(57)【要約】【課題】拡張性心不全の病態に関与する因子を同定し、新たな拡張性心不全の治療ターゲットを提供する。【解決手段】ＩＬ−１６機能阻害因子を用いて拡張性心不全を治療する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１６機能阻害因子を含む、拡張性心不全を治療するための組成物。
【請求項２】
前記ＩＬ−１６機能阻害因子が、ＩＬ−１６タンパク質に対する中和抗体、アプタマーおよびデコイ核酸からなる群より選択されるＩＬ−１６活性抑制因子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＩＬ−１６機能阻害因子が、ＩＬ−１６遺伝子に対するアンチセンス核酸、リボザイムおよびｓｉＲＮＡからなる群より選択されるＩＬ−１６発現阻害因子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ＩＬ−１６機能阻害因子を備えている、拡張性心不全を治療するためのキット。
【請求項５】
被験体から取得したサンプル中のＩＬ−１６タンパク質またはＩＬ−１６  ｍＲＮＡの量を測定する工程を包含する、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断するためのデータを取得する方法。
【請求項６】
前記工程によって得られた測定値を基準値と比較する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＩＬ−１６結合因子を含んでいる、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断するための組成物。
【請求項８】
前記ＩＬ−１６結合因子が、ＩＬ−１６タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはポリヌクレオチド、およびＩＬ−１６遺伝子に特異的に結合するポリヌクレオチドからなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
ＩＬ−１６結合因子を備えている、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、拡張性心不全を治療または診断するための組成物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全患者は、日本に２００万人以上存在すると推定される。心不全は、日本を含む先進国の主要な死因であり、また、患者の生活の質を低下させている。心不全は、左心室が拡大してその動きが低下する（左室駆出率が低下する）収縮性心不全と、左心室が拡大せず左室駆出率も保持されている拡張性心不全とに分類される。心不全患者における両者の比率は約３：２であり、いずれも予後不良である。
【０００３】
収縮性心不全では、予後改善効果のある治療法が複数知られている。日米欧の循環器学会がそれぞれ作成している治療ガイドラインに、いくつかの標準的な治療法が記載され、生命予後は過去二十年間において改善傾向にある。近年、収縮性心不全の発症や進展における免疫系の関与が注目されている。収縮性心不全では、いくつかの炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６等）の関与が報告されており、実際にこれらのサイトカインの血中濃度が高値であるほど予後不良であることが明らかになっている。
【０００４】
しかし、拡張性心不全では、有効な治療法が全く確立しておらず、生命予後は過去二十年間において改善していない。特に、収縮性心不全の増悪への関与が報告されている上記炎症性サイトカインは、拡張性心不全に対する効果を示さない。もちろん、収縮性心不全に効果がない炎症性サイトカインの中で拡張性心不全に有効であることが示された例は存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０１１５７２  Ａ１（２０１２年１月２６日国際公開）
【特許文献２】ＷＯ２００８／０５２１６５  Ａ１（２００８年５月２日国際公開）
【特許文献３】ＵＳ２００８／０３１１１２８  Ａ１（２００８年１２月１８日公開）
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Keates AC et al., Gastroenterology 2000; 119: pp.972-982
【非特許文献２】Skundric DS et al., J Neuroinflammation 2006; 3: pp.13
【非特許文献３】Hessel EM et al., J Immunol. 1998; 160: pp.2998-3005
【非特許文献４】Meagher C et al., Diabetes 2010; 59: pp.2862-2871
【非特許文献５】Kimura N. et al., J Heart Lung Transplant 2011; 30: pp.1409-17
【非特許文献６】William G. Glass et al., Cytokine 2009; 46: pp.17-23
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
拡張性心不全は、高齢者、女性に多いため、心不全全体に占める患者の割合は先進国にて年々増加しており、この病態に対する治療方法の確立は急務である。本発明者らは、カルニチンまたはその誘導体が拡張性心不全の予防および治療に有効であることを見出している（特許文献１）。しかし、拡張性心不全の治療方法を確立するために、特許文献１に記載の技術以外にも新たな知見が求められている。
