(57)【要約】      （修正有）【課題】脂肪酸を製造し、外因性アルコール等の存在下でロウエステルシンターゼを発現するために遺伝子組換えした微生物を培養することによる脂肪酸エステル製造法の提供。【解決手段】マロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路の酵素活性を増加させることによって、少なくとも５個の炭素原子を含む脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）を製造を可能にする第一の遺伝子突然変異、及び、ロウエステルシンターゼは、配列番号１〜８及びそれらの組合せのポリペプチドに対して、又は脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを脂肪酸エステルに変換することを触媒するためのあらゆるポリペプチドの機能的断片に対して少なくとも５０％の配列同一性のある１つのロウエステルシンターゼの活性を増加させる第二の遺伝子突然変異を含む細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの脂肪酸エステルを製造するための微生物細胞であって、以下、
−  マロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路の野生型細胞と比較して細胞における酵素活性を増加させることによって、前記細胞が少なくとも１つの脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）を製造することを可能にする、少なくとも１つの第一の遺伝子突然変異、ここで、脂肪酸は少なくとも５個の炭素原子を含む、及び
−  野生型細胞と比較して細胞における少なくとも１つのロウエステルシンターゼの活性を増加させる第二の遺伝子突然変異、ここで、ロウエステルシンターゼは、配列番号１〜８及びそれらの組合せのポリペプチドに対して、又は脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを脂肪酸エステルに変換することを触媒するためのあらゆるポリペプチドの機能的断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する
を含む遺伝子組換えをした、前記細胞。
【請求項２】
前記ロウエステルシンターゼが、配列番号２、配列番号７、配列番号８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記第一の遺伝子突然変異が、野生型細胞と比較して、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（又はエロンガーゼ）、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素の発現における増加、及び場合により、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現における減少をもたらす、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞が、野生型細胞と比較して、細胞の脂肪酸分解能力を減少させる第三の遺伝子突然変異を含む、請求項１から３までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
前記第三の遺伝子突然変異が、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素の発現における減少をもたらす、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記脂肪酸がラウリン酸であり、脂肪酸のアシル補酵素Ａがラウロイル補酵素Ａであり、かつ脂肪酸エステルが、メチルラウレート、エチルラウレート、プロピルラウレート、ブチルラウレート、及びペンチルラウレートからなる群から選択される、請求項１から５までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞が、少なくともβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ｆａｂＨ）の発現における増加をもたらす第一の突然変異を含む、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼが、
−  配列番号２４〜２７及びそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性、又は
−  配列番号２４〜２７及びそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性
を有する、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞をさらに遺伝子組換えして、野生型細胞と比較して、３−ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドラターゼ（３ＨＣＤｈ）及び／又はケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）の発現を増加させる、請求項６から８までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記３ＨＣＤｈがクロトナーゼ／エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｃｒｔ）であり、かつＫＣＲがヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（Ｈｂｄ）である、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記Ｃｒｔが、配列番号２６のポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、及び／又は前記Ｈｂｄが、配列番号２７のポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記脂肪酸エステルを、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール及びペンタノールからなる群から選択される少なくとも１つの外因性アルコールの存在下で製造する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１３】
メチルラウレートを製造するための方法であって、ラウリン酸及び／又はラウロイル補酵素Ａと、配列番号１〜８及びそれらの組合せのポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する単離したロウエステルシンターゼとを接触することを含む、前記方法。
【請求項１４】
前記ロウエステルシンターゼが、配列番号２、配列番号７及び配列番号８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法を、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の細胞内で実施する、請求項１３又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖から少なくとも１つの脂肪酸エステルを製造するための、生物工学的な方法及び細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪酸エステルは、いくつかの目的のために商業的に使用されうる。例えば、バイオディーゼル、代替燃料は、エステル（例えば脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル等）からなる。ある低分子量のエステルは、フレグランス又は香味料として有用にする心地よいにおいを揮発する。脂肪酸エステルを、ラッカー、ペイント、ワニス等のための溶媒としても使用してよい。エステルを、樹脂及びプラスチックにおける軟化剤、可塑剤、難燃剤、並びにガソリン及び油における添加剤としても使用する。さらに、エステルを、ポリマー、フィルム、織物、染料、及び医薬品の製造において使用できる。従って、脂肪酸エステルは、今日では非常に有用である。
【０００３】
脂肪酸エステルは石油から抽出できる。しかしながら、この方法は、エネルギーを消費し、費用がかかる。さらに、この方法は非効率なプロセスであり、それというのもしばしば原油中の長鎖炭化水素を分解して、より小さいモノマーを製造するからである。そしてそれらのモノマーを原料として使用して、より複雑な特殊な化学物質を製造する。ガソリン又は石油を分解するこのプロセスは、環境に悪い。また、これらの出発材料についての費用が石油の価格に関連するため、今後の石油価格の増加が予期され、これらの脂肪酸エステルを製造する費用も、石油価格における増加に相対して増加しうる。
【０００４】
石油によって生じた固有の挑戦により、調査され、抽出され、長期間輸送され、又は実質的に例えば石油に精製される必要のない再生可能な石油源が必要とされる。経済的に製造でき、かつ石油工業及び石油系燃料の燃焼によって生じる環境破壊を生じない再生可能な石油源についても必要とされている。
【０００５】
脂肪酸エステルは、いくつかのバイオ燃料に見出されうる。しかしながら、これらのバイオ燃料及び／又は植物系燃料からの脂肪酸エステルの収率は低い。従って、脂肪酸エステルの代替の生物源を開発する必要がある。１つの選択としては、脂肪酸エステルの効率的な製造のための微生物種を組換え操作することである。
【０００６】
脂肪酸エステルは、時にロウエステルシンターゼの存在下でのアシル−ＣｏＡ分子とあらゆる鎖長のアルコールとの縮合反応の生成物であることが公知である。例えば、脂肪酸エステルは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソブタノール、２−メチルブタノール、３−メチルブタノール、又はペンタノールとアシル−ＣｏＡ分子との縮合生成物であってよい。ある場合に、脂肪酸エステル、例えば脂肪酸メチルエステル（“ＦＡＭＥ”）又は脂肪酸エチルエステル（“ＦＡＥＥ”）を反応中に使用されるアルコール（例えばメタノール又はエタノール）を培地に供給することによって製造できる。同様に、ロウエステルを、脂肪アルコールを供給することによって製造できる。
【０００７】
ほとんどの脂肪酸エステルは、前記のような有用な機能を有する。これらのエステルの１つであるメチルラウレートＣＨ3（ＣＨ2）10ＣＯＯＣＨ3（水不溶性であり透明な無色のエステル）は、医薬品工業及び化粧品工業を含む工業におけるいくつかの使用を有する。
【０００８】
しかしながら、脂肪酸エステルを製造するために使用される現行の方法は、無駄な資源をもたらす大量の副生成物を生じるため非効率的である。また、現在利用できる方法は、特定の脂肪酸エステルを選択することができない。従って、より良いエネルギー効率、及びメチルラウレートを含む脂肪酸エステルの特定の製造が要求される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Heath et al., Prog. Lipid Res. 40(6):467-97 (2001)
【非特許文献２】McCue et al., Nucleic Acids Res., 29(3):774-82 (2001)
【非特許文献３】Zhang et al., J. Biol. Chem. 277 (18):15558-65 (2002)
【非特許文献４】Chang et al., J. Bacteriol. 154(2):756-62 (1983)
【非特許文献５】Abdel-Ahmid et al., Microbiol. 147(6):2001
【非特許文献６】Mat-Jan et al., J. Bacteriol. 171(1):342-8
【非特許文献７】Bunch et al., Microbiol. 143(1):187-95 (1997)
【非特許文献８】Enoyl-Acyl Carrier Protein (fabI) Plays a Determinant Role in Completing Cycles of Fatty Acid Elongation in Escherichia coli,” Richard J. Heath and Charles 0. Rock, J. Biol. Chem. 270:44, pp. 26538-26543 (1995),
