(57)【要約】【課題】真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物、その製造方法および該組成物を含有する医薬品を提供する。【解決手段】豚の臍帯を備えるステップと、血球および体液を完全に取り除くために、洗浄液で該臍帯を洗浄するステップと、洗浄された前記臍帯から細胞を分離させ、継代培養を行い、サイトカインを獲得するステップと、サイトカインおよび細胞に対して、凍結融解サイクルを少なくとも二回以上繰り返し、ポリペプチド混合物を獲得するステップと、該ポリペプチド混合物に対して、濃縮および脱塩を施し、３０００ダルトンより大きい分子量を有する組成物を獲得するステップと、を有することを特徴とする。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
豚の臍帯組織を備えるステップと、
血球および体液を完全に取り除くために、洗浄液で該臍帯を洗浄するステップと、
洗浄された前記臍帯から細胞を分離させ、継代培養を行い、サイトカインを獲得するステップと、
サイトカインおよび細胞に対して、凍結融解サイクルを少なくとも二回以上繰り返し、ポリペプチド混合物を獲得するステップと、
該ポリペプチド混合物に対して、濃縮および脱塩を施し、３０００ダルトンより大きい分子量を有する組成物を獲得するステップと、を有することを特徴とする、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法。
【請求項２】
前記ポリペプチド混合物に対して、濃縮および脱塩を施し、３０００ダルトンより大きい分子量を有する組成物を獲得するステップにおいて得られた組成物は、アンジオジェニン、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、およびその組合せからなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法。
【請求項３】
前記洗浄された前記臍帯から細胞を分離させ、継代培養を行い、サイトカインを獲得するステップにおいて、臍帯から分離された細胞を血清無含有の培地に三日間ないし十八日間培養することにより、サイトカインを獲得することを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法。
【請求項４】
前記洗浄された前記臍帯から細胞を分離させ、継代培養を行い、サイトカインを獲得するステップにおいて、臍帯から分離された細胞を血清無含有の培地に六日間培養することにより、サイトカインを獲得することを特徴とすることを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法。
【請求項５】
前記豚の臍帯組織は、特定病原体不在豚由来の臍帯組織であることを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の製造方法により製造され、真皮乳頭細胞の成長を促進する効果を有することを特徴とする、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物。
【請求項７】
アンジオジェニン、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、およびその組合せからなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項６に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物。
【請求項８】
前記組成物が適用されていない真皮乳頭細胞の成長率に比べて、前記組成物が適用される真皮乳頭細胞の成長率を５％ないし５０％増大する効果を有することを特徴とする、請求項６に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物。
【請求項９】
有効量の請求項７または請求項８に記載の組成物と、医薬的に許容される溶剤および／または賦形剤とを有することを特徴とする、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物を含有する医薬品。
【請求項１０】
前記組成物の有効量は、０．０５ｎｇ／ｍｌないし２０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項９に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物を含有する医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に臍帯（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄｓ）組織由来の繊維芽様細胞の培養により得られた特定の成分を有する、真皮乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ）の成長を促進する組成物の製造方法に関する。