【０００８】
本発明の目的は、拡張性心不全の病態に関与する因子を同定し、新たな拡張性心不全の治療ターゲットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、独自の観点に基づいて、インターロイキン−１６（Interleukin-16；ＩＬ−１６）が拡張性心不全の病態に関与すること、そしてＩＬ−１６が拡張性心不全の原因である左室線維化による左室スティフネス増大へ作用すること、ＩＬ−１６中和抗体の投与によってマウスモデルにおける左室線維化が抑制されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、拡張性心不全を治療するための医薬組成物を提供し、本組成物はＩＬ−１６機能阻害因子を含むことを特徴としている。
【００１１】
ＩＬ−１６は、ヒト末梢血単核細胞によって生成されるＴ細胞誘引物質として最初に報告され、いくつかの炎症性疾患、アレルギー性疾患または感染性疾患の主要なメディエータであることが示されている（非特許文献１〜３）。また、ＩＬ−１６を中和することによって糖尿病モデルマウスをＩ型糖尿病から保護すること（非特許文献４）、心移植モデルマウスにおいてＩＬ−１６を欠損させることによって移植片拒絶が抑制されること（非特許文献５）が報告されている。これらの報告は、拡張性心不全の治療におけるＩＬ−１６の有効性を何ら示唆しない。
【００１２】
さらに、特許文献２および３には、抗ＩＬ−１６抗体を用いて病的な肺やブレオマイシン関連肺線維症を処置することが開示されている。しかし、特許文献２および３の発明者らは、さらに研究を進めることによって、ＩＬ−１６ノックアウトマウスにおいて、ＩＬ−１６によるブレオマイシン誘発性肺線維症の抑制効果がないことを確認し、その結果、ＩＬ−１６は、原発性肺線維症のバイオマーカーの候補であるが、ブレオマイシン誘発性の肺線維症の発症に無関係であると結論付けている（非特許文献６）。これらの報告もまた、拡張性心不全の治療におけるＩＬ−１６の有効性を何ら示唆しない。
【００１３】
本発明において、上記ＩＬ−１６機能阻害因子は、ＩＬ−１６活性抑制因子、ＩＬ−１６発現阻害因子およびＩＬ−１６レセプターアンタゴニストからなる群より選択されることが好ましい。
【００１４】
本発明はまた、拡張性心不全を治療するためのキットを提供し、本キットはＩＬ−１６機能阻害因子を含むことを特徴としている。
【００１５】
本発明はさらに、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断する方法を提供する。本方法は、被験体から取得したサンプル中のＩＬ−１６タンパク質またはＩＬ−１６  ｍＲＮＡの量を測定する工程を包含することを特徴としており、測定値を基準値と比較する工程をさらに包含することが好ましい。
【００１６】
本発明は、上記方法に用いるためのマーカー組成物を提供し、本組成物は、ＩＬ−１６結合因子を含んでいることを特徴としている。本発明において、ＩＬ−１６結合因子は、ＩＬ−１６タンパク質に特異的に結合する抗体もしくはポリヌクレオチド、およびＩＬ−１６遺伝子に特異的に結合するポリヌクレオチドからなる群より選択されることが好ましく、標識化されていることがより好ましい。
【００１７】
本発明はまた、上記方法に用いるためのマーカーキットを提供し、本キットは、ＩＬ−１６結合因子を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１８】
本発明を用いれば、拡張性心不全を治療することができ、これにより、拡張性心不全を誘発する原疾患の症状を緩和させる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ａは、コントロールおよび拡張性心不全患者における血清ＩＬ−１６レベルを示す。Ｂは、血清ＩＬ−１６レベルと、拡張早期左室流入血流速度／僧帽弁輪部移動速度比（Ｅ／ｅ’）との相関を示す。Ｃは、血清ＩＬ−１６レベルと、左心房容積インデックス（ＬＡＶＩ）との相関を示す。Ｄは、血清ＩＬ−１６レベルと、拡張期左室壁ストレイン（ＤＷＳ）との相関を示す。
【図２】Ａは、コントロールラットおよび拡張性心不全のモデルラットにおける血清ＩＬ−１６レベルを示す。Ｂは、血清ＩＬ−１６レベルと、左心室拡張末期圧との相関を示す。Ｃは、血清ＩＬ−１６レベルと、肺重量と体重との比（肺重量／体重）との相関を示す。Ｄは、血清ＩＬ−１６レベルと、心筋スティフネス定数との相関を示す。Ｅは、コントロールおよび拡張性心不全ラットの左心室におけるＩＬ−１６のｍＲＮＡレベルを示す。Ｆは、培養心筋細胞のＩＬ−１６  ｍＲＮＡレベルに対するリポ多糖（ＬＰＳ）の効果を示す（ｎ＝５／各群）。
【図３】Ａは、非トランスジェニックマウス（Ｎｏｎ−ＴＧ）およびトランスジェニックマウス（ＴＧ）における、心臓でのＩＬ−１６タンパク質の発現を示す。Ｂは、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色した、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスからの心臓の４房室を示す（バーは１ｍｍ）。Ｃは、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスの、シリウスレッド染色の心切片の顕微鏡写真の代表例、および線維化領域（ＡＯＦ）の割合を示す（バーは１００μｍ）。Ｄは、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスの、ヤング率ＥＨを示す。Ｅは、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスの、左心室におけるＣｏｌｌａｇｅｎ  ＩのｍＲＮＡレベルを示す。Ｆは、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスの、左心室におけるＴＧＦ−β１のｍＲＮＡレベルを示す。Ｇは、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスの、左心室におけるＣＴＧＦのｍＲＮＡレベルを示す。Ｈは、ＴＧマウスの左心室におけるＩＬ−１６のｍＲＮＡレベルとＡＯＦとの相関を示す。Ｉは、ＴＧマウスの左心室におけるＩＬ−１６のｍＲＮＡレベルとヤング率ＥＨとの相関を示す。
