(57)【要約】【課題】茶抽出物中のカフェインが低減された精製茶抽出物の製造方法を提供すること。【解決手段】茶抽出物とリン脂質とを混合し、混合液中からリン脂質相を回収する工程を含む、精製茶抽出物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
茶抽出物とリン脂質とを混合し、混合液中からリン脂質相を回収する工程を含む、精製茶抽出物の製造方法。
【請求項２】
リン脂質の相転移温度よりも高い温度で茶抽出物とリン脂質とを混合する、請求項１記載の精製茶抽出物の製造方法。
【請求項３】
リン脂質の相転移温度が−２５〜６０℃である、請求項１又は２記載の精製茶抽出物の製造方法。
【請求項４】
リン脂質がリポソームの形態である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の精製茶抽出
物の製造方法。
【請求項５】
リポソームは、体積基準の累積粒度分布におけるメジアン径が１０〜２０,０００ｎｍである、請求項４記載の精製茶抽出物の製造方法。
【請求項６】
茶抽出物とリン脂質との混合割合が、茶抽出物中の（Ａ）非重合体カテキン類と（Ｂ）リン脂質との質量比[（Ａ）／（Ｂ）]として、０．００１〜０．２０である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の精製茶抽出物の製造方法。
【請求項７】
茶抽出物とリン脂質との混合時間が１０〜３６０分である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の精製茶抽出物の製造方法。
【請求項８】
混合液中からリン脂質相を遠心分離により回収する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の精製茶抽出物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精製茶抽出物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
茶葉には非重合体カテキン類が豊富に含まれており、茶葉から抽出することにより非重合体カテキン類を得ることができるが、抽出の際にはカフェイン等の夾雑物も同時に抽出されてしまう。
【０００３】
このような夾雑物を低減する技術として、例えば、茶葉を熱湯又は有機溶媒水溶液で抽出し、抽出成分を含む溶液をクロロホルムで洗浄し、次いで抽出成分を有機溶媒に転溶した後、有機溶媒を留去する方法（特許文献１）、茶抽出物を活性白土又は酸性白土と接触させる方法（特許文献２）、茶抽出物を水又は含水有機溶媒中に溶解又は懸濁し、アルカリ性条件下、合成吸着剤と接触させる方法（特許文献３）等が知られている。
【０００４】
一方、茶抽出物をリン脂質と共存させることで、茶抽出物の渋味を低減できることが報告されているが（特許文献４）、リン脂質を用いた茶抽出物中の夾雑物の除去については知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭５９−２１９３８４号公報
【特許文献２】特開平６−１４２４０５号公報
【特許文献３】特開平８−１０９１７８号公報
【特許文献４】特表２０１２−５０３４７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、茶抽出物中のカフェインが低減された精製茶抽出物の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、茶抽出物とリン脂質とを混合し、リン脂質膜内又はその内水相に非重合体カテキン類を取り込ませるか、あるいはリン脂質膜に非重合体カテキン類を吸着させることで、非重合体カテキン類とカフェインが分離され、そしてリン脂質相を回収することで、カフェインが低減された精製茶抽出物が得られることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、茶抽出物とリン脂質とを混合し、混合液中からリン脂質相を回収する工程を含む、精製茶抽出物の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、茶抽出物中のカフェインが低減された精製茶抽出物を簡便な操作で製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の精製茶抽出物の製造方法について説明する。
本発明の精製茶抽出物の製造方法は、茶抽出物とリン脂質とを混合し、混合液中からリン脂質相を回収する工程を含むものである。
【００１１】
