(57)【要約】      （修正有）【課題】タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析する方法であって、Ｎ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのいずれのシグナルも観測しつつ、個々のシグナルがどちらの系列のものなのかを確実に帰属することができる方法を提供する。【解決手段】解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違や有無に起因する質量差を利用し、質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属する。【選択図】図２
2016004032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析する方法であって、以下の３つのステップを少なくとも含んでなる方法。
（１）解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してラベル化を行ったペプチドのスペクトルを取得するステップ
（２）解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチド、および／または、解析対象とするペプチドそれ自体のスペクトルを取得するステップ
（３）ステップ（１）で取得したスペクトルとステップ（２）で取得したスペクトルを対比し、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違および／または有無に起因する質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属するステップ
【請求項２】
ステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドと、ステップ（２）でスペクトルを取得するペプチドが、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違によってアイソトポログの関係である請求項１記載の方法。
【請求項３】
アイソトポログの関係が、アセチル化と重アセチル化の関係である請求項２記載の方法。
【請求項４】
解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を、下記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いて行う請求項３記載の方法。
【化１】
2016004032.tif 000007
［式中、Ｒは、同一または異なって、置換基を有していてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシル基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。ｎは、同一または異なって、０〜３の整数を示す。］
【請求項５】
解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を、上記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの略１：１の混合物（モル比）をペプチドに対して反応させることで行う請求項４記載の方法。
【請求項６】
さらに以下の３つのステップを少なくとも含んでなる請求項１記載の方法。
（４）解析対象とするペプチドについてそのＣ末端カルボキシル基に対してラベル化を行ったペプチドのスペクトルを取得するステップ
（５）解析対象とするペプチドについてそのＣ末端カルボキシル基に対してステップ（４）でスペクトルを取得するペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチド、および／または、解析対象とするペプチドそれ自体のスペクトルを取得するステップ
（６）ステップ（４）で取得したスペクトルとステップ（５）で取得したスペクトルを対比し、解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対するラベル化の有無および／または相違に起因する質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属するステップ
【請求項７】
解析対象とするペプチドが、３〜２０残基のアミノ酸からなるペプチドである請求項１記載の方法。
【請求項８】
タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析するために、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を行うための下記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの使用。
【化２】
2016004032.tif 000008
［式中、Ｒは、同一または異なって、置換基を有していてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシル基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。ｎは、同一または異なって、０〜３の整数を示す。］
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いたペプチドのアミノ酸配列の解析は、今日、ライフサイエンス分野において盛んに行われている。この方法は、装置の第１の質量分析計においてペプチドをイオン化して特定の質量のイオンを選択した後、選択したイオンを開裂させ、第２の質量分析計においてプロダクトイオンとして検出されたフラッグメントイオンからペプチドのアミノ酸配列をインタープリテート（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｅ）するものであり、それぞれのフラッグメントイオンのシグナル間の質量差に相当するアミノ酸やペプチドを、開裂様式について蓄積されたデータベースから検索してマッチングを行うことで解析が進められる。フラッグメントイオンは、ペプチドの開裂位置によって区別される、Ｎ末端フラッグメントイオン（ａ，ｂ，ｃイオン系列）とＣ末端フラッグメントイオン（ｘ，ｙ，ｚイオン系列）からなるが（Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ−Ｆｏｈｌｍａｎｎ−Ｂｉｅｍａｎｎによる命名）、Ｎ末端フラッグメントイオンのシグナルとＣ末端フラッグメントイオンのシグナルがスペクトル上で混在することはペプチドのアミノ酸配列の解析を困難にする。そこで、Ｎ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのいずれか一方のみを選択的に発生させることで解析を容易にする試みがなされているが（例えば非特許文献１〜３を参照のこと）、こうした方法では他方から得られる情報を失ってしまうため、解析によって決定されたアミノ酸配列の信頼度には自ずと限界がある。以上の点に鑑みれば、Ｎ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのいずれのシグナルも観測しつつ、個々のシグナルがどちらの系列のものなのかを確実に帰属することができれば理想的である。しかしながら、そのような効果的な手法は未だ存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍｉｙａｓｈｉｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１１，２５，１１３０．
