(57)【要約】      （修正有）【課題】マウスクロナール抗体の精製に有用である、アルカリ耐性能が向上したプロテインG変異体の提供。【解決手段】特定の配列で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したプロテインG変異体であって、特定の配列で表されるアミノ酸配列の８番目のGをＣ、D、E及びY以外のアミノ酸に置換し、３７番目のGをC、F、I、P、Q、R、Y以外のアミノ酸に置換した、抗体結合能を有し、アルカリ溶液耐性能が向上したプロテインG変異体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、３又は４で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したプロテインG変異体であって、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列の８番目のGをC、D、E及びY以外のアミノ酸に置換し、３７番目のGをC、F、I、P、Q、R、Y以外のアミノ酸に置換した、抗体結合能を有し、アルカリ溶液耐性能が向上したプロテインG変異体。
【請求項２】
配列番号２、３又は４で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体を１〜８個含むプロテインG変異体であって、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列の８番目のGをC、D、E及びY以外のアミノ酸に置換し、３７番目のGをC、F、I、P、Q、R、Y以外のアミノ酸に置換した、抗体結合能を有し、アルカリ溶液耐性能が向上したプロテインG変異体。
【請求項３】
配列番号２、３又は４で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体を５個含む、請求項２記載のプロテインG変異体。
【請求項４】
配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの８番目のGをA、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロテインG変異体。
【請求項５】
配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの８番目のGをF、I、L、M、S、T及びVのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項４記載のプロテインG変異体。
【請求項６】
配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの８番目のGをS又はTのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項５記載のプロテインG変異体。
【請求項７】
配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの３７番目のGをA、D、E、H、K、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロテインG変異体。
【請求項８】
配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの３７番目のGをD、H、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項７に記載のプロテインG変異体。
【請求項９】
配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの３７番目のGをH又はWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項８に記載のプロテインG変異体。
【請求項１０】
配列番号２で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインPGBに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体を５個含む、請求項２記載のプロテインG変異体。
【請求項１１】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの８番目のGをA、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロテインG変異体。
【請求項１２】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの８番目のGをF、I、L、M、S、T及びVのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１１記載のプロテインG変異体。
【請求項１３】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの８番目のGをS又はTのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１２記載のプロテインG変異体。
【請求項１４】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの３７番目のGをA、D、E、H、K、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のプロテインG変異体。
【請求項１５】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの３７番目のGをD、H、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１４に記載のプロテインG変異体。
