(57)【要約】      （修正有）【課題】豚回虫に対するワクチンによる駆除方法を提供する上で有効な抗原蛋白質の提供。【解決手段】（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質である。（ａ）特定のアミノ酸配列からなる蛋白質、（ｂ）特定のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有するとしての生物学的活性を有する蛋白質、及び、それをコードする核酸及びAs16h1蛋白質抗原としての結合する抗体。【選択図】図５
2016084332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質。
【請求項２】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸がコードする蛋白質、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードする蛋白質が、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質
【請求項３】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す核酸。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードする蛋白質が、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する核酸
【請求項４】
以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質。
【請求項５】
請求項３または４に記載の核酸を含む組換体分子。
【請求項６】
請求項３または４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞を培養し、培養物からAs16h1を取得することを特徴とするAs16h1蛋白質の製造方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の蛋白質と結合する抗体。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の蛋白質を含む、豚回虫感染防御のためのワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生虫の感染防御に関連する蛋白質およびそれをコードする核酸およびそれらの使用に関する。より具体的には、豚回虫（Ascaris suum）の感染防御に関わる蛋白質およびそれをコードする核酸およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
回虫はヒトや動物に寄生する線虫であり、亜熱帯・熱帯地域を中心に広く分布している。
中でも、豚を終宿主とする豚回虫は世界中の畜産現場に分布しており、途上国のみならず先進国においても畜産市場に大きな経済的損失を与えている。
一方、ヒトを終宿主とするヒト回虫は東南アジアなどでは認められているものの、豚回虫との違いは明らかにされておらず、日本を含め様々な国でヒトへの感染も豚回虫によるとされている。現在、約１５億人が回虫に感染していると言われており、犬回虫など他の回虫症が減少傾向にあるのに対し、豚回虫の感染者数は未だ増加傾向にある。このように豚回虫は、蓄量産現場だけでなく人獣共通感染症として公衆衛生上でも問題となっている。
現在、豚回虫への対策は、駆虫薬のイベルメクチン、レバミゾール等に依存しているが、コストが高く、また、薬剤耐性を獲得した豚回虫の出現や畜産物への薬物残留が懸念されている。そこで期待されている対策の一つがワクチンによる予防である。これまでに、放射線や化学的処置により弱めた豚回虫の幼虫(L3)を豚に接種させると、豚回虫に対して免疫効果があるとの報告があり、これは豚回虫対策としてワクチン接種が有効であることを示唆している。
畜産市場への経済的損失のひとつに、豚回虫幼虫が成虫になる過程で発生する、寄生豚の肝臓に白斑が生じる現象（ミルクスポット）がある。駆虫薬は成虫に対して働くため、ミルクスポットを明確に防御できる薬は存在しない。
現在、豚回虫ワクチンは市販されていないが、ワクチンの開発は薬剤耐性や薬物残留の問題を回避できるだけでなく、薬剤よりもコストを大幅に押さえられるという点、さらにはミルクスポットの減少効果においても期待がもたれている。
【０００３】
不活性化ワクチンによる回虫駆除を行う場合、幼虫など、その疾患を引き起こす生物を入手する必要があるが、回虫の安定した供給は難しい。これに対し、組み換え蛋白によるワクチンは、遺伝学的手法により比較的容易に生産、供給できるという利点を有している。これまでに、豚回虫組み換え蛋白の免疫による豚回虫感染防御に関し、豚とマウスモデルにおいて、As14，As16，As24，As37の各蛋白質による結果が報告されている（非特許文献１〜４、特許文献１）。これらの蛋白質は全て回虫表面蛋自のスクリーニングから発見されたものである。この中で免疫効果が最も高いとされているのはAs16であることが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第3613577号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Tsujiら, Infect Immun., 69:7285-7292, 2001
【非特許文献２】Tsujiら, Infect Immun., 71:5314-5323, 2003
【非特許文献３】Islamら,Parasitology, 130:131-139, 2005
【非特許文献４】Tsujiら, Int J Parasitol., 32:1739-1746, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、豚回虫に対するワクチンによる駆除方法を提供する上で有効な抗原蛋白質の提供を目的とする。より具体的には、豚回虫の感染防御抗原蛋白質およびそのコード核酸の提供、並びに、それらの使用方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者は、上記課題を解決する手がかりを得るために、前出のAs16に着目した。As16は上述の通り、豚回虫の表面蛋白として同定されたものであるが、免疫組織染色の結果では虫体の腸管、表皮、真皮、筋細胞、卵巣、子宮上皮が陽性を示したことが明らかとなっている(非特許文献２)。このことから、抗As16抗体は豚回虫の表面のみならず腸管を攻撃することによって相乗的に感染防御効果を示していることを示唆するものと考えた。腸管を攻撃することは、虫体の栄養吸収を妨げる、あるいは腸管での酵素活性を抑えることが想定される。そこで、発明者は、腸管を標的とした感染防御方法が、より効果的な回虫駆除の方法を提供する可能性を考慮し、回虫腸管由来のcDNAライブラリーに対しBLAST検索を行った。その結果、予想外にも、回虫腸管由来のライブラリー中には、As16のcDNA は見つからず、As16とアミノ酸配列上の類似性はあるが、異なる新規な分子量約15kDaの蛋白質（As16h1蛋白質と称する）を見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）である。
（１）以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質。
（２）以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸がコードする蛋白質、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードする蛋白質が、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質
（３）以下の（ａ）または（ｂ）に示す核酸。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードする蛋白質が、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する核酸
（４）以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質。
（５）上記（３）または（４）に記載の核酸を含む組換体分子。
（６）上記（３）または（４）に記載の核酸を含むベクター。
（７）上記（６）に記載のベクターを含む細胞。
