(57)【要約】【課題】検体中の微小粒子を高速に且つ効率よく検出する。【解決手段】微小粒子検出装置は、微小粒子を含む検体が注入される検体注入部を有する検体チップ(７)と、光源(８)と、上記光源(８)からの光を上記検体に照射する照射光学系(１)と、上記光の照射により上記微小粒子から発せられた光を検出する光検出光学系と、上記微小粒子からの光の強度に基づいて上記微小粒子を検出する検出部とを備え、上記光検出光学系は、上記光源(８)からの光を上記検体に向けて透過させる一方、上記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズ素子(２)を含み、上記対物レンズ素子(２)は、上記光源(８)からの光を上記検体に向かって集光する形状を有するビーム光透過部を含み、上記検体注入部の厚みをＤ、上記光源(８)からの照射光の波長をλ、上記ビーム光透過部での照射光のビーム半径の減少率をＲとした場合に、関係式Ｄ≦λ/Ｒ2を満たすようになっている。【選択図】図１
2016038360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小粒子を含む検体が注入される検体注入部を有する検体チップと、
光源と、
上記光源から出射された光を、上記検体チップにおける上記検体に対して照射する照射光学系と、
上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた光を検出する光検出光学系と、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの光の強度に基づいて、上記微小粒子を検出する検出部と
を備え、
上記光検出光学系は、上記光源から出射された光を上記検体に向けて透過させる一方、上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズ素子を含み、
上記対物レンズ素子は、上記光源からの光を透過させると共に、透過後の光を上記検体に向かって集光させる形状を有するビーム光透過部を含んでおり、
上記検体チップの上記検体注入部における光照射方向への厚みをＤ、上記光源からの照射光の波長をλ、上記ビーム光透過部における上記集光による照射光のビーム半径の減少率をＲとした場合に、関係式
Ｄ≦λ/Ｒ2
を満たすようになっている
ことを特徴とする微小粒子検出装置。
【請求項２】
請求項１に記載の微小粒子検出装置において、
下記の関係式
Ｄ≦λ/Ｒ2≦３Ｄ
を満たすようになっている
ことを特徴とする微小粒子検出装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の微小粒子検出装置において、
上記対物レンズ素子における上記ビーム光透過部の表面は、光を屈折によって集光させる曲率を有しており、
上記検体チップの上記検体注入部における光照射方向への厚みをＤ、上記光源からの照射光の波長をλ、上記ビーム光透過部を透過する照射光のビーム半径をｒ0、上記ビーム光透過部を透過後の光の焦点距離をｆとした場合に、関係式
Ｄ≦λ(ｆ/ｒ0)2
を満たすようになっている
ことを特徴とする微小粒子検出装置。
【請求項４】
請求項３に記載の微小粒子検出装置において、
上記対物レンズ素子における上記ビーム光透過部は、光軸に沿った領域であって、透過後の光の屈折角が上記ビーム光透過部を除く他の領域よりも小さくなるような形状を有して、上記光源からの照射光を上記検体に向かって絞る機能を有しており、
上記対物レンズ素子における上記ビーム光透過部を除く他の領域は、透過後の上記微小粒子からの光の屈折角が上記ビーム光透過部側から外周縁側に向かって大きくなるような形状を有して、上記微小粒子から広角に発せられた光を集光する機能を有している
ことを特徴とする微小粒子検出装置。
【請求項５】
請求項１から請求項４までの何れか一つに記載の微小粒子検出装置において、
上記対物レンズ素子と上記検出部との間に設けられると共に、上記対物レンズ素子を透過した上記微小粒子からの光を透過させる穴を有するアパーチャを備え、
上記アパーチャにおける上記穴の径を、上記検体注入部における厚みＤの範囲に分布する上記微小粒子からの光を全て取り込むと共に、上記検体注入部の厚みＤの範囲内に存在する上記微小粒子から発せられる光の上記検出部による光検出効率の変動率が１０％以下になるように設定した
ことを特徴とする微小粒子検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、微小粒子検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、微小粒子検出装置として、液体中あるいはメンブレンやスライドガラス上に展開された微小粒子に光を照射し、上記微小粒子から発生する蛍光あるいは散乱光を検出して、粒子の計数あるいは性状検査を行うものがある。ここで、上記微小粒子としては、無機粒子、微生物、細胞、血液中の赤血球、白血球、血小板、血管内皮細胞、上記組織の微小細胞片等が含まれる。そして、上記微小粒子は、液体中にある場合には微小粒子懸濁液となる。
【０００３】
上記微小粒子の検出方法としては、幾つかの検出方式が知られている。
【０００４】
フローサイトメーターにおいては、上記微小粒子の懸濁液を毛細管にシース液と共に流す。そして、上記毛細管の一部にレーザー光を照射し、上記微小粒子に光が当たった時に生ずる散乱光あるいは蛍光を検出することによって、粒子の種類や粒子の大きさを分類する。例えば、特定の粒子と結合する蛍光試薬で粒子を標識することによって、蛍光を発する粒子の数を計数して上記特定の粒子のみを計数することができる。
【０００５】
このフローサイトメーターを用いることにより、微小粒子の懸濁液を高速にフローしながら測定することが可能であるので、大量の検体を短時間で処理し、微小粒子から発せられる蛍光や散乱光等の強度を定量的に計測することができる。
【０００６】
しかしながら、上記サブミクロンの粒子から発せられる散乱光の強度を定量的にまで測定可能なフローサイトメーターは、装置が大型であって高価なシステムとなっている。
【０００７】
また、一般的に、上記フローサイトメーターにおいては、フロー機構等の複雑な機構が必要であり、メンテナンス性の悪化やコスト上昇の原因となっている。
【０００８】
上記フローサイトメーター以外の粒子の検出方法として、上記フロー機構を用いずに、微小粒子が二次元的に分布する所定の範囲を撮像して、撮像画像の情報から微小粒子の数を係数し、さらには種類や大きさを判定する方法がある。この方法では、撮像画像を用いて粒子の検出や分析を行うことから、上記フローサイトメーターに対してイメージサイトメーターと呼ばれる。
【０００９】
上記イメージサイトメーターにおける画像化方法としては、ある程度の視野範囲を有する顕微鏡とデジタルカメラとから成る撮像装置を用いて、光源および上記撮像装置を固定した状態で視野範囲の二次元領域を撮像する方法と、レーザー光を二次元的にスキャンしながら散乱光または蛍光を検出して、スキャン領域の粒子を画像化する方法とがある。
【００１０】
上記顕微鏡とデジタルカメラとによる撮像の場合には、１μｍ以上の粒子では高精度な画像測定が可能であるが、サブミクロンの粒子を測定する場合には、高倍率な対物レンズを有する顕微鏡と高感度な(つまり、低ノイズでダイナミックレンジの幅が広い)デジタルカメラとが必要になるので、非常に高価なシステムとなる。また、サブミクロン粒子の場合、光の波長と粒子のサイズとが同等になるので回折限界によって結像性能が低下し、粒子サイズの正確な判定が困難になる。
【００１１】
さらに、上記顕微鏡として蛍光顕微鏡システムを用いれば、容易に粒子を検出することが可能である。ところが、同様に、サブミクロン粒子の場合に光の波長と粒子のサイズとが同等になるので、粒子サイズの正確な判定ができない。また、微小粒子を測定する場合には高倍率の対物レンズを使用しなければならず、必然的に視野が小さくなるので測定回数が増える。つまり、高倍率な顕微鏡では、測定時間が膨大になることと定量性とが問題になるのである。
【００１２】
一方、上記レーザー光をスキャンしながら散乱光または蛍光を検出するシステムにおいては、レーザー光を粒子に集光して照射し、粒子から発生する散乱光または蛍光を検出しながら、上記レーザー光を搭載した光学ヘッドを二次元的に走査して画像化する。この場合、レーザー光を粒子に集光して照射し、粒子から発生する散乱光または蛍光を検出しながら、上記光学ヘッドを二次元的に走査して画像化する。
