(57)【要約】【課題】  サブトラクション超解像法で機械的要素を低減または排除して、信頼性の高い超解像イメージングを実現する。【解決手段】  光源からの光を２つに分割し、一方のビームをそのままガウスビームとして用いて第１の変調周波数で変調し、他方のビームを第２の変調周波数で変調するとともにドーナツビームにモード変換し、第１の変調周波数で変調されたガウスビームと、第２の変調周変調で変調されたドーナツビームを重畳して試料を照射し、試料からの蛍光のうち、ガウスビームの照射による第１の蛍光成分とドーナツビームの照射による第２の蛍光成分を、前記第１の変調周波数と前記第２の変調周波数のそれぞれで同時に復調し、第１の蛍光成分と第２の蛍光成分の差分を算出することで迅速かつ信頼性の高い超高解像の光学測定を実現する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源と、
前記光源から出射される光を第１ビームと第２ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第１ビームを第１の変調周波数で変調する第１の光変調器と、
前記第２ビームを第２の変調周波数で変調する第２の光変調器と、
前記第２ビームを、焦点面でドーナツ型の強度分布を有するドーナツモードのビームに変換するモード変換素子と、
前記第１の変調周波数で変調された前記第１ビームと、前記第２の変調周変調で変調され、かつ前記ドーナツモードに変換された前記第２ビームを重畳して試料に導く光学素子と、
前記試料からの蛍光を前記第１の変調周波数で復調する第１のロックイン増幅器と、
前記試料からの蛍光を前記第２の変調周波数で復調する第２のロックイン増幅器と、
前記第１のロックイン増幅器で復調された蛍光成分と、前記第２のロックイン増幅器で復調された蛍光成分の差分を測定結果として算出する演算装置と、
を有することを特徴とする光学測定装置。
【請求項２】
前記第１及び第２の光変調器は電気光学変調器であり、
前記モード変換器は、前記第２の光変調器の後段に配置されることを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項３】
前記第１及び第２の光変調器は光チョッパーであり、
前記モード変換器は、前記第２の光変調器の前段に挿入されることを特徴とする請求項１に記載の光学測定装置。
【請求項４】
前記試料からの蛍光を検出する蛍光検出器、
をさらに有し、前記蛍光検出器で検出された蛍光が、前記第１のロックイン増幅器と前記第２のロックイン増幅器に入力されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の光学測定装置。
【請求項５】
前記試料を１次元的、２次元的、または３次元的に駆動する駆動メカニズム、
をさらに有し、
前記演算装置は、前記第１の蛍光成分と前記第２の蛍光成分の差分を前記重畳されたビームのスポット位置ごとに算出する
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の光学測定装置。
【請求項６】
光源からの光を第１ビームと第２ビームに分割し、
前記第１ビームを第１の変調周波数で変調し、
前記第２ビームを第２の変調周波数で変調するとともに、焦点面でドーナツ型の強度分布を有するドーナツモードのビームに変換し、
前記第１の変調周波数で変調された前記第１ビームと、前記第２の変調周変調で変調され、かつ前記ドーナツモードに変換された前記第２ビームを重畳して試料を照射し、
前記試料からの蛍光のうち、前記第１ビームにより励起され放出された第１の蛍光成分を前記第１の変調周波数で復調し、
前記試料からの蛍光のうち、前記ドーナツモードのビームに変換された前記第２ビームにより励起され放出された第２の蛍光成分を前記第２の変調周波数で復調し、
前記第１の蛍光成分と前記第２の蛍光成分の差分を算出する、
工程を有することを特徴とする光学測定方法。
【請求項７】
前記第１の変調周波数による変調と、前記第２の変調周波数による変調を電気光学変調器によって行い、
前記第２ビームを前記第２の変調周波数で変調した後に、前記ドーナツモードのビームに変換する、
