(57)【要約】【課題】１つには、向上した生体内における安定性を示す、抗ＮＧＦ抗体を提供すること。【解決手段】本発明は、安定化ヒンジ領域変異を含むＩｇＧ４定常領域を含有する抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体を提供し、本抗体は、カニクイザルにおいて、予想外に長い血清半減期を示す。抗ＮＧＦ抗体を含む薬学的組成物、ＮＧＦ抗体をコードする核酸、ＮＧＦ抗体を発現するための宿主細胞、およびＮＧＦ関連の疾患または状態を治療するために本抗体を使用する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体であって、（ｉ）配列番号３、４及び５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、２及び３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号６、７及び８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、２及び３を含む軽鎖可変領域、並びに（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、前記ヒトＩｇＧ４定常領域が、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、前記抗体が、少なくとも１０〜３０日のヒトにおける平均終末消失半減期を有するか、又は、少なくとも３０日のヒトにおける平均薬理学的半減期を有する、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び
（ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ４定常領域
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体であって、（ｉ）配列番号３、４及び５のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、２及び３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号６、７及び８のアミノ酸配列をそれぞれ有するＣＤＲ１、２及び３を含む軽鎖可変領域、並びに（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含み、前記抗体が、１００ｐＭ以下のＫＤでヒト又はラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０でＴｒｋＡ又はｐ７５ＮＴＲへのＮＧＦの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍｌ以下のＩＣ５０でＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する、抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗ＮＧＦ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の抗ＮＧＦ抗体と、ＮＧＦ関連の疾患又は状態の治療における前記抗体の使用のための説明書とを含む、キット。
【請求項６】
対象におけるＮＧＦ関連の疾患又は状態を軽減又は阻害するための薬学的組成物であって、請求項１に記載の抗ＮＧＦ抗体を含む、薬学的組成物。
【請求項７】
状態が、痛みであり、前記痛みが、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、骨転移による痛み、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群、慢性無菌前立腺炎に伴う痛み、子宮内膜症に伴う痛み、子宮筋腫に伴う痛み、及び術後痛からなる群から選択される、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記抗体が、対象への単回用量の前記抗ＮＧＦ抗体の投与の後、少なくとも４週間〜１２週間の間、前記対象における痛みを緩和する、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記対象におけるリバウンド効果が回避され、前記抗体が、少なくとも１０〜３０日のヒトにおける終末消失半減期を有するか、又は、少なくとも３０日のヒトにおける平均薬理学的半減期を有し、前記抗体が、リバウンド効果が前記対象において回避されるような投与量及び頻度で投与される、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体をコードする発現ベクターであって、抗体重鎖をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列と、抗体軽鎖をコードする配列番号１４のヌクレオチド配列とを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
抗ＮＧＦ抗体を発現させる方法であって、配列番号１１によりコードされる重鎖と、配列番号１４によりコードされる軽鎖とを含む抗ＮＧＦ抗体が発現するように、請求項１１に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、感覚および交感神経ニューロンの生存および分化を促進する分子として、５０年以上前に発見された分泌タンパク質である。ＮＧＦのβ鎖は、単独で、ＮＧＦの神経成長刺激活性に関与する。β鎖は、ホモ二量体化され、より大きなタンパク質複合体に取り込まれる。ＮＧＦは、ニューロトロフィンとして知られる神経栄養因子のファミリーのメンバーである。ＮＧＦは、ＴｒｋＡとして知られるトロポミオシン受容体キナーゼに高親和性で結合する。ＮＧＦは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである、ｐ７５ＮＴＲとして知られる受容体に結合することもでき、これは、他のニューロトロフィンとも相互作用する。ＮＧＦの構造および機能は、例えば、Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１２１７−１２８１、Ｗｅｉｓｍａｎｎ，Ｃ．  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．（２００１）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５８：７４８−７５９、Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｍ．（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１−２６に概説される。
【背景技術】
【０００２】
ＮＧＦは、当初、ニューロンの生存および分化を促進するその能力について特定されたが、これらの発育作用は、ＮＧＦの生物学的側面の１つでしかないという証拠が増加している。特に、ＮＧＦは、持続性の痛み、または慢性の痛みの伝達および維持に関係づけられている。例えば、ＮＧＦの局所および全身投与は、痛覚過敏および異痛を誘発することが示されている（Ｌｅｗｉｎ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１９０３−１９１２）。ヒトにおけるＮＧＦの静脈内注射は、全身の筋痛をもたらし、一方、局所投与は、全身作用に加え、注入部位の痛覚過敏および異痛を惹起する（Ａｐｆｅｌ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５１：６９５−７０２）。さらに、特定の形態の癌において、過剰なＮＧＦは、癌性疼痛の誘発を伴う、神経線維の成長および浸潤を促進する（Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２４１−２２８）。
【０００３】
慢性の痛みにおけるＮＧＦの関与は、ＮＧＦの作用の阻害に基づく治療アプローチへの相当な関心を引き起こした（例えば、Ｓａｒａｇｏｖｉ，Ｈ．Ｕ．ａｎｄ  Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｋ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９３−９８を参照）。例えば、ＴｒｋＡ受容体の可溶型がＮＧＦの活性を遮断するために使用され、これは、病変部のニューロンの細胞体を損傷することなく、神経因性痛を担う神経腫の形成を著しく減少させることが示された（Ｋｒｙｇｅｒ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ．（Ａｍ．）２６：６３５−６４４）。
ＮＧＦ活性を中和する別のアプローチは、抗ＮＧＦ抗体の使用であり、その抗体の例が記載されている（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／７８６９８号、同第ＷＯ２００１／６４２４７号、同第ＷＯ２００２／０９６４５８号、同第ＷＯ２００４／０３２８７０号、同第ＷＯ２００５／０６１５４０号、同第ＷＯ２００６／１３１９５１号、同第ＷＯ２００６／１１０８８３号、米国特許第７，４４９，６１６号、米国公開第ＵＳ２００５００７４８２１号、同第ＵＳ２００８００３３１５７号、同第ＵＳ２００８０１８２９７８号、および同第ＵＳ２００９００４１７１７号を参照）。神経因性痛の動物モデル（例えば、神経幹または脊髄神経結紮）において、ＮＧＦに対する中和抗体の全身注入は、異痛および痛覚過敏の両方を防止している（Ｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７−８４６、Ｒｏ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐａｉｎ７９：２６５−２７４）。さらに、中和抗ＮＧＦ抗体を用いた治療は、マウス癌性疼痛のモデルにおいて、顕著な痛みの軽減をもたらしている（Ｓｅｖｃｉｋ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐａｉｎ  １１５：１２８−１４１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／７８６９８号
【特許文献２】ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／６４２４７号
【特許文献３】ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２／０９６４５８号
【特許文献４】ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０３２８７０号
【特許文献５】ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０６１５４０号
【特許文献６】ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１３１９５１号
【特許文献７】ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１１０８８３号
【特許文献８】米国特許第７，４４９，６１６号
【特許文献９】米国公開第ＵＳ２００５００７４８２１号
【特許文献１０】米国公開第ＵＳ２００８００３３１５７号
【特許文献１１】米国公開第ＵＳ２００８０１８２９７８号
【特許文献１２】米国公開第ＵＳ２００９００４１７１７号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｏｆｒｏｎｉｅｗ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４：１２１７−１２８１
【非特許文献２】Ｗｅｉｓｍａｎｎ，Ｃ．  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．（２００１）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５８：７４８−７５９
【非特許文献３】Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｍ．（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１−２６
【非特許文献４】Ｌｅｗｉｎ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．６：１９０３−１９１２
【非特許文献５】Ａｐｆｅｌ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５１：６９５−７０２
【非特許文献６】Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：２４１−２２８
【非特許文献７】Ｓａｒａｇｏｖｉ，Ｈ．Ｕ．ａｎｄ  Ｇｅｈｒｉｎｇ，Ｋ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９３−９８
【非特許文献８】Ｋｒｙｇｅｒ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ．（Ａｍ．）２６：６３５−６４４
【非特許文献９】Ｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｓ．ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ，Ｍ．Ａ．（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：８３７−８４６
【非特許文献１０】Ｒｏ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐａｉｎ７９：２６５−２７４
【非特許文献１１】Ｓｅｖｃｉｋ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐａｉｎ  １１５：１２８−１４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
よって、前述を考慮すると、さらなるＮＧＦ拮抗薬が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、向上した生体内における安定性を示す、抗ＮＧＦ抗体を提供する。特に、本発明は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体を提供し、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、変異、好ましくはヒンジ領域変異を含み、本抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日、典型的には、約１５〜約２２の範囲（もしくは１５日〜２２日の範囲）、または約１５日〜２８日の範囲（もしくは１５日〜２８日の範囲）、または約２１日〜約２８日の範囲（もしくは２１日〜２８日の範囲）の終末消失半減期等の、予想外の長い終末消失半減期を示す。この安定した抗ＮＧＦ抗体（例えば、ヒンジ安定化抗体）は、ラットにおいて、少なくとも８日、典型的には、約８〜約９日の範囲（もしくは８〜９日の範囲）の終末消失半減期も示す。また他の実施形態において、安定化抗ＮＧＦ抗体（例えば、ヒンジ安定化抗体）は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日、または少なくとも１０日、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、または約１０日〜約４０日の範囲、または約１５日〜約３０日の範囲（もしくは１０〜４０日の範囲もしくは１５〜３０日の範囲）の平均終末消失半減期を示し得る。また他の実施形態において、安定化抗ＮＧＦ抗体（例えば、ヒンジ安定化抗体）は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または少なくとも４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間の範囲）、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【０００８】
好ましくは、ＩｇＧ４定常領域における変異は、ヒンジ領域変異である。さらにより好ましくは、ＩｇＧ４定常領域におけるヒンジ領域変異は、（ヒトＩｇＧ４定常領域の野生型アミノ酸配列を示す）配列番号９のアミノ酸位置１０８に対応するアミノ酸位置でセリンの変異を含む。したがって、本発明は、ヒトＩｇＧ４定常領域を有する抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体を提供し、ヒンジ領域変異を含む前記ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号９のアミノ酸位置１０８に対応するアミノ酸位置で、セリンの変異を含む。より好ましくは、配列番号９のアミノ酸位置１０８に対応するアミノ酸位置のセリンは、プロリンに変異される。好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体のヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。代替的に、他の可能なＩｇＧ４安定化変異を本明細書に記載する。
【０００９】
本発明の好ましい抗ＮＧＦ抗体は、重鎖アミノ酸配列が配列番号１３に示され、軽鎖アミノ酸配列が配列番号１６に示される、抗体ＰＧ１１０である。したがって、本発明は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体を提供し、本抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。別の実施形態において、本発明は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体を提供し、本抗体は、配列番号１１のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖と、配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖とを含む。また別の実施形態において、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗ＮＧＦ抗体を提供し、本抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日（典型的には、約１５〜約２２日の範囲もしくは１５〜２２日の範囲、または約１５日〜２８日の範囲もしくは１５〜２８日の範囲、または約２１日〜約２８日の範囲もしくは２１〜２８日の範囲）の終末消失半減期を有する、および／またはヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日（または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または約１０日〜約４０日の範囲、または約１５〜約３０日の範囲、または１０〜４０日の範囲、または１５〜３０日の範囲）の終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または少なくとも４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間の範囲）、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。好ましくは、重鎖は、配列番号１１のヌクレオチド配列によりコードされる。好ましくは、抗体は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。好ましくは、軽鎖は、配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされる。
【００１０】
別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む（これは、ＰＧ１１０の重鎖可変領域を示す）。別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む（これは、ＰＧ１１０の軽鎖可変領域を示す）。また別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。さらに別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、ＮＧＦへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。
【００１１】
別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域を含む（配列番号３、４、および５は、それぞれ、ＰＧ１１０の重鎖可変領域ＣＤＲ１、２、および３を示す）。別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域を含む（配列番号６、７、および８は、それぞれ、ＰＧ１１０の軽鎖可変領域ＣＤＲ１、２、および３を示す）。さらに別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域を含み、かつそれぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、以下の機能特性のうちの１つ以上を有する：
ａ）ヒトＮＧＦに結合するが、ヒトの脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、またはヒトニューロトロフィン４（ＮＴ−４）には結合しない、
ｂ）１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合する、
ｃ）ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害する、
ｄ）ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する、
ｅ）ＮＧＦ依存性のニワトリ後根神経節の生存を阻害する、
ｆ）ＮＧＦ依存性のＰＣ１２細胞神経突起伸長を阻害する、。
【００１３】
別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、対象に投与された時に、リバウンド効果を示さない。例えば、抗体の投与の投与量および投与頻度は、対象に投与された時に、抗体がリバウンド効果を示さないように選択することができる。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、長期間、例えば、少なくとも約１週間、または少なくとも約２週間、または少なくとも約４週間、または少なくとも約８週間、少なくとも約１２週間、または少なくとも約１週間〜約１２週間、または少なくとも約４週間〜約１２週間、または少なくとも約８週間〜約１２週間の間、または少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間の間、または少なくとも１〜１２週間、または少なくとも４〜１２週間、または少なくとも８〜１２週間、対象の痛みを緩和することができる。
【００１５】
特に好ましい実施形態において、本発明は、延長された終末消失半減期と、長期間の痛み緩和とを組み合わせた有利な特徴を有する抗ＮＧＦ抗体を提供する。したがって、本発明は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体も提供し、本ヒトＩｇＧ４定常領域は変異を含み（好ましくは、ヒンジ領域変異）、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日、または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または約１０日〜約４０日の範囲、または約１５日〜約３０日の範囲（または１０〜４０日の範囲もしくは１５〜３０日の範囲）の終末消失半減期を有し、本抗体は、ヒト対象に単回用量の抗体を投与した後、少なくとも約１週間〜約１２週間もしくは少なくとも１週間〜１２週間、または少なくとも約４週間〜約１２週間もしくは少なくとも４週間〜１２週間（またはヒト対象に単回用量の抗体を投与した後、少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間、または１〜１２週間、または４〜１２週間、または８〜１２週間）の間、痛みを緩和する。好ましくは、ヒンジ領域変異は、配列番号９のアミノ酸位置１０８に対応するアミノ酸位置でセリンの変異、好ましくは、配列番号９のアミノ酸位置１０８に対応するアミノ酸位置でセリンのプロリンへの変異を含む。より好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。種々の実施形態において、抗体は、本明細書に記載される機能特性の１つ以上を示すことができる。好ましい実施形態において、抗体は、ＮＧＦへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。
【００１６】
また別の実施形態において、本発明は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体を提供し、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。好ましくは、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日、または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または約１０日〜約４０日の範囲、または約１５日〜３０日の範囲（または１０〜４０日の範囲もしくは１５〜３０日の範囲）の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間の範囲）、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。抗体は、ヒトＮＧＦに結合するが、ヒトの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、またはヒトニューロトロフィン４（ＮＴ−４）には結合しない、ＮＧＦ依存性のニワトリ後根神経節生存の阻害、および／またはＮＧＦ依存性のＰＣ１２細胞神経突起伸長の阻害等の、１つ以上のさらなる機能特性をさらに示し得る。好ましくは、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１週間〜約１２週間、または少なくとも約４週間〜約１２週間、または少なくとも約８週間〜約１２週間、または少なくとも１週間〜１２週間、または少なくとも４週間〜１２週間、または少なくとも８週間〜１２週間（または少なくとも１週間、または少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間、または１〜１２週間、または４〜１２週間、または８〜１２週間）の間、痛みを緩和する。好ましくは、抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体は、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域を含むか、または抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、または抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか、または抗体は、ＮＧＦへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。
【００１７】
種々の好ましい実施形態において、本発明は、以下の特徴を有する抗ＮＧＦ抗体を提供する：
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００１８】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００１９】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００２０】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００２１】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含む定常領域を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００２２】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含む定常領域を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００２３】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害し、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示してもよい。
【００２４】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。
【００２５】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。
【００２６】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。
【００２７】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。
