(57)【要約】【課題】血液適合性に優れ、検体がヒトの全血であっても、当該検体に含有されるウイルスを効率良く分離可能なウイルス分離デバイスを提供する。【解決手段】検体に含有されるウイルス等を検体から分離可能なウイルス分離デバイスであって、高マンノース型糖鎖に特異的に結合する所定のポリペプチドと、上記ポリペプチドを固定する所定の固定化担体と、を備え、上記ポリペプチドが上記固定化担体に固定されているデバイス。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を検体から分離可能なウイルス分離デバイスであって、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドと、上記ポリペプチドを固定する固定化担体と、を備え、上記ポリペプチドが上記固定化担体に固定されており、上記固定化担体がモノリスゲルであり、
上記ポリペプチドは、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチン、タイプＩＩＩレクチンおよびタイプＩＶレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることを特徴とするデバイス。
【請求項２】
上記検体がヒトの全血であり、上記全血を上記ポリペプチドに接触させることによって、上記全血に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を上記全血から分離可能であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
上記モノリスゲルは、マクロポア径が１μｍ以上２００μｍ以下であり、メソポア径が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
上記モノリスゲルは、マクロポア径が２０μｍ以上２００μｍ以下であることを特徴とする請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
上記モノリスゲルはシリカモノリスであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項６】
上記ポリペプチドは、上記固定化担体１ｍｌあたり２μｇ以上固定されることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
上記ポリペプチドは、ペプチド鎖のカルボキシ末端で上記固定化担体に固定化されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項８】
上記ポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を１個以下有することを特徴とする請求項７に記載のデバイス。
【請求項９】
上記ポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を含まないことを特徴とする請求項８に記載のデバイス。
【請求項１０】
上記ポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基およびリジン残基を含まないことを特徴とする請求項９に記載のデバイス。
【請求項１１】
上記ウイルスが、高マンノース型糖鎖を有するウイルスであることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１２】
上記ウイルスが、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、デングウイルス、エイズウイルス、エボラウイルスおよび重症急性呼吸症候群ウイルスからなる群より選ばれる１種または２種以上のウイルスであることを特徴とする請求項１から１１のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１３】
上記ウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞が、エイズウイルスおよび／またはエイズウイルス感染Ｔ細胞であることを特徴とする請求項１から１２のいずれか１項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス分離デバイスに関する。より詳細には、血液適合性に優れ、全血を検体とした場合でも検体に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を検体から分離可能なウイルス分離デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト免疫不全ウイルス（以下「ＨＩＶ」または「エイズウイルス」）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」）、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス、重症急性呼吸症候群（以下「ＳＡＲＳ」）ウイルスなどのウイルスは、しばしば人体に対して重篤な症状を惹起し、その感染拡大が社会問題ともなっている。
【０００３】
これらのウイルスは、高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質を表面に有しており、当該糖タンパク質が宿主への感染に重要な役割を果たすことが知られている（例えば、非特許文献１）。表面に高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質を持つウイルスとして、上記以外に、ウエストナイルウイルス、デング熱ウイルス、マールブルグウイルス、黄熱ウイルス、サイトメガロウイルスが報告されている。また、重症熱性血小板減少症候群（ＳＦＴＳ）ウイルスなどの各種出血性ウイルス類も樹状細胞のＤＣ‐ＳＩＧＮレセプターを介し感染するという感染形式の共通性から、表面に高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質を持っているものと考えられる。
【０００４】
また、ウイルス以外にも、原生生物であるリーシュマニア、カビの一種であるカンジダ・アルビカンス、その他、マイコバクテリウム、マンソン住血吸虫等も、その表面に高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質を持っていることが報告されている。
【０００５】
これまでに、海藻類または藻類（淡水産藍藻）から多くの種類のレクチンが単離され、その生化学的性質が明らかにされている。上記レクチンの一部は、高マンノース型糖鎖に特異的に結合すること、および、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス等の上述のウイルスに特異的に結合することが知られている（非特許文献２〜１２）。また、トサカノリ（Meristotheca papulosa (Montagne) J. Agardh）由来のレクチン（ＭＰＬ）を、高マンノース型糖鎖を備えるウイルス（高マンノース型糖鎖がウイルスの表面に存在するウイルス）を標的とする抗ウイルス剤として用いうることも知られている（特許文献５）。
【０００６】
レクチンを用いたＨＩＶなどの分離に関しては、レクチンとＨＩＶとの結合に関する発明として、例えば、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）などのレクチンが結合した疎水性基材からなる微粒子固定化担体にＨＩＶまたはその一部のタンパク質もしくはペプチドを捕捉してなる微粒子を含有するエイズワクチン（特許文献１）、ＧＮＡなどのレクチンを固定した多孔性中空糸膜に血液を通過させ、ウイルスに感染した個体の血液中のウイルス粒子及びそのレクチン結合性フラグメントを減じる方法（特許文献２）、癌患者における感染症の予防および／または処置用の医薬の製造において、マンナン結合レクチンサブユニット等を含むマンナン結合レクチンオリゴマーを含有する組成物を使用する発明（特許文献３）、スクシニル‐コンカナバリンＡなどのレクチンを結合成分として用い、ウイルス粒子を含んでなるサンプルのウイルス力価を高める方法（特許文献４）などが知られている。
【０００７】
また、タンパク質アレイ上のタンパク質の量を定量するタンパク質アレイとして、モノリスゲル基板上にタンパク質を配向制御して高密度で固定化したタンパク質アレイが知られている（特許文献６）。
【０００８】
なお、レクチンはラテン語のlectus (選別の意味)がその名の由来であり、１８８８年、ロシアの研究者であるHermann Stillmarkによりヒマの実の抽出液から血球凝集素として発見されたのが最初である。そして、これまでに見つかっている多くのレクチンは赤血球凝集活性やその阻害試験により発見されてきた（非特許文献１３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００１‐３３５５１０号公報（２００１年１２月４日公開）
【特許文献２】特表２００７‐５２５２３２号公報（２００７年９月６日公表）
【特許文献３】特表２００８‐５３５８７２号公報（２００８年９月４日公表）
【特許文献４】特表２００４‐５００８３１号公報（２００４年１月１５日公表）
【特許文献５】特開２０１２‐２１３３８２号公報（２０１２年１１月８日公開）
【特許文献６】特開２０１０‐１２７８５３号公報（２０１０年６月１０日公開）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Kilby, J. M. and Eron, J. J., N. Engl. J. Med. 348, 2228-2238, 2003.
【非特許文献２】Boyd, M. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 41, 1521-1530, 1997.
【非特許文献３】O’Keefe, B. R. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 47, 2518-2525, 2003.
【非特許文献４】Helle, F., .et al., J. Biol. Chem. 281, 25177-25183, 2006.
【非特許文献５】Barrientos, L. G., et al., Antiviral. Res. 58, 47-56, 2003.
【非特許文献６】Dey, B., et al., J. Virol. 74, 4562-4569, 2000.
【非特許文献７】O’Keefe, B. R. et al., J. Virol. 84, 2511-2521, 2010.
【非特許文献８】Hori, K. et al., Glycobiology, 17, 479-491, 2007.
【非特許文献９】Sato, Y. et al., J. Biol. Chem. 282, 11021-11029, 2007.
【非特許文献１０】Sato, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. commun. 405, 291-296, 2011.
【非特許文献１１】佐藤雄一郎、平山  真、藤原佳史、森本金治郎、堀  貫治 (2010) 第１３回マリンバイオテクノロジー学会大会講演要旨 (2010. 5.29発表)
【非特許文献１２】Sato, Y. et al., J. Biol. Chem. 286, 19446-19458, 2011.
【非特許文献１３】日本農芸化学会関東支部2009年度第一回支部例会講演要旨集 日時：2009年7月4日 会場：日本獣医生命科学大学 発表：2009年度農芸化学会奨励賞受賞記念講演  R1-01 レクチンの構造・機能解析と糖鎖生物学への応用、舘野浩章（独立行政法人産業技術総合研究所・糖鎖医工学研究センター）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記特許文献１〜４で用いられているレクチンは赤血球凝集作用を有する。そのため、上記レクチンは、全血を対象として血中ウイルスを分離するデバイス等には直接使用することができず、血漿分離後に接触させることなどが必要であった。
【００１２】
一方、海藻類または藻類由来のレクチンは、上述のようにウイルスとの結合性を示すものがあることは知られており、トリプシンまたはプロナーゼで処理したウサギおよびヒツジの赤血球を凝集させることが知られている。しかし、ヒト血液に対する適合性については知られておらず、ヒトの血液に影響を与えることなく、血中に含有されるウイルスを分離することができるか否かについては知見が存在していなかった。また、上記レクチンをどのような固定化担体に固定すれば、全血を処理した場合でも血中のウイルスを効率よく分離することができるかという点についての知見も存在していなかった。
【００１３】
