(57)【要約】【課題】照明の非対称性に起因する歪みを良好に補正すること【解決手段】照明光学系は、瞳面において光軸周りに非対称な位置を通過する、互いにコヒーレントな２つの平行光が作る干渉パターンによって物体を照明する第１照明手段と、２つの平行光を光軸周りに（３６０／ｎ）度（ｎは２以上の整数）ごとに回転させるダブプリズムユニット９０５と、を有する。【選択図】図１
2016114896.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物体を照明する照明光学系であって、
瞳面において光軸周りに非対称な位置を通過する、互いにコヒーレントな複数の平行光が作る干渉パターンによって、前記物体を照明する第１照明手段と、
前記複数の平行光を光軸周りに（３６０／ｎ）度（ｎは２以上の整数）ごとに回転させる回転手段と、を有することを特徴とする照明光学系。
【請求項２】
一様な強度分布をもつ励起光によって前記物体を照明する第２照明手段を更に有することを特徴とする請求項１に記載の照明光学系。
【請求項３】
前記第１照明手段は、２つの光路を形成し、２つのハーフミラーと２つのミラーを含むマッハ＝ツェンダー干渉系を有することを特徴とする請求項１または２に記載の照明光学系。
【請求項４】
前記第１照明手段は、２つの光路を形成し、２つのハーフミラーと２つのミラーを含むマッハ＝ツェンダー干渉系を有し、
前記照明光学系は、前記マッハ＝ツェンダー型干渉系の一方の光路に挿入、および、前記光路から退避されるように構成された遮光板を更に有し、
を有し、
前記第２照明手段は、前記マッハ＝ツェンダー型干渉系の前記光路に前記遮光板が挿入されることによって形成されることを特徴とする請求項２に記載の照明光学系。
【請求項５】
前記回転手段は、物体面と共役な位置に配置されたダブプリズムと、該ダブプリズムを照明光学系の光軸周りに回転する手段を有することを特徴とする請求項１乃至４のうちいずれか１項に記載の照明光学系。
【請求項６】
前記回転手段は、物体面と共役な位置に配置されたダブプリズムと、該ダブプリズムを光路から退避させる手段を有することを特徴とする請求項１乃至４のうちいずれか１項に記載の照明光学系。
【請求項７】
請求項１乃至６のうちいずれか１項に記載の照明光学系を有することを特徴とする顕微鏡。
【請求項８】
請求項２に記載の照明光学系を有し、
前記第１照明手段によって前記物体を照明して撮像することによって得られた第１画像と、前記第２照明手段によって前記物体を照明して撮像することによって得られた第２画像と、に基づいて前記物体の所定の合焦平面における情報を取得する画像処理手段を更に有し、
前記画像処理手段は、前記回転手段により設定される複数の回転位置のそれぞれにおける前記干渉パターンによって前記物体を照明して得られた複数の画像の強度平均をとることによって前記第１画像を取得することを特徴とする顕微鏡。
【請求項９】
互いにコヒーレントな複数の平行光が作る干渉パターンによって物体を照明して撮像することによって得られた第１画像と、一様な強度分布をもつ励起光で前記物体を照明して撮像することによって得られた第２画像と、に基づいて前記物体の所定の合焦平面における情報を取得する画像処理装置であって、
前記複数の平行光は、瞳面において光軸周りに互いに非対称な位置を通過し、
前記複数の平行光を光軸周りに（３６０／ｎ）度（ｎは２以上の整数）ごとに回転させ、前記複数の平行光についてのｎ個の回転位置のそれぞれで前記干渉パターンによって前記物体を照明して撮像された複数の画像の強度平均をとることによって前記第１画像を取得し、前記瞳面に前記複数の光源を前記複数の回転位置に同時に配置すると、前記複数の光源は光軸周りに対称に配置されることを特徴とする画像処理装置。
【請求項１０】
請求項４に記載の照明光学系を有する顕微鏡の制御方法であって、
前記光路に前記遮光板を挿入することによって、前記第２照明手段で前記物体を照明して撮像する第１ステップと、
