(57)【要約】【課題】神経変性障害の予防又は治療剤を提供する。【解決手段】グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１に対する阻害剤を有効成分とする、神経変性障害の予防又は改善剤を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１に対する阻害剤を有効成分とする、神経変性障害の予防又は改善剤。
【請求項２】
以下の式（１）で表される化合物若しくはその誘導体又はその塩を有効成分として含有する、神経変性障害の予防又は改善剤。
【化３】
2016044127.tif 000004
【請求項３】
前記神経変性障害は、虚血性脳疾患である、請求項１又は２に記載の予防又は改善剤。
【請求項４】
前記虚血性脳疾患は、脳梗塞である、請求項３に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
脳梗塞の超急性期における神経変性障害を予防又は治療するための、請求項４に記載の予防又は治療剤。
【請求項６】
神経変性障害の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質のグルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１の阻害能を評価する工程、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、神経変性障害の予防又は治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血性脳疾患は概して後遺症を残しやすい。例えば、典型的な虚血性脳疾患である脳梗塞は、迅速な対応及び適切な処置が求められる。
【０００３】
脳梗塞の治療方法としては、発症から数時間以内の超急性期においては、血栓溶解剤、ニューロン保護剤などが用いられる。また、それ以降の急性期においては、抗脳浮腫療法や抗血栓剤が用いられる。
【０００４】
脳虚血等において、過度の興奮性アミノ酸であるグルタミン酸(Ｇｌｕ)による神経細胞の異常興奮がその発症や憎悪に重要な働きをしているとされており、多くの神経変性疾患の発症メカニズムにＧｌｕシグナリングの異常が深く関わっているとされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Simon RP et al., 1984、Science 226:850-852
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ｔ−ＰＡなどに代表される血栓溶解剤は、その投与タイミングが限られており、予後の改善は、ｔ−ＰＡ被投与者の３０％程度である。また、ニューロン保護剤としては、フリーラジカルを消去するエダラボンがあるが、全ての国でその使用が可能というわけではない。
【０００７】
本発明者らは、グルタミントランスポーターに着目した。グルタミントランスポーターは、グルタミン酸トランスポーターとともに、中枢神経系におけるグルタミン／グルタミン酸サイクルに関与している。神経伝達物質として神経細胞から有利されたグルタミン酸は、その一部がグルタミン酸トランスポーターによりグリア細胞に取り込まれ、グリア細胞内のグルタミン合成酵素により非興奮性アミノ酸であるグルタミンに変換され、その後、グリア細胞から放出される。このグルタミンは、グルタミントランスポーターによって神経細胞に再び取り込まれてグルタミナーゼによりグルタミン酸に変換されて細胞内にプールされることになる。
【０００８】
こうしたグルタミン／グルタミン酸サイクルにおいて、グルタミントランスポーターの機能を阻害することができれば、結果として、神経細胞が放出するグルタミン酸を低減して、その興奮毒性による神経細胞死ひいては神経障害を回避できると考えられた。
【０００９】
本明細書は、グルタミントランスポーター阻害剤を利用した神経変性障害の予防又は治療剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、グルタミントランスポーター阻害剤によって、虚血性脳疾患における神経細胞死を抑制できるという知見を得た。本明細書によれば、こうした知見に基づき以下の手段が提供される。
【００１１】
（１）グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１に対する阻害剤を有効成分とする、神経変性障害の予防又は改善剤。
（２）以下の式（１）で表される化合物若しくはその誘導体又はその塩を有効成分として含有する、神経変性障害の予防又は治療剤。
【化１】
2016044127.tif 000002
（３）前記神経変性障害は、虚血性脳疾患である、（１）又は（２）に記載の予防又は改善剤。
（４）前記虚血性脳疾患は、脳梗塞である、（３）に記載の予防又は治療剤。
（５）脳梗塞の超急性期における神経変性障害を予防又は治療するための、（４）に記載の予防又は治療剤。
（６）神経変性障害の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、
被験物質のグルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１の阻害能を評価する工程、
を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】マウス脳内でのＳｌｃ３８ファミリーの発現状況を示す図である。
【図２】Ｓｌｃ３８ａ１及びＳｌｃ３８ａ２の発現分布を示す図である。
【図３】脳梗塞モデルマウスを用いた実験プロトコールを示す図である。
【図４】ＭｅＡＩＢの投与の神経細胞死に対する効果（ＴＴＣ染色）を示す図である。
【図５】ＢＣＨの投与の神経細胞死に対する効果（ＴＴＣ染色）を示す図である。
【図６】ＭｅＡＩＢの投与の神経細胞死に対する効果（ＨＥ染色）を示す図である。
【図７】ＭｅＡＩＢの投与の神経細胞死に対する効果（免疫染色）を示す図である。
【図８】ＭｅＡＩＢ投与によるマウスの同側皮質のP-p70S6K標識によるｍＴＯＲの活性に対する効果（P-p70S6K標識）を示す図である。
【図９】ＭｅＡＩＢ投与によるNeuroA細胞におけるP-p70S6K標識によるｍＴＯＲの活性に対する効果（P-p70S6K標識）を示す図である。
