(57)【要約】【課題】細胞培養担体の凹部内での細胞の培養の経過を簡便に観察することができ、均一なサイズの複数の細胞凝集塊を効率的に形成することができる細胞培養担体を提供する。【解決手段】透光性を有する部材の上面に複数の凹部１０が設けられた細胞培養担体１であって、前記凹部１０の底部には、前記凹部１０の開口部１０ａの面積に対して、前記開口部１０ａから底部をみた平面視上の面積が少なくとも１０％の面積を有する多孔体３が配置されると共に、前記凹部１０の側面が緻密体２で形成されている。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
上面に複数の凹部が設けられた細胞培養担体であって、
前記凹部の底部には、前記凹部の開口部の面積に対して、前記開口部から底部をみた平面視上の面積が少なくとも１０％の面積を有する多孔体が配置されると共に、前記凹部の側面が透光性を有する緻密体で形成されていることを特徴とする細胞培養担体。
【請求項２】
前記多孔体が板状であり、
前記凹部の底部に前記板状の多孔体が配置され、
前記凹部の底面が形成されることを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
【請求項３】
前記多孔体が球状であり、
前記凹部の底部の一部に前記球状の多孔体が配置されることを特徴とする請求項１記載の細胞培養担体。
【請求項４】
前記透光性を有する部材が、ガラス又は有機物のうちのいずれか１種からなることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞培養担体に関し、特に、均一なサイズの細胞凝集塊を得るのに好適な細胞培養担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、新規の医薬品候補物質についての代謝・薬効・毒性の評価試験のために、ヒト細胞等を用いた試験が注目されている。そして、スクリーニング結果等のバラツキを抑制するためには、できる限り、均一なサイズの細胞塊を多数培養することが求められる。
【０００３】
このような細胞の培養方法としては、細胞同士を凝集させて細胞凝集塊を形成させ、細胞を生体内環境に近づけて培養する方法が開発されている。
例えば、特許文献１〜３に記載されているような、セラミックスを基材とした細胞培養担体や、所定の表面粗さの基材表面に所定の形状の複数の凹部（ウェル）が形成されている細胞培養担体を用いて培養することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１３−２０８０８６号公報
【特許文献２】特開２０１２−５０４２６号公報
【特許文献３】特開２００４−５８３４４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記のような従来の細胞培養担体では、微小な凹部内での細胞の培養の経過は十分に観察することができなかった。また、所望の細胞塊以外に、該凹部内の側壁部にサテライトコロニーが生成する場合もあり、均一なサイズの細胞凝集塊を効率的に形成することが困難であった。
【０００６】
したがって、培養中の細胞の全体を簡便に観察しながら、均一なサイズの複数の細胞凝集塊を形成することができる細胞培養担体が求められている。
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、細胞培養担体の凹部内での細胞の培養の経過を簡便に観察することができ、均一なサイズの複数の細胞凝集塊を効率的に形成することができる細胞培養担体を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る細胞培養担体は、上面に複数の凹部が設けられた細胞培養担体であって、前記凹部の底部には、前記凹部の開口部の面積に対して、前記開口部から底部をみた平面視上の面積が少なくとも１０％の面積を有する多孔体が配置されると共に、前記凹部の側面が透光性を有する緻密体で形成されていることを特徴とする。
このように前記凹部の側面が透光性を有する緻密体で形成され、さらに前記凹部の底部に多孔体が配置されることにより、サテライトコロニーの生成が抑制され、細胞の培養経過を簡便に観察することができると共に、多孔体表面への細胞付着性が高くなり、細胞凝集塊を形成させやすくすることができ、サイズが均一な細胞凝集塊を効率的に形成することができる。
更に、前記凹部の多孔体を通じて、前記凹部内で培養される細胞に栄養を連続的に供給することができる。
