(57)【要約】【課題】β−ＡＮＰを特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体を得て、それを用いて特異性が高く高感度なβ−ＡＮＰの免疫学的測定方法を提供することである。【解決手段】β−ＡＮＰを特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体、好ましくはβ−ＡＮＰのジスルフィド結合を含むアミノ酸配列を認識するモノクローナル抗体を調製し、そのモノクローナル抗体とα−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体やポリクローナル抗体とを用いてサンドイッチ測定法により免疫学的測定を行う。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ＡＮＰを特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
β−ＡＮＰのジスルフィド結合を含むアミノ酸配列を認識する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするβ−ＡＮＰの免疫学的測定方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体と、α−ＡＮＰを認識する抗体とを用いたサンドイッチ測定法により測定する、請求項４に記載の免疫学的測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はβ−ＡＮＰを認識する抗体およびβ−ＡＮＰの免疫学的測定方法に関する。さらに詳しくは、β−ＡＮＰの特定の位置のアミノ酸残基や構造を認識するモノクローナル抗体とα−ＡＮＰを認識するモノクローナル抗体、あるいはポリクローナル抗体用いるβ−ＡＮＰの免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ：ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は松尾・寒川らにより１９８４年に報告されたペプチドホルモンで（非特許文献１参照）、心臓で産生され強力な利尿、ナトリウム利尿活性と平滑筋弛緩活性を持つ。ＡＮＰはヒトばかりでなく、げっ歯類以外の哺乳類では同一のアミノ酸配列を有し、例えばヒト、ウシ、ブタのＡＮＰは同一である。ＡＮＰには、分子量約３０００のα型、α型の逆平行二量体であるβ型、α型の前駆物質であるγ型の３種類の分子型が確認されている（図１参照）。
【０００３】
ＡＮＰは、心臓、特に心房から分泌されるホルモンで、利尿作用、Ｎａ利尿作用、血管拡張作用、レニン・アンジオテンシン・アルドステロン系や交感神経系の抑制作用など多様な生物活性を有し、体液量、血圧の調節に重要な役割を担っている（非特許文献２，３参照）。
【０００４】
ＡＮＰは心血行動態的負荷、特に心房内圧の増加が主要な産生、分泌刺激になると考えられ、体液量あるいは心房内圧の増加する各種心疾患、腎疾患において血中濃度の増加が認められることから、これら病態の把握、重症度の指標として極めて有用であり、ルーチンの検査項目として日常臨床に応用されている（非特許文献４〜６参照）。
【０００５】
α−ＡＮＰは血中に存在するＡＮＰ類の中心となる分子種であり、２８アミノ酸残基からなり、Ｎ末端から７番目のＣｙｓと２３番目のＣｙｓが分子内でジスルフィド結合し、その間の配列が環状構造をなしている。一方、β−ＡＮＰは、２分子のα−ＡＮＰが分子間でジスルフィド結合した、α−ＡＮＰの逆平行二量体である（特許文献１参照）。γ−ＡＮＰは１２６アミノ酸残基からなり、そのＣ末端にα−ＡＮＰ配列を有する。健常者においては、γ−ＡＮＰは心房中に保存されており、分泌時にα−ＡＮＰとＮ末端ペプチドに切断され、血中ではこの２つの分子で存在する（非特許文献７参照）。
【０００６】
α−ＡＮＰの有用性は多く報告されているが、β−ＡＮＰとγ−ＡＮＰについても重症心不全症例で増加していることが報告されている（非特許文献８参照）。この報告ではα型、β型、γ型の各分子型の共通領域（即ちα−ＡＮＰ）を用いる抗体と逆相高速液体クロマト（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法を用いた測定法により確認している。
【０００７】
ＡＮＰの測定は、酵素やラジオアイソトープで標識した抗体と、担体に固定化した固定化抗体とでサンドイッチされる免疫学的測定法が利用されており、特に臨床検査薬として広く医療現場で使用されており（非特許文献９参照）、α型、β型、γ型の３種類の総和が測定されるものである。その他にα−ＡＮＰを測定できる方法が記載されている（特許文献２，３参照）。特許文献２には、ＫＹ−ＡＮＰ−Ｉ（環状部位Ｎ末端側を認識）とＣ末端認識ポリクローナル抗体とのサンドイッチＥＩＡが記載されているが、β−ＡＮＰとの交差反応性は４．７％と記載され、またγ−ＡＮＰとも交差反応すると推定され、α−ＡＮＰに高度に特異的とは言い難いものである。一方、特許文献３にはＫＹ−ＡＮＰ−ＩＩ（α−ＡＮＰのＮ末端部を認識すると推定される）が記載されているが、ＲＩＡにおけるβ−ＡＮＰ、γ−ＡＮＰとの交差反応性はそれぞれ２０％，５０％であり、α−ＡＮＰに特異的とは言い難いものである。