(57)【要約】【課題】分析すべき抗原の検出に必要な手順の簡略化が可能な生体分子固定基材を提供する。【解決手段】本発明の生体分子固定基材１００は、基材２００に固定された捕捉用抗体２５０と、捕捉用抗体２５０の近傍で基材２００上に付着された検出用抗体３１０と標識３５０と、を含む。検出用抗体３１０および標識３５０は、凍結乾燥物の状態で基材２００上に付着していることが好ましい。基材２００上に検出用抗体３１０が標識３５０とともに予め用意されているため、分析すべき抗原の検出に必要な手順が簡略化される。【選択図】図１
2016173237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材上に固定された捕捉用生体分子と、
前記捕捉用生体分子の近傍で前記基材上に付着した検出用生体分子および標識物質と、
を含む、生体分子固定基材。
【請求項２】
前記検出用生体分子および標識物質が、凍結乾燥物の状態で前記基材上に付着している、請求項１に記載の生体分子固定基材。
【請求項３】
前記基材が、表面に非特異的吸着抑制高分子化合物の層を有する、請求項１または２に記載の生体分子固定基材。
【請求項４】
前記標識物質が蛍光物質である、請求項１から３のいずれか１項に記載の生体分子固定基材。
【請求項５】
前記生体分子が、糖鎖、核酸、ペプチド、タンパク質、およびそれらの複合体からなる群から選ばれる分子種である、請求項１から４のいずれか１項に記載の生体分子固定基材。
【請求項６】
前記生体分子が、抗体およびレクチンからなる群から選ばれる分子種である、請求項１から５のいずれか１項に記載の生体分子固定基材。
【請求項７】
前記検出用生体分子がビオチン化された生体分子であり、前記標識物質がアビジン類を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の生体分子固定基材。
【請求項８】
前記標識物質が、ストレプトアビジンに直接結合した標識である、請求項７に記載の生体分子固定基材。
【請求項９】
基材上に捕捉用生体分子を固定する固定化工程と、
前記基材上に、検出用生体分子と標識物質とを含む液を用意し、前記液を凍結乾燥させる凍結乾燥工程と、
を含む、生体分子固定基材の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子固定基材および生体分子固定基材の製造方法に関する。より具体的には、使用時の手順が簡略化される生体分子固定基材および生体分子固定基材の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子を基板に固定化させたバイオチップが種々開発されている。たとえば、特開２０１３−２２８３８３号公報（特許文献１）には、検体中に含まれる肌診断用の特定の抗原を検出するために用いられる検出キットが記載されている。この検出キットは、検体を貯留するための複数の穴部を有する基材と、抗原を特異的に認識する特異抗体と、穴部の内面に吸着したポリマーとを有し、複数の穴部のうち第１の穴部の内面には第１のポリマーを介して第１の特異抗体が担持され、第２の穴部の内面には第２のポリマーを介して第２の特異抗体が担持されており、第１の穴部において、検体中の第１の抗原が第１の抗体に認識されることにより検出され、第２の穴部において、検体中の第２の抗原が第２の抗体に認識されることにより検出される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−２２８３８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従来の抗体固定基板は、抗体（捕捉用抗体）の固定化または非特異吸着抑制などの目的で設けられる表面コーティングを除いて、基本的に捕捉用抗体のみが固定される。抗体固定基板を用いて検体中の抗原は、捕捉用抗体、抗原、検出用抗体および標識を含む免疫複合体を形成することによって検出されるが、この免疫複合体を構成する要素は逐次的に反応させられる。今後、上記工程の削減による時間短縮・費用削減が望まれる。
【０００５】
そこで本発明の目的は、アナライトの検出に必要な手順の簡略化が可能な生体分子固定基材を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（１）
本発明の生体分子固定基材は、基材上に固定された捕捉用生体分子と、捕捉用生体分子の近傍で基材上に付着された検出用生体分子と標識物質と、を含む。
【０００７】
このように、基材上に検出用生体分子が標識物質とともに予め用意されているため、手順が簡略化される。
【０００８】
捕捉用生体分子が基材上に「固定」されている状態とは、基材に捕捉用生体分子が共有結合または非共有結合（イオン結合または水素結合）によって結合しており、水系液体（水、水溶液、コロイド溶液などであって、捕捉用生体分子と基材との共有結合および非共有結合の切断に実質的に関与しないもの）が接触したとしても、基材から遊離することなく安定的に結合状態が保たれる程度の結合状態をいう。
【０００９】
検出用生体分子が基材上に「付着」している状態とは、水系液体（水、水溶液、コロイド溶液などであって、捕捉用生体分子と基材との共有結合および非共有結合の切断に実質的に関与しないもの）が存在しない場合では検出用生体分子が基材上に留まった状態を維持できる一方、検出用生体分子が当該水系液体に接触した場合には、基材から遊離して水媒体に取り込まれる結合状態をいう。したがって、アナライト（分析すべき物質）を含む試料液と接触することを契機として付着状態が解除される。
【００１０】
近傍とは、固定化生体分子と、アナライトと、検出用生体分子とが複合体を形成する反応系の反応場の領域内にあることをいう。例を挙げると、当該反応場がウェルまたは流路である場合、近傍とは、同一のウェル内または同一の流路内にあることをいう。
【００１１】
検出用生体分子は、少なくとも、検出目的のアナライト上の、捕捉用生体分子が認識する部位とは異なる部位と特異的に結合する生体分子である。
【００１２】
なお、本明細書中における「生体分子」は、生体内に存在する分子を基本構造として有し、かつアナライトとの結合性を有するアフィニティ分子をいう。つまり、アナライトとの結合性を有する限り、天然の分子および天然の分子の分解物のみならず、それらを化学反応により人工的に変化させた分子、遺伝子工学的に変異された分子、および人工的に合成した分子も含む。
【００１３】
（２）
検出用生体分子および標識物質は、凍結乾燥物の状態で基材上に付着していてよい。
【００１４】
この場合、検出用生体分子および標識物質の活性が良好な状態であるとともに、取り扱いが容易である点で好ましい。
【００１５】
（３）
基材が、非特異的吸着抑制高分子化合物層を表面に有してよい。
【００１６】
この構成によって、バックグランドが低く、高Ｓ／Ｎを得ることができる状態であるとともに、基材上で付着状態にある検出用生体分子および標識物質がアナライトを含む試料液と接触した場合に、基材から容易に遊離して、速やかに反応系を構築することができる。
【００１７】
（４）
標識物質は、蛍光物質であってよい。
【００１８】
この場合、生体分子固定基材の使用方法をより簡素にすることができる。
【００１９】
（５）
生体分子は、糖鎖、核酸、ペプチド、タンパク質、およびそれらの複合体からなる群から選ばれる分子種であってよい。
【００２０】
複合体の例としては、糖ペプチド、糖タンパク質、およびペプチド核酸など、任意の組み合わせによる複合体が挙げられる。
【００２１】
（６）
生体分子は、抗体およびレクチンからなる群から選ばれる分子種であってよい。
【００２２】
このように、本発明では、様々なアフィニティ分子に適用することができるため、様々なアナライトに広く適用することができる。さらに、検出用生体分子と捕捉用生体分子とで同じ分子種だけでなく、異なる分子種を組み合わせることもできるため、さらに様々なアナライトに適用することができる。
【００２３】
（７）
検出用生体分子はビオチン化された生体分子であり、標識物質はアビジン類を含むものであってよい。
【００２４】
この場合、低分子のビオチンが生体分子の複数の箇所に結合可能であり、且つ、アビジン類との強力な結合によって検出できるため、高感度での検出が可能となる。
なお、アビジン類には、塩基性のアビジンおよび中性のストレプトアビジンが含まれる。
【００２５】
（８）
標識物質は、ストレプトアビジンに直接結合した標識であってよい。
【００２６】
この場合、ストレプトアビジンが中性であるため基材への非特異的結合が少ないとともに、標識が直接結合した状態であるため安定性が高い状態で付着状態を維持することができる。
【００２７】
（９）
本発明の生体分子固定基材の製造方法は、基材上に捕捉用生体分子を固定する固定化工程と、基材上に、検出用生体分子と標識物質とを含む液を用意し、当該液を凍結乾燥させる凍結乾燥工程とを含む。
【００２８】
これによって、基材上に活性が良好な状態の検出用生体分子および標識物質が予め用意された生体分子固定基材を製造することができる。この生体分子固定基材は取り扱いが容易であり、使用に当たっては、アナライトの検出に必要な手順が簡略化される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】第１実施形態の生体分子固定基材の断面図を模式的に示す。
【図２】図１の生体分子固定基材の製造方法を説明する模式的断面図である。
【図３】図１の生体分子固定基材の製造方法を説明する模式的断面図である。
【図４】図１の生体分子固定基材の製造方法を説明する模式的断面図である。
【図５】図１の生体分子固定基材の使用方法を説明する模式的断面図である。
【図６】図１の生体分子固定基材の使用方法を説明する模式的断面図である。
【図７】図１の生体分子固定基材の使用方法を説明する模式的断面図である。
【図８】第１実施形態の生体分子固定基材の第１変形例を模式的に示す。
【図９】第１実施形態の生体分子固定基材の第２変形例を模式的に示す。
【図１０】第１実施形態の生体分子固定基材の第３変形例を模式的に示す。
【図１１】第１実施形態の生体分子固定基材の第４変形例を模式的に示す。
【図１２】第２実施形態の生体分子固定基材の断面図を模式的に示す。
【図１３】第３実施形態の生体分子固定基材の断面図を模式的に示す。
【図１４】実施例の生体分子固定基材を用いた検体検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
［１．第１実施形態］
以下、アナライトを抗原とし、捕捉用生体分子および検出用生体分子がいずれも抗体である場合を挙げ、本発明を説明する。
【００３１】
［１−１．生体分子固定基材］
［１−１−１．基本構成］
図１は、第１実施形態の生体分子固定基材の一例を模式的に示す。図１に示す生体分子固定基材１００は、基材２００と、捕捉用抗体２５０と、検出用抗体３１０と、標識３５０とを含む。
【００３２】
［１−１−２．基材］
基材２００は、固相となりうるものであれば透明および不透明を問わずどのような材料で構成されてもよい。
基材２００の材料としては、樹脂、多糖系ポリマー、無機ポリマー、金属および磁性体を問わない。
【００３３】