【００２８】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含む定常領域を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。
【００２９】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および（ｉｉｉ）ヒンジ領域変異を含む定常領域を含み、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。
【００３０】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は変異を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００３１】
抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は変異を含み、本抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日の終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。
【００３２】
種々の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくはヒト抗体、または潜在的Ｔ細胞エピトープが排除された抗体であることができる。
【００３３】
別の態様において、本発明は、本発明の抗ＮＧＦ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。
【００３４】
また別の態様において、本発明は、対象のＮＧＦ関連の疾患もしくは状態を軽減する、または阻害する方法を提供し、本方法は、本発明の抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含む。ＮＧＦ関連の疾患および状態の非限定例としては、炎症性疼痛、術後痛、神経因性痛、骨折痛、痛風関節痛、ヘルペス後神経痛、癌性疼痛、変形性関節炎痛または関節リウマチ痛、座骨神経痛、鎌状赤血球クリーゼに伴う痛み、頭痛、月経困難、子宮内膜症、筋骨格痛、慢性腰痛、線維筋痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢胞、前立腺炎、膀胱炎、間質性膀胱炎、切開による痛み、偏頭痛、三叉神経痛、焼けどおよび／または創傷による痛み、外傷に伴う痛み、筋骨格系疾患に伴う痛み、強直性脊椎炎、関節周囲病変、骨転移による痛み、ＨＩＶによる痛み、紅痛症、または膵炎もしくは腎結石により生じる痛みが挙げられる。ＮＧＦ関連の疾患および状態の他の例としては、悪性メラノーマ、シェーグレン症候群、および重度の気道過敏反応を伴う制御不能な喘息および難治性の咳等の、喘息が挙げられる。本発明の方法に従う治療における特定の好ましい疾患および状態は、炎症性疼通（特に、変形性関節炎痛または関節リウマチ痛）、筋骨格痛（特に、慢性腰痛）、神経因性痛（特に、糖尿病神経障害）、癌性疼痛および骨転移による痛み、間質性膀胱炎／有痛性膀胱症候群、慢性無菌前立腺炎に伴う痛み、子宮内膜症および／または子宮筋腫に伴う痛み、ならびに術後痛を含む。
【００３５】
他の適切な投与経路が本明細書に記載されるが、抗体は、例えば、静脈内、皮下（例えば、注入ペンまたは皮下移植片を介して）、筋肉内、または関節内に投与することができる。好ましくは、抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。抗体は、例えば、約３μｇ／ｋｇ〜約３０００μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与することができ、好ましい投与量は、１００μｇ／ｋｇまたは３００μｇ／ｋｇを含む。他の実施形態において、他の適切な投与量および用量範囲が本明細書に記載されるが、抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。さらに、抗体の固定量製剤を使用することができる。
【００３６】
抗体は、単独で、または１つ以上の追加の薬学的薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、ＮＳＡＩＤ、鎮痛薬（例えば、オピオイド鎮痛薬）、局所麻酔薬、神経遮断、フェノール遮断、治療抗体、抗痙攣薬、抗うつ剤、局所カプサイシン、ステロイド、または抗ウイルス剤等の第２の薬学的薬剤は、本発明の抗ＮＧＦ抗体と組み合わせて投与することができる。本発明の抗体を用いた併用治療において特に好ましい第２の薬学的薬剤は、モルヒネ等のオピオイド鎮痛薬を含む。併用治療における他の好ましい第２の薬学的薬剤は、ＴｒｋＡ阻害剤およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤を含む。
【００３７】
好ましい実施形態において、本発明は、対象の痛みを軽減する、または阻害する方法を提供し、本方法は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体を対象に投与することを含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも４〜１２週間（または少なくとも１〜１２週間、または少なくとも８〜１２週間、または４〜１２週間、または１〜１２週間、８〜１２週間、または少なくとも１週間、または少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間）の間、対象の痛みを緩和する。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、痛みは、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、骨転移による痛み、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群、慢性無菌前立腺炎に伴う痛み、子宮内膜症に伴う痛み、子宮筋腫に伴う痛み、および術後痛から成る群から選択される。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、０．１〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。好ましくは、抗体は、静脈内または皮下に投与される。好ましくは、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日（または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または約１０日〜約４０日の範囲、または約１５〜３０日の範囲、または１０〜４０日の範囲、または１５〜３０日の範囲）の終末消失半減期を有する。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、リバウンド効果が対象において回避されるように、対象の神経成長因子（ＮＧＦ）関連の疾患または状態を軽減する、または阻害する方法を提供し、本方法は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域はヒンジ領域変異を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日（または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または約１０〜約４０日の範囲、または約１５〜約３０日の範囲、または１０〜４０日の範囲、または１５〜３０日の範囲）の終末消失半減期を有し、本抗体は、リバウンド効果が対象において回避されるような投与量および頻度で投与される。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号９のアミノ酸位置１０８に対応するアミノ酸位置で変異を含む。好ましくは、配列番号９のアミノ酸位置１０８に対応するアミノ酸位置のセリンは、プロリンに変異される。好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、抗体は、ＮＧＦへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。好ましくは、ＮＧＦ関連の疾患または状態は、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、骨転移による痛み、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群、慢性無菌前立腺炎に伴う痛み、子宮内膜症に伴う痛み、子宮筋腫に伴う痛み、および術後痛から成る群から選択される痛みである。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、０．１〜３ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。好ましくは、抗体は、静脈内または皮下に投与される。
【００３９】
別の態様において、本発明は、対象のＮＧＦ関連の疾患もしくは状態を軽減する、または阻害するように使用するための薬剤の製造ための、本発明の抗ＮＧＦ抗体の使用を提供する。ＮＧＦ関連の疾患および状態の例としては、上に記載したものが挙げられるが、これらに限定されない。好ましいＮＧＦ関連の疾患または状態は痛みである。好ましくは、痛みは、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、骨転移による痛み、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群、慢性無菌前立腺炎に伴う痛み、子宮内膜症に伴う痛み、子宮筋腫に伴う痛み、および術後痛から成る群から選択される。
【００４０】
別の態様において、本発明は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、痛みが、少なくとも約１週間〜約１２週間、または少なくとも約４週間〜約１２週間、または少なくとも約８週間〜約１２週間の間（または１〜１２週間、または４〜１２週間、または８〜１２週間、または少なくとも１週間、または少なくとも２週間、または少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間の間）、対象において、軽減される、または阻害されるように、対象の痛みを軽減する、または阻害するように使用するための薬剤の製造のために、本発明の抗ＮＧＦ抗体の使用を提供する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、リバウンド効果が対象において回避されるように、対象のＮＧＦ関連の疾患もしくは状態を軽減する、または阻害するように使用するための薬剤の製造のために、本発明の抗ＮＧＦ抗体の使用を提供する。特に、抗体は、リバウンド効果が、対象において回避されるような投与量および頻度で投与される。
【００４２】
さらに他の態様において、本発明は、本発明の抗ＮＧＦ抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子、ならびにそのようなベクターを含むベクター（例えば、発現ベクター）、そのようなベクターを含む宿主細胞、および本発明の宿主細胞を使用して抗ＮＧＦ抗体を発現するための方法を提供する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、リバウンド効果が対象において回避されるように、対象の神経成長因子（ＮＧＦ）関連の疾患および状態を軽減する、または阻害する方法を提供する。本方法は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は変異（好ましくは、ヒンジ領域変異）を含み、本抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日、より好ましくは少なくとも２１日の終末消失半減期を有し、本抗体は、リバウンド効果が対象において回避されるような投与量および頻度で投与される。別の実施形態において、抗体は、カニクイザルにおいて、約１５日〜約２２日の範囲（もしくは１５〜２２日）、または約１５日〜約２８の範囲（もしくは１５〜２８日）、または約２１日〜約２８日の範囲（もしくは２１〜２８日）の終末消失半減期を有する。別の実施形態において、抗体は、ラットにおいて、少なくとも８日の終末消失半減期を有する。また別の実施形態において、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日（または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または約１０日〜約４０日の範囲、または約１５〜約３０日の範囲、または１０〜４０日の範囲、または１５〜３０日の範囲）の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間）、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。好ましい変異は、上述のものを含む。好ましい抗体は、上述の配列および／または追加の機能特性を有するものを含む。ＮＧＦ関連の疾患および状態の非限定例としては、上に記載したものが挙げられる。
【００４４】
本発明は、リバウンド効果が対象において回避されるように、対象のＮＧＦ関連の疾患もしくは状態を軽減する、または阻害するように使用するための薬剤の製造のために、本発明の抗ＮＧＦ抗体の使用も提供する。
【００４５】
本発明の抗ＮＧＦ抗体を含むキットも、本明細書に提供される。例えば、キットは、抗ＮＧＦ抗体と、ＮＧＦ関連の疾患または状態の治療において抗体を使用するための説明書とを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ＥＬＩＳＡにより判定して、ＰＧ１１０はヒト神経成長因子（ＮＧＦ）に結合するが、ヒトの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、またはヒトニューロトロフィン４（ＮＴ−４）には結合しないことを示すグラフである。
【図２Ａ】放射性標識リガンド実験により判定した、ＰＧ１１０抗体によるＮＧＦのＴｒｋＡ受容体への結合の阻害を示すグラフである。
【図２Ｂ】放射性標識リガンド実験により判定した、ＰＧ１１０抗体によるＮＧＦのｐ７５ＮＴＲ受容体への結合の阻害を示すグラフである。
【図３Ａ】ヒトＮＧＦにより刺激されたＴＦ−１細胞増殖に対するＰＧ１１０抗体の阻害作用を示すグラフである。
【図３Ｂ】ラットＮＧＦにより刺激されたＴＦ−１細胞増殖に対するＰＧ１１０抗体の阻害作用を示すグラフである。
【図３Ｃ】マウスＮＧＦにより刺激されたＴＦ−１細胞増殖に対するＰＧ１１０抗体の阻害作用を示すグラフである。
【図４】ラットにおける皮膚病変に対するＰＧ１１０抗体治療の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、例えば、カニクイザルにおける、予想外に長い終末消失半減期により立証されるように、生体内において向上した安定性を示す抗神経成長因子抗体に関する。本発明の抗体は、変異をＩｇＧ４定常領域の中、好ましくは定常領域のヒンジ領域の中に導入することによる、抗体のヒトＩｇＧ４定常領域の修飾を含む。
【００４８】
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、発明を実施するための最良の形態にわたって記載される。
【００４９】
Ｉ．定義
「神経成長因子」または「ＮＧＦ」という用語は、本明細書において、互換的に使用され、変異体、イソ型、ホモログ、オルソログ、およびパラログを含む。例えば、ヒトＮＧＦに特異的な抗体は、特定の場合において、ヒト以外の種からのＮＧＦと交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＮＧＦに特異的な抗体は、ヒトＮＧＦに完全に特異的であり得、種または他の種類の交差反応性を示さなくてもよい。「ヒトＮＧＦ」という用語は、ヒトＮＧＦ−β鎖のアミノ酸配列を含む等の、ヒト配列ＮＧＦを指し、その前駆体形態は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２５０６のヌクレオチド配列によりコードされる、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２４９７を有する。ヒトＮＧＦ−β鎖配列は、例えば、ヒトＮＧＦ−βが、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２４９７のヒトＮＧＦ−βと実質的に同じ生物学的機能を有する、保存置換または非保存領域における置換を有することにより、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２４９７のヒトＮＧＦ−βと異なり得る。「ラットＮＧＦ」という用語は、ラットＮＧＦ−β鎖のアミノ酸配列を含む等の、ラット配列ＮＧＦを指し、その前駆体形態は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＸＰ＿２２７５２５のヌクレオチド配列によりコードされる、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＸＰ＿２２７５２５を有する。「マウスＮＧＦ」という用語は、マウスＮＧＦ−β鎖のアミノ酸配列を含む等の、ラット配列ＮＧＦを指し、その前駆体形態は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０１３６０９のヌクレオチド配列によりコードされる、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿０３８６３７を有する。
【００５０】
本明細書に使用される、「ＴｒｋＡ受容体」という用語は、当該分野で、トロポミオシンキナーゼ受容体Ａおよび神経栄養性チロシンキナーゼ１型受容体（ＮＴＲＫ１）としても知られるＮＧＦ受容体を指す。ヒトＴｒｋＡ受容体の限定されない例示的な配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００１０１２３３１（イソ型１）、ＮＰ＿００２５２０（イソ型２）、およびＮＰ＿００１００７７９３（イソ型３）のアミノ酸配列を含む。
【００５１】
本明細書に使用される、「ｐ７５ＮＴＲ受容体」という用語は、約７５ｋＤａの分子量を有するニューロトロフィン受容体を指し、ＮＧＦおよび他のニューロトロフィンに結合し、その受容体は、例えば、Ｂｏｔｈｗｅｌｌ，Ｍ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：５０６−５０７に記載される。ヒトｐ７５ＮＴＲ受容体の限定されない例示的な配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２５０７のヌクレオチド配列によりコードされる、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＰ＿００２４９８のアミノ酸配列である。
【００５２】
抗ＮＧＦ抗体に関して本明細書に使用される、「終末消失半減期」という用語は、抗体の吸収および再分布の両方が完了した時点で、抗体を投与された対象の血清において測定される時、抗体の濃度が半分に減少するのに必要な時間量を指す。対象群が使用される時、対象における終末消失半減期の幾何平均を、抗体の終末消失半減期の測定値として使用することができる。
【００５３】
抗ＮＧＦ抗体に関して本明細書に使用される、「薬理学的半減期」とは、生体内において薬物作用を維持するための平均時間量を指す（薬物作用についてのＭＲＴ）。以下の公式を使用して、第１モーメントベースライン補正作用時間曲線の面積（ＡＵＭＥＣ）対経時的蓄積ベースライン補正薬物作用（作用時間曲線下面積、ＡＵＥＣ）の割合として計算することができる。
【化１】
2016026221.tif 000002
対象群が使用される時、対象における薬理学的半減期の幾何平均を、抗体の薬理学的半減期の測定値として使用することができる。
【００５４】
本明細書に使用される、「ヒンジ領域変異」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのヒンジ領域における点変異、置換、付加または欠失等の変異を指す。
【００５５】
本明細書に使用される、「阻害」という用語は、活性の完全な遮断を含む、生物学的活性において、任意の統計的に有意な減少を指す。例えば、「阻害」は、生物学的活性において、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の減少を指すことができる。
【００５６】
本明細書において互換的に使用される、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、全抗体、および本明細書に記載される生体内において安定性の向上を保持する、任意の抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部分」）またはその単鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続される、少なくとも２本の重鎖（Ｈ）および２本の軽鎖（Ｌ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＶＨのように省略される）および重鎖定常領域から成る。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインから成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＶＬのように省略される）および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、ＣＬの１つのドメインから成る。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域に散らばる相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順でアミノ末端からカルボキシ末端へ配列される、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介し得、免疫系（例えば、エフェクター細胞）の種々の細胞および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む。
【００５７】
本明細書に使用される、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体、すなわち、集団を成す個々の抗体が、わずかな量で存在する場合がある自然に生じる変異の可能性を除き同一である集団から得られた抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられる。さらに、典型的に、異なる決定因子（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体を含む、従来（ポリクローナル）の抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して向けられる。モノクローナル抗体は、任意の当該分野において認識される技法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５に記載されるハイブリドーマ法、例えば、（例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９を参照）に記載される遺伝子導入動物、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）を使用して、または例えば、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技法を使用したファージ抗体ライブラリーを使用して調製することができる。モノクローナル抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体を含み、自然に生じるか、または組み換えにより生成され得る。
【００５８】
「組み換え抗体」という用語は、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）について遺伝子導入または染色体導入された動物（例えば、マウス）から単離される抗体またはそれから調製されたハイブリドーマ、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、形質移入細胞から単離される抗体、（ｃ）ファージ提示を使用する組み換え型組み合わせ抗体ライブラリー（例えば、ヒト抗体配列を含有する）から単離される抗体、ならびに（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段で調製されるか、発現されるか、作製されるか、もしくは単離される抗体等の、組み換え手段によって調製されるか、発現されるか、作製されるか、もしくは単離される抗体を指す。そのような組み換え型抗体は、ヒトの生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有し得る。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組み換え型ヒト抗体を対象に生体外変異誘発を行うことによって、組み換え型抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒトの生殖系列のＶＨおよびＶＬ配列に由来し、関連するが、生体内におけるヒト抗体生殖系列のレパートリー内に自然に存在しない可能性がある配列である。
【００５９】
「キメラ免疫グロブリン」または抗体という用語は、可変領域が第１の種に由来し、定常領域が第２の種に由来する免疫グロブリンまたは抗体を指す。キメラ免疫グロブリンまたは抗体は、例えば、遺伝子組み換えにより、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築することができる。
【００６０】
「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、少なくとも１つのヒト化抗体または免疫グロブリン鎖（すなわち、少なくとも１本のヒト化軽鎖または重鎖）を含む、抗体または免疫グロブリンを指す。「ヒト化免疫グロブリン鎖」または「ヒト化抗体鎖」（すなわち、「ヒト化免疫グロブリン軽鎖」または「ヒト化免疫グロブリン重鎖」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体からの可変フレームワーク領域と、実質的にヒト以外の免疫グロブリンまたは抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは２つのＣＤＲ、より好ましくは３つのＣＤＲ）とを含み、さらに定常領域（例えば、軽鎖の場合、少なくとも１つの定常領域またはその一部、および重鎖の場合、好ましくは３つの定常領域）を含む、可変領域を有する免疫グロブリン鎖または抗体鎖（すなわち、それぞれ、軽鎖または重鎖）を指す。「ヒト化可変領域」（例えば、「ヒト化軽鎖可変領域」または「ヒト化重鎖可変領域」）という用語は、実質的にヒト免疫グロブリンまたは抗体からの可変フレームワーク領域と、実質的にヒト以外の免疫グロブリンまたは抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む可変領域を指す。
【００６１】
本明細書に使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方が、例えば、Ｋａｂａｔら（Ｋａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）により説明される、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する、可変領域を有する抗体を含むように意図される。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、その定常領域も、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、生体外におけるランダムな、もしくは部位特異的な変異誘発、または生体内における体細胞変異により導入される変異）によりコードされないアミノ酸残基を含んでもよい。しかしながら、本明細書に使用される「ヒト抗体」という用語は、マウス等の別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列にグラフトされた抗体が含まれることを意図しない。
【００６２】
本明細書に使用される、「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＮＧＦに特異的に結合する単離された抗体は、ＮＧＦ以外の抗原を特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。加えて、単離された抗体は、典型的に、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まない。
【００６３】
本明細書に使用される、「特異的結合」、「特異的に結合する」、「選択的結合」、および「選択的に結合する」という用語は、抗体またはその抗原結合部分が、特定の抗原またはエピトープに高い親和性を示すが、一般に、他の抗原およびエピトープに有意な交差反応性を示さないことを意味する。「高い」または好ましい結合は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９  Ｍ−１、または１０１０  Ｍ−１の親和性での結合を含む。１０７  Ｍ−１を超える、好ましくは１０８  Ｍ−１を超える親和性がより好ましい。本明細書に記載されるものの中間値も、本発明の範囲内であることを意図し、好ましい結合親和性は、例えば、１０６〜１０１０Ｍ−１、好ましくは１０７〜１０１０Ｍ−１、より好ましくは１０８〜１０１０Ｍ−１の親和性の範囲として示すことができる。「有意な交差反応性を示さない」抗体は、望ましくない実体（例えば、望ましくないタンパク質様実体）に認め得るほどに結合しないものである。特異的または選択的結合は、例えば、スキャッチャード分析および／または競合結合アッセイに従った、そのような結合を決定するための任意の当該分野に認識される手段に従い決定することができる。
