(57)【要約】【課題】関節症若しくは関節炎に対する治療効果又は予防効果を有する、新規な関節症治療剤又は予防剤を提供する。【解決手段】下記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。［式（１）中、Ｒは、飽和若しくは不飽和の脂肪族カルボン酸に由来するアシル基を表わす。］前記脂肪族カルボン酸は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、２−ヘキシルデカン酸又はイソステアリン酸であることが好ましい。［化１］2016216452.tif 000007【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【化１】
2016216452.tif 000006
［式（１）中、Ｒは、飽和若しくは不飽和の脂肪族カルボン酸に由来するアシル基を表わす。］
【請求項２】
前記脂肪族カルボン酸が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、２−ヘキシルデカン酸又はイソステアリン酸である請求項１に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【請求項３】
前記脂肪族カルボン酸がパルミチン酸である請求項１に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【請求項４】
前記脂肪族カルボン酸が２−ヘキシルデカン酸である請求項１に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【請求項５】
前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体の薬理学的に許容される塩又はその溶媒和物を有効成分として含有し、前記塩が、Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｍｇ塩またはＺｎ塩である請求項１〜４のいずれか一項に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【請求項６】
前記関節症若しくは関節炎が関節症であり、変形性関節症である請求項１〜５のいずれか一項に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【請求項７】
注射剤または外用剤である請求項１〜６のいずれか一項に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節に関わる疾患に、関節症又は関節炎があり、社会の高齢化に伴う患者数の増加が社会的問題となっている。中でも変形性関節症は、軟骨の変性を主体とした関節疾患である。変形性関節症の原因として加齢や機械的負荷が知られており、軟骨がすり減り、大きな摩擦を生じる。また損傷した軟骨の組織片によって関節内の滑膜に炎症が起き、関節液が溜まり、関節痛や関節機能の障害が起こる。この状態を放置すると慢性的に進行し、生活の質の低下につながる。
変形性関節症の治療には，抗炎症・鎮痛効果のある非ステロイド系の薬剤（ＮＳＡＩＤｓ）が使用されてきた。また、この他にも関節液を抜いたり、副腎皮質ホルモン剤やコンドイチン硫酸ナトリウムなどの関節軟骨の保護剤を注入する治療が行われてきた。しかし十分な効果が得られていないのが現状である。変形性膝関節症に対するヒアルロン酸の関節内注射の効果について、これまでにいくつかのメタアナリシスが報告されているが、効果は明確となっていない（非特許文献１〜６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】C. T. Wang, J. Lin, C. J. Chang, Y. T. Lin, S. M. Hou, Therapeutic effects of hyaluronic acid on osteoarthritis of the knee. A meta-analysis of randomized controlled trials. J Bone Joint Surg Am 86-A, 538-545 (2004).
【非特許文献２】N. Bellamy et al., Viscosupplementation for the treatment of osteoarthritis of the knee. Cochrane Database Syst Rev, CD005321 (2006).
【非特許文献３】G. H. Lo, M. LaValley, T. McAlindon, D. T. Felson, Intra-articular hyaluronic acid in treatment of knee osteoarthritis: a meta-analysis. JAMA 290, 3115-3121 (2003).
【非特許文献４】A. Modawal, M. Ferrer, H. K. Choi, J. A. Castle, Hyaluronic acid injections relieve knee pain. J Fam Pract 54, 758-767 (2005).
【非特許文献５】J. Arrich et al., Intra-articular hyaluronic acid for the treatment of osteoarthritis of the knee: systematic review and meta-analysis. CMAJ 172, 1039-1043 (2005).
