(57)【要約】      （修正有）【課題】セレンテラジンを修飾することによる、ウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)-セレンテラジン発光系による発光の波長を長波長化する技術の提供。【解決手段】一般式[I]で表される蛍光色素結合セレンテラジン。2016050296.tif 000038（Ａは、蛍光色素を含む蛍光色素部）【選択図】図３
2016050296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式[I]で表される、蛍光色素結合セレンテラジン。
【化１】
2016050296.tif 000037
（式[I]中、Ａは、蛍光色素を含む蛍光色素部を示す）。
【請求項２】
前記蛍光色素は、吸収波長ピークが300〜600nmの範囲にある蛍光色素である請求項１記載の蛍光色素結合セレンテラジン。
【請求項３】
前記蛍光色素がフルオレッセインイソチオシアネートである請求項２記載の蛍光色素結合セレンテラジン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光色素が結合されたセレンテラジンに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体内の生命現象を光により可視化し、病気の解明等に広く用いられている技術として、光学的な生体内イメージングが注目されている。光を用いたイメージングは他のイメージング方法であるMRIなどと比較すると比較的安価で、高感度、非侵襲的などの利点がある。イメージングに用いられる光として、近赤外光と呼ばれる600 nm〜900 nmの領域が適している。この理由は、近赤外領域において生体内の分子であるヘモグロビンや水などの吸光係数が小さく、また生体内の自家蛍光物質の影響が少ないため、深部組織への応用も可能で、バックグラウンドの小さい高感度な測定が行えるためである。
【０００３】
生体内イメージングで用いられる光の種類として蛍光、化学発光、生物発光がある。これらのうち、生物発光は、励起光源を用いず、量子収率が比較的高いという利点がある。生物発光において最も有用であるとされているのは、ホタルのルシフェリン-ルシフェラーゼ反応である。ホタルルシフェリンの発光は、生物発光種の中で最も量子収率が0.41と高く、また560 nmの比較的長波長の発光を示すため、生体内イメージングに多く用いられている。しかし、ホタルルシフェリンはマグネシウムイオンとATPといった補因子存在下でないと起こらないため、その点が生体内イメージングに応用した際の弊害となってしまう。
【０００４】
一方、ウミシイタケやオワンクラゲ由来の生物発光基質であるセレンテラジンも知られている。セレンテラジンはホタルルシフェリンと異なり、マグネシウムイオンとATP存在下でなくても発光を示すことが報告されている。しかし、セレンテラジンは最大発光波長のピークが約480nmであるため、生体内イメージングに応用するためにはその発光波長を近赤外領域まで長波長化することが求められている。
【０００５】
セレンテラジンの発光波長を長波長側にシフトさせるために、セレンテラジンの構造を改変したセレンテラジン-vが知られている（非特許文献１）。セレンテラジン-vでは、発光波長が40nm長波長側にシフトするが、安定性に難があり、生体内イメージングに使用するのは困難である。
【０００６】
一方、セレンテラジンを基質とする酵素であるウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)は、その構造が研究され、そのアミノ酸配列のうち８個のアミノ酸を置換することにより生体内安定性を高めたRluc8（非特許文献２）が開発され、その活性部位も明らかにされ（非特許文献３）、さらにRluc8中のアミノ酸配列を６個置換することによりさらに生体内安定性を高めたRluc8.6も開発された（非特許文献４）。さらにRlucの活性部位が明らかにされたので、酵素活性に影響しない領域も明らかになったことから、Rlucやその改変体に蛍光色素を結合してBRET（Bioluminescence Resonance Energy Transfer：生物発光共鳴エネルギー移動)やFRETを利用して発光波長を長波長化した例も知られている（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Galina. A. et al., Anal. Bioanal. Chem.,2010, 398, 1809-1817
【非特許文献２】Loening A. M., et. al., Protein Eng. Des. Sel., 2006, 19, 391
【非特許文献３】Loening A. M., et. al., J. Mol. Biol., 2007, 374, 1017
【非特許文献４】Loening A. M., et. al., Nat. Methods, 2007, 4 (8), 641
【非特許文献５】Chen F. Q. et. al., J. Chem. Soc. PERKIN TRANS. 1, 1992, 1607
