(57)【要約】      （修正有）【課題】成型可能な骨代用材を生成する複合体及び方法の提供。【解決手段】骨成長のための足場は、ナノ結晶性ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、生体吸収性可塑剤及び生分解性ポリマーを含む。本発明の可塑剤には、オレイン酸、トコフェロール、オイゲノール、１，２，３−トリアセトキシプロパン、モノオレイン及びオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドが含まれる。本発明のポリマーには、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）及びポリ（グリコリド−ｃｏラクチド）が含まれる。多孔性、硬化速度及び成形性を制御する方法、および、アミノ酸を伴って、及びそれなしに生成したナノ結晶性ＨＡを使用する複合体及び方法の提供。また、骨成長のための足場は、高い強度及び成形性を示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、
生体吸収性可塑剤、及び
生分解性ポリマー
を含む、骨成長のための足場。
【請求項２】
可塑剤が親油性物質である、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
可塑剤が、オレイン酸、トコフェロール、オイゲノール及び１，２，３−トリアセトキシプロパンからなる群から選択される、請求項２に記載の足場。
【請求項４】
可塑剤が両親媒性物質である、請求項１に記載の足場。
【請求項５】
可塑剤が、モノオレイン及びオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群から選択される、請求項４に記載の足場。
【請求項６】
ポリマーが生分解性ポリエステルである、請求項１に記載の足場。
【請求項７】
可塑剤がトコフェロールであり、ポリマーがポリ（カプロラクトン）である、請求項１に記載の足場。
【請求項８】
可塑剤がオイゲノールであり、ポリマーがポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）である、請求項１に記載の足場。
【請求項９】
有効量の請求項１に記載の組成物を骨欠損部位に適用するステップを含む、骨欠損において骨成長を誘発する方法。
【請求項１０】
１）カルシウム化合物及びアミノ酸の第１溶液と、
リン酸化合物及びアミノ酸の第２溶液
を含む溶液を一緒に混合するステップであって、長さ１０〜２０ｎｍの大きさの懸濁させたナノ結晶性ＨＡ粒子と、リン酸カルシウム結晶の表面に付着したアミノ酸との分散液を形成する上記ステップ、
２）ポリマーと１つ又は複数の可塑剤とのマトリックスを、熱を使用して溶解して、第３溶液を形成するステップ、
３）ステップ１）のＨＡ粒子をステップ２）の溶液に添加するステップ、並びに
この混合物を室温に冷却することによって成形可能な複合体を形成するステップであって、得られた複合体は、手作業で少なくとも３０分間成形することができる上記ステップ
を含む、請求項１に記載の骨成長のための足場を生成する方法。
【請求項１１】
１）カルシウム化合物の第１溶液と、
リン酸化合物の第２溶液
を含む溶液を一緒に混合するステップであって、長さ１０〜２０ｎｍの大きさの懸濁させたナノ結晶性ＨＡ粒子の分散液を形成する上記ステップ、
２）ポリマーと１つ又は複数の可塑剤とのマトリックスを、熱を使用して溶解して、第３溶液を形成するステップ、
３）ステップ１）のＨＡ粒子をステップ２）の溶液に添加するステップ、並びに
この混合物を室温に冷却することによって成形可能な複合体を形成するステップであって、得られた複合体は、手作業で少なくとも３０分間成形することができる上記ステップ
を含む、請求項１に記載の骨成長のための足場を生成する方法。
【請求項１２】
アミノ酸が、ステップ１）の後に除去される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
多孔性が、両親媒性物質の添加によって低減される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ３）で添加するナノ結晶性ＨＡの量を増大することによって硬化速度が増大される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
可塑剤の量を増大することによって硬化速度を低減する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
１つ又は複数の可塑剤がトコフェロール及びオイゲノールを含み、トコフェロールに対するオイゲノールの比を増大することによって硬化速度を低減する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
抗生物質、化学療法剤、骨細胞誘発物質、骨細胞刺激物質、組織促進因子、組織分解阻害剤及び増殖因子からなる群から選択される生物活性因子をさらに含む、請求項１に記載の骨成長のための足場。
【請求項１８】
ステップ１）のアミノ酸がＬ−アスパラギン酸及びＬ−リシンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
リン酸カルシウム化合物（単数又は複数）、
生体吸収性可塑剤、及び
生分解性ポリマー
を含む、骨成長のための足場。
【請求項２０】
リン酸カルシウム化合物（単数又は複数）が、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウム、リン酸四カルシウム及びリン酸二カルシウムから選択される、請求項１９に記載の骨成長のための足場。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ナノ結晶性ハイドロキシアパタイト（「ＨＡ」）、可塑剤及び生分解性ポリマーを含む、骨細胞の成長のための足場として働く複合体に関する。本発明の特定の実施形態を、それに限定することを意図せずに開示する。本発明の一実施形態では、特定の生分解性可塑剤を添加して複合体の硬化速度を制御し、長時間にわたり成形性（ｓｈａｐｅａｂｉｌｉｔｙ）を保ち、最終的に高い強度を有する複合体をもたらす方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
医学では、ヒトの身体が新しい骨を構築するのを助ける必要が生じる状況が多い。骨折などの身体的外傷は、標準の骨折治療では不十分となる複雑な方法で骨組織に損傷を与えるおそれがある。骨組織の大部分を破壊する腫瘍は、身体が損傷を自然に治癒できないようにすることがある。もう１つの例には、自然骨が歯科インプラントを支えるには薄過ぎて骨組織を増加しなければならない、いわゆる上顎洞挙上がある。
【０００３】
骨の足場の挿入は、これらの問題を解決する一般的な方法である。骨の足場材料は、ヒトの身体に埋め込まれた場合に骨の形成を誘発し、骨細胞の培養基質として作用することになる構造及び組成物を含有する。いくつかの骨の足場は、元の骨組織にかかっていた機械的荷重に耐えることもできる。自然骨は、コラーゲン網によって囲まれた、長さ２０〜４０ｎｍ、厚さ２ｎｍ及び幅２〜４ｎｍの棒状リン酸カルシウム結晶からなる１。化学式Ｃａ５（ＰＯ４）３ＯＨを有するＨＡは無機物であり、自然骨に見出されるリン酸カルシウム無機物に非常に類似している。
【０００４】
合成の骨の足場は、ＨＡ又はリン酸三カルシウムなどの粉末形態であってよい。粉末系生成物は、骨組織を上手く修復するが、耐荷重適用には適しにくい。挿入手順を容易にすることを目的とする、注入可能な硬化する骨の足場材料もある。一例が、ＨＡ及び硫酸カルシウム半水和物の混合物であり、この組成物は水と混合され、所望の領域に注入される。硫酸カルシウムは水と反応し、ＨＡ結晶間の「接着剤」として働く。その後、硫酸カルシウム結晶は身体に吸収されて多孔質構造をもたらし、骨細胞の成長に適した環境を作り出す２。もう１つの種類の骨の足場は、剛性の種類のものであり、これらは通常、高温で焼結された多孔質ＨＡ又はリン酸三カルシウムからなる。いくつかの市販の生成物は、原料として天然サンゴを使用する。サンゴは高温でリン酸塩と反応し、得られる構造は、剛性の多孔質ＨＡ材料となる３。環境への配慮により、多孔質ＨＡ構造を生成するための合成法がより一般的になっている。剛性の骨の足場生成物の主な利点は、収縮しない材料構造であり、骨細胞が成長するために利用できる表面積を増大する多孔性である。不利益には、材料がそれにかかる力を消散できるポリマーなどの物質を含有していないことに起因して、自然骨にみられるように構造が脆いことが挙げられる。もう１つの不利益は、材料が身体に挿入され得る前に、材料を注意深く適合させる必要があるということである。
