(57)【要約】      （修正有）【課題】動物ウイルスに対して活性を有する抗ウイルス剤を提供する。【解決手段】動物ウイルスに対する抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤であって、微細藻類のコッコミクサと、ベンゼン：メタノール（２：１）又は、エタノール、アセトン、ヘキサンからなる揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌のうち一つ又は複数を組み合わせて遠心分離を行なう脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程と、によって抽出されたコッコミクサ多糖体を有効成分とする抗ウイルス剤。有効成分中の大半の脂質が除去されており、少なくとも動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対して抗ウイルス活性を有する、動物用の医薬品或いは消毒剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物ウイルスに対する抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤であって、
微細藻類のコッコミクサと、ベンゼン：メタノール（２：１）もしくは、エタノール、アセトン、ヘキサンからなる揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌のうち一つまたは複数を組み合わせて遠心分離を行なう脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とによって抽出されたコッコミクサ多糖体を有効成分とするものであり、
該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対して抗ウイルス活性を有すること
を特徴とする動物ウイルスの抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コッコミクサ藻体より抽出した多糖類による動物ウイルス、特に、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に対する抗ウイルス剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この種のコッコミクサ藻体より抽出した抗ウイルス剤としては、ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するウイルスに抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤が公知になっている。この公知に係る抗ウイルス剤の抽出に用いたコッコミクサ藻体は、緑色植物門（Chlorophyta）、緑藻綱（Chlorophyceae）、クロロコッカム目（Chlorococcales）、クロロコッカム科（Chlorococcaceae）に属するコッコミクサ・ミロール（Coccomyxa minor）又はコッコミクサ・グロエオボトリディフォルミス（Coccomyxa gloeobotrydiformis）とする乾燥したコッコミクサ藻体にイオン交換水を加え、還流下で加熱抽出を行って得た抽出液を遠心分離し、上清を減圧濃縮して抽出物（ＣＥ）を得て、該抽出物を蒸留水による溶出画分し、および、蒸留水による溶出後の無機塩溶液による溶出画分した多糖体画分を有効成分とするものである。
【０００３】
そして、この抗ウイルス剤は、Ｒｉｂ（リボース）、Ｇａｌ（ガラクトース）、Ｇｕｌ（グルコース）、Ｒｈａ（ラムノース）が主たる成分になっており、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトコロナウイルス等のＤＮＡ型ウイルス、ＲＮＡ型ウイルスに対して高い抗ウイルス活性を示すというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２４７７５７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
前記公知例の抗ウイルス剤は、あくまでも、ヒトインフルエンザウイルスやコロナウイルス等のエンベロープを有するウイルスに対して抗ウイルス活性を有するものであって、動物ウイルスである伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に対する抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤ではないのである。
【０００６】
従って、従来技術においては、動物ウイルス、特に、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に対して抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤の開発に解決課題を有している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、種々研究及び実験の結果、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであるが、その多糖体が動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に対して抗ウイルス活性を抑制する効果を見出して本発明を完成した。
【０００８】
