(57)【要約】      （修正有）【課題】グラム陽性細菌に特異的に結合する改良された結合化合物の提供【解決手段】黄色ブドウ球菌、フェカリス菌、化膿連鎖球菌、表皮ブドウ球菌、及びバチルス・リケニフォルミスから選択される全グラム陽性細菌に結合する能力を有するが、肺炎球菌又はミュータンス菌には結合しない単離された抗体。前記抗体がヒト型であり、黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）、又はバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）である抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（S.aureus）、フェカリス菌（S.faecalis）、化膿連鎖球菌(S.pyrogen)、表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）、及びバチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）からなる群から選択される全グラム陽性細菌に結合する能力を有するが、肺炎球菌（S.pneumonia）又はミュータンス菌（S.mutans）には結合しない単離された抗体。
【請求項２】
前記抗体がヒト型である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
黄色ブドウ球菌がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
黄色ブドウ球菌がメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
黄色ブドウ球菌が、バンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
抗体がラクトコッカス・ラクティス（L.lactis）、溶血性レンサ球菌（L.garvieae）、ビフィズス菌（B.bifidum）、ルテウス菌（M.luteus）、カゼイ菌（L.casei）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（L.mesenteroides）、リステリア‐ウェルシメリ（L.welshimeri）、エンテロコッカス・ヒラエ（E.hirae）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（L.raffinolactis）、ミュータンス菌（S.mutans）又は肺炎球菌（S.pneumoniae）に結合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ａ）重鎖ＣＤＲ１配列ＲＦＡＭＳ（配列番号１）、及び
ｂ）重鎖ＣＤＲ２配列ＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹ（配列番号２）、及び
ｃ）重鎖ＣＤＲ３配列ＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳ（配列番号３）
を含む単離された抗体。
【請求項８】
更に可変軽鎖を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
ａ）軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡ（配列番号４）、及び
ｂ）軽鎖ＣＤＲ２配列ＫＴＳＩＬＥＳ（配列番号５）、及び
ｃ）ＸがＩ又はＭである軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＨＹＸＲＦＰＹＴ（配列番号６）
を含む単離された抗体。
【請求項１０】
更に可変重鎖を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
ａ）軽鎖ＣＤＲ１配列ＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡ（配列番号４）、及び
ｂ）軽鎖ＣＤＲ２配列ＫＴＳＩＬＥＳ（配列番号５）、及び
ｃ）ＸがＩ又はＭである軽鎖ＣＤＲ３配列ＱＨＹＸＲＦＰＹＴ（配列番号６）
を更に含む請求項７に記載の抗体。
【請求項１２】
軽鎖ＣＤＲ３配列がＱＨＹＩＲＦＰＹＴ（配列番号６）である請求項９又は１１に記載の抗体。
【請求項１３】
軽鎖ＣＤＲ３配列がＱＨＹＭＲＦＰＹＴ（配列番号６）である請求項９又は１１に記載の抗体。
【請求項１４】
抗体が、
ａ）ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳ（配列番号３７）に対して少なくとも９０％同一であるフレームワーク１（ＦＷ１）；
ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡ（配列番号３９）に対して少なくとも９０％同一であるフレームワーク２（ＦＷ２）；
ｃ）ＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫ（配列番号４１）に対して少なくとも９０％同一であるフレームワーク３（ＦＷ３）；及び
ｄ）ＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４３）に対して少なくとも９０％同一であるフレームワーク４（ＦＷ４）
を含む可変重鎖配列を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項１５】
抗体が、
ａ）ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳ（配列番号３７）の配列を有するフレームワーク１（ＦＷ１）；
ｂ）ＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡ（配列番号３９）の配列を有するフレームワーク２（ＦＷ２）；
ｃ）ＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫ（配列番号４１）の配列を有するフレームワーク３（ＦＷ３）；及び
ｄ）ＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４３）の配列を有するフレームワーク４（ＦＷ４）
を含む可変重鎖配列を有する、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
抗体が、配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ  （配列番号７）
に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む可変重鎖配列を含む、請求項７に記載の抗体。
【請求項１７】
抗体が、配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ  （配列番号７）
を有する可変重鎖配列を含む、請求項１６に記載の抗体。
【請求項１８】
抗体が、
ａ）ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣ（配列番号４７）に対して少なくとも９０％同一性を有するフレームワーク１（ＦＷ１）；
ｂ）ＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹ（配列番号４９）に対して少なくとも９０％同一性を有するフレームワーク２（ＦＷ２）；
ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号５１）に対して少なくとも９０％同一性を有するフレームワーク３（ＦＷ３）；及び
ｄ）ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号５３）に対して少なくとも９０％同一性を有するフレームワーク４（ＦＷ４）
を含む可変軽鎖配列を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１９】
抗体が、
ａ）ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣ（配列番号４７）の配列を有するフレームワーク１（ＦＷ１）；
ｂ）ＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹ（配列番号４９）の配列を有するフレームワーク２（ＦＷ２）；
ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号５１）の配列を有するフレームワーク３（ＦＷ３）；及び
ｄ）ＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号５３）の配列を有するフレームワーク４（ＦＷ４）
を含む可変軽鎖配列を有する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
抗体が、
ａ）ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣ（配列番号４７）の配列を有するフレームワーク１（ＦＷ１）；
ｂ）ＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹ（配列番号４９）の配列を有するフレームワーク２（ＦＷ２）；
ｃ）ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣ（配列番号５１）の配列を有するフレームワーク３（ＦＷ３）；及び
ｄ）ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号５９）の配列を有するフレームワーク４（ＦＷ４）
を含む可変軽鎖配列を有する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２１】
抗体が、ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号１１）
に対して少なくとも９０％配列同一性を有する可変軽鎖配列を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項２２】
抗体が、ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号１１）
を有する可変軽鎖配列を含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
抗体が、
ａ）配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ
（配列番号７）を含む可変重鎖、及び
ｂ）ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号１１）を含む可変軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２４】
抗体が、
ａ）配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）を含む可変重鎖、
ｂ）ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号８）を含む可変軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２５】
抗体が、
ａ）配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）を含む可変重鎖、
ｂ）ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（配列番号１０）を含む可変軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体が、
ａ）配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）を含む可変重鎖、及び
ｂ）ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号１１）を含む可変軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２７】
抗体が、
ａ）配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む可変重鎖、及び
ｂ）ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号８）を含む可変軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
抗体が、
ａ）配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む可変重鎖、及び
ｂ）配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴ
ｃ）ＸがＩ又はＭである、ＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（配列番号１０）を含む可変軽鎖
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
ａ）配列番号５５の配列を含む重鎖、及び
ｂ）配列番号５７の配列を含む軽鎖
を含む、単離された抗体。
【請求項３０】
ａ）配列番号５６の配列を含む重鎖、及び
ｂ）配列番号５８の配列を含む軽鎖
を含む、単離された抗体。
【請求項３１】
Ｋａｂａｔ（１９９１）のアミノ酸番号付けによる可変重鎖の位置５３のアスパラギンが他のアミノ酸に置換された、請求項１１に記載の抗体。
【請求項３２】
Ｋａｂａｔ（１９９１）のアミノ酸番号付けによる位置５３の前記アスパラギンがセリンに置換され、位置１１４のアラニンがシステインに置換され、位置２２２のアルギニンがリジンに置換された、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３３】
Ｋａｂａｔ（１９９１）のアミノ酸番号付けによる可変軽鎖の位置２０５のバリンがシステインに置換され、可変軽鎖の位置１１０のアラニンがバリンに置換され、可変軽鎖の位置１０４のロイシンがバリンに置換された、請求項１１に記載の抗体。
【請求項３４】
抗体の機能部分が単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片からなる群から選択される、請求項１、７、９、又は１１の何れか一項に記載の抗体の機能部分を含む組成物。
【請求項３５】
インビボで増殖した黄色ブドウ球菌に結合する単離された抗体。
【請求項３６】
前記抗体がヒト型である、請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
ＳＤリピート依存性エピトープに結合する能力を持つ抗体。
【請求項３８】
黄色ブドウ球菌ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥに結合する能力を持つ抗体。
【請求項３９】
請求項１１に記載の抗体とブドウ球菌属への結合に関して拮抗する能力を持つ抗体。
【請求項４０】
請求項１から３３及び３５から３９に記載の抗体の何れかをコードする、単離された、合成された又は組換え型核酸配列。
【請求項４１】
配列が、重鎖ＣＤＲ１配列ｃｇｃｔｔｔｇｃｃａｔｇａｇｃ（配列番号１２）、重鎖ＣＤＲ２配列ｔｃｇａｔｃａａｔａａｔｇｇｇａａｔａａｃｃｃａｔａｃｔａｃｇｃａｃｇｇｔｃｇｇｔａｃａａｔａｃ（配列番号１３）、重鎖ＣＤＲ３配列ｇａｔｃａｃｃｃｔａｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｔｔｔｇａｃｔｃｃ（配列番号１４），軽鎖ＣＤＲ１配列ｃｇｇｇｃｃａｇｔｇａａａａｃｇｔｔｇｇｔｇａｃｔｇｇｔｔｇｇｃｃ（配列番号１５），軽鎖ＣＤＲ２配列ａａｇａｃａｔｃｔａｔｔｃｔａｇａａａｇｔ（配列番号１６）及び軽鎖ＣＤＲ３配列ｃａａｃａｃｔａｔａｔａｃｇｔｔｔｃｃｃｇｔａｃａｃｔ（配列番号１７）からなる群から選択される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３又は軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３をコードする単離された、合成された又は組換え型の核酸配列。
