(57)【要約】【課題】新たなコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害物質であるフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する、新たなコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤の提供。【解決手段】フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有するコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有するコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載の阻害剤を含む抗しわ剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有するコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚構造を支持するエラスチン、コラーゲン等の細胞外マトリックスは皮膚の水分保持、柔軟性維持、弾力性維持等に重要であり、加齢によりエラスチン、コラーゲンが減少すると皮膚のしわ形成や皮膚の弾力性低下等の原因となる。エラスチン、コラーゲンの減少を抑制する、エラスターゼ阻害剤、コラゲナーゼ阻害剤の開発が行われている（特許文献１、２）。
【０００３】
一方で、植物や、緑藻などの藻類、細菌、酵母などの生体内では、カロテノイド合成経路において、グルコースなどその生物種に対して適切な炭素源を出発物質として、最初のカロテノイドであるフィトエンが合成され、次いでフィトフルエンが合成されることが知られている。カロテノイド合成経路において合成されるカロテノイドのうち、フィトエン、フィトフルエンは、その構造の一部に共役二重結合を欠損する物質である。特にフィトエンは、細胞の脂質過酸化抑制作用を有することが知られている。
【０００４】
フィトエンは、デュナリエラ藻体内に多量に含まれている。癌や生活習慣病の予防等を目的として、このデュナリエラ藻体自体を配合した食品や、デュナリエラ藻体の培養により得られるフィトエンを配合した食品などが知られている（特許文献３）。さらに、フィトエン及びフィトフルエンが皮膚細胞中のメラニン含有量を低減させること、抗酸化特性を有すること、紫外線を吸収すること等の知見に基づいて、これらを含有する皮膚漂白剤や、酸化または紫外線によって生じる皮膚損傷の予防のための化粧品または医薬品なども知られている（特許文献４、５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−００１４５７号公報
【特許文献２】特開２００３−０５５２４５号公報
【特許文献３】特開２００３−１８３１３０号公報
【特許文献４】特開２００８−１３５４１号公報
【特許文献５】特開２００８−１７２１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
フィトエンやフィトフルエンが、抗酸化機能等を有することは知られていたが、コラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性を阻害する効果を有することは知られていなかった。
本発明はこの様な状況下でなされたものであり、新たなコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害物質であるフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する、新たなコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、以下に示すような新たなコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤が上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成させた。す
なわち、本発明は以下に示すとおりである。
〔１〕フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有するコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤。
〔２〕〔１〕に記載の阻害剤を含む抗しわ剤。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、新たなコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害物質であるフィトエン及び／又はフィトフルエンを含有する、新たなコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の一実施態様における、フィトエン濃度とエラスターゼ活性阻害率との関係を示す図である。
