(57)【要約】【課題】検体に含まれる微小物質の１個単位の回収を、微小物質の大きさにかかわらず効率よく行う方法を提供する。【解決手段】微小物質を含有する検体から、光透過性の基板と前記基板の一方の主面に形成された微小物質捕捉層とを備える微小物質捕捉用基板の前記微小物質捕捉層に前記微小物質を捕捉する捕捉工程と、前記微小物質が捕捉された前記微小物質捕捉層を観察して前記微小物質の捕捉位置を特定する観察工程と、前記特定された前記微小物質の捕捉位置に、前記微小物質捕捉用基板の前記光透過性の基板側から光を照射し、前記光の放射圧により前記微小物質を前記微小物質捕捉層から脱離させる脱離工程と、前記脱離した微小物質を回収する回収工程とを有する微小物質の回収方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小物質を含有する検体から、光透過性の基板と前記基板の一方の主面に形成された微小物質捕捉層とを備える微小物質捕捉用基板の前記微小物質捕捉層に前記微小物質を捕捉する捕捉工程と、
前記微小物質が捕捉された前記微小物質捕捉層を観察して前記微小物質の捕捉位置を特定する観察工程と、
前記特定された前記微小物質の捕捉位置に、前記微小物質捕捉用基板の前記光透過性の基板側から光を照射し、前記光の放射圧により前記微小物質を前記微小物質捕捉層から脱離させる脱離工程と、
前記脱離した前記微小物質を回収する回収工程と
を有する微小物質の回収方法。
【請求項２】
前記微小物質の平均粒子径は１ｎｍ〜１０μｍであり、前記微小物質捕捉層は複数の開孔部を有し前記微小物質の１個を前記開孔部の１つに捕捉する請求項１記載の微小物質の回収方法。
【請求項３】
前記観察工程の前に、さらに、前記微小物質のうちの特定の微小物質を蛍光標識して蛍光微小物質を作製する標識工程を有し、前記観察工程において、観察を蛍光観察で行い前記蛍光微小物質の捕捉位置を特定し、前記脱離工程において、前記観察工程で特定された前記蛍光微小物質の捕捉位置に前記光を照射して前記蛍光微小物質を選択的に脱離させる操作を含む請求項１または２記載の微小物質の回収方法。
【請求項４】
前記回収を、前記微小物質捕捉用基板の前記微小物質捕捉層に対向するように配置された回収基板の前記微小物質捕捉層に対向する主面上で行う請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小物質の回収方法。
【請求項５】
前記回収基板は前記微小物質捕捉層に対向する主面に前記微小物質を固定可能に成形された層を有する請求項４に記載の微小物質の回収方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微小物質の回収方法に関し、特には、検体に含まれる微小物質の１個単位の回収を、微小物質の大きさにかかわらず効率よく行う回収方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微小物質の捕捉に光ピンセットが用いられるようになっている。この光ピンセットは集光された光の光圧力によって、試料溶液中などに存在する微小物質を焦点にトラップするものである。この捕捉方法によれば、非接触・非破壊で微小物質を捕捉することができ、微小物質を捕捉した状態で、微小物質を含む試料ステージ側を相対移動させることにより、微小物質を移動・搬送することができる（特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、光ピンセットによる微小物質の補足と移動・搬送は１回につき１個ずつ行われるため、処理される微小物質の量が多い場合には、多くの処理時間が必要とされ、作業効率の点で問題であった。
【０００４】
また、微小物質に対する操作としては、一度その微小物質を焦点に捕捉した後に、周囲媒体、もしくはレーザー照射システム全体を移動させることで微小物質を移動することが必要となる。そのため、広範囲操作や連続的操作、高速操作といった作業を行うことは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−１８０４６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、検体に含まれる微小物質の１個単位の回収を、微小物質の大きさにかかわらず効率よく行う方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の微小物質の回収方法は、微小物質を含有する検体から、光透過性の基板と前記基板の一方の主面に形成された微小物質捕捉層とを備える微小物質捕捉用基板の前記微小物質捕捉層に前記微小物質を捕捉する捕捉工程と、前記微小物質が捕捉された前記微小物質捕捉層を観察して前記微小物質の捕捉位置を特定する観察工程と、前記特定された前記微小物質の捕捉位置に、前記微小物質捕捉用基板の前記光透過性の基板側から光を照射し、前記光の放射圧により前記微小物質を前記微小物質捕捉層から脱離させる脱離工程と、前記脱離した前記微小物質を回収する回収工程と、を有する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、検体に含まれる微小物質の１個単位の回収を、微小物質の大きさにかかわらず効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の回収方法に用いる微小物質捕捉用基板の一例の正面図、断面図、部分拡大正面図、およびその断面図である。