【０００５】
無機物の剛性足場の脆性を低減する一方法は、ポリマーを構造に組み込むことである。ポリマー／無機物複合材は、生分解性であってよいポリマー、及びＨＡなどの骨再生特性を有する無機物からなる。ポリマーは、複合体に弾性及び耐亀裂性をもたらし、無機物は、内因性の骨の形成を誘発する。生分解速度は、ポリマーの選択によって管理することができる。生分解性ポリマーには、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド）又はポリ（乳酸）（ＰＬＡ）及びポリ（グリコリド）（ＰＧＬ）などの合成ポリエステルが含まれるが、コラーゲン、ヒアルロン酸、キチン及びキトサンなどの天然に生じるポリマーも含まれる。これらのポリマーはヒトの身体で加水分解され、非毒性の分解生成物をもたらす４。ＰＣＬは、組成（Ｃ６Ｈ１０Ｏ２）ｎのポリエステルである。ＰＣＬは−６０℃のＴｇ及び６０℃の溶融温度を有する。生体材料への適用では、ＰＣＬは、縫合糸、根管充填剤及び薬物送達適用で使用される。ＰＣＬは、破断まで著しく高い伸長度を示し（＞７００％）、これによりＰＣＬが耐力適用に適したものになっている４。ＰＣＬが溶融すると、分子量に伴って増大する粘度を有するペーストが得られる。８００００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＣＬ溶融物は、粘性の粘着性物質である。溶融温度を超えると、ＰＣＬは任意の望ましい形状に流延することができる。冷却すると、ポリマー鎖が凝集し、その移動度が低下するため、ポリマーは急速に粘性を増す。ＰＣＬ／ＨＡの複合体は、文献に報告されており５、６、良好な機械特性を有し、骨細胞の成長を誘発することも示されている。しかしこれらの複合体は、一般に、室温で成形するには硬すぎる。
【０００６】
高密度の非多孔質ポリマー／無機物複合体を生成するために、混合物は、一般に溶融押出７、８、又は溶媒／溶液流延８、９にかけられる。高密度の複合体は高い強度を有するが、骨細胞が成長するための表面積が少ないため、骨結合特性に欠けている。多孔質構造は、骨細胞の成長のより良好な足場である。多孔質構造を生成する一方法は、いわゆるポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）、すなわち初期構造を支持し、その後洗浄又は加熱によって除去される材料を添加することである１０。一般的なポロゲンは、移植前に水によって容易に除去できる塩化ナトリウムである１１〜１３（ＵＳ５７６６６１８）。
【０００７】
骨の足場の多孔性に加えて、リン酸カルシウムの結晶径も、内因性の骨の成長を刺激するために重要である。特定の生体材料への適用では、ナノサイズの、すなわち長さ１〜１００ｎｍの粒径を有するＨＡを使用することが非常に望ましい。この径範囲の粒子に対する他の用語は、「ナノ結晶」又は単に「ナノ粒子」であり得る。一般にＨＡの生物活性は、ＨＡ結晶が、ヒトの身体によって生成されたものと類似の径及び形状である場合に改善するとみなされる。身体は、ナノサイズのＨＡを身体自体の骨組織の一部と認識し、異物周辺に新しい骨を成長し始める。移植片では、ナノサイズのＨＡによるコーティングは、マイクロサイズのＨＡと比較して、骨細胞活性を著しく増大する１４、１５。ポリマー／ＨＡ複合体では、生物活性並びに強度が、ナノサイズのＨＡによって大きく改善されている１６、１７。
【０００８】
多くの場合、室温で又はヒトの体温に近い温度でポリマー／ＨＡ複合体が成形可能な（ｓｈａｐｅａｂｌｅ）又は注入可能な場合、非常に有利である。材料は、それが埋め込まれる場合には硬化後に高い機械的荷重に耐えられるべきであり、好ましくは、材料は、骨細胞の内部成長を可能にするために多孔性であるべきである。複合体はまた、内因性の骨の成長を刺激するために、ヒトの身体に見出されるものと同じ径及び形状のＨＡ粒子を含有すべきである。
【０００９】
文献では、いくつかの特許文書が、先の必要性を満たすことを目的とする生成物を記載している。ＷＯ２００７０１５２０８Ａは、ポリ（ビニルアルコール）、水及びリン酸三カルシウムを含み、混合するとヒドロゲルを生成する注入可能な骨の足場を記載している。複合体は、存在するポリマーの量に応じて２〜６０分かけて、空洞に容易に注入することができる。硬化は、周囲の媒体に水を漏出することによって誘発される。しかしこの特許出願文書は、本明細書における本発明とは異なり、ヒトの身体において非常にゆっくり分解するポリマーを用いている。さらにその複合体は、非多孔質の高密度な骨の足場を含む。
【００１０】
ＵＳ６３３１３１２は、結晶性の低いアパタイトと生分解性ポリマーからなる骨の足場材料の生成方法を記載している。生成物は水と混合され、それによって成型可能な（ｍｏｕｌｄａｂｌｅ）複合体が作り出される。しかしこの特許出願文書は、本明細書における本発明とは異なり、主に非多孔質の高密度な複合体を得ることを企図した調製経路を記載している。
【００１１】
ＵＳ７００４９７４は、リン酸カルシウムの顆粒、脂質及びヒアルロン酸からなる物質を記載している。この物質を水と混合すると、圧縮強度が相対的に低い成型可能且つ注入可能な複合体が得られる。
【００１２】
ＵＳ２００６０１３８５７は、体温においてパテの形態を有し、室温で硬質である様々な組成物を記載している。組成物は、ゼラチン、ステアリン酸カルシウム、酢酸トコフェロールを含有し、ある例では、マイクロサイズのＨＡ粒子（６〜１２μｍ）を含有する。この文書は、ナノサイズのＨＡの使用を記載しておらず、複合体の硬化速度を制御する方法も記載していない。
【００１３】
生分解性ポリマーとＨＡ及び可塑剤の併用に関する文書がいくつかある。ＵＳ７１８６７５９は、例えば、生体適合性ポリマー、ポリ（エチレングリコール）などの水溶性の又は加水分解で分解するポリマー、及び生理活性物質からなる三成分系を記載している。複合体は、加熱時に軟化し、冷却時に硬化することができる。生理活性物質は、骨成長を誘発することができるハイドロキシアパタイトなどの物質であってよい。加水分解で分解可能な成分を除去すると、例えば水又はヒトの体内に存在する他の流体と接触させると、複合材の細孔内、ポリマーマトリックス内、又は外表面に生理活性物質が存在する状態で、多孔質構造が生成されることになる。しかし特許文書ＵＳ７１８６７５９は、水溶性の又は加水分解で分解するポリマーの形態のポロゲンを含有する複合体を開示しているものの、その成型性（ｍｏｕｌｄａｂｉｌｉｔｙ）は短時間に制限されることが証明されている。ＰＥＧの分解速度は、支持ポリマーの分解と同範囲であり１８、１９、複合体の所望の多孔性は、ＰＥＧポリマーの除去の際にさほど効率的に得られないことにも留意されたい。さらにこの特許文書は、マイクロメータサイズのＨＡ粒子を用いている。
【００１４】
ＳＥ５２０６８８は、二部から構成される注入可能な骨置換材について報告している。一方の部分は、生物学的に相溶性のある油などの生物活性物質を含有する。第２の部分は、硫酸カルシウム（硬化過程を促進するため）及び／又はＨＡなどの骨無機物代用物（１０μｍの径範囲、好ましくはそれよりも小さい）からなる骨セメントを含む。２つの成分を混合することによって、選択領域への低粘度の骨置換材の注入が容易になる。材料は、インプラントと周辺組織の間の間隙を充填するために、又は単独成分として注入することができる。骨置換材は、その組成に応じて約４分から８分後に最大硬度に達するので、身体に挿入する前に様々な形状に成型することもできる。しかし、本発明は、生分解性ポリマーを主要成分として使用しない。
【００１５】
