(57)【要約】【課題】本発明は、肝細胞増殖促進剤、線維素溶解剤、組織修復剤、癒着防止剤等を提供することを課題とする。【解決手段】本発明は、中皮細胞を含む肝細胞増殖促進剤、線維素溶解剤、組織修復剤、癒着防止剤等を提供する。本発明にかかる肝細胞増殖促進剤、線維素溶解剤、組織修復剤、癒着防止剤等は、細胞シート、細胞懸濁剤、細胞含有ゲル等として製剤化される。【選択図】図３Ｂ
2016030755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中皮細胞を含む肝細胞増殖促進剤。
【請求項２】
さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びオンコスタチンＭを含む、請求項１に記載の肝細胞増殖促進剤。
【請求項３】
前記中皮細胞が、肝中皮細胞である、請求項１又は２に記載の肝細胞増殖促進剤。
【請求項４】
前記中皮細胞が、胎仔から幼児の個体由来である、又は幹細胞から分化させたものである、請求項１から３のいずれか１項に記載の肝細胞増殖促進剤。
【請求項５】
細胞シート、細胞含有ゲル、又は細胞懸濁液として製剤化されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の肝細胞増殖促進剤。
【請求項６】
中皮細胞を含む線維素溶解剤。
【請求項７】
中皮細胞を含む線維素症又は線維素塞栓症治療剤。
【請求項８】
中皮細胞を含む組織修復剤。
【請求項９】
前記組織修復は、傷害組織の溶解除去である、請求項８に記載の組織修復剤。
【請求項１０】
中皮細胞を含むｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−１の発現亢進剤。
【請求項１１】
前記中皮細胞が、肝中皮細胞である、請求項６から１０のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１２】
前記中皮細胞が、胎仔から幼児の個体由来である、又は幹細胞から分化させたものである、請求項６から１０のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１３】
肝臓に用いられる、請求項６から１２のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１４】
細胞シート、細胞含有ゲル、又は細胞懸濁液として製剤化されている、請求項６から１３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項１５】
中皮細胞を含み、細胞含有ゲル、又は細胞懸濁液として製剤化されている、癒着防止剤。
【請求項１６】
中皮細胞を含み、１年以上、又は１年半以上、癒着防止効果が持続する、癒着防止剤。
【請求項１７】
前記中皮細胞が、肝中皮細胞である、請求項１５又は１６に記載の癒着防止剤。
【請求項１８】
前記中皮細胞が、胎仔から幼児の個体由来である、又は幹細胞から分化させたものである、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の癒着防止剤。
【請求項１９】
肝部分切除後の離断面の癒着防止、又は腹膜癒着の防止に用いられ、癒着防止効果を長期維持できる、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の癒着防止剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中皮細胞を含む肝細胞増殖促進剤、線維素溶解剤、線維素塞栓症治療剤、組織修復剤、tPA及び／又はPAI-1の発現亢進剤、及び癒着防止剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
再発率の高い肝がんの治療法として、「繰り返し肝切除」が生存期間の延長や根治を期待しうる方法として最も有効であるとされ、広く施行されている。しかしながら、繰り返し肝切除では、術後癒着の問題がある。術後癒着が生じると、再度肝切除を行う際にまず癒着を剥離する必要があるが、それに伴い、手術時間の延長、出血量の増大、感染症などの合併症の増加といったリスクが高くなる。
癒着は、年齢・性別・人種を問わず腹部手術後には必ず発生する現象であり、肝臓に限らず様々な場所で生じ、腸閉塞、慢性骨盤痛、腹痛、不妊などの原因にもなり得る。
【０００３】
程度の軽いものまで含めると外科手術後93〜100％という高い割合で生じるとされる術後癒着については、これまでにも様々な対処法及び防止法が提案されてきた。例えば、開腹又は腹腔鏡による再手術による癒着の剥離が挙げられるが、前者は患者に過度な負担がかかり、後者は術者に高度な技術を要求する。また、再手術そのものに起因する新たな癒着が生じうるという問題がある。
投薬によって術後癒着を軽減する方法も試みられているが、現時点では効果はほとんど認められていない。
現在、術後癒着に対する最も一般的な対処法として、高分子材料を用いた吸収性癒着防止剤の貼付がある。吸収性癒着防止剤の貼付によって癒着の程度が軽減されることが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、近年のメタアナリシスの結果により、腸閉塞の頻度そのものは減少しないことが判明し、腹腔内膿瘍及び縫合不全の頻度が増加することが明らかとなった（非特許文献２、３）。さらに、吸収性癒着防止剤は、創傷治癒を阻害する可能性や、肝臓に使用した場合、術後胆汁漏のリスクが高くなる可能性も指摘されている。
【０００４】
また、繰り返し肝切除では、癒着の問題に加えて、残存肝の予備能が低下するという問題もある。予備能の低下は、肝不全とつながるため、繰り返し肝切除を行うことができる回数や切除範囲が制限されてしまうという問題がある。
【０００５】
さらに、繰り返し肝切除に伴う問題を解決するために、肝細胞増殖促進、傷害により生じた線維素（フィブリン）による血液凝固・血餅・血栓等の溶解、組織の修復のための方法も必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Fazio, VW. et al., Dis ColonRectum, 49, 1-11, 2006