β−ＡＮＰの測定を可能にするサンドイッチ酵素免疫測定法（特許文献４参照）は、α−ＡＮＰの同一のエピトープを認識する抗α−ＡＮＰ抗体でβ−ＡＮＰをサンドイッチすることを特徴とする免疫学的測定方法である。この測定方法では、共存するα−ＡＮＰの濃度の影響を受けやすく高感度化するのは難しい。γ−ＡＮＰについては、γ−ＡＮＰのＮ末端認識抗体を用いたＲＩＡが記載されており（特許文献５参照）、サンドイッチ法の可能性を具体例をあげて記しているが、実施例はない。このように、従来は、ＡＮＰの各分子型に非常に特異的な抗体や測定方法は見出されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６０−１８４０９８号公報
【特許文献２】特開昭６４−６１５００号公報
【特許文献３】特開平１−２２１３９９号公報
【特許文献４】特許第２６８１３７０号公報
【特許文献５】特開平２−１６９９７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，１１８；１３１，１９８４
【非特許文献２】成瀬光栄，成瀬清子：呼吸と循環，３７：３７：３７５−８６，１９８９
【非特許文献３】ｌｎａｇａｍｉ，  Ｔ．  ＆  Ｎａｒｕｓｅ，  Ｍ．：Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１，ｐ．４６７
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｎａｇａ， Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  ７：１７３−９，１９８６
【非特許文献５】Ｈａｓｅｇａｗａ， Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ  ６３：８１９−２２，１９８６
【非特許文献６】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｊ．  Ｖ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｎｄｏｃｒ．  １１０：１９３−６，１９８６
【非特許文献７】Ｓｕｇａｗａｒａ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ８（Ｓｕｐｐｌ．１），  Ｉ−１５１−１５５，  １９８６
【非特許文献８】Ａｋｉｍｏｔｏ，  Ｋ．  ｅｔ  ｅｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．，６７：９３−９７，１９８８
【非特許文献９】浜典男ら，基礎と臨床  ２５：４２０５−１２，１９９１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
市販されているＡＮＰを測定するサンドイッチ免疫測定法においては、ＡＮＰの異なるエピトープ（Ｃ末端と環状部位）を認識する２種類の抗体を用いる測定系であり、α型、α型の２量体であるβ型、α型の前駆物質とされるγ型の３種類の分子型も測定される。
【００１１】
α−ＡＮＰの測定に関しては、多くの報告が成されているが、これらの測定系がβ−ＡＮＰと交差反応性を示すことが明らかにされている。
【００１２】
β−ＡＮＰに特異的な測定系については、α−ＡＮＰのホモダイマーであることから、同一のモノクローナル抗体を用いてβ−ＡＮＰを測定する測定系は報告（特許文献４参照）されているが、β−ＡＮＰに特異的な抗体を用いているわけではなく、α−ＡＮＰ濃度が高くなると競合阻害を受けることになり測定系によっては感度が低くなることがあり、依然、高感度にβ−ＡＮＰのみを測定するためには、課題が残っている。
【００１３】
本発明の目的は、β−ＡＮＰを特異的に測定できる免疫測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、β−ＡＮＰを特異的に認識するモノクローナル抗体の研究をつづけた結果、α−ＡＮＰの逆平行ダイマーが特異的につくるジスルフィド結合を含むアミノ酸配列や構造をエピトープとして認識する抗体を獲得し、それを利用するβ−ＡＮＰの高感度測定法を完成させた。
【００１５】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）β−ＡＮＰを特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体。
（２）β−ＡＮＰのジスルフィド結合を含むアミノ酸配列を認識する、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）上述の（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体を産生することを特徴とするハイブリドーマ。
（４）上述の（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とするβ−ＡＮＰの免疫学的測定方法。
