(57)【要約】      （修正有）【課題】皮膚美容分野で使用を主目的とする、赤外光によって引き起こされる損傷に対する保護をもたらす組合せの提供。【解決手段】加水分解されたイネ抽出物から得られるペプチド断片等のサーチュイン酵素タンパク質活性化因子とグアノシン一リン酸塩等の少なくとも1つのグアノシン誘導体を1:10から10:1の比率で用いるとの組み合せ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
SIRT1ペプチド活性化因子(成分A)及びグアノシン誘導体アラーモン(成分B)を含む、赤外光によって引き起こされる損傷に対する皮膚保護のための組み合わせ。
【請求項２】
前記成分Aは、タンパク質断片、ペプチド断片、ポリペプチド及びペプチド並びにペプチド結合によって結合した2以上のアミノ酸の任意の配列から選択される、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項３】
前記成分Aは、加水分解されたイネ抽出物から得られるペプチド断片である、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項４】
前記成分AがG-L-Y-D-N-L-E Gly-Leu-Tyr-Asp-Asn-Leu-Glu(配列番号1)ペプチド断片であり、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項５】
前記成分Bは、グアノシン一リン酸塩(RN: 85-32-5)、グアノシン二リン酸塩(RN: 146-91-8)、グアノシン三リン酸塩(RN: 86-01-1)、5'-ジホスファート-3'-グアノシン一リン酸塩(RN: 58902-76-4)、グアノシン四リン酸塩(RN: 33503-72-9)、ジグアノシン四リン酸塩(RN: 4130-19-2)及びグアノシン五リン酸塩(RN: 38918-96-6)の中の1又は複数である、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項６】
前記成分Bは、ジグアノシン四リン酸塩(RN: 4130-19-2)である、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項７】
前記組み合わせを含む組成物の合計重量に対する成分A及びBの組み合わせの量は、0.01%から2%の間で変えられる、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項８】
成分AとBとの比率は、1:10から10:1の間で変えられる、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項９】
成分Aは、商用製品であるオリシルチン(登録商標)に含まれ、成分Bは、商用製品であるGP4G(登録商標)に含まれている、請求項1に記載の組み合わせ。
【請求項１０】
オリシルチン(登録商標)とGP4G(登録商標)との比率は、1:4から4:1、特に1.5:1から1:1.5の範囲に及ぶ、請求項8に記載の組み合わせ。
【請求項１１】
水中油型、油中水型、水中シリコーン型、シリコーン中水型、水中油中水型、油中水中油型乳濁液、クリーム、ローション、溶液、リップスティック若しくは粉末といった無水物を基調としたもの、ゲル、ペースト、軟膏、乳状液、液体、エアゾール、ゼリー又は固体より選択される乳濁物として調製される、請求項1から9のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【請求項１２】
赤外光によって皮膚に引き起こされる損傷の予防及び修復に用いられる、請求項1から9のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【請求項１３】
赤外光によって皮膚に引き起こされる損傷の予防に有効な製剤及び組成物の調製において用いられる、請求項1から9のいずれかに記載の組み合わせの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚美容分野での使用を主に目的とする化合物の組み合わせに関するものであり、赤外光によって引き起こされる損傷に対する保護をもたらす。より詳しくは、本発明は、SIRT1ペプチド活性化因子及びグアノシン誘導体アラーモンを含む組み合わせに関する。
