(57)【要約】【課題】前駆脂肪細胞分化誘導促進活性作用を有し、糖尿病及びインスリン抵抗性に有用な薬剤や飲食物の提供。【解決手段】アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する、前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防または改善剤、あるいは、インスリン抵抗性の予防または改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する、前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項２】
アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する、糖尿病の予防または改善剤。
【請求項３】
アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する、インスリン抵抗性の予防または改善剤。
【請求項４】
アクレアチン類縁体が、トダクリンまたはトッダノールである、請求項１記載の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
【請求項５】
アクレアチン類縁体が、トダクリンまたはトッダノールである、請求項２記載の糖尿病の予防または改善剤。
【請求項６】
アクレアチン類縁体が、トダクリンまたはトッダノールである、請求項３記載のインスリン抵抗性の予防または改善剤。
【請求項７】
サルカケミカンを原料として用い、ヘキサン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ブタノール、もしくはジエチルエーテル、又はこれらのいずれかの含水物で抽出を行うことを含む、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有する組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法で得られた組成物に対して分取用HPLCにて単一成分にまで精製を行うことを含む、アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体の製造方法。
【請求項９】
アクレアチン類縁体が、トダクリンまたはトッダノールである、請求項７または８に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミカン科サルカケミカン属に属する植物であるサルカケミカンから抽出されたアクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分とし、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化促進作用を有し、インスリン抵抗性を予防及び改善するための健康食品、医薬品に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、我が国では生活が豊かになり、食生活も欧米化したことで糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化症などの生活習慣病を発症する人々が急増している。生活習慣病は、日本人の死亡原因の３分の２を占めており、生活習慣病への対応は我が国にとって非常に重要な課題となっている。生活習慣病である糖尿病の患者数は年々増加傾向にある。糖尿病を大別すると、I型糖尿病とII型糖尿病に分類される。糖尿病患者のほとんどがII型糖尿病であると言われている。I型糖尿病は、膵β細胞からインスリンが分泌されない糖尿病であり、II型糖尿病は、インスリンの分泌が低下またはインスリン抵抗性による糖尿病である。現代において、糖尿病が急増している最大の原因は、生活習慣に起因したインスリン抵抗性にある。脂肪細胞に脂肪が蓄積して肥大化すると、TNF-αやレジスチン等の悪玉アディポカインを過剰分泌するようになり、インスリン抵抗性が引き起こされる原因となる。つまり、内臓脂肪の過剰蓄積が糖尿病の発症やインシュリン抵抗性に深く関係していると考えられている。
【０００３】
細胞レベルにおけるインスリン抵抗性は、インスリン刺激下において血中グルコースを細胞に取り込む機能が低下していることが原因であるが、現在の臨床では、インスリン抵抗性を改善する薬剤として、経口糖尿病治療薬であるピオグリタゾンなどのチアゾリジン系の薬剤が用いられている（特許文献１参照）。ピオグリタゾンなどのチアゾリジン系の薬剤は強力なPPARγアゴニストであり、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化誘導を転写レベルで促進する。前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化を促進することにより、血中グルコースを効率よく取り込むことができる脂肪細胞が増殖することで、血糖値が下がると考えられている。このように前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化誘導を促進できれば、インスリン抵抗性の予防または改善作用が期待できる。このような効果が報告されているものとして、例えば、キササゲから抽出されるカタルパラクトンを有効成分とする脂肪細胞分化促進剤（特許文献２参照）やマティコから抽出される成分を有効成分とする脂肪細胞分化促進剤（特許文献３参照）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第3176694号公報
