(57)【要約】      （修正有）【課題】試料溶液中のプローブ分子を結合した微粒子と分析対象の生体分子との反応速度を向上することができる自動分析装置及び分析方法を提供する。【解決手段】磁場発生装置によって反応領域３６内に磁気微粒子３８の密集領域３６ａを形成させ、送液装置によって磁気微粒子３８の密集領域３６ａに反応液３９を通過させる。そして、反応液３９が反応領域３６を通過した時点で送液方向を反転させて密集領域に再度反応液３９を通過させる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象の試料と、前記試料の分析に用いる磁気微粒子を含む試薬が混合された反応液を反応流路に送る送液装置と、
前記反応流路の予め定めた反応領域に前記磁気微粒子に作用する磁場を発生させる磁場発生装置と、
前記磁場発生装置によって前記反応領域内に形成された前記磁気微粒子の密集領域に、前記反応液を通過させるように前記送液装置を制御する制御装置と
を備えたことを特徴とする自動分析装置。
【請求項２】
請求項１記載の自動分析装置において、
前記制御装置は、前記反応液を前記磁気微粒子の密集領域に複数回通過させるように前記送液装置を制御することを特徴とする自動分析装置。
【請求項３】
請求項１記載の自動分析装置において、
前記反応領域における前記磁気微粒子の占める体積は、前記反応液の占める体積よりも大きいことを特徴とする自動分析装置。
【請求項４】
請求項１記載の自動分析装置において、
前記反応液は、
前記試料中に含まれる分析対象の生体分子を捕獲するための捕獲プローブ分子が結合された前記磁気微粒子と、
標識と捕獲プローブ分子とで形成された標識分子と前記生体分子とからなる複合体として形成された被反応分子と
を含むことを特徴とする自動分析装置。
【請求項５】
請求項１記載の自動分析装置において、
前記反応液は、
前記磁気微粒子と、
前記試料中に含まれる分析対象の生体分子を捕獲するための捕獲プローブ分子と、前記生体分子と、捕獲プローブ分子とで形成された標識分子と、からなる複合体として形成された被反応分子と
を含むことを特徴とする自動分析装置。
【請求項６】
分析対象の試料と、前記試料の分析に用いる磁気微粒子を含む試薬と、が混合された反応液を反応流路に送る手順と、
前記反応流路の予め定めた反応領域に前記磁気微粒子に作用する磁場を発生させ、前記反応領域内に前記磁気微粒子の密集領域を形成する手順と、
前記反応液を前記反応領域に通過させる手順と
を有することを特徴とする分析方法。
【請求項７】
請求項６記載の分析方法において、
前記反応液は前記反応領域を複数回通過することを特徴とする分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原と抗体の反応を利用して試料の分析を行う自動分析装置及び分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析対象の試料溶液中に含まれる特定の生体分子の種類や存在量を解析する方法としては、例えば、反応支持体としての微粒子に解析対象の生体分子を捕獲するプローブ分子（捕獲プローブ分子）を結合し、プローブ分子と解析対象の生体分子を反応させて捕獲した後、さらに、標識を結合したプローブ分子（標識分子）と反応させ、標識を定量することによって対象となる生体分子の解析を行う方法が知られている。
【０００３】
一方で、微粒子を反応支持体として用いる場合には、溶液中における微粒子の移動速度が解析対象の生体分子などに比べて桁違いに小さいため、微粒子に結合させた捕獲プローブ分子と生体分子との反応速度が著しく低下することも知られている。このような問題に対し、微粒子上での反応の加速を目的として、例えば、特許文献１（米国特許出願公開第２００９／０２２７０４４号明細書）には、微粒子を含む反応液を流路内に封入し、電磁石で外部より変動磁場を与えることによって反応液中の磁気微粒子を運動させ、反応液を攪拌する技術が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０２２７０４４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記従来技術のように溶液の攪拌によって反応速度の向上を図る場合、反応する分子同士、すなわち、プローブ分子を結合した微粒子と解析対象の生体分子は溶液の流れに沿って概ね同一方向に移動するため、反応速度に大きく貢献する分子同士の衝突頻度に係る相対移動速度を大きくすることが難しく、反応速度の向上は限定的であり改善の余地があった。
