(57)【要約】【課題】皮膚の粘弾性を向上させるための新しい剤を提供することを課題とする。【解決手段】チオレドキシンを有効成分とする皮膚粘弾性向上剤。【選択図】図６
2016216436.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオレドキシンを有効成分とする皮膚角層のＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）産生促進剤。
【請求項２】
チオレドキシンを有効成分とする皮膚粘弾性の向上剤。
【請求項３】
チオレドキシンをＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）産生促進又は皮膚粘弾性向上のための有効成分として含有する皮膚外用剤。
【請求項４】
チオレドキシンを皮膚粘弾性向上のための有効成分として１ｐｐｍ以上含有する皮膚外用剤。
【請求項５】
チオレドキシンが清酒由来である請求項１〜４のいずれかに記載の剤。
【請求項６】
チオレドキシンを有効成分とするコラーゲンＩＶ・ラミニン−５・エラスチン・フィブリン−５の産生促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚粘弾性の向上剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の健康状態は、様々な指標を用いて評価される。例えば、皮膚の「はり」感の有無が健康状態や老化度の評価指標の一つとされる。「はり」は、角層・表皮由来のはりと、真皮由来のはりの二つに分けられる。特に真皮由来のはりは、指で皮膚を押すと押し返すような弾力があり、指を離すと速やかに元に戻る状態をいい、物理的には粘弾性ともいう。そして皮膚の示すこの粘弾性は、年齢や紫外線被曝、化学物質への皮膚露出などによっても低下する。このため、皮膚のはりは、皮膚老化の指標ともなり得る。
皮膚を一つの弾性体であるとみなして、皮膚の粘弾性率を測定し、「はり」という官能的な評価方法に代えて用いようとする方法及び測定装置が開発されている。代表的な皮膚粘弾性測定装置としてＣＵＴＯＭＥＴＥＲ・キュートメーター（商品名）（Ｃｏｕｒａｇｅ  ＆  Ｋｈａｚａｋａ社製）がある。この装置は、皮膚表面を陰圧状態のプローブ開口部に引き込み、開口部に引き込まれた皮膚長をプリズムで測定し、次いで吸引を解除し、解除したときの変位長（戻り）を同様に測定し、この測定結果をパラメータとして粘弾性率を求めるものである（非特許文献１参照）。この装置を用いた粘弾性率を指標として、皮膚の老化度の評価や、化粧料の効果を評価することが化粧品業界や、美容関連医療分野において広く普及している。
特許文献１には、皮膚のたるみを改善させるような美容施術を行ったときの効果を評価する手段としてキュートメーターを使用することが記載されている。
非特許文献２には、グルコシルセラミド含有ビート抽出物の皮膚弾力性に及ぼす影響を、キュートメーターを用いて評価したことが記載されている。このように皮膚粘弾性は皮膚の健康状態を評価するための重要なパラメータであると認識されている。
【０００３】
また、皮膚の粘弾性という物理的指標を、化学的な分析手法で測定する方法も提案されている。
特許文献２には、ヒト前腕を０．１５％の次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し、洗浄前後の酸化タンパク質を蛍光標識して測定すると、酸化タンパク質量が増加し、さらに、前腕部を前記キュートメーターで測定して得られる物理量であるＲ０（最大引っ張り幅）の処理前後の比が増加することが記載されている。そして、この結果に基づき酸化タンパク質を指標として皮膚の柔軟性を評価する方法が、同じく特許文献２に提案されている。
【０００４】
一方、皮膚の粘弾性を向上させる成分や組成物も各種提案されている。特許文献３には、昆布由来のフコイダンは、低下した皮膚の弾性を向上させることが記載されている。特許文献４には、アスタキサンチンが皮膚の弾性を向上させることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−５１７１７号公報
【特許文献２】特開２００６−３４９３７２号公報
【特許文献３】特開２００３−３１３１３１号公報
【特許文献４】特開２００５−２７５８９号公報
【０００６】
【非特許文献１】皮膚粘弾性測定装置  ＣＵＴＯＭＥＴＥＲ  ＭＰＡ５８０  マニュアル、２００７．５修正版、株式会社インテグラル
【非特許文献２】堀未央、米井嘉一他、Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、  ７［１１］１２９−１４２、２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、新たな皮膚粘弾性の向上剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記のキュートメーターを用い、皮膚の粘弾性を測定し、粘弾性のパラメータと相関関係を有している皮膚のマーカーを探索してきた。この過程で、皮膚角層中のリポカリンファミリーに属するタンパク質であるＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（以下「ＮＧＡＬ」）が粘弾性の向上の指標となりうることを見いだした。本発明は、このＮＧＡＬを指標として各種成分の皮膚角層中のＮＧＡＬ量に及ぼす作用を測定したところ、チオレドキシンが、皮膚角層におけるＮＧＡＬの遺伝子発現や産生を増加させ、そして皮膚の粘弾性を向上させることを見いだした。またチオレドキシンは、コラーゲンＩＶ・ラミニン−５・エラスチン・フィブリン−５を増加させることが判明した。本発明は、これらの知見に基づいてなされたものである。
