(57)【要約】      （修正有）【課題】ミツバチの女王蜂幼虫に由来し、ローヤルゼリーを分解して機能性ペプチドを得る新規タンパク質分解酵素及び当該酵素を用いたタンパク質分解物の製造方法の提供。【解決手段】（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（Ｂ）前記特定のアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド、又は（Ｃ）前記特定のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド、からなるキモトリプシン様プロテアーゼ。フェニルメチルスルフォニルフルオリド及びトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトンによって阻害されるが、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドによっては阻害されないキモトリプシン活性を有する、キモトリプシン様プロテアーゼ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド、
からなるキモトリプシン触媒ドメインを有する、キモトリプシン様プロテアーゼ。
【請求項２】
フェニルメチルスルフォニルフルオリド及びトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトンによって阻害されるが、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドによっては阻害されないキモトリプシン活性を有する、請求項１に記載のキモトリプシン様プロテアーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のキモトリプシン様プロテアーゼを触媒とし、ｐＨ９〜１２でタンパク質を分解することを特徴とする、タンパク質分解物の製造方法。
【請求項４】
前記タンパク質がローヤルゼリーである、請求項３に記載のタンパク質分解物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミツバチ（Apis mellifera）の幼虫に発現している、新規なキモトリプシン様プロテアーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
ミツバチは、幾つかのカーストを有する社会的な昆虫である。女王蜂か働き蜂かは、幼虫期の食物により、決定されるカーストである。ローヤルゼリー（ＲＪ）は、女王バチと幼虫のための栄養物であるが、働き蜂の下咽頭腺と顎下腺から分泌されており、女王蜂の分化で重要な役割を果たす。ＲＪはタンパク質リッチ（乾燥質量の約４０％）な食物であり、最近、ＲＪ中の５７ｋＤａタンパク質（ｒｏｙａｌａｃｔｉｎ）が女王分化に極めて重要であると報告された（非特許文献１）。他方では、ヒトの健康のためのＲＪのいくつかの機能的活性も報告された。ＲＪは、多くの国で一般的に健康食品として使用されている。その上、市販プロテアーゼによって生産されているＲＪタンパク質由来のペプチドは、サルコペニア防止作用と同様に、酸化防止作用（非特許文献２〜４）、降圧作用（非特許文献５、６）、抗骨粗鬆症作用（非特許文献７）、及びコレステロール低下作用（非特許文献８）を含む、様々な特性を示す。しかしながら、女王蜂と幼虫が実際にどのようしてＲＪを消化するのかは、未だ明らかではない。
【０００３】
トリプシン、キモトリプシン、システインプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、及びカルボキシペプチダーゼ等の幾つかの消化プロテアーゼが、昆虫で見つかっている（非特許文献９）。幾つかのレポートは、トリプシン活性又はキモトリプシン活性が、ミツバチの食物消化において重要な役割を果たしていることを示唆している。例えば、Burgessらは、クニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）ダイズトリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）の経口摂取は、働き蜂の死亡率を増加させ、ハチ中腸におけるトリプシン活性、キモトリプシン活性、及びエラスターゼ活性を低下させることを報告した（非特許文献１０）。それに応じて、食物中に１．０％のＳＴＢＩを与えたミツバチの幼虫は、高い死亡率を示し、成虫になっても低体重を示した（非特許文献１１）。加えて、Giebelらは、ミツバチの働き蜂の成虫の中腸から４つのエンドペプチダーゼを見つけた（非特許文献１２）。このうちの１つは、ウシのトリプシンに類似しており、残り３つはウシのキモトリプシンに類似していた。これらのプロテアーゼのうち１つのみが、女王蜂の成虫と働き蜂の幼虫で見つかった。女王蜂の成虫と働き蜂の幼虫で見つかったプロテアーゼは、キモトリプシン様の特性を有している分子量約３０ｋＤａのプロテアーゼであり、トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）及びフェニルメチルスルフォニルフルオリド（ＰＭＳＦ）によって阻害されるが、トリプシン基質（ＢＡＥＥ及びＢＡＮＡ）及びキモトリプシン基質（ＡＴＥＥ、ＡＰＮＥ、及びＧｌｕｐＮａ）は消化できなかった。働き蜂の成虫から得られたトリプシン様プロテアーゼは、女王蜂と幼虫では見つからなかった。Dahlmannらは、働き蜂の発達の過程で、例えば、巣房に蓋をする前と後の幼虫、蛹、及び成虫における、キモトリプシンプロテアーゼ活性、トリプシンプロテアーゼ活性、及びアミノペプチジルプロテアーゼ活性の変化を調べた（非特許文献１３）。彼らは、３つのプロテアーゼ活性は、同じカースト内でそれぞれの発達段階において変化することを示した。彼らは、幼虫期におけるキモトリプシン活性が、巣房に蓋をした後のもはや食事を必要としなくなった状態では減少することも示した。
【０００４】
これらの先行技術文献による報告は、キモトリプシン酵素は、ハチ幼虫による食物の消化で重要な役割を果たす可能性があることを示唆する。ミツバチゲノムには、４４のセリンタイププロテアーゼと１２のセリンタイププロテアーゼホモログがある（非特許文献１４、１５）。しかしながら、これらのミツバチセリンプロテアーゼ遺伝子にコードされたプロテアーゼの発現と機能について、ほとんど有用な情報がない。
【０００５】
主に食物の違いのため、ミツバチの消化プロテアーゼの構成は、カースト、ステージ（幼虫か成虫か）、及び年齢に依存して異なる。ミツバチの消化プロテアーゼに関する以前の報告は、トリプシン様プロテアーゼ及びキモトリプシン様プロテアーゼが、成虫の働き蜂の食物の消化に含まれている（非特許文献１２、１３、１６）。成虫及び幼虫の中腸から分離された昆虫のキモトリプシン様酵素の大部分は、ｐＨ８〜９の範囲内に至適ｐＨがある（非特許文献９）。ミツバチの成虫の腸内ｐＨは、弱酸性であり、幼虫ではほぼ中性であるが（非特許文献１７）、ミツバチの成虫のキモトリプシン様及びトリプシン様酵素も、ｐＨ７〜９の範囲内で高い活性を示した（非特許文献１６、１８）。その他、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は典型的なメタロプロテアーゼ阻害剤であるが、ゴミムシダマシの幼虫（非特許文献１９〜２１）、コフキコガネ（非特許文献２２）、シロイチモンジョトウの幼虫（非特許文献２３）、及びサソリ（非特許文献２４）の酵素のような幾つかのキモトリプシン様又はトリプシン様消化酵素がＥＤＴＡによって弱く阻害されることが報告されている。また、ゴミムシダマシの幼虫（非特許文献２０）とカミアリ（非特許文献２５）のキモトリプシン様酵素は、Ｎ−トシル−Ｌ−リジン  クロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）とＴＰＣＫの両方によって影響を受けなかった。加えて、カミアリのキモトリプシンは、異なった哺乳類のシステムに由来するホモログ中でみつかるキモトリプシンとは、顕著に類似しているが、相違点があることも報告されている（非特許文献２６）。しかしながら、ミツバチの女王蜂又は幼虫の消化プロテアーゼについての報告はわずかであった。
【０００６】
最近、本発明者らによって、２〜３日齢の女王蜂の幼虫由来の、カルボキシペプチダーゼＡ様活性とキモトリプシン様活性を含む、ＲＪタンパク質を消化し得る３つのプロテアーゼ画分が報告された（非特許文献２７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kamakura, Nature, 2011, vol.473, p.478-483.
【非特許文献２】Guo et al., Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 2008, vol.54, p.191-195.
【非特許文献３】Guo et al., Food Chemistry, 2009, vol.113, p.238-245.
【非特許文献４】Nagai et al., Journal of Medicinal Food, 2006, vol.9, p.363-367.
【非特許文献５】Tokunaga et al., Biological and pharmaceutical bulletin, 2004, vol.27, p.189-192.
【非特許文献６】Matsui et al., Journal of Nutritional Biochemistry, 2002, vol. 13, p.80-86.
【非特許文献７】Hidaka et al., Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine , 2006, vol.3, p.339-348
【非特許文献８】Nakasa et al., Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi, 2003, vol.10, p.463-467.
【非特許文献９】Terra et al., Comparative Biochemistry and Physiology, 1994, vol.109B, p.1-62.
【非特許文献１０】Burgess et al., Journal of Insect Physiology, 1996, vol.42, p.823-828.