樹脂としては、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、および光硬化性樹脂が挙げられ、より具体的には、（メタ）アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリシクロオレフィンなど）、エステル系樹脂（ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレートなど）、スチレン系樹脂（ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体、スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン−スチレン共重合体など）、ポリサルフォン、ポリカーボネート、ポリイミド、エポキシ系樹脂、フェノール系樹脂、塩素含有樹脂（ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）フッ素含有樹脂、シリコーン系樹脂、金属錯体樹脂などが挙げられる。多糖系ポリマーとしては、アガロース、セファロース、デキストランなどが挙げられる。無機ポリマーとしては、シリカゲル、ガラスなどが挙げられる。基材２００は、上記の材料から選択される１種が単独で、または複数種が組み合わされて構成されてよい。
【００３４】
基材２００の形態は、本実施形態ではウェル２１０が形成されたウェルプレート、好ましくは多穴ウェルプレートである。ウェル２１０内は、捕捉用抗体２５０、検出用抗体３１０、および標識３５０の免疫複合体を形成させる抗原抗体反応系の反応場となる。本実施形態の他にも、基材２００の形態は、流路チップ（１または複数の流路が設けられてよい）、スライド形状基板、容器、ビーズなど様々な形態から選ばれてよい。
【００３５】
［１−１−３．表面コーティング］
［１−１−３−１．コーティング態様］
基材２００の表面には、コーティング層２３０が設けられている。コーティング層２３０は、１個の基材２００の表面全体に設けられてもよいし、基材２００の表面のうち特定領域のみに設けられてもよい。１個の基材２００に対して当該特定領域が複数設けられる場合、特定領域の全てにおいて同じ材料で構成されるコーティング層２３０が設けられてもよいし、一部の特定領域と他の特定領域とにおいて、それぞれ異なる材料で構成されるコーティング層２３０が設けられてもよい。
【００３６】
本実施形態では、図１に示すように、特定領域としてウェル２１０の底面のみを被覆するように設けられているが、加えて、ウェル２１０の側面も被覆するように設けられてもよい。基材２００が多穴ウェルプレートである場合、１個のウェルプレートの全てのウェル２１０において、同じ材料で構成されるコーティング層２３０が設けられてもよいし、一部のウェル２１０と他のウェル２１０とにおいて、それぞれ異なる材料で構成されるコーティング層２３０が設けられてもよい。
【００３７】
基材２００が本実施形態のようなウェルプレートでない場合も、同様にコーティング層２３０が設けられる。たとえば基材２００が流路チップの場合、コーティング層２３０は、流路の底面、または側面と底面とを被覆するように設けられてよい。基材２００がスライド形状基板の場合、コーティング層２３０は、基板２００の表面全体を被覆するように設けられてもよいし、基板２００の特定領域を被覆するように設けられてもよい。当該特定領域は、１または複数設けられてよい。基材２００が容器の場合、コーティング層２３０は、容器の底面、または側面と底面とを被覆するように設けられてよい。基材２００がビーズの場合、コーティング層２３０は、ビーズ表面全体を被覆するように設けられてよい。
【００３８】
［１−１−３−２．コーティング層の材料−基本構造と機能性基］
コーティング層２３０は、基材２００とは異なる材料で構成され、当該材料は当業者が目的に応じて適宜選択することができる。コーティング層２３０は高分子化合物で構成されてよい。好ましくは、エチレン系不飽和重合性モノマー単位を構成単位とする高分子化合物を基本構造として有する。エチレン系不飽和重合性モノマー単位としては、（メタ）アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリシクロオレフィンなど）、スチレン系樹脂（ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体、スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン−スチレン共重合体など）、塩素含有樹脂（ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素含有樹脂、などの樹脂を構成可能なモノマー単位が挙げられる。コーティング層２３０を構成し得る高分子化合物は、上記の単位から選択される１種を単独で含む高分子化合物であってもよいし、複数種が組み合わされた高分子化合物であってもよい。
【００３９】
コーティング層２３０表面には、機能性基２３５が露出している。（なお、図示された機能性基２３５は、コーティング層２３０の片面に強調表示しているが、図示していない面にも当然露出している。）機能性基２３５は、親水性基、結合性基、疎水性基、架橋基などが挙げられ、それぞれ、目的に対応する機能を発揮する。なお、本明細書において、単に「結合性基」と記載する場合は、捕捉用生体分子と結合するための基を指し、後述の捕捉用生体分子が有する「固相結合性基」とは区別される。
【００４０】
たとえば、機能性基２３５が親水性基として機能する場合は、抗原、抗体など不所望物質の基材２００への非特異吸着を抑制する。
機能性基２３５が結合性基として機能する場合は、捕捉用抗体２５０における固相結合性基と共有結合または非共有結合することにより、捕捉用抗体２５０を基材２００に固定化させる。なお、コーティング層２３０が結合性基として機能する機能性基２３５を有してなくても、捕捉用抗体２５０を非共有結合により固定化させることができる。
【００４１】
機能性基２３５が疎水性基として機能する場合は、コーティング層２３０の基材２００表面への吸着性を確保するため、基材２００表面をコーティング層２３０で安定的に被覆する。
機能性基２３５が架橋基として機能する場合は、高分子化合物の主鎖を架橋させることにより、当該高分子化合物に不溶性を付与することができる。あるいは、基材２００表面に架橋して基材２００と強固に結合することができる。
コーティング層２３０は、複数種の機能性基２３５を有することが好ましく、この場合、複数の機能を発揮することができる。
【００４２】
コーティング層２３０が上記の高分子化合物を基本構造として有する場合、機能性基２３５は、高分子化合物のモノマー単位の置換基を構成する。この場合、コーティング層２３０は、上記の基本構造を有する多官能高分子化合物で構成されることが好ましい。
【００４３】
本実施形態におけるコーティング層２３０は、機能性基２３５として少なくとも親水性基を有することができ、この場合、非特異吸着抑制高分子化合物の層といえる。非特異吸着抑制高分子化合物は優れた非特異吸着抑制効果を有するため、基材２００表面上に付着した検出用抗体３１０および標識３５０（後述）を、検体との接触時に容易に基材２００表面から遊離させることができる。このようなコーティング層２３０を構成する高分子化合物としては、機能性基２３５として親水性基を有していれば任意であるが、機能性基２３５として親水性基を有する高分子化合物、機能性基２３５として親水性基および疎水性基を有する高分子化合物、機能性基２３５として親水性基、結合性基および疎水性基を有する高分子化合物、機能性基２３５として親水性基、結合性基および架橋基を有する高分子化合物などが挙げられる。
【００４４】
なお、本実施形態の他、コーティング層２３０を構成する高分子化合物は、機能性基２３５として結合性基を有さなくてもよい。この場合、非共有結合により固定化される。
【００４５】
［１−１−３−３．コーティング層の材料−機能性基（親水性基）］
親水性基は、非特異吸着の抑制が可能な基であれば特に限定されない。
具体的な例としては、ホスホリルコリン基およびアルキレングリコール残基が挙げられる。
【００４６】
ホスホリルコリン基を機能性基２３５として有する単位としては、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基等が挙げられる。
【００４７】
上記の単位を構成する基の中でも、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。これにより、基材２００の表面における非特異的吸着をより確実に抑制することができる。
【００４８】
コーティング層２３０を構成する高分子化合物において、ホスホリルコリン基を機能性基２３５として有する単位の割合は特に限定されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、５ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは１５ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下である。
【００４９】
アルキレングリコール残基を機能性基２３５として有する単位の由来元となるモノマーとしては、たとえば、下記一般式［２Ａ］で表されるエチレン系不飽和モノマーが挙げられる。
【００５０】
【化１】
2016173237.tif 000003
【００５１】
上記式［２Ａ］のエチレン系不飽和モノマーは、（メタ）アクリル基がアルキレングリコール残基Ｙとを含む。より具体的には、式［２Ａ］中、Ｒ２は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１以上２０以下のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１以上１０以下であってよいアルキレングリコール残基を示し、ｑは１以上１００以下であってよい整数を示す。
【００５２】
式［２Ａ］中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１以上１０以下であってよく、好ましくは１以上６以下であり、より好ましくは２以上４以下であり、さらに好ましくは２以上３以下であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、１以上１００以下の整数であってよく、好ましくは２以上１００以下の整数であり、より好ましくは２以上９５以下の整数であり、最も好ましくは５以上９０以下の整数である。コーティング層２３０を構成する高分子化合物が、ｑの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、ｑは、当該高分子化合物全体における平均値として特定される。繰り返し数ｑが２以上の場合は、Ｙは同一であっても、異なっていてもよい。
【００５３】
アルキレングリコール残基を機能性基２３５として有する単位の由来元となるエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、より具体的には、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００５４】
これらのなかでも、抗体および抗原の非特異的吸着の少なさおよび入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。特に、エチレングリコール残基の平均繰り返し数が５以上９０以下であるメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが、合成時の操作性（ハンドリング）の良さの点からより好ましく用いられる。
【００５５】
コーティング層２３０を構成する高分子化合物において、アルキレングリコール残基を機能性基２３５として有する単位の割合は特に限定されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、０ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは３０ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは５０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下である。