【図２】本発明の一実施態様における、フィトエン濃度とコラゲナーゼ活性阻害率との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有するコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤に係る第一の実施態様と、前記阻害剤を含む抗しわ剤に係る第二の実施態様を含む。
【００１１】
＜１．フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有するコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤＞
本発明の第一の実施態様は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを含有するコラゲナーゼ活性及び／又エラスターゼ活性阻害剤である。
【００１２】
＜１−１．フィトエン＞
本実施態様に係るフィトエンは、その構造が次の化学式で表される既知の物質である。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
上記フィトエンを得る方法は特段限定されず、植物や微生物から抽出してもよいし、微生物に生産させて回収してもよいし、化学合成により生産してもよい。
植物から抽出する場合、その植物の種類は特段限定されないが、フィトエンを多く含有することから、例えば、トマト、オレンジ白菜などの植物が好ましく、さらにトマトを加工したトマトパウダーなども好ましい。微生物から抽出する場合、その微生物の種類は特段限定されず、例えば、光合成又は非光合成細菌、酵母、カビなどを挙げることができる。中でも、フィトエンを多く含有することから、例えば、緑藻（デュナリエラ、ヘマトコッカス）などの藻類や、海水由来の非光合成細菌Ａｌｇｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（アルギバクター・エスピー）などが好ましい。微生物にフィトエンを生産させて回収する場合には、フィトエンを産生するように変異させたＰａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（パラコッカス・エスピー）ＦＡ１又はＦＡ３や、フィトエンを生成するように外来遺伝子が導入された遺伝子組換え大腸菌を利用してもよい。本実施態様のフィトエンは、上記したいずれか１種の方法により得たものを使用してもよいし、２種以上の方法により得たものを使用してもよい。
【００１５】
植物や微生物からのフィトエンの抽出方法及び抽出条件は特段限定されず、例えば、水抽出、熱水抽出、温水抽出、アルコール抽出、超臨界抽出等の公知の抽出方法を用いることができる。
溶媒抽出を行う場合、溶媒としては例えば水；メタノール、無水エタノール、エタノール等の低級アルコールや、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール等のアルコール類（無水、含水の別を問わない）；アセトン等のケトン類、ジエチルエーテル、ジオキサン、アセトニトリル、酢酸エチルエステル等のエステル類、キシレン、ベンゼン、クロロホルム等が挙げられ、好ましくは水、エタノール等である。これらの溶媒は、いずれか１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００１６】
また、トマトから抽出する場合であれば、特開２００８−１３５４１号公報に記載の方法などに従ってもよい。デュナリエラのような藻類から抽出する場合であれば、特開２００３−１８０３８７号公報、海水由来の非光合成細菌Ａｌｇｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ．（アルギバクター・エスピー）から抽出する場合であれば、特開２００８−５４１６９７号公報に記載の方法などに従ってもよい。また、変異体Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．（パラコッカス・エスピー）ＦＡ１又はＦＡ３を用いて発酵により生産する場合には、ＷＯ２００９−１１５６２９号パンフレットに記載の方法などに従ってもよい。さらに、フィトエンを生成するように外来遺伝子が導入された遺伝子組換え大腸菌に生産させて回収する場合には、J.Agric. Food Chem., 59(18), 9996-10005 (2011)や、Appl. Microbiol. Botechnol., 81(5), 915-925 (2009)に記載の方法などに従ってもよい。
【００１７】