【特許文献２】特開2008-7440号公報
【特許文献３】特開2006-28049号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ピオグリタゾンなどのチアゾリジン系の薬剤は、副作用として体重増加や浮腫も報告されており、処方において医師の慎重なコントロールが必要とされる。そこで、副作用が少なく、安全性も高いインスリン抵抗性を予防及び改善する新たな有効成分の探索が求められている。
【０００６】
本発明の目的は、これまでにも食に供された経験があり、前駆脂肪細胞分化誘導促進作用を有し、さらに糖尿病及びインスリン抵抗性の予防および改善に有用な有効成分を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前駆脂肪細胞分化誘導促進を有する有効成分について、種々の素材から探索を重ねた結果、ミカン科サルカケミカン属の植物であるサルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物が、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を促進することを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有する前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防および改善剤ならびにインスリン抵抗性の予防および改善剤である。
【０００９】
また、本発明は、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有する飲食品である。
【００１０】
上記のサルカケミカンの抽出物において、サルカケミカンの葉、茎、実、種子、根または全草を用いることができる。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する、前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
[２]  アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する、糖尿病の予防または改善剤。
[３]  アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する、インスリン抵抗性の予防または改善剤。
[４]  アクレアチン類縁体がトダクリンまたはトッダノールである、[１]の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤。
[５]  アクレアチン類縁体がトダクリンまたはトッダノールである、[２]の糖尿病の予防または改善剤。
[６]  アクレアチン類縁体がトダクリンまたはトッダノールである、[３]のインスリン抵抗性の予防または改善剤。
[７]  サルカケミカンを原料として用い、ヘキサン、酢酸エチル、メタノール、エタノール、ブタノール、もしくはジエチルエーテル、又はこれらのいずれかの含水物で抽出を行うことを含む、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有する組成物の製造方法。
[８]  [７]の方法で得られた組成物に対して分取用HPLCにて単一成分にまで精製を行うことを含む、アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体の製造方法。
[９]  アクレアチン類縁体がトダクリンまたはトッダノールである、[７]または[８]の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤は、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有し、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導の促進作用により、血中グルコースの脂肪細胞への取り込み活性を促進することができる。本発明の糖尿病の予防および改善剤は、前駆脂肪細胞分化誘導促進作用により、血中グルコースの細胞への取り込み活性が促進し、インスリン抵抗性の糖尿病を予防及び改善できる。本発明のインスリン抵抗性の予防および改善剤は、前駆脂肪細胞分化誘導促進作用により、インスリン抵抗性を予防及び改善ができる。さらに、本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤は、脂肪分解促進作用も有するためチアゾリジン系の薬剤に認められる体重増加などの副作用は比較的軽いと思われる。
【００１３】
