(57)【要約】【課題】タンパク質を含み輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる水性懸濁剤を提供する。【解決手段】緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアクリル酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水または緩衝液を除去することによりタンパク質の濃縮が可能であり、複合体中で、タンパク質が振とうストレス耐性を有するタンパク質水性懸濁剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアクリル酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水または緩衝液を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が振とうストレス耐性を有するタンパク質水性懸濁剤。
【請求項２】
前記複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質溶液を添加して前記タンパク質が溶解可能である、請求項１に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項３】
前記ポリアクリル酸の重量平均分子量が０．５ｋＤａ〜５０００ｋＤａの範囲である、請求項１または２に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項４】
前記タンパク質の分子量が３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項５】
前記複合体が、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に前記タンパク質の最大濃縮比が存在するように濃縮可能である、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項６】
前記振とうストレス耐性を有する水性懸濁剤は前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して振とうストレス耐性が高い、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項７】
前記タンパク質が生物活性を有するタンパク質である、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項８】
前記タンパク質が、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項９】
前記タンパク質が糖鎖を有する、請求項１ないし８のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１０】
前記水性懸濁剤が、緩衝液、タンパク質、ポリアクリル酸およびｐＨ調製剤以外の添加剤を含有しない、請求項１ないし９のいずれか１項に記載のタンパク質水性懸濁剤。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の前記複合体を含む水性懸濁液に低濃度の電解質が添加され前記タンパク質が溶解されてなるタンパク質含有水性液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質とポリアクリル酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体中で前記タンパク質が振とうストレス耐性を有する水性懸濁剤に関する。また、前記複合体を緩衝液中で再溶解して得られる水性液に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の進歩により、種々のタンパク質が医薬品として提供される機会が増している。特に抗体についての技術進歩は目覚しく、キメラ抗体やヒト化抗体、さらには糖鎖改変技術を応用した抗体も実用化され、数々の抗体医薬品が大きな治療効果を上げている。タンパク質医薬品は、従来用時溶解して用いる凍結乾燥製剤として提供されることが多かったが、近年では、より簡便に使用できる水性剤として提供されるようになってきている。また、投与についても、従来静脈注射による投与が一般的であったが、患者の利便性まで考慮し、経皮吸収型製剤または経粘膜吸収製剤として用いられるタンパク質医薬品が望まれている。しかし、経皮、経粘膜吸収製剤は、充分な吸収量が得られない場合が多く、タンパク質を高濃度化することが必須となる。また、特に抗体医薬品は、高用量で用いられるため、経皮・経粘膜吸収を増進するためには、より高濃度化することが要求される。さらに最近は、投与回数を減らす目的で高濃度化する試みもなされており、提供される市販製剤にはタンパク質濃度が１００ｍｇ／ｍＬ以上のものも存在する。
【０００３】
しかしながら、元来生体高分子であるタンパク質は、振とう等の物理的ストレスや酸化等の化学的ストレスに弱く、特に凍結乾燥製剤に比べ水に溶解して水性剤とした場合には変性しやすい。変性したタンパク質は、本来の活性を失い凝集体や会合体を形成することが多く、また、この反応は不可逆な場合が多い。このような凝集体の形成は、一般にタンパク質が高濃度である程起きやすく、振とう等による気液界面への暴露およびタンパク質分子どうしの相互作用の機会が増えることにより、特に長期保存時や輸送時に凝集体が形成される可能性が高まる。凝集体の形成は、タンパク質医薬品の有効性を低下させ、さらに安全性をも脅かす。すなわち、投与後に抗薬物抗体の産生が起こる等の望まれない免疫反応を惹起する可能性を有する（非特許文献１）。このため、米国ＦＤＡおよび欧州ＥＭＥＡでは、免疫原性の評価に対するガイドラインを設定し、対策を喚起している。また、酵素やサイトカイン等の低濃度のタンパク質製剤においても、種類や製剤によって凝集体を形成しやすいものが存在し、溶解時や投与時に激しく振とうしない、フィルターを通す等、用時の取扱に注意を要するものも少なくない。
【０００４】
このような背景から、タンパク質の各種ストレスに対する安定性を向上させることは極めて重要な課題であり、特にタンパク質が高濃度な状態や凝集体を形成しやすいタンパク質においても適用できる汎用性が高い安定化技術の構築が望まれている。
