(57)【要約】      （修正有）【課題】結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群の１以上のマイコバクテリアの検出と、結核菌群のマイコバクテリアによるヒトなどの動物対象の感染の診断および予後診断と、このような感染、特に結核と関連する状態の診断方法の提供。【解決手段】結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を特異的に検出する方法であって、試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出しない条件下で検出することを含む方法を提供する。【選択図】図１
2016005470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を特異的に検出する方法であって、
（ｉ）試料から核酸を単離する工程と、
（ｉｉ）配列番号２に示すようなヌクレオチド配列にアニールする１以上のプライマーを用いるインビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程と、
（ｉｉｉ）ｉｌｖＣ核酸を検出する工程と
を含み、
ここにおいて、ｉｌｖＣ核酸の検出が、前記試料中の前記結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を示し、Ｍ．アウィウム群の１以上のマイコバクテリアの不存在を示す
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記検出されたｉｌｖＣ核酸が、結核菌ｉｌｖＣのＤＮＡまたはＲＮＡの配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結核菌群の生物が、結核菌、ウシ型結核菌、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．カネッティおよびネズミ型結核菌またはそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結核菌群の生物が、結核菌およびウシ型結核菌またはそれらの組合せから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記結核菌群の生物が結核菌である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記結核菌が結核菌の臨床株または臨床分離株である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記結核菌群の生物がウシ型結核菌である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
Ｍ．アウィウム群のマイコバクテリアがＭ．アウィウムである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｍ．アウィウム群のマイコバクテリアがＭ．イントラセルラーレである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、温度サイクリングを伴う増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、温度サイクリングを伴わない増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅反応が、ＲＮＡの逆転写により生成された一本鎖もしくは二本鎖のｃＤＮＡ鋳型またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を用いて行なわれる、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｉｌｖＣ核酸を検出する工程が、配列番号２に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸を検出することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉｌｖＣ核酸を検出する工程が、配列番号２に示すような少なくとも４０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸を検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｉｌｖＣ核酸を検出する工程が、配列番号２の長さが少なくとも５０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸を検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｉｌｖＣ核酸を検出する工程が、配列番号２に示すような少なくとも５０の連続するヌクレオチドのアンプリコンを検出することを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｉｌｖＣ核酸を検出する工程が、配列番号２に示すような少なくとも８０の連続するヌクレオチドのアンプリコンを検出することを含む、請求項１〜１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、各々配列番号２のその位置４２０から位置６００までの少なくとも約１８の連続するヌクレオチド配列、または配列番号２に相補的なその位置４２０から位置６００までの配列を含む１つまたは複数のプライマーを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、各々配列番号２のその位置４０から位置１８０までの少なくとも約１８の連続するヌクレオチド配列、または配列番号２に相補的なその位置４０から位置１８０までの配列を含む１つまたは複数のプライマーを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、各々配列番号２のその位置８８０から位置１０００までの少なくとも約１８の連続するヌクレオチド配列、または配列番号２に相補的なその位置８８０から位置１０００までの配列を含む１つまたは複数のプライマーを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、３０回未満の増幅サイクルで増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、１２回の増幅サイクルから２７回の増幅サイクルで増幅反応を行なうことを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、１４回の増幅サイクルから２０回の増幅サイクルで増幅反応を行なうことを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、２ｎｇ／ｍｌ未満のインプットの原核生物核酸に対して増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を、前記Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出することなく検出することが、１つまたは複数の増幅プライマーと、前記増幅プライマーの核酸産物にハイブリダイズし、それにより検出可能なシグナルを生じさせることができる配列を含む標識プローブとを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、１つまたは複数の増幅プライマーと、前記増幅プライマーの少なくとも１つに結合することができる標識プローブとを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料が培養結核菌細胞を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料が喀痰を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料がリンパ節生検を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、血液、血清、血漿、血液画分、血清画分または血漿画分を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が尿を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、少なくとも１０４コピーのｉｌｖＣ核酸を６０分未満で検出するのに十分な条件下で増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、少なくとも１０３コピーのｉｌｖＣ核酸を約６０分未満で検出するのに十分な条件下で増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、少なくとも１０４ＣＦＵ／ｍｌの前記結核菌群のマイコバクテリアを検出するのに十分な条件下で増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
試料中の前記結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上の核酸を検出することをさらに含み、ここで、前記１以上の核酸がｉｌｖＣ核酸以外のものである、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｉｌｖＣ核酸以外の１以上の核酸が１６ｓ  ｒＲＮＡである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｉｌｖＣ核酸以外の１以上の核酸が、ＢＳＸ、Ｓ９、Ｒｖ１２６５、ＥＦ−Ｔｕ、Ｐ５ＣＲ、ＴｅｔＲ様タンパク質およびグルタミン合成酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸、またそれらに相補的な核酸である、請求項３６に記載の方法
【請求項３９】
（ｉ）前記ＢＳＸの検出は、配列番号４に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｉｉ）前記Ｓ９の検出は、配列番号６に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｉｉｉ）前記Ｒｖ１２６５の検出は、配列番号８に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｉｖ）前記ＦＦ−Ｔｕの検出は、配列番号１０に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｖ）前記Ｐ５ＣＲの検出は、配列番号１２に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｖｉ）前記ＴｅｔＲ様タンパク質の検出は、配列番号１４に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｖｉｉ）前記グルタミン合成酵素の検出は、配列番号１６に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含む、
請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年２月２６日に出願された豪州特許出願第２００９９００８７６号の優先権を主張し、この内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）群の１以上のマイコバクテリアの検出と、結核菌群のマイコバクテリアによるヒトなどの動物対象の感染の診断および予後診断と、このような感染、特に結核と関連する状態の診断とに関する。より特には、本発明は、感染した対象における結核菌のケトール−酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）ｍＲＮＡおよびそのコードされたタンパク質（配列番号１）の発現と、新規の診断および予後診断方法のためのならびに感染の治療（ｔｈｅｒａｐｙ）および／または結核の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の効力のモニタリングのための試薬とに関する。
【背景技術】
【０００３】
結核（ＴＢ）は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）による感染または結核菌群の１以上の生物によって通常引き起こされる慢性の感染性疾患である。本明細書で使用される場合、「結核菌群」という用語は、結核菌、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、マイコバクテリウム・カネッティ（Ｍ．ｃａｎｅｔｔｉ）およびネズミ型結核菌（Ｍ．ｍｉｃｒｏｔｉ）からなる群から選択される１以上の生物を意味する。当業者は、結核菌群が、例えば、農業用動物におけるパラ結核として知られる無関係な疾患の原因病原体である、Ｍ．アウィウムやＭ．イントラセルラーレをはじめとする、いわゆる、Ｍ．アウィウム群と異なることも知っている。
【０００４】
結核（ＴＢ）は、発展途上国で主要な疾患であるだけでなく、世界の先進地域でも増加している問題であり、毎年約８００万件の新症例と３００万人の死亡が発生している。感染はかなりの期間にわたって無症状であることがあるが、この疾患は、ほとんどの場合、肺の急性炎症として現れ、発熱と喀痰を伴う咳とを引き起こす。治療しないで放置すると、結核菌感染は、肺の原発感染部位を越えて、体の任意の器官に進むことがあり、一般に、深刻な合併症と死をもたらす。
【０００５】
ＴＢの急増する世界的発生の問題は、ヘルスケア産業の多くの従事者によってしばしば記載されており、その分野の当業者には周知である。結核菌感染の治療には、複数の薬物を用いる何ヶ月もの治療が必要とされるので、そのような大規模な治療は、低コンプライアンスと、多剤耐性（ＭＤＲ）および広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）ＴＢの出現とをもたらすことがある。
【０００６】
問題はＨＩＶ感染により悪化する。結核の発生は、末期のＡＩＤＳ患者で特に一般的であり、その大多数はそれに罹る。実際、ＨＩＶ感染は、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）−ツベルクリン陽性対象で活動性結核の発症の最も重要な危険因子であり、ＨＩＶ感染免疫抑制状態の個体での結核感染の獲得の危険は、ＨＩＶ非感染の個体と比較して著しく高い可能性がある。ＨＩＶ−１と結核菌による同時感染は、おそらく、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の欠乏および免疫不全または免疫抑制をもたらすウイルス複製およびウイルス負荷の増加を誘発することによって、対象におけるＨＩＶ無症状期間の短縮および生存期間の短縮をもたらす可能性も高い（Ｃｏｒｂｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ  ２００３；Ｈｏ，Ｍｅｍ．Ｉｎｓｔ．Ｏｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ，９１，３８５−３８７，１９９６）。
【０００７】
結核の大きな世界的負担にもかかわらず、症例検出も相変わらず問題である。ＴＢ患者全体の約半分は、今も診断や適切な治療を受けていないと推定されている（ＷＨＯ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２００７，ＷＨＯ／ＨＴＭ／ＴＢ／２００７．３７６，Ｇｅｎｅｖａ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。こうしたデータから、急性感染の早期の正確な診断、および潜伏感染の診断が、結核の管理に必要であることは明白である。
【０００８】
従来の結核診断は、抗酸菌検出のための喀痰塗抹顕微鏡検査、培養、ツベルクリン皮膚試験、および胸部Ｘ線に相変わらず頼っており、これらは全て、いくつかの限界があることが分かっている。活動性結核感染の検出において、顕微鏡検査は迅速かつ安価あるが、感度が低く、喀痰塗抹試料中での桿菌の可視化を必要とする。培養はより感度が高いが、結果に数週間かかることがあり、１０〜２０％の偽陽性発生率がある。これらの検査は１世紀近く使用されているが、特に、開発途上国やＨＩＶが流行している場所で結核を管理するのには不十分である。
【０００９】
結核の診断検査の開発は、数々の困難により妨げられてきた。本発明まで、結核菌群の１以上の細菌による感染の検出で使用するのに適したバイオマーカーの同定が問題になっていた。これは、任意の特定のインビボ環境で結核菌のどの結核菌タンパク質が最も大量に発現されているかが明確でなかったためである。さらに、様々な環境での発現が、感染マーカーおよび潜伏感染と比較して活動性感染を区別するマーカーの同定を複雑化した。実験用のシステムと実験株の使用とは、この欠点に対処しない。さらに、結核菌群の他のマイコバクテリアの検出に有用なマーカーを同定するのは困難であった。候補マーカーが同定されても、ＴＢの診断は、現行の検査に感度が欠け、また、臨床試料の大規模コホート全体での再現性がないためにさらに複雑になる。ＤＮＡおよびｒＲＮＡ標的配列の増幅に依存する分子検査は、急性感染の検査として、または感染マーカーとして好適ではなかった。さらに、ｍＲＮＡの検出に基づく分子検査は、タンパク質検出に基づく検査と同じ障害に直面し、特に、臨床試料の保存中のメッセージの安定性という困難な事態をさらに伴う。したがって、当技術分野では、一般的なマイコバクテリアタンパク質にわたる臨床試料中の、結核菌群の１以上の細菌を検出するための、必要な感度や選択性を提供する試薬が必要とされている。
【００１０】
高レベルで発現される好適なバイオマーカーの同定における進歩は、当技術分野においていくつかの障害に直面している。結核菌ゲノムの配列決定は、この生物によって理論的に発現され得る結核菌タンパク質およびｍＲＮＡを同定するための厖大な研究努力を促進したが、任意の特定のタンパク質またはｍＲＮＡが、ヒトまたは他の動物対象の感染の時は言うまでもなく、インビボで生物によって発現されると結論するには、配列データ単独では不十分である。結核菌のゲノム中のオープンリーディングフレームの単なる解明は、コードされた任意の特定のタンパク質がこの細菌で実際に発現され、かつそのようなタンパク質を抗原またはｍＲＮＡに基づく診断として使用し得ることを示さない。例えば、特定のタンパク質または結核菌のタンパク質をコードするｍＲＮＡが抗原に基づく検査、または核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）における診断試薬としての効力を有すると結論するには、この細菌の感染サイクルの間のタンパク質発現を反映するタンパク質またはｍＲＮＡが試料中に存在し、かつ利用可能でなければならない。さらに、臨床試料の保存中のｍＲＮＡの既知の不安定性のために、ｍＲＮＡ検出に基づく診断検査が、実際の検出、および臨床試料の大規模コホート全体での再現性の点において、特に至難の業となっている。
【００１１】
培養で結核菌を増殖させる能力は、発現された結核タンパク質をインビトロで同定するための好都合なモデルを提供した。しかしながら、培養環境は、結核菌がインビボで見出される、ヒトマクロファージ、肺または肺外部位の環境と著しく異なる。さらに、結核菌は、細胞間病原体でもあり、細胞内病原体でもある。最近の証拠から、インビトロでの生物の発現プロファイルがインサイチュでの生物の発現プロファイルを正確に反映し得ないほど、細胞内寄生虫のタンパク質発現プロファイルが環境信号によって著しく変動することが示されている。これは、その細胞内状態のときの結核菌に同様に当てはまる。
【００１２】
結核桿菌による感染または潜伏感染の再活性化は、感染部位への単球およびマクロファージの動員を含む宿主応答を誘導する。より多くの免疫細胞が集積するに従い、マクロファージの細胞傷害産物によって破壊された免疫細胞および宿主組織を含む肉芽腫の結節が形成される。疾患の進行に伴い、マクロファージ酵素がタンパク質、脂質および核酸の加水分解を引き起こし、周囲組織の液状化および肉芽腫形成をもたらす。最終的には、病巣が破裂し、桿菌が周囲の肺、血液またはリンパ系に放出される。
【００１３】
この感染周期の間、桿菌は４つの異なる宿主環境、すなわち、肺胞マクロファージ、乾酪性肉芽腫、細胞外肺、および例えば腎臓もしくは腹膜腔、リンパ、骨または脊椎などの肺外部位に曝露される。
【００１４】
桿菌はこれらの全ての環境において様々な程度で複製することができると考えられているが、各部位での環境条件についてはほとんど知られていない。４つの宿主環境は全て異なっており、各環境での結核菌の発現プロファイルが異なることが示唆される。
【００１５】
したがって、対数期培養からの結核菌タンパク質の同定は、インビボの各環境でどのタンパク質またはｍＲＮＡが発現されるかを必ずしも示唆するわけではない。同様に、インビトロで増殖させたマクロファージでの結核菌タンパク質の同定は、乾酪性肉芽腫、高曝気肺、または酸素含有量の低い肺外部位での結核菌のタンパク質またはｍＲＮＡ発現プロファイルを必ずしも反映するわけではない。
【００１６】
さらに、宿主内の結核菌感染は、宿主免疫系が感染マクロファージの破壊を通して桿菌を封入および破壊しようと絶えず努力する動的事象と理解することができる。その結果として、結核桿菌は、細胞内の増殖、破壊（この場合、細胞内細菌タンパク質と分泌細菌タンパク質の両方が曝露および破壊される）、ならびに急速な細胞外増殖の周期を経る。宿主および病原体の相互作用は多くの因子の結果であって、これはインビトロで再現することができない。
【００１７】
結核菌群メンバーに特異的なＤＮＡ、およびｒＲＮＡ標的配列の増幅のための系が記載されているが、そのような検査は、核酸標的が持続するため、患者の治療応答のモニタリングには好適でなかった。これは、細菌ＤＮＡおよびｒＲＮＡの安定性が、増幅可能なＤＮＡおよびｒＲＮＡ標的が患者の中で持続することができることを意味するためである。これらの核酸種の持続は、死んだまたは休止した桿菌が肺病変から剥がれ落ちることを反映すると考えられ、結果として、急性感染の優れた指標とならない。このような核酸に基づく検査はまた、塗抹または培養による確認なしでは、成功を収めていないかまたはＷＨＯによって独立型の検査として推奨されていない。
【００１８】
いくつかの核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）は、結核菌遺伝子および仮想コード配列の同定に基づいて現われた。ＤＮＡ、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡ標的に基づく全ての利用可能なＮＡＡＴの最近のメタ分析により、利用可能な検査の実際の性能は最適ではないことが示されている（Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（２）：ｅ１５３６，Ｆｅｂ．２００８）。呼吸器標本におけるＮＡＡＴの感度および特異性の推定値にはかなりのばらつきがあり、感度は特異性よりも低くかつ一貫性がなく、診断精度の要約測定値は、臨床的に有意義であるとみなされない。メタ分析研究により、ＮＡＡＴは非生菌の検出に今も問題があり、かつ偽陽性の結果を生じさせるので、現在利用されているＮＡＡＴを肺ＴＢ診断用の従来の検査の代わりにするよう推奨することができないことも、治療進行をモニタリングする有用性を示していないことも確認されている。
【００１９】
結核菌および／またはそれと関連する疾患状態による感染を費用効率高くかつ迅速に決定する診断および予後診断試薬の診断精度（特に感度）を改善する必要性が明らかに存在し続けている。
【００２０】
分子生物学、微生物学、プロテオミクス、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の従来技術は、例えば、以下のテキストに記載されている。
１．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９），  ｗｈｏｌｅ  ｏｆ  ＶｏＩｓ  Ｉ，  ＩＩ，  ａｎｄ  ＩＩＩ；
２．  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＶｏＩｓ．  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  （Ｄ．  Ｎ．  Ｇｌｏｖｅｒ，  ｅｄ．，  １９８５），  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｗｈｏｌｅ  ｏｆ  ｔｅｘｔ；
３．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  １９８４）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｗｈｏｌｅ  ｏｆ  ｔｅｘｔ，  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  ｔｈｅ  ｐａｐｅｒｓ  ｔｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  Ｇａｉｔ，  ｐｐｌ−２２；  Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｐｐ３５−８１；  Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ，  ｐｐ  ８３−１１５；  ａｎｄ  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ｐｐ  １３５−１５１；  
４．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｂ．  Ｄ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．，  １９８５）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｗｈｏｌｅ  ｏｆ  ｔｅｘｔ；
５．  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （１９８６）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  ｗｈｏｌｅ  ｏｆ  ｔｅｘｔ；
６．  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  （１９８４）；
７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｈｉ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ｓ．  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．），  ｗｈｏｌｅ  ｏｆ  ｓｅｒｉｅｓ；
８．  Ｊ．Ｆ．  Ｒａｍａｌｈｏ  Ｏｒｔｉｇａｏ，  “Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”  Ｉｎ：  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ａｃｃｅｓｓ  ｔｏ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗｅｂｓｉｔｅ  （Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）；
９．  Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，  Ｄ．，  Ｔｅｉｃｈｍａｎ，  Ｊ．，  Ｌｉｅｎ，  Ｅ．  Ｌａｎｄ  Ｆｅｎｉｃｈｅｌ，  Ｒ．Ｌ．  （１９７６）．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ７３  ３３６−３４２
１０．  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．  （１９６３）．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５，  ２１４９−２１５４．
１１．  Ｂａｒａｎｙ，  Ｇ．  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｒ．Ｂ．  （１９７９）  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  （Ｇｒｏｓｓ，  Ｅ．  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，  Ｊ．  ｅｄｓ．），  ｖｏｌ．  ２，  ｐｐ．  １−２８４，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
１２．  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｅ．，  ｅｄ．  （１９７４）  Ｓｙｎｔｈｅｓｅ  ｖｏｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｎ  ｉｎ  Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌｓ  Ｍｅｔｏｄｅｎ  ｄｅｒ  Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ  Ｃｈｅｍｉｅ  （Ｍｕｌｅｒ，  Ｅ．，  ｅｄ．），  ｖｏｌ．  １５，  ４ｔｈ  ｅｄｎ．，  Ｐａｒｔｓ  １  ａｎｄ  ２，  Ｔｈｉｅｍｅ，  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．
１３．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ｍ．  （１９８４）  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
１４．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ｍ．  ＆  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ａ．  （１９８４）  Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
１５．  Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ｍ．  （１９８５）  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ２５，  ４４９−４７４．
１６．  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ＶｏＩｓ．  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．  Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，  ｅｄｓ．，  １９８６，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）．
１７．  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｍ．  Ｒ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｋ．  Ｌ．，  Ａｐｐｅｌ  Ｒ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ  （Ｅｄｓ）  １９９７  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：  Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明に至る研究において、本発明者らは、１以上の結核菌群のマイコバクテリアによるＴＢ感染のバイオマーカーであって、すなわち、タンパク質レベルおよび／またはＲＮＡレベルで、好ましくは細菌量と相関するレベルで、かつ臨床試料および臨床株中で発現されるものを同定すること、および／またはマイコバクテリアの包括的な検出とは対照的な結核菌群の特定のマイコバクテリアの検出のための試薬を提供すること、および／または従来の検査と比較して、臨床試料（保存試料を含む）中での検出の感度および／または選択性が改善された検査を開発すること、および／または臨床試料（保存試料を含む）のパネル全体で結核菌群の生物を再現性よく検出する能力を有する検査を開発することを目指してきた。
【００２２】
本発明は、様々なインビボ環境で結核菌群の生物によって発現される様々なタンパク質の発見、それによる、結核菌および結核菌群の他の生物の高度に発現されるおよび／または高度に免疫原性のタンパク質の同定に一部基づくものである。このようなタンパク質は、いくつかの特許出願に記載されており、それらは全て、参照により本明細書に組み込まれる（国際刊行物：ＷＯ２００６／０１７９２号、ＷＯ２００７／０８７６７９号、ＷＯ２００７／１３１２９１号、ＷＯ２００７／１４０５４５号、ＷＯ２００７／１３１２９３号、ＷＯ２００７／１３１２９２号、ＷＯ２００６／００００４５号）。プロテオミクスの手法を用いて、インビボで発現され、かつ喀痰、胸水、血漿および血清をはじめとする、罹患患者のコホートの体液中に存在する結核菌群タンパク質が同定された。結核菌群タンパク質は、結核と診断された患者（例えば、結核菌または結核菌群の他の生物に感染した患者）のコホートから事前に得られた免疫グロブリン含有試料（特にＩｇＧ）の二次元電気泳動によりインビボで同定された。ペプチド断片が同定され、ペプチド断片のアミノ酸配列がトリプシン消化した断片の質量分析により決定され、ケトール−酸レダクトイソメラーゼ（Ｋｅｔｏｌ−Ａｃｉｄ  Ｒｅｄｕｃｔｏ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）（ＫＡＲＩ）タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列と一致することが示された。特に、マッチしたペプチドは、ＫＡＲＩタンパク質配列の一領域と一致した。配列番号１のＫＡＲＩタンパク質をコードする核酸は、結核菌またはホモログのｉｌｖＣ遺伝子によってコードされている。
【００２３】
本発明者らは、これらの発見を用いて、上記のように臨床試料中に存在することが分かっている、いくつかの事前に同定された結核マーカーを用いる核酸増幅検査を開発した。発現された結核バイオマーカーを検出するための比較定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて、本発明者らは、ｉｌｖＣ転写産物が最も信頼できるものであり、最も多い転写産物コピー数が臨床試料中で検出できることを見出した。ｉｌｖＣの転写産物レベルは、患者における感染の重症度とも相関した。
【００２４】
これらの発見により、ハイブリダイゼーションに基づく診断検査（例えば、ＦＩＳＨ）と、核酸増幅（ＮＡＡ）に基づく診断検査とを生み出す手段が与えられた。この核酸増幅（ＮＡＡ）に基づく診断検査には、ＮＡＳＢＡに基づくプラットフォーム（例えば、ＰＣＲに基づく検査および温度サイクリングを必要としない等温増幅方法）と、リアルタイムで行なわれる増幅方法（例えば、リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびリアルタイム等温法およびリアルタイムＮＡＳＢＡ）と、プライマーに結合する標識レポーター（例えば、ＳＹＢＲグリーンＩおよび／またはＩＩに基づくもの）を援用して、またはアンプリコンに結合するプローブ（例えば、スコーピオンプローブ、ＴａｑＭａｎプローブおよび分子ビーコン）を用いて行なわれるような検査とが含まれる。これらの検査は、例えば、対象における結核菌および／または他の結核菌群の生物の検出に基づく、結核菌群の生物による感染の特異的検出、および結核の診断または感染もしくは治療のモニタリングあるいは感染もしくはそれと関連する疾患状態の予後診断に有用である。このようなＮＡＡに基づく診断および予後診断は、臨床試料中のｉｌｖＣ転写産物（ｉｌｖＣ−ＮＡＡ）の特異性および感度が高い検出に基づく。例えば、本発明者らは、反応液中で少なくとも約１０３個のｉｌｖＣコードＲＮＡのコピーを検出することができる。例えば、治療的介入の効力を決定するために、このような診断および予後検査を結核またはそれと関連する感染症の治療的治療とともに使用し得ることも当業者には明白であろう。
【００２５】
したがって、本発明は、結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を特異的に検出する方法であって、本明細書に記載の検出手段を用いて、生物学的試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアの核酸を検出することを含む方法を提供する。例えば、本方法は、Ｍ．アウィウム群の核酸を検出しない条件下でこの検出手段を用いて行なわれる。
【００２６】
一実施例では、本発明は、結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を特異的に検出する方法であって、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出しない条件下で試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出することを含む方法を提供する。
【００２７】
一実施例では、検出は、標準的な核酸ハイブリダイゼーションまたはその変化形、例えば、ＦＩＳＨ、もしくは核酸増幅を含まない任意の他の方法によって行なわれる。これは、ｉｌｖＣが、結核菌群のマイコバクテリアの特異的検出のためのバイオマーカーとして、かつ許容可能な感度レベルで、好適な条件下で好都合に利用され得るということを示す点において本発明の精神に一致する。
【００２８】
したがって、検出されるｉｌｖＣ核酸は、結核菌ｉｌｖＣＤＮＡまたはＲＮＡの配列を含み得る。結核菌群の生物は、結核菌、ウシ型結核菌、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．カネッティおよびネズミ型結核菌またはそれらの組合せから個々にまたはまとめて選択され得る。結核菌群の生物は、結核菌およびウシ型結核菌またはそれらの組合せから選択される。結核菌群の生物は、結核菌または結核菌の臨床株もしくは臨床分離株であり得る。結核菌群の生物はウシ型結核菌であり得る。Ｍ．アウィウム群のマイコバクテリアは、Ｍ．アウィウムまたはＭ．イントラセルラーレであり得ることが当業者には知られているであろう。
【００２９】
特に好ましい実施例では、結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出するための本発明の方法は、いくつかのＮＡＳＢＡに基づくアッセイのうちのいずれか１つ、例えば、等温増幅もしくは温度サイクリングを必要としない他の増幅、または、温度サイクリングを必要とする増幅反応、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、例えば、標準的なＰＣＲまたは逆転写酵素を介するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））、などの増幅反応を行なうことを含む。本明細書に提供される実施例は、温度サイクリングを必要とする方法だけでなく、温度サイクリングを利用しない方法も明確に支援する。したがって、この文脈での「増幅」という用語は、別途特に示さない限り、温度サイクリングとは無関係な全ての増幅方法を包含するとみなされるべきである。本明細書で特に記述されていない増幅アッセイフォーマットを除外すべきではない。
【００３０】
例えば、結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出することは、１以上のｉｌｖＣ核酸を増幅し、それにより、増幅されたｉｌｖＣ核酸を生成させることと、増幅された核酸を検出することとを含み得、ここで、増幅されたｉｌｖＣ核酸の検出は、試料中の１以上の該結核菌群のマイコバクテリアの存在を示す。この実施例において、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出することなく結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出することは、増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応を行ない、それにより、配列番号２の長さが少なくとも１２もしくは１５もしくは２０もしくは４０もしくは５０の連続するヌクレオチドの配列または結核菌群の１以上のマイコバクテリアに由来するそれに相同な配列を含むｉｌｖＣ核酸を検出することを含む。本明細書で使用される場合、「長さが少なくとも２０または４０または５０の連続するヌクレオチドの配列を含むｉｌｖＣ核酸を検出する」という用語は、プライマーまたはプローブに特異的にハイブリダイズしている試料のｉｌｖＣ核酸中の最小領域を指す。あるいは、またはさらに、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出することなく結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出することは、増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応を行ない、それにより、配列番号２の長さが少なくとも５０もしくは６０もしくは７０もしくは８０もしくは９０もしくは１００もしくは１１０もしくは１２０もしくは１３０もしくは１４０もしくは１５０もしくは１６０もしくは１７０もしくは１８０もしくは１９０もしくは２００の連続するヌクレオチドのアンプリコンまたは結核菌群の１以上のマイコバクテリアに由来するそれに相同な配列を生成させることを含む。当業者は、「アンプリコン」という用語が増幅された核酸を指すことを知っている。
【００３１】
あるいは、またはさらに、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出することなく結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出することは、
（ｉ）配列番号２の位置４２０から位置６００または配列番号２に相補的なその位置４２０から位置６００までの配列；
（ｉｉ）配列番号２の位置４０から位置１８０または配列番号２に相補的なその位置４０から位置１８０までの配列；
（ｉｉｉ）配列番号２の位置８８０から位置１０００または配列番号２に相補的なその位置８８０から位置１０００までの配列
からなる群から選択される配列番号２の領域由来の、配列番号２の少なくとも約１８の連続するヌクレオチドの配列を各々含む、１つまたは複数のプライマーを用いて、増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応を行なうことを含む。例えば、フォワードプライマーは、配列番号１９、２７、２９、３１、および３５からなる群から選択される。別の実施例では、リバースプライマーは、配列番号２０、２８、３０、３２、３６、３７、３８、３９および４０からなる群から選択される。
【００３２】
あるいは、またはさらに、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出することなく結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出することは、増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応を、約３０回未満の増幅サイクルで、例えば、約１２回の増幅サイクルから約２７回の増幅サイクルまたは約１４回の増幅サイクルから約２０回の増幅サイクルで、行なうことを含む。
【００３３】
あるいは、またはさらに、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出することなく結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を検出することは、約２ｎｇ／ｍｌ未満のインプット核酸に対して、増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応を行なうことを含む。「インプット核酸」とはＰＣＲ反応に含まれる核酸を意味し、必ずしもｉｌｖＣ核酸を意味するものではない。
【００３４】
結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸は、いくつかの増幅プラットフォームのうちのいずれか１つにおいて、場合により、定量手段を用いて検出される。１つの例示的な定量手段は、１つまたは複数の増幅プライマーと、増幅プライマーの核酸産物にハイブリダイズし、それにより検出可能なシグナルを生じさせることができる配列を含む標識プローブとを用いて、増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応を行なうことを含む。別の実施例では、増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応は、１つまたは複数の増幅プライマーと、増幅プライマーのうちの少なくとも１つに結合することができる標識プローブとを用いて行なわれる。
【００３５】
本発明は、いくつかの異なる試料タイプのうちのいずれか１つにおいて結核菌群のマイコバクテリアを検出するのに有用である。例えば、試料は、任意の結核菌群の生物の培養細胞を含み得る。あるいは、試料は、喀痰および／または気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）および／またはリンパ節生検および／または血液もしくはその画分、例えば、血清、血漿、血清画分または血漿画分を含み得る。あるいは、試料は尿を含み得る。結核菌群のマイコバクテリアを含むことが知られている他の試料を除外すべきではない。
【００３６】
本明細書の任意の実施例による本発明の方法は、少なくとも約１０４コピーのｉｌｖＣ核酸を約６０分未満で、好ましくは少なくとも約１０３コピーのｉｌｖＣ核酸を約６０分未満で検出することができる。あるいは、またはさらに、本明細書の任意の実施例による本発明の方法は、少なくとも約１０４ＣＦＵ／ｍｌの結核菌群のマイコバクテリアを検出することができる。
【００３７】
本発明の方法は、多検体フォーマット、例えば、マルチプレックス増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応、例えば、マルチプレックスＮＡＳＢＡまたはマルチプレックスＰＣＲにも適しており、結核菌群のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸の特異的検出が、ｉｌｖＣ核酸以外の結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上の核酸検出によって補完される。例えば、ｉｌｖＣ核酸以外の核酸は、結核菌群のマイコバクテリアの１６ｓ  ｒＲＮＡであり得る。あるいは、またはさらに、１以上のｉｌｖＣ核酸以外の核酸は、例えば、それにより、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６からなる群から選択される配列の長さが少なくとも２０もしくは３０もしくは４０もしくは５０もしくは６０もしくは７０もしくは８０もしくは９０もしくは１００もしくはそれを上回る連続するヌクレオチド、またはそれらに相補的な配列を検出するための、ＢＳＸ、Ｓ９、Ｒｖ１２６５、ＥＦ−Ｔｕ、Ｐ５ＣＲ、ＴｅｔＲ様タンパク質およびグルタミン合成酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸、またはそれらに相補的な核酸であり得る。本発明はまた、該核酸が試料中に存在するときに、１以上のｉｌｖＣ核酸以外の核酸に由来する各々長さが少なくとも５０または６０または７０または８０または９０または１００の連続するヌクレオチドの１以上のアンプリコンを生成させ得る。これらの核酸の組合せが検出されるフォーマットも本発明に包含される。
