(57)【要約】【課題】  マウスノロウイルス持続感染細胞を提供すること。【解決手段】  本発明のマウスノロウイルス持続感染細胞は、マウスノロウイルスを感染させたマウス由来細胞を継代培養した１年後において、細胞増殖能を有し、ウイルス感染状態を維持している。本発明のマウスノロウイルス持続感染細胞の具体例としては、ＲＡＷ２６４．７細胞にＭＮＶ−１またはＭＮＶ−Ｓ７を接種して感染させた後、継代培養することで樹立したＭＮＶ−１持続感染細胞（ＭＮＶ−１ＣＣ）とＭＮＶ−Ｓ７持続感染細胞（ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣ）が挙げられる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスノロウイルスを感染させたマウス由来細胞を継代培養した１年後において、細胞増殖能を有し、ウイルス感染状態を維持しているマウスノロウイルス持続感染細胞。
【請求項２】
マウス由来細胞がＲＡＷ２６４．７細胞である請求項１記載のマウスノロウイルス持続感染細胞。
【請求項３】
マウスノロウイルスがＭＮＶ−１である請求項１または２記載のマウスノロウイルス持続感染細胞。
【請求項４】
マウスノロウイルスがＭＮＶ−Ｓ７である請求項１または２記載のマウスノロウイルス持続感染細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウスノロウイルス持続感染細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトノロウイルスは、エンベロープを持たない易変異性ＲＮＡウイルスの一つで、嘔吐や下痢などの非細菌性急性胃腸炎の主因となることは周知の通りである。また、ヒトノロウイルスは、免疫不全患者において、数ヶ月以上の下痢を伴う慢性感染を引き起こすことも知られている（例えば非特許文献１）。従って、ヒトノロウイルスの感染対策のためにその研究を行うことは重要である。しかしながら、ヒトノロウイルスは培養細胞を用いて増殖させることができないため、ヒトノロウイルスに形態学的にも遺伝学的にも類似し、細胞培養が可能なマウスノロウイルスが、ヒトノロウイルスのモデルウイルスとして利用されている（例えば非特許文献２）。けれども、現在のところ、マウスノロウイルスの細胞培養については初感染系（急性感染モデル）しか知られておらず、持続感染系についての報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｂｏｋ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ．２０１２．Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６７：２１２６−２１３２
【非特許文献２】Ｗｏｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｍｕｒｉｎｅ  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ：ａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｔｏ  Ｓｔｕｄｙ  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５１４０−５１１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、マウスノロウイルス持続感染細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上記の点に鑑みてなされた本発明のマウスノロウイルス持続感染細胞は、請求項１記載の通り、マウスノロウイルスを感染させたマウス由来細胞を継代培養した１年後において、細胞増殖能を有し、ウイルス感染状態を維持している。
また、請求項２記載のマウスノロウイルス持続感染細胞は、請求項１記載のマウスノロウイルス持続感染細胞において、マウス由来細胞がＲＡＷ２６４．７細胞である。
また、請求項３記載のマウスノロウイルス持続感染細胞は、請求項１または２記載のマウスノロウイルス持続感染細胞において、マウスノロウイルスがＭＮＶ−１である。
また、請求項４記載のマウスノロウイルス持続感染細胞は、請求項１または２記載のマウスノロウイルス持続感染細胞において、マウスノロウイルスがＭＮＶ−Ｓ７である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、マウスノロウイルス持続感染細胞を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】実施例において樹立したＭＮＶ−１ＣＣを間接蛍光抗体法で解析した蛍光顕微鏡像である。
【図２】同、ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣを間接蛍光抗体法で解析した蛍光顕微鏡像である。
【図３】同、ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣの透過電子顕微鏡像である（右下のスケールバーは２００ｎｍ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明のマウスノロウイルス持続感染細胞は、マウスノロウイルスを感染させたマウス由来細胞を継代培養した１年後において、細胞増殖能を有し、ウイルス感染状態を維持している。ここで「ウイルス感染状態の維持」とは、細胞の増殖に伴って、１×１０６〜１×１０１２コピー／ｍＬのウイルスを産生し、培養上清中にウイルス粒子を放出することを意味する。
【０００９】
本発明のマウスノロウイルス持続感染細胞の樹立に用いるマウス由来細胞は、マウスノロウイルスに対して感受性を有する細胞であれば特段限定されるものではなく、マウスマクロファージ由来細胞として知られているＲＡＷ２６４細胞やＲＡＷ２６４．７細胞の他、マウスマイクログリア由来細胞として知られているＢＶ−２細胞などを例示することができる（必要であれば例えばＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．２００９．Ｖｉｒｏｌ．Ｊ．６：１９６などを参照のこと）。マウス由来細胞としてＲＡＷ２６４．７細胞を用いる場合、長期間（例えば１年以上）培養した後にマウスノロウイルスを感染させることが望ましい。本発明者は、ＲＡＷ２６４．７細胞は、長期間培養することでマウスノロウイルスに対する感受性が低下することを突き止めており（例えば２年以上継代培養するとそのＴＣＩＤ５０（５０％組織培養感染値量）は当初のＴＣＩＤ５０の１／１０００〜１／１００００となる）、このウイルスに対する感受性の低下（ウイルス増殖効率の低下）が、細胞内でウイルスが増殖しても死滅せずに生き残る細胞を生み出し、マウスノロウイルス持続感染細胞の樹立に寄与するものと考えられる。
【００１０】