【図２】本発明の回収方法に用いる微小物質捕捉用基板の別の一例の正面図、断面図、部分拡大図、およびその断面図である。
【図３】本発明の回収方法に用いる微小物質捕捉用基板のさらに別の一例の正面図、断面図、部分拡大図、およびその部分拡大斜視図である。
【図４】本発明の回収方法の実施形態の一例における脱離工程および回収工程を概略的に示す図である。
【図５】本発明の回収方法の実施形態において蛍光標識された微小物質の脱離工程および回収工程の一例を概略的に示す図である。
【図６】本発明の回収方法の実施形態において蛍光標識された微小物質の一例を概念的に示す図である。
【００１０】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。なお、本発明は、下記説明に限定して解釈されるものではない。
本発明の微小物質の回収方法は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の工程を含む。
（Ａ）微小物質を含有する検体から、光透過性の基板と前記基板の一方の主面に形成された微小物質捕捉層とを備える微小物質捕捉用基板の前記微小物質捕捉層に前記微小物質を捕捉する捕捉工程（以下、（Ａ）工程ともいう。）
（Ｂ）前記微小物質が捕捉された前記微小物質捕捉層を観察して前記微小物質の捕捉位置を特定する観察工程（以下、（Ｂ）工程ともいう。）
（Ｃ）前記特定された前記微小物質の捕捉位置に、前記微小物質捕捉用基板の前記光透過性の基板側から光を照射し、前記光の放射圧により前記微小物質を前記微小物質捕捉層から脱離させる脱離工程（以下、（Ｃ）工程ともいう。）
（Ｄ）前記脱離した微小物質を回収する回収工程（以下、（Ｄ）工程ともいう。）
【００１１】
本発明の微小物質の回収方法は、上記（Ｂ）の観察工程の前に以下の（Ｅ）の標識工程を有してもよい。なお、（Ｅ）の標識工程は（Ｂ）工程の前であれば、（Ａ）工程の前に行われても、後に行われてもよい。
（Ｅ）前記微小物質のうちの特定の微小物質を蛍光標識して蛍光微小物質を作製する標識工程（以下、（Ｅ）工程ともいう。）
本発明の微小物質の回収方法が（Ｅ）工程を有する場合、（Ｂ）工程において、観察を蛍光観察で行い前記蛍光微小物質の捕捉位置を特定し、（Ｃ）工程において、（Ｂ）工程で特定された前記蛍光微小物質の捕捉位置に前記光を照射して前記蛍光微小物質を選択的に脱離させる。
【００１２】
以下、各工程について説明する。
（Ａ）捕捉工程
捕捉工程は、微小物質を含有する検体から、光透過性の基板と前記基板の一方の主面に形成された微小物質捕捉層とを備える微小物質捕捉用基板の前記微小物質捕捉層に前記微小物質を捕捉する工程である。
【００１３】
（微小物質）
本発明の回収方法が適用される微小物質としては、平均粒子径が概ね３０μｍ以下の微小物質であれば特に制限されない。本発明の回収方法は、具体的には、平均粒子径が１ｎｍ〜１０μｍの微小物質に適用した場合に、作業効率的の観点から顕著な効果が得られる。微小物質の平均粒子径は、１ｎｍ〜５００ｎｍであれば、より本発明の方法による効果は顕著である。なお、本明細書において、平均粒子径とは、レーザー回折・散乱法によって測定された体積基準の粒度分布から求められる５０％積算値（Ｄ５０）である。
【００１４】
微小物質の種類としては、生体細胞および生体細胞以外の各種コロイド粒子等が挙げられる。生体細胞としては、例えば、リンパ球などの免疫細胞、がん細胞、ハイブリドーマ、細胞株、幹細胞、浮遊細胞、バクテリア、酵母細胞、菌類の細胞、赤血球、組織、ＤＮＡ、ＲＮＡ、遺伝子、精子、卵子、ウイルス、エクソソーム、血中循環がん細胞（ＣＴＣ）、ミクロＲＮＡ、白血球、血小板、アルブミン等のタンパク質等が挙げられる。
【００１５】
また、微小物質を含有する検体としては、微小物質を含有していれば固体であっても、液体であっても制限されない。以下に説明する、微小物質捕捉用基板による微小物質の捕捉は、通常、液状物質を対象としている。例えば、検体が固体の場合、検体を液状の媒体に溶解、分散させて液状にして、微小物質捕捉用基板による微小物質の捕捉を行えばよい。
【００１６】
（微小物質捕捉用基板）
（Ａ）工程で用いられる微小物質捕捉用基板は、光透過性の基板と前記基板の一方の主面に形成された微小物質捕捉層とを備える。微小物質捕捉層は微小物質を検体から捕捉可能に構成された層であれば、捕捉の具体的な方法は特に制限されない。捕捉の方法として具体的には、吸着、濾過、開孔部への取込等が挙げられる。（Ｃ）工程において、微小物質捕捉層から個別に微小物質を脱離できる観点から微小物質捕捉層への微小物質の捕捉は、微小物質が互いに重なり合わないように行われることが好ましい。さらに、（Ｃ）工程において光の放射圧により微小物質捕捉層から微小物質が容易に脱離可能な程度に捕捉されていることが好ましい。
【００１７】
このような観点から、微小物質捕捉層は、複数の開孔部を有し上記微小物質の１個を該開孔部の１つに捕捉できる形態が好ましい。このような微小物質捕捉層としては、マイクロウェル層、多孔質層、マイクロ流路層等が挙げられる。
【００１８】
図１〜図３は本発明の回収方法に用いる微小物質捕捉用基板の一例、別の一例、およびさらに別の一例を示す。図４は、本発明の回収方法の実施形態の一例における脱離工程および回収工程を概略的に示す図である。図５は本発明の回収方法の実施形態において蛍光標識された微小物質の脱離工程および回収工程の一例を概略的に示す図である。
