(57)【要約】【課題】うねりを有する対象物上の各位置に対する顕微鏡の焦点合わせを自動でかつ素早く行えるようにする。【解決手段】プレパラート作製装置は、スライドガラス１上に対象物３、封入剤４およびカバーガラス２を載せてプレパラート１０を作製する。該装置は、カバーガラスを載せた状態で対象物上の計測点に対して、顕微鏡の合焦動作に用いられるフォーカス情報を得るための計測を行う計測手段５，７，８と、フォーカス情報または該フォーカス情報に対応付けられた識別情報をプレパラートに記録する記録手段７とを有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スライドガラス上に対象物、封入剤およびカバーガラスを載せてプレパラートを作製するプレパラート作製装置であって、
前記カバーガラスを載せた状態で前記対象物上の計測点に対して、顕微鏡の合焦動作に用いられるフォーカス情報を得るための計測を行う計測手段と、
前記フォーカス情報または該フォーカス情報に対応付けられた識別情報を前記プレパラートに記録する記録手段とを有することを特徴とするプレパラート作製装置。
【請求項２】
前記計測手段は、前記対象物が載せられた前記スライドガラス上に前記封入剤と前記カバーガラスが載せられた後、前記封入剤が固化するまでの間に前記計測を行うことを特徴とする請求項１に記載のプレパラート作製装置。
【請求項３】
前記計測手段は、前記対象物上に複数の前記計測点を設定し、該複数の計測点のそれぞれに対して前記計測を行い、
前記記録手段は、前記複数の計測点のそれぞれに対して得られた前記フォーカス情報または前記識別情報を前記プレパラートに記録することを特徴とする請求項１または２に記載のプレパラート作製装置。
【請求項４】
前記記録手段は、前記フォーカス情報または前記識別情報を前記プレパラートに設けられた情報記録素子に記録することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のプレパラート作製装置。
【請求項５】
前記記録手段は、前記識別情報を前記プレパラートに記録するとともに、該識別情報に対応付けられた前記フォーカス情報を前記プレパラートとは別体の情報記録装置に記録することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載のプレパラート作製装置。
【請求項６】
スライドガラス上に組織片、封入剤およびカバーガラスを載せてプレパラートを作製し、
前記カバーガラスを載せた状態で前記対象物上の計測点に対して、顕微鏡の合焦動作に用いられるフォーカス情報を得るための計測を行い、
前記フォーカス情報または該フォーカス情報に対応付けられた識別情報を前記プレパラートに記録することを特徴とするプレパラート作製方法。
【請求項７】
前記計測を、前記対象物が載せられた前記スライドガラス上に前記封入剤と前記カバーガラスが載せられた後、前記封入剤が固化するまでの間に行うことを特徴とする請求項６に記載のプレパラート作製方法。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載のプレパラート作製装置または請求項５もしくは６に記載のプレパラート作製方法によって前記フォーカス情報または前記識別情報が記録された前記プレパラート内の前記対象物を観察する顕微鏡であって、
対物光学系と、
前記フォーカス情報または前記識別情報を読み取る読取り手段と、
読み取られた前記フォーカス情報を用いて、または読み取られた前記識別情報を用いて取得した前記フォーカス情報を用いて、前記対象物に対して前記対物光学系を合焦させるための合焦動作を行う制御手段と、
前記対物光学系を通して前記対象物を撮像する撮像手段とを有することを特徴とする顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織片等の対象物を封入したプレパラートを作製するプレパラート作製技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体の組織片等の対象物を顕微鏡によって観察する場合には、スライドガラス上に対象物と封入剤を載せ、さらにそれらを覆うようにスライドガラス上にカバーガラスを載せてプレパラートが作製される。特許文献１には、このようなプレパラートの作製を自動で行う装置が開示されている。
【０００３】
