(57)【要約】【課題】必ずしも複雑な工程を行わなくても製造できるサイトカイン産生誘導剤及びその製造方法を提供すること。【解決手段】コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、チオフェン、ジメチルスルフィド、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、及び２−メチル−３−ヘキサノンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が１３．６ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とするサイトカイン産生誘導剤。コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェン、２−メチルピラジン、及び２，３−ジメチルピラジンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が２４．５ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とするサイトカイン産生誘導剤。【選択図】 図１
2016084301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、
チオフェン、ジメチルスルフィド、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、及び２−メチル−３−ヘキサノンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が１３．６ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とするサイトカイン産生誘導剤。
【請求項２】
コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、
チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェン、２−メチルピラジン、及び２，３−ジメチルピラジンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が２４．５ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とするサイトカイン産生誘導剤。
【請求項３】
コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、
２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、エチルピラジン、及び２−エチル−５−メチルピラジンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が１６．５ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とするサイトカイン産生誘導剤。
【請求項４】
焙煎後１５分間以内に温度を２８℃以下にした前記コーヒー焙煎豆から前記抽出物を抽出することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のサイトカイン産生誘導剤の製造方法。
【請求項５】
前記コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、前記抽出物を抽出するまでの保持時間が３０時間以下であり、前記保持時間における前記コーヒー焙煎豆の温度が−３０〜２８℃の範囲内であることを特徴とする請求項４に記載のサイトカイン産生誘導剤の製造方法。
【請求項６】
前記コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、前記抽出物を抽出するまでの保持時間において、前記コーヒー焙煎豆の温度は−３０〜２８℃の範囲内であり、前記保持時間の始期から３０時間経過後は、前記温度が−３０〜０℃の範囲内であることを特徴とする請求項４に記載のサイトカイン産生誘導剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイン産生誘導剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトを含む生体は、ウイルス、細菌等の微生物、寄生虫、薬剤、環境汚染物質等の外的因子や、体内で発生するがん細胞等の内的因子から身を守る免疫機能を備えている。しかしながら、近年、免疫機能の低下が懸念されている。免疫機能を低下させる要因としては、食行動の多様化に伴う、脂質、糖質の摂取過剰、ミネラル類の摂取不足等による栄養バランスの偏向が挙げられる。また、他の要因として、現代社会において継続的に掛かりやすいストレス負荷が挙げられる。
【０００３】
免疫機能の低下は、ガン、感染症、アレルギ−症状等、各種疾患を誘発するといわれている。従って、免疫機能を増強することは、前記各種疾患の予防につながる。
免疫機能の増強に関与する物質として、インタ−フェロン（以下、ＩＦＮと略す）類、インタ−ロイキン（以下、ＩＬと略す）類等、サイトカインと呼ばれる微量タンパク質が知られている。サイトカインは免疫担当細胞に作用し、免疫機能を増強する。主にリンパ球が産生するＩＦＮ類には、α、β、γの３種類がある。ＩＦＮ類は、抗ウイルス作用、ナチュラルキラ−細胞及びマクロファ−ジの活性化、分化誘導の作用を奏する。
【０００４】
また、ＩＬ類としては、１〜１８が知られている。特に単球やマクロファ−ジが産生するＩＬ１２は、その産生量が増加するとリンパ球に働きかけ、ＩＦＮγを産生誘導することが知られている。  
【０００５】
また、ＩＬ２は、未分化なＴ細胞(ナイ−ブT細胞)及びＩＦＮγやＩＬ１２の刺激を受けてナイ−ブＴ細胞から分化した１型ヘルパ−Ｔ細胞によって産生される。ＩＬ２は、ナチュラルキラ−細胞の増殖・活性化、リンホカイン活性化キラ−細胞の誘導を行うことが知られている。
【０００６】
以上のようなＩＦＮ、ＩＬの産生誘導は、免疫機能の低下に起因する様々な病態の予防、症状改善に対して有益である。従って、ＩＦＮ、ＩＬの産生誘導作用を奏する産生誘導剤の開発が強く求められている。
【０００７】