本発明の飲食品は、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有し、経口摂取することにより前駆脂肪細胞の分化誘導を促進し、糖尿病やインスリン抵抗性を予防および改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】アクレアチン（aculeatin）及びアクレアチン類縁体の抽出プロトコールを示す図である。
【図２】アクレアチンの1H- 及び13C-NMR スペクトルの帰属データを示す図である。
【図３】アクレアチンの構造式を示す図であり、図中の番号は図２の位置に相当する。
【図４】アクレアチン類縁体であるトダクリンの1H- 及び13C-NMR スペクトルの帰属データを示す図である。
【図５】アクレアチン類縁体であるトダクリンの構造式を示す図であり、図中の番号は図４の位置に相当する。
【図６】アクレアチン類縁体であるトッダノールの1H- 及び13C-NMR スペクトルの帰属データを示す図である。
【図７】アクレアチン類縁体であるトッダノールの構造式を示す図であり、図中の番号は図６の位置に相当する。
【図８】アクレアチン（aculeatin）およびアクレアチン類縁体の3T3-L1前駆脂肪細胞分化誘導促進活性を示す図である。
【図９】アクレアチン（aculeatin）およびアクレアチン類縁体による3T3-L1細胞におけるグリセロール３リン酸脱水素酵素（GPDH）活性の上昇を示す図である。
【図１０】アクレアチン（aculeatin）の脂肪分解促進活性を示す図である。
【図１１】アクレアチン（aculeatin）の２型糖尿病発症モデルKK-Ay/TaJclマウスを用いた血糖値上昇抑制を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防および改善剤、インスリン抵抗性の予防および改善剤は、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含有する。アクレアチン（aculeatin）は、下記の式（１）に示す構造式を有し、化合物名は(-)-6-[(3,3-ジメチルオキシラニル)メチル]-5,7-ジメトキシ-2H-1-ベンゾピラン-2-オン（(-)-6-[(3,3-Dimethyloxiranyl)methyl]-5,7-dimethoxy-2H-1-benzopyran-2-one）である。アクレアチン類縁体とはアクレアチンと構造の近似性が認められるトダクリン、トッダノール等を含む。トダクリンは、下記の式（２）に示す構造式を有し、正式な化合物名は5,7-ジメトキシ-6-(3-メチル-2-ブテニル)-2H-1-ベンゾピラン-2-オン(5,7-Dimethoxy-6-(3-methyl-2-butenyl)-2H-1-benzopyran-2-one)である。トッダノールは、下記の式（3）に示す構造式を有し、正式な化合物名は5,7-ジメトキシ-6-(2-ヒドロキシ-3-メチル-3-ブテニル)-2H-1-ベンゾピラン-2-オン(5,7-Dimethoxy-6-(2-hydroxy-3-methyl-3-butenyl)-2H-1-benzopyran-2-one)である。
【００１６】
アクレアチン（aculeatin）およびアクレアチン類縁体は、サルカケミカンの抽出物から分離、精製することにより得ることが可能である。例えば、液液分配、クロマトグラフィーなど汎用的な分画技術を用いることができる。例えば、サルカケミカンの植物体からアセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール、メタノール、エタノール等の有機溶媒を用いて抽出し、さらに疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーによりアクレアチンまたはアクレアチン類縁体を分離、精製することができる。サルカケミカン乾燥植物体1kgから１〜10g程度のアクレアチンを分離、精製することができる。疎水性相互作用を利用したクロマトグラフィーとして、スチレン-ジベニルベンゼン系合成吸着剤であるダイヤイオン（商標）HP20（三菱化学株式会社）等を用いたクロマトグラフィーが挙げられる。
【００１７】
サルカケミカンは、ミカン科サルカケミカン属に属する植物（学名：Toddalia asiatica）で、国内では沖縄地方で生育している。移動規制植物であるため、本州では生植物としての入手は困難であるが、加工されたものが販売されており、加工品として入手することは可能である。サルカケミカンはすでに、沖縄などでは民間薬やお茶として使用されているので、サルカケミカンに含有されるアクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体は安全性に優れる。アクレアチンまたはアクレアチン類縁体は、ミカン科サルカケミカン属に属する他種植物から分離、精製することもできる。
【００１８】
【化１】
2016037487.tif 000002
【００１９】
【化２】
2016037487.tif 000003
【００２０】
【化３】
2016037487.tif 000004
【００２１】
また、アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体は合成により製造したものでもよい。当業者ならば上記化学式に基づいて容易に合成することができる。