一方、顕微鏡にプレパラートがセットされると、プレパラート内に封入された対象物に対して該顕微鏡の対物光学系の焦点合わせを行う必要がある。特許文献２には、プレパラート内の対象物を撮像して得られた画像のコントラストに基づいて対物光学系の合焦位置を検出することにより自動で焦点合わせを行えるようにした顕微鏡システムが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−２０４１１０号公報
【特許文献２】特開２００４−６１９４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、プレパラート内の対象物は、その表面全体にわたって対物光学系の光軸方向での高さ変化（うねり）を有する場合が多い。この場合、特許文献２にて開示された顕微鏡システムでは、対象物における観察位置を変えるごとに画像のコントラストに基づく合焦位置検出を行う必要があるため、対象物の広い範囲の観察に要する時間が長くなる。
【０００６】
本発明は、うねりを有する対象物上の各位置に対する顕微鏡の焦点合わせを自動でかつ素早く行えるようにしたプレパラート作製装置およびプレパラート作製方法を提供する。さらに、本発明は、これらプレパラート作製装置およびプレパラート作製方法により作製されたプレパラートを用いて対象物を観察する顕微鏡を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面としてのプレパラート作製装置は、スライドガラス上に対象物、封入剤およびカバーガラスを載せてプレパラートを作製する。該装置は、カバーガラスを載せた状態で対象物上の計測点に対して、顕微鏡の合焦動作に用いられるフォーカス情報を得るための計測を行う計測手段と、フォーカス情報または該フォーカス情報に対応付けられた識別情報をプレパラートに記録する記録手段とを有することを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の他の一側面としてのプレパラート作製方法は、スライドガラス上に組織片、封入剤およびカバーガラスを載せてプレパラートを作製し、カバーガラスを載せた状態で対象物上の計測点に対して、顕微鏡の合焦動作に用いられるフォーカス情報を得るための計測を行い、フォーカス情報または該フォーカス情報に対応付けられた識別情報をプレパラートに記録することを特徴とする。
【０００９】
さらに、本発明の他の一側面としての顕微鏡は、上記プレパラート作製装置またはプレパラート作製方法によってフォーカス情報または識別情報が記録されたプレパラート内の対象物を観察する。該顕微鏡は、対物光学系と、フォーカス情報または識別情報を読み取る読取り手段と、読み取られたフォーカス情報を用いて、または読み取られた識別情報を用いて取得したフォーカス情報を用いて、対象物に対して対物光学系を合焦させるための合焦動作を行う制御手段と、対物光学系を通して対象物を撮像する撮像手段とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、うねりを有する対象物上の各位置に対する顕微鏡の焦点合わせを自動でかつ素早く行えるようにすることができ、対象物の広い範囲に対して短時間でピントが合った状態での観察を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施例１であるプレパラート作製方法を示すフローチャート。
【図２】実施例１のプレパラート作製方法においてプレパラート（組織片）上にて決定された計測点を示す図。
【図３】実施例１のプレパラート作製方法によりプレパラートを作製するプレパラート作製装置の構成を示す図。
【図４】実施例１のプレパラート作製方法により作成されたプレパラートを示す図。
【図５】本発明の実施例２である顕微鏡の動作を示すフローチャート。
【図６】実施例２の顕微鏡の構成を示す図。
【図７】一般的なプレパラートの作製工程を説明する図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施例について図面を参照して説明する。
【００１３】
まず、実施例の説明に先立って、図７を用いて、組織片（対象物）を封入したプレパラートの従来の作製方法について説明する。ステップ７−１では、人体等の生体から採取された組織は、洗浄された後、ホルマリン等の固定剤を用いて固定される。次に、ステップ７−２では、アルコール等を用いて組織内の水分および脂肪を抜く脱水・脱脂が行われる。その後、ステップ７−３では、脱水・脱脂に用いたアルコール等を取り除き、組織にパラフィンを浸透させて該組織を固め、組織片を切り出し易くする。そして、ステップ７−４では、組織から組織片がパラフィンごと薄く（通常は２〜５μｍの厚みで）切り出される。