【非特許文献２】Ｖａｓｉｃｅｋ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９，２０，３７７．
【非特許文献３】Ｄｉｋｌｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９７，３２，１３３７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析する方法であって、Ｎ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのいずれのシグナルも観測しつつ、個々のシグナルがどちらの系列のものなのかを確実に帰属することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してラベル化を行ったペプチドと、このペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対して行ったペプチドや解析対象とするペプチドそれ自体について、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いて取得したそれぞれのスペクトルを対比することで、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違や有無に起因する質量差を利用して、個々のシグナルがＮ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのどちらの系列のものなのかを確実に帰属することができる方法を見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析する方法であって、以下の３つのステップを少なくとも含んでなる方法である。
（１）解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してラベル化を行ったペプチドのスペクトルを取得するステップ
（２）解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチド、および／または、解析対象とするペプチドそれ自体のスペクトルを取得するステップ
（３）ステップ（１）で取得したスペクトルとステップ（２）で取得したスペクトルを対比し、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違および／または有無に起因する質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属するステップ
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、ステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドと、ステップ（２）でスペクトルを取得するペプチドが、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違によってアイソトポログの関係である。
また、請求項３記載の方法は、請求項２記載の方法において、アイソトポログの関係が、アセチル化と重アセチル化の関係である。
また、請求項４記載の方法は、請求項３記載の方法において、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を、下記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いて行う。
【０００７】
【化１】
2016004032.tif 000003
【０００８】
［式中、Ｒは、同一または異なって、置換基を有していてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシル基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。ｎは、同一または異なって、０〜３の整数を示す。］
また、請求項５記載の方法は、請求項４記載の方法において、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を、上記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの略１：１の混合物（モル比）をペプチドに対して反応させることで行う。
また、請求項６記載の方法は、請求項１記載の方法において、さらに以下の３つのステップを少なくとも含んでなる。
（４）解析対象とするペプチドについてそのＣ末端カルボキシル基に対してラベル化を行ったペプチドのスペクトルを取得するステップ
（５）解析対象とするペプチドについてそのＣ末端カルボキシル基に対してステップ（４）でスペクトルを取得するペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチド、および／または、解析対象とするペプチドそれ自体のスペクトルを取得するステップ
（６）ステップ（４）で取得したスペクトルとステップ（５）で取得したスペクトルを対比し、解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対するラベル化の有無および／または相違に起因する質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属するステップ
また、請求項７記載の方法は、請求項１記載の方法において、解析対象とするペプチドが、３〜２０残基のアミノ酸からなるペプチドである。
また、本発明は、請求項８記載の通り、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析するために、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を行うための下記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの使用である。
