(57)【要約】【課題】本発明は、ヒトＴリンパ好性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）に対するバイオマーカーを提供することを課題とする。【解決手段】ＳＰＡＲＣ及びＶＣＡＭ１等の特定のマーカーの発現量が、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関することを見出した。当該発現量に基づいて、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）を検査することが可能である。【選択図】図５
2016090456.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検動物に由来する体液における下記（１）〜（１３）のマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定し、当該発現量に基づいて、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）を検査する方法。
（１）Secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）
（２）Vascular cell adhesion protein 1（VCAM1）
（３）Contactin-1
（４）Dystroglycan
（５）Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4
（６）Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1
（７）Myelin-oligodendrocyte glycoprotein
（８）N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunit gamma
（９）Neural cell adhesion molecule 1
（１０）Pigment epithelium-derived factor
（１１）ProSAAS
（１２）Testican-2
（１３）Tyrosine-protein kinase receptor TYRO33
【請求項２】
前記マーカーが、前記（１）及び（２）の組合せである、請求項１の記載の方法。
【請求項３】
前記マーカーの発現量が、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関を示す、請求項１または２に
記載の方法。
【請求項４】
被検動物に由来する体液におけるＨＴＬＶ−１のウイルス量を測定する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記体液が、血液、血漿、血清または脳脊髄液である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
被検動物に由来する体液における下記（１）〜（１３）のマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定するための試薬を含む、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）の検査用キット。
（１）Secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）
（２）Vascular cell adhesion protein 1（VCAM1）
（３）Contactin-1
（４）Dystroglycan
（５）Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4
（６）Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1
（７）Myelin-oligodendrocyte glycoprotein
（８）N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunit gamma
（９）Neural cell adhesion molecule 1
（１０）Pigment epithelium-derived factor
（１１）ProSAAS
（１２）Testican-2
（１３）Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3
【請求項７】
前記マーカーが、（１）及び（２）の組合せである、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記マーカーの発現量はＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関することを示す添付文書を含む
、請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
被検動物に由来する体液におけるＨＴＬＶ−１のウイルス量を測定するための試薬をさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
被検動物に由来する体液における下記表１に記載のペプチドにより特定されるマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定し、当該発現量に基づいて、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）を検査する方法。
【表１−１】
2016090456.tif 000020
【表１−２】
2016090456.tif 000021
【表１−３】
2016090456.tif 000022
【請求項１１】
被検動物に由来する体液における下記表２に記載のペプチドにより特定されるマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定するための試薬を含む、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）の検査用キット。
【表２−１】
2016090456.tif 000023
【表２−２】
2016090456.tif 000024
【表２−３】
2016090456.tif 000025
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴリンパ好性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳ
Ｐ）の検査方法、及び検査用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡレトロウイルスであるＨＴＬＶ−１は、日本、カリブ海地域、イラン、アフリカ、南米、およびメラネシア諸島における風土病である（非特許文献１）。感染者の数は現在では世界中で３０００万人程度と推定されており（非特許文献２）、ウイルス保持者のうちの５％が通常３０年を越える無症候期の後に、ＨＴＬＶ−１関連脊髄症（ＨＡＭ／ＴＳＰ）または成人性Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）を発病する（非特許文献３）。
【０００３】
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者の主要な症状は脊髄の慢性炎症であり、進行性下肢痙攣麻痺、歩行障害、または排尿障害等を引き起こす（非特許文献４）。しかしながら、ＨＡＭ／ＴＳＰの根治療法は開発されていないため、現在は、ＩＮＦ−αまたはステロイドによる抗炎症性治療が行われている。しかし、それら薬物の過剰な使用または長期の使用は、悪性副作用のリスクを上昇させ得るため、問題となっている（非特許文献５、６）。したがって、その治療計画は、疾患ステージと疾患活動性の徹底的な評価に基づいて、注意深く管理されるべきである。
【０００４】
ＨＡＭ／ＴＳＰの重症度指針については、納の運動障害重症度（ＯＭＤＳ）が疾患ステージを定義し、疾患進行の速度を推定するために広く使用されている（非特許文献７）。この尺度は運動機能の結果的な機能障害の評価に役立つが、主に主観的な健康上の訴えに基づくものであるため、客観的に判断可能な分子ベースの診断法の開発が、ＨＡＭ／ＴＳＰの早期検出と適切な治療介入にとっての大きな課題であった。これまでに脳脊髄液（ＣＳＦ）ネオプテリン、血清可溶性ＩＬ−２受容体、またはプロウイルス量が、疾患重症度指針バイオマーカーとして測定されてきた。また、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ＣＥＣＲ１は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者において血清濃度が健常者と比較して上昇している事が報告されている（非特許文献１１）。
しかしながら、より感度が良く、特異的であり、且つ、非侵襲性のスクリーニング検査手法が緊急に必要である。
【０００５】
これまで、ＨＡＭ／ＴＳＰ特異的バイオマーカーを特定するために、感染Ｔ細胞試料および血漿試料に対して様々なゲノム分析またはプロテオーム分析が実施された（非特許文献８〜１０、特許文献１）。しかしながら、ＣＳＦに対する包括的な調査は、ＨＡＭ／ＴＳＰ病変の最も根源的な部位であるにもかかわらずなされていなかった。したがって、本発明においては、脊髄微小環境のＨＡＭ／ＴＳＰ関連変化を反映するＣＳＦの最初のプロテオームワイドな像を取得することを目指した。そして、ＣＳＦに由来する重症度指針バイオマーカーの統計学的な特定に続いて、侵襲性が少ない血漿試料を使用するＨＡＭ／ＴＳＰ診断モデルの構築を試みた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−０４７１４３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamashita M, Ido E, Miura T, Hayami M. Molecular epidemiology of HTLV-I in the world. J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol. 1996;13(Suppl 1):S124-31.
【非特許文献２】Asquith B, Zhang Y, Mosley AJ, et al. In vivo T lymphocyte dynamics in humans and the impact of human T-lymphotropic virus 1 infection. Proc Natl Acad Sci U S A.2007;104(19):8035-40. Epub 2007 May 1.
【非特許文献３】Enose-Akahata Y, Abrams A, Johnson KR, Maloney EM, Jacobson S. Quantitative differences in HTLV-I antibody responses: classification and relative risk assessment for asymptomatic carriers and ATL and HAM/TSP patients from Jamaica. Blood. 2012;119(12):2829-36. doi: 10.1182/blood-2011-11-390807. Epub 2012 Feb 7.