ことを特徴とする請求項６に記載の光学測定方法。
【請求項８】
前記第１の変調周波数による変調と、前記第２の変調周波数による変調を光チョッパーによって行い、
前記第２ビームを前記ドーナツモードのビームに変換した後に、前記第２の変調周波数で変調する、
ことを特徴とする請求項６に記載の光学測定方法。
【請求項９】
前記試料からの蛍光を検出し、
前記検出された蛍光を、第１のロックイン増幅器と第２のロックイン増幅器に入力し、前記第１のロックイン増幅器で前記第１の蛍光成分を復調し、前記第２のロックイン増幅器で前記第２の蛍光成分を復調する、
ことを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載の光学測定方法。
【請求項１０】
前記試料を１次元的、２次元的、または３次元的に駆動し、
前記第１の蛍光成分と前記第２の蛍光成分の差分を前記重畳されたビームのスポット位置ごとに算出する
ことを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載の光学測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガウスビームとドーナツビームを用いた光学測定技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、レーザ顕微鏡で光の回折限界値以下の空間分解能を有する超解像を得る様々な方法が提案されている。その一つに、焦点面において動径方向（ｒ）にガウス関数状の強度分布を持つガウスモードのビーム（「ガウスビーム」と称する）と、ドーナツ状の強度分布を持つドーナツモードのビーム（「ドーナツビーム」と称する）で交互に試料を励起し、それぞれのビームによる蛍光イメージの差分をとることで解像度を向上させるサブトラクション超解像法が知られている（たとえば、非特許文献１及び２参照）。
【０００３】
公知のサブトラクション超解像法では、メカニカルシャッターや回転式のミラーによりガウスビームとドーナツビームを切り替えている。しかし、機械的な機構では切り替え時間に数ミリ秒以上の時間がかかるため、一方のビームで１フレームまたは１ライン分の測定を行った後にビームを切り替え、その後同じ領域を他方のビームで走査して差分を計算している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】"Breaking the Diffraction Barrier Using Fluorescence Emission Difference Microscopy" Scientific Report 3, 1441(2013)
【非特許文献２】"Resolution and contrast enhancement in laser scanning microscopy using dark beam imaging"Optics Express 21, 15912 (2013)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
サブトラクション超解像法では、測定中に外部からの振動や温度変化等に起因するドリフトの影響を受けると、２つのビームの間で測定した場所がずれてしまうため、差分により計算された像は正しい象を反映しておらず、間違った結果を生じる。
【０００６】
また、機械的機構は切り替え時に光学系に振動を与え、測定に不安定をもたらす。サブトラクション超解像法では、厳密に同じ位置に照射した２本のビームの差を計算することが重要であるから、従来の機械的なビームの切り替えは信頼性の観点から好ましくない。
【０００７】
本発明は、サブトラクション超解像法で機械的要素を低減または排除して、信頼性の高い超解像イメージングを実現することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
課題を解決するために、実施形態では、ガウスビームとドーナツビームの機械的な切り替えを行わず、ロックイン検出法により同時測定を行い、ピクセル毎に差分を計算する。
【０００９】
具体的には、光学測定装置は、
光源と、
