(57)【要約】【課題】目的物質の捕捉量が高く、不純物の非特異的な捕捉を抑制することができる精製装置を提供する。【解決手段】本発明に係る精製装置は、目的物質を精製する精製装置であり、カラム管と、当該カラム管に充填された充填剤１２と、を備え、前記充填剤１２が、細孔径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である孔部１２３を複数有する多孔質担体から成り、前記多孔質担体が、両性イオン物質１２４と、前記目的物質に特異的に結合する捕捉部１２５と、を含むことを特徴とする。【選択図】図３
2016142724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質を精製する精製装置であり、
カラム管と、当該カラム管に充填された充填剤と、を備え、
前記充填剤が、細孔径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である孔部を複数有する多孔質担体から成り、
前記多孔質担体が、両性イオン物質と、前記目的物質に特異的に結合する捕捉部と、を含む
ことを特徴とする精製装置。
【請求項２】
前記多孔質担体が、モノリス構造体であることを特徴とする請求項１に記載の精製装置。
【請求項３】
前記モノリス構造体が、有機ポリマーを用いて形成されたものであることを特徴とする請求項２に記載の精製装置。
【請求項４】
前記有機ポリマーが、活性化部位を含むモノマーを用いて形成されたものであることを特徴とする請求項３に記載の精製装置。
【請求項５】
前記活性化部位が、グリシジル基であることを特徴とする請求項４に記載の精製装置。
【請求項６】
前記両性イオン物質はチオール基を有し、当該チオール基を介して前記多孔質担体に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の精製装置。
【請求項７】
前記両性イオン物質が、チオール基を有するアミノ酸およびチオール基を導入したアミノ酸のうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の精製装置。
【請求項８】
前記両性イオン物質が、システイン、システインの誘導体、スルホベタイン３−ウンデカンチオール、ホスホリルコリン基およびポリエチレングリコールのうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の精製装置。
【請求項９】
前記目的物質が、抗体であることを特徴とする請求項１に記載の精製装置。
【請求項１０】
前記捕捉部が、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬのうちの少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載の精製装置。
【請求項１１】
前記孔部の細孔径が、１ｎｍ以上３０ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載の精製装置。
【請求項１２】
カラム管と、当該カラム管に充填された充填剤と、を備え、
前記充填剤が、細孔径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である孔部を複数有する多孔質担体から成り、
前記多孔質担体が、両性イオン物質と、前記目的物質に特異的に結合する捕捉部と、を含む精製装置を用いて目的物質を精製する精製方法であり、
前記カラム管に充填された充填剤を平衡化する平衡化工程と、
前記平衡化工程後、前記目的物質および前記目的物質以外の成分を含む処理溶液を前記充填剤に通液させて、前記目的物質を前記捕捉部に捕捉させる捕捉工程と、
前記捕捉工程後、前記充填剤に洗浄液を通液させて、前記捕捉部に捕捉させた前記目的物質以外の成分を洗い流す洗浄工程と、
前記洗浄工程後、前記充填剤に溶離液を通液させて、前記捕捉部に捕捉させた前記目的物質を前記充填剤から溶離させて回収する溶離工程と、を含む
ことを特徴とする精製方法。
【請求項１３】
前記溶離工程後、前記充填剤に後洗浄液を通液させて、前記多孔質担体に残っている前記目的物質以外の成分を洗い流す後洗浄工程を含んでいることを特徴とする請求項１２に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製装置および精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
有用物質を生産する上で、夾雑物から目的物質を分離精製する技術は広く使用されている。このような技術としては、液体の化合物を加熱し、一度気体にしたのち凝縮させる蒸留法、化合物を溶媒に加熱して溶かし、冷却することで行う再結晶法、化合物の溶けた溶液と化合物をあまり溶かさない溶媒（貧溶媒）を混合することで目的の化合物を沈殿として得る再沈殿法、固体の化合物を一度気体にしたのち再び固体として得る昇華法、シリカなどとの親和性の差を利用したカラム法（クロマトグラフィー法）が知られている。
【０００３】
目的物質を劣化させることなく、高純度で精製するには、カラム法が適している。そのため、例えば、抗体医薬品である抗体タンパク質は、カラム法を用いて、夾雑物を多く含む細胞培養液から劣化させることなく高純度で分離されている。一方、カラム法では他の分離精製技術と比較し、大容量を一度に精製することが困難であるというデメリットがある。
【０００４】
カラム法には、アフィニティークロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー法、ゲルろ過クロマトグラフィー法などがある。抗体医薬品の精製においては、粗精製でプロテインＡを固定したアフィニティークロマトグラフィー法を用い、後工程で、イオン交換クロマトグラフィー法を用いるなど、複数の手法を組み合わせて行っている。
【０００５】
ここで、従来より、クロマトグラフィーに利用されるカラムの充填剤として、アガロースやシリカゲルなどで形成されたビーズ状の多孔質担体（ビーズ状担体）が用いられている。ビーズ状担体は、直径約１０〜１００μｍのビーズ内部にサイズの異なる細孔を有した構造の担体である。
【０００６】
アガロースで形成されたビーズ状担体（アガロースビーズ）には、生体親和性の高さから不純物の非特異的な捕捉量が低いという利点がある。そのため、アガロースビーズは、主にタンパク質精製用カラムの充填剤として用いられているが、圧力損失に対する機械的強度が低いという欠点がある。また、ビーズ状担体には、当該担体をカラム内に充填した場合に、担体間に狭窄箇所が発生して流路が縮小するという欠点がある。この場合、狭窄箇所に侵入する流路が、対抗する担体の影響によって大きく屈曲すると考えられ、圧力損失が増加することが指摘されている（特許文献１参照）。このような理由から、ビーズ状担体を用いる場合は、一般的に流速を高く設定することができず、処理工程に時間を要するという欠点がある。
【０００７】
流速を上げて処理時間を短縮するため、例えば、特許文献１では、ビーズ状担体の替わりにモノリス構造の多孔質担体（モノリス担体）を提案している。なお、モノリス担体とは、骨格と空隙をそれぞれ連続に有する（つまり、３次元網目構造を有する）一塊の多孔質担体をいう。空隙は、細孔径が約５０ｎｍ以上のマクロ孔であることが多く、骨格の表面には、細孔径が約２〜５０ｎｍのメソ孔や、細孔径が約２ｎｍ以下のマイクロ孔が形成されていることが多い。カラムの充填剤としてモノリス担体を用いた場合、液相は、モノリス担体中において連続的に形成されているマクロ孔を通過する。