コーヒー由来の成分の中には、ＩＦＮγ、またはＩＬ１２の産生誘導作用を奏するものが知られている。例えば、特許文献１には、コーヒー焙煎豆から得られたマンノ−スを主体としたオリゴ糖類を主成分とする組成物であって、ＩＦＮγ、ＩＬ１２の産生誘導作用を奏する組成物が開示されている。また、特許文献２には、コーヒー抽出物に含有されるアラビノガラクタンを有効成分とする組成物であって、ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１２の産生誘導作用を奏する組成物が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−０５１５８２号公報
【特許文献２】特開２００９−１４９５２３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１、２記載の組成物を製造するには、複雑な工程を行う必要がある。本発明は、上記問題を解決するためになされたものであり、必ずしも複雑な工程を行わなくても製造できるサイトカイン産生誘導剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１のサイトカイン産生誘導剤は、コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、チオフェン、ジメチルスルフィド、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、及び２−メチル−３−ヘキサノンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が１３．６ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とする。
【００１１】
本発明の第１のサイトカイン産生誘導剤は、血中ＩＦＮγの産生誘導を行うことができる。また、本発明の第１のサイトカイン産生誘導剤は、必ずしも複雑な工程を行わなくても製造できる。
【００１２】
本発明の第２のサイトカイン産生誘導剤は、コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェン、２−メチルピラジン、及び２，３−ジメチルピラジンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が２４．５ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とする。
【００１３】
本発明の第２のサイトカイン産生誘導剤は、血中ＩＬ２の産生誘導を行うことができる。また、本発明の第２のサイトカイン産生誘導剤は、必ずしも複雑な工程を行わなくても製造できる。
【００１４】
本発明の第３のサイトカイン産生誘導剤は、コーヒー焙煎豆の抽出物を含み、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、エチルピラジン、及び２−エチル−５−メチルピラジンから成る群から選択される１以上の成分の合計濃度が１６．５ｍｇ／Ｌ以上であることを特徴とする。
【００１５】
本発明の第３のサイトカイン産生誘導剤は、血中ＩＬ１２の産生誘導を行うことができる。また、本発明の第３のサイトカイン産生誘導剤は、必ずしも複雑な工程を行わなくても製造できる。
【００１６】
本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法は、焙煎後１５分間以内に温度を２８℃以下にした前記コーヒー焙煎豆から前記抽出物を抽出することを特徴とする。本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法によれば、必ずしも複雑な工程を行わなくてもサイトカイン産生誘導剤を製造できる。
【００１７】
また、本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法によれば、有効成分の濃度が高いサイトカイン産生誘導剤を製造できる。
本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法において、前記コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、前記抽出物を抽出するまでの保持時間が３０時間以下であり、前記保持時間における前記コーヒー焙煎豆の温度が−３０〜２８℃の範囲内であることが好ましい。この場合、有効成分の濃度が一層高いサイトカイン産生誘導剤を製造できる。
【００１８】
また、本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法において、前記コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、前記抽出物を抽出するまでの保持時間において、前記コーヒー焙煎豆の温度は−３０〜２８℃の範囲内であり、前記保持時間の始期から３０時間経過後は、前記温度が−３０〜０℃の範囲内であることが好ましい。この場合、有効成分の濃度が一層高いサイトカイン産生誘導剤を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にするまでに要する時間と、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度との関係を表すグラフである。
【図２】焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでの時間と、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度との関係を表すグラフである。
【図３】コーヒー焙煎豆を３０時間保持しているときの温度と、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度との関係を表すグラフである。
【図４】コーヒー焙煎豆を５日間保持しているときの温度と、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度との関係を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、コーヒー焙煎豆の抽出物を含む。本発明のサイトカイン産生誘導剤は、コーヒー焙煎豆の抽出物から成るもの（他の成分を実質的に含まないもの）であってもよいし、コーヒー焙煎豆の抽出物に加えて、他の成分を含んでいてもよい。