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、セレンテラジンを修飾することにより、Rluc-セレンテラジン発光系による発光の波長を長波長化する技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、セレンテラジンに蛍光色素を結合することにより、BRETを引き起こし、それによって発光波長をセレンテラジンの発光波長よりも長波長化することが可能かもしれないと考えた。上記の通り、これまで酵素であるRlucに蛍光色素を結合した例は報告されているが、セレンテラジンに蛍光色素を結合した例は報告されていない。しかしながら、周知のとおり、一般に酵素の基質特異性は極めて高いため、セレンテラジンに蛍光色素のような大きな構造を結合すれば、高い基質特異性の故に酵素反応が起きなくなる可能性も予想された。実際に、セレンテラジンの２位のヒドロキシル基に蛍光色素を結合したところ、予想されたように酵素反応自体が起きなくなってしまった。しかし、これであきらめずに今度はセレンテラジンの６位のヒドロキシル基に蛍光色素を結合したところ、酵素Rlucでは酵素反応が起きなくなったが、驚くべきことに、上記したRlucの改変体であるRluc8やRluc8.6を用いれば酵素反応は十分な程度に生じ、BRETにより発光波長が長波長化することが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、下記一般式[I]で表される、蛍光色素結合セレンテラジンを提供する。
【００１１】
【化１】
2016050296.tif 000003
【００１２】
（式[I]中、Ａは、蛍光色素を含む蛍光色素部を示す）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、Rluc-セレンテラジン系の発光反応の発光波長が長波長側にシフトした新規なRluc基質が提供された。Rlucは、分子量が小さいので生体内イメージングにおける酵素標識として適しており、また、マグネシウムイオンとATP存在下でなくても発光を示すという利点を有しており、本発明により、さらに発光波長が長波長化されたので、本発明は、生体内イメージングに大いに貢献するものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】下記実施例で合成したセレンテラジン−FITC結合体(CTZ-6-FITC)の化学発光スペクトルを示す。
【図２】下記実施例で合成したCTZ-6-FITCの生物発光強度の測定結果をCTZ-6-azideの測定結果と比較して示す図である。
【図３】下記実施例で合成したCTZ-6-FITCおよびCTZ-6-azideの、酵素Rluc又は酵素Rluc8.6を用いた酵素反応における生物発光スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記の通り、本発明の蛍光色素結合セレンテラジンは、上記一般式[I]で示される構造を有する。一般式[I]中、Ａは、蛍光色素を含む蛍光色素部であり、好ましくは、吸収波長ピークが300〜600nmの範囲にある蛍光色素を含む蛍光色素部である。本発明の蛍光色素結合セレンテラジンは、Rluc8又はRluc8.6（これらをコードする組換えプラスミドがスタンフォード大学より入手可能）による酵素反応によりセレンテラジン部分に生じる蛍光エネルギーを、蛍光色素に共鳴移動させて該蛍光色素を発光させる(BRET)ことにより、セレンテラジンの発光ピーク波長(478nm)よりも発光波長を長波長化するものである。このようなBRETを起こす蛍光色素としては、吸収波長ピークが300〜600nmの範囲にある蛍光色素が好ましい。吸収波長ピークが300〜600nmの範囲にある蛍光色素の例として、以下のものを挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
フルオレッセイン系蛍光色素（フルオレッセインイソチオシアネート(FITC)、フルオレッセイン、カルボキシナフトフルオレッセイン等）
【００１７】
【化２】
2016050296.tif 000004
フルオレッセインイソチオシアネート(FITC)
【００１８】
【化３】
2016050296.tif 000005
フルオレッセイン
【００１９】
【化４】
2016050296.tif 000006
カルボキシナフトフルオレッセイン
【００２０】
Alexa Fluor系蛍光色素（Alexa Fluor 480（商品名）及びAlexa Fluor 568（商品名）等）
【００２１】
【化５】
2016050296.tif 000007
Alexa Fluor 480（商品名）
【００２２】
【化６】
2016050296.tif 000008
Alexa Fluor 568（商品名）
【００２３】
ATTO系蛍光色素（ATTO 590等）
【００２４】
【化７】
2016050296.tif 000009
ATTO 590
【００２５】
BODIPY系蛍光色素（BODIPY TR-X（商品名）等）
【００２６】
【化８】
2016050296.tif 000010
BODIPY TR-X
【００２７】
