(57)【要約】【課題】厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に合成するための抽出液、無細胞タンパク質合成反応液、安定同位体標識タンパク質合成キット、及び安定同位体標識タンパク質の製造方法、並びに、それらに用いる大腸菌細胞体を提供する。【解決手段】本発明の大腸菌変異体は、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、及びトリプトファナーゼからなる群から選ばれる二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下または失活していることを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ及びトリプトファナーゼからなる群から選ばれる二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活していることを特徴とする大腸菌変異体。
【請求項２】
ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ｇｓｈＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、ａｓｎＢ遺伝子、ｓｐｅＡ遺伝子、及びｔｎａＡ遺伝子からなる群から選ばれる二種以上の遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が置換又は欠損している請求項１に記載の大腸菌変異体。
【請求項３】
ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損している請求項１又は２に記載の大腸菌変異体。
【請求項４】
ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損している請求項１〜３のいずれか一項に記載の大腸菌変異体。
【請求項５】
ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損している請求項１〜４のいずれか一項に記載の大腸菌変異体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸菌変異体より抽出されたことを特徴とする抽出液。
【請求項７】
請求項６に記載の抽出液を含有することを特徴とする無細胞タンパク質合成反応液。
【請求項８】
更に、アミノオキシ酢酸、Ｌ−メチオニンスルホキシイミン、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリン、Ｓ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミン、及びＤ−リンゴ酸からなる群から選ばれる一種以上のアミノ酸代謝阻害剤を含有する請求項７に記載の無細胞タンパク質合成反応液。
【請求項９】
請求項７又は８に記載の無細胞タンパク質合成反応液を含有することを特徴とする安定同位体標識タンパク質合成キット。
【請求項１０】
請求項７又は８に記載の無細胞タンパク質合成反応液を用いることを特徴とする安定同位体標識タンパク質の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の大腸菌変異体をグルタミン含有培地で培養することを特徴とする大腸菌変異体の培養方法。
【請求項１２】
前記グルタミン含有培地は、更にピルビン酸ナトリウムを含有する請求項１１に記載の大腸菌変異体の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大腸菌変異体、抽出液、無細胞タンパク質合成反応液、安定同位体標識タンパク質合成キット、安定同位体標識タンパク質の製造方法、及び、大腸菌変異体の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々なタンパク質が持つ多様な生体機能は、その固有のアミノ酸配列とそれに起因する立体構造に基づくことが知られており、個々のタンパク質の立体構造を知ることは、それらの生体機能を知る上で極めて重要である。タンパク質の立体構造情報は、医学、生物学的基礎研究としての生命理解を深めるとともに、重要な疾患に関わる知見を与え、医薬品開発にも大きく貢献している。
また、タンパク質工学による有用な酵素作出のための基盤情報として活用されるなど、産業応用可能な重要な知的財産として広く利用されている。
【０００３】
現在、タンパク質の立体構造を解析する手段として、タンパク質の結晶を用いるＸ線回折法が主流であるが、結晶化が困難なタンパク質も少なくない。また、Ｘ線回折法では、結晶状態での構造決定に限られ、この結晶構造は、タンパク質が実際に生体機能を発現する溶液状態と異なることから、核磁気共鳴分光分析法（ＮＭＲ法）による構造解析が注目を集めている。
【０００４】
ＮＭＲ法は、タンパク質分子が自由に動き回ることのできる溶液状態での解析が可能であることから、Ｘ線回折法による静的環境とは異なる構造情報を得ることができる。特に動的構造を伴う分子間相互作用などの構造解析に有効とされており、Ｘ線回折法により得られる構造情報を補完することで、より実用的な機能構造情報を得ることが可能になる。
【０００５】
このように、ＮＭＲ法は、結晶化が不要で、溶液状態での動的構造情報を得られる有用な手法であるが、その一方で課題もある。それは、一般に構造決定可能な分子量が概ね１−２万に限られることである。
近年、この課題を解決するため、様々な改良、改善がなされてきた。例えば、ＮＭＲで検出可能な安定同位体核種である１３Ｃ、１５Ｎをタンパク質に標識する技術、多次元多核種ＮＭＲ測定技術、ハードウェア、ソフトウェアの改良などである。これらの技術開発により、最近では分子量２−２．５万程度のタンパク質の立体構造を決定できるようになってきている。
また、最近ではタンパク質を構成するアミノ酸の適切な部位に立体選択的に安定同位体を導入したＮＭＲ法に最適化されたＳＡＩＬ（Ｓｔｅｒｅｏ−ａｒｒａｙ  ｉｓｏｔｏｐｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ;立体整列同位体標識)アミノ酸が開発され，これらを駆使することで、解析対象は分子量４−５万程度まで拡大した（非特許文献１、特許文献１参照。）。
さらに、近年カナダのＮＭＲ研究グループにより、タンパク質の疎水性コアを形成するアミノ酸残基のうち，ロイシン、バリン、イソロイシンのメチル基のみを選択的に１３ＣＨ３にし、残りの水素を全て重水素化することにより分子量１０万を超える高分子量タンパク質の構造解析に成功している（非特許文献２、３参照。）。