【０００６】
本発明は上記に鑑みてなされたものであり、試料溶液中のプローブ分子を結合した微粒子と分析対象の生体分子との反応速度を向上することができる自動分析装置及び分析方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、分析対象の試料と、前記試料の分析に用いる磁気微粒子を含む試薬が混合された反応液を反応流路に送る送液装置と、前記反応流路の予め定めた反応領域に前記磁気微粒子に作用する磁場を発生させる磁場発生装置と、前記磁場発生装置によって前記反応領域内に形成された前記磁気微粒子の密集領域に、前記反応液を通過させるように前記送液装置を制御する制御装置とを備えたものとする。
【発明の効果】
【０００８】
試料溶液中のプローブ分子を結合した微粒子と分析対象の生体分子との反応速度を向上することができる
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】第１の実施の形態の分析ユニットの反応部を抜き出して示す図である。
【図２】図１のＡ部を拡大して示す図である。
【図３】第１の実施の形態に係る自動分析装置の全体構成を概略的に示す図である。
【図４】図３に示した自動分析装置の分析ユニットの構成を模式的に示す図である。
【図５】反応液中で生じる反応の一例を模式的に示す図である。
【図６】反応液中で生じる反応の他の例を模式的に示す図である。
【図７】磁場発生機構の一構成例を示す図である。
【図８】磁場発生機構の他の構成例を示す図である。
【図９】磁場発生機構のさらに他の構成例を示す図である。
【図１０】第１の実施の形態における効果を説明する図であり、反応液を静置した場合と、反応液に本実施の形態の反応処理を適用した場合の反応速度を比較する図である。
【図１１】第１の実施の形態によって反応領域に形成された密集領域における磁気微粒子の反応液に対する割合と反応効率との関係を示す図である。
【図１２】第２の実施の形態における反応流路の分解斜視図である。
【図１３】第２の実施の形態における反応流路の縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の実施の形態を図面を参照しつつ説明する。
【００１１】
＜第１の実施の形態＞
本発明の第１の実施の形態を図１〜図１１を参照しつつ詳細に説明する。
【００１２】
図３は本実施の形態に係る自動分析装置の全体構成を概略的に示す図である。
【００１３】
図３において、自動分析装置１００は、血液や尿などの生体サンプル（以下、試料と称する）を収容する複数の試料容器１が収納された試料容器ラック２と、試料容器ラック２を搬送するラック搬送ライン３と、試料の分析に用いる種々の試薬が収容された複数の試薬容器４が収納・保温され試薬ディスクカバー７により覆われた試薬容器ディスク５と、試料と試薬とを混合するための複数の反応容器８が収納されたインキュベータディスク９と、回転駆動及び上下駆動により試料容器１からインキュベータディスク９の反応容器８に試料を分注する試料分注機構１０と、試薬ディスクカバー７に設けられた試薬ディスクカバー開口部７ａを介して、回転駆動及び上下駆動により試薬容器４からインキュベータディスク９の反応容器８に試薬を分注する試薬分注機構１１と、反応容器８に収容された反応液（試料と試薬の混合液）を攪拌する反応容器攪拌機構１４と、発光誘導試薬が収容された発光誘導試薬容器４０と、洗浄試薬が収容された洗浄試薬容器４１と、回転駆動及び上下駆動によりインキュベータディスク９の反応容器８で混合された反応液、発光誘導試薬容器４０、或いは、洗浄試薬容器４１に収容された試薬を吸引する吸引機構１７と、吸引機構１７で吸引された反応液や試薬を用いて分析を行う分析ユニット１８と、各部の分注動作、分析ユニット１８による分析処理（反応処理、測定処理など）を含む自動分析装置１００全体の動作を制御する制御部１９とを概略備えている。試薬ディスク５には試薬容器４として、発光標識を含む試薬を収容する発光標識試薬容器や、磁気微粒子を含む試薬を収容する磁気微粒子試薬容器などが収納されている。磁気微粒子としては、特に限定すべき用件はなく、例えば、ポリマー中にフェライトを分散させて製造したものや、フェライト微粒子の表面にデキストランやポリエチレングリコールなどを固定したものなどがある。また、発光標識としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）などの通常の蛍光色素やフィコエリスリン、アロフィコシアニンなどの蛍光タンパクを用いることができる。
