(57)【要約】【課題】本発明は、健康上の安全性を向上することを目的とするものである。【解決手段】そしてこの目的を達成するために本発明は、未分化細胞２を分化誘導した細胞群から未分化細胞２を識別分離する方法であって、未分化細胞２を分化誘導した細胞群を、未分化細胞２に特異的に結合する抗体９に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬を溶かした培養液に一定時間培養し、未分化細胞２と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬を溶かした培養液に一定時間培養し、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む細胞識別分離方法。
【請求項２】
前記未分化細胞不活性化物質は、光活性化物質である請求項１に記載の細胞識別分離方法。
【請求項３】
前記未分化細胞標識工程の後に、光を照射して、光活性化物質の活性化を行う工程を含む請求項１または２に記載の細胞識別分離方法。
【請求項４】
前記光活性化物質はフタロシアニン色素(phthalocyanide dye)である請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞識別分離方法。
【請求項５】
前記光活性化物質はポルフィリンである請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞識別分離方法。
【請求項６】
前記光活性化物質はChlorin e6 monoethylenediamine(SnCe6)である請求項１から３のいずれか一つに記載の細胞識別分離方法。
【請求項７】
前記未分化細胞不活性化物質は、抗癌物質である請求項１に記載の細胞識別分離方法。
【請求項８】
前記未分化細胞不活性化物質は、磁性体物質である請求項１に記載の細胞識別分離方法。
【請求項９】
前記未分化細胞標識工程の後に、培地交換を行い、未分化細胞不活性化物質と抗体の洗浄を行う工程を含む請求項１から８のいずれか一つに記載の細胞識別分離方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一つに記載の細胞識別分離方法に用いる装置であって、
操作部と、この操作部からの指示に従う制御部と、この制御部からの指示に従い点灯、消灯をする光源と、この光源からの光を並行光に変える光変換手段と、この光変換手段からの光を受光する受光部と、この受光部に設けた標識未分化細胞設置部と、を備えた細胞識別分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞識別分離方法および細胞識別分離装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞識別、分離の方法の一つに、フローサイトメトリがある。フローサイトメトリでは、細胞をばらばらに分解し、細胞を懸濁液の状態にした状態で、細胞表面マーカー認識抗体と蛍光標識により細胞を種類別標識した後、細胞を１個ずつ流しながら蛍光標識物を確認し、細胞を分離する方法である（下記非特許文献１）。
【０００３】
また、未分化細胞を排除するための遺伝子を導入して、分化細胞から未分化細胞を選択的に排除する手段がある（下記特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００４−５２３２１７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】フローサイトメトリ  American Journal of Pathology 1998, Vol. 152, No. 6; 1655-1665
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記従来例における課題は、健康上の安全性が低下してしまう可能性が高いことであった。
【０００７】
すなわち、ＥＳ細胞や、ｉＰＳ細胞など未分化細胞から治療を目的に分化誘導した細胞集団の中には、未分化細胞を完全に分化誘導することができないため、一部混在してしまった未分化細胞が、移植治療後、癌を引き起こすなどの健康上の問題を引き起こす可能性が高かったのであった。
【０００８】
現在の再生医療では、未分化細胞を増やし、分化誘導した後、治療に用いる場合において、分化誘導の効率を上げるための多くの研究がされているが、未分化細胞を１００％分化細胞に誘導することは難しいと思われる。また、分化誘導後にも混在する未分化細胞を治療に用いると人体の中で癌化する可能性が心配されている。
【０００９】
この問題を解決するための従来法として、上記特許文献１の遺伝子導入する方法があるが、この遺伝子導入を用いて未分化細胞を選択的に排除する方法は、細胞を選別する手段にはなり得るが、遺伝子導入により以下の２点において健康上の問題を及ぼす可能性がある。