【０００８】
特許文献１には、具体的に、３次元網目構造のシリカゲルまたはシリカガラスからなる骨格体と、前記骨格体の表面に分散して形成された前記骨格体の表面から内部まで貫通する細孔とを有し、窒素吸着法で測定した前記細孔の中心直径が４０ｎｍ以上７０ｎｍ以下である多孔質担体の表面に、プロテインＡを固定してなる吸着体を備えてなる抗体精製用カラムを用い、精製対象の抗体を含む精製前溶液と前記吸着体との接触時間が４０秒以下の条件で、前記抗体精製用カラムに前記精製前溶液を通液させて、前記精製前溶液内の抗体を前記吸着体に吸着させ、前記抗体を精製することを特徴とする抗体精製方法が開示されている。
【０００９】
この特許文献１に記載の発明によれば、担体にシリカモノリスを用い、しかも抗体吸着に最適な範囲の中心細孔直径を使用することで、高線速下において高い動的吸着容量（ｄＢＣ、動的結合容量とも呼ばれる）が実現でき、吸着工程での所要時間を４０秒以下にして、高効率且つ短時間での抗体精製を実施できる、とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１４−２００８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
特許文献１に記載されているシリカモノリス（モノリス担体）は、３次元網目構造を有しているため、従来のビーズ状担体よりも構造的に圧力負荷がかかりにくく、また比較的容易に作製できるという利点がある。
【００１２】
ここで、一般的に、モノリス担体中のマクロ孔が大きくなると、流路が確保されて圧力損失は低減されるものの、表面積が小さくなるため、目的物質の捕捉量（吸着量）が低下する。その一方で、モノリス担体中のマクロ孔が小さくなると、表面積は大きくなるものの、流路が縮小するため圧力損失が増加し、高流速処理が困難となる。
また、低流速条件であれば、目的物質がマクロ孔内に拡散できる時間が十分にあるため、マクロ孔中のメソ孔内に浸入することができるが、高流速条件では、目的物質はメソ孔内に浸入しきれず、メソ孔内部の捕捉部に接触する機会が減少するため、メソ孔表面積の全領域を有効に利用することができない。従って、圧力損失の少ないモノリス担体を利用することによって高流速処理が可能になっても、メソ孔内部に浸入できる目的物質が減少することによって捕捉効率（吸着効率）は低下するため、総処理時間および処理コストを大幅に低減することは難しい。
【００１３】
つまり、特許文献１に記載されている発明には、目的物質を含む処理溶液をカラムへ通液する場合において、流速と捕捉効率を両立することが困難であるという問題がある。換言すれば、特許文献１に記載されている発明には、目的物質の捕捉量を高くすることが困難であるという問題がある。また、モノリス担体で主に用いられるシリカ材料には、不純物の非特異的な捕捉が多いという問題がある。なお、不純物の非特異的な捕捉が多くなると、回収された目的物質の純度低下やカラムの寿命が短くなるおそれがある。
【００１４】
本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、目的物質の捕捉量が高く、不純物の非特異的な捕捉を抑制することができる精製装置および精製方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記課題を解決した本発明に係る精製装置は、目的物質を精製する精製装置であり、カラム管と、当該カラム管に充填された充填剤と、を備え、前記充填剤が、細孔径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である孔部を複数有する多孔質担体から成り、前記多孔質担体が、両性イオン物質と、前記目的物質に特異的に結合する捕捉部と、を含むことを特徴とする。
【００１６】
さらに本発明に係る精製方法は、カラム管と、当該カラム管に充填された充填剤と、を備え、前記充填剤が、細孔径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である孔部を複数有する多孔質担体から成り、前記多孔質担体が、両性イオン物質と、前記目的物質に特異的に結合する捕捉部と、を含む精製装置を用いて目的物質を精製する精製方法であり、前記カラム管に充填された充填剤を平衡化する平衡化工程と、前記平衡化工程後、前記目的物質および前記目的物質以外の成分を含む処理溶液を前記充填剤に通液させて、前記目的物質を前記捕捉部に捕捉させる捕捉工程と、前記捕捉工程後、前記充填剤に洗浄液を通液させて、前記捕捉部に捕捉させた前記目的物質以外の成分を洗い流す洗浄工程と、前記洗浄工程後、前記充填剤に溶離液を通液させて、前記捕捉部に捕捉させた前記目的物質を前記充填剤から溶離させて回収する溶離工程と、を含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明に係る精製装置は、目的物質の捕捉量が高く、不純物の非特異的な捕捉を抑制することができる。
また、本発明に係る精製方法は、目的物質の捕捉量が高く、不純物の非特異的な捕捉を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明に係る精製装置を用いた目的物質製造装置の概略構成図である。
【図２】本発明に係る精製装置の構成を説明する概略断面図である。
【図３】本発明に係る精製装置に用いられる充填剤を説明する要部拡大断面図である。
【図４】本発明に係る精製装置の他の実施形態を示す概略断面図である。
【図５】本発明に係る精製装置の他の実施形態を示す概略断面図である。
【図６】本発明に係る精製装置の他の実施形態を示す概略断面図である。
【図７】本発明に係る精製方法の内容を説明するフローチャートである。
【図８】〔測定２〕で測定した実施例１と比較例１に係る有機モノリス担体のプロテインＡ固定量と抗体捕捉相対量との関係を示すグラフである。
【図９】〔測定２〕で測定した実施例１、比較例２、３におけるシステイン濃度に対するプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量（実施例１の測定結果を基準とした相対量）の比較結果を示すグラフである。
【図１０】〔測定２〕で測定した実施例１および比較例１に係る有機モノリス担体におけるプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量（比較例１の測定結果を基準とした相対量）の比較結果を示すグラフである。
【図１１】〔測定２〕で測定した実施例２および比較例４に係る有機モノリス担体におけるプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量（比較例４の測定結果を基準とした相対量）の比較結果を示すグラフである。
【図１２】〔測定３〕で測定した実施例１および比較例１に係る各有機モノリス担体を用いたＢＳＡの非特異的吸着量（比較例１の測定結果を基準とした相対量）の比較結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、適宜図面を参照して、本発明に係る精製装置および精製方法を実施するための形態（実施形態）について詳細に説明する。
【００２０】
［目的物質製造装置］