本発明は、このような問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、血液適合性に優れ、検体がヒトの全血であっても、当該検体に含有されるウイルスを効率良く分離可能な、ウイルス分離デバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記の課題を解決するために、本発明者は鋭意検討し、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドを固定化担体に固定したデバイスを作製した。そして、当該デバイスを用いることにより、検体がヒトの全血であっても、検体中に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を効率よく分離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１５】
〔１〕検体に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を検体から分離可能なウイルス分離デバイスであって、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドと、上記ポリペプチドを固定する固定化担体と、を備え、上記ポリペプチドが上記固定化担体に固定されており、上記固定化担体がモノリスゲルであり、上記ポリペプチドは、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチン、タイプＩＩＩレクチンおよびタイプＩＶレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであることを特徴とするデバイス。
【００１６】
〔２〕上記検体がヒトの全血であり、上記全血を上記ポリペプチドに接触させることによって、上記全血に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を上記全血から分離可能であることを特徴とする〔１〕に記載のデバイス。
【００１７】
〔３〕上記モノリスゲルは、マクロポア径が１μｍ以上２００μｍ以下であり、メソポア径が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載のデバイス。
【００１８】
〔４〕上記モノリスゲルは、マクロポア径が２０μｍ以上２００μｍ以下であることを特徴とする〔３〕に記載のデバイス。
【００１９】
〔５〕上記モノリスゲルはシリカモノリスであることを特徴とする〔１〕から〔４〕のいずれか１つに記載のデバイス。
【００２０】
〔６〕上記ポリペプチドは、上記固定化担体１ｍｌあたり２μｇ以上固定されることを特徴とする〔１〕から〔５〕のいずれか１つに記載のデバイス。
【００２１】
〔７〕上記ポリペプチドは、ペプチド鎖のカルボキシ末端で上記固定化担体に固定化されていることを特徴とする〔１〕から〔６〕のいずれか１つに記載のデバイス。
【００２２】
〔８〕上記ポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を１個以下有することを特徴とする〔７〕に記載のデバイス。
【００２３】
〔９〕上記ポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を含まないことを特徴とする〔８〕に記載のデバイス。
【００２４】
〔１０〕上記ポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基およびリジン残基を含まないことを特徴とする〔９〕に記載のデバイス。
【００２５】
〔１１〕上記ウイルスが、高マンノース型糖鎖を有するウイルスであることを特徴とする〔１〕から〔１０〕のいずれか１つに記載のデバイス。
【００２６】
〔１２〕上記ウイルスが、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、デングウイルス、エイズウイルス、エボラウイルスおよび重症急性呼吸症候群ウイルスからなる群より選ばれる１種または２種以上のウイルスであることを特徴とする〔１〕から〔１１〕のいずれか１つに記載のデバイス。
【００２７】
〔１３〕上記ウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞が、エイズウイルスおよび／またはエイズウイルス感染Ｔ細胞であることを特徴とする〔１〕から〔１２〕のいずれか１つに記載のデバイス。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係るウイルス分離デバイスは、高マンノース型糖鎖に特異的に結合する所定のポリペプチドが固定化担体であるモノリスゲルに固定されているため、ヒトの血液に対する影響を与えることなく、検体に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を検体から効率よく分離することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】組換え体である担体固定化用ポリペプチドの構造の概略を示す模式図である。
【図２】１％溶血（Positive Control）を１．０としたときの、レクチンへの接触時間が５分での溶血の程度を示すグラフである。
【図３】１％溶血（Positive Control）を１．０としたときの、レクチンへの接触時間が３０分での溶血の程度を示すグラフである。
【図４】ウイルス分離デバイスのカラム通過画分について、蛍光抗体法でＨＩＶ‐１の抗原であるＰ２４タンパク質を染色した結果を示す写真である。
【図５】高マンノース型糖鎖の構造の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明に係るウイルス分離デバイスについて詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更、実施することができる。
【００３１】
なお、本明細書において、範囲を示す「Ａ〜Ｂ」は、Ａ以上Ｂ以下であることを表す。また、本明細書中に記載された特許文献および非特許文献は、本明細書中において参考として援用される。
【００３２】
〔１．ウイルス分離デバイス〕
本発明に係るウイルス分離デバイスは、検体に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を検体から分離可能なウイルス分離デバイスであって、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドと、上記ポリペプチドを固定する固定化担体と、を備え、上記ポリペプチドが上記固定化担体に固定されており、上記固定化担体がモノリスゲルであり、上記ポリペプチドは、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチン、タイプＩＩＩレクチンおよびタイプＩＶレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンである。
【００３３】
（１）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド
高マンノース型糖鎖とは、Ｎ型糖鎖に共通する「トリマンノシルコア」と呼ばれる〔Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕からなる共通母核構造に加え、分岐構造部分にα‐マンノース残基のみを含んでおり、〔Manα1-6（Manα1-3）Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc〕という七糖を共通の母核として含む糖鎖である。
【００３４】
「高マンノース型糖鎖に特異的に結合する」とは、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有し、かつ、複合型糖鎖および混成型糖鎖に対する結合性を有さないことをいう。
【００３５】
上述したようにＨＩＶウイルス、インフルエンザウイルス等のウイルスは、高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質を表面に有している。
【００３６】
一方、人間の体細胞表面には、高マンノース型糖鎖、および上記糖タンパク質はほとんど存在しないと考えられている。本発明に係るウイルス分離デバイスは、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドを備えているため、例えばヒトの全血などの生体由来の検体と接触した場合、上記糖タンパク質を有するウイルスが検体中に含まれていると、上記ウイルスの高マンノース型糖鎖に特異的に結合するため、検体中の他の成分に与える影響は非常に小さい。
【００３７】
しかも、本発明に係るウイルス分離デバイスは、上記ポリペプチドが固定化担体であるモノリスゲルに固定されているため、上記ポリペプチドが上記ウイルスと接触しやすい状態になっており、極めて効率的に上記ウイルスおよび／または上記ウイルスに感染した細胞（以下、ウイルスと、ウイルスに感染した細胞とを総称して単に「ウイルス」という場合がある）を検体から分離することができる。
【００３８】
以上のことから、本発明に係るウイルス分離デバイスは、ヒトの全血等の検体に対し影響を与えることなく、検体中のウイルスを極めて効率的に検体から分離することができる。
【００３９】
ここで、高マンノース型糖鎖の「糖鎖」とは、直鎖または分岐したオリゴ糖または多糖を意味する。オリゴ糖とは、単糖または単糖の置換誘導体が２〜１０個脱水結合して生じたものをいう。さらに多数の単糖が結合している糖質を多糖という。
【００４０】
本発明では、高マンノース型糖鎖と特異的に結合するポリペプチドとして、分岐オリゴマンノシドの認識部位と一次構造の違いとに基づいて下記の４つのタイプに分類されるレクチン（堀貫治、バイオサイエンスとインダストリー  vol.71  No.2（2013）129-133）、つまり、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチン、タイプＩＩＩレクチンおよびタイプＩＶレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンを用いる。図５は、高マンノース型糖鎖の構造の一例を示す図である。図中、Ｄ１〜Ｄ３は、それぞれＤ１アーム〜Ｄ３アームを表す。
（ａ）タイプＩ：高マンノース型糖鎖のＤ２アームの非還元末端にα（１‐３）Ｍａｎ残基を有するものと強く結合し、当該残基にα（１‐２）Ｍａｎが付加したものでは結合力が著しく低下する。また、Ｍａｎα１‐６（Ｍａｎα１‐３）Ｍａｎα１‐６（Ｍａｎα１‐３）‐Ｍａｎ構造を認識部位とする。
（ｂ）タイプＩＩ：Ｄ１アームの非還元末端のα（１‐２）Ｍａｎ残基、Ｄ２アームの非還元末端のα（１‐２）Ｍａｎ残基、およびＤ３アームの非還元末端のα（１‐２）Ｍａｎ残基を認識部位とし、α（１‐２）Ｍａｎ残基数が多い高マンノース型糖鎖に対してより強く結合する。非還元末端にα（１‐２）Ｍａｎ残基をもたない高マンノース型糖鎖とは結合しない。
（ｃ）タイプＩＩＩ：分岐糖鎖部分の構造の違いを認識せず、全ての高マンノース型糖鎖と遊離トリマンノシルコア構造（（Manα1-6（Manα1-3）Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA）とに結合する。遊離トリマンノシルコア構造への結合性よりも、高マンノース型糖鎖への結合性の方がより高い。
（ｄ）タイプＩＶ：Ｄ３アームの非還元末端にα（１‐２）Ｍａｎ残基を持つものとのみ結合する。
【００４１】
上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに属するレクチンとしては、海藻類または藍藻類から単離可能なレクチンである藻類由来レクチンを挙げることができる。なお、「レクチン」とは、分子内に糖結合ドメインをもつタンパク質で、抗体を除くものの総称である。
【００４２】
上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに属する藻類由来レクチンとしては、例えば、タイプＩレクチンとして、淡水産藍藻Oscillatoria agardhii由来のＯＡＡ（UniProtKB/Swiss-Prot Accession No.: P84330；アミノ酸配列を配列番号５に示す）、海藻トゲキリンサイ（Eucheuma serra）由来のＥＳＡ（ＥＳＡ‐１、ＥＳＡ‐２（GenBank Accession No.: P84331；アミノ酸配列を配列番号２９に示す））、海藻Kappaphycus alvarezii由来のＫＡＡ（ＫＡＡ‐１（GenBank Accession No: LC007080；アミノ酸配列を配列番号６に示す）、ＫＡＡ‐２（GenBank Accession No: LC007081；アミノ酸配列を配列番号３０に示す）、ＫＡＡ‐３）、海藻Kappaphycus striatum由来のＫＳＡ（ＫＳＡ‐１、ＫＳＡ‐２）、海藻アマクサキリンサイ（Eucheuma amakusaensis）由来のＥＡＡ（ＥＡＡ‐１、ＥＡＡ‐２、ＥＡＡ‐３）、海藻Eucheuma denticulatum由来のＥＤＡ（ＥＤＡ‐１、ＥＤＡ‐２（GenBank Accession No.: LC007085；アミノ酸配列を配列番号３３に示す）、ＥＤＡ‐３）、海藻ミリン（Solieria pacifica）由来のＳｏｌｎｉｎ（Ｓｏｌｎｉｎ  Ａ、Ｓｏｌｎｉｎ  Ｂ、Ｓｏｌｎｉｎ  Ｃ）、海藻トサカノリ（Meristotheca papulosa）由来のＭＰＡ（ＭＰＡ‐１（GenBank Accession No: LC008514；アミノ酸配列を配列番号３４に示す）、ＭＰＡ‐２（GenBank Accession No: LC008515；アミノ酸配列を配列番号３５に示す））、海藻シラモ（Gracilaria bursa-pastoris）由来のＧｒａｎｉｎ‐ＢＰ、海藻Agardhiella subulata由来のＡＳＬ（ＡＳＬ‐１（GenBank Accession No: LC007083；アミノ酸配列を配列番号３１に示す）、ＡＳＬ‐２（GenBank Accession No: LC007084；アミノ酸配列を配列番号３２に示す））、細菌Pseudomonas fluorescens由来のＰＦＬ（GenBank Accession No: ABA72252；アミノ酸配列を配列番号３７に示す）、細菌Myxococcus xanthus由来のＭＢＨＡ（GenBank Accession No: M13831；アミノ酸配列を配列番号３８に示す）、細菌Burkholderia oklahomensis由来のＢＯＡ（GenBank Accession No: AIO69853；アミノ酸配列を配列番号３９に示す）等を用いることができる。
