(57)【要約】【課題】  本発明は、増幅効率が低減されることを抑制しつつＰＣＲ産物の生成時間を短縮し得る核酸増幅方法および増幅核酸装置を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、標的核酸および標的核酸の増幅に要する試料を含む液滴を収容する容器の第１領域を標的核酸の変性温度に加熱し、当該第１領域とは独立した第２領域を標的核酸の合成温度に加熱するステップと、容器に収容される液滴を第１領域に移動させて留める変性段階、および、当該液滴を第２領域に移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増幅ステップとを備える。この増幅ステップでは、複数回のサイクルのうち一部のサイクルの期間が他のサイクルの期間よりも短くされる。【選択図】    図１１
2016129504.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に要する試料を含む液滴を収容す
る容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に加熱するとともに、前記第１領域とは独立
した第２領域を前記標的核酸の合成温度に加熱する加熱ステップと、
前記容器に収容される前記液滴を前記第１領域に移動させて留める変性段階、および、
当該液滴を前記第２領域に移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す増
幅ステップと、
を備え、
前記増幅ステップでは、複数回の前記サイクルのうち一部のサイクルの期間が他のサイ
クルの期間よりも短くされる
ことを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項２】
前記増幅ステップでは、初回から起算して規定回数目となる回の１つ後の回以降の各サ
イクルの期間が、当該初回から起算して規定回数目となる回までの各サイクルの期間より
も短くされる
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記増幅ステップでは、初回から起算して規定回数目となる回までの各サイクルの期間
が、当該回の１つ後の回以降の各サイクルの期間よりも短くされる
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項４】
前記一部のサイクルにおける前記変性段階の変性反応期間は、前記他のサイクルにおけ
る前記変性段階の変性反応期間よりも短くされ、
前記一部のサイクルにおける前記合成段階の合成反応期間は、前記他のサイクルにおけ
る前記合成段階の合成反応期間よりも短くされない
ことを特徴とする請求項１〜請求項３いずれか１項に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記一部のサイクルにおける前記変性段階の変性反応期間を、前記他のサイクルにおけ
る前記変性段階の変性反応期間よりも短くした分の期間の一部の期間は、前記一部のサイ
クルにおける前記合成段階の合成反応期間に割り当てられる
ことを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅方法。
【請求項６】
鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に要する試料を含む液滴を収容す
る容器が装着される装着部と、
前記装着部に装着される前記容器における第１領域を前記標的核酸の変性温度に加熱す
るとともに、前記第１領域とは独立した第２領域を前記標的核酸の合成温度に加熱するヒ
ーターと、
前記第１領域から前記第２領域または前記第２領域から前記第１領域に前記液滴を移動
させる移動機構と、
前記第１領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を留める
合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、
を備え、
前記制御部は、複数回の前記サイクルのうち一部のサイクルの期間を他のサイクルの期
間よりも短くする、
ことを特徴とする核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸増幅方法および核酸増幅装置に関し、増幅効率が低減されることを抑制し
つつＰＣＲ産物の生成時間を短縮する場合に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ(polymerase chain reaction)法は、ＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)などの核酸
における鎖長の違いなどを要因としてその核酸の変性やアニーリングの違いが生じること
を利用し、当該核酸に対して温度変化を繰り返し与えることで核酸を増幅する手法である
。
【０００３】
このようなＰＣＲ法を用いた核酸増幅装置として、下記特許文献１のＰＣＲ装置が本出
願人により提案されている（例えば下記特許文献１参照）。下記特許文献１のＰＣＲ装置
に装着されるバイオチップには、標的核酸などが含まれる反応液が移動する流路が形成さ
れ、その流路には反応液が収容されるとともに、当該反応液よりも比重が小さく反応液と
は混和しない液体が充填されている。
【０００４】
ＰＣＲ装置には、バイオチップが装着される装着部にそのバイオチップを装着した場合
において、当該バイオチップに形成される流路の第１領域を加熱する加熱部と、当該第１
領域と異なる温度で第２領域を加熱する加熱部が備えられる。また、ＰＣＲ装置には、装
着部および加熱部の配置を、第１の配置と第２の配置との間で切換える駆動機構が備えら
れる。この駆動機構によって、装着部に装着されるバイオチップの反応液は、互いに異な
る温度に加熱される第１の領域と第２の領域との相互に移動される。このような下記特許
文献１のＰＣＲ装置によれば、バイオチップ全体の温度を互いに異なる温度に切り替える
場合に比べると、増幅反応期間を短縮できるというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上述のＰＣＲ装置におけるＰＣＲ産物の生成時間をより一段と早めるべき要
請がある。しかしながら、増幅反応期間（サイクルタイム）を短くし過ぎると増幅効率が
著しく低減することが懸念される。
【０００７】
そこで本発明は、増幅効率が低減されることを抑制しつつＰＣＲ産物の生成時間を短縮
し得る核酸増幅方法および増幅核酸装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するため本発明の核酸増幅方法は、標的核酸および前記標的核酸の増幅
に要する試料を含む液滴を収容する容器の第１領域を前記標的核酸の変性温度に加熱する
とともに、前記第１領域とは独立した第２領域を前記標的核酸の合成温度に加熱する加熱
ステップと、前記容器に収容される前記液滴を前記第１領域に移動させて留める変性段階
、および、当該液滴を前記第２領域に移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回
繰り返す増幅ステップと、を備え、前記増幅ステップでは、複数回の前記サイクルのうち
一部のサイクルの期間が他のサイクルの期間よりも短くされることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の核酸増幅装置は、標的核酸および前記標的核酸の増幅に要する試料を含
む液滴を収容する容器が装着される装着部と、前記装着部に装着される前記容器における
第１領域を前記標的核酸の変性温度に加熱するとともに、前記第１領域とは独立した第２
領域を前記標的核酸の合成温度に加熱するヒーターと、前記装着部に装着される前記容器
と前記ヒーターとの相対位置を変えずに、前記第１領域から前記第２領域または前記第２
領域から前記第１領域に前記液滴を移動させる移動機構と、前記第１領域に前記液滴を留
める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数