【請求項４２】
請求項４０に記載の核酸を含む単離された細胞。
【請求項４３】
請求項４１に記載の核酸を含む単離された細胞。
【請求項４４】
医薬として及び／又は予防薬として使用のための、請求項１から３３又は３５から４１の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列。
【請求項４５】
グラム陽性細菌関連疾患の治療及び／又は予防のための医薬及び／又は予防薬として使用のための、請求項１から３３又は３５から４１の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列。
【請求項４６】
グラム陽性細菌関連疾患の治療及び／又は予防のための医薬及び／又は予防薬の調製ための、請求項１から３３又は３５から４１の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列の使用。
【請求項４７】
請求項１から３３又は３５から４１の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４８】
請求項１から３３又は３５から３９の何れか一項に記載の抗体を産生することが可能な、単離された又は組換え型抗体を産生する細胞。
【請求項４９】
請求項４０から４１の何れか一項に記載の核酸配列を持つ細胞を提供し、前記細胞に請求項４０から４１の何れか一項に記載の前記核酸配列を翻訳させ、請求項１から３３又は３５から３９の何れか一項に記載の抗体を産生することを含む、請求項１から３３又は３５から３９の何れか一項に記載の抗体を産生する方法。
【請求項５０】
請求項１から３３又は３５から３９の何れか一項に記載の前記抗体を回収し、精製し及び／又は単離することを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ブドウ球菌感染症の診断のための請求項１から３３又は３５から４１の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列の使用。
【請求項５２】
黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌を検出するための請求項１から３３又は３５から４１の何れか一項に記載の抗体又は核酸配列の使用。
【請求項５３】
ブドウ球菌感染症の診断における使用のための請求項１から３３又は３５から３９の何れか一項に記載の抗体。
【請求項５４】
請求項１から３３又は３５から３９の何れか一項に記載の抗体を使用して、溶液から黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌を単離する方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、生物学、免疫学、医学の分野に関連する。
【０００２】
グラム陽性微生物は、全身感染症の大部分を引き起こす。これらのグラム陽性病原体の一つの重要なメンバーの一つは、黄色ブドウ球菌（S.aureus）である。人口の約２０％が黄色ブドウ球菌の長期的なキャリアである。黄色ブドウ球菌は、ニキビ、膿痂疹（impetigo）、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）によっても引き起こされる可能性がある）、おでき、蜂巣炎毛嚢炎（cellulitis folliculitis）、せつ、よう、熱傷様皮膚症候群及び膿瘍等の軽度の皮膚感染から、肺炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、トキシックショック症候群（ＴＳＳ）、及び敗血症等の生命を脅かす疾患に至る範囲の疾患を引き起こす可能性がある。黄色ブドウ球菌は、全種の臓器や組織に感染が可能である。黄色ブドウ球菌感染症は、免疫応答性並びに免疫不全のヒトに発生する。米国の集中治療室における感染の約５０％はこの病原体によって引き起こされる。年間３０万件の黄色ブドウ球菌感染症により１２０００人が死亡すると米国で報告されている（Moran等、NEMJ 355,666-674(2006)を参照）。
【０００３】
主要な問題は、黄色ブドウ球菌の抗生物質耐性の増加である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）は１９６０年代に出現した。当初は医療現場で同定された。しかしながら、ＭＲＳＡは入院してない市中の人々に存在しているように見える。ＭＲＳＡの治療は、抗生物質に対するＭＲＳＡの限られた感受性のため困難でかつ高価である。しかしながら、抗生物質の非常に少ない選択肢が利用できる。バンコマイシンは、しばしばペニシリン耐性ＭＲＳＡを治療するために使用される。米国特許第６９３９５４３号は、黄色ブドウ球菌に結合できるリポタイコ酸（ＬＴＡ）に対するマウス抗体を記載している。このマウス抗体に基づいて、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む組換えキメラマウス/ヒト抗体が産生された。しかしこのようなキメラマウス/ヒト抗体は、ヒトに投与した場合に重篤な副作用の危険性を伴うマウスの配列が存在するという欠点を持っている。
【０００４】
グラム陽性菌関連疾患に対抗するか、及び／又は予防するための手段および方法を提供することが本発明の目的である。様々なグラム陽性細菌、好ましくは、ブドウ球菌属、より好ましくはＭＲＳＡに対する代替の、及び／又は改善された結合化合物を提供することが、本発明の更なる目的である。様々なグラム陽性細菌、好ましくは、ブドウ球菌属、より好ましくはＭＲＳＡに対するヒト型の結合化合物を提供することが、本発明の更なる目的である。
【０００５】
本発明は、自然な環境においてブドウ球菌属に特異的に結合する抗体、その機能性部分、又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を提供する。従って、それらはブドウ球菌属の存在に関連した疾患への対抗、及び／又は予防、及び／又は診断に有用である。好ましくは、黄色ブドウ球菌に対抗する。特に好ましい実施態様ではＭＲＳＡに対抗する。対抗する別の好ましいブドウ球菌属は表皮ブドウ球菌である。
【０００６】
表皮ブドウ球菌は、通常は非病原性であるが、免疫不全の患者はしばしば感染症を発症する危険性がある。感染症は、病院や市中の両方で感染し得るが入院患者に対してはより脅威である。表皮ブドウ球菌による感染症に最も感受性が高いのは、静注薬物使用者、新生児、高齢者、及びカテーテル又は他の人工器具を使っている人である。感染症は血管内機器（人工心臓弁、シャントなど）に関わりがあるが、人工関節、カテーテル及び大きな傷においても一般的に起きる。症状は発熱、頭痛、倦怠感、食欲不振、呼吸困難を含む。
【０００７】
好ましい実施態様において、本発明は、ブドウ球菌属に特異的に結合することが可能である、単離された又は組換え型のヒト抗体、その機能部分、又は免疫グロブリン鎖又はそれらの機能的等価物を提供する。本発明によるヒト抗体及び機能部分は、その自然な環境中でブドウ球菌属へ結合できるため、様々なブドウ球菌属は、前記抗体、その機能部位、又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物の投与により対抗される。従って、前記ヒト抗体、その機能部分、又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物は、そのようなブドウ球菌属による感染症の治療又は予防に特に適している。本発明による前記ヒト抗体、その機能部分、又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物は、非ヒト配列が存在しないため、キメラ抗体に比べてヒト個人のための治療上及び／又は予防的使用により適している。これにより副作用のリスクを著しく軽減する。
【０００８】
本発明による一つの特に好ましい抗体は、図１に示した重鎖及び軽鎖の可変ドメイン配列を持つ「Ｆ１」と指定された抗体である。ここで使用される用語「Ｆ１」は、全てのＦ１抗体、例えば単離された又は組換え体として産生されたＦ１を包含する。組換え体として産生したＦ１はここでは「ｒＦ１」とも呼ばれる。Ｆ１の抗原結合特性に特に寄与するＦ１のＣＤＲ配列もまた図１に示す。抗体Ｆ１は完全にヒト型であり、黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌等のブドウ球菌球菌種に特異的に結合し、従ってヒト個人の治療のための治療的使用に適している。
【０００９】
重要なのは、抗体Ｆ１がインビボ及びインビトロにおいて全ての細菌へ結合可能であることである。更に提供されるのは、従って、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌へ特異的に結合する、単離された又は組換え型のヒト抗体又はその機能的部分である。更に、抗体Ｆ１は、例えば動物の感染組織において増殖する細菌に結合可能である。従って提供されるのは、インビボで増殖した黄色ブドウ球菌に結合する単離された抗体であり、ここで「インビボで増殖」とは黄色ブドウ球菌に感染している動物の感染組織における増殖と定義される。同様に提供されるのは、黄色ブドウ球菌、及び／又は表皮ブドウ球菌に対して特異的であるヒト免疫グロブリンの可変領域の少なくとも一つのＣＤＲ配列を含む、単離された又は合成による免疫グロブリン鎖、又はその機能的等価物である。
【００１０】
抗体の機能部分とは、必ずしも量でなく種類において前記抗体と少なくとも１つの共通する性質を持つ部分として定義される。前記機能部分は、必ずしも同程度ではないが、前記抗体と同じ抗原に結合できる。抗体の機能部分は、好ましくは単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、ユニボディ（ｕｎｉｂｏｄｙ）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片を含む。
【００１１】
抗体の機能部分はまた、得られた化合物の少なくとも一つの特性−好ましくは抗原結合特性が、必ずしも量においてでなく種類において本質的に同じであるように、抗体を変えることによっても産生される。これは多くの方法で、例えば、アミノ酸残基が、全体的な機能が恐らくは深刻に影響されないように、一般的に類似特性（サイズ、疎水性等）を持つ他の残基によって置換される、保存的アミノ酸置換を介して行われる。
【００１２】
当業者に知られているように、抗体の重鎖は免疫グロブリン分子を構成する鎖の２つのタイプの大きい方である。重鎖は定常ドメイン及び可変ドメインを含み、該可変ドメインが抗原結合に関与している。抗体の軽鎖は免疫グロブリン分子を構成する鎖の２つのタイプの小さい方である。軽鎖は定常ドメイン及び可変ドメインを含む。可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと一緒に抗原結合に関与する。
【００１３】
補完性決定領域（ＣＤＲ）は重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメイン中に存在する超可変領域である。抗体の重鎖ＣＤＲ及び連結した軽鎖は一緒に抗原結合部位を形成する。
【００１４】
免疫グロブリン鎖の機能的等価物は、ここでは免疫グロブリン鎖の少なくとも一つのＣＤＲ配列を含む、人工的な結合化合物として定義される。
【００１５】
さて、本発明は、図１に示されたＣＤＲ配列が所望の結合特性を提供するという見識を与えるため、当業者が少なくとも一つの改変されたＣＤＲ配列を含む変異体を生成することが十分可能である。例えば、保存的アミノ酸置換が適用される。Ｆ１に比べて少なくとも一つの改変された特性を持つ、変異体抗体又はその機能部分を生成するために、図１に示した少なくとも一つのＣＤＲ配列を変更することも可能である。好ましくは、図１に示したＣＤＲ配列と少なくとも７０％同一であるＣＤＲ配列を含む、抗体又は機能部分が提供され、Ｆ１の有利な結合特性が少なくとも部分的に維持されるか若しくは改善される。図１に示すようにＣＤＲ配列は、得られた抗体又はその機能部分が少なくとも一つの改善された特性、例えばＦ１に比べて向上した結合親和性、選択性及び／又は安定性等を含むように、好ましくは変更される。従って、変異体抗体、又は、図１に示すＣＤＲ配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む機能部分もまた本発明の範疇にある。アミノ酸配列を変更するための様々な方法が当該技術分野で利用可能である。例えば、所望のＣＤＲ配列を有する重鎖又は軽鎖配列は人工的に合成される。好ましくはＣＤＲ配列をコードする核酸配列は、ランダム−又は部位特異的−変異誘発を用いて、変異させられる。
【００１６】
一実施態様では、本発明は従って、抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を提供し：
−配列ＲＦＡＭＳ（配列番号１）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は
−配列ＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹ（配列番号２）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は
−配列ＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列
を含む。
【００１７】
更に提供されるのは、抗体又はその機能的部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物であり：
−配列ＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡ（配列番号４））に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ１配列、及び／又は
−配列ＫＴＳＩＬＥＳ（配列番号５）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ２配列、及び／又は
−ＸがＩ又はＭである、配列ＱＨＹＸＲＦＰＹＴ（配列番号６）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列
を含む。
【００１８】
上記のＣＤＲ配列は抗体Ｆ１のＣＤＲ配列である：ＶＨ ＩｇＨＶ３−２３及びＶＬ ＩｇＫＶｌ−５、及びそれらの変異体。Ｆ１のＣＤＲに少なくとも７０％の配列同一性を持つＣＤＲ配列を含む結合化合物は、黄色ブドウ球菌、及び／又は表皮ブドウ球菌による感染（の影響）に対抗、及び／又は予防に特に適している。ＶＨ ＩｇＨＶ３−２３及びＶＬ ＩｇＫＶｌ−５を含むＦ１の変異体は、軽鎖の軽鎖ＣＤ３中のイソロイシンがメチオニンに変えられているが、なお黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌等のブドウ球菌属に結合可能であることが見いだされた。
【００１９】
好ましくは、本発明による結合化合物は、図１に示すＣＤＲ配列の少なくとも一つに対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるＣＤＲ配列を含む。最も好ましくは、本発明による結合化合物は、図１に示すＣＤＲ配列の少なくとも一つに対して、少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％同一であるＣＤＲ配列を含む。上記の特に好ましい抗体Ｆ１は、図１に示すＣＤＲ配列からなるＣＤＲ配列を含む。本発明による特に好ましい実施態様は従って、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌に結合可能である、単離された、合成された又は組換え型の抗体又はその機能的等価物を提供し、
−配列ＲＦＡＭＳ（配列番号１）を含む重鎖ＣＤＲ１、及び／又は