本発明に係る動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対して抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサと、ベンゼン：メタノール（２：１）もしくは、エタノール、アセトン、ヘキサンからなる揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌のうち一つまたは複数を組み合わせて遠心分離を行なう脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とからなるコッコミクサ多糖体（ＡＥＸ）からなるものであって、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対する抗ウイルス活性を有する抗ウイルス剤である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサより抽出された多糖体画分を有効成分とするものであって、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであるとともに、多糖体画分の有効成分が、ラムノース、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコースを主成分とすることにより、動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対する抗ウイルス活性を有するので、例えば、液剤または飼料に混ぜる粉末補助剤、或いは消毒剤として使用できるという優れた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明に係る抗ウイルス剤の試験において、Ｖｅｒｏ細胞をＡＥＸの示された濃度で処理し、４８時間のインキュベーション後に、代謝活性をＭＴＴアッセイによって測定した結果を示すグラフであり、値は平均±ＳＥＭであり、（ｎ＝３）である。なお、表中のポイントマーク＊は、＊Ｐ＜０．０５対非薬剤処理対照群である。
【図２】本発明に係る抗ウイルス剤の試験において、Ｖｅｒｏ細胞をＡＥＸの示された濃度で処理し、４８時間のインキュベーション後に、代謝活性をＭＴＴアッセイによって測定した結果を示すグラフであり、値は平均±ＳＥＭであり、（ｎ＝３）である。なお、表中のポイントマーク＊は、＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１対非薬剤処理対照群である。
【図３】本発明に係る抗ウイルス剤の試験において、ＭＤＣＫ細胞は、４つの異なる処理条件により（０．１ｍｏｌ）ＩＢＤＶに感染させ、４８時間後、ウイルス力価は、全てのＴＣＩＤ５０アッセイにより決定したグラフであり、値は平均±ＳＥＭであり、（ｎ＝３）である。なお、表中のポイントマーク＊は、＊Ｐ＜０．０５、ウイルス対照群対である。
【図４】本発明に係る抗ウイルス剤の試験において、ＩＢＤＶ（０．１ｍｏｌ）は、１時間でＶｅｒｏ細胞ウイルスのインターナリゼーション後、ＡＥＸまたはＰＢＳ５００μｇ／ｍｌを添加し、次いで１２時間３７℃でインキュベートして感染させた後、抗ＩＢＤＶ血清を用いて免疫蛍光染色した後の顕微鏡写真であり、（Ａ）（Ｃ）が暗視野像、（Ｂ）（Ｄ）が半透明視野像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る抗ウイルス剤の原料としては、微細藻類の一種である乾燥したコッコミクサ藻体が用いられる。
この乾燥したコッコミクサ藻体を揮発性の溶剤と一緒に超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌等のうち一つまたは複数を組み合わせて遠心分離を行なうと共に、この操作を複数回行って大半の脂質を脱脂し、その後、所要時間に亘り熱湯抽出し、該熱湯抽出物を遠心分離により固液分離し、分離した液層を濃縮し凍結乾燥して第１の発明に係る中性の熱水抽出物を得る。
【００１２】
さらに、上記分離して得られた固層に所要量の水を加え、アルカリ性に調整し所要時間撹拌して抽出を行ない、遠心分離にて液層を回収し、該回収した液層を酸性に調整し低温にて所要時間静置して沈殿物を生成させ、該沈殿物を遠心分離して固形物として回収し、複数回の洗浄操作を行なって抽出物を得る。得られた抽出物は揮発性溶剤で複数回の脱脂操作を行った後、凍結乾燥するものである。
【００１３】
［実施例］
次に、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。
[コッコミクサの水溶性多糖体の抽出方法]
乾燥したコッコミクサ藻体２ｇに１００ｍｌのベンゼン：メタノール（２：１）からなる揮発性溶剤を入れ、超音波処理を１０分行った後、５０℃に加温した状態で３時間振とう及び遠心分離を行なった後に、同様の揮発性溶剤、即ち、ベンゼン：メタノール（２：１）を１００ｍｌ入れて脱脂操作を少なくとも３回繰り返して行ない、遠心分離により溶剤を除去する。
【００１４】
この脱脂後のパウダー状になったものに１００ｍｌの水を加え、９０℃に加熱して３時間撹拌抽出した。所要時間保冷後に遠心分離（３０００ｒｐｍ）を行って固液分離した。分離して回収した液層は濃縮し、該濃縮液を凍結乾燥して中性多糖体(推定)の乾燥粉末を得た。コッコミクサ多糖類であるＣoccomyxa Ｐolysaccharides(ＣｍＰＳ)は、中性多糖体（ＮＰＳ）及び酸性多糖体（ＡＰＳ）が確認されており、特に、中性多糖体（ＮＰＳ）はヘルペスウイルス、コロナウイルス、ＨＩＶの増殖抑制効果が確認されている。そして、乾燥粉末の中性多糖体、つまり、コッコミクサから０．２６ｇの熱水抽出物（ＣｍＮＥ）を得た。なお、水に替えてルカリ水を加えて前記同様の抽出処理をすることによって、アルカリ性抽出物（ＣｍＡＥ）の乾燥粉末を得た。
凍結乾燥物をＰＢＳに溶解し、除タンパク及び脂質除去を行なった後透析チューブにて透析し、透析チューブ内試料を凍結乾燥した。
なお、複数回の脱脂処理を行うことによって有効成分は、ラムノース、ガラクトース、マンノース、グルコース、キシロース、Ｎ-アセチルグルコサミン、フコース等からなる脱脂された純度の高いコッコミクサ多糖体（ＡＥＸ）であり、これが動物ウイルスに対する抗ウイルス剤になるのである。
【００１５】
[試験]
検体として、本発明で得たコッコミクサの抽出物（ＡＥＸ）を用いて、動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）に対する抗ウイルス活性を検証した。
その検証のための試験試料として鶏抗伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス血清については研究室で調整した。
【００１６】
［細胞培養及びウイルス感染］
Ｖｅｒｏ細胞を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および抗生物質を充填したＤＭＥＭ培地（ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地）中で増殖させた。