（５）上述の（１）又は（２）に記載のモノクローナル抗体と、α−ＡＮＰを認識する抗体とを用いたサンドイッチ測定法により測定する、（４）に記載の免疫学的測定方法。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体は、β−ＡＮＰを特異的に認識するものであり、好ましくはβ−ＡＮＰのジスルフィド結合を含むアミノ酸配列を認識するものであり、さらに好ましくはβ−ＡＮＰのジスルフィド結合とその周辺のアミノ酸配列を認識するものである。これにより、本発明のモノクローナル抗体はβ−ＡＮＰを特異的に認識することができ、α−ＡＮＰやγ−ＡＮＰを実質的に認識しないものである。
【００１７】
本発明のモノクローナル抗体の親和定数は、後述の実施例で示すように、β−ＡＮＰに対してＫｄ値が１０−１１Ｍオーダーであるのに対して、α−ＡＮＰに対するＫｄ値が１０−８Ｍオーダーであり、β−ＡＮＰに対して極めて高い親和性を有するものが得られ、即ちβ−ＡＮＰを特異的に認識するものが得られた。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体の製法としては特に限定されるものではなく、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを用いる方法や遺伝子組換えの手法を用いて作製することができ、β−ＡＮＰを特異的に認識するモノクローナル抗体を回収すればよい。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをマウス腹腔中で増殖させ、得られた腹水や抗血清からモノクローナル抗体を回収するには、ＤＥＡＥ−セルロースカラムやプロテインＡ−セファロースカラム、プロテインＧ-セファロースカラムを用いることができる。得られたモノクローナル抗体は、そのまま本発明の免疫学的測定方法に用いてもよく、またさらにペプシンで消化して得られるＦ（ａｂ’）２断片、また、さらに２−メルカプトエチルアミンなどで還元して得られるＦａｂ’断片などを用いることも可能である。
【００１９】
本発明の免疫学的測定方法は、本発明のモノクローナル抗体を用いるものであれば特に限定されるものではないが、本発明のモノクローナル抗体と、α−ＡＮＰを認識する抗体とを用いたサンドイッチ測定法であることが好ましい。ここで用いられるα−ＡＮＰを認識する抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、またα−ＡＮＰの認識部位は特に限定されるものではないが、ジスルフィド結合の結合部を認識しないものが好ましく、例えばα−ＡＮＰの環状部位を認識するものが好ましい。
【００２０】
本発明の免疫学的測定方法では、標識を用いることができる。標識としては、１２５Ｉ、３Ｈなどの放射性物質、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光物質、金コロイド、セレンコロイド、ルシフェリンなどの発光又は発色物質などが用いられ、標識された抗原あるいは抗体が試薬として用いられている。また、直接これらの物質を検出に用いる物質に標識せず、ビオチン−アビジン等を利用して間接的に標識してもよい。抗原に結合した標識物質を検出することは、例えば、公知の酵素免疫測定法（ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）又は発光酵素免疫測定法（ＣＬＥＩＡ）等により行うことができる。
【００２１】
本発明の免疫学的測定法においては、不溶性担体を用いることができる。不溶性担体に関しては、よく知られているガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストランなどの物質からなるビーズ、チューブ、プレート、磁性微粒子など用いることができ、反応後にＢ／Ｆ分離可能な担体が好ましく、その材質などは問わない。また、不溶性担体と抗体（あるいはレセプター、結合蛋白質）との結合は、物理的結合あるいは化学的に中間体を介した結合等、Ｂ／Ｆ分離時に結合能が失われない方法が好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、β−ＡＮＰを特異的に認識するモノクローナル抗体を得ることができ、これを用いた本発明の測定法によれば、従来のβ−ＡＮＰの測定法よりも特異性が高く高感度な測定が可能となる。この測定方法はβ−ＡＮＰ測定による心疾患の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ヒトにおけるＡＮＰの３分子型を示す図である。Ａ．α−、β−、γ−ＡＮＰの生合成経路。遺伝子、ｍＲＮＡ、前駆体タンパク質との関係を示す。Ｂ．α−、β−、γ−ＡＮＰのアミノ酸配列。システイン残基に付した線はジスルフィド結合を示す。
【図２】ＣＬＥＩＡ法におけるβ−ＡＮＰの標準曲線を示す図である。ＰＥＧ化した場合としない場合の標準曲線を示す。
【図３】ＣＬＥＩＡ法におけるβ−ＡＮＰの標準曲線と関連するナトリウム利尿ペプチドやペプチド断片の交差反応性を示す図である。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。
【００２５】