【００２１】
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、例えば、チオフェン、ジメチルスルフィド、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、及び２−メチル−３−ヘキサノンから成る群から選択される１以上の成分を含む。チオフェン、ジメチルスルフィド、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、及び２−メチル−３−ヘキサノンのそれぞれを、以下では、ＩＦＮγ関与成分とする。
【００２２】
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、全てのＩＦＮγ関与成分を含んでいてもよいし、その一部を含んでいてもよい。
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、例えば、チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェン、２−メチルピラジン、及び２，３−ジメチルピラジンから成る群から選択される１以上の成分を含む。チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェン、２−メチルピラジン、及び２，３−ジメチルピラジンのそれぞれを、以下では、ＩＬ２関与成分とする。
【００２３】
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、全てのＩＬ２関与成分を含んでいてもよいし、その一部を含んでいてもよい。
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、例えば、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、エチルピラジン、及び２−エチル−５−メチルピラジンから成る群から選択される１以上の成分を含む。２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、エチルピラジン、及び２−エチル−５−メチルピラジンのそれぞれを、以下では、ＩＬ１２関与成分とする。
【００２４】
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、全てのＩＬ１２関与成分を含んでいてもよいし、その一部を含んでいてもよい。
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、ＩＦＮγ、ＩＬ２、及びＩＬ１２のうちのいずれか１以上の産生を誘導する。ＩＦＮγ、ＩＬ２、及びＩＬ１２は、例えば  マクロファ−ジ、単球から放出される。ＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１２の産生量の向上は、免疫機能の増強につながる。
【００２５】
コーヒー焙煎豆、及びその抽出物は、例えば、食用に供される天然物由来の物とすることができる。この場合、抽出物を含むサイトカイン産生誘導剤を長期的に連続して使用しても安全性が高く、副作用を抑制することができる。
【００２６】
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、例えば、飲食品や医薬品として経口摂取することができる。飲食品としては、例えば、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品、ドリンク剤等が挙げられる。飲食品の形態は、例えば、顆粒、飴、ゼリ−、飲料等の形態とすることができる。医薬品の製剤形態は特に限定されず、例えば、液剤、錠剤、散剤、シロップ剤等の形態とすることができる。
【００２７】
本発明のサイトカイン産生誘導剤は、例えば、ヒトに適用してもよいし、ヒト以外の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、猿等）に適用してもよい。
【００２８】
コーヒー焙煎豆は、例えば、コーヒー豆を常法に従って焙煎したものである。焙煎方法としては、例えば、熱風式ドラム焙煎機を用い、４００〜５００℃の熱風温度において２０分間程度焙煎する方法がある。
【００２９】
焙煎されるコーヒー豆は、適宜選択することができる。コーヒー豆は、単一の種類であってもよいし、複数種類をブレンドしたものであってもよい。コーヒー焙煎豆の抽出物は、従来公知のコーヒー焙煎豆の抽出方法から適宜選択した方法により、得ることができる。抽出方法としては、例えば、ドリップ式抽出法、浸漬抽出法、サイフォン式抽出法、エスプレッソ式抽出法等が挙げられる。
【００３０】
本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法によれば、サイトカイン産生誘導剤におけるＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を高くすることができる。その理由は、次のように推測される。
【００３１】
コーヒー豆の焙煎過程で生じた香気成分を含む炭酸ガスは、焙煎直後から不可逆的な散逸を続ける。さらに、コーヒー焙煎豆中に保持された炭酸ガスの散逸速度は、焙煎終了後においてコーヒー焙煎豆を保持する環境の温度が高いほど、速い。前記の香気成分には、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、ＩＬ１２関与成分が含まれている。
【００３２】
コーヒー焙煎豆の温度を、焙煎後１５分間以内に２８℃以下にすることによって、焙煎直後から始まる香気成分の揮散を大きく抑制できる。
よって、コーヒー焙煎豆の温度を、焙煎後１５分間以内に２８℃以下にすることによって、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、ＩＬ１２関与成分の揮散を抑制し、その結果として、コーヒー焙煎豆の抽出物におけるＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を高くすることができる。