【００１３】
このように、上記光学ヘッドを上記サンプルに対して相対的にスキャンしながら光を検出するシステムにおいては、サブミクロンの粒子を検出する場合、レーザー光の照射スポット径は、粒子サイズと同等かそれ以上に大きくなる。そのために、二次元スキャンの結果得られる画像は、粒子の一つ一つが解像された画像になってはいないので、画像から直接粒子の大きさを計測することは困難である。ところが、上記レーザー光の照射スポットが粒子サイズよりも大きくても、粒子サイズによって粒子から生じる散乱光強度が異なるので、散乱光の強さから粒子径を判定することは可能である。その理由は、粒子径と散乱光強度とに相関があるためである。
【００１４】
その場合、散乱光を高感度に検出する検出器(低ノイズで広ダイナミックレンジな検出器)とレーザー光源とが必要になるが、高倍率な対物レンズを有する顕微鏡と高感度なデジタルカメラとを用いるシステムに比較して、安価なシステム構成が可能である。
【００１５】
上記光学ヘッドを上記サンプルに対して相対的にスキャンしながら光を検出するシステムとして、特開２０１２‐８３６２１号公報(特許文献１)に開示された走査型レーザ顕微鏡がある。この走査型レーザ顕微鏡においては、標本上においてレーザー光を二次元走査する走査部と、この走査部によって走査されたレーザー光を上記標本に集光する対物レンズと、上記標本からの光を検出する光検出部とを有している。そして、拡大部分画像生成部によって、上記光検出部で検出された光の強度と上記走査部の走査位置情報とに基づいて、相互に重複せずに隣接する上記標本の部分画像を含み、且つ、この分画像よりも大きな拡大部分画像を、上記部分画像と同じ画素分解能で生成する。さらに、拡大部分画像蓄積部によって、上記拡大部分画像生成部で生成された複数の上記拡大部分画像を蓄積し、画像合成部によって、上記拡大部分画像蓄積部に蓄積された複数の上記拡大部分画像を互いに一部重複するように合成して、上記標本の全体画像を生成するようにしている。
【００１６】
しかしながら、上記特許文献１に開示された従来の走査型レーザ顕微鏡においては、以下のような問題がある。すなわち、レーザー光を二次元的に走査しながら微小粒子から発せられる散乱光または蛍光を検出する場合には、走査面積が広くなるとそれに応じて測定時間が長くなる。そこで、同じ量の検体を検出する場合に測定時間を短くするためには、単位走査面積当たりのサンプル量(微小粒子量)を増やすことが有効である。
【００１７】
しかしながら、上記従来の走査型レーザ顕微鏡においては、単位走査面積当たりのサンプル量を増やすことを実現するための考慮は何ら行われてはいない。したがって、上記従来の走査型レーザ顕微鏡を、微小粒子の検出に用いた場合には、走査面積が広くなると測定時間が長くなるという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開２０１２‐８３６２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
そこで、この発明の課題は、検体中の微小粒子を高速に且つ効率よく検出可能な微小粒子検出装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上記課題を解決するため、この発明の微小粒子検出装置は、
微小粒子を含む検体が注入される検体注入部を有する検体チップと、
光源と、
上記光源から出射された光を、上記検体チップにおける上記検体に対して照射する照射光学系と、
上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた光を検出する光検出光学系と、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの光の強度に基づいて、上記微小粒子を検出する検出部と
を備え、
上記光検出光学系は、上記光源から出射された光を上記検体に向けて透過させる一方、上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズ素子を含み、
上記対物レンズ素子は、上記光源からの光を透過させると共に、透過後の光を上記検体に向かって集光させる形状を有するビーム光透過部を含んでおり、
上記検体チップの上記検体注入部における光照射方向への厚みをＤ、上記光源からの照射光の波長をλ、上記ビーム光透過部における上記集光による照射光のビーム半径の減少率をＲとした場合に、関係式
Ｄ≦λ/Ｒ2
を満たすようになっている
ことを特徴としている。
【００２１】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
下記の関係式
Ｄ≦λ/Ｒ2≦３Ｄ
を満たすようになっている。
【００２２】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記対物レンズ素子における上記ビーム光透過部の表面は、光を屈折によって集光させる曲率を有しており、
上記検体チップの上記検体注入部における光照射方向への厚みをＤ、上記光源からの照射光の波長をλ、上記ビーム光透過部を透過する照射光のビーム半径をｒ0、上記ビーム光透過部を透過後の光の焦点距離をｆとした場合に、関係式
Ｄ≦λ(ｆ/ｒ0)2
を満たすようになっている。
【００２３】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記対物レンズ素子における上記ビーム光透過部は、光軸に沿った領域であって、透過後の光の屈折角が上記ビーム光透過部を除く他の領域よりも小さくなるような形状を有して、上記光源からの照射光を上記検体に向かって絞る機能を有しており、
上記対物レンズ素子における上記ビーム光透過部を除く他の領域は、透過後の上記微小粒子からの光の屈折角が上記ビーム光透過部側から外周縁側に向かって大きくなるような形状を有して、上記微小粒子から広角に発せられた光を集光する機能を有している。
【００２４】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記対物レンズ素子と上記検出部との間に設けられると共に、上記対物レンズ素子を透過した上記微小粒子からの光を透過させる穴を有するアパーチャを備え、
上記アパーチャにおける上記穴の径を、上記検体注入部における厚みＤの範囲に分布する上記微小粒子からの光を全て取り込むと共に、上記検体注入部の厚みＤの範囲内に存在する上記微小粒子から発せられる光の上記検出部による光検出効率の変動率が１０％以下になるように設定している。
【００２５】
尚、ここで言う、光検出効率の変動率が１０％以内とは、同程度の光強度の点光源が厚みＤの範囲に分布している状態を想定した場合に、検出強度のバラツキが１０％未満であることを意味している。
【発明の効果】
【００２６】
以上より明らかなように、この発明の微小粒子検出装置は、上記検体チップの上記検体注入部における光照射方向への厚みＤは、関係式「Ｄ≦λ/Ｒ2」を満たすようになっている。また、上記対物レンズ素子の上記ビーム光透過部における照射光のビーム半径の減少率Ｒは、概ねＦ値の逆数の２分の１と同義であって、Ｒ＝１/(２Ｆ)＝ＮＡの関係にある。したがって、上記関係式「Ｄ≦λ/Ｒ2」は、次のように変形することができる。
Ｄ≦λ/Ｒ2＝λ/ＮＡ2
【００２７】
そして、焦点深度ｄ＝λ/ＮＡ2を用いて上記関係式は、さらに次のように変形することができる。
Ｄ≦λ/Ｒ2＝ｄ
【００２８】
すなわち、この発明においては、上記対物レンズ素子における上記照射光の焦点深度ｄは、上記検体注入部における光照射方向への厚みＤ以上になるように設定されている。したがって、上記検体注入部に注入されて厚みを有する検体領域に対して、上記照射光を均一に照射することができる。換言すれば、上記検体領域の厚み方向で異なる位置に微小粒子が存在していても、上記微小粒子を検出することが可能になる。
【００２９】
さらに、上記検査チップを回転または一方向に走査した際に、上記検査チップが光照射方向に面ブレを起こした場合でも、上記焦点深度ｄが上記検体注入部の厚みＤ以上であるので、上記焦点深度ｄが上記厚みＤより大きい分だけ上記面ブレの影響を低減することができる。
【００３０】
さらに、厚みＤを有する上記検体を一度に測定可能になるので、上記検体中の微小粒子を高速に且つ効率よく検出することが可能になり、測定時間の短縮を図ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】この発明の微小粒子検出装置における概略構成を示す図である。
