(57)【要約】【課題】  Ｚ方向の試料の分布情報を迅速に取得することができる非線形光学顕微鏡装置を提供する。【解決手段】  非線形光学顕微鏡装置１００は、レーザー光を集光したスポットとして試料５に照射する照射手段１と、スポットの照射位置をＸＹ方向に走査するＸＹ走査手段と、スポットの照射位置から発せられる光を検出する光検出手段３と、を有する。非線形光学顕微鏡装置１００は、選択されたｎ種（ｎは２以上の整数）の波長のレーザー光を用いて、ＸＹ走査手段によってスポットを走査してｎ個の２次元分布データを取得する。非線形光学顕微鏡装置１００は、スポットの照射位置をＺ方向に走査するＺ走査手段をさらに有し、選択されたｍ種（ｍ＜ｎ；ｍは１以上の整数）の波長のレーザー光を用いて、Ｚ走査手段によってスポットを走査してＺ走査方向に沿った光の強度の１次元分布データを取得する。【選択図】  図１
2016091004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
波長選択可能なレーザー光を、集光したスポットとして試料に照射する照射手段と、
前記照射手段によって照射された前記レーザー光の前記スポットの照射位置をＸＹ方向に走査するＸＹ走査手段と、
前記スポットの照射位置から発せられる光を検出する光検出手段と、を備え、
選択されたｎ種（ｎは２以上の整数）の波長のレーザー光を用いて、前記ＸＹ走査手段によって前記スポットをＸＹ方向に走査しつつ前記光を前記光検出手段によって検出し、前記光の強度が前記スポットの照射位置のＸＹ座標ごとに格納されたｎ個のＸＹ２次元分布データを取得する非線形光学顕微鏡装置であって、
前記照射手段によって照射された前記レーザー光の前記スポットの照射位置をＺ方向に走査するＺ走査手段をさらに有し、
選択されたｍ種（ｍ＜ｎ；ｍは１以上の整数）の波長のレーザー光を用いて、前記Ｚ走査手段によって前記スポットをＺ方向に走査しつつ前記光を前記光検出手段によって検出し、前記光の強度が前記スポットの照射位置のＺ座標ごとに格納された１次元分布データを取得することを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
【請求項２】
前記ＸＹ２次元分布データを解析することにより、前記試料の成分の分布を示すＸＹ２次元画像データを生成する画像データ生成手段をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項３】
前記１次元分布データに基づいて、前記試料の上面または下面のＺ方向における位置情報を取得する界面位置取得手段をさらに有することを特徴とする請求項１または請求項２に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項４】
前記界面位置取得手段によって取得した前記試料の上面または下面のＺ方向における位置情報に基づいて、前記スポットのＺ方向の照射位置を前記試料中の任意の位置に決定する合焦位置決定手段をさらに有することを特徴とする請求項３に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項５】
前記合焦位置決定手段によって決定した前記スポットのＺ方向の照射位置に、前記スポットを移動させ、前記ＸＹ走査手段によって前記スポットをＸＹ走査することを特徴とする請求項４に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項６】
前記１次元分布データに基づいて、前記試料を保持する保持部材のＺ方向における位置情報を取得することを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項７】
同一Ｚ座標における前記光の信号強度を積算または平均化することで前記１次元の分布データを取得することを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項８】
前記界面位置取得手段によって取得した前記試料の上面または下面のＺ方向における位置情報に基づいて、前記試料中の任意の深度として設定可能な数値範囲を提示する提示手段をさらに有することを特徴とする請求項３乃至請求項７のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項９】
前記界面位置取得手段によって取得した前記試料の上面および下面のＺ方向における位置情報に基づいて、前記試料の厚さを計測することを特徴とする請求項３乃至請求項８のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１０】
前記選択されたｍ種の波長が、Ｃ−Ｈ伸縮振動の振動数に対応する波長であることを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１１】
前記選択されたｍ種の波長が、いずれも７００ｎｍ以上８００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１乃至請求項９のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１２】
ｍ＝１であることを特徴とする請求項１乃至請求項１１のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１３】
前記光が、誘導ラマン散乱またはコヒーレントアンチストークスラマン散乱またはコヒーレントストークスラマン散乱のうち、少なくとも１つの現象によって発せられた光であることを特徴とする請求項１乃至請求項１２のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１４】
前記ＸＹ２次元分布データを画像表示する画像表示部をさらに有する請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１５】
第１の波長を有する第１のレーザー光と、第２の波長を有する第２のレーザー光と、を含む照射光を試料に照射する照射手段と、
前記試料を透過した、あるいは前記試料によって反射または散乱された光を検出する光検出手段と、
前記第１の波長および前記第２の波長の少なくとも一方を変更する波長変更手段と、
前記照射光の照射位置を前記試料に対してＸＹ方向に走査するＸＹ走査手段と、を有し、
前記波長変更手段によって前記第１の波長および前記第２の波長の少なくとも一方を変更して、前記第１の波長と前記第２の波長の差がそれぞれ異なるｎ種（ｎは２以上の整数）の前記光を用いて、前記照射光の照射位置を前記ＸＹ走査手段によってＸＹ方向に走査しつつ前記光を前記光検出手段により検出することで、前記光の強度がＸＹ座標ごとに格納されたｎ個のＸＹ２次元分布データを取得する非線形光学顕微鏡であって、
前記照射光の照射位置を前記試料に対してＺ方向に走査するＺ走査手段をさらに有し、
前記第１の波長と前記第２の波長の差がそれぞれ異なるｍ種（ｍ＜ｎ；ｍは１以上の整数）の前記照射光を用いて、前記照射光の照射位置を前記Ｚ走査手段によってＺ方向に走査しつつ前記光を前記光検出手段によって検出することで、前記光の強度がＺ座標ごとに格納された１次元分布データを取得することを特徴とする非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１６】