【０００２】
発明の背景
以下の文章において、「IR」は、700から1500nmの波長の赤外光を意味し、「UVA」は、320から400nmの紫外線A-放射を意味、「UVB」は、290から320nmの紫外線B-放射を意味する。
【０００３】
太陽放射に対する過度の曝露によって、早期の損傷、柔軟性の低下及びシワの形成となる皮膚の早期老化から、ある種の皮膚がんの出現までの健康に対する副作用を引き起こす。
【０００４】
ヒトの皮膚をUVA及びUVBから保護する必要性があることは、少なくとも30年間警告されてきた一方で、最近まで、皮膚の熱性紅斑(例えば、日焼け)を引き起こすだけの熱感発生因子と言われていたIR作用については殆ど警告されてこなかった。最近まで、低エネルギー放射線であるため、光化学反応を誘発する能力がないことから、皮膚への発がん性に対する寄与が低いと思われていた。しかしながら、IRには、皮膚の早期老化に関与するだけでなくUVの有害作用を増幅して、脈管構造を変化させ(毛細管拡張)、遊離ラジカルを生産し、ヒストン結合特性を変更して、DNA修復プロセスを損なうことを示す数多くの根拠が存在する。
【０００５】
UVA及びUVBに対する保護のために、現在の太陽保護製品の技術では、かかる放射を反射又は吸収する局所製剤中に含まれる成分を改良している。これらの成分は、化学成分(例えば、アヴォベンゾン及びベンゾフェノン)又は物理成分(例えば、金属酸化物(例：亜鉛及びチタン))である。それらの一部は、UVA及びUVBに対する保護をもたらす。しかしながら、大部分のそれらの成分は、UVA又はUVBより皮膚の中により深く侵入し、吸収されるにつれて伝導及び対流によって熱を拡散させるIRに対する保護をもたらさない。
【０００６】
IRに対する保護をもたらす組成物の提案がいくつか先行技術に見られる。
【０００７】
文献US5876699は、二酸化チタンがIR放射の吸収及び散乱をもたらすことを開示しているが、脱色作用を回避するために組成物において使用することができる量は4%未満でなければならない。
【０００８】
文献US4822600は、ヒュームドシリカ(組成物に1から10%含む)、好ましくはUV遮断剤との組み合わせが、IRに対する保護をもたらすことを開示している。
【０００９】
文献US5427771は、粒子径が1.5から25μmの二酸化チタンフレーク並びに水、低級一価アルコール及びC1-C6ポリオールから選択されるアジュバントを含む化粧品組成物を開示している。
【００１０】
文献JP2006151917は、粒子径が0.5から5μmの二酸化チタンと窒化ほう素粉末との混合物を含む化粧品組成物を開示している。
IRに対する皮膚保護は、発展中の知識分野であり、現在利用されており、UVA及びUVBに対する保護を既にもたらしている局所組成物と互換性及び有効性をもたらす代替物の持続的な調査が行われている分野である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】-  MTT試験によって評価した、48時間後の、ヒト皮膚線維芽細胞の生存度に関する本発明の組み合わせの効果-  クラスカル-ウォリスの検定の一元配置分散分析法のチャート-  ダネット方法-  平均±標準誤差、* p < 0.05対未処理。
【図２】-  ヒト皮膚線維芽細胞におけるIRAによって誘導されたMMP1発現に関する本発明の組み合わせの効果-  順位による一元配置分散分析法のチャート-  クラスカル-ウォリスの検定-  スチューデント-  ニューマン-クールズ方法;*p < 0.05対未処理(本発明の0%の組み合わせ(IRAなし));+p < 0.05対IRA(単独); #p < 0.05対明示した処置。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
簡潔な発明の要約
本発明は、皮膚美容分野で使用する有効成分の組み合わせに関するものであり、赤外光(IR)によって引き起こされる損傷に対する保護をもたらす。
【００１３】
より詳しくは、本発明は、SIRT1ペプチド活性化因子(成分A)及びグアノシン誘導体アラーモン(成分B)を含むことによって特徴づけられる、赤外光によって引き起こされる損傷に対する皮膚保護のための組み合わせに関する。