尚、開口部からをみた平面視上の多孔体の面積が、開口部の１０％未満の場合には、多孔体の大部分が細胞の接着面となり、培養液の供給に不足が起きる等の問題があり、好ましくない。
【０００９】
前記細胞培養担体においては、前記多孔体が板状であり、前記凹部の底部に前記板状の多孔体が配置され、前記凹部の底面が形成されることが好ましい。
これにより、前記凹部の底面（多孔体）を通じて、凹部の底面全体から前記凹部内で培養される細胞に栄養を連続的に供給することができる。
【００１０】
あるいはまた、前記多孔体が球状であり、前記凹部の底部の一部に前記球状の多孔体が配置されることが好ましい。
このような構成とすることにより、球状の多孔体の前記凹部内への突出量あるいは粒径を制御することで、前記凹部底面の多孔体の面積を容易に変化させることができる。
また、前記多孔体を通じて、前記凹部内で培養される細胞に栄養を連続的に供給することができる。
【００１１】
前記透光性を有する部材としては、ガラス又は有機物のうちのいずれか１種が好適に用いられる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る細胞培養担体によれば、細胞の培養経過を簡便に観察することができ、凹部におけるサテライトコロニーの生成を抑制することができ、均一なサイズの複数の細胞凝集塊を効率的に形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る細胞培養担体の一例を示した概略断面図である。
【図２】図１の細胞培養担体の凹部の拡大断面図である。
【図３】本発明に係る細胞培養担体の他の態様の凹部の概略断面図である。
【図４】球状の多孔体と凹部の位置関係を説明するための概略図である。
【図５】本発明に係る細胞培養担体の他の態様の凹部の概略断面図である。
【図６】本発明に係る細胞培養担体で培養した細胞塊を示す図である。
【図７】従来の細胞培養担体で培養した細胞塊を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について、図面を参照して詳細に説明する。
図１に、本発明に係る細胞培養担体の一例の概略を示す。図１に示した細胞培養担体１は、板状の多孔体３の上面に、複数の均一の孔が設けられ、周縁部に壁を有する板状の緻密体２が設けられている。
そして、緻密体２と多孔体３とが溶着又は接着等により接合されることにより、細胞培養担体１の上面に複数の凹部１０が形成されている。ここで、前記溶着又は接着等とは、緻密体２と多孔体３の接する面全体に溶着又は接着等してもいいし、一部だけもよく、特に限定するものではない。
【００１５】
図２に、図１の細胞培養担体１の凹部１０の拡大図を示す。凹部１０は、底面が連通した孔を有する多孔体３であり、側面が透光性を有する緻密体２である。
このような細胞培養担体を用いることにより、細胞の培養経過を簡便に観察することができ、また、凹部にサテライトコロニーが生成することを抑制することができ、サイズが均一な細胞凝集塊を効率的に形成することができる。また、底面が連通した孔を有する多孔体３で形成されるため、凹部内で培養される細胞に栄養を連続的に供給することができる。
なお、凹部１０の形状は、特に限定されるものではないが、細胞を凝集させやすくする観点から、また、細胞の播種及び取り出し容易の観点から、図１，２に示すように、下方の方が断面積の小さい形状であることが好ましい。
【００１６】
前記細胞培養担体１の凹部１０の底面１１（多孔体３）の面積は、前記凹部１の開口部１０ａの面積に対し１０％以上に形成される。即ち、前記凹部１の開口部１０ａの面積に対し１０％以上の面積を有する多孔体３からなる底面１１が形成される。
尚、凹部１０の底面１１（多孔体３）の面積が、前記凹部１の開口部１０ａの面積に対し１０％未満の場合には、多孔体（底面）の大部分が細胞の接着面となり、培養液の供給に不足が起きる等の問題があり好ましくない。
したがって、凹部１０の底面１１（多孔体３）は、前記凹部１の開口部１０ａの面積に対し１０％以上に形成されるのが好ましい。また、前記凹部１０をこのように形成することにより、凹部１０内の底面１１の一部に細胞が付着しやすくなり、培養細胞が凝集しやすくなる。
【００１７】
本発明でいう多孔体とは、水銀ポロシメータを用いた水銀圧入法により測定される気孔率が２０〜５０％であるものを指すものとする。また、平均気孔径は、０．１〜５μｍとする。
このような多孔体を適用することにより、底面を構成する多孔体表面への細胞付着性が高くなり、細胞凝集塊を形成させやすくすることができる。
