(57)【要約】【課題】より正確なレポーター遺伝子アッセイを可能とする細胞株を提供する。【解決手段】活性化した転写因子が結合する応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（a）を連結したプラスミド（A）がゲノム上の任意の部位に組み込まれており、同じ活性化した転写因子が結合しない非応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（b）を連結したプラスミド（B）が前記部位とは別のゲノム上の部位に組み込まれている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化された転写因子が特異的に結合する応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（a）を連結したプラスミド（A）がゲノム上のある部位に組み込まれており、同じ活性化された転写因子が結合せず、恒常的に働く非応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（b）を連結したプラスミド（B）が前記とは異なるゲノム上の部位に組み込まれていることを特徴とするレポーター遺伝子アッセイ用細胞株。
【請求項２】
レポーター遺伝子（a）とレポーター遺伝子（b）がホタルルシフェラーゼ遺伝子とウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の組み合わせである請求項１の細胞株。
【請求項３】
受容体がアリル炭化水素受容体（AhR）であり、応答性プロモーター領域はXRE配列を有する請求項１または２の細胞株。
【請求項４】
請求項１から３記載の細胞株の樹立方法であって、プラスミド（A）を細胞に導入し、これを安定的に発現する細胞を選別し、次いでその細胞にプラスミド（B）を導入しこれを安定的に発現する細胞を選別するか、またはその逆の順番で細胞導入と選別を行うことによって、各々ゲノム上の別の部位にプラスミド（A）とプラスミド（B）を組み込むことを特徴とするレポーター遺伝子アッセイ用細胞株の樹立方法。
【請求項５】
請求項１記載のレポーター遺伝子アッセイ用細胞株にサンプルを接触させ、レポーター遺伝子（b）の発現量を基準として補正したレポーター遺伝子（a）の発現量を指標としてサンプルが特異的にその転写因子を活性化するか否かを判定することを特徴とするレポーター遺伝子アッセイ。
【請求項６】
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中または成人ヒト血清（AHS）中の細胞株にサンプルを接触させる請求項５のレポーター遺伝子アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レポーター遺伝子アッセイ用細胞株と、この細胞株の樹立方法、この細胞株を用いたレポーター遺伝子アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のリガンド依存性転写因子は固有のリガンドが結合することによって活性化する転写因子であり、活性化した転写因子は標的遺伝子のプロモーター領域に特異的に結合する。この結合により受容体は標的遺伝子の発現を正負に制御し、薬剤や化学物質等の体外物質、あるいはステロイド、グルコース、脂質等の体内物質の代謝等に重要な役割を果たしている。
【０００３】
アリル炭化水素受容体（AhR）はダイオキシン類［例えば2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン（TCDD））］や多環芳香族炭化水素（PAH）［例えばベンゾ[a]ピレン（B[a]P）］などの毒性化学物質によって活性化されることが古くから知られているリガンド依存性転写因子である。AhRは内因性物質［例えばビリルビン（非特許文献１）］、栄養成分［例えばインドール-3-カルビノール（非特許文献２）］および薬物代謝産物［例えば3-メチル-2-チオヒダントイン（MTH）（非特許文献３）］などによっても活性化される。活性化されたAhRは、Arntなる他因子とヘテロ二量体を形成し、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、ALDH3A1、NQO1、UGT1A1等の標的遺伝子の転写制御領域にある応答配列（XRE）に特異的に結合し、これらの発現を増強する（非特許文献４）。これらの遺伝子の多くは、代謝や有害物質の解毒に重要な役割を果たしている。
【０００４】
任意のサンプルがリガンド依存性転写因子を活性化するか否かを判定する方法としてレポーター遺伝子アッセイが知られている。細胞内に取り込まれた活性化物質が結合し、活性化した転写因子が特定の遺伝子の近傍に存在する特異的応答配列に結合し、その遺伝子の転写が促進されるが、レポーター遺伝子アッセイは、この活性化した転写因子が特異的に結合するプロモーターの下流にレポーター遺伝子を連結し、レポーター遺伝子（もともと細胞が内因性には発現していないルシフェラーゼ遺伝子など）の発現量を指標としてサンプルが転写因子を活性化するか否かを判定する方法である。様々なリガンド依存性転写因子を対象としたレポーター遺伝子アッセイが確立されており、またそのための専用の細胞株も樹立されている（例えば、特許文献１）。
【０００５】
AhRについても、活性化AhRの応答配列（XRE）をプロモーター領域に有するレポーター遺伝子を安定発現させた哺乳動物細胞（肝癌由来細胞など）を樹立した報告が幾つか存在する。また、ダイオキシン等のAhR活性化物質の検出や含有量を推定するためのアッセイ系として商業化もされている（例えば、CALUXアッセイ：http://www.calux.jp/c-profile.html）.
