(57)【要約】【課題】  胃炎、消化性潰瘍および／または胃がん等の疾患の原因とされているヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の除菌用組成物を提供する。【解決手段】  ヘリコバクター・ピロリ(Helicobactor pylori)で免疫した哺乳動物の初乳、常乳または血清あるいはそれらから単離したヘリコバクター・ピロリ抗体および補体を含有するヘリコバクター・ピロリの除菌用組成物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ピロリで免疫した哺乳動物の初乳、常乳または血清あるいはそれらから単離したヘリコバクター・ピロリ抗体および補体を含有するヘリコバクター・ピロリの除菌用組成物。
【請求項２】
哺乳動物がウシである請求項１に記載の除菌用組成物。
【請求項３】
ヘリコバクター・ピロリでの免疫が６回以上行われたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の除菌用組成物。
【請求項４】
ヘリコバクター・ピロリでの免疫が１２〜１８回行われたものであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の除菌用組成物。
【請求項５】
ヘリコバクター・ピロリに対するＩＦＡ抗体価が１：８〜１：５１２、あるいはそれ以上の力価を有する抗体を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の除菌用組成物。
【請求項６】
液体製剤、粉末製剤、錠剤またはカプセル製剤の形態である請求項１〜５のいずれか１項に記載の除菌用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胃炎、消化性潰瘍および／または胃がん等の疾患の原因とされているヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)の除菌用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリは、1983年にウォレンとマーシャルにより発見されたヒト等の胃の内部に生息している細菌であり、これまでに、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍や胃がん等の疾患の要因として関連していることが明らかになってきている。
【０００３】
これらの疾患の治療および予防の観点から、ヘリコバクター・ピロリの除菌を行うことは極めて有効かつ必要であり、現在、ヘリコバクター・ピロリの除菌は、プロトンポンプ阻害剤と２種の抗菌剤を組み合わせて投与することにより行われている。しかし、これらの薬剤を用いる除菌法では、耐性菌の出現により除菌率が低下するなどの問題が報告されている。
これに代わるヘリコバクター・ピロリの除菌法として、ウシ免疫初乳抗体を利用することも提案されている。
【０００４】
例えば、特許文献１には、ヒトの胃内に存在する細菌であるヘリコバクター・ピロリに特異的に結合する非変性免疫グロブリンおよび薬理学的および／または栄養学的に許容し得る担体をヘリコバクター・ピロリに伴う胃炎の治療に用いることが提案されているが、ヘリコバクター・ピロリの除菌率は十分ではなかった。
また、非特許文献１には、未処理の牛（非免疫牛）の血清およびヘリコバクター・ピロリを４〜５回免疫した牛（免疫牛）の血清について、これらがヘリコバクター・ピロリに対して抗菌作用を有するか否かをin vitroで検討している。その結果、非免疫牛の非加熱血清および免疫牛の非加熱血清のいずれもがヘリコバクター・ピロリの増殖を検出限界以下に抑制したと報告している。また、ヘリコバクター・ピロリで免疫した牛および非免疫牛の血清、初乳ならびに常乳のヘリコバクター・ピロリに対する抗菌活性について検討した結果では、免疫された牛ならびに非免疫牛の非加熱と加熱した血清と初乳には共に抗菌活性が存在するが、血清と初乳では免疫しても抗菌活性が増強しなかったことおよび抗菌活性は抗体の力価とは関連しなかったことを報告している。すなわち、この論文ではヘリコバクター・ピロリに対する抗体の有無に関係なく抗菌活性があると報告しており、その活性は、抗体によるものではなくリゾチームのような抗菌物質によって発現されていると推察される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第２９６８０９５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Applied Bacteriology 1995,78, 655-662
