(57)【要約】      （修正有）【課題】新規メカニズムによるNF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】過酸化水素存在下に細胞と被験物質を接触させて、当該細胞のNF-κB活性を抑制する物質を過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質として選別するスクリーニング方法。ケラチノサイトに関し、アクアポリン3を介して取り込まれた過酸化水素がPP2A（Protein Phosphatase 2A）を不活性化し、その結果、NF-κBが活性化される。該スクリーニング方法は、アクアポリン3を介して取り込まれた過酸化水素存在下において、過酸化水素依存性のNF-κB活性抑制物質を選別することによる。【選択図】図３
2016082947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞膜上にアクアポリン3を発現する細胞と被験物質を、過酸化水素存在下に接触させて、当該アクアポリン3を介して細胞内に取り込まれた過酸化水素により活性化されたNF-κB活性を抑制する物質を選択することからなる、過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
過酸化水素が、培養液中から細胞膜上のアクアポリン３を介して細胞内に取り込まれたものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
過酸化水素が、細胞内在性のものである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞内在性の過酸化水素が、細胞膜上にアクアポリン3を発現する細胞をTNF-α刺激することにより生成したものであって、当該細胞膜上のアクアポリン3を介して細胞内に取り込まれたものである請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞膜上にアクアポリン3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成する過酸化水素を、当該アクアポリン３を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化した後、被験物質と接触させて、当該TNF-αで刺激された細胞のNF-κB活性を抑制する物質を選択することを特徴とする過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項６】
以下の（１）〜（４）の工程を含む、過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法：
（１）細胞膜上にアクアポリン3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成する過酸化水素を当該アクアポリン３を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化する工程；
（２）当該TNF-α刺激によりNF-κBが活性化された細胞と被験物質を接触させる工程；
（３）前記（２）の細胞のNF-κB活性を測定する工程；および
（４）前記（３）のNF-κB活性を、対照としての前記（２）で被験物質非存在下とするほかは同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、NF-κB活性が抑制された被検物質を選択する工程。
【請求項７】
以下の（１’）〜（６’）の工程を含む、過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法：
（１'）細胞膜上にアクアポリン3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成する過酸化水素を当該アクアポリン３を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化する工程；
（２'）当該TNF-α刺激によりNF-κBが活性化された細胞と被験物質を接触させる工程；
（３'）前記（２'）の細胞のNF-κB活性を測定する工程；
（４'）前記（３'）のNF-κB活性を、対照としての前記（２'）で被験物質非存在下とするほかは同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、NF-κB活性が抑制された被験物質を選択する工程；
（５'） 前記（１'）と同様にTNF-α刺激した細胞膜上のアクアポリン３の機能が阻害された細胞と、前記（４'）で選択した被験物質を接触させる工程；および
（６'）前記（５'）の細胞のNF-κB活性を測定して、当該細胞のアクアポリン３を介さないTNF-α刺激によるNF-κB活性を抑制しない物質を選択する工程。
【請求項８】
請求項６または７のスクリーニング方法により選択されたNF-κB活性抑制物質を、さらにアクアポリン3を介した過酸化水素以外のシグナル伝達によりNF-κBが活性化された細胞と接触させてNF-κB活性を測定し、対照としての当該NF-κB活性抑制物質非存在下に同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、当該NF-κB活性を抑制しない物質をさらに選択することを含む、過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞が、ヒトケラチノサイトである請求項１〜８のいずれか１記載の過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過酸化水素依存性NF-κB（Nuclear Factor-kappa B）活性抑制物質として選別する過酸化水素依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は慢性で非感染性の皮膚疾患であり、皮膚に赤く、鱗状にカサカサした斑点や平らな盛り上がりができるのが特徴である。乾癬は皮膚の表皮細胞（ケラチノサイト）が異常に増殖し、正常な皮膚細胞の7〜10倍の速さで皮膚の表面に移動し、その結果、鱗状のカサカサ（鱗屑）が形成される。その原因については、皮膚細胞の増殖異常、代謝異常、皮膚免疫機能の異常などさまざまな研究報告がなされているが、その主要因についてはまだよく分かっていない。また、欧米の白人では家族内に同じ乾癬をもつ人が多いことから、遺伝要因（HLA-C）の関与が考えられている。免疫機能の異常が原因の乾癬については、樹状細胞やマクロファージからTumor Necrosis Factor-α（TNF-α）やIL-23が放出され、TNF-αは活性化されたマクロファージに作用してIL-19、IL-20、IL-24を産生し、また、IL-23はTh17を誘導してIL-17、IL-22を産生することが鍵となり、ケラチノサイトを異常増殖させることにより乾癬の病態を形成すると言われている（非特許文献１：Nature Medicine 13(3): 242-244(2007)）が、まだ議論のあるところである。
【０００３】
