(57)【要約】      （修正有）【課題】積極的かつ短時間に脱核を誘導する方法及び脱核赤血球の生存率を向上させる方法を提供する。【解決手段】造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、及び／又は赤芽球を1.0％〜18.0％の酸素条件下の培養液で培養することを特徴とする赤芽球の脱核方法及び／又は脱核赤血球の維持方法。前記酸素条件が2.0％〜10.0％である方法。前記培養液に、プロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物を含む方法。前記化合物は、ACTHである方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、及び／又は赤芽球を1.0％〜18.0％の酸素条件下の培養液で培養することを特徴とする赤芽球の脱核方法及び／又は脱核赤血球の維持方法。
【請求項２】
前記酸素条件が2.0％〜10.0％である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸素条件が3.0％〜7.0％である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸素条件が4.0％〜6.0％である請求項１〜３のいずれか１に記載の方法。
【請求項５】
前記培養液に、プロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物を含む請求項１〜４のいずれか１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる請求項５に記載の方法。
（１）ACTH
（２）POMC
（３）MSH
（４）LPH
（５）エンドルフィン
（６）CLIP
【請求項７】
前記化合物は、ACTHである請求項５又は６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低酸素条件下で赤芽球を培養することを特徴とする有核赤血球の脱核方法及び脱核赤血球の維持方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療分野では現在献血による輸血が主体であるが、その供給を確保するには収集、感染等の検査、保存、に多大な労力や費用が必要となっている。医療や研究の分野において血液を十分量供給する為には、短時間かつ効率的に培養造血系幹細胞から成熟赤血球を誘導する方法が必要である。将来的に、iPS細胞やES細胞などを含む全能性又は多能性幹細胞から造血幹細胞の培養技術と応用が可能となれば、すべての行程を人工的に培養でき、感染のリスクが低くかつ安定的に血液の供給が可能となり医療への貢献は高い。また、工業的に多量の血液培養が可能となり、低コストでの生産と医療産業としての発展が期待できる。
【０００３】
赤血球は、酸素を運ぶ重要な血液成分であるが、それ自身は核を持たないために増えることはできない。よって、生体内では、赤血球の前段階の赤血球前駆細胞が増殖し、核を排出する「脱核」を経て成熟する。
従って、大量に赤血球を製造するには、赤血球前駆細胞の大量増殖が必要で、そのためには、「細胞株（赤血球前駆細胞株）」の樹立が必要であった。
【０００４】
また、造血に関する研究では、Ihleらのグループにより、「SOCS3が胎児肝臓での造血に必須であること」が報告されている（参照：非特許文献１）。
さらに、長田らのグループにより、「DNase IIノックアウトマウスの胎児では成熟赤血球が出来ず、重篤な貧血を引き起こし、胎児肝臓のマクロファージDNase IIは赤血球分化のサポートとして重要であること」が報告されている（参照：非特許文献２）。
【０００５】
一方、独立行政法人理化学研究所のグループによりマウスES細胞から赤血球前駆細胞株が樹立され、赤血球前駆細胞の試験管内での大量培養が可能となった（参照：非特許文献３）。
該大量培養が可能になったことにより、赤血球前駆細胞を直接体内に輸血する方法も考えられる。しかし、該前駆細胞は有核であるため癌化の問題など安全性の面が非常に危惧される。実際には、該前駆細胞をさらに分化させて脱核し、無核となった成熟赤血球を得るための誘導方法が必要である。
【０００６】
また、Miharadaらによって報告されている臍帯血を利用した成熟赤血球の製造方法（非特許文献４）では、「赤血球前駆細胞から脱核した成熟赤血球の生成まで20日間の培養日数を必要とし、最終の脱核細胞は77％であること」を開示している。
前記成熟赤血球の製造方法では、脱核を誘導する因子として抗エストロゲン剤であるミフェプリストンを添加している。培養初期に添加される分化誘導因子により赤血球前駆細胞を分化させ、非生理的分子により赤芽球の増殖を停止させることにより脱核が誘導されている。
【０００７】
前述のとおり、赤血球前駆細胞の製造方法はすでにいくつか知られているが、その過程で生理的条件及び生理的分子のみで赤芽球を短時間かつ高効率に脱核させる技術については、ほとんど知られていない。しかし、本発明者らは、脱核を誘導する因子であるプロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物を培地に添加する方法を報告している（参照：特許文献１）。
【０００８】
特許文献１は、「有核赤血球をプロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物を含む培養液で培養することを特徴とする有核赤血球の脱核方法」を開示している。しかし、脱核率は、9日目では、最大で約70％である。また、該脱核方法は、脱核赤血球の生存率が低かった。
【０００９】
以上の背景から、現状の製造方法で得られた赤血球では、赤芽球が約20〜30％残存し、さらに該赤血球を体内に投与すると癌化の危険性を有することが問題となっている。
加えて、今後、ヒトiPS又はES細胞から大量の赤芽球を誘導可能となり、短時間で赤血球の脱核を誘導するための方法が必要になると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開WO2010/098079
【００１１】
【非特許文献１】Jean-Christophe et al., Cell. 1999;98(5):617-27.
