(57)【要約】【課題】ＨＬＡ−Ａ２により提示されるＷＴ１ペプチドへのＴ細胞受容体様抗体の提供。【解決手段】本発明は、ＷＴ１、抗体断片、キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）、融合タンパク質、及びそれらの結合体に対するヒト化、キメラ及び完全ヒト抗体を含むウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）に特異的に結合する抗原結合性タンパク質を提供する。抗原結合性タンパク質や抗体は、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束性ＷＴ１ペプチドに結合する。このような抗体、断片、融合タンパク質、及びその結合体は、例えば、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄／骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）のようなＷＴ１関連腫瘍の治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載された発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に関する相互参照）
本出願は、米国仮出願第６１／４７０６３５号（２０１１年４月１日出願）及び米国仮
出願第６１／４９１３９２号（２０１１年３月３１日出願）の優先権を主張する。前記出
願の全開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
《連邦政府による資金提供を受けた研究》
以下の発明は、米国国立衛生研究所によって授与された契約番号Ｐ０１ＣＡ２３７６６
及びＲ０１ＣＡ５５３４９の下で、米国政府支援によりなされたものである。米国政府は
、この発明において一定の権利を有する。
【０００３】
《配列表》
本出願は配列表を含む。配列表は、３３１４０１３ＡＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓ
ｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔのファイル名で２１１２年３月２９日に作成されたＡＳＣＩ
Ｉ形式のファイルとして提出される。電子フォーマットでの配列表の情報は、参照により
その全体が本明細書に取り込まれる。
【０００４】
《発明の分野》
本発明は、一般に細胞質タンパク質に対する抗体に関する。特に、本発明は、ウィルム
ス腫瘍遺伝子タンパク質（ＷＴ１）に対する抗体であって、主要な組織適合抗原と一体と
なってＷＴ１ペプチドを認識する特異的抗体にも関する。
【背景技術】
【０００５】
《発明の背景》
ウィルムス腫瘍遺伝子タンパク質（ＷＴ１）は、大抵の白血病及び広い範囲の癌の免疫
療法の魅力的な標的である。ＷＴ１は、通常は、胚発生の間の中胚葉性組織において発現
されるジンクフィンガー転写因子である。正常な成体組織において、ＷＴ１発現は、ＣＤ
３４造血幹細胞内で低レベルに制限されるが、多系統の白血病及び広い範囲の固形腫瘍（
１−２）において過剰発現される。最近では、ＷＴ１発現は微小残存病変のマーカーにな
ることが報告されている。形態学的寛解にある急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者における
転写レベルの増加は明白な臨床的再発の前兆であった（３、４）。さらに、ＷＴ１に対す
る抗体は、造血性悪性腫瘍及び固形腫瘍を有する患者において検出され、このことは、Ｗ
Ｔ１が高い免疫原性抗原であることを示す（７）。
【０００６】
大抵は、臨床的に承認された治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）は、細胞表面タン
パク質の構造を認識する。ＷＴ１は、しかしながら、核タンパク質であり、それゆえ、古
典的な抗体療法には到達し難い。今まで、ＷＴ１を対象とした免疫療法は、細胞のアプロ
ーチに制限され、もっぱらＭＨＣクラスＩ分子によって細胞表面に提示されるペプチドを
認識するＷＴ１特異的細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を発生させることを目的と
していた。
【０００７】
ＣＴＬ応答を誘導するため、細胞内のタンパク質は、通常プロテアソーム又は内部／リ
ソソームによって分解され、得られたペプチド断片は、ＭＨＣクラスI又はII分子に結合
する。これらのペプチド−ＭＨＣ複合体は、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）−Ｔ細胞受容
体（ＴＣＲ）相互作用を介して、それらにＴ細胞認識のための標的を提供するために細胞
表面に表示されている（８、９）。ＷＴ１タンパク質由来ペプチドによるワクチン接種は
、腫瘍細胞を死滅させることができるＨＬＡ拘束性細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞を誘導する。
【０００８】
有効性を改善させるために、腫瘍抗原はモノクローナル抗体治療の標的とされることが
できる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依
存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、及び標的分子を過剰発現する腫瘍細胞に対する直接細胞阻害
又はアポトーシス誘導効果を含む複数のメカニズムによって、強力な抗腫瘍効果を発揮す
ることが示されている。さらに、モノクローナル抗体は、腫瘍細胞に対する放射性核種、
細胞傷害性薬、又は毒素などの細胞傷害性部分を特異的に運搬するために、担体として用
いることができる（１８）。
【０００９】
細胞の免疫療法のアプローチに加えて、液性免疫療法のアプローチが非細胞表面腫瘍抗
原を標的とすることが可能であった場合、多大なメリットが存在するであろう。それゆえ
、ＭＨＣ分子と連結する細胞内タンパク質断片を含む標的に特異的であることから、Ｔ細
胞受容体を模倣するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えばＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ
２複合体は、単独で、又は、薬物、毒素、若しくは放射性元素などの強力な抗癌薬を送達
することができる媒体として、新規かつ効果的な治療剤になるであろう。このようなモノ
クローナル抗体はまた、診断や予後のツールとして有用であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
《発明の要約》
本出願による開示は、細胞質／細胞内タンパク質、例えばＷＴ１腫瘍タンパク質を標的
とすることができる抗体などの抗原結合性タンパク質を、識別し特徴付ける。開示される
抗体は、一般的に、細胞による提示及びＷＴ１タンパク質の抗原処理に続いて細胞表面に
現れるものとして、ペプチド／ＭＨＣ複合体を標的とする。この点において、ペプチドが
ＭＨＣ抗原に結合したときに、ＭＨＣで拘束される現象において、抗体が特異的に認識す
る能力を有し、ペプチドに結合する能力を有するということから、Ｔ細胞受容体を模倣す
る。ペプチド／ＭＨＣ複合体は、一般的に、Ｔ細胞へのＷＴ１タンパク質の提示及び抗原
処理に続いて細胞表面に現れるものとして、抗原を再現する。
【００１１】
開示された抗体は、特異的に認識し、ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体のエピトープ、特
にＷＴ１／ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体に結合する。ＨＬＡ−ペプチド複合体の一部として
、本発明の抗原結合性タンパク質によって認識されるペプチドの例としては、表７に示す
もの例えば、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するペプチドを含むが
、これに限定されるものではない。
【００１２】
ある観点においては、それゆえに、本発明は、前記ペプチドがＨＬＡ−Ａ２のようなＭ
ＨＣ抗原に結合したときに単離される抗体、又はアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを有す
るペプチドに結合する、その抗原結合性断片に関する。
【００１３】
別の観点においては、本発明は（Ａ）（ｉ）配列番号２、３、及び４のアミノ酸配列を
それぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）
可変領域；並びに、配列番号８、９、そして１０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−Ｃ
ＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、そしてＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域；（ｉｉ）
配列番号２０、２１、及び２２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−Ｃ
ＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）可変領域；並びに、配列番号２６、２７
、及び２８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−
ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域；（ｉｉｉ）配列番号３８、３９、及び４０のアミ
ノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重
鎖（ＨＣ）可変領域；並びに、配列番号４４、４５、及び４６のアミノ酸配列をそれぞれ
含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域
；（ｉｖ）配列番号５６、５７、及び５８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１
、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）可変領域；並びに、配列番号
６２、６３、及び６４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、
及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域；（ｖ）配列番号７４、７５、及び７６
のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を
含む重鎖（ＨＣ）可変領域；並びに、配列番号８０、８１、及び８２のアミノ酸配列をそ
れぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）可
変領域；又は、（ｖｉ）配列番号９２、９３、及び９４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨ
Ｃ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖（ＨＣ）可変領域；並び
に、配列番号９８、９９、及び１００のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、Ｌ
Ｃ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域を含む単離された抗原結
合性タンパク質、抗体、又はその抗原結合性断片に関する。
【００１４】
別の観点においては、本発明は、配列番号１４及び１６；３２及び３４；５０及び５２
；６８及び７０；８６及び８８；並びに１０４及び１０６から選択される第一及び第二ア
ミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ及びＶＬを含む単離された抗原結合性タンパク質、抗体、
又はその抗原結合性断片に関する。
【００１５】
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号１８、３６、５４、７２、９０、及び
１０８から選択されるアミノ酸配列を含む単離された抗原結合性タンパク質、抗体、又は
その抗原結合性断片に関する。
【００１６】
関連する観点においては、単離された抗原結合性タンパク質は、表１〜８のいずれかに
開示された抗原結合性領域を含む。抗原結合性タンパク質は融合タンパク質であってもよ
い。
【００１７】
別の観点においては、本発明は、抗原結合性タンパク質、抗体、又はその抗原結合性断
片として開示されている第一の成分を含む免疫結合体に関するものである。
前記免疫結合体は、細胞毒素、検出可能な標識、放射性同位体、治療剤、結合タンパク質
、又は第二のアミノ酸配列を有する分子である第二成分を含む。第二成分が結合タンパク
質又は二次抗体である場合、結合タンパク質又は二次抗体は、最初に特定されたＨＬＡ−
ペプチド複合体とは異なる標的に対する結合特異性を有する。
【００１８】
関連する観点においては、それゆえ、本発明は、本明細書に記載されたようにその抗原
結合性タンパク質又はその機能的断片を含む二重特異性抗体に関する。
【００１９】
さらに別の観点においては、本発明は、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ複合体、特にＷＴ１ペ
プチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ／ＨＬＡ−Ａ０２０１に特異的な抗体及びキメラ抗原受容体を
含む抗原結合性タンパク質をコードする核酸に関する。
【００２０】
別の関連する観点においては、本発明は、本明細書に開示された核酸又は抗原結合性タ
ンパク質を含む細胞に関し、前記細胞には本開示による抗原結合性領域を含むキメラ抗原
受容体を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞のような組換え免疫エフェクター細胞
が含まれる。本開示に従って、抗体を産生するように操作された細胞もまた、本発明に包
含される
【００２１】
関連する観点においては、本発明は、本明細書に開示された抗原結合性タンパク質をコ
ードする核酸を含むベクターに関し、前記ベクターは、本開示による抗体又はキメラ抗原
受容体のような抗原結合性タンパクの発現及び／又は分泌を容易にするベクターを含む。
【００２２】
関連する観点においては、抗原結合性タンパク質、抗体、核酸、ベクター、又は細胞を
含む医薬組成物に関し、細胞は、薬学的に許容される担体とともに、本明細書に開示され
る核酸又は抗原結合性領域を含む細胞を含む。
【００２３】
別の観点においては、本発明は、本発明のＷＴ１抗体を用いて細胞又は組織の表面のＷ
Ｔ１を検出する方法に関するものである。
【００２４】
さらに別の観点においては、本発明は、ＷＴ１陽性疾患を有する被験者を治療する方法
に関し、前記方法は、治療上有効な量の抗原結合性タンパク質、抗体若しくはその抗原結
合性断片、又は抗原結合性タンパク質をコードする核酸若しくは抗体若しくは核酸又は本
開示によるタンパク質を含む細胞を投与することを含む。ＷＴ１陽性疾患は、慢性骨髄性
白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄／骨髄性白血
病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、卵巣癌、消化管癌、乳癌、前立腺
癌、及びグリア芽腫からなる群から選択される慢性白血病、急性白血病、又はＷＴ１＋癌
である。いくつかの実施態様では、抗原結合性タンパク質又は抗体は、それらに結合する
細胞傷害性部分を有する結合体である。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（Ａ）（ｉ）配列番号２、３、及び４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、
ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８、９、及び
１０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ
３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２０、２１、及び２２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１
、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号２６、２７
、及び２８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−
ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号３８、３９、及び４０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ
１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４、４
５、及び４６から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ
２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号５６、５７、及び５８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１
、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６２、６３
、及び６４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−
ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）配列番号７４、７５、及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、
ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号８０、８１、
及び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−Ｃ
ＤＲ３を含む軽鎖可変領域；若しくは
（ｖｉ）配列番号９２、９３、及び９４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１
、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号９８、９９