【００１９】
図１は微小物質捕捉層としてマイクロウェル層を有する微小物質捕捉用基板の一例を示し、（ａ）はマイクロウェル層側から見た正面図、（ｂ）は断面図、（ｃ）は部分拡大正面図、（ｄ）はその断面図をそれぞれ示す。
【００２０】
図１に示す微小物質捕捉用基板１０Ａは、光透過性の基板１の一方の主面上に、開孔部として円筒形のマイクロウェル２１を複数個有するマイクロウェル層２Ａを有する。実施形態の回収方法においては、例えば、図４に示すように、マイクロウェル層２Ａのマイクロウェル２１内に捕捉された微小物質３は、（Ｂ）工程において観察により捕捉位置が特定され、（Ｃ）工程においてこの特定された微小物質３の捕捉位置に、微小物質捕捉用基板１０Ａの光透過性の基板１側から光（Ｌ）を照射し、その放射圧により微小物質３をマイクロウェル層２Ａから脱離させる。
【００２１】
光透過性の基板１において、透過性が必要とされる光としては、その放射圧により微小物質３を脱離させる光（Ｌ）が挙げられる。これは、本発明の回収方法においては、微小物質３を脱離させる光（Ｌ）は、微小物質捕捉用基板１０Ａの基板１側から照射され、基板１を透過して微小物質３に到達する態様を有することによる。後述のとおり、微小物質３を脱離させる光（Ｌ）としては、通常、波長４００〜２５００ｎｍ程度のレーザー光が用いられる。特に脱離対象の微小物質が生体由来の微小物質の場合、７００〜１３００ｎｍ程度のレーザー光が用いられる。
【００２２】
また、光（Ｌ）の放射圧により微小物質３を脱離させる際、通常、光（Ｌ）は集光されて微小物質の１個にのみ照射される。そのため、本発明の回収方法においては、観察によるマイクロウェル層２Ａの微小物質３が捕捉された位置の特定が必要とされる。微小物質３の捕捉位置が特定される限り、観察は光（Ｌ）の照射と同じ側、すなわち基板１側から行ってもよく、その反対側のマイクロウェル層２Ａ側から行ってもよい。回収手段にもよるが、通常は、微小物質３の観察は基板１側から行われる。
【００２３】
観察は、微小物質の種類によるが、例えば、顕微鏡により行う。マイクロウェル２１に捕捉された微小物質は必要に応じて全てが脱離、回収されてもよく、観察により識別されて、適宜選択された微小物質のみを脱離、回収してもよい。顕微鏡による観察において微小物質を認識するために、基板１を透過することが必要とされる光は、波長が概ね４００〜８００ｎｍの範囲の可視光である。
【００２４】
ここで、本発明の回収方法においては、図５に示すように、マイクロウェル層２Ａが蛍光標識された微小物質３Ａと蛍光標識されていない微小物質３Ｂを捕捉しており、蛍光標識された微小物質３Ａのみを脱離、回収する場合がある。微小物質を蛍光標識する方法は後述のようにして蛍光体を用いて行われる。蛍光観察は、この蛍光体が励起光により励起され蛍光発光した光を観察する観察手法である。微小物質への励起光の照射およびそれによる蛍光発光の観察は、光（Ｌ）の照射と同じ側、すなわち基板１側から行ってもよく、その反対側のマイクロウェル層２Ａ側から行ってもよい。
【００２５】
微小物質への励起光の照射およびそれによる蛍光発光の観察を、基板１側から行う場合には、基板１を透過することが必要とされる光は、上記に加えてさらに上記観察のための励起光および蛍光発光を含む。励起光および蛍光発光の波長としては、用いる蛍光体の種類によるが、概ね３５０〜８００ｎｍの光が挙げられる。
【００２６】
基板１は、上に説明したとおり、その放射圧により微小物質３を脱離させる光（Ｌ）を必ず透過し、さらに、必要に応じて観察に必要な可視光を透過する性質を有する。なお、本明細書において、所定の波長の光を透過するとは、その波長の光の透過率が６０％以上であることをいう。上記透過が必要とされる光の透過率は７０％以上が好ましく、８０％以上がより好ましい。
【００２７】
基板１は、例えば、光透過性のガラス、樹脂等からなる。ガラスとしては、例えば、石英ガラス、ソーダライムガラス、硼珪酸ガラスなどを使用できる。樹脂としては、例えばＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）等のアクリル樹脂、ＰＶＣ、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＥＮ（ポリエチレンナフタレート）等のポリエステル樹脂などが挙げられる。
【００２８】
ただし、基板１側からマイクロウェル２１内の蛍光標識された微小物質３Ａ（図５参照）を蛍光観察する場合には、基板１は、光透過性を有することに加えて、自家蛍光を発しないか、発しても微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材からなることが適当である。光透過性を有し、かつ自家蛍光を全く発しない素材としては、石英ガラスを挙げることができる。自家蛍光が微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材としては、低蛍光ガラス、アクリル樹脂、ＣＯＣ（シクロオレフィンコポリマー）などを挙げることができる。
【００２９】
基板１の厚さは特に制限されない。通常、微小物質捕捉層が形成されて微小物質捕捉用基板として用いられる基板の厚さと同様とできる。具体的には、０．５〜２ｍｍ程度の厚さの基板１が好ましく用いられる。基板１の主面の大きさについても特に制限されない。
【００３０】
