施例の細胞培養試験観察システム１２０では、回収制御ルーチンを実行することにより、ウェル指定画面に表示された１０行１０列に配列したウェル５９ａａ〜５９ｊｊに対して所望のウェルを１つ或いは複数のウェルの指定ボタンを操作して「実行」ボタンを操作するだけで所望のウェルで培養されている細胞等を回収することができる。
【００４５】
実施例の細胞培養試験観察システム１２０では、ウェル指定画面にａ〜ｊの１０行１０列のウェル５９ａａ〜５９ｊｊに対応するようマトリックス状に配置された複数の指定ボタンを表示するものとしたが、図１７の変形例のウェル指定画面の一部に示すように、顕微観察装置１３０により観察された各ウェル５９ａａ〜５９ｊｊの細胞等の画像をマトリックス状に配置された複数の指定ボタンに重ねて表示するものとしてもよい。図１７では、ｃ行ｂ列のウェル５９ｃｂが指定操作された状態を示している。こうすれば、リアルタイムで観察されている１０行１０列に配列する各ウェル５９ａａ〜５９ｊｊで培養されている細胞等の画像を見ながら取り出すべき細胞等を指定して取り出すことができる。
【００４６】
実施例の細胞培養試験観察システム１２０では、細胞等の回収に接続チューブ１５５ａ〜１５５ｊを介して受け皿１５６ａ〜１５６ｊを用いるものとしたが、受け皿に代えてシャーレや試験管などを用いるものとしてもよい。
【００４７】
実施例の細胞培養試験観察システム１２０では、チャンバー用連通路部材４０の連通路４２ａ〜４２ｊに給排する流体として空気を用い、そのために流体給排装置１４０として真空ポンプ１４１等を備えるものとしたが、チャンバー用連通路部材４０の連通路４２ａ〜４２ｊに給排する流体としてオイルなどの液体を用い、流体給排装置として油圧回路を備えるものとしてもよい。
【００４８】
実施例の細胞培養装置２０では、接続チューブ１５４ａ〜１５４ｊや接続チューブ１５５ａ〜１５５ｊを培養液給排部材６５，６６の給排孔６５ａ〜６５ｊ，６６ａ〜６６ｊに接続して培養液給排装置１５０や受け皿１５６ａ〜１５６ｊを取り付けるために、ケース蓋２１に貫通孔２２ａ，２２ｂを形成するものとしたが、ケース蓋２１には貫通孔２２ａ，２２ｂを形成せず、培養液給排部材６５，６６をケース内に収納するものとしてもよい。
【００４９】
以上、本発明を実施するための形態について実施例を用いて説明したが、本発明はこうした実施例に何等限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることは勿論である。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は、細胞培養装置や細胞培養試験観察システムの製造産業などに利用可能である。
【符号の説明】
【００５１】
２０  細胞培養装置、２１  ケース蓋、２２ａ，２２ｂ  貫通孔、２３  ケース箱、２４ａ，２４ｂ  仕切り壁、２５ａ  デバイス収納部、２５ｂ  滅菌水収納部、２５ｃ  炭酸ガス濃度調整剤収納部、２６ａ，２６ｂ  貫通孔、２８  わた材、２９  炭酸ガス濃度調整剤、３０  細胞培養デバイス、３２  ガラス基板、４０  チャンバー用連通路部材、４２ａ〜４２ｊ  連通路、４４ａ〜４４ｊ  チューブ取付部、４６ａ〜４６ｊ  給排用チューブ、５０  チャンバー層、５２ａａ〜５２ｊｊ  チャンバー、５８  薄膜、５９ａａ〜５９ｊｊ  ウェル、６０  培養液流路部材、６２ａ〜６２ｊ  培養液流路、６３ａ〜６３ｊ，６４ａ〜６４ｊ  連通孔、６５，６６  培養液給排部材、６５ａ〜６５ｊ，６６ａ〜６６ｊ  給排孔、６８  絶縁シート、７０  加熱シート部材、７２  透明導電膜、７４ａ，７４ｂ  電極、７６ａ，７６ｂ  電力ライン、１２０  細胞培養試験観察システム、１３０  顕微観察装置、１４０  流体給排装置、１４１  真空ポンプ、１４２  分岐管、１４３，１４４，１４５ａ〜１４５ｊ  電磁弁、１４６ａ〜１４６ｊ  接続チューブ、１５０  培養液給排装置、１５２ａ〜１５２ｊ  アクチュエータ、１５３ａ〜１５３ｊ  シリンジ、１５４ａ〜１５４ｊ，１５５ａ〜１５５ｊ  接続チューブ、１５６ａ〜１５６ｊ  受け皿、１６０  コンピュータ、１７０  ディスプレイ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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