ＷＯ２００８／０００４８８は、β−リン酸三カルシウムなどの生理活性材料、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）などの生分解性ポリマー及び生分解性ポリマーの分解を低減するための硫酸カルシウムなどの水結合剤からなり得る、組織再生のための生体材料を記載している。この文書は、生分解性ポリマーの溶解を改善するために、ポリ（エチレングリコール）４００などの化合物を使用することも記載している。この文書は、複合体の成形性を長持ちさせるための可塑剤の使用を記載しておらず、ナノサイズのＨＡの使用を記載していない。
【００１６】
既に言及した通り、骨代用材にとって、１）室温で又は３７℃を超えない温度で長時間にわたり成形可能且つ注入可能であり、２）高い機械的荷重に耐えることができ、３）骨細胞の内部成長を可能にするために多孔質であり、４）骨細胞の成長を可能な限り効率的に刺激するために、ヒトの身体に見出されるものと同じ径及び形状のＨＡ粒子を含有することが、非常に有利である。
【００１７】
前述の手法を、強力な成型可能な複合体を合成するために同時に、又は順に組み合わせる方法は、過去に開示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の主な目的は、ナノ結晶性ＨＡ、可塑剤及び生分解性ポリマーを含む、骨細胞の成長のための足場として働く複合体を提供することである。もう１つの目的は、特定の生分解性可塑剤を添加することによって複合体の硬化速度を制御して、長時間にわたり成形性を保ち、最終的に高い強度を有する複合体をもたらす方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的及び利点は、読み手に明らかとなり、これらの目的及び利点は、本発明の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＣｕＫα放射線（１．５４Å）を用いて得られたナノサイズのＨＡ粒子のＸＲＤディフラクトグラムである。
【図２】ナノサイズのＨＡ粒子のＴＥＭ画像である（拡大率１００ｋ×）。
【図３】室温における純粋なＰＣＬ、ＰＣＬ／ナノサイズのＨＡ及びＰＣＬ／マイクロサイズのＨＡ複合体についての圧縮強度（Ｐａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図４ａ】ＰＣＬ／トコフェロール／ナノサイズのＨＡとアミノ酸（ＨＡ２９重量％）の複合体について、７０℃にして１時間加熱し、次いで室温に冷却した後の、様々な時間における圧縮強度（Ｐａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図４ｂ】アミノ酸非存在のＰＣＬ／トコフェロール／ナノサイズのＨＡ（ＨＡ２９重量％）の複合体について、７０℃にして１時間加熱し、次いで室温に冷却した後の、様々な時間における圧縮強度（Ｐａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図４ｃ】ＰＣＬ／トコフェロール／マイクロサイズのＨＡ（ＨＡ２９重量％）の複合体について、７０℃にして１時間加熱し、次いで室温に冷却した後の、様々な時間における圧縮強度（Ｐａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図５】ＰＣＬ／ＰＥＧ２００００／ナノサイズのＨＡ（ＨＡ３１重量％）について、７０℃にして１時間加熱し、次いで室温に冷却した後の、様々な時間における圧縮強度（Ｐａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図６】ＰＣＬ／トコフェロール／オイゲノール／ナノサイズのＨＡ（ＨＡ２９重量％）について、７０℃にして１時間加熱し、次いで室温に冷却した後の、様々な時間における圧縮強度（Ｐａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図７ａ】ＰＣＬ／トコフェロール／モノオレイン／ナノサイズのＨＡ（ＨＡ３１重量％）の複合体について、７０℃にして１時間加熱し、次いで室温に冷却した後の、圧縮強度（ＭＰａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図７ｂ】ＰＣＬ／トコフェロール／モノオレイン／ナノサイズのＨＡ（ＨＡ３８重量％）の複合体について、７０℃にして１時間加熱し、次いで室温に冷却した後の、圧縮強度（ＭＰａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図８】ＰＣＬ／トコフェロール／ナノサイズのＨＡ（ＨＡ２９重量％）、ＰＣＬ／トコフェロール／マイクロサイズのＨＡ（ＨＡ２９重量％）、及びアミノ酸非存在のＰＣＬ／トコフェロール／ナノサイズのＨＡ（ＨＡ２９重量％）のエタノールで抽出した複合体について、室温（ｒ．ｔ．）及び体温の両方で測定した圧縮強度（ＭＰａ）対距離（ｍｍ）のグラフである。
【図９】エタノールを用いた抽出によるトコフェロールの除去後の、ＰＣＬ／トコフェロール／ナノサイズのＨＡ複合体のＳＥＭ画像である（拡大率３０ｋ×）。
【図１０ａ】水銀多孔度測定で得られたＰＣＬ／トコフェロール／ナノサイズのＨＡ複合体の細孔径分布のグラフである。
【図１０ｂ】水銀多孔度測定で得られたＰＣＬ／トコフェロール／モノオレイン／ナノサイズのＨＡ複合体の細孔径分布のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ここで、現在好ましい本発明の実施形態について詳細に言及する。
【００２２】
本発明は、ナノ結晶性ＨＡ、可塑剤及び生分解性ポリマーの複合体を含む。複合体は、室温で所望の形状に成形することができる。一定時間後に、複合体は硬化し、純粋なポリマー−ＨＡ複合体と類似の強度を有することになる。複合体の硬化速度は、生分解性可塑剤を添加することによって制御することができる。可塑剤は、埋め込まれると身体に吸収され、ナノ結晶性ＨＡ及びポリマーからなる多孔質構造を残す。可塑剤の除去後、複合体の機械的強度は著しく増大する。ナノサイズのＨＡ粒子の生理活性特性により、この構造は骨細胞の成長にとって優れた足場として働く。
【００２３】
ナノサイズのＨＡは、カルシウム化合物の水性分散液をリン酸溶液と混合するステップを含む方法を用いて合成される（例１参照）。得られたＨＡ結晶は、長さ１０〜２０ｎｍの大きさ及び２００ｍ２／ｇを超える比表面積を有する。ナノサイズのＨＡを生成する別の方法は、カルシウム化合物及びアミノ酸の水性分散液を、リン酸及びアミノ酸の溶液と一緒に混合するステップを含む。アミノ酸を用いてナノ結晶性ＨＡを生成する方法は、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６０／９９６，５６１号に記載されている。より具体的な非限定的な一例は、カルシウム化合物及びＬ−アスパラギン酸の水性分散液を、リン酸及びＬ−リシンの溶液と一緒に混合することによって生成されるものである（例２参照）。合成は、他のアミノ酸を用いて実施することもできる。
【００２４】
アミノ酸が結晶化溶液中に存在する場合、そのアミノ酸は、成長するリン酸カルシウム結晶の表面に付着し、静電斥力によって凝集及び結晶の成長を防止する。その結果、アミノ酸で被覆された、長さ１０〜２０ｎｍの大きさのナノサイズのＨＡ粒子の懸濁液が得られる。アミノ酸は、複合体の強度を改善するために使用できるが、カルボン酸、エポキシド、シアニド、アルデヒド、エステル、ハロゲン化アルキル、酸ハロゲン化物、酸無水物、ケトン及びリン酸塩などの他の官能基をＨＡ結晶に付着させるためのアンカーとして使用することもできる。任意選択によりアミノ酸は、３５０℃に加熱することによって、又は水で広範に洗浄することによって、複合体内に結晶を挿入する前に除去することができる。
【００２５】
ＨＡ粉末の粉末Ｘ線ディフラクトグラムは、図１に見ることができる。図２のＴＥＭ画像が示す通り、沈殿した結晶は長さ約１０〜２０ｎｍである（ＴＥＭサンプルの調製については例１４参照）。
【００２６】