回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、を備え、前記制御部は、複数回の
前記サイクルのうち一部のサイクルの期間を他のサイクルの期間よりも短くすることを特
徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】カートリッジの断面を示す図である。
【図２】カートリッジ本体に装着される前のタンクの様子を示す図である。
【図３】タンクに検体が導入される様子を示す図である。
【図４】外部から押し込まれる前後のカートリッジの様子を示す図である。
【図５】カートリッジにおけるＰＣＲ容器に着目した図である。
【図６】核酸増幅装置のブロック図である。
【図７】回転機構の様子を示す図である。
【図８】カートリッジが装着部に装着された様子を示す図である。
【図９】熱サイクル処理の様子を示す図である。
【図１０】液滴の温度推移を模式的に示した図である。
【図１１】制御部の熱サイクル処理手順を示すフローチャートである。
【図１２】第２実施形態における液滴の温度推移を模式的に示した図である。
【図１３】実施形態以外の液滴の温度推移（１）を模式的に示した図である。
【図１４】実施形態以外の液滴の温度推移（２）を模式的に示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態が添付図面を用いて例示する。以下に例示する実施
形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するための
ものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良することができる。
【００１２】
（１）第１実施形態
第１実施形態として、まず核酸増幅装置に装着されるカートリッジを説明した後に、当
該核酸増幅装置およびその方法を説明する。
【００１３】
＝＝＝カートリッジ＝＝＝
図１は、カートリッジ１の断面を示す図である。図１に示すように、カートリッジ１は
、タンク３、アダプター５およびカートリッジ本体９を有し、当該タンク３とカートリッ
ジ本体９とはアダプター５によって着脱自在に構成される。
【００１４】
＜タンク＞
図２は、カートリッジ本体９に装着される前のタンク３の様子を示す図である。図２に
示すように、タンク３は、検体が導入される容器である。このタンク３の所定部位には開
口が形成され、当該開口には封止部材３Ａが設けられている。
【００１５】
タンク３内には、ヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルスの核酸を抽出する
ための溶解吸着液４１と、当該核酸に対して結合性を有する固相担体である磁気ビーズ７
とが収容される。
【００１６】
溶解吸着液４１は、緩衝液であってもよいが、ｐＨ６〜８の中性であることが好ましい
。この溶解吸着液４１にはカオトロピック剤が含有される。カオトロピック剤は、水溶液
中でカオトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオン）を生じ、疎水性分子の
水溶性を増加させる作用を有しており、核酸の磁気ビーズ７への吸着に寄与するものであ
れば、特に限定されない。具体例として、グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩
、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００１７】
また、溶解吸着液４１には、細胞膜の破壊あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性
させる目的で界面活性剤が含有されていてもよい。この界面活性剤としては、一般に細胞
などからの核酸抽出に使用されるものであれば特に限定されない。具体例として、Ｔｒｉ
ｔｏｎ−Ｘなどのトリトン系界面活性剤、Ｔｗｅｅｎ２０などの非イオン性界面活性剤、
Ｎ‐ラウロイルサルコシンナトリウム（ＳＤＳ）などの陰イオン性界面活性剤が挙げられ
る。さらに、溶解吸着液４１には、２−メルカプトエタノールあるいはジチオスレイトー
ルなどの還元剤が含有されていてもよい。
【００１８】
なお、溶解吸着液４１の組成の一例として、５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、２％Ｔｒ
ｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）が挙げられる。
【００１９】
図３は、タンク３に検体が導入される様子を示す図である。図３に示すように、タンク
３に検体を導入する場合、タンク３から封止部材３Ａが取り除かれてタンク３の開口が開
かれ、綿棒などの採取具によって採取された検体がタンク３の開口からタンク３内に導入
される。
【００２０】
この検体に例えばウイルスが含まれている場合、そのウイルスのエンベローブやカプシ
ドが溶解吸着液４１により溶解され、ウイルス核酸が遊離して磁気ビーズ７の表面に吸着
することになる。
【００２１】
タンク３の開口にはアダプター５が嵌合され、そのアダプター５を介してタンク３の開
口がカートリッジ本体９と連通される（図１参照）。
【００２２】
＜カートリッジ本体＞
図４は、外部から押し込まれる前後のカートリッジ１の様子を示す図である。具体的に
図４の（Ａ）は外部から押し込まれる前のカートリッジ１の様子を示し、図４の（Ｂ）は
外部から押し込まれた後のカートリッジ１の様子を示している。
【００２３】
図４の（Ａ）および（Ｂ）に示すように、カートリッジ本体９は、プランジャー１０と
、チューブ２０と、ＰＣＲ容器３０とを有する。
【００２４】
≪プランジャー≫
プランジャー１０は、シリンジとして機能するチューブ２０内の所定量の液体をチュー
ブ２０側の末端からＰＣＲ容器３０へ押し出す押子であり、筒状部１１および棒状部１２
を有する。この筒状部１１および棒状部１２は、一体として形成されてもよいし、別体と
して形成されてもよい。
【００２５】
筒状部１１は、アダプター５を介してタンク３の開口と連通される部位である。この筒
状部１１のタンク３側の開口周囲には、当該開口の外側に向かって筒状部１１から外側に
突出するフランジ状の取付台１１Ａが形成されている。取付台１１Ａに装着されるアダプ
ター５が筒状部１１の開口に嵌合されることで、当該筒状部１１の開口とタンク３の開口
とが連通される。なお、取付台１１Ａは、核酸増幅装置によって押される押圧部位になっ
ている。
【００２６】
筒状部１１のチューブ２０側の端部は、チューブ２０の上シリンジ２１の内壁に嵌合し
ており、当該上シリンジ２１の内壁に接しながら上シリンジ２１に沿ってスライド自在と
なっている。なお、プランジャー１０の取付台１１Ａとチューブ２０の上縁との間隔が、
プランジャー１０のスライド長になる。
【００２７】
棒状部１２は、筒状部１１のチューブ２０側端部の内壁から突出するリブ１３によって
支持されている。この棒状部１２のチューブ２０側の端部は、プランジャー１０が押され
ていない初期状態では、上シリンジ２１の内部に位置し、下シリンジ２２から離れている
（図４の（Ａ）参照）。一方、棒状部１２のチューブ２０側の端部は、プランジャー１０
が押された場合、チューブ２０の下シリンジ２２に挿入され、当該下シリンジ２２に内壁
に接した状態で下シリンジ２２に沿ってスライドする（図４の（Ｂ）参照）。
【００２８】
棒状部１２のチューブ２０側の先端にはシール１２Ａが形成されており、当該シール１
２Ａによってチューブ２０内の液体がプランジャー１０へ逆流することが防止される。な
お、シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドした体積相当分だけ、チューブ２０内の
液体が下流側に押し出される。
【００２９】
このようなプランジャー１０の内部には、他の溶液とは相分離するオイル４２と、当該
オイル４２よりも比重が大きい第１洗浄液４３とが収容されている。プランジャー１０内
のオイル４２は第１洗浄液４３よりも比重が小さい。このため、プランジャー１０の取付
台１１Ａを上にしてカートリッジ本体９が立てられた場合には、図４の（Ａ）に示すよう
に、タンク３内の溶解吸着液４１とカートリッジ本体９の第１洗浄液４３との間にオイル