【００１０】
まず第１点目は、遺伝子を導入することにより細胞の遺伝子が損傷を受ける可能性がある。次に、第２点目として外部の遺伝子を、人体内に入れることになるので、分化誘導後も外部の遺伝子が細胞の中に残ることになり、この点においても健康上の問題となりうるのである。
【００１１】
そこで本発明は、健康上の安全性を向上することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
そして、この目的を達成するために本発明は、未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬を溶かした培養液に一定時間培養し、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む細胞識別分離方法としたので、所期の目的を達成できる。
【発明の効果】
【００１３】
以上のように本発明は、未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬を溶かした培養液に一定時間培養し、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む細胞識別分離方法であるので、健康上の安全性を向上することができる。
【００１４】
すなわち、未分化細胞と抗原抗体反応をする抗体と、この抗体と一体となった未分化細胞不活性化物質よりなる試薬を用いることで、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別、分離することが可能となるので、健康上の安全性を向上することができるのである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態の工程を示す図
【図２】本発明の一実施形態の図
【図３】本発明の一実施形態の主要部の図
【図４】本発明の一実施形態の工程を示す図
【図５】本発明の一実施形態の工程を示す図
【図６】本発明の一実施形態の装置の模式図
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（実施の形態１）
以下、本発明の一実施形態を細胞識別分離方法の一例として添付図面を用いて説明する。
【００１７】
図１は、本発明の一実施形態における、未分化細胞不活性化物質として、光感受性物質を用いた細胞識別分離方法を説明する。
【００１８】
図１（ａ）の工程は、培養容器１（例えばフィダー細胞が培養されている培養容器）に未分化細胞２を播種した状態であり、図１（ｂ）の工程では、複数の培養容器１内の培地交換をしながら培養を行い、未分化細胞２を未分化状態を維持しながら増殖させていく工程である。
【００１９】
次に、図１（ｃ）の工程では、前工程で増殖させた未分化細胞２を分化細胞３へ分化誘導をする工程を示す。
【００２０】
現在の再生医療では、未分化細胞を増やし、分化誘導した後、治療に用いている。この分化誘導後にも残存する未分化細胞をそのまま残した状態で、細胞膜の移植などの治療に用いると、人体の中で未分化細胞が癌化する可能性が心配されているため、未分化細胞を１００％分化誘導することが必要となっているが、未分化細胞を１００％分化細胞に誘導することは難しいとされている。
【００２１】
このように分化誘導後にも分化細胞３の中に残存する未分化細胞２に対しては、図１（ｄ）の工程に示すように、未分化細胞２を抗原とし、この抗原に結合する抗体と、この抗体と、未分化細胞不活性化物質としての光感受性物質を結合させて作った試薬を混ぜた培地４を形成し、この培地４で分化誘導後の細胞群を一定時間培養して、残存する未分化細胞を標識する。
【００２２】
次に図１（ｅ）の工程では、試薬を混合した培地４を洗い流し、未分化細胞２と結合していない余分な光感受性物質を洗い流す。その結果、細胞群には、未分化細胞２と抗体の結合による標識未分化細胞５ができる。
【００２３】
次に、図１（ｆ）の工程では、標識未分化細胞５に対して、光感受性物質を活性化させるための光を照射し、光感受性物質を活性化することにより、標識された未分化細胞５を不活性化、つまり死滅させる。
【００２４】
次に、図１（ｇ）の工程では、死滅した未分化細胞６の破砕物、および、未反応活性化物質などを洗い流し、分化細胞を得る。
【００２５】
そして、図１（ｈ）の工程では、未分化細胞排除処理結果を光学システム７を用いて確認する。
【００２６】
上記、工程において、図１（ｃ）、図１（ｄ）、図１（ｆ）の工程について、更に詳細に説明する。
【００２７】
図２は、図１（ｃ）、図１（ｄ）、図１（ｆ）の工程における未分化細胞２の識別、分離について説明した図である。
【００２８】