【請求項１６】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの３７番目のGをH又はWのいずれかのアミノ酸に置換した、請求項１５に記載のプロテインG変異体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプロテインG変異体に抗体を結合させ、次いで抗体を溶出させることを含む、抗体の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルカリ耐性能が向上したプロテインG変異体に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテインG、プロテインA等の抗体に特異的に結合するタンパク質が知られており、プロテインAがマウスIgGと結合しないのに対して、プロテインGはマウスIgGと結合するため、マウスモノクローナル抗体の精製に有用である。
【０００３】
上記の抗体に特異的に結合するタンパク質を用いて抗体を精製する場合、該タンパク質を固相化したカラム等を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行うが、固相化カラムを洗浄する場合に、アルカリ溶液を用いることがあった。しかしながら、前記抗体に結合するタンパク質はアルカリ耐性が小さく、アルカリ溶液により抗体結合能が低下してしまう。
【０００４】
プロテインAについては、アルカリ耐性が向上した変異体が知られていた（特許文献１〜３を参照）。
【０００５】
一般的には、タンパク質のアルカリ溶液に弱いアミノ酸残基としてアスパラギン残基が知られ、特にその隣の残基がグリシンの場合（NG配列）、最も分解を受けやすいことが報告されていた（特許文献４を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2005-538693号公報
【特許文献２】特表2010-504754号公報
【特許文献３】特開2006-304633号公報
【特許文献４】特表2002-527107号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アルカリ耐性能が向上したプロテインG変異体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、アルカリ溶液による洗浄によっても抗体結合能が低下しないプロテインGの開発を目指して鋭意検討を行った。そこで、プロテインGの３つのイムノグロブリン結合ドメインに２つずつのNG配列があることに着目した。本発明者は、３つのイムノグロブリン結合ドメインのうち、B1(2)の２つのNG配列のGを他のアミノ酸に置換した場合にアルカリ溶液耐性能が向上するか否か確認した。その結果、NG配列のGを特定のアミノ酸に置換した場合にアルカリ溶液耐性能が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  配列番号２、３又は４で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したプロテインG変異体であって、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列の８番目のGをC、D、E及びY以外のアミノ酸に置換し、３７番目のGをC、F、I、P、Q、R、Y以外のアミノ酸に置換した、抗体結合能を有し、アルカリ溶液耐性能が向上したプロテインG変異体。
[２]  配列番号２、３又は４で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体を１〜８個含むプロテインG変異体であって、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列の８番目のGをC、D、E及びY以外のアミノ酸に置換し、３７番目のGをC、F、I、P、Q、R、Y以外のアミノ酸に置換した、抗体結合能を有し、アルカリ溶液耐性能が向上したプロテインG変異体。
[３]  配列番号２、３又は４で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体を５個含む、[２]のプロテインG変異体。
[４]  配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの８番目のGをA、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、[１]〜[３]のいずれかのプロテインG変異体。
[５]  配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの８番目のGをF、I、L、M、S、T及びVのいずれかのアミノ酸に置換した、[４]のプロテインG変異体。
[６]  配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの８番目のGをS又はTのいずれかのアミノ酸に置換した、[５]のプロテインG変異体。
[７]  配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの３７番目のGをA、D、E、H、K、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、[１]〜[６]のいずれかのプロテインG変異体。
[８]  配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの３７番目のGをD、H、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、[７]のプロテインG変異体。
[９]  配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの３７番目のGをH又はWのいずれかのアミノ酸に置換した、[８]のプロテインG変異体。