４２が配置される。
【００３０】
なお、オイル４２としては例えば２ＣＳシリコーンオイルが挙げられ、第１洗浄液４３
としては例えば８Ｍグアニジン塩酸塩、０．７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が挙げられる
。また、上述のカオトロピック剤が第１洗浄液４３に含有された場合、磁気ビーズ７に吸
着した核酸の吸着状態を維持または強化させつつ洗浄することが可能となる。
【００３１】
≪チューブ≫
チューブ２０は、上シリンジ２１、下シリンジ２２およびキャピラリー２３を有してお
り、各部の内径がプランジャー１０からＰＣＲ容器３０に向かって段階的に小さくなって
いる。
【００３２】
上シリンジ２１は、プランジャー１０の筒状部１１に対するシリンジとして機能する筒
状部位であり、当該上シリンジ２１の内壁には、上述したようにプランジャー１０の筒状
部１１がスライド自在に接している。
【００３３】
下シリンジ２２は、プランジャー１０の棒状部１２に対するシリンジとして機能する筒
状部位であり、当該下シリンジ２２の内壁には、上述したようにプランジャー１０の棒状
部１２のシール１２Ａがスライド自在に嵌合される。
【００３４】
キャピラリー２３は、複数種類の液体を有する細管部位である。このキャピラリー２３
のＰＣＲ３０側の端部はＰＣＲ容器３０に挿入され、当該挿入部分の先端はテーパー状に
細くなっている。すなわち、キャピラリー２３の末端の内径（キャピラリー２３の開口径
）は、当該末端以外のキャピラリー２３の内径よりも小さくなっている。
【００３５】
このキャピラリー２３内には、第１オイルプラグ４４、洗浄液プラグ４５、第２オイル
プラグ４６、反応液プラグ４７、第３オイルプラグ４８がプランジャー１０側から順次配
置されている。
【００３６】
「プラグ」とは、キャピラリー２３内において特定の一区画を占める液体を意味し、図
４の例では柱状に保持されている。プラグの中やプラグの間には気泡がないことが好まし
い。
【００３７】
第１オイルプラグ４４、第２オイルプラグ４６および第３オイルプラグ４８は、その両
側の溶液プラグが互いに混合することを防止する機能を有する。これらオイルプラグとし
ては例えば２ＣＳシリコーンオイルが挙げられ、洗浄液プラグ４５としては例えば８Ｍグ
アニジン塩酸塩、０．７％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が挙げられる。なお、ＰＣＲ容器３
０にカオトロピック剤が移行することを抑止するため、洗浄液プラグ４５にはカオトロピ
ック剤が含有されていないことが望ましい。
【００３８】
反応液プラグ４７には、標的核酸の増幅反応に要する試料が含有される。この試料とし
ては、溶出液、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ(deoxyribonucleotide triph
osphate)、バッファーなどが挙げられる。
【００３９】
溶出液は、磁気ビーズ７に吸着される核酸をその磁気ビーズ７から遊離させて液中に溶
出させる液体である。磁気ビーズ７から遊離されて液中に溶出される核酸は鋳型核酸であ
り、その鋳型核酸において増幅させるべき核酸断片が標的核酸である。この標的核酸は、
ＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)断片、ｃＤＮＡ(complementary  DNA)断片又はＰＮＡ(pe
ptide nucleic acid)などである。なお、タンク３に収容される磁気ビーズ７を反応液プ
ラグ４７にまで移動させる手法については後述する。
【００４０】
ところで、磁気ビーズ７から遊離される核酸がＲＮＡ(ribonucleic acid)の場合、その
ＲＮＡのｃＤＮＡを得るため、逆転写酵素や逆転写酵素用プライマーなども、標的核酸の
増幅反応に要する試料として含有される。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いて標的核酸
の増幅を定量する場合、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、
サイクリングプローブなどの蛍光色素が結合するプローブやＳＹＢＲグリーンなどのイン
ターカレーター用蛍光色素も、標的核酸の増幅反応に要する試料として含有される。
【００４１】
このようなチューブ２０の外壁面には、核酸増幅装置の所定部位にカートリッジ１を装
着するための固定爪２５およびガイド板２６が形成される。
【００４２】
≪ＰＣＲ容器≫
図５は、カートリッジにおけるＰＣＲ容器に着目した図である。具体的に図５の（Ａ）
は外部からプランジャー１０が押される前のＰＣＲ容器の様子を示し、図５の（Ｂ）は外
部からプランジャー１０が押された後のＰＣＲ容器の様子を示している。
【００４３】
ＰＣＲ容器３０は、チューブ２０から押し出される液滴４７Ａを収容する容器であり、
シール形成部３１および流路形成部３５を有する。液滴４７Ａは、キャピラリー２３内の
反応液プラグ４７がチューブ２０から押し出されるときに得られる。このため、液滴４７
Ａの組成は、反応液プラグ４７の組成と同じである。すなわち、液滴４７Ａには、磁気ビ
ーズ７から遊離した鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅反応に要する試料
とが含有されている。
【００４４】
シール形成部３１は、チューブ２０が挿入されている部位であり、オイル受容部３２お
よび段差部３３を有する。オイル受容部３２は、筒状の部位であり、当該オイル受容部３
２の下流側に位置する流路形成部３５に充填されるオイル３７を受容するリザーバーとし
て機能する。オイル受容部３２の内壁と、チューブ２０のキャピラリー２３の外壁との間
には隙間があり、この隙間が、流路形成部３５から溢れるオイル３７を受容するオイル受
容空間３２Ａとなる。オイル受容空間３２Ａの体積は、プランジャー１０のシール１２Ａ
がチューブ２０の下シリンジ２２でスライドする体積よりも大きい。
【００４５】
オイル受容部３２の上流側の内壁はチューブ２０の環状の凸部と接触することによって
、上シール部３４Ａが形成される。上シール部３４Ａは、空気の通過は許容しつつ、オイ
ル受容空間３２Ａのオイル３７が外部に漏洩することを抑制するシールである。上シール
部３４Ａは、オイルの表面張力によってオイルが漏洩しない程度に、通気口が形成されて
いる。上シール部３４Ａの通気口は、チューブ２０の凸部とオイル受容部３２の内壁との
間の隙間でもよいし、チューブ２０の凸部に形成した穴、溝または切欠でもよい。また、
オイルを吸収するオイル吸収材によって上シール部３４Ａを形成してもよい。
【００４６】
段差部３３は、オイル受容部３２の下流側に設けられた段差のある部位である。段差部
３３の下流部の内径は、オイル受容部３２の内径よりも小さい。段差部３３の内壁は、チ
ューブ２０のキャピラリー２３の下流側の外壁と接触している。段差部３３の内壁とチュ
ーブ２０の外壁が接触することによって、下シール部３４Ｂが形成される。下シール部３
４Ｂは、流路形成部３５のオイルがオイル受容空間３２Ａへ流れることを許容しつつ、そ
の流れに抵抗するシールである。下シール部３４Ｂでの圧力損失によって、流路形成部３
５の圧力が外気圧よりも高くなるので、流路形成部３５のオイル３７が加熱されても、そ
のオイル３７に気泡が発生しにくい。
【００４７】
流路形成部３５は、管状の部位であり、液滴４７Ａが移動する流路となる部位である。
この流路形成部３５にはオイル３７が充填されている。流路形成部３５の上流側はチュー
ブ２０の末端によって閉じられており、流路形成部３５に向かってチューブ２０の末端が
開口している。流路形成部３５の内径は、チューブ２０のキャピラリー２３の内径よりも
大きく、液滴４７Ａの外径よりも大きい。流路形成部３５の内壁は、液滴４７Ａが付着し
ない程度の撥水性を有することが望ましい。
【００４８】
上述したように、プランジャー１０が押されていない初期状態では、当該プランジャー
１０の棒状部１２がチューブ２０の上シリンジ２１の内部に位置している（図４の（Ａ）
参照）。このため、チューブ２０内の液体がＰＣＲ容器３０に押し出されることはない。
