(57)【要約】【課題】９−アミノアントラセン（９ＡＡ）又はその誘導体を含み、９ＡＡ又はその誘導体の分解が抑制された蛍光組成物を提供する。また、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制剤、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制方法、プロトン性有機化合物の検出剤、及び、プロトン性有機化合物の検出方法を提供する。【解決手段】９ＡＡ又はその誘導体、及びプロトン性有機化合物を含む蛍光組成物；プロトン性有機化合物を有効成分として含有する、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制剤；９ＡＡ又はその誘導体にプロトン性有機化合物を共存させる工程を含む、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制方法；９ＡＡ又はその誘導体を有効成分として含有する、プロトン性有機化合物の検出剤；及び、サンプルに、９ＡＡ又はその誘導体を接触させる工程を含む、プロトン性有機化合物の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
９−アミノアントラセン又はその誘導体、及びプロトン性有機化合物を含む、蛍光組成物。
【請求項２】
前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸又はアルコールである、請求項１に記載の蛍光組成物。
【請求項３】
プロトン性有機化合物を有効成分として含有する、９−アミノアントラセン又はその誘導体の分解抑制剤。
【請求項４】
前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸又はアルコールである、請求項３に記載の分解抑制剤。
【請求項５】
９−アミノアントラセン又はその誘導体にプロトン性有機化合物を共存させる工程を含む、９−アミノアントラセン又はその誘導体の分解抑制方法。
【請求項６】
前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸又はアルコールである、請求項５に記載の分解抑制方法。
【請求項７】
９−アミノアントラセン又はその誘導体を有効成分として含有する、プロトン性有機化合物の検出剤。
【請求項８】
プロトン性有機化合物の検出方法であって、サンプルに、９−アミノアントラセン又はその誘導体を接触させる工程と、前記９−アミノアントラセン又はその誘導体の蛍光を検出する工程と、を含み、前記蛍光の存在がプロトン性有機化合物の存在を示す、検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光組成物、９−アミノアントラセン又はその誘導体の分解抑制剤及び分解抑制方法、プロトン性有機化合物の検出剤及びプロトン性有機化合物の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑色及び赤色蛍光物質は、蛍光顕微鏡観察に有用であり、細胞イメージング等に用いられる。蛍光物質には、天然の動植物から抽出された天然物と人工的に合成された非天然物が存在する。天然物は、大量の動植物から選択的に抽出しなければならないため、大量に得ることが困難な場合があるが、非天然物は、大量に得ることが比較的容易である。
【０００３】
非天然物の緑色蛍光物質の１つとして、下記式（１）で表される９−アミノアントラセン（以下、「９ＡＡ」という場合がある。）が知られている（例えば、非特許文献１を参照）。９ＡＡは、波長約４４０ｎｍの励起光を照射すると、波長約５１０ｎｍの蛍光を発する化合物である。
【０００４】
【化１】
2016079191.tif 000002
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】H. Prichystalova, et al., N-Triazinyl Derivatives of 1- and 9-aminoanthracene: Synthesis and Photo-Physical Properties, J. Fluoresc., 23, 425-437, 2013.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、９ＡＡ又はその誘導体は不安定で徐々に分解し、例えば大気中では数十秒で退色するため、その利用が限られている。
【０００７】
そこで本発明は、９ＡＡ又はその誘導体を含み、９ＡＡ又はその誘導体の分解が抑制された蛍光組成物を提供することを目的とする。また、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制剤、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制方法、プロトン性有機化合物の検出剤、及び、プロトン性有機化合物の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の通りである。
（１）９ＡＡ又はその誘導体、及びプロトン性有機化合物を含む、蛍光組成物。