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2007-209284号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Sinal CJ, Bend JR (1997) Aryl hydrocarbon receptor-dependent induction of cyp1a1 by bilirubin in mouse hepatoma hepa1c1c7 cells. Mol Pharmacol 52: 590-599.
【非特許文献２】Miller CA 3rd (1997) Expression of the human aryl hydrocarbon receptor complex in yeast. Activation of transcription by indole compounds. J Biol Chem 272: 32824-32829. doi: 10.1074/jbc.272.52.32824
【非特許文献３】Ishikawa T, Okinaga H, Takahashi S, Numakura M, Mashimo Y, et al. (2012) Serum from methimazole-treated patients induces activation of aryl hydrocarbon receptor, a transcription factor that binds to dioxin-response elements. Thyroid 22: 769-777. doi: 10.1089/thy.2012.0057
【非特許文献４】Okey AB, Franc MA, Moffat ID, Tijet N, Boutros PC, et al. (2005) Toxicological implications of polymorphisms in receptors for xenobiotic chemicals: the case of the aryl hydrocarbon receptor. Toxicol Appl Pharmacol 207: 43-51. doi: 10.1016/j.taap.2004.12.028
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
転写因子の活性化に反応して発現が上昇するレポーター遺伝子は、理論上、転写因子の活性化とは無関係な刺激によっても発現が増減しうる。例えば、細胞内の遺伝子発現を総じて増加させるような細胞増殖刺激が加わった場合は、活性化転写因子に特異的な応答経路を介さずにレポーター遺伝子の発現が増加しうるが、そのような場合も試験サンプルはその転写因子の活性化物質であると誤判定される可能性がある。
【０００９】
従来、様々な刺激による細胞内の特定遺伝子の発現量（mRNAや蛋白の量）の増減を論じる場合には、前記のような遺伝子発現の非特異的な増減による誤判定を防ぐため、刺激の種類によって影響を受けにくい内部標準遺伝子（例えば、GAPDHやβ-アクチン等）の発現量で目的遺伝子の発現量を除するという補正が行われている。しかしながら、これまで確立されてきたレポーター遺伝子アッセイでは、レポーター遺伝子の発現量に対する適切な補正は行われていない。
【００１０】
本発明は、非特異的なレポーター遺伝子の発現増加による誤判定を防ぎ、より正確に転写因子活性化リガンドを検出、定量できる新たなレポーター遺伝子アッセイ系を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を解決するための手段である本発明は、活性化した転写因子が特異的に結合する応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（a）を連結したプラスミド（A）がゲノム上のある部位に組み込まれており、活性化した転写因子が結合しない非応答性プロモーターの下流に異なるレポーター遺伝子（b）を連結したプラスミド（B）がゲノム上の異なる部位に組み込まれていることを特徴とするレポーター遺伝子アッセイ用細胞株である。
【００１２】
この細胞株における一つの態様は、レポーター遺伝子（a）とレポーター遺伝子（b）の組み合わせとしてホタルルシフェラーゼ遺伝子とウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を用いている点である。
【００１３】
またこの細胞株における別の態様は、転写因子がAhRであり、応答性プロモーター領域がXRE配列を有することである。
【００１４】
本発明は、また、前記の細胞株の樹立方法であって、細胞内に導入したプラスミド（A）がゲノム上に組み込まれレポーター遺伝子(a)を安定的に発現する細胞を選別し、次いで導入したプラスミド（B）がゲノム上の別の部位に組み込まれレポーター遺伝子(b)を安定的に発現する細胞を選別するか、またはその逆の順番で導入と選別を行うことによって、ゲノム上の異なる部位にプラスミド（A）とプラスミド（B）を組み込むことを特徴とするレポーター遺伝子アッセイ用細胞株の樹立方法である。