【図４】Ａは、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスのＣＤ６８について、左心室の免疫組織化学染色の顕微鏡写真の代表例を示す（バーは１００μｍ）。Ｂは、Ｎｏｎ−ＴＧマウスおよびＴＧマウスの左心室におけるＣＤ６８のｍＲＮＡレベルを示す。Ｃは、マウスリコンビナントＩＬ−１６（ｍＩＬ−１６）で処理したマクロファージによるＴＧＦ−β１の産生を示す。マウス腹腔マクロファージ（２×１０６細胞／ウエル）を、示された濃度のｍＩＬ−１６で２４時間処理した。マクロファージ培養物の上清を回収し、ＴＧＦ−β１を測定した。各群についてｎ＝５。＊０ｎｇ／ｍＬ群と比較してＰ＜０．０５。
【図５】Ａは、コントロールマウスと、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）を１４日間投与したマウスの左心室におけるＩＬ−１６のｍＲＮＡレベルを示す。Ｂは、シリウスレッド染色した心切片の顕微鏡写真の代表例、ならびに、コントロールマウス、および、Ａｎｇ  ＩＩを２８日間投与し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または抗ＩＬ−１６中和抗体（Ｎ−Ａｂ）を腹腔内投与したマウスの、線維化領域（ＡＯＦ）の割合を示す（バーは１００μｍ）。＊コントロール群と比較してＰ＜０．０５。†ＰＢＳ処理したＡｎｇ  ＩＩ投与マウスと比較してＰ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ〜Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
【００２１】
〔１：ＩＬ−１６機能阻害因子〕
本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１６機能阻害因子」は、心臓にて発現されているＩＬ−１６タンパク質の機能を阻害する物質であることが好ましいが、内因性のＩＬ−１６タンパク質の機能を阻害する物質であれば特に限定されない。また、「ＩＬ−１６機能阻害因子」は、精製された化合物の形態であっても、その薬学的に受容可能な塩の形態であってもよい。
【００２２】
「ＩＬ−１６機能」は、非特許文献１〜４に開示されているようなＴ細胞誘引物質としての機能、炎症性疾患、アレルギー性疾患または感染性疾患におけるメディエータとしての機能が含まれてもよいが、本明細書中で使用される場合、拡張性心不全を誘発する機能が意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１６機能阻害」は、ＩＬ−１６を標的として拡張性心不全を抑制することが意図される。用語「阻害」は、目的の活性が、コントロールと比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、なおさらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは１００％低減されている状態が意図される。
【００２３】
本発明に利用されるＩＬ−１６機能阻害因子は、ＩＬ−１６活性抑制因子、ＩＬ−１６発現阻害因子およびＩＬ−１６レセプターアンタゴニストからなる群より選択され得る。
【００２４】
本発明に好適に利用されるＩＬ−１６活性抑制因子としては、ＩＬ−１６タンパク質に結合してその機能を阻害するものであれば特に限定されず、例えば、ＩＬ−１６に対する中和抗体、アプタマー、デコイ核酸等が挙げられ、従来公知のものであってもよい。
【００２５】
本発明に好適に利用されるＩＬ−１６発現阻害因子としては、ＩＬ−１６遺伝子に特異的に結合してＩＬ−１６タンパク質の発現を抑制するものであれば特に限定されず、ＩＬ−１６遺伝子の発現を抑制するものが好ましく、例えば、ＩＬ−１６遺伝子アンチセンス核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等が挙げられ、従来公知のものであってもよい。
【００２６】
ＩＬ−１６レセプターアンタゴニストもまた、本発明に好適に利用される。また、ＣＤ４がＩＬ−１６のレセプターとして機能していることがすでに知られているので、ＣＤ４の機能を阻害するものや、ＣＤ４遺伝子の発現を抑制するものもまた、本発明に利用されるＩＬ−１６レセプターアンタゴニストであり得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。「抗体」は、種々の公知の方法に従えば作製することができる。そして、作製された抗体から所望の中和活性を有しているものが中和抗体として選択されればよい。
【００２８】