【非特許文献６】J. M. Medina, A. Thomas, C. R. Denegar, Knee osteoarthritis: should your patient opt for hyaluronic acid injection? J Fam Pract 55, 669-675(2006).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規な関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明者らは、変形性関節症のモデル動物に対して、アスコルビン酸−２−リン酸エステルの高級脂肪酸エステルの塩を投与したところ、関節の軟骨細胞における活性酸素が減少すること、及び関節の病態が改善されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の手段を提供する。
［１］下記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有することを特徴とする関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【化１】
2016216452.tif 000002
［式（１）中、Ｒは、飽和若しくは不飽和の脂肪族カルボン酸に由来するアシル基を表わす。］
［２］前記脂肪族カルボン酸が、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、２−ヘキシルデカン酸又はイソステアリン酸である前記［１］に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
［３］前記脂肪族カルボン酸がパルミチン酸である前記［１］に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
［４］前記脂肪族カルボン酸が２−ヘキシルデカン酸である前記［１］に記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
［５］前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体の薬理学的に許容される塩又はその溶媒和物を有効成分として含有し、前記塩が、Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｍｇ塩またはＺｎ塩である前記［１］〜［４］のいずれか一つに記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
［６］前記関節症若しくは関節炎が関節症であり、変形性関節症である前記［１］〜［５］のいずれか一つに記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
［７］注射剤又は外用剤である前記［１］〜［６］のいずれか一つに記載の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤によれば、関節症若しくは関節炎を、治療又は予防可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例において１２か月齢の軟骨細胞特異的にＳｏｄ２遺伝子が欠損したマウス（Ｃｏｌ２Ａｌ−Ｃｒｅ；Ｓｏｄ２ｆｌ／ｆｌ，  Ｓｏｄ２  ｃＫＯ）と、コントロールマウスとで、膝関節における軟骨変性の様子を比較した結果を示す図である。
【図２】外科的に機械的ストレスを誘導した時の、軟骨細胞特異的Ｓｏｄ２欠損マウスと、コントロールマウスとで、膝関節における軟骨変性の様子を比較した結果を示す図である。
【図３】Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウス由来の軟骨の培養細胞における、アスコルビン酸誘導体の塩の投与による、活性酸素レベルの抑制効果を示す図である。
【図４】Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスの膝関節の軟骨細胞における、アスコルビン酸誘導体の塩の投与による、活性酸素レベルの抑制効果を示す図である。
【図５】Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスの膝関節における、アスコルビン酸誘導体の塩の投与による、軟骨変性の抑制効果を示す図である。
【図６】アスコルビン酸誘導体の塩の投与による、野生型マウス膝関節の軟骨細胞における活性酸素レベルの抑制効果を示す図である。
【図７】アスコルビン酸誘導体の塩の投与による、軟骨細胞株の細胞数増加に関する効果を示す図である。
【図８】ヒト線維芽細胞株へのアスコルビン酸誘導体の塩の投与による、細胞内のアスコルビン酸量増加に関する効果を示す図である。
【図９】ヒト線維芽細胞株へのアスコルビン酸誘導体の塩の投与による、細胞内のアスコルビン酸量増加に関する効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤は、下記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を有効成分として含有する。