【非特許文献２】Tang, CL. et al., Ann Surg., 243, 449-455, 2006
【非特許文献３】Zeng, Q. et al., World J Surg., 31, 2125-2131, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、繰り返し肝切除に伴う種々の問題も解決できる手段、具体的には、肝細胞増殖促進剤、線維素溶解剤、組織修復剤、癒着防止剤等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、中皮細胞には、外科手術等によって生じた組織の離断面の癒着を防止する作用に加え、周囲の肝細胞の増殖を促進する作用、周囲の細胞におけるtPAやPAI-1の発現促進による線維素溶解作用や組織修復作用等があることを見出し、本発明を解決するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕中皮細胞を含む肝細胞増殖促進剤；
〔２〕さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）及びオンコスタチンＭを含む、上記〔１〕に記載の肝細胞増殖促進剤；
〔３〕前記中皮細胞が、肝中皮細胞である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の肝細胞増殖促進剤；
〔４〕前記中皮細胞が、胎仔から幼児の個体由来である、又は幹細胞から分化させたものである、上記〔１〕から〔３〕のいずれか１項に記載の肝細胞増殖促進剤；
〔５〕細胞シート、細胞含有ゲル、又は細胞懸濁液として製剤化されている、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の肝細胞増殖促進剤；
〔６〕中皮細胞を含む線維素溶解剤；
〔７〕中皮細胞を含む線維素症又は線維素塞栓症治療剤；
〔８〕中皮細胞を含む組織修復剤；
〔９〕前記組織修復は、傷害組織の溶解除去である、上記〔８〕に記載の組織修復剤；
〔１０〕中皮細胞を含むｔＰＡ及び／又はＰＡＩ−１の発現亢進剤；
〔１１〕前記中皮細胞が、肝中皮細胞である、上記〔６〕から〔１０〕のいずれか１項に記載の剤；
〔１２〕前記中皮細胞が、胎仔から幼児の個体由来である、又は幹細胞から分化させたものである、上記〔６〕から〔１０〕のいずれか１項に記載の剤；
〔１３〕肝臓に用いられる、上記〔６〕から〔１２〕のいずれか１項に記載の剤；
〔１４〕細胞シート、細胞含有ゲル、又は細胞懸濁液として製剤化されている、上記〔６〕から〔１３〕のいずれか１項に記載の剤；
〔１５〕中皮細胞を含み、細胞含有ゲル、又は細胞懸濁液として製剤化されている、癒着防止剤；
〔１６〕中皮細胞を含み、１年以上、又は１年半以上、癒着防止効果が持続する、癒着防止剤；
〔１７〕前記中皮細胞が、肝中皮細胞である、上記〔１５〕又は〔１６〕に記載の癒着防止剤；
〔１８〕前記中皮細胞が、胎仔から幼児の個体由来である、又は幹細胞から分化させたものである、上記〔１５〕から〔１７〕のいずれか１項に記載の癒着防止剤；及び
〔１９〕肝部分切除後の離断面の癒着防止、又は腹膜癒着の防止に用いられ、癒着防止効果を長期維持できる、上記〔１５〕から〔１８〕のいずれか１項に記載の癒着防止剤、
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係る肝細胞増殖促進剤、線維素溶解剤、癒着防止剤等によれば、肝部分切除などの手術後に、離断面に配置するだけで、癒着を防ぎ、臓器や組織における血液凝固・血餅・血栓を溶解し、肝臓の再生を促進することができる。癒着防止、血液凝固・血餅・血栓の溶解、肝細胞増殖、肝臓再生などの効果は、肝切除などの手術に関連しない目的においても得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、マウス肝臓についての従来の肝部分切除法（PHx）と、本発明者らの方法（PPHx）の概要を示す。PPHx法では、離断面が形成される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、PPHx法により肝臓を部分切除したC57BL/6Jマウスの肝離断面を示す。右のパネルは、左のパネルの拡大図である。離断面は点線で囲んだ部分である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、術後10日目の肝離断面における癒着を示す。離断面は点線で囲んだ部分である。
【図１Ｄ】図１Ｄは、癒着部位の組織所見である。術後10日目の肝切片にHE染色を行った。スケールバーは100μmを示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、術後10日、30日、及び548日目の癒着率（平均±SD。術後10日及び30日はn=5、術後548日はn=3。*p<0.05）を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、GFP遺伝子組換えマウスから単離した初代培養の胎仔肝中皮細胞、腹膜中皮細胞、及び線維芽細胞の形態を示す。培養細胞を、位相差顕微鏡で観察した。スケールバーは100μmを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、温度応答性培養皿に移した細胞を示す。低温処理により、細胞はシートとして培養皿から完全に剥離された。
【図２Ｃ】図２Ｃは、細胞シートの移植の概要を示す。上のパネルは、PPHxによって形成された肝離断面へのシートの移植を示す。下のパネルは、PPHx直後にGFPを発現する細胞シートを置いた肝離断面の蛍光を観察した様子を示す。離断面は点線で囲んだ部分である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、術後10日目における、細胞シートあり又はなしの4つの群における癒着率（平均±SD。n=5。**p<0.01（細胞シート(-)に対する））の比較を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、術後30日目の肝離断面の癒着を示す。右のパネルは、左のパネルの拡大図である。離断面は点線で囲んだ部分である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、術後30日目の、肝離断面における胎児肝中皮細胞移植片を示す。GFPシグナルを経口で検出した（左のパネル）。右のパネルは、抗GFP抗体で染色した切断した肝臓の葉と胎児肝中皮細胞シートの垂直断面を示す。スケールバーは100μmを示す。