【００３８】
本発明の方法は、結核菌群のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸の特異的検出が、結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上のタンパク質、例えば、ｉｌｖＣ核酸によってコードされるＫＡＲＩタンパク質および／またはＢＳＸおよび／またはＳ９および／またはＲｖ１２６５および／またはＥＦ−Ｔｕおよび／またはＰ５ＣＲおよび／またはＴｅｔＲ様タンパク質および／またはグルタミン合成酵素の検出によって補完される、マルチプラットフォームフォーマット、例えば、ＮＡＡに基づくプラットフォームと抗原に基づくプラットフォームの組合せにも適している。このアッセイフォーマットでは、本明細書の任意の実施例によって記載されるようなタンパク質を検出するために、抗原に基づくアッセイを利用することが特に好ましい。
【００３９】
本発明はまた、生物学的試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を検出する方法であって、
（ｉ）対象から生物学的試料を準備することと、
（ｉｉ）該試料から核酸を単離することと、
（ｉｉｉ）インビトロ核酸増幅アッセイにおいて１以上のｉｌｖＣ核酸を増幅し、増幅された核酸を生成させることと、
（ｉｖ）増幅された核酸を検出することと、
を含み、ここで、増幅された核酸の陽性検出は、該試料中の１以上の該結核菌群のマイコバクテリアの存在を示す、方法を提供する。
【００４０】
別の実施例では、本発明はまた、生物学的試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を検出する方法であって、増幅プライマーおよびプローブ、例えば、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブまたはスコーピオンプローブの存在下で１以上のｉｌｖＣ核酸を増幅し、それにより、プローブがｉｌｖＣ核酸にハイブリダイズするときに、検出可能なシグナルを生じさせることを含み、ここで、検出可能なシグナルは、該試料中の１以上の該結核菌群のマイコバクテリアの存在を示す、方法を提供する。
【００４１】
ｉｌｖＣ核酸（ｉｌｖＣ−ＮＡＡ）を検出するための、本明細書中の任意の実施形態によって記載される１以上のＮＡＡに基づくアッセイは、感染または疾患の早期診断に有用であり、種々の臨床試料中のｉｌｖＣ核酸の存在を検出することによって結核菌群のマイコバクテリアによる活動性感染または過去の感染を検出する手段を提供する。
【００４２】
別の実施例では、本発明は、対象における結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を診断するためのプロセスであって、対象由来の生物学的試料に対して本発明の任意の実施例による方法を行ない、それにより、試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出しない条件下で検出することを含み、ここで、結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上のｉｌｖＣ核酸の検出が感染を示す、プロセスを提供する。本発明のこのプロセスは、活動性感染または潜伏感染の診断に特に適している。
【００４３】
別の実施例では、本発明は、対象における結核を診断するためのプロセスであって、対象由来の生物学的試料に対して本発明の任意の実施例による方法を行ない、それにより、試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアのｉｌｖＣ核酸を、Ｍ．アウィウム群のｉｌｖＣ核酸を検出しない条件下で検出することを含み、ここで、結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上のｉｌｖＣ核酸の検出が結核を示す、プロセスを提供する。本発明のこのプロセスは、肺結核または肺外結核の診断に特に適している。本発明のこのプロセスはまた、結核または結核もしくは結核菌感染と関連する状態のための他の臨床検査、例えば、対象における結核の１以上の臨床症状の診断および／または対象における免疫抑制の１以上の臨床症状の診断および／または対象におけるＨＩＶ感染の診断と組み合わせて特に有用である。
【００４４】
別の実施例では、本発明は、対象における結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を診断する方法であって、該対象由来の生物学的試料中に存在する結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上のｉｌｖＣ核酸を検出することを含み、試料中の該ｉｌｖＣ核酸の存在が感染を示す、方法を提供する。
【００４５】
したがって、本発明のさらなる実施例は、対象における結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を診断する方法であって、プローブ（例えば、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブまたはスコーピオンプローブ）の存在下でポリメラーゼ連鎖反応を行なうことによって、該対象由来の生物学的試料中に存在する結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上のｉｌｖＣ核酸を検出することを含み、ここで、試料中の該ｉｌｖＣ核酸の存在は、プローブの蛍光によって検出され、かつ該蛍光は感染を示す、方法を提供する。
【００４６】
別の実施例では、本発明は、結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を治療するためのプロセスであって、
（ｉ）対象由来の試料に対して本発明の任意の実施例による方法を行ない、それにより、試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアを検出することと、
（ｉｉ）治療有効量の薬学的組成物を対象に投与し、それにより、対象の肺、血液またはリンパ系における病原菌の数を減少させることと、
を含むプロセスを提供する。
【００４７】
本発明はまた、結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を治療する方法であって、
（ｉ）本明細書に記載の任意の実施形態による診断方法を行ない、それにより対象由来の生物学的試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を検出することと、
（ｉｉ）治療有効量の薬学的組成物を投与して、対象の肺、血液またはリンパ系における病原菌の数を減少させることと、
を含む方法を提供する。
【００４８】
本発明はまた、結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を治療する方法であって、
（ｉ）本明細書に記載の任意の実施形態による診断方法を行ない、それにより、第１の薬学的組成物で治療されている対象由来の生物学的試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を検出することと、
（ｉｉ）治療有効量の第２の薬学的組成物を投与して、対象の肺、血液またはリンパ系における病原菌の数を減少させることと、
を含む方法を提供する。
【００４９】
本発明はまた、対象における結核を治療する方法であって、本明細書に記載されたような診断方法または予後診断方法を行なうことを含む方法を提供する。一実施形態では、本発明は、
（ｉ）対象由来の生物学的試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリア感染の存在を検出することと、
（ｉｉ）治療有効量の薬学的組成物を投与して、対象の肺、血液またはリンパ系における病原菌の数を減少させることと、
を含む予防方法を提供する。
【００５０】
本発明はまた、生物学的試料中の結核菌群の１以上のマイコバクテリアを検出するためのキットであって、
（ｉ）ＮＡＡに基づく検出用の１以上のプライマーと、
（ｉｉ）本発明の方法を用いる核酸の増幅に好適な試薬（例えば、緩衝液および／または１以上のデオキシヌクレオチドおよび／またはポリメラーゼおよび／または対照プライマー）ならびに増幅産物の定量に好適な試薬と、
を含むキットを提供する。場合により、キットは使用説明書とともにパッケージングされる。
【００５１】
別の実施例では、本発明は、抗原に基づく検出に好適な試薬をさらに含むキットであって、
（ｉ）結核菌群の１以上のマイコバクテリアの単離されたもしくは組換えの免疫原性ＫＡＲＩタンパク質、または本明細書に記載の任意の実施形態による免疫原性ＫＡＲＩペプチドもしくは免疫原性ＫＡＲＩ断片もしくはそれらのエピトープ、または該ペプチドもしくはエピトープもしくは断片の組合せもしくは混合物、または該免疫原性ＫＡＲＩタンパク質、ペプチド、断片もしくはエピトープを含む融合タンパク質またはタンパク質凝集体に特異的に結合する、１以上の単離された抗体またはその免疫反応性断片と、
（ｉｉ）抗原抗体複合体の形成を検出するための手段と
をさらに含むキットを提供する。場合により、キットは使用説明書とともにパッケージングされている。
【００５２】
別の実施例では、本発明は、抗体に基づく検出に好適な試薬をさらに含むキットであって、
（ｉ）結核菌群の１以上のマイコバクテリアの単離されたもしくは組換えの免疫原性ＫＡＲＩタンパク質、または本明細書に記載の任意の実施形態による免疫原性ＫＡＲＩペプチドもしくは免疫原性ＫＡＲＩ断片もしくはそれらのエピトープ、または該ペプチドもしくはエピトープもしくは断片の組合せもしくは混合物と、
（ｉｉ）抗原抗体複合体の形成を検出するための手段と
をさらに含むキットを提供する。場合により、キットは使用説明書とともにパッケージングされている。
【００５３】
定義
本明細書は、パテントイン（ＰａｔｅｎｔＩｎ）バージョン３．３を用いて準備されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、数字表示  ＜２１０＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２、＜２１０＞３など）によって配列表に中に同定されている。配列（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）など）の長さおよび種類、各ヌクレオチド配列の供給源生物は、それぞれ、数字表示フィールド＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞で提供された情報によって示されている。
【００５４】
本明細書におけるヌクレオチド配列は、用語「配列番号」と、それに続く配列識別子によって定義される（例えば、配列番号１は、配列表中の＜４００＞１と命名された配列を指す）。
【００５５】
本明細書で参照したヌクレオチド残基の命名は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨されるものであり、その場合、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｙはピリミジン残基を表し、Ｒはプリン残基を表し、Ｍはアデニンまたはシトシンを表し、Ｋはグアニンまたはチミンを表し、Ｓはグアニンまたはシトシンを表し、Ｗはアデニンまたはチミンを表し、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表し、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを表し、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを表し、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを表し、Ｎは任意のヌクレオチド残基を表す。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「ケトール−酸レダクトイソメラーゼ」または「ＫＡＲＩ」という用語は、配列番号１または本出願の配列番号１に示すものと実質的に同じ配列との少なくとも約８０％の同一性を含むかもしくは有するおよび／または結核菌のｉｌｖＣ遺伝子によってコードされる配列と少なくとも約８０％同一な配列を含むかもしくは有する結核菌タンパク質組成物であって、結核菌群の１以上のマイコバクテリアまたは該１以上のマイコバクテリアに感染した対象由来の臨床マトリックスと交差反応する免疫原性ペプチドを産生するか、またはそのような抗体を調製する目的に好適であり、かつ任意の他の機能性（例えば、タンパク質翻訳における役割）を必要としない組成物を意味すると解釈する。本発明までは、配列番号１に示す結核菌タンパク質は、インビボで発現されること、または免疫原性もしくは他の生物と免疫学的に非交差反応性であることが示されておらず、ＫＡＲＩタンパク質に関する情報は、配列番号１のポリペプチドをコードする結核菌ゲノム中のオープンリーディングフレームのバイオインフォマティック解析に由来した。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「に由来する」という用語は、特定された整数が、必ずしもその源から直接ではないにしても、特定の源から得られ得ることを示すと解釈するものとする。
【００５８】
文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、または具体的に反対のことを記述しない限り、単数形の整数、工程または要素として本明細書に記載された本発明の整数、工程または要素は、記載された整数、工程または要素の単数形と複数形の両方を明確に包含する。
【００５９】
任意の単一の実施形態に関して、特に、任意のタンパク質または結核菌の診断、予後診断または治療におけるその使用に関して本明細書に記載された本発明の実施形態は、本明細書に記載された本発明の任意の他の実施形態において準用されると解釈するものとする。
【００６０】
個々の対象について本明細書に記載された診断実施形態は、個体群、人種集団もしくは亜集団の疫学、または特定のＭＨＣ拘束を有する個体の診断もしくは予後診断において明確に準用される。本発明の全てのこのようなバリエーションは、本明細書に記載の内容に基づいて、当業者によって容易に導き出される。
【００６１】
結核菌の検出もしくは同定に対する本明細書中の言及および／または結核もしくは結核菌による感染の診断、予後診断もしくはモニタリングに対する言及は、結核菌群のいずれか１種または複数種の生物の検出にまで明確に及ぶが、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、パラ結核および／またはＭ．アウィウム群の１以上の生物の診断にまでは及ばない。例えば、本明細書に記載されているように、本発明は、結核菌ＫＡＲＩおよび断片ならびにＭ．アウィウムおよびＭ．イントラセルラーレのうちの１つまたは複数と交差反応する抗体を、結核を検出するためのおよび／または結核菌群の１以上のマイコバクテリアを検出するための１以上の代用アッセイの使用と組み合わせた（しかし、パラ結核を診断するためのおよび／またはＭ．アウィウム群の１以上のマイコバクテリアを検出するための代用アッセイとは組み合わせていない）マイコバクテリアの包括的なスクリーニングとして使用することを包含する。
【００６２】
本明細書の全体を通じて、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、記載した工程もしくは要素もしくは整数または工程もしくは要素もしくは整数の群の包含を意味するが、任意の他の工程もしくは要素もしくは整数または工程もしくは要素もしくは整数の群の排除を意味しないと理解するものとする。
【００６３】
当業者であれば、本明細書に記載された本発明が具体的に記載されたもの以外のバリエーションおよび修正を受け入れる余地があるということを理解するであろう。本発明は、全てのこのようなバリエーションおよび修正を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、本明細書において、個別的にまたは集合的に言及されているかまたは示されている、工程、特徴、組成物および化合物の全て、ならびに該工程または特徴の任意のおよび全ての組合せまたはいずれか２つ以上を含む。
【００６４】
本発明は、本明細書に記載された具体的な実施例による範囲に限定されるものではない。機能的に同等な産物、組成物および方法は、明確に、本明細書に記載されたような、本発明の範囲内にある。
【００６５】
本発明は、別途示さない限り、分子生物学、微生物学、プロテオミクス、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成、および免疫学の従来技術を用いて、過度の実験を行なうことなく実施される。このような従来技術を教示する下記のテキスト１〜１７は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ゲノムＤＮＡをＰＣＲ鋳型として用いて計算された、リアルタイムＰＣＲでの転写産物の定量に用いられる標準曲線を示すグラフ表示である。パネルＡは、プライマーペアのｒｔＭ．ｔｂ１６ＳＦ（配列番号１７）とｒｔＭ．ｔｂ１６ＳＲ（配列番号１８）とを用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡ転写産物について計算された標準曲線である。パネルＢは、プライマーペアのｒｔＭ．ｔｂｉｌｖＣＦ（配列番号１９）とｒｔＭ．ｔｂｉｌｖＣＲ（配列番号２０）とを用いてｉｌｖＣ転写産物について計算された標準曲線である。パネルＣは、プライマーペアのｒｔＭ．ｔｂＢＳＸＦ（配列番号２１）とｒｔＭ．ｔｂＢＳＸＲ（配列番号２２）とを用いてＢＳＸ転写産物について計算された標準曲線である。パネルＤは、プライマーペアのｒｔＭ．ｔｂＲｖ１２６５Ｆ（配列番号２３）とｒｔＭ．ｔｂＲｖ１２６５Ｒ（配列番号２４）とを用いてＲｖ１２６５転写産物について計算された標準曲線である。パネルＥは、プライマーペアのｒｔＭ．ｔｂＳ９Ｆ（配列番号２５）とｒｔＭ．ｔｂＳ９Ｒ（配列番号２６）とを用いてＳ９転写産物について計算された標準曲線である。曲線の回帰（Ｒ２）と方程式が示されている。
【図２】結核菌ケトール−酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）を検出するための増幅サンドイッチＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフ表示である。実施例に記載されているような緩衝液中でＫＡＲＩを検出するための最適化されたＥＬＩＳＡ条件を用いて、標準曲線を作成した。組換えＫＡＲＩタンパク質（ｐｇ／ｍｌ）の濃度は、対数目盛でＸ軸に示され［ｒｉｌｖＣ］、平均ＯＤは、Ｙ軸に示されている。捕捉抗体および検出抗体（それぞれ、Ｍｏ１２８３ＦおよびＣｈ３４／３５）を、それぞれ、５および２．５μｇ／ｍＬ用いた。４−パラメータロジスティック方程式を用いて、代表的なＥＬＩＳＡデータ（ｎ＝２）（＃１２１７；ＬＯＤ＝１６９０ｐｇ／ｍｌ）に標準曲線を当てはめた。
【図３】サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、結核菌の１つの実験株（Ｈ３７Ｒｖ）および２つの臨床株（ＣＳＵ９３およびＨＮ８７８）における（全細胞タンパク質と比べた）ＫＡＲＩタンパク質の発現を示すグラフ表示である。結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（左）、結核菌株ＣＳＵ９３（中央）およびＨＮ８７８（右）由来の全細胞ライセート（ＷＣＬ）をサンドイッチＥＬＩＳＡで解析した。内在性タンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、スパイキングレベルに対して補正した。データは、各試料を２つ複製して解析する反復実験から得られた。（ｐｇ／μｇ全細胞タンパク質として表される）内在性タンパク質のレベルを、３つの培養株の各々の平均±ＳＤとしてプロットした。結核菌株は、コロラド州立大学からの無料提供で得られた。
【図４】サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、結核菌、Ｍ．イントラセルラーレおよびＭ．アウィウムにおける（全細胞タンパク質と比べた）ＫＡＲＩタンパク質の発現を示すグラフ表示である。結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（左）、Ｍ．アウィウム（中央）およびＭ．イントラセルラーレ（右）由来の全細胞ライセートを２回の独立の実験において２つ複製してアッセイした。内在性タンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、希釈係数に対して補正した。ｐｇ／μｇ全細胞タンパク質として表される内在性タンパク質のレベルを、検査した３つのマイコバクテリアの各々の平均±ＳＤとしてプロットした。
【図５】サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、結核菌、Ｍ．イントラセルラーレおよびＭ．アウィウムの全細胞ライセートから得られた濾過液中のＫＡＲＩタンパク質発現を示すグラフ表示である。結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（左）、Ｍ．アウィウム（中央）およびＭ．イントラセルラーレ（右）の全細胞ライセートから得られた濾過液を、２つ複製してアッセイした。内在性タンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、（もしあれば）希釈係数に対して補正した。ｐｇ／μＬ濾過液として表される内在性タンパク質のレベルを、３つのマイコバクテリアの各々の平均±ＳＤとしてプロットした。
【図６】非マイコバクテリア病原体である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（列１および２）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（列３および４）、ならびに緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（列５および６）由来の０．１μｇ／ｍｌ（列２、４、６）または１００μｇ／ｍｌ（列１、３、５）の全細胞ライセートを用いた、結核菌ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体の顕著な交差反応性の欠如を示すサンドイッチＥＬＩＳＡ結果のグラフ表示である。全細胞ライセートを２回の別々の実験において２つ複製してアッセイした。対照として、精製された組換えＫＡＲＩタンパク質が、ブロッキング緩衝液中での組換えタンパク質の連続希釈により調製されて、０ｎｇ／ｍｌ（列７）、０．１２ｎｇ／ｍｌ（列８）、０．４９ｎｇ／ｍｌ（列９）、１．９５ｎｇ／ｍｌ（列１０）、７．８ｎｇ／ｍｌ（列１１）、３１．３ｎｇ／ｍｌ（列１２）、または１２５ｎｇ／ｍｌ（列１３）で存在した。試料および対照について、平均ＯＤ＋ＳＤがプロットされている。
【図７】そのＴＢ塗抹検査結果、ＴＢ培養検査結果およびＨＩＶ状態によって分類された患者から得られた臨床喀痰におけるＫＡＲＩタンパク質の発現を示すグラフ表示である。図の左側の一連のヒストグラムは、結核菌株Ｈ３７Ｒｖ全細胞ライセートの連続希釈：６０μｇ／ｍｌ（列１）；２０μｇ／ｍｌ（列２）；６．６７μｇ／ｍｌ（列３）；２．２２μｇ／ｍｌ（列４）；０．７４μｇ／ｍｌ（列５）；０．２５μｇ／ｍｌ（列６）；０．０８μｇ／ｍｌ（列７）；０μｇ／ｍｌ（列８）を含む較正標準に存在するＫＡＲＩタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイの平均ＯＤ値を示す。図の左側の一連のヒストグラムは、付随する実施例（方法３：４．５ｍＬ  喀痰−Ｃ１、１７×１５０μＬ  交換増幅ＥＬＩＳＡ）に記載されているように調製された患者試料中に存在するＫＡＲＩタンパク質のＥＬＩＳＡアッセイの平均ＯＤ値を示す。「ＭＰＣ」は試料同定コードを示し、「塗抹」は塗抹検査結果を示し、「ｃｕｌｔ」は培養検査結果を示し、「ＨＩＶ」はＨＩＶ状態を示す。白抜きの棒は、塗抹陰性／培養陰性試料を示す。黒塗りの棒は、塗抹陽性／培養陽性試料を示す。データは、対象のＨＩＶ状態から独立した、塗抹陽性／培養陽性試料における顕著に高いレベルのＫＡＲＩタンパク質交差反応性を示している。
【図８】ｐｇ  ＫＡＲＩタンパク質／ｍｌ試料容量として表された、そのＴＢ塗抹検査結果、ＴＢ培養検査結果およびＨＩＶ状態によって分類された患者から得られた臨床喀痰における発現を示すグラフ表示である。図６に示すデータを、データ中のＫＡＲＩタンパク質較正値（これにより、結核菌Ｈ３７Ｒｖの全細胞抽出液のμｇ／ｍＬ  ＫＡＲＩタンパク質をｐｇ／ｍＬ  ｒＫＡＲＩタンパク質に内挿することが可能になる）に基づいてｐｇ抗原に変換した。「ＭＰＣ」は試料同定コードを示し、「塗抹」は塗抹検査結果を示し、「ｃｕｌｔ」は培養検査結果を示し、「ＨＩＶ」はＨＩＶ状態を示す。白抜きの棒は、塗抹陰性／培養陰性試料を示す。黒塗りの棒は、塗抹陽性／培養陽性試料を示す。データは、対象のＨＩＶ状態から独立した、塗抹陽性／培養陽性試料における顕著に高いレベルのＫＡＲＩタンパク質交差反応性を示している。アッセイのＬＯＤ＝約９００ｐｇ／ｍＬ。
【図９】喀痰による組換えＫＡＲＩ（Ｉｌｖｃ）タンパク質に対する抗体結合の阻害を示すグラフ表示を示す。増幅ＥＬＩＳＡ系を用いて、ＴＢ陰性喀痰中での組換えタンパク質に対する抗体結合の阻害の程度を解析した。喀痰に、ブロッキング緩衝液中の混合物の３分の１希釈物（列４〜６）として、ブロッキング緩衝液中の混合物の９分の１希釈物（列７〜９）として、およびブロッキング緩衝液中の混合物の２７分の１希釈物（列１０〜１２）として、各々の組換えタンパク質１０ｎｇ／ｍＬをスパイクした（列１〜３；列１と２はグラフでは見えないことに留意する）。試料をアッセイ前に４℃で一晩インキュベートしたか（列１、４、７、１０）またはすぐにアッセイした（列２、５、８、１１）。陽性対照試料は喀痰を含まず、アッセイ前に一晩インキュベートした（列３、６、９、１２）。試料を２回の別々の実験の各々において２つ複製したウェルでアッセイした。各希釈の喀痰中で検出された組換えタンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、スパイクされた組換えタンパク質の濃度の％（％シグナル回復）として表した。回復のレベルを３つの処理についての４つの希釈係数の各々の平均％シグナル回復±ＳＤとしてプロットした。データは、ｘ軸に示した各希釈に対するシグナル回復パーセンテージ（Ｙ軸）として提示されている。
【図１０】増幅サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、喀痰による内在性結核菌ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体結合の阻害を示すグラフ表示を示す。増幅ＥＬＩＳＡ系を用いて、ＴＢ陰性喀痰中にスパイクされた結核菌Ｈ３７Ｒｖの全細胞ライセートにおける内在性ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体結合のクエンチングとマスキングのレベルを解析した。喀痰に、ブロッキング緩衝液中の混合物の３分の１希釈物（列４〜６）として、ブロッキング緩衝液中の混合物の９分の１希釈物（列７〜９）として、およびブロッキング緩衝液中の混合物の２７分の１希釈物（列１０〜１２）として、全細胞ライセートをスパイクし、ＫＡＲＩ＝３１ｎｇ／ｍＬという喀痰中の標的濃度を達成した（列１〜３；列１と２はグラフでは見えないことに留意する）。試料をアッセイ前に４℃で一晩インキュベートしたか（列１、４、７、１０）またはすぐにアッセイした（列２、５、８、１１）。陽性対照試料は喀痰を含まず、アッセイ前に一晩インキュベートした（列３、６、９、１２）。試料を２回の別々の実験の各々において２つ複製したウェルでアッセイした。各希釈の喀痰中で検出された組換えタンパク質の濃度を標準曲線（ブロッキング緩衝液に連続希釈されたＨ３７Ｒｖ−ＷＣＬ）からの内挿により計算し、スパイクされた濃度の％（％シグナル回復）として表した。回復のレベルを３つの処理についての４つの希釈係数の各々の平均％シグナル回復としてプロットした。
【図１１】サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（各々３列の群の最初の列）、ＣＳＵ９３（各々３列の群の２番目の列）およびＨＮ８７８（各々３列の群の３番目の列）における全細胞タンパク質を基にして表された、ＢＳＸ（列１〜３）、ＥＦ−Ｔｕ（列４〜６）、ＫＡＲＩ（列７〜９）、Ｐ５ＣＲ（ＰｒｏＣ）（列１０〜１２）、Ｒｖ１２６５（列１３〜１５）、Ｓ９（列１６〜１８）、およびＴｅｔＲ（列１９〜２１）の相対発現を示すグラフ表示である。内在性タンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、希釈係数に対して補正した。データは、各試料を２つ複製して解析する反復実験から得られた。（ｐｇ／μｇ全細胞タンパク質として表される）内在性タンパク質のレベルを、解析したＴＢ抗原の各々の平均±ＳＤとしてプロットした。
【図１２】いくつかの低発現抗原の発現レベルを示す図１１に示されたグラフ表示の拡大図である。
【図１３】サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（各々３列の群の最初の列）、Ｍ．アウィウム（各々３列の群の２番目の列）、およびＭ．イントラセルラーレ（各々３列の群の３番目の列）の１×１０６ＣＦＵ当たりのｎｇタンパク質として表された、ＢＳＸ（列１〜３）、ＥＦ−Ｔｕ（列４〜６）、ＫＡＲＩ（列７〜９）、Ｐ５ＣＲ（ＰｒｏＣ）（列１０〜１２）、Ｒｖ１２６５（列１３〜１５）、Ｓ９（列１６〜１８）、およびＴｅｔＲ（列１９〜２１）の相対発現を示すグラフ表示である。内在性タンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、希釈係数に対して補正した。データは、各試料を２つ複製して解析する反復実験から得られた。内在性タンパク質のレベルを、解析したＴＢ抗原の各々の平均±ＳＤとしてプロットした。データは、結核菌におけるＢＳＸ、ＥＦ−Ｔｕ、ＫＡＲＩ、Ｒｖ１２６５およびＳ９の特異的発現を示している。
【図１４】いくつかの低発現抗原の発現レベルを示す図１３に示されたグラフ表示の拡大図である。データは、これらの低い検出限界でのＭ．イントラセルラーレおよびＭ．アウィウムにおけるＫＡＲＩの検出可能な発現とともに、結核菌におけるＢＳＸ、ＥＦ−Ｔｕ、Ｐ５ＣＲ、Ｒｖ１２６５、Ｓ９、およびＴｅｔＲの特異的発現を示している。
【図１５】サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（各々３列の群の最初の列）、Ｍ．アウィウム（各々３列の群の２番目の列）、およびＭ．イントラセルラーレ（各々３列の群の３番目の列）のμｇ全細胞タンパク質当たりのｐｇ抗原として表された、ＢＳＸ（列１〜３）、ＥＦ−Ｔｕ（列４〜６）、ＫＡＲＩ（Ｉｌｖｃ）（列７〜９）、Ｐ５ＣＲ（ＰｒｏＣ）（列１０〜１２）、Ｒｖ１２６５（列１３〜１５）、Ｓ９（列１６〜１８）、およびＴｅｔＲ（列１９〜２１）の相対発現を示すグラフ表示である。内在性タンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、希釈係数に対して補正した。データは、各試料を２つ複製して解析する反復実験から得られた。内在性タンパク質のレベルを、解析したＴＢ抗原の各々の平均±ＳＤとしてプロットした。データは、結核菌におけるＢＳＸ、ＥＦ−Ｔｕ、Ｒｖ１２６５、Ｓ９、およびＴｅｔＲの特異的発現を示している（図１６参照）。ＫＡＲＩの検出可能な発現は、これらの条件下で、Ｍ．イントラセルラーレおよびＭ．アウィウムにおいて明白であった。
【図１６】いくつかの低発現抗原の発現レベルを示す図１５に示されたグラフ表示の拡大図である。データは、これらの低い検出限界でＭ．イントラセルラーレおよびＭ．アウィウムにおいて検査された他の大部分の抗原の検出可能な発現とともに、結核菌におけるＲｖ１２６５の特異的発現を示している。
【図１７】サンドイッチＥＬＩＳＡで測定したときの、結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（各々３列の群の最初の列）、Ｍ．アウィウム（各々３列の群の２番目の列）およびＭ．イントラセルラーレ（各々３列の群の３番目の列）の細胞培養上清のμＬ濾過液、すなわち、細胞濾過液当たりのｐｇ抗原として表された、ＢＳＸ（列１〜３）、ＥＦ−Ｔｕ（列４〜６）、ＫＡＲＩ（ｉｌｖＣ）（列７〜９）、Ｐ５ＣＲ（ＰｒｏＣ）（列１０〜１２）、Ｒｖ１２６５（列１３〜１５）、Ｓ９（列１６〜１８）、およびＴｅｔＲ（列１９〜２１）相対発現を示すグラフ表示である。内在性タンパク質の濃度を標準曲線からの内挿により計算し、希釈係数に対して補正した。データは、各試料を２つ複製して解析する反復実験から得られた。内在性タンパク質のレベルを、解析したＴＢ抗原の各々の平均±ＳＤとしてプロットした。
【図１８】いくつかの低発現抗原の発現レベルを示す図１７に示されたグラフ表示の拡大図である。
【図１９】定量的リアルタイムＰＣＲで測定したときの、喀痰試料におけるｉｌｖＣの転写産物レベルのグラフ表示である。臨床患者で発現されているｉｌｖＣ遺伝子のＲＮＡ転写産物のレベルを患者試料から単離された試料中で測定した。核酸を単離し、ｃＤＮＡを調製し、リアルタイムＰＣＲを用いて発現を測定した。値は、コピー／μｇ  ｃＤＮＡである。
【図２０】定量的リアルタイムＰＣＲで測定したときの、喀痰試料中の１６Ｓ  ｒＲＮＡと比較したｉｌｖＣの転写産物レベル、および塗抹状態と比較したｉｌｖＣの転写産物レベルのグラフ表示である。ｉｌｖＣ遺伝子および１６Ｓ  ｒＲＮＡのＲＮＡ転写産物のレベルを患者試料から単離された試料中で測定した。核酸を単離し、ｃＤＮＡを調製し、リアルタイムＰＣＲを用いて発現を測定した。値は、コピー／μｇ  ｃＤＮＡである。
【図２１】４つの標的アッセイによる組換えタンパク質および結核菌の比較検出のグラフ表示である。結核菌株Ｈ３７Ｒｖの培養細胞の全細胞ライセートを調製し、材料をＰＢＳ−Ｔに連続希釈し、本明細書に記載されるような臨床喀痰のスクリーニングに用いられる条件を用いるＥＬＩＳＡに適用した。
【図２２】一般的な微生物に対する抗ＫＡＲＩ  Ｍｏ２Ｂ１の交差反応性決定のグラフ表示である。結核菌株Ｈ３７Ｒｖの培養細胞の全細胞ライセートを調製し、材料をＰＢＳ−Ｔに連続希釈し、本明細書に記載されるような臨床喀痰のスクリーニングに用いられる条件を用いるＥＬＩＳＡに適用した。
【図２３】結核菌の細胞壁および細胞膜の亜細胞画分中のＫＡＲＩタンパク質のグラフ表示である。結核菌株Ｈ３７Ｒｖの亜細胞画分をＰＢＳ−Ｔに連続希釈し、本明細書に記載されるような臨床喀痰のスクリーニングに用いられる条件を用いるＥＬＩＳＡに適用した。
【図２４】ＫＡＲＩタンパク質を含む緩衝液中の結核菌の標準曲線およびポイント・オブ・ケアアッセイフォーマット（ＤｉａｇｎｏｓｔＩＱ）のグラフ表示である。カオトロピック平衡緩衝液に７．５〜１２０μｇ／ｍＬの結核菌（Ｈ３７Ｒｖ  ＷＣＬ）をスパイクした。５００μＬの各試料をＤｉａｇｎｏｓｔＩｑテストに添加し、金コンジュゲートモノクローナル２Ｂ１を用いて検出した。内在性ＫＡＲＩをニワトリ抗ＫＡＲＩ（Ｃｈ３４／３５）で捕捉した。各アッセイポイントを２つ複製して行なった。５μｇのＨ３７Ｒｖ  ＷＣＬは、約２ｎｇの組換えＫＡＲＩ（ｉｌｖＣ）である。
【図２５】標的抗原としてのＫＡＲＩと抗体Ｍｏ１２８３Ｆとを用いた臨床喀痰試料における結核菌のスクリーニング結果のグラフ表示である。ＨＩＶ陽性患者と陰性患者の両方を含む、塗抹陰性、２＋、および３＋の個人に相当する十分に特徴付けられた臨床試料を連続希釈系列を介して解析した。抗体１２８３Ｆを検出器として用いた結果により、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて６つの塗抹陽性臨床試料のうちの６つでｉｌｖＣが検出されることが示されている。
【図２６】標的抗原としてのＫＡＲＩと最適化されたＭｏ２Ｂ１モノクローナル抗体とを用いた臨床喀痰試料中の結核菌のグラフ表示である。ＨＩＶ陽性患者と陰性患者の両方を含む、塗抹陰性、２＋、および３＋の個人に相当する十分に特徴付けられた臨床試料を連続希釈系列を介して解析した。対照喀痰もまた、可溶化時に１０μｇ／ｍＬの結核菌ＷＣＬのスパイクを伴うまたは伴わない試料プロセスにかけた。１回のＥＬＩＳＡにつき１２の試料を処理し、各試料は連続希釈して２つ複製して解析した（１／１および１／３の希釈物しかアッセイしない場合は３つの複製物を用いた。１／１、１／３、および１／９希釈の場合の２つの複製物を示す）。ＭＰＣは、カメルーンから供給された試料を示す。
【図２７】ウェスタンブロット解析によるｒｉｌｖＣ（ｒＫＡＲＩ）および内在性ｉｌｖＣ（ＫＡＲＩ）検出の写真表示である。組換えＫＡＲＩタンパク質（ｒｉｌｖＣ）、および培養結核菌の全細胞ライセート（ＷＣＬ  Ｈ３７Ｒｖ）を、それぞれ、１０ｎｇ／レーンおよび１０μｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した。ブロットを、過剰な組換えタンパク質の存在下および非存在下にて、一次抗体でプロービングした。
【図２８】ウェスタンブロット解析によるｒｉｌｖＣ（ｒＫＡＲＩ）および内在性ｉｌｖＣ（ＫＡＲＩ）検出の写真表示である。ＭＷマーカー、組換えｉｌｖＣ、および培養結核菌全細胞ライセート（ＷＣＬ  Ｈ３７Ｒｖ）を、レーン１〜３中、それぞれ、１ｎｇ／レーンおよび５ｍｇ／レーンでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した。ブロットを一次抗体でプロービングした。もとのニワトリ抗体プールのＣｈ３５に由来するＣｈ３４／３５は、高度に精製された組換えｉｌｖＣ調製物で後から追加免疫したものである。Ｍｏ２Ｂ１、Ｍｏ１Ｅ７、Ｍｏ２Ｃ７およびＭｏ３Ａ２は、それぞれ、ＫＡＲＩペプチド骨格の領域１、２、５、および６に結合するモノクローナル抗体である（図３６参照）。
【図２９】ＫＡＲＩ（ｉｌｖＣ）ＥＬＩＳＡフォーマットの特異性を示すグラフ表示である。培養細胞の全細胞ライセートを調製し、ＰＢＳ−Ｔに連続希釈して、臨床喀痰のスクリーニングの標準に対して用いられたのと同じ条件下のＥＬＩＳＡに適用した。他の一般的な細菌標的である大腸菌、緑膿菌、および枯草菌と、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）とについて、顕著な交差反応性は検出されなかった。
【図３０】Ｍｏ２Ｂ１モノクローナル抗体捕捉アッセイを用いた臨床試料中のＫＡＲＩ（ｉｌｖＣ）の検出のグラフ表示である。臨床試料（ｎ＞２５）は本明細書に記載の通りに処理した。スクリーニングされた臨床試料のサブセットについての代表的なデータが上に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
検出手段
本方法の検出手段は、例えば、従来の方法、および／または当技術分野で公知の他の核酸増幅方法と比較して、高い感度および／または高い特異性および／または高い再現性を提供する。
【００６８】
「高い感度」という用語は、試料中のｉｌｖＣ核酸の約１００％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９９％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９８％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９７％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９６％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９５％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９４％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９３％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９２％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９１％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約９０％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約８９％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約８８％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約８７％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約８６％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約８５％の検出；または試料中のｉｌｖＣ核酸の約８０〜約８４％の検出を意味すると解釈する。
【００６９】
一実施例では、検出手段は、既知の方法よりも約１５〜２０倍高い感度でｉｌｖＣ核酸を検出する。別の実施例では、本発明の方法は、既知の方法よりも約２０〜３０倍高い感度でｉｌｖＣ核酸を検出する。別の実施例では、本発明の方法は、既知の方法よりも約３０〜５０倍高い感度でｉｌｖＣ核酸を検出する。別の実施例では、本発明の方法は、既知の方法よりも約２〜１５倍感度高い感度でｉｌｖＣ核酸を検出する。別の実施例では、本発明の方法は、既知の方法よりも約５〜１０倍高い感度でｉｌｖＣ核酸を検出する。
【００７０】
「高い特異性」という用語は、ｉｌｖＣ核酸検出についての約１００％の特異性；またはｉｌｖＣ核酸検出についての約９９％の特異性；またはｉｌｖＣ核酸検出についての約９８％の特異性；またはｉｌｖＣ核酸検出についての約９７％の特異性；またはｉｌｖＣ核酸検出についての約９６％の特異性；またはｉｌｖＣ核酸検出についての約９５％の特異性；またはｉｌｖＣ核酸検出についての約８０％〜約９５％の特異性；またはｉｌｖＣ核酸検出についての約８０％〜約８５％の特異性を意味すると解釈する。
【００７１】
一実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による検出手段は、出発鋳型１μｇ当たり少なくとも約１コピーの鋳型を再現性よく検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり約１〜２０００コピーの鋳型を再現性よく検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり約１〜１０００コピーの鋳型を検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり１〜５００コピーの鋳型を検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり約１〜４００コピーの鋳型を検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり約１〜３００コピーの鋳型を検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり約１〜２００コピーの鋳型を検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり約１〜１００コピーの鋳型を検出する。別の実施例では、本明細書に記載の任意の実施形態による本発明の方法は、出発鋳型１μｇ当たり約１〜５０コピーの鋳型を検出する。
【００７２】
本発明の方法で利用される検出手段は、例えば、検出可能なシグナルを生じさせることによってインプット核酸を検出するために、プローブまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロックされた核酸（ＬＮＡ）プローブ）を利用する、核酸ハイブリダイゼーションを含み得る。あるいは、本発明の方法で利用される検出手段は、１以上のプライマーと、場合により本明細書に記載の１以上のプローブとを用い、それによりインプット核酸に由来するｉｌｖＣ核酸を含むアンプリコンを生成させる増幅反応、例えば、温度サイクリングを必要とする増幅反応または温度サイクリングを必要としない増幅反応を含み得る。
【００７３】
インプット核酸または鋳型
本明細書の任意の実施例に記載されるような核酸増幅に基づくアッセイは、同じ対象由来の多様な試料において、高い感度および／または高い選択性および再現性で、臨床試料中のｉｌｖＣ核酸（ｉｌｖＣ−ＮＡＡ）を検出および／または定量するためのものである。ｉｌｖＣ−ＮＡＡに基づく検査はまた、臨床試料の大規模コホート全体で再現性のある結果、例えば、感染および／または疾患進行の重症度と相関するｉｌｖＣ転写産物レベルを提供する。例えば、これは、増幅された核酸の検出と定量とによって達成し得る。
【００７４】
「鋳型」は任意のｉｌｖＣ核酸であると解釈され、かつ一本鎖または二本鎖のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをはじめとする、その中に任意のヌクレオチド類似体を含むまたは含まないＤＮＡ、ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡを含み得る。しかしながら、鋳型は、ｉｌｖＣ遺伝子のｍＲＮＡ転写産物から生成されたｃＤＮＡであることが好ましい。
【００７５】
一実施例では、鋳型は、配列番号１に示すようなＫＡＲＩタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１に示すようなＫＡＲＩタンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１に示すようなＫＡＲＩタンパク質に８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１に示すようなＫＡＲＩタンパク質に８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１に示すようなＫＡＲＩタンパク質に９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１に示すようなＫＡＲＩタンパク質に９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【００７６】
別の実施例では、鋳型は、配列番号２に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号２に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号２に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号２に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号２に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号２に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号２に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【００７７】