【００６４】
本明細書に使用される、「ＫＤ，」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数、または抗原に対する抗体の親和性を指すように意図される。一実施形態において、本発明に従う抗体は、表面プラスモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを使用して測定して、約１００ｐＭ以下（すなわち、約１００ｐＭまたはそれより良い）の親和性（ＫＤ）（例えば、約９０ｐＭ、または約８０ｐＭ、または約７０ｐＭ、または約６０ｐＭ、または約５０ｐＭ、または約４０ｐＭ、または約３０ｐＭ）で、抗原（例えば、ＮＧＦ）に結合する。好ましい実施形態において、抗体は、約２５〜３５ｐＭの範囲の親和性（ＫＤ）で、ＮＧＦに結合する。
【００６５】
本明細書に使用される、「Ｋａｓｓ」という用語は、抗体の抗体／抗原複合体への会合における会合速度定数を指すことが意図される。
【００６６】
本明細書に使用される、「Ｋｄｉｓｓ」という用語は、抗体の抗体／抗原複合体からの解離における解離速度定数を指すことが意図される。
【００６７】
本明細書に使用される、「ＩＣ５０」という用語は、生体外または生体内アッセイのいずれかにおいて、最大阻害応答の５０％、すなわち、最大阻害応答と未治療応答との中間であるレベルに対する応答を阻害する抗体の濃度を指す。
【００６８】
本明細書に使用される、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことが意図される。核酸分子は１本鎖または２本鎖であってもよいが、好ましくは２本鎖のＤＮＡである。本明細書において、ＮＧＦに結合する抗体、または抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して使用される「単離された核酸分子」という用語は、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、ＮＧＦ以外の抗原を結合する抗体をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子を指すことが意図され、他の配列はヒトゲノムＤＮＡ中の核酸に天然に隣接している場合がある。
【００６９】
「作動可能に連結される」という用語は、別の核酸配列と機能的関係に配置される核酸配列を指す。例えば、シグナル配列または分泌リーダー配列のＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現する場合、ペプチドのＤＮＡに作動可能に連結され、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結され、またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、「作動可能に連結される」とは、連結されるＤＮＡ配列は隣接し、分泌リーダーの場合においては、隣接し、かつリーディング相にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接しなくてもよい。結合は、都合のよい制限部位での連結により達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の慣習により使用される。核酸は、別の核酸配列と機能的関係に配置される時に「作動可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列に関して、作動可能に連結されるとは、連結されるＤＮＡ配列は隣接し、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合においては、隣接し、かつリーディングフレームにあることを意味する。スイッチ配列において、作動可能に連結されるとは、配列がスイッチ組み換えをもたらすことができることを示す。
【００７０】
本明細書に使用される、「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターのタイプの１つは、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状の２本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結させることができるウイルスベクターである。あるベクターは、導入される宿主細胞において自律的な複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム型の哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム型の哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムへ組み込まれ得、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あるベクターは、作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは本明細書において、「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ手法に有用な発現ベクターは、プラスミドの形態をしていることが多い。「プラスミド」および「ベクター」という用語は、互換的に使用することができる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損型のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルス）等の、そのような他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。
【００７１】
本明細書に使用される、「組み換え型宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組み換え型発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されると理解するべきである。ある修飾は、変異または環境的な影響のいずれかのために、世代を超えて生じ得るため、そのような子孫は実際には、親細胞と同一ではない可能性があるが、それでも本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。
【００７２】
本明細書に使用される、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、本明細書に記載される治療または予防手段を指す。「治療」の方法は、疾患または状態の１つ以上の症状を予防する、治癒する、遅延する、その重篤度を軽減する、または改善するために、本発明の抗体の、対象、例えば、ＮＧＦ関連の疾患または状態を有する対象への投与を用いる。
【００７３】
本明細書に使用される、「ＮＧＦ関連の疾患または状態」という用語は、ＮＧＦ活性が疾患または状態の１つ以上の症状に関与するか、またはそれに関連するか、またはそれを媒介するか、またはそれを促進する疾患または状態を指す。
【００７４】
本明細書に使用される、「対象」という用語は、任意のヒトまたはヒト以外の動物を含む。特定の実施形態において、対象はヒトである。「ヒト以外の動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等の哺乳類および非哺乳類を含む。
【００７５】
本明細書に使用される、「リバウンド効果」という用語は、抗ＮＧＦ抗体等のＮＧＦ封鎖剤の効果の減少を指し、単回投与または反復投与後の初期の有効性後に対象に生じる。例えば、抗ＮＧＦ抗体を用いた治療は、例えば、炎症または神経障害または他の原因による痛みを最初に軽減し、その後、痛みが治療前と同様に激しくなる、またはさらに激しくなる沈痛効果の低減期間が続く。別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、投与後１週間の間（例えば、投与後１〜７日）等の、単回または反復投与後の時間期間の間、対象において初期効果を示し、その後、投与後１〜２週間の間（例えば、投与後７〜１４日）等の、効果の減少期間が続く場合がある。この「リバウンド」期間の後に抗ＮＧＦ抗体の効果の回復期間が続く場合がある。例えば、効果の減少または過度の痛覚の中間期間を伴う、抗ＮＧＦ抗体の単回投与または反復投与後の沈痛の二相性プロファイルがある場合がある。このリバウンド効果は、例えば、臨床疼通試験、痛みの実験モデル、および／または抗ＮＧＦ効果の他のモデル等において評価することができる。このリバウンド効果は、リバウンド期間の間、例えば、対象の痛みの増加および／または有害事象（異痛から異感覚、錯感覚、および感覚過敏または感覚鈍麻に至る異常感覚等）を伴う場合がある。機序によって制限されることを意図するものではないが、リバウンド効果はＮＧＦ発現の変化、ＴｒｋＡもしくはｐ７５受容体発現の変化、または、効果の初期後の抗ＮＧＦの単回投与または反復投与後の効果の一過性の減少をもたらすシグナル伝達もしくは任意の他の機序に起因し得る。
【００７６】
本発明の種々の態様は、以下の小節でさらに詳細に記載される。
【００７７】
ＩＩ．本発明の抗体
Ａ．生体内における向上した安定性
本発明の抗ＮＧＦ抗体は、生体内において観察される長い終末消失半減期により立証されるように、生体内における向上した安定性を特徴とする。機序によって制限されることを意図するものではないが、抗体の延長された終末消失半減期は、抗体の分布容積の増加ではなく抗体のクリアランス速度の減少によって生じる。本発明の抗体は、変異を含むヒトＩｇＧ４定常領域を含む。好ましい変異は、ヒンジ領域変異である。好ましくは、ヒンジ領域変異は、配列番号９のアミノ酸位置１０８でセリンの変異を含む（配列番号９は、野生型ヒトＩｇＧ４定常領域のアミノ酸配列を示す）。より好ましくは、ヒンジ領域変異は、配列番号９のアミノ酸位置１０８のセリンのプロリンへの変異を含む。好ましい実施形態において、ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【００７８】
本発明の抗ＮＧＦ抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日、典型的には、約１５〜約２２の範囲（もしくは１５日〜２２日の範囲）、または約１５日〜約２８日の範囲（もしくは１５日〜２８日の範囲）、または約２１日〜約２８日の範囲（もしくは２１日〜２８日の範囲）の終末消失半減期等の、予想外の長い終末消失半減期を示す。この安定した抗ＮＧＦ抗体は、ラットにおいて、少なくとも８日、典型的には、約８〜約９日の範囲（もしくは８〜９日の範囲）の終末消失半減期も示す。実施例４に詳細に記載される、本発明の抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日、典型的にはそれ以上の平均終末消失半減期を示す。例えば、カニクイザルの一試験において、約１５〜約２２日の範囲の平均終末消失半減期が観察された。別のカニクイザルの試験において、約２１〜約２８日の範囲の平均終末消失半減期が観察された。さらに、ＰＧ１１０は、ラットにおいて、約８〜約９日の平均終末消失半減期を示す。またさらに、ヒトにおけるＩｇＧの終末消失半減期は、当該分野においてサル類の約２倍であることが知られているため、ＰＧ１１０等の本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日、または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、またはより好ましくは、少なくとも３０日、または少なくとも４０日、または約１０日〜約４０日の範囲（もしくは１０〜４０日の範囲）、または約１５日〜約３０日の範囲（もしくは１５〜３０日の範囲）の終末消失半減期を有し得る。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または少なくとも４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間の範囲）、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。実施例８にさらに記載する、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ヒトにおいて、前述の範囲の平均終末消失半減期を有するように示されている。
【００７９】
カニクイザルにおけるＰＧ１１０の終末消失半減期は、カニクイザルにおいて他のＩｇＧ４抗体について当該分野に報告される半減期より有意に長い。例えば、カニクイザルにおいて、約４０〜９０時間（約１．６〜３．８日）の半減期が、ＩｇＧ４抗ＴＮＦ抗体であるＣＤＰ５７１について報告されている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．８５：６６８−６７４を参照）。同様に、カニクイザルにおいて、約３日の半減期が、ＩｇＧ４抗インテグリン抗体であるナタリズマブについて報告されている（Ｒｅｆｕｓａｌ  ＣＨＭＰ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｆｏｒ  Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ，Ｌｏｎｄｏｎ，１５  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００７，Ｄｏｃ．Ｒｅｆ．ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／８２０３／２００８を参照）。
【００８０】
本発明に使用される好ましいヒンジ領域変異は、配列番号９の位置１０８でのセリンからプロリンへの変異である。この変異は、当該分野において、以前に記載されており（Ａｎｇａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０５−１０８）、ＩｇＧ４分子の異種性、特に一本の重鎖と一本の軽鎖を含有する半抗体の形成を消失させることが報告されている。したがって、配列番号９の位置１０８でのプロリン以外のアミノ酸の置換も、本発明により包含され、その置換は、ＩｇＧ４分子の異種性（例えば、半抗体の形成）の排除において、ＳｅｒからＰｒｏへの変異と同じ結果を達成する。ＩｇＧ４分子の異種性を排除するための位置１０８での変異の能力は、上記のＡｎｇａｌら（１９９３）に記載されるように評価することができる。
【００８１】
配列番号９の位置１０８の修飾に加えて、またはその代替として、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用の親和性を向上する他のＩｇＧヒンジ領域変異が説明され、これは、修飾ＩｇＧの延長された半減期をもたらしている。そのような追加または代替の修飾の例としては、Ｔｈｒ２５０、Ｍｅｔ２５２、Ｓｅｒ２５４、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｕ３０８、Ｍｅｔ４２８、His433および／またはＡｓｎ４３４に対応する１つ以上のＩｇＧ定常領域残基が挙げられる（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１−６６０４、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：１７５９−１７６９、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３−６２１６、Ｋａｍｅｉ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：７４８−７６０、Ｖａｃｃａｒｏ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１２８３−１２８８、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：３４６−３５６にさらに記載される）。
【００８２】
またさらに、ヒンジ領域の代替えとして、他のＩｇＧ４定常領域の安定化修飾が説明されている。例えば、他の実施形態において、ヒトＩｇＧ４定常領域の変異は、米国特許公開第２００８００６３６３５号にさらに記載されるように、ＩｇＧ４  ＣＨ３領域のＩｇＧ１  ＣＨ３領域との置換、ＩｇＧ４  ＣＨ２およびＣＨ３領域のＩｇＧ１  ＣＨ２およびＣＨ３領域との置換、またはＩｇＧ４定常領域の位置４０９（Ｋａｂａｔ番号付による）でのアルギニンのリジンとの置換を含む。また他の実施形態において、ヒトＩｇＧ４定常領域の変異は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００８／１４５１４２号にさらに記載されるような、Ａｒｇ４０９のＬｙｓ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、もしくはＬｅｕとの置換、またはＰｈｅ４０５のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、もしくはＬｅｕとの置換等の、Ａｒｇ４０９、Ｐｈｅ４０５、もしくはＬｙｓ３７０（Ｋａｂａｔ番号付による）の置換を含む。
【００８３】
所望の変異は、ヒトＩｇＧ４定常領域をコードする核酸の部位特異的変異誘発、またはＰＣ媒介変異誘発等の、標準的な組み換えＤＮＡ技法を使用して、ヒトＩｇＧ４定常領域に導入することができる。さらに、抗体重鎖可変領域をコードするＤＮＡは、可変領域および定常領域が作動可能に連結されて、それによって、定常領域が変異ヒトＩｇＧ４定常領域である完全長免疫グロブリン重鎖をコードするベクターを作製するように、変異ヒトＩｇＧ４定常領域をコードする発現ベクターに導入することができる。次いで、発現ベクターは、標準の組み換えタンパク質発現法を使用して、完全長の免疫グロブリン重鎖を発現するように使用することができる。例えば、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、実施例１にさらに詳細に記載されるように構築することができる。
【００８４】
抗体の終末消失半減期は、当該分野に公知の標準的な方法を使用して決定することができる。例えば、抗体を対象（例えば、カニクイザル、スプラーグドーレイラット）に投与した後、血液サンプルを投与後の種々の時間点で得ることができ、抗体濃度を決定するための、当該分野に公知の技法を使用して（ＥＬＩＳＡアッセイ等）、血液サンプルからの血清において抗体の濃度を決定することができる。抗体の終末半減期の計算は、例えば、薬物動態パラメータを計算するように設計された、コンピュータシステムおよびソフトウェアを使用する等（その非限定の例としては、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアを伴うＳＮＢＬ  ＵＳＡ薬物動態分析システムである）の、公知の薬物動態法を使用して達成することができる。
【００８５】
Ｂ．抗体の可変領域
本発明の抗ＮＧＦ抗体に使用するための好ましい抗体可変領域は、ＰＧ１１０抗体の重鎖および軽鎖の可変領域である。ＰＧ１１０の重鎖可変領域は配列番号１に示され、ＰＧ１１０の軽鎖可変領域は配列番号２に示される。したがって、一実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００８６】
ＰＧ１１０重鎖（可変領域および定常領域）の完全長のアミノ酸配列は、配列番号１３に示される。この重鎖は、前駆体重鎖から調製することができ、配列番号１２に示されるアミノ酸配列等の、リーダー配列またはシグナル配列を含む。配列番号１２の前駆体重鎖は、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００８７】
ＰＧ１１０軽鎖（可変領域および定常領域）の完全長のアミノ酸配列は、配列番号１６に示される。この軽鎖は、前駆体軽鎖から調製することができ、配列番号１５に示されるアミノ酸配列等の、リーダー配列またはシグナル配列を含む。配列番号１５の前駆体軽鎖は、配列番号１４に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。
【００８８】
したがって、別の実施形態において、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む、重鎖を含む抗ＮＧＦ抗体を提供し、本抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日の血清半減期を有する。別の実施形態において、カニクイザルにおける血清半減期は、約１５日〜約２２日の範囲（または１５〜２２日の範囲）であり得る。他の実施形態において、ラットにおける血清半減期は、約８日、または約８日〜約９日の範囲（もしくは８〜９日の範囲）であり得る。また他の実施形態において、ヒトにおける血清半減期は、少なくとも１０〜３０日、または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または少なくとも４０日、または約１０日〜約４０日の範囲（もしくは１０〜４０日の範囲）、または約１５日〜約３０日の範囲（もしくは１５〜３０日の範囲）であり得る。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または少なくとも４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間の範囲）、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。好ましくは、重鎖は、配列番号１１のヌクレオチド配列によりコードされる。好ましくは、抗体の軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖は、配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされる。
【００８９】
また別の実施形態において、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗ＮＧＦ抗体を提供する。
【００９０】
また別の実施形態において、本発明は、配列番号１１のヌクレオチド配列によりコードされる重鎖と、配列番号１４のヌクレオチド配列によりコードされる軽鎖とを含む、抗ＮＧＦ抗体を提供する。
【００９１】
別の実施形態において、ＰＧ１１０の結合特異性が可変ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ）により提供されることを考慮すると、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＰＧ１１０の重鎖、ＰＧ１１０の軽鎖、またはその両方のＣＤＲを含む。ＰＧ１１０の重鎖ＣＤＲ１、２、および３は、それぞれ、配列番号３、４、および５に示される。ＰＧ１１０の軽鎖ＣＤＲ１、２、および３は、それぞれ、配列番号６、７、および８に示される。したがって、一実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域を含む。また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域を含み、かつそれぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域を含む。
【００９２】
また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＰＧ１１０の重鎖および／または軽鎖可変領域と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含むことができ、本抗体は、ＰＧ１１０によって示される、生体内における向上された安定性を保持する。例えば、抗ＮＧＦ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列に、少なくとも９０％相同、より好ましくは、少なくとも９５％相同、より好ましくは、少なくとも９７％相同、さらにより好ましくは、少なくとも９９％相同である、アミノ酸配列を含むことができる。抗ＮＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列に、少なくとも９０％相同、より好ましくは、少なくとも９５％相同、より好ましくは、少なくとも９７％相同、さらにより好ましくは、少なくとも９９％相同である、アミノ酸配列を含むことができる。
【００９３】
本明細書に使用される、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと等しい。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置数の関数（すなわち、相同性％＝同一位置の数／位置の総数×１００）であり、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮し、これは２つの配列の最適な整合のために取り入れられる必要がある。配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、Ｅ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを使用して決定することができ、これは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、および４のギャップペナルティーを使用する。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定することができ、これは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれ、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップの重み、ならびに１、２、３、４、５、または６の長さの重みを使用する。
【００９４】
また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＰＧ１１０の重鎖および／または軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含むことができるが、１つ以上の保存的置換が配列に導入されており、それでも抗体は、ＰＧ１１０により示される、生体内における向上した安定性を保持する。例えば、抗ＮＧＦ抗体の重鎖可変領域は、配列番号１と比較して、１、２、３、４、または５の保存アミノ酸置換を除き、配列番号１のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むことができる。抗ＮＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２と比較して、１、２、３、４、または５の保存アミノ酸置換を除き、配列番号２のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むことができる。
【００９５】
本明細書に使用される、「保存アミノ酸置換」という用語は、アミノ酸配列を含有する抗体の結合または安定性の特徴に有意に影響を及ぼさない、またはそれを変更しないアミノ酸修飾を指すことが意図される。そのような保存修飾は、アミノ酸の置換、付加、および欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発等の、当該分野に公知の標準的な技法により、本開示の抗体に導入することができる。保存アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸を含む。よって、ＰＧ１１０の可変領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と置換することができ、変更された抗体は、本明細書に記載される機能アッセイを使用して、機能保持について検査され得る。
【００９６】
また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＰＧ１１０抗体と同じＮＧＦ上のエピトープに結合する、またはＮＧＦへの結合においてＰＧ１１０と交差競合する抗原結合領域（すなわち、可変領域）を含む。したがって、一実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と、ＮＧＦへの結合において競合する。
【００９７】
そのような交差競合抗体は、標準的なＮＧＦ結合アッセイにおいて、ＰＧ１１０と交差競合するそれらの能力に基づき特定することができる。例えば、組み換え型ＮＧＦタンパク質（例えば、ヒトＮＧＦ−β）をプレート上に固定し、抗体の１つがを蛍光的に標識し、非標識抗体の標識された抗体と結合において競合する能力が評価される、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを使用することができる。加えて、または代替的に、抗体の交差競合する能力を評価するために、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用することができる。ＮＧＦへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する抗体の能力を検査するために使用され得る適切な結合アッセイは、実施例２において、さらに詳細に記載される。