また、ＮＭＲ法による構造解析の際、アミノ酸毎のシグナルの帰属を容易にする目的で、培養液中に特定の安定同位体標識アミノ酸を添加し、アミノ酸選択的に標識する方法なども検討されている（非特許文献５参照。）。
このように、タンパク質分子内にＮＭＲで測定可能な安定同位体核種を適切に配することで、従来ＮＭＲ法では困難であった高分子量のタンパク質の構造解析が可能であることが示された。
【０００６】
ＮＭＲ法によるタンパク質の構造解析用に安定同位体標識タンパク質を調製する場合、一般に安定同位体標識されたブドウ糖（Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ−１３Ｃ６;１３Ｃ６Ｈ１２Ｏ６）および塩化アンモニウム（Ａｍｍｏｎｉｕｍ−１５Ｎ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ;１５ＮＨ３Ｃｌ）を含む無機培地で遺伝子組換え大腸菌等を培養することにより安定同位体標識タンパク質を得ることができる（非特許文献４参照。）。この場合、得られるタンパク質の全ての炭素および窒素が、１３Ｃ、１５Ｎ標識されており、ＮＭＲ測定において良好なシグナルとして、タンパク質を構成する炭素、窒素を高感度に計測することが可能となる。
【０００７】
しかしながら，全ての炭素、窒素を安定同位体標識する方法では、高分子量タンパク質では多くのシグナルが重なってしまい、解析が困難である。そこで、上述のようにＮＭＲ法に最適化されたＳＡＩＬアミノ酸やメチル選択的標識およびアミノ酸選択標識など、部位特異的に安定同位体を導入したアミノ酸を効率的にタンパク質に導入する技術が求められている。
【０００８】
アミノ酸選択的および部位特異的安定同位体標識アミノ酸をタンパク質に導入する方法として、アミノ酸やアミノ酸前駆体を無機培地に添加し、それが細胞内に取り込まれることで安定同位体標識タンパク質を調製するという方法が提案されている（非特許文献２、３、５参照。）。
しかしながら、この方法では、細胞内に取り込まれた安定同位体標識アミノ酸やその前駆体が生命維持に関わるさまざまな代謝を受け、他のアミノ酸等へ安定同位体が流れてしまうという問題があった。せっかくアミノ酸選択的標識や高価な部位特異的安定同位体標識アミノ酸等でタンパク質を合成したとしても、この方法では、タンパク質の適切な部位に正確かつ効率的に導入することはできなかった。
【０００９】
ただし、一部の代謝を受けにくい特徴的なアミノ酸前駆体については実用的な標識が可能である。トロント大学のルイス・ケイらは、疎水性アミノ酸であるロイシン、バリン、イソロイシンのそれぞれの前駆体であるα-ケトブチル酸及びα-ケトイソバレニン酸のメチル基を１３ＣＨ３にし、その他の炭素及び水素をそれぞれ１２Ｃと重水素（Ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ；２Ｈ）にしたものを無機培地に添加することで、ロイシン、バリン、イソロイシンのメチル基選択的な１３Ｃ標識を達成している（非特許文献２、３参照。）。しかし、本方法はロイシン、バリン、イソロイシンという特徴的な前駆体を持つ疎水性アミノ酸に限られ、様々な代謝を受けることから他のアミノ酸への適用は困難である。
【００１０】
これらの課題を解決するため開発されたものが無細胞タンパク質合成系を用いた安定同位体標識タンパク質調製方法である（非特許文献６、特許文献２参照。）。無細胞タンパク質合成とは、細胞の抽出液を用い、試験管内でタンパク質を合成する技術であり、生細胞と異なり、添加したアミノ酸が様々な生命維持に関わる代謝を受けることなくタンパク質に取り込まれるという特徴を有する。すなわち、アミノ酸選択的および部位特異的標識アミノ酸を無細胞タンパク質合成系内に添加することで、非常に効率的かつ適切な部位に安定同位体を目的タンパク質に導入することが可能となる（非特許文献７参照。）。
【００１１】
しかしながら、この無細胞タンパク質合成系による標識タンパク質調製法においても細胞抽出液に含まれるアミノ酸等代謝酵素による安定同位体標識アミノ酸の代謝反応を完全には抑えることができていない。
そこで、無細胞タンパク質合成系による安定同位体標識アミノ酸の代謝反応を抑えるために、反応液内にアミノ酸代謝阻害剤を添加する方法が開発された（特許文献３、非特許文献８参照。）。特に発明者らは、無細胞タンパク質合成系内のアミノ酸や有機酸等の代謝反応の詳細を高感度なアミノ酸分析計や質量分析計を用いて調査した。その結果、アミノ酸代謝に関わる各種酵素反応が無細胞タンパク質合成系内で起こることを見いだした。その後、それぞれの酵素反応に特異的な酵素阻害剤６種類を添加することで、目的の安定同位体標識を正確に効率よく導入することに成功した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０３／０５３９１０号
【特許文献２】特許第３３１７９８３号公報
【特許文献３】特許第３１４５４３１号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｋａｉｎｏｓｈｏ, Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００６) ｖｏｌ．４４０，ｐｐ．５２−５７．
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎ， Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.，(１９９６)ｖｏｌ．２６３，ｐｐ．６２７−６３６．
【非特許文献３】Ｔｕｇａｒｉｎｏｖ，Ｖ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００３) ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１３８６８−１３８７８．
【非特許文献４】Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉ，Ｔ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．,(１９９４) ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１１３４３−１１３４７.
【非特許文献５】Ｔａｎｉｏ,Ｍ．, ｅｔ．ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（２００８) ｖｏｌ．３８６ ，ｐｐ．１５６−１６０.
【非特許文献６】Ｋｉｇａｗａ, Ｔ．,ｅｔ．ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ，（１９９９) ｖｏｌ．４４２, ｐｐ．１５−１９.