微小物質捕捉用基板１０Ａが基板１の一方の主面に有するマイクロウェル層２Ａは複数のマイクロウェル２１を有する。複数のマイクロウェル２１は同一間隔で縦横に同数が配置されている。図１（ｃ）に部分拡大正面図を、図１（ｄ）はそのＸ−Ｘ線に沿った断面図を示す。マイクロウェル層２Ａにおいて、マイクロウェル２１は、円筒形の開孔部であり、開口面の直径、開孔部の深さは、マイクロウェル２１に収容されるべき微小物質の大きさ、例えば、平均粒子径に合わせて適宜決定される。なお、マイクロウェル２１は、１つのマイクロウェル２１に１個の微小物質のみを収容する形状と寸法を有することが好ましい。
【００３１】
なお、マイクロウェル層が有するマイクロウェルの形状は、マイクロウェル層２Ａが有するマイクロウェルのような円筒形に限定されない。例えば、図２に示す微小物質捕捉用基板が有するような直方体形状のマイクロウェルを有するマイクロウェル層であってもよい。図２に示す微小物質捕捉用基板１０Ｂは、光透過性の基板１の一方の主面上に、開孔部として直方体形状のマイクロウェル２１を有するマイクロウェル層２Ｂを有する。図２（ａ）は微小物質捕捉用基板１０Ｂのマイクロウェル層２Ｂ側から見た正面図、（ｂ）はその断面図、（ｃ）は部分拡大正面図、（ｄ）は（ｃ）のＹ−Ｙ線断面図をそれぞれ示す。
【００３２】
微小物質捕捉用基板１０Ｂにおける基板１は、図１に示す微小物質捕捉用基板１０Ａにおける基板１と同様にできる。直方体形状のマイクロウェル２１の開口面の各辺の長さ、開孔部の深さは、マイクロウェル２１に収容されるべき微小物質の大きさ、例えば、平均粒子径に合わせて適宜決定される。なお、この場合もマイクロウェル２１は、上記同様に１つのマイクロウェル２１に１個の微小物質のみを収容する形状と寸法を有することが好ましい。
【００３３】
さらに、マイクロウェルの形状は、円筒形、直方体形状以外の形状、例えば、複数の面により構成される多面体（六角柱、八角柱等）、逆円錐形、逆角錐形（逆三角錐形、逆四角錐形、逆五角錐形、逆六角錐形、七角以上の逆多角錐形）であってもよい。これらの形状の二つ以上を組み合わせた形状であってもよい。例えば、一部が円筒形であり、残りが逆円錐形であることができる。また、逆円錐形、逆角錐形の場合、底面がマイクロウェルの開口面となるが、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状である（その場合、マイクロウェルの底部は平坦になる）こともできる。円筒形、直方体は、マイクロウェルの底部は通常、平坦であるが、曲面（凸面や凹面）とすることもできる。マイクロウェルの底部を曲面とすることができるのは、逆円錐形、逆角錐形の頂上から一部を切り取った形状の場合も同様である。
【００３４】
マイクロウェル層が有するマイクロウェルの数は、特に制限されない。例えば、略同じ平均粒子径の微小物質から種類の異なる微小物質を選択して回収する場合、略同じ平均粒子径の微小物質の全体数に対する選択回収される微小物質の割合に応じて、それに適した数のマイクロウェルを有するマイクロウェル層が用いられる。マイクロウェル層が有するマイクロウェルの個数は、１ｃｍ２当たり、例えば、２，０００〜１，０００，０００個の範囲とすることができる。
【００３５】
なお、必要に応じて、所定個数のマイクロウェル毎にマーカーが設けられてもよい。さらに、所定個数のマイクロウェルを１つのクラスタとして、そのクラスタが縦横に複数個ずつ配列されたマイクロウェル層のように、所定個数のマイクロウェル毎にグループ分けして基板の主面上に設けられてもよい。
【００３６】
マイクロウェル層２Ａ、２Ｂの本体２２は、例えば、樹脂により構成できる。樹脂としては、例えば、光感光性樹脂あるいは熱可塑性樹脂などが利用できる。光感光性樹脂あるいは熱可塑性樹脂は、基板の材料と同様に、基板１側からマイクロウェル内の微小物質の蛍光観察ができる微小物質捕捉用基板１０Ａ、１０Ｂを提供するという観点から、自家蛍光を全く発しないか、発しても微弱であり上記蛍光観察に支障がない素材からなることが適当である。そのような観点から、マイクロウェル層２Ａ、２Ｂの本体２２は、例えば、シリコーン樹脂、アクリル樹脂等からなることが好ましい。なお、基板１の一方の主面上へのマイクロウェル層２Ａ、２Ｂの形成は、常法によればよい。
【００３７】
微小物質捕捉用基板の微小物質捕捉層がマイクロウェル層の場合、例えば、図３に示す微小物質捕捉用基板１０Ｃのように、マイクロピラーで形成されたマイクロウェル２１を複数有するマイクロウェル層２Ｃが、光透過性の基板１の一方の主面上に配置された構成であってもよい。
【００３８】
図３に示す微小物質捕捉用基板１０Ｃは、光透過性の基板１の一方の主面上に、マイクロウェル層２Ｃを有する。図３（ａ）は微小物質捕捉用基板１０Ｃのマイクロウェル層２Ｃ側から見た正面図、（ｂ）はその断面図である。図３（ｃ）は微小物質捕捉用基板１０Ｃのマイクロウェル層２Ｃ側から見た部分拡大正面図であり、図３（ｄ）はマイクロウェル層２Ｃが有するマイクロウェル２１の部分拡大斜視図である。図３（ｄ）に示すように、マイクロウェル層２Ｃの本体２２は、連続的に並べられた円柱状のマイクロピラー２４の集合体からなり、このマイクロピラー２４に囲まれた直方体形状の空間がマイクロウェル２１として機能する。
【００３９】
マイクロウェル層２Ｂとマイクロウェル層２Ｃは、マイクロウェル層２Ｂにおいて本体２２が隙間なく一体として形成されているのに対して、マイクロウェル層２Ｃにおいて本体２２が連続的に配置されたマイクロピラー２４の集合体である点で異なる以外は、略同様とできる。微小物質捕捉用基板１０Ｃにおける光透過性の基板１は、微小物質捕捉用基板１０Ａにおける光透過性の基板１と同様にできる。
