(57)【要約】【課題】マスターモールドからの転写性が良好であり、かつ滅菌処理時の変形性を抑制した生体デバイス作製用樹脂製モールドを提供する。さらに、本発明の生体デバイス作製用樹脂製モールドを用いて成型した生体デバイスを提供する。【解決手段】ガラス転移温度または融点が１２０〜２７０℃であり、樹脂温度１８０℃、周波数１Ｈｚにおける引張弾性率が５×１０４〜１×１０７Ｐａである樹脂を用いることで、転写性が良好であり、かつ滅菌処理時の変形性を抑制した生体デバイス作製用樹脂製モールドが得られる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マスターモールドからインプリントにより作製される生体デバイス作製用樹脂製モールドであって、
一方の面に凸パターンを有し、
樹脂のガラス転移温度または融点が１２０〜２７０℃であり、
樹脂温度１８０℃、周波数１Ｈｚにおける引張弾性率が５×１０４〜１×１０７Ｐａである、生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項２】
前記樹脂のガラス転移温度または融点が１３０〜１８０℃である、請求項１に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項３】
前記樹脂がシクロオレフィン樹脂およびポリカーボネートから選択される１種以上である、請求項１または２記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項４】
前記凸パターン径に対する高さの比が０．１〜３である、請求項１〜３の何れか一項に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項５】
前記凸パターンの径が１０〜１０００μｍである、請求項１〜４の何れか一項に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項６】
前記凸パターンの高さが１０〜５００μｍである、請求項１〜５の何れか一項に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項７】
前記凸パターンの隣接する凸パターンとの間隔が、５〜２００μｍである、請求項１〜６の何れか一項に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項８】
前記生体デバイス作製用樹脂製モールドの厚さが１５０〜１０００μｍである、請求項１〜７の何れか一項に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか一項に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールドを用いて成型した生体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体デバイス作製用樹脂製モールドおよびそれを用いた生体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などを用いた再生医療に関する研究が活発に行われている。これらの研究において重要な点として、細胞や細胞塊の大きさや形状を制御するという点が挙げられる。これは、細胞や細胞塊の大きさや形状によって、分化のし易さや細胞の生存率などが異なってくるためである。しかし、一般的に用いられているポリスチレンなどでできたシャーレによって細胞を播種すると、多くの細胞は２次元的に広がった単層シートを作り、その大きさや形状を制御することは困難である。
【０００３】
生体内の細胞の挙動を再現するため、３次元的に凝集した細胞塊（スフェロイド）を培養する手法に関し、多数の提案がなされている。その技術に関し重要なポイントとして、大きさが均一なスフェロイドを一度に多数培養するという点がある。
【０００４】
大きさが均一なスフェロイドを一度に多数培養するための細胞培養用基材（以下、生体デバイスと略す）の形状として、生体デバイスの底面に凹陥部を複数設ける方法が提案されている。このような形状の生体デバイスに細胞を播種すると、凹陥部に細胞が集まり、スフェロイドが形成される。また凹陥部の大きさによってスフェロイドのサイズも調節できるため、大きさが均一なスフェロイドを培養することができる。
【０００５】
また、上記のように、生体デバイスに凹陥部を複数設ける方法として、近年熱インプリント技術が注目を集めている。熱インプリントとは、微細凸パターンを有する金型（モールド）を生体デバイスに押し当て、加熱により柔らかくした生体デバイスに微細凸パターンを転写することで、微細凹パターンを有する生体デバイスを作製するものである。
【０００６】