[１０]  配列番号２で表されるプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインPGBに含まれる２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換したイムノグロブリン結合ドメイン変異体を５個含む、[２]のプロテインG変異体。
[１１]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの８番目のGをA、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、[１]〜[３]のいずれかのプロテインG変異体。
[１２]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの８番目のGをF、I、L、M、S、T及びVのいずれかのアミノ酸に置換した、[１１]のプロテインG変異体。
[１３]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの８番目のGをS又はTのいずれかのアミノ酸に置換した、[１２]のプロテインG変異体。
[１４]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの３７番目のGをA、D、E、H、K、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、[１０]〜[１３]のいずれかのプロテインG変異体。
[１５]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの３７番目のGをD、H、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換した、[１４]のプロテインG変異体。
[１６]  配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインPGBの３７番目のGをH又はWのいずれかのアミノ酸に置換した、[１５]のプロテインG変異体。
[１７]  [１]〜[１６]のいずれかのプロテインG変異体に抗体を結合させ、次いで抗体を溶出させることを含む、抗体の精製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインのNG配列のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換したプロテインG変異体は、抗体結合能を維持しており、なおかつアルカリ溶液耐性が向上している。
【００１１】
本発明のプロテインG変異体は、抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製に用いた後にアルカリ溶液を用いて洗浄しても分解せず抗体結合能も低下しないので、繰り返し抗体の精製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プロテインGの構造を示す図である。
【図２】プロテインG配列中の３つのイムノグロブリン結合ドメインの配列（B1）のアラインメントを示す図である。図中、B1の後の括弧内の数字はN末端側から出現する順番を表す。また、図中の＊印は３つすべての配列で保存されたアミノ酸の位置を示す。
【図３】PGB（B1(2))の８番目のアミノ酸残基（グリシン）をシステイン以外の他のアミノ酸に置換した時のアルカリ溶液に対する耐性を示す図である。図中のWTは置換する前の野生型を表し、AからYは置換したアミノ酸を一文字表記で示したものである。
【図４】PGBの３７番目のアミノ酸残基（グリシン）をシステイン以外の他のアミノ酸に置換した時のアルカリ溶液に対する耐性を示す図である。図中のWTは置換する前の野生型を表し、AからYは置換したアミノ酸を一文字表記で示したものである。
【図５】野生型および変異体プロテインG固定化カラムの抗体結合量に対するアルカリ洗浄の影響を示す図である。図中のWTは置換する前の野生型を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
プロテインGとは、Streptococci（連鎖状球菌、ストレプトコッカス）の細胞壁成分であり、これらのタンパク質は、多くのほ乳類のイムノグロブリンと結合する能力を有する。特にプロテインAがマウス抗体に結合しないのに対して、プロテインGはマウス抗体に結合するので、マウスモノクローナル抗体等のマウス抗体の精製に用いることができる。
【００１５】
本発明は、野生型プロテインGの抗体結合能を維持し、アルカリ耐性能が向上したプロテインG変異体である。
【００１６】
プロテインGは図１に示す構造を有しており、３つのアルブミン結合ドメインと３つのイムノグロブリン結合ドメイン（B1(1)、B1(2)及びB1(3)）を有する。
【００１７】
野生型プロテインGのイムノグロブリン結合ドメインB1(2)をコードするDNA配列を配列番号１に示し、アミノ酸配列を配列番号２に示す。本発明において、B1(2)ドメインをPBGとも呼ぶ。また、B1(1)及びB1(3)のアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号３及び４に示す。なお、B1(1)及びB1(3)はB1(2)の等機能変異体（functional variant)である。ここで、イムノグロブリン結合ドメインの等機能変異体とは、元となるイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において、部分的にアミノ酸の欠失、置換、付加を有するが、イムノグロブリンに結合するという機能を保持している変異体をいう。
【００１８】