クマリン系蛍光色素（Coumarin 1（商品名）及びCoumarin 6（商品名）等）
【００２８】
【化９】
2016050296.tif 000011
Coumarin 1（商品名）
【００２９】
【化１０】
2016050296.tif 000012
Coumarin 6（商品名）
【００３０】
Cy系蛍光色素（Cy3等）
【００３１】
【化１１】
2016050296.tif 000013
Cy3
【００３２】
DY系蛍光色素（DY-405 (商品名)等）
【００３３】
HiLyte Fluor系蛍光色素（HiLyte Fluor 555 Labeling Kit - NH2 (商品名)等）
【００３４】
IRDye（商品名）系蛍光色素（IRDye 650 Alkyne（商品名）及びIRDye 750 Carboxylate（商品名）等）
【００３５】
【化１２】
2016050296.tif 000014
IRDye 650 Alkyne（商品名）
【００３６】
【化１３】
2016050296.tif 000015
Nile Brue
【００３７】
【化１４】
2016050296.tif 000016
Nile Red
【００３８】
PromoFluor系蛍光色素（PF-405 (商品名)等）
【００３９】
ローダミン系蛍光色素（ローダミンＢ、ローダミン１０１等）
【００４０】
【化１５】
2016050296.tif 000017
ローダミンＢ
【００４１】
【化１６】
2016050296.tif 000018
ローダミン１０１
【００４２】
SYTO系蛍光色素（SYTO 9 Stain (商品名)等）
【００４３】
クロロフィル系蛍光色素
【００４４】
【化１７】
2016050296.tif 000019
【００４５】
一般式[I]中のＡは、上記したような蛍光色素を含む蛍光色素部である。蛍光色素部は、蛍光色素のみから成っていてもよいし、セレンテラジンに蛍光色素を結合するリンカーを含んでいてもよい。リンカーは、蛍光色素とセレンテラジンとを結合するものであるから、構造は特に限定されるものではなく、蛍光色素とセレンテラジンとを結合できてBRETに悪影響を与えない構造であれば何ら限定されるものではない。好ましくは、アルキレン基や、アルキレン基の末端に蛍光色素との結合に供した官能基の残基を有するもの等が挙げられる。下記の実施例では、FITCのイソチオシアネート基とセレンテラジンの６位のヒドロキシル基とを-NH-CH2-CH2-O-の構造を介して結合している（右端の-O-は、セレンテラジンの６位のヒドロキシル基の残基）が、これをリンカーと考えることができる。リンカーのサイズは特に限定されないが、BRETが起きるためには、蛍光色素とセレンテラジンの距離が1nm〜10nm程度であることが望まれるので、リンカーの主鎖の原子数は３〜５程度が望まれる（-NH-CH2-CH2-O-の場合には、主鎖の原子数は４）。
【００４６】
セレンテラジン及びその製造方法も、蛍光色素及びその製造方法も公知であるので、本発明の蛍光色素結合セレンテラジンは、有機化学の常識に従って化学合成することが可能で有り、下記実施例にも蛍光色素がFITCであるものの合成方法が詳細に記載されている。
【００４７】
酵素Rlucやその改変体であるRluc8やRluc8.6は周知の通り酵素標識として用いられるので、本発明の蛍光色素結合セレンテラジンは、セレンテラジンと全く同様にしてRluc8やRluc8.6の基質として生体内イメージングに用いることができる。
【００４８】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
実施例１    FITC-セレンテラジンの合成
セレンテラジン(CTZ)とFITCを結合させたモデル分子の全合成スキームを以下に示した。まず、アジド基を修飾したセレンテラミンを合成し、これとアセタール保護されたピルビンアルデヒドを反応させ、アジド基修飾のセレンテラジンを合成した。その後、水素化還元反応によりアジド基をアミン基にし、FITCのイソチオシアネートの部分と結合させた。以下のように12ステップ中すべての合成にトータル収率0.58%で成功した。各々の工程の詳細を説明する。
【００５０】
【化１８】
2016050296.tif 000020
【００５１】
試薬は和光純薬、関東化学、東京化成、またはシグマアルドリッチから購入し、精製せずそのまま用いた。 NMRはJEOL社のECA500を用い、内部標準としてテトラメチルシラン(TMS、0 ppm)を用いた。
【００５２】
【化１９】
2016050296.tif 000021
【００５３】
窒素雰囲気下、200 ml三口フラスコに化合物(1)(2.0 g, 21.0 mmol, 1.0 eq.), THF (25 ml)を入れ攪拌した。次に、N-bromosuccinimide (8.2 g, 46.1 mmol, 2.2 eq.) をTHF (25 ml)に溶解させたものを0 ℃で滴下し、室温で20分間撹拌した。
【００５４】