【図１０】ＭｅＡＩＢ投与によるマウス培養神経細胞におけるP-p70S6K標識によるｍＴＯＲの活性に対する効果（P-p70S6K標識）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書の開示は、メチルアミノイソブタン酸（ＭｅＡＩＢ）若しくはその誘導体又はその塩が、グルタミントランスポーター阻害剤（以下、単に本阻害剤ともいう。）として機能するとともに、虚血性脳疾患において神経細胞死を効果的に抑制するこという知見に基づくものである。また、本明細書の開示は、グルタミントランスポーターのなかでもＳｌｃ３８ａ１に対する阻害剤が、神経変性障害の予防又は治療に有効であるという知見に基づくものである。
【００１４】
本阻害剤によれば、脳梗塞等における超急性期において、神経細胞に投与されることで、神経細胞の変性、神経細胞死を抑制できる。推論であって本開示を拘束するものではないが、グルタミントランスポーターの機能を阻害することにより、グルタミンの神経細胞への取り込みが阻害され、その結果、神経細胞による興奮性アミノ酸であるグルタミン酸の過剰な放出が抑制されることによるものと考えられる。
【００１５】
本阻害剤は、また、グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１をターゲットとすることができる。このグルタミントランスポーターは、Ｓｌｃ３８ａ１〜Ｓｌｃ３８ａ１１からなるファミリーを構成している。グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１は、グルタミンのほか、アラニン、システィン、ヒスチジン及びセリンを対象とする中性アミノ酸トランスポーターとして知られている。本発明者らによれば、図１に示すように、このグルタミントランスポーターは、例えば、マウスの脳などにおいて、高い確率で発現されている。また、図２に示すように、特の脳の大部分、例えば、視床下部、嗅球、小脳及び中脳等において、グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ２よりも極めて優位に発現していることがわかっている。したがって、このグルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１に対する阻害剤は、中枢神経系における神経細胞死の抑制や、虚血性脳疾患に対する予防又は治療に有効であると考えられる。
【００１６】
なお、本明細書において、神経変性障害とは、外傷、脳血管の障害、脳出血、ウイルス感染、および腫瘍など、様々な原因により脳内の様々な部位で神経細胞が病的に死滅してしまうために生じる疾患が包含される。急性であっても慢性であってもよい。また、神経変性障害には、中枢神経の中の特定の神経細胞群が徐々に死んでいく疾患が包含される。典型的には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、ハンチントン病、正常眼圧緑内障、および、脊髄小脳変性症が挙げられるがこれらに限定されない。また、グルタミン酸毒性に関連する神経変性障害（例えば、脳神経障害のような中枢神経障害）も含まれる。グルタミン酸毒性に関連する神経変性障害としては脊髄損傷、脳卒中、脳梗塞、外傷性脳損傷、外傷性脳障害、難聴、および、てんかんが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１７】
神経変性障害としての虚血性脳疾患とは、一過性脳虚血、脳梗塞等が挙げられる。また、脳梗塞の超急性期とは、脳梗塞発症から６時間以内をいい、好ましくは５時間以内、より好ましくは４時間半以内をいう、さらに好ましくは３時間以内をいう。
【００１８】
以下、本明細書の開示に関し、詳細に説明する。
【００１９】
（神経変性障害の予防又は改善剤）
本予防又は治療剤は、上記阻害剤を含む、グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１に対する阻害剤を有効成分とすることができる。
【００２０】
（グルタミントランスポーター阻害剤）
本阻害剤としては、下記式（１）で表される化合物若しくはその誘導体又はその塩を有効成分として用いることができる。この阻害剤は、グルタミントランスポーター、特に、グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１をターゲットとすることができる。
【００２１】
【化２】
2016044127.tif 000003
【００２２】
式（１）で表される化合物は、メチルアミノイソブタン酸（ＭｅＡＩＢ）である。この化合物は、グルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１（溶質キャリアファミリー３８、メンバー１（Solute Carrier Family３８、member１）に属するタンパク質であって、グルタミンを含む中性アミノ酸トランスポーターとして知られている）を阻害する化合物として知られている（Varoqui H, Zhu H,Yao D, Ming H, Erickson JD 2000 Cloning and Functional Identification of a neuronal glutamine transporter, J Biol Chem 275(6):4049-54、Wang, H., Huang, W., Sugawara, M., Devoe, L. D., Leibach, F. H., Prasad, P. D., and Ganapathy, V. (2000) Cloning and functional expression of ATA1, a subtype of amino acid transporter A, from human placenta. Biochem. Biophys. Res. Commun. 273, 1175-11796）。
【００２３】
この化合物は、当業者であれば適宜合成できるほか、東京化成工業株式会社(TCI)（コード M1388・製品名2-Methylamino)isobutyric Acid Hydrate）及び関東化学株式会社(Cica)（製品番号22922-1A 、2‐(Methylamino)isobutyric acid）から入手可能である。
【００２４】
式（１）で表される化合物の誘導体としては、特に限定しないが、例えば、３つのメチル基の１又は２以上を、Ｃ２〜Ｃ４のアルキル基等に置換した化合物が挙げられる。
【００２５】