−配列ＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、及び／又は
−配列ＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３、及び／又は
−配列ＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、及び／又は
−配列ＫＴＳＩＬＥＳ（配列番号５）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び／又は
−ＸがＩ又はＭである配列ＱＨＹＸＲＦＰＹＴ（配列番号６）を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含む。
【００２０】
一実施態様では、図１に示す重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列及び軽鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列、又はそれらと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％同一である配列を含む結合化合物が提供される。更に提供されるのは、配列ＲＦＡＭＳ（配列番号１）に少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖ＣＤＲ１配列、及び配列ＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹ（配列番号２）に少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖ＣＤＲ２配列、及び配列ＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡ（配列番号４）に少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、及びＫＴＳＩＬＥＳ（配列番号５）に少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖ＣＤＲ２を含む、単離された、合成された、又は組換え型の抗体又はその機能部分、又は免疫グロブリン鎖又はその機能等価物である。前記結合化合物は好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、最も好ましくは少なくとも９５％上記の重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。好ましくは前記結合化合物はまた配列ＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳ（配列番号３）と少なくとも７０％同一である配列を含む重鎖ＣＤＲ３配列、及び／又はＸがＩ又はＭである配列ＱＨＹＸＲＦＰＹＴ（配列番号６）と少なくとも７０％同一である配列を含む軽鎖ＣＤＲ３配列をも含む。上記重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，及びＣＤＲ３配列並びに上記軽鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２，及びＣＤＲ３配列を含む結合化合物もまた提供される。
【００２１】
さて、ブドウ球菌属に特異的に結合する能力を持つヒト抗体が本発明により提供され、ブドウ球菌属に特異的であり、ヒト免疫グロブリン可変ドメインの少なくとも一つのＣＤＲ配列を含む、免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を生成することが可能である。更に提供されるのは従って、ブドウ球菌属に特異的であり、ヒト免疫グロブリンの可変領域の少なくとも一つのＣＤＲ配列を含む、単離、組換え型又は合成による免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物である。好ましい実施態様ではヒト型抗体が提供される。必要に応じて、前記少なくとも一つのヒトＣＤＲ配列、又はフレームワーク領域の少なくとも一つにおける少なくとも１つの配列が、好ましくは結合効力や安定性を向上させるために最適化される。これは例えば、突然変異誘発実験によって行われ、その後得られた化合物の安定性及び／又は結合効力が好ましくは試験され、改良された結合化合物が選択される。
【００２２】
結合効力や安定性を向上させるためにＣＤＲ配列を最適化するだけでなく、フレームワーク領域の少なくとも一つにおいて少なくとも１つの配列を最適化することがしばしば有利である。これは好ましくは、結合効力や安定性を向上させるために行われる。フレームワーク配列は、例えば、フレームワーク配列をコードする核酸分子を変異させることによって最適化され、その後得られた抗体−又は機能部分−の特性が好ましくは試験される。この方法で、改良された抗体又は機能部分を得ることが可能である。好ましい実施態様では、ヒト生殖系列配列が、本発明による抗体又はその機能的部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物のフレームワーク領域として使用される。生殖系列配列の使用が、前記抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又は部分の免疫原性のリスクを好ましくは最小にするが、その理由はこれらの配列は、フレームワーク領域が由来する個体に特有であり、他のヒト個人に適用されると免疫応答を引き起こす可能性がある、体細胞変異を含む可能性が低いためである。
【００２３】
図１に示す重鎖配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する重鎖アミノ酸配列を含む、抗体又はその機能部分、又は免疫グロブリン鎖又はそれらの機能的等価物もまた提供される。このような重鎖配列は、抗体Ｆ１により明らかにされた所望の結合特性を提供する。また、図１に示すように軽鎖配列に対し少なくとも７０％配列同一性を有する軽鎖アミノ酸配列、及びＣＤＲ３のイソロイシンがメチオニンへ変えられた軽鎖配列は、抗体Ｆ１、及び前記改変を含む抗体Ｆ１の変異体により明らかにされた所望の結合特性も提供する。更に提供されるのは従って、本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能等価物が、配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）に少なくとも７０％の配列同一性を持つ配列を含む重鎖配列を持ち、及び／又は
ＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号８）に少なくとも７０％の配列同一性を持つ軽鎖配列を有する。
【００２４】
本明細書上記に示した軽鎖ＣＤＲ３のイソロイシンがメチオニンに変えられた変異体のほか、Ｆ１抗体の複数の変異体が開発されてきた。これらの変異体はブドウ球菌属に結合することができる。このような抗体変異体の例としては、本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物を含み、配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）、及び／又は、配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む重鎖配列、及びＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（配列番号１０）、及び／又はＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号１１）、及び／又はＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号８）を含む軽鎖配列を含む。
【００２５】
本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物は、セリン−アスパラギン酸（ＳＤ）リピートを含むタンパク質に特に結合する。ＳＤリピート（Ｓｄｒ）タンパク質は、ブドウ球菌属等、いくつかの細菌に存在する細胞表面結合タンパク質である。Ｓｄｒタンパク質は一般にアミノ末端シグナル配列、Ａ領域と称する機能ドメイン、ＳＤリピート領域、細胞壁貫通領域、ＬＰＸＴＧモチーフ、疎水性膜貫通ドメイン、及び正に荷電した一連の残基を含む。ＬＰＸＴＧモチーフはスレオニンとグリシン残基の間のモチーフを開裂するトランスペプチダーゼのターゲットであり、グラム陽性細菌の細胞壁のペプチドグリカンにタンパク質をアンカーする。Ｓｄｒタンパク質は、ホスト分子と相互作用すると考えられている。既知のＳｄｒタンパク質は黄色ブドウ球菌のＣｌＦＡ（ＳｄｒＡ）、ＣｌｆＢ（ＳｄｒＢ）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥ、表皮ブドウ球菌のＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨ、腐性ブドウ球菌（S.saprophyticus）のＳｄｒＩ、スタフィロコッカス・キャピティス（S.capitis）のＳｄｒＸ及びスタフィロコッカス・カプラエ（S.caprae）のＳｄｒＹ及びＳｄｒＺを含む。
【００２６】
従って、本発明による好ましい抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、腐性ブドウ球菌、スタフィロコッカス・キャピティス及びスタフィロコッカス・カプラエに特異的に結合する。前記抗体、イムノグロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部分はＣｌＦＡ（ＳｄｒＡ）、ＣｌｆＢ（ＳｄｒＢ）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥ、表皮ブドウ球菌のＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ、及びＳｄｒＨ、腐性ブドウ球菌のＳｄｒＩ、スタフィロコッカス・キャピティスのＳｄｒＸ及びスタフィロコッカス・カプラエのＳｄｒＹ及びＳｄｒＺに結合するのが望ましい。本発明による、抗体のエピトープ、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部分は、Ｓｄｒタンパク質のＳＤリピート依存性エピトープ、例えば黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥに存在するＳＤリピート依存性エピトープを含む。ＳＤリピート依存性エピトープはここでは抗体Ｆ１に認識されるエピトープと定義され、該エピトープは、限定しないが、黄色ブドウ球菌のＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥ、及び表皮ブドウ球菌のＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ及びＳｄｒＨに存在するＳＤリピート領域の少なくとも一部の存在を必要とする。一実施態様では、前記エピトープはＳｄｒタンパク質に結合するか又は関連する分子の少なくとも一部を含んでもよい。このような分子の例としては、限定しないが、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖及び糖残基を含む。別の実施態様では、前記エピトープは、ＳＤリピート領域の修飾を含む。前記修飾には、限定しないが、例えば、グリコシル化、アミド化、及び／又はリン酸化を含む。これら２つの実施態様の組み合わせも可能であることが当業者には明らかであろう。
【００２７】
従って、本発明はＳＤリピート−依存性エピトープと結合可能な本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物を提供する。同様に提供されるのは、黄色ブドウ球菌ＣｌＦＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥに結合可能な、抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物である。更に提供されるのは、本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖、又は機能的等価物と、ブドウ球菌属、好ましくは黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌及び／又は腐性ブドウ球菌及び／又はスタフィロコッカス・キャピティス、より好ましくはＭＲＳＡとの結合において競合することが可能な、抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖、又は機能的等価物である。
【００２８】
抗体の欠点はその安定性が例えば過酷な条件下で低減する可能性があることである。例えば機能的アミド基の除去である脱アミド化が生じる可能性がある。脱アミド化は、タンパク質の生物学的機能に影響を与え得るタンパク質の分解経路であり、主にアスパラギン残基で起き、及びグルタミン残基で低い割合で起きる。一実施態様では、従って、本発明による抗体又はその機能的部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物の脱アミド化は、アスパラギン又はグルタミンを他のアミノ酸によって置き換えることによって防止される。脱アミドはまたグルタミン残基にも起こり得るため、アスパラギンは、好ましくは、グルタミン以外のアミノ酸に置換される。アスパラギンの置換は、好ましくは、本発明による抗体の抗原に対する結合親和性に実質的に影響を与えない。一実施態様において、（Ｋａｂａｔの番号付け（１９９１）による）重鎖の位置５３におけるアスパラギンの脱アミドは別のアミノ酸によってに置き換えることによって防止される。位置５３位のアスパラギンの脱アミド化を防止することにより、本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物の安定性が好ましくは増加する。例に示すように、前記アスパラギンはＣＤＲに位置するという事実にもかかわらず、該位置でのアスパラギンの置換は本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物における結合親和性に実質的に影響を与えない。重鎖の位置５３のアスパラギンは好ましくはグルタミン以外のアミノ酸に置換され、より好ましくは該位置のアスパラギンはセリンに置換される。従って、また本発明によって提供されるのは、アスパラギン好ましくは重鎖の位置５３のアスパラギンが他のアミノ酸好ましくはセリンに置換された、本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物である。
【００２９】