なお、この初期状態では、オイル３７の界面は、オイル受容空間３２Ａの比較的下流側に
位置している（図５の（Ａ）参照）。
【００４９】
一方、プランジャー１０が押されると、当該プランジャー１０の棒状部１２がチューブ
２０の下シリンジ２２内にスライドするため（図４の（Ｂ）参照）、チューブ２０内の液
体がＰＣＲ容器３０に押し出される。
【００５０】
具体的には、まず、チューブ２０の第３オイルプラグ４８が流路形成部３５に流入し、
流入分のオイルが流路形成部３５からオイル受容空間３２Ａに流れ込み、オイル受容空間
３２Ａのオイル界面が上昇する。このとき、下シール部３４Ｂの圧力損失によって、流路
形成部３５の液体の圧力が高くなる。第３オイルプラグ４８がチューブ２０から押し出さ
れた後、反応液プラグ４７がチューブ２０から流路形成部３５に流入する。流路形成部３
５の内径がキャピラリー２３の内径よりも大きいため、チューブ２０内で柱状の反応液プ
ラグ４７は、流路形成部３５のオイル中で液滴４７Ａとなる（図５の（Ｂ）参照）。この
液滴４７Ａは、オイル３７よりも比重が大きいため、流路形成部３５を沈降する。
【００５１】
＝＝＝核酸増幅装置＝＝＝
図６は、核酸増幅装置のブロック図である。図６に示すように、核酸増幅装置５０は、
回転機構６０、磁石移動機構７０、押圧機構８０、蛍光測定器５５および制御部９０を有
する。
【００５２】
＜回転機構＞
図７は、回転機構の様子を示す図である。図７の（Ａ）は回転機構６０の斜視図であり
、図７の（Ｂ）は回転機構６０の側面図である。以下の核酸増幅装置５０の説明では、図
に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、核酸増幅装置５０のベース５１
を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」
とを定義する。また、カートリッジ１の回転軸の軸方向を「左右方向」とし、上下方向及
び左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。カートリッジ１の回転軸からみてカート
リッジ挿入口５３の側を「後」とし、逆側を「前」とする。前側からみたときの左右方向
の右側を「右」、左側を「左」とする。
【００５３】
図７に示すように、回転機構６０は、回転体６１および回転用モーター６６を有する。
回転体６１には、カートリッジ１が装着される装着部６２と、ヒーター６５とが設けられ
ている。回転体６１は、カートリッジ１とヒーター６５との相対位置を変えずに、ベース
５１に固定された支持台５２に支持される回転軸を中心として回転する。
【００５４】
回転用モーター６６は、回転体６１を回転させる動力源であり、制御部９０からの指示
にしたがって、カートリッジ１が上下反転するように回転体６１を回転させる。
【００５５】
図８は、カートリッジが装着部に装着された様子を示す図である。図８に示すように、
装着部６２は、カートリッジ１のチューブ２０を固定する固定部６３と、ＰＣＲ容器３０
を固定する挿入穴６４Ａとを有する。
【００５６】
挿入穴６４Ａは、ヒーター６５に形成されている。本実施形態のヒーター６５は、磁気
ビーズ７から遊離する核酸の遊離反応が進行する温度に加熱するための溶出用ヒーター６
５Ａと、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱するための高温側ヒーター６５Ｂと、
標的核酸の合成反応（アニーリング反応および伸長反応）が進行する温度に加熱するため
の低温側ヒーター６５Ｃとを有する。挿入穴６４Ａは、これら溶出用ヒーター６５Ａ、高
温側ヒーター６５Ｂおよび低温側ヒーター６５Ｃを貫通している。
【００５７】
固定部６３は、挿入穴６４Ａの開口脇に互いに対向して設けられる部材である。この固
定部６３には、カートリッジ１のガイド板２６を前後方向に拘束しながら挿入穴６４Ａに
カートリッジ１を案内するガイドレール６３Ａが設けられている。
【００５８】
このような装着部６２では、ガイドレール６３Ａによって案内されるカートリッジ１の
ＰＣＲ容器３０が挿入穴６４Ａに挿入されると、当該カートリッジ１の固定爪２５が固定
部６３のノッチ部位に引っ掛かることによって、カートリッジ１が装着される。ここでは
、ヒーターの一部が装着部６２を兼ねていることになるが、装着部６２とヒーターが別々
であってもよい。また、装着部６２は、溶出用ヒーター６５Ａを介して回転体６１に間接
的に固定されているが、回転体６１に直接設けられてもよい。また、装着部６２が装着可
能なカートリッジ１の数は、１つに限られず、複数でもよい。
【００５９】
カートリッジ１が装着部６２に装着された場合、そのカートリッジ１の反応液プラグ４
７が溶出用ヒーター６５Ａに囲まれる。溶出用ヒーター６５Ａは、反応液プラグ４７を例
えば５０℃に加熱する。これによりタンク３から反応液プラグ４７に移動された磁気ビー
ズ７から核酸が遊離することが促進される。
【００６０】
また、カートリッジ１が装着部６２に装着された場合、そのカートリッジ１のＰＣＲ容
器３０における流路形成部３５の一端側となる第１領域３６Ａが高温側ヒーター６５Ｂに
囲まれる。高温側ヒーター６５Ｂは、第１領域３６Ａを例えば９５〜１００℃に加熱する
。
【００６１】
さらに、カートリッジ１が装着部６２に装着された場合、そのカートリッジ１のＰＣＲ
容器３０における流路形成部３５の他端側となる第２領域３６Ｂが低温側ヒーター６５Ｃ
に囲まれる。低温側ヒーター６５Ｃは、第２領域３６Ｂを例えば５０〜７５℃に加熱する
。
【００６２】
このように標的核酸の変性反応が進行する温度にＰＣＲ容器３０の第１領域３６Ａが加
熱され、当該標的核酸の合成反応が進行する温度にＰＣＲ容器３０の第２領域３６Ｂが加
熱されることにより、流路形成部３５に充填されるオイル３７には温度勾配が形成される
。
【００６３】
なお、高温側ヒーター６５Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間には、高温側ヒーター６５
Ｂと低温側ヒーター６５Ｃとの間の熱伝導を抑制するスペーサー６５Ｄが配置されている
。このスペーサー６５Ｄには、高温側ヒーター６５Ｂおよび低温側ヒーター６５Ｃの挿入
穴６４Ａの長手方向に沿った位置に貫通孔が形成され、挿入穴６４Ａに対してカートリッ
ジ１のＰＣＲ容器３０の挿入を妨げることが防止される。
【００６４】
＜磁石移動機構＞
磁石移動機構７０は、図７の（Ｂ）に示すように、一対の磁石７１と、それら一対の磁
石７１を保持するアーム７２と、そのアーム７２を昇降させる昇降部７３とを有し、制御
部９０からの指示にしたがって駆動する。
【００６５】
すなわち、磁石移動機構７０は、装着部６２に装着されたカートリッジ１のタンク３内
の磁気ビーズ７を磁石７１に引き寄せ、当該磁気ビーズ７をカートリッジ本体９に沿って
反応液プラグ４７にまで移動させる。
【００６６】
この磁気ビーズ７に吸着する核酸が反応液プラグ４７において磁気ビーズ７から遊離さ
れた場合、磁石移動機構７０は、反応液プラグ４７内の磁気ビーズ７をカートリッジ本体
９に沿ってタンク３にまで戻す。
【００６７】
＜押圧機構＞
押圧機構８０は、図７の（Ｂ）に示すように、ロッド駆動部８１と、カートリッジ１に
おけるプランジャー１０の取付台１１Ａを押すロッド８２とを有する。このロッド８２が
取付台１１Ａを押す方向は、上下方向ではなく、上下方向に対して４５度傾いている。こ
のため、押圧機構８０によってプランジャー１０を押す場合、回転体６１が４５度回転さ
れ、カートリッジ１の長手方向がロッド８２の移動方向に合わせられる。
【００６８】
この状態においてロッド駆動部８１は、制御部９０からの指示にしたがって、カートリ
ッジ１の長手方向に沿ってロッド８２を取付台１１Ａに押す。これによりカートリッジ１
の反応液プラグ４７がＰＣＲ容器３０に液滴４７Ａとして収容される。
【００６９】
なお、ロッド８２によってプランジャー１０が押される方向が上下方向に対して４５度
傾いているため、昇降部７３と干渉しないように押圧機構８０を配置することが容易にな
る。また、ロッド８２によってプランジャー１０が押される方向が上下方向に対して４５
度傾いているため、核酸増幅装置５０の上下方向の寸法を小さくすることができる。