【００１４】
また、自動分析装置１００は、未使用である複数の反応容器８や試料分注チップ１０ａが収納された反応容器・試料分注チップ収納部１３、及び、その交換・補充用にスタンバイされた反応容器・試料分注チップ収納部１２と、使用済みの反応容器８及び試料分注チップ１０ａを廃棄するための廃棄孔１５と、反応容器８及び試料分注チップ１０ａを把持して搬送する搬送機構１６とを備えている。搬送機構１６は、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸方向（図示せず）に移動可能に設けられており、反応容器・試料分注チップ収納部１３に収納された反応容器８をインキュベータディスク９に搬送したり、使用済み反応容器８を廃棄孔１５に破棄したり、未使用の試料分注チップ１０ａをチップ装着位置１６ａに搬送したりする。
【００１５】
図４は、図３に示した自動分析装置の分析ユニットの構成を模式的に示す図である。また、図１は分析ユニットの反応部を抜き出して示す図であり、図２は図１のＡ部を拡大して示す図である。
【００１６】
図４において、分析ユニット１８は、インキュベータディスク９の反応容器８から吸引機構１７により吸引された反応液に含まれる反応支持体としての磁気微粒子と分析対象の生体分子との反応を促進させる反応処理を行う反応部３０と、反応部３０により反応処理の施された反応液の測定処理を行う測定部３１と、反応部３０の吸引部３２ａから反応液を吸引して測定部３１の吐出部３２ｂに吐出することにより反応液を移送する移送機構３２とを備えている。
【００１７】
反応部３０は、ベースとなる基板３０ａと、基板３０ａ上に形成された反応流路３５と、吸引機構１７によって吸引された反応液や発光誘導試薬、洗浄試薬などの保管及び反応流路３５への送液が可能な反応液送液ユニット３３と、反応流路３５上に予め定めた反応領域３６に配置され、反応液中の磁気微粒子に作用する磁場を発生させる磁場発生装置３７と、反応液送液ユニット３３による反応液の移送先を切り換える切換バルブ３４と、移送機構３２による反応液の吸引を行う吸引部３２ａとを備えている。なお、図４においては、図示の簡単のために反応部３０の各構成を簡略化して示しており、その詳細について以下に説明する。
【００１８】
図１及び図２に示すように、反応部３０において、反応液送液ユニット３３は、磁気微粒子３８などを含む反応液３９を反応流路３５内で送液するポンプ３３ａと、反応液３９を保管する反応液保管部３３ｂ，３３ｃなどにより構成されている。また、切換バルブ３４は、ポンプ３３ａと反応液保管部３３ｂと反応流路３５とで反応液３９の流通方向を切り換える切換バルブ３４ａと、反応流路３５と反応液保管部３３ｃと吸引部３２ａとで反応液の流通方向を切り換える切換バルブ３４ｂなどにより構成されている。また、磁場発生措置３７は、反応領域３６において反応流路３５の両側に対向するように配置された磁石３７ａ，３７ｂにより構成されている。
【００１９】
ポンプ３３ａとしては、例えば、微量液滴の搬送に適したペリスターポンプやシリンジポンプを用いることが出来る。なお、反応液３９を反応流路３５の反応領域３６に複数回往復で通過させるには、吸気と排気の両方が出来るポンプが好ましい。
【００２０】
図７は、磁場発生機構の一構成例を示す図である。
【００２１】
図７において、磁場発生装置３７の磁石は、反応流路３５を挟む位置に対向して配置された一対の永久磁石１３７ａ，１３７ｂ（例えば、ネオジム磁石）であり、反応流路３５に対して永久磁石１３７ａ，１３７ｂを近接させる、或いは離間させる方向に移動可能なＸ−Ｙステージ１３０上に配置されている。また、Ｘ−Ｙステージ１３０は、反応流路３５が永久磁石１３７ａ，１３７ｂの間の空間、すなわち、永久磁石１３７ａ，１３７ｂの磁力の影響を受ける空間から離脱する位置まで移動可能である。
【００２２】
磁気微粒子３８を含む反応液３９がポンプ３３ａの圧力制御により切換バルブ３４ａを介して反応流路３５に送液される場合、反応液３９は反応領域３６を通過する。このとき、磁場発生装置３７によって反応領域３６に磁場が形成されると、反応液３９中の磁気微粒子３８は反応領域３６内でトラップされて、反応流路３５の断面全体に亘る密集領域３６ａを形成する。つまり、Ｘ−Ｙステージ１３０の動作によって反応領域３６に変動磁場が発生さされると、磁気微粒子３８は反応流路３５内の反応領域３６内に留まり、磁場の大きさや強度に従った分布を取りつつ、反応領域３６内を動きながら長時間滞在することが可能となる。なお、反応領域３６の空間的な大きさは、磁場発生装置３７によって形成される磁場の空間的な大きさに依存する。