【００５６】
［１−１−３−４．コーティング層の材料−機能性基（結合性基）］
結合性基は、捕捉用抗体と共有結合または非共有結合が可能な基であれば特に限定されず、たとえば、化学的に活性な（つまり捕捉用抗体との反応性が高くなるように活性化された）基、受容体基、リガンド基等が挙げられる。
【００５７】
具体的な例としては、活性化されたカルボキシル誘導基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチニル基、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、アビジン、ストレプトアビジン、金属キレート等があるがこれらに限定されない。これらの中でも捕捉用抗体に多く含まれるアミノ基との反応性の点から、アルデヒド基、活性化されたカルボキシル誘導基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また捕捉用抗体と結合定数が高いビオチニル基も好ましい。特に、モノマーの保存安定性の点から活性化されたカルボキシル誘導基が好ましい。
【００５８】
このような結合性基を機能性基２３５として有する単位の由来元となるモノマーとしては、たとえば、下記の一般式［１Ａ］で表されるエチレン系不飽和モノマーが挙げられる。
【００５９】
【化２】
2016173237.tif 000004
【００６０】
上記式［１Ａ］のエチレン系不飽和モノマーは、（メタ）アクリル基に、活性化されたカルボキシル誘導基が、アルキレングリコール残基またはアルキル基の連結基を介して結合している。より具体的には、式［１Ａ］中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１以上１０以下であってよいアルキレングリコール残基またはアルキレン基である二価の連結基を示し、Ｗは活性化されたカルボキシル誘導基を示す。ｐは１以上１００以下の整数であってよい。
【００６１】
アルキレングリコール残基は、それ自体がタンパク質の非特異吸着を抑制する性質を有している。このため、上記式［１Ａ］のエチレン系不飽和モノマーは、連結基Ｘがアルキレングリコール残基である場合、捕捉用抗体を固定化する性質と、抗体類および抗原の非特異吸着を抑制する性質とを併せ持つ。
【００６２】
式［１Ａ］で、連結基Ｘがアルキレングリコール残基である場合、Ｘの炭素数は１以上１０以下であってよく、好ましくは１以上６以下であり、より好ましくは２以上４以下であり、さらに好ましくは２以上３以下であり、最も好ましくは２である。
【００６３】
なお、アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側末端または両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）をいう。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）である。
【００６４】
Ｘの繰り返し数ｐは、１以上１００以下の整数であってよく、Ｘがアルキレングリコール残基の場合、より好ましくは２以上５０以下の整数であり、さらに好ましくは２以上３０以下の整数であり、最も好ましくは２以上２０以下の整数である。コーティング層２３０を構成する高分子化合物が、ｐの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、ｐは、当該高分子化合物全体における平均値として特定される。繰り返し数ｐが２以上の場合は、繰り返されるＸは同一であっても、異なっていてもよい。
【００６５】
式［１Ａ］で、連結基Ｘがアルキレン基である場合、ｐ個分のアルキレン基の炭素数の合計（（Ｘ）ｐ）が１以上１００以下であることが好ましく、１以上２０以下であることがより好ましい。アルキレン基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。
【００６６】
活性化されたカルボン酸誘導基は、カルボキシル基が活性化された基であり、下記式（１Ｂ）に示されるように、カルボニル基に脱離基Ａ（水酸基を除く。）が結合した基である。
【００６７】
【化３】
2016173237.tif 000005
【００６８】
上記式（１Ｂ）で示される活性化されたカルボン酸誘導基は、脱離基Ａとして酸性度の高い電子求引性基を有することにより求核反応に対して活性化された基である。具体的には、活性化されたカルボン酸誘導基としては、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸等のカルボン類のカルボキシル基が、活性エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性化アミドに変換された基が挙げられる。
【００６９】
活性エステル基の例として、下記式（ｐ）または下記式（ｑ）で表されるようにＯＣＲ１またはＯＮＲ２を脱離基Ａとして有する基が挙げられる。
【００７０】
【化４】
2016173237.tif 000006
【００７１】
上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、一価の有機基であってよく、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ１はＣとともに脂肪族環を形成する二価の基であってもよいし、Ｃとともに芳香族環を形成する基であってもよい。さらに、上記式（ｑ）において、Ｒ２はＮとともに脂肪族環を形成する二価の基であってもよいし、Ｎとともに芳香族環を形成する基であってもよい。なお、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ１およびＲ２がそれぞれＣまたはＮとともに芳香族環を形成する場合を除き、当該ＣおよびＮには、Ｒ１およびＲ２の価数に応じ、表示を省略したＨが結合している。
【００７２】
活性エステル基のより具体的な例として、上記式（ｐ）に示されるＯＣＲ１基がｐ−ニトロフェニル基（下記式（ｗ）参照）等である置換または無置換のフェノール活性エステル基；および、上記式（ｑ）に示されるＯＮＲ２基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基（下記式（ｕ）参照）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド基、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、等であるＮ−ヒドロキシイミド活性エステル基が挙げられる。中でも、保存安定性と反応性の高さとのバランスの点からｐ−ニトロフェノール活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェノール活性エステル基が特に好ましい。
【００７３】
【化５】
2016173237.tif 000007
【００７４】
活性エステルの他の例として、上記活性エステル基に対応するチオエステル基も挙げられる。好ましくは、置換または無置換のチオフェノールエステル基が挙げられる。
【００７５】
活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れる点で好ましく用いられる。穏やかな条件としては、例えば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらに具体的にはｐＨ８．０とすることができる。
【００７６】
酸無水物基の例としては、下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される基が挙げられる。
【化６】
2016173237.tif 000008
【００７７】
酸ハロゲン基の例としては、上記式（１Ｂ）において−Ｃｌおよび−Ｆ等のハロゲンを脱離基Ａとして有する基が挙げられる。
【００７８】
活性化アミド基としては、下記式（ｖ）等に示される基が挙げられる。
【化７】
2016173237.tif 000009
【００７９】
上記した結合性基を有する単位の由来元となるエチレン系不飽和重合性モノマーとして、特に好ましい化合物は、下記式に示すｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）メタクリレートである。下記式中、エチレングリコールの繰り返し数ｐは２以上２０以下が好ましい。
【化８】
2016173237.tif 000010
【００８０】
コーティング層２３０を構成する高分子化合物において、結合性基を機能性基２３５として有する単位の割合は、特に限定されない。たとえば、コーティング層２３０を構成する高分子化合物が、機能性基２３５として親水性基、結合性基および疎水性基を有するものである場合、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、１ｍｏｌ％以上３０ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは１ｍｏｌ％以上２０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは２ｍｏｌ％以上１５ｍｏｌ％以下である。またたとえば、コーティング層２３０を構成する高分子化合物が、機能性基２３５として親水性基、結合性基および架橋基を有するものである場合、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、１ｍｏｌ％以上９９．７ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは１ｍｏｌ％以上７０ｍｏｌ％以下、最も好ましくは１ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％である。
【００８１】
［１−１−３−５．コーティング層の材料−機能性基（疎水性基）］
疎水性基は、上記の親水性基より疎水性である基であれば特に限定されない。
具体的な例としては、直鎖、分岐、および環状のアルキル基が挙げられる。アルキル基の炭素数は、たとえば１以上２０以下、好ましくは４以上２０以下である。
【００８２】
このような疎水性基を機能性基２３５として有する単位の由来元となるモノマーとしては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで特に好ましい基として、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートが挙げられる。
【００８３】
コーティング層２３０を構成する高分子化合物において、疎水性基を機能性基２３５として有する単位の割合は特に限定されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、２０ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは３０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは３０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下である。
【００８４】
［１−１−３−６．コーティング層の材料−機能性基（架橋基）］
架橋基は、高分子化合物同士を架橋する基、または高分子化合物と基材２００表面とを架橋する基であれば特に限定されない。
このような架橋基は、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが重合した後、架橋可能な官能基を反応させて、高分子化合物同士を架橋することによって生じさせることができる。