本発明に利用可能なＩＬ−１６に対する中和抗体は、少なくとも、ＩＬ−１６を認識しかつその活性を阻害する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含んでいればよく、個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのでない。すなわち、ＩＬ−１６を認識しかつその活性を阻害する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンもまた、本発明に利用可能である。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」、「遺伝子配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、結合標的の遺伝子配列の相補配列であってもよい。また、用語「遺伝子」および「（ポリ）ヌクレオチド」はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００３０】
本発明に利用可能なポリヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチド（例えば、ＩＬ−１６タンパク質をコードするｃＤＮＡ全長からなるポリヌクレオチド）の切断フラグメントとして生成されても、化学合成されても、あるいはＰＣＲ増幅によって取得されてもよい。ＩＬ−１６遺伝子の塩基配列は、ＩＬ−１６タンパク質のアミノ酸配列とともにすでに知られているので、当業者は，本発明に利用可能なポリヌクレオチドを容易に作製することができる。
【００３１】
アプタマーは、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡからなり、対応するタンパク質に対して非常に高い親和性および特異性を有する。これまでに、医学関連の標的タンパク質に対するいくつかのアプタマーが同定されている。本発明に利用されるポリヌクレオチドがアプタマーである場合、ポリヌクレオチドは、１０〜１００塩基長からなるポリヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは１５〜７０塩基長、さらに好ましくは２０〜５０塩基長からなるポリヌクレオチドである。
【００３２】
二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始されるＲＮＡｉは、ｓｉＲＮＡによって相同なＲＮＡの分解が引き起こされる、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングプロセスである。ｓｉＲＮＡは、遺伝子特異的な発現抑制を行うためには十分な長さを有していることが必要とされるが、哺乳動物細胞中での悪影響を回避するために十分に短いことが必要とされる。よって、本発明に利用されるポリヌクレオチドがｓｉＲＮＡである場合、ポリヌクレオチドは、１５〜５０塩基長からなるヌクレオチドの塩基対であることが好ましく、より好ましくは１５〜４０塩基長、さらに好ましくは１８〜３０塩基長からなるヌクレオチドの塩基対である。
【００３３】
〔２：ＩＬ−１６機能阻害因子を含む医薬組成物〕
本発明は、拡張性心不全を治療するための医薬組成物を提供し、本組成物はＩＬ−１６機能阻害因子を含むことを特徴としている。本明細書中にて使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。
【００３４】
本実施形態に係る医薬組成物は、製薬分野における公知の方法により製造することができる。本実施形態に係る医薬組成物におけるＩＬ−１６機能阻害因子の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬組成物を用いて後述の投与量範囲でＩＬ−１６機能阻害因子を投与できるような量であれば特に限定されない。
【００３５】
本実施形態に係る医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与することができる。投与方法も特に限定はなく、内用、外用および注射によることができる。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内、胸腔内、腹腔内等に投与することができる。
【００３６】
本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定されればよく一定であることを要しない。投与は、所望の投与量範囲内において、一日内において単回で、または数回に分けて行ってもよい。また、本実施形態に係る医薬組成物はそのまま経口投与するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
【００３７】
本発明に係る医薬組成物中に使用される医薬用担体は、医薬組成物の投与形態および剤型に応じて選択することができる。経口剤の場合、例えばデンプン、乳糖、白糖、マンニット、無機塩等が医薬用担体として利用される。非経口剤の場合、当該分野において公知の方法に従って、本発明の有効成分（すなわちＩＬ−１６機能阻害因子）を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液等に溶解し、所望によって殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることにより調製することができ、また、患部に塗布可能な形態にて調製されてもよい。
【００３８】
本発明に係る医薬組成物を使用すれば、拡張性心不全を治療することができる。これにより、拡張性心不全を誘発する原疾患の症状を緩和させる可能性がある。拡張性心不全を誘発する原疾患としては、高血圧性心疾患、虚血性心疾患、弁膜疾患、心筋症、心筋蓄積疾患等が挙げられる。
【００３９】