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、胃炎、消化性潰瘍および／または胃がん等の疾患の要因に関連の深いヘリコバクター・ピロリを除菌することにより、これらの疾患の治療および予防を図ることのできる除菌用組成物を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobactor pylori)で免疫し、ヘリコバクター・ピロリに対する高い抗体活性を有する哺乳動物(ウシなど)の初乳、常乳または血清あるいはそれらから単離したヘリコバクター・ピロリ抗体と補体を含有するヘリコバクター・ピロリの除菌用組成物に関する。
すなわち、本発明には、以下の態様が含まれる。
（１）ヘリコバクター・ピロリで免疫し、ヘリコバクター・ピロリに対する高い抗体活性を有する哺乳動物の初乳、常乳または血清あるいはそれらから単離したヘリコバクター・ピロリ抗体および補体を含有するヘリコバクター・ピロリの除菌用組成物。
（２）哺乳動物がウシである上記１の除菌用組成物。
（３）ヘリコバクター・ピロリでの免疫が６回以上行われたものであることを特徴とする上記１または２の除菌用組成物。
（４）ヘリコバクター・ピロリでの免疫が１２〜１８回行われたものであることを特徴とする上記１〜３の除菌用組成物。
（５）ヘリコバクター・ピロリに対するＩＦＡ抗体価が１：８〜１：５１２、あるいはそれ以上の力価を有する抗体を含む上記１〜３の除菌用組成物。
（６）液体製剤、粉末製剤、錠剤またはカプセル製剤の形態である上記１〜５の除菌用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の除菌用組成物は、ヘリコバクター・ピロリの高い除菌率を示し、しかもこの高い除菌率を短期間の投与で達成することができる。
本発明者らは、ヘリコバクター・ピロリで免疫した哺乳動物の初乳、例えばウシの初乳、および血清からの抗体を反復投与するin vivo試験により、２か月間の投与で９０％以上のヘリコバクター・ピロリを除菌できることを確認した。これは、これはプロトンポンプ阻害剤と２種の抗菌剤を組み合わせて投与した場合の成績に匹敵する効果である。
さらに、驚くべきことには、ウシの免疫初乳抗体または血清抗体と補体を併用した場合には、わずか３日間の投与でヘリコバクター・ピロリを７５〜１００％除菌できることが確認できた。これらの方法は、これまでの薬剤投与による方法と異なり、耐性菌の出現の可能性が全くないという点でも優れている。さらに、何度でも反復応用が可能な点も、薬剤投与による方法よりも優れている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明においては、ヘリコバクター・ピロリを免疫した哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、ウサギ等、から採取した初乳、常乳から得られる乳清が免疫初乳抗体、免疫常乳抗体として、またヘリコバクター・ピロリを免疫した哺乳動物からの血清が血清抗体として、使用される。哺乳動物としては、ウシ、ヤギ、ヒツジ等が好ましく、牛、例えば乳牛が特に好ましい。本発明で使用するヘリコバクター・ピロリは、例えばＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）のような生物資源バンクから、例えばＡＴＣＣ株２６６９５として入手することができる。
【００１１】
本発明においては、初乳抗体の場合には、ヘリコバクター・ピロリを、分娩前のウシなどの哺乳動物の血管、皮内、皮下、筋肉内等へ免疫し、分娩後に採取した初乳を遠心分離して得られる脱脂乳からカゼインを取り除いて得られた乳清等を免疫初乳抗体として使用することができる。常乳中の抗体も同様にして除菌に使用することができる。