野生型プロテインGのイムノグロブリン結合ドメインB1(1)、B1(2)及びB1(3)には、NGで表わされる配列が、７番目及び８番目のアミノ酸の位置並びに３６番目及び３７番目の位置の２箇所ある。本発明のプロテインG変異体はこれらの３ドメインに２箇所ずつ存在するNG配列中のGの少なくとも１つを置換し、NG配列以外の配列にした変異体である。すなわち、配列番号２、３又は４で表されるアミノ酸配列からなるイムノグロブリン結合ドメインの２箇所のNG配列からなるアミノ酸配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換した変異体である。好ましくは、本発明のプロテインG変異体は、配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるPGB（B1(2）)の２つのNG配列の少なくとも１つのGを他のアミノ酸に置換した変異体であり、さらに好ましくは、８番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換するか、３７番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換する。また、８番目のGと３７番目のGの両方を他のアミノ酸に置換してもよい。
【００１９】
さらに、本発明のプロテインG変異体は、イムノグロブリン結合ドメインとして、８番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換するか、３７番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換するか、あるいは８番目のGと３７番目のGの両方を他のアミノ酸に置換したB1(1)、B1(2)(PGB)又はB1(3)イムノグロブリン結合ドメイン変異体のみを含むプロテインG変異体である。好ましくは、８番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換するか、３７番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換するか、あるいは８番目のGと３７番目のGの両方を他のアミノ酸に置換したB1(2)(PGB)イムノグロブリン結合ドメイン変異体のみを含む。本発明のプロテインG変異体における上記のPGBイムノグロブリン結合ドメイン変異体の数は限定されず、少なくとも１つを含んでいればよい。好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは２〜８個、さらに好ましくは３〜７個、さらに好ましくは４〜６個、特に好ましくは５個のイムノグロブリン結合ドメイン変異体を含む。このようなプロテインG変異体の例として、PGBの３７番目のGがAに置換されるように変異導入し、これを５つ連結した配列（G37A、配列番号１２）、PGBの８番目のGがWに置換されるように変異導入し、これを５つ連結した配列（G37W、配列番号１４）、PGBの８番目のGがAに、３７番目のGがAになるように二重変異を導入し、これを５つ連結した配列（G8A/G37A、配列番号１３）、PGBの８番目のGがSに、３７番目のGがWになるように二重変異を導入し、これを５つ連結した配列（G8S/G37W、配列番号１５）、及びPGBの８番目のGがSに、３７番目のGがMになるように二重変異を導入し、これを５つ連結した配列（G8S/G37M、配列番号１６）が挙げられる。
【００２０】
さらに、本発明のプロテインG変異体は、上記の８番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換するか、３７番目のGをG以外の他のアミノ酸に置換するか、あるいは８番目のGと３７番目のGの両方を他のアミノ酸に置換したB1(1)、B1(2)(PGB)又はB1(3)イムノグロブリン結合ドメイン変異体からなるタンパク質も含む。該プロテインG変異体は、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは２〜８個、さらに好ましくは３〜７個、さらに好ましくは４〜６個、特に好ましくは５個のイムノグロブリン結合ドメイン変異体からなる。該プロテインG変異体は、イムノグロブリン結合ドメイン変異体の１量体、２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体、９量体、１０量体等の多量体である。イムノグロブリン結合ドメイン変異体はタンデムに連結されており、イムノグロブリン結合ドメイン変異体の間にはリンカー配列が含まれていてもよい。リンカー配列としては、１〜１５個のアミノ酸配列が挙げられる。例えば、Glu-Lysで表わされる配列やLys-Val-Asp-Gluで表わされるアミノ酸配列をリンカーとして用いることができるが、これらの配列には限定されない。
【００２１】
本発明において、アミノ酸の置換について、例えばイムノグロブリン結合ドメインのアミノ酸配列の８番目のGのAへの置換をG8Aと表し、また、イムノグロブリン結合ドメインPGBの８番目のGのAへの置換をPGB8Aと表す。
【００２２】
上記のプロテインG変異体のイムノグロブリン結合ドメイン変異体において、８番目のGは、C、D、E、Y以外のアミノ酸に置換すればよく、好ましくは、A、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換すればよい。さらに好ましくはF、I、L、M、S、T及びVのいずれかのアミノ酸に置換すればよく、特に好ましくはS又はTのいずれかアミノ酸に置換すればよい。また、３７番目のGは、C、F、I、P、Q、R、Y以外のアミノ酸に置換すればよく、好ましくは、A、D、E、H、K、L、M、N、S、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換すればよく、さらに好ましくはD、H、L、M、N、T、V及びWのいずれかのアミノ酸に置換すればよく、特に好ましくはH又はWのいずれかのアミノ酸に置換すればよい。
