(57)【要約】      （修正有）【課題】マダニ科のダニによって媒介される原虫の一種のヒトおよび家畜感染性バベシア類として、イヌバベシア、ウシバベシア、ウマバベシア、げっ歯類バベシアの増殖抑制剤、治療剤及び予防剤の提供。【解決手段】クロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、イヌバベシア、ウマバベシア、ウシバベシア、げっ歯類バベシア等のバベシア類の増殖抑制用薬剤、並びに、ヒトおよび家畜におけるバベシア類感染症の治療用又は予防用薬剤等。クロファジミンとは、２−（４−クロロアニリノ）−３−イソプロピルイミノ−５−（４−クロロフェニル）３，５−ジヒドロフェナジンのであり、フェナジン系化合物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、バベシア類の増殖抑制用薬剤。
【請求項２】
クロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、バベシア類感染症の治療用又は予防用薬剤。
【請求項３】
ヒト又は家畜動物におけるバベシア類の感染症を治療又は予防するための、請求項２に記載の治療用又は予防用薬剤。
【請求項４】
バベシア類が、ヒトおよび家畜感染性バベシアである請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項５】
バベシア類が、イヌバベシア、ウマバベシア、ウシバベシア、げっ歯類バベシアである請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項６】
バベシア類が薬剤耐性バベシアである請求項１〜５のいずれか１項に記載の薬剤。
【請求項７】
経口投与形態又は非経口的投与形態である請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フェナジン系化合物クロファジミン（ｃｌｏｆａｚｉｍｉｎｅ）を有効成分として含有するヒトおよび家畜のバベシア症の治療剤及び予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
バベシア症は主に家畜動物に発症するバベシア感染症である。イヌバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）、ウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、ウマバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、  Ｂａｂｅｓｉａ  （Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）  ｅｑｕｉ）、げっ歯類バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）などがあり、これらはマダニ科のダニによって媒介され、吸血により感染する。バベシアは赤血球内で増殖を繰り返すため、発熱、脾腫、貧血、血色素尿を呈し、その死亡率は１０〜５０％に至る。また、げっ歯類バベシアはヒトにも感染することが報告されており、人獣共通感染症として認識されている。ヒトのバベシア症の場合、特に高齢者、脾臓摘出患者、ＡＩＤＳ患者においては死に至る場合がある。また、不顕性感染の場合があり、輸血などで他者への感染が危惧される。
【０００３】
家畜に対するバベシア症には、既存の薬剤としてガナゼック（ジミナゼンアセチュレート）、イミドカルブ、フェナミジン、トリパンブルーが用いられるが、いずれも原虫を完全に殺滅することが困難であり、また肝毒性といった重篤な副作用を伴うこと、また、その残留性が問題となっている。さらにはこれら薬剤に耐性を持つバベシアの出現が報告されている。ヒトのバベシア症の治療にはアジスロマイシンとアトバコンの併用、又はキニンとクリンダマイシンの併用を用いるが、新たな治療薬は開発されていない。
【０００４】
このように、既存の抗バベシア薬の欠点を克服する新規な抗バベシア薬剤の開発が望まれている。特に中南米、アフリカ、アジア、オセアニア諸国などでの大規模な家畜経営において家畜のバベシア症は生産性の低下をもたらし、食糧経済問題につながることが危惧される。さらに、最近における地球規模での環境変化によりバベシア類の流行地域がさらに拡大傾向の様相を呈している。従って今後殺原虫効果が高く、かつ宿主に対する毒性が低い新規抗バベシア薬開発の必要性が極めて高いものと考えられている。
【０００５】
抗バベシア薬の開発においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効果が確認されたものは報告されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは効果が確認できない、毒性が確認される、一部のバベシアに対して効果を示さない等の問題があり、安全な薬剤は見出されていない。
【０００６】
クロファジミンは抗結核作用、抗炎症作用、免疫抑制作用が報告されており、ハンセン病治療薬として知られている化合物である（特許文献１および非特許文献１）。例えば特許文献１にはクロファジミンの製造法及び性状が開示されている。しかしながら、クロファジミンとバベシアとの関係は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２，９４８，７２６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍ．Ｃ．Ｃｈｏｌｏ，Ｈ．Ｃ．Ｓｔｅｅｌ，Ｐ．Ｂ．Ｆｏｕｒｉａ  Ｗ．Ａ．  Ｇｅｒｍｉｓｈｕｉｚｅｎ＆Ｒ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ：Ｃｌｏｆａｚｉｍｉｎｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ２９：２９０−２９８，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