【００９８】
さらに他の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ＰＧ１１０抗体の１つ以上の機能特性を示す。例えば、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、以下の機能特性のうちの１つ以上を示すことができる：
ａ）ヒトＮＧＦに結合するが、ヒトの脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、またはヒトニューロトロフィン４（ＮＴ−４）には結合しない、
ｂ）１００ｐＭ以下のＫＤで、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合する、
ｃ）ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害する、
ｄ）ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する、
ｅ）ＮＧＦ依存性のニワトリ後根神経節の生存を阻害する、
ｆ）ＮＧＦ依存性のＰＣ１２細胞神経突起伸長を阻害する。
これらの機能特性は、実施例２および３に詳細に記載される、生体外アッセイを使用して評価することができる。抗体のヒトＮＧＦへの特異的結合に関して、本明細書に使用される、「脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、またはヒトニューロトロフィン４（ＮＴ−４）には結合しない」という用語は、標準的な結合アッセイ（例えば、実施例に記載される、ＥＬＩＳＡ、または他の適切な生体外アッセイ）において、抗体のＢＤＮＦ、ＮＴ−３、またはＮＴ−４への観察される結合の量が、結合の背景レベル（例えば、対照抗体の）と同等である、例えば、背景レベルの２倍以内、またはヒトＮＧＦへの結合と比較して、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、またはＮＴ−４への結合が５％以下である（ヒトＮＧＦへの結合レベルは１００％結合として設定される）ことを意味することが意図される。
【００９９】
また別の実施形態において、本発明は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体を提供し、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み（またはヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号９のアミノ酸位置１０８でセリンの変異、好ましくは、位置１０８でのセリンのプロリンへの変異を含む）、本抗体は、１００ｐＭ以下のＫＤ（または代替的に、３００ｐＭ以下、２００ｍＰ以下、１５０ｐＭ以下、７５ｐＭ以下、または５０ｐＭ以下のＫＤ）で、ヒトまたはラットのＮＧＦに結合し、２５０ｐＭ以下のＩＣ５０（または代替的に、５００ｐＭ以下、４００ｐＭ以下、３００ｐＭ以下、または２００ｐＭ以下のＩＣ５０）で、ＮＧＦのＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲへの結合を阻害し、５０／ｍＬ以下のＩＣ５０（または代替的に、１５０ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、７５ｎｇ／ｍＬ以下、または４０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０）で、ＴＦ−１細胞のＮＧＦ依存性増殖を阻害する。好ましくは、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日、または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または約１０日〜約４０日の範囲（もしくは１０〜４０日の範囲）、または約１５日〜約３０日の範囲（もしくは１５〜３０日の範囲）の平均終末消失半減期を有する。加えて、または代替的に、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲（もしくは４〜６週間の範囲）、または少なくとも４〜７週間の範囲（もしくは４〜７週間の範囲）、または少なくとも４〜８週間の範囲（もしくは４〜８週間の範囲）の平均薬理学的半減期を示し得る。加えて、または代替的に、抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日、典型的には、約１５〜約２２の範囲（もしくは１５日〜２２日の範囲）、または約１５日〜約２８日の範囲（もしくは１５日〜２８日の範囲）、または約２１日〜約２８日の範囲（もしくは２１日〜２８日の範囲）の平均終末消失半減期を示し得る。加えて、または代替的に、抗体は、ラットにおいて、少なくとも８日、典型的には、約８〜約９日の範囲（もしくは８〜９日の範囲）の終末消失半減期も示し得る。抗体は、ヒトＮＧＦに結合するが、ヒトの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ヒトニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、またはヒトニューロトロフィン４（ＮＴ−４）には結合しない、ＮＧＦ依存性のニワトリ後根神経節生存を阻害する、および／またはＮＧＦ依存性のＰＣ１２細胞神経突起伸長を阻害する等の、１つ以上のさらなる機能特性をさらに示し得る。好ましくは、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１週間〜約１２週間の間、痛みを緩和する。好ましくは、抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体は、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域を含むか、または抗体は、それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域と、それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域とを含む。好ましくは、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むか、または抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むか、または抗体は、ＮＧＦへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。
【０１００】
また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、対象に投与された時に、リバウンド効果を示さない（例えば、抗体は、リバウンド効果が対象において回避されるような投与量および頻度で投与される）。抗ＮＧＦ抗体が、単回投与または反復投与後の初期の有効期間後、対象において効果の減少を示すリバウンド効果は、他の抗ＮＧＦ抗体の動物モデルおよび臨床試験の両方において報告されている。例えば、「リバウンド現象」と呼ばれるそのような効果は、ラットの慢性絞縮傷（ＣＣＩ）モデルにおける抗ラットＮＧＦ抗体について報告された（Ｒｏ，Ｌ−Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐａｉｎ７９：２６５−２７４）。加えて、抗ＮＧＦ抗体タネズマブ（ＲＮ６２４、Ｅ３としても知られる、ＣＡＳ登録番号８８０２６６−５７−９）を用いた臨床疼痛試験は、触覚および「しびれ」感に対する過敏性等の有害事象の増加期間が初期の沈痛期間後に観察されたことを報告している＆（Ｈｅｆｔｉ，Ｆｒａｎｚ  Ｆ．，Ｒｉｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＳＵＨＳＣ，Ｓｈｒｅｖｅｐｏｒｔ，Ｌｏｕｉｓｉａｎａ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２６，２００６のプレゼンテーションを参照）。機序によって制限されることを意図するものではないが、本発明の抗ＮＧＦ抗体の延長された終末消失半減期は、それらがリバウンド効果を示すことを回避させると考えられる。よって、本発明の抗ＮＧＦ抗体の他の利点は、他の既存技術の抗ＮＧＦ抗体と比較して、生体内におけるより一貫した、延長された活性を含む。本発明の抗ＮＧＦ抗体の延長された終末消失半減期を考えると、低投与量（他の抗ＮＧＦ抗体と比較して）を使用することが可能であり、抗体は、必要に応じて、より頻繁な間隔で使用することが可能であり、そのため、対象においてリバウンド効果が回避されるように、投与量およびタイミング治療レジメンを選択することができる。
【０１０１】
また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、長期間、対象の痛みを緩和することができ、例えば、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１週間〜約１２週間（もしくは１週間〜１２週間）の間、痛みを緩和することができる。一実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１週間（または少なくとも１週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約２週間（または少なくとも２週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約４週間（または少なくとも４週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約８週間（または少なくとも８週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１２週間（または少なくとも１２週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約４週間〜約１２週間（または４週間〜１２週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約８週間〜約１２週間（または８週間〜１２週間）の間、痛みを緩和する。
【０１０２】
抗体の対象の痛みを緩和する能力は、当該分野で確立されたアッセイを使用して評価することができる。抗ＮＧＦ抗体による痛みの緩和の期間を評価するための適切な動物モデルは、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１３１９５１号および米国特許公開第２００８０１８２９７８号に記載される。そのような動物モデルの非限定例としては、座骨神経の慢性絞縮により惹起される神経因性痛モデル、後肢の切開に関する術後痛モデル、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）誘発関節炎に関する関節リウマチ痛モデル、ならびにＨａｌｖｏｒｓｏｎ，Ｋ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：９４２６−９４３５およびＳｅｖｃｉｋ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐａｉｎ  １１５：１２８−１４１に記載される等の、癌性疼痛モデルが挙げられる。さらに、痛みの緩和はヒトにおいて臨床的に評価することができ、痛みの緩和期間は、抗ＮＧＦ抗体で治療されたヒト対象により報告される痛みのレベルに基づき決定することができる。
【０１０３】
また他の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、当該分野において記載される抗ＮＧＦ抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含むことができる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／７８６９８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００１／６４２４７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００２／０９６４５８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０３２８７０，号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０５８１８４号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０６１５４０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０１９２６６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０７７４４１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１３１９５１号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／１１０８８３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０２３５４０号、米国特許第７，４４９，６１６号、米国公開第ＵＳ２００５００７４８２１、米国公開第ＵＳ２００８００３３１５７号、米国公開第ＵＳ２００８０１８２９７８号、または米国公開第ＵＳ２００９００４１７１７号に記載される、抗ＮＧＦ抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域は、本発明の抗ＮＧＦ抗体に使用することができる。
【０１０４】
また別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、ヒト以外のモノクローナル抗体（抗体はその後ヒト化され得る）を作製するために、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５により説明される標準的な体細胞ハイブリッド形成法等の、モノクローナル抗体を産生させるための当該分野に公知の標準的な方法、ならびにヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する遺伝子導入動物を使用したファージ提示ライブラリー技法または方法により調製される、抗ＮＧＦ抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含むことができる。抗体を選択するためのファージ提示ライブラリー技法は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）およびＨｏｅｔ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２３，３４４−３４８、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、および同第５，５７１，６９８号、Ｄｏｗｅｒらの米国特許第５，４２７，９０８号および同第５，５８０，７１７号、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの米国特許第５，９６９，１０８号および同第６，１７２，１９７号、ならびにＧｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号、同第６，５２１，４０４号、同第６，５４４，７３１号、同第６，５５５，３１３号、同第６，５８２，９１５号、および同第６，５９３，０８１号に記載される。抗体を産生させるためのヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する遺伝子導入動物の使用方法は、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ３６８（６４７４）：８５６−８５９、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３，Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８７７，３９７号、同第５，６６１，０１６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７４，２９９号、および同第５，７７０，４２９号、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、全てＬｏｎｂｅｒｇおよびＫａｙのＰＣＴ公開第ＷＯ９２／０３９１８号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９７／１３８５２号、同第ＷＯ９８／２４８８４号、および同第ＷＯ９９／４５９６２号、ＩｓｈｉｄａらのＰＣＴ公開第ＷＯ０２／４３４７８号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらの米国特許第５，９３９，５９８号、同第６，０７５，１８１号、同第６，１１４，５９８号、同第６，１５０，５８４号、および同第６，１６２，９６３号に記載される。
【０１０５】
種々の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体であり得る。さらに、抗体は、存在する可能性のあるＴ細胞エピトープが排除されたものであり得る。存在する可能性のあるＴ細胞エピトープを排除し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させる方法は、当該分野において説明されている（例えば、Ｃａｒｒらによる米国特許公開第２００３０１５３０４３号を参照）。
【０１０６】
本発明の抗体または抗体部分は、誘導体化、または別の官能分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結され得る。したがって、本発明の抗体および抗体部分は、本明細書に記載されるＰＧ１１０抗体の誘導体化された形態、およびさもなければ修飾形態を含むことが意図される。例えば、本発明の抗体または抗体部分は、別の抗体（例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体）、検出可能薬剤、細胞傷害性薬剤、薬学的薬剤、および／または抗体または抗体部分の別の分子との会合を媒介できるタンパク質もしくはペプチド（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグ）等の、１つ以上の他の分子実体に（化学カップリング、遺伝的融合、非共有結合性会合またはその他の方法により）機能的に連結され得る。
【０１０７】
誘導体化抗体のタイプの１つは、（二重特異性抗体を作製するように、同じタイプまたは異なるタイプの）２つ以上の抗体を架橋することにより産生される。好適な架橋剤は、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）により分離される２つの明確な反応性基を有するヘテロ二官能性、またはホモ二官能性（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）であるものを含む。そのようなリンカーは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから入手可能である。
【０１０８】
本発明の抗体または抗体部分が誘導体化され得る有用な検出可能薬剤は、蛍光化合物を含む。例示的な蛍光検出可能薬剤は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン等を含む。抗体は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の検出可能な酵素で誘導体化することができる。抗体が検出可能酵素で誘導体化される時、検出可能な反応生成物を生成するために酵素が使用する、さらなる試薬を添加することにより検出される。例えば、検出可能薬剤である西洋わさびペルオキシダーゼが存在する時、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加は、検出可能な着色反応生成物をもたらす。抗体は、ビオチンでも誘導体化され、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定により検出され得る。
【０１０９】
ＩＩＩ．抗体の生成
本開示の別の態様は、本開示の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞可溶化物、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法、および当該分野に周知の他の技法を含む、標準的な技法により、他の細胞構成要素または他の混入物、例えば、他の細胞核酸もしくはタンパク質から生成される時、「単離される」、または「実質的に純粋にされる」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、介在配列を含有しても、含有しなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。本開示の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して得ることができる。
【０１１０】
本発明の好ましい核酸分子は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の好ましい核酸分子は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む。
【０１１１】
ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られたら、これらのＤＮＡ断片は、例えば、可変領域が定常領域に作動可能に連結されるように、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子に変換するために、標準的な組み換えＤＮＡ技法によりさらに操作することができる（例えば、実施例１を参照）。これに関連して使用される、「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がフレーム内にとどまるように、２つのＤＮＡ断片が結合されることを意味することが意図される。
【０１１２】
抗体は、当該分野に公知の方法を使用して、宿主細胞の中に生成され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２）。例えば、抗体を発現させるために、重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターの中に挿入され得る。これに関連して、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する、それらの意図される機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターの中に連結されることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、個別のベクターの中に挿入され得るか、またはより典型的に、両方の遺伝子は、同じ発現ベクターの中に挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法により（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位が存在しない場合、平滑末端連結）、発現ベクターの中に挿入される。加えて、組み換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム内で連結されるように、ベクターの中にクローン化され得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、または非相同シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であり得る。
【０１１３】
抗体鎖遺伝子に加え、組み換え発現ベクターは、典型的に、宿主細胞の抗体鎖遺伝子の発現を制御する、調節配列を有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写および翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））に記載される。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル等の、そのような要因に依存する場合があることを、当業者は理解するであろう。哺乳類の宿主細胞発現の好ましい調節配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）、およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー等の、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。代替的に、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーター等の、非ウイルス性調節配列が使用することができる。またさらに、調節要素は、ＳＲαプロモーター系等の、異なる供給源からの配列から成り、これは、ＳＶ４０初期プロモーターおよびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復からの配列を含有する（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。
【０１１４】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、組み換え発現ベクターは、宿主細胞（例えば、複製元）および選択可能なマーカー遺伝子におけるベクターの複製を調節する配列等の、さらなる配列を有してもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば、Ａｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、および同第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、典型的に、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入される宿主細胞上で、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサート等の、薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いて、ｄｈｆｒ宿主細胞において使用するため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択）を含む。
【０１１５】
軽鎖および重鎖の発現において、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技法により、宿主細胞の中に形質移入される。種々の形態の「形質移入」という用語は、外来性ＤＮＡの原核生物または真核生物の宿主細胞の中への導入に通常使用される広範な技法、例えば、電気穿孔、カルシウム−リン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入等を包含することが意図される。原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞において、抗体を発現させることが理論的に可能であるが、そのような真核細胞は、特定の哺乳類の細胞において、適切に折り畳まれ、かつ免疫学的に活性な抗体を構築し、分泌する可能性が原核細胞より高いため、真核細胞、最も好ましくは、哺乳類の宿主細胞における抗体の発現が、最も好ましい。抗体遺伝子の原核生物発現は、高収率の活性抗体の生成において、効果がないことが報告されている（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ６：１２−１３）。
【０１１６】
本開示の組み換え抗体を発現するための好ましい哺乳類の宿主細胞は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載される等の、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞を含む。別の好ましい発現系は、第ＷＯ８７／０４４６２号（Ｗｉｌｓｏｎ）、第ＷＯ８９／０１０３６号（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）、および第ＥＰ３３８，８４１号（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ）に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組み換え発現ベクターが、哺乳類の宿主細胞の中に導入される時、抗体は、宿主細胞の中で抗体を発現させるか、またはより好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地の中に抗体を分泌させるのに十分な時間期間、宿主細胞を培養することにより生成される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を使用して、培養培地から回収され得る。
【０１１７】