【００８５】
架橋可能な官能基としては、エチレン系不飽和重合性モノマーの重合反応中には反応しない架橋性基であれば特に限定されない。例えば、加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、（メタ）アクリル基、グリシジル基などが挙げられる。中でも、架橋処理が容易なことから、加水分解によりシラノール基を生成する官能基、エポキシ基、グリシジル基が好ましい。さらに、より低温で架橋できることから、加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。
【００８６】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。中でも、ハロゲンを含まないことから、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましい。さらに、シラノール基を生成し易い点から、アルコキシシリル基が最も好ましい。
【００８７】
加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が直接または炭素数１以上２０以下のアルキル鎖を介して結合した一般式［３Ａ］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。
【００８８】
【化９】
2016173237.tif 000011
【００８９】
アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。中でも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００９０】
コーティング層２３０を構成する高分子化合物において、架橋可能な官能基を有する単位の割合は、特に制限されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、好ましくは１ｍｏｌ％以上２０ｍｏｌ％以下であり、より好ましくは２ｍｏｌ％以上１５ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは２ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下である。
【００９１】
［１−１−３−７．コーティング層の材料−好適例］
以上より、コーティング２３０を構成する高分子化合物のより具体的な好適例として、下記式（２Ｂ）に示す多官能メタクリル系樹および［５Ａ］に示す多官能メタクリル系高分子化合物）が挙げられる。
【００９２】
【化１０】
2016173237.tif 000012
【００９３】
上記式（２Ｂ）において、ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立した正の整数であり、ｎは、１以上１００以下の整数を示す。
また、上記式（２Ｂ）では３種の単位から構成されていることを表しているが、それぞれの単位の重合態様はブロック共重合でもよいし、ランダム共重合でもよい。
【００９４】
【化１１】
2016173237.tif 000013
【００９５】
上記式［５Ａ］において、Ａ１、Ａ２、Ａ３はそれぞれ同一または異なっていてよく、それらの内、少なくとも１つはアルコキシ基であり、Ａ１、Ａ２、Ａ３のいずれかがアルコキシ基でない場合、当該アルコキシ基でない基はアルキル基である。ａ、ｂおよびｃは、それぞれ独立した正の整数であり、ｐおよびｑは、それぞれ独立した１以上１００以下の整数を示す。
また、上記式［５Ａ］では３種の単位から構成されていることを表しているが、それぞれの単位の重合態様はランダム共重合、ブロック共重合、グラフト共重合等いずれの重合態様であってもよい。
なお上記式［５Ａ］は、架橋前の状態を示しており、コーティング層２３０においては、アルコキシ基が加水分解により架橋基を形成している。
【００９６】
［１−１−４．捕捉用抗体］
コーティング層２３０には、捕捉用抗体２５０が結合している。具体的には、コーティング層２３０の側に機能性基２３５として結合性基が露出しており、このコーティング層２３０の結合性基（機能性基２３５）と捕捉用抗体２５０側の固相結合性基とが結合することによって、捕捉用抗体２５０が固定される。
【００９７】
捕捉用抗体２５０と基材２００との結合態様は、捕捉用抗体２５０の結合安定性の点からは、共有結合による固定が好ましいが、特異的結合によるものであれば非共有結合（イオン結合または水素結合）による固定であっても構わない。非共有結合による固定である場合、結合速度定数ka（単位1/Ms）が少なくとも１０3または少なくとも１０4、たとえば１０3以上１０5以下または１０4以上１０5以下の親和性を有することが好ましい。
【００９８】
このように、捕捉用抗体２５０は安定的に固定されているため、水系液体が接触したとしても、基材２００から遊離することなく安定的に結合状態が保たれる。なお、この場合の水系液体とは、水、水溶液、コロイド溶液などを含み、捕捉用抗体２５０と基材２００との共有結合または非共有結合の切断に関与しないものを指す。
【００９９】
捕捉用抗体２５０の固定密度（本実施形態ではウェル２１０内の固定密度）としては特に限定されないが、たとえば、基材２００の表面積３００００μｍ２あたり１０μｇ以上１０００μｇ以下であってよい。固定密度を上記下限値以上とすることによって、抗原を良好な感度で検出しやすく、上記上限値以下とすることによって、抗原との結合に際しての立体的な障害を回避しやすい。
【０１００】
本実施形態では、コーティング層２３０側の結合性基（機能性基２３５）が活性エステルである一方、捕捉用抗体２５０側の固相結合基が、抗体が生来的に有するアミノ基であり、それらが共有結合を形成している。本発明の他の実施形態では、コーティング層２３０側の結合性基（機能性基２３５）と捕捉用抗体２５０側の固相結合性基との組み合わせとして、上記以外の組み合わせが当業者によって適宜選択される。
【０１０１】
コーティング層２３０側の結合性基（機能性基２３５）がアミノ基に結合可能な官能基（たとえば、カルボキシル基、活性化されたカルボキシル誘導基、エポキシ基、アルデヒド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、ビオチニル基など）でない場合は、捕捉用抗体２５０側の固相結合基は、分解、合成、修飾などの反応によって人工的に生じさせたものであってよい。たとえば、捕捉用抗体２５０側の固相結合基は、抗体の消化および／または還元により生じさせたチオール基、抗体が生来的に有するアミノ基の修飾によるビオチニル基などが挙げられる。
【０１０２】
捕捉用抗体２５０は、検体中の抗原を特異的に認識する分子認識系を構築することができるアフィニティ物質である。捕捉用抗体２５０は、検出目的となる抗原に応じ、当業者によって適宜選択されるものである。１個のウェル２１０には、１種類の捕捉用抗体２５０のみが固定されていてもよいし、複数種の捕捉用抗体２５０が固定されていてもよい。基材２００が多穴ウェルプレートである場合、１個のウェルプレートの全てのウェル２１０において、同じ捕捉用抗体２５０または同じ組み合わせの捕捉用抗体２５０が固定されていてもよいし、一のウェル２１０と他のウェル２１０とにおいて、それぞれ異なる捕捉用抗体２５０または異なる組み合わせの捕捉用抗体２５０が固定されていてもよい。
【０１０３】
捕捉用抗体２５０は、免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片からなる群から選ばれる抗体物質である。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４等が挙げられる。免疫グロブリンは、いかなる動物由来であってもよいが、特にヒト由来である。また、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を問わず、特異性の点ではモノクローナル抗体が好ましく、感度の点ではポリクローナル抗体が好ましい。
【０１０４】
免疫グロブリン断片としては、抗原結合能を有する断片であれば特に限定されない。このような断片としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｌ鎖、及びＨ鎖などが挙げられる。
【０１０５】
［１−１−５．検出用抗体および標識］
［１−１−５−１．付着態様］
検出用抗体３１０および標識３５０は、捕捉用抗体２５０の近傍で基材２００上に付着している。検出用抗体３１０および標識３５０は、捕捉用抗体２５０とともに免疫複合体を形成する抗原抗体反応系の反応場となるべき領域（本実施形態ではウェル２１０内の領域）において、基材２００上で共存する。
【０１０６】
検出用抗体３１０および標識３５０の付着態様は、捕捉用抗体２５０よりも弱い力で基材２００上に物理吸着しているものであり、捕捉用抗体２５０のような固定態様とは異なる。たとえば、基材２００上の捕捉用抗体２５０と接触した場合に捕捉用抗体２５０の固定態様に影響を与えない（つまり捕捉用抗体２５０固定状態を解除しない）水系液体を想定した場合、検出用抗体３１０および標識３５０は、基材２００上で当該水系液体と接触することにより、基材２００上から遊離して水媒体内に取り込まれる。
【０１０７】
検出用抗体３１０および標識３５０は、凍結物として付着していてもよいし、凍結乾燥物として付着していてもよい。
【０１０８】
付着物が凍結状態の場合、溶媒または分散媒の凍結物（特に氷）の中に、溶質または分散質であった検出用抗体３１０および標識３５０が散在した状態で存在する。つまり、溶質または分散質であった検出用抗体３１０および標識３５０が、溶媒または分散媒の凍結物が介在された状態で安定的に存在する。
【０１０９】
付着物が凍結乾燥状態の場合、検出用抗体３１０および標識３５０が、ポーラス塊として存在する。つまり、検出用抗体３１０および標識３５０が、気体が介在された状態で安定的に存在する。
【０１１０】
このような付着状態であることにより、活性が良好な状態で保存することができるとともに、検出用抗体３１０および標識３５０を含む付着物が水系液体に接触した場合に、基材２００から容易に遊離して水系媒体に取り込まれる。したがって、アナライトを含む試料液を接触することを契機として容易に付着状態を解除することができる。
【０１１１】
特に凍結乾燥物として付着している態様は、たとえば保存がより容易である点、基材２００が複数の検出箇所（本実施形態ではウェル２１０）を有する場合には、一部のウェル２１０のみを使用し、他のウェル２１０の使用は別の機会に保留することが容易である点、などで好ましい。
【０１１２】
検出用抗体３１０の付着量は、捕捉用抗体２５０の固定量、検体の種類、検体の濃度等に応じて当業者が適宜決定してよいが、たとえば、反応場（本実施形態ではウェル２１０）１個あたり、０．０１μｇ以上１０μｇ以下程度であってよい。標識３５０も同様に当業者が適宜決定してよいが、たとえば、反応場１個あたり０．０５μｇ以上１５μｇ以下程度であってよい。
【０１１３】
［１−１−５−２．検出用抗体］
検出用抗体３１０は、検出目的の抗原上の部位のうち、捕捉用抗体２５０が認識する部位とは異なる部位をエピトープとする抗体物質である。さらに検出用抗体３１０は、標識３５０と結合した状態、または結合可能な態様で標識３５０と別個独立した状態の抗体物質である。ここで、検出用抗体３１０と標識３５０との結合態様は、直接的結合であっても間接的結合であってもよい。
【０１１４】