、及び１００のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ
−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（Ｂ）配列番号１４及び１６、３２及び３４、５０及び５２、６８及び７０、８６及び８
８、並びに１０４及び１０６から選択される第一及び第二アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶ
Ｌ；又は
（Ｃ）配列番号１８、３６、５４、７２、９０、及び１０８から選択されるアミノ酸配列
のうちの１を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
（項目２）
（Ａ）（ｉ）配列番号２、３、及び４；（ｉｉ）２０、２１、及び２２；（ｉｉｉ）３
８、３９、及び４０；（ｉｖ）５６、５７、及び５８；（ｖ）７４、７５、及び７６；並
びに（ｖｉ）９２、９３、及び９４から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−Ｃ
ＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
（Ｂ）（ｉ）配列番号８、９、及び１０；（ｉｉ）２６、２７、及び２８；（ｉｉｉ）４
４、４５、及び４６；（ｉｖ）６２、６３、及び６４；（ｖ）８０、８１、及び８２；並
びに（ｖｉ）９８、９９、及び１００から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−
ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
（項目３）
（ｉ）配列番号１４及び１６；（ｉｉ）３２及び３４；（ｉｉｉ）５０及び５２；（ｉ
ｖ）６８及び７０；（ｖ）８６及び８８；並びに（ｖｉ）１０４及び１０６から選択され
る第一及び第二アミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ及びＶＬ
を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
（項目４）
配列番号１８、３６、５４、７２、９０、及び１０８から選択されるアミノ酸配列
を含む単離された抗体、若しくはその抗原結合性断片。
（項目５）
抗体が、ヒト可変領域フレームワーク領域を含む、項目１〜４のいずれか１項に記載
の抗体。
（項目６）
抗体が、完全ヒト抗体である、項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
（項目７）
抗体が、ＨＬＡ−Ａ２に結合したＷＴ１ペプチドに特異的に結合する、項目１〜４の
いずれか１項に記載の抗体。
（項目８）
ＷＴ１が、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬを有する、項目７に記載の抗体。
（項目９）
ＨＬＡ−Ａ２が、ＨＬＡ−Ａ０２０１である、項目７に記載の抗体。
（項目１０）
抗体の抗原結合性断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（
ｓｃＦｖ）である、項目１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１１）
治療薬に結合した、項目１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
（項目１２）
治療薬が、薬剤、毒素、放射性同位体、タンパク質、又はペプチドである、項目１１
に記載の抗体。
（項目１３）
項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体をコードしている単離された核酸。
（項目１４）
（Ａ）（ｉ）配列番号５、６、及び７；２３、２４、及び２５；４１、４２、及び４３
；５８、５９、及び６０；７７、７８、及び７９；並びに９５、９６、及び９７からなる
群から選択される第一、第二、及び第三ヌクレオチド配列；及び
（ｉｉ）配列番号１１、１２、及び１３；２９、３０、及び３１；４７、４８、及び４
９；６５、６６、及び６７；８３、８４、及び８５；並びに１０１、１０２、及び１０３
からなる群から選択される第四、第五、及び第六ヌクレオチド配列；又は
（Ｂ）配列番号１５及び１７、３３及び３５、５１及び５３、６９及び７１、８７及び８
９、並びに１０５及び１０７からなる群から選択される第一及び第二ヌクレオチド配列；
又は
（Ｃ）配列番号１９、３７、５５、７３、９１、及び１０９からなる群から選択されるヌ
クレオチド配列
を含む単離された核酸。
（項目１５）
（Ａ）配列番号（ｉ）５、６、及び７；（ｉｉ）２３、２４、及び２５；（ｉｉｉ）４
１、４２、及び４３；（ｉｖ）５８、５９、及び６０；（ｖ）７７、７８、及び７９；並
びに（ｖｉ）９５、９６、及び９７からなる群から選択される第一、第二、及び第三ヌク
レオチド配列；及び
（Ｂ）配列番号（ｖｉｉ）１１、１２、及び１３；（ｖｉｉｉ）２９、３０、及び３１；
（ｉｘ）４７、４８、及び４９；（ｘ）６５、６６、及び６７；（ｘｉ）８３、８４、及
び８５；並びに（ｘｉｉ）１０１、１０２、及び１０３からなる群から選択される第四、
第五、及び第六ヌクレオチド配列
を含む単離された核酸。
（項目１６）
第一、第二、及び第三ヌクレオチド配列が、抗体のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、
及びＨＣ−ＣＤＲ３をそれぞれコードし、第四、第五、及び第六ヌクレオチド配列が、抗
体のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３をそれぞれコードする、請求
項１５に記載の核酸。
（項目１７）
配列番号（ｉ）１５及び１７；（ｉｉ）３３及び３５；（ｉｉｉ）５１及び５３；（ｉ
ｖ）６９及び７１；（ｖ）８７及び８９；並びに（ｖｉ）１０５及び１０７からなる群か
ら選択される第一及び第二ヌクレオチド配列をそれぞれ含む単離された核酸。
（項目１８）
第一ヌクレオチド配列が、抗体のＶＨをコードし、第二ヌクレオチド配列が抗体のＶＬ
をコードする、項目１７に記載の核酸。
（項目１９）
配列番号１９、３７、５５、７３、９１、及び１０９からなる群から選択されるヌクレ
オチド配列を含む核酸。
（項目２０）
核酸が、ｓｃＦｖをコードする、項目１９に記載の核酸。
（項目２１）
項目１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
（項目２２）
項目１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含む細胞。
（項目２３）
その表面に項目１〜４に記載の抗体を発現させる、項目２２に記載の細胞。
（項目２４）
全細胞又は組織中のＷＴ１を探知する方法であって、
（Ａ）細胞又は組織に、ＨＬＡ−Ａ２に結合するＷＴ１ペプチドに特異的に結合する、探
知可能な標識を含む抗体又はその抗原結合性断片と接触させ；
（Ｂ）抗体に結合した量が、細胞又は組織中のＷＴ１の量を示し、細胞又は組織に関連し
た探知可能な標識の量を測定することにより、細胞又は組織に結合した抗体の量を決定す
ること
を含む方法。
（項目２５）
抗体が、アミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）を有するＨＬＡ−Ａ２に結合
したＷＴ１ペプチドに特異的に結合する、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
ＷＴ１ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ０２０１に結合する、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
項目２４に記載の方法であって、抗体が、
（Ａ）（ｉ）配列番号２、３、及び４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、Ｈ
Ｃ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８、９、及び１
０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号２０、２１、及び２２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１
、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号２６、２７
、及び２８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−
ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号３８、３９、及び４０のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ
１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号４４、４
５、及び４６から選択されるアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ
２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号５６、５７、及び５８のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１
、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号６２、６３
、及び６４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−
ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；
（ｖ）配列番号７４、７５、及び７６のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１、
ＨＣ−ＣＤＲ２及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号８０、８１、及
び８２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤ
Ｒ３を含む軽鎖可変領域；若しくは
（ｖｉ）配列番号９２、９３、及び９４のアミノ酸配列をそれぞれ含むＨＣ−ＣＤＲ１
、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号９８、９９
、及び１００のアミノ酸配列をそれぞれ含むＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ
−ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；又は
（Ｂ）配列番号１４及び１６；３２及び３４；５０及び５２；６８及び７０；８６及び８
８；並びに１０４及び１０６から選択される第一及び第二アミノ酸配列を含むＶＨ及びＶ
Ｌ、又は
（Ｃ）配列番号１８、３６、５４、７２、９０及び１０８から選択されるアミノ酸配列
のうちの１を含む単離された抗体又はその抗原結合性断片。
（項目２８）
項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体を含むキット。
（項目２９）
ＷＴ１陽性疾患の治療への項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体の使用。
（項目３０）
項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成
物。
（項目３１）
治療的に効果のある量の項目１〜４のいずれか１項に記載の抗体又はその抗原結合性
断片を患者に投与することを含むＷＴ１陽性疾患患者の治療方法。
（項目３２）
ＷＴ１陽性疾患が、慢性白血病、急性白血病、又はＷＴ１＋腫瘍である、項目３１に
記載の方法。
（項目３３）
ＷＴ１陽性疾患が、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（
ＡＬＬ）、急性骨髄／骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、
卵巣癌、消化管癌、乳癌、前立腺癌、及びグリア芽腫からなる群から選択される、項目
３１に記載の方法。
（項目３４）
抗体が、抗体に結合する細胞傷害性部分を有する結合体である、項目３４に記載の方
法。
（項目３５）
治療的に効果のある量の項目１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を患者に投与す
ることを含む、ＷＴ１陽性疾患患者の治療方法。
（項目３６）
ＷＴ１陽性疾患が、慢性白血病、急性白血病、又はＷＴ１＋腫瘍である、項目３５に
記載の方法。
（項目３７）
ＷＴ１陽性疾患が、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ性白血病（
ＡＬＬ）、急性骨髄／骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、中皮腫、
卵巣癌、消化管癌、乳癌、前立腺癌、及びグリア芽腫からなる群から選択される、項目
３６に記載の方法。
（項目３８）
ＷＴ１陽性疾患の治療への、項目１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸の使用。
（項目３９）
項目１３〜２０のいずれか１項に記載の核酸を含む、医薬組成物。
（項目４０）
ＷＴ１＋細胞を死滅させる方法であって、細胞に、ＨＬＡ−Ａ２に結合したＷＴ１ペプ
チドに特異的に結合する抗体又はその抗原結合性断片を接触させることを含む方法。
（項目４１）
抗体又はその抗原結合性断片が、それらに結合する細胞傷害性部分を有する、項目４
０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ウィルムス腫瘍タンパク質のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１９５４４）であり、太字はＨＬＡ拘束性ペプチドを示す図である。１２１〜１４０番目のペプチドはさらに９ｍｅｒが下線を引いてあり、このＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１）は、そのアナログであるのに加えて、ＷＴ１特異的細胞傷害性Ｔ細胞活性を誘導する。
【００２６】
【図２】ＷＴ１＋白血病細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するＷＴ１ペプチドのワクチン接種を示すグラフである。
【００２７】
【図３】ＰＢＳコントロール又はＲ３／ＨＬＡＡ０２０１（Ｒ３）に対するＷＴ１／Ａ２（ＷＡ）の特異的結合のためのファージＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
【００２８】
【図４】ＷＴ１ＡペプチドでパルスしたＴ２細胞と結合するＷＴ１ファージ抗体のみの特異的結合が選択されたことを示す図である。
【００２９】
【図５】様々な濃度の抗体のタイトレーションによりテストされた、ＲＭＦ／Ａ０２０１複合体へのＷＴ１抗体の完全長ＩｇＧ１の結合親和性を示す図である。結果は５０μｇ／ｍＬのＲＭＦ（上のパネル）でパルスしたＴ２細胞として示される。コントロールの抗体は、下のパネルに示される。
【００３０】
【図６】ＲＭＦ（上のパネル）又はコントロールであるＲＨＡＭＭ−Ｒ３（下のパネル）でパルスしたＴ２細胞上のＷＴ１抗体により認識されたＲＭＦ／ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体の濃度依存性を示す図である。
【００３１】
【図７】ヒト抗体の発現のための発現ベクターを示す図である。
【００３２】
【図８】還元又は非還元条件下におけるＷＴ１／Ａ２抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す図である。
【００３３】
【図９】ＷＴ１／Ａ２に対する抗体の親和性を明らかにするＷＴ１／Ａ２抗体の動的結合分析の結果を示す図である。
【００３４】
【図１０】ＷＴ１／Ａ２複合体に結合する抗体の親和性（ＫＤ）を示す図である。
【００３５】
【図１１】様々な濃度のペプチド、すなわち、ＷＴ１−Ａ、ＷＴ１−Ａ１、又はコントロールでパルスしたＴ２生細胞に対するいくつかの実施態様、すなわち、ｍＡｂクローン５（上のパネル）、クローン１５（中央のパネル）そして、コントロール（下のパネル）の結合のペプチド滴定のフローサイトメトリーによる平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す図である。
【００３６】
【図１２】様々な濃度のＷＴ１ＡペプチドでパルスしたＴ２生細胞に対する、ＷＴ１抗体、ｍＡｂ５（上のパネル）、ｍＡｂ１５（下のパネル）の結合のペプチド滴定の結果を示す図である。
【００３７】
【図１３】ペプチド（Ｒ３、ＷＴ１−Ａ１、ＷＴ１−Ａ、又はペプチドなし）の異なった濃度（５０μｇ／ｍＬ上；２５μｇ／ｍＬ中央；及び１２．５μｇ／ｍＬ下）での、一つの実施態様であるｍＡｂ５の結合特異性を示す図である。
【００３８】
【図１４】ペプチド（Ｒ３、ＷＴ１−Ａ１、ＷＴ１−Ａ、又はペプチドなし）の異なった濃度（５０μｇ／ｍＬ上；２５μｇ／ｍＬ中央；１２．５μｇ／ｍＬ下）での、一つの実施態様であるｍＡｂ１５の結合特異性を示す図である。
【００３９】
【図１５】ＷＴ１−Ａ、ＷＴ１−Ａ１、又はＲＨＡＭＭ−Ｒ３ペプチドでパルスしたＴ２細胞に対する、ｍＡｂ５（上のパネル）及びｍＡｂ１５（下のパネル）の用量依存的結合を示す図である。
【００４０】
【図１６】ｍＡｂ５及び１５の、骨髄腫細胞株であるＵ２６６への結合を示す図である。
【００４１】
【図１７】ｍＡｂ１５の、（Ｐｈ１）陽性急性白血病を有する患者由来の細胞株であるＢＶ１７３への結合を示す図である。
【００４２】
【図１８】ＷＴ１ペプチドでパルスしたＴ２細胞表面上にあるＷＴ１／Ａ２複合体へ対するＥＳＫ１（♯１３）の特異的結合を示す図である。
【００４３】
【図１９】図１９及び図２０は、アラニンで異なる位置の置換をしたＲＭＦペプチドを、ＷＴ１抗体が認識できること（表１０参照）、及びアラニン（ＷＴ１−Ａ１−Ｂ）又はチロシン（ＷＴ１−Ａ１）のいずれかによる、１位における置換とともに見られた結合の喪失は、ＨＬＡ−Ａ２分子に対するペプチド結合親和性減少のためではなく、クローンＢＢ７であるＨＬＡ−Ａ２分子に特異的なモノクローナル抗体を使用したＴ２安定化アッセイにおいて、両方のペプチドが最も強い結合を示したためであることを示す図である。
【００４４】