前記第１のレーザー光および前記第２のレーザー光のうち少なくとも一方のレーザー光は強度変調されたレーザー光であり、
前記光検出手段が、強度変調されたレーザー光の変調信号を参照信号として、もう一方のレーザー光を同期検波することを特徴とする請求項１５に記載の非線形光学顕微鏡装置。
【請求項１７】
波長選択可能なレーザー光を、集光したスポットとして試料に照射する第１のステップと、
前記スポットの照射位置をＺ方向に走査して前記光を検出する第２のステップと、
選択されたｍ種（ｍは１以上の整数）の波長のレーザー光を用いて、Ｚ走査方向に沿った前記光の強度の１次元分布データを取得する第３のステップと、
前記１次元分布データから前記試料の上面または下面のＺ方向における位置情報を取得する第４のステップと、
前記試料の上面または下面のＺ方向における位置情報に基づいて、前記スポットのＺ方向の照射位置を前記試料中の任意の位置に決定する第５のステップと、
前記第５のステップにおいて決定した前記スポットのＺ方向の照射位置に、前記スポットを移動させる第６のステップと、
選択されたｎ種（ｍ＜ｎ；ｎは２以上の整数）の波長のレーザー光を集光したスポットとして試料に照射し、前記スポットの照射位置をＸＹ方向に走査して前記光を検出する第７のステップと、を有することを特徴とする情報取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非線形光学顕微鏡装置、レーザー光を用いた試料情報取得方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料の成分分析のために、試料中の所定の位置にレーザー光をスポットとして集光照射し、その光学的特性を評価する技術がある。
【０００３】
非特許文献１では、レーザー光の波長を掃引しながらレーザー光の照射位置をＸＹ方向に走査することで、ラマンスペクトルの２次元分布を取得する誘導ラマン散乱顕微鏡が提案されている。取得したラマンスペクトルの２次元分布である多次元データを、多変量解析によって解析することによって、試料中の成分分布を示す２次元画像データを生成することができる。
【０００４】
また、非特許文献１では、レーザー光の照射位置を試料の深さ方向に変化させてＺ座標の異なる複数のラマンスペクトルの２次元分布を取得する方法も提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｙ．  Ｏｚｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−ｓｐｅｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｗｉｔｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ６，８４５−８５１（２０１２）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の非線形光学顕微鏡装置においては、試料を顕微鏡装置の試料ステージ上に載置した後、試料が存在する高さ（Ｚ座標）が不明であった。そのため顕微鏡装置の操作者は、試料ステージを少しずつ動かしながら顕微鏡画像を逐次確認することによって、観察を行うために適切な合焦位置を探索していた。
【０００７】
非特許文献１に記載の誘導ラマン散乱顕微鏡装置では、ラマンスペクトルの２次元分布データの取得と２次元画像データの生成とを、適切な合焦位置を見つけるまで何度も繰り返す必要があり、合焦位置の決定までに多大な時間を要していた。
【０００８】
そこで本発明は上述の課題に鑑み、Ｚ方向の試料の分布情報を迅速に取得することができる非線形光学顕微鏡装置の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の非線形光学顕微鏡装置は、波長選択可能なレーザー光を、集光したスポットとして試料に照射する照射手段と、前記照射手段によって照射された前記レーザー光の前記スポットの照射位置をＸＹ方向に走査するＸＹ走査手段と、前記スポットの照射位置から発せられる光を検出する光検出手段と、を備え、選択されたｎ種（ｎは２以上の整数）の波長のレーザー光を用いて、前記ＸＹ走査手段によって前記スポットをＸＹ方向に走査しつつ前記光を前記光検出手段によって検出し、前記光の強度が前記スポットの照射位置のＸＹ座標ごとに格納されたｎ個のＸＹ２次元分布データを取得する非線形光学顕微鏡装置であって、前記照射手段によって照射された前記レーザー光の前記スポットの照射位置をＺ方向に走査するＺ走査手段をさらに有し、選択されたｍ種（ｍ＜ｎ；ｍは１以上の整数）の波長のレーザー光を用いて、前記Ｚ走査手段によって前記スポットをＺ方向に走査しつつ前記光を前記光検出手段によって検出し、前記光の強度が前記スポットの照射位置のＺ座標ごとに格納された１次元分布データを取得することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、Ｚ方向の試料の分布情報を迅速に取得することができる非線形光学顕微鏡装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第１の実施形態に係る非線形光学顕微鏡装置の構成を示す模式図である。
【図２】第１の実施形態に係る非線形光学顕微鏡装置の合焦モードにおける動作を示すフローチャートである。
【図３】（ａ）は第１の実施形態に係る検波信号の挙動を示す模式図、（ｂ）および（ｃ）は第３の実施形態に係る検波信号の挙動を示す模式図、（ｄ）は第４の実施形態に係る検波信号の挙動を示す模式図である。
【図４】第５の実施形態に係る非線形光学顕微鏡装置の動作を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の非線形光学顕微鏡装置に係るいくつかの実施形態について説明する。なお、これらの実施形態は本発明における最良の実施形態の一例ではあるものの、本発明はこれらの実施形態にて説明する各種構成のみに限定されるものではない。
【００１３】
（第１の実施形態）
まず、第１の実施形態に係る非線形光学顕微鏡装置１００（以下、「装置１００」と称する）の構成について、図１を用いて説明する。図１は、本実施形態に係る装置１００を含む非線形光学顕微鏡システムを示している。ここで、本実施形態に係る装置１００は、非線形光学効果の一種である誘導ラマン散乱を利用した誘導ラマン散乱顕微鏡装置である。
【００１４】
図１に示すように、本実施形態に係る装置１００は、照射手段１と、試料ステージ２と、光検出手段３と、制御部４と、試料ステージ制御部２１と、を有する。
【００１５】
照射手段１は、第１の光源１１と、第２の光源１２と、変調手段１３と、合波部１４と、光スキャナ１５と、第１の対物レンズ１６と、を有する。照射手段１は、第１の光源１１から出射された第１のレーザー光と、第２の光源１２から出射された第２のレーザー光とを合波して照射光とする。そしてこの照射光を集光し、試料５中にスポットとして照射する手段である。なお、本実施形態では２種類のレーザー光を合波して照射光とする構成について説明するが、照射光は単一のレーザー光からなる光であってもよいし、３以上のレーザー光を合波して形成される光であってもよい。