【００１５】
さらに本発明は、前記のレポーター遺伝子アッセイ用細胞株にサンプルを接触させ、レポーター遺伝子（b）の発現量を基準として補正したレポーター遺伝子（a）の発現量を指標としてサンプルが転写因子を特異的に活性化するか否かを判定することを特徴とするレポーター遺伝子アッセイである。
【００１６】
そして、このAhRを扱うレポーター遺伝子アッセイでは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中または成人ヒト血清（AHS）中の細胞株にサンプルを接触させることを好ましい態様としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の細胞株は、転写因子の活性化に反応して特異的に発現が増強するレポーター遺伝子（a）と、転写因子の活性化とは無関係に恒常的に発現するレポーター遺伝子（b）を備えている。そして、これらのレポーター遺伝子（a）（b）はゲノム上の異なる部位に組み込まれているため、レポーター遺伝子（b）の発現がプラスミド（A）上に存在する転写因子応答配列に依存した発現制御を受けることはない。従って、レポーター遺伝子（b）の発現量を基準として補正したレポーター遺伝子（a）の発現量を指標としてサンプルが転写因子を活性化するか否かを判定することができるため、非特異的な発現増減に基づく誤判定のリスクを排除することができる。
【００１８】
また、本発明のレポーター遺伝子アッセイの一つの態様において、PBSまたは純粋AHSはAhRなどの転写因子の活性化因子を含まないと考えられるために、サンプルが転写因子活性化物質であるか否かを優れた感度、再現性で判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】血清添加によるDMEMによるAhR活性化の阻害。HepG2-XRE細胞を、10μM CH（CH+）または0.1％（v/v）DMSO溶媒（CH-）と共に表示された条件中で4時間静置した。ウミシイタケルシフェラーゼ活性値で除して補正を行ったホタルルシフェラーゼ活性値の変化が、ウミシイタケルシフェラーゼ活性値の極端な高値ないし低値に由来している可能性を否定するために、ウミシイタケルシフェラーゼ活性値のみのグラフも示している。エラーバーは同条件に置いた３つのウェルの標準偏差（SD）を示す。アステリスクは、CHを含まないPBS中に置いた細胞（第1カラム）に比べて有意（p<0.05）に高い補正ホタルルシフェラーゼ活性値を示している。第1カラムの平均値を1.0とした。
【図２】様々な実験環境においてMTHが惹起するAhR活性。HepG2-XRE細胞を80μM MTH（MTH+）または0.1％（v/v）DMSO（MTH-）と共に各実験環境中で4時間培養した。（A）および（B）は異なる時に同じ材料およびプロトコールを用いて行った同じ実験である。ウミシイタケルシフェラーゼ活性値のグラフは図1と同目的で示されている。エラーバーは、同条件の３つのウェルのSDを表す。アステリスクは、MTH添加のないPBSに置いた細胞（第1カラム）に比べて有意（p <0.05）に高い補正ホタルルシフェラーゼ活性値を示す。第1カラムの平均値を1.0とした。
【図３】コーヒーその他の飲料によるAhRの活性化。HepG2-XRE細胞を各化学物質または飲料（表1）と共に、PBS（A）、50％（v/v）AHSを含むPBS（B）またはAHS（C）中に4時間置いた。ウミシイタケルシフェラーゼ活性のグラフを図1と同じ目的のため表示している。CH+およびCH-は、それぞれ10μM CHないしその溶媒である0.1％（v/v）DMSOの添加を示す。0.1％（v/v）DMSOをTCDD（10-9、10-8、10-7および10-6 M）、MTH（80μM）およびB[a]P（10μM）の溶媒として使用しているため、等量のDMSOを、TCDD、MTHまたはB[a]Pを添加していない試料に加えてある（すなわち、第3〜11カラム以外の全てのカラム）。飲料［10％（v/v）］を加えていない試料（すなわち、第1〜11カラム）では、等量の蒸留水を対照として加えた。エラーバーは３つのウェルのSDを示している。（A）、（B）および（C）の実験は同時に行われ、（A）のCH非添加の値（第1カラム）の平均を1.0とし、（B）および（C）の値もこれに基づいて示している。アステリスクは、各グラフのCH非添加（第1カラム）の対照細胞に比べて有意（p<0.05）に高い補正後ホタルルシフェラーゼ活性を示している。
【図４】コーヒーによるCYP1A1 mRNAの発現誘導。HepG2（A）、Caco-2（B）およびMCF-7（C）細胞を、TCDD濃度を10-6 Mのみとしたことを除き、図３同様に添加した各試料と共にPBSまたはAHSに4時間置いた。エラーバーは3つのウェルのSDを示す。PBS中でDMSOを添加したコントロール細胞の平均値を1.0とした。アステリスクは、AHS中に置いたコントロール細胞（矢頭）との有意差（p<0.05）を表す。