好ましい実施形態において、本発明は、抗ＮＧＦ抗体をコードする発現ベクターを提供し、本ベクターは、抗体の重鎖をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列と、抗体の軽鎖をコードする配列番号１４のヌクレオチド配列とを含む。本発明の好ましい発現ベクターは、ＧＳ（グルタミン合成）遺伝子を含む。別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明の好ましい宿主細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞である。また別の好ましい実施形態において、本発明は、配列番号１１によりコードされる重鎖と、配列番号１４によりコードされる軽鎖とを含む抗ＮＧＦ抗体が発現するように、配列番号１１のヌクレオチド配列（抗体重鎖をコードする）と、配列番号１４のヌクレオチド配列（抗体軽鎖をコードする）とを含む、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することを含む、抗ＮＧＦ抗体を発現させる方法を提供する。
【０１１８】
また別の態様において、本発明は、抗体の定常領域に変異（例えば、ヒンジ領域変異）を有する抗ＮＧＦ抗体を作製するためのプロセスに関し、本プロセスは、例えば、標準的な組み換えＤＮＡ技法により、適切な変異を定常領域の中に導入することを含む。例えば、本発明は、抗ＮＧＦ抗体を作製するためのプロセスを提供し、本抗体は、（ｉ）それぞれ、配列番号３、４、および５のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む重鎖可変領域、（ｉｉ）それぞれ、配列番号６、７、および８のアミノ酸配列を有する、ＣＤＲ１、２、および３を含む軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉｉ）ヒトＩｇＧ４定常領域を含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み（例えば、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日の平均終末消失半減期を有するか、または加えて、もしくは代替的に、少なくとも３０日、または少なくとも３５日、または少なくとも４０日、または少なくとも４〜６週間の範囲、または４〜６週間の範囲、または少なくとも４〜７週間の範囲、または４〜７週間の範囲、または少なくとも４〜８週間の範囲、または４〜８週間の範囲の平均薬理学的半減期を有する）、抗体を作製するための本プロセスは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ４定常領域を作製するように、配列番号９のアミノ酸位置１０８のセリンをプロリンに変異することを含む。好ましくは、重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。好ましくは、重鎖は、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
ＩＶ．薬学的組成物
別の態様において、本発明は、組成物、例えば、薬学的組成物を提供し、これは、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、本発明の抗体を含有する。好ましい実施形態において、他の適切な投与経路が本明細書に記載されるが、薬学的組成物は、静脈内、皮下（例えば、注入ペンを介して）、または関節内投与に適している。一実施形態において、組成物は、複数（例えば、２つ以上）の本発明の抗体、例えば、ＮＧＦ上の異なるエピトープを結合する抗体の組み合わせを含むことができる。
【０１２０】
本明細書に使用される、「薬学的に許容される担体」とは、生理的に適合性を有する、任意の、および全ての溶媒、塩、分散媒体、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。投与形態に応じて、活性化合物は、化合物を不活性化する可能性がある酸作用および他の自然条件から化合物を保護するための材料でコーティングされ得る。
【０１２１】
「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望ましくない毒性作用をも付与しない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照）。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の、非毒性無機酸、ならびに脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族酸、および芳香族スルホン酸等の非毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属、ならびにＮ，Ｎ‘−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の、非毒性有機アミンに由来するものを含む。
【０１２２】
本発明の薬学的組成物は、単独で、または併用療法、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも１つ以上の追加の薬学的薬剤とともに、本発明の組成物を含むことができる。例えば、少なくとも１つ以上の追加の薬学的薬剤は、個別に投与されるか、または組成物の中に組み込むこともできる。好ましい実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、第２の薬学的薬剤と組み合わせて投与され、本第２の薬学的薬剤は、ＮＳＡＩＤ、鎮痛薬（オピオイド鎮痛薬および異型鎮痛薬を含む）、局所麻酔薬、神経遮断、フェノール遮断、治療抗体、ステロイド、抗痙攣薬、抗うつ剤、局所カプサイシン、および抗ウイルス剤から成る群から選択される。痛み緩和に使用するための特に好ましいクラスの第２の薬学的薬剤は、オピオイド鎮痛薬である。加えて、または代替的に、第２の治療レジメンは、例えば、痛み緩和において、本発明の抗体の使用と組み合わせることができる。そのような第２の治療レジメンの例としては、放射線療法（例えば、癌性疼痛に）、外科処置（例えば、三叉神経痛のためのガッサー神経節およびガッサー神経節後切断（穿刺）処置）、催眠法、および鍼治療が挙げられる。
【０１２３】
ＮＳＡＩＤＳの例としては、アスピリンを含むアセチル化サリチル酸、サルサレート、ジフルニサルを含む非アセチル化サリチル酸、エトドラク、ジクロフェナク、インドメタシン、ケトロラク、ナブメトンを含む酢酸、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジンを含むプロピオン酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸を含むフェナメート、フェニルブタゾン、ピロキシカム、セレコキシブ、エトリコキシブ、バルデコキシブ、ロフェコキシブ、ルミラコキシブを含むＣＯＸ−２阻害剤が挙げられる。鎮痛剤の例としては、パラセタモール（アセトアミノフェン）、トラマドール、タペンタドール、カプサイシン（局所）、オピオイド鎮痛薬、および異型鎮痛薬が挙げられる。オピオイド鎮痛薬の例としては、モルヒネ、コデイン、テバイン、ヒドロモルホン、ヒドロコドン、オキシコドン、オキシモルホン、デソモルヒネ、ジアセチルモルヒネ、ニコモオルフィン、ジプロパノイルモルフィン、ベンジルモルフィン、エチルモルフィン、フェンタニル、ペチジン、メサドン、トラマドール、およびプロポキシフェンが挙げられる。非定型鎮痛薬の例としては、三環系抗うつ剤、カルバマゼピン、ガバペンチン、プレガバリン、デュロキセチン、およびカフェインが挙げられる。ステロイドの例としては、関節内副腎皮質ステロイド（ＩＡＣ）およびプレドニゾンが挙げられる。治療抗体の例としては、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）およびＨｕｍｉｒａ（登録商標）等の抗ＴＮＦ抗体、ならびにＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）およびＡｒｚｅｒｒａ（登録商標）等の抗ＣＤ２０抗体が挙げられる。抗ウイルス剤の例としては、アシクロビルおよびオセルタミビルリン酸塩（Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標））が挙げられる。
【０１２４】
好ましい実施形態において、併用療法は、少なくとも１つ以上のＴｒｋＡ阻害剤（例えば、ＴｒｋＡ活性を拮抗する化合物）とともに、本発明の抗ＮＧＦ抗体を含むことができる。ＴｒｋＡ阻害剤は、例えば、ＴｒｋＡ受容体と細胞外で相互作用させることにより、またはＴｒｋＡシグナル伝達機構（例えば、ＴｒｋＡキナーゼ活性の阻害）と細胞内で相互作用させることにより、機能することができる。細胞外ＴｒｋＡ阻害剤の非限定例としては、抗ＴｒｋＡ抗体（米国特許公開第２００９０２０８４９０号および米国特許公開第２００９０３００７８０号に記載されるヒト化抗ＴｒｋＡ抗体）およびＴｒｋＡを拮抗するＮＧＦペプチド模倣物（Ｄｅｂｅｉｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：４０６７−４０７２に記載される等）が挙げられる。細胞内ＴｒｋＡ阻害剤の非限定例としては、ＴｒｋＡ機能を拮抗する細胞透過ペプチド（例えば、（Ｈｉｒｏｓｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１０６：１０７−１１３、Ｕｅｄａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．，Ｍａｒｃｈ  ３０，２０１０出版に記載される）、およびＴｒｋＡキナーゼ阻害剤等の小分子阻害剤（例えば、Ｗｏｏｄ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：９５３−９５７、Ｔｒｉｐａｔｈｙ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１８：３５５１−３５５５に記載される）が挙げられる。ＴｒｋＡ阻害剤の他の非限定例としては、ＡＲＲＹ−４７０およびＡＲＲＹ−８７２（Ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）が挙げられる。
【０１２５】
別の好ましい実施形態において、併用療法は、少なくとも１つ以上のタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤（例えば、ＰＫＣ活性を拮抗する化合物）とともに、本発明の抗ＮＧＦ抗体を含むことができる。
【０１２６】
本発明の組成物は、当該分野に公知の種々の方法によって投与することができる。当業者に理解されるように、投与経路および／または投与形式は、所望の結果に応じて異なる。好ましくは、担体は、静脈内、関節内、皮下、筋肉内、非経口、腫瘍内、鼻腔内、小胞内、経口、粘膜、舌下、脊髄、もしくは表皮投与、または体腔内（例えば、腹部、胸膜腔、鼻洞）、もしくは眼の表面上、もしくは吸入による投与により肺内への注入に適している。特定の投与形態において、使用のために適切な送達デバイスが選択され得る。例えば、皮下または筋肉内投与において、注入ペン（例えば、自己投与できるもの）を使用することができる。注入器とも呼ばれるそのような注入ペンは、当該分野において公知であり、抗体の液体用量（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）を投与するために使用される単回使用注入ペン等）を含有するもの、より好ましくは、注入直前に液体形態に再構成される抗体の固体用量を含有するものを含む。皮下投与においても、皮下に埋め込まれたものを使用することができる。加えて、経皮送達は、局所的皮膚（皮膚）パッチ（例えば、接着パッチ）の使用により達成することができる。経皮送達は、乾燥粉末の注入（Ｇｌｉｄｅ  Ｐｈａｒｍａから商業的に入手可能な注入器等）により達成することもできる。またさらに、肺内への送達において（例えば、喘息または難治性の咳の治療において）、噴霧装置において噴霧溶液を使用することができる。
【０１２７】
活性化合物は、徐放性製剤等の急激な放出に対して化合物を保護する担体とともに調製することができ、それには移植片、経皮パッチ、およびマイクロカプセル送達系を含む。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ酪酸等の、生物分解性で生物適合性の重合体を使用することができる。そのような製剤を調製するための多くの方法は、特許権を取得しており、一般に、当業者に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。
【０１２８】
特定の投与経路により本発明の化合物を投与するために、その不活性化を防止するための材料で化合物をコーティングする、またはそれとともに化合物を同時投与することが必要である場合がある。例えば、化合物は、例えば、リポソーム等の適切な担体、または希釈剤で、対象に投与され得る。薬学的に許容される希釈剤は、生理食塩水および水性緩衝液を含む。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルジョンならびに従来のリポソームを含む（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０１２９】
薬学的に許容される担体は、減菌水溶液または分散液、および減菌注入可能溶液または分散液の即時調製用の減菌粉末を含む。薬学的に活性な物質におけるそのような媒体および薬剤の使用は、当該分野に公知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性化合物と不適合である場合を除き、本発明の薬学的組成物において、その使用が意図される。補助活性化合物も、組成物の中に組み込むことができる。
【０１３０】
治療組成物は、典型的に、減菌され、製造および保管の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適切な他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン等）、およびそれらの適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合においては、必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウム等のポリアルコールが組成物中に含まれることが好ましいであろう。注入可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによってもたらされ得る。
【０１３１】
減菌注入可能溶液は、必要に応じて、前述の成分の１つ、またはそれらの組み合わせを用いて、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を組み込んだ後、減菌マイクロ濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒体および前述の成分から必要なその他の成分を含有する減菌ビヒクルの中に活性化合物を組み込むことによって調製される。減菌注入可能溶液の調製用の減菌粉末の場合において、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加え、前述のその減菌濾過された溶液から任意の追加の所望の成分を産生する、真空乾燥および凍結−乾燥（凍結乾燥）である。
【０１３２】
投与量レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調整される。例えば、単回ボーラスが投与され得る、いくつかに分けた用量が経時的に投与され得る、または用量は、治療状況の要求により指示される通りに、比例的に減少させる、またはた増加させることができる。典型的な単回用量（以下にさらに記載される投与量スケジュールで投与することができる）は、本明細書に記載する要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３０００μｇ／ｋｇ（３ｍｇ／ｋｇ）〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上のうちのいずれかからいずれかまでの範囲であり得る。例えば、抗ＮＧＦ抗体は、約１μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約４００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇで投与することができる。好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、約３μｇ／ｋｇ〜３０００μｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。別の好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、約１００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、約２００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、約３００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、約４００μｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１３３】
数日、数週間、または数ヶ月より長くにわたる反復投与において、状態に応じて、症状の所望の抑制が生じるまで、または十分な治療レベルが達成されるまで（例えば、痛みを減少させる）、治療は持続される。例示的な用量レジメンは、抗ＮＧＦ抗体の約３μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇの範囲の初期用量後、約３μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇの月単位の維持用量を投与することを含む。別の実施形態において、約２００μｇ／ｋｇの用量が毎月１回投与される。また別の実施形態において、約４００μｇ／ｋｇの用量が２ヶ月に１回投与される。しかしながら、他の投与量レジメンが有用であってもよく、これは、実施者が達成したい薬物動態の減衰のパターンによる。例えば、いくつかの実施形態において、１週間に１〜４回の投薬が意図される。しかしならが、抗ＮＧＦ抗体による長期間の痛み緩和を考えると、投薬が使用される頻度は低い可能性がある。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、毎週１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、５週間に１回、６週間に１回、７週間に１回、８週間に１回、９週間に１回、１０週間に１回、１５週間に１回、２０週間に１回、２５週間に１回、２６週間以上に１回投与される。いくつかの実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、４ヶ月に１回、５ヶ月に１回、６ヶ月以上に１回投与される。
【０１３４】
実施例６にさらに説明するように、好ましい実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、１２週間に１回、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、０．１５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に（例えば、ヒトに）投与される。別の好ましい実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、１２週間に１回、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．４ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、０．３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に（例えば、ヒトに）投与される。また他の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。
【０１３５】
投与の容易性および投与量の均一性のために、投与量単位形態で非経口組成物を製剤化することが、特に有用である。本明細書に使用される、投与量単位形態は、治療される対象の単位投与量として適した単位を物理的に分離することを指し、各単位は、必要な薬学的担体とともに所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の予め決められた量を含有するものである。本発明の投与量単位形態の仕様は、（ａ）活性化合物の独特の特徴および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個人の感応性の治療のためのそのような活性化合物を配合する技術においてもともと付随する制約によって定められ、それらに直接依存する。例えば、投与量単位形態の例としては、０．２ｍｇ（約７０ｋｇの個人において、３μｇ／ｋｇの用量に相当する）、２ｍｇ（約７０ｋｇの個人において、３０μｇ／ｋｇの用量に相当する）、および７ｍｇ（約７０ｋｇの個人において、１００μｇ／ｋｇの用量に相当する）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
薬学的に許容される抗酸化剤の例としては、（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤、（２）パルミチン酸アルコルビル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒトロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等の油溶性抗酸化剤、および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート化剤を含む。
【０１３７】
製剤は、投与量単位形態で提供されることが都合良く、調剤分野に公知のいずれかの方法によって調製することができる。本明細書に使用される、投与量単位形態は、治療される対象の単位投与量として適した単位を物理的に分離することを指し、各単位は、必要な薬剤薬学的担体とともに所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の予め決められた量を含有するものである。単回投与量形態を産生するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象および特定の投与形式により変動する。単回投与量形態を産生するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物の量である。一般に、この量は、１００％のうち、約０．００１パーセント〜約９０パーセントの活性成分、好ましくは、約０．００５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは、約０．０１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１３８】
本明細書に使用される、「非経口投与」および「非経口的に投与される」という慣用句は、経腸および局所投与以外の、通常、注入による投与形式を指し、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、角皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注入ならびに点滴を含む。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物に利用することができる適切な水性および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、グリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注入可能な有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティング材料の使用によって、分散液の場合においては、必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１４０】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤等のアジュバントも含有することができる。当該分野に周知のアジュバントの特定の例としては、例えば、無機アジュバント（アルミニウム塩、例えば、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウム等）、有機アジュバント（例えば、スクアレン）、油系アジュバント、ビロソーム（例えば、膜結合性血球凝集素およびインフルエンザウイルスに由来するノイラミニダーゼを含むビロソーム）が挙げられる。
【０１４１】
微生物の存在の防止は、上の減菌手順、ならびに例えば、パラベン、クロロブタノール、ソルビン酸フェノール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤を含むことの両方により確実にされ得る。糖類、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物中に含むことも望ましい場合がある。加えて、注入可能な薬学的形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の、吸収を遅延する薬剤を含むことによってもたらされ得る。
【０１４２】
本発明の化合物は、医薬品として、ヒトおよび動物に投与される時、それらは、単独で、および例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせて、０．００１〜９０％（より好ましくは、０．０１〜３０％等の０．００５〜７０％）の活性成分を含有する薬学的組成物として提供することができる。
【０１４３】
選択される投与形態に関わらず、適切な水和形態で、および／または本発明の薬学的組成物に使用することができる本発明の化合物は、当業者に公知の従来の方法により薬学的に許容される投与量形態に製剤化される。
【０１４４】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、患者への毒性がなく、特定の患者、組成物、および投与形式において所望の治療応答を達成するのに効果的である活性成分の量を得るように変動させることができる。選択された投与量レベルは、利用される本発明の特定の組成物、またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与時間、利用される特定の化合物の排出速度、治療期間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、治療される患者の年齢、性別、状態、一般健康状態、および以前の病歴を含む種々の薬物動態要因、ならびに医療分野に周知の同様の要因に依存する。当該分野の医師および獣医は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、医師および獣医は、所望の治療効果を達成するために必要とされるより低いレベルで、薬学的組成物に利用される本発明の化合物の用量から始めて、所望の効果が達成されるまで、徐々に投与量を増加することができる。一般に、本発明の組成物の適切な日用量は、治療効果をもたらすのに効果的な最低量の化合物の量である。そのような効果的な用量は、一般に、上述の要因に依存する。
【０１４５】
治療組成物は、当該分野に公知の医療器具を用いて投与することができる。例えば、好ましい実施形態において、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号、または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイス等の、針なしの皮下注入デバイスを用いて投与することができる。本発明に有用な周知の移植片およびモジュールの例としては、制御速度で薬剤を分注するための移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬剤を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号、正確な点滴速度で薬剤を送達するための薬剤点滴ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達のための変流の埋め込み可能な点滴装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号、多重チャンバ室を有する浸透性薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号、および浸透性薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。多くの他のそのような埋め込み物、送達システム、およびモジュールは、当業者に公知である。
【０１４６】