【非特許文献２】Kawane K. et al., Science. 2001;292(5521):1546-9.
【非特許文献３】Hiroyama T. et al., PLoS ONE. 2008;3(2):e1544.
【非特許文献４】Miharada K. et al.,Nat Biotechnol. 2006 ;24(10):1255-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、以上の背景から、新たに積極的かつ短時間に脱核を誘導する方法及び脱核赤血球の生存率を向上させる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、「低酸素条件下での赤芽球の培養は、脱核開始時期促進効果、核排出効果、脱核誘導促進効果及び脱核赤血球の生存率上昇効果を有すること」を見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、上記の課題を解決するものとして以下のことを特徴としている。
「１．造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、及び／又は赤芽球を1.0％〜18.0％の酸素条件下の培養液で培養することを特徴とする赤芽球の脱核方法及び／又は脱核赤血球の維持方法。
２．前記酸素条件が2.0％〜10.0％である前項１に記載の方法。
３．前記酸素条件が3.0％〜7.0％である前項１又は２に記載の方法。
４．前記酸素条件が4.0％〜6.0％である前項１〜３のいずれか１に記載の方法。
５．前記培養液に、プロオピオメラノコルチン（POMC）由来の化合物を含む前項１〜４のいずれか１に記載の方法。
６．前記化合物は、以下のいずれか１から選ばれる前項５に記載の方法。
（１）ACTH
（２）POMC
（３）MSH
（４）LPH
（５）エンドルフィン
（６）CLIP
７．前記化合物は、ACTHである前項５又は６に記載の方法。」
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、低酸素条件下での赤芽球を培養することで、脱核開始時期促進効果、脱核誘導促進効果、核排出効果及び脱核赤血球の生存率上昇効果を有する赤芽球の脱核方法及び／又は脱核赤血球の維持方法を提供することができた。
これにより、血液の製造期間の短縮が可能になり、赤芽球の輸血に伴う癌化の危険性を除くことが可能となる。すなわち、安全な血液を短時間かつ安定して得ることができ、医療技術への貢献は非常に大きい。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】低酸素条件下での赤血球の脱核開始時期促進効果及び脱核誘導促進効果の確認
【図２】低酸素条件下での脱核赤血球の生存率増加の確認
【図３】低酸素条件下及びPOMC由来化合物添加条件下での赤血球の脱核誘導促進効果の確認及び低酸素条件下における核排除率増加の確認
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は「造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、及び／又は赤芽球を1.0％〜18.0％の酸素条件下の培養液で培養することを特徴とする赤芽球の脱核方法及び／又は脱核赤血球の維持方法」に関する。以下に、本発明の実施の形態について説明する。
なお、「脱核赤血球の維持方法」とは、脱核赤血球の変異・消失を防ぐことだけでなく、脱核赤血球の培養、増幅、分化、成熟の方法も含む。
【００１７】
（造血系幹細胞）
本発明の「造血系幹細胞」は、あらゆる種類の血球に分化する能力を有するとともに造血再構築能を有する細胞である。主に骨髄、臍帯血、脾臓あるいは肝臓中に存在し、微量ながら末梢血にも存在する。なお、「幹細胞」は、多能性造血系幹細胞及びこれから分化した骨髄系幹細胞（CFU−GEMM）を意味する。これら細胞はCD34、CD133陽性細胞である。
造血系幹細胞は、自体公知の方法で得ることができる。例えば、上記記載の骨髄、臍帯血、脾臓、肝臓又は末梢血に存在する造血系幹細胞を細胞分離装置（フローサイトメトリー等）から分離することで得られることができる。
より詳しくは、造血系幹細胞は、造血系幹細胞表面抗原（例えば、CD34）に結合する市販の抗体を用い、当業者に周知の方法を用いて単離することができる。例えば、該抗体は、磁性ビーズに結合され、そして免疫学的方法が、所望の細胞型を回収するために利用される。好ましくは、造血系幹細胞は、CD34陽性細胞の形態である。実際、CD34は、造血系幹細胞の標準マーカーとして知られている。
CD34陽性細胞の分離は、多くの様々な方法により達成できる。最も広く使用されるものは、固体支持体上に固定された抗CD34抗体(Cellpro, Baxter, Myltenyi)に当該細胞を結合させることに基づく陽性免疫学的選別である。他の選別方法は、細胞系列特異的細胞表面抗原の発現に基づいてCD34陽性細胞から、CD34を発現しない細胞の全てを単離するネガティブ選別を含む。加えて、培養される造血系幹細胞は、胚性幹細胞からex vivoで産生することもできる（参照：WO 01/34776、US 6,613,568）。
また、例えば、ヒト臍帯血CD34陽性細胞（独立行政法人理化学研究所のCell Bankから入手可能）を利用することができる。
【００１８】
（赤血球前駆細胞）