前記光源から出射される光を第１ビームと第２ビームに分割するビームスプリッタと、
前記第１ビームを第１の変調周波数で変調する第１の光変調器と、
前記第２ビームを第２の変調周波数で変調する第２の光変調器と、
前記第２ビームを、焦点面でドーナツ型の強度分布を有するドーナツモードのビームに変換するモード変換素子と、
前記第１の変調周波数で変調された前記第１ビームと、前記第２の変調周変調で変調され、かつ前記ドーナツモードに変換された前記第２ビームを重畳して試料に導く光学素子と、
前記試料からの蛍光を前記第１の変調周波数で復調する第１のロックイン増幅器と、
前記試料からの蛍光を前記第２の変調周波数で復調する第２のロックイン増幅器と、
前記第１のロックイン増幅器で復調された蛍光成分と、前記第２のロックイン増幅器で復調された蛍光成分の差分を測定結果として算出する演算装置と、
を有する。
【発明の効果】
【００１０】
サブトラクション超解像法において機械的な要素を排除または低減して、信頼性の高い超解像イメージングを実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施形態の光学測定装置の概略構成図である。
【図２】焦点面におけるガウスビームとドーナツビームの点広がり関数（ＰＳＦ：Point Spread Function）のサイズと、ドーナツビームの強度プロファイルの図である。
【図３】サブトラクション超解像法の原理を説明する図である。
【図４】減算係数を説明する図である。
【図５】実施形態の光学測定装置の変形例を示す図である。
【図６】実施形態の光学測定法による蛍光ビーズの画像である。
【図７】実施形態の光学測定法により得られた標識したマウスの神経細胞の画像を、ガウスビームによる通常の画像と比較して示す図である。
【図８】実施形態の光学測定法により得られた標識したマウスの神経細胞の画像を、ガウスビームによる通常の画像と比較して示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
図１は、実施形態の光学測定装置１０Ａの概略構成図である。光学測定装置１０Ａは、従来のサブトラクション超解像法と異なり、ガウスビームとドーナツビームを機械的に切り替えて差分をとるのではなく、２台のロックイン増幅器を用いた同時検出により、各ビームによる蛍光の強度差分をピクセルごとに算出する。
【００１３】
光学測定装置１０Ａでは、単一光源としての半導体レーザ１１から出射される同一波長のビームをビームスプリッタ１２で２つに分割し、一方をそのままガウスビームＬＧとして用い、他方をドーナツビームＬＤに変換して用いる。ガウスビームＬＧは、ビームの動径方向にガウスモードの強度分布exp(-r2／(2*w2))を有する。ドーナツビームＬＤは、焦点面でドーナツモードの強度分布r2*exp(-r2／(2*w2))を有する。ここで、ｒはビーム中心軸からの距離、ｗはビームのスポットサイズである。
【００１４】
図２（Ａ）に示すように、ガウスビームＬＧは焦点面においてスポット中心で強度が最も大きくなり、ドーナツビームＬＤは、焦点面においてスポット中心が暗いドーナツ型の強度分布を有する。図２（Ｂ）の強度プロファイルに示すように、ドーナツビームＬＤは強度がほぼゼロとなる中心に対して、径方向に対称な２つのピークと広いフリンジを有する。
【００１５】
図１に戻って、ガウスビームＬＧは第１の変調器１６に導かれ、角周波数ω１で変調される。この例では、変調器１６は電気光学変調器（ＥＯＭ：Electro-Optic Modulator）であり機械的動作を含まない。
【００１６】
分割された他方のビームは、ミラー１３により第２の変調器１７に導かれ、ω１と異なる角周波数ω２で変調される。第２の変調器１７も電気光学変調器（ＥＯＭ）であり、機械的動作を含まない。ω２で変調された他方のビームは、モード変換素子としての可変位相板（ＶＰＰ：Variable Phase Plate）１５に導かれてドーナツビームＬＤに変換される。
【００１７】
ＥＯＭ１６、１７に供給される変調周波数ω１とω２は、２チャンネルファンクションジェネレータ２１により生成され、ドライバ２２、２３を介してＥＯＭ１６，１７の図示しない電気光学結晶に印加される。ドライバ２２、２３の出力は、ロックイン検出のための参照信号としても使用される。ロックイン検出については後述する。