【００４３】
また、本発明者は、タイプＩのレクチンのアミノ酸配列と共通する配列を有するtheoretical proteinsが、他生物種（細菌、藍藻）にも存在することをデータベース（GenBank）検索から見出しているが、上記theoretical proteinsを用いることもできる。上記theoretical proteinsとしては、例えば、Lyngbya sp. PCC 8106 (Accession No. ZP_01622218)の配列番号４０に示す演繹アミノ酸配列を有するタンパク質、Herpetosiphon aurantiacus ATCC 23779(Accession No. YP_001544456) の配列番号４１に示す演繹アミノ酸配列を有するタンパク質、Stigmatella aurantiaca DW4/3-1(Accession No. ZP_01464390) の配列番号４２に示す演繹アミノ酸配列を有するタンパク質、等を挙げることができる。
【００４４】
タイプＩＩレクチンとしては、例えば、海藻 アオモグサ（Boodlea coacta）由来のＢＣＡ（GenBank Accession No: BAK23238；アミノ酸配列を配列番号７に示す））等を用いることができる。
【００４５】
タイプＩＩＩレクチンとしては、例えば、海藻ハネモ（Bryopsis plumosa）由来のＢＰＬ‐１７（GenBank Accession No: BAI43482；アミノ酸配列を配列番号８に示す）、海藻オオハネモ（Bryopsis maxima）由来のＢＭＬ‐１７（GenBank Accession No: BAI94585；アミノ酸配列を配列番号３６に示す）等を用いることができる。
【００４６】
タイプＩＶレクチンとしては、海藻Meristhotheca papulosa由来のＭＰＬ‐１（GenBank Accession No: LC007082；アミノ酸配列を配列番号９に示す）、ＭＰＬ‐Ｐ２、ＭＰＬ‐２およびＭＰＬ‐Ｐ４等を挙げることができる。なお、配列番号９に示すアミノ酸配列において、Ｎ末端はピログルタミン酸である。
【００４７】
以上、タイプＩからタイプＩＶのレクチンを例示したが、本発明で用いる高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドは、上記例示したレクチンに限定されるものではない。２種以上の上記レクチンを用いる場合、使用量の比は任意であってよい。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。上記藻類由来レクチンを初めとする「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」は、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００４９】
なお、上記藻類由来レクチンは、従来公知の方法によって海藻類または藍藻類から単離することができる。例えば、ＯＡＡは文献（Sato, Y. et al., Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol., 125, 169-177,2000）に開示の方法；ＥＳＡ‐１およびＥＳＡ‐２は文献（Kawakubo, A. et al., J. Appl. Phycol. 9, 331-338,1997）に開示の方法；ＥＡＡ‐１、ＥＡＡ‐２およびＥＡＡ‐３は文献（Kawakubo, A. et al., J. Appl. Phycol. 11, 149-156,1999）に開示の方法；ＥＤＡ‐１、ＥＤＡ‐２およびＥＤＡ‐３は文献（Hung,L.D. et al., J. Appl. Phycol. in press（DOI 10.1007/s10811-014-0441-0））に開示の方法；ＫＡＡ‐１、ＫＡＡ‐２およびＫＡＡ‐３は文献（Hung, L.D. et al., Fish. Sci. 75, 723-730,2009）に開示の方法；ＫＳＡ‐１およびＫＳＡ‐２は文献（Hung, L.D. et al., Phytochemistry 72, 855-861,2011）に開示の方法；Ｓｏｌｎｉｎ Ａ、Ｓｏｌｎｉｎ ＢおよびＳｏｌｎｉｎ Ｃは文献（Hori, K. et al., Phytochemistry 27, 2063-2067,1988）に開示の方法；Ｇｒａｎｉｎ‐ＢＰは文献（Okamoto, T. et al., Experientia. 46, 975-977,1990）に開示の方法；ＭＢＨＡは文献（Cumsky, M. G., Zusman, D. R., J. Biol. Chem. 256, 12581-12588, 1981）に開示の方法、によってそれぞれ単離することができる。
【００５０】
また、ＢＯＡは文献（Whitley, M. J. et al., FEBS J. 280, 2056-2067, 2013）に開示の方法、ＰＦＬは文献（Sato, Y. et al., PLoS One 7, e45922, 2012）に開示の方法によって大腸菌発現系を用いてそれぞれ単離することができる。
【００５１】
ＭＰＡ‐１およびＭＰＡ‐２は、海藻Meristotheca papulosa生藻体を液体窒素下で粉末とした後、０．８５％ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で抽出操作し、その後、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィーに順次供することで単離することができる。
【００５２】
ＡＳＬ‐１およびＡＳＬ‐２は、海藻Agardhiella subulata生藻体を液体窒素下で粉末とした後、０．８５％ ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で抽出操作し、その後、硫安塩析、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過に順次供することで単離することができる。
【００５３】
ＢＣＡは文献（Sato, Y. et al., J. Biol. Chem. 286, 19446-19458,2011）に開示の方法で単離することができる。ＢＭＬ‐１７は特許第４８７６２５８号公報に開示の方法、ＢＰＬ‐１７は、海藻Bryopsis plumosaから、上記公報に開示されるＢＭＬ‐１７の単離方法と同様の手法によって単離することができる。
【００５４】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質としては、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００５５】
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１‐５１３５（１９８５））。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００５６】
上記高マンノース型糖鎖と特異的に結合するポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、上記ポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、上記ポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００５７】
例示した上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに属する藻類由来レクチンのアミノ酸配列および塩基配列は公知である。一実施形態において、上記藻類由来レクチンは、それぞれの公開されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよいし、当該ポリペプチドの変異体であってもよい。
【００５８】
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強い親水性の残基を強い疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００５９】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００６０】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。
【００６１】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または挿入を有する。好ましくは、サイレント置換、挿入、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明にかかるポリペプチド活性を変化させない。
【００６２】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００６３】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，  Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６‐１３１０  （１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００６４】
上記藻類由来レクチンは、それぞれの公開されたアミノ酸配列からなるポリペプチド；または、上記アミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、からなるポリペプチドであることが好ましい。
【００６５】
上記「１個もしくはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００６６】
一方、本発明に係るウイルス分離デバイスに用いる「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」は、配向制御して固定化担体に固定化することが好ましい。つまり、上記ポリペプチドは、ペプチド鎖の一端で上記固定化担体に固定化されていることが好ましい。この点については後述するが、配向制御して固定化担体に固定化するためには、（１）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を１個以下有すること；（２）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を含まないこと；もしくは、（３）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基およびリジン残基を含まないこと、がより好ましい。そのため、上述したアミノ酸置換またはアミノ酸添加を行うことは可能であるが、あるアミノ酸のシステインまたはリジンへの置換は行わないことがより好ましい。
【００６７】
なお、本発明に係るウイルス分離デバイスに用いる「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」は、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００６８】
また、上記「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００６９】
上記「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」は、融合タンパク質のような改変された形態で組換え体として発現され得る。後述するように、固定化担体としてシリカモノリス等のモノリスゲルを用いる場合、上記ポリペプチドのカルボキシ末端にリンカー配列、固定化反応用配列、および精製タグ配列を付加した組換え体として発現させることが好ましい。上記精製タグ配列は、融合タンパク質の簡便な精製に寄与することができ、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。