【非特許文献９】Beguin, P and Aubert, J-P (1994) FEMS Microbial. Rev. 13: 25-58
【非特許文献１０】Ohima, K. et al. (1997) Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 14: 365414
【非特許文献１１】Antonenkov, V., D. et al. Van Veldhoven, P., P., Waelkens, E., and Mannaerts, G.P. J. Biol. Chem. 1997, 272:26023-26031
【非特許文献１２】Reed, 1981
【非特許文献１３】Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3rd edition,
【非特許文献１４】Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680, 1994
【非特許文献１５】Katoh et al., Genome Information, 16(1), 22-33, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
脂肪酸エステルを製造するために使用される現行の方法は、無駄な資源をもたらす大量の副生成物を生じるため非効率的である。また、現在利用できる方法は、特定の脂肪酸エステルを選択することができない。従って、より良いエネルギー効率、及びメチルラウレートを含む脂肪酸エステルの特定の製造が要求される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、遺伝子組換えした微生物から脂肪酸エステルを製造する少なくとも１つの方法を提供することにより、前記問題を解決することを試みる。特に、脂肪酸エステルを、脂肪酸を製造し、外因性アルコール、例えば外因性エタノール、外因性メタノール等の存在下で少なくとも１つのロウエステルシンターゼを発現するために遺伝子組換えした微生物を培養することによって製造する。
【００１２】
一態様に従って、本発明は、少なくとも１つの脂肪酸エステルを製造するための微生物細胞を提供し、その際、該細胞は、遺伝子組換えされて、以下
−  細胞が少なくとも１つの脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを製造することを可能にする少なくとも１つの第一の遺伝子突然変異、ここで脂肪酸は少なくとも５個の炭素原子を含む、及び
−  野生型細胞と比較して細胞における少なくとも１つのロウエステルシンターゼの活性を増加する少なくとも１つの第二の遺伝子突然変異、ここで、ロウエステルシンターゼは、配列番号１〜８及びそれらの組合せのポリペプチドに対して、又は脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを脂肪酸エステルに変換することを触媒するためのあらゆるポリペプチドの機能的断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する
を含む。
【００１３】
特に、前記細胞は、マロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸−ＣｏＡ代謝経路の野生型細胞と比較して細胞において酵素活性を増加させることによって、脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを製造することができる。
【００１４】
本発明の任意の態様に従った微生物細胞は、原核生物又は真核生物であってよい。これらは、哺乳動物細胞（例えばヒトからの細胞）、植物細胞、又は微生物、例えば酵母、真菌又は細菌であってよく、その際、微生物、特に細菌及び酵母を使用してよい。
【００１５】
適した細菌、酵母又は真菌は、特に、細菌株、酵母株又は真菌株として、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) GmbH (DSMZ), Brunswick, Germanyにおいて受託されている細菌、酵母又は真菌である。本発明によって適している細菌は、以下で挙げられる属
http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm
に属し、本発明によって適している酵母は、以下で挙げられる属
http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm
に属し、かつ本発明によって適している真菌は、以下で挙げられる属
http://www.dsmz.de/species/fungi.htm
に属する。
【００１６】
特に、前記細胞は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パラコッカス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチロバクテリウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）及びカプリアビダス属（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）から選択されてよい。より詳述すれば、前記細胞は、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アルカリゲネス・レイタス（Alcaligenes latus）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、バークホルデリア・アンドロポゴニス（Burkholderia andropogonis）、Ｂ．ブラシレンシス（B. brasilensis）、Ｂ．カレドニカ（B. caledonica）、Ｂ．カリベンシス（B. caribensis）、Ｂ．カリオフィリ（B. caryophylli）、Ｂ．フンゴラム（B. fungorum）、Ｂ．グラジオリ（B. gladioli）、Ｂ．グラテイ（B. glathei）、Ｂ．グルミア（B. glumae）、Ｂ．グラミニス（B. graminis）、Ｂ．ホスピタ（B. hospita）、Ｂ．クルリエンシス（B. kururiensis）、Ｂ．フェナジニウム（B. phenazinium）、Ｂ．フィマタム（B. phymatum）、Ｂ．フィトフィルマンス（B. phytofirmans）、Ｂ．プランタリー（B. plantarii）、Ｂ．サッカリー（B. sacchari）、Ｂ．シンガポレンシス（B. singaporensis）、Ｂ．ソルジジコーラ（B. sordidicola）Ｂ．テリコーラ（B. terricola）、Ｂ．トロピカ（B. tropica）、Ｂ．ツベラム（B. tuberum）、Ｂ．ウドネンシス（B. ubonensis）、Ｂ．ウナマエ（B. unamae）、Ｂ．キセノボラン（B. xenovorans）、Ｂ．アンチナ（B. anthina）、Ｂ．ピロシニア（B. pyrrocinia）、Ｂ．タイランデンシス（B. thailandensis）、カンジダ・ブランキ（Candida blankii）、カンジダ・ルゴサ（Candida rugosa）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、大腸菌（Escherichia coli）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クリベロミセス・ラクティス（Kluveromyces lactis）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）、パラコッカス・バルスタス（Paracoccus versutus）、シュードモナス・アルゲンチネ���ス（Pseudomonas argentinensis）、Ｐ．ボルボリ（P. borbori）、Ｐ．シトロネロリス（P. citronellolis）、Ｐ．フラベセンス（P. flavescens）、Ｐ．メンドシナ（P. mendocina）、Ｐ．ニトロレジュセン（P. nitroreducens）、Ｐ．オレオボランス（P. oleovorans）、Ｐ．シュードアルカリゲン（P. pseudoalcaligenes）、Ｐ．レジノボラン（P. resinovorans）、Ｐ．ストラミネア（P. straminea）、Ｐ．アウランチアカ（P. aurantiaca）、Ｐ．オーレオファシエンス（P. aureofaciens）、Ｐ．クロロラフィス（P. chlororaphis）、Ｐ．フラギ（P. fragi）、Ｐ．ランデンシス（P. lundensis）、Ｐ．タエトロレンス（P. taetrolens）、Ｐ．アンタルクティカ（P. antarctica）、Ｐ．アゾトホルマン（P. azotoformans）、Ｐ．ブラッチホルダエ（P. blatchfordae）、Ｐ．ブラシカセアラム（P. brassicacearum）、Ｐ．ブレネリ（P. brenneri）、Ｐ．セドリナ（P. cedrina）、Ｐ．コルゲータ（P. corrugata）、Ｐ．フロレッセンス（P. fluorescens）、Ｐ．ゲサルジ（P. gessardii）、Ｐ．リバネンシス（P. libanensis）、Ｐ．マンデリ（P. mandelii）、Ｐ．マルギナリス（P. marginalis）、Ｐ．メジテルラネア（P. mediterranea）、Ｐ．メリジアナ（P. meridiana）、Ｐ．ミグラエ（P. migulae）、Ｐ．ムシドレン（P. mucidolens）、Ｐ．オリエンタリス（P. orientalis）、Ｐ．パナシス（P. panacis）、Ｐ．プロテオリティカ（P. proteolytica）、Ｐ．ロデジア（P. rhodesiae）、Ｐ．シンキサンタ（P. synxantha）、Ｐ．チベルバレンシス（P. thivervalensis）、Ｐ．トラアージ（P. tolaasii）、Ｐ．ベロニー（P. veronii）、Ｐ．デニトリフィカンス（P. denitrificans）、Ｐ．ペルツシノゲナ（P. pertucinogena）、Ｐ．クレモリコロレート（P. cremoricolorata）、Ｐ．フルバ（P. fulva）、Ｐ．モンテイリ（P. monteilii）、Ｐ．モゼリ（P. mosselii）、Ｐ．パラフルバ（P. parafulva）、Ｐ．プチダ（P. putida）、Ｐ．バレアリカ（P. balearica）、Ｐ．スタッツェリ（P. stutzeri）、Ｐ．アミグダリ（P. amygdali）、Ｐ．アベラネ（P. avellanae）、Ｐ．カリカパパイエ（P. caricapapayae）、Ｐ．チコリー（P. cichorii）、Ｐ．コロナファシエンス（P. coronafaciens）、Ｐ．フィクセレクタ（P. ficuserectae）、Ｐ．ヘリアンティ（P. helianthi）、Ｐ．メリアエ（P. meliae）、Ｐ．サバスタノイ（P. savastanoi）、Ｐ．シリンゲ（P. syringae）、Ｐ．トマト（P. tomato）、Ｐ．ビリジフラバ（P. viridiflava）、Ｐ．アビエタニフィラ（P. abietaniphila）、Ｐ．アシドフィラ（P. acidophila）、Ｐ．アガリシ（P. agarici）、Ｐ．アルカリフィラ（P. alcaliphila）、Ｐ．アルカノリティカ（P. alkanolytica）、Ｐ．アミロデラモサ（P. amyloderamosa）、Ｐ．アスプレニー（P. asplenii）、Ｐ．アゾチフィゲン（P. azotifigens）、Ｐ．カンナビナ（P. cannabina）、Ｐ．コエノビオ（P. coenobios）、Ｐ．コンゲランス（P. congelans）、Ｐ．コスタンチニー（P. costantinii）、Ｐ．クルシビエ（P. cruciviae）、Ｐ．デルヒエンシス（P. delhiensis）、Ｐ．エキシビス（P. excibis）、Ｐ．エクストレモリエンタリス（P. extremorientalis）、Ｐ．フレデリクスベルゲンシス（P. frederiksbergensis）、Ｐ．フスコバギネ（P. fuscovaginae）、Ｐ．ゲリジコーラ（P. gelidicola）、Ｐ．グリモンティ（P. grimontii）、Ｐ．インディカ（P. indica）、Ｐ．イェセニー（P. jessenii）、Ｐ．ジンジュエンシス（P. jinjuensis）、Ｐ．