【００７０】
＜蛍光測定器＞
蛍光測定器５５は、ＰＣＲ容器３０に収容される液滴４７Ａの蛍光強度を測定する測定
器であり、図７の（Ｂ）に示すように、装着部６２に装着されるカートリッジ１の末端に
対して所定距離を隔てて対向する状態で配置される。
【００７１】
蛍光測定器５５は、制御部９０からの測定指示に応じて液滴４７Ａに含有される蛍光色
素に対応する励起光を照射し、当該液滴４７Ａで発光する蛍光強度を測定する。また蛍光
測定器５５は、測定結果として得られる蛍光強度を示すデータを制御部９０に与える。な
お、蛍光測定器５５は、１つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであっても、
複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであってもよい。
【００７２】
＜制御部＞
制御部９０は、図６に示すように、記憶部９１を有し、当該制御部９０には入力部９２
および表示部９３などが接続される。記憶部９１には、プログラムを格納する領域と、入
力部９２から入力される設定データおよび核酸増幅処理によって得られるデータなどの各
種のデータを格納する領域と、当該プログラムやデータを展開する領域とが含まれる。
【００７３】
制御部９０は、記憶部９１に格納されるプログラムおよび設定データに基づいて回転機
構６０、磁石移動機構７０、押圧機構８０および蛍光測定器５５を適宜制御し、核酸溶出
処理、液滴形成処理、熱サイクル処理または増幅解析処理を適宜実行する。
【００７４】
≪核酸溶出処理≫
核酸溶出処理は、例えば、装着部６２の所定部位に設けられる図示しないセンサに基づ
いてカートリッジ１が装着されたことを制御部９０が検知した後に実行される。
【００７５】
すなわち、制御部９０は、昇降部７３を制御し、装着部６２に装着されたカートリッジ
１のタンク３から所定距離隔てた退避位置に配置される一対の磁石７１を、当該タンク３
の外側面の周囲に配置させる。これによりタンク３内の磁気ビーズ７は磁石７１に引き寄
せられる。
【００７６】
次いで制御部９０は、磁石７１の移動に磁気ビーズ７が追従できる程度の速度で所定期
間だけ昇降部７３を下降させ、反応液プラグ４７が配置されるチューブ２０の外側面の周
囲に一対の磁石７１を配置させる。これにより磁気ビーズ７は反応液プラグ４７内に導入
される。
【００７７】
また制御部９０は、反応液プラグ４７内に磁気ビーズ７が導入される前の時点から所定
期間だけ溶出用ヒーター６５Ａを駆動し、当該反応液プラグ４７を例えば５０℃に加熱す
る。これにより磁気ビーズ７に吸着される核酸はその磁気ビーズ７から遊離する。この核
酸がＲＮＡの場合、磁気ビーズ７から遊離した後に逆転写反応が進行し、ｃＤＮＡが得ら
れる。
【００７８】
制御部９０は、磁気ビーズ７を反応液プラグ４７に停滞させるべきとして設定される期
間が経過すると、磁石７１の移動に磁気ビーズ７が追従できる程度の速度で所定期間だけ
昇降部７３を上昇させ、磁気ビーズ７をタンク３にまで戻す。
【００７９】
その後、制御部９０は、磁気ビーズ７が磁石７１の移動に追従できない程度の速度に切
り替え、上述の退避位置にまで磁石７１を戻す。これによりタンク３にまで戻された磁気
ビーズ７が磁石７１から離れ、当該タンク３内に停滞する。こうして、核酸溶出処理が終
了する。
【００８０】
なお、磁気ビーズ７が上シリンジ２１にまで移動されていれば、プランジャー１０を押
したときに磁気ビーズ７がＰＣＲ容器３０に導入されることはない。したがって、上シリ
ンジ２１が配置されるチューブ２０の外側面の周囲に磁石７１が配置された時点から、磁
気ビーズ７が磁石７１の移動に追従できない程度の速度に制御部９０が速度を変更して、
上シリンジ２１で磁気ビーズ７が磁石７１から離れるようにしてもよい。
【００８１】
≪液滴形成処理≫
液滴形成処理は、上述の核酸溶出処理を実行した後に実行される。すなわち、制御部９
０は、回転体６１を基準位置から４５度回転させ、カートリッジ１の長手方向がロッド８
２の移動方向に合わせられる。
【００８２】
次いで制御部９０は、ロッド駆動部８１を駆動し、所定の速度で所定の期間だけロッド
８２を基準位置から移動させることで、プランジャー１０の取付台１１Ａがチューブ２０
の上縁に接触するまでプランジャー１０を押す。これによりプランジャー１０における棒
状部１２のシール１２Ａがチューブ２０の下シリンジ２２に嵌合した後にスライドし（図
２の（Ｂ）参照）、当該シール１２Ａが下シリンジ２２内でスライドした体積相当分の液
滴４７ＡがＰＣＲ容器３０の流路形成部３５に押し出される（図５の（Ｂ）参照）。
【００８３】
その後、制御部９０は、ロッド８２および回転体６１を元の基準位置にまで戻す。こう
して、液滴形成処理が終了する。
【００８４】
≪熱サイクル処理≫
図９は、熱サイクル処理の様子を示す図である。具体的に図９の（Ａ）および（Ｂ）は
標的核酸の変性段階の様子を示し、図９の（Ｃ）および（Ｄ）は標的核酸の合成段階の様
子を示す図である。
【００８５】
熱サイクル処理は、上述の液滴形成処理を実行した後に実行される。すなわち、制御部
９０は、回転体６１に設けられた高温側ヒーター６５Ｂを駆動し、ＰＣＲ容器３０の第１
領域３６Ａを、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱する。また、制御部９０は、回
転体６１に設けられた低温側ヒーター６５Ｃを駆動し、ＰＣＲ容器３０の第２領域３６Ｂ
を、標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱する。これによりＰＣＲ容器３０の流路形
成部３５内のオイル３７に温度勾配が形成される。
【００８６】
高温側ヒーター６５Ｂおよび低温側ヒーター６５Ｃが駆動されてから、第１領域３６Ａ
における流路形成部３５内のオイル３７が例えば９５℃に達し、第２領域３６Ｂにおける
流路形成部３５内のオイル３７が例えば６０℃に達するまでには所定の期間を要する。こ
の期間に標的核酸の増幅反応は適切に進行しないため、制御部９０は当該期間を待機期間
として待機する。
【００８７】
このとき、図９の（Ａ）に示すように、装着部６２に装着されたカートリッジ１のタン
ク側が上側に配置され、当該カートリッジ１のＰＣＲ容器側が下側に配置される基準位置
に回転体６１が位置している。回転体６１が基準位置に位置している場合、図９の（Ｂ）
に示すように、液滴４７Ａは自重により沈降して第２領域３６Ｂに留まる。したがって、
液滴４７Ａに含有する標的核酸が１回目の変性段階に移行することはない。
【００８８】
制御部９０は、上述の待機期間を経過した場合、回転体６１を１８０度回転させる。こ
の場合、図９の（Ｃ）に示すように、装着部６２に装着されたカートリッジ１のタンク側
が下側に配置され、当該カートリッジ１のＰＣＲ容器側が上側に配置される反転位置に回
転体６１が位置することになる。回転体６１が反転位置に位置している場合、図９の（Ｄ
）に示すように、液滴４７Ａは自重により沈降して第１領域３６Ａに移動する。したがっ
て、液滴４７Ａに含有する標的核酸は変性段階に移行することになる。
【００８９】
また制御部９０は、回転体６１を１８０度回転し終えた時点（回転体６１を停止した）
から標的核酸の変性反応に要する変性段階の期間として設定された変性反応期間だけ、回
転体６１を停止させる。これにより液滴４７Ａに含有する標的核酸の変性反応が進行する
。なお、変性反応期間は、少なくとも、回転体６１の回転により流路形成部３５の一端か
ら他端にまで液滴４７Ａが移動する期間よりも長い期間とされる。
【００９０】
次いで制御部９０は、変性反応期間を経過すると、回転体６１を１８０度回転させて、
当該回転体６１を反転位置から基準位置に切り替え、第２領域３６Ｂに液滴４７Ａを移動
させる。これにより液滴４７Ａに含有する標的核酸は合成段階に移行することになる。
【００９１】
また制御部９０は、回転体６１を１８０度回転し終えた時点（回転体６１を停止した）
時点から標的核酸の合成反応に要する合成段階の期間として設定された合成反応期間だけ
、回転体６１を停止させる。これにより液滴４７Ａに含有する標的核酸のアニーリング反
応および伸長反応が進行する。なお、合成反応期間は、上述の変性期間と同様に、少なく