【００１６】
第１の光源１１は、第１の波長を有する第１のレーザー光を発する光源であり、第２の光源１２は第２の波長を有する第２のレーザー光を発する光源である。第１の光源１１は波長可変光源である。すなわち、第１のレーザー光は波長選択可能なレーザー光である。なお、本実施形態では第１の光源１１のみ波長可変光源としたが、第２の光源１２も波長可変光源としてもよく、第２の光源１２のみを波長可変光源としてもよい。すなわち、第１のレーザー光の波長と第２のレーザー光の波長との差を選択可能な構成であればよい。このように、本実施形態に係る照射手段１は第１の波長および第２の波長の少なくとも一方を変更する波長変更手段を有する。なお第１のレーザー光および第２のレーザー光の波長は、誘導ラマン散乱現象が発生するものであれば特に限定はされず、紫外光、可視光、赤外光等、いずれの波長であってもよい。
【００１７】
変調手段１３は、第１の光源１１から出射した第１のレーザー光を強度変調する手段である。変調手段１３は、例えば電気光学効果、音響光学効果、磁気光学効果、熱光学効果、非線型光学効果等を利用することによって第１のレーザー光を強度変調することができる。なお、第１の光源１１がパルス発振することにより、実質的に強度変調された第１のレーザー光を発する構成としてもよい。すなわち、第１のレーザー光を強度変調する変調手段１３を、第１の光源１１が兼ねる構成としてもよい。
【００１８】
合波部１４は、第１のレーザー光と第２のレーザー光とを同軸に合波し、合波レーザー光（照射光）とする部分である。合波部１４は、不図示のミラー及び不図示のダイクロイックミラーを有し、第２のレーザー光を第１のレーザー光に対して同軸に合波する。あるいは、第１のレーザー光を第２のレーザー光に対して同軸に合波する構成としても良い。
【００１９】
光スキャナ１５は、合波部１４において合波された合波レーザー光の集光点（スポット）を合波レーザー光の光軸に対して垂直な平面方向（以下「ＸＹ方向」と称する）に走査する部分である。
【００２０】
第１の対物レンズ１６は、合波部１４において合波レーザー光（照射光）を集光し、スポットとして試料５中に照射する部分である。
【００２１】
試料ステージ２は、試料５を載置するステージである。試料５は、保持部材５１によって保持された状態で試料ステージ上に載置される。これにより、試料５を第１の対物レンズ１６と第２の対物レンズ３１（後述）との間に配置する。
【００２２】
保持部材５１は、ガラスなどの第１のレーザー光および第２のレーザー光の透過率の高い材質の部材であることが好ましい。保持部材５１としては、典型的にはスライドガラス５１ｂおよびカバーガラス５１ａを用いることができる。このとき、試料５をスライドガラス５１ｂ上に載置し、その上にカバーガラス５１ａを配置して試料５を保持部材５１で挟む構成とする。スライドガラス５１ｂとカバーガラス５１ａとによって挟まれた空間内は、水などの液体で満たしておいてもよい。また、保持部材５１としてスライドガラス５１ｂのみを用い、試料５を単にスライドガラス５１ｂ上に載置することによって保持する構成としてもよい。
【００２３】
光検出手段３は、照射手段１によって合波レーザー光を照射された試料５のスポットの照射位置から発せられる光を検出する部分である。光検出手段３は具体的には、試料５を透過した、あるいは試料５によって反射または散乱された光を検出する。光検出手段３は、第２の対物レンズ３１と、光学フィルタ３２と、検出器３３と、を有する。
【００２４】
第２の対物レンズ３１は、試料５を透過、あるいは試料５によって散乱または反射した光である光など、試料５から発せられた光を含む光を取り出す部分である。その後、第２の対物レンズ３１によって取り出された光を光学フィルタ３２を通過させることで、第２のレーザー光と同じ波長の光のみを通過させる。
【００２５】
光学フィルタ３２を透過した光は、検出器３３で検出され、検出器３３は検出強度（信号強度）を出力する。本実施形態では、検出器３３は、光電変換部３３１と検波部３３２とを有する。すなわち、光学フィルタ３２を通過した光はまず、フォトダイオード等の光電変換部３３１で光電変換され、電気信号として出力される。そしてこの電気信号が、ロックインアンプ等の回路を有する検波部３３２に導入される。検波部３３２は、第１のレーザー光の変調信号を変調手段１３から取得し、変調信号を参照信号として同期検波を行う。これにより、誘導ラマン散乱によって強度変調が生じた第２のレーザー光の中から、誘導ラマン散乱によって生じた光成分のみを検出し、検波信号として取得することができる。
【００２６】
制御部４は、光スキャナ１５や試料ステージ２の制御を行う部分である。制御部４は、試料ステージ制御部２１を制御することで試料ステージ２をＺ方向（合波レーザー光の光軸方向）に移動させる。これにより、試料５と第１の対物レンズ１６との距離を変化させる。これに伴って、合波レーザー光のスポットの照射位置をＺ方向に走査することができる。すなわち、制御部４および試料ステージ制御部２１はＺ走査手段である。
【００２７】
また、制御部４は、光スキャナ１５を制御することによって、合波レーザー光のスポットの照射位置をＸＹ方向に走査することができる。すなわち、制御部４および光スキャナ１５はＸＹ走査手段である。
【００２８】
本実施形態においてはＸＹ走査手段を制御部４および光スキャナ１５、Ｚ走査手段を制御部４および試料ステージ制御部２１としたが、これに限定はされない。すなわち、制御部４および試料ステージ制御部２１によって試料ステージ２をＸＹ方向に移動させることでＸＹ走査を行ってもよい。また、対物レンズ１６をＺ方向に移動可能に構成するなどの方法によって、照射手段１をＺ走査手段としてもよい。
【００２９】
制御部４は、光検出手段３から取得した検波信号の信号強度、光スキャナ１５および試料ステージ２の制御量（合波レーザー光の集光点（スポット）のＸＹＺ座標）をもとに、各種データを生成する部分でもある。
【００３０】
制御部４は、各種データを処理するデータ処理部（不図示）や、各種データを一時的に記憶したり、データ処理結果や計測の際の各種条件等を記憶したりするための記憶部（不図示）を有する。
【００３１】
なお、本実施形態に係る装置１００は透過型の非線形光学顕微鏡装置としたが、反射型の非線形光学顕微鏡装置であってもよい。
【００３２】
また、本実施形態に係る非線形光学顕微鏡システムは装置１００の他に、画像表示部６１と、指示入力部６２と、を有する。
【００３３】
画像表示部６１は、制御部４に接続され、計測結果や計測の際の各種条件等を表示する部分である。指示入力部６２は、制御部４に接続され、非線形光学顕微鏡システムを使用する操作者が計測の際の各種条件等を入力する部分である。
【００３４】
次に、本実施形態に係る非線形光学顕微鏡システムによる画像取得の動作を説明する。
【００３５】