【非特許文献７】Ｋｉｇａｗａ, Ｔ,ｅｔ．ａｌ．，Ｊ.Ｂｉｏｍｏｌ. ＮＭＲ （１９９５) ｖｏｌ．６, ｐｐ．１２９−１３４．
【非特許文献８】Ｙｏｋｏｙａｍａ,Ｊ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（２０１１) ｖｏｌ． ４１１(２)，  ｐｐ．２２３−２２９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかし、アミノ酸代謝阻害剤を用いる方法では、一部の阻害剤が市販されておらず、危険性の高い原料および反応を経て合成する必要があった。また、阻害剤添加によりタンパク質の合成量が減少するという問題があった。
【００１５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に合成するための抽出液、無細胞タンパク質合成反応液、安定同位体標識タンパク質合成キット、及び安定同位体標識タンパク質の製造方法、並びに、それらに用いる大腸菌変異体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わる代謝酵素の酵素活性を低下又は失活させた大腸菌変異体を作製することにより課題を解決できることを見出した。本発明の一実施態様は、下記（１）〜（１２）を提供するものである。
（１）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、及びトリプトファナーゼからなる群から選ばれる二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活していることを特徴とする。
（２）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ｇｓｈＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、ａｓｎＢ遺伝子、ｓｐｅＡ遺伝子、及びｔｎａＡ遺伝子からなる群から選ばれる二種以上の遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が置換又は欠損していることが好ましい。
（３）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましい。
（４）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましい。
（５）本発明の一実施態様における大腸菌変異体は、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましい。
【００１７】
（６）本発明の一実施態様における抽出液は、先に記載の大腸菌変異体より抽出されたことを特徴とする。
（７）本発明の一実施態様における無細胞タンパク質合成反応液は、先に記載の抽出液を含有することを特徴とする。
（８）本発明の一実施態様における無細胞タンパク質合成反応液は、更に、アミノオキシ酢酸、Ｌ−メチオニンスルホキシイミン、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリン、Ｓ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミン、及びＤ−リンゴ酸からなる群から選ばれる一種以上のアミノ酸代謝阻害剤を含有することが好ましい。
（９）本発明の一実施態様における安定同位体標識タンパク質合成キットは、先に記載の無細胞タンパク質合成反応液を含有することを特徴とする。
（１０）本発明の一実施態様における安定同位体標識タンパク質の製造方法は、先に記載の無細胞タンパク質合成反応液を用いることを特徴とする。
（１１）本発明の一実施態様における大腸菌変異体の培養方法は、先に記載の大腸菌変異体をグルタミン含有培地で培養することを特徴とする。
（１２）本発明の一実施態様における大腸菌変異体の培養方法は、前記グルタミン含有培地が、更にピルビン酸ナトリウムを含有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。
【図２】アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。
【図３】アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。
【図４】アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。
【図５】アミノ酸選択的１５Ｎ標識の際に同位体希釈に関わるアミノ酸代謝とその阻害剤を示した図である。
【図６】実施例１におけるＰＣＲの結果を示した図である。
【図７】実施例１における大腸菌の増殖速度比較の結果を示した図である。
【図８】実施例１における大腸菌の増殖速度比較の結果を示した図である。
【図９】実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。
【図１０】実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。
【図１１】実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。
【図１２】実施例１におけるＮＭＲ測定の結果を示した図である。
【図１３】実験例２におけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの活性測定の結果を示した図である。
【図１４】実施例３におけるＰＣＲの結果を示した図である。
【図１５】実施例３における大腸菌の増殖速度比較の結果を示した図である。
【図１６】実施例４におけるアミノ酸分析の結果を示した図である。
【図１７】実施例４におけるアミノ酸分析の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
≪大腸菌変異体≫
本発明の大腸菌変異体は、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、及びトリプトファナーゼからなる群から選ばれる二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活している変異体である。
本発明において、「酵素活性が低下又は失活している」とは、本発明の大腸菌変異体の酵素活性が、対応する野生型の代謝酵素の酵素活性に対して相対的に低下又は失活していることを意味する。
【００２１】
本発明者らは、無細胞タンパク質合成系内のアミノ酸や有機酸等の代謝反応の詳細を高感度なアミノ酸分析計や質量分析計を用いて調査したところ、図１〜図５に示すようなアミノ酸代謝に関わる酵素反応が無細胞タンパク質合成系内で起こることを見出した（Ｙｏｋｏｙａｍａ,Ｊ．， ｅｔ．ａｌ．， Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（２０１１) ｖｏｌ． ４１１（２），ｐｐ．２２３−２２９．参照。）。図１〜図５中、ＡＯＡ:はアミノオキシ酢酸を示し、ＤＯＮ:は６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを示し、ＤＯＮＶ:は５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリンを示し、ＭＳはＬ−メチオニンスルホキシイミンを示し、ＳＭＣＳはＳ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミンを示し、ＢＳＯはＬ−ブチオニンスルホキシイミンを示し、Ｄ−ＭａｌａｔｅはＤ−リンゴ酸を示す。
無細胞タンパク質合成系内の代謝酵素として、上述したアスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、トリプトファナーゼ等が挙げられる。かかる酵素の中から二種以上の代謝酵素を選択し、選択した代謝酵素の酵素活性を低下又は失活させた大腸菌変異体を用いて安定同位体標識タンパク質を製造することにより、安定同位体標識したアミノ酸が代謝されて目的以外のアミノ酸に変化することを防ぐことができる。
【００２２】
大腸菌中の代謝酵素の酵素活性を低下又は失活させる方法としては、該代謝酵素をコードする大腸菌の染色体ＤＮＡの少なくとも一部の塩基を置換又は欠損させる方法、該染色体ＤＮＡに挿入配列を組み込み、フレームシフトを引き起こさせる方法、該代謝酵素のドミナントネガティブ型を一過的又は安定的に大腸菌に過剰発現させる方法等が挙げられる。
これらの中でも、該代謝酵素をコードする大腸菌の染色体ＤＮＡの少なくとも一部の塩基を置換又は欠損させる方法が好ましい。
【００２３】
大腸菌の染色体ＤＮＡを欠損させる方法としては、相同組換えを利用した方法が挙げられる。相同組換えを利用した方法としては、大腸菌の染色体ＤＮＡ上において欠損させたい遺伝子又はＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡ断片を、該大腸菌内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子等を有するプラスミドＤＮＡと連結した相同組換え用プラスミドを用いる方法が挙げられる。該相同組換え用プラスミドを常法により大腸菌内に導入した後、薬剤耐性を指標にして、相同組換えによって染色体ＤＮＡ上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株が選択される。
