(57)【要約】【課題】センシング部分や流路内の汚染を抑制し、測定精度の低下を抑える。【解決手段】チップ１に第１の導入口２と第２の導入口３と導出口４とを設け、この第１の導入口２と第２の導入口３と導出口４とをＹ字状の流路５でつなぎ、第１の導入口２と連通する流路５−１を第１の流路、第２の導入口３と連通する流路５−２を第２の流路、導出口４と連通する流路５−３を第３の流路とする。導出口４と吸引ポンプ６との間をチューブ７で接続し、吸引ポンプ６を用いて流路５内を吸引した状態で、第１の導入口２から凝固試薬１０を導入し、第２の導入口３から血漿１１を導入する。このような構成とすることにより、凝固試薬１０および血漿１１が、第３の流路５−３内をその流れ方向に沿って接しながら、導出口４に向かって流れて行く。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検査溶液が導入される第１の導入口と、
凝固活性化溶液が導入される第２の導入口と、
前記第１の導入口から導入された被検査溶液が流れる第１の流路と、
前記第２の導入口から導入された凝固活性化溶液が流れる第２の流路と、
前記第１の流路を流れる被検査溶液と前記第２の流路を流れる凝固活性化溶液とが流入し、この流入した被検査溶液と凝固活性化溶液とがその流れ方向に沿って接しながら流れる第３の流路と、
前記第３の流路を流れる被検査溶液と凝固活性化溶液が導出される導出口と
を備えることを特徴とする血液凝固検査チップ。
【請求項２】
請求項１に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記第１の導入口から導入された被検査溶液および前記第２の導入口から導入された凝固活性化溶液は、前記導出口から吸引されることによって前記第３の流路に流入し、
前記第３の流路に流入した被検査溶液と凝固活性化溶液とは、前記第３の流路の中央部で接しながらその接した面を界面として、前記第３の流路を前記導出口に向かって流れて行く
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。
【請求項３】
請求項２に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記第３の流路の底面に、前記界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域が形成されている
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。
【請求項４】
請求項２に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記第３の流路の底面の一部に、前記界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域が形成され、
少なくとも前記１の流路の底面および前記第３の流路の底面の前記屈折率の変化を観測する領域以外の領域に、生体分子が吸着し難い材料の薄膜が形成されている
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。
【請求項５】
請求項２に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記第３の流路の底面の一部に、前記屈折率の変化を観測する領域が形成され、
前記屈折率の変化を観測する領域の上に、生体分子の吸着を抑制するこができる生体適合性の高いポリマーが修飾されている
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。
【請求項６】
請求項３〜５の何れか１項に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記屈折率の変化を観測する領域は、金薄膜である
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。
【請求項７】
請求項４に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記生体分子が吸着し難い材料の薄膜は、酸化チタン薄膜である
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。
【請求項８】
請求項３〜７の何れか１項に記載された血液凝固検査チップにおいて、
前記屈折率の変化を観測する領域は、前記第３の流路の底面の前記凝固活性化溶液が流れる側の面に形成されている
ことを特徴とする血液凝固検査チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、血液の凝固能の測定に用いられる血液凝固検査チップに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