記述されたタンパク質および上記のコード配列は、例示されたタンパク質および配列表によって例示されたコード配列のホモログを含み、その場合、該ホモログは、結核菌群の１種または複数種の細菌、例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌によって発現されることがこの文脈において理解されるべきである。
【００７８】
別の実施例では、本発明による結核菌または結核菌群のｉｌｖＣ核酸の特異的増幅は、標準的な２５μｌの反応液中、プライマーまたはプローブの寄与分を除いた、約１０ｎｇ未満または約５ｎｇ未満または４ｎｇ未満または３ｎｇ未満または２ｎｇ未満または１ｎｇ未満または約５００ｐｇ未満または約１００ｐｇ未満または約５０ｐｇ未満の核酸濃度を利用する。標準的な２５μｌの反応液中の好ましい核酸濃度は、プライマーまたはプローブの寄与分を除いた、約１０ｐｇまたは１５ｐｇまたは２０ｐｇまたは２５ｐｇまたは３０ｐｇまたは３５ｐｇまたは４０ｐｇまたは４５ｐｇまたは５０ｐｇ（例えば、約３５ｐｇ〜約４５ｐｇ）である。（プライマーまたはプローブの寄与分を除いた）より低濃度のインプット核酸は、本明細書に記載の特定のプライマーペアについてのＭ．アウィウム配列の増幅などの非特異的増幅効果を低下させ得る。当業者であれば、過度の実験または努力を伴うことなく、様々な反応条件についてのこれらの核酸濃度を調整することができるであろう。
【００７９】
プライマー設計
当業者には知られているように、「プライマー」は、それに含まれる１以上のリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド類似体を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡを含むように、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの類似体の任意の組合せを含み、かつ核酸鋳型にアニーリングして、酵素（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）の結合部位として働き、それにより、５’から３’の方向に特定の核酸の複製開始部位を提供することができる核酸分子である。プライマーのヌクレオチド配列は、通常、増幅される鋳型核酸のヌクレオチド配列に実質的に相補的であるか、またはアニーリングが起こり、そこから５’から３’の方向に伸長するのに十分な相補的領域を少なくとも含む。しかしながら、当業者には明白であるように、非相補性の程度は、プライマーが伸長を開始する能力にそれほど悪影響を及ぼすものではない。本発明の方法での使用に好適なプライマーを設計および／または作成するための好適な方法は当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。プライマーは、通常、長さ約１２〜５０ヌクレオチドの短い合成核酸であるが、必ずしもそうであるわけではない。好ましくは、第１のプライマーまたは第１のプライマーセットの各々のプライマーは、核酸鋳型の鎖にアニーリングすることができる長さが少なくとも約１２〜１５のヌクレオチドを含む。プライマーはまた、鋳型の鎖にアニーリングすることができる長さが少なくとも約２０または２５または３０のヌクレオチドを含み得る。
【００８０】
当業者には明白であるように、核酸鋳型にアニーリングすることができるヌクレオチドの数は、プライマーがアニーリングするストリンジェンシーに関連する。好ましくは、本発明の方法で使用されるプライマーは、中程度から高いストリンジェンシー条件下で核酸鋳型にアニーリングする。
【００８１】
一実施形態では、本発明のプライマーが鋳型核酸にアニーリングするストリンジェンシーを実験的に決定する。別の実施例では、プライマーが鋳型核酸にアニーリングする条件をコンピュータで決定する。別の実施例では、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，５３：３７４６−３７５０，１９８６に記載されている最近隣法は、プライマーのＴｍを決定するのに有用である。プライマーのＴｍを決定するための他の例示的な方法は本明細書に記載されている。
【００８２】
ｉｌｖＣ核酸の特異的検出および感度の高い検出のためのプライマーの設計が本明細書に記載されている。例えば、本明細書で例示されるようなＢＬＡＳＴ検索を行なうことによって、プライマーおよび推定上の増幅産物をスクリーニングし、特異性を保証し得る。したがって、結核菌群全体での高い相同性を有するが、他のマイコバクテリアとの大きな相同性を示さないプライマーを開示する。一実施形態では、プライマーが鋳型核酸の鎖の領域に対して全体で少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含むように、プライマーを設計する。より好ましくは、配列同一性の程度は、少なくとも約８０％または８５％または９０％または９５％または９８％または９９％または１００％である。例えば、プライマーまたはプライマーの領域は、対象となる鋳型（例えば、ｉｌｖＣ配列または他の結核菌群配列）の鎖の領域に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含み得る。
【００８３】
一実施形態では、プライマーは、鋳型核酸（例えば、本発明の単一検体ＮＡＡに基づくアッセイの場合、ｉｌｖＣ転写産物）、または多検体検査で記載されているような他の転写産物のうちのいずれか１つ（例えば、ＢＳＸ転写産物）の鎖に対して全体で少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含むように設計される。より好ましくは、鋳型に対する配列同一性の程度は、少なくとも約８５％または９０％または９５％または９８％または９９％である。例えば、プライマーまたはプライマーの領域は、核酸の鋳型の鎖に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含み得る。
【００８４】
本発明のプライマーの具体的な組成が、対象となる核酸の配列に依存することは明らかである。特に、配列は、核酸の鋳型へのプライマーのアニーリングと増幅反応の開始とを可能にするのに十分であるだけでよい。
【００８５】
この文脈において、「アニーリング」という用語または同様の用語は、相補的ヌクレオチド残基間の塩基対形成を促進するかまたは許容することが当技術分野で知られている温度または他の反応条件を用いて、プライマーと増幅される核酸（すなわち、鋳型または一次増幅産物）が互いに塩基対形成して、二本鎖または部分二本鎖核酸を形成することを意味すると解釈するものとする。当業者に知られているように、二重鎖を形成する能力および／または形成された二重鎖の安定性は、プライマーと増幅される核酸の間の相補的領域の長さ、相補的領域におけるアデニンとチミンの含有量パーセンテージ（すなわち、「Ａ＋Ｔ含有量」）、二重鎖の融解温度（Ｔｍ）に対するインキュベーション温度、および増幅が行なわれる緩衝液または他の溶液の塩濃度をはじめとする、１以上の因子に左右される。通常、アニーリングを促進するために、プライマーと増幅される核酸は、そのＡ＋Ｔ含有量と長さから予測されるプライマーＴｍよりも少なくとも約１〜５℃低い温度でインキュベートされる。二重鎖形成は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８５）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（１９８７）；またはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ  ０４７１５０３３８（１９９２）に記載されているように、反応緩衝液中の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、クエン酸ナトリウムなど）の量を増加させることによって、またはインキュベーション期間を長くすることによって強化するかまたは安定化することもできる。
【００８６】
プライマーは、通常、５’から３’の方向に伸長するので、少なくとも３’末端ヌクレオチドが、鋳型核酸中の関連するヌクレオチドに相補的であることが好ましい。より好ましくは、プライマーの３’末端の少なくとも３または４または６または８または１０個の連続するヌクレオチドが鋳型核酸中の関連するヌクレオチドに相補的である。プライマーの３’末端の相補性により、伸長するプライマー末端が、例えば、ポリメラーゼによる鋳型核酸の増幅を開始することができることが保証される。
【００８７】
非相補的な領域は、プライマーの予想Ｔｍを減少させ、かつ非鋳型核酸の増幅と関連する可能性があるので、本発明のプライマーは、鋳型核酸の鎖と同一でない多数の連続するヌクレオチドを含まないことが好ましい。好ましくは、プライマーは、鋳型核酸の鎖と同一でないわずか６または５または４または３または２個の連続するヌクレオチドを含む。より好ましくは、鋳型核酸の鎖と同一でないいかなるヌクレオチドも非連続的である。
【００８８】
２つのヌクレオチド配列が、本明細書に記載された特定の同一性限界パーセンテージの範囲に含まれるかどうかを決定するために、当業者であれば、配列の並列比較または多重アラインメントを行なう必要があることを知っているであろう。このような比較またはアラインメントでは、アラインメントの実施に用いられるアルゴリズムによって、非同一の残基の位置決めにおいて相違が生じ得る。この文脈において、この文脈において、２以上のヌクレオチド配列間の同一性パーセンテージに対する言及は、当業者に公知の任意の標準アルゴリズムを用いて決定したときの、該配列間の同一の残基の数を表すと解釈するものとする。例えば、ヌクレオチド配列を整列させ、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＣｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５，１９８４）の他の適当なプログラムを用いてその同一性を計算し得る。
【００８９】
あるいは、一般に用いられかつ自由に利用可能な配列比較ルゴリズム一式は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）によって提供されており、これは、ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．をはじめとする、いくつかの供給源から入手可能である。ＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のヌクレオチド配列を種々のデータベース由来の他のポリヌクレオチド配列と整列させるのに用いられる、「ｂｌａｓｔｎ」をはじめとする様々な配列解析プログラムが含まれる。２つのヌクレオチド配列の直接的な対比較に用いられる「ＢＬＡＳＴ  ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールも利用可能である。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」という用語は、アメリカ合衆国政府の国立衛生研究所の国立医学図書館にある国立生物工学情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，２０８９４）のデータベースを意味すると解釈するものとする。
【００９１】
通常、プライマーは、核酸鋳型にアニールするかまたは核酸鋳型に相補的である少なくとも約１０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１２個のヌクレオチドまたは少なくとも約１５個もしくは２０個のヌクレオチドを含むか、またはこれらのヌクレオチドからなる。しかしながら、より長いプライマーも、増幅反応、例えば、長い核酸領域（例えば、１０００ｂｐを超えるもの）を増幅する反応で用いられる。したがって、本発明はさらに、核酸鋳型にアニールするかまたは核酸鋳型に相補的である少なくとも約２５個または３０個または３５個のヌクレオチドを含むプライマーを意図する。
【００９２】
あるいは、例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）などの１以上の修飾された塩基を含むプライマーは、核酸鋳型にアニールするかまたは核酸鋳型に相補的である少なくとも約８個のヌクレオチドの領域を含みさえすれば十分である。好ましくは、相補的ヌクレオチドは連続的である。
【００９３】
当業者には明白であるように、核酸鋳型にアニーリングすることができるヌクレオチドの数は、プライマーがアニーリングするストリンジェンシーに関連する。好ましくは、本発明のプライマーは、中程度から高いストリンジェンシー条件下で核酸鋳型にアニーリングする。
【００９４】
一実施形態では、本発明のプライマーが核酸鋳型にアニーリングするストリンジェンシーを実験的に決定する。通常、このような方法は、様々な条件下で１以上のプライマーを用いる増幅反応の実施ともたらされる特異的増幅のレベルの決定とを必要とする。
【００９５】
あるいは、本発明のプライマーを検出可能マーカー（例えば、放射性ヌクレオチドまたは蛍光マーカー）で標識し、好適にストリンジェントな条件下で標的核酸にアニーリングしたプライマーのレベルを決定する。
【００９６】
ストリンジェンシーのレベルを定義するために、中程度のストリンジェンシーのアニーリング条件は、通常、
（ｉ）約４２℃〜約５５℃のインキュベーション温度と、
（ｉｉ）プライマーの予想Ｔｍよりも約１５℃〜１０℃低いインキュベーション温度と、
（ｉｉｉ）約２ｍＭ〜３ｍＭのＭｇ２＋濃度と、
からなる群から選択される条件を用いて達成される。
【００９７】
高いストリンジェンシーのアニーリング条件は、通常、
（ｉ）約５５℃を超える、好ましくは約６５℃を超えるインキュベーション温度と、
（ｉｉ）プライマーの予想Ｔｍよりも約１０℃〜１℃低いインキュベーション温度と、
（ｉｉｉ）約１ｍＭ〜１．９ｍＭのＭｇ２＋濃度と、
からなる群から選択される条件を用いて達成される。
【００９８】
アニーリングのストリンジェンシーを高めるための代わりのまたはさらなる条件は、当業者に明白であろう。例として、例えば、グリセロール（５〜１０％）、ＤＭＳＯ（２〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）、ベタイン（０．５〜２Ｍ）またはテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ、＞５０ｍＭ）などの試薬は、プライマーと核酸鋳型のアニーリング温度を変化させることが知られている（Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：７４６５；１９９０，Ｂａｓｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：６３３−６３８，１９９６；およびＦｒａｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  ６５：２７，１９９８）。
【００９９】
増幅反応のストリンジェンシーを変化させるための条件は当業者に理解されている。さらに明確にすることだけが目的で、核酸分子間のアニーリングに影響を及ぼすパラメータへの言及は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ  ０４７１５０３３８，１９９２）に見られ、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１００】
あるいは、プライマーが核酸鋳型にアニーリングする条件はコンピュータで決定される。例えば、プライマーの予想融解温度（すなわち、Ｔｍ）（すなわち、プライマーが変性して、特定の核酸から離れる温度）を決定するための方法は、当技術分野で公知である。
【０１０１】
例えば、Ｗａｌｌａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６，３５４３，１９７９）の方法は、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＡ含有量に基づいてプライマーのＴｍを推定する。特に、記載された方法は、２（Ａ＋Ｇ）＋４（Ｇ＋Ｃ）という式を用いて、プローブまたはプライマーのＴｍを決定する。
【０１０２】
あるいは、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，８３：３７４６−３７５０，１９８６に記載されている最近隣法は、プライマーのＴｍを決定するのに有用である。最近隣法では、以下の式が用いられる。
【数１】
2016005470.tif 000003
式中、ΔＨ０はらせん形成の標準エンタルピーであり、ΔＳ０はらせん形成の標準エントロピーであり、Ｃｔはトータルの鎖濃度であり、ｎは対称性因子（これは、自己相補的な鎖の場合は１であり、非自己相補的な鎖の場合は４である）を示し、かつＲは気体定数（１．９８７）である。
【０１０３】
Ｒｙｕｃｈｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６４０９−６４１２，１９９０には、オリゴヌクレオチドのＴｍを決定するための別の式が記載されている。
【数２】
2016005470.tif 000004
式中、ｄＨはらせん形成のエンタルピーであり、ｄＳはらせん形成のエントロピーであり、Ｒはモル気体定数（１．９８７ｃａｌ／℃  ｍｏｌ）であり、「ｃ」は、核酸モル濃度（実験的に決定される、Ｗ．Ｒｙｃｈｌｉｋ  ｅｔ．ａｌ．，前掲書）であり（デフォルト値は、統一的な熱力学的パラメータに対して０．２μＭ）、［Ｋ＋］は塩モル濃度である（デフォルト値は５０ｍＭである）。
【０１０４】
最近隣法を用いてオリゴヌクレオチドのＴｍを決定するための好適なソフトウェアは当技術分野で公知であり、かつ、例えば、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手可能である。
【０１０５】
あるいは、より長いプライマー（すなわち、少なくとも約２００個のヌクレオチドを含むプライマー）の場合、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｈｌ（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１３８：２６７−２８４，１９８４）の方法が、プライマーのＴｍを決定するのに有用である。この方法では、以下の式が用いられる。
（数３）
８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒｍ）−５００／塩基対長
式中、ＭはＮａ＋のモル濃度であり、かつ％ｆｏｒｍはホルムアミドのパーセンテージである（５０％に設定）。
【０１０６】
ＰＮＡを含むかまたはＰＮＡからなるプライマーの場合、Ｔｍは、以下の式（Ｇｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６：５００４−５００６に記載）を用いて決定される。
（数４）
Ｔｍｐｒｅｄ＝ｃ０＋ｃ１＊ＴｍｎｎＤＮＡ＋ｃ２＊ｆｐｙｒ＋ｃ３＊長さ
式中、ＴｍｎｎＤＮＡは、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：３５５５−３５６２，１９９５に記載されているΔＨ０値およびΔＳ０値を当てはめた対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に対して最近隣モデルを用いて計算したときの融解温度である。ｆｐｙｒはピリミジン含有率を表し、長さはＰＮＡ配列の塩基長である。定数は、ｃ０＝２０．７９、ｃ１＝０．８３、ｃ２＝−２６．１３およびｃ３＝０．４４である。
【０１０７】
１以上のＬＮＡ残基を含むプライマーのＴｍを決定するために、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：３５５５−３５６２，１９９５の式を改変した形態が用いられる。
【数５】
2016005470.tif 000005
【０１０８】
ＬＮＡを含むプライマーのＴｍを決定するための好適なプログラムは、例えば、Ｅｘｉｑｏｎ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能である。
【０１０９】
プライマーが変性して、鋳型核酸から離れる提案された／推定された温度と似ている（例えば、５℃の範囲内もしくは１０℃の範囲内）かまたはこれに等しい温度は、高いストリンジェンシーであると考えられる。中程度のストリンジェンシーは、プローブまたはプライマーの計算Ｔｍの１０℃〜２０℃または１０℃〜１５℃の範囲内であると考えられるべきである。
【０１１０】
好ましくは、本発明のプライマーは、標的核酸に選択的にアニーリングする。「選択的にアニーリングする」という用語は、標的核酸がプローブにアニーリングして、バックグラウンドを有意に上回るシグナル（すなわち、高いシグナル対ノイズ比）を生じさせる条件下でプローブが用いられることを意味する。アニーリングの特異性のレベルは、例えば、プライマーを用いて増幅反応を行ない、生成された異なるアンプリコンの数を検出することによって決定される。「異なるアンプリコン」とは、異なるヌクレオチド配列および／または分子量の増幅された核酸が生成されることを意味する。分子量が異なるアンプリコンが、例えば、ゲル電気泳動を用いて容易に同定されることは明らかである。標的核酸に選択的にアニーリングするプライマーは、任意の他のアンプリコンよりも大きいレベルでアンプリコンを生成させる。１つのアンプリコンだけが検出可能なレベルで生成されるのが好ましい。
【０１１１】
本発明のプライマーの選択的アニーリングを決定する別の技術は、アッセイされている試料由来の既知のヌクレオチド配列（例えば、鋳型核酸が得られる生物または細胞由来の既知配列のデータベース）の検索を行なうことを含む。この技術を用いて、プライマーの配列に似ているかまたは相補的な配列を同定する。このような技術は、選択的アニーリングを保証しないものの、核酸中の複数の部位にアニーリングすることができ、かつ多数のアンプリコンを生成させる（すなわち、非選択的アニーリング）可能性があるプライマー（プライマーセット）の決定に有用である。
【０１１２】
核酸鋳型に選択的にアニーリングすることができることが予測されているかまたはそのようにできることが示されているプライマーまたはプライマー配列を、場合により、本発明の方法におけるプライマーとしての使用に相応しくする１以上の追加の特徴についても解析する。例えば、プライマーを解析して、二次構造を形成する可能性が低い（すなわち、プライマーは自己相補的な領域を含まない）ことを保証する。
【０１１３】
さらに、プライマーが１以上の他のプライマーを含む反応液中で使用されることが提案される場合、全てのプライマーを評価して、互いにアニーリングし、「プライマーダイマー」を形成するその能力を決定し得る。自己二量体化および／またはプライマーダイマー形成が可能なプライマーを決定するための方法は当技術分野で公知であり、かつ／または上に記載されている。
【０１１４】
増幅反応での使用に好適なプライマーを設計および／または選択するための方法は当技術分野で公知であり、かつ例えば、Ｉｎｎｉｓ  ａｎｄ  Ｇｅｌｆａｎｄ（１９９０）（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲｓ．ｐｐ．３−１２：ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｓｎｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，編）；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（編）（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）に記載されている。このような方法は、例えば、本発明のプライマーの標的特異的配列の設計に特に適している。本明細書で使用される場合、標的は、対象となる鋳型の少なくとも１個のヌクレオチドにまたがる領域を意味すると解釈する。
【０１１５】
通常、プライマーは以下の基準を満たすことが推奨される。
（ｉ）プライマーは、長さが少なくとも約１７〜２８塩基の標的配列にアニーリングする領域を含む；
（ｉｉ）プライマーは約５０〜６０％の（Ｇ＋Ｃ）を含む；
（ｉｉｉ）プライマーの３’末端は、ＧもしくはＣ、またはＣＧもしくはＧＣである（これにより、末端の「開裂（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」が防がれ、増幅の開始効率が高まる）；
（ｉｖ）プライマーは、約５５〜約８０℃のＴｍを有することが好ましい；
（ｖ）プライマーは、プライマーの３’末端に３以上の連続するＣおよび／またはＧを含まない（アニーリングの安定性のために、ＧまたはＣリッチ配列での誤プライミングを促進する可能性があるので）；
（ｖｉ）プライマーの３’末端は、反応液中の別のプライマーと相補的であるべきではない；および
（ｖｉｉ）プライマーは、自己相補的な領域を含まない。
【０１１６】
１以上のプライマー、またはプライマーの領域を設計することができるいくつかのソフトウェアプログラムが利用可能である。例えば、プログラムは、以下からなる群から選択される。
（ｉ）Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡから入手可能なＰｒｉｍｅｒ３は、既知の鋳型配列に基づいて増幅反応で用いられる１以上のプライマーを設計する；
（ｉｉ）Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能なＰｒｉｍｅｒ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ５は、プライマーを設計および／または解析する；
（ｉｉｉ）Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡから入手可能なＣＯＤＥＨＯＰは、多数のタンパク質アラインメントに基づいてプライマーを設計する；および
（ｉｖ）Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄから入手可能なＦａｓｔＰＣＲは、１以上の既知の配列に基づいて、マルチプレックス反応で用いられるプライマーを含む、多数のプライマーを設計する。
【０１１７】
本発明のプライマーを設計する場合、使用される増幅反応の種類と同様に、鋳型核酸の組成（すなわち、ヌクレオチド配列）を考慮する。
【０１１８】
ｉｌｖＣ核酸の特異的検出および感度の良い検出のためのプライマーを設計する際に、上記の基準を利用する。次に、プライマーおよび推定上の増幅産物を、本明細書で例示されているようなＢＬＡＳＴ検索を行なうことによってスクリーニングし、特異性を保証してもよい。このようにして、結核菌群全体での高い相同性を有し、他のマイコバクテリアには大きな相同性を示さないプライマーを設計し得る。同じ方法を、例えば、ＢＳＸ、Ｓ９などの転写産物を検出する多検体検査用のプライマーを設計するために使用し得ることが当業者には明白であろう。
【０１１９】
プライマー合成
設計および／または解析に続いて、特異的プライマーを生成および／または合成する。本発明のプライマーを生成／合成するための方法は当技術分野で公知である。例えば、オリゴヌクレオチド合成は、Ｇａｉｔ（編）（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）に記載されている。例えば、プローブまたはプライマーは、生物学的合成によって（例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いた核酸の消化によって）または化学的合成によって入手し得る。短い配列（最大約１００ヌクレオチド）の場合、化学合成が好ましい。
【０１２０】
一実施形態では、デオキシヌクレオチドを含むヌクレオチド（例えば、ＤＮＡベースのオリゴヌクレオチド）は、標準的な固相ホスホルアミダイト化学を用いて生成される。本質的に、この方法は、保護ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いて、短いオリゴヌクレオチド（すなわち、最大約８０ヌクレオチド）を生成させる。通常、最初の５’保護ヌクレオシドをその３’水酸基によってポリマー樹脂に付着させる。次に、５’水酸基を脱保護し、配列中の後ろのヌクレオシド−３’−ホスホルアミダイトを脱保護された基に結合させる。次に、結合したヌクレオシドを酸化してホスホトリエステルを形成させることにより、ヌクレオチド間結合を形成させる。脱保護、結合および酸化の工程を繰り返すことにより、所望の長さおよび配列のオリゴヌクレオチドが得られる。オリゴヌクレオチド合成の好適な方法は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，”  第１５４巻，ｐｐ．２８７−３１４（１９８８）に記載されている。
【０１２１】
オリゴヌクレオチド合成のための他の方法としては、例えば、ホスホトリエステル法およびホスホジエステル法（Ｎａｒａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ  ６８：９０，１９７９）ならびに支持体上での合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，ｅｔ  ａｌ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２２：１８５９−１８６２，１９８１）、ならびに“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ，”  Ｓ．Ａ．Ｎａｒａｎｇ，編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７、およびその中に含まれる参考文献に記載されている他の方法が挙げられる。
【０１２２】
より長い配列の場合、例えば、Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ（１９８３）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１０１，２０−７８に記載されているような、一本鎖ＤＮＡに対するＭ１３の使用などの、分子生物学で利用される標準的な複製方法が有用である。
【０１２３】
あるいは、標準的な技術を用いて、各プライマーが所望のプライマーの部分と別のプライマーへのアニーリングを可能にする領域とを含む、複数のプライマーを生成させる。次に、これらのプライマーを、プライマーをアニーリングさせ、ポリメラーゼを用いて完全なプライマーのコピーを合成することを可能にする重複伸長法で用いる。このような方法は、例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １６４，４９−５３，１９９５に記載されている。
【０１２４】
上で論じたように、本発明のプライマー、または本発明の方法で用いられるプライマーはまた、１以上の核酸類似体を含み得る。例えば、プライマーは、リン酸エステル類似体および／またはペントース糖類似体を含む。あるいは、またはさらに、本発明のプライマーは、リン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル結合が、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンアミドおよび他のアミド（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００，１９９１；ＷＯ９２／２０７０２号；および米国特許出願第５，７１９，２６２号参照）；モルホリノ（例えば、米国特許出願第５，６９８，６８５号参照）；カルバマート（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ＆  Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５２：４２０２，１９８７に記載されているもの）；メチレン（メチルイミノ）（例えば、Ｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：４００６，１９９２に記載されているもの）；３’−チオホルムアセタール（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５８：２９８３，１９９３参照）；スルファマート（例えば、米国特許出願第５，４７０，９６７号に記載されているもの）；一般にＰＮＡと呼ばれる、２−アミノエチルグリシン（例えば、ＷＯ９２／２０７０２号参照）などの他の種類の結合と置き換えられているポリヌクレオチドを含む。リン酸エステル類似体としては、限定するものではないが、（ｉ）Ｃ１−Ｃ４アルキルホスホナート、例えば、メチルホスホナート；（ｉｉ）ホスホルアミダート；（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ６アルキル−ホスホトリエステル；（ｉｖ）ホスホロチオアート；および（ｖ）ホスホロジチオアートが挙げられる。このような修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド結合を含むプライマーを生成させるための方法は当技術分野で公知であり、上で参照した文書で論じられている。
【０１２５】
例えば、本発明のプローブまたはプライマーは、１以上のＬＮＡおよび／またはＰＮＡ残基を含む。１以上のＬＮＡまたはＰＮＡ残基を含むプローブまたはプライマーは、実質的に同じ配列を含むが、ＬＮＡまたはＰＮＡ残基を含まないプローブまたはプライマーよりも高い温度で核酸鋳型にアニーリングすることが事前に示されている。さらに、ＬＮＡをプローブまたはプライマーに組み入れることにより、プローブまたはプライマーのレベルが限定的である反応で生成されるシグナルが増加することが示されている（Ｌａｔｏｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  １７：２５３−２５９，２００３）。
【０１２６】
ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．，１：３４２３，１９９７；Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２４７，１９９８に記載されている。ＰＮＡを含むオリゴヌクレオチドを合成するための方法は、例えば、Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１１４：１８９５，１９９２；Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６，１９９３；およびＯｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：５３３２，１９９３に記載されている。
【０１２７】
ｉｌｖＣ核酸を増幅するための例示的なプライマー
本発明はまた、結核菌または結核菌群の生物由来のｉｌｖＣ遺伝子またはｍＲＮＡ配列を極めて特異的に増幅する際に用いられる増幅プライマーのセットを提供する。一実施例では、フォワードプライマーは、配列番号１９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２８に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３１に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３２に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３２に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３２に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３１に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３６に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３７に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３８に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３９に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２７に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号４０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３７に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３８に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３９に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号４０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３７に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３８に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３９に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号２９に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号４０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３１に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３７に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３１に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３８に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３１に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３９に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３１に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号４０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３５に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２０に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３５に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３７に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３５に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３８に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３５に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号３９に示すようなヌクレオチド配列を有する。別の実施例では、フォワードプライマーは、配列番号３５に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号４０に示すようなヌクレオチド配列を有する。
【０１２８】
別の実施例では、本発明は、結核菌または結核菌群の生物由来のｉｌｖＣ遺伝子またはｍＲＮＡ配列を極めて特異的に増幅するためのプライマーペアを提供し、ここで、該プライマーペアは、
（ａ）配列番号１９および配列番号２０と、
（ｂ）配列番号２０ならびに配列番号２７、２９、３１および３５から選択されるプライマーと、
からなる群から選択される。
【０１２９】
別の実施例では、本発明は、結核菌または結核菌群の生物由来のｉｌｖＣ遺伝子またはｍＲＮＡ配列を極めて特異的に増幅するためのプライマーペアを提供し、ここで、該プライマーペアは、
（ａ）配列番号２７ならびに配列番号２８、３０および３２から選択されるプライマーと、
（ｂ）配列番号２９ならびに配列番号３０および３２から選択されるプライマーと、
（ｃ）配列番号３１および配列番号３２と、
からなる群から選択される。
【０１３０】
別の実施例では、本発明は、結核菌または結核菌群の生物由来のｉｌｖＣ遺伝子またはｍＲＮＡ配列を極めて特異的に増幅するためのプライマーペアを提供し、ここで、該プライマーペアは、
（ａ）配列番号２７ならびに配列番号２８および３０から選択されるプライマーと、
（ｂ）配列番号２９および配列番号３０と、
からなる群から選択される。
【０１３１】
別の実施例では、本発明は、結核菌または結核菌群の生物由来のｉｌｖＣ遺伝子またはｍＲＮＡ配列を極めて特異的に増幅するためのプライマーペアを提供し、ここで、該プライマーペアは、
（ａ）配列番号２９ならびに配列番号３０および３２から選択されるプライマーと、
（ｂ）配列番号３１および配列番号３２と、
からなる群から選択される。
【０１３２】
別の実施例では、本発明は、結核菌または結核菌群の生物由来のｉｌｖＣ遺伝子またはｍＲＮＡ配列を極めて特異的に増幅するための、および場合により、分子ビーコンとともに使用するためのプライマーペアを提供し、ここで、該プライマーペアは、
（ａ）配列番号３２および配列番号３８と、
（ｂ）配列番号３２および配列番号３９と、
（ｃ）配列番号３２および配列番号４０と、
（ｄ）配列番号３５および配列番号３８と、
（ｅ）配列番号３５および配列番号３９と、
（ｆ）配列番号３５および配列番号４０と、
からなる群から選択される。
【０１３３】
別の実施例では、本発明は、結核菌または結核菌群の生物由来のｉｌｖＣ遺伝子またはｍＲＮＡ配列を極めて特異的に増幅するための、および場合により、分子ビーコンとともに使用するためのプライマーペアを提供し、ここで、該プライマーペアは、
（ａ）配列番号３２および配列番号３８と、
（ｂ）配列番号３２および配列番号４０と、
（ｃ）配列番号３５および配列番号３８と、
（ｄ）配列番号３５および配列番号３９と、
からなる群から選択される。
【０１３４】
当業者には知られているように、本発明のプライマーの長さは、５’末端および／または３’末端への１以上のヌクレオチドの付加によって、または５’末端および／または３  ’末端からの１以上のヌクレオチドの欠失によって変化し得る。一実施例では、本発明は、本明細書で例示されるプライマーの１以上の変異体プライマーの使用を明確に包含し、ここで、この変異体プライマーは、配列番号１９、２０または２７〜３２のうちのいずれか１つまたは複数と比べて５’末端および／または３’末端に１または２または３または４または５個の追加のヌクレオチドを含み、但し、ｉｌｖＣ特異的配列の増幅が変異体プライマーを用いて起こり得るように、該配列番号への３’末端付加は、該配列番号のすぐ下流にある配列番号２のヌクレオチド配列または配列番号２に相補的な配列と連続していることを条件とする。あるいは、またはさらに、変異体プライマーはまた、該配列番号のすぐ下流にある配列番号２のヌクレオチド配列または配列番号２に相補的な配列と連続している該配列番号への５’末端付加を含み得るが、そのような連続性の要件は、通常、ｉｌｖＣ特異的配列の増幅が変異体プライマーを用いて起こるために必要とされない。別の実施例では、本発明は、本明細書で例示されるプライマーの１以上の変異体プライマーの使用を明確に包含し、ここで、この変異体プライマーは、配列番号１９、２０または２７〜３２または３５〜４０のうちのいずれか１つまたは複数と比べて５’末端および／または３’末端から除去された１または２または３または４または５個のヌクレオチドを有する。
【０１３５】
核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）
核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）は、温度サイクリングの非存在下で、例えば、等温条件下で（例えば、約４１℃の一定温度で）ＲＮＡを検出するための任意のプライマー依存的で、均一な増幅プロセスを指す。ＮＡＳＢＡは、特定のＲＮＡ配列の最大約１００倍またはそれより多くの増幅をもたらすことができ、かつゲノムＤＮＡのバックグラウンドにおいてＲＮＡを増幅する独特の可能性を提供する。ＲＮＡの検出は、遺伝子発現もしくは細胞生存をモニタリングするために用いることができるし、またはウイルス複製および産生を予想する兆候となることができる。検出限界を超えるＲＮＡの増幅は、ＲＮＡ標的が試料中に高コピー数で存在する場合に、容易に達成される。
【０１３６】
簡潔に述べると、ＲＮＡ鋳型は、第１のプライマーが鋳型の３’末端でその相補的部位に付着し、次に、逆転写酵素が相補的ＤＮＡを合成し、ＲＮアーゼＨ酵素がＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鋳型を分解し、第２のプライマーがＤＮＡ鎖の５’末端に付着し、それによりＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが、次に第２のサイクルのための鋳型として働く相補的ＲＮＡ鎖を生成させるような条件下で反応混合物に提供される。
【０１３７】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
一実施例では、検出手段は、ＰＣＲ増幅アッセイフォーマットを含み得る。本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」という用語は、（ｉ）二本鎖核酸（例えば、増幅される核酸「鋳型」または「鋳型」と相補「プライマー」のハイブリッド）の変性；（ｉｉ）一本鎖「鋳型」中のその相補的配列へのプライマーのアニーリング；および（ｉｉｉ）ポリメラーゼ活性、例えば、熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ）の活性による５’から３’方向へのプライマーを伸長と、それによる一本鎖鋳型に相補的な新たに合成された鎖を含む二本鎖核酸の生成からなる多数のサイクルを利用する増幅反応を意味すると解釈するものとする。二本鎖鋳型中の相補鎖に（すなわち、各々の変性した一本鎖鋳型に）アニーリングすることができる２つのプライマーを利用することによって、多数のコピーの鋳型が各サイクルで生成され、それにより、鋳型が増幅される。
【０１３８】