【図２】図１における検査チップの概略構成を示す斜視図および断面図である。
【図３】図２における検体注入層の中心に被検出微小粒子が存在する図である。
【図４】上記検体注入層の上部に被検出粒子が存在する図である。
【図５】上記検査チップの表面で散乱光が発生すると想定した場合の図である。
【図６】図１とは異なる微小粒子検出装置の概略構成を示す図である。
【図７】図１および図６とは異なる微小粒子検出装置の概略構成を示す図である。
【図８】図７における光学モジュールによる検体のスキャン状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、この発明を図示の実施の形態により詳細に説明する。
【００３３】
・第１実施の形態
図１は、本実施の形態の微小粒子検出装置の概略構成を示す図である。この微小粒子検出装置は、検体が注入されたディスク状の検査チップと、検査チップを回転させる回転駆動系と、散乱光および蛍光を検出する光検出光学系と、上記検出光学系を半径方向に駆動させる駆動機構とから、概略構成されている。 
図１において、１は光源装置、２は対物レンズ、３〜５は第１〜第３検出装置である。光源装置１と対物レンズ２と第１〜第３検出装置３〜５とは、枠体内に収納されて光学モジュール６を構成している。そして、光学モジュール６の上方には対物レンズ２に対向して円形のディスク状の検査チップ７が配置され、検査チップ７内には例えば蛍光物質によって標識された微小粒子が分布する懸濁液やゲル支持体やメンブレン等の転写支持体が検体として注入されている。
【００３４】
上記光学モジュール６の光源装置１には、光源としての半導体レーザー８が設けられており、半導体レーザー８の光軸上には、コリメータレンズ９,第１バンドパスフィルタ１０,第１ＮＤ(減光)フィルタ１１および第１アパーチャ１２をこの順で配置している。ここで、半導体レーザー８,コリメータレンズ９,第１バンドパスフィルタ１０,第１ＮＤフィルタ１１および第１アパーチャ１２は、一つのケース内に収納されて上記照射光学系の一例である光源装置１を構成している。
【００３５】
さらに、上記半導体レーザー８の光軸上には、第１アパーチャ１２を透過した光を、対物レンズ２側に向かうように反射させるプリズムミラー１３を配置している。また、対物レンズ２の光軸上におけるプリズムミラー１３の図１中下方には、プリズムミラー１３側から順に、対物レンズ２からの蛍光を透過する一方、散乱光を反射する第１ダイクロイックミラー１４と、第１ダイクロイックミラー１４を透過した蛍光のうち、第１波長を有する第１の蛍光を透過する一方、上記第１波長よりも波長が短い第２波長を有する第２の蛍光を反射する第２ダイクロイックミラー１５とを配置している。
【００３６】
尚、この発明で言うところの「散乱光」とは、上記半導体レーザー８から出射された光が、上記検体の照射箇所から周囲に等方的あるいは異方的に散乱された光であり、出射光と同じ波長の光である。これに対し、「蛍光」とは、半導体レーザー８から出射された光が上記検体を照射して微小粒子を標識している蛍光物質を励起し、上記検体の照射箇所から周囲に等方的に散乱された蛍光であり、出射光とは異なる波長の光である。
【００３７】
ここで、詳述はしないが、上記対物レンズ２はレンズホルダ(図示せず)に格納されており、ステッピングモータ等の駆動部(図示せず)によって光軸方向に移動されて、焦点位置を変更可能になっている。
【００３８】
また、図１において、上記対物レンズ２の光軸上における第２ダイクロイックミラー１５の図１中下方には、第２ダイクロイックミラー１５側から順に、対物レンズ２によって集光されて平行光に変換された上記検体からの光(上記第１波長とは異なる波長の光)を減光する第２バンドパスフィルタ１６、第２バンドパスフィルタ１６を通過した第１波長の第１の蛍光を集光する第１レンズ１７、および、第１レンズ１７を通過した第１の蛍光の迷光をカットする第２アパーチャ１８が配置されている。さらに、対物レンズ２の光軸上における第２アパーチャ１８の上記下方には、第２アパーチャ１８を通過した第１の蛍光を検出する光電子増倍管(ＰＭＴ)等の検出素子を含む第１検出器１９が配置されている。ここで、第２アパーチャ１８と第１検出器１９とは、一つのケース内に収納されて上記光検出光学系の一例である第１検出装置３を構成している。
【００３９】
上記第２ダイクロイックミラー１５の図１中左方には、第２ダイクロイックミラー１５側から順に、第３バンドパスフィルタ２０,第２レンズ２１,第３アパーチャ２２および第２検出器２３が配置されており、第３アパーチャ２２と第２検出器２３とは、一つのケース内に収納されて上記光検出光学系の一例である第２検出装置４を構成している。尚、上記第３バンドパスフィルタ２０,第２レンズ２１,第３アパーチャ２２および第２検出器２３は、基本的には、第２バンドパスフィルタ１６,第１レンズ１７,第２アパーチャ１８および第１検出器１９と同じ構成を有している。但し、上記第２波長の第２の蛍光に対する処理を行う点において異なる。
【００４０】
また、上記第１ダイクロイックミラー１４の図１中右方には、第１ダイクロイックミラー１４側から順に、第２ＮＤフィルタ２４,第３レンズ２５,第４アパーチャ２６および第３検出器２７が配置されており、第４アパーチャ２６および第３検出器２７は、一つのケース内に収納されて上記光検出光学系の一例である第３検出装置５を構成している。尚、第２ＮＤフィルタ２４,第３レンズ２５,第４アパーチャ２６および第３検出器２７は、基本的には第２バンドパスフィルタ１６,第１レンズ１７,第２アパーチャ１８および第１検出器１９と同じ構成を有している。但し、上記検体からの散乱光に対する処理を行う点において異なる。
【００４１】
すなわち、本実施の形態においては、上記光検出光学系を、対物レンズ２、各ダイクロイックミラー１４,１５、各フィルタ１６,２０,２４、各レンズ１７,２１,２５、各アパーチャ１８,２２,２６、および、各検出器１９,２３,２７で構成するのである。
【００４２】
上記検査チップ７は、透明に且つ円形に構成されており、中心軸２８に固定された透明且つ円形なテーブル２９に載置されて、中心軸２８に対して固定されている。中心軸２８は、上記回転駆動系の一例としてのモータ３０で回転可能になっている。これに対し、光学モジュール６は、検査チップ７が成す円板の半径方向に、上記駆動機構によって移動可能になっている。尚、光学モジュール６の上記駆動機構については特に限定するものではない。例えば、光学モジュール６の枠体を、ステッピングモータ等で上記半径方向に往復動されるタイミングベルト等により、上記半径方向に配設されたガイドレールで案内されて、移行可能に構成する。
【００４３】
図２に、上記検査チップ７の概略構成を示す。但し、図２(a)は外観斜視図であり、図２(b)は図２(a)におけるＡ‐Ａ’矢視断面図である。検査チップ７は、中心に固定用のセンターホール３３が設けられた２枚の透明な基板３１,３２を、中心に固定用のセンターホール３５が設けられたスペーサ３４を介して貼り合わせた構造を有している。
【００４４】
上記スペーサ３４には、上記センターホール３５と同心円状の円形溝３６が形成されている。そして、スペーサ３４の両側面を２枚の基板３１,３２で塞ぐことによって、円形溝３６はドーナツ状の空間と成り、上記検体が注入される検体注入層となる。検体注入層３６はスペーサ３４の厚さに相当する厚みＤを有している。尚、検体注入層３６の厚みＤとしては、数十マイクロメートル程度が望ましい。また、一方の(例えば、図２中上側に位置する)基板３１には、検体注入層３６に上記検体を注入するための検体注入口３７が形成されている。この検体注入口３７は、周方向に複数箇所(図２(a)では４箇所)、径方向に複数箇所(図２(a)では２箇所)設けられ、上記検体が注入された後に封止される。
【００４５】
こうして上記検体が注入された検査チップ７をテーブル２９に載置し、モータ３０によって回転させながら、光学モジュール６を半径方向に移動させて、上記検体中の微小粒子からの蛍光および散乱光の検出が行われる。
【００４６】
以下、一例として、上記２種類の蛍光と上記散乱光とを同時に検出する場合を例に挙げて、本微小粒子検出装置の動作および機能について説明する。
【００４７】