本発明の「赤血球前駆細胞」は、造血系幹細胞から各系統の血液細胞が分化形態学的には同定できないが、すでに赤血球系の一方向の血液細胞にしか分化し得ない細胞を意味する。
具体的には血小板コロニー形成細胞（CFU−MEG）、好酸球コロニー形成細胞（CFU−EO）、顆粒球単球コロニー形成細胞（CFU−GM）、赤血球形成細胞（BFU−E、CFU−E）、T前駆細胞、B前駆細胞などである。これらはいずれもCD34陽性細胞である。
赤血球前駆細胞は、自体公知の方法で得ることができる。例えば、上記記載の骨髄、臍帯血、脾臓、肝臓又は末梢血に存在する赤血球前駆細胞を細胞分離装置（フローサイトメトリー等）から分離することで得られる。
加えて、マウスES細胞から赤血球前駆細胞に誘導する方法も知られている（参照：非特許文献３）。
【００１９】
加えて、造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞を大量に増幅するために、各種の方法及び最適な培養条件への開発が試みられてきている。そして、下記のようにいくつかの報告がされている。
よって、本発明で使用する造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞は、下記記載の方法を利用して得ることもできる。
（１）哺乳動物由来のストローマ細胞と造血系幹細胞を共培養することにより造血系幹細胞を増殖する方法（参照：特開平10-295369）。
（２）ヒト臍帯血から得られる造血支持能を有する細胞を体外で増幅させて造血系幹細胞を得る方法（参照：特開2002-6520）。
（３）ヒト造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞を、ヒト胎盤組織又は臍帯組織由来のストローマ細胞の共存下で培養する方法（参照：特開2004-222502）。
（４）子宮内膜細胞を用いた造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞の培養及び増幅方法（参照：特表2007-525231）。
【００２０】
（赤芽球）
本発明の「赤芽球」は、脱核をした赤血球（成熟赤血球）と区別するために使用する。赤血球前駆細胞より分化した細胞であり、塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球のすべてのステージを含める。
赤芽球の調製方法は、多種報告されており自体公知の方法が利用することができる。例えば、国際公開WO2004/012750に記載の「採集した全血に水溶性高分子化合物を添加して選択促進的に赤血球を凝集沈降させる方法」を利用することができるが、特に限定されない。
加えて、臍帯血由来の造血幹細胞又は赤血球前駆細胞を赤芽球に分化させる方法も知られている（参照：非特許文献４）。
【００２１】
上記造血系幹細胞、赤血球前駆細胞又は赤芽球の由来は、哺乳類由来であれば特に限定されない。好ましくは、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ等が例示されるが、より好ましくはヒトである。なお、ヒト由来の上記造血系幹細胞、赤血球前駆細胞又は赤芽球は、生体から分離されたものを対象とする。
【００２２】
｛培養液（培地）｝
本発明の「培養液（培地）」は、ES細胞、造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、赤芽球、網状赤血球、若しくは成熟赤血球が維持・生存でき、又はES細胞、造血系幹細胞若しくは赤血球前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ、如何なる培養液（培地）を用いることができる。
例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素などの無機物、アミノ酸、ビタミン、ホルモン、抗生物質、サイトカイン、脂肪酸、糖又は目的に応じてその他の化学成分もしくは血清のような生体成分を含有することもできる。
例として、 hematopoietic progenitor growth medium （HPGM、ロンザ社）、DMEM 、RPMI、 IMDM、10%FBS （細胞培養のための抗生物質を含む）等を使用することができる。
【００２３】
（培養条件）
本発明の「培養条件」は、酸素条件を除き、温度、浸透圧、光などの物理的環境条件、及び炭酸ガス、pH、酸化還元電位などの化学的環境条件のいずれについても、ES細胞、造血系幹細胞、赤血球前駆細胞、赤芽球、網状赤血球、若しくは成熟赤血球が維持・生存でき、又はES細胞、造血系幹細若しくは赤血球前駆細胞が維持・生存・分化・成熟・自己複製するのに何ら阻害するものでなければ、如何なる環境条件であってもよい。
温度については、20〜40℃、好ましくは約37℃である。
浸透圧については具体的には生理条件における浸透圧であり、好ましくは生理食塩水と等しい浸透圧である。
光としては暗室ほどの暗い条件であってもよいし、晴天時の外の明るさほどに明るくてもよい。
培養系における一般的なpHは、6.0〜8.0であり、好ましくは生理条件と同等のpHである。pHをコントロールするには二酸化炭素を用いてもよいし、他のいかなる緩衝液を用いてもよい。
炭酸ガスの濃度としては具体的には培養が5％の気相と接触している状態での溶存炭酸ガス濃度である。
【００２４】
（低酸素条件）