【図５】コーヒーによるCYP1A1蛋白の発現誘導。HepG2（A）、Caco-2（B）およびMCF-7（C）細胞を、TCDD濃度を10-6 Mのみとしたことを除き、図３同様に添加した各試料と共にPBSまたはAHSの中に4時間または24時間置いた。CYP1A1蛋白は4・24時間のいずれでもPBS中に置いた細胞では検出不能であったため、AHS中に置いた細胞の結果のみを示す。CYP1A1蛋白のシグナル（56 kDa）を明確に可視化するため、同時に検出したβアクチンのバンド（43 kDaの）が過度に強いイムノブロットの図を示す。２回の実験（1stおよび2nd）を独立して行った。対照の細胞でみられた値を1.0と定めた補正後のバンドの強度（CYP1A1／βアクチン）の値を、各イムノブロットの下に記した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の細胞株では、活性化した転写因子が結合する応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（a）を連結したプラスミド（A）があるゲノム上の部位に組み込まれており、活性化した転写因子の影響を受けない非応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（b）を連結したプラスミド（B）が（A）とは別のゲノム上の部位に組み込まれている。
【００２１】
応答性プロモーターとは、活性化転写因子が特異的に結合する応答配列を含むプロモーターを意味する。非応答性プロモーターとはその応答配列を含まないため、その転写因子の活性化に影響されず恒常的に転写活性を発揮するプロモーターである。転写因子とその応答配列には公知の組み合わせを用いることが可能であり、例えば、エストロゲン受容体とERE配列、アンドロゲン受容体とARE配列、グルココルチコイド受容体とGRE配列などが挙げられるが、下記の実施例ではAhRとXRE配列の組み合わせを提示した。
【００２２】
レポーター遺伝子（a）（b）としては、各種の蛍光タンパク質（GFPやYFPなど）を組合わせて使用することが可能であるが、連続して測定することが容易であるため汎用されている組み合わせとして、（a）（b）のいずれか一方をホタルルシフェラーゼ遺伝子とし、他方は、同じくルシフェラーゼを発現するがホタルとは由来・測定法が全く異なり測定上全く交差を生じないウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子とするのが好ましい。
【００２３】
応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（a）を連結したプラスミド（A）と、非応答性プロモーターの下流にレポーター遺伝子（b）を連結したプラスミド（B）をゲノム上の別部位に組み込む方法の一つは、まず一方のプラスミドを細胞に導入して、このプラスミドがゲノムに組み込まれた細胞を選別する。この選別は、プラスミドに任意の薬剤耐性遺伝子を配することによって行うことができる。次いで、選別した細胞に他方のプラスミドを導入し、別の薬剤耐性を指標としてこのプラスミドが組み込まれた細胞を選別し、最終的に目的とする細胞株を樹立することができる。このように、二つのプラスミドを、同時にではなく逐次的に導入するのには理由がある。一般的に、プラスミドが哺乳類細胞に導入される際、導入されたプラスミド分子のいくつかは切断を受け、その切断端が結合して直鎖状にプラスミド分子が連結したDNA分子の重合体が形成される。これは、異なるプラスミド分子上の切断片が、Nonhomologous end joiningなる哺乳類細胞の持つDNA修復経路を介して結合されるからである（Ishikawa T, Lee EJ, Jameson JL (2004) Nonhomologous end-joining ligation transfers DNA regulatory elements between cointroduced plasmids. Mol Cell Biol 24: 8323-8331. doi: 10.1128/mcb.24.19.8323-8331.2004）。従って、プラスミド（A）と、プラスミド（B）が同時に細胞に導入された場合、（A）および（B）の両者を含む重合体が形成され、これがゲノムに組み込まれる可能性が高い（Chen C, Chasin LA (1998) Cointegration of DNA molecules introduced into mammalian cells by electroporation. Somat Cell Mol Genet 24: 249-256. doi: 10.1023/b:scam.0000007127.80657.10）。すると、本来はレポーター遺伝子（a）とは独立して恒常的に発現するはずのレポーター遺伝子（b）が、レポーター遺伝子（a）上流の応答性プロモーターの近傍に位置することになり、その影響を受けてしまう。これを回避するために、２つのプラスミド（A）（B）を同時にではなく逐次的に細胞導入し、その都度選別を行う。そうすると、両者はゲノム上の異なる部位に組み込まれ、互いのプロモーターの影響を受けず独立した発現をすることが可能となる。
