(57)【要約】【課題】  動物の血糖値を低下させるための手段の提供。【解決手段】（ａ）胚体内胚葉細胞集団の膵臓内胚葉細胞集団への分化工程、及び（ｂ）ＤＭＥＭ−高グルコース培地中での膵臓内胚葉細胞集団の膵内分泌前駆細胞集団への分化工程により得られ、かつ、動物に移植されるべきものである膵内分泌前駆細胞集団。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の血糖値を低下させるための医薬を製造する際の膵内分泌前駆細胞集団の使用であって、該膵内分泌前駆細胞集団が
（ａ）胚体内胚葉細胞集団の膵臓内胚葉細胞集団への分化工程、及び
（ｂ）ＤＭＥＭ−高グルコース培地中での膵臓内胚葉細胞集団の膵内分泌前駆細胞集団への分化工程
により得られ、かつ、
前記膵内分泌前駆細胞集団が動物に移植されるべきものである、
前記使用。
【請求項２】
ＤＭＥＭ−高グルコース培地がＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＤＭＥＭ−高グルコース培地が外因性レチオノイドを補充されている、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
請求項１に記載の使用であって、膵臓内胚葉細胞集団の膵内分泌前駆細胞集団への分化工程が、
膵臓内胚葉細胞を、ＦＧＦ７、レチノイン酸、ＢＭＰを阻害できる因子及びソニックヘッジホッグシグナリング阻害剤の補足されたＤＭＥＭ高グルコース培地で培養する工程、並びに
工程（ｉ）の細胞を、ＢＭＰを阻害できる因子及びＴＧＦ−β受容体阻害剤の補足されたＤＭＥＭ高グルコース培地で培養する工程
を含む使用。
【請求項５】
ＢＭＰを阻害できる因子がノギンである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ソニックヘッジホッグシグナリング阻害剤がシクロパミン−ＫＡＡＤである、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ５阻害剤ＩＩである、請求項２〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
膵内分泌前駆細胞が、ＤＭＥＭ低グルコース、ＣＭＲＬ及びＤＭ−Ｆ１２において分化された細胞に比べ、ＮＫＸ６．１、ＰＦＴ１及びＮＧＮ−３の増大した発現を示す、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
膵内分泌前駆細胞が、ＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１を発現するが、ＣＤＸ２は発現しない、請求項１〜８のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
胚体内胚葉細胞集団のＮＫＸ６．１及びＰＤＸ１を発現するが、ＣＤＸ２は発現しない膵内分泌前駆細胞集団への分化方法であって、
（ａ）胚体内胚葉細胞集団の膵臓内胚葉細胞集団への分化工程、
（ｂ）膵臓内胚葉細胞集団の膵内分泌前駆細胞へのＤＭＥＭ−高グルコース培地での分化工程
含み、かつ、膵内分泌前駆細胞がイン・ビボで動物に移植されたとき、さらに分化できる、前記方法。
【請求項１１】
ＤＭＥＭ−高グルコース培地がＴＧＦ−β受容体阻害剤を含む、請求項１０に記載の方
法。
【請求項１２】
ＤＭＥＭ−高グルコース培地が外因性レチノイドで補足されている、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）が、膵臓内胚葉細胞を、ＦＧＦ７、レチノイン酸、ＢＭＰを阻害できる因子及びソニックヘッジホッグシグナリング阻害剤の補足されたＤＭＥＭ高グルコース培地で培養する工程、並びに工程（ｉ）の細胞を、ＢＭＰを阻害できる因子及びＴＧＦ−β受容体阻害剤の補足されたＤＭＥＭ高グルコース培地で培養する工程を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ＢＭＰを阻害できる因子がノギンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ソニックヘッジホッグシグナリング阻害剤がシクロパミン−ＫＡＡＤである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＧＦ−β受容体阻害剤がＡｌｋ５阻害剤ＩＩである、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
膵内分泌前駆細胞が、ＤＭＥＭ低グルコース、ＣＭＲＬ及びＤＭ−Ｆ１２において分化された細胞に比べ、ＮＫＸ６．１、ＰＦＴ１及びＮＧＮ−３の増大した発現を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）が、ベータセルリン及びＴＧＦ−β受容体阻害剤をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
ＤＭＥＭ−高グルコース培地を用いる膵内分泌前駆細胞集団のインスリン発現細胞集団への分化工程をさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
血中グルコース濃度を低下するための医薬の製造おける、請求項１０〜１９のいずれかに記載の方法で得られた細胞集団の使用であって、該集団が移植されるためのものである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵内分泌前駆細胞集団を動物に移植することにより、動物の血糖値を低下させる方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞すなわちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法は、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することである。
【０００３】
脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにより３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓などの組織は、内胚葉から中間ステージを経て発達する。このプロセスにおける中間ステージは、胚体内胚葉（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）の形成である。胚体内胚葉細胞は、例えばＨＮＦ３β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７などの多くのマーカーを発現する。
【０００４】
膵臓の形成は、胚体内胚葉が膵臓内胚葉へと分化することにより生じる。膵臓内胚葉の細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成より先に発達が進行しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程として特徴付けられる。成熟した膵臓は、他の細胞型間で外分泌組織及び内分泌組織を含有する。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。
【０００５】
島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら）は、膵島と同様のインスリン分泌構造へのマウスの胚性幹細胞の分化を報告している（非特許文献１）。Ｓｏｒｉａらは、ストレプトゾトシン誘発糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が血糖を正常化することを報告している（非特許文献２）。
【０００６】
一例において、Ｈｏｒｉらは、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している（非特許文献３）。
【０００７】
他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋらが、Ｐａｘ４を構成的に発現しているマウス胚性幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している（非特許文献４）。
【０００８】
Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚性幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を制御できることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に該当する期間中、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、ＰＤＸ１発現の誘導に最も効果的である（非特許文献５）。
【０００９】
Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現しているマウス胚性幹細胞株を報告している。Ｍｉｙａｚａｋｉらの研究結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、Ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨＮＦ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（非特許文献６）。
【００１０】
Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ  βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大の効果は、１ｎＭアクチビンＡを使用した場合に認められた。Ｓｋｏｕｄｙらはまた、インスリン及びＰｄｘ１  ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸により影響されなかったが、３ｎＭのＦＧＦ７による処理によりＰｄｘ１の転写レベルが増加したことも観察している（非特許文献７）。
【００１１】
Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＰＤＸ１陽性細胞への胚性幹細胞の分化を特異的に増加させる増殖因子の効果を研究した。Ｓｈｉｒａｋｉらは、ＴＧＦ  β２によってＰＤＸ１陽性細胞がより高い比率で再現性よく得られたことを観察している（非特許文献８）。
【００１２】
Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ−３  β［陽性］内胚葉細胞への誘導を示した（特許文献１）。
【００１３】
Ｇｏｒｄｏｎらは、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている（非特許文献９）。
【００１４】
しかしながら、胚性幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒトなどのより高等な哺乳動物における発達プログラムを正確には模倣しない恐れがある。
【００１５】
Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚性幹細胞を単離した（非特許文献１０）。同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児腺組織から、ヒト胚性生殖細胞（ｈＥＧ）株を誘導した（非特許文献１１）。単に白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養すれば分化が阻止され得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（特許文献２、特許文献３、特許文献４）。
【００１６】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（非特許文献１２）。これらの細胞を、マウスの腎臓被膜下に移植することにより、内胚葉性器官の特徴の一部を有するより成熟した細胞への分化が得られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（特許文献５）。
【００１７】
Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、「我々は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）を、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンといった膵臓ホルモンを合成可能な内分泌細胞へと転換させる分化プロセスを開発した（非特許文献１３）。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を介して細胞を指向させることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。
【００１８】
別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚性幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（特許文献６）。この場合、分化経路は３つのステージに分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化させた。次に細胞をノギンなどのＴＧＦ  βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンの組み合わせと培養してＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘導した。