【０００９】
【化２】
2016004032.tif 000004
【００１０】
［式中、Ｒは、同一または異なって、置換基を有していてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシル基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。ｎは、同一または異なって、０〜３の整数を示す。］
【発明の効果】
【００１１】
本発明の方法によれば、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いて取得した解析対象とするペプチドについてのスペクトルにおける個々のフラッグメントイオンのシグナルが、Ｎ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのどちらの系列のものなのかを確実に帰属することができるので、そのアミノ酸配列の解析が容易になる。また、本発明の方法は、フラッグメントイオンのシグナルとノイズシグナルの区別を容易にするという利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１における、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図２】同、本発明の方法に従って、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドのそれぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルをデータ処理することによって取得したスペクトルである。
【図３】参考例１における、本発明の方法の基礎となる原理を解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対して適用し、メチルエステル化を行ったペプチドと重メチルエステル化を行ったペプチドのそれぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルをデータ処理することによって取得したスペクトルである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析する方法であって、以下の３つのステップを少なくとも含んでなる方法である。
（１）解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してラベル化を行ったペプチドのスペクトルを取得するステップ
（２）解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチド、および／または、解析対象とするペプチドそれ自体のスペクトルを取得するステップ
（３）ステップ（１）で取得したスペクトルとステップ（２）で取得したスペクトルを対比し、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違および／または有無に起因する質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属するステップ
【００１４】
本発明の方法において、解析対象とするペプチドのアミノ酸配列の解析のために用いるタンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）は、自体公知のものであってよい。スペクトルを取得するための質量分析計としては、磁場偏向型、四重極型、イオントラップ型、飛行時間型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型、これらのハイブリッド型などのものが挙げられる。ペプチドをイオン化する方法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ法）、高速原子衝突法（ＦＡＢ法）などが挙げられる。ペプチドを開裂させる方法としては、衝突誘起解離法（ＣＩＤ法）、ポストソース分解法（ＰＳＤ法）、インソース分解法（ＩＳＤ法）、電子捕獲解離法（ＥＣＤ法）、電子移動解離法（ＥＴＤ法）などが挙げられる。なお、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）の前段に液体クロマトグラフィー装置（ＬＣ）を配置し、解析対象とするペプチドを予め精製したり他の物質から分離したりしてからタンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）に導入するようにしてもよい。
【００１５】
本発明の方法におけるステップ（１）は、解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してラベル化を行ったペプチドのスペクトルを取得するステップであり、ステップ（２）は、解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチド、および／または、解析対象とするペプチドそれ自体のスペクトルを取得するステップである。ステップ（２）でスペクトルを取得するペプチドは、解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチドおよび解析対象とするペプチドそれ自体のいずれか一方であってもよいし、両方であってもよい。
【００１６】
ステップ（１）で解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対して行うラベル化は、例えばアセチル化、ベンゾイル化、ピバロイル化、Ｎ，Ｎ−ジメチルナフタレンスルホニル化などの中から選択することができる。また、ステップ（２）でスペクトルを取得するペプチドが、解析対象とするペプチドについてそのＮ末端アミノ基に対してステップ（１）でスペクトルを取得するペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチドである場合におけるそのラベル化は、例えばアセチル化、ベンゾイル化、ピバロイル化、Ｎ，Ｎ−ジメチルナフタレンスルホニル化などの中から、ステップ（１）で解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対して行うラベル化として選択したもの以外のものを選択することができる。こうしたラベル化は、ラベル化剤として対応する酸無水物や酸塩化物などを用いて自体公知の方法によって行うことができる。しかしながら、ステップ（１）とステップ（２）で解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対して行うそれぞれのラベル化は、それぞれのラベル化によってスペクトルを取得する双方のペプチドがアイソトポログの関係になるものであることが、双方のペプチドの開裂様式が略同一であることでシグナル強度が略同一である点などにおいて望ましい。スペクトルを取得する双方のペプチドがＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違によってアイソトポログの関係になるそれぞれのラベル化の具体例としては、アセチル化と重アセチル化に例示されるアシル化と重アシル化が挙げられる。