【００１４】
成分A
サーチュイン酵素(SIRT)は、脱アセチル化酵素タンパク質の高保存ファミリーであり、その活性はNAD+(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)に依存し、ヒストン脱アセチルに著しく関与する。7つのサーチュインが哺乳動物において知られており、かかるタンパク質は、ストレスに対する抵抗性、ゲノム安定性及びエネルギー代謝の変調を介した老化及びカロリー制限にリンクしている。
【００１５】
哺乳動物の種々のサーチュインは、種々の細胞内部位に位置しており、SIRT1は、通常、核に位置しているが、アポトーシス、分化及び腫瘍化転換に関係する細胞質SIRT1に関する記述も存在する。
【００１６】
SIRTタンパク質、特にSIRT1は皮膚細胞において発現し、かかる発現は皮膚細胞が被っている種々のストレスに関係するという先行技術の指摘が存在する。従って、かかるタンパク質の発現誘導は、細胞の保護を向上して、環境による攻撃及び老化に対する反応を助ける。
【００１７】
SIRT1活性化因子は、ペプチドであることが知られている。本願明細書において使用される意味によれば、SIRT1を活性化させることができる天然ペプチド化合物の中には、タンパク質断片、ペプチド及びポリペプチド断片及びペプチド結合によって結合した2以上のアミノ酸の全配列がある。加水分解したイネ抽出物から得られたペプチド断片は、例えば、特許US 8,703,161に述べられている、特に配列番号8として言及される断片(オリシルチン(登録商標)GLという名前で商業的に入手可能で、ISP Vincience社(Ashlandグループ)によって商品化):G-L-Y-D-N-L-E Gly-Leu-Tyr-Asp-Asn-Leu-Glu(配列番号:1)が適している。
【００１８】
成分B
アラーモンは、有害な環境要因(例えば酸化的ストレス)に応答して生産されるホルモン細胞内のシグナル分子である。ある状況において、それらは、ミトコンドリアDNAの保護及び修復と関連している。
【００１９】
グアノシン、特にグアノシン一リン酸塩(RN: 85-32-5)、グアノシン二リン酸塩(RN: 146-91-8)、グアノシン三リン酸塩(RN: 86-01-1)、5'-ジホスファート-3'-グアノシン一リン酸塩(RN: 58902-76-4)、グアノシン四リン酸塩(RN: 33503-72-9)、ジグアノシン四リン酸塩(RN: 4130-19-2)、及び、グアノシン五リン酸塩(RN:-38918-96-6)より選択されるものから誘導されたアラーモンは、本発明に適している。特定の実施形態において、例えば、GP4G(登録商標)(アルテミア生理食塩水の抽出物)の名前で、ISP Vincience社(Ashlandグループ)によって商業的に供給されている、ジグアノシン四リン酸塩を使用している。
【００２０】
適切に、且つ、非排他的に、IR放射によって引き起こされる損傷に対する保護に関する本発明の組み合わせは、少なくとも1つのSIRT1ペプチド活性化因子である成分Aと、少なくとも1つのグアノシン誘導体アラーモンである成分Bを含む。
【００２１】
本発明の組み合わせは、任意の皮膚美容用の製薬外用剤(例えば、日焼け止め、フェイスクリーム、ボディクリーム、又は、IR放射によって引き起こされる損傷に対する保護から利益を得る任意のもの)に用いることができる。適切に、任意の他の代替物を除外するものではないが、本組み合わせ含む組成物の合計重量に対する本組み合わせの含量は、0.01%から2%の間で変えられる。
【００２２】
成分Aがオリシルチン(登録商標)であり成分BがGP4G(登録商標)である場合、それらを含む組成物の合計重量に対する適切な比率は、任意の他のものを除外するものではないが、1:4から4:1、特に1.5:1から1:1.5の間で変えられる。
【００２３】
従って、本発明の組み合わせは、任意の他の代わりのものを除外するものではないが、1:10から10:1までの成分AとBとの比率を含む。
【００２４】
本発明の組み合わせは、全てのタイプのビヒクル、例えば、水中油型、油中水型、水中シリコーン型、シリコーン中水型、水中油中水型、油中水中油型乳濁液等、クリーム、ローション、溶液、無水物を基調としたもの(リップスティック、粉末)、ゲル、ペースト、軟膏、乳状液、液体、エアゾール、ゼリー、固体等と調製することができる。