茶抽出物としては、茶抽出液、その濃縮物、又はそれらの精製物が挙げられ、その形態としては、固体、液体、溶液、スラリー等の種々のものがある。これらは１種又は２種以上組み合わせて使用することができる。ここで、本明細書において「茶抽出液」とは、茶葉から熱水又は親水性有機溶媒を用いて抽出されたものであって、濃縮や精製操作が行われていないものをいう。抽出方法及び抽出条件は、公知の方法及び条件を採用することが可能であり、特に限定されない。茶葉としては、例えば、Camellia属、例えば、C. sinensis var.sinensis（やぶきた種を含む）、C. sinensis var.assamica及びそれらの雑種から選択される茶樹（Camellia sinensis）が挙げられる。茶樹は、その加工方法により、不発酵茶、半発酵茶、発酵茶に分類することができる。
不発酵茶としては、例えば、煎茶、番茶、碾茶、釜入り茶、茎茶、棒茶、芽茶等の緑茶が挙げられる。また、半発酵茶としては、例えば、鉄観音、色種、黄金桂、武夷岩茶等の烏龍茶が挙げられる。更に、発酵茶としては、ダージリン、アッサム、スリランカ等の紅茶が挙げられる。これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。中でも、非重合体カテキン類の含有量の点から、不発酵茶が好ましく、緑茶が更に好ましい。
【００１２】
また、「茶抽出液の濃縮物」とは、茶抽出液から溶媒の一部を除去して非重合体カテキン類濃度を高めたものであり、例えば、濃縮方法として、常圧濃縮、減圧濃縮、膜濃縮等を挙げることができる。茶抽出液の濃縮物としては市販品を使用してもよく、例えば、三井農林（株）の「ポリフェノン」、伊藤園（株）の「テアフラン」、太陽化学（株）の「サンフェノン」等の緑茶抽出液の濃縮物が挙げられる。更に、「茶抽出液の精製物」とは、茶抽出液又はその濃縮物を精製して非重合体カテキン類の純度を高めたものであり、例えば、特開２００４−１４７５０８号公報、特開２００４−１４９４１６号公報、特開２００６−１６０６５６号公報、特開２００７−２８２５６８号公報、特開２００８−０７９６０９号公報等に記載の方法を採用することができる。
【００１３】
混合する際の茶抽出物は、水溶液の形態であることが好ましい。茶抽出物を溶解させた水溶液は、例えば、茶葉から水を用いて抽出された茶抽出液を、必要により水希釈又は濃縮して用いても、茶抽出液の濃縮物又はその精製物を水希釈して用いても、茶抽出液、その濃縮物、又はそれらの精製物の乾燥物を再び水に溶解して用いてもよい。
【００１４】
茶抽出物を溶解させた水溶液中の非重合体カテキン類の含有量は適宜選択可能であるが、精製効率の観点から、０．０２質量％以上が好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．０６質量％以上が更に好ましく、そして１０.０質量％以下が好ましく、７．０質量％以下がより好ましく、５．０質量％以下が更に好ましい。かかる非重合体カテキン類の含有量の範囲としては、好ましくは０．０２〜１０．０質量％、より好ましくは０．０５〜７．０質量％、更に好ましくは０．０６〜５．０質量％である。ここで、本明細書において「非重合体カテキン類」とは、エピガロカテキンガレート、ガロカテキンガレート、エピカテキンガレート及びカテキンガレートからなるガレート体と、エピガロカテキン、ガロカテキン、エピカテキン及びカテキンからなる非ガレート体を併せての総称である。なお、非重合体カテキン類の含有量は、上記８種の合計量に基づいて定義され、本発明においては、上記８種の非重合体カテキン類のうち少なくとも１種を含有すればよい。
【００１５】
また、本発明に用いる茶抽出物は、非重合体カテキン類中のガレート体の割合（以下、「ガレート体率」とも称する）が、生理効果の観点から、３０質量％以上が好ましく、３５質量％以上がより好ましく、４０質量％以上が更に好ましく、また風味の観点から、７０質量％以下が好ましく、６５質量％以下がより好ましく、６０質量％以下が更に好ましい。かかるガレート体率の範囲としては、好ましくは３０〜７０質量％、より好ましくは３５〜６５質量％、更に好ましくは４０〜６０質量％である。ここで、本明細書において「ガレート体率」とは、非重合体カテキン類８種に対する上記ガレート体４種の質量比率である。
【００１６】
更に、本発明に用いる茶抽出物は、（Ａ）非重合体カテキン類と（Ｃ）カフェインとの質量比[（Ｃ）／（Ａ）]が、０．０１以上が好ましく、０．０３以上がより好ましく、０．０５以上が更に好ましく、そして３．０以下が好ましく、２．０以下がより好ましく、１．５以下が更に好ましい。かかる質量比[（Ｃ）／（Ａ）]の範囲としては、好ましくは０．０１〜３．０、より好ましくは０．０３〜２．０、更に好ましくは０．０５〜１．５である。
【００１７】
リン脂質は、卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するものを特に限定されることなく用いることができ、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、合成品等であってもよい。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されず、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸のいずれでもよい。また、リン脂質は、中性リン脂質の他に、アニオン性リン脂質、カチオン性リン脂質といった荷電リン脂質、更には重合性リン脂質を含んでもよい。