【００２３】
このような磁場発生装置３７によって、反応流路３５内における反応液中の磁気微粒子３８は反応領域３６内に十分に保持される。例えば、反応流路３５として内径０．７２ｍｍのガラス製キャピラリー（Hilgenberg社製）、磁場発生装置３７として幅１０ｍｍ、高さ２０ｍｍ、厚み５ｍｍのネオジム磁石２枚を間隔５ｍｍで対向させてＸ−Ｙステージ（シグマ光機製）上に配置したものを用い、磁気微粒子２８として直径３００ｎｍの磁気微粒子（Ademtech社製）６０Ｍ個を分散させた５０ｕｌの反応液２９を流速２００ｕｌ／分で送液し、反応液２９が反応領域３６を通過した時点で送液方向を反転させて反応領域３６に再度反応液２９を通過させ、磁気微粒子２８が密集した密集領域３６ａを通過させ、磁場発生装置３７を０．５Ｈｚ、移動距離５ｍｍで動作させた場合、時間１０分間での反応領域３６内の密集領域３６ａにおける磁気微粒子２８の保持率は約９５％程度であった。
【００２４】
また、磁場発生装置３７によって磁気微粒子２８を保持する場合、磁気微粒子２８に作用する磁場を、Ｘ−Ｙステージを駆動することによって変動磁場とし、その変動磁場の周波数を０．０２Ｈｚ以上のとすれば、反応領域３６内で磁気微粒子３８の密集した状態が反応時間に対して十分に長くなった場合にも、一部の磁気微粒子３８にだけ反応分子が反応してしまうことを抑制できる。
【００２５】
例えば、磁気微粒子３８の一例として磁気微粒子上に一分子のビオチンを導入したものを作製し、ストレプトアビジンと蛍光タンパクが結びついたものをラベル材（標識分子）とし、変動磁場の周波数を変えながら反応領域中でラベル材が導入された磁気微粒子の個数を調べ、変動磁場の周波数とラベル材が導入された微粒子の個数との関係を詳細に調べることにより、どの程度の周波数で磁気微粒子３８の密集領域３６ａを反応流路３５中で動かす必要があるのかを調べた。
【００２６】
磁気微粒子としては、直径３００ｎｍのマウス二次抗体付磁気ビーズ（Ademtech社製）を用い、磁気ビーズのビーズ数に対して分子数比が１／１０となるようにマウスビオチン化抗体（Abcom社製）を反応させた。また、反応分子としては、ストレプトアビジン付フィコエリスリン（Roche社製）の３０ｐＭ溶液を用いた。そして、これらの磁気微粒子の溶液と反応分子の溶液を混合し、磁気微粒子６０Ｍ個を分散させた液量５０ｕｌの反応液を作製した。
【００２７】
反応流路３５として内径０．７２ｍｍのガラス製キャピラリー（Hilgenberg社製）、磁場発生装置３７として幅１０ｍｍ、高さ２０ｍｍ、厚み５ｍｍのネオジム磁石２枚を間隔５ｍｍで対向させてＸ−Ｙステージ（シグマ光機製）上に配置したものを用い、磁気微粒子２８として直径３００ｎｍの磁気微粒子（Ademtech社製）６０Ｍ個を分散させた５０ｕｌの反応液２９を流速２００ｕｌ／分で送液し、反応液２９が反応領域３６を通過した時点で送液方向を反転させて再度反応液２９を反応領域３６を通過させ、磁気微粒子２８が密集した密集領域３６ａを通過させた。このとき、Ｘ−Ｙステージによって磁場発生装置３７のネオジム磁石を移動距離５ｍｍで移動させ、磁気微粒子に作用する磁場の周波数が２Ｈｚ、１Ｈｚ、０．５Ｈｚ、０．２Ｈｚ、０．１Ｈｚ、０．０５Ｈｚ、及び０．０２Ｈｚの場合の蛍光基点数を計測した。蛍光輝点数の計測は、３００Ｗキセノンランプ（朝日分光製）を光源とし、蛍光画像はｓＣＭＯＳカメラ（浜松ホトニクス社製）を用い、蛍光顕微鏡（オリンパス社製）により行った。この結果、蛍光輝点数は、２Ｈｚ から０．０２Ｈｚの間ではほとんど変動しないことがわかり、したがって、変動磁場として０．０２Ｈｚ以上の周波数であれば、一部の磁気微粒子に偏った反応にはならないことがわかった。
【００２８】
なお、磁場発生装置３７としては、上記のような永久磁石１３７ａ，１３７ｂを用いるものの他に、図８に示すように電磁石２３７ａ，２３７ｂを対向して配置し、その間に反応流路３５を配置した構成や、図９に示すように導線３３７をコイル状に巻き、その中に反応流路３５を通した構成などが考えられる。
【００２９】
ここで、反応部などにおいて反応液中で生じる反応について説明する。図５は反応液中で生じる反応の一例を模式的に示す図であり、図６は他の例を模式的に示す図である。
