(57)【要約】【課題】抗原Ａβ４３ペプチドには実質的に反応せず、抗原Ａβ４２ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体、及び、当該モノクローナル抗体を生産し得るハイブリドーマを提供すること。【解決手段】受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１４６３であるハイブリドーマ；当該ハイブリドーマにより産生される、抗原Ａβペプチドに対するモノクローナル抗体；及び抗原Ａβ４２ペプチドに反応し、抗原Ａβ４３ペプチドに反応しないモノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１４６３であるハイブリドーマ。
【請求項２】
受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１４６３であるハイブリドーマにより生産される、抗原Ａβペプチドに対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
抗原Ａβ４２ペプチドに反応し、抗原Ａβ４３ペプチドに反応しないモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号８で表される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号９で表される重鎖ＣＤＲ、配列番号１０で表される重鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列から構成される重鎖可変領域と、
配列番号１３で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１４で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１５で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域、又は、配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域と、を含む、モノクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号８で表される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号９で表される重鎖ＣＤＲ、配列番号１０で表される重鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン重鎖由来のヒト化重鎖フレームワーク配列から構成される重鎖可変領域と、
配列番号１３で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１４で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１５で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来のヒト化軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域、又は、配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来のヒト化軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域と、を含む、ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を含む、Ａβ検出又は測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原Ａβペプチドに対するモノクローナル抗体を生産し得るハイブリドーマ、及び、当該モノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（以下「ＡＤ」ともいう）は、初老期から老年期に起こる進行性の認知症を特徴とする疾患であり、現在、国内の患者数は１００万人以上と言われている。今後、人口の高齢化に伴いその数は確実に増加すると予想される。
【０００３】
早期にアルツハイマー病を診断するために、血液や髄液などの体液中に存在するβアミロイド（以下Ａβともいう）ペプチドを検出する方法が知られている。Ａβペプチドとは、４０〜４３個のアミノ酸からなるペプチドであり、アルツハイマー病ではＡβペプチドが凝集してアミロイドとなって、脳内に沈着することが知られている。
【０００４】
Ａβペプチドの中でも、４２個のアミノ酸からなるペプチドであるＡβ４２ペプチドはアルツハイマー病の因子マーカーと言われている。
【０００５】
一方、Ａβペプチドの凝集体である脳内老人斑を免疫組織学検査に付すると、４３個のアミノ酸からなるペプチドであるＡβ４３ペプチドが脳内老人斑の中心に局在していることが最近の研究で明らかにされている（非特許文献１を参照）。
【０００６】