よって、本発明の目的は、バベシア類、例えば、イヌバベシア、ウシバベシア、ウマバベシア、げっ歯類バベシアの感染によるヒトおよび家畜のバベシア症の治療および予防のための新規の医薬組成物を提供することである。また、本発明の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのみならず、ｉｎ  ｖｉｖｏで有効であり、毒性が低く、臨床において適用可能なヒトおよび家畜のバベシア症の治療剤および予防剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上述の既存の抗バベシア薬における種々の問題点を解決すべく、種々のバベシアに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で有効な化合物について鋭意研究したところ、クロファジミンがバベシア類の増殖抑制に対して優れた有効性を示し、かつ、毒性の低い化合物であることを見出した。特に、本発明者らは、クロファジミンがバベシア感染動物モデルにおいて優れた治療効果と安全性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
よって、本発明は、バベシア類、例えば、イヌバベシア、ウシバベシア、ウマバベシア、げっ歯類バベシアなどのヒトおよび家畜への感染症の治療及び予防、並びにバベシア類の増殖抑制のための新規の医薬組成物として、クロファジミンを提供するものである。
具体的には、本発明は、クロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するバベシア類の増殖抑制剤に関する。また、本発明はクロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩を投与することを特徴とするバベシア類の増殖抑制方法に関する。
【００１２】
本発明はまた、クロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、バベシア類の感染治療剤及び予防剤に関する。また、本発明はクロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩を投与することを特徴とするバベシア類の感染症の治療方法及び予防方法に関する。
【００１３】
本明細書において、「クロファジミン」とは、下記式で表わされる、化学名が２−（４−クロロアニリノ）−３−イソプロピルイミノ−５−（４−クロロフェニル）３，５−ジヒドロフェナジンであり、分子式Ｃ２７Ｈ２２Ｃｌ２Ｎ４で表される分子量４７３．４０のフェナジン系化合物である。
【００１４】
【化１】
2016164125.tif 000002
【００１５】
クロファジミンは二級又は三級のアミン基を有することから、水溶液中等においてプロトンが配位して塩基となることができる。本明細書においてクロファジミンとは、このようなクロファジミンの（遊離）塩基を包含する。また、同様に本明細書におけるクロファジミンは、このようなクロファジミンの塩基と無機又は有機の酸とが結合して形成した塩であって、医薬として体内に投与することが許容可能な塩を包含する。「薬理学的に許容される塩」とは、クロファジミンが、無機又は有機の塩基又は酸と結合して形成した塩であって、医薬として体内に投与することが許容可能な塩のことである。このような塩は、例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９（１９７７）等に記載されている。塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸の塩；メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸、酢酸、プロピオン酸塩、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、ケイ皮酸、乳酸、グリコール酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、サリチル酸等の有機酸との塩；又はアスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸との塩などを挙げることができる。なお、クロファジミンの水和物又は溶媒和物およびクロファジミンの塩の水和物又は溶媒和物も本発明のクロファジミンに包含される。
【００１６】