【００２４】
上記のように作られた細胞を用いた本発明のレポーター遺伝子アッセイでは、活性化転写因子に反応したレポーター遺伝子（a）の発現量を、レポーター遺伝子（b）の発現量で除して補正することによって、非特異的は遺伝子発現等による誤判定を防ぐことが可能となる。
【００２５】
レポーター遺伝子アッセイに供するサンプルとしては、ヒトまたは動物（例えば、家畜・水産生物・愛玩動物など）の生活環境に存在する飲料、食糧、飼料またはそれらの原料素材、生活土壌や水、またはそれらから抽出された化学物質、あるいは薬物などが挙げられる。
【００２６】
さらに、通常のレポーター遺伝子アッセイにおいて細胞を維持するために使用するDMEM等の動物細胞培地は、AhR受容体などを活性化させる物質を含むため、本発明のレポーター遺伝子アッセイは、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）または成人ヒト血清（AHS）に細胞を置いた状態でサンプルを添加することを好ましい態様としている。
【００２７】
以下、実施例と試験例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
細胞株HepG2-XREの樹立
直列に繋いだ4つのXRE［プラスミドDRE4-GLのKpn IおよびXho I切断部位の間のフラグメント（非特許文献３）］を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子とハイグロマイシン耐性遺伝子を有するpGL4.27ベクター（Promega, Madison, WI）に挿入してAhR応答性ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子X4-4.27を構築した。X4-4.27を、FuGENE HD（Promega）を用いてHepG2ヒト肝癌細胞（Riken cell bank, Tsukuba, Japan）に導入し、安定発現細胞をハイグロマイシンB（400μg/mL）を用いて選択した。この安定発現細胞に、再びFuGENE HDを用いて、pBAsi-hU6 Pur DNAベクター（ピューロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミド；TaKaRa, Shiga, Japan）とphRL-CMV（ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクター；Promega）を共導入した後、ハイグロナウシンB・ピューロマイシン（2μg/ml）両者の存在下でクローンを選択した。得られたクローンの1つをHepG2-XREと命名し、レポーター遺伝子アッセイに使用した。ホタルルシフェラーゼ活性は、基本的にはAhR依存性の転写を反映するはずであるが、HepG2-XRE細胞内のAhR非依存的な全般的な遺伝子発現に対する影響も受けるので、AhR非依存性転写を反映するウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を除して補正することにより、AhR依存性転写を特異的に評価することが可能となる。この補正プロセスはまた、各ウェルに蒔かれた細胞数の差異（実験時には各ウェルに均等に蒔くように注意するが、それでもウェルごとの細胞数のずれは避けられない）を修正するのにも有用である。
試験例
AhR活性化物質である多環芳香族炭化水素（PAH）は、通常、比較的低い温度で炭素含有物質を燃焼させると形成されるが、約240℃で処理される焙煎コーヒー豆にもPAHが含有されることが報告されている（Grover IS, Sharma R, Singh S, Pal B (2013) Polycyclic aromatic hydrocarbons in some grounded coffee brands. Environ Monit Assess 185: 6459-6463. doi: 10.1007/s10661-012-3037-7）。しかし、実際にコーヒー飲料がAhRを介した遺伝子転写を促進するかどうかは確立していなかった。