【００１４】
次に、ステップ７−５において、切り出された組織片は、スライドガラス上に載せられて広げられる）。そして、ステップ７−６において、組織の状態を観察し易くするために、組織片が目的に応じて染色される。最後に、ステップ７−７では、染色された組織片上にパラフィン等の封入剤が適量載せられ（滴下され）、これらを覆うようにカバーガラスがスライドガラス上に載せられる。
【００１５】
ステップ７−７の封入工程では、封入剤の滴下後に１０分〜１時間程度、封入剤の固化を待つ。この封入工程は、現在では封入装置によって自動的に行われることが多い。
【実施例１】
【００１６】
次に、本発明の実施例１であるプレパラート作製方法について、図１を用いて説明する。図１には、図７に示した従来のプレパラート作製方法のうちステップ７−７に示した封入工程に代えて行われる封入／フォーカス位置記録工程を示している。なお、図１において、太い実線矢印は封入／フォーカス位置記録工程内での工程の移行を表し、細い破線矢印は情報の流れを表す。また、図１に示す封入／フォーカス位置記録工程は、プレパラート作製装置としての封入装置により自動的に行われる。
【００１７】
図７にステップ７−６として示した染色工程が終了すると、ステップ１−１では、プレパラートにおける組織片の存在領域を検出する。これは、プレパラートにおいて組織片が存在し得る領域を含む所定範囲の画像を不図示の撮像部で取り込み、該撮像部にて生成された画像信号から組織片が存在する領域を定量的に認識することで行う。
【００１８】
図２には、プレパラートの例を示している。図２において、１０はプレパラートであり、１はスライドガラスである。３は封入剤が滴下された組織片であり、２はカバーガラスである。組織片３は、その表面全体にわたってプレパラート１０の厚さ方向（撮像部の光軸方向）での高さ変化であるうねりを有する。
【００１９】
次に、ステップ１−２では、ステップ１−１で得た組織片の存在領域を示す位置情報から、これ以降の工程に必要なプレパラートの位置調整を行う。これは、後述するステップ１−３での封入剤滴下やステップ１−４でのカバーガラス設置が正しく組織片の位置に対応して行われるようにするためである。
【００２０】
ステップ１−３では、パラフィン等の封入剤が組織片上に適量滴下される。滴下される封入剤の量は、ステップ１−１で認識された組織片の面積に応じて最適化される。封入剤を組織片上に均等に分布させるために、封入剤の滴下を複数回、滴下位置を変えながら行ってもよい。
【００２１】
次に、ステップ１−４では、封入剤が滴下された組織片を覆うようにカバーガラスがスライドガラス上に載せられる。そして、ステップ１−４での封入剤滴下後において封入剤の固化を待つ間に、以下のステップ１−５〜ステップ１−７の工程を行う。
【００２２】
まず、ステップ１−５では、組織片の表面（上面）、つまりは対象物上においてフォーカス情報を取得するための計測を行う複数の計測点（計測位置）を決定する。フォーカス情報とは、作製されたプレパートがセットされる後述する顕微鏡の対物光学系を該プレパラート内の組織片に対して合焦させる動作（合焦動作）を行うために用いられる情報である。具体的には、例えば顕微鏡の対物光学系と同じ光学構成の計測光学系が組織片上の計測点に対して合焦したときの該計測光学系の光軸方向でのスライドガラス等の基準面に対する位置を計測し、これをフォーカス情報とすることができる。
【００２３】
また、計測点は、該測定点以外の任意の組織片上の点におけるフォーカス情報を測定点で得られたフォーカス情報から内挿または外挿によって十分な精度で予想できるように十分に多くの数だけ決定（設定）する。図２には、組織片３上に設定された複数の計測点を黒丸で示している。
【００２４】
次に、ステップ１−６では、ステップ１−５にて設定された複数の計測点のそれぞれに対してフォーカス情報を取得するための計測を行う。図３には、フォーカス情報の取得のための計測を行うために封入装置に設けられた計測部の構成を示している。
【００２５】
図３において、不図示のステージ上に設置されたプレパラート１０におけるスライドガラス１とカバーガラス２との間には、固化する前の封入剤４の中に浮かぶ状態で組織片３が保持されている。計測は既知の様々な方法で行うことができるが、図３には、その一例を示している。
【００２６】
５は計測光学系（対物光学系）とこれにより形成される組織片の光学像を撮像（光電変換）するＣＣＤセンサやＣＭＯＳセンサ等の２次元イメージセンサとにより構成される撮像ユニットである。７はイメージセンサからの出力信号を処理して画像信号を生成するとともにフォーカス情報を生成するコンピュータにより構成される処理ユニットである。