（２）前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸又はアルコールである、（１）に記載の蛍光組成物。
（３）プロトン性有機化合物を有効成分として含有する、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制剤。
（４）前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸又はアルコールである、（３）に記載の分解抑制剤。
（５）９ＡＡ又はその誘導体にプロトン性有機化合物を共存させる工程を含む、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制方法。
（６）前記プロトン性有機化合物は、カルボン酸又はアルコールである、（５）に記載の分解抑制方法。
（７）９ＡＡ又はその誘導体を有効成分として含有する、プロトン性有機化合物の検出剤。
（８）プロトン性有機化合物の検出方法であって、サンプルに、９ＡＡ又はその誘導体を接触させる工程と、前記９ＡＡ又はその誘導体の蛍光を検出する工程と、を含み、前記蛍光の存在がプロトン性有機化合物の存在を示す、検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、９ＡＡ又はその誘導体を含み、９ＡＡ又はその誘導体の分解が抑制された蛍光組成物を提供することができる。また、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制剤、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制方法、プロトン性有機化合物の検出剤、及び、プロトン性有機化合物の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】（ａ）及び（ｂ）は、９−アミノアントラセン及び９−アントリルアンモニウム塩化物の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示すグラフである。（ａ）はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で測定した結果であり、（ｂ）はメタノール中で測定した結果である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、９ＡＡの蛍光を示すデジタル写真である。
【図３】９ＡＡの蛍光を示すデジタル写真である。
【図４】９ＡＡの蛍光を示すデジタル写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［蛍光組成物］
１実施形態において、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体、及びプロトン性有機化合物を含む、蛍光組成物を提供する。後述するように、本実施形態の蛍光組成物中の９ＡＡ又はその誘導体は、分解が抑制されており、長時間（例えば大気中において１日以上）蛍光を発することができる。
【００１２】
（９ＡＡ又はその誘導体）
本実施形態の蛍光組成物において、９ＡＡの誘導体としては、例えば、下記式（２）で表される化合物を利用することができる。式（２）中、Ｒ１は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基である。上記のハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素が挙げられる。
【００１３】
【化２】
2016079191.tif 000003
【００１４】
（プロトン性有機化合物）
発明者らは、本実施形態の蛍光組成物中の９ＡＡ又はその誘導体は、次の機構により長時間蛍光を発することができるものと推測している。すなわち、本実施形態の蛍光組成物中では、９ＡＡ又はその誘導体の９位のアミノ基が、プロトン性有機化合物から供与されたプロトンを受容し、９−アントリルアンモニウム塩又はその誘導体となる。９−アントリルアンモニウム塩又はその誘導体は、逆反応により９ＡＡ又はその誘導体に戻ることができる。９ＡＡ又はその誘導体と、９−アントリルアンモニウム塩又はその誘導体との間で平衡状態が成立している間は、９ＡＡ又はその誘導体の分解が抑制され、長時間蛍光を発することができるものと考えられる。
【００１５】
プロトン性有機化合物がプロトンを供与しやすくなる観点から、本実施形態の蛍光組成物のｐＨは７以下であることが好ましい。本実施形態の蛍光組成物のｐＨは、例えば４〜７程度であってもよい。本実施形態の蛍光組成物は、ｐＨ調整剤として、例えば、リン酸、硫酸等を含有していてもよい。
【００１６】
本実施形態の蛍光組成物において、プロトン性有機化合物としては、カルボン酸又はアルコールを使用することができる。
【００１７】
カルボン酸としては、例えば、酢酸、ラウリン酸等の飽和脂肪酸；フタル酸等の芳香族カルボン酸；シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マレイン酸等のジカルボン酸；クエン酸等のヒドロキシ酸；シアル酸等が挙げられる。カルボン酸としては、これらのうち１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１８】