抗体物質は免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片からなる群から選ばれる。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４等が挙げられる。免疫グロブリンは、いかなる動物由来であってもよいが、特にヒト由来である。また、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を問わず、特異性の点ではモノクローナル抗体が好ましく、感度の点ではポリクローナル抗体が好ましい。
【０１１５】
免疫グロブリン断片としては、抗原結合能を有する断片であれば特に限定されない。このような断片としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆ（ａｂ’）、Ｆａｂ、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｌ鎖、及びＨ鎖などが挙げられる。
【０１１６】
本実施形態では、検出用抗体３１０はビオチン化された免疫グロブリンであり、標識３５０と別個独立した状態である。検出用抗体３１０はビオチニル基３１５により、標識３５０（つまりアビジン類３５５の標識）と間接的に結合可能な態様をなす。
【０１１７】
検出用抗体３１０と標識３５０との結合を可能にする要素は、検出用抗体３１０側のビオチニル基３１５と標識３５０側のアビジン類３５５であるが、両者の結合を可能にする要素の組み合わせはこれに限定されるものではなく、当業者が適宜選択することができる。また、ビオチニル基３１５とアビジン類３５５とは入れ替わってもよい。
【０１１８】
［１−１−５−３．標識］
標識３５０としては、蛍光物質、酵素、および放射性物質など特に限定されない。この中でも、蛍光物質は、安全性、および生体分子固定基材１００の使用方法が簡素である点で好ましい。蛍光物質としては、蛍光色素および蛍光タンパク質が挙げられる。蛍光物質の中でも、蛍光化合物は生体物質でないため、基材２００上で安定的な付着状態を維持しやすい点で好ましい。
【０１１９】
蛍光色素としては、フルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（Integrated DNA Technologies社）、ポリハロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、ヘキサクロロフルオレセイン・ファミリーの蛍光色素（アプライドバイオシステムズジャパン(株)）、クマリン・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ローダミン・ファミリーの蛍光色素（GEヘルスケア  バイオサイエンス(株)）、シアニン・ファミリーの蛍光色素、インドカルボシアニン・ファミリーの蛍光色素、オキサジン・ファミリーの蛍光色素、チアジン・ファミリーの蛍光色素、スクアライン・ファミリーの蛍光色素、キレート化ランタニド・ファミリーの蛍光色素、BODIPY（登録商標）・ファミリーの蛍光色素（インビトロジェン(株)）、ナフタレンスルホン酸・ファミリーの蛍光色素、ピレン・ファミリーの蛍光色素、トリフェニルメタン・ファミリーの蛍光色素、Alexa Fluor（登録商標）色素シリーズ（インビトロジェン(株)）等の有機蛍光色素が挙げられる。
蛍光タンパク質としては、青色蛍光タンパク質（BFP）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、緑色蛍光タンパク質（GFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、赤色蛍光タンパク質（DsRed）またはAllophycocyanin（APC；LyoFlogen（登録商標））などが挙げられる。
【０１２０】
放射性物質としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど）が挙げられる。
【０１２１】
酵素としては、ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）およびＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）が挙げられる。
【０１２２】
本実施形態では、標識３５０はアビジン類３５５に結合しており、前述の検出用抗体３１０のビオチニル基３１５と強力に結合することができる。アビジン類３５５としては、ビオチン結合性タンパク質であればよく、たとえば、塩基性のアビジンおよび中性のストレプトアビジンが含まれる。
【０１２３】
［１−２．生体分子固定基材の製造］
図２から図４に、生体分子固定基材１００の製造方法を模式的に示す。
【０１２４】
［１−２−１．コーティング層に使用する高分子化合物の合成］
コーティング層に使用する高分子化合物は、既に述べた単位の由来元となるモノマーを適宜選択して混合し、ラジカル重合などの公知の重合方法によって合成することができる。例えば、アルゴン、窒素等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
【０１２５】
溶液重合に使用される溶媒は、たとえば、アルコール（メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブチルアルコール等）、エーテル（ジエチルエーテル等）、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム等の有機溶媒が挙げられる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【０１２６】
重合開始剤としては、たとえば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ化合物；過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物等が挙げられる。これらの重合開始剤は、１種または２種以上の組み合わせで用いられる。
【０１２７】
コーティング層に使用する高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応のモノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【０１２８】
［１−２−２．コーティング層の被覆］
図２は、コーティング層２３０の被覆工程を模式的に示す。被覆工程においては、コーティング層に使用する高分子化合物で基材２００表面（本実施形態においてはウェル２１０の底面）を被覆する。
【０１２９】
基材２００表面にコーティング層に使用する高分子化合物を被覆する際、前処理として、基材２００表面を活性化してもよい。これにより、基材２００表面とコーティング層２３０との密着性が高まる。活性化する方法としては、たとえば、酸素、アルゴン、窒素、空気などの雰囲気下でプラズマ処理する方法、ArF、KrFなどのエキシマレーザーで処理する方法がある。この中でも、酸素雰囲気下でプラズマ処理する方法が好ましい。
【０１３０】
基材２００表面へのコーティング層２３０の被覆は、たとえば、有機溶剤にコーティング層に使用する高分子化合物を、０．０１重量％以上１５重量％以下、好ましくは０．０５重量％以上１０重量％以下となるように溶解し、浸漬、吹き付け、塗布等の公知の被覆法によって被覆し、その後、室温下または加熱条件下において乾燥させることによって行われてよい。
【０１３１】
コーティング層に使用する高分子化合物を溶解させる媒体としては、基材２００を変性させない溶剤が当業者によって適宜選択される。たとえば、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等の有機溶媒が単独で、または複数が組み合わされて使用される。中でも、エタノール、メタノールがプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすい点で好ましい。
【０１３２】
［１−２−３．コーティング層の被覆−架橋性基を有する場合］
コーティング層２３０が架橋基を有する高分子化合物である場合は、基材２００上を高分子化合物層で被覆し、乾燥する時に架橋反応を行うことができる。架橋反応により、高分子化合物の主鎖同士が架橋されてコーティング層２３０が不溶性となる。
【０１３３】
架橋反応は、高分子化合物中の架橋可能な官能基に応じて当業者によって任意の方法が行われる。
架橋可能な官能基が、加水分解によりシラノール基を生成する官能基である場合、高分子化合物を溶解させる媒体として、有機溶剤中に水を含有させた水混和性有機溶剤を用いてもよい。この場合、媒体に含有される水により加水分解が起こって高分子化合物にシラノール基が生成し、さらに加熱することにより、シラノール基と水酸基、アミノ基などの反応性基と脱水縮合し、高分子化合物の主鎖同士が架橋される。水混和性有機溶剤中の水の量は、理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な量であればよいが、水混和性有機溶剤の調製容易性を考慮すると、たとえば０．０１重量％以上１５重量％以下であってよい。水の量が上記下限値以上であることは、シラノール基が十分に生成し、強い架橋を生じさせることができる点で好ましく、上記上限値以下であることは、高分子化合物を溶解させやすい点で好ましい。
【０１３４】
さらに、基材２００表面に水酸基、カルボニル基、アミノ基などの反応性基がある場合も同様にシラノール基と脱水縮合し、基材２００表面と化学的に結合することができる。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるため、基材２００表面に被覆されたコーティング層２３０が容易に溶解すること、基材２００から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。たとえば高分子化合物が熱により変性されない温度範囲内、例えば、６０度以上１２０度以下で５分以上１００時間以下加熱処理することが好ましい。
【０１３５】
［１−２−４．抗体類等の調製］
捕捉用抗体２５０は、抗原の種類に応じて当業者によって適宜用意される。また、抗体が生来的に有する官能基以外を固相結合性基とする場合、捕捉用抗体２５０の調製においては、固相結合性基を生じさせる処理も行われる。
具体的には、捕捉用抗体２５０は、生物の生体内からの単離、生体内からの単離物の分解、遺伝子工学的合成、生化学的合成および修飾、有機化学的合成および修飾等の方法が単独で、または複数の方法が組み合わされて調製される。
検出用抗体３１０も同様に用意される。具体的には、抗原の種類および当該抗原において捕捉用抗体２５０が認識する部位を考慮して、当業者によって適宜調製される。本実施形態においては、抗体部分の調製の後、ビオチン化のための修飾が行われる。
標識３５０は、アビジン類３５５を標識することで調製される。
【０１３６】
［１−２−５．捕捉用抗体の固定］
図３は、捕捉用抗体２５０の固定工程を模式的に示す。固定工程では、捕捉用抗体２５０を基材２００上へ（本実施形態ではコーティング層２３０の結合性基である機能性基２３５を介して）結合させる。
【０１３７】
捕捉用抗体２５０の基材２００への固定は、捕捉用抗体２５０を溶解または分散させた水性溶媒を、基材２００の表面（本実施形態においてはウェル２１０の底面）に接触させ、その後、静置することにより行うことができる。
水性溶媒としては、緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び硼酸緩衝液等）および水混和性有機溶剤（メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等）等が挙げられる。
【０１３８】