図２（ａ）は、図１（ｃ）の工程において、分化誘導後の細胞群を拡大したものであり、この細胞群には、分化細胞３と未分化細胞２を含んでいる。
【００２９】
この分化誘導後の細胞群に、未分化細胞２を抗原とし、抗体薬としての試薬８を混ぜ合わせる。
【００３０】
この試薬８の構造について、図３に示す。
【００３１】
図３に示すように、試薬８は、この抗原に結合する抗体９と、この抗体９と、未分化細胞不活性化物質としての光感受性物質１０を結合させて作ったものである。この抗体９と、未分化細胞のエピトープ１１部分が、抗体抗原反応によって結合することになる。
【００３２】
再び図２用いた説明を行う。図２（ｂ）に示すように、未分化細胞４のエピトープ１２に、試薬９の抗体１０の部分が結合し、標識未分化細胞５として識別可能となる。
【００３３】
この状態において、光を照射することで、図２（ｃ）に示すように、標識未分化細胞５に結合した試薬８の光感受性物質１０が活性化し、その結果、図２（ｄ）に示すように、
標識未分化細胞５は破壊される。
【００３４】
尚、上記光感受性物質１０としては、具体的には、例えば、フタロシアニン色素（phthalocyanide dye）、ポルフィリン、Chlorin e6 monoethylenediamine (SnCe6)などがある。
【００３５】
以上説明したように、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別、分離することが可能となるので、例えば、この細胞群を再生医療に用いる場合に、健康上の安全性を向上することができるのである。
【００３６】
次に、本実施の形態１における細胞識別分離装置について説明する。
【００３７】
図６に細胞識別分離装置を示す。
【００３８】
この装置は、上述した図１（ｆ）の工程において、標識未分化細胞５に対して、光感受性物質を活性化させるための光を照射し、光感受性物質を活性化することにより、標識された未分化細胞５を不活性化、つまり死滅させる工程を行う装置である。
【００３９】
まず、使用者は、標識未分化細胞５の入った培養容器１を、標識未分化細胞設置部としての培養容器保持部１６に設置する。そして、操作部１７の操作ボタンを押すと、その操作信号は、制御部１８に入力される。
【００４０】
次に制御部１８は、光源１９に対して点灯を指示する。光源から出た光は、所定の光だけを通すフィルター２０を通して、並行照明手段２１に入力される。
【００４１】
そして、並行照明手段２１から出た並行光は、培養容器設置部１６に設置された培養容器１に照射される。この光によって、培養容器１内の標識未分化細胞５の光感受性物質は活性化され、その結果、標識された未分化細胞５を不活性化、つまり死滅することになる。
【００４２】
所定時間の間、光を照射した後、制御部１８は、光源１９からの光を遮断するためにシャッター２２を閉じる。
【００４３】
尚、これらの装置は、外部からの光を遮断するために遮光箱２３内に設けられている。
【００４４】
（実施の形態２）
以下、本発明の一実施形態を細胞識別分離方法の一例として添付図面を用いて説明する。
【００４５】
図４は、本発明の一実施形態における、未分化細胞不活性化物質として、抗癌物質を用いた細胞識別分離方法を説明する。
【００４６】
図４（ａ）の工程は、培養容器１（例えばフィダー細胞が培養されている培養容器）に未分化細胞２を播種した状態であり、図４（ｂ）の工程では、複数の培養容器１内の培地交換をしながら培養を行い、未分化細胞２を未分化状態を維持しながら増殖させていく工程である。
【００４７】
次に、図４（ｃ）の工程では、前工程で増殖させた未分化細胞２を分化細胞３へ分化誘導をする工程を示す。
【００４８】
現在の再生医療では、未分化細胞を増やし、分化誘導した後、治療に用いている。この分化誘導後にも残存する未分化細胞をそのまま残した状態で、細胞膜の移植などの治療に用いると、人体の中で未分化細胞が癌化する可能性が心配されているため、未分化細胞を１００％分化誘導することが必要となっているが、未分化細胞を１００％分化細胞に誘導することは難しいとされている。
【００４９】
このように分化誘導後にも分化細胞３の中に残存する未分化細胞２に対しては、図４（ｄ）の工程に示すように、未分化細胞２を抗原とし、この抗原に結合する抗体と、この抗体と、未分化細胞不活性化物質としての抗癌物質を結合させて作った、抗体薬としての試薬を混ぜた培地４を形成し、この培地４で分化誘導後の細胞群を一定時間培養して、残存する未分化細胞と試薬１２を結合させる。
【００５０】
次に図４（ｅ）の工程では、試薬１３を混合した培地４を洗い流し、未分化細胞２と結合していない余分な抗癌物質を洗い流す。その結果、細胞群には、未分化細胞２と抗癌物質の結合による標識未分化細胞１３ができる。
【００５１】
次に、図４（ｆ）の工程では、標識未分化細胞１３に対して、所定の時間をおくことで、標識未分化細胞１３を死滅させる。