【図２Ｇ】図２Ｇは、初代培養の胎児肝中皮細胞、腹膜中皮細胞、及び線維芽細胞におけるPCLP1のmRNA発現の相対量をqRT-PCRで測定した結果を示す（3回の独立した実験の平均±SD。**p<0.01）。
【図２Ｈ】図２Ｈは、線溶系関連遺伝子の発現レベルを測定した結果である。術後1日目に、離断面を含む肝切片を採取した。相対的なtPA及びPAI-1のmRNA発現レベルは、qRT-PCRで測定した（平均±SD。n=5。*p<0.05）。
【図３Ａ】図３Ａは、3つの群における肝細胞の増殖の比較を示す。術後3日目に、非移植群、胎児肝中皮細胞シート移植群、腹膜中皮細胞シート移植群の左葉から採取した肝切片について、Ki67蛍光染色を行った。
【図３Ｂ】図３Ｂは、イメージングサイトメトリーによる、術後3日目の左葉におけるKi67陽性肝細胞の定量を示す。黒いバーは、離断面から離れた領域のKi67陽性細胞を示し、白いバーは、離断面に隣接した領域のKi67陽性細胞を示す（平均±SD。n=5。*p<0.05、**p<0.01）。
【図３Ｃ】図３Ｃは、培養胎仔肝中皮細胞、及び培養腹膜中皮細胞におけるHGF、IL-6、HB-EGF、Mdk、及びPtnの相対的なmRNA発現レベルを、qRT-PCRで測定した結果を示す（平均±SD。3つの独立した実験の代表例を示す。**p<0.01）。
【図３Ｄ】図３Ｄは、共培養システムの概要を示す。初代成人肝細胞を、胎仔肝中皮細胞とトランスウェルで共培養した。胎仔肝中皮細胞は、E12.5マウスから単離し、bFGF及びOSM存在下、in vitroで拡大培養した。共培養システムにおける肝細胞の増殖は、WST-1アッセイで測定した（平均±SD。n=3。**p<0.01（コントロールに対して）。++p<0.01（コントロールに対して））。
【図３Ｅ】図３Ｅは、術後3日目の血清アルブミン濃度を示す（平均±SD。n=5。*p<0.05）。
【図３Ｆ】図３Ｆは、PPHx後、図示された日の血清アルブミン濃度を示す（平均±SD。n=5（腹膜中皮細胞移植群の術後10日目はn=4）。*p<0.05。**p<0.01（術後0日目に対して））。
【図４Ａ】図４Ａは、C57BL/6JマウスのGFP遺伝子組換えマウスから調製した胎仔肝中皮細胞シートを、BALP/cマウス、FVB/NJclマウス、及びC3H/H3JJclマウスに移植し、術後30日の癒着率を比較した結果である（平均±SD。n=5。**p<0.01）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａと同様の実験において、術後3日目の左葉のKi67陽性肝細胞を、イメージングサイトメトリーで測定した結果を示す。バーは、離断面から離れた領域におけるKi67陽性細胞の割合（％）を示す（平均±SD。n=5。*p<0.05）。
【図５】図５は、PHx、又はPPHx後の肝臓の傷害の経時変化を示す。ALTレベルとASTレベルを図示された日に測定した（平均±SD。PHxはn=4。PPHxはn=6。）。
【図６】図６は、4つの群について術後30日の癒着率を比較した結果を示す（平均±SD。n=5。*p<0.05（細胞シート(-)に対して））。
【図７】図７は、PPHx後2日目の肝再生を示す。非移植群、胎仔肝中皮細胞移植群、及び腹膜中皮細胞移植群について、術後2日目に、左葉の肝切片のKi67免疫蛍光染色を行った。核をHoechst33342で染色し、細胞外周をAlexa Fluor 488 phalloidinで対比染色した。Ki67陽性細胞はイメージングサイトメトリーで定量した。黒いバーは、離断面から離れた領域におけるKi67陽性細胞を示し、白いバーは、離断面に隣接した領域におけるKi67陽性細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（中皮細胞）
本明細書において「中皮細胞」とは、中皮（胸腔、心嚢、腹腔などの体腔表面を覆う模様組織）の最表面を被覆する単層細胞をいう。中皮とは、胸腔、心嚢、腹腔などの体腔表面を覆う模様組織をいう。本明細書においては、「中皮細胞」という場合、中皮前駆細胞も含む。
【００１２】
中皮細胞は、例えば、腹膜、腸間膜、精巣鞘膜、胸膜、心膜の表層や、肝臓、心臓、肺、大腸などの組織や臓器から単離したものであってもよく、幹細胞（例えば、iPS細胞やES細胞）を分化させて得たものや、線維芽細胞からのダイレクトリプログラミングにより得たものであってもよい。
【００１３】
組織や臓器から単離する場合、中皮細胞は、胎児から成人のいずれに由来するものであってもよいが、例えば、胎児から幼児の間の個体から得ることができる。胎児から幼児の細胞には、肝細胞増殖因子（HGF）、上皮成長因子（EGF）などの成長因子が多く含まれているため、癒着防止に加え臓器や組織の再生促進にも有用である。本明細書において、「臓器や組織の再生促進」とは、臓器や組織が本来有する構成や機能であって、手術や癒着によって損なわれたものの全部又は一部を、元の状態に近づくように回復させることを意味する。
また、中皮細胞は、癒着防止剤の移植対象と同一個体に由来するものであってもよく、移植対象と異なる個体に由来するものであってもよい。
【００１４】
幹細胞から分化させて得る場合、中皮細胞は、例えば、iPS細胞から中胚葉細胞を経て以下の方法で作製することができる。
【００１５】
マウスiPS細胞
マウスiPS細胞は、例えば、Cell, 2010, 142, 787-799に従って、C57BL/6マウスの尾先端の線維芽細胞に3つの因子をレトロウイルスベクターで導入することにより得られる。こうして樹立されるマウスiPS細胞の例として、EGFP遺伝子組換えC57BL/6アダルトマウスから樹立したGT3.2マウスiPS細胞が挙げられる。.