（１）モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製とモノクローナル抗体の産生
［抗原の調製］
固相法で合成、精製した還元型ヒトα−ＡＮＰ（シグマジェノシス社製、２．１ｍｇ）を、ジスルフィド結合を形成しない状態で、マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（３ｍｇ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  ７７６０５）と結合した。これを透析し、生理的食塩水で１ｍｇ／ｍＬの溶液とした。
【００２６】
［モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの調製］
抗原溶液１００μＬとアジュバント１００μＬ（Ｆｒｅｕｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ，三菱化学ヤトロン社  ＲＭ６０６−１）を十分に混合して安定したエマルジョンにして、４週齢のＣ３Ｈ系マウス（４匹）の足の裏に各５０μＬずつ免疫した。これを合計５回、３日おきに実施した。最終免疫の３日後にマウス両足からリンパ節を収集し、リンパ節内の細胞を回収した。リンパ節由来細胞と増殖させたミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１）を２：１〜１０：１の割合で混和し、遠心して回収後、５０％ポリエチレングリコールを加えて細胞を融合させた。
【００２７】
無血清培地で洗浄後、レスキュー用ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ含有の１５％ウシ胎児血清含有ＨＡＴ培地に懸濁し、９６穴プレート３枚に播種した。１〜２週間後に、ハイブリドーマのコロニー形成を確認し、各ウェルから培養上清を一部回収した。
【００２８】
［ハイブリドーマの１次スクリーニング］
１次スクリーニングは標準的なＥＬＩＳＡ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｒｏｓｅ  ａｎｄ  Ｂｉｇａｚｚｉ，  ｅｄｓ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  １９８０;  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｗ．  Ａ．  Ｂｅｎｊａｍｉｎ，  Ｉｎｃ．，  １９６４；  Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ，  Ｍ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｌｉｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２：８９５−９０４，  １９８４；  羊土社  タンパク質実験ノート（下）岡田雅人編集  改訂第４版  ２０１１年１１月１日発行）で実施した。抗原を１μｇ／ｍＬに希釈後、９６穴プレート（ＮＵＮＣ  ４６８６６７）に分注し、４℃で一晩、静置した。抗原溶液を除去後、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、ブロッキングを行った。培養上清５０μＬを各ウェルに添加して反応させた。洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧヤギ抗体と反応後、発色剤を添加し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ヘモシアニンに対する吸光度が０．２以下で、抗原に対する特異的な吸光度を０．２以上有するクローンを陽性として選択した。
【００２９】
［ハイブリドーマの２次スクリーニング］
ヒトα−ＡＮＰ（ペプチド研究所製）を還元後、カルボキシアミドメチル（ＣＡＭ）化し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。精製したＣＡＭ−α−ＡＮＰをラクトペルオキシダーゼ法によりヨード１２５（１２５Ｉ）で標識し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製することにより、１分子の１２５Ｉで標識されたペプチドを調製した。以下の反応には、ＲＩＡ用標準バッファー（ＲＩＡバッファー、５０  ｍＭリン酸緩衝液、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  ＮａＮ３、０．５％  Ｎ−エチルマレイミド処理済ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ社  Ａ７８８８）、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４）（Ｋａｔａｆｕｃｈｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７８：１２０４６−１２０５４，  ２００３）を使用した。
【００３０】