アクアポリン3（以下「AQP3」という。）はケラチノサイトに多く発現しており、細胞内への水とグリセリンの取り込みを調節している水・グリセリンチャネルである。このAQP3と乾癬との関連が知られている。例えば、特許文献１（WO2014/013727）には、乾癬、光線性角化症、魚鱗癬、脂漏性皮膚炎等の皮膚疾患ではケラチノサイトの細胞増殖制御が破綻をきたし、ケラチノサイトの異常増殖により皮膚の肥厚化がおこり、その結果、皮膚バリア機能が低下することで環境抗原が侵入しやすくなる。そして、ケラチノサイトの細胞増殖を制御する因子としてAQP3が知られていることから、マンゴスチン果皮抽出物によるIgE、IFN-γ、TSLP、IL-4、CCL22、CCL24、NGF、AQP3等の産生を抑制するための免疫調節剤が提案されている。また、AQP3はEpidermal Growth Factor（EGF）刺激により、Nox（NADPH oxidase）が活性化されて生成した細胞外過酸化水素（細胞外H2O2）を細胞内に取り込むことにも関与していることが報告されている（非特許文献２：Proceedings of the National Academy of Sciences (2010), 107(36), 15681-15686）。
【０００４】
一方、乾癬においてTNF-αがTh17やケラチノサイトを刺激して産生されるIL-17、プラスミンが樹状細胞やケラチノサイトを刺激して産生されるCCL-20やIL-12/23、或いは、TLRs（Toll様受容体）が樹状細胞を刺激して産生されるIL-6、IL-10、IL-12、TNF-αによる炎症にNF-κBが重要な役割を果たしており、NF-κBが乾癬治療の標的になり得ることが報告されている（非特許文献３：Journal of Dermatological Science 69 (2013) 89-94）。また初代ヒトケラチノサイトにおいて、TNF-αは活性酸素腫（ROS）を誘導し、mTOR(mammalian Target of Rapamycin)刺激し、そしてNF-κBを活性化し、その結果として炎症性サイトカインが発現すること、それらの経路は関連して、或いは、独立して機能していると思われ、その経路の複雑さが乾癬等の皮膚病の複雑さを反映していること、それら経路の詳細な解明が始まるかもしれないこと等が言及されている（非特許文献４：Journal of Investigative Dermatology (2008) 128, 2606-2614）。
【０００５】
しかしながら、NF-κBシグナルの活性化に関し、AQP3とNF-κBシグナルとの関係については知られていない。従って、AQP3を介したNF-κBの活性抑制を指標とする物質のスクリーニング方法を見いだせれば、当該スクリーニング方法で得られた物質は、優れた乾癬等の治療薬なりうる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Nature Medicine 13(3): 242-244(2007)
【非特許文献２】Proceedings of the National Academy of Sciences (2010), 107(36), 15681-15686
【非特許文献３】Journal of Dermatological Science 69 (2013) 89-94
【非特許文献４】Journal of Investigative Dermatology (2008) 128, 2606-2614
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2014/013727
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規メカニズムによるAQP3を介して取り込まれた過酸化水素（H2O2）によるNF-κB活性抑制を指標とする物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、本発明の課題を解決するために鋭意を重ねた結果、AQP3のH2O2の細胞内への取り込みに着目し、AQP3を介して取り込まれたH2O2とNF-κBの関連について検討したところ、ケラチノサイトのAQP3を介して取り込まれたH2O2がPP2A（Protein Phosphatase 2A）を不活性化することを見出した。そして、それによってIKK、I-κBαおよびNF-κBが活性化されることを初めて見出した。よって、AQP3を介して取り込まれたH2O2依存性のNF-κB活性抑制物質をスクリーニングすることにより、乾癬等のケラチノサイトの異常増殖による疾患に有用な医薬を提供し得ることを知得し、本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、即ち以下よりなる。
１．細胞膜上にAQP3を発現する細胞と被験物質を、H2O2存在下に接触させて、当該AQP3を介して細胞内に取り込まれたH2O2により活性化されたNF-κB活性を抑制する物質を選択することからなる、H2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
２．H2O2が、培養液中から細胞膜上のAQP3を介して細胞内に取り込まれたものである前項１記載のスクリーニング方法。
３．H2O2が、細胞内在性のものである前項１記載のスクリーニング方法。
４．細胞内在性のH2O2が、細胞膜上にAQP3を発現する細胞をTNF-α刺激することにより生成したものであって、当該細胞膜上のAQP3を介して細胞内に取り込まれたものである前項３記載のスクリーニング方法。
５．細胞膜上にAQP3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成するH2O2を、当該AQP3を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化した後、被験物質と接触させて、当該TNF-αで刺激された細胞のNF-κB活性を抑制する物質を選択することを特徴とするH2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
６．以下の（１）〜（４）の工程を含む、H2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法：
（１）細胞膜上にAQP3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成するH2O2を当該AQP3を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化する工程；
（２）当該TNF-α刺激によりNF-κBが活性化された細胞と被験物質を接触させる工程；
（３）前記（２）の細胞のNF-κB活性を測定する工程；および
（４）前記（３）のNF-κB活性を、対照としての前記（２）で被験物質非存在下とするほかは同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、NF-κB活性が抑制された被検物質を選択する工程。
７．以下の（１’）〜（６’）の工程を含む、H2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法：
（１'）細胞膜上にAQP3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成するH2O2を当該AQP3を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化する工程；
（２'）当該TNF-α刺激によりNF-κBが活性化された細胞と被験物質を接触させる工程；
（３'）前記（２'）の細胞のNF-κB活性を測定する工程；