【非特許文献１１】Brodsgaard et al., Apidologie, 2003, vol.34, p.139-145.
【非特許文献１２】Giebel et al., Comparative Biochemistry and Physiology, 1971, vol.38B,p.197-210.
【非特許文献１３】Dahlmann et al., Insect Biochemistry, 1978, vol.8, p. 203-211.
【非特許文献１４】Honeybee Genome Sequencing Consortium, Nature, 2006, vol.443, p.931-949.
【非特許文献１５】Zou et al., Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2006, vol.15, p.603-614.
【非特許文献１６】Moritz et al., Journal of Insect Physiology, 1987, vol.12, p.923-931.
【非特許文献１７】Herbert et al., Apidologie, 1983, vol.14, p.191-196.
【非特許文献１８】Jimenez et al., Apidologie, 1989, vol.20, p.287-303.
【非特許文献１９】Vinokurov et al., Comparative Biochemistry and Physiology Part B, 2006, vol.145, p.126-137.
【非特許文献２０】Elpidina et al., Biochimie, 2005, vol.87, p.771-779.
【非特許文献２１】Tsybina et al., Biochemistry (Moscow), 2005, vol.70, p.370-377.
【非特許文献２２】Wagner et al., Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, vol.32, p.803-814.
【非特許文献２３】Herrero et al., Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2005, vol.35, p.1073-1082.
【非特許文献２４】Louati et al., Lipids in Health and Disease, 2011, vol.10, p.121
【非特許文献２５】Whitworth et al., Journal of Biological Chemistry, 1998, vol.273, p.14430-14434.
【非特許文献２６】Botos et al., Journal of Molecular Biology, 2000, vol.298, p.895-901.
【非特許文献２７】Matsuoka et al., Apidologie, 2012, vol.43, p.685-697.
【非特許文献２８】Moore, Journal of Biological Chemistry, 1968, vol.243, p.6281-6283.
【非特許文献２９】Shevchenko et al., Analytical Chemistry, 1996, vol.68, p.850-858.
【非特許文献３０】Jones et al., Science, 2004, vol.305, p.402-404.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ミツバチの女王蜂幼虫に由来し、ローヤルゼリーを分解して機能性ペプチドを得るために好適な新規タンパク質分解酵素及び当該酵素を用いたタンパク質分解物の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ミツバチの女王蜂幼虫のホモジネートから、カルボキシペプチダーゼ様活性とキモトリプシン様活性を含むフラクションを分離し、当該フラクションに含まれているキモトリプシン様プロテアーゼ（ＨＣＬＰＡＳＥ）を同定し、その酵素活性を解析することにより、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下のキモトリプシン様プロテアーゼ及びタンパク質分解物の製造方法を提供するものである。
［１］  （Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド、
からなるキモトリプシン触媒ドメインを有する、キモトリプシン様プロテアーゼ。
［２］  フェニルメチルスルフォニルフルオリド及びトシル−Ｌ−フェニルアラニンクロロメチルケトンによって阻害されるが、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリドによっては阻害されないキモトリプシン活性を有する、前記［１］のキモトリプシン様プロテアーゼ。
［３］  前記［１］又は［２］のキモトリプシン様プロテアーゼを触媒とし、ｐＨ９〜１２でタンパク質を分解することを特徴とする、タンパク質分解物の製造方法。
［４］  前記タンパク質がローヤルゼリーである、前記［３］のタンパク質分解物の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、ＲＪを主な栄養源とするミツバチの女王幼虫に由来する酵素である。このため、当該キモトリプシン様プロテアーゼは、特に、ＲＪの分解酵素として有益である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１において、ミツバチの女王幼虫からの、カルボキシペプチダーゼ様活性を示すフラクション（フラクションＩ）及びキモトリプシン様活性を示すフラクション（フラクションＩＩ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図２】実施例２において、大腸菌で発現させたリコンビナントＧＳＴタグ−キモトリプシン様プロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。
【図３】実施例２において、リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼのキモトリプシン活性に対するｐＨ及び温度の効果を調べた結果を示す。
【図４】実施例２において、リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼの各基質に対するキモトリプシン活性の測定結果（相対値）を示す。
【図５】実施例３において、大腸菌及び昆虫細胞（ＳＦ９細胞）で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示した図である。
【図６】実施例３において、大腸菌及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥの酵素活性のｐＨに対する影響を調べた結果を示す。
【図７】実施例３において、大腸菌及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥの酵素活性の温度に対する影響を調べた結果を示す。
【図８】実施例３において、大腸菌及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥの各基質に対するキモトリプシン活性の比活性の測定結果を示す。
【図９】実施例３において、大腸菌及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥのキモトリプシン活性に対する各阻害剤の影響を調べた結果を示す。
【図１０】実施例４において、大腸菌及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥによる、ＲＪタンパク質の分解の経時的変化を調べた結果を示す。
【図１１】実施例５において、昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥ及び女王幼虫の粗酵素による、ＲＪタンパク質の分解の経時的変化を調べた結果を示す。
【図１２】実施例６において、様々な濃度のＳＤＳ存在下における、昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥによるＲＪタンパク質の分解の経時的変化を調べた結果を示す。
【図１３】実施例６において、様々な濃度のＳＤＳ存在下における、昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰＡＳＥのキモトリプシン活性を調べた結果を示す。
【図１４】実施例７において、女王蜂の幼虫の体重の経時的変化を調べた結果を示す。
【図１５】実施例７において、女王蜂の幼虫におけるＨＣＬＰＡＳＥのｍＲＮＡ発現量の経時的変化を調べた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［キモトリプシン様プロテアーゼ］
本発明者らは、ミツバチの女王幼虫は、ＲＪを消化して機能性ペプチドを作り出す効率的なプロテアーゼを持っているのだろうと考えた。そこで、後記実施例に示すように、ミツバチの女王幼虫のホモジネートを、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけ、カルボキシペプチダーゼ活性を示すフラクションとキモトリプシン活性を示すフラクションを分離し、当該フラクションに含まれていたカルボキシペプチダーゼＢ様プロテアーゼとキモトリプシン様プロテアーゼを単離し同定した。同定されたカルボキシペプチダーゼＢ様プロテアーゼは、ミツバチゲノム解析により明らかにされた塩基配列情報から、カルボキシペプチダーゼＢ様プロテアーゼと推定されていたタンパク質（ＸＰ＿６２３７２７）であった。また、同定されたキモトリプシン様プロテアーゼは、同じくミツバチゲノムの塩基配列情報から、キモトリプシン様プロテアーゼと推定されていたタンパク質（ＸＰ＿３９４３７０、ｇｉ｜４８０９５１５９）であった。これらの２種類のプロテアーゼは、ミツバチの女王幼虫において実際に発現して機能しているプロテアーゼとしては、初めて見つかったものである。本発明者らは、同定されたキモトリプシン様プロテアーゼを、ミツバチキモトリプシン様プロテアーゼ（ｈｏｎｅｙｂｅｅ  ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ；ＨＣＬＰＡＳＥ）と名付けた。
【００１４】
すなわち、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるキモトリプシン触媒ドメインを有する、キモトリプシン様プロテアーゼである
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＨＣＬＰＡＳＥ）、
（Ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド、又は
（Ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、キモトリプシン活性を有するポリペプチド。
【００１５】
前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。各アミノ酸配列において、欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の位置は、欠失等されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが、キモトリプシン活性を有する限り、特に限定されるものではない。