画像取得の際は、まず合波レーザー光のスポットの照射位置情報に基づいて制御部４が光スキャナ１５を制御する。これにより、光スキャナ１５が合波レーザー光の集光点（スポット）をＸＹ方向に走査する。このとき、第１のレーザー光又は第２のレーザー光のうち少なくとも一方のレーザー光の波長を、光スキャナ４１による走査と同期して掃引する。波長の掃引は、第１のレーザー光又は第２のレーザー光のうちどちらか一方について行えばよいが、両方のレーザー光の波長を掃引してもよい。
【００３６】
照射手段１によって合波レーザー光を照射した試料５のスポットの照射位置から発せられる光は、光検出手段３によって検出される。
【００３７】
制御部４は、スポットの照射位置情報、第１のレーザー光および第２のレーザー光の波長に関する情報、光検出手段３によって取得された検波信号等の各種データを取得する。制御部４は、これらの各種データをもとに、ラマンスペクトルの二次元分布データを生成する。
【００３８】
さらに制御部４は、ラマンスペクトルのＸＹ２次元分布データを解析することによって、試料５の成分分布を示すＸＹ２次元画像データを生成することができる。すなわち、制御部４は画像データ生成手段でもある。解析の手法としては、例えば多変量解析や機械学習などの各種解析手法を用いることができる。
【００３９】
ここで、「多変量解析」とは、複数の変数に関するデータをもとにして、これらの変数間の相互関連を分析する統計的な技法である。すなわち本実施形態では、例えば波数などの各スペクトル成分間の相互関連を分析することでそれぞれのスペクトルを分類し、成分に帰属することができる。このとき、各スペクトルがどの成分に帰属されるかの判断基準である基底ベクトルを用いることができる。基底ベクトルを各スペクトルに対して作用することで次元圧縮を行い、各成分に対応する基底ベクトルに対するスコアを得ることができる。なお、ここで言う「成分」は、単一の物質からなる成分であっても良いし、複数の物質の混合物からなる成分であっても良い。すなわち成分は、スペクトルを計測した試料中の特定の分子であっても良いし、スペクトルを計測した試料中の、複数の分子から構成される組織や成分であっても良い。
【００４０】
本実施形態に係る非線形光学顕微鏡システムにより画像を取得する際には、装置１００を上記のように駆動させることによって、試料５内のラマンスペクトルのＸＹ平面（ＸＹ２次元）分布データを取得する。
【００４１】
ここで、試料５内のラマンスペクトルのＸＹ平面分布データを取得するためには、合波レーザー光のスポットの照射位置が試料５内のいずれかの位置に一致していることが必要である。しかし、合波レーザー光のスポットの照射位置が試料５内の位置に常に一致しているとは限らない。すなわち、装置１００が合波レーザー光のスポットを、試料５が存在しない領域でＸＹ走査してしまう場合もある。例えば、試料５を保持した保持部材５１を試料ステージ２上に載置した直後に、画像の取得を行う場合が挙げられる。この場合、試料５からの検出信号が全く得られない領域において合波レーザー光のスポットがＸＹ走査され、走査された平面内からは試料５内のラマンスペクトルのＸＹ平面分布データが取得できない可能性がある。
【００４２】
そこで、本実施形態に係る非線形光学顕微鏡システムは、以下に説明するような合焦動作を行う。以下、上述したように装置１００が画像の取得を行うモードを「画像取得モード」、装置１００が合焦動作を行うモードを「合焦モード」と称する。合焦モードでの動作を行うことで、合波レーザー光のスポットの照射位置を試料５内の任意の高さ（Ｚ座標）に一致させることができる。また、合焦モードでの動作を行った上で、画像取得モードでの動作を行うことで、試料５内の任意の高さ（Ｚ座標）のＸＹ平面領域におけるラマンスペクトルのＸＹ２次元分布データを取得することができる。
【００４３】
画像取得モードでは、装置１００は第１のレーザー光の波長を掃引し、波長をｎ−１回（ｎは２以上の整数）変更して計測を行う。すなわち、ｎ種の波長のレーザー光を用いて計測を行い、光の強度がＸＹ座標ごとに格納されたｎ個のＸＹ２次元分布データ（ｎ枚の多重画像）を取得する。すなわち、ｎ個のラマンスペクトルの２次元分布データを取得する。
【００４４】
一方、本実施形態に係る装置１００は合焦モードにおいて、ｎより少ないｍ種の波長のレーザー光を用いて計測を行うことが好ましい。すなわち、ｍ＜ｎであり、ｍは１以上の整数である。本実施形態では、このように選択されたｍ種の波長のレーザー光のスポットをＺ方向に走査して計測を行うことで、光の強度がスポットの照射位置のＺ座標ごとに格納された１次元分布データを取得する。すなわち、本実施形態に係る装置１００は、上記のような１次元分布データを取得するＺ方向分布取得手段を有する。
【００４５】
以下、本実施形態に係る装置１００の合焦モードにおける動作を図２および図３を用いて説明する。
【００４６】
図２は、本実施形態に係る装置１００の合焦モードにおける動作を示すフローチャートである。本実施形態に係る装置１００は、合焦モードにおいて１種の波長のレーザー光を用いて計測を行う。すなわち、合焦モードにおけるレーザー光の波長選択数ｍが１の場合の実施形態である。
【００４７】
なお、本実施形態においては、誘導ラマン散乱現象を発生させるために波長の異なる２つのレーザー光を合波して集光照射する。この２つのレーザー光の波長の差分に対応する波数が、試料５中の成分の分子振動数と一致した場合に誘導ラマン散乱現象が生じる。そのため、本実施形態において合波レーザー光の波長を選択する場合は、２種類のレーザー光の波長差を選択することになる。すなわち、２つのレーザー光（第１のレーザー光および第２のレーザー光）の波長をそれぞれ選択することで、実質的に合波レーザー光の波長を１つ選択することになる。すなわち、本実施形態において「ｎ種の波長のレーザー光」とは、２種類のレーザー光を合波した合波レーザー光においてそれぞれのレーザー光の波長差がｎ種類であることを指すものとする。
【００４８】
装置１００の操作者はまず、試料５中の観察対象（成分）に応じて第１のレーザー光の波長である第１の波長および第２のレーザー光の波長である第２の波長を１つずつ選択し、指示入力部６２により入力する。また、操作者は試料５の観察を行う試料５中の位置として、試料５の上面からの任意の深度Ｚｘを、指示入力部６２により入力する（Ｓ２０１）。なお、後述するように任意の深度ＺｘはＳ２０１において入力しなくてもよい。
【００４９】
第１の波長および第２の波長は、試料５からの検波信号が得られる波長であれば特に限定はされない。すなわち、第１の波長と第２の波長との差分に対応する波数が、試料５に含まれる分子の分子振動数と一致するように、各波長を選択すればよい。例えば試料５が生体試料である場合、一般に試料５には炭化水素に代表される有機物が多数含まれるため、Ｃ−Ｈ結合が豊富に存在する可能性が高い。そのため、操作者は、Ｃ−Ｈ伸縮振動が観測される波数である２８００ｃｍ−１〜３１００ｃｍ−１のいずれかの波数に合わせて、第１の波長および第２の波長を選択し、入力すれば良い。これにより、合波レーザー光を試料５に集光照射することで誘導ラマン散乱現象を発生させ、光検出手段３において検波信号を検出することができる。
【００５０】