本発明の「低酸素条件下」は、培養液に溶存している酸素濃度が、通常の好気的培養条件（20% O2)よりは低く、1.0％〜18.0％、好ましくは2.0％〜10.0％、より好ましくは3.0％〜7.0％、さらに好ましくは4.0％〜6.0％、最も好ましくは約5.0％である。
特に、培養液に溶存している酸素濃度が、1.0％〜18.0％になるように設定する時期は、増幅期、分化期、第１成熟期及び第２成熟期において、分化期、第１成熟期及び第２成熟期であるが、その他の期間でも設定しても良い。
なお、培養液に溶存している酸素濃度は、窒素ガスを用いたインキュベーターにより容易に1.0％〜18.0％の範囲に設定することができる。また、酸素吸着剤を培養液に添加することによっても達成することができる。
さらに、酸素センサー等を使用することにより容易に培養液に溶存している酸素濃度を測定することができる。
Expansion phase（増幅期）：約７日間。CD34陽性細胞及び赤血球前駆細胞を８〜２０倍に増幅させる時期である。
Differentiation phase（分化期）：３〜４日間。エリスロポイエチン存在下での培養により、CD34陽性細胞及び赤血球前駆細胞が細胞分裂し前赤芽球に分化する。
Maturation Phase1（第１成熟期）：約３日間。前赤芽球から細胞分裂し、塩基性赤芽球、多染性赤芽球に分化する。また、多染性赤芽球はさらに成熟し正染性赤芽球となる。
Maturation Phase2（第２成熟期：M3以降）：正染性赤芽球が脱核し、網状赤血球を経て成熟赤血球に成熟する。
【００２５】
（脱核方法）
本発明の「脱核方法」は、以下の方法を利用することができるが、赤血球の脱核を誘導できるならば特に限定されない。
細胞濃度（赤芽球を含む）を1.0％〜18.0％の酸素濃度の培養液1ml中に1.0×102〜1.0×1010、好ましくは1.0×103〜1.0×108、より好ましくは1.0×104〜1.0×107、最も好ましくは約1.0×105に調製する。
そして、好ましくは、POMC由来の化合物を培養液中の最終濃度が0.005 nＭ〜50 nＭ、好ましくは0.01 nＭ〜30 nＭ、より好ましくは0.1 nＭ〜20 nＭ、最も好ましくは1.0 nＭ〜10 nＭになるように添加する。なお、該化合物の添加時期は、培養開始時点でもよいが、培養途中に適宜追加しても良い。
培養温度は、33〜38℃が好ましく、CO2濃度は、約3〜7％が好ましい。
ラット胎児由来の赤芽球における脱核誘導のための培養時間は、2〜24時間、好ましくは3〜12時間、より好ましくは4〜8時間である。
また、ヒト臍帯血由来の造血幹細胞の培養から脱核赤血球へは20日間を要するが（参照：非特許文献４）、本方法においては14日目頃から脱核を導き、15日目には半数以上の脱核を誘導できる。
なお、ヒトとラットにおけるに脱核に要する時間の違いは、胎児の発生に要する時間や赤血球の生存日数の違いによるものと考えられる。
【００２６】
本発明の「脱核赤血球の培養／及び増幅方法」は、以下の方法を利用することができるが、赤芽球の脱核を誘導できるならば特に限定されない。
造血系幹細胞又は赤血球前駆細胞を上記記載の方法により有核を有する赤血球に分化する。なお、分化の過程において、必要に応じて各種サイトカインを培養液中に導入する。次に、有核を有する赤血球が培養液中に存在する時期に、好ましくは、POMC由来の化合物を培養液中の最終濃度が0.005 nＭ〜50 nＭ、好ましくは0.01 nＭ〜30 nＭ、より好ましくは0.1 nＭ〜20 nＭ、最も好ましくは1.0 nＭ〜10 nＭになるように添加する。なお、該化合物の添加時期は、培養開始時点でもよいが、培養途中に適宜追加しても良い。
【００２７】
（サイトカイン）
本発明の「サイトカイン」は、細胞から放出され、細胞間相互作用を媒介するタンパク質性因子で、免疫応答の制御作用、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖・分化の調節作用などを示す物質を意味する。具体的には、インターロイキン−１（IL−1）、インターロイキン−２（IL−2）、インターロイキン−３（IL−3）、インターロイキン−４（IL−4）、インターロイキン−５（IL−5）、インターロイキン−６（IL−6）、インターロイキン−７（IL−7）、インターロイキン−８（IL−8）、インターロイキン−９（IL−9）、インターロイキン−１０（IL−10）、インターロイキン−１１（IL−11）、インターロイキン−１２（IL−12）、インターロイキン−１３（IL−13）、インターロイキン−１４（IL−14）、インターロイキン−１５（IL−15）、インターロイキン−１６（IL−16）、インターフェロンα（IFN−α）、インターフェロンβ（IFN−β）、インターフェロンγ（IFN−γ）、顆粒球コロニー刺激因子（G−CSF）、顆粒球-単球コロニー刺激因子（GM−CSF）、単球コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、好酸球コロニー刺激因子、血小板コロニー刺激因子、幹細胞因子（SCF）、幹細胞増殖因子、flk2/flt3-リガンド、白血病阻害（阻止）因子、エリスロポエチン（EPO）、マクロファージ由来炎症性タンパク１α（MIP−1α）などが挙げられ、好ましくはインターロイキン−３、幹細胞因子（SCF）、Flt-3L、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、flk2/flt3-リガンド、MIP-1α又はエリスロポエチン、トロンボポイエチン、トランスフェリン、血管内皮増殖因子（VEGF）、インスリン等が挙げられる。