一実施態様において、本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物が、抗体−薬物複合体を形成するための別の部分に結合されている。本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物が、抗生物質等の細胞傷害性薬物に結合されている。ここで使用される「細胞傷害性薬物」なる用語は、細菌の機能又は増殖を低減又は阻止し、及び／又は細菌の破壊を引き起こす物質を指す。前記の他の部分とは、例えば細胞傷害性薬物であり、好ましくは前記抗体又はその機能部分にチオール基を介して結合している。従って、好ましくは1つ以上のシステインが前記抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物に組み込まれる。システインはチオール基を含み、従って、本発明による抗体又はその機能部分に一以上のシステインの取込み、又は一以上のシステインによる一以上のアミノ酸の置換は、それらをその他の部分へ結合することを可能とする。前記抗体又はその機能的等価物のフォールディングには影響を与えず、かつ抗体結合又はエフェクター機能を変えない位置において、前記1つ以上のシステインが好ましくは本発明による抗体又はその機能等価物に導入される。従って本発明は本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を提供し、システイン以外の少なくとも１つのアミノ酸がシステインに置換される。好ましくはシステイン以外の少なくとも2つのアミノ酸がシステインに置換されている。好ましい実施態様において、システイン以外の前記少なくとも一つのアミノ酸は軽鎖位置１５のバリンか、及び／又は軽鎖位置１４４のアラニンか、及び／又は軽鎖位置１６８のセリンか、及び／又は軽鎖位置２０５のバリンか、及び／又は軽鎖位置１１０のバリンか、及び／又は重鎖位置８４のアラニンか、及び／又は重鎖位置１１４のアラニンか、及び／又は重鎖位置１６８のアラニンか、及び／又は重鎖位置１７２のセリンか、より好ましくは軽鎖位置２０５のバリンか及び／又は軽鎖位置１１０のバリンか、及び／又は重鎖位置１１４のアラニンである（Ｋａｂａｔの番号付け（１９９１）による）。当業者は、代替又は追加として、置換が前記抗体又は機能的等価物のフォールディングに影響を与えず、かつ抗原結合又はエフェクター機能を変えなければ、重鎖及び／又は軽鎖の1つ以上の他のアミノ酸がシステインに置き換え可能であることを理解するであろう。
【００３０】
国際特許出願の国際公開第２００６／０３４４８８号、国際公開第２００８／１４１０４４号、国際公開第２００９／０５２２４９号、国際公開第２００９／０１２２５６号、国際公開第２００９／０１２２６８号及び国際公開第２００９／０９９７２８号において、システイン・エンジニアリングに適したアミノ酸の位置とともに反応性システイン残基を有する抗体設計の方法が記載されている。
【００３１】
本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物は、図１の重鎖配列及び／又は軽鎖配列、又はＣＤＲ３のイソロイシンがメチオニンに変えられた図１に記載の軽鎖配列に対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、可変重鎖配列及び／又は可変軽鎖配列を好ましくは含む。同一性が高いほど前記結合化合物は抗体Ｆ１に密接に類似している。本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物は好ましくは、Ｆ１の重鎖及び軽鎖に似ている重鎖並びに軽鎖を含む。更に提供されるのは従って、図１の重鎖配列及び軽鎖配列、又はＣＤＲ３のイソロイシンがメチオニンに変えられた図１に記載の軽鎖配列に対して、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である、重鎖配列及び軽鎖配列を含む、抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物である。一実施態様では、図１に示した重鎖配列及び図１に示した軽鎖配列又はＣＤＲ３のイソロイシンがメチオニンに変更された図１に示した軽鎖配列を有する抗体又はその機能部分が提供される。
【００３２】
一実施態様では、図１に示した重鎖配列から成る重鎖配列、及び／又は図１に示した軽鎖配列からなる軽鎖配列、又はＣＤＲ３のイソロイシンがメチオニンに変更された図１に示した軽鎖配列を含む、抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を提供する。あるいは当業者に良く知られているとおり、目的の結合特性を維持しつつ短縮重鎖又は軽鎖配列を生成することが可能である。好ましくはそうした短縮重鎖又は軽鎖は元の重鎖又は軽鎖に比べて短い定常領域を持って生成される。可変領域は好ましくは維持される。例えば、図１に示した重鎖配列又は軽鎖配列に基づいて、Ｆａｂ断片又はＦ(ａｂ')２断片、又は単一ドメイン抗体又は一本鎖抗体又はナノボディ又はユニボディ、又はｓｃＦｖ断片が生成される。前記機能性部分は少なくとも２０アミノ酸の長さを有し、図１に示した重鎖ＣＤＲ１配列と少なくとも７０％同一である配列、及び図１に示した重鎖ＣＤＲ２配列と少なくとも７０％同一である配列、及び図１に示した重鎖ＣＤＲ３配列と少なくとも７０％同一である配列、及び図１に示した軽鎖ＣＤＲ１配列と少なくとも７０％同一である配列、及び図１に示した軽鎖ＣＤＲ２配列と少なくとも７０％同一である配列、及び図１に示した軽鎖ＣＤＲ３配列と少なくとも７０％同一である配列、又はイソロイシンがメチオニンに変えられた図１に示した軽鎖ＣＤＲ３配列からなる群から選択される少なくとも一配列を含む。
【００３３】
本発明は、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチドの長さを持ち、本発明による結合化合物をコードした、単離、合成又は組換え核酸配列又はその機能的等価物を更に提供する。そのような核酸は、例えば本発明による抗体を産生することが可能であるＢ細胞から単離される。好ましい実施態様では、図１に示すように、核酸配列の少なくとも１５ヌクレオチドに対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む核酸配列を提供する。本発明による核酸配列は、図１に示した核酸配列の少なくとも１５ヌクレオチドに対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を持つ配列を含む。好ましくは、図１に示した前記核酸配列は、少なくとも一つのＣＤＲをコードする配列を含む。
【００３４】
一つの好ましい実施態様は、本発明の抗体又は免疫グロブリン鎖の少なくとも一つのＣＤＲ配列をコードし、少なくとも１５ヌクレオチド長の単離、合成又は組換え核酸配列、又はその機能的等価物を提供する。前記核酸配列は、好ましくは、抗体Ｆ１のＣＤＲ領域に少なくとも７０％の配列同一性を有する少なくとも一つのＣＤＲ配列をコードする。Ｆ１のＣＤＲ領域をコードする核酸配列を図１に示す。更に提供されるのは、従って、
ｃｇｃｔｔｔｇｃｃａｔｇａｇｃ（配列番号１２）、
ｔｃｇａｔｃａａｔａａｔｇｇｇａａｔａａｃｃｃａｔａｃｔａｃｇｃａｃｇｇｔｃｇｇｔａｃａａｔａｃ（配列番号１３）、
ｇａｔｃａｃｃｃｔａｇｔａｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｔｔｔｇａｃｔｃｃ（配列番号１４）、
ｃｇｇｇｃｃａｇｔｇａａａａｃｇｔｔｇｇｔｇａｃｔｇｇｔｔｇｇｃｃ（配列番号１５）、
ａａｇａｃａｔｃｔａｔｔｃｔａｇａａａｇｔ（配列番号１６）、及び
ｃａａｃａｃｔａｔａｔａｃｇｔｔｔｃｃｃｇｔａｃａｃｔ（配列番号１７）
からなる群から選択される配列に対して少なくとも７０％配列同一性を有する配列を含む、単離、合成又は組換え核酸配列、又はその機能的等価物である。
【００３５】
前記核酸配列又は機能的等価物は好ましくは、上記配列の何れかに対して、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。更に提供されるのは、図１に示した核酸配列の少なくとも一部分に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を含む核酸配列又はその機能等価物であり、該一部分は少なくとも１５ヌクレオチドを有しかつ少なくとも一つのＣＤＲ領域をコードする。
【００３６】
本発明による核酸配列又はその機能的等価物は好ましくはＦ１のＣＤＲ領域、Ｆ１の重鎖及び／又はＦ１の軽鎖に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する領域をコードする。一実施態様では、配列ＲＦＡＭＳ（配列番号１）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、及び／又は配列ＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹ（配列番号２）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、及び／又は配列ＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳ（配列番号３）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、及び／又は配列ＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡ（配列番号４）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、及び／又は配列ＫＴＳＩＬＥＳ（配列番号５）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、及び／又は、ＸがＩ又はＭである配列ＱＨＹＸＲＦＰＹＴ（配列番号６）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、及び／又は配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するか、及び／又はＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号８）に対して少なくとも７０％の配列同一性を有する、アミノ酸配列をコードする配列を含む単離、合成又は組換え核酸配列又は機能的等価物を提供する。同様に提供されるのは、本発明によるＦ１抗体の変異体をコードする核酸配列又はその機能性部分である。本発明によって提供されるのは、例えば、配列
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）、及び／又は配列
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＬＳＲＦＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＷＶＡＳＩＮＮＧＮＮＰＹＹＡＲＳＶＱＹＲＦＴＶＳＲＤＶＳＱＮＴＶＳＬＱＭＮＮＬＲＡＥＤＳＡＴＹＦＣＡＫＤＨＰＳＳＧＷＰＴＦＤＳＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７）を含む重鎖配列をコードし、かつ
及びＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（配列番号１０）、及び／又はＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶ（配列番号１１）、及び／又はＸがＩ又はＭである配列
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＡＬＰＡＳＶＧＤＲＶＳＩＴＣＲＡＳＥＮＶＧＤＷＬＡＷＹＲＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＫＴＳＩＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＨＹＸＲＦＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶ（配列番号８）を含む軽鎖配列をコードする核酸配列である。
【００３７】
一実施態様では、重鎖の位置５３のアスパラギン（Ｋａｂａｔによる番号付け（１９９１））は、該位置のアスパラギンの脱アミド化を防ぐために、グルタミン以外の他のアミノ酸に置換される。好ましくは前記アスパラギンがセリンに置換される。
【００３８】
「％配列同一性」なる用語は本明細書において、２つの配列が最大割合の同一性を達成するべく必要あらばギャップを導入してアラインした後において、リファレンス配列における残基と同一である、核酸配列の候補アミノ酸における残基の割合として定義される。アラインメントのための方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野において良く知られている。
【００３９】
本明細書において使用する、本発明の核酸分子又は核酸配列は、好ましくはヌクレオチドの鎖、より好ましくはＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。他の実施態様において、本発明の核酸分子又は核酸配列は、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡらせん、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、及び／又はリボザイム等の他の種の核酸構造を含む。このような他の核酸構造は、核酸配列の機能的等価物と呼ばれる。「核酸配列の機能的等価物」なる用語はまた非天然のヌクレオチド、修飾ヌクレオチド及び／又は天然のヌクレオチドと同じ機能を発揮する非ヌクレオチド基本単位を含む鎖をも網羅する。
【００４０】
本発明による核酸配列は、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌に特異的な結合化合物を生成するために特に有用である。これは、細胞の核酸翻訳機構がエンコードされた結合化合物を生成できるように、例えば細胞内にそうした核酸配列を導入することによって行われる。一実施態様において、本発明による重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、又は２９３（Ｔ）細胞株等のいわゆるプロデューサー細胞で発現され、そのうち幾つかは、商業的な抗体産生に適応されている。前記プロデューサー細胞の増殖は本発明による抗体又はその機能部分を生産することができるプロデューサー細胞株をもたらす。好ましくは、前記プロデューサー細胞株は、ヒトにおける使用のための化合物を製造するために好適である。従って、前記プロデューサー細胞株は、そのような病原性微生物などの病原体が好ましくはフリーである。最も好ましくは、ヒト配列から成る結合化合物は本発明による核酸配列を使って生成される。
【００４１】
従って本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物を作り出すことができる単離、又は組換え型抗体を産生する細胞と、並びに、本発明による核酸配列又は機能的等価物を細胞に与え、前記細胞が本発明による前記核酸配列又は機能的等価物を翻訳できるようにし、それによって本発明による前記抗体又は機能部分又は免疫グロブリンの鎖又は機能的等価物を生産することを含む、本発明の抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物を産生するための方法もまた提供される。
【００４２】
抗体産生細胞は、本明細書において抗体又はその機能部分を産生及び／又は分泌可能な細胞として、及び／又は抗体又はその機能部分を産生及び／又は分泌可能な細胞に成長することが可能な細胞として定義される。本発明による抗体産生細胞は、好ましくは、商業的抗体産生に適応したプロデューサー細胞である。好ましくは、該プロデューサー細胞はヒトにおける使用のために化合物を製造するために適している。
【００４３】
本発明による方法は好ましくは更に、本発明による前記抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物を、回収し、精製し、及び／又は単離する工程を含む。本発明によるこうして得られた結合化合物は、必要に応じて追加の精製、単離及び／又は他の処理の後、好ましくは、ブドウ球菌感染症の診断、ブドウ球菌の単離又は検出、ブドウ球菌属と他のグラム陽性菌との識別、及びヒト治療に使用される。
【００４４】