【０００５】
これに対し、タンパク質の安定性を向上させるための取組みとして、主に各種添加剤による安定化が数多く検討されている。例えば、特許文献１では、アミノ酸エステル、ポリアミンの添加によるタンパク質の安定化方法が、また、特許文献２では、ポリエチレングリコール、および特定のアミノ酸としてアラニン、アルギニン、グルタミン酸、またはこれらの誘導体を共存させることによる熱ストレスに対するタンパク質の安定化方法が開示されている。
【０００６】
特許文献３には、請求項１に、「抗体製剤を作製する方法であって、抗体をポリカチオンと組み合わせる工程を含む方法。」が記載されている。請求項４には、「ポリカチオンが、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、ポリヒスチジン、およびカチオン性多糖類、またはその混合物からなる群より選択される。」と記載され、請求項２４には、「製剤が、前記ポリカチオン組成物と組み合わせたときに、ポリカチオンの非存在下での前記抗体製剤の溶解性と比較して、より大きい溶解性を有する」と記載される。また、請求項２５には、「製剤が、ポリカチオン組成物と組み合わせていない抗体製剤と比較して、増大した貯蔵寿命を有する」ことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第３９７６２５７号
【特許文献２】特許第５１１９５４５号
【特許文献３】特表２０１０−５３６７８６号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Schellekens, H.、「Immunogenicity of therapeutic proteins: Clinical implications and future prospects」、Elsevier、Clinical Therapeutics、2002年、第24巻、第11号、ｐ．1720−1740
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、上述の状況に鑑みてなされたもので、タンパク質を含み輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる水性懸濁剤を提供することにある。本発明者らは、上記目的で種々のタンパク質について鋭意研究を重ねた結果、タンパク質とポリアクリル酸とが緩衝液中で懸濁する複合体を形成し、この複合体中でタンパク質が振とうストレス耐性を有し安定性が向上することを見出し、本発明をなすに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、タンパク質とポリアクリル酸とを組み合わせる工程を含む方法で、タンパク質の安定性が向上し、振とうストレス耐性を有することを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
（１）緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアクリル酸とが複合体を形成して懸濁する水性懸濁液で、前記複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水または緩衝液を除去することにより前記タンパク質の濃縮が可能であり、前記複合体中で、前記タンパク質が振とうストレス耐性を有するタンパク質水性懸濁剤。
（２）前記複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質溶液を添加して前記タンパク質が溶解可能である、（１）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（３）前記ポリアクリル酸の重量平均分子量が０．５ｋＤａ〜５０００ｋＤａの範囲である、（１）または（２）に記載のタンパク質水性懸濁剤。
（４）前記タンパク質の分子量が３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲である、（１）ないし（３）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（５）前記複合体が、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点（ｐＩ）の差の絶対値が０．５〜４．０の範囲に前記タンパク質の最大濃縮比が存在するように濃縮可能である、（１）ないし（４）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（６）前記振とうストレス耐性を有する水性懸濁剤は前記複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液と比較して振とうストレス耐性が高い、（１）ないし（５）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（７）前記タンパク質が生物活性を有するタンパク質である、（１）ないし（６）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（８）前記タンパク質が、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つである、（１）ないし（７）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（９）前記タンパク質が糖鎖を有する、（１）ないし（８）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１０）前記水性懸濁剤が、緩衝液、タンパク質、ポリアクリル酸およびｐＨ調製剤以外の添加剤を含有しない、（１）ないし（９）のいずれか１つに記載のタンパク質水性懸濁剤。