抗原Ａβペプチドに反応するモノクローナル抗体はすでに知られており（例えば特許文献１を参照）、このようなモノクローナル抗体を含むＡβペプチド検出キットがすでに市販されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４７３８６９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｉｔｏ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ、“Ｐｏｔｅｎｔ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ａβ４３”、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１１年、ｐ．１０２３−１０３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上のように、Ａβペプチドの中でもＡβ４２ペプチドとＡβ４３ペプチドは異なる機能を有することから、血液や髄液などの体液中に存在するＡβペプチドを検出するにあたっては、Ａβ４２ペプチドとＡβ４３ペプチドを区別して検出できることが好ましいと考えられる。
【００１０】
しかしながら、本発明者らの検討によると、従来知られている抗原Ａβペプチドに反応するモノクローナル抗体は、Ａβ４２ペプチドとＡβ４３ペプチドの双方に反応するものであった。このように、Ａβ４３ペプチドには反応せず、アルツハイマー病の因子マーカーであるＡβ４２ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体は従来知られていなかった。
【００１１】
本発明は、上記現状に鑑み、抗原Ａβ４３ペプチドには実質的に反応せず、抗原Ａβ４２ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体、及び、当該モノクローナル抗体を生産し得るハイブリドーマを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−１４６３であるハイブリドーマに関する。
【００１３】
また、当該ハイブリドーマにより産生される、抗原Ａβペプチドに対するモノクローナル抗体にも関する。
【００１４】
さらには、抗原Ａβ４２ペプチドに反応し、抗原Ａβ４３ペプチドに反応しないモノクローナル抗体にも関する。
【００１５】
配列番号８で表される重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）、配列番号９で表される重鎖ＣＤＲ、配列番号１０で表される重鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列から構成される重鎖可変領域と、
さらにまた、配列番号１３で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１４で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１５で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域、又は、配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域と、を含む、モノクローナル抗体にも関する。
【００１６】
さらにまた、配列番号１３で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１４で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号１５で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来のヒト化軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域、又は、配列番号２１で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２２で表される軽鎖ＣＤＲ、配列番号２３で表される軽鎖ＣＤＲ、並びに、免疫グロブリン軽鎖由来のヒト化軽鎖フレームワーク配列から構成される軽鎖可変領域と、を含む、ヒト化モノクローナル抗体にも関する。
【００１７】
また本発明は、上述したいずれかのモノクローナル抗体を含む、Ａβ検出又は測定キットにも関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により提供されるモノクローナル抗体は、Ａβ４３ペプチドには実質的に反応せず、Ａβ４２ペプチドに特異的に反応するので、アルツハイマー病の因子マーカーであるＡβ４２ペプチドを特異的に検出することができる。本発明のモノクローナル抗体を含むＡβ検出キットは、従来の検出キットでは不可能であったＡβ４２ペプチドの特異的な検出が可能となるので、極めて有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３と市販の抗Ａβ抗体が示すＡβ４０ペプチドに対する反応性を示すグラフ
【図２】本発明のモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３と市販の抗Ａβ抗体が示すＡβ４２ペプチドに対する反応性を示すグラフ
【図３】本発明のモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３と市販の抗Ａβ抗体が示すＡβ４３ペプチドに対する反応性を示すグラフ