【００１７】
ステップ（１）とステップ（２）で解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対して行うそれぞれのラベル化としてアセチル化と重アセチル化を選択する場合、下記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル（ＨＯＢｔエステル）を用いて行うことが望ましい。
【００１８】
【化３】
2016004032.tif 000005
【００１９】
［式中、Ｒは、同一または異なって、置換基を有していてもよい低級アルキル基、低級アルコキシ基、カルボキシル基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基のいずれかを示す。ｎは、同一または異なって、０〜３の整数を示す。］
【００２０】
上記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルは、水中で十分な反応性を有するアセチル化剤と重アセチル化剤であり、ｐＨ４〜６．５程度の弱酸性の条件下において、温度５〜３５℃で、ペプチドが有するＮ末端アミノ基を選択的にアセチル化と重アセチル化することができる（Ｎ末端アミノ基以外のアミノ基はプロトン化されることでアセチル化と重アセチル化されない）。上記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルにおいて、置換基を有していてもよい低級アルキル基における低級アルキル基とは、炭素数が１〜６の直鎖または分岐鎖のアルキル基を意味し、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。低級アルコキシ基とは、炭素数が１〜６の直鎖または分岐鎖のアルコキシ基を意味し、具体的には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、イソブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基などが挙げられる。Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基としては、その低級アルキル部は上記と同義であり、例えば、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、エチルメチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、メチルプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基などが挙げられる。置換基を有していてもよい低級アルキル基における置換基としては、低級アルコキシ基、カルボキシル基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基などが挙げられ、低級アルコキシ基、Ｎ，Ｎ−ジ低級アルキルアミノ基は上記と同義である。上記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルは、対応する１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと酢酸または酢酸−ｄ４から自体公知の方法によって調製することができる。なお、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、ピバリン酸と酢酸または酢酸−ｄ４の酸無水物などを用いて行ってもよい。
【００２１】
解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を、解析対象とするペプチドに対し、アセチル化用の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルと重アセチル化用の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルをそれぞれ別個に反応させることで行い、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドをそれぞれ別個に得るようにしてもよいが、解析対象とするペプチドに対し、アセチル化用の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルと重アセチル化用の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルの略１：１の混合物（モル比）を反応させることで、Ｎ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を同時に行い、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドの略１：１の混合物（モル比）を得るようにしてもよい。解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドの略１：１の混合物（モル比）をタンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）に導入すれば、ステップ（１）とステップ（２）を一度に行うことができる。
【００２２】
本発明の方法におけるステップ（３）は、ステップ（１）で取得したスペクトルとステップ（２）で取得したスペクトルを対比し、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するラベル化の相違および／または有無に起因する質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属するステップである。このステップは、マニュアル（手計算など）で行ってもよいが、常法に従ってプログラム化されたソフトウェアを用いてコンピュータプラットフォーム上において行ってもよい。例えば、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化を、上記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いて行った場合、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドの質量差は、Ｎ末端アミノ基に対するラベル化の相違に起因する３である。