上記の熱インプリント技術を用いて、微細凹パターンを有する生体デバイスを作製する手法が提案されている（特許文献１）。
【０００７】
特許文献１は、簡便に作製した凹パターンにおいて、一度に多数のスフェロイドを培養できる点で優れている。しかしこの手法では、ニッケル製のモールドを直接用いて熱インプリントを行っている。同一のモールドで熱インプリントを繰り返し行うと、モールドと生体デバイスとの剥離性が悪化し生産性が低下してしまい、また微細加工が施された高価な金属製モールドを破損する可能性も高めてしまう。
【０００８】
上記の課題を解決する手法として、金属製のマスターモールドから樹脂製のモールドを複製する手法が提案されている。
【０００９】
複製した樹脂製モールドは、一つのマスターモールドから大量に生産することができるため生産性が良く、剥離性が悪化する前に使い捨てすることができ、また高価なマスターモールドを破損する可能性も低減できる。その結果、生体デバイスをより低コストで生産性良く製造することができる。
【００１０】
一方、生体デバイスを作製する際には、生体デバイスに意図しない細菌等が混入しないよう、作製のために用いる機器、装置等をあらかじめ滅菌処理しておく必要がある。この滅菌処理の方法として、最も多く用いられているのが煮沸滅菌である。煮沸滅菌は、水蒸気にさらす等の高温雰囲気にすることで、機器、装置を滅菌処理するものであり、滅菌処理にかかる時間、コストが他の手法に比べ少なくて済むという利点がある。
【００１１】
上記の熱インプリント技術を用いて樹脂製のモールドを複製するには、加熱により柔軟性が高くなり、凸パターンが精度よく転写される材料を用いる必要がある。しかし加熱によって柔軟になる材料は、煮沸滅菌処理によって変形を生じてしまい、複製した樹脂製モールドの品質を低下させてしまう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２０１２−２４９５４７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記のような課題を鑑みなされたものであり、生体デバイス成型時の転写性が良好であり、かつ滅菌処理時の耐変形性が向上した生体デバイス作製用樹脂製モールドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、上記問題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、樹脂のガラス転移温度または融点が特定範囲にあり、かつ引張弾性率が特定値以下である樹脂を用いることで、
生体デバイス成型時の転写性および滅菌処理時の耐変形性に優れる生体デバイス作製用樹脂モールドを提供しうることを見出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。
【００１５】
上記課題を解決する本発明は、下記より構成される。
（１）マスターモールドからインプリントにより作製される生体デバイス作製用樹脂製モールドであって、一方の面に凸パターンを有し、樹脂のガラス転移温度または融点が１２０〜２７０℃であり、樹脂温度１８０℃、周波数１Ｈｚにおける引張弾性率が５×１０４〜１×１０７Ｐａである、生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（２）前記樹脂のガラス転移温度または融点が１３０〜１８０℃である、（１）に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（３）前記樹脂がシクロオレフィン樹脂およびポリカーボネートから選択される１種以上である、（１）または（２）に記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（４）前記凸パターン径に対する高さの比が０．１〜３である、（１）〜（３）の何れか一つに記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（５）前記凸パターンの径が１０〜１０００μｍである、（１）〜（４）の何れか一つに記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（６）前記凸パターンの高さが１０〜５００μｍである、（１）〜（５）の何れか一つに記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（７）前記凸パターンの隣接する凸パターンとの間隔が、５〜２００μｍである、（１）〜（６）の何れか一つに記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（８）前記生体デバイス作製用樹脂製モールドの厚さが１５０〜１０００μｍである、（１）〜（７）の何れか一つに記載の生体デバイス作製用樹脂製モールド。
