(57)【要約】【課題】乳酸菌のインターロイキン１０産生誘導能の増強方法の提供。【解決手段】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープおよびオレンジの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時の到達生菌数が、共に１０8ＣＦＵ／mL以上であるラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を、pH２．０〜５．７に調整した培地で培養する工程を含む、当該乳酸菌のインターロイキン１０産生誘導能の増強方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープおよびオレンジの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時の到達生菌数が、共に１０8ＣＦＵ／mL以上であるラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を、pH２．０〜５．７に調整した培地で培養する工程を含む、当該乳酸菌のインターロイキン１０産生誘導能の増強方法。
【請求項２】
前記乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４９）またはラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１４８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３５０）である請求項１記載の増強方法。
【請求項３】
培養開始から少なくとも定常状態到達時点まで、培地のpHを２．０〜５．７に調整する請求項１又は２記載の増強方法。
【請求項４】
培地のpHを３．４〜５．２に調整する請求項１〜３のいずれか１項に記載の増強方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の増強方法により得られた乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分とするインターロイキン１０産生誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌のインターロイキン１０（ＩＬ−１０）産生誘導能の増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌が発酵過程で種々のサイトカインを産生することが知られている。例えば乳酸菌は、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）を産生する能力を有し、コーンスチープリカー及びカゼイン含有培地でpHを６．５〜７．５に保持して培養するとＩＬ−１２の産生量が向上することが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００４−４１０９９号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１１５１１４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
前記のように乳酸菌のＩＬ−１２産生誘導能の増強に関しては報告されているが、ＩＬ−１０産生誘導能の増強に関してはどのような手段を採用すればよいのかについての報告はない。
従って、本発明の課題は、乳酸菌のＩＬ−１０産生誘導能の増強方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで本発明者は、種々の条件で乳酸菌を培養し、ＩＬ−１０産生誘導能に及ぼす影響について検討してきたところ、全く意外にも、グレープやオレンジの１００％果汁を発酵基質としたときに１０8ＣＦＵ／mL以上の生菌数に到達することが知られているラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌（特許文献２）を、pH２．０〜５．７という一定のpH条件で培養すれば、ＩＬ−１０産生誘導能が顕著に増強されることを見出し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、次の発明〔１〕〜〔５〕を提供するものである。
【０００７】
〔１〕Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープおよびオレンジの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時の到達生菌数が、共に１０8ＣＦＵ／mL以上であるラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌を、pH２．０〜５．７に調整した培地で培養する工程を含む、当該乳酸菌のインターロイキン１０産生誘導能の増強方法。