【００１８】
一方、凹部１０の側面１２は、緻密体２である。
ここで、本発明でいう緻密体とは、水銀ポロシメータを用いた水銀圧入法により測定される気孔率が１０％未満のものを指すものとする。
このような緻密体を適用することにより、細胞が凹部側面に付着し、サテライトコロニーが形成されるのを抑制することができ、また、細胞培養担体の強度を保持することができる。
【００１９】
また、前記多孔体３は、細胞に供給するための培養液を浸透可能とさせる観点から、気孔が３次元網目状に連通していることが好ましい。
このような多孔体３であれば、図１に示したように、凹部１０底面の多孔体３が板状体である場合に、該板状体の下面から、培養液を浸透させ、凹部１０内の細胞に連続的に培養液を供給し続けることが可能となる。
【００２０】
前記緻密体２は、透光性を有する部材により構成される。材質としては、ガラス又は有機物のうちのいずれか１種が好適に用いられる。具体的には、生体親和性及び生体適合性に優れているものが好ましく、石英ガラス、ホウケイ酸塩系ガラス、ポリスチレン等が挙げられる。
細胞培養担体１の上面を構成する緻密体２にこのような部材を適用することにより、細胞培養担体１の上方、下方、側方等から光を照射することにより、凹部内が明るくなり細胞を上方から見やすくなるため、細胞の培養経過の観察が簡便となる。
【００２１】
また、前記多孔体３の材質としては、アルミナ、ジルコニア、チタニア、ハイドロキシアパタイト、シリカ等が挙げられる。また、多孔体３は透光性部材であってもよい。
なお、この多孔体３を構成する透光性を有する部材を用いる場合は、前記緻密体と同様の材質のものを適用することが好ましい。
【００２２】
図３に、図１，２とは異なる態様の細胞培養担体の凹部の構成を示す。図３に示す凹部２０は、側面２１及び底部２２が緻密体４からなり、該底部２２に球状の多孔体５が埋め込まれた形態として構成されている。
また、前記底部２２は、図３に示したように平面のほか、例えば、図５（ａ）に示すように、前記底部２２が断面Ｕ字状の曲面であっても良く、また図５（ｂ）に示すように、前記凹部２０（側面２１）全体が逆円錐状面に形成されていても良く、更に図５（ｃ）に示すように、側面２１が円筒状で、底部２２が逆円錐状の曲面であっても良い。
このような形態により、凹部２０の底部２２に埋め込まれた球状の多孔体５の面積（開口部から多孔体５をみた、平面視上の面積）は、前記凹部２０の開口部２０ａの面積に対し１０％以上となるように構成されている。
【００２３】
前記多孔体５の面積（開口部から多孔体５をみた、平面視上の面積）が、前記凹部２０の開口部２０ａの面積に対し１０％未満の場合には、多孔体５の大部分が細胞の接着面となり、培養液の供給に不足が起きる等の問題があり好ましくない。また前記多孔体５の面積が、前記凹部２０の開口部２０ａの面積に対し６０％を超えると、透過できる光量が少なくなり、細胞を観察することが難しくなるため、好ましくない。
したがって、凹部２０の底部２２は、前記凹部２０の開口部２０ａの面積に対し１０％以上６０％以下に形成されるのが好ましい。
【００２４】
また、前記多孔体５が前記凹部２０の底部２２に位置することから、前記凹部２０の底部２２の面積（開口部から底部２２をみた、平面視上の面積）は、前記球状の多孔体５の面積（開口部から多孔体５をみた、平面視上の面積）よりも大きい。
【００２５】
上記した、底部に球状の多孔体５が埋め込まれた形態にあっては、前記凹部２０内への球状の多孔体５の突出量あるいは粒径を変えることにより、前記凹部底部の多孔体５の面積を容易に制御することができ、均一なサイズの細胞凝集塊のサイズの制御もより簡便になる。
また多孔体５が透光性を有しない場合であっても、底面の一部に多孔体の球状粒子５が配置されるため、底面全体が多孔体の場合に比べて、下方あるいは上方のみからの光照射によって、より容易に細胞を観察することできる。
【００２６】
前記球状の多孔体５の位置は、図４に示したとおり前記凹部２０の開口部２０ａ中心線Ｌ１と球状の多孔体５の中心線Ｌ２との距離Ｌ３が球状の多孔体５の半径以下であることがより好ましい。
このような位置関係であることにより、形成する細胞塊の大きさを均一にできる。
前記凹部の中の培養液の流れは、多孔体が中心部に存在するほど、凹部内の流れが均一になり、中心部からずれるほど多孔体の面積や厚みが変わり、不均一な流れになり、細胞塊の成長に差が生じ、細胞塊の大きさが不均一になる。そのため、前記距離Ｌ３は球状の多孔体５の半径以下であることが好ましい。
【００２７】