【００２５】
本発明の組み合わせは、化粧的且つ医薬的に許容可能な成分、例えば、芳香剤、着色剤、色素、吸着剤、乳化剤、安定剤、潤滑油、溶媒、皮膚軟化薬、湿潤薬、膜形成剤、閉塞剤、物理的又は化学的紫外線吸収剤、精油、ビタミン、微量金属、抗刺激物、植物抽出物、抗菌物質、抗酸化剤、キレート化剤、pH調整剤、吸収剤、剥脱剤、皮膚コンディショナ、増粘剤、シリコーン配合薬剤、医薬成分及び任意の他の化粧的及び医薬的に許容可能な基質と調製することができる。
【００２６】
別の態様においては、本発明は、IR放射によって皮膚に引き起こされた損傷の予防及び修復において、上述の組み合わせの使用に関する。
【００２７】
別の態様においては、本発明は、IR放射によって皮膚に引き起こされる損傷の予防に有効な製剤及び組成物の調製において、上述の組み合わせの使用に関する。
【実施例】
【００２８】
特定の実施形態に関する実施例を以下に記載しているが、以下の請求項に含まれるもの以上に、如何なる限定をも本発明の範囲に課すものではない。
【００２９】
実施例1  -ヒト皮膚線維芽細胞におけるIRAにより誘導された遺伝子発現に対する本発明の組み合わせの効果
グリセロールを含むイネ抽出物とアルテミア生理食塩水抽出物との組み合わせがヒト皮膚線維芽細胞に対して、赤外光によって誘導される損傷を防止することが可能かどうか判断するために、かかる細胞を、24時間予めインキュベートして、その後、本発明の組み合わせの存在又は非存在下で24時間インキュベートした。本目的は、IRによって誘導されるMMP-1酵素(マトリックス金属蛋白分解酵素-1)の発現の評価とした。
【００３０】
細胞培養
J Invest Dermatol 128: 2491-2497, 2008に記載されている通り、新生児の包皮から作成されたヒト皮膚線維芽細胞を、コンフルエンスに達するまで、4日間、5%CO2を含む湿潤雰囲気下で、5%のFCS(Invitrogen(ドイツ)提供のウシ胎仔血清)、1%のL-グルタミン、1%の非必須アミノ酸(Invitrogen(ドイツ)提供)、1%のストレプトマイシン/B アンフォテリン(Invitrogen(ドイツ)提供)を補充した、EMEM(PAA Laboratories GmbH(ドイツ)提供のイーグル最小基本培地)で培養した。継代培養の間に、それらの本来の表現型が変化するのを回避するために、12未満の継代細胞の線維芽細胞だけを使用した。細胞を、培養及び照射のために6ウェルプレートに維持した。
【００３１】
化合物に関する細胞生存度/毒性
J Biol Chem 278: 47498-47507, 2003にて先に述べた通り、化合物の細胞毒性を、J Immunol Methods 65: 55-63, 1983によるMTTを用いた比色評価法によって評価した。
【００３２】
MTT(3-(4,5-ジメチル-2-チアゾリル)-2,5-ジフェニル-2H-テトラゾリウム)臭化物は、細胞が減ると、酵素的に、又は、NADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)又はNADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)との直接反応で明るい青になり、不溶性の沈殿物を形成し得る。即ち、退色は、細胞代謝の減少と毒性増加を示す。
【００３３】
ヒト皮膚線維芽細胞を、各ウェルに15,000細胞/200μlとなるように96ウェルプレートに播種した。次の日、細胞を、16時間、関心のある物質で処理した。16時間後、培地を交換して、25μlのMTT(2mg/mLのPBS、リン酸緩衝食塩水)を加えて、この混合物を3時間インキュベートした。最後に、溶液を除去して、ホルマザン結晶を200μlのMe2SOに溶解し、Infinite 200モノクロメーター(Tecan Deutschland GmbH(ドイツ)提供)にて540nmのマイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定した。生存度を、コントロール細胞のパーセンテージとして算出した。(Carcinogenesis 23: 1111-1120, 2002に従って)かかる細胞を、培地にだけ曝露して100%とした。