【００３３】
ここで、焙煎後１５分間以内とは、焙煎を終了した時点から、１５分間以内であることを意味する。コーヒー焙煎豆の温度を、焙煎後１５分間以内に２８℃以下にするためには、必ずしも、特殊な冷却機器は必要なく、通常使用される冷却機器を用いることができる。冷却機器としては、例えば、空冷ファン、ブラストフリ−ザ−、トンネルフリ−ザ−、スパイラルフリ−ザ−等が挙げられる。
【００３４】
本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法において、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、抽出物を抽出するまでの保持時間が３０時間以下であり、保持時間におけるコーヒー焙煎豆の温度が−３０〜２８℃の範囲内であることが好ましい。この場合、コーヒー焙煎豆からの香気成分の揮散を一層抑制することができるので、コーヒー焙煎豆の抽出物におけるＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を一層高くすることができる。前記保持時間は、短いほど好ましい。
【００３５】
本発明のサイトカイン産生誘導剤の製造方法において、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、抽出物を抽出するまでの保持時間において、コーヒー焙煎豆の温度は−３０〜２８℃の範囲内であり、前記保持時間の始期から３０時間経過後は、コーヒー焙煎豆の温度が−３０〜０℃の範囲内であることが好ましい。
【００３６】
この場合、コーヒー焙煎豆からの香気成分の揮散を一層抑制することができるので、コーヒー焙煎豆の抽出物におけるＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を一層高くすることができる。前記保持時間は、短いほど好ましい。
【００３７】
ここで、前記保持時間とは、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度が２８℃以下になった時点から、抽出物の抽出を開始する時点までの期間を意味する。保持時間の始期とは、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度が２８℃以下になった時点を意味する。
（実施例１）
１．サイトカイン産生誘導剤の製造
（１−１）サイトカイン産生誘導剤Ａ１
コーヒー豆（ブラジルサントスＮｏ．２）を、家庭用焙煎機（ｉ−ＲＯＡＳＴ、Ｈｅａｒｔｈｗａｒｅ  Ｈｏｍｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ製）を使用して、色差計（Ｎ Ｄ１００１ＤＰ、日本電色工業社製）で測定した色調のＬ値が２２になるまで焙煎した。
【００３８】
焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にした。そのコーヒー焙煎豆をアルミパウチに入れて密閉し、０℃に冷却して５日間保存した。
次に、前記のように５日間保存したコーヒー焙煎豆を、ボンマックコーヒーカッタ−（ＢＭ６５０、ラッキ−コーヒーマシ−ン社製）を使用して挽き豆にした。その後、挽き豆と熱湯とを混合して混合液を調製し、２分間静置した（抽出の一例）。このとき、挽き豆と熱湯との比率は、重量比で１：１０とした。静置後、混合液を数回攪拌してから、カリタ式ペ−パ−ドリッパ−を用いてろ過し、ろ過液（抽出物）を回収した。この抽出物を、サイトカイン産生誘導剤Ａ１とした。
【００３９】
（１−２）サイトカイン産生誘導剤Ａ２
基本的には前記サイトカイン産生誘導剤Ａ１の場合と同様に、サイトカイン産生誘導剤Ａ２を製造した。ただし、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでに、コーヒー焙煎豆を２４時間保持した。保持中、コーヒー焙煎豆の温度は２８℃とした。
【００４０】
（１−３）サイトカイン産生誘導剤Ａ３
基本的には前記サイトカイン産生誘導剤Ａ１の場合と同様に、サイトカイン産生誘導剤Ａ３を製造した。ただし、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでに、コーヒー焙煎豆を３０時間保持した。保持中、コーヒー焙煎豆の温度は２８℃とした。
【００４１】
（１−４）サイトカイン産生誘導剤Ａ４
基本的には前記サイトカイン産生誘導剤Ａ１の場合と同様に、サイトカイン産生誘導剤Ａ４を製造した。ただし、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでに、コーヒー焙煎豆を３６時間保持した。保持中、コーヒー焙煎豆の温度は２８℃とした。
【００４２】
（１−５）サイトカイン産生誘導剤Ａ５
基本的には前記サイトカイン産生誘導剤Ａ１の場合と同様に、サイトカイン産生誘導剤Ａ５を製造した。ただし、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでに、コーヒー焙煎豆を４２時間保持した。保持中、コーヒー焙煎豆の温度は２８℃とした。
【００４３】
（１−６）サイトカイン産生誘導剤Ａ６
基本的には前記サイトカイン産生誘導剤Ａ１の場合と同様に、サイトカイン産生誘導剤Ａ６を製造した。ただし、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでに、コーヒー焙煎豆を４８時間保持した。保持中、コーヒー焙煎豆の温度は２８℃とした。
【００４４】
（１−７）サイトカイン産生誘導剤Ａ７
基本的には前記サイトカイン産生誘導剤Ａ１の場合と同様に、サイトカイン産生誘導剤Ａ７を製造した。ただし、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでに、コーヒー焙煎豆を７２時間保持した。保持中、コーヒー焙煎豆の温度は２８℃とした。
【００４５】
（１−８）サイトカイン産生誘導剤Ａ８
基本的には前記サイトカイン産生誘導剤Ａ１の場合と同様に、サイトカイン産生誘導剤Ａ８を製造した。ただし、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでに、コーヒー焙煎豆を９６時間保持した。保持中、コーヒー焙煎豆の温度は２８℃とした。