前記球状の多孔体５の真球度は０．８〜１．０の真球に近い粒子であることがより好ましい。
このような球状の多孔体５を用いることにより、該底部２２に容易に埋め込むことができ、下方からの光照射により簡便に細胞を観察することができる。
ここで真球度とは、走査型電子顕微鏡により写真撮影して得られる写真投影図における粒子の最大径とこれと直交する短径との比を意味する。真球度１．０は真球を指す。
【００２８】
尚、上記実施形態では、前記開口部１０ａ，２０ａの平面視が円形の場合について説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、例えば、平面視が矩形形状の開口部１０ａ，２０ａであっても良い。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに具体的に説明するが、本発明は下記の実施例により制限されるものではない。
［実施例１］
図１，２に示すような細胞培養担体１を用いて、直径約１０μｍのマウスＥＳ細胞を培養し、細胞塊を形成させた。
細胞培養担体１は、直径１４ｍｍの円板状であり、開口径３００μｍ、底部径１５０μｍの凹部１０を１０００個有するものを用いた。表１に示すように、緻密体２は気孔率２％の石英ガラス、多孔体３は気孔率３０％、平均気孔径０．１５μｍのチタニアとし、凹部の開口部の面積に対して１００％の板状とした。
そして、市販の２４ウェルプレートのウェルに培養液３００μｌを入れた後、所定の滅菌処理を行った上記培養担体を２４ウェルプレートに入れた。培養担体の多孔体により毛細管現象で吸上げられた培養液で培養担体の凹部が満たされたことを確認した後に細胞懸濁液（マウスＥＳ細胞１００万個／ｍｌ）１ｍｌを培養担体に播種した。その後、３７℃のＣＯ２インキュベーターで１日培養した。細胞の培養の経過を観察することができ、図５に示すとおりサテライトコロニーは生成されておらず、均一なサイズの細胞塊が得られた。
【００３０】
［実施例２］
図１，２に示すような細胞培養担体１を用いて、直径約１０μｍのマウスＥＳ細胞を培養し、細胞塊を形成させた。
細胞培養担体１は、直径１４ｍｍの円板状であり、開口径３００μｍ、底部径１５０μｍの凹部１０を１０００個有するものを用いた。表１に示すように、緻密体２は気孔率２％の石英ガラス、多孔体は気孔率３０％、平均気孔径０．１５μｍのチタニアとし、凹部の開口部の面積に対して１０％の板状とした。
このような細胞培養担体を用いて、実施例１と同様に培養試験を行ったところ、実施例１と同様サテライトコロニーは生成されておらず、細胞培養経過観察が良好で均一なサイズの細胞塊が得られた。
【００３１】
［実施例３〜１０］
表１に示した緻密体、多孔体を用いて実施例１と同様にして細胞を培養した。その結果、実施例３〜１０においてもサテライトコロニーは生成されておらず、細胞培養経過観察も良好で均一なサイズの細胞塊が得られた。
【００３２】
［比較例１］
直径１４ｍｍの円盤状であり、表１に示すように、開口径３００μｍの凹部を１０００個有する気孔率３０％、平均気孔径０．１５μｍのチタニアの多孔体からなる細胞培養担体を用いて、直径約１０μｍのマウスＥＳ細胞を培養し、細胞塊を形成させた。
このような細胞培養担体を用いて、実施例１と同様に培養試験を行ったところ、サテライトコロニーが生成され、細胞塊も均一のものが得られなかった（図６参照）。
【００３３】
［比較例２］
図１，２に示すような細胞培養担体を用いて、直径約１０μｍのマウスＥＳ細胞を培養し、細胞塊を形成させた。
細胞培養担体１は、直径１４ｍｍの円板状であり、開口径３００μｍの凹部１０を１０００個有するものを用いた。表１に示すように、緻密体は気孔率２％の石英ガラス、多孔体は気孔率３０％、平均気孔径０．１５μｍのチタニアとし、開口部の面積に対し５％の板状とした。
このような細胞培養担体を用いて、実施例１と同様に培養試験を行ったところ、球形状とは異なる歪な形状の細胞塊や浮遊して死滅した細胞塊が多数存在した。
【００３４】
【表１】
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【符号の説明】
【００３５】
１          細胞培養担体
２，４      緻密体
３          多孔体
５          球状体（多孔体）
１０，２０  凹部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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