(57)【要約】【課題】細胞を使用した、薬剤感受性の高い、薬剤の評価方法及び薬剤スクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明の薬剤の評価方法は、生体親和性高分子ブロックと、細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、被検薬剤を添加し、細胞構造体の形態的変化等を評価するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）生体親和性高分子ブロックと、細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、被検薬剤を添加する工程、及び
（b）工程（a）の後、細胞構造体の形態的変化、生化学的変化及び組織学変化からなる群から選択される変化のうち、少なくとも一つの変化を評価する工程、
を含む、薬剤の評価方法。
【請求項２】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、請求項１に記載の薬剤の評価方法。
【請求項３】
前記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、請求項１又は２に記載の薬剤の評価方法。
【請求項４】
前記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、請求項１から３の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項５】
前記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックである、請求項１から４の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項６】
細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、請求項１から５の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項７】
生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンである、請求項１から６の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項８】
生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１から６の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項９】
リコンビナントゼラチンが、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される、請求項８に記載の薬剤の評価方法。
【請求項１０】
リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、請求項８又は９に記載の薬剤の評価方法。
【請求項１１】
前記細胞が、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞又は成熟細胞である、請求項１から１０の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項１２】
毒性評価である、請求項１から１１の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項１３】
薬効評価である、請求項１から１１の何れか１項に記載の薬剤の評価方法。
【請求項１４】
請求項１から１３の何れか１項に記載の薬剤の評価方法を用いた薬剤スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤の評価方法及び薬剤スクリーニング方法に関する。詳しくは、本発明は、生体親和性高分子ブロックと、細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を用いる薬剤の評価方法及び薬剤スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、新薬の探索等で、薬剤の薬効評価及び毒性評価を行う際に、組織から単離した細胞を用いることが、一般的に行われている。このときに、in vivo試験のような、生体内での試験に近い、薬剤感受性、毒性反応を示すことが求められており、細胞凝集体を用いた方が、遊離した単独の細胞より、生体機能が高く、薬剤感受性等を高いことが知られている。
【０００３】
また、特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体が記載されている。特許文献１に記載の細胞構造体においては、外部から細胞構造体の内部への栄養送達が可能であり、十分な厚みを有するとともに、構造体中で細胞が均一に存在している。特許文献１の実施例においては、リコンビナントゼラチンや天然ゼラチン素材からなる高分子ブロックを用いて、高い細胞生存活性が実証されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５１７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞凝集体を用い、薬効の評価及び毒性の評価を行った場合、遊離した単独の細胞より、薬剤感受性等を高くはなるが、必ずしも十分なものではなく、より薬剤感受性の高い、薬剤の評価方法及び薬剤スクリーニング方法が求められている。また、特許文献１には、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体は開示されているが、薬剤の評価方法及び薬剤スクリーニング方法は、詳細には記載されておらず、単に毒性評価に使用できると記載されているのみである。そこで、このような事情の下、本発明の課題は、細胞を使用した、薬剤感受性の高い、薬剤の評価方法及び薬剤スクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含み、上記複数個の細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体は、細胞構造体全体における物質透過能に優れるため、細胞構造体を用いて、薬剤の評価方法及び薬剤スクリーニング方法を行うと、薬剤感受性が高くなることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、ここで、物質透過能とは、栄養分等の内部への送達、細胞からの産生物等の外部への排出のいずれか一方又は両方を意味するものであり、三次元構造体である、本発明にかかる細胞構造体の内部への栄養分等の送達により、細胞が生存すること可能となり、また、細胞からの産生物等の外部への排出により、薬剤評価に悪影響を及ぼす成分を細胞構造体外に排出されることが可能となる。