（８）上記（７）に記載の細胞を培養し、培養物からAs16h1を取得することを特徴とするAs16h1蛋白質の製造方法。
（９）上記（１）または（２）に記載の蛋白質と結合する抗体。
（１０）上記（１）または（２）に記載の蛋白質を含む、豚回虫感染防御のためのワクチン。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、豚回虫の感染を効率的に防御するために有用なAs16h1蛋白質が提供される。この蛋白質を用いることで、ワクチンの製造など豚回虫の感染防御に利用可能な物、および感染防御手段の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】組換え蛋白質（GST, GST-As16, His-As16, GST-As16h1, His-As16h1）を発現させ精製したサンプルの電気泳動結果を示す。
【図２】組換えGST-As16h1蛋白質の精製標品に含まれる26kDa断片の解析結果。ａはアミドブラック染色、ｂは抗GST抗体によるウエスタンブロットの結果である。組換えGST-As16h1蛋白質の精製標品はGST-As16h1蛋白質（約37kDa）に加えて分解したGST分子断片（約26ｋDa）が含まれていた。
【図３】GST-As16蛋白質（ａ）とGST-As16h1蛋白質（ｂ）をFactor Xaで処理し、電気泳動を行った結果を示す。
【図４】抗His-NDV-F-HR1抗体（ａ；コントロール）、抗His-As16抗体（ｂ）、抗His-As16h1抗体（ｃ）による豚回虫（雌成虫）の免疫組織染色像を示す。cu:cuticle（外皮）、hyp:hypodermis（皮下組織）、mc:muscle（筋肉）、ov:ovary（卵巣）、int:intestine（腸）、ut:uterus（子宮）
【図５】As16h1蛋白質の豚回虫（Ascaris suum）に対するマウスの感染防御免疫効果を確認した結果を示す。As16h1を10μg（As16h1(10)）、As16h1を50μg（As16h1(50)）、As16を10μg（As16(10)）、As16を50μg（As16(50)）免疫したマウス群、および、非免疫マウス群の肺から回収された豚回虫の幼虫の数を示す。各グループ５匹ずつ免疫を行い（As16h1を10μg免疫した群では途中で1匹死亡したため４匹、非免疫マウス群は６匹）、豚回虫の成熟卵を経口投与し、その後、各マウス肺から回収された幼虫の数をカウントした。回収された幼虫の数は、各群の平均値から一番離れた数を除外し、平均値±SDを算出してグラフ化した。マンホイットニーの有意差検定において、非免疫群と比べて、回収された幼虫数が有意に低値を示したもの（ｐ<0.01）を＊＊で示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施形態の１つは、以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質である。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質。
本発明は、豚回虫による感染を防御、あるいは、感染した豚回虫を駆除するための方法を提供し、および、そのために有用な抗原候補因子を検索し、提供することを目的としている。これまでに、豚回虫による感染防御のためのワクチン候補分子として、As16を抗原とするものが報告されている（特許文献１）。発明者らは、さらに有効な感染防御効果を示すワクチンを製造するために、As16のアミノ酸配列を手がかりにして、ワクチン抗原候補の検索を行った。その結果、As16とは塩基配列の同一性が50%程度であり、かつ、回虫の生体内において分布を異にする新規蛋白質であるAs16h1を同定することに成功した。
本発明によって提供される豚回虫の駆除方法等は、豚回虫が感染し得る動物であれば、豚に限ることなく、如何なる動物に対しても適用可能である。特に、前述のように、回虫のヒトへの感染の多くが、豚回虫によるものであることが報告されていることに鑑みて、本発明はヒトに対しても十分な効果を示すものである。従って、後述する医薬または医薬組成物、あるいは、ワクチン等は、豚のみならず、その他の動物、特に、ヒトも投与対象となる。
なお、本明細書において、As16h1蛋白質のことは、「As16h1」、「As16h1蛋白質」または「As16h1ポリペプチド」と記載することとし、As16h1をコードする核酸または遺伝子のことは、「As16h1核酸」、「As16h1 cDNA」、「As16h1 DNA」、「As16h1核酸ポリヌクレオチド」または「As16h1遺伝子」等と記載することとする。
【００１２】
As16h1 cDNAは、線虫の各種臓器または細胞から調製した一本鎖cDNAまたはcDNAライブラリー（特に、豚回虫の腸管特異的なライブラリーが好ましい）を鋳型にして、As16h1  cDNAに特異的なプライマーを用いてPCR法等により取得することができる。あるいは、cDNAライブラリーから、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、イムノスクリーニング法などを用いて取得することもできる。豚回虫の各種臓器または各種細胞由来の一本鎖cDNAおよびcDNAライブラリーは、常法により調製することができ、市販されているキットを使用して調製してもよい。
得られた断片が不完全長の場合は、該断片をプローブとして、さらに、cNDAライブラリーを検索することで完全長cDNAを得ることが可能である。あるいは、該cDNAの存在が確認されたcDNAライブラリー等を鋳型として、5'RACE法と3'RACE法を行うことにより、該当する配列を有するcDNAの5'末端側の断片と3'末端側の断片を取得し、両断片を連結することにより、完全長cDNAを取得することもできる。
得られたcDNAは、常法により塩基配列を決定して確認をすることができる（例えば、マキサムギルバート法（Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74 56, 1977）、ジデオキシ法（Messing et al., Nucl. Acides. Res., 9 309 1981）等）。
【００１３】
本発明の「As16h1」または「As16h1蛋白質」とは、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質」とは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1kDa蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質のことである。あるいは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列中の１または数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1kDa蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質のことである。
上記アミノ酸の欠失、付加および置換は、タンパク質をコードする核酸に元々存在した変異であってもよく、また、該核酸を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものであってもよい。当該改変は、例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、MutanTM-G（TaKaRa社））等を使用し、Guppedduplex法やKunkel法等の公知の方法、または、それらに準じる方法により塩基の置換を行なうことによって実施することができる。
ここで、「生物学的活性を有する」とは、豚回虫感染防御機能を有することを意味し、具体的には、豚回虫の感染を防御する抗体またはワクチン製造の抗原としての活性を有すること（具体的には、豚回虫が感染した動物体内での豚回虫の増殖を抑制、阻害する）を意味する。また、抗As16ｈ1抗体としての活性は、好ましくは、該抗体が豚回虫のAs16h1と結合することで、該豚回虫を不動化（回虫の動きを停止させること）する、または、該豚回虫の動きを抑制することである。
【００１４】
また、本発明には、他の実施形態として、以下の（ａ）または（ｂ）に示す核酸が含まれる。
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードする蛋白質が、As16h1kDa蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する核酸