得られた抽出物をそのままの状態で使用することもできるが、乾燥させた粉末状のものを用いてもよい。また、必要に応じて得られた抽出物に精製、濃縮処理等を施してもよい。精製処理としては、濾過又はイオン交換樹脂や活性炭カラム等を用いた吸着、脱色といった処理を行うことができる。また、濃縮処理としては、エバポレーター等の常法を利用できる。
【００１８】
また、得られた抽出物（又は精製処理物若しくは濃縮物）を凍結乾燥処理に供して粉末化する方法、デキストリン、コーンスターチ、アラビアゴム等の賦形剤を添加してスプレードライ処理により粉末化する方法等、公知の方法に従って粉末化してもよい。さらにその後に、必要に応じて純水、エタノール等に溶解して用いてもよい。
【００１９】
＜１−２．フィトフルエン＞
本実施態様に係るフィトフルエンは、その構造が次の化学式で表される既知の物質である。
【００２０】
【化２】
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【００２１】
上記フィトフルエンを得る方法は特段限定されず、上記したフィトエンの場合と同様である。また、抽出方法及び抽出条件、得られた抽出物のその後の処理についても、上記したフィトエンの場合と同様である。
【００２２】
＜３．コラゲナーゼ活性阻害剤＞
本実施態様に係るコラゲナーゼ活性阻害剤は、拮抗阻害によりコラゲナーゼの活性を阻害するものである。例えば、抗しわの観点からいえば、当該メカニズムによりコラゲナーゼの活性が阻害され、コラーゲンの減少が抑制されるため、結果的に抗しわ効果が実現さ
れる。
このことから、本実施態様に係るエラスターゼ活性阻害剤は、抗しわの用途に好ましく用いられる。
【００２３】
本実施態様に係るコラゲナーゼ活性阻害剤は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを単独で使用することもできるが、上記成分以外に公知の賦形剤、香料、着色料、乳化剤、安定化剤、増粘剤、酵素、防腐剤、滑沢剤、界面活性剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、結合剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、可溶化剤、保存剤、風味剤、甘味剤等を、本実施態様の効果を損なわない範囲で必要に応じて配合することができる。
【００２４】
本実施態様に係るコラゲナーゼ活性阻害剤全量に対する上記フィトエン及び／又はフィトフルエンの含有量は、本実施態様の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、総量で、通常０．００００１〜２０質量％であり、好ましくは０．０００１〜３質量％であり、より好ましくは０．００１〜１質量％である。
【００２５】
＜４．エラスターゼ活性阻害剤＞
本実施態様に係るエラスターゼ活性阻害剤は、エラスターゼの活性を阻害するものである。例えば、抗しわの観点からいえば、エラスターゼの活性が阻害され、エラスチンの減少が抑制されるため、結果的に抗しわ効果が実現される。
このことから、本実施態様に係るエラスターゼ活性阻害剤は、抗しわの用途に好ましく用いられる。
【００２６】
本実施態様に係るエラスターゼ活性阻害剤は、フィトエン及び／又はフィトフルエンを単独で使用することもできるが、上記成分以外に公知の賦形剤、香料、着色料、乳化剤、安定化剤、増粘剤、酵素、防腐剤、滑沢剤、界面活性剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、結合剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、可溶化剤、保存剤、風味剤、甘味剤等を、本実施態様の効果を損なわない範囲で必要に応じて配合することができる。
【００２７】
本実施態様に係るエラスターゼ活性阻害剤全量に対する上記フィトエン及び／又はフィトフルエンの含有量は、本実施態様の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、総量で、通常０．００００１〜２０質量％であり、好ましくは０，０００１〜３質量％であり、より好ましくは０．００１〜１質量％である。
【００２８】
＜５．抗しわ剤＞
本発明の第二の実施態様は、上記阻害剤を含む抗しわ剤である。
本実施態様に係る抗しわ剤は、上記したコラゲナーゼ活性及び／又はエラスターゼ活性阻害剤を単独で含有してもよいが、上記成分以外に公知の賦形剤、香料、着色料、乳化剤、安定化剤、増粘剤、酵素、防腐剤、滑沢剤、界面活性剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、結合剤、吸収促進剤、吸着剤、保湿剤、可溶化剤、保存剤、風味剤、甘味剤等を、本実施態様の効果を損なわない範囲で必要に応じて配合することができる。
本実施態様に係る抗しわ剤は、実施形態に合わせ、化粧料や医薬品、食品などの素材として用いることができる。