【００２８】
（脱核開始時期促進効果）
本発明の「脱核開始時期促進効果」は、従来の脱核方法とは異なり、実施例２の結果が示すように脱核開始時期を早めることができる効果を意味する。
【００２９】
（脱核誘導促進効果）
本発明の「脱核誘導促進効果」は、従来の脱核方法とは異なり、実施例２の結果が示すように脱核率を高めることができる効果を意味する。
【００３０】
（脱核赤血球の生存率上昇効果）
本発明の「脱核赤血球の生存率上昇効果」は、従来の脱核方法とは異なり、実施例３の結果が示すように、成熟段階での脱核赤血球の生存率（脱核赤血球/総細胞）を高めることができる効果を意味する。
【００３１】
（核排出効果）
本発明の「核排出効果」は、従来の脱核方法とは異なり、実施例３の結果が示すように、脱核した核が細胞膜から離脱する割合を高めることができる効果を意味する。
【００３２】
（POMC由来の化合物）
本発明の「POMC由来の化合物」は、POMC、MSH（α-、β-、γ-MSH）、ACTH、LPH（γ-、β-LPH）、エンドルフィン（α、β、γ-エンドルフィン）若しくはCLIP、又はそれらの保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体を対象とする。
保護化誘導体、糖鎖修飾体、アシル化誘導体、若しくはアセチル化誘導体は、自体公知の方法で得ることができる。
なお、POMC由来の化合物の詳細は、特許文献１に記載されている。
【００３３】
POMC は、メラノサイト刺激ホルモン（MSH）、アドレノコルチコトロピン（ACTH）、リポトロピン（LPH）、CLIP並びにβエンドルフィンの前駆体である。これら全てのホルモンは、ただ１つの大きな前駆体POMCから切断されて、生成される。
【００３４】
ACTHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。加えて、本明細書において、ACTHは、以下のACTHの断片配列と区別するために、ACTH1-39と称する場合がある。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe（配列番号１）
【００３５】
加えて、様々なACTHの断片配列が知られている。これらの断片配列自体が脱核作用を有すると考えられる。
ACTH1-24（ACTHの1番から24番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro（配列番号２）
ACTH1-10（ACTHの1番から10番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly（配列番号１３）
ACTH1-14（ACTHの1番から14番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly（配列番号１４）
ACTH1-16（ACTHの1番から16番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys（配列番号１５）
ACTH1-17（ACTHの１番から17番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg（配列番号１６）
ACTH4-10（ACTHの4番から10番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly（配列番号１７）
ACTH7-38（ACTHの7番から38番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg-Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu（配列番号１８）
ACTH4-9（ACTHの4番から9番目の配列）は、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp（配列番号１９）
【００３６】
MSH｛（melanocyte-stimulating hormone）、メラノサイト刺激ホルモン｝は、脳下垂体中葉で生成されるペプチドホルモンであり、α-MSH、β-MSH、γ-MSHが存在している。
α-MSHは、Acetyl基を含む以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Acetyl-(N)-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2（配列番号３）
β-MSHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Ala-Glu-Lys-Lys-Asp-Glu-Gly-Pro-Tyr-Arg-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Ser-Pro-Pro-Lys-Asp（配列番号４）
γ-MSHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Val-Met-Gly-His-Phe-Arg-Trp-Asp-Arg-Phe-Gly（配列番号５）