〔２〕前記乳酸菌が、ラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４９）またはラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１４８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３５０）である〔１〕記載の増強方法。
〔３〕培養開始から少なくとも定常状態到達時点まで、培地のpHを２．０〜５．７に調整する〔１〕又は〔２〕記載の増強方法。
〔４〕培地のpHを３．４〜５．２に調整する〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の増強方法。
〔５〕〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の増強方法により得られた乳酸菌及び／又はその処理物を有効成分とするインターロイキン１０産生誘導剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、簡便な手段により乳酸菌のＩＬ−１０産生誘導能が顕著に増強される。得られた乳酸菌及び／又はその処理物は、ヒトを含む動物体内でＩＬ−１０産生を顕著に誘導するため、ＩＬ−１０産生誘導剤として有用であり、ＩＬ−１０の産生不足による疾患、例えば敗血症や炎症性腸疾患の予防又は治療剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】マウス脾臓細胞培養系におけるＹＩＴ  ０１３２のＩＬ−１０産生誘導能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に用いられる乳酸菌は、グレープ又はオレンジ１００％果汁を含有する培地で３７℃で４８時間培養した時の到達生菌数が、共に１０8ＣＦＵ／mL以上であるラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する乳酸菌であり、特許文献２に記載の乳酸菌である。この乳酸菌は、果汁を発酵基質としたときの到達生菌数が多いことが知られている。
ここで「１００％果汁」、「到達生菌数」は、特許文献２記載の定義に従う。
【００１１】
これらの乳酸菌のうち、プラスミドを持たない乳酸菌が好ましく、さらに次の（ａ）及び／又は（ｂ）の性質を有するラクトバチルス・プランタラムに属する乳酸菌が好ましい。
（ａ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープおよびオレンジの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時の到達生菌数が、共に１０8ＣＦＵ／mL以上である。
（ｂ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープ、グレープフルーツ、オレンジ、パインおよびアップルの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時のそれぞれの到達生菌数（ＣＦＵ／mL）を１０8で除して加えた増殖スコア値が２５以上である。
【００１２】
これらの乳酸菌のうち、さらにＩＬ−１０産生誘導能が顕著に増強される点で、ラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４９）、ラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１４８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３５０）がより好ましく、ラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４９）がさらに好ましい。なお、これらの乳酸菌は２種以上を混合して用いてもよい。
【００１３】
本発明方法では、pHを２．０〜５．７に調整した培地で培養する工程を含む。通常、乳酸菌の培養においては、培養開始時のpHは中性（pH６〜８）付近であるが、本発明では培養開始時の培地のpHを２．０〜５．７と低く設定することにより、乳酸菌のＩＬ−１０産生誘導能が顕著に増強される。
培養開始時の好ましい培地のpHはＩＬ−１０産生誘導能増強効果の点から、２．０〜５．７が好ましく、３．４〜５．７がより好ましく、さらに好ましくは３．４〜５．２である。
【００１４】
培地のpHを前記範囲に調整するには、培地中に酸又はアルカリを添加することが好ましい。用いられる酸としては、特に限定されないが、例えば、食用に用いられる酸が好ましく、クエン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、酢酸、グルコン酸等が挙げられる。また、これらの酸を含有する天然物、例えば柑橘類果汁等を使用することもできる。用いられるアルカリとしては、特に限定されないが、例えば、食用に用いられるアルカリが好ましく、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。
【００１５】