上記光源装置１の半導体レーザー８からレーザー光を出射させる。出射されたレーザー光はコリメータレンズ９で平行光にされ、第１バンドパスフィルタ１０を透過する。第１バンドパスフィルタ１０では不要な波長の光がカットされる。次に、レーザー光は、第１ＮＤフィルタ１１を透過して照射光強度の一部が減光され、入射光ビーム径成形用の第１アパーチャ１２を透過し、プリズムミラー１３に導かれる。そして、レーザー光は、プリズムミラー１３によって反射され、対物レンズ２およびテーブル２９を通過して、検査チップ７の検体注入層３６に集光される。
【００４８】
その場合、上記プリズムミラー１３の長手方向(水平方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くなっており、半導体レーザー８からのレーザー光は対物レンズ２の光軸付近(ビーム光透過部)のみを通過するようになっている。こうして、検体注入層３６中の微小粒子に集束光が照射されると、上記集束光が照射された部分から周囲に等方的に散乱された蛍光および散乱光が生ずる。
【００４９】
このとき、上記対物レンズ２の開口径に対して、第１アパーチャ１２を透過したレーザー光のビーム径を小さくている。すなわち、対物レンズ２のＮＡ(numerical aperture：開口数)に対して、上記レーザー光の実効ＮＡを小さくしている。したがって、上記レーザー光の焦点深度が深くなり、厚みを有する検体注入層３６に注入されて厚みのある検体領域に対して、上記レーザー光を均一に照射することができる。これにより、上記検体領域の厚み方向で異なる位置に微小粒子が存在していても、微小粒子を検出することができるのである。
【００５０】
また、上記検査チップ７を回転させた際に中心軸２８の延在方向に面ブレが生じても、焦点深度が検体注入層３６の厚みＤより大きければ、その分だけ上記面ブレの影響を低減させることができる。さらに、厚みのある上記検体を一度に測定可能になるので、大量の検体を高速に測定および処理することが可能になり、測定時間を短縮することが可能になる。尚、上記焦点深度は、焦点位置でのスポット径のルート２倍の位置までの距離と定義するのが一般的である。また、スポット径は、スポットの中心位置での光強度に対して１/ｅ2の強度となる位置での直径とするのが一般的である。
【００５１】
また、上記焦点深度を、照射光の波長/(照射光の実効ＮＡ)2で定め、その値を検査チップ７における検体注入層３６の厚み以上に、且つ検体注入層３６の厚みの３倍以下に設定している。したがって、照射光のスポット径を一定の大きさに収め、必要な焦点深度を確保することができる。
【００５２】
尚、上記実効ＮＡは、検査チップ７のタンジェンシャル方向とラジアル方向とで異なっていても良い。例えば、タンジェンシャル方向の実効ＮＡが、ラジアル方向の実効ＮＡよりも大きくても良い。その場合には、焦点位置近傍ではラジアル方向のビーム径がタンジェンシャル方向に比べて大きくなる。こうすることによって、ディスク状の検査チップ７を回転させた際に、回転非同期の偏心が生じた場合であっても、ラジアル方向へのビームの広がりの分だけ余裕があり、微小粒子を読み飛ばすことを防ぐことができる。また、タンジェンシャル方向とラジアル方向とで実効ＮＡが同一である場合に比較して、タンジェンシャル方向の分解能を高めることができる。また、焦点位置近傍での単位面積当たりの照射光強度を高めることができる。
【００５３】
上記対物レンズ２で集光されたレーザー光が、検査チップ７内の微小粒子に照射されると、微小粒子によって散乱された散乱光と蛍光とが発生する(以下、散乱光と蛍光とをまとめて信号光と言う)。発生した上記信号光を、第１〜第３レンズ１７,２１,２５で集束光にする。ここで、第１〜第３レンズ１７,２１,２５は、上記レーザー光を集光する際に用いた対物レンズ２と同一のレンズを用いてもよい。その場合には、同一のレンズを用いることによって、本微小粒子検出装置の小型化を図ることが可能になる。さらに、散乱光の検出において対物レンズ２と同一のレンズを用いた場合には、微小粒子で散乱された光のうち所謂後方散乱光を検出することとなり、散乱光による微小粒子系の分別が容易になる。
【００５４】
上記信号光のうちの散乱光は、第１ダイクロイックミラー１４で反射され、第２ＮＤフィルタ２４で減光された後、第３レンズ２５で収束されて第３検出器２７に導かれる。第３レンズ２５の焦点位置には第４アパーチャ２６が配置されており、迷光が除去される。
【００５５】
上記第４アパーチャ２６の径は、レーザ光(照射光)の焦点深度内に位置する物質からの光は十分に通過可能であるが、合焦位置以外からの散乱光や迷光を除去可能な径に、設定されている。例えば、検査チップ７における基板３２の面やレンズ２,２５の面で発生した反射光は対物レンズ２の焦点位置から大きくずれているので、対物レンズ２の後段に続く光学系によって第４アパーチャ２６の位置では広がった光となる。そのため、効率よく第４アパーチャ２６を透過することができずにカットされるのである。
【００５６】
ここで、上記第４アパーチャ２６のアパーチャ径の決定方法は、以下のとおりである。
【００５７】
・アパーチャ径決定方法Ａ
（１）図３に示すように、上記検体注入層３６における厚み方向の中心に被検出微小粒子３８が存在する場合、散乱光が対物レンズ２および第３レンズ２５で集光され、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７で検出される光強度を１００とする。
（２）図４に示すように、上記検体注入層３６における厚み方向の上部または下部に被検出粒子３８が存在する場合、散乱光が対物レンズ２および第３レンズ２５で集光され、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７で検出される光強度が９０以上になる。
【００５８】
上記Ａ‐(１)およびＡ‐(２)が成立するようにアパーチャ径を決定することによって、検体注入層３６内において厚み方向の異なる位置に微小粒子が存在したとしても、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７によって検出される光強度の変動率は１０％以内であり、散乱光検出時における微小粒子径の誤差も１０％以内にすることができる。
【００５９】
・アパーチャ径決定方法Ｂ
（１）図３に示すように、上記検体注入層３６における厚み方向の中心に被検出微小粒子３８が存在する場合、散乱光が対物レンズ２および第３レンズ２５で集光され、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７で検出される光強度を１００とする。
（２）上記検体注入層３６における厚み方向の上部または下部であって厚みの２倍の位置で散乱光が発生すると想定した場合、散乱光が対物レンズ２および第３レンズ２５で集光され、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７で検出される光強度が７０以上になる。
【００６０】
上記Ｂ‐(１)およびＢ‐(２)が成立するようにアパーチャ径を決定することによって、中心軸２８方向(つまり光照射方向)への面ブレによって検査チップ７が厚み方向に移動したとしても、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７によって検出される光強度の変動率は３０％以内であり、散乱光検出時における微小粒子径の誤差も３０％以内にすることができる。
【００６１】
・アパーチャ径決定方法Ｃ
（１）図３に示すように、上記検体注入層３６における厚み方向の中心に被検出微小粒子３８が存在する場合、散乱光が対物レンズ２および第３レンズ２５で集光され、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７で検出される光強度を１００とする。
（２）図５に示すように、上記検査チップ７の表面または裏面で散乱光が発生すると想定した場合、散乱光が対物レンズ２および第３検出レンズ２５で集光され、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７で検出される光強度が０.０１以下になる。
【００６２】
上記Ｃ‐(１)およびＣ‐(２)が成立するようにアパーチャ径を決定することにより、検査チップ７の表面やテーブル２９の面に存在するキズやゴミに起因して散乱光が発生したとしても、第４アパーチャ２６を透過して第３検出器２７によって検出される光強度は０.０１％以下であり、不要な面からの散乱光の影響も０.０１％以下にすることができる。