【００３７】
LPH｛（lipotropin）、脂肪動員ホルモン｝は、下垂体前葉及び中葉で生成される単鎖のポリペチドであり、γ-LPH，β-LPHがある。
γ-LPHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu（配列番号６）
β-LPHは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr（配列番号７）
【００３８】
エンドルフィン（endorphin）は、哺乳類の脳及び下垂体に存在する内因性オピオイドペプチドで、α、β、γの3種類が知られている。
α-エンドルフィンは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr（配列番号８）
β-エンドルフィンは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu（配列番号９）
γ-エンドルフィンは、以下のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu（配列番号１０）
【００３９】
CLIP（カルジオトロピン様ペプチド）は、下記のアミノ酸残基からなるペプチドである。
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro-Asn-Gly-Ala-Glu-Asp-Glu-Ser-Ala-Glu-Ala-Phe-Pro-Leu-Glu-Phe（配列番号１１）
【００４０】
なお、上記のMSH（α-、β-、γ-MSH）、ACTH、LPH（γ-、β-LPH）、エンドルフィン（α、β、γ-エンドルフィン）又はCLIPは、各種間において一部のアミノ酸が異なる場合がある。
例えば、ACTHにおいて、クジラは配列番号１と同じ配列であるが、ブタでは配列番号の１の31番目のSerがLeuになっており、ヒツジ、ウシでは配列番号１の33番目のGluがGlnになっている。
本発明では、各種間において異なるMSH（α-、β-、γ-MSH）、ACTH、LPH（γ-、β-LPH）、エンドルフィン（α、β、γ-エンドルフィン）及びCLIPもPOMC由来の化合物として含める。
【００４１】
また、本発明者らは、「ACTH1-39、ACTH1-24及びCLIPは、赤血球の脱核誘導作用を有すること」を確認している。よって、ACTH1-39、ACTH1-24及びCLIPに共通する下記のアミノ酸残基を有するペプチドが赤血球の脱核誘導作用を担っていると考えられる。よって、下記ペプチドもPOMC由来の化合物として含める。
Arg-Pro-Val-Lys-Val-Tyr-Pro（配列番号１２）
【００４２】
また、本発明は、上記いずれかに記載のペプチドを含むペプチド、上記いずれかに記載のペプチドと90％以上の相同性を有しかつ該ペプチドと実質的同質の赤血球の脱核誘導作用を持つペプチド又は、上記いずれかに記載のペプチドに対して、1〜5個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しておりかつ実質的同質の赤血球の脱核誘導作用を持つペプチドもPOMC由来の化合物として含める。
【００４３】
「配列番号１に記載のペプチドを含むペプチド」とは、配列番号１に記載のペプチドの赤血球の脱核作用を実質的に維持し、Ｎ末端及び／又はＣ末端に1〜30、1〜20、1〜10、1〜5個の任意のアミノ酸を付加したペプチドを意味する。
【００４４】
「配列番号１に記載のペプチドと実質的に同質の脱核誘導作用」とは、該ペプチドの赤芽球の脱核作用を有することを意味し、その程度が該ペプチドの脱核作用と比較して強くても弱くてもよい。
【００４５】
「配列相同性」とは、通常、アミノ酸配列の全体で70％以上、好ましくは80％、より好ましくは85％以上、さらに好ましくは90％以上、さらにより好ましくは95％以上、最も好ましくは98％以上であることが適当である。
【００４６】
配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと配列相同性を有するペプチドとして、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、例えば1〜15個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個、さらにより好ましくは1個〜3個、またさらに好ましくは1個〜2個、最も好ましくは1個のアミノ酸の変異、例えば欠失、置換、付加又は挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表されるペプチドが例示できる。アミノ酸の変異の程度及びそれらの位置等は、該変異を有するペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列で表されるペプチドと実質的に同質の脱核作用を有するものである限り特に制限されない。
【００４７】
（脱核赤血球の保存方法）
脱核赤血球を保存（長期間も含む）する場合、自体公知の方法を用いることができる。保存の方法として、例えば凍結保存法が挙げられ、この場合必要に応じてセルバンカー(C)（日本全薬工業株式会社）、グリセリン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ショ糖、グルコース、ポリビニルピロリドン（PVP）、トレハロースなどの凍結防御剤を加え、プログラムフリーザーなどを用い緩速凍結を行い、その後液体窒素又は-80℃のディープフリーザー等中に保存すればよい。