【０００７】
即ち、本発明の態様は以下に関する。
〔１〕（a）生体親和性高分子ブロックと、細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、被検薬剤を添加する工程、及び
（b）工程（a）の後、細胞構造体の形態的変化、生化学的変化及び組織学変化からなる群から選択される変化のうち、少なくとも一つの変化を評価する工程、を含む、薬剤の評価方法。
〔２〕上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが２０μｍ以上２００μｍ以下である、〔１〕に記載の薬剤の評価方法。
〔３〕上記生体親和性高分子ブロック一つの大きさが５０μｍ以上１２０μｍ以下である、〔１〕又は〔２〕に記載の薬剤の評価方法。
〔４〕上記生体親和性高分子ブロックにおいて、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されている、〔１〕から〔３〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔５〕上記生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックである、〔１〕から〔４〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔６〕細胞１個当り０．００００００１μｇ以上１μｇ以下の生体親和性高分子ブロックを含む、〔１〕から〔５〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔７〕生体親和性高分子が、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、又はキトサンである、〔１〕から〔６〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔８〕生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、〔１〕から〔６〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔９〕リコンビナントゼラチンが、
式：Ａ−［（Gly−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂ
（式中、Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎは３〜１００の整数を示し、ｍは２〜１０の整数を示す。なお、n個のGly-X-Yはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示される、〔８〕に記載の薬剤の評価方法。
〔１０〕リコンビナントゼラチンが、（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、生体親和性を有するアミノ酸配列を有する、〔８〕又は〔９〕に記載の薬剤の評価方法。
〔１１〕上記細胞が、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞又は成熟細胞である、〔１〕から〔１０〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔１２〕毒性評価である、〔１〕から〔１１〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔１３〕薬効評価である、〔１〕から〔１１〕の何れかに記載の薬剤の評価方法。
〔１４〕〔１〕から〔１３〕の何れか１項に記載の薬剤の評価方法を用いた薬剤スクリーニング方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の薬剤の評価方法は、薬剤感受性の高く、また、その薬剤の評価方法を用いた、本発明の薬剤スクリーニング方法は、薬剤を効率的かつ効果的にスクリーニングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は「ア」に記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図２】図２は「イ」に記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図３】図３は「ウ」に記載した実験の液温プロファイリングを示す。
【図４】図４は「細胞構造体に含まれる細胞」および「細胞塊を構成する細胞」が産生、保持しているATP量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明を好適実施形態に基づき、詳細に説明する。
本発明の薬剤の評価方法は、（a）生体親和性高分子ブロックと、細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体に、被検薬剤を添加する工程、及び（b）工程（a）の後の細胞構造体の形態的変化、生化学的変化及び組織学変化からなる群から選択される変化のうち、少なくとも一つの変化を評価する工程を含むものである。
なお、本発明にかかる細胞構造体は、本明細書中において、モザイク細胞塊（モザイク状になっている細胞塊）と称する場合もある。
また本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
【００１１】
（１）生体親和性高分子ブロック
生体親和性高分子ブロックについて以下に説明する。
（１−１）生体性親和性高分子
生体性親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。本発明で用いる生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン及びＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的にはリコンビナントペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。細胞接着性を高める工夫として、具体的には、１．「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を挙げることができる。