捕捉用抗体２５０を共有結合により固定化する場合は、たとえば５℃以上５０℃以下の範囲で、反応に関与する結合性基の反応性および捕捉用抗体２５０の熱安定性を考慮し、当業者が適宜決定することができる。好ましくは、１０℃以上３５℃以下の範囲で反応させることができる。
【０１３９】
なお、捕捉用抗体２５０は、非共有結合によって固定化することも可能である。この場合は、たとえば、コーティング層２３０を構成する高分子化合物が親水性基を有する場合、コーティング層２３０の表面に、リン酸塩濃度が０．１Ｍ以上であるリン酸塩緩衝液に捕捉用抗体２５０を溶解または分散させた溶液を接触させることにより、結合性基に依らずに捕捉用抗体２５０を固定化することができる。しかもこの場合、コーティング層２３０の表面を、生理活性物質に対して非特異的吸着が少なく、ＳＮ比を高くすることができる。通常用いられるリン酸緩衝生理食塩水と比べてリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上という著しく濃度が高いリン酸塩緩衝液を用いることにより、ホスホリルコリン基やアルキレングリコール残基などの非特異的吸着を抑制する親水性基が膨潤したり、ゲル化を生じさせたりしやすく、捕捉用抗体２５０が物理的に取り込まれやすくなると考えられる。このため、結合性基を用いなくても捕捉用抗体２５０を固定化する能力が高くなっていると推定される。生理活性物質結合基を用いない場合には、生理活性物質を固定化後、後述の不活性処理が不要であるというメリットがある。
【０１４０】
［１−２−６．不活性処理］
捕捉用抗体２５０の固定後は、基材２００を洗浄した後、捕捉用抗体２５０の固定化に関与しなかった結合性基を不活性化処理することが好ましい。不活性化処理は、結合性基の種類に応じ、結合性を有しない他の基に変更させることによって行うことができる。たとえば、結合性基が活性エステル基、アルデヒド基などの場合は、アルカリ化合物、一級アミノ基などを有する化合物で不活化処理することができる。
【０１４１】
アルカリ化合物としては、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウム等が挙げられる。
【０１４２】
一級アミノ基を有する化合物としては、たとえば、メチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等が挙げられる。この中でも、アミノエタノール、グリシンが好ましい。
【０１４３】
［１−２−７．付着工程］
捕捉用抗体２５０の固定化後、または適宜行われるさらなる不活性処理の後、付着工程が行われる。図４は、検出用抗体３１０および標識３５０の付着工程を模式的に示す。
【０１４４】
本実施形態の付着工程では、検出用抗体３１０および標識３５０を、水系溶媒中に含ませた調製液３００の状態で、基材２００上に（本実施形態ではコーティング層２３０を介して）滴下する。検出用抗体３１０および標識３５０は、捕捉用抗体２５０の固定位置に接触するように滴下してもよいし、免疫複合体を形成する抗原抗体反応系の反応場となるべき領域（本実施形態ではウェル２１０内の領域）内であれば捕捉用抗体２５０と離れた場所に滴下してもよい。
【０１４５】
付着工程においては、本実施形態のように、検出用抗体３１０と標識３５０との両方を予め水系溶媒中に含ませた調製液３００を滴下してもよいし、他の例として、検出用抗体３１０を水系溶媒中に含ませた前調製液と、標識３５０を水系溶媒中に含ませた前調製液とを別々に調製し、それぞれの前調製液を逐次的に基材２００上へ滴下してもよい。検出用抗体３１０を水系溶媒中に含ませた前調製液と、標識３５０を水系溶媒中に含ませた前調製液とは、同じ場所に重ねて滴下されることによって基材２００上で混ざり合い調製液３００に調製されてもよいし、免疫複合体を形成する抗原抗体反応系の反応場となるべき領域内であれば互いに離れた場所に滴下されてもよい。以下、付着処理の対象となる上記の調製液３００およびそれぞれの前調製液をまとめて付着処理用調製液と記載し、付着処理用調製液中、水系溶媒以外の不揮発性成分を溶質または分散質と記載する。
【０１４６】
水性溶媒としては、緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液及び硼酸緩衝液等）および水混和性有機溶剤（メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、エチレングリコール、グリセリン、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド等）等が挙げられる。
【０１４７】
凍結される状態の付着処理用調製液における水性媒体の量は、溶質または分散質の終濃度が０．０１μｇ／ｍＬ以上１０００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上１００μｇ／ｍＬ以下となる量であってよい。上記下限値以上であることは、限局した領域に滴下しやすい点および水分の除去時間の節約の点で好ましい。特に凍結乾燥により付着させる場合は、凍結乾燥物の付着態様が安定的であるなどの点で好ましい。上記上限値以下であることは、滴下時の操作性などの点で好ましい。
【０１４８】
基材２００上に滴下された付着処理用調製液には、さらに保護剤が含まれてもよい。保護剤は、付着処理用調製液中のペプチド成分またはタンパク質成分（たとえば、タンパク質である検出用抗体３１０、および、ペプチドまたはタンパク質を含む場合の標識３５０）の変性を防止し、生体分子固定基材１００の作製中、および保存中に当該成分の活性を維持するために用いられる。保護剤としては、グルコース、ラクトース、マントース、ラフィノース、スクロース及びトレハロースなどの糖類、アルギニン、グリシン及びヒスチジンなどのアミノ酸、シルクプロテイン等などのペプチドが挙げられる。さらに、保護剤は、糖類に、αアミノ基がアシルアミノ基などで変性されたアルギニンエステルを混合したものであってもよい。
【０１４９】
保護剤は、基材２００上において最終的に付着処理用調製液中に含ませればよく、その混合順序は問わない。また、保護剤の量は、変性を防止すべきペプチド成分およびタンパク質成分の総量に対して１重量％以上１００００重量％以下、好ましくは６０重量％以上１００重量％以下の割合で用いることができる。
【０１５０】
凍結状態で付着させる場合は、付着処理用調整液を凍結工程に供する。凍結乾燥状態で付着させる場合は、付着処理用調整液を凍結工程および乾燥工程にこの順で供する。
【０１５１】
凍結工程においては、基材２００上の、凍結乾燥用調製液（本実施形態では調製用液３００）を凍結する。凍結方法としては、水性溶媒の融点以下に冷却することが可能な方法を特に限定することなく用いることができる。たとえば、冷却棚に基材２００を載置する方法であってもよいし、冷却ガス、液化ガスなどを凍結乾燥用調製液に接触させて冷却してもよい。これによって、凍結乾燥用調製液の凍結物を得る。
【０１５２】
乾燥工程においては、凍結物が、水性溶媒中の融点以上とならないように条件が制御された減圧乾燥法に供されてよい。水性溶媒の昇華に伴って熱が奪われ過ぎることを防ぐため、水性溶媒の融点を超えない程度に凍結物を加熱してもよい。
以上の操作を行うことによって、生体分子固定基材１００（図１参照）が得られる。
【０１５３】
［１−３．生体分子固定基材の使用］
図５から図７は、生体分子固定基材１００の使用方法を説明する模式的断面図である。生体分子固定基材１００は、検体５００中のアナライトである抗原５５０を検出するために用いることができる。
【０１５４】
［１−３−１．検体］
検体５００はアナライトを含み得る液体であればよく、たとえば、生体内から採取物を含む液体であってよい。採取物としては、血液、髄液、膿、穿刺液、尿、便、組織、細胞などが挙げられる。採取物は、適宜希釈液で希釈され、溶液または分散液として調製されてよい。この場合、採取物は、ホモジェナイズ、可溶化、精製などの任意の処理が行われてよい。
【０１５５】
希釈液としては、等張液が好ましく用いられる。等張液は、細胞内液の浸透圧とほぼ等しい浸透圧の液体をいう。これにより、検体５００が抗原に接触した際に、細胞内に存在するのと同様の浸透圧を維持することができるため、抗原の破壊を防止することができる。
【０１５６】
等張液としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ液（ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水）、Ｌｏｃｋｅ液、Ｒｉｎｇｅｒ液、Ｔｙｒｏｄｅ液、Ｅａｒｌｅ液、Ｋｒｅｂｓ液、生理食塩水などの水系溶媒が挙げられる。等張液には、必要に応じて、各種界面活性剤が添加されていてもよい。
【０１５７】
界面活性剤としては、例えば、ｎ−デシル−α−Ｄ−グルコピラノシドのようなアルキルグルコシド系非イオン界面活性剤、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビンタン（Ｔｗｅｅｎ２０）のようなポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
【０１５８】
検体５００のｐＨは特に限定されず、後述の抗原抗体反応系の至適ｐＨを考慮して当業者が適宜設定することができる。たとえば、検体５００のｐＨは、好ましくは５以上１０以下、より好ましくは６以上８以下である。
【０１５９】
［１−３−２．接触工程］
図５に示すように、製造された生体分子固定基材１００（図１参照）に検体５００が接触させられる。生体分子固定基材１００における検出用抗体３１０および標識３５０は、固定されずに付着した状態であるため、検体５００と接触することを契機として付着状態が解除される。その結果、図５に示すように、捕捉用抗体２５０は基材２００表面に固定されたままであることに対し、検出用抗体３１０および標識３５０は基材２００表面から遊離する。
【０１６０】
［１−３−３．抗原抗体反応工程］
生体分子固定基材１００が検体５００と接触し、かつ、温度条件およびｐＨ条件が至適範囲を満たすことによって、抗原抗体反応系が構築される。検体５００に目的のアナライトである抗原５５０が含まれていれば、図６に示すように、抗原抗体反応が起こる。図６では、検体５００中の抗原５５０の特定のエピトープが捕捉用抗体２５０に認識されるとともに、他のエピトープが検出用抗体３１０に認識される。さらに、検出用抗体３１０のビオチニル基３１５と標識３５０のアビジン類３５５とも結合する。これによって、捕捉用抗体２５０、抗原５５０、検出用抗体３１０および標識３５０で構成される免疫複合体ＩＣが形成される。
【０１６１】
抗原抗体反応は抗原抗体反応系の種類に応じて当業者が適宜決定することができるが、たとえば５分以上１８０分以下、好ましくは３０分以上１５０分以下であってよい、反応時間が上記下限値以上であることは、検体５００中の抗原５５０をより効率的に検出する点などから好ましく、上記上限値以下であることは、分析効率またはスループット性を担保する点などから好ましい。
【０１６２】
抗原抗体反応の温度およびｐＨも、抗原抗体反応系の種類に応じて当業者が適宜決定することができるが、たとえば温度は０℃以上４０℃以下、好ましくは１０℃以上３７℃以下であってよく、ｐＨは５以上１０以下、好ましくは６以上８以下であってよい。温度およびｐＨを上記範囲内に設定することによって、検体５００内の抗原５５０がより迅速かつ選択的に認識される。
【０１６３】
［１−３−４．洗浄工程］
抗原抗体反応終了後は、洗浄により未反応の抗原５５０、検出用抗体３１０、標識３５０およびその他の検体５００に含まれていた不要な成分（夾雑物など）を除去する。これにより、図７に示すように免疫複合体ＩＣのみが基材２００上に残る。
【０１６４】