【図４】本発明のモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３と別の市販の抗Ａβ抗体が示すＡβ４２ペプチドに対する反応性を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者らは、抗原Ａβペプチドに反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する過程で、抗原Ａβ４３ペプチドには実質的に反応せず、抗原Ａβ４２ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体を産生する特異なハイブリドーマを樹立することに成功し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
当該ハイブリドーマは、寄託機関に寄託され、受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−１４６３である。当該ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、抗原Ａβ４０ペプチド及び抗原Ａβ４３ペプチドに反応せず、抗原Ａβ４２ペプチドにのみ反応する。そのため、Ａβの中でも、Ａβ４２ペプチドを特異的に検出することができるため、極めて有用である。また、当該ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体は、市販の抗Ａβ抗体と比較して、Ａβ４２ペプチドに対する反応性が高いという優れた特性を示す。
【００２２】
本発明のハイブリドーマの製造方法（免疫方法及び選択採取方法）は特に限定されない。抗原としてＡβ４２ペプチド又はその一部を使用して、ハイブリドーマの通常の製造方法により製造することができる。すなわち、抗原をラット等の免疫動物に注射し、それに対する抗体の産生に関するリンパ細胞を取り出し、これをミエローマと混合して細胞融合させ、これをＨＡＴ培地上で培養すればよい。
【００２３】
抗原としてＡβ４２ペプチドの一部を使用する場合には、特に、Ａβ４２ペプチドのＣ末端を含むアミノ酸配列を使用することが好ましい。Ａβ４０ペプチド（配列番号１６）、Ａβ４２ペプチド（配列番号１７）、及びＡβ４３ペプチド（配列番号１８）はそれぞれＣ末端のアミノ酸配列が異なるため、Ａβ４２ペプチドのＣ末端を含むアミノ酸配列を使用することで、Ａβ４２ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得することが可能となる。後述する実施例では、Ａβ４２ペプチドのアミノ酸配列のうちＣ末端側の３３位から４２位のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を抗原ペプチドとして使用した。
【００２４】
本発明のハイブリドーマの製造を確認する手法としては、当該ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を、例えば一般的な標識タンパク質により標識した上で、Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４３ペプチドそれぞれに対する反応性を測定すればよい。これと、従来公知の抗Ａβ抗体が示す、Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４３ペプチドそれぞれに対する反応性とを比較することで、Ａβ４２ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体を確認することができる。
【００２５】
本発明者が、本発明のモノクローナル抗体のアミノ酸配列を決定したところ、超可変領域である相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定することに成功した。モノクローナル抗体の重鎖の可変領域に含まれる３つのＣＤＲは、配列番号８〜１０で表されるアミノ酸配列を有する。これに対し、モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域に含まれる３つのＣＤＲは、配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
配列番号８〜１０で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲを、免疫グロブリン重鎖由来の重鎖フレームワーク配列に組み込んで重鎖可変領域を構成し、かつ、配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列、又は、配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲを、免疫グロブリン重鎖由来の軽鎖フレームワーク配列に組み込んで軽鎖可変領域を構成することで、抗体を作製することができる。このような抗体の作製方法については従来公知の方法を採用することができる。また、前記重鎖フレームワーク配列及び軽鎖フレームワーク配列としてヒト化重鎖フレームワーク配列及びヒト化軽鎖フレームワーク配列を適用することで、ヒト化抗体を作製することができる。
【００２７】