本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又その機能的等価物は診断の用途に特に適している。例えば、組織又は血液サンプル等の試料は、個体から、又はブドウ球菌、好ましくは黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌、より好ましくはＭＲＳＡに感染する疑いのある任意の他の由来から得ることができる。続いて、前記試料を本発明による抗体又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部を混合させることが可能である。前記抗体、免疫グロブリン鎖又は機能等価物又は一部は、特にブドウ球菌、好ましくは、黄色ブドウ球菌、及び／又は表皮ブドウ球菌に結合する。抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又は一部に結合した細菌は、当該技術分野で公知の任意の方法を使用して、試料から単離することができる。限定しないが例えば、磁性ビーズ、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いた単離、又はカラム上に固定化した二次抗体を使用した単離を用いて単離することができる。結合した細菌及び抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部を洗浄した後、細菌を、抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又は一部から当該技術分野で公知の任意の方法によって溶出することができる。例えば、細菌と、抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又は一部との間の結合は、塩及び／又は濃度を増加し、及び／又はｐＨを減少又は増加し、及び／又は過剰なエピトープを添加することによって壊すことが可能である。
【００４５】
ブドウ球菌、好ましくは、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌の単離は、様々な用途に使用され得る。例えば、いくつかの異なるグラム陽性菌による感染は、個々において症状が重複する可能性がある。そのような場合、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌及び他のグラム陽性細菌を区別することは困難であり得る。本発明による抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部は、次いで黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌を検出するために、又は黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌、及び他の細菌を区別するために用いることができる。黄色ブドウ球菌、及び／又は表皮ブドウ球菌による感染症に罹患が疑われる個々の試料から、又は細菌培養等の他の由来から細菌を単離することは、単離が前記ブドウ球菌の増加した濃度及び／又は高純度をもたらすため、前記ブドウ球菌の検出を容易にすることが可能となる。
【００４６】
ブドウ球菌属、好ましくは、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌、より好ましくはＭＲＳＡの単離は、例えば試料中の特異的な黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌、好ましくはＭＲＳＡの菌株を同定するために更に使用することができる。前記菌株の同定は例えば、細菌のＤＮＡの配列を決定することにより行うことが可能である。そのような場合、単離された黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌を最初に得ることが望まれる。
【００４７】
本発明の一実施態様において、本発明による抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部が、前記抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又は一部を検出するために、限定しないが、例えば蛍光標識又は放射性標識で標識される。あるいは、本発明による抗体、免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物は、本発明による前記の抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部に対する標識された二次抗体を使用して決定される。もし、前記の抗体、免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又はその一部の結合が検出された場合、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌が存在する。
【００４８】
本発明により提供されるのは、従って、ブドウ球菌感染、好ましくは黄色ブドウ球菌感染、より好ましくはＭＲＳＡ感染の診断を目的として、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌、好ましくはＭＲＳＡの検出のため、及び黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌、好ましくはＭＲＳＡ及び他のグラム陽性菌を識別するために、本発明による抗体又はその機能的等価物又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物又は一部の使用である。更に提供されるのは、ブドウ球菌感染、好ましくは黄色ブドウ球菌感染、より好ましくはＭＲＳＡ感染の診断における使用のために、本発明による抗体又はその機能的等価物又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物である。
【００４９】
更に提供されるのは、発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を使用して溶液から黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌の細菌を単離する方法である。前記方法は好ましくは黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌、好ましくはＭＲＳＡによる感染、又は細菌培養培地等の任意の他の由来による感染に罹患していると疑われる個体の試料を提供し、本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を前記試料に添加し、本発明による前記の抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌が存在する場合結合させ、かつ前記試料から本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物を単離することを含む。
【００５０】
本発明によるグラム陽性菌特異的結合化合物及び、ヒト型の結合化合物を含みそれをコードする核酸配列が与えられたので、改良された治療への応用が利用できるようになった。黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌等のグラム陽性菌は本発明による化合物に結合することにより対抗される。本発明による結合化合物は、従って薬又は予防薬としての使用に特に適している。好ましくは、ヒト個人が治療された場合に有害な副作用の可能性を減らすために、結合化合物はヒトの配列からなるか、最大で５％の非ヒト配列を有するものが使用される。医薬及び／又は予防薬としての使用のための本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物、又は核酸配列又はその機能的等価物もまたこれにより提供される。本発明による核酸又は機能的等価物が投与されると、本発明の結合化合物にその場で翻訳される。特に好ましい実施態様において、前記抗体は抗体Ｆ１、又はその機能部分を含む。前記医薬又は予防薬は好ましくは、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌による感染症に対抗する、又は少なくとも一部は感染症を防ぐために、又は少なくとも一部は黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌による有害な副作用に対抗するために使用される。従って更に提供されるのは、少なくとも一部は黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌に関連する疾患の治療及び／又は予防のための医薬及び／又は予防薬として使用するための本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物、又は核酸配列又はその機能的等価物である。そうした疾患の非限定的な例は、皮膚感染症、ニキビ、膿痂疹、おでき、蜂巣炎毛嚢炎、せつ、よう、熱傷様皮膚症候群、膿瘍、肺炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、トキシックショック症候群及び敗血症である。好ましくは、黄色ブドウ球菌感染症が対抗され又は少なくとも部分的に予防される。最も好ましくは、ＭＲＳＡに関連する疾患が対抗され、減弱され、及び／又は少なくとも一部は予防される。従って、黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌を少なくとも一部は治療、及び／又は予防のための医薬及び／又は予防薬の調製のために、本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物、又は核酸配列又はその機能的等価物の使用、並びに黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌に関連する疾患を少なくとも一部は治療又は予防するための方法もまた提供され、該方法は本発明による抗体又は機能部分又は免疫グロブリン鎖又は機能的等価物を治療に有効な量、好ましくは前記個人が黄色ブドウ球菌及び／又は表皮ブドウ球菌に感染していると診断後に、それを必要とする個人へ投与することを含む。前記疾患は好ましくは上記にリストされた黄色ブドウ球菌関連疾患の少なくとも一つ、最も好ましくはＭＲＳＡ関連疾患を含む。前記抗体は好ましくは抗体Ｆ１、又はその機能部分を含む。
【００５１】
グラム陽性菌に対抗するために、本発明による結合化合物は好ましくは感染が起きる前に個人に投与される。あるいは個人がすでに感染している場合に本発明による結合化合物が投与される。前記結合化合物は、好ましくは例えば入院している個人及び／又は易感染性免疫を持つ個人等、合併症が増大するリスクを抱えた個人に投与される。また、高齢者は細菌疾患のリスクが増加している。本発明による結合化合物は、好ましくは１回以上の注射により投与される。本明細書で前に記載された通り治療用途において使用されるべき本発明による結合化合物の用量範囲は、厳格なプロトコルの要件が存在する臨床試験におけるクリニックでの上昇投与量試験に基づいて設計される。典型的な用量は体重ｋｇ当たり０．１から１０ミリグラムである。治療への応用のために、本発明による結合化合物は一般的に薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤と組み合わされる。例えば適切な担体の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン（例えばＢＳＡ又はＲＳＡ）とオボアルブミンを含む。一つの好ましい実施態様において、前記適切な担体は、例えば生理食塩水などのような溶液を含む。
【００５２】
更に別の態様において、本発明による結合化合物をコードする核酸が使用される。既に説明された通り、そのような核酸を投与することで結合化合物が宿主機構により生産される。生産された結合化合物は、グラム陽性細菌感染及び／又はそうした感染症の有害作用を予防及び／又は対抗することができる。従って本発明による核酸配列又は機能的等価物も医薬及び／又は予防薬として使用するためにこれにより与えられる。前記核酸は、好ましくは、黄色ブドウ球菌、及び／又は表皮ブドウ球菌、より好ましくは黄色ブドウ球菌、最も好ましくはＭＲＳＡに対抗するために使用される。更に提供されるのは従って、グラム陽性菌に関連する疾患を少なくとも部分的に治療及び／又は予防するための医薬及び／又は予防薬を調製するための本発明による核酸配列又は機能的等価物の使用である。前記グラム陽性菌に関連する疾患は、好ましくは黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌、より好ましくは黄色ブドウ球菌による感染症、最も好ましくはＭＲＳＡ感染による感染症を含む。
【００５３】
更に提供されるのは、本発明による抗体又はその機能部分又は免疫グロブリン鎖又はその機能的等価物又は核酸配列又はその機能的等価物、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤である。前記薬学的組成物は好ましくはヒトへの使用に適している。
【００５４】
本発明は更に以下の実施例において説明される。これらの例は本発明の範囲を限定せず、単に発明を明確にするために提供される。
【００５５】
詳細な説明において言及されている全ての特許文書及び他の刊行物は、全ての目的のために参照により本明細書に援用される。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００５６】
実施例１  方法
Ｂ細胞の単離
Ｂ−細胞はフィコール分離、及び製造業者(Miltenyi Biotech)により説明された通りにＭＡＣＳマイクロビーズによるＣＤ４／ＣＤ８の負の選択により成人の新鮮な血液から得た。記憶Ｂ細胞を得るために、細胞はＦＡＣＳａｒｉａ(Becton Dickinson)上でＣＤ１９＋ＣＤ３ＣＤ２７＋ＩｇＤ ＩｇＡによって分類された。これらの組織の使用は機関の医療倫理委員会によって承認され、インフォームドコンセントを条件とした。ドナーは遺伝子型クラスター１０９及び１６を持つ院内感染ＭＲＳＡ株の保菌に基づいて選択された。
【００５７】
細胞培養
ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、８％のＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ロッシュ）を含む標準培地中で維持されたＢ−細胞が、γ−照射（５０Ｇｙ）マウスＬ細胞繊維芽細胞を安定に発現するＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ−Ｌ細胞、１０５細胞／ｍｌ）及び組換えマウスＩＬ−２１（２５ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）上で共培養された。ｒｈＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ）は５０ｎｇ／ｍｌで使用した。細胞は、日常的にＰＣＲにより試験され、マイコプラズマ及びＥＢＶの存在について否定的であることが分かった（データ非表示）。
【００５８】
大量に形質移入されたＮＧＦＲ及びＧＦＰの二重陽性ヒト記憶Ｂ細胞はＦＡＣＳセルソーティングにより精製され、ウェル当たり５００細胞の細胞密度で９６ウェルプレート中で培養された。培養上清はＮｅｗｍａｎ及びＳＨ株の細菌ライセートを用いてＥＬＩＺＡで試験された。陽性培養液は９６穴プレート中の１０細胞／ウェルの細胞密度でサブクローニングされ、再度ＥＬＩＳＡにより試験した。続いて陽性培養液は、ウェル当たり１細胞で播種され、黄色ブドウ球菌株Ｎｅｗｍａｎ及びＳＨ１０００に対する反応性についてＥＬＩＳＡにより再試験した。
【００５９】
レトロウイルス形質導入
ＢＣＬ６レトロウイルスコンストラクトは以前説明されている（Shvarts A.等、Genes Dev16、681-686（2002））。ヒトＢｃｌ−ｘＬをコードするｃＤＮＡはＳｔａｎｌｅｙ Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ博士により好意的に提供された。ＢＣＬ６及びＢｃｌ−ｘＬは別個にＢＣＬ６−ＮＧＦＲ及びＢｃＩｘＬ−ＧＦＰコンストラクトにクローニングした。これらのコンストラクトは、前述したようにＬＺＲＳレトロウイルスパッケージング細胞のフェニックスに形質移入した(Jaleco A.C.等、Blood 94,2637-2646(1999)；Scheeren F.A.等、Nat Immunol 6,303-313(2005))。記憶Ｂ細胞は、前述のように３６時間ｒｍＩＬ−２１の存在下でＣＤ４０Ｌ−Ｌ細胞の活性化の後にレトロウイルスを含むＢＣＬ６及びＢｃｌ−ｘＬにより二重形質導入された(Diehl S.A.等、J Immunol 180,4805-4815(2008);Kwakkenbos M.等、Nat Med印刷中(2009))。形質導入細胞はｒｍＩＬ−２１によりＣＤ４０Ｌ−Ｌ細胞で維持された。