（９）（１）〜（８）の何れか一つに記載の生体デバイス作製用樹脂製モールドを用いて成型した生体デバイス。
【発明の効果】
【００１６】
本発明による生体デバイス作製用樹脂製モールドは、生体デバイス成型時の転写性および滅菌処理時の耐変形性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はマスターモールドを用いた樹脂製モールドの成型状態における側面断面模式図を示したものである。
【図２】図２は樹脂製モールドを用いた生体デバイスの成型状態における側面断面模式図を示したものである。
【図３】図３は樹脂製モールドの側面断面模式図を示したものである。
【図４】図４は樹脂製モールドの凸パターンの走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の生体デバイス作製用樹脂製モールド（以下、樹脂製モールドと略す。）は、樹脂のガラス転移温度または融点が１２０〜２７０℃であり、樹脂温度１８０℃、周波数１Ｈｚにおける引張弾性率が５×１０４〜１×１０７Ｐａである樹脂を成型して得られる。樹脂のガラス転移温度については非結晶性樹脂のミクロブラウン運動の凍結及び開放に伴う転移温度を、樹脂の融点については結晶性樹脂の融解に伴う転移温度を意味するものである。ガラス転移温度に関しては非結晶樹脂を、融点に関しては結晶性樹脂を対象とする。
【００１９】
樹脂のガラス転移温度または融点は１２０〜２７０℃であり、より好ましくは１３０〜１８０℃である。ガラス転移温度または融点が１２０℃未満であると、耐熱性が不十分であるため滅菌処理の際に樹脂製モールドが変形する場合がある。また、２７０℃を超えるとマスターモールドからの凸パターンの転写が不十分となり、所定の凸形状が得られない場合がある。ガラス転移温度または融点は、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定することができる。
【００２０】
樹脂の引張弾性率は、樹脂温度１８０℃、周波数１Ｈｚにおいて５×１０４〜１×１０７Ｐａであり、より好ましくは７×１０４〜７×１０６Ｐａである。樹脂温度１８０℃における引張弾性率が５×１０６Ｐａを超えると、マスターモールドからの凸パターンを転写する際に、多大な加圧力が必要となるためマスターモールドを破損したり、所定の凸形状が得られない場合がある。
【００２１】
樹脂としては、シクロオレフィン樹脂、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、ＡＢＳ樹脂等の非結晶性樹脂や、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン等の結晶性樹脂が挙げられる。これらの中では、転写性の点でシクロオレフィン樹脂及びポリカーボネートから選択される１種以上であることが好ましい。
【００２２】
樹脂には本発明の効果を損なわない範囲で、充填剤、可塑剤、離型剤、分散剤、酸化防止剤等を添加することができる。
【００２３】
本発明の樹脂製モールドは、図１に示すように、マスターモールドからのプレス成型により製造することができる。マスターモールドとしては、鉄合金、アルミ合金等で作製された金型を用いることができる。樹脂は、樹脂製モールドの厚み分布を抑えるために、予めシート形状に加工されたものを使用することが好ましい。さらに、図２に示すように、得られた樹脂製モールドを用いて、生体デバイスを成型する。生体デバイスとしてはポリスチレンやヒアルロン酸ゲル等が挙げられる。樹脂製モールドは、適当な成型サイクルを経た後、滅菌処理し再度生体デバイスの成型に利用される。
【００２４】
本発明の樹脂製モールドは図３に示すように、一方の面に生体デバイスに凹陥部を作製するための多数の凸パターンを有する。凸パターンの形状としてはレンズ型、半球、円柱、円錐、多角柱、多角錐、矩形型など細胞培養の目的に合わせて多様なものを選択することができる。樹脂製モールドの面積には制約がないが、プレス成型時の加圧力の点から、１ｃｍ２〜１００ｃｍ２が好ましい。
【００２５】
凸パターンの径に対する高さの比は、０．１〜３であることが好ましい。径に対する高さの比が０．１未満であると細胞は平面で培養させた場合と同様に二次元的に広がった形状になる場合があり、３より大きいと生体デバイスの成型時に、生体デバイスを形成する樹脂が樹脂製モールドに充填されにくくなり、所定形状の生体デバイスを作製することが困難になる場合がある。
【００２６】