（１１）上記（１）ないし（１０）のいずれか１つに記載の前記複合体を含む水性懸濁液に低濃度の電解質が添加され前記タンパク質が溶解されてなるタンパク質含有水性液。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の水性懸濁剤は、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質とポリアクリル酸とが複合体を形成して懸濁し、振とうストレス耐性を有する、という特徴を有する。具体的にはタンパク質とポリアクリル酸が複合体を形成し安定化され、水性懸濁液から水を除去することにより濃縮可能である。輸送時や保存時の安定性に優れ、用時の取り扱い性に優れる。一般にタンパク質医薬品の安定化には、賦形剤、界面活性剤、安定化剤等の添加剤が用いられるが、これらを用いる際には、タンパク質医薬品毎にその種類や組合せ、添加量を最適化するための複雑かつ膨大な検討が必要となる。本発明の水性懸濁剤は、ポリアクリル酸との複合体を形成することで簡便に安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、そのまま投与する、あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて溶解させて水性液として投与することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明のタンパク質・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁剤の一例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１４】
〔タンパク質〕
本発明に使用されるタンパク質は、緩衝液中で表面電荷を有するタンパク質であれば特に限定されない。好ましくは生物活性を有するタンパク質であり、より具体的には、植物、動物、微生物等の生物由来のタンパク質、あるいは遺伝子組換え技術を用いて製造されたタンパク質などが挙げられる。本発明において、より好ましい形態のタンパク質は、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメント、融合タンパク質等の医療用タンパク質である。これらのタンパク質は１種類を単独で、または２種類以上を組み合わせて使用することができ、酵素、サイトカイン、ホルモン、抗体、抗体フラグメントおよび融合タンパク質からなる群から選択される少なくとも１つを使用することが好ましい。
タンパク質が抗体または抗体フラグメントであると、これらのタンパク質を製剤または診断剤としてヒトに適用する際に、本発明の水性懸濁剤を用いればより安定に運搬、保存が可能であり、しかも用時にヒトに投与することが容易であり有用性が高い。タンパク質は糖鎖を有していてもよく、糖鎖は親水性であり、本発明の複合体含有水性懸濁液中で何らかの相互作用を有すると考えられる。
【００１５】
〔ポリアクリル酸〕
本発明に使用されるポリアクリル酸は、アクリル酸のホモポリマー、メタクリル酸のホモポリマー、アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマー、およびこれらの水溶性金属塩からなる群から選択される少なくとも１つであれば特に限定されない。アクリル酸とメタクリル酸とのコポリマーは、ランダム・コポリマー、タンデムコポリマーまたはブロック・コポリマーのいずれであってもよい。ポリアクリル酸としては、アクリル酸のホモポリマー、メタクリル酸のホモポリマーおよびこれらの水溶性金属塩からなる群から選択される少なくとも１つが好ましく、アクリル酸のホモポリマーまたはその水溶性金属塩がより好ましい。水溶性金属塩としては、アルカリ金属塩が好ましく、ナトリウム塩またはカリウム塩がより好ましく、ナトリウム塩がさらに好ましい。
本発明に使用されるポリアクリル酸の分子量は特に限定されないが、重量平均分子量（以下「Ｍｗ」と表記する場合がある。）で、０．５ｋＤａ〜５０００ｋＤａの範囲内が好ましく、１ｋＤａ〜１０００ｋＤａの範囲内がより好ましく、１ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲内がさらに好ましく、５ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲内がいっそう好ましく、５ｋＤａ〜２５ｋＤａの範囲内がよりいっそう好ましい。
なお、本発明において、ポリアクリル酸の重量平均分子量は光散乱法により測定したものである。
【００１６】
〔緩衝液〕
本発明に使用する緩衝液は、水素イオン濃度に対する緩衝作用のある溶液を指し、緩衝液は少量の酸や塩基を加えたり、多少濃度が変化したりしてもｐＨが大きく変化しないように調整された水溶液である。緩衝液は通常化学的に用いられるものであれば特に限定されないが、生物学的に用いられる緩衝液が好ましい。より好ましい形態の緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）緩衝液、トリスＨＣｌ緩衝液、ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）緩衝液、グリシンＮａＯＨ緩衝液等の生体試料に適したもので、生体への投与が可能な緩衝液を用いることができる。
【００１７】
〔タンパク質・ポリアクリル酸複合体〕
本発明のタンパク質・ポリアクリル酸複合体は、以下の（１）〜（３）のいずれかの特性を有する。
（１）タンパク質は緩衝液中で複合体を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水または緩衝液を除去することにより濃縮可能である。
（２）複合体は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質溶液を添加して溶解可能である。
（３）タンパク質は前記複合体中で振とうストレス耐性を有する。
【００１８】
上記（１）について説明する。
タンパク質は緩衝液中で複合体を形成し、得られる複合体含有水性懸濁液から少なくとも一部の水または緩衝液を除去することにより濃縮可能である。得られたタンパク質・ポリアクリル酸複合体は、上清の緩衝液を除去して濃縮されたタンパク質を保持する複合体を得ることができる。遠心分離して複合体を得てもよい。複合体含有水性懸濁液は緩衝液、水等を添加して任意の濃度に薄めることもできる。
【００１９】
上記（２）について説明する。
複合体は、複合体含有水性懸濁液に低濃度の電解質溶液を添加して溶解可能である。電解質としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等が例示でき、好ましくは、これらのうちで最も生体適合性が高いＮａＣｌが選択される。電解質濃度は特に限定されないが、複合体が溶解する十分量を用いることができ、好ましくは５質量％以下である。再溶解に使用するＮａＣｌ濃度は、好ましくは８ｍＭ（０．０４８質量％）以上であり、より好ましくは４０ｍＭ（０．２４質量％）以上である。