【０００９】
【化２】
2016216452.tif 000003
【００１０】
［式（１）中、Ｒは、飽和若しくは不飽和の脂肪族カルボン酸に由来するアシル基を表わす。］
【００１１】
＜アスコルビン酸誘導体＞
まず、本発明に係るアスコルビン酸誘導体について説明する。
本発明係るアスコルビン酸誘導体は、前記一般式（１）で表される化合物である。本発明に係るアスコルビン酸誘導体は、アスコルビン酸の２位の水酸基にリン酸がエステル結合し、６位の水酸基に脂肪族カルボン酸がエステル結合した化合物である。
一般式（１）中、Ｒは、飽和若しくは不飽和の脂肪族カルボン酸から誘導されるアシル基であり、より詳しくは、脂肪族カルボン酸から脂肪族カルボン酸のカルボニル炭素に結合しているＯＨを除いたものである。飽和若しくは不飽和の脂肪族カルボン酸に由来する、又は飽和若しくは不飽和の脂肪族カルボン酸から誘導されるとは、前記脂肪族カルボン酸が、アスコルビン酸の６位の水酸基とエステル結合を形成するのに必要な構造の変化を受けたことを意味する。脂肪族カルボン酸としては、直鎖状でも分岐鎖状でもよく、脂肪族モノカルボン酸であることが好ましく、飽和脂肪族カルボン酸であることが好ましく、飽和脂肪族モノカルボン酸であることがより好ましい。
【００１２】
前記脂肪族カルボン酸の炭素数は、５〜３０が好ましく、１０〜２０がより好ましく、炭素数１４〜１８がさらに好ましい。
炭素数５〜３０の脂肪族カルボン酸としては、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、２−ヘキシルデカン酸、イソステアリン酸などを好ましく挙げることができる。これらのうちでは、パルミチン酸、２−ヘキシルデカン酸がより好ましい。
【００１３】
本発明に係るアスコルビン酸誘導体は、２位の水酸基にリン酸がエステル結合したことによる安定性の向上、及び、６位の水酸基に脂肪族カルボン酸がエステル結合したことによる細胞浸透性の向上により、関節症若しくは関節炎に対する優れた治療又は予防効果が発揮されると考えられる。
【００１４】
本発明に係るアスコルビン酸誘導体のイオンの一例として、下記式（２）で表されるアニオンが挙げられる。
本発明に係る前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体の薬理学的に許容される塩は、例えば、下記式（２）で表されるアニオンと対イオンとの塩が挙げられる。
【００１５】
【化３】
2016216452.tif 000004
【００１６】
前記対イオンとしては、金属イオンが好ましく、アルカリ金属イオンがより好ましい。
本発明に係るアスコルビン酸誘導体の塩としては、薬理学的に許容される塩であれば特に制限されず、具体的には、Ｎａ塩、Ｋ塩、Ｃａ塩、Ｍｇ塩、Ｚｎ塩などを好ましく挙げることができ、これらのうちではＮａ塩がより好ましい。
【００１７】
本発明に係るアスコルビン酸誘導体又はその薬理学的に許容される塩の溶媒和物としては、薬理学的に許容される溶媒和物であれば特に制限されず、水和物、有機溶媒和物等が挙げられる。
【００１８】
前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体は、アスコルビン酸の２位水酸基をリン酸エステル化した後、６位の水酸基を脂肪族カルボン酸でエステル化することによって製造可能である。パルミテート体としては、市販の昭和電工社製アプレシエ（登録商標）を原料として使用することができる。
【００１９】
前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、本発明の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤に、１種単独で含有されていてもよく、２種以上を組み合わせて含有されていてもよい。
【００２０】
本発明の関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤は、関節症若しくは関節炎への処置剤である限りにおいて、その投与目的、投与対象、投与経路、投与方法、剤形、有効成分の配合量、投与量、投与間隔等も特に限定されない。
【００２１】
本発明の治療剤又は予防剤の投与経路は、上記目的が達成される限り特に限定されず、投与方法としては、例えば、注射（関節腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、胸腔内、脊髄腔内等）、点滴、経口、経皮、吸入、注腸、経直腸、経鼻、点眼、点鼻、点耳、粘膜への塗布投与等が例示される。投与方法は治療等が所望される部位等によって適宜選択することができる。上記投与経路方法のなかでも、注射又は塗布投与による特定部位への投与が好ましく、注射による特定部位への投与がより好ましく、注射による関節腔内への直接投与が特に好ましい。
【００２２】