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、生体内において適切な分布を確実にするように製剤化することができる。例えば、血液−脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高度に親水性の化合物を除外する。本発明の治療化合物がＢＢＢを通過する（所望する場合）ことを確実にするために、それらは、例えば、リポソームに製剤化することができる。リポソームの製造方法においては、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号、および同第５，３９９，３３１号を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器の中に選択的に輸送される１つ以上の部分を含み、よって標的薬物送達を強化することができる（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。標的部分の例としては、葉酸またはビオチン（例えば、Ｌｏｗらの米国特許第５，４１６，０１６号を参照）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）、抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０、Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）、その異なる種は、本発明の製剤ならびに本発明の分子の構成要素を含むことができる、界面活性タンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）、ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）が挙げられるが、Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ、Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３、Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ、Ｉ．Ｊ．Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ４：２７３も参照のこと。
【０１４７】
Ｖ．本発明の抗体の使用方法
別の態様において、本発明は、例えば、対象のＮＧＦ抗体関連の疾患もしくは状態を軽減する、または阻害する治療方法を提供し、本方法は、本発明の抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含む。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、痛み、例えば、痛みの増進または持続が、少なくとも部分的にＮＧＦにより媒介される疾患または状態に関する痛みを軽減する、または緩和するために使用される。ＮＧＦ関連の疾患または状態の例としては、炎症性疼痛、外科手術後の痛み、術後痛（歯痛を含む）、神経因性痛、抹消神経障害、糖尿病神経障害、骨折痛、痛風関節痛、ヘルペス後神経痛、癌性疼痛、変形性関節炎痛または関節リウマチ痛、座骨神経痛、鎌状赤血球クリーゼに伴う痛み、頭痛（例えば、偏頭痛、緊張性頭痛、群発性頭痛）、月経困難、子宮内膜症、子宮筋腫、膵炎、慢性腰痛、線維筋痛、捻挫、内臓痛、卵巣嚢胞、前立腺炎、慢性骨盤痛症候群、膀胱炎、間質性膀胱炎、有痛性膀胱症候群およびまたは膀胱痛症候群、慢性無菌前立腺炎に伴う痛み、切開による痛み、偏頭痛、三叉神経痛、焼けどおよび／または創傷による痛み、外傷に伴う痛み、筋骨格系疾患に伴う痛み、強直性脊椎炎、関節周囲病変、骨転移による痛み、ＨＩＶによる痛み、紅痛症、または膵炎もしくは腎結石により生じる痛み、悪性メラノーマ、シェーグレン症候群、喘息（例えば、重度の気道過敏反応を伴う制御不能な喘息）、難治性の咳、脱髄性疾患、慢アルコール依存、脳卒中、視床痛症候群、毒素による痛み、化学療法による痛み、線維筋痛、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、炎症性眼疾患、炎症性または不安定な膀胱疾患、乾癬、炎症性要因を伴う皮膚の病状、日焼け、心臓炎、皮膚炎、筋肉炎、神経炎、膠原病性脈管疾患、慢性炎症状態、炎症性疼痛ならびに関連する痛覚過敏および異痛、神経因性痛および関連する痛覚過敏または異痛、糖尿病神経障害痛、交感神経維持疼痛、求心路遮断症候群、上皮組織損傷または機能障害、呼吸器、尿生殖器、胃腸管もしくは脈管領域の内臓運動性の障害、アレルギー性皮膚反応、掻痒症、白斑、全身胃腸疾患、大腸炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、血管運動性またはアレルギー性鼻炎、気管支疾患、胃腸障害、胃食道逆流、膵炎、ならびに臓器痛が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
さらに、ＮＧＦは、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、プロラクチノーマ、およびメラノーマ等の、癌の増殖に関連付けられている。したがって、別の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体を使用して治療することができるＮＧＦ関連の疾患または状態は、癌、好ましくは、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、プロラクチノーマ、またはメラノーマである。よって、別の実施形態において、本発明は、対象の癌、好ましくは、前立腺癌、甲状腺癌、肺癌、プロラクチノーマ、またはメラノーマを治療する方法も提供し、本発明の抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含む。
【０１４９】
またさらに別の実施形態において、ＮＧＦ関連の疾患または状態はＨＩＶ／ＡＩＤＳであり得る。本発明の抗ＮＧＦ抗体を使用するＮＧＦの遮断は、ＨＩＶ感染マクロファージを遮断することができ、それによって、ＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療する。したがって、別の実施形態において、本発明は、対象のＨＩＶ／ＡＩＤＳＡを治療する方法も提供し、本発明の抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含む。
【０１５０】
本発明の方法に従う治療における特に好ましい疾患および状態は、炎症性疼通（特に、変形性関節炎痛または関節リウマチ痛）、筋骨格痛（特に、慢性腰痛）、癌性疼痛、神経因性痛（特に、糖尿病神経障害）、骨転移による痛み、間質性膀胱炎／有痛性膀胱症候群、慢性無菌前立腺炎に伴う痛み、子宮内膜症および／または子宮筋腫による痛み、ならびに術後痛を含む。
【０１５１】
子宮内膜症および／または子宮筋腫に伴う痛みおよび／または他の症状は、月経困難、慢性の非月経、骨盤痛、性交疼痛症、排便障害、月経過多、下腹部痛または背痛、不妊症および低妊孕率、排尿障害、排尿による腹部膨満および痛み、吐気、嘔吐、ならびに／または下痢を含み得る。症状は、例えば、喀血、気胸、または血胸として現れる胸部子宮内膜症候群ならびに呼吸困難および肺腫瘤として現れる肺性筋腫を含む、腹腔の外側に位置する子宮内膜症病変または子宮筋腫に関連する症状も含む場合がある。
【０１５２】
特定の好ましい実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、痛みを治療するために使用される。好ましくは、治療される痛みの種類は、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、ならびに子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みから選択される。したがって、好ましい実施形態において、本発明は、対象の痛みを治療するように本発明の抗ＮＧＦ抗体を投与することを含む、対象の痛みを治療する方法を提供する。好ましくは、痛みは、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、ならびに子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みから成る群から選択される。したがって、一実施形態において、本発明は、対象の変形性関節炎痛を治療するように本発明の抗ＮＧＦ抗体を投与することを含む、対象の変形性関節炎痛を治療する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、対象の慢性腰痛を治療するように本発明の抗ＮＧＦ抗体を投与することを含む、対象の慢性腰痛を治療する方法を提供する。また別の実施形態において、本発明は、対象の糖尿病神経因性痛を治療するように本発明の抗ＮＧＦ抗体を投与することを含む、対象の糖尿病神経因性痛を治療する方法を提供する。また別の実施形態において、本発明は、対象の癌性疼痛を治療するように本発明の抗ＮＧＦ抗体を投与することを含む、対象の癌性疼痛を治療する方法を提供する。また別の実施形態において、本発明は、対象の子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みを治療するように本発明の抗ＮＧＦ抗体を投与することを含む、対象の子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みを治療する方法を提供する。
【０１５３】
別の実施形態において、本発明は、ＮＧＦ関連の疾患を治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。ＮＧＦ関連の疾患または状態の非限定例としては、上に列挙したものが挙げられる。別の実施形態において、本発明は、痛みを治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、ならびに子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みから成る群から選択される痛みを治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、変形性関節炎痛を治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、慢性腰痛を治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、糖尿病神経因性疼痛を治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、癌性疼痛を治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みを治療するために、本明細書に記載される抗ＮＧＦ抗体を提供する。
【０１５４】
特定の実施形態において、本発明は、対象の痛みを軽減する、または阻害する方法を提供し、本方法は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗神経成長因子（ＮＧＦ）抗体を対象に投与することを含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含み、本抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約４〜約１２週間（または少なくとも４〜１２週間、または少なくとも４週間、または少なくとも８週間、または少なくとも１２週間、または少なくとも１〜１２週間、または４〜１２週間、または８〜１２週間）の間、対象の痛みを緩和する。好ましくは、痛みは、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、子宮内膜症の痛み、および／または子宮筋腫の痛みから成る群から選択される。好ましくは、抗ＮＧＦ抗体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、もしくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、もしくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、もしくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量、または本明細書に記載される他の投与用範囲のうちの１つで投与される。
【０１５５】
別の特定実施形態において、本発明は、リバウンド効果が対象において回避されるように、対象の神経成長因子（ＮＧＦ）関連の疾患または状態を軽減する、または阻害する方法を提供し、本方法は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号９のアミノ酸配列位置１０８でヒンジ領域変異を含み、本抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日（または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、または少なくとも２０日、または少なくとも２５日、または少なくとも３０日、または少なくとも４０日、または約１０〜約４０日の範囲、または１０〜４０日の範囲、または約１５〜約３０日の範囲、または１５〜３０日の範囲）の終末消失半減期を有し、本抗体は、リバウンド効果が対象において回避されるような投与量および頻度で対象に投与される。好ましくは、配列番号９のアミノ酸位置１０８のセリンは、プロリンに変異される。好ましくは、ヒトＩｇＧ４定常領域は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗体は、ＮＧＦへの結合において、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体と競合する。好ましくは、ＮＧＦ関連の疾患または状態は、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、子宮内膜症の痛み、および子宮筋腫の痛みから成る群から選択される痛みである。このましくは、抗ＮＧＦ抗体は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、または本明細書に記載される他の投与量範囲のうちの１つで投与される。より好ましくは、リバウンド効果を回避するために、抗体は、低投与量範囲、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．００１ｍｇ／ｋｇ〜０．３ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．３ｍｇ／ｋｇの範囲で投与される。より好ましくは、リバウンド効果を回避するために、抗体は、低投与量範囲で（上記に記載される）、かつ毎週１回、または２週間に１回、または４週間に１回等の、より頻繁な間隔で投与される。
【０１５６】
本発明は、対象のＮＧＦ関連の疾患もしくは状態を軽減する、または阻害するように使用するための薬剤の製造ために、本発明の抗ＮＧＦ抗体の使用も提供する。ＮＧＦ関連の疾患または状態の非限定例としては、上に列挙したものが挙げられる。別の実施形態において、本発明は、痛みの治療のための薬剤の製造ために、本発明の抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、変形性関節炎痛、慢性腰痛、糖尿病神経因性疼痛、癌性疼痛、ならびに子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みから成る群から選択される痛みを治療するための薬剤の製造のために、本発明の抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、変形性関節炎痛の治療のための薬剤の製造ために、本発明の抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、慢性腰痛の治療のための薬剤の製造ために、本発明の抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、糖尿病神経因性疼痛の治療のための薬剤の製造ために、本発明の抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、癌性疼痛の治療のための薬剤の製造ために、本発明の抗ＮＧＦ抗体を提供する。また別の実施形態において、本発明は、子宮内膜症および／または子宮筋腫の痛みの治療のための薬剤の製造ために、本発明の抗ＮＧＦ抗体を提供する。好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、約３μｇ／ｋｇ〜約３０００μｇ／ｋｇの範囲の用量で、または１００μｇ／ｋｇの用量で、または３００μｇ／ｋｇの用量で投与される。別の好ましい実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、０．１５ｍｇ／ｋｇの用量で、１２週間に１回、（例えば、ヒトに）静脈内投与される。別の好ましい実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、１２週間に１回、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．４ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは、０．３ｍｇ／ｋｇの用量で皮下に（例えば、ヒトに）投与される。また他の実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。しかしながら、他の適切な投与量範囲および用量が、薬学的組成物の節で上に記載される。
【０１５７】
好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、静脈内に投与される。別の好ましい実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、皮下または関節内に投与される。しかしながら、他の適切な投与経路が、薬学的組成物の節で上に記載される。
【０１５８】
好ましい実施形態において、本発明の抗ＮＧＦ抗体は、抗体が長期間の間投与される対象の痛みを緩和する。例えば、一実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１週間〜約１２週間（または少なくとも１週間〜１２週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１週間（または少なくとも１週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約２週間（または少なくとも２週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約４週間（または少なくとも４週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約８週間（または少なくとも８週間）の間、痛みを緩和する。別の実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約１２週間（または少なくとも１２週間）の間、痛みを緩和する。一実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約４週間〜約１２週間（または４週間〜１２週間）の間、痛みを緩和する。一実施形態において、抗体は、対象に単回用量の抗ＮＧＦ抗体を投与した後、少なくとも約８週間〜約１２週間（または８週間〜１２週間）の間、痛みを緩和する。
【０１５９】
別の実施形態において、抗ＮＧＦ抗体は、第２の薬学的薬剤、または第２の治療レジメンとともに投与される。抗体と第２の薬剤、または抗体と第２の治療レジメンは、同時に、もしくは交互に投与される、または実施され得る、抗体を最初に投与することができ、その後、第２の薬学的薬剤もしくは第２の治療レジメンが続く、または第２の薬学的薬剤またはレジメンを最初に投与する、または実施することができ、その後、抗体が続く。適切な第２の薬学的薬剤および第２の治療レジメンの例としては、薬学的組成物のセクションで上に記載されるが、これらに限定されない。特に、本発明の抗体と組み合わせて使用するための参照される第２の薬学的薬剤は、オピオイド鎮痛薬である。本発明の抗体と組み合わせて使用するための他の好ましい第２の薬学的薬剤は、ＴｒｋＡ阻害剤（例えば、薬学的組成物のセクションで詳細に記載する、細胞外ＴｒｋＡ阻害剤または細胞内ＴｒｋＡ阻害剤）およびタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤である。
【０１６０】
また別の態様において、本発明は、リバウンド効果が対象において回避されるように、対象の神経成長因子（ＮＧＦ）関連の疾患または状態を軽減する、または阻害する方法を提供し、本方法は、ヒトＩｇＧ４定常領域を含む抗ＮＧＦ抗体等の、本発明の抗ＮＧＦ抗体を対象に投与することを含み、本ヒトＩｇＧ４定常領域は変異（好ましくは、ヒンジ領域変異）を含み、本抗体は、カニクイザルにおいて、少なくとも１５日の終末消失半減期を有する。別の実施形態において、抗体は、カニクイザルにおいて、約１５日〜約２２日の範囲（もしくは１５〜２２日の範囲）、または約１５日〜約２８の範囲（もしくは１５〜２８日の範囲）、または約２１日〜約２８日の範囲（もしくは２１〜２８日の範囲）の終末消失半減期を有する。別の実施形態において、抗体は、ラットにおいて、少なくとも８日の終末消失半減期を有する。また別の実施形態において、抗体は、ヒトにおいて、少なくとも１０〜３０日（または少なくとも１０日、または少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも４０日、または約１０日〜約４０日の範囲、または１０〜４０日の範囲、または約１５〜約３０日の範囲、または１５〜３０日の範囲）の平均終末消失半減期を有する。好ましい変異は、前述に詳細に記載されるものを含む。好ましい抗体は、前述に詳細に記載される配列の、および／または機能特性を有する抗ＮＧＦ抗体を含む。ＮＧＦ関連の疾患または状態の非限定例としては、前述に詳細に記載したものが挙げられる。本発明は、リバウンド効果が対象において回避されるように、対象のＮＧＦ関連の疾患もしくは状態を軽減する、または阻害するように使用するための薬剤の製造のために、本発明の抗ＮＧＦ抗体の使用も提供する（例えば、抗体は、リバウンド効果が対象において回避されるような投与量および頻度で投与される）。
【０１６１】
ＶＩ．製造物品
ＮＧＦ関連の疾患または状態の治療に使用するために任意に説明書を含む、本発明の抗体を含むキットも、本発明の範囲内である。キットは、キットの内容の意図される使用を示すラベルを含む場合がある。ラベルという用語は、キット上に、もしくはそれとともに提供される、またはさもなければキットに付随する任意の文書、販売資料、または記録資料を含む。
【０１６２】
例えば、本発明は、本明細書に記載されるＰＧ１１０抗体（配列番号１３に示される重鎖を有し、かつ配列番号１６に示される軽鎖を有する）または誘導化形態が、キットまたは製造物品内にパッケージされる、パッケージされた薬学的組成物も提供する。本発明のキットまたは製造物品は、対象のＮＧＦ関連の疾患または状態の防止、治療、および／または診断を含む、治療に有用な材料を含有する。好ましい実施形態において、ＮＧＦ関連の疾患または状態は、炎症性疼通（特に、変形性関節炎痛または関節リウマチ痛）、筋骨格痛（特に、慢性腰痛）、神経因性痛（特に、糖尿病神経障害）、癌性疼痛（特に、骨転移による痛み）、子宮内膜症および／または子宮筋腫に伴う痛み、ならびに術後痛である。キットまたは製造物品は、容器、および容器上にまたはそれに伴うラベルもしくは添付文書または印刷資料を含み、これは、本明細書に記載されるＮＧＦ関連の疾患または状態の治療のためのＰＧ１１０抗体の使用に関する情報を提供する。
【０１６３】
キットまたは製造物品は、ＮＧＦ関連の疾患または状態の治療のためのＰＧ１１０抗体を投与するための構成成分を含むパッケージされた製品を指す。キットは、好ましくは、キットの構成成分を保持する箱または容器を含み、ＰＧ１１０抗体を投与するためのプロトコルおよび／または「添付文書」も含む。箱または容器は、好ましくは、プラスチック、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン、またはプロピレン容器中に含有される本発明の構成成分を保持する。例えば、ＰＧ１１０抗体に適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ペン等を含む。
【０１６４】
「添付文書」という用語は、治療製品の商業パッケージに通例含まれる説明書を指すように使用され、これは、そのような治療製品の使用に関する適応症、使用方法、用法、用量、禁忌、および／または注意事項についての情報を含む。一実施形態において、本発明の添付文書は、治療のためにＰＧ１１０を投与するであろう対象、例えば、購入者を含む利用者に、本明細書に記載されるＰＧ１１０抗体がＮＧＦ関連の疾患または状態の治療のために提示されることを説明する。一実施形態において、添付文書は、痛みの緩和を含む、ＰＧ抗体の特定の治療利点を説明する。別の実施形態において、添付文書は、ＰＧ１１０抗体の投与量の説明を含む場合がある。別の実施形態において、添付文書は、ＰＧ１１０抗体の投与経路および投与頻度の説明を含む場合がある。別の実施形態において、本発明の添付文書は、安全性および有効性の両方の目的の併用使用に関して、ＰＧ１１０抗体を投与されるであろう対象に情報を提供する場合もある。例えば、特定の実施形態において、キットは第２の薬学的組成物をさらに含み、これは、ＮＧＦ関連の疾患または状態を治療するための両方の製剤を投与するための説明書とともにパッケージされる、または共同販売される追加の治療を含む。本発明のキットを使用する治療に特に好ましい疾患および状態は、炎症性疼通（特に、変形性関節炎痛または関節リウマチ痛）、筋骨格痛（特に、慢性腰痛）、神経因性痛（特に、糖尿病神経障害）、癌性疼痛および骨転移による痛み、子宮内膜症および／または子宮筋腫に伴う痛み、ならびに術後痛を含む。
【０１６５】
本発明の他の実施形態は、以下の実施例に記載される。
【０１６６】
本発明は、さらに制限するものと解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに図示される。配列リスト、図面、および全ての参考文献の内容、本明細書にわたって引用される特許および公開された特許出願は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１６７】
実施例
実施例１：変異ＩｇＧ４ヒンジ領域を用いた抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０の構築
本実施例において、ヒト化抗ＮＧＦ抗体の変異形態は、ＩｇＧ４定常領域のヒンジ領域においてセリンをプロリン変異に導入することにより作製された。
【０１６８】
ヒト化抗ＮＧＦ抗体であるａｌｐｈａＤ１１の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を使用した。ヒト化ａｌｐｈａＤ１１抗体は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０６１５４０号および同第ＷＯ２００６／１３１９５１号にさらに詳細に記載される。ａｌｐｈａＤ１１の重鎖可変領域（Ｈｕ−ａｌｐｈａＤ１１  ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。ａｌｐｈａＤ１１の軽鎖可変領域（Ｈｕ−ａｌｐｈａＤ１１  ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。Ｈｕ−ａｌｐｈａＤ１１  ＶＨのＣＤＲ１、２、および３の領域は、それぞれ、配列番号３、４、および５に示される。Ｈｕ−ａｌｐｈａＤ１１  ＶＬのＣＤＲ１、２、および３の領域は、それぞれ、配列番号６、７、および８に示される。
【０１６９】
Ｈｕ−ａｌｐｈａＤ１１  ＶＨをコードする核酸配列は、３’端でＬｏｎｚａ  ＢｉｏｌｏｇｉｃのＩｇＧ４−Ｐｒｏ定常領域（定常配列のアミノ酸残基１０８をセリンからプロリンに変更する変異をコードする）に結合された。マウスＩｇＧ１由来シグナル配列を５’端に導入して、完全なＨｕ−ａｌｐｈａＤ１１重鎖ｃＤＮＡ配列を生成した。野生型ヒトＩｇＧ４定常領域のアミノ酸配列は、配列番号９に示され、一方、変異ヒトＩｇＧ４定常領域のアミノ酸配列は、配列番号１０に示される。セリン（配列番号９）からプロリン（配列番号１０）に変異されるアミノ酸は、配列番号９および１０内でアミノ酸位置１０８に位置する。
【０１７０】
Ｈｕ−ａｌｐｈａＤ１１  ＶＬをコードする核酸配列は、３’端でヒトカッパ定常領域（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって供給される）に連結され、マウスＩｇＧ１由来シグナル配列は５’端に導入され、それによって完全長軽鎖可変領域をコードする。
【０１７１】
抗体は、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ細胞）で発現されることになっていたため、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ（チャイニーズハムスター）遺伝子のコドンバイアスに対する抗体配列の適応を含む、コドン最適化を実行した（Ｇｅｎｅａｒｔ；ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用）。加えて、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は、可能である場合、避けた。最適化プロセスの間、以下のシス作法配列モチーフを避けた：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム進入部位、ＡＴ豊富またはＧＣ豊富配列ストレッチ、ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ配列要素（細菌におけるベクター複製に関与する）、反復配列およびＲＮＡの二次構造、（潜在）スプライス供与および受容部位ならびに分岐点、指定された内部制限酵素部位（Ｅｃｏ  ＲＩ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｐｖｕ  Ｉ、およびＮｏｔ  Ｉ）。コドンの最適化を含む抗体遺伝子配列の最適化、およびＣＨＯ細胞における抗体遺伝子の発現は、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣが所有する、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００６／１２２８２２号にさらに詳細に記載される。