本発明のAs16h1をコードする核酸または遺伝子は、配列番号１で表される核酸配列からなるDNAのみならず、配列番号１で表される核酸配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、該核酸がコードする蛋白質が、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する核酸も含まれる。
【００１５】
配列番号１で表わされる核酸配列からなるDNAと相補的な配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、配列番号１で表わされるポリヌクレオチド配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％の核酸配列相同性を有する配列からなるDNA等が挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーション条件のことで、一般的に、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度に依存する経験的な実験条件である。通常、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。DNA同士のハイブリッドの形成は、相補的鎖がその融点よりやや低い環境における再アニールする能力に依存する。
ストリンジェントな条件とは、具体的には、低ストリンジェントな条件として、例えば、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、37℃〜42℃の温度条件下、0.1×SSC（１倍濃度のSSC溶液の組成は、例えば、150mmol/L 塩化ナトリウム、15mmol/L クエン酸ナトリウム）、0.1%SDS溶液中で洗浄する条件などが挙げることができる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、60℃〜70℃、好ましくは65℃の温度条件下、5×SSC、0.1%SDS中で洗浄する条件などが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高い核酸を得ることができる。
【００１６】
本発明には、As16h1遺伝子の発現を抑制または喪失させる核酸も含まれる。そのような核酸としては、例えば、アンチセンスRNAまたはDNAなどの一本鎖核酸およびその誘導体、As16h1遺伝子領域の一部と相補的配列を有する短い二本鎖RNAなどを挙げることができる。アンチセンスRNAは、例えば、インビボにおいてmRNAとハイブリダイズし、mRNAからAs16h1ポリペプチドへの翻訳を阻害するようにデザインされる。また、アンチセンスDNAは、例えば、As16h1遺伝子の転写開始領域に対して相補的となるようにデザインされ、その結果、As16h1遺伝子の発現を阻害する。
これらのアンチセンスRNAまたはDNAが、As16h1ポリペプチドまたは遺伝子の発現を阻害するようにインビボにおいて機能し得るように細胞へ導入することができる。アンチセンスDNAが用いられる場合には、例えば、標的遺伝子配列の約-10と+10の間の位置に結合するオリゴヌクレオチドであることが望ましい。
また、As16h1遺伝子と相補的な配列を有する二本鎖RNAはRNAi（RNA干渉）に用いることもできる。RNAiは、目的のmRNA（例えば、ｃAs16h1遺伝子のmRNA）が、目的のmRNAと相補的な配列を持つ二本鎖RNAにより分解される現象のことである。この現象を利用して人工的に二本鎖RNAを導入することにより、目的の遺伝子の発現を抑制することができる。
【００１７】
さらに、本発明には、以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質、
（ａ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸がコードする蛋白質、
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードする蛋白質が、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質、
および、
以下の（ａ）または（ｂ）に示す蛋白質をコードする核酸、
（ａ）配列番号２表されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、As16h1蛋白質の抗原としての生物学的活性を有する蛋白質、
が含まれる。
【００１８】
本発明のAs16h1蛋白質は、例えば、遺伝子工学的手法により調製することができる。例えば、As16h1蛋白質をコードする核酸を適当な発現ベクターに組込み、該発現ベクターを適当な宿主細胞に形質転換または形質導入し、これを適当な培地中で培養し、As16h1蛋白質を発現させ、精製することで調製することができる。
【００１９】
蛋白質の発現用ベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合に、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pCBD-C、pGEX（GEヘルスケアバイオサイエンス社）、pCold（TaKaRa社）などを挙げることができる。動物細胞を宿主とする場合に、例えば、pEGF-C、pEGF-N（クロンテック社）の他、アデノウイルスを介した遺伝子導入による蛋白質発現のためのpAdenoX（クロンテック社）やレトロウイルスを介した遺伝子度乳による蛋白質発現のためのRetro-X（クロンテック社）なども使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合に、例えば、pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII（すべてInvitrogen社製）、pFastBac HT、pTrC（すべてライフテクノロジー社）、pET（Novagen社）などを使用することができる。また、酵母細胞を宿主とする場合には、例えば、pG-1、Yep13、pPICZ（ライフテクノロジー社）などを使用することができる。これらの発現ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。
【００２０】
用いられるプロモーターは、特に限定されるものではなく、用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターを使用すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合には、tacプロモーター、trpプロモーター、lacプロモーターなどが、宿主が酵母である場合には、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーターなどが、宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが、宿主が動物細胞である場合は、SRαプロモーター、CMVプロモーター、CAGプロモーター、SV40プロモーター、などが使用可能である。
【００２１】
複製開始点としては、大腸菌用ベクターの場合、例えば、ColiE1、R因子、F因子由来のもの、酵母用ベクターの場合、例えば、2μmDNA、ARS1由来のもの、動物細胞用ベクターの場合、例えば、SV40、アデノウイルス由来のものなどを使用することができる。
選択マーカーとしては、大腸菌用ベクターの場合、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子など、酵母用ベクターの場合、例えば、Leu2、Trp1、Ura3遺伝子など、動物細胞用ベクターの場合、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを使用することができる。
As16h1をコードする核酸の発現用ベクターへの組込みは、当業者において容易に選択可能な公知技術によって行うことができる。発現に用いるベクターは、１または複数の制限酵素切断部位を有していることが望ましく、この部位を利用して、As16h1核酸を発現用ベクターに組み込むことができる。また、As16h1核酸の他、精製に使用されるタグ配列（Hisタグ、HAタグなど）をベクターに組み込んでもよい。