【００４０】
マイクロウェル層２Ｃにおいてマイクロピラー２４の形状は円柱形であるが、これに限定されない。マイクロピラーの形状は、円柱形以外の三角柱、四角柱、五角柱、六角柱等の多角柱等であってもよい。マイクロピラー２４間の隙間の設定は、捕捉する微小物質やこれを含有する検体の種類等に応じて適宜調整可能である。該隙間が存在することで、微小物質をマイクロウェル２１に捕捉する際に、微小物質以外の成分をマイクロウェル２１外に排除しやすくなる。マイクロピラー２４の構成材料としては、上記マイクロウェル層２Ａ、２Ｂにおける本体２２を構成する材料と同様の樹脂が使用可能である。なお、基板１の一方の主面上へのマイクロウェル層２Ｃの形成は、常法によればよい。
【００４１】
以上、図１〜３に示す微小物質捕捉用基板１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃについて説明したが、本発明の回収方法に用いる微小物質捕捉用基板はこれに限定されない。本発明の趣旨に反しない限度において各構成部材の形状や材料等の設計を適宜変更できる。また、必要に応じて上に説明した以外の構成部材を設けてもよい。
【００４２】
（微小物質の捕捉）
（Ａ）工程において、上に説明した微小物質捕捉用基板を用いて、微小物質を含有する検体から微小物質を、微小物質捕捉層に捕捉する方法は、常法による。例えば、図１〜３に示す微小物質捕捉用基板１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃを用いて、微小物質を含む検体から、微小物質３をマイクロウェル２１内に取込む方法について以下に説明する。
【００４３】
まず、検体が固体である場合、検体を液状の媒体に溶解、分散させて液状にした後、この液状物を微小物質捕捉用基板のマイクロウェル層に供給して微小物質の捕捉を行う。以下、検体を媒体に溶解、分散させて得られた液状物を処理液という。また、準備された検体が液状である場合は、それをそのまま処理液としてもよい。必要に応じて、希釈または濃縮したものを処理液としてもよい。処理液における微小物質の濃度は、特に制限されない。捕捉に用いる微小物質捕捉用基板のマイクロウェル層の種類や捕捉操作の際の条件等に応じて適宜調整される。
【００４４】
なお、（Ａ）捕捉工程においては、回収対象となる微小物質の平均粒子径等の大きさや形状等に対応したマイクロウェル層を備える微小物質捕捉用基板を用いる。微小物質捕捉層がマイクロウェル層であり、微小物質の捕捉がマイクロウェル内に微小物質を取込むことで行われる場合、検体に回収対象となる微小物質と略同じ大きさの微小物質が含まれない場合には、捕捉工程において回収対象の微小物質のみが選択的に捕捉されるため、これ以降の工程において分離を行う必要はない。
【００４５】
また、上記において検体に回収対象となる微小物質と略同じ大きさの微小物質が含まれる場合には、回収対象の微小物質と対象以外の微小物質が区別なくマイクロウェル内に取り込まれる。この場合には、以降の工程において分離を行い、最終的に回収対象の微小物質のみを回収する。
【００４６】
微小物質捕捉用基板のマイクロウェル層に処理液を供給する方法としては、ピペット等によるマイクロウェル層上への処理液の回分供給や、処理液中への微小物質捕捉用基板の浸漬、マイクロウェル層の主面上を該主面に平行する方向に処理液を連続的に流して供給する連続供給等が挙げられる。マイクロウェル内への微小物質の効率的な捕捉を目的として、必要に応じて、超音波振動処理、振盪、吸引、加圧、加熱、電圧印加等の操作を加えてもよい。
【００４７】
微小物質捕捉用基板が有する微小物質捕捉層が、吸着等の上記以外の微小物質の特性を利用して微小物質を捕捉する場合にも、上記大きさの特性により微小物質を捕捉する場合と同様に、回収対象とする微小物質のみが捕捉される場合と、回収対象とする微小物質と共にそれ以外の微小物質が捕捉される場合がある。回収対象とする微小物質と共にそれ以外の微小物質が捕捉される場合には、以降の工程において分離を行い、最終的に回収対象の微小物質のみを回収する。
【００４８】
このように、捕捉工程において回収対象とする微小物質と共にそれ以外の微小物質が微小物質捕捉用基板の微小物質捕捉層に捕捉される場合には、以降の工程においてこれらを分離するために、（Ｂ）観察工程の前に、（Ｅ）回収対象とするまたは回収対象としない微小物質を蛍光標識する標識工程を行うことが好ましい。なお、蛍光標識による蛍光観察なしに、または別の処理を施すこと、例えば染色等により、通常の観察で回収対象とする微小物質とそれ以外の微小物質の識別が可能な場合には、（Ｅ）標識工程を行わずに、何もしないか上記別の処理等を行う。
【００４９】
（Ｅ）標識工程
標識工程は、微小物質のうちの特定の微小物質を蛍光標識して蛍光微小物質を作製する工程である。ここで、特定の微小物質は上記において回収対象とする微小物質であっても、回収対象としない微小物質であってもよい。回収対象とする微小物質を蛍光標識して蛍光微小物質とすれば、蛍光観察、脱離工程、回収工程により回収対象となる微小物質が最初の回収工程で回収できる。
【００５０】