本発明の治療剤又は予防剤の剤形としては、液剤（溶液、懸濁液、乳濁液、用時溶解用固形剤等）、分散製剤、半固形製剤、粉粒製剤、成型製剤、浸出製剤が挙げられ、具体的には錠剤、被覆錠剤、糖衣剤、丸剤、トローチ剤、硬カプセル剤、マイクロカプセル剤、リポ化剤、埋込剤、粉末剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、注射剤、液剤、エリキシル剤、エマルジョン剤、シロップ剤、水剤、乳剤、懸濁剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、スプレー剤、吸入剤、噴霧剤、軟膏製剤、硬膏製剤、貼付剤、パスタ剤、パップ剤、テープ剤、ゲル剤、クリーム剤、油剤、坐剤、チンキ剤、皮膚用水剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、塗布剤、輸液剤、凍結乾燥製剤、注射剤などのための粉粒剤、機能性食品等が挙げられる。
これらの剤形のなかでは、関節症若しくは関節炎に対して優れた効果が発揮されやすいという観点から、本発明の治療剤又は予防剤の剤形は、注射剤、塗布剤、貼付剤等の外用剤であることが好ましく、関節症若しくは関節炎に対して優れた効果が発揮されやすいという観点からは、本発明の治療剤又は予防剤の剤形は、注射剤であることがより好ましい。注射剤は液剤であってもゲル剤であってもよい。
【００２３】
注射剤は、関節腔内への注射に用いられる注射剤であることが好ましい。後述の実施例において示されるように、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体は、軟骨細胞に対する細胞増殖促進効果を有する。関節腔内へ注入された化合物は、線維芽細胞、軟骨細胞等へと効果的に取り込まれ、関節症若しくは関節炎に対して優れた効果が発揮されやすい。
【００２４】
液剤は、例えば、適当な水性溶媒あるいは医薬分野において慣用されている溶媒に、有効成分とする前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を溶解させることにより製造することができる。このような溶媒としては、蒸留水、注射用水、緩衝液、生理食塩水、水混和性有機溶媒を含有する水等が例示される。
ゲル剤は、例えば前記液剤にゲル化剤を添加し、ゲル状とすることにより製造することができる。
注射剤として提供する場合、その形態は、溶液、凍結物、乾燥物、凍結乾燥物等のいずれであってもよい。これをアンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存して、注射剤として提供し、投与することができる。
【００２５】
本発明の治療剤又は予防剤の製剤化には公知の方法を用いることができる。また製剤化にあたり、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の作用に対して悪影響を与ない限りにおいて、他の医薬活性成分（例えば、抗炎症剤、鎮痛剤、ビタミン剤、抗菌剤、成長因子、接着因子など）や、安定化剤、乳化剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤等、医薬分野において通常用いられている成分を使用できる。
【００２６】
製剤における前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の配合量、１回あたりの投与量、投与間隔等は、投与目的、投与対象、投与経路、投与方法、剤形、患者の具体的症状、年齢、性別、体重等に応じて個別に決定されるべき事項であり、特に限定されない。
【００２７】
注射による関節腔内への直接投与の場合、注射剤における前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の濃度は、０．０００１〜３０％（ｗ/ｖ）が好ましく、は０．００１〜１０％（ｗ/ｖ）がより好ましく、は０．０１〜３％（ｗ/ｖ）がさらに好ましい。このような濃度で、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が注射剤に含まれていると、関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤に求められる効能効果がより効果的に発揮されるため好ましい。
【００２８】
注射による関節腔内への直接投与の場合、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を、成人１人１回当り、０．０００００５〜１．５ｇを投与することが好ましく、０．００００５〜０．５ｇを投与することがより好ましく、０．０００５〜０．２ｇを投与することがさらに好ましい。
また本発明処置剤の投与は、１回限りでもよく、複数回投与してもよい。複数回投与する場合には、連日投与してもよく、また１日〜３か月間程度の間隔をあけて投与してもよい。また１日１回投与してもよく、１日２〜３回に分けて投与することもできる。
【００２９】
本発明において、関節症若しくは関節炎の治療剤とは、関節症若しくは関節炎に対する治癒効果、改善効果、軽減効果、又は維持効果（悪化防止効果）の効果を奏するものを包含する意味で用いている。本発明において、関節症若しくは関節炎の予防剤とは当該効果を予防的に奏するものを包含する意味で用いている。関節症若しくは関節炎への効果は、医学的又は病理学的指標に基づき評価可能である。