【００３４】
インビトロ照射
一次ヒト皮膚線維芽細胞を、この種の細胞の生存度に影響を及ぼすことなく遺伝子形質を誘導する最適条件として決定済みの360J/cm2の赤外線A-放射量を浴びせた(J Invest Dermatol 128: 2491-2497, 2008)。要するに、培地をPBSに交換して、キャップを取り外し、Hydrosun 500H IRA装置(Hydrosun Medizintechnik GmbH(ドイツ)提供)を使用して細胞に赤外線A-放射(IRA)を浴びせた。IR-A装置は、黒色フィルターを備えた水にてフィルターして、760から1400nmの間の波長を発し、20cm離れたところに360mW/cm2の放射量(放射量計装置Hydrosun HBM1(Hydrosun, Medizintechnik GmbH(ドイツ)提供)によって測定)を発生させた。培養ディスクを、恒温槽(Thermo Haake GmbH(ドイツ)提供)に接続した冷却プレートに置いて、照射中37℃未満に温度を維持した。コントロール細胞は、照射なしの類似の条件下で、37℃で自動温度調節プレートに維持した。
【００３５】
化合物の使用
細胞を、照射(0%のFCS)の前に24時間飢餓状態に維持して、評価する本発明の組み合わせを24時間加えた。飢餓期間の前、照射の前、及び、回収の前に、PBSを用いて細胞を洗浄した。照射の間、本発明の組み合わせは存在させなかった(PBSインキュベーション)。照射後、本発明の組み合わせを、再び、2%のFCSを含む新しい培地に加えて、IRAを用いた処理の24時間後に細胞を回収するまで維持した。
【００３６】
本発明の組み合わせの構成成分は、
-  GP4G(登録商標)SP:アルテミア生理食塩水の水抽出物
-  オリシルチン(登録商標)GL:イネ抽出物、グリセロール及び水であった。
【００３７】
初めに、生存度データを取得して、細胞の生存に危険が生じていないが効果が観察できる適切な濃度範囲を選択した。生存度は、各濃度、8つ複製して試験した。各刺激条件を、遺伝子発現の評価について三重で試験した。
【００３８】
RNA単離及びPCR
全RNAは、Exp Dermatol 17: 771-779, 2008の通り実行した。全RNAの単離のために、Qiagen (ドイツ)が提供するRNeasy Total RNAキットを用いた。RNA濃度は、Eppendorf暗順応計(ドイツ)を用いて、260/280nmでの光度測定器によって決定した。Invitrogen(ドイツ)が提供するSuperscript(登録商標) III First-Strand synthesis システムにおいて、全RNA(100ng)のアリコートを、cDNA合成に用いた。このシステムは、Invitrogen(ドイツ)が提供するランダムプライマーを用いた逆転写システムである。各遺伝子に関して、1対の特異的プライマーを、下表に公表するcDNA配列に基づき、Primer Express(登録商標) 2.0ソフトウェア(Applied Bio Systems(ドイツ)提供)によって設計した。3つの独立した実験をそれぞれ3回の測定を実施して、それらの平均値を算出した。PCR反応を、SYBR Green(登録商標) PCR Master Mix試薬(Applied Bio Systems(ドイツ)提供)を使用したOption1装置(MJ Research, USA提供)を用いて実施した。各サンプルは、46サイクル中に汎用プロトコールを使用して、二重に分析した。更に詳細な:活性化:94℃、10分間のホットスタートポリメラーゼ;変性:95℃、20秒;アニーリング:55℃、20秒;伸長:72℃、30秒。コントロール細胞と処理済み細胞に関するリアルタイムPCRによるPCR発現の比較のために、Methods 25: 402-408, 2006にて述べられている、方法2(デルタデルタ(C(T))を用いた。
リアルタイムPCRのためのマーカープライマー:
-18SリボソームRNA  -参考文献:Biochem J 232: 725-733, 1985
-MMP-1  -参考文献:J Biol Chem 261: 6600-6605, 1986
【００３９】
統計