前記光路から前記遮光板を退避させることによって、前記回転手段によって前記複数の光源の複数の回転位置のそれぞれで前記第１照明手段によって前記物体を照明して撮像する第２ステップと、
前記顕微鏡の対物レンズの光軸方向に前記物体を移動させる第３ステップと、
該第３ステップの後で、前記回転手段によって前記複数の光源の複数の回転位置のそれぞれで前記第１照明手段によって前記物体を照明して撮像する第４ステップと、
前記光路に前記遮光板を挿入することによって、前記第２照明手段で前記物体を照明して撮像する第５ステップと、
該第５ステップの後で、前記光軸方向に前記物体を移動させる第６ステップと、
を有し、前記第１ステップから前記第３ステップまでと、前記第４ステップから前記第６ステップまでを交互に所定回数繰り返すことを特徴とする制御方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の制御方法をコンピュータに実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、照明光学系、顕微鏡、画像処理装置、顕微鏡の制御方法、及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１は、非対称格子照明方式（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｌａｔｔｉｃｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ：ＡＬＩ）の３次元顕微鏡（デジタル顕微鏡）を提案している。この顕微鏡は、二種類の照明モードで試料の全視野を照明し、照明モード毎に取得した画像データを演算処理することにより、所望の合焦平面付近に位置する試料が発した蛍光情報を抽出する。３次元的な立体像を得るには、ステージを昇降させて対物レンズの合焦位置を変更する。
【０００３】
一つの照明モードでは一様な強度分布をもつ励起光で蛍光試料を照明し、もう一つの照明モードでは干渉縞などの周期的な強度分布を持つ励起光で試料を照明する。ＡＬＩでは、励起光の強度分布が光軸方向に沿って一様ではなく、光軸方向に対しても有限の周期を持ち、これによって光軸方向の分解能を向上させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−４４２５４公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、ＡＬＩでは、光軸中心に非対称な強度分布をもつ照明を行った場合、光軸方向の分解能を向上させることができる一方で、本来の試料にはない像の歪み（アーティファクト）が発生してしまう。
【０００６】
本発明は、照明の非対称性に起因する歪みを良好に補正することが可能な照明光学系、顕微鏡、画像処理装置、顕微鏡の制御方法、及びプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の照明光学系は、物体を照明する照明光学系であって、瞳面において光軸周りに非対称な通過位置を通過する、互いにコヒーレントな複数の平行光が作る干渉パターンによって、前記物体を照明する第１照明手段と、前記複数の平行光を光軸周りに（３６０／ｎ）度（ｎは２以上の整数）ごとに回転させる回転手段と、を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、照明の非対称性に起因する歪みを良好に補正することが可能な照明光学系、顕微鏡、画像処理装置、顕微鏡の制御方法、及びプログラムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】対物レンズの瞳共役面における有効光源の配置を表す図である。
【図２】数式１で実現される照明パターンを模式的に示す図である。
【図３】図１の光源配置を実現するための照明光学系の例を模式的に示す図である。
【図４】モデル物体を示す図である。