例えば、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が投与された動物の投与個体群と、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が投与されていない動物の非投与個体群とで、関節軟骨の軟骨変性スコア（病理学的指標）を算出する。ここで、軟骨変性スコアは、スコアが高いほど軟骨が変性していることを表すものとする。投与個体群の軟骨変性スコアが、非投与個体群の軟骨変性スコアよりも有意に低い値であった場合には、前記アスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、関節症若しくは関節炎に対する治療効果、改善効果、軽減効果、又は維持効果（悪化防止効果）の効果を有すると判断できる。
予防的な効果については、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が投与された後に生じ得る関節症若しくは関節炎の症状について判断すればよい。
【００３０】
また例えば、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が投与された細胞の投与細胞群と、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が投与されていない細胞の非投与細胞群とで、増殖した細胞数を計測する。投与細胞群の細胞増殖が、非投与細胞群の細胞増殖よりも有意に高い値であった場合には、前記アスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、関節症若しくは関節炎に対する治療効果、改善効果、軽減効果、又は維持効果（悪化防止効果）の効果を有すると判断できる。細胞は、軟骨細胞又は繊維芽細胞であることが好ましい。
【００３１】
関節症若しくは関節炎に係る関節部位としては、膝関節や、肩関節、肘関節、股関節、手の指の関節、足の指の関節、顎関節、脊椎の関節や椎間板等が挙げられ、これらに制限されない。
【００３２】
関節症としては、例えば、変形性膝関節症、変形性股関節症、変形性指関節症、変形性脊椎症等の変形性関節症；シャルコー関節等の神経原性関節症が挙げられ、その他、外傷や手術などによる外傷性関節症（半月板損傷、前十字靭帯損傷、外側側副靭帯損傷、内側側副靭帯損傷、膝蓋腱損傷）、顎関節症が挙げられる。
関節炎としては、例えば、関節リウマチ、結核性関節炎、関節周囲炎（五十肩、石灰化腱炎、アキレス腱炎、滑液包炎、膝蓋下脂肪織炎）、が挙げられ、その他、痛風性関節炎等が挙げられる。
本発明に係る関節症若しくは関節炎は、関節軟骨の損傷又は変性を伴う疾患であることが好ましい。上記に挙げた関節症若しくは関節炎のなかでは、変形性関節症であることがより好ましく、変形性膝関節症であることがさらに好ましい。
【００３３】
一実施形態において、本発明は、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を哺乳動物に投与する工程を備える関節症若しくは関節炎の、治療方法又は予防方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を非ヒト哺乳動物に投与する工程を備える関節症若しくは関節炎の、治療方法又は予防方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を哺乳動物の関節腔内へ注射する工程を備える関節症若しくは関節炎の、治療方法又は予防方法を提供する。
一実施形態において、本発明は、前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を非ヒト哺乳動物の関節腔内へ注射する工程を備える関節症若しくは関節炎の、治療方法又は予防方法を提供する。
【００３４】
一実施形態において、本発明は、関節症若しくは関節炎の、治療又は予防のための前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を提供する。
【００３５】
一実施形態において、本発明は、関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤を製造するための前記一般式（１）で表されるアスコルビン酸誘導体若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物の使用を提供する。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００３７】
＜実験例１＞軟骨細胞でのＳｏｄ２欠乏による軟骨変性への影響