【図２０】図１９及び図２０は、アラニンで異なる位置の置換をしたＲＭＦペ@0018プチドを、ＷＴ１抗体が認識できること（表１０参照）、及びアラニン（ＷＴ１−Ａ１−Ｂ）又はチロシン（ＷＴ１−Ａ１）のいずれかによる、１位における置換とともに見られた結合の喪失は、ＨＬＡ−Ａ２分子に対するペプチド結合親和性減少のためではなく、クローンＢＢ７であるＨＬＡ−Ａ２分子に特異的なモノクローナル抗体を使用したＴ２安定化アッセイにおいて、両方のペプチドが最も強い結合を示したためであることを示す図である。
【００４５】
【図２１】ヒト中皮腫細胞株であるＪＭＮ（ＷＴ１＋／Ａ０２０１＋）の細胞表面のＲＭＦ／ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体により自然に提示されるＷＴ１抗体を認識するが、ＭＳＴＯ（ＷＴ１＋／ＨＬＡ−Ａ０２０１-）は認識しないことを示す図である。
【００４６】
【図２２】ヒトＣＭＬ由来細胞であるＢＶ１７３に対するＷＴ１抗体の結合を示す図である。
【００４７】
【図２３】ＷＴ１抗体のＪＭＮ細胞への結合に基づいたスキャッチャード解析及び０．２ｎｍの定数についてのアビディティーを示す図である。
【００４８】
【図２４】中皮腫及び白血病細胞のパネルに結合するＷＴ１抗体を示す図である。
【００４９】
【図２５】ＨＬＡ−Ａ２陽性の患者からのＣＤ３３及びＣＤ３４二重陽性のＡＭＬ芽球細胞にゲートされたフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。ＥＳＫ１は、白血病芽球に結合する。
【００５０】
【図２６】ＨＬＡ−Ａ２陰性の患者からのＣＤ３３及びＣＤ３４二重陽性のＡＭＬ芽球細胞にゲートされたフローサイトメトリー分析の結果を示す図である。ＷＴ１  ｍＡｂ  ＥＳＫ１は、芽球に結合しなかった。
【００５１】
【図２７】ＲＭＦペプチドでパルスしたＴ２細胞に対するＡＤＣＣで媒介されるＷＴ１  ｍＡｂ  ＥＳＫ１を示す図である。
【００５２】
【図２８】ＪＭＮ及び白血病細胞株であるＢＶ１７３（下のパネル）において、ヒトエフェクターにＡＤＣＣを媒介させる能力をＷＴ１抗体が有すること、及びＭＳＴＯにおいては能力を有しないことを示す図である。
【００５３】
【図２９】ＷＴ１ｍＡｂはヒト白血病細胞であるＢＶ１７３に有効であり、ＨＬＡ−Ａ２＋でないＨＬ６０に有効ではないことを示す図である。
【００５４】
【図３０】ＷＴ１抗体は、ＨＬＡ−Ａ２陽性患者からの一次性ＡＭＬ芽球に対して、ＡＤＣＣを誘導することを示す図である。
【００５５】
【図３１】本発明の抗体を使用したＮＳＧマウスにおけるヒトＢＶ１７３処理の結果を示す図である。
【００５６】
【図３２】後の時点で、ＷＴ１抗体のみを処理したマウスは再発が始まり、一方、エフェクターとともに抗体を処理した５匹のマウスは、そのうち２匹が治癒したことを示す図である。
【００５７】
【図３３】用量依存的方法において、ＷＴ１抗体が全身腫瘍組織量を有意に減少させることを示す図である。
【００５８】
【図３４】Ｆｃ（ＭＡＧＥ）中に変更した糖鎖を有する抗体が、ＡＤＣＣにおいて、もとの抗体より活性があることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
（発明の詳細な説明）
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及びその他の参考文献は、本開示にその全
体が参照として組み込まれる。
【００６０】
本発明の実施において、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の多
くの従来の技術が使用されており、これらは当業者の技術の範囲内である。これらの技術
は例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕ
ａｌ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｆ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓ
ｅｌｌ， ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅ
ｓｓ  ２００１；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎ
ｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｍｅｌｖｙｎ  Ｌｉｔｔｌｅ，  ｅｄ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９； “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ
Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；“
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（
Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉ
ｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ”， （Ｍｕｌｌｉｓｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“ａ  Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ  
Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：ａ  Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）において、より詳
細に記載されている。これらの参考文献及び基本的なプロトコルを含むその他の参考文献
の内容は、当業者に広く知られるとともに信頼されており、前記プロトコルにはメーカー
の説明書等も含まれ、これらは本開示の一部として本明細書に組み込まれる。次の略語は
出願全体を通して使用される。
【００６１】
Ａｂ：抗体
【００６２】
ＡＤＣＣ：抗体依存性細胞傷害
【００６３】
ＡＬＬ：急性リンパ性白血病
【００６４】
ＡＭＬ：急性骨髄性白血病
【００６５】
ＡＰＣ：抗原提示細胞
【００６６】
β２Ｍ：β２−ミクログロブリン
【００６７】
ＢｉＴＥ：二重特異性Ｔ細胞結合抗体
【００６８】
ＣＡＲ：キメラ抗体受容体
【００６９】
ＣＤＣ：補体依存性細胞傷害
【００７０】
ＣＭＣ：補体依存性細胞傷害
【００７１】
ＣＤＲ：相補性決定領域（下記ＨＶＲ参照)
【００７２】
ＣＬ：軽鎖定常領域
【００７３】
ＣＨ１：第一重鎖定常領域
【００７４】
ＣＨ１，２，３：第一、第二、及び第三重鎖定常領域
【００７５】
ＣＨ２，３：第二及び第三重鎖定常領域
【００７６】
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
【００７７】
ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔ細胞
【００７８】
Ｅ：Ｔ  Ｒａｔｉｏ：エフェクター：標的  比率
【００７９】
Ｆａｂ：抗体結合部分
【００８０】
ＦＡＣＳ：フローアシスティッドサイトメトリックセルソーティング
【００８１】
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
【００８２】
ＦＲ：フレームワーク領域
【００８３】
ＨＣ：重鎖
【００８４】
ＨＬＡ：ヒト白血球抗原
【００８５】
ＨＶＲ−Ｈ：重鎖超可変領域（ＣＤＲ参照）
【００８６】
ＨＶＲ−Ｌ：軽鎖超可変領域（ＣＤＲ参照）
【００８７】
Ｉｇ：免疫グロブリン
【００８８】
ＩＲＥＳ：インターナルリボソームエントリーサイト
【００８９】
Ｋｄ：解離定数
【００９０】
Ｋｏｆｆ：解離速度
【００９１】
Ｋｏｎ：会合速度
【００９２】
ＭＨＣ：主要組織適合性遺伝子複合体
【００９３】
ＭＭ：多発性骨髄腫
【００９４】
ｓｃＦｖ：単鎖可変領域断片
【００９５】
ＴＣＲ：Ｔ細胞受容体
【００９６】
ＶＨ：重鎖超可変領域、及び重鎖可変フレームワーク領域を含む可変重鎖
【００９７】
ＶＬ：軽鎖超可変領域、及び軽鎖可変フレームワーク領域を含む可変軽鎖
【００９８】
ＷＴ１:ウィルムス腫瘍タンパク質１
【００９９】
以下の記載においては、用語の使用に関しては、一定の規則に従うことになる。一般に
、本明細書で使用される用語は、当業者に知られているようなそれらの用語の意味に一貫
して解釈されることを意図している。
【０１００】
「抗原結合性タンパク質」は、ある抗原結合性領域又はその抗原結合性部分を含むタン
パク質又はポリペプチドであり、それが結合する他の分子への強い親和性を有する。抗原
結合性タンパク質は、抗体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲＳ）との融合タンパク質を包含す
る。
【０１０１】
用語「抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ）」及び「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」は、当該技
術分野で知られているように、免疫系の抗原結合性タンパク質を指す。本明細書で使用さ
れる用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、抗原結合性領域を有する完全長の
抗体、そして、「抗原結合性部分」若しくは「抗原結合性領域」は、保持されたその任意
の断片又は単鎖を含み、例えば、単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）が挙げられる。天然に存
在する「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ジスルフィド結合により相互に連結された少な
くとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖には、
重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）及び重鎖定常領域（ＣＨ）が含まれる。
重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインから構成される。各軽鎖
には、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）が含ま
れる。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインから構成される。ＶＨ及びＶＬの領域
はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）という超可変性を有する領域、及びフレームワーク
領域（ＦＲ）という散在するより保存されている領域に細分することができる。ＶＨ及び
ＶＬではアミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ
３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲが、それぞれ配列されている
。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域
は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的な補体系の第一補体（Ｃ
１ｑ）を含む宿主組織又は宿主因子への免疫グロブリンの結合を媒介できる。
【０１０２】
本明細書において使用される抗体の「抗原結合性部分」又は「抗原結合性領域」という
用語は、抗体に対して結合し、そして抗原に対する特異性を抗体に付与するその領域又は
部分や抗原結合性タンパク質の断片として言及され、例えば、抗体には、抗原に特異的に
結合する能力を維持する抗体の１又はそれ以上の断片が含まれる（例えば、ペプチド／Ｈ
ＬＡ複合体）。抗体の抗原結合機能は完全長抗体の断片で行うことができることが示され
ている。抗体の「抗体断片」という用語に含まれる抗原結合性断片の例としては、ＶＬ、
ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインから構成される一価の断片であるＦａｂ断片、ヒンジ部の
ジスルフィド結合により結合した二つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ）２
断片、ＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成されるＦｄ断片、抗体の単腕のＶＬ及びＶＨから
構成されるＦＶ断片、ＶＨドメインから構成されるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．
，１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、及び単離された相補性決定領域
（ＣＤＲ）が含まれる。
【０１０３】
さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコード
されており、一価の分子を形成する対のＶＬ及びＶＨを有する単鎖タンパク質としてそれ
らを作ることを可能とする合成リンカーにより、組換え法を用いて接合することができる
。これらは単鎖ＦＶ（ｓｃＦｖ）として知られている；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８
８  Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８
８  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３参照。これらの
抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、完全な抗体と同様に、断片は有用
性のためにスクリーニングされる。
【０１０４】
「単離された抗体」又は「単離された抗原結合性タンパク質」は、その自然環境の成分
から同定され、及び分離され、及び／又は回収されたものである。「合成抗体」又は「組
み換え抗体」は、一般に、組換え技術を用いて、又は当業者に公知のペプチド合成技術を
用いて生成される。
【０１０５】
伝統的に、ＭＨＣ−ペプチド複合体のみが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識され
ることができ、このことが、Ｔ細胞ベースの読み出しアッセイを用いて、目的のエピトー
プを検出する我々の能力を制限する。本開示では、組換えＨＬＡ−ペプチド複合体を用い
たヒトのｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーから選択されたｓｃＦｖをもとにし
て抗原結合性領域を有する抗体を含む抗原結合性タンパク質が記載されている。これらの
分子は、例えば、ＨＬＡ−Ａ２−ＲＭＦＰＮＡＰＹＬのみ認識する抗ＷＴ１抗体で示され
るように、強い特異性を実証する。加えて、他のペプチドを含有するＨＬＡ−複合体に結
合することができず、その分子はペプチドそれ自身に結合することもできず、さらに、そ
れらのＴＣＲ様の特異性を実証する。
【０１０６】
ファージディスプレイにより選択した本開示のｓｃＦｖを、最初はＨＬＡ陽性細胞の表
面に提示されるペプチドに結合する能力について試験した。
Ｔ２細胞が、ペプチドの存在下でインキュベートされた後、フローサイトメトリーを使用
して、抗原パルス細胞を選択的に認識するために蛍光標識抗体を使用することができた。
【０１０７】
いくつかの実施態様においては、本発明は、全体的な親和性と安定性が増加した二価タ
ンパク質を得るためのヒト免疫グロブリンのＦｃ領域を有する抗体を形成するために、一
つ又はそれ以上重鎖定常ドメインに融合したｓｃＦｖ配列を有する抗体を含む。また、Ｆ
ｃ部分は、他の分子が抗体に直接結合することを可能とし、前記分子には蛍光色素、細胞
毒素、放射性同位体などが含まれるがこれに限られないものとし、例えば、抗原定量化調
査のため、親和性測定の目的で抗体を固定するため、治療薬の標的遺伝子導入のため、免
疫エフェクター細胞及びその他の多くのアプリケーションを利用して、Ｆｃ媒介性細胞傷
害性を試験するために用いられる。
【０１０８】
ここに提示した結果は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を標的とする本発明の抗体の特異性、
反応性、及び有用性を強調する。
【０１０９】
本発明の分子は、ファージディスプレイを使用した単鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）の同
定及び選択に基づいており、そのアミノ酸配列は、興味のあるＭＨＣ拘束性ペプチドに分
子特異性を付与し、本開示の抗原結合性タンパク質の主成分を形成する。ｓｃＦｖは、そ
れゆえに、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）分子の多様なアレイの設計に使用することができ、
抗体分子には、例えば、完全長抗体、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２のようなその断片、ミニ
ボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、ｓｃＦｖ−Ｆｖ融合を含む融合タンパク質、及び多価
抗体、すなわち、例えば、Ｔ細胞結合性抗体（ＢｉＴｅ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｉ
ｅｓ）などのような１以上の同じ抗原若しくは異なった抗原に対して特異性を有する抗体
が含まれる(Ｃｕｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉ
ｅｓ：ｗｈｅｎ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｕｒｐａｓｓｅｓ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄ
ｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８：３５５−３６２  ２０１０参照）。
【０１１０】
抗原結合性タンパク質が完全長抗体である実施態様においては、本発明の抗体の重鎖及
び軽鎖は、完全長とすることができ（例えば、少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な
重鎖、及び少なくとも１つ、好ましくは２つの完全な軽鎖を含むことができる抗体）、又
は、抗原結合性部分［Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、若しくは単鎖Ｆｖ断片（「ｓｃＦ