細胞培養
未分化のGT3.2マウスiPS細胞は、ゼラチンコーティングした培養皿上で、フィーダー細胞なしで、LIF、CHIR99021、及びPD0325901を加えた維持培地で維持することができる。細胞培養は、37℃、5％CO2の条件で行うことができる。
細胞培養培地
iPS細胞維持培地は、例えば以下の組成とすることができる。
グラスゴー改変イーグル培地（invitrogen）
10％ウシ胎仔血清
0.1 mM 2-メルカプトエタノール (invitrogen)
0.1 mM非必須アミノ酸 (invitrogen)
1 mM ピルビン酸ナトリウム(invitrogen)
1% L-グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン (sigma)
1000 U/ml マウスLIF (Millipore)
1 μM PD0325901 (Wako)
3 μM CHIR99021 (Millipore)
EB培地は、例えば以下の組成とすることができる。
グラスゴー改変イーグル培地 (invitrogen)
10% ウシ胎仔血清
0.1 mM 2-メルカプトエタノール (invitrogen)
0.1 mM 非必須アミノ酸 (invitrogen)
1 mM ピルビン酸ナトリウム (invitrogen)
1% L-グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液 (sigma)
中胚葉細胞培養培地は、例えば以下の組成とすることができる。
MEM alpha + GlutaMAX培地 (invitrogen)
10% ウシ胎仔血清
50 nM 2-メルカプトエタノール(invitrogen)
1% L-グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン溶液 (sigma)
分化培地は、例えば以下の組成とすることができる。
MEM alpha+GlutaMAX培地(invitrogen)
10%ウシ胎仔血清
50 nMメルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン
10 ng/mL塩基性線維芽細胞成長因子
10 ng/mLオンコスタチンM
抗体
抗体は、例えば以下のものを用いることができる。
抗マウスビオチンPCLP1抗体（MBL）
抗ALCAM抗体（eBioscience）
抗ウサギKi67抗体（Leica）
抗マウスメソセリン抗体
マウスiPS細胞からメソセリン細胞へのin vitroでの分化
胚葉体（embryo body）の形成のために、維持培地をEB培地に交換する。約4日間培養後、細胞を、IV型コラーゲンでコーティングした培養皿で、中皮細胞培養培地中で約7日間培養する。続いて、培地を分化培地に交換して約5日間培養する。
GT3.2マウスiPS細胞由来の中胚葉細胞を単離するためには、セルソーターで、GFP、メソセリン、及びPCLP1陽性細胞画分を選択すればよい。選択後、中皮細胞に分化させるために、インスリン−トランスフェリン−セレニウム−Xを加えた分化培地でさらに培養する。
最後に、GT3.2マウスiPS細胞由来の胎仔中皮細胞を単離するために、GFP、PCLP1、及びALCAM陽性細胞をセルソーターで分離する。
【００１６】
上記の例では、中胚葉細胞は、iPS細胞から分化させたものを使用しているが、本発明に用いられる中皮細胞を作製するための中胚葉細胞の由来は特に限定されず、生体から抽出したものであっても、多能性幹細胞から分化させたものであってもよい。本明細書において多能性幹細胞とは、生体に存在するあらゆる細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能を有する幹細胞であり、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ES細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（nuclear transfer embryonic stem cell；ntES細胞）、精子幹細胞（germline stem cell；GS細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；EG細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；iPS細胞。例えば、Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126:663-676, 2006）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell；Muse細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
多能性幹細胞から中胚葉細胞への分化は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、胚様体（Embryo body；EB）を経由する方法であってもよい。中胚葉細胞は、例えば、血小板由来増殖因子α（PDGFRα）、血管内皮増殖因子2（VEGFR2）等の中胚葉細胞マーカーで特徴づけられる。
【００１８】
一態様において、中皮細胞は、肝中皮細胞である。肝中皮細胞は、肝臓表面を覆う中皮細胞である。また、一態様において、中皮細胞は、「肝中皮細胞前駆細胞」である。肝中皮細胞前駆細胞は、胎仔（胎児）肝中皮細胞ともいい、妊娠１１日〜１３日程度の胎仔肝臓から分離した肝中皮細胞をいい、例えばマウスにおいては、妊娠１１日〜１３日程度の胎仔肝臓から分離した肝中皮細胞と同程度までin vitroで分化させた細胞も含む。
本明細書において、中皮細胞はいかなる哺乳動物に由来するものであってもよく、ヒト、マウス、ラット、マーモセット、ウサギ、ネコ、イヌ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ等が挙げられるがこれらに限定されず、前記、肝中皮細胞前駆細胞は、それぞれ対応する細胞を用いることができる。
【００１９】
（肝細胞増殖促進用剤）
本発明に係る「肝細胞増殖促進剤」は、中皮細胞を含む。後述の実施例に示されるとおり、中皮細胞は周囲の肝細胞の増殖を促進させる機能を有する。
本明細書において、「肝細胞増殖促進剤」とは、in vivo又はin vitroで、肝細胞と共存させると、共存させない場合に比較して肝細胞の増殖を促進する剤をいう。本発明に係る肝細胞増殖促進剤は、in vivoの場合、肝臓の周辺、特に肝部分切除後の離断面周辺に配置することにより、肝細胞の増殖を促進する。in vitroの場合、肝細胞、あるいは肝臓の全部又は一部の組織を培養する培地に添加することにより、当該細胞、又は肝臓組織の肝細胞の増殖を促進する。本発明に係る肝細胞増殖促進剤は、肝実質細胞の増殖促進剤として用いてもよい。
【００２０】