ＩＢＤＶＴｓ株をＶｅｒｏ細胞中で増幅した。力価はＶｅｒｏ細胞上でＩＦＡによってＴＣＩＤ５０％（５０％組織培養感染値量）として決定した。ウイルス感染の場合、ウイルス増殖液をＤＭＥＭ中で希釈し、感染の示された多重度（ｍｏｌ）で細胞に添加した。ウイルスを、３７℃で６０分間吸着させた。ウイルス接種物を除去した後、細胞を３７℃の５％ＣＯ2含有培地（ＤＭＥＭ培地）で培養した。
【００１７】
［細胞毒性アッセイ］
試料の細胞毒性を、ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、ＵＳＡ−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）で測定した。
Ｖｅｒｏ細胞は一晩、完全増殖培地１００μｌ中で、９６ウエルプレートのウエル当たり１×１０4細胞密度で処理した。Ｖｅｒｏ細胞を、５％ＣＯ2  下３７℃で3種類の濃度の化合物に暴露した。４８時間後にＭＴＴ試験方法（最終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有するリン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）１０μｌを各ウエルに加えた。３７℃で４時間のインキュベーション後、上清みを除去し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２００μｌのホルマザン結晶を可溶化するために各ウエルに添加した。激しく振盪した後、吸光度値を５７０ｎｍでマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００１８】
［感染性ウイルスアッセイ］
Ｖｅｒｏ細胞は、３７℃で１時間、０．１ｍｏｌでＩＢＤＶと共にインキュベートした。その後ウイルスを除去し、感染培地と５００μｇ／ｍｌのＡＥＸを細胞に添加し、４８時間３７℃でインキュベートした。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）を３６時間３７℃でインキュベートし、１０倍段階希釈したウイルスをＶｅｒｏ細胞で測定した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍｌのウイルス力価は、ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈ（１９３８）に従って測定した。
【００１９】
［間接蛍光抗体法］
ＩＢＤＶは（１ｍｏｌ）Ｖｅｒｏ細胞を、３７℃でウイルス吸着後ＡＥＸまたはＰＢＳを５００μｇ／ｍｌ加えた後、３７℃で１時間インキュベートし感染させた。１２時間後、細胞を0.5％トリトンX／PBS（V／V）中で10分間透過処理し３７℃で１時間３％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）／ＰＢＳと共にインキュベートした。細胞を洗浄後、細胞を３７℃で１時間蛍光色素（ＦＩＣＴ）の標識二次抗体と共にインキュベートした。最後に、細胞を洗浄し、倒立蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、日本）を用いて観察した。
【００２０】
［結果］
前記細胞毒性アッセイにおいて、図１に示したように、複数のＡＥＸ濃度で処理した細胞について、代謝活性をＭＴＴアッセイによって測定した結果を示すグラフであり、ＡＥＸが５０００μｇ／ｍｌ以下の濃度では、細胞毒性を示さなかった。また、ＡＥＸが５００μｇ／ｍｌ以上の濃度で、ＩＢＤＶの複製を阻害することが解った。
また、ＡＥＸがＩＢＤＶの感染から細胞を保護する方法を解明するためにＡＥＸはウイルス粒子またはウイルス吸着に直接阻害作用を誘発するかどうかを調べた結果を図２に示した。ＡＥＸは、直接ウイルス粒子およびウイルス吸着の両方の阻害作用を有していることを示している。
【００２１】
さらに、４つの異なるＡＥＸ添加処理条件によるＩＢＤＶの増殖抑制については、図３に示した通りである
1）  IBDV処理群：ＩＢＤＶとＡＥＸ５００μｇ／ｍｌを３７℃で1時間処理し、その後ウイルス／AEX混合物を細胞に添加し１時間感染した後、培地を除去し、新しい培地と交換した。
2）  細胞処理群：Ｖｅｒｏ細胞とＡＥＸ５００μｇ／ｍｌを、３７℃で１時間処理し、その後IBDVに１時間感染させた後、培地を除去し新しい培地と交換した。
3）  同時感染群：ＡＥＸ５００μｇ／ｍｌを含む培地中でIBDVと細胞を同時に混合し感染させ、４℃で１時間吸着後、通常の新しい培地を重層した。
4）  感染後処理群：IBDVと細胞を感染させ、余分なウイルスを除いた後、ＡＥＸ５００μｇ／ｍｌを含む培地を加えた。
４８時間後、ウイルス力価は、全てのＴＣＩＤ５０アッセイにより決定した。
いずれの場合でも、ＡＥＸは、ウイルス粒子およびウイルスに直接的に阻害作用を有していることが確認された。
【００２２】
また、図４に示したように、蛍光抗体法によって、ＡＥＸは、ＩＢＤＶタンパク質発現を阻害することが確認されたのである。
【産業上の利用可能性】
【００２３】
以上説明したように、本発明に係る動物ウイルスの抗ウイルス剤は、微細藻類のコッコミクサと、ベンゼン：メタノール（２：１）もしくは、エタノール、アセトン、ヘキサンからなる揮発性溶剤とを一緒にして超音波振とう、高圧ホモジナイズ、羽根攪拌のうち一つまたは複数を組み合わせて遠心分離を行なう脱脂操作を複数回行なう工程と、脱脂工程後に所要量の水を加え所要時間に亘って加熱し熱湯抽出する工程と、熱湯抽出物を遠心分離により固液分離した液層を濃縮し乾燥する工程とによって抽出されたコッコミクサ多糖体（ＡＥＸ）を有効成分とするものであり、該有効成分中の大半の脂質が除去されたものであり、少なくとも動物ウイルスの伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対して抗ウイルス活性を有すること、さらには鳥インフルエンザウイルスや、ＰＥＤウイルス等の家畜に感染する多種のウイルス等にも抗ウイルス効果が発揮されると考えられるので、動物用の医薬品や消毒剤として広く利用できるのである。
【符号の説明】
【００２４】
なし
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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