順位による一元配置分散分析法を、平均間の相違を比較するためのノンパラメトリック検定法として使用した;0.05未満のp値は、統計的に有意であるとみなした(Systat Software Inc. (米社)のSigmaPlot 11.0ソフトウェア)。
【００４０】
結果
ヒト皮膚線維芽細胞の生存度に対する本発明の組み合わせの効果を評価した(図1)。ヒト皮膚線維芽細胞の生存度が48時間のインキュベーション期間中に危うくならない適切な用量範囲を決定するために、広範囲にわたる容量百分率(vol%)を、0.1%から50%まで評価した。本発明の組み合わせは、水に溶解するため、溶解制御を必要としない。
【００４１】
図1から分かるように、6%未満の濃度は、48時間のインキュベーション期間中の細胞生存度に影響を与えない。かかる結果については、6vol%未満の濃度を3つ、継続試験のために選択した。効果的でない低用量を回避するために、1%vol、2%vol及び4%volの濃度を用いて、ヒト皮膚線維芽細胞においてIRAによって誘導されるMMP-1(マトリックス金属蛋白分解酵素-1 = 線維芽細胞コラゲナーゼ)の過調節を阻害する傾向を試験した。MMP-1発現は、リアルタイムPCRによって決定した。方法2(デルタデルタC(T))を用いて、リアルタイムPCRにより、コントロール細胞と処理済み細胞との相対的遺伝子発現を比較した。この目的のために、値1を、未処理細胞におけるMMP-1/18SリボソームRNAの発現に割り当て、次に、他の処理細胞に対応する比率を算出した。
【００４２】
未処理皮膚線維芽細胞の平均は、0.97±0.03と記録された。本発明の組み合わせの用量を増加させても、MMP-1の基礎発現にほとんど影響を及ぼさなかった(図2)。赤外線照射は、MMP-1発現が2.1倍±0.12 SE(標準誤差)となり顕著に過調節された。本発明の組み合わせの用量増加は、IRAによって誘導されるMMP-1のこの発現を著しく阻害することができた。
-詳細：本発明の組み合わせは、2.1倍から1.3倍±0.03 SE(1vol%)、1.5倍±0.06 SE(2vol%)及び1.31倍±0.06 SE(4vol%)、IRAによって誘導されるMMP-1の発現を低減させた。評価した本発明の組み合わせの全3つの濃度は、45%、55%及び73%で、IRAによって誘導されるMMP-1の発現を著しく増加させた。1vol%又は2vol%用量よりも、4vol%用量のほうが、IRAによって誘導されるMMP-1の過調節を保護する。
【００４３】
図2で分かるように、1〜4vol%の本発明の組み合わせを評価した全ての用量は、ヒト皮膚線維芽細胞におけるIRAによって誘導されるMMP-1の過調節を部分的に阻害した。用量依存的効果は、45〜73%の範囲の阻害において確かめられた。
表2:IRA反応の阻害%
2016006048.tif 000002
+  単独のIRA効果に対して有意差あり、a, b  両処置間で有意差ある(順位によるクラスカル-ウォリス一元配置分散分析法)
実施例2  -本発明の組み合わせを含む一般的な日焼け止め製剤。
2016006048.tif 000003
2016006048.tif 000004
2016006048.tif 000005
製造モード:
フェーズ1(水性):
1.  主反応器において、水相のポリマーを分散させる。
2.  アイテム1の完全な分散後、水相の他のアイテムを、順次加えて混合する。加熱を開始して、80-87℃の温度にする。
フェーズ2(油性):
油相の構成成分を二次反応器に加えて、80-87℃の温度で溶解する。
乳濁液調製:  両相が80-87℃の温度に達したら、油相を水相に加えて均質化する。
3.  乳濁液を35-40℃に冷却して、調製品の他の構成成分を加えた。必要に応じて、pHを調整した。必要に応じて、精製水を用いてバッチ処理を完了した。均質化を続けた。
【００４４】
本願明細書に含まれる情報によって、当業者は、明記されていない特定の実施形態を実行して、機能を実施し、記載のものと同質の結果を、添付の特許請求の範囲内で成し遂げることができる。
【図１】
2016006048.tif 000006
【図２】
2016006048.tif 000007
【配列表】
2016006048000001.app
【外国語明細書】
2016006048000001.pdf