【００２４】
また、複数の遺伝子に効率よく塩基の欠失、置換又は付加を導入する相同組換えを利用した方法としては、直鎖ＤＮＡを用いた方法が挙げられる。
具体的には、染色体ＤＮＡ上において欠損させたい遺伝子又はＤＮＡの両外側に存在するＤＮＡ断片を含有する直鎖ＤＮＡを細胞内に取り込ませ、染色体ＤＮＡと導入した直鎖ＤＮＡとの間で相同組換えを起こさせる方法が挙げられる。当該方法は、上述した代謝酵素をコードする遺伝子群の中から二種以上の遺伝子を欠損させた欠損株を作製する際に適している。
遺伝子欠損方法は、様々な技術や関連製品が販売されており、何れの方法を採用しても構わない。遺伝子欠損方法として、例えば、Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ 社より発売されているＲｅｄ／ＥＴ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍなどが例示される。
Ｒｅｄ／ＥＴ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍは、直鎖状のＤＮＡ断片を用いることができ、薬剤耐性遺伝子とスクロース感受性遺伝子をそれぞれ２段階で染色体ＤＮＡ上の標的遺伝子領域に導入する方法で、標的遺伝子領域に薬剤耐性遺伝子等の挿入領域が残存しないことから、複数の遺伝子欠損を実施する方法として優れている（Ｚｈａｎｇ,  Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９８) ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１２３−１２８．参照。）。
【００２５】
上述した代謝酵素をコードする遺伝子としては、アスパラギナーゼをコードするａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子；セリンデアミナーゼをコードするｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子；グルタミンシンセターゼをコードするｇｌｎＡ遺伝子；γ-グルタミルシステインシンセターゼをコードするｇｓｈＡ遺伝子；アスパラギン酸アンモニアリアーゼをコードするａｓｐＡ遺伝子；アスパラギンシンセターゼをコードするａｓｎＡ遺伝子、ａｓｎＢ遺伝子；アルギニンデカルボキシラーゼをコードするｓｐｅＡ遺伝子；トリプトファナーゼをコードするｔｎａＡ遺伝子等の遺伝子群が挙げられる。
本発明の大腸菌変異体は、これらの遺伝子群の中から、二種以上の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活するように、遺伝子を選択して、選択したそれぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が置換又は欠損しているものであることが好ましい。より詳細には、標的遺伝子の開始コドンＡＴＧのＡから−２００塩基上流から、終止コドンＴＡＡのＡから＋１００塩基下流までの範囲内にある塩基が欠損しているものであることが好ましく、開始コドンＡＴＧのＡから−１７０塩基上流から、終止コドンＴＡＡのＡから＋５０塩基下流までの範囲内にある塩基を欠損しているものであることがより好ましい。フレームシフトが生じるように塩基を欠損させてもよいし、代謝酵素の活性中心に相当する塩基配列を含む範囲を欠損させてもよい。
これら遺伝子群において、欠損した遺伝子は３種以上が好ましく、４種以上がより好ましく、５種以上が更に好ましく、６種以上が更に好ましく、７種以上が更に好ましい。なお、これら遺伝子群において８種以上欠損させても良いが、細胞増殖への影響を考慮すると、７種欠損以下が最も好ましい。具体的には、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子からなる群のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることが好ましく、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していることがより好ましい。また、ａｎｓＡ遺伝子、ａｎｓＢ遺伝子、ｓｄａＡ遺伝子、ｓｄａＢ遺伝子、ａｓｐＡ遺伝子、ｇｌｎＡ遺伝子、ａｓｎＡ遺伝子、及びａｓｎＢ遺伝子のすべての遺伝子において、それぞれの遺伝子中の少なくとも一部の塩基が欠損していてもよい。
これらの遺伝子群は、生命活動に重要なアミノ酸代謝経路に関わることから、大腸菌の生命維持に及ぼす影響が大きいことが予想されるため、通常、複数の遺伝子を同時に欠損させるという着想はし難いものである。しかし、実施例において後述するように、本発明者は、ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ａｓｎＡおよびａｓｎＢの４重遺伝子欠損株の培養時の増殖を調べたところ野生株と比較して遜色なく増殖することを確認している（図７）。しかしながら、上記遺伝子群の内、ｇｌｎＡを欠損させた株では、野生株に比べ、著しい増殖抑制がみられた。発明者らは、鋭意当該ｇｌｎＡ欠損株の培養条件を検討した結果、培養時の培地中に最終濃度で０．５ｍＭのグルタミンを添加することで、野生株と遜色ない増殖を示すことを見出した。培地中のグルタミンの濃度としては、１μＭ〜１Ｍが好ましく、１０μＭ〜１００ｍＭがより好ましく、０．１ｍＭ〜１０ｍＭが更に好ましく、０．２ｍＭ〜０．８ｍＭが特に好ましい。
さらに、欠損遺伝子を増やし、ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢおよびｇｌｎＡの７重欠損株を作成し、同様に培養速度を調べたところ、当該７重欠損株においても培地に最終濃度で０．５ｍＭのグルタミンを添加することで、野生株とほぼ同等の増殖速度で培養できることを見出した（図８）。さらに発明者らは、上記ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢおよびｇｌｎＡの７重欠損にａｓｐＡを加えた８重遺伝子欠損株の作製も試みた。当該８重遺伝子欠損株では、培地に０．５ｍＭのグルタミンを添加した場合においても野生株と比べ、増殖速度および到達濁度の低下が見られた。当該８重欠損株についても、増殖抑制を改善する添加物につき鋭意調査および検討を重ねた結果、０．５ｍＭのグルタミンに加え、ピルビン酸ナトリウムを終濃度で３０ｍＭになるように培地に添加することにより、培養時の増殖速度および到達濁度が向上し、改善が見られた（図１５）。培地中のピルビン酸ナトリウムの濃度としては、０．１ｍＭ〜０．５Ｍがより好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭが更に好ましく、１０ｍＭ〜６０ｍＭが特に好ましい。当該８重欠損株からＳ３０抽出液を調製し、ＣＡＴタンパク質合成量を野生株と比較したところ、遜色ない合成量が得られることを確認した。生命活動に極めて重要なアミノ酸に関わる代謝遺伝子群の内、８遺伝子にも及ぶ多重欠損を行った例は無く、グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムの添加による増殖速度の改善方法の発見は本発明において重要な知見であった。
更に、本発明者は、７種の酵素遺伝子を欠損させることで、バッチ反応におけるタンパク質合成量の増加を確認している（図１３）。これは、アミノ酸分解に関わる酵素遺伝子を欠損させたことで、アミノ酸の分解が抑えられたためと推察される。
このように上記に限らず、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、γ-グルタミルシステインシンセターゼ、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、及びトリプトファナーゼからなる酵素群に関わる遺伝子欠損により、アミノ酸要求性等が示されるなど生育低下が確認された場合は、培養液にアミノ酸および有機酸等適切な物質を添加して培養してもよい。
本発明の大腸菌変異体は、ハンドリングが容易で、かつ、後述する安定同位体標識タンパク質の作製に最適である。
【００２６】
≪抽出液≫
本発明の抽出液は、上述した本発明の大腸菌変異体より抽出されたものである。該抽出液は、大腸菌Ｓ３０の抽出物であることが好ましい。大腸菌Ｓ３０抽出液は、増殖させた大腸菌の菌体を破砕して細胞破砕液を得て、この細胞破砕液を３０，０００ｘｇの遠心分離にかけて分離した上清から得られる。
大腸菌Ｓ３０抽出液は、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、ポリペプチド鎖開始因子（ＩＦ）、同伸長因子（ＥＦ）及び同終結因子等、翻訳に必要な大腸菌の全ての酵素と因子を含んでいるため、無細胞タンパク質合成に適している。
【００２７】
≪無細胞タンパク質合成反応液≫
本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、上述した本発明の抽出液を含有する。無細胞タンパク質合成系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系であり、この系にはリボゾーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子等、翻訳に必要な要素が含まれている。