本発明では、培養開始から少なくとも定常状態到達時点まで、培地のpHを前記範囲に調整することが、ＩＬ−１０産生誘導能増強効果の点から好ましい。ここで、定常状態到達時点とは、後述の実施例に示す通り、対象菌株の培養中に、定期的（例えば、２時間毎）にサンプリングして、６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０）をモニターし、ＯＤ６６０の増加が止まった時点のことをいう。培養開始から定常状態到達時点までの時間は、対象菌株や培地のpH等により変動し得るため、上記方法により適宜設定すればよいが、例えば、本発明に用いられる乳酸菌（ラクトバチルス・プランタラム  ＹＩＴ  ０１３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３４９））の場合、pH３．４で３０時間（ＯＤ６６０  ６．９９）、pH３．８で３０時間（ＯＤ６６０  ５．７６）、pH４．５で２８時間（ＯＤ６６０  ６．２２）、pH５．２で１４時間（ＯＤ６６０  ９．０８）、pH５．８で１３時間（ＯＤ６６０  ９．５２）、pH６．４で７時間後（ＯＤ６６０  ５．６）であった。培養開始から少なくとも定常状態到達時点まで、pHを前記範囲に維持することにより、乳酸菌のＩＬ−１０産生誘導能が顕著に増強される。なお、定常状態到達時点を越えて、前記pH範囲に調整した培地での培養を継続した場合、その後のＩＬ−１０産生誘導能の増強はほとんど認められないことから、本発明における培養時間としては、培養開始から少なくとも定常状態到達時点を含んでいれば良い。例えば、本発明に用いられる乳酸菌の場合、培養開始から少なくとも１０時間、培地のpHを前記範囲に調整することが好ましく、さらに好ましくは少なくとも２４時間であり、さらに好ましくは少なくとも３０時間である。
【００１６】
本発明の方法は、培養開始時のpHを前記範囲に調整する以外は、通常の条件で行えばよい。用いられる培地としては、乳酸菌が生育可能な培地であればよく、例えば乳、ＭＲＳ培地、ＢＬ培地、Ｂｒｏｔｈ培地や合成培地等を用いることができる。培地には、前記のpH調整剤の他、炭素源、窒素源、無機物その他の栄養素を含有させるのが好ましい。また、果汁、野菜汁等を培地に含有させるか、果汁、野菜汁等をそのまま培地として用いることもできる。例えば、果汁としてはレモン果汁等が挙げられ、レモン果汁をそのまま培地として用いた場合のpHは約２．０となる。
培養方法は、好気条件または嫌気条件のいずれでもよく、液体静置培養等であってもよい。
【００１７】
本発明の方法によれば、前記乳酸菌のＩＬ−１０産生誘導能が顕著に増強される。ここで、ＩＬ−１０産生誘導能が増強されたとは、通常培養（培地のpHを制御せずに培養）したときのＩＬ−１０産生誘導能に対して１倍を超えて増強されていることをいう。ＩＬ−１０産生誘導能は、例えば乳酸菌の加熱死菌体をマウス脾臓細胞培養系に添加して培養し、上清中のＩＬ−１０濃度を測定することにより評価できる。pH３．４〜５．２に調整した培地で培養した前記乳酸菌のＩＬ−１０産生誘導能は、通常培養した前記乳酸菌に比べて１．０４〜１．９４倍である。
【００１８】
また、本発明の方法によっては、前記乳酸菌のＩＬ−１２産生誘導能の増強作用はほとんどみられなかった。従って、本発明方法によるＩＬ−１０産生誘導能増強作用は、乳酸菌の一般的なサイトカイン（ＩＬ−１２等）産生誘導能の増強作用とは相関しない。
【００１９】
本発明の方法により得られる前記乳酸菌は、ＩＬ−１０産生誘導能が顕著に増強されているので、ヒトを含む動物体内でのＩＬ−１０産生誘導剤として有用である。当該ＩＬ−１０産生誘導剤は、例えば敗血症や炎症性腸疾患等の予防又は治療に用いることができる。
さらに、本発明のＩＬ−１０産生誘導剤は炎症性サイトカインであるＩＬ−１２の産生誘導を増強する作用がほとんどみられないことから、上記各種疾患の治療や改善、或いはその予防がさらに容易になることが期待される。
【００２０】
本発明のＩＬ−１０産生誘導剤の有効成分（前記乳酸菌及び／又はその処理物）は、乳酸菌菌体（生菌）であってもその処理物であってもよく、その処理は特に限定されない。前記処理物としては、具体的には、加熱菌体（死菌体）、その凍結乾燥物、これらを含む培養物、細菌の超音波などによる破砕液、細菌の酵素処理液、それらを濾過ないし遠心分離など固液分離手段によって分離した固体残渣等が挙げられる。また、細胞壁を酵素もしくは機械的手段により除去した処理液、これらの濃縮物、これらの希釈物又はこれらの乾燥物なども含まれる。また、乳酸菌を界面活性剤等によって溶解した後、エタノール等によって沈殿させて得られる核酸含有画分も含まれる。さらに、前記乳酸菌の超音波などによる破砕液、細胞の酵素処理液などに対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの分離・精製処理をさらに行ったものも含まれる。さらに、乳酸菌菌体には死菌体も含まれてよく、該死菌体は、例えば、加熱処理、抗生物質などの薬物による処理、ホルマリンなどの化学物質による処理、紫外線による処理、γ線などの放射線による処理により得ることができる。これら処理のうち、特に超音波処理、酵素処理、加熱処理が好ましい。これらの処理は常法に従って行うことができ、特別な方法を用いる必要はない。
【実施例】