可塑剤は、完全に又は部分的にポリマーマトリックスに溶解する。複合体が加熱されると、粘度は、ポリマー鎖の可動性の増大により低減する。室温に冷却すると、可塑剤によってポリマー鎖の急速な凝集が防止されるため、複合体はその成形性を保持する。一定時間後、一般に３０分後に、ポリマー鎖は凝集し始め、粘度及び強度が急速に増大する。硬化過程を制御する能力を有する可塑剤には、オレイン酸、トコフェロール及びオイゲノールなどの生分解性の親油性物質、１，２，３−トリアセトキシプロパン（トリアセチン）などのトリグリセリドが含まれるが、モノオレイン及びオクチル−β−Ｄ−グルコピラノシドなどの両親媒性の物質も含まれ得る。
【００２７】
ナノ結晶性ＨＡ及び可塑剤との併用に適したポリマーには、それに限定されるものではないが、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ＤＬ−乳酸）及びポリ（グリコリド−ｃｏ−ラクチド）などの生分解性ポリエステルが含まれる。これらのポリマーは併用することもできる。
【００２８】
一実施形態では、複合体は、ナノ結晶性ＨＡ、ＰＣＬ及びトコフェロールの混合物を含む。この複合体を７０℃に加熱し、３７℃又は室温に冷却する。複合体は、３７℃において手作業で少なくとも６０分間成形することができる。この複合体は、室温では手作業で少なくとも４５分間成形することができる。
【００２９】
別の実施形態では、複合体は、ナノ結晶性ＨＡ、ＰＣＬ、オイゲノール及びトコフェロールの混合物を含む。この複合体は、溶融し、室温に冷却した後、手作業で少なくとも１２０分間成形することができる。
【００３０】
さらに別の実施形態では、複合体は、ナノ結晶性ＨＡ、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）及びオイゲノールの混合物を含む。この複合体は、加熱し、室温に冷却した後、長期保存後も硬化しない粘性のペーストになる。
【００３１】
さらに別の実施形態では、複合体は、ナノ結晶性ＨＡ、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、トコフェロール及びオイゲノールの混合物を含む。この複合体は、加熱し、室温に冷却した後、弾性のゴム状の外観を有する。
【００３２】
さらに別の実施形態では、複合体は、ナノ結晶性ＨＡ、ＰＣＬ、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、オイゲノール及びトコフェロールの混合物を含む。この複合体は、加熱し、その後室温に冷却した後、手作業で約３０分間成形することができる。
【００３３】
さらに別の実施形態では、複合体は、ナノ結晶性ＨＡ、ＰＣＬ、モノオレイン及び１，２，３トリアセトキシプロパンの混合物を含む。この複合体は、ＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ複合体と類似の機械特性を有する。
【００３４】
骨成長の足場に追加の生物活性因子を含む利点は、当業者には明らかである。患者の医学的必要性に応じて、これらの因子には、それに限定されるものではないが、抗生物質、化学療法剤、骨細胞誘発物質、骨細胞刺激物質、組織促進因子、組織分解阻害剤及び増殖因子が含まれ得る。
【００３５】
ナノ結晶性ＨＡを他のリン酸カルシウムで置き換える又はそれらを混合する可能性も、当業者には明らかである。骨の足場の所望の特徴に応じて、これらのリン酸カルシウムには、それに限定されるものではないが、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウム、リン酸四カルシウム及びリン酸二カルシウムが含まれ得る。
【００３６】
複合体サンプルの機械特性を、図３〜８に示す通り、７０℃にして１時間加熱した後に冷却した際の、様々な時間（１５、２０、３０、４５、６０、１２０、２４０、３６０及び１４４０分）における圧力（Ｐａ）対距離（ｍｍ）を測定することによって試験した。図３〜８は、単に読み取る目的を容易にするための測定の代表例を示すことに留意されたい。各複合体を、寸法７ｍｍ（高さ）×７ｍｍ（直径）を有するシリンダーに入れて成形した。成形手順は、単に複合体を使い捨てのシリンジに充填し、その後少なくとも１時間、７０〜１００℃の間に加熱することによって実施した。粘性の塊を、前述の寸法を有するテフロン（登録商標）型に注入することによって、円柱形を作り出した。サンプルにかけた圧力を、距離の関数として記録した。サンプルが元の７ｍｍの高さから１ｍｍに圧縮されたときに表１〜４の値を記録した。実験はＴＡ−ＨＤｉ  Ｔｅｘｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｔａｂｌｅ  Ｍｉｃｒｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で実施し、圧縮速度０．２ｍｍ／ｓを使用した。
【００３７】
ＰＣＬの圧縮強度
背景技術の部分で言及した通り、ＰＣＬの溶融サンプルは、その融点未満に冷却してもすぐには固化しない。ポリマー鎖は徐々に凝集し始め、粘度及び圧縮強度を増大させる。４ＭＰａを超える圧縮強度を有するサンプルは、手作業で成形するか、又はシリンジを用いて注入するには硬いことを本発明者らは見出した。表１に示す通り、純粋なＰＣＬでは、ポリマーを室温に冷却した後、１５分未満でこの値に達する。冷却の約３０分後、ＰＣＬは１４．８ＭＰａの最大強度に達したこともわかる（図３参照）。
【００３８】
ナノサイズのＨＡ対マイクロサイズのＨＡ
以下の部分では、アミノ酸の存在下で調製したナノ結晶性（ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｌｉｎｅ）ＨＡをナノサイズのＨＡと呼び、アミノ酸非存在下で合成したナノ結晶性ＨＡをアミノ酸非存在のＨＡと呼ぶ。
【００３９】
ナノサイズのＨＡとマイクロサイズのＨＡの作用を比較するために、一連の圧縮強度測定を行った。マイクロサイズのＨＡは、スウェーデンＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た。結果を表１及び図３に示す。ナノ結晶性ＨＡ（ＨＡ２９重量％）では、２０分後の圧縮強度は１５．６ＭＰａとなり、それから先は複合体を手作業で成形することが不可能になった。冷却の３０分後に最大強度に達して約１７ＭＰａになり、したがって純粋なＰＣＬより１５％高かった。市販のマイクロサイズのＨＡによって、３０分後及びそれ以降に約１５ＭＰａの圧縮強度を有する、純粋なＰＣＬと類似の機械特性を有する複合体を得た。したがって、マイクロサイズのＨＡの代わりにナノサイズのＨＡを使用すると、強度が１５％高い複合体が得られる。またこれらの結果によって、ナノサイズ又はマイクロサイズのＨＡをＰＣＬと混合することは、最終的な硬化状態が類似の強度を有するにしても、硬化過程に対して、主に初期段階に対して作用を有するということが示される。ＨＡは、ポリマーの凝集過程を促進し、材料を手作業で成形することができる時間を著しく短縮する。本発明は、添加するナノ結晶性ＨＡを増大するにつれて複合体の硬化速度が増大する方法を含む。
【００４０】
可塑剤の添加
ＰＣＬ／ＨＡ複合体を成形できる時間を増大するために、生物学的に相溶性のあるいくつかの異なる可塑剤を評価した。これらの測定の結果を、図４ａ〜４ｃ及び表２に示す。
【００４１】
アミノ酸の存在下でナノサイズのＨＡを用いたＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ複合体の圧縮強度測定（例３参照）を、図４ａ及び表２に示す。ＨＡナノ粒子を例２に従って生成した。この複合体では、圧縮強度は４ＭＰａ未満を４５分間維持し、したがってこの時間内での成形が容易になる。６０分後、この複合体は圧縮強度がプラトーに達し、最大圧縮強度は７．３ＭＰａであった。
【００４２】
例１に従って調製したアミノ酸非存在のナノサイズのＨＡ粒子を用いたＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ複合体（例３参照）では、成形性は最大約４５分間維持され、圧縮強度は４ＭＰａ未満を維持した（図４ｂ参照）。６時間後に最大圧縮強度に達した。ナノサイズのＨＡをマイクロサイズのＨＡで置き換えると、図４ｃ及び表２に示す通り、圧縮強度はわずかに低下した。驚くべきことに、可塑剤としてのトコフェロールの存在は、ポリマー鎖の凝集を有効に遅延し、それによって長時間にわたり容易な成形性が可能となる。したがって本発明は、添加する可塑剤を増大するにつれて複合体の硬化速度を低減する方法を含む。