また、試料５が生体試料である場合、試料５中には水分子が豊富に存在する。そのため、操作者は、水分子の分子振動が観測される波数である３２００ｃｍ−１〜３３００ｃｍ−１のいずれかの波数に合わせて、第１の波長および第２の波長を選択し、入力しても良い。これにより、合波レーザー光を試料５に集光照射することで誘導ラマン散乱現象を発生させ、光検出手段３において検波信号を検出することができる。
【００５１】
次に、光検出手段３は第２のレーザー光の同期検波を開始する（Ｓ２０２）。同期検波が開始されると、制御部４は光検出手段３から検波信号を取得する。
【００５２】
これを受けて制御部４は、試料ステージ２のＺ方向（試料ステージ２に対して垂直な方向）への移動を開始する。これにより、試料ステージ２はＺ方向の一方向に移動する（Ｓ２０３）。試料ステージ２の移動の際には、制御部４が試料ステージ２を連続的に移動させても良いし、段階的に移動させても良い。
【００５３】
なおこのとき、合波レーザー光のスポットはＸＹ方向にも走査されていてもよいし、走査されていなくてもよい。合波レーザー光のスポットがＸＹ方向に走査されている場合は、同一ＸＹ平面内から複数の検波信号を取得できるので、ＸＹ平面内の平均的な情報を取得できる。そのため、ＸＹ走査しない場合に比べてより信頼度の高いデータが得られるので好ましい。また、非線形光学効果を発生させるためには一般に高いエネルギーのレーザー光を集光照射するため、試料５が損傷してしまう場合がある。ＸＹ走査しながらＺ走査することで、合波レーザー光のスポットが試料５中の１箇所に留まっている時間を短くすることができ、試料５の損傷リスクを低減することが可能となる。そのため、Ｚ走査を行う場合にはＸＹ走査を行いながらＺ走査を行うことが好ましい。
【００５４】
なお、ＸＹ走査を行いながらＺ走査を行う場合には、１つの視野内でＸＹ走査が完了してからＺ方向に走査してもいいし、１つの視野内でのＸＹ走査の途中でＺ方向への走査を行ってもよい。１つの視野内でのＸＹ走査の途中でＺ方向への走査を行うことで、１次元分布データをより高速に取得することができる。
【００５５】
以降、制御部４が試料ステージ２を下方から上方に向かって移動させる場合について説明する。この試料ステージ２の移動によって、試料５と第１の対物レンズ１６との相対的な位置関係が変更される。これにより、合波レーザー光のスポットの照射位置がＺ方向に走査される。なお、試料ステージ４４を固定したまま、照射手段１を上方または下方へと移動させることで、試料５と第１の対物レンズ１６との相対的な位置関係を変更してもよい。
【００５６】
試料ステージ２が下方から上方へ移動していくにつれ、合波レーザー光の集光点（スポット）も相対的に移動する。すなわち、この場合、合波レーザー光の集光点（スポット）は上方から下方へと移動する。
【００５７】
合波レーザー光の集光点（スポット）が試料５の上面（図１におけるＡ面）に到達すると、試料５からの検波信号が得られはじめる。これは、第１の波長と第２の波長との差分に対応する波数と、試料５に含まれる分子の分子振動数とが一致したことによって誘導ラマン散乱現象が発生するためである。
【００５８】
試料ステージ２をさらに下方から上方へと移動させていき、合波レーザー光のスポットが試料５の下面（図１におけるＢ面）に到達すると、試料５からの検波信号は得られなくなる。
【００５９】
試料ステージ２を下方から上方に向かって移動させた場合について、縦軸に検波信号の信号強度を、横軸に試料ステージ２のＺ座標（または初期位置からの移動量）をとると、図３（ａ）のような信号強度プロファイルが得られる。試料５に十分な厚みがある場合、このように上端がほぼ平坦で、左右に急峻な立ち上がり部分と立ち下がり部分（エッジ）を有する形状のピークが得られる。制御部４は、この立ち上がり位置のＺ座標を試料５の上面の座標Ｚ１として記録する（Ｓ２０４）。すなわち、界面位置取得手段である制御部４は、上記の方法により、試料５の上面または下面の位置情報を取得することができる。
【００６０】
なおこのとき、同一Ｚ座標のＸＹ平面上において合波レーザー光のスポットをＸＹ走査しながら計測を行った場合には、同一ＸＹ平面から得られた検波信号の信号強度を積算または平均化した値を用いて信号強度プロファイルを生成することが好ましい。これにより、ＸＹ平面内の平均的な情報を取得することができ、ＸＹ走査しない場合に比べてより信頼度の高い信号強度プロファイルを取得することができる。また、エッジの立ち上がり位置は、あらかじめ設定されたしきい値を超えた位置とすることが好ましい。また、エッジの立ち下がり位置についても同様に、あらかじめ設定されたしきい値を下回った位置とすることが好ましい。あるいは、信号強度プロファイルにおける信号強度の変化率、すなわちエッジの立ち上がりおよび立ち下がりの急峻さに基づいて、エッジの立ち上がりおよび立ち下がりの位置を判定してもよい。
【００６１】
次に制御部４は、Ｓ２０１において任意の深度Ｚｘが入力されたか否かを確認する（Ｓ２０５）。深度Ｚｘが入力されている場合（Ｓ２０５においてＹｅｓ）、以降のステップ（Ｓ２０６〜Ｓ２０８）を省略し、Ｓ２０９へと移行する。
【００６２】
深度Ｚｘが入力されていない場合（Ｓ２０５においてＮｏ）、制御部４は試料ステージ２をさらに移動させていき、検波信号の立ち下がり位置のＺ座標を試料５の下面の座標Ｚ２として記録する（Ｓ２０６）。その後、試料ステージ２の移動を停止する（Ｓ２０７）。
【００６３】
制御部４はＳ２０４とＳ２０６とで記録した試料５の上面の座標Ｚ１と下面の座標Ｚ２をもとに、上面の座標Ｚ１からの任意の深度Ｚｘとして設定可能な数値範囲を算出し、装置１００の操作者に提示する。すなわち、Ｚ２−Ｚ１を計算し、深度Ｚｘの上限値として装置１００の操作者に知らせる。ここで、Ｚ２−Ｚ１は試料５のＺ方向の厚みに相当する。これにより、後述する合焦位置の決定ステップにおいて、試料５の外側に合焦位置が決定されることを避けることができる。装置１００の操作者は、提示された深度Ｚｘの設定可能範囲に基づいて深度Ｚｘを入力する。
【００６４】
次に、制御部４は試料５の上面の座標Ｚ１と、操作者が入力した深度Ｚｘとを用いて合波レーザー光のスポットのＺ方向における照射位置（Ｚ座標）を決定する（Ｓ２０９）。すなわち、制御部４は、Ｚ１＋Ｚｘを合波レーザー光のスポットのＺ座標として決定し、記録する。すなわち、合焦位置決定手段である制御部４は、上記の方法により、試料５の任意の深度に対応するＺ座標を合焦位置として決定することができる。
【００６５】
続いて制御部４は試料ステージ２をＳ２０９において決定したＺ座標であるＺ１＋Ｚｘに移動させ（Ｓ２１０）、一連の動作が終了する。
【００６６】
図２では、試料ステージ２を下方から上方へ向かって移動させる場合のフローチャートを示したが、試料ステージ２を上方から下方に向かって移動させてもよい。この場合、検波信号の立ち上がりの位置が試料５の下面の位置に相当し、検波信号の立ち下がりの位置が上面の位置に相当する。そのため図２において、Ｓ２０４でＺ２を記録し、Ｓ２０６ではＺ１を記録するようにすればよい。
【００６７】