アルコールとしては、炭素数１〜５の低級アルコール、炭素数６以上の高級アルコール等が挙げられる。低級アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコール等が挙げられる。高級アルコールとしては、例えば、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、オクタデカノール等の飽和アルコール；ドデセノール、トリデセノール、オクタデセノール等の不飽和アルコール；メチルウンデカノール、メチルドデカノール、エチルメチルウンデカノール等の分岐アルコール；ドデカンジオール、トリデカンジオール、テトラデカンジオール、ヘキサデカンジオール等の多価アルコール；ダイマージオール、ノニルシクロヘキサノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール等の環状アルコール等が挙げられる。アルコールとしては、これらのうち１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００１９】
本実施形態の蛍光組成物における、９ＡＡ又はその誘導体、及びプロトン性有機化合物の含有量は、本発明の効果が得られる限り特に制限はなく、適宜設定することができる。
【００２０】
本実施形態の蛍光組成物は液体状態で使用してもよく、試料に塗布する等して大気中で使用してもよい。
【００２１】
液体状態で使用する例として、例えば、９ＡＡをメタノール又はエタノール中に溶解させると、２週間以上蛍光を維持することができる場合がある。ここで、９ＡＡの退色を長時間抑制するためには、蛍光組成物における９ＡＡの濃度を、例えば１０−３ｍｏｌ／Ｌ以上に高めること、蛍光組成物を冷暗所で保存すること等も有効である。
【００２２】
一方、大気中で使用する場合には、プロトン性有機化合物が蒸発してしまうと、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制効果を十分に発揮することができない。そこで、プロトン性有機化合物として、大気中で蒸発しにくいものを用いることが好ましい。大気中で蒸発しにくいプロトン性有機化合物としては、上述したカルボン酸又はアルコールのうち、例えば炭素数が１０以上であるものが挙げられる。
【００２３】
例えば、大気中で使用する例として、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上に９ＡＡをスポットした場合、９ＡＡ単独では数十秒で蛍光を発しなくなるのに対し、プロトン性有機化合物との共存下では、１日以上蛍光を維持することができる。
【００２４】
［分解抑制剤］
１実施形態において、本発明は、プロトン性有機化合物を有効成分として含有する、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制剤を提供する。９ＡＡの誘導体としては、上述したものと同様の化合物が挙げられる。
【００２５】
上述したように、プロトン性有機化合物は、９ＡＡ又はその誘導体の９位のアミノ基にプロトンを供与し、９−アントリルアンモニウム塩又はその誘導体を形成させる。その結果、９ＡＡ又はその誘導体と、９−アントリルアンモニウム塩又はその誘導体との間で平衡状態を成立させ、９ＡＡ又はその誘導体の分解を抑制することができる。
【００２６】
本実施形態の分解抑制剤において、プロトン性有機化合物としては、カルボン酸又はアルコールを用いることができる。カルボン酸又はアルコールとしては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００２７】
本実施形態の分解抑制剤は、液体状態で使用してもよく、大気中で使用してもよい。大気中で使用する場合には、プロトン性有機化合物が蒸発してしまうと、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制効果を十分に発揮することができない。そこで、プロトン性有機化合物として、大気中で蒸発しにくいものを用いることが好ましい。大気中で蒸発しにくいプロトン性有機化合物としては、上述したカルボン酸又はアルコールのうち、例えば炭素数が１０以上であるものが挙げられる。
【００２８】
［分解抑制方法］
１実施形態において、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体にプロトン性有機化合物を共存させる工程を含む、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制方法を提供する。
【００２９】
本実施形態の分解抑制方法によれば、９ＡＡ又はその誘導体の分解を抑制し、９ＡＡ又はその誘導体の蛍光を長寿命化することができる。９ＡＡの誘導体としては、上述したものと同様の化合物が挙げられる。
【００３０】
本実施形態の分解抑制方法において、プロトン性有機化合物としては、カルボン酸又はアルコールを用いることができる。カルボン酸又はアルコールとしては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００３１】