ＰＣＲの多くのフォーマットが当技術分野で公知であり、かつ例えば、ワンアームド（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ）（またはシングルプライマー）ＰＣＲ、逆転写酵素を介するＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、タッチアップおよびループ組込みプライマー（ＴＵＬＩＰ）ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、競合ＰＣＲ、迅速競合ＰＣＲ（ＲＣ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、ＬＡＭＰ、ＲＴ−ＬＡＭＰおよびＬＡＭＰ−ＥＬＩＳＡ−ハイブリダイゼーションをはじめとする、本明細書に記載されているような任意の実施形態での使用が意図されている。他の実施例では、ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、増幅プライマーと分子ビーコンとを含む反応液中で行なわれ、ここで、この分子ビーコンは、増幅プライマーの核酸産物にハイブリダイズし、それによりシグナル（例えば、蛍光シグナル）を生じさせることができる配列を含む。
【０１３９】
ＰＣＲの方法は当技術分野で公知であり、かつ例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（編）ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（編）（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）に記載されている。通常、ＰＣＲのために、少なくとも約８個、より好ましくは少なくとも約１５または２０個のヌクレオチドを含む２つの非相補的核酸プライマーを鋳型核酸の異なる鎖にアニーリングさせ、鋳型の増幅された核酸を、ポリメラーゼ、好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて酵素的に増幅する。
【０１４０】
ＰＣＲに必要な試薬は当技術分野で公知であり、かつこれには、例えば、１以上のプライマー（本明細書に記載）、好適なポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド、緩衝液が含まれる。好適な試薬は、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（編）  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（編）（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）に記載されている。
【０１４１】
例えば、本発明の方法で用いられる好適なポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）（商標）、クレノー断片、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ誘導体、Ｔａｑポリメラーゼ変異体、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｐｆｘポリメラーゼ、ＡｍｐｌｉＴａｑ（商標）ＦＳポリメラーゼ、最小限の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するかもしく３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または上記のポリメラーゼのいずれかの酵素活性のある変異体もしくは断片が挙げられる。好ましくは、本発明の方法で用いられるポリメラーゼは熱安定性ポリメラーゼである。
【０１４２】
一実施形態では、２以上のポリメラーゼの混合物を用いる。例えば、ＰｆｘまたはＰｆｕポリメラーゼとＴａｑポリメラーゼの混合物は、高いＧＣ含有量を含む鋳型の増幅または大きい鋳型の増幅に有用であることがこれまでに示されている。
【０１４３】
本発明の実施に有用なポリメラーゼの好適な市販源は当業者には明白であり、これには、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）が含まれる。
【０１４４】
本発明による結核菌または結核菌群のｉｌｖＣ核酸の特異的増幅は、約２５または３０または３５または４０または４５または５０回の増幅サイクル、およびより好ましくは２８または２９または３０または３１または３２または３３または３４または３５を上回る増幅サイクルを利用し得る。場合により、より多数の増幅サイクルを用いる場合、例えば、増幅産物を分別し、かつ結核菌ｉｌｖＣ核酸または結核菌群ｉｌｖＣ核酸を含まない産物を除外することによって、非特異的増幅産物、例えば、プライマーダイマーおよび／またはＭ．アウィウム核酸を除外する。標準的な手段を用いて、例えば、増幅産物の融解曲線を作成し、結核菌または結核菌群核酸産物のＴｍを示す融解曲線を有する増幅産物を選択することによって、および／またはゲル電気泳動を行なって増幅産物を分別し、結核菌または結核菌群核酸産物のＴｍを示すサイズ／長さを有する電気泳動図中の核酸断片を選択することによって、特異的増幅産物と非特異的増幅産物を分別し、非特異的増幅産物を除外する。
【０１４５】
別の実施例では、本発明による結核菌または結核菌群のｉｌｖＣ核酸の特異的増幅は、例えば、本明細書に記載の特定のプライマーペアについて、Ｍ．アウィウム配列の増幅などの非特異的増幅を減らすために、より少ない数の増幅サイクルを利用する。例えば、標準的な増幅プロトコルは、３０回未満のサイクルまたは２９回未満のサイクルまたは２８回未満のサイクルまたは２７回未満のサイクルまたは２６回未満のサイクルまたは２５回未満のサイクルを利用し得る。あるいは、またはさらに、少なくとも約１２回のサイクルまたは少なくとも約１３回のサイクルまたは少なくとも約１４回のサイクルまたは少なくとも約１５回のサイクルまたは少なくとも約１６回のサイクルまたは少なくとも約１７回のサイクルまたは少なくとも約１８回のサイクルまたは少なくとも約１９回のサイクルまたは少なくとも約２０回のサイクルまたは少なくとも約２１回のサイクルまたは少なくとも約２２回のサイクルを利用する。特に好ましいサイクルプロトコルは、約１７または１８または１９または２０または２１または２２または２３または２４または２５または２６または２７回の増幅サイクル、より好ましくは約２２または２３または２４または２５または２６または２７回の増幅サイクル、さらにより好ましくは約２２または２３または２４または２５回の増幅サイクルを利用する。
【０１４６】
別の実施例では、本明細書における好ましい濃度の核酸鋳型を本明細書で言及される好ましいプライマーペアと組み合わせ、増幅を約１７〜約２７回の増幅サイクルでまたは約２２〜約２５回の増幅サイクルで行なう。従来のプライマー濃度を利用してもよく、好都合には、例示されるプライマーは、約５０ｎＭの濃度または約１００ｎＭの濃度または約１５０ｎＭの濃度または約２００ｎＭの濃度または約２５０ｎＭの濃度である。
【０１４７】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲのために、ＲＮＡを（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素などの）逆転写酵素を用いて逆転写して、ｃＤＮＡを生成させる。これに関連して、ＲＮＡの逆転写を、例えば、ランダムプライマー（例えば、ヘキサヌクレオチドランダムプライマー）またはオリゴ−ｄＴ（ｍＲＮＡ中のポリアデニル化シグナルに結合する）を用いて開始させる。あるいは、部位特異的プライマーを用いて、逆転写を開始させる。試料を加熱して、確実に一本鎖核酸を生成させた後、冷却して、プライマーのアニーリングを可能にする。次に、試料を、逆転写酵素による、アニーリングしたプライマーに隣接する核酸の逆転写に十分な条件下でインキュベートする。逆転写した後、ｃＤＮＡを、ＰＣＲ反応、例えば、標準的なＰＣＲ、または本明細書に記載されたような任意の他のＰＣＲの鋳型核酸として用い、例えば、ｃＤＮＡを、ＬＡＭＰ（すなわち、ＲＴ−ＬＡＭＰ）と組み合わせてもよい。ｃＤＮＡを生成させるための任意の市販のキット（例えば、ｃＤＮＡ合成キット（Ｍａｒｌｉｇｅｎ）を用いるもの）もまた、本発明の方法によって意図されることが明白であろう。
【０１４８】
当業者であれば、どのＲＴ−ＰＣＲも、標的ＲＮＡを定量するための内部参照標準の使用を含み得ることを理解するであろう。これに関して、高度に精製されたインタクトのＲＮＡ試料を扱う場合、インタクトのトータルＲＮＡをＯＤ値で推定することができる。しかしながら、粗ＲＮＡ試料もまた、ＲＴ−ＰＣＲで用いられる本発明の方法において意図される。粗ＲＮＡ試料の場合、インタクトのＲＮＡは、ＤＮＡ夾雑物および／または分解されたＲＮＡのために、ＯＤ値で推定される量よりも少ない。それゆえ、ＯＤ値は、粗ＲＮＡ試料間の比較には用いることができない。特に、試料間の標的遺伝子の発現レベルを比較する場合、ＲＮＡ量を補正して、正確な比較結果を得ることができる。細胞内の標的遺伝子の発現レベルを正確にアッセイするために、アッセイに適用されるＲＮＡ量を試料間で一定量に補正することができる。これに関して、ハウスキーピング遺伝子などの内部参照鋳型を増幅するＲＴ−ＰＣＲを行なうことによって、アッセイに適用されるＲＮＡ量を試料間で一定量に補正するために。
【０１４９】
本発明の方法で用いられる好適なハウスキーピング遺伝子は当業者には明白であろう。一実施例では、ハウスキーピング遺伝子は通常、発現産物が検出され、インタクトのＲＮＡの総量が適切に推定されるように、高レベルで発現されていることが好ましい。例えば、ハウスキーピング遺伝子は、宿主由来のＲＮＡ（例えば、β−アクチン）であってもよい。別の実施例では、ハウスキーピング遺伝子は、結核群の生物のいずれか１つの発現産物（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ）である。別の実施例では、全ての１６Ｓ  ｒＲＮＡ種を検出するプライマーの使用が意図される。
【０１５０】
ワンアームドＰＣＲ
その名前が示唆する通り、シングルプライマーＰＣＲは、１つのプライマーしか用いないで、核酸を増幅する。通常、この技術は、第１のプライマーが鋳型中の多数の部位にアニーリングすることを保証するのに十分に低いストリンジェンシーで第１のプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせることを含む。ポリメラーゼを介する複製の後、増幅が可能になるほど十分に密接にプライマーがアリーリングした場合に、核酸産物が生成される。第２のプライマーまたはそのセットを用いて、増幅された核酸をさらに増幅する。
【０１５１】
ネステッドＰＣＲ
ネステッドＰＣＲは、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ（編）  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（編）（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＮＹ，１９９５）に詳細に記載されている。本質的に、ネステッドＰＣＲ反応は、対象となる配列に特異的な２つのプライマーセットの使用を伴う。第１セットのプライマーは、核酸鋳型を所望のレベルまで増幅するのに用いられる。第２セットのプライマーは、第１のプライマーのアニーリング部位とアニーリング部位の間の核酸の領域にアニーリングするように設計され、核酸鋳型をさらに増幅する。
【０１５２】
ネステッドＰＣＲ反応は、全てのプライマーを１本の閉じたチューブの中に入れて行ない得る。あるいは、最初のＰＣＲを１つのチューブの中で行ない、第２のＰＣＲを別の閉じたチューブの中で行なう。
【０１５３】
タッチダウンＰＣＲ
タッチダウンＰＣＲは、従来のＰＣＲの別の改良法であり、これは、非特異的増幅も軽減する。タッチダウンＰＣＲは、Ｄｏｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１  Ｊｕｌ  ２５；１９（１４）：４００８）に詳細に記載されている。本質的に、タッチダウンＰＣＲは、初期のＰＣＲサイクルにおける標的最適条件よりも高いアニーリング温度の使用を伴う。アニーリング温度は、特定のアニーリング温度または「タッチダウン」アニーリング温度に達するまで１サイクル毎にまたは１サイクルおきに１℃ずつ減少する。次に、タッチダウン温度は、残った数のサイクルのために用いられる。これにより、任意の非特異的産物より正しい産物を濃縮することが可能になる。
【０１５４】
タッチアップおよびループ取込みプライマー（ＴＵＬＩＰ）−ＰＣＲ
ＴＵＬＩＰＳ−ＰＣＲは、例えば、Ａｉｌｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２９（５），１０１８−２３（２０００））に詳細に記載されている。ＴＵＬＩＰＳ−ＰＣＲは、３’領域にセット−アニーリングして、重合の開始を阻害する追加の非鋳型５’配列であるループプライマーを利用する。反応液を加熱することにより、プライマーが融解し、ホットスタートを開始する。この反応はまた、アニーリング温度を徐々に上昇させるタッチアッププレサイクリングを用いて、正確な対形成を保証している。プライマー設計および反応条件に関するさらなる詳細は、オンラインで、例えば、Ａｉｌｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ（アプリケーションノート、オンライン参照：ｈｔｔｐ：／／２０９．１９７．８８．２２５／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ａｂｌ／ｂ０１１０ａｉｌ．ｐｄｆ）で見出すことができる。
【０１５５】
競合および迅速競合ＰＣＲ
競合ＰＣＲは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ試料を、ヌクレオチド配列の大部分を標的と共有する既知量のコンペティターＤＮＡまたはＲＮＡと同時増幅することを含む。この方法では、ＰＣＲ増幅に影響を及ぼす任意の予測可能なまたは予測不可能な変数は、両方の分子種に対して同じ効果を有する。それゆえ、競合ＰＣＲは、コンペティターＤＮＡの量と比較した標的分子の絶対数の定量を可能にする。当業者であれば、競合ＰＣＲが標的分子の数を定量するために迅速かつ正確な方法であることを理解するであろう。競合ＰＣＲは、例えば、Ｃｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１；ｐ．１０４７（１９９１））；Ｓｃｈｎｅｅｇｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ４；ｐ．２３４−２３８（１９９５））；およびｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｂｏｏｋ  ３；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に詳細に記載されている。
【０１５６】
本方法では、標的ＤＮＡまたはＲＮＡの定量は、コンペティターの初期量と比較して相対的に定量することができる。標的ＤＮＡまたはＲＮＡの初期量は、Ｔ／Ｃ＊比によって推定することができる。
＊Ｔ：標的ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の増幅産物の量
Ｃ：コンペティター由来の増幅産物の量
【０１５７】
標的ＤＮＡまたはＲＮＡの初期量は、Ｔ／Ｃ比＝１のときのコンペティターの量に相当する。
【０１５８】
競合ＰＣＲは通常、内部標準の連続希釈物の添加を含む。競合ＰＣＲの変法である、迅速競合ＰＣＲ（ＲＣ−ＰＣＲ）も本発明の方法で使用し得る。ＲＣ−ＰＣＲは、内部標準の同一配列と標的ｃＤＮＡの間の競合ＰＣＲ増幅に基づく非放射性アッセイを用いて、２以上の試料のｍＲＮＡレベルでの相対的な遺伝子発現を測定することを特徴とする。この技術では、１試料当たり１本の反応チューブしか使用しない。ＲＣ−ＰＣＲは、例えば、Ｊｉａｎｇら（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（２）：２２７−２３１）に詳細に記載されている。
【０１５９】
ループを介する等温増幅（ＬＡＭＰ）
本発明の方法はまた、ループを介する等温増幅（ＬＡＭＰ）の使用を意図している。ＬＡＭＰは、１本のチューブの中でＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼによって自動的にサイクリングされる標的ＤＮＡ中の６つの異なる領域の増幅を行なう。この反応は、一定の温度で検出される極めて大量の標的ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ断片を生成させることができる。ＬＡＭＰは、例えば、Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：Ｅ６３（２０００））に詳細に記載されている。当業者であれば、オンラインプライマーツール（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｉｐ／ｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌのＮｅｔｌａｂｏｒａｔｏｒｙ支援ソフトウェアプログラム）を用いて、ＬＡＭＰプライマーを設計するためのオンラインプロトコルを用いることもできるであろう。
【０１６０】
ｉｌｖＣ反応産物またはアンプリコン
アッセイで検出される１以上のｉｌｖＣ核酸またはアンプリコンは、配列番号２の長さが少なくとも約２０または３０の連続するヌクレオチドの配列を含み得る。アンプリコンは、通常は各々長さが少なくとも約１２〜１５ヌクレオチドである増幅プライマーの配列を含むので、通常、配列番号２の長さが少なくとも約４０または５０の連続するヌクレオチドを含む。例えば、アッセイで検出される１以上のｉｌｖＣ核酸またはアンプリコンは、配列番号２の長さが少なくとも約５５または少なくとも約６０または少なくとも約６５または少なくとも約７０または少なくとも約７５または少なくとも約８０または少なくとも約８５または少なくとも約９０または少なくとも約９５または少なくとも約１００または少なくとも約１０５または少なくとも約１１０または少なくとも約１１５または少なくとも約１２０または少なくとも約１２５または少なくとも約１３０または少なくとも約１３５または少なくとも約１４０または少なくとも約１４５または少なくとも約１５０または少なくとも約１５５または少なくとも約１６０の連続するヌクレオチドの配列を含み得る。本明細書に記載の例示的なアンプリコンは、長さが約７５〜約１３５ヌクレオチドである。本発明のアッセイでは、例えば、配列番号２の約９００の連続するヌクレオチドまたは配列番号２の全配列などの、より長いｉｌｖＣ核酸が検出され得るか、またはより長いアンプリコンが生成され得る。
【０１６１】
増幅された核酸の検出および定量
当技術分野で公知の増幅された核酸を検出する任意の方法が本発明の方法で意図されることが当業者には明白であろう。ＴａｑＭａｎプローブ、ＳＹＢＲグリーンＩまたはＩＩ標識プライマー、分子ビーコン、またはスコーピオンプローブなどのプローブの使用をはじめとする、当業者に公知の種々の方法を利用し得る。
【０１６２】
一実施例では、ＴａｑＭａｎプローブを利用する。ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲに用いられるＤＮＡポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性に依存して、標的アンプリコンにハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドを加水分解する。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端に付着した蛍光レポーター色素と３’末端に結合したクエンチャー部分とを有するオリゴヌクレオチドである。これらのプローブは、ＰＣＲ産物の内部領域にハイブリダイズするよう設計される。ハイブリダイズしていない状態では、フルオロ分子とクエンチ分子が近接していることにより、プローブからの蛍光シグナルの検出が抑制されている。ＴａｑＭａｎプローブが結合している鋳型をポリメラーゼが複製するＰＣＲの間に、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性により、プローブが切断される。これによって、蛍光色素とクエンチング色素が分離し、ＦＲＥＴはもはや起こらない。したがって、蛍光は、プローブ切断の量に比例して、各サイクルで増加する。うまく設計されたＴａｑＭａｎプローブは、最適化の必要がほとんどないこともある。ＴａｑＭａｎプローブは、例えば、スペクトルが固有のフルオロ／クエンチペアを有する各プローブを設計することによって、本明細書に記載のマルチプレックスアッセイにも用いられる。
【０１６３】
別の実施例では、分子ビーコンを利用する。分子ビーコンは、ＦＲＥＴを用いて、オリゴヌクレオチド基質の５’末端に結合したフルオロと３’末端に付着したクエンチを介してＰＣＲ産物（すなわち、アンプリコン）を検出および定量する。ＴａｑＭａｎプローブとは異なり、分子ビーコンは、増幅反応の間、無傷のままであり、シグナルが測定される全てのサイクルで標的に再結合する。溶液中に遊離し、フルオロ分子とクエンチ分子の密接により、プローブが蛍光を発することが抑制されているとき、分子ビーコンは、ステムループ構造を形成する。分子ビーコンが標的にハイブリダイズすると、蛍光色素とクエンチャーが分離し、照射されたときに、蛍光色素が光を放出する。分子ビーコンは、各プローブ上のスペクトル的に分離されたフルオロ／クエンチ部分を用いることにより、本明細書に記載のマルチプレックスアッセイに用いることができる。
【０１６４】
別の実施例では、スコーピオンプローブを利用する。スコーピオンプローブは、単一のオリゴヌクレオチドを用いた配列特異的なプライミングとアンプリコン検出を提供する。好適なスコーピオンプローブは、ハイブリダイズしていない状態でステムループ形状を維持し、５’末端に付着したフルオロフォアと３  ’末端に付着したクエンチャー部分を有することにより、ハイブリダイズしていない状態では、シグナルがクエンチングされている。ステムの３’部分は、プライマーの伸長産物に相補的であり、かつ増幅不可能なモノマーを介して特異的プライマーの５’末端に結合している配列を含む。スコーピオンプライマーから伸長した後、特異的なプローブ配列は、伸長したアンプリコン中の相補的な配列にハイブリダイズし、それによってヘアピンループが開き、蛍光のクエンチングが妨げられ、シグナルが生じる。
【０１６５】
別の実施例では、ＳＹＢＲグリーンを増幅プライマーまたはプローブ中で利用する。ＳＹＢＲグリーンは、リアルタイム反応でＰＣＲ産物を検出および定量するための簡単でかつ経済的なフォーマットを提供する。ＳＹＢＲグリーンは、二本鎖ＤＮＡ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは標準的なＰＣＲで生成されるアンプリコン）に結合し、それにより、励起されたときに光を放出する。したがって、生成される蛍光のレベルは、生成されるアンプリコンの量に比例する。ＳＹＢＲグリーンはうまく機能し、非特異的なバックグラウンドシグナルはわずかしか発生しない。
【０１６６】
これらの実施例において、プローブ（例えば、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブまたはスコーピオンプローブ）は、増幅プライマーによって生成されるアンプリコンの鎖に含まれる配列を含む。本明細書に言及される任意のプライマー組合せは、このプライマー組合せが、プローブ（例えば、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブまたはスコーピオンプローブ）がハイブリダイズするのに十分な長さのアンプリコンを生じさせるという条件付きで、本発明のこの例で利用され得る。例示的なプローブ（例えば、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブまたはスコーピオンプローブ）は、配列番号３３または３４に示す配列を含む。配列番号３３または３４を含むプローブとともに使用される例示的なプライマー組合せは、
（ａ）配列番号３２および配列番号３８と、
（ｂ）配列番号３２および配列番号３９と、
（ｃ）配列番号３２および配列番号４０と、
（ｄ）配列番号３５および配列番号３８と、
（ｅ）配列番号３５および配列番号３９と、
（ｆ）配列番号３５および配列番号４０と、
からなる群から選択される。これらのプライマーの変異体（例えば、本明細書で上に記載したような５’末端および／または３’末端の付加または欠失を含む変異体）も利用し得る。
【０１６７】
配列番号３３または３４を含む、プローブ（例えば、分子ビーコンまたはＴａｑＭａｎプローブまたはスコーピオンプローブ）とともに使用される例示的なプライマー組合せは、
（ａ）配列番号３２および配列番号３８と、
（ｂ）配列番号３２および配列番号４０と、
（ｃ）配列番号３５および配列番号３８と、
（ｄ）配列番号３５および配列番号３９と、
からなる群からも選択される。これらのプライマーの変異体（例えば、本明細書で上に記載したような５’末端および／または３’末端の付加または欠失を含む変異体）も利用し得る。
【０１６８】
別の実施例では、本発明の方法を用いて増幅された核酸を、ゲル電気泳動を用いて分離する。次に、分離された核酸を、例えば、エチジウムブロマイド、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、メチレンブルーまたはＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＩまたはＩＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）などの、核酸に選択的に結合する検出可能マーカーを用いて検出する。ゲル電気泳動を用いた核酸の検出に好適な方法は当技術分野で公知であり、かつ例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ  ０４７  １５０３３８，１９８７）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，第３版  ２００１）に記載されている。例えば、１次元アガロース電気泳動、アガロース−アクリルアミド電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて核酸を分離する。このような分離技術は、分子量に基づいて核酸を分離する。
【０１６９】
別の実施例では、増幅された核酸を、２次元電気泳動を用いて分離し、検出可能マーカー（例えば、上記のもの）を用いて検出する。２次元アガロースゲル電気泳動は、Ｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｂｙｅｒｓ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３０：５２７，１９８３による手順を改変したものである。第１次元のゲルについては、低いパーセンテージのアガロース中を低電圧で泳動し、ＤＮＡ分子をその質量に応じて分離する。第２次元については、非線状分子の移動度がその形状によって大きく影響を受けるように、エチジウムブロマイドの存在下、より高いアガロース濃度のゲル中を高電圧で泳動する。
【０１７０】
別の実施例では、増幅産物を、キャピラリー電気泳動を用いて特徴付けるかまたは単離する。キャピラリー電気泳動は、例えば、Ｈｅｌｌｅｒ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２２：６２９−４３，２００１；Ｄｏｖｉｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １６７：２２５−３９，２００１；Ｍｉｔｃｈｅｌｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  １６２：３−２６，２００１；またはＤｏｌｎｉｋ，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４７：１０３−１９，１９９９に概説されている。キャピラリー電気泳動は、高電圧を用いて、分子をそのサイズと電荷によって分離する。電圧勾配をカラム（すなわち、キャピラリー）中で生じさせ、この勾配によって、異なるサイズおよび電荷の分子が異なる速度でチューブの中を通り抜けるようにする。
【０１７１】
別の実施例では、増幅産物をクロマトグラフィーを用いて同定および／または単離する。例えば、イオン対逆相ＨＰＬＣは、ＰＣＲ産物の単離に有用であることが示されている（Ｓｈａｗ−Ｂｒｕｈａ  ａｎｄ  Ｌａｍｂ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２８：７９４−７，２０００）。
【０１７２】
本発明はまた、本発明の核酸を検出するための自動化または半自動化された方法を意図している。自動化されたシステムは、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。
【０１７３】
別の実施例では、増幅された核酸を、例えば、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を用いて検出する。例えば、本発明の方法を用いて増幅された核酸を含む試料を、例えば、３−ヒドロキシプロピオン酸、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、３，５ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）または２，５ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチシン酸）などの、マトリックスに取り込ませる。次に、試料とマトリックスを金属プレートにスポットして、レーザーによる照射にさらし、分子イオンの形成を促進する。生成された分子イオンの質量を、本質的にはＹａｔｅｓ，Ｊ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３３，１−１９，１９９８およびその中の参考文献に記載されているように、その飛行時間（ＴＯＦ）によって分析する。飛行時間型装置は、イオンが飛行管の長さを横断するのに要する時間を決定することにより、イオンの質量対電荷（ｍ／ｚ）比を測定する。場合により、このようなＴＯＦ質量分析計は、飛行管の一方の端にイオンミラーを含み、このイオンミラーは、該イオンを反射し、飛行管の中を通して検出器に戻らせる。したがって、イオンミラーは、飛行管の長さを増加させる役割を果たし、この形の分析の精度を高めている。イオンの飛行時間を決定することによって、増幅された核酸の分子量を決定する。
【０１７４】
上記の検出方法の任意の定量方法が、例えば、標準的なデンシトメトリー技術によって意図されることが明白であろう。
【０１７５】
好ましい実施形態では、例えば、リアルタイムＰＣＲなどの、任意の既知の定量的ＰＣＲ法が利用される。リアルタイムＰＣＲは、標的とされたＤＮＡ分子を増幅し、かつ同時に定量するために用いられる任意のＰＣＲ反応に基づく。これは、ＤＮＡ試料中の特定の配列を（絶対コピー数またはＤＮＡインプットもしくは追加の正規化遺伝子に対して正規化されたときの相対量として）検出および定量することを両方可能にする。この手順は、一般的なポリメラーゼ連鎖反応の原理に従う。その重要な特色は、増幅されたＤＮＡが定量されると同時に、それが、各増幅サイクルの後、リアルタイムに反応液中に蓄積するということである。２つの一般的な定量方法は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートする蛍光色素と、相補的なＤＮＡとハイブリダイズしたときに蛍光を発する修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブの使用である。リアルタイムＰＣＲは、ＲＴ−ＰＣＲと組み合わせてｍＲＮＡ転写産物を定量する場合に、特に有用である。任意の既知リアルタイムＰＣＲ法および／または市販のプラットフォームを、例えば、Ｗｈｅｌａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２７８：２６１−２６９）に記載されているように、本発明の方法で使用し得ることが明白であろう。本明細書で例示されているように、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ）が、製造元のプロトコルに従って、本発明者らにより使用されている。
【０１７６】
別の実施例では、増幅された核酸を、固相検出系（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて検出し得る。本明細書に記載の任意のＰＣＲアッセイフォーマットがＰＣＲ−ＥＬＩＳＡフォーマットに適用可能であることが理解される。これは、ＬＡＭＰ  ＰＣＲフォーマットの場合に特に有用でもある。この実施例では、ＮｕｃｌｅｏＬｉｎｋチューブ（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を利用し得る。これらのチューブは、その表面に共有結合した第２級アミノ基を有する活性化された熱安定性ポリマーを有する。ＰＣＲ−ＥＬＩＳＡフォーマットの条件は、例えば、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，５１（２）：１６３−１７０（２００２））に詳細に記載されている。
【０１７７】
マルチプレックスアッセイフォーマット
ｉｌｖＣ核酸に加えて、多数の核酸を検出するこのアッセイフォーマットに多検体ＮＡＡ検査を含めることは本発明の範囲内である。ｉｌｖＣ−ＮＡＡを用いて得られる診断を確認するために、結核菌群の１以上のマイコバクテリアによって発現されるタンパク質のいずれか１つに由来する他のタンパク質の遺伝子からコードされる他の核酸が用いられる。
【０１７８】
特定のアッセイフォーマットに限定されるものではなく、本発明の方法は、マルチプレックスＮＡＳＢＡまたはマルチプレックスＰＣＲの使用も意図している。マルチプレックス方法は、１本の反応チューブ中で２以上のプライマーペアを用いて、多数のＲＮＡまたはＤＮＡ標的を増幅する。
【０１７９】
当業者であれば、定量的マルチプレックス反応には、プライマー濃度、鋳型濃度、サイクリング条件および緩衝液構成要素を決定するための最適化が必要となる場合があることを理解するであろう。マルチプレックスプラットフォームを実施し、かつこれを最適化するための条件および詳細が公知であり、例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ（Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．２７（８）：８２２−８（２００６））；Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６２，５００−７（１９９１）；Ｗｉｔｔｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５（４）：４３０−４２（２００１））；Ｍａｒｋｏｕｌａｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ａｎａｌ．１７（４）：１０８−１２（２００３））を参照されたい。さらなる詳細を、オンラインで、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｗｗ．ｎｅｔ／ｄｅｔａｉｌ−４１６．ｈｔｍｌに見出すこともできる。当業者であれば、例えば、Ｒａｃｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（ｍｕＰｌｅｘ：Ａ  Ｍｕｌｔｉ−Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３３（Ｗｅｂサーバー版）：Ｗ５４４−Ｗ５４７（２００５）によって開発されたｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｉｃｓｌ４．ｂｕ．ｅｄｕ：８０８０／ＭｕＰｌｅｘ／ＭｕＰｌｅｘ．ｈｔｍｌに見られるような、マルチプレックスプライマーを設計するためのオンラインツールを用いることもできるであろう。
【０１８０】
当業者には明白であるように、本明細書に記載の診断または予後診断アッセイは、マルチプレックス化されたアッセイであってもよい。本明細書で使用される場合、「マルチプレックス」という用語は、単一の試料中で２以上の診断または予後診断マーカーを同時に検出することを意味するだけでなく、単一の試料中で２以上の診断または予後診断マーカー連続的に検出すること、異なっているがマッチした試料中で２以上の診断または予後診断マーカーを同時に検出すること、および異なっているがマッチした試料中で２以上の診断または予後診断マーカー連続的に検出することをも包含することが理解されるものとする。本明細書で使用される場合、「マッチした試料」は、同じ最初の生物学的試料に由来する２以上の試料、または同じ時点で単離された２以上の生物学的試料を意味することが理解されるものとする。
【０１８１】
一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約１００％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９９％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９８％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９７％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９６％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９５％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９４％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９３％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９２％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９１％相同である。一実施例では、プライマーは、結核菌群の２以上のそのような核酸全体にわたってｉｌｖＣ核酸に約９０％相同である。
【０１８２】
例えば、他の結核菌群由来のタンパク質は、ＢＳＸタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬアクセッション番号Ａ５ＴＺＫ２；配列番号３）、リボソームタンパク質Ｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ａ５Ｕ８Ｂ８；配列番号５）、タンパク質  Ｒｖ１２６５（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ６４７８９；配列番号７）、伸長因子−Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ａ５Ｕ０７１；配列番号９）、Ｐ５ＣＲタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ１１１４１；配列番号１１）、ＴｅｔＲ様タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬアクセッション番号Ａ１ＱＷ９２；配列番号１３）グルタミンシンターゼ（ＧＳ）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬアクセッション番号Ｏ３３３４２；配列番号１５）および／または核酸１６Ｓ  ｒＲＮＡ（配列番号２７）からなる群から選択される。結核菌群の１種または複数種の細菌（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）によって発現される任意の１６ｓ  ｒＲＮＡ配列を、利用可能な編集された（ｃｕｒａｔｅｄ）配列データベースから、本明細書に記載されたように容易に入手することができることが当業者には明白であろう。これに関連して、記述されたタンパク質およびコード配列には、配列表によって例示された例示的タンパク質およびコード配列のホモログが含まれ、その場合、該ホモログは、結核菌群の１種または複数種の細菌（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）によって発現されることが理解されるべきである。
【０１８３】
当業者であれば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔが、タンパク質の機能、ドメイン構造、翻訳後修飾、および変異体に関するデータを提供するＳｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓの編集されたタンパク質配列データベースであることや、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬが、コンピュータによる注釈付きのＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔの補完物であり、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔにまだ統合されていないＥＭＢＬヌクレオチド配列エントリーの翻訳を含むことを知っているであろう。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬデータへのアクセスは、例えば、Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓのＥｘＰＡＳｙ（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）プロテオミクスサーバー経由で容易に入手することができる。
【０１８４】
１以上の二次検体（例えば、ＢＳＸ、Ｓ９、ＥＦ−Ｔｕ、Ｐ５ＣＲ、ＴｅｔＲ様タンパク質、グルタミン合成酵素および／または１６ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸）のアッセイを、臨床試料中のｉｌｖＣ核酸（ｉｌｖＣ−ＮＡＡ）の検出について本明細書に記載されているのと同じ方法で好都合に行なう。したがって、当業者であれば、これらの二次検体の検出において、鋳型は、二次検体によって表されるタンパク質の遺伝子によってコードされていることを除き、本明細書でｉｌｖＣ核酸について定義されたようなものであることを理解するであろう。アッセイは、同時にまたは異なる時に、同じ患者試料または異なる患者試料を用いて行ない得る。
【０１８５】
一実施例では、鋳型は、配列番号３に示すようなＢＳＸタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号３に示すようなＢＳＸタンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号３に示すようなＢＳＸタンパク質に少なくとも８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号３に示すようなＢＳＸタンパク質に少なくとも８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号３に示すようなＢＳＸタンパク質に少なくとも９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号３に示すようなＢＳＸタンパク質に少なくとも９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【０１８６】
別の実施例では、鋳型は、配列番号４に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号４に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号４に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号４に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号４に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号４に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号４に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【０１８７】
一実施例では、鋳型は、配列番号５に示すようなＳ９タンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号５に示すようなＳ９タンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号５に示すようなＳ９タンパク質に少なくとも８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号５に示すようなＳ９タンパク質に少なくとも８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号５に示すようなＳ９タンパク質に少なくとも９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号５に示すようなＳ９タンパク質に少なくとも９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【０１８８】
別の実施例では、鋳型は、配列番号６に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号６に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号６に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号６に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号６に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号６に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号６に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【０１８９】
一実施例では、鋳型は、配列番号７に示すようなＲｖ１２６５タンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号７に示すようなＲｖ１２６５タンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号７に示すようなＲｖ１２６５タンパク質に少なくとも８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号７に示すようなＲｖ１２６５タンパク質に少なくとも８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号７に示すようなＲｖ１２６５タンパク質に少なくとも９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号７に示すようなＲｖ１２６５タンパク質に少なくとも９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【０１９０】