【００１６】
前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、９０％以上であれば特に限定されないが、９３％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましく、９８％以上であることがよりさらに好ましい。なお、アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。
【００１７】
なお、ＰＲＯＳＩＴＥ (http://prosite.expasy.org/) により、ＨＣＬＰＡＳＥの酵素活性部位は、配列番号１で表されるアミノ酸配列中、４１番目のヒスチジン残基（His-41）、８７番目のアスパラギン残基（Asn-87）、及び１７８番目のセリン残基（Ser-178）であると推測される。このため、前記（Ｂ）及び前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列に対して置換等がなされるアミノ酸は、４１、８７、及び１７８番目のアミノ酸以外とする。
【００１８】
本発明において、キモトリプシン活性は、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニンｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）を基質とする加水分解酵素活性を意味する。本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、ＳＡＡＰＦｐＮＡに対する加水分解酵素活性を有しており、スクシニル−アラニル−アラニル−プロリル−ロイシンｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＰＬｐＮＡ）に対する加水分解酵素活性も有しているが、スクシニル−アラニル−アラニル−アラニンｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＡｐＮＡ）、及びＮ−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニンｐ−ニトロアニリド（ＢＡＰＡ）に対する加水分解酵素活性は有していない。
【００１９】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、ＰＭＳＦ及びＴＰＣＫによって阻害される。本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼとしては、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）、ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、アンチパイン（Ａｎｔｉｐａｉｎ）、ペプスタチンＡ（Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ）によってはそのキモトリプシン活性が阻害されないことが好ましい。なお、ＰＭＳＦ及びＡＥＢＳＦはセリンプロテアーゼ阻害剤であり、ＴＰＣＫはキモトリプシン阻害剤であり、ロイペプチン及びアンチパインはセリン及びシステインプロテアーゼ阻害剤であり、ペプスタチンＡはアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤である。
【００２０】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、少なくとも２０〜５０℃でキモトリプシン活性を示し、２０〜６０℃でキモトリプシン活性を示すものが好ましい。
また、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、少なくともｐＨ７〜９でキモトリプシン活性を示し、ｐＨ７〜１２でキモトリプシン活性を示すものが好ましい。
【００２１】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるキモトリプシン触媒ドメインのみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。例えば、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに由来するキモトリプシン活性を損なわない限り、その他の機能ドメインを有していてもよい。
【００２２】
例えば、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えばＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＳＵＭＯ（Ｓｍａｌｌ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｒｅｌａｔｅｄ（ｌｉｋｅ）  Ｍｏｄｉｆｉｅｒ）タグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、及びＧＳＴタグ等の組換えタンパク質の発現・精製において汎用されているタグを用いることができる。また、これらのタグと前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるキモトリプシン触媒ドメインとを、特定の酵素によって切断可能なペプチドリンカーで連結させておいてもよい。
【００２３】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、当該キモトリプシン様プロテアーゼをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクターを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。使用されるタンパク質発現系としては、例えば、大腸菌等の原核細胞の発現系であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、植物細胞等の真核細胞の発現系であってもよい。
【００２４】
前記（Ａ）の配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、ミツバチの女王幼虫から抽出されたｍＲＮＡを鋳型としたＲＴ−ＰＣＲにより得ることができる。また、得られたポリヌクレオチドに対して、塩基の変異を導入する遺伝子組換え技術を用いることにより、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを人工的に合成することもできる。
【００２５】
タンパク質発現系に導入される発現ベクターとしては、使用するタンパク質発現系の種類に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。また、発現ベクターへのキモトリプシン様プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの組込みは、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより行うことができる。また、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
【００２６】
発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）−カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等がある。
【００２７】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼとしては、タンパク質発現系から回収した後にリフォールディング処理が不要であり、より比活性の高い酵素を効率よく合成可能であることから、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドにＨｉｓタグ又はＳＵＭＯタグが付加されたものが好ましく、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドとＨｉｓタグ又はＳＵＭＯタグが、特定の酵素によって切断可能なペプチドリンカーで連結させたものがより好ましい。例えば、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドとＨｉｓタグ又はＳＵＭＯタグを切断可能なペプチドリンカーで連結させたキモトリプシン様プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを組込んだ発現ベクターを、大腸菌や昆虫細胞、哺乳細胞等の発現系の宿主細胞に導入して形質転換体を製造する。当該形質転換体を培養し、発現させたキモトリプシン様プロテアーゼを回収することができる。回収したキモトリプシン様プロテアーゼは、そのままタンパク質分解酵素として使用してもよく、タグを切断した後に使用してもよい。
【００２８】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、他のキモトリプシンと同様に、タンパク質分解酵素として使用できる。酵素反応の温度やｐＨは、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼがキモトリプシン活性を発揮し得る範囲内であればよい。例えば、ｐＨ９〜１２で、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼを基質とするタンパク質に接触させることにより、当該タンパク質を分解し、タンパク質分解物を製造することができる。タンパク質分解反応の温度は、２０〜４０℃で行ってもよいが、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼのキモトリプシン様活性がより高いことから、４０〜６０℃で行うことが好ましい。
【００２９】
本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、ミツバチの女王幼虫において発現していた消化酵素であり、ＲＪを消化して機能性ペプチドを作り出す効率的なプロテアーゼであることが期待できる。このため、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、特にＲＪの分解に使用することが好ましい。ＲＪの分解においては、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼのキモトリプシン様活性をより高められることから、低濃度の陰イオン性界面活性剤の存在下で行うことが好ましく、低濃度のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の存在下で行うことがより好ましく、０．０１〜０．０５％のＳＤＳの存在下で行うことがさらに好ましい。
【００３０】
ミツバチの女王と幼虫がどのようにしてＲＪを消化し、その発達及び生理に役立てるのかについては、未だ明らかではない。本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、ミツバチの発達と分化の解析において有用なツールとなる。また、健康食品としてのＲＪの機能のメカニズムを明らかにし、さらに機能的な価値を開発するためにも、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは有用である。