【００４６】
２．サイトカイン産生誘導剤の有効成分濃度
サイトカイン産生誘導剤Ａ１〜Ａ８について、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を、ＧＣ−ＭＳ（Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、ガスクロマトグラフ質量分析）を用いて以下のように測定した。
【００４７】
まず、２０ｍｌ容のＧＣ用スクリュ−キャップ付きバイアル瓶に試料を充填し、密閉した。試料は、サイトカイン産生誘導剤２０ｍｌと、内標準物質５μｌとから成る。内標準物質は、濃度１００ｐｐｍのシクロヘキサノール（ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｌ）である。
【００４８】
その後、試料を６０℃の温度で２０分間予備保温してから、固相抽出マイクロファイバ−（Ｓｕｐｅｒｃｏ製、ＤＶＢ／Ｃａｒｂｏｘｅｎ／ＰＤＭＳ）に、試料中の揮発性成分を３０分間吸着させた。次に、注入口内で固相抽出マイクロファイバ−を露出させ、固相マイクロファイバ−に吸着した成分を３分間脱離させ、分析に供した。分析の条件は以下のとおりである。
【００４９】
分析測定機器：ＧＣは７８９０Ａ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）、ＭＳは７０００Ｂ（Ａｇｉｌｅｎｔ製）  
カラム：ＶＦ−ＷＡＸ  ０．２５ｍｍ×６０ｍ（Ｖａｒｉａｎ製）
注入口温度：２５０℃
昇温条件：４０℃で５分保持、１００℃までは２℃／分、１００℃〜２３０℃は８℃／分、２３０℃ に達温後、５分保持
ＭＳ の測定条件：スキャンモ−ド
イオン源温度：２３０℃
イオン化電圧：７０ｅＶ
測定結果を表１〜表３に示す。表１〜表３における濃度の単位はｍｇ／Ｌである。
【００５０】
【表１】
2016084301.tif 000003
【００５１】
【表２】
2016084301.tif 000004
【００５２】
【表３】
2016084301.tif 000005
表１〜表３に示すように、サイトカイン産生誘導剤Ａ１〜Ａ３においては、ＩＦＮγ関与成分の合計濃度は１３.６ｍｇ／Ｌ以上、ＩＬ２関与成分の合計濃度は２４．５ｍｇ／Ｌ以上、ＩＬ１２関与成分の合計濃度は１６．５ｍｇ／Ｌ以上であった。サイトカイン産生誘導剤の製造工程において、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、抽出物を抽出するまでの保持時間が短いほど、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度は高くなっていた。
【００５３】
また、図２に、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を、１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出を行うまでの保持時間と、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の合計濃度との関係を示す。保持時間が短いほど、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の合計濃度は高かった。
【００５４】
３．サイトカイン産生誘導剤の使用
（３−１）試験用サンプルの調製
生後６週令のＩＣＲ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）マウス雄性を１週間固形飼料(日本クレア製  ＣＥ−２)で予備飼育した後、平均体重が均等になるように群分けした。
【００５５】
各群のＩＣＲマウスに対して、サイトカイン産生誘導剤Ａ１を投与した。投与の方法は、ゾンデを用いて胃内に強制的に注入する強制経口投与とした。投与量は、ヒトが一日あたりコーヒーカップ４杯分のコーヒーを摂取する量（６００ｍｌ）に相当する量とした。飼料および水は自由摂取とした。投与は１日１回ずつ、定期的に行った。
【００５６】
ＩＣＲマウスの尾静脈より採血を行い、その後、採取した血液を遠心分離（３，０００ｇ×２０分、５℃）し、分離した血清を試験用サンプルＢ１とした。サンプルＢ１は、試験開始時から４週間にわたって、１週間ごとに繰り返し取得した。すなわち、サンプルＢ１には、試験開始時（０週間経過後）に取得したものと、試験開始から１週間後に取得したものと、試験開始から２週間後に取得したものと、試験開始から３週間後に取得したものと、試験開始から４週間後に取得したものとがある。
【００５７】
また、サイトカイン産生誘導剤Ａ１の代わりに、サイトカイン産生誘導剤Ａ２〜Ａ８を投与した場合についても、前記と同様の手順により、サンプルＢ２〜Ｂ８を得た。サイトカイン産生誘導剤Ａｉを投与した場合のサンプルが、サンプルＢｉである（ｉ＝２〜８）。サンプルＢ２〜Ｂ８についても、それぞれ、サンプルＢ１と同様に、試験開始時（０週間経過後）に取得したものと、試験開始から１週間後に取得したものと、試験開始から２週間後に取得したものと、試験開始から３週間後に取得したものと、試験開始から４週間後に取得したものとがある。
【００５８】
（３−２）血中サイトカイン濃度の測定方法
以下のようにして、サンプルＢ１〜Ｂ８中のＩＦＮγ濃度（血中ＩＦＮγ濃度）、ＩＬ２濃度（血中ＩＬ２濃度）、及びＩＬ１２濃度（血中ＩＬ１２濃度）を測定した。測定には、Ｍｕｒｉｎｅ  ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ、Ｍｕｒｉｎｅ  ＩＬ２  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ、及びＭｕｒｉｎｅ  ＩＬ１２  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（何れもＰｅｐｒｏＴｅｃｈ製）を用い、そのプロトコ−ルに従って測定を行った。
【００５９】
(i)血中ＩＦＮγ濃度の測定