反応終了後、不純物をセライト濾過した。そして、そのろ液を酢酸エチルで抽出、H2Oとsat.NH4Cl aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣の一部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶離液 : n -ヘキサン：酢酸エチル = 7 : 3) で分離精製、濃縮して目的化合物 (2) (3.16 g, 収率：60 %) を白色の固体として得た。
【００５５】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.53 (溶離液：n - ヘキサン/酢酸エチル = 7/3 (v/v))
・1H-NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ=8.04 (s, 1H), 5.05 (s, 2H)  
【００５６】
【化２０】
2016050296.tif 000022
【００５７】
100 ml 三口ナスフラスコ(A)にZnCl2 (1.62 g, 11.9 mmol, 3.0 eq. )を入れて、予め真空乾燥をした。次にそのフラスコにEt2O (26.7 ml) を投入し、撹拌した。
【００５８】
次に、予め真空脱気した50 ml 二口ナスフラスコにTHF (5.0 ml)を入れ、そこにBenzylmagnesium Chloride 2.0M THF溶液 (4.37 ml, 8.70 mmol, 2.2 eq.)を滴下した。この溶液を、先ほどの三口ナスフラスコ(A)に滴下した。次に、100 ml 二口ナスフラスコに化合物(2) (1.0 g, 3.95 mmol, 1 eq.)を入れて真空乾燥させた。そこに、THF (7 ml)を加えて攪拌し、その溶液を三口ナスフラスコ(A)に加えた。最後に、(Ph3P)2PdCl2 (ミクロスパチュラ1杯程度)をいれ、常温で17時間攪拌を行った。Pd触媒を入れる前後では3回ずつ真空脱気を行った。
【００５９】
反応終了後、不純物をセライト濾過した。そしてそのろ液を酢酸エチルで抽出、H2Oとsat.NaHCO3 aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液 : n - ヘキサン：酢酸エチル = 9：1 → 4:1 ) で分離精製し、目的化合物(3) (0.617 g, 収率60%)を黄色液体として得た。
【００６０】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.25 (溶離液：n - ヘキサン/酢酸エチル = 4/1 v/v)
・1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ=8.04 (s, 1H), 7.21-7.34 (m, 5H), 4.37 (s, 2H), 4.09 (s, 2H)
【００６１】
【化２１】
2016050296.tif 000023
【００６２】
窒素雰囲気下、200 ml二口フラスコに化合物(4)(1.0 g, 4.5 mmol, 1.0 eq.), K2CO3(0.82 g, 5.9 mmol, 1.3 eq.), およびアセトン(20 ml)を入れ撹拌した。次に、1,2-dibromoethane(4.1 g, 22.7 mmol, 22.7 eq.), KI(0.02 g, 0.1 mmol, 0.02 eq.)をアセトン(20 ml)に溶解させたものを反応系に入れ、70 ℃で16時間撹拌した。
【００６３】
反応終了後、CH2Cl2で抽出、H2Oとsat.NaCl aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液 : クロロホルム)で分離精製し、目的化合物(3) (0.446 g, 収率20%)を白色個体として得た。
【００６４】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.85 (溶離液：クロロホルム  100％)
・1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ=7.68 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.32 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 1.33 (s, 12H)
【００６５】
【化２２】
2016050296.tif 000024
【００６６】
窒素雰囲気下，50ml二口フラスコに化合物(5)(350 mg,1.07 mmol, 1.0 eq.), DMF (10 ml), NaN3(83 mg, 1.28 mmol, 1.2 eq.)を入れて、100 ℃にて1時間攪拌を行った。
【００６７】
反応終了後、トルエンで抽出、H2Oとsat.NaCl aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。そして、目的化合物(6)(299 mg, 収率97%)を白色個体として得た。
【００６８】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.63 (溶離液：クロロホルム 100%)
・1H-NMR (300 MHz, CD3OD, TMS, r.t.)