本発明における他の側面は、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物に関する。
本発明におけるさらに他の側面は、真皮乳頭細胞の成長を促進する、該組成物を有効量に含有する医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術は、上皮細胞または間葉系幹細胞の培養により、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ、ＳＣＦ）、血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＶＥＧＦ）、表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＥＧＦ）、インシュリン様成長因子（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＩＧＦ）などの成長因子を得るものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、上記の従来技術には、以下のような問題がある。
従来の凍結工程は、漸進的に行われるものであるので、時間コストの増大および単位時間当たりの生産量が低下してしまう。
また、濃縮・脱塩が施されていないので、複雑な培養工程が行われていたものの、培養工程で用いられる培地が含有する塩類が皮膚や毛への刺激になってしまう。
【０００４】
そこで、出願されたのが本発明であって、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法を提供することを目的としている。
本発明に係る前記製造方法は、液体窒素による凍結融解サイクルで細胞を破壊し、細胞溶解物（ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）を回収し、大量のポリペプチド・タンパク質カクテル（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｃｋｔａｉｌ）を抽出すると共に、濃縮・脱塩を施すことにより、特定の分子量を有する組成物を得るものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願の請求項１の発明は、豚の臍帯組織を備えるステップと、血球および体液を完全に取り除くために、洗浄液で該臍帯を洗浄するステップと、洗浄された前記臍帯から細胞を分離させ、継代培養を行い、サイトカインを獲得するステップと、サイトカインおよび細胞に対して、凍結融解サイクルを少なくとも二回以上繰り返し、ポリペプチド混合物を獲得するステップと、該ポリペプチド混合物に対して、濃縮および脱塩を施し、３０００ダルトンより大きい分子量を有する組成物を獲得するステップと、を有することを特徴とする、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法、を提供する。
【０００６】
本願の請求項２の発明は、前記ポリペプチド混合物に対して、濃縮および脱塩を施し、３０００ダルトンより大きい分子量を有する組成物を獲得するステップにおいて得られた組成物は、アンジオジェニン、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、およびその組合せからなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法、を提供する。
【０００７】
本願の請求項３の発明は、前記洗浄された前記臍帯から細胞を分離させ、継代培養を行い、サイトカインを獲得するステップにおいて、臍帯から分離された細胞を血清無含有の培地に三日間ないし十八日間培養することにより、サイトカインを獲得することを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法、を提供する。
【０００８】
本願の請求項４の発明は、前記洗浄された前記臍帯から細胞を分離させ、継代培養を行い、サイトカインを獲得するステップにおいて、臍帯から分離された細胞を血清無含有の培地に六日間培養することにより、サイトカインを獲得することを特徴とすることを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法、を提供する。
【０００９】
本願の請求項５の発明は、前記豚の臍帯組織は、特定病原体不在豚由来の臍帯組織であることを特徴とする、請求項１に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法、を提供する。