【００１８】
ドーナツビームＬＤは焦点面、すなわち試料２０の表面で動径方向にドーナツ状の強度分布を持つが、可変位相板１５の出射直後は、等位相面が螺旋状になった光渦として生成される。可変位相板１５は、たとえば、円周方向に屈折率が変化する位相板であり、結晶中にドープする不純物濃度を円周方向に変化させることで屈折率を変えることができる。図２（Ｂ）の強度プロファイルは、可変位相板１５を用いて生成したドーナツビームＬＤの強度プロファイルである。
【００１９】
可変位相板１５の中心部では円周方向への屈折率変化が少ないため、光渦の密度はほとんどないが、円周に向かうほど屈折された光が異なる方向に分かれやすいため螺旋状の光渦が生成される。実施形態では、可変位相板１５で形成される光ビームを、「ガウスビームＬＧ」と区別するために「ドーナツビームＬＤ」と称する。
【００２０】
可変位相板１５から出射されるドーナツビームＬＤは、ミラー１８によりビームコンバイナ１９に導かれ、ガウスビームＬＧと同軸に重ね合わせられる。重ね合されたガウスビームＬＧとドーナツビームＬＤは、ダイクロイックミラー２４を透過し、対物レンズ２５により試料２０に入射する。
【００２１】
試料２０は、半導体レーザ１１の波長で励起される蛍光色素で標識されており、ガウスビームＬＧとドーナツビームＬＤのそれぞれによって励起されて、光源波長よりも長い蛍光波長の光を発する。試料２０からの蛍光は、ダイクロイックミラー２４で反射されて励起光（入射ガウスビームＬＧ及び入射ドーナツビームＬＤ）と分離され、光電子増倍管などの蛍光検出器２６に導かれる。
【００２２】
蛍光検出器２６で検出される蛍光には、ガウスビームＬＧによる励起で放出された蛍光と、ドーナツビームＬＤによる励起で放出された蛍光の２つの蛍光成分が含まれる。そこで、検出された蛍光を２つのロックイン増幅器（アンプ）２７と２８に入力し、対応する参照周波数ω１とω２でロックイン検出することで、ガウスビームＬＧによる蛍光成分と、ドーナツビームＬＤによる蛍光成分をそれぞれ個別に検出する。
【００２３】
ロックイン増幅器２７，２８で参照周波数ω１とω２で復調された各周波数成分はＡ／Ｄ変換器２９でディジタル信号に変換され、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）３０の演算装置に含まれるサブトラクタ（不図示）で、１ピクセル分の強度の差分が算出される。
【００２４】
同軸上に重畳されたガウスビームＬＧとドーナツビームＬＤを、試料２０面（Ｘ−Ｙ面）に対して相対的に走査することで平面画像を得ることができる。３次元蛍光メージングを行う場合は、試料２０をＺ軸方向（試料のＸ−Ｙ面に対する垂直方向）に駆動するピエゾステージ３１を用いる。ピエゾステージ３１は、たとえば圧電アクチュエータとしてチタン酸ジルコン酸鉛(ＰＺＴ)セラミックを用いたＰＺＴステージ３１である。
【００２５】
ＰＣ３０は、１ピクセル分の強度差分が算出される都度、制御信号を生成する。Ｄ／Ａ変換器３３でアナログ変換された制御信号はＰＺＴステージドライバ３２に入力され、ＰＺＴステージドライバ３２から出力される駆動信号で、試料２０を保持するＰＺＴステージ３１が駆動される。
【００２６】
図１の光学測定装置１０Ａは、機械的要素を全く含まないので、光学系に対する振動等の影響を排除することができる。また、ガウスビームＬＧとドーナツビームＬＤを重畳して同時に試料測定を行い、ピクセル単位で２つのロックイン増幅器２７，２８で各蛍光成分を検出し差分計算きることから、ドリフトの影響を排除することができる。したがって、非常に高速かつ安定した動作で、光の回折限界を超える超高解像の蛍光画像を取得することができる。
【００２７】
図３は、サブトラクション超解像法の原理を説明する図である。たとえば、情報パターンＳを有する試料２０を光学測定する。ガウスビームを対物レンズ２５を介して試料２０に照射して蛍光標識された試料２０を励起し、試料２０からの蛍光を検出することで、強度Ｉ１の画像Ａが得られる。また、ドーナツビームを対物レンズ２５を介して試料２０に照射して試料２０を励起し、試料２０からの蛍光を検出することで、強度Ｉ２の画像Ｂが得られる。