【００２３】
本発明のプロテインG変異体は、アミノ酸配列情報又はDNA配列情報に基づいて製造することができ、例えば、遺伝子工学の手法を理由して、リコンビナントタンパク質として製造することができる。
【００２４】
野生型プロテインGのイムノグロブリン結合ドメインのNG配列のアミノ酸を置換することにより、抗体結合能は低下せず維持され、かつアルカリ溶液耐性が向上する。
【００２５】
本発明のプロテインG変異体はアルカリ溶液に対する耐性が大きい。アルカリ溶液に対する耐性が大きいことを、アルカリ感受性が低いともいう。
【００２６】
アルカリ溶液耐性が大きいとは、アルカリ溶液中で分解されずに、抗体結合能を保持し得ることをいい、アルカリ溶液耐性が大きいかどうかは、例えば、プロテインG変異体を水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液に添加し、一定時間放置した後に分解されずに残存したプロテインG量を測定することにより決定することができる。プロテインGの量は、例えば、SDS-PAGEを行いバンドの強度をデンシトメーターで測定することにより決定することができる。デンシトメーターで測定したアルカリ溶液未処理のバンド強度を100％として、アルカリ溶液処理後のバンド強度からバンド残存率を算出することができる。本発明のプロテインG変異体のバンド残存率は、60％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、特に好ましくは90％以上である。
【００２７】
例えば、プロテインG変異体に10mM水酸化ナトリウム溶液を添加し、37℃で24時間放置した後にSDS-PAGEを行った場合に、バンド強度はアルカリ溶液を添加しなかったプロテインG変異体と同等である。
【００２８】
本発明のプロテインG変異体が含むイムノグロブリン結合ドメインは、配列番号２、３及び４で表わされるアミノ酸配列の８番目及び３７番目以外のアミノ酸において、１又は数個のアミノ酸において欠失、置換又は付加があってもよい、１又は数個は、５個以下、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個である。このようなイムノグロブリンのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、３及び４で表わされるアミノ酸配列と95％以上、好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上の配列同一性を有する。
【００２９】
プロテインGを用いてアフィニティークロマトグラフィーにより抗体の精製を行う場合、使用後プロテインGを0.01〜0.5Nの水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を用いて洗浄する。野生型プロテインGはアルカリ溶液を用いた洗浄により、分解し抗体結合能が低下するが、本発明のプロテインG変異体はアルカリ溶液を用いた洗浄によっても抗体結合能が低下しないため繰り返しアフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製に用いることができる。
【００３０】
本発明のプロテインG変異体は、抗体のアフィニティー精製に用いることができる。プロテインG変異体は、マウスの抗体に結合するためマウスモノクローナル抗体を含むマウス抗体のアフィニティークロマトグラフィーによる精製に用いることができる。
【００３１】
アフィニティー精製は、精製しようとする抗体をプロテインG変異体を固定化した担体と結合させ、その後溶出すればよい。
【００３２】
担体としては、Sepharose、Sephadex、Cellulofine等のセルロース、アガロース、デキストラン、シリカ、合成ポリマー等の樹脂が挙げられる。これらの担体へのプロテインG変異体の結合は公知の方法で行うことができる。
【００３３】
本発明は、本発明のプロテインL変異体を固定化した抗体精製用担体および該担体を充填したアフィニティークロマトグラフィー用カラムも包含する。
【００３４】
本発明は、本発明のプロテインG変異体を用いて抗体を精製する方法も包含する。例えば、プロテインG変異体を結合させた担体を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加し、プロテインG変異体に抗体を結合させ、ついで洗浄した後に、溶出液を添加し、抗体を溶出し回収すればよい。具体的には例えば、以下の方法で行うことができる。
【００３５】
アフィニティー精製はバッチ法で行ってもよいし、プロテインG変異体を担体に結合させ、カラムに詰めアフィニティーカラムを製造して行ってもよい。例えば、アフィニティーカラムを用いて精製を行う場合、あらかじめカラムをpH6.0〜8.5の緩衝液で平衡化しておく。この時用いる緩衝液はリン酸ナトリウム、リン酸カリウム等がある。また、該緩衝液は0〜4.0Mまでの塩化ナトリウムや塩化カリウムを含んでいてもよい。例えば、10〜100mM、好ましくは20mMリン酸ナトリウム及び0〜4.0M、好ましくは0.15M塩化ナトリウムを含有する緩衝液を用いることができる。カラムサイズはサンプルとしてアプライする抗体含有混合物の量にもよるが、例えば長さ1〜30cmのものを用いればよい。精製しようとする抗体が含有した混合物をアプライした後に緩衝液、例えばpH6.0〜8.5、好ましくはpH7.0の緩衝液でカラムを洗浄する。この際用いる緩衝液は好ましくは、平衡化に用いた緩衝液である。また、この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で洗浄すればよい。次いで、pH2.0〜pH4.0、好ましくはpH2.5の緩衝液、例えばグリシン緩衝液やクエン酸ナトリウム緩衝液で抗体をカラムから溶出する。この際の溶出用緩衝液の濃度は、10〜100mMが好ましい。この際用いる緩衝液の量は限定されないが、例えば５カラム容量の緩衝液で溶出。溶出液中に目的の抗体が含まれているので回収すればよい。