【非特許文献４】Franzoi AC, Araujo AQ. Disability and determinants of gait performance in tropical spastic paraparesis/HTLV-I associated myelopathy (HAM/TSP). Spinal Cord. 2007;45(1):64-8. Epub 2006 Mar 28.
【非特許文献５】Yamano Y, Sato T. Clinical pathophysiology of human T-lymphotropic virus-type 1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. Front Microbiol. 2012;3:389.(doi):10.3389/fmicb.2012.00389. Epub 2012 Nov 9.
【非特許文献６】Kannagi M, Harashima N, Kurihara K, et al. Tumor immunity against adult T-cell leukemia. Cancer Sci. 2005;96(5):249-55.
【非特許文献７】Shublaq M, Orsini M, Puccioni-Sohler M. Implications of HAM/TSP functional incapacity in the quality of life. Arq Neuropsiquiatr. 2011;69(2A):208-11.
【非特許文献８】Semmes OJ, Cazares LH, Ward MD, et al. Discrete serum protein signatures discriminate between human retrovirus-associated hematologic and neurologic disease. Leukemia. 2005;19(7):1229-38.
【非特許文献９】Kirk PD, Witkover A, Courtney A, et al. Plasma proteome analysis in HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis. Retrovirology. 2011;8:81.(doi):10.1186/742-4690-8-81.
【非特許文献１０】Rahman S, Quann K, Pandya D, Singh S, Khan ZK, Jain P. HTLV-1 Tax mediated downregulation of miRNAs associated with chromatin remodeling factors in T cells with stably integrated viral promoter. PLoS One. 2012;7(4):e34490. doi: 10.1371/journal.pone.0034490. Epub 2012 Apr 4.
【非特許文献１１】Adenosine deaminase isoenzyme levels in patients with human T-cell lymphotropic virus type 1 and human immunodeficiency virus type 1 infections. I Tsuboi, K Sagawa, S Shichijo, M M Yokoyama, D W Ou and M D Wiederhold Clin Vaccine Immunol, September 1995, vol. 2, no. 5, 626-630.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒトＴリンパ好性ウイルス−１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳ
Ｐ）に対するバイオマーカーを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、特定のマーカーの発現量がＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関することを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  被検動物に由来する体液における下記（１）〜（１３）のマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定し、当該発現量に基づいて、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）を検査する方法。
（１）Secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）
（２）Vascular cell adhesion protein 1（VCAM1）
（３）Contactin-1
（４）Dystroglycan
（５）Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4
（６）Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1
（７）Myelin-oligodendrocyte glycoprotein
（８）N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunit gamma
（９）Neural cell adhesion molecule 1
（１０）Pigment epithelium-derived factor
（１１）ProSAAS
（１２）Testican-2
（１３）Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3
［２］  前記マーカーが、前記（１）及び（２）の組合せである、［１］の記載の方法。［３］  前記マーカーの発現量が、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関を示す、［１］または
［２］に記載の方法。
［４］  被検動物に由来する体液におけるＨＴＬＶ−１のウイルス量を測定する工程をさらに含む、［１］〜［３］のいずれか一に記載の方法。
［５］  前記体液が、血液、血漿、血清またはＣＳＦである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法。
［６］  被検動物に由来する体液における下記（１）〜（１３）のマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定するための試薬を含む、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）の検査用キット。
（１）Secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）
（２）Vascular cell adhesion protein 1（VCAM1）
（３）Contactin-1
（４）Dystroglycan
（５）Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4
（６）Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1
（７）Myelin-oligodendrocyte glycoprotein
（８）N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunit gamma
（９）Neural cell adhesion molecule 1
（１０）Pigment epithelium-derived factor