【００４３】
ポリ（ＤＬ−ラクチド）／オイゲノール／ＨＡの複合体を、例４に従って調製した。この複合体は、オイゲノールへのポリ（ＤＬ−ラクチド）の高い可溶性に起因して粘性のペーストになったが、長期保存後も硬化しなかった。
【００４４】
可塑剤の混合物
２つの可塑剤の混合物は、凝集過程をさらに遅延するために使用することもできる。生物学的に相溶性のある親油性化合物であるオイゲノールを、ＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ系に添加した。オイゲノールは、ＰＣＬにとってトコフェロールよりも良好な溶媒であり、ポリマー凝集過程に対してより強力な影響を有する。硬化速度は、可塑剤の種類によって制御することもできる。等量のトコフェロール及びオイゲノールを使用することによって（例７参照）、ポリマー鎖の凝集が有効に抑制され、室温で最大１２０分間、複合体を容易に成形することが可能になる。これは、容易な成形性を可能にする可塑剤としてトコフェロールのみを用いた複合体と比較することができる。これらの測定の結果を、図６及び表３に示す。表３に示す通り、ＰＣＬ／トコフェロール／オイゲノール／ＨＡ複合体の最終強度は、約６．７ＭＰａであり、すなわちＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡの強度と同範囲である。本発明は、トコフェロールに対するオイゲノールの比を増大することによって、複合体の硬化速度を低減する方法を含む。
【００４５】
ポリ（ＤＬ−ラクチド）／オイゲノール／トコフェロール／ＨＡ複合体を、例５に従って調製した。この複合体は、加熱し、室温に冷却した後、手作業で３０分間成形することが可能であった。次いで、弾性のゴム状の物質に固化した。
【００４６】
ポリマーの混合物
ポリ（ＤＬ−ラクチド）／ＰＣＬ／オイゲノール／トコフェロール／ＨＡ複合体を、例６に従って調製した。この複合体は、加熱し、冷却した後、手作業で１２０分間成形することが可能であった。
【００４７】
多孔質複合体の圧縮強度
既に記載の通り、親油性及び両親媒性の分子などの生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）可塑剤は、ポリマー鎖の急速な凝集を抑制するのに上手く使用され、したがって複合体を自由に形成できる時間を増大する。複合体を身体に移植した後、可塑剤はヒトの身体に吸収され、脊椎動物の骨細胞の成長に適した、ナノ結晶性ＨＡ及びポリマーからなる多孔質構造を残す。本発明は、有効量の複合体を骨欠損部位に適用することによって、骨欠損において骨成長を誘発する方法を含む。足場が身体に埋め込まれた後、身体が可塑剤を吸収し、骨成長が生じる。
【００４８】
吸収過程を模倣するために、エタノールを使用して可塑剤を抽出して（例１１参照）、多孔質複合体を得た（図９参照）。その後、得られた多孔質サンプルで圧縮強度測定を実施して、可塑剤の除去後の強度を比較した。これを、付着したアミノ酸を伴う、及びアミノ酸非存在のナノサイズのＨＡ、並びにマイクロサイズのＨＡの複合体で実施した。測定結果を図８及び表４に示す。この表からわかる通り、ナノサイズのＨＡの複合体の圧縮強度は約６．５ＭＰａであり、これと比較したマイクロサイズのＨＡの複合体は、４．０ＭＰａの強度を有していた。したがって、ナノサイズのＨＡでは、マイクロサイズのＨＡを使用した場合よりも７０％高い強度の複合体が得られる。表４及び図８からもわかる通り、アミノ酸非存在のＨＡを含有する被抽出複合体は、ナノ結晶性ＨＡを含有する複合体とマイクロサイズのＨＡを含有する複合体によって示される強度の間の複合体強度を示した。室温で圧縮強度を測定すると５．７ＭＰａであった。体温ではわずかに高い強度が観測された（５．９ＭＰａ）。したがって、ナノ結晶性ＨＡの使用によって、マイクロサイズのＨＡの使用と比較して４５％高い圧縮強度を有する複合体が得られる。つまり、アミノ酸の存在下で、又はアミノ酸非存在下でナノ結晶性ＨＡを使用しても、温度上昇に影響を受けない高い圧縮強度の複合体が得られる。室温で示された圧縮強度は、体温では低減しない。これは、体温において低い圧縮強度が観測されるマイクロサイズのＨＡの使用と比較することができる。
【００４９】
可塑剤を抽出した複合体のＳＥＭ画像を、図９に示す（手順については、例１２参照）。水銀多孔度測定（例１３参照）によって、トコフェロールの抽出後、ＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ複合体によって約０．１〜１μｍの径範囲の細孔が生成したことが明らかとなった（図１０ａ参照）。可塑剤として、等量のトコフェロール及びモノオレインの混合物を使用することにより（例８参照）、約０．０１〜０．１μｍの径範囲の小さい細孔体積の細孔、並びに１０μｍ領域の大きい細孔の複数が得られた（図１０ｂ参照）。全体の多孔性（細孔体積と、固体及び間隙成分を含む総体積の比）は、ＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ及びＰＣＬ／トコフェロール／モノオレイン／ＨＡについてそれぞれ３１％及び１４％であった。吸収後、可塑剤を用いないものでは、純粋なポリマー／ＨＡ複合体で観測されたのと類似の機械的強度の複合体が得られる。トコフェロールと両親媒性物質であるモノオレインを組み合わせることにより、約３０分間自由に成型可能である複合体が得られる。ＨＡの量を３１重量％から３８重量％に増大すると、複合体の強度が増大し、硬化が完了するまでの時間に影響する（図７及び表３参照）。最終的に、モノオレインなどの両親媒性物質は、埋め込まれた骨の足場材料の多孔性を制御するために使用することができる。多孔性は、トコフェロール対モノオレイン（ｍｏｎｏｌｅｉｎ）の比を変えることによって調節することができる。モノオレインの量を増大すると、多孔性が低減する。圧縮強度は、ナノサイズのＨＡの百分率を増大することによって増大することができる。表３からわかる通り、約２９〜３８重量％のナノサイズのＨＡを含む複合体は、適切な強度であることが見出された。
【００５０】
ＰＣＬ／ＰＥＧ／ＨＡ
既に言及した通り、ＵＳ７１８６７５９は、生分解性ポリマー、ポリ（エチレングリコール）などの水溶性の又は加水分解で分解するポリマー、及びＨＡなどの生理活性物質からなる三成分系を基にした成型可能な複合体を記載している。ポリ（エチレングリコール）に割り当てられた課題は、加水分解時に多孔性を誘発する能力である。ＰＣＬ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ２００００）及びナノ結晶性ＨＡから構成される複合体の調製により（例１０参照）、純粋なＰＣＬに匹敵する最終的な機械的強度を有する、成形可能な複合体が得られた。しかし、成形性は約１５分という短時間に制限され、その後の圧縮強度は、約１５．５ＭＰａで横ばいになった（図５及び表２参照）。表２から、およそヒトの体温である３７℃において、ＰＣＬ／ＰＥＧ／ＨＡ複合体は手作業で成形不可能であったこともわかる。これは、ポリマーマトリックス内に存在する場合のトコフェロールによって示される効果の逆の作用ではなく、ポリ（エチレングリコール）が硬化過程を促進する硬化剤のように作用することを示している。
【００５１】
使用した化学物質
生分解性ポリマーであるポリ（カプロラクトン）及びポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）を、それぞれスウェーデンＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ及び米国Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから得た（例３〜９参照）。
【００５２】