本明細書において、「バベシア類」とは、アピコンプレクサ門胞子虫綱ピロプラズマ目に属する原虫である。本明細書において、バベシア類としては、ヒト又は家畜に感染する能力を有するバベシア類（ヒト又は家畜感染性バベシア）が好ましい。バベシア類がヒト又は家畜に感染性であるか否かは、公知の文献により、又は被験動物由来の赤血球に被験バベシア類を接触させ、バベシア類が増殖するか否かを測定し、増殖する場合には該被験動物に感染性であると判定することにより調べることができる。バベシア類は、イヌバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）、ウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、ウマバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ）およびタイレリア（Ｂａｂｅｓｉａ  （Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）  ｅｑｕｉ）、並びに、げっ歯類バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）を含む。バベシア類として、好ましくは、イヌバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）、タイレリア（Ｂａｂｅｓｉａ  （Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ）  ｅｑｕｉ）、及びげっ歯類バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）である。また、本明細書において、バベシア類として好ましくは、薬剤耐性バベシア類である。薬剤耐性バベシア類が耐性を示す薬剤としては、抗バベシア薬として用いられているか、又は用いることができる薬剤であれば特に限定されるものではなく、例えば、ガナゼック（ジミナゼンアセチュレート）、イミドカルブ、フェナミジン、又はトリパンブルーを挙げることができる。被験バベシア類が薬剤耐性バベシア類であるか否かは、該バベシア類に関する公知の情報により知ることができる。あるいは、被験バベシア類が薬剤耐性バベシア類であるか否かは、被験バベシア類を抗バベシア作用が発揮可能な濃度の前記抗バベシア薬と共に動物由来の赤血球に接触させ、バベシア類が増殖するか否かを測定し、増殖する場合には該被験バベシア類は薬剤耐性バベシア類であると判定することにより調べることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】クロファジミンのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗バベシア活性試験の結果を示すグラフである。縦軸は原虫感染赤血球率（Ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ）（％）を示し、横軸はバベシア投与後の経過日数（Ｄａｙｓ  ｐｏｓｔ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）を示す。黒丸は薬剤無添加の陰性対照群を示し、白丸はクロファジミンを２０ｍｇ／ｋｇで経口投与した群を示し、三角はクロファジミンを２０ｍｇ／ｋｇで腹腔投与した群を示し、逆三角はガナゼックを２５ｍｇ／ｋｇで皮下投与した群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
前記の式（Ｉ）で表されるフェナジン系化合物であるクロファジミンは、ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ２，９４８，７２６記載の方法に従って製造することができる。また、クロファジミンは、市販品（例えば、Ｓｉｇｍａ社、米国）として購入することもできる。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、経口投与形態、又は注射剤（筋肉注射、静脈内注射、皮下注射）、点滴剤等の非経口投与形態で用いることができる。本発明のバベシア類の増殖抑制方法、並びに、バベシア類感染症の治療方法及び予防方法は、クロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩の有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。クロファジミン、クロファジミンの遊離塩基又はその薬理学的に許容される塩により治療又は予防する対象としては、哺乳動物が好ましく、特には、ヒト及び家畜動物（犬、猫、馬、羊、山羊、牛、豚、驢馬、駱駝、アルパカ、モルモット、兎、ミンク、ラット、及びネズミ等の哺乳類）であり、更に好ましくは、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、及びげっ歯類であり、最も好ましくは、ヒト、ウシ、及びウマである。本化合物を哺乳動物等に投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤等として経口投与してもよいし、又は、注射剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。また、家畜等へ投与する場合、飼料等へ混和した形で投与することができる。投与量は症状の程度、年齢、疾患の種類等により異なるが、通常成人１日当たり５０ｍｇ〜５００ｍｇを１日１〜数回に分けて投与する。
【００２０】
本発明のバベシア類の感染治療剤及び予防剤は、通常の薬学的に許容される担体を用いて、常法により製剤化することができる。経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えた後、常法により溶剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤等を添加し、常法により皮下又は静脈内用注射剤とする。
【００２１】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【実施例１】
【００２２】
クロファジミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるバベシア増殖阻害活性