【０１７２】
最適化された重鎖および軽鎖可変領域配列（シグナル配列を含む）は、それぞれ、ＧＳベクターｐＥＥ６．４およびｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって供給される）にクローン化され、２つの単一遺伝子ベクター（ＳＧＶ）を生成する。次いで、重鎖ベクターからの完全な発現カセットを軽鎖ベクターに連結することにより、二重遺伝子ベクター（ＤＧＶ）を構築して、完全な重鎖および軽鎖遺伝子の両方ならびにＧＳ（グルタミンシンテターゼ）遺伝子を発現する単一ベクターを作製した。
【０１７３】
得られた変異抗体はＰＧ１１０と称された。完全なＰＧ１１０重鎖のヌクレオチド配列（シグナル配列、可変領域、および変異ＩｇＧ４定常領域を含む）は、配列番号１１に示される。完全なＰＧ１１０重鎖のアミノ酸配列（シグナル配列、可変領域、および変異ＩｇＧ４定常領域を含む）は、配列番号１２に示され、アミノ酸残基１〜１９はシグナル配列を構成し、アミノ酸２０〜１４１は可変領域を構成する。シグナル配列を含まない成熟ＰＧ１１０重鎖のアミノ酸配列（可変領域および変異ＩｇＧ４定常領域を含む）は、配列番号１３に示される。
【０１７４】
完全なＰＧ１１０軽鎖のヌクレオチド配列（シグナル配列、可変領域、およびカッパ定常領域を含む）は、配列番号１４に示される。完全なＰＧ１１０軽鎖のアミノ酸配列（シグナル配列、可変領域、およびカッパ定常領域を含む）は、配列番号１５に示され、アミノ酸残基１〜２０はシグナル配列を構成し、アミノ酸２１〜１２７は可変領域を構成する。シグナル配列を含まない成熟ＰＧ１１０軽鎖のアミノ酸配列（可変領域およびカッパ定常領域を含む）は、配列番号１６に示される。
【０１７５】
ＰＧ１１０抗体の発現を検証するために、ＰＧ１１０の重鎖および軽鎖をコードするＤＧＶをＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓによって供給される）の中に過渡的に形質移入した。細胞（ウェル当り０．１２５×１０６生細胞）を、１０％ウシ胎仔血清および６ｍＭのＬグルタミンで補足したＤＭＥＭ系培地の２４ウェルプレート中で平板培養し、３７℃（１０％ＣＯ２インキュベータ）で一晩インキュベートした。形質移入前、種培地を８００μＬの新しい培地と交換し、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。
【０１７６】
各形質移入において、５μｇのＰＧ１１０  ＤＧＶを、１００μＬの形質移入培地（ＯｐｔｉＭＥＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。別のＩｇＧ４／カッパ抗体をコードするベクターを、正の対照として使用し、緩衝液のみを、負の対照として使用した。各形質移入において、５μＬのリポフェクタミン−２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１００μＬの形質移入培地に希釈した。室温で５分間インキュベートした後、ＤＮＡおよび希釈したリポフェクタミン試薬を組み合わせて混合し、周囲温度で２０分間放置した。次いで、この２０５μＬの混合物を、細胞を含有する２４ウェルプレートのウェルに添加した。細胞を３７℃で６８〜７２時間インキュベートした。培養上澄を回収し、抗体の存在についてのアッセイを行う前に遠心分離により清澄化した。
【０１７７】
形質移入した細胞からの培地は、構築されたＩｇＧについて、標準的なＥＬＩＳＡ法を使用してアッセイした。これは、試料および標準物質を抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃでコーティングされた９６ウェルプレート上に捕捉することを含む。結合分析物は、西洋わさびペルオキシダーゼおよび発色性基質テトラメチルベンジジンに連結された抗ヒトカッパ鎖抗体を用いて明らかにされた。着色の進行は、試料に存在する構築された抗体の量に比例した。標準試料は、商業的に得られるＩｇＧ４／カッパ抗体の原液から調製された。結果は、ＰＧ１１０重鎖および軽鎖をコードするＤＧＶが構築された抗体を発現することができることを示した。
【０１７８】
実施例２：変異抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０の結合特徴
本実施例において、実施例１に記載されるように調製された変異抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０の結合特異性および結合速度を検討した。
【０１７９】
Ａ．結合特異性
ヒトニューロトロフィンに結合するＰＧ１１０の選択的プロファイルを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）結合アッセイを使用して決定した。ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇ／ウェルのヒトＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２５６−ＧＦ）、脳由来の神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２４８−ＢＤ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ３）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２６７−Ｎ３）、またはニューロトロフィン４（ＮＴ４）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２６８−Ｎ４）のいずれかでコーティングした。３ｐＭ〜３ｎＭの範囲の濃度で、ＰＧ１１０をニューロトロフィンでコーティングされたウェルに添加した。洗浄（ＰＢＳ含有０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３）後、ＰＧ１１０結合は、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ２８９０）と共役するビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号６０９−１６０２）を使用して検出した後、４−リン酸メチルウンベリフェリル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ３１６８）を添加して着色反応を進行させた。反応生成物は、蛍光光度計（３６０ｎｍで励起；４４０ｎｍで発光）を使用して定量化した。
【０１８０】
結果を図１のグラフに要約する。ＰＧ１１０は、濃度に依存する様式で、ヒトＮＧＦコーティングされたウェルに結合し、５０％最大結合濃度は７２６ｐＭであった（単一アッセイプレートの三重測定から算出された）。対照的に、ＰＧ１１０は、ヒトＢＤＮＦ、ＮＴ３、またはＮＴ４でコーティングされたアッセイウェルに対して測定可能な結合を示さず、これは、これらのニューロトロフィンに特異的な正の対照抗体を使用した、別の方法では検出可能であった。これらの結果は、ＰＧ１１０が、生体外で最大３ｎＭまでの濃度で検査される時、ヒトＮＧＦに特異的に結合し、関連するニューロトロフィンに交差反応性を示さないことを実証する。
【０１８１】
Ｂ．結合速度
ＢＩＡｃｏｒｅ分析を、ＰＧ１１０と、組み換えラットＮＧＦ（ｒｒＮＧＦ）または組み換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）のいずれかとの間の相互作用の結合速度を評価するために使用した。
【０１８２】
移動緩衝液としてＨＢＳＥＰ（１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭエチレン−ジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）、および０．００５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ｐＨ７．４）を用いて、組み換えヒトβ神経成長因子（ｒｈＮＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２５６ＧＦ／ＣＦ）または組み換えラットβ神経成長因子（ｒｒＮＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５５６ＧＦ／ＣＦ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、第１級アミン基を介して、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、以前のＢｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上に共有結合的に固定した。センサーチップ表面を、１０μＬ／分の流量で、７分間、４００ｍＭのＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、および１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１：１、ｖ／ｖ）の混合物を注入することにより活性化した。β−ＮＧＦ（ｒｈまたはｒｒ）を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中で２００ｎｇ／ｍＬに希釈し、希釈された溶液を種々の時間で活性化された表面上に注入し、異なる面密度を得た。定量相互作用分析のために、６０ＲＵの面密度を、５０μＬの希釈されたβ−ＮＧＦを注入することにより調製した（接触時間５分）。非反応性ＮＨＳエステルを７０μＬ（接触時間７分）のエタノールアミン溶液（１Ｍ、ｐＨ８．５）で不活性化した。
【０１８３】
固定化されたＮＧＦを用いて実施された実験のパラメータは、以下の通りである：移動緩衝液：１００μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを含有するＨＢＳＥＰ；流量：２５μＬ／分；温度：３７℃；リガンド密度：６０ＲＵ／６０ＲＵ（ｒｈＮＧＦ／ｒｒＮＧＦにおいて）；分析物：ＰＧ１１０濃度：移動緩衝液において２ｎＭ、４ｎＭ、８ｎＭ、１７ｎＭ、３３ｎＭ、および６６ｎＭ；接触時間：２４０秒；解離時間：６００秒；再生：２×１分、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５。
【０１８４】
データおよび速度評価は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン５．０１、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．０．１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行われ、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにデータをあてはめた。
【０１８５】
結果を以下の表１に要約する（Ｋａｓｓは会合速度定数を表し、Ｋｄｉｓｓは解離速度定数を表し、ＫＤは平衡解離定数を表す）。データは、３つの個別の測定の平均±（標準誤差）を示す。
【表１】
2016026221.tif 000003
試験の結果は、ＮＧＦとのＰＧ１１０の相互作用が高親和性結合を特徴とし、いずれの種のホモログ（ヒト対ラット）の親和性（ＫＤ）において有意な相違が検出できなかったことを示した。
【０１８６】
結合速度のさらなる分析を、パパイン−セファロース（温度特異的）上でのＰＧ１１０の断片化により生成されたＰＧ１１０Ｆａｂ物質を使用して実施した。ｒｈＮＧＦの固定化は、移動緩衝液としてＨＢＳＥＰを使用して、２５℃で実施された。センサーチップ表面を、１０μＬ／分の流量で、７分間、２００ｍＭのＥＤＣおよび５０ｍＭのＮＨＳ（１：１、ｖ／ｖ）の混合物を注入することにより活性化した。ｒｈＮＧＦを１０ｍＭの酢酸ナトリム（ｐＨ４．０）中で５００ｎｇ／ｍＬに希釈し、２０μＬ（接触時間２分）の希釈された溶液を３つの細胞のそれぞれの活性化された表面上に注入し、９３．１、１００．３、および８８．７ＲＵの固定化レベルを生成した。非反応性ＮＨＳエステルを７０μＬ（接触時間７分）のエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．５）で不活性化した。
【０１８７】
２５０μＬ中一連の濃度（０．３９、０．７８、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、および２５ｎＭ）のＰＧ１１０Ｆａｂを、１００μｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含有するＨＰＳＥＰの移動緩衝液で、３７℃、５０μＬ／分の流量で新しく固定化されたｒｈＮＧＦ表面上に通した。解離を３０分間監視し、相互作用分析が完了した後、再生を、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）の１つのパルス（３０μＬ）で達成した。加えて、非常に遅いｋｄｉｓｓをより正確に定義するために、各ｒｈＮＧＦ表面上で、高濃度の１つ（１００ｎＭ）のＰＧ１１０Ｆａｂの解離を８時間監視し、解離速度定数（ｋｄｉｓｓ）の定量化のために使用した。データは、固定ｋｄｉｓｓを使用して、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルによって全体的にあてはめ、延長された解離測定から決定した。速度定数の再現性を評価するために、３つの新しく固定された表面上で、分析を３回実施した。計算された速度定数を表２に要約する。
【表２】
2016026221.tif 000004
【０１８８】
実施例３：変異抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０の機能特性
本実施例において、実施例１に記載されるように調製された変異抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０の種々の機能特性を生体外アッセイにおいて検証した。
【０１８９】
Ａ．ＮＧＦのＴｒｋＡよびｐ７５ＮＴＲ受容体への結合の阻害
ＮＧＦのヒトＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲ受容体への結合に対するＰＧ１１０の阻害作用を比較するために、放射性リガンド結合試験を行った。完全長ヒトＴｒｋＡまたはｐ７５ＮＴＲ受容体のいずれかを発現するＨＥＫ２９３細胞を、０．０１〜１００ｎＭの最終濃度で、ＰＧ１１０の存在下、２ｎＭの１２５Ｉ−ＮＧＦとともにインキュベートした。非標識ＮＧＦ（０〜１μＭの濃度で変動）も反応物に含まれた。反応は、高壁のＰＴ１２７６平底使い捨てチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）内で実施された。最初に、放射標識されたＮＧＦ、非標識ＮＧＦ、およびＰＧ１１０抗体を混合し、結合緩衝剤（１×ＰＢＳ、０．９ｍＭのＣａＣｌ、０．５ｍＭのＭｇＣｌ、０．１％ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ、０．１％（ｗ／ｖ）グルコース）中で、振盪させながら室温で１０分間、チューブ内でインキュベートした。次いで、２００μＬの調製された細胞（５×１０５細胞／ｍＬに希釈）を添加した。激しく振盪させながら、室温でさらに３０分間インキュベートした後、各反応を３つのプラスチックのチューブ（０．４ｍＬマイクロチューブ、ＰＥ、Ｓａｒｓｔｅｄｔ７２．７００）に分配し、１００μＬの反応物を各チューブに添加した。各マイクロチューブは、既に、結合緩衝剤中に、２００μＬの１５０ｍＭスクロースを含有した。これらのチューブは、次いで、細胞をペレット化するために、４℃で３０秒間、２０，０００×ｇで遠心分離された。スクロースは、任意の移動した放射標識されたＮＧＦを分離するように作用する密度勾配を提供する。その後、ドライアイス／エタノール槽中でチューブを凍結した。次いで、ＬＫＢ  Ｗａｌｌａｃミニ−ガンマ計数器を使用して計数するために、これらの凍結したチューブの先端を別のプラスチックチューブ（Ｎａｉａｄ  Ｌｔｄ）に取り出し、それによって、細胞に結合した１２５Ｉ−ＮＧＦを定量化した。
【０１９０】
結果を図２Ａおよび２Ｂのグラフに図示するが、ＴｒｋＡに結合するＮＧＦに対するＰＧ１１０の作用が図２Ａに示され、ｐ７５ＮＴＲに結合するＮＧＦに対するＰＧ１１０の作用が図２Ｂに示される。ＰＧ１１０は、濃度に依存する様式で、ＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲ受容体への１２５Ｉ−ＮＧＦの結合を阻害し、幾何平均（９５％ＣＩ）ＩＣ５０値は、それぞれ、１７０（８８−３３１）ｐＭおよび２０６（８６−４９１）ｐＭであった（両方ともｎ＝３）。イソ型の対照抗体は、いずれの受容体への１２５Ｉ−ＮＧＦの結合を阻害しなかった。これらの結果は、ＰＧ１１０が生体外においてヒトＮＧＦのその受容体の両方との結合相互作用を強力に遮断することを実証する。
【０１９１】
Ｂ．ＴＦ−１細胞増殖アッセイ
ＴＦ−１は、ヒトＴｒｋＡを発現するヒト赤血球白血球細胞株であり、ＮＧＦに応答して増殖する。これらの実験において、ＴＦ−１細胞は、ＰＧ１１０抗体の濃度を増加しながら、１０ｎｇ／ｍＬのヒト、ラット、またはマウス組み換えＮＧＦの存在下で培養され、細胞増殖は、黄色のテトラゾリウム塩ＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラナトリムブロミド］から紫色のホルマザンまでの代謝減少に基づく比色法を使用して、４０時間後に定量化された。
【０１９２】
アッセイに使用する前に、２ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５−ＧＭ−５０）とともに、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０で、ＴＦ−１細胞を１週間培養した。細胞を洗浄し、３００，０００細胞／ｍＬの濃度にＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ中で再懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（５０μＬ中１５，０００細胞／ウェル）上で再び平板培養した。９６ウェルアッセイプレートに添加してから少なくとも６０分後、ＰＧ１１０抗体を含有する１０％ＦＰＢ（５０μＬ／ウェル）を含有するＲＰＭＩ−１６４０中で、細胞をヒト、ラット、またはマウスの組み換えＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかに曝した。ＮＧＦを含有する媒体およびテスト抗体は、予め播種された細胞に添加される少なくとも３０分前に、２Ｘ最終アッセイ濃度で調製された。０．６ｎｇ／ｍＬ〜２４μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、テスト抗体をアッセイした。培地のみを含有するか、またはＮＧＦ不在下のＴＦ−１細胞（「細胞ブランク」）を含有するかのいずれかの対照ウェルを含んだ。各処理は、３回実施された。４０時間のインキュベーション期間後（３７℃、５％ＣＯ２）、ＭＴＴ細胞増殖キット（ＡＴＣＣカタログ番号３０−１０１０Ｋ）を使用して、増殖を定量化した。３７℃でさらに４時間インキュベートする前に、１０μＬのＭＴＴ試薬を添加した。その後続いて、暗所で、室温で一晩インキュベートするために、ウェルを洗浄試薬（１００μＬ／ウェル；穏やかに混合）とともにインキュベートした。その後、５７０ｎｍで吸光度を記録した。３回の測定における最終平均ＯＤ値は、細胞ブランクの平均値を引くことにより計算された。
【０１９３】
ＰＧ１１０（０．６ｎｇ／ｍＬ〜２４μｇ／ｍＬ）の存在下でＮＧＦを含むＴＦ−１細胞のインキュベーションは、濃度に関連する細胞増殖の阻害をもたらした。結果を図３Ａ〜３Ｃのグラフに図示するが、図３Ａは、ヒトＮＧＦにより刺激されたＴＦ−１細胞増殖に対するＰＧ１１０治療の作用を示し、図３Ｂは、ラットＮＧＦにより刺激されたＴＦ−１細胞増殖に対するＰＧ１１０治療の作用を示し、図３Ｃは、マウスＮＧＦにより刺激されたＴＦ−１細胞増殖に対するＰＧ１１０治療の作用を示す。ＰＧ１１０は、検査されたＮＧＦのホモログの全てにおいて、同様の阻害能力を実証し、ＩＣ５０値は、約３０ｎｇ／ｍＬであった。ＩＣ５０値を以下の表３に要約する（ＩＣ５０値はｎｇ／ｍＬで表される）：
【表３】
2016026221.tif 000005
【０１９４】
ＴＦ−１細胞増殖アッセイは、ＰＧ１１０が、ヒトまたはゲッ齒類ＮＧＦによって、同等の強度でヒトＴｒｋＡ受容体の活性を中和することを実証する。
【０１９５】
Ｃ．ニワトリ後根神経節の生存の阻害
感覚神経に対するＮＧＦの作用を阻害するＰＧ１１０の能力を検査するために、８日目のニワトリの胚から得た後根神経節（ＤＲＧ）細胞の一次培養物を使用する生体外アッセイを使用した。これらの条件下において、ニワトリＤＲＧの生存は、培養培地に添加された外因性ＮＧＦの存在に依存する。
【０１９６】
後根神経節を８日目のニワトリの胚から単離し、５０ｍＬのファルコンチューブ（５ｍＬのＦ−１２Ｈａｍ栄養剤混合物＋Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ：ＧＩＢＣＯ  ３１７６５−０２７中）に回収した。各実験において、回収された神経節の総数は、約４００であり、おおよそ２０の胚に相当した。神経節を、続いて、３７℃で５分間、トリプシン処理し（トリプシン−ＥＤＴＡ  Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、ＥＣＢ３０５２Ｄ）、４〜５回、１０ｍＬのシリンジ（２０Ｇ「黄色」針）を用いて分離した後、８００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
【０１９７】
トリプシン含有培地を慎重に取り出し、細胞を１０ｍＬの新しい培地（Ｆ−１２  Ｈａｍ栄養剤混合物＋Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ）に再懸濁した後、分離手順を繰り返し、培地の量を１００，０００〜４００，０００細胞／ｍＬの種濃度に調整した。蒸留水に溶解されたポリ−Ｌ−リジン（ポリ−Ｌ−リジンヒドロブロミドの１００×＝１ｍｇ／ｍＬ溶液；Ｓｉｇｍａ  Ｐ２６３６）でコーティングされた２４多穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ  ３５３０４７）（ＵＶ下で３０分、その後、減菌フード下で３０分乾燥）を使用して、２０％ウマ血清（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ  ＥＣＳ００９１Ｌ）を含有する最終容量の半分に、処置をせずに細胞を播種した。
【０１９８】
細胞がプレートに接着する間（５％ＣＯ２インキュベータで３０分、３７℃）、ＮＧＦまたはＮＧＦ／抗−ＮＧＦ抗体のいずれかの溶液を最終容量の半分の２Ｘ濃度で調製し、正しい最終濃度（すなわち、ウマ血清の最終％＝１０％、ＮＧＦの最終濃度＝５ｎｇ／ｍＬ）に達するようにウェルごとに添加した。ＮＧＦの不在下のＤＲＧ細胞を含有する対照ウェルが含まれた。各条件を２重試験した。ＮＧＦまたはＮＧＦ／抗ＮＧＦ混合物のいずれかを添加した後、プレートをインキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）に戻した。各ウェルの垂直直径に沿って観察された全てのＤＲＧ細胞を数えることにより（Ｎｉｋｏｎ  ＴＭＳ顕微鏡、１０Ｘ拡大率）、細胞の数を４８時間後に記録した。ＤＲＧ細胞のみが計数に含まれ、これは、それらの形態的特徴、すなわち、長い神経突起を有する丸く、鮮やかな、光を反射する細胞により、容易に識別することができた。
【０１９９】
ＰＧ１１０のＮＧＦ中和能力を、組み換えヒトＮＧＦ（ｒｈＮＧＦ）、組み換えラットＮＧＦ（ｒｒＮＧＦ）、または組み換えマウスＮＧＦ（ｒｍＮＧＦ）のいずれかの中和について、１０ｎｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬの範囲の濃度で検査した。これらの実験において、生存の１００％阻害は、抗ＮＧＦ抗体の不在下において、細胞がＮＧＦなしで培養された時に計数された細胞の数と等しいものとした。逆に、０％阻害は、抗ＮＧＦ抗体の不在下において、細胞が５ｎｇ／ｍＬの関連のあるＮＧＦイソ型に曝された時に計数された細胞の数と等しいものとした。
【０２００】
ＰＧ１１０の存在下（１０ｎｇ／ｍＬ〜２５μｇ／ｍＬ）での細胞のインキュベーションは、細胞生存において、濃度に依存する減少をもたらし、全ての種のＮＧＦホモログにおいて、１０から５０ｎｇ／ｍＬの間のＩＣ５０であった（ｎ＝１）。これらのデータは、ＰＧ１１０が感覚神経に対するＮＧＦの活性を阻害することを実証する。
【０２０１】
Ｄ．ＰＣ１２細胞神経突起伸長の阻害
ＰＣ１２は、ラットＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲ受容体の両方を発現するラットのクロム親和性細胞腫（クロム親和性細胞由来腫瘍）細胞株である。ＮＧＦの存在下、コラーゲンコーティングされたプレート上で培養された時、ＰＣ１２細胞は、交感神経様神経に分化され、平らな伸長した神経突起（神経芽）になる。ＮＧＦ媒介神経突起伸長の阻害は、ＮＧＦのラットＴｒｋＡおよびｐ７５ＮＴＲ受容体との相互作用を阻害するＰＧ１１０の能力の半定量的生体外測定として利用された。
【０２０２】
無血清培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉを含むＲＰＭＩ−１６４０、Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ６１８７０−０１０）で１００，０００個の細胞を洗浄することにより、ＰＣ１２細胞（ＥＣＡＡＣ  ８８０２２４０１）をプライムし（すなわち、ＮＧＦに予め曝す）、１０％ＦＢＳを含有するＧｌｕｔａｍａｘ−Ｉおよび組み換えラットＮＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号５５６−ＮＧ−１００）（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むＲＰＭＩ−１６４０の、コラーゲン処理されたプラスチック培養フラスコ（Ｉ型コラーゲンであるＢＤ３５−４２３６を０．５ｍｇ／ｍＬ使用液として利用した）上で再び平板培養した。播種前に、細胞塊を脱凝集するために、少なくとも５回、細胞を２１Ｇ針に静かに通過させた。ＮＧＦを含有する培地を取り除き、１週間のプライミングの間、２回交換した。
【０２０３】
この期間の終わりに、プライムされたＰＣ１２細胞を無血清培地で洗浄し、加湿したインキュベータ（５％ＣＯ２、３７℃）中で、２〜３分間、トリプシン処理した（トリプシン−ＥＤＴＡ  Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ、ＥＣＢ３０５２Ｄ）。血清含有培地を添加することによりトリプシンを遮断し、細胞を遠心分離し、無血清培地で洗浄し、１０％ＦＢＳを含有するＧｌｕｔａｍａｘ−Ｉを含むＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁した。５０，０００細胞／ｍＬの密度でコラーゲン処理されたペトリ皿上で再び平板培養する前に、細胞塊を脱凝集するために、細胞を少なくとも５回、２１Ｇ針に静かに通過させた。アッセイ条件ごとに３つの皿を調製した。抗体検査のために、予め播種された細胞に添加する１時間前に、２Ｘインキュベーション混合物（組み換えラットＮＧＦ＋抗ＮＧＦ）を調製した。ＮＧＦの最終濃度は２０ｎｇ／ｍＬであり、一方、抗ＮＧＦ抗体は、４つの希釈剤で検査された：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、および２０ｎｇ／ｍＬ。
【０２０４】
ＮＧＦ誘発神経突起伸長を７２時間後に記録した。その時点で、培地を取り除き、細胞をカルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ，１００１０）で洗浄し、ＰＢＳ中４％のホルムアルデヒドで３０分間固定した。Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２０００−Ｅ顕微鏡およびＬｅｉｃａ  ＩＭ１０００Ｉｍａｇｅ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェアを使用して、顕微鏡画像（２０Ｘ拡大率）を取得した。神経突起伸長の阻害を評価し、非分化表現型（＝明確に定義された神経突起の不在）を示す細胞の数に基づき、スコア（＋＋；＋／−；−−）を得た。
【０２０５】
ＰＧ１１０（２０ｎｇ／ｍＬ〜２０μｇ／ｍＬ）の存在下での細胞のインキュベーションは、ＮＧＦ媒介神経突起伸長を阻害し、完全な阻害は２００ｎｇ／ｍＬで明らかであり、ＰＧ１１０が、ラット組み換えＮＧＦとその未変性のラットニュートロフィン受容体との間の相互作用の効果的な阻害剤であることを強調する。
【０２０６】
実施例４：変異抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０の生体内における安定性
本実施例において、ＰＧ１１０抗体の終末消失半減期（Ｔ１／２）をラットおよびカニクイザルの生体内において決定した。
【０２０７】
Ａ．ラット試験