本発明のマウスノロウイルス持続感染細胞の樹立に用いるマウスノロウイルスは、自体公知のＭＮＶ−１，ＭＮＶ−２，ＭＮＶ−３，ＭＮＶ−４，ＭＮＶ−Ｓ７などであってよい（必要であれば例えばＫａｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：１５７５−１５７８、Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  ３４：１４７−１５５、Ｋｉｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．５９：４７−５５などを参照のこと）。
【００１１】
マウス由来細胞にマウスノロウイルスを感染させる方法や、マウスノロウイルスを感染させたマウス由来細胞を継代培養する方法は、マウス由来細胞やマウスノロウイルスに応じた自体公知の方法であってよい。マウス由来細胞にマウスノロウイルスを感染させる方法としては、例えば７０〜８０％集密度のマウス由来細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄した後、マウスノロウイルスの上清を接種して５％炭酸ガス存在下３７℃で１時間ウイルスを細胞に吸着させ、その後、ウイルス上清を吸引除去してから無血清ＤＭＥＭ培地を加え、細胞を５％炭酸ガス存在下３７℃で培養する方法が挙げられる。マウスノロウイルスを感染させたマウス由来細胞を継代培養する方法としては、例えば７０〜９０％集密度に達した細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄した後、１０％ウシ胎児血清加ＤＭＥＭ培地で再浮遊させ、さらに１０％ウシ胎児血清加ＤＭＥＭ培地で１／５〜１／１０希釈して再播種する方法が挙げられる（必要であれば例えばＨａｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０４：１７−２４などを参照のこと）。
【００１２】
以上の方法で樹立された本発明のマウスノロウイルス持続感染細胞を用いることで、初感染系では行うことができなかったヒトノロウイルスの慢性感染に対する薬効評価などを行うことができる。
【実施例】
【００１３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００１４】
（実験方法）
２年以上継代培養したＲＡＷ２６４．７細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で洗浄した後、ＭＮＶ−１またはＭＮＶ−Ｓ７の上清を接種して５％炭酸ガス存在下３７℃で１時間ウイルスを細胞に吸着させ、その後、ウイルス上清を吸引除去してから無血清ＤＭＥＭ培地を加え、細胞を５％炭酸ガス存在下３７℃で培養した。ほとんどの細胞でＣＰＥを確認した時点で培地を１０％ウシ胎児血清加ＤＭＥＭ培地に置換し、引き続き培養した。ほぼ１００％集密度の培養状態になってからは細胞を１／５〜１／１０希釈して再播種し、６０〜９０％集密度になる４〜６日毎に継代を行った。細胞増殖能の評価と産生ウイルス量の測定のため、細胞を２×１０５個／２ｍＬで６ウェルプレートに播種し、経日的に生死細胞数測定とリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法（Ｈａｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１４．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ９８１０８）による培養上清中ウイルスＲＮＡ定量を行った。また、細胞がウイルス抗原を保持していることを確認するため、４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．５％トリトンＸ−１００で透過処理した細胞に、一次抗体としてＭＮＶ−１またはＭＮＶ−Ｓ７で感染免疫したマウス由来血清、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させて蛍光顕微鏡観察を行った。さらに、ウイルス粒子が細胞内に存在していることを確認するため、細胞を２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタールアルデヒドで固定し、エポン包埋後に超薄切した切片を用いて透過電子顕微鏡観察を行った。
【００１５】
（実験結果）
ＲＡＷ２６４．７細胞にＭＮＶ−１またはＭＮＶ−Ｓ７を接種して感染させた後、継代培養した細胞は、７０代、１６ヶ月を経過した後も、細胞増殖能を有し、ウイルス感染状態を維持していたことから、ＭＮＶ−１持続感染細胞（ＭＮＶ−１ＣＣ）とＭＮＶ−Ｓ７持続感染細胞（ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣ）を樹立することができたと判断した。ＭＮＶ−１ＣＣは接着増殖性を有し、ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣは接着増殖性と浮遊増殖性を有していた。それぞれの細胞増殖能は、６ウェルプレートに播種後４時間の生細胞数を１とした場合、未感染細胞は５日目で最大となる４６．７であったのに対し、ＭＮＶ−１ＣＣは６日目で最大となる２２．４であって、ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣは５日目で最大となる２２．８であった。死細胞を含む播種後６日目の総細胞数比較では、未感染細胞を１とすると、ＭＮＶ−１ＣＣは０．４７であって、ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣは０．７２であった。培養上清中のウイルスＲＮＡ量は、ＭＮＶ−１ＣＣは播種直後に１．１×１０６コピー／ｍＬで６日目は８．３×１０７コピー／ｍＬであって、ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣは播種直後に１．２×１０８コピー／ｍＬで６日目は１．９×１０１０コピー／ｍＬであった。蛍光顕微鏡観察では、ＭＮＶ−１ＣＣとＭＮＶ−Ｓ７ＣＣのいずれも、ウイルス抗原が細胞質で顆粒状に集蔟している様子を認めた。ＭＮＶ−１ＣＣとＭＮＶ−Ｓ７ＣＣの蛍光顕微鏡像をそれぞれ図１と図２に示す。また、ＭＮＶ−Ｓ７ＣＣの透過電子顕微鏡観察では、ウイルス粒子と思われる３０ｎｍ弱の高電子密度粒子の細胞質内集蔟を認めた（図３）。なお、ＭＮＶ−１ＣＣとＭＮＶ−Ｓ７ＣＣは、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターにおいて寄託ができないため、出願人（学校法人岩手医科大学）が保管し、分譲を保証する。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明は、マウスノロウイルス持続感染細胞を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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