回収対象としない微小物質を蛍光標識して蛍光微小物質とすれば、蛍光観察、脱離工程、回収工程により最初の回収工程で、回収対象でない微小物質が回収され、さらに、観察、脱離工程、回収工程を行うことで２回目の回収工程で回収対象の微小物質が回収できる。例えば、回収対象の微小物質の蛍光標識が困難な場合等に、この方法を用いればよい。作業効率の観点から、好ましくは、回収対象とする微小物質を蛍光標識する。
【００５１】
微小物質を蛍光標識する処理は処理液を準備した後、処理液中の微小物質に対して行ってもよく、（Ａ）工程の後、微小物質捕捉用基板の微小物質捕捉層に補足された微小物質に対して行ってもよい。本発明の回収方法の実施形態において（Ｅ）標識工程を有する場合の（Ａ）捕捉工程および（Ｅ）標識工程の順番は、対象とする微小物質やそれを含む検体に応じて適宜選択される。
【００５２】
微小物質を蛍光標識して蛍光微小物質を作製する方法としては、常法を用いればよい。例えば、蛍光標識の対象となる微小物質と所定の蛍光発光を有する蛍光体を準備する。次いで蛍光標識の対象となる微小物質の特定箇所を選択し、その特定箇所と特異的に結合する末端を有する物質を蛍光体に導入する。蛍光標識の対象となる微小物質と、該微小物質の特定箇所と、該特定箇所に特異的に結合する末端を有する蛍光体を結合させて蛍光微小物質を得る。
【００５３】
図６は、上記のようにして得られる蛍光微小物質を概念的に示した図である。蛍光微小物質３０は、蛍光標識の対象となる微小物質３Ａの特定箇所３３に、該特定箇所３３と特異的に結合する末端３２を有する蛍光体３１が該結合を介して結合した構造である。
【００５４】
蛍光体としては、蛍光発光する化合物が特に制限なく使用可能である。蛍光体はそれぞれ独自の蛍光発光の波長を有する。ここで、本発明においては、蛍光発光の異なる２種以上の蛍光体を用いて、それぞれ異なる種類の微小物質を蛍光標識してもよい。そして、以下の蛍光発光の種類ごとに蛍光観察工程、脱離工程、回収工程を行い、蛍光発光の異なる蛍光微小物質を順次回収していくことで、異なる種類の微小物質の分離回収を行ってもよい。
【００５５】
（Ｂ）観察工程
観察工程は、微小物質が捕捉された上記微小物質捕捉層を観察して微小物質の捕捉位置を特定する工程である。ここで、本願発明が対象とする微小物質は、その平均粒子径が概ね３０μｍ以下のものであることから、観察は通常、顕微鏡で行う。
【００５６】
微小物質捕捉層に補足された全ての微小物質を脱離させる場合や、補足された微小物質から形状や色により脱離されるべき微小物質が識別可能な場合、観察は一般的な光学顕微鏡で行う。また、微小物質に蛍光標識を行った場合には、観察は蛍光顕微鏡で行う。いずれの場合も、微小物質捕捉層を観察できれば観察は、微小物質捕捉用基板の基板側から行ってもよく微小物質捕捉層側から行ってもよい。
【００５７】
微小物質捕捉用基板の微小物質捕捉層側から行う場合は、回収手段の形状や種類による。回収手段の種類等によらず一定の観察が行える観点から、観察は微小物質捕捉用基板の基板側から行うことが好ましい。上記のとおり、その場合には微小物質捕捉用基板は、光透過性の基板として、後述の脱離に必要な光とともに観察に必要な光、例えば、可視光や蛍光観察のための励起光、蛍光発光等を透過するものが用いられる。
【００５８】
（Ｂ）工程で、顕微鏡観察により微小物質捕捉層における微小物質の捕捉位置を特定することで、以下の（Ｃ）工程において微小物質を脱離させるために照射する光の照射位置が特定される。なお、顕微鏡観察においては、顕微鏡観察で得られた画像情報をＣＣＤカメラ等で取得し画像解析用コンピュータに送信して利用することも可能である。
【００５９】
（Ｃ）脱離工程
（Ｃ）工程の脱離工程は、（Ｂ）工程で特定された微小物質の捕捉位置に、微小物質捕捉用基板の光透過性の基板側から光を照射し、該光の放射圧により微小物質を微小物質捕捉層から脱離させる工程である。
【００６０】
以下、（Ｃ）工程について、微小物質捕捉層がマイクロウェル層である場合を例に以下に説明する。具体的には、図１に示す光透過性の基板１の一方の主面上にマイクロウェル層２Ａを有する微小物質捕捉用基板１０Ａを用いた場合の（Ｃ）工程について、図４および図５を参照して説明する。図４は、本発明の回収方法の実施形態において微小物質が蛍光標識されていない場合の脱離工程および回収工程の一例を概略的に示す図である。図５は、微小物質が蛍光標識されている蛍光微小物質と蛍光標識されていない微小物質を含む場合の脱離工程および回収工程の一例を概略的に示す図である。
【００６１】
図４には、微小物質捕捉用基板１０Ａが有するマイクロウェル層２Ａのマイクロウェル２１内に捕捉された微小物質３について、（Ｂ）工程の観察により特定された微小物質３の捕捉位置に、（Ｃ）工程において微小物質捕捉用基板１０Ａの光透過性の基板１側から光（Ｌ）を照射し、その放射圧により微小物質３をマイクロウェル層２Ａから脱離させ回収基板４により回収する例が示されている。
【００６２】
図４（ａ）は、微小物質３の捕捉位置に光（Ｌ）を照射するための光照射装置２０と、微小物質捕捉用基板１０Ａと、マイクロウェル層２Ａから脱離した微小物質３を回収するための回収基板４の位置関係を概略的に示す図である。図４（ｂ）は、光（Ｌ）が照射される付近の微小物質捕捉用基板１０Ａと回収基板４を拡大して示す断面図である。図４に示す例においては、光（Ｌ）が照射され、その放射圧によりマイクロウェル層２Ａから脱離された微小物質３の回収は、微小物質捕捉用基板１０Ａのマイクロウェル層２Ａに対向するように配置された回収基板４のマイクロウェル層２Ａに対向する主面上で行う。