【図５】従来のＡＬＩで図４に示すモデル物体を撮像した時に得られる画像である。
【図６】照明モード１と照明モード１’の対物レンズの瞳共役面における光源配置を示す図である。
【図７】照明モード１と照明モード１’のそれぞれの下で得られたモデル物体の画像とそれらの強度平均画像である。
【図８】強度平均画像と照明モード２の下で得られた画像から作成した差分画像に基づいて抽出された最終画像である。
【図９】本発明の落射型蛍光顕微鏡の光路図である（実施例１、２）。
【図１０】図９に示すダブプリズムの模式図である（実施例１、２）。
【図１１】図９に示す蛍光顕微鏡の制御方法を説明するためのフローチャートである（実施例２）。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、デジタルスライドスキャナーなどを用いて蛍光染色された厚みのある試料を顕微鏡で３次元的に観察する用途などに適用することができる。デジタルスライドスキャナーとは、生物学や病理学的検査等で使用するプレパラートを高速でスキャンし、高解像度なデジタルデータに変換する装置である。本発明は、非対称格子照明方式（ＡＬＩ）に適用することができる。
【００１１】
ＡＬＩは蛍光染色された試料を互いにコヒーレントな２つの平行光が作る干渉パターンによって照明する照明モードを含む。２つの平行光の直線偏光の向きを揃えて干渉パターンのコントラストを高くするため、２つの平行光がｓ波もしくはＴＥ（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）波にされる。
【００１２】
そうすると必然的に、双方の平行光を表す二つの波数ベクトルは対物レンズの瞳共役面上において直径上の２点として表わされる（図１参照）。ここで、図１は、対物レンズの瞳面またはそれと共役な面（以下、単に「瞳面」と称する場合もある）における有効光源の配置を示す図である。
【００１３】
図１において、２つの黒い点（有効光源）１、２は、互いにコヒーレントな複数の（ここでは、２つの）平行光を表す二つの波数ベクトルによって形成される２次光源点である。水平軸と垂直軸の設定方法は任意であり、円で表わされる瞳の半径を１とする。励起光の波数ベクトルの大きさを励起光の波長λを用いてｋ＝２π／λとし、対物レンズの開口数をＮＡと表記すると、瞳の半径は波数ｋＮＡに対応する。
【００１４】
図１において、点１の励起平行光を表す波数ベクトルを（ｋｓｉｎθ１，０，ｋｃｏｓθ１）とすると、点１の座標は（ｓｉｎθ１／ＮＡ，０）となる。同様にして、点２の座標は（ｓｉｎθ２／ＮＡ，０）となる。
【００１５】
対物レンズの瞳共役面上にこのような二つの等強度の光源点が配置された時、蛍光染色された試料は数式１で表わされる強度分布Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）で照明される。
【００１６】
【数１】
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【００１７】
数式１において、水平方向の座標をｘ、光軸方向の座標をｚとした。Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）は垂直方向の座標ｙには依存しない。図２（ａ）はＩ（ｘ，ｙ，ｚ）のｘ−ｙ断面、図２（ｂ）はＩ（ｘ，ｙ，ｚ）のｘ−ｚ断面を示している。ｚは光軸方向、ｘ−ｙ断面は光軸に垂直な面である。図２（ｂ）からわかるようにＡＬＩは励起光の強度分布が、光軸方向に沿って一様ではなく、光軸方向に対しても有限の周期をもつが、そのためにはθ１の絶対値とθ２の絶対値が異なる必要がある。
【００１８】
このとき、図１において、点１と点２は垂直軸に関して（瞳中心周りに）非対称に配置されることになり、垂直軸の方向が二つの平行光の共通した電場振動方向となる。ＡＬＩの実施に好適なθの値の組は、主たる要因である光学系の仕様のほか、試料やその他実験条件によっても異なる。いずれにしても、顕微鏡の対物レンズの瞳と共役な面に図１で示されるような非対称な光源配置を実現することになる。