【００３０】
例えば、図５に示すように、反応流路３５の反応領域３６に送液される反応液３９を、分析対象の生体分子７０と、生体分子７０を捕獲する抗体や核酸分子などのプローブ分子（捕獲プローブ分子７１）を結合した磁気微粒子２８と、蛍光タンパクなどの標識７２を結合した捕獲プローブ分子７３（すなわち、標識７２と捕獲プローブ７３とから成る標識分子７４）とを含むように構成する。このとき、生体分子７０が標識分子７４の捕獲プローブ７３に捕獲されることによって複合体としての被反応分子が形成され、さらに、被反応分子の生体分子７０が磁気微粒子２８の捕獲プローブ分子７１に捕獲されることによって、磁気微粒子２８と生体分子７０と標識７２との複合体が形成される。
【００３１】
また、他の例としては、図６に示すように、反応容器８に収容された反応液を、分析対象の生体分子７０と、ビオチン（又は、アビジン・ストレプトアビジン）を結合した捕獲プローブ分子７１と、標識７２を結合した捕獲プローブ分子７３（すなわち、標識７２と捕獲プローブ７３とから成る標識分子７４）とを含むように構成する。このとき、生体分子７０が標識分子７４の捕獲プローブ７３及び捕獲プローブ７１に捕獲されることによって複合体としての被反応分子７５が形成される。
【００３２】
さらに、反応流路３５の反応領域３６に送液される反応液３９を、アビジン・ストレプトアビジン（又は、ビオチン）を結合した磁気微粒子２８と、被反応分子７５とを含むように構成する。このとき、磁気微粒子２８のアビジン・ストレプトアビジンと被反応分子７５のビオチン（又は、磁気微粒子２８のビオチンと被反応分子７５のアビジン・ストレプトアビジン）とが結合することによって、磁気微粒子２８と生体分子７０と標識７２との複合体が形成される。
【００３３】
測定部３１は、ベースとなる基板３１ａと、基板３１ａ上に形成された測定流路５１と、移送機構３２により反応部３０から搬送される反応液が吐出される吐出部３２ｂと、測定流路５１内の反応液の送液を行う送液ユニット（図示せず）と、測定流路５１上に予め定めた測定領域５２に配置され、吐出部３２ｂに吐出された反応液反応液中の磁気微粒子に作用する磁場を発生させる磁場発生装置５７と、磁場発生装置５７によって測定領域５２内に形成された磁気微粒子群５２ａの計測を行う計測機構１０１と、計測機構１０１による計測が終了した反応液を排出する排出部６１とを備えている。
【００３４】
計測機構１０１は、光源６０と、光源６０から照射された光を集光する集光レンズ５９と、集光レンズ５９を介した光から標識（蛍光色素や蛍光タンパク）の励起に不要な波長の光を遮断して励起光だけを透過させるフィルター５８と、フィルター５８からの励起光を反射・透過するダイクロックミラー５４と、ダイクロックミラー５４で反射された励起光を測定領域５２に照射する対物レンズ５３と、励起光によって測定領域５２の磁気微粒子群５２ａから発せられ、対物レンズ５３で集光されてダイクロックミラー５３を透過した蛍光から、励起光の反射光を除去するフィルター５５と、フィルター５５を透過した蛍光を集光する集光レンズ５６と、集光レンズ５６により集光されて結像された蛍光を検出する光検出器５７とを備えている。
【００３５】
光源６０としては、標識として用いた蛍光色素の励起に適したものを選択すればよく、キセノンランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプなどが用いられるほか、レーザーやＬＥＤを用いることもできる。測定領域５２では、磁場発生装置５７によって磁気微粒子３８が広くかつ薄く密集した磁気微粒子群５２ａが形成されており、対物レンズ５３を介した励起光が照射される。励起光により磁気微粒子群５２ａの磁気微粒子３８から発せられた蛍光と、測定領域５２で反射された励起光は、対物レンズ５３及びダイクロックミラー５４を介してフィルター５５に導かれる。フィルター５５では、励起光の反射光のみが除去されて、蛍光のみが透過され、集光レンズ５６で集光されて光検出器５７のセンサー上に結像されて検出される。光検出器５７としては、ＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラ、フォトマル、或いはアバランシェフォトダイオードなどを用いることができる。なお、デジタルカウント方式で検出する場合には、蛍光輝点数を求めることが好ましく、光検出器として位置分解能を有する２次元撮像素子を用いることが好ましい。
【００３６】