リン脂質は、１種又は２種以上組み合わせて用いることができる。
【００１８】
リン脂質としては、例えば、グリセロリン脂質、リゾグリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質が挙げられる。中でも、グリセロリン脂質、スフィンゴリン脂質が好ましい。グリセロリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリンが挙げられるが、中でもホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリンが好ましい。スフィンゴリン脂質としては、スフィンゴミエリン、セラミドシリアチンが挙げられる。これらリン脂質を含む原料として、天然レシチン、又はそれを水素添加処理した精製品を利用することもできる。天然レシチンとしては、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチン、イカレシチン等が挙げられ、水素添加リン脂質としては、例えば、水素添加大豆ホスファチジルコリン、水素添加卵黄レシチン等が挙げられる。
【００１９】
茶抽出物と混合する際のリン脂質は、リン脂質膜を形成していることが好ましく、更に好ましくはリポソームの形態である。リン脂質をリン脂質膜又はリポソームの形態とすることで、リン脂質膜内又はその内水相への非重合体カテキン類の取り込みや、リン脂質膜への非重合体カテキン類の吸着が容易になる。ここで、本明細書において「リポソーム」とは、リン脂質２分子膜により囲まれた内水相部分を有する閉鎖小胞をいい、そのサイズや脂質二分子の数によって多重相リポソーム（Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ）、大きな一枚膜リポソーム（Ｌａｒｇｅ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＬＵＶ）、小さな一枚膜リポソーム（Ｓｍａｌｌ Ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ）の３種類に分類される。本発明においてはいずれの種類のリポソームも使用可能である。
【００２０】
リン脂質膜へ非重合体カテキン類を吸着させる場合、例えば、茶抽出物とリン脂質とを混合し、震盪等により応力を与えてリン脂質膜の形成とリン脂質膜への非重合体カテキン類の吸着を略同時に行ってもよい。また、リン脂質に震盪等により応力を与えて予めリン脂質膜の形成した後、これに茶抽出物を混合することもできる。
【００２１】
リン脂質をリポソーム化する場合、その膜構成成分として、リン脂質と、糖脂質及びジアルキル型合成界面活性剤から選ばれる１種又は２種とを適宜組み合わせてよい。さらに、膜安定剤としてコレステロール類等を、また荷電物質としてステアリルアミン、ホスファチジン酸等を、更に酸化防止剤としてトコフェロール等を、１種又は２種以上適宜組み合わせて加えても良い。
【００２２】
リポソームの形成方法としては特に限定されず、Ｂａｎｇｈａｍ法、脂質溶解法、メカノケミカル法、凍結乾燥リポソーム法等の方法を採用することができる。例えばＢａｎｇｈａｍ法では、リン脂質をクロロホルム、エーテル、エタノール等の有機溶媒に溶解し、減圧下にて溶媒を留去し、更に減圧乾燥した後、当該リン脂質の相転移温度以上の温度で懸濁させることにより形成することができる。また、リポソームの粒子径は、膜透過や機械力による剪断力を利用し、適宜調節することもできる。
【００２３】
本発明に用いるリン脂質、リン脂質膜、リポソームは、相転移温度を有するものが好ましい。ここで、本明細書において「相転移温度」とは、リン脂質が取り得るゲルと液晶との両状態間の相転移を生じる温度をいい、リン脂質に対して十分量の水が存在する場合の値である。相転移温度は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて示差熱分析により測定することができる。示差走査熱量計として、例えばＤＳＣ７０２０（日立ハイテクサイエンス製）を用いることができる。なお、本明細書における相転移温度は、後述の実施例記載の方法に基づく測定値を示すものとする。
【００２４】
リン脂質の相転移温度は、ハンドリングの観点から、−２５℃以上が好ましく、−２０℃以上がより好ましく、また非重合体カテキン類の取込み率、吸着率の観点から、６０℃以下が好ましく、５０℃以下がより好ましく、４０℃以下が更に好ましく、３０℃以下がより更に好ましい。かかる相転移温度の範囲としては、好ましくは−２５℃〜６０℃、より好ましくは−２０℃〜５０℃、更に好ましくは−２０℃〜４０℃、より更に好ましくは−２０℃〜３０℃である。
【００２５】