【００２２】
本発明の前駆脂肪細胞分化誘導促進剤、糖尿病の予防および改善剤ならびにインスリン抵抗性症候群の予防および改善剤は、サルカケミカンの抽出物を含有する。サルカケミカンの抽出物は、サルカケミカンを未乾燥で、または乾燥させ、抽出溶媒で抽出することで得ることができる。サルカケミカンの抽出に用いられる抽出溶媒は、アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体を抽出成分として含ませることができる限り、特に限定はないが、例えば、アセトン、ヘキサン、エーテル、酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール、プロパノール、メタノール、エタノール等の有機溶媒、有機溶媒の混合溶媒、水と有機溶媒の混合溶媒などを用いることができる。ただし、使用する有機溶媒や濃縮乾固または温度状態によってはアクレアチンのエポキシ環が開環してしまうため、注意が必要である。好ましくは、ヘキサンを用いる。例えば、ヘキサンを用いて抽出した抽出物をヘキサン抽出エキスという。抽出は、室温抽出または還流抽出により行うことができる。抽出に用いるサルカケミカンの部位は、アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体が抽出成分として含まれる限り、木部、葉、花、果実、果皮、茎、根、根皮などいずれの部位をも用いることはできる。また、アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体を含む限り、ミカン科サルカケミカン属に属する他種植物を用いることもできる。
【００２３】
サルカケミカンの抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、必要に応じて濾過等の処理、濃縮化や粉末化したものを用いることもできる。
【００２４】
アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導を促進するので、血中グルコースの脂肪細胞への取り込み活性を促進し、インスリンに依存しない糖尿病に有用である。また、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物は、インスリン抵抗性を予防または改善するので、インスリン抵抗性症に有効である。サルカケミカン抽出物が前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化誘導促進活性を有することは、マウス3T3-L1細胞等の哺乳動物前駆脂肪細胞とサルカケミカン抽出物を接触させ培養し、脂肪細胞へ分化することを確認することにより決定することができる。脂肪細胞への分化は、例えば、細胞内への脂肪滴の増加量を評価すればよい。また、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化に伴って、グリセロール３リン酸脱水素酵素（GPDH）活性が上昇することが知られており，培養細胞にアクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を添加し、細胞中のGPDH活性が上昇することを確認してもよい。さらに、脂肪細胞分化のマーカーである、Ap2、Cd36、Adipoq、Glut4などの遺伝子発現上昇を確認してもよい。
【００２５】
アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物は、前駆脂肪細胞分化誘導促進剤として用いることができる。前駆脂肪細胞分化誘導促進剤は、研究用試薬としても用いることができる。
【００２６】
また、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物は、インスリン抵抗性に起因する高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、脳梗塞）を予防または改善するための医薬として用いることができる。本発明は、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を有効成分として含む、インスリン抵抗性に起因する高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、脳梗塞）を予防または改善するための医薬組成物を包含する。すなわち、アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を、糖尿病の予防または改善剤、あるいはインスリン抵抗性症の予防または改善剤として用いることができる。
【００２７】