（４'）前記（３'）のNF-κB活性を、対照としての前記（２'）で被験物質非存在下とするほかは同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、NF-κB活性が抑制された被験物質を選択する工程；
（５'） 前記（１'）と同様にTNF-α刺激した細胞膜上のAQP3の機能が阻害された細胞と、前記（４'）で選択した被験物質を接触させる工程；および
（６'）前記（５'）の細胞のNF-κB活性を測定して、当該細胞のAQP3を介さないTNF-α刺激によるNF-κB活性を抑制しない物質を選択する工程。
８．前項６または７のスクリーニング方法により選択されたNF-κB活性抑制物質を、さらにAQP3を介したH2O2以外のシグナル伝達によりNF-κBが活性化された細胞と接触させてNF-κB活性を測定し、対照としての当該NF-κB活性抑制物質非存在下に同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、当該NF-κB活性を抑制しない物質をさらに選択することを含む、H2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
９．細胞が、ヒトケラチノサイトである前項１〜８のいずれか１記載のH2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のスクリーニング方法により、新規メカニズムによるNF-κB活性抑制物質を得ることができ、乾癬等のケラチノサイトの異常増殖による疾患に有用な医薬を提供し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、H2O2の細胞へ取り込みを確認した結果を示す図である。（実施例１）
【図２】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、TNF-α処理による細胞外H2O2の細胞内に取り込みを確認した結果を示す図である。（実施例１）
【図３】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）およびNox2遺伝子欠損マウス由来細胞を（Nox2-/-）について、H2O2添加またはTNF-α処理によるH2O2の細胞へ取り込みを確認した結果を示す図である。（実施例２）
【図４】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、TNF-α処理したときの各種蛋白の挙動をウエスタンブロッティングにより確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図５】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、TNF-α処理したときの各種蛋白の挙動を免疫沈降分析により確認した結果を示す図である。（実施例３）
【図６】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、PBS（Vehicle）、DPIまたはCatalaseによる前処理を行い、その後TNF-α処理したときのNF-κB/p65を確認した結果を示す図である。（実施例４）
【図７】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、TNF-α処理またはH2O2処理によるPP2A活性を確認した結果を示す図である。（実施例５）
【図８】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、PP2AのsiRNA で抑制したときのIKKβおよびNF-κB/p65のリン酸化を確認した結果を示し（ａ）、Catalase（2000U/ml）で30分間前処理した後、についてもIKKβおよびNF-κB/p65のリン酸化を確認した結果を示す図である。（実施例６）
【図９】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、PP2Aを過剰発現させたときの、TNF-α処理によるNFκB の活性化が抑制を確認した結果を示す図である。（実施例７）
【図１０】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、IL-23投与によるマウスでの耳の肥厚を確認した結果図である。（実施例８）
【図１１】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、IL-23投与によるマウスでの蛋白の挙動をイムノブロットにより分析した結果を示す図である。（実施例９）
【図１２】野生型マウス由来細胞（WT）とAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞（AQP3-/-）について、IL-23投与による細胞内のH2O2を測定した結果を示す図である。(実施例１０）。
【図１３】HaCaT細胞（CLS社）をAQP3のsiRNAで処理したときの細胞外H2O2の取り込み、およびTNF-α処理によるH2O2の取り込みを確認した結果を示す図である。（実施例１１）
【図１４】HaCaT細胞（CLS社）をAQP3のsiRNAとPP2AのsiRNAで処理し、さらにTNF-α処理したときの各種蛋白の挙動をイムノブロットで分析した結果を示す図である。（実施例１２）
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、H2O2存在下に細胞と被験物質を接触させて、当該細胞のAQP3を介して取り込まれたH2O2によるNF-κB活性を抑制する物質をH2O2依存性NF-κB活性抑制物質として選別することからなるH2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法に関する。
【００１４】
本発明のスクリーニング方法に使用可能な細胞は、細胞膜上にAQP3を発現している細胞であれば良く、当該AQP3を介して細胞内に取り込まれたH2O2によりNF-κBが活性化されるものであれば特に限定されないが、例えばケラチノサイトはその細胞膜上にAQP3を多く発現しており、TNF-α刺激により生成するH2O2がAQP3を介して細胞内に取り込まれ、NF-κBが活性化される細胞を好適に使用できる。このTNF-αで細胞を刺激することによって、細胞膜上のNADPH Oxidase(Nox)を活性化させ、H2O2を生成する。具体的には、例えば、Normal Human Epidermal Keratinocytes(NHEK)（KURABO）、Human Skin keratinocyte(HaCaT)（CLS社）などが挙げられる。その他には、HSC-1（JCRB1015、JCRB細胞バンク）、MDA-MB231（ATCC(R)HTB-26TM）、MCF7（ATCC(R)HTB-22TM）、A549（RIKEN BRC）、OVCAR-3（RIKEN BRC)、H1666（ATCC(R)CRL5885TM）、PC9（RIKEN BRC）などが挙げられる。本発明においては、必要に応じて、常法に従いAQP3遺伝子（The Journal of Biological Chemistry, 270, 30, 17913-17916, 1996、Genomics 1995, 27(2), 352-354、aquaporin 3（Gill blood group）Entrez Gene ID: 360）を含む発現ベクターを使用して、これら細胞表面に発現させたものを使用してもよい。
【００１５】