はじめに、図１を参照して、本発明に係る精製装置１０が用いられる目的物質製造装置１００の一例について簡単に説明する。なお、図１は、本発明に係る精製装置１０を用いた目的物質製造装置１００の概略構成図である。
【００２１】
図１に示すように、精製装置１０は、目的物質製造装置１００の一部として用いられる。具体的には、目的物質製造装置１００は、処理溶液貯蔵タンク１１０と、洗浄液貯蔵タンク１２０と、溶離液貯蔵タンク１３０と、これらのタンクと接続されたバルブ１４０と、通液用ポンプ１５０と、精製装置１０と、目的物質貯蔵タンク１６０と、を備えている。なお、後洗浄を行う態様とする場合、精製装置１０は、後洗浄液貯蔵タンクを備えていてもよく、また、後洗浄液貯蔵タンクは、他のタンクと同様にバルブ１４０と接続されていてもよい（図示せず）。
【００２２】
処理溶液貯蔵タンク１１０は、目的物質を含む処理すべき処理溶液を貯蔵するタンクである。洗浄液貯蔵タンク１２０は、精製装置１０内の充填剤１２（図２参照）を洗浄する洗浄液を貯蔵するタンクである。溶離液貯蔵タンク１３０は、精製装置１０内の充填剤１２に捕捉された目的物質を溶離させるための溶離液を貯蔵するタンクである。これらのタンクは、それぞれの溶液によって腐食等されない材質で形成されていればよい。そのような材質として、例えば、ステンレスやアルミニウム合金などが挙げられる。処理溶液は、目的物質を含むものであればよく、細胞を培養した培養液、培養した動物細胞の細胞膜や植物細胞の細胞壁を破砕処理した破砕処理液などが挙げられる。洗浄液および溶離液は、目的物質に応じて適宜選択することができる。目的物質については後述する。
【００２３】
バルブ１４０は、処理溶液貯蔵タンク１１０、洗浄液貯蔵タンク１２０および溶離液貯蔵タンク１３０と接続されており、通液用ポンプ１５０および精製装置１０に通液させる溶液を自在に切り替えることができる。通液用ポンプ１５０は、バルブ１４０によって切り替えられた溶液に圧力を加えて精製装置１０に通液させることができる。
【００２４】
精製装置１０は、後述する充填剤１２を含んでおり、目的物質を精製する。精製装置１０について詳しくは後述する。
そして、目的物質貯蔵タンク１６０は、精製装置１０によって精製された目的物質を含む溶離液を貯蔵するタンクである。目的物質貯蔵タンク１６０も他のタンクと同様、ステンレスやアルミニウム合金などで形成することができる。
【００２５】
［精製装置］
次に、図２、３を参照して、本発明に係る精製装置１０について説明する。なお、図２は、本発明に係る精製装置１０の構成を説明する概略断面図である。図３は、本発明に係る精製装置１０に用いられる充填剤１２を説明する要部拡大断面図である。
【００２６】
前記したように、精製装置１０は、目的物質を精製するために用いられる。ここで、目的物質としては、例えば、生理活性物質や工業的に有用なタンパク質などが挙げられる。生理活性物質としては、特に、抗体（抗体分子）が挙げられる。抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免疫グロブリンなどが挙げられる。なお、生理活性物質は抗体に限定されるものではなく、生物に対して生理作用や薬理作用を発現する物質単体および化合物群であればどのようなものも含まれる。生物に対して生理作用や薬理作用を発現する物質単体および化合物群としては、例えば、アルカロイド、サイトカイン、植物ホルモン、神経伝達物質、フェロモン、ホルモン（動物のホルモン）などのほか、成長因子、成長調節因子、成長阻害因子などが挙げられる。生物に対して生理作用や薬理作用を発現する物質単体および化合物群の一例として、例えば、血栓溶解剤として利用される組織型プラスミノーゲン活性化因子やインスリンなどのバイオ医薬品が挙げられる。また、工業的に有用なタンパク質としては、例えば、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、除去付加酵素、異性化酵素、合成酵素などを挙げることができる。
【００２７】
なお、処理溶液には、目的物質以外の物質、つまり、不純物も含まれる。本発明における不純物とは、捕捉部１２５（図３参照）が特異的に認識する目的物質以外の物質であるが、担体部１２１（図３参照）の表面に捕捉（吸着）する分子をいう。例えば抗体医薬品の精製工程で処理すべき処理溶液中には、目的物質である抗体以外にも細胞培養により細胞が分泌するタンパク質、培養細胞を構成するタンパク質やＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、または細胞培養用の培地にあらかじめ含まれている血清由来のタンパク質やその他の栄養成分等が含まれており、これらの物質が不純物となる。不純物は、抗体の回収時における純度低下やカラム（精製装置１０）の劣化の原因となる。
【００２８】
図２に戻って精製装置１０の説明を続ける。図２に示すように、精製装置１０は、カラム管１１と、当該カラム管１１に充填された充填剤１２と、を備えている。カラム管１１の両端部には、カラム管１１の内部と外部を連通させ、溶媒などの通液を可能とする通液用プラグ１３、１３が設けられている。
【００２９】
（カラム管、通液用プラグ）
カラム管１１および通液用プラグ１３は、目的物質の精製に用いる溶液と反応せず、かつ、液相に印加される圧力によって変形等しない金属や樹脂などを用いて形成されたものであればよい。このような金属としては、例えば、ステンレスやアルミニウム合金などを挙げることができる。また、樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、アクリロニトリルブタジエンスチレン樹脂、アクリロニトリルスチレン樹脂、アクリル樹脂、ゴムなどを挙げることができる。カラム管１１の形状は、例えば、円筒状とすることができる。
【００３０】
（充填剤）
図３の要部拡大図に示すように、充填剤１２は、担体部１２１、貫通孔部１２２、孔部１２３、両性イオン物質１２４、捕捉部１２５を含んでいる。なお、貫通孔部１２２が前記したマクロ孔に相当し、細孔部分１２３が前記したメソ孔およびマイクロ孔に相当する。つまり、充填剤１２は、細孔径が約５０ｎｍ以上の貫通孔部１２２と、細孔径が１ｎｍ以上５０ｎｍ以下である孔部１２３と、を複数有する多孔質担体から成る。なお、孔部１２３の細孔径は、１ｎｍ以上３０ｎｍ以下であればよい。孔部１２３の細孔径が１ｎｍ以上３０ｎｍ以下であれば目的物質を確実に捕捉することができる。貫通孔部１２２の細孔径と孔部１２３の細孔径は、ガス吸着法による比表面積測定装置を用いて細孔径分布を求めることによって算出することができる。
【００３１】
前記した多孔質担体は、モノリス構造体であるのが好ましい。多孔質担体がモノリス構造体であると、骨格と空隙をそれぞれ連続に有する（つまり、３次元網目構造を有する）一塊の構造体であるため、流速を上げて処理時間を短縮することができ、かつ高い捕捉効率を維持することができる。なお、従来のビーズ状担体（例えば、アガロースビーズなど）では、圧力損失の問題からカラムの高さを数十ｃｍ程度までしか増加することができなかった。従って、従来のアガロースビーズなどを用いてカラム容量を増やすためには、円筒形のカラムの場合、直径方向へ拡大しなくてはならなかった。また、このような事情により、従来のアガロースビーズなどを用いたカラムは溶液を鉛直方向に流す縦型の精製装置とすることしかできなかった。