医薬組成物は、経口で投与しても、また静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与等の非経口で投与してもよい。該医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤等を含んでいてもよい。また、着色料、香料、防腐剤などを含んでいてもよい。賦形剤としては例えば乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、滑沢剤としては例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、結合剤としては例えばジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、崩壊剤としては例えばデンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが、それぞれあげられる。使用する際の形態は特に限定されず、カプセル状、粉末、粒状、タブレット状、液状などの形態とでき、また、外用剤としてクリーム、ペースト状、ジェルなどの形態で用いることもできる。
【００２８】
本発明のアクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物は、サプリメントとして用いることができ、あるいは、飲食物に混合して、または飲食用組成物として用いることもできる。
【００２９】
サプリメントとして用いる場合、錠剤や顆粒の形態で用いることができ、他の有用成分と混合してもよい。
【００３０】
飲食用組成物として用いる場合、健康飲食品、特定保健用飲食品、栄養機能飲食品、健康補助飲食品等として供することが可能である。これらの飲食品は、糖尿病やインスリン抵抗性症候群を予防、改善する機能性食品として供することができ、特定保健用飲食品やその他のサプリメント、健康飲食品等には、インスリン抵抗性に起因する高インスリン血症、インスリン非依存型糖尿病、異常脂質血症、高血圧、肥満、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、脳梗塞）等を予防または改善する等の機能を表示することができる。
【００３１】
飲食用組成物は、固形物、液状、粉末、顆粒状、ペースト状等の種々の形態であり、具体的には、例えば、清涼飲料、乳酸飲料、嗜好飲料、コーヒー、緑茶、紅茶、ウーロン茶などの飲料品；キャンディー、チョコレート、ビスケット類、菓子パン類、ケーキ、餅菓子、米菓類などの菓子類；果実飲料、野菜飲料、ジャム類、ペースト類などの野菜・果実加工品；日本酒、焼酎、ワイン、中国酒、ウイスキー、ウオッカ、ブランデー、ジン、ラム、酒、ビール、清涼アルコール飲料、果実酒、リキュールなどのアルコ−ル飲料；ヨーグルト、アイスクリーム、バター、チーズ、練乳、粉乳のなどの乳製品；ドレッシング、マヨネーズ、てんぷら油、サラダ油などの油脂加工品；しょうゆ、ソース、酢、みりん、ドレッシングタイプ調味料などの調味料；粉末ジュース、粉末スープ、インスタントコーヒー、即席麺類、即席カレー、即席味噌汁、調理済み食品、調理済み飲料、調理済みスープなどの乾燥飲食品、小麦粉加工品、でんぷん類加工品などの穀物加工品等が挙げられる。例えば飴、クッキー、チューインガム、ビスケットのような固形物として用いても、あるいは清涼飲料水、牛乳、ヨーグルト、シロップのような液状でもよい。飲食物とする場合、クエン酸、乳酸、カゼインなど、通常飲食物に使用される添加剤を配合することができる。
【００３２】
アクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有する医薬組成物薬剤、サプリメントまたはあるいは飲食物等の飲食用組成物におけるアクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物の含有量は、その剤型に応じて異なるが、通常アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体が、全組成物中の0.1〜50重量％、好ましくは0.1〜20重量％程度含まれていればよい。アクレアチン（aculeatin）またはアクレアチン類縁体の場合の摂取量は、摂取者の年齢、性別、体重、症状の種類、症状の程度などを考慮して適宜増減できるが、一日当たりの摂取量が0.01〜250mg/kgになるように、飲食品の形態に合わせて設定するのが好ましい。１日１回または数回に分けて投与、摂食等により摂取すればよい。
【００３３】
本発明のアクレアチン（aculeatin）、アクレアチン類縁体またはサルカケミカンの抽出物を含有する医薬組成物、サプリメントまたは飲食物等の飲食用組成物は、ヒトを含む哺乳動物を対象とする。ヒト以外の哺乳動物としては、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ等が挙げられる。
【実施例】
【００３４】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００３５】
[実施例１]  アクレアチン（aculeatin）およびアクレアチン類縁体の抽出・分離・精製
アクレアチン（aculeatin）およびアクレアチン類縁体の抽出には、サルカケミカンの茎部乾燥物を用いた。図１に示すように、乾燥物（乾燥重量1Kg）を粉砕し、ヘキサンで還流抽出することにより、ヘキサン抽出エキス（26 g）を調製した。得られたエキスについて、ダイヤイオン（商標）HP-20(三菱化学)を用いたカラムクロマトグラフィーを行い、アセトニトリルのグラジエントでFr.1-5の各画分に分離を行った。次に分取HPLCにより、Fr.3-1、2、3の単離・精製を行った。減圧下濃縮後、凍結乾燥で結晶化させることにより、白色板状晶としてアクレアチン（Fr.3-2）を3.0gの収量で単離した。また、アクレアチン類縁体であるトダクリン（Fr.3-3）、トッダノール(Fr.3-1)はそれぞれ110mg、14mgの収量で単離した。