式（１）で表される化合物若しくはその誘導体の塩としては、薬理学に許容される塩であれば、特に限定されない。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩などが挙げられる。
【００２６】
無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミニウム塩、アンモニウム塩などが挙げられる。
【００２７】
有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N-ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。
【００２８】
本阻害剤は、Ｓｌｃ３８ａ１トランスポーターの活性を抑制するものであればよい。すなわち、Ｓｌｃ３８ａ１の発現を抑制するものであってもよいし、また、タンパク質としてのＳｌｃ３８ａ１の活性を抑制するものであってもよい。
【００２９】
Ｓｌｃ３８ａ１は、既に述べたように、溶質キャリアファミリー３８、メンバー１（Solute Carrier Family３８、member１）に属するタンパク質であって、グルタミンを含む中性アミノ酸トランスポーターとして知られている（Varoqui H,及びWang, H）。
ここで、例えば、ヒトＳｌｃ３８ａ１は、１１個の膜貫通構造を有している（J.Biol. Chem. 275(6);4049-54）. ヒトＳｌｃ３８ａ１をコードするＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２（アクセッション番号：NM_001077484(mRNA)、NP_001070952(Protein)）として知られている。また、マウスＳｌｃ３８ａ１をコードするＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４（アクセッション番号： NM_001166456(mRNA)、NP_001159928(Protein)）として知られている。これらの各種動物のＳｌｃ３８ａ１の配列情報は、当業者であれば、例えば適宜データベースから取得することができる。
【００３０】
本阻害剤としては、Ｓｌｃ３８ａ１をコードする遺伝子の発現を抑制できるＲＮＡ干渉剤、アンチセンス核酸又はこれらを発現し得る発現ベクターが挙げられる。
【００３１】
Ｓｌｃ３８ａ１に対するＲＮＡ干渉剤としては、例えば、以下の形態が挙げられる。
（１）Ｓｌｃ３８ａ１をコードするmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は18塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む1本鎖又は2本鎖のRNA
（２）Ｓｌｃ３８ａ１と投与対象の哺乳動物（例えばヒト等の霊長類やマウス等のげっ歯類）の細胞内でハイブリダイズし得る18塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズすることによりＳｌｃ３８ａ１のRNA干渉を誘導する1本鎖又は2本鎖のRNA
【００３２】
ＲＮＡ干渉剤は、代表的には、標的遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列又はその部分配列（以下、標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するRNAとその相補鎖からなる2本鎖オリゴRNAである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第1の配列）と、その相補配列（第2の配列）とが連結された一本鎖RNAであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第1の配列が第2の配列と2本鎖構造を形成するRNA（small hairpin RNA: shRNA）であってもよい。
【００３３】
RNA干渉剤に含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約18塩基以上、好ましくは約19塩基以上、より好ましくは約21塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。ＲＮＡ干渉剤が23塩基よりも長い場合には、該ＲＮＡ干渉剤は細胞内で分解されて、約20塩基前後のsiRNAを生じ得るので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、標的遺伝子のmRNA（成熟mRNAもしくは初期転写産物）のヌクレオチド配列の全長である。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約50塩基以下、好ましくは約25塩基以下、最も好ましくは約23塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、通常、約18〜50塩基、好ましくは約19〜約25塩基、より好ましくは約21〜約23塩基である。
【００３４】
また、RNA干渉剤を構成する各RNA鎖の長さも、通常、約18塩基以上、好ましくは約19塩基以上、より好ましくは約21塩基以上の長さであるが、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されず、理論的には各RNA鎖の長さの上限はない。しかし、インターフェロン誘導の回避、合成の容易さ、抗原性の問題等を考慮すると、ＲＮＡ干渉剤を構成する各RNA鎖の長さは、例えば約50塩基以下、好ましくは約25塩基以下、最も好ましくは約23塩基以下である。即ち、各RNA鎖の長さは、例えば通常、約18〜50塩基、好ましくは約19〜約25塩基、より好ましくは約21〜約23塩基である。なお、shRNAの長さは、2本鎖構造をとった場合の2本鎖部分の長さとして示すものとする。
【００３５】
尚、本明細書において、全長が23塩基以下の2本鎖のRNA干渉剤をsiRNAということもある。
【００３６】
標的ヌクレオチド配列と、RNA干渉剤に含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、当該相補配列の中央から外れた位置についての塩基の変異（少なくとも90％以上、好ましくは95％以上の同一性の範囲内であり得る）については、完全にRNA干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、相補配列の中央部の塩基の変異は影響が大きく、RNA干渉によるmRNAの切断活性が極度に低下し得る。