【００１０】
本願の請求項６の発明は、請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の製造方法により製造され、真皮乳頭細胞の成長を促進する効果を有することを特徴とする、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物、を提供する。
【００１１】
本願の請求項７の発明は、アンジオジェニン、血小板由来成長因子、繊維芽細胞成長因子、およびその組合せからなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項６に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物、を提供する。
【００１２】
本願の請求項８の発明は、前記組成物が適用されていない真皮乳頭細胞の成長率に比べて、前記組成物が適用される真皮乳頭細胞の成長率を５％ないし５０％増大する効果を有することを特徴とする、請求項６に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物、を提供する。
【００１３】
本願の請求項９の発明は、有効量の請求項７または請求項８に記載の組成物と、医薬的に許容される溶剤および／または賦形剤とを有することを特徴とする、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物を含有する医薬品、を提供する。
【００１４】
本願の請求項１０の発明は、前記組成物の有効量は、０．０５ｎｇ／ｍｌないし２０ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項９に記載の、真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物を含有する医薬品、を提供する。
【００１５】
本発明でいう「洗浄液」とは、豚の臍帯と等張の溶液である。
本発明でいう洗浄液は、例えば、９０％塩化ナトリウム溶液またはリン酸緩衝塩類溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）であっても良い。
【００１６】
本発明でいう「細胞の分離」とは、例えば豚の臍帯から切った臍帯細片を４枚ないし６枚を、例えばアルファＭＥＭ培地と１０％のウシ胎児血清とからなる１０ミリリットルの成長培地を含む培養皿に播いてから、該臍帯細片を含有する培養皿を、恒温培養器で培養し、培養１０日目、該臍帯細片を培養皿の成長培地から取り除き、例えば週二回それぞれ３ミリリットルの新鮮な成長培地を添加する方式で培養した細胞を獲得することである。
また、前記恒温培養器は、例えば５％の二酸化炭素雰囲気のインキュベータであることがこのましい。
【００１７】
本発明でいう「継代培養」とは、培養細胞が高密度になる時、細胞を回収し、希釈してから、希釈された細胞を新しい培地を有する培養皿に低密度から継続的に培養することである。
また、希釈比率は、細胞種類により異なるものである。
【００１８】
本発明でいう「凍結融解サイクル」とは、サイトカインおよび細胞を液体窒素で凍結させてから、室温で融解させることを複数回繰り返すことにより、細胞膜を破壊する効果を発揮することである。
例えば、細胞を保持するバイアルを液体窒素に浸入して凍結させてから、該凍結されたバイアルをセ氏３７度の水浴で解凍することを、少なくとも二回以上繰り返し、破壊された細胞をさらに１０００Ｇで１５分間ないし２０分間遠心してもよい。
【００１９】
本発明でいう「濃縮および脱塩」とは、ポリペプチド混合物を含有する溶液をろ過し、上清液を取り除くことにより、該ポリペプチド混合物を含有する溶液における体積を縮減し、濃度を増大させると共に、塩類を除去することである。
例えば、ポリペプチド混合物を含有する溶液を、超ろ過装置または遠心ろ過装置でろ過し、該ポリペプチド混合物を含有する溶液における体積の縮減、濃度の増大ならびに塩類などの不純物の除去行うことにより、３０００ダルトン（ｄａｌｔｏｎ、Ｄａ）より大きい分子量を有する組成物を獲得することができる。
【００２０】
本発明でいう「豚の臍帯組織」とは、特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ、ＳＰＦ）豚由来の臍帯組織である。
【００２１】
本発明でいう「真皮乳頭細胞の成長を促進する効果」とは、本発明に係る組成物が適用されていない真皮乳頭細胞の成長率に比べて、本発明に係る組成物が適用される真皮乳頭細胞の成長率は、５％ないし５０％増大することである。
【００２２】