血清抗体の場合には、ヘリコバクター・ピロリをウシなどの哺乳動物の血管、皮内、皮下、筋肉内等へ免疫し、抗体価が上昇したのちに採取した血液を凝固させたのちに、遠心分離することによって細胞成分を除いて血清抗体を得ることができる。
【００１２】
本発明においては、ヘリコバクター・ピロリでの免疫は、６回以上、好ましくは８回以上、さらに好ましくは、１０回以上または１２回以上行われ、特に好ましくは１２〜１８回程度免疫が行われる。免疫回数が少ない場合、例えば５回以下では、高い抗体価の抗体を得ることが困難なために、in vivoで十分な除菌効果を得ることができない。
【００１３】
本発明において免疫初乳抗体と併用される補体としては、ウシの血清を用いることができる。例えば、健康なウシ（乳牛）から採取した血液から得られた液状成分を遠心分離することによって細胞成分を除いて、新鮮な血清を得ることができる。他方、抗凝固剤を加えて採取した血液から得た新鮮血漿も補体として使用できる。
【００１４】
本発明の除菌用組成物は、ヘリコバクター・ピロリ抗体と補体を単独で、或いはこれらを薬理学的に許容し得る担体と組み合わせて用いることができる。本発明の除菌用組成物の投与形態は、液体製剤、粉末製剤、錠剤、カプセル製剤等の通常の医薬組成物で使用されるいずれの形態であってよいが、乳清として採取したヘリコバクター・ピロリ抗体と採取した補体を、液体製剤として投与するのが好ましい。
【００１５】
ヘリコバクター・ピロリ抗体と補体の投与量は、患者の症状等に応じて変更することができるが、ヘリコバクター・ピロリ抗体として、患者の体重あたり０.１〜１.０ｍＬ／Ｋｇ、好ましくは０.２〜０.８ｍＬ／Ｋｇ、特に好ましくは０.３〜０.５ｍＬ／Ｋｇの範囲で、１日１〜４回程度投与するのが好ましい。
【００１６】
ヘリコバクター・ピロリ抗体と併用する補体の量は、抗体に対して０.１〜１０倍、好ましくは０.５〜２倍であるが、ほぼ同程度の量とするのが最も好ましい。
次に、実施例および試験例によって本発明を更に具体的に説明するが、本発明は下記の実施例および試験例のみに限定されるものではない
【実施例】
【００１７】
実施例１
ヘリコバクター・ピロリで免疫したウシの免疫初乳抗体の製造
ブレインハートインフージョン培地（ＢＨＩ培地）で培養したヘリコバクター・ピロリを、滅菌生理食塩水で１×１０6〜１×１０7ＣＦＵ(Colony forming unit)／ｍＬに調製した。このヘリコバクター・ピロリ抗原とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混和して調製したエマルジョン１ｍＬを乳牛の皮内１０箇所へ分けて免疫した。この免疫は、分娩約４か月前の乳牛へ週に１回、計１４回行った。分娩後、５日までの初乳を採取した。
【００１８】
採取した初乳１３０Ｌを低速遠心（１０００×ｇ、２０分間）して上層の脂肪と下層の細胞成分を除去し、中間層の脱脂乳を得た。室温（２５℃前後）に置いた脱脂乳あるいは３７℃に加温した脱脂乳１０００ｍＬに対してレンネット（ICNiocheｍicals Inc., OH, USA）を１００ｍｇの割合で加えて混和し、カゼインを凝固させるために室温に１晩静置した。凝固したカゼインを取り除くために遠心（２０００×ｇ、１５分間）を行い、上清の乳清を免疫初乳抗体として７０Ｌ採取し、本実験に用いた。
【００１９】
この乳清を分離する方法は、Edkins（Edkins J.S. : The changes produced in casein by the action of pancreatic and rennet extracts. The Journal of physiology, 12,
193-219. 1891）の手法に従った。
【００２０】
実施例２
ヘリコバクター・ピロリに対する血清抗体の製造
雄の乳牛（４か月齢）にヘリコバクター・ピロリ１×１０7ＣＦＵ／ｍＬを１２回免疫し、ヘリコバクター・ピロリに対する抗体（ウシ抗ヘリコバクター・ピロリ抗体）を作製した。この抗体の抗体価は、蛍光抗体法間接法（ＩＦＡ法）による測定でＩＦＡ価が１:６４（参考までに免疫初乳抗体のＩＦＡ抗体価は１:３２であった）であった。
【００２１】
実施例３