【００２０】
本発明の複合体は、緩衝液中に表面電荷を有するタンパク質とポリアクリル酸とを含み、前記タンパク質と前記ポリアクリル酸とが好ましくは静電的相互作用によって形成される複合体である。本発明においては、理由は不明であるが、前記緩衝液のｐＨと前記タンパク質の等電点ｐＩとの差の絶対値、｜ｐＨ−ｐＩ｜が、好ましくは０．５〜４．０、より好ましくは１．０〜４．０、さらに好ましくは１．０〜３．５、いっそう好ましくは１．８〜３．５、よりいっそう好ましくは１．８〜３．０、とりわけ好ましくは１．８〜２．５の範囲で適切に濃縮できる。
【００２１】
タンパク質とポリアクリル酸との複合体中のタンパク質の最大濃縮比は、緩衝液のｐＨとタンパク質の等電点ｐＩとの差の絶対値、｜ｐＨ−ｐＩ｜が０．５〜４．０の範囲に存在する。その理由は不明であるが、本発明者らは、複合体中のタンパク質の最大濃縮比が、緩衝液のｐＨとタンパク質の等電点ｐＩの差の絶対値、｜ｐＨ−ｐＩ｜が、好ましくは０．５〜４．０、より好ましくは１．０〜４．０、さらに好ましくは１．０〜３．５、いっそう好ましくは１．８〜３．５、よりいっそう好ましくは１．８〜３．０、とりわけ好ましくは１．８〜２．５の範囲に存在することは、タンパク質とポリアクリル酸とが複合体を形成する静電的相互作用の状態を表す１つの特徴であると考えている。ただし、本発明はこれらの機序に限定されるものではない。
【００２２】
上記（３）について説明する。
タンパク質は前記複合体中で振とうストレス耐性を有する。ここで、振とうストレス耐性を有するとは、複合体が同一緩衝液中で同一濃度である同一タンパク質の水溶液（対照液）に対して振とうストレス耐性がより高いことを言い、具体的には、タンパク質の残存率がより高いことをいう。
振とうストレスとは、例えば後に実施例の試験例で示すような１００〜５００ｒｐｍ×１０〜１００時間の振とうを緩衝液中のタンパク質または複合体に与えることを言う。
上記の振とうストレスの前後において、タンパク質の濃度を吸光度で測定すると、複合体を形成しない場合は多量の不溶性の沈殿物ができて振とう後、遠心分離して凝集体を除くと緩衝液中のタンパク質の濃度が低くなりタンパク質含量の残存率が小さくなり、７％未満となる場合もある。一方複合体を形成する場合は振とうストレスの前後において複合体中のタンパク質が安定でありタンパク質含量の残存率が測定によっては１００％以上の値となる。複合体中のタンパク質含量の残存率の値は、複合体を形成しない場合の対照液のタンパク質含量の残存率の値より、好ましくは１５〜９９％高く、より好ましくは１８〜９５％高く、さらに好ましくは２５〜９０％高い。
【００２３】
〔タンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁剤の好適特性〕
タンパク質は表面電荷を有する。
タンパク質の分子量は３ｋＤａ〜６７０ｋＤａの範囲であり、ポリアクリル酸の重量平均分子量は１〜１００ｋＤａの範囲である。
タンパク質は、水性懸濁液中で０．０１〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれる。
水性懸濁液に用いる緩衝液のｐＨは、ｐＨ３〜９の範囲内である。
本発明の水性懸濁剤は、緩衝液中にタンパク質とポリアクリル酸とを含み、これらの配合比が前記タンパク質１質量部に対し前記ポリアクリル酸が０．００５質量部〜６質量部の範囲であり、前記緩衝液のｐＨが含まれる前記タンパク質の等電点ｐＩより０．５以上４．０以下塩基性側または酸性側に調整されていて、前記タンパク質と前記ポリアクリル酸が静電的相互作用による複合体を形成している、安定なタンパク質・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁剤である。
本発明の水性懸濁剤は、タンパク質の等電点に応じて緩衝液のｐＨを選択するのみで簡便に濃縮、安定化させることができ、従来必要であった添加剤を加える必要がない。水性懸濁剤は、緩衝液、タンパク質、ポリアクリル酸、ｐＨ調製剤以外の添加剤を加えることもできるが加える必要はない。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、そのまま製剤として投与できる。あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて溶解して製剤として投与することができる。
【００２４】
〔水性懸濁剤の製造方法〕
〈工程１〉緩衝液に、表面電荷を有するタンパク質を０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲、ポリアクリル酸を０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲となるように加えて、タンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液を得る。
〈工程２〉工程１で得られたタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液から少なくとも一部の水または緩衝液を、遠心分離、限外濾過、上清除去等より選ばれる方法で除去し、水性懸濁液中の上記タンパク質が０．１〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれるように調整する。
〈工程３〉工程２で得られた水性懸濁液に、工程２で除去した水または緩衝液の量よりも少ない量の水または緩衝液を添加することにより、濃縮されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液を得る。あるいは、工程２で除去した水または緩衝液の量と等しい量の水または緩衝液を添加することにより、同等のタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液を得る。あるいは、工程２で除去した水または緩衝液の量よりも多い量の水または緩衝液を添加することにより、希釈されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液を得る。