ｖ」）］を含む。その他の実施態様では、抗体の重鎖定常領域は、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、
ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＭ、ｌｇＡ１、ｌｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥから選択される
。いくつかの実施態様においては、免疫グロブリンアイソタイプは、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２
、ｌｇＧ３、及びｌｇＧ４から、より具体的にはｌｇＧ１（例えばヒトｌｇＧ１）から選
択される。抗体の種類の選択は、抗体が誘発されるように設計されている免疫エフェクタ
ー機能に依存する。
【０１１１】
組換え免疫グロブリンの構築において、様々な免疫グロブリンアイソタイプ定常領域に
適切なアミノ酸配列及び豊富な抗体の製造方法は、当業者によく知られている。
【０１１２】
ある実施態様においては、抗体又は他の抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１／ＨＬＡ−
Ａ２−ｓｃＦｖであるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡ
ＰＹＬ（配列番号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号１８のアミノ酸配
列を含む抗原結合性領域を有するその抗原結合性断片である。いくつかの実施態様におい
ては、抗ＷＴ１抗体は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは
表１から選択されるＣＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表１】
2016026209.tif 000002
【０１１３】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖ
であるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番
号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号３６のアミノ酸配列を含む抗原結
合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は
、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表２から選択されるＣ
ＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表２】
2016026209.tif 000003
【０１１４】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖ
であるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番
号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号５４のアミノ酸配列を含む抗原結
合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は
、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表３から選択されるＣ
ＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表３】
2016026209.tif 000004
【０１１５】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖ
であるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番
号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号７２のアミノ酸配列を含む抗原結
合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は
、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表４から選択されるＣ
ＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表４】
2016026209.tif 000005
【０１１６】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖ
であるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番
号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号９０のアミノ酸配列を含む抗原結
合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体は
、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表５から選択されるＣ
ＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表５】
2016026209.tif 000006
【０１１７】
その他の実施態様においては、抗体又は抗原結合性タンパク質は、抗ＷＴ１−ｓｃＦｖ
であるか、又はＨＬＡ−Ａ０２０１と連結してアミノ酸配列ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番
号１）を有するペプチドに特異的に結合する、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む抗原
結合性領域を有するその抗原結合性断片である。他の実施態様においては、抗ＷＴ１抗体
は、ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質、又はＶＨ及びＶＬ領域若しくは表６から選択される
ＣＤＲを有する完全長ヒトＩｇＧである。
【表６】
2016026209.tif 000007
【０１１８】
開示された抗体及び抗原結合性タンパク質のその他の実施態様は、例えば、表７（重鎖
）、８（軽鎖）、及び９（定常領域）として示される軽鎖及び重鎖超可変領域及び定常領
域を含む。
【表７】
2016026209.tif 000008
【表８】
2016026209.tif 000009
2016026209.tif 000010
【表９】
2016026209.tif 000011
【０１１９】
本発明は、細胞内タンパク質由来のペプチド／タンパク質断片複合体エピトープを特異
的に認識する組み換え抗原結合性タンパク質、抗体、及びその抗原結合性断片、並びに、
例えば、抗原提示の間に細胞表面に表示されることができるような複合体ＭＨＣクラスＩ
分子に関する。本発明の抗体の重鎖及び軽鎖は、完全長（例えば、少なくとも１つの、好
ましくは２つの完全な重鎖、及び少なくとも１つの、好ましくは２つの軽鎖を含むことが
できる抗体）であることができ、又は抗原結合性部分［Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、
又は単鎖Ｆｖ断片（「ｓｃＦｖ」）］を含むことができる。その他の実施態様では、抗体
の重鎖定常領域は、例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌｇＧ３、ｌｇＧ４、ＩｇＭ、ｌｇＡ
１、ｌｇＡ２、ＩｇＤ、及びＩｇＥから、具体的には、例えば、ｌｇＧ１、ｌｇＧ２、ｌ
ｇＧ３、及びｌｇＧ４から、より具体的には、ｌｇＧ１（例えばヒトｌｇＧ１）から選択
される。そのほかの実施態様では、抗体の軽鎖定常領域は、例えば、カッパ又はラムダ、
具体的にはカッパから選択される。
【０１２０】
本発明の抗体及び抗原結合性タンパク質は、二重特異性Ｔ細胞結合性抗体、すなわち２
つの分離した抗原に結合することができる単鎖ポリペプチド上の２つの抗体可変領域を有
する抗体を含む二重特異性抗体を包含することを意図している。例えば、二重特異性抗体
の第一部分が腫瘍細胞上の抗原に結合する部位、及び二重特異性抗体の第二部分がヒト免
疫エフェクター細胞の表面の抗原を認識する部位によって、抗体は、エフェクター細胞が
ヒト免疫エフェクター細胞上のエフェクター抗原に特異的に結合することにより、活性を
回復させることができる。場合によっては、二重特異性抗体は、それゆえに、エフェクタ
ー細胞の、例えば、Ｔ細胞及び腫瘍細胞の結合を形成することができ、そこで、エフェク
ター機能を活性化する。
【０１２１】
ある実施態様では、定常領域／フレームワーク領域は、例えば、アミノ酸の置換により
抗体の特性を修正するために改変される（例えば、１又はそれ以上の、抗原結合親和性、
Ｆｃ受容体結合、例えば、グリコシル化、フコシル化などの抗体の炭水化物、システイン
残基の数、エフェクター細胞の機能、補完機能、又は結合部位の導入を増加又は減少させ
るため）。さらに、薬物、毒素、放射性同位体、サイトカイン、炎症性ペプチド、又は細
胞傷害性剤に対する抗体の結合も考えられる。
【０１２２】
ある実施態様では、抗体は抗ＷＴ１／Ａ２抗体であり、表９に示されるヒトＩｇＧ１定
常領域及びＦｃドメインを含む。ある実施態様では、抗ＷＴ１／Ａ２抗体は表９に示され
る配列を有するヒトカッパ配列又はヒトラムダ配列を含む。発明に係る抗体のいくつかの
相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列は、表１−８に示される。
【０１２３】
本発明は、様々な抗原結合性タンパク質を生産することができる抗原特異的結合配列の
同定に基づいている。Ｔ細胞へのタンパク質の提示及び抗原処理後のＴ細胞受容体によっ
て、典型的に認識されるものと同様のタンパク質断片（ペプチド）／ＨＬＡ複合体を表す
抗原に特異的な抗体に加えて、抗体の調製のために本明細書に開示されるようなアミノ酸
配列及び核酸配列の同定もまた、タンパク質断片（ペプチド）／ＨＬＡ複合体に対する特
異性を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む他の抗原結合分子を生成するために使用する
ことができる。これらは、抗原発現細胞に対して特異的に細胞傷害性となるように細胞に
組み込むことができる。
【０１２４】
本発明は、細胞表面に発現させていないため、得がたいタンパク質を含む任意のタンパ
ク質への治療用抗体を得るための新規なアプローチを採用している。ほぼ全ての細胞質内
又は核内タンパク質は、（細胞表面タンパク質に加えて）本明細書に記載されたアプロー
チの潜在的な標的である。これには、発癌性タンパク質、転写因子、酵素などが含まれる
が、これらに限定されない。
【０１２５】
細胞内又は核タンパク質に由来する腫瘍抗原を標的とするために、治療用抗体の開発は
ありふれていないアプローチが必要とされた。このアプローチは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ
）と同じ特異性を有する、細胞表面上に発現させたペプチド／ＭＨＣ複合体を認識するモ
ノクローナル抗体を生成することである。このようなモノクローナル抗体は、ターゲット
認識に関してのＴＣＲとの機能的相同性を共有するが、その抗体を特徴づける強力な細胞
傷害性薬剤を付与する高い親和性と能力を与える。技術的には、ＴＣＲ様モノクローナル
抗体は、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体を産生するための当業者に公知の従来のハイブリ
ドーマ技術によって生成することができる。
【０１２６】
さらに、マウス抗体を人に投与したときは、ＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応（２４
、２５）として知られる免疫原性反応を引き起こし、アナフィラキシー及び過敏性反応を
含む重篤な副作用を生じさせるため、完全ヒトモノクローナル抗体が、人における治療的
使用に好ましい。この免疫原性反応は、天然のヒト抗体とは若干異なるアミノ酸配列であ
るため、マウス抗体を異質であると認識するヒト免疫系によって引き起こされる。当該技
術分野で知られているヒト化法（２６、２７）は、マウス由来抗体（２８）の免疫原性を
低減するために使用することができる。
【０１２７】
近年、ファージディスプレイライブラリーを用いることにより、たくさんの抗体レパー
トリーから特定のエピトープに対して独特で珍しい抗体を選択することが可能になる（フ
ァージディスプレイのさらに詳細についてはＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈ
ａｇｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ
ｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ，３４８
：５５２−５５４参照）。腫瘍抗原由来ペプチド−ＭＨＣ複合体分子に対する非常に特異
的なヒトＦａｂ又は単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片の迅速な同定は、このように可能になった
（１９−２２）。より最近では、シュードモナスエンドトキシンのメラノーマＡｇ−ＭＡ
ＲＴ‐１−２６‐３５／Ａ２又はｇｐ１００−２８０‐２８８／Ａ２欠失型に特異的なＴ
ＣＲ様Ｆａｂを融合することにより生成される免疫毒素は、インビトロ及びインビボの両
方で、ヒトメラノーマの増殖を阻害することが示されている。加えて、Ｆａｂ断片を用い
た完全長モノクローナル抗体を遺伝子工学で作ることにより、治療用モノクローナル抗体
の開発に通常必要である数か月の時間を消費する作業を行わずして、治療用ヒトモノクロ
ーナル抗体を直接生成することが可能となる。本発明は、例えば、癌治療のためのＷＴ１
ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ：配列番号１）を認識するＴＣＲ様
完全ヒトモノクローナルの開発を含む。
【０１２８】
ＴＣＲ様特異性を有する組み換え抗体は、腫瘍免疫学及び免疫療法の研究と治療への応
用のための新しい貴重なツールを表している。予後因子及び治療標的のマーカーとして世
界中で調査され続けてきた、よく検証され、確立された腫瘍抗原である。それは、最近Ｎ
ＣＩタスクフォース（２９）によって最優先腫瘍抗原として優先順位付けされた。
【０１２９】
《ＨＬＡ分子に対して高い予測結合を有するペプチドの同定》
ある実施形態において、本発明は、ＨＬＡ拘束性ペプチドに特異的に結合する抗体の生
成に関し、前記ペプチドは、ペプチド／ＭＨＣ複合体の一部として提示されたときに、特
異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発することができる。ＨＬＡクラスＩ分子は、ＣＤ８＋
細胞傷害性Ｔリンパ球の長さで約８−１２のアミノ酸の、内在性誘導ペプチドを示す。本
発明の方法において使用されるペプチドは、一般的に約６〜２２個の長さのアミノ酸であ
り、いくつかの実施態様では約９及び２０個のアミノ酸の長さであり、対象のタンパク質
に由来するアミノ酸配列、例えば、ヒトＷＴ１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ
ン番号Ｐ１９５４４）又はそのアナログを含む。 
【０１３０】
本発明の方法に従って、抗体を生成する際に使用するのに適したペプチドはＨＬＡ−Ａ
０２０１結合モチーフの存在及びプロテアソーム及び免疫プロテアソームの切断部位に基
づいて、当業者に周知のコンピュータ予測モデルを使用して、決定することができる。Ｍ
ＨＣクラスI結合部位を予測するために、ＰｒｏＰｒｅｄ１（さらに詳細は、Ｓｉｎｇｈ
ａｎｄ  Ｒａｇｈａｖａ，ＰｒｏＰｒｅｄ：ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｄ
Ｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ１７（１２）：１２３
６−１２３７  ２００１に記載されている)、及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（Ｓｃｈｕｌｅｒ
ｅｔ  ａｌ．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  
ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ.ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｉ
ｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，
ｖｏｌ４０９（１）：７５−９３  ２００７参照）のようなモデルが含まれるが、これら
に限定されない。
【０１３１】
ＨＬＡ−＊０２０１は、すべての白人の３９〜４６パーセントで発現し、従って、本発
明の方法において使用するためＭＨＣ抗原の適切な選択を表している。ＷＴ１ペプチド抗
原のある実施態様の調整のため、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子に対する結合予測した推定上の
ＣＤ８４＋のエピトープおよびアミノ酸配列はＳＹＦＰＥＩＴＨＩデータベース（Ｓｃｈ
ｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ，Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ｓｅａｒｃｈ
ｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ｉｎ  Ｉｍｍ
ｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，ｖｏｌ４０９（１）：７５−９３  ２００７参照）の予測アルゴリズムを用いて
同定される。
【０１３２】
一旦適切なペプチドが同定されれば、ペプチド合成は、当業者に周知のプロトコルに従
って行うことができる。それらの比較的小さいサイズのために、本発明のペプチドは、直
接溶液中又は従来のペプチド合成技術による固体支持体上で合成することができる。様々
な自動シンセサイザーが市販されており、公知のプロトコルに従って使用することができ
る。液相中のペプチドの合成は、合成ペプチドの大規模生産のための十分に確立された手
順となり、それ自体は本発明のペプチドを調製するための適切な代替方法である。（例え
ばＳｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｍ
ｏｒｒｏｗ  Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ  ｏｆ  Ａｌｍｅｚ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｉｄａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ
ｔｏ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｅｔ
ｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  Ｖｏｌ．３９，ｐａｇｅｓ  １５１７−１５２０  
１９９８．参照）
【０１３３】
本明細書に記載されているプロトコルで使用されているそれぞれのペプチドは、Ｇｅｎ
ｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（サンアントニオ、テキサス州）が、フルオレ
ニルメトキシカルボニル化学及び固層合成を用いて合成し、高圧液体クロマトグラフィー
により精製し、購入した。ペプチドの品質は、高速液体クロマトグラフィー分析により評
価し、予想分子量は、マトリックス支援レーザー脱離質量分析法を用いて観察した。ペプ
チドは無菌であり、純度７０％〜９０％であった。ペプチドをＤＭＳＯに溶解し、ＰＢＳ
（ｐＨ７．４）又は生理食塩水５ｍｇ／ｍＬで希釈し、−８０℃で保存した。
【０１３４】
ペプチドの選択の後で、選択したペプチドの結合活性は、抗原提示溝におけるペプチド
によって安定化させたときにＨＬＡ−Ａの発現を増加させる、抗原プロセッシング欠損Ｔ
２細胞株を用いて試験する。簡単に述べると、Ｔ２細胞は、ＨＬＡ−Ａ発現を誘導するの
に十分な時間ペプチドでパルスしている。Ｔ２細胞のＨＬＡ−Ａ発現は、次いで、ＨＬＡ
−Ａ（例えばＢＢ７．２）に特異的な蛍光標識モノクローナル抗体を用いた免疫染色及び
フローサイトメトリーによって測定する。蛍光指数（ＦＬ）は、式ＦＩ＝［ＭＦＩ（ペプ
チドとＴ２細胞）／ＭＦＩ（ペプチドなしのＴ２細胞）］−１を用いた蛍光活性化細胞ソ
ーティング分析によって決定する、Ｔ２細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１平均蛍光強度（ＭＦ
Ｉ）として計算する。
【０１３５】
ウィルムス腫瘍遺伝子タンパク質（ＷＴ１）に対する完全ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
様抗体は、本明細書に開示した方法を用いて製造した。ファージディスプレイ技術によっ
て生成したＴＣＲ様抗ＷＴ１抗体は、ＨＬＡ拘束性細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞を誘導したも
のと同様のＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ複合体に特異的である。
【０１３６】
ＷＴ１タンパク質配列は、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズム及び複数の白人人口におい
て高度に発現したＨＬＡ分子への高親和性結合を予測していたことが確認されたＷＴ１ペ
プチド（例えば、４２８、３２８、および１２２の設計されたペプチド）を使用してスク
リーニングした。ペプチド４２８は、ＷＴ１のアミノ酸４２８〜４５９、ペプチド３２８
はＷＴ１アミノ酸の３２８〜３４９、そしてペプチド１２２はＷＴ１アミノ酸１２２〜１
４０にわたる（図１参照）。
【０１３７】
ヘテロクリティックペプチドは、予測アルゴリズムによって予測されたとして、ＭＨＣ
クラス１対立遺伝子に対して親和性を高めることが期待されるＭＨＣ結合性残基の保存ア
ミノ酸置換によって設計することができる。ＷＴ１ペプチド１２２は、公知のＣＤ８＋エ
ピトープ（１２６−１３４）を含む。したがって、一実施形態では、ＷＴ１のアミノ酸残
基１２６−１３４にわたり、その位置における修飾されたアミノ酸を含有するペプチドで
ある、修飾されたペプチドを使用することができる。ＷＴ１Ａ（そうでなければ、ＲＦＭ
として設計）のアラニン変異誘発に使用するペプチドは、置換が行われた位置に基づいて
命名した。使用することができるＷＴ１ペプチドの例を無関係な（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ
）ペプチドであるＲＨＡＭＭ−Ｒ３及びＥＷとともに、表１０に示す。
【表１０】
2016026209.tif 000012
【０１３８】
一旦適切なペプチドを同定すると、ペプチド／ＨＬＡ複合体（例えば、ＷＴ１ペプチド
／ＨＬＡ−Ａ０２０１）であるファージディスプレイライブラリースクリーニングに使用
する標的抗原は、複合体を形成するために、溶液中でペプチド及び組織適合抗原をともに
もたらすことによって調整される。
【０１３９】
《ＷＴ１ペプチドに対して高親和性のｓｃＦＶの選択》
次のステップは、結合しないか、若しくは弱い親和性で結合するかのどちらかのヒトフ
ァージディスプレイライブラリーにおけるファージから高親和性で関心のある標的抗体に
結合するファージの選択である。これは、例えば、ビーズ又は哺乳動物細胞に続いて、結
合していないファージを除去し、及び特異的に結合したファージを溶出することにより、
固体支持体に結合している抗原に対するファージの結合を反復することによって達成され
る。ある実施形態では、抗原は、例えば、ストレプトアビジン結合ダイナビーズＭ−２８
０への固定化のためにまず、ビオチン化される。ファージライブラリーを、細胞、ビーズ
又は他の固体支持体とともにインキュベートし、結合していないファージは洗浄により除
去する。結合するクローンを選択し、試験する。
【０１４０】
一旦選択すると、陽性のｓｃＦｖクローンを、間接的なフローサイトメトリーによって
、Ｔ２生細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体へのそれらの結合について試験する
。簡潔には、ファージクローンを、ＷＴ１−Ａペプチド又は無関係なペプチド（コントロ
ール）でパルスしたＴ２細胞とともにインキュベートする。細胞を、次いで、マウス抗Ｍ
１３コートタンパク質モノクローナル抗体とともに洗浄する。細胞を再び洗浄し、フロー
サイトメトリーに先立って、ＦＩＴＣ−ヤギ（Ｆａｂ）２抗マウスＩｇで標識する。
【０１４１】
他の実施形態では、抗ＷＴ１／Ａ抗体は、タンパク質の安定性、抗体結合、発現レベル
を向上させるため又は治療薬の結合のための部位を導入するように設計した１つ又はそれ
以上のフレームワーク領域のアミノ酸置換を含むことができる。これらのｓｃＦｖを、次
いで、当業者に公知の方法に従って組換えヒトモノクローナルＩｇを生成するために使用
する。
【０１４２】
白血病細胞の増殖を減少させる方法もまた含まれており、本発明のＷＴ１抗体と白血病
細胞を接触させることも含む。関連する態様において、本発明の抗体を、白血病の予防又
は治療に使用することができる。治療用抗体の投与は、当該技術分野で公知である。
【０１４３】
《抗癌剤と結合する抗体》
モノクローナル抗体は、細胞毒、放射性核種、又は免疫調節サイトカインの抗体に基づ
いた送達を含む、生物活性剤を腫瘍部位へ標的送達する好ましい媒体を表している。本発
明の抗体と治療薬の結合体は、薬物（カリケアミシン、オーリスタチン、ドキソルビシン
など）、又は毒素（リシン、ジフテリア、ゲロニンなど）、又はアルファ若しくはベータ
粒子を放出する放射性同位体（９０Ｙ、１３１Ｉ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、２２３Ｒａ
、及び２２７Ｔｈなど）、炎症性ペプチド（ＩＬ２、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γなど）が本発明
に包含されるが、これに限定されるものではない。
【０１４４】
《医薬組成物及び治療方法》
【０１４５】
本発明のＷＴ１抗体は、予防、阻害、若しくは腫瘍又は病的状態の進行を減少させるの
に十分な量を、腫瘍又はＷＴ１関連の病的状態を患う患者への治療的処置のために投与す
ることができる。進行には、例えば、成長、侵襲、転移、及び／又は腫瘍若しくは病的状
態の再発が含まれる。この使用のために有効な量は、疾患の重症度及び患者自身の免疫系
の一般的な状態に依存するであろう。投与スケジュールはまた、疾患状態及び患者の状態
に応じて変化し、通常、単一のボーラス投与若しくは持続注入から一日あたり複数回の投
与（例えば、４−６時間ごと）の範囲又は治療する医師によって示されたものである。
【０１４６】
本発明のＷＴ１抗体によって治療可能な病状の同定は、当業者の能力及び知識の範囲内
である。例えば、臨床的に有意な白血病疾患に苦しんでいる人間又は臨床的に有意な症状
が発生する個人のいずれかは、ＷＴ１抗体の投与に適している。個人がこのような治療の
ための候補者であれば、当業者である臨床医は容易に、例えば、臨床試験、理学的診察、
及び医療／家族歴のテストを使用することにより、判断することができる。
【０１４７】
ＷＴ１発現により特徴づけられる病理学的状態の非限定的な例には、慢性骨髄性白血病
、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、及び骨髄異形成症候群
（ＭＤＳ）を含む。また、固形腫瘍、特に、中皮腫、卵巣癌、消化器癌、乳癌、前立腺癌
、及び神経膠芽腫に関連する腫瘍は、一般にＷＴ１抗体を用いた治療に適している。
【０１４８】
別の実施態様では、従って、本発明は、１又はそれ以上の他の薬剤と組み合わせた本発
明のＷＴ１抗体を投与することによって、病状を治療する方法を提供する。例えば、本発
明の実施形態は、抗腫瘍剤又は抗血管新生剤とともに、本発明のＷＴ１抗体を投与するこ
とによって病状を治療する方法を提供する。ＷＴ１抗体は、１又はそれ以上の抗腫瘍剤又
は抗血管新生剤に、化学的又は生合成的に結合させることができる。
【０１４９】
任意の適切な方法又は経路は、本発明のＷＴ１抗体を投与するため、及び必要に応じて
、抗腫瘍剤及び／又は他の受容体のアンタゴニストと併用するために使用することができ
る。投与経路は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内投与を含む。本発明
は、しかしながら、任意の特定の方法又は投与経路に限定されないことを強調すべきであ
る。
【０１５０】
本発明のＷＴ１抗体は、リガンド毒素の内在化の後に、受容体に特異的に結合し毒性の
ある致命的なペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）を運搬する結合体として投与することができ
ることに留意する。
【０１５１】
本発明のＷＴ１抗体を、さらに、薬学的に許容可能な担体を含む組成物の形態で投与す
ることが理解される。好ましい薬学的に許容可能な担体としては、例えば、１又はそれ以
上の水、生理食塩水、リン酸緩衝水溶液、デキストロース、グリセロール、エタノール、
及びそれらの組み合わせを含む。薬学的に許容可能な担体は、さらに、保存可能期間又は
結合タンパク質の有効性を高める湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝剤のような少量の補
助物質を含むことができる。当技術分野でよく知られているように、哺乳動物への投与後
に迅速で、持続的な又は遅効的な活性成分の放出を提供するように、注入する組成物を製
剤化することができる。
【０１５２】
本発明の他の観点としては、細胞及び組織におけるＷＴ１探索のための研究ツールとし
ての使用と同様に、診断及び予知の用途でＷＴ１関連疾患の治療のためにそれらをコード
する抗体及び核酸の使用も含むが、これに限定されない。開示された抗体及び核酸を含む
医薬組成物は、本発明に包含される。ベクター免疫療法による抗体ベースの治療のための
本発明の核酸を含むベクターも、本発明によって企図される。ベクターには、キメラ抗原
受容体などの抗原結合性タンパク質の細胞表面発現に向けられるベクターと同様に、抗体
の発現及び分泌を可能にする発現ベクターが含まれる。
【０１５３】
核酸を含む細胞、例えば、本発明のベクターでトランスフェクトされた細胞は本開示に
包含される。
【０１５４】
診断及び研究用途に使用するため、キットはまた、ＷＴ１抗体又は本発明の核酸、アッ
セイ試薬、緩衝液などを含有して提供される。
【０１５５】
本発明の方法を、代表的な実施態様に関して、より詳細に説明する。
【０１５６】
《材料》
細胞サンプル、細胞株、及び抗体
メモリアルスローンケタリングがんセンター治験審査委員会のインフォームドコンセン
トにプロトコルが承認された後、ＨＬＡ型の健康ドナー及び患者からの末梢血単核細胞（
ＰＢＭＣ）を、フィコール密度遠心分離によって得た。ヒト中皮腫細胞株を得るためのソ
ースは、前述されている（２９）。細胞株は、Ｈ−Ｍｅｓｏ１Ａ、ＪＭＮ、ＶＡＭＴ、Ｈ
２４５２、Ｈ２３７３、Ｈ２８、ＭＳＴＯ、Ｍｅｓｏ１１、Ｍｅｓｏ３４、Ｍｅｓｏ３７
、Ｍｅｓｏ４７、及びＭｅｓｏ５６を含む。すべての細胞は、メモリアルスローンケタリ
ングがんセンターの細胞免疫学教室によってＨＬＡ型とされた。白血病細胞株ＬＡＭＡ８
１、ＢＶ１７３、及び６９７、（ＷＴ１＋、Ａ０２０１＋）は、ＨＪ  Ｓｔａｕｓｓ博士
（ロンドン大学、ロンドン、イギリス）によって，親切にも提供された。メラノーマ細胞
株ＭｅＷｏ（ＷＴ１−、Ａ２０１＋）、ＳＫＬＹ１６（Ｂ細胞リンパ腫、ＷＴ１‐、Ａ０
２０１＋）、Ｋ５６２、ＲｗＬｅｕ４、及びＨＬ６０、全てのＷＴ１＋白血病、及びＴＡ
Ｐ欠損Ｔ２細胞株を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから得た。細胞株
を、５％ＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン２ｍｍｏｌ／Ｌ、及び２
−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０中で、３７℃、５％のＣＯ２で培養
した。
【０１５７】
ＦＩＴＣ又はＡＰＣに結合させたヒトＨＬＡ−Ａ２に対するモノクローナル抗体、及び
ヒト又はマウスＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓ社、サンディエゴ）に対するそのアイソタイプコントロールマウスＩｇＧ２ｂ
／ＦＩＴＣ又はＡＰＣ、ＰＥ、又はＦＩＴＣに結合させたヤギＦ（ＡＢ）２抗ヒトＩｇＧ
及び蛍光（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ、シティー）に結合させたヤギＦ（ＡＢ）２抗マウス
ＩｇＧを購入した。ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２）に対するモノクローナル抗体を、Ｍ
ＳＫＣＣモノクローナル抗体基盤施設から得た。
【０１５８】
ペプチド
すべてのペプチドは、Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ社（サンアントニオ、テキ
サス州）によって合成され、購入した。ペプチドは、＞９０％の純度であった（表１）。
ペプチドを、ＤＭＳＯに溶解し、生理食塩水５ｍｇ／ｍＬで希釈し、−１８０℃で凍結さ
せた。ビオチン化された単鎖のＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ０２０１とＲＨＡＭＭ−３／
ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体は、ＭＳＫＣＣのテトラマー施設（Ｔｅｔｒａｍｅｒ  ｆａｃ
ｉｌｉｔｙ）において、組換えＨＬＡ−Ａ２とβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）とともに
ペプチドをリフォールディングすることにより合成した。
【０１５９】
動物
８−１０週齢のＮＯＤ  ｓｃｉｄ  ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）として知られるＮＯＤ．Ｃｇ
−Ｐｒｋｄｃ  ｓｃｉｄ  ＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪマウスを、ジャクソン研究所
（バーハーバー、メーン州）から購入し、又はＭＳＫＣＣ動物飼育施設から得た。
【０１６０】
《方法》
フローサイトメトリー分析
細胞表面染色のため、細胞を、適切なモノクローナル抗体とともに氷上で３０分間イン
キュベートし、洗浄し、必要なときは、二次抗体試薬とともにインキュベートした。フロ
ーサイトメトリーのデータは、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎ
ｓｏｎ）上に集め、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ８．７．１及び９．４．８ソフトウェアで分析した。
【０１６１】
ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体に特異的なｓｃＦｖの選択及び同定
ヒトｓｃＦｖ抗体ファージディスプレイライブラリーを、モノクローナル抗体クローン
の選択のために使用した。プラスチックの表面に固定化することによるＭＨＣ１複合体導
入の立体構造変化を低減するために、従来のプレートパニング（ｐｌａｔｅ  ｐａｎｎｉ
ｎｇ）の代わりに、溶液パニング法（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐａｎｎｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ
）を用いた。手短に言うと、まず、ビオチン化抗原を、ヒトｓｃＦｖファージライブラリ
ーと混合し、次いで、抗原ｓｃＦｖ抗体複合体を、磁気ラックを通してストレプトアビジ
ン結合ダイナビーズＭ−２８０によって、プルダウンした。結合したクローンを、その後
溶出し、大腸菌ＸＬ１−ブルーに感染させるために使用した。細菌中で発現させたｓｃＦ
ｖファージクローンを、精製した（３５，３６）。パニングを、ＨＬＡ−Ａ０２０１／Ｗ
Ｔ１複合体に特異的に結合したｓｃＦｖファージクローンを豊富にするために３−４サイ
クル行った。陽性のクローンを、ビオチン化された単鎖ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＷＴ１ペプ
チド複合体に対する標準的なＥＬＩＳＡ法によって決定した。陽性クローンをさらに、Ｔ
ＡＰ欠損、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋細胞株、Ｔ２を使用して、フローサイトメトリーによる
生細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体への結合について試験した。Ｔ２細胞を、
２０μｇ／ｍＬβ２ミクログロブリンの存在下において、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中