【００６３】
上記アパーチャ径決定方法Ａ,Ｂ,Ｃの条件を総て満たすアパーチャ径が、最も第４アパーチャ２６のアパーチャ径として適している。その理由は、キズやホコリ等の異物に起因して意図しない散乱光が混入することが想定され、散乱光検出時におけるアパーチャ径の設定が特に重要だからである。
【００６４】
上記第１ダイクロイックミラー１４を透過した上記信号光のうち、波長がより短い上記第２波長を有する第２の蛍光は第２ダイクロイックミラー１５で反射され、第３バンドパスフィルタ２０を透過した後、第２レンズ２１で収束されて第２検出器２３に導かれる。第２レンズ２１の焦点位置には第３アパーチャ２２が配置されており、第３アパーチャ２２によって迷光が除去される。
【００６５】
上記第２ダイクロイックミラー１５を透過した波長がより長い上記第１波長を有する第１の蛍光も同様に、第２バンドパスフィルタ１６を透過した後に、第１レンズ１７で収束されて第１検出器１９に導かれる。第１レンズ１７の焦点位置には第２アパーチャ１８が配置されており、迷光が除去される。
【００６６】
上記第１検出器１９および第２検出器２３による蛍光検出の場合には、傷によって蛍光が生ずる可能性は低いので、第２アパーチャ１８および第３アパーチャ２２のアパーチャ径は、必ずしも上記アパーチャ径決定方法Ａ,Ｂ,Ｃの条件を総て満たす必要はない。上記アパーチャ径決定方法Ａのみを満たしていればよい。
【００６７】
以上のようにして、上記第１の蛍光が第１検出器１９に導かれ、上記第２の蛍光が第２検出器２３に導かれ、上記散乱光が第３検出器２７に導かれると、第１検出器１９,第２検出器２３および第３検出器２７では、上記信号光に対して光電変換が行われ、得られた電気信号が信号処理部に導かれる。そして、上記信号処理部によって、アナログ信号である上記電気信号がＡＤ変換されてデジタル信号に変換され、さらに上記デジタル信号が処理されて、上記検出部の一例であるパーソナルコンピュータ等の情報処理装置に転送される。
【００６８】
そうすると、上記情報処理装置においては、処理された上記デジタル信号に基づいて、どのような蛍光または散乱光を発生する微小粒子が存在したかを定量的に分析して、分析結果を表示するのである。
【００６９】
以上のごとく、本実施の形態においては、上記検査チップ７の検体注入層３６に注入された上記検体に対して、半導体レーザー８から出射されたレーザー光をコリメータレンズ９およびプリズムミラー１３を介して照射する。そして、上記検査チップ７が載置されたテーブル２９をモータ３０によって回転する一方、光源装置１と対物レンズ２と第１〜第３検出装置３〜５とが収納された光学モジュール６を半径方向に移動させる。こうして、集束されたレーザー光が照射された上記検体中の微小粒子から周囲に等方的に散乱された蛍光および散乱光を、第１〜第３検出装置３〜５の第１〜第３検出器１９,２３,２７によって検出する。
【００７０】
このように、レーザー光を二次元的に走査しながら微小粒子から発せられる散乱光または蛍光を検出する場合には、走査面積が広くなって測定時間が長くなるので測定時間を短くする必要がある。それには、単位走査面積当たりの微小粒子量を増やすことが有効である。
【００７１】
そして、そのために、上記検査チップ７の検体注入層３６に厚みＤを持たせると共に、それに合わせて光学系を以下のように最適化している。
【００７２】
先ず、微小粒子検出の精度を向上させるためには、照射光であるレーザーの径をできる限り絞った状態で、上記検体に照射することが望ましい。そこで、レーザー光を対物レンズ２で上記検体の位置に焦点が合うように絞って上記検体に照射する。レーザー光をレンズを用いて絞る場合には、回折の効果によってレーザー光の径を無限小にまで絞れない。レーザー光を絞る場合の径の最少値であるスポット半径ｒは、強度分布を持たない場合の円形フランフォーファ回折像を考慮した場合、ｒ＝０.６１λ/ＮＡ(ＮＡ：開口数、λ：光の波長)で与えられることが一般的に知られている。したがって、ビーム半径を、上記検体が注入されている厚みＤの範囲全体おいて、上記スポット半径ｒに近い値になる(例えば、ビーム半径がスポット半径ｒのルート２倍以下に納まる)ように設定することが望ましい。
【００７３】
ここで、ビーム半径がスポット半径ｒのルート２倍以下となるための条件は、焦点深度ｄ＝λ/ＮＡ2を用いて、Ｄ≦ｄで与えられる。また、対物レンズ２の集光によるレーザー光のビーム半径の減少率Ｒは、概ねＦ値の逆数の２分の１と同義であって、Ｒ＝１/(２Ｆ)＝ＮＡの関係にある。したがって、上記条件は、以下のように変形できる。
Ｄ≦ｄ＝λ/ＮＡ2＝λ/Ｒ2
【００７４】
尚、上記特許文献１においては、上述のような「ビーム半径がスポット半径ｒのルート２倍以下に納まるように設定する」や「上記検体が注入されている厚みＤを焦点深度ｄ以下にする」という配慮に関する記載がない。したがって、上記特許文献１において上記条件を満たしていない場合には、検体注入部に厚みＤを持たせたとしても、厚みＤ内でレーザー光のビーム径が大きい箇所と小さい箇所とができてしまう。特に、ビーム径が大きい箇所ではレーザー光の光密度が小さいことから、微小粒子から発せられる光の強度が微弱となり、上記厚みＤの領域に在る微小粒子は検出感度が低下してしまう。
【００７５】
そのため、上記厚みＤの検体注入部内の全ての微小粒子の検出に有効に活用することができない。あるいは、上記厚みＤの検体注入部内で微小粒子から発せられる光の強度に分布ができてしまうため、検出される微小粒子からの光の強度のばらつきが大きくなってしまうのである。
【００７６】
また、上記焦点深度ｄ(＝λ/Ｒ2)を、検体注入層３６の厚みＤの３倍以下に設定している。焦点深度ｄ(＝λ/Ｒ2)が大き過ぎると、以下のような問題が生ずる。
【００７７】
すなわち、上記レーザー光のスポット半径ｒは、ビーム半径の減少率Ｒに比例する(上述のごとくｒ＝０.６１λ/ＮＡ＝０.６１λ/Ｒ(ＮＡ：開口数、λ：光の波長))。そのために、上記減少率Ｒが小さい(つまり、レーザー光の集光率が小さい)場合には、上記検体に照射されるレーザー光のビーム半径が大きくなってしまい、微小粒子の検出精度が低下してしまう。
【００７８】
すなわち、上記減少率Ｒが小さいと、焦点深度ｄを大きくすることができる一方で、レーザー光のビーム半径を絞ることができないというトレードオフの関係にある。
【００７９】
そこで、Ｄ≦λ/Ｒ2(＝ｄ)の関係を満たしつつ、ビーム半径は可能な限り小さくするため、上述のように、焦点深度ｄ(＝λ/Ｒ2)を、検体注入層３６の厚みＤの３倍以下に設定するのである。ここで、上記焦点深度ｄの上限値である「３Ｄ」は、上記照射光学系および上記光検出光学系の精度や、光学モジュール６の径方向へのスキャン時における中心軸２８の延在方向のブレ等を考慮して、第１検出器１９,第２検出器２３および第３検出器２７によって最適な精度で光を検出可能なように設定されている。
【００８０】
また、本実施の形態においては、上記微小粒子から発せられる光は広い角度の範囲で発せられるため、その光を効率的に第１〜第３検出器１９,２３,２７に導くため、開口の広い対物レンズ２を用いている。さらに、対物レンズ２は、光軸に沿った一部がレーザー光を透過できるようになっている。すなわち、本実施の形態においては、対物レンズ２は、レーザー光を透過させて上記検体に導くための機能と、上記微小粒子からの光を集光するための機能とを兼ね備えているのである。
【００８１】
そして、上記半導体レーザー８からのレーザー光は、対物レンズ２の光軸付近のごく狭い領域のみを透過し、対物レンズ２を透過後にＤ≦λ/Ｒ2の条件を満たして上記検体に照射されるようになっている。さらに、対物レンズ２全体の領域は、上記微小粒子から発せられた光を第１〜第３検出器１９,２３,２７に導くようになっている。
【００８２】
本実施の形態においては、上述のこと実現するために、上記対物レンズ２の形状を以下のように設定している。
【００８３】
すなわち、上述したように、上記対物レンズ２の光軸近傍の一部であって、上記光源である半導体レーザー８からのレーザー光を透過するビーム光透過部は、緩やかな曲率を有して半導体レーザー８からのレーザービーム(以下、単にビームと言う)を検査チップ７に向かって絞る機能を有している。ここで、対物レンズ２に入射するビームの半径をｒ0、対物レンズ２透過後のビームの焦点距離をｆとすると、焦点距離ｆを有効口径(２・ｒ0)で割った値である実効Ｆ値を用いて、上記減少率Ｒの定義は、Ｒ＝１/(２Ｆ)＝１/２(ｆ/(２・ｒ0))＝ｒ0/ｆで与えられる。したがって、上述した「Ｄ≦λ/Ｒ2」の条件は、Ｄ≦λ/Ｒ2＝λ(ｆ/ｒ0)2と変形することができる。尚、対物レンズ２の一部にしかレーザー光が入射しないので、ｒ0の取り方をレンズ直径とする普通のＦ値ではなく、ｒ0を入射するビームの直径とする実効的なＦ値となる。