特に、任意のベクターの位置に不必要な配列を付加することなく、クローニングする方法として、In-Fusionクローニング（TaKaRa社）法を挙げることができる。In-Fusionクローニング法は、市販のキットを購入することで、容易に実施することができる（TaKaRa社）。
【００２２】
蛋白質を発現させる宿主細胞としては、例えば、大腸菌、酵母、動物細胞などの中から選択することができる。
宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、EscherichiacoliXL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coliMC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coliW1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB101、Escherichiacoli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coliNY49、Escherichia coli BL21(DE3)、Escherichia coliBL21(DE3)pLysS、Escherichia coli HMS174(DE3)、Escherichia coliHMS174(DE3)pLysSなどの大腸菌株を使用することができる。
宿主細胞として酵母を用いる場合、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces lactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomycesalluvius などの酵母株を使用することができる。
宿主細胞として動物細胞を用いる場合、例えば、マウス・ミエローマ細胞であるSP2/0細胞、NSO細胞など、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、BHK細胞など、アフリカミドリザル腎臓細胞であるCOS-1細胞、COS-7細胞など、ヒトの細胞であるNamalwa細胞、ヒト白血病細胞であるBALL-1細胞、ヒト大腸癌細胞であるHCT-15細胞などを使用することができる。
宿主細胞として昆虫細胞を用いる場合、例えば、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHigh 5、BTI-TN-5B1-4（Invitrogen社）など、カイコ卵巣由来の培養細胞であるBombyxmori N4などを使用することができる。
【００２３】
蛋白質を発現させるための組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、当業者において実施可能な如何なる方法を選択してもよい。
例えば、大腸菌に組換えベクターを導入する場合、例えば、エレクトロポレーション法（Nucleic Acids Res., 16, 6127 1988）、カルシウムイオンを用いる方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 1972）、プロトプラスト法（Gene, 17, 107 1982））などが利用可能である。
また、酵母に組換えベクターを導入する場合、例えば、エレクトロポレーション法（Methods. Enzymol., 194, 182 1990）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriol., 153, 163 1983）などが利用可能である。
動物細胞に組換えベクターを導入する場合、例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133 1990）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 1987）などが利用可能である。
【００２４】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、公知の文献等に記載の方法によって目的の蛋白質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, NewYork 1992； Bio/Technology, 6, 47 1988等）。具体的には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、該組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、目的の蛋白質を発現させることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換えベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 1987）などが利用可能である。
【００２５】
蛋白質を発現させるための宿主細胞を培養する培地は、該宿主細胞が栄養源として利用し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含み、形質転換体を効率良く培養し得る培地であれば、いかなるものであっても使用することができる。ここで、培地に含まれる炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、スクロースなどの等、または、エタノール、プロパノール等のアルコール類が使用可能である。また、窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩などの他、ペプトン、酵母エキス、カゼイン加水分解物、などを使用することができる。無機物塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどの塩を用いることができる。
【００２６】
蛋白質発現用ベクターを形質転換または形質導入した宿主細胞は、振盪培養または攪拌培養など、宿主細胞に適した条件下で行うことが望ましい。培養温度も宿主細胞の生育条件に適した温度において行い、例えば、１５〜４０℃の間で、また、培養時間も数時間〜数日間の間で適宜選択することができる。また、動物細胞などを使用する場合は、5%程度のCO2の存在下において培養してもよい。
蛋白質を発現する形質転換体が大腸菌である場合、該細胞を培養する培地として、例えば、LB培地、M9培地などを使用することができる。プロモーターとして発現誘導性のプロモーターを用いた場合には、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを有する発現用ベクターで形質転換した大腸菌等を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）等を、trpプロモーターを有する発現用ベクターで形質転換した大腸菌等を培養するときにはインドールアクリル酸（IAA）等を培地に添加してもよい。
また、蛋白質を発現する形質転換体が酵母である場合、SD培地、YPD培地、YPAD培地、YPED培地などを使用することができる。
【００２７】
蛋白質を発現する形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、例えば、RPMI1640培地、Eagle’s MEM培地、DMEM培地などを使用してもよく、必要に応じて、適宜、FBSなどの血清等を添加してもよい。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿主細胞とした場合、形質転換体を培養する培地としては、例えば、TNM-FH培地（PharMingen社）、Sf-900 II SFM培地（GibcoBRL社）などを使用することができる。
【００２８】
発現させた蛋白質を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。得られた抽出液から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的の蛋白質（As16h1など）を取得することができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法（例えば、GSTタグと共に蛋白質を発現させた場合にはグルタチンを担体に結合させた樹脂を、Hisタグと共に蛋白質を発現させた場合にはNi-NTA樹脂やCoベースの樹脂を、HAタグと共に蛋白質を発現させた場合には、抗HA抗体結合カラムなどを使用することができる）、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００２９】