【０００９】
すなわち、本発明の構成は、以下のとおりである。
（１）チオレドキシンを有効成分とする皮膚角層のＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）産生促進剤。
（２）チオレドキシンを有効成分とする皮膚粘弾性の向上剤。
（３）チオレドキシンをＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）産生促進又は皮膚粘弾性向上のための有効成分として含有する皮膚外用剤。
（４）チオレドキシンを皮膚粘弾性向上のための有効成分として１ｐｐｍ以上含有する皮膚外用剤。
（５）チオレドキシンが清酒由来である（１）〜（４）のいずれかに記載の剤。 
（６）チオレドキシンを有効成分とするコラーゲンＩＶ・ラミニン−５・エラスチン・フィブリン−５の産生促進剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規なＮＧＡＬ産生促進剤、コラーゲンＩＶ・ラミニン−５・エラスチン・フィブリン−５の産生促進剤、及び皮膚の粘弾性向上剤が提供される。本発明のＮＧＡＬ産生促進剤、コラーゲンＩＶ・ラミニン−５・エラスチン・フィブリン−５の産生促進剤、皮膚粘弾性向上剤は皮膚外用剤や、スキンケア剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】キュートメーターを操作したときに得られる皮膚の変形を測定したチャートである。
【図２】角層中のＮＧＡＬ測定値と皮膚粘弾性パラメータＲ２の相関分析を行った図である。
【図３】角層中のＮＧＡＬ測定値と皮膚粘弾性パラメータＲ７の相関分析を行った図である。
【図４】チオレドキシンを添加したケラチノサイト培養液中に分泌されるＮＧＡＬを測定した結果のグラフである。チオレドキシンがＮＧＡＬ産生を促進している。
【図５】ヒト３次元培養皮膚モデルに１ｐｐｍのチオレドキシンを添加した効果を確認した画像である。左は対照、右はチオレドキシンを添加した皮膚モデルの抗体染色画像である。
【図６】処方例１の組成物のヒト試験による皮膚粘弾性に対する効果を確認したグラフである。
【図７】ＨＰＥＫｐ．０５細胞の継代培養３代目と継代培養７代目の細胞が産生するインボルクリン量を比較したグラフである。継代培養７代目の細胞のインボルクリン量が増加しており、細胞の老化を示している。
【図８】培養ＨＰＥＫｐ．０５細胞に遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのコラーゲンＩＶ産生促進効果を確認したグラフである。
【図９】培養ＨＰＥＫｐ．０５細胞に遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのラミニン−５の産生促進効果を確認したグラフである。
【図１０】ヒト三次元皮膚モデルに遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのコラーゲンＩＶ産生促進効果を確認したグラフである。
【図１１】ヒト三次元皮膚モデルに遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのラミニン−５産生促進効果を確認したグラフである。
【図１２】ヒト三次元皮膚モデルに遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのエラスチン産生促進効果を確認したグラフである。
【図１３】ヒト三次元皮膚モデルに遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのフィブリン−５産生促進効果を確認したグラフである。
【図１４】コラーゲンゲルに遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのゲル収縮率を示すグラフである。
【図１５】紫外線照射したコラーゲンゲルに遺伝子組み換えチオレドキシン又は清酒TRXエキスを添加したときのゲル収縮率を示すグラフである。コラーゲンゲルは単独では紫外線照射によって膨張しているが、チオレドキシンにより収縮する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、チオレドキシンを有効成分とする皮膚角層のＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）産生促進剤に係る発明である。また本発明は、チオレドキシンを有効成分とする皮膚粘弾性の向上剤に係る発明である。
Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｉｐｏｃａｌｉｎ（ＮＧＡＬ）は、皮膚角層中に存在するリポカリンファミリーに属するタンパク質である。ＮＧＡＬは、健常人の血中や尿中に存在し、その量は各種の炎症性疾患や細菌感染時に上昇することが知られている。また急性腎機能障害の血中マーカーとされているほか、各種の腫瘍マーカーとしても注目を集めている。本発明においては、ヒト皮膚角層のＮＧＡＬが皮膚の粘弾性パラメータとして利用できるため、ＮＧＡＬの増加を皮膚粘弾性の指標として利用している。