（１１）ProSAAS
（１２）Testican-2
（１３）Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3
［７］  前記マーカーが、（１）及び（２）の組合せである、［６］に記載のキット。
［８］  前記マーカーの発現量はＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関することを示す添付文書
を含む、［６］または［７］に記載のキット。
［９］  被検動物に由来する体液におけるＨＴＬＶ−１のウイルス量を測定するための試薬をさらに含む、［６］〜［８］のいずれか一に記載のキット。
［１０］  被検動物に由来する体液における下記表１に記載のペプチドにより特定されるマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定し、当該発現量に基づいて、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）を検査する方
法。
【表１−１】
2016090456.tif 000003
【表１−２】
2016090456.tif 000004
【表１−３】
2016090456.tif 000005
［請求項１１］  被検動物に由来する体液における下記表２に記載のペプチドにより特定されるマーカーにおいて、１種以上の発現量を測定するための試薬を含む、被検動物のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）の検査用キ
ット。
【表２−１】
2016090456.tif 000006
【表２−２】
2016090456.tif 000007
【表２−３】
2016090456.tif 000008
【発明の効果】
【００１１】
上記のマーカー発現量を測定することにより、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度予測、発症予測
、治療介入時期の決定、または治療効果の評価等の検査をすることができる。また、被検動物の血液を試料として使用して、侵襲性の低い検査とすることができ、被検動物にとって検査を受ける負担を軽減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】５７例のＣＳＦ試料に由来するＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを、エクスプレッショニスト（Expressionist）・サーバーに移入した後の処理方法について概説するワークフロー図。
【図２】重症度指針マーカーのスクリーニングの概観図。６人の無症候性保持者（ＡＣ）と５１人ＨＡＭ／ＴＳＰ患者に由来するＣＳＦをＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。重症度と相関がある強度を有する候補ペプチドを、ピアソンの積率相関係数に従って探し出した。候補ペプチドは、二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより確立された蛋白質／ペプチド同定データベースを使用して同定された。
【図３】ＣＳＦプロテオームの概要を示す図。（Ａ）ＬＣ／ＭＳベースの定量分析の評価。質量分析によって計算されたＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）の相対濃度をサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）による独立した測定値と比較した。（Ｂ）５７例のＣＳＦ分析において同定された蛋白質のベン図。ＤＡＶＩＤバイオインフォマティクス・リソースを用いるジーン・オントロジー（ＧＯ）分析により、ＡＣ（Ｃ）またはＨＡＭ／ＴＳＰ患者（Ｄ）におけるＣＳＦプロテオームで濃縮された細胞成分が示された。ＡＣ（Ｅ）またはＨＡＭ／ＴＳＰ患者（Ｆ）においてＣＳＦプロテオームで濃縮された生物学的機能も示された。エクスプレッション・アナリシス・システマティック・エクスプローラー（ＥＡＳＥ）濃縮スコアが示されている。
【図４】ＨＡＭ／ＴＳＰの同定された重症度指針マーカー候補のパネル図。１４種類の候補蛋白質に由来する１６種類のペプチドの箱髭図が示されている。Ｙ軸はＬＣ／ＭＳイオン強度を表す。＊１、＊２、および＊３は別個のＳＰＲＣ由来ペプチドに対応する。ペプチドのアミノ酸番号は次の通りである：＊１；１２４〜１３３番、＊２；１５６〜１６４番、＊３；２５２〜２６２番。
【図５】血漿中のＳＰＡＲＣ（Ａ）およびＶＣＡＭ１（Ｂ）をＥＬＩＳＡアッセイにより測定した結果を示す図。ピアソンの相関係数により重症度と新規のマーカーの間に有意な相関が示された。ＨＡＭ／ＴＳＰ発症（Ｃ）と適切な治療介入ポイント（Ｄ）の予測のために、３因子ロジスティック回帰モデル（血漿中のＳＰＡＲＣ、ＶＣＡＭ１、およびＨＴＬＶ−１ウイルス量）を１０５試料を用いて確立した。その３因子モデルはウイルス量のみの診断成績よりも良い診断成績を示した。曲線下面積（ＡＵＣ）の値が示された。
【図６】ＨＡＭ／ＴＳＰ発症のための分類指標を示す図。ＲＯＣ曲線のＡＵＣによって評価された。実線は、（Ａ）２因子モデル（ＳＰＡＲＣおよびＶＣＡＭ１）、（Ｂ）ＳＰＡＲＣのみ、（Ｃ）ＶＣＡＭ１のみによるモデルのＲＯＣ曲線を示す。破線はＨＴＬＶ−１ウイルス量によるモデルのＲＯＣ曲線を示す。
【図７】ＨＡＭ４−１１とその他とを区別するための（治療介入時期を決定するための）分類指標を示す図。ＲＯＣ曲線のＡＵＣによって評価された。実線は、（Ａ）２因子（ＳＰＡＲＣおよびＶＣＡＭ１）、（Ｂ）ＳＰＡＲＣのみ、（Ｃ）ＶＣＡＭ１のみによるモデルのＲＯＣ曲線を示す。破線はＨＴＬＶ−１ウイルス量によるモデルのＲＯＣ曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ
）を検査する方法は、被検動物に由来する体液における下記（１）〜（１３）のマーカーまたは前記表１に記載のペプチドにより特定されるマーカーにおいて、１種以上の該マーカーの発現量を測定し、当該発現量に基づいて、被検者のＨＡＭ/ＴＳＰを検査する。
（１）Secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）
（２）Vascular cell adhesion protein 1（VCAM1）
（３）Contactin-1
（４）Dystroglycan
（５）Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4
（６）Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1
（７）Myelin-oligodendrocyte glycoprotein
（８）N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunit gamma
（９）Neural cell adhesion molecule 1
（１０）Pigment epithelium-derived factor
（１１）ProSAAS
（１２）Testican-2
（１３）Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3
【００１４】
ＨＴＬＶ−１（ヒトＴリンパ好性ウイルス−１）関連脊髄症（ＨＡＭ/ＴＳＰ）とは、
ＷＨＯの「ＨＡＭ／ＴＳＰ診断指針」等により定義される疾患である。具体的には、血液やＣＳＦ中の抗ＨＴＬＶ−１抗体が陽性であり、進行性下肢痙性麻痺等の神経学的所見や、画像診断等による脊髄の組織破壊等の特徴的な臨床徴候がみられることにより定義される。
【００１５】
被験動物としては、ＨＡＭ/ＴＳＰを起こす可能性のある動物であれば如何なるもので