【実施例】
【００３１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］
ミツバチの女王幼虫由来のプロテアーゼ、具体的には、非特許文献２７に開示されている、ミツバチ女王の幼虫から得られたキモトリプシン活性とカルボキシペプチダーゼ活性を含むプロテアーゼフラクション中のプロテアーゼを単離し同定した。
ミツバチの幼虫のプロテアーゼの質量分析のために、まず、非特許文献２７に記載の通り、ミツバチ女王の幼虫のタンパク質を陽イオン交換とゲル濾過クロマトグラフィーによって分離した。キモトリプシン活性を含むフラクション（フラクションＩ）とカルボキシペプチジル活性を含むフラクション（フラクションＩＩ）を含むフラクションの活性を、それぞれ、ＳＡＡＰＦｐＮａ又はＮ−カルボベンゾオキシ−グリシル−L−フェニルアラニン（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ）を基質として決定した。フラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。詳細を以下に示す。
【００３３】
＜サンプル調製＞
２〜３日齢のミツバチの女王幼虫は、秋田屋本店株式会社（岐阜県、日本）から得た。ミツバチの女王幼虫をホモジナイズし、ナイロンメッシュを用いて濾過した。ホモジネートは、等量の５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）で希釈した後、１００００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離処理された。透明な黄色がかった中間層を回収し、最初にガラス繊維ろ紙（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製、東京(日本))、次いで０．２０μｍのセルロースアセテートフィルター（Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）に透過させて濾過し、粗酵素液（ＬＣ）を得た。
【００３４】
＜カラムクロマトグラフィー＞
プロテアーゼは、陽イオン交換カラムクロマトグラフィーとゲル濾過カラムクロマトグラフィーで精製した。陽イオン交換カラムクロマトグラフィーのｐＨ値は、より高い比活性を示す酵素を回収するために、予備実験により調べた。粗酵素液の５ｍＬの相当量を、２０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．６）により平衡化された１ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製、リトル・チャルフォント、イギリス）にロードした。当該カラムは、カラム容量の５倍量の２０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．６）により洗浄した後、タンパク質を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する２０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．６）により溶出した。ゲル濾過カラムクロマトグラフィーは、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって行った。陽イオン交換カラムからの溶出物を、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）により平衡化されたＨｉＬｏａｄ１６／６００ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ｐｇカラム（１．６×６０ｃｍ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。タンパク質は、同じバッファーで、２ｍＬのフラクション容量で０．７ｍＬ／分の流量で溶出して、２８０ｎｍの吸光度で検出した。
【００３５】
＜キモトリプシン様プロテアーゼアッセイ＞
キモトリプシンプロテアーゼ活性は、ＳＡＡＰＦｐＮＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）を基質とする加水分解によって決定した。反応混合物は、３８６μＬの５０ｍＭ  トリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）、２μＬの５０ｍＭ  ＳＡＡＰＦｐＮＡのジメチルホルムアミド溶液、及び１０μＬのサンプルを含有し、３７℃で１０分間インキュベートした。反応は、２０μＬの氷酢酸を添加して停止させた。遊離のｐ−ニトロアニリンの吸光度を４０５ｎｍで測定した。１ユニットの活性は、標準的なアッセイ条件下で１分間当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量に相当する。
【００３６】
＜カルボキシペプチダーゼ様プロテアーゼアッセイ＞
カルボキシペプチダーゼ活性は、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として決定した。反応混合物は、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有するトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶解させた１ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅを１９０μＬと、１０μＬのサンプルとを含有し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応は、６００μＬの０．４Ｍ  酢酸バッファー（ｐＨ５．０）を添加して停止させた。遊離のフェニルアラニンの吸光度を、ニンヒドリンアッセイにより決定した（非特許文献２８）。１００μＬのサンプルを別のチューブに回収し、１００μＬのニンヒドリン試薬（２％溶液、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。サンプルを１００℃で１５分間インキュベートした。インキュベート後、１ｍＬの氷冷エタノールをサンプルに添加した。遊離のフェニルアラニンの吸光度を５７０ｎｍで決定した。１ユニットの活性は、標準的なアッセイ条件下で１分間当たり１μｍｏｌのフェニルアラニンを遊離させる酵素量に相当する。
【００３７】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ＞
カラムクロマトグラフィーによって回収された、カルボキシペプチダーゼ活性を含むフラクション（フラクションＩ）とキモトリプシン活性を含むフラクション（フラクションＩＩ）の中のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。
【００３８】
フラクションＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１（Ａ）に、フラクションＩＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１（Ｂ）に、それぞれ示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたフラクションＩに含まれているタンパク質のうち、図１（Ａ）中の番号１〜７をふったバンドは、ＥＳＩ−イオントラップＭＳのために切り出されたタンパク質スポットを示す。同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたフラクションＩＩに含まれているタンパク質のうち、図１（Ｂ）中の番号１〜７をふったバンドは、エレクトロスプレ−イオン化イオントラップマススペクトロメトリー（ＥＳＩ−ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ＭＳ）のために切り出されたタンパク質スポットを示す。
【００３９】
＜マススペクトロメトリーとデータベースサーチ＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、切除されたタンパク質スポットは、トリプシンによるゲル内消化された（非特許文献２９）。サンプルは、ナノフロー多次元ＨＰＬＣシステム（Paradigm MS4; Michrom BioResources、オーバーン、カリフォルニア州）を用いて分離し、ＥＳＩ−ｉｏｎ  ｔｒａｐ  ＭＳ（ＬＣＱＤＥＣＡＸＰ；  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）によって最適な条件下（キャピラリー温度、２００℃；キャピラリー圧、３．０Ｖ；及びスプレー圧、１．９０ｋＶ）で解析した。ペプチド配列は、ＭＡＳＣＯＴソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．、ロンドン、イギリス）を用いてプロテインデータベース（ＭＳＤＢ）に対して探索した。
【００４０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから得られた各タンパク質を、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した。カルボキシペプチダーゼ様プロテアーゼフラクション及びキモトリプシン様プロテアーゼフラクション中のプロテアーゼの同定結果を表１に示す。ミツバチゲノムデータベースから、フラクションＩの約４０ｋＤａであったＮｏ．４のバンド（図１（Ａ））はカルボキシペプチダーゼＢ様プロテアーゼ（ＸＰ＿６２３７２７）であると同定され、フラクションＩＩの約２５〜２８ｋＤａであったＮｏ．１のバンド（図１（Ｂ））はキモトリプシン様プロテアーゼ（ＸＰ＿３９４３７０）（配列番号１）であると同定された。これらの結果は、ＳＡＡＰＦｐＮａ又はＺ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅの酵素アッセイの結果と適合した。
【００４１】
【表１】
2016052302.tif 000002
【００４２】
＜Ｎ末端アミノ酸配列＞
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、フラクションＩＩのタンパク質を、セミドライブロッティングによりＰＶＤＦ膜にトランスファーし、各バンドを切り出した。キモトリプシン様タンパク質のＮ末端アミノ酸配列を、転写したＰＶＤＦ膜片から、ペプチドシークエンサー（Ｍｏｄｅｌ  ４９１；  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア州）を用いて解析した。
【００４３】
すなわち、２〜３日齢の女王バチの幼虫のホモジネートから分離されたフラクションから、それぞれ、カルボキシペプチダーゼの基質であるＺ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅとキモトリプシンの基質であるＳＡＡＰＦｐＮａを加水分解できる２種のプロテアーゼが同定された。マススペクトロメトリーとＭＡＳＣＯＴ検索は、これらの活性が、ミツバチのカルボキシペプチダーゼＢ（ＸＰ＿６２３７２７）又はキモトリプシン（ＸＰ＿３９４３７０）と類似したタンパク質に由来することを示唆した（図１、表１）。
【００４４】
［実施例２］