凸パターンの径は１０〜１０００μｍであることが好ましい。ここで径とは、図３に示す様に、樹脂製モールド面内の、凸パターンの最大径を意味する。径が１０μｍ未満であると細胞を凹陥部の中に播種することが困難になる場合があり、１０００μｍを超えると、細胞は平面で培養させた場合と同様に二次元的に広がった形状になる場合がある。
【００２７】
凸パターンの高さは１０〜５００μｍであることが好ましい。ここで高さとは、図３に示す様に、樹脂製モールド面に垂直方向の、凸パターンの最大高さを意味する。高さが１０μｍ未満であると細胞が凹陥部の外側にも広がって成長しスフェロイドの大きさを制御できなくなる場合があり、５００μｍを超えると樹脂製モールドの作製が困難になり生産性が低下する場合がある。
【００２８】
凸パターンの隣接する凸パターンとの間隔は、５〜２００μｍであることが好ましい。ここで間隔とは、図３に示す様に、凸パターンに隣接する凸パターンとの最も短い間隔を意味する。隣接する凸パターンとの間隔が５μｍ未満であると、生体デバイスの側壁の成型性が低下する場合がある。また間隔が２００μｍより大きいと生体デバイスの単位面積当たりの凹陥部の個数が減り、一度に培養できる細胞の数が減少して生産性が低下する場合がある。
【００２９】
樹脂製モールドの厚みは１５０〜１０００μｍであることが好ましい。厚みが１５０μｍ未満であると、滅菌処理において樹脂製モールドが熱によって変形する場合があり、厚みが１０００μｍを超えると、樹脂製モールドの機能低下は特に起こらないが、一定量の樹脂から作製できる樹脂製モールドの枚数が減少してしまい、生産性が低下する場合がある。
【００３０】
本発明における樹脂製モールドは、滅菌処理によって変形が生じないものである。滅菌処理としては、特に限定するものではないが、例えば、オートクレーブ中で温度１２１℃、２気圧の水蒸気に、２０分間暴露する方法が挙げられる。
【実施例】
【００３１】
以下、本発明を実施例および比較例により具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００３２】
［実施例１］
樹脂製モールドを成型するための樹脂として、厚さ１８８μｍのシクロオレフィン樹脂シート（日本ゼオン社製「ＺＦ−１４」）を用いた。樹脂のガラス転移温度は１３６℃、引張弾性率は７．８×１０４Ｐａであった。なお、ガラス転移温度および引張弾性率は以下の方法により測定した。
【００３３】
（ガラス転移温度、融点）
樹脂のガラス転移点または融点は、ブルカー・エイエックスエス社製「ＤＳＣ３１００」を用い、昇温速度１０℃／分、窒素雰囲気下で測定した。ガラス転移温度は温度−熱量曲線変曲点での接線と元のベースラインとの交点から求めた。また融点は、温度−熱量曲線の潜熱変化に伴うピーク温度より求めた。
【００３４】
（引張弾性率）
樹脂の引張弾性率は、１８０℃、引張モードにて、ティーエイ・インストゥルメンツ社製「ＲＳＡＩＩＩ」を用い、周波数１Ｈｚで測定した。
【００３５】
＜マスターモールド＞
マスターモールドは、アルミ合金Ａ５０５２製（後藤精機社）モールドを使用した。マスターモールドの形状は、凸パターンの径が１７５μｍ、隣接する凸パターンの間隔が５μｍ、高さ１００μｍの凸パターンを、縦横８９個ずつ（計７９２１個）正方形状に配置させたパターンを、樹脂製モールドに転写させる形状を有する。マスターモールド面に対し、転写した際のマスターモールドと樹脂製モールドの剥離を容易かつ確実にするため、離型処理を施した。離型処理としては、マスターモールドをダイキン工業社製オプツールＨＤ−２１００ＴＨに約１分浸し、乾燥させたのち、一晩静置した。
【００３６】
＜樹脂製モールドの成型＞
上記のマスターモールドを用い、シクロオレフィン樹脂からなる縦３５ｍｍ、横３５ｍｍ、厚さ１８８μｍの樹脂製モールドを成型した。成型には、ＳＣＩＶＡＸ社製「Ｘ−３００」を使用し、成型温度は１５５℃、圧力１１ＭＰａ、成型時間３分、冷却温度１１０℃、冷却時間３分とした。このような手法で、凸パターンが転写された樹脂製モールドを作製した。作製した樹脂製モールドの、凸パターンの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像を図４に示した。
【００３７】
＜滅菌処理＞
樹脂製モールド作製後、サイクルトミー精工社製「ＳＸ−５００」オートクレーブを用いて、樹脂製モールドを１２１℃、２気圧の水蒸気で２０分間煮沸滅菌を行った。
【００３８】
＜生体デバイスの成型＞
生体デバイスの成型は、熱インプリント法によって行った。熱インプリントはＳＣＩＶＡＸ社製「Ｘ−３００」を用いて行った。成型温度は１２０℃、圧力は５．５ＭＰａ、成型時間３分、冷却温度８０℃、冷却時間３分とした。生体デバイスを成型するための樹脂には厚さ２００μｍのポリスチレンシートを用いた。
【００３９】