もよく、具体的には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、フェレットの他、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモット等のげっ歯類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類等が挙げられる。本発明の検査方法は、このうち、歩行障害等がありＨＡＭ/ＴＳＰが疑われ
るヒトに好ましく用いられる。また、ＨＴＬＶ−１の母乳を介する母子間垂直感染を防ぐ目的で、妊婦にも好適である。さらに、ＨＡＭ/ＴＳＰの初期症状は、「歩きにくい」ま
たは「足がもつれる」等のような軽微なものもあり、本人に発症の自覚がないことも多いことから、一般健康診断等において健常者を対象として検査することも好ましい。
【００１６】
被検動物に由来する体液としては、上記特定のマーカーのｍＲＮＡまたは蛋白質を含有し、その濃度を測定できるものであれば特に制限はない。具体的には、ＣＳＦ、血液、血漿、血清、尿、唾液等が挙げられる。これらのうち、ＣＳＦ、血液、血漿、血清が好ましく、さらに、血液、血漿、血清は簡便に採取でき侵襲性も比較的低いためより好ましく用いられる。
【００１７】
前記表１及び表２は、後述する実施例において示すとおり、ＨＡＭ/ＴＳＰ患者の体液
において検出されたペプチドのうち、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と定量的な相関関係が示さ
れた上位１００ペプチドのリストから、ＨＡＭ/ＴＳＰ患者との関連が報告されていたＣ
ＥＣＲ１を除いたものである。これらペプチドについて、二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる蛋白質同定分析を行った結果、上記（１）〜（１３）の１３種のマーカーが同定された。
【００１８】
上記特定の１３種のマーカーのうち、Secreted protein acidic and rich in cysteine（SPARC）(UniProt accession P09486）は、Basement-membrane protein 40(BM-40)また
はOsteonectinとも呼ばれている。これまでに、細胞外マトリックスおよびサイトカイン
との相互作用を通した細胞増殖への関与が報告されている。
【００１９】
Vascular cell adhesion protein 1 (VCAM1)(UniProt accession P19320)は、ＩＮＣＡＭ−１００またはＣＤ１０６とも呼ばれている。ＶＣＡＭ１の発現は、ＩＬ−１等の炎症性サイトカインや活性酸素などの刺激により、血管内皮細胞上で増強して、循環血中や組織内のリンパ球または好酸球などとの接着や活性化に関与すると考えられている。このことから、ＶＣＡＭ１の発現は、炎症性疾患の活動性の指標と考えられている。
【００２０】
Contactin-1（UniProt accession Q12860）は、有髄末梢神経におけるparanodal axo-glial junctionsの形成への関与と、軸索と有髄グリア細胞との間のシグナリングへの関与が、報告されている。
【００２１】
Dystroglycan（UniProt accession Q14118）は、ジストロフィンに結合して複合体を形成する糖蛋白質である。Dystroglycanの糖鎖異常は、ある種の先天性筋ジストロフィーの原因となり得ることが報告されている。
【００２２】
Latent-transforming growth factor beta-binding protein 4 (LTBP4)（UniProt accession Q8N2S1）は、エラスチン繊維を作る際に必須と言われており、弾力性の高い血管壁等に高発現する蛋白質である。ＬＴＢＰ４は、顔の皮膚が垂れ下がり老人様顔貌になる皮膚弛緩症の原因遺伝子の一つとされている。
【００２３】
Lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 (LYVE-1)（UniProt accession Q9Y5Y7）は、ヒアルロン酸（ＨＡ）と結合性を有する分子群の１つとして同定された。ＬＹＶＥ−１は、ＨＡと共にリンパ管内腔の表面に局在するが、血管には存在しないことから、リンパ管の特異的なマーカーとされている。
【００２４】
Myelin-oligodendrocyte glycoprotein（UniProt accession Q16653）は、細胞間接着
を仲介すると考えられている。ミエリン鞘の成分の１つであり、ミエリン鞘の維持や細胞間伝達に関与するとされている。
【００２５】
N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase subunit gamma（UniProt accession Q9UJJ9）は、N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase複合体の非触媒性サブユニットであり、この蛋白質をコードする遺伝子が変異するとムコリピドーシスIIIとなり得ることが
示されている。
【００２６】
Neural cell adhesion molecule 1 (NCAM-1)（UniProt accession P13591）は、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーの細胞接着蛋白質であり、神経内分泌細胞のマーカーとして知られている。
【００２７】
Pigment epithelium-derived factor（UniProt accession P36955）は、網膜芽細胞腫
細胞において神経分化を誘発する神経栄養性蛋白質であり、血管新生抑制作用を有することが知られている。
【００２８】
ProSAAS（UniProt accession Q9UHG2）は、神経内分泌経路の調節機能を有することが
示唆されており、ＰＣＳＫ１の特異的内因性阻害剤であり得ることが報告されている。
【００２９】
Testican-2（UniProt accession Q92563）は、脳の細胞外プロテオグリカンであり、神経発生の種々の段階に関与することが示唆されている。
【００３０】
Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3（UniProt accession Q06418）は、TULP1ま
たはGAS6等のリガンドの結合により、細胞外マトリックスからのシグナルを細胞質に伝える受容体チロシンキナーゼであることが報告されている。
【００３１】
上記マーカーの発現量の測定には、当該マーカーのｍＲＮＡを測定しても、蛋白質を測定してもよい。さらに、発現量を測定する上記マーカーとしては、上記マーカーと同様の機能を有する断片、誘導体、および変異体も包含される。
【００３２】
本発明におけるマーカーの発現量は、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関を示す。詳細には
、たとえば、本発明におけるマーカーが、前記（１）、（３）〜（１３）から選ばれる１種以上のマーカーである場合、当該マーカーの発現量が低いほど、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症
度は高いことが予測される。また、本発明におけるマーカーが、前記（２）のマーカーである場合、当該マーカーの発現量が高いほど、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度は高いことが予測
される。
【００３３】
上記発現量の高低は、検査する目的に応じて、種々の値と比較し得る。たとえば、被検動物自身の過去の発現量と比較することにより、ＨＴＬＶ−１に感染しているが無症候である無症候性キャリアの経過観察や、発症後の経過観察を行うことができる。また、被検動物の治療開始前後での発現量を比較することにより、治療効果を適切に評価することができる。さらにＨＡＭ/ＴＳＰモデル動物への治療候補薬の投与前後での発現量を比較す