別の実施例では、鋳型は、配列番号８に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号８に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号８に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号８に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号８に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号８に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号８に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【０１９１】
一実施例では、鋳型は、配列番号９に示すようなＥＦ−Ｔｕタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号９に示すようなＥＦ−Ｔｕタンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号９に示すようなＥＦ−Ｔｕタンパク質に少なくとも８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号９に示すようなＥＦ−Ｔｕタンパク質に少なくとも８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号９に示すようなＥＦ−Ｔｕタンパク質に少なくとも９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号９に示すようなＥＦ−Ｔｕタンパク質に少なくとも９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【０１９２】
別の実施例では、鋳型は、配列番号１０に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１０に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１０に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１０に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１０に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１０に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１０に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【０１９３】
一実施例では、鋳型は、配列番号１１に示すようなＰ５ＣＲタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１１に示すようなＰ５ＣＲタンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１１に示すようなＰ５ＣＲタンパク質に少なくとも８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１１に示すようなＰ５ＣＲタンパク質に少なくとも８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１１に示すようなＰ５ＣＲタンパク質に少なくとも９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１１に示すようなＰ５ＣＲタンパク質に少なくとも９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【０１９４】
別の実施例では、鋳型は、配列番号１２に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１２に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１２に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１２に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１２に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１２に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１２に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【０１９５】
一実施例では、鋳型は、配列番号１３に示すようなＴｅｔＲ様タンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１３に示すようなＴｅｔＲ様タンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１３に示すようなＴｅｔＲ様タンパク質に少なくとも８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１３に示すようなＴｅｔＲ様タンパク質に少なくとも８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１３に示すようなＴｅｔＲ様タンパク質に少なくとも９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１３に示すようなＴｅｔＲ様タンパク質に少なくとも９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【０１９６】
別の実施例では、鋳型は、配列番号１４に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１４に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１４に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１４に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１４に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１４に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１４に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【０１９７】
一実施例では、鋳型は、配列番号１５に示すようなＧＳタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１５に示すようなＧＳタンパク質に少なくとも８０％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１５に示すようなＧＳタンパク質に少なくとも８０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１５に示すようなＧＳタンパク質に少なくとも８５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１５に示すようなＧＳタンパク質に少なくとも９０％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１５に示すようなＧＳタンパク質に少なくとも９５％〜１００％相同なタンパク質をコードする核酸である。
【０１９８】
一実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に少なくとも８０％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６ｓ  ＲＮＡをコードする核酸に８０％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に８５％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に９０％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に９５％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。
【０１９９】
別の実施例では、鋳型は、配列番号１６に示すようなヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１６に示すようなコード配列に少なくとも８０％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１６に示すようなコード配列に少なくとも８０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１６に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１６に示すようなコード配列に少なくとも９０％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１６に示すようなコード配列に少なくとも９５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。別の実施例では、鋳型は、配列番号１６に示すようなコード配列に少なくとも８５％〜１００％相同なヌクレオチドコード配列である。
【０２００】
一実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に少なくとも８０％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６ｓ  ＲＮＡをコードする核酸に８０％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に８５％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に９０％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。別の実施例では、鋳型は、結核菌群の１以上の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸に９５％〜１００％相同な１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸である。
【０２０１】
これに関連して、記述されたタンパク質および／またはｒＲＮＡならびに該タンパク質および／またはｒＲＮＡをコードする配列には、配列表によって例示される例示的なタンパク質および／またはｒＲＮＡならびにコード配列のホモログも含まれ、その場合、該ホモログは、結核菌群の１種または複数種の細菌（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）によって発現されることが理解されるべきである。
【０２０２】
１以上の二次検体（例えば、ＢＳＸ、Ｓ９、ＥＦ−Ｔｕ、Ｐ５ＣＲ、ＴｅｔＲ様タンパク質、グルタミン合成酵素および／または１６ｓ  ｒＲＮＡをコードする核酸）を増幅するためのいずれか１つまたは複数のプライマーは、この１つまたは複数のプライマーが各々の対応する鋳型核酸の鎖に対して全体で少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含むように、本明細書でｉｌｖＣ核酸について記載されたように設計されることが当業者によって理解されるであろう。より好ましくは、配列同一性の程度は、少なくとも約８５％または９０％または９５％または９８％または９９％である。例えば、プライマーまたはプライマーの領域は、対象となる鋳型の鎖の領域に対して少なくとも約８０％の同一性を有する配列を含み得る。
【０２０３】
一実施例では、ＢＳＸをコードする核酸を増幅するために、フォワードプライマーは配列番号２１に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２２に示すようなヌクレオチド配列を有する。
【０２０４】
別の実施例では、Ｒｖ１２６５をコードする核酸を増幅するために、フォワードプライマーは配列番号２３に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２４に示すようなヌクレオチド配列を有する。
【０２０５】
別の実施例では、Ｓ９をコードする核酸を増幅するために、フォワードプライマーは配列番号２５に示すようなヌクレオチド配列を有し、リバースプライマーは配列番号２６に示すようなヌクレオチド配列を有する。
【０２０６】
異なる放出スペクトルを有する蛍光色素を異なるプローブに付着させるという条件付きで、マルチプレックスアッセイ用のリアルタイムレポーター（例えば、  ＴａｑＭａｎプローブ、分子ビーコンまたはスコーピオンプローブ）をマルチプレックスアッセイフォーマットで利用し、それにより、多数のＲＮＡまたはＤＮＡ種を同じ試料中で測定するのを可能にすることもできる。マルチプレックス反応は、１本のチューブでの、均一なアッセイで共増幅される内部対照も提供する。
【０２０７】
ＮＡＡ−抗原併用アッセイフォーマット
例えば、診断および／または予後診断を確認するために、上記の実施形態のいずれか１つを、例えば、ＡＵ２００８９０２６１１号に記載されているようなＫＡＲＩタンパク質またはその断片を検出するための抗原に基づく検査と組み合わせ得ることが理解されるであろう。特に、抗体に基づくアッセイとは対照的に、結核菌抗原を検出する１つの利点は、重症免疫不全患者は検出可能なレベルで抗体を産生しない場合があり、どの患者の抗体のレベルも桿菌量を反映しないことである。他方、抗原レベルは、桿菌量を反映するはずであり、また、桿菌の産物であるので、その存在を検出する直接的な方法となる。
【０２０８】
一実施例では、本明細書中の任意の実施形態によって記載されるようなｉｌｖＣ−ＮＡＡ診断および予後診断アッセイを抗原に基づくアッセイと組み合わせて、組み合わせたＮＡＡ−抗原に基づくアッセイを提供し、その場合、該抗原に基づくアッセイは、該対象由来の生物学的試料中でＫＡＲＩタンパク質、またはその断片を検出することを含む。組み合わせたアッセイを、同時にまたは例えば、ＮＡＡの次に抗原に基づく検出もしくは抗原に基づく検出の次にＮＡＡのように、任意の順序で行なう。例えば、生物学的試料を、結核菌または結核菌群の他の生物の免疫原性ＫＡＲＩタンパク質、免疫原性ＫＡＲＩペプチドまたは免疫原性ＫＡＲＩ断片またはそれらのエピトープに特異的に結合する単離されたリガンド（例えば、小分子、ペプチド、抗体、または抗体の免疫反応性断片）と接触させる。好ましいリガンドはペプチドまたは抗体である。好ましい抗体としては、例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体調製物が挙げられる。これは、任意の単離された抗体産生細胞または抗体産生細胞集団、例えば、ＫＡＲＩタンパク質またはＫＡＲＩタンパク質の免疫原性断片またはＫＡＲＩタンパク質の配列に由来する配列を含む他の免疫原性ペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマまたは形質細胞腫にまで及ぶ。抗原に基づくアッセイで使用される好適なリガンド、抗体、方法および試薬は、ＡＵ２００８９０２６１１号に記載されているようなものである。
【０２０９】
本明細書中の任意の実施形態による組み合わせたＮＡＡ−抗原に基づくアッセイフォーマットは、結核菌群の生物（例えば、対象における結核菌）による過去もしくは現在の（すなわち、活動性の）感染または潜伏感染を検出するのに有用であり、その場合、該感染は、ｉｌｖＣ−ＮＡＡに基づくアッセイを用いてＫＡＲＩタンパク質をコードする核酸の存在により決定され、かつ対象から得られた生物学的試料中に存在するＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープへの抗原に基づくアッセイ中のリガンドの結合によって確認される。
【０２１０】
本明細書中の任意の実施形態による組み合わせたＮＡＡ−抗原に基づくアッセイフォーマットは、結核菌群の細菌もしくは結核菌群の細菌により感染した細胞の同定または該細菌もしくは該細胞の選別もしくは計数に有用である。この実施例は、結核菌群の複数の細菌（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）の同定を明確に包含する。
【０２１１】
任意の実施形態によって記載されるような組み合わせたＮＡＡ−抗原に基づくアッセイフォーマットは、免疫障害のない対象（例えば、ＨＩＶ陰性対象）に有用であり、このアッセイは、免疫障害があるかまたは免疫不全である対象、例えば、ヒト免疫不全ウイルスに感染した対象（すなわち、「ＨＩＶ＋」）におけるＴＢを検出するのに特に有用でもある。このようなアッセイを行なうのに用いられる試料としては、例えば、（ｉ）脳、乳房、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉、骨からなる群から選択される組織由来の抽出物およびそれらの混合物；（ｉｉ）喀痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸水からなる群から選択される体液およびそれらの混合物；ならびに（ｉｉｉ）喀痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸水からなる群から選択される体液由来の試料およびそれらの混合物が挙げられる。
【０２１２】
好ましい試料は、ヒト免疫グロブリンと複合体を形成したＫＡＲＩタンパク質またはその断片を含む循環免疫複合体を含み得る。このような免疫複合体の検出は明らかに本発明の範囲内である。この実施形態によって、捕捉試薬（例えば、捕捉抗体）を用いて、対象の循環中の単離された抗原の他に、対象の免疫グロブリンと複合体を形成したＫＡＲＩ抗原（ＫＡＲＩタンパク質、ポリペプチドまたはそれらの免疫反応性断片もしくはエピトープ）を捕捉する。任意で検出可能な標識とコンジュゲートした、抗Ｉｇ抗体を用いて、捕捉されたＣＩＣに特異的に結合させ、それによりＣＩＣ患者試料を検出する。本発明の範囲内で、抗Ｉｇ抗体は、試料中のＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＧに優先的に結合する。特に好ましい実施形態では、抗Ｉｇ抗体は、ヒトＩｇ、例えば、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＧまたはヒトＩｇＭに結合する。抗Ｉｇ抗体は、当技術分野で公知の任意の標準的な検出可能な標識にコンジュゲートさせ得る。これは、病原性因子（例えば、細菌もしくはウイルス）による感染の検出に、またはＣＩＣと関連する任意の疾患もしくは障害の診断に特に有用である。したがって、本明細書中の任意の実施形態により記載される診断方法は、修飾に適しており、その場合、対象由来の試料が結核菌のＫＡＲＩタンパク質または１以上のその免疫原性ＫＡＲＩペプチド、断片もしくはエピトープに結合した免疫グロブリン（Ｉｇ）を含む１以上の循環免疫複合体を含み、かつ抗原抗体複合体の形成を検出することが、複合体が形成するのに十分な時間および条件下で抗Ｉｇ抗体を循環免疫複合体の免疫グロブリン部分と接触させた後、結合した抗Ｉｇ抗体を検出することを含む。
【０２１３】
ＮＡＡ−抗体に基づくアッセイ
本発明の方法を用いて得られる対象中の結核または結核菌による感染の診断が、該対象由来の生物学的試料中でＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープに結合する抗体を検出することにより、診断を確認することをさらに含み、その場合、試料中の該抗体の存在は感染を示すことも意図される。感染は、過去の感染もしくは現在の感染、または潜伏感染であり得る。
【０２１４】
さらなる実施例では、本明細書中の任意の実施形態によって記載されるようなｉｌｖＣ−ＮＡＡ診断および予後診断アッセイは、対象中の結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を診断するための抗体に基づくアッセイと組み合わされ、その場合、該抗体に基づくアッセイは、該対象由来の生物学的試料中で免疫原性ＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性ＫＡＲＩペプチドもしくは免疫原性ＫＡＲＩ断片もしくはエピトープに結合する抗体を検出することを含み、試料中の該抗体の存在は感染を示す。組み合わせたアッセイは、同時にまたは例えば、ＮＡＡの次に抗原に基づく検出もしくは抗原に基づく検出の次にＮＡＡのように、任意の順序で行なわれる。感染は、過去の感染もしくは活動性の感染、または潜伏感染であり得るが、好ましい実施形態では、このアッセイフォーマットは、活動性の感染および／または最近の感染の検出に特に有用である。
【０２１５】
例えば、抗体に基づくアッセイは、例えば、対象に由来する生物学的試料を、抗原抗体複合体が形成するのに十分な時間および条件下で、本明細書に記載の任意の実施形態による単離されたまたは組換えの免疫原性ＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性ＫＡＲＩペプチドもしくは免疫原性ＫＡＲＩ断片もしくはエピトープあるいは該ペプチドまたはエピトープまたは断片の組合せまたは混合物と接触させた後、抗原抗体複合体の形成を検出することを含む、イムノアッセイであり得る。試料は、抗体を含む試料、例えば、対象から得られた血液または血清または血漿または免疫グロブリン画分を含む試料である。試料は、ＫＡＲＩ抗原性断片との複合体の形態の循環抗体を含み得る。通常、抗原抗体複合体は、患者の免疫グロブリン（例えば、抗ヒトＩｇ抗体）に結合することができる抗体を用いて、このようなアッセイフォーマットで検出される。抗体に基づくアッセイで用いられる好適な抗体、方法および試薬は、ＡＵ２００８９０２６１１号に記載されているようなものである。
【０２１６】
好ましくは、ＮＡＡ−抗体に基づく検査を受けている対象は、結核もしくは結核菌による感染を患っていることが疑われるおよび／または結核を発症する危険に曝されているおよび／または結核菌に感染する危険に曝されている。
【０２１７】
抗体に基づくアッセイは主に、結核菌による活動性感染の確認に用いられる。好ましくは、対象の病歴は、結核菌によるごく最近の感染または慢性感染において持続し得る残存抗体レベルによるものと考えられる。
【０２１８】
このフォーマットは、安価でかつ極めて感度が高いが、免疫が低下した個人における感染の検出を確認するにあたって、抗原に基づくアッセイフォーマットほどは有用でない。しかしながら、抗体に基づくアッセイは、免疫が低下していないＨＩＶ−またはＨＩＶ＋の個人における結核菌感染の検出を確認するにあたっては、明らかに有用である。
【０２１９】
抗体に基づくアッセイは、ＡＵ２００８９０２６１１号に記載されているようなものであり、かつ対象に由来する生物学的試料をＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープと接触させることと、抗原抗体複合体の形成を検出することとを含む。
【０２２０】
抗体に基づくアッセイでは、抗体の検出に用いられるＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープは、非感染対象由来の抗血清とそれほど交差反応しないことが好ましい。したがって、単離されたまたは組換えのＫＡＲＩは、本明細書に記載の抗体に基づくプラットフォームで用いられることが好ましい。
【０２２１】
別の実施形態では、抗体に基づくアッセイを含む本発明の方法は、本明細書中の任意の実施形態によって記載されるＮＡＡに基づくアッセイによって決定されるような、対象中の結核または結核菌による感染の進行の決定を確認するのに有用である。本発明のこれらの予後診断用途において、対象由来の血液または血清、血漿、または免疫グロブリン画分中のＫＡＲＩタンパク質または断片またはエピトープに結合する抗体の量は、感染状態と正に相関する。例えば、結核または感染の症状を患っている対象中の検出可能な抗ＫＡＲＩタンパク質抗体のレベルよりも低いそれに対する抗ＫＡＲＩタンパク質抗体のレベルは、対象が感染から回復していることを示す。同様に、健康個体と比較した対象由来の試料中のより高い抗体レベルは、対象が疾患または感染から脱しきれていないことを示す。
【０２２２】
さらなる実施形態では、抗体に基づくアッセイを含む本発明の方法は、結核または結核菌による感染を有する対象の、該結核または感染のための治療的化合物による治療に対する応答の決定を確認し、該方法は、該対象由来の生物学的試料中のＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープに結合する抗体を検出することをさらに含み、その場合、正常または健康対象において検出可能な抗体のレベルと比較して増強されている抗体のレベルは、対象が該治療に応答していないかまたは疾患もしくは感染から脱しきれていないことを示す。この場合もやはり、単離されたまたは組換えのＫＡＲＩタンパク質が好ましい。
【０２２３】
代わりの実施形態では、抗体に基づくアッセイを含む本発明の方法は、結核または結核菌による感染を有する対象の、該結核または感染のための治療的化合物による治療に対する応答の決定を確認し、該方法は、該対象由来の生物学的試料中のＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープに結合する抗体を検出することをさらに含み、その場合、結核または結核菌による感染を患っている対象において検出可能な抗体のレベルよりも低い抗体のレベルは、対象が該治療に応答していることまたは疾患もしくは感染から脱したことを示す。
【０２２４】
結核を有する対象由来の生物学的試料中で検出されるＫＡＲＩタンパク質または断片に対する抗体の量を参照試料と比較してもよく、その場合、この参照試料は、事前に結核菌に感染したことがないかまたは最近結核菌に感染していない１以上の健康対象に由来する。このような陰性対照対象は循環抗体力価が低く、そのため、抗体に基づくアッセイフォーマットにおける好適な標準となっている。例えば、ＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片に結合する抗体は参照試料中では検出されず、患者試料中でしか検出されないが、これは、試料が由来した患者が結核もしくは結核菌による感染を患っているかまたは急性感染を発症することを示している。単離されたまたは組換えＫＡＲＩタンパク質は、このような実施形態で用いられるのが好ましい。
【０２２５】
抗体に基づくアッセイを利用する記載された診断／予後診断方法の一実施形態では、生物学的試料は事前に対象から得られている。このような実施形態によって、予後診断または診断方法がエクスビボで行なわれる。
【０２２６】
さらに別の実施形態では、抗体に基づくアッセイを利用する記載された本診断／予後診断方法は、対象由来の試料を処理して、検体（例えば、血液、血清、血漿、または任意の免疫グロブリン含有試料）を含む派生物または抽出物を生成させることをさらに含む。
【０２２７】
抗体に基づくアッセイで用いられる好適な試料としては、例えば、免疫グロブリン（例えば、血液、骨）を含む組織由来の抽出物、または体液（例えば、血清、血漿、全血、血清の免疫グロブリン含有画分、血漿の免疫グロブリン含有画分、血液の免疫グロブリン含有画分が挙げられる。
【０２２８】
抗原および抗体に基づくアッセイの検出系
本明細書で意図される好ましい検出系には、例えば、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、等電点フォーカシング、ＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび等電点フォーカシングを含む２次元ゲル電気泳動、免疫アッセイ、抗体または例えば、小分子（例えば、化学的化合物、タンパク質のアゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節因子、競合阻害因子、または非競合阻害因子）などのタンパク質の非抗体リガンドを用いた検出に基づく系などの、ヒト対象から単離された生物学的試料中のタンパク質または抗体を検出するための任意の既知のアッセイが含まれる。これらの実施形態によって、抗体または小分子を、タンパク質の検出に適している任意の標準的な固相または溶液相アッセイフォーマットで使用し得る。例えば、質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバー光学、または蛍光共鳴エネルギー移動などの、光学的検出または蛍光検出は、本発明に明確に包含される。大量試料のハイスループットスクリーニング、特に、ハイスループットスペクトロスコピー共鳴法（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、エレクトロスプレーＭＳまたはナノエレクトロスプレーＭＳ）で使用するのに好適なアッセイ系が特に意図される。
【０２２９】
例えば、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイからなる群から選択されるイムノアッセイフォーマットが特に好ましい。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、同位体コード親和性タグ（ｉｓｏｔｏｐｅ−ｃｏｄｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔａｇ）（ＩＣＡＴ）、質量分析（例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ））、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバー光学技術またはタンパク質チップ技術を利用する修飾されたイムノアッセイも有用である。
【０２３０】
好ましくは、アッセイは、半定量的アッセイまたは定量的アッセイである。
【０２３１】
標準的な固相ＥＬＩＳＡフォーマットは、種々の患者試料由来のタンパク質または抗体の濃度を決定する際に特に有用である。
【０２３２】
一形態では、そのようなアッセイは、抗ＫＡＲＩタンパク質抗体、またはあるいはＫＡＲＩタンパク質もしくはその免疫原性断片を含む生物学的試料を、例えば、ポリスチレンまたはポリカーボネートマイクロウェルまたはディップスティック、メンブレンまたはガラス支持体（例えば、ガラススライド）などの、固体マトリックスに固定することを含む。
【０２３３】
抗原に基づくアッセイの場合、ＫＡＲＩタンパク質に特異的に結合する固定化された抗体を生物学的試料と直接的に接触させ、該試料中に存在するその標的タンパク質のいずれかとの直接的な結合を形成させる。抗体に基づくアッセイの場合、固定化された単離されたまたは組換えのＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープを生物学的試料と接触させる。溶液中の添加された抗体またはタンパク質は、通常、例えば、コロイド金、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣもしくはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ）または酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）もしくはβ−ガラクトシダーゼ）などの、検出可能なレポーター分子で標識されている。
【０２３４】
あるいは、またはさらに、第１の抗体にまたは単離された／組換えＫＡＲＩ抗原に結合する第２の標識抗体を用いることができる。洗浄して、未結合の抗体またはＫＡＲＩ抗原を全て除去した後、直接（蛍光標識の場合）、または例えば、過酸化水素、ＴＭＢ、もしくはトルイジン、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）などの、基質の添加によって、標識を検出し得る。
【０２３５】
このようなＥＬＩＳＡに基づく系は、例えば、既知の量の標準に対して検出系を較正することなどによって、試料中のタンパク質または抗体の量を定量するのに特に好適である。
【０２３６】
別の形態では、ＥＬＩＳＡは、ＫＡＲＩタンパク質に特異的に結合する抗体を、例えば、メンブレン、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネートディップスティックまたはガラス支持体などの固体マトリックス上に固定することからなる。次に、患者試料を該抗体と物理的に関連させ、試料中の抗原と結合させるかまたはこれを「捕捉する」。次に、結合したタンパク質を、標識抗体を用いて検出することができる。例えば、タンパク質がヒト試料から捕捉する場合、抗ヒトＩｇ抗体を用いて、捕捉されたタンパク質を検出する。
【０２３７】
例示的なアッセイは、
（ｉ）免疫原性ＫＡＲＩペプチドまたはＫＡＲＩタンパク質に特異的に結合する抗体を固体マトリックスまたは支持体に固定化することと、
（ｉｉ）結合した抗体を対象、固定化された抗体が試料中のＫＡＲＩタンパク質またはその断片に結合し、それにより抗原抗体複合体を形成するのに十分な時間および条件下で、好ましくは、抗体含有試料（例えば、血液、血清またはこれらのＩｇ含有画分）から得られた試料と接触させることと、
（ｉｉｉ）該複合体を、ヒトＩｇを認識する抗体と接触させることを含むプロセスで形成された抗原抗体複合体を検出することと、
を含み、ここで、該ヒトＩｇの存在は、患者試料中の結核菌の存在を示す。
【０２３８】
固定化された抗体の特異性は、抗体が認識するエピトープを含む単離されたまたは免疫複合体を形成したＫＡＲＩタンパク質または断片が実際に結合することを保証するのに対し、抗ヒトＩｇの特異性は、免疫複合体を形成したＫＡＲＩタンパク質または断片のみが検出されることを保証する。これに関連して、「免疫複合体を形成した」という用語は、患者試料中のＫＡＲＩタンパク質またはその断片がヒトＩｇ（例えば、ヒトＩｇＡまたはヒトＩｇＭまたはヒトＩｇＧなど）と複合体を形成することを意味すると解釈するものとする。したがって、この実施形態は、対象において免疫応答を生じさせている結核菌または結核菌による感染の存在を検出するのに特に有用である。検出抗体（例えば、抗ヒトＩｇＡまたは抗ヒトＩｇＧまたは抗ヒトＩｇＭ）を適切に選択することにより、対象の免疫応答をアイソタイピングすることがさらに可能である。ヒトＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＧに結合するこのような検出抗体は当技術分野で公に利用可能である。
【０２３９】
前述の実施形態の代わりにまたは前述の実施形態に加えて、第２の（検出）抗体に結合する第３の標識抗体を用いることができる。
【０２４０】
本明細書に記載のアッセイフォーマットが、例えば、スクリーニングプロセスの自動化などのハイスループットフォーマット、またはＭｅｎｄｏｚａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２７（４）：７７８−７８８，１９９９に記載されているようなマイクロアレイフォーマットに適していることは当業者に明白であろう。さらに、例えば、競合ＥＬＩＳＡなどの上記のアッセイの変法が当業者には明白であろう。
【０２４１】
あるいは、抗ＫＡＲＩタンパク質抗体、またはあるいはＫＡＲＩタンパク質もしくはその免疫原性断片の存在を、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）を用いて検出する。このアッセイの基本的な原理は、放射性標識された抗体または抗原を用いて、抗体抗原相互作用を検出することである。例えば、ＫＡＲＩタンパク質に特異的に結合する抗体を固体支持体に結合させ、生物学的試料を該抗体と直接的に接触させることができる。結合した抗原を検出するために、単離されたおよび／または組換え形態の放射性標識された抗原を同じ抗体と接触させる。洗浄した後、結合した放射能の量を検出する。生物学的試料中の抗原はいずれも、放射性標識された抗原の結合を阻害するので、検出された放射能の量は、試料中の抗原の量に反比例する。増加する既知濃度の単離された抗原を用いる標準曲線を用いて、このようなアッセイを定量し得る。
【０２４２】
当業者には明白であるように、放射性標識の代わりに、例えば、酵素または蛍光分子などの任意のレポーター分子を用いるように、このようなアッセイを改変し得る。
【０２４３】
ウェスタンブロッティングもまた、ＫＡＲＩタンパク質またはその免疫原性断片の検出に有用である。このようなアッセイでは、生物学的試料由来のタンパク質を、当技術分野でよく知られており、かつ例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第３版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されている技術を用いるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて分離する。次に、分離されたタンパク質を、当技術分野で周知の方法（例えば、電気転写）を用いて、例えば、メンブレンまたはより具体的には、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレンもしくはＰＶＤＦメンブレンなどの、固体支持体に転写する。次に、このメンブレンをブロッキングし、ＫＡＲＩタンパク質に特異的に結合する標識抗体またはリガンドでプロービングする。あるいは、標識された二次抗体もしくはリガンドを用いて、またはさらには三次抗体もしくはリガンドを用いて、特異的一次抗体の結合を検出することができる。
【０２４４】
抗ＫＡＲＩタンパク質抗体、またはあるいはＫＡＲＩタンパク質もしくはその免疫原性断片の存在または不在を検出するためのハイスループットな方法が特に好ましい。
【０２４５】
一実施形態では、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を、１次元または２次元ゲル電気泳動によって分離されたタンパク質の迅速な同定に用いる。したがって、対象となるタンパク質に特異的に結合する抗体またはリガンドを用いて対象となるタンパク質を検出する必要はない。そうではなく、生物学的試料由来のタンパク質を、当技術分野で公知の方法を用いるゲル電気泳動を用いて分離し、ほぼ正確な分子量および／または等電点のタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて分析して、対象となるタンパク質の存在または不在を決定する。
【０２４６】
あるいは、質量分析（例えば、ＭＡＬＤＩまたはＥＳＩ、または手法の組合せ）を用いて、例えば、喀痰などの生物学的試料中の特定のタンパク質の濃度を決定する。このようなタンパク質は、分子量や等電点などのパラメータに関して事前に十分に特徴付けられていることが好ましい。
【０２４７】
バイオセンサー装置は、通常、電極表面と電流または電気抵抗測定素子とを組み合わせて装置内に統合したものを、アッセイ基板（例えば、米国特許第５，５６７，３０１号に記載されているもの）と組み合わて利用する。対象となるタンパク質に特異的に結合する抗体またはリガンドをバイオセンサー装置の表面に組み込み、患者から単離された生物学的試料（例えば、本明細書に記載の方法を用いて可溶化した喀痰）を該装置に接触させることが好ましい。バイオセンサー装置により検出された電流または電気抵抗の変化は、タンパク質の該抗体またはリガンドへの結合を示す。当技術分野で公知のバイオセンサーのいくつかの形態はまた、表面プラズモン共鳴に基づいて、タンパク質相互作用を検出し、それにより、反射表面の表面プラズモン共鳴の変化が、タンパク質のリガンドまたは抗体への結合を示す（米国特許第５，４８５，２７７号および同第５，４９２，８４０号）。
【０２４８】
バイオセンサーは、そのような系をマイクロまたはナノスケールへと容易に適合させることができるために、ハイスループット解析において特に有用である。さらに、そのような系は、いくつかの検出試薬を組み入れるように適合させるのにも好都合であり、単一のバイオセンサーユニットでの診断試薬のマルチプレックス化が可能になる。これにより、少量の体液中でいくつかのエピトープを同時に検出することが可能になる。
【０２４９】
対象となるタンパク質の検出に前に生物学的試料を前処理する必要がないので、エバネッセントバイオセンサーも好ましい。エバネッセントバイオセンサーは通常、例えば、プローブの表面付近に結合した蛍光抗体などの、蛍光分子と相互作用する所定の波長の光に基づいて、診断用タンパク質と抗体またはリガンドの結合により、異なる波長の蛍光を放出する。
【０２５０】
タンパク質チップを作製するために、対象となる特異的抗体またはタンパク質に結合することができるタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗体またはリガンドを、例えば、ガラス、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、酸化ケイ素、金属または窒化ケイ素などの固体支持体に結合させる。この固定化は、直接的なもの（例えば、共有結合、例えば、シッフ塩基形成、ジスルフィド結合、またはアミドもしくは尿素結合形成によるもの）、あるいは間接的なもののいずれかである。タンパク質チップの作製方法は当技術分野で公知であり、かつ例えば、米国特許出願第２００２０１３６８２１号、同第２００２０１９２６５４号、同第２００２０１０２６１７号および米国特許第号６，３９１，６２５号に記載されている。タンパク質を固体支持体に結合させるために、多くの場合、例えば、アルデヒド含有シラン試薬を用いて、表面上に化学的反応基を創出するように固体支持体を処理する必要がある。あるいは、抗体またはリガンドを微細加工ポリアクリルアミドゲルパッド表面に捕捉し、Ａｒｅｎｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７５：１２３−１３１，２０００に記載されているようなマイクロ電気泳動を用いて、ゲル内へと加速させ得る。
【０２５１】
タンパク質チップは、いくつかのタンパク質、リガンドまたは抗体が該チップ上に配置されるように作製されることが好ましい。このフォーマットにより、試料中のいくつかのタンパク質の存在を同時スクリーニングすることができる。
【０２５２】
あるいは、タンパク質チップは、１種のみのタンパク質、リガンドまたは抗体を含み、かつ対象となる１種のポリペプチドの存在について１以上の患者試料をスクリーニングするために使用されてもよい。このようなチップはまた、対象となるポリペプチドについて患者試料のアレイを同時にスクリーニングするために使用されてもよい。
【０２５３】
タンパク質チップを用いて解析される試料は、例えば、当技術分野で周知の方法を用いて検出可能な蛍光分子、放射性分子、酵素、または抗体などのレポーター分子に付着していることが好ましい。したがって、タンパク質チップを標識された試料と接触させ、その後、洗浄して、未結合のタンパク質を除去することにより、結合したタンパク質の存在を、当技術分野で周知の方法を用いて（例えば、ＤＮＡマイクロアレイリーダーを用いて）検出する。  
【０２５４】
あるいは、生体分子相互作用分析−質量分析（ＢＩＡ−ＭＳ）を用いて、低フェムトモルからサブフェムトモル（ｆｍｎｏｌ）レベルで複合生物学的試料中に存在するタンパク質を迅速に検出し、特徴付ける（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２１：１１５５−１１６３，２０００）。タンパク質チップの解析において有用な１つの技術は、タンパク質チップに結合したタンパク質を特徴付けるための表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）技術である。あるいは、タンパク質チップを、米国特許出願第２００２０１３９７５１号に記載されているようなＥＳＩを用いて解析する。
【０２５５】
当業者には明白であるように、タンパク質チップは、検出試薬のマルチプレックス化に特に適している。したがって、各々、異なるペプチドまたはタンパク質に特異的に結合することができるいくつかの抗体またはリガンドを該タンパク質チップの異なる領域に結合させ得る。次に、該チップを用いた生物学的試料の解析により、対象となる多数のタンパク質、またはＫＡＲＩタンパク質の多数のＢ細胞エピトープを検出することができる。診断および予後マーカーのマルチプレックス化は、本発明において特に意図される。
【０２５６】
さらなる実施形態では、試料を、本質的に米国特許出願第２００２００７６７３９号に記載されているような、ＩＣＡＴまたはＩＴＲＡＣを用いて解析する。この系は、１つの源（すなわち、健康個体）由来のタンパク質試料を試薬で標識することと、別の源（すなわち、結核患者）由来のタンパク質試料を、第１の試薬と化学的に同一であるが、同位体組成のために質量が異なる第２の試薬で標識することとに基づく。第１の試薬および第２の試薬がビオチン分子を含むことも好ましい。次に、等濃度の２つの試料を混合し、アビジン親和性クロマトグラフィーでペプチドを回収する。次に、試料を質量分析を用いて解析する。重いペプチドイオンと軽いペプチドイオンの間のピーク高さの差は、生物学的試料中のタンパク質存在量の差と直接相関する。次に、このようなタンパク質の正体を、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、またはＥＳＩなどの当技術分野で周知の方法を用いて、決定し得る。
【０２５７】
特に好ましい実施形態では、抗ＫＡＲＩタンパク質抗体、またはあるいはＫＡＲＩタンパク質もしくはその免疫原性断片を含む生物学的試料を２次元ゲル電気泳動にかける。この実施形態によって、電気泳動の前に、例えば、遠心分離、濾過、または遠心分離と濾過の組合せなどによって、特定の粒状物質を試料から取り除くことが好ましい。次に、生物学的試料中のタンパク質を分離する。例えば、タンパク質を、等電点フォーカシングを用いてその電荷によって、および／またはその分子量によって分離し得る。よく似た分子量を有するタンパク質もその電荷によって分離されるので、２次元分離によって、タンパク質の様々なアイソフォームの同定が可能になる。質量分析を用いて、対象となるタンパク質が患者試料中に存在するかどうかを決定することが可能である。
【０２５８】
他のアッセイフォーマットとしては、例えば、固相ＥＬＩＳＡ、フロースルーイムノアッセイフォーマット、ラテラルフローフォーマット、キャピラリーフォーマット、および免疫原性タンパク質、ペプチド、断片の精製または単離用のフォーマット（例えば、抗体、プロテインＧまたはプロテインＡにコンジュゲートした固体マトリックスを用いるもの）が挙げられる。抗体に基づくまたは抗原に基づくアッセイで用いられる好適なアッセイフォーマットはＡＵ２００８９０２６１１号に記載されている。
【０２５９】
他の組合せ検査
本明細書に記載されたような補助的な抗原に基づく検査および／または抗体に基づく検査を伴うまたは伴わない本発明のｉｌｖＣ核酸に基づく検査を結核または結核と関連する状態を診断するための１以上の標準的な検査と組み合わせる。
【０２６０】
一実施例では、標準的な検査は、例えば、初期診断を確認するためにおよび／または関連している特定病原体を示すために、例えば、臨床試料中の結核菌または結核菌群の他の生物の存在を検出することによって、結核を診断するための培養検査である。一実施例では、培養検査によって、別のマイコバクテリア病原体ではなく、臨床試料中の結核菌の存在が確認される。別の実施例では、培養検査によって、対象から得られた臨床検体中に存在する結核菌または他のマイコバクテリア病原体の株が確認される。臨床試料中の結核菌または結核菌群の他の生物の存在を検出するために利用可能な任意の既知の培養検査を使用し得ることが明白であろう。例えば、製造元の標準的なプロトコルに従ってＭＧＩＴ−９６０システム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で培養することを利用し得る。