凝固活性は、臨床検査の重要な項目であり、特にその一つの凝固活性指標であるプロトロンビン時間（血液凝固時間：ＰＴ（Prothrombin time））は、外因系の凝固因子への感度が高いと考えられており、外因系の凝固因子の欠損のスクリーニングや、肝機能の異常、さらに経口の抗凝血薬療法のモニタリングなどに用いられる指標である。
【０００３】
従来、血液凝固時間の測定には、かくはん抵抗方式、光散乱方式、熱伝導方式、水晶振動子方式などの方法が発明されているが、一般にかくはん抵抗方式と光散乱方式が多く用いられている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００４】
かくはん抵抗方式は、サンプルを活性化剤と一緒に導入してフィンで攪拌し、攪拌の抵抗の上昇から血液凝固時間を測定する方法である。
【０００５】
光散乱方式は、試験用容器内で、血漿に凝固活性化を促す成分を含む試薬を混合し、容器に対し光を入射させ、その散乱光の光量変化を測定して血液凝固時間を測定する方法である。散乱光量から血液凝固時間を得る方法としては、散乱光量をそのまま利用する方法、散乱光量の微分値を利用する方法、散乱光量がある一定値に達するまでの時間を求める方法がある。
【０００６】
最近では、屈折率変化を用いて血液の凝固能を測定する手法も提案されている。この屈折率変化を用いて血液の凝固能を測定する手法では、マイクロ流路内における異なる地点の屈折率変化と時間、溶液の移動距離から流速を算出し、その流速が血漿の凝固活性度の違いにより変化することを利用して血液凝固を検査する（例えば、特許文献１〜３参照）。
【０００７】
また、従来の血液凝固検査は、血液凝固カスケードの最終生成物であるフィブリンによる物理的、光学的変化を捉えることにより行われてきたが、近年ではフィブリンと同時に生成される低屈折率成分の屈折率と血液の凝固能との間に相関があることが報告されている（例えば、非特許文献１，２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−２２１３７号公報
【特許文献２】特開２０１３−０５３９５９号公報
【特許文献３】特開２０１３−０５３９６０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Inoue et al.,「SUB-SECOND DETERMINATION OF BIOGENIC PROTEIN POLYMERIZATION ACTIVITY USING FLOW INDUCED REFRACTIVE INDEX “VALLEY”」,Micro TAS 2013,pp.230-232.年１０月発表）
【非特許文献２】Hayashi et al.,「POLYMERIZATION OF BIOLOGICAL MOLECULES IN A MICROCHANNEL GENERATES BOTH HIGH AND LOW-REFRACTIVE INDEX INGREDIENTS」,Micro TAS 2013,pp.898-900.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
屈折率変化を用いて血液の凝固能を測定する手法では、マイクロ流路内における異なる地点の屈折率変化と時間、溶液の移動距離から流速を算出し、その流速が血漿の凝固活性度の違いにより変化することを利用して血液凝固を検査する。この場合、マイクロ流路を備える血液凝固検査チップを用い、流路に血漿と凝固試薬（凝固活性化剤）を流しながら、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定法で屈折率の変化を観測する。
【００１１】
従来の血液凝固検査チップにおいては、流路に先ず凝固活性化溶液として凝固試薬を流し、次に被検査溶液として血漿を流し、流路内で血漿と凝固試薬とを直列に接触させ、その血漿と凝固試薬とが接触した面を界面とし、この界面で凝固反応を生じさせていた。そして、その界面付近で生じる屈折率の変化をＳＰＲ測定法で観測していた。
【００１２】
ＳＰＲ測定法で屈折率の変化を観測する場合、一般に流路の底面の全体を金薄膜としたガラス等の基板を用いるが、この流路の底面の屈折率の変化を観測する領域（センシング部分）の全体に、血漿もしくは凝固反応による生成物であるフィブリンが触れることにより、センシング部分が汚染され、感度が変化して行くという問題があった。また、流路の断面方向で凝固反応が生じるため、流路断面方向にフィブリンが形成され、流路が汚れやすい、詰まりやすいという問題があった。このような理由から、従来の血液凝固検査チップでは、血液の凝固能の測定を繰り返して行くうちに、測定精度が低下してしまうという問題が生じていた。
【００１３】