キロネンシス（P. kilonensis）、Ｐ．ナックムッシ（P. knackmussii）、Ｐ．コレエンシス（P. koreensis）、Ｐ．リニ（P. lini）、Ｐ．ル���ア（P. lutea）、Ｐ．モラビエンシス（P. moraviensis）、Ｐ．オチチディス（P. otitidis）、Ｐ．パチャストレラ（P. pachastrellae）、Ｐ．パレロニアナ（P. palleroniana）、Ｐ．パパベリス（P. papaveris）、Ｐ．ペリ（P. peli）、Ｐ．ペロレンス（P. perolens）、Ｐ．ポエ（P. poae）、Ｐ．ポハンゲンシス（P. pohangensis）、Ｐ．フィクロフィラ（P. psychrophila）、Ｐ．シクロトレランス（P. psychrotolerans）、Ｐ．ラトニス（P. rathonis）、Ｐ．レプチリボラ（P. reptilivora）、Ｐ．レジニフィラ（P. resiniphila）、Ｐ．リゾスフェラ（P. rhizosphaerae）、Ｐ．ルベセンス（P. rubescens）、Ｐ．サロモニー（P. salomonii）、Ｐ．セジチス（P. segitis）、Ｐ．セプチカ（P. septica）、Ｐ．ジミエ（P. simiae）、Ｐ．スイス（P. suis）、Ｐ．テルモトレランス（P. thermotolerans）、Ｐ．アエルギノーサ（P. aeruginosa）、Ｐ．トレマエ（P. tremae）、Ｐ．トリビアリス（P. trivialis）、Ｐ．ツルビネラ（P. turbinellae）、Ｐ．ツチコリエンシス（P. tuticorinensis）、Ｐ．ウンソンゲンシス（P. umsongensis）、Ｐ．バンコベレンシス（P. vancouverensis）、Ｐ．ブラノベンシス（P. vranovensis）、Ｐ．キサントマリナ（P. xanthomarina）、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）、ロドスピリルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・スファロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）及びザイモモナス・モビレ（Zymomonas mobile）からなる群から選択されてよい。より詳述すれば、前記細胞は、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、バチルス属及びエシェリキア属からなる群から選択される細菌細胞であってよい。さらに詳述すれば、前記細胞は，シュードモナス・プチダ及び大腸菌からなる群から選択されてよい。
【００１７】
遺伝子組換え細胞は、野生型細胞とは遺伝的に異なってよい。本発明の任意の態様による遺伝子組換え細胞と野生型細胞との遺伝子的差異は、野生型細胞において存在しなくてよい、遺伝子組換え細胞における完全な遺伝子、アミノ酸、ヌクレオチド等の存在であってよい。一例において、本発明の任意の態様による遺伝子組換え細胞は、前記細胞から少なくとも１つの脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを製造し、脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを脂肪酸エステルに変換することができる酵素を含んでよい。野生型細胞は、本発明の遺伝子組換えした細胞と比較して、遺伝子組換え細胞が少なくとも１つの脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを製造することができる酵素、並びに遺伝子組換え細胞が脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａをそれぞれの脂肪酸エステルに変換することができる酵素の活性を検出できなくてよい。
【００１８】
細胞に関して本明細書において使用される“野生型”の語句は、野生の状態で天然に見出せる形でのゲノム構成を有する細胞を示してよい。前記用語は、全細胞に及び個々の遺伝子に適用できる。従って“野生型”の用語は、遺伝子配列が組換え法を使用して当業者に少なくとも部分的に改変されているかかる細胞又はかかる遺伝子を含まない。
【００１９】
当業者は、細胞を遺伝子組換えする技術において公知のあらゆる方法を使用することができる。本発明の任意の態様に従って、遺伝子組換え細胞は遺伝子組換えされて、２時間以内、特に８時間又は２４時間以内の定義された時間間隔で、野生型細胞よりも少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍又は少なくとも１００００倍多い脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａ及びそれぞれの脂肪酸エステルを形成してよい。生成物形成における増加を、例えば、本発明の任意の態様に従った細胞と野生型細胞を、それぞれ別々に同一条件（同一の細胞密度、同一の栄養培地、同一の培養条件）で、特定の時間間隔で、適した栄養培地中で培養し、そして栄養培地中の標的生成物（脂肪酸、それらのアシル補酵素Ａ及びそれぞれの脂肪酸エステル）の量を測定することによって測定できる。
【００２０】
特に、前記細胞は、細胞が少なくとも１つの脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを製造することを可能にする少なくとも１つの第一の遺伝子突然変異を含む。特に、第一の遺伝子突然変異は、細胞が、マロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路によって少なくとも１つの脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを製造することを可能にしてよい。より詳述すれば、野生型細胞と比較して細胞中のマロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路における酵素活性の増加がある。
【００２１】
前記細胞を、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路（“ＭＤＭＩＦＡＡ”）における酵素活性を増加するために遺伝子組換えしてよい。この経路は、本明細書においてマロニル−ＣｏＡ依存性であるがマロニル−ＡＣＰ非依存性である脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路ともいわれる。細胞のマロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路におけるかかる増加は、増加させた活性もしくは遺伝子の発現、又はアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現又は活性における減少と組み合わせて、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（又はエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び／又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む経路によって達せられてよい。代わりに、微生物のマロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路における増加は、増加させた遺伝子の発現、又はアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現又は活性における減少と組み合わせて、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び／又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む経路によって達せられてよい。
【００２２】
細胞に脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを製造させてよく、かつ本発明の任意の態様に従った第一の遺伝子突然変異と考えられてよい酵素又は酵素活性に対する制限のない遺伝子組換えの例は、以下の第１表において提供され、かつＵＳ２０１４００５１１３６号において説明されている。
【００２３】
特に、本発明の細胞における脂肪酸生合成経路は、前駆体アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを使用する。含まれうる酵素は図１１において提供される。
【００２４】
一例において、これらのポリペプチドの温度感受性型をコードする核酸配列を、天然酵素の場所に挿入してよく、かかる遺伝子組換え微生物を高温で（これらの熱不安定性ポリペプチドを、部分的に又は完全にタンパク質構造における改変又は完全失活によって不活性化させる温度で）培養する場合に、化学生成物における増加が観察される。例えば、大腸菌において、それらの温度感受性突然変異遺伝子は、ＦａｂＩｔｓ（Ｓ２４１Ｆ）、ＦａｂＢｔｓ（Ａ３２９Ｖ）又はＦａｂＤｔｓ（Ｗ２５７Ｑ）等を含んでよい。これらの例のほとんどにおいて、遺伝子組換えは、マロニル−ＣｏＡの使用を増加してよく、その結果、天然経路を介したマロニル−ＣｏＡの脂肪酸への変換を減少し、全体のバイオマス、及び脂肪酸を含む化学生成物又はマロニル−ＣｏＡ依存性経路及びマロニル−ＡＣＰ非依存性経路を介した生成物に由来する脂肪酸への炭素源の変換が割合的に多くなる。また、例えばマロニル−ＣｏＡ製造を増加するための追加の遺伝子組換えをいくつかの例のために実施してよい。
【００２５】
他の例において、酵素、エノイル−アシルキャリヤータンパク質レダクターゼ（ＥＣ番号１．３．１．９、エノイル−ＡＣＰレダクターゼともいう）は、マロニル−ＣｏＡからの脂肪酸生合成の鍵となる酵素である。大腸菌において、この酵素、ＦａｂＩは、遺伝子ＦａｂＩによってコードされる（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ． Ｈｅａｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。
【００２６】
一例において、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ａｂｄｅｌ−Ａｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ．， ２００１）の発現レベルを、本発明の任意の態様に従った細胞中で減少又は機能的に消失させてよい。ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子は、例えばＥＣ １．２．３．３の酵素をコードしてよい。特に、ピルビン酸オキシダーゼは、ＰｏｘＢ遺伝子であってよい。
【００２７】
一例において、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｍａｔ−Ｊａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９７）の発現レベルを、減少又は機能的に消失させてよい。ある例において、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、例えばＥＣ １．１．１．２７の酵素をコードする。乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＮＡＤ連結発酵性Ｄ−乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であってよい。特に、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、ｌｄｈＡ遺伝子である。
【００２８】
一例において、第一の遺伝子突然変異は、フィードバック耐性酵素の増加させた発現をもたらす細胞の少なくとも１つのフィードバック耐性酵素中にあってよい。特に、酵素は、パントテン酸キナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ等であってよい。大腸菌において、フィードバック耐性突然変異遺伝子は、ＣｏａＡ（Ｒ１０６Ａ）及び／又はｌｐｄ（Ｅ３５４Ｋ）を含みうる。
【００２９】