〈工程２’〉工程１で得られたタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液から水および緩衝液のいずれも除去せずに、水または緩衝液を添加することにより、希釈されたタンパク質濃度を有するタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液を得る。
【００２５】
上記タンパク質が、医療用タンパク質である場合は、上記の工程１、工程２および工程３により、または上記の工程１および工程２’により、水性懸濁剤が製造される。
【００２６】
上記工程１においては、上記緩衝液のｐＨと上記タンパク質のｐＩとの差の絶対値、｜ｐＨ−ｐＩ｜が、好ましくは０．５〜４．０、より好ましくは１．０〜４．０、さらに好ましくは１．０〜３．５、いっそう好ましくは１．８〜３．５、よりいっそう好ましくは１．８〜３．０、とりわけ好ましくは１．８〜２．５の範囲内となるように、緩衝液のｐＨを調整することが望ましい。緩衝液のｐＨは、例えば、酸または塩基を添加することにより調整することができる。
【００２７】
〔水性剤の製造方法〕
〈工程１〉緩衝液に、表面電荷を有するタンパク質を０．０１〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲、ポリアクリル酸を０．０１〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲となるように加えて、タンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液を得る。
〈工程２〉工程１で得られたタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液から少なくとも一部の水または緩衝液を、遠心分離、限外濾過、上清除去等より選ばれる方法で除去し、水性懸濁液中の上記タンパク質が０．１〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲で含まれるように調整する。
〈工程３〉工程２で得られた水性懸濁液に、工程２で除去した水または緩衝液の量よりも少ない量の低濃度の電解質溶液を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより、濃縮されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。あるいは、工程２で除去した水または緩衝液の量と等しい量の低濃度の電解質溶液を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより、同等のタンパク質濃度を有する水性液を得る。あるいは、工程２で除去した水または緩衝液の量よりも多い量の低濃度の電解質溶液を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより、希釈されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。
〈工程２’〉工程１で得られたタンパク質・ポリアクリル酸複合体を含む水性懸濁液から水および緩衝液のいずれも除去せずに、低濃度の電解質溶液を添加して複合体中のタンパク質を緩衝液中に再溶解することにより、希釈されたタンパク質濃度を有する水性液を得る。
【００２８】
上記タンパク質が、医療用タンパク質である場合は、上記の工程１、工程２および工程３により、または上記の工程１および工程２’により、水性剤が製造される。
【００２９】
上記工程１においては、上記緩衝液のｐＨと上記タンパク質のｐＩとの差の絶対値、｜ｐＨ−ｐＩ｜が、好ましくは０．５〜４．０、より好ましくは１．０〜４．０、さらに好ましくは１．０〜３．５、いっそう好ましくは１．８〜３．５、よりいっそう好ましくは１．８〜３．０、とりわけ好ましくは１．８〜２．５の範囲内となるように、緩衝液のｐＨを調整することが望ましい。緩衝液のｐＨは、例えば、酸または塩基を添加することにより調整することができる。
【００３０】
（１）タンパク質の濃縮方法
以下の工程１．１）〜１．３）は任意の順序で行うことができ、同時に行っても逐次に行ってもよい。
１．１）タンパク質を緩衝液に加える。
１．２）ポリアクリル酸を緩衝液に加える。
１．３）所望により、緩衝液のｐＨを、タンパク質の等電点ｐＩとして、｜ｐＨ−ｐＩ｜が０．５〜４．０の範囲内となるように調整する。
１．４）緩衝液中でタンパク質とポリアクリル酸とが複合体を形成し水性懸濁液が得られる。
１．５）少なくとも一部の水または緩衝液を除去する。得られる複合体中のタンパク質濃度は上記１．１）の緩衝液中のタンパク質濃度より濃縮したタンパク質が得られる。
１．６）必要な場合は、得られた水性懸濁液を遠心分離して複合体を得る。
【００３１】
（２）複合体の溶解方法
複合体は、水性懸濁液中に低濃度の電解質溶液を添加して再溶解することができる。電解質としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２等が例示でき、好ましくは、これらのうちで最も生体適合性が高いＮａＣｌが選択される。電解質濃度は特に限定されないが、複合体が溶解する十分量を用いることができ、好ましくは５質量％以下である。再溶解に使用するＮａＣｌ濃度は、好ましくは８ｍＭ（０．０４８質量％）以上であり、より好ましくは４０ｍＭ（０．２４質量％）以上である。
得られた複合体を再溶解して緩衝液中に溶解したタンパク質を可逆的量で得るためには、上記緩衝液のｐＨと上記タンパク質のｐＩとの差の絶対値、｜ｐＨ−ｐＩ｜が、好ましくは０．５〜４．０、より好ましくは１．０〜４．０、さらに好ましくは１．０〜３．５、いっそう好ましくは１．８〜３．５、よりいっそう好ましくは１．８〜３．０、とりわけ好ましくは１．８〜２．５の範囲内とするのが望ましい。
【００３２】
（３）タンパク質濃度測定方法
緩衝液中のタンパク質濃度は、例えば波長２８０ｎｍの吸光度を測定して標準曲線から濃度を算出する。複合体中のタンパク質濃度は遠心分離して得られる複合体を上記（２）の方法で溶解して、例えば波長２８０ｎｍの吸光度を測定して標準曲線から濃度を算出する。例えばタンパク質濃縮時の濃度変化を非濃縮に対する濃縮倍率で算出し、また複合体に振とうストレス負荷を行い負荷後の濃度変化を負荷前に対する残存率で算出する。
【００３３】
（４）振とうストレスに対する安定性の測定方法