このような無細胞翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が一般的に用いられる。ウサギ網状赤血球抽出液や小麦胚芽抽出液と比較して、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、遺伝子操作や培養等の容易な大腸菌を用いたものであるため、簡便さという点で優れている。更に、標的とする代謝酵素の欠損株を的確に作製でき、目的の安定同位体標識タンパク質を得られる点からも優れている。
更に、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、目的タンパク質の構成材料となるアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン、及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸を含むことが好ましい。また、上記に限らず非天然型のアミノ酸や放射性および蛍光標識アミノ酸を添加しても良い。
【００２８】
無細胞タンパク質合成反応系内で、転写と翻訳の両反応を共役させる場合、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ等のＲＮＡポリメラーゼとリボヌクレオチドを含有していることが好ましい。また、アミノアシルｔＲＮＡの合成、及びｍＲＮＡの翻訳反応にはＡＴＰ及びＧＴＰが必要であることから、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、これらをＡＴＰ再生に関与する酵素とともにエネルギー源として含むことが好ましい。
ＡＴＰ再生に関与する酵素としては、ホスホエノールピルベートとピルビン酸キナーゼの組み合わせ又はクレアチンホスフェートとクレアチンキナーゼの組み合わせが挙げられる。また、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、合成したタンパク質が適切立体構造を形成できるように、ＤｎａＪ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥ、ＧｒｏＥＬ、ＧｒｏＥＳ及びＨＳＰ７０等のシャペロンタンパク質を含有してもよい。
また、本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、タンパク質合成能を向上させる点で、アンモニウム塩を含有することが好ましい。アンモニウム塩としては、酢酸アンモニウム、安息香酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、塩化アンモニウム等が挙げられる。
本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、添加剤として、リボヌクレアーゼ阻害剤、ジチオトレイトール等の還元剤、スペルミジン等のＲＮＡ安定化剤、フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）等のプロテアーゼ阻害剤等を含有してもよい。
また、本発明の無細胞タンパク質合成反応液中の緩衝液としては、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ、Ｔｒｉｓ−ＯＡｃのような一般的な緩衝剤が用いられる。
【００２９】
本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、所定の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活した大腸菌抽出液を含有していることに加えて、代謝酵素の阻害剤を含有していてもよい。かかる代謝酵素阻害剤としては、アスパラギン酸アミノ基転移酵素の阻害剤であるアミノオキシ酢酸；グルタミンシンセターゼの阻害剤であるＬ−メチオニンスルホキシイミン；γ-グルタミルシステインシンセターゼの阻害剤であるＬ−ブチオニンスルホキシイミン；グルタミナーゼの阻害剤である６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；アスパラギナーゼの阻害剤である５−ジアゾ−４−オキソ−Ｌ−ノルバリン；アスパラギンシンセターゼの阻害剤であるＳ−メチル−Ｌ−システインスルホキシイミン；アスパラギン酸アンモニアリアーゼの阻害剤であるＤ−リンゴ酸等が挙げられる。
本発明の無細胞タンパク質合成反応液は、これらの代謝酵素阻害剤からなる群の中から、一種以上選択されることが好ましい。かかる代謝酵素阻害剤は、本発明の大腸菌変異体において酵素活性が低下又は失活している代謝酵素の阻害剤であってもよく、該代謝酵素とは異なる別の代謝酵素の阻害剤であってもよい。前者の場合には、無細胞タンパク質合成反応系において、特定の代謝酵素の酵素活性をより強力に阻害することができ、後者の場合には、複数の代謝経路における代謝酵素の酵素活性を広範に阻害することができる。特に、アミノオキシ酢酸は、アミノ基転移酵素を広く阻害することが知られており、本発明の大腸菌抽出液と組み合わせることで、アミノ酸選択的な安定同位体標識等の厳密な安定同位体標識タンパク質を合成するのに非常に有効である。
【００３０】
≪安定同位体標識タンパク質合成キット≫
本発明の安定同位体標識タンパク質合成キットは、上述した本発明の無細胞タンパク質合成反応液を含有する。
該安定同位体標識タンパク質合成キットは、上述したタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸のうちの少なくとも１種のアミノ酸が、１３Ｃ、１５Ｎ、重水素（Ｄ）等の安定同位体により標識された標識アミノ酸を含むことが好ましい。
１種類以上の標識アミノ酸を含むアミノ酸混合体としては、多種類の組み合わせが考えられ、その組み合わせは、様々な目的に応じて適宜選択できる。例えば、２０種類のアミノ酸のうちの１種類を標識アミノ酸とし、残りの１９種類を非標識アミノ酸としたアミノ酸混合体の２０種類の組合せにすることで、ＮＭＲ測定におけるシグナルがどのアミノ酸に由来するかを特定できる点で好ましい。また、２種類又は３種類のアミノ酸を標識アミノ酸とし、残りの１８種類又は１７種類を非標識アミノ酸としたアミノ酸混合体を組合せることで、隣り合うアミノ酸との結合をＮＭＲ測定により観測することが可能となり、帰属をより容易に行うことが可能となる。もちろん、ＮＭＲ測定におけるシグナルの対比用サンプルとして、全ての種類のアミノ酸を標識アミノ酸としたアミノ酸混合体、全ての種類のアミノ酸を非標識アミノ酸としたアミノ酸混合体を組み合わせてもよい。選択される標識アミノ酸は、１３Ｃ、１５Ｎ、Ｄ、１７Ｏ、１８Ｏのいずれかの安定同位体で一か所でも標識されていればよく。その組み合わせは目的に応じて決定すればよい。
所定の代謝酵素の酵素活性が低下又は失活している大腸菌変異体と、所定の標識アミノ酸とを適切に組み合わせることにより、得られた安定同位体標識タンパク質のＮＭＲ測定において構造解析に適したシグナルを得ることができる。
【００３１】
≪安定同位体標識タンパク質の製造方法≫
本発明の安定同位体標識タンパク質の製造方法は、上述した本発明の無細胞タンパク質合成反応液を用いる方法であり、該方法は、上述した安定同位体標識タンパク質合成キットを用いた方法であることが好ましい。
安定同位体標識タンパク質の製造において、従来から知られているバッチ法、透析法のいずれの方法を用いてもよい。これらの方法については定法に従う。
無細胞タンパク質合成系により合成されたタンパク質は、大腸菌内で合成されたタンパク質と比較して、集菌や溶菌作業が不要のため、簡便に、構造解析に適した純度のタンパク質を得ることができる。精製法としては、硫酸アンモニウム沈殿、アニオン若しくはカチオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の方法が挙げられ、これらの方法を目的タンパク質の性質に応じて適宜組み合わせて行うことができる。
また、目的タンパク質に予めタグペプチド配列を付加させておき、タグを特異的に認識する物質を用いたアフィニティー精製法も挙げられる。当該精製法は、高純度のタンパク質を得る上で特に好ましい。当該タグとしては６×ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）、ＧＳＴタグ及びマルトース結合性タグ等が挙げられる。
本発明の安定同位体標識タンパク質の製造方法によれば、ＮＭＲ測定において構造解析に適したシグナルを簡便に得ることができる。
【００３２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
［実施例１］
大腸菌ＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のゲノムＤＮＡを抽出し、アスパラギナーゼ、セリンデアミナーゼ、グルタミンシンセターゼ、及びアスパラギンシンセターゼ、それぞれの代謝酵素をコードする遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定し、ａｓｎＡ（配列番号１）、 ａｓｎＢ（配列番号２）、 ａｎｓＡ（配列番号３）、 ａｎｓＢ（配列番号４）、ｇｌｎＡ（配列番号５）、 ｓｄａＡ（配列番号６）、ｓｄａＢ（配列番号７）の遺伝子配列情報を得た。