δ=7.68 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 6.93 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.18 (t, J = 4.5 Hz, 5H), 3.59 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 1.33 (s, 12H)
【００６９】
【化２３】
2016050296.tif 000025
【００７０】
窒素雰囲気下、100 ml三口フラスコに化合物(3)(0.660 g, 2.50 mmol, 1.0 eq.), 化合物(6)(1.0 g, 3.46 mmol, 1.6 eq.), エタノール(5 ml), トルエン(15 ml), および1 M Na2CO3 aq.(7 ml)をいれ撹拌した。最後に、Pd(Ph3P)4 (ミクロスパチュラ1杯程度)をいれ、100 ℃20時間攪拌を行った。Pd触媒を入れる前後では3回ずつ真空脱気を行った。
【００７１】
反応終了後、不純物をセライト濾過した。そして、そのろ液を酢酸エチルで抽出、H2Oとsat.NaHCO3 aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(溶離液 :クロロホルム：酢酸エチル = 19 : 1 → 9 : 1) で分離精製し、目的化合物(7)(0.590 g, 収率68%)を白色個体として得た。
【００７２】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.24 (溶離液：クロロホルム/酢酸エチル ＝ 19/1 v/v)
・1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ= 8.33 (s, 1H), 7.89 (d, J = 9 Hz, 2H), 7.19-7.38 (m, 5H), 7.01 (d, J = 8.7 Hz,2H), 4.37 (s,2H), 4.18-4.22 (m, 4H), 3.63 (t, J = 4.8 Hz, 2H)
【００７３】
【化２４】
2016050296.tif 000026
【００７４】
窒素雰囲気下、1 L三口ナスフラスコに、化合物(9)(10.0 g, 82.7 mmol, 1.0 eq.)および、t-ブチルジメチルシリルクロリド(13.64 g, 90.5 mmol, 1.1 eq.)を加え, CH2Cl2(400 mL)に溶解させ、0℃に冷却した。これにトリエチルアミン(14 mL,  99.2 mmol, 1.2 eq.)を加え、ゆっくりと室温に戻し、一晩反応させた。
【００７５】
反応終了後、反応液を一部濃縮し、CH2Cl2で抽出、H2Oとsat.NaCl aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン：酢酸エチル = 9：1)で分離精製、濃縮して目的化合物(10)(18.68 g, 収率96 %)を無色の液体として得た。
【００７６】
・TLC(シリカ) : Rf = 0.63 (n-ヘキサン/酢酸エチル= 4 / 1)
・1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ= 9.89 (s, 1H), 7.79 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.95(d, J = 8.4 Hz, 2H), 0.96 (s, J = 23.7 Hz, 9H), 0.25 (s, 6H)
【００７７】
【化２５】
2016050296.tif 000027
【００７８】
窒素雰囲気下、1 L三口ナスフラスコに、化合物(10)(18.6 g, 78.7 mmol, 1.0 eq.)を加え、メタノール300 mLに溶解させた。これに水素化ホウ素ナトリウム(3.57 g, 94.3 mmol, 1.2 eq.)を加え、室温で30分間反応させた。
【００７９】
反応終了後、反応液を濃縮し、CH2Cl2で抽出、H2Oとsat.NaCl aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮して、目的化合物(13)(14.65 g, 収率78%)を無色の液体として得た。得られた無色の液体はそれ以上精製せず、そのまま次の反応に用いた。
【００８０】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.09(溶離液：n - ヘキサン/酢酸エチル = 9/1 v/v)
・1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ= 7.24 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.83 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.61 (s, 2H), 0.95 (s, 9H), 0.20 (s, 6H)
【００８１】
【化２６】
2016050296.tif 000028
【００８２】