４．１）振とうストレスに対する抗ＩｇＥモノクローナル抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク質含量残存率を求める。
４．２）振とうストレスに対する抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定して抗ＴＮＦαモノクローナル抗体濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定して抗ＴＮＦαモノクローナル抗体濃度を測定しタンパク質含量残存率を求める。
４．３）振とうストレスに対するＬ−アスパラギナーゼの安定性
振とうストレス前後におけるタンパク質含量の変化をタンパク質含量残存率として測定する。振とうストレス前に吸光度を測定してＬ−アスパラギナーゼ濃度を測定する。振とうストレスを与え、それにより不溶性の凝集体ができた場合の不溶性の沈殿物を遠心分離して除いた後の吸光度を測定してＬ−アスパラギナーゼ濃度を測定しタンパク質含量残存率を求める。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３５】
［実施例１］
〈抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液の製造〉
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体（オマリズマブ；ゾレア（Ｒ），ノヴァルティスファーマ社製；ｐＩ＝７．６）濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液を調製した。
調製した抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液の一部を採り、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．１質量部のポリアクリル酸（Ｍｗ＝５ｋＤａ）を加え、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去し、残部として抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００３６】
〈ポリアクリル酸（Ｍｗ＝５ｋＤａ）によるタンパク質濃縮効果（１）〉
（被験液・対照液の調製）
抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を被験液とした。
抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液の一部を採り、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去した。残部に１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を対照液とした。
（タンパク質濃縮比の計測）
対照液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ０）および被験液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ１）を測定し、タンパク質濃度を算出した。
算出したタンパク質濃度に基づいて、タンパク質の濃縮比を下記式により求めた。
濃縮比＝被験液のタンパク質濃度／対照液のタンパク質濃度
抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液のポリアクリル酸／タンパク質質量比および上記により求められた濃縮比を表１に示す。
【００３７】
〈ポリアクリル酸（Ｍｗ＝５ｋＤａ）による振とうストレス抑制効果（１）〉
抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液を被験液として、ポリプロピレン製容器に充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６，タイテック社製）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。
振とう前および振とう後の被験液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
被験液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めた。結果を表２に示す。
【００３８】
［実施例２］
〈抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液の製造〉
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（アダリムマブ；ヒュミラ（Ｒ），エーザイ社製；ｐＩ＝８．７）濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように抗ＴＮＦαモノクローナル抗体溶液を調製した。
調製した抗ＴＮＦαモノクローナル抗体溶液の一部を採り、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体１質量部に対し０．０４質量部のポリアクリル酸（Ｍｗ＝５ｋＤａ）を加え、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去し、残部として抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液を得た。
【００３９】
〈ポリアクリル酸（Ｍｗ＝５ｋＤａ）によるタンパク質濃縮効果（２）〉
（被験液・対照液の調製）
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を被験液とした。
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体溶液の一部を採り、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去した。残部に１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を対照液とした。
（タンパク質濃縮比の計測）
対照液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ０）および被験液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ１）を測定し、タンパク質濃度を算出した。