【００１９】
一例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、ＰＤＸ１の過剰発現が、膵臓
に多く見られる遺伝子の発現を上昇させたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、ｉｎ  ｖｉｖｏでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（非特許文献１４）。
【００２０】
他の例では、特許文献７は、次の工程ａ）及びｂ）を含む、インスリンを分泌する細胞の製造方法を請求する：ａ）インスリンを生産していない細胞を得る工程；及びｂ）高濃度のグルコースを含有している培地で細胞をインキュベートする工程（この工程で細胞はインスリンを分泌する）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】米国特許第２００６／０００３４４６（Ａ１）号
【特許文献２】米国特許第６，２００，８０６号
【特許文献３】国際公開第９９／２０７４１号
【特許文献４】国際公開第０１／５１６１６号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００５／０２６６５５４（Ａ１）号
【特許文献６】米国特許出願公開第２００６／００４０３８７（Ａ１）号
【特許文献７】米国特許第２００８／０２４１１０７（Ａ１）号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｌｕｍｅｌｓｋｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１３８９，２００１
【非特許文献２】Ｓｏｒｉａら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９：１５７，２０００
【非特許文献３】Ｈｏｒｉら、ＰＮＡＳ  ９９：１６１０５，２００２
【非特許文献４】Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら、ＰＮＡＳ  １００：９９８，２００３
【非特許文献５】Ｍｉｃａｌｌｅｆら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４：３０１，２００５
【非特許文献６】Ｍｉｙａｚａｋｉら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３：１０３０，２００４
【非特許文献７】Ｓｋｏｕｄｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４
【非特許文献８】Ｓｈｉｒａｋｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．２００５  Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６
【非特許文献９】Ｇｏｒｄｏｎら、ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ  １０３，ｐ  １６８０６，２００６
【非特許文献１０】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４，１９９８
【非特許文献１１】Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８
【非特許文献１２】Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００５
【非特許文献１３】Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６）
【非特許文献１４】Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００６；２４：１９２３〜１９３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
したがって、膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞へと分化する可能性を維持する一方で、現在の臨床上の必要性に対処するよう拡張できる、多能性幹細胞株を確立するための条件を開発する有意な必要性が今尚存在する。本発明者らは、膵内分泌細胞に向かうヒト胚幹細胞の分化の効率を改善する代替的な手法を採用した。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
一実施形態では、本発明は、膵内分泌前駆細胞集団を動物に移植することにより、動物
の血糖値を低下させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＮＫＸ６．１（パネルａ）、ＰＤＸ１（パネルｂ）、ＰＴＦ１  α（パネルｃ）及びＮＧＮ３（パネルｄ）の発現に対する、種類の異なる基本培地の効果を示す。ステージ４の３日目に、リアルタイムＰＣＲ解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子についての誘導倍率をＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養した場合と比較して表す。
【図２】膵臓マーカーＰＤＸ１（パネルａ及びｂ）、ＮＫＸ６．１（パネルｃ及びｄ）、ＣＤＸ２（パネルｅ及びｆ）及びＮＧＮ３（パネルｇ及びｈ）についての、実施例１に記載のように処理したステージ４の３日目のＤＭＥＭ／Ｆ１２処理細胞（パネルａ、ｃ、ｅ及びｇ）及びＤＭＥＭ（高グルコース）処理細胞（パネルｂ、ｄ、ｆ及びｈ）の免疫蛍光顕微鏡画像を示す。
【図３】実施例２に記載の方法に従って処理した細胞サンプル由来のＰＤＸ１（パネルａ）、ＮＫＸ６．１（パネルｂ）、ＰＴＦ１  α（パネルｃ）、ＮＧＮ３（パネルｄ）、ＰＡＸ４（パネルｅ）及びＮＫＸ２．２（パネルｆ）の発現を示す。記載の時期に、リアルタイムＰＣＲ解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子についての誘導倍率を、ステージ３の１日目での遺伝子発現と比較して表す。
【図４】実施例２に記載の方法に従って処理した細胞の、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＭＡＦＢ及びＮＥＵＲＯＤ発現を示す。リアルタイムＰＣＲ解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子についての誘導倍率を、ステージ３の４日目での遺伝子発現と比較して表す。明るい灰色のバーは、ステージ３の４日目に採取した細胞群由来のサンプルから得たデータを表す。濃い灰色のバーは、ステージ４の３日目に採取した細胞群由来のサンプルから得たデータを表す。黒いバーは、ステージ５の５日目に採取した細胞群由来のサンプルから得たデータを表す。
【図５】パネルａは、実施例３に記載の方法に従って処理した細胞の、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ、及びＰＴＦ１  α発現を示す。ステージ４の３日目に、リアルタイムＰＣＲ解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子についての誘導倍率を、ステージ４の３日目の処理群１の遺伝子発現と比較して表す。明るい灰色のバーは、Ｔ１（処理１）群から採取した細胞群由来のサンプルから得たデータを示す。白色のバーは、Ｔ２（処理２）群から採取した細胞群由来のサンプルから得たデータを示す。濃い灰色のバーは、Ｔ３（処理３）群から採取した細胞群由来のサンプルから得たデータを示す。黒色のバーは、Ｔ４（処理４）群から採取した細胞群由来のサンプルから得たデータを示す。パネルｂは、実施例３に記載の方法に従って処理した細胞のインスリン発現を示す。ステージ４の３日目（Ｓ４，Ｄ３）及びステージ４の８日目に（Ｓ４，Ｄ８）、リアルタイムＰＣＲ解析用に二つ組サンプルを回収した。プロットは、各遺伝子についての誘導倍率を、ステージ４の３日目の処理群１（Ｔ１）の遺伝子発現と比較して表す。
【図６】グルコース刺激による、移植内分泌前駆細胞からのヒトＣペプチドの放出動態を示す。グルコース投与の６０分後のヒトＣペプチドレベル（ｙ軸）を具体的に示す。ｘ軸は動物数及び移植後日数を示す。
【図７】グルコース刺激による、移植内分泌前駆細胞からのヒトＣペプチドの放出動態を示す。グルコース投与の６０分後のヒトＣペプチドレベル（ｙ軸）（パネルａ）並びにグルコース投与前及び後のヒトＣペプチドレベル（パネルｂ）を具体的に示す。ｘ軸は動物数及び移植後日数を示す。
【図８】グルコース刺激による、移植内分泌前駆細胞からのヒトＣペプチドの放出動態を示す。グルコース投与の６０分後のヒトＣペプチドレベル（ｙ軸）を具体的に示す。ｘ軸は動物数及び移植後日数を示す。
【図９】グルコース刺激による、移植内分泌前駆細胞からのヒトＣペプチドの放出動態を示す。グルコース投与の６０分後のヒトＣペプチドレベル（ｙ軸）（パネルａ）並びにグルコース投与前及び後のヒトＣペプチドレベル（パネルｂ）を具体的に示す。ｘ軸は動物数及び移植後日数を示す。
【図１０】グルコース刺激による、移植内分泌前駆細胞からのヒトＣペプチドの放出動態を示す。グルコース投与の６０分後のヒトＣペプチドレベル（ｙ軸）（パネルａ）並びにグルコース投与前及び後のヒトＣペプチドレベル（パネルｂ）を具体的に示す。ｘ軸は動物数及び移植後日数を示す。
【図１１】移植３週間後の移植サンプルの形態解析及び細胞へと分化させる工程を示す。連続切片由来の顕微鏡写真を、ａ）ヒト核抗原及びＤＡＰＩについて；ｂ）ＣＫ１９及びＰＤＸ１について染色して示す。
【図１２】移植後３週（パネルａ）、１０週（パネルｂ）及び１３週（パネルｃ）経過時点でインスリン及びグルカゴンについて染色した移植サンプルの形態解析及び免疫蛍光解析を示す。パネルｄは、移植後１３週経過時点でＰＤＸ１及びインスリンについて染色した移植サンプルの形態解析及び免疫蛍光解析を示す。パネルｅは、移植後１３週経過時点でＮＥＵＲＯＤ１及びインスリンについて染色した移植サンプルの形態解析及び免疫蛍光解析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
開示を明確にするために、本発明の「発明を実施するための形態」を、限定を目的とすることなく、本発明の特定の特徴、実施形態又は応用を説明若しくは図示した以下の小項目に分ける。
【００２７】
定義
幹細胞は、単一の細胞レベルにて自己複製し、分化して後代細胞を生成する、それら両方の能力で定義される未分化細胞であり、後代細胞としては、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が挙げられる。幹細胞はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後、全部ではないとしてもほとんどの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。
【００２８】
幹細胞は、発生上の能力によって、（１）全ての胚性及び胚体外細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化全能性、（２）全ての胚性細胞のタイプを生ずる能力を有することを意味する、分化万能性、（３）細胞系のサブセットを生ずる能力を有するが、それらが全て特定の組織、臓器、又は生理学的システムのものであるような、分化多能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生性）、血球限定的寡能性前駆細胞、及び血液の通常の成分である全ての細胞種及び要素（例えば、血小板）を生じ得る）、（４）多能性幹細胞よりも限定された細胞系のサブセットを生ずる能力を有することを意味する、分化寡能性、及び（５）単一の細胞系（例えば、精原幹細胞）を生ずる能力を有することを意味する、分化単能性に分類される。
【００２９】
分化は、特殊化していない（「中立の」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化した、又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化した（「傾倒した」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「傾倒した」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、通常の環境下で異なる細胞型に分化し、又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は傾倒して）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用するとき、細胞系は、細胞の遺伝、すなわちその細胞がどの細胞から来たか、またどの細胞を生じ得るかを規定する。細胞系は、細胞を発達及び分化の遺伝的スキーム内に配置する。系特異的なマーカーは、対象とする系の細胞の表現型に特異的に関連した特徴を指し、中立細胞の対象とする系への分化を評価する際に使用することができる。
【００３０】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」、又は「ステージ１細胞」、又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、すなわち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ−３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞」とは、以下のマーカー、すなわち、ＰＤＸ１、ＨＮＦ−１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、又はＨＢ９のうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。