【００２９】
＜５−１．化粧料＞
本実施態様に係る抗しわ剤を化粧料の素材として用いる場合、該抗しわ剤を水溶液、ローション、スプレー液、懸濁液および乳化液などの液状；粉末、顆粒およびブロック状などの固体状；クリームおよびペーストなどの半固体状；ゲル状等の各種所望の剤形の化粧料に調製することができる。このような化粧料は、洗顔料、乳液、クリーム、ゲル、エッセンス（美容液）、パック・マスク等の基礎化粧料、ファンデーション、口紅等のメーキャップ化粧料、口腔化粧料、芳香化粧料、毛髪化粧料、ボディ化粧料等の各種化粧料とし
て有用である。
【００３０】
本実施態様に係る抗しわ剤を含有する化粧料は、常法に従って製造することができる。また、化粧料への本実施態様に係る抗しわ剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、スプレー缶、噴霧容器、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
【００３１】
本実施態様に係る抗しわ剤を化粧料の素材として用いる場合、化粧料全量に対する上記抗しわ剤の含有量は、本実施態様の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、フィトエン及び／又はフィトフルエンとして、総量で、通常０．００００１〜１０質量％であり、好ましくは０．０００１〜３質量％であり、より好ましくは０．０００３〜１質量％である。
【００３２】
本実施態様に係る抗しわ剤を化粧料の素材として用いる場合、通常用いられる公知の成分を適宜加えて用いることができる。
例えば、アニオン性界面活性剤（脂肪酸石鹸、スルホン酸塩型アニオン性界面活性剤、硫酸エステル型アニオン性界面活性剤、リン酸エステル型アニオン性界面活性剤、アシルメチルタウリン塩、モノアルキルリン酸塩、アシルグルタミン酸塩、イセチオン酸エステル塩等）、カチオン性界面活性剤（アミン塩型カチオン性界面活性剤、第四アンモニウム型カチオン性界面活性剤（テトラアルキルアンモニウム型、ピリジニウム型））、非イオン性界面活性剤（グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）、両性界面活性剤（イミダゾリン型、ベタイン型、アミノ酸型）、フッソ系界面活性剤、シリコーン系界面活性剤等の天然、合成界面活性剤、
アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、アラビアガム、キサンタンガム、ペクチン、トラガント、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カチオン化セルロース、カチオン化デキストラン、カチオン化デキストリン、キトサン、カチオン化ビニルピロリドンポリマー、塩化Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，５−メチレンピペリジニウムポリマー、乳タンパク、大豆タンパク、ゼラチン、卵タンパク、カゼインナトリウム、ホエータンパク等の水溶性高分子、
イチョウ、ツボクサ、トウヤク、ニンジン、シコッピ、カイカ、インチコウ、ヤシャジツ、甘草分画物、ゴカヒ、センプクカ、ヒカイ、ユズリハ、カミツレ、マロニエ、エスシン、テルミナリア、ルスコゲニン、ブッチャーブルーム、コラ、ガラナ、マテ、コーヒー、カカオ、プレクトランタス、タンジン、ビスナガ、シリマリン、ロイコシアニン、オトギリ草、クマハゼ、シソ、オウゴン、ケイガイ、ローズマリー、セージ、タイム、ヨモギ、カワラヨモギ、ソウジュツ、セイヨウノコギリソウ、シコン、ウイキョウ、オウバク、ショウキョウ、トウキ、センキュウ、チンビ、カノコソウ、ビャクシ、トウヒ、芍薬、紅花、菖蒲、ブクリョウ、ハッカ等の植物成分、
コハク酸、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸、グルクロン酸、２−ヒドロキシ酪酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、タルトロン酸、ピルビン酸メチル、ピルビン酸エチル、ビタミンＡ酸、ビタミンＣ誘導体、ビタミンＤ、ビタミンＥ、オリゴペプチド、トラネキサム酸エステル等の活性成分、
多価アルコール、アミノ酸、ムコ多糖類、蛋白質、生体抽出物、発酵代謝物、多糖類、植物抽出物、リン脂質、セラミドなどの保湿剤、
油脂類（大豆油、ヌカ油、ホホバ油、アボガド油、アーモンド油、カカオ油、オリーブ