【００７０】
精製タグ配列としては、例えばヘキサヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な「ＨＡ」タグ等を利用することができる。
【００７１】
（２）ポリペプチドを固定する固定化担体
本発明に係るウイルス分離デバイスは、上記「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」を固定する固定化担体を備える。上記固定化担体としては、溶液の流路となるマクロポア（マクロ細孔）と、分離の場となるメソポア（メソ細孔）とを備え、上記ポリペプチドを固定しやすく、かつ、全血をも処理可能であり、上記ポリペプチドと検体中のウイルスが含有する高マンノース型糖鎖との結合を効率的に行うことができることから、固定化担体としては、モノリスゲルを用いる。
【００７２】
モノリスゲルとは、モノリス材料（モノリス型ポリマー）でできたゲルをいう。モノリス材料は、単一の連続的な構造体から構成され、その構造を貫通する連続的な流路となる孔を有する。モノリスゲルは、水溶液ゾルを作成するゾル化ステップ、得られたゾルを加温してゲルにするゲル化ステップ、得られたゲルを焼成する焼成ステップにより製造することができる。
【００７３】
モノリスゲルは、例えば、シリカを主成分とする反応溶液を、相分離を伴うゾル‐ゲル転移を起こさせることにより得られる。ゾル‐ゲル反応に用いられるゲル形成を起こす網目成分の前駆体としては、金属アルコキシド、錯体、金属塩、有機修飾金属アルコキシド、有機架橋金属アルコキシド、およびこれらの部分加水分解生成物、部分重合生成物である多量体を用いることができる。水ガラスほかケイ酸塩水溶液のｐＨを変化させることによるゾル‐ゲル転移も、同様に利用することができる。
【００７４】
さらに具体的に、モノリスゲルは、水溶性高分子、熱分解性の化合物を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行い、生成物が固化した後、次いで湿潤状態のゲルを加熱することにより、ゲル調製時にあらかじめ溶解させておいた低分子化合物を熱分解させ、次いで乾燥し加熱して製造することが好ましい。
【００７５】
ここで、上記水溶性高分子は、理論的には適当な濃度の水溶液と成し得る水溶性有機高分子であって、加水分解性の官能基を有する金属化合物によって生成するアルコールを含む反応系中に均一に溶解し得るものであれば良い。具体的には、高分子金属塩であるポリスチレンスルホン酸のナトリウム塩またはカリウム塩、高分子酸であって解離してポリアニオンとなるポリアクリル酸、高分子塩基であって水溶液中でポリカチオンを生ずるポリアリルアミンおよびポリエチレンイミン、あるいは中性高分子であって主鎖にエーテル結合を持つポリエチレンオキシド、側鎖にカルボニル基を有するポリビニルピロリドン等が好適である。また、有機高分子に代えてホルムアミド、多価アルコール、界面活性剤を用いてもよく、その場合多価アルコールとしてはグリセリンが、界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類が最適である。
【００７６】
上記加水分解性の官能基を有する金属化合物としては、金属アルコキシド又はそのオリゴマーを用いることができ、これらのものは例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等の炭素数の少ないものが好ましい。また、その金属としては、最終的に形成される酸化物の金属、例えばＳｉ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ａｌが使用される。この金属としては１種又は２種以上であっても良い。一方オリゴマーとしてはアルコールに均一に溶解分散できるものであればよく、具体的には１０量体程度まで使用できる。
【００７７】
また、上記酸性水溶液としては、通常塩酸、硝酸等の鉱酸０．００１モル濃度以上のもの、あるいは酢酸、ギ酸等の有機酸０．０１モル濃度以上のものが好ましい。
【００７８】
相分離・ゲル化は、溶液を室温４０〜８０℃で０．５〜５時間保存することにより達成できる。相分離・ゲル化は、当初透明な溶液が白濁してシリカ相と水相との相分離を生じついにゲル化する過程を経る。この相分離・ゲル化で水溶性高分子は分散状態にありそれらの沈殿は実質的に生じない。
【００７９】
あらかじめ共存させる、上記熱分解性の化合物の具体的な例としては、尿素あるいはヘキサメチレンテトラミン、ホルムアミド、Ｎ‐メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミド、アセトアミド、Ｎ‐メチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ‐ジメチルアセトアミド等の有機アミド類を利用できるが、加熱後の溶媒のｐＨ値が重要な条件であるので、熱分解後に溶媒を塩基性にする化合物であれば特に制限はない。
【００８０】
共存させる上記熱分解性化合物は、化合物の種類にもよるが、例えば尿素の場合には、反応溶液１０ｇに対し、０．０５〜０．８ｇ、好ましくは０．１〜０．７ｇである。また、加熱温度は、例えば尿素の場合には４０〜２００℃で、加熱後の溶媒のｐＨ値は、６．０〜１２．０が好ましい。
【００８１】
また、熱分解によってフッ化水素酸のようにシリカを溶解する性質のある化合物を生じるものも、同様に利用できる。
【００８２】
上記方法では、水溶性高分子を酸性水溶液に溶かし、それに加水分解性の官能基を有する金属化合物を添加して加水分解反応を行うと、溶媒リッチ相と骨格相とに分離したゲルが生成する。生成物（ゲル）が固化した後、適当な熟成時間を経た後、湿潤状態のゲルを加熱することによって、反応溶液にあらかじめ溶解させておいたアミド系化合物が熱分解し、骨格相の内壁面に接触している溶媒のｐＨが上昇する。そして、溶媒がその内壁面を浸食し、内壁面の凹凸状態を変えることによって細孔径を徐々に拡大する。
【００８３】
シリカを主成分とするゲルの場合には、酸性あるいは中性領域においては変化の度合は非常に小さいが、熱分解が盛んになり水溶液の塩基性が増すにつれて、細孔を構成する部分が溶解し、より平坦な部分に再析出することによって、平均細孔径が大きくなる反応が顕著に起こるようになる。
【００８４】
巨大空孔を持たず３次元的に束縛された細孔のみを持つゲルでは、平衡条件としては溶解し得る部分でも、溶出物質が外部の溶液にまで拡散できないために、元の細孔構造が相当な割合で残る。これに対して巨大空孔となる溶媒リッチ相を持つゲルにおいては、２次元的にしか束縛されていない細孔が多く、外部の水溶液との物質のやり取りが十分頻繁に起こるため、大きい細孔の発達に並行して小さい細孔は消滅し、全体の細孔径分布は顕著に広がることがない。
【００８５】
なお、加熱過程においては、ゲルを密閉条件下に置き、熱分解生成物の蒸気圧が飽和して溶媒のｐＨが速やかに定常値をとるようにすることが有効である。
【００８６】
溶解・再析出反応が定常状態に達し、これに対応する細孔構造を得るために要する、加熱処理時間は、巨大空孔の大きさや試料の体積によって変化するので、それぞれの処理条件において実質的に細孔構造が変化しなくなる、最短処理時間を決定することが必要である。
【００８７】
加熱処理を終えたゲルは、溶媒を気化させることによって、溝内において、管壁に密着した乾燥ゲルとなる。この乾燥ゲル中には、出発溶液中の共存物質が残存する可能性があるので、適当な温度で熱処理を行い、有機物等を熱分解することによって、目的の無機系多孔質体を得ることができる。なお、乾燥は、３０〜８０℃で数時間〜数十時間放置して行い、熱処理は、２００〜８００℃程度で加熱する。
【００８８】
モノリスゲルとしては、例えば、アクリルアミド系、メタクリル酸エステル系、スチレン‐ジビニルベンゼン系などの有機系モノリス、シリカモノリス等を用いることができ、後述する一級アミノ基を導入しやすいため、シリカモノリスが特に好適に用いられるが、これに限られるものではない。
【００８９】
上記モノリスゲルは、マクロポア径が１μｍ以上２００μｍ以下であり、メソポア径が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。上記構成によれば、マクロポア径が血球を通過させうる大きさであると共に、メソポア径が分離対象であるウイルスの約２倍以上の大きさとなっているため、ウイルスを通過させやすく、かつ、単位体積当たりの分離可能なウイルス量を高く維持することができる。
【００９０】
そのため、上記モノリスゲルに上記「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」を固定することによって、ウイルスが有する高マンノース型糖鎖と上記ポリペプチドとを特異的に結合させることができる。したがって、ウイルスを効率よく検体から分離することができる。
【００９１】
なお、メソポア径が２００ｎｍを超えると、ゲルの強度が著しく低下し、実使用に耐えないものとなるため好ましくない。
【００９２】
上記モノリスゲルは、マクロポア径が２０μｍ以上２００μｍ以下であり、メソポア径が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることがより好ましい。上記構成によれば、マクロポアへの負荷圧を軽減しつつ、血球を通過させ、かつ、高分離能を維持することができる。したがって、ウイルスをより効率よく検体から分離することができ、全血の処理も容易に行うことができる。
【００９３】
モノリスゲルは上述のようにゾル‐ゲル法によって調製することができる。１μｍ以上２００μｍ以下、２０μｍ以上２００μｍ以下などの所望の大きさのマクロポア径を有するモノリスゲルは、相分離を誘起するために加える水溶性ポリマーの分子量および添加量、相分離のタイミングに影響を与えるブロックコポリマーの添加量等を調整し、ゾルの粘度を調整すること等によって得ることができる。
【００９４】
また、モノリスゲルのメソポア径は、ゲル化後のエージング条件によって制御することができる。例えば、エージングにおける溶媒組成、加熱温度、および加熱時間を調整することによって、１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下、４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下などの所望の大きさのメソポア径を有するモノリスゲルを得ることができる。
【００９５】
マクロポア径およびメソポア径は、例えば水銀圧入法等の従来公知の方法によって細孔径の分布を測定することや、モノリスゲルを顕微鏡で観察すること等によって確認することができる。
【００９６】
また、モノリスゲルは市販品を用いてもよい。市販品としては例えば、MonoBisカラム  低圧タイプ  未修飾  品番：3250L30SI  マクロポア径１．４μｍ・メソポア径３０ｎｍ（（株）京都モノテック製）等を用いることができる。
【００９７】
上記「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」は、固定化担体１ｍｌあたり２μｇ以上固定されることが好ましく、１０μｇ以上固定されることがより好ましく、１００μｇ以上固定されることがさらに好ましく、１ｍｇ以上固定されることが特に好ましい。上記構成によれば、固定化担体の単位体積当たりに上記ポリペプチドが高密度に固定化されるため、検体中のウイルスを検体から効率よく分離する上で好ましい。
【００９８】
なお、上記ポリペプチドの固定化担体１ｍｌ当たりの固定化量の上限値は、１０ｍｇ以下であることが好ましい。
【００９９】
上記ポリペプチドが固定化担体に所望の量固定化されているか否かについては、例えば、反応前後の反応溶液中の上記ポリペプチドの濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定し、測定結果に基づき、反応で消費された上記ポリペプチドの量を求め、この量を固定化量とすることによって確認することができる。詳細は実施例４で後述する。
【０１００】
（３）ポリペプチドを固定化担体に固定化する方法
上記ポリペプチドを固定化担体（モノリスゲル）に固定化する方法は特に限定されないが、上記のように高密度に固定化するためには、上記ポリペプチドを配向制御して固定化担体に固定化することが好ましい。配向制御したポリペプチドの固定化とは、ポリペプチドをペプチド鎖の一端で上記固定化担体に固定化することをいい、例えばペプチド鎖のカルボキシ末端で固定化することをいう。配向制御してポリペプチドを固定化する方法としては、例えば特許第２５１７８６１号公報、特開２０００‐１１９３００号公報、特開２００３‐３４４３９６号公報に記載の方法が挙げられる。
【０１０１】
上記固定化担体はモノリスゲルであるため、上記ポリペプチドを固定化するために、モノリスゲルにエポキシ基を導入し、続いてアミノ基含有ポリマーを導入することによって、一級アミノ基をモノリスゲルに高密度に導入することが好ましい。これによって、上記ポリペプチドを効率よく配向制御してモノリスゲルに固定化することができる。
【０１０２】