とも流路形成部３５の一端から他端にまで液滴４７Ａが移動する期間よりも長い期間とさ
れる。
【００９２】
このように制御部９０は、上述の反転位置と基準位置とを交互に切り替えて、第１領域
３６Ａに液滴４７Ａを移動させて留める変性段階および第２領域３６Ｂに液滴４７Ａを移
動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す。繰り返すべきサイクル数は制
御部９０に設定され、例えば３０回とされる。
【００９３】
ところで、本実施形態では、初回から起算して規定回数目となる回の１つ後の回以降の
各サイクルの期間が、当該初回から起算して規定回数目となる回までの各サイクルの期間
よりも短くされる。規定回数は制御部９０に設定され、例えば１回〜１５回の範囲内とさ
れる。なお、繰り返すべきサイクル数に対する、短くすべきサイクル数の割合は、５０％
未満されることが望ましい。
【００９４】
図１０は、液滴の温度推移を模式的に示した図である。なお、図１０では、便宜上、変
性反応期間と合成反応期間との間における液滴４７Ａの移動期間、および、合成反応期間
と変性反応期間との間における液滴４７Ａの移動期間は省略している。
【００９５】
図１０に示すように、本実施形態では、基準となるサイクルである基準サイクルＣＳと
、基準サイクルＣＳよりも短いサイクルである短縮サイクルＳＳとが制御部９０に設定さ
れる。基準サイクルＣＳは、基準となる変性反応期間である第１変性反応期間ＰＤ１と、
基準となる合成反応期間である第１合成反応期間ＰＳ１とで構成される。例えば、第１変
性反応期間ＰＤ１は５秒〜６０秒の範囲内とされ、第１合成反応期間ＰＳ１は６秒〜〜６
０秒の範囲内とされる。短縮サイクルＳＳは、第１変性反応期間ＰＤ１よりも短い第２変
性反応期間ＰＤ２と、第１合成反応期間ＰＳ１よりも短い第２合成反応期間ＰＳ２とで構
成される。例えば、第２変性反応期間ＰＤ２は２秒〜５秒の範囲内とされ、第２合成反応
期間ＰＳ２は４秒〜６秒の範囲内とされる。
【００９６】
このように制御部９０は、初回から起算して規定回数目となる回まで基準サイクルＣＳ
を繰り返し、当該回の１つ後の回から最終回まで短縮サイクルＳＳを繰り返すようになっ
ている。
【００９７】
≪増幅解析処理≫
増幅解析処理は、熱サイクル処理と同時期に並行して実行される。すなわち、制御部９
０は、蛍光測定器５５に対して合成反応期間（第１合成反応期間ＰＳ１および第２合成反
応期間ＰＳ２）ごとに測定指示を与え、当該測定指示結果として蛍光測定器５５から与え
られる蛍光強度を示すデータを記憶部９１に記憶する。
【００９８】
なお、図９の（Ａ）および（Ｂ）に示したように、合成反応期間では回転体６１が基準
位置にあるため、ＰＣＲ容器３０内の液滴４７ＡはＰＣＲ容器３０の底３５Ａに沈降して
いく。しかしながら、基準位置になった直後では、液滴４７ＡがＰＣＲ容器３０の底３５
Ａに到達していない場合がある。したがって、制御部９０が蛍光測定器５５に対して測定
指示を与える時期は、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転し終えた時点から所
定時間経過した後であることが望ましい。特に、基準位置から反転位置に回転させる直前
であることが望ましい。
【００９９】
また制御部９０は、入力部９２から入力される命令に応じて、繰り返すべきサイクル数
として設定される回数分の蛍光強度を示すデータを記憶部９１から読み出し、当該データ
に基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成する。そして制御部
９０は、増幅曲線を生成した場合、その増幅曲線に基づいて基準の増幅効率に対する良否
を判定し、当該判定結果と増幅曲線との双方またはいずれか一方を適宜表示部９３に表示
させる。
【０１００】
＜熱サイクル処理手順＞
図１１は、制御部の熱サイクル処理手順を示すフローチャートである。図１１に示すよ
うに、制御部９０は、核酸溶出処理を実行した以降にステップＳＰ１に進んで、ＰＣＲ容
器３０における第１領域３６Ａを、標的核酸の変性反応が進行する温度として設定される
変性温度に加熱する。また制御部９０は、ＰＣＲ容器３０における第２領域３６Ｂを、標
的核酸の合成反応が進行する温度として設定される合成温度に加熱し、ステップＳＰ２に
進む。
【０１０１】
制御部９０は、ステップＳＰ２では、加熱し始めた時点から加熱対象が目的の温度に達
するとして設定される待機期間を経過するまで待機し、当該待機期間を経過した場合には
ステップＳＰ３に進む。
【０１０２】
制御部９０は、ステップＳＰ３では、回転体６１を基準位置から反転位置にまで回転さ
せてＰＣＲ容器３０の変性温度領域（第１領域３６Ａ）に液滴４７Ａを移動させる。次い
で制御部９０は、回転体６１を反転位置に位置させた時点から第１変性反応期間ＰＤ１を
経過するまで、回転体６１を停止させ続けてＰＣＲ容器３０の変性温度領域に液滴４７Ａ
を留める。制御部９０は、第１変性反応期間ＰＤ１を経過した場合にはステップＳＰ４に
進む。
【０１０３】
制御部９０は、ステップＳＰ４では、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転さ
せてＰＣＲ容器３０の合成温度領域（第２領域３６Ｂ）に液滴４７Ａを移動させる。次い
で制御部９０は、回転体６１を基準位置に位置させた時点から第１合成反応期間ＰＳ１を
経過するまで、回転体６１を停止させ続けてＰＣＲ容器３０の合成温度領域に液滴４７Ａ
を留める。制御部９０は、第１合成反応期間ＰＳ１を経過した場合にはステップＳＰ５に
進む。
【０１０４】
制御部９０は、ステップＳＰ５では、サイクル期間を切り替えるべき回数として設定さ
れる規定回数にサイクル終了数が至ったかを認識する。ここで、サイクル終了数が規定回
数に至っていない場合、制御部９０は、サイクル終了数を１回分だけ増加させた後、ステ
ップＳＰ３に戻って上述の処理を繰り返す。一方、サイクル終了数が規定回数に至った場
合、制御部９０は、サイクル終了数を１回分だけ増加させた後、ステップＳＰ６に進む。
【０１０５】
制御部９０は、ステップＳＰ６では、回転体６１を基準位置から反転位置にまで回転さ
せてＰＣＲ容器３０の変性温度領域（第１領域３６Ａ）に液滴４７Ａを移動させる。次い
で制御部９０は、回転体６１を反転位置に位置させた時点から第２変性反応期間ＰＤ２を
経過するまで、回転体６１を停止させ続けてＰＣＲ容器３０の変性温度領域に液滴４７Ａ
を留める。制御部９０は、第２変性反応期間ＰＤ２を経過した場合にはステップＳＰ７に
進む。
【０１０６】
制御部９０は、ステップＳＰ７では、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転さ
せてＰＣＲ容器３０の合成温度領域（第２領域３６Ｂ）に液滴４７Ａを移動させる。次い
で制御部９０は、回転体６１を基準位置に位置させた時点から第２合成反応期間ＰＳ２を
経過するまで、回転体６１を停止させ続けてＰＣＲ容器３０の合成温度領域に液滴４７Ａ
を留める。制御部９０は、第２合成反応期間ＰＳ２を経過した場合にはステップＳＰ８に
進む。
【０１０７】
制御部９０は、ステップＳＰ８では、繰り返すべきサイクル数として設定される回数に
サイクル終了数が達したかを認識する。ここで、サイクル終了数が繰り返すべきサイクル
数に達していない場合、制御部９０は、サイクル終了数を１回分だけ増加させた後、ステ
ップＳＰ６に戻って上述の処理を繰り返す。一方、サイクル終了数が繰り返すべきサイク
ル数に達した場合、制御部９０は、ステップＳＰ９に進む。
【０１０８】
制御部９０は、ステップＳＰ９では、ＰＣＲ容器３０における第１領域３６Ａおよび第
２領域３６Ｂの加熱を停止した後、熱サイクル処理を終了する。
【０１０９】
＜小括＞
以上のとおり、本実施形態では、ＰＣＲ容器３０における第１領域３６Ａが標的核酸の
変性温度に加熱され、当該第１領域３６Ａとは独立した第２領域３６Ｂが標的核酸の合成
温度に加熱される。
【０１１０】
また、ＰＣＲ容器３０内の液滴４７Ａを変性温度領域（第１領域３６Ａ）に移動させて
留める変性段階、および、当該４７Ａを合成温度領域（第２領域３６Ｂ）に移動させて留
める合成段階を経るサイクルが複数回繰り返される。