ることにより、治療候補薬のスクリーニングを行うことも可能である。
【００３４】
または、本発明における発現量は、予め設定されたカットオフ値と比較してもよい。たとえば、ＨＴＬＶ−１に感染しておらず他の病気もない健常者における発現量や、またはＨＴＬＶ−１の無症候性キャリアにおける発現量と、発症後の患者における発現量とを測定し、作成されるＲＯＣ曲線からカットオフ値を設定する。そして、当該カットオフ値が、被検動物における発現量と同等であるか、または被検動物の方が重症度が高いことを示す発現量である場合には、発症したと予測することができる。
【００３５】
また、治療介入時期を決定する場合には、たとえば、治療介入前の患者における発現量と、治療介入後の患者における発現量とを測定し、作成されるＲＯＣ曲線からカットオフ
値を設定する。そして、当該カットオフ値が、被検動物における発現量と同等であるか、または被検動物の方が重症度が高いことを示す発現量である場合には、治療介入の時期であると決定できる。
【００３６】
本発明におけるマーカーは、いずれか１種の発現量を測定してもよいし、１種以上を組み合わせてその発現量を測定してもよい。複数のマーカーの発現量を測定することにより、より正確な検査を行うことができ好ましい。発現量を測定するマーカーの組合せに制限はないが、（１）ＳＰＡＲＣおよび（２）ＶＣＡＭ１の組合せが好ましく例示される。１種以上のマーカーを組み合わせるときには、その組合せが適切であるか否かを判断するためのアルゴリズムとして、ロジスティック回帰分析等の手法を用いることができる。
【００３７】
本発明の検査方法においては、他の検査用マーカーの発現量を組み合わせてもよい。さらに、臨床症候の観察や、画像診断の結果を関連付けた複合指標を用いることで、より的確に検査することが可能である。併用する他の検査用マーカーとしては、既存のものを制限なく使用できる。例えば、ＨＴＬＶ−１のウイルス量、ネオプテリン、ＣＸＣＬ１０、可溶性ＩＬ−２レセプター（ｓＩＬ−２Ｒ）等が挙げられる。特に、ＨＴＬＶ−１のウイルス量、すなわち、被検動物に由来する体液におけるＨＴＬＶ−１のウイルス量を測定する工程をさらに含めることが好ましい。この場合、当該ウイルス量が高いほど、ＨＡＭ/
ＴＳＰの重症度は高いことを示す。
【００３８】
本発明の方法における発現量の測定方法としては、ｍＲＮＡまたは蛋白質の量が測定できる方法であれば特に制限はないが、例えば、ｍＲＮＡの測定としては、ＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、分光光度法、蛍光光度法等が挙げられる。
【００３９】
蛋白質の測定方法としては、該蛋白質に対する抗体を用いた既存の免疫測定法の他に、ＦＡＣＳ解析法、分光光度法、蛍光光度法、質量分析法、またはクロマトグラフィーや、クロマトグラフィー技術と飛行時間型質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ）を組み合わせて、クロマト担体（例：カチオン交換体、アニオン交換体、疎水性クロマト担体、金属イオンなど）に一定条件下で捕捉されるすべての成分の質量を一括して測定する方法、二次元ゲル電気泳動法等が用いられる。
【００４０】
上記免疫測定法としては、ウエスタンブロット法、酵素免疫定量法に従い定量検出する方法、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法等で測定する方法等が好ましい。酵素免疫定量法は、標識イムノアッセイ法のうち、酵素を標識物質として用いる検出方法である。中でも、イムノソルベントを用いる、enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 法を選
択するのが、特に好適である。また、ＥＬＩＳＡには、競合法やサンドイッチ法等が含まれ得るが、サンドイッチ法は、操作の簡便性、経済上の利便性、とりわけ臨床検査における汎用性を考慮すると、特に好適な測定態様の一つとして挙げられる。これらの測定方法は、例えば、新生化学実験講座（日本生化学会編；東京化学同人）、Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (2001))
、Antibodies - A Laboratory Manual(E.Harlow, et al., ColdSpring Harbor Laboratory(1988))等の一般的実験書に記載の方法またはそれに準じて行うことができる。
【００４１】
上記測定を行う際に用いられる抗体等（抗体断片を含む）は、対象の蛋白質を抗原として公知の方法によって得ることができる。ただし、対象の蛋白質を抗原として製造されたものである必要はなく、該蛋白質と少なくとも交差反応性を示し、該蛋白質の含有量を測定することができるものであれば何れのものでもよい。
【００４２】
本発明には、さらにＨＡＭ/ＴＳＰの検査用キットも含まれる。キットの内容は、本発
明における上記方法において使用され得る機器および／または試薬の組み合わせにより構
成されるが、以下に述べる各構成要素と本質的に同一、またはその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成または形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。
【００４３】
本発明のキットには、上記１種以上のマーカーの発現量を測定するための試薬を含む。当該試薬には、発現量を測定するのに使用される試薬である限り制限なく含まれるが、たとえば、免疫測定法により上記１種以上のマーカーの発現量を測定する場合には、それらマーカーがコードする蛋白質に対する抗体を含む。また、必要に応じ、被検動物に由来する体液の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体またはその抗体断片、標識体の検出用試薬、標準物質なども含まれる。上記希釈液としては、生理食塩水や、界面活性剤、緩衝液などにＢＳＡやカゼインなどの蛋白質を含む水溶液などが挙げられる。
【００４４】
抗体固定化固相としては、各種高分子素材を用途に合うように整形した素材に、抗体またはそれらの抗体断片を固相化したものが用いられる。形状としてはチューブ、カップ、ビーズ、プレート、ラテックスなどの微粒子、スティック等が、素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックスや金属等が挙げられる。抗体の固相化の方法としては、物理的方法と化学的方法またはこれらの併用方法等、公知の方法が挙げられる。例えば、ポリスチレン製９６ウェルの免疫測定用マイクロタイタープレートに抗体または抗体断片等を疎水固相化したものが挙げられる。
【００４５】
反応緩衝液は、抗体固定化固相の抗体と被検動物に由来する体液中の抗原とが結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよいが、界面活性剤、緩衝液、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤、安定化剤、反応促進剤等を含む反応緩衝液が挙げられる。
【００４６】
標識された二次抗体またはその抗体断片としては、上記１種以上のマーカーがコードする蛋白質に対する抗体を認識する抗体または抗体断片に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどの標識用酵素をラベルしたもの、緩衝液、ＢＳＡやカゼインなどの蛋白質、防腐剤などを混合したものが用いられる。
【００４７】
標識体の検出用試薬としては、前記の標識用酵素に応じて、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼであれば、テトラメチルベンジジンやオルトフェニレンジアミンなどの吸光測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸やヒドロキシフェニル酢酸などの蛍光基質、ルミノールなどの発光基質が、アルカリホスファターゼであれば、４−ニトロフェニルフォスフェートなどの吸光度測定用基質、４−メチルウンベリフェリルフォスフェートなどの蛍光基質等が挙げられる。