本発明の他の実施形態は、As16h1蛋白質と結合する抗体（抗As16h1抗体）またはその断片である。本発明の抗As16h1抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体などが含まれ、本発明の抗As16h1抗体の断片には、FabまたはF(ab’)2などの抗体断片、または、単一鎖抗体などが含まれ、抗体の一部をなすポリペプチド（あるいは、ポリペプチド複合体）であってAs16h1蛋白質と結合するものが含まれる。また、本発明の抗As16h1抗体は、As16h1蛋白質と結合するのみならず、豚回虫に体内で発現するAs16h1に結合し、該豚回虫を不動化または該豚回虫の動きを抑制し、あるいは、該豚回虫の生命活動を抑制し、あるいは、該豚回虫が寄生する豚の体内から該豚回虫を駆逐する活性を有していてもよい。
抗体を作製するための免疫抗原として用いる本発明のAs16h1蛋白質は、豚回虫から抽出した天然蛋白質でも、組換え蛋白質でも、また、化学合成したものでもよい。また、全アミノ酸配列を有する蛋白質でも、該蛋白質の部分構造を有するペプチド断片や他の蛋白質またはペプチドとの融合蛋白質であってもよい。
【００３０】
ここで「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体の集団より得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法により製造されることを限定するものではない。モノクローナル抗体の製造方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256 495 1975）、または、組換え法（米国特許第4,816,567号）などを挙げることができる。また、本発明におけるモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352 624-628 1991；Marks et al., J.Mol.Biol. 222 581-597 1991）。本発明におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種、または特定の抗体クラス若しくはサブクラス由来であり、本発明におけるモノクローナル抗体の重鎖および／または軽鎖の残りの部分が別の種、または別の抗体クラス若しくはサブクラス由来である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、抗体変異体であってもよく、抗体断片には、その断片が含まれる（米国特許第4,816,567号；Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA  81 6851-6855 1984）。
【００３１】
本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、例えば、ハイブリドーマ法を用いて調製することができる。この方法には、例えば、以下に示す４つの工程が含まれる：（i）本発明のAs16h1蛋白質またはその一部を免疫動物に免疫する、（ii）モノクローナル抗体分泌性（または潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（iii）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（iv）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが選択可能である。免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラット若しくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球および不死化細胞株の成長または生存を阻害する一または複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選択したハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。
【００３２】
本発明の抗As16h1抗体がポリクローナル抗体の場合、例えば、哺乳類宿主動物に対して、免疫原およびアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、免疫原としての抗原および／またはアジュバントを宿主動物の皮下または腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントの例には、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、モノホスホリル脂質Ａ合成−トレハロースジコリノミコレート（MPL-TDM）、水酸化アルミニウムなどが含まれる。
【００３３】
本発明の抗As16h1抗体には、遺伝子組換え抗体が含まれる。遺伝子組換え抗体としては、特に限定はされないが、例えば、キメラ抗体等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体、例えば、マウス由来抗体の可変領域を豚あるいはヒト由来の定常領域に連結した抗体などである。キメラを作製する場合、そのように連結した抗体が得られるよう、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
【００３４】
また、本発明には、As16h1蛋白質と結合する抗体（抗As16h1抗体）またはその断片を含む医薬または医薬組成物が含まれる。このような本発明の医薬または医薬組成物は、豚回虫の感染の予防または感染した豚回虫を体内から駆除するために使用することができる。
本発明の医薬には、有効成分として上述の本発明の抗体またはその機能的断片が含まれる他、その生理学的に許容される塩が含まれていてもよい。塩としては、例えば、酸性基が存在する場合には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩；アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）ピペラジン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン、Ｌ−グルカミン等のアミンの塩；またはリジン、δ−ヒドロキシリジン、アルギニンなどの塩基性アミノ酸との塩を形成することができる。塩基性基が存在する場合には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；またはアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の化合物を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。経口投与用または非経口投与用の任意の製剤形態で提供される。例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤または液剤等の形態の経口投与用医薬組成物、静脈内投与用、筋肉内投与用、若しくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの形態の非経口投与用医薬組成物として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。また、高分子などで被覆した徐放製剤を脳内に直接投与することも可能である。
【００３６】
医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、または医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質あるいは固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
【００３７】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。
【００３８】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
【００３９】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜等で被覆すればよい。
【００４０】