以上のように構成した本実施の形態における動作を説明する。
【００３７】
分析処理において、制御部１９は、試料容器ラック２に収納された試料容器１から試料分注機構１０によって反応容器８に試料を分注し、試薬容器ディスク５に収納された試薬容器４から試薬分注機構１１によって反応容器８に試薬を分注する。続いて、制御部１９は、インキュベータディスク９の反応容器８で混合された反応液（試料と試薬の混合液）を反応容器攪拌機構１４によって攪拌し、吸引機構１７によって分析ユニット１８に送液し、反応処理及び測定処理を実施する。
【００３８】
反応処理において、制御部１９は、磁場発生装置３７によって反応領域３６内に磁気微粒子３８の密集領域３６ａを形成させ、送液装置３３によって磁気微粒子３８の密集領域３６ａに反応液３９を通過させる。反応液２９が反応領域３６を通過した時点で送液方向を反転させて密集領域３６に再度反応液２９を通過させる。このとき、制御部１９は、磁場発生装置３７によって磁気微粒子３８に作用する磁場を０．５Ｈｚ（更に言えば０．０２Ｈｚ以上）で変動させる。
【００３９】
このように、反応支持体として用いた磁気微粒子３８を磁場発生措置３７で捕獲することによって反応流路３５の断面全体に亘る密集領域３６を形成し、その密集領域３６に分析対象の生体分子を含む複合体として形成された被反応分子を含む反応液２９を通すことによって、磁気微粒子と被反応分子との反応を促進させることができる。
【００４０】
図１０及び図１１は、本実施の形態における効果を説明する図であり、図１０は反応液を静置した場合と、反応液に本実施の形態の反応処理を適用した場合の反応速度を比較する図、図１１は本実施の形態によって反応領域に形成された密集領域における磁気微粒子の反応液に対する割合と反応効率との関係を示す図である。
【００４１】
図１０及び図１１の結果を得るにあたり以下のような実験を行った。
【００４２】
まず、反応流路３５として内径０．７２ｍｍのガラス製キャピラリー（Hilgenberg社製）、磁場発生装置３７として幅１０ｍｍ、高さ２０ｍｍ、厚み５ｍｍのネオジム磁石２枚を間隔５ｍｍで対向させてＸ−Ｙステージ（シグマ光機製）上に配置したものを用い、磁気微粒子２８として直径３００ｎｍの磁気微粒子（Ademtech社製）６０Ｍ個を分散させた５０ｕｌの反応液２９を流速２００ｕｌ／分で送液し、反応液２９が反応領域３６を通過した時点で送液方向を反転させて反応領域３６に再度反応液２９を通過させ、磁気微粒子２８が密集した密集領域３６ａを通過させ、磁場発生装置３７による磁場変動の周波数を０．５Ｈｚ、ネオジム磁石の移動距離５ｍｍで動作させた。
【００４３】
磁気微粒子には、マウス二次抗体付磁気微粒子（Ademtech社製G0503、anti-mouse IgG coated）を用い、これにマウスビオチン化抗体（R&D社製mAb ER-PR8 biotin）を、磁気微粒子の個数とマウスビオチン化抗体の濃度比が10：1になるように濃度を調整後、両者を混合し、１時間静置することで、磁気微粒子１個にビオチン付抗体を一分子固定した。蛍光ラベル材には、ストレプトアビジン付Ｒ−フィコエリスリン（Roche社製LumiGrade Ultrasensitive）を用い、ビオチンを導入した磁気微粒子２ｐＭ・５０ｕｌを反応チューブに入れ、磁石で集磁後、液をピペットで吸引・除去後、蛍光ラベル材溶液３０ｐＭ・５０ｕｌを入れ、反応液とした。反応液５０ｕｌを２本作成した。１本の反応液をシリンジ（テルモ社製）に入れ、シリンジポンプ（アイシス社製ヒュージョンタッチ２００）に取り付け、シリンジ出口とキャピラリーの間をシリコンゴムチューブでつなぎ、流速２００ｕｌ／分でシリンジからキャピラリーへ反応液５０ｕｌを送液した。キャピラリーの他方にもシリコンゴムチューブを２０ｃｍほどつなぎ、チューブの端は開放の状態とした。
【００４４】
反応液がネオジム磁石に差し掛かると、反応液中の磁気微粒子がトラップされ、かつ、ネオジム磁石の動きに合わせてキャピラリー管内を動いていることが観察された。反応液が磁石を通り過ぎた時に、シリンジポンプを吸引モードに切り替え、反応液を反対方向に移動させることで、再度、磁石近傍を通過させ、これを繰り返すことで、反応液を磁石近傍を往復で複数回通過させた。合計の反応時間は１０分とした。送液開始から１０分後、反応液をチューブの開放端から反応容器に回収した。一方、もう１本の反応液は、１０分間、静置することで反応させた。反応後、反応液中の磁気微粒子を集磁後、反応バッファーを５ｕｌ入れて分散させ、この５ｕｌの液を厚み５０ｕｍで８ｍｍ×８ｍｍの中抜き部を作ったＰＤＭＳ（Polydimethylpolysiloxane）シートをスライドガラスと１８ｍｍ×１８ｍｍのカバーガラスではさんで作成した観察用セルに封入し、直径５０ｍｍの円柱状ネオジム磁石の上に置き、蛍光顕微鏡に設置し、蛍光輝点数を計測した。対物レンズは２０倍とし、一視野のサイズは０．６６７×０．６６７ｍｍとした。視野観察した後、一視野あたりの輝点数を平均化して算出した。