Ｓｏｄ２（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  ２）は、ミトコンドリアにおいて活性酸素を分解する酵素として知られている。発明者らは、ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用い、軟骨細胞特異的にＳｏｄ２遺伝子が欠損したマウス（Ｃｏｌ２Ａｌ−Ｃｒｅ；Ｓｏｄ２ｆｌ／ｆｌ，  Ｓｏｄ２  ｃＫＯ）を作出した。Ｓｏｄ２の欠損が、加齢による軟骨変性を促進しているかどうかを確認するため、１２か月齢のＳｏｄ２  ｃＫＯマウスと、コントロールとして１２か月齢のＳｏｄ２ｆｌ／ｆｌマウス（コントロールマウス）とで、膝関節の組織学的解析を行い、結果を比較した。なお、１２か月齢において、Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスとコントロールマウスとでは、体重および運動機能に顕著の差は見られなかった。
結果を図１に示す。組織学的解析の数値化は、ＯＡＲＳＩスコア(軟骨変性スコア)に基づいて行った（Glasson et al. “The OARSI histopathology initiative e recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse.” Osteoarthritis Cartilage 18, 17-23 (2010)）。ＯＡＲＳＩスコアを表１に示す。Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスの関節では、コントロールマウスの膝関節と比べて、軟骨細胞部分を示すサフラニンＯ染色部分の顕著な損失を示していた。関節のうち、大腿骨内顆（ＭＦＣ）と内側脛骨高原（ＭＴＰ）に対する解析結果を図１に示す［図１中、顕微鏡写真の各スケールバーは１ｍｍを表す。図１中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝４）、**Ｐ＜０．０１、***Ｐ＜０．００１を示す（対コントロール、ｔ検定）］。Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスのＭＦＣ及びＭＴＰでは、コントロールマウスと比べて、軟骨組織成分を染色するサフラニンＯの顕著な低下を示していた。
これらの結果から、軟骨特異的にＳｏｄ２遺伝子を欠損したマウスでは、加齢に伴い、自然発症的に膝関節の軟骨変性が促進されることが示された。
【００３８】
【表１】
2016216452.tif 000005
【００３９】
＜実験例２＞機械的負荷存在下におけるＳｏｄ２欠乏軟骨細胞による誘導される軟骨変性への影響
発明者らはＳｏｄ２のない関節軟骨に対し機械的負荷を加えることで、軟骨変性が促進するかを明らかにするため、既報（S. S. Glasson, T. J. Blanchet, E. A. Morris, The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis Cartilage 15, 1061-1069 (2007)）に基づいて、８週齢のコントロールマウスおよびＳｏｄ２  ｃＫＯマウスの膝に対し、内側半月板を不安定にする手術Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｄｉａｌ  ｍｅｎｉｓｃｕｓ（ＤＭＭ））を行った。ＤＭＭとは、内側半月脛骨靭帯medial meniscotibial ligament（MMTL）を切離することで内側半月板を不安定にする手術である。組織学的解析の数値化は、前述のＯＡＲＳＩスコアに基づいて行った。大腿骨内顆（ＭＦＣ）と内側脛骨高原（ＭＴＰ）に対する解析結果を図２に示す［図２中、上段の顕微鏡写真の各スケールバーは２００μｍを表し、中段・下段の顕微鏡写真の各スケールバーは２０μｍを表す。中段・下段の写真は、上段の写真の拡大図。図２中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝５）、*Ｐ＜０．０５、***Ｐ＜０．００１を示す（対コントロール、ｔ検定）］。内側半月板を不安定化させたコントロールマウスでは、術後８週において、タイドマークレベルまでサフラニンＯの染色性の低下を認めるが、構造的破綻を認めなかった。一方で、内側半月板を不安定化させたＳｏｄ２のないマウス関節軟骨では、タイドマークレベルまで軟骨層の顕著な欠損を認めた。
これらの結果から、軟骨特異的にＳｏｄ２遺伝子を欠損したマウスでは、機械的負荷により誘導される軟骨変性が加速されることが明らかとなった。
【００４０】
＜実験例３＞Ｓｏｄ２  ｃＫＯの軟骨細胞へのＡＰＰＳの投与
ビタミンＣは抗酸化作用を有する抗酸化剤として知られている。ビタミンＣ誘導体の塩であるパルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ（ＡＰＰＳ）が軟骨細胞における活性酸素レベルを弱める効果について、検証を行った。前記Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスから軟骨細胞を単離・培養を行なった。Ｓｏｄ２  ｃＫＯの軟骨細胞にＡＰＰＳを投与し、終濃度１０μＭのＡＰＰＳの存在下で２４時間培養した。コントロールとしてＳｏｄ２ｆｌ／ｆｌマウスからも同様の手法で軟骨細胞を単離・培養を行ない、終濃度１０μＭのＡＰＰＳの存在下で２４時間培養した。培養６日後の軟骨細胞に対して、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）による染色を行い、フローサイトメトリーを用いて、各マウスの軟骨細胞における活性酸素量の測定を行った。結果を図３に示す［図３中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝４）、**Ｐ＜０．０１を示す（対コントロール、ｔ検定）］。ＡＰＰＳの投与により、Ｓｏｄ２  ｃＫＯの軟骨細胞で、ミトコンドリアの活性酸素レベルが抑制可能であることが判明した。