また本実施形態では、試料ステージ２上に試料５を載置した後、合波レーザー光のスポットが試料５内に存在しない場合について説明した。すなわち、試料ステージ２を下げた状態で試料５を載置したものとした。しかし、試料５の厚みが厚い場合などには、試料ステージ２上に試料５を載置した後、試料ステージ２を移動させる前に、合波レーザー光のスポットが試料５の内部に存在する場合もある。この場合はＳ２０２において、第２のレーザー光の同期検波の開始とともに検波信号が得られる。この場合はＳ２０４をスキップしてもよい。なおこのとき、装置１００は、装置１００の操作者が入力した試料５の上面からの深度Ｚｘを試料５の下面からの深度Ｚｘ´として記録し直してもよいし、装置１００の操作者に試料５の下面からの深度Ｚｘ´を再入力するように知らせてもよい。
【００６８】
以上のように本実施形態に係る装置１００は、合焦モードにおいて画像取得モードよりも少ない種類数のレーザー光を用いて計測を行うため、画像取得モードと同じ種類数のレーザー光を用いてＺ方向にも計測を行う場合に比べて高速に計測を行うことができる。これにより、Ｚ方向の試料の分布情報を迅速に取得することができる。例えば、画像取得モードにおける波長数ｎが９１である場合、本実施形態によればＺ方向の試料の分布情報を取得するのに要するのに要する時間を、少なくとも１／９１倍に短縮することができる。
【００６９】
また、本実施形体に係る装置１００はさらに界面位置取得手段を有することで、Ｚ方向の試料の分布情報に基いて試料界面の位置情報を取得することができる。これにより、試料界面の位置を基準とした、試料５中の任意深度に合焦位置を決定することができる。さらに、決定した合焦位置に基いて試料ステージ２を移動させ、画像取得モードで画像取得を行うことで、試料５中の任意深度における画像取得を行うことができる。
【００７０】
なお本実施形態では、合焦モードにおいては画像取得モードにおいて行うような多変量解析などの解析処理を行わずにＺ走査方向に沿った信号強度の１次元分布データを取得するため、データ処理に要する時間も大幅に短縮することができる。
【００７１】
（第２の実施形態）
第２の実施形態として、合焦モードにおいてｍ種類（ｍは２以上の整数）のレーザー光（合波レーザー光）を用いて計測を行う実施形態について説明する。本実施形態に係る非線形光学顕微鏡装置の構成は、第１の実施形態で説明した装置１００と同じ構成である。
【００７２】
第１の実施形態では１種類のレーザー光を用いて計測を行うため、同一Ｚ座標のＸＹ平面内の各点から、検波信号の信号強度がそれぞれ取得される。そのため、同一ＸＹ平面内の各点から取得された信号強度の平均値を取得することで、ＸＹ平面ごとの信号強度に変換することができる。第１の実施形態では、これを異なるＺ座標ごとに行うことで、Ｚ軸方向（Ｚ走査方向）に沿った信号強度プロファイルを取得する。
【００７３】
一方、２種類以上のレーザー光を用いて計測を行う場合は、同一のＺ座標におけるＸＹ平面内の各点から、ｍ次元のスペクトルがそれぞれ取得される。すなわち、１つのＸＹ平面からはｍ個の２次元分布データが取得できる。
【００７４】
このデータを用いて第１の実施形態と同様にＺ走査方向に沿った信号強度プロファイルを取得する方法として、２つの方法を説明する。
【００７５】
第１の方法としては、まず、ｍ次元のスペクトルのそれぞれについて、合波レーザー光の各波長に対応する信号強度の平均値を算出する。すなわち、同一座標からの光の信号強度を平均化することによって、１つの信号値に変換する。その後、第１の実施形態の場合と同様に、同一Ｚ座標のＸＹ平面内の各点の信号強度（平均値）を平均化することによって、そのＺ座標の全体的な平均信号強度とする。
【００７６】
第２の方法としては、多変量解析などの解析方法によって、取得したｍ個の２次元分布データを用いて２次元画像データを生成し、その画像を画像処理することによってＺ走査方向に沿った信号強度プロファイルを取得する方法がある。すなわち、生成した２次元画像データのコントラスト値などを、Ｚ座標ごとの信号強度として記録していく方法である。なお、２次元画像データを生成する方法としては、例えば多変量解析によって予め用意された基底ベクトルを用いて各スペクトルのスコア値を算出することで、スコアプロットを生成する方法がある。
【００７７】
なお、合焦モードにおいて用いるｍ種類のレーザー光は、Ｚ座標ごとに同じ種類であってもよいし、Ｚ座標ごとに異なる種類であってもよい。すなわち、第１のＺ座標において波長Ａおよび波長Ｂおよび波長Ｃの３種類のレーザー光を用いて計測を行ったとする。この場合、第１のＺ座標とは異なる第２のＺ座標においては、波長Ａ〜Ｃを用いて計測を行ってもよいし、波長Ａ〜Ｃとは異なる波長Ｄ〜Ｆを用いて計測を行ってもよい。
【００７８】
以上のように本実施形態に係る装置１００は、合焦モードにおいて画像取得モードよりも少ない種類数のレーザー光を用いて計測を行うため、画像取得モードと同じ種類数のレーザー光を用いてＺ方向にも計測を行う場合に比べて高速に計測を行うことができる。これにより、Ｚ方向の試料の分布情報を迅速に取得することができる。具体的には、本実施形態によれば、Ｚ方向の試料の分布情報を取得するのに要する時間を、少なくともｍ／ｎ倍に短縮することができる。
【００７９】
また、本実施形態にかかる合焦モードにおいては、ｍ次元スペクトルの２次元分布データを解析することによって２次元画像データを生成することもできる。そのため、装置１００の操作者は、Ｚ座標ごとのＸＹ画像を大まかに確認することができる。したがって、本実施形態によれば、深度毎の大まかなＸＹ画像を確認した上で、画像取得モードにおいて画像取得を行う試料５中の任意の深度Ｚｘを決定することもできる。
【００８０】
（第３の実施形態）
第１の実施形態および第２の実施形態では、Ｚ走査手段によって合波レーザー光のスポットの照射位置をＺ方向に走査することによって、図３（ａ）に示すような信号強度プロファイル（１次元分布データ）を取得する。図３（ａ）は、試料５の近傍において合波レーザー光のスポットの照射位置をＺ方向に走査した場合に得られる信号強度プロファイルである。
【００８１】
本実施形態では、合波レーザー光のスポットの照射位置を、試料５の近傍のみならず、保持部材５１の近傍においても走査する。本実施形態に係る非線形光学顕微鏡システムの構成については、第１の実施形態と同様であるので省略する。
【００８２】
以降、第１の実施形態と同様に、制御部４が試料ステージ２を下方から上方に向かって移動させる場合について説明する。この試料ステージ２の移動によって、試料５および保持部材５１と第１の対物レンズ１６との相対的な位置関係が変更される。これにより、合波レーザー光のスポットの照射位置がＺ方向に走査される。なお、試料ステージ４４を固定したまま、照射手段１を上方または下方へと移動させることで、試料５および保持部材５１と第１の対物レンズ１６との相対的な位置関係を変更してもよい。
【００８３】
本実施形態では、Ｚ方向への走査の開始前に、試料ステージ４４を十分に下方へ移動させておく。すなわち、第１の対物レンズ１６と保持部材５１との間の距離を十分に確保しておく。これにより、合波レーザー光のスポットの照射位置の初期位置が、カバーガラス５１ｂの上方に位置するようにする。
【００８４】