従って、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドのそれぞれのスペクトルを対比すると、Ｎ末端フラッグメントイオン（ａ，ｂ，ｃイオン系列）のシグナルは、アセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドの間で質量差が３の分だけ異なるｍ／ｚ値で略同一の強度で観測される。一方、Ｃ末端フラッグメントイオン（ｘ，ｙ，ｚイオン系列）は、Ｎ末端アミノ基のラベル化の相違が反映されないので、そのシグナルはアセチル化を行ったペプチドのものであっても重アセチル化を行ったペプチドのものであっても同じｍ／ｚ値で略同一の強度で観測される。よって、フラッグメントイオンのシグナルのｍ／ｚ値についての以上の関係を利用することで、スペクトル上の個々のシグナルが、Ｎ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのどちらの系列のものなのかを確実に帰属することができるとともに、以上の関係を満足しないシグナルをノイズシグナルとして処理することができる。スペクトルを取得するための質量分析計として飛行時間型のものなどを用いた場合、フラッグメントイオンの精密質量を測定することができるので、Ｎ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチドの質量差を理論値（Δｍ／ｚ＝３．０１８４９）に近づけて処理することで、それぞれのフラッグメントイオンのシグナル間の質量差に相当するアミノ酸やペプチドを精密質量から検索することができる。なお、解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対して行うそれぞれのラベル化としてアセチル化と重アセチル化を選択した場合、ペプチドのアミド結合のＣ−Ｎ間で開裂が起こることで、ｂイオンとｙイオンが優先的に発生するという特徴がある。
【００２３】
なお、本発明の方法において解析対象とするペプチドは、例えば３〜２０残基のアミノ酸からなるペプチド（分子量にして約３００〜２０００のペプチド）である。２１残基を超えるアミノ酸からなるタンパク質やペプチドは、３〜２０残基のアミノ酸からなるペプチドに断片化して本発明の方法を適用することが望ましい。タンパク質やペプチドの断片化は、自体公知のプロテアーゼ（トリプシンなど）を用いた酵素的方法や化学的方法によって行えばよい。
【００２４】
また、当業者が容易に理解することができることであるが、本発明の方法の基礎となる原理は、解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対しても適用することができる。従って、本発明の方法によってステップ（１）〜（３）を行うことに加え、さらに以下のステップ（４）〜（６）を行うことで、解析によって決定されるアミノ酸配列の信頼度の向上を図ってもよい。
（４）解析対象とするペプチドについてそのＣ末端カルボキシル基に対してラベル化を行ったペプチドのスペクトルを取得するステップ
（５）解析対象とするペプチドについてそのＣ末端カルボキシル基に対してステップ（４）でスペクトルを取得するペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対するラベル化と質量が異なるラベル化を行ったペプチド、および／または、解析対象とするペプチドそれ自体のスペクトルを取得するステップ
（６）ステップ（４）で取得したスペクトルとステップ（５）で取得したスペクトルを対比し、解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対するラベル化の有無および／または相違に起因する質量差の分だけ異なるｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＣ末端フラッグメントイオンのものと帰属し、同じｍ／ｚ値のイオンのシグナルをＮ末端フラッグメントイオンのものと帰属するステップ
【００２５】
ステップ（４）とステップ（５）で解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対して行うそれぞれのラベル化は、それぞれのラベル化によってスペクトルを取得する双方のペプチドがアイソトポログの関係になるものであることが、双方のペプチドの開裂様式が略同一であることでシグナル強度が略同一である点などにおいて望ましい。スペクトルを取得する双方のペプチドがＣ末端カルボキシル基に対するラベル化の相違によってアイソトポログの関係になるそれぞれのラベル化の具体例としては、メチルエステル化と重メチルエステル化に例示されるアルキルエステル化と重アルキルエステル化が挙げられる。但し、本発明の方法の基礎となる原理を解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対して適用した場合、Ｎ末端フラッグメントイオン（ａ，ｂ，ｃイオン系列）のシグナルへの、プロダクトイオンとしてのＮ末端フラッグメントイオンでもなくＣ末端フラッグメントイオンでもない内部フラッグメントイオンのシグナルと推察されるシグナルの混在が多い傾向があり、また、解析対象とするペプチドが酸性アミノ酸を含んでいると、Ｃ末端カルボキシル基に対して選択的にラベル化を行うことができないといった問題がある。従って、解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対して本発明の方法の基礎となる原理を適用することは、あくまで本発明の方法の補助的役割を担うものであり、本発明の方法に取って代わるものではない。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２７】
実施例１：
液体クロマトグラフ−タンデム型質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いて以下の実験を行った。なお、装置のＭＳ／ＭＳ部分にはＨＩＴＡＣＨＩ  Ｎａｎｏ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＤを用い、そのコントロールはＨＩＴＡＣＨＩ  Ｎａｎｏ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ＬＤ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐａｎｅｌによって行った。ＬＣ部分（ＨＰＬＣ）はＨＩＴＡＣＨＩ  ２１００  ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−２４００  ＵＶ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−２３００  ｃｏｌｕｍｎ  ｏｖｅｎ、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−２２００  ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒを用いて構成し、そのコントロールはＨＩＴＡＣＨＩ  ＥＺＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅによって行った。