【００１９】
図３は、図１の有効光源配置を実現するための物体を照明する照明光学系（の互いにコヒーレントな複数の平行光が作る干渉パターンによって前記物体を照明する第１照明手段）を示す光路図である。コヒーレント光源として直線偏光したレーザ（励起光源３０４）を用い、コリメートされたレーザビームをマッハ＝ツェンダー型の干渉系に入射させる。マッハ＝ツェンダー型干渉系は、２つのハーフミラーと２つのミラーを有し、第１照明手段として機能する。マッハ＝ツェンダー型干渉系により、コリメートされたレーザビームを等強度の２つの光路に分割し、ミラー３０２およびハーフミラー３０３を適宜調整することによって２つの平行光の波数ベクトルを調整してハーフミラー３０３を通して合波させる。２つの平面波同士が重なり合う領域が、顕微鏡の対物レンズの物体面に対して光学的に共役であればよい。
【００２０】
生物学的観察に用いる多くの蛍光顕微鏡は接眼観察をするための双眼鏡のほかに、試料の画像をデジタル撮像するためのカメラポートを複数備えている。カメラポートは、物体面と共役の位置に設けられるので、そのうちの一つを励起光の入射口として用いることができる（カメラポート３０１）。物体面と共役になるのは、視野絞りの位置であるので、ここで２つの平行光を重ね合わせればよい。また、マッハ＝ツェンダー干渉系の片方の光路に遮光板を挿入することにより、一様な強度分布をもつ励起光で蛍光試料を照明するモードも容易に実現できる。
【００２１】
図４（ａ）は、モデル物体のＸ−Ｚ断面、図４（ｂ）は、そのＸ−Ｙ断面を示している。モデル物体は、ｙ方向に伸びる四角柱で、ｘ−ｚ断面が一辺の長さがλ／ＮＡに等しい正方形をしている。波長λは４８８ｎｍ、開口数ＮＡは０．７であり、試料内部の発光強度は簡単のため一様とする。
【００２２】
モデル物体を、数式１及び図２で示されるような照明強度分布下（照明モード１）で撮像すると、図５の最左図のような画像が得られる。上段がｘ−ｙ断面、下段がｘ−ｚ断面である。下段の最左図は光軸方向に非対称な照明強度分布を反映して光軸周りの対称性を大きく損なった画像となっている。照明モード１は、照明光学系の第１照明手段によって実現される第１照明方式である。また、本実施形態の照明光学系は、一様な強度分布をもつ励起光によって前記物体を照明する第２照明手段を更に有する。
【００２３】
一方、図５の左から二番目の図はＡＬＩのもう一つの照明モード、即ち、一様な強度分布をもつ励起光で蛍光試料を照明するモード（照明モード２）の下で撮像されたモデル物体の画像であり、光軸に対して対称な画像（第２画像）となっている。照明モード２は、照明光学系の第２照明手段によって実現される第２照明方式である。照明モード１では、第１照明手段が使用され、第２照明手段が使用されず、照明モード２では、第２照明手段が使用され、第１照明手段が使用されない。
【００２４】
特許文献１及びその先行技術文献に開示されているように、これら二つの照明モードで撮られた２枚の画像の強度差分画像をコンピュータ上で作成し、これに基づいて光軸方向の分解能に優れた合焦平面の断層像を抽出することができる。モデル物体における差分強度画像は図５の右から二番目の図である。右から二番目のｘ−ｚ断面の画像は照明モード１が非対称な画像であることに起因して光軸に非対称な画像となっている。この非対称なデータを解析することによってコンピュータ上で合焦平面の外の強度を消しても、元データの非対称性が残存する。得られた最終画像は図５の最右図である。上段のｘ−ｙ断面の画像に大きな欠陥は見当たらないが、下段のｘ−ｚ断面の最終画像には図４に示すモデル物体にはない歪みが残存して画質も悪くなっている。本実施形態は、照明光学系への変更を最小限にとどめた形でこの歪みを補正する。
【００２５】