洗浄操作は、本実施形態では、ウェル２１０内への洗浄液の供給および除去によって行われてよい。また、ウェル２１０内への洗浄液の供給の後、ウェル２１０内で洗浄液を穏やかに撹拌してもよい。これによって、抗原５５０の認識に関与しなかった成分をより確実に分散させることができるため、より確実な洗浄が可能となる。洗浄操作は、洗浄液を洗瓶で流す操作によって行ってもよい。
【０１６５】
洗浄液としては、等張液が好ましく用いられる。これによって、免疫複合体ＩＣの変性および変質を防ぐことができる。具体的には、生体分子固定基材１００の製造における付着工程で用いられ得る等張液から選択されてよい。
洗浄操作は、複数回繰り返して行われてもよい。これによって、抗原５５０の認識に関与しなかった成分をより確実に除去することが可能となる。さらに、全ての洗浄操作において同一組成の洗浄液を同一洗浄条件で用いてもよいし、各回の洗浄操作において洗浄液の組成および洗浄条件の少なくともいずれかを変更してもよい。
【０１６６】
［１−３−５．検出工程］
洗浄後、免疫複合体ＩＣにおける標識３５０を検出することにより、抗原５５０を検出することができる。
標識３５０が蛍光物質である場合、免疫複合体ＩＣに光を照射し、当該光照射に伴う発色または吸光を観察することにより抗原５５０の有無の判定（陽性または陰性の判定）を行うことができ、発光強度または吸光強度の定量によって、抗原５５０の定量を間接的に行うことができる。
【０１６７】
標識３５０が酵素である場合、この酵素に反応して発色または吸光する色原性基質をさらに加え、色原性基質を色素に変換する。反応停止液を加えて洗浄液で洗浄することにより、上述と同様に標識３５０が光学的に検出可能となる。
【０１６８】
［１−４．変形例］
図８から図１１に、第１実施形態の生体分子固定基材の変形例を示す。以下の変形例では、主に第１実施形態と異なる点について説明し、同じ点については基本的に説明を省略する。
【０１６９】
［１−４−１．第１変形例］
図８に示す生体分子固定基材１００ａは、第１実施形態と同じ基材２００、基材２００表面を被覆するコーティング層２３０、およびコーティング層２３０表面の結合性基（機能性基２３５）を介して結合していてよい捕捉用抗体２５０を含むとともに、基材２００上に付着された検出用抗体３１０ａと標識３５０ａとを含む。
【０１７０】
検出用抗体３１０ａと標識３５０ａとは、それぞれ、ビオチニル基３１５ａおよびアビジン類３５５ａを有しており、ビオチニル基３１５ａとアビジン類３５５ａとが既に結合していることにより検出用抗体３１０ａと標識３５０ａとが複合体を形成している点で、第１実施形態の検出用抗体３１０および標識３５０と異なる。
【０１７１】
生体分子固定基材１００ａの製造では、付着工程における凍結乾燥用調製液を、検出用抗体３１０ａと標識３５０ａとが複合体を形成した状態で調製する。このような凍結乾燥用調製液は、予め形成させた複合体を水性媒体に溶解または分散させてもよいし、互いに遊離した検出用抗体３１０ａおよび標識３５０ａを水性媒体中に含む液体を、検出用抗体３１０ａと標識３５０ａとの結合反応の至適条件に供することで調製してもよい。検出用抗体３１０ａと標識３５０ａとの結合反応は、基材２００とは離れた場所で行ってもよいし、基材２００上で行ってもよい。
【０１７２】
図８に示す生体分子固定基材１００ａは、第１実施形態と同様に使用されることで、捕捉用抗体２５０、抗原５５０、検出用抗体３１０ａおよび標識３５０ａで構成される免疫複合体ＩＣを形成する。
【０１７３】
［１−４−２．第２変形例］
図９に示す生体分子固定基材１００ｂは、第１実施形態と同じ基材２００、基材２００表面を被覆するコーティング層２３０、およびコーティング層２３０表面の結合性基（機能性基２３５）を介して結合していてよい捕捉用抗体２５０を含むとともに、基材２００上に付着された検出用抗体３１０ｂと標識３５０ｂとを含む。
【０１７４】
検出用抗体３１０ｂと標識３５０ｂとは、いずれもビオチニル基およびアビジン類を有さず直接的に結合している点で、第１実施形態の検出用抗体３１０および標識３５０と異なる。
【０１７５】
生体分子固定基材１００ｂの製造では、付着工程における凍結乾燥用調製液を、検出用抗体３１０ｂと標識３５０ｂとが直接結合した状態で調製することが好ましい。
【０１７６】
生体分子固定基材１００ｂの使用では、第１実施形態と同様に使用されることで、捕捉用抗体２５０、抗原５５０、検出用抗体３１０ｂおよび標識３５０ｂで構成される免疫複合体ＩＣｂを形成する。
【０１７７】
［１−４−３．第３変形例］
図１０に示す生体分子固定基材１００ｃは、第１実施形態と同じ基材２００、基材２００表面を被覆するコーティング層２３０、およびコーティング層２３０表面の結合性基（機能性基２３５）を介して結合していてよい捕捉用抗体２５０を含むとともに、基材２００上に付着された検出用抗体３１０ｃと標識３５０ｃとを含む。
【０１７８】
検出用抗体３１０ｃは、ビオチニル基を有しない点で第１実施形態の検出用抗体３１０と異なる。標識３５０ｃは、抗体３５１ｃを標識している点で第１実施形態の標識３５０と異なる。標識３５０ｃにおける抗体３５１ｃは、検出用抗体３１０ｃを認識するものであり、検出用抗体３１０ｃを一次抗体とした場合の二次抗体として機能する。検出用抗体３１０ｃと標識３５０ｃとは、互いに別個独立した態様で付着している。
生体分子固定基材１００ｃは、第１実施形態と同様に製造することができる。
【０１７９】
図１０に示す生体分子固定基材１００ｃは、第１実施形態と同様に使用されることで、捕捉用抗体２５０、抗原５５０、検出用抗体３１０ｃおよび標識３５０ｃで構成される免疫複合体ＩＣｃを形成する。
【０１８０】
［１−４−４．第４変形例］
図１１に示す生体分子固定基材１００ｄは、第１実施形態と同じ基材２００、基材２００表面を被覆するコーティング層２３０、およびコーティング層２３０表面の結合性基（機能性基２３５）を介して結合していてよい捕捉用抗体２５０を含むとともに、基材２００上に付着された検出用抗体３１０ｄと標識３５０ｄとを含む。
【０１８１】
検出用抗体３１０ｄおよび標識３５０ｄは、互いに結合して複合体を形成していることを除いて、図１０における検出用抗体３１０ｃおよび標識３５０ｃと同様である。
【０１８２】
生体分子固定基材１００ｄの製造では、付着工程における凍結乾燥用調製液を、検出用抗体３１０ｄと標識３５０ｄとが、一次抗体である検出用抗体３１０ｄと二次抗体である抗体３５１ｄとの特異的結合により複合体を形成した状態で調製する。このような凍結乾燥用調製液は、予め形成させた複合体を水性媒体に溶解または分散させてもよいし、互いに遊離した検出用抗体３１０ｄおよび標識３５０ｄを水性媒体中に含む液体を、検出用抗体３１０ｄと標識３５０ｄとの結合反応の至適条件に供することで調製してもよい。検出用抗体３１０ｄと標識３５０ｄとの結合反応は、基材２００とは離れた場所で行ってもよいし、基材２００上で行ってもよい。
【０１８３】
生体分子固定基材１００ｄは、第１実施形態と同様に使用されることで、捕捉用抗体２５０、抗原５５０、検出用抗体３１０ｄおよび標識３５０ｄで構成される免疫複合体ＩＣｃを形成する。
【０１８４】
［２．第２実施形態］
本実施形態では、主に第１実施形態と異なる点について説明し、同じ点については基本的に説明を省略する（引き続く実施形態についても同様）。
図１２に、第２実施形態の生体分子固定基材の一例を模式的に示す。図１２に示す生体分子固定基材１００ｅは、第１実施形態と同じ基材２００、基材２００表面を被覆するコーティング層２３０、およびコーティング層２３０表面の結合性基（機能性基２３５）を介して結合していてよい捕捉用抗体２５０を含む。一方、図１２に示す生体分子固定基材１００ｅは、基材２００上に付着された検出用レクチン３１０ｅと標識３５０ｅとを含み、検出用生体分子が検出用レクチン３１０ｅである点で第１実施形態と異なる。
【０１８５】
検出用レクチン３１０ｅと標識３５０ｅとは、それぞれ、ビオチニル基３１５ｅおよびアビジン類３５５ｅを有しており、ビオチニル基３１５ｅとアビジン類３５５ｅとが既に結合して複合体となっている。しかしながら、ビオチニル基３１５ｅとアビジン類３５５ｅとは結合状態でなく（つまり検出用レクチン３１０ｅと標識３５０ｅとが複合体でなく）てもよい。
【０１８６】
検出用レクチン３１０ｅは、糖鎖を特異的に認識する分子認識系を構築することができるアフィニティ物質である。好ましくは、免疫反応の産物ではなく、糖結合性のタンパク質または糖タンパク質であり、細胞または複合糖質を凝集するものであること；２以上の結合部位を持ち、動植物細胞を凝集することができること；および、凝集は、単糖またはオリゴ糖により特異的に阻止されること、のすべての要件を満たす物質である。たとえば、インゲン豆レクチン（Lectin from Phaseolus vulgaris; 以下PHA-L ）、ダイズレクチン（Lectin from Glycine max ）、アメリカヤマゴボウ由来レクチン（Lectin from Pokeweed mitogen）、タチナタマメ（Canavalia ensiformis）レクチン（コンカナバリンA ）などが挙げられる。
【０１８７】
検出用レクチン３１０ｅは、アナライトが有する糖鎖に応じ、当業者によって適宜選択される。本実施形態に適用されるアナライトである糖鎖含有体５５０ｅは、表面に抗原５５２ｅと糖鎖５５３ｅとを有する。糖鎖含有体５５０ｅのより具体的な例としては、細胞、細菌、ウイルスなどが挙げられる。
【０１８８】
検出用レクチン３１０ｅと標識３５０ｅとの複合体は基材２００に固定されずに付着した状態であるため、糖鎖含有体５５０ｅを含む検体が生体分子固定基材１００ｅに接触すると、付着状態が解除されて遊離する。一方、捕捉用抗体２５０は基材２００表面に固定されたままである。
【０１８９】
その結果、糖鎖含有体５５０ｅの抗原５５２ｅ側では抗原抗体反応系が構築され、糖鎖５５３ｅ側では糖鎖認識系が構築される。これによって、捕捉用抗体２５０、糖鎖含有体５５０ｅ、検出用レクチン３１０ｅおよび標識３５０ｅで構成される免疫複合体ＩＣｅが形成される。
【０１９０】
［３．第３実施形態］
図１３に、第３実施形態の生体分子固定基材の一例を模式的に示す。図１３に示す生体分子固定基材１００ｆは、第１実施形態と同じ基材２００、基材２００表面を被覆するコーティング層２３０、検出用抗体３１０および標識３５０を含む。一方、コーティング層２３０表面の結合性基（機能性基２３５）を介して結合していてよい捕捉用生体分子が、捕捉用レクチン２５０ｆである点で第１実施形態と異なる。
【０１９１】
捕捉用レクチン２５０ｆは、標識と結合するためのビオチニル基を有しないことを除いて第２実施形態の検出用レクチン３１０ｅと同じである。なお、コーティング層の機能性基２３５として、結合性基として機能するアビジン類が結合している場合、捕捉用レクチン２５０ｆが固相結合性基としてのビオチニル基を有することは許容する。
【０１９２】
検出用抗体３１０および標識３５０は固定されずに付着した状態であるため、糖鎖含有体５５０ｅを含む検体が生体分子固定基材１００ｆに接触すると、付着状態が解除されて遊離する。一方、捕捉用レクチン２５０ｆは基材２００表面に固定されたままである。
【０１９３】
その結果、糖鎖含有体５５０ｅの糖鎖５５３ｅ側では糖鎖認識系が構築され、抗原５５２ｅ側では抗原抗体反応系が構築される。これによって、捕捉用レクチン２５０ｆ、糖鎖含有体５５０ｅ、検出用抗体３１０および標識３５０で構成される免疫複合体ＩＣｆが形成される。
【０１９４】
なお、検体接触前の生体分子固定基材１００ｆにおけるビオチニル基３５０およびアビジン類３５５とは結合して複合体状態であってもよいし、抗原抗体反応系におけるプロービングもこの態様に限定されるものではない。したがって、第１実施形態に対する第１変形例から第４変形例と同様の変形態様が可能である。
【０１９５】