試験１日目と５６日目に、３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、スプラーグドーレイラットに静脈内（ＩＶ）点滴でＰＧ１１０抗体を１０分間投与した。各群の６匹の動物／時間点からの平均血清濃度および時間点を使用して、毒物動態データ評価を実施した。名目上の採血時間は、投与前、ならびに試験１日目および５６日目の投与から０．２５、１、３、６、および２４時間後であり、また、試験１日目の投与から４８、９６、１６８、３３６、５０４、６７２、８４０、１００８、および１１７６時間後であった。血清サンプル生体分析を、有効なＥＬＩＳＡ法を使用して、Ａｌｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施された。薬物動態データ分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌのバージョン４．０ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）を用いたＳＮＢＬ  ＵＳＡ薬物動態分析システムを使用して実施した。
【０２０８】
ＩＶ投与後、Ｔｍａｘ値（最大血清濃度までの時間）は、最初の２つのサンプル回収時間点である０．２５〜１時間の範囲であった。全ての動物は二相傾向を示し、終末消失半減期は約８〜９日であった。より具体的に、３つの治療群の時間でのＴ１／２を以下の表４に要約する。
【表４】
2016026221.tif 000006
よって、群の平均半減期の値は、ラットにおいて、１９２〜２１７時間（８〜９日）の範囲であった。
【０２０９】
Ｂ．最初のサルの試験
３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、カニクイザルに静脈内（ＩＶ）点滴でＰＧ１１０抗体を約３０分間、単回投与した。動物を雄と雌に分け、各用量を２匹の雄と２匹の雌で検査した（１匹の雌のみが３０ｍｇ／ｋｇで検査されたことを除く）。毒物動態データ分析用の名目上の採血時間は、投与直後（点滴終了から２分以内）、点滴終了から０．２５、１、３、６、２４、４８、９６、１６８、３３６、５０４、６７２、８４０、１００８、１１７６、１３４４、１５１２、および１６８０時間後であった。血清サンプル生体分析を、有効なＥＬＩＳＡ法を使用して、Ａｌｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施された。薬物動態データ分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌのバージョン４．０ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）を用いたＳＮＢＬ  ＵＳＡ薬物動態分析システムを使用して実施した。
【０２１０】
ＩＶ投与後、点滴の開始から測定したＴｍａｘ値（最大血清濃度までの時間）は、点滴の終了から約１．６時間の範囲であった。全ての動物は二相傾向を示し（３０ｍｇ／ｋｇで治療された１匹の雌を除く、この雌は５０４時間後の時間点で、急激な減衰を示した）、終末消失半減期は約１５〜２２日であった。より具体的に、６つの治療群の時間でのＴ１／２を以下の表５に要約する。
【表５】
2016026221.tif 000007
よって、群の平均半減期の値は、カニクイザルにおいて、３７０〜５３１時間（１５〜２２日）の範囲であった。少数の動物が検査されたことを考えると、これが統計的に有意な相違であるかは明らかではないが、平均半減期の値は、一般に、雌より雄の方が長かった。
【０２１１】
Ｃ．第２のサルの試験
４週間にわたり、ＰＧ１１０抗体をカニクイザルに毎週静脈内点滴した。１日目、８日目、１５日目、および２２日目に、３ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの投与量で、約３０分間、静脈内（ＩＶ）点滴した。動物を雄と雌に分け、各用量を３匹の雄と３匹の雌で検査した。以下の名目上の時間点で順次血液サンプルを回収した：投与前、投与直後（点滴終了から２分以内）、１日目および２２日目の点滴終了から０．２５、１、３、６、２４、および１６８時間後。１５日目の投与前の全ての動物から、および２２日目の最終用量投与から３３６、５０４、６７２、８４０、１００８、１１７６、１３４４、１５１２、１６８０、１８４８、２０１６、および２２０８時間後、回復した動物から追加サンプルを回収した。点滴から２４時間後に開始する列挙される時間は、薬物動態１日目、７日目１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目、４９日目、５６日目、６３日目、７０日目、７７日目、８４日目、および９２日目に相当する。全ての実際の血液時間は、点滴の開始から始まるように変換された。
【０２１２】
ＰＧ１１０濃度分析用の血清サンプル生体分析を、有効なＥＬＩＳＡ法を使用して、Ａｌｔａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施された。薬物動態データ分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌのバージョン４．０ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）を用いたＳＮＢＬ  ＵＳＡ薬物動態分析システムを使用して実施した。
【０２１３】
ＩＶ投与後、点滴の開始から測定した群の平均Ｔｍａｘ値（最大血清濃度までの時間）は、約０．６時間〜２．６時間の範囲であった。全ての動物は二相傾向を示し、終末消失半減期は約２１〜２８日（５０３〜６８５時間）であった。より具体的に、６つの治療群の時間でのＴ１／２を以下の表６に要約する。
【表６】
2016026221.tif 000008
よって、群の平均半減期の値は、カニクイザルにおいて、約２１〜２８日の範囲であった。少数の動物が検査されたことを考えると、これが統計的に有意な相違であるかは明らかではないが、平均半減期の値は、一般に、雌より雄の方が長かった。
【０２１４】
実施例５：ラット前駆体抗体と比較したＰＧ１１０の効能
本実施例において、ＰＧ１１０のＮＧＦ中和潜在能をその前駆体であるラットαＤ１１と比較するために、ＴＦ１細胞増殖アッセイ（上記実施例３Ｂに記載）を使用して、さらなる実験を実施した。ラットαＤ１１抗体は、１つが０．７３ｍｇ／ｍＬの原液濃度、もう１つが０．６３ｍｇ／ｍＬの原液濃度である、２つの個別のバッチとして供給された。ＰＧ１１０およびラットαＤ１１の抗体は、ＭＴＴ細胞増殖キット（ＡＴＣＣカタログ番号３０−１０１０Ｋ）を使用して、ヒトＮＧＦまたはラットＮＧＦにより媒介されるＴＦ１細胞増殖のアッセイにおいて評価された。
【０２１５】
アッセイに使用する前に、ＴＦ１細胞を２ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２１５−ＧＭ−５０）とともに、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ，Ｃａｍｂｒｅｘ  ＤＥ１４−８０１Ｆ、ロット６ＳＢ０００６）を含有するＲＰＭＩ−１６４０（ＡＴＣＣ、カタログ番号３０−２００１）中で１週間培養した。細胞を洗浄し、３００，０００細胞／ｍＬの濃度にＲＰＭＩ−６４０＋１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（５０μＬ中１５，０００細胞／ウェル）上で再び平板培養した。
【０２１６】
９６ウェルアッセイプレートに添加してから少なくとも６０分後、抗ＮＧＦ抗体を含有する培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０中１０％ＦＢＳ；５０μＬ／ウェル）中で、細胞をヒトまたはマウスの組み換えＮＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）のいずれかに曝した。ＮＧＦを含有する培地およびテスト抗体は、予め播種された細胞に添加される少なくとも３０分前に、２Ｘ最終アッセイ濃度で調製された。０．６ｎｇ／ｍＬ〜２４μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、テスト抗体をアッセイした。培地のみを含有するか、またはＮＧＦ不在下のＴＦ１細胞（「細胞ブランク」）を含有するかのいずれかの対照ウェルを必ず含んだ。各処理は、３回実施された。４０時間のインキュベーション期間後（３７℃、５％ＣＯ２）、３７℃でさらに４時間インキュベートする前に、１０μＬのＭＴＴ試薬を添加した。その後続いて、暗所で、室温で一晩インキュベートするために、ウェルを洗浄試薬（１００μＬ／ウェル；穏やかに混合）とともにインキュベートした。その後、５７０ｎｍで吸光度を記録した。３回の測定における最終平均ＯＤ値は、細胞ブランクの平均値を引くことにより計算された。最大阻害は、テスト抗体の不在下において、ＮＧＦなしで培養された細胞で観察された平均ＯＤ値に対応するように設定された。ゼロ阻害は、テスト抗体の不在下において、１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦに曝された細胞で観察された平均ＯＤ値に対応するように設定された。
【０２１７】
ＮＧＦ抗体の阻害効能は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ５．０１ソフトウェアを使用して、ＩＣ５０値（すなわち、ＮＧＦ媒介増殖性応答を５０％減少させるのに必要な抗体の濃度）として定量化した。各実験における各テスト抗体の個別のＩＣ５０値を得るために、阻害曲線を個別にプロットした。細胞増殖の測定は、添加されたテスト抗体の不在下で、そのアッセイ内で得られた最大ＯＤ値に対して正規化された。正規化された応答は、次いで、対数目盛りでテスト抗体濃度に対してプロットされ、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ非線形曲線適合関数「ログ（阻害剤）対応答−可変スロープ」を使用して、ＩＣ５０値を得た。
【０２１８】
その前駆体抗体であるラットαＤ１１と比較したＰＧ１１０の阻害効果を以下の表７に要約する。
【表７】
2016026221.tif 000009
結果は、その前駆体抗体であるラットαＤ１１と比較して、ＮＧＦ抗体の中和において、ＰＧ１１０抗体が２倍高い効能を有することを示す。さらに、ラットαＤ１１のバッチ２について得られた効能の値は、このバッチがバッチ１の材料より低い効能を有する可能性があることを示唆する。
【０２１９】
実施例６：抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０は動物モデルにおいてリバウンド効果を示さない
本実施例において、ＰＧ１１０ｍＡｂの活性を検証するために、ラットの皮膚病変モデルを使用した。ラットの皮膚病変モデルは、抗ＮＧＦ抗体で治療されたラットが掻痒性応答を現わし、引っ掻き行動において用量に依存する増加が観察されたという観察に基づき開発された。障害は、表皮に対する神経支配の減少に関係しなかった。さらに、ラットは、抗体の排除後、急速な回復を示した。この皮膚病変活性は、毛づくろい行動を行うゲッ齒類だけに観察された。機序によって制限されることを意図するものではないが、抗ＮＧＦ治療されたラットにおいて、引っ掻き応答を止めるフィードバックループの障害により、毛づくろいが継続し、これが皮膚の損傷をもたらすことが仮説される。ラットにおける抗ＮＧＦ抗体の活性の測定値として、定量的スコアを皮膚病変に付与することができる。
【０２２０】
抗ＮＧＦ抗体（米国特許公開第２００４０２３７１２４号およびＡｂｄｉｃｈｅ，Ｙ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１７：１３２６−１３３５にさらに記載されるヒト化抗体ＲＮ−６４２等）の活性についての種々の臨床試験において、抗体の効果は、投与後の一定期間（例えば、投与後１４〜２１日目）低下した後、抗体の活性の回復が続くことが報告されている。抗体活性が低下する投与後のこの期間の間、痛みの増加および／または有害事象の増加（異痛から刺痛、穿痛またはしびれ感に至る異常感覚等）が報告されている。投与後の一定期間の抗体活性の減少は、本明細書において、「リバウンド効果」と称されれる。
【０２２１】
覚醒ラットにおける毛づくろいおよび引っ掻き行動についてのＰＧ１１０抗体の作用を評価するために、ｉ．ｖ．ボーラスとして、またはビヒクル対照とともに投与されるＰＧ１１０ｍＡｂ（０．００３、０．０１、０．０３、０．３、または３ｍｇ／ｋｇ）で雄および雌のスプラーグドーレイラットを治療した。ラットは、４週間、１週用量を投与された。評価基準は、毛づくろいおよび引っ掻き発作の数、体温、足なめまでの潜伏時間、跳ぶまでの潜伏時間（脱走の試み）、ならびに経時的な皮膚病変の数および重篤度スコアであった。
【０２２２】
結果は、ビヒクルを投与されたラットにおいて、皮膚の病変は観察されず、一方、ＰＧ１１０を投与されたラット群において、検査された全抗体投与量の全ての動物において、皮膚の病変が観察されたことを示す。さらに、皮膚の病変の数および重篤度は経時的に増加し、抗体の投与量の増加とともに増加した。引っ掻き発作の数も、抗体治療された動物において増加したが、抗体治療は、毛づくろい行動、体温、足なめまでの潜伏時間、または跳ぶまでの潜伏時間（脱走の試み）に対していずれの効果もなかった。
【０２２３】
皮膚の病変の重篤度は、病変スコアを使用して定量化され、これは、病変の数×病変の面積（ｍｍ２）に等しい。ビヒクルと比較したＰＧ１１０治療の経時的な病変スコアを図４のグラフに示す。結果は、ＰＧ１１０治療されたラットが、経時的な病変スコアにおいて、特に、検査されたより高い用量（０．３ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ）で着実な増加を示したことを示す。つまり、抗体は、実験の経過にわたって有意なリバウンド効果を示さず、リバウンド効果が回避されるように、ヒトに使用するための投与量および投与頻度パラメータを選択することが可能であり得ることを示唆する。
【０２２４】
よって、要約すると、ラットの皮膚の病変モデルは、ＰＧ１１０抗体が目立ったリバウンド効果を示さなかったという点で、抗ＮＧＦ抗体であるＰＧ１１０の利点を説明し、これは、他の抗ＮＧＦ抗体についても報告されており、ＰＧ１１０が生体内においてより一貫した、長期活性を示すことを示唆する。機序によって制限されることを意図するものではないが、生体内においてＰＧ１１０のリバウンド効果を回避する本能力は、本抗体で観察された延長された終末消失半減期に関係する。
【０２２５】
実施例７：ＰＧ１１０のヒト薬物動態
ＰＧ１１０は、ヒトにおいて、約１０〜３０日（１０〜４０日の範囲）の半減期を有することが予想され、多相傾向を有する。約０．２５μｇ／ｍＬ（約０．１３μｇ／ｍＬ〜０．４０μｇ／ｍＬの範囲）の標的Ｃｍｉｎ値に基づき、４〜１２週間ごとに１０ｍｇ（約０．１５ｍｇ／ｋｇ；約０．１ｍｇ／ｋｇ［５ｍｇ］〜約０．２ｍｇ／ｋｇ［１５ｍｇ］の範囲）のヒトＩＶ用量、および４〜１２週間ごとに２０ｍｇ（約０．３ｍｇ／ｋｇ；約０．２ｍｇ／ｋｇ［１５ｍｇ］〜約０．４ｍｇ／ｋｇ［３０ｍｇ］の範囲）のＳＣ用量が有効であると予想される。
【０２２６】
ヒトの薬物動態の予想は、２つの種（ラットおよびサル）からの濃度データに基づいた。ヒトの薬物動態は、サルおよびラットの薬物動態パラメータの測定、固定相対成長率、ならびに他のモノクローナル抗体からの前臨床データおよび臨床データに基づく方法を含む、複数の方法を使用して予測された。予測は、一相および二相傾向の両方について実施された。
【０２２７】
方法１：ヒトの薬物動態の予測は、２つの種（ラットおよびサル）における２区画モデルあてはめＰＧ１１０濃度−時間プロファイルに基づいた。ＰＧ１１０のヒトの薬物動態パラメータは、サルおよびラットの薬物動態パラメータの固定指数を用いた相対成長率を使用して予測された。
【０２２８】
クリアランスについて：
【化２】
2016026221.tif 000010
分布容量について：
【化３】
2016026221.tif 000011
【表８】
2016026221.tif 000012
【０２２９】
次いで、予測されたヒトのＣＬおよびＶ１に基づき、ＰＧ１１０のヒト半減期を計算する。予測されたＰＧ１１０のヒトの半減期は２６日であった。
【０２３０】
方法２：ヒトの薬物動態の予測は、２つの種（ラットおよびサル）からの観察されたデータに基づいた。ヒトのＣＬおよびＶは、方法１と同じ方法を使用して予測された。ＰＧ１１０のヒトの半減期は、０．２５の固定指数を用いた修正された相対成長率を使用して予測された：
【化４】
2016026221.tif 000013
【表９】
2016026221.tif 000014
【０２３１】
方法２を使用した、予測されたＰＧ１１０のヒトの半減期は３６日であった。
【０２３２】
方法３：ヒトの薬物動態の予測は、ラットおよびサルのＰＧ１１０データ、ならびに他のモノクローナル抗体からの前臨床および臨床の薬物動態パラメータに基づいた。測定は、ラットおよびサルの観察されたＰＧ１１０の半減期、ならびに他のモノクローナル抗体の半減期のラット／ヒトおよびサル／ヒトの割合に基づいた。ラットおよびサルにおける他のモノクローナル抗体の推定薬物動態パラメータ（クリアランス、分布容量、および半減期）は、最初に臨床試験のものと比較された。ラット、サル、およびヒトの間での相違は、ラット／ヒトおよびサル／ヒトの割合として推定された。次いで、ＰＧ１１０のヒトの薬物動態パラメータは、他のモノクローナル抗体のラット／ヒトまたはサル／ヒトの割合を補正した、ラットまたはサルのその薬物動態パラメータに基づき推定された。方法３を使用した、予測されたＰＧ１１０のヒトの半減期は１１〜２９日であった。
【表１０】
2016026221.tif 000015
【０２３３】
方法４：ヒトの薬物動態の予測は、２つの種（ラットおよびサル）における２区画モデルあてはめＰＧ１１０濃度−時間プロファイルに基づいた。ＰＧ１１０のヒトの薬物動態パラメータは、サルおよびラットの薬物動態パラメータの回帰を用いた相対成長率を使用して予測された。
【０２３４】
クリアランスおよび分布容量の両方について：
【化５】
2016026221.tif 000016
線形回帰は、スロープ（ａ）および切片（ｂ）を推定するために、ラットおよびサルの薬物動態パラメータならびに体重（ＢＷ）に基づき行われた。次いで、ＰＧ１１０のヒトの薬物動態パラメータは、典型的なヒトＢＷならびに推定されたスロープおよび切片を使用して推定された。
【表１１】
2016026221.tif 000017
次いで、予測されたヒトの薬物動態パラメータに基づき、ＰＧ１１０のヒト半減期を計算する。予測されたＰＧ１１０のヒトの半減期は１２日であった。
【０２３５】
これらの方法に基づき、ＰＧ１１０は、ヒトにおいて、約１５〜３０日（１０〜４０日の範囲）の半減期を有することが予測され、二相傾向（予測された薬物動態パラメータ：Ｖ１＝２．５Ｌ、ＣＬ＝５．０ｍＬ／時間、Ｖ２＝２．５Ｌ、ＣＬＤ＝４０ｍＬ／時間）を有する。
【０２３６】
実施例８：ＰＧ１１０を用いたヒトの変形性関節炎の治療
ヒトの臨床試験を、ひざの変形性関節炎に起因する痛みを伴う患者において、ＰＧ１１０の安全性、寛容性、および薬物動態を検査するために開始した。試験の設計および一次結果を以下に記載する。
【０２３７】
この第Ｉ相、プラセボ対照、二重盲検、単回漸増用量試験において、６つの用量レベルを評価した：０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、および１ｍｇ／ｋｇ。用量レベルごとに、ひざの変形性関節炎に起因する痛みを伴う７人に患者集団（総数４２人の患者）を、活性またはプラセボ治療に６：１の割合に無作為に割り付けた。軽い朝食の後、０日目の朝に、各患者に単回用量のＰＧ１１０またはプラセボを２時間間隔で静脈内に投与した。患者は、点滴開始から約２４時間後（１日目）まで臨床薬理室（ＣＰＵ）に留まり、試験から４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、５６日目、および８４日目に診察のために戻ってきてもらった。
【０２３８】
ＰＧ１１０アッセイ用の血液サンプルを０日目（投与前、１、２、３、６、および１２時間）ならびに投与後１日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、５６日目、および８４日目に採取した。ＰＧ１１０の血清濃度は、有効なＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定された。抗ＰＧ１１０アッセイも、０日目（投与前）１４日目、２８日目、５６日目、および８４日目サンプルで実施された。
【０２３９】
患者の痛みの評価、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  ａｎｄ  ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ（ＷＯＭＡＣ（登録商標））の変形性関節炎指数調査書、ＭｃＧｉｌｌ疼痛調査書、６分歩行テスト、ひざの超音波、およびｈｓ−ＣＲＰを含む、薬力学的評価を試験において行った。
【０２４０】
患者の痛み評価の一次結果を表１２に要約する。患者の痛み評価は、痛みの程度の評価として使用した。患者は、０ｍｍは痛みなしと等しく、１００ｍｍは最悪の痛みと等しい、０〜１００ｍｍの視覚的アナログスケールで、かれらの回答をスコアするように依頼された。
【表１２】
2016026221.tif 000018
【０２４１】
一次薬力学データに基づき、０〜０．３ｍｇ／ｋｇのＰＧ１１０用量範囲で、見かけ用量応答が観察された。
【０２４２】
薬理学的半減期は、薬物作用を維持するための平均時間量に基づき推定された（薬物作用についてはＭＲＴ）。それは、経時的蓄積ベースライン補正薬物作用（作用時間曲線下面積、ＡＵＥＣ）に対する第１モーメントベースライン補正作用時間曲線の面積の割合として計算される。
【化６】
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推定された薬理学的半減期を表１３に要約する。
【表１３】
2016026221.tif 000020
【０２４３】
薬理学的半減期の推定は、ＰＧ１１０投与後最大８４日目までに収集されたデータに基づいた。ＰＧ１１０の効果は、特に０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇ用量で、８４日目でもなお維持されていたため、ＰＧ１１０の推定される平均薬理学的半減期は少なくとも５〜７週間であり、少なくとも４〜８週間の範囲である。
【０２４４】
一次薬力学的データは、予測された治療用量（０．１０〜０．３ｍｇ／ｋｇまたは７〜２１ｍｇ）と一致する。一次薬力学的半減期は、４〜１２週ごとの投与が効果的であり得ることを示唆する。
【０２４５】
等価物
当業者は、単に日常的な実験を用いて、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲により包含されることが意図される。従属する請求項に開示される実施形態の任意の組み合わせは、本発明の範囲内であることが企図される。
【０２４６】
参照による組み込み
本明細書に引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
配列リストの要約
配列番号：１（ＰＧ１１０ＶＨ）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＮＮＮＶＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＶＷＡＧＧＡＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＳＳＴＬＹＡＭＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０２４８】
配列番号：２（ＰＧ１１０ＶＬ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＤＩＹＮＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＴＤＴＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＹＦＨＹＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ
【０２４９】
配列番号：３（ＰＧ１１０  ＶＨＣＤＲ  １）
ＧＦＳＬＴＮＮＮＶＮ
【０２５０】
配列番号：４（ＰＧ１１０  ＶＨＣＤＲ  ２）
ＧＶＷＡＧＧＡＴＤＹＮＳＡＬＫＳ
【０２５１】
配列番号：５（ＰＧ１１０  ＶＨＣＤＲ３）
ＤＧＧＹＳＳＳＴＬＹＡＭＤＡ
【０２５２】
配列番号：６（ＰＧ１１０  ＶＬＣＤＲ１）
ＲＡＳＥＤＩＹＮＡＬＡ
【０２５３】
配列番号：７（ＰＧ１１０ＶＬＣＤＲ２）
ＮＴＤＴＬＨＴ
【０２５４】
配列番号：８（ＰＧ１１０ＶＬＣＤＲ３）
ＱＨＹＦＨＹＰＲＴ
【０２５５】
配列番号：９（野生型ヒトＩｇＧ４定常領域）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０２５６】
配列番号：１０（セリンからプロリンへの変異ヒトＩｇＧ４定常領域）
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０２５７】
配列番号：１１（ＰＧ１１０完全重鎖ヌクレオチド配列、シグナル配列を含む）
ＡＴＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＴＧＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＴＧＧＧＣＣＧＧＧＧＧＡＧＣＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＧＧＧＴＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＴＣＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＴＧＡ
【０２５８】
配列番号：１２（ＰＧ１１０完全重鎖アミノ酸、シグナル配列を含む）
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＮＮＮＶＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＶＷＡＧＧＡＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＳＳＴＬＹＡＭＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０２５９】
配列番号：１３（ＰＧ１１０成熟重鎖アミノ酸配列、シグナル配列を除く）
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＬＴＮＮＮＶＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＶＷＡＧＧＡＴＤＹＮＳＡＬＫＳＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＧＧＹＳＳＳＴＬＹＡＭＤＡＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
【０２６０】
配列番号：１４（ＰＧ１１０完全軽鎖ヌクレオチド配列、シグナル配列を含む）
ＡＴＧＡＧＣＧＴＧＣＣＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＴＡＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＡＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＴＡＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＡＡＧＣＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣＣＣＧＴＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＧＡ
【０２６１】
配列番号：１５（ＰＧ１１０完全軽鎖アミノ酸配列、シグナル配列を含む）
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＤＩＹＮＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＴＤＴＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＹＦＨＹＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０２６２】
配列番号：１６（ＰＧ１１０成熟軽鎖アミノ酸配列、シグナル配列を除く）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＤＩＹＮＡＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＮＴＤＴＬＨＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＱＨＹＦＨＹＰＲＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【図１】
2016026221.tif 000021
【図２Ａ】
2016026221.tif 000022
【図２Ｂ】
2016026221.tif 000023
【図３Ａ】
2016026221.tif 000024
【図３Ｂ】
2016026221.tif 000025
【図３Ｃ】
2016026221.tif 000026
【図４】
2016026221.tif 000027
【配列表】
2016026221000001.app
【外国語明細書】
2016026221000001.pdf