【０２６１】
本明細書中の任意の実施形態によって記載されているようなｉｌｖＣ−ＮＡＡ診断および予後診断アッセイは、結核診断用の標準的な培養検査と組み合わせたときに、培養検査のみ（例えば、ＭＧＩＴのみ）よりも早く短期培養に対する結果を出すのに有用である場合がある。この実施例では、例えば、ＭＧＩＴシステムで試料を培養し、培養試料に対してｉｌｖＣ−ＮＡＡを行なう。プライマーを本明細書に記載したように標識して、検出可能な終点、例えば、ＭＧＩＴシステムで検出可能な比色終点を生じさせる。この実施例では、陽性結果を得るために必要な培養時間は約３日〜４週間；または約１〜２週間；または約１週間；または約５日；または約３日；または約１日であることが好ましい。
【０２６２】
別の実施例では、標準的な検査は塗抹検査である。
【０２６３】
別の実施例では、標準的な検査は、対象から得られた臨床試料中の結核菌群の１以上の生物における薬剤耐性（ＭＤＲ）および広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ）の１以上の既知のマーカーの存在を検出するための検査である。臨床試料中の結核菌または結核菌群の他の生物の１以上のＭＤＲまたはＸＤＲの存在を検出するために利用可能な任意の既知の検査を使用し得ることが明白であろう。例えば、リファンピシン（ＲＩＦ）、イソニアジド（ＩＮＨ）、およびストレプトマイシン（ＳＴＲ）に対する薬剤耐性と関連する突然変異を検出するための既知のライン−プローブアッセイを使用し得る。使用し得る市販のライン−プローブアッセイの例としては、限定するものではないが、ＩＮＮＯ−ＬｉＰＡ  Ｒｉｆ．ＴＢキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＮＶ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびＧｅｎｏＴｙｐｅ  Ｍ．ＴＢＤＲ  ｐｌｕｓ（Ｈａｉｎ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃ  ＧｍｂＨ，Ｎｅｈｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられる。
【０２６４】
生物学的試料および参照試料
ｉ．検査試料
好ましくは、本明細書に記載されているような任意の実施形態による生物学的試料は、肺、肺と関連するリンパ系組織、副鼻腔、気管支、細気管支、肺胞、気道の線毛粘膜上皮、気道の粘膜上皮、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）、肺胞被覆液、喀痰、粘液、唾液、血液、血清、血漿、尿、腹水、心膜液、胸水、気道の扁平上皮細胞、肥満細胞、杯細胞、肺細胞（１型または２型）、上皮内樹状細胞、ＰＢＭＣ、好中球、単球、または該組織、体液または細胞のいずれか１つもしくは複数の任意の免疫グロブリン含有画分からなる群から選択される試料である。
【０２６５】
一実施形態では、生物学的試料は事前に対象から得られている。
【０２６６】
好ましくは、試料が得られた対象は、結核を患っていることまたは結核菌が感染していることおよび／または結核を発症する危険に曝されていることおよび／または結核菌が感染する危険に曝されていることが疑われる。
【０２６７】
一実施形態では、生物学的試料は、手術または他の切除方法、体液（例えば、高張食塩水またはプロピレングリコールの吸引）、気管支肺胞洗浄、気管支鏡検査、ガラス管、サリベット（ｓａｌｉｖｅｔｔｅ）（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  ＡＧ，Ｓｅｖｅｌｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、オラ−シュア（Ｏｒａ−ｓｕｒｅ）（Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、オムニ−サル（ｏｍｎｉ−ｓａｌ）（Ｓａｌｉｖａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を用いた唾液採取、および当技術分野で周知の任意の方法を用いた（例えば、注射器を用いた）血液採取からなる群から選択される方法によって対象から得られる。
【０２６８】
生物学的試料は、例えば、Ｇｅｒｓｈｍａｎ，Ｎ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，１０（４）：３２２−３２８，１９９９に記載されている方法を用いて、患者の肺から単離された喀痰であることが特に好ましい。喀痰は、喀出されたもの、すなわち、自然に咳で吐き出されたものであることが好ましい。
【０２６９】
別の好ましい実施形態では、生物学的試料は、当技術分野で周知の方法を用いて患者から採取された血液から単離された血漿である。
【０２７０】
２．参照試料
明らかなように、本発明によって提供される診断および予後診断方法は、ある程度の定量化を行なって、感染または疾患の診断または予後診断となるＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のいずれかの量を決定することによってさらに容易になり得る。このような定量化は、適当な参照試料を本明細書に記載のアッセイに含めることによって決定することができ、その場合、該参照試料は、健康なまたは正常な個体に由来する。
【０２７１】
一実施形態では、参照試料は、例えば、以前にまたは最近感染したことがなく、かつ感染または疾患を患っていない健康対象由来の細胞、体液または組織を含む。このような参照試料は、それを得るために外科的な切除または介入を必要としない体液または組織由来のものであることが好都合である。したがって、体液およびその派生物が好ましい。極めて好ましい参照試料は、喀痰、粘液、唾液、血液、血清、血漿、尿、ＢＡＬ液、腹水、心膜液、胸水、ＰＢＭＣ、好中球、単球、または該組織、体液もしくは細胞のいずれか１つまたは複数の任意の免疫グロブリン含有画分を含む。
【０２７２】
参照試料および検査試料（すなわち患者試料）を処理し、解析またはアッセイし、参照試料および検査試料について得られたデータを比較する。一実施形態では、参照試料および検査試料を処理し、同時に解析またはアッセイする。別の実施形態では、参照試料および検査試料を処理し、別のときに解析またはアッセイする。
【０２７３】
代わりの実施形態では、参照試料をアッセイに含めない。その代わりに、参照試料を、事前に作成された確立されたデータセットから得てもよい。したがって、一実施形態では、参照試料は、例えば、検定されている整数の健常な範囲についての統計的に有意なデータなどの、健康個体の試料集団試験に由来するデータを含む。次に、検査試料の処理、解析またはアッセイから得られたデータを試料集団について得られたデータと比較する。
【０２７４】
集団を代表するものとなるように十分に大きい数の参照試料から得られたデータは、特定のパラメータの平均レベルを決定するためのデータセットの作成を可能にする。したがって、単独または感染もしくは疾患の診断もしくは予後診断となるタンパク質の量と組み合わせた核酸の量を、任意の個体集団について、および該個体から得られた任意の試料について決定し、その後、アッセイされている試料について決定された発現産物のレベルと比較することができる。このような正規化されたデータセットに基づく場合は、ばらつきを調整するために行なわれる各々のアッセイに内部対照を含めることが好ましい。
【０２７５】
ＮＡＡに基づくアッセイ用の試料調製
当技術分野で公知の、または生物学的試料から核酸を抽出するための市販のプロトコルとして公知の任意の方法が、本発明の方法での使用に好適であることが明白であろう。例えば、トータルＲＮＡは、市販の試薬、例えば、Ｔｒｉｚｏｌ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、またはＤＮＡおよびＲＮＡ抽出用の市販のキット、例えば、  Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＲＮＡ（商標）  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｋｉｔ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ａ  Ｇ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｄ  Ｅ）；ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて、製造元のプロトコルに従って抽出し得る。
【０２７６】
併用アッセイフォーマットの抗原および／または抗体に基づくアッセイ用の試料調製
一実施形態では、生物学的試料を処理して、該試料中の細胞を溶解させる。このような方法には、とりわけ、洗剤、酵素の使用、該細胞の凍結と解凍の反復、超音波処理またはガラスビーズ存在下での該細胞のボルテックス処理が含まれる。
【０２７７】
別の実施形態では、生物学的試料を処理して、該試料中に存在するタンパク質を変性させる。タンパク質を変性させる方法は、試料を加熱すること、試料を２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−アセチルシステイン、洗剤または例えば、グアニジニウムもしくは尿素などの他の化合物で処理することを含む。例えば、喀痰の液状化にはＤＴＴの使用が好ましい。
【０２７８】
さらに別の実施形態では、生物学的試料を処理して、該試料中のタンパク質を濃縮する。タンパク質を濃縮する方法は、沈殿、フリーズドライ、漏斗管ゲルの使用（ＴｅｒＢｕｓｈ  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｃｋ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１０（３）；１９９９）、限外濾過または透析を含む。
【０２７９】
結核または結核菌感染を検出するための診断／予後診断方法
本発明は、対象における結核または結核菌による感染を診断する方法であって、該対象由来の生物学的試料において、生物学的試料中に存在する結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上のｉｌｖＣ核酸を検出することを含み、ここで、試料中の該ｉｌｖＣ核酸の検出は感染を示す、方法を提供する。
【０２８０】
例えば、他のＮＡＡに基づく検査ではなく、ｉｌｖＣ遺伝子の発現に基づいて、ｉｌｖＣ核酸を検出する１つの利点は、それが、他の手段で検出されない可能性がある抗原レベルを反映すること、およびｉｌｖＣ遺伝子の産物であるＫＡＲＩタンパク質は、桿菌の産物であり、その存在を検出する直接的な方法であるので、桿菌量を反映するはずであることである。例えば、抗体に基づくアッセイと比較した別の利点は、重度の免疫低下患者が検出可能なレベルで抗体を産生しない可能性があり、任意の患者における抗体のレベルが桿菌量を反映しないことである。例えば、ＤＮＡ検出を用いる他のＮＡＡに基づく検査に優るさらなる利点は、本発明の方法がｍＲＮＡ転写産物レベル（これもまた活動性感染の存在を反映する）を検出する手段を提供することである。
【０２８１】
別の実施形態では、本発明のＮＡＡに基づく診断アッセイは、対象における結核または結核菌による感染の進行を決定するのに有用である。本発明のこれらの予後診断用途において、生物学的試料におけるｉｌｖＣ遺伝子（例えば、ｉｌｖＣ転写産物）の発現のレベルは、感染状態と正に相関する。例えば、結核または感染の症状を患っている対象において検出可能なｉｌｖＣ転写産物のレベルよりも低いｉｌｖＣ転写産物のレベルは、対象が感染から回復していることを示す。同様に、健康個体と比較した、対象由来の試料におけるｉｌｖＣ転写産物より高いレベルは、対象が疾患または感染から脱しきれていないことを示す。
【０２８２】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、結核または結核菌による感染を有する対象の、該結核または感染のための治療的化合物による治療に対する応答を決定するための方法であって、該対象由来の生物学的試料中のｉｌｖＣ転写産物を検出することを含み、ここで、正常または健康対象において検出可能なそのタンパク質または断片またはエピトープのレベルと比較して亢進しているｉｌｖＣ転写産物のレベルは、対象が該治療に応答していないかまたは疾患もしくは感染から脱しきれていないことを示す、方法を提供する。
【０２８３】
代わりの実施形態では、本発明は、結核または結核菌による感染を有する対象の、該結核または感染のための治療的化合物による治療に対する応答を決定するための方法であって、該対象由来の生物学的試料中のｉｌｖＣ転写産物を検出することを含み、ここで、ｉｌｖＣ転写産物のレベルが、結核または結核菌による感染を患っている対象において検出可能なタンパク質または断片またはエピトープのレベルよりも低いことは、対象が該治療に応答しているかまたは疾患もしくは感染から脱したことを示す、方法を提供する。ｉｌｖＣ転写産物のレベルが対象において検出されない場合、対象は治療に応答していることは明確である。
【０２８４】
さらなる実施形態では、患者由来の生物学的試料中のｉｌｖＣ転写産物の量を、同じ患者から以前に得られた生物学的試料中で検出される同じｉｌｖＣ転写産物の量と比較する。当業者には明白であるように、この方法を用いて、潜伏感染を有する患者または結核を発症した患者を継続的にモニタリングし得る。この方法で、特に、ＨＩＶ＋個体で感染が確立する前に治療を開始する目的で患者を感染もしくは疾患の発症または進行についてモニタリングし得る。
【０２８５】
あるいは、またはさらに、結核を有する対象に由来する生物学的試料中で検出されるｉｌｖＣ転写産物の量を参照試料と比較し得、ここで、この参照試料は、感染もしくは疾患を患っていない１以上の結核患者またはあるいは、成功した感染治療を最近受けた１以上の結核患者および／または結核を有しておらず、かつ感染または疾患を患っていない１以上の対象に由来している。
【０２８６】
一実施形態では、ｉｌｖＣ転写産物は参照試料中で検出されないが、該ｉｌｖＣ転写産物は患者試料中で検出され、試料が得られた患者が、結核もしくは結核菌による感染を患っているかまたは急性感染を発症していることが示す。
【０２８７】
あるいは、ｉｌｖＣ転写産物の量は、参照試料中で検出されたレベルと比較して、患者試料中で亢進している場合がある。この場合も、これは、結核もしくは結核菌による感染を患っているかまたは急性感染を発症していることを示す。
【０２８８】
本明細書に記載の診断／予後診断方法の一実施形態では、生物学的試料は事前に対象から得られている。このような実施形態によって、予後診断または診断方法をエクスビボで行なう。
【０２８９】
さらに別の実施形態では、対象となる診断／予後診断方法は、対象由来の試料を処理して、検体（例えば、胸水または喀痰または血清）を含む派生物または抽出物を生成させることをさらに含む。
【０２９０】
好適な試料としては、脳、胸部、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉および骨組織などの組織、または喀痰、血清、血漿、全血、血清もしくは胸水などの体液由来の抽出物が挙げられる。
【０２９１】
好ましくは、生物学的試料は、唾液、血漿、血液、血清、喀痰、尿、および肺からなる群から選択される体液または組織試料である。他の試料を除外するものではない。
【０２９２】
実際、本明細書中の任意の実施形態によるｉｌｖＣ−ＮＡＡに基づくアッセイは、結核菌群の生物（例えば、対象由来の生物学的試料中の結核菌）による過去もしくは現在の（すなわち、活動性の）感染または潜伏感染を検出するのに有用であり、ここで、該感染は、結核菌群の細菌のいずれか１種または複数種のＫＡＲＩタンパク質をコードする核酸の存在によって決定される。過去の感染は、例えば、血液または尿などの試料中の核酸の検出によって決定され得る。急性感染は、例えば、喀痰、または気管支洗浄試料などの試料中で検出可能である。過去の感染は、例えば、血液または尿などの試料中の核酸の検出によって決定され、かつ喀痰試料と比較され得、その場合、喀痰試料中の陰性の検出および血清中の陽性の検出は、過去の感染を示す可能性がある。この実施例は、結核菌群の細菌（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）のＫＡＲＩタンパク質をコードする複数の核酸の同定を明確に包含する。
【０２９３】
１以上のｉｌｖＣ−ＮＡＡに基づくアッセイはまた、例えば、喀痰、および気管支洗浄試料を使用することによって、肺結核を診断する手段を提供する。１以上のｉｌｖＣ−ＮＡＡに基づく検査はまた、例えば、血液、血清、血清の画分など、または尿試料を使用することによって、肺外結核を診断する手段を提供する。
【０２９４】
好ましい実施形態では、対象は、結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を患っていることが疑われる、および／または対象は、結核を発症する危険に曝されているかもしくは該１以上のマイコバクテリア（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）によって感染される危険に曝されている。
【０２９５】
結核または結核菌群の１以上のマイコバクテリアによる感染を患っていることが疑われる対象は、結核またはそのような感染の１以上の症状、例えば、発熱、喀痰を伴う咳、喀血（喀痰中の血液）、胸痛、寝汗、体重減少、不快感、空洞形成（ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）および／または肺の結節の石灰化を示す。結核またはそのような感染を患っていることが疑われる対象は、例えば、結核を患っている人と接触してしまったことによって、結核菌群の１種または複数種の細菌（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）に曝露された可能性がある。
【０２９６】
結核を発症する危険に曝されている対象とは、結核を発症する危険性を増大させる状態に曝露されているかまたは結核を発症する危険性を増大させる状態を患っているかまたは結核菌群の１以上の細菌によって感染されている対象であり、そのような対象は、結核を患っている人と接触したことがある対象、結核が普及しているおよび／またはその原因因子が流行している国または地域（例えば、南アフリカ）に旅行したことがある対象、病院または看護施設で働いている対象、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に感染した対象、コルチコステロイドを使用している対象、免疫が低下しているかまたは免疫が抑制されている対象、珪肺症を患っている対象または結核菌群の１以上のマイコバクテリア（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）による潜伏感染を患っている対象である。
【０２９７】
本明細書で使用される場合、「感染」という用語は、対象の気道における、微生物の侵入および／またはコロニー形成および／または微生物（特に、細菌またはウイルス）の増殖を意味することが理解されるものとする。このような感染は、はっきり見えないかまたは局所的な細胞損傷をもたらす可能性がある。感染は、限局性、無症候性および一過性であり得るか、またはあるいは広がって、急性もしくは慢性の臨床感染になり得る。感染はまた、過去の感染でもあり得、その場合、ｉｌｖＣに由来するおよび／またはｉｌｖＣからコードされる残存核酸は宿主内に留まる。感染はまた、潜伏感染であり得、その場合、微生物は対象内に存在するが、対象は、生物と関連する疾患の症状を示さない。好ましくは、感染は、結核菌による肺感染または肺外感染であり、より好ましくは、肺外感染である。「肺」感染とは、肺の気道の感染、例えば、肺組織、気管支、細気管支、呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢、または肺胞の感染を意味する。「肺外」とは、肺の外側を意味し、例えば、腎臓、リンパ液、尿路、骨、皮膚、脊髄液、腸、腹膜腔、胸膜腔および心膜腔を包含する。
【０２９８】
本明細書中の任意の実施形態によるｉｌｖＣ−ＮＡＡに基づくアッセイは、免疫が低下していない対象（例えば、ＨＩＶ陰性対象）に有用であり、このアッセイはまた、免疫が低下しているかまたは免疫不全である対象、例えば、ヒト免疫不全ウイルスに感染した（すなわち、「ＨＩＶ＋」の）対象中のＴＢを検出するのに特に有用である。このようなアッセイを行なうのに用いられる試料は、例えば、（ｉ）脳、胸部、卵巣、肺、結腸、膵臓、精巣、肝臓、筋肉、骨からなる群から選択される組織由来の抽出物およびそれらの混合物；（ｉｉ）喀痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸水からなる群から選択される体液およびそれらの混合物；ならびに（ｉｉｉ）喀痰、血清、血漿、全血、唾液、尿、胸水からなる群から選択される体液に由来する試料およびそれらの混合物を含む。
【０２９９】
本明細書中の任意の実施形態によるｉｌｖＣ−ＮＡＡに基づくアッセイは、結核菌群の細菌もしくは結核菌群の細菌により感染した細胞の同定または該細菌もしくは該細胞の選別もしくは計数に有用である。この実施例は、結核菌群の複数の細菌（例えば、結核菌および／またはウシ型結核菌および／またはＭ．アフリカヌムおよび／またはＭ．カネッティおよび／またはネズミ型結核菌）の同定を明確に包含する。
【実施例】
【０３００】
本発明は、これから、以下の実施例および／または図面によって説明されるが、これらは、限定的であることを決して意図するものではない。本明細書に記載された全ての参考文献の教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０１】
実施例１
試料の回収、処理、核酸の抽出、合成、および定量、抗体産生ならびにイムノアッセイ。
後の実施例、すなわち、実施例２（以下参照）における開示に従って、以下の一般的な方法を、試料の回収ならびに核酸の抽出、処理、合成、および定量に利用した。別法が、後の実施例（すなわち、実施例２（以下参照））で特に記載されない限り、本実施例に言及される方法が利用されている。後の実施例で言及されている方法は、その特定の実施例に関するものとみなすべきである。
【０３０２】
１．患者喀痰試料の回収
ＴＢ陰性およびＴＢ陽性の喀痰を用いて、場合によっては、後の実施例で記載されるようなＴＢ診断用の抗原に基づくアッセイと抗体に基づくアッセイとを用いて、プライマーペアを用いる核酸に基づくアッセイを評価した。２００７年に、８０の患者喀痰試料をカメルーンから集めた。試料をプロテアーゼ阻害剤で処理し、−３０℃で凍結させた。
【０３０３】
同様に、未処理の喀痰もまた、Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＆  ＣＯ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡから入手した。これらは、本明細書において、「喀痰−ＢＤ」と表されている。さらなる試料を別の場所（南アフリカのヨハネスブルグ、オーストラリア）から、およびタイのＨｅａｌｔｈ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄから集めた。
【０３０４】
２．喀痰の前処理
ａ）「喀痰−Ｍ１」
一実施例では、本明細書において「喀痰−Ｍ１」と表されている喀痰画分は、回収された喀痰を１：１（ｖ／ｖ）に希釈して、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の最終濃度１０ｍＭの、新鮮に作製されたジチオスレイトール（ＤＴＴ）となるようにすることによって調製した。ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃａｔ＃１８７３５８０）を製造元または供給元の説明書に従って適宜添加し、最終的な１：４（ｖ／ｖ）の喀痰希釈液を得た。試料を、約３０秒間のボルテックス処理によって撹拌した後、大幅な細胞溶解を避けるように気を付けて、オービタルシェーカーまたは穏やかなボルテックス処理を用いて、４℃で約３０間混合した。次に、液状化した喀痰を２，０００×ｇにて４℃で約１０分間遠心分離して、細胞をペレット化し、不溶性物質を除去した。上清を１４，０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離して、微粒子物質をペレット化する。上清を取り除き、０．２μｍの孔径のＧＤ／Ｘ  ＰＶＤＦ滅菌フィルターを用いて濾過し、濾過液を保持し、−２０℃で凍結保存する。
【０３０５】
ｂ）「喀痰−Ｃ１」
さらなる実施例では、本明細書において「喀痰−Ｃ１」と表されている喀痰画分は、回収された喀痰を１：１（ｖ／ｖ）に希釈して、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の最終濃度１０ｍＭの、新鮮に作製されたジチオスレイトール（ＤＴＴ）となるようにすることによって調製する。ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤カクテル錠（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃａｔ＃１８７３５８０）を製造元または供給元の説明書に従って適宜添加し、最終的な１：２（ｖ／ｖ）の喀痰希釈液を得る。試料を、約３０秒間のボルテックス処理によって撹拌した後、大幅な細胞溶解を避けるように気を付けて、オービタルシェーカーまたは穏やかなボルテックス処理を用いて、４℃で約３０間混合する。次に、液状化した喀痰を２，０００×ｇにて４℃で約１０分間遠心分離して、細胞をペレット化し、不溶性物質を除去する。上清を１４，０００×ｇにて４℃で１０分間遠心分離して、微粒子物質をペレット化する。上清を取り除き、濾過しないで−２０℃で凍結保存する。
【０３０６】
３．イムノアッセイ用の凍結喀痰の処理
４つの別の処理を利用して、本明細書で上に記載されたように調製された凍結された前処理済み喀痰をさらに処理した。
【０３０７】
ａ）方法１
本明細書で上に記載されたように調製された喀痰−Ｍ１（２．５ｍＬ）は、約０．６ｍＬの未希釈（「ニート」）喀痰と等価である。この例示的な方法では、喀痰−Ｍ１は、１７×１５０μＬの置換物を用いる置換ＥＬＩＳＡでアッセイするために、さらには処理されない。
【０３０８】
ｂ）方法２
上記のように調製された喀痰−Ｃ１（１．８ｍＬ）は、０．９ｍＬの未希釈（「ニート」）喀痰と等価である。この例示的な方法では、喀痰−Ｃ１を、４×１５０μＬの置換物を用いる置換ＥＬＩＳＡでアッセイするために、アセトン沈殿で０．６ｍＬの容量にまで減らす。特に、喀痰−Ｃ１を遠心分離して、不溶性物質を除去し、上清を新しいチューブに移し、４容量の冷アセトンを添加し、試料を−８０℃で３０分間インキュベートし、その後、それらを４，０００×ｇにて４℃で３０分間遠心分離して、沈殿したタンパク質画分を回収する。タンパク質ペレットを保持し、約３０分間風乾させ、０．６ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２に穏やかに再溶解させる。
【０３０９】
ｃ）方法３
上記のように調製された喀痰−Ｃ１（９ｍＬ）は、４．５ｍＬの未希釈（「ニート」）喀痰と等価である。この例示的な方法では、喀痰−Ｃ１をサイズ分画し、脱塩し、４×１５０μＬの置換物を用いる置換ＥＬＩＳＡでアッセイするために、約０．６ｍＬの容量にする。簡潔に述べると、凍結喀痰−Ｃ１を解凍し、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡの最終濃度に調整し、４ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加する。試料を４，０００×ｇにて周囲温度で２０分間遠心分離して、不溶性物質をペレット化する。上清を保持し、新しいチューブに移し、等量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２に希釈し、１００ｋＤａ  ＭＷカットオフのサイズ排除スピンカラムに適用し、４，０００×ｇにて周囲温度で２５分間遠心分離する。溶出物を保持し、５ｋＤａＭＷカットオフのサイズ排除スピンカラムに移し、４，０００×ｇ（周囲温度）で少なくとも約６０分間または約０．６ｍＬの溶出物が回収されるまで遠心分離する。試料容量を、上記のような置換ＥＬＩＳＡでアッセイするために５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いて約０．６２ｍＬに調整する。
【０３１０】
ｄ）方法４
上記のように調製された喀痰−Ｍ１（１８ｍＬ）は、４．５ｍＬの未希釈（「ニート」）喀痰と等価である。この例示的な実施例では、喀痰をサイズ分画し、脱塩し、４×１５０μＬの置換物を用いる置換ＥＬＩＳＡでアッセイするために、約０．６ｍＬの容量にする。簡潔に述べると、凍結喀痰−Ｍ１を解凍し、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡの最終濃度に調整し、４ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加する。試料を４，０００×ｇにて周囲温度で２０分間遠心分離して、不溶性物質をペレット化する。上清を保持し、新しいチューブに移し、等量の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２に希釈し、１００ｋＤａ  ＭＷカットオフのサイズ排除スピンカラムに適用し、４，０００×ｇにて周囲温度で２５分間遠心分離する。溶出物を保持し、５ｋＤａ  ＭＷカットオフのサイズ排除スピンカラムに移し、４，０００×ｇ（周囲温度）で少なくとも約６０分間または約０．６ｍＬの溶出物が回収されるまで遠心分離する。試料容量を、上記のような置換ＥＬＩＳＡでアッセイするために５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を用いて約０．６２ｍＬに調整する。
【０３１１】
４．培養結核菌からのＤＮＡ抽出
結核菌細胞を破壊緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．６％ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫ）にて５０℃で１２時間インキュベートし、ビーズによる打撃（ｂｅａｄｂｅａｔｉｎｇ）で破壊した。細胞ライセートを遠心分離して、破片を除去し、ＤＮＡをフェノール−クロロホルムを用いて上清から抽出し、イソプロパノール中で一晩沈殿させた。ペレットを７５％エタノールで洗浄し、水に再懸濁した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＤＮＡの質と量を決定した。後に、このＤＮＡをプライマー検査とＰＣＲに用いて、標準曲線を構築した。
【０３１２】
５．喀痰からのＲＮＡ抽出
２００または５００マイクロリットル（５００μｌ）の喀痰試料を、５０ｍｇ／ｍｌのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＬＣ）を含む１．３％クエン酸ナトリウムに再懸濁した。２容量のＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し、試料をビーズによる打撃で３０秒間ホモジナイズした。ＲＮＡを含む水性相を２００μｌのクロロホルムで抽出し、１３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ＲＮＡを氷冷イソプロパノール中で一晩沈殿させた。ペレットを７５％ＥｔＯＨで２回洗浄した後、ＲＮＡをＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。試料をＴｕｒｂｏ  ＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理し、Ｔｒｉｚｏｌで再度抽出した。１６Ｓ  ＰＣＲを行なって、ＤＮＡを含まない調製物であることを確認し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、トータルＲＮＡ濃度を測定した。細胞懸濁物からＲＮＡを抽出するために、１ｍｌのＴｒｉｚｏｌを２５０μｌの凍結細胞（１．９×１０９  細胞／ｍｌ）に添加した。本明細書におけるプロトコルは次の通りであった。
【０３１３】
６．ｃＤＮＡ合成
ランダムｃＤＮＡ合成キット（Ｍａｒｌｉｇｅｎ）を用いてトータルｃＤＮＡを調製した。喀痰由来の最大５００ｎｇのＲＮＡを逆転写し、反応条件は、２２℃で５分間、４２℃で２時間、および８５℃で５分間であった。最大２．５μｌのｃＤＮＡをその後のリアルタイム解析で用いた。
【０３１４】
７．定量的リアルタイムＰＣＲ
対象となる標的用の特異的プライマーセットを本明細書中の実施例２に記載されているように設計した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をハウスキーパーとして選んだ。転写産物レベルをＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ３０００システム（Ｃｏｒｂｅｔｔ）を用いるｑＲＴ−ＰＣＲで定量した。２μｌのｃＤＮＡ、１２．５μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲスーパーミックスＵＤＧキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５μｌのＲＯＸ参照色素、１０ｐｍｏｌの各プライマーおよびＤＥＰＣ処理水（最終容量２５μｌまで）を含む、３つ複製した反応液を用意した。シグナルが得られない試料については、過剰量の鋳型による阻害がないことを確認するために、１００ｎｇのｃＤＮＡを用いて反応を繰り返した。最初に６０℃、５分間および９５℃、５分間で保持し、次いで９５℃、１５秒間および６０℃、３０秒間の４０サイクルで、２段階サイクリングを行なった。Ｂｓｘ検出については、６３℃のアニーリングおよび伸長温度を用いた。
【０３１５】
８．定量的リアルタイムＰＣＲ用の標準曲線作成
Ｗｈｅｌａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｎ．Ｂ．Ｒｕｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｗｈｅｌａｎ．  Ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００３）２７８：２６１−２６９（その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を用いて、絶対定量を行なった。簡潔に述べると、結核菌ゲノムＤＮＡを、各プライマーセットのＰＣＲ鋳型として用いた。この産物をエタノール沈殿させ、ＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。上記のようなリアルタイムＰＣＲ反応で連続希釈液を用い、その結果を用いて標準曲線を構築した。回帰線をフィッティングし、得られた方程式を用いて、転写産物レベル（単位はコピー／μｇ  ｃＤＮＡ）を計算した。
【０３１６】
９．塗抹状態のグレーディング
抗酸菌感染の重症度を推定するために、喀痰標本を、Ｒｅｖｉｓｅｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ（Ｃｅｎｔｒａｌ  ＴＢ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｄｅｌｈｉ：Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｃｉａｎｓ，ＤＧＨＳ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｆａｍｉｌｙ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｍａｙ  １９９９）の指針の通りに、およびＳｅｌｖａｋｕｍａｒ  Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  １２４：ｐｐ  ４３９−４４２（Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００６）に記載の通りに、チール・ネルゼン（Ｚｉｅｈｌ  Ｎｅｅｌｓｅｎ）染色および当技術分野で許容されている従来法による塗抹のグレーディングにも供した（これらの文献は両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。喀痰試料の連続希釈液（最大１０６倍の希釈液）を、最大５つの複製セットを作って調製した。各希釈液（喀痰顕微鏡検査状態）中の細菌量の範囲は、３＋から陰性であり、これは感染の重症度を示す。
【０３１７】
１０．喀痰、血清または血漿からのＩｇＧ画分の調製
患者の喀痰、血清または血漿を８．２ｍｌのＩｍｍｕｎｅ−ｐｕｒｅ  ＩｇＧ結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）に希釈し、その後、０．２２μｍフィルターに通して濾過した後、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に接続したプロテインＡカラムに適用した。結合した抗体を、Ｉｍｍｕｎｅ−ｐｕｒｅ  ｇｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて溶出した。溶出画分（抗原に結合したＩｇＧ）をプールし、氷上に３時間放置して、免疫複合体を解離させた。その後、ＩｇＧ画分を１００，０００分子量カットオフカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通して濾過することにより、抗原画分から分離した。プロテインＡカラムからの画分とフロースルーの両方を、ベンゾイル化した透析膜（Ｓｉｇｍａ）を用いて４リットルのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）に対して４℃で一晩、その後、さらに４リットルで３時間透析した。全ての画分（１００，０００カットオフカラムからのフロースルーおよび残留物とプロテインＡカラムからのフロースルー）を、アセトン１０部：試料１部の比で、−２０℃で１時間アセトン沈殿させ、その後、４０００ｇで２０分間スピンした。沈殿した試料を、５Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、２％ＳＢ３−１０および４０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む試料緩衝液中で可溶化して約２ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした後、５ｍＭトリブチルホスフィンで還元し、１０ｍＭアクリルアミドで１．５時間アルキル化した。ＤＴＴを１０ｍＭの最終濃度まで添加して、アルキル化反応をクエンチングした。試料を２００μｌのアリコートに分けて、−２０℃で保存した。
【０３１８】
１１．診断アッセイ用の結核菌ＫＡＲＩ抗原の選択
抗原に基づく診断アッセイ用の結核菌抗原を選択する主な基準は、簡単な診断検査を提供するＴＢ陽性喀痰の存在と免疫原性である。以下の段落に記載するように、候補抗原をＴＢ陽性喀痰中で同定した。
【０３１９】
ａ）タンパク質含有量の決定
試料のタンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて推定した。ＩＰＧストリップを再水和する前に、試料を２１０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、１ｍｌ当たり１０μｌの１％Ｏｒａｎｇｅ  Ｇ（Ｓｉｇｍａ）を指示色素として添加した。
【０３２０】
ｂ）２次元ゲル電気泳動
１次元
乾燥した１１ｃｍのＩＰＧストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を１８０μｌのタンパク質試料で１６〜２４時間再水和する。再水和したストリップを、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＥＦ  Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）またはＰｒｏｔｅｏｍｅ  ＳｙｓｔｅｍのＩｓｏＥｌｅｃｔｒＩＱ電気泳動装置で、最大１０ｋＶで、約１４０ｋＶ時間フォーカシングした。その後、フォーカシングしたストリップを、尿素／ＳＤＳ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ブロモフェノールブルー緩衝液中で平衡化した。
【０３２１】
ｃ）２次元
平衡化したストリップを６〜１５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｓ−アセテートＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャスト１０ｃｍ×１５ｃｍ  ＧｅｌＣｈｉｐｓ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｙｄｎｅｙ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）のローディングウェルに挿入した。ゲル当たり５０ｍＡで、１．５時間か、または追跡用色素がゲルの底部に到達するまで、電気泳動を行なった。残留物画分またはフロースルー画分由来のタンパク質を、ＳｙｐｒｏＲｕｂｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて染色した。抽出物画分由来のタンパク質を、Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏら（Ａｎａｌ  Ｃｈｅｔｎ．６８（５）：８５０−８，１９９６）のプロトコルに従って、銀を用いて染色した。Ａｌｐｈａｌｍａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．）を用いて脱染した後、ゲル画像をスキャンした。次に、その後の解析におけるタンパク質スポットの可視化を補助するために、クマシーＧ−２５０を用いてゲルを染色した。
【０３２２】
ｄ）質量分析：
質量分析の前に、タンパク質試料をゲル内トリプシン消化により調製した。切出し／液体処理ロボット（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｄｚｕ−Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）であるＸｃｉｓｅ（商標）を、Ｍｏｎｔａｇｅゲル内消化キット（Ｔｙｒｉａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａ，０１８２１，ＵＳＡによって開発された）と関連させて用いて、タンパク質ゲル片を切り出し、脱染し、消化し、脱塩した。一定のサイズを維持し、乾燥を防ぐために、スポットを切断する前に、２−Ｄゲルを水の中でインキュベートした。その後、２−ＤゲルをＸｃｉｓｅ上に置き、デジタル画像を撮影し、切断するスポットを選択した。自動でスポットを切り出した後、ゲル片を自動液体処理とゲル内消化に供した。簡潔に述べると、各スポットを、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム中の１００μｌの５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを用いて脱染した。１００％アセトニトリルを添加してゲル片を乾燥させ、アセトニトリルを５秒後に除去し、残りのアセトニトリルを３７℃で蒸発させて、ゲルを完全に乾燥させた。乾燥したゲル片を、５μｇ／ｍＬの修飾ブタトリプシンを含む３０μｌの５０ｍＭ  炭酸水素アンモニウム（ｐＨ７．８）で再水和して、タンパク質分解による消化を行ない、３７℃で一晩インキュベートした。
【０３２３】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳによるさらなる解析が必要である場合には、１０マイクロリットル（１０μｌ）のトリプシン消化ペプチド混合物をきれいなマイクロタイタープレートに取り出した。
【０３２４】
トリプシン消化ペプチドを自動的に脱塩および濃縮した後、Ｒ２に基づくクロマトグラフィーを用いてＭＡＬＤＩ  ＭＳを行なった。吸着したペプチドを先端から９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．０８５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ中の２ｍｇ／ｍｌのα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を２μｌ用いて、３８４ポジションＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ試料標的プレート（Ｋｒａｔｏｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫまたはＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｒｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に溶出させた。
【０３２５】
陽イオンレフレクトロンモードでＡｘｉｍａ−ＣＦＲ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ質量分析計（Ｋｒａｔｏｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いて消化物を解析した。３３７ｎｍの波長の窒素レーザーを用いて試料に照射した。各試料スポットに６４ポイントラスターを適用して、質量範囲６００Ｄａ〜４０００Ｄａの自動モードでスペクトルを獲得した。特定の基準を通過するスペクトルのみを確保した。全てのスペクトルに対して、自己消化トリプシンピーク質量、ｍ／ｚ８４２．５１Ｄａとスパイクした副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）ペプチド、ｍ／ｚ２４６５．１１７Ｄａとを用いて、内部二点較正を行った。ウェブベースのプロテオミック・データ・マネージメント・システム・バイオインインフォーマットＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔＩＱ（商標）（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に含まれる、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓによって設計されたソフトウェアを用いて、ＭＳスペクトルから同位体ピークを抽出した。
【０３２６】
タンパク質同定は、ＩｏｎＩＱまたはＭＡＳＣＯＴデータベース検索ソフトウェア（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｎｏｒｔｈ  Ｒｙｄｅ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてトリプシン消化ペプチドのモノアイソトピック質量（すなわち、ペプチド質量フィンガープリント）をタンパク質データベースからの理論質量とマッチングすることにより実施した。クエリーは非冗長ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ（リリース４０）およびＴｒＥＭＢＬ（リリース２０）データベース（２００２年６月バージョン）に対して行い、ＭＯＷＳＥスコアリングシステムを改変することによって、タンパク質の正体をランク付けした。プロピオンアミド−システイン（ｃｙｓ−ＰＡＭ）またはカルボキシアミドメチル−システイン（ｃｙｓ−ＣＡＭ）および酸化メチオニン修飾を考慮し、１００ｐｐｍの質量許容度を認めた。