油、ゴマ油、パーシック油、ヒマシ油、ヤシ油、ミンク油、牛脂、豚脂等の天然油脂、これらの天然油脂を水素添加して得られる硬化油およびミリスチン酸グリセリド、２−エチルヘキサン酸グリセリド等の合成トリグリセリド、ジグリセリド等）、ロウ類（カルナウバロウ、鯨ロウ、ミツロウ、ラノリン等）、炭化水素類（流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、マイクロクリスタリンワックス、セレシン、スクワラン、プリスタン等）、高級脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ラノリン酸、イソステアリン酸等）、高級アルコール類（ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、コレステロール、２−ヘキシルデカノール等）、エステル類（オクタン酸セチル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ミリスチル、パルミチン酸イソプロピル、アジピン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、イソステアリン酸コレスチール等）、精油類（ハッカ油、ジャスミン油、シヨウ脳油、ヒノキ油、トウヒ油、リュウ油、テレピン油、ケイ皮油、ベルガモット油、ミカン油、シヨウブ油、パイン油、ラベンダー油、ベイ油、クローブ油、ヒバ油、バラ油、ユーカリ油、レモン油、ペパーミント油、タイム油、ローズ油、セージ油、メントール、シネオール、オイゲノール、シトラール、シトロネラール、ボルネオール、リナロール、ゲラニオール、カンファー、チモール、スピラントール、ピネン、リモネン、テルペン系化合物等）、シリコーン油類等の油脂成分（エモリエント成分）、
炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、セスキ炭酸ナトリウム、ホウ砂、硫酸ナトリウム、硫化ナトリウム、硝酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、りん酸ナトリウム、塩化カリウム、硫化カリウム、酸化カルシウム、酸化マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム等の無機塩類、
ホウ酸、メタケイ酸、無水ケイ酸等の無機酸類、
黄色４号、青色１号、黄色２０２号、クロロフィル、リボフラビン、紅花、クロシン、アントラキノン等の色素類、
香料類、
アクリル樹脂、スチレン樹脂、エポキシ樹脂、ナイロン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリテトラフルオロエタン等の高分子、これらの高分子のコポリマー、ケイ酸、ケイ酸カルシウム、天然ケイ酸アルミニウム、合成ケイ酸アルミニウム、ゼオライト、酸化チタン、タルク、カオリン、マイカ、ベントナイト等の微粉体、
硫黄、湯の花、鉱砂、雲母末、中性白土、いり糠、殺菌剤、防腐剤、
をはじめ、その他製剤上必要な成分などが挙げられる。
【００３３】
＜５−２．医薬品＞
本実施態様に係る抗しわ剤を医薬品の素材として用いる場合、その剤形は、使用形態、投与経路等に応じて選択することができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、注射剤、坐剤、浸剤、煎剤、チンキ剤等が挙げられる。これらの各種製剤は、常法に従って主薬に対して必要に応じて充填剤、増量剤、賦形剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。また、この医薬製剤中に着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤等や他の医薬品を含有させてもよい。
【００３４】
本実施態様に係る抗しわ剤を医薬品の素材として用いる場合、医薬品全量に対する上記抗しわ剤の含有量は、本実施態様の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、フィトエン及び／又はフィトフルエンとして、総量で、通常０．０００１〜２０質量％であり、好ましくは０．００１〜５質量％であり、より好ましくは０．００３〜１質量％である。
【００３５】
＜５−３．食品＞
本実施態様に係る抗しわ剤を食品の素材として用いる場合、一般の食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品、食品添加物等として使用できる。食品の形態としては、本発明に係る抗糖化剤を含む清涼飲料、ミルク、プリン、ゼリー、飴、ガム、グミ、ヨーグルト、チョコレート、スープ、クッキー、スナック菓子、アイスクリーム、アイスキャンデー、パン、ケーキ、シュークリーム、ハム、ミートソース、カレー、シチュー、チーズ、バター、ドレッシング等を例示することができる。
【００３６】