【００２８】
焦点面で異なるスポット形状を有する２つのビームを照射することで、異なるＰＳＦを有するコンフォーカルイメージが得られる。ガウスビームによるスポット画像（強度Ｉ１）からドーナツビームによるスポット画像（強度Ｉ２）を引き算することで、スポット中心部の強度情報だけを抽出することができ、解像度を向上することができる。
【００２９】
引き算を行う際の係数を適切に選択することで、解像度を調整することができる。たとえば、ＰＣ３０にてＩ１−ｂ×Ｉ２の演算を行う際に、減算係数ｂを変えることで所望の解像度を得ることができる。減算係数ｂは、ドーナツビーム画像の重み付け係数と言い換えることができる。画像Ｃはｂ＝０．４のときの画像、画像Ｄはｂ＝０．７のときの画像、画像Ｅはｂ＝１．０のときの画像である。
【００３０】
図４は、減算係数を説明する図である。サブトラクション超解像法では減算後に負になる部分は通常ゼロとする。そのため観察像のサイズは減算係数が大きいほど小さくなるが、大きすぎると実際のサイズより小さくなってしまい、間違ったイメージになる。従って観察像と実際の物体のサイズが等しくなる最適な減算係数を決める必要がある。
【００３１】
図４（Ａ）は物体のサイズとその観察像のサイズの減算係数依存性を計算した結果を示す。縦軸、及び横軸は入射光の波長で規格化している。対物レンズの開口数（ＮＡ）は１．３としている。実線Ａは共焦点（コンフォーカル）顕微鏡での観察値、破線Ｂは回折限界値である。一点鎖線Ｃは物体のサイズと観察像が等しくなる条件を示しており、この直線上の減算係数値を最適な減算係数と定義することができる。
【００３２】
図４（Ｂ）は最適な減算係数と物体サイズの関係を示す。波長より大きい物体の場合は減算係数を小さくして通常の共焦点顕微鏡に近い条件で観察するのが好ましく、一方で波長より小さい物体の場合は減算係数を大きくし、サブトラクション法を有効に働かせることで超解像を達成することができる。
【００３３】
図４（Ｂ）から決まる最適な減算係数は照射光の波長や開口数によって異なるが、事前に光学測定装置１０Ａの減算係数曲線を求めておくことで、観察対象物のサイズに応じた減算係数を選択することができる。
【００３４】
図１の光学測定装置１０Ａでは、ガウスビームＬＧとドーナツビームＬＤの差分をスポットごと、すなわちピクセルごとに算出するので、ステージを移動する際の機械的振動による誤差やドリフトによる誤差を含まない高解像の測定画像を得ることができる。また、適切に減算係数を選択することで観察画像の解像度を向上することができる。
【００３５】
図５は、図１の変形例として、光学測定装置１０Ｂの概略構成を示す。光学測定装置１０Ｂでは、光変調器としてＥＯＭ１６、１７に替えて光チョッパー４６、４７を用い、可変位相板１５に替えて、ラジアル偏光板４５を用いる。その他の構成は、図１と同様である。
【００３６】
半導体レーザ１１を出射した光はビームスプリッタ１２によりで２つに分割される。ビームスプリッタ１２を透過した一方の光は、ガウスビームＬＧとして光チョッパー４６に入射し、変調周波数ω１で変調される。ビームスプリッタ１２で反射された他方の光は、ミラー１３によりラジアル偏光板４５に導かれ、ドーナツビームＬＤが生成される。生成されたドーナツビームＬＤは光チョッパー４７に入射し、変調周波数ω２で変調される。
【００３７】
それぞれの周波数で変調されたガウスビームＬＧとドーナツビームＬＤは、ビームコンバイナ１９で同軸に重ね合されて、試料２０に入射する。試料２０からの蛍光を、２つのロックイン増幅器２７，２８を用いて参照周波数ω１とω２で個別に復調する構成は図１と同様である。
【００３８】
図５の構成では、光チョッパー４６、４７はドライバ２２、２３からの駆動信号によって機械的に回転する。これらはビームの指向方向を全く変えないでガウスビームＬＧとドーナツビームＬＤを切り替える。一方、従来の方法ではビームの切り替えにメカニカルシャッターやフリップミラーを用いている。これらの機械的パーツはビームの指向方向の揺らぎを与える機械的変動要因を有する。本方法では、それらを用いていないので、その影響はない。また、図１と同様に、スポットごと（ピクセルごと）に２つのビーム照射による蛍光の差分を算出できるので、迅速かつ安定して高解像画像を得ることができる。差分を算出する際に、減算係数ｂを適切に選択することで解像度を向上できる点も図１の光学測定装置１０Ａと同様である。