可塑剤であるトコフェロール、オイゲノール、モノオレイン及び１，２，３−トリアセトキシプロパンは、すべてスウェーデンＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た。同様に、ＨＡナノ粒子の合成に使用されるカルシウムオキシド、Ｌ−アスパラギン酸及びＬ−リシンなどのすべての試薬も、スウェーデンＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た（例１〜１０参照）。リン酸（８５重量％）はＦｌｕｋａから得た。
【００５３】
例１０で使用したポリ（エチレングリコール）２００００は、Ｆｌｕｋａから得た。
【００５４】
複合体の調製に使用した比表面積９．４ｍ２／ｇの市販のＨＡは、スウェーデンＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【００５５】
本発明の特徴は、以下の例を参照することによってより明確に理解されるが、これらの例は本発明を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５６】
その開示が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６０／９９６，５６１号に記載の通り、成型可能な複合体の合成手順の以下の例を本明細書の一般的な説明及び詳細な説明と組み合わせることによって、本発明の性質及び特徴をより完全に示す。
【００５７】
（例１）
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
ＣａＯ２．８２ｇを、ビーカー中Ｈ２Ｏ１５０ｍｌと混合した。分散液を１時間撹拌した。別のビーカーで、Ｈ３ＰＯ４３．４５ｇ（８５重量％）をＨ２Ｏ１５０ｍｌと混合した。２つのビーカーの内容物を周囲温度で混合し、得られたゲルを１２時間撹拌した。混合物をグレード４のガラスフィルターで濾過し、水（２．５Ｌ）で広範に洗浄した。ゲルの一部を乾燥させ、ＸＲＤで分析し、窒素吸着した。ＢＥＴ法で算出したこのサンプルの比表面積は、２００ｍ２／ｇであることが見出された。
【００５８】
（例２）
アミノ酸を用いたナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトを、以下の通り調製した。Ｌ−アスパラギン酸６．７０ｇを、ビーカー中Ｈ２Ｏ１５０ｍｌと混合した。ＣａＯ２．８２ｇをこの溶液に添加し、混合物を１時間撹拌した。別のビーカーで、Ｈ３ＰＯ４３．４５ｇ（８５重量％）、Ｌ−リシン６．６５ｇ及びＨ２Ｏ１５０ｍｌを混合した。この溶液のｐＨは６．４６であった。２つのビーカーの内容物を周囲温度で混合し、ｐＨを測定すると８．１０であった。混合物を１２時間撹拌した。混合物をグレード４のガラスフィルターで濾過し、水（２．５Ｌ）で広範に洗浄して、過剰のアミノ酸を除去した。得られたゲルのｐＨを測定すると７．９０であった。
【００５９】
ゲルの一部を乾燥させ、ＸＲＤで分析し、窒素吸着した。Ｘ線ディフラクトグラムを図１に示す。ＢＥＴ法で算出したこのサンプルの比表面積は、２１０ｍ２／ｇであることが見出された。
【００６０】
（例３）
ＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ
ＨＡゲルを、例１又は２に従って調製した。被覆したハイドロキシアパタイト粒子及び水からなるゲルを、分子量８００００ｇ／ｍｏｌのポリ（カプロラクトン）６グラム及びトコフェロール６グラムと混合した。水が完全に蒸発するまで、広範に撹拌しながら混合物を７０℃に加熱した。黄色混合物を撹拌装置から取り出し、室温に冷却した。複合体は、約４５分間容易に成型可能であり、その間の圧縮強度は４ＭＰａ未満であることが見出された。約１２０分後に、６．７ＭＰａの最大圧縮強度に達した。
【００６１】
（例４）
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）／オイゲノール／ＨＡ
ａ）ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
例１又は２において既に記載の通り調製した。
ｂ）成型可能な骨代用材の生成
被覆したハイドロキシアパタイト粒子及び水からなる得られたゲルを、オイゲノール４グラムと混合した。水が完全に蒸発するまで、広範に撹拌しながら混合物を７０℃に加熱した。その後、ペースト状のブレンドを、オイゲノール４グラムに溶解したポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）４グラムに添加した。次いで混合物を再度７０℃に加熱し、パン生地状の均質な混合物が得られるまで撹拌した。得られた黄色の複合材を撹拌装置から取り出し、室温に冷却した。
【００６２】
（例５）
Ｄ，Ｌ−ラクチド／トコフェロール／オイゲノール／ＨＡ
ａ）ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
例１又は２において既に記載の通り調製した。
ｂ）成型可能な骨代用材の生成
被覆したハイドロキシアパタイト粒子及び水からなる得られたゲルを、トコフェロール３グラムと混合した。混合物を７０℃に加熱し、褐色の乾燥粉末が得られるまで撹拌した。別のビーカーで、Ｄ，Ｌ−ラクチド３グラムをオイゲノール３グラムと混合し、その後７０℃に約３時間、又は均質なブレンドが観測されるまで加熱した。この均質な溶融物に、トコフェロール／ＨＡ粉末を添加し、その後混合物を７０℃で撹拌し続けた。粉末と粘性のポリマー／油溶融物との混合を容易にするために、温度を９０℃に徐々に上げた。均質な材料が得られるまで温度を９０℃に維持し、その後材料を撹拌装置から取り出した。反応混合物を室温に冷却して、ペースト状の材料を得た。
【００６３】
（例６）
ＰＣＬ／ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）／トコフェロール／オイゲノール／ＨＡ
ａ）ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
例１又は２において既に記載の通り調製した。
ｂ）成型可能な骨代用材の生成
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルを、トコフェロール１．５グラム及びオイゲノール１．５グラムに添加した。反応混合物を７０℃に加熱し、褐色の乾燥粉末が得られるまで撹拌した。トコフェロール／オイゲノール／ＨＡ粉末を添加する前に、ポリ（カプロラクトン）４．５グラム及びポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）１．５グラムを、トコフェロール１．５グラム及びオイゲノール１．５グラムと混合した。粘性の混合物を、７０℃に約３時間、又は均質なブレンドが観測されるまで加熱した。均質な溶融物に、トコフェロール／オイゲノール／ＨＡ粉末を添加し、その後均質な複合材が得られるまで、混合物を７０℃で撹拌した。得られた褐色の複合材を撹拌装置から取り出し、室温に冷却した。
【００６４】
（例７）
ＰＣＬ／トコフェロール／オイゲノール／ＨＡ
ａ）ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
例１又は２において既に記載の通り調製した。
ｂ）成型可能な骨代用材の生成
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルを添加する前に、オイゲノール３グラムを、トコフェロール３グラム及び分子量８００００ｇ／ｍｏｌを有するポリ（カプロラクトン）６グラムと混合した。粘性の混合物を、７０℃にして撹拌なしに約２時間加熱し、その後２時間撹拌した。均質な黄色溶融物に、ハイドロキシアパタイトをゲルとして添加した。次いで、水が完全に蒸発するまで、広範に撹拌しながら混合物を７０℃に加熱した。その後、水が完全に蒸発するまで、広範に撹拌しながら混合物を７０℃に加熱した。得られた褐色の複合材を撹拌装置から取り出し、室温に冷却した。可塑剤としてのトコフェロール／オイゲノールの組合せにより、複合体を最大１２０分間成形可能にすることができる。ＰＣＬ／トコフェロール／オイゲノール／ＨＡ複合体の最終圧縮強度は、約６．７ＭＰａであった。