まず、互いにコヒーレントな２つの平行光が作る干渉パターンによって照明する照明モード１を複数のモードに分割する。以降の説明では簡単のために分割数を２つとするが、３つ以上でもよい。
【００２６】
まず、図１に示す瞳共役面における光源配置（図６（ａ））と光軸対称になるような光源配置（図６（ｂ））を実現し（照明モード１’）、照明モード１’下でもモデル物体を撮像する。このときモデル物体を照射する励起光源の強度分布Ｉ’（ｘ，ｙ，ｚ）は数式２で与えられる。
【００２７】
【数２】
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【００２８】
次に、照明モード１’下で撮像された画像と照明モード１下で撮像された画像との強度平均画像をコンピュータ上で作成する。そして、この強度平均画像と照明モード２下で撮像された画像から差分画像を作成する。断層像再生手順は同様である。これらのプロセスで使用する画像群を図７に示す。
【００２９】
図７（ａ）は、照明モード１によるモデル物体の画像、図７（ｂ）は、照明モード１’によるモデル物体の画像を示している。図７（ａ）に示す画像と図７（ｂ）に示す画像は、複数の光源（図６に示す点１、２）の複数の回転位置のそれぞれで干渉パターンによってモデル物体を照明して撮像された複数の画像である。
【００３０】
図７（ｃ）は、これら二枚の画像の強度平均をとることによって取得される強度平均画像（第１画像）である。図７（ｃ）から分かるように、光軸に対する非対称性が消失している。
【００３１】
本実施形態の照明光学系は、瞳面の瞳中心周り（光軸周り）に非対称な位置を通過する複数の平行光（図６（ａ）に示す点１、２）を光軸周りに（３６０／ｎ）度（ｎは２以上の整数）ごとに回転させる回転手段を有する。この結果、複数の平行光についてｎ個の回転位置が形成されることになる。例えば、ｎが２であれば、回転手段は、図６（ａ）に示す０度と図６（ｂ）に示す１８０度の２つの回転位置を形成する。ｎが３であれば、回転手段は、０度、１２０度、２４０度の３つの回転位置を形成する。そして、回転手段によって形成された複数の平行光についての複数の回転位置のそれぞれで第１照明手段によって物体を照明する。第１照明手段は、複数の光源に対応する互いにコヒーレントな複数の平行光が作る干渉パターンによって物体を照明する。瞳面において複数の平行光の複数の回転位置に合成（同時に配置）すると（例えば、図６（ａ）に示す点１、２と図６（ｂ）に示す点１、２とを瞳面に配置すると）、複数の平行光は、光軸周りに均等に分布することになる。
【００３２】
図８左図は先に作成した照明モード１によるモデル物体の像と照明モード１’によるモデル物体の像から作成した強度平均画像（第１画像）である。図８の左から２番目が照明モード２によるモデル物体の画像（第２画像）である。図８の右から２番目が、照明モード１’で撮像された画像と照明モード１で撮像された画像との強度平均画像から照明モード２によるモデル物体の像を差し引いてできた差分強度画像であるが、光軸に対する非対称性が消失したことが分かる。対称性が回復された差分画像が断層像抽出の演算に使用され、図８の最右列下段の最終画像が得られる。光軸周りの非対称性は消失しており、図４の最右図と比べても良好な再現性を有している。
【００３３】
本実施形態によれば、照明の非対称性に起因するアーティファクトが良好に補正された高画質な最終画像を得ることができる。図６（ｂ）に示す光源配置を実現するには、図３に示す照明光学系全体を光軸周りに１８０度回転すればよい。また、蛍光染色された試料自体を試料ステージ上で１８０度回転させてもよい。
【００３４】
実施例１で説明するように、２光束の干渉角が極めて小さいため、マッハ＝ツェンダー干渉系は数十センチ程度以上の大きさになる。この干渉系全体の１８０度反転を高い再現性で高速に行うことは困難かもしれない。また、後者の方法も、興味ある視野が回転軸からずれている場合、回転後は視野から外れるおそれがある。そこで、透過する光束を任意角度だけ光軸周りに回転させることができるダブプリズム（ローテーションプリズム）を使用してもよい。以下、顕微鏡システムの構成などを本発明の実施例で説明する。