【００３６】
アクレアチンの1H- 及び13C-NMR スペクトルの帰属データは図２及び図３に示した。図３中の番号は、図２の位置に相当する。
【００３７】
トダクリンの1H- 及び13C-NMR スペクトルの帰属データは図４及び図５に示した。図５中の番号は、図４の位置に相当する。
【００３８】
トッダノールの1H- 及び13C-NMR スペクトルの帰属データは図６及び図７に示した。図７中の番号は、図６の位置に相当する。
【００３９】
Fr.3-2の化合物は、無色プリズム状結晶として得られ、EIMSスペクトルにおいてm/z 291に分子イオンピークが観察されたことから、その分子式はC16H18O5であると予想された。13C-NMRは面積強度比から炭素数を推察するために逆ゲートデカップリング法で測定した。二次元相関法を用いて，1H及び13C-NMRで認められた各シグナルを帰属した(図２)。NMRの結果から本物質の構造は図３に示すような構造であると推察された。構造式をPub Chemで検索したところ，aculeatinと呼ばれる既知成分であった。今回測定した本物質の1H-NMRスペクトルはaculeatinの文献（藥學雜誌 111(7), 365-385)の帰属データと高い一致性を示した。以上の結果から、本物質はアクレアチン（aculeatin）であると同定した。同様の手法で同定したところ、Fr.3-3はトダクリン、Fr.3-1はトッダノールであり、アクレアチン類縁体として同定した。
【００４０】
[実施例２]  前駆脂肪細胞分化誘導促進活性評価
マウス前駆脂肪細胞（3T3-L1、以下、3T3-L1細胞という）（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手）は、通常培養条件下においては線維芽細胞様の形態を示す。3T3-L1細胞は、インスリン刺激を与えることにより、細胞内に脂肪粒を形成しながら、効率的に脂肪細胞へと分化するので、化合物による脂肪滴の蓄積増加活性を評価することで、脂肪細胞への分化誘導促進活性の評価が可能である。3T3-L1細胞の脂肪細胞への分化誘導は、以下の方法で行った。
【００４１】
培養した3T3-L1細胞をトリプシン処理により回収し、4℃、1000rpm、2分間遠心分離を行った後、培地（10%CS(子牛血清)を含むダルベッコ変法イーグル培地）を用いて5.0 x 104 細胞/mlとなるよう調整し、これを24ウェルマルチウェルプレートに0.5ml/wellにて分注した。培養プレートは、72時間、37℃、5％CO2存在下で培養後、各ウェルに1μMインスリンからなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）ならびにアクレアチン類縁体であるトダクリンおよびトッダノールを最終濃度が50μMになるように添加した。また、比較例として、インスリン感受性を高める作用を有するチアゾリン系薬剤であるピオグリタゾンを上記のアクレアチン等の場合と同様の方法で1μMになるように添加した。72時間後、培地を交換し、インシュリンとアクレアチンを再度同濃度添加した。その後、さらに4日間培養を行った。培地を除去した後、細胞を洗浄し、中性緩衝ホルマリン溶液0.2mlで細胞を固定した。15分静置後に洗浄液で洗浄し、オイルレッドO染色液0.2mlを加え、20分間静置した。水および洗浄液で洗浄した後、光学顕微鏡下で、脂肪滴の蓄積量の変化についてオイルレッドOによる染色像を観察し、溶解液をプレートリーダーで測定した。値は平均値±標準誤差（n=3）で示した。各群の有意差検定はDunnett検定を用いて評価した。結果を図８に示す。 
【００４２】
図８の結果より、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）およびアクレアチン類縁体は、優れた脂肪細胞分化誘導促進活性を有することが分かった。特にアクレアチンは最も強い脂肪細胞分化誘導促進活性を有することが分かった。
【００４３】
[実施例３]  グリセロール３リン酸脱水素酵素（GPDH）活性
次いで、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）ならびにアクレアチン類縁体であるトダクリンおよびトッダノールを用いて前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化に伴い上昇が認められるグリセロール３リン酸デヒドロゲナーゼ活性について検討を行った。
【００４４】
GPDH活性は、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）ならびにアクレアチン類縁体であるトダクリンおよびトッダノールを最終濃度が50μMになるように添加して測定した。また、比較例として、ピオグリタゾンを上記のアクレアチン等の場合と同様の方法で1μMになるように添加した。72時間後、培地を交換し、インシュリンとアクレアチンを再度同濃度添加した。その後、さらに4日間培養を行った。培地を除去した後、細胞を溶解し、GPDH活性を測定した。値は平均値±標準誤差（n=3）で示した。各群の有意差検定はDunnett検定を用いて評価した。結果を図９に示す。