他の例において、細胞のマロニル−ＣｏＡ依存性であるが、マロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路における増加は、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ活性及び／又はトリガー因子活性及び／又は細胞分裂において含まれる分子シャペロンの活性における減少をもたらしてよい。一例において、前記細胞は、Ｔｔｉｇ遺伝子における遺伝子突然変異を含んでよい。
【００３０】
一例において、前記細胞における最初の遺伝子突然変異は、野生型細胞と比較してＮＡＤＰＨ−依存性トランスデヒドロゲナーゼ経路における増加された酵素活性をもたらしてよい。この結果は、ヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ活性をコードするポリペプチドについてコードする非相同核酸配列の挿入により生じてよい。
【００３１】
他の例において、前記細胞における第一の遺伝子突然変異は、当業者に公知のあらゆる方法によって脂肪アシル−ＣｏＡシンターゼ及び／又はリガーゼ活性の減少させた発現をもたらしてよい。
【００３２】
さらに他の例において、前記細胞における第一の遺伝子突然変異は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する酵素の過剰発現をもたらしてよい。
【００３３】
一例において、前記細胞は、シアナーゼ及び／又はカルボン酸無水物活性を有するポリペプチドについてコードする非相同核酸配列の挿入によってもたらされる細胞内重炭酸レベルを増加させてよい。
【００３４】
より詳述すれば、前記細胞の任意の態様に従った第一の遺伝子突然変異は、脂肪アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性の増加及び／又は減少されたレベルをもたらしてよい。この結果は、鎖長特異性脂肪アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性のレベルを増加すること、及び所望でない脂肪酸の鎖長に対して脂肪アシル−ＣｏＡチオエステラーゼ活性を減少させることによって、所望の脂肪酸生成物の鎖長特異性を増加してよい。一例において、脂肪酸又は脂肪酸由来の生成物の増加させた鎖長特異性は、鎖長特異性ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ又は３−ヒドロキシ−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性のレベルを個々に又は組み合わせて増加することによって生じてよい。
【００３５】
本発明の任意の態様に従った細胞における第一の遺伝子突然変異は、前記酵素のリストから選択される酵素の１つのみの発現における増加もしくは減少、又は前記酵素の組合せ物の発現における増加もしくは減少をもたらしてよい。
【００３６】
他の例において、前記細胞における第一の遺伝子突然変異は、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（又はエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素中であってよい。より詳述すれば、前記細胞における第一の遺伝子突然変異は、場合によりアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現又は活性における減少と組み合わせて、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（又はエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼの発現における増加をもたらす。特に、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ及び／又はケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、コファクターＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨのいずれかを使用してよい。
【００３７】
特に、本発明の任意の態様に従った細胞における遺伝子組換えは、次の酵素、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（又はエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び／又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ及びアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼと組み合わせて、第１表において挙げられているあらゆる酵素を含んでよく、その際、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（又はエロンガーゼ）、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼの酵素の発現又は活性を増加させ、かつアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの活性を減少させる。
【００３８】
さらに他の例において、本発明の任意の態様に従った細胞におけるマロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪アシル−ＣｏＡ代謝経路は、増加させた遺伝子の発現、又はアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現又は活性における減少と組み合わせて、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び／又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼを含む経路によって達せられてよい。
【００３９】
特に、本発明の任意の態様に従った細胞における第一の遺伝子組換えは、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼの発現又は活性における減少と組み合わせて、以下の酵素、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、エノイル−ＣｏＡレダクターゼ、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ及び／又は３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼと組み合わせて第１表において挙げられたあらゆる酵素を含んでよい。
【００４０】
一例において、本発明の任意の態様に従った細胞は、次の酵素、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（ＦａｂＢ）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＦａｂＦ）、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ及びエノイルＡＣＰレダクターゼと組み合わせて、第１表において挙げたあらゆる酵素における第一の遺伝子組換えを含んでよい。
【００４１】
より詳述すれば、第一の遺伝子突然変異は、野生型細胞と比較して、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（ＦａｂＢ）、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＦａｂＦ）、３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼＩ及びエノイルＡＣＰレダクターゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素の発現における増加をもたらしてよい。特に、第一の遺伝子突然変異は、マロニル−ＣｏＡ依存性及びマロニル−ＡＣＰ非依存性の脂肪酸−ＣｏＡ代謝経路の野生型細胞と比較して細胞において酵素活性を増加させることによって、脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａを細胞に製造させることができる、本発明の任意の態様に従った細胞における１つ以上の酵素の発現における増加をもたらしてよい。
【００４２】
一例において、本発明の任意の態様に従った細胞におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ及び３−オキソアシル−ＡＣＰ−シンターゼの発現における増加があってよい。他の例において、本発明の任意の態様に従った細胞におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ及びマロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰ−トランスアシラーゼの発現における増加があってよい。さらに他の例において、本発明の任意の態様に従った細胞におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ及びエノイルＡＣＰレダクターゼの発現における増加があってよい。一例において、本発明の任意の態様に従った細胞におけるβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、マロニル−ＣｏＡ−ＡＣＰ−トランスアシラーゼ及びエノイルＡＣＰレダクターゼの発現における増加があってよい。全ての例において、エノイルＡＣＰレダクターゼ及び／又はアシル−ＣｏＡチオエステラーゼの発現における増加があってよい。
【００４３】
“酵素の増加させた活性”の語句は、本明細書において使用されるように、増加させた細胞内活性と理解されるべきである。基本的に、酵素活性における増加は、強力プロモーターを使用して、又は増加させた活性を有する相応する酵素についてコードする遺伝子又は対立遺伝子を使用して、及び場合によりそれらの方法を組み合わせることによって、酵素をコードする１つ又は複数の遺伝子配列のコピー数を増加することによって達せられてよい。本発明の任意の態様に従って使用される遺伝子組換え細胞は、例えば、形質転換、形質導入、接合、又はそれらの方法と所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子及び遺伝子候補を発現させるベクターを含むベクターとの組合せによって製造される。非相同発現は、特に、細胞の染色体又は染色体外複製ベクターにおける遺伝子又は対立遺伝子の組込みによって達せられる。
【００４４】
従って、本発明の細胞及び方法は、脂肪酸又は脂肪酸由来の生成物に対する製造経路と減少させた活性を示すマロニル−ＡＣＰ依存性脂肪酸シンターゼ系の酵素をコードする改質したポリヌクレオチドとの双方を含む遺伝子組換え微生物を提供することを含んでよく、その結果、マロニル−ＣｏＡの利用は、かかる改質を欠く比較可能な（対照の）微生物と比較して製造経路にシフトする。前記方法は、栄養培地と一緒に提供された容器中でかかる遺伝子組換え細胞の集合体を使用する化学生成物の製造を含む。本明細書に記載された、他の酵素、例えばアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ及び／又はＮＡＤＰＨ−依存性トランスデヒドロゲナーゼに対する他の遺伝子組換えが、ある例において存在してよい。これらの酵素活性示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのさらなる複製を提供することは、脂肪酸又は脂肪酸由来の生成物の製造を増加させることを示す。これらのそれぞれの酵素活性を増加させる他の方法は、当業者に公知であり、かつ本発明の種々の例に適用されてよい。
【００４５】
【表１−１】
2016052303.tif 000002
【表１−２】
2016052303.tif 000003
第１表  脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａの製造のための微生物の細胞における遺伝子組換えの例。
【００４６】