しかしながら、前記したように、多孔質担体をモノリス構造体とすると、圧力損失を低減することができるため、カラムの流路方向への拡大が可能となり、装置構造の自由度を広げることができる。すなわち、溶液を水平方向に流す横型の精製装置とすることができるようになる。また、多孔質体をモノリス構造体とすると圧力損失を低減することができるため、流路方向への長さを増大させることができる。従って、目的物質の担体への接触時間を増加させることができるため、アガロースビーズと比較して同じ担体体積で目的物質の捕捉量を増加させることができる。さらに、従来よりも装置の設置スペースを縮小することもできる。
【００３２】
また、前記した多孔質担体は、表面の少なくとも一部、望ましくは図３に示すように、孔部１２３の内表面１２３ａに、両性イオン物質１２４と捕捉部１２５とが固定されている。もちろん、両性イオン物質１２４と捕捉部１２５とは、孔部１２３の内表面１２３ａ以外の部分、例えば、担体部１２１の外表面１２１ａに固定されていてもよい。
【００３３】
充填剤１２内における溶液の主な流路は貫通孔部１２２である。各種の溶液は、通液用ポンプ１５０によって加えられた圧力により、例えば、図３の矢印Ａの方向に流れる。前記したように、多孔質担体の表面には複数の孔部１２３が存在しているため、処理溶液と、当該処理溶液に含まれている目的物質は、貫通孔部１２２から孔部１２３内に入り込む。
【００３４】
その際、本発明で用いる充填剤１２は、多孔質担体（担体部１２１）の表面の少なくとも一部（例えば、孔部１２３の内表面１２３ａ）に両性イオン物質１２４が固定されているので、濡れ性（親水性）が高くなっている。そのため、充填剤１２は、両性イオン物質１２４が固定されていない従来の充填剤（例えば、特許文献１に記載されている吸着体）と比較して処理溶液が孔部１２３の内部に入り込み易いものとなっている。従って、充填剤１２を用いることによって、担体部１２１の表面の少なくとも一部（例えば、孔部１２３の内表面１２３ａに固定されている捕捉部１２５）と、処理溶液に含まれている目的物質と、の捕捉機会を増やすことができ、捕捉部１２５が目的物質を捕捉し易くすることができる。よって、従来の充填剤では処理できなかったような高流速条件で処理溶液を通液させた場合であっても、目的物質を孔部１２３内へ侵入させることができ、孔部１２３に固定された捕捉部１２５に捕捉させることができる。このような充填剤１２は、従来の充填剤と比較して、目的物質の捕捉率を約１０〜５０％またはそれ以上向上させることができる。また、目的物質を精製するための処理時間を従来よりも大幅に短縮することができる。
【００３５】
また、充填剤１２は、担体部１２１の表面に両性イオン物質１２４を固定することによって、電荷的に中性かつ高い親水性を有している。そのため、溶離液中に含まれるタンパク質などの不純物の非特異的な相互作用、すなわち捕捉などを抑制することができる。なお、タンパク質はポリアミノ酸が複雑な立体構造を形成しており、疎水性領域やイオン性領域を有している。そのため、これらの領域が担体部１２１の表面に対して疎水的相互作用および静電的相互作用することによって、非特異的な捕捉が引き起こされるとされている。従って、上述した両性イオン物質１２４の作用によってこれらの相互作用を回避することができるため、前記した如くタンパク質などの不純物の非特異的な捕捉を抑制することができる。
【００３６】
充填剤１２の材料は特に限定されるものではなく、無機系および有機系どちらの材料を主成分としたものでよい。
無機系の材料としては、例えば、ケイ素、チタン、亜鉛、アルミニウムのうちの少なくとも一種、またはこれらから選択されるいずれか一種の酸化物や、ケイ素、ガリウム、アルミニウム、インジウムのうちの少なくとも一種、またはこれらから選択されるいずれか一種の窒化物を単独または複合体として使用することができる。
【００３７】
有機系の材料としては、例えば、アガロース、セルロース、キチン、キトサン、アミロース、ヘパリン、ヒアルロン酸、ペクチンなどの多糖類や、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸エステル、ポリアクリル酸エステル、およびこれらの誘導体などを用いることができる。
【００３８】
多孔質担体が有機系の材料を用いたモノリス構造体である場合は、有機ポリマーを用いて形成されたものであるのが好ましい。また、当該有機ポリマーが活性化部位を含むモノマーを用いて形成されたものであることが好ましく、活性化部位がグリシジル基（エポキシ基）であることが好ましい。このようなモノマーとしては、例えば、グリシジルメタクリレートが挙げられる。すなわち、前記有機ポリマーは、グリシジルメタクリレートを用いて架橋させたものであるのが好ましい。グリシジルメタクリレートを用いて架橋させて形成した充填剤１２の製造方法については後述する。
【００３９】
なお、多孔質担体は、合成高分子の一般的な作製方法によって合成されたものであってもよい。合成高分子の一般的な作製方法としては、例えば、ラジカル重合反応が挙げられる。具体的には、例えば、ビニルモノマーと、架橋剤としてジビニル化合物と、ラジカル開始剤と、を用いて溶媒中で反応させることにより重合体を形成させることを挙げることができる。
この場合の架橋剤としては、例えば、エチレングリコールジメタクリレート、ポリプロピレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジビニルエーテル、ジビニルベンゼン、ジアリルフタレート、メチレンビスアクリルアミド、ポリエチレングリコールジアクリレートなどを用いることができる。このような架橋剤を用いることによって担体部１２１の強度を増加させることができる。
また、ラジカル開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリルなどのアゾ化合物、過酸化ベンゾイルやメチルエチルケトンペルオキシドなどの有機過酸化物を用いることができるが、その他にも過酸化水素と鉄（II）塩などの酸化剤と還元剤の組み合わせで用いられるものも使用可能である。
【００４０】
（両性イオン物質）
両性イオン物質１２４は、チオール基を有し、このチオール基を介して多孔質担体（担体部１２１）に固定させたものを用いることができる。このような両性イオン物質１２４としては、例えば、チオール基を有するアミノ酸およびチオール基を導入したアミノ酸のうちの少なくとも一つを用いることができる。より具体的には、チオール基を有するアミノ酸としては、例えば、システインおよびシステインの誘導体を挙げることができる。アミノ酸へのチオール基の導入は公知の手法によって行うことができる。なお、システインの誘導体とは、システインの有する官能基のうちの少なくとも一つ（例えば、水酸基）を他の官能基に置換したものをいう（ただし、両性イオンの性質を有するものが好ましい。）。
また、両性イオン物質１２４としては、例えば、スルホベタイン３−ウンデカンチオール（Sulfobetaine3-undecanethiol；N-(11-Mercaptoundecyl)-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate）を用いることもできる。
さらに、両性イオン物質１２４としては、例えば、ホスホリルコリン基などの両性イオン基や、ポリエチレングリコールなども、電荷として中性であり、かつ親水性の高い官能基である。
つまり、両性イオン物質１２４は、具体的には、システイン、システインの誘導体、スルホベタイン３−ウンデカンチオール、ホスホリルコリン基およびポリエチレングリコールのうちの少なくとも一つを用いることができる。