【００４８】
以下に具体例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【実施例１】
【００４９】
（材料及び方法）
実施例で使用した材料及び方法は、以下の通りである。
【００５０】
本実施例の培養液は、すべてhematopoietic progenitor growth medium （HPGM、ロンザ社）を使用した。
（各フェーズにおける培養条件）
（１）Expansion phase（増幅期）
細胞：CD34陽性造血前駆細胞1×105 (cells/ml) （純度90％以上、ロンザ社）
培養日数：7日間
培養液の添加因子：50 ng/ml トロンボポイエチン（ペプロテック社）、50 ng/ml Flt3 リガンド（ペプロテック社）、50 ng/ml Stem Cell Factor （SCF）（R & D社）
温度：37℃
酸素濃度：2.0％〜20.0％
（２）Differentiation phase（分化期）
細胞：上記（１）で増幅された細胞を2×105 (cells/ml)に希釈した。
培養日数：３日間
培養液への添加因子： 3 U/ml エリスロポイエチン（協和発酵キリン社）、25 ng/ml SCF、10 ng/ml インターロイキン-3 (IL-3)（ペプロテック社）、 10 ng/ml インターロイキン-6 (IL-6)（ペプロテック社）
温度：37℃
酸素濃度：2.0％〜20.0％
（３）Maturation Phase１（第１成熟期）
培養開始時を M0とし、以下、M0, M1, M2と称する。
細胞：上記（２）で培養された細胞を1×105 (cells/ml)に希釈した。
培養日数：３日間(M0-M3)
培養液への添加因子： 3 U/mlエリスロポイエチン
温度：37℃
酸素濃度：2.0％〜20.0％
（４）Maturation Phase2（第２成熟期：M3以降）
細胞：上記（３）で培養された細胞を4×105 (cells/ml)に希釈した。
培養日数： M5以降脱核率を測定
培養液への添加因子：なし
温度：37℃
酸素濃度：2.0％〜20.0％
【００５１】
（フローサイトメトリーによる脱核率測定方法）
フローサイトメトリーによる脱核率測定方法は、以下の通りである。
（１）細胞染色試薬
核染色：SYTO16（モルキュラープローブ社）
赤血球マーカー：APCラベルーグリコホリンA（GPA)（ベクトンディッキンソン社）
（２）測定方法
上記（１）で染色した細胞を、フローサイトメトリーで測定した。脱核率は以下の式により算出した。フローサイトメトリーでの測定では、完全に核が排出された（細胞膜から離れた）赤血球のみが脱核細胞として測定され、脱核してもなお核が細胞膜に接着しているものは赤芽球（脱核していない細胞）として測定した。
脱核率（％）＝100 × ｛GPA+ SYTO16-/(GPA+ SYTO16- + GPA+ SYTO16+)｝
脱核した細胞（成熟赤血球）: GPA+ SYTO16- 
赤芽球：GPA+ SYTO16+
【００５２】
（顕微鏡下による脱核率測定方法）
顕微鏡下による脱核率測定方法は、以下の通りである。
（１）細胞染色試薬
核染色：ヘキスト33342（モルキュラープローブ社）
（２）測定方法
上記（１）の染色試薬で染色した細胞を蛍光顕微鏡下にて10視野撮影（位相差像＋蛍光像）し、核のある細胞と無い細胞をそれぞれカウントした。脱核率は以下の式により算出した。なお、脱核細胞の定義は、核が細胞膜の円周よりも外に突出している脱核中の細胞、もしくは核が細胞膜内に無いものとした。それ以外の核が細胞膜内にあるものを有核細胞とした。より詳しくは、顕微鏡下での脱核率は、脱核が誘導された細胞はすべて脱核細胞として測定されるため、フローサイトメトリーでの脱核率（核が細胞膜に接着しているものは有核細胞に分類される）と比較して、高くなる。また、フローサイトメトリーでの脱核率と顕微鏡下での脱核率の差は、脱核中の細胞（脱核が誘導されたが核が細胞から完全に排出されておらず、細胞膜に接着している）の率を表している。
脱核率＝脱核細胞/全細胞（有核細胞＋脱核細胞）
【実施例２】
【００５３】
（低酸素条件下での赤血球の脱核開始時期促進効果及び脱核誘導促進効果）
低酸素条件下（2%〜10% O2）での赤血球培養は、通常の好気的培養条件下（20% O2）での赤血球培養と比較して、脱核開始時期促進効果及び脱核誘導促進効果があるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５４】
下記の培養条件により、成熟培養８日目（M8）における脱核率をフローサイトメトリーにより測定した。
＜培養条件＞
培養液：HPGM+ EPO (ACTHは添加していない）
酸素濃度(O2)：2, 5, 10, 20%
【００５５】
各酸素濃度条件下での脱核率を図１に示す。
低酸素条件下（2%〜10% O2）は、好気的培養条件下（20% O2）と比較して、4日目の脱核率が約4倍であった。すなわち、低酸素条件下（2%〜10% O2）は、脱核開始時期促進効果を示す。
さらに、低酸素条件（2%〜10% O2）は、好気的培養条件（20% O2）と比較して、7日目の脱核率は非常に高い。特に、5% O2条件下は78％、好気的培養条件下（20% O2）の45％と比較して、脱核率は約1.8倍であった。これは、生理的条件下（非生理的分子の添加及び、非生理的な条件を使用しない）での脱核率としては非常に高い値である。