【００４１】
＜処方例１＞関節症若しくは関節炎の、治療剤又は予防剤の調製
下記に示す処方で各成分を混合し、本発明に係るアスコルビン酸誘導体の塩を含む注射剤を製造した。
・注射剤１
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）  １００ ｍＬ
パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ（ＡＰＰＳ）（アプレシエ（登録商標）昭和電工社製）  １ｇ
【００４２】
Ｓｏｄ２  ｃＫＯのマウスの膝関節へのＡＰＰＳの投与
＜実験例４＞
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、ＡＰＰＳが、ミトコンドリアの活性酸素を抑制可能かどうか検証した。８週齢のＳｏｄ２  ｃＫＯマウスの膝関節に対し、ＤＭＭ手術を行った。ＤＭＭ手術から２週後の時点で、手術側（ＤＭＭ側）の関節腔内に、前記処方例１の注射剤又はＰＢＳを各々２０ μＬ注入した。関節注射から２４時間後、それぞれのマウス膝関節の脛骨高原から関節軟骨を単離した。軟骨細胞のミトコンドリア活性酸素は、ＤＨＥ染色を行い、フローサイトメトリーで定量化した。結果を図４に示す［図４中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝５）、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１を示す（対コントロール、ｔ検定）］。膝関節腔への１％（ｗ／ｖ）のＡＰＰＳの投与により、Ｓｏｄ２
ｃＫＯマウスの関節軟骨のミトコンドリアの活性酸素レベルが抑制されたことが明らかとなった。
【００４３】
＜実験例５＞
膝軟骨に対するＡＰＰＳの治療効果を評価するため、以下の実験を行った。８週齢のＳｏｄ２  ｃＫＯのマウスに対してＤＭＭ手術を行い、ＤＭＭ手術後１〜８週にかけて、週に一度、ＤＭＭ側の関節腔内に、前記処方例１の注射剤を２０ μＬ注入した。また、コントロールとして、Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスのＤＭＭ側の関節腔内に、処方例１の注射剤に代えてＰＢＳを注入したこと以外は、同様に実験を行った。組織学的解析の結果を図５に示す。また組織学的解析結果をＯＡＲＳＩスコアに基づき数値化した結果を、図５のグラフに示す［図５中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝５〜７）、*Ｐ＜０．０５を示す（対コントロール、ｔ検定）］。膝関節腔への１％（ｗ／ｖ）のＡＰＰＳの投与により、Ｓｏｄ２  ｃＫＯマウスの関節軟骨の変性が抑制されたことが明らかとなった。
【００４４】
＜実験例６＞野生型マウスの膝関節へのＡＰＰＳの投与
野生型のマウスに対してＤＭＭ手術を行い、ＤＭＭ手術の２週間後、ＤＭＭ側の関節腔内に、前記処方例１の注射剤を２０ μＬ注入した。注射剤の注入から２４時間経過後、野生型マウスのＤＭＭ側の関節から、軟骨細胞を採取した。コントロールとして、ＤＭＭ手術を受けていない野生型マウスの膝関節から、軟骨を採取した。また、コントロールとして、野生型マウスのＤＭＭ側の関節腔内に、処方例１の注射剤に代えてＰＢＳを注入したこと以外は、同様に実験を行い、マウスの膝関節から、軟骨を採取した。
各マウスの脛骨高原軟骨の細胞におけるミトコンドリアの活性酸素量の測定は、ＤＨＥ染色を行い、フローサイトメトリーで測定した。結果を図６に示す［図６中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝３）、*Ｐ＜０．０５を示す（対コントロール、ｔ検定）］。膝関節腔への１％（ｗ／ｖ）のＡＰＰＳの投与により、野生型マウスの関節軟骨細胞のミトコンドリアの活性酸素レベルが抑制されたことが明らかとなった。
【００４５】
＜培地調製例１〜３＞
下記に示す処方で各成分を混合し、本発明に係るアスコルビン酸誘導体の塩を含む培地を製造した。
・培地１
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ−ｓｅｌｅｎｉｔｅ）（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：１７５００７０  ＩＴＳ：４１４００４５）
パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ（ＡＰＰＳ）（アプレシエ（登録商標）昭和電工社製）  終濃度  １０μｍｏｌ／Ｌ
・培地２