窒素雰囲気下、500 mL三口ナスフラスコに、化合物(13)(7.0 g, 29.3 mmol, 1.0 eq.)を加え、CH2Cl2(150 mL)に溶解させた。これを0 ℃に冷却して、トリエチルアミン(8.0 mL, 58.6 mmol, 2.0 eq.)を加え、15分間撹拌した。これを室温に戻した後、CH2Cl2(50 mL)に溶解させたメタンスルホニルクロリド(3.4 g, 44.6 mmol, 1.5 eq.)を加え、3時間反応させた。
【００８３】
反応終了後、反応液を一部濃縮し、CH2Cl2で抽出、H2Oとsat.NaCl aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた液体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン：酢酸エチル = 95：5)で分離精製、濃縮して無色液体の目的化合物(12)(5.09 g, 収率68 %で得た。
【００８４】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.78(溶離液：n - ヘキサン/酢酸エチル = 9/1 v/v)
・1H-NMR (500 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ= 7.24 (d, J = 8.6 Hz,2H), 6.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.55 (s,2H), 0.98 (s, 9H), 0.20 (s, 6H)
【００８５】
【化２７】
2016050296.tif 000029
【００８６】
アルゴン雰囲気下、200 mL三口ナスフラスコに化合物(12)(4.0 g, 15.6 mmol, 1 eq.)を入れ、真空乾燥した。その後、THF(40 ml)を加え、撹拌した。次に200 mL三口ナスフラスコ(A)に、マグネシウム(775 mg, 31.9 mmol, 2.0 eq.)を加え、真空乾燥した。これにTHF(10 mL)を入れた。そして化合物(12) THF溶液を(A)に取り付けた滴下ロートに入れた。そして(A)に1,2-dibromoethane(1 mL, 触媒量)を加え、手で温めながら攪拌し、マグネシウムを活性化させた。続いて滴下ロートから10分間かけて滴下した。滴下後、反応液を50℃で1時間加熱し、その後室温に戻して、褐色溶液の化合物を得た。得られた化合物はそれ以上精製せず、すぐに次の反応に用いた。 
【００８７】
アルゴン雰囲気下、200 mL二口ナスフラスコに、エチルジエトキシアセテート3.2 mL(15.6 mmol, 1 eq.)を加え、THF 30 mLに溶解させて-78℃に冷却した。これに、 先ほど合成した化合物のTHF溶液を20分間かけて滴下し、2時間反応させた。
【００８８】
反応後、水を加えて反応を停止し、室温に戻した。酢酸エチルで抽出、H2Oとsat.NaHCO3 aq.で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濃縮した。得られた液体を, シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー(n-ヘキサン：酢酸エチル = 95：5 )で分離精製、濃縮して目的化合物(13)(2.98 mg, 収率54%)を無色の液体として得た。
【００８９】
・TLC (シリカゲル)：Rf = 0.56 (溶離液：n-ヘキサン：酢酸エチル= 9/1 v/v)
・1H-NMR (300 MHz, CDCl3, TMS, r.t.)
δ= 7.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.78 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.63 (s, 1H), 3.81 (s, 2H), 3.74-3.63 (m, 2H), 3.58-3.48 (m, 2H), 1.24 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 0.98 (s, 9H), 0.18 (s, 6H)
【００９０】
【化２８】
2016050296.tif 000030
【００９１】
アルゴン気流下、30 ml 二口ナスフラスコに化合物(7) (500 mg, 1.44 mmol, 1 eq.)、化合物(13) (814 g, 2.31 mmol, 1.6 eq.)、EtOH(25 ml)、水(8 ml)に溶かし、最後に、0℃に冷却し、N2下でHCl(4 ml)をいれ、80 ℃でover nightで攪拌を行った。HClを入れる前では3回ずつ真空脱気を行った。
【００９２】
反応後、反応液を濃縮し、得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/メタノール=20/1)で精製し、濃縮して、目的化合物(8)(287 mg, 収率40%)を黄色固体として得た。
【００９３】
・TLC(シリカゲル): Rf=0.43(溶離液: 酢酸エチル/メタノール=20/1, v/v)
1H-NMR( 500 MHz, MeOD, TMS, r.t.)