【００３６】
カラムを用いた後、0.01〜0.5Nの水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ溶液を用いて洗浄することにより、再度用いることができる。
【実施例】
【００３７】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３８】
（実施例１）
プロテインGのイムノグロブリン結合ドメインタンパク質発現プラスミドの作製
図２に記載のプロテインGのイムノグロブリン結合ドメインのうち２番目のドメイン（B1(2)、以下、PGBとする）のアミノ酸配列を含む合成遺伝子を人工遺伝子合成メーカーから入手した。PGBをコードするDNA配列を配列番号１に示し、PGBのアミノ酸配列を配列番号２に示す。当該合成遺伝子の５’側には制限酵素BamHI認識配列を、３’側には制限酵素XhoI認識配列をあらかじめ付与しておき、BamHI/XhoIで処理したｐＥＴ２１ベクター（Novagen）にT4 DNA ligaseを用いて連結後、大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行なう。得られた形質転換体からコロニーPCR法、DNAシーケンス法により陽性クローンを選別し、プラスミドミニキット（FastGene）により、発現用プラスミドpET21-PGBを得た。
【００３９】
（実施例２）
PGB変異体ライブラリーの作製１
PGBのアミノ酸配列のうち、８番目のグリシン残基を、システインを除く１８種類のアミノ酸に変異させたライブラリーを作製するために、pET21-PGBプラスミドを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６のプライマー、QuickChang Site-directed Mutagenesis kit（Stratagene社）を用いた、クイックチェンジ法により、PGB8X遺伝子ライブラリーを取得した。ここで記載したPGB8Xとは、PGBの８番目のアミノ酸残基がアミノ酸Xに置換したことを示すものである（Xはアミノ酸を一文字表記した時のアルファベットを一般化したものとする）。
【００４０】
次いで、pET21-PGB8Xライブラリーを用いて、大腸菌ＤＨ５αの形質転換を行なった。１００個程度の独立したコロニーから、そのプラスミドの塩基配列をDNAシーケンス法により確認し、１８種類のアミノ酸に置換された発現プラスミドを取得した。
【００４１】
（実施例３）
PGB変異体ライブラリーの作製２
PGBのアミノ酸配列のうち、３７番目のグリシン残基に変異を導入した発現プラスミドを取得するために、配列番号７及び配列番号８のプライマーを用いる以外は実施例２と同様の手法でpET21-PGB37Xライブラリーを取得し、次いで、独立したコロニーから３７番目のグリシン残基がシステインを除く１８種類のアミノ酸に置換された発現プラスミドを取得した。
【００４２】
（実施例４）
PGB及びPGB変異体タンパク質の取得
作製したプラスミドpET21-PGB、１８種類のpET21-PGB8X、１８種類のpET21-PGB37Xを用いて、大腸菌BL21(DE3)の形質転換を行ない、１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢプレートに塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーを１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含んだＬＢ培地に移し、３７℃で一晩培養した。培養液１００μＬを１００μｇ/ｍＬのアンピシリンを含んだＴＢ培地１０ｍＬに移し、３７℃で３時間培養した後に、ＩＰＴＧ（終濃度0.5mM）を添加し、２０℃で１８時間培養する。培養終了後、１０，０００ｇ、１０分間の遠心により菌体を回収し、１ｍＬのＰＢＳに懸濁する。懸濁した菌体を超音波処理により破砕し、１０，０００ｇ、１０分間の遠心により、可溶性画分を得た。PGB及びPGB変異体はＣ末端にヒスチジンタグを保有するので、可溶性画分からHisSpin Trap（GEヘルスケア）を用いて、精製タンパク質溶液を得た。このタンパク質溶液は透析法により蒸留水に溶媒置換を行ない、凍結保存した。
【００４３】
（実施例５）
PGB及びPGB変異体タンパク質のアルカリ耐性能
PGB及びPGB変異体タンパク質に終濃度１０ｍＭとなるように水酸化ナトリウム溶液を添加し、３７℃で２４時間放置した。２４時間後、酢酸を加えて中性にし、水酸化ナトリウム未処理のものとともに、SDS-PAGEを行なった。ＣＢＢ染色を行ない、水酸化ナトリウム溶液処理前後のPGB及びPGB変異体タンパク質のバンド強度を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://imagej.nih.gov/ij/）を用いて定量し、水酸化ナトリウム溶液処理後のバンドの残存率を（アルカリ処理後バンド強度）/（アルカリ処理前バンド強度）×１００の計算式で算出した。図３には８番目のアミノ酸残基の置換によるアルカリ処理によるバンド残存率の変化を、図４には３７番目のアミノ酸残基の置換によるアルカリ処理によるバンド残存率の変化をグラフ化したものを示す。
【００４４】