【００２１】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。
【００２２】
実施例１
Ａ．材料と方法
（１）使用菌株
Lactobacillus plantarum  ＹＩＴ  ０１３２  
Lactobacillus plantarum  ＹＩＴ  ０１０２（基準株）
ここで、ＹＩＴ  ０１０２（基準株）は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ Ｂｒｏｔｈ培地で定常状態になるまで３７℃で１６時間培養した菌液を、グレープおよびオレンジの１００％果汁に対してそれぞれ０.４％容量接種したものを３７℃で４８時間培養した時の到達生菌数が、１０8ＣＦＵ／mL未満である。
（２）ＭＲＳ液体培地の調製
ＲＯ水にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ＭＲＳ  Ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ）を５５ｇ／Ｌ溶解後、クエン酸一水和物（試薬特級、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ）を用いてpH３．４、pH３．８、pH４．５、pH５．２、pH５．８、pH６．４に調整後、１２１℃、１５分間滅菌した。
（３）pH制御培養
pH３．４、pH３．８、pH４．５、pH５．２、pH５．８、pH６．４に調整したＭＲＳ液体培地およびpH未調整（市販粉末溶解時のpH６．４）のＭＲＳ液体培地３Ｌをオートクレーブ滅菌後、３Ｌ容のミニジャーファーメンター（マルビシバイオエンジ製、以下ミニジャーと略）に仕込み、各菌株の前培養液をそれぞれ０．４％接種した。各pHに維持されるよう５Ｎ  ＮａＯＨで制御しつつ、３７℃で攪拌培養した（pH３．４、pH３．８での培養は、増殖過程中のpHの大幅な低下がないことを確認したため、pH制御は行わなかった）。培養中は２時間毎にサンプリングして６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ６６０）をモニターし、定常状態到達時点（ＯＤ６６０の増加が止まった時点）で培養を停止した。
【００２３】
（４）マウス脾臓細胞培養系におけるサイトカイン誘導能試験
各菌株の培養液を滅菌水にて洗浄して、１００℃、３０分間の加熱死菌化後に凍結乾燥した。メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ）より調製した脾臓細胞（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／２００μＬ）を９６ウエル培養プレートに播き込み、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で加熱死菌体を１００μｇ／mLとなるよう添加して、７２時間培養した。上清中のＩＬ−１０濃度をＥＬＩＳＡで測定した。
【００２４】
Ｂ．結果
（１）pH制御培養菌体の調製
ミニジャーでの培養中のpHは、初発pH±０．２の範囲内に制御されていた。ＹＩＴ  ０１３２の培養中のＯＤ６６０を２時間毎にモニターしたところ、pH３．４は培養３０時間後（ＯＤ６６０  ６．９９）、pH３．８は培養３０時間後（ＯＤ６６０  ５．７６）、pH４．５は培養２８時間後（ＯＤ６６０  ６．２２）、pH５．２は培養１４時間後（ＯＤ６６０  ９．０８）、pH５．８は培養１３時間後（ＯＤ６６０  ９．５２）、pH６．４は培養７時間後（ＯＤ６６０  ５．６）にそれぞれ増加が止まったため、培養を停止した。
同様に、ＹＩＴ  ０１０２（基準株）の培養中のＯＤ６６０を２時間毎にモニターしたところ、pH3.8は培養２８時間後（ＯＤ６６０  ７．１７）、pH６．４は培養７時間後（ＯＤ６６０  ６．７）にそれぞれ増加が止まったため、培養を停止した。
【００２５】
（２）pH制御培養加熱死菌体の脾臓細胞培養系におけるサイトカイン誘導能
（ｉ）ＩＬ−１０産生誘導能
ＹＩＴ  ０１３２（菌体１００μｇ／mL添加）では、低pHで培養した菌体を添加したものほどＩＬ−１０産生量が高くなる傾向がみられた（図１）。７２時間培養後のＹＩＴ  ０１３２によるＩＬ−１０産生量は、通常培養の場合に比べて、pH５．８で１．００倍、pH５．２で１．０４倍、pH４．５で１．１１倍、pH３．８で１．５１倍、pH３．４で１．９４倍であった。
一方、ラクトバチルス・プランタラムＹＩＴ  ０１０２（基準株）においては、７２時間培養後のＹＩＴ  ０１３２によるＩＬ−１０産生量は、pH６．４で培養した場合に比べて、pH３．８では０．７０倍であり、低pHで培養した菌体を添加すると、ＩＬ−１０産生量が低くなることが明らかになった。
すなわち、本発明の培養条件（pH３．４〜５．７）で培養した場合に、pH依存的に（低pHで培養したときほど）ＩＬ−１０産生誘導能が増強される作用は、種々のラクトバチルス・プランタラム菌株の中でも、本発明の乳酸菌（ＹＩＴ  ０１３２等）において特異的に認められる作用であることが確認された。
【図１】
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