実施例１で得られた樹脂製モールドの、滅菌処理時の耐変形性および生体デバイス成型時の転写性を以下の方法にて評価した。結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
2016117156.tif 000003
【００４１】
（滅菌処理時の耐変形性）
作製した樹脂製モールドを滅菌処理後、２３±１℃、相対湿度５０±２％の環境に２４時間放置した前後の、樹脂製モールドの平面における任意の一辺の形状変化率を測定した。測定には、５枚の樹脂製モールドを使用し、それぞれの任意の一辺の形状変化率を算術平均した値を求めた。なお、形状変化率は以下の式に従い、耐変形性は以下の判定に従った。
形状変化率＝（滅菌処理前の任意の一辺の寸法−滅菌処理後の先の測定と同一の辺の寸法）／滅菌処理前の任意の一辺の寸法×１００（％）
耐変形性の評価
優：形状変化率が１％未満
可：形状変化率が１％以上５％未満
不良：形状変化率が５％以上
【００４２】
（生体デバイス成型時の転写性）
生体デバイスの断面をミクロトームで切削した試料を用い、凹パターンの深さを顕微鏡で観察し、転写率を測定した。測定には、１０サイクル〜１４サイクル目に成型した５枚の生体デバイスを使用し、それぞれの生体デバイスの転写率を算術平均した値を求めた。なお、転写率は以下の式に従い、転写性は以下の判定に従った。
転写率＝生体デバイスの中心の凹パターン深さ／樹脂製モールドの中心の凸パターン高さ×１００（％）
耐変形性の評価
優：転写率が９０％以上
可：転写率が８０％以上９０％未満
不良：転写率が８０％以下
【００４３】
［実施例２〜６］
樹脂製モールドの凸パターンを表１に示す値に変更した以外は、実施例１の方法と同様に樹脂製モールドを成型し、各種評価を行った。結果を表１に示す。
【００４４】
［実施例７］
実施例１における樹脂を、ポリカーボネート（帝人社製「パンライト」、ガラス転移温度：１６０℃、引張弾性率：４．５×１０６Ｐａ）に変更し、成型温度を１８５℃とした以外は、実施例１と同様に樹脂製モールドを成型し、各種評価を行った。結果を表２に示す。
【００４５】
［実施例８］
実施例１における樹脂を、シクロオレフィン樹脂シート（日本ゼオン社製「ＺＦ−１６」、ガラス転移温度：１６３℃、引張弾性率：６．５×１０６Ｐａ）に変更し、成型温度を１８５℃とした以外は、実施例１と同様に樹脂製モールドを成型し、各種評価を行った。結果を表２に示す。
【表２】
2016117156.tif 000004
【００４６】
［比較例１］
実施例１における樹脂を、ポリメチルメタクリレート（住友化学社製「Ｓ００１Ｇ」、ガラス転移温度：１１５℃、１８０℃における引張弾性率：４．７×１０５Ｐａ）に変更し、成型温度を１４０℃とした以外は、実施例１と同様に樹脂製モールドを成型し、各種評価を行った。結果を表２に示す。
【００４７】
［比較例２］
実施例１における樹脂を、ポリテトラフルオロエチレン（ダイキン工業社製「ポリフロンＦ１０４」、融点：３２７℃、１８０℃における引張弾性率：５．０×１０８Ｐａ）に変更し、成型温度を装置限界値である２５０℃とした以外は、実施例１と同様に樹脂製モールドを成型し、各種評価を行った。結果を表２に示す。
【００４８】
表１および２の結果から、本発明による樹脂製モールドは、滅菌処理後の耐変形性および転写性に優れることが示された。また、本発明のガラス転移温度または融点、引張弾性率を満たす他の樹脂についても同様な評価を行ったところ、良好な結果が得られた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明により、ｉＰＳ細胞をはじめとする種々の細胞を３次元的に成長させるための生体デバイスを作製するための、樹脂製モールドを提供することができる。この樹脂製モールドを用いてインプリントすることで、微細凸パターンを多数有する生体デバイスを簡便に作製できる。また、使い捨て可能な樹脂製モールドを用いることで、インプリントを繰り返すことによる剥離性の低下を抑えることができ、高価なマスターモールドを破損する可能性を低減できるため、生産性の観点からも優れているということが言える。さらに、生体デバイスに対する金属の残留量も少なくでき、品質の向上も同時に実現することができる。
【符号の説明】
【００５０】
１ａ  マスターモールド
１ｂ  樹脂製モールド用樹脂
２    生体デバイス
３    樹脂製モールド
３ａ  高さ
３ｂ  径
３ｃ  凸パターン間隔
４    樹脂製モールド凸パターン
【図１】
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【図２】
2016117156.tif 000006
【図３】
2016117156.tif 000007
【図４】
2016117156.tif 000008