【００１３】
従来技術のキュートメーターによる皮膚粘弾性の測定は次のようにして行われている。  標準的には、吸引径６ミリで３００ｍｂの吸引圧にて５秒間吸引し、その後開放したときの変形する皮膚の変位を解析する。キュートメーターで得ることのできる皮膚粘弾性値の測定パラメータとして、前記したとおり一定の吸引圧及び時間で変形する皮膚の変位を解析して求められる戻り弾性比率（Ｕｒ／Ｕｆ）が主として評価に用いられる。キュートメーターによる皮膚の変位量の経時的測定の代表的なチャートを図１に示す。図１において、Ｕｆ：吸引時の皮膚の伸び（図１のＵｆ１に対応）、Ｕｒ：即時的収縮（図１のＵｒ１に対応）、Ｕａ：吸引解放時の皮膚の戻り（図１のＵａ１に対応）である。皮膚の粘弾性指標として用いられるパラメータは、Ｒ２：吸引時の皮膚の伸びた長さに対する吸引開放時の皮膚の戻り率＝皮膚の復元率（Ｒ２＝Ｕａ／Ｕｆ）、Ｒ７：吸引時の皮膚の伸びた長さに対する即時的（瞬間的）な収縮率＝収縮時の弾性率（Ｒ７＝Ｕｒ／Ｕｆ）である。
Ｒ２は全体の弾力を表しており、完全弾性体で１．００、ヒト皮膚は０．３〜０．５である。Ｒ７は戻り弾性比率であり、１に近いほど弾性があり、ヒト皮膚は０．３〜０．５である。
【００１４】
一方、本発明で採用する皮膚粘弾性は、皮膚角層試料中のＮＧＡＬの発現量として、遺伝子量または蛋白質量を測定し、この数値の増加を粘弾性向上の指標とする。ここで、皮膚試料としては、ヒトの表皮角層を含む皮膚試料が好ましく、方法としては、皮膚に粘着性のテープを貼付し、これを剥離する際に、テープに付着してくる角層を試料とするテープストリッピング法を採用することが、患者への負担が少なく望ましい。
【００１５】
皮膚試料中のＮＧＡＬを遺伝子試料として測定する場合には例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。また、ＮＧＡＬ遺伝子の定量はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより行うことができる。ＮＧＡＬ蛋白質の測定手段としては、例えば免疫染色等が採用できる。測定に用いる抗ＮＧＡＬ抗体及びその標識体は市販品を用いることができる。
免疫染色の場合には、例えば蛍光免疫染色により測定可能である。ＮＧＡＬの定量は、例えば蛍光強度を、市販の測定装置とソフトウェアで定量することにより行うことができる。このような測定操作は、当業者において十分周知されている。そして下記に説明するように、キュートメーターによる皮膚粘弾性の測定は、ＮＧＡＬの測定によって代替できることが、本発明者らによってすでに特許出願されている（特願２０１４−２５２６０７号参照）。
【００１６】
一方、皮膚の粘弾性を向上させる物質の探索に当たっては、培養ケラチノサイトを用いて、この培養系に被験物質を添加し一定期間培養することで、被験物質の皮膚粘弾性向上に対する効果を評価する。細胞培養中の培養液を回収し、この培養液中に含有されるＮＧＡＬ量を測定し、その値が被験物質無添加のケラチノサイト培養系に比較して増加した場合、被験物質が皮膚粘弾性を向上する機能を有すると評価することができる。さらに２次評価として、ヒト３次元培養皮膚モデルに被験物質を添加し、一定時間培養後、組織切片を作成し、前記の免疫染色法によって組織切片のＮＧＡＬに由来する蛍光強度を、対照の被験物質を添加していない組織切片と比較観察することで、皮膚組織における効果を評価することができる。
このようにして天然に存在する各種化合物や組成物、あるいは各種化学物質を評価した結果、本発明に係るチオレドキシンが皮膚のＮＧＡＬを増加させ、粘弾性を向上させることを見いだした。
【００１７】
チオレドキシンは、ＤＮＡ合成に必須のリボヌクレオチドリダクターゼの補酵素として１９６４年に大腸菌から発見されたタンパク質チオール−ジスルフィド・オキシドレダクターゼの一つであり、あらゆる生物種に普遍的に認められる。チオレドキシンは、それを電子受容体とするペルオキシレドキシン等と共に生体内で主要な抗酸化酵素の一つとして機能して、遺伝子発現の制御、細胞増殖の制御、細胞死の制御、細胞内の活性酸素種の消去、好中球の活性化阻害、好中球の遊走阻害等の生理活性を発現することが知られている。さらに、チオレドキシンは、老化、虚血障害、急性肺不全、糖尿病等の酸化ストレスに密接な関係を示す症状や疾病に対して抵抗性を示すことから、酸化ストレスに対して重要な保護作用を示すことも明らかにされている。このように、チオレドキシンには各種の有用な生理活性があり、機能性食品や医薬品等に有用であると考えられている。
【００１８】
チオレドキシンは、試薬として市販の精製品を用いてもよく、またこれを含有する動植物抽出物や細菌、真菌、藻類等の抽出物を用いてもよいし、ヒト型の遺伝子組み換えタンパク質であっても良い。例えばＷＯ２００７／０３２４９０号公報に開示されている酵母抽出物が例示できる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。皮膚外用剤とする場合は、全量当たりの含有量としては特に限定されないが、チオレドキシン量として０．１ｐｐｍ〜５重量％とするのが好ましく、通常１〜１００ｐｐｍとすることで、本発明の効果を発揮する。
本発明の皮膚外用剤は、ローション剤、乳剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤等、種々の剤型で提供することができる。また必要に応じて製剤化のための各種添加剤を配合することができる。