本発明の医薬または医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。一般的には、経口投与における成人一日あたりの投与量は0.01〜1000mg(有効成分重量)程度であり、一日1回または数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して一日量0.001〜400mg(有効成分重量)を連続投与または間欠投与することが望ましい。
【００４１】
本発明の医薬または医薬組成物は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。担体として、例えば、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。
【００４２】
本発明の医薬は、医薬組成物としてキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明の医薬組成物がキットとして供給される場合、該組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。
キット中に含まれる試薬は、構成成分の活性を長期間有効に持続し、容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質することのない材質で製造された容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、または試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料によって構成される。
【００４３】
また、キットには使用説明書が添付されてもよい。本キットの使用説明は、紙などに印刷され、および／またはCD-ROM、DVD-ROMなどの電気的または電磁的に読み取り可能な媒体に保存されて使用者に供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者または分配者によって指定されまたは電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態は、本発明のAs16h1を抗原蛋白質として含む豚回虫の感染防御のための全身性および粘膜誘導型ワクチンである。
ここで、本発明のワクチンに使用されるAs16h1蛋白質は、豚回虫から抽出した天然蛋白質でも、組換え蛋白質でも、また、化学合成したものでもよい。また、As16h1蛋白質の全アミノ酸配列を有する蛋白質でも、As16h1蛋白質の部分構造を有するペプチド断片や他の蛋白質またはペプチドとの融合蛋白質であってもよい。ペプチド断片の場合、該断片が回虫の感染を防御する抗体が認識するエピトープを含んでいることが必要である。
【００４５】
本発明のワクチンは、１または複数種類のアジュバント、例えば、完全フロイント若しくは不完全フロイントアジュバント、コレラトキシン、易熱性大腸菌毒素、水酸化アルミニウム、カリウムミョウバン、サポニンもしくはその誘導体、ムラミルジペプチド、鉱物油または植物油、ノバソームまたは非イオン性ブロック共重合体、DEAEデキストラン等を含むことができる。また、医薬上許容される担体を含んでいてもよい。医薬上許容される担体は、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を及ぼさない化合物であることが必要である。医薬上許容される担体は、例えば、無菌水またはバッファーである。
本発明のワクチンは、通常の能動免疫法で投与することができ、注射により投与する全身性ワクチンでも、注射によらず経口または経鼻投与等により投与する粘膜誘導型ワクチンでもあってもよい。また、本発明のワクチンは、豚回虫の感染を予防するために有効な量（ 回虫による攻撃に対し、動物において免疫を誘導するに足りる量）にて、剤形に適合した方法による単回または複数回投与により投与することができる。ワクチンは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口的に、あるいは、鼻腔内に投与することができる。また、本発明のワクチンは、他の抗原成分と混合して用いることもできる。
ワクチンの投与量、投与回数は対象動物により変わり得るが、例えば本発明のAs16h1蛋白質またはその一部である抗原を数10μg 含むワクチンを１週間から数週間に一度の頻度で、数回投与することにより動物に防御免疫を誘導し得る。
【００４６】
さらに、本発明には、本発明の医薬、医薬組成物またはワクチンを対象動物に投与し、豚回虫による感染の防御、および、動物に感染した豚回虫の駆除などの、予防および治療方法も含まれる。医薬、医薬組成物およびワクチンの投与量や投与方法は、上述の医薬に関し記述したように実施することができる。
また、豚回虫の感染の有無を診断する方法も本発明の範囲に含まれる。具体的には、豚回虫の感染が疑われる被験動物由来の組織、血液または排泄物などのサンプル中に、As16h1の核酸または蛋白質の有無を確認すること、および／またはAs16h1に対する抗体の有無を確認することで、豚回虫による感染の有無を評価することができる。As16h1の核酸または蛋白質の存否の確認は、当業者であれば容易に実施することができ、例えば、As16h1の核酸の存否の確認は、As16h1核酸の相補鎖等を利用したIn situ ハイブリダイゼーションなどの方法を使用し、また、As16h1蛋白質の存否の確認は、抗As16h1抗体を利用した免疫学的手法等を使用することにより容易に行うことができる。As16h1に対する抗体の有無については、As16h1蛋白質等を利用した免疫学的手法により確認することができる。
本発明の予防、治療または診断方法は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、豚の他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などに加え、ヒトに対しても適用することができる。
【００４７】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４８】
１．実験方法
１−１．遺伝子解析
線虫cDNAデータベースであるnematoda.netver.3.0に登録されているライブリーを用いて、As16に関し、BLAST検索を行い、新規蛋白質であるAs16h1を同定した。
【００４９】
１−２．組み換え蛋白の作製
１−２−１．pGex-5X3ベクターを用いたグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合As16hl、およびAs16、ならびにGST蛋白質単体の作製
As16遺伝子のアミノ酸コード領域をpGex-5X3ベクターに挿入したpGex-5X3-As16プラスミドスミドを作製した。
As16h1遺伝子は、豚回虫cDNAライブラリーから、プライマーとして、ACACACGTTTAAAGCAGATTGG（配列番号３；As16h1F）とAACAAGTTGCACGTGATTGTCAC（配列番号４；As16h1R）を使用し、PCR法により増幅して、クローニングを行った。その後、表１に示すプライマー（As16h1_Gex_F（配列番号５）およびAs16h1_Gex_R（配列番号６））を設計し、PCR法を行い、As16h1遺伝子を増幅した。PCRは、94℃、2分間の後、98℃、10秒、55℃、30秒、68℃、40秒を40回、その後68℃、7分間のサイクルで行った。PCRで増幅したAs16hl遺伝子とpGex-5X3ベクターをEcoRIとXhoIで切断した後、DNALigation Kit Ver.2.1 (Takara Bio社)を用いてAs16h1遺伝子とpGex-5X3ベクターのライゲーションを行った。
【００５０】
作製したpGex-5X3-As16h1 、pGex-5X3-As16プラスミドおよびpGex-5X3プラスミドを大腸菌BL21(Invitorogen社)に形質転換し、50 μl/mlのアンピシリンを含むLuria broth (LB)培地10mlに植菌し、37℃で一晩振とう培養した。その後、同濃度のアンピシリンを合むLB培地を90ml加え、37℃で振とう培養し、O.D.600が0.6前後になったとこで、IPTG を最終濃度、1 mMとなるように添加した。37℃ で4 時間振とう培養し、800 x g、4℃で10分間遠心分離を行い、ペレットと上清に分離した。ペレットをPBSにけん濁し、氷上で超音波破砕し、再度、7000 x g、4℃で15分間遠心分離を行い、ペレットと上清に分離した。