のペプチド（５０μｇ／ｍＬ）で、一晩パルスした。細胞を洗浄し、染色を、以下の手順
で行った。
【０１６２】
細胞をまず、精製したｓｃＦｖファージクローンで染色し、続いて、マウス抗Ｍ１３モ
ノクローナル抗体で染色し、そして最終的にヤギＦ（ａｂ）２抗マウスＩｇがＦＩＴＣに
結合させた。染色の各ステップを、氷上で３０−６０分の間で行い、細胞を染色の各工程
間で２回洗浄した。
【０１６３】
選択したｓｃＦｖ断片を用いた完全長モノクローナル抗体の作製
選択したファージクローンの完全長ヒトＩｇＧ１を、前述（３７）のように、ＨＥＫ２
９３及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株において作製した。手短に言うと
、抗体の可変領域を、ヒトラムダ又はカッパ軽鎖定常領域及びヒトＩｇＧ１定常領域配列
と一致させるとともに、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。精製した完全長
ＩｇＧ抗体の分子量を、電気泳動によって、還元及び非還元条件下の両方で測定した。
【０１６４】
キメラ抗原受容体及び免疫エフェクター細胞の作製
本明細書において同定されている抗体及び抗原結合性タンパク質をコードする核酸は、
組換え免疫エフェクター細胞の作製に用いることができる。遺伝子改変したＴ細胞を発生
させる方法及びベクターは、例えば、当技術分野で公知である（Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ  ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅ
ｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ＣＤ１９−ｔａｒｇｅｔｅｄ  
Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｃｈｅ
ｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａｓ  ｉｎ
Ｂｌｏｏｄ  １１８（１８）：４８１７−４８２８，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２０１１参照
）。
【０１６５】
ＷＴ１ｐ／Ａ２複合体の全長ヒトＩｇＧ１の特性評価
初めに、ＷＴ１ペプチド／Ａ２複合体の完全ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の特異性
を、ＲＭＦ又はＲＨＡＮＮ−Ｒ３コントロールペプチドあり、又はなしの状態で、パルス
したＴ２細胞を染色することにより決定した。続いて、二次ヤギＦ（ａｂ）２抗ヒトＩｇ
Ｇモノクローナル抗体を、ＰＥ又はＦＩＴＣに結合させた。蛍光強度は、フローサイトメ
トリーにより測定した。同様の方法を、新鮮腫瘍細胞及び細胞株に対するモノクローナル
抗体の結合を決定するために用いた。
【０１６６】
放射免疫測定
ＷＴ１ａｂ１を、１２５−Ｉ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）をクロラミン−Ｔ法（３８）
を用いて標識した。抗体１００μｇを、１ｍＣｉ−１２５−Ｉ及びクロラミン‐Ｔ２０μ
ｇと反応させ、ピロ亜硫酸ナトリウム２００μｇとクエンチングし、その後、ＰＢＳ中の
２％ウシ血清アルブミンと平衡させた１０ＤＧカラム（ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて、遊離
した１２５−Ｉと分離した。生成物の比放射能は、７−８ｍＣｉ／ｍｇの範囲であった。
【０１６７】
造血細胞株、付着細胞株［非酵素的細胞ストリッパー（ｎａｍｅ）を用いて回収］、正
常なドナー及びＡＭＬ患者由来の末梢血単核細胞を、前述のように得た。細胞をＰＢＳで
一度洗浄し、ＰＢＳ中の２％ヒト血清中において、０℃で１０７細胞／ｍＬで再懸濁した
。細胞（１０６チューブで２回実施）を、氷上で４５分間、１２５−Ｉ標識ＷＴ１ＡＢ１
（１μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、次に、ＰＢＳ内の１％ウシ血清アルブミン
を用いて、０℃で広範囲に洗浄した。特異的結合を決定するために、５０過剰量非標識Ｗ
Ｔ１ＡＢ１存在下で、氷上で２０分間プレインキュベーションした後に、細胞の２つのセ
ットを評価した。結合放射線を、ガンマカウンターによって測定し、特異的結合を決定し
、細胞辺りの結合した抗体の数を、比放射能から計算した。
【０１６８】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣに使用される標的細胞は、ＷＴ１若しくはＲＨＡＡＭ−３ペプチドあり、又は
なしの状態でパルスしたＴ２細胞、及びペプチドでパルスをしなかった腫瘍細胞株である
。ＷＴ１ａｂ１又は様々な濃度におけるそのアイソタイプコントロールヒトＩｇＧ１を、
標的細胞及び新鮮な末梢血単核細胞とともに、異なったエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比
率で１６時間インキュベートした。上清を採取し、それらの操作の後に、細胞傷害性を、
Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｙｔｏｔｏｘ  ９６  ｎｏｎ−ｒａｄｉｏｒｅａｃｔｉｖｅキット
を用いて、ＬＤＨ放出アッセイにより測定した。細胞傷害性をまた、標準４時間５１Ｃｒ
放出アッセイにより測定した。
【０１６９】
ルシフェラーゼ／ＧＦＰ陽性細胞の選択及び導入
ｌｕｃ／ＧＦＰをコードしているプラスミドを含むレンチウイルス（３９）を用いて、
高レベル発現のＧＦＰ−ルシフェラーゼ融合タンパク質を作出した。単細胞クローニング
を使用して、高レベルのＧＦＰの発現を示す細胞のみを、フローサイトメトリー分析によ
り選択し、維持し、動物実験に使用した。
【０１７０】
ヒト白血病異種移植ＮＳＧモデルにおけるＷＴ１ａｂ１の治療試験
ＢＶ１７３ヒト白血病細胞２００万個を、ＮＳＧマウスに静脈内注射した。５日目に、
腫瘍の生着を、処置された全てのマウスにおけるホタルルシフェラーゼイメージングによ
って確認した。次いで、マウスを異なる処置群に無作為に分けた。６日目と１０日目に、
モノクローナル抗体ＷＴ１ａｂ１又はアイソタイプコントロールモノクローナル抗体を静
脈内注射した。モノクローナル抗体あり、又はなしの状態で、ヒトエフェクター細胞を受
けた動物において、細胞（ＣＤ３４及びＣＤ３枯渇健康ドナーヒト末梢血単核細胞）を、
モノクローナル抗体注入の４時間前にマウス（１０７細胞／マウス）に静脈内注射した。
腫瘍の増殖を、一週間に１回から２回発光イメージングにより評価し、臨床活性は毎日評
価した。
【０１７１】
ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体に特異的なｓｃＦｖの選択及び同定
ＷＴ１特異的ｓｃＦＶの選択を、ＷＴ１の１２６〜１３４（配列番号１  ＲＭＦＰＮＡ
ＰＹＬ）のアミノ酸を含む９ｍｅｒのＷＴ１由来のペプチドを用いて達成した。このペプ
チドは、ＷＴ１陽性腫瘍細胞を死滅させる細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するために、
ＨＬＡ−Ａ０２０１により提示され、処理されることが示されている。
【０１７２】
ＷＴ１−ＲＭＦペプチドの６回のワクチン接種後のＡＭＬ患者からの代表的なデータは
、ＷＴ１ペプチドが、ヒトにおいて免疫原性であることを示す証拠として、図２に示され
ている。ＣＤ３Ｔ細胞はＷＴ１ペプチド（アミノ酸１２６−１３４）により刺激され、そ
して、細胞傷害性は、６９７（Ａ０２０１＋ＷＴ１＋）又はＳＫＬＹ−１６（Ａ０２０１
＋ＷＴ１‐）細胞株に対して標準クロム５１放出アッセイを用いて測定された。ＷＴ１−
Ａ又は無関係なペプチドであるＥＷでパルスしたＳＫＬＹ−１６細胞を、死滅の特異性の
ためのポジティブ又はネガティブコントロールとして使用した。エフェクター：標的（Ｅ
：Ｔ）比率はＸ軸上に示されている。データは、ＨＬＡ−Ａ０２０１拘束法において、Ｔ
細胞がＷＴ１＋腫瘍細胞を死滅させたことの証拠となる。
【０１７３】
当業者に公知の十分に確立されたファージディスプレイライブラリー及びスクリーニン
グ方法を、ＷＴ１ペプチド／ＨＬＡ−Ａ２複合体に高度に特異的なｓｃＦｖ断片を選択す
るために使用した。ある実施態様では、ヒトｓｃＦｖ抗体のファージディスプレイライブ
ラリー（７×１０１０クローン）を、モノクローナル抗体クローンの選択のために使用し
た。プラスチックの表面に固定化することによって導入されたＭＨＣ１複合体の立体構造
変化を低減するために、溶液パニング法を、従来のプレートパニングの代わりに用いた。
手短に言うと、まず、ビオチン化抗原を、トｓｃＦｖファージライブラリーと混合し、次
いで、抗原ｓｃＦｖ抗体複合体を、磁気ラックを通してストレプトアビジン結合ダイナビ
ーズＭ−２８０によって、プルダウンした。
【０１７４】
結合させたクローンは、その後溶出し、大腸菌ＸＬ１−ブルーに感染させるために使用
した。細菌中で発現させたｓｃＦｖファージクローンを、精製した（３５，３６）。パニ
ングを、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＷＴ１複合体に特異的に結合させたｓｃＦｖファージクロ
ーンを豊富にするために３−４サイクル行った。陽性のクローンを、ビオチン化された単
鎖ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＷＴ１ペプチド複合体に対する標準的なＥＬＩＳＡ法によって決
定した（図３）。陽性クローンをさらに、ＴＡＰ欠損、ＨＬＡ−Ａ０２０１＋細胞株、Ｔ
２を使用して、フローサイトメトリーによる生細胞表面上のＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合
体への結合について試験した。Ｔ２細胞は、２０μｇ／ｍＬβ２ミクログロブリンの存在
下において、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中のペプチド（５０μｇ／ｍＬ）で、一晩パル
スした。細胞を洗浄し、染色を以下の手順で行った。
【０１７５】
細胞をまず、精製したｓｃＦｖファージクローンで染色し、続いて、マウス抗Ｍ１３モ
ノクローナル抗体で染色し、そして最終的にヤギＦ（ａｂ）２抗マウスＩｇを、ＦＩＴＣ
に結合させた。染色の各ステップを氷上で３０−６０分の間で行い、細胞を、染色の各工
程間で２回洗浄した。結果は図４に示されている。ＷＴ１ａｂ１のファージクローンは、
ＷＴ１−Ａペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ：本明細書中でＲＭＦと略記）でパルスしたＴ
２細胞にのみ結合し、Ｔ２細胞単独やコントロールＥＷ又はヘテロクリティックペプチド
であるＷＴ１−ＡペプチドでパルスしたＴ２細胞には結合しないことが示された。
【０１７６】
ペプチド／Ａ０２０１複合体へのＷＴ１ａｂ１の完全長ＩｇＧの結合親和性を、示され
た濃度のＷＴ１ａｂ１の滴定によりテストした。Ｔ２細胞は、５０μｇ／ｍＬ又は１０μ
ｇ／ｍＬ、続いて二次ヤギＦ（ａｂ）抗ヒトＩｇＧ／ＰＥでパルスした。結果を図５に示
す。
【０１７７】
図６は、ＷＴ１抗体により認識されたペプチド／ＨＬＡ−Ａ０２０１複合体の濃度を示
す。Ｔ２細胞を、ＲＭＦ（上のパネル）又はＲＨＡＭＭ−Ｒ３ペプチド（下のパネル）に
より示された濃度で一晩パルスし、１μｇ／ｍＬ濃度におけるＷＴ１ａｂ１、ＷＴ１ａｂ
３、及びＷＴ１ａｂ５を、フローサイトメトリーによって分析した。
ＷＴＩ／Ａ２に関するファージパニングの概要
【表１１】
2016026209.tif 000013
【０１７８】
陽性のｓｃＦｖクローンを、（ｉ）ＷＴ１ペプチド又は無関係のペプチドでパルスした
ＴＡＰ欠損ＨＬＡ−Ａ０２０１＋Ｔ２細胞；（ｉｉ）ペプチドでパルスしない、ＢＶ１７
３、Ｕ２６６のようなＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ０２０１＋Ｔ２細胞、及びコントロールＷＴＩ
−ＨＬＡ−Ａ０２０１＋細胞株であるＳＫＬＹ−１６、又はＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ０２０１
−細胞株であるＫ５６２の間接的なフローサイトメトリーによって、生細胞表面上のＨＬ
Ａ−Ａ２／ペプチド複合体への結合を試験した。後者は、自然に処理された腫瘍細胞上の
ＷＴ１ｐ／Ａ２複合体へのｓｃＦｖの認識及び結合親和性を決定する。
【０１７９】
合計２８ファージクローンを、ＷＴＩ−Ａペプチド／Ａ２複合体に特異的なモノクロー
ナル抗体を産生する能力についてスクリーニングした。生細胞上のＷＴ１ｐ／Ａ２複合体
の認識を、ＷＴＩ−ＡペプチドでパルスしたＴ２細胞及びその他のＨＬＡ−Ａ２結合ペプ
チド（５０μｇ／ｍＬ）へのファージｓｃＦｖの結合によって測定した。これらは、Ｔ２
細胞単独；ＷＴＩ−ＡペプチドでパルスしたＴ２細胞；ヘテロクリティックペプチドであ
るＷＴ１−Ａ１でパルスしたＴ２細胞；無関係のＥＷペプチド（ユーイング肉腫由来のＨ
ＬＡ−Ａ０２０１に結合する９ｍｅｒのペプチド）又はＲＨＡＭＭ−Ｒ３でパルスしたＴ
２細胞を含む（図４）。
【表１２】
2016026209.tif 000014
【０１８０】
《選択したｓｃＦｖ断片を使用した完全長モノクローナル抗体の作製》
ファージディスプレイ技術により、抗原特異性ｓｃＦｖ及びＦａｂ断片の迅速な選択及
び生産ができるようになり、これ自体が有用であり、又は、完全抗体、抗原結合性タンパ
ク質、又はその抗原結合性断片を提供するためにさらに開発することができる。Ｆｃドメ
インを有する完全モノクローナル抗体は、ｓｃＦｖ及びＦａｂ抗体に比べて多くの利点を
有している。まず、完全長抗体のみがＦｃドメインにより媒介されるＣＤＣ及びＡＤＣＣ
のような免疫学的機能を発揮する。第二に、二価のモノクローナル抗体は、単量体のＦａ
ｂ抗体よりも強い抗原結合親和性を提供する。第三に、血漿内半減期と腎クリアランスは
、Ｆａｂ及び二価のモノクローナル抗体とは異なるものになる。各々の特定の特徴および
利点は、計画したエフェクター戦略に合わせることができる。第四に、二価のモノクロー
ナル抗体を、ｓｃＦｖ及びＦａｂよりも異なった割合で内在化することができ、免疫機能
又は担体機能を変更する。アルファ放射体を、例えば、標的を殺すために内在化する必要
はない。しかし、多くの薬物や毒素は、免疫複合体の内在化の恩恵を受ける。ある実施態
様では、従って、一旦ＷＴ１ｐ／Ａ２に特異的なｓｃＦｖクローンを、ファージディスプ
レイライブラリーから獲得すれば、ｓｃＦｖフラグメントを用いた完全長ＩｇＧモノクロ
ーナル抗体が生産される。
【０１８１】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で組換えヒトモノクローナルＩｇＧ抗体を
生成するために、完全長ＩｇＧモノクローナル抗体を、当業者に公知の方法に基づいて設
計した。(Ｔｏｍｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａ
ｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＦｃｅＲＩａ  ｂ
ｙ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉ
ｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  
Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７３（７）：１４６５−１４６９  ２００９)。簡潔には、抗体可変領
域を、ラムダ又はカッパ軽鎖定常配列、及びＩｇＧ１サブクラスＦｃ（例えば、表９参照
）（３３、３４）で、哺乳動物発現ベクター（図７）内にサブクローニングした。精製し
た完全長ＩｇＧ抗体は、還元及び非還元条件下（図８）の両方において、予測された分子
量を示した。動的結合分析（３５）は、ナノモル範囲のＫＤ（図９、図１０）で、ＷＴ１
／Ａ２に対する完全長ＩｇＧの特異的結合を確認した。
【０１８２】
《実施例１》
完全ヒトファージディスプレイライブラリーを用いたＷＴ１ｐ／Ａ２複合体に特異的な
ｓｃＦｖの選択
ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＷＴ１ペプチド複合体に対するファージディスプレイは、ＨＬＡ
−Ａ０２０１／ＷＴ１ペプチド複合体に特異的に結合したｓｃＦｖファージクローンを豊
富にするために３−４パニングラウンドを行った。ＷＴ１ペプチド／Ａ２複合体に陽性の
個々のｓｃＦｖファージクローンは、ＥＬＩＳＡ及びさらなる特徴づけの対象となる独特
のＤＮＡをコードする配列を有するクローンにより決定された。ｓｃＦｖが生細胞上のＷ
Ｔ１ｐ／Ａ２複合体に結合するかどうかをテストするために、陽性のファージクローンは
、ＴＡＰ欠損株であり、ＨＬＡ−Ａ０２０１陽性細胞株であるＴ２への結合について試験
した。Ｔ２細胞は、外来性ペプチドを提示することができ、それゆえにＨＬＡ−Ａ２分子
によって提示される特定のエピトープを検出するために広く使用されている。合計３５個
のファージクローンは、Ｔ２細胞上でスクリーニングされ、１５個のクローンは、ＷＴ１
−ＲＭＦペプチドのみでパルスしたＴ２細胞への特異的結合を示し、Ｔ２細胞単独又はコ
ントロールのＲＨＡＭＭ‐３ペプチド（図４）でパルスしたものに対しては特異的結合を
示さなかった。ｓｃＦｖのファージクローンは、完全長二価モノクローナル抗体に比べ、
ｓｃＦｖの親和性が弱いことを示唆するＷＴ１−及びＨＬＡ−Ａ２陽性のいくつかの腫瘍
細胞株に結合することができなかった。
【０１８３】
《実施例２》
完全長ヒトＩｇＧ１の生成
ＣＤＣやＡＤＣＣのような免疫機能は二価ＩｇＧのＦｃドメインに依存する。また、二
価モノクローナル抗体は、単量体ｓｃＦｖ抗体よりも強力な抗原結合親和性を提供する。
したがって、ＨＥＫ２９３及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、１
５個の陽性のファージクローンのうち、６個のｓｃＦｖファージクローンを、全長ヒトＩ
ｇＧ１のモノクローナルを生成するように選択した。簡潔に言うと、モノクローナル抗体
の可変領域を、ヒトλ若しくはκ軽鎖定常領域、及びヒトＩｇＧ１定常領域配列が一致す
る哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。精製した完全長ＩｇＧ抗体は、還元及
び非還元条件下（図８）の両方において、予測された分子量を示した。５個のクローンを
首尾よくヒトＩｇＧ１に設計した。
《実施例３》
ＩｇＧ１モノクローナル抗体の特異性及び結合親和性
ヒト細胞株への結合
初めに、ＲＭＦ又はＲＨＡＭＭ−Ｒ３ペプチドあり、又はなしの状態で、パルスしたＴ
２細胞を、モノクローナル抗体の結合特異性を決定するために使用した。ＷＴ１ａｂ１を