【００１２】
リコンビナントペプチドを含むポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン又はキトサンを好適に用いることができ、ゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン又はレトロネクチンが好ましく、ゼラチン、コラーゲン又はアテロコラーゲンがより好ましい。本発明で用いるためのゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン又はリコンビナントゼラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。ここでいう天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。
【００１３】
本発明で用いる生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin", vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」, vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ4）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図−基礎と応用−」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。
【００１４】
本発明で用いる高分子の「１／ＩＯＢ」値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００１５】
本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。
本発明で用いる高分子のＧＲＡＶＹ値を上記範囲とすることにより、親水性が高く、かつ、吸水性が高くなることから、栄養成分の保持に有効に作用し、結果として、本発明にかかる細胞構造体（モザイク細胞塊）における細胞の安定化・生存しやすさに寄与するものと推定される。
【００１６】
（１−２）架橋
本発明で用いる生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよいが、架橋されているものが好ましい。架橋されている生体親和性高分子を使用することにより、培養する際に瞬時に分解してしまうことを防ぐという効果が得られる。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、生体親和性高分子が熱、紫外線又は酵素により架橋されていることが好ましく、熱による架橋されていることがより好ましい。
【００１７】
酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として発売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic echnologies， Inc.社）などが挙げられる。
【００１８】
架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、−１００℃〜５００℃であり、より好ましくは０℃〜３００℃であり、更に好ましくは５０℃〜３００℃であり、更に好ましくは１００℃〜２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃〜２００℃である。
【００１９】
（１−３）リコンビナントゼラチン
本発明で言うリコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばEP1014176、US特許6992172号、国際公開WO2004/85473、国際公開WO2008/103041等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。
【００２０】
リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然セラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。
【００２１】
リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２ｋＤａ以上１００ｋＤａ以下であり、より好ましくは２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下であり、さらに好ましくは５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下であり、最も好ましくは１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下である。
【００２２】
リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ において、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列とは、ゼラチン・コラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％〜４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの繰り返し構造である。
【００２３】
一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０〜４０％であり、好ましくは２０〜３０％である。且つ上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が５％以上２０％未満、好ましくは１０％未満であることが好ましい。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸、好ましくは２以上のアミノ酸を配列上に含まないことが好ましい。
【００２４】
一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。例えば、細胞として、間葉系幹細胞を用いた軟骨分化の場合には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産生を向上させることができる。
【００２５】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０〜１００の間、好ましくは２５〜６０の間で均一でないことが好ましい。