コーヒーを添加した培養細胞がAhR活性化を介してUDP-glucronosyl transferase（UGT）の発現を増強するという報告（Kalthoff S, Ehmer U, Freiberg N, Manns MP, Strassburg CP (2010) Coffee induces expression of glucuronosyltransferases by the aryl hydrocarbon receptor and Nrf2 in liver and stomach. Gastroenterology 139: 1699-1710. doi: 10.1053/j.gastro.2010.06.048８）が存在するが、一方でコーヒーによるUGTの発現促進はみられないという報告も存在する（Okamura S, Suzuki K, Yanase M, Koizumi M, Tamura H (2005) The effects of coffee on conjugation reactions in human colon carcinoma cells. Biol Pharm Bull 28: 271-274. doi: 10.1248/bpb.28.271）。このような相違が起こる理由のひとつとして、もともと細胞培地に含まれるAhR活性化物質（特に紫外線照射後に、培地中のトリプトファンから作られる）による実験への干渉の可能性が挙げられる。
【００２９】
そこで、実施例で作成した細胞株HepG2-XREを様々な実験環境に置き、そこに添加したコーヒー飲料がAhRを活性化するか否かを調べた。
1．材料と方法
1−1．化学物質と飲料
以下の化学物質を購入した：MTH（Research Organics, Cleveland, OH）、B[a]P（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）、TCDD（AccuStandard, New Haven, CT）および2-methyl-2H-pyrazole-3-carboxylic acid (2-methyl-4-o-tolylazo-phenyl)-amide（CH-223191としても知られる。以下「CH」と略記する； Calbiochem, San Diego, CA）。これらの試薬はジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解した。以下の最終濃度を実験に使用した：MTH（80μM）、B[a]P（10μM）、TCDD（10-9-10-6 M）、CH（10μM）。飲料サンプル（表1：実験に用いた飲料の一覧）は、糖とミルクを含まないものを、スーパーマーケット・食料品店で購入し、実験では、それらを10％（v/v）の最終濃度で細胞に添加した。0.1% (v/v) DMSOを化学物質の溶媒コントロールとして、10% (v/v)蒸留水を飲料のコントロールとして使用した。予備実験において、これらの濃度のDMSOおよび蒸留水を加えても検出可能な影響を呈さないことを、予め確認済みである。
【００３０】
【表１】
2016123282.tif 000002
【００３１】
1−2．細胞
実施例で作成した細胞株HepG2-XREの他、HepG2ヒト肝癌細胞（Riken cell bank, Tsukuba, Japan）、Caco-2ヒト大腸癌細胞（Riken cell bank）、およびMCF-7ヒト乳癌細胞（JCRB cell bank, Osaka, Japan）を10％（v/v）の補体非動化済みFBSおよび抗生物質を添加したDMEM（Sigma-Aldrich）中で維持培養した。DMEMボトルは冷蔵庫に保存し遮光した。
1−3．レポーター遺伝子アッセイ
実験前日に、約80％コンフルエントの10 cm培養ディッシュ1枚分のHepG2-XRE細胞をトリプシン処理し、10％（v/v）FBSおよび抗生物質を含むDMEMで、96ウェルのBlack & White組織培養プレート（Perkin-Elmer, Waltham, MA）に均等に蒔いた。実験上、さらに多くのウェルが必要になった場合は、それに応じた数の細胞・プレートを使用した。実験当日、培地を以下のものに交換した：図１の実験においては、PBS、AHS、FBS、またはDMEM［無血清、10％（v/v）AHS含有、50％（v/v）AHS含有、10％（v/v）FBS含有、50％（v/v）FBS含有］で、それぞれCH有または無；図２の実験においては、PBS、DMEM［無血清または10％（v/v）FBS含有］であり、それぞれMTH有または無；図３の実験においては、PBS［無血清（図3A）または50%(v/v)AHS含有（図3B）］またはAHS（図3C）に、それぞれAhRアゴニスト（TCDD、MTH、B[a]Pが有または無、CH有または無、飲料サンプル有または無。4時間後に細胞を回収し、Dual-Luciferase Assay System (Promega)とAB-2350 Phelios microplate luminometer (ATTO, Tokyo, Japan)を用いてホタルおよびウミシイタケのルシフェラーゼ活性を測定し、補正したホタルルシフェラーゼ活性値（ホタルルシフェラーゼ活性値をウミシイタケルシフェラーゼ活性値で除したもの）を算出した。なお、細胞を各条件に曝す時間を4時間後としたのは以下の３つの理由による。