ウサギ抗Ｍｕｒｉｎｅ  ＩＦＮ抗体を１次抗体として、各ウェルに１００μｌ注入した後、室温で一晩コ−ティングを行った。翌日、各ウェルを、０．０５%ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭリン酸緩衝液（洗浄液Ａ）を用いて５回洗浄し、各ウェルに１％ＢＳＡを含む１５０ｍＭリン酸緩衝液を３００μｌ加え、室温で少なくとも６０分以上ブロッキングした。
【００６０】
０．１％ＢＳＡ、０．０５%ｔｗｅｅｎ２０を含む１５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用いて適当な濃度に希釈したサンプル（サンプルＢ１〜Ｂ８のいずれか）とＭｕｒｉｎｅ  ＩＦＮγ抗体の標準品とを各ウェルに１００μｌ分注し、室温で少なくとも２時間以上保持した。その後、各ウェルを洗浄液Ａで５回洗浄後、ビオチン標識したウサギ抗Ｍｕｒｉｎｅ ＩｇＡ抗体を１００μｌ加えて、室温で２時間保持した。その後、各ウェルを洗浄液Ａで５回洗浄後、アビジン−ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：西洋ワサビ由来ペルオキシダ−ゼ）接合体を１００μｌずつ各ウェルに加え、室温で３０分間保持した。
【００６１】
その後、各ウェルを５回洗浄後、ＡＢＴＳ（２，２‘−ａｖｉｎｏｚｉ(３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ)ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ：２，２’−アビノジ（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルフォン酸）アンモニウム塩）発色液（ナカライテスク製）を１００μｌ加え、アルミホイルで遮光しながら室温で３０分間反応させた。
【００６２】
その後、しゅう酸水溶液を１００μｌ加えて反応を停止し、反応液の４０５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレ−トリ−ダ−により測定した。なお、コントロ−ル群として、サイトカイン産生誘導剤を投与しないＩＣＲマウス血中のＩＦＮγ濃度（ｐｇ／ｍｌ）も前記と同様に測定した。
【００６３】
（ii）血中ＩＬ２濃度、血中ＩＬ１２濃度の測定
血中ＩＦＮγ濃度の場合と同様の方法で、血中ＩＬ２濃度、及び血中ＩＬ１２濃度を測定した。  （３−３）血中サイトカイン濃度の測定結果
サンプルＢ１〜Ｂ８における血中ＩＦＮγ濃度の測定結果を表４に示し、サンプルＢ１〜Ｂ８における血中ＩＬ２濃度の測定結果を表５に示し、サンプルＢ１〜Ｂ８における血中ＩＬ１２濃度の測定結果を表６に示す。
【００６４】
【表４】
2016084301.tif 000006
【００６５】
【表５】
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【００６６】
【表６】
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表４に示すように、サンプルＢ１では、試験開始から３週間後、血中ＩＦＮγ濃度がコントロ−ル群に比較して有意に増加していた。サンプルＢ２、Ｂ３では、試験開始から４週間後、血中ＩＦＮγ濃度がコントロ−ル群に比較して有意に増加していた。一方、サンプルＢ４〜Ｂ８では、コントロ−ル群と比較して血中ＩＦＮγ濃度の有意な増加は認められなかった。
【００６７】
表５に示すように、サンプルＢ１、Ｂ２では、試験開始から３週間後、マウスの血中ＩＬ２濃度がコントロ−ル群に比較して有意に増加していた。
サンプルＢ３では、試験開始から４週間後、血中ＩＬ２濃度がコントロ−ル群に比較して有意に増加していた。一方、サンプルＢ４〜Ｂ８では、コントロ−ル群と比較して、血中ＩＬ２濃度の有意な増加は認められなかった。
【００６８】
表６に示すように、サンプルＢ１、Ｂ２では、試験開始から３週間後、血中ＩＬ１２濃度がコントロ−ル群と比較して有意に増加していた。サンプルＢ３では、試験開始から４週間後、血中ＩＬ１２濃度がコントロ−ル群と比較して有意に増加していた。一方、サンプルＢ４〜Ｂ８では、コントロ−ル群に比較して血中ＩＬ２濃度の有意な増加は認められなかった。
【００６９】
以上の結果から、使用するサイトカイン産生誘導剤におけるＩＦＮγ関与成分の合計濃度が１３．６ｍｇ／Ｌ以上であれば、血中ＩＦＮγ濃度が増加することが確認できた。
また、使用するサイトカイン産生誘導剤におけるＩＬ２関与成分の合計濃度が２４．５ｍｇ／Ｌ以上であれば、血中ＩＬ２濃度が増加することが確認できた。
【００７０】
また、使用するサイトカイン産生誘導剤におけるＩＬ１２関与成分の合計濃度が１６．５ｍｇ／Ｌ以上であれば、血中ＩＬ１２濃度が増加することが確認できた。
４．サイトカイン産生誘導剤の有効成分を確認するための試験
前記「２．サイトカイン産生誘導剤の有効成分濃度」での測定結果において、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、抽出物を抽出するまでの保持時間が長いほど、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度が低下していた。
【００７１】
また、前記「３．サイトカイン産生誘導剤の使用」の評価結果において、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にしてから、抽出物を抽出するまでの保持時間が長い条件で製造したサイトカイン産生誘導剤では、サイトカイン産生誘導効果が低くなった。
【００７２】
このことから、コーヒー焙煎豆の保持中に失われる香気成分であって、揮発速度が速い成分の中に、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分が含まれると推測できる。
【００７３】
コーヒー焙煎豆に含まれる、揮散速度の速い香気成分としては、アセトアルデヒド、ペンタナール、２−メチルブタナール、３−メチルブタナール、フラン、２，５−ジメチルフラン、２，３，５−トリメチルフラン、３−メチルテトラヒドロフラン、２−アセチルフラン、フルフリルプロピオネート、２，３−ブタンジオン、３−ヘキサノン、２，３−ペンタンジオン、２−ヘキサノン、２−メチル−３−ヘキサノン、ピラジン、２−メチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、エチルピラジン、２−エチル−５−メチルピラジン、２−エチル−３，５−ジメチルピラジン、ジメチルスルフィド、チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェン、４−メチルチアゾール、１−メチルピロール、３−メチルフェノール、ピリジン、トリメチルオキサゾール、２，５−ジメチル‐１Ｈ−ピロールが挙げられる。