【００３２】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞」は、以下のマーカー、すなわち、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＭＡＦＢ、インスリン、グルカゴン又はソマトスタチンのうちの少なくとも１つを発現している細胞を指す。膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞としては、膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ−細胞系の細胞が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカー：ＨＮＦ３  β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、ケルベロス、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１を発現する。
【００３４】
本明細書で使用するとき、「マーカー」とは、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。本文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーの発現レベルの上昇、及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。検出可能なレベルのマーカー核酸又はポリペプチドは、他の細胞と比較して対象とする細胞内で十分高く又は低く、そのため当該技術分野において既知の多様な方法のいずれかを使用して、対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することができる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。
【００３６】
本明細書で使用するとき、「膵内分泌前駆細胞」は、ＮＧＮ３を発現し、かつ内分泌系の細胞（限定するものではないが膵島ホルモン発現細胞が挙げられる）へと更に分化し得る胚体内胚葉系の多能性細胞を指す。比較した場合に、内分泌前駆細胞は、より未分化の胚体内胚葉系細胞（ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞など）程多くの異なる細胞、組織及び／又は器官型へと分化することはできない。
【００３７】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン産生細胞」は、以下のホルモン、すなわち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを産生することができる細胞を指す。
【００３８】
本明細書で使用するとき、「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモン、すなわちイ
ンスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを分泌することが可能な細胞を指して言う。
【００３９】
多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体によって検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現している（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が減少し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が上昇する。未分化の多能性幹細胞は通常アルカリホスファターゼ活性を有し、これは、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  Ｃａｌｉｆ．））によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒＲｅｄを基質として現像することによって検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲで検出されるように、典型的にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴも発現している。
【００４０】
別の望ましい表現型の、増殖させた多能性幹細胞は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３胚葉の全ての細胞に分化し得る。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、形成される奇形腫を４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでこれを３つの胚細胞層由来の細胞種の根拠について組織学的に調べることによって確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成させ、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。
【００４１】
増殖した多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用して核型を決定することができ、確立された対応する霊長類種の核型と比較される。「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは細胞が正倍数体であり、全ヒト染色体が存在し、かつ著しく変更されてはいないことを意味する。
【００４２】
多能性幹細胞源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織、胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の株化細胞系が挙げられる。非限定的な例は、例えばヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株である。それらの細胞の最初の樹立又は安定化中に本開示の組成物を使用することも想定され、その場合、供給源となる細胞は、供給源となる組織から直接採取した一次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ、Ａｔｈｅｎｓ、ＧＡ）などの変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。
【００４３】
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞はＴｈｏｍｓｏｎらにより説明されているように調製される（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３  ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）。
【００４４】
多能性幹細胞の培養
一実施形態では、多能性幹細胞は、典型的にはフィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。あるいは、多能性幹細胞を、フィーダー細胞を本質的に含まないにも関わらず、細胞を実質的に分化させることなく多
能性幹細胞の増殖を支持するような培養システム中で培養する。フィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の、分化を伴わない増殖は、あらかじめ他の細胞種を培養することにより馴化培地を使用して支持される。あるいはフィーダー細胞不含培養における多能性幹細胞の分化を伴わない増殖は、合成培地を使用して支持される。
【００４５】
例えば、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：３９９〜４０４（２０００））及びＴｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚線維芽細胞層（フィーダー細胞層）を用いる、ヒト線維芽細胞由来多能性幹細胞株の培養法を開示している。
【００４６】
Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２１：５４６〜５５６，２００３）は、１１種類の異なるヒト成人、胎児、及び新生児フィーダー細胞層についてヒト多能性幹細胞の培養を支持する能力の評価を行っている。Ｒｉｃｈａｒｄｓらは、「成人の皮膚線維芽フィーダー細胞上で培養したヒト胚性幹細胞系は、ヒト胚性幹細胞の形態を有し、多能性を維持する」と述べている。
【００４７】
米国特許出願公開第２００２００７２１１７号は、フィーダー不含細胞培養中に霊長類の多能性幹細胞の増殖を支持する培地を生成する細胞系を開示している。使用される細胞系は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系である。米国特許出願公開第２００２００７２１１７号はまた、この細胞系の１次フィーダー細胞層としての使用を開示している。
【００４８】
別の例として、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：１２２１〜１２２７，２００５）は、ヒト胚性幹細胞由来のフィーダー細胞層上でヒト多能性幹細胞を長期にわたって増殖させるための方法を開示している。
【００４９】
別の例として、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００５  ２３：３０６〜３１４，２００５）は、ヒト胚性幹細胞の自然分化により誘導されたフィーダー細胞システムを開示している。
【００５０】
更なる別の例として、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：４３３〜４４０，２００４）は、ヒトの胎盤から得られたフィーダー細胞の供給源を開示している。
【００５１】
Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ  ６８：２１５０〜２１５６，２００３）は、ヒト包皮に由来するフィーダー細胞層を開示している。
【００５２】
別の例として、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３：５４４〜５４９，２００５）は、ヒトの出生直後産児の包皮線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。
【００５３】
米国特許第６６４２０４８号は、フィーダー不含細胞培養中での霊長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を支持する培地、及びこうした培地の製造に有用な細胞系を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明は、胚性組織から得られるかあるいは胚性幹細胞から分化した間葉系かつ線維芽細胞様の細胞系を含む。本開示では、こうした細胞系を誘導し、培地を調整し、この馴化培地を用いて幹細胞を増殖させるための方法を説明及び図示する」と述べている。
【００５４】
別の例として、国際公開第２００５０１４７９９号は、哺乳動物細胞の維持、増殖及び分化のための馴化培地を開示している。国際公開特許第２００５０１４７９９号は、「本
発明に基づいて製造される培地は、マウス細胞、特にＭＭＨ（Ｍｅｔマウス肝細胞）と称される分化及び不死化したトランスジェニック肝細胞の細胞分泌活性によって馴化される」と述べている。
【００５５】
別の例として、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２２：９７２〜９８０，２００４）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子改変されたヒト胚性幹細胞由来細胞から得られた馴化培地を開示している。
【００５６】
別の例において、米国特許出願公開第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞を維持するための合成培地を開示している。
【００５７】
代替的な培養システムでは、胚性幹細胞の増殖を促進することが可能な増殖因子を添加した無血清培地を使用している。例えば、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ  ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ  １９，２００５）は、胚性幹細胞の自己再生を誘導することが可能な異なる増殖因子を添加した非馴化血清補充（ＳＲ）培地中に胚性幹細胞が維持された、フィーダー細胞不含でかつ無血清の培養システムを開示している。
【００５８】
別の例において、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２４：５６８〜５７４，２００６）は、線維芽細胞又は馴化培地の非存在下で、ｂＦＧＦを添加した培地を使用して、胚幹細胞を長期間培養する方法を開示している。