【００４５】
図１０に示すように、反応液を静置で反応させた場合に比べて、本実施の形態のように反応支持体である磁気微粒子の密集領域を形成させ、その密集領域に反応液を通過させて反応させた場合の方が蛍光輝点数が約１０倍多く、したがって、反応速度が１０倍ほどに速くなっていることがわかる。以上のように、本発明の生体分子分析方法を用いることで、反応速度を著しく速くすることが出来ることが明らかとなった。
【００４６】
また、本願発明者は、反応液中の被反応分子と磁気微粒子の表面（捕獲プローブ分子等）との反応効率は、密集領域３６ａに占める磁気微粒子３８の体積割合が大きな影響を与えることを見出しており、密集領域３６ａに占める磁気微粒子の体積割合（％）と反応効率との関係を調査した。その結果、図１１に示すように、密集領域３６ａに占める磁気微粒子の体積割合が５０％を超えると反応効率が急激に大きくなることが分かった。これは、密集領域３６ａにおける磁気微粒子３８の間の距離が短くなることにより、密集領域３６ａを通過する時間内に被反応分子が磁気微粒子３８と衝突する確率が増加したためと考えられる。したがって、本実施の形態においては、磁気微粒子３８の密集領域３６ａに占める体積割合を５０％以上とする。
【００４７】
また、測定処理において、制御部１９は、磁場発生装置５７によって測定領域５２内に磁気微粒子群５２ａを形成させ、計測機構１０１によって蛍光輝点数（或いは、蛍光光量）を計測し、計測結果を記憶領域に記憶する。
【００４８】
以上のように構成した本実施の形態における作用効果を説明する。
【００４９】
従来技術のように、試料と試薬とを混合した反応液を攪拌することによって反応速度の向上を図る場合、反応する分子同士、すなわち、プローブ分子を結合した微粒子と解析対象の生体分子は溶液の流れに沿って概ね同一方向に移動するため、反応速度に大きく貢献する分子同士の衝突頻度に係る相対移動速度を大きくすることが難しく、反応速度の向上は限定的であり改善の余地があった。
【００５０】
これに対して本実施の形態においては、試料と試薬とが混合された反応液が送液される反応流路の予め定めた反応領域に磁気微粒子に作用する磁場を発生させる磁場発生装置を配置し、磁場発生装置によって反応領域内に磁気微粒子の密集領域を形成させ、その密集領域に反応液を通過させる反応処理を行うように構成したので、試料溶液中のプローブ分子を結合した微粒子と分析対象の生体分子との反応速度を飛躍的に向上することができ、分析のスループットを大幅に向上することができる。
【００５１】
なお、本実施の形態においては、標識として蛍光色素や蛍光タンパク質を用い、分析対象の生体分子と複合体を形成した標識の蛍光を測定することによって分析対象の生体分子の定量を行う場合について説明したが、これに限られず標識として標識として特定の電荷を有する微粒子を用いることも考えられる。すなわち、標識分子として特定の電荷を有する微粒子を含む分子を用い、電極上に磁気微粒子を固定した後、電極上における特定の電荷を有する微粒子の量を電極が検知する電荷量から定量することで、分析対象の生体分子の濃度情報を得ることができる。例えば、分析対象の生体分子を認識する抗体をポリスチレンビーズ表面に固定したものを標識分子として用いることができる。測定は、表面に磁気微粒子を固定した電極と対向電極とをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ:Phosphate buffered saline）などのバッファー中に挿入し、両電極間にマイナス５ボルトからプラス５Ｖ程度のバイアスを掃引・印加して、両電極間に流れる電流をピコアンメーターなどの電流計で測定することにより、電極上の標識分子の量（すなわち、分析対象の生体分子の量）を求めることができる。
【００５２】
＜第２の実施の形態＞
本発明の第２の実施の形態を図１２及び図１３を参照しつつ詳細に説明する。
【００５３】
第１の実施の形態においては、１つの反応流路を用いたのに対し、本実施の形態では、複数の反応流路を並列に用いるものである。