【００４１】
（捕捉部）
捕捉部１２５は、捕捉する目的物質に応じて適宜設定することができる。捕捉部１２５は、目的物質を特異的に捕捉することのできるものであるのが好ましい。例えば、目的物質が抗体である場合は、捕捉部１２５として、プロテインＡ、プロテインＧおよびプロテインＬのうちの少なくとも一つを用いるのが好ましい。これらはいずれもイムノグロブリン結合能を有しているので、抗体を特異的に捕捉して高効率で精製することができる。なお、目的物質が前記したアルカロイドなどであればそれと親和性の高い物質を捕捉部１２５として用いることができる。また、目的物質が酵素などのタンパク質であれば当該酵素に特異的に結合する抗体を捕捉部１２５として用いることができる。
【００４２】
［充填剤の製造方法］
次に、充填剤の製造方法について説明する。
充填剤の製造方法は、多孔質担体製造工程と、固定化工程と、を含んでなり、少なくともこれらの工程は前記した順序で行う。
【００４３】
（多孔質担体製造工程）
多孔質担体製造工程は、多孔質担体を製造する工程である。多孔質担体の製造は、公知の手法（例えば、参考文献１：Ｙ．Ｕｅｋｉほか、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年１２月、ｐ．７００７〜７０１２）によって行うことができる。
【００４４】
（固定化工程）
固定化工程は、多孔質担体の表面の少なくとも一部、望ましくは図３に示すように、孔部１２３の内表面１２３ａに、両性イオン物質１２４と捕捉部１２５とを固定する工程である。
【００４５】
多孔質担体の表面への両性イオン物質１２４と捕捉部１２５の固定は、公知の手法（例えば、参考文献２：特開２０１１−２５２９２９号公報参照）によって行うことができる。すなわち、エポキシ法、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、トレシルクロリド法、過ヨウ素酸酸化法、ジビニルスルホン酸法、ベンゾキノン法、カルボニジルイミダゾール法、アシルアジド法などを用いて、アミノ基を有する捕捉部１２５および両性イオン物質１２４を固定化したり、エポキシ法、ジアゾカップリング法などを用いて水酸基を有する捕捉部１２５および両性イオン物質１２４を固定化したり、エポキシ法、トレシルクロリド法、ジビニルスルホン酸法などを用いて、チオール基を有する捕捉部１２５および両性イオン物質１２４を固定化したり、さらに多孔質担体の表面の一部をアミノ化させたアミノ化担体にカルボン酸やホルミル基を有する捕捉部１２５および両性イオン物質１２４を固定化したりすることによって、前記したように、多孔質担体の表面への両性イオン物質１２４と捕捉部１２５を固定することができる。
【００４６】
また、無機系の多孔質担体への捕捉部１２５および両性イオン物質１２４の固定化は、シランカップリング剤を用いることで容易に実施可能である。また、所望の官能基を多孔質担体の表面に付加することもできる。付加できる官能基としては、例えば、ビニル基、エポキシ基、スチリル基、メタクリル基、アクリル基、アミノ基、メルカプト基、スルフィド基が挙げられる。シランカップリング剤の例としては、ビニルトリメトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
前記したシランカップリング剤を用いて多孔質担体の表面に前記官能基を付加した後は、例えば、前記参考文献２に記載されているエポキシ法、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、トレシルクロリド法、過ヨウ素酸酸化法、ジビニルスルホン酸法、ベンゾキノン法、カルボニジルイミダゾール法、アシルアジド法などによる活性化方法で前記官能基を活性化し、アミノ基を有する捕捉部１２５および両性イオン物質１２４を固定化することができる。
【００４７】
本発明で用いられる多孔質担体に補足部１２５と両性イオン物質１２４を固定化する順番は特に限定されない。本発明においては、作製した多孔質担体に補足部１２５を先に固定化した後で両性イオン物質１２４を固定化してもよく、作製した多孔質担体に両性イオン物質１２４を先に固定化した後で補足部１２５を固定化してもよく、また、作製した多孔質担体に補足部１２５と両性イオン物質１２４を同時に固定化してもよい。また、あらかじめ両性イオン物質１２４を側鎖に有するモノマーを用いて重合することにより、多孔質担体を作製した後、補足部１２５を固定化してもよい。両性イオン基を側鎖に有するモノマーとしては、例えば、両性イオンビニルモノマーが挙げられる。両性イオンビニルモノマーとジビニルベンゼンなどのビニル基を持つ架橋剤とを併用してラジカル重合させると、両性イオン物質１２４を有する多孔質担体を得ることができる。
【００４８】
［充填剤の製造方法の好ましい実施形態］
充填剤１２がグリシジルメタクリレートを用いて架橋させてなる有機ポリマーで形成したものであるのが好ましいことは前述したとおりである。そこで、グリシジルメタクリレートを用いて架橋させてなる有機ポリマーで形成した充填剤１２の製造方法について説明する。
【００４９】
当該充填剤１２の製造方法は、はじめに、主成分としてグリシジルメタクリレートを用い、架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレートやメチレンビスアクリルアミドなどのジビニル化合物を用い、開始剤としてアゾビスイソブチロニトリルや過酸化ベンゾイルなどを用い、これらをラジカル重合させることによって、多孔質担体を得る。
【００５０】
次いで、得られた多孔質担体に両性イオン物質１２４を接触させることにより、温和な条件で容易に固定化することができる。両性イオン物質１２４としては、前記したように、システイン、システインの誘導体およびスルホベタイン３−ウンデカンチオールが挙げられるが、本実施形態においてはシステインを用いることが好ましい。多孔質担体にシステインを固定させるには、例えば、前記得られた多孔質担体と、０．０１質量％のシステインを含む溶液と、を中性条件下で接触させ、４０℃で終夜保温するとよい。このようにするだけで、システインのチオール基が選択的に多孔質担体のグリシジル基と反応して共有結合を形成させることができ、多孔質担体へのシステインの固定化が達成される。本手法によれば、一段階の反応で容易に両性イオン物質１２４を多孔質担体へ固定化することができる。また、システインという安価な試薬を用いるので低コスト化することができる。
【００５１】
なお、本実施形態において、異なる二種類の官能基を有する多孔質担体を用いることによって、捕捉部１２５と両性イオン物質１２４の固定化配分を制御することも可能である。捕捉部１２５と両性イオン物質１２４の固定化配分の制御は、例えば、グリシジル基（エポキシ基）とカルボキシル基を有する多孔質担体を作製し、グリシジル基と両性イオン物質１２４のアミノ基などを介して反応させて固定化した後、カルボキシル基をカルボジイミドなどの活性化剤を用いて活性化し、活性化したカルボキシル基と捕捉部１２５のアミノ基などを反応させることによって任意に調節することができる。つまり、多孔質担体に導入するグリシジル基とカルボキシル基の配分を任意に調節することによって捕捉部１２５と両性イオン物質１２４の固定化配分を制御することが可能である。
【００５２】
［精製装置の他の構成］
以上、本実施形態に係る精製装置１０および当該精製装置１０に用いる充填剤１２の好ましい実施形態などについて説明したが、精製装置は以下のような他の構成とすることもできる。