【０３２７】
誤切断部位は、誤切断を含まない最初の検索が行なわれた後に初めて考慮された。以下の基準：ＭＯＷＳＥスコア、候補タンパク質とマッチするペプチドの数および強度、マッチングペプチドによる候補タンパク質配列のカバレージならびにゲル位置、を用いて検索結果を評価した。
【０３２８】
さらに、またはあるいは、タンパク質をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて解析した。タンパク質のトリプシン消化溶液（１０μｌ）を、オートサンプラーとポンプから構成されたＳｕｒｖｅｙｏｒ  ＬＣシステムを備えたＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いるナノフローＬＣ／ＭＳによって解析した。ペプチドは、Ｃ１８  ＰｉｃｏＦｒｉｔカラム（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に連結させたＰｅｐＦｉｎｄｅｒキット（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を用いて分離した。３０〜６０分間かけて、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有する水（移動相Ａ）から０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含む９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（移動相Ｂ）への勾配溶出を行った。質量分析計は、３回のスキャン事象、すなわち、１回のフルスキャン（４００〜２０００ａｍｕの範囲）と、それに続く２回のデータ依存ＭＳ／ＭＳスキャンを獲得するよう設定した。
【０３２９】
ｅ）バイオインフォマティック解析：
マススペクトルピークの自動回収後、データを以下の通りに処理した。全てのスペクトルを、ペプチド質量の正確な較正についてまずチェックした。次に、スペクトルを処理して、トリプシンピークとマトリックスに対応する質量を含むバックグラウンドノイズを除去した。次に、データを、Ｔｙｒｉａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ検索エンジンＩｏｎＩＱ  ｖ６９および／またはＭＡＳＣＯＴを用いて、公的に利用可能なＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＴｒＥＭＢＬデータベースに対して検索した。ＰＳＤデータを、自家製の検索エンジンＦｒａｇｍｅｎｔａｓｔＩＱを用いて、同じデータベースに対して検索した。ＬＣ  ＭＳ−ＭＳデータについても、ＳＥＱＵＥＳＴ検索エンジンソフトウェアを用いてデータベースを検索する。
【０３３０】
１２．診断アッセイ用の結核菌抗原および抗体の検証
候補となる診断マーカーおよび抗体の検証は、本明細書で以下に記載するような増幅ＥＬＩＳＡ系を用いて、Ｈ３７Ｒｖと命名された結核菌の実験株の培養物に由来する全細胞ライセート（ＷＣＬ）、ならびにＣＳＵ９３およびＨＮ８７８と命名された２つの結核菌臨床株の培養物に由来する全細胞ライセート（ＷＣＬ）における対応する内在性抗原の存在を決定することにより行なわれた。全細胞から採取された細胞培養上清の濾過液も利用した。３つ全ての株で検出可能な抗原および抗体を選択してさらに検証した。
【０３３１】
候補となる診断マーカーおよび抗体の検証はまた、本明細書で以下に記載するような増幅ＥＬＩＳＡ系を用いて、非マイコバクテリア生物（例えば、大腸菌、枯草菌および緑膿菌）の培養物に由来する全細胞ライセート（ＷＣＬ）における対応する内在性抗原の特異的発現を決定することにより行なわれた。全細胞ライセートの濾過液も利用した。結核菌で特異的に検出される抗原および抗体が好ましかった。
【０３３２】
候補となる診断マーカーおよび抗体の検証はまた、本明細書で以下に記載するような増幅ＥＬＩＳＡ系を用いて、Ｈ３７Ｒｖと命名された結核菌の実験株の培養物に由来する全細胞ライセート（ＷＣＬ）における対応する内在性抗原の特異的発現を他のマイコバクテリア種（例えば、Ｍ．アウィウムおよびＭ．イントラセルラーレ）における発現と対照させて決定することにより行なわれた。全細胞培養物由来の上清の濾過液も利用した。結核菌で特定の抗体によって特異的に検出される抗原が好ましかったが、Ｍ．アウィウムおよび／またはＭ．イントラセルラーレで発現される抗原も廃棄しなかった。これは、試料中の任意のマイコバクテリアを検査する診断検査には、一次的な包括的アッセイとしての有用性があり、これを、例えば、本明細書に開示されているような特異的診断マーカーおよび／または結核菌の存在もしくは不在を決定する培養検査を利用する、結核菌の種特異的検査と組み合わせて利用することができるからである。
【０３３３】
１３．全細胞ライセートの調製
タンパク質を凍結乾燥した結核菌細胞から抽出した。細胞を抽出緩衝液に再懸濁し、ビーズミル中で処理して細胞を破裂させ、タンパク質を放出させた。細胞破片を遠心分離でペレット化し、上清を全細胞ライセート（ＷＣＬ）として用いた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ式比色アッセイを行ない、タンパク質濃度を推定した。場合によっては、コロラド州立大学から得られた細胞質抽出物を用いた。
【０３３４】
１４．抗体産生方法
後の実施例に記載されるように同定された結核菌の特定の免疫原性タンパク質に由来する合成免疫原性ペプチドによる免疫化によるか、またはあるいは、結核菌の全長免疫原性タンパク質もしくは標準的な手順を用いる組換え手段で産生された結核菌免疫原性タンパク質の免疫原性断片による免疫化によって抗体を調製した。組換えタンパク質または断片を産生するために、免疫原をコードする結核菌株Ｈ３７ＲｖのＤＮＡ配列を単離し、大腸菌での発現用の好適なベクターにクローニングし、発現されたタンパク質または断片を標準的なクロマトグラフィー技術で精製した。
【０３３５】
１５．抗体選択基準
好ましい検出限界（ＬＯＤ）が、例えば、単一部位ＥＬＩＳＡにおいて組換え抗原１ｍＬ当たり約１００ｎｇ未満および／または増幅２部位ＥＬＩＳＡにおいて組換え抗原１ｍＬ当たり約５００ｐｇ未満であるＥＬＩＳＡでの免疫原に対するその感度および特異性に基づいて、抗体を選択した。
【０３３６】
結核菌培養物中の結核菌抗原を検出し、他のマイコバクテリア種または非マイコバクテリア病原体に対してはほとんどまたは全く交差反応性を示さない抗体も選択した。
【０３３７】
抗体を最初に、１部位ＥＬＩＳＡを用いて、各々の場合の免疫原に対する反応性によってスクリーニングした。当業者であれば、１部位ＥＬＩＳＡが、固体基板の表面に結合した未標識の組換え免疫原と、標識検出抗体（例えば、コロイド金またはビオチンなどの検出可能マーカーにコンジュゲートされた抗体）とを必要とし、その場合、検出抗体は、固定化された抗原に含まれる標的抗原上のエピトープに特異的に結合することを知っている。検出抗体は、免疫原が固体基板に固定化され、検出抗体上の標識の結合によって間接的に標識されるように、固定化された免疫原に結合する。
【０３３８】
あるいは、またはさらに、２部位検査において検査抗体と対を成すべき抗体が利用可能な場合に限り、２部位ＥＬＩＳＡを行なう。２部位ＥＬＩＳＡは、固体基板の表面に結合した未標識の捕捉抗体と、標識検出抗体（例えば、コロイド金またはビオチンなどの検出可能マーカーにコンジュゲートされた抗体）とを必要とし、その場合、捕捉抗体と検出抗体は両方とも、標的抗原上の異なるまたは不干渉エピトープにではあるが、標的抗原に特異的に結合する。抗原が検査試料中に存在する場合、検出抗体と捕捉抗体は、抗原が固体基板に固定化され、検出抗体上の標識の結合によって間接的に標識されるように、抗原を「サンドイッチする」。
【０３３９】
通常、２部位ＥＬＩＳＡにおけるＬＯＤが約５００ｐｇ／ｍｌ未満の抗体については、ウェスタンブロット（ＷＢ）免疫電気泳動を行ない、組換えタンパク質および全細胞ライセート中に存在する予想される分子量の内在性結核菌タンパク質に対する抗体の特異性を確認した。簡潔に述べると、組換えタンパク質および全細胞ライセートを、製造元の説明書に従ってＭＯＰＳまたはＭＥＳ緩衝液系を用いて、１次元ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（１０％ポリアクリルアミドＮｕ−ＰＡＧＥゲル）上で、電気泳動により分離した。分離したタンパク質を、セミドライ式の電気ブロッティングシステムを用いて、ゲルからＰＶＤＦメンブレンに転写した。次に、メンブレンを、対応する抗原に対する一次抗体、次いで標準的な手順に従って用いられる抗体プローブに結合することができるＨＲＰコンジュゲート二次抗体でプロービングした。次に、特異的シグナルを化学発光検出系によって可視化し、画像をＸ線フィルムを用いた後に、スキャニングして取得するか、またはＦｕｊｉ−ＬＡＳ−３０００イメージャーを用いて処理したメンブレンから直接画像を取得した。検査される各々の抗原について、最適なシグナル対ノイズ比をもたらすために必要な一次抗体および二次抗体の希釈に関してウェスタンブロット条件を最適化した（データは示さない）。レプリカのブロットを一次抗体および二次抗体（陽性対照）または二次抗体のみ（陰性対照）でプロービングした。
【０３４０】
これらのウェスタンのデータを競合実験によって確認した。この競合実験では、一次抗体をウェスタンブロットを行なう前にモル過剰の組換え免疫原と溶液中でプレインキュベートし、それにより、分離されたタンパク質上のエピトープと競合させた。したがって、ウェスタンブロッティングでのシグナルの喪失によって、抗体特異性に関する最初の結論が確認される。簡潔に述べると、一次抗体を１００〜２００モル過剰の対応する組換えタンパク質とプレインキュベートすることを除き、ウェスタンブロット解析を前述の段落に記載したように行なった。ブロットを通常の方法でプロービングした。
【０３４１】
１６．抗体ペアの選択
抗体ペアを選択するために、前述の項に記載した抗体選択基準を満たす利用可能な最も感度の高い抗体を用いて、２部位ＥＬＩＳＡを行なった。抗体ペアの選択に関して２部位ＥＬＩＳＡを行なう際に、本発明者らは、検出抗体および捕捉抗体としての両方の構成において抗体候補を利用し、それにより捕捉抗体および検出抗体の最適な構成を決定した。一般に、検出抗体は、検査される各々の捕捉抗体濃度についての組換え免疫原の力価に対して様々な希釈で利用した。この目的のために好ましい検出抗体は、ポリＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを用いて検出可能なビオチン化抗体である。ビオチン化検出抗体が利用可能でない場合、好ましい検出抗体は、（ｉ）ビオチン化二次抗体（例えば、抗ウサギＩｇまたは抗ニワトリＩｇまたは抗マウスＩｇ）が検出抗体に、そして（ｉｉ）ポリＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンがこの結合したビオチン化二次抗体に順次結合することによって検出可能となる未標識の検出抗体を含む。
【０３４２】
１７．ＥＬＩＳＡフォーマット
ａ）１部位ＥＬＩＳＡ
ＮＵＮＣプレートを組換えタンパク質の連続希釈液でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキングした後、プレートを様々な希釈の検査抗体、次いでＨＲＰコンジュゲート二次抗体およびＴＭＢとともにインキュベートした。各反応液の容量は５０μｌであった。各添加と添加の間に、プレートを洗浄した。発色の目視検査に基づく適当な時間（通常、約３０分）の後、０．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加して免疫反応を停止させ、４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーにてＯＤを読み取った。
【０３４３】
得られたデータをマイクロソフトエクセルにエクスポートし、そこに、データ解析のために、ΔＯＤ（ＯＤ４５０〜６２０）（ＯＤと呼ぶ）を記録した。アッセイの感度を下記のように決定し、ＬＯＤＡｂＴと表した。約１００ｎｇ／ｍＬ未満のＬＯＤＡｂＴを有する抗体を、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける捕捉抗体かまたは検出抗体かのいずれかとしての好適性についてさらに検査した。
【０３４４】
ｂ）標準的な２部位または「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡ
例えば、捕捉抗体かまたは検出抗体かのいずれかとしての好適性を決定するために、選択された抗体ペアを用いて標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを行なった。ＮＵＮＣ免疫プレートを様々な希釈の捕捉抗体でコーティングした後、関連する組換えタンパク質または検査免疫原を含む濾過液の全細胞ライセート、および様々な希釈の検出抗体、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体およびＳＩＧＭＡ  ＴＭＢとともに順次インキュベートした。各反応液の容量は５０μｌであった。各添加と添加の間に、プレートを洗浄した。発色の目視検査に基づく適当な時間（通常、約３０分）の後、０．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加して免疫反応を停止させ、４５０ｎｍと６２０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーにてＯＤを読み取った。
【０３４５】
得られたデータを、解析のためにマイクロソフトエクセルにエクスポートした。アッセイの感度を下記のように決定し、ＬＯＤと表した。最も低いＬＯＤスコア（例えば、約３ｎｇ／ｍＬ未満）をもたらす抗体ペアを選択し、増幅サンドイッチＥＬＩＳＡでさらに最適化した。
【０３４６】
ｃ）増幅サンドイッチＥＬＩＳＡ
増幅サンドイッチＥＬＩＳＡを、プレートをビオチン化検出抗体とともにインキュベートするか、または検出抗体、次いでビオチン化二次抗体とともにインキュベートすることを除き、本明細書で上に記載したような標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡのように行ない、同じ手順で解析した。５０〜２００μｌの様々な希釈のポリ８０−ＨＲＰ−ストレプトアビジン、次いで５０〜２００μｌのＰｉｅｒｃｅ  ＴＭＢを添加して、増幅を達成した。最も低いＬＯＤスコア（例えば、約５００ｐｇ／ｍｌ未満）をもたらす抗体ペアを選択した。
【０３４７】
ｄ）ＥＬＩＳＡデータ解析
ＥＬＩＳＡデータを、解析のためにマイクロソフトエクセルにエクスポートした。標準曲線を、平均ＯＤ＋ＳＤ（ＯＤ＝ＯＤ４５０ｎｍ−ＯＤ６２０ｎｍ）がＹ軸上に、組換えタンパク質／ペプチド濃度（例えば、ｐｇ／ｍｌ）がＸ軸（対数目盛）上にあるＸ−Ｙグラフを用いてプロットした。変動係数（平均で割った標準偏差として計算され、パーセント（ＣＶ％）として表される）をアッセイ内のばらつきおよびアッセイ間のばらつきの尺度として用いた。
【０３４８】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、４−パラメータのロジスティック曲線を標準曲線データ点に対してフィッティングした。作成された曲線にＯＤ値を内挿して、未知試料の抗原濃度を決定した。
【０３４９】
ｅ）検出限界（ＬＯＤ）値の決定
好適な較正曲線が利用可能な２部位「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおける抗体ペアの検出限界（ＬＯＤ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで利用可能な関数を用いて、平均ベースライン値＋３×ＳＤに等しいＯＤ値を生じる免疫原の濃度と定義した。１部位ＥＬＩＳＡの場合、または較正曲線が利用可能でないサンドイッチＥＬＩＳＡの場合、抗体または抗体ペアのＬＯＤは、マイクロソフトエクセルを用いて推定した。解析されている各々の免疫原性タンパク質について、ＥＬＩＳＡ用量応答曲線からの光学密度データを用いてＬＯＤ値を計算した。
【０３５０】
１部位ＥＬＩＳＡの場合
ソフトウェアが非線形回帰曲線フィット関数を適用するにはデータ点が不十分である１部位ＥＬＩＳＡデータまたは２部位ＥＬＩＳＡデータの場合、ＬＯＤの推定値をＥｘｃｅｌで得た。用量応答曲線のベースラインの開始およびベースライン平均ＯＤ＋３×ＳＤを以下のように決定した。所与の免疫原濃度の光学密度とその次に高い免疫原濃度との間の差として計算される光学密度の増分を決定した。光学密度の増分が約０．０５ＯＤ単位未満のデータ点をベースラインの開始とみなした。みなしベースライン開始点およびその次の２つの増分点における複製試料の平均値およびＳＤ光学密度値を用いて、そのシリーズについての平均＋３×ＳＤを計算した。平均ベースラインＯＤ＋３×ＳＤよりも大きい光学密度をもたらした免疫原の濃度をＬＯＤ値とみなした。
【０３５１】
サンドイッチＥＬＩＳＡの場合
１つのアプローチでは、組換えタンパク質／ペプチド免疫原の濃度（すなわち、「ｌｏｇ１０［免疫原］」値）およびサンドイッチＥＬＩＳＡから得られた反復光学密度値を、生のＥＬＩＳＡデータから必要なデータを自動的に計算するように作成されたＥｘｃｅｌワークシートテンプレートに移した。Ｒ２値を標準曲線の適合度の推定値として生成し、約０．９９よりも大きい値を良好なフィットとして許容した。９９％信頼区間（ＣＩ）値範囲も計算した。フィッティングした曲線の下の漸近線（ｂｏｔｔｏｍ  ａｓｙｍｐｔｏｔｅ）の範囲における最大値を、フィッティングした標準曲線から内挿した。内挿された値は、対数変換されていない場合、平均ベースライン値＋３×ＳＤに等しいＯＤ値を有する組換えタンパク質濃度に相当した。ＬＯＤ値と呼ばれるその値を、ＥＬＩＳＡの感度を示すものとみなした。
【０３５２】
あるいは、ｌｏｇ１０［免疫原］および対応する反復光学密度値を、非線形回帰曲線フィット関数を用いて４−パラメータロジスティック曲線をデータ点にフィッティングするＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにエクスポートした。非線形回帰曲線フィット関数を用いて、シグモイド曲線をデータにフィッティングした。Ｒ２値を標準曲線の適合度の推定値として生成し、約０．９９よりも大きい値を良好なフィットとして許容した。９９％信頼区間（ＣＩ）値範囲も計算した。ベースライン平均光学密度（ＯＤ）＋３×ＳＤに対応する組換えタンパク質／ペプチド免疫原の濃度を標準曲線から内挿した。
【０３５３】
実施例２
定量的ＰＣＲを用いた臨床喀痰における活動性ＴＢ群の検出
第１セットの実験で、本発明者らは、結核または結核菌群の１以上の生物による感染を検出する手段として、結核菌群ＫＡＲＩタンパク質（配列番号１）をコードするｉｌｖＣバイオマーカー（配列番号２）を検出する定量的リアルタイムＰＣＲアッセイを開発しようとした。本発明者らはまた、得られた結果を塗抹状態のグレーディングによって示される感染の重症度と相互に関連付け、かつｉｌｖＣバイオマーカーを検出するアッセイの感度を結核菌群の１以上の生物の他のバイオマーカーの検出と比較しようとした。アッセイされる他のバイオマーカーには、結核菌ＢＳＸタンパク質（配列番号３）、結核菌Ｒｖ１２６５タンパク質（配列番号５）および結核菌  Ｓ９タンパク質（配列番号７）をコードする核酸（配列番号４、６、８および２８）が含まれた。１６Ｓ  ｒＲＮＡマーカー（配列番号２７）もまた含まれた。対象となる標的のための特異的プライマーを本明細書に記載したように設計した。これを表１に記載する。
【０３５４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子をハウスキーピング遺伝子として選んだ。１６Ｓ  ｒＲＮＡプライマーは、結核菌群の生物に特異的ではなく、いくつかの他のマイコバクテリア属の１種を検出し得る。しかしながら、マイコバクテリアの部類の中で結核菌群に特異性を示すｉｌｖＣプライマーの特異性を解析した。次に、プライマーおよび１２６塩基対の増幅産物をスクリーニングし、ＮＣＢＩで入手可能な９４０種の細菌、４８種の古細菌、および１６２種の真核生物のゲノムツリー全体でＢＬＡＳＴ検索を行なうことにより特異性を保証した。検索を行ない、データベース情報を記録した。これらのデータ（図示せず）により、結核菌群全体での１００％の相同性が示され、顕著な相同性を示す他のマイコバクテリアはなかった。これらのデータにより、これらのプライマーが結核菌群のマイコバクテリアに特異的であり、本質的にマイコバクテリアまたは他の細菌に特異的であるというわけではないことが確認された。ヒトゲノムデータベースに対する同様の検索もヒットを示さなかった。
【表１】
2016005470.tif 000006
【０３５５】
１．標準曲線
結核菌ゲノムＤＮＡを実施例１に記載したようにＰＣＲ鋳型として用いて、表１に記載の各プライマーセットについての標準曲線を計算した。これを図１に示す。図１に示す標準曲線を用いて、ｃＤＮＡ  １μｇ当たりの転写産物コピーの量を計算した。この曲線は、９．７×１０９転写産物コピー（約１μｇの標的ＤＮＡ）までは線形であった。
【０３５６】
２．定量的リアルタイムＰＣＲアッセイおよび塗抹状態のグレーディング
設計されたプライマーを用いて、２つの臨床集団（すなわち、カメルーンと米国）の全体で試料のコホートをスクリーニングした。実施例１に記載したような対象から回収した１３のＴＢ陰性およびＴＢ陽性喀痰試料を用いて、プライマーペアを用いる核酸に基づくアッセイを評価した。トータルＲＮＡを試料から抽出し、ｃＤＮＡを合成し、実施例１に記載したような定量的リアルタイムＰＣＲで用いた。喀痰試料を、実施例１に記載したような、当技術分野で許容された従来の方法に従って、塗抹状態のグレーディングにも供した。ｉｌｖＣおよび１６Ｓ  ｒＲＮＡのリアルタイムＰＣＲを用いて喀痰試料について得られた結果と、１３の試料についての塗抹のグレーディングの結果とを以下の表２および図２０に示す。
【表２】
2016005470.tif 000007
【０３５７】
値は転写産物コピー／μｇ  ｃＤＮＡと表す。ＮＤは、喀痰試料から抽出された最大量のトータルＲＮＡ（５００ｎｇ）をｃＤＮＡ合成に用いたときに、標的／ｉｌｖＣまたは１６Ｓ  ｒＲＮＡ転写産物が喀痰試料で検出されなかったことを表す。感染の重症度と相関させたときに、各試料の塗抹状態のグレーディングの範囲が陰性（ｎｅｇ）から３＋であったことも示す。このコホートでは、データは、１００％の感度と、ｉｌｖＣ転写産物検出に対する８８％の特異性とを示す。さらに、ｉｌｖＣ発現のレベルは塗抹のグレーディングと相関した。さらなる試料をこのコホート内で解析した。ｉｌｖＣ発現のレベルを１６ｒＲＮＡの発現とともに決定し、図２１に示すように塗抹状態に対してプロットした。これらのデータは、ｉｌｖＣ核酸の検出が、この実施例では、ＰＣＲによる１６Ｓ  ｒＲＮＡ検出よりも１５〜２０倍感度が高いことを示す。さらに、データは、ｉｌｖＣ転写産物が臨床試料中で比較的安定な状態であることを示す。
【０３５８】
３．臨床試料における結核菌群核酸のリアルタイムＰＣＲ
次に、３つのさらなる試料（「スパイク１」、「１１６スパイク」および「４４３６スパイク」）を結核菌細胞が添加される解析に含め、ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成およびリアルタイムＰＣＲを上記のように行なった。全ての試料をｉｌｖＣならびに１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ＢＳＸ、Ｓ９およびＲｖ１２６５についてリアルタイムＰＣＲでアッセイした。得られた結果を下の表３に示す。
【０３５９】
リアルタイムＰＣＲアッセイによるｉｌｖＣ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ＢＳＸ、Ｓ９、Ｒｖ１２６５の検出の比較は、転写産物レベルは例外的に低い（２６８コピー／細胞の１６Ｓ転写産物と比較して、結核菌培養物では０．０１コピー／細胞）にもかかわらず、ｉｌｖＣ転写産物の検出が最も信頼性が高いことを示した。対照的に、他の３つのバイオマーカー（ＢＳＸ、Ｓ９およびＲｖ１２６５）のシグナルは、最高可能量の核酸を反応で用いたときに、非常に低くて、喀痰中のこれらの転写産物を定量することができなかった。現在のＲＴ−ＰＣＲアッセイが喀痰中のＢＳＸ、Ｓ９およびＲｖ１２６５を検出することができないのは、それぞれの転写産物の量が比較的少ないこと、および／または試料中のＲＮアーゼの作用によって試料が分解されることおよび夾雑宿主ＲＮＡが大量にあることが原因である可能性がある。
【０３６０】
ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成工程を妨害した可能性のある喀痰中の阻害因子の存在を推定するために、全ての試料に結核菌の細胞懸濁物をスパイクした。いくつかの試料（４９８４７、タイ１４３、ｍｐｃ３７９、ｍｐｃ３５９）は、スパイクされたとき、より少ない数の１６Ｓ転写産物を有することが分かり、阻害によって正確な定量が妨げられることが示唆された。スパイキングから得た結果を解釈するときの主な難しさは、試料中の夾雑ＲＮＡ（特に、宿主細胞）の寄与分が計り知れないことであり、これが、１６Ｓのレベルに大きなばらつきがある理由である。
【０３６１】
参照１６Ｓ遺伝子およびｉｌｖＣについてのＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られた結果を表３に示す。１６Ｓは、結核菌特異的でも結核菌群特異的でもなく、Ｍ．アウィウム、Ｍ．アウィウム亜種、パラ結核およびＭ．イントラセルラーレをはじめとする、いくつかの他のマイコバクテリア種を検出することに留意すべきである。それゆえ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、報告された塗抹結果を問わず、全ての試料について検出された。
【０３６２】
値は転写産物コピー／μｇ  ｃＤＮＡと表す。ＮＤは、喀痰試料から抽出された最大量のトータルＲＮＡ（５００ｎｇ）をｃＤＮＡ合成に用いたときに、標的／ｉｌｖＣ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ＢＳＸ、Ｓ９、またはＲｖ１２６５転写産物が喀痰試料で検出されなかったことを表す。
【０３６３】
本明細書に示す結果に基づいて、本発明者らは、例えば、結核菌群の１以上の生物による感染と相関させることができ、かつｉｌｖＣ標的転写産物核酸の検出に基づく、臨床試料中の結核菌群を検出するリアルタイムＰＣＲを用いた、核酸増幅に基づくアッセイを提供する。本発明者らは、対象試料（例えば、喀痰)におけるｉｌｖＣ転写産物コピーの量が多いために、ｉｌｖＣが、結核菌群の１以上の生物による感染の有利な標的バイオマーカーを提供することを本明細書で示している。結核菌群の他の標的遺伝子（例えば、ＢＳＸ、Ｓ９、Ｒｖ１２６５）のＲＮＡ転写産物の増幅は、おそらくは、感染生物の細胞におけるこれらの遺伝子転写産物コピー数の量が少ないために、検出が難しい可能性がある。
【表３】
2016005470.tif 000008
【０３６４】
ＢＳＸ、Ｓ９およびＲｖ１２６５をコードする増幅された核酸の検出が、結核菌群におけるｉｌｖＣ核酸の増幅の検出よりも難しい可能性があるにもかかわらず、本明細書に記載のｉｌｖＣ増幅は、結核菌Ｒｖ１２６５および／または結核菌ＢＳＸ、および／または結核菌Ｓ９および／または本明細書に記載の結核菌および／またはＥＦ−Ｔｕタンパク質および／または結核菌Ｐ５ＣＲタンパク質および／または結核菌ＴｅｔＲ様タンパク質および／またはグルタミン合成酵素タンパク質ならびにそれらの組合せをコードする核酸に対する１組以上のプライマーであって、検査した他のマイコバクテリアに対する交差反応性が低いプライマーと同時にまたは連続的に利用し得る。このような多検体検査の解釈において、ｉｌｖＣ核酸の検出は、臨床試料における結核菌群の存在を示し、結核菌Ｒｖ１２６５および／または結核菌ＢＳＸ、および／または結核菌Ｓ９および／または結核菌および／またはＥＦ−Ｔｕタンパク質および／または結核菌Ｐ５ＣＲタンパク質および／または結核菌ＴｅｔＲ様タンパク質および／またはグルタミン合成酵素タンパク質ならびにそれらの組合せをコードする核酸のさらなる検出は、結核菌または結核菌群感染のより大きな可能性を示す。
【０３６５】
あるいは、またはさらに、本明細書に記載のｉｌｖＣ−ＮＡＡは、本明細書で実施例３（以下参照）に記載されているようなｉｌｖＣによってコードされるＫＡＲＩタンパク質に対する抗体を用いた抗原に基づくアッセイと同時にまたは連続的に利用し得る。あるいは、またはさらに、このようなアッセイはまた、本明細書に記載したように、ｉｌｖＣまたはその断片によってコードされる単離されたＫＡＲＩタンパク質またはその断片を用いて、臨床試料中のリガンドまたはＫＡＲＩに対する抗体を検出するリガンドに基づくアッセイと同時にまたは連続的に利用し得る。
【０３６６】
要約すると、本明細書におけるデータは、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、検査した全ての喀痰試料において結核菌ＲＮＡまたは結核菌群ＲＮＡが検出され得るが、ｉｌｖＣは、その転写産物の安定性のために、ＲＴ−ＰＣＲによる定量に最も相応しい好ましいバイオマーカーであり、アッセイにおけるばらつきは、わずかな割合（例えば、検査した試料の約７％）の阻害化合物（例えば、非結核菌群宿主および共生細菌のＲＮＡ）の存在やＲＮＡ分解から生じ得ることを示す。
【０３６７】
実施例３
結核菌ケトール−酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）に結合する抗体を用いた結核または結核菌による感染の抗原に基づく診断
【０３６８】
１．ＴＢ陽性対象におけるＫＡＲＩタンパク質の同定
約３６ｋＤａの分子量を有するタンパク質がＴＢ＋試料中に認められた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータからの１０ペプチドの配列は、配列番号１に示す結核菌のｉｌｖＣ遺伝子によってコードされる配列と一致した。これらの１０ペプチドによる配列番号１のカバーレージパーセントは約３７％であり、このペプチド断片がこの同じタンパク質マーカーに由来することが示唆された。
【０３６９】
配列番号１に示すアミノ酸配列を有する同定されたタンパク質は、推定上のケトール−酸レダクトイソメラーゼであり、これを「ＫＡＲＩ」と命名した。
【０３７０】
２．抗体
本明細書に記載の手順を用いて、結核菌のｉｌｖＣ遺伝子（配列番号２）によってコードされる組換えＫＡＲＩタンパク質に対して抗体を調製した。１０種の抗体を産生し、実施例１に記載したように、その好適性についてスクリーニングした。このプロセスにより、「Ｍｏ１２８３Ｆ」と命名された好ましい捕捉抗体としてのマウス由来抗体および「Ｃｈ３４／３５」と命名された好ましい検出抗体としてのニワトリ由来ポリクローナル抗体からなる、結核菌の診断用の抗体ペアが同定された。もう一方の方向性と抗体組合せを除外するものではない。
【０３７１】
３．診断試薬としてのＫＡＲＩおよびそれに対する抗体の検証
結核菌株Ｈ３７Ｒｖ由来のＫＡＲＩタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１として示す。この翻訳産物は、約３６ｋＤａの予想分子質量を有する。本質的に実施例１に記載したように行なわれた、ヘキサ−ヒスチジンタグ化ｒＫＡＲＩタンパク質の１次元ＳＤＳ／ＰＡＧＥ解析により、ＫＡＲＩタンパク質は、約３７ｋＤａ（これは、この翻訳産物とヘキサヒスチジンタグ部分の理論質量に基づく、融合タンパク質の予想質量である）の単一のバンドとして移動することが示された（データは示さない）。
【０３７２】
組換えＫＡＲＩタンパク質と、結核菌Ｈ３７Ｒｖ、結核菌ＣＳＵ９３および結核菌ＨＮ８７８の全細胞ライセート中の内在性ＫＡＲＩタンパク質とを検出するために、ＥＬＩＳＡ捕捉抗体（Ｍｏ１２８３Ｆ）と検出抗体（Ｃｈ３４／３５）を別々に用いて、ウェスタンブロット解析を行なった。両抗体とも、天然のＫＡＲＩタンパク質の予想分子質量（すなわち、約３６ｋＤａ）を有する、３つ全ての結核菌株に由来する全細胞ライセート中のバンドを認識しただけでなく、わずかにより大きい組換えＫＡＲＩタンパク質も検出した（データは示さない）。結合は、極めて特異的であり、バックグラウンドはほとんどなかった。それゆえ、利用可能なデータから、結核菌ＫＡＲＩタンパク質の検出に対する抗体Ｍｏ１２８３ＦとＣｈ３４／３５の特異性が確認される。
【０３７３】
本質的に実施例１に記載したように行なわれた競合ウェスタンブロット解析により、ポリクローナル抗体Ｃｈ３４／３５の組換えＫＡＲＩタンパク質および内在性ＫＡＲＩタンパク質への結合が、抗体と過剰濃度の未標識組換えＫＡＲＩタンパク質とのプレインキュベーションによって消失し得ることが示された（データは示さない）。
【０３７４】
要約すると、利用可能なデータから、抗体Ｍｏ１２８３ＦとＣｈ３４／３５抗体は、結核菌ＫＡＲＩタンパク質に特異的に結合することが示される。
【０３７５】
４．結核菌ＫＡＲＩタンパク質を検出するための増幅サンドイッチＥＬＩＳＡ
結合した検出抗体を検出するために、５μｇ／ｍＬのＭｏ１２８３Ｆ抗体を捕捉試薬として、２．５μｇ／ｍＬのＣｈ３４／３５ポリクローナル抗体を検出抗体として、かつビオチン化二次抗体をＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンとともに用いて、本質的に、この実施例と実施例１に記載されたように、増幅ＥＬＩＳＡを行なった。
【０３７６】
図２に示すデータは、検査したアッセイ条件下で、かつ必須ではないが、この好ましい抗体の方向性で、バックグラウンドノイズが低く、ＬＯＤが約１６９０ｐｇ／ｍｌであったことを示している。サンドイッチＥＬＩＳＡにおける低いバックグラウンドと合わせたこのような検出感度は、本発明者らにより有用な限度範囲内であるとみなされる。
【０３７７】
５．抗ＫＡＲＩ抗体と様々な結核菌分離株の交差反応性
生物学的試料における結核菌の存在の診断マーカーとしてのＫＡＲＩの好適性をさらに評価するために、およびＫＡＲＩタンパク質に対して調製された抗体の特性を評価するために、本発明者らは、臨床結核菌株ＣＳＵ９３およびＨ８７８と実験結核菌株Ｈ３７Ｒｖの細胞抽出物の間で、本明細書に上で記載したように行なわれた増幅サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて抗体反応性を比較した。
【０３７８】
簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体Ｍｏ１２８３Ｆで一晩コーティングした。洗浄して未結合抗体を除去した後、各分離株由来の細胞抽出物を抗体がコーティングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。各アッセイの陰性対照として、細胞抽出物を含まない緩衝液を用いた。１時間インキュベートし、洗浄して、未結合の抗原を除去した後、検出抗体Ｃｈ３４／３５を、結合した抗原抗体複合体と接触させた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、５０μｌの希釈した二次抗体（例えば、ビオチン化ロバ抗ニワトリＩｇＧおよびポリ４０ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート）とともに１時間インキュベートし、再び洗浄し、ＴＭＢとともに１０分間インキュベートし、４５０〜６２０ｎｍでの吸光度を測定した。試料を全細胞抽出液の３つの希釈物に対して２つ複製してアッセイした。標準化されたＫＡＲＩタンパク質のレベルに基づいて、較正標準曲線を作成した。
【０３７９】
図４に示すデータは、結核菌ＫＡＲＩタンパク質が、臨床結核菌分離株ＣＳＵ９３と実験株Ｈ３７Ｒｖの両方に同程度のレベルで存在することを示している。より低いレベルのＫＡＲＩタンパク質が結核菌Ｈ８７８で検出可能であったが、これは、ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体が、特定の結核菌臨床株を区別しない可能性があることを示唆している。
【０３８０】
図３に示すデータは、一般的な単一検体診断検査における、またはあるいは、特定の結核菌株（例えば、本明細書に記載のものまたは当技術分野で公知のもの）に対する抗体と組み合わせた多検体検査の一部としての、ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体の有用性を否定するものではない。
【０３８１】
例えば、ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体は、必要に応じて、試料中に存在する臨床的に意義のある株に関する情報を得るために、ＫＡＲＩ陽性臨床標本由来の結核菌の後から得られる培養物と組み合わせて利用し得る。
【０３８２】
６．異なるマイコバクテリア種間の交差反応性
生物学的試料における結核菌の存在の診断マーカーとしてのＫＡＲＩの好適性をさらに評価するために、およびＫＡＲＩタンパク質に対して調製された抗体の特性を評価するために、本発明者らは、マイコバクテリア種結核菌、Ｍ．アウィウム、およびＭ．イントラセルラーレの細胞抽出物の間で、本明細書に上で記載したように行なわれた増幅サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて抗体反応性を比較した。
【０３８３】
簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体Ｍｏ１２８３Ｆで一晩コーティングした。洗浄して未結合抗体を除去した後、各マイコバクテリア種由来の細胞抽出物を抗体がコーティングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。各アッセイの陰性対照として、細胞抽出物を含まない緩衝液を用いた。１時間インキュベートし、洗浄して、未結合の抗原を除去した後、検出抗体Ｃｈ３４／３５を、結合した抗原抗体複合体と接触させた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、５０μｌの希釈した二次抗体（例えば、ビオチン化ロバ抗ニワトリＩｇＧおよびポリ４０ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート）とともに１時間インキュベートし、再び洗浄し、ＴＭＢとともに１０分間インキュベートし、４５０〜６２０ｎｍでの吸光度を測定した。試料を全細胞抽出液の３つの希釈物に対して２つ複製してアッセイした。標準化されたＫＡＲＩタンパク質のレベルに基づいて、較正標準曲線を作成した。
【０３８４】
図４および５に示すデータは、この３つのマイコバクテリア種間での検出可能な交差反応性を示し、結核菌ＫＡＲＩタンパク質が、これらのアッセイ条件下でのまたは選択された抗体ペアを用いる結核菌の種特異的検出にあまり適していないことを示している。このことは、一般的な単一検体診断検査における、またはあるいは、結核菌の種特異的マーカー（例えば、本明細書に記載のものまたは当技術分野で公知のもの）に対する抗体と組み合わせた多検体検査の一部としての、ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体の有用性を否定するものではない。
【０３８５】
例えば、ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体は、ＫＡＲＩ陽性臨床標本由来の結核菌の後から得られる培養物と組み合わせて利用し得る。
【０３８６】
あるいは、またはさらに、ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体は、検査した他のマイコバクテリアとの交差反応性が低い、本明細書に記載したような結核菌Ｒｖ１２６５および／または結核菌ＢＳＸタンパク質および／または結核菌ＥＦ−Ｔｕおよび／または結核菌Ｓ９タンパク質に対する１以上の抗体と同時に利用し得る。このような多検体検査の解釈において、抗体のＫＡＲＩタンパク質への結合は、臨床試料におけるマイコバクテリアの存在を示し、かつ抗体の結核菌Ｒｖ１２６５および／または結核菌ＢＳＸタンパク質および／または結核菌ＥＦ−Ｔｕおよび／または結核菌Ｓ９タンパク質へのさらなる結合は、結核菌感染のより大きい可能性を示す。結核菌ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体と結核菌Ｒｖ１２６５タンパク質に対する１以上の抗体と結核菌ＢＳＸタンパク質に対する抗体の組合せは、Ｒｖ１２６５およびＢＳＸに対する抗体の、Ｍ．アウィウムおよびＭ．イントラセルラーレに対する低い交差反応性に基づいて、このような用途に特に好ましい。
【０３８７】
７．結核菌と非マイコバクテリア病原体の低い交差反応性
生物学的試料における結核菌の存在の診断マーカーとしてのＫＡＲＩの好適性をさらに評価するために、本発明者らは、結核菌株Ｈ３７Ｒｖ（実験株）、大腸菌、枯草菌または緑膿菌の細胞抽出物の間で行なわれた増幅サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて抗体交差反応性を比較した。
【０３８８】
簡潔に述べると、ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体Ｍｏ１２８３Ｆで一晩コーティングした。洗浄して未結合抗体を除去した後、各微生物由来の細胞抽出物を抗体がコーティングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。各アッセイの陰性対照として、細胞抽出物を含まない緩衝液を用いた。１時間インキュベートし、洗浄して、未結合の抗原を除去した後、検出抗体Ｃｈ３４／３５を、結合した抗原抗体複合体と接触させた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、５０μｌの二次抗体（すなわち、ビオチン化ロバ抗ニワトリＩｇＧおよびポリ４０ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート）とともに１時間インキュベートし、再び洗浄し、ＴＭＢとともに１０分間インキュベートし、４５０〜６２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０３８９】
図６に示すデータは、試験した条件下での結核菌ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体と大腸菌、枯草菌または緑膿菌細胞抽出物との大きな交差反応性を示さず、この抗体が、マイコバクテリア特異的検査の基礎を形成することを示している。
【０３９０】
８．臨床試料におけるＫＡＲＩタンパク質の検出
生物学的試料における結核菌の存在の診断マーカーとしてのＫＡＲＩの好適性をさらに評価するために、本発明者らは、塗抹検査と結核菌培養アッセイの結果に基づいて事前に診断を受けたＴＢ陽性対象から得られた臨床試料中の内在性ＫＡＲＩタンパク質を検出する抗体の能力を決定した。患者は、塗抹検査と培養検査の両方の結果、およびＨＩＶ状態に基づいて分類されていた。検査した対象は全て、塗抹陰性かつ培養陰性、またはあるいは、塗抹陽性かつ培養陽性であった。
【０３９１】
簡潔に述べると、本明細書で上に記載したように、喀痰試料に対してサンドイッチＥＬＩＳＡを行なった。この喀痰試料は、方法３で調製され、交換増幅プロトコル（下記参照）の下で１７×１５０マイクロリットルアリコートとしてアッセイされたものである。ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体Ｍｏ１２８３Ｆで一晩コーティングした。洗浄して未結合抗体を除去した後、処理した喀痰を抗体がコーティングされたＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。各アッセイの陰性対照として、緩衝液を用いた。１時間インキュベートし、洗浄して、未結合の抗原を除去した後、検出抗体Ｃｈ３４／３５を、結合した抗原抗体複合体と接触させた。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、５０μｌの二次抗体（すなわち、ビオチン化ロバ抗ニワトリＩｇＧおよびポリ４０ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート）とともに１時間インキュベートし、再び洗浄し、ＴＭＢとともに１０分間インキュベートし、４５０〜６２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０３９２】
図７および８に示すデータは、培養陽性かつ塗抹陽性であることが事前に示されていた検査した４つのＴＢ陽性試料のうちの少なくとも２つにおいて顕著に高いレベルのＫＡＲＩタンパク質が検出されたことを示している。対照的に、バックグラウンドシグナルは、全てのＴＢ陰性試料で検出された。
【０３９３】
９．試料によるシグナル阻害の評価
例えば、ＥＬＩＳＡまたはポイント・オブ・ケアフォーマットもしくは野外検査フォーマットにおいて、アッセイ感度に悪影響を及ぼし得る阻害性因子またはシグナル抑制因子が喀痰中に存在するかどうかを評価するために、喀痰試料に１０ｎｇ／ｍＬ組換え結核菌ＫＡＲＩタンパク質をスパイクし、得られた試料を３工程かけて２７分の１に連続希釈した。試料を一晩インキュベートし、本明細書で上に記載したような増幅ＥＬＩＳＡでアッセイしたか、またはすぐにアッセイした。
【０３９４】
図９および１０に示すデータ（「ｉｌｖＣ」と印が付けられた右下のパネル）は、アッセイがすぐに行なわれるかまたは一晩のインキュベーションの後に行なわれるかを問わず、シグナル強度が未希釈の喀痰を添加した後に低下するので、喀痰がＫＡＲＩタンパク質シグナル検出を阻害するいくつかの因子を含むことを示している。しかしながら、このシグナル強度の損失は、喀痰を希釈することにより段階的に阻害することができ、シグナル強度の損失は、喀痰を少なくとも約９分の１に希釈することによって大いに抑えられた。シグナル強度は、喀痰中で組換えタンパク質を一晩インキュベートした後にも減少し、このシグナル強度の損失もまた、喀痰試料の希釈によって部分的に抑えることができる。これらのデータは、喀痰をブロッキング緩衝液中に９分の１に希釈することと、試料を迅速にアッセイすることとが、これらの条件下でＫＡＲＩタンパク質をアッセイする際にシグナル強度を増強するのに推奨されることを示している。
【０３９５】
１０．マイコバクテリア細胞で検出可能なＫＡＲＩタンパク質の相対レベル
マイコバクテリア感染の診断マーカーとしてのＫＡＲＩの好適性をさらに評価するために、ＫＡＲＩタンパク質のレベルを、本明細書に記載のＢＳＸ、ＥＦ−Ｔｕ、Ｐ５ＣＲ、Ｒｖ１２６５、Ｓ９およびＴｅｔＲ様タンパク質を含む１０種の他の結核菌抗原と比べて、結核菌株Ｈ３７Ｒｖ、ＣＳＵ９３およびＨＮ８７８、ならびに結核菌、Ｍ．アウィウムおよびＭ．イントラセルラーレの全細胞ライセートで決定した。
【０３９６】
増幅サンドイッチＥＬＩＳＡを、この実施例および実施例１に本質的に記載されているように行ない、定量を可能にするために較正標準を含めて、標準的なプロトコルに従って、各抗原の相対レベルを同定した。
【０３９７】