本発明は、このような課題を解決するためになされたもので、その目的とするところは、センシング部分や流路内の汚染を抑制し、測定精度の低下を抑えることができる血液凝固検査チップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このような目的を達成するために本発明は、被検査溶液が導入される第１の導入口と、凝固活性化溶液が導入される第２の導入口と、第１の導入口から導入された被検査溶液が流れる第１の流路と、第２の導入口から導入された凝固活性化溶液が流れる第２の流路と、第１の流路を流れる被検査溶液と第２の流路を流れる凝固活性化溶液とが流入し、この流入した被検査溶液と凝固活性化溶液とがその流れ方向に沿って接しながら流れる第３の流路と、第３の流路を流れる被検査溶液と凝固活性化溶液が導出される導出口とを備えることを特徴とする。
【００１５】
このような特徴を有する本発明では、第１の導入口から導入された被検査溶液および第２の導入口から導入された凝固活性化溶液を導出口から吸引することによって第３の流路に流入させると、この第３の流路に流入した被検査溶液と凝固活性化溶液とが第３の流路の中央部で接しながらその接した面を界面として、第３の流路を導出口に向かって流れて行く。
【００１６】
本発明において、被検査溶液と凝固活性化溶液との界面で生じる凝固反応による生成物は、第３の流路の中央部のみで生成され、流れて行く。これにより、被検査溶液と凝固活性化溶液との界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域（センシング部分）には、その一部にしか凝固反応による生成物が触れず、センシング部分の汚染が抑制されるものとなる。また、流路の内壁の汚染も抑制されるものとなる。また、センシング部分を第３の流路の底面の凝固活性化溶液が流れる側の面に形成すれば、センシング部分に被検査溶液が触れることもない。
【００１７】
本発明において、第３の流路の底面の一部に、界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域を形成し、少なくとも第１の流路の底面および第３の流路の底面の屈折率の変化を観測する領域以外の領域に、生体分子が吸着し難い材料の薄膜を形成するものとしてもよい。このようにすることにより、流路の底面に吸着する生体分子や凝固物の量が減り、流路の底面に積層される生体分子や凝固物の厚みが薄くなり、センシング部分や流路内の汚染をさらに抑制することが可能となる。生体分子が吸着し難い材料としては、チタン及びチタン合金、コバルト−クロム合金などが挙げられる。例えば、本発明では、屈折率の変化を観測する領域を金薄膜とし、屈折率の変化を観測する領域以外の領域に酸化チタン薄膜を形成するようにする。
【００１８】
また、本発明において、第２の流路の底面や第３の流路の底面の屈折率の変化を観測する領域以外の領域に生体分子が吸着し難い薄膜を形成する代わりに、屈折率の変化を観測する領域の上にフィブリノゲン等の吸着を抑制することのできる生体適合性の高いポリマーを修飾するようにしてもよい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、第１の導入口から被検査溶液を導入して第１の流路に流し、第２の導入口から凝固活性化溶液を導入して第２の流路に流し、第１の流路を流れる被検査溶液と第２の流路を流れる凝固活性化溶液とを第３の流路に流入させ、この第３の流路を被検査溶液と凝固活性化溶液とがその流れ方向に沿って接しながら流れるようにしたので、被検査溶液と凝固活性化溶液との界面で生じる凝固反応による生成物が第３の流路の中央部のみで生成されるものとなり、センシング部分や流路内の汚染を抑制して、測定精度の低下を抑えることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の原理を説明する図である。
【図２】本発明の原理において血漿と凝固試薬とが第３の流路の中央部で接して流れて行く様子を示す図である。
【図３】実施の形態の血液凝固検査チップを構成する流路基板を示す図である。
【図４】実施の形態の血液凝固検査チップを構成する測定用基板を示す図である。
【図５】流路基板と測定用基板とを組み合わせた状態を示す側断面図である。
【図６】実施の形態の血液凝固検査チップにおいて血漿と凝固試薬とが第３の流路の中央部で接して流れて行く様子を示す図である。
【図７】血漿と凝固試薬を実施の形態の血液凝固検査チップの流路内に導入したときのある時間の屈折率を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
〔発明の原理〕
本発明において、血液凝固検査チップは、被検査溶液が導入される第１の導入口と、凝固活性化溶液が導入される第２の導入口と、第１の導入口から導入された被検査溶液が流れる第１の流路と、第２の導入口から導入された凝固活性化溶液が流れる第２の流路と、第１の流路を流れる被検査溶液と第２の流路を流れる凝固活性化溶液とが流入し、この流入した被検査溶液と凝固活性化溶液とがその流れ方向に沿って接しながら流れる第３の流路と、第３の流路を流れる被検査溶液と凝固活性化溶液が導出される導出口とを備えた構成とする。