本発明の生体分子固定基材において、捕捉用生体分子および検出用生体分子の組み合せは、上記に限定されるものではない。当該組み合わせは、アナライトに応じ、糖鎖、核酸、ペプチド、タンパク質、およびそれらの複合体からなる群から選ばれる分子種、ならびに、抗体およびレクチンからなる群から選ばれる分子種を用い、当業者によって適宜選択される。
【０１９６】
本発明の生体分子固定基材を構成する各要素は、同様の機能を発揮することができる任意の要素と置換することができる。また、本発明の生体分子固定基材には、本発明の趣旨を損なわない限り、任意の要素を付加することができる。
【実施例】
【０１９７】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限されるものではない。
【０１９８】
［実験例］
コーティング層に用いる高分子化合物を調製した。
（１）高分子化合物の合成
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と記載）、n−ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」と記載）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載。）を１ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させた。なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に２５：７０：５である。
そこに、さらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載、和光純薬工業社製）を０．０１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。
【０１９９】
その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させ、反応溶液をジエチルエーテル／クロロホルム混合溶媒（容積比８０／２０）中に滴下し、沈殿を収集することにより高分子化合物を得た。
なお、上述したＭＥＯＮＰについては、以下の（２）に示すようにして合成した。
【０２００】
（２）ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂製、「Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００」）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。
−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業社製）およびクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。
−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してＭＥＯＮＰを得た。
【０２０１】
［実施例］
（１）以下のように、生体分子固定基材を作製した。
（１−１）ＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮの検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
基材：穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
特異抗体（一次抗体）：RABBIT IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用意した。
標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識 SHEEP IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用意した。
抗原：Ａｌｂｕｍｉｎ ,Ｒａｔ （−）（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用意した。
洗浄液：０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ／ＰＢＳ  を用意した。
【０２０２】
（１−２）上記実験例で合成された高分子化合物の０．５ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを成型品の穴部に点着したのち乾燥させることで、穴部の底面に高分子化合物を導入した。
（１−３）エタノールを用いて洗浄を行った。
（１−４）次に、特異抗体の５μｇ／ｍＬリン酸バッファー溶液を調製し、これを穴部底面に点着したのち、５０％以下の乾燥状態、室温下で一晩静置した。
（１−５）洗浄液を用いて５回洗浄を行った。
【０２０３】
（１−６）高分子化合物の活性基を不活性化するために０．１Ｍ  ３−アミノ−１プロパノール溶液（東京化成社製）を用いてブロッキングを行った。
（１−７）標識化特異抗体の１μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）およびＣｙ３標識されたストレプトアビジンの６０μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を調製し、これを穴部底面に６μＬ添加し、凍結を行った後に−２０℃で真空乾燥を一晩行った。
（１−８）真空乾燥機を室温に戻した後に真空を開放し、スライドを回収した。
【０２０４】
（２）以下のように、抗原を検出した。
（２−１）抗原の７０μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを穴部底部に点着したのち、３７℃の環境下に１．５時間静置して、抗原抗体反応を実施した。
（２−２）次に、洗浄液を用いて５回洗浄を行った。
（２−３）その後、穴部に対し、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０ｎｍ蛍光波長：５７０ｎｍ）を行った。
その結果、抗原由来の蛍光シグナルが得られた。また、抗体をスポットしていない部分（ＢＧ）においても非特異的なシグナルは検出されなかった（図１４参照）。
【０２０５】
［比較例］
（１）以下のように、生体分子固定基材を作製した。
（１−１）ＲＡＴ  ＡＬＢＵＭＩＮの検出のために、以下の部材および原材料等を用意した。
基材：穴部を備えるポリエチレン樹脂基板を用意した。
特異抗体（一次抗体）：RABBIT IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用意した。
標識化特異抗体（二次抗体）：ビオチン標識 SHEEP IGG FRACTION TO RAT ALBUMIN（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用意した。
抗原：Ａｌｂｕｍｉｎ ,Ｒａｔ （−）（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用意した。
洗浄液：０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００ ／ＰＢＳ  を用意した。
【０２０６】
（１−２）高分子化合物の０．５ｗｔ％エタノール溶液を調整し、これを成型品の穴部に点着したのち乾燥させることで、穴部の底面に高分子化合物を導入した。
（１−３）エタノールを用いて洗浄を行った。
（１−４）次に、特異抗体の５μｇ／ｍＬリン酸バッファー溶液を調製し、これを穴部底面に点着したのち、５０％以下の乾燥状態、室温下で一晩静置した。
（１−５）洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【０２０７】
（２）以下のように、抗原を検出した。
（２−１）抗原の７０μｇ／ｍＬＰＢＳ溶液（検体）を調製し、これを穴部底面に点着したのち、３７℃の環境下に４０分静置して、抗原抗体反応を実施した。
（２−２）洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（２−３）標識化特異抗体の１μｇ／ｍＬ  ＰＢＳ溶液（０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に４０分静置して、抗原抗体反応を実施した。
（２−４）洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
【０２０８】
（２−５）Ｃｙ３標識されたストレプトアビジンのＰＢＳ溶液（０．０５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００）を調製し、これを穴部に点着したのち、３７℃の環境下に１０分静置した。
（２−６）洗浄液を用いて３回洗浄を行った。
（２−７）その後、穴部に対して、それぞれ、蛍光測定（励起波長：５５０ｎｍ蛍光波長：５７０ｎｍ）を行った（図１４参照）。
【０２０９】
図１４に示すように、本発明の生体分子固定基材は、比較例と同様に優れた検出感度を保ちながら、検出の工程を大幅に簡素化することが可能であることが示された。
【０２１０】
本発明の好ましい実施形態は上記の通りであるが、本発明はそれらのみに限定されるものではなく、本発明の趣旨から逸脱することのない様々な実施形態が他になされる。
【０２１１】
［実施形態における各部と請求項の各構成要素との対応関係］
本明細書における生体分子固定基材１００，１００ａ，１００ｂ，１００ｃ，１００ｄ，１００ｅ，１００ｆが請求項における「生体分子固定基材」に相当し、基材２００が「基材」に相当し、コーティング層２３０が「非特異的吸着抑制高分子化合物の層」に相当し、捕捉用抗体２５０および捕捉用レクチン２５０ｆが「捕捉用抗体」に相当し、調製液３００および凍結乾燥用調製液が「検出用生体分子と標識物質とを含む液」に相当し、検出用抗体３１０，３１０ａ，３１０ｂ，３１０ｃ，３１０ｄおよび検出用レクチン３１０ｅが「検出用抗体」に相当し、ビオチニル基３１５，３１５ａ，３１５ｅが「ビオチン化」された部分に相当し、標識３５０，３５０ａ，３５０ｂ，３５０ｃ，３５０ｄ，３５０ｅが「標識物質」および「蛍光物質」に相当し、アビジン類３５５，３５５ａ，３５５ｅが「アビジン類」および「ストレプトアビジン」に相当する。
【符号の説明】
【０２１２】
１００，１００ａ，１００ｂ，１００ｃ，１００ｄ，１００ｅ，１００ｆ  生体分子固定基材
２００  基材
２３０  コーティング層（非特異的吸着抑制高分子化合物の層）
２５０  捕捉用抗体（捕捉用生体分子）
２５０ｆ  捕捉用レクチン（捕捉用生体分子）
３００  調製液（検出用生体分子と標識物質とを含む液）
３１０，３１０ａ，３１０ｂ，３１０ｃ，３１０ｄ  検出用抗体（検出用生体分子）
３１０ｅ  検出用レクチン（検出用性生体分子）
３１５，３１５ａ，３１５ｅ  ビオチニル基（ビオチン化された部分）
３５０，３５０ａ，３５０ｂ，３５０ｃ，３５０ｄ，３５０ｅ  標識（標識物質）
３５５，３５５ａ，３５５ｅ  アビジン類（ストレプトアビジン）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016173237.tif 000022
【図１０】
2016173237.tif 000023
【図１１】
2016173237.tif 000024
【図１２】
2016173237.tif 000025
【図１３】
2016173237.tif 000026
【図１４】
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