【００６０】
ＥＬＩＳＡ
抗体含有量を決定するためにＥＬＩＳＡプレートは５μｇ／ｍｌのＰＢＳ中の抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により１時間３７℃又は４℃で一晩コーティングし、ＥＬＩＳＡ洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄した。細胞培養上清の連続希釈前及び酵素標識検出抗体が添加される前に、ＰＢＳ中の４％のミルクを遮断薬として使用した（ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）において希釈は１：２５００）。ＴＭＢ基質／停止液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）がＥＬＩＳＡの構築に使用された。
【００６１】
スクリーニング目的のために我々は、Ｎｅｗｍａｎ及びＳＨ１０００株由来のライセートを使用した。Ｂ細胞培養上清が無希釈で又は１：２希釈で試験される前に、両方ともＰＢＳ中で作られ直接５から１０μｇｍｌ−１にてコーティングされた。
【００６２】
ヒトＩｇＧ１クローンＦ１の抗原特異性を調べるために、ＬＴＡ検出ＥＬＩＳＡを構築した。２次抗体が添加される前に、黄色ブドウ球菌、枯草菌（B.subtilis）、フェカリス菌（S.faecalis）、化膿連鎖球菌（S.pyogenes）（シグマ）由来の精製ＬＴＡ調製物がポリクロナールＩｇＧ精製マウス抗ＬＴＡ（１／２００ストック１ｍｇｍｌ−１、ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加された。
【００６３】
更に、Ｗ．Ｆｉｓｃｈｅｒ（生化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）、エルランゲン大学、ドイツ）により構築されたライブラリーに由来する複数のＬＴＡ調製物が、Ｂ．Ａｐｐｅｌｍｅｌｋ（ＶＵ，アムステルダム、オランダ）により好意的に提供され（より詳細は（(Keller R.等、Infect Immun 60,3664-3672(1992),Polotsky V.Y.等、Infection and Immunity 64,380-383(1996)及びGreenberg J.W.等、Infection and Immunity 64,3318-3325(1996)）を参照）、及び直接（ｄｉｒｅｃｔ）ＥＬＩＳＡに関して(Weidenmaier C.等、Nat Rev Microbiol 6,276-287(2008))にレビューされる。ｒＦ１（１０μｇｍｌ−１）又はコントロール抗体（ハイブリドーマ上清の１：５希釈）が添加される前に、ＬＴＡ調製物は１μｇｍｌ−１でコーティングされ、更に複合型の抗ヒト又はマウス抗体により検出された。精製ＬＴＡ調製物のパネルは、枯草菌（B.subtilis）、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、ラクトコッカス・ラクティス（L.lactis）、L.garvieae、ビフィズス菌（B.bifidum）、ミクロコッカス・ルテウス（M.luteus）、カゼイ菌（L.casei）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（L.mesenteroides）、バチルス・リケニフォルミス（B.licheniformis）、リステリア‐ウェルシメリ（L.welshimeri）、エンテロコッカス・ヒラエ（E.hirae）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（L.raffinolactis）、ミュータンス菌（S.mutans）、肺炎球菌（S.pneumoniae）、を含有した。複数の変異体がアラニン残基及び／又は脂質アンカーを含むか又は欠いている（ここでは示さない）。
【００６４】
細菌培養液へのＦ１抗体の結合
Ｎｅｗｍａｎの黄色ブドウ球菌及び肺炎球菌株（セロタイプ３）を用いた。ＮｅｗｍａｎはＴＳＨ ５０ｍｌ中で一晩培養し、次いで１ｍｌを１００ｍｌ中にＯＤ：１になるまで２から２．５時間再懸濁し、細菌が回収された。肺炎球菌は、酵母培地と混合したトッドヒューイット（Ｔｏｄｄ Ｈｅｗｉｉｔ）培地で培養した。細菌がＦ１抗体、コントロールのＩｇＧ（Ｄ２５、ヒト抗ＲＳＶ抗体）と共に、又は２次抗体（ＩｇＧ−ＰＥのみ）のみと共にインキュベートされる前に、細胞はバックグランド染色を防ぐために１００％完全なマウス血清で前処理された。洗浄後２次抗体が添加された（ＩｇＧ−ＰＥ）。抗体インキュベーションは氷上で２０分間行った。
【００６５】
Ｆ１配列決定及び発現クローニング
我々は全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（インビトロジェン）を用いて単離し、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＲＴを用いてｃＤＮＡを生成し、重鎖及び軽鎖の可変領域をｐＣＲ２．１ ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン）へクローニングした。逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼの誘発変異を除外するために、我々は複数の独立したクローニング実験を行った。組換え型Ｆ１モノクローナル抗体を産生するために、我々は、ヒトＩｇＧ１及びカッパ（κ）定常領域を持つフレーム中のＦ１重鎖及び軽鎖可変領域をｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン）をベースとしたベクターへクローニングし、一過性に２９３Ｔ細胞に形質移入した。我々は、プロテインＡにより培養上清から組換えＦ１を精製した。
【００６６】
結果
Ｆ１クローンの生成
ＭＲＳＡ陽性と判定されたが病気ではない３人の患者から、フィコール精製工程の後にヘパリン血液５０−６０ｍｌを回収し、末梢Ｂ細胞が単離された。複数のＢ細胞集団由来のＢ細胞はＢＣＬ６−ＮＧＦＲ及びＢｃｌ−ＸＬ−ＧＦＰ（Ｄｉｅｈｌ等及びＫｗａｋｋｅｎｂｏｓ等）を含むレトロウイルスで二重に形質導入した。ＩｇＧ、ＣＤ２７陽性細胞集団から、Ｂ−細胞培養ポリクローナル小規模培養のＢ細胞培養が、５００細胞／ウェルの細胞密度で９６穴プレートで開始された。これらの小規模培養の上清が回収され、黄色ブドウ球菌特異的ＩｇＧ抗体のスクリーニングのためＥＬＩＳＡに用いられた（これらのＥＬＩＳＡではコーティングはＳＨ１０００及びＮｅｗｍａｎの２種の黄色ブドウ球菌株の細胞ライセートであった）。ＳＨ１０００並びにＮｅｗｍａｎ黄色ブドウ球菌の両方で陽性とスクリーニングされた小規模培養は、１０細胞／ウェルの密度で新たな小規模培養に播種した。再び、これらの小規模培養の上清が回収され、ＳＨ１０００及びＮｅｗｍａｎＥＬＩＳＡでスクリーニングされた。両方のＥＬＩＳＡで陽性とスクリーニングされたクローンをモノクロナール培養（すなわち、１細胞／ウェル）に播種した。これらのモノクローナル培養の上清を試験した後、１つのクローン（Ｆ１と命名）が黄色ブドウ球菌に特異的なモノクローナルＩｇＧ抗体を産生することが見いだされた。
【００６７】
黄色ブドウ球菌由来のＬＴＡ調製物に結合したＦ１クローンの上清中の抗体
Ｆ１のクローンを産生し、我々は、Ｆ１の上清が２種の黄色ブドウ球菌株、ＳＨ１０００及びＮｅｗｍａｎの細菌の細胞ライセートに結合することを既に見いだした。グラム陽性菌の主要な細胞壁化合物はＬＴＡであり、従って我々は、ＥＬＩＳＡにおいて、Ｆ１上清の黄色ブドウ球菌のＬＴＡ調製物への結合を試験することを決めた。表１に示した通り、Ｆ１クローンの上清はＳＨ１０００及びＮｅｗｍａｎの黄色ブドウ球菌株だけでなく商業的に購入した精製黄色ブドウ球菌のＬＴＡ調製物にも結合する。しかし我々は、ＬＴＡ調製物への結合は全細菌で観察されたものより著しく低かったことに気がついた。
【００６８】
表１：Ｆ１クローンの上清が黄色ブドウ球菌ＬＴＡ調製物に結合する。陰性コントロールとして抗マウスＨＲＰ標識二次抗体が使用された。別のコントロールは、インフルエンザＨ３タンパク質を検出するだけの抗インフルエンザウイルス抗体であった。
2016135771.tif 000002
【００６９】
組換え産生されたＦ１抗体は複数のソース由来のＬＴＡ調製物に結合する。
抗体遺伝子を発現ベクター中にクローニングし、発現系において組換えＦ１（ｒＦ１）抗体を産生した後、ｒＦ１抗体が複数の細菌由来の精製ＬＴＡ調製物で試験された。図２Ａに示すように、ｒＦ１抗体は、黄色ブドウ球菌及び枯草菌から得た商用ＬＴＡ試料に良く結合し、フェカリス菌（S.faecalis）及び化膿レンサ球菌（S.pyogenes）由来のＬＴＡ試料にもそれに劣らず良く結合した。ｒＦ１抗体は、肺炎球菌由来のＬＴＡ試料には結合しなかった（データ非表示）。更にｒＦ１は、枯草菌、B.licheniformis及び黄色ブドウ球菌の２つの分離株から高度に精製されたＬＴＡ試料を認識した（図２ｂ）。ｒＦ１はミュータンス（S.mutans）菌由来のＬＴＡ調製物（図２ｂ）、又はラクトコッカス・ラクティス（L.lactis）、L.garvieae、ビフズス菌（B.bifidum）、ミクロコッカス・ルテウス（M.luteus）、カゼイ菌（L.casei）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（L.mesenteroides）、リステリア‐ウェルシメリ（L.welshimeri）、エンテロコッカス・ヒラエ（E.hirae）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（L.raffinolactis）、ミュータンス菌（S.mutans）、肺炎球菌（S.pneumoniae）に結合しなかった（結果非表示）。
【００７０】
組換え型Ｆ１抗体は生きている黄色ブドウ球菌の細菌に結合する。
ｒＦ１抗体が生きているグラム陽性細菌をも認識するかどうかを検討するために、Ｆ１抗体の黄色ブドウ球菌及び肺炎球菌に対する結合をフローサイトメトリーを用いて試験した。図３Ａに示すように、ｒＦ１抗体は、生きている黄色ブドウ球菌の細菌（Ｎｅｗｍａｎ株）に結合するが、肺炎球菌には結合しない。さらに、我々はｒＦ１が６つの臨床的黄色ブドウ球菌分離株を認識することを示した；一つは、ＰＶＬ陽性である病原性株であり、３つは通常株、及び２つはＭＲＳＡ株である（図３ｂ）。
【００７１】
実施例２
方法
細菌株及び培養。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株ＵＳＡ３００（１１１４）、ＵＳＡ４００、Ｎ３１５、ＵＳＡ１００、ＵＳＡ１０００、ＣＯＬ、ＭＲＳＡ２５２、並びにメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株のＲｅｙｎｏｌｄｓ、Ｂｅｃｋｅｒ、Ｓｍｉｔｈ Ｄｉｆｆｕｓｅ、ＭＮ８、及びバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）株のＭｕ５０は全て黄色ブドウ球菌の抗生物質抵抗性に関するネットワーク（ＮＡＲＳＡ）から入手した；ＭＳＳＡ株のＮｅｗｍａｎ及びＲｏｓｅｎｂａｃｈはＡＴＣＣから得た。表皮ブドウ球菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、及び化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）は、Ｗａｒｄ’ｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅから得た；リステリア菌（Listeria monocytogenes）はＡＴＣＣから得た。細菌は３７℃で１８時間、５％ヒツジ血液を補充されたトリプシン大豆寒天（ＴＳＡ）プレート上で増殖させた。液体培養に対しては、ＴＳＡプレートからの単一コロニーをトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）に接種し、３７℃で１８時間２００ｒｐｍで振とうしながら培養した。新鮮なＴＳＢ中でこれらの培養物の新鮮な１００倍希釈液が更に何回も継代培養された。
【００７２】
インビトロで増殖した全細菌に結合しているｒＦ１のＦＡＣＳ分析。
全細胞の抗体染色のために、細菌はＴＳＡプレート又はＴＳＢ培養物から回収され、０．１％ＢＳＡ（ＩｇＧフリー、シグマ社）、及び１０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．４（ＨＢバッファー）を添加したフェノールレッド無しで、ハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で２０分間１７００×ｇでの遠心分離により洗浄した。細菌の濃度は、６３０ｎｍで光学密度を読み取ることにより見積もられた。ＨＢバッファ−内の２０×１０８ＣＦＵ／ｍＬの細菌懸濁液が等量の３００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧ（シグマ）と混合され、非特異的ＩｇＧ結合をブロックするために室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。ｒＦ１及びヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールを含む一次抗体は、２μｇ／ｍＬの最終濃度になるように追加され、これらの混合物は１５分間室温でインキュベートされた。ＨＢで２回洗浄した後、細菌ペレットを蛍光抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ジャクソンイムノ）の溶液に再懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。細菌はＰＢＳで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。
【００７３】
感染組織由来の全細菌に結合しているｒＦ１のＦＡＣＳ分析。
感染組織由来の細菌に結合する抗体の解析のために、ＴＳＢ中のＵＳＡ３００の４時間継代培養細胞をＰＢＳで洗浄した。マウスは、ＰＢＳ中のＵＳＡ３００の懸濁液１００μＬを推定濃度１０×１０８ＣＦＵ／ｍＬにて静脈内注射された。三日後、腎臓、肝臓、肺を採取し円錐形の組織グラインダーチューブ（ＶＷＲ）を使用してホモジナイズした。必要あらば、臓器は感染の異なる時点で採取された。マウスの細胞を溶解するために、ホモジネートは、０．１％トリトン−Ｘ１００（Ｔｈｅｒｍｏ社）、１０μｇ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（ロシュ）及び完全なミニプロテアーゼインヒビターカクテル（ロッシュ）を含むＰＢＳで室温で１０分間インキュベートされ、４０μｍのフィルター（ファルコン）を通された。細胞懸濁液をＰＢＳで２回洗浄し、ＨＢ緩衝液に再懸濁させ、等量の６００μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（シグマ）と混合され、室温で１時間インキュベートした。ｒＦ１及びヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールを含む一次抗体が、最終濃度２μｇ／ｍＬまで追加された。マウス臓器の破片由良の細菌を区別するために、ウサギＩｇＧ抗黄色ブドウ球菌（Ａｂｅａｍ）が濃度２０μｇ／ｍＬまで追加された。室温で１５分間インキュベーション後、細胞をＨＢ緩衝液で２回洗浄し、各々異なる蛍光色素（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で標識された、抗ヒトＩｇＧ及び抗ウサギＩｇＧ二次抗体の混合物に再懸濁させた。ＰＢＳで２回洗浄後、細胞を２％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。ウサギＩｇＧ抗黄色ブドウ球菌による陽性染色のためのゲーティングにより二重蛍光のプロットから細菌を選択した後、ｒＦ１及びアイソタイプコントロールの蛍光強度の重ね描きヒストグラムプロットが生成された。