【００５９】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０１４８０７０号は、無血清でかつ線維芽細胞フィーダー細胞不含の合成培地でのヒト胚幹細胞の培養方法を開示する。この方法は、幹細胞を、アルブミン、アミノ酸、ビタミン、無機物、少なくとも１つのトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１つのインスリン又はインスリン代替物を含有し、哺乳動物胎児血清は本質的に不含であり、線維芽細胞増殖因子シグナル伝達受容体を活性化できる少なくとも約１００ｎｇ／ｍＬの線維芽細胞増殖因子を含有している培地中で培養することを含み、この方法において、増殖因子は線維芽細胞フィーダー層のみだけでなく他の供給源からも供給され、培地は、フィーダー細胞又は馴化培地を用いられずとも、未分化状態の幹細胞の増殖を支持した。
【００６０】
別の例において、米国特許出願公開第２００５０２３３４４６号は、未分化の霊長類始原幹細胞などの幹細胞の培養に有用な合成培地を開示している。溶液において、培地は、培養されている幹細胞と比較して実質的に等張である。所定の培養において、特定の培地は、基本培地と、実質的に未分化の始原幹細胞の増殖の支持に必要な、ある量のｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の各々とを含有する。
【００６１】
別の例として、米国特許第６８００４８０号は、「一実施形態では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を増殖させるための細胞培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な低浸透圧、低エンドトキシンの基本培地を含む細胞培地を提供する。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を支持する上で効果的な栄養素血清、並びにフィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導される細胞外支持体成分からなる群から選択される支持体と組み合わされる。培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化剤、並びにヌクレオシド及びピルビン酸塩からなる群から選択される第１の増殖因子を含む。」と述べている。
【００６２】
別の例では、米国特許出願公開第２００５０２４４９６２号は、「一態様では、本発明は、霊長類の胚性幹細胞を培養する方法を提供する」と記述している。１つの方法は、哺乳動物の胎児血清を本質的に含まない（好ましくはあらゆる動物の血清をも本質的に含ま
ない）培地中で、線維芽フィーダー細胞層以外の供給源から供給される線維芽細胞増殖因子の存在下で、幹細胞を培養する。好ましい形態では、十分な量の線維芽増殖因子を添加することによって、幹細胞の培養を維持するために従来必要とされていた線維芽フィーダー細胞層の必要性がなくなる。
【００６３】
更なる例として、国際特許出願公開第２００５０６５３５４号は、本質的にフィーダー不含細胞でかつ無血清の合成等張培地であって、ａ．基本培地、ｂ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で十分な量のｂＦＧＦ、ｃ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で十分な量のインスリン、及びｄ．実質的に未分化の哺乳動物幹細胞の増殖を支持する上で十分な量のアスコルビン酸、を含む培地を開示している。
【００６４】
別の例として、国際公開第２００５０８６８４５号は、幹細胞を、細胞を未分化な状態に維持するのに十分な量の、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）ファミリータンパク質のメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリータンパク質のメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、所望の結果を得るのに十分な時間曝露することを含む、未分化の幹細胞を維持するための方法を開示している。
【００６５】
多能性幹細胞は、好適な培養基材上に播くことができる。一実施形態では、好適な培養基材は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るものなどの細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養基材はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ  Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。
【００６６】
他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、代替基材はラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫塩、及び同様物を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。
【００６７】
多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下で、基材上に好適に分布させることで播いてもよい。これら全ての特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから効果が得られ、かつこれら全ての特徴は当業者により容易に決定することができる。
【００６８】
好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ  ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％  ＤＭＥＭ基本培地、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ  ＃１５０３９−０２７；非不可欠アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ  １１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  ＃７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ  ＃１３２５６−０２９などから調製することができる。
【００６９】
膵内分泌前駆細胞の形成
一実施形態では、本発明は、以下の工程ａ〜ｄを含む、膵内分泌前駆細胞の産生方法を提供する：
ａ．多能性幹細胞を培養する工程、
ｂ．多能性幹細胞を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させる工程、
ｄ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、膵内分泌前駆細胞へと分
化させる工程。
【００７０】
本発明での使用に好適な多能性幹細胞としては、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ
ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚性幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ  ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）が挙げられる。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、すなわち、ＡＢＣＧ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０又はＴｒａ  １−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明での使用に適している。
【００７１】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３  β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４  ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現している細胞である。本発明の一態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、原始線条前駆体細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉細胞である。
【００７２】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ１  β、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【００７３】
膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２．２、又はＡＲＸからなる群から選択される。本発明で使用するのに好適な細胞は、膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーを少なくとも１つ発現している細胞である。
【００７４】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
多能性幹細胞は、当該技術分野のいかなる方法、又は本発明で提案されるいかなる方法によって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させてもよい。
【００７５】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７６】
例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３１，１６５１〜１６６２（２００４）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７７】
例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎら、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２５，２９〜３８（２００７）により開示される方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【００７８】
例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示される方法に従って胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００７９】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び血清と培養し、次いで細胞をアクチビンＡ及び異なる濃度の血清と培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の一例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，１５３４〜１５４１（２００５）に開示されている。
【００８０】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いで細胞をアクチビンＡと、別の濃度の血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）に開示されている。
【００８１】
例えば、多能性幹細胞は、アクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地中、血清の非存在下で多能性幹細胞を培養し、次いでＷｎｔリガンドを除去し、細胞をアクチビンＡと、血清の存在下で培養することによって胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【００８２】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８３】
例えば、多能性幹細胞は、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８４】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８５】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８６】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９００号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８７】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８８】
例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願第６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。
【００８９】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の性質決定
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより決定することができる。多能性
幹細胞は、一般にこのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出される。
【００９０】
分化効率は、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより測定することができる。