〔３．さらなる利用〕
本発明はまた、ＩＬ−１６機能阻害因子、またはＩＬ−１６機能阻害因子を含む医薬組成物を備えたキットを提供する。
【００４０】
本明細書中にて使用される場合、「キット」は、組成物中に含有されるべき各種成分が容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）に含まれておりかつ容器の全てが全体として１つに梱包されている形態が意図される。本明細書中にてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、組成物中に含有されるべき成分が、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、キットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であってもよく、異なる２つ以上の成分を同一の容器に混合して備えてもよい。また、キットは、本発明を実行するために用いられるべき器具を備えていてもよい。キットは、上記成分を使用する手順（拡張性心不全を治療するための手順）を記載した指示書を備えていることが好ましい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。キットは、上述した組成物を構成するために用いられてもよく、組成物とさらなる成分とを別々に備えていてもよい。
【００４１】
なお、本キットは、ＩＬ−１６機能阻害因子を含む医薬組成物を調製するためのキットとして用いられてもよい。その場合、キットは、上記成分を使用する手順として拡張性心不全を治療するための組成物を調製するための手順を記載した指示書を備えていることが好ましい。
【００４２】
後述する実施例に示すように、ＩＬ−１６は拡張性心不全患者の血清中で高値である。このことは、ＩＬ−１６濃度を測定すれば、拡張性心不全の発症または発症可能性の予測が可能であることを示している。（また、ＩＬ−１６濃度の上昇は、ｍＲＮＡ発現量を伴っていた。このことは、ｍＲＮＡ発現量に基づいて、拡張性心不全の発症または発症可能性の予測が可能であることを示している。）
すなわち、本発明は、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断する方法を提供する。本発明に係る方法は、拡張性心不全の発症または発症可能性の診断を補助する方法でもあり得、具体的には、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断するためのデータを取得する方法でもあり得る。本発明に係る方法は、被験体から取得したサンプル（被験体サンプル）中のＩＬ−１６タンパク質および／またはＩＬ−１６  ｍＲＮＡの量を測定する工程を包含すればよく、測定値を基準値と比較する工程をさらに包含することが好ましい。基準値は、予め取得された値が用いられても、本発明の方法の一部として、上記工程と同様の手順によって取得されてもよい。基準値は、正常患者から取得したサンプル中のＩＬ−１６タンパク質またはＩＬ−１６  ｍＲＮＡの量であることが好ましく、収縮性心不全患者から取得したサンプル中のＩＬ−１６タンパク質および／またはＩＬ−１６  ｍＲＮＡの量であることがより好ましい。
【００４３】
用語「サンプル」は当該分野において標本、調製物と同義で用いられ、本明細書中で使用される場合、「生物学的サンプル」またはその等価物が意図される。「生物学的サンプル」は、供給源としての生物材料（例えば、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる、任意の調製物が意図される。
【００４４】
好ましい生物学的サンプルは、被験体サンプルである。被験体サンプルしては、例えば、体液（例えば末梢血）、種々の組織の生検などが挙げられ、哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。また、得られたサンプル中の細胞を培養して増殖させたものが用いられてもよい。なお、本明細書中で使用される場合、「被験体サンプル」は「生体から分離された試料」と交換可能に使用され、医師によって、または医師の監督下での専門の知識を有する者によって、生体から分離された試料（サンプル）が意図される。
【００４５】
また、本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプル以外に、上記生物学的サンプルから抽出したタンパク質サンプル、ゲノムＤＮＡサンプルおよび／または総ＲＮＡサンプルも挙げられる。
【００４６】
ＩＬ−１６タンパク質またはＩＬ−１６  ｍＲＮＡの量の測定には、ＩＬ−１６結合因子が用いられればよい。本明細書中で使用される場合、「ＩＬ−１６結合因子」は、ＩＬ−１６タンパク質またはＩＬ−１６遺伝子に特異的に結合する物質であれば特に限定されず、ＩＬ−１６機能を阻害する活性を有していなくてもよい。種々のサイトカインの測定と同様に、本発明に好適に利用されるＩＬ−１６結合因子としては、ＩＬ−１６タンパク質に特異的に結合する抗体またはポリヌクレオチドや、ＩＬ−１６遺伝子に特異的に結合するポリヌクレオチドが好ましく、これらはいずれも標識化されていることが好ましい。また、測定手順は、種々のサイトカインと同様に従来公知の手法が用いられればよい。
【００４７】