【００７４】
結果
ｒＦ１は１４種の黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌に強く結合する。
７つのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）株、６つのメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）株、１つのバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）株、表皮ブドウ球菌及び他の複数のグラム陽性菌種がｒＦ１抗体への結合について試験された。図４に示すように、ｒＦ１は全１４種の黄色ブドウ球菌株（図４Ａ）及び表皮ブドウ球菌（図４Ｂ）に強く結合したが、他の試験されたグラム陽性種（図４Ｂ）には結合しなかった。
【００７５】
ｒＦ１は、異なる増殖段階由来の、及びインビトロでの感染由来のＭＲＳＡに結合する。
我々は、細菌に結合するモノクローナル抗体ｒＦ１の能力を、異なる組織において及び感染経過に関しての両方で試験した。我々はｒＦ１はマウスの腎臓、肝臓、肺組織から単離した細菌に感染後２日で結合し、及び感染した腎臓から単離した細菌への結合は安定であり、感染後２、３及び８日後の結合細菌であることを見いだした。
【００７６】
ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００株）の異なる増殖段階、すなわち初期の対数増殖（２時間）及びＴＳＢ培養中のポスト指数関数的成長（８時間）、及びＴＳＡプレート上の個体コロニーの増殖に対するｒＦ１抗体の結合が試験された。ｒＦ１は試験した全ての増殖段階に対して強く結合する（図５Ａ）。
【００７７】
感染した組織由来の全細菌に対して、ＭＲＳＡ（ＵＳＡ３００株）に対するｒＦ１抗体の結合が、マウスをＭＲＳＡに全身感染させた３日後にマウス由来のホモジナイズした腎臓において試験された。図５Ｂに示すように、ｒＦ１は感染した組織から得られたＭＲＳＡに結合する。
【００７８】
実施例３
更なる実験が、抗体ｒＦ１が結合したエピトープを同定するために行われた。ＬＴＡ調製物への結合は観察されていたが（例えば、実施例１）、その結合は全細菌に結合するほど強力ではなく、別のエピトープがｒＦ１結合に関与する可能性を示唆している。
【００７９】
方法
黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌及び商用ＷＴＡ調製物の細胞壁ライセートの免疫沈降、ウェスタンブロット法及び質量分析
Ｗｏｏｄ４６黄色ブドウ球菌株（バイオデザイン／メリディアンライフサイエンス社、メイン州）からの商用のタイコ酸（ＷＴＡ）調製物４０マイクログラムを２つの部分に分割し、１ｕｇ／ｍｌのｒＦ１又はアイソタイプコントロールヒト抗体で免疫沈降した。抗体は、プロテインＡ／Ｇ Ｕｌｔｒａｌｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）で捕捉された。次に、試料を５０ｍＭのジチオスレイトール、１０ｍＭの２−ヨードアセトアミドで処理し、８％トリス−グリシンゲル上で流し、続いてｒＦ１でウェスタンブロットを行った。
【００８０】
ＵＳＡ３００黄色ブドウ球菌株の２０ｍｌ一晩培養物の細胞壁調製物は、培養物（４０ｍｇの細胞ペレット／ｍｌ）を３０％ラフィノースバッファ中の１００ｍｇ／ｍｌのリゾスタフィンにより３７℃で３０分間処理することにより調製した。全細胞壁調製物は濾過され、ＮＰ４０溶解緩衝液で１０ｍｌまで希釈し、細胞壁調製物からできる限りプロテインＡを枯渇させるために抗Ｆｌａｇ Ｍ２アガロース（シグマ）で２回インキュベートした。最終的な細胞壁調製物は、二つの部分に分けられ、１ｕｇ／ｍｌのｒＦ１又はアイソタイプコントロールヒト抗体の１ｕｇ／ｍｌで免疫沈降した。抗体は、プロテインＡ／ＧＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）で捕捉された。次に、試料を５０ｍＭのジチオスレイトール、１０ｍＭの２−ヨードアセトアミドで処理し、８％トリス−グリシンゲル上で流し、続いてｒＦ１でウェスタンブロットを行った。
【００８１】
表皮ブドウ球菌の２０ミリリットル一晩培養物からのライセートをＮＰ４０溶解バッファー中でビーズ破砕することにより調製した。得られたライセート調製物は、ＮＰ４０溶解緩衝液で１０ｍｌに希釈され、二つの部分に分けられ１ｕｇ／ｍｌのｒＦ１又はコントロール抗体でで免疫沈降した。抗体は、プロテインＡ／ＧＵｌｔｒａｌｉｎｋ Ｒｅｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）で捕捉された。次に、試料を５０ｍＭのジチオスレイトール、１０ｍＭの２−ヨードアセトアミドで処理し、８％トリス−グリシンゲル上に流し、続いてｒＦ１でウェスタンブロットを行った。
【００８２】
プロテオーム解析のために、試料はプレキャストＳＤＳ ＰＡＧＥミニゲルへ適用され、分離されたタンパク質はクーマシーブルーで染色された。ｒＦ１ウェスタンブロットにより可視化されたバンドに対応するゲルの領域からゲルスライスが切り出され、還元され、ヨードアセトアミドでアルキル化されトリプシンでその場で消化した。得られたトリプシンペプチドは、データ依存性実験においてハイブリッドリニアイオントラップフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＬＴＱ−ＦＴ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で、マイクロキャピラリー逆相液体クロマトグラフィーナノエレクトロスプレータンデム質量分析により分析した。タンデム質量スペクトルの結果は、マスコットのソフトウェア（マトリックスサイエンス社）を使用してデータベースの検索のために提出された。
【００８３】
黄色ブドウ球菌及び大腸菌で発現された外因性ＣｌｆＡの発現
Ｈｉｓタグ付きＣｌｆＡの黄色ブドウ球菌発現：クランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ）遺伝子は、シグナル配列をコードする配列からＵＳＡ３００ゲノムＤＮＡ由来のＬＰＸＴＧモチーフ中のグリシンをコードする配列へと増幅された。Ｃ末端ＨｉｓタグはＬＰＸＴＧモチーフの終わりに設計され、ｐＴｅｔ黄色ブドウ球菌発現ベクター（ジェネンテック社のｐＳＡＳｌＯ）に連結された。得られたコンストラクトは次いで黄色ブドウ球菌ＷＴ ＲＮ４２２０へ電気穿孔された。電気穿孔されたＲＮ４２２０、又はＲＮ４２２０無し（ｐＴｅｔ発現ベクターを持たない）の何れかの２０ｍｌの培養は、一晩培養物（ＯＤ６００が０．１５から開始）から播種され、１時間トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）中で成長させ、次いでアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍｌ）で２時間タンパク質発現を誘導した。誘導期間の終了時に、黄色ブドウ球菌の培養は、リゾスタフィン（５０ｕｇ／ｍｌ）であらかじめ溶解した後、更に溶解バッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１％トリトン−Ｘ、及びロシュプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ−フリー錠）でビーズ破砕により溶解した。清澄化ライセートがその後１０ｍＭイミダゾールの存在下で４℃で１時間ＮｉＮｔａ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社）と共にインキュベートされ、組換えＣｌｆＡタンパク質をプルダウンした。
【００８４】
ＨｉｓタグＣｌｆａの大腸菌発現：クランピング因子（ＣｌｆＡ）遺伝子は、Ｎ末端シグナル配列（開始メチオニンを含む）からＵＳＡ３００ゲノムＤＮＡ由来Ｃ末端ＬＰＸＴＧモチーフ中のグリシンをコードする配列へとＰＣＲ増幅された。増幅されたＰＣＲ産物は、次いでｃ−末端Ｈｉｓタグと共に、ｐＥＴ２１ｂ（＋）大腸菌発現ベクター（ノバジェン社）へインフレーム連結した。得られたコンストラクトを大腸菌ＢＬ２１−ゴールド（ＤＥ３）コンピテント細胞（ストラタジーン社）に形質転換し、製造元の指示に従って、ＩＰＴＧで３．５時間タンパク質発現を誘導した。誘導された大腸菌培養物は、溶解バッファー中で（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１％トリトン−Ｘ、及びロシュプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ−フリー錠）ビーズ破砕により溶解した。清澄化ライセートがその後１０ｍＭイミダゾールの存在下で４℃で１時間ＮｉＮｔａ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ社）と共にインキュベートされ、組換えＣｌｆＡタンパク質をプルダウンした。
【００８５】
大腸菌で発現した外因性ＣｌｆＡの発現及び黄色ブドウ球菌ライセートによるインキュベーション
黄色ブドウ球菌の細胞表面ＳＤＲタンパク質ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥの大腸菌における発現及び精製：ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥ遺伝子は、タンパク質の成熟したスタートをコードする配列から、ＵＳＡ３００ゲノムＤＮＡ由来Ｃ末端ＬＰＸＴＧモチーフ中のグリシンをコードする配列へとＰＣＲ増幅され、ＳＴ２３９ベクター（ジェネンテック）へＮ末端Ｕｎｉｚｙｍｅタグと共にインフレームで連結した。コンストラクトは、大腸菌５８Ｆ３（ジェネンテック社）に形質転換され、タンパク質の発現が誘導され、続いて精製された。
【００８６】
ＮＴ Ｕｎｉｚｙｍｅタグ付きＳＤＲタンパク質のＮｉＮｔａ捕捉：精製したＮ末端Ｕｎｉｚｙｍｅタグ付きＳＤＲタンパク質（ＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ、ＳｄｒＥ）の５００ｕｇがプロテアーゼ阻害剤含有ＰＢＳ（ＥＤＴＡフリー）に希釈され、ＮｉＮｔａ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）とともに１．５時間４℃でインキュベートされた。捕捉されたＵｎｉｚｙｍｅタグ付きＳＤＲタンパク質が吸着したＮｉＮｔａ樹脂は洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ８．０）で１回洗浄された。
【００８７】
大腸菌産生ＳＤＲタンパク質の黄色ブドウ球菌ライセートによる修飾：２５ｍｌ培養がΔＰａｎ Ｓｄｒ変異体（ＣｌｆＡ−ＣｌｆＢ−ＳｄｒＣＤＥ−欠損（ｎｕｌｌ）；ダブリンのトリニティカレッジのティム・フォスターから贈与）Ｎｅｗｍａｎ黄色ブドウ球菌（開始ＯＤ６００は０．１５）の一晩培養から開始され、ＴＳＢ中で３時間（対数期）３７℃、２００ｒｐｍで増殖された。対数期培養物は次いで１ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（ノバジェン社製）の２５０ユニットの存在下、２００ｕｇ／ｍｌのリゾスタフィンで３７℃で３０分間溶解した。ライセートは４℃で１０分間マイクロ遠心機で最高速度でスピンダウンして残骸が除去された。ＮｉＮｔａに捕捉された大腸菌ＳＤＲタンパク質の修飾は、清澄なΔＰａｎ Ｓｄｒ変異体黄色ブドウ球菌ライセートで１時間３７℃でインキュベーションすることで実施された。
【００８８】
修飾された大腸菌ＳＤＲ蛋白質のウエスタンブロット：非修飾又は修飾されＮｉＮｔａに捕捉された大腸菌ＳＤＲタンパク質は次いで洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール；ｐＨ８．０）で３×洗浄され、ウエスタンブロット法のために調製されて、８％のトリスグリシンゲル（インビトロジェン）上に流された。ウエスタンブロットはｒＦ１抗体又は抗Ｕｎｉｚｙｍｅ抗体（ジェネンテック社）の何れかでブロットした。
【００８９】
ｒＦ１に対する抗原としてのＳＤＲドメインの同定
ＭＢＰ−ＳＤコンストラクトの黄色ブドウ球菌の発現：マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）遺伝子は、成熟タンパク質の開始をコードする配列からファクターＸａ開裂部位の終点をコードする配列まで、ｐＭａｌ−ｃ５ｘベクター（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社［ＮＥＢ］、イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）からＰＣＲ増幅された。Ｃ末端にＨｉｓタグが付いた様々な長さのＳＤ（ＳＤ、ＳＤＳ、ＤＳＤ、ＳＤＳＤ、ＳＤＳＤＳ、ＳＤＳＤＳＤ）は、一本鎖オリゴヌクレオチドとして合成され、二本鎖ＤＮＡを作るために一緒にアニールされた。ＣｌｆＡ遺伝子のＳｄｒ領域は、Ｓｄｒ領域の先頭（５６０Ｄ）をコードする配列からＰＣＲ増幅され、プラスミドｐＴｅｔ．ＣｌｆＡ．ＳＤ６１８Ａ又はｐＴｅｔ．ＣｌｆＡ．ＳＤ７０９Ｓ（ジェネンテック）のそれぞれに由来のＨｉｓタグをコードする配列が続くＳＤ領域の６１８Ａ又は７０９Ｓの何れかをコードする配列まで包含された。コントロールとして、成熟タンパク質の開始からＡドメインの終点までコードする配列（５３８Ｇ）にＨｉｓタグをコードする配列が続くＣｌｆＡ遺伝子のＡドメインをコードする配列が、プラスミドｐＴｅｔ．ＣｌｆＡ．Ａｄｏｍ．５３８Ｇ（ジェネンテック）からＰＣＲ増幅された。様々なＳＤ挿入の一つと共にＭＢＰ挿入又はＣｌｆＡドメインが、ｐＴｅｔ黄色ブドウ球菌発現ベクター（ジェネンテックのｐＳＡＳｌＯ）に結合された。得られたコンストラクトは次いで、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０のΔｓｏｒｔａｓｅ（ＲＮ４２２０バックグラウンド中のｓｏｒｔａｓｅ欠失変異株）に電気穿孔された。
【００９０】
電気穿孔されたＲＮ４２２０Δｓｏｒｔａｇｅ又はＲＮ４２２０Δｓｏｒｔａｇｅ無し（ｐＴｅｔ発現ベクターをもたない）の何れかの２０ｍｌの培養は、一晩培養物（ＯＤ６００が０．１５から開始）から播種され、１時間、グルコース（２ｇ／Ｌ）を補完したトリプチケースソイブロス（ＴＳＢ）中で増殖させ、次いでアンヒドロテトラサイクリン（２００ｎｇ／ｍｌ）で２時間タンパク質発現を誘導した。誘導期間終了時に、黄色ブドウ球菌培養物は、カラムバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）とロシュプロテアーゼ阻害剤ＥＤＴＡ−フリー錠）中に再懸濁され、２５０ユニットのベンゾナーゼヌクレアーゼ（ノバジェン）の存在下、２００ｕｇ／ｍｌのリゾスタフィンで３７℃で３０分間溶解した。清澄なライセートは次いでアミロース樹脂（ＮＥＢ）で１．５時間４℃でインキュベートされ、発現されたＭＢＰ−ＳＤタンパク質を捕捉した。
【００９１】
ＭＢＰ−ＳＤコンストラクトを発現した黄色ブドウ球菌のウェスタンブロッティング：捕捉されたＭＢＰ−ＳＤタンパク質が吸着したアミロース樹脂は、カラムバッファーで３回洗浄され、更にウェスタンブロッティング分析のために調製され、８％トリス−グリシンゲル上に流された。ウエスタンブロットは、ｒＦ１抗体の抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ社製）又は抗ＭＢＰ抗体（ＮＥＢ）の何れかでブロットされた。
【００９２】
結果
ｒＦ１は黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌のＳＤＲ（Ｓｅｒ−Ａｓｐリピート）タンパク質のユニークなファミリーに反応する。