【００４５】
図９の結果より、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）ならびにアクレアチン類縁体であるトダクリンおよびトッダノールにより3T3-L1細胞において濃度依存的なGPDH活性の上昇が認められることが分かった。
【００４６】
[実施例４]  DNAマイクロアレイ解析
次いで、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化における遺伝子発現解析の検討を行った。すなわち、インスリンからなる分化誘導剤とサルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）ならびにアクレアチン類縁体であるトダクリンおよびトッダノールを最終濃度が50μMとなるように添加し、7日後の3T3-L1細胞をTRIzol(商標)（ライフテクノロジーズ・ジャパン）で溶解し、TotalRNAを得た。TotalRNAからBiotin標識aRNAを作製し、三菱レイヨン製フォーカストアレイ・ジェノパールにハイブリダイズした。
【００４７】
遺伝子発現解析の結果、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）ならびにアクレアチン類縁体であるトダクリンおよびトッダノールにおいて、脂肪細胞分化のマーカーであるAp2、Cd36、AdipoqおよびGlut4の発現上昇が顕著であった。
【００４８】
DNAマイクロアレイの結果より、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）ならびにアクレアチン類縁体であるトダクリンおよびトッダノールには前駆脂肪細胞分化誘導促進活性を示すピオグリタゾンと同様の優れた脂肪蓄積促進活性を示すことが分かった。また、アクレアチンは、ピオグリタゾンのようなチアゾリジン系の薬剤とは全く異なる構造を有しており、同様の副作用を発現する可能性が低いと考えられる。
【００４９】
[実施例５]  脂肪分解促進活性評価
培養した3T3-L1細胞をトリプシン処理により回収し、4℃、1000rpm、2分間遠心分離を行った後、培地（10%CS(子牛血清)を含むダルベッコ変法イーグル培地）を用いて5.0 x 104 細胞/mlとなるよう調整し、これを24ウェルマルチウェルプレートに0.5ml/wellにて分注した。培養プレートは、72時間、37℃、5％CO2存在下で培養後、各ウェルにAdipogenesis Assay Kit（Cayman Chemical）に付属のイソブチルメチルキサンチン(IBMX)、デキサメタゾン、インスリンからなる分化誘導剤を培地に添加した。3日後に培地を交換し、さらに3日間培養を行い、細胞内に脂肪滴が十分に蓄積した成熟脂肪細胞に分化させた。培地を除去した後、アクレアチンを終濃度50、100、200μMになるように添加し、6時間培養を行った。また、比較例として、β３作動薬で、脂肪分解促進作用を有するイソプレテレノール（ISO）を上記のアクレアチンの場合と同様の方法で10μMになるように添加した。培養終了後に上清を回収し、上清中の遊離グリセロールを定量した。値は平均値±標準誤差（n=3）で示した。各群の有意差検定はDunnett検定を用いて評価した。結果を図１０に示す。
【００５０】
図１０の結果より、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）により3T3-L1成熟脂肪細胞において濃度依存的な脂肪分解促進活性の上昇が認められることが分かった。
【００５１】
[実施例６]  ２型糖尿病発症モデルKK-Ay/TaJclマウスを用いた血糖値上昇抑制
２型糖尿病発症モデルマウスとして5週齢の雄KK-Ay/TaJclマウスを日本クレア（株）より購入し、１週間の予備飼育後に実験を行った。マウスは温度22±2℃、湿度50±10％、午前７時〜午後７時の点灯条件下で42日間飼育した。飼育中は飼料および水は自由摂取させた。飼料はCE-2粉末飼料を基本とし、CE-2粉末飼料のみをコントロール群（7匹）、CE-2粉末飼料に0.1重量％となるようにアクレアチンを添加したものを0.1％アクレアチン投与群（8匹）とした。実験飼料を摂取させてから32日目に糖負荷試験を実施した。具体的には、一晩（約18時間）絶食させたマウスの血糖値を測定し、グルコース（2 g/Kg体重）を経口投与し、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。結果を図１１に示す。2群間の有意差検定はStudentのｔ-testを用いて評価した。
【００５２】
図１１の結果より、サルカケミカンに含まれるアクレアチン（aculeatin）は、２型糖尿病モデルマウス（KK-Ayマウス）において、コントロール群と比較して、糖負荷後の血糖値の上昇が有意に抑制されることが認められた。 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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