【００３７】
ＲＮＡ干渉剤は、5’及び／又は3’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、ＲＮＡ干渉剤が標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り特に限定されないが、通常5塩基以下、例えば2〜4塩基である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとsiRNAの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
shRNAのヘアピンループのループ部分の長さは、標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されないが、通常、5〜25塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、shRNAが標的遺伝子の発現を特異的に抑制可能である限り、特に限定されない。
【００３９】
また、Ｓｌｃ３８ａ１に対するアンチセンス核酸も本阻害剤の有効成分として用いることができる。ここで、「アンチセンス核酸」とは、標的mRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）を発現する細胞内の生理的条件下で該標的mRNAとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で該標的mRNAにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA／RNAキメラであってもよいが、好ましくはDNAである。
【００４０】
Ｓｌｃ３８ａ１の発現を特異的に抑制し得るアンチセンス核酸としては、例えば以下の形態が挙げられる。
（１）Ｓｌｃ３８ａ１をコードするmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は12塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸
（２）Ｓｌｃ３８ａ１をコードするmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）と治療対象動物（好ましくはヒト）の細胞内でハイブリダイズし得る12塩基以上のヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で当該Ｓｌｃ３８ａ１ポリペプチドへの翻訳を阻害し得る核酸
【００４１】
アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、Ｓｌｃ３８ａ１の発現を特異的に抑制する限り特に制限はなく、通常、約12塩基以上であり、長いものでmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）の全長配列と同一の長さである。ハイブリダイゼーションの特異性を考慮すると、該長さは好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上である。また、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、通常、約200塩基以下、好ましくは約50塩基以下、より好ましくは約30塩基以下である。即ち、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約12〜約200塩基、好ましくは約15〜約50塩基、より好ましくは約18〜約30塩基である。
【００４２】
アンチセンス核酸の標的ヌクレオチド配列は、Ｓｌｃ３８ａ１の発現を特異的に抑制可能であれば特に制限はなく、Ｓｌｃ３８ａ１のmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）の全長配列であっても部分配列（例えば約12塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上）であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、好ましくは、標的配列はＳｌｃ３８ａ１のmRNAの5’末端からコード領域のC末端までに位置することが望ましい。
【００４３】
アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下でＳｌｃ３８ａ１のmRNAとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約90％以上（好ましくは95％以上、最も好ましくは100％）の同一性を有するものである。
【００４４】
アンチセンス核酸の大きさは、通常約12塩基以上、好ましくは約15塩基以上、より好ましくは約18塩基以上である。該大きさは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常約200塩基以下、好ましくは約50塩基以下、より好ましくは約30塩基以下である。
【００４５】
天然型の核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明において使用されるＲＮＡ干渉剤やアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のP=OをP=Sに置換）や2’-O-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。ＲＮＡ干渉剤やアンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。
【００４６】
Ｓｌｃ３８ａ１に対するＲＮＡ干渉剤及びアンチセンス核酸は、標的とするＳｌｃ３８ａ１のmRNA配列や染色体DNA配列に基づいて標的配列を決定し、市販の核酸自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を有する核酸を合成することにより調製できる。２本鎖のＲＮＡ干渉剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を核酸自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い2本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。