次に決定した遺伝子配列に基づき、ＢＬ２１株において、Ｒｅｄ／ＥＴ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（フナコシ株式会社，Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ ＧｍｂＨ製）を用いて、安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした４遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ）の欠損及び７遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ,ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の欠損を行った。欠損方法の詳細は、製品マニュアルおよびＺｈａｎｇ,  Ｙ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（１９９８) ｖｏｌ．２０，ｐｐ．１２３−１２８．を参照し、実施した。
ａｓｎＡ遺伝子については、ａｓｎＡのプロモーター配列(開始コドンＡＴＧのＡから−２４塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡから−２１５塩基上流までを欠損させた。ａｓｎＢ遺伝子については、ａｓｎＢのプロモーター配列(開始コドンＡＴＧのＡから−４５塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡから＋３０塩基下流まで欠損させた。ａｎｓＡ遺伝子については、ａｎｓＡの推定上のＳＤ配列 (開始コドンＡＴＧのＡから−１４塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ａｎｓＢ遺伝子については、ａｎｓＢのプロモーター配列(開始コドンＡＴＧのＡから−６２塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ｇｌｎＡ遺伝子については、ｇｌｎＡの開始コドンＡＴＧのＡから−１６３塩基上流から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ｓｄａＡ遺伝子については、ｓｄａＡの転写開始配列(開始コドンＧＴＧのＧから−１２３塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。ｓｄａＢ遺伝子については、ｓｄａＢの推定上のＳＤ配列(開始コドンＡＴＧのＡから−２１塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。
目的の遺伝子が正しく欠損されたことをＤＮＡシークエンサーにより確認した。
ａｓｎＡ遺伝子については、配列番号８で表される配列が欠損していることが確認され、ａｓｎＢ遺伝子については、配列番号９で表される配列が欠損していることが確認され、ａｎｓＡ遺伝子については、配列番号１０で表される配列が欠損していることが確認され、ａｎｓＢ遺伝子については、配列番号１１で表される配列が欠損していることが確認され、ｇｌｎＡ遺伝子については、配列番号１２で表される配列が欠損していることが確認され、ｓｄａＡ遺伝子については、配列番号１３で表される配列が欠損していることが確認され、ｓｄａＢ遺伝子については、配列番号１４で表される配列が欠損していることが確認された。
【００３４】
更に、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）及び７遺伝子欠損株（Δ７）において、各７遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）を増幅するためのプライマーを用意し、各遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ後の各反応液を、アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図６に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図６中、レーン１はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｎｓＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン２は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｎｓＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン３はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｎｓＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン４は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｎｓＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号１８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン５はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｓｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン６は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｓｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号１９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン７はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｓｎＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン８は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ａｓｎＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２１で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２２で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン９はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ｇｌｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１０は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ｇｌｎＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２３で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２４で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１１はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ｓｄａＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１２は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ｓｄａＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２５で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２６で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１３はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ｓｄａＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１４は７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型とし、ｓｄａＢ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号２８で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、左端のレーンＭｒ１は１０００ｂｐＤＮＡラダーマーカーであり、右端のレーンＭｒ２は２５０ｂｐＤＮＡラダーマーカーである。図６右に、ＢＬ２１野生株（ＷＴ）及び７遺伝子欠損株（Δ７）をそれぞれ鋳型としたときに、予想される各遺伝子の増幅断片の大きさを示す。