例えば、多孔質担体としてモノリス構造体とするのが好ましい旨説明したが、モノリス構造体の多孔質担体をビーズ状に成形したものであってもよい。このような多孔質担体であっても、圧力損失を低減することができるため、カラムの流路方向への拡大が可能となり、装置構造の自由度を広げることができる。すなわち、溶液を水平方向に流す横型の精製装置とすることができるようになる。また、多孔質体をモノリス構造体とすると圧力損失を低減することができるため、流路方向への長さを増大させることができる。従って、目的物質の担体への接触時間を増加させることができるため、アガロースビーズと比較して同じ担体体積で目的物質の捕捉量を増加させることができる。さらに、従来よりも装置の設置スペースを縮小することもできる。
【００５３】
また、精製装置は、図４〜６に示すような態様とすることができる。なお、図４〜６は、本発明に係る精製装置の他の実施形態を示す概略断面図である。
図４に示す精製装置１０Ａは、図２に示す精製装置１０を溶液の通液方向に沿って長く設計したものである。また、図５に示す精製装置１０Ｂは、図２に示す精製装置１０を直列に複数配置したものである。そして、図６に示す精製装置１０Ｃは、図２に示す精製装置１０を並列で複数配置したものである。図４〜６に示す精製装置１０Ａ〜１０Ｃのいずれの態様も、カラム管１１に前記した充填剤１２が充填されているので、従来の充填剤では処理できなかったような高流速条件で処理溶液を通液させた場合であっても、目的物質を孔部１２３内へ侵入させることができ、孔部１２３に固定された捕捉部１２５に捕捉させることができる。このような充填剤１２は、従来の充填剤と比較して、目的物質の捕捉効率を向上させることができる。また、目的物質を精製するための処理時間を従来よりも大幅に短縮することができる。
【００５４】
以上に説明した精製装置によれば、両性イオン物質１２４を含んでいるので、従来の充填剤と比べて目的物質の捕捉量を増加できる。従って、従来と同じ流速で処理を行った場合でも、処理時間を短縮することができる。また、捕捉部１２５の固定化量を減らしても、従来の充填剤と同等の捕捉効率を維持することができる。これは例えば、抗体医薬品の精製においては、捕捉部１２５としてプロテインＡを利用することが多いが、本発明によれば両性イオン物質１２４を含んでいるので、プロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量を増加させることができる。従って、多孔質担体に固定化するプロテインＡの量を減らしても、従来の充填剤と同等の抗体捕捉量を発揮することができる。なお、プロテインＡは主に大腸菌の形質転換体によって生産されるタンパク質であり、高価な材料であることから、プロテインＡの使用量を低減できることは、低コスト化を図る点で有利である。
【００５５】
［精製方法］
次に、本発明に係る精製方法について説明する。
本発明に係る精製方法は、前記した本発明に係る精製装置１０（１０Ａ〜１０Ｃ）を用いて目的物質を精製する精製方法である。図７は、本発明に係る精製方法の内容を説明するフローチャートである。
図７に示すように、本発明に係る精製方法は、平衡化工程Ｓ１と、捕捉工程Ｓ２と、洗浄工程Ｓ３と、溶離工程Ｓ４と、を含み、これらの工程についてはこの順で行うものである。なお、この精製方法は、精製装置１０を使い捨て（ディスポーザブル）のものとして用いる場合に適用することができる。
他方、精製装置１０をディスポーザブルタイプではないものとして用いる場合、つまり、複数回繰り返し用いる場合は、前記した溶離工程Ｓ４の後に後洗浄工程Ｓ５を行い、後洗浄工程Ｓ５を終えたら再び平衡化工程Ｓ１に戻って前記した順で各工程を行うことができる。
以下、各工程について説明する。なお、本発明に係る精製方法で用いる精製装置１０については既に詳述しているので、説明を省略し、同一の構成要素については同一の符号を付すこととする。
【００５６】
（平衡化工程）
平衡化工程Ｓ１は、カラム管１１に充填された充填剤１２を平衡化する工程である。充填剤１２の平衡化は、例えば、緩衝液を用いることによって行うことができる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などを用いることができる。
【００５７】
（捕捉工程）
捕捉工程Ｓ２は、平衡化工程Ｓ１後、目的物質および目的物質以外の成分を含む処理溶液を、カラム管１１内の充填剤１２に通液させて、目的物質を捕捉部１２５に捕捉させる工程である。処理溶液としては、例えば、抗体を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養上清液や、血清などを挙げることができる。
【００５８】
（洗浄工程）
洗浄工程Ｓ３は捕捉工程Ｓ２後、カラム管１１内の充填剤１２に洗浄液を通液させて、捕捉部１２５に捕捉させた目的物質以外の成分、つまり不純物を洗い流す工程である。洗浄液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水などを用いることができる。
【００５９】
（溶離工程）
溶離工程Ｓ４は、洗浄工程Ｓ３後、カラム管１１内の充填剤１２に溶離液を通液させ、捕捉部１２５に捕捉させた目的物質を充填剤１２から溶離させて回収する工程である。溶離液としては、例えば、クエン酸ナトリウム緩衝液などの酸性溶液を用いることができる。
【００６０】
（後洗浄工程）
後洗浄工程Ｓ５は、溶離工程Ｓ４後、カラム管１１内の充填剤１２に後洗浄液を通液させて、多孔質担体に残っている目的物質以外の成分（不純物）を洗い流す工程である。後洗浄液としては、例えば、水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリ溶液を用いることができる。
【００６１】
以上に説明した精製方法によれば、充填剤１２が両性イオン物質１２４を含んでいるので、従来の充填剤と比べて目的物質の捕捉量を増加できる。従って、従来と同じ流速で処理を行った場合でも、処理時間を短縮することができる。また、捕捉部１２５の固定化量を減らしても、従来の充填剤と同等の捕捉効率を維持することができる。これは例えば、抗体医薬品の精製においては、捕捉部１２５としてプロテインＡを利用することが多いが、本発明によれば、充填剤１２が両性イオン物質１２４を含んでいるので、プロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量を増加させることができる。従って、多孔質担体に固定化するプロテインＡの量を減らしても、従来の充填剤と同等の抗体捕捉量を発揮することができる。なお、プロテインＡは主に大腸菌の形質転換体によって生産されるタンパク質であり、高価な材料であることから、プロテインＡの使用量を低減できることは、低コスト化を図る点で有利である。
【実施例】
【００６２】
次に、本発明の効果を確認した実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
以下のようにして実施例１、２および比較例１〜４を作製した。
【００６３】
［実施例１］
〔１〕有機モノリス担体の作製
参考文献１（Ｙ．Ｕｅｋｉほか、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年１２月、ｐ．７００７〜７０１２）に従い、モノリス構造体である多孔質担体を調製した。そして、得られた多孔質担体をエタノール中にて終夜振とうして洗浄し、風乾した。このようにして得られた多孔質担体のメソ孔の細孔径は、後記表１に示すように３０ｎｍ以下であった。以下、当該多孔質担体を有機モノリス担体という。