【００４７】
Ｓｌｃ３８ａ１に対するＲＮＡ干渉剤又はアンチセンス核酸を発現し得る発現ベクターにおいては、投与対象である哺乳動物（例えばヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類）の細胞（好ましくは、標的とするＳｌｃ３８ａ１を発現している細胞（例えば、骨芽細胞又は破骨細胞））内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターの下流に、上述のＲＮＡ干渉剤又はアンチセンス核酸或いはそれらをコードする核酸（好ましくはDNA）が機能的に連結されている。
【００４８】
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物（例えばヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類）の細胞（好ましくは、標的とするＳｌｃ３８ａ１を発現している細胞（例えば、骨芽細胞又は破骨細胞））内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、polI系プロモーター、polII系プロモーター、polIII系プロモーター等を使用することができる。具体的には、SV40由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスLTR等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにtRNAプロモーター等のRNAプロモーター等が用いられる。
【００４９】
ＲＮＡ干渉剤の発現を意図する場合には、プロモーターとしてpolIII系プロモーターを使用することが好ましい。polIII系プロモーターとしては、例えば、U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーター等を挙げることができる。
【００５０】
上記発現ベクターは、好ましくはＲＮＡ干渉剤又はアンチセンス核酸或いはそれらをコー  ドする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、上記発現ベクターは、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。上記発現ベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、SV40複製オリジンなどを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。
【００５１】
発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、プラスミドベクター；レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【００５２】
Ｓｌｃ３８ａ１へ特異的に結合し、且つ該Ｓｌｃ３８ａ１のアミノ酸輸送機能を阻害する抗体（中和抗体）も、本阻害剤として使用できる。
【００５３】
本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。抗体の結合性断片とは、抗原に対する特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。
【００５４】
Ｓｌｃ３８ａ１を特異的に認識する抗体は、Ｓｌｃ３８ａ１ポリペプチドやその抗原性を有する部分ペプチド、或いはＳｌｃ３８ａ１のトランスフェクタントを免疫原として用い、既存の一般的な抗体製造方法に準じて製造することができる。
【００５５】
例えば、モノクローナル抗体は、ケーラーおよびミルシュタインらの方法［Nature, vol.256, p.495 (1975)］や、組換えDNA法（Cabillyら、米国特許第4816567号）を用いて作製することができる。
【００５６】
例えば、上述の免疫原を市販のアジュバントと共にマウスに2〜4回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の約3日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1、P3X63Ag8など）を細胞融合して所望のＳｌｃ３８ａ１に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はPEG（ポリエチレングリコール）法［J. Immunol. Methods, 81(2): 223-228 (1985)］でも電圧パルス法［Hybridoma, 7(6): 627-633 (1988)］であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のEIAまたはRIA法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、又はマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清及び動物の腹水から取得することができる。
【００５７】
キメラ抗体は、前記のようにして得たモノクローナル抗体のＶ領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。
【００５８】
ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（EP125023、WO96/02576参照）。
【００５９】
具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region; FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDR及びFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する（WO98/13388に記載の方法を参照）。
【００６０】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato,K.et al., Cancer Res.(1993)53, 851-856）。