一態様において、本発明に係る「中皮細胞を含む肝細胞増殖促進剤」は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）及びオンコスタチンMと共に使用してもよい。また、本発明に係る「中皮細胞を含む肝細胞増殖促進剤」は、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）及びオンコスタチンMを含んでいてもよい。
bFGF及びオンコスタチンMの濃度は当業者が適宜決定することができるが、例えば、bFGFの濃度は、1ng／mL〜100ng／mL、2ng／mL〜50ng／mL、3ng／mL〜25ng／mL、5ng／mL〜15ng／mL、約10ng／mLとすることができる。オンコスタチンMの濃度は、1ng／mL〜100ng／mL、2ng／mL〜50ng／mL、3ng／mL〜25ng／mL、5ng／mL〜15ng／mL、約10ng／mLとすることができる。
また、オンコスタチンMに代えて、IL−6ファミリーに含まれる成分を用いてもよい。IL-6ファミリーには、例えば、Cardiotrophin-1、IL-11、Leukemia Inhibitory Factor (LIF)、IL-31、ciliary neurotrophic factor (CNTF)、cardiotrophin-like cytokine (CLC)等が知られている。
【００２１】
（線維素溶解剤等）
本明細書において「線維素溶解剤」は、疾患、外傷又は臓器や組織の傷害等により生じた線維素（フィブリン）による血液凝固、血餅、血栓を溶解する組成物をいう。
本発明に係る「線維素溶解剤」は、例えば、血栓症又は血栓塞栓症（例えば、心筋梗塞、脳梗塞、深部静脈血栓症、肺塞栓症、門脈血栓症、腎静脈血栓症、頸静脈血栓症、肺血栓塞栓症。）の予防又は治療剤としても有用である。
【００２２】
本明細書において「組織修復剤」は、手術等により傷害を受けた生体内の組織や血液凝固の溶解除去を意味する。
【００２３】
凝固・線溶系、フィブリンによる血液凝固作用系と、凝固した血液を溶解する作用系のバランスは、線溶活性を表すユーグロブリンクロット溶解時間との関係から、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）とプラスミノーゲン活性化抑制因子（ＰＡＩ−１）の濃度バランスで決まり、特にＰＡＩ−１濃度よりもｔＰＡ濃度が優勢となると、線溶系にバランスが傾くことが知られている（UranoT et al. Thromb Haemost, 2001, 85, p751-752）。本発明者らは、中皮細胞シートを貼付すると、周囲の組織・細胞において、ＰＡＩ−１よりもｔＰＡの発現が優位に亢進することを確認した。このことから、中皮細胞に線溶活性があることが強く示唆される。実際、術後癒着も、フィブリン溶解反応が阻害されてフィブリンの沈着が遷延することで生じると考えられており、中皮細胞シートが癒着を防止したことも、中皮細胞に線溶活性があることを裏付けている。
【００２４】
（癒着防止剤）
本明細書において「癒着防止剤」とは、手術後などに、本来は離れているべき臓器や組織同士がくっついてしまう現象である「癒着」を防ぐことを目的として、癒着が生じる可能性のある臓器や組織に配置する物質をいう。
本明細書において「防止」は、完全に癒着を防ぐことだけでなく、癒着を有意に抑制することも含む。
【００２５】
本発明にかかる癒着防止剤は、臓器や組織に配置した後、その効果が長期間（例えば、１年以上、又は１．５年以上）持続する。癒着防止機能と、癒着を長期間抑制できることとは、別のメカニズムに基づく独立した現象であるものと考えられ、１年を超える長期にわたって当該機能を維持できることは、当業者が予測し得ない効果である。
【００２６】
癒着防止剤は、あらゆる臓器や組織（例えば腸、腹膜）の癒着防止及び／又は再生の促進に用いることができるが、例えば、肝部分切除後の離断面の癒着防止に有用である。肝部分切除後の離断面には、腹腔内の脂肪組織等が付着し、癒着が生じやすい。
現在、原発性肝がんや大腸癌肝転移に対しては、肝切除後の残肝再発に対して「繰り返し肝切除」を積極的に試みることが根治や延命を期待しうる唯一の治療法であるところ、癒着が生じると再手術や再々手術の際にこれを剥離する必要が生じ、大量出血や感染のリスクが高くなる。また、癒着により肝予備能も低下するため、繰り返し回数が制限されるとともに、術後肝不全に陥りやすい。
肝中皮細胞を含む癒着防止剤によれば、肝部分切除後の離断面の癒着を有意に防止することができるとともに、肝再生を促して、肝予備能の低下を防止することもできる。
なお、本明細書において「離断面」とは、臓器や組織の一部を切除又は剥離することによって現れた面をいう。
【００２７】
本明細書において「肝予備能」とは、肝臓自体の働きを意味する。肝予備能は公知の方法によって評価することができ、例えば、肝障害度分類やChild-Pugh分類がよく用いられる。
肝障害度は、腹水、血清ビリルビン値、血清アルブミン値、ICG R15、およびプロトロンビン活性値を測定して評価する方法であり、Child-Pughは、脳症、腹水、血清ビリルビン、血清アルブミン、プロトロンビン活性値を測定して評価する方法である。
【００２８】
本明細書において「肝再生が促される」とは、腹水、血清ビリルビン値、血清アルブミン値、ICG R15、プロトロンビン活性値、及び脳症の数値の少なくとも1つが改善されること；肝障害度分類又はChild-Pugh分類による評価が向上すること；肝臓が大きくなること；肝臓の重量が増えること；肝細胞の増殖が促進されること；及び肝細胞のサイズが大きくなることの少なくとも1つの状態が達成されることをいう。
【００２９】
（製剤化）
本発明に係る、肝細胞増殖促進剤、血栓溶解剤、組織修復剤、及び癒着防止剤は、いずれもその製剤の形態は限定されないが、例えば、細胞シート、細胞含有ゲル、細胞懸濁液として製剤化し、投与・移植することができる。
これらの製剤には、細胞以外の成分（例えば、培地、培地添加物、細胞外マトリックスが挙げられるがこれらに限定されない）が含まれていてもよい。
また、これらの製剤は、中皮細胞を含む限り、他の細胞を含んでいてもよい。細胞シートに含まれる細胞の総数における中皮細胞の割合は、例えば、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上とすることができる。中皮細胞には、中皮細胞に分化する中皮前駆細胞が含まれていてもよい。
【００３０】
（細胞シート）
本明細書において「細胞シート」とは、細胞を主成分とするシートを意味する。シート形状である限り、その構成は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、単層細胞シートであってもよく、二層以上の細胞で形成されたシートや、三次元培養された細胞で形成されたシートであってもよい。典型的には単層細胞シートである。
【００３１】
細胞シートは、公知の培養細胞シートの製造方法又はそれに準ずる方法で製造することができる。