【００２７】
処理ユニットは、撮像ユニット５をプレパラート１０の上方、すなわち計測光学系の光軸方向（ｚ方向）の待機位置から徐々にプレパラート１０に近づけるように下動させていく。このときの計測光学系の焦点は、組織片上に設定された計測点の真上に位置する。撮像ユニット５の光軸方向位置としてのｚ位置（例えば、スライドガラス１の上面を基準面とした位置）は、位置センサ８により検出される。撮像ユニット５、位置センサ８および処理ユニット７により計測手段が構成される。
【００２８】
そして、処理ユニット７は、撮像ユニット５の下動中において画像信号の高周波成分（コントラスト）がピークとなる撮像ユニット５のｚ位置を位置センサ８を通じて取得する。このときの計測光学系の焦点は、組織片上の計測点に一致する。これにより、組織片上の計測点に対して撮像ユニット５の計測光学系が合焦するときの該計測光学系のｚ位置を示す情報としてのフォーカス情報を取得することができる。
【００２９】
処理ユニット７は、以上のような計測を設定された複数の計測点のすべてに対して行い、各計測点でのフォーカス情報をその計測点の水平方向（ｘｙ方向）での位置（ｘｙ座標）を示す座標情報とともに保存する。
【００３０】
次に、ステップ１−７では、記録手段としての処理ユニット７は、ステップ１−６で保存した複数の計測点の座標情報と各計測点に対するフォーカス情報とをプレパラート１０に対して記録する。ここにいう「プレパラート１０に対して記録する」とは、プレパラート１０に直接記録する場合と間接的に記録する場合の双方を含む。直接記録する場合は、例えば、図４（Ａ）に示すようにプレパラート１０のスライドガラス１上に取り付けた情報記録素子としてのマイクロタグ２６に複数の計測点の座標情報とフォーカス情報とを書き込む。間接的に記録する場合は、図４（Ｂ）に示すように、スライドガラス１上に識別情報を示すバーコードを印刷する。そして、プレパラート１０とは別体の記録装置（例えば、後述する顕微鏡のコンピュータ）に、該識別番号と対応付けられた複数の計測点の座標情報と各計測点に対するフォーカス情報とを記録する。
【００３１】
図４（Ａ），（Ｂ）においてスライドガラス１上に設けられた２つのマーク２８は、プレパラート１０のｘｙ方向での位置の基準を示す指標となる。
【００３２】
なお、ステップ１−６では、先に説明したように組織片の表面（上面）の計測点に対するフォーカス情報を取得するだけでなく、組織片の裏面（下面）において設定した計測点に対するフォーカス情報を取得してもよい。このためには、図３に示した撮像ユニット５を、組織片の表面の計測点に対して合焦したときのｚ位置からさらに下動させ、画像信号の高周波成分が再びピークになったときの撮像ユニット５のｚ位置を取得すればよい。
【００３３】
次に、ステップ１−８では、撮像ユニット５を待機位置に戻すとともに、プレパラート１０を封入装置から搬出する。
【００３４】
上述したように、本実施例で説明したフォーカス情報を取得するための計測方法は例にすぎず、他の計測方法を用いて計測を行ってもよい。
【実施例２】
【００３５】
図５のフローチャートには、実施例１のプレパラート作製方法によって作製されたプレパラート１０上の組織片を観察する顕微鏡の動作を示す。また、図６には、該顕微鏡の構成を示している。
【００３６】
図６に示す顕微鏡本体２０において、１１はプレパラート１０が設置され、該プレパラート１０をｘｙ方向に移動させるように動作するｘｙステージである。１３はｘｙステージ１１が設置され、ｘｙステージ１１（つまりはプレパラート１０）をｚ方向に移動させるように動作するｚステージである。
【００３７】
１２は対物光学系であり、１４は対物光学系１２によって形成される組織片の光学像を撮像するＣＣＤセンサやＣＭＯＳセンサ等の２次元イメージセンサを含む撮像部（撮像手段）である。１５はステージ１１，１３の動作を制御したり撮像部１４の撮像動作を制御したりするコンピュータ（制御手段）である。
【００３８】
図５において、ステップ５−１では、自動搬送または観察者の手によりプレパラート１０が顕微鏡本体２０のｘｙステージ１１上にセットされる。
【００３９】