相転移温度を有するリン脂質としては、例えば、大豆ホスファチジルコリン（後述の実施例記載の方法により測定した相転移温度約−１０℃）、水素添加大豆ホスファチジルコリン（メーカー公称相転移温度約５３℃）、ジミリストイルホスファチジルコリン（下記の参考文献１記載の相転移温度約２３℃）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（下記の参考文献１記載の相転移温度約４１℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（下記の参考文献１記載の相転移温度約５４℃）、ジヘキサデシルホスファチジルコリン（下記の参考文献２記載の相転移温度約４５℃）、ステアロイルパルイトミルホスファチジルコリン（下記の参考文献３記載の相転移温度約４５℃）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（下記の参考文献２記載の相転移温度約６３℃）等が挙げられる。中でも、コリン基を有するホスファチジルコリンが好ましい。本発明で使用するリン脂質は、市販品又は合成品を適宜選択して使用することができるが、リン脂質の含有量が６０質量％以上であるものが好ましく、８０質量％以上であるものが更に好ましい。
【００２６】
参考文献１：金品ら， 高圧力下におけるリン脂質二重膜. 高圧力の科学と技術、vol9，No3，p.213-220（1999）
参考文献２：松木ら. 生体膜脂質の膜状態−圧力研究から見えてくる構造機能相関−，高圧力の科学と技術，vol23，No1，p.30-38（2013）
参考文献３：第32回物性物理化学研究会  講演要旨集
【００２７】
リポソームのメジアン径は、リン脂質相と液相との分離操作の観点から、１０ｎｍ以上が好ましく、３０ｎｍ以上がより好ましく、５０ｎｍ以上が更に好ましく、８０ｎｍ以上がより更に好ましく、１００ｎｍ以上が殊更に好ましく、また非重合体カテキン類の取込み率の観点から、２０,０００ｎｍ以下が好ましく、１５,０００ｎｍ以下がより好ましく、１０,０００ｎｍ以下が更に好ましく、５,０００ｎｍ以下がより更に好ましく、３,０００ｎｍ以下がより好ましく、１，０００ｎｍ以下が更に好ましく、５００ｎｍ以下が殊更に好ましい。かかるメジアン径の範囲としては、好ましくは１０〜２０,０００ｎｍ、より好ましくは３０〜１５,０００ｎｍ、更に好ましくは５０〜１０,０００ｎｍ、より更に好ましくは５０〜５,０００ｎｍ、より更に好ましくは５０〜３,０００ｎｍ、より更に好ましくは８０〜１，０００ｎｍ、殊更に好ましくは１００〜５００ｎｍである。ここでいう「メジアン径」とは、レーザー回折散乱法を用いて測定した体積基準の累積粒度分布において、累積値が５０％（ｄ50）に相当する粒子径をいう。
【００２８】
茶抽出物とリン脂質との混合割合は、茶抽出物中の（Ａ）非重合体カテキン類と（Ｂ）リン脂質との質量比[（Ａ）／（Ｂ）]として、生産効率の観点から、０．００１以上が好ましく、０．０１以上がより好ましく、０．０２以上が更に好ましく、また非重合体カテキン類の回収率の観点から、０．２０以下が好ましく、０．１８以下がより好ましく、０．１１以下が更に好ましく、０．０９以下が殊更に好ましい。かかる質量比[（Ａ）／（Ｂ）]の範囲としては、好ましくは０．００１〜０．２０、より好ましくは０．０１〜０．１８、更に好ましくは０．０１〜０．１１、殊更に好ましくは０．０２〜０．０９である。
【００２９】
茶抽出物とリン脂質との混合温度は、使用するリン脂質の相転移温度よりも高い温度であることが好ましく、使用するリン脂質の相転移温度よりも５℃以上高い温度であることがより好ましく、１０℃以上高い温度であることがより好ましく、２０℃以上高い温度であることがより更に好ましい。
茶抽出物とリン脂質との混合時間は、製造スケール等により一様ではないが、非重合体カテキン類の回収率の観点から、１０分以上が好ましく、１５分以上がより好ましく、２０分以上が更に好ましく、また精製効率の観点から、３６０分以下が好ましく、１２０分以下がより好ましく、６０分以下が更に好ましい。かかる混合時間の範囲としては、好ましくは１０〜３６０分、より好ましくは１５〜１２０分、更に好ましくは２０〜６０分である。なお、混合液の温度が所定時間一定に保持されるように、液温制御手段を設けることができる。
【００３０】
茶抽出物とリン脂質との混合する際のｐＨ（２５℃）は、設備腐食防止の観点から、２．５以上が好ましく、４．０以上がより好ましく、６．０以上が更に好ましく、また非重合体カテキン類の安定性の観点から、９．０以下が好ましく、８．０以下がより好ましく、７．０以下が更に好ましい。かかるｐＨの範囲としては、好ましくは２．５〜９．０、より好ましくは４．０〜８．０、更に好ましくは６．０〜７．０である。
【００３１】
茶抽出物とリン脂質との混合順序は特に限定されず、茶抽出物とリン脂質とを同時に投入して混合しても、一方を他方に投入して混合してもよい。また、茶抽出物とリン脂質とを混合する際には、撹拌、震盪、超音波照射等の処理を行ってもよい。
【００３２】