【実施例】
【００１９】
次に試験例、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【００２０】
１．皮膚粘弾性及びＮＧＡＬの相関関係の測定試験
Ａ．方法
（１）試験対象
健常者女性４５歳〜６９歳（３７名） 
【００２１】
（２）キュートメーターを使用した粘弾性測定
顔面右頬部に測定部位を統一して粘弾性を測定した。測定はキュートメーターＭＰＡ５８０を用いた。付属のプローブにより、吸引径６ミリ、３００ｍｂの吸引圧で５秒間吸引するモードで行った。
【００２２】
Ｂ．ＮＧＡＬの測定
・角層採取
被験者の頬部より２．５×２．５ｃｍの角層チェッカー(アサヒテクノラボ社製)１枚を用いてストリッピングを行い、角層を採取した。
・角層抽出方法
ガラスビーズとＴ−ＰＥＲバッファー（＃７８５１０/Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）５００μlの入ったチューブに角層を採取した角層チェッカーを入れ、ビーズ式細胞破砕装置（トミー精工社製）を用い、４６００ｒｐｍ、１８０秒にて角層タンパク
を抽出した。
・角層中総タンパク量の測定
各サンプルのタンパク量はＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ＃２３２２５)を用いて測定した。測定には角層サンプルを１０μｌに ｒｅａｇｅｎｔＡ：ｒｅａｇｅｎｔ＝５０：１で混和した液２００μｌを加え、６０℃３０分間インキュベーションしたのち、５６２ｎｍの吸光度で測定した。同時に精製ウシ血清アルブミンを標準品として検量線を作成し、吸光度の値からタンパク量を算出した。
【００２３】
・角層中ＮＧＡＬ量の測定
各サンプルのＮＧＡＬ発現量は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製  ＃ＤＹ１７５７）を用い、サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法によって次の基準で測定した。
（１）吸着抗体の固定化
９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ(ＣＯＳＴＡＲ ＃３５９０)にラットＮＧＡＬ（ｒａｔ ａｎｔｉ−Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２  Ｐａｒｔ ８４２２７１)を最終濃度２．０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ(−) (Ｗａｋｏ社製  ＃１６２１９３２１)で希釈したものを１００μｌ/ｗｅｌｌで添加し、２５℃、酸素／窒素混合雰囲気でインキュベートした。
（２）ブロッキング
蒸留水を用いて１０倍に希釈した希釈液(Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製  ＃８９０８０３)を３００μｌ/ｗｅｌｌ加え２５℃、１時間インキュベートした。
（３）サンプル添加
検量線作製用の遺伝子組み換えＮＧＡＬ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２  Ｐａｒｔ ８４２２７３）、ヒト角層抽出液（Ｔ−ＰＥＲ ｂｕｆｆｅｒで２倍希釈）をそれぞれ１００μｌ/ｗｅｌｌで加え、２５℃で２時間インキュベート
した。
（４）検出用抗体反応
ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２(Ｐａｒｔ ８４２２７２)を最終濃度１００ｎｇ/ｍｌになるように希釈液で希釈した反応液を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、２５℃、２時間インキュベートした。
（５）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ反応
Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｌｕｅｎｔで２００倍に希釈したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ(Ｐａｒｔ ８９０８０３)を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、２５℃、２０分間インキュベートした。
（６）ＴＭＢ反応
ＴＭＢ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ(Ｐｒｏｍｅｇａ社製  ＃Ｇ７４３１)を１００μｌ/ｗｅｌｌ添加し、２５℃、７．５分間インキュベートした。
（７）反応停止液の添加と吸光度計での測定
０．５ＮＨ２ＳＯ４(Ｗａｋｏ社製  ＃１９８−０９５９５)を１００μｌ/ｗｅｌｌ加え、反応を止め、ＳＰＥＣＴＲＡ ＭＡＸ １９０(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ)を用いて４５０ｎｍ−５４０ｎｍの吸光度を測定した。
なお手順（２）〜（６）を行う前には洗浄用緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０/ＰＢＳ)を用いてプレートの洗浄を行った。
【００２４】
角層中ＮＧＡＬ量として、抽出液中の総タンパク量で補正し、単位タンパク量あたりのＮＧＡＬ量で表した。