本実施形態の分解抑制方法は、液体中でも大気中でも実施することができる。液体中で実施する場合には、例えば、９ＡＡ又はその誘導体の溶液中にプロトン性有機化合物を添加して共存させればよい。
【００３２】
また、大気中で実施する場合、例えば、次のような方法が例示できる。一例として、固相上に塗布した９ＡＡ又はその誘導体の分解を抑制する方法について説明する。固相としては、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等が挙げられる。
【００３３】
まず、固相上にプロトン性有機化合物を塗布する。続いて、プロトン性有機化合物と接触するように９ＡＡ又はその誘導体を塗布する。これにより、９ＡＡ又はその誘導体の分解を抑制することができる。ここで、固相上に９ＡＡ又はその誘導体を塗布した後に、９ＡＡ又はその誘導体と接触するようにプロトン性有機化合物を塗布してもよい。しかしながら、この場合、９ＡＡ又はその誘導体は、大気中において数十秒で分解してしまうことから、分解してしまう前にプロトン性有機化合物を塗布する必要がある。
【００３４】
［プロトン性有機化合物の検出剤］
１実施形態において、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体を有効成分として含有する、プロトン性有機化合物の検出剤を提供する。９ＡＡの誘導体としては、上述したものと同様の化合物が挙げられる。
【００３５】
上述したように、９ＡＡ又はその誘導体は速やかに分解し退色してしまう。ところが、プロトン性有機化合物と共存した９ＡＡ又はその誘導体は、その分解が抑制され、長時間蛍光を発することができる。
【００３６】
したがって、サンプルを９ＡＡ又はその誘導体と共存させた場合、プロトン性有機化合物の周辺に存在する９ＡＡ又はその誘導体は、その分解が抑制され、長時間蛍光を発することができる。すなわち、蛍光の存在は、プロトン性有機化合物の存在を示す。そこで、９ＡＡ又はその誘導体は、プロトン性有機化合物の検出剤として使用することができる。サンプルは、液体であっても固体であってもよい。固体サンプルとしては、例えば、ＴＬＣ上に展開された化合物のサンプル、生体組織サンプル等が挙げられる。生体組織サンプルとしては、例えば、スライドグラス上の培養細胞、組織切片等が挙げられる。
【００３７】
本実施形態の検出剤は、低級アルコール溶液又は水溶液の形態であってもよい。
【００３８】
［プロトン性有機化合物の検出方法］
１実施形態において、本発明は、プロトン性有機化合物の検出方法であって、サンプルに、９ＡＡ又はその誘導体を接触させる工程と、前記９ＡＡ又はその誘導体の蛍光を検出する工程と、を含み、前記蛍光の存在がプロトン性有機化合物の存在を示す、検出方法を提供する。９ＡＡの誘導体としては、上述したものと同様の化合物が挙げられる。サンプルは、液体であっても固体であってもよい。固体サンプルとしては、例えば、ＴＬＣ上に展開された化合物のサンプル、生体組織サンプル等が挙げられる。生体組織サンプルとしては、例えば、スライドグラス上の培養細胞、組織切片等が挙げられる。
【００３９】
例えば、低級アルコール溶液又は水溶液の形態の９ＡＡ又はその誘導体をサンプルに接触させ、数分から数時間経過した後、９ＡＡ又はその誘導体の蛍光を検出するとよい。９ＡＡは、波長約４４０ｎｍの励起光を照射すると、波長約５１０ｎｍの蛍光を発する。９ＡＡの励起は波長約３６５ｎｍの紫外線でも行うことができる。
【００４０】
プロトン性有機化合物の非存在下では、９ＡＡ又はその誘導体は速やかに分解し、蛍光を発しなくなる。このため、本実施形態の検出方法により蛍光が検出された場合、プロトン性有機化合物が存在することを意味する。すなわち、本実施形態の検出方法により蛍光が検出された領域には、プロトン性有機化合物が存在する。いいかえると、本実施形態の検出方法により、ｐＨ７未満の領域を検出することができるともいえる。
【００４１】
癌細胞の周辺には、シアル酸等のプロトン性有機化合物が多く存在するといわれている。したがって、本実施形態の検出方法により、生体組織サンプル中のプロトン性有機化合物を検出することにより、癌細胞を検出できる可能性が考えられる。
【実施例】
【００４２】
次に、実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００４３】
［実験例１］
（９ＡＡ及びその誘導体の蛍光特性の検討）
９ＡＡ及び９−アントリルアンモニウム塩化物（９ＡＡＣ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及びメタノールにそれぞれ１．０×１０−４ｍｏｌ／Ｌの濃度で溶解した。続いて、ＤＭＳＯ溶液及びメタノール溶液の作成後３０分〜１時間の間に、室温で、各化合物の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。
【００４４】
図１（ａ）及び（ｂ）は、各化合物の励起スペクトル及び蛍光スペクトルを示すグラフである。図１中、「９ＡＡ」は９−アミノアントラセンを表し、「９ＡＡＣ」は９−アントリルアンモニウム塩化物を表す。図１（ａ）はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で測定した結果であり、図１（ｂ）はメタノール中で測定した結果である。