茶抽出物とリン脂質との混合により、リン脂質膜内又はリポソームに非重合体カテキン類が取り込まれるか、あるいはリン脂質膜に非重合体カテキン類が吸着される一方、カフェイン等の夾雑物はリン脂質膜外、あるいはリポソームの外水相にそのまま存在するため、非重合体カテキン類と、カフェイン等の夾雑物とを分離することができる。
【００３３】
混合後、混合液中からリン脂質相を回収するが、回収方法としては、限外濾過、遠心分離、ゲルクロマトグラフィー、透析等の固液分離を挙げることができる。固液分離は、１種又は２種以上を組み合わせて行うことができる。中でも、遠心分離が好ましい。混合液を遠心分離することで、リン脂質相を沈殿層として簡便に回収することができる。
【００３４】
遠心分離機としては、分離板型、円筒型、デカンター型等の一般的な機器を使用することができ、必要に応じて超遠心機を用いても良い。
遠心分離する際の温度は、リン脂質相の回収率の観点から、１℃以上が好ましく、２℃以上がより好ましく、３℃以上が更に好ましく、そして６０℃以下が好ましく、５０℃以下がより好ましく、４０℃以下が更に好ましい。かかる温度範囲としては、好ましくは１〜６０℃、より好ましくは２〜５０℃、更に好ましくは３〜４０℃である。
遠心分離の時間は、リン脂質相の回収率の観点から、好ましくは３〜３００分、より好ましくは５〜２００分、更に好ましくは１０〜１００分、より更に好ましくは１５〜６０分である。
また、遠心分離の条件は、カフェイン除去、非重合体カテキン類の回収率の観点から、相対遠心加速度として、３００Ｇ以上が好ましく、５００Ｇ以上がより好ましく、８００Ｇ以上が更好ましい。また、処理時間の短縮の観点から、１０，０００Ｇ以上が好ましく、６０，０００Ｇ以上がより好ましく、１２０，０００Ｇ以上が更に好ましい。上限は限定されるものではないが、例えば１７０，０００Ｇ以下が好ましい。遠心分離機の回転数と回転半径は、相対遠心加速度が上記範囲内となるように適宜選択することができる。ここで、本明細書において「相対遠心加速度」とは、次の式（１）により算出した値をいう。
【００３５】
相対遠心加速度（Ｇ）＝１１８８×ｒ×Ｎ２×１０−８        （１）
【００３６】
〔式（１）中、ｒは遠心機の最大回転半径（ｃｍ）を示し、Ｎは一分間あたりの回転数（ｒｐｍ）を示す。〕
【００３７】
固液分離により得られたリン脂質相は、必要に応じ、例えばエタノール等の溶媒で抽出した後に、膜分離等の分離操作を行うことで、非重合体カテキン類をリン脂質と分離することが可能であり、またそのまま精製茶抽出物として利用することもできる。
【００３８】
得られたリン脂質相の脂質量は、例えば、リン脂質Ｃテストワコー（和光純薬社製）等のリン脂質定量キット、ＨＰＬＣを用いることにより定量することが可能である。
【００３９】
このようにして、カフェインが低減された精製茶抽出物を製造することができる。また、本発明の製造方法は、非重合体カテキン類を、好ましくは５０％以上、より好ましくは５５％以上、更に好ましくは６０％以上の収率で回収することもできる。
【００４０】
本発明の製造方法により得られた精製茶抽出物は、（Ａ）非重合体カテキン類と（Ｃ）カフェインとの質量比[（Ｃ）／（Ａ）]が、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．５以下、更に好ましくは０．１以下、より更に好ましくは０．０１以下、殊更に好ましくは０．００９以下とすることができる。なお、かかる質量比[（Ｃ）／（Ａ）]は、０であってもよいが、生産効率の観点から、０．００００１以上が好ましく、０．０００１以上が更に好ましい。
【実施例】
【００４１】
１．非重合体カテキン類、及びカフェインの測定
精製茶抽出物を、０．１ｍｏｌ／Ｌの酢酸−ジメチルスルホオキシド溶液で適宜希釈し０．２μｍのフィルターでろ過して試料を調製した。非重合体カテキン類、及びカフェインの測定は、高速液体クロマトグラフ（型式ＳＣＬ−１０ＡＶＰ、島津製作所製）を用い、オクタデシル基導入液体クロマトグラフ用パックドカラム（Ｌ−カラムＴＭ ＯＤＳ、４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ：財団法人 化学物質評価研究機構製）を装着し、カラム温度３５℃でグラジエント法により行った。非重合体カテキン類の標準品としては、三井農林製のものを使用し、検量線法で定量した。移動相Ａ液は酢酸を０．１ｍｏｌ／Ｌ含有する蒸留水溶液、Ｂ液は酢酸を０．１ｍｏｌ／Ｌ含有するアセトニトリル溶液とし、試料注入量は２０μＬ、ＵＶ検出器波長は２８０ｎｍの条件で行った。なお、グラジエントの条件は、以下のとおりである。
【００４２】
時間（分）      Ａ液濃度（体積％）      Ｂ液濃度（体積％）
０．０                ９７                      ３
５．０                ９７                      ３
３７．０                ８０                    ２０