【００９１】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００１年度版補遺、を参照）、並びに材料切片の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）などの免疫アッセイが含まれる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照）。
【００９２】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば多能性幹細胞マーカーとしては、例えば、以下のもののうちの１つ以上の発現が挙げられる：ＡＢＣＧ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、又はＴｒａ  １−８１。
【００９３】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４などのタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【００９４】
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞からの、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化し得る。
【００９５】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化し得る。
【００９６】
例えば、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理した後、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地を除去し、続いて細胞をレチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含有する培地中で培養することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４，１３９２〜１４０１（２００６）に開示されている。
【００９７】
本発明の一態様では、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７３６，９０８号に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、レ
チノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。
【００９８】
本発明の一態様では、ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願第１１／７７９，３１１号に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞を、レチノイン酸及び少なくとも１種類の線維芽細胞増殖因子で所定の時間処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと更に分化させる。
【００９９】
本発明の一態様では、米国特許出願第６０／９９０，５２９号に記載の方法に従って処理することにより、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化させる。
【０１００】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞の性質決定
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、当業者に周知であり、膵臓内胚葉系の特徴を示す追加のマーカーが、継続して同定されている。これらのマーカーは、本発明に従って処理された細胞が分化して膵臓内胚葉系の特徴を示す性質を獲得したことを確認するために使用され得る。膵臓内胚葉系に特異的なマーカーとしては、例えば、ＨＬＸＢ９、ＰＴＦ−１  α、ＰＤＸ１、ＨＮＦ６、ＨＮＦ−１  βなどの転写因子の１つ以上のものの発現が挙げられる。
【０１０１】
分化効率は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する薬剤（抗体など）に、処理した細胞集団を曝露することにより測定することができる。
【０１０２】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、２００１年度版補遺）を参照）、並びに材料切片の免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、及び無傷細胞中のアクセシブルなマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照）などの免疫アッセイが含まれる。
【０１０３】
膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞からの、膵内分泌前駆細胞の形成
本発明の一態様では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＢＭＰ阻害能を持つ因子及びＴＧＦ−β受容体Ｉキナーゼ阻害剤を添加した培地で膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を培養することにより、膵内分泌前駆細胞に分化する。
【０１０４】
一実施形態では、ＢＭＰ阻害能を持つ因子はノギンである。ノギンは、約１００ｐｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。
【０１０５】
一実施形態では、ＴＧＦ−β受容体Ｉキナーゼ阻害剤はＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）である。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用することができる。一実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは濃度１μＭで使用される。
【０１０６】
一実施形態では、培地は４５００ｍｇ／Ｌのグルコースと１％のＢ２７を含有しているＤＭＥＭである。
【０１０７】
一実施形態では、細胞は培地で４日間にわたって培養される。
【０１０８】
分化効率は、被処理細胞集団を、膵内分泌前駆細胞により発現されたタンパク質マーカーを特異的に認識する剤（例えば抗体）に曝露することにより決定することができる。
【０１０９】
培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準技術である。こうした方法には、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，２００１年度版補遺を参照））、並びに材料切片の免疫組織化学的解析、ウエスタンブロット、及び無傷細胞中の利用可能なマーカーに対する免疫アッセイ、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照）などの免疫アッセイが含まれる。
【０１１０】
多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもののうちの一つ以上の発現が挙げられる：ＡＢＣＧ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ  １−６０、又はＴｒａ  １−８１。
【０１１１】
多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現されるタンパク質マーカー（例えばＣＸＣＲ４など）を特異的に認識する薬剤（抗体など）に曝露することにより、分化した細胞を精製することができる。
【０１１２】
膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＨＮＦ−１  β、ＰＴＦ１  α、ＨＮＦ６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。本発明での使用に好適なものは、膵臓内胚葉系の特徴を示す少なくとも１つのマーカーを発現している細胞である。本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵臓内胚葉細胞である。
【０１１３】
膵内分泌前駆細胞に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６又はＡＲＸからなる群から選択される。
【０１１４】
膵内分泌前駆細胞からの、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞の形成
一実施形態では、本発明の方法により産生した膵内分泌前駆細胞は、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化することができる。
【０１１５】
膵内分泌前駆細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明で提案する任意の方法により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと分化させることができる。
【０１１６】
例えば、本発明の方法に従って得られる、膵内分泌前駆細胞は、エキセンディン４を含有している培地で膵内分泌前駆細胞を培養し、次にエキセンディン４を含有している培地を除去し、エキセンディン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含有している培地で培養すること
により、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１７】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵内分泌前駆細胞は、ＤＡＰＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）及びエキセンディン４を含有している培地で膵内分泌前駆細胞を培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１８】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵内分泌前駆細胞は、エキセンディン４を含有している培地で膵内分泌前駆細胞を培養することにより、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。この方法の例は、Ｄ’Ａｍｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている。
【０１１９】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵内分泌前駆細胞は、米国特許出願第１１／７３６，９０８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、Ｎｏｔｃｈシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【０１２０】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵内分泌前駆細胞は、米国特許出願第１１／７７９，３１１号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、Ｎｏｔｃｈシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【０１２１】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵内分泌前駆細胞は、米国特許出願第６０／９５３，１７８号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、Ｎｏｔｃｈシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【０１２２】
例えば、本発明の方法に従って得られる膵内分泌前駆細胞は、米国特許出願第６０／９９０，５２９号（ＬｉｆｅＳｃａｎ，Ｉｎｃ．に譲渡）に開示された方法に従って、Ｎｏｔｃｈシグナル経路を阻害する因子で膵内分泌前駆細胞を処理することで、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞へと更に分化する。
【０１２３】
膵内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、ＰＡＸ６、ＮＧＮ３及びＮＫＸ２．２からなる群から選択される。一実施形態では、膵内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも１つを発現することができる。本発明で使用するのに好適なものは、膵内分泌系に特徴的なマーカーを少なくとも１つ発現している細胞である。本発明の一態様において、膵内分泌系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってよい。
【０１２４】
本発明の一態様では、膵内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現している細胞は、ＰＤＸ１と、以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ＮＥＵＲＯＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３  β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６のうちの少なくとも１つを発現している。本発明の一態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。
【０１２５】
治療