図６に示すように、７遺伝子欠損株（Δ７）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン２，４，６，８，１０，１２，１４）では、ＢＬ２１野生株（ＷＴ）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン１，３，５，７，９，１１，１３）と比較して増幅断片が短く、標的遺伝子の欠損がなされていることが確認された。
【００３５】
作製した４遺伝子欠損株（ΔａｓｎＡ, ΔａｓｎＢ, ΔａｎｓＢ, ΔａｎｓＡ）及び通常のＢＬ２１株の増殖速度を比較した。結果を図７に示す。作製した４遺伝子欠損株と通常のＢＬ２１株との間で増殖速度の差は見られなかった。
また、作製した７遺伝子欠損株（Δ７）及び通常のＢＬ２１株の増殖速度を比較した。結果を図８に示す。７遺伝子欠損株では、４遺伝子欠損株には見られなかった増殖速度の低下が確認されたことから、まず、どの遺伝子欠損が増殖抑制に関与しているかの特定を進めた。その結果、グルタミンシンセターゼの遺伝子であるｇｌｎＡ欠損が、増殖速度抑制の原因であることを突き止めた。次に、ｇｌｎＡ欠損を含む７遺伝子欠損株の増殖速度を改善する添加物を鋭意探索したところ、培養時に終濃度で０．５ｍＭのＬ−グルタミンを培養液に添加することで、通常のＢＬ２１とほぼ同等の増殖速度を示すことを見出した。
【００３６】
遺伝子欠損させた大腸菌ＢＬ２１株及び欠損させていない通常の大腸菌ＢＬ２１株それぞれより木川らの方法（国際公開第０３／０５３９１０号パンフレット、特許第３３１７９８３号公報、特許第３１４５４３１号公報、Ｔｕｇａｒｉｎｏｖ，Ｖ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，（２００３) ｖｏｌ．１２５，ｐｐ．１３８６８−１３８７８．）で無細胞タンパク質合成反応用の抽出液（Ｓ３０抽出液）を調製した。
調製した抽出液を用いて、特許第４７８７４８８号公報、特開２００５−１０２５１３号公報、Ｋｉｇａｗａ，Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，（２００４)ｖｏｌ．５, ｐｐ．６３−６８.、Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ，ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ， （２００７) ｖｏｌ．３７, ｐｐ．２２５−２２９．を参考に無細胞タンパク質合成反応液を調製した。次にそれぞれ安定同位体標識アミノ酸として、アスパラギン−１５Ｎ２、グルタミン−１５Ｎ２、アスパラギン酸−１５Ｎ、及びグルタミン酸−１５Ｎのうち１種類と、それ以外の非標識のアミノ酸１９種類と、を混合したアミノ酸混合物溶液を調製し、上述の遺伝子欠損させた大腸菌株より調製した抽出液と、通常の大腸菌より調製した抽出液をそれぞれ含む無細胞タンパク質合成反応液を用いて、１種類のアミノ酸のみを安定同位体標識したタンパク質を合成した。
モデルタンパク質として、タンパク質を構成する２０種類の全てのアミノ酸を含み，比較的安定で取り扱いやすいユビキチン結合ドメイン（［ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（ＵＢＡ）ｄｏｍａｉｎｓ；Ｌｅｕ６５５−Ｓｅｒ７１５ ｏｆ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ    ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ   ５（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ４５９７４，ＰＤＢ：２ＤＡＧ，ＢＭＲＢ：１１１７３）]、以下、ＵＢＡドメインともいう。）を用いた。
【００３７】
合成したそれぞれのＵＢＡドメインを常法により単離精製し、ＮＭＲ測定用緩衝液に置換して、１Ｈ，１５Ｎ−ＨＳＱＣ  ＮＭＲ測定を実施した。結果を図９〜１２に示す。
図９（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識アスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のアミノ酸選択標識（アスパラギン酸のみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｄのみならず、グルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）およびアスパラギン（Ａｓｎ， Ｎ）のシグナルも観察された。
図９（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液による無細胞タンパク質合成反応にアミノ酸代謝阻害剤であるＡＯＡおよびＤ−リンゴ酸をそれぞれ最終濃度で２０ｍＭと１０ｍＭになるように添加した。Ｄ以外のシグナルは観察されず、厳密なアスパラギン酸選択標識がなされていることが確認された。
【００３８】
図１０（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識グルタミン酸（Ｇｌｕ，Ｅ）のアミノ酸選択標識（グルタミン酸のみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｅのみならず、アスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）およびグルタミン（Ｇｌｎ， Ｑ）のシグナルも観察された。
図１０（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液による無細胞タンパク質合成反応にアミノ酸代謝阻害剤であるＡＯＡを最終濃度で２０ｍＭになるように添加した。Ｅ以外のシグナルは観察されず、厳密なグルタミン酸選択標識がなされていることが確認された。
【００３９】
図１１（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識グルタミン（Ｇｌｎ，Ｑ）のアミノ酸選択標識（グルタミンのみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｑのみならず、グルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のシグナルも観察された。
図１１（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液にグルタミナーゼの阻害剤であるＤＯＮを最終濃度で５ｍＭ添加し、内在するグルタミナーゼを不活化した抽出液を用いて合成したＱのアミノ酸選択標識ＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。図１１（Ｂ）に示すように、Ｑ以外のシグナルは観察されず、厳密なグルタミン選択標識がなされていることが確認された。
【００４０】
図１２（Ａ）は、通常のＢＬ２１株から抽出したＳ３０抽出液による１５Ｎ標識アスパラギン（Ａｓｎ， Ｎ）のアミノ酸選択標識（アスパラギンのみ１５Ｎ標識、残りの１９種類は非標識）によるＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。内在するアミノ酸代謝酵素によるアミノ基転移反応等により、Ｎのみならず、グルタミン酸（Ｇｌｕ， Ｅ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ， Ｄ）のシグナルも観察された。
図１２（Ｂ）は、７種の遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）欠損ＢＬ２１株（Δ７）から抽出したＳ３０抽出液を用いて合成したＮのアミノ酸選択標識ＵＢＡタンパク質の１Ｈ−１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。図１２（Ｂ）に示すように、Ｎ以外のシグナルは観察されず、厳密なグルタミン選択標識がなされていた。
【００４１】
図９〜１２から明らかなように、安定同位体標識したアミノ酸代謝に関わる遺伝子を欠損させた大腸菌株より抽出したＳ３０抽出液で合成したＵＢＡドメインでは、添加した安定同位体標識アミノ酸残基のみが標識されているのに対して、遺伝子欠損していない大腸菌株抽出液で合成したＵＢＡタンパク質では、添加したアミノ酸残基以外にも比較的強いシグナルが観測された。
【００４２】
［実施例２］
実施例１の方法で安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の7重欠損を行った大腸菌株と、遺伝子欠損していない通常の大腸菌株のＳ３０抽出液をそれぞれ含む無細胞タンパク質合成反応液を調製し、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を合成し、その生産量を活性測定により定量した。
その結果を図１３に示す。遺伝子欠損させた大腸菌より抽出したＳ３０抽出液を含む無細胞タンパク質合成系では、遺伝子欠損させていない通常の大腸菌抽出液を用いた場合に比べ合成量が３０％以上向上していることが分かる。これは、分解され易いアスパラギンやセリンの分解が抑えられたことが要因である。