【００２２】
このよう構成を有する本発明では、第１の導入口から導入された被検査溶液および第２の導入口から導入された凝固活性化溶液を導出口から吸引することによって第３の流路に流入させ、第３の流路に流入させた被検査溶液と凝固活性化溶液とを第３の流路の中央部で接するものとし、その接した面を界面として、被検査溶液と凝固活性化溶液とが第３の流路を導出口に向かって流れて行くようにする。
【００２３】
例えば、図１に示すように、チップ１に第１の導入口２と第２の導入口３と導出口４とを設け、第１の導入口２と第２の導入口３と導出口４とをＹ字状の流路（Ｙ字流路）５でつなぎ、第１の導入口２と連通する流路５−１を第１の流路、第２の導入口３と連通する流路５−２を第２の流路、導出口４と連通する流路５−３を第３の流路とする。そして、導出口４と吸引ポンプ６との間をチューブ７で接続し、吸引ポンプ６を用いて流路５内を吸引した状態で、ピペット８を用いて第１の導入口２から被検査溶液として血漿１０を導入し、ピペット９を用いて第２の導入口３から凝固活性化溶液として凝固試薬１１を導入する。
【００２４】
すると、第１の導入口２から導入された血漿１０は第１の流路５−１を流れ、第２の導入口３から導入された凝固試薬１１は第２の流路５−２を流れ、第３の流路５−３に流入する。そして、第３の流路５−３に流入した血漿１０と凝固試薬１１とは、第３の流路５−３の中央部で接しながら、その接した面を界面１２（図２参照）として導出口４に向かって流れて行く。すなわち、血漿１０と凝固試薬１１とが、第３の流路５−３内をその流れ方向に沿って接しながら、導出口４に向かって流れて行く。
【００２５】
この場合、血漿１０と凝固試薬１１とは界面１２で接するため、界面１２で凝固反応が起こる。そこで、第３の流路５−３の底面に界面１２付近で生じる屈折率の変化を観測する領域をセンシング部分１３として形成するようにして、このセンシング部分１３で観測される屈折率の変化をもとに血漿１０の凝固能を決定する。すなわち、血漿１０の凝固能は、屈折率の変化が大きい場合に高い。この屈折率の変化をもとに血漿１０の凝固能を血液の凝固能として決定する。
【００２６】
なお、屈折率の変化を検出する検出器としては、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定装置を用いる。ＳＰＲ測定装置は、ＬＥＤ等の光源と偏光板、集光レンズ、ＣＣＤカメラから構成されている。
【００２７】
〔実施の形態〕
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。
図３は本実施の形態の血液凝固検査チップを構成する流路基板を示す図であり、図３（ａ）は平面図、図３（ｂ）は図３（ａ）におけるＡ−Ａ線断面図である。
【００２８】
この流路基板２０１はポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いて作製されており、第１の導入口２０２と第２の導入口２０３と導出口２０４とをつなぐＹ字状の流路（Ｙ字流路）２０５が流路基板２０１の下面に形成されている。
【００２９】
なお、流路２０５の高さｈは５０μｍ、幅ｗは０．５ｍｍとされている。また、第１の導入口２０２、第２の導入口２０３および導出口２０４は、流路基板２０１の上面に開口している。
【００３０】
図４は本実施の形態の血液凝固検査チップを構成する測定用基板であり、図４（ａ）は平面図、図４（ｂ）は図４（ａ）におけるＢ−Ｂ線断面図である。
【００３１】
この測定用基板２０６の材質はガラス（ＢＫ７）とされている。測定用基板２０６の上面には、流路基板２０１に形成されている流路２０５に対応する位置に、その平面形状を流路２０５の平面形状と同じとした金属薄膜２０９が形成されている。金属薄膜２０９は金薄膜２０７と酸化チタン薄膜２０８とから構成されている。
【００３２】
金薄膜２０７は、血漿と凝固試薬との界面付近で生じる屈折率の変化を観測する領域（センシング部分（ＳＰＲ観測領域））として、第３の流路２０５−３の平面形状に対応する領域の一部（凝固試薬が流れる面側）に形成されており、酸化チタン薄膜２０８は、流路２０５の平面形状に対応する領域のＳＰＲ観測領域を除く全ての領域に形成されている。
【００３３】
図５は流路基板２０１と測定用基板２０６とを組み合わせた状態を示す側断面図である。本実施の形態の血液凝固検査チップ２００は、図３に示した流路基板２０１と図４に示した測定用基板２０６とを、反応性イオンエッチング装置を用いて酸素プラズマで処理した後に、流路２０５の平面形状と金属薄膜２０９の平面形状とが合致するように貼り合わせて作製される。
【００３４】
この血液凝固検査チップ２００は、血液凝固検査装置の主要部品として用いられ、ＳＰＲ測定装置に設置される。また、導出口２０４には内径が１ｍｍのチューブが接続され、このチューブには吸引ポンプが接続される。また、血漿や凝固試薬を血液凝固検査チップ２００に分注するための分注装置が設けられる。この血液凝固検査チップ２００を用いた血液凝固検査装置の構成については図示していない。