含む５個のヒトＩｇＧ１のうち３個では、ＷＴ１ペプチドのみでパルスしたＴ２細胞に対
して特異的な結合を示し、Ｔ２単独又はコントロールペプチドＲＨＡＭＭ−Ｒ３でパルス
したＴ２に対しては、特異的な結合を示さなかった。モノクローナル抗体の結合親和性は
、それらの親のｓｃＦｖファージクローンに比べて、実質的に強化された（５０〜１００
倍）。結合は、ＲＭＦペプチドで細胞をパルスすることによって大幅に強化されたが、５
個のうち２個のモノクローナル抗体は、Ｔ２細胞単独又はコントロールペプチドＲＨＡＭ
Ｍ−Ｒ３でパルスしたものへの結合を示した。これは、これらの２個のモノクローナル抗
体が、単独でもＨＬＡ−Ａ２分子上のエピトープに対する高い親和性を有していたことを
示唆しており、それゆえに、さらなる調査から除外された。それは複合体中のＭＨＣクラ
スＩ分子のエピトープの優位性を考えると、ペプチド／ＭＨＣ複合体に対して、このよう
なモノクローナル抗体を製造するための共通の問題となっているので、これは予想外では
なかった。また、複合体のモノクローナル抗体の正確な特異性は、二価ＩｇＧ１モノクロ
ーナル抗体に比べて低い親和性のために、ｓｃＦｖの段階で容易に決定されることがない
可能性を示唆している。
【０１８４】
まず、ＷＴ１ｐ／Ａ２複合体に特異的な３個の残りのモノクローナル抗体の結合親和性
を、モノクローナル抗体の滴定により、ＲＭＦあり、又はなしの状態及びコントロールＲ
ＨＡＭＭ−Ｒ３ペプチド（５０μｇ／ｍＬ）でパルスしたＴ２細胞上で、調査した。０．
０１μｇ／ｍＬ濃度に至るまでは、モノクローナル抗体ＷＴ１ａｂ１が、最も強い結合を
示した。アイソタイプコントロールヒトＩｇＧ１は、試験されたいずれの濃度においても
、結合を示さなかった（図５）。ＷＴ１ａｂ１に加えて、２つの他のモノクローナル抗体
ＷＴ１ａｂ３及びＷＴ１ａｂ５は、＜１μｇ／ｍＬの使用されたモノクローナル抗体濃度
の範囲で特異的結合を示した。モノクローナル抗体の特異的認識はまた、細胞表面上の抗
原濃度に依存していた。Ｔ２細胞はＲＭＦ又はＲ３ペプチドで、５０、２５、１２．５、
６．２５、３．１３及び１．６μｇ／ｍＬでパルスされ、Ｔ２結合アッセイのために、テ
ストのモノクローナル抗体を、１μｇ／ｍＬで使用した。ＷＴ１ａｂ１は、他の２つのモ
ノクローナル抗体（図６）よりも有意に高い蛍光強度があり、１．６μｇ／ｍＬのような
低濃度でも、濃度依存的にＴ２細胞上でＲＭＦペプチド／Ａ２複合体を検出することがで
きた。これらの結果は、ＷＴ１ａｂ１がＲＭＦｐ／Ａ０２０１複合体に最も高い親和力を
有していることをさらに確認した。
【０１８５】
《実施例４》
エピトープマッピング
より正確にＷＴ１ａｂ１認識のためのエピトープを調査するために、ＲＭＦペプチドの
１、３、４、５、６、７及び８位をアラニンで置換し、Ｔ２細胞上でパルスし、ＷＴ１ａ
ｂ１の結合について試験した。ＲＭＦの２位および９位は、これらはＨＬＡ−Ａ０２０１
分子に結合するペプチドのアンカー残基として、そのまま残された。１位を除いて、他の
位置でのアラニン置換は、ネイティブのＲＭＦペプチド（図１９）と比較して、ＷＴ１ａ
ｂ１結合に大きく影響しなかった。しかしながら、アラニン（ＷＴ１−Ａ１−Ｂ）又はチ
ロシン（ＷＴ１−Ａ１）のどちらかによる１位の置換は、ＷＴ１ａｂ１の結合を完全に排
除した。両ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２分子、クローンＢＢ７（図２０）に特異的なモノク
ローナル抗体を使用してＴ２安定化アッセイにおける最も強い結合を示したように、結合
の喪失は、ＨＬＡ−Ａ２分子へのペプチド結合親和性の減少によるものではなかった。こ
れらの結果は、ＲＭＦペプチドの１位のアルギニンは、ＷＴ１ａｂ１認識のための最も重
要なものの一つであることを示している。位置における残基の役割は＃２と９については
、評価することができなかった。
【０１８６】
次の重要な問題は、ＷＴ１ａｂ１が細胞表面上のＨＬＡ−Ａ０２０１分子によって提示
され、自然に処理されたＷＴ１エピトープＲＭＦを認識できたかどうかであった。細胞株
のパネルは、ＷＴ１ｍＲＮＡ及びＨＬＡ遺伝子型（表１３）の発現に基づいて選択された
。
【表１３】
2016026209.tif 000015
【０１８７】
ＷＴ１−ｍＲＮＡ発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、前の研究（Ｒｅｎａ）
に従って推定した。
【０１８８】
ＨＬＡ−Ａ０２０１とＷＴ１ｍＲＮＡの両方に陽性である７個のヒト中皮腫細胞株のう
ち、ＷＴ１ａｂ１は、７細胞株のうち６個に結合したが、メラノーマ細胞株であるＭｅｗ
ｏのようなＨＬＡ−Ａ０２０１陰性（ＭＳＴＯ及びＶＡＭＴ）又はＷＴ１−ｍＲＮＡ陰性
のいずれかであった細胞には結合しなかった（図２１）。
【０１８９】
同様に、試験した９白血病細胞株のうち、ＷＴ１ａｂ１は、ＷＴ１−ｍＲＮＡ及びＨＬ
Ａ−Ａ０２０１の両方に対して陽性であるＢＶ１７３（図２２）、ＢＡ２５、及びＡＬＬ
−３の３細胞株に結合したが、多くの研究においてＷＴ１転写物を高レベルに発現するこ
とが示されているＨＬＡ−Ａ２陰性細胞株であるＨＬ６０及びＫ５６２には結合しなかっ
た。
【０１９０】
予想されたように、ＷＴ１ＡＢ１の結合の強さも、中皮腫細胞Ｈ２３７３、白血病細胞
株６９７とＬＡＭＡ、及び骨髄腫細胞株Ｕ２６６に示すように、直接ＨＬＡ−Ａ０２０１
分子の発現レベルと関連付けられているように思われた。これらの細胞株は、ＷＴ１転写
物及びＨＬＡ−Ａ２の両方に陽性であり、ＨＬＡ−Ａ２の発現レベルは低く（表１３）、
モノクローナル抗体は結合を示さなかった。一方、Ｔ２細胞を用いて得られた結果は、Ｈ
ＬＡ−Ａ２分子を高レベルで発現させたＴ２細胞として単独でＨＬＡ−Ａ０２０１へ結合
する、ＷＴ１ａｂ１の可能性に反論する。特に、ＷＴ１ａｂ１は単独では、又はＲ３及び
Ｅｗｉｎｇ肉腫由来のような他のＨＬＡ−Ａ０２０１結合ペプチド、又はＲＭＦペプチド
のヘテロクリティックペプチドであるＷＴ１−Ａ１でパルスしても、Ｔ２細胞に結合しな
い。これら２種のペプチドは、Ｔ２安定化アッセイ（２８）において、ＨＬＡ−Ａ０２０
１分子に対する高い親和性が示されている。これらの結果は、ＷＴ１ａｂ１認識が、複合
体においてＲＭＦペプチドとＡ０２０１分子の共同で構成されるエピトープに特異的であ
ったという強い証拠を提供した。ＷＴ１ａｂ３及びＷＴ１ａｂ５の２つの他のモノクロー
ナル抗体の、ＢＶ１７３及びＪＭＮ細胞に対する結合もまた、ＷＴ１ａｂ１より弱かった。
【０１９１】
《実施例５》
細胞上のＷＴ１ａｂ１結合部位の定量化
１２５Ｉ標識ＷＴ１ａｂ１を用いた放射免疫測定を、抗体のＷＴ１＋ＨＬＡ−Ａ０２０
１＋細胞株に対する特異性を確認するため、親和定数を決定するため、かつ細胞株のパネ
ル上の細胞当たりの抗体結合部位の数を評価するために、用いた。ＪＭＮ細胞への結合に
基づくスキャッチャード分析は、約０．２ｎＭの親和定数を示した（図２３）。この数値
は、Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ装置を用いて、干渉分光法により確認した。１２５Ｉ標識ＷＴ１
ａｂ１を、抗体のＷＴ１＋  ＨＬＡ−Ａ０２０１＋細胞株に対する特異性を確認するため
、及び細胞株のパネル上の抗体結合部位の数を評価するために用いた（図２４）。二価の
モノクローナル抗体が表面上の１又は２の複合体に結合しているかどうかを、我々は判断
できないため、細胞当たりのエピトープの合計は、モノクローナル抗体結合部位の数の二
倍になることがある。再度、ＷＴ１ａｂ１は、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＷＴ１ｍＲＮＡの
両方に陽性である、ＪＭＮ、ＡＬＬ−３、ＢＡ２５、ＢＶ１７３に結合したが、ＨＬＡ−
Ａ０２０１陰性（ＨＬ６０）又はＷＴ１ｍＲＮＡ陰性（ＳＫＬＹ−１６）には結合しなか
った。ＷＴ１ａｂ１は、ＨＬＡ−Ａ０２０１及びＷＴ１の両方に陽性の６９７細胞には結
合しなったが、低レベルのＨＬＡ−Ａ０２０１（表１３）を含んでおり、あるレベルのＭ
ＨＣ複合体の総数が、ＷＴ１ａｂ１結合のための十分なＷＴ１ペプチドが存在するために
必要であると確認した。ＲＭＦでパルスしたＴ２は最も多い数のモノクローナル抗体と結
合し（５００００／細胞）、次いで、細胞辺り〜６×１０３ＷＴ１ａｂ１分子と結合した
ＪＭＮ細胞であり、これは、それぞれが一価又は二価抗体結合だと想定して、１細胞辺り
、６×１０３及び１．２×１０４ＲＭＦペプチド／Ａ２複合体を翻訳したこととなる。３
個の白血病陽性細胞株は、１×１０３及び２×１０３ＷＴ１ａｂ１分子、又は２×１０３
及び４×１０３の結合部位と結合した（図２４）。これらの結果を、定量的フローサイト
メトリーによって確認した。
【０１９２】
《実施例６》
白血病患者サンプルに対するＷＴ１ａｂ１の結合
私たちは次に、一次性ＡＭＬ細胞上のＲＭＦエピトープをＷＴ１ａｂ１分子が探知するこ
とができるかどうかを調査した。放射免疫測定は、ＨＬＡ−Ａ２陽性及びＷＴ１−ｍＲＮ
Ａ＋である患者１のＡＭＬ芽球に対する、ＷＴ１ＡＢ１の有意な結合を示した。ＷＴ１ａ
ｂ１は、細胞集団全体の８３％以上の割合を占めるＣＤ３３＋及びＣＤ３４＋二重陽性細
胞に結合した（図２５）。ＷＴ１ａｂ１は、ＨＬＡ−Ａ２陽性だがｍＲＮＡ陰性、又はＨ
ＬＡ−Ａ２陰性のいずれかである他の３人の細胞には結合しなかった。ＷＴ１ａｂ１は、
ＨＬＡ−Ａ２陽性又はＨＬＡ−Ａ２陰性のいずれかである健康なドナーからの末梢血単核
細胞には結合しなかった。結果をフローサイトメトリー分析によって確認した。ＷＴ１Ａ
Ｂ１はＡ０２０１陰性の患者からの芽球に有意な結合を示さなかった。結果は、細胞のｍ
ＲＮＡ発現で得られた結果と一致した。これらのデータにより、白血病細胞の表面上のＲ
ＭＦｐ／ＨＬＡ−Ａ０２０１のレベルは、ＷＴ１ａｂ１の反応性のために十分であり、Ｗ
Ｔ１陰性健康細胞のレベルが重要ではないことを確認した。
【０１９３】
《実施例７》
ＷＴ１ＡＢ１は、腫瘍細胞に対するＡＤＣＣを媒介する
ＡＤＣＣは、ヒトにおける治療用モノクローナル抗体の主要なエフェクター機構の一つ
であると考えられている。ヒト末梢血単核細胞の存在下で、ＷＴ１ａｂ１は、ＲＭＦペプ
チドをロードしたＴ２細胞に対する、用量依存的な末梢血単核細胞のＡＤＣＣを媒介した
が、Ｔ２細胞単独又はコントロールＲ３ペプチドでパルスしたＴ２細胞に対しては媒介し
なかった（図２７）。重要なのは、ＷＴ１ａｂ１は、中皮腫細胞株、ＪＭＮ（図３３）、
及び白血病細胞株ＢＶ１７３（図３４）のような腫瘍細胞上のＨＬＡ−Ａ０２０１によっ
て自然に提示されるＲＭＦエピトープに対するＡＤＣＣを媒介したが、ＨＬＡ−Ａ２陰性
細胞であるＭＳＴＯ（図２８）又はＨＬ−６０（図２９）に対しては媒介しなかった。死
滅を、複数の健康なドナーからのエフェクター細胞として末梢血単核細胞を用いたＷＴ１
ａｂ１の１μｇ／ｍＬ又はそれより低い濃度で、一貫して観察した。重要なことに、ＷＴ
１ａｂ１も、ＷＴ１ａｂ１結合に陽性である一次性Ａ０２０１陽性ＡＭＬ芽球を死滅させ
たが、ＨＬＡ−Ａ０２０１陰性の芽球を死滅させなかった（図３０）。これらの結果は、
ＷＴ１ａｂ１が、細胞株上と同様に生理学的なレベルで、ＲＭＦ及びＨＬＡ−Ａ２０１複
合体を自然に発現した細胞に対する特異的なＡＤＣＣを媒介することを実証した。
【０１９４】
《実施例８》
ＷＴ１ＡＢ１は、ＮＳＧマウスにおけるヒト白血病細胞を排除する
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＷＴ１ａｂ１の有効性を、ＢＶ１７３−ｂｃｒ／ａｂｌ陽性急性リ
ンパ性白血病で６日以前に静脈内に異種移植されたＮＯＤ−ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マ
ウスで試験した。治療の際に、マウスはその肝臓、脾臓、及び骨髄（ＢＭ）において、ル
シフェラーゼイメージングにより認識できる白血病を有していた。ＮＳＧマウスは、成熟
したＢ−、Ｔ−、及びＮＫ細胞を欠いており、そして、我々は、ＷＴ１ａｂ１治療ととも
に、人間のエフェクター細胞（ＣＤ３−、ＣＤ３４−、末梢血単核細胞）を導入すると、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察されたＡＤＣＣによって媒介された抗腫瘍効果が、生体内におい
ても再現されるという仮説を立てた。ＷＴ１ａｂ１の２回の１００μｇ用量とともにされ
たエフェクターの注入は、コントロールに比べて、腫瘍の増殖を、ほぼ除去した（図３１
）。この効果は、実験の間持続した（図３２）。興味深いことに、実験の初期に、エフェ
クター細胞単独又はコントロールＩｇＧと結合したエフェクター細胞は、白血病を単独で
注入したマウスに対する白血病の迅速な成長をさらに促進するように見え、これは、抗腫
瘍効果は、それ自体でエフェクターとは無関係であったことを実証している。エフェクタ
ーを与えられたマウスのいくつかは（モノクローナル抗体あり又はなしで）、ＢＶ１７３
の広範囲に及ぶ浸潤を伴い、実験の早い段階で死亡した。
【０１９５】
驚くべきことに、ヒトエフェクターなしのＷＴ１ａｂ１治療もまた、エフェクターと結
合されたＷＴ１ａｂ１同様に、約３０日の間、劇的に全身腫瘍組織量を減少させるが（図
３２）、エフェクターと結合したＷＴ１ａｂ１と比べた場合には、ＷＴ１ａｂ１単独グル
ープにおいては、腫瘍は結局、はるかに早く再発する（図３２）。我々は、ＷＴ１ａｂ１
単独での効果を確認し、有効性を評価するために用量を漸増させた。ＷＴ１ａｂ１単独で
は、試験したすべての用量（２５−１００μｇの用量を２回投与）の早期の時点で、全身
腫瘍組織量の顕著な減少が生じた。全ての治療群の腫瘍は、抗体治療が停止した後ゆっく
りと再発し、２３日目（最後の抗体注入後１３日）までに、２５μｇ群では１００μｇ群
と比較して有意に多い再発した腫瘍が観察された。これは、ＷＴ１ａｂ１治療の用量反応
を示している（図３３）。治療の前に、肝臓に最も大きい腫瘍組織量を示したマウスは、
ＷＴ１ａｂ１により直ちに除去された。再発中は、最も多い用量を投与した群の腫瘍は主
に骨髄で発生し、一方、最も少ない用量を投与したマウスは、直ちに肝臓に腫瘍が再発し
た。
【０１９６】
《実施例９》
細胞傷害性能力を強めた抗体の作製
ヒトＩｇＧ１−Ｆｃで述べたように（４３、４４）、二重特異性抗体を、免疫Ｔ細胞の
ＷＴ１／Ａ２複合体及びＣＤ３の両方を認識するように設計した。二重特異性抗体は、Ｆ
ｃエフェクター機能及びｉｎ  ｖｉｖｏにおける長半減期を維持する一方で、ＷＴ１／Ａ
２陽性腫瘍細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞を回復させ、そして標的とすると予想されてい
る。ｉ）活性化Ｔ細胞による死滅、ｉｉ）ＡＤＣＣ活性、ｉｉｉ）ＣＤＣ活性、の３つの
メカニズムが、二重特異性抗体によって媒介される腫瘍細胞の特異的死滅に関与している
。二重特異性抗体の他の形式は、タンデム型のｓｃＦｖ分子（ｔａＦｖ）、ダイアボディ
ー（Ｄｂ）、又は単鎖ダイアボディー（ｓｃＤｂ）のように、そしてヒト血清アルブミン
との融合タンパク質のように設計されることができるが（４５、４６、４７、４８）、は
っきりとした薬物動態の特徴のＦｃエフェクター機能を欠く。
【０１９７】
ＷＴ１／Ａ２標的特異的ＡＤＣＣ活性は、米国特許第８，０２５，８７９号、第８，０
８０，４１５号、及び第８，０８４，０２２号に記載されているように、グリコールで操
作されたＣＨＯ細胞において、組換え抗体を発現させることによって強められる。Ａｓｎ
２９７上のＮ−グリカン修正オリゴ糖は、次のようにエフェクター機能を変化させる、す
なわち、１）ヒトナチュラルキラー細胞によって媒介される改良されたＡＤＣＣ活性のた
めのＣＤ１６／ＦｃＲＩＩＩａへの、より高い結合親和性、２）マクロファージ及びＤＣ
細胞によって提示される抗原及び好中菌のようなエフェクターセルによって媒介される改
良されたＡＤＣＣ活性のための（５０、５１、５２）、多くのタイプの免疫細胞（ＮＫ細
胞を除く）で発現している抑制性受容体であるＣＤ３２ｂ／ＦｃＲＩＩｂとの低下した結
合親和性、である。強化した抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍治療のための優れた効果を
達成することが期待される。
【０１９８】
ＩｇＧのＦｃのグリコシル化（とりわけフコシル化）変異体は、米国特許第８，０２５
，８７９号、第８，０８０，４１５号、及び第８，０８４，０２２号に記載の宿主発現細
胞及び方法を用いて製造することができ、その記載内容は参照として取り込まれる。簡単
に述べると、本明細書に開示された抗体の重鎖又は軽鎖をコードするメッセンジャーＲＮ
Ａ（ｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ単離精製及び任意のサイズに基づく分離の標準的な技術を用い
ることによって得られる。重鎖又は軽鎖をコードするｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡは、次
いで、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ファージライブラリーの構築及び特異的関連プライ
マーを使用したスクリーニング又はＲＴ−ＰＣＲのような、当該技術分野において公知の
技術を用いて作製され、単離される。いくつかの実施態様ではｃＤＮＡ配列は、特定の所
望のｃＤＮＡを生成するために、公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏのＤＮＡ操作技術を使用して、
完全に又は部分的に製造されるものであってもよい。ｃＤＮＡ配列は、次いで、遺伝子及
び低フコース変性宿主細胞と互換性を持つリーディングフレーム内にあるプロモーターを
含むベクターに配置されることができる。
【０１９９】
適当なプロモーター、制御配列、リボソーム結合部位、及び転写終結部位を含んでいる
多数のプラスミド及び任意の便利なマーカーは、当技術分野で公知であり、これらは米国
特許４，６６３，２８３号及び米国特許４，４５６，７４８号に記載のベクターを含むが
、これらに限定されない。ある実施態様において、軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡ及
び重鎖をコードするｃＤＮＡは、別々の発現プラスミドに挿入されることができる。別の
実施態様においては、軽鎖をコードするｃＤＮＡ及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、それ
ぞれが適切なプロモーター及び翻訳調節下にあるようであれば、同じプラスミドに一緒に
挿入することができる。結果を図３４に示す。
《参照文献》
１  MundlosS, et al. Nuclear localization of the protein encoded by the Wilms’
tumorgene WT1 in embryonic and adult tissues. Development 1993;119: 1329-41.