一例として、中皮細胞を、温度応答性高分子でコーティングした培養皿で培養し、中皮細胞がシート状になったら、温度を変えることによって培養皿から回収して細胞シートを得ることができる。温度応答性高分子は、例えば、温度が変わると親水性が疎水性に変化するものが挙げられる。温度応答性高分子は、公知のもの又はそれに準ずるものを用いることができる。温度応答性高分子で予めコーティングされた市販の培養皿を用いてもよい。温度応答性高分子でコーティングした培養皿を用いることにより、支持体を含まず、実質的に中皮細胞のみからなる細胞シートを得ることができる。
【００３２】
細胞シートは、患部や癒着が生じる可能性のある組織又は臓器の表面若しくは離断面等に配置することにより、用いることができる。
【００３３】
（細胞含有ゲル）
本明細書において「細胞含有ゲル」とは、ゲル中に細胞を含む製剤をいう。ゲルはそのまま患部等に配置することができる。ゲルの材料は、細胞含有ゲルが、肝細胞増殖促進、血栓溶解、癒着防止等の所望の効果を奏し、生体に悪影響を与えない限り、特に限定されないが、例えば、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン、デキストラン硫酸、キトサン、セルロース、アガロース、などを使用することができる。例えば、アルギン酸の場合、イオン交換によりゲル化することができ、アルギン酸ナトリウム水溶液にカルシウムイオンを添加することにより、アルギン酸カルシウムゲルを得ることができる。
また、細胞外マトリックス成分をゲル化してもよい。細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン、アテロコラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン等が挙げられる。細胞外マトリックス成分のゲル化は、常法にしたがって行うことができる。例えば、コラーゲンの場合、適当な濃度のコラーゲン水溶液を３７℃に加温することでコラーゲンゲルを得ることができる。細胞外マトリックスのゲル化には、ゲル化剤を用いてもよく、マトリゲル等市販の細胞外マトリクスを用いてもよい。
【００３４】
一態様において、細胞含有ゲルは以下の方法で製造することができる。培養細胞を、必要に応じて、トリプシン処理、遠心処理を行って回収し、シングルセルとなるように培地によく懸濁する。この細胞懸濁液を、培地を含む0.2％アテロコラーゲンと混合し、37℃に加温して30分インキュベートすることによって細胞含有ゲルを得ることができる。市販のゲル細胞培養キットを用いてもよい。
【００３５】
（細胞懸濁液）
本明細書において「細胞懸濁液」は、溶媒に細胞を懸濁した製剤をいう。細胞懸濁液は、注射器などで幹部等に投与することができる。溶媒は、細胞懸濁液が肝細胞増殖促進、血栓溶解、癒着防止等の所望の効果を奏し、生体に悪影響を与えない限り、特に限定されないが、例えば、生理食塩水を用いることができる。
【実施例】
【００３６】
１．材料と方法
〔動物〕
雄の野生型C57BL/6J、BALB/c、C3H/HeJJcl、及びFVB/NJclマウス（10週齢）をNihon CLEAより購入した。GFPを発現するC57BL/6J遺伝子組換えマウスは、大阪大学のOkabe博士より提供を受けた。胚の成長は、膣栓が出現した日からの日数で数え、その日の正午をE0.5とした。すべての実験は、東京大学のthe institutional animal care and use committeeに承認された。
【００３７】
〔肝部分切除（Practical Partial Hepatectomy; PPHx）〕
標準的な70％の肝部分切除（70％ Partial Hepatectomy; 70% PHx）は、公知の方法（Higgins GM and Anderson RM, Arch Pathol 1931;12:186-202.; Mitchell C and Willenbring H, Nature Protocols 2008;3:1167-1170.）に従って行った。PPHxマウスモデルは、以下のように作製した。全身麻酔下で、マウスをあおむけに配置した。開腹後、中葉の根部を糸で結紮して切離した。続いて、電気メスを用いて左葉の周囲の肝臓被膜を焼灼し、左葉を中程で切離した。途中、左門脈と左肝静脈をまとめて結紮し、分離した。次に、精巣上体脂肪組織を腹腔上部まで持ち上げて左葉の離断面に配置した。閉腹する際、精巣上体脂肪組織を腹壁に一針縫いつけてずれないようにした。
癒着部分の最も長い径を、肝離断面の最も長い径で除した値を癒着率とし、各マウスについて測定した。
【００３８】
〔初代胎仔肝中皮細胞の単離と培養〕
胎児肝中皮細胞は、E12.5のGFP遺伝子組換えマウスから、Onitsukaらの方法（Onitsuka, I. et al., Gastroenterology. 138, 1525-1535（2010））に従って単離した。簡単に説明すると、胎児肝組織を刻み、Liver Digest Medium（Life technologies社）で消化した。消化後の肝臓を、70μmのセルストレイナーに通した。フロースルー画分に溶血バッファーを加えて5分間氷上に置き、遠心処理により細胞を回収した。細胞を、ビオチン結合抗PCLP1抗体（MBL社）とインキュベートし、その後、APC結合ストレプトアビジン（Invitrogen社）と共にインキュベートした。サンプルをセルソーターMoflo XDP（Beckman Coulter社）でソーティングし、GFP+PCLP1high細胞をソートした。ソーティングの後、IV型コラーゲンでコーティングした培養皿で、MEMα培地＋GlutaMAX培地（10％ウシ胎児血清、50nmol/Lのメルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミン、10ng/mLの塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、10ng/mLのオンコスタチンM（OSM）、10ng/mLの骨形成タンパク質7、及びインスリン−トランスフェリン−セレニウム−Xを含む。）を用いて、37℃、5％CO2インキュベーターで培養した。
【００３９】
〔初代成人線維芽細胞及び初代成人腹膜中皮細胞の単離と培養〕
成人線維芽細胞は、GFP遺伝子組換えマウスの皮膚組織から採取した。皮膚組織を刻み、0.05%トリプシンと0.5mMのEDTAにより、37℃で20分処理した。細胞懸濁液を遠心処理し、10%FBSとペニシリン、ストレプトマイシン、及びグルタミンを含むDMEM培地に再懸濁した。
成人腹膜中皮細胞は、GFP遺伝子組換えマウスの精巣上体脂肪から、Loureiroらの方法（Loureiro, J. et al., Nephrol Dial Transplant. 25, 1098-1108（2010））に従って採取した。精巣上体脂肪を、0.05%トリプシンと0.5mMのEDTAにより、37℃で30分処理した。細胞懸濁液を遠心処理し、ペレットを、氷上で5分間溶血処理した。PBSで数回洗浄後、腹膜中皮細胞は、20％FBS、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及びハイドロコルチゾン（0.4μg/mL）を含むRPMI1640培地に再懸濁し、I型コラーゲンでコーティングした培養皿に播種した。