【００４８】
また、ＰＣＲ法により発現量を測定する場合には、例えば、上記１種以上のマーカーの一部または全体を特異的に増幅することが可能なプライマーを含む。また、必要に応じて、逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、反応用緩衝液等を含めてもよい。リアルタイムＰＣＲの場合には、蛍光試薬、蛍光光度計、サーマルサイクラー等も含まれる。
【００４９】
マイクロアレイにより発現量を測定する場合には、上記１種以上のマーカー断片をスポットしたガラス、プラスチック、シリコン又はメンブレン等の支持体を含む。また、必要に応じて、ラベル化試薬、ハイブリダイゼーション用バッファー、フラグメンテーション用バッファー等を含めてもよい。
【００５０】
本発明のキットには、被検動物に由来する体液におけるＨＴＬＶ−１のウイルス量を測定するための試薬を含めてもよい。そのような試薬としては、ＨＴＬＶ−１ウイルスを検出できるものであれば制限なく使用されるが、たとえば、ＨＴＬＶ−１ウイルスの定量的ＰＣＲに使用される試薬であるプライマー、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、反応用緩衝液等が好ましく例示される。また、リアルタイムＰＣＲ用の試薬として、検出用の蛍光色素または蛍光標識プローブ等を含めてもよいし、サザンブロット用の試薬として、プライマー、プローブ、Ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰ混合液、ＰＣＲ反応用緩衝液、標識用試薬、アガロースゲル、制限酵素、制限酵素用緩衝液、トランスファー用バッファー、ハイブリダイゼーション用バッファー、ニトロセルロース膜、洗浄用バッファー、ブロッキング試薬等を含めてもよい。
【００５１】
本発明のキットは、本発明の方法と同様に、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度予測、発症予測、
治療介入時期の決定、または治療効果の評価のために使用され得る。
【００５２】
本発明のキットには、使用方法等を示す添付文書を適宜含めることができる。その例としては、前記マーカーの発現量はＨＡＭ/ＴＳＰの重症度と相関することを示す添付文書
等が挙げられる。詳細には、たとえば、発現量を測定するマーカーが、前記（１）、（３）〜（１３）から選ばれる１種以上のマーカーである場合、当該マーカーの発現量が低いほど、ＨＡＭ/ＴＳＰの重症度が高いことを示す添付文書を含めることができる。または
、前記（２）のマーカーである場合には、当該マーカーの発現量が高いほど、ＨＡＭ/Ｔ
ＳＰの重症度が高いことを示す添付文書を含めてもよい。
【実施例】
【００５３】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ限定を受けないことは言うまでもない。
【００５４】
＜対象と方法＞
１.実験参加者
ＣＳＦ試料（５１人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者と６人の無症候性キャリア（ＡＣ）に由来する）および血漿試料（５０人のＨＡＭ／ＴＳＰ患者と５５人のＡＣに由来する）を聖マリアンナ医科大学において収集し、使用直前まで−８０℃で凍結保存した。研究手法を説明し、全ての患者から書面による同意書を得た。本研究は東京大学の倫理委員会（承認番号１４−１）と聖マリアンナ医科大学の倫理委員会（承認番号第１６４６号）により承認された。
【００５５】
２．ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
ＣＳＦを２０μｌずつ凍結乾燥し、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（シグマ・アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ州）および８Ｍ尿素（ＧＥヘルスケア社、バッキンガムシャー、英国）を含む溶液に全蛋白質を溶解した。これらの蛋白質に対し５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（シグマ・アルドリッチ社）により３７℃で３０分間還元処理をした後に、２５ｍＭのヨードアセトアミド（シグマ・アルドリッチ社）で４５分間アルキル化処理した。５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムで４倍希釈した後に、固相化トリプシン（サーモサイエンティフィック社、ブレーメン、ドイツ）を３７℃で６時間使用して、蛋白質を消化した。次に、該消化試料を、Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  μＥｌｕｔｉｏｎプレート（ウォータース社、ミルフォード、マサチューセッツ州）により脱塩し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。
【００５６】
ペプチドは、０．０７５×１５０ｍｍ  Ｃ１８チップカラム（日京テクノス株式会社、東京、日本）を装着したＵｌｔｉｍａｔｅ３０００  ＲＳＬＣ  ナノＨＰＬＣシステム（
サーモサイエンティフィック社）上で、０．１％のギ酸を含む２〜３５％のアセトニトリル（９５分間）と３５〜９５％のアセトニトリル（１５分間）からなる２段階直線濃度勾配を２５０ｎＬ／分の流速で用いて、分離された。溶出液はＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計（サーモサイエンティフィック社）により分析した。スペクトルは４００〜１６００の質量電荷比（ｍ／ｚ）範囲にわたってフルＭＳスキャンモードを用いて収集された。ＭＳ／ＭＳは、ダイナミック・エクスクルージョンによるデータ依存的取得モードを用いて、各ＭＳスキャンにおける強度を基準に上位２０種類のイオンについて、実施された。
【００５７】
３．二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
ＣＳＦトリプシン消化物を、１０ｍＭのギ酸アンモニウム（シグマ・アルドリッチ社）を含む２５％アセトニトリル溶液に溶解し、０．２×２５０ｍｍ強陽イオン交換モノリス（Ｍｏｎｏｌｉｔｈ）・カラム（ジーエルサイエンス株式会社、東京、日本）を用いて、それらを分画した。それらの試料は、プロミネンスＨＰＬＣシステム（株式会社島津製作所、京都、日本）を使用して、カーブ＝３モードで、ギ酸アンモニウムの１０ｍＭから１Ｍまでの濃度勾配により７０分間の間に溶出された。溶出液は１１画分に分離され、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析された。
【００５８】
４．蛋白質／ペプチドの同定
プロテオーム・ディスカバラー１．３ソフトウェア（サーモサイエンティフィック社）上で、ＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムを使用して、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース・バージョン２０１２＿０６（２０，２３２ヒト蛋白質配列）をレファレンスとしてＭＳ／ＭＳスペクトルを対象として実施した。プロテオーム・ディスカバラー上のペプチド・バリデーターＦＤＲ推定アルゴリズムにより、１％未満の偽発見率（ＦＤＲ）を基準として蛋白質を同定した。ＧＯターム分析は、ＤＡＶＩＤバイオインフォマティクス・リーソース６．７（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）を使用して実施された。