【００５４】
図１２は反応流路の分解斜視図であり、図１３は反応流路の縦断面図である。図中、第１の実施の形態と同様の部材には同じ符号を付し、説明を省略する。
【００５５】
図１２及び図１３に示すように、本実施の形態の複数の反応流路２３５は、上板ガラス２３５ａと、下板ガラスと２３５ｂと、上板ガラス２３５ａと下板ガラス２３５ｂに挟み込まれて接合されたＰＤＭＳシート２３５ｃとから構成されている。
【００５６】
上板ガラスと２３５ａ、下板ガラスと２３５ｂ、及び、ＰＤＭＳシート２３５ｃは、長さ方向の寸法が約１２８ｍｍ、幅方向の寸法が約６０ｍｍとなるよう構成されており、それぞれに複数設けられたアライメント用キリ穴２３８を合わせることによって正確に位置合わせができるように形成されている。また、上板ガラスと２３５ａは厚みｔ≒０．１７５ｍｍ、下板ガラス２３５ｂは厚みｔ≒１．０ｍｍ、ＰＤＭＳシート２３５ｃは厚みｔ≒０．０５ｍｍで形成されている。
【００５７】
ＰＤＭＳシート２３５ｃには、長さ方向に延在するような中抜き部２３９が複数（本実施の形態では６つ）並行に並べて配置されておりＰＤＭＳシート２３５ｃが上板ガラス２３５ａと下板ガラスと２３５ｂとに挟み込まれて接合されることにより、各中抜き部２３９が反応液が送液される複数の反応流路２３５となる。
【００５８】
上板ガラス２３５ａにおいて、各反応流路２３５の一方の端部に対応する位置には、反応液を注入するための注入口２３６がそれぞれ設けられており、各反応流路２３５の他方の端部に対応する位置には、反応液を排出するための排出口２３７がそれぞれ設けられている。
【００５９】
図１３に示すように、上板ガラスの上側面及び下板ガラスの下側面に沿って磁場発生装置を構成する板状の永久磁石３３７ａ，３３７ｂが配置されており、第１の実施の形態と同様に各反応流路２３５に対して永久磁石３３７ａ，３３７ｂを近接させる、或いは離間させる方向に駆動する駆動機構（図示せず）を備えている。
【００６０】
ＰＤＭＳシート２３５ｃは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のシートに複数の中抜き部２３９を作成するには、レーザーで中抜き部２３９に沿って描画することで容易に作成できる。また、金属などで鋳型を作成しておき、そこに、ポリマー液を流し込むことで複数の中抜き部２３９をもつポリマーシートを簡便に作成することができる。
【００６１】
その他の構成は第１の実施の形態と同様である。
【００６２】
以上のように構成した本実施の形態においても第１の実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００６３】
また、本実施の形態においては、反応流路をマルチ化することにより、複数の試料の反応を同時に行うことができる。
【００６４】
また、複数の反応流路に対して、一つの磁場発生装置で磁気微粒子の分散・位置制御を同時に行うことが容易に出来る。
【００６５】
なお、本発明は上記した各実施の形態に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。例えば、上記した実施の形態は本願発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を備えるものに限定されるものではない。
【符号の説明】
【００６６】
１・・・サンプル容器、２・・・サンプル容器ラック、３・・・ラック搬送ライン、４・・・試薬容器、５・・・試薬容器ディスク、８・・・反応容器、９・・・インキュベータディスク、１０・・・試料分注機構、１１・・・試薬分注機構、１４・・・反応容器攪拌機構、１７・・・吸引機構、１８・・・分析ユニット、１９・・・制御部、３０・・・反応部、３０ａ，３１ａ・・・基板、３１・・・測定部、３２・・・移送機構、３２ａ・・・吸引部、３２ｂ・・・吐出部、３３・・・反応液送液ユニット、３３ａ・・・ポンプ、３３ｂ・・・反応液保管部、３３ｃ・・・反応液保管部、３４・・・切換バルブ、３５・・・反応流路、３６・・・反応領域、３６ａ・・・密集領域、３７・・・磁場発生装置、３８・・・磁気微粒子、３９・・・反応液、１００・・・自動分析装置、１０１・・・計測機構
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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