【００４０】
〔細胞シートの作製とPPHxマウスへの移植〕
それぞれの初代培養細胞を、UpCell（登録商標）プレート（セルシード社）に移し、37℃で4日間培養した。プレートを室温に置くことにより、細胞を培養皿から回収し、細胞シートを得た。
PPHxを施した直後のマウスの肝離断面に細胞シートを移植し、閉腹した。130S-GFPカメラ（Science eye社）によりGFPシグナルを検出した。
【００４１】
〔肝機能検査〕
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）と、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の血漿中濃度を、市販のキット（Transaminase C2-Test Wako、和光純薬社）で測定した。血清アルブミン濃度は、オリエンタル酵母社が測定した。
【００４２】
〔組織化学分析〕
左葉の凍結切片（8μm）を、Microm HM505Eクライオスタット（Microm International GmbH）で調製し、APSでコーティングしたスライドガラス（松浪硝子社）に配置した。切片を、4％パラホルムアルデヒドを含むPBSで固定し、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行った。
免疫組織化学分析のため、切片を5%スキムミルクを含むPBSで1時間ブロッキングし、1次抗体と共に一晩4℃でインキュベートした。1次抗体としては、ウサギ抗マウスGFP抗体、及びウサギ抗マウスKi67抗体を使用した。核は、Hoechst33342（Sigma-Aldrich社）で対比染色した。細胞の外周は、Alexa Fluor 488 phalloidinで対比染色した。シグナルは、Alexa Fluor 488ロバ抗ウサギIgG（H+L）、又はAlexa Fluor 555ヤギ抗ウサギIgG（H+L）（Invitrogen社）で可視化した。
【００４３】
〔細胞サイズの測定と増殖した細胞数〕
肝細胞のサイズと、Ki67陽性肝細胞数は、IN Cell Analyzer2000（GE Healthcare社）を用い、Miyaokaらの方法に従って行った（Miyaoka Y. et al., Curr Biol. 22, 1166-1175（2012））。各マウスについて、約1600〜2000の肝細胞を調べた。
【００４４】
〔定量RT-PCR〕
各細胞シート、又は離断面を含む左葉から、術後1日目にTRIzol試薬（Invitrogen社）を用いて全RNAを抽出し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（タカラバイオ社）でcDNAを合成した。LightCycler 480（Roche社）と以下のプライマーを用いて定量RT-PCRを行った。サンプルは、マウスβアクチンとUniversal ProbeLibrary Mouse ACTB Gene Assay（Roche社）を用いて標準化した。
マウスPCLP1：
TCCTTGTTGCTGCCCTCT（配列番号：１）
CTCTGTGAGCCGTTGCTG（配列番号：２）
マウスHGF：
CACCCCTTGGGAGTATTGTG（配列番号：３）
GGGACATCAGTCTCATTCACAG（配列番号：４）
マウスIL6：
GCTACCAAACTGGATATAATCAGGA（配列番号：５）
CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA（配列番号：６）
マウスMdk：
CGCACTGGTAAAACCGAACT（配列番号：７）
GAAGAAGCCTCGGTGCTG（配列番号：８）
マウスPtn：
AGGACCTCTGCAAGCCAAA（配列番号：９）
CACAGCTGCCAAGATGAAAAT（配列番号：１０）
マウスβアクチン：
CTAAGGCCAACCGTGAAAAG（配列番号：１１）
ACCAGAGGCATACAGGGACA（配列番号：１２）
マウスｔPA：
GCTACGGCAAGCATGAGG（配列番号：１３）
GGACGGGTACAGTCTGACG（配列番号：１４）
マウスPAI-1
AGGATCGAGGTAAACGAGAGC（配列番号：１５）
GCGGGCTGAGATGACAAA（配列番号：１６）
マウスHB-EGF
TGATAGCTTTGCGCTGTGAC（配列番号：１７）
CCAAGGAAGAAGGGCTTTGT（配列番号：１８）
【００４５】
〔胎仔肝中皮細胞と肝細胞の共培養、及びWST-1アッセイ〕
C57BL/6Jアダルトマウスの肝臓から肝細胞を単離した。簡単に説明すると、肝臓をLiver perfusion medium（Invitrogen社）でかん流し、続いて、0.5g/lのIV型コラゲナーゼと0.25g/lのDNase I（Sigma-Aldrich社）を含むBasic perfusion solution（10%ウシ胎仔血清、136mMのNaCl、5.4mMのKCl、5mMのCaCl2、0.5mMのNaH2PO3 2H2O、0.42mMのNa2HPO3 12H2O、10mMのHEPES pH7.5、5mMのグルコース、及び4.2mMのNaHCO3）でかん流した。消化した肝臓を刻み、ピペッティングで分散させてから、70μｍのセルストレイナーを通した。遠心処理後、ペレットを際懸濁させ、50％パーコールを用いた密度勾配遠心分離で肝細胞を精製した。ラミニン111でコーティングした24穴プレートの各ウェルに、MEM alpha+GlutaMAX培地（10％FBS、50nMメルカプトエタノール、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミンを含む）を加え、2×103個の肝細胞を配置し、in vitroで拡大培養した1×105個の胎仔肝中皮細胞の存在下、又は非存在下で培養した。胎仔肝中皮細胞の存在下で培養する場合は、3.0μMの穴が開いたトランスウェル（Corning社）を用いた。胎仔肝中皮細胞は、10ng/mLのbFGF、及び10ng/mLのOSMの存在下で、拡大し維持した。bFGFとOSMは、肝細胞と共培養する際にも培地に加えた。肝細胞の増殖は、共培養開始から3日目に、WST-1アッセイで行った。
【００４６】
２．結果
〔術後癒着モデルマウス〕