この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着・増殖性の観点から、タンパク質１分子中３〜５０個が好ましく、さらに好ましくは４〜３０個、特に好ましくは５〜２０個である。最も好ましくは１２個である。
【００２６】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、更に好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に好ましくは少なくとも１．０％であり、更に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、更に好ましくは６、更に好ましくは８、更に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、リコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。リコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。なお、リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。
【００２７】
好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式：Ａ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）n］m−Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍとして好ましくは２〜１０、好ましくは３〜５である。ｎは３〜１００が好ましく、１５〜７０がさらに好ましく、５０〜６５が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。
【００２８】
より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、式：Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−［（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）63］3−Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ−Ｘ−Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。
【００２９】
繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。
【００３０】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５〜１０であり、より好ましくは６〜１０であり、さらに好ましくは７〜９．５である。また、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていないことが好ましく、テロペプタイドを有さないことも好ましく、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドであることも好ましい。
【００３１】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；
である。
【００３２】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００３３】
本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。
【００３４】
（１−４）生体親和性高分子ブロック
本発明では、上記した生体親和性高分子からなるブロック（塊）を使用する。
本発明にかかる生体親和性高分子ブロックの形状は特に限定されるものではない。例えば、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状、多孔質状、繊維状、紡錘ましくは不定形である。なお、ここで、不定形とは、表面形状が均一でないもののことを示し、例えば、岩のような凹凸を有する物を示す。不定形とすることにより、細胞構造体を形成した際の物質透過のためのスペースを生じさせることができる。
【００３５】
本発明における生体親和性高分子ブロック一つの大きさは、特に限定されないが、好ましくは１μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、より好状、扁平状及びシート状であり、好ましくは、不定形、球状、粒子状（顆粒）、粉状及び多孔質状であり、より好ましくは１０μｍ以上７００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上３００μｍ以下であり、さらに好ましくは１０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは２０μｍ以上１５０μｍ以下であり、さらに好ましくは５０μｍ以上１２０μｍ以下である。生体親和性高分子ブロック一つの大きさを上記の範囲内にすることにより、細胞構造体中、細胞をより均一に存在させることができ、また、より物質透過させることができる。なお、生体親和性高分子ブロック一つの大きさとは、複数個の生体親和性高分子ブロックの大きさの平均値が上記範囲にあることを意味するものではなく、複数個の生体親和性高分子ブロックを篩にかけて得られる、一つ一つの生体親和性高分子ブロックのサイズを意味するものである。
【００３６】
ブロック一つの大きさは、ブロックを分ける際に用いたふるいの大きさで定義することができる。例えば、１８０μｍのふるいにかけ、通過したブロックを１０６μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、１０６〜１８０μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、１０６μｍのふるいにかけ、通過したブロックを５３μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、５３〜１０６μｍの大きさのブロックとすることができる。次に、５３μｍのふるいにかけ、通過したブロックを２５μｍのふるいにかけた際にふるいの上に残るブロックを、２５〜５３μｍの大きさのブロックとすることができる。
【００３７】
（１−５）生体親和性高分子ブロックの製造方法