【００３９】
なお、ドーナツモードの強度分布を実現する光渦の生成には、屈折率可変位相板やラジアル偏光板の他、表面形状を螺旋状に加工した螺旋位相板等、任意のモード変換素子を用いてもよい。光変調器として、電気光学光変調器１６、１７や光チョッパー４６、４７の他に、磁気的な光変調器や、光励起キャリアの生成による光変調器を用いてもよい。
【００４０】
図６は、図１の光学測定装置１０Ａによる蛍光ビーズの観察画像である。図６（Ａ）はガウスビームＬＧの入射による蛍光像、図６（Ｂ）はドーナツビームＬＤの入射による蛍光像、図６（Ｃ）と図６（Ｄ）は、図６（Ａ）から図６（Ｂ）を引き算したときに得られるサブトラクション像である。ガウスビームＬＧの変調・復調周波数ω１は１．２ｋＨｚ、ドーナツビームＬＤの変調・復調周波数ω２は１．８ｋＨｚ、図６（Ｃ）の減算係数ｂは０．３、図６（Ｄ）の減算係数ｂは０．７である。
【００４１】
図６（Ａ）の蛍光像は、通常の光学顕微鏡でガウスビームのみの照射で得られる画像と等価である。実施例の光学測定装置１０Ａで得られる画像の空間分解能は、減算係数ｂの値に依存するが、通常の蛍光像（図５（Ａ））と比較して２倍前後に向上する。図６（Ｃ）で減算係数ｂ＝０．３のときのＦＷＨＭ（Full Width at Half Maximum：半値全幅）は１６０ｎｍ、図６（Ｄ）で減算係数ｂ＝０．７のときのＦＷＨＭは１００ｎｍである。図６（Ａ）のガウスビームによる通常の光学測定のＦＷＨＭである２２０ｎｍと比較して、空間分解能が大きく向上していることがわかる。
【００４２】
図７及び図８は、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein：黄色蛍光タンパク質）で標識したマウスの神経細胞の観察結果を示す図である。図７（Ａ）及び図８（Ａ）は、実施形態の光学測定装置１０Ａによる蛍光像（測定画像）、図７（Ｂ）及び図８（Ｂ）は、比較例として通常のガウスビームによる蛍光像を示す。図７（Ｃ）は、図７（Ａ）と図７（Ｂ）の矢印で示す範囲の強度分布を示すグラフ、図８（Ｃ）は、図８（Ａ）と図８（Ｂ）の矢印で示す範囲の強度分布を示すグラフである。図７（Ｃ）と図８（Ｃ）で、実線（Ａ）が実施形態の方法による強度スペクトル、破線（Ｂ）がガウスビームの通常測定で得られる強度スペクトルである。
【００４３】
図８においても、ガウスビームを用いた通常測定でのＦＷＨＭが３００ｎｍであるのに対し、実施形態の方法による測定では、ＦＷＨＭが１５０ｎｍにまで低減され、２倍の分解能が得られることがわかる。
【００４４】
実施形態では、ひとつの光源１１を用いて、同一波長のガウスビームとドーナツビームを重畳して用いるので、生体試料を対称とした多色イメージングへの拡張が容易である。また、単色の測定では、光源として数ｍＷ程度の汎用の半導体レーザを１つ用いるだけなので、ＳＴＥＤ（Stimulated Emission Depletion：誘導放出抑制）法等の他の超解像法と比較してコストを１／４〜１／２に低減することができる。
【符号の説明】
【００４５】
１０Ａ、１０Ｂ  光学測定装置
１１  半導体レーザ（光源）
１５  可変位相板（モード変換素子）
１６，４６  第１の光変調器
１７、４７  第２の光変調器
１９  ビームコンバイナ
２０  試料
２１  ２チャンネルファンクションジェネレータ
２２、２３  ドライバ
２４  ダイクロイックミラー
２５  対物レンズ
２６  蛍光検出器
２７，２８  ロックイン増幅器
３０  ＰＣ（演算装置）
３１  ＰＺＴステージ
４５  ラジアル偏光板（モード変換素子）
【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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