【実施例１】
【００３５】
図９は、実施例１、２に共通の蛍光顕微鏡の光路図である。蛍光顕微鏡は、一般的な落射型蛍光顕微鏡に、図３に示すマッハ＝ツェンダー型干渉系による照明光学系を適用している。蛍光顕微鏡は、励起光源９０１、ハーフミラー９０２ａ、ｂ、ミラー９０３ａ、ｂ、遮光板ユニット９０４、ダブプリズムユニット９０５、制御手段９０６、ステージ９０７を有し、これらは実施例の特徴的な構成である。また、蛍光顕微鏡は、カメラポート９０８、レンズ９０９、フィルターキューブ９１０、対物レンズ９１１、ハーフミラー９１３、結像レンズ９１４、９１７、撮像素子９１５、９１８、ミラー９１６を更に有する。これらは一般的な落射型蛍光顕微鏡の構成をそのまま使用できる部分である。
【００３６】
励起光源９０１には、例えば、直線偏光したレーザを用い、コリメートされたレーザビームをマッハ＝ツェンダー型干渉系に入射させる。実施例１では、互いにコヒーレントな複数の平行光が作る干渉パターンによって（照明モード１によって）物体を照明する第１照明手段をマッハ＝ツェンダー型干渉系から構成している。
【００３７】
ハーフミラー９０２ａは、コリメートされたレーザビームを等強度の２つの光路に分割する。ミラー９０３ａ、ｂは、各光路のレーザビームを折り曲げる。ハーフミラー９０２ｂは２つの光路の光を合成する。ハーフミラー９０２ａ、ｂおよびミラー９０３ａ、ｂを適宜調整することによって２つの平行光の波数ベクトルがそれぞれ適宜好適なものになるようにする。
【００３８】
遮光板ユニット９０４は、遮光板とそれを駆動する駆動手段から構成され、駆動手段による駆動は制御手段９０６によって制御される。駆動手段は、遮光板をマッハ＝ツェンダー型干渉系の一方の光路に挿入、および、当該光路から退避させる。遮光板を光路に挿入することにより、一様な強度分布をもつ励起光で（照明モード２で）試料９１２を照明する第２照明手段を形成することができる。２つの平面波同士が重なり合う領域は、物体面に光学的に共役な場所であればよい。
【００３９】
カメラポート９０８は、試料のデジタル画像を取得するのに使用される。カメラポートは、物体面と共役の位置に設けられ、そのうちの一つを励起光の入射口として用いることができる。カメラポート９０８の位置にダブプリズムユニット９０５を配置する。ダブプリズムユニット９０５は、複数の光源を瞳中心周りに回転させる回転手段として機能する。ダブプリズムユニット９０５は、ダブプリズムとそれを駆動する駆動手段から構成され、駆動手段による駆動は制御手段９０６によって制御される。駆動手段は、ダブプリズムを光軸周りに回転させると共に、光路からダブプリズムを退避させることもできる。ダブプリズムが回転すると、透過像はダブプリズムの２倍の回転角だけ回転する。
【００４０】
蛍光染色された試料（物体）９１２は、試料本体のほか固定液、カバーガラス、スライドガラスなどを含み、ステージ９０７上に配置されている。ステージ９０７は、電動で３次元駆動が可能に構成され、制御手段９０６によって駆動制御される。
【００４１】
制御手段９０６は各部の駆動を制御する。また、本実施例の制御手段９０６は、画像処理手段としても機能する。制御手段９０６は、蛍光顕微鏡の一部として構成されてもよいし、専用の制御装置として構成されてもよい。例えば、制御手段９０６は、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）であってもよいし、ＬＡＮやインターネットなどのネットワークを介して接続されたサーバーであってもよい。画像処理手段も顕微鏡の外部の画像処理装置として構成されてもよい。
【００４２】
画像処理手段は、照明モード１、１’で物体を照明して撮像することによって得られた物体の第１画像と、照明モード２で物体を照明して撮像することによって得られた物体の第２画像と、に基づいて物体の所定の合焦平面における情報を取得する。そして、画像処理手段は、複数の光源の複数の回転位置のそれぞれで干渉パターンによって物体を照明して撮像された複数の画像の強度平均をとることによって第１画像を取得する。画像処理装置も同様である。