モノリスゲルへのエポキシ基の導入は、例えば、モノリスゲルをエポキシシランの溶液中に浸漬することによって行うことができる。また、一級アミノ基の導入はアミノ基含有ポリマーをモノリスゲル表面に添加し、内部に浸透させればよい。これらの操作によりモノリスゲルにエポキシ基を導入し、さらにエポキシ基に一級アミノ基を共有結合により結合させることができる。
【０１０３】
上記一級アミノ基への上記ポリペプチドの固定化の一例として、特開２０００‐１１９３００号公報に開示の方法に基づく方法について説明する。
【０１０４】
上記「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」を、一般式（２）で表す。
ＮＨ2 -Ｒ1 -ＣＯＯＨ・・・（２）
（式中、Ｒ1 は任意のアミノ酸残基を表す）
次に、一般式（２）で表されるポリペプチドに、以下の一般式（３）で表されるペプチドが結合した、以下の一般式（４）で表される融合ポリペプチドを作製し、この融合ポリペプチドのＳＨ基をシアノ化することによって、以下の一般式（５）で示されるシアノ基含有ポリペプチドに転換し、これを、以下の一般式（６）に示される固定化担体（モノリスゲル）に導入された一級アミノ基に結合させることによって、以下の一般式（１）で示されるポリペプチドとして固定化担体に固定化することができる。
【０１０５】
ＮＨ2 -Ｒ2 -ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ（ＣＨ2-ＳＨ）-ＣＯ-Ｘ・・・（３）
（式中、Ｒ2 は任意のアミノ酸残基、Ｘは、ＯＨもしくは任意のアミノ酸残基を表す）
ＮＨ2 -Ｒ1 -ＣＯ-ＮＨ-Ｒ2-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ（ＣＨ2-ＳＨ）-ＣＯ-Ｘ・・・（４）
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は任意のアミノ酸残基、Ｘは、ＯＨもしくは任意のアミノ酸残基を表す）
ＮＨ2 -Ｒ1 -ＣＯ-ＮＨ-Ｒ2-ＣＯ-ＮＨ-ＣＨ（ＣＨ2-ＳＣＮ）-ＣＯ-Ｘ・・・（５）
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は任意のアミノ酸残基、Ｘは、ＯＨもしくは任意のアミノ酸残基を表す）
ＮＨ2 -Ｙ・・・（６）
（式中、Ｙは固定化担体であるモノリスゲルを表す）
ＮＨ2 -Ｒ1-ＣＯ-ＮＨ-Ｒ2-ＣＯ-ＮＨ-Ｙ・・・（１）
（式中、Ｒ1 及びＲ2 は任意のアミノ酸残基、Ｙは固定化担体であるモノリスゲルを表す）
一般式（１）に示すように、Ｒ２は、固定化しようとする一般式（２）で表されるポリペプチドと、一級アミノ基との間のリンカーペプチド（リンカー配列）となる。Ｒ２は任意のアミノ酸残基であり、アミノ酸の種類、数ともに特に限定されないが、例えば、配列番号１に示すグリシン５残基からなる配列、配列番号２に示すグリシン６残基からなる配列などを用いることができる。なお、Ｒ1も任意のアミノ酸残基であり、アミノ酸の種類、数ともに特に限定されない。
【０１０６】
一般式（３）中、-ＮＨ-ＣＨ（ＣＨ2-ＳＨ）-ＣＯ-Ｘで表される部分は、本明細書において固定化反応用配列と称され、一般式（５）に示すようにシアノ化され、シアノ基を有するポリペプチドを生成することによって、一般式（６）で示される固定化担体との反応を可能とする。
【０１０７】
固定化反応配列には一般式（３）に示すように、一残基のシステインが含まれていることを要する。ＸはＯＨもしくは任意のアミノ酸残基（アミノ酸の種類、数ともに特に限定されない）であり、特に限定されないが、一般式（４）で示される物質の等電点は４〜５であることが好ましく、当該等電点を４〜５に調整することが容易であるため、Ｘとしてはアスパラギン酸やグルタミン酸を多く含む配列が好適である。例えば、アスパラギン酸６残基からなる配列や、アラニル‐ポリアスパラギン酸を好適に用いることができる。アラニル‐ポリアスパラギン酸は、一般式（５）に示されるシアノシステインの次位のアミノ酸をアラニンにすることにより、シアノシステイン残基を介したアミド結合形成反応を生じさせやすいことと、アミノ酸側鎖の中でアスパラギン酸のカルボキシル基が最も酸性であるため、上記等電点を４〜５に調整しやすいためである。
【０１０８】
固定化反応配列としては、一残基のシステインが含まれていれば特に限定されるものではないが、例えば配列番号３に示す、システイン１残基を含む８残基のアミノ酸からなる配列（ＣＡＤＤＤＤＤＤ）などを用いることができる。上記Ｘとしては、固定化反応配列のＣ末端側に、さらに、上述した精製タグ配列が付加されていることが好ましい。
【０１０９】
一般式（２）で表されるポリペプチドの一般式（４）で表される融合ポリペプチドへの転換は、従来公知の組換えＤＮＡ手法を用いることによって行うことができる。すなわち、一般式（２）で示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、一般式（３）で示されるペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとを結合することにより、一般式（４）で示される融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製し、これを大腸菌などの宿主生物で発現させ、その後、発現したポリペプチドを分離精製することにより、目的とする上記融合ポリペプチドを作製することができる。
【０１１０】
一般式（４）で表される融合ポリペプチドから一般式（５）で表される融合ポリペプチドへの転換、いわゆるシアノ化反応は、シアノ化試薬を用いて行うことができる。シアノ化試薬としては、通常、２‐ニトロ‐５‐チオシアノ安息香酸（２-ｎｉｔｒｏ-５-ｔｈｉｏｃｙａｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ （ＮＴＣＢ））（Ｙ．Ｄｅｇａｎｉ， Ａ．Ｐｔｃｈｏｒｎｉｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３，１-１１（１９７４）に記載）または、１-シアノ-４-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロほう酸（１‐ｃｙａｎｏ‐４-ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ ｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ（ＣＤＡＰ））などを用いる方法が簡便である。
【０１１１】
ＮＴＣＢおよびＣＤＡＰは市販のものをそのまま用いることができる。ＮＴＣＢを用いたシアノ化は、ｐＨ７‐９の間で効率よく行うことができ、かつ遊離するチオニトロ安息香酸の４１２ｎｍの吸光度の増加（分子吸光係数＝１３，６００Ｍ-1ｃｍ-1 ）で反応効率を調べることができる。また、ＳＨ基のシアノ化は、例えば、文献（Ｊ．Ｗｏｏｄ ＆ Ｃａｔｓｉｐｏｏｌａｓ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３３， ２８８７（１９６３））に記載の方法に従っても行うことができる。
【０１１２】
一般式（５）で示されるシアノ化された融合ポリペプチドと、一般式（６）で示される固定化担体（モノリスゲル）との反応は、弱アルカリ条件下（ｐＨ８〜１０）に、室温で行うことができる。
【０１１３】
固定化反応を行う溶媒としては、一般式（５）で示されるシアノ化した融合ポリペプチドが溶ける溶媒で、かつｐＨを調整できる溶媒であれば利用可能である。例えば、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液などの種々の緩衝液、メタノール、エタノールなどのアルコール類の他、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホオキサイドなどが利用可能である。反応温度は、室温で高い反応効率が得られるが、用いる溶媒が凍結もしくは沸騰しない範囲、及び一般式（５）で示されるシアノ化した融合ポリペプチドが変性の結果凝集しない温度範囲であれば問題なく用いることができる。
【０１１４】
このように、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドを固定化担体に固定することによって、上記ポリペプチドは、ペプチド鎖のカルボキシ末端で上記固定化担体に固定化される。つまり、配向制御して固定化担体に固定化されるため、当該担体に高密度に固定化される。それゆえ、高マンノース型糖鎖の結合効率を向上させることができるため、検体中に含まれるウイルスをより効率的に検体から分離することができる。また、固定化された上記ポリペプチド同士が互いに衝突することができないため、上記ポリペプチドの変性を可逆的なものとすることができる。
【０１１５】
（４）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの構造
高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドは、上述のように、ペプチド鎖のカルボキシ末端で上記固定化担体に固定化されていることが好ましい。
【０１１６】
本願明細書では、天然から単離したポリペプチドを「天然由来のポリペプチド」と称する。また、天然由来のポリペプチドと同じアミノ酸配列を持つ組換え体を「野生型ポリペプチド」と称し、天然由来のポリペプチドのアミノ酸配列中、システインおよび／またはリジン以外の１個または数個のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したポリペプチドも「野生型ポリペプチド」と称する。そして、天然由来のポリペプチドまたは野生型のポリペプチドが有する１以上のシステインおよび／またはリジンを他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を有するポリペプチドを「改変ポリペプチド」と称する。なお、上記「１個または数個」については既に説明したとおりである。
【０１１７】
後述する実施例２に示すように、天然由来のＫＡＡ‐１はシステインを１残基含み、リジンを１１残基含むが、システインを含まず、リジンを１１残基含む改変ＫＡＡ‐１と、上記システイン残基およびリジン残基をそのまま存置したＫＡＡ‐１（実施例２の「野生型ＫＡＡ‐１」）とは、ともに、「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」に、リンカー配列、固定化反応用配列および精製タグ配列を付加したポリペプチドである「担体固定化用ポリペプチド」の調製に成功している。なお、担体固定化用ポリペプチドは、上述した一般式（４）に示すポリペプチドに相当する。
【０１１８】
また、天然由来のＢＣＡはシステインを１残基含み、リジンを１０残基含むが、システインを含まず、リジンを９残基含む改変ＢＣＡと、野生型ＢＣＡとは、ともに、担体固定化用ポリペプチドの調製に成功している。
【０１１９】
さらに、天然由来のＯＡＡはシステインを含まず、リジンを１残基含むが、システインおよびリジンを含まない改変ＯＡＡも、担体固定化用ポリペプチドの調製に成功している。
【０１２０】
以上のことから、担体固定化用ポリペプチドを調製するためには、（１）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を１個以下有すること；（２）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を含まないこと；もしくは、（３）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基およびリジン残基を含まないこと、という条件のいずれかを満たすことがより好ましい。
【０１２１】
なお、「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列」とは、天然から単離された上記ポリペプチドと同一のアミノ酸配列をいう。
【０１２２】
上記一般式（２）に示す、天然由来の「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」のＲ１がシステイン残基を含まない場合は、一般式（４）に示す担体固定化用ポリペプチド中のＲ１がシアノ化され、固定化用担体への固定化反応の際に加水分解されてしまうことを回避することができるため、上記Ｒ１がシステイン残基を含まないこと（上記条件の（２）（３））が最も好ましい。
【０１２３】
上記Ｒ１がシステイン残基を１個含む場合は、システイン残基が外部に露出せずに存在し得るため、上記条件の（１）の場合も上記固定化反応を好適に行い得る。上記Ｒ１がシステイン残基を２個以上含む場合は、ＳＳ結合が存在する可能性があり、Ｒ１がシアノ化される可能性が高いため好ましくない。
【０１２４】
なお、「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」の天然由来のアミノ酸配列の一部が改変されたポリペプチドである、野生型のポリペプチドおよび改変ポリペプチドが、アミノ酸配列中にシステイン残基を含まないこと、等の上記条件を満たしていても、野生型のポリペプチドおよび改変ポリペプチドに対応する天然由来のポリペプチドのアミノ酸配列が上記条件を満たしていない場合は、担体固定化用ポリペプチドを調製する上で好ましくない。例えば、後述する実施例２では、改変ＢＰＬ‐１７、野生型ＢＰＬ‐１７、改変ＭＰＬ‐１および野生型ＭＰＬ‐１の発現が不首尾であったという結果が得られている。