一態様では、本発明は、Ｉ型糖尿病に罹患しているかあるいはＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ細胞系に分化させることと、β細胞系の細胞を患者に移植することと、を包含する。代替的実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵内分泌前駆細胞に分化させることと、膵内分泌前駆細胞を患者に移植することと、を包含する。
【０１２６】
更に別の態様では、本発明は、ＩＩ型糖尿病に罹患しているかあるいはＩＩ型糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ細胞系に分化させることと、β細胞系の細胞を患者に移植することと、を包含する。代替的実施形態では、本方法は、多能性幹細胞を培養することと、多能性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵内分泌前駆細胞へと分化させることと、膵内分泌前駆細胞を患者に移植することと、を包含する。
【０１２７】
適切であるならば、移植した細胞の生存及び機能を亢進する医薬品又は生理活性物質で患者を更に処置してもよい。それらの薬剤は、例えば特に、インスリン、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１５）、血管内皮由来増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンを含んでもよい。他の医薬化合物としては例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−１）及びＩＩ、ＧＬＰ−１及び２模倣体（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示される化合物のようなＭＡＰＫ阻害剤などが挙げられる。
【０１２８】
多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にインスリン産生細胞へと分化させてもよい。具体的な実施形態では、多能性幹細胞は、レシピエントに移植する前にβ細胞へと完全に分化させる。あるいは多能性幹細胞は、未分化又は一部が分化した状態でレシピエントに移植してもよい。更なる分化はレシピエント内で行われ得る。
【０１２９】
胚体内胚葉細胞、又は代替的には膵臓内胚葉細胞、又は代替的にはβ細胞を、分散した細胞として移植してもよく、又は肝門静脈内に注入され得るクラスターとして編成してもよい。あるいは細胞は、生体適合性の分解性ポリマー支持体、多孔性の非分解性デバイス内に提供されてもよく、又は宿主免疫応答から保護されるよう封入されてもよい。細胞は、レシピエント内の適切な部位内に移植されてもよい。移植部位としては、例えば肝臓、天然の膵臓、腎被膜下空間、網、腹膜、漿膜下空間、腸、胃、又は皮下ポケットが挙げられる。
【０１３０】
移植された細胞の更なる分化、生存又は活性を向上するために、増殖因子、抗酸化剤又は抗炎症剤などの追加の因子を、細胞の投与前に、投与と同時に、又は投与後に投与してもよい。所定の実施形態において、増殖因子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、投与された細胞を分化させるよう使用される。これらの因子は、内在性細胞により分泌され、投与された細胞にｉｎ  ｓｉｔｕで曝露されてもよい。移植された細胞には、当該技術分野で既知の内因性の及び外因性の増殖因子の任意の組み合わせにより、分化を誘導することもできる。
【０１３１】
移植に使用する細胞の量は、患者の状態及び治療に対する応答を含む、多数の様々な要因に基づいて当業者により決定され得る。
【０１３２】
一態様では、本発明は糖尿病に罹患しているかあるいは糖尿病を発症するリスクを有する患者を治療する方法を提供する。本方法は、多能性幹細胞を培養し、培養した細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏでβ細胞系に分化させ、この細胞を３次元支持体に埋め込むことを含む。細胞は、患者に移植する前に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの支持体上に維持してもよい。あるいは細胞を含む支持体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで更に培養することなく直接患者に移植してもよい。支持体は、場合により、埋め込まれた細胞の生存及び機能を亢進する少なくとも１つの医薬品を組み込んでもよい。
【０１３３】
本発明の目的のために使用するのに好適な支持体材料には、組織修復に有用な組織鋳型、導管、バリア及びリザーバが挙げられる。より詳細には、発泡体、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、及び不織構造の形態を有する合成及び天然材料であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで使用されて、生物組織を再構築又は再生し、また走化性薬剤を送達して組織増殖を誘発する材料が、本発明の方法の実施における使用に適切である。例えば、米国特許第５，７７０，４１７号、同第６，０２２，７４３号、同第５，５６７，６１２号、同第５，７５９，８３０号、同第６，６２６，９５０号、同第６，５３４，０８４号、同第６，３０６，４２４号、同第６，３６５，１４９号、同第６，５９９，３２３号、同第６，６５６，４８８号、米国特許出願公開第２００４／００６２７５３Ａ１号、米国特許第４，５５７，２６４号及び同第６，３３３，０２９号に開示されている材料を参照されたい。
【０１３４】
医薬品が組み込まれた支持体を形成するために、支持体を形成するのに先立ち、薬剤をポリマー溶液と混合することもできる。あるいは加工された支持体上に、医薬品を好ましくは医薬担体の存在下で被覆してもよい。医薬品は、液体、超微粒子状固体、又は任意の他の適切な物理的形態として存在し得る。あるいは医薬品の放出速度を変更するために、支持体に賦形剤を加えてもよい。別の実施形態では、抗炎症性化合物である少なくとも１種の医薬化合物（例えば米国特許第６，５０９，３６９号に開示される化合物）を支持体に組み込む。
【０１３５】
支持体には、抗アポトーシス化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，７９３，９４５号に開示されている化合物を組み込んでもよい。
【０１３６】
支持体には、線維症阻害剤である少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許第６，３３１，２９８号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１３７】
支持体には、血管新生を促進させることができる少なくとも１種の医薬化合物、例えば米国特許出願公開第２００４／０２２０３９３号及び同第２００４／０２０９９０１号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１３８】
支持体には、免疫抑制化合物である少なくとも１種の医薬化合物、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７１６２３号に開示されている化合物も組み込まれ得る。
【０１３９】
例えば支持体には、特に、ＴＧＦ−β１、２、及び３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、増殖分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、−１５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリンなどの増殖因子である、少なくとも１種の医薬化合物も組み込まれ得る。他の医薬化合物としては、例えばニコチンアミド、低酸素誘導因子１−α、グルカゴン様ペプチド−Ｉ（ＧＬＰ−Ｉ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２疑似体、並びにＩＩ、エキ
センディン４、ｎｏｄａｌ、ノギン、ＮＧＦ、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、テネイシン−Ｃ、トロポエラスチン、トロンビン由来ペプチド、カテリシジン、デフェンシン、ラミニン、フィブロネクチン及びビトロネクチンなどの接着性細胞外マトリックスタンパク質の細胞−及びヘパリン−結合ドメインを含む生物ペプチド、例えば米国特許出願公開第２００４／０２０９９０１号及び同第２００４／０１３２７２９号に開示されている化合物などのＭＡＰＫ阻害剤を挙げることができる。
【０１４０】
スキャフォールド内への本発明の細胞の組み込みは、細胞をスキャフォールド上に単に沈着させることにより達成できる。細胞は、単純拡散によりスキャフォールドに入り込ませることができる（Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｓｕｒｇ．２３（１  Ｐｔ  ２）：３〜９（１９８８））。細胞播種の効率を向上させるために、いくつかの他の手法が開発されている。例えば、軟骨細胞をポリグリコール酸スキャフォールド上に播種する際に、スピナーフラスコが使用されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１４（２）：１９３〜２０２（１９９８））。細胞播種のための他の手法は遠心法の使用であり、これは播種する細胞に与えるストレスを最小にし、かつ播種効率を高める。例えば、Ｙａｎｇらは、遠心分離細胞固定法（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ＣＣＩ）と呼ばれる細胞播種方法を開発した（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５５（３）：３７９〜８６（２００１））。
【０１４１】
以下の実施例により本発明を更に例示するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【０１４２】
（実施例１）
膵内分泌前駆細胞集団の形成
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させた：
ａ．２％のＢＳＡ（カタログ＃１５２４０１，ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃１００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を添加したＲＰＭＩ培地（カタログ＃２２４００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）で１日培養した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（カタログ番号１１３３０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７（＃１７５０４−０４４，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ（＃２３９８０４，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，ＣＡ）、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加した表１に記載の異なる基本培地を使用して４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）を添加した、表１に記載の異なる基本培地を使用して３日間にわたって培養した（ステージ４）。
【０１４３】
【表１】
2016164190.tif 000002
【０１４４】
ステージ４の分化３日目の培養物から２つ組でサンプルを調製し、リアルタイムＰＣＲを用いて膵臓マーカーの発現について解析した。並行して、ステージ４の培養３日目の培養物を固定し、次のタンパク質について染色した：ＮＫＸ６．１（カタログ＃Ｆ６４Ａ６Ｂ４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｏｗａ）、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３及びＣＤＸ２。
【０１４５】
ＤＭＥＭ培地で培養したステージ４の培養３日目のサンプル（表１の処理１及び処理２）は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（表１の処理４）又はＣＭＲＬ（表１の処理３）で培養した細胞群と比べ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３及びＰＴＦ１  αの発現レベルが有意に上昇したことがＰＣＲにより示された（図１）。試験した培地では、ＰＤＸ１発現レベルに差異は観察されなかった。しかしながら、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した細胞群では、ＰＤＸ１を発現している細胞の大部分が、腸内胚葉マーカーであるＣＤＸ２も発現していることが、免疫細胞化学解析により明らかになった（図２のパネルａ及びｅ）。それに対して、ＤＭＥＭ培地で処理した細胞群では、ＰＤＸ１陽性細胞とＣＤＸ２陽性細胞（図２のパネルｂ及びｆ）は別のものであり、ＰＤＸ１を発現している細胞の大部分はＣＤＸ２を発現していなかった。
【０１４６】