次に、ステップ５−２では、コンピュータ１５は、ｘｙステージ１１を動作させてプレパラート１０をｘｙ方向に移動させながら撮像部１４を通して図４（Ａ），（Ｂ）に示したプレパラート１０上のマーク２８を探索する。さらに、コンピュータ１５は、プレパラート１０上に図４（Ａ）に示したマイクロタグ２６が設けられている場合には、該マイクロタグ２６に記録された複数の計測点の座標情報と各計測点でのフォーカス情報とを読取り部１７を通じて無線通信により読み取る。
【００４０】
一方、プレパラート１０上に図４（Ｂ）に示したバーコード２７が設けられている場合は、コンピュータ１５は、撮像部１４を通じて該バーコード２７を読み取る。この場合、コンピュータ１５には、上述したプレパラート作製方法または封入装置により作製された複数のプレパラートのそれぞれに対して設定された複数の計測点の座標情報と各計測点でのフォーカス情報とが予め保存されている。バーコード２７が示すプレパラート１０の識別情報を認識したコンピュータ１５は、その識別情報に対応するプレパラートにおいて設定された複数の計測点の座標情報と各計測点でのフォーカス情報とを読み込む。
【００４１】
次に、ステップ５−３では、コンピュータ１５は、撮像部１４を通して得られた画像を用いてプレパラート１０全体の位置を認識して、プレパラート１０上の座標系と顕微鏡本体２０の座標系とを対応させる。これ以降は、顕微鏡本体２０に設けられた不図示の位置センサによって、対物光学系１２の光軸上にあるプレパラート１０上の点のｘｙ座標は、随時コンピュータ１５に送られる。
【００４２】
そして、コンピュータ１５は、ｘｙステージ１１を動作させ、プレパラート１０上の初期観察点が対物光学系１２の光軸上に位置するようにプレパラート１０をｘｙ方向に移動させる。初期観察点は、組織片の中央またはその近傍等、観察者が任意に設定することが可能である。以上のステップ５−１〜ステップ５−３は、プレパラート１０を顕微鏡本体２０にセットした直後に初期動作として行われる。
【００４３】
続いて、ステップ５−４では、コンピュータ１５は、観察者による所望の観察点の選択に応じてｘｙステージ１１を動作させ、プレパラート１０を該選択された観察点（以下、選択点という）が対物光学系１２の光軸上に位置するようにｘｙ方向に移動させる。
【００４４】
さらに観察者がコンピュータ１５に対して合焦を指示すると、ステップ５−５では、コンピュータ１５は合焦動作を開始する。具体的には、コンピュータ１５は、まずステップ５−２で得られた複数の計測点のうちいずれかのｘｙ座標が選択点のｘｙ座標に一致する場合は、その計測点に対するフォーカス情報を取得する。また、複数の計測点のいずれも選択点に一致しない場合は、その選択点に近い２つ以上の計測点に対するフォーカス情報を用いた内挿または外挿によって該選択点でのフォーカス情報を演算する。
【００４５】
そして、コンピュータ１５は、組織片上の選択点が対物光学系１２に対して該選択点のフォーカス情報により示されるｚ位置に位置するようにｚステージ１３を動作させ、プレパラート１０をｚ方向に移動させる。これにより、対物光学系１２が組織片上の選択点に対して合焦する。したがって、撮像部１４により焦点が合った組織片画像を取得することができる。
【００４６】
この後、選択点が変更されるごとに、ｘｙステージ１１の動作による変更後の選択点の対物光学系１２の光軸上への移動と、該選択点のフォーカス情報の取得（演算）およびそのフォーカス情報を用いたｚステージ１３の動作を含む合焦動作とが行われる。これにより、従来のように観察点が変更されるごとに対物光学系の合焦位置検出を行う場合に比べて迅速に変更後の観察点に対して対物光学系１２を合焦させることができる。したがって、組織片の広い範囲の合焦画像を短時間で取得し、観察することができる。
【００４７】
なお、観察者が実際に組織片上の任意の観察点を観察した結果、そのときのピント状態がより良いと判断した場合に、そのピント状態に対応するフォーカス情報を該観察点に対する新たなフォーカス情報として記録できるようにしてもよい。また、その観察点での新たなフォーカス情報から該観察点に近い計測点に対するフォーカス情報を演算し、演算結果で該計測点に対して既に記録されているフォーカス情報を書き換えられるようにしてもよい。
【００４８】
以上説明した各実施例は代表的な例にすぎず、本発明の実施に際しては、各実施例に対して種々の変形や変更が可能である。
【符号の説明】
【００４９】
１  スライドガラス
２  カバーバラス
３  組織片
４  封入剤
１０  プレパラート
２０  顕微鏡本体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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