ケラチノサイトは、例えばマウスから採取することもできる。生後１〜３日齢のマウスの皮膚全層を採取し、細胞分散試薬、例えばプロテアーゼを含む試薬、界面活性を含む試薬等により分散させ、表皮層を剥離したものを更に分散させ、ケラチノサイト増殖培地等の培養液を用いて培養し得られた細胞を使用することができる。細胞分散試薬としては、自体公知の試薬を用いることはでき、例えばDispase II (5 U/ml; Boehringer Mannheim)や0.25% trypsin/0.1% EDTA溶液（Sigma）を用いることができる。同様の機能を有する試薬であれば、自体公知の試薬であってもよいし、今後開発されるあらゆる試薬を適用することができる。
【００１６】
本発明においては、H2O2存在下に細胞と被験物質を接触させることを要件とする。本明細書において「H2O2存在下」とは、細胞自身が産生するH2O2（以下、「細胞内在性のH2O2」ということがある。）の存在下であってもよいし、培養液中に人為的に添加したH2O2の存在下であってもよい。
【００１７】
細胞培養液中にH2O2を添加する場合は、市販のH2O2溶液を、細胞増殖因子を含まない上記の培養液に添加し、最終濃度が1μM〜5mM、好ましくは10μM〜500μM、特に好ましくは100μM〜300μMとなるように調製したものを使用することができる。細胞培養液中に添加したH2O2は細胞膜上表面のAQP3を介して細胞内に取り込まれる。
【００１８】
「細胞内在性のH2O2」としては、細胞を、例えば、TNF-α等で処理することによって、細胞膜上のNoxを活性化させ、生成したH2O2を、AQP3を介して細胞内に取り込まれたものが挙げられる。TNF-α処理は、例えば、ヒト若しくはマウス由来TNF-αや組換えヒト若しくはマウスTNF-α（R&D社）を用いて処理することができる。係るTNF-αを、例えば細胞増殖因子を含まない培地、具体的にはKBM(keratinocyte basal medium)（Lonza）、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)（Gibco）、RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640（Gibco）、HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)（Gibco）またはPBS(Phosphate-buffered Saline)（Gibco）などの培養液に溶解し使用することができる。TNF-αの最終濃度は、例えば1〜500ng/mlのTNF-α処理溶液とすることができる。TNF-α処理は、細胞（例えば60mmデュッシュあたり1〜5×106個）を前記TNF-α処理溶液で、37℃で1分間〜2時間、好ましくは10分間〜30分間処理することにより達成される。TNF-α溶液は、例えば12ウェルプレートであれば1ウェルあたり1ml程度、6ウェルプレートであれば1ウェルあたり2ml程度、60mmプレートまたはディッシュであれば3〜5ml程度使用することができるが、使用量は適宜決定することができる。
【００１９】
本明細書において、「被験物質」とはH2O2依存性NF-κB活性抑制物質の候補となりうる物質であればよく、特に制限されない。本発明において「被験物質」は、公知または新規いずれであっても差し支えなく、その構造、由来、物性等にも特に制限はなく、天然化合物、合成化合物、高分子化合物、低分子化合物、ペプチド、核酸類似物のいずれであってもよい。
「H2O2依存性NF-κB活性」とは、細胞のAQP3、例えばケラチノサイトのAQP3を介して取り込まれたH2O2により、その細胞内のNF-κBが活性化されることを意味する。より具体的には、当該H2O2が細胞内のPP2Aを不活性化し、その結果、NF-κBが活性化されることを意味する。または、細胞を例えばTNF-α等で処理することによって、細胞のNoxを活性化させて細胞膜上のAQP3を介して細胞内に取り込まれたH2O2により、細胞内のNF-κBが活性化されることを意味する。
「H2O2依存性NF-κB活性抑制物質」とは、上述の「H2O2依存性NF-κB活性」を抑制する物質である。
【００２０】
本発明は、細胞膜上にAQP3を発現する細胞をTNF-αで刺激して生成するH2O2を当該AQP3を介して細胞内に取り込ませてNF-κBを活性化させ、当該細胞と被験物質を接触させて、当該TNF-αで刺激された細胞のNF-κB活性を測定することによるH2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法に及ぶ。被験物質から、TNF-αで刺激された細胞のNF-κB活性を抑制する物質を選別することで、H2O2依存性NF-κB活性抑制物質をスクリーニングすることができる。その際、対照として、TNF-α刺激によりNF-κBを活性化させた細胞を、被験物質非存在下とするほかは、被験物質の接触と同様の条件で処理した後、当該細胞のNF-κB活性を測定して比較する。
【００２１】
具体的には、以下の（１）〜（４）の工程を含む、H2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法にも及ぶ。
（１）細胞膜上にAQP3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成するH2O2を当該AQP3を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化する工程；
（２）当該TNF-α刺激によりNF-κBが活性化された細胞と被験物質を接触させる工程；
（３）前記（２）の細胞のNF-κB活性を測定する工程；および
（４）前記（３）のNF-κB活性を、対照としての前記（２）で被験物質非存在下とするほかは同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、NF-κB活性が抑制された被検物質を選択する工程。
上記において、工程（１）と工程（２）は、同時に行ってもよい。上述の工程（１）のTNF-α刺激によるH2O2の生成は、例えば、TNF-α等で処理することによって、細胞膜上のNoxを活性化させ、H2O2を生成することが挙げられる。
【００２２】
上記の方法で選択されたNF-κB活性抑制物質のH2O2依存性の精度をあげるために、AQP3の機能が阻害された細胞を使用して、当該細胞のNF-κB活性を抑制しないことを確認するのが好ましい。
より具体的には、以下の（１'）〜（６'）の工程を含む、H2O2依存性NF-κB活性抑制物質のスクリーニング方法：
（１'）細胞膜上にAQP3を発現する細胞をTNF-αで刺激して、生成するH2O2を当該AQP3を介して細胞内に取り込ませて当該細胞のNF-κBを活性化する工程；
（２'）当該TNF-α刺激によりNF-κBが活性化された細胞と被験物質を接触させる工程；
（３'）前記（２'）の細胞のNF-κB活性を測定する工程；
（４'）前記（３'）のNF-κB活性を、対照としての前記（２'）で被験物質非存在下とするほかは同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、NF-κB活性が抑制された被験物質を選択する工程；
（５'） 前記（１'）と同様にTNF-α刺激した細胞膜上のAQP3の機能が阻害された細胞と、前記（４'）で選択した被験物質を接触させる工程；および
（６'）前記（５'）の細胞のNF-κB活性を測定して、当該細胞のAQP3を介さないTNF-α刺激によるNF-κB活性を抑制しない物質を選択する工程。