生体親和性高分子ブロックの製造方法は、特に限定されないが、例えば、生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕機（ニューパワーミルなど）を用いて粉砕することにより、顆粒の形態の生体親和性高分子ブロックを得ることができる。生体親和性高分子ブロックが、生体親和性高分子の多孔質体を粉砕することにより得られる生体親和性高分子ブロックであることが好ましい。多孔質体を粉砕することにより、不定形の生体親和性高分子ブロックを製造することができる。
【００３８】
生体親和性高分子の多孔質体を製造する方法としては、特に限定されないが、生体親和性高分子を含む水溶液を凍結乾燥させることによっても得ることができる。例えば、溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以下となる凍結工程を含めることによって、形成される氷は球状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されることで、球状の等方的な空孔（球孔）を持つ多孔質体が得られる。溶液内で最も液温の高い部分の液温（内部最高液温）が、未凍結状態で「溶媒融点−３℃」以上となる凍結工程を含まずに、凍結されることで、形成される氷は柱／平板状とすることができる。この工程を経て、氷が乾燥されると、一軸あるいは二軸上に長い、柱状あるいは平板状の空孔（柱／平板孔）を持つ多孔質体が得られる。生体親和性高分子の多孔質体を、粉砕し、生体親和性高分子ブロックを製造する場合には、粉砕前の多孔質の空孔が、得られる生体親和性高分子ブロックの形状に影響を与えるため、上記の通り、凍結乾燥の条件を調整することにより、得られる生体親和性高分子ブロックの形状を調整することができる。
【００３９】
生体親和性高分子の多孔質体の製造方法の一例としては、
（ａ）溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、かつ、溶液内で最も液温の高い部分の温度が溶媒の融点以下で、生体親和性高分子の溶液を、未凍結状態に冷却する工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する工程
を含む方法を挙げることができるが、上記方法に限定されるわけではない。
【００４０】
上記方法においては、生体親和性高分子の溶液を未凍結状態に冷却する際に、最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下（好ましくは２．３℃以下、より好ましくは２．１℃以下）、つまり温度の差を小さくすることによって、得られる多孔質のポアの大きさのばらつきが少なくなる。なお最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差の下限は特に限定されず、０℃以上であればよく、例えば０．１℃以上、０．５℃以上、０．８℃以上、又は０．９℃以上でもよい。これにより、製造された多孔質体を用いて製造した生体親和性高分子ブロックを用いた細胞構造体は、高い細胞数を示すという効果が達成される。
工程（ａ）の冷却は、例えば、水よりも熱伝導率の低い素材（好ましくは、テフロン（登録商標））を介して冷却することが好ましく、溶液内で最も液温の高い部分は、冷却側から最も遠い部分と擬制することができ、溶液内で最も液温の低い部分は、冷却面の液温と擬制することができる。
【００４１】
好ましくは、工程（ａ）において、凝固熱発生直前の、溶液内で最も液温の高い部分の温度と溶液内で最も液温の低い部分の温度との差が２．５℃以下であり、より好ましくは２．３℃以下であり、さらに好ましくは２．１℃以下である。ここで「凝固熱発生直前の温度差」とは、凝固熱発生時の１秒前〜１０秒前の間で最も温度差が大きくなるときの温度差を意味する。
好ましくは、工程（ａ）において、溶液内で最も液温の低い部分の温度は、溶媒融点−５℃以下であり、より好ましくは溶媒融点−５℃以下かつ溶媒融点−２０℃以上であり、更に好ましくは溶媒融点−６℃以下かつ溶媒融点−１６℃以上である。なお、溶媒融点の溶媒とは、生体親和性高分子の溶液の溶媒である。
【００４２】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で得られた生体親和性高分子の溶液を凍結する。工程（ｂ）にて凍結されるための冷却温度は、特に制限されるものではなく、冷却する機器にもよるが、好ましくは、溶液内で最も液温の低い部分の温度より、３℃から３０℃低い温度であり、より好ましくは、５℃から２５℃低い温度であり、更に好ましくは、１０℃から２０℃低い温度である。
【００４３】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で得られた凍結した生体親和性高分子を凍結乾燥する。凍結乾燥は、常法により行うことができ、例えば、溶媒の融点より低い温度で真空乾燥を行い、さらに室温（２０℃）で真空乾燥を行うことにより凍結乾燥を行うことができる。
【００４４】
（２）細胞
本発明で使用する細胞は、その種類は特に限定されるものではなく、本発明の目的である、薬剤評価として一般的に使用される細胞を好適に用いることができ、実際の薬剤評価の目的に応じて、任意の細胞を使用することができる。使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ＧＳ細胞、又はｉＰＳ細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。
また、使用する細胞は、生体組織から分離した細胞（初代培養細胞）、継代した細胞でもよく、また、万能細胞等、幹細胞から分化された幹細胞由来の分化細胞であってもよく、分化細胞としては、例えば、肝臓系細胞、心臓系細胞が挙げられる。ここで、肝臓系細胞としては、肝細胞、肝芽細胞、星細胞、クッパー細胞、類洞内皮細胞、胆管上皮細胞、門脈域線維芽細胞、星細胞前駆細胞、間葉系前駆細胞、横中隔間充織細胞、前腸内胚葉細胞、胆管幹細胞、中皮細胞が挙げられるまた、。心臓系細胞としては、心筋細胞、心筋芽細胞、心筋幹細胞、が挙げられる。
【００４５】
（３）細胞構造体
細胞構造体は、上記した生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを含み、複数個の細胞間の隙間に複数個の生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体である。本発明においては、上記した生体親和性高分子ブロックと上記した細胞とを用いて、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体を形成され、前述したように、物質透過能を有することとなる。