試料ステージ４４の上方への移動を開始し、合波レーザー光のスポットの照射位置がカバーガラス５１ｂの界面に到達すると、カバーガラス５１ｂの界面からの検波信号Ｇ１が得られる（図３（ｂ））。この現象は、スライドガラス５１ａの界面においても同様に発生し、検波信号Ｇ２が得られる。誘導ラマン散乱は、波長の異なる２つのレーザー光のそれぞれの波長の差分に対応する波数が試料５中の成分の分子振動数と一致した場合に発生する。しかし、スライドガラス５１ａおよびカバーガラス５１ｂの界面、すなわち保持部材界面（ガラス面）からの検波信号Ｇ１およびＧ２は、合波レーザー光の波長に依存せずに得られる。また、検波信号Ｇ１およびＧ２の信号強度は、試料５から得られる誘導ラマン散乱由来の検波信号Ａ〜Ｂよりも小さい。
【００８５】
従って、保持部材界面からの検波信号は、誘導ラマン散乱とは異なる現象に由来した信号であると考えられる。この検波信号が生じる原因としては、以下の原因が考えられる。
【００８６】
第１に、移動する合波レーザー光のスポットの照射位置がガラス中と液体中との間、またはガラス中と空気中との間を推移する際の非線形屈折率変化による現象が考えられる。すなわち、保持部材界面において誘導ラマン散乱以外の非線形光学効果が発生しているためであると考えられる。第２に、保持部材界面において合波レーザー光の少なくとも一部が反射されることによって、合波レーザー光の強度が変化することが考えられる。あるいは、これらの両方の現象に由来すると考えられる。
【００８７】
試料ステージ４４を下方から上方に向かって移動させた場合について、縦軸に検波信号の信号強度を、横軸に試料ステージ４４の初期位置からの移動量をとると、図３（ｂ）のような信号強度プロファイルが得られる。上述のように、この信号強度プロファイルには、Ｇ１やＧ２のようなやや小さいピークと、Ａ〜Ｂのような、Ｇ１およびＧ２よりも信号強度が大きく、上端がほぼ平坦で、左右に急峻な立ち上がり部分と立ち下がり部分（エッジ）を有する形状のピークとが現れる。取得した信号強度プロファイル（１次元分布データ）をもとに、制御部４は、ピークの強度や検出順序などを判断基準として、保持部材５１のＺ方向における位置情報を取得することができる。
【００８８】
このように、保持部材５１を含む範囲でＺ走査手段によって１次元分布データを取得することで、カバーガラス５１ａやスライドガラス５１ｂの位置情報を取得することができる。
【００８９】
本実施形態に係る非線形光学顕微鏡システムでは、保持部材５１の位置情報を用いることで、例えば試料ステージ４４の可動範囲を制御することができる。すなわち、例えば図３（ｃ）のようにカバーガラス５１ａの界面の検波信号Ｇ１がＺ座標ＺＧ１において検出されたら、試料ステージ４４の可動範囲の上限を（ＺＧ１＋ＷＤ）より小さくなるように設定する。ここで、ＷＤは第１の対物レンズ１６の作動距離、すなわち、第１の対物レンズ１６の下端と合波レーザー光のスポットとの間の距離である。これにより、第１の対物レンズとカバーガラス５１ａとが衝突することを避けることができる。
【００９０】
あるいは、保持部材５１の界面位置からの任意深度を指定することで、カバーガラス５１ａとスライドガラスｂとの間の任意の位置に合焦位置を決定することもできる。
【００９１】
また、図３（ｃ）のように、カバーガラス５１ａの界面のみを検出する構成とすることによって、試料５の損傷を避けることができる。上述のように、非線形光学効果を発生させるためには一般に高いエネルギーのレーザー光を集光照射するため、試料５が損傷してしまう場合がある。そこで図３（ｃ）のように、合焦モードにおいてはカバーガラス５１ａの界面のみを検出して合波レーザー光のスポットを試料５に照射せず、カバーガラス５１ａの界面の位置情報を用いて合焦位置を決定する。そして、合焦モードで決定した合焦位置において画像取得モードによって試料５からの情報取得を行う。これにより、試料５の損傷のリスクを低減することができる。
【００９２】
（第４の実施形態）
第１〜第３の実施形態では、試料５において非線形光学効果が発生する波長にレーザー光の波長を設定して、１次元分布データを取得する。また、第３の実施形態では試料５だけでなく、カバーガラス５１ａやスライドガラス５１ｂの位置情報も取得する。
【００９３】
第４の実施形態では、試料５において非線形光学効果が発生しない波長にレーザー光の波長を設定して、１次元分布データを取得する。このとき、第３の実施形態と同様に、保持部材５１及び試料５を含む範囲でＺ走査手段によって１次元分布データを取得する。なお、本実施形態に係る非線形光学顕微鏡システムの構成については、第１の実施形態と同様であるので省略する。また本実施形態における該装置の動作は、第３の実施形態と同様であるので省略する。
【００９４】
第３の実施形態で説明したように、スライドガラス５１ａおよびカバーガラス５１ｂの界面、すなわち保持部材界面（ガラス面）からの検波信号Ｇ１およびＧ２は、合波レーザー光の波長に依存せずに得られる。そのため、試料５において非線形光学効果が発生しない波長にレーザー光の波長を設定して、保持部材５１及び試料５を含む範囲で１次元分布データを取得すると、図３（ｄ）に示すような信号強度プロファイルが得られる。
【００９５】
このように、試料５において非線形光学効果が発生しない波長にレーザー光の波長を設定することによって、保持部材界面（ガラス面）から発せられる検波信号のみを選択的に抽出することが可能となる。
【００９６】
第３の実施形態では、保持部材５１の界面位置からの任意深度を指定することで、カバーガラス５１ａとスライドガラスｂとの間の任意の位置に合焦位置を決定することができる。ここで、試料５が複数の界面を有する場合には、１次元分布データを取得するとその界面の数だけ類似ピークが取得される可能性がある。そのため、どのピークが試料５の界面に由来するピークであり、どのピークが保持部材５１に由来するピークであるかを識別することが困難な場合がある。
【００９７】
一方、本実施形態によれば、保持部材界面（ガラス面）から発せられる検波信号のみを選択的に抽出することが可能なため、カバーガラス５１ａとスライドガラス５１ｂの位置を容易に特定することができる。その結果、カバーガラス５１ａとスライドガラス５１ｂとの間の任意の位置に合焦位置を決定することができる。試料５の種類によっては試料５由来の信号強度がガラス面由来の信号強度と同程度の場合もあり得るため、このような試料を観察する場合に特に有効である。
【００９８】
本実施形態では、レーザー光の波長を試料５の光吸収係数が小さい波長に設定することによって、レーザー光を照射することによる試料５の損傷を抑制しつつ、カバーガラス５１ａとスライドガラス５１ｂの位置を取得することもできる。
【００９９】