４３．０                ８０                    ２０
４３．５                  ０                  １００
４８．５                  ０                  １００
４９．０                ９７                      ３
６０．０                ９７                      ３
【００４３】
２．ｐＨの測定
ｐＨメータ（ＨＯＲＩＢＡ  コンパクトｐＨメータ、堀場製作所製）を用いて２５℃にて行った。
【００４４】
３．メジアン径の測定
レーザ回折・散乱式粒度分布測定装置（ＨＯＲＩＢＡ  ＬＡ−９２０、堀場製作所製）を用いて体積基準の累積粒度分布測定を行い、メジアン径を求めた。
【００４５】
４．リン脂質の相転移温度の測定
（１）０℃を超える温度に相転移温度を有するリン脂質は、下記の手順により相転移温度を測定する。まず、リン脂質に対して十分量の水が存在するよう、リン脂質濃度が１〜１０ｇ／１００ｇとなるように、リン脂質を水に十分分散させた試料を準備する。次いで、試料０．００５ｇをアルミニウム製の試料容器に秤量し、アルミニウム製のカバーをした後、電動サンプルシーラーを用い、密封する。密封した試料容器を、電気炉内のホルダーユニットに乗せる。また、空気を密封したブランク容器を、ホルダーユニットのブランク側に乗せる。電気炉に蓋をし、窒素雰囲気下で１℃、５分間保持する。次いで、１℃から９８℃まで、昇温速度０．５℃／分で加熱する（昇温工程）。この、昇温工程において、示差走査熱量計ＤＳＣ７０２０（日立ハイテクサイエンス製）を用いて、ＤＳＣ曲線を計測する。この際、昇温工程で吸熱ピークが見られた際の温度を、リン脂質の相転移温度とする。
（２）また、上記の測定条件により相転移温度が確認できないリン脂質においては、下記の手順により相転移温度を測定する。まず、リン脂質に対して５０質量％のエチレングリコール水溶液を、リン脂質濃度が１〜１０ｇ／１００ｇとなるように、リン脂質を水に十分分散させた試料を準備する。次いで、上記と同様の操作により、試料容器、ブランク容器を用意し、ホルダーユニットに乗せる。電気炉に蓋をし、窒素雰囲気下で２５℃、５分間保持する。次いで、２５℃から―４０℃まで、降温速度０．５℃／分で冷却する（冷却工程）。この、冷却工程において、示差走査熱量計ＤＳＣ７０２０（日立ハイテクサイエンス製）を用いて、ＤＳＣ曲線を計測する。この際、冷却工程で発熱ピークが見られた際の温度を、リン脂質の相転移温度とする。
【００４６】
調製例１
リポソーム懸濁液Ａの調製
リン脂質として、大豆ホスファチジルコリン（コートソームＮＣ２０、日油株式会社製、相転移温度の測定値：―１０℃）を用い、これを１００ｍＬナスフラスコに０．３１２ｇ採取した。次いで、１０ｍＬのクロロホルムを滴下し、ウォータバスで２５℃に加熱しつつ、完全溶解した。次いで、ロータリーエバポレータを用い、クロロホルムを留去した。さらに、有機溶媒を完全に除去するため、減圧乾燥を３０〜６０分行った後、リン酸バッファ（１７ｍＭ―Ｎａ2ＨＰＯ4＋４９ｍＭ−ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．４）を６ｍＬ滴下した。その後、２５℃に加熱しつつ攪拌を行い、大豆ホスファチジルコリンを水和し、リポソームを形成した。次いで、容器を密閉した状態で、−４０℃の冷却バスで３０分以上冷却し、凍結させた。その後、２５℃のウォータバスで、試料が完全に溶解するまで加熱した。この凍結、溶解の操作を、３回繰り返した。次いで、孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜に、懸濁液を２５℃に加熱した状態で１１回以上通過させることで、粒子径を調節した。以上の操作により、リポソーム懸濁液Ａ（リン脂質濃度４９４３ｍｇ／１００ｍＬ、リポソームのメジアン径１６８ｎｍ）を得た。
【００４７】
調製例２
リポソーム懸濁液Ｂの調製
リン脂質として、メーカー公称相転移温度５３℃の水素添加大豆ホスファチジルコリン（コートソームＮＣ２１、日油株式会社製、相転移温度の測定値：５１℃）を用い、加熱温度を６０℃に変更したこと以外は、調製例１と同様の操作を行い、リポソーム懸濁液Ｂ（リン脂質濃度４９４３ｍｇ／１００ｍＬ、リポソームのメジアン径２１５ｎｍ）を得た。
【００４８】
調製例３
リポソーム懸濁液Ｃの調製
孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通過させる代わりに、孔径１０００ｎｍのポリカーボネート膜を用いたこと以外は、調製例１と同様の操作を行い、リポソーム懸濁液Ｃ（リン脂質濃度４９４３ｍｇ／１００ｍＬ、リポソームのメジアン径７３３ｎｍ）を得た。
【００４９】
調製例４
リポソーム懸濁液Ｄの調製
孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜の代わりに、小型密閉式高圧ホモジナイザーによる剪断処理を４０００ｒｐｍ、２０分行ったこと以外は、調製例１と同様の操作を行い、リポソーム懸濁液Ｄ（リン脂質濃度４９４３ｍｇ／１００ｍＬ、リポソームのメジアン径２４６１ｎｍ）を得た。
【００５０】
調製例５
リポソーム懸濁液Ｅの調製
孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を通過させなかったこと以外は、調製例１と同様の操作を行い、リポソーム懸濁液Ｅ（リン脂質濃度４９４３ｍｇ／１００ｍＬ、リポソームのメジアン径６３７８ｎｍ）を得た。
【００５１】
調整例６
リポソーム懸濁液Ｆの調製
リン脂質として大豆ホスファチジルコリン（コートソームＮＣ２０、日油株式会社製）０．１２４ｇと、水素添加大豆ホスファチジルコリン（コートソームＮＣ２１、日油株式会社製）０．１２４ｇ用いた。さらに、加熱温度を６０℃とし、滴下するリン酸バッファを１０ｍＬとした以外は、調製例１と同様の操作を行い、リポソーム懸濁液Ｆ（リン脂質２４７１ｍｇ／１００ｍＬ、リポソームのメジアン径１４１ｎｍ、相転移温度測定値：３６℃）を得た。
【００５２】
調製例７
脂質懸濁液Ａの調製
脱臭油脂を原料とした大豆油脂肪酸：菜種油脂肪酸＝７：３（質量比）の混合脂肪酸１００質量部とグリセリン１５質量部とを混合し、酵素によりエステル化反応を行った。得られたエステル化物から、トップカット蒸留により脂肪酸とモノアシルグリセロールを除去した後、８０℃にて酸処理（５０％クエン酸水溶液を０．５％添加）を行った。次に、油脂に対して１０％の蒸留水を用いた水洗を３回行い、ジアシルグリセロール水洗油（ジアシルグリセロール８８％）を得た。次に、２３５℃で６０分間脱臭を行い、脱臭油を得た。この脱臭油（ジアシルグリセロール８６質量％）０．３１２ｇをリン酸バッファ６ｍＬに分散し、脂質懸濁液Ａを調製した。
【００５３】
調製例８
脂質懸濁液Ｂの調製
市販のナタネ油（トリアシルグリセロール９９質量％）０．３１２ｇをリン酸バッファ６ｍＬに分散し、脂質懸濁液Ｂを調製した。
【００５４】
調製例９
緑茶抽出物Ａの調製
緑茶抽出物（非重合体カテキン類濃度３２質量％）、酸性白土（ミズカエース＃６００水澤化学社製）３８ｇを６８質量％エタノール水溶液８００ｇ中に分散させ、４０℃に加熱した状態で６時間の攪拌を続けた。その後、生成している沈殿及び酸性白土を２号ろ紙でろ過した。得られたろ液を活性炭（クラレコールＧＬＣ、クラレケミカル社製）３０ｇと接触させ、続けて０．２μｍメンブランフィルターによってろ過を行った。最後にイオン交換水２００ｇを添加し減圧下でエタノールを留去し、その後、水分量を調整して「緑茶抽出物Ａ」を得た。緑茶抽出物Ａ中の非重合体カテキン類濃度は０．２質量％、カフェイン濃度は０．０１６質量％、ガレート体率は５０質量％、カフェイン／非重合体カテキン類の質量比は０．０８であった。
【００５５】
調製例１０
緑茶抽出物Ｂの調製
酸性白土（ミズカエース＃６００水澤化学社製）１００ｇを常温の９２質量％エタノール水溶液８００ｇ中に分散させ、約１０分間攪拌を行った後、緑茶抽出物（非重合体カテキン類濃度３２質量％）２００ｇを投入し、６時間の攪拌を続けた。その後、生成している沈殿及び酸性白土を２号ろ紙でろ過した。得られたろ液にイオン交換水を４１７ｇ添加し、１５℃で約５分間攪拌を行った。その混合液を小型冷却遠心分離機を用い（日立工機社製）、操作温度１５℃で析出した濁り成分を分離した（６０００ｒｐｍ、５分）。分離した溶液を活性炭（クラレコールＧＬＣ、クラレケミカル社製）３０ｇと接触させ、続けて０．２μｍメンブランフィルターによってろ過を行った。最後にイオン交換水２００ｇを添加し減圧下でエタノールを留去し、その後、水分量を調整して「緑茶抽出物Ｂ」を得た。緑茶抽出物Ｂ中の非重合体カテキン類濃度は０．１３質量％、カフェイン濃度は０．００３４質量％、ガレート体率は４６．４質量％、カフェイン／非重合体カテキン類との質量比は０．０２６であった。
【００５６】
実施例１
調製例１で得られたリポソーム懸濁液Ａ１．０ｍＬと、調製例９で得られた緑茶抽出物Ａ（非重合体カテキン類濃度１９７ｍｇ／１００ｍＬ）１．０ｍＬとを２５℃で混合した。混合物を２５℃にて３０分震盪しつつ、インキュベートした。次いで、分離操作として４℃、１６６０００Ｇ（回転数５００００ｒｐｍ、３０分）の条件にて遠心分離を行い、リポソーム相を沈殿させ、上澄みの液相を除去した。沈殿相の精製緑茶抽出物を回収した。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。なお、沈殿相中の非重合体カテキン類及びカフェインの各取り込み率は、遠心分離によってリン脂質が１００％沈降したとして配合質量を元に換算した。その結果を表１に示す。
【００５７】
実施例２