北里大学獣医学部で保有しているイヌバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）を用いて、イヌバベシアに対するクロファジミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗バベシア活性をＭａｔｓｕｕらの方法（Ｍａｔｓｕｕ，  Ａ．，Ｋｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｋａｗａｈａｒａ，  Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．，Ｉｋａｄａｉ，  Ｈ．，Ｈｉｋａｓａ，  Ｙ．，Ｏｋａｎｏ，  Ｓ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．，  Ｖｅｔ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１２４：９−１８．（２００４））に従って測定した。
帯広畜産大学原虫病研究センターで保有しているウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、ウマバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、  Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ）を用いて、これらのバベシアに対するクロファジミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける抗バベシア活性をＢｏｒｋらの方法（Ｂｏｒｋ，Ｓ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  Ｉｋｅｈａｒａ，  Ｙ．，Ｋｕｍａｒ，  Ｓ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，  Ｃ．，Ｉｇａｒａｓｈｉ，  Ｉ．，  Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．，４８：２３６−２４１（２００４））に従って測定した。
【００２３】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉの培養については、Ｍａｔｓｕｕの方法（Ｍａｔｓｕｕ，  Ａ．，Ｋｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，Ｋａｗａｈａｒａ，Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．，Ｉｋａｄａｉ，Ｈ．，Ｈｉｋａｓａ，Ｙ．，Ｏｋａｎｏ，Ｓ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｓ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．，Ｖｅｔ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１２４：９−１８（２００４））にて、維持、継代を行ったものを用いた。すなわち、２４穴培養プレート内で、２０％イヌ血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培養液と新鮮なイヌ赤血球を用いて継代した原虫感染赤血球を希釈し（ヘマトクリット値：５〜１０％、原虫感染赤血球率：０．５〜１％）、３７℃にて５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で培養を行い、毎日の培養液交換と４〜５日毎に新鮮な赤血球を添加して連続培養を行った。
【００２４】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、  Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉの培養については、それぞれＬｅｖｙ  と  Ｒｉｓｔｉｃの方法（Ｌｅｖｙ，  ＭＧ  ａｎｄ  Ｒｉｓｔｉｃ，Ｍ．，Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ：  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｏｕｓ  ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．，２０７：１２１８−１２２０，（１９８５））、Ｖｅｇａらの方法（Ｖｅｇａ，ＣＡ，．  Ｂｕｅｎｉｎｇ，ＧＭ．，  Ｇｒｅｅｎ，ＴＪ．，Ｃａｒｓｏｎ，ＣＡ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ，．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，４６：４１６−４２０（１９８５））、Ｈｏｌｍａｎ  らの方法（Ｈｏｌｍａｎ，ＰＪ．，  Ｆｒｅｒｉｃｈｓ，ＷＭ．，Ｃｈｉｅｖｅｓ，Ｌ．，Ｗａｇｎｅｒ，ＧＧ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｈｏｒｓｅｓ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．，３１：６９８−７０１（１９９３）、Ｈｏｌｍａｎ  らの方法（Ｈｏｌｍａｎ，ＰＪ．，Ｃｈｉｅｖｅｓ，Ｌ．，Ｆｒｅｒｉｃｈｓ，ＷＭ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｄ．，Ｗａｇｎｅｒ，ＧＧ．，Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ  ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  ｓｔａｇｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ａｎ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ．，８０：２３２−２３６  （１９９４））を若干改変し、維持、継代を行ったものを用いた。すなわち、２４穴培養プレート内で、４０％ウシあるいはウマ血漿を添加した１９９（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ，  Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ）あるいはＲＰＭＩ１６４０（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ）培養液と新鮮なウシあるいはウマ赤血球を用いて継代した原虫感染赤血球を希釈し（ヘマトクリット値：５〜１０％、原虫感染赤血球率：０．５〜１％）、３７℃にて５％Ｏ２−５％ＣＯ２−９０％Ｎ２の混合ガス下で培養を行い、毎日の培養液交換と４〜５日毎に新鮮な赤血球を添加して連続培養を行った。
【００２５】
Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉは自然感染した青森の土佐犬から分離し、連続培養で維持した株を用いた。Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓおよびＢａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａはワシントン州立大学獣医学部  Ｇｕｙ  Ｐａｌｍｅｒ教授、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、  Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉは日本競馬界競走馬総合研究所栃木支所金丸卓美所長より分与を受けた。
【００２６】
薬剤感受性試験は、Ｍａｔｓｕｕ  の方法（Ｍａｔｓｕｕ，  Ａ．，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｘｕａｎ，Ｘ．，．Ｉｋａｄａｉ，  Ｈ．，Ｈｉｋａｓａ，  Ｙ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  １５  ｄｒｕｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ（Ａｏｍｏｒｉ  ｓｔｒａｉｎ）  ．，Ｖｅｔ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１５７：１−８（２００８）およびＢｏｒｋらの方法（Ｂｏｒｋ，  Ｓ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，Ｉｋｅｈａｒａ，  Ｙ．，Ｋｕｍａｒ，  Ｓ．，  Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｃ．，Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｉ．，Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．，  ４８：２３６−２４１  （２００４））に従って測定した。被験化合物としては、クロファジミン、既存抗バベシア剤であるガナゼック（ジミナゼンジアセチュレート、ノバルティス社）を用いた。具体的には、Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉの場合、９６穴プレートの各ウェルに２００μＬの培養したバベシア感染赤血球（感染率：１〜３％）、最終濃度０．０００１〜１μＭとなるような濃度段階希釈した被験化合物を含む２０％血漿加培養液（ＲＰＭＩ１６４０）が含まれる条件で培養を行った。２４時間毎に被験化合物を含む培養液を交換した。Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、  Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉの場合、９６穴プレートの各ウェルに培養したバベシア感染赤血球（感染率：１％）２０μＬと最終濃度０．０５〜２００μＭとなるような濃度段階希釈した被験化合物を含む４０％血漿加培養液（ＲＰＭＩ１６４０あるいは１９９培養液）２００μＬを混和し、前述の混合ガス下で９６時間培養を行った。２４時間毎に被験化合物を含む培養液を交換した。
【００２７】