【０１２５】
以上述べたように、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドを固定化用担体に配向制御して固定化するためには、上述したように、まず上記担体固定化用ポリペプチド（上記一般式（４）に示すポリペプチドに相当する）を調製することが好ましい。そのため、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドが上記条件のいずれかを満たす場合、上記配向制御を行う上で好適であると考えられる。
【０１２６】
（５）検体およびウイルスの分離
本発明に係るウイルス分離デバイスは、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドが固定化担体に固定されているため、検体中にウイルスが含有されていれば、これを効率よく検体から分離することができ、ウイルスに感染した細胞をも分離することができる。
【０１２７】
検体としては、上記ポリペプチドが凝集させるものではなく、かつ、固定化担体に固定された上記ポリペプチドに接触させることができるものであれば、特に限定されない。例えば、ヒトの全血、血漿、血清、唾液、鼻粘膜、尿、その他の体液等を挙げることができる。これらはそれ自体を検体として用いてもよいし、例えばＭＥＭ培地や生理食塩水等に添加して調製した液体として用いることもできる。
【０１２８】
本発明に係るウイルス分離デバイスは、上記検体がヒトの全血である場合も、上記全血を上記ポリペプチドに接触させることによって、上記全血に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を上記全血から分離可能である。
【０１２９】
上記特許文献１〜４で用いられているレクチンは、上述のように赤血球凝集作用を有する。そのため、上記レクチンは、ヒトの全血を対象として血中ウイルスを分離するデバイス等には直接使用することができず、血漿分離後に接触させることなどの必要があった。つまり、ヒトの全血をポリペプチドに直接接触させてウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を全血から分離することができるデバイスはこれまでに存在していなかった。
【０１３０】
例えば特許文献２にはＧＮＡ、ＮＰＡ、ＣｏｎＡおよびシアノビリンからなる群より選択されるレクチンを、多孔性中空糸膜の多孔質性の外側部分に固定し、血液を当該多孔性中空糸に通過させることが開示されている（特許文献２の請求項７、９等）。
【０１３１】
しかし、上記ＧＮＡ、ＮＰＡ、ＣｏｎＡは、文献および解析データ等から、高マンノース型糖鎖以外に単糖のマンノース、トリマンノシルコア構造（Ｎ‐グリカンの共通構造のコアペンタサッカライド）、複合型糖鎖、および混成型糖鎖にも結合することが分かっている（ＧＮＡ/ＮＰＡについては、レクチンフロンティアデーターベース（http://jcggdb.jp/rcmg/glycodb/LectinSearch）、ＣｏｎＡについては、Mega, T. et al., J.Biochem., 111, 396-400,(1992)）。また、シアノビリン‐Ｎ（ＣＶ‐Ｎ）は遊離のマンノビオースおよび高マンノース型糖鎖と結合するが、高マンノース型糖鎖中の分岐マンノシドのＤ１およびＤ３アームの非還元末端のα（１‐２）Ｍａｎ残基を認識部位とし、Ｄ２アームの非還元末端のα（１‐２）Ｍａｎ残基は認識部位としない。
【０１３２】
一方、上述したように、本願発明で用いる「高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド」は、高マンノース型糖鎖に対する結合性を有し、かつ、複合型糖鎖および混成型糖鎖に対する結合性を有さないポリペプチドである。また、上記ポリペプチドは、上述したように、タイプＩレクチン、タイプＩＩレクチン、タイプＩＩＩレクチンおよびタイプＩＶレクチンからなる群より選ばれる１種または２種以上のレクチンであり、当該レクチンの分岐マンノシドの認識部位は、上記（１）の（ａ）〜（ｄ）に記載したとおりである。
【０１３３】
つまり、本発明で用いる上記ポリペプチドは、特許文献２で用いられているＣＶ‐Ｎとは、高マンノース型糖鎖の分岐マンノシドの認識部位が異なる。また、ＧＮＡ、ＮＰＡ、ＣｏｎＡのように、複合型糖鎖、および混成型糖鎖を認識しない。
【０１３４】
そして、特許文献２では、レクチンが多孔性中空糸膜の多孔質性の外側部分に固定されている。つまり、当該レクチンは血球と接触しないようにされている。このことから、当該レクチンの血液適合性は高いものではないと推察される。
【０１３５】
一方、本発明に係る上記ウイルス分離デバイスには、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドが固定化担体（モノリスゲル）に固定化されており、後述する実施例に示すように、血液適合性が非常に高い。つまり、赤血球凝集作用は非常に低く、補体活性に与える影響も非常に小さい。それゆえ、ヒトの全血に上記ポリペプチドが直接接触しても何ら全血に与える影響はない。
【０１３６】
したがって、ヒトの全血を検体とし、ヒトの全血に含有されるウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を上記全血から分離することができる。例えば後述する実施例では、ＯＡＡ‐１をシリカモノリスに固定化したウイルス分離デバイスを用いることにより、ＯＡＡ‐１をヒトの全血に直接接触させた場合も、血栓の形成、溶血、血球の付着、凝集、補体の活性化などを生じさせることなく、ＨＩＶを全血から効率よく分離できることが実証されている。
【０１３７】
このように、本発明に係るウイルス分離デバイスは、ヒトの全血を検体とすることができるので、例えば患者の全血を採取して、ペリスタポンプ等を用いて上記デバイスに導入し、高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドに接触させて全血中のウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を全血から分離し、分離後の全血を再び患者の体内に戻すという体外循環の工程によって、患者の全血中に含まれているウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞を分離することができる。分離したウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞は、患者に戻すことなく廃棄すればよい。
【０１３８】
もちろん、分離の態様は全血の体外循環に限られるものではなく、例えば、唾液の希釈液を上記デバイスに導入し、ウイルスを分離した後、上記ポリペプチドに結合したウイルスを解析して、患者がいかなるウイルスに感染しているかを確認することなどの用途に用いることもできる。
【０１３９】
上記ポリペプチドを固定した固定化担体（モノリスゲル）は、検体を導入しやすくし、かつ、上記ポリペプチドへの高マンノース型糖鎖の固定を円滑に行うために、カラム等に充填して用いることが好ましい。カラムとしては、例えば、従来公知のスピンカラム、液体クロマトグラフィー用のステンレスカラム等を用いることができる。
【０１４０】
検体からの分離の対象は、高マンノース型糖鎖を有するウイルスおよび／または高マンノース型糖鎖を有するウイルスに感染した細胞であればよい。上記ウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、デングウイルス、エイズウイルス、エボラウイルス、および重症急性呼吸症候群ウイルスからなる群より選ばれる１種または２種以上のウイルスを挙げることができる。また、上記ウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞としては、エイズウイルスおよび／またはエイズウイルス感染Ｔ細胞をより好ましく用いることができる。
【０１４１】
なお、上記デバイスによる、検体からのウイルスおよび／またはウイルスに感染した細胞の分離は、後述する実施例に示すＴＣＩＤ５０法、蛍光抗体法等の方法によって確認することができる。
【０１４２】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１４３】
以下、実施例に従って本発明を説明するが、本発明は実施例に限定されて解釈されるものではない。
【０１４４】
〔実施例１：ＨＩＶと藻類由来レクチンとの結合性の確認〕
ポリペプチドのＨＩＶ結合能の指標とするために、藻類由来レクチン（高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド）によるＨＩＶ感染性中和能を測定した。
【０１４５】
藻類由来レクチンを、細胞培養用平底９６ウェルプレートで、ウイルス混和時のレクチン終濃度が１μＭから１ｎＭの範囲になるように２倍段階希釈を行った（１希釈あたり４あるいは８ウェルずつ）。
【０１４６】
ＨＩＶ‐１ ＬＡＶ株（ｐＮＬ４‐３由来）１００個程度を各ウェルに添加して１０分間インキュベートした。その後、Jurkat細胞を１ウェルあたり、５×１０４個加えて、１週間程度培養した。Jurkat細胞は不死化したＴリンパ球細胞である。Jurkat細胞での膜融合の出現を指標にして、上記レクチンによって膜融合発現が５０％阻止される希釈率をBehrens-Karber法で評価し、５０％阻止濃度（ＩＣ５０）を算出した。同時に、添加ウイルス量を定量し、ウイルス１００個を５０％阻止する濃度として補正した。実験は時期を変えて少なくとも３回行い、その平均値を得た。
【０１４７】
試験に供した藻類由来レクチンと、その５０％阻止濃度（ｎＭ）とを表１にまとめた。いずれの藻類由来レクチンも、ｎＭレベルでＨＩＶの感染を抑制し、ＨＩＶと高い結合性を示した。特にＭＰＬは、１．８〜６．３ｎＭという極めて高い感染中和性を示した。一方、比較例として供試したコアα１‐６フコース特異的ポリペプチドであるＨｙｐｎｉｎＡ‐１は、５０％阻止濃度が１６３．１ｎＭであり、ＨＩＶとの結合性が弱かった。
【０１４８】
【表１】
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【０１４９】
〔実施例２：担体固定化用ポリペプチドの設計、該ポリペプチドの遺伝子発現および精製〕
藻類由来レクチン（高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチド）を固定化担体であるシリカモノリスに固定するに際しては、特開２０００‐１１９３００に開示の方法を用い、上記レクチンの組換え体である担体固定化用ポリペプチドを調製した。
【０１５０】
藻類由来レクチンとしては、タイプＩのＯＡＡ、タイプＩのＫＡＡ‐１、タイプＩＩのＢＣＡ、タイプＩＩＩのＢＰＬ‐１７、タイプＩＶのＭＰＬ‐１サブユニットを用いた。これらのレクチンのアミノ酸配列は公知である。天然由来のＯＡＡ、ＫＡＡ‐１、ＢＣＡ、ＢＰＬ‐１７、ＭＰＬ‐１サブユニットのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５〜９に示す。
【０１５１】
天然由来のＯＡＡは、アミノ酸配列中にシステイン残基を含まず、Ｎ末端から１２８番目にリジン１残基を含む。まずここで、アミノ酸配列中、１２８番目のリジンをアルギニンに置換し、８２番目のプロリンをフェニルアラニンに置換した改変ＯＡＡを調製した。なお、本願明細書において、天然由来のポリペプチドのアミノ酸の一部が置換されたポリペプチドの調製は常法に従って行った。
【０１５２】
天然由来のＫＡＡ‐１は、アミノ酸配列中Ｎ末端から２５２番目にシステイン１残基を含み、リジン１１残基を含む。ここで、２５２番目のシステインをアラニンに置換し、１番目のグリシンをアラニンに置換した改変ＫＡＡ‐１と、天然由来のＫＡＡ‐１の１番目のグリシンのみをアラニンに置換したレクチン（野生型ＫＡＡ‐１と称する）とを調製した。
【０１５３】
天然由来のＢＣＡは、アミノ酸配列中Ｎ末端から９０番目にシステイン１残基を含み、当該配列中にリジン１０残基を含む。ここで、９０番目のシステインをアラニンに置換し、１２４番目のリジンをロイシンに置換した改変ＢＣＡを調製し、野生型ＢＣＡと共に後述する組換え体の調製に供した。
【０１５４】
天然由来のＢＰＬ‐１７は、システイン６残基とリジン１１残基とを含む。ここで、Ｎ末端から２７番目、８９番目、および１３０番目のシステインをアラニンに置換し、４３番目、１１３番目、１５１番目のシステインをバリンに置換した改変ＢＰＬ‐１７と、天然由来のＢＰＬ‐１７の１番目（Ｎ末端）のバリンをアラニンに置換したレクチン（野生型ＢＰＬ‐１７と称する）とを調製した。
【０１５５】
天然由来のＭＰＬ‐１サブユニットは、システイン３残基を含み、リジンを含まない。ここで、Ｎ末端から５番目、２７番目のシステインをアラニンに、１２１番目のシステインをバリンに、１番目のピログルタミン酸をアラニンにそれぞれ置換した改変ＭＰＬ‐１と、天然由来のＭＰＬ‐１サブユニットの１番目のピログルタミン酸をアラニンに置換したレクチン（野生型ＭＰＬ‐１と称する）とを調製した。
【０１５６】