【００４３】
以下、生物学的観察に用いられる対物レンズの典型的な仕様としてＮＡ０．９５、倍率４０倍とする。光軸方向の解像力が最大となる条件は、図１に示す点１の座標を（ｓｉｎθ１／ＮＡ，０）、点２の座標を（ｓｉｎθ２／ＮＡ，０）とすると、ｓｉｎθ１＝−０．１９、ｓｉｎθ２＝０．７６である。一方、顕微鏡の対物レンズは通常、収差を良好に補正するために数式３で示される正弦条件を満たすように設計されている。数式３において、Ｍは対物レンズの倍率、θｉは光源側の最大入射角、θｏは物体側の最大入射角である。
【００４４】
【数３】
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【００４５】
つまり、物体面に対して角度θｏをもって光線を入射させようとするとき、光源側では対物レンズの倍率（４０倍）分の１だけ浅い角度で入射させる必要がある。ｓｉｎθ１＝−０．１９、ｓｉｎθ２＝０．７６は物体側での値であるから、光源側ではｓｉｎθ１＝−０．００４７５、ｓｉｎθ２＝０．０１９０となる。交差角は度換算で約１．５度である。
【００４６】
図１０は、ダブプリズムユニット９０５のダブプリズムの概念図である。ダブプリズムは一様な屈折率を持つガラス材（ここでは、ＢＫ７ガラス製で屈折率１．４９）で、底面と上面が長方形、２つの側面が台形をなしている。台形の底角は両方とも４５度であり、一例として、上底６７ｍｍ、下底１２７ｍｍ、奥行き３０ｍｍを有する。使用の際には光軸が高さ１５ｍｍ奥行１５ｍｍの条件で指定される直線に一致させる。
【００４７】
互いにコヒーレントな２つの平行光がダブプリズム中を通過するときの角度は大きくてもｓｉｎθ２≒ｔａｎθ２０．０１９０なので、１２７ｍｍの長さを走ったとしても、光軸からのずれは２．４ｍｍにすぎない。４０倍の対物レンズで２５０μｍ四方を照射しようとすると、ビーム径は１ｃｍ程度であるから、現実的な有限の幅を持つ場合も広く流通している図１０に示す市販サイズのダブプリズムを使用することができる。
【００４８】
光軸周りにダブプリズムをある角度だけ回転させるとその２倍の角度だけ光線が光軸周りに回転するので、図６で示すように、光軸に関して１８０度回転した瞳面上の光源分布を形成するには、ダブプリズムを９０度回転させればよい。
【００４９】
適当な回転を受けた２組の平行な励起光はレンズ９０９で集光され、フィルターキューブ９１０に入射する。フィルターキューブ９１０は、励起波長の光のみを偏向して反射させる。フィルターキューブ９１０で９０度偏向された励起光は、対物レンズ９１１を経て平行光として試料９１２に照射される。
【００５０】
励起光の照射を受けて試料９１２は蛍光を発する。蛍光は対物レンズ９１１を通過後平行光束になる。なお、試料９１２からの光の中には蛍光のみならず、カバーガラスによって反射された励起光も含まれているが、蛍光のみがフィルターキューブ９１０を直進し、戻り励起光は進路を９０度変え光源側に戻る。
【００５１】
蛍光の平行光束はハーフミラー９１３によって２つの光路に分割される。一方の光路は、ミラー９１６によって折り曲げられて結像レンズ９１７によって撮像素子９１８に結像する。撮像素子は、ＣＣＤやＣＭＯＳセンサなど、被写体像（試料９１２の光学像）を光電変換する。通常の蛍光顕微鏡ではこの場所が第一のカメラポートとされる。
【００５２】
なお、結像レンズ９１７と撮像素子９１８の間にハーフミラーを入れて光路を９０度折り曲げたのち接眼レンズで平行光にすれば、いわゆる肉眼観察用の双眼鏡部分となる。
【００５３】
ハーフミラー９１３によって分割された蛍光のもう一方の光路は、結像レンズ９１４によって撮像素子９１５に結像する。この場所が第二のカメラポートであるが、顕微鏡によってはない場合もある。