【００６１】
キメラ抗体及びヒト化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。
【００６２】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびC領域とからなる。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明に使用する抗体として有用である。
【００６３】
ヒト抗体は、免疫する非ヒト動物としてヒト抗体産生マウス（特許第3030092号、US6632976、US2004073957、US2009253902等）を用いることにより、上述のモノクローナル抗体の製造方法と同様にして製造することが出来る。
【００６４】
Ｓｌｃ３８ａ１ポリペプチドの部分ペプチドを抗原として用いる場合には、好ましくは、Ｓｌｃ３８ａ１の細胞外ドメイン内の部分ペプチドが用いられる。各Ｓｌｃ３８ａ１の細胞外ドメインは、そのアミノ酸配列をTMPred（EMBnet提供）等の公知のタンパク質のトポロジー解析ソフトや膜貫通ドメイン解析ソフトに付すことにより決定することが出来る。
【００６５】
更に、得られたＳｌｃ３８ａ１を特異的に認識する抗体の中から、該Ｓｌｃ３８ａ１のアミノ酸輸送機能を阻害する活性を有するものを選択することにより、目的とする中和抗体を得ることが出来る。Ｓｌｃ３８ａ１のアミノ酸輸送機能を阻害する活性の評価は、後述の本発明のスクリーニング方法において使用することのできるＳｌｃ３８ａ１の活性の評価方法に記載された方法等により行うことが出来る。
【００６６】
ヒトへの適用を意図する場合には、ヒトＳｌｃ３８ａ１に特異的に結合し、且つ該ヒトＳｌｃ３８ａ１のアミノ酸輸送機能を阻害する抗体が用いられる。
【００６７】
本開示に用いられるＳｌｃ３８ａ１阻害剤は、結晶であっても非結晶であってもよく、水和物および／または溶媒和物の形で存在することもあるので、これらの水和物および／または溶媒和物も本発明に包含される。化学量論量の水和物および凍結乾燥のような方法によって得られる種々の量の水を含む化合物も本発明の範囲内にある。
【００６８】
本開示の剤は、有効成分である化合物又はＳｌｃ３８ａ１阻害剤を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。本開示の剤は、Ｓｌｃ３８ａ１阻害剤以外の任意の他の治療のための有効成分を更に含んでいてもよい。
【００６９】
薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、その具体例としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加剤を用いてもよい。
【００７０】
また、投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、通常は、経皮、静脈内等の非経口又は経口で投与される。非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液又は塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。これら非経口剤には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、pH調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することもできる。また、非経口に適当な製剤は、本阻害剤を、注射用蒸留水又は植物油に懸濁して調製したものであってもよく、この場合、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。また、非経口に適当な製剤は、本阻害剤の粉末又は凍結乾燥品を用時溶解する形であってもよく、必要に応じて賦形剤等を添加することができる。経口製剤としては、錠剤（舌下錠、口腔内崩壊剤を含む）、カプセル剤（ソフトカプセル、マイクロカプセルを含む）、散剤、顆粒剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。これらの製剤は、速放性製剤又は除放性製剤などの放出制御製剤（例、除放性マイクロカプセル）であってもよい。
【００７１】
本開示の剤における、本阻害剤の含有量は、通常0.01〜100重量％の範囲内であるが、製剤の形態等により変動し得る。注射剤の場合には、本阻害剤の含有量は例えば、0.01〜10重量％の範囲内である。
【００７２】
また、本開示の剤は、食品（一般食品類、病者用食品、栄養機能食品、特定保健用食品等）の形態として製剤化することもできる。食品の形態は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、クッキー、ゼリー、飲料、あるいは一般食品の形態が可能である。食品中のＳｌｃ３８ａ１阻害剤の含有量は、通常0.01〜100重量％、好ましくは0.1〜30重量％程度とするが、食品が飲料である場合は、溶解性等の観点から通常0.01〜5重量％程度が含まれる。
【００７３】
また、食品には、一般の食品素材をベースとするほか、例えば、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、ミネラル、合成風味剤、天然風味剤、着色剤、充填剤（チーズ、チョコレート等）、ペクチン酸又はその塩、アルギン酸又はその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール等が含まれていても良い。
【００７４】
本開示の剤は、既述の神経変性障害に有用である。特に、グルタミン酸毒性に関連する神経変性障害に有用であり、なかでも、一過性脳虚血、脳梗塞等の虚血性脳疾患が挙げられる。さらに、こうした虚血性脳疾患の超急性期への処置法として好ましい。
【００７５】
本開示の剤の投与対象は、通常哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）である。ある特定の動物種の哺乳動物に対しては、その動物種のＳｌｃ３８ａ１を阻害する本発明の剤が投与される。
【００７６】