【００８４】
上記対物レンズ２における光軸近傍の上記ビーム光透過部と、その他の周辺部分とを含む対物レンズ２全体は、上記検体から広角に出射された散乱光および蛍光を第１〜第３検出器１９,２３,２７に向かって集光する検体光透過部となっている。そして、上記ビーム光透過部の領域から外側に向かって、徐々に透過後の散乱光および蛍光の屈折角が大きくなるような形状になっている。
【００８５】
すなわち、本実施の形態において、上記対物レンズ２における光軸に沿った上記ビーム光透過部は、レーザー光を緩く絞る(但し、絞り過ぎると焦点距離ｆが小さくなり過ぎるため、上記減少率Ｒが大きくなり、上述した「Ｄ≦λ/Ｒ2」の条件を満たさなくなってしまう)ために、対物レンズ２を透過後のレーザー光の屈折角が上記周辺部分よりも小さくなるような形状になっている。一方において、それ以外の領域は、上記検体から広角に出射されたレーザー光を集光するために、対物レンズ２を透過後の散乱光および蛍光の屈折角が上記ビーム光透過部側から外周縁側に向かって徐々に大きくなるような形状になっているのである。
【００８６】
また、本実施の形態においては、上記対物レンズ２で集光された蛍光および散乱光は第１〜第３レンズ１７,２１,２５で収束され、第２〜第４アパーチャ１８,２２,２６を介して第１〜第３検出器１９,２３,２７に導かれる。その場合における各アパーチャ１８,２２,２６のアパーチャ径の決定は、検体注入層３６における厚みＤの範囲に分布する微小粒子からの上記蛍光および上記散乱光を全て取り込めるように決定している。その場合、検体注入層３６内において厚み方向の異なる位置に微小粒子が存在したとしても、各アパーチャ１８,２２,２６を透過して各検出器１９,２３,２７によって検出される光の検出効率の変動率は１０％以内に在るようにしている。ここで言う、光検出効率の変動率が１０％以内とは、同程度の光強度の点光源が厚みＤの範囲に分布している状態を想定した場合に、検出強度のバラツキが１０％未満であることを意味する。
【００８７】
通常、アパーチャは、目的の光のみを透過し、それ以外の光を遮蔽するように設計される。例えば、光軸方向における特定の深さから発せられた光は透過し、それ以外の深さからの光は遮光するように設計される。ここで、各アパーチャ１８,２２,２６を透過する上記蛍光および上記散乱光が発せられる位置における深さの範囲が検体注入層３６の厚みＤよりも小さい場合には、厚みＤの範囲に分布する微小粒子の全てを検出することができなくなってしまう。そこで、この発明においては、上述のごとくレーザー光の焦点深度ｄを検体注入層３６の厚みＤよりも大きく設定するだけではなく、各アパーチャ１８,２２,２６を透過する光が発せられる位置の深さ範囲をも検体注入層３６の厚みＤよりも大きく設定している。
【００８８】
こうすることによって、上記検体注入層３６内において厚み方向の異なる位置に微小粒子が存在したとしても、各アパーチャ１８,２２,２６を透過して各検出器１９,２３,２７によって検出される光強度の変動率を１０％以内にし、蛍光および散乱光検出時における微小粒子径の誤差を１０％以内にすることができるのである。
【００８９】
・第２実施の形態
本実施の形態は、上記第１実施の形態における上記照射光学系とは異なる照射光学系に関するものであり、照射レーザー光をダイクロイックミラーで反射させる構成を有している。
【００９０】
図６は、本実施の形態の微小粒子検出装置における概略構成を示す図である。４１は光源装置、４２は対物レンズ、４３は第１検出装置、４４は第２検出装置である。光源装置４１と対物レンズ４２と第１検出装置４３と第２検出装置４４とは、枠体内に収納されて光学モジュール４５を構成している。そして、光学モジュール４５の上方には対物レンズ４２に対向して円形のディスク状の検査チップ４６が配置され、検査チップ４６内には例えば蛍光物質によって標識された微小粒子が分布する懸濁液やゲル支持体やメンブレン等の転写支持体が検体として封入される検体注入層４７が設けられている。
【００９１】
上記光学モジュール４５の光源装置４１には、光源としての第１半導体レーザー４８が設けられており、第１半導体レーザー４８の光軸上には、第１コリメータレンズ４９,スポットサイズ調整レンズ５０および第１アパーチャ５１を、この順で配置している。さらに、第１半導体レーザー４８に加えて、第１半導体レーザー４８から出射されるレーザー光の第１波長とは異なる、第２波長のレーザー光を出射する第２半導体レーザー５２を配置している。さらに、第２半導体レーザー５２からのレーザー光を平行光化する第２コリメータレンズ５３を配置している。そして、第１半導体レーザー４８の光軸と第２半導体レーザー５２の光軸との交差位置には、第１波長のレーザー光を透過する一方、第２波長のレーザー光を反射する第１ダイクロイックミラー５４を配置している。ここで、第１半導体レーザー４８,第１コリメータレンズ４９,スポットサイズ調整レンズ５０,第１アパーチャ５１,第２半導体レーザー５２,第２コリメータレンズ５３および第１ダイクロイックミラー５４は、一つのケース内に収納されて上記照射光学系の一例である光源装置４１を構成している。
【００９２】
さらに、上記第１半導体レーザー４８の光軸上には、上記第１ダイクロイックミラー５４を透過した光を、対物レンズ４２側に向かうように反射させるプリズム５５を配置している。また、プリズム５５によって反射された光と対物レンズ４２の光軸との交差位置には、プリズム５５からの光を対物レンズ４２に入射するように反射させる第２ダイクロイックミラー５６を配置している。ここで、第２ダイクロイックミラー５６は、検体注入層４７内の微小粒子からの蛍光を透過する一方、散乱光を反射する。
【００９３】
上記構成においては、第１半導体レーザー４８および第２半導体レーザー５２の複数の光源を搭載しているが、必ずしも複数の光源が必要ではない。
【００９４】
また、５７はバンドパスフィルタ、５８は第１レンズ、５９は第２アパーチャ、６０は第１検出器であり、蛍光の検出を行う。一方、６１はＮＤフィルタ、６２は第２レンズ、６３は第３アパーチャ、６４は第２検出器であり、散乱光の検出を行う。すなわち、本実施の形態においては、上記光検出光学系を、対物レンズ４２、第２ダイクロイックミラー５６、各フィルタ５７,６１、各レンズ５８,６２、各アパーチャ５９,６３、および、各検出器６０,６４で構成するのである。
【００９５】
上記検査チップ４６は、透明に且つ円形に構成されており、中心軸６５に固定された円形の皿状のホルダ６６に収容されて、中心軸６５に対して固定されている。上記中心軸６５は、上記回転駆動系の一例としてのスピンドルモータ６７で回転可能になっている。これに対し、光学モジュール４５は、検査チップ４６が成す円板の半径方向に、上記駆動機構によって移動可能になっている。尚、６６aはエンコーダリングが設けられたホルダ６６の外周面、６８は上記エンコーダリングを検知するための一対の発光素子と受光素子とが搭載されたヘッドである。
【００９６】
以下、一例として、上記散乱光を検出する散乱光検出の場合を例に挙げて説明する。
【００９７】
上記光源装置４１における第１半導体レーザー４８および第２半導体レーザー５２のうちの、第２ダイクロイックミラー５６で反射される波長のレーザー光を出射する方の半導体レーザー、例えば第１半導体レーザー４８から第１波長のレーザー光を出射させる。
【００９８】
上記第１半導体レーザー４８から出射されたレーザー光は、第１コリメータレンズ４９,スポットサイズ調整レンズ５０および第１アパーチャ５１で収束され、第１ダイクロイックミラー５４を透過する。次いで、プリズム５５および第２ダイクロイックミラー５６によって反射され、対物レンズ４２および検査チップ４６を通過して、検体注入層４７に集光される。その場合、プリズム５５の長手方向(水平方向)の長さは短く、上記長手方向に直交する方向の幅は狭くなっており、第１半導体レーザー４８からのレーザー光は対物レンズ４２の光軸付近(レーザー光透過部)のみを通過するようになっている。こうして、検体注入層４７中の微小粒子に集束光が照射されると、上記集束光が照射された部分から周囲に等方的に散乱された散乱光が生ずる。