本発明はＡβ検出又は測定キットにも関し、当該Ａβ検出キットは、本発明のモノクローナル抗体を含む。本発明のＡβ検出キットは、ＡβのうちＡβ４２ペプチドを特異的に検出又は測定することができる。本発明のＡβ検出キットは、本発明のモノクローナル抗体以外に、洗浄液、２次抗体溶液、検出された測定値の濃度回帰に必要な検量線試薬等を含むことができる。また、発色反応によりＡβペプチドを検出する系の場合、本発明のＡβ検出キットは、さらに、発色液、発色停止液等を含むことができる。しかし、蛍光または発色によりＡβペプチドを検出する系の場合、発色液、発色停止液を含む必要はない。
【実施例】
【００２８】
以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００２９】
（実施例１）ハイブリドーマの取得
以下の手順により、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得した。
【００３０】
（１）抗原デザイン及びペプチド合成
抗原ペプチドとして、配列番号１で表されるアミノ酸配列のペプチドを合成した。このペプチドは、Ａβ４２ペプチドのアミノ酸配列のうちＣ末端側の３３位から４２位のアミノ酸配列に対して、そのＮ末端にＣｙｓを付加したものである。Ｃｙｓの付加は、キャリアータンパク質とのコンジュゲーションのためである。
【００３１】
（２）ペプチドコンジュゲーション
以下の内容で、前記（１）で合成した抗原ペプチドとキャリアータンパク質のペプチドコンジュゲーションを行った。
・方法：ＭＢＳ法
・キャリアータンパク質：ＫＬＨ（免疫用）／ＢＳＡ（ＥＬＩＳＡ用）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのペプチド−ＢＳＡ結合物のバンドシフトにより、ペプチドコンジュゲーションの完了を確認した。
【００３２】
（３）免疫
以下の内容で免疫を実施した。
・抗原調製：ペプチド−ＫＬＨ結合物とフロイントコンプリートアジュバントを体積比１：２で混合し、エマルジョンを作製した。
・抗原量：約１７０μｇ（キャリアータンパク質換算）
・免疫動物：ラット（ＷＫＹ／Ｉｚｍ）  １０週齢  雌１匹
・免疫箇所：ｆｏｏｔｐａｄ／皮下注射
免疫後にラットの健康状態に問題がないことを確認した。
【００３３】
（４）細胞融合
以下の内容で細胞融合を実施した。目視にて腸骨リンパ節の腫れが十分であることを確認した。
・方法：ＰＥＧ法
・リンパ球採取組織：腸骨リンパ節
・リンパ球数：１．０×１０８個
・ミエローマ：ＳＰ２（マウス）
・ハイブリドーマの培養：９６ウェルプレート８枚に細胞を播種し、ＨＡＴ選択培地にて培養した。
【００３４】
また、スクリーニング前日には、培養中の全ウェルの培地を除き、新たなＨＡＴ選択培地を加えた。本作業は培養液中に含まれる死滅したリンパ球由来の抗体を除去する目的で行った。
【００３５】
（５）第一回ＥＬＩＳＡスクリーニング
前記（４）により得られたハイブリドーマの培養上清を用い、以下に記載の実験条件にてＥＬＩＳＡスクリーニングを実施し、Ａβ４２ペプチドに対しては反応性を示すが、Ａβ４０ペプチドに対しては反応性を示さないウェルを選抜した。
【００３６】
（実験条件）
・プレート：ｃｏｓｔａｒ  ２７９７
・抗原：ペプチド−ＢＳＡ結合物／１０ｍＭ  リン酸Ｎａバッファー（ｐＨ７．０）、濃度３μｇ／ｍｌ（キャリアタンパク質換算）、１ウェルあたり５０μＬ、反応条件：４℃／一晩
・ブロッキング：１％ＢＳＡ／ＰＢＳ、１ウェルあたり１００μＬ、反応条件：室温／３０分
・１次抗体：培養上清／ブロッキング、希釈率２０倍、１ウェルあたり５０μＬ、反応条件：室温／６０分
・２次抗体：ａ−ＲａｔＩｇＧ（ＨＲＰ標識）／ブロッキング（ＳＩＧＭＡ社製、Ａ５７９５−１ＭＬ）、希釈率２００００倍、１ウェルあたり５０μＬ、反応条件：室温／３０分
・発色：ＨＲＰ／Ｈ２Ｏ２／ＴＭＢＺ  発色系
抗原である上記ペプチドとしては、Ａβ４２ペプチド及びＡβ４０ペプチドを使用した。なお、Ａβ４０ペプチドはネガティブコントロールである。
【００３７】
スクリーニングの結果、８００ウェル中、１２個の陽性ウェルが得られた。
【００３８】
（６）ハイブリドーマのクローニング
前記１２個の陽性ウェルからハイブリドーマをクローニングし、下記試験を実施した。
・限界希釈による細胞の播種
・ＥＬＩＳＡによる反応性のチェック（Ａβ４２ペプチドに対して反応性を示し、Ａβ４０ペプチドに対して反応性を示さないことを確認）
・ＥＬＩＳＡ陽性ウェルについて、顕微鏡観察によるシングルコロニー形成のチェック
以上の試験により、ＥＬＩＳＡ陽性シングルクローンのハイブリドーマを１つ得た。当該ハイブリドーマの名称を、６Ｃ１０Ｈ３とした。
【００３９】
（７）ハイブリドーマの寄託
前記ハイブリドーマを凍結保存し、独立行政法人製品評価技術基盤機構に寄託した。受託番号はＮＩＴＥ  Ｐ−１４６３であり、寄託日は２０１２年１１月８日である。
【００４０】
（実施例２）モノクローナル抗体の特異性評価
（標識抗体の作製）
ハイブリドーマ６Ｃ１０Ｈ３からモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３を取得した。次いで、以下に示す手順でモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３に対して標識を行い、標識抗体を得た。
【００４１】