【００４６】
細胞構造体は、複数個の細胞間の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞間の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞間に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞間の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００４７】
また、本発明にかかる高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００４８】
なお、本明細書中、「構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体」等、「均一に存在する」との表現を使用しているが、完全な均一を意味するものではない。
【００４９】
細胞構造体の厚さ又は直径は、所望の厚さとすることができるが、下限としては、２１５μｍ以上であることが好ましく、４００μｍ以上がさらに好ましく、７３０μｍ以上であることが最も好ましい。厚さ又は直径の上限は特に限定されないが、使用上の一般的な範囲としては３ｃｍ以下が好ましく、２ｃｍ以下がより好ましく、１ｃｍ以下であることが更に好ましい。また、細胞構造体の厚さ又は直径の範囲として、好ましくは、４００μｍ以上３ｃｍ以下、より好ましくは５００μｍ以上２ｃｍ以下、更に好ましくは７２０μｍ以上１ｃｍ以下である。
【００５０】
細胞構造体は、好ましくは、高分子ブロックからなる領域と細胞からなる領域がモザイク状に配置されている。尚、本明細書中における「細胞構造体の厚さ又は直径」とは、以下のことを示すものとする。細胞構造体中のある一点Ａを選択した際に、その点Ａを通る直線の内で、細胞構造体外界からの距離が最短になるように細胞構造体を分断する線分の長さを線分Ａとする。細胞構造体中でその線分Ａが最長となる点Ａを選択し、その際の線分Ａの長さのことを「細胞構造体の厚さ又は直径」とする。
【００５１】
細胞構造体は、細胞と高分子ブロックの比率は特に限定されないが、好ましくは細胞1個当りの高分子ブロックの比率が０．００００００１μｇ以上１μｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは０．０００００１μｇ以上０．１μｇ以下、より好ましくは０．００００１μｇ以上０．０１μｇ以下、最も好ましくは０．００００２μｇ以上０．００６μｇ以下である。上記範囲とするこのより、より細胞を均一に存在させることができる。また、下限を上記範囲とすることにより、上記用途に使用した際に細胞の効果を発揮することができ、上限を上記範囲とすることにより、任意で存在する高分子ブロック中の成分を細胞に供給できる。ここで、高分子ブロック中の成分は特に制限されないが、後述する培地に含まれる成分が挙げられる。
【００５２】
（７）細胞構造体の製造方法
細胞構造体は、生体親和性高分子ブロックと、少なくとも一種類の細胞とを混合することによって製造することができる。より具体的には、細胞構造体は、生体親和性高分子ブロック（生体親和性高分子からなる塊）と、細胞とを交互に配置することにより製造できる。製造方法は特に限定されないが、好ましくは高分子ブロックを形成したのち、細胞を播種する方法である。具体的には、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートすることによって、細胞構造体を製造することができる。例えば、容器中、容器に保持される液体中で、細胞と、予め作製した生体親和性高分子ブロックをモザイク状に配置する。配置の手段としては、自然凝集、自然落下、遠心、攪拌を用いることで、細胞と生体親和性基材からなるモザイク状の配列形成を、促進、制御することが好ましい。
【００５３】
用いられる容器としては、細胞低接着性材料、細胞非接着性材料からなる容器が好ましく、より好ましくはポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレートからなる容器である。容器底面の形状は平底型、Ｕ字型、Ｖ字型であることが好ましい。
【００５４】
上記の方法で得られたモザイク状細胞構造体は、例えば、（ａ）別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる、又は（ｂ）分化培地又は増殖培地下でボリュームアップさせる、などの方法により所望の大きさの細胞構造体を製造することができる。融合の方法、ボリュームアップの方法は特に限定されない。
【００５５】
例えば、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、培地を分化培地又は増殖培地に交換することによって、細胞構造体をボリュームアップさせることができる。好ましくは、生体親和性高分子ブロックと細胞含有培養液との混合物をインキュベートする工程において、生体親和性高分子ブロックをさらに添加することによって、所望の大きさの細胞構造体であって、細胞構造体中に細胞が均一に存在する細胞構造体を製造することができる。
【００５６】
上記別々に調整したモザイク状細胞塊同士を融合させる方法とは、具体的には、複数個の生体親和性高分子ブロックと、複数個の細胞とを含み、上記複数の細胞により形成される複数個の隙間の一部または全部に、一または複数個の上記生体親和性高分子ブロックが配置されている細胞構造体を複数個融合させる工程を含む、細胞構造体の製造方法である。
【００５７】
本発明にかかる細胞構造体の製造方法にかかる「生体親和性高分子ブロック（種類、大きさ等）」、「細胞」、「細胞間の隙間」、「得られる細胞構造体（大きさ等）」、「細胞と高分子ブロックの比率」等の好適な範囲は、本明細書中上記と同様である。
【００５８】
（８）被検薬剤
本発明の薬剤の評価方法は、上述した細胞構造体に、被検薬剤を添加する工程を含むものであるが、ここで、本発明に使用する被検薬剤は、特に制限されるものではなく、広義に解釈し、医薬品、食品、食品添加物、及び、栄養補助食品など、摂取を目的とする物質を含むものとする。被検薬剤の添加方法は特に制限されるものではなく、細胞を使用した、通常の薬剤の評価方法に用いられる添加方法を用いることができる。
【００５９】
（９）評価方法
本発明の薬剤の評価方法は、被検物質を添加した細胞構造体の形態的変化、生化学的変化および組織学変化からなる群から選択される変化のうち、少なくとも一つの変化を評価する工程を含むものであり、被検物質を添加した後、使用する評価系に応じて、適宜、培養した後、変化を評価する。