１次スクリーニング陽性クローンの培養上清を，１／１０希釈より３倍希釈系列液を各１００μＬ作製し、これに約２０，０００ｃｐｍの１２５Ｉ標識ＣＡＭ−α−ＡＮＰ（１２５Ｉ−ＣＡＭ−α−ＡＮＰ）を含む溶液１００μＬ、ＲＩＡバッファー１００μＬを添加、撹拌し、４℃で４０時間静置した。抗体に結合した１２５Ｉ−ＣＡＭ−α−ＡＮＰの放射活性量をポリエチレングリコール分離法で分離し測定した（Ｋａｔａｆｕｃｈｉ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  同上文献）。具体的には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、５０ｍＭリン酸緩衝液、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ７．４）を用いて作製した１００μＬの１％  ウシγ−グロブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社  Ｇ５００９）溶液および５００μの２３％ポリエチレングリコール（＃６０００、ナカライテスク社  ２８２５４−８５）溶液を加え、混合し、氷上で１０分間静置した後、遠心分離（４℃、３０００ｒｐｍ、１５分間）し、上清を除去した。得られた沈殿の１分間の放射活性をγカウンター（ＡＲＣ−１０００Ｍ、Ａｌｏｋａ社）にて測定した。希釈された培養上清でも１２５Ｉ−ＣＡＭ−α−ＡＮＰに対する結合能力のあるクローン５種選択した。
【００３１】
［限界希釈法によるモノクローン化］
上記５種のクローンを増殖し、対数増殖期の状態でハイブリドーマを分散させ、培地で希釈後、９６穴プレートに播種した。１〜２週間後にハイブリドーマのシングルコロニーの形成が確認された段階で、各ウェルから培養上清をサンプリングし、上述の「ハイブリドーマの１次スクリーニング」に記載した方法に従い、活性を評価した。抗原に対する特異的な吸光度の強いクローンを各３種、合計１５種を選択した。
【００３２】
［ハイブリドーマの３次スクリーニング］
ＣＡＭ−α−ＡＮＰに加えて、α−ＡＮＰ、β−ＡＮＰ（ペプチド研究所製）をそれぞれラクトペルオキシダーゼ法により１２５Ｉで標識後、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、１分子の１２５Ｉで標識されたペプチドを調製した（１２５Ｉ−α−ＡＮＰ、１２５Ｉ−β−ＡＮＰ）。
【００３３】
上記５種のクローンより調製した各３種のクローンについて、連続した希釈液を作製し、１２５Ｉ−ＣＡＭ−α−ＡＮＰに対する結合能力を評価し、２次スクリーニングより得られた５種のクローンより得られた各３種のクローンの中で、最も結合能力の高いクローンを選択した。
【００３４】
これら５種について、連続した希釈液を作製し、１２５Ｉ−α−ＡＮＰ、１２５Ｉ−β−ＡＮＰを用いて２次スクリーニングに記載した方法に従い、各ペプチドに対する結合能力を評価した。
【００３５】
次に、通常のＲＩＡ法に従い、１２５Ｉ−β−ＡＮＰ、１２５Ｉ−ＣＡＭ−α−ＡＮＰ、１２５Ｉ−α−ＡＮＰをトレーサーとして、それぞれについてβ−ＡＮＰ、α−ＡＮＰ、ＣＡＭ−α−ＡＮＰの標準曲線あるいは交差活性曲線を作成し、各クローンの特異性、感度を評価した。その結果、β−ＡＮＰに対して強い結合活性を有し、α−ＡＮＰ、ＣＡＭ−α−ＡＮＰとの交差性が少なく、かつＲＩＡ法において高感度にβ−ＡＮＰを測定できるクローン（＃３２−３）を選択した。
【００３６】
［モノクローナル抗体＃３２−３の産生］
腹水採取用にはヌードマウスを使用し、アジュバントとしてプリスタンを腹腔に注射して１週間後のマウスを用いた。選定したクローン（＃３２−３）を増殖、培養し、ＰＢＳにて懸濁し、上記のマウスに１匹当たり約１×１０６細胞を腹腔に注射した。２週間後ごろになると腹水がたまるので、経過をよく観察して腹水を複数回にわたり回収した。回収する容器には、予め保存用抗凝固剤（ＡＣＤ液）を添加して凝固を抑制した。遠心により血球成分や不要物を除去し、上清を凍結保存した。
【００３７】
（２）抗体の精製
［精製モノクローナル抗体＃３２−３の調製］
腹水の上清画分からのモノクローナル抗体の精製にはＡｆｆｉ  Ｇｅｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＢｉｏＲａｄ社  １５３−６１５３）を用いたプロテインＡ結合アフィニティーカラムを使用した。アフィニティーカラムへのサンプルの結合、洗浄、溶出は製造業者のマニュアルに従った。溶出液を５００μＬごとに、予め１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１６０μＬを加えた１．５ｍＬ容チューブに回収した。精製モノクローナル抗体を含む画分を、ＰＢＳ中で４℃、オーバーナイトにて透析した。精製した溶液中のタンパク質量をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社  ２３２２７）を用いて定量した。
【００３８】
［精製ポリクローナル抗体＃１３１−７の調製］