上記において、工程（１'）と工程（２'）は、同時に行ってもよい。上述の工程（１'）のTNF-α刺激によるH2O2の生成は、例えば、TNF-α等で処理することによって、細胞膜上のNoxを活性化させ、H2O2を生成することが挙げられる。また、工程（６'）において、工程（５'）の細胞のNF-κB活性を、工程（４'）で選択した被験物質非存在下に同様に処理した細胞膜上のAQP3の機能が阻害された細胞のNF-κB活性と比較するのが好ましい。
【００２３】
本明細書において、AQP3の機能が阻害された細胞は、スクリーニングに使用する細胞膜上にAQP3を発現している細胞において、当該AQP3をノックアウト（KO）したものであってもよいし、siRNAによってAQP3の機能を阻害したものであってもよい。AQP3ノックアウト（KO）細胞は、自体公知の方法、または今後開発されるあらゆる方法によって作製することができる。例えばMolecular and Cellular Biology 2008, 28:326-32に記載された方法等に準じて作製することができる。より具体的には、生後１日齢のAQP3 遺伝子欠損マウス（Proceedings of the National Academy of Sciences (2000), 97, 4386-4391）を使用し、上述の生後１〜３日齢のマウスの皮膚全層を採取する方法と同手法により、得ることができる。
【００２４】
siRNAによってAQP3の機能を阻害する方法としては、自体公知の方法または今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。具体的には、British Journal of Cancer(2009) 100, 1889-1895、Journal of Moleculer Medicine(2008) 86, 221-231に記載された方法等に準じて行なうことができる。例えば、細胞を60mmディッシュあたり2〜4×105個となるように播種した後、AQP3 siRNA smart pool (Dharmacon, Lafayette, CO,USA) 等のsiRNAを、LipofectamineTM 2000（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）等のトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトし、２〜４日後の細胞を使用することができる。かかる方法により作製された細胞は、通常、95%程度AQP3の発現が抑制されている。
【００２５】
また、本発明では、上述のスクリーニング方法により選別されたNF-κB活性抑制物質のH2O2依存性の精度をあげるために、さらにAQP3を介したH2O2以外のシグナル伝達によりNF-κBが活性化された細胞と接触させてNF-κB活性を測定し、対照としての当該NF-κB活性抑制物質非存在下に同様にして処理した細胞のNF-κB活性と比較して、当該NF-κB活性を抑制しない物質をさらに選択してもよい。
【００２６】
本明細書において、「細胞膜上にAQP3を発現する細胞のTNF-αで刺激」とは、上述したごとく、細胞をTNF-α等で処理することによって、Noxが活性化されてH2O2を生成し、当該H2O2が細胞膜上のAQP3を介して細胞内に取り込まれてNF-κBを活性化することを意味する。繰り返しになるが、TNF-α処理は、例えば、ヒト若しくはマウス由来TNF-αや組換えヒト若しくはマウスTNF-α（R&D社）を用いて処理することができる。係るTNF-αを、例えば細胞増殖因子を含まない培地、具体的にはKBM(keratinocyte basal medium) (Lonza)、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Gibco)、RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 (Gibco)、HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) (Gibco)またはPBS(Phosphate-buffered Saline) (Gibco)などの培養液に溶解し使用することができる。TNF-αの最終濃度は、例えば1〜500ng/mlのTNF-α処理溶液とすることができる。TNF-α処理は、細胞（例えば60mmデュッシュあたり1〜5×106個）を前記TNF-α処理溶液にて37℃で1分間〜2時間、好ましくは10分間〜30分間処理することにより達成される。TNF-α溶液は、例えば12ウェルプレートであれば1ウェルあたり1ml程度、6ウェルプレートであれば1ウェルあたり2ml程度、60mmプレートまたはディッシュであれば3〜5ml程度使用することができるが、使用量は適宜決定することができる。
【００２７】
本明細書において、「TNF-αで刺激された細胞と被験物質を接触させる」とは、上記TNF-αで刺激された細胞と被験物質を、H2O2を添加した上記培養液中で接触させることで達成される。例えば、本発明において使用する細胞が培養液中で50〜100％コンフルエントとなったときに、被験物質を添加し、CO2インキュベーターにて37±1℃ 、約5% CO2 の条件下で培養し、接触させることができる。例えば10分〜48時間、好ましくは、10分〜3時間、特に好ましくは、30分間〜1時間接触させることができる。
【００２８】
本明細書において、「NF-κB活性」の測定方法は特に制限されるものではなく、自体公知の方法および今後開発されるあらゆる方法を適用することができる。例えば、NF-κB活性は、ウエスタンブロット法或いは蛍光免疫染色にて測定することができる。ウエスタンブロット法でNF-κB活性を測定する場合は、細胞から常法により抽出した蛋白中のリン酸化NF-κB/p65量を、ウエスタンブロッティングで定量することで評価することができる。具体的には例えば、培養した細胞を回収し、蛋白抽出用緩衝液を用いて抽出し、ウエスタンブロッティング用試料とすることができる。ウエスタンブロッティングは、通常の器具や試薬等を用いて、自体公知の方法により行うことができる。
【００２９】
より具体的には、以下の方法によることができるが、これに限定されるものではない。抽出物の10〜20μg蛋白量相当をSDS-Pageにて展開し、展開した蛋白を例えばPVDF膜（Bio-Rad）に転写することができる。蛋白を転写したPVDF膜は、リン酸化NF-κB/p65抗体および抗ラビットHRP抗体と反応させ、メンブレンに固定されたリン酸化NF-κB/p65は、ECLウエスタンブロッティング検出システム等を使用してHRP試薬にて化学発光させ、発光量を検出することにより測定することができる。リン酸化NF-κB/p65の検出量は、例えばImage J (NIH)にて定量することができる。コントロール群に対して、リン酸化NF-κB/p65量が20％以上抑制したものを、NF-κB活性を抑制したと判断することができる。
【００３０】
蛍光免疫染色法でNF-κB活性を測定する場合は、NF-κBのサブユニットであるNF-κB/p65を蛍光免疫染色し、活性化したNF-κBの核内への移行を蛍光顕微鏡で観察することで測定することもできる。例えば、細胞を4%パラホルムアルデヒド溶液、続いて0.1％ Triton-X/PBS溶液等で10分間処理したのち、一次抗体（NF-κB/p65抗体と１時間反応させ、その後、二次抗体（ANTI-RABBIT IgG FITC CONJUGATE (Sigma)、200倍希釈）と１時間反応させることで蛍光染色することができ、NF-κB/p65の染色部位を蛍光顕微鏡にて観察することができる。核内へNF-κB/p65が移行した細胞数をカウントし、全体の細胞数に対するNF-κB/p65の核移行細胞数の比率を、例えば以下の式に従って算出することができる。