１）より長時間の刺激添加では、間接的なAhR活性化（すなわち、刺激が直接AhRを活性化するのではなく、まず他の細胞内因子に影響を与え、この因子が最終的にAhRの活性化をもたらす、という状況）を検出してしまう可能性が高くなる；２）pGL4.27上にコードされているホタルルシフェラーゼは転写促進刺激に迅速に対応するように設計されており、実際に予備実験を行ったところ、Promegaの説明通り、最適な刺激添加時間が4時間であることが判明している；３）4時間という比較的短い添加時間は、以前に報告されたAhRレポーター遺伝子アッセイにおいても用いられている（Pieterse B, Felzel E, Winter R, van der Burg B, Brouwer A (2013) PAH-CALUX, an optimized bioassay for AhR-mediated hazard identification of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) as individual compounds and in complex mixtures. Environ Sci Technol 47: 11651-11659. doi: 10.1021/es403810w）。補正されたホタルルシフェラーゼ活性値にみられた変化が、除する際に用いたウミシイタケルシフェラーゼ活性値の極端な高・低値に由来している可能性を排除するために、ウミシイタケルシフェラーゼ活性のグラフも図１、２、３に示した。各図における補正ホタルルシフェラーゼ活性値とウミシイタケルシフェラーゼ活性値のグラフでは、PBSに置いた対照細胞においてみられた平均値を1として示した。
1−4．統計分析
対照群と処置群の分散が等しくなかったので、分散分析（ANOVA）の代わりに、Kruskal-Wallis test を行い、引き続きDunnのpost hoc testを行った。p値<0.05を有意な差とみなした。統計ソフトとしては、GraphPad Prism version 6.0 for Windows（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いた。
2．結果
2−1．細胞培地を含まない実験環境の確立
HepG2-XRE細胞を、様々な割合のAHSまたはFBSを含有するPBSないしDMEMに4時間置き、補正ホタルルシフェラーゼ活性値（ウミシイタケルシフェラーゼ活性値でホタルルシフェラーゼ活性値を除したもの）を測定した（図1）。PBS中に置いた細胞の補正ホタルルシフェラーゼ活性と比較して、DMEM中に置いた細胞の補正ホタルルシフェラーゼ活性値は288倍と著しく高かった（図1の第1および第7カラム）。AhR拮抗薬CHとの同時添加によって、DMEMで誘導されたホタルルシフェラーゼ発現は減弱した（図１の第7と第8カラム）。10％（v/v）AHS、50％（v/v）AHS、10％（v/v）FBSおよび50％（v/v）FBSの添加は、DMEMによるAhRの活性化を、それぞれ10％、50％、33％および52％阻害した（図１の第7、第9、第11、第13および第15カラム）。血清によるこの阻害は、MTH添加によるAhR活性の上昇が、FBS含有DMEMに置いた細胞に比べて、AHSに置いた細胞で顕著にみられるという発明者らが以前に報告した現象（非特許文献３）に関与している可能性がある。そこで、10％（v/v）FBSまたはAHSが有または無のDMEM中に置いたHepG2-XRE細胞においてMTHがどのようにAhR活性を誘導するかを調べた（図2、AとB）。AとBは同じ実験を異なる時期に繰り返して行った結果を示している。図1と同様に図2においても、DMEM中に置いた細胞では、PBS中に置いた細胞よりも189倍（図2A、第1および第2カラム）または226倍（図2B、第1および第2カラム）と、明らかに高いホタルルシフェラーゼ活性を示した。しかし、血清がDMEMによるAhR活性化を阻害する程度は実験ごとにかなり変動した。すなわち、10％（v/v）FBSの添加は、図1ではDMEMによるAhR活性化を33％（第7および第13カラム）、図2Aでは40％（第2および第4カラム）減弱させたのに対して、図2BではDMEMによるAhR活性化を98％（第2および第4カラム）減少させた。10％（v/v）FBS含有DMEMに置いた細胞でのAhR活性の「基礎値」（MTH添加の無い状態の値）が図2Aのように高くなるか、あるいは図2Bのように低くなるか次第で、MTHによるAhR活性上昇の程度が「それ程著明ではない」（図2A、第4と第5カラム）ように見えるか、または「非常に強力に上昇させる」（図2B、第4と第5カラム）ように見えるか、という違いが生じた。このように、FBSがDMEMによるAhR活性化を阻害する度合いは、同じ材料およびプロトコールを用いて実験を行ったとしても差が生じ、予測不可能であった。また、FBSがDMEMによるAhR活性化を強力に抑制した場合（図2B、第4および第6カラム）においても、10%(v/v)FB含有DMEMに置いた細胞におけるAhR活性の「基礎値」は、依然として、AHSに置いた細胞におけるAhR活性の「基礎値」よりも高かった。従って、実験の再現性・感度向上のために、以下の実験については、汎用されるDMEM＋FBSの代わりに、PBSまたは血清のいずれかに細胞を置いた状態で行うこととした。PBSまたは血清自体によるAhRの活性化はCHの効果（図1）から判断して無視できる程度であると考えられたからである。