【００６３】
図５は、微小物質が蛍光標識されている蛍光微小物質と蛍光標識されていない微小物質を含む場合の微小物質捕捉用基板１０Ａと回収基板４を拡大して示す断面図であり、この場合においても、光照射装置２０と、微小物質捕捉用基板１０Ａと、回収基板４の位置関係は図４（ａ）に示されるのと同様である。図５には、（Ａ）捕捉工程および（Ｅ）標識工程を経た、微小物質捕捉用基板１０Ａが有する、微小物質３Ａが蛍光標識された蛍光微小物質３０と蛍光標識されていない微小物質３Ｂを捕捉したマイクロウェル層２Ａから、光（Ｌ）照射により蛍光微小物質３０が脱離され、回収基板４のマイクロウェル層２Ａに対向する主面上に回収される例が示されている。
【００６４】
なお、図５に示す例では、（Ｂ）観察工程において、観察を蛍光観察で行い蛍光微小物質３０の捕捉位置を特定し、（Ｃ）脱離工程において、観察工程で特定された蛍光微小物質３０の捕捉位置に光（Ｌ）を照射して蛍光微小物質３０をマイクロウェル層２Ａから選択的に脱離させる。
【００６５】
マイクロウェル層２Ａのマイクロウェル２１内から微小物質３や蛍光微小物質３０（以下、「微小物質３等」ともいう。）を、脱離させるために照射される光（Ｌ）について、図４に示す光照射装置２０と共に以下に説明する。光照射装置２０は、光源５と偏光素子６と集光レンズ７を有し、光源５から発せられた光が偏光素子６により方向を変え、集光レンズ７により焦点が脱離される微小物質３等の基板１側の表層に位置するように集光される。図４において点線は光路を示す。
【００６６】
微小物質３等に照射される光（Ｌ）は、その放射圧により微小物質３等をマイクロウェル層２Ａのマイクロウェル２１内から脱離させることができる光（Ｌ）であれば限定されない。脱離に必要とされる放射圧は、微小物質の大きさ、物性等に依存する。さらに微小物質の微小物質捕捉層への捕捉状態に依存する。したがって、光（Ｌ）は微小物質の大きさ、物性、微小物質捕捉層への捕捉状態を適宜勘案して選択される。
【００６７】
光（Ｌ）としては、レーザー光が好ましい。レーザー光としては、例えば、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザーが挙げられる。レーザー光としては、必要とされる放射圧に応じてパルスレーザー光であってもよく、連続波レーザー光であってもよい。
【００６８】
パルスレーザー光の場合、光源５はパルスレーザー光を発生するためのパルス光源である。パルスレーザー光は、微小物質３等に連続波レーザー光以上の放射圧を与えることが可能であり、これにより、微小物質３等の周囲に存在する立体障害の影響を回避することができる。また、微小物質３等がある物質に吸着している場合であっても、パルスレーザー光を対象物に照射することで微小物質３等にエネルギーを与えて、その物質から微小物質３等を取り外すことができる。
【００６９】
パルス光源は、レーザー光の光エネルギーをパルス幅の時間に凝集させて放出する。そのためパルスレーザー光の光強度（パワー）は、通常瞬間的に連続波レーザー光の１万倍から１０万倍となる。連続波レーザー光とは異なり、パルスレーザー光を対象物に照射した場合、放射圧が瞬間的にしか発生しない。光ピンセットの場合、対象物を安定してトラッピングする必要があるため、放射圧が大きいパルスレーザー光を効率的に利用できないが、本発明の回収方法においては、瞬間的に大きな放射圧が作用すれば、微小物質捕捉層から微小物質３等は脱離されるためパルスレーザー光を効果的に使用できる。
【００７０】
パルス光源は、Ｑスイッチレーザーが好ましい。パルスレーザー光の半値全幅は、１００ナノ秒以上１マイクロ秒以下が好ましく、１００ナノ秒以上２００ナノ秒以下がより好ましい。
【００７１】
パルスレーザー光の波長は、熱や光化学反応により微小物質３等が破壊されることがないように、例えば、微小物質３等に吸収されにくい波長とする。一般に生体物質は近赤外線領域の透過性が高く、生体に多く含まれる水は中赤外線領域に吸収をもつ。このため、微小物質３等が、生体物質である場合、特にレーザー光として、近赤外領域（７００〜２５００ｎｍ）の光を用いることが好ましい。パルスレーザー光の波長領域は、７００〜１３００ｎｍが好ましく、８００〜１２００ｎｍがより好ましい。
【００７２】
なお、パルスレーザー光の半値全幅を１００ナノ秒以上と広くするためには、例えば、レーザー光源を連続発光させつつ、所定のタイミングでＱ値を上げる処理を行えばよい。そうすることで、パルスレーザー光としての出力は通常のパルスレーザー光に比べて低くなるが、連続光に比べればはるかにエネルギーが高いパルスレーザー光が得られる。このようなパルスレーザー光は、生体物質を損傷せずに、該生体物質にエネルギーを与えることができる点で好ましい。パルスレーザー光は、微小物質３等を、微小物質捕捉層、例えば、マイクロウェル層２Ａのマイクロウェル２１内から脱離する際にのみ照射されればよく、したがって、パルス光源は、適宜、ＯＮ／ＯＦＦできるようにされていることが好ましい。
【００７３】
上記のとおり高い放射圧を得る観点からは、上記のようなパルスレーザー光を、微小物質捕捉層から微小物質を脱離する際に照射する光（Ｌ）として使用するのが好ましい。ただし、連続波レーザー光によっても、上記脱離に必要な十分な放射圧が得られる場合には、連続波レーザー光を上記光（Ｌ）としてもよい。連続波レーザー光を、微小物質捕捉層から微小物質を脱離する際に照射する光（Ｌ）として使用する場合には、上記においてパルス光源のかわりに連続波光源を用いればよい。連続波レーザー光の波長は、上記パルスレーザー光の波長と同様とできる。