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ
パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ  終濃度  ３０μｍｏｌ／Ｌ
・培地３
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ
パルミチン酸アスコルビルリン酸３Ｎａ  終濃度  ４０μｍｏｌ／Ｌ
【００４６】
＜比較培地調製例１〜３＞
下記に示す処方で各成分を混合し、比較対象の培地を製造した。
・比較培地１
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｉｎ−ｓｅｌｅｎｉｔｅ）（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：１７５００７０  ＩＴＳ：４１４００４５）
Ｌ−アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製、Ｌ−Ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ  ＃ＳＬＢＧ５１３６Ｖ）  終濃度  １０μｍｏｌ／Ｌ
・比較培地２
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ
Ｌ−アスコルビン酸  終濃度  ３０μｍｏｌ／Ｌ
・比較培地３
ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ
Ｌ−アスコルビン酸  終濃度  ４０μｍｏｌ／Ｌ
【００４７】
＜実験例７＞軟骨細胞株へのＡＰＰＳの投与
ＡＴＤＣ５軟骨細胞株の細胞を、上記の培地１〜３又は比較培地１〜３を収容したウェルに、各ウェルあたり２×１０５個／ｍｌになるように播種した。播種から２４時間後に細胞数を測定した。
結果を図７に示す［図７中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝３）、＊Ｐ＜０．０５を示す（ｔ検定）］。アスコルビン酸（ＡＡ）添加培地と比較して、ＡＰＰＳ添加培地で培養された軟骨細胞では、有意に細胞数の増加が認められた。
【００４８】
＜実験例８＞線維芽細胞へのＡＰＰＳの投与
ヒト線維芽細胞（ＴＩＧ１１８）を、上記のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ培地、培地１又は比較培地１で１時間培養し、細胞内でのアスコルビン酸（ＡＡ）量を測定した。
結果を図８に示す［図８中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝４）、＊Ｐ＜０．０５を示す（ｔ検定）］。図８中、「Ｃｔｒｌ．」は上記のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ培地のことを表し、「ＡＰＰＳ」はＡＰＰＳが添加された上記の培地１のことを表し、「ＡＡ」ははＡＡが添加された上記の比較培地１のことを表す。なお、ＡＡの分子量は１７６．１２であり、ＡＰＰＳの分子量は５６０である。ＡＡ添加培地と比較して、ＡＰＰＳ添加培地で培養されたヒト線維芽細胞では、細胞内ＡＡ量が有意に（約１．８倍）高かった。
【００４９】
＜実験例９＞線維芽細胞へのアスコルビン酸トランスポーター阻害剤及びＡＰＰＳの投与
ヒト線維芽細胞（ＴＩＧ１１８）を、上記のＤＭＥＭ／Ｆ１２＋ＩＴＳ培地が、ＰＭＡ［ＡＡトランスポーター阻害剤（終濃度１０ｍＭ  Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）］、及び／又はＧｌｃ［グルコース（終濃度１０ｍＭ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）］を含む培地で、１時間、前培養した。その後、ＡＡ又はＡＰＰＳを、それぞれ終濃度１０ｍＭとなるよう添加して、さらに１時間培養し、細胞内ＡＡ量を測定した。ＡＡまたＡＰＰＳの添加後の、最終的な各培地のＡＡ、ＡＰＰＳ、ＰＭＡ、及びＧｌｃの含有状況は、図９に示す９通りの組み合わせである。
結果を図９に示す［図９中、グラフの値は平均値±標準偏差を示し（ｎ＝４）、＊Ｐ＜０．０５を示し、＊＊Ｐ＜０．０１を示す（ｔ検定）］。ＡＡ添加による細胞内ＡＡ量増加は阻害剤前処理により有意に抑制された。一方、ＡＰＰＳ添加による細胞内ＡＡ量増加は阻害剤前処理で抑制されなかった。このことから、ＡＰＰＳはＡＡトランスポーター非依存的に細胞内ＡＡ量を高めることが出来ると結論できる。
【００５０】
以上の実験例７〜９に示された結果から、ＡＰＰＳはＡＡより細胞内ＡＡ量を高める点での優位性があることが示された。本発明の治療剤又は予防剤を、注射剤、塗布剤、貼付剤等の外用剤として、直接患部に注射、塗布又は貼付する方法は、局所組織の細胞内ＡＡ量を高める方法として非常に有益であることが明らかとなった。
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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