制限されることなく、脂肪酸を製造する同様の多相法における第一工程は、容器中に、例えば培養容器又はバイオリアクタ容器中に、栄養培地、例えば当業者に公知の最少培地、及び遺伝子組換え微生物の接種物を提供して、かかる微生物、例えば細菌、及びより詳述すれば、腸内細菌科の種類、例えば大腸菌を提供することによって例示されてもよく、その際、遺伝子改質微生物は、マロニル−ＣｏＡから脂肪酸に変換する代謝経路を含む。この接種物を、容器中で培養して、細胞密度を、前記方法の次の工程を考慮にいれた全体の生産性マトリックスを満たす、脂肪酸又は脂肪酸由来の生成物の製造レベルを達成するために適した細胞密度まで増加させる。種々の代わりに実施態様において、これらの遺伝子組換え微生物の集合体を、最初に予備容器中で、最初の細胞密度まで培養し、そしてそれを容器に移して、選択された細胞密度を提供してよい。種々の多数の容器の培養ストラテジーは、当業者に公知である。任意のかかる例は、前記方法の第一の工程に従った選択された細胞密度を提供する。
【００４７】
制限されることなく、続く工程は、種々の例において組み合わせて実施されてもよい、２つのアプローチによって例示されてもよい。第一のアプローチは、遺伝子組換え微生物に遺伝子組換えを提供して、そのエノイル−ＡＣＰレダクターゼ酵素活性を制御してよい。一例として、遺伝子組換えを、天然のエノイル−ＡＣＰレダクターゼを、温度感受性突然変異体エノイル−ＡＣＰレダクターゼ（例えば大腸菌におけるｆａｂＩTS）に置き換えるために実施してよい。その形成体は、３０℃より高い温度で減少された酵素活性を示してよいが、３０℃で通常の酵素活性を示し、例えば３４℃、３５℃、３６℃、３７℃又はさらに４２℃までの培養温度の上昇は、エノイル−ＡＣＰレダクターゼの酵素活性を減少させる。かかる場合に、より多くのマロニル−ＣｏＡが、３０℃で脂肪酸に変換され、その際、マロニル−ＣｏＡの脂肪酸への変換は、効果的でないエノイル−ＡＣＰレダクターゼによって妨害されない。
【００４８】
脂肪酸の製造に有用であってよい他の遺伝子組換えが細胞中で含まれてよい。例えば、スクロースを使用する能力が提供されてよく、かつこれは、脂肪酸又は脂肪酸由来の生成物又は他の化学生成物を製造するために使用されてよい供給原料の範囲を拡張する。通常の研究室及び大腸菌の工業菌株、例えば本明細書において記載される株は、単独の炭素源としてスクロースを使用できない。スクロース、及びスクロース含有供給原料、例えば糖蜜が豊富であり、しばしば微生物発酵による生成物のための供給原料として使用されるために、適した遺伝子組換え物を添加してスクロースの取り込み及び使用を可能にすることを、本明細書において提供された他の特徴を有する株において実施してよい。種々のスクロースの取り込み及び代謝系は、当業者に公知である（例えば、米国特許番号第６，９６０，４５５号）。
【００４９】
遺伝子組換えを提供して、より複雑な炭素源、例えばセルロースバイオマス又はそれらの生成物の破壊のための機能性を、かかる炭素源の取り込みのため及び／又は使用のために付加してもよい。例えば、多数のセルロース及びセルラーゼを基礎とするセルロース分解系が研究されており、かつ特徴付けられている（Ｂｅｇｕｉｎ， Ｐ ａｎｄ Ａｕｂｅｒｔ， Ｊ−Ｐ， １９９４； Ｏｈｉｍａ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【００５０】
ある例において、遺伝子組換えは、かつ補因子ＮＡＤＰＨのプール及び利用可能性を高め、及び／又は、従って、ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰ+比も提供してよい。例えば、大腸菌において、これは、例えば遺伝子組換えによって、次の遺伝子の１つ以上の活性を高めることにより実施されてよい：ｐｇｉ（突然変異形で）、ｐｎｔＡＢ、過剰発現した、ｇａｐＡ：ｇａｐＮ置換／置き換え、及び可溶性トランスヒドロゲナーゼ、例えばｓｔｈＡ、及び／又はｚｗｆ、ｇｎｄ、及びｅｄｄの１つ以上の遺伝子組換え物を破壊又は改質すること。
【００５１】
あらゆるかかる遺伝子組換えを、かかる機能性を有さない、又は所望のレベルよりも低いかかる機能性を有する種に提供してよい。より詳述すれば、及び遺伝子組換えのために選択された微生物の特定の代謝経路に依存性して、任意の下位群の遺伝子組換え物を製造して、アセテート、アセトイン、アセトン、アクリル、マレート、脂肪酸エチルエステル、イソプレノイド、グリセロール、エチレングリコール、エチレン、ポルピレン、ブチレン、イソブチレン、酢酸エチル、酢酸ビニル、他のアセテート、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ブチレート、イソブチレート、２−ＯＨ−イソブチレート、３−ＯＨ−ブチレート、エタノール、イソプロパノール、Ｄ−ラクテート、Ｌ−ラクテート、ピルベート、イタコネート、レブリネート、グルカレート、グルタレート、カプロラクタム、アジピン酸、プロパノール、イソプロパノール、フーゼルアルコール、及び１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、ホルメート、フマル酸、プロピオン酸、コハク酸、吉草酸、及びマレイン酸からなる群から選択される発酵生成物の細胞質生成物を減少してよい。遺伝子消失を、一般に本明細書において記載されるように実施してよく、かつ他のアプローチを使用して、選択された発酵生成物の所望の減少させた細胞生成物を得てもよい。
【００５２】
本発明の任意の態様に従った第一の遺伝子突然変異は、少なくとも１つの脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａ（ＣｏＡ）の形成をもたらしてよく、その際脂肪酸は、少なくとも５個の炭素原子を含む。特に、脂肪酸は、５個から１８個を超える任意の鎖長であってよい。脂肪酸は、ペンタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ドデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸塩、ステアリン酸及びオレイン酸からなる群から選択されてよい。特に、これらの脂肪酸を、脂肪アシル−ＣｏＡチオエステラーゼの活性によって、脂肪アシル−ＣｏＡ中間体から製造してよい。代わりに、これらの脂肪酸を、最初に脂肪酸アシル−ホスフェートを製造する脂肪アシル−ＣｏＡホスホトランスフェラーゼ、及び脂肪酸を脂肪アシル−ホスフェートから製造するために操作する脂肪酸キナーゼの作用の協同活性によって、脂肪アシル−ＣｏＡ中間体から製造してよい。
【００５３】
本発明の任意の態様に従って、本発明の任意の態様に従った細胞を組み合わせて、脂肪酸を製造することを可能にしてよい。特に、細胞に提供される炭素源は、約１．０×１０-14以上の炭素−１４と炭素−１２の割合を有してよい。炭素源は、例えばグルコース、スクロース、フルクトース、デキストロース、ラクトース、キシロース、ペントース、ポリオール、ヘキソース、他のセルロース糖、又はそれらの組合せからなる群から選択されてよい。一例において、炭素源はグリセロールである。他の例において、炭素源は合成ガスであってよい。合成ガスは、例えば、石炭ガス化の副生成物として製造されうる。従って、本発明の任意の態様に従った微生物は、廃棄物である物質を価値のある資源に変換することが可能であってよい。
【００５４】
他の例において、合成ガスは、置換した及び置換していない有機化合物を製造するための、本発明の混合培養で使用するための広く入手でき低費用の農業用原料のガス化の副生成物であってよい。合成ガスに変換できる多数の原料の例があり、ほとんど全ての形の植生をこの目的のために使用できる。特に、原料は、多年草、例えばススキ、トウモロコシ残滓、加工廃棄物、例えばおがくず等からなる群から選択される。
【００５５】
一般に、合成ガスを、所望のバイオマスのガス化装置において、主に加水分解、部分酸化及び蒸気改質によって得てよく、その際合成ガスの主な生成物は、ＣＯ、Ｈ2及びＣＯ2である。通常、ガス化プロセスから得られた合成ガスの一部を最初に加工して、生成物の収率を最適化し、タールの形成を妨げる。所望でないタール及び合成ガス中のＣＯの破壊を、石灰及び／又はドロマイトを使用して実施してよい。これらの加工は、例えばＲｅｅｄ（１９８１）において詳細に記載されている。特に、細胞培養は、脂肪酸シンターゼの阻害剤を含んでよく、細胞は、細胞の脂肪酸シンターゼ経路において減少させた酵素活性のために遺伝子組換えされてよい。これは、特定の所望の脂肪酸を製造するために良好な制御を可能にしてよい。
【００５６】
本発明の任意の態様に従った細胞は、野生型細胞と比較して、細胞中の少なくとも１つのロウエステルシンターゼの活性を高めてよい少なくとも１つの第二の遺伝子突然変異を含んでよい。ロウエステルシンターゼは、配列番号１〜２３のポリペプチドに対して、又は脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａのそれぞれの脂肪酸エステルへの変換を触媒作用するためのあらゆるポリペプチドの機能的断片に対して、少なくとも５０％の配列同一性を含んでよい。特に、ロウエステルシンターゼは、配列番号１〜８及びそれらの組合せのポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を含んでよい。より詳述すれば、本発明の任意の態様に従って使用されるロウエステルシンターゼは、配列番号１〜８の配列のいずれか１つ及びそれらの組合せのポリペプチドに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を含んでよい。これらの配列は単に参考のアミノ酸配列である。特に、本発明の任意の態様に従って使用されるロウエステルシンターゼの配列は、機能、例えばタンパク質の触媒活性のために必須なもの以外のアミノ酸を含んでよく、又は分子の折りたたみもしくは構造を挿入によって削除、置換又は置き換えてよく、又は必須アミノ酸を、参考配列又はそれらに由来する分子の生物学的活性を維持する効果に保存的な方法で置き換える。技術水準は、２つの与えられたアミノ酸配列を整列するため、及び同一性の程度を算出するために使用されてよいアルゴリズムを含む（Ａｒｔｈｕｒ Ｌｅｓｋ （２００８）、及びＫａｔｏｈ ｅｔ ａｌ．， ２００５を参照）。特に、本発明の任意の態様に従って使用されるロウエステルシンターゼ配列は、タンパク質に機能を提供するアミノ酸を含んでよい。より詳述すれば、ロウエステルシンターゼ配列は、アミノ酸配列における消失、挿入又は置換、及び脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａのそれぞれの脂肪酸エステルへの変換を触媒作用することができるロウエステルシンターゼの機能を含んでよい。一例において、配列番号１〜８の配列のいずれか１つの突然変異体を、本発明の任意の態様において使用してよい。本明細書において使用される“突然変異体”は、脂肪酸及び／又はそれらのアシル補酵素Ａのそれぞれの脂肪酸エステルへの変換するロウエステルシンターゼの機能を維持することができる配列番号１〜８の配列のいずれか１つに由来する突然変異体を示す。かかる突然変異体は、少なくとも１つのアミノ酸の消失、置換、挿入、又は付加を受けたアミノ酸配列を有する。本発明の突然変異体を、当業者に公知の任意の方法を使用して適切に製造してよい。
【００５７】
【表２−１】
2016052303.tif 000004
【表２−２】
2016052303.tif 000005
【表２−３】
2016052303.tif 000006
【表２−４】
2016052303.tif 000007
【表２−５】
2016052303.tif 000008
【表２−６】
2016052303.tif 000009
第２表  ロウエステルシンターゼの配列。
【００５８】
この適用を通して、任意のデータベースコードは、反対に明記されない限り、ＮＣＢＩデータベース、より詳述すれば２０１４年６月１２日のオンライン版から入手できる配列をいい、かかる配列が、ヌクレオチド配列である場合、ポリペプチド配列は、形成体を翻訳することにより得られる。
【００５９】
本発明の任意の態様に従った細胞は、野生型細胞と比較して、細胞の脂肪酸分解能力を減少させた第三の遺伝子突然変異を含んでよい。
【００６０】