ポリクローナル抗体＃１３１−７は、Ａ．  Ｓａｓａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １０；３０８−３１２，  １９８７に記載の方法で調製した。得られたウサギ抗血清にキャリアタンパク質として使用したサイログロブリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社  Ｔ１００１、１７ｍｇ／ｍＬ抗血清）およびアジュバント（Ｍ．  Ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、ＤＩＦＣＯ社  ５２６−０２６５１、１０ｍｇ／ｍＬ抗血清）を加え、ローテーターにより撹拌しながら４℃、一晩インキュベートした後、遠心分離（４℃、１３，０００×ｇ、１５分間）し、上清を回収した。上清は直ちに上述のプロテインＡ結合アフィニティーカラムによる精製に供した。アフィニティーカラムへのサンプルの結合、洗浄、溶出は製造業者のマニュアルに従った。溶出液を５００μＬごとに、予め１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）１６０μＬを加えた１．５ｍＬ容チューブに回収した。精製ポリクローナル抗体を含む画分を、ＰＢＳ中で４℃、一晩、透析した。精製した溶液中のタンパク質量をＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて定量した。このようにして精製ポリクローナル抗体＃１３１−７を得た。これはヒトα−ＡＮＰの１３〜１７残基目をエピトープとするウサギポリクロ―ナル抗体である（Ｎａｇａｉ  Ｃ，  Ｍｉｎａｍｉｎｏ  Ｎ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４６１：１０−１６，  ２０１４）。
【００３９】
（３）モノクローナル抗体の特性
ヒトα−ＡＮＰおよびβ−ＡＮＰに対する精製モノクローナル抗体＃３２−３の親和定数はＲＩＡ法を用いて算出した。具体的には、ＲＩＡバッファーを用いて精製モノクローナル抗体の５倍希釈系列液（２００μＬ）を作製し、試験管内にて１２５Ｉで標識したα−ＡＮＰおよびβ−ＡＮＰ（２０，０００ｃｐｍ、１００μＬ）と混合し、４℃で４０時間インキュベートした。抗体に結合した１２５Ｉ−α−ＡＮＰまたは１２５Ｉ−β−ＡＮＰの放射活性量を上述のポリエチレングリコール分離法で分離し、測定した。１２５Ｉ−α−ＡＮＰまたは１２５Ｉ−β−ＡＮＰの結合量が５０％となる抗体濃度をＫｄ値として算出したところ、モノクローナル抗体＃３２−３はヒトα−ＡＮＰに対して１．３４×１０−８Ｍ、ヒトβ−ＡＮＰに対して１．６９×１０−１１ＭのＫｄ値を示し、この抗体がβ−ＡＮＰを選択的に認識することが実証された。
【００４０】
（４）サンドイッチ酵素免疫測定法
［実験用試薬等］
・固相化用緩衝液：５０ｍＭ炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）
・ＰＥＧ化試薬溶液：５μＭ  ｍｅｔｈｙｌ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳ  ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社  ２２６８５）、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
・ブロッキング溶液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ（ＤＳファーマバイオメディカル社  ＵＫ−Ｂ８０）、５％  ウマ血清、２０％  スクロース
・洗浄液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０５％  ＮａＮ３
・反応液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ−２Ｎａ、５％  ＢＳＡ、０．０５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５００ＫＩＵ／ｍＬ  アプロチニン（和光純薬社）、０．０５％  ＮａＮ３
・検出抗体希釈用緩衝液：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．４％  ＢｌｏｃｋＡｃｅ、０．０５％  ＮａＮ３
・化学発光基質：ＣＤＰ−Ｓｔａｒ  ｗｉｔｈ  Ｅｍｅｒａｌｄ  ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社  Ｔ２２１６）
［ヒト血漿抽出物の調製］
ヒト正常血漿は市販品（ＥＤＴＡ−２Ｎａ、コージンバイオ社  １２２７１４４０）を使用した。血漿抽出物の調製には固相抽出カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８  Ｐｌｕｓ、Ｗａｔｅｒｓ社  ＷＡＴ０２０５１５）を用いた。具体的には、固相抽出カートリッジを５ｍＬの６０％  アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液にて洗浄し、５ｍＬの０．１％ＴＦＡ溶液にて平衡化した後、３００μＬの血漿を添加した。５ｍＬの１０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ溶液にて２回洗浄した後、６ｍＬの４０％  アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ溶液にて溶出した。溶出液を濃縮した後、凍結乾燥し、反応液に溶解して測定に用いた。