ここで、形態的変化としては、細胞構造体のサイズ、細胞構造体の形状等が挙げられ、生化学的変化としては、遺伝子発現パターンの変化、発現量の増減、産生液性因子（サイトカイン、ケモカイン、ホルモン等）量の増減、細胞含有mRNAパターンや量的変化、細胞表面抗原の質的・量的変化、細胞表面糖鎖の質的・量的変化、細胞代謝産物の組成的・量的変化、等が挙げられ、組織学的変化としては、細胞形状変化、細胞核形状変化、細胞質内の組成変化、細胞外基質の質的・量的変化、構成細胞の比率的変化、細胞死の頻度変化、細胞配列や配向的変化、等が挙げられる。
本発明の薬剤の評価方法は、毒性評価または薬効評価も用いることができ、毒性評価に好適に使用することができ、例えば、肝毒性評価、心毒性評価、又は細胞毒性評価に用いることができ、使用する細胞は、それぞれの用途で一般的に使用されている細胞を使用することができる。本発明の薬剤の評価方法は、肝毒性評価に好適に使用することができる。肝臓細胞のスフェロイドを用い、毒性評価を行うと、細胞自身が産生する胆汁酸の影響により、細胞の生存率が低下するが、本発明にかかる細胞構造体を用いることにより、細胞構造体の物質透過能により、胆汁酸を排出することが可能となり、胆汁酸の影響を軽減され、薬剤の評価を行うことができる。
本発明の薬剤スクリーニング方法は、本発明の薬剤の評価方法を用いたものである。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
［実施例１］リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）
リコンビナントペプチド（リコンビナントゼラチン）として以下のＣＢＥ３を用意した（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報に記載）。
ＣＢＥ３：
分子量：５１．６ｋＤ
構造：  ＧＡＰ［（ＧＸＹ）63］3Ｇ
アミノ酸数：５７１個
ＲＧＤ配列：１２個
イミノ酸含量：３３％
ほぼ１００％のアミノ酸がＧＸＹの繰り返し構造である。ＣＢＥ３のアミノ酸配列には、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインは含まれていない。ＣＢＥ３はＥＲＧＤ配列を有している。
等電点：９．３４
ＧＲＡＶＹ値：−０．６８２
１／ＩＯＢ値：０．３２３
アミノ酸配列（配列表の配列番号１）（国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号公報の配列番号３と同じ。但し末尾のＸは「Ｐ」に修正）
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
【００６１】
[実施例２] リコンビナントペプチド多孔質体の作製
[PTFE厚・円筒形容器]
底面厚さ３ｍｍ、直径５１ｍｍ、側面厚さ８ｍｍ、高さ２５ｍｍのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は８ｍｍのPTFEで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も３ｍｍのPTFEで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。よって、円筒カップの内径は４３ｍｍになっている。以後、この容器のことをPTFE厚・円筒形容器と呼称する。
[アルミ硝子板・円筒形容器]
厚さ１ｍｍ、直径４７ｍｍのアルミ製円筒カップ状容器を用意した。円筒カップは曲面を側面としたとき、側面は１ｍｍのアルミで閉鎖されており、底面（平板の円形状）も１ｍｍのアルミで閉鎖されている。一方、上面は開放された形をしている。また、側面の内部にのみ、肉厚１ｍｍのテフロン（登録商標）を均一に敷き詰め、結果として円筒カップの内径は４５ｍｍになっている。また、この容器の底面にはアルミの外に２．２ｍｍの硝子板を接合した状態にしておく。以後、この容器のことをアルミ硝子・円筒形容器と呼称する。
【００６２】
[差温の小さい凍結工程、および乾燥工程]
PTFE厚・円筒形容器、アルミ硝子板・円筒形容器、にＣＢＥ３水溶液を流し込み、真空凍結乾燥機（ＴＦ５−８５ＡＴＮＮＮ：宝製作所）内で冷却棚板を用いて底面からＣＢＥ３水溶液を冷却した。この際の容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度、液量、および棚板温度の設定の組み合わせは、以下に記載の通りで用意した。
「ア」  ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
「イ」  アルミ・硝子板・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量４ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
「ウ」  ＰＴＦＥ厚・円筒形容器、ＣＢＥ３水溶液の最終濃度４質量％、水溶液量１０ｍＬ。  棚板温度の設定は、−１０℃になるまで冷却し、−１０℃で１時間、その後−２０℃で２時間、さらに−４０℃で３時間、最後に−５０℃で１時間凍結を行った。本凍結品はその後、棚板温度を−２０℃設定に戻してから−２０℃で２４時間の真空乾燥を行い、２４時間後にそのまま真空乾燥を続けた状態で棚板温度を２０℃へ上昇させ、十分に真空度が下がる（１．９×１０5Ｐａ）まで、さらに２０℃で４８時間の真空乾燥を実施した後に、真空凍結乾燥機から取り出した。それによって多孔質体を得た。
【００６３】
[各凍結工程での温度測定]
「ア」〜「ウ」のそれぞれについて、溶液内で冷却側から最も遠い場所の液温（非冷却面液温）として容器内の円中心部の水表面液温を、また、溶液内で冷却側に最も近い液温（冷却面液温）として容器内の底部の液温を測定した。
その結果、それぞれの温度とその差温のプロファイルは図１〜図３の通りとなった。
この図１、図２、図３から「ア」、「イ」、「ウ」では棚板温度−１０℃設定区間（−２０℃度に下げる前）において液温が融点である０℃を下回り、かつその状態で凍結が起こっていない（未凍結・過冷却）状態であることがわかる。また、この状態で、冷却面液温と非冷却面液温の差温が２．５℃以下となっていた。なお、本明細書において、「差温」とは、「非冷却面液温」-「冷却面液温」を意味する。その後、棚板温度を−２０℃へ更に下げていくことによって、液温が０℃付近へ急激に上昇するタイミングが確認され、ここで凝固熱が発生し凍結が開始されたことが分かる。また、そのタイミングで実際に氷形成が始まっていることも確認出来た。その後、温度は０℃付近を一定時間経過していく。ここでは、水と氷の混合物が存在する状態となっていた。最後０℃から再び温度降下が始まるが、この時、液体部分はなくなり氷となっている。従って、測定している温度は氷内部の固体温度となり、つまり液温ではなくなる。