NF-κB/p65核移行率＝NF-κB/p65が核へ移行した細胞数/全体の細胞数
上記の結果、コントロール群と比較して、NF-κB/p65核移行率が20%以上抑制されたものを、NF-κB活性を抑制したと判断することができる。
【００３１】
本発明においては、上記のようにして選別された被験物質が、AQP3を介さないシグナル伝達によりNF-κBを活性する細胞と接触させたとき、当該NF-κB活性を抑制しないものであれば、より選択的なH2O2依存性NF-κB活性抑物質を得ることができるので好ましい。
【００３２】
上記「AQP3を介したH2O2以外のシグナル伝達によりNF-κBが活性された細胞」としては、AQP3が発現していないか、または発現量が非常に低い細胞が挙げられる。例えば、A172（RIKEN BRC）、MRC5（ATCC(R)CCL171）、T98G（RIKEN BRC）、CCD34（DSファーマバイオメディカル）などの細胞が挙げられる。例えば、これらの細胞をヒト由来IL-1βを使用して最終濃度1〜500ng/mlにて、または、LSPを使用して最終濃度1〜500μg/mlにて、37℃で1分間〜2時間、好ましくは、10分〜30分間処理してNF-κBを活性化させた後、被験物質を接触させて当該物質のNF-κB活性を測定すればよい。接触条件や活性測定方法は上記と同様に行なえばよい。
【００３３】
かくして本発明のH2O2依存性NF-κB活性抑制剤をスクリーニングすることができる。本発明のH2O2依存性NF-κB活性抑制物質は、ケラチノサイトの増殖を抑制することから、ケラチノサイト増殖異常による乾癬等の治療薬として使用し得る。
【実施例】
【００３４】
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことは明らかである。
【００３５】
（実施例１）H2O2の細胞内取り込みについて
（１）マウス初代培養細胞（ケラチノサイト）の調製
本実施例では、C57BL/6マウス（野生型マウス）およびC57BL/6マウスを遺伝的背景とするAQP3遺伝子欠損マウス（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 4386-4391 (2000)）を使用した。生後１日齢の野生型マウスまたはAQP3遺伝子欠損マウスの皮膚全層を採取し、Dispase(R) II（5 U/ml; Boehringer Mannheim）溶液中、4℃にて一晩処理した後、表皮層をピンセットにて剥離し、0.25% トリプシン/0.1% EDTA溶液（Sigma）中で37℃、10分間処理することで細胞を分離した。分離した表皮細胞をKeratinocyte Growth Medium（Lonza）に浮遊させ、バイオコート コラーゲン1プレート（Collagen type I plates， BD Biosciences）上に播種し、CO2インキュベーターで5% CO2条件下、37℃ にて3〜4日間培養して野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来のケラチノサイト細胞を調製した。
【００３６】
（２）H2O2の細胞内取り込みの測定
上記（１）で調製した野生型マウス由来またはAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を96ウェルのバイオコート コラーゲン1プレート(BD Biosciences)に、 1well あたり1×105個播種し、CO2インキュベーターで5% CO2条件下、37℃にて3〜4日間培養した。培養後の細胞を、0、10、50、100および300μMのH2O2を含んだリン酸緩衝液（PBS）0.2ml中で、37℃、10秒から10分間処理した。その後、活性酸素種検出試薬CM-H2DCFDA（Invitrogen）を使用して当該マニュアルに従い、細胞内に取り込まれたH2O2を蛍光プレートリーダーより測定した。
【００３７】
結果を図１に示した。図中において野生型マウス由来細胞をWT、AQP3遺伝子欠損マウス由来細胞をAQP3-/-と表した。以下同様である。AQP3-/-では、WTに比べて細胞内へのH2O2の取り込みが顕著に抑制されていた。これは細胞外のH2O2は、AQP3を介して細胞内に取り込まれたことを示している。
【００３８】
（３）TNF-α刺激によるH2O2の細胞内取り込みの測定
上記（１）で調製した野生型マウス由来またはAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を使用し、J Exp Med. 2012, 209:1743-52およびAntioxidants & redox signaling 11, 2223-2243 (2009)に記載された方法に準じて、TNF-α刺激によりNoxを介して産生される細胞外H2O2の細胞内取り込みを測定した。
【００３９】
1ウェルあたり1×105個の細胞を播種し、播種3〜4日後の細胞をDPI（Diphenylene iodonium）5μM、またはカタラーゼ（Catalase）2000U/mlで30分間前処理した。PBSで処理したものをVehicleとした。前記前処理において、DPIはNox阻害剤であり、Catalaseは細胞外H2O2を分解する作用を有する。その後各細胞に、TNF-α（R&D社）を細胞増殖因子を含まないPBSに100 ng/mlとなるように溶解した溶液100μlを添加し、37℃で30秒間TNF-α処理を行った。前処理およびTNF-α処理した各細胞について、上記（２）と同様にして、細胞内に取り込まれたH2O2を主体とする活性酸素種を蛍光プレートリーダーにより測定した。
【００４０】
結果を図２に示した。図中、TNF-α処理していない細胞をControlとした。AQP3-/-では、WTに比べて細胞内へのH2O2の取り込みが顕著に抑制されていた。これに対して、DPIおよびCatalaseで前処理を行なった場合は、AQP3-/-およびWTのいずれにおいても細胞内へのH2O2の取り込みが見られなかった。これらの結果は、TNF-α処理により、細胞外H2O2がAQP3を介して細胞内に取り込まれたことを示している。
【００４１】
（実施例２）H2O2の細胞内取り込みについて（２）
C57BL/6系統のNox2遺伝子欠損マウス（The Jackson Laboratory）を使用する以外は、実施例１の（１）と同様にしてNox2遺伝子欠損マウス由来細胞を調製した。
【００４２】
Nox2遺伝子欠損マウス由来細胞と実施例１の（１）で調製した野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を使用し、実施例１の（２）および（３）と同様にして、H2O2の細胞内取り込みを測定した。ただし、本実施例では実施例１の（２）において使用したH2O2濃度は100μMとした。また、本実施例では実施例１の（３）で行った前処理は行なわなかった。
【００４３】