本実施態様に係る抗しわ剤は、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を主成分として使用することができる。タンパク質としては、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、及びこれらの加水分解物、バターなどが挙げられる。糖質としては、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレン、乳清ミネラルなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用してもよく、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。
【００３７】
本実施態様に係る抗しわ剤を含有する食品は、常法に従って製造することができる。また、食品への抗しわ剤の配合量、配合方法、配合時期は適宜選択することができる。さらに、必要に応じて、瓶、袋、缶、箱、パック等の適宜の容器に封入することができる。
本実施態様に係る抗しわ剤を食品の素材として用いる場合、食品全量に対する上記抗しわ剤の含有量は、本実施態様の所望の効果が奏される限り特に限定されないが、フィトエン及び／又はフィトフルエンとして、総量で、通常０．００００１〜３質量％であり、好ましくは０．０００１〜１質量％であり、より好ましくは０．００１〜０．３質量％である。
【実施例】
【００３８】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
〔フィトエン濃度算出方法〕
下記「１．フィトエンの製造」において分離精製した各サンプルにおけるフィトエンの定量は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて以下の条件で行った。所定条件下、フィトエンの異性体は４３分及び４６分に保持時間を有する。
【００４０】
（分析条件）
分析カラム： Ｎｏｖａ−Ｐａｋ Ｃ１８、３．９×３００ｍｍ （Ｗａｔｅｒｓ）
検出波長：  ２８６ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ
移動相：    アセトニトリル／メタノール／イソプロパノール ＝ ９０／６／４
カラム温度：３０℃
流速：      １ｍＬ／ｍｉｎ
【００４１】
標準液のフィトエン濃度は、フィトエンの検出波長２８６ｎｍにおけるｎ−ヘキサン溶
液でのε（分子吸光係数）（ｍＭ−１ｃｍ−１）＝５０、標準液の２８６ｎｍにおける吸光度（Ａ）、フィトエン分子量＝５４４．９４及び上記分析条件でＨＰＬＣ分析を行ったときのフィトエンピークの面積百分率％（Ｂ）を用いて、下記式（１）により算出した。（標準液のフィトエン濃度算出式）
標準液のフィトエン濃度（ｍｇ／Ｌ）＝Ａ／（５０×Ｂ×５４４．９４）・・・（１）
【００４２】
サンプルのフィトエン濃度は、以下の方法で算出した。
（サンプルの調製および検出）
測定においては、各工程で得られた溶液状態のサンプル液を直接、又はｎ−ヘキサンで希釈（希釈率Ｘ）した状態で上記分析カラムに２０μＬ注入し、カラム溶離液中のフィトエンの検出を波長２８６ｎｍで行った。
【００４３】
（サンプルのフィトエン濃度算出式）
測定サンプルのフィトエン濃度（ｍｇ／Ｌ）＝（サンプル中のフィトエンピークの面積百分率（％）×希釈率（Ｘ）×標準液のフィトエン濃度（ｍｇ／Ｌ））／標準液中のフィトエンピークの面積百分率（％）・・・（２）
【００４４】
＜１．フィトエンの製造＞
［工程１：抽出工程］
トマトパウダー（カゴメ株式会社製）中のフィトエン濃度を分析した結果、０．１１％（乾重あたりの濃度）であった。このトマトパウダー２０ｇ（乾重）に、水６０ｇ、エタノール１５８ｇ、２５％ＮａＯＨ水溶液１０ｇを加え、窒素雰囲気下、室温（２０〜３０℃）にて３０分間攪拌しながら油脂類のケン化処理及びカロテノイドの抽出を行った。その後、ｎ−ヘキサン１３２ｇを加え、窒素雰囲気下、室温（２０〜３０℃）にて３０分間攪拌しながらフィトエンを含む低極性カロテノイドの抽出を行った。この抽出液を分液ロートへ移液し、静置によって分液後、下層を除き、フィトエン約１８ｍｇを含有する赤褐色のｎ−ヘキサン抽出液１０２ｇ（１１６ｍｇ／Ｌ）を得た。
【００４５】
［工程２：抽出液濃縮、カラムチャージ液調製工程］
工程１で得られた抽出液をロータリー・エバポレーターにて４０℃以下で濃縮乾固した。その後、ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９９／１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の溶離液６ｍＬで再溶解し、フィトエン含有カラムチャージ液を得た。
【００４６】
［工程３：シリカゲルカラム分取工程］