新鮮血清（補体）の採取
健康なウシ（乳牛）から採取した血液６００ｍＬを、室温（２５℃前後）に１時間静置して凝固させ、その後、２〜４℃下に２〜３時間静置して血餅を収縮させて得られた液状成分を遠心（２０００×ｇ、１５分間）し、細胞成分を除いて血清約３００ｍＬを得た。得られたこれらの新鮮血清は、直ちに５ｍＬずつに小分けして使用時まで−８０℃に凍結保存した。
同様な方法によって、ヒトおよびモルモットの新鮮血清を補体として得た。
【００２２】
[除菌効果の測定方法]
スナネズミへの各種液状成分の投与あるいはヘリコバクター・ピロリの接種には、全て経口ゾンデを用いた。ヘリコバクター・ピロリの除菌に関する実験には、５〜１０週齢のスナネズミ（１０６匹）を用いた。スナネズミへのヘリコバクター・ピロリの接種は、感染が成立しやすくするために０.１％重曹０.３ｍＬを投与して胃内のｐＨを中性付近に調整後、５×１０7ＣＦＵのヘリコバクター・ピロリを１日に１回、２日間接種した。
その２週間後に、ＥＬＩＳＡによって、ヘリコバクター・ピロリに対する血中のＩｇＭおよびＩｇＧ抗体価の上昇から感染の成立が確認できたスナネズミを除菌の実験に用いた。なお、このヘリコバクター・ピロリに対するＩｇＧおよびＩｇＭクラスの抗体価の上昇が、ヘリコバクター・ピロリ感染成立の指標となることは、別な実験で確認済みである。
【００２３】
除菌処置を施したスナネズミは、除菌処置終了後１か月間は無処理で通常どおりに飼育し、１か月後に安楽死させ、胃のホモジネート１０μｌをウマ血清加ＢＨＩ培地に塗抹して３７℃、微好気環境下で７日間培養した後に、ヘリコバクター・ピロリのコロニー形成の有無によって除菌効果を判定した。
【００２４】
試験例１
ウシの免疫初乳抗体のみによる除菌実験
ウシの免疫初乳抗体のみによる除菌実験では、抗体が機能を発揮できる胃内環境を整えるためにスナネズミへ０.１％重曹０.３ｍＬを投与して胃内のｐＨを中性付近に調整した後に、実施例１で得られたウシの免疫初乳抗体０.５ｍＬを１日２回、１か月間または２か月間経口投与した。対照群へは、免疫初乳抗体の代わりにヘリコバクター・ピロリに対する抗体を含まない別の乳牛の初乳乳清を同量投与した。
結果を表１に示す。
【００２５】
【表１】
2016050193.tif 000002
【００２６】
表１から明らかなとおり、ヘリコバクター・ピロリの除菌率は、ウシの免疫初乳抗体１か月間投与群で８３％（１０／１２例）、２か月間投与群では９２％（１１／１２例）と高い値を示しているのに対し、対照群の除菌率はいずれも０％（０／６例）であった。
【００２７】
本実験に用いた免疫初乳抗体は、ＩＦＡでヘリコバクター・ピロリの菌体と鞭毛の両方に対する抗体活性を有していたことから、抗体分子がヘリコバクター・ピロリの菌体や鞭毛へ結合することによってヘリコバクター・ピロリの運動性や胃粘膜への定着の阻害に加えてヘリコバクター・ピロリとの免疫複合体が形成されて排泄が促進され、除菌効果が発現されたものと考えられた。
【００２８】
試験例２
ウシの免疫初乳抗体と補体とによる除菌実験
ウシの免疫初乳抗体と補体とによる除菌実験では、上記のウシの免疫初乳抗体のみによる除菌処置の場合と同様に、スナネズミへ０.１％重曹０.３ｍＬ投与後、実施例１で得られた免疫初乳抗体および実施例３で得られたウシ血清からなる補体をそれぞれ０.５ｍＬ、１日２回、２日間および３日間経口投与した。対照群のスナネズミへは、免疫初乳抗体と５６℃で３０分間加熱して不活化した補体を実験群と同じ条件で投与した。
結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
2016050193.tif 000003
【００３０】
表２から明らかなとおり、ウシの免疫初乳抗体と補体の２日間投与群で８３％（１０／１２例）、３日間投与群では１００％（１２/１２例）という短期間で高い除菌効果が認められた。これらの対照群における除菌率は、いずれも０％（０／１１例）であった。
【００３１】
in vitroで、ヘリコバクター・ピロリへ免疫初乳抗体とウシ血清からなる補体とを作用させた場合に、ヘリコバクター・ピロリが強く傷害（溶菌）される現象が確認されたことから、胃内においても、in vitroと同様に、活性化された補体によってヘリコバクター・ピロリの菌体が傷害された結果、短期間で強い除菌効果が発現したと考えられた。