２  KeilholzU, et al. Wilms’ tumor gene 1 (WT1) in human neoplasia. Leukemia 2
005; 19:1318-1323.
３  InoueK, et al. WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the dete
ction ofminimal residual disease in acute leukemia. Blood 1994; 84 (9): 3071-30
79.
４  OgawaH, et al. The usefulness of monitoring WT1 gene transcripts for the pr
ediction andmanagement of relapse following allogeneic stem cell transplantatio
n in acute typeleukemia. Blood 2003; 101 (5): 1698- 1704.
５  YarnagarniT, et al. Growth Inhibition of Human Leukemic Cells by WT1(Wilms 
Tumor Gene)Antisense Oligodeoxynucleotides: Implications for the Involvement of
WT1 inLeukemogenesis. Blood 1996; 87: 2878- 2884.
６  BellantuonoI, et al. Two distinct HLA-A0201-presented epitopes of th Wilms 
tumor antigen 1can function as targets for leukemia-reactive CTL. Blood 2002; 1
00 (10):3835-3837.
７  GaigerA, et al. WT1- specific serum antibodies in patients with leukemia. C
lin. CancerRes. 2001; 7 (suppl 3): 761-765.
８  Oka Y,et al. WT1 peptide cancer vaccine for patients with hematopoietic mal
ignancies andsolid cancers. The Scientific World Journal 2007; 7: 649-665.
９  KobayashiH, et al. Defining MHC class II T helper epitopes from WT1 antigen
. CancerImmunol.Immunother. 2006; 55 (7): 850-860.
１０  Pinilla-IbarzJ, et al. Improved human T-cell responses against synthetic 
HLA-A0201analog peptides derived from the WT1 oncoprotein. Leukemia 2006; 20 (1
1): 2025-2033.
１１  MayRJ, et al. Peptide epitopes from the Wilms tumor 1 oncoprotein stimula
te CD4+ andCD8+ T cells that recognize and kill human malignant mesothelioma tu
mor cells. ClinCancer Res. 2007; 13:4547-4555.
１２  KeiholzU, et al. A clinical and immunologic phase 2 trial of Wils tumor g
ene product(WT1) peptide vaccination in patients with AML and MDS. Blood 2009; 
113: 6541-6548.
１３  RezwaniK, et al. Leukemia-associated antigen-specific T-cell responses fo
llowingcombined PR1 and WT1 peptide vaccination in patients with myeloid malign
ancies. Blood2008; 111 (1): 236-242.
１４  MaslakP, et al.. Vaccination with synthetic analog peptides derived from 
WT1 oncoproteininduces T cell responses in patients with complete remission fro
m acute myeloidleukemia. Blood 2010; Accpt Minor rev.
１５  KrugLM, et al. WT1 peptide vaccinations induce CD4 and CD8 T cell immune 
responses inpatients with mesothelioma and non-small cell lung cancer. Cancer I
mmunolImmunother 2010; in revision.
１６  MorrisE, et al. Generation of tumor-specific T-cell therapies. Blood Revi
ews 2006; 20:61-69.
１７  HoughtonAN et al. Monoclonal antibody therapies- a “constant” threat to
cancer.Nat Med 2000; 6:373- 374.
１８  MiedererM, et al. Realizing the potential of the Actinium-225 radionuclid
e generator intargeted alpha particle therapy applications. Adv Drug Deliv Rev 
2008; 60 (12):1371-1382.
１９  Noy R,T-cell-receptor-like antibodies: novel reagents for clinical cancer
immunologyand immunotherapy. Expert Rev Anticancer Ther 2005: 5 (3): 523-536.
２０  ChamesP, et al. Direct selection of a human antibody fragment directed ag
ainst the tumorT-cell epitope HLA-A1-MAGE-A1 from a nonimmunized phage-Fab libr
ary. Proc NaltAcad Sci USA 2000; 97: 7969-7974.
２１  HeldG, et al. Dissecting cytotoxic T cell responses towards the NY-ESO-1 
protein bypeptide/MHC- specific antibody fragments. Eur J Immunol. 2004: 34:291
9-2929.
２２  Lev A,et al. Isolation and characterization of human recombinant antibodi
es endowed withthe antigen- specific, major histocompatibility complex-restrict
ed specificityof T cells directed toward the widely expressed tumor T cell-epit
opes of thetelomerase catalytic subunit. Cancer Res 2002; 62: 3184-3194.
２３  KlechevskyE, et al. Antitumor activity of immunotoxins with T-cell recept
or-likespecificity against human melanoma xenografts. Cancer Res 2008; 68 (15):
6360-6367.
２４  AzinovicI, et al. Survival benefit associated with human anti-mouse antib
ody (HAMA) inpatients with B-cell malignancies. Cancer Immunol Immunother 2006;
55(12):1451-8.
２５  TjandraJJ, et al. Development of human anti-murine antibody (HAMA) respon
se in patients.Immunol Cell Biol 1990; 68(6):367-76.
２６  RiechmannL, et al. Reshaping human antibodies for therapy. Nature 1988; 3
32 (6162):332:323.
２７  QueenC, et al. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 recep
tor. Proc NatlAcad Sci USA 1989; 86 (24): 10029-33.
２８  GerdR, et al. Serological Analysis of Human Anti-Human Antibody Responses
in ColonCancer Patients Treated with Repeated Doses of Humanized Monoclonal An
tibody A33.Cancer Res 2001; 61, 6851- 6859.
２９  CheeverMA, et al. The prioritization of cancer antigens: A national Cance
r Institutepilot project for the acceleration of translational research. Clin C
ancer Res 2009;15 (17): 5323-5337.
３０  DrakosE, et al. Differentiual expression of WT1 gene product in non-Hodgk
in lymphomas.Appl Immunohistochem Mol Morphol 2005; 13 (2): 132-137.
３１  AsemissenAM, et al. Identification of a highly immunogenic HLA-A*01-bindi
ng T cellepitope of WT1. Clin Cancer Res 2006; 12 (24):7476-7482.
３２  TomimatsuK, et al. Production of human monoclonal antibodies against FceR
Ia by a methodcombining in vitro immunization with phage display. Biosci Biotec
hnol Biochem2009; 73 (7): 1465-1469.
３３  LidijaP, et al. An integrated vector system for the eukaryotic expression
ofantibodies or their fragments after selection from phage display libraries. 
Gene 1997;187(1): 9-18.
３４  LisaJH, et al. Crystallographic structure of an intact IgG1 monoclonal an
tibody. Journal of Molecular Biology 1998; 275 (5): 861-872.
３５  YasminaNA, et al. Probing the binding mechanism and affinity of tanezumab
, a recombinanthumanized anti-NGF monoclonal antibody, using a repertoire of bi
osensors. ProteinScience 2008; 17(8): 1326-1335.
３６  RobertsWK, et al. Vaccination with CD20 peptides induces a biologically a
ctive, specificimmune response in mice. Blood 2002: 99 (10): 3748-3755.
３７  CaronPC, Class K, Laird W, Co MS, Queen C, Scheinberg DA.  Engineered hum
anized dimericforms of IgG are more effective antibodies.  J Exp Med 176:1191-1
195. 1992.
３８  McDevittM, et al. Tumor targeting with antibody-functionalized, radiolabe
led carbonnanotubes. J. Nuclear Med 2207; 48 (7))1180-1189.
３９  XueSA, et al. Development of a Wilms’ tumor-specific T-cell receptor for
clinicaltrials: engineered patient’s T cells can eliminate autologous leukemi
a blasts inNOD/SCID mice. Haematologica 2010; 95 (1): 126-134.
４０  McDevittMR, et al. Tumor therapy with targeted atomic nanogenerators. Sci
ence 2001; 294(5546): 1537-1540.
４１  BorchardtPE, et al. Targeted Actinium-225 in vivo generators for therapy 
of ovariancancer. Cancer Res 2003; 63: 5084-5090.
４２  SinghJaggi J, et al. Selective alpha-particle mediated depletion of tumor
vasculaturewith vascular normalization. Plos One 2007; 2 (3): e267.
４３  Yan W,et al. Enhancing antibody Fc heterodimer formation through electros
tatic steeringeffects. J. Biol. Chem. 2010; 285: 19637-19646.
４４  RossiEA, et al. Stably tethered multi-functional structures of defined co
mposition madeby the dock and lock method for use in cancer targeting. Proc Nat
l Aca Sci USA2006; 103:6841-6.
４５  RyutaroA, et al. Cytotoxic enhancement of a bispecific diabody by format 
conversion totandem single-chain variable fragment (taFv). J Biol Chem 2011; 28
6: 1812-1818.
４６  AnjaL, et al. A recombinant bispecific single-chain antibody, CD19 × CD3
, induces rapidand high lymphoma-directed cytotoxicity by unstimulated T lympho
cytes. Blood2000; 95(6): 2098-2103.
４７  WeinerGJ, et al. The role of T cell activation in anti-CD3 x antitumor bi
specificantibody therapy. J. Immunology 1994; 152(5): 2385-2392.
４８  DafneM, et al. Improved pharmacokinetics of recombinant bispecific antibo
dy molecules byfusion to human serum albumin. J Biol Chem 2007; 282: 12650-1266
0.
４９  Liu C,et al. Modified host cells and uses thereof, PCT/US2010/0081195.
５０  FranciscoJ, et al. Neutrophils Contribute to the Biological Antitumor Act
ivity ofRituximab in a Non-Hodgkin’s Lymphoma Severe Combined Immunodeficiency
MouseModel. Clin Cancer Res 2003; 9: 5866.
５１  KavitaM, et al. Selective blockade of inhibitory Fc receptor enables huma
n dendriticcell maturation with IL-12p70 production and immunity to antibody-co
ated tumorcells. Proc natl Aca Sci USA 2005; 102(8): 2910-2915.
５２  RaphaelA, et al. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity agai
nst tumortargets. Nature Medicine 2000; 6:443-446.
５３  MilenicED. Monoclonal antibody-based therapy strategies: providing option
s for thecancer patient. Curr Pharm Des. 2002; 8: 1794-1764.
５４  Grillo-LopezAJ. Anti-CD20 mAbs: modifying therapeutic strategies and outc
omes in thetreatment of lymphoma patients. Expert Rev Anticancer Ther. 2002: 2 
(3): 323-329.
５５  JonesKL & Buzdar AU. Evolving novel anti-Her2 strategies. Lancet Oncol. 2
009: 10 (12):1179-1187.
５６  ReddyMM, Deshpande A & Sattler M. targeting JAK2 in the therapy of myelop
roliferativeneoplasms. Exper Opin Ther targets 2012: 3: 313-324.
５７  TakeuchiK & Ito F. Receptor tyrosine kinases and targeted cancer therapeu
tics. BiolPharm Bull. 2011; 34 (12) 1774-1780.
５８  RoychowdhuryS & Talpaz M. Managing resistance in chronic myeloid leukemia
. Blood Rev.2011; (6): 279- 290.
５９  KonnigR. Interactions between MHC molecules and co-receptors of the TCR. 
Curr OpinImmunol  2002: 14 (1) 75-83.
６０  SergeevaA, Alatrash G, He H, Ruisaard K, Lu S, Wygant J, McIntyre BW, Ma 
Q, Li D, StJohn L, Clise-Dwyer K & Molldrem JJ. An anti-PR1/HLA-A2 T-cell recep
tor-likeantibody mediated complement-dependent cytotoxicity against acute myelo
id leukemiaprogenitor cells. Blood2011; 117 (16): 4262-4272).
６１  TakigawaN, Kiura K & Kishimoto T. Medical Treatment of Mesothelioma: Anyt
hing New? CurrOncol Rep 2011; DOI 10.1007/s11912-011-0172-1.
６２  RajaS, Murthy SC & Mason DP. Malignant  Pleural Mesothelioma. Curr Oncol 
Rep 2011; DOI10. 1007/s11912-0177-9.
６３  GerberJM, Qin L, Kowalski J, Smith D, Griffin CA, Vala MS, Collector MI, 
Perkins B,Zahurak M, Matsui W, Gocke CD, Sharkis S, Levitsky H & Jones RJ. Char
acterization ofchronic myeloid leukemia stem cells. 2011; Am J Hematol. 86: 31-
37.
６４  RezwaniK, Yong AS, Savani BN, Mielke S, Keyvanfar K, Gostick E, Price DA,
Douek DC& Barrett AJ. Graft-versus-leukemia effects associated with detectable
Wilmstumor-1 specific T lymphocytes after allogeneic stem-cell transplantation
for acutelymphoblastic leukemia. Blood 2007: 110 (6): 1924-1932.
６５  PersicL, Roberts A, Wilton J et al. An integrated vector system for the e
ukaryoticexpression of  antibodies or their fragments  after selection frompha
ge displaylibraries. Gene 1997; 187(1): 9-18.
６６  ChengL, Xiang JY, Yan S et al. Modified host cells and uses thereof. PCT/
US2010/0081195.
６７  LindmoT, Boven E, Cuttitta F, Fedorko J & Bunn PA Jr. Determination of th
e    immunoreactive fraction of radiolabeled monoclonal antibodies by linear ex
trapolation tobinding at infinite antigen excess. J Immunol Methods. 1984; 72 (
1): 77-89.
６８  FengM, Zhang JL, Anver M, Hassan R & Ho M. In vivoimaging of human malign
antmesothelioma growth orthotopically in the peritoneal cavity of nude mice. J 
Cancer 2011; 2:123-131.
【図１】
2016026209.tif 000016
【図２】
2016026209.tif 000017
【図３】
2016026209.tif 000018
【図４】
2016026209.tif 000019
【図５】
2016026209.tif 000020
【図６】
2016026209.tif 000021
【図７】
2016026209.tif 000022
【図８】
2016026209.tif 000023
【図９】
2016026209.tif 000024
【図１０】
2016026209.tif 000025
【図１１】
2016026209.tif 000026
【図１２】
2016026209.tif 000027
【図１３】
2016026209.tif 000028
【図１４】
2016026209.tif 000029
【図１５】
2016026209.tif 000030
【図１６】
2016026209.tif 000031
【図１７】
2016026209.tif 000032
【図１８】
2016026209.tif 000033
【図１９】
2016026209.tif 000034
【図２０】
2016026209.tif 000035
【図２１】
2016026209.tif 000036
【図２２】
2016026209.tif 000037
【図２３】
2016026209.tif 000038
【図２４】
2016026209.tif 000039
【図２５】
2016026209.tif 000040
【図２６】
2016026209.tif 000041
【図２７】
2016026209.tif 000042
【図２８】
2016026209.tif 000043
【図２９】
2016026209.tif 000044
【図３０】
2016026209.tif 000045
【図３１】
2016026209.tif 000046
【図３２】
2016026209.tif 000047
【図３３】
2016026209.tif 000048
【図３４】
2016026209.tif 000049
【配列表】
2016026209000001.app
【外国語明細書】
2016026209000001.pdf