図１Ａ左に示されるとおり、従前の方法（70% PHx）で作製された肝部分切除モデルは、肝臓の離断面が露出せず、癒着モデルとして使用できなかった。本発明者らの方法（PPHx）によれば、図１Ａ右及び図１Ｂに示されるとおり、肝離断面が作られる。PPHxモデルと、70% PHxモデルにおける肝臓の損傷の程度を調べるために、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）と、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の血漿中濃度を測定した（図５）。いずれのモデルにおいても、AST濃度は術後1日目に増大し、2日目に低下した。一方、ALT濃度は、PPHxモデルにおいては術後1日目にピークとなり、その後徐々に低下したが、PHxモデルにおいては2日目に急激に低下した。PPHxモデルのALT濃度の減少の経過は、ヒトの肝切除後の経過に類似していた。
術後10日目、PPHxモデルは、肝離断面の広い領域に、脂肪組織の重度の癒着が見られた（図１Ｃ）。HE染色により、PPHxモデルでは、ヒトと同様に、肝細胞と脂肪細胞の間に線維芽細胞からなる強固な癒着組織が見られた（図１Ｄ）。癒着部分の最も長い径を、肝離断面の最も長い径で除した値を癒着率として計算したところ、C57BL/6Jマウスでは、術後10日目にほぼ100％となった（図１Ｅ）。癒着率は、術後30日までにある程度低下したが、その後は同じレベルが長期間続き、術後548日においても癒着が維持されていた。以上の結果から、PPHxモデルは、ヒトの肝切除の治癒プロセスを反映するモデルであると認められた。
【００４７】
〔胎仔肝中皮細胞シートを用いた、PPHx後の癒着防止〕
次に、胎仔肝中皮細胞によって、PPHxモデルにおける術後の癒着を防止できるか検討を行った。セルソーターを使用して、GFP遺伝子組換えマウスからGFP陽性の胎仔肝中皮細胞を単離し、培養した。コントロールとして、成人腹膜中皮細胞と成人皮膚線維芽細胞を用意した（図２Ａ）。温度応答性培養皿で、各細胞から細胞シートを形成し（図２Ｂ）、PPHxモデルマウスの肝離断面に移植した。細胞のGFPシグナルをモニターして、細胞シートが離断面に正確に接着したことを確認した（図２Ｃ）。移植後30日には、ほとんど癒着が見られなかった（図２Ｅ）。術後10日、30日のいずれにおいても、非移植群に比較して、移植群では有意に癒着率が低下したが、癒着防止効果は胎仔肝中皮細胞の方が高かった（図２Ｄ、２Ｅ、６）。腹膜中皮細胞移植群においても癒着率は低下した。一方、線維芽細胞移植群は、非移植群と同程度の癒着が見られた。
また、術後30日においても、胎仔肝中皮細胞シートのGFPシグナルは離断面の表面のみで検出され、胎仔肝中皮細胞は、他の細胞中に浸潤したり、他の細胞に変換されたりしないことが確認された。
【００４８】
〔胎仔肝中皮細胞シートによる癒着防止効果のメカニズム〕
続いて、各細胞シートにおけるポドカリキシン様タンパク質1（Podocalyxin-like protein 1; PCLP1）の発現を調べた。PCLP1は、膜透過型シアロムチンタンパク質ファミリーの1つであり、胎仔肝中皮細胞に多く発現することがが知られている（Kerjaschki D. et al. J Cell Biol 1984, 98:1591-1596.; Dekan G. et al. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88:5398-5402）。PCLP1の発現レベルは、線維芽細胞シートに比較して、胎仔肝中皮細胞シートと腹膜中皮細胞シートで有意に高かった（図２Ｇ）。
また、術後癒着の重症度は、線溶系に関与している。術後数日間、線溶系は、組織型プラスミノーゲン活性化因子（tPA）と1型プラスミノーゲン活性化因子阻害剤（PAI-1）に制御され、活性化される。術後1日目のtPAのmRNA発現レベルは、非移植群に比較して胎仔肝中皮細胞シート移植群において有意に高かった（図２Ｈ）が、PAI-1発現レベルには有意な差は見られなかった。これらの結果は、胎仔肝中皮細胞が、線溶系をさらに活性化することによって術後癒着を抑制していることを示唆している。
【００４９】
〔胎仔肝中皮細胞シートによるPPHx後の肝再生の促進〕
胎仔肝中皮細胞又は腹膜中皮細胞が、残存する肝臓の再生に寄与するか検討を行った。細胞分割の程度を評価するために、Ki67蛍光染色を行った。各グループにおいて、肝細胞は術後2日目で細胞周期に入り（図７）、術後3日目に、肝細胞の増殖が、より活性化された（図３Ａ、３Ｂ）。肝細胞の増殖は、胎児肝中皮細胞移植群の肝臓において、特に亢進した。また、肝細胞の増殖は、胎児肝中皮細胞シートを配置した離断面の表面だけでなく、離断面から離れた肝臓内部でも見られた。これらの結果から、胎児肝中皮細胞シートによる肝細胞への効果は、細胞シートと肝臓の直接の接触だけによるのではなく、胎児肝中皮細胞から肝細胞に何らかの可溶性因子が放出されることにもよることが示唆された。
続いて、各細胞シートが産生するサイトカインを分析し、これらが肝臓の再生を促進するか検討を行った（図３Ｃ）。胎仔肝中皮細胞におけるヘパリン結合EGF様増殖因子（HB-EGF）、ミッドカイン（Mdk）、及びプレイオトロフィン（Ptn）のmRNA発現レベルは、腹膜中皮細胞における発現レベルより有意に高かった。ミッドカインとプレイオトロフィンは、肝臓の発達や再生を促進することが知られている。
次に、初代肝細胞を胎仔肝中皮細胞とトランスウェルで共培養し、肝細胞の増殖をin vitro WST-1アッセイでモニターした（図３Ｄ）。共培養中、胎仔肝中皮細胞を維持するために、培地にbFGFとOSMを加えた。その結果、肝細胞の増殖は、胎児肝中皮細胞存在下では有意に促進された。
以上より、胎児肝中皮細胞は、ミッドカインやプレイオトロフィンなどの可溶性因子を分泌して肝細胞の増殖を促進させるものと考えられた。
【００５０】
〔胎仔肝中皮細胞によるPPHx後の肝臓の機能的回復〕
術後、各マウス群について、肝機能のよい臨床的指標として知られている血清アルブミン濃度を測定した。術後3日目、胎児肝中皮細胞移植群では、コントロール群に比較して、血清アルブミン濃度が著しく高かった（図３Ｅ）。胎仔肝中皮細胞移植群では、術後3日目の血清アルブミン濃度の減少が抑えられ、術後5日目には正常レベルまで回復した（図３Ｆ）。
以上の結果から、胎児肝中皮細胞の移植は、PPHx後、早い段階で肝機能を著しく改善し、再生を促進することが示唆された。
【００５１】
〔他家胎仔肝中皮細胞による術後癒着の抑制と肝再生〕
C57BL/6Jから作製したGFP遺伝子組換えマウス由来のGFP陽性胎仔肝中皮細胞シートを調製し、MHCの異なる系統のマウスである、BALB/c、FVB/NJcl、及びC3H/HeJJclマウスに移植した。胎仔肝中皮細胞シートの移植により、すべての系統のマウスにおいて、術後30日の癒着率は有意に低下した（図４Ａ）。また、肝細胞の増殖を調べたところ、肝臓におけるKi67陽性肝細胞の割合は、BALB/cマウスにおいては、胎児肝中皮細胞シート移植群で有意に高くなった。FVB/NJcl、及びC3H/HeJJclマウスにおいても、肝細胞の増殖が促進される傾向が見られた（図４Ｂ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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