【００２５】
Ｃ．結果
皮膚粘弾性とＮＧＡＬの相関解析
粘弾性及びＮＧＡＬの測定結果についてピアソンの単相関分析を行い、単相関回帰式と相関係数を求めた。散布図グラフ及び回帰式を図２、３に示す。
Ｒ２の粘弾性パラメータとＮＧＡＬ測定値の相関係数Ｒ＝０．３１９、Ｒ７の粘弾性パラメータとＮＧＡＬ測定値の相関係数はＲ＝０．３０３であった。この解析結果から皮膚角層のＮＧＡＬ測定結果は、キュートメーターで測定した皮膚の粘弾性パラメータのＲ２、Ｒ７に代替できることが明らかとなった。
すなわち、皮膚の粘弾性の物理的な測定結果に代えて、ＮＧＡＬを測定することで皮膚の粘弾性を評価できることが明らかとなった。またＮＧＡＬの増加は、皮膚の粘弾性の増加に対応していることも明らかとなった。したがって以上の試験は、ＮＧＡＬを指標として皮膚の粘弾性向上を評価できる技術であるといえる。
【００２６】
２．チオレドキシンによるケラチノサイトＮＧＡＬ産生促進作用
（１）細胞培養方法・試験方法
使用細胞はＮＨＥＫ−Ｎｅｏ（ヒト表皮角化細胞：ケラチノサイト、新生児皮膚由来、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ社製、Ｌｏｔ Ｎｏ.２４６９９２）を用いた。培養液は、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ ６０μＭ   Ｃａｌｃｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｊａｐａｎ）にＨｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２増殖添加剤セット（倉敷紡績社製）を加えた培地を用いた。
ＮＨＥＫ−Ｎｅｏを５０，０００ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌの細胞密度で平板１２ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、一晩３７℃、５％ＣＯ2雰囲気のインキュベーターにて培養し、コンフルエントに細胞定着後、試験試料をふくむ培養液に交換し、さらに２４時間、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気のインキュベーターにて培養した。１試験試料あたり３ｗｅｌｌとし、培養終了後、培養液を回収し、ＮＧＡＬのＥＬＩＳＡ測定サンプルとした。
【００２７】
（２）試験試料
遺伝子組み換えヒトチオレドキシン（オリエンタル酵母工業社製）およびチオレドキシン含有組成物（清酒ＴＲＸエキス：アリスタヘルスアンドニュートリションサイエンス社製）を試験試料とした。
ヒトチオレドキシンは、最終濃度が３０ｐｐｍ、１００ｐｐｍになるように前記の培養液中に添加した。また、清酒ＴＲＸエキス中には、チオレドキシンが１００ｐｐｍ含有されている。これを最終濃度が清酒ＴＲＸエキスとして０．２％になるように培養液に添加した。
【００２８】
（３）総タンパク量の測定
各サンプルのタンパク量はＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製  ＃２３２２５)を用いて測定した。測定にはサンプル１０μｌに、ｒｅａｇｅｎｔＡ：ｒｅａｇｅｎｔ＝５０：１で混和した液２００μｌを加え、６０℃３０分間インキュベーションしたのち、５６２ｎｍの吸光度を測定した。同時に精製ウシ血清アルブミンを標準品として検量線を作成し、吸光度の値からタンパク量を算出した。
【００２９】
（４）ＮＧＡＬ量の測定
ＮＧＡＬ量の測定は、上記のヒト角層の測定と同様の方法と手順で行った。
【００３０】
（５）結果
培養上清のＮＧＡＬの測定結果を図４に示した。
図４からヒトチオレドキシン、清酒ＴＲＸエキスともにケラチノサイトのＮＧＡＬ産生を促進していることが明らかである。
【００３１】
３．チオレドキシンによるヒト３次元培養皮膚モデルに対する角層ＮＧＡＬ産生促進作用（１）ヒト３次元培養皮膚モデル、培養方法
ヒト３次元培養皮膚モデル（ＬａｂＣｙｔｅ Ｅｐｉ−ＭＯＤＥＬ ２４：ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製）を常法に従いラボサイト用アッセイ培地（ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング社製）で培養を開始した。
２４時間後に皮膚モデルカップ上に、以下に示す処方例１のローション剤（チオレドキシン１ｐｐｍ含有）を１００μｌ添加した。そしてさらに２４時間培養後組織を回収した。
【００３２】
（２）抗体染色
回収した皮膚モデルを組織用迅速固定液Super fix（倉敷紡績社製）で一晩固定した後、組織を切り出し、パラフィンブロックを作成した。薄切切片を定法に従って脱パラフィン処理した後、Ｈｕｍａｎ Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２/ＮＧＡＬ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｂ, Ｇｏａｔ ＩｇＧ （Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）と、Ｃｈｉｃｋｅｎ ａｎｔｉ−Ｇｏａｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ, Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ, Ｃｏ.社製）で組織中のＮＧＡＬの存在を観察した。