図１１〜１２に示すデータは、ＫＡＲＩが、総細胞タンパク質ベースで表した場合、検査した３つ全ての結核菌株において比較的豊富なタンパク質であることを示している。これをもとにすると、結核菌Ｒｖ１２６５、ＢＳＸおよびＳ９タンパク質も、検査した１１種の免疫原性タンパク質の中で比較的豊富である。図１３〜１８に示すデータは、ＫＡＲＩタンパク質が、マイコバクテリア種一般においても比較的豊富なタンパク質であるのに対し、検査した他の主な免疫原性タンパク質、すなわち、ＢＳＸ、Ｒｖ１２６５およびＳ９は、細胞ベース（図１３〜１４）または全細胞ライセートタンパク質のマイクログラム当たり（図１５〜１６）または全細胞ライセート濾過液のマイクロリットル当たり（図１７〜１８）で表した場合、ＫＡＲＩと比較して、結核菌に対するより大きい特異性を有するように見えることを示している。これらのデータは、マイコバクテリア感染の一般的な単一検体マーカーとしての、またはＢＳＸおよび／またはＲｖ１２６５および／またはＳ９タンパク質と組み合わせたマイコバクテリア感染または結核菌感染の多検体検査の一部としてのＫＡＲＩの有用性を示唆している。結核菌感染の多検体検査のために、他の組合せを除外するものではない。
【０３９８】
１１．検出限界の最適化
サンドイッチＥＬＩＳＡ感度をさらに増強するために、交換増幅手順を用いて、捕捉抗体をＥＬＩＳＡプレートにコーティングした後の反復抗原結合を利用した。
【０３９９】
本質的には、これにより、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートの５０μｌという容量制限にもかかわらず、捕捉抗体に結合する抗原の量が増加する。簡潔に述べると、この反復抗原充填は、洗浄および検出抗体の添加の前に、サンドイッチＥＬＩＳＡの抗原結合工程を数回（例えば、２または３または４または５回など）繰り返すことを含む。当然、抗原試料の各アリコートは、標準的なインキュベーション期間の後、次のアリコートを添加する前に除去される。反復の回数は、過度の実験をすることなく、検査される試料の性質（例えば、試料の種類）に応じて、アッセイを最適化するように変更することができる（例えば、シグナル：ノイズ比、検出限界および半最大シグナルで検出される抗原の量などのパラメータ）。例えば、最大約２０回の試料充填の反復（すなわち、最大２０回の置換増幅）を利用して、低バックグラウンドシグナル、および結核菌ＫＡＲＩタンパク質の検出限界の低下をもたらすことができる。
【０４００】
実施例４
結核菌群に対するｉｌｖＣアッセイの相対的特異性
モノクローナル抗体Ｍｏ２Ｂ１を、ＫＡＲＩタンパク質を認識する２Ｂ１細胞株の細胞培養上清を用いて調製し、実施例１および３に記載したように、検出器としてのニワトリ抗体３４／３５とペアにした。この抗体ペアを用いるＥＬＩＳＡの最適化を実施例３に記載したように行なった。
【０４０１】
検出限界
４つのマーカーのＥＬＩＳＡアッセイを、組換えタンパク質およびＨ３７Ｒｖ全細胞ライセートを用いて決定される検出限界および動作範囲について評価した。緩衝液（図２２）
および喀痰において標準曲線を作成した。動作範囲を表４に一覧にする。
【表４】
2016005470.tif 000009
【０４０２】
全ての標的アッセイで結核菌が検出され、検出限界は１μｇ  Ｈ３７Ｒｖ  ＷＣＬ／ｍＬ未満である。組換え標的と発現されたタンパク質の関係は、図２に明確に示されている。
【０４０３】
２．ＫＡＲＩ抗体の特異性
結核菌（細胞株Ｈ３７Ｒｖ、ＴＭＣ  １０２、１．９×１０ｅ９ｃｆｕ／ｍＬ  ＬＯＴ  ＷＡ０４２６Ａ）、Ｍ．アウィウム（細胞株ＴＭＣ  ７２４、１×１０ｅ１１ｃｆｕ／ｍＬ  ＬＯＴ  ＷＡ０４２６Ｂ）、およびＭ．イントラセルラーレ（細胞株ＴＭＣ  ６４５０、２５×ｌ０ｅ１０ｃｆｕ／ｍＬ  ＬＯＴ  ＷＡ０４２６Ｃ）について、既知の細胞数を含む放射線照射した細胞懸濁液を得た。
【０４０４】
これらの細胞懸濁液を緩衝液中の連続希釈物としてＥＬＩＳＡに直接適用して、全細胞懸濁液中に存在する標的のレベルを決定した。また、各細胞型の３００μＬのアリコートを取り、これを用いて、上記のように全細胞ライセートを調製した（結核菌および組換え抗原標準の調製）。３つの細胞株を同一の条件および希釈の下で処理して、これらのライセートの公平な比較を保証した。
【０４０５】
結核菌、Ｍ．アウィウム、およびＭ．イントラセルラーレの標準曲線データを、各標的の精製組換えタンパク質が与えた応答に対して評価し、このデータを用いて、全細胞ライセートタンパク質１マイクログラム当たり、および培養細胞１０ｅ６個当たりの各標的の発現レベルに関する情報を提供した（この図は、ビーズミルプロセスにおけるブロッカーとして使用されたＢＳＡからのわずかな寄与分を含むことに注意）（表２Ａ〜Ｄ）。
【０４０６】
４つ全てのアッセイの反応性を、一般的な細菌標的の大腸菌、緑膿菌、枯草菌と、酵母の出芽酵母とについてさらに特徴付けた。データはｉｌｖｃ（図３）について示されているが、他の３つのアッセイは同様のプロファイルを示し、これらの非標的生物に対する顕著な交差反応性はなかった。これらの結果は、新たに開発されたｉｌｖｃアッセイの結核菌に対する相対的特異性を立証した。
【０４０７】
放射線照射された全細胞懸濁液、および培養マイコバクテリアの全細胞ライセートを上記のように調製した。細胞１００万個当たりの標的の検出レベル、および結核菌の検出と比べた交差反応性（ＣＲ）のレベルを決定した。
【０４０８】
３．亜細胞画分におけるＫＡＲＩ抗原の利用可能性
結核菌について、細胞壁および細胞膜の亜細胞画分も細胞株Ｈ３７Ｒｖの培養物から得、これを用いて、これらの調製物における利用可能な抗原のレベルを決定した。図２４は、ＫＡＲＩが、結核菌の細胞壁調製物と細胞膜調製物両方において相当なレベルで存在することを示している。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０４０９】
実施例５
ＫＡＲＩ（ｉｌｖＣ）の検出のためのポイント・オブ・ケアアッセイの開発
精製ＫＡＲＩモノクローナル抗体２Ｂ１試薬を金にコンジュゲートし、ポイント・オブ・ケア検査であるＤｉａｇｎｏｓｔＩＱアッセイフォーマットにおける好適性について評価した。このコンジュゲートを膜結合Ｃｈ３４／３５とともに用いる最適化されていないシステムで開発された緩衝液における標準曲線の予備データを図２５に示す。
【０４１０】
実施例６
ＫＡＲＩに最適化されたＥＬＩＳＡを用いた臨床試料のスクリーニング
Ｔｙｒｉａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓは、本研究で使用するために、いくつかの異なる場所から試料を調達した（例えば、表６）。カメルーンは、関連臨床データを有する試料と反復アッセイの実施に十分な量を適時提供するために、本臨床研究の主要な研究場所とした。これらの試料は、試料を速やかに処理し、「瞬間凍結」することができる現地の診療所から採集した。患者をＨＩＶ状態についてスクリーニングし、可能な場合は、ＣＤ４の数を得て、免疫機能を決定した。ＴＢへの事前の曝露に関して患者に問診し、マイコバクテリア感染の治療を受けている患者をコホートから除外した。喀痰容量は、通常、塗抹と培養による判定のためのアリコートを取り除いた後、１〜２ｍＬであり、少数の患者は、最大７ｍＬの容量を提供した。
【０４１１】
さらに、本発明者らは、タイおよび南アフリカ由来のＴＢ陽性試料を検査した。これまでに、受け取った試料は、容量が少なく（＜１ｍＬ）、かつもっぱらＴＢ陰性であった。
【０４１２】
臨床試料をｉｌｖｃについてもスクリーニングし、可能な場合は、４つの候補マーカー由来の他の標的をスクリーニングした。表７のデータは、２６人の塗抹陽性患者についてのものである。表８のデータは、２９人の塗抹陰性患者についてのものである。平均シグナルが、アッセイ緩衝液ブランクを超えて３標準偏差よりも大きい場合、試料を陽性と記録する。ｉｌｖｃの弱陽性シグナルはイタリック体で示す。
【表９ａ】
2016005470.tif 000014
【表９ｂ】
2016005470.tif 000015
【表９ｃ】
2016005470.tif 000016
【表１０】
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【表１１】
2016005470.tif 000018
【０４１３】
結果を図２６および２７に示す。臨床試料の初期スクリーニングについては、最大量の喀痰をアッセイに適用することに焦点を当てた。（収集場所での処理以外）試料の可溶化または喀痰中の干渉成分の除去は一切しなかった。未処理の喀痰４．５ｍＬ当量を解析した。この結果を図６に示す。４つのＴＢ陽性試料のうちの２つが、ｉｌｖｃの有意な検出を示した。対照的に、Ｓ９の有意な検出は観察されなかった。結果を図３１に示す。
【０４１４】
実施例７
ＫＡＲＩタンパク質に対する特異的抗体のさらなる特徴解析
本発明者らは、結核菌のＫＡＲＩタンパク質が高度に免疫原性であり、かつ免疫応答を生成させることができる多数のエピトープを有することを見出した。抗体は、組換えＫＡＲＩタンパク質および／または合成ペプチド抗原で免疫されたニワトリとマウスにおいて作製された。図２８および２９は、ニワトリ、およびマウス形質細胞腫において作製された抗体の組換えおよび内在性ＫＡＲＩタンパク質に対する抗体特異性を示している。
【０４１５】
放射線照射した全細胞懸濁液、および培養マイコバクテリアの全細胞ライセートを上記のように調製した。細胞１００万個当たりの標的の検出レベル、および結核菌の検出と比べた交差反応性（ＣＲ）のレベルを決定した（表９）。
【表１２】
2016005470.tif 000019
【０４１６】
マウスＭｏ２Ｂ１−ニワトリ３４／３５フォーマットにおけるＥＬＩＳＡアッセイの感度および特異性を決定し、表９に示した。図３０は、このＥＬＩＳＡアッセイの特異性を示している。これらのデータは、アッセイ検出限界が、＜２００ｐｇ  ｒＩｌｖＣ／ｍＬであり、かつＥＣ５０が２０３９ｐｇ  ｒＩｌｖＣ／ｍＬであったことを示している。結核菌に対するマイコバクテリアの交差反応性は０．３％未満であった。
【０４１７】
実施例８
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により結核菌および／または結核菌群由来のｉｌｖＣ転写産物を増幅するためのプライマーペアの設計および検査
本実施例は、本明細書の実施例２に記載の定量的ＰＣＲアッセイで使用される有利なプライマーペアならびに結核菌および結核菌群由来のｉｌｖＣ配列の特異的増幅を達成するための増幅条件の決定を示している。
【０４１８】
１．培養結核菌からのＤＮＡ調製
結核菌細胞を破壊緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）；１０ｍＭ  ＥＤＴＡ；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；０．６％ＳＤＳ；プロテイナーゼＫ）にて５０℃で１２時間インキュベートし、ビーズによる打撃で破壊して、細胞ライセートを調製した。細胞ライセートを遠心分離して、破片を除去した後、凍結させた。凍結ライセートを、短い保存期間の間、ドライアイス上で保持した後、さらに処理した。等量のＴｒｉｓ緩衝（ｐＨ８）フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１；Ｆｌｕｋａ）を各ライセートに添加し、混合物を２０秒間ボルテックス処理し、試料を卓上型遠心分離器にて１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、層を分離して、ＤＮＡを抽出した。上の層（ＤＮＡを含む）を注意深く除去し、きれいなエッペンドルフチューブに移し、等量の冷イソプロパノールを添加した。この混合物を短くボルテックス処理し、−２０℃で一晩沈殿させておいた。沈殿させた後、試料を１３，０００ｒｐｍにて４℃で２０分間スピンし、ＤＮＡをペレット化した。次に、上清を捨て、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、１３，０００ｒｐｍにて４℃でさらに２０分間スピンした。最終的な沈殿の後、上清を捨て、ペレットを１０分間風乾させておき、その後、水中で溶出させた。最終的なＤＮＡ濃度をナノドロップ分光光度計で決定した。
【０４１９】
２．定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ
ＡＢＩＰｒｉｓｍ−７５００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍにて、最初の９５℃、１０分間の段階の後、２段階の温度サイクルで９５℃、１５秒間および６０℃、１分間を４０回（またはそれ以外の場合は、記述した回数）繰り返して、ｑＰＣＲアッセイを行なった。ゲノムＤＮＡを最初に１００ｎｇ／μｌに希釈し、１μｌを、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と各々１５０ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマーとを含む２５μｌのｑＰＣＲ反応に用いた（すなわち、合計４ｎｇ）。アンプリコンを２％アガロースゲル電気泳動でまず解析し、各実験について解離曲線解析を行ない、単一の生成物の増幅をモニタリングした。６つ連続の１０倍希釈に対して３つ複製して標準曲線解析を行なった。ＡＢＩＰｒｉｓｍ−７５００  ＳＤＳソフトウェアを閾値（Ｃｔ）データ獲得、解離曲線および標準曲線解析に用いた。プライマーは、配列番号１９および２０（実施例２）を含んでいた。これを表１０に記載する。
【０４２０】
３．コンピュータによるＰＣＲ解析
コンピュータによるＰＣＲシミュレーションを、マイコバクテリア種および他の規定の除外生物：プセウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ハエモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコックス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびスタフィロコックス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）に対してオンラインで行なった。プライマーペアをモラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）に対してはスクリーニングしなかった。除外生物に対しては、プライマーペアのｉｌｖＣ１、ｉｌｖＣ２またはｉｌｖＣ３によって増幅が検出されず、全てのマイコバクテリア属の種に対してスクリーニングしたとき、結核菌およびウシ型結核菌の亜種のみが、予想された増幅を示した。
【０４２１】
４．プライマーペアの増幅特異性および効率
結核菌から抽出されたＤＮＡを１反応に４ｎｇ用いて、プライマー特異的増幅を得た。鋳型核酸の存在下でのみ、予想されたサイズのアンプリコンを得た。解離解析で決定したとき、プライマーペアのｉｌｖＣ１、ｉｌｖＣ２およびｉｌｖＣ３は各々単一のバンドを生成した。プライマーペアのｒｔＭ．ｔｂｉｌｖＣＦ／ｒｔＭｔｂｉｌｖＣＲは、ＰＣＲサイクリングの延長後（＋３０サイクル）、二次的な産物を生成した。実験的に決定されたこれらのアンプリコンの融解温度を表１０に示す。標準曲線解析を、微量のプライマー特異的アンプリコンをスパイクした、結核菌から抽出されたＤＮＡに対して行ない、また、６つ連続の１０倍希釈に対して３つ複製して行なった。プライマー特異的増幅効率（Ｅ）を式Ｅ＝１０（−１／ｓｌｏｐｅ）で定義し、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ（２００１）、“Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ”，Ｒａｐｉｄ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ，  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｓ．Ｍｅｕｅｒ，Ｃ．Ｗｉｔｔｗｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｎａｋａｇａｗａｒａ編）に記載されているような式（Ｅ−１）×１００％でパーセンテージ値に変換した。増幅効率を表１０に示す。
【０４２２】
５．様々なＤＮＡ濃度および／またはサイクル数でのプライマー性能
非特異的および／またはプライマー配列相同性の低い標的の増幅は、通常、インプットＤＮＡ濃度が高いおよび／またはＰＣＲサイクリング数が高い場合に観察される。したがって、表１０に示すプライマーペアを、１反応にインプットＤＮＡを４００ｐｇ用いる（すなわち、ＤＮＡ濃度が比較的高い）４０サイクルのｑＰＣＲ反応で、サイクル数を変化させて検査した。同じインプットＤＮＡ濃度でアッセイしたとき、これらのプライマーについて、約１２サイクルでＣｔ値がシフトした。４００ｐｇのインプットＤＮＡ濃度で、Ｍ．Ｔｂ＋試料由来のｉｌｖＣ配列の増幅は、配列番号２７〜３２については、約１７サイクル、ならびに配列番号１９および２０については、約２２サイクルで閾値ベースラインレベルを超えることが観察された。この高いＤＮＡ濃度での増幅産物は、陰性試料で検査されたプライマーペアについて検出可能であったが、配列番号２７〜３２については、約２９サイクル、ならびに配列番号１９および２０については、約３６サイクルで閾値ベースライン検出限界を超えたに過ぎなかった。
【０４２３】
同じインプットＤＮＡ濃度でアッセイしたときに、これらのプライマーについて、約１２サイクルでＣｔ値がシフトしたので、特異的な結核菌＋ｉｌｖＣ配列の検出、すなわち、非特異的増幅の排除が、より低いインプットＤＮＡ濃度および／またはより少ないサイクル数で予想される。
【０４２４】
表１０に示すプライマーペアを用いるが、先程よりも１０倍低いインプットＤＮＡ濃度、すなわち、約４０ｐｇのＤＮＡ、および３０サイクルの増幅で、さらなるｑＰＣＲアッセイを行なった。約９０％（表１０）の増幅効率で、この１０倍低いＤＮＡ濃度は、３．５サイクルの下方へのシフトに対応する、すなわち、増幅は、より高いＤＮＡ濃度で観察されたサイクルの約３．５サイクル後にベースラインを超える。これらの条件下で、表１０に示す全てのプライマーペアは、結核菌＋陽性試料の場合に増幅産物を生成し、結核菌陰性試料の場合は、３０サイクル後に増幅産物が検出されなかった。予想通り、増幅は、より高いＤＮＡ濃度で観察されたサイクルの約３．５サイクル後に、例えば、配列番号２７〜３２については、約２０〜２１サイクル、および配列番号１９および２０については、約２５〜２６サイクルで、ベースラインを超えた。解離曲線（図示せず）は、配列番号２７〜３２のついての単一産物の増幅と、配列番号１９および２０を用いたいくつかの非特異的な産物の増殖も示した。
【０４２５】
６．ｑＰＣＲにおけるプライマー性能のまとめ
本研究では、表１０に示す４つのプライマーペアを生物学的標本（例えば、喀痰）由来の結核菌ｉｌｖＣ配列および／または結核菌群ｉｌｖＣ配列を増幅する際のその特異性および効率について検査した。Ｍ．アウィウムなどの他の源を除いて、アッセイにより結核菌群ｉｌｖＣ配列が特異的に検出されるように、適切なインプットＤＮＡ濃度とＰＣＲサイクル数を保証し、それにより増幅の特異性を低下させることに注意しなければならない。本明細書におけるデータは、インプット鋳型濃度が高い場合および／またはＰＣＲサイクリングが約２５〜３０サイクルを超えて延長された場合に、ＰＣＲ増幅が起こることを示唆している。例えば、サイクル数が約２５〜３０サイクルを超えるときに、高濃度のＭ．アウィウム鋳型によって、これらの配列の増幅が起こり得る。しかしながら、結核菌群（すなわち、結核菌とウシ型結核菌の両方を含むもの）の特異的検出のためには、本明細書における最適なＤＮＡ濃度とサイクリングパラメータを利用することが好ましい。
【表１３】
2016005470.tif 000020
【０４２６】
本明細書におけるデータは、ｑＰＣＲで結核菌および／または結核菌群を検出するのに配列番号２７〜３２が好ましいが、これに関連して４つ全てのプライマーペアが有用であることも示している。プライマーペアの好ましい順は、最も好ましいものからあまり好ましくないものへ、次の通りである。
配列番号２９−３０＞配列番号２７−２８＞配列番号３１−３２＞配列番号１９−２０
【０４２７】
本明細書に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーを入れ換えるのは好ましくない。
【０４２８】
ｉｌｖＣコード配列（配列番号２）におけるそのアラインメントに基づいて、プライマーペア、特に配列番号２７〜３２、またはより好ましくは配列番号２９〜３２を交差して組み合わせ、それにより増幅プロトコルで使用される追加のプライマーペアを作り出すことが可能である（但し、望ましくない、配列番号３０および３１を有する重複プライマーの交差組合せを除く）。例えば、表１１に示す追加のプライマー組合せを利用し得る
【表１４】
2016005470.tif 000021
【０４２９】
実施例９
臨床試料における定量的ＲＴ−ＰＣＲによる結核菌群の生物の検出
本実施例は、培養試料、および臨床試料（例えば、喀痰、リンパ節組織の細針吸引物、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ））中の結核菌群生物を検出するための定量的ＲＴ−ＰＣＲの有用性を示す。
【０４３０】
１．試料
本実施例で用いた培養試料は、ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ０．５（１５０×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）から始めた、ＡおよびＢと命名された２つの結核菌臨床株の懸濁液であり、連続希釈物を１０８ＣＦＵ／ｍＬ、１０６ＣＦＵ／ｍＬ、１０４ＣＦＵ／ｍＬ、１０２ＣＦＵ／ｍＬ、１０ＣＦＵ／ｍＬおよび１ＣＦＵ／ｍＬに等しくなるようにした。２つのさらなる培養抽出物は、Ｔｙｒｉａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓにより供給された。
【０４３１】
本実施例で用いた対照喀痰（Ａ〜Ｇと命名）は、Ｒｏｙａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ  Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ（ＲＣＰＡ）ＱＡＰプログラムにより供給された。ストック喀痰は、顕微鏡検査で６０〜８５  ＡＦＢ／１００ＨＰＦを含んでいた。試料ＡおよびＤは結核菌陰性であった。試料Ａ、ＣおよびＥには、薄い濃度のＭ．アウィウムもスパイクした。
【０４３２】
さらに、ＩＣＰＭＲで事前に検査された４つの保存された一揃いの臨床試料を検査した。これらの臨床試料は、２つの喀痰、１つのリンパ節組織の細針吸引物、および１つの気管支肺胞洗浄液からなっていた。
【０４３３】
２．ＲＮＡ抽出
製造元のプロトコルに従ってＮｕｃｌｉＳＥＮＳ（登録商標）ｅａｓｙＭＡＧ（登録商標）プラットフォーム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）を用いて、各培養試料および各臨床試料からＲＮＡを抽出した。ＥａｓｙＭａｇは、種々の試料タイプおよび容量からトータル核酸を抽出するためのＩＶＤ標識自動化システムであり、生物学的試料からトータル核酸を抽出するように最適化されている。このシステムでは、強化磁性シリカに基づくｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＢＯＯＭ（登録商標）技術が自動化されている。抽出された核酸を１１０μＬのアリコートとして溶出し、ＤＮアーゼで処理し、それによりＲＮＡを得た。
【０４３４】
３．逆転写
製造元のプロトコルに従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いた逆転写により、各ＲＮＡ試料からｃＤＮＡを産生した。
【０４３５】
４．定量的ＰＣＲ
各ｃＤＮＡ試料を、本明細書の表１０に示すプライマーセットを含む別々のＰＣＲ反応の鋳型として用いた。
【０４３６】
Ｒｏｃｈｅ  ＬＣ  ４８０プラットフォームを利用した前述の実施例と本質的に同様に、ＰＣＲを行なっが、第１のインキュベーションを、５０℃で２分間の後、９５℃で５分間、その後、９５℃で１０秒間の後、６０℃で４５秒間、各々３０〜５０サイクルとした。最後に４０℃で５分間インキュベートして、反応を完了させた。
【０４３７】
５．結果
前述の実施例に示したように、サイクル数を５０サイクルから約３０サイクルに減らしたときに、あまり非特異的でない増幅産物が生成された。融解曲線からの予想Ｔｍ値を有する産物を、本明細書の表１０に示すプライマーペアの各々を用いて増幅した。
【０４３８】
培養試料では、配列番号２７および２８からなるプライマーペアにより、少なくとも約１０４ＣＦＵ／ｍＬの濃度で特異的な結核菌群ｉｌｖＣが検出され、配列番号２９および３０からなるプライマーペアにより、少なくとも約１０４ＣＦＵ／ｍＬの濃度で特異的な結核菌群ｉｌｖＣが検出され、配列番号３１および３２からなるプライマーペアにより、少なくとも約１０４ＣＦＵ／ｍＬの濃度で特異的な結核菌群ｉｌｖＣが検出され、配列番号１９および２０からなるプライマーペアにより、少なくとも約１０６ＣＦＵ／ｍＬの濃度で特異的な結核菌群ｉｌｖＣが検出された。Ｃｐカットオフ値は３５サイクルであった。結核菌株Ｈ３７ＲｖおよびＣＳＵ９３のライセートは、全てのプライマーによる信頼できる検出を示し、この材料について、１０９ＣＦＵ／ｍＬよりも大きい試料中の細胞濃度が推定された。試料の細胞数が増加するのに伴って、予想した通り、かつＣｐ値がより小さいことによって示されるように、シグナルを検出するのに必要なサイクルがより少なくなった。
【０４３９】
６０〜８５  ＡＦＢ／強拡大を達成するために培養細菌を培養物および塗抹陰性喀痰にスパイクして調製されたスパイク喀痰の場合、表１０に示すｉｌｖＣプライマーセットにより、出発材料の１／１０希釈物中でｉｌｖＣ配列が特異的に検出され、出発材料の１／１００希釈では、配列番号２９および３０以外の全てのプライマーペアについて、出発材料の１／０００希釈では、プライマーペアの配列番号１９および２０と、配列番号２９および３０とについて、ｉｌｖＣ配列が特異的に検出された。陰性の喀痰は、全てのアッセイにおいて正しく陰性と同定された。
【０４４０】
臨床塗抹および培養陽性喀痰、ＢＡＬ、ならびにリンパ節針生検（ＦＮＡ）の場合、配列番号１９および２０と、配列番号２７および２８のｉｌｖＣプライマーセットにより、ＢＡＬ中でｉｌｖＣ配列が特異的に検出され、配列番号２７および２８と、配列番号２９および３０のｉｌｖＣプライマーセットにより、ＦＮＡ中でｉｌｖＣ配列が特異的に検出され、表１０に示すｉｌｖＣプライマーセットでは、Ｍ．アウィウムを含む喀痰由来の核酸が増幅されなかった。表１２は、全ての試料のＣｐ値（サイクル数）を示す。Ｃｐ値は、特異的産物がバックグラウンドシグナルを超える、サイクル中で測定される交差点である。
【表１５】
2016005470.tif 000022
【０４４１】
実施例１０
ｉｌｖＣ分子ビーコンを用いた核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）
本実施例は、本明細書の実施例２、８および９に記載された増幅プラットフォームをＮＡＳＢＡ−分子ビーコンプラットフォームに拡大する支援を提供する。
【０４４２】
１．分子ビーコンおよびプライマー
分子ビーコンプローブは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）によって作製され、Ｖｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．編），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，第２８８巻，ｐｐ．２７３−２９０（２００４）に記載されている通りに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製された。ｉｌｖｃ４−ＭＢと命名された分子ビーコンは、次のようなプライマーｉｌｖＣ４Ｆ（配列番号３３）配列に基づいて作製された。
（化１）
プライマーｉｌｖＣ４Ｆ（配列番号３３）：ＡＡＧＡＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＧＡＣＧＡ
【０４４３】
分子ビーコンは、以下のように、配列番号３３と、ｉｌｖＣのｍＲＮＡまたは遺伝子の隣接配列には存在しない相補的な５’末端配列および３’末端配列とを含んでいた。
（化２）
ビーコンｉｌｖｃ４−ＭＢ（配列番号３４）：ｃｃｇｇｇＡＡＧＡＣＧＡＣＧＴＴＣＡＡＡＧＡＣＧＡｃｃｃｇｇ
【０４４４】
オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により作製された。分子ビーコンのアニーリング部位に隣接するプライマーは、結核菌Ｈ３７Ｒｖの配列データに基づいて作製され、配列番号３１もしくは配列番号３２（表１０）または以下の配列を含んでいた。
（化３）
プライマーｉｌｖＣ５Ｆ（配列番号３５）：ＣＧＴＧＴＴＴＧＧＴＴＧＣＧＧＴＡＧＡＧ；
プライマーｉｌｖＣ６Ｒ（配列番号３６）：ＧＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣ；および
プライマーｉｌｖＣ７Ｒ（配列番号３７）：ＣＣＧＣＡＣＡＡＣＡＣＣＧＴＴＴＧＣＴＣＡＣＣＧＡＡＣ
【０４４５】
分子ビーコンとともに使用されるリバースプライマーには、３’テール配列が含まれていた。例えば、リバースプライマーは、配列番号３２に基づいて作製され、以下の配列を有していた（配列番号３２には、下線が付されている）。
【化４】
2016005470.tif 000023
【０４４６】
別の実施例では、リバースプライマーは、配列番号３６に基づいて作製され、以下の配列を有していた（配列番号３６には、下線が付されている）。
【化５】
2016005470.tif 000024
【０４４７】
別の実施例では、リバースプライマーは、配列番号３７に基づいて作製され、以下の配列を有していた（配列番号３７には、下線が付されている）。
【化６】
2016005470.tif 000025
【０４４８】
分子ビーコンとともに使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せは、プライマー配列と配列番号２に示すｉｌｖＣ配列とのアラインメントに基づくと明白である。例えば、プライマーセットＩは、表１０（配列番号３２）に示すプライマーｉｌｖＣ３Ｆと、プライマーｉｌｖｃ３Ｒ−テール（配列番号３８）とを含んでいた。プライマーセットＩＩは、プライマーｉｌｖＣ５Ｆ（配列番号３５）とプライマーｉｌｖＣ６Ｒ−テール（配列番号３９）とを含んでいた。プライマーセットＩＩＩは、プライマーｉｌｖＣ５Ｆ（配列番号３５）とプライマーｉｌｖｃ３Ｒ−テール（配列番号３８）とを含んでいた。プライマーセットＩＶは、プライマーｉｌｖＣ３Ｆ（配列番号３２）とプライマーｉｌｖＣ６Ｒ−テール（配列番号３９）とを含んでいた。プライマーセットＶは、プライマーｉｌｖＣ３Ｆ（配列番号３２）とプライマーｉｌｖＣ７Ｒ−テール（配列番号４０）とを含んでいた。プライマーセットＶＩは、プライマーｉｌｖＣ５Ｆ（配列番号３５）とプライマーｉｌｖＣ７Ｒ−テール（配列番号４０）とを含んでいた。
【０４４９】
２．分子ビーコンを用いた培養試料に対する試験的増幅反応
プライマーセットＩ〜ＩＶおよび分子ビーコンを、４つの結核菌陽性試料由来のＤＮＡを用いた増幅によって評価した。簡潔に述べると、Ｍｘ３００５Ｐマルチプレックス定量的ＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、増幅を行なった。増幅のために、２０μｌの反応液は、１ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、４ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、および０．４μＭの各プライマー、０．１μＭのビーコンを１×ＰＣＲ緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中に含んでいた。ＰＣＲサイクリング条件は、９５℃、１０分間の最初の変性段階と、その後の、各々９５℃、３０秒間（変性）と、それに次ぐ５５℃、３０分間（アニーリング）および７２℃、３０秒間（伸長）を含む４０サイクルを含んでいた。
【０４５０】
これらの予備研究から、１４．９６〜１７．８１という、上記の４つのプライマーセットＩ〜ＩＶのサイクル閾値が得られ、結核菌群ｉｌｖＣ核酸の検出におけるその好適性が示された。
【０４５１】
３．分子ビーコンを用いた培養試料に対するｉｌｖＣの定量的アッセイ
４つの結核菌陽性培養試料を得て、本明細書に記載したように、増幅用の鋳型としてＲＮＡを生成した。簡潔に述べると、結核菌陽性試料由来のＲＮＡを鋳型として用いた増幅によって、プライマーセットＩおよびＩＩと分子ビーコンとを評価した。ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ基本キットバージョン２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）を用いて、ＮＡＳＢＡ反応を行なった。５μｌの反応容量は、試薬ミックス（０．２μＭの各プライマー、０．１μＭの分子ビーコン、２．５μｌのＲＮＡ鋳型、および２．５μｌのＮＡＳＢＡ酵素ミックス（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ））を含んでいた。酵素混合物は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素、ＲＮアーゼＨ、およびウシ血清アルブミンを含んでいた。６５℃で２分間および４１℃で２分間という２段階のインキュベーションの後に、この酵素混合物を反応混合物に添加した。各サイクルについて、４１℃、３０秒間を１８０サイクルに設定したＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５ＰリアルタイムＰＣＲシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ＮＡＳＢＡアッセイ反応を行なった。各サイクルで１回、蛍光シグナルを測定した。陽性シグナルのカットオフ閾値は、鋳型なしの対照からの終点シグナルよりも１５％高いものとして設定した。この対照では、核酸の代わりに、２．５μｌのヌクレアーゼフリー水が反応混合物中で用いられた。陽性になるまでの時間は、陽性シグナルが閾値を超える時点として定義した（より短い時間は、より感度の高い検出を示す）。
【０４５２】
プライマーセットのＩとＩＩの両方で、約３０〜６０分で、陽性増幅産物、すなわち、バックグラウンドを上回る産物が得られ、プライマーセットＩＩでは、３７〜５０分以内に、これらの培養試料から有意に高いレベルの増幅産物が得られた。
【０４５３】
４．合成ＲＮＡ転写産物からの増幅
この増幅系をさらに評価するために、ｉｌｖＣ配列に基づく合成ＲＮＡ内部転写産物を産生し、これを用いて、プローブ／プライマー組合せの感度を決定した。簡潔に述べると、Ｔ７プロモーター配列に連結されたフォワードプライマーを用いて、ＤＮＡアンプリコンを産生した。ＤＮＡアンプリコンを精製した後、ＲＮＡＭａｘｘ高収率転写キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いたインビトロでの転写によって、合成ＲＮＡ転写産物を産生し、その後、ＲＮアーゼフリーＤＮアーゼＩ（ＮＥＢ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）により３７℃で３０分間処理した。ＲＮＡクリーンアッププロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従ってＲＮｅａｓｙキットを用いて、ＲＮＡ産物を精製した。精製したＲＮＡ標的をＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により定量した。ＲＮＡコピー数を計算した。次に、ｉｌｖＣ  ＮＡＳＢＡの感度を評価した。１０９〜１０２コピーの合成ＲＮＡ標的の希釈系列も用いて、アッセイ標準曲線を作成し、プライマーセットＩおよびＩＩを用いて前述の節と同様にＮＡＳＢＡを行なった。１０５〜１０２コピーの合成ＲＮＡ標的の希釈系列も用いて、アッセイ標準曲線を作成し、プライマーセットＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＶＩを用いて前述の節と同様にＮＡＳＢＡを行なった。
【０４５４】
これらの実験では、プライマーセットＩおよびＩＩにより、約２０〜６０分でバックグラウンドを上回るレベルのｉｌｖＣ  ＲＮＡが検出され、プライマーセットＩＩにより、これらの試料からより早い期間で顕著に高いレベルの増幅産物が得られた。プライマーセットＩＩＩにより、５０．９分以内にバックグラウンドを上回るレベルの１０５コピーのｉｌｖＣ  ＲＮＡが検出され、５４．１分以内にバックグラウンドを上回る１０４コピーのｉｌｖＣ  ＲＮＡが検出された。プライマーセットＶにより、４７．５分以内にバックグラウンドを上回る１０５コピーのｉｌｖＣ  ＲＮＡが検出され、４９．５分以内にバックグラウンドを上回る１０４コピーのｉｌｖＣ  ＲＮＡが検出された。これらのデータは、プライマーセットＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶが、ｉｌｖＣ  ｍＲＮＡの特異的検出に有用であることを示している。
【０４５５】
５．結核菌ＲＮＡ転写産物からの増幅
この増幅系をさらに評価するために、本明細書で上に記載したのと同じ条件下でＴＢ  ＲＮＡ試料を用いて、プライマーセットＩおよびＩＩも検査した。この場合もやはり、プライマーセットＩＩによって、プライマーセットＩよりも早い期間でより高いレベルの特異的アンプリコンが得られた。
【０４５６】
６．細胞培養物から単離されたＲＮＡの回収
固形培地から擦り取られた結核菌培養物からＲＮＡを単離した。ＲＮＡの質は、ＲＮＡをゲル電気泳動した後の調製物における２３Ｓおよび１６Ｓバンドの存在によって評価した。上記のアッセイ条件下で、上記のプライマーセットＩＩを、標準としての上記の合成ＲＮＡの希釈系列と一緒に用いて、ＲＮＡをＲＴ増幅にかけた。本研究により作成された標準曲線から、ＲＮＡコピー数を決定した。
【０４５７】
これらの実験では、合成ＲＮＡ標準の産生までの時間（ＴＴＰ）は、１０９コピーのＲＮＡでは、２２．１１分であり、１０４コピーでは６７．６６分にまで増加した。少なくとも１０９〜１０４コピーの線形範囲が実用的に許容可能である（Ｒ２＝０．９９９）。
【０４５８】
結核菌培養試料により、３５．５８分〜５０．３５分で特異的なｉｌｖＣ増幅産物が得られ、以前の検査と一致した。プライマーセットＩＩは、これらの条件下で少なくとも９．６１×１０４コピーのｉｌｖＣ  ＲＮＡを検出することができた。プライマーセットＶは、これらの条件下で約１０３コピーのｉｌｖＣ  ＲＮＡを検出することができた。
【０４５９】
培養物で達成される検出レベルは、一次喀痰標本で達成可能なものよりも感度が低いことが事前に示されている。したがって、本発明者らは、本明細書におけるプローブとプライマーとともに一次喀痰を用いて、単離し、増幅感度を検査しているところである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年8月28日(2015.8.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核菌群の１以上のマイコバクテリアからｉｌｖＣのｍＲＮＡ転写物を検出する方法であって、
（ｉ）喀痰の試料から核酸を単離する工程と、
（ｉｉ）配列番号２に示すようなヌクレオチド配列にアニールする１以上のプライマーを用いるインビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程と、
（ｉｉｉ）ｉｌｖＣのｍＲＮＡ転写物を検出する工程と
を含み、
ここにおいて、ｉｌｖＣのｍＲＮＡ転写物の検出が、前記試料中の前記結核菌群の１以上のマイコバクテリアの存在を示し、Ｍ．アウィウム群の１以上のマイコバクテリアの不存在を示す
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記結核菌群の生物が、結核菌、ウシ型結核菌、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．カネッティおよびネズミ型結核菌またはそれらの組合せから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結核菌群の生物が、結核菌およびウシ型結核菌またはそれらの組合せから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記結核菌群の生物が結核菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記結核菌が結核菌の臨床株または臨床分離株である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記結核菌群の生物がウシ型結核菌である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
Ｍ．アウィウム群のマイコバクテリアがＭ．アウィウムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｍ．アウィウム群のマイコバクテリアがＭ．イントラセルラーレである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、温度サイクリングを伴う増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、温度サイクリングを伴わない増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｉｌｖＣのｍＲＮＡ転写物を検出する工程が、少なくとも２０の連続する長さのヌクレオチドのアンプリコンを検出することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ｉｌｖＣのｍＲＮＡ転写物を検出する工程が、少なくとも４０の連続する長さのヌクレオチドのアンプリコンを検出することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｉｌｖＣのｍＲＮＡ転写物を検出する工程が、少なくとも５０の連続する長さのヌクレオチドのアンプリコンを検出することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｉｌｖＣのｍＲＮＡ転写物を検出する工程が、少なくとも８０の連続する長さのヌクレオチドのアンプリコンを検出することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、各々配列番号２のその位置４２０から位置６００までの少なくとも約１８の連続するヌクレオチド配列、または配列番号２に相補的なその位置４２０から位置６００までの配列を含む１つまたは複数のプライマーを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
１以上のプライマーの各々が、少なくとも１８の連続するヌクレオチド配列を含むと共に、１以上のプライマーの各々が、配列番号２の位置４０から位置１８０まで、又は配列番号２の相補的な位置４０から位置１８０まで、のヌクレオチド配列とアニールする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
１以上のプライマーの各々が、少なくとも１８の連続するヌクレオチド配列を含むと共に、１以上のプライマーの各々が、配列番号２の位置８８０から位置１０００まで、又は配列番号２の相補的な位置８８０から位置１０００まで、のヌクレオチド配列とアニールする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、３０回未満の増幅サイクルで増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、１２回の増幅サイクルから２７回の増幅サイクルで増幅反応を行なうことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、１４回の増幅サイクルから２０回の増幅サイクルで増幅反応を行なうことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、２ｎｇ／ｍｌ未満のインプットの原核生物核酸に対して増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、１つまたは複数の増幅プライマーと、前記増幅プライマーの核酸産物にハイブリダイズし、それにより検出可能なシグナルを生じさせることができる配列を含む標識プローブとを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、１つまたは複数の増幅プライマーと、前記増幅プライマーの少なくとも１つに結合することができる標識プローブとを用いて増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、少なくとも１０４コピーのｉｌｖＣ核酸を６０分未満で検出するのに十分な条件下で増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、少なくとも１０３コピーのｉｌｖＣ核酸を約６０分未満で検出するのに十分な条件下で増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記インビトロ増幅に基づくアッセイを行う工程が、少なくとも１０４ＣＦＵ／ｍｌの前記結核菌群のマイコバクテリアを検出するのに十分な条件下で増幅反応を行なうことを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
試料中の前記結核菌群の１以上のマイコバクテリアの１以上の核酸を検出することをさらに含み、ここで、前記１以上の核酸がｉｌｖＣ核酸以外のものである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｉｌｖＣ核酸以外の１以上の核酸が１６ｓ  ｒＲＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｉｌｖＣ核酸以外の１以上の核酸が、ＢＳＸ、Ｓ９、Ｒｖ１２６５、ＥＦ−Ｔｕ、Ｐ５ＣＲ、ＴｅｔＲ様タンパク質およびグルタミン合成酵素からなる群から選択されるタンパク質をコードする核酸、またそれらに相補的な核酸である、請求項２７に記載の方法
【請求項３０】
（ｉ）前記ＢＳＸの検出は、配列番号４に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｉｉ）前記Ｓ９の検出は、配列番号６に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｉｉｉ）前記Ｒｖ１２６５の検出は、配列番号８に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｉｖ）前記ＦＦ−Ｔｕの検出は、配列番号１０に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｖ）前記Ｐ５ＣＲの検出は、配列番号１２に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含み、
（ｖｉ）前記ＴｅｔＲ様タンパク質の検出は、配列番号１４に示すような少なくとも２０の連続するヌクレオチド配列を含む核酸またはそれに相補的な核酸を検出するためにポリメラーゼ連鎖反応を行なうことを含む、
請求項２９に記載の方法。