これに加え、ＤＭＥＭで処理した細胞群より得られたＰＤＸ１発現細胞は、ＮＫＸ６．１も発現していた。図２に見られるように、ステージ４の終了時にはＰＤＸ１陽性細胞の５０〜６０％はＮＫＸ６．１も発現し（図２のパネルｄ）、ＰＤＸ１陽性細胞の２０〜３０％はＮＧＮ３も発現していた（図２のパネルｈ）。しかしながら、ＤＭＥＭ培養細胞群ではＮＫＸ６．１及びＮＧＮ３の共発現は観察されなかった。ＰＤＸ１及びＮＧＮ３の共発現はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養細胞群又はＣＭＲＬ培地培養細胞群でも同様に観察されたが（図２のパネルｇ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＣＭＲＬ培地で処理した細胞群のいずれにおいてもＮＫＸ６．１の発現は観察されなかった（図２のパネルｃ）。
【０１４７】
異なる基本培地は、異なる膵臓内胚葉細胞集団の生成を促進することをこれらのデータは示す。つまり、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いることでＰＤＸ１及びＣＤＸ２を共発現する集団が生じたが、一方でＤＭＥＭを用いることでＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現しているがＣＤＸ２は発現していない集団が生じた。更にこのデータは、培地中のグルコース濃度の増加により膵臓遺伝子の発現が上昇することを示す。図１及び図２を参照されたい。
【０１４８】
（実施例２）
膵内分泌前駆細胞へのヒト胚性幹細胞の直接的な分化
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させた：
ａ．２％のＢＳＡ（カタログ＃１５２４０１，ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｈｉｏ）、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（カタログ＃１３２４−ＷＮ−００２，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（カタログ＃１００−１８Ｂ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ）を添加したＲＰＭＩ培地（カタログ番号２２４００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）で１日処理した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって培養し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（カタログ番号１１３３０，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａ）で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）及び１００ｎｇ／ｍＬのノギン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（カタログ＃６１６４５２，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で３日間にわたって培養し（ステージ４）、次いで
ｅ．０．５％のＩＴＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、０．１％のＢＳＡ、１μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩ、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び２０ｎｇ／ｍＬのベータセルリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＭＮ）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で５日間にわたって培養した（ステージ５）。
【０１４９】
ステージ２の分化３日目から、ステージ４の分化３日目までの各日取りで培養物から２つ組でサンプルを調製し、リアルタイムＰＣＲを用いて膵臓マーカーの発現について解析した。ステージ４に進行後の細胞で、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＰＴＦ１  αの劇的な上昇が観察された（図３，パネルａ，ｂ及びｃ）。これに加え、ＮＧＮ３、ＰＡＸ４、ＮＫＸ２．２及びＮＥＵＲＯＤの有意な上方制御も観察された（図３，パネルｄ〜ｆ）。ＰＡＸ４、ＮＫＸ２．２及びＮＥＵＲＯＤはＮＧＮ３により直接的に制御され、これは、膵臓内胚葉が膵内分泌系への傾倒を開始したことを示唆する。
【０１５０】
ＴＧＦ−β受容体阻害剤、ノギン及びベータセルリンを添加することで、膵内分泌前駆細胞を、インスリンを発現している細胞へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで更に分化させた。図４に示されるように、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＴＧＦ−β受容体阻害剤）、ノギン及びベータセルリンを５日間にわたって添加した後、インスリン発現の有意な上昇が観察された。ＮＧＮ３及びＰＡＸ４発現レベルは減少した一方で、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１  ＭＡＦＢ及びＮＥＵＲＯＤの発現は一定量で留まった。
【０１５１】
（実施例３）
ヒト胚性幹細胞を膵内分泌前駆細胞へと直接的に分化させるための代替法
本実施例は、ヒト胚性幹細胞を膵内分泌前駆細胞へと分化させるための、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＴＧＦ−β受容体ファミリー阻害剤）を、Ｂ２７などの培地添加物中に存在し得る、低濃度の外因性のレチノイド（例えばレチノール（ビタミンＡ））と共に用いる代替法を例示する。
【０１５２】
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させた：
ａ．２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ添加したＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって培養し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、０．１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって培養し（処理１、ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、０．１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１μＭのＡｌｋ５阻害剤及びノギン１００ｎｇ／ｍＬを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって培養し（処理２、ステージ３）、次いで
ｅ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、１μＭのＡｌｋ５阻害剤及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって培養し（処理３、ステージ３）、次いで
ｆ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって培養し（処理４、ステージ３）、次いで
ｇ．１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で８日間にわたって培養し（ステージ４）。
【０１５３】
ステージ４の分化３日目から８日目までの各日取りで培養物から２つ組でサンプルを調製し、リアルタイムＰＣＲを用いて膵臓マーカーの発現について解析した。
【０１５４】
ＦＧＦ７、ノギン、シクロパミン−ＫＡＡＤ及びＡＬＫ５阻害剤ＩＩに加え、低濃度でレチノイン酸（０．１μＭ）を添加した培地又は外因性のレチノイン酸は不含の培地により、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を処理すると、ＮＧＮ３の発現が誘導され、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現は継続して上方制御された（図５のパネルａの処理３及び４）。ＮＧＮ３の発現レベルは高濃度（２μＭ）のレチノイン酸で処理した細胞と同様であった（それぞれ、図５のパネルａの処理４）。これらのデータは、臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞を、ＦＧＦ７、ノギン及びシクロパミン−ＫＡＡＤで処理した場合、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩの添加は、膵内分泌前駆細胞の形成を誘導するのに十分であることを示す。図５のパネルａを参照すると、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩの非存在下で低濃度のレチノイン酸（０．１μＭ）で処理した細胞ではＮＧＮ３は発現していなかったことが分かる（図５のパネルａの処理１）。上記処理により形成された膵内分泌細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでインスリン発現細胞を形成する能力があった。図５のパネルｂを参照すると、ＮＧＮ３を発現している細胞は、１％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で８日間処理した後にインスリン発現細胞を形成した。
【０１５５】
（実施例４）
膵内分泌前駆細胞のＩｎ  Ｖｉｖｏ成熟
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させた：
ａ．２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって培養し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）及び１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で３日間にわたって培養した（ステージ４）。
【０１５６】
細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する上記方法（方法１）は、動物番号８、１１、１４、１７、２０及び２３での移植に使用された。図６を参照されたい。
【０１５７】
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させる、代替え的な分化プロトコルについても試験した：
ａ．２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって培養（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で３日間にわたって培養した（ステージ４）。
【０１５８】
ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。生じた凝集塊を回収し、５〜８百万個の細胞を含有する凝集塊を免疫不全（ＳＣＩＤ／Ｂｇ）マウスの腎臓被膜に移植した。細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するこの方法（方法２）は、動物番号３２４、３２６、３２９、３３１、３３３での移植に使用した。図７のパネルａ及びｂを参照されたい。
【０１５９】
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させる、代替え的な分化プロトコルについても試験した：
ａ．２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって培養し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、０．１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で細胞を４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で３日間にわたって培養した（ステージ４）。
【０１６０】
ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。生じた凝集塊を回収し、５〜８百万個の細胞を含有する凝集塊を免疫不全（ＳＣＩＤ／Ｂｇ）マウスの腎臓被膜に移植した。細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するこの方法（方法３）は、動物番号２９４、２９５、２９６、２９７での移植に使用した。図８を参照されたい。
【０１６１】
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させる、代替え的な分化プロトコルについても試験した：
ａ．２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって培養し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、０．１μＭのレチノイン酸（ＲＡ）、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で細胞を４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で３日間にわたって培養した（ステージ４）。
【０１６２】
ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。生じた凝集塊を回収し、５〜８百万個の細胞を含有する凝集塊を免疫不全（ＳＣＩＤ／Ｂｇ）マウスの腎臓被膜に移植した。細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するこの方法（方法４）は、動物番号３３６、３３８、３４０、３４２、３４４での移植に使用した。図９のパネルａ及びｂを参照されたい。
【０１６３】
継代数４５のヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（１：３０希釈）をコートしたプレート上で培養し、以下のプロトコルを使用して膵内分泌前駆細胞へと分化させる、代替え的な分化プロトコルについても試験した：
ａ．２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ、８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で１日処理した後に、２％のＢＳＡ、１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ及び８ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって培養し（ステージ１）、次いで
ｂ．２％のＢＳＡ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって培養し（ステージ２）、次いで
ｃ．１％のＢ２７、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７、０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及び１μＭのＡｌｋ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で細胞を４日間にわたって培養し（ステージ３）、次いで
ｄ．１％のＢ２７、１００ｎｇ／ｍＬのノギン及びＡｌｋ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で培養した（ステージ４）。
【０１６４】
ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。生じた凝集塊を回収し、５〜８百万個の細胞を含有する凝集塊を免疫不全（ＳＣＩＤ／Ｂｇ）マウスの腎臓被膜に移植した。細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養するこの方法（方法５）は、動物番号３３５、３３７、３３９、３
４１、３４３での移植に使用した。図１０のパネルａ及びｂを参照されたい。
【０１６５】
５〜６週齢のオスのｓｃｉｄ−ｂｅｉｇｅマウス（Ｃ．Ｂ−Ｉｇｈ−１ｂ／ＧｂｍｓＴａｃ−Ｐｒｋｄｃscid−Ｌｙｓｔbg  Ｎ７）をＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓより購入した。滅菌した餌と水を自由に利用できるような状態で、マウスをｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒケージ内に収容した。外科手術の準備に、マウスをイヤータグで同定し、体重を測定し、手持ち式ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ；ＯｎｅＴｏｕｃｈ）を用いて血糖を測定した。
【０１６６】
マウスにイソフルランと酸素の混合物で麻酔をかけ、手術部位を小動物用はさみで剪毛した。マウスには手術前に皮下に０．１ｍｇ．ｋｇ  Ｂｕｐｒｅｎｅｘを投与した。７０％のイソプロピルアルコール及び１０％のポビドンヨウ素で連続的に洗浄することで手術部位を調製した。
【０１６７】
ステージ４の終了時に、細胞を１ｍｇ／ｍＬのディスパーゼで５分間にわたって簡単に処理し、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。マウスの手術前準備の間に、細胞を１．５ｍＬ遠心管で遠心し、次いで細胞ペレットを回収するのに十分な量の培地を残しつつほとんどの上清を除去した。細胞をＲａｉｎｉｎ製Ｐｏｓ−Ｄポジティブディスプレイスメント式ピペットに回収し、ピペットを反転させて重力により細胞を沈降させた。移植用に充填した細胞調製物を残して過剰な培地を除去した。
【０１６８】
移植用に２４Ｇ×１．９ｃｍ（３／４”）のＩ．Ｖ．カテーテルを用い、腎臓皮膜を貫通させ、針を除去した。次いで腎臓皮膜下でカテーテルを腎臓の遠位極まで前進させた。Ｐｏｓ−Ｄピペットチップをカテーテルのハブにしっかりと取り付け、腎臓皮膜下でカテーテルを通してピペットから５百万個の細胞を分配し、腎臓の遠位極に供給した。腎臓皮膜を低温焼灼でシールし、腎臓を解剖学的な元の位置に戻した。並行して、Ｐｏｓｔ−Ｄピペットチップを用い、５百万個の細胞を含有している細胞凝集物を５０μＬデバイスに充填した。５０μＬデバイスはＴｈｅｒａＣｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入した。細胞充填後にデバイスを医療用接着剤ｓｉｌｉｃｏｎｅ  ｔｙｐｅ  Ａ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ＃１２９１０９）によりシールし、ＳＩＣＤ／Ｂｇマウス（動物番号３及び４）の皮下に移植した。５−０  ＶＩＣＲＹＬを用いて連続縫合することで筋を縫合し、皮膚を創傷クリップにより閉じた。マウスには手術後に１．０ｍｇ．ｋｇ  Ｍｅｔａｃａｍを皮下投与した。マウスを麻酔から覚めさせ、完全に回復させた。
【０１６９】
移植後に、マウスを週に１回秤量し、週に２回血糖を測定した。移植に続き、マウスには様々な間隔で３ｇ／ｋｇグルコースを腹腔内投与し、グルコース注入の６０分後に、ヘパリンを少量含有している遠心管に後眼窩静脈洞から血液を吸引した。血液を遠心分離し、２本目の遠心管中に血漿を配置し、ドライアイス上で凍結させ、その後、ヒトＣペプチドアッセイを実施するまでの間−８０℃で保管した。製造者による取扱説明書に従い、Ｍｅｒｃｏｄｉａ／ＡＬＰＣＯ  Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ  Ｎｏ．８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１，Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＨ）を用いてヒトＣペプチドレベルを測定した。
【０１７０】
移植後４週目程の早期に、動物血清中のヒトＣペプチドを検出した。ヒトＣペプチドは経時的に増加した。３カ月の終わりまでに動物には約１５〜２０時間にわたって絶食させ、その後、後眼窩から血液サンプルを採取した（処理前グルコース）。次いで各動物に、約３ｇ／ｋｇのグルコース／３０％のデキストロース溶液を腹腔内注射して投与し、グルコース注入の約６０分後に血液を採取した。マイクロチューブ中で遠心することで、血液細胞と血清を分離させた。非常に感受性の高い、ヒト特異的なＣペプチドＥＬＩＳＡプレ
ート（カタログ番号８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１，Ａｌｐｃｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＨ）を用い、血清２５μＬに対し、ＥＬＩＳＡ解析を２つ組で実施した。ヒトＣペプチドの検出は、インスリン分泌が移植細胞に由来していることを示す。
【０１７１】
移植の６０日後、膵内分泌前駆細胞を含有している移植片を移植した全ての動物において、血清中ヒトＣペプチド濃度が低い（０．５ｎｇ／ｍｌ未満）ことが、グルコース刺激への応答により検出された。移植後２〜３カ月の間、これらの動物ではグルコース刺激によりヒトＣペプチドの血清濃度が急激に上昇した（図６〜１０）。概して、細胞クラスター移植片を移植したこれらの動物は、同様にグルコースに応答した（図７のパネルｂ、図９のパネルｂ及び図１０のパネルｂ）。
【０１７２】
異なる時点で採取した移植片を組織学的検査したところ、マウス腎臓皮膜下にヒト細胞が存在していることが明らかになった（抗ヒト核抗体染色により検出）。図１１のパネルａ及びｂを参照されたい。腎臓皮膜下に移植した細胞は、移植の３週間後、構造を形成することが観察された。図１１のパネルａを参照されたい。管様の構造の数は、時間が経過するにつれて増加した。管様構造のほとんどはＰＤＸ１及びＣＫ１９を高濃度で含有していた（図１１，パネルｂ）。このことは、膵内分泌前駆細胞が更にｉｎ  ｖｉｖｏでも分化し得ることを示唆する。
【０１７３】
管でのＰＤＸ１発現は、最終的には内分泌膵臓を形成する前駆細胞集団を特定するのに重要であることから、移植片中でのＰＤＸ１とインスリン又はグルカゴンのいずれかとの共発現を測定した。移植片中でインスリン及びグルカゴンを発現している細胞は移植後最初の３週間で観察された（図１２のパネルａ）。ＰＤＸ１細胞は、管構造から浸潤したときには、内分泌ホルモンを発現している細胞のほとんどを形成していた。およそ１０週経過時には、移植片中には有意な数のインスリン陽性細胞が検出された；インスリン陽性細胞のほとんどはＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現していた（図１２のパネルｂ）。これらのデータは、上記に報告されたＣペプチドの発現データと相関する。２０週で、インスリン陽性細胞の数は有意に増加し、その結果、移植片中には、単独でインスリンを発現している単独細胞が有意な数検出された。インスリンを発現しているほとんどの細胞はＰＤＸ１（図１２のパネルｃ）、ＮＫＸ６．１（図１２のパネルｂ）及びＮＥＵＲＯＤ（図１２のパネルｅ）も発現していた。ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１は、グルコース刺激による成熟β細胞のインスリン放出を維持するのに効果的であると報告されてきた。
【０１７４】
別個の対照実験では、実施例１に記載の方法に従って、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中でステージ４の終了時に分化した細胞を動物に移植した。移植後最大３カ月にわたって、細胞を移植したいずれの動物の血清にもヒトＣペプチドは観察されなかった。更に、ＰＣＲ及び免疫組織化学解析では、インスリン、ＰＤＸ１又はＮＫＸ６．１の発現は認められなかった。しかしながら、移植の３カ月後、移植片中に有意な数のグルカゴン陽性細胞が観察された。
【０１７５】
（実施例５）
移植片の組織学的検査
移植を受ける動物から採取した移植片を、実質的に前述の実施例に記載されるように組織学的に検査した。
【０１７６】
前述の実施例で処理した動物の移植片を動物から解体し、ＰＢＳ−／−（Ｍｇ＋＋及びＣａ＋＋不含，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回洗浄し、次いで４％のパラホルムアルデヒド／ＰＢＳに移して４℃にて約２〜３時間にわたって固定し、１時間後にＰＢＳ（−）を交換した。次いで移植片を４℃にて一晩３０％のスクロース／ＰＢＳ（−）で平衡化し、ＯＣＴ化合物（ＳＡＫＵＲＡ，＃４５８３）に包埋し、ドライアイスで凍結させた。クラ
イオスタットを用いて移植片組織を１０マイクロ四方の切片に切り出し、切片を−８０℃で保管した。
【０１７７】
解析のため、凍結切片を室温に解凍し、解凍後にＳｈａｎｄｏｎ製のスライドカセット中でＰＢＳで２回洗浄した。組織切片をＰＢＳと０．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘにより２０分にわたって透過処理し、続いて２ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで切片を４％のニワトリ血清／ＰＢＳを含有しているブロッキング溶液でインキュベートした。スライドを室温で１時間にわたってインキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、２ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。４％のニワトリ血清で希釈した一次抗体と共に切片を４℃で一晩再度Ｓｈａｎｄｏｎ製のスライドカセット中でインキュベートした。
【０１７８】
一次抗体とのインキュベーション後、次いでスライドを２ｍＬのＰＢＳで３回洗浄した。４％のニワトリ血清で希釈した適切な二次抗体と共に切片を室温で再度Ｓｈａｎｄｏｎ製のスライドカセット中でインキュベートした。約３０分〜１時間後、切片を２ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、Ｓｈａｎｄｏｎ製のスライドカセットから取り外し、ＤＡＰＩを含有しているＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄで包埋した。膵臓ホルモン分泌細胞に典型的な他のマーカーに対する更なる抗体を解析した（転写因子ＰＤＸ１を含む）。以下の表２を参照されたい。
【０１７９】
【表２】
2016164190.tif 000003
【０１８０】
本明細書を通して引用された刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈される以下の「特許請求の範囲」によって定義されるものである点は認識されるであろう。
【図１】
2016164190.tif 000004
【図２】
2016164190.tif 000005
【図３】
2016164190.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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