脂肪酸の分解は、酵素による触媒反応の結果により達せられる。第一に、脂肪酸を取り込み、そして大腸菌の場合にそれぞれＦａｄＬ及びＦａｄＤ／ＦａｄＫといわれる、少なくとも１つの外膜タンパク質及び脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ活性を有する１つの内膜介在タンパク質を含む輸送／アシル活性機構による細胞膜を越えて転移される。細胞の内側で、分解されるべき脂肪酸は、β−酸化経路の他の反応を触媒作用する酵素をうける。第一の細胞間の工程は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼを介したアシルＣｏＡのエノイルＣｏＡの変換を含み、後者は、大腸菌の場合にＦａｄＥといわれる。アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの活性を、先行技術において記載されているように、例えば３４０ｎｍで１００ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．４、０．２ｍＭエノイル−ＣｏＡ、０．４ｍＭ ＮＡＤ+中で、分光測定でＮＡＤＨの濃度を監視することにより分析評価してよい。得られたエノイル−ＣｏＡを、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡにより、大腸菌においてＦａｄＢ及びＦａｄＪといわれる、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒作用した水和及び酸化を介して、３−ケトアシル−ＣｏＡに変換する。エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ／３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ活性、より詳述すれば生成物ＮＡＤＨの形成を、先行技術において記載されているように、例えばＦａｄＥについて概説されるように分光測定で分析評価してよい。最終的に、３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ、大腸菌においてＦａｄＡ及びＦａｄＩは、３−ケトアシル−ＣｏＡの分裂を触媒作用して、アセチル−ＣｏＡ及び２つの炭素原子によって短縮された入力アシル−ＣｏＡを得る。ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼの活性を、例えばAntonenkov, V., D. et al. (1997)、Substrate specificities of 3-oxoacyl-CoA thiolase and sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-coa thiolase purified from normal rat liver peroxisomesにおける、先行技術において記載されているように分析評価してよい。ステロールキャリヤータンパク質２／３−オキソアシル−ＣｏＡチオラーゼは、２−メチル分枝鎖脂肪酸及び胆汁酸中間体の代謝に含まれる。一例において、本明細書において使用される“減少させた脂肪酸分解能力を有する細胞”は、脂肪酸を吸収する及び／又は分解する減少させた能力を有する細胞をいう。細胞の脂肪酸分解能力は、種々の方法で減少されてよい。他の例において、細胞は、その野生型と比較して、β−酸化経路において含まれる酵素の減少させた活性を有する。他の例において、本明細書において使用される“β−酸化経路において含まれる酵素”の用語は、β−酸化経路により脂肪酸の分解の一部として形成される脂肪酸又はそれらの誘導体と触接相互作用し、β−酸化経路の一部として形成された代謝物へ変換する酵素をいい、その際反応の順は、例えば脂肪酸又はそれらの誘導体を基質として認識することによって脂肪酸のアセチル−ＣｏＡ及び短縮された脂肪酸のＣｏＡエステルへの変換に影響する。より詳述すれば、本発明の任意の態様に従った細胞における減少された脂肪酸分解能力は、野生型細胞と比較して、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素の発現における減少をもたらす、第三の遺伝子突然変異であってよい。
【００６１】
例えば、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、β−酸化経路に含まれる酵素であってよく、それは、脂肪酸−ＣｏＡと相互作用し、かつ脂肪酸−ＣｏＡエステルをエノイル−ＣｏＡに変換し、β−酸化の一部として形成された代謝物である。他の例において、本明細書において使用される“β−酸化経路において含まれる酵素”は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ及び３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼからなる群からの任意のポリペプチドを含む。続いて、アシル−ＣｏＡシンテターゼは、脂肪酸を脂肪酸のＣｏＡエステル、すなわち分子への変換を触媒作用してよく、その際カルボキシル基の官能基−ＯＨを、−Ｓ−ＣｏＡに、前記脂肪酸をβ−酸化経路に導入するために置き換える。例えば、大腸菌におけるポリペプチドＦａｄＤ及びＦａｄＫ（受託コード：ＢＡＡ１５６０９．１）は、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。一例において、本明細書において使用される“アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ”は、β−酸化経路の一部として、アシル−ＣｏＡのエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒作用することができるポリペプチドである。例えば、大腸菌におけるポリペプチドＦａｄＥ（受託コード：ＢＡＡ７７８９１．２）はアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼである。一例において、本明細書において使用される“２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼ”は、β−酸化経路の一部として、不飽和脂肪酸からの２，４−ジエノイル−ＣｏＡのエノイル−ＣｏＡへの変換を触媒作用することができるポリペプチドである。例えば、大腸菌におけるポリペプチドＦａｄＨは、２，４−ジエノイル−ＣｏＡレダクターゼである。一例において、本明細書において使用される“エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ”は、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼともいい、β−酸化経路の一部として、水和及び酸化を介して、エノイル−ＣｏＡの３−ケトアシル−ＣｏＡへの変換を触媒作用することができるポリペプチドをいう。例えば、大腸菌におけるポリペプチドＦａｄＢ及びＦａｄＪ（受託コード：ＢＡＥ７７４５７．１）は、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼである。一例において、本明細書において使用される“ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ”は、例えばβ−酸化経路の最終工程として、２つの炭素原子及びアセチル−ＣｏＡによって短縮されたアシル−ＣｏＡをもたらす、３−ケトアシル−ＣｏＡを分割する変換を触媒作用することができるポリペプチドである。例えば、大腸菌におけるポリペプチドＦａｄＡ及びＦａｄＩ（受託コード：ＡＰ００９０４８．１）は、ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼである。
【００６２】
特に、本発明の任意の態様に従った細胞は、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩの発現における増加をもたらす遺伝子突然変異を含んでよい。これは、本発明の任意の態様に従った細胞における第一の突然変異であってよい。当業者に公知の任意のβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ｆａｂＨ）を、本発明の任意の態様に従った方法において使用してよい。特に、ｆａｂＨは第３ａ表から選択されてよい。
【００６３】
【表３−１】
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【表３−２】
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第３ａ表  脂肪酸、例えばラウリン酸を製造するために使用してよいＦａｂＨの可能の源。
【００６４】
β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ）は、配列番号２４〜２７及びそれらの組合せからなる群から選択されるポリペプチドに対して、又はポリペプチドのあらゆる機能的断片に対して少なくとも５０％の配列同一性を含んでよい。特に、ＦａｂＨは、配列番号２４〜２７及びそれらの組合せのポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を含んでよい。より詳述すれば、本発明の任意の態様に従って使用されるＦａｂＨは、配列番号２４〜２７及びそれらの組合せの配列のいずれか１つのポリペプチドに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を含んでよい。より詳述すれば、本発明の任意の態様に従った細胞は、ＦａｂＨの配列の組合せを含む第一の突然変異を有してよい。例えば、本発明の任意の態様に従った細胞は、配列番号２４及び２７、配列番号２５及び２７、配列番号２６及び２７等を含むポリペプチドに対して少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含むために、遺伝子組換えしてよい。
【００６５】
これらの配列は単に参考のアミノ酸配列である。特に、本発明の任意の態様に従って使用されるＦａｂＨの配列は、機能、例えばタンパク質の触媒活性のために必須なもの以外のアミノ酸を含んでよく、又は分子の折りたたみもしくは構造を挿入によって削除、置換又は置き換えてよく、又は必須アミノ酸を、参考配列又はそれらに由来する分子の生物学的活性を維持する効果に保存的な方法で置き換える。
【００６６】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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第３ｂ表  本発明の任意の態様に従った細胞において使用してよいＦａｂＨ、ｃｒｔ、Ｈｂｄの配列。
【００６７】
本明細書において使用される“脂肪エステル”の用語はエステルをいう。特に、脂肪エステルは、脂肪酸エステルを製造する脂肪酸から製造したあらゆるエステルである。一例において、脂肪酸エステルは、Ａ側（すなわち、カルボキシレート酸素に付着する炭素鎖）及びＢ側（すなわち、親カルボキシレートを含む炭素鎖）を含む。特に、脂肪エステルが脂肪酸生合成経路に由来する場合に、Ａ側は、アルコールにより生じ、Ｂ側は脂肪酸により生じる。あらゆるアルコールが使用され、脂肪酸のＡ側を形成しうる。例えば、アルコールは、脂肪酸生合成経路に由来してよい。代わりに、アルコールを、脂肪酸でない生合成経路を介して製造してよい。一例において、アルコールは、外因的に提供されてよい。例えば、アルコールを、脂肪エステルを脂肪酸も製造できる生物により製造する場合に、発酵ブロス中で供給してよい。代わりに、カルボン酸、例えば脂肪酸又は酢酸を、脂肪エステルをアルコールも製造できる生物により製造する場合に、外因的に供給してよい。
【００６８】
Ａ側又はＢ側を含む炭素鎖は、任意の長さであってよい。一例において、エステルのＡ側は、少なくとも約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、又は１８個の炭素の長さである。エステルのＢ側は、少なくとも約４個、６個、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、１８個、２０個、２２個、２４個、又は２６個の炭素原子の長さである。Ａ側及び／又はＢ側は、直鎖又は分枝鎖であってよい。分枝鎖は、１つ以上の分枝点を有してよい。分枝鎖は、環状分枝鎖を含んでもよく、及び／又はＡ側及び／又はＢ側は飽和又は不飽和であってよい。不飽和の場合に、Ａ側及び／又はＢ側は、１つ以上の不飽和の部分を有してよい。
【００６９】