結果を図３に示した。図３中、H2O2添加もTNF-α処理も行なっていない場合をControlとした。また、Nox2遺伝子欠損マウス由来細胞をNox2-/-とした。図３中、AQP3-/-およびNox2-/-において、TNF-α処理を行った場合はH2O2の細胞内取り込みがいずれの細胞においても抑制されており、一方、H2O2を添加した場合はAQP3-/-で抑制されているのに対してNox2-/-では抑制されていないことから、TNF-α処理により産生するH2O2はNox2によるものであることを示している。また、そのH2O2はAQP3を介して細胞内に取り込まれたことを示している。
【００４４】
（実施例３）
（１）イムノブロット分析
実施例１の（１）で調製した野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を、実施例１の（３）と同様にしてTNF-α処理した。ただし、前処理は行なわず、TNF-α処理時間は0、5、15、30および60分間とした。TNF-α処理後、RIPA（Radio-Immunoprecipitation Assay）緩衝液（Cell Signaling Technology：CST社）を用いて細胞を溶解処理し、14,000gで10分間遠心分離してして上清を得、蛋白を抽出した。この抽出した蛋白溶液をイムノブロット分析に供した。イムノブロット分析は、P-IKKβ（リン酸化IKKβ）、IKKβ、P-Iκβα（リン酸化Iκβα） 、Iκβα、P-p65（リン酸化NF-κB/p65）およびp65（NF-κB/p65）に対する抗体（いずれもCST社）を使用し、マニュアルに従って行った。また、β-actinに対する抗体（Sigma）をコントロールとして使用した。
【００４５】
結果を図４に示した。TNF-α処理によりWTではIKKβ、Iκβαおよびp65がリン酸化されており、これに対し、AQP3-/-ではそれらのリン酸化が抑制されていた。これは、AQP3-/-ではNFκBシグナルが抑制されていることを示している。
【００４６】
（２）免疫沈降分析
実施例１の（１）で調製した野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を、実施例１の（３）と同様にしてTNF-α処理を行った。ただし、前処理は行なわず、TNF-α処理時間は5分間とした。本実施例３の（１）と同様にTNF-α処理後、細胞を500μlのRIPA緩衝液（CST社）を用いて蛋白を抽出した。抽出した蛋白溶液は、TNFR1（TNF receptor 1）に対する抗体（CST社）と反応させた（4℃、1時間〜18時間）。TNFR1と結合した蛋白は、Protein G Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）と反応させた（4℃、1時間）。Protein G Sepharoseに結合した蛋白を、SDS sample buffer（Invitrogen）を用いて当該マニュアルに従い溶出した。溶出物は、SDS-Pageにて展開し、PVDF膜（Bio-Rad）に転写した。蛋白を転写したPVDF膜は、Traf2（TNF receptor-associated factor 2）、RIP1（receptor-interacting protein kinase 1）およびTNFR1に対する抗体（いずれもCST社）と反応させた。抗体を反応させたPVDF膜をECLウエスタンブロッティング検出システム（ECL Western Blotting Detection System）等を使用してHRP試薬にて化学発光させ、LAS4000（GEヘルスサイエンス）にて発光を検出した。
【００４７】
結果を図５に示した。WTおよびAQP3-/-でTraf2、RIP1およびTNFR1のリン酸化の抑制は認められなかった。
【００４８】
上記イムノブロット分析および免疫沈降分析の結果、TNF-α処理によりAQP3を介して細胞内に取り込まれたH2O2は、NFκBシグナルのIKKβ以降に作用したと考えられる。
【００４９】
（実施例４）
実施例１の（１）で調製した野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を、実施例１の（３）と同様に、PBS（Vehicle）、DPIまたはCatalaseによる前処理を行い、その後TNF-α処理した。TNF-αの処理時間は1時間とした。
【００５０】
96ウェルプレート1ウェルあたり1×105個の細胞を播種し、播種3〜4日後の細胞を4%ホルマリンで固定し、0.1% Triton X-100で透過処理後、抗p65抗体（CST社）および抗ウサギ抗体（FITC、Sigma）で免疫染色した。p65蛍光染色は、蛍光顕微鏡で観察した。
【００５１】
結果を図６に示した。TNF-α処理したWTでのみで核（図中、一部の核を矢印で示した）が明るく染まっていることが認められ、TNF-α処理によりNF-κB/p65が核内に移行したことを示している。それ以外では、核が黒い丸として見えており、NF-κB/p65が核内に取り込まれていないことを示している。これらの結果は、TNF-α処理によるNFκB活性化は、AQP3を介して細胞内に取り込まれたH2O2によるものであることを示している。
【００５２】
（実施例５）
実施例１の（１）で調製した野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を使用した。各細胞は、60mmディッシュあたり4×105個を播種し、播種3〜4日後に試験に供した。実施例１の（３）または（２）に準じて、TNF-α（100ng/ml）またはH2O2（300μM）で10分間処理した後、ProFluor Ser/Thr PPase assay kit (Promega)を使用し、そのマニュアルに従ってPP2A活性を測定した。PP2A活性は、PP2A阻害剤であるオカダ酸（Okadaic Acid、10μM）の存在下および非存在下における脱リン酸化の割合から求めた。
【００５３】
上記TNF-αまたはH2O2処理の前に、実施例１の（３）に準じて、Catalase（2000U/ml）で30分間前処理した場合についても、上記と同様にしてPP2A活性を測定した。
【００５４】
結果を図７に示した。WTではTNF-α処理またはH2O2処理によりPP2A活性が抑制されたが、AQP3-/-では抑制されなかった。また、Catalaseで前処理をするとPP2A活性は抑制されなかった。これは、TNF-α処理により取り込まれたH2O2がPP2A活性を抑制していることを示している。
【００５５】
（実施例６）
実施例１の（１）で調製した野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を使用した。各細胞は、60mmディッシュあたり4×105個を播種し、播種翌日に試験に供した。PP2AのsiRNA (Ppp2ca：ID 19052、Origene)またはControl siRNA （ON-TARGET plus SMART pool、Thermo scientific） をLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて、そのマニュアルに従って各細胞に導入した。次いで、実施例１の（３）に準じて、TNF-α（100ng/ml）で0〜30分間処理した後、実施例３の（１）に準じて、イムノブロット分析を行なった。イムノブロット分析は、P-IKKα/β（リン酸化IKKα/β）、IKKβ、P-p65（リン酸化NF-κB/p65）およびp65（NF-κB/p65）に対する抗体（いずれもCST社）を使用し、マニュアルに従って行った。
【００５６】