【００６５】
（例８）
ＰＣＬ／トコフェロール／モノオレイン／ＨＡ
ａ）ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
例１又は２において既に記載の通り調製した。
ｂ）成型可能な骨代用材の生成
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルを添加する前に、モノオレイン３グラムを、トコフェロール３グラム及び分子量８００００ｇ／ｍｏｌを有するポリ（カプロラクトン）５グラムと混合した。粘性の混合物を、７０℃にして約１２時間加熱した後、ハイドロキシアパタイトゲルを添加した。その後、水が完全に蒸発するまで、広範に撹拌しながら混合物を７０℃に加熱した。得られた黄色の複合材を撹拌装置から取り出し、室温に冷却した。可塑剤としてのトコフェロール／モノオレインの組合せにより、その後約３０分間自由に成型可能であり、約５．５ＭＰａの最大圧縮強度に達する複合体が得られる。
【００６６】
（例９）
ＰＣＬ／モノオレイン／トリアセチン／ＨＡ
ａ）ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
例１又は２において既に記載の通り調製した。
ｂ）成型可能な骨代用材の生成
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルを添加する前に、モノオレイン３グラムを、１，２，３−トリアセトキシプロパン３グラム及び分子量８００００ｇ／ｍｏｌを有するポリ（カプロラクトン）６グラムと混合した。粘性の混合物を、７０℃に加熱した。均質でわずかに不透明な溶融物に、ハイドロキシアパタイトをゲルとして添加した。その後、水が完全に蒸発するまで、広範に撹拌しながら混合物を７０℃に加熱した。得られたオフホワイト色の複合材を撹拌装置から取り出し、室温に冷却した。可塑剤としてのモノオレイン及び１，２，３−トリアセトキシプロパンの組合せにより、約４５分間自由に成型可能であり、ＰＣＬ／トコフェロール／ＨＡ複合体の圧縮強度に類似の６．３ＭＰａの圧縮強度を有する複合体が得られる（例３参照）。
【００６７】
（例１０）
ＰＣＬ／ＰＥＧ２００００／ＨＡ
ポロゲンとして作用する加水分解性化合物を、生分解性ポリマー及び本明細書における本発明のナノサイズのＨＡと組み合わせて添加することの作用を評価するために、ＵＳ７１８６７５９で調製された複合体の機械特性及び成形時間を、本明細書における本発明の複合体と比較した。マイクロメータサイズのＨＡの代わりにナノ結晶性ＨＡ粒子を使用して、ＵＳ７１８６７５９の複合体を記載の通り調製した（以下の説明参照）。
【００６８】
ａ）ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルの合成
例１又は２において既に記載の通り調製した。
ｂ）成型可能な骨代用材の生成
ナノ結晶性ハイドロキシアパタイトゲルを添加する前に、８０℃で５グラムのＰＥＧ２００００をポリ（カプロラクトン）６．７グラムと２時間混合し、その後同じ温度において機械撹拌した。次いで、水が完全に蒸発するまで、広範に撹拌しながら混合物を８０℃に維持した。得られた不透明な複合材を撹拌装置から取り出し、室温に冷却した。複合体は、約２０〜３０分後に約１５ＭＰａの最大圧縮強度に達した。
【００６９】
（例１１）
可塑剤の抽出
抽出過程を６日にわたって室温で実施し、１日おきにエタノール相を交換した。圧縮強度を、表４に示す通り室温及び３７℃で測定した。体温で実施した実験では、複合材を測定の前に少なくとも１時間、３７℃に加熱した。表４に示した圧縮強度値は、少なくとも４つの実験の平均を表す。
【００７０】
（例１２）
ＳＥＭ分析のためのエタノールで抽出した複合体サンプルの調製
被抽出サンプルは、例１１に記載の方法に従って調製した。被抽出被験物をカーボンテープ上に置き、その後ＪＥＯＬスパッタコーターを使用して薄金膜をスパッタリングした。ＳＥＭ分析は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｃａ  ＥＤＸ系を備えたＬＥＯ  Ｕｌｔｒａ  ５５  ＦＥＧ  ＳＥＭにより、２〜５ｋＶで操作して実施した。二次電子検出器を検出のために使用した。
【００７１】
（例１３）
Ｈｇ−ポロシメトリー測定のためのサンプルの調製
サンプルを、寸法約１×１×１ｃｍの立方体に手作業で成形した。その後、既に記載の手順に従って、トコフェロール相をエタノールで抽出した。分析の前に、サンプルを周囲温度で真空下に終夜置いた。
【００７２】
（例１４）
ＴＥＭ分析のためのサンプルの調製
ＨＡ材料を細粉に粉砕し、その粉末をエタノールに分散させ、次いでその分散液の数滴を穴開きカーボングリッド上に置き、その後室温で乾燥させることによって被験物を調製した。分析は、ＪＥＯＬ  １２００  ＥＸ  ＩＩ  顕微鏡により、１２０ＫＶで操作して実施した。
【００７３】
本発明は、そのより広範な態様において、示し記載した特定の詳細に限定されず、本発明の原則から逸脱することなく、また本発明の主な利点を損なうことなく、かかる詳細から逸脱してもよい。
【００７４】
【表１】
2016005555.tif 000002
【表２】
2016005555.tif 000003
【表３】
2016005555.tif 000004
【表４】
2016005555.tif 000005
2016005555.tif 000006
【図１】
2016005555.tif 000007
【図２】
2016005555.tif 000008
【図３】
2016005555.tif 000009
【図４ａ】
2016005555.tif 000010
【図４ｂ】
2016005555.tif 000011
【図４ｃ】
2016005555.tif 000012
【図５】
2016005555.tif 000013
【図６】
2016005555.tif 000014
【図７ａ】
2016005555.tif 000015
【図７ｂ】
2016005555.tif 000016
【図８】
2016005555.tif 000017
【図９】
2016005555.tif 000018
【図１０ａ】
2016005555.tif 000019
【図１０ｂ】
2016005555.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成27年8月7日(2015.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム化合物を含む第１溶液と、リン酸化合物を含む第２溶液とを一緒に混合
するステップ、
１０〜２０ｎｍの長さを有するリン酸カルシウム粒子を含む懸濁液を形成するステップ、
リン酸カルシウム粒子を、生分解性ポリマー及び１つ又は複数の可塑剤と組み合わせて複合体を形成するステップ、
成形可能な複合体を形成するのに十分な温度で該複合体を加熱するステップ、
並びに成形可能な複合体を室温まで冷却するステップ、
を含む骨成長のための足場を生成する方法であって、
該成形可能な複合体は、該加熱処理後一定期間手作業で成形することができ、それにより骨成長のための足場を形成する、上記方法。
【請求項２】
冷却を行って前記成形可能な複合体を硬化させて移植可能な足場とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、複合体への両親媒性物質の添加を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
複合体中の可塑剤の量を増大することによって低減された硬化速度でもって冷却が実行される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
足場が抗生物質、化学療法剤、骨細胞誘発物質、骨細胞刺激物質、組織促進因子、組織分解阻害剤、増殖因子及びこれらの組み合わせからなる群から選択される生物活性因子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リン酸カルシウム粒子が、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸二カルシウム、ハイドロキシアパタイト、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