本発明でいう「医薬的に許容される溶剤および／または賦形剤」とは、ヒトや動物の内用または外用に好適な溶剤／賦形剤である。例えば、該医薬的に許容される溶剤および／または賦形剤は、エタノール水溶液、水、生理食塩水であっても良い。
また、該医薬的に許容される溶剤および／または賦形剤が水または生理食塩水であると共に、該溶剤および／または賦形剤の添加量が本発明に係る組成物の有効量を維持することができるものであることがこのましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法は、血清無含有の培地を用い、細胞を既定の日数培養することにより、サイトカインを回収することができる。
また、凍結融解サイクルを繰り返すことにより、細胞を破壊し、ポリペプチド混合物を得ることができると共に、濃縮・脱塩を施すことにより、特定の分子量を有する組成物を得ることができる。
得られた組成物は、真皮乳頭細胞の成長を促進する効果を有するものである。具体的に、本発明に係る組成物が適用されていない真皮乳頭細胞の成長率に比べて、本発明に係る組成物が適用される真皮乳頭細胞の成長率は、５％ないし５０％増大する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】本発明に係る組成物が被験者の額及び頭髪の生え際に施される実験における初日の状態を示す写真である。
【図１Ｂ】本発明に係る組成物が被験者の額及び頭髪の生え際に施される実験を二ヶ月継続した状態を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、図面を参照しながら、本発明の好適な実施の形態を詳細に説明する。
【００２６】
［製造例１］
本製造例は、豚の臍帯から細胞を分離させることに関する。
【００２７】
豚の臍帯を備え、血球および体液を完全に取り除くために、該臍帯を７５％のエタノールで２０秒ないし３０秒洗うと共に、ＰＢＳによりさらに洗浄する。洗浄された前記臍帯を、３等分または４等分し、滅菌器の皿に置く。
さらに、前記臍帯をメスまたはピンセットで静脈に沿って切開してから、二本のピンセットで該切開された臍帯を広げる状態で、ホウォートンゼリーに血を付けないように、動脈、ならびに静脈を取り除く。
該ホウォートンゼリーを、臍帯羊膜から、該ホウォートンゼリーの湿潤性が維持されるように、新鮮なアルファＭＥＭ培地に移動する。
手術用剪刀で該動脈、静脈およびホウォートンゼリーを除去された臍帯を切って細かく裂くことにより、臍帯細片が得られる。
前記４枚ないし６枚臍帯細片を、アルファＭＥＭ培地と１０％のウシ胎児血清とからなる１０ミリリットルの成長培地を含む培養皿に播いてから、該臍帯細片を含有する培養皿を、５％の二酸化炭素雰囲気のインキュベータで保管し、週二回、毎回３ミリリットルの前記成長培地を該培養皿に添加するように、該培養皿に細胞を培養する。培養１０日目、該臍帯細片を培養皿の成長培地から取り除き、ＰＢＳで培養皿の細胞を洗い流してから、新鮮な成長培地を添加し、細胞を８０％ないし９０％コンフルエントの状況まで培養する。
【００２８】
［製造例２］
本製造例は、細胞の継代培養に関する。
【００２９】
アスピレーターで、８０％ないし９０％コンフルエントの状況まで培養された前記細胞を保持する培養皿から、成長培地を除去した後、５ミリリットルのＰＢＳで培養皿に保持されている細胞を洗い流す。
ＰＢＳを除去し、濃度が０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡを培養皿に添加する。
前記トリプシン−ＥＤＴＡを添加された培養皿をセ氏３７度で５分放置してから、分離された細胞を１５−ｍｌ遠心管に移す。
４００Ｇで５分間遠心した後、上清液を除去し、２ミリリットルの成長培地を添加すると共に、細胞を再懸濁させ、細胞懸濁液を調製する。
１０マイクロリットルの前記細胞懸濁液と、１０マイクロリットルのトリパンブルーとを混合させてなる混合液に対して、自動細胞計数装置で細胞を計数する。
【００３０】
［製造例３］
本製造例は、サイトカインの製造に関する。
【００３１】
サイトカインを製造するために、前記製造例２で得られた細胞を、サイトカイン製造用培養皿に接種し、各サイトカイン製造用培養皿に、細胞数が３x１０５ないし７x１０５になるまで培養してから、二酸化炭素雰囲気のインキュベータに、セ氏３７度で、週二回の頻度、すなわち三日または四日おきに成長培地を交換し、さらに９０％コンフルエントになるまで培養する。
【００３２】
９０％コンフルエントの状況まで培養された前記細胞を、二回、５ミリリットルのＰＢＳで洗い流してから、各サイトカイン製造用培養皿に８ミリリットルの血清無含有培地を添加し、セ氏３７度で、二酸化炭素雰囲気のインキュベータに、６日間培養してサイトカインを獲得する。
【００３３】
［製造例４］
本製造例は、ポリペプチド混合物の回収に関する。
【００３４】