【００６４】
以下に、「ア」、「イ」、「ウ」について、非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温、棚板温度を−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温と、凝固熱発生直前の差温を記載する。尚、本発明で言うところの「直前の差温」とは、イベント（凝固熱発生等）の１秒前〜２０秒前までの間で検知可能な温度差の内、最も高い温度のことを表している。
「ア」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：１．１℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：０．２℃
凝固熱発生直前の差温：１．１℃
「イ」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：１．０℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：０．１℃
凝固熱発生直前の差温：０．９℃
「ウ」
非冷却面液温が融点（０℃）になった時の差温：１．８℃
−１０℃から−２０℃へ下げる直前の差温：１．１℃
凝固熱発生直前の差温：２．１℃
【００６５】
[実施例３] 生体親和性高分子ブロックの作製（多孔質体の粉砕と架橋）
実施例２で得られた「ア」、「イ」のＣＢＥ３多孔質体をニューパワーミル（大阪ケミカル、ニューパワーミルＰＭ−２００５）で粉砕した。粉砕は、最大回転数で１分間×５回、計５分間の粉砕で行った。得られた粉砕物について、ステンレス製ふるいでサイズ分けし、２５〜５３μｍ、５３〜１０６μｍ、１０６〜１８０μｍの未架橋ブロックを得た。その後、減圧下１６０℃で熱架橋（架橋時間は８時間、１６時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の６種類を実施した）を施して、試料ＣＢＥ３ブロックを得た。以下、４８時間架橋を施した「ア」の多孔質体由来ブロックをE、４８時間架橋を施した「イ」の多孔質体由来ブロックをFと呼称する。つまり、EおよびFが差温の小さい凍結工程・多孔質体から作られた差温小ブロックである。なお、架橋時間の違いは本願の評価においては性能に影響が見られなかったため、以降、４８時間架橋したものを代表として使用した。また、結果的にEおよびFでは性能に差が見られなかった。以下、本実施例で得られた生体親和性高分子ブロックを「花弁状ブロック」とも称する。
【００６６】
[実施例４]細胞構造体の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKitTM）にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整し、実施例３で作製した生体親和性高分子ブロック  ５３−１０６μｍを０．１ｍｇ／ｍＬとなるように加えた後、２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置し、直径１ｍｍ又は直径１．３ｍｍ程度の球状の、花弁状ブロックとｈＭＳＣ細胞からなるモザイク細胞塊を作製した（細胞1個当たり０．００１μｇのブロック）。なお、Ｕ字型のプレート中で作製したため、本モザイク細胞塊は球状であった。１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製したモザイク細胞塊はモザイク細胞塊小、４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製したモザイク細胞塊はモザイク細胞塊大と称する。
【００６７】
[比較例１] 細胞塊の作製（ｈＭＳＣ）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）を増殖培地（タカラバイオ：MSCGM BulletKit（登録商標））にて１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。得られた細胞懸濁液２００μＬをスミロンセルタイトＸ９６Ｕプレート（住友ベークライト、底がＵ字型）に播種し、卓上プレート遠心機で遠心（６００ｇ、５分）し、２４時間静置した。これにより、直径約４００μｍ又は直径約１ｍｍの球状の細胞塊を作製した。１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製した細胞塊は細胞塊小、４×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬで作製した細胞塊は細胞塊大と称する。
【００６８】
[ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＴＰ  アッセイ]
実施例４にて得られた細胞構造体中の細胞が産生・保持しているＡＴＰ（アデノシン三リン酸）量を定量した。ＡＴＰは生物全般のエネルギー源として知られ、ＡＴＰ合成量・保持量を定量することで、細胞の代謝活性の状態、活動状態を知ることができる。これが高いかどうかで薬剤の評価に好適な細胞構造体であるかを知ることができる。測定には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。得られた結果を図４に示す。実施例４および比較例１で作製したモザイク細胞塊と細胞塊について、ともにＤａｙ７（７日後）のもので、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて、各モザイク細胞塊中のＡＴＰ量を定量した。その結果、同じ細胞数（2万cells/個）を用いて作成された細胞構造体と細胞塊では、圧倒的に細胞構造体の方がATP産出量が高いことが分かった。また、4倍細胞数の多い細胞塊（8万cells/個）と比べても、細胞構造体（2万cells/個）の方が高いATP産出量を示すことが分かった。これは、本発明で規定したモザイク細胞塊が高い物質透過性を有しており、薬剤の評価法に用いる細胞構造体として好適であることを示している。
【図１】
2016136848.tif 000002
【図２】
2016136848.tif 000003
【図３】
2016136848.tif 000004
【図４】
2016136848.tif 000005
【配列表】
2016136848000001.app