複合体が１，２，３−トリアセトキシプロパン及びポリ−カプロラクトンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
カルシウム化合物を含む第１溶液と、リン酸化合物を含む第２溶液とを一緒に混合するステップ、
１０〜２０ｎｍの長さと２００ｍ２／ｇを超える比表面積を有するナノ結晶性ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）粒子を含む懸濁液を形成するステップ、
並びに該ナノ結晶性ＨＡ粒子を、生分解性ポリマー及び１つ又は複数の可塑剤と組み合わせてナノ結晶性ＨＡ複合体を形成し、それにより骨成長のためのナノ結晶性ＨＡの足場を形成するステップ、
を含む骨成長のためのナノ結晶性ＨＡの足場を生成する方法。
【請求項９】
第１溶液と第２溶液とがそれぞれ少なくとも一つのアミノ酸を含み、及びナノ結晶性ＨＡ粒子がアミノ酸コーティングを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み合わせのステップの前にアミノ酸コーティングを除去するステップを更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ酸コーティングがＬ−アスパラギン酸及びＬ−リシンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記組み合わせのステップの後に、複合体を加熱し、室温まで複合体を冷却するステップを更に含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
成形可能な複合体を形成するのに十分な温度で複合体を加熱し、次いで冷却を行って成形可能な複合体を硬化させて移植可能な足場とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、複合体への両親媒性物質の添加を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
両親媒性物質が足場の多孔性を低減させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
複合体中のナノ結晶性ＨＡの量を増大することによって増大された硬化速度でもって冷却が実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
複合体中の可塑剤の量を増大することによって低減された硬化速度でもって冷却が実行される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
１つ又は複数の可塑剤がトコフェロール及びオイゲノールを含み、トコフェロールに対するオイゲノールの比を増大することによって複合体の硬化速度を低減する、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
足場が抗生物質、化学療法剤、骨細胞誘発物質、骨細胞刺激物質、組織促進因子、組織分解阻害剤、増殖因子及びこれらの組み合わせからなる群から選択される生物活性因子を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
足場が、更にリン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸二カルシウム、ハイドロキシアパタイト、又はそれらの組み合わせを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
複合体が１，２，３−トリアセトキシプロパン及びポリ−カプロラクトンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２２】
成形可能な複合体は、手作業で少なくとも１０分間成形することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
成形可能な複合体は、手作業で少なくとも１５分間成形することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
成形可能な複合体は、手作業で少なくとも３０分間成形することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
成形可能な複合体は、手作業で少なくとも４５分間成形することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
カルシウム化合物を含む第１溶液と、リン酸化合物を含む第２溶液を含む溶液とを一緒に混合するステップ、
１０〜２０ｎｍの長さを有するリン酸カルシウム粒子を含む懸濁液を形成するステップ、
リン酸カルシウム粒子を、生分解性ポリマー及び１つ又は複数の可塑剤と組み合わせて複合体を形成するステップであって、該複合体は１，２，３−トリアセトキシプロパン及びポリ−カプロラクトンを含むステップ、
成形可能な複合体を形成するのに十分な温度で該複合体を加熱するステップ、
並びに成形可能な複合体を室温まで冷却し、それにより骨成長のための足場を生成するステップ、
を含む骨成長のための足場を生成する方法。
【請求項２７】
さらに、複合体への両親媒性物質の添加を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
成形可能な複合体は、手作業で少なくとも１０分間成形することができる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
足場が抗生物質、化学療法剤、骨細胞誘発物質、骨細胞刺激物質、組織促進因子、組織分解阻害剤、増殖因子及びこれらの組み合わせからなる群から選択される生物活性因子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
リン酸カルシウム粒子が、リン酸三カルシウム、リン酸オクタカルシウム、リン酸四カルシウム、リン酸二カルシウム、ハイドロキシアパタイト、又はそれらの組み合わせから選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
リン酸カルシウム粒子が、ハイドロキシアパタイトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
カルシウム化合物を含む第１溶液と、リン酸化合物を含む第２溶液とを一緒に混合するステップ、
１０〜２０ｎｍの長さを有するナノ結晶性ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）粒子を含む懸濁液を形成するステップ、
並びに該ナノ結晶性ＨＡ粒子を、生分解性ポリマー及び１つ又は複数の可塑剤と組み合わせて、１，２，３−トリアセトキシプロパン及びポリ−カプロラクトンを含むナノ結晶性ＨＡ複合体を形成し、それにより骨成長のためのナノ結晶性ＨＡの足場を形成するステップ、
を含む骨成長のためのナノ結晶性ＨＡの足場を生成する方法。
【請求項３３】
さらに、複合体への両親媒性物質の添加を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
成形可能な複合体を形成するのに十分な温度で複合体を加熱するステップを更に含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
成形可能な複合体は、手作業で少なくとも１０分間成形することができる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
足場が抗生物質、化学療法剤、骨細胞誘発物質、骨細胞刺激物質、組織促進因子、組織分解阻害剤、増殖因子及びこれらの組み合わせからなる群から選択される生物活性因子を含む、請求項３２に記載の方法。
【外国語明細書】
2016005555000001.pdf