【００６４】
〔２〕有機モノリス担体の表面修飾
前記〔１〕で得られた有機モノリス担体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）により洗浄後、システインを０．０１質量％の濃度条件下で接触させて４０℃で終夜保温して固定化を行った。そして、この有機モノリス担体を再度ＰＢＳにより洗浄した。その後、この有機モノリス担体とプロテインＡ（１ｍｇ／ｍＬ）とを室温で１時間接触させて、有機モノリス担体の表面にプロテインＡを固定化し、当該有機モノリス担体をＰＢＳにより洗浄して、有機モノリス担体の表面修飾を終了した（実施例１）。
【００６５】
実施例１に係る有機モノリス担体に対して６６０ｎｍプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて非固定のプロテインＡを測定し、有機モノリス担体へのプロテインＡの固定量を見積もった。その後、目的物質である抗体が担体に固定化されたプロテインＡ以外に吸着してしまわないようにするため、有機モノリス担体に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を注入してブロッキングを行った。
【００６６】
［比較例１］
システインの固定化は行わず、プロテインＡの固定化のみ行った以外は、実施例１と同様にして、比較例１に係る有機モノリス担体を作製した。
比較例１に係る有機モノリス担体に対して６６０ｎｍプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて非固定のプロテインＡを測定し、有機モノリス担体へのプロテインＡの固定量を見積もった。その後、実施例１と同様、有機モノリス担体に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を注入してブロッキングを行った。
【００６７】
［比較例２］
システインを１質量％の濃度条件下で接触させて固定化した以外は、実施例１と同様にして、比較例２に係る有機モノリス担体を作製した。
【００６８】
［比較例３］
システインを０．１質量％の濃度条件下で接触させて固定化した以外は、実施例１と同様にして、比較例３に係る有機モノリス担体を作製した。
【００６９】
［実施例２］
実施例１と同様、参考文献１（Ｙ．Ｕｅｋｉほか、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２００４年１２月、ｐ．７００７〜７０１２）に従い、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、ｎ−プロパノール、１，４−ブタンジオール、水の混合比率を変更することにより、実施例２に係る有機モノリス担体を作製した。このようにして得られた多孔質担体のメソ孔の細孔径は、後記表１に示すように１０〜５０ｎｍであった。
【００７０】
［比較例４］
システインの固定化は行わず、プロテインＡの固定化のみ行った以外は、実施例２と同様にして、比較例４に係る有機モノリス担体を作製した。
【００７１】
作製した実施例１、２および比較例１〜４に係る有機モノリス担体を用いて適宜下記〔測定１〕〜〔測定３〕の測定を行った。
【００７２】
〔測定１〕細孔径分布の測定
実施例１、２に係る有機モノリス担体について、ガス吸着法による比表面積測定装置を用いて細孔径分布を測定した。その結果を表１に示す。
【００７３】
【表１】
2016142724.tif 000003
【００７４】
表１に示すように、実施例１に係る有機モノリス担体と、実施例２に係る有機モノリス担体はいずれも、細孔径分布が孔径数十ｎｍのメソ孔と孔径数百ｎｍのマクロ孔で二極化が確認された。実施例１に係る有機モノリス担体における細孔容積０．１ｃｍ３／ｇ・ｎｍ以上の領域のメソ孔サイズは、表１に示すように３０ｎｍ以下であった。また、実施例２に係る有機モノリス担体における細孔容積０．１ｃｍ３／ｇ・ｎｍ以上の領域のメソ孔サイズは、表１に示すように１０〜５０ｎｍであった。
また、上記の結果から、実施例１と同様の条件で作製した比較例１〜３も実施例１と同様のメソ孔サイズおよびマクロ孔サイズを有していると言える。また、実施例２と同様の条件で作製した比較例４も実施例２と同様のメソ孔サイズおよびマクロ孔サイズを有していると言える。
【００７５】
〔測定２〕有機モノリス担体のプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量
実施例１、２および比較例１〜４に係る各有機モノリス担体を用いて、プロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉相対量（以下、単に「抗体捕捉量」と呼称することもある。）を求めた。
はじめに、次のようにして実施例１、２および比較例１〜４に係る各有機モノリス担体の抗体捕捉量を求め、次いで後記するように、この抗体捕捉量を用いてプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉相対量を算出した。
【００７６】
実施例１、２および比較例１〜４に係る各有機モノリス担体をクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア社製）に接続し、担体下流側の溶液を波長２８０ｎｍの吸光度をモニタリングしながら溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで通液して担体内部を洗浄した。クロマトチャートのベースラインが安定したことを確認した後、バルブを切り替えて処理溶液である１ｍｇ／ｍＬの抗体タンパク（ＩｇＧ）溶液を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで連続的に通液した。処理溶液の通液は、担体を通過した抗体の吸光度が飽和するまで続けた。そして、実施例１、２および比較例１〜４に係る各有機モノリス担体の抗体捕捉量を下記式（１）により求めた。
抗体捕捉量＝添加抗体の５％の漏出が見られた時点の添加抗体量・・・式（１）
【００７７】
そして、式（１）で求めた抗体捕捉量を用いて、実施例１、２および比較例１〜４に係る各有機モノリス担体のプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉相対量を下記式（２）により算出した。ただし、下記式（２）において、Ｘは、抗体捕捉量（ｍｇ）であり、Ｙは、プロテインＡ固定化量（ｍｇ）である。
プロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉相対量＝Ｘ／Ｙ・・・式（２）
【００７８】
〔測定３〕非特異的吸着の測定