本発明に係る方法を実行するための組成物およびキットもまた、本発明の範囲内に含まれる。この場合、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断するための組成物は、ＩＬ−１６結合因子を含んでいることを特徴としており、拡張性心不全の発症または発症可能性を診断するためのキットは、ＩＬ−１６結合因子を備えていることを特徴とし、好ましくは拡張性心不全の発症または発症可能性を診断するための手順を記載した指示書を備えている。なお、上記ＩＬ−１６結合因子は、標的であるＩＬ−１６タンパク質またはＩＬ−１６遺伝子に特異的に結合すればよく、ＩＬ−１６タンパク質に特異的に結合する抗体またはポリヌクレオチドや、ＩＬ−１６遺伝子に特異的に結合するポリヌクレオチドが好ましく、ＩＬ−１６機能を阻害する活性を有していなくてもよい。
【００４８】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００４９】
〔実施例〕
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これらに限定されるべきではない。
【００５０】
〔Ｉ．手順〕
臨床的研究は、大阪大学病院倫理委員会によって承認され、the Declaration of Helsinkiに従って行われた。実験的研究は、大阪大学医学部の施設倫理委員会によって承認され、the United States National Institutes of Healthによって刊行されたthe Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従った。
【００５１】
血液サンプルおよび心エコー図を、大阪大学病院にて心疾患のための入院歴を有する患者から得た。心疾患を、the Framingham Heart Study projectに使用された基準に従って臨床的に診断した。左心室ＥＦが４０％よりも高い患者および４０％以下の患者をそれぞれ左室駆出率が保持されている心不全（拡張性心不全；ＨＦｐＥＦ）および左室駆出率が低下している心不全（収縮性心不全；ＨＦｒＥＦ）と規定した。健康なボランティアをコントロール群とした。
【００５２】
ヒト被験体における経胸壁心エコー撮影を、標準的な技術に従って実施した。左心室質量インデックスおよび相対的壁厚（ＲＷＴ）を算出し、拡張早期左室流入血流速度（Ｅ）をドプラ脈波によって測定し、僧帽弁輪部移動速度比（ｅ’）を、標準的な方法を用いる組織ドプラスペクトル画像撮影によって測定した。左心房容インデックス（ＬＡＶＩ）、拡張期左室壁ストレイン（ＤＷＳ）および左心室の受動的スティフネスを算出した。これらの手順については、Takeda Y et al., J Card Fail. 2009; 15: 68-77, Lang RM et al., J Am Soc Echocardiogr. 2005; 18: 1440-1463, Lester SJ et al., Am J Cardiol. 1999; 84: 829-832、およびOhtani T et al., Eur Heart J. 2012; 33: 1742-1749 を参照のこと。
【００５３】
ヒト血清サンプルを、Bio-Plex human cytokine 23-plex and 27-plex panel assay (Bio-Rad)を用いて分析した。
【００５４】
高血圧ＨＦｐＥＦモデルとして雄のＤａｈｌ食塩感受性ラット（ＳＬＣ  Ｊａｐａｎ）に、高塩（８％ＮａＣｌ）の食餌（Oriental Yeast Co.）を６週齢から与え、２１週齢あたりで分析した。０．３％ＮａＣｌの餌を給餌した雄のＤａｈｌ食塩感受性ラットを、週齢を合わせたコントロールとした。
【００５５】
麻酔後に、経胸壁心エコー撮影を行い、Ｍモードの心エコー図を記録した。１．５Ｆで、高フィデラリティの血圧計を搭載したカテーテル（SPR-407, Millar Instruments）を、左心室へ導入して、左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）、時定数および左室心筋スティフネス定数（ＭＳＣ）を測定した。これらの手順については、Kamimura D et al., Eur Heart J. 2012; 33: 1408-1416を参照のこと。
【００５６】
マウスＩＬ−１６  ｍＲＮＡを単離し、α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ）プロモータを含むプラスミドにクローニングした。この構築物を、ＢＤＦ１（Ｃ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２）マウス接合子の前核へマイクロインジェクトした。ＩＬ−１６トランスジェニック（ＴＧ）マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ  Ｊａｐａｎ）と交配させ、雄のＦ２マウスを本研究に使用した。ＴＧマウスの同腹子を、非トランスジェニック（非ＴＧ）マウスとして用いた。全てのマウスを２０〜２２週齢にて分析した。
【００５７】
Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ（Ａｎｇ  ＩＩ）の投与（１．２ｍｇ／ｋｇ／日；A-9525, Sigma-Aldrich, Inc.）のために、ＡＬＺＥＴ浸透ミニポンプ（DURECT Corp.）を、８〜１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ  Ｊａｐａｎ）の皮下に埋め込んだ。ＩＬ−１６の効果をブロックするために、Ａｎｇ−ＩＩ処理したマウスの群に、抗ＩＬ−１６モノクローナル中和抗体クローン１４．１（BD Biosciences）を注入した。これらの手順については、Meagher C et al., Diabetes 2010; 59: 2862-2871およびKimura N et al., J Heart Lung Transplant. 2011; 30: 1409-1417を参照のこと。