第１の実施形態で説明したように、第１のレーザー光および第２のレーザー光の波長は、非線形光学効果が発生するものであれば特に限定はされず、紫外光、可視光、赤外光等、いずれの波長であってもよい。中でも、レーザー光の波長を例えば近赤外域の波長にすることで、レーザー光を照射することによる試料５の損傷の度合いを相対的に低減させることができる。さらに、近赤外域の波長中でも、水や有機化合物、ヘモグロビン等の生体試料に多く含まれる成分による光吸収が小さい波長のレーザー光を用いることによって、試料の損傷をさらに抑制することができる。例えば、７００ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長光は、水およびヘモグロビンにほとんど吸収されないため、特に好ましい。このような波長を選択すれば、試料への損傷を抑制しながら、保持部材５１の位置を取得することができる。
【０１００】
第３の実施形態で説明したように、カバーガラス５１ａの界面のみを検出する構成とすることでも、試料５の損傷を避けることは可能である。しかし、カバーガラス５１ａとスライドガラス５１ｂとの間の任意の位置に合焦位置を決定したい場合には、スライドガラス５１ｂの位置も取得することが必要である。本実施形態ではカバーガラス５１ａおよびスライドガラス５１ｂを含む一連のプロファイルを一度に測定できるため、測定に要する時間を短縮することができ好ましい。
【０１０１】
（第５の実施形態）
第５の実施形態として、本発明に係る装置１００の合焦モードにおける動作を、ＸＹ方向により広い領域についての計測である広域計測へ応用した場合の動作を、図４を用いて説明する。前述の通り、本発明に係る装置１００は、光スキャナ１５によって合波レーザー光のスポットの照射位置をＸＹ走査することによってＸＹ平面内での計測を行い、画像を取得する。光スキャナ１５によって走査可能な範囲よりも広い領域の画像を取得する場合、試料ステージ制御部２１が試料ステージ２をＸＹ方向に移動させ、各々のＸＹ座標において画像を取得する。広域計測においては、このようにして得られた複数の画像を貼り合わせる（タイリング）処理を施すことによって、大きな領域の画像を取得する。
【０１０２】
まず装置１００の操作者は、Ｘ方向、Ｙ方向それぞれについて、計測を行う領域の数を入力する（Ｓ４０１）。例えばＸ方向に２０枚、Ｙ方向に１０枚というように、タイリングの枚数を方向ごとに指定して入力する。入力する領域の数は特に限定はされず、任意の自然数を入力することができる。あるいは、Ｘ方向に１ｍｍ、Ｙ方向に１ｍｍというように、計測を行いたい領域のサイズを直接入力し、入力されたサイズをもとに制御部４が計算を行い、領域の数に換算してもよい。
【０１０３】
次に、試料ステージ制御部２１が試料ステージ２を所定のＸＹ座標へ移動させる（Ｓ４０２）。なお、複数の計測領域のうち最初の計測領域へ移動する場合は、試料ステージ制御部２１は、装置１００の操作者が初期ＸＹ座標として予め入力した座標へと試料ステージ２を移動させる。そして、２つ目以降の計測領域へ移動する場合は、初期ＸＹ座標と計測領域の数に基づいて移動する座標を制御部４が決定し、試料ステージ制御部２１はその座標へと試料ステージ２を移動させる。そのため、操作者によるＸＹ座標の入力は最初の１回のみでよい。
【０１０４】
試料ステージ２の所定のＸＹ座標への移動が完了すると、本実施形態に係る装置１００は、試料５中の任意のＺ座標への合焦動作を行う（Ｓ４０３）。このとき装置１００は、第１の実施形態および第２の実施形態で説明した合焦モードにおける動作を行う。Ｓ４０２およびＳ４０３の動作によって、試料ステージ２を特定のＸＹＺ座標に移動させることができる。これにより、合波レーザー光のスポットの照射位置を規定することができる。
【０１０５】
次に、装置１００は画像取得モードにより画像取得を行う（Ｓ４０４）。計測領域における画像の取得が完了したら、制御部４はＳ４０１で操作者が入力した計測を行う領域の数だけ画像を取得したかどうかを判定する（Ｓ４０５）。所定数の領域から画像を取得していない場合は（Ｓ４０５においてＮｏ）、Ｓ４０２へと戻り、次の計測領域へと試料ステージ２を移動し、前述した合焦動作（Ｓ４０３）と画像取得（Ｓ４０４）を継続する。すなわち、それぞれの計測領域へと試料ステージ２を移動させるごとに逐次合焦動作を行い、特定のＺ座標の画像を取得する。一方、所定数の計測領域からの画像の取得が完了した場合は（Ｓ４０５においてＹｅｓ）、画像の取得動作を終了し、Ｓ４０６へと移行する。
【０１０６】
次に、制御部４は取得した所定の数の画像を貼り合わせる、タイリング処理を行う（Ｓ４０６）。これにより、１回の計測で取得できるサイズの画像よりも広域の画像を得ることができる。
【０１０７】
このように計測領域に試料ステージ２を移動させるごとに、逐次合焦動作を行ってから画像の取得を行うことで、測定領域ごとに試料の上面または下面からの高さのずれがない滑らかな広域画像を取得することが可能となる。これは、試料５が厚みのある試料である場合やうねりを有する試料である場合に特に有効である。
【０１０８】
なお、本実施形態では計測領域を移動させるごとに逐次合焦動作を行い、広域計測を行う場合について説明したが、合焦動作は毎回行わなくてもよい。例えば、タイリング後の広域画像の四隅に相当する計測領域においてのみ合焦動作を行い、それ以外の計測領域については合焦動作を行わずに（Ｓ４０３をスキップ）、画像の取得を行ってもよい。この場合、まずタイリング後の広域画像の四隅に相当する計測領域において合焦動作を行い、制御部４が各計測領域における合焦位置のＺ座標を取得する。その後、制御部４は取得した４つのＺ座標の平均値を算出する。このようにして取得した平均Ｚ座標において、全ての計測領域における画像取得を行ってもよい。これにより、計測領域ごとに合焦動作を毎回行うよりも高速に、広域計測を行うことができる。
【０１０９】
（その他の実施形態）
以上、本発明の好ましい実施形態について説明したが、本発明はこれらの実施形態に限定されず、その要旨の範囲内で種々の変形および変更が可能である。
【０１１０】
上述した実施形態では非線形光学顕微鏡装置として、誘導ラマン散乱を利用した誘導ラマン散乱顕微鏡について説明したが、これに限定はされない。すなわち、本発明に係る非線形光学顕微鏡装置は、レーザー光の波長を掃引する等して複数種類の波長のレーザー光を使用し、レーザー光のスポットにおける非線形光学効果を検出して試料の情報を取得する非線形光学顕微鏡装置であればよい。したがって本発明に係る非線形光学顕微鏡装置が利用する非線形光学効果は、誘導ラマン散乱（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＳＲＳ）のみに限定されるものではなく、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＣＡＲＳ）、コヒーレントストークスラマン散乱（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｓｔｏｋｅｓ  Ｒａｍａｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ：ＣＳＲＳ）、多光子吸収、和周波発生などであってもよい。
【符号の説明】
【０１１１】
１  照射手段
２  試料ステージ
３  光検出手段
４  制御部
【図１】
2016091004.tif 000003
【図２】
2016091004.tif 000004
【図３】
2016091004.tif 000005
【図４】
2016091004.tif 000006