工程２で得られたフィトエン含有チャージ液を、ワコーシルＣ３００を充填したシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供して分取を実施し、フィトエン含有フラクションを回収した。溶媒はｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９９／１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて溶出し、５ｍＬずつフラクションカットして各フラクション液を得た。分取の結果、得られたフラクション溶出液をＨＰＬＣ分析し１５．６ｍｇのフィトエンを含む黄色の溶液を得た。
【００４７】
［工程４：活性炭処理脱色工程］
工程３で得られた黄色のフィトエン含有フラクション１３．２ｍＬに、８０ｍｇの活性炭（強力シラサギ）を加え、窒素雰囲気下、室温（２０〜３０℃）にて１５分間攪拌を実施した。その後、活性炭を除去し、ロータリー・エバポレーターにて４０℃以下で濃縮乾固し、１１．４ｍｇの無色カロテノイドであるフィトエンを取得した。
【００４８】
＜２−１．エラスターゼ活性阻害率の測定＞
［試験例１］
２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．５）（１Ｍ ＮａＣｌを含む）、１μｇ／ｍＬ好中球由来エラスターゼ（Sigma-Aldrich社製）、試験サンプルとして各濃度の
フィトエンを含む組成液を９６ウェルマイクロプレートに添加し、３７℃、２０分間インキュベーションした。フィトエンはＤＭＳＯに溶解させたものを添加した。その後、０．１ｍＭ Ｎ−メトキシスクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−バリン  ４−メチルクマリル−７−アミド（Ｓｕｃ（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＭＣＡ）（ペプチド研究所製）（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ：配列番号１）を５０μＬ添加して２００μＬの反応液を調製し、３７℃、３０分間酵素反応を行った。この反応液を、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍで蛍光強度を測定することによって、Ｓｕｃ（ＯＭｅ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−ＭＣＡから酵素反応によって遊離する７−アミノ−４−メチルクマリンの生成量を測定した。
【００４９】
［比較試験例１］
また、試験サンプルを添加しないこと以外は上記試験例１と同様にしたものをコントロールとして用いた。
【００５０】
エラスターゼ活性阻害率は下記式（３）により算出した。
エラスターゼ活性阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００  ・・・（３）
Ａ：試験サンプルを添加した３０分後の蛍光強度
Ｂ：試験サンプルを添加した０分における蛍光強度
Ｃ：コントロールの３０分後の蛍光強度
Ｄ：コントロールの０分における蛍光強度
【００５１】
反応液におけるフィトエン濃度とエラスターゼ活性阻害率との関係を表すグラフを図１に示す。図１から分かるように、フィトエンは濃度依存的にエラスターゼ活性を阻害し、エラスチンの分解を抑制する効果を有することが確認された。
【００５２】
＜２−２．コラゲナーゼ活性阻害率の測定＞
［試験例２］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．３）、４０μｇ／ｍＬコラゲナーゼ ＴｙｐｅＶ（和光純薬製）、試験サンプルとして各濃度のフィトエンを含む組成液を９６ウェルマイクロプレートに添加し、３７℃、２０分間インキュベーションした。フィトエンはＤＭＳＯに溶解させたものを添加した。その後、５μＭ  ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ペプチド研究所製）（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ：配列番号２）を５０μＬ添加して２００μＬの反応液を調製し、３７℃、３０分間酵素反応を行った。この反応液を、励起波長３２０ｎｍ、蛍光波長４０５ｎｍで蛍光強度を測定することによって、ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２から酵素反応によって遊離する分解物の生成量を測定した。
【００５３】
［比較試験例２］
また、試験サンプルを添加しないこと以外は上記試験例２と同様にしたものをコントロールとして用いた。
【００５４】
コラゲナーゼ活性阻害率は下記式（４）により算出した。
コラゲナーゼ活性阻害率（％）＝｛１−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）｝×１００  ・・・（４）
Ａ：試験サンプルを添加した３０分後の蛍光強度