【００５８】
経胸壁心エコー撮影を、意識のあるマウスにて行った。心エコー撮影の後に、マウスを適切に麻酔し、心臓および肺を迅速に取り出し、次いで、心臓を直ちに潅流し、心筋スティフネス、免疫組織化学、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの測定、ならびにシリウスレッド染色のために、左心室サンプルを得た。
【００５９】
除膜したマウス左心室筋肉を調製し、バルーン型センシングシステムを用いて心筋スティフネスを評価した。これらの手順については、Terui T et al., J Gen Physiol. 2010; 136: 469-482およびIshii R et al., Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2011: 904-907を参照のこと。
【００６０】
タンパク質をマウス左心室から抽出した。ＧＡＰＤＨタンパク質レベルおよびＩＬ−１６タンパク質レベルを、ＧＡＰＤＨに対するウサギポリクローナル抗体（１：１００００希釈、Santa Cruz Biotechnology, Inc.）およびＩＬ−１６に対するラットモノクローナル抗体（１:２００希釈、clone 228109, R&D Systems）を用いて評価した。クリオスタットによる、マウスの左心室の横断切片を、ラット抗マウスＣＤ６８モノクローナル抗体（１：２００希釈、clone FA-11, Serotec）で染色した。これらの手順については、Ohtani T et al., J Hypertens. 2009; 27: 1074-1083 およびYoshida J et al., Hypertension 2004; 43: 686-691を参照のこと。
【００６１】
National Institutes of Health ImageJ Version 1.45ソフトウエアを使用し、シリウスレッド染色した切片上で心筋線維化の量を調べた。手順については、Shimoyama M et al., Circulation. 1999; 100: 2449-2454 およびDoser TA et al., Circulation. 2009; 119: 1941-1949を参照のこと。
【００６２】
新生仔ラットの心室筋細胞を探知した。ＩＬ−６  ｍＲＮＡレベルを評価するために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１１１（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｗａｋｏ）からのリポ多糖（ＬＰＳ）を用いて、心筋細胞を４８時間にわたって刺激した。腹腔マクロファージを、６〜８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ  Ｊａｐａｎ）より得て、マウスリコンビナントＩＬ−１６（Shenandoah Biotechnology Inc.）を含む無血清培地中で２４時間インキュベートした。細胞培養物から上清を回収した。
【００６３】
ヒト血清およびラット血清におけるＩＬ−１６の濃度を、市販の酵素免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（ヒトＩＬ−１６特異的（R&D Systems）およびラットＩＬ−１６特異的（Cusabio））によって測定した。マクロファージ培養培地中のＴＧＦ−β１の濃度を、マウスＴＧＦ−β１に対する市販のＥＬＩＳＡキット（R&D Systems）を用いて測定した。
【００６４】
総ＲＮＡを、左心室または培養心筋細胞より単離し、これらのｍＲＮＡレベルを、ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection System and Software (Applied Biosystems)を用いるリアルタイムＰＣＲによって定量化した。全てのデータを、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。
【００６５】
データを平均±ＳＥＭとして示した。データを、統計ソフトウエア（StatView version 5.0, SAS Institute Inc.）を用いて分析した。連続および不連続の変数における二群間での差異を、それぞれ独立スチューデントｔ検定およびフィッシャー正確確率検定を用いて分析した。２つよりも多い群の間での差異を、一因子ＡＮＯＶＡおよびTukey-Kramerの多重比較検定によって調べた。ピアソンの積率相関係数を用いて相関を調べた。Ｐ値＜０．０５を、統計学的な有意差とみなした。
【００６６】
〔ＩＩ．結果〕
〔１．心不全患者における検討〕
拡張性心不全に関与する免疫液性因子の候補をスクリーニングした。心不全患者（収縮不全１０名、拡張性心不全１１名）および健常人（９名）の血清サンプルにおいて、ＢｉｏＰｌｅｘ法を用いて液性因子５０項目を網羅的に測定し、その結果から、ＩＬ−１６が拡張性心不全と健常人との差が最も顕著であることを見出した。
【００６７】
さらに症例数を増やし、ＥＬＩＳＡ法にて確認したところ、拡張性心不全患者の血清では、ＩＬ−１６濃度の明らかな増加が認められた（図１Ａ）。
【００６８】
血清ＩＬ−１６濃度と左室拡張機能を反映する指標との関連を調べたところ、ＩＬ−１６濃度が高いほどＥ／ｅ’およびＬＡＶＩが高値であり、ＤＷＳが低値であるという有意な相関関係があることがわかった（図１Ｂ〜Ｄ）。このことは、血清ＩＬ−１６値が拡張機能異常を反映していることを示している。