次に、これらの改変レクチンおよび野生型レクチンを用い、特開２０００‐１１９３００に開示の方法に基づいて組換え体を調製した。上記組換え体とは、レクチンのカルボキシ末端にリンカー配列、固定化反応用配列、および精製タグ配列を付加したものである。
【０１５７】
上記リンカー配列としては、配列番号１に示すグリシン５残基からなる配列、または配列番号２に示すグリシン６残基からなる配列を用いた。また、上記固定化反応用配列としては、配列番号３に示す、システイン１残基を含む８残基のアミノ酸からなる配列を用いた。精製タグ配列としては、配列番号４に示すヒスチジン６残基からなる配列を用いた。
【０１５８】
図１は、組換え体である担体固定化用ポリペプチドの構造の概略を示す模式図である。図中の藻類由来レクチンが、上記改変レクチン、または野生型レクチンに該当する。図に示すように、藻類由来レクチンのカルボキシ末端側にリンカー配列、固定化反応用配列および精製タグ配列が付加されている。
【０１５９】
上記担体固定化用ポリペプチドの調製は、上記改変レクチンのポリペプチドまたは野生型レクチンのポリペプチドをコードする塩基配列において、開始コドン（ＡＴＧ）の上流側に所定の８０塩基対からなる配列を導入し、終始コドン（ＴＡＡ）の下流側にＥｃｏＲＩ配列（６塩基対）を導入して調製した合成ＤＮＡ（TAAGAATTC）をpUC18のBamHI/EcoRI部位に挿入することによって得られた組換えプラスミドを用いて行った。上記８０塩基対からなる配列および開始コドンを配列番号２８に示す。
【０１６０】
調製した上記担体固定化用ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１０〜１８に示す。配列番号１０は改変ＯＡＡ、配列番号１１は改変ＫＡＡ‐１、配列番号１２は野生型ＫＡＡ‐１、配列番号１３は改変ＢＣＡ、配列番号１４は野生型ＢＣＡ、配列番号１５は改変ＢＰＬ‐１７、配列番号１６は野生型ＢＰＬ‐１７、配列番号１７は改変ＭＰＬ‐１、配列番号１８は野生型ＭＰＬ‐１、のアミノ酸配列にそれぞれリンカー配列、固定化反応用配列および精製タグ配列を付加した担体固定化用ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。
【０１６１】
配列番号１０〜１８に示す上記担体固定化用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（開始コドンおよび終始コドンは記載せず）を、それぞれ、配列番号１９〜２７に示す。
【０１６２】
上記担体固定化用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを増幅し、得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、ＢａｍＨＩで切断したクローニングベクターｐＵＣ１９と結合し、得られた組み替えプラスミドを大腸菌に導入することにより、上記担体固定化用ポリペプチドを大腸菌の菌体中に発現できたか否かを確認した。
【０１６３】
その結果、改変ＢＰＬ‐１７、野生型ＢＰＬ‐１７、改変ＭＰＬ‐１および野生型ＭＰＬ‐１は発現させることができなかったが、他の上記担体固定化用ポリペプチドは大腸菌の菌体中に発現させることができた。
【０１６４】
上述のように、天然由来のＯＡＡは、アミノ酸配列中にシステイン残基を含まず、リジン１残基を含む。天然由来のＫＡＡ‐１は、アミノ酸配列中にシステイン１残基を含み、リジン１１残基を含む。天然由来のＢＣＡは、アミノ酸配列中システイン１残基を含み、リジン１０残基を含む。
【０１６５】
上記担体固定化用ポリペプチドの大腸菌における発現の結果から、上述したように、担体固定化用ポリペプチドを調製するためには、（１）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を１個以下有すること；（２）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基を含まないこと；もしくは、（３）高マンノース型糖鎖に特異的に結合するポリペプチドの天然由来のアミノ酸配列が、システイン残基およびリジン残基を含まないこと、という条件のいずれかを満たすことが好ましいことが分かった。
【０１６６】
得られた培養菌体を破砕後、遠心分離により不溶性物質を取り除いた上清からの精製法の検討を行った。すなわち、除核酸の条件、ニッケルキレートカラムを用いたクロマトグラフィーの分離条件、イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィーの分離条件を検討した。
【０１６７】
カラムを用いたクロマトグラフィー操作においては、独自に開発した連続クロマトグラフィーを用いたニッケルキレートカラム単独での精製では、純度８０％以上の精製タンパク質が得られた。さらに、陰イオン交換カラムで精製することにより、純度を９５％以上に高めることができた。結果的に、８Ｌの培養液から精製タンパク質を約６００ｍｇ得ることができた。
【０１６８】
上記連続クロマトグラフィーは、同じカラムを２本用い、互いに異なる操作をしながら精製を進めていく方法である。この方法では、先ず、１番目のカラムにサンプルをアプライし、洗浄、溶出、カラムの準備、を行うが、洗浄、溶出、カラムの準備、を行っている間に、２番目のカラムにサンプルをアプライする。１番目のカラムはこの間に準備が完了し、２番目のカラムが洗浄、溶出、カラムの準備、を行っている間に、２回目のサンプルアプライを行う。その後も同様に互いに異なる操作をしながら精製を進めていく。
【０１６９】
また、上記陰イオン交換カラムによる精製は、陰イオン交換カラムを２本用い、上記ニッケルキレートカラムによる精製と同様に、連続クロマトグラフィーにより行った。
【０１７０】
〔実施例３：配向制御した精製タンパク質の固定化担体への固定化、固定化効率の測定〕
改変ＯＡＡのカルボキシ末端に上記リンカー配列、上記固定化反応用配列および上記精製タグ配列を付加し、実施例２で精製タンパク質として得られた担体固定化用ポリペプチドを、以下「ＯＡＡ‐１」と称する（配列番号１０）。本実施例では、ＯＡＡ‐１を配向制御して固定化担体に固定化するために、すなわち、ＯＡＡ‐１がカルボキシ末端のカルボキシル基で、固定化担体が有するアミノ基と共有結合することによって上記固定化担体に固定化される（ＯＡＡ‐１をカルボキシ末端の一箇所で、かつ主鎖を介して固定化担体に結合させる）ようにするために、システイン残基のシアノ化反応を行った。
【０１７１】
本実施例では、アミノ基固定化担体としてアミノセルロファイン（商品名：生化学工業で販売；アミン含有量約１０−５ｍｏｌｅｓＮＨ２／ｍｌゲル）固定化担体を０．１ｍＬ用いて、反応効率の測定を行った。
【０１７２】
２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を溶媒として、約１０μＭの濃度のＯＡＡ‐１タンパク質溶液１ｍＬを調製した。当該溶液を、上記アミノセルロファイン固定化担体０．１ｍＬに対して混合し、遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０秒間）により上澄み溶液を固定化担体と分離して、上澄み溶液を（Ａ）とした。上澄み溶液（Ａ）のタンパク質濃度を、上澄み溶液（Ａ）の２８０ｎｍの吸光度を測定することによって推定した。この条件では、ＯＡＡ‐１タンパク質は、定量的に固定化担体に吸着した。
【０１７３】
次に、上記アミノセルロファイン固定化担体にシアノ化試薬として２‐ニトロ‐５‐チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）溶液を１ｍＬ加えてシアノ化反応を行い、その後遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０秒間）により、反応溶液と固定化担体とを分離し、上澄み液を（Ｂ）とした。上澄み溶液（Ｂ）中のタンパク質濃度を測定した。この上澄み中には、ＯＡＡ‐１タンパク質は検出されなかった。
【０１７４】
次に、２０ｍＭのほう酸緩衝液（ｐＨ９．５）を上記固定化担体に１ｍＬ加えて固定化反応を行わせ、反応後、遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０秒間）により緩衝液溶液と固定化担体とを分離し、上澄み溶液を（Ｃ）とした。この上澄み溶液中には、ＯＡＡ‐１タンパク質は検出されなかった。
【０１７５】
次に、上記固定化担体に、１ｍLのＫＣＬ溶液を加え、イオン吸着で上記固定化担体に結合しているタンパク質を遊離させた。遠心分離（１０００ｒｐｍ、２０秒間）により、溶液と固定化担体とを分離し、上澄み溶液を（Ｄ）とした。この上澄み溶液（Ｄ）中のタンパク質濃度を測定した。その結果、約２μＭのタンパク質が、上澄み溶液（Ｄ）から検出された。
【０１７６】
この結果は、約８μＭに相当するタンパク質が、上記固定化担体中に保持されていること、すなわち、約８０％の高率で固定化が起こったことを示している。同様の実験を５回繰り返したところ、固定化効率の値としては約７５％±５％程度の値が得られた。
【０１７７】
固定化に用いるＯＡＡ‐１タンパク質の量を増やすと、上澄み溶液（Ａ）にタンパク質が検出されるようになる。上記固定化担体１ｍＬあたり約１００ｎｍｏｌを超える量のＯＡＡ‐１を用いた場合は、ＯＡＡ‐１の固定化担体への吸着段階での効率低下を招くが、固定化担体に吸着されたタンパク質の固定化反応は、ほぼ一定（約７５％±５％、すなわち７０％以上）であると考えられる。
【０１７８】
〔実施例４：シリカモノリスへのレクチンの固定化〕
担体固定化用ポリペプチドのシリカモノリスへの固定化においては、固定化反応の場となる固相表面の表面官能基として１級アミノ基の導入を行った。１級アミノ基の導入にあたり、未修飾のシリカモノリス（未修飾シリカモノリスと称する）にエポキシ基を持つシランカップリング剤を反応させて、固相表面にエポキシ基が導入されたシリカモノリス（エポキシ化シリカモノリスと称する）を作製した。これに１級アミノ基を側鎖に持つアミノポリマーであるポリ‐Ｌ‐リジンを反応させることにより、固相表面に１級アミノ基が導入されたシリカモノリス（アミノ化シリカモノリスと称する）を作製した。
【０１７９】
ポリ‐Ｌ‐リジンは固相表面に導入されたエポキシ基と重合することにより、均一な膜を形成し固相表面を被覆することができる。これにより、固相表面に露出するシリカを減少させ、生体物質と非特異的に吸着することを防止する効果もある。このようにして作製したアミノ化シリカモノリスに、シアノシステイン化した改変レクチンタンパク質を反応させて固定化を行い、反応終了後に、未反応のまま残存したアミノ基を無水酢酸で処理した。アミノ化シリカモノリスの調製と担体固定化用ポリペプチドの調製、および、固定化についての詳細は以下のように実施した。
【０１８０】
未修飾シリカモノリスへのエポキシ基の導入（即ち、エポキシ化シリカモノリスの作製）は、トルエンで２０％に希釈したエポキシシラン（３‐グリシジルオキシプロピルトリメトキシシラン）溶液の中に未修飾シリカモノリスを浸し、８０℃で一晩放置することによって行った。
【０１８１】
次に、アミノ基含有ポリマーであるポリ‐Ｌ‐リジン（分子量4,000〜15,000：シグマ社より購入）が０．２％（ｗ／ｖ）となるよう２０ｍＭのほう酸緩衝液（ｐＨ９．５）で溶かし、シリカモノリスカラムの体積の６倍量を調製した。この溶液全量を、上記で作製したエポキシ化シリカモノリスに添加し、１６時間穏やかに攪拌しながら反応させた。即ち、ポリ‐Ｌ‐リジンをエポキシ化シリカモノリス内に浸みこませ、エポキシ基に共有結合させて、アミノ基をエポキシ化シリカモノリスに導入（即ち、アミノ化シリカモノリスの作製）した。
【０１８２】
その後、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でアミノ化シリカモノリスを洗浄し、引き続いて０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍモノエタノールアミン溶液（ｐＨ＝８．５に塩酸で調節）に上記アミノ化シリカモノリス全体を浸し、１２時間穏やかに攪拌することにより、残存エポキシ基をブロッキングするとともに未反応のポリ‐Ｌ‐リジンを除去した。この後、シリカモノリスカラムの体積の５倍量の超純水で数回洗浄することにより、モノエタノールアミンおよび未反応のポリ‐Ｌ‐リジンを除去し、上記アミノ化シリカモノリスカラムを調製して、これを担体固定化用ポリペプチドの固定化反応に用いた。
【０１８３】
実施例２に記載の方法に基づいて、レクチンのカルボキシ末端にリンカー配列、固定化反応用配列、および精製タグ配列を付加した組換え体（担体固定化用ポリペプチド）は、実施例３に記載したシアノ化反応を効率よく行うために前処理に供した。具体的には、固定化反応に供するシリカモノリスカラムの体積１ｍＬあたり担体固定化用ポリペプチド１２ｍｇとジチオスレイトール４．５ｍｇを、２．５ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶かして、該カラム体積と等量の試料溶液を調製した。これを３０℃の恒温槽で１時間反応させることで担体固定化用ポリペプチドに含まれているシステインによるジスルフィド結合を還元した。
【０１８４】