原虫増殖の測定はＭａｔｓｕｕ  の方法（Ｍａｔｓｕｕ，  Ａ．，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｍ．，Ｘｕａｎ，Ｘ．，Ｉｋａｄａｉ，Ｈ．，Ｈｉｋａｓａ，Ｙ．，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  １５  ｄｒｕｇｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ（Ａｏｍｏｒｉ  ｓｔｒａｉｎ）  ．，Ｖｅｔ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，１５７：１−８（２００８）およびＢｏｒｋらの方法（Ｂｏｒｋ，Ｓ．，Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．，Ｉｋｅｈａｒａ，  Ｙ．，Ｋｕｍａｒ，  Ｓ．，Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｃ．，Ｉｇａｒａｓｈｉ，Ｉ．，Ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｏｎ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．，４８：２３６−２４１（２００４））を若干変更して用いた。
【００２８】
すなわち、毎日培養液を換える時に、感染赤血球の一部を用いて塗抹標本を作製し、メタノール固定後、ギムザ染色を行った。その後、約１０００個の赤血球を観察し、バベシアに感染している赤血球の数を求め、感染率を算出した。化合物の５０％原虫増殖阻止濃度（ＩＣ５０値）は培養３日のバベシア感染率を用いて化合物濃度作用曲線より求めた。
【００２９】
本発明に用いたクロファジミンの化合物と既知の抗バベシア剤の培養バベシアに対する抗バベシア活性は表１に示す通りであった。
【００３０】
【表１】
2016164125.tif 000003
【００３１】
クロファジミンは、イヌバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）、ウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、ウマバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ）、に対してそれぞれＩＣ５０値：０．７４μＭ、４．５μＭ、３．０μＭ、４．３μＭ、０．２９μＭであり、既存の抗バベシア剤であるガナゼックの１／４７７〜１／０．４６倍程度の抗バベシア活性を示し、特にＢａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉに対する増殖抑制効果は顕著であった。
【実施例２】
【００３２】
クロファジミンの細胞毒性試験
クロファジミンの細胞毒性試験は乙黒らの方法（Ｏｔｏｇｕｒｏ，Ｋ．，  Ｋｏｈａｎａ，Ａ．，  Ｍａｎａｂｅ，Ｃ．，  Ｉｓｈｉｙａｍａ，Ａ．，  Ｕｉ，Ｈ．，  Ｓｈｉｏｍｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，Ｈ．  ＆  Ｏｍｕｒａ，Ｓ．：Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，Ｘ−２０６．Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．，５４：６５８−６６３，（２００１））に準じて行った。すなわち、Ｄｒ．  Ｌ．  Ｍａｅｓ  （Ｔｉｂｏｔｅｃ  ＮＶ，  Ｍｅｃｈｅｌｅｎ，  ベルギー）より分与された、宿主細胞のモデルであるヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質添加ＭＥＭ培地にて維持、継代培養を行ったものを用いた。
【００３３】
１０％ＦＣＳ−ＭＥＭにて１×１０３細胞／ウェルとなるように調整したヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５細胞浮遊液を、９６穴プレートに１００μＬ添加し混和後、３７℃にて５％ＣＯ２−９５％ａｉｒ下で２４時間培養を行った。その後、各ウェルに１０％ＦＣＳ−ＭＥＭ  ９０μＬと最終濃度２５０〜０．１μｇ／ｍＬとなるような濃度段階希釈した被験化合物の溶液（５％ジメチルスルホキシド水溶液）１０μＬを添加し、混和後、前述のガス下で７日間培養を行った。ＭＲＣ−５細胞の増殖の有無はＭＴＴ法にて比色定量した。化合物の５０％細胞増殖阻止濃度（ＩＣ５０値）は化合物濃度作用曲線より求めた。また、選択毒性比（ＳＩ：  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）は、（細胞毒性のＩＣ５０値）／（抗バベシア活性のＩＣ５０値）により計算して求めた。
【００３４】
本発明に用いたクロファジミンと既存の抗バベシア剤の細胞毒性を表２に示す
【００３５】
【表２】
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【００３６】
クロファジミンのヒト胎児肺由来正常繊維芽細胞ＭＲＣ−５に対する細胞毒性（ＩＣ５０値）は２１１．２４μＭであった。また、既存薬であるガナゼックの細胞毒性値は１８．４０μＭであった。クロファジミンの細胞毒性はガナゼックの１／１１．５倍程度と弱いものであった。
【００３７】
本発明に用いたクロファジミンと既存の抗バベシア剤の選択毒性比（ＳＩ）を表３に示す。
【００３８】
【表３】
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【００３９】
選択毒性比（ＳＩ：  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）は（細胞毒性のＩＣ５０値）／（抗バベシア活性のＩＣ５０値）により計算して求めた。
クロファジミンは、イヌバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｇｉｂｓｏｎｉ）、ウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）、ウマバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｃａｂａｌｌｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｅｑｕｉ）、に対してそれぞれＳＩ：２８５、４７、７０、４９、７２８であった。