【００６９】
〔２．拡張性心不全動物モデルを用いた検討〕
本発明者らは、ダール食塩感受性ラットを用いた拡張性心不全モデルを確立しており（J. Hypertens. (2000) 18: 111-20）、このモデルラットを用いて拡張性心不全の病態解析をこれまで行っている。この拡張性心不全モデルラットを用いて拡張性心不全におけるＩＬ−１６の関与を検討した。
【００７０】
まず、心不全期（２０週齢）におけるダールラット拡張性心不全モデルの血清ＩＬ−１６濃度をＥＬＩＳＡにて測定した。その結果、ヒトの場合と同様に、拡張性心不全群（ＨＦｐＥＦ）にて血清ＩＬ−１６濃度が高値であることがわかった（図２Ａ）。さらに、心不全の指標としての左室拡張末期圧および肺重量が血清ＩＬ−１６濃度と相関していることも確認され（図２Ｂ〜Ｃ）。左室の硬さを反映する左室スティフネスの指標であるＭＳＣもまた、血清ＩＬ−１６濃度との有意な相関を示していることも確認された（図２Ｄ）。これらの結果は、血清ＩＬ−１６濃度が高いほど左室スティフネスが増大し、心不全を呈しやすいことが示し、ＩＬ−１６が拡張性心不全の診断マーカーとして有効であることを示している。
【００７１】
また、拡張性心不全モデルラットの心臓中においてＩＬ−１６  ｍＲＮＡの増加が観察されること（図２Ｅ）、培養心筋細胞においてもＩＬ−１６  ｍＲＮＡの発現が認められ、その発現量がＬＰＳ刺激で増大すること（図２Ｆ）もわかった。これらのことから、心臓中の心筋細胞がＩＬ−１６の産生源の一つであることが示唆された。
【００７２】
ＬＰＳは、ＮＦ−κＢ活性を亢進させることが知られている。心不全において産生が亢進する活性酸素・炎症性サイトカインもまた、ＬＰＳと同様にＮＦ−κＢ活性を亢進させる。このことから、拡張性心不全の心臓では活性酸素・炎症性サイトカイン産生の亢進等を介して心筋細胞がＩＬ−１６を産生している可能性が示唆される。
【００７３】
〔３．心臓におけるＩＬ−１６過剰発現モデルを用いた検討〕
心臓におけるＩＬ−１６発現量の増加の効果を直接的に検討するため、心臓においてＩＬ−１６が過剰に発現しているマウスを作製した。このマウスの心臓中では、活性型のＩＬ−１６タンパク質の発現が亢進しており（図３Ａ）、心房の拡大が確認された（図３Ｂ）。このマウスの心臓組織中では線維化が亢進しており（図３Ｃ）、ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｉ  ｍＲＮＡの増加、線維化に関与する遺伝子（ＴＧＦ−β、ＣＴＧＦなど）の発現増加も確認された。また、左室スティフネス計測指標は、ＩＬ−１６過剰発現マウスにて増加していた。心臓線維化の程度および左室スティフネス増大の程度は、心臓でのＩＬ−１６発現量に比例していた（図３ＨおよびＩ）。
【００７４】
さらに、ＩＬ−１６過剰発現マウスの心臓中ではマクロファージの増加が認められた（図４ＡおよびＢ）。マクロファージは炎症、線維化の役割を担っているため、マウス腹腔マクロファージを用いて、マクロファージに対するＩＬ−１６の直接的な作用を検討した。その結果、ＩＬ−１６は濃度依存性にマクロファージからの強い線維化促進因子であるＴＧＦ−β１の分泌を亢進させることがわかった（図４Ｃ）。
【００７５】
〔４．ＩＬ−１６中和抗体の効果の検討〕
Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩを持続的に投与（１．２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙを２週間投与）したマウスの心臓において、ＩＬ−１６遺伝子発現の亢進が確認され、４週間投与でこのマウスの心臓における線維化が確認された（図５ＡおよびＢ）。このマウスに対してＩＬ−１６中和抗体を腹腔内に投与したところ、心臓における線維化が抑制された。
【００７６】
〔ＩＩＩ．考察〕
拡張性心不全患者において血清ＩＬ−１６は高値であり、この濃度増加は拡張性心不全の主要因である左室拡張機能障害の指標の悪化を反映していた。拡張性心不全ラットモデルにおける高値の血清ＩＬ−１６は、左室拡張機能の中で心不全の顕在化に強く関与しているとされる左室スティフネスの増加と関連していることが確認された。
【００７７】
心臓におけるＩＬ−１６の発現量を増加させると、左室線維化増加およびこれに起因すると考えられる左室スティフネスの増加が確認され、心臓中でのＩＬ−１６の増加が拡張性心不全発症の病態に関与していることが示された。さらに、ＩＬ−１６中和抗体を投与することにより、マウスモデルにおける左室線維化が抑制され、ＩＬ−１６抑制の効果が実証された。
【００７８】
このように、ＩＬ−１６が拡張性心不全の病態に関与すること、そしてＩＬ−１６が拡張性心不全の原因である左室線維化による左室スティフネス増大へ作用することが示された。ＩＬ−１６のこのような機能は、従来知られていたＩＬ−１６の機能と関連するものでなく、予測し得たものでない。また、このような機能を有するサイトカインはこれまで知られていない。拡張性心不全に対する治療ターゲットの一つの候補としてＩＬ−１６が非常に有望であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によって、拡張性心不全を治療および診断することができるので、医薬分野における開発に寄与することができる。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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