【００５９】
５．無標識定量分析
５７例のＣＳＦ試料に由来するＬＣ／ＭＳ／ＭＳデータを、エクスプレッショニスト（Expressionist）・サーバー（ジーンデータＡＧ社、バーゼル、スイス）に移入し、図１
に示されているワークフローに沿って処理した。（１）ＲＴ構造除去（RT structure removal）＝真、最小ＲＴ長＝２スキャン、（２）ｍ／ｚ構造除去（m/z structure removal
）＝真、最小ｍ／ｚ長＝６スキャン、（３）ＲＴウインドウ＝５０１スキャン、変位点控除（quantile subtraction）＝９０％、および（４）ＲＴ構造除去（RT structural removal）＝真、最小ＲＴ長＝２スキャンからなる４段階のクロマトグラム・ケミカルノイズ
・サブトラクション（Chromatogram Chemical Noise Subtraction）を実施した。５００
未満のイオン強度を有するデータポイントをノイズとして０とした。クロマトグラム平準化（chromatogram smoothing）＝真、ＲＴウインドウ＝５スキャン、およびエスティメーター（estimator）＝移動平均（Moving average）を用いて、クロマトグラム・ケミカル
ノイズ・サブトラクション（Chromatogram Chemical Noise Subtraction）を再度実施し
た。
【００６０】
スキャンカウント＝１０の距離を有するクロマトグラム・グリッド（Chromatogram Grid）を適用した後に、ｍ／ｚウインドウ＝１１ポイント、ＲＴウインドウ＝１１スキャン
、ギャップペナルティ＝１、ＲＴ検索間隔＝２分、アラインメントスキーム＝ペアワイズ・アラインメント・ベース・ツリー（Pairwise alignment based tree）のクロマトグラ
ムＲＴアラインメント（Chromatogram RT Alignment）により、５７試料中のＲＴ多様性
を正規化した。統合ウインドウ＝２０スキャン、オーバーラップ＝１０、最小ピークサイズ＝６スキャン、最大統合距離（maximum merge distance）＝１ポイント、ピークＲＴスプリッティング（peak RT splitting）＝真、強度プロファイリング（intensity profili
ng）＝最大、ギャップ／ピーク比＝５％、リファインメント閾値（refinement threshold）＝８０、整合性閾値（consistency threshold）＝１のクロマトグラム統合ピークディ
テクション（Chromatogram Summed Peak Detection）によりピークを検出した。
【００６１】
検出されたピークを、最小チャージ＝１、最大チャージ＝１０、最大ミッシングピーク（maximum missing peaks）＝０、ファースト・アラウド・ギャップ・ポジション（maximum missing peaks）＝１０、ＲＴウインドウ＝０．０２分、ｍ／ｚ公差（m/z tolerance
）＝５ｐｐｍ、同位体形状公差（isotope shape tolerance）＝１０、最小クラスターサ
イズ割当量（minimum cluster size ration）＝０．５のクロマトグラム同位体ピークク
ラスタリング（Chromatogram Isotopic Peak Clustering）を用いて、同位体クラスター
にグループ分けした。
【００６２】
６．サイトメトリー・ビーズ・アレイ（ＣＢＡ）
ＣＳＦ中のＣＸＣＬ１０の濃度を、ＣＢＡ（ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）により、製造業者の指示に従って決定した。
【００６３】
７．酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
１０５例の血漿試料中のＳＰＡＲＣ（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）とＶＣＡＭ１（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）の濃度を市販のＥＬＩＳＡキットにより、製造業者の指示に従って測定した。ウイルス量は１００細胞あたりのプロウイルスのコピー数の事であり、リアルタイムＰＣＲ法により測定した。３つの因子、すなわち、ＳＰＡＲＣ、ＶＣＡＭ１、およびウイルス量を利用するＨＡＭ／ＴＳＰの新しい診断モデルを構築するために、Pepe MSら（Biometrics. 2006;62(1):221-9）が
記載したように、多変量ロジスティック回帰を適用した。
【００６４】
＜実施例１＞
ＨＡＭ／ＴＳＰ患者に由来するＣＳＦの定量的プロテオームプロファイリング
６人のＡＣと５１人ＨＡＭ／ＴＳＰ患者（表３）に由来するＣＳＦを、本研究の図式によるワークフロー（図２）に従って処理した。５７人の個体に由来する６８，０７７種類の非重複性のペプチドを、エクスプレッショニストプロテオームサーバーシステム上で検出および定量した。一方、１４，４５１種類のＣＳＦペプチド（１，８７１蛋白質）を、二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により同定した。
【００６５】
【表３】
2016090456.tif 000009
【００６６】
上記ＬＣ／ＭＳベースのプロテオームプロファイリングの定量的信頼性を評価するために、ＣＸＣＬ１０の観察された相対濃度を、ＣＢＡにより測定された臨床データと比較した（図３Ａ）。その結果は、２つの測定値間で強力な相関（Ｒ２＝０．９１１）が示され、上記ＬＣ／ＭＳベースの定量結果は、低濃度範囲（１〜２０ｎｇ／ｍｌ）においても非常に信頼できるものであることが示された。
【００６７】
次に、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者のＣＳＦプロテオームワイドな変化を説明するため、それぞれＡＣ群またはＨＡＭ／ＴＳＰ患者群で特定された１，３４５種類または１，７５０種類の蛋白質（図３Ｂ）を、ＤＡＶＩＤ機能アノテーションツールを使用して、細胞成分（図３Ｃおよび３ＤのＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）または生物学的過程（図３Ｅおよび３ＦのＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ）により分類した。Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ分析により、細胞突起および形質膜において発現される蛋白質が、ウイルス蛋白質の特異的な濃縮に加えて、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者のＣＳＦにおいて濃縮されていることが明らかになった。これは、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者においてしばしば観察される、ＨＴＬＶ−１感染細胞の脊髄への侵入活性の上昇を反映している可能性がある。さらに、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓ分析により、細胞接着、細胞運動、細胞移動、細胞骨格、および細胞構造分解に関与する蛋白質が、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者のＣＳＦにおいて非常に濃縮されていることが示された。これらの特徴は、リンパ球の活発な移動および／または浸潤を誘導する、脊髄におけるプロテオームワイドな環境変化も意味する。細胞死および細胞増殖に関連する蛋白質は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者における脊髄炎症と関係があるかもしれない。
【００６８】
＜実施例２＞
重症度指針マーカー候補をスクリーニングするための統計学的分析