【００４３】
以上の結果から、本発明の大腸菌変異体によれば、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に合成することができる。よって、本発明の大腸菌変異体を用いて、ＮＭＲによるタンパク質立体構造解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。 
【００４４】
［実施例３］
実施例１において作製した（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ，ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の７重欠損を行った大腸菌株をもとに、さらにアスパラギン酸アンモニアリアーゼをコードする遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）で決定し、ａｓｐＡ（配列番号３１）の遺伝子配列情報を得た。
次に決定した遺伝子配列に基づき、実施例１の方法で上記遺伝子情報に基づいてａｓｐＡのプロモーター配列（開始コドンＡＴＧのＡから−１０５塩基上流）から終止コドンＴＡＡのＡまで欠損させた。また、ａｓｐＡ遺伝子（配列番号３１）で表される配列が欠損していることがＤＮＡシークエンサーにより確認された。
【００４５】
更に、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）及び８遺伝子欠損株（Δ８）において、各８遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢおよびａｓｐＡ）を増幅するためのプライマーを用意し、各遺伝子を増幅させた。ＰＣＲ後の各反応液を、アガロースゲルにアプライし、電気泳動を行った後、当該アガロースゲルをエチジウムブロマイドで染色した。図１４に、電気泳動後のアガロースゲルのエチジウムブロマイド染色像を示す。
図１４中、レーン１から１４については、実施例１に記載の7遺伝子欠損株（Δ７）と同様である。レーン１５はＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型とし、ａｓｐＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号３０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液；レーン１６は８遺伝子欠損株（Δ８）を鋳型とし、ａｓｐＡ遺伝子増幅用のフォワードプライマーとして配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーと、リバースプライマーとして配列番号３０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた反応溶液を、それぞれアプライしたレーンである。
尚、左端と右側のＭｒは５００ｂｐＤＮＡラダーマーカーである。図１４右に、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）及び８遺伝子欠損株（Δ８）をそれぞれ鋳型としたときに、予想される各遺伝子の増幅断片の大きさを示す。
図１４に示すように、８遺伝子欠損株（Δ８）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン２，４，６，８，１０，１２，１４、１６）では、ＢＬ２１野生株（ｗｔ）を鋳型として各遺伝子を増幅させたレーン（レーン１，３，５，７，９，１１，１３、１５）と比較して増幅断片が短く、標的遺伝子の欠損がなされていることが確認された。
【００４６】
また、作製した８遺伝子欠損株（Δ８）及び通常のＢＬ２１株の増殖速度を比較した。結果を図１５に示す。グルタミンシンセターゼの遺伝子であるｇｌｎＡおよびアスパラギン酸アンモニアリアーゼの遺伝子であるａｓｐＡの欠損により、８遺伝子欠損株の増殖速度が遅くなる傾向が見られたが、培養時に終濃度で０．５ｍＭのＬ−グルタミンと終濃度で３０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを培養液に添加することで、通常のＢＬ２１とほぼ同等の増殖速度を示したものの、到達濁度は、通常のＢＬ２１株と比較して若干低かった。ただし、８遺伝子欠損株よりＳ３０抽出液を調製し、無細胞タンパク質合成反応を実施したところ、遺伝子欠損していないＢＬ２１株より調製したものと比べ遜色のないタンパク質合成量を示し、実用上十分耐えるものであった。
【００４７】
［実施例４］
実施例の方法で安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした７遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ）の欠損を行った大腸菌株と、遺伝子欠損していない通常の大腸菌株のＳ３０抽出液およびアミノ酸代謝阻害剤として、アミノオキシ酢酸、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを添加した場合と添加しない場合とでそれぞれ鋳型ＤＮＡを含まない無細胞タンパク質合成反応液を調製し，３０℃で１時間反応させ、添加したアミノ酸の安定性をアミノ酸分析計（Ｗａｔｅｒｓ）で評価した。無細胞タンパク質合成反応液において、主に分解されるアミノ酸は、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニン、セリンの５種類であり、それぞれのアミノ酸量の変化を０分、３０分および６０分後に調べた結果を図１６に示す。遺伝子欠損していない大腸菌（ｗｔ）より調製した無細胞タンパク質合成反応液では、阻害剤を添加しない場合では、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニンおよびセリンの分解が見られた。一方、７重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ７）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、遺伝子欠損していない大腸菌の場合と比較して、アスパラギンとセリンの分解が顕著に抑えられていた。さらに、阻害剤を添加した、７重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ７）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、上記に加え、グルタミンおよびアルギニンの分解が抑えられていた。
【００４８】
実施例４の方法で安定同位体標識アミノ酸の代謝に関わるそれぞれの酵素をコードした８遺伝子（ａｓｎＡ, ａｓｎＢ, ａｎｓＡ, ａｎｓＢ, ｇｌｎＡ, ｓｄａＡ, ｓｄａＢ, ａｓｐＡ）の欠損を行った大腸菌株と、遺伝子欠損していない通常の大腸菌株のＳ３０抽出液およびアミノ酸代謝阻害剤として、アミノオキシ酢酸、Ｌ−ブチオニンスルホキシイミン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシンを添加した場合と添加しない場合とでそれぞれ鋳型ＤＮＡを含まない無細胞タンパク質合成反応液を調製し，３０℃で１時間反応させ、添加したアミノ酸の安定性をアミノ酸分析計（Ｗａｔｅｒｓ）で評価した。それぞれのアミノ酸量の変化を０分、３０分および６０分後に調べた結果を図１７に示す。遺伝子欠損していない大腸菌（ＷＴ）より調製した無細胞タンパク質合成反応液では、阻害剤を添加しない場合では、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニンおよびセリンの分解が見られた。一方、８重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ８）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、遺伝子欠損していない大腸菌の場合と比較して、アスパラギン、アスパラギン酸およびセリンの分解が顕著に抑えられていた。さらに、阻害剤を添加した、８重遺伝子欠損させた大腸菌（Δ８）から調製した無細胞タンパク質合成反応液では、上記に加え、グルタミンおよびアルギニンの分解が抑えられ、無細胞タンパク質合成反応中に内在性の酵素により分解されるアミノ酸全ての分解を抑えることができていた。
【００４９】
以上の結果から、本発明の大腸菌変異体によれば、厳密な安定同位体標識タンパク質を簡便に合成することができる。よって、本発明の大腸菌変異体を用いて、ＮＭＲによるタンパク質立体構造解析を迅速かつ容易に行えることが明らかである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図６】
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【図１４】
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【配列表】
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