ＮＧＡＬの蛍光を蛍光顕微鏡下で観察すると同時に画像を撮影した。
【００３３】
（３）結果
蛍光顕微鏡画像を図５に示す。左の画像はチオレドキシン無添加の組織の画像であり、右の画像が清酒ＴＲＸエキス１％（チオレドキシン１ｐｐｍ含有）を添加した組織の画像である。チオレドキシンを添加した場合、組織のＮＧＡＬに由来の蛍光量が明らかに増大した。 
試験２、３からチオレドキシンにより皮膚を構成するケラチノサイト及び角層のＮＧＡＬ産生が促進されることが確認できた。またＮＧＡＬが増加することから皮膚の粘弾性が向上することが明らかとなった。
【００３４】
処方例１；
市販の清酒ＴＲＸエキスを配合し、チオレドキシン１ｐｐｍを含有するローションの組成を以下に示す。
清酒ＴＲＸエキス                          １質量％（チオレドキシン１ｐｐｍ）
グリセリン                                ７
１，３ブチレングリコール                  ６
ジグリセリン                              ３
スクワラン                                ３
ペンチレングリコール                      ２
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油            ０．５
精製水                                    残余
【００３５】
＜処方例１によるヒト試験＞
（１）試験対象：４０歳以上の、肌の弾力性低下に悩む女性２０名を対象とした。被験者の平均年齢５１．７歳であった。
（２）試験方法：処方例１のローションと、清酒ＴＲＸエキスを水で置換した対照品を化粧時に通常の化粧水と同様に肌に塗布して、化粧を行う。１ヶ月間連用してもらい、１ヶ月経過後皮膚の角層を採取した。なお、試験に当たっては、処方例１、対照品を被験者にランダムに割付て、塗布した。さらに肌の粘弾性に影響を及ぼすその他の基礎化粧品の使用を禁じた。両頬からテープストリッピング法によって皮膚角層サンプルを採取し、上記したＮＧＡＬの測定方法に従って測定した。
【００３６】
（３）結果
ＮＧＡＬの試験開始前後の増加量（ΔＮＧＡＬ）を図６に示す。この結果から明らかなようにチオレドキシンを含有する組成物を投与した皮膚は顕著なＮＧＡＬの増加が認められ、皮膚粘弾性が向上している。これに対して対照の組成物を投与した皮膚はＮＧＡＬが殆ど増加しておらず、皮膚の粘弾性が向上しなかったことがわかる。したがってチオレドキシンは皮膚の粘弾性を向上させることが明らかとなった。
【００３７】
４．細胞培養におけるチオレドキシンによる皮膚粘弾性関与タンパク質の産生促進確認試験
上記の試験１〜３の結果からＮＧＡＬが増加することで皮膚粘弾性が改善することが明らかとなった。さらにチオレドキシンが、皮膚粘弾性に関与するタンパク質であるコラーゲンＩＶ・ラミニン−５についての産生促進試験を行った。
【００３８】
（１）継代培養による皮膚老化細胞の作成
使用細胞は、ＨＰＥＫｐ．０５（ヒト表皮角化細胞、ＣＥＬＬｎＴＥＣ社）を用いた。ＨＰＥＫｐ．０５をメーカー指定の培地ＣｎＴ−Ｐｒｉｍｅで継代培養し、継代培養３代目を本試験に用いる若い細胞とし、継代培養１０代目を本試験に用いる老化細胞として調製した。若い細胞と老化細胞の分別の指標として、老化にともなって細胞表面に発現する角化タンパク質インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）を用いた。インボルクリンの測定は市販の抗体を用いた測定キットを使用した。若い細胞と老化細胞の、細胞当たりβ−アクチンタンパク質に対するインボルクリンの量の測定結果を図７に示す。
なお、インボルクリン量は、老化細胞（７代目）が若い細胞の約３倍に達しており、継代７代目以上で老化していることが確認できる。したがって以下の試験では３代目の細胞を若い細胞、１０代目の細胞を老化細胞としてそれぞれ用いた。
【００３９】
（２）コラーゲンＩＶ・ラミニン−５の産生促進試験
ＨＥＰＫｐ．０５細胞（継代３代目及び継代１０代目）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍｌ／ｗｅｌｌになるように６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにそれぞれ播種し、３７℃、ＣＯ２雰囲気下で３日間培養した。次いで、最終濃度が遺伝子組み換えチオレドキシン（ｒＴＲＸ）３０ｐｐｍ、清酒TRXエキス１％になるように添加した。また、陽性対照として、レチノイン酸を最終濃度１ｎＭになるように添加した後、さらに４８時間培養した。
次いで細胞タンパク質を抽出した。
細胞はＰＢＳ（−）で１回洗浄した後、Ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを入れて、４℃の冷蔵庫で振動しながら３０分間浸透させた。スクレーパーで回収し、６０００Ｇで４分間遠心した後、上清を回収した（以下細胞抽出液と称する）。Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃ）でタンパク定量した。
【００４０】