【００５２】
次に、図４（ｇ）の工程では、死滅した未分化細胞６の破砕物、および、抗癌物質などを洗い流し、分化細胞を得る。
【００５３】
そして、図４（ｈ）の工程では、未分化細胞排除処理結果を光学システム７を用いて確認する。
【００５４】
以上説明したように、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別、分離することが可能となるので、例えば、この細胞群を再生医療に用いる場合に、健康上の安全性を向上することができるのである。
【００５５】
（実施の形態３）
以下、本発明の一実施形態を細胞識別分離方法の一例として添付図面を用いて説明する。
【００５６】
図５は、本発明の一実施形態における、未分化細胞不活性化物質として、磁性体を用いた細胞識別分離方法を説明する。
【００５７】
図５（ａ）の工程は、培養容器１（例えばフィダー細胞が培養されている培養容器）に未分化細胞２を播種した状態であり、図５（ｂ）の工程では、複数の培養容器１内の培地交換をしながら培養を行い、未分化細胞２を未分化状態を維持しながら増殖させていく工程である。
【００５８】
次に、図５（ｃ）の工程では、前工程で増殖させた未分化細胞２を分化細胞３へ分化誘導をする工程を示す。
【００５９】
現在の再生医療では、未分化細胞を増やし、分化誘導した後、治療に用いている。この分化誘導後にも残存する未分化細胞をそのまま残した状態で、細胞膜の移植などの治療に用いると、人体の中で未分化細胞が癌化する可能性が心配されているため、未分化細胞を１００％分化誘導することが必要となっているが、未分化細胞を１００％分化細胞に誘導することは難しいとされている。
【００６０】
このように分化誘導後にも分化細胞３の中に残存する未分化細胞２に対しては、図５（ｄ）の工程に示すように、未分化細胞２を抗原とし、この抗原に結合する抗体と、この抗体と、未分化細胞不活性化物質としての磁性体を結合させて作った、抗体薬としての試薬１４を混ぜた培地４を形成し、この培地４で分化誘導後の細胞群を一定時間培養して、残存する未分化細胞を標識する。
【００６１】
次に図５（ｅ）の工程では、試薬１４を混合した培地４を洗い流し、未分化細胞２と結合していない余分な磁性体物質を洗い流す。その結果、細胞群には、未分化細胞２と抗体の結合による標識未分化細胞１６ができる。
【００６２】
次に、図５（ｆ）の工程では、標識未分化細胞１５に対して、磁性体物質を活性化させるための交流電場を掛け、磁性体物質を活性化することにより、標識された未分化細胞１５を不活性化、つまり死滅させる。
【００６３】
次に、図５（ｇ）の工程では、死滅した未分化細胞６の破砕物、および、未反応活性化物質などを洗い流し、分化細胞を得る。
【００６４】
そして、図５（ｈ）の工程では、未分化細胞排除処理結果を光学システム７を用いて確認する。
【００６５】
以上説明したように、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別、分離することが可能となるので、例えば、この細胞群を再生医療に用いる場合に、健康上の安全性を向上することができるのである。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
以上のように本発明は、未分化細胞を分化誘導した細胞群から未分化細胞を識別分離する方法であって、未分化細胞を分化誘導した細胞群を、前記未分化細胞に特異的に結合する抗体に未分化細胞不活性化物質を結合させた抗体薬を溶かした培養液に一定時間培養し、未分化細胞と抗体薬を結合させる未分化細胞標識工程を含む細胞識別分離方法であるので、健康上の安全性を向上することができる。
【００６７】
すなわち、未分化細胞と抗原抗体反応をする抗体と、この抗体と一体となった未分化細胞不活性化物質よりなる試薬を用いることで、未分化細胞を分化誘導した細胞群から、未分化細胞を識別、分離することが可能となるので、健康上の安全性を向上することができるのである。
【００６８】
したがって、再生医療に用いる細胞膜の製造方法として、広く活用が期待されるものである。
【符号の説明】
【００６９】
１  培養容器
２  未分化細胞
３  分化細胞
４  培地
５  標識未分化細胞
６  死滅した未分化細胞
７  光学システム
８  試薬
９  抗体
１０  光感受性物質
１１  エピトープ
１２  試薬
１３  標識未分化細胞
１４  試薬
１５  標識未分化細胞
１６  培養容器保持部
１７  操作部
１８  制御部
１９  光源
２０  フィルター
２１  並行照明手段
２２  シャッター
２３  遮光箱
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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