δ= 7.55(1H, s), 7.41(2H, J = 7.5 Hz, d), 7.31(2H, J = 7.0 Hz, t), 7.23(5H, m), 7.04(2H, J = 9.0 Hz, d), 6.74(2H, J = 8.5 Hz, d), 4.39(2H, s), 4.22(2H, J = 5.0 Hz, t), 4.11(2H, s), 3.64(2H, J = 4.5 Hz, t )
【００９４】
【化２９】
2016050296.tif 000031
【００９５】
アルゴン気流下、30 ml二口ナスフラスコに化合物(8)(19.8 mg, 0.04 mmol, 1.0 eq)、CH2Cl2(3 mL)、MeOH(5 ml)に溶かし、撹拌した。脱気を三回行った後、5% Pd/C(ミクロスパチュラ1杯程度)を入れ、ふたたび真空脱気を行った。そして、水素バルーンにつけかえた後、再び真空脱気して水素を充填し、3時間撹拌した。反応終了後、セライトろ過を行い、ろ液を濃縮した。精製をせずに次の反応をかけた。
【００９６】
・TLC (ODS-18)：Rf = 0 (溶離液：水/メタノール = 1/1 v/v)
・MALDI-TOF-MS(positive mode, CHCA): m/z=467.08 [M+H]+
【００９７】
【化３０】
2016050296.tif 000032
【００９８】
窒素気流下、30 ml 二口ナスフラスコに化合物(14)crude、THF(3.0 ml)、MeOH(5 ml)、fluorescein isothiocyanate(7.8 mg, 0.02 mmol )に溶かし、40℃で3時間撹拌した。その後、反応液を濃縮し、逆相カラムクロマトグラフィー(溶離液:水：メタノール = 1：4)でかきとり精製を行い、次いで逆相カラムクロマトグラフィー(溶離液:水：アセトニトリル = 1：2)を行なった。その後、アセトンとヘキサンを用いて、再沈殿により精製した。精製された目的化合物(15)は(2.12 mg, 収率6%)を赤色固体として得た。
【００９９】
・TLC(ODS-18): Rf=0.58 (溶離液: 水/MeOH=1/4, v/v)
1H-NMR( 500 MHz, MeOD, TMS, r.t.)
δ= 8.11(1H, J = 2.0 Hz d), 7.71(1H, J = 7.0 Hz, d), 7.59(2H, s), 7.38(2H, J = 7.5 Hz, d), 7.28(2H, J = 7.0 Hz, t), 7.22(1H, J = 7.5 Hz, t), 7.14(5H, m), 6.68(6H, m), 6.54(2H, J = 8.5 Hz q), 4.40(2H, s), 4.30(2H, J = 5.5 Hz, t), 4.60(4H, m)
【０１００】
実施例２    発光特性
実施例１で合成したセレンテラジン(CTZ)とFITCとの６位結合体(CTZ-6-FITC)の化学発光特性を調べた。
【０１０１】
1-1  装置と測定条件
以下に示す装置条件にて測定を行った。測定溶媒にはメタノール、ジメチルスルホキシド(関東化学、蛍光分析用)、PBSバッファー(pH 7.4, ニッポンジーン)を用いた。化学発光スペクトルの測定においては蛍光光度計用いた。
【０１０２】
・蛍光光度計  F-7000 (Model FL-3-11, Horiba Jobin Yvon Co.,Kyoto,Japan)
測定波長：350-650 nm
波長送り幅：0.5 nm
スキャンスピード：1200 nm / min
スリット幅(検出光)：25 nm
・測定試料        CTZ-6-FITC
・測定条件
【０１０３】
試料をメタノールに溶解させ、1 mMの溶液とした。上記のメタノール溶液を100 μL、PBSバッファーを100 μLまたは炭酸バッファー(pH 9.6)を測定容器に取り、これにDMSO 2 mLを加えて混ぜ、ただちに測定を行った。
【０１０４】
1-2  化学発光スペクトル
図１に化学発光スペクトルを示す。スペクトルは最大発光強度を1.0として規格化した。
【０１０５】
1-3   CTZ-6-FITCの化学発光特性の考察
図１から最大発光波長は表１のようになった。またCTZの発光ピーク(文献値)についても併せて示した。
【０１０６】
【表１】
2016050296.tif 000033
【０１０７】