同定されたキモトリプシン様プロテアーゼを、大腸菌発現系によって発現させ、機能解析を行った。
【００４５】
＜標的ＤＮＡ増幅及びリコンビナントベクター構築＞
ミツバチの女王幼虫の総ＲＮＡは、ＦａｓｔＰｕｒｅ  ＲＮＡキット（タカラ、滋賀県、日本）を用いて幼虫全体から調製した。総ＲＮＡは、使用まで−８０℃で保存した。ｃＤＮＡは、総ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）プライマー（東洋紡、大阪府、日本）と逆転写酵素（ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、東洋紡）によって調製した。総ＲＮＡの１μｇ相当量と、０．５μＬのオリゴ（ｄＴ）プライマー、４μＬの４×バッファー、８μＬの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物、１μＬのＲＮアーゼ阻害剤、及び１μＬのＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅを混合し、３７℃で３０分間インキュベートして逆転写反応を行った。逆転写反応終了後、反応液を９９℃で１時間加熱して酵素を不活性化した。ミツバチキモトリプシン様プロテアーゼＤＮＡは、ＳａｌＩ制限酵素部位を含むセンスプライマー（5'-AAA GTC GAC ATT GTT GGC GGC AGT GAT G-3'；下線部が制限酵素部位である。）（配列番号２）とＥｃｏＲＩ制限酵素部位を含むアンチセンスプライマー（5'-AAAAA GAA TTC TAA GAA ATG TAG AAA CCG TCT GCT G-3'；下線部が制限酵素部位である。）（配列番号３）を用いてＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ条件は以下の通りである；９８℃で３０秒間を１サイクル、９８℃で１０秒間、５８℃で１５秒間、及び７２℃で２０秒間を３０サイクル、並びに、７２℃で５分間を１サイクル。この結果、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列部分を含むＰＣＲ産物が得られた。
【００４６】
リコンビナント大腸菌を構築するために、ＰＣＲ産物とＧａｔｅｗａｙ（登録商標）ｐＥＮＴＲ（登録商標）１Ａ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カールスバッド、カリフォルニア州）を、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、マサチューセッツ州）を用いて連結させた。連結したエントリークローンは、コンピテント大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地プレート上で選択した。エントリークローンのキモトリプシン様タンパク質のコーディング領域は、メーカーの指示に従ってＬＲクロネース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってｐＤＥＳＴ１５ベクターに転換した。リコンビナントｐＤＥＳＴ１５ベクターは、コンピテント大腸菌ＤＨ５α株に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培地プレート上で選択した。ポジティブクローンは、ＰＣＲと塩基配列解析（ＡＢＩ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＰＲＩＳＭ３１００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって選択した。
【００４７】
＜リコンビナントタンパク質の発現＞
リコンビナントタンパク質は、リコンビナントベクターに組込んだ後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。リコンビナント大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２００μＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を含有するＬＢ培地中で、２０℃で培養した。大腸菌は、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離処理して回収した。
【００４８】
＜リコンビナントタンパク質の精製＞
発現させたタンパク質は、Ｒａｐｉｄ  ＧＳＴ  Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｂｏｄｙ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いてリフォールディングした。大腸菌は、当該キットに含まれているＳＴＥバッファーに０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチームと１ｍＭのジチオスレイトールを含有させた液で再懸濁した後、氷上で超音波処理して溶解させた。各大腸菌のライセートは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ＩＰＴＧなしのライセートと比較して、リコンビナントタンパク質発現を確認した。さらに、封入体の構成を確認するために、大腸菌ライセートは、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離処理して可溶性タンパク質のフラクションと不溶性タンパク質のフラクションに分離し、タンパク質組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べた。封入体は、メーカーの指示に従ってキットを用いて、可溶化しリフォールティングした。すなわち、リコンビナントＧＳＴ−キモトリプシンが不溶性タンパク質として発現したので、Ｒａｐｉｄ  ＧＳＴ  Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  Ｂｏｄｙ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて、可溶化させてリフォールディングした。
【００４９】
リフォールティングしたリコンビナントＧＳＴタンパク質サンプルは、０．２μｍの膜フィルター（ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ州）を通して濾過した。グルタチオンセファロース４Ｂビーズ（５０％スラリー、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の５００μＬ相当量を、１０ｍＬのサンプル溶液に添加し、室温で回転させながらインキュベートした。ビーズは、５００×ｇ、室温で５分間遠心分離処理して回収し、上清を捨てた。この洗浄ステップを全部で３回繰り返した。リコンビナントタンパク質は、室温で１６時間、２００μＬの２５Ｕ／ｍＬ  トロンビン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）含有ＰＢＳ溶液中で、ＧＳＴタグから切断した。リコンビナントタンパク質は、５００×ｇ、室温で５分間遠心分離処理して回収し、再度２００μＬのＰＢＳをビーズに添加して遠心分離処理し、２つの上清を混合した。リコンビナントタンパク質サンプル中のタンパク質濃度を、Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ヘルクレス、カリフォルニア州）とスタンダードとしてＢＳＡを用いて、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により測定した。
【００５０】
図２（Ａ）に、大腸菌ライセートから抽出されたリコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼのＣＢＢ染色を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。左パネルにおいて、各レーンは、ＩＰＴＧ刺激無し及び有りの全大腸菌ライセートを示す。右パネルにおいて、各レーンは、ＩＰＴＧ刺激した大腸菌ライセートの可溶性画分及び不溶性画分と、グルタチオンセファロース４Ｂビーズによって精製されたタンパク質を示す。図２（Ａ）に示すように、ＩＰＴＧにより、分子量約５３ｋＤａのタンパク質の発現が誘導された。アミノ酸配列情報から、同定されたキモトリプシン様プロテアーゼの分子量は約２６ｋＤａであると予想され、２６ｋＤａのＧＳＴタグとコンジュゲートしたことから、リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼの分子量は、約５２ｋＤａと予想された。つまり、ＩＰＴＧにより発現誘導された分子量約５３ｋＤａのタンパク質が、目的のリコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼ（リコンビナントＧＳＴ−キモトリプシン）であった。
【００５１】
リフォールディング後、グルタチオンセファロース４Ｂビーズを用いて回収されたＧＳＴタグキモトリプシン（可溶化したキモトリプシン）から、トロンビンによりＧＳＴタグが切断された。図２（Ｂ）に、トロンビン処理後のリコンビナントタンパク質の銀染色を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。図２（Ｂ）に示すように、得られたタンパク質の大きさは、予想された大きさである約２６ｋＤａと一致した。
【００５２】
＜ＳＡＡＰＦｐＮａの加水分解反応の至適のｐＨ及び温度＞
ＧＳＴタグが切断されたリコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼについて、ＳＡＡＰＦｐＮａを基質としたキモトリプシン様プロテアーゼ活性の至適ｐＨ及び至適温度を、実施例１と同様にして調べた。
具体的には、酵素活性の至適ｐＨは、５０ｍＭ  ｐＨ４、５、及び６のクエン酸バッファー、ｐＨ６、７、及び８の５０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ８及び９の５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー、並びにｐＨ９及び１０の５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨバッファーを用いて測定した。酵素活性は、ＳＡＡＰＦｐＮａを基質として３７℃で測定した。
至適温度は、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）とＳＡＡＰＦｐＮＡを用いて、２０℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、及び５０℃で測定した。
【００５３】
リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼのプロテアーゼ活性のｐＨ依存性を、図３（Ａ）に示す。図３（Ａ）中、５０ｍＭ  クエン酸バッファー（ｐＨ４、５、及び６）の結果を白点と黒線で、５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ６、７、及び８）の結果を濃グレーの点と線で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌバッファー（ｐＨ８及び９）の結果を薄グレーの点と線で、５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨバッファー（ｐＨ９及び１０）の結果を黒点と点線で、それぞれ示す。データは、平均値±ＳＤで表した。リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼのＳＡＡＰＦｐＮａを基質とするプロテアーゼ活性は、ｐＨ９．０で最大活性を示した。また、ｐＨ７における活性は、ｐＨ９．０における活性の約半分であった。