【０１１１】
ここで、初回から起算して規定回数目となる回の１つ後の回以降の各サイクルの期間が
、当該初回から起算して規定回数目となる回までの各サイクルの期間よりも短くされる。
すなわち、複数回のサイクルのうち最初の数サイクルは基準サイクルＣＳとされ、当該数
サイクルを経た以降の各サイクルは短縮サイクルＳＳとされる。このため、複数回のサイ
クルのすべてが基準サイクルＣＳとされる場合に比べると、最初の数サイクルを経た以降
の各サイクルの期間が短縮される。
【０１１２】
ＰＣＲ法では、増幅反応が生じ難い要因として、鋳型として採取される核酸の鎖長が長
く変性し難い場合、当該核酸においてスーパーコイル部位が存在して変性し難い場合、あ
るいは、当該核酸の合成反応で伸長鎖が完全に伸びきらずに終了する場合などがある。こ
のような場合、標的核酸以外の増幅サイクルが進んで目的とするＰＣＲ産物の増幅効率が
著しく低減することになる。
【０１１３】
本実施形態では、複数回のサイクルのうち最初の数サイクルは基準サイクルＣＳとされ
、当該数サイクルを経た以降の各サイクルは短縮サイクルＳＳとされる。このため、増幅
反応が生じ難い要因が増幅対象の標的核酸に存在していたとしても、最初の数サイクルを
その後のサイクルよりも長めに確保しない場合に比べると、鎖長が短く線形で変性し易い
ＰＣＲ産物や完全長のＰＣＲ産物が獲得し易くその割合が多くなる。したがって、最初の
数サイクルを経た以降の各サイクルをその数サイクルの期間よりも短くしても、少なくと
も最低限確保すべき増幅効率が維持される。
【０１１４】
このように本実施形態によれば、ある一定の増幅効率を維持しながらも増幅反応期間（
サイクルタイム）を短縮することができ、この結果、増幅効率が低減することを抑制しつ
つＰＣＲ産物の生成時間を短縮することが実現される。
【０１１５】
なお、本実施形態の場合、ＰＣＲ容器３０内の液滴４７Ａを変性温度領域（第１領域３
６Ａ）に移動させて留める変性段階、および、当該４７Ａを合成温度領域（第２領域３６
Ｂ）に移動させて留める合成段階を経るサイクルが複数回繰り返されている。このため、
ＰＣＲ容器３０における温度を標的核酸の変性温度と合成温度とに切り替える場合に比べ
ると、当該温度に達するまでの待機期間が省略され、その分だけ増幅反応期間（サイクル
タイム）が短縮されている。
【０１１６】
（２）第２実施形態
次に、第２実施形態を説明する。なお、本実施形態のカートリッジは上記第１実施形態
と同一であるため、当該カートリッジの説明は省略する。また、本実施形態の核酸増幅装
置のうち制御部９０の熱サイクル処理以外は上記第１実施形態と同一であるため、当該熱
サイクル処理以外の説明は省略する。
【０１１７】
≪熱サイクル処理≫
本実施形態の熱サイクル処理は、複数回のサイクルのうち一部のサイクルの期間を他の
サイクルの期間よりも短くする点では、第１実施形態の熱サイクル処理と共通する。これ
に対し、複数回のサイクルのなかで短くするサイクルの時間的部位が、本実施形態の熱サ
イクル処理と第１実施形態の熱サイクル処理とで相違する。
【０１１８】
すなわち、第１実施形態では、初回から起算して規定回数目となる回の１つ後の回以降
の各サイクルの期間が、当該初回から起算して規定回数目となる回までの各サイクルの期
間よりも短くされた。
【０１１９】
これに対し、本実施形態では、初回から起算して規定回数目となる回までの各サイクル
の期間が、当該回の１つ後の回以降の各サイクルの期間よりも短くされる。
【０１２０】
図１２は、第２実施形態における液滴の温度推移を模式的に示した図である。なお、図
１２では、図１０に示した合と同様に、変性反応期間と合成反応期間との間における液滴
４７Ａの移動期間、および、合成反応期間と変性反応期間との間における液滴４７Ａの移
動期間は省略されている。
【０１２１】
図１２に示すように、本実施形態の制御部９０は、初回から起算して規定回数目となる
回まで短縮サイクルＳＳを繰り返し、当該回の１つ後の回から最終回まで基準サイクルＣ
Ｓを繰り返すようになっている。
【０１２２】
＜熱サイクル処理手順＞
第１実施形態の熱サイクル処理（図１０参照）では基準サイクルＣＳを経てから短縮サ
イクルＳＳが実行されていたのに対し、本実施形態の熱サイクル処理（図１２参照）では
短縮サイクルＳＳを経てから基準サイクルＣＳが実行される。すなわち、本実施形態の熱
サイクル処理と第１実施形態の熱サイクル処理とでは、基準サイクルＣＳと短縮サイクル
ＳＳとの順序が逆となっている。
【０１２３】
したがって、本実施形態の熱サイクル処理手順は、上記第１実施形態における熱サイク
ル処理手順（図１１参照）のステップＳＰ３、ステップＳＰ４、ステップＳＰ６およびス
テップＳＰ７のみ異なる。
【０１２４】
具体的には本実施形態の熱サイクル処理手順のステップＳＰ３では上述のステップＳＰ
６の処理が実行され、ステップＳＰ４では上述のステップＳＰ７の処理が実行される。ま
た、ステップＳＰ６では上述のステップＳＰ３の処理が実行され、ステップＳＰ７では上
述のステップＳＰ４の処理が実行される。
【０１２５】
＜小括＞
以上のとおり、本実施形態では、初回から起算して規定回数目となる回までの各サイク
ルの期間が、当該回の１つ後の回以降の各サイクルの期間よりも短くされる。すなわち、
複数回のサイクルのうち最初の数サイクルは短縮サイクルＳＳとされ、当該数サイクルを
経た以降の各サイクルは基準サイクルＣＳとされる。このため、複数回のサイクルのすべ
てが基準サイクルＣＳとされる場合に比べると、最初の数サイクルにおける各サイクルの
期間が短縮される。
【０１２６】
ＰＣＲ法では、非特異的な合成反応が生じ易い要因として、鋳型として採取される核酸
の量が採取者の技量などによって異なる場合、あるいは、その採取方法に応じて、増幅対
象である生物の核酸とは別にその生物由来とは異なる由来の核酸が混ざる場合などがある
。このような場合、標的核酸以外の増幅サイクルが進んで目的とするＰＣＲ産物の増幅効
率が著しく低減することになる。
【０１２７】
本実施形態では、複数回のサイクルのうち最初の数サイクルは短縮サイクルＳＳとされ
、当該数サイクルを経た以降の各サイクルは基準サイクルＣＳとされる。このため、非特
異的な合成反応が生じ易い要因が存在していても、最初の数サイクルをも基準サイクルＣ
Ｓとされる場合に比べると、非特異的な合成反応量が少なくなり、目的とするＰＣＲ産物
に対する非特異的なＰＣＲ産物の割合が少なくなる。したがって、数サイクルを経た以降
の各サイクルにおいて非特異的な合成反応が生じたとしても、ある一定以上の特異的な合
成反応量が確保され、少なくとも最低限確保すべき増幅効率が維持される。
【０１２８】
このように本実施形態によれば、ある一定の増幅効率を維持しながらも増幅反応期間（
サイクルタイム）を短縮することができ、この結果、増幅効率が低減することを抑制しつ
つＰＣＲ産物の生成時間を短縮することが実現される。
【０１２９】
（３）変形例
上記実施形態では、短縮サイクルＳＳにおける第２変性反応期間ＰＤ２が第１変性反応
期間ＰＤ１よりも短くされ、当該短縮サイクルＳＳにおける第２合成反応期間ＰＳ２が第
１合成反応期間ＰＳ１よりも短くされた（図１０および図１２参照）。
しかしながら、各短縮サイクルＳＳのうち一部の短縮サイクルＳＳにおける変性反応期
間は第１変性反応期間ＰＤ１より短くされていなくてもよい。
また、図１３に示すように、短縮サイクルＳＳにおける第２変性反応期間ＰＤ２は第１
変性反応期間ＰＤ１よりも短くされ、当該短縮サイクルＳＳにおける合成反応期間は短く
されずに第１合成反応期間ＰＳ１と同程度としてもよい。なお、図１３の（Ａ）は第１実
施形態の第２変性反応期間ＰＤ２だけを第１変性反応期間ＰＤ１よりも短くした場合に相
当し、図１３の（Ｂ）は第２実施形態の第２変性反応期間ＰＤ２だけを第１変性反応期間
ＰＤ１よりも短くした場合に相当する。
このようにした場合、第２合成反応期間ＰＳ２が第１合成反応期間ＰＳ１よりも短い上
記実施形態に比べて、当該第２合成反応期間ＰＳ２に実行される蛍光測定の期間を長く確
保することができる。したがって、蛍光測定精度を低減させることなく、増幅反応全体の
期間を短縮することができる。なお、この図１３に示す例では、各短縮サイクルＳＳにお