【実施例３】
【００４０】
クロファジミンのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗バベシア活性試験
クロファジミンのネズミバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ  ミュンヘン株感染実験モデルに対するｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果をＡｂｏｕＬａｉｌａらの方法（ＡｂｏｕＬａｉｌａ，  Ｍ．，  Ｍｕｎｋｈｊａｒｇａｌ，  Ｔ．，  Ｓｉｖａｋｕｍａｒ，  Ｔ．，  Ｕｅｎｏ，  Ａ．，  Ｎａｋａｎｏ，  Ｙ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｍ．，  Ｙｏｓｈｉｎａｒｙ，  Ｔ．，  Ｎａｇａｎｏ，  Ｄ．，  Ｋａｔａｙａｍａ，  Ｋ．，  Ｅｌ−Ｂａｈｙ，  Ｎ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｉｇａｒａｓｈｉ，  Ｉ．  Ａｐｉｃｏｐｌａｓｔ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  Ｂａｂｅｓｉａ  ｐａｒａｓｉｔｅｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，  ５６：３１９６−３２０６  （２０１２））を用いて測定した。
ネズミバベシアＢａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉミュンヘン株は、Ｄｒ．Ｏ．Ｈｅｙｄｏｒｎ（Ｆｒｅｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｒｉｎ、ドイツ）より分与を受けた。
【００４１】
供試動物としては８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア社）の雌、体重１９〜２２ｇの一群５匹を用いた。ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐａｓｓａｇｅにて維持・継代したＢ．ｍｉｃｒｏｔｉ  １×１０７個の感染赤血球を腹腔内接種にて感染させた。感染日を０日目として、赤血球感染率が１％に達した時（感染後１日目）に１０％ジメチルスルホキサイド水溶液（ＤＭＳＯ）に溶解したクロファジミンを腹腔内（ｉ．ｐ．）又は経口（ｐ．ｏ．）、ガナゼックを皮下（ｓ．ｃ．）に投与し、以後１日１回５日間連続投与し（１〜５日目）、毎日尾静脈より血液塗末標本を作製し、原虫感染赤血球率（ｐａｒａｓｉｔｅｍｉａ）を測定した。
【００４２】
本発明に用いたクロファジミンと既存の抗バベシア剤の感染実験モデルにおける治療効果の結果を図１に示す。
【００４３】
薬剤無添加の対照群では、感染後７日でＢａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉの原虫感染赤血球率が４５．９％と最高に達し、以後漸減し感染後２０日で抹消血液中から消失した。クロファジミンの２０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与で、８．８％の最高寄生率が感染後７日で認められ、対照群と比べ原虫感染赤血球率が８０．８％抑制され、治療効果が認められた。更に、クロファジミンの２０ｍｇ／ｋｇの経口投与では、感染後５日で最高寄生率が５．３％より認められず、対照群と比べ８８．５％の原虫感染赤血球率の抑制効果を示し、更なる治療効果が認められた。一方、陽性対照として用いた既存の抗バベシア剤であるガナゼックは、２５ｍｇ／ｋｇの皮下投与で、感染後６日で５．４％の最高寄生率に達し、無添加対照群と比較して８８．２％の原虫感染赤血球率の抑制効果が認められた。このことより、クロファジミンは腹腔内投与又は経口投与でガナゼックと同程度の用量で同等の治療効果があることが示された。ガナゼックは生体内での副作用が強いが、本発明によりクロファジミンと併用し、ガナゼックの用量を低減する可能性も見出された。
なお、クロファジミンの経口投与におけるＬＤ５０は、マウスに対し＞１３，３００ｍｇ／ｋｇ、ラット８，４００ｍｇ／ｋｇ、モルモット４，４００ｍｇ／ｋｇ、ウザギ１，５００ｍｇ／ｋｇである（文献：日本標準商品分類番号８７６２３９  医薬品インタビューフォーム）。一方、ガナゼックの皮下投与におけるＬＤ５０はマウスに対し２５８ｍｇ／ｋｇであり、クロファジミンよりも毒性が高い。（Ｂａｕｅｒ，Ｆ，．  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ−ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．６：６７４−６７７（１９５６））
【産業上の利用可能性】
【００４４】
以上説明したように、本発明に用いたクロファジミンは、バベシア類に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで抗バベシア活性を示すことから、バベシア症に対する治療薬および予防剤としてヒトおよび家畜の臨床応用に用いることができる。
【図１】
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