【００７４】
マイクロウェル層２Ａのマイクロウェル２１内に通常、複数個存在する微小物質３等に対応して、各微小物質３を脱離するために光（Ｌ）が照射できるように、微小物質捕捉用基板１０Ａは、回収基板４と共にその主面に対して平行に移動可能な作業ステージ（図示せず）上に配置されることが好ましい。または、光照射装置２０は光（Ｌ）の照射位置が変更可能であるか、光照射装置２０自体が微小物質捕捉用基板１０Ａの主面に対して平行に移動可能であることが好ましい。
【００７５】
図４および図５に示す例では、上記のようにして、マイクロウェル層２Ａのマイクロウェル２１内に存在する複数の微小物質３および蛍光微小物質３０について１個ずつ光（Ｌ）を照射しその放射圧によって脱離させて回収基板４上に回収し、この操作を繰り返すことにより、それぞれ複数個の微小物質３および蛍光微小物質３０が、回収基板４上に回収される。光ピンセットでの回収においては、回収対象の微小物質をトラップして基板上から別の場所に移動させるため、微小物質１個当たりの処理時間が長いのに比較して、上記に説明した本発明の回収方法においては微小物質１個当たりの処理時間が短く効率的な回収が可能である。
【００７６】
（Ｄ）回収工程
（Ｄ）工程は、上記（Ｃ）工程で脱離した微小物質を回収する工程である。すでに、上記の（Ｃ）脱離工程の説明に際して、図４、図５に示す例を参照して（Ｄ）の回収工程についても説明した。（Ｄ）回収工程は、図４、図５に示す例に限定されないが、これらの例のように、回収基板を用いてその主面上に微小物質を回収することが好ましい。
【００７７】
図４、図５に示す例では、回収手段としていずれも、微小物質捕捉用基板１０Ａのマイクロウェル層２Ａに、主面４ａが対向するように配置された回収基板４を用いており、該対向する主面４ａ上に微小物質３および蛍光微小物質３０がそれぞれ回収される。
【００７８】
なお、図５に示すような、微小物質３Ａが蛍光標識された蛍光微小物質３０と蛍光標識されていない微小物質３Ｂを捕捉したマイクロウェル層２Ａから、微小物質を回収する場合には、蛍光観察により蛍光微小物質３０の捕捉位置を特定して、蛍光微小物質３０の脱離、回収を行った後に、別の回収基板を用いて、蛍光標識されていない微小物質３Ｂについて、通常の顕微鏡観察により捕捉位置を特定して、微小物質３Ｂの脱離、回収を行ってもよい。
【００７９】
ここで、微小物質捕捉用基板の微小物質捕捉層と回収基板との距離は、微小物質の種類や大きさにより適宜調整される。例えば、平均粒子径が１０〜１００ｎｍの微小物質を回収する場合、微小物質捕捉用基板の微小物質捕捉層と回収基板との距離は、概ね１０〜３００ｍｍ程度とできる。回収基板の厚さは特に制限されない。微小物質捕捉用基板における光透過性の基板と同等にできる。回収基板の材質についても、特に制限されない。ただし、（Ｂ）工程の観察を回収基板側から行う場合や、例えば、蛍光観察における励起光を回収基板側から照射する場合には、これらにおいて透過が必要とされる光を透過する材料で回収基板を構成する。
【００８０】
また、微小物質捕捉用基板と回収基板は、例えば、両基板を略同寸、同形とし、周縁部に上記距離と同じ厚さのスペーサーを配し、該スペーサーを挟んで両基板を固定した構成とすることが、安定した回収を行う点から好ましい。
【００８１】
さらに、必要に応じて、回収基板の微小物質を回収する側の主面に、上記微小物質捕捉層と同様の構成の微小物質回収層を設けてもよい。微小物質回収層を設けることで、所定の位置に微小物質を留めておくことができ、後の評価の際に微小物質を区別できる点で好ましい。
【００８２】
以上、本発明の微小物質の回収方法およびそれに用いる各種手段やその構成部材について説明したが、本発明の微小物質の回収方法は、これらに限定されない。本発明の微小物質の回収方法においては、本発明の趣旨に反しない限度において、各工程における条件や工程の順番等を適宜変更できる。また、必要に応じて上に説明した以外の工程を設けてもよい。さらに、本発明の微小物質の回収方法に用いる各種手段やその構成部材についても、本発明の趣旨に反しない限度において各種手段それ自体や各構成部材の形状、材料等の設計を適宜変更できる。また、必要に応じて上に説明した以外の構成部材を設けてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明によれば、検体に含まれる微小物質の１個単位の回収を、微小物質の大きさにかかわらず効率よく行うことができる。これにより、特に各種生体微小物質の分析の高速化に寄与できる。
【符号の説明】
【００８４】
１…光透過性の基板、２Ａ，２Ｂ，２Ｃ…マイクロウェル層（微小物質捕捉層）、２１…マイクロウェル、２２…本体、２４…マイクロピラー、３，３Ａ，３Ｂ…微小物質、３０…蛍光微小物質、３１…蛍光体、３２…末端、３３…特定箇所、４…回収基板、１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ…微小物質捕捉用基板、２０…光照射装置、５…光源、６…偏光素子、７…集光レンズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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