ウシ血清に代えて、ヒトおよびモルモットの血清を補体として使用したin vitroの実験でも有効性が確認されたが、ウシの場合に比べれば細胞傷害作用が弱かったことから、ウシの免疫初乳抗体にはウシ血清からなる補体が特に有効であるといえる。
【００３２】
試験例３
ヘリコバクター・ピロリに対する血清抗体と補体（新鮮ウシ血清）とを用いたヘリコバクター・ピロリの除菌実験
本除菌実験は、免疫初乳抗体と補体とを用いた実験と全く同じ条件で実施した。
除菌効果：
ヘリコバクター・ピロリの感染が確認されたスナネズミへヘリコバクター・ピロリに対する血清抗体と補体とを１日２回、２日間および３日間投与した結果、表３に示す通り、２日間投与群ならびに３日間投与群ともに１２例中９例（７５％）でヘリコバクター・ピロリの除菌が確認された（対照群については、表２参照）。
これらの結果から、胃内のヘリコバクター・ピロリの除菌には、ヘリコバクター・ピロリで免疫したウシなどの免疫初乳抗体および血清中の抗体の両方が、ウシ血清である補体の存在下で、有効に補体を活性化させて、ヘリコバクター・ピロリを傷害し、除菌することが確認された。
【００３３】
【表３】
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【００３４】
試験例４
ヘリコバクター・ピロリで免疫した牛（免疫牛）および非免疫牛の初乳ならびにヘリコバクター・ピロリで免疫した牛（免疫牛）と非免疫牛の血清から、プロテインＧ−セファロース４Bカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、それぞれのＩｇＧ（抗体）を分離し、これらのＩｇＧがin vitroで補体を活性化してヘリコバクター・ピロリを傷害するか否かを培養系で確認した。その結果を次の表４に示す。
【００３５】
【表４】
2016050193.tif 000005
【００３６】
ヘリコバクター・ピロリに対する抗体活性を有している牛（免疫牛）の初乳および血清から分離したＩｇＧと補体との組合せでは、in vitroでヘリコバクター・ピロリの傷害作用が強く発現された。他方、非免疫牛の初乳および血清から分離したＩｇＧと補体との組合せでヘリコバクター・ピロリの傷害作用が全く発現されなかった。
これらの結果は、免疫牛由来のＩｇＧ抗体がヘリコバクター・ピロリに反応（結合）して免疫複合体を形成した結果、補体が活性化されてヘリコバクター・ピロリを傷害したことを裏付けるものである。他方、非免疫牛由来のＩｇＧは、ヘリコバクター・ピロリに結合できないので免疫複合体が形成されず、そのため補体が活性化されないのでヘリコバクター・ピロリを傷害することができなかったと容易に解釈することができる。
このように、本請求の原理は、ヘリコバクター・ピロリの菌体および鞭毛に対する抗体がin vivoとin vitroの両方においてヘリコバクター・ピロリと結合して免疫複合体を形成すると補体が活性化されてヘリコバクター・ピロリを傷害するものである。その結果として、in vivoにおけるヘリコバクター・ピロリの除菌作用が発現する訳で、乳汁あるいは血清中に生理学的に含有されているリゾチームのような抗菌物質によるヘリコバクター・ピロリの傷害とは全く作用原理が異なるものである。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明の組成物は、ヒトを含む哺乳動物の胃内に存在し、胃炎、消化性潰瘍または胃がんの要因になり得ると考えられているヘリコバクター・ピロリの除菌に有用である。
【００３８】
ヒトのヘリコバクター・ピロリの除菌治療においては、薬剤耐性菌の出現による除菌率の低下および薬剤に対する過敏症患者への薬剤投与が問題となっている。それに対して、免疫初乳抗体、免疫常乳抗体または免疫血清抗体と補体とを用いる方法は、耐性菌出現の恐れが全くなく、反復投与ができる有用なヘリコバクター・ピロリの除菌法として応用が可能である。特に、胃内で補体を活性化させる方法は、初めての試みであるが極めて有効性が高く、しかも短期間で除菌が可能であるので、薬剤治療で除菌ができない患者に対しても有用な治療法となり得ることが期待される。