【００７４】
揮散速度の速い香気成分を、化学構造の基本骨格に基づいて６グループに分けた。６つのグループは以下のとおりである。
アルデヒド群：アセトアルデヒド、ペンタナール、２−メチルブタナール、３−メチルブタナール
フラン群：フラン、２，５−ジメチルフラン、２，３，５−トリメチルフラン、３−メチルテトラヒドロフラン、２−アセチルフラン、フルフリルプロピオネート
ケトン群：２，３−ブタンジオン、３−ヘキサノン、２，３−ペンタンジオン、２−ヘキサノン、２−メチル−３−ヘキサノン
ピラジン群：ピラジン、２−メチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、エチルピラジン、２−エチル−５−メチルピラジン、２−エチル−３，５−ジメチルピラジン
含硫化合物群：ジメチルスルフィド、チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェン、４−メチルチアゾール
混合群：１−メチルピロール、３−メチルフェノール、ピリジン、トリメチルオキサゾール、２，５−ジメチル‐１Ｈ−ピロール
いずれのグループがＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１２の産生誘導に関与しているのかを確かめるために、各グループに属する成分の標準品溶液を作成し、その標準品溶液によるＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１２の産生誘導効果を、前記「３．サイトカイン産生誘導剤の使用」と同様の方法で評価した。
【００７５】
標準品溶液の組成は以下のとおりである。標準品溶液における各成分の濃度は、サイトカイン産生誘導剤Ａ１における濃度と同じとした。
アルデヒド群の標準品溶液：アセトアルデヒド(8.3mg/L)、ペンタナール(0.8mg/L)、２−メチルブタナール(2.3mg/L)、 ３−メチルブタナール(2.1mg/L)
フラン群の標準品溶液の組成：フラン（0.9mg/L)、２，５−ジメチルフラン0.1mg/L)、２，３，５−トリメチルフラン(0.2mg/L)、３−メチルテトラヒドロフラン(0.2mg/L)、２−アセチルフラン(0.3mg/L)、フルフリルプロピオネート(0.2mg/L)
ケトン群の標準品溶液の組成：２，３−ブタンジオン（4.8mg/L)、３−ヘキサノン(0.1mg/L)、２，３−ペンタンジオン(2.1mg/L)、２−ヘキサノン(0.1mg/L)、２−メチル−３−ヘキサノン(0.7mg/L)
ピラジン群の標準品溶液の組成：ピラジン(0.6mg/L)、２−メチルピラジン(16.0mg/L)、２，３−ジメチルピラジン(2.2mg/L)、２，５−ジメチルピラジン(5.0mg/L)、２，６−ジメチルピラジン(6.2mg/L)、エチルピラジン(4.8mg/L)、２−エチル−５−メチルピラジン(0.6mg/L)、２−エチル−３，５−ジメチルピラジン(0.2mg/L)
含硫化合物群の標準品溶液の組成：ジメチルスルフィド(3.3mg/L)、チオフェン(4.2mg/L)、２−メチルチオフェン(2.0mg/L)、 ３−メチルチオフェン(1.9mg/L)、４−メチルチアゾール(1.0mg/L)
混合物群の標準品溶液の組成：１−メチルピロール(3.4mg/L)、３−メチルフェノール(3.5mg/L)、ピリジン(3.8mg/L)、トリメチルオキサゾール(1.0mg/l)、２，５−ジメチル‐１Ｈ−ピロール(1.2mg/L)
なお、標準品溶液の調製において、水溶性成分は蒸留水に溶解した。また、水に難溶性の成分は、0.1%カルボキシメチルセルロース（CMC）水溶液に分散した。アセトアルデヒドは和光純薬製のものを用い、2,3,5-トリメチルフラン、2-エチル-5-メチルピラジン、及びフルフリルプロピオネートはシグマアルドリッチ製のものを用い、それ以外の成分は東京化成工業製の試薬（特級グレード）を用いた。
【００７６】
各グループによるＩＦＮγの産生誘導効果を表７に示し、各グループによるＩＬ２の産生誘導効果を表８に示し、各グループによるＩＬ１２の産生誘導効果を表９に示す。
【００７７】
【表７】
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【００７８】
【表８】
2016084301.tif 000010
【００７９】
【表９】
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表７に示すように、ケトン群、含硫化合物群の場合、試験開始から２週間後、血中ＩＦＮγ濃度がコントロ−ル群と比較して有意に増加した。一方、アルデヒド群、ピラジン群、フラン群、及び混合物群の場合、コントロール群と比較して血中ＩＦＮγ濃度の有意な増加は認められなかった。
【００８０】
また、表８に示すように、含硫化合物群、ピラジン群の場合、試験開始から３週間後、血中ＩＬ２濃度がコントロ−ル群と比較して有意に増加した。一方、アルデヒド群、ケトン群、フラン群、及び混合物群の場合、コントロール群と比較して血中ＩＬ２濃度の有意な増加は認められなかった。
【００８１】
また、表９に示すように、ピラジン群の場合、試験開始から３週間後、血中ＩＬ１２濃度がコントロ−ル群と比較して有意に増加した。一方、アルデヒド群、ケトン群、含硫化合物群、フラン群、及び混合物群の場合、コントロール群と比較して、血中ＩＬ１２濃度の有意な増加は認められなかった。
【００８２】
以上の結果から、血中ＩＦＮγの産生誘導にはケトン群、含硫化合物群が関与し、血中ＩＬ２の産生誘導には含硫化合物群、ピラジン群が関与し、血中ＩＬ１２の産生誘導にはピラジン群が関与することが確かめられた。
【００８３】
次に、サイトカインの産生誘導に関与する具体的な成分を特定するため、産生誘導効果が確認されたグループに属する各成分のサイトトカイン産生誘導効果を評価した。すなわち、ケトン群に属する各成分単独によるＩＦＮγ産生誘導効果と、含硫化合物群に属する各成分単独によるＩＦＮγ及びＩＬ２の産生誘導効果と、ピラジン群に属する各成分単独によるＩＬ２及びＩＬ１２産生誘導効果とを評価した。