同仁化学研究所製のＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−ＳＨのプロトコルに従って処理を実施した。すなわち、抗体２００μｇを含むサンプル溶液とキット付属のＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  １００μＬをキット付属のＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｕに加えた。ピペッティングにより軽く混合した後、８０００×ｇで１０分間遠心処理を行った。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  １００μＬをキット付属のＲｅｄｕｃｉｎｇ  Ａｇｅｎｔに加え、ピペッティングにより溶解した。この溶液１００μＬを、抗体が濃縮されているＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅのメンブレン上に加え、ピペッティングにより抗体とよく混合した。３７℃で３０分間反応した後、キット付属のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  １００μＬをＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに加え、８０００×ｇで１０分間遠心処理を行った。ろ液を捨てた後、ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  ２００μＬをＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに加え、８０００×ｇで１０分間遠心処理を行った。Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０μＬをキット付属のＳＨ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅに加え、ピペッティングにより溶解した。ＳＨ−Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを含む溶液を、還元抗体が濃縮されているＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅのメンブレン上に加えた。ピペッティングによりメンブレン上の抗体とよく混合した後、３７℃で１時間反応させた。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  １００μＬをＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅに加えた。８０００×ｇで１０分間遠心処理を行った。キット付属のＳｔｏｒａｇｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２００μＬを加えて、１０回程度ピペッティングし、標識抗体として回収した。
【００４２】
（反応性の測定）
標識抗体を１０００倍に希釈し、以下の手順でＡβ４０ペプチド、Ａβ４２ペプチド、及びＡβ４３ペプチドそれぞれに対する反応性を測定した。次いで、比較例として、市販のＡβ検出キット（和光社製）に含まれるモノクローナル抗体を用いて、同様に、各ペプチドに対する反応性を測定した。
【００４３】
抗体（ＢＮＴ７７）固相化マイクロプレート（和光社製キット付属）の各ウェルに、Ａβ４０ペプチド、Ａβ４２ペプチド、Ａβ４３ペプチド（それぞれペプチド研究所製）を０、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００ｐＭを添加し、３７℃にて２時間反応させた（２セット準備した）。その後、洗浄処理を５回実施した。
【００４４】
その後、１セットには、ＨＲＰ標識抗体（ＢＣ０５）溶液（和光キット付属）を各ウェルに１００μＬずつ添加した．別の１セットには、ＨＲＰ標識抗体（６Ｃ１０Ｈ３）溶液を各ウェルに１００μＬずつ添加した。添加後、室温下にて、攪拌しながら、５分間反応させた。洗浄処理を５回実施した後、１００μＬのＴＭＢ溶液を加えて室温暗所で３０分間反応させた。
【００４５】
１００μＬの停止液を加え、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍと６２０ｎｍの吸光度を測定した。
【００４６】
結果を図１〜図３に示す。
【００４７】
図１より、本発明のモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３及び市販のモノクローナル抗体のいずれも、Ａβ４０ペプチドに対して反応性を示さないこと、図２より、双方の抗体ともにＡβ４２ペプチドに対して反応性を示すことが分かる。これらに対し、図３より、本発明のモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３はＡβ４３ペプチドに対して反応性を示さないが、市販のモノクローナル抗体はＡβ４３ペプチドに対して反応性を示すことが分かる。
【００４８】