【００９９】
上記散乱光は、上記検体注入層４７における上記集束光が照射された部分から周囲に等方的に出射される。そして、出射された散乱光のうちの検査チップ４６を透過して対物レンズ４２に入射した成分が、対物レンズ４２を通過し、第２ダイクロイックミラー５６によって反射され、ＮＤフィルタ６１,第２レンズ６２および第３アパーチャ６３を通過して、第２検出器６４によって検出される。そして、第２検出器６４で検出された信号は、内蔵されるＡＤ変換器等によってＡＤ変換等の処理が施された後に、上記検出部の一例であるパーソナルコンピュータ(ＰＣ)等へ送出される。こうして、検体注入層４７上の各測定点での散乱光強度の分布が内部メモリ等に記録される。また、検出信号に基づいて粒子カウントを行った場合には、粒子カウントデータが上記内部メモリ等に記録される。
【０１００】
上記第３アパーチャ６３は、空間的な迷光をカットするために配置されている。また、共焦点アパーチャとしても機能しており、検体注入層４７が存在する面以外からの不必要な反射光や迷光を除去する。例えば、検査チップ４６の面やレンズ面で発生した反射光は対物レンズ４２の焦点位置からずれているので、対物レンズ４２の後段に続く光学系によって第３アパーチャ６３の位置で広がった光となり、効率よく第３アパーチャ６３を透過することができない。
【０１０１】
こうして、上記検査チップ４６を回転させながら上述のような検出を行うことにより、各測定点での散乱光強度が上記ＰＣの内部メモリ等に記録される。
【０１０２】
尚、上述の説明は、上記第１半導体レーザー４８からの第１波長のレーザー光による散乱光検出の場合を説明したが、第２半導体レーザー５２からの第２波長のレーザー光による場合も、第１ダイクロイックミラー５４で反射される以外は、全く同様である。また、上記蛍光を検出する蛍光検出の場合も、第２ダイクロイックミラー５６を透過した蛍光を第１検出装置４３で検出する以外は、全く同様である。
【０１０３】
本実施の形態によれば、微小粒子で発生した蛍光がプリズム５５およびその支持台(図示せず)で遮られることがなく、上記蛍光を高感度で検出することができるのである。
【０１０４】
本実施の場合においても、上記対物レンズ４２の焦点深度ｄを、照射光の波長λ/(照射光の実効ＮＡ)2で、つまり照射光の波長λ/(ビーム半径の減少率Ｒ)2で定め、その値を検査チップ４６における検体注入層４７の厚みＤ以上に、且つ検体注入層４７の厚みＤの３倍以下に設定している。こうして、照射光のビーム半径をスポット半径ｒのルート２倍以下に収めて、必要な焦点深度ｄを確保するようにしている。
【０１０５】
また、上記各アパーチャ５９,６３を透過する光が発せられる位置の深さ範囲を検体注入層４７の厚みＤよりも大きく設定している。
【０１０６】
また、上記対物レンズ４２の形状を、光軸に沿った領域である上記ビーム光透過部は、透過後の光の屈折角が他の領域よりも小さくなるような形状を有して、各半導体レーザー４８,５２からの照射光を上記検体に向かって絞る機能を有するようにしている。一方、上記ビーム光透過部を除く他の領域は、透過後の上記微小粒子からの光の屈折角が上記ビーム光透過部側から外周縁側に向かって大きくなるような形状を有して、上記微小粒子から広角に発せられた光を集光する機能を有するようにしている。
【０１０７】
こうすることによって、上記検体注入層４７内において厚み方向の異なる位置に微小粒子が存在したとしても、各アパーチャ５９,６３を透過して各検出器６０,６４によって検出される光強度の変動率を１０％以内にし、蛍光および散乱光検出時における微小粒子径の誤差を１０％以内にすることができるのである。
【０１０８】
・第３実施の形態
本実施の形態は、上記第１実施の形態および上記第２実施の形態における微小粒子の検出方法を、検査チップまたは光学モジュールを互いに直交する二方向への二次元走査する二次元スキャン方式に適用した微小粒子検出装置に関する。
【０１０９】
図７は、一例として、上記検査チップを、Ｙ方向に移動させながらＸ方向にスキャンする微小粒子検出装置を示す。
【０１１０】
図７において、７１は光源装置であり、７２は対物レンズであり、７３はバンドパスフィルタであり、７４は検出装置である。上記照射光学系の一例である光源装置７１と対物レンズ７２とバンドパスフィルタ７３と検出装置７４とは、枠体内に収納されて上記光学モジュール７５を構成している。そして、光学モジュール７５の上方には対物レンズ７２に対向してガラスステージ７６が配置され、ガラスステージ７６上には例えば蛍光物質によって標識された微小粒子が分布する懸濁液やゲル支持体やメンブレン等の転写支持体が検体として注入された検査チップ７７がセットされている。
【０１１１】
ここで、上記ガラスステージ７６は矩形を成しており、長辺方向の第１走査方向と、第１走査方向に直交する短辺方向の第２走査方向との、二次元方向に走査するように構成されている。その場合における走査方法については、特に限定するものではない。要は、ガラスステージ７６を上記第１走査方向に往復動作をさせる第１動作部と、上記第２走査方向に往復動作をさせる第２動作部とを備えていれば良いのである。あるいは、光学モジュール７５側を二次元方向に走査してもよいし、ガラスステージ７６を上記第２走査方向に移動させながら光学モジュール７５を上記第１走査方向に往復動作をさせてもよい。
【０１１２】
上記光源装置７１は、上記第１実施の形態において図１に示す光源装置１または上記第２実施の形態において図６に示す光源装置４１と同様に機能する構成を有している。
【０１１３】
また、光検出光学系として、上記第１実施の形態において図１に示す上記光検出光学系または上記第２実施の形態において図６に示す上記光検出光学系と同様に機能する構成を有している。尚、バンドパスフィルタ７３は、回転フォルダ７９に配置されて、蛍光の波長に応じて他の波長のフィルタと交換可能になっている。
【０１１４】
上述したように、本実施の形態の微小粒子検出装置においては、上記光学モジュール７５または検査チップ７７を載せたガラスステージ７６を相対的に二次元方向に走査させることにより、散乱光または蛍光の強度の分布画像を読取る構成になっている。
【０１１５】
例えば、図８に示すように、微小粒子検出装置は、上記第２走査方向であるＹ方向にガラスステージ７６を移動させながら、上記第１走査方向であるＸ方向に光学モジュール７５でスキャンする。こうして、散乱光または蛍光の強度の分布画像を生成する。
【０１１６】
本実施の場合においても、上記対物レンズ７２における焦点深度ｄを、照射光の波長λ/(照射光の実効ＮＡ)2で、つまり照射光の波長λ/(ビーム半径の減少率Ｒ)2で定め、その値を検査チップ７７における検体注入層７８の厚みＤ以上に、且つ検体注入層７８の厚みＤの３倍以下に設定している。こうして、照射光のビーム半径をスポット半径ｒのルート２倍以下に収め、必要な焦点深度ｄを確保するようにしている。
【０１１７】
また、上記アパーチャを透過する光が発せられる位置の深さ範囲を検体注入層７８の厚みＤよりも大きく設定している。
【０１１８】
また、上記対物レンズ７２の形状を、光軸に沿った領域であるビーム光透過部は、透過後の光の屈折角が他の領域よりも小さくなるような形状を有して、半導体レーザー(光源)からの照射光を上記検体に向かって絞る機能を有するようにしている。一方、上記ビーム光透過部を除く他の領域は、透過後の上記微小粒子からの光の屈折角が上記ビーム光透過部側から外周縁側に向かって大きくなるような形状を有して、上記微小粒子から広角に発せられた光を集光する機能を有するようにしている。
【０１１９】
こうすることによって、上記検体注入層７８内において厚み方向の異なる位置に微小粒子が存在したとしても、アパーチャを透過して検出器によって検出される光強度の変動率を１０％以内にし、蛍光および散乱光検出時における微小粒子径の誤差を１０％以内にすることができるのである。
【０１２０】
以上のごとく、この発明の微小粒子検出装置は、
微小粒子を含む検体が注入される検体注入部３６,４７,７８を有する検査チップ７,４６,７７と、
光源８,４８,５２と、
上記光源８,４８,５２から出射された光を、上記検査チップ７,４６,７７における上記検体に対して照射する照射光学系１,４１,７１と、
上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた光を検出する光検出光学系と、