本開示の剤の投与量及び投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、適用疾患、骨粗鬆症の種類、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、脳梗塞患者の超急性期に静脈内投与により治療する場合、有効成分である本阻害剤として、体重１ｋｇ当たり１００〜４００ｍｇを一日１回ないし数回投与する。投与期間は、例えば、必要に応じて数日間投与することが好ましい。しかしながら、これら投与量、投与回数及び投与期間は前述の種々の条件により変動する。
【００７７】
（スクリーニング方法）
本明細書の開示によれば、神経変性疾患の予防又は治療剤のスクリーニング方法であって、被験物質のグルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１の阻害能を評価する工程、を備える、方法が提供される。このスクリーニング方法によれば、新規な神経変性疾患の予防又は治療剤を得ることができる。
【００７８】
本開示のスクリーニング方法は、具体的には、以下の工程を含むことができる。：
（１）被験物質を、Ｓｌｃ３８ａ１の活性を測定可能な細胞へ接触させる
（２）該細胞における当該Ｓｌｃ３８ａ１の活性を測定する
（３）被験物質を接触させた細胞における当該Ｓｌｃ３８ａ１の活性を、被験物質を接触させない対照細胞における当該Ｓｌｃ３８ａ１の活性と比較する
【００７９】
以上の工程を少なくとも含むことで、被験化合物のＳｌｃ３８ａ１阻害活性を検出することができ、当該化合物を有用な化合物として取得できる。
【００８０】
さらに、被験化合物につき、以下の工程を実施することで、本開示の剤として有用な化合物を得ることができる。
（４）比較の結果得られた当該Ｓｌｃ３８ａ１の活性の変化を、の神経細胞死を抑制する活性と関連付ける
【００８１】
本開示のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００８２】
「Ｓｌｃ３８ａ１の活性を測定可能な細胞」の由来は、通常動物である。動物には、哺乳動物のほか、鳥類（ニワトリ等）、爬虫類、両生類（カエル等）、魚類（ゼブラフィッシュ等）、昆虫（カイコ等）等が包含される。
【００８３】
本発明において、哺乳動物には、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等が包含されるが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）である。
【００８４】
本発明において用いられる「Ｓｌｃ３８ａ１の活性を測定可能な細胞」は、Ｓｌｃ３８ａ１を天然で発現する細胞であるか、あるいは遺伝子導入によりＳｌｃ３８ａ１を強制発現する細胞である。
【００８５】
Ｓｌｃ３８ａ１を天然で発現する細胞は、Ｓｌｃ３８ａ１を潜在的に発現するものである限り特に限定されず、当該細胞として、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株、腫瘍細胞、卵母細胞などを用いることができる。Ｓｌｃ３８ａ１は、中枢神経系（神経細胞等）等に発現しているので、これらの細胞から誘導された細胞株、及びこれらの細胞由来の腫瘍細胞を、Ｓｌｃ３８ａ１を天然で発現する細胞として使用することができる。好ましくは、神経細胞である。また、こうした細胞は、採取された器官又はその一部あるいは組織であってもよい。
【００８６】
Ｓｌｃ３８ａ１を強制発現する細胞は、適切なＳｌｃ３８ａ１の発現ベクターを、周知のトランスフェクション法で細胞内へ導入することにより、製造することができる。あるいは、Ｓｌｃ３８ａ１の発現ベクター又はmRNAをマイクロインジェクションにより注入することによっても、Ｓｌｃ３８ａ１を強制発現する細胞を製造することができる。遺伝子導入に用いる好適な細胞としては、HEK293、COS7等を挙げることが出来る。
【００８７】
被験物質のＳｌｃ３８ａ１の活性を測定可能な細胞への接触は、通常、インビトロにおいて行われる。例えば、Ｓｌｃ３８ａ１の活性を測定可能な細胞を、被験物質を含む適切な培地中で培養する。培地は、細胞の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、哺乳動物細胞を用いる場合には、約5〜20％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）等が例示される。他の培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約6〜約8であり、培養温度は通常約30〜約40℃であり、培養時間は約0.5〜約72時間である。当業者であれば、細胞の種類に応じて適切な培養条件を容易に設定することが可能である。
【００８８】
Ｓｌｃ３８ａ１の活性の検出にあたっては、グルタミンの取り込みに関するため、グルタミンの存在下で行われることが好ましい。Ｓｌｃ３８ａ１の活性は、アポトーシスを検出してもよい。Ｓｌｃ３８ａ１の活性が高い場合には、アポトーシスが促進される。また、Ｓｌｃ３８ａ１の活性は、例えば、放射線同位体（例えば3H、14C、13C、15S等）により標識された、Ｓｌｃ３８ａ１が輸送するグルタミンの細胞内への取り込みを、シンチレーションカウンター等により測定することにより評価することができる（J. Neurosci. Res. 2008, 86(8), 1846-1856.等参照）。
【００８９】
Ｓｌｃ３８ａ１の活性の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被験物質を接触させない対照細胞におけるＳｌｃ３８ａ１の活性は、被験物質を接触させた細胞におけるＳｌｃ３８ａ１の活性の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００９０】
尚、対照細胞についての試験条件（細胞の種類、培養条件等）は、被験物質を接触させない点を除き、被験物質を接触させる細胞と同一であることが好ましい。
【００９１】
そして、比較の結果得られたＳｌｃ３８ａ１の活性の変化を、神経変性疾患を予防及び／又は治療する活性、神経細胞死抑制活性等と相関付けることが好ましい。Ｓｌｃ３８ａ１活性の低下は、神経変性疾患を予防又は治療する活性、神経細胞死の抑制活性と正に相関するので、Ｓｌｃ３８ａ１の活性を低下させた被験物質を、神経変性疾患の予防及び／又は治療剤、神経細胞死抑制剤の候補物質として選択することが出来る。
【００９２】
このようにして選択された候補物質について、神経変性疾患において有用であるか否かについては、引き続き評価を行ってもよい。例えば、本実施例において開示するように、動物モデルを利用して、候補物質を投与して、その効果（神経細胞死の抑制等）を確認することもできる。