抽出した細胞抽出液は、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％βメルカプトエタノール濃度になるように調整し、９５℃、５分間タンパク変性させた。次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％  ＤＲＣ  ｇｅｌ）で分離し、０．２μｍ  ＰＶＤＦ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋに転写した。Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温、１時間ブロッキングし、一次抗体を反応させた。一次抗体ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／１０００，Ａｂｃａｍ）をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで希釈し、４℃、冷蔵庫で一晩振動させながら反応させた。
次いで０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで洗浄し、２次抗体を入れて室温で１時間反応させた。２次抗体にはＨＲＰ−Ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．８１−１６２０）を１：１００００に希釈、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ａ１０５５１）を１：１００００になるようにｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した。反応終了後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで３回洗浄し、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分間反応させ、ルミノ・イメージアナライザーＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉシリーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、解析を行った。
【００４１】
（３）結果
コラーゲンＩＶの測定結果を図８、ラミニン−５の測定結果を図９に示す。
いずれのタンパク質もチオレドキシンの添加によって産生が促進された。また老化細胞にあっては、レチノイン酸（ＲＡ）は効果を示さなかったがチオレドキシンはコラーゲンＩＶ型、ラミニン−５の両方のタンパク質について産生を促進した。
【００４２】
５．三次元ヒト皮膚モデルにおけるチオレドキシンによる皮膚粘弾性関与タンパク質の産生促進確認試験
三次元ヒト皮膚モデルを用いて、表皮構造中の皮膚粘弾性関与タンパク質の産生促進効果を試験した。
（１）三次元ヒト皮膚モデル試験
三次元皮膚モデルはＬＳＥ−ｈｉｇｈ（東洋紡：ＬＳＥ−００３）を使用した。
まず、メーカーのマニュアルに従い、到着した三次元皮膚組織を１．２ｍｌの培養培地で２４時間馴化した。そして、組織の上にはＰＢＳで調整したｒＴＲＸ及び清酒ＴＲＸ溶液を１００μｌずつ添加し、組織の下には培養培地で調整したｒＴＲＸをそれぞれ３０ｐｐｍ又は清酒ＴＲＸエキス０．０１％になるように添加した。また陽性対照としてレチノイン酸を同様に３０ｎＭになるように添加した。
なお対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、同量のＰＢＳ（−）を組織の上部に入れ、培養培地を組織の下に入れて培養した。
培養２日後、組織上部の溶液を吸引除去し、ＰＢＳ（−）で一回洗浄した後、続けて空気暴露を行った。尚、組織の下は新しいｒＴＲＸ及び清酒ＴＲＸ溶液を添加し、さらに３日間培養した。合計５日間培養した後、組織を取り出し、ＰＢＳ（−）で一回洗浄した。
次いで、あらかじめビーズ破砕チューブ（ＴＯＭＹ．ＴＭ−６２６）にビーズ一粒（ＴＯＭＹ．ＺＢ−５０）と３５０μｌのｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを入れて置き、バイオプシーパンチで切り抜いた組織をチューブに入れて、ビーズ式細胞破砕機（トミー精工社）で２８００ｒｐｍ、１２０秒間回転破砕した。破砕した組織蛋白を８０００Ｇで４分間遠心分離を行い、上清を回収して蛋白定量した。
【００４３】
抽出した細胞抽出液は、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ、１０％βメルカプトエタノール濃度になるように調整し、９５℃、５分間タンパク変性させた。次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％  ＤＲＣ  ｇｅｌ）で分離し、０．２μｍ  ＰＶＤＦ  Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋに転写した。ウエスタンブロット操作は、上記と同様に実施した。
Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｔ２０（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で室温、１時間ブロッキングし、一次抗体を反応させた。一次抗体、ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  Ｅｌａｓｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／１０００，ＥＰＣ），ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｌａｍｉｎｉｎ−５  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ），ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  ＩＶ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／１０００，Ａｂｃａｍ），ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｆｉｂｕｌｌｉｎ−５  ａｎｔｉｂｏｄｙ（１／１０００，Ａｂｃａｍ）をｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで希釈し、４℃、冷蔵庫で一晩振動させながら反応させた。
次いで０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで洗浄し、２次抗体を入れて室温で１時間反応させた。２次抗体にはＨＲＰ−Ｒａｂｂｉｔ−ＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．８１−１６２０）を１：１００００に希釈、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ａ１０５５１）を１：１００００になるようにｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで希釈した。反応終了後、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで３回洗浄し、ＥＣＬ  ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で５分間反応させ、ルミノ・イメージアナライザー  ＬＡＳ−４０００ｍｉｎｉシリーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出し、解析を行った。
【００４４】
（２）結果
コラーゲンＩＶの測定結果を図１０、ラミニン−５の測定結果を図１１、エラスチンの測定結果を図１２、フィブリン−５の測定結果を図１３に示す。いずれのタンパク質もチオレドキシンによって皮膚モデルにおいて産生が促進されていた。
【００４５】
６．コラーゲンゲル収縮試験におけるチオレドキシンの効果
皮膚の粘弾性に作用する物質のスクリーニングに用いられるコラーゲンゲル収縮試験によりチオレドキシンの作用を確認した。また紫外線照射によるコラーゲンゲル収縮抑制に対する効果を確認した。
（１）コラーゲンゲル収縮
ＮＨＤＦ細胞（線維芽細胞）をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｎｏ．１９９６−０６５）＋１０％ＦＢＳで混濁し、細胞密度を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞混濁液とゲル溶液（ブタ皮膚性コラーゲンＩ溶液）（日本ハム製、３０７−３１６１１）を１：６になるように混合し、氷冷上で２ｍｌずつ６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに分注した。このゲルプレートの半分にＵＶＢ（２５ｍＪ／ｃｍ２）（ＯＭＲＯＮ  Ｈ５ＡＮ）を照射し、３７℃、ＣＯ２雰囲気の条件で培養した。４時間後、ゲルの固化を確認し、予め調整したｒＴＲＸと清酒ＴＲＸ溶液をそれぞれ２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加した。次いで３７℃、５％ＣＯ２の条件下でさらに４８時間継続培養した。
培養終了後、培地を除き、ＰＢＳにて洗浄した。次いで１０％ホルマリン溶液に入れて２４時間ゲルの固定操作をおこなった。ホルマリン溶液を１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ溶液に置換した。ゲルをカメラで撮影し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（ＮＩＨ（アメリカ国立衛生研究所））を用いて、ゲル及びＷｅｌｌの直径を計測した。
各サンプル４か所ずつ測定し、平均値を算出した。Ｐｌａｔｅの直径に対するゲルの収縮率を算出し、面積を計算した。そして、紫外線を照射しない対照のゲル（無添加ゲル）の面積を１００％とし、各試験群の収縮率（％）を求めた。
【００４６】
（２）結果
チオレドキシン添加によるゲルの収縮率を図１４、紫外線照射（ＵＶＢ照射）による収縮率変化を図１５に示す。
チオレドキシンは、コラーゲンゲルの収縮作用を有しており、さらに紫外線照射によるコラーゲンゲル収縮阻害に対して抑制作用を有することが確認できた。
【００４７】
上記の試験４〜６によりチオレドキシンは、皮膚粘弾性関与タンパク質の産生を促進し、紫外線によるコラーゲンゲルの収縮阻害を抑制する作用を有することが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図５】
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