この上清にGlutathioneSepharose4B (GE Healthcare社)を加え、4℃で1時間振とうした後、カラムで精製を行った。カラムには、Polypropylene Column (QIAGEN社)を用いた。カラムに振とう物を充填し、PBSでカラムを洗浄し後、GST Elution Buffer (50 mM Glutathione, 50 mM Tris-HCl)で溶出を行い、GST-As16hl、GST-As16およびGST を得た。精製した蛋白質は、SDS-PAGEで確認を行った。
【００５１】
１−２−２．pColdIベクターを用いたAs16h1、As16蛋自質の作製
As16遺伝子のアミノ酸コード領域をpColdIベクターに挿入したpColdI -As16プラスミドスミドを作製した。
As16h1遺伝子は、表１に示したプライマー（As16h1_pColdI_F（配列番号７）およびAs16h1_ pColdI _R（配列番号８））を用いてPCR法を行い増幅した。PCRは、95℃、2分間の後、94℃、10秒、55.5℃、30秒、68℃、40秒を35回、その後68℃、7分間というサイクルで行った。PCRで増幅したAs16h1遺伝子とpColdベクターをEcoRIとXhoIで切断した後、DNA Ligation Kit Ver.2.1を用いて、As16h1遺伝子とpColdベクターのライゲーシヨンを行った。
【表１】
2016084332.tif 000003
作製したpCold-As16h1プラスミドおよびpCold-As16プラスミドを大腸菌BL21に形質転換し、50 μl/mlのアンピシリンを含む滅菌LB培地10mlに植菌、37℃で一晩振とう培養した。その後、同濃度のアンピシリンを含むLB培地を90ml加え、37℃で振とう培養し、O.D.600が0.4前後になったところで、15℃で30分間振とうし、IPTGを最終濃度1mMになるように添加した。その後、15℃で24時間接とう培養し、800 x g、4℃で10分間遠心分離を行い、ペレッ卜と上清に分離した。ペレットをLysis Buffer (50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, 10mM imidazole)で、けん濁し、氷上で超音波破砕した後、再度、7000 x g、4℃で15分間遠心分離を行い、ペレットと上清に分離した。上清にNi-NTA agarose (QIAGEN社)を加え、4℃で1時間振とうした後、カラム精製を行った。カラムに振とう物を充填し、Wash Buffcr (50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, 20mM imidazole)でカラムを洗浄した後、Elution Buffer (50 mM Na2HPO4, 0.3 M NaCl, 250 mM imidazole)で溶出を行い、His-As16h1 およびHis-As16を得た。精製した蛋白質は、SDS-PAGEで確認を行った。
【００５２】
１−３．ウエスタンブロット法による蛋白質の解析
精製した蛋白質を２ｘSDS sample buffer (0.125 M Tris-HCl(pH6.8), 10%(v/v) 2-メルカプトエタノール, 4%(w/v) SDS, 10%(w/v) スクロース, 0.01%(w/v) BPB) と等量混合し、95℃で10分間処理し、1μg/wellになるよう添加し、15% SDS-PAGEを行った。その後、蛋白質をImmobilon Transfer Membrane (Millipore社)にトランスファーした後、メンブレンをメタノール処理し、風乾させた。1次抗体は、マウス3回免疫後血清（後述）を用い、スキムミルクを終濃度3%となるように添加し、PBS (3%スキムミルク-PBS)で800倍に希釈した後、室温で1時間、メンブレンとインキュベートした。その後、PBSでメンブレンを振とう洗浄後、3%スキムミルク−PBSで6000倍に希釈した2次抗体（HRP 標識ラビット−マウス IgG (h+l)）(BENTHYL社)で、室温にて、1時間反応させた。その後、PBSでメンブレンを振とう洗浄後、TMB Membrane Peroxidase Substrate (1-C) (KPL社)を用い発色させた。
【００５３】
１−４．Factor Xaによる消化
GST-As16h1およびGST-As16、2μgに対し、Factor Xa (Millipore社)を0.1U加え、10μlとし、室温で2時間、4時間、8時間、16時間、32時間、37℃で30分、1時間、2時間、4時間、8時間反応させた。
【００５４】
１−５．抗体の作製
１−５−１．マウス抗体
6 週齢のBALB/cメスマウス(日本クレア、東京)を用いて抗体の調製を行った。GST、GST-As16h1、His-As16を１匹あたり 10 μgずつ免疫を行った。免疫は2週間おきに3回行い、各免疫の前に頬静脈から採血し、血清分離した。1回目の免疫はアジュバントとして、Freund's Complete Adjuvant (FCA) (DIFCO社)を用い、2、3回目の免疫はアジュバントとしてFreund's Incomplete Adjuvant (FIA) (D IFCO社)を用いた。3回目の免疫から2週間後、心臓より採血を行い、最終免疫後血清を得た。また、コントロール血清として、ニューカッスル病ウイルスのHis tag精製F 蛋白HR1 ペプチド(His-NDV-F-HR1)をマウスに免疫し、血清を採取した。
１−５−２．ブロッキング用血清の調製
不活化したニューカッスル病ウイルスを含む発育鶏卵漿尿液をFCA/FIAをアジュバントとして皮下免役したメスのウサギJW/CSK(日本エスエルシ一大阪)の耳介静脈から採血し、血清を得、免疫組織染色のブロッキングに用いた。
【００５５】
１−６．ELISA法による特異的IgG抗体の検出
マウス血清中の免疫抗原に対する特異的なIgG抗体をELISA法により調べた。抗原を0.1 M Bicarbonate Buffer (pH 9.6)で希釈し、96穴ELISAプレートに25 ng/wellとなるように加え40℃で一晩インキュベートした。Triton-X 100を終濃度0.1%となるように添加したPBS (0.1% Triton-PBS)で、プレートを洗浄し、3%スキムミルク-PBSを200 μl/wellとなるように添加し、室温で1時間インキュベー卜した。その後、プレートを洗浄し、1次抗体として1%スキムミルク-PBSにマウス3回免疫後血清を1/128から2倍まで、19段階希釈したものを100μl/wel1となるように加えた。この際、3wellのみ免疫前血清を1/100希釈したものを100 μl/wellとなるように加えた。プレートを37℃で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、2次抗体としてHRP標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、1%スキムミルク-PBSで10,000倍に希釈し、100μl/wellとなるように加え、37℃で1時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate System (KPL社)で発色させ、各wellのO.D.400を計測した。免疫前血清の平均値+6×標準偏差をカットオフ値とし、それを超える最大希釈倍率をエンドポイントタイター（endpoint titer）とした。
【００５６】
１−７．免疫組織染色
豚回虫メスの成虫パラフィン切片を動物衛生研究所の辻尚利博士より頂いた。この切片を、100%キシレン溶液に5分間ずつ4回浸し、脱パラフィン作業を行った。その後、100%エタノールに1分、95%アルコールに1分、85%アルコールに1分、70%アルコールに3分順番に浸すことで水和し、水道水で、5分間洗浄した。超純水で一度洗浄した後、3% H2O2溶液に室温で10分浸すことで、内存性ペルオキシダーゼを失活させた後、PBSで5分間、3回洗浄した。プロッキング溶液として10%ウサギ血清添加PBSを用い、室温で1時間インキュベートした。1次抗体はマウス3回免疫後血清を用い、10%ウサギ血清添加PBSで100倍に薄めたもので室温2時間インキュベートした。その後、PBSで5分間、3回洗浄し、2次抗体はHRP標識ウサギ抗マウスIgG抗体を用い、10%ウサギ血清添加PBSで200倍に薄め、室温にて1 時間インキュベートした。その後、PBS で5 分間、3 回洗浄し、NovaRedTMSubstrate Kit For Pcroxidase (Vector Laboratories社)を用いて発色させた。発色後、超純水で発色停止し、完全に風乾させた後、キシレンに浸して脱水し、封入後、顕微鏡にて観察した。