リポソーム懸濁液Ａの代わりに、調製例２で得られたリポソーム懸濁液Ｂ０．５ｍＬを、また緑茶抽出物Ａの代わりに、緑茶抽出物Ｂを１．０ｍＬと、リン酸バッファ（１７ｍＭ―Ｎａ2ＨＰＯ4＋４９ｍＭ−ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ６．４）０．５ｍＬを用い、これらを６０℃で３００分混合したこと以外は、実施例１と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を表１に示す。
【００５８】
比較例１及び２
リポソーム懸濁液Ａの代わりに、調製例７で得られた脂質懸濁液Ａを０．４ｍＬ用い、緑茶抽出物Ａ１．０ｍＬとリン酸バッファ０．６ｍＬとともに、２５℃又は６０℃で混合したこと以外は、実施例１と同様の操作を行い、水相の上部に浮上した脂質相を回収し、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を表１に示す。
【００５９】
比較例３及び４
リポソーム懸濁液Ａの代わりに、調製例８で得られた脂質懸濁液Ｂを０．４ｍＬ用い、緑茶抽出物Ａ１．０ｍＬとリン酸バッファ０．６ｍＬとともに、２５℃又は６０℃で混合したこと以外は、実施例１と同様の操作行い、水相の上部に浮上した脂質相を回収し、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を表１に示す。
【００６０】
【表１】
2016082966.tif 000002
【００６１】
実施例３〜６
リポソーム懸濁液Ａと、緑茶抽出物Ａと、リン酸バッファとの混合割合を表２に示す量に変更し、更に実施例４及び５においては混合時間を６０分に変更したこと以外は、実施例１と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を実施例１の結果とともに表２に示す。
【００６２】
【表２】
2016082966.tif 000003
【００６３】
実施例７〜９
リポソーム懸濁液Ａの代わりに、調製例３〜５で得られたリポソーム懸濁液Ｃ〜Ｅをそれぞれ用い、更に実施例８においては混合時間を６０分に変更したこと以外は、実施例１と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を実施例１の結果とともに表３に示す。
【００６４】
【表３】
2016082966.tif 000004
【００６５】
実施例１０
緑茶抽出物Ａの代わりに、緑茶抽出物Ｂを用い、混合時間を３００分に変更したこと以外は、実施例１と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を実施例２の結果とともに表４に示す。
【００６６】
実施例１１
混合温度を６０℃にしたこと以外は、実施例１０と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を実施例２の結果とともに表４に示す。
【００６７】
実施例１２
混合温度を２５℃に変更したこと以外は、実施例２と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を実施例２の結果とともに表４に示す。
【００６８】
実施例１３、１４
リポソーム懸濁液Ａの代わりに、調製例６で得られたリポソーム懸濁液Ｆ １．０ｍＬと、また緑茶抽出物Ａの代わりに、緑茶抽出物Ｂ １．０ｍＬとを、５℃又は６０℃で３０分混合したこと以外は、実施例１と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を実施例２の結果とともに表４に示す。
【００６９】
【表４】
2016082966.tif 000005
【００７０】
実施例１５
リン脂質として、大豆ホスファチジルコリン（コートソームＮＣ２０、日油株式会社製相転移温度の測定値：―１０℃）を０．８０６ｇと、緑茶抽出物粉末（非重合体カテキン類濃度３２質量％）を０．２４７ｇとを、１０．０１４ｇのイオン交換水と混合した。混合物を２５℃にて３０分震盪しつつ、インキュベートした。震盪後の混合物を１．０ｍＬ採取し、混合後懸濁液組成の分析を行った。次いで、分離操作として２５℃、１０００Ｇ（回転数３０００ｒｐｍ）３０分の条件にて遠心分離を行い、リン脂質相を沈殿させ、上澄みの液相を除去した。沈殿相の精製緑茶抽出物を回収した。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を表５に示す。
【００７１】
実施例１６
リン脂質として、大豆ホスファチジルコリンを０．２０３ｇと、緑茶抽出物粉末を０．１２４ｇとを、１０．００９ｇのイオン交換水と混合した以外は、実施例１５と同様の操作により、精製緑茶抽出物を得た。得られた精製緑茶抽出物について分析を行った。その結果を表５に示す。
【００７２】
【表５】
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【００７３】
表１〜５から、茶抽出物とリン脂質とを混合し、混合液中からリン脂質相を回収することで、カフェインが低減された精製茶抽出物が得られることがわかる。