ＨＡＭ／ＴＳＰの進行に従って増加／減少を示すバイオマーカー蛋白質を抽出するため、４群の臨床的に適切な重症度群（それぞれＡＣ、ＨＡＭ／ＴＳＰ  ＯＭＤＳ１〜３、４〜６、および７〜１１）に実数クラス（０、１、２、および３）をそれぞれ与えた（表４参照）。
【００６９】
【表４】
2016090456.tif 000010
【００７０】
次に、重症度クラスと６８，０７７種類のペプチド強度の間の定量的相関を、ピアソンの相関分析によりランク付けした。次に、下から１００個の小さいｐ値を有するペプチド（表５）を、二次元ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる蛋白質同定分析の対象とし、１６種類のペプチドに由来する１４種類の蛋白質の特定に成功した（表６）。表６のピアソンの相関係数とｐ値の他に、１６種類のペプチドのＬＣ／ＭＳベースの定量的プロファイルが箱髭図により示された（図４）。既存の重症度指針マーカーであるネオプテリン（Ｒ＝０．４１０５、ｐ＝１．１２×１０−３）と比較すると、特定された蛋白質のいずれもＣＳＦ疾患状態を反映するバイオマーカーとして利用できる高い可能性を示した。
【００７１】
【表５−１】
2016090456.tif 000011
【表５−２】
2016090456.tif 000012
【表５−３】
2016090456.tif 000013
【００７２】
【表６】
2016090456.tif 000014
【００７３】
＜実施例３＞
血漿中のＨＡＭ／ＴＳＰ重症度指針マーカーとしてのＳＰＡＲＣとＶＣＡＭ−１
バイオマーカー候補をさらに絞り、血漿ベースの侵襲性が少ない診断法を確立するため、前記の１４種類の蛋白質の血漿中レベルを、７１例のトレーニングケースを対象としてＥＬＩＳＡアッセイにより測定して調査した（表７）。
【００７４】
【表７】
2016090456.tif 000015
【００７５】
その結果、２種類の蛋白質、すなわち、ＳＰＡＲＣとＶＣＡＭ１が、ＣＳＦレベルと統計学的に同じ傾向を血漿中で示すことが明らかになった（｜Ｒ｜＞０．４およびｐ＜０．０５）（図５Ａおよび５Ｂ）。そこで、新しく同定した２種類の蛋白質とＨＴＬＶ−１ウイルス量を使用する複合バイオマーカー診断法の構築を試みた。それら３種のマーカーは、少量の血液試料より測定することができるため、侵襲性が低く有用なマーカーとなり得るからである。ＨＡＭ／ＴＳＰの進行を停止させ、患者のより良いクオリティ・オブ・ライフを維持するためには、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症の早期診断と、適切な時点での治療介入の、両方が必須である。これらの臨床上のニーズに基づき、ＡＣをＨＡＭ／ＴＳＰ患者と比較して（発症予測；（１））、または、ＡＣおよびＯＭＤＳ１〜３のＨＡＭ／ＴＳＰ患者をＯＭＤＳ４〜１１のＨＡＭ／ＴＳＰ患者と比較して（治療介入予測；（２））、ＲＯＣ曲線の曲線下面積（ＡＵＣ）を最大化する２つのロジスティック回帰モデルを作成した。
【００７６】
【数１】
2016090456.tif 000016
【００７７】
【数２】
2016090456.tif 000017
【００７８】
最後に、１０５例の血漿試料（７１例のトレーニング試料と３４例の独立した試験試料）を使用して、上記予測モデルを評価した。図５Ｃおよび５ＤのＲＯＣ曲線のＡＵＣより、発症予測と治療介入予測の両方について、３因子モデル（それぞれＡＵＣ＝０．８９７およびＡＵＣ＝０．８７９）の優れた診断力が示された。この結果は、２因子モデル（それぞれＡＵＣ＝０．８６１およびＡＵＣ＝０．８５６）、ＳＰＡＲＣ（それぞれＡＵＣ＝０．７４８およびＡＵＣ＝０．７３６）、ＶＣＡＭ１（それぞれＡＵＣ＝０．７６８およびＡＵＣ＝０．７７４）およびＨＴＬＶ−１ウイルス量（それぞれＡＵＣ＝０．７５６およびＡＵＣ＝０．７２６）と比べて（図６および７）、著しく優れていた。
【００７９】
加えて、発症予測についての３因子モデルの感度と特異度はそれぞれ８６．０％と８１．８％であり、治療介入予測についての感度と特異度はそれぞれ８１．８％と８２．０％であった（表８）。これらの診断率は以前に報告されたバイオマーカーであるＣＳＦ中ネオプテリン、ＣＳＦ中ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、および血清可溶性ＩＬ−２受容体（ｓＩＬ−２Ｒ）の診断率よりも著しく高かった（表９）。したがって、３因子診断法は、ＨＴＬＶ−１保持者およびＨＡＭ／ＴＳＰ患者に、有効で非侵襲性の定期的検査を提供することができ、適切な疾患管理およびより良い治療成績をもたらす。
【００８０】
【表８】
2016090456.tif 000018
【００８１】
【表９】
2016090456.tif 000019
【００８２】
新しいバイオマーカーであるＳＰＡＲＣの生理学的考察に関して、発現は脊髄を含む神経系のグリア細胞に特異的に限定されている。この事実は、ＨＡＭ／ＴＳＰ患者におけるＳＰＡＲＣの血漿レベルがＨＡＭ／ＴＳＰの病理的な特徴である脊髄変性により引き起こされるグリア細胞数の下落と共に低下することを示唆した。一方、ＣＳＦネオプテリンは、多発性硬化症、ＨＩＶ脳症、および神経ライム病（Lyme neuroborreliosis）などの多
くの炎症性神経疾患において発現上昇する炎症性化合物として知られており、ネオプテリンが脊髄変性を特異的に特徴づけることはあり得ないことを示している。したがって、血漿またはＣＳＦ中のＳＰＡＲＣは、ＣＳＦネオプテリンと比べてより特異的なＨＡＭ／ＴＳＰのバイオマーカーであると考えられ得る。
【００８３】
別の新しいバイオマーカーであるＶＣＡＭ１は表皮細胞の表面に発現し、その可溶型は炎症過程の間に血漿中で発現上昇することが知られている。したがって、ＶＣＡＭ１の診断的特徴はネオプテリンと同様である可能性があるが、ＶＣＡＭ１は非侵襲性の血液試料から測定され得る点でより好ましい。
【００８４】
結論すると、ＣＳＦのプロテオームワイドな定量的プロファイリングにより、ＨＡＭ／ＴＳＰに対する１００種類の重症度指針バイオマーカー（表５に示す）が同定された。それらのうち、ＳＰＡＲＣとＶＣＡＭ１は、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症の血漿ベースの診断および重症度の検査に有用であることが確認された。ＨＴＬＶ−１保持者の０．５％の保持者において数十年の無症候期の後にＨＡＭ／ＴＳＰの突然の発症を予測することは、長らく困難であった。しかし、３種類（ＳＰＡＲＣ、ＶＣＡＭ１及びウイルス量）のバイオマーカーの定期的検査は、ＨＡＭ／ＴＳＰの早期診断に貢献し、重い症状を患う前の適切な疾患管理をもたらす。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明において、ＨＡＭ／ＴＳＰに対する重症度指針バイオマーカーを特定した。それらのバイオマーカーの発現量を測定することにより、重症度予測、発症予測、治療介入時期の決定、および治療効果の評価等のＨＡＭ／ＴＳＰの検査が可能となる。さらに、血漿中のＳＰＡＲＣ、ＶＣＡＭ１、およびＨＴＬＶ−１ウイルス量から、直接的にＨＡＭ／ＴＳＰ疾患状態を定量的に定義することができる。この３因子予測モデルは、ＣＳＦの収集のような侵襲的な手法をとることなく、１回の血液採取から３種類のバイオマーカーが測定可能であることから、ＨＡＭ／ＴＳＰ発症をモニターするための無症候性キャリアの定期的な医療検査に容易に加わり得る。ＨＡＭ／ＴＳＰの進行は発症から通常数年以内では急速である傾向があるので、治療開始ポイントについての予測モデルは、早期のＨＡＭ／ＴＳＰ患者に対する治療介入の決定の遅延を効果的に防止する。また、本発明の方法により治療効果を評価することにより、適切な投薬治療を受けることが可能となる。
【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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