算出したタンパク質濃度に基づいて、タンパク質の濃縮比を下記式により求めた。
濃縮比＝被験液のタンパク質濃度／対照液のタンパク質濃度
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液のポリアクリル酸／タンパク質質量比および上記により求められた濃縮比を表１に示す。
【００４０】
〈ポリアクリル酸（Ｍｗ＝５ｋＤａ）による振とうストレス抑制効果（２）〉
抗ＴＮＦαモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体の濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとして、被験液とした。被験液をポリプロピレン製容器に充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６，タイテック社製）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。
振とう前および振とう後の被験液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
被験液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めた。結果を表２に示す。
【００４１】
【表１】
2016084329.tif 000002
【００４２】
［比較例１］
〈ポリアリルアミンによるタンパク質濃縮効果〉
（Ｌ−アスパラギナーゼ溶液の調製）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼ濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＬ−アスパラギナーゼ溶液を調製した。
（被験液の調製）
調製したＬ−アスパラギナーゼ溶液の一部を採り、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対して０．０５質量部のポリアリルアミン（Ｍｗ＝５ｋＤａ）を加え、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去し、残部としてＬ−アスパラギナーゼ・ポリアリルアミン複合体含有水性懸濁液を得た。
得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリアリルアミン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を被験液とした。
（対照液の調製）
調製したＬ−アスパラギナーゼ溶液の一部を採り、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去した。残部に１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を対照液とした。
（タンパク質濃縮比の計測）
対照液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ０）および被験液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ１）を測定して対照液および被験液のタンパク質濃度を算出したところ、両者のタンパク質濃度に差異は認められなかった。すなわち、ポリアリルアミンによるタンパク質濃縮効果は認められなかった。
【００４３】
［比較例２］
〈ポリエチレンイミンによるタンパク質濃縮効果〉
（Ｌ−アスパラギナーゼ溶液の調製）
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼ濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるようにＬ−アスパラギナーゼ溶液を調製した。
（被験液の調製）
調製したＬ−アスパラギナーゼ溶液の一部を採り、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対して０．０５質量部のポリエチレンイミン（Ｍｗ＝１．８ｋＤａ）を加え、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去し、残部としてＬ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液を得た。
得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液の一部を採り、１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を被験液とした。
（対照液の調製）
調製したＬ−アスパラギナーゼ溶液の一部を採り、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去した。残部に１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を対照液とした。
（タンパク質濃縮比の計測）
対照液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ０）および被験液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ１）を測定して対照液および被験液のタンパク質濃度を算出したところ、被験液の方が対照液よりもタンパク質濃度が高かった。すなわち、ポリエチレンイミンによるタンパク質濃縮効果が認められた。
【００４４】
〈ポリエチレンイミンによる振とうストレス抑制効果〉
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において、Ｌ−アスパラギナーゼを１．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製し、Ｌ−アスパラギナーゼ１質量部に対し０．０５質量部のポリエチレンイミン（Ｍｗ＝１．８ｋＤａ）を加え、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去して、Ｌ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液を得た。