以上により、低酸素条件下（2%〜10% O2）での赤血球培養は、脱核開始時期促進効果及び脱核誘導促進効果があることを確認した。
【実施例３】
【００５６】
（低酸素条件下での脱核赤血球の生存率上昇の確認）
低酸素条件下（2%〜5% O2）での赤血球培養は、赤血球通常の好気的培養条件下（20% O2）と比較して、脱核赤血球の生存率上昇効果があるかどうかを確認した。詳細は、以下の通りである。
【００５７】
下記の培養条件により、成熟培養11日目（M11）における脱核率をフローサイトメトリーにより測定した。
＜培養条件＞
培養液：HPGM+ EPO (ACTHは添加していない）
酸素濃度(O2)：2, 5, 20%
【００５８】
各酸素濃度条件下での脱核赤血球の生存率を図２に示す。
通常の好気的培養条件（20% O2)では、M8以降に脱核赤血球は急激に変性・消失するため、脱核赤血球を維持することができなかった。通常の好気的培養条件（20% O2)の脱核赤血球/総細胞比に関し、成熟培養8日目は43.3％であったのに対し、11日目は3.2％まで急激に低下した。すなわち、約7.4％（3.2／43.3％）の脱核赤血球のみが維持できた。
一方、低酸素条件下（2%,5% O2）は、好気的培養条件下（20% O2）と比較して、11日目の生存率が非常に高かった。より詳しくは、低酸素条件下である5% O2の脱核赤血球/総細胞比に関し、成熟培養8日目は75.9％であったのに対し、11日目はわずか41.1％にしか低下しなかった。すなわち、約54.2％（41.1／75.9％）の脱核赤血球を維持できた。
以上により、低酸素条件下である5% O2での培養は、通常の好気的培養条件（20% O2)での培養と比較して、約7.3倍（54.2／7.4％）の脱核赤血球の生存率上昇効果を示した。
【実施例４】
【００５９】
（低酸素条件及びPOMC由来化合物添加条件下での赤血球脱核誘導促進効果の確認及び低酸素条件による核排出効果の確認）
低酸素条件（2%〜5% O2）下及びPOMC由来化合物添加条件下での赤血球培養は、赤血球通常の好気的培養条件下（20% O2）と比較して、脱核誘導促進効果があるかどうかを確認した。さらに、脱核した核が細胞膜から離脱する効果（核排出効果）についても確認した。詳細は、以下の通りである。
【００６０】
下記の培養条件により、成熟培養7日目（M7）における脱核率を、蛍光顕微鏡下でのヘキストによる核染色後の脱核赤血球のカウントにより測定した。
＜培養条件＞
培養液：HPGM+ EPO+POMC由来化合物であるACTH添加｛添加時期は、成熟培養１日目（M0）と３日目（M3）｝
酸素濃度(O2)：5, 20%
【００６１】
各酸素濃度条件及びACTH（図中：A39）添加有無条件下での赤血球の脱核率を図３に示す。
低酸素条件及びPOMC由来化合物添加条件下(O2 5% A39)での脱核率は、非常に高く90％を超えた。低酸素条件でPOMC由来化合物無添加条件下(O2 5% CNT)では81%であり、低酸素条件でもPOMC由来化合物による脱核促進効果が確認された。
低酸素条件及びPOMC由来化合物添加条件下での脱核率は、通常の好気的培養条件（20% O2）及びPOMC由来化合物添加条件下での脱核率と比較して、約1.3倍高かった。
これにより、低酸素条件及びPOMC由来化合物添加により、脱核率を上昇させることができることを確認した。
また、図１のフローサイトメトリーでの測定によるO2 5%の7日目の脱核率の値と図３の顕微鏡下での測定によるO2 5%の7日目の脱核率の値を比較すると、フローサイトメトリーの測定では78%であり、顕微鏡下の80％とほぼ変わらない。一方、好気的培養条件（20%）に関し、フローサイトメトリーでの脱核率の値は45%であり、顕微鏡下での脱核率の値は55%であった。これらの数値により、低酸素条件では脱核が誘導された細胞において核がほぼ完全排出されているが、好気的条件では約10%の細胞では脱核が誘導されたにも関わらず核が細胞から離脱できていないことを確認した。つまり、低酸素条件は核排出効果を有することを確認した。
【００６２】
（総論）
以上の実施例２〜４の結果により、低酸素条件下での赤芽球の培養は、脱核開始時期促進効果、脱核誘導促進効果、核排出促進効果、及び脱核赤血球の生存率上昇効果を示す。さらに、低酸素条件下及びPOMC由来化合物添加条件下での赤芽球の培養の脱核率は、低酸素条件下での赤芽球の培養の脱核率と比較して、高い。
よって、本発明の赤芽球の脱核方法は、短時間に哺乳類由来赤血球分化の最終段階の脱核を誘導し、さらに維持することができた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明は、短時間に赤血球分化の最終段階の脱核を誘導し、さらに維持することができる脱核方法を提供することができた。
これにより、血液の製造期間を短縮可能になり、赤血球前駆細胞や赤芽球の輸血に伴う癌化の危険性を除くことが可能となる。すなわち、安全な血液を短時間・かつ安定して得ることができ、医療技術への貢献は非常に大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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