【００５４】
リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼのプロテアーゼ活性の温度依存性を、図３（Ｂ）に示す。データは、平均値±ＳＤで表した。リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼのＳＡＡＰＦｐＮａを基質とするプロテアーゼ活性は、４０℃が最高であった。リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼは、アルカリｐＨにおいて最大活性を示し、当該酵素は、低温適合性と熱耐性は有していなかった。
【００５５】
すなわち、大腸菌により生産された２６ｋＤａのキモトリプシン様プロテアーゼ（図２）は、キモトリプシン活性を示した。当該活性は、ｐＨ９と４０℃で最も高かった（図３）。正常な幼虫の発達（brood development）のためにミツバチのコロニーの温度がおおよそ３５℃に維持されているように（非特許文献３０）、当該リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼの至適温度は、ミツバチの幼虫の生育環境と一致しているようであった。さらに、当該酵素の至適ｐＨは、アルカリ領域にあった。非特許文献９、非特許文献１６〜１８から、幼虫の消化酵素の至適ｐＨがアルカリ領域にあることが示唆されるが、本願発明に係るミツバチの幼虫由来のリコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼのｐＨ依存性は、これらのの報告と一致した。
【００５６】
＜リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼの基質特異性＞
リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼの基質特異性を調べるために、幾つかのセリンプロテアーゼの基質に対する活性を調べた。基質としては、ＳＡＡＰＦｐＮＡ、ＳＡＡＰＬｐＮＡ、ＳＡＡＡｐＮＡ、及びＢＡＰＡを用いた。酵素活性は、各基質についてｐＨ９、３７℃で測定された。
具体的には、１０μＬのサンプル（リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼ）溶液と９０μＬの１ｍＭの各基質を含む５０ｍＭ  トリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）を９６ウェルプレートに添加し、３７℃でインキュベートした。インキュベート後の反応溶液について、４０５ｎｍの吸光度の変化を測定した。１ユニットのプロテアーゼ活性は、１分間当たり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリンを遊離させる酵素量に相当した。
【００５７】
各基質に対するプロテアーゼ活性の測定結果を図４に示す。データは、ＳＡＡＰＦｐＮａ（１００％）に対する比活性（相対値）で示した。データは、平均値±ＳＤで表した。この結果、エラスターゼ（ＳＡＡＰＬｐＮａ及びＳＡＡＡｐＮａ）及びトリプシン（ＢＡＰＡ）に対する活性は、キモトリプシン基質に対する活性よりも低かった。ＳＡＡＰＬｐＮａ、ＳＡＡＡｐＮａ、及びＢＡＰＡに対する活性の相対値は、それぞれ、ＳＡＡＰＬｐＮａの３２．７％、１３．５％、及び８．１６％であった。これらの結果は、リコンビナント酵素がキモトリプシンプロテアーゼであることを示唆した。また、当該リコンビナント酵素は、非特許文献１２に記載のキモトリプシン基質に対する分解活性のない女王蜂由来のプロテアーゼとは異なることが明らかになった。
【００５８】
＜阻害アッセイ＞
リコンビナントタンパク質の活性に対する種々のプロテアーゼ阻害剤の効果を、１ｍＭのＳＡＡＰＦｐＮＡを含む５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）中、３７℃で測定した。阻害アッセイには、阻害剤として、ＰＭＳＦ、ＴＬＣＫ、ペプシン、ＥＤＴＡ（ナカライテスク、京都府、日本）、４−（２−アミノエチル）ＡＥＢＳＦ、ＴＰＣＫ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、アンチパイン、ロイペプチン、及びＥ―６４（ペプチド研究所株式会社、大阪府、日本）を用いた。リコンビナントプロテアーゼのＳＡＡＰＬｐＮａの加水分解反応に対するプロテアーゼ阻害剤の効果は、阻害剤なしのサンプルの活性と比較して求めた。
【００５９】
【表２】
2016052302.tif 000003
【００６０】
リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼに対するプロテアーゼ阻害剤の効果を表２に示す。この結果、ＰＭＳＦは当該活性を強く阻害した。さらに、アンチパインも阻害効果を示した。これらの阻害剤は、両方とも、セリンタイププロテアーゼの活性の阻害剤である。他方では、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤であるペプスタチンＡ、及びシステインプロテアーゼ阻害剤であるＥ−６４は、当該リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼの活性を阻害しなかった。これらの結果から、当該リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼは、セリンプロテアーゼとみなされた。
【００６１】
また、メタロプロテアーゼ阻害剤であるＥＤＴＡは、当該リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼに対して弱い阻害活性を示し、一般的にＰＭＳＦの基質として使用されるＡＥＢＳＦ、及び幾つかのセリン又はシステインタイププロテアーゼの阻害剤であるロイペプチンは、弱い阻害活性を示した。さらに、ＴＰＣＫとＴＬＣＫのいずれも、当該リコンビナントプロテアーゼの活性を阻害しなかった。これらの結果は、当該リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼが、哺乳類のキモトリプシンとは異なる活性部位を有していることを示唆した。
【００６２】
すなわち、当該リコンビナントキモトリプシン様プロテアーゼは、トリプシン基質とエラスターゼ基質よりも強く、キモトリプシンの基質であるＳＡＡＰＦｐＮａを加水分解した（図４）。ＰＭＳＦ及びアンチパインは、当該活性を阻害したが、ペプスタチンＡとＥ−６４は阻害しなかった（表２）。これらの結果は、この酵素がセリンタイププロテアーゼであることを示唆した。さらに、ＥＤＴＡは弱い阻害活性を示した。他方、ＴＬＣＫとＴＰＣＫは、当該リコンビナントプロテアーゼに対する阻害活性を示さなかった。この阻害アッセイの結果から、本発明に係るキモトリプシン様プロテアーゼは、哺乳類のキモトリプシンとは異なる反応メカニズムを持つと考えられた。さらに、当該反応メカニズムを明らかにするためには、当該プロテアーゼの結晶学等の構造解析が必要である。
【００６３】
本発明者らは、当該リコンビナントプロテアーゼを、ミツバチのキモトリプシン様プロテアーゼ（ＨＣＬＰＡＳＥ）と名付けた。なお、ミツバチの幼虫のプロテアーゼとしては、ＨＣＬＰＡＳＥが最初に同定されたものになる。
【００６４】
［実施例３］
ＨＣＬＰＡＳＥを、ＧＳＴタグに代えて、リフォールディングせずにより正確な立体構造を形成させ得るＳＵＭＯタグとタンパク質精製のためのＨｉｓタグとの２種類のタグを融合させたリコンビナントタンパク質として、大腸菌及び昆虫細胞で発現させ、その機能解析を行った。
【００６５】
＜リコンビナントベクター構築とリコンビナントタンパク質の発現＞
リコンビナントベクターの構築には、６×Ｈｉｓタグの下流にＳＵＭＯタグが連結されており、ＳＵＭＯタグの下流に発現させる目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入するためのマルチクローニングサイトがあるＳＵＭＯタグ発現ベクターであって、大腸菌発現用ベクター（ｐＥ−ＳＵＭＯｐｒｏベクター）と昆虫細胞発現用ベクター（ｐＩ−ｓｅｃＳＵＭＯｓｔａｒベクター）（いずれも、LifeSensors）を用いた。
【００６６】
実施例２と同様にして、ミツバチの女王幼虫の総ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応を行って得られたｃＤＮＡを鋳型とし、ＢｓａＩ制限酵素部位を含むセンスプライマー（5'- AAG GTC TCA AGG TAT TGT TGG CGG CAG-3'；下線部が制限酵素部位である。）（配列番号４）とＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含むアンチセンスプライマー（5'- AAA AAG CTT TTA AGA AAT GTA GAA ACC GTC TGC TG-3'；下線部が制限酵素部位である。）（配列番号５）を用いたＰＣＲにより、ミツバチキモトリプシン様プロテアーゼＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ条件は実施例２と同様にした。
【００６７】
得られたＰＣＲ産物とｐＥ−ＳＵＭＯｐｒｏベクターをＢｓａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結させ、リコンビナント大腸菌用ＳＵＭＯタグ発現ベクターを得た。同様にして、ＰＣＲ産物とｐＩ−ｓｅｃＳＵＭＯｓｔａｒベクターを連結させ、リコンビナント昆虫細胞用ＳＵＭＯタグ発現ベクターを得た。
【００６８】
＜大腸菌におけるリコンビナントタンパク質の発現及びライセートの調製＞
得られたリコンビナント大腸菌用ＳＵＭＯタグ発現ベクターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテントセルに導入し、リコンビナント大腸菌を得た。リコンビナント大腸菌を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと１００μＭのＩＰＴＧを含有するＬＢ培地中で、２０℃で培養し、リコンビナントタンパク質を発現させた。大腸菌は、５０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離処理して回収した。
【００６９】
回収したリコンビナント大腸菌は、０．２Ｍ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）で再懸濁した後、氷上で超音波処理して溶解させ、リコンビナント大腸菌ライセートを調製した。リコンビナント大腸菌ライセートは、１２０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離処理して可溶性タンパク質のフラクションと不溶性タンパク質のフラクションに分離した。
【００７０】
＜昆虫細胞におけるリコンビナントタンパク質の発現＞