解析対象とするサンプルを装置に導入する際のバイアルは、ＨＩＴＡＣＨＩ  Ｌ−２２００  ａｕｔｏ−ｓａｍｐｌｅｒ用の１２×３２ｍｍ  Ｃｈｒｏｍａｃｏｌスキュリューバイアルとセプタムとキャップ（いずれもジーエルサイエンス社製）、または１２×３２ｍｍ透明ガラスバイアルとセプタム付キャップ（いずれもＷａｔｅｒｓ社製）を用いた。溶媒系はＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（０．１％ＨＣＯＯＨを含む）を用いた。ＬＣ部分での検出波長は２８０ｎｍに設定した。分析カラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ  ＯＤＳ−３  ５μｍ  ２．１×３３ｍｍ（ＧＬサイエンス社製）を用いた。
解析対象とするペプチド：Ｌ−Ａ−Ｉ−Ｙ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ｇ−Ｋ（配列番号１）が有するＮ末端アミノ基に対し、下記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用いてアセチル化と重アセチル化を行った。Ｎ末端アミノ基に対するアセチル化と重アセチル化は、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０〜５．７、酢酸＋酢酸ナトリウム）中にペプチドを溶解し、アセチル化用の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルと重アセチル化用の１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルのそれぞれを２５℃で添加して別々に行った。
【００２８】
【化４】
2016004032.tif 000006
【００２９】
なお、上記の化学式で表される１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルは、常法に従って、ジクロロメタン（１０ｍＬ）中で、酢酸または酢酸−ｄ４（１．２ｇ、１．７×１０−２ｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．２ｇ、１ｅｑ）、ＷＳＣＩ・ＨＣｌ（２．３ｇ、１ｅｑ）を反応させて調製した（酢酸を用いた場合の収率：７０．６％、酢酸−ｄ４を用いた場合の収率：５８．１％）。
解析対象とするペプチドが有するＮ末端アミノ基に対してアセチル化を行ったペプチドと重アセチル化を行ったペプチド（以下、前者を「アセチル化体」と略称し、後者を「重アセチル化体」と略称する）のそれぞれを含む反応混液を、精製せずに別々のバイアルに入れ、水で希釈後、装置に導入し、ＭＳ／ＭＳスペクトルを取得した。ＭＳ／ＭＳ測定のための、ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｗｉｄｔｈ、ＣＩＤ  ｔｉｍｅ、ＣＩＤ  ｇａｉｎ、Ｑ  ｐｏｌｅ  ＲＦ  ｖｏｌｔａｇｅなどの各種パラメータは、手動で調整した。アセチル化体のＴＩＣのピークをＭＳスペクトルで同定することで、アセチル化体と重アセチル化体は、いずれも保持時間８．４分に現れることを確認した。アセチル化体のＭＳ／ＭＳのターゲットイオンは一価イオンでｍ／ｚ＝１０４７．５、重アセチル化体のＭＳ／ＭＳのターゲットイオンは同じく一価イオンでｍ／ｚ＝１０５０．５である。アセチル化体と重アセチル化体のいずれのＭＳ／ＭＳスペクトルも、多種多様なシグナルが存在して複雑であり、どのシグナルがどのフラッグメントイオン由来であるかを帰属することは容易ではなかった（図１にアセチル化体のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す）。しかしながら、本発明の方法に従って、アセチル化体と重アセチル化体のそれぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルのデータを、タブ切りテキストファイルに加工し、双方の質量差を３、有効桁を小数点以下ゼロ、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを最大シグナルに対して１％としてデータを変換し、Ｎ末端フラッグメントイオン（ａ，ｂ，ｃイオン系列）のシグナルとＣ末端フラッグメントイオン（ｘ，ｙ，ｚイオン系列）のシグナルを分離し、前者を上向きに、後者を下向きに表示させたスペクトルを得ることで、個々のシグナルの帰属を容易に行うことができた（図２：上向きのＮ末端フラッグメントイオンのシグナルは重アセチル化体のシグナルを質量を３だけ減じてアセチル化体のシグナルに重ね合せたものであり、下向きのＣ末端フラッグメントイオンのシグナルはアセチル化体のシグナルと重アセチル化体のシグナルをそのまま重ね合せたものである）。
【００３０】
参考例１：
実施例１に記載の解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対し、常法に従って、酸触媒の存在下、メタノールと重メタノールを用いてメチルエステル化と重メチルエステル化を行い、Ｃ末端カルボキシル基に対してメチルエステル化を行ったペプチドと重メチルエステル化を行ったペプチドを得、実施例１と同様にして、それぞれのＭＳ／ＭＳスペクトルのデータを加工することで、Ｎ末端フラッグメントイオン（ａ，ｂ，ｃイオン系列）のシグナルとＣ末端フラッグメントイオン（ｘ，ｙ，ｚイオン系列）のシグナルを分離し、前者を上向きに、後者を下向きに表示させたスペクトルを得た（図３）。図３から明らかなように、本発明の方法の基礎となる原理を、解析対象とするペプチドが有するＣ末端カルボキシル基に対して適用した場合、Ｎ末端フラッグメントイオンのシグナルへの、プロダクトイオンとしてのＮ末端フラッグメントイオンでもなくＣ末端フラッグメントイオンでもない内部フラッグメントイオンのシグナルと推察されるシグナルの混在が多いことがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、タンデム型質量分析装置（ＭＳ／ＭＳ）を用いてペプチドのアミノ酸配列を解析する方法であって、Ｎ末端フラッグメントイオンとＣ末端フラッグメントイオンのいずれのシグナルも観測しつつ、個々のシグナルがどちらの系列のものなのかを確実に帰属することができる方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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