【００８４】
前記の評価においては、評価対象の成分ごとに、その成分を単独で含む標準品溶液を作成し、その標準品溶液によるＩＦＮγ、ＩＬ２、ＩＬ１２産生誘導効果を、前記「３．サイトカイン産生誘導剤の使用」と同様の方法で評価した。標準品溶液における各成分の濃度は、サイトカイン産生誘導剤Ａ１における濃度と同じとした。
【００８５】
各成分によるＩＦＮγの産生誘導効果を表１０に示し、各成分によるＩＬ２の産生誘導効果を表１１に示し、各成分によるＩＬ１２の産生誘導効果を表１２に示す。
【００８６】
【表１０】
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【００８７】
【表１１】
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【００８８】
【表１２】
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表１０に示す評価結果から、ＩＦＮγの産生誘導に関与する成分は、ジメチルスルフィド、チオフェン、２，３−ブタンジオン、２，３−ペンタンジオン、２−メチル−３−ヘキサノンであることが確認できた。
【００８９】
また、表１１に示す評価結果から、ＩＬ２の産生誘導に関与する成分は、２−メチルピラジン、２，３−ジメチルピラジン、チオフェン、２−メチルチオフェン、３−メチルチオフェンであることが確認できた。
【００９０】
また、表１２に示す評価結果から、ＩＬ１２の産生誘導に関与する成分は、２，５−ジメチルピラジン、２，６−ジメチルピラジン、エチルピラジン、２−エチル‐５−メチルピラジンであることが確認できた。
（実施例２）
基本的には前記実施例１におけるサイトカイン産生誘導剤Ａ１と同様の方法で、本実施例のサイトカイン産生誘導剤を製造した。ただし、本実施例では、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にするまでに要する時間（所要時間）を、表１３に示すとおり、種々に変化させた。
【００９１】
【表１３】
2016084301.tif 000015
そして、それぞれの条件で製造したサイトカイン産生誘導剤において、前記実施例１と同様に、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を測定した。その結果を表１３及び図１に示す。
【００９２】
表１３及び図１に示すように、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にするまでに要する時間が短いほど、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度が高くなった。特に、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を２８℃以下にするまでに要する時間が１５分間以内であると、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度が一層高くなった。
【００９３】
なお、ＩＦＮγ関与成分の濃度とは、ＩＦＮγ関与成分に該当する成分の合計濃度をいう。また、ＩＬ２関与成分の濃度とは、ＩＬ２関与成分に該当する成分の合計濃度をいう。また、ＩＬ１２関与成分の濃度とは、ＩＬ１２関与成分に該当する成分の合計濃度をいう。
（実施例３）
基本的には前記実施例１におけるサイトカイン産生誘導剤Ａ１と同様の方法で、本実施例のサイトカイン産生誘導剤を製造した。ただし、本実施例では、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出物を抽出するまでに３０時間保持した。そして、保持している間の温度（保持温度）を、表１４に示すように、種々に変化させた。
【００９４】
【表１４】
2016084301.tif 000016
それぞれの条件で製造したサイトカイン産生誘導剤において、前記実施例１と同様に、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を測定した。その結果を表１４及び図３に示す。
【００９５】
表１４及び図３に示すように、保持している間の温度が低いほど、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度が高くなった。特に、保持している間の温度が０〜２８℃の範囲内にあると、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度が一層高くなった。
（実施例４）
基本的には前記実施例１におけるサイトカイン産生誘導剤Ａ１と同様の方法で、本実施例のサイトカイン産生誘導剤を製造した。ただし、本実施例では、焙煎後、コーヒー焙煎豆の温度を１５分間以内に２８℃以下にしてから、抽出物を抽出するまでに、２８℃の温度で３０時間保持した。その後さらに、コーヒー焙煎豆を５日間保持してから、抽出物の抽出を行った。５日間保持している間の温度を、表１５に示すように、種々に変化させた。
【００９６】
【表１５】
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それぞれの条件で製造したサイトカイン産生誘導剤において、前記実施例１と同様に、ＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度を測定した。その結果を表１５及び図４に示す。
【００９７】
表１５及び図４に示すように、５日間保持している間の温度が低いほど、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度が高くなった。特に、５日間保持している間の温度が−３０〜０℃の範囲内であると、サイトカイン産生誘導剤中のＩＦＮγ関与成分、ＩＬ２関与成分、及びＩＬ１２関与成分の濃度が一層高くなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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