【００９３】
本明細書に引用するすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【実施例】
【００９４】
以下、本開示に関し、具体例を実施例として挙げて説明するが、本開示は、以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００９５】
本実施例のプロトコールの一例を図３に示す。本実施例では、脳梗塞モデルマウス（７〜９週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス）を、２時間の中大脳脈結紮術（ＭＣＡＯ）を負荷することにより作製した。この脳梗塞モデルマウスのＭＣＡＯ中還流前１時間の時点でＭｅＡＩＢを１００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。ＭＣＡＯ後灌流開始から一定時間経過後、染色法に応じて組織切片を作製し、ＴＴＣ染色（再灌流後後から２４時間経過後）、ＨＥ染色（同９６時間経過後）及び免疫染色（同９６時間経過後）して、脳梗塞領域等を評価した。
【００９６】
２−アミノビシクロ−（２，２，１）−ヘプタン−２−カルボン酸（ＢＣＨ）についても４００ｍｇ／ｋｇで同様に腹腔内投与し、同様に評価した。これらの結果を図４〜図７に示す。
【００９７】
図４には、ＭｅＡＩＢ投与群の２４時間経過後のＴＴＣ染色結果を示す。図４に示すように、対照群（ＰＢＳ投与群）では、梗塞側において広範囲の梗塞巣及び組織の脱落を観察した。これに対して、ＭｅＡＩＢ投与群では、梗塞側において広範囲の染色陰性の領域を認めた。梗塞側の脳半球に対する染色巣の割合を算出したところ、対照群では、ブレグマ前後２ｍｍの範囲において、特に、ブレグマ±０ｍｍの部分を中心として梗塞巣が広がっているが、ＭｅＡＩＢ投与群では、梗塞巣の広がりに応じてそれを抑制する傾向が観察された。また、ＭｅＡＩＢの用量依存的に梗塞巣が抑制されていた。
【００９８】
図５には、ＢＣＨ投与群の２４時間経過後のＴＴＣ染色結果を示す。図５に示すように、ＢＣＨを投与したマウスでも、梗塞巣の広がりを抑制する効果を観察できた。
【００９９】
図６には、ＭｅＡＩＢ投与群（４００ｍｇ／ｋｇ）の９６時間経過後のＨＥ染色結果を示す。図６に示すように、ＭｅＡＩＢ投与群では、対照群に比較して、虚血による核の濃染が抑制されるとともに、神経細胞の細胞間隙の増大が抑制され、神経細胞の脱落等が抑制されていることがわかった。また、梗塞巣体積の算出結果からも、ＭｅＡＩＢ投与群において同様の傾向が明らかであった。
【０１００】
図７には、ＭｅＡＩＢ投与群（４００ｍｇ／ｋｇ）の９６時間経過後の神経細胞マーカーに対する抗体を用いた免疫組織学的染色結果を示す。図７に示すように、神経細胞マーカーＮｅｕＮ及びＭＡＰ２によると、ＭｅＡＩＢ投与群では、明らかに、マーカー陰性領域が低減しており、神経細胞の脱落の抑制が観察された。また、染色陰性体積の算出結果からも、ＭｅＡＩＢ投与群においてその傾向が明らかであった。
【実施例２】
【０１０１】
本実施例では、実施例１と同様にして作製した脳梗塞モデルマウス（７〜９週齢のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス）に対してＭｅＡＩＢ（４００ｍｇ／ｋｇ）及びラパマイシン（０．５ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内投与して、再灌流１時間後に、脳を摘出し、灌流固定及びパラフィン包理で同側皮質の脳環状切片を作製し、抗P-p70S6K抗体を用いて蛍光免疫組織化学法（ＩＨＣ）にてｍＴＯＲ（mammalian  target of rapamycin）活性について評価した。なお、ｍＴＯＲは、セリン／スレオニンリン酸化酵素であり、細胞内外の栄養やエネルギー状態などの環境情報に関連し、細胞の生存に中心的役割を示すタンパク質として知られている。以下の実施例では、ｍＴＯＲの活性抑制が神経細胞死の保護に作用すると考えられることから（Bove, J., Martinez-Vicente, M., and Vila, M. (2011) Fighting neurodegeneration with rapamycin: mechanistic insights. Nat Rev Neurosci 12,437-452）、ｍＴＯＲの活性の抑制程度を、ＭｅＡＩＢのグルタミントランスポーターＳｌｃ３８ａ１阻害効果の評価手段とした。結果を、図８に示す。
【０１０２】
図８に示すように、ＭｅＡＩＢ投与群及びラパマイシン投与群では、対照群に比較しマーカー陽性細胞は大きく低減されており、ｍＴＯＲ活性が抑制されたことがわかった。
【実施例３】
【０１０３】
本実施例のプロトコール及び結果を図９に示す。本実施例では、マウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞を一定の条件で培養後、飢餓培地で培養し、その後に、各種のＤＭＥＭ培地（グルタミン添加あり（Gln584 mg/L）／なし、ＭｅＡＩＢ及びＢＣＨの添加の有無等）で培養し、その後、常法に従い細胞タンパク質を抽出して、抗P-p70S6K抗体を用いてｍＴＯＲ活性をウェスタンブロットにより解析した。
【０１０４】
図９に示すように、ＤＭＥＭ（グルタミンあり）に比べて、ＭｅＡＩＢ投与群及びＢＣＨ投与群では、大幅にｍＴＯＲ活性が抑制されたことがわかった。
【実施例４】
【０１０５】
本実施例のプロトコール及び結果を図１０に示す。本実施例では、マウス培養神経細胞を一定の条件で培養後、飢餓培地で培養し、その後に、各種のＤＭＥＭ培地（グルタミン添加あり（Gln876 mg/L）／なし、ＭｅＡＩＢ及びＢＣＨの添加の有無等）で培養し、その後、一定時間毎に常法に従い細胞タンパク質を抽出して、抗P-p70S6K抗体を用いてｍＴＯＲ活性ウェスタンブロットにより解析した。
【０１０６】
図９に示すように、ＤＭＥＭ（グルタミンあり）に比べて、時間を追うごとに、ＭｅＡＩＢ投与群及びＢＣＨ投与群では、大幅にｍＴＯＲ活性が抑制されたことがわかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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