一部のサイトカインは前記培地へ放出されるが、ほかのサイトカインは培地へ放出されずに細胞内に留まる。
該培地を回収し、前記サイトカイン製造用培養皿の表面に付着される細胞を、該培養皿に添加される濃度が０．２％のトリプシン−ＥＤＴＡにより、セ氏３７度で５分間処理する。トリプシン−ＥＤＴＡ処理で剥離された細胞を回収し、４０Ｇで５分間遠心した後、上清液を除去し、さらに１０ミリリットルのＰＢＳで沈殿された細胞を再懸濁し、該懸濁細胞液に対して再び遠心および上清液除去の工程を行ってから、３ミリリットルのＰＢＳに細胞を再懸濁する。
再懸濁された細胞を凍結バイアルに移し、液体窒素に浸入して凍結させる。
凍結されたバイアルをセ氏３７度の水浴で解凍する。
前記凍結融解サイクルを二回繰り返すことにより、細胞を破壊する。
破壊された細胞を１０００Ｇで１５分間ないし２０分間遠心してから、ポリペプチド混合物を含有する溶液として、上清液および、該上清液に懸濁される細胞溶解物を回収することにより、総産出を向上させる。
また、酵素結合免疫吸着測定法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）で、例えばＦＧＦ７またはＰＤＧＦを対象として、上清液におけるポリペプチド混合物の濃度を測定する。
【００３５】
［製造例５］
本製造例は、ポリペプチド混合物の濃縮および脱塩に関する。
【００３６】
前記ポリペプチド混合物を含有する溶液を濃縮することにより、特定の濃度のポリペプチドを得ることができる。前記製造例４に述べた該上清液および該上清液に懸濁される細胞溶解物を超ろ過装置（ｓｔｉｒｒｅｄ  ｃｅｌｌ、アメリカ、Ａｍｉｃｏｎ社）または遠心ろ過装置（ｆｉｌｔｅｒ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ、アメリカ、Ａｍｉｃｏｎ社）を用い、該ポリペプチド混合物を含有する溶液における体積の縮減および濃度の増大を図り、ポリペプチド混合物濃縮液を得る。
該ポリペプチド混合物濃縮液を前記超ろ過装置または遠心ろ過装置から回収チューブに移して保存する。２ミリリットルの該ポリペプチド混合物濃縮液を取って、濃度を測定してもよい。
【００３７】
［製造例６］
本製造例は、ポリペプチド濃縮液の凍結乾燥に関する。
【００３８】
５０ミリリットルの前記製造例５で製造されたポリペプチド混合物濃縮液をチャック袋に入れ、セ氏−８０度で一晩（１２時間ないし１６時間）凍結させる。
凍結乾燥装置で、該チャック袋に保持されたままの該凍結されたポリペプチド混合物濃縮液に対して、四日間ないし五日間をかけて、凍結乾燥工程を施す。
凍結乾燥されたポリペプチド混合物濃縮液を、無菌水に再懸濁させ、ポリペプチド溶液を得る。
該ポリペプチド溶液を０．２２μｍメンブレンフィルターでろ過し、本発明に係る組成物を獲得することができる。
該組成物は、セ氏−８０度で保存される。
また、該組成物は、５５ｎｇ／ｍｌのアンジオジェニン、６ｎｇ／ｍｌの血小板由来成長因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）および４ｎｇ／ｍｌの繊維芽細胞成長因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−７、ＦＧＦ７）を有する。
【実施例１】
【００３９】
本実施例は、毛髪成長の促進に関する。
【００４０】
マイクロニードルで被験者の皮膚の投与部位に、深さが０．２ミリメートルないし０．２５ミリメートルの微細創傷を作り、該投与部位に前記製造例６で獲得した組成物を、一回の投与量を１ミリリットルとし、全部７回の投与を行う。投与頻度は、一週間ないし二週間で一回投与することである。
図１Ａに示すように、製造例６で獲得された組成物を被験者の額における髮際部位に投与すると、図１Ｂに示すように、毛包を構成する真皮乳頭細胞は毛髪を成長させる主な細胞であるので、本発明に係る組成物を投与した二ヶ月後、該真皮乳頭細胞の成長は、新たに毛髪の成長を促進するのみならず、該新たに成長する毛髪の太さを増大することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明に係る真皮乳頭細胞の成長を促進する組成物の製造方法は、血清無含有の培地を用い、細胞を既定の日数培養することにより、サイトカインを回収ことができる。
また、凍結融解サイクルを繰り返すことにより、細胞を破壊し、ポリペプチド混合物を得ることができると共に、濃縮・脱塩を施すことにより、特定の分子量を有する組成物を得ることができる。
得られた組成物は、真皮乳頭細胞の成長真皮乳頭細胞の成長率を促進する効果を有するものである。よって、本発明は、産業上の利用可能性を有する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2016079177.tif 000004