結果を図８（ａ）に示した。AQP3-/-において、PP2AをsiRNAで抑制したときのみIKKβおよびNF-κB/p65のリン酸化が認められた。
【００５７】
また、上記において、PP2AのsiRNAを導入した各細胞を、Catalase（2000U/ml）で30分間前処理した後、同様にしてイムノブロット分析を行なった。
【００５８】
結果を図８（ｂ）に示した。WTをCatalaseで前処理してTNF-α誘導によるNFκB活性化が抑制された系において、PP2Aの発現をsiRNAで抑制したところ、IKKβおよびNF-κB/p65のリン酸化が回復した。これは、PP2AがTNF-α処理によるNFκBの活性化に関与していることを示している。
【００５９】
（実施例７）
実施例１の（１）で調製した野生型マウス由来およびAQP3遺伝子欠損マウス由来の細胞を使用した。各細胞は、60mmディッシュあたり4×105個を播種し、播種翌日に試験に供した。PP2A のcDNAを含む発現ベクター（Ppp2ca(NM_019411)、Origene）またはControlとして空ベクター(pCMV6)をLipofectamine(R) 2000（Invitrogen）を用いて、そのマニュアルに従って各細胞に導入した。その後、TNF-α（100ng/ml）で0〜60分間処理した後、実施例６と同様にしてイムノブロット分析を行なった。
【００６０】
結果を図９に示した。WTにおいてPP2Aを過剰発現させると、TNF-α処理によるNFκB の活性化が抑制された。これはPP2AがNFκB の活性化に関与していることを示している。
【００６１】
（実施例８）
The Journal of experimental medicine 203, 2577-2587 (2006)およびNature 445, 648-651(2007)に記載された方法に準じて、実施例１の（１）の野生型マウスおよびAQP3遺伝子欠損マウスの耳に、IL-23 (500 ng、Miltenyi Biotec)またはControlとしてのPBSを4日間毎日皮下投与した。最終投与から24時間後に、麻酔下に安楽死させ、耳介組織を採取した。耳介組織は4%ホルマリンで固定し、パラフィン包埋切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色して、光学顕微鏡写真で耳介皮膚組織を観察した。
【００６２】
結果を図１０に示した。IL-23投与によりWTマウスでは耳の肥厚が見られたが、AQP3-/-マウスでは肥厚が見られなかった。これはAQP3の存在が耳の肥厚に関与していることを示している。
【００６３】
（実施例９）
実施例８と同様にして、野生型マウスおよびAQP3遺伝子欠損マウスの耳に、IL-23またはPBSを皮下投与した。次いで、実施例１の（１）と同様にして、各マウスの耳介の表皮を、200μlのRIPA溶液（CST社）にてホモジネート処理した。この皮膚抽出物を14,000gで10分間遠心して上清を採取した。この上清をイムノブロット分析に供した。イムノブロット分析は、P-Iκβα（リン酸化Iκβα）、Iκβαに対する抗体（いずれもCST社）を使用し、マニュアルに従って行った。また、β-actinに対する抗体（Sigma）をコントロールとして使用した。
【００６４】
結果を図１１に示した。IL-23投与により、WTではIκβαのリン酸化、およびIκβαの分解産物が検出されたが、AQP3-/-ではIκβαのリン酸化は抑制され、またIκβαの分解産物は検出されなかった。これは、IL-23投与によるNFκBの活性化にAQP3が関与していることを示している。
【００６５】
（実施例１０）
実施例８と同様にして、野生型マウスおよびAQP3遺伝子欠損マウスの耳に、IL-23またはPBSを皮下投与した。次いで、実施例１の（１）と同様にして、野生型マウス由来細胞およびAQP3遺伝子欠損マウス由来細胞を調製した。この細胞を使用し、実施例１の（２）と同様の方法にて、細胞内のH2O2を主体とする活性酸素種を測定した。
【００６６】
結果を図１２に示した。IL-23投与により、WTマウスの細胞内活性酸素種（H2O2量）が増加していたが、AQP3-/-マウスでは、H2O2量の増加は認められなかった。これは、IL-23投与により、WTの細胞内H2O2量が増加していること、さらにH2O2の細胞内への取り込みが、AQP3を介していることを示している。
【００６７】
（実施例１１）
HaCaT細胞（CLS社）に、AQP3のsiRNA(ON-TARGET plus SMART pool、Thermo scientific)またはControl siRNA （ON-TARGET plus SMART pool、Thermo scientific）をLipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて、そのマニュアルに従って導入した。次いで、各細胞を、実施例１の（２）に準じて、H2O2（50μMまたは100μM）で処理した後、細胞内に取り込まれたH2O2の量を測定した。また各細胞を、TNF-αの濃度を10ng/mlとするほかは実施例１の（３）と同様にして30秒間処理した後、細胞内に取り込まれたH2O2の量を測定した。
【００６８】
結果を図１３に示した。AQP3の発現をsiRNAで抑制（95%抑制）したときに、細胞外H2O2の取り込み、およびTNF-α処理によるH2O2の取り込みが抑制された。これは、ヒト皮膚細胞における細胞外H2O2の取り込みにAQP3が関与していることを示す。
【００６９】
（実施例１２）
実施例１１と同様に、HaCaT細胞（CLS社）にAQP3のsiRNAまたはControl siRNAを導入した。さらに、AQP3のsiRNAとPP2AのsiRNA (Ppp2ca：ID 19052、Origene)を同時に導入した。次いで、これらの細胞を、実施例１の（３）において前処理を行なわなかったほかは同様にしてTNF-α処理（0〜15分間）し、イムノブロット分析を行なった。イムノブロット分析は、リン酸化IKKβ（P-IKKβ）およびIKKβに対する抗体（いずれもCST社）を使用し、マニュアルに従って行った。
【００７０】
結果を図１４に示した。AQP3の発現を抑制するとIKKβのリン酸化は抑制されたが、同時にPP2Aの発現を抑制するとIKKβのリン酸化は回復した。これは、PP2AがNFκBの活性化に関与していることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
以上詳述したように、本発明のスクリーニング方法により、新規メカニズムによるH2O2依存性NF-κB活性抑制物質を得ることができ、乾癬等のケラチノサイトの異常増殖による疾患に有用な医薬を提供し得る。
【図１】
2016082947.tif 000003
【図２】
2016082947.tif 000004
【図３】
2016082947.tif 000005
【図７】
2016082947.tif 000006
【図１２】
2016082947.tif 000007
【図１３】
2016082947.tif 000008
【図４】
2016082947.tif 000009
【図５】
2016082947.tif 000010
【図６】
2016082947.tif 000011
【図８】
2016082947.tif 000012
【図９】
2016082947.tif 000013
【図１０】
2016082947.tif 000014
【図１１】
2016082947.tif 000015
【図１４】
2016082947.tif 000016