Ｂ：試験サンプルを添加した０分における蛍光強度
Ｃ：コントロールの３０分後の蛍光強度
Ｄ：コントロールの０分における蛍光強度
【００５５】
反応液におけるフィトエン濃度とコラゲナーゼ活性阻害率との関係を表すグラフを図２に示す。図２から分かるように、フィトエンは濃度依存的にコラゲナーゼ活性を阻害し、コラーゲンの分解を抑制する効果を有することが確認された。
【００５６】
＜３．官能試験＞
（１）化粧クリームの官能試験１
［実施例１、比較例１］
表１に記載の処方に基づいて調製した化粧クリームを用いて官能試験を実施した。
【００５７】
【表１】
2016011259.tif 000005
【００５８】
パネラーは、小じわや皮膚のハリが気になると自覚する３０代後半、および４０代の女性パネラー１６名で、１日２回朝夕洗顔後、右目尻周辺には実施例１の化粧クリームを、また左目尻周辺には比較例１の化粧クリームを３週間使用した。その後、鏡を使用し、両目尻の「シワの多さ」及び「シワの深さ」を比較した。その結果を表２に示す。
【００５９】
【表２】
2016011259.tif 000006
【００６０】
表２の結果より、フィトエン含有トマト抽出物を含む実施例１の化粧クリームを使用することで、目尻の皮膚表面の「シワの多さ」及び「シワの深さ」が改善されることが分かった。
【００６１】
（２）化粧クリームの官能試験２
［実施例２］
フィトエン含有トマト抽出物の配合量を０．５重量％とした以外は、実施例１と同様に実施した。その結果を表３に示す。
【００６２】
【表３】
2016011259.tif 000007
【００６３】
表３の結果より、フィトエン含有トマト抽出物の配合量を０．０３重量％とした実施例１よりも、０．５重量％とした実施例２の化粧クリームの方が、目尻の皮膚表面の「シワの多さ」及び「シワの深さ」がより改善されることが分かった。
【００６４】
（３）化粧ローションの官能試験１
［実施例３、比較例３］
表４に記載の処方に基づいて調製した化粧ローションを用いて官能試験を実施した。
【００６５】
【表４】
2016011259.tif 000008
【００６６】
パネラーは、小じわや皮膚のハリが気になると自覚する４０代の女性パネラー１４名で、１日２回朝夕洗顔後、顔右半分には実施例３の化粧ローションのみを適量使用、また、顔左半分には比較例３の化粧ローションのみを同量使用した。１か月経過後、触診で左右のほほ皮膚の「ハリのよさ」を比較した。その結果を表５に示す。
【００６７】
【表５】
2016011259.tif 000009
【００６８】
表５の結果より、フィトエン含有トマト抽出物を含む実施例３の化粧ローションを使用することで、ほほの皮膚表面の「ハリのよさ」が改善されることが分かった。
【００６９】
（４）化粧ローションの官能試験２
［実施例４、比較例４］
表４に記載の処方に基づいて調製した化粧ローションを用いて官能試験を実施した。
【００７０】
【表６】
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【００７１】
パネラーは、小じわや皮膚のハリが気になると自覚する４０代の女性パネラー１６名で、夜寝る前に、洗顔後、顔右半分には実施例４の化粧ローションのみを適量使用、また、顔左半分には比較例４の化粧ローションのみを同量使用した。１か月経過後、触診で左右のほほ皮膚状態を比較した。その結果を表７に示す。
【００７２】
【表７】
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【００７３】
表７の結果より、フィトエン含有トマト抽出物を含む実施例４の化粧ローションを使用することで、ほほの皮膚表面の「ハリのよさ」が改善されることが分かった。
【００７４】
＜４．配合例＞
錠剤、飲料（清涼飲料）、食品（キャンデー、トマトゼリー）の配合例を、それぞれ表８〜１１に記載した。
【００７５】
【表８】
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【００７６】
【表９】
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【００７７】
【表１０】
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【００７８】
【表１１】
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【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、化粧料や医薬、食品等の製剤技術に適用できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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