【００５７】
１−８．As16h1蛋白質を免疫したマウスにおける豚回虫（Ascaris suum）の排除試験
以下の５つのグループの免疫マウスを調製した。なお、マウスは、日本クレアから購入した。
グループ１：As16h1（10μg）免疫群
グループ２：As16h1（50μg）免疫群
グループ３：As16（10μg）免疫群
グループ４：As16（50μg）免疫群
グループ５：非免疫群
各グループ５匹のマウス（As16h1を10μg免疫した群では途中で1匹死亡したため４匹、非免疫マウス群は６匹）に免疫を行った。初回に完全アジュバントを用いて、上記各グループに示す抗原を腹腔内接種により免疫し、その２週間後および４週間後に、２回目および３回目の免疫を不完全アジュバントを用いて行った。
各グループの最終免疫から３週間後に、Ascaris suumの成熟卵4,620個を経口投与した。感染後、８日目に、マウスを安楽死させ、肺を取り出し、ベールマン法により抗生物質として、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンフォテリシンBと１０％FCSを加えた、RPMI-1640中に肺組織内の幼虫を回収し、顕微鏡下でその幼虫数をカウントした。回収した幼虫の数は、平均値±SDで算出した。
【００５８】
２．結果
２−１．遺伝子解析
２−１−１．As16 cDNAが存在する豚回虫ライブラリー
As16 cDNAがどの豚回虫ライブラリーに存在しているのか検索を行ったところ、female/male head（雌／雄の頭部）、L4およびpharynx（咽頭）のライブラリーにその存在が認められた。存在部位については、表皮または筋細胞での存在が確認できたが、腸管、卵巣では確認できなかった。
２−１−２．As16h1cDNAの同定
まず、As16 cDNAと相同性を有するcDNAを豚回虫腸管特異的ライブラリーに対してBLAST検索を行ったところ、そのようなcDNAを見出すことはできなかった。そこで、As16の推定アミノ酸配列を用いてアミノ酸ベースのBLAST検索を腸管特異的ライブラリーに対して行ったところ、36個の相同性のある配列が見つかった。その中から、53%の塩基配列同一性、88%のアミノ酸配列類似性を有するcDNA（As16h1cDNAと称する）を選び（表２）、詳細な解析を行うことにした。As16h1のcDNAは432bp（配列番号１）で、推定アミノ酸配列は、144個のアミノ酸残基から構成されていた（配列番号２）。As16h1 cDNAの存在部位につき検討を行ったところ、腸管および表皮、または筋細胞に存在することが分かった。
【表２】
2016084332.tif 000004
【００５９】
２−２．組み換え蛋白の作製
GST、GST-As16、His-As16、GST- As16h1およびHis- As16h1の5種類の蛋白を大腸菌で産生させた。遺伝子配列から推測した蛋自質の予想分子量はGST tagが26kDa、His tagが3kDa、As16が16kDa、As16h1が14.8kDaである。図１に示した通り、全ての蛋白において、予想された分子量のバンド(GST:26kDa、GST-As16: 40kDa、His-As16:17kDa、GST-As16h1:40.8kDa、His- As16h1:17.8kDa)が認められた。ただし、GST-As16h1のみ、予想される大きさのバンドに加え、26kDa付近にバンドが認められた。
【００６０】
２−３．ウエスタンブロット法によるGST-As16hlに含まれる26kDaのバンドの解析
抗原としてBSA、GST、GST- As16h1をそれぞれ1μg、1μg、2.5μg泳動し、1次抗体として抗GST抗体を用いて、ウエスタンブロットを行った。その結果を図２に示す。図２（ａ）は、メンブレンへのブロット後、乾燥させたのちに、アミドブラックで染めた染色像である。抗GST抗体が、GST- As16h1の精製後に認められた26kDa付近のバンドに反応した。また、抗GST抗体がBSAには反応していないことから、この反応が非特異的でないことが示された。従って、GST- As16h1蛋白質はプロテアーゼに対する感受性が高いことが示唆された。そこで、GST- As16h1蛋白質をFactor Xaで消化し、プロテアーゼ感受性につき、検討を行った。
【００６１】
２−４．GST-As16h1のFactor Xaによる消化
GST-As16、GST-As16h1を血清中に存在するプロテアーゼであるFactor Xaで処理を行った後、消化産物の電気泳動を行った（図３）。GSTのC’末端にはFactor Xaの切断配列が組みこまれており、GST-As16は、Factor Xaの作用により、40kDaの蛋白質のバンドがGST部分である26kDaとAs16部分である14kDaに分かれている様子が認められた。反応時間を増やすにつれて、消化も進み、40kDaのバンドが薄くなり、26kDa のバンドと14kDaのバンドが濃くなっていく様子が見られた。
他方、GST-As16hlは、Factor Xaの作用により、GST-As16h1の40.8kDaのバンドが徐々に薄くなり、GST部分である26kDaのバンドが濃くなっていく様子が認められたが、As16h1部分である14.8kDaのバンドはどの反応条件においても見られなかった。
As16hlはFactor Xaの切断部位を持たないのにも関わらず、GST-As16のAs16部分が消化されない条件で、As16h1部分は消化されることが明かとなった（図３）。このことから、GST-As16h1は非常に不安定な蛋白であると考えられる。これらの結果から、As16h1が免疫抗原として生体内に入った際に、プロテアーゼ等によって消化されやすく、抗体産生能が低いのではないかと考えられたが、後述するように、特に問題なく、As16h1の抗体を取得することができた。従って、As16h1蛋白質はGSTをつけると分離しやすく、Hisタグをつけると分離しにくい性質をもつものの、抗体産生誘導効果には問題はないと考えられる。
【００６２】
２−５． ELISA法による抗体産生の確認
精製したGST、GST-As16、His-As16、GST-As16h1および His-As16h1蛋白質を、各々、マウスへ3頭ずつ接種し、血清回収を行った。最終免疫血清を用い、抗原特異的IgG抗体価の計測を行った。
いずれの蛋白質に対しても抗原特異的IgG抗体が十分に得られた。
【００６３】
２−６．免疫組織染色
1次抗体として、His-NDV-F-HR1、His-As16およびHis-As16h1の最終免疫血清を用いた。これらの抗体を用いた免疫組織染色の結果を図４に示す。抗His-NDV-F-HRl抗体では豚回虫が染まらないことから、Hisタグに対する抗体は豚回虫切片に反応しないことが確認された。抗His-As16抗体と抗His-As16h1抗体では、染色結果が異なっていた。すなわち、抗His-As16抗体では、表皮、筋細胞が濃く染まり、腸管、子宮、卵巣の染色は弱かったのに対し、抗His-As16hl抗体では、卵巣は弱く染まり、表皮、腸管、子宮が濃く染色されることが明らかとなった。
【００６４】
２−７．As16h1蛋白質による豚回虫（Ascaris suum）の感染防御効果
As16h1（10μg、50μg）を免疫したマウス、As16（10μg、50μg）を免疫したマウスおよび非免疫マウス（ネガティブコントロール）の肺から豚回虫の幼虫を回収し、数をカウントした。各グループの５匹のマウス（As16h1を10μg免疫したグループでは、１匹が実験中に死亡したため４匹、非免疫マウス群は６匹）から回収された幼虫数のうち、平均値からもっとも離れた数を除外して算出した平均値±SDの値を図５に示した。
その結果、As16h1で免疫したマウスにおいては、すでに回虫の排除効果が確認されているAs16と同様に、非免疫群と比較して、明らかに、マウス肺から回収された幼虫の数が少なくなっていた。
以上のように、本発明において新規に見出されたAs16h1蛋白質は、豚回虫の感染に対する防御疫誘導効果を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明の蛋白質を利用することで、豚回虫による感染症に対する予防および／または治療用の製剤、あるいは、手段を提供することが可能である。従って、本発明は豚回虫による感染症の予防医療等の分野においてその使用が期待される。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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