得られたリコンビナント昆虫細胞用ＳＵＭＯタグ発現ベクターを、大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ１コンピテントセルにヒートショック法にて導入し、ＬＢ培地プレート（５０μｇ／ｍＬ  カナマイシン、７μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬ  テトラサイクリン、１００μｇ／ｍＬ  Ｘ−ｇａｌ、４０μｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧを含有。）にて培養した。得られたコロニーから白色のものを選別して培養し、組み換えバクミドを得た。得られたバクミドを、トランスフェクション試薬セルフェクチンII試薬 (Invitrogen) を用いて、ヨトウガ卵巣由来ＳＦ９細胞に導入した。導入処理後のＳＦ９細胞をＳＦ９００ＩＩＩＳＦＭ培地（Life Technologies）中、２７℃で培養した後、５００×ｇ、室温で５分間の遠心分離処理により培養液を回収し、これを組み換えバキュロウィルスストックとした。６ウェルプレートに２×１０６細胞／ウェルとなるように播いたＳＦ９細胞に、１００μＬのバキュロウィルスストックを加えて２７℃にて培養し、ウィルスの増殖が認められたら遠心分離処理により培養液を回収した。この操作を二回繰り返して高力価組み換えバキュロウィルスストックを得た。７５ｃｍ２フラスコに１．５×１０７細胞／フラスコとなるように播いたＳＦ９細胞にバキュロウィルスストックを添加して感染させ、リコンビナントタンパク質を発現させた。発現したリコンビナントタンパク質は、培養液中に分泌される。そこで、培養液を５００×ｇ、室温、５分間の遠心分離処理することにより、発現したリコンビナントタンパク質を含む培養液（リコンビナントバキュロウィルス感染昆虫細胞培養液）を回収した。
【００７１】
＜リコンビナントタンパク質の精製＞
リコンビナント大腸菌ライセートの可溶性フラクション及びリコンビナントバキュロウィルス感染昆虫細胞培養液から、ＴＡＬＯＮ  ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた金属アフィニティークロマトグラフィーによって、Ｈｉｓタグタンパク質のみを精製した。
【００７２】
精製されたＨｉｓタグタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５（Ａ）に示す。この結果、リコンビナント大腸菌とリコンビナント昆虫細胞の両方において、４５ｋＤａ弱にバンドが確認された。リコンビナント昆虫細胞に発現したリコンビナントタンパク質のほうがやや大きいのは、分泌シグナルタンパク質ｇｐ６７（約５ｋＤａ）が付加されているためである。
【００７３】
精製したリコンビナントタンパク質は１００μｇ／ｍＬの濃度で、ＳＵＭＯタグ切断用プロテアーゼ（ＳＵＭＯ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  １及びＳＵＭＯｓｔａｒ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  １）を用いてタグを切断し、活性化させた。ＳＵＭＯ  ｐｒｏｔｅａｓｅ、切断された６×Ｈｉｓ−ＳＵＭＯタグ、及び未切断のタンパク質は、再びＴＡＬＯＮ  ｒｅｓｉｎで精製することで除いた。この結果、４０〜５０μｇ／ｍＬの精製リコンビナントタンパク質が得られた。
【００７４】
精製した後のリコンビナントタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図５（Ｂ）に示す。この結果、ＨＣＬＰａｓｅのサイズはアミノ酸配列から２６ｋＤａ程度と予想されていたが、予想していたサイズのバンドが確認できた (図中、黒矢印)。リコンビナント大腸菌とリコンビナント昆虫細胞の両方において発現したリコンビナントタンパク質の大きさが同じであったことから、ＨＣＬＰａｓｅは糖鎖は付加していないものと推察された。
【００７５】
しかしながら、リコンビナント大腸菌とリコンビナント昆虫細胞の両方において、目標のバンド以外に４０ｋＤａ付近にもう一つバンドが見られた（図中、白矢印)。当該バンドは、セリンプロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ又はＳＢＴＩ）を添加した場合は生じなかった（図示せず。）ことから、ＨＣＬＰａｓｅによる自己消化によるものと推定された。
【００７６】
＜キモトリプシン活性測定＞
精製したリコンビナントＨＣＬＰａｓｅのキモトリプシン活性を、ＳＡＡＰＦｐＮａを基質とし、ｐＨ９、３７℃の条件で、実施例２と同様にして測定した。大腸菌で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅ及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅの回収量（タンパク質濃度、μｇ／ｍＬ）とキモトリプシン比活性（Ｕ／ｍｇ）の測定結果を、実施例２のＧＳＴタグを切断したリコンビナントＨＣＬＰａｓｅの結果と共に表３に示す。
【００７７】
【表３】
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【００７８】
この結果、ＳＵＭＯタグで発現させた場合、酵素の比活性は、大腸菌発現に比べて、昆虫細胞発現のほうが  ３〜４倍高かった。比活性に違いが生じる原因はわからないが、大腸菌発現の場合、封入体化して不溶なタンパク質も多量に存在することが確認できているため、可溶化しているもののフォールディングが上手くいっていない酵素が含まれていた可能性が考えられた。
【００７９】
また、キモトリプシン比活性は、ＧＳＴタグで発現させた後切断したリコンビナントＨＣＬＰａｓｅに比べて、ＳＵＭＯタグで発現させた後切断したリコンビナントＨＣＬＰａｓｅのほうが、精製タンパク質の回収量も酵素の比活性も明らかに高かった。これは、リフォールディング処理が必要であったＧＳＴタグとは異なり、ＳＵＭＯタグで発現させた場合にはよりネイティブな状態に近いフォールディングであり、より安定性の高いタンパク質が得られたためと推察された。
【００８０】
＜ＳＡＡＰＦｐＮａの加水分解反応の至適のｐＨ＞
ＳＵＭＯタグを切断したリコンビナントＨＣＬＰａｓｅのＳＡＡＰＦｐＮａを基質としたキモトリプシン活性のｐＨの影響を、実施例２と同様にして調べた。
具体的には、酵素活性の至適ｐＨは、５０ｍＭ  ｐＨ４及び５のクエン酸バッファー、ｐＨ６及び７の５０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ８及び９の５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー、ｐＨ１０、１１、及び１２の５０ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨバッファー、並びにｐＨ１３のＫＣｌ−ＮａＯＨを用いて測定した。酵素活性は、１ｍＭのＳＡＡＰＦｐＮａ、２μｇ／ｍＬの酵素タンパク質、３７℃、３０分間の酵素反応を行い、測定した。
【００８１】
大腸菌発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅの比活性の測定結果を図６（Ａ）に、昆虫細胞発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅの比活性の測定結果を図６（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、大腸菌発現と昆虫細胞発現のいずれでも、得られたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅに対するｐＨの影響はほぼ同じであり、アルカリ側で活性が高く、ｐＨが下がるに応じて活性が低くなっていた。ＧＳＴタグ発現させた場合には、ｐＨ９で最も活性が高く、ｐＨ１０で活性は低下していたが（図３（Ａ））、ＳＵＭＯタグ発現させた場合には、ｐＨ１２で最も活性が高く、ｐＨ１３で活性は低下していた。ＧＳＴタグ発現サンプルは、精製されたタンパク質の濃度が低かったため、活性が上がった際に自己消化により失活が起きていた可能性が考えられた。
【００８２】
＜ＳＡＡＰＦｐＮａの加水分解反応の至適の温度＞
ＳＵＭＯタグを切断したリコンビナントＨＣＬＰａｓｅのＳＡＡＰＦｐＮａを基質としたキモトリプシン活性の温度の影響を、実施例２と同様にして調べた。
具体的には、酵素活性の至適温度は、１ｍＭのＳＡＡＰＦｐＮＡ、２μｇ／ｍＬの酵素タンパク質、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて、２０〜７０℃で３０分間の酵素反応を行い、測定した。
【００８３】
図７（Ａ）に、各温度における比活性（Ｕ／ｍｇ）の測定結果を、図７（Ｂ）に、３７℃における比活性を１００％とした時の各温度での比活性の相対値（％）を、それぞれ示す。この結果、比活性は、昆虫細胞発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅのほうが大腸菌発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅよりも高かったが、温度による割合変化はどちらもほぼ同じであった。また、ＧＳＴタグ発現させた場合には、４０℃で最も活性が高かったが（図３（Ｂ））、ＳＵＭＯタグ発現させた場合には、６０℃で最も活性が高かった。ただし、５０〜６０℃では酵素活性は大きく変わらなかった。
【００８４】
＜リコンビナントＨＣＬＰａｓｅの基質特異性＞
リコンビナントＨＣＬＰａｓｅの基質特異性を、実施例２と同様にして測定した。基質としては、ＳＡＡＰＦｐＮＡ、ＳＡＡＰＬｐＮＡ、ＳＡＡＡｐＮＡ、及びＢＡＰＡを用いた。
具体的には、酵素活性は、１ｍＭの基質、２μｇ／ｍＬの酵素タンパク質、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて、３７℃で３０分間の酵素反応を行い、測定した。
【００８５】
大腸菌発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅの比活性の測定結果を図８（Ａ）に、昆虫細胞発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅの比活性の測定結果を図８（Ｂ）に、それぞれ示す。この結果、大腸菌で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅ及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅは、いずれも、キモトリプシンの基質であるＳＡＡＰＦｐＮａに高い活性を示したが、他の３基質への活性は低かった。３つのうち、ＳＡＡＰＬｐＮａへの活性のみ若干高かった。これらの結果は、ＧＳＴタグ発現させた場合（図４）と同様であった。この結果からも、ＨＣＬＰａｓｅがキモトリプシン様の酵素であるといえる。
【００８６】
＜阻害アッセイ＞
リコンビナントＨＣＬＰａｓｅの活性に対する種々のプロテアーゼ阻害剤の効果を、実施例２と同様にして測定した。プロテアーゼ阻害剤としては、実施例２と同じものを用いた。