得られたＬ−アスパラギナーゼ・ポリエチレンイミン複合体含有水性懸濁液に９倍量の１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、Ｌ−アスパラギナーゼ濃度を１０．０ｍｇ／ｍＬに調整し、被験液として、ポリプロピレン製チューブに充填し、振とう機（バイオシェーカーＶ・ＢＲ−３６，タイテック社製）に設置し、５００ｒｐｍ、室温下で６０時間振とうした。
振とう前および振とう後の被験液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
また、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中においてＬ−アスパラギナーゼを１０．０ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液とし、ポリプロピレン製チューブに充填し、同時に振とうした。振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
被験液および対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めたところ、被験液と対照液との間に残存率の差異は認められなかった。すなわち、ポリエチレンイミンによる振とうストレス抑制効果は認められなかった。
【００４５】
［比較例３］
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において抗ＩｇＥモノクローナル抗体（オマリズマブ；ゾレア（Ｒ），ノヴァルティスファーマ社製；ｐＩ＝７．６）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液として、ポリプロピレン製容器に充填し、実施例１と同条件で振とうした。
振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めた。結果を表２に示す。
【００４６】
［比較例４］
１０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０）中において抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（アダリムマブ；ヒュミラ（Ｒ），エーザイ社製；ｐＩ＝８．７）を０．５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように調製した液を対照液として、ポリプロピレン製容器に充填し、実施例２と同条件で振とうした。
振とう前および振とう後の対照液に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウムを加え、１０，０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清部のタンパク質濃度測定として波長２８０ｎｍの吸光度を測定した。
対照液について、振とう前に対する振とう後のタンパク質含量残存率を求めた。結果を表２に示す。
【００４７】
【表２】
2016084329.tif 000003
【００４８】
［実施例３］
〈ポリアクリル酸（Ｍｗ＝２５ｋＤａ）によるタンパク質濃縮効果〉
１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中において、抗ＩｇＥモノクローナル抗体（オマリズマブ；ゾレア（Ｒ），ノヴァルティスファーマ社製；ｐＩ＝７．６）濃度が０．５ｍｇ／ｍＬとなるように抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液を調製した。
（被験液の調製）
調製した抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液の一部を採り、抗ＩｇＥモノクローナル抗体１質量部に対し０．０１質量部、０．０２質量部、０．０３質量部、０．０４質量部、０．０５質量部または０．１質量部のポリアクリル酸（Ｍｗ＝２５ｋＤａ）を加え、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去し、残部として抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液を得た。
得られた抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液に１５０ｍＭとなるよう塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を被験液とした。
（対照液の調製）
調製した抗ＩｇＥモノクローナル抗体溶液の一部を採り、遠心分離し、全容の９割を上清部として除去した。残部に１５０ｍＭとなるように塩化ナトリウム水溶液を加え、遠心分離し、上清部を回収した。回収した上清部を対照液とした。
（タンパク質濃縮比の計測）
対照液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ０）および被験液の波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ１）を測定し、タンパク質濃度を算出した。
算出したタンパク質濃度に基づいて、タンパク質の濃縮比を下記式により求めた。
濃縮比＝被験液のタンパク質濃度／対照液のタンパク質濃度
抗ＩｇＥモノクローナル抗体・ポリアクリル酸複合体含有水性懸濁液のポリアクリル酸／タンパク質質量比および上記により求められた濃縮比を表３に示す。
【００４９】
【表３】
2016084329.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明は以下のいずれかの特性を有するので有用性が高い。
広範なタンパク質について、輸送時の振動に対して安定である水性懸濁剤である。本発明は複合体を形成し安定化され、輸送時や保存時の安定性に優れる。本発明の複合体は限外ろ過等の特別な設備を必要とせずにタンパク質濃度を簡便に高濃度に濃縮できる。また、凍結乾燥製剤で必要となる煩雑な溶解操作を必要とせず、複合体含有水性懸濁液をそのまま製剤として投与でき、あるいは用時に塩化ナトリウムに代表される無機塩を加えて再溶解して水性液として投与することができる。