一例において、本発明の任意の態様に従った脂肪エステルを、生合成により製造してよい。特に、脂肪酸は、アシル補酵素Ａ（アシル−ＣｏＡ）及びアシルホスフェートからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を製造するために“活性化”されてよい。より詳述すれば、脂肪エステルは、アシル−ＣｏＡ、脂肪酸生合成又は分解の直接生成物に活性化されてよい。アシル−ＣｏＡは、遊離脂肪酸、ＣｏＡ、又はアデノシンヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ）から合成されてもよい。アシル−ＣｏＡを製造する酵素の例はアシル−ＣｏＡシンターゼである。そしてアシル−ＣｏＡは、受容求核物質、例えばアルコール、チオール、ホスフェート等に移されてよい。
【００７０】
本発明の任意の態様に従った細胞は、さらに遺伝子組換えして、野生型細胞と比較して、３−ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドラターゼ（３ＨＣＤｈ）及び／又はケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）の発現を増加させてよい。この発現における増加は、ｆａｂＢの活性を改良してよい。特に、３ＨＣＤｈは、クロトナーゼ／エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｃｒｔ）であってよく、及び／又はＫＣＲは、ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（Ｈｂｄ）であってよい。より詳述すれば、Ｃｒｔは、配列番号２８のポリペプチドに対して少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を有し、及び／又はＨｂｄは、配列番号２９のポリペプチドに対して、少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を有する。
【００７１】
特に、脂肪酸エステルを、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、デカノール、ドデカノール、テトラデカノール、ヘキサデカノール等からなる群から選択される少なくとも１つの外因性アルコールの存在で製造してよい。
【００７２】
より詳述すれば、脂肪酸は、１２個の炭素原子の長さであってよい。脂肪酸は、ラウリン酸であってよく、それらのアシル補酵素Ａは、ラウロイル補酵素Ａであってよく、かつ脂肪酸エステルは、メチルラウレートであってよい。
【００７３】
本発明の他の態様に従って、メチルラウレートを製造するための方法が提供され、その際該方法は、ラウリン酸及び／又はラウロイル補酵素Ａと、配列番号１〜８及びそれらの組合せのポリペプチドに対して少なくとも５０％の配列同一性を有する単離したロウエステルシンターゼとの接触を含む。より詳述すれば、本発明の任意の態様に従って使用されるロウエステルシンターゼは、配列番号１〜８の配列のいずれか１つのポリペプチド及びそれらの組合せに対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は１００％の配列同一性を含んでよい。これらの配列は単に参考のアミノ酸配列である。特に、本発明の任意の態様に従って使用されるロウエステルシンターゼの配列は、機能、例えばタンパク質の触媒活性のために必須なもの以外のアミノ酸を含んでよく、又は分子の折りたたみもしくは構造を挿入によって削除、置換又は置き換えてよく、又は必須アミノ酸を、参考配列又はそれらに由来する分子の生物学的活性を維持する効果に保存的な方法で置き換える。
【００７４】
特に、本発明の任意の態様に従った方法は、本発明の任意の態様に従った細胞内で実施する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】４個の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）製造株についての、６８時間後の撹拌フラスコ培養におけるＦＦＡ製造を示すグラフ。
【図２】５０ｍｌの撹拌フラスコ中でＯＤ600＝２で評価したＢＸＦ＿１６９についてのラウリン酸製造プロフィールを示すグラフ。
【図３】８時間、２４時間及び４８時間で測定したＢＸＦ＿１６９における種々の経路遺伝子（ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅ）についてのｃｙｓＧと比較したｍＲＮＡ発現を示すグラフ。
【図４】８時間及び２４時間でＢＸＦ＿１６９について溶菌液中で測定した種々の伸長工程についての酵素活性を示すグラフ。ＥｎＣＲ活性はＴｅｒ遺伝子によりコードされる。ＫＡＳ活性は、ＮｐｈＴ７遺伝子及びＦａｂＨ遺伝子によりコードされる。
【図５】ＦａｄＢ、ＦａｄＢ＋Ｃｒｔ及びＦａｄＢ＋Ｃｒｔ＋Ｈｂｄで再構築したｉｎ ｖｉｔｒｏ経路からの、ラウロイル−ＣｏＡ製造経路のＣ４からＣ６への伸長工程に特異的な中間生成物形成及び利用性を示すグラフ（Ｃ６からＣ１２への中間体についてデータを収集したが示されていない）。
【図６】２０個のＷＥＳ候補について測定した生成物形成を示すグラフ。精製した候補酵素を、メタノール及びＣ６〜Ｃ１４−ＣｏＡ基質で個々にインキュベートして生成物形成を評価した。
【図７】２ｍＬのスモールスケールプロトコルで評価した種々のロウエステルシンターゼ候補を発現する９個のチオラーゼを基礎とする株についての２４時間でのＦＡＭＥ生成を示すグラフ。
【図８】種々のメチルラウレート製造のための合成経路で設計した５０個の株による２４時間の株によるアッセイをスクリーニングする、１ｍｌ中で、２４時間でのメチルラウレート及び他のＦＡＭＥ（Ｃ６〜Ｃ１４）の製造を示すグラフ。
【図９】種々の試験条件下で１Ｌの発酵における４０時間後の株ＢＸＥ＿０２２により示されたＦＡＭＥ製造分布を示すグラフ。
【図１０】製造の約４５時間での株ＢＸＥ＿０５８及びＢＸＥ＿０６２についてのＦＡＭＥ及びＦＦＡ濃度分布を示すグラフ。メチルミリステート濃縮物は含まれず、５０ｇ／Ｌとしての分析において第二相として添加した。
【図１１】中間体マロニル−ＣｏＡを介した流れを増加した遺伝子組換えに関する細胞の代謝経路を示す図。
【図１２】ラウロイル−ＣｏＡ製造経路のＣ４からＣ６への伸長工程に特異的な中間生成物蓄積の評価を示すグラフ（Ｃ６からＣ１２への中間体についてデータを収集したが示されていない）。
【図１３】野生型ＦａｂＨと比較した、Ｃ６〜Ｃ１０−ＣｏＡ基質での３個のＦａｂＨ突然変異体酵素についての特異的な酵素活性を示すグラフ。
【図１４】製造の２０時間後の標準１ｍＬ方法でのＦＡＭＥ製造を示すグラフ（注：ＢＸＥ＿１９８は、ＢＸＥ＿２７１−２７３についての対照比較であり、かつＢＸＥ＿２３３は、ＢＸＥ＿２４３−２４４についての対照である）。
【図１５】代わりのＷＥＳ酵素候補での製造の２０時間後の標準１ｍＬ方法でのＦＡＭＥ製造を示すグラフ。
【図１６】ＧＣ−ＭＳによって測定した精製したＭｈｙｄ変異体での５分間のインキュベート後のメタノール及びＣ１２−ＣｏＡからのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成物形成を示すグラフ。
【図１７】Ｍａｑｕ突然変異体（配列番号７及び８）での製造の２０時間後の標準１ｍＬ方法でのＦＡＭＥ製造を示すグラフ。
【図１８】ＧＣ−ＭＳによって経時的な生成物形成によって測定したＢＸＥ＿０６２及びＢＸＥ＿２３３細胞溶解物についてのＷＥＳ酵素活性を示すグラフ。細胞溶解物におけるＷＥＳについての標的活性は０．０２Ｕ／ｍｇである。
【図１９】メチルラウレートについての平均生成プロフィール及びＦＭ１４プロセスにおけるＢＸＥ＿２７６での１Ｌ発酵についての合計ＦＡＭＥを示すグラフ。
【実施例】
【００７６】
当業者によって理解されうる前記の好ましい実施態様は、特許請求の範囲から逸脱せずに設計、構築又は操作して変更又は改良してよい。これらの変更は、例えば、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【００７７】
実施例１
大腸菌におけるＣ１２脂肪アシル−ＣｏＡ製造の最適化
撹拌フラスコ実験におけるマロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡによる脂肪酸の製造
【表５−１】
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【表５−２】
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第４ａ表  次の例において脂肪酸を製造するために使用した微生物株のリスト。製造方法及び株の配列は、ＷＯ２０１４０２６１６２号Ａ１（ＯＰＸ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）の表３．２において提供される。基礎株を、ＢＸ＿１０１８親株へのＨｂｄ及びＣｒｔの染色体導入により構築した。次の株のセットを形質転換し、そしてスモールスケールで、ＦＡＭＥ製造及び代謝物蓄積の双方について評価した。
【００７８】
【表６】
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第４ｂ表  ＦＡＭＥ製造におけるｈｂｄ及びｃｒｔの存在を試験するために使用した株のリスト。
【００７９】
Ｈｂｄ／Ｃｒｔ発現の影響をより理解するために、代謝物蓄積を、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡ基質でインキュベートした細胞溶解物中で監視した。このアッセイの結果は、図１２において示されるように、ケト−Ｃ４−ＣｏＡ及びヒドロキシ−Ｃ４−ＣｏＡの期待された活性と一致するＣ４〜Ｃ６−ＣｏＡの増加した蓄積を示した。
【００８０】
β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ（ＦａｂＨ）の設計
スクリーニングのアプローチを、β−ケトアシル−ＣｏＡシンターゼ相同体について、Ｃ４〜Ｃ１０アシル−ＣｏＡ基質で証明した活性を基礎とするラウリン酸製造についての候補を同定するために使用した。７０個より多い相同体が合成され、発現され、精製され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を評価した。
【００８１】
Ｃ４〜Ｃ１０−ＣｏＡ基質に対して有意な活性を有すると同定されたシンターゼ候補を、製造宿主中に導入し、撹拌フラスコ中でＦＦＡ製造について評価した。図１は、有意なラウリン酸製造を示す、いくつかの設計された株（第４ｃ表）についての６８時間でのＦＦＡ製造プロフィールを示す。示されているように、ラウリン酸及び合計ＦＦＡ製造プロフィールの双方は、導入された個々のシンターゼ候補によって調整される。例えば、Ａａｇｒ ｆａｂＨ構築物を含む株ＢＸＦ＿１９８は、ラウリン酸について最も高い特異性を示す一方で、Ｒｓｏｌ ｆａｂＨの同時発現は、合計ＦＦＡにおいて最も高い力価に相応する。図１において示される全ての４つのシンターゼの組合せは、メチルラウレートの製造に焦点を合わせた実施例３のために選択されている。
【００８２】
【表７】
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第４ｃ表  スクリーニング相において使用された特定のプラスミドを有する細菌株。
【００８３】
ベースラインＦＦＡ分析
より総合的なベースライン分析を、前記のような種々のシンターゼの組合せを有するＦＦＡ製造株で実施した。株ＢＸＦ＿１６９についてのデータを、より総合的な試験で評価された全ての株の中で観察した。図２において示されるデータは、株ＢＸＦ＿１６９についてのラウリン酸製造の経時変化を示す。撹拌フラスコ試験条件において、前記株は、１０〜２０時間の安定した最初の製造速度を示した。２０時間後に、その速度は著しく減少し、製造力価のレベルは下がった。
【００８４】
分析した全ての株について、試料をそれぞれの時点で採取し、そして脂肪酸製造経路におけるキー酵素についての転写、発現、及び活性について分析した。図３及び４は、経路遺伝子の相対的なｍＲＮＡ発現、及びＢＸＦ＿１６９についての経時的な相応する酵素活性を示す。転写レベルは良好であったが、しかし、同一のプロモーターに由来するにも関わらず、５個の遺伝子間で異なった。転写及び酵素活性の双方は、経時的な減少傾向を示し、その際酵素活性は、２４時間の時点でいくつかの反応について落ちる。同様の傾向を、評価した全ての他のＦＦＡ製造株について観察した。
【００８５】
減少したｍＲＮＡ及び酵素活性に加えて、２４時間の時点では、全ての株について増加した不溶性タンパク質の蓄積及び減少したグルコース消費によっても特徴付けられる（データは示されていない）。ラウリン酸を含む脂肪酸が、特定の輸送体の不在下で細胞の内側に蓄積することが公知であるために、２４時間での生産性における減少が細胞間ＦＦＡ毒性によることが仮定される。