【００４５】
その結果、９ＡＡと９ＡＡＣは、ＤＭＳＯ中において同一の吸収波長と放出波長を示し、いずれも極大波長４４０ｎｍの光を吸収し、極大波長５１０ｎｍの緑色蛍光を発した。また、９ＡＡと９ＡＡＣは、メタノール中においても同一の吸収波長と放出波長を示し、いずれも極大波長４２０ｎｍの光を吸収し、極大波長５０３ｎｍの緑色蛍光を発した。
【００４６】
この結果から、９ＡＡと９ＡＡＣは溶液中において平衡状態にあり、９ＡＡＣが緑色蛍光を発する原因は９ＡＡとの平衡に由来することが示された。
【００４７】
［実験例２］
（９ＡＡの蛍光寿命の検討１）
シリカゲルＴＬＣ上に、１．０μｇ／μＬのシアル酸、１．０μｇ／μＬ及び３．０μｇ／μＬの３’−シアリルラクトース、１．０μｇ／μＬのラウリン酸、１．０μｇ／μＬのラウリン酸メチルをそれぞれ２．０μＬずつスポットした。続いて、上記の各スポットの上、及び上記の各スポットとは異なる位置に１．０μｇ／μＬの９ＡＡをそれぞれ２．０μＬずつスポットした。続いて、１日放置した後、波長約３６５ｎｍの紫外線ランプを用いて紫外線を照射し、９ＡＡの蛍光を観察した。
【００４８】
図２（ａ）〜（ｃ）は、９ＡＡの蛍光を示すデジタル写真である。図２（ａ）の上段左及び上段右のスポットは、９ＡＡのみをスポットした結果である。図２（ａ）の下段左のスポットは、シアル酸及び９ＡＡをスポットした結果である。図２（ａ）の下段右のスポットは、３’−シアリルラクトース及び９ＡＡをスポットした結果である。図２（ｂ）の上段左及び上段右のスポットは、９ＡＡのみをスポットした結果である。図２（ｂ）の下段左のスポットは、３’−シアリルラクトース（図２（ａ）の３倍濃度）及び９ＡＡをスポットした結果である。図２（ｂ）の下段右のスポットは、ラウリン酸及び９ＡＡをスポットした結果である。図２（ｃ）の上段左のスポットは、図２（ｂ）の上段右と同一のスポットである。図２（ｃ）の上段右のスポットは、９ＡＡのみをスポットした結果である。図２（ｃ）の下段左のスポットは、図２（ｂ）の下段右と同一のスポットである。図２（ｃ）の下段右のスポットは、ラウリン酸メチル及び９ＡＡをスポットした結果である。
【００４９】
９ＡＡのみのスポットと比較して、シアル酸、３’−シアリルラクトース、ラウリン酸及びラウリン酸メチルの共存下では、９ＡＡの蛍光が強いことが示された。この結果は、シアル酸、３’−シアリルラクトース、ラウリン酸、ラウリン酸メチルが９ＡＡの分解を抑制したことを示す。
【００５０】
また、ラウリン酸とラウリン酸メチルの共存下では、ラウリン酸の共存下の方が９ＡＡの蛍光が強いことが示された。また、３’−シアリルラクトースの共存下では、３’−シアリルラクトースの濃度が高い方が、９ＡＡの蛍光が強いことが示された。
【００５１】
［実験例３］
（９ＡＡの蛍光寿命の検討２）
シリカゲルＴＬＣ上に、１．０、２．０、３．０、４．０及び５．０μｇ／μＬの３’−シアリルラクトースをそれぞれ２．０μＬずつスポットした。続いて、上記の各スポットの上に１．０μｇ／μＬの９ＡＡをそれぞれ２．０μＬずつスポットした。続いて、１日放置した後、波長約３６５ｎｍの紫外線ランプを用いて紫外線を照射し、９ＡＡの蛍光を観察した。
【００５２】
図３は、９ＡＡの蛍光を示すデジタル写真である。図３中、左から右に向かって、３’−シアリルラクトースの濃度が高くなっている。その結果、共存するシアリルラクトースが高濃度であるほど、９ＡＡの分解抑制効果が高いことが示された。
【００５３】
この結果は、９ＡＡが３’−シアリルラクトースにより９ＡＡＣとなり、ＴＬＣ上で安定に存在し、９ＡＡＣは９ＡＡと平衡にあることで緑色蛍光を発し続けることを示す。
【００５４】
［実験例４］
（９ＡＡの蛍光寿命の検討３）
シリカゲルＴＬＣ上に、１．０、２．０、３．０、４．０及び５．０μｇ／μＬのテトラデカノールをそれぞれ２．０μＬずつスポットした。続いて、上記の各スポットの上に１．０μｇ／μＬの９ＡＡをそれぞれ２．０μＬずつスポットした。続いて、１日放置した後、波長約３６５ｎｍの紫外線ランプを用いて紫外線を照射し、９ＡＡの蛍光を観察した。
【００５５】
図４は、９ＡＡの蛍光を示すデジタル写真である。図４中、左から右に向かって、テトラデカノールの濃度が高くなっている。その結果、共存するテトラデカノールが高濃度であるほど、９ＡＡの分解抑制効果が高いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明によれば、９ＡＡ又はその誘導体を含み、９ＡＡ又はその誘導体の分解が抑制された蛍光組成物を提供することができる。また、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制剤、９ＡＡ又はその誘導体の分解抑制方法、プロトン性有機化合物の染色剤、及び、プロトン性有機化合物の検出方法を提供することができる。
【図１】
2016079191.tif 000004
【図２】
2016079191.tif 000005
【図３】
2016079191.tif 000006
【図４】
2016079191.tif 000007