【実施例２】
【００５４】
ＡＬＩを使用して３次元画像生成のための断層像を合焦平面の高さをスキャンしながら多数枚撮像する（スルーフォーカス撮像）場合、合焦平面の高さを変えながら同様の操作が反復されるのでシステムを全自動化することが望ましい。そのために、光軸方向ステージ昇降のほかにもＡＬＩで必要とされる複数の照明モードを電動で切り替え制御可能にすることが必要である。
【００５５】
図１１は、本実施例による図９に示す蛍光顕微鏡における制御手段９０６の制御方法を示すフローチャートであり、「Ｓ」はステップ（工程）を表す。図１１に示す制御方法は、コンピュータに各ステップを実行させるためのプログラムとして具現化が可能である。実施例２では、照明モード１を照明モード１と１’の２つに分けた場合の制御フローについて説明する。ダブプリズムは最初光路中に挿入されているものとする。
【００５６】
スルーフォーカスが開始されると、まず、遮光板ユニット９０４を制御してマッハ＝ツェンダー干渉系の片側光路を遮光板によって遮断し（Ｓ１０）、高さ方向のステップ移動数が奇数の場合は、照明モード２で試料９１２を撮像する（第１ステップ、Ｓ１１）。次に、遮光板ユニット９０４を制御して遮光板を光路から退避させ（Ｓ１２）、照明モード１で試料９１２を撮像する（Ｓ１３）。次に、ダブプリズムユニット９０５を制御してダブプリズムを９０度回転させ（Ｓ１４）、照明モード１’で試料９１２を撮像する（Ｓ１５）。Ｓ１３とＳ１５は、複数の光源の複数の回転位置のそれぞれで第１照明手段によって物体を照明して撮像する第２ステップとして機能する。
【００５７】
次に、ステージ９０７を昇降させ（対物レンズ９１１の光軸方向に移動させ）、次の高さに合わせる（第３ステップ、Ｓ１６）。その後、高さ方向のステップ移動数が偶数の場合は、そのまま照明モード１’で試料９１２を撮像する（Ｓ１７）。次に、ダブプリズムユニット９０５を制御してダブプリズムを９０度回転させ（Ｓ１８）、照明モード１で試料９１２を撮像する（Ｓ１９）。Ｓ１７とＳ１９は、複数の光源の複数の回転位置のそれぞれで第１照明手段によって物体を照明して撮像する第４ステップとして機能する。
【００５８】
次に、遮光板ユニット９０４を制御してマッハ＝ツェンダー干渉系における片側光路を遮光板によって遮断し（Ｓ２０）、照明モード２で試料９１２を撮像する（第５ステップ、Ｓ２１）。その後、ステージ９０７を昇降させ、次の高さに合わせる（第６ステップ、Ｓ２２）。Ｓ１１からＳ１６までと、Ｓ１７からＳ２２までを、試料９１２の厚みに亘って交互に所定回数繰り返す。
【００５９】
なお、本実施例のように照明モード１と１’に対しては、ダブプリズムを回転せずに光路から挿入及び退避させることによっても実現することができる。また、照明モードの数が増加し、ダブプリズムの回転と挿脱都を組み合わせて干渉パターンによる像の対称性を回復してもよい。
【００６０】
以上、本発明の実施例について説明したが、本発明はその要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。なお、本発明は、ＡＬＩに限定されず、照明の非対称性に起因する歪みを補正する用途に適用することができる。例えば、本発明は、第２照明手段がない照明光学系にも適用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の光学系は、蛍光顕微鏡またはデジタルスライドスキャナー等に好適に使用することが可能であり、生物学・病理学的観察の分野において非常に有用である。
【符号の説明】
【００６２】
１、２…点（光源）、９０２ａ、ｂ…ハーフミラー、９０３ａ、ｂ…ミラー、９０４…遮光板ユニット、９０５…ダブプリズムユニット（回転手段）
【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１１】
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