その後脱塩カラム（ＧＥヘルスケア社製、ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を用いてバッファ交換を行い、該ポリペプチドのシアノ化を行った。具体的には、シアノ化試薬である２‐ニトロ‐５‐チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）を１ｍＭ含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で予め該脱塩カラムを平衡化しておき、これにジチオスレイトールを含む上記試料溶液を添加してバッファ交換することにより、該試料溶液に含まれている過剰量のジチオスレイトールを速やかに除くと同時に、該ポリペプチドの溶媒を該ＮＴＣＢ溶液に速やかに置換した。
【０１８５】
このようにして上記担体固定化用ポリペプチドのシアノ化反応を行い、シアノ化された試料を、再び上記脱塩カラムを用いたバッファ交換に供し、ＮＴＣＢおよび反応副産物を除去して２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置換した。このようにして得られたシアノ化された上記ポリペプチドを、上記の１級アミノ基が導入されたアミノ化シリカモノリスカラムに添加して緩やかに振盪しながら３０分間吸着させた。その後、０．５Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ９．５）を、シアノ化された上記ポリペプチドの添加量の１／４倍量添加して反応系のｐＨを９．２とし、室温で緩やかに振盪しながら、担体固定化用ポリペプチドのアミノ化シリカモノリスへの固定化反応を開始した。固定化反応は２０時間行って終了させた。
【０１８６】
反応終了後に反応液を取り除き、固定化されなかった残存ポリペプチドに対して、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。具体的には、固定化後のシリカモノリスカラムに、シリカモノリスカラムの体積の５倍量の上記塩化ナトリウムを含む緩衝液を添加して洗浄する操作を数回繰り返し、未反応の残存ポリペプチドを除去した（洗浄工程）。引き続いて、無水酢酸を１．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に溶かして１％（ｖ／ｖ）濃度に調製した溶液をシリカモノリスカラムの体積の５倍量調製し、固定化後のシリカモノリスカラムに添加して１０分間反応させた後、溶液を取り除く、という一連の操作を５回繰り返し行うことで、未反応のまま残存した固相表面の一級アミノ基をアセチル化し、残存一級アミノ基の保護を行った。
【０１８７】
担体固定化用ポリペプチドの固定化量の定量は、該ポリペプチドのアミノ酸配列から推定される２８０ｎｍの吸光係数をもとに該波長の吸光度から算出し、固定化反応開始前と終了後の反応溶液、および、洗浄工程における回収溶液に含まれる担体固定化用ポリペプチド量をそれぞれ決定し、それらの収支を担体固定化用ポリペプチドの固定化量とした。即ち、［固定化量］＝［反応前の液中含量］−（［反応後の液中含量］＋［洗浄液の液中含量］）により決定した。
【０１８８】
以上のようにしてシリカモノリスカラムに担体固定化用ポリペプチドＯＡＡ‐１を固定化した結果、体積２７μＬのシリカモノリスカラム（φ４．８ｍｍ×１．５ｍｍ，マクロポア径２μｍ，メソポア径２００ｎｍ）に対して３７μｇ（１．３６ｍｇ／ｍＬ担体）のＯＡＡ‐１を固定化することができた。
【０１８９】
〔実施例５：血液適合性試験（溶血試験）〕
高マンノース型糖鎖特異的ポリペプチドＯＡＡ（天然由来のＯＡＡ）、ヒスチジンタグ付きのＯＡＡ（Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡ）、シリカモノリスに固定化したＯＡＡ‐１、市販のタチナタマメ由来のレクチンＣｏｎＡを用いて、溶血性試験、補体活性化試験を行った。各試験は、ＩＳＯ１０９９３‐ｐａｒｔ４（ＤＲＡＦＴ）に準拠して行った。溶血試験は、１％溶血させた試料の吸光度の比較で評価した。なお、上記Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡは、配列番号５に示すアミノ酸配列を有するＯＡＡと、配列番号４に示すヒスチジン６残基からなる精製タグ配列とを融合させたものである。
【０１９０】
ＯＡＡ‐１のシリカモノリスへの固定化は実施例４に記載した方法に従って行った。用いたシリカモノリスは以下のように作製した。すなわち、水溶性高分子であるポリエチレンオキシド（アルドリッチ製  商品番号85,645-2）０．８０ｇおよび尿素０．９０ｇを０．０１規定酢酸水溶液１０ｇに溶解し、この溶液にテトラメトキシシラン４ｍｌを攪拌下で加えて、加水分解反応を行った。数分攪拌したのち、得られた透明溶液を内径６ミリメートルのガラスチューブ内に注入し４０℃の恒温漕中に保持したところ約３０分後に固化した。
【０１９１】
固化した試料をさらに数時間熟成させ、密閉条件下で２４０℃に１時間保った。この処理の後、ゲルを４０℃で３日間乾燥し、１００℃／ｈの昇温速度で８００℃まで加熱し、直径４．８ｍｍの棒状の無機系多孔質体（すなわち、シリカモノリス）を得た。
【０１９２】
得られた多孔質体中には中心孔径３．５μｍ（＝３５００ｎｍ）程度の揃った貫通孔が３次元網目状に絡み合った構造で存在していることが確かめられた。そして、その貫通孔の内壁に直径２００ｎｍ程度の細孔が多数存在していることが、窒素吸着測定によって確かめられた。
【０１９３】
試験に供したシリカモノリスへのＯＡＡ‐１の固定化量は、シリカモノリス１ｍＬあたり７ｍｇであった。
【０１９４】
次に、生理食塩水を溶媒として、上記各レクチンの１００μｇ／ｍＬ溶液、および１ｍｇ/ｍＬ溶液を調製した。次に、当該溶液と、ヘパリン採血したＡ型、Ｂ型、Ｏ型のヒト全血とを、レクチン溶液：全血＝１：２０の比率で混合し、接触させた。接触時間は５分および３０分とし、反応温度３７℃で試験した。
【０１９５】
結果を図２、３に示す。図２、３は、それぞれ、１％溶血（Positive Control）を１．０としたときの、レクチンへの接触時間が５分または３０分での溶血の程度を示すグラフである。図中、「陰性対照（生食）」は、生理食塩水を用いた場合の結果である。「市販デバイス」は、カネカ株式会社製のデキストラン硫酸を固定したセルロースゲル（リポソーバ）を終濃度１００ｍｇ/ｍＬで用いた場合の結果を示す。「１００μｇ／ｍＬ ＯＡＡＨｉｓｔａｇ」は、ヒスチジンタグ付きのＯＡＡ（上述したＨｉｓ‐ｒＯＡＡ）を１００μｇ／ｍＬ用いた場合の結果を示す。
【０１９６】
図２，３に示すように、天然由来のＯＡＡ、ヒスチジンタグ付きＯＡＡ（Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡ）、シリカモノリスに固定化したＯＡＡ‐１では、溶血は起きなかったが、接触時間が５分、３０分のいずれの場合も、ＣｏｎＡを１ｍｇ／ｍＬ供した場合に溶血が見られた。また、全てのサンプルについて、Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、ＳＣ５ｂ‐９の補体の活性化は観測されなかった。
【０１９７】
以上の結果から、天然由来のＯＡＡ、Ｈｉｓ‐ｒＯＡＡ、シリカモノリスに固定化したＯＡＡ‐１はいずれも血液適合性に優れていること、すなわち、血液に接触しても血液に対して影響を与えないことが明らかとなった。
【０１９８】
〔実施例６：ヒト全血通過試験〕
ＯＡＡ‐１をシリカモノリスに固定化したウイルス分離デバイスを用い、ＩＳＯ１０９９３‐ｐａｒｔ４に準拠して、血液適合性試験を実施した。ＯＡＡ‐１のシリカモノリスへの固定化は実施例４に記載した方法に従って行った。シリカモノリスは、マクロポア径１００μｍ、メソポア径１６１ｎｍ、直径４ｍｍ、厚さ２ｍｍの円柱状のものを使用し、ＯＡＡ‐１を固定化後、スピンカラム（自作品）に充填してウイルス分離デバイスとした。
【０１９９】
ペリスタポンプにて、０．５ｍＬ/ｍｉｎ（線速４．０ｃｍ/ｍｉｎ）の流速でヒト全血１５ｍＬを上記スピンカラムに注入し、通過画分を回収した。抗凝固剤としてはＡＣＤ‐Ａを用いた。また、比較例として、ＯＡＡ‐１を固定化していないシリカモノリスを用いた。上記通過画分を血液適合性試験に供した結果を表２に示す。
【０２００】
【表２】
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【０２０１】
結果として、ＯＡＡ‐１をシリカモノリスに固定化したウイルス分離デバイスでは、血栓の形成や溶血、血球の付着、凝集、補体の活性化などは見られず、血液に影響を与えなかった。ブラジキニン産生についてはＯＡＡ‐１の固定化により低減されたため、ＯＡＡ‐１は、シリカモノリス表面に高密度に固定化されていると推測された。
【０２０２】
なお、表中、「デバイス前圧力」とは、ペリスタポンプにて、０．５ｍＬ/ｍｉｎの流速で全血を流した時のデバイス入口の圧力を意味する。表中に記載した各項目について、血栓形成は、光学顕微鏡を用い、シリカモノリスの表面および切断面を観測し、血栓が形成されているか否かの観測を行う方法；溶血は、上記スピンカラムを通過後の血液を血球分離し、血漿の溶血を、１％溶血（Positive Control）と比較する方法、によって測定した。また、白血球数、赤血球数、血小板数は血球カウンターを用いて測定した。補体活性化、およびブラジキニンの産生は、市販キットを用いたＥＬＩＳＡ法によって測定した。
【０２０３】
〔実施例７：ウイルス分離デバイスを用いたＨＩＶの分離〕
担体固定化用ポリペプチドとしてＯＡＡ‐１を用い、これをシリカモノリスに固定化して使用した。シリカモノリスとしては、マクロポア径２μｍ、メソポア径６０ｎｍ、直径４ｍｍ、厚さ２ｍｍの円柱状のものを使用し、ＯＡＡ‐１を固定化後、スピンカラム（自作品）に充填してウイルス分離デバイスとした。
【０２０４】
分離試験は、流速０．１ｍＬで、感染価１．３×１０４（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）の１ｍＬのＨＩＶ‐１溶液を負荷して、負荷前の感染価および負荷後の通過液の感染価を測定した。通過液は、１０画分で回収し、各々の画分の感染価を測定した。感染価の測定は、ウイルスによる細胞病原性変化を指標としたＴＣＩＤ５０法に基づいて行った。いずれの画分も、検出限界である１．３×１０２以下の感染価であり、少なくとも９９％のＨＩＶ‐１を除去することができていた。
【０２０５】
〔実施例８：感染リンパ球除去試験〕
担体固定化用ポリペプチドとしてＯＡＡ‐１を用い、これをシリカモノリスに固定化して使用した。シリカモノリスとしては、マクロポア径１００μｍ、メソポア径１６０ｎｍ、直径４．５ｍｍ、厚さ１００ｍｍの円柱状のものを使用した。ＯＡＡ‐１を固定化したシリカモノリスの周囲を熱収縮フッ素樹脂で被覆したものを内径５ｍｍのステンレス製空カラムに挿入し、隙間をエポキシ樹脂で固めることによりカラムを作製し、当該カラムをウイルス分離デバイスとした。
【０２０６】
ＨＩＶ‐１感染リンパ球除去試験は、感染細胞のモデルとして、不死化したＴリンパ球細胞であるJurkat細胞を用いて行った。前日に、約１０６個のJurkat細胞に、細胞あたり１０個以上のＨＩＶ‐１を感染させた。ＨＩＶ‐１に感染させたJurkat細胞は約５×１０５個を細胞培養液ＲＰＭＩ１６４０  ４ｍＬに分散させ、上記ステンレスカラムにペリスタポンプで負加した。対照として、ＨＩＶ‐１に感染させていないJurkat細胞（非感染Jurkat細胞）も用いた。流速は０．１ｍＬ/ｍｉｎとし、ロードした細胞液が排出されはじめる時点からカラム通過画分を５００μＬずつ回収した。
【０２０７】
次に、各画分について、低速遠心で細胞を回収し、蛍光抗体法に供した。蛍光抗体法は、細胞をポリ‐Ｌ‐リジンコートスライドグラス（ＡＧＣテクノグラス社）に接着させ、３％パラフォルムアミド固定、界面活性剤による透過処理ののちに、蛍光標識抗体として抗ｐ２４抗体（ウサギ抗血清、バイオアカデミア社）とＤｙｌｉｇｈｔ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて行った。
【０２０８】
図４は、ウイルス分離デバイスのカラム通過画分について、蛍光抗体法でＨＩＶ‐１の抗原であるＰ２４タンパク質を染色した結果を示す写真である。図４の（ａ）はカラムに供する前のＨＩＶ‐１感染Jurkat細胞の分散液であり、蛍光が確認されている。しかし、カラム通過画分である図４の（ｂ）〜（ｈ）では、いずれも蛍光が観測できなかった。つまり、ＨＩＶ‐１に感染したJurkat細胞は全てウイルス分離デバイスに吸着した。非感染Jurkat細胞および羊赤血球はカラムを通過したので（結果は図示せず）、ＨＩＶ‐１感染Jurkat細胞はウイルス分離デバイスの表面にあるＯＡＡ‐１で特異的に吸着除去できたと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【０２０９】
本発明は、高い血液適合性を持ち、かつ、検体中のウイルスを分離する能力に優れる。それゆえ、本発明は、医療機器等の分野に非常に好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【配列表】
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