以上より、市販のモノクローナル抗体はＡβ４２ペプチドとＡβ４３ペプチドの双方に反応性を示し、両ペプチドを識別できないのに対し、本発明のモノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３はＡβ４２ペプチドに対して反応性を示すものの、Ａβ４３ペプチドに対しては反応性を示さないため、Ａβ４２ペプチドに特異的な反応性を有し、Ａβ４２ペプチドとＡβ４３ペプチドを識別できることが分かる。
【００４９】
（実施例３）モノクローナル抗体の認識能力評価
モノクローナル抗体６Ｃ１０Ｈ３と、一般的に研究者の使用頻度の高い抗Ａβ抗体である１Ｆ１１５抗体（ＩＢＬ社製）を使用して、Ａβ４２ペプチドの認識能力を比較した。
【００５０】
（事前準備）
まず、ビオチン標識キット（ＳＨ標識、同仁堂社製）を使用し、４Ｇ８抗体のビオチン化を行った。
【００５１】
次いで、ＨＲＰ標識キット（ＳＨ標識、同仁堂社製）を使用し、６Ｃ１０Ｈ３抗体及び１Ｆ１１５抗体（ＩＢＬ社製）のＨＲＰ標識を行った。
【００５２】
また、Ａβ４２ペプチド（Ｈｕｍａｎ，１−４２、ペプチド研究所社製）を希釈し、濃度が０，５，１０，２０，５０，１００，２００，又は５００ｐＭのＡβ４２ペプチド溶液を得た。
【００５３】
（評価方法）
まず、ビオチン化した４Ｇ８抗体をストレプトアビジン標識プレートに固定した。次に、Ｎ１０１（日油社）を使用し、ブロッキングを行った後、１×ＰＢＳでプレートを洗浄した。
【００５４】
次いで、調製したＡβ４２ペプチド溶液（０，５，１０，２０，５０，１００，２００，５００ｐＭ）を１００μＬずつ、プレートに添加し、室温で２時間、反応させた後、Ａβ４２ペプチド溶液をプレートから除去した。洗浄液を使用して、プレートの洗浄を各５回実施した。
【００５５】
各プレートに、同濃度のＨＲＰ標識抗体（６Ｃ１０Ｈ３抗体及び１Ｆ１１５抗体）のいずれかを添加し、反応を行った。その後、洗浄液を使用して、プレートの洗浄を各５回実施した（各５回）。
【００５６】
次いで、ＨＲＰ酵素用基質（ＳＩＧＭＡ社製）を１００μＬずつ添加し、室温で３０分間、反応させた。その後、停止液（ＫＰＬ社製）を添加し、波長４５０ｎｍ−６２０ｎｍでの発色測定を実施した。
【００５７】
図４では、２５００倍に希釈したＡβ４２ペプチド溶液を用いた場合のＨＲＰ標識６Ｃ１０Ｈ３抗体（黒色正方形）及びＨＲＰ標識１Ｆ１１５抗体（白色正方形）の発色値を示す。この図より、本発明の６Ｃ１０Ｈ３抗体は、市販されている抗Ａβ抗体である１Ｆ１１５抗体よりも、Ａβ４２ペプチドに対する反応性が優れていることが分かる。
【００５８】
（実施例４）モノクローナル抗体のＣＤＲ配列決定
以下の手順により本発明の６Ｃ１０Ｈ３抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を決定した。
【００５９】
（１）全ＲＮＡ抽出手順
ハイブリドーマ６Ｃ１０Ｈ３（約１×１０７細胞）を用い、次に示す手順をこの順で行って全ＲＮＡを回収した。
・ホモジナイズ工程：ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製，Ｎｏ．１５５９６−０２６）１ｍＬをピペッティングで添加、室温で５分間処理。
・ＲＮＡ抽出工程：クロロホルム０．２ｍＬを添加、転倒混和、室温で３分間処理。その後、遠心分離（１２０００ｇ，４℃，１５分間）を行い、水層を回収。
・第一回洗浄工程：イソプロパノール０．５ｍＬを添加、転倒混和、室温で１０分間処理。その後、遠心分離（１２０００ｇ，４℃，１０分間）を行い、沈殿を回収（上清を吸引除去）。
・第２回洗浄工程：７５％エタノール１ｍＬを添加、転倒混和。その後、遠心分離（１２０００ｇ，４℃，５分間）を行い、沈殿を回収（上清を吸引除去）し、風乾。
・調整工程：Ｒｎａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ０．０２ｍＬを添加し、５５℃で１０分間処理。
【００６０】
（２）ｃＤＮＡ作製手順
前記（１）で回収した全ＲＮＡを用いて、以下の手順でｃＤＮＡを作製した。
・変性工程：全ＲＮＡ５μｇを２０μＬに希釈。その後、６５℃で１０分間処理した後、急冷。その後、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＦｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットから、Ｂｕｌｋ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘを１１μＬ、ＤＴＴ溶液を１μＬ、プライマー（Ｎｏｔ  Ｉ  ｄ（Ｔ）１８）を１μＬ添加。
・インキュベーション工程：３７℃で１時間保持した。
【００６１】
（３）ＲＴ−ＰＣＲ
前記（２）で得られたｃＤＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ここでは、重鎖プライマーとして、配列番号２及び３で表される配列のプライマーを、軽鎖プライマーとして、配列番号４及び５で表される配列のプライマーを使用した。
【００６２】
（４）切り出し
前記ＲＴ−ＰＣＲで増幅されたバンドを、ＱＩＡＧＥＮ社製のゲル抽出キットを用いて切り出した後、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉを用いてＴＡクローニングを行った。
【００６３】
（５）配列決定
Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社製のＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔから、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒに特異的なプライマーを用いて配列決定を行った。
【００６４】
結果、６Ｃ１０Ｈ３抗体の重鎖は配列番号７で表されるアミノ酸配列からなり、そのうち、重鎖ＣＤＲは配列番号８〜１０で表されるアミノ酸配列からなることが判明した。一方、６Ｃ１０Ｈ３抗体の軽鎖は２つ確認された。軽鎖Ｎｏ．１は、配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなり、そのうち、軽鎖ＣＤＲは配列番号１３〜１５で表されるアミノ酸配列からなること、及び軽鎖Ｎｏ．２は、配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなり、そのうち、軽鎖ＣＤＲは配列番号２１〜２３で表されるアミノ酸配列からなることが判明した。配列番号６は、６Ｃ１０Ｈ３抗体の重鎖をコードする塩基配列、配列番号１１は、６Ｃ１０Ｈ３抗体の軽鎖Ｎｏ．１をコードする塩基配列、配列番号１９は、６Ｃ１０Ｈ３抗体の軽鎖Ｎｏ．２をコードする塩基配列である。
【００６５】
（実施例５）キメラ抗体の作製
以下の手順によりキメラ抗体（ヒト化抗体）を作製した。
【００６６】
（１）抗体遺伝子ＣＤＲ領域増幅
Ａｂ  ６Ｃ１０Ｈ３抗体遺伝子（重鎖および軽鎖）を組み込んだｐＧＥＭ−Ｔベクターを鋳型とし、以下のプライマーを用いてＰＣＲ法によりＣＤＲ領域を増幅した。ここでは、重鎖プライマーとして、配列番号２４及び２５で表される配列のプライマーを、軽鎖Ｎｏ．１プライマーとして、配列番号２６及び２７で表される配列のプライマーを使用した。
【００６７】
（２）制限酵素処理
上記ＰＣＲ産物を、下記制限酵素を用いて切断した。
重鎖：Ａｆｌ  ＩＩ  ＆  Ｎｈｅ  Ｉ
軽鎖：ＥｃｏＲ  Ｖ  ＆  ＢｓｉＷ  Ｉ
【００６８】
（３）キメラ抗体発現用ベクターに組み込み
Ｔ４ライゲースを用いて、制限酵素処理した各ＰＣＲ産物を、同じ制限酵素処理した下記ベクターに組み込んだ。なお、両ベクターともヒトＩｇＧ１遺伝子Ｆｃ領域がすでに組み込まれたものである。
重鎖：ｐＣＡＧＧＳベクター
軽鎖：ｐＣＡＧＧＳベクター
【００６９】
（４）配列確認
各ベクターに組み込んだＭａｂ  ６Ｃ１０Ｈ３由来ＣＤＲ領域遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーにより確認した。
【００７０】
（５）キメラ抗体の発現
ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔを宿主として用い、５ｍＬスケールで培養を行った。培養は全て３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。まず、６ｃｍディッシュ１枚にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で培養した。８０〜９０％コンフルエントになったところで、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの際には事前に、０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ  ２９３μｌにプラスミド７．０μｇ（重鎖：３．５μｇ、軽鎖：３．５μｇ）を混ぜたものと、０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ  ２９３μｌに１ｍｇ／ｍｌポリエチレンイミン溶液１０．６μｌを混ぜたものをそれぞれ用意した。この２つの溶液を混合し、２０分間静置後、２％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ  ３．５ｍｌに加え、これをトランスフェクション溶液とした。細胞を播種したディッシュから培地を除いた後、ディッシュにトランスフェクション溶液を全量注ぎ、１６時間培養した。ＦＢＳを含む培地を除き、ＰＢＳで洗浄した後、０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭを５ｍｌ注ぎ、さらに３日間培養した。培養上清を回収し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と、抗ヒトＦｃ抗体及び抗ヒト軽鎖抗体を用いたウェスタンブロッティングとによって発現を確認した。
【００７１】
（６）キメラ抗体の反応性の確認
ＥＬＩＳＡ法を用いて、上記で得られたキメラ抗体がＡβ４２ペプチドを認識することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明により提供されるモノクローナル抗体は、ＡＤ患者やＡＤの可能性がある健常者から採取した検体を利用した体外でのＡＤ診断を行うに際し、検体に含まれるＡβペプチドの検出を可能とする。また、本発明により提供されるモノクローナル抗体は、ヒト化抗体とすることにより抗体医薬として使用できる可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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