【００３５】
〔血液凝固検査〕
この血液凝固検査チップ２００を用いて血液凝固検査を行う場合、吸引ポンプを動作させ、続いて２種類の溶液を同時に滴下可能なピペットを用いて、第１の導入口２０２に血漿を第２の導入口２０３に凝固試薬を同時に滴下する。
【００３６】
すると、図６に示すように、第１の導入口２０２から導入された血漿は第１の流路２０５−１を流れ、第２の導入口２０３から導入された凝固試薬は第２の流路２０５−２を流れ、第３の流路２０５−３に流入する。そして、第３の流路２０５−３に流入した凝固試薬と血漿とは、第３の流路２０５−３の中央部で接しながら、その接した面を界面として、導出口２０４に向かって流れて行く。
【００３７】
なお、図６において、３０１は血漿であり、３０２は凝固試薬である。また、３０３は血漿と凝固試薬との界面である。３０４はＳＰＲを観測するラインであり、このＳＰＲを観測するライン３０４が第３の流路２０５−３を跨ぐように、血液凝固検査チップ２００はマウントされている。
【００３８】
図７に血漿と凝固試薬を血液凝固検査チップ２００の流路２０５内に導入したときのある時間の屈折率を示す。図７の横軸はＳＰＲ観測点を示しており、縦軸は各ＳＰＲ観測点での屈折率変化を示している。
【００３９】
ＳＰＲ観測点が「０」の位置は血漿と凝固試薬との界面が形成されている位置であり、すなわち凝固反応が起こっている位置である。図７のｎ１は凝固反応によって生じた低屈折率成分の屈折率であり、ｎ２は凝固試薬の屈折率である。ｎ１の屈折率が得られたのは凝固活性率が８６％の血漿を用いた場合である。凝固活性率が４３％の血漿ではｎ３の屈折率が得られる。凝固試薬の屈折率ｎ２を基準にｎ１，ｎ３の屈折率との差をとったものがそれぞれΔｎ12、Δｎ32である。
【００４０】
このように凝固活性率が半分になると屈折率差も約１／２になり、この差は凝固活性率の高さによって変化する。低屈折率成分の屈折率ｎ１と凝固試薬の屈折率ｎ２との差を指標に血液の凝固能の測定を行うことができる。また、血漿の屈折率は低屈折率成分のそれより高いことを確認しているため、ＳＰＲ観測領域に凝固試薬が流れていないことが確認することができる。さらに、本測定を繰り返し行ったところ、凝固試薬の屈折率ｎ２、低屈折率成分の屈折率ｎ１に変化は認められなかった。これはすなわち、ＳＰＲ観測領域（金薄膜２０７）の表面が汚染されないことを意味している。
【００４１】
金薄膜２０７の表面の汚染は血漿中に含まれる成分の吸着および凝固物の付着によると考えられるが、本実施の形態のように金薄膜２０７が形成されているＳＰＲ観測領域上に血漿が流れないような送液方法をとることで、金薄膜２０７の汚染を抑制し、繰り返し血液の凝固能の測定を行うことができる。
【００４２】
なお、流路２０５の底面の金薄膜２０７を除く領域に酸化チタン薄膜２０８を形成する代わりに、金薄膜２０７上にフィブリノゲン等の吸着を抑制することのできる生体適合性の高いポリマーを修飾するようにしてもよい。
【００４３】
また、流路２０５の底面の金薄膜２０７を除く領域に酸化チタン薄膜２０８を形成せず、ガラス基板のままとすることも考えられるが、金薄膜２０５を除く領域に酸化チタン薄膜２０８を形成して積極的に生体分子が吸着し難くすることによって、より大きな効果を得ることができる。
【００４４】
また、上述した実施の形態では、被検査溶液を血漿とし、血液の凝固能を血液の凝固能として測定するようにしたが、被検査溶液は血漿に限定されるものではない。
【００４５】
〔実施の形態の拡張〕
以上、実施の形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記の実施の形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明の技術思想の範囲内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
【符号の説明】
【００４６】
１…チップ、２…第１の導入口、３…第２の導入口、４…導出口、５…流路、５−１…第１の流路、５−２…第２の流路、５−３…第３の流路、１０…血漿、１１…凝固試薬、１２…界面、１３…センシング部分、２００…血液凝固検査チップ、２０１…流路基板、２０２…第１の導入口、２０３…第２の導入口、２０４…導出口、２０５…流路、２０５−１…第１の流路、２０５−２…第２の流路、２０５−３…第３の流路、２０６…測定用基板、２０７…金薄膜（センシング部分（ＳＰＲ観測領域））、２０８…酸化チタン薄膜、２０９…金属薄膜、３０１…血漿、３０２…凝固試薬、３０３…界面。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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