一般に、Asn-Gly（NG）又はAsn-Ser（NS）配列、特にNG配列が、アルカリ耐性が弱い配列として報告されている。今回作製したPGB変異体は８番目又は３７番目のグリシン残基に変異を導入することで、PGB配列中のNG配列をNX配列（Xは任意のアミノ酸を示す）に置換したものであり、すべての変異体において、野生型PGBよりもアルカリ耐性能が高くなるものとの想定であった。しかし、８番目のグリシン残基をD、E、Yへ置換した変異体、３７番目のグリシン残基をF、I、P、Q、R、Yへ置換した変異体は野生型PGBよりもアルカリ耐性が弱まるという予期しない結果が得られた。さらに、８番目のグリシンをセリンに置換した変異体は、NG配列に次いでアルカリ耐性が弱いとして知られているNS配列となるにも関わらず、８番目の残基の変異体の中でも２番目にアルカリ耐性が高い変異体であるとの結果が得られ、両残基への変異の導入は一般的なアルカリ耐性配列の適用外であり、本タンパク質特有の事象であることが示された。
【００４５】
（実施例６）
野生型PGB連結プロテインGの作製
野生型プロテインGとしてPGBを５つ連結した配列（配列番号９）をコードする合成遺伝子を人工遺伝子合成メーカーから入手した。その際、Brevibacillus choshinensis用発現ベクターpNY326に導入するために、５’側に制限酵素NcoI配列を含むccatggctttcgct（配列番号１０）を、３’側に終止コドンと制限酵素HindIII配列を含むtagaagctt（配列番号１１）を付与しておいた。NcoI/HindIIIで処理したpNY326に同処理を行なったプロテインG遺伝子をT4 DNA ligaseを用いて連結後、Brevibacillus choshinensis HPD31株の形質転換を行なった。得られた形質転換体からコロニーPCR法、DNAシーケンスにより陽性クローンを選別し、プラスミドミニキット（FastGene）により、野生型プロテインG発現用プラスミドpNY326-PGwtを得た。
【００４６】
pNY326-PGwtにて形質転換したBrevibacillus choshinensis HPD31株をＴＭＮ培地（1％ ポリペプトン、0.5％ 肉エキス、0.2％ 酵母エキス、0.001％ FeSO47H2O、0.0001% ZnSO47H2O、0.001% MnSO47H2O、1％ グルコース、50μg/mL ネオマイシン）で３０℃、４８時間培養を行なう。培養終了後、１０，０００ｇ、１０分間の遠心により培養上清を回収し、０．２μｍのフィルターでろ過滅菌を行なった。滅菌後の培養上清から、IgG sepharose（ＧＥヘルスケア）を用いて、分泌生産された野生型PGB連結プロテインGタンパク質の精製を行ない、蒸留水に溶媒置換したものを野生型PGB連結プロテインG溶液とし、使用まで凍結保存した。
【００４７】
（実施例７）
変異体プロテインGの作製
表１に示すPGB変異体を５つ連結した配列をコードする合成遺伝子を人工遺伝子合成メーカーから入手、実施例と同様に変異体プロテインGを作製した。ここでG37AはPGBの３７番目のGがAに置換されるように変異導入し、これを５つ連結した配列、G37WはPGBの３７番目のGがWに置換されるように変異導入し、これを５つ連結した配列、G8A/G37AはPGBの８番目のGがAに、３７番目のGがAになるように二重変異を導入し、これを５つ連結した配列、G8S/G37WはPGBの８番目のGがSに、３７番目のGがWになるように二重変異を導入し、これを５つ連結した配列、G8S/G37MはPGBの８番目のGがSに、３７番目のGがMになるように二重変異を導入し、これを５つ連結した配列であることを表す。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
（実施例８）
プロテインG固定化カラムの作製と抗体結合容量の測定
１０ｍｇの野生型PGB連結プロテインGまたは変異体プロテインGを１ｍＬのセルファインホルミル（JNC）に常法に従い固定化を行ない、プロテインG固定化カラムを作製した。作製したプロテインG固定化カラム１ｍＬに対して、ウサギ標準血清を１０ｍＬ加え、１時間放置する。ＰＢＳで洗浄した後に、２５ｍＭ  グリシン緩衝液（pH2.5）によって、プロテインG固定化カラムに結合した抗体を溶出した。溶出された抗体はトリス緩衝液（pH9.0）添加により中性にした後、２８０ｎｍの吸光度を測定することで、定量した。
【００５０】
（実施例９）
プロテインG固定化カラムのアルカリ耐性能
上記のように作製した野生型PGB連結プロテインGおよび変異体プロテインG固定化カラムがアルカリ洗浄に対し、どの程度の耐性があるか調べるため、抗体の結合、洗浄、酸溶出、蒸留水に置換、長時間でのアルカリ溶液での洗浄（５０ｍＭ  ＮａＯＨ水酸化ナトリウム、溶液に１時間暴露）蒸留水に置換、ＰＢＳに置換という工程を１サイクルとして繰り返し、各サイクルで溶出された抗体の定量を行なった。対照として、市販のプロテインG固定化カラム（Protein G-Sepharose 4 Fast Flow、ＧＥヘルスケア）を用い、１サイクル目の抗体溶出量を100%として、抗体結合能がどのように変化したかを示したものが、図５である。野生型PGB連結プロテインG固定化カラム（WT）および既存製品であるProtein G-Sepharose 4 Fast Flow（GE）と比して、作製した５つのプロテインG変異体固定化カラムはいずれも抗体結合能の低下が減少しており、アルカリ洗浄工程に対して、耐久性が高くなったとの結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のプロテインG変異体を用いて抗体を繰り返し精製することができき、効率的な抗体精製が可能になる。
【配列表フリーテキスト】
【００５２】
配列番号５〜８  プライマー
配列番号１０、１１  合成
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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