【００８６】
脂肪酸合成経路のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析
アッセイを、精製した酵素でｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪アシル−ＣｏＡ経路を再構築することによって発達させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの再構築は、反応条件下で代謝物蓄積によって特徴付けられた、速度制限工程の同定を単純にした。競合酵素（例えばチオエステラーゼ）からの経路流の単離、基質限定（例えばＮＡＤＨプール）、及び多数の経路の酵素の均一な発現を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏの経路再構築のいくつかの利点があった。経路の平衡を、変動する量の酵素又は基質（アシル−ＣｏＡ中間体）の存在で、マロニル−ＣｏＡからラウロイル−ＣｏＡまでの全ての２０個の経路中間体によって評価した。
【００８７】
図５は、観察したＣ４〜Ｃ６伸張サイクルのための経路中間体の蓄積を示し、ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＫＣＲ）及び３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（３ＨＣＤｈ）反応のための酵素を変動する。示されているように、経路がＦａｄＢで再構築される場合に、順方向の反応を駆動するために不十分な３ＨＣＤｈを示唆する、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡの優位な蓄積があった。観察された蓄積は、逆反応を触媒作用するこの酵素を好むことによってよく、ｉｎ ｖｉｖｏでの全体の順方向の経路流を減少してもよい。しかしながら、ＦａｄＢをＨｂｄ及び／又はＣｒｔ（代わりにＣ４中間体と順方向で有意な活性を有するＫＣＲ及び３ＨＣＤｈ酵素）で補う場合に、３−ヒドロキシブチル−ＣｏＡ蓄積における減少が観察された。これらのデータは、補った活性がブチリル−ＣｏＡに順方向の経路を駆動するために十分であり、かつＨｂｄ及びＣｒｔの製造宿主中への導入が長鎖脂肪酸の製造を高めてよいことを示唆した。
【００８８】
シンターゼ突然変異体の評価
ＦａｂＨ変異体を、Ｃ１０−ＣｏＡに対して改良した活性を有する有益な突然変異体を検出するために開発された９６ウェルプレートを基礎とするスクリーンから単離した。１０００より多い突然変異体の最初のスクリーニングに続いて、陽性の変異体を配列し、そしてＣ６〜Ｃ１０−ＣｏＡに対する活性を評価した。図１３において示されるように、３つの同定された精製した変異体は、Ｃ６〜Ｃ１０−ＣｏＡ基質に対する活性を増加させたことを確認した。
【００８９】
陽性の確認に続いて、ＦａｂＨ突然変異体をｉｎ ｖｉｖｏで評価した。次の株を、ＦａｂＨ突然変異をＢＸＥ＿１９８及びＢＸＥ＿２３３中に導入することによって構築した。
【００９０】
株を、標準１ｍＬスクリーニングプロトコルで、ＦＡＭＥ製造について２０時間で評価した（図１４）。以下で示されるように、増加したメチルラウレートが、対照株（株ＢＸＥ＿１９８及びＢＸＥ＿２３３）と比較して、Ｅ３７Ｋ（株ＢＸＥ＿２７１）及びＤ１９６Ｇ／Ｋ３４２Ｅ（株ＢＸＥ＿２７３及びＢＸＥ＿２４３）変異体で観察された。しかしながら、ｈｂｄ／ｃｒｔモジュールと同様に、これらの突然変異体が、改良されたＷＥＳ活性を有する製造株において大きな影響を有してよいことが期待される。
【００９１】
溶解物中で標的の活性を得るために要求されるＡａｇｒ ＦａｂＨの発現は、総タンパク質プールの有意な断片を要求することが、最新の製造株で矛盾なく証明されている。さらに、高い発現レベルでさえも、Ｃ１０−ＣｏＡに対するＦａｂＨ活性は、しばしば標的活性であるか、又は標的の活性よりわずかに低い。
【００９２】
【表８】
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第４ｄ表  次の株を、ＦａｂＨ突然変異をＢＸＥ＿１９８及びＢＸＥ＿２３３中に導入することによって構築した。
【００９３】
実施例２
メチルラウレート製造のためのロウエステルシンターゼ（ＷＥＳ）活性の最適化
ＷＥＳ候補を、発現し、精製し、そして溶解性及びｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦＡＭＥ製造について評価した。最初のスクリーニングの結果に基づいて、２１個のＷＥＳ候補を、基質特異性及びｉｎ ｖｉｖｏでのＦＡＭＥ製造を含むさらなる評価のために選択した。ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、生成物の形成を測定し、続いて個々のＣｏＡ基質を添加することによって完了した。図６においてまとめたように、活性の範囲を種々の基質で観察し、多数の候補を、高い全体の活性（Ｓｖａｒ、Ｍａｑｕ）又は基質に対する特異性≧Ｃ１２−ＣｏＡ（Ｍ３６０．２、Ａｃｉｐ）に基づいて同定した。使用したＷＥＳの配列は前記第１表において提供される。
【００９４】
ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を試験するための直交法として、メタノールの存在でラウロイル−ＣｏＡに対して活性があることを示す９個のＷＥＳ候補（第４ｆ表）が脂肪酸製造宿主中で発現される。
【００９５】
【表９】
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第４ｆ表  メタノールの存在でラウロイル−ＣｏＡに対して活性があることを示す９個のＷＥＳ候補が脂肪酸製造宿主中で発現される。
【００９６】
スモールスケール評価を、ＯＤ600＝２．０で２０ｍＬの蓋をしたガラス試験管中で２ｍＬの作業体積で培養したそれぞれの株について実施した。成長及びグルコース測定のための１ｍＬの培地を取り出し、そしてＧＣ−ＭＳによってＦＡＭＥ製造について分析する前にＭＴＢＥを有する残りのブロスを抽出することによって、試料を２４時間で取った。図７において示されるように、控えめなｉｎ ｖｉｖｏでのＷＥＳ活性を示す、０．０４〜０．５ｇ／Ｌまで変動するメチルラウレート力価を観察した。
【００９７】
ｉｎ ｖｉｖｏで観察した生成物形成の特異性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに基づいて予期した特異性とは著しく異なった。この矛盾は、Ｃ６〜Ｃ１６ＦＦＡからのほぼ等価の力価を生じるチオラーゼＦＦＡ株の製造プロフィールによるものであってよい。チオラーゼ株におけるロウエステルシンターゼ候補をスクリーニングする制限によって、続くｉｎ ｖｉｖｏでの特徴付けを高い特異性、割合及び力価でＣ１２ＦＦＡ及びＦＡＭＥ生成物を製造する、シンターゼを基礎とする株で実施した。
【００９８】
ＷＥＳ高スループットスクリーニング
９６ウェルプレートのナイルレッドを基礎とするアッセイを、蛍光によるＦＡＭＥ製造の高スループット定量化のために実施した。突然変異体ライブラリをＭａｑｕ ＷＥＳで構築した。スクリーニングで同定された上位２０個の突然変異体を単離し、配列し、製造宿主中にクローニングし、そしてＦＡＭＥ及びＦＦＡ製造について１ｍＬ法で評価した。１ｍＬの確認のための広いデータ分析が未完了である一方で、最初の結果は、この方法によって同定された少なくとも２つのＷＥＳ構築物を有する著しく改良されたＦＡＭＥ製造を示した。図１７において証明されるように、双方の突然変異体は、高い程度の特異性を維持しながら、対照株と比較した場合に改良されたメチルラウレート製造をもたらした。
【００９９】
同様に、Ｍｈｙｄの突然変異体を製造し、そしてメチルラウレート製造を測定した。その結果を図１６において示す。
【０１００】
実施例３
メチルラウレート製造株の構築及び評価
メチルラウレート製造のための株の設計
多数のメチルラウレート製造株を、前記実施例１及び２において開発したキー経路モジュールを導入し、ＷＯ２０１４０２６１６２号Ａ１（ＯＰＸ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）において記載されたマロニル−ＣｏＡ製造技術に基づいて構築した。スモールスケール評価を、ＯＤ600＝２．０で２０ｍＬの蓋をしたガラス試験管中で１ｍＬの作業体積で培養したそれぞれの株について実施した。全体の培養液をＭＴＢＥで抽出し、そしてＧＣ−ＭＳによってＦＡＭＥ製造について分析することによって、試料を２４時間で取った。この１ｍＬプロトコルは、撹拌フラスコ評価中に見られるＦＡＭＥ製造の揮発減量を減少する努力により設けられた。
【０１０１】
【表１０】
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第５表  実施例３において使用したメチルラウレート製造株。
【０１０２】
図８において、２４時間のＦＡＭＥ製造データは、Ｍａｙ ＳＣＭから１ｍｌアッセイでスクリーニングした１００個より多いメチルラウレート製造株の５０個を示す。この株のセットにおいて、１ｇ／Ｌより多い力価が、２０時間の製造で、〜１ｇ ＤＣＷ／Ｌのバイオマスレベルで得られた。さらに、ＦＡＭＥに基づいて７０〜９８％の特異性が観察されている。
【０１０３】
図１５は、第５表において示される４個のＷＥＳ候補を発現する株についての１ｍＬのスクリーニング結果を示す。これらの結果は、ＷＥＳを変動することがメチルラウレート製造における有意な変化を導くことを示す。さらに、Ｈｃｈｅは高レベルの製造を示した。図１８は、大部分の活性（ＦａｂＨ、ＦａｄＢ、Ｔｅｒ）が、２つの宿主、ＢＸＥ＿２３３及びＢＸＥ＿０６２間で有意な差がなく、ＢＸＥ＿０６２と比較した場合に、ＷＥＳ活性が、ＢＸＥ＿２３３でほぼ３倍高かったことも示す。異なるＷＥＳ候補、及び同一のＷＥＳ酵素についての異なる発現構築物で見られるメチルラウレートにおける有意差は、ＷＥＳ活性が現行の製造株において制限されたままである仮説を支持する。
【０１０４】
実施例４
メチルラウレート製造のための発酵法の開発及び最適化
メチルラウレート製造のための１Ｌバイオプロセスの初期開発
メチルラウレートのための１Ｌバイオプロセスの開発を、ｐＨ制御した条件下で、及び市販製品のより代表的なバイオマス濃度で、製造株の評価を支持するために実施した。
【０１０５】
ｐＨ設定点、メタノール供給、温度プロフィール及び増加したＦＡＭＥ回収のための第二相の導入を含むいくつかのプロセスパラメータ（第６表）を調査した。
【０１０６】
生じたデータのサブセットを図９において示す。全体的に、メタノール供給及び制御手法は、メチルラウレート製造又は全体的な発酵性能に著しい影響を及ぼすように見えなかった。第二相の包含は、ＦＡＭＥ回収に対するわずかに正の効果があったように見られた。３５℃〜３７℃の温度シフトプロフィールの導入は、製造に対する正の効果を示した。これらの結果に基づいて、第７表において示される次のベースラインプロセスを確立し、続く１Ｌ発酵及び実施例３において設計したメチルラウレートを製造する株の評価のために使用した。
【０１０７】
【表１１】
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第６表  実施例４において使用したいくつかのプロセスパラメータ。
【０１０８】
【表１２】
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第７表  実施例３において設計したメチルラウレート製造株の発酵において使用したベースラインプロセス。
【０１０９】
ＢＸＥ＿２７６株を前期のように試験した。３倍のＢＸＥ＿２７６についての平均製造時間経過を操作した。公平に一定のメチルラウレート製造速度を、３６．５時間にわたって、３ｇ／Ｌ（メチルラウレート）の平均力価で観察した。興味深いことに、この株は、著しい量のメチルデカノエート（３〜５ｇ／Ｌ）を製造し、前記株で観察したものよりも著しく高い合計ＦＡＭＥ製造をもたらした（図１９）。ＢＸＥ＿２７６は、１Ｌでメチルラウレートよりも高いメチルデカノエートの製造についての特異性を示し、メチルラウレートお製造について１ｍＬで証明されたより高い特異性（６９％）と対照的であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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