具体的には、酵素活性は、１ｍＭのＳＡＡＰＦｐＮＡ、２μｇ／ｍＬの酵素タンパク質、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて、各プロテアーゼ阻害剤の存在下、３７℃で３０分間の酵素反応を行い、測定した。各プロテアーゼ阻害剤の濃度は、ＰＭＳＦは１ｍＭ、ＡＥＢＳＦは１ｍＭ、ＥＤＴＡは１０ｍＭ、ＴＬＣＫは１００μＭ、ＴＰＣＫは１００μＭ、ロイペプチンは１０μＭ、アンチパインは１０μＭ、ペプスタチンＡは１０μＭ、Ｅ−６４は１０μＭとして行った。リコンビナントＨＣＬＰａｓｅのＳＡＡＰＬｐＮａの加水分解反応に対するプロテアーゼ阻害剤の効果は、阻害剤なしのサンプルの活性と比較して求めた。
【００８７】
リコンビナントＨＣＬＰａｓｅに対するプロテアーゼ阻害剤の効果を図９に示す。この結果、大腸菌で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅ及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅは、セリンプロテアーゼ阻害剤のＰＭＳＦ及びキモトリプシン阻害剤ＴＰＣＫで高い阻害活性を示したが、一般にＰＭＳＦの代替品として用いられるＡＥＢＳＦで阻害活性を示さなかった。また、ＧＳＴタグ発現させた場合にはＴＰＣＫによっては阻害されなかったが（表２）、これは、フォールディングの影響で上手くＴＰＣＫが機能しなかった可能性が考えられた。
【００８８】
＜ＨＣＬＰａｓｅの確認＞
得られたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅが間違いなくＨＣＬＰａｓｅ（ＸＰ＿３９４３７０）かどうか、またアミノ酸配列にエラーがないかどうかを、リコンビナントＨＣＬＰａｓｅのトリプシンによるゲル内消化物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及びＰＭＦ法によって調べた。
【００８９】
具体的には、精製したリコンビナントＨＣＬＰａｓｅをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動した後、分離されたバンドをゲルから切り出し、トリプシンにてゲル内消化を３７℃にて一晩行った。次いで、ペプチド断片を抽出し、ＭＡＬＤＩーＴＯＦーＭＳを用いて質量分析を行った。ＭＳ−ｄｉｇｅｓｔ (http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest) を用いてＨＣＬＰａｓｅのトリプシン消化時に生じるペプチド片の予想質量を算出し、ＴＯＦ−ＭＳによって得られたピークの中から質量が一致するものをピックアップした。ＭＡＬＤＩーＴＯＦーＭＳによる分析を５回行い、ＭＳ−ｄｉｇｅｓｔによる計算と一致したピークを５回分まとめてＭＡＳＣＯＴ（http://www.matrixscience.com/search_form_select.html) にてＰＭＦ法によるタンパク質の同定を行った。
【００９０】
この結果、大腸菌発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅと昆虫細胞発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅの両方とも、本発明者らが命名したＨＣＬＰａｓｅ（ＸＰ＿３９４３７０、ｇｉ｜４８０９５１５９）であると同定された。また、両発現サンプルともほぼ同じ位置をカバーしており、カバー率は８９％であった。また、活性部位であると推測される配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４１番目のヒスチジン残基（His-41）、８７番目のアスパラギン残基（Asn-87）、及び１７８番目のセリン残基（Ser-178）を含む領域のアミノ酸配列は、データベース上のアミノ酸配列（ＸＰ＿３９４３７０）と一致しており、活性中心付近にアミノ酸の誤翻訳は無いと考えられた。ただし、大腸菌発現と昆虫細胞発現のいずれでも、配列番号１のアミノ酸配列中、ＶＶＡＨＲ及びＬＡＳＧＳＫの配列及びＣ末端のＧＥＡＰＡＤＧＦＹＩＳの配列が検出できなかった。
【００９１】
［実施例４］
実施例３で精製した大腸菌で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅ及び昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅを用いてＲＪを分解した。
具体的には、ｐＨ４、７、９、又は１２のＲＪ水溶性タンパク質溶液（１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）に、リコンビナントＨＣＬＰａｓｅを １μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬとなるように加え、３７℃にてインキュベートした。インキュベート開始から１、３、６、及び２４時間経過時点においてサンプリングし、ＲＪタンパク質の分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。酵素無添加のＲＪ水溶性タンパク質溶液を対照とした。
【００９２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１０に示す。この結果、ＲＪタンパク質の分解パターンは、大腸菌発現と昆虫細胞発現で大きな違いは見られず、いずれもアルカリ性が強くなるほど全体的に分解が早かった。ｐＨ４では、インキュベート後短時間でいくつか分解産物と思われるはっきりとしたバンドが生じていた。また、インキュベート開始から２４時間経過の時点において、２５ｋＤａ付近のバンドはｐＨが低いほど濃く、ｐＨ１２では全く見えなかった。単一酵素で分解しているのにもかかわらず、ｐＨにより分解パターンが異なったのは、基質タンパク質がｐＨの影響を受けている可能性が考えられた。
【００９３】
［実施例５］
実施例３で精製した昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅとミツバチの女王幼虫の粗酵素（ＬＣ）を用いてＲＪを分解した。ＬＣは、実施例１において調製した粗酵素液を用いた。
具体的には、添加する酵素を、１μｇの精製リコンビナントＨＣＬＰａｓｅ、２．５ｍＵのＬＣ（ＬＣ−１）、又はタンパク質量でＲＪに対して１０分の１量となるＬＣ（ＬＣ−２）を添加した以外は、実施例４と同様にしてＲＪの分解反応を行った。なお、昆虫細胞で発現させた精製リコンビナントＨＣＬＰａｓｅ１μｇは約２．５ｍＵであったため、ＬＣ−１は、酵素の比活性を精製リコンビナントＨＣＬＰａｓｅに揃えたものである。各サンプルに添加した酵素について、タンパク質濃度（μｇ／ｍＬ）と基質：酵素の比率を表４に示す。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１１に示す。この結果、ＬＣ−１及びＬＣ−２によるＲＪタンパク質の分解パターンは、ｐＨによって大きく異なっていた。アルカリ条件下の分解パターンは、リコンビナントＨＣＬＰａｓｅとＬＣ−１及びＬＣ−２とでは、比較的似ているようであったが、中性条件下の分解パターンは異なっていた。ｐＨ７では、ＬＣにより速やかにＭＲＪＰ１が消化され、かわりに４５  ｋＤａ付近にバンドが生じていた。これは、ＬＣ中には、ＨＣＬＰａｓｅ以外であって、中性で強く働くプロテアーゼやグリコシダーゼ等の酵素が存在しているためと推測された。
【００９６】
［実施例６］
実施例３で精製した昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅによるＲＪ分解反応に対するＳＤＳの影響を調べた。
具体的には、ＲＪ水溶性タンパク質溶液（１ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ）、精製リコンビナントＨＣＬＰａｓｅ（１μｇ／ｍＬ）、５０ｍＭのトリス−塩酸バッファー（ｐＨ９．０）からなる反応液に、ＳＤＳを最終濃度が０、０．０１、０．０５、０．１、０．５、又は１％となるように添加し、３７℃にてインキュベートした。インキュベート開始から１、３、及び６時間経過時点においてサンプリングし、ＲＪタンパク質の分解をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べた。酵素無添加のＲＪ水溶性タンパク質溶液を対照とした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１２に示す。
【００９７】
また、反応液に、最終濃度が０、０．０１、０．０５、０．１、０．５、又は１％となるようにＳＤＳを添加し、基質としてＳＡＡＰＦｐＮａを、酵素として実施例３で精製した昆虫細胞で発現させたリコンビナントＨＣＬＰａｓｅを用い、ｐＨ９、３７℃とした以外は実施例２と同様にして、キモトリプシン活性を調べた。ＳＤＳ無添加（ＳＤＳ濃度が０％）の場合のキモトリプシン活性の比活性を１００％とした場合の相対値（％）を、図１３に示す。
【００９８】
図１２に示すように、ＳＤＳ濃度が０．０１〜０．１％では、ＳＤＳ無添加（０％）と比べてＲＪタンパク質バンドの消失が早くなっていた。また、ＳＤＳ濃度によって分解の途中産物と思われるバンドの出現パターンが変化していることが確認できた。これは、ＳＤＳがＲＪタンパク質に作用することでタンパク質の切断部位を露出させるために、分解が促進されているのではないかと推察された。
【００９９】
一方で、図１３に示すように、ＨＣＬＰａｓｅのキモトリプシン活性は、低濃度のＳＤＳを添加することにより、１２０％程度にまで増大していた。ただし、ＳＤＳ濃度０．１％では、キモトリプシン活性は７０％程度にまで低下していた。つまり、ＲＪタンパク質の分解速度と、ＨＣＬＰａｓｅのキモトリプシン活性の増減は一致していなかった。
【０１００】
［実施例７］
ミツバチの女王蜂幼虫におけるＨＣＬＰａｓｅの発現量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ量を測定することにより調べた。女王蜂幼虫は、秋田屋本店株式会社養蜂部より得た。幼虫の体重を経時的に測定した結果を図１４に示す。
【０１０１】
ＨＣＬＰａｓｅのｍＲＮＡ量は、具体的には、まず、各日齢の幼虫について、５〜１０匹をまとめて液体窒素中で粉砕し、総ＲＮＡを抽出し、得られた総ＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、２種類のプライマー｛ＨＣＬＰａｓｅ−Ｆ（5'-AAATGCAAGCAAGCTCACTG、配列番号６）及びＨＣＬＰａｓｅ−Ｒ（5'-ACAACGAGAGGACCACCAGA、配列番号７）｝を用いてＰＣＲを行い、ＨＣＬＰａｓｅのｍＲＮＡ量を測定した。内部標準遺伝子として、リボソーマルプロテインＬ３２（ＲｐＬ３２）を用い、２種類のプライマー｛ＲｐＬ３２−Ｆ（5'-CGTCATATGTTGCCAACTGGT、配列番号８）及びＲｐＬ３２−Ｒ（5'-TTGAGCACGTTCAACAATGG、配列番号９）｝を用いて同様にして、ＲｐＬ３２のｍＲＮＡ量を測定した。
【０１０２】
図１５に、女王幼虫の３〜５日齢におけるＨＣＬＰａｓｅのｍＲＮＡ量の経時的変化を示す。各日齢間の有意差は、Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  ｔｅｓｔにより検定した。この結果、ＨＣＬＰａｓｅのｍＲＮＡ量は、女王蜂幼虫では、３から４日目には変化はないが、５日目で有意に増加していた。この結果から、ＨＣＬＰａｓｅが、女王蜂の幼虫で実際に発現しており、幼虫が成長するほど発現量が高くなることがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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