【００４１】
［組換えヒトγ−ＡＮＰ（ＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰ）の調製］
ＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰは、γ−ＡＮＰ（図１参照）のＮ末端にＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１））およびスペーサー配列（ＧＭＡＳＧＳＧＳＧＬＶＰＲＧＳＲＳＩＥＧＲ（配列番号２））を有する１５５残基のタンパク質である。この組換え体はカイコ蛹発現系を用いて調製した。具体的には、ＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰを発現させたカイコ蛹を１００℃で１０分間加熱処理した後、１％  ＣＨＡＰＳＯ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加してホモジナイズし、遠心分離（４℃、２０，０００×ｇ、１０分間）した。得られた上清をＡｎｔｉ  ＤＹＫＤＤＤＤＫ  ｔａｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｂｅａｄｓ（和光純薬社  ０１２−２２７８１）を用いて作製した抗ＦＬＡＧ抗体固相化カラムに供し、製造業者のマニュアルに従い溶出した。アフィニティー精製後のＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰ溶液をさらにゲル濾過クロマトグラフィーカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００  ＧＬ、  ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社  １７−５１７４−０１）を用いたゲル濾過（３０％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ）により精製した。ゲル濾過精製後のＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰ溶液を逆相クロマトグラフィーカラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００  Ｃ１８、４．６φ×２５０ｍｍ、５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社  ＷＡＴ１０６１６０）を用いた逆相ＨＰＬＣ（１０〜６０％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡのリニアグラジエント、流速１ｍＬ／ｍｉｎ）により精製した。得られた精製ＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰを１１０℃で２２時間の酸加水分解後、アミノ酸分析（Ｌ−８５００、日立製作所）に供し、純度の確認および定量を行った。
【００４２】
［アルカリホスファターゼ標識＃３２−３の調製］
＃３２−３のアルカリホスファターゼ標識にはＡｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学社  Ｌ１２）を用いた。標識および標識抗体の精製は製造業者のマニュアルに従い行った。
【００４３】
［＃１３１−７固相化プレートの作製］
本ＣＬＥＩＡ法では、ヒトα−ＡＮＰの１３〜１７残基目をエピトープとするウサギポリクローナル抗体＃１３１−７（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４６１；１０−１６，２０１４）を固相化抗体として用いた。固相化プレートの作製では、プレートへの非特異的吸着および固相化抗体のＦｃ領域への血漿由来成分の結合を低減するため、従来のＣＬＥＩＡ法と比較して、固相化抗体のＦｃ領域を標的としたポリエチレングリコール修飾（ＰＥＧ化）を追加した方法（Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ４６１；１０−１６，２０１４）を採用した。具体的には、固相化用緩衝液に溶解した＃１３１−７（３μｇ／ｍＬ、１５０μＬ）を９６穴プレート（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐ、Ｎｕｎｃ社  ４３７７９６）に添加し、４℃で２４時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、ＰＥＧ化試薬溶液（１００μＬ）を添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＰＥＧ化試薬溶液を除去し、ブロッキング溶液（２００μＬ）を添加し、室温で２時間インキュベートした。ブロッキング溶液を除去した＃１３１−７固相化プレートをデシケーターにより乾燥させ、酸素吸収剤（アズワン社  １−６６５５−０２）およびゼオライト乾燥剤（アズワン社  １−６６５５−０３）と同封して密閉し、使用時まで−２０℃にて保存した。