市販のタイコ酸調製物及び黄色ブドウ球菌の細胞壁ライセート（ＷＴＡ）（ＵＳＡ３００株）が、免疫沈降後にｒＦ１に対する結合について試験された。ｒＦ１は、市販のタイコ酸調製物（図６Ａ、左パネル）及び黄色ブドウ球菌（図６ｂ、左パネル）の細胞壁溶解物の複数の成分に結合する。質量分析法を使用してこれらのＷＴＡ調製物及び細胞壁溶解液の成分をＣｌｆＡ（ＳｄｒＡ）、ＣｌｆＢ（ＳｄｒＢ）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥ（図６Ａの右パネル及び図６Ｂの右パネル）として同定された。
【００９３】
表皮ブドウ球菌の細胞壁溶解液が、免疫沈降後にｒＦ１に対する結合について試験された。図６Ｃ（左パネル）は表皮ブドウ球菌細胞壁溶解物の複数の成分に対するｒＦ１の結合を示す。これらの成分は、コントロール抗体では同定されなかった。質量分析法を使用してこれらの細胞壁成分はＳｄｒＦ、ＳｄｒＧ及びＳｄｒＨ（図６Ｃ右パネル）として同定された。
【００９４】
黄色ブドウ球菌及び大腸菌における外来ＣｌｆＡの発現
黄色ブドウ球菌で発現される外因性のＣｌｆＡは、ｒＦ１に対し反応性であるが、大腸菌で発現させたＣｌｆＡは（図７ａ）反応性ではなかった。しかしながら、大腸菌で発現させたＳｄｒタンパク質ＣｌｆＡ（ＳｄｒＡ）、ＣｌｆＢ（ＳｄｒＢ）、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥを黄色ブドウ球菌のライセートとともにインキュベーションするとｒＦ１反応性を取り戻した（図７ｂ）。
【００９５】
ｒＦ１は黄色ブドウ球菌で発現されたＳＤＲドメインに結合する。
ｒＦ１抗体は黄色ブドウ球菌で発現されたＣｌｆＡ５６０Ｄ−６１８Ｓ及びＣｌｆＡ５６０Ｄ−７０９Ｓ（図８）から成るＣｌｆＡ Ｓｄｒ領域に結合する。ｒＦ１はＣｌｆＡのＡドメイン又は最大３つのＳＤリピートから成る小さなペプチド配列には結合しない。
【００９６】
実施例４
方法
ｒＦ１の可変領域のｐＲＫベクターへのクローニング
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩＩ、Ａｐａｌ、Ａｇｅｌ，及びＡｈｄｌ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、イプスウィッチ、米国マサチューセッツ州から購入した。Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、クイックチェンジＩＩ部位特異的突然変異誘発キットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社／アジレント・テクノロジー、サンタクララ、カリフォルニア州、米国から購入した。２％アガロースゲルは、インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国から購入した。ｐＲＫベクターのｐＲＫ．ＬＰＧ３．ＨｕＫａｐｐａ及びｐＲＫ．ＬＰＧ４．ＨｕｍａｎＨＣはジェネンテック／ロシュ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州、米国から得た。
【００９７】
ｐＣＰＥＯベクター由来のｒＦ１モノクロナール抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインがｐＲＫ哺乳動物発現ベクター中に入れられた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は標準的なＰＣＲ手順に従い総容量５０μｌにおいてＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて行った。ＶＨはプライマーのＹｉＨＣＦ）５’−ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＧＡＧ  ＴＣＴ  Ｇ−３’（配列番号１８）及びＹｉＨＣＲ２ ５’−ＧＡＡ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＧＣＣ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＧＣＴ  ＧＧＣ  ＡＣＴ  ＣＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＣＡＧ  ＧＧＴ  ＧＣＣ  ＡＧＧ  Ｔ＊ＣＣ  ＣＣＡ  Ｇ−３’（配列番号１９）（ＰｖｕＩＩ及びＡｐａｌの制限部位に下線が引かれ、＊は内部Ａｐａｌ部位を除去するための単一塩基ＧからＴへの変化を示す）を用いて増幅され、ＶＬはプライマーＹｉＬＣＦ ５’−ＣＧＧ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＡＧ−３’（配列番号２０）及びＹｉＬＣＲ ５’−ＧＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＣＴＧ  ＧＣＣ  Ｇ−３’（配列番号２１）（ＥｃｏＲＶ及びＫｐｎｌは下線が引かれる）を用いて増幅された。３９３（ＶＨ）及び３２８（ＶＬ）塩基対によるユニークなＰＣＲ産物はそれぞれ直接、ＶＨに対してはＰｖｕＩＩ及びＡｐａｌにより、ＶＬに対してはＥＣＯＲＶ及びＫｐｎｌにより消化し、続いてゲル精製（インビトロジェン社、カタログ番号Ｋ２１００−１２）を行った。ＶＨ及びＶＬはＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて、重鎖に対してはｐＲＫ／Ｐｖｕｌｌ、Ａｐａｌの、及び軽鎖に対してはｐＲＫ／ＥｃｏＲＶ、ＫｐｎｌのｐＲＫベクター断片へそれぞれ結合された。ＤＮＡプラスミドは制限酵素による消化パターンによって確認された；すなわちｒＦ１ＶＨはＡｇｅＩにより〜３００塩基対及び５．８ｋｂバンド、５．８ｋｂのバンドをリリースしたのに対し、ｒＦ１ＶＬは２％アガロースゲル上でＡｈｄＩにより２．３及び３．１ｋｂのバンドを示した。
【００９８】
化学ストレス試験
抗体の一次配列データを実験的に観察された分解事象と比較することによって、所定の配列モチーフが劣化しやすい可能性がある（すなわち、ＤＤ、ＤＧ及びＤＳ配列でのアスパラギン酸異性化、及びＮＧ配列でのアスパラギンの脱アミド）ことが明らかになった。そのような劣化による「ホットスポット」が抗体のＣＤＲに現れる場合、結合及び効力が負の影響を及ぼされる可能性がある。ホットスポットを含む分子において化学ストレス試験は、抗体をプラットフォームフォーミュレーションバッファーに入れ、コントロール試料を４０℃で２週間ストレスを受けたものと比較することにより、劣化に対するこれらのモチーフの感受性を評価する方法を提供する。もし劣化が観察される場合、一次配列はホットスポットを除去するために再設計することができる。
【００９９】
試料が４０℃で２週間ストレスを与えられた後、分解がどこでどの程度起きるかを評価するために様々な分析アッセイが実施される。イメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）解析が電荷変異体を調べるために行われ、インタクトな減少した抗体の質量が質量分析計を用いて検証され、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳペプチドマップが部位特異的分解情報を得るために実施された。
【０１００】
突然変異生成
ｒＦ１のｐＲＫプラスミドはｒＦ１モノクロナール抗体を安定させるためにＱｕｉｋ ｃｈａｎｇｅ ＩＩ部位特異的キットを介して、ＦＨＶ５’−ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＣＧＧ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＣＣＣ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＣＧ−３’（配列番号２２）及びＲＨＶ５’−ＣＧＴ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＴＧＣ  ＣＧＣ  ＴＧＴ  ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  ＣＣ−３’（配列番号２３）（変異生成部位は下線が引かれる）を使用することにより、重鎖ＣＤＲ２のＮ（ＡＡＣ）５３Ｓ（ＡＧＣ）により一連の部位特異的突然変異誘発を受けた。突然変異誘発変異体は配列決定された。
【０１０１】
結果
抗体ｒＦ１の一次配列は、軽鎖ＣＤＲ２に１つの潜在的なアスパラギン脱アミド部位をを含有した：ＮＮＧＮＮ（配列番号２４）。ストレステストでは、Ｎ５３（Ｋａｂａｔによる番号付け、１９９１）においてストレスをかけた試料における脱アミド化の増加を明らかにした。部位特異的突然変異誘発が、重鎖ＣＤＲ２のＮ（ＡＡＣ、（配列番号２５））を５３Ｓ（ＡＧＣ、（配列番号２６））へ置換することでｒＦ１モノクロナール抗体を安定化させるために実施された。突然変異誘発変異体の配列はＮ５３Ｓ変異を確認した。
【０１０２】
実施例５
抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）適用のためのＣｙｓ変異体の開発
ｒＦｌ ｐＲＫプラスミドはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社の部位特異的方法により、ｒＦ１チオモノクロナール抗体の軽鎖リンカーを生成するために、ｒＦｌｐＲＫ．ＬＣ（２０５／２１０）ＶＣＦ（４６８０７５）５’−ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＧＣＣ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＡ  ＣＡＧ−３’（配列番号２７）及びｒＦｌｐＲＫ．ＬＣ（２０５／２１０）ＶＣＲ（４６８０７６）５’−ＣＴＧ  ＴＴＧ  ＡＡＧ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＣＣＣ−３
’（配列番号２８）（Ｃｙｓ変異は下線）、及びｒＦ１チオモノクロナール抗体の重鎖リンカーを作成するために、ｒＦｌｐＲＫ．ＨＣＮ５３Ｓ．Ａｌ２ｌＣＦ（４６８４６４）５’−ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＧ  ＡＧＴ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＴＣ−３’（配列番号２９）及びｒＦｌｐＲＫ．ＨＣＮ５３Ｓ．Ａｌ２ｌＣＲ（４６８４６５）５’−ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＣＣＣ  ＴＴＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＡＧ−３’（配列番号３０）（Ｃｙｓ変異は下線）のオリゴによる一連の部位特異的変異誘発をうけた。軽鎖Ｖ２０５Ｃと重鎖のＡ１１４Ｃは、変異体（図９）シーケンシングにより確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】抗体Ｆ１の重鎖及び軽鎖配列。
【図２】Ｆ１抗体は、複数のグラム陽性菌由来のＬＴＡ調製物に結合する：（ａ）ＬＴＡ調製物はシグマから入手し、マウスポリクローナル抗ＬＴＡにより捕捉ＥＬＩＳＡで試験し、又は（ｂ）Ｗ．フィッシャーから入手したＬＴＡ調製物を高度に精製した一式。Ｄ２５、ヒト抗ＲＳＶ抗体が陽性コントロールとして非特異的陰性コントロール及びマウスモノクローナル抗ＬＴＡ抗体として使用された。
【図３】組換えＦ１抗体は、黄色ブドウ球菌に結合するが肺炎球菌には結合しない。（ａ）細菌は、Ｆ１抗体又はコントロールＩｇＧ（Ｄ２５、ヒト抗ＲＳＶ抗体）で、又は第一抗体（ＩｇＧ−ＰＥのみ）なしでインキュベートした。洗浄後、二次抗体が添加された（ＩｇＧ−ＰＥ）。（ｂ）６つの臨床分離株がＦ１の結合に関して２つの別々の実験で試験された。試験されたのはＰＶＬ＋株（ＳＡ−１）、３つの通常株（ＳＡ−２、ＳＡ−３及びＳＡ−４）、及び２つのＭＲＳＡ株（ＳＡ−５及びＳＡ−６）であった。
【図４】（ａ）ｒＦ１抗体の１４種の黄色ブドウ球菌株に対する結合、（ｂ）ｒＦ１抗体は表皮ブドウ球菌に結合するが、枯草菌（Bacillus subtilis）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）及び化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)には結合しない。
【図５】（ａ）ｒＦ１抗体は、異なる増殖段階でＭＲＳＡに結合する、Ｉｓｏ Ｃ：アイソタイプコントロール、Ｍｅｄ；メディアコントロール（ｂ）ｒＦ１抗体は感染した組織から分離されたＭＲＳＡと結合する。
【図６】ｒＦ１抗体はＳＤＲタンパク質に結合する。（ａ）ｒＦ１又はアイソタイプコントール抗体による黄色ブドウ球菌（Ｗｏｏｄ４６株）の商用タイコ酸調製物の免疫沈降（ＩＰ）と、続く、ｒＦ１抗体によるウエスタンブロット（左）及びｒＦ１抗体に結合されたＷＴＡ調製物由来断片の質量分析（右）、（ｂ）ｒＦ１又はコントロール抗体による黄色ブドウ球菌（ＵＳＡ３００株）の細胞壁ライセートの免疫沈降（ＩＰ）と、続くｒＦ１によるウエスタンブロット（左）及びｒＦ１抗体に結合された細胞壁断片（ＵＳＡ３００株）の質量分析（右）、（ｃ）ｒＦ１又はアイソタイプコントロール抗体による表皮ブドウ球菌の細胞壁ライセートの免疫沈降と、続くｒＦ１抗体によるウエスタンブロット（左）及びｒＦ１抗体に結合された細胞壁断片の質量分析（右）。
【図７】黄色ブドウ球菌及び大腸菌で発現させたＳＤＲタンパク質へのｒＦ１の結合。（ａ）抗Ｈｉｓ（左）及びｒＦ１（右）抗体を使用して過剰発現したＨｉｓタグＣｌｆＡを含む黄色ブドウ球菌及び大腸菌のライセートのウエスタンブロット。（ｂ）ｒＦ１（上）又は抗Ｈｉｓ（下）抗体による黄色ブドウ球菌ライセートとによるインキュベーション後のＨｉｓタグ付きＣｌｆＡ、ＣｌｆＢ、ＳｄｒＣ、ＳｄｒＤ及びＳｄｒＥを含む大腸菌ライセートのウエスタンブロット。
【図８】ｒＦ１は、黄色ブドウ球菌により発現されたＳＤＲドメインに結合する。黄色ブロウ球菌により発現され、ｒＦ１への結合について試験されたコンストラクト（左）、抗ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）、抗Ｈｉｓ及びｒＦ１抗体により発現されたコンストラクトを含む黄色ブロウ球菌ライセートのウエスタンブロット（右）。
【図９】抗体ｒＦ１の重鎖Ａ１１４Ｃ（ａ）及び軽鎖Ｖ２０５Ｃ（ｂ）変異体の配列。番号付けはＫａｂａｔ（１９９１）により、囲みはＣＤＲである。
【０１０４】
参考文献
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【図１−１】
2016135771.tif 000003
【図１−２】
2016135771.tif 000004
【図１−３】
2016135771.tif 000005
【図２Ａ−２Ｂ】
2016135771.tif 000006
【図３Ａ】
2016135771.tif 000007
【図３Ｂ】
2016135771.tif 000008
【図４Ａ】
2016135771.tif 000009
【図４Ｂ】
2016135771.tif 000010
【図５】
2016135771.tif 000011
【図６Ａ−６Ｂ】
2016135771.tif 000012
【図６Ｃ】
2016135771.tif 000013
【図７Ａ−７Ｂ】
2016135771.tif 000014
【図８】
2016135771.tif 000015
【図９Ａ】
2016135771.tif 000016
【図９Ｂ】
2016135771.tif 000017
【配列表】
2016135771000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年2月4日(2016.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【外国語明細書】
2016135771000001.pdf