実施例１および比較例１に係る各有機モノリス担体を用いて非特異的吸着の測定を次のようにして行った。非特異的吸着の測定は、実施例１および比較例１に係る各有機モノリス担体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）により洗浄後、システイン（０．０１質量％）を接触させて４０℃で終夜保温し、固定化を行った。その後、担体をクロマトグラフィーシステム（ＧＥヘルスケア社製）に接続し、担体下流側の溶液を波長２８０ｎｍの吸光度をモニタリングしながら溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を流速０．５ｍＬ／ｍｉｎで通液して担体内部を洗浄した。クロマトチャートのベースラインが安定したことを確認した後、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを１００μＬ添加して担体通過時のピーク波形を確認した。ピーク面積を求め、予め作成しておいた検量線から担体へ非特異的に吸着しているＢＳＡの量を算出した。
【００７９】
〔試験結果および考察〕
〔１〕両性イオン物質（システイン）の有無における抗体捕捉量の比較
図８に、前記〔測定２〕で測定した実施例１と比較例１に係る有機モノリス担体のプロテインＡ固定量に対する抗体捕捉相対量の結果を示す。
図８に示すように、実施例１に係る有機モノリス担体は、システインをプロテインＡと同時に担体へ固定化していたので、比較例１に係る有機モノリス担体と比較して、抗体捕捉相対量（比較例１の抗体捕捉量を基準とした相対量）が増加することが確認できた。
【００８０】
通常、連続的なカラムへの通液条件では、メソ孔（孔部１２５）の細孔径が小さいほど抗体が侵入し辛くなるため、固定化されたプロテインＡに対して十分な抗体量を捕捉することができない。
しかしながら、実施例１に係る有機モノリス担体では、システインを両性イオン物質として担体表面に固定化していたので、メソ孔の親水性が増加して溶液の浸入が容易となった。そのため、抗体がメソ孔内部に固定化されたプロテインＡに接触する機会が増加したと考えられる。
【００８１】
また、前記観点からは、両性イオン物質としてシステインと同様に、システインの有する官能基のうちの少なくとも一つ（例えば、水酸基）を他の官能基に置換したシステインの誘導体、およびスルホベタイン３−ウンデカンチオールも用いることができると推測された。また、両性イオン物質として、ホスホリルコリン基などの両性イオン基、およびポリエチレングリコールなどは、電荷として中性であり、かつ親水性の高い官能基であるため、システインに換えて、またはシステインとともにホスホリルコリン基およびポリエチレングリコールのうちの少なくとも一つを用いることができると推測された。
さらに、多孔質担体のグリシジル基にシステインを温度条件４０℃において接触させるだけで、中性の温和な条件下でシステインのチオール基を選択的にグリシジル基に共有結合させることができる点も本発明における固定化方法の利点であることが確認された。
【００８２】
〔２〕両性イオン物質（システイン）の固定化量の最適化
また、図９に、前記〔測定２〕で測定した実施例１、比較例２、３におけるシステイン固定化時の濃度（システイン濃度）に対するプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量（実施例１の測定結果を基準とした）の比較結果を示す。
図９に示すように、システイン固定化時の濃度が０．１質量％以上の場合、プロテインＡが抗体をほとんど捕捉しないことが確認された。この結果より、両性イオン物質が多孔質担体表面に過剰に存在する場合、抗体が担体表面付近に接近するのを阻害すること、および担体のメソ孔内部に侵入するのを阻害すると推察される。従って、システインを両性イオン物質として担体に固定化する条件としては、０．１質量％より低い濃度とするのが好ましく、０．０１質量％とするのがより好ましい。
【００８３】
〔３〕異なる細孔径における効果の比較
表１に示したように、実施例１に係る有機モノリス担体のメソ孔の細孔径は３０ｎｍ以下であり、これと同じ条件で製造した比較例１に係る有機モノリス担体のメソ孔の細孔径も３０ｎｍ以下であると言える。
図１０に、前記〔測定２〕で測定した実施例１および比較例１に係る有機モノリス担体におけるプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量（比較例１の測定結果を基準とした相対量）の比較結果を示す。
図１０に示すように、実施例１に係る有機モノリス担体はシステインが固定化されていたので、システインが固定化されていない比較例１に係る有機モノリス担体と比較して抗体捕捉量が１．５倍増加していた。
【００８４】
また、表１に示したように、実施例２に係る有機モノリス担体のメソ孔の細孔径は１０〜５０ｎｍであり、これと同じ条件で製造した比較例４に係る有機モノリス担体のメソ孔の細孔径も１０〜５０ｎｍであると言える。
図１１に、前記〔測定２〕で測定した実施例２および比較例４に係る有機モノリス担体におけるプロテインＡ単位量あたりの抗体捕捉量（比較例４の測定結果を基準とした相対量）の比較結果を示す。
図１１に示すように、実施例２に係る有機モノリス担体はシステインが固定化されていたので、システインが固定化されていない比較例４に係る有機モノリス担体と比較して抗体捕捉量が１．１倍増加していた。
【００８５】
前記した図１０、図１１、および表１を併せて参照すると次のことが言える。つまり、実施例１および比較例１に係る有機モノリス担体の群（メソ孔サイズの小さい群）と、実施例２および比較例４に係る有機モノリス担体の群（メソ孔サイズの大きい群）とを比較すると、メソ孔サイズの小さい群の方が、システインを固定化する効果が高いことがわかった。また、担体中のメソ孔のサイズは１ｎｍから５０ｎｍの範囲内、より好ましくは１ｎｍから３０ｎｍの範囲内に設定するのが良いと言えることもわかった。
【００８６】
〔４〕両性イオン物質（システイン）の有無における非特異的吸着量の比較
図１２に、前記〔測定３〕で測定した実施例１および比較例１に係る各有機モノリス担体を用いたＢＳＡの非特異的吸着量（比較例１の測定結果を基準とした相対量）の比較結果を示す。
図１２に示すように、実施例１に係る各有機モノリス担体は、システインを担体へ固定化していたので、システインを担体へ固定化していない比較例１に係る有機モノリス担体と比較して、ＢＳＡ（不純物）の非特異的吸着量を１０倍以上低減することができた。
上記の結果からも、両性イオン物質としてシステインと同様に、システインの有する官能基のうちの少なくとも一つ（例えば、水酸基）を他の官能基に置換したシステインの誘導体、およびスルホベタイン３−ウンデカンチオールも用いることができると推測された。また、両性イオン物質として、ホスホリルコリン基などの両性イオン基、およびポリエチレングリコールなどは、電荷として中性であり、かつ親水性の高い官能基であるため、システインに換えて、またはシステインとともにホスホリルコリン基およびポリエチレングリコールのうちの少なくとも一つを用いることができると推測された。
【符号の説明】
【００８７】
１０、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ  精製装置
１１    カラム管
１２    充填剤
１２１  担体部
１２２  貫通孔部
１２３  孔部
１２４  両性イオン物質
１２５  捕捉部
１３    通液用プラグ
１００  目的物質製造装置
１１０  処理溶液貯蔵タンク
１２０  洗浄液貯蔵タンク
１３０  溶離液貯蔵タンク
１４０  バルブ
１５０  通液用ポンプ
１６０  目的物質貯蔵タンク
【図１】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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