図１および表1から、ドナーであるセレンテラジンからアクセプターであるFITCへのエネルギー-移動が観測でき、また、化学発光において61 nmの長波長化に成功した。このことから、セレンテラジンにFITCを結合させることにより、エネルギー移動が起きたことを確認できた。また、CTZ由来の発光ピークは、pH7.4において449 nm、pH9.6においてだと438 nmであった。一般的にCTZは、塩基の非存在下では、Phenolate anionの形態で発光することが知られている。しかし、中性条件下において、CTZ-6-FITCはそれよりもBlue-shiftしている。これはおそらくセレンテラジンの6位の水酸基をなくしてしまったことによる影響であると予想できる。また塩基性条件下において、CTZはPyrazine anionの形態をとるが、これも同様の理由により、Blue-shiftしてしまったことが予想される。
【０１０８】
2  CTZ-6-FITCの生物発光特性
2-1  装置と測定条件
測定には以下の装置を用いた。生物発光スペクトルには蛍光分度計、生物発光強度は発光用プレートリーダーを用いた。
【０１０９】
蛍光光度計 F-7000 (Hitachi Co. Ltd., Tokyo, Japan)
測定波長 : 360-650 nm
波長送り幅 : 0.2 nm
スキャンスピード : 1200 nm / min
発光測定用プレートリーダー : Lumat LB9507 (single tube type luminometer)
測定時間 : 1 sec
【０１１０】
・測定試料
基質  CTZ-6-azide
CTZ-6-FITC
酵素  Rluc
Rluc8
Rluc8.6
【０１１１】
【化３１】
2016050296.tif 000034
CTZ-6-azide
【０１１２】
Rluc, Rluc8及びRluc8.6を発現するベクター（入手先：RlucはPromega社、Rluc8およびRluc8.6はDr. Sanjiv S. Gambhir, Stanford Univ.）を用いて、COS-7細胞にRluc, Rluc8及びRluc8.6をそれぞれ発現させ、Promega社のRenilla Luciferase Lysis Bufferを用いて細胞を溶解し、その溶出液を酵素溶液としてそのまま用いた。
【０１１３】
・測定条件
生物発光測定は、Promega社のRenilla Luciferase Assay System(Cat. No. E2810)のプロトコルに従って行った。基質CTZ-6-FITCおよびCTZ-6-azideを脱気したメタノールに溶解させ、1 mMとした。これをPromega社のRenilla Luciferase Lysis Bufferで10 μMに希釈し、基質溶液とした。
【０１１４】
上記の基質溶液100 μLに対し、細胞溶液(Rluc, Rluc8, Rluc8.6)各々20 μLを加え混ぜただちに測定した。また全ての基質及び酵素溶液は、調製直後のものを使用した。
【０１１５】
2-2  酵素認識
CTZ-6-FITCの測定結果を図２に示した。図２の結果より、CTZ-6-azideおよびCTZ-6-FITCはRluc8およびRluc8.6において、酵素によって認識されたことがわかる。また、天然のCTZとそれぞれの強度を表２で比較した。また強度の比較において、CTZ-Rlucの組み合わせを100%とした。
【０１１６】
【表２】
2016050296.tif 000035
【０１１７】
表２の結果より、CTZ-6-azideおよびCTZ-6-FITCは酵素Rluc8.6において天然のセレンテラジンとほぼ同等の発光強度を示した。このことから、6位に色素を修飾しても、Rluc8およびRluc8.6に認識されることが示唆される。
【０１１８】
5-2-3  生物発光スペクトル
CTZ-6-FITCおよびCTZの生物発光を図３に示す。図３より、それぞれの最大生物発光波長は表３のようになった。
【０１１９】
【表３】
2016050296.tif 000036
【０１２０】
以上に結果より、CTZ-6-FITCは天然のものよりも約40 nm長波長化に成功した。またCTZ-6-azideおよびCTZ-6-FITCのCTZ由来の発光ピークは、約400 nm付近であることがわかる。これから、天然のセレンテラジンの6位の水酸基をなくすことによって、Neutral speciesの形態をとって発光している可能性が示唆された。
【図１】
2016050296.tif 000039
【図２】
2016050296.tif 000040
【図３】
2016050296.tif 000041