上記光検出光学系によって検出された上記微小粒子からの光の強度に基づいて、上記微小粒子を検出する検出部と
を備え、
上記光検出光学系は、上記光源８,４８,５２から出射された光を上記検体に向けて透過させる一方、上記光の照射によって上記検体中の上記微小粒子から発せられた光を集光する対物レンズ素子２,４２,７２を含み、
上記対物レンズ素子２,４２,７２は、上記光源８,４８,５２からの光を透過させると共に、透過後の光を上記検体に向かって集光させる形状を有するビーム光透過部を含んでおり、
上記検査チップ７,４６,７７の上記検体注入部３６,４７,７８における光照射方向への厚みをＤ、上記光源８,４８,５２からの照射光の波長をλ、上記ビーム光透過部における上記集光による照射光のビーム半径の減少率をＲとした場合に、関係式
Ｄ≦λ/Ｒ2
を満たすようになっている
ことを特徴としている。
【０１２１】
上記構成によれば、上記検査チップ７,４６,７７の上記検体注入部３６,４７,７８における光照射方向への厚みＤは、関係式「Ｄ≦λ/Ｒ2」を満たすようになっている。また、上記対物レンズ素子２,４２,７２の上記ビーム光透過部における集光による照射光のビーム半径の減少率Ｒは、概ねＦ値の逆数の２分の１と同義であり、開口数ＮＡを用いてＲ＝１/(２Ｆ)＝ＮＡの関係にある。
【０１２２】
したがって、上記関係式「Ｄ≦λ/Ｒ2」は、次のように変形することができる。
Ｄ≦λ/Ｒ2＝λ/ＮＡ2
【０１２３】
そして、焦点深度ｄ＝λ/ＮＡ2を用いて上記関係式は、さらに次のように変形することができる。
Ｄ≦λ/Ｒ2＝ｄ
【０１２４】
すなわち、この発明によれば、上記対物レンズ素子２,４２,７２における上記照射光の焦点深度ｄは、上記検体注入部３６,４７,７８における光照射方向への厚みＤ以上になるように設定されている。したがって、上記検体注入部３６,４７,７８に注入されて厚みを有する検体領域に対して、上記照射光を均一に照射することができる。換言すれば、上記検体領域の厚み方向で異なる位置に微小粒子が存在していても、上記微小粒子を検出することが可能になる。
【０１２５】
さらに、上記検査チップ７,４６,７７を回転または一方向に走査した際に、上記検査チップ７,４６,７７が光照射方向に面ブレを起こした場合でも、上記焦点深度ｄが上記検体注入部３６,４７,７８の厚みＤ以上であるので、上記焦点深度ｄが上記厚みＤより大きい分だけ上記面ブレの影響を低減することができる。
【０１２６】
さらに、厚みＤを有する上記検体を一度に測定可能になるので、上記検体中の微小粒子を高速に且つ効率よく検出することが可能になり、測定時間の短縮を図ることが可能になる。
【０１２７】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
下記の関係式
Ｄ≦λ/Ｒ2≦３Ｄ
を満たすようになっている。
【０１２８】
上述のごとく、上記照射光の焦点深度ｄは光照射方向への厚みＤよりも大きい方が望ましい。しかしながら、焦点深度ｄ(＝λ/Ｒ2)が大き過ぎると、上記ビーム光透過部による上記減少率Ｒが小さくなって照射光のビーム半径を絞ることができなくなってしまう。
【０１２９】
この実施の形態によれば、さらに加えて、λ/Ｒ2で表される焦点深度ｄを検体注入部３６,４７,７８における光照射方向の厚みＤの３倍以下に設定している。したがって、上記照射光学系１,４１,７１および上記光検出光学系の精度や、上記検査チップ７,４６,７７の光照射方向に面ブレ等を考慮して、上記光検出光学系によって最適な精度で光検出を行うことが可能になる。
【０１３０】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記対物レンズ素子２,４２,７２における上記ビーム光透過部の表面は、光を屈折によって集光させる曲率を有しており、
上記検査チップ７,４６,７７の上記検体注入部３６,４７,７８における光照射方向への厚みをＤ、上記光源８,４８,５２からの照射光の波長をλ、上記ビーム光透過部を透過する照射光のビーム半径をｒ0、上記ビーム光透過部を透過後の光の焦点距離をｆとした場合に、関係式
Ｄ≦λ(ｆ/ｒ0)2
を満たすようになっている。
【０１３１】
この実施の形態によれば、上記ビーム光透過部の表面は光を屈折によって集光させる曲率を有しており、上記検体注入部３６,４７,７８の厚みＤは関係式「Ｄ≦λ(ｆ/ｒ0)2」を満たすようになっている。したがって、上記ビーム光透過部を透過する照射光のビーム半径ｒ0は、上記関係式「Ｄ≦λ/Ｒ2」を満たす範囲内で、より小さい方が望ましい。
【０１３２】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記対物レンズ素子２,４２,７２における上記ビーム光透過部は、光軸に沿った領域であって、透過後の光の屈折角が上記ビーム光透過部を除く他の領域よりも小さくなるような形状を有して、上記光源８,４８,５２からの照射光を上記検体に向かって絞る機能を有しており、
上記対物レンズ素子２,４２,７２における上記ビーム光透過部を除く他の領域は、透過後の上記微小粒子からの光の屈折角が上記ビーム光透過部側から外周縁側に向かって大きくなるような形状を有して、上記微小粒子から広角に発せられた光を集光する機能を有している。
【０１３３】
この実施の形態によれば、表面が屈折により光を集光させる曲率を有すると共に、透過する照射光のビーム半径ｒ0が小さい上記ビーム光透過部を、上記対物レンズ素子２,４２,７２における光軸に沿った領域とし、透過後の光の屈折角が他の領域よりも小さくなるような形状にしている。さらに、上記ビーム光透過部を除く他の領域(光軸に沿った領域の周囲の領域)を、透過後の上記微小粒子からの光の屈折角が外側に向かって大きくなるような形状にしている。
【０１３４】
したがって、単一の上記対物レンズ素子２,４２,７２に、上記光源８,４８,５２からの照射光を上記検体に向かって絞る機能と、上記微小粒子から広角に発せられた光を集光する機能とを兼ね備えることが可能になる。
【０１３５】
また、一実施の形態の微小粒子検出装置では、
上記対物レンズ素子２,４２,７２と上記検出部との間に設けられると共に、上記対物レンズ素子２,４２,７２を透過した上記微小粒子からの光を透過させる穴を有するアパーチャ１８,２２,２６,５９,６３を備え、
上記アパーチャ１８,２２,２６,５９,６３における穴の径を、上記検体注入部３６,４７,７８における厚みＤの範囲に分布する上記微小粒子からの光を全て取り込むと共に、上記検体注入部３６,４７,７８の厚みＤの範囲内に存在する上記微小粒子から発せられる光の上記検出部による光検出効率の変動率が１０％以下になるように設定している。
【０１３６】
この実施の形態によれば、上記対物レンズ素子２,４２,７２と上記検出部との間に上記アパーチャ１８,２２,２６,５９,６３を設け、上記アパーチャ１８,２２,２６,５９,６３の穴の径を、上記検体注入部３６,４７,７８の厚みＤの範囲内に存在する上記微小粒子から発せられる光の上記検出部による光検出効率の変動率が１０％以下になるように設定している。したがって、上記検体注入部３６,４７,７８内において厚み方向の異なる位置に微小粒子が存在したとしても、上記アパーチャ１８,２２,２６,５９,６３の穴を透過する光強度の変動率を１０％以内にすることができる。
【符号の説明】
【０１３７】
１,４１,７１…光源装置
２,４２,７２…対物レンズ
３〜５,４３,４４,７４…検出装置
６,４５,７５…光学モジュール
７,４６,７７…検査チップ
８,４８,５２…半導体レーザー
９,４９,５３…コリメータレンズ
１０,１６,２０,５７,７３…バンドパスフィルタ
１１,２４,６１…ＮＤフィルタ
１２,１８,２２,２６,５１,５９,６３…アパーチャ
１３…プリズムミラー
１４,１５,５４,５６…ダイクロイックミラー
１７,２１,２５,５８,６２…レンズ
１９,２３,２７,６０,６４…検出器
２８,６５…中心軸
２９…テーブル
３０,６７…モータ
３１,３２…基板
３４…スペーサ
３６,４７,７８…検体注入層
３７…検体注入口
３８…被検出微小粒子
５０…スポットサイズ調整レンズ
５５…プリズム
６６…ホルダ
７６…ガラスステージ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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