【００４４】
［ＣＬＥＩＡ法を用いた測定手順］
マイクロプレートウォッシャー（ＡＭＷ−８Ｒ、バイオテック社）を用いて＃１３１−７固相化プレートを洗浄液（３５０μＬ）で３回洗浄した。反応液（５０μＬ）を各ウェルに添加した後、標準β−ＡＮＰ溶液（反応液に溶解した定量済の合成β−ＡＮＰ溶液、ペプチド研究所）またはヒト血漿抽出物溶液（５０μＬ）を添加し、マイクロプレートシェーカー（Ｎ−７０４、日伸理化社）を用いて振盪撹拌しながら４℃で２４時間インキュベートした。上記と同様に３回洗浄した後、検出抗体希釈用緩衝液で０．２ｎｇ／ｍＬに希釈したアルカリホスファターゼ標識＃３２−３溶液（１００μＬ）を添加し、マイクロプレートシェーカーを用いて振盪撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。上記と同様に４回洗浄した後、化学発光基質（１００μＬ）を添加し、室温で２０分間インキュベートした。マイクロプレートルミノメーター（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）により１秒間に生ずる発光量を測定した。各試料は異なる２ウェルで個別に測定し、その平均値より定量値を算出した。
【００４５】
（５）検出感度と再現性
本サンドイッチＣＬＥＩＡ法では、固相化抗体のＰＥＧ化によりβ−ＡＮＰの標準曲線の直線性が改善し、０．１〜２５０ｐＭの範囲で直線性を示した（図２参照）。
【００４６】
検出限界は、試料非添加の２０ウェルの平均測定値に標準偏差の２倍を加えた発光強度を、標準曲線を用いて定量することにより算出した。固相化抗体をＰＥＧ化しなかった場合の検出限界は１．７７ｐＭであったが、ＰＥＧ化した場合には、０．２３ｐＭとなり、感度が７．７倍向上した。この値は、同一の抗α−ＡＮＰモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法（特許文献４）において得られる検出限界（０．３３ｐＭ、算出方法は異なる）を超える値であり、サンドイッチＣＬＥＩＡ法で得られる検出限界としては成績が良いといえる値であった。
【００４７】
再現性の評価として、同一プレートにて同一の試料を測定したｉｎｔｒａａｓｓａｙ、および、異なるプレートにて同一の試料を測定したｉｎｔｅｒａｓｓａｙにおける測定値のばらつきを検討した。標準β−ＡＮＰ溶液およびヒト血漿抽出物のいずれを試料として用いた場合にも、ｉｎｔｒａａｓｓａｙおよびｉｎｔｅｒａｓｓａｙにおけるＣＶ値は１０％未満であり（表１参照）、サンドイッチＣＬＥＩＡ法では充分な再現性を示した。
【００４８】
【表１】
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（６）交差反応性
本サンドイッチＣＬＥＩＡ法では、検出抗体としてα−ＡＮＰに対する親和性が低く、かつβ−ＡＮＰに高い親和性を示すモノクローナル抗体、即ちβ−ＡＮＰを特異的に認識する抗体を使用することを特徴とする。本ＣＬＥＩＡ法における、０．２ｐＭ〜１２５０ｐＭのα−ＡＮＰ、β−ＡＮＰ、ＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰ、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ−３２）、ヒトＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ−２２）およびヒトγ−ＡＮＰ（ｐｒｏＡＮＰ）のＮ末端断片ペプチド（ヒトｐｒｏＡＮＰ１−３１＋Ｔｙｒ）の交差反応性を測定した。その結果、β−ＡＮＰに対し、ＢＮＰ−３２、ＣＮＰ−２２、およびｐｒｏＡＮＰ１−３１＋Ｔｙｒは０．３％以下、α−ＡＮＰおよびＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰは約１．０％の交差反応性しか示さなかったことから（図３、表２参照）、当該ＣＬＥＩＡ法ではβ−ＡＮＰを選択的に測定できることが実証された。また、１ｎＭのα−ＡＮＰまたはＦＬＡＧ−ｐｒｏＡＮＰを共添加した場合にもβ−ＡＮＰの標準曲線には差が見られなかった。この結果から、本ＣＬＥＩＡ法では、血漿のようにβ−ＡＮＰよりも高濃度のα−ＡＮＰやγ−ＡＮＰを含む試料においても、α−ＡＮＰやγ−ＡＮＰの干渉を受けることなく正確にβ−ＡＮＰを定量できると考えられる。同一の抗α−ＡＮＰモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法（特許文献４）では、１００ｆｍｏｌ（５００ｐＭ）以上のα−ＡＮＰを共添加した場合にβ−ＡＮＰの測定に影響が出ていたことから、本発明を用いたＣＬＥＩＡ法では従来法と比較してβ−ＡＮＰの測定選択性が改善したといえる。
【００４９】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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