けるすべての変性反応期間が第１変性反応期間ＰＤ１よりも短くされているが、当該変性
反応期間の一部が第１変性反応期間ＰＤ１より短くされていなくてもよい。
また、第２変性反応期間ＰＤ２が第１変性反応期間ＰＤ１よりも短くされ、当該第２合
成反応期間ＰＳ２が第１合成反応期間ＰＳ１よりも短くされない場合、図１４に示すよう
に、第２変性反応期間ＰＤ２を第１変性反応期間ＰＤ１よりも短くした分の期間ＳＨＰの
一部の期間ＰＰが、当該第１合成反応期間ＰＳ１に割り当てられてもよい。このようにす
れば、増幅反応全体の期間を短縮させつつも、増幅効率に影響し易い合成反応期間を長め
にとって増幅効率が低減することを抑えることができる。なお、この図１４に示す例では
、各サイクルにおけるすべての変性反応期間が第１変性反応期間ＰＤ１よりも短くされ、
各変性反応期間を短くした分の一部の期間ＰＰが、当該サイクルの第１合成反応期間ＰＳ
１に割り当てられている。しかしながら、各サイクルにおける一部の変性反応期間だけが
第１変性反応期間ＰＤ１よりも短くされていてもよく、その短くした分の一部の期間ＰＰ
が、当該サイクルの第１合成反応期間ＰＳ１以外の第１合成反応期間ＰＳ１に割り当てら
れていてもよい。
また、短縮サイクルＳＳにおける変性反応期間が短くされずに第１変性反応期間ＰＤ１
と同程度とし、当該短縮サイクルＳＳにおける第２合成反応期間ＰＳ２が第１合成反応期
間ＰＳ１よりも短くされるようにしてもよい。
また、上記第１実施形態では複数回のサイクルのうち最初の数サイクルを経た以降のサ
イクルが短縮サイクルＳＳとされ（図１０参照）、上記第２実施形態では複数回のサイク
ルのうち最初の数サイクルが短縮サイクルＳＳとされた（図１２参照）。しかしながら、
短縮サイクルＳＳと基準サイクルＣＳとが交互に繰り返されてもよい。なお、交互に繰り
返されるべき短縮サイクルＳＳのサイクル数と、基準サイクルＣＳのサイクル数とは同じ
であっても異なっていてもよい。
また、複数回のサイクルのうち最初の数サイクルを短縮サイクルＳＳとする第１サイク
ルパターンと、当該複数回のサイクルのうち最初の数サイクル以降を短縮サイクルＳＳと
する第２サイクルパターンとが切り替えられるようにしてもよい。この切り替え方法とし
ては、例えば、入力部９２からの切り替え命令に応じて制御部９０が第１サイクルパター
ンと第２サイクルパターンとを切り替える手法が挙げられる。
要するに、複数回のサイクルのうち一部のサイクルの期間が他のサイクルの期間よりも
短くされていれば、上記実施形態と同様に、増幅効率が低減することを抑制しつつ増幅反
応期間を短縮することができる。
【０１３０】
また上記実施形態では、変性反応期間および合成反応期間の始期が回転体６１を１８０
度回転し終えた（回転体６１を停止した）時点とされたが、当該回転体６１を１８０度回
転し始める時点とされてもよい。
【０１３１】
また上記実施形態では、ＰＣＲ容器３０内の液滴４７ＡをＰＣＲ容器３０の第１領域３
６Ａと第２領域３６Ｂとに交互に移動させる機構として回転機構６０が採用された。しか
しながら、ＰＣＲ容器において標的核酸の変性温度にされる第１領域と、その第１領域と
は独立した領域であって標的核酸の合成温度にされる第２領域とに液滴４７Ａを交互に移
動させる機構であれば、上記回転機構６０以外の種々の移動機構を適用することが可能で
ある。
また、上記実施形態では、ＰＣＲ容器内で液滴４７Ａを移動させるべき領域として、標
的核酸の変性温度にされる第１領域と、その第１領域とは独立した領域であって標的核酸
の合成温度にされる第２領域とが配置された。しかしながら、例えば特願２０１４−１０
７８４４のように３つの領域が配置されていてもよい。すなわち、ＰＣＲ容器内の第１領
域として、標的核酸の変性温度にされる領域が配置される。また、第２領域として、互い
に独立した２つ領域が配置され、一方の領域は標的核酸の合成反応におけるアニーリング
反応が進行する温度として設定されるアニーリング温度にされ、他方の領域は標的核酸の
伸長反応が進行する温度として設定される伸長温度にされる。このように、サイクルにお
ける温度変化が変性段階および合成段階の２段階とされる上記実施形態の場合に限らず、
変性段階、アニーリング段階および伸長段階の３段階とされる場合であっても、ＰＣＲ容
器内で液滴４７Ａを移動させることができる。なお、サイクルにおける温度変化が３段階
とされる場合であっても、回転機構以外の種々の移動機構を適用することが可能である。
【０１３２】
また上記実施形態では、ＰＣＲ容器３０内に収容される液滴４７ＡがそのＰＣＲ容器３
０内に充填されるオイル３７の比重よりも大きくされた。しかしながら、液滴４７Ａがオ
イル３７の比重よりも小さくされていてもよい。このようにしても上記実施形態と同様の
効果を奏する。
【０１３３】
また上記実施形態では、ＰＣＲ容器３０内にオイル３７が充填された。しかしながら、
液滴４７Ａが壊れることなくＰＣＲ容器３０内を移動する限りにおいて、オイル３７が省
略されてもよい。すなわち、ＰＣＲ容器３０内に充填されるオイル３７は必須の構成要素
となるものではない。
【０１３４】
上記実施形態では、高温側ヒーター６５Ｂおよび低温側ヒーター６５Ｃを備えた核酸増
幅装置５０が適用された。しかしながら、ＰＣＲ容器３０の内部に温度勾配を形成できる
のであれば、上記実施形態の核酸増幅装置５０以外の核酸増幅装置が適用されてもよい。
例えば、高温側ヒーターのみが備えられていてもよく、低温側ヒーター６５Ｃが冷却器に
変更されてもよい。あるいは、回転体６１の外部に高温側ヒーターおよび低温側ヒーター
が備えられていてもよい。あるいは、高温側ヒーター６５Ｂを設ける部位と、低温側ヒー
ター６５Ｃを設ける部位とが逆にされてもよい。
【０１３５】
また上記実施形態では、溶出用ヒーター６５Ａが備えられたが省略されていてもよい。
ただし、核酸増幅装置５０が溶出用ヒーター６５Ａを備えていれば、核酸の磁気ビーズか
らの遊離が促進されるので望ましい。
【０１３６】
また上記実施形態では、磁石移動機構７０が備えられたが省略されていてもよい。磁石
移動機構７０を省略する場合、例えば、作業者が磁石を持ち、チューブ２０に沿って磁石
を移動させるとよい。ただし、作業者の技量に応じて、核酸結合性を有する固相担体であ
る磁気ビーズ７の移動速度などが異なるおそれがあるため、磁石移動機構７０が備えられ
ることが望ましい。
【０１３７】
また上記実施形態では、押圧機構８０が備えられたが省略されていてもよい。押圧機構
８０を省略する場合、例えば、作業者がカートリッジのプランジャー１０を手で押すとよ
い。ただし、作業者の技量に応じて、単位時間あたりにプランジャー１０を押す圧力量な
どが異なるおそれがあるため、押圧機構８０が備えられることが望ましい。
【０１３８】
また上記実施形態では、蛍光測定器５５が備えられたが省略されていてもよい。蛍光測
定器５５を省略する場合、核酸の増幅を定量することができないが、当該核酸を増幅させ
ることは可能である。
【符号の説明】
【０１３９】
１・・・カートリッジ、３・・・タンク、５・・・アダプター、９・・・カートリッジ
本体、１０・・・プランジャー、２０・・・チューブ、３０・・・ＰＣＲ容器、３５・・
・流路形成部、３６Ａ・・・第１領域、３６Ｂ・・・第２領域、３７・・・オイル、４７
Ａ・・・液滴、５０・・・核酸増幅装置、６０・・・回転機構、６５Ｂ・・・高温側ヒー
ター、６５Ｃ・・・低温側ヒーター、９０・・・制御部、ＣＳ・・・基準サイクル、ＳＳ
・・・短縮サイクル
【図１】
2016129504.tif 000003
【図２】
2016129504.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2016129504.tif 000008
【図７】
2016129504.tif 000009
【図８】
2016129504.tif 000010
【図９】
2016129504.tif 000011
【図１０】
2016129504.tif 000012
【図１１】
2016129504.tif 000013
【図１２】
2016129504.tif 000014
【図１３】
2016129504.tif 000015
【図１４】
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