2−2．コーヒーによるAhR反応性レポーター遺伝子の発現誘導
HepG2-XRE細胞を、既知のAhRアゴニストおよび各種飲料（表１）を加えたPBS中で4時間静置した後には、全てのコーヒー飲料はホタルルシフェラーゼ活性を強力に誘導し、この活性はCH添加によって明らかに阻害された（図3A）。コーヒー飲料の中には10-6 M TCDDよりも高いAhR活性化作用を示すものもあった。2つのココア試料はわずかにAhRを活性化し、4種類のその他の飲料のうち3つがAhRを活性化した。AHS中において飲料サンプルの中では最も強力にAhRを活性化した「コーヒー（1）」（図3A）については、そのAhR活性化能を、50％（v/v）AHSを含むPBS（図3B）およびAHS（図3C）においても調べた。このコーヒーサンプルは、PBS中に置かれた細胞においてはTCDD（10-6 M）、MTH（80μM）、B[a]P（10μM）よりも強力にAhRを刺激したが（図3A）、50％（v/v）AHS含有PBS中に置かれた細胞では、AhR活性化能はTCDD・MTHよりも弱かった（図3B）。また、AHS中に置かれた細胞においては、このコーヒー飲料はTCDD、MTHに加えてB[a]PよりもAhR活性化能が弱かった（図3C）。これらの実験結果より、種々のAhR活性化物質の強さは、バイオアッセイを行う際に細胞が置かれていた環境に依って全く異なる可能性がある。しかし、いずれにせよコーヒーがAhR活性化物質であることは間違いない。
参考例
コーヒー飲料によるAhRの活性化を、AhRの標的遺伝子であるヒトCYP1A1遺伝子の発現量（mRNA量および蛋白量）を指標として調べた。
1−1．リアルタイムRT-PCR
HepG2、Caco-2およびMCF-7細胞を、12ウェルプレート中で4時間、PBSまたはAHSのいずれかに置いた状態で、既知のAhR活性化物質またはコーヒーを加えた。1条件につき、3つのウェルの細胞を割り当てた。細胞から全RNAをTRIzol（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）を用いて抽出し、RNaseフリーのDNase（Promega）で処理した。その後、ランダムヘキサマープライマー（Amersham, Uppsala, Sweden）、dNTPs、RNAsin（Promega）、モロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素（Promega）を用いて逆転写を行った。こうして得られたcDNAを、LightCycler TaqMan Master kit（Roche Applied Science, Penzberg, Germany）とLightCycler 480（Roche Applied Science）を使用して行う定量的リアルタイムPCRに供した。PCR条件はRoche社のプロトコール通りに設定した。ヒトCYP1A1のプライマー（5'-TCCAAGAGTCCACCCTTCC-3'：配列番号１および5'-AAGCATGATCAGTGTAGGGATCT-3'：配列番号２）の配列および検出用プローブ #83（Roche Applied Science）は、Roche Applied Science Universal ProbeLibrary Assay Design Center（http://www.roche-applied-science.com）に基づいて決定した。各サンプルについて、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）のリアルタイムPCRをUniversal ProbeLibrary Human GAPD Gene Assay（Roche Applied Science）を用いて同時に実施し、CYP1A1/GAPDH比を算出した。
1−2．ウェスタンブロッティング
6cmディッシュ中で、PBSまたはAHSの環境下でHepG2、Caco-2、MCF-7細胞に、4ないし24時間、既知のAhR活性化物質またはコーヒーを添加した。細胞を、プロテアーゼ阻害薬（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA）を含むRIPAバッファーで溶解した。細胞溶解物の上清（蛋白20μg）を7％（w/v）のポリアクリルアミドゲル上で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にかけ、ニトロセルロース膜に移した。Ponceau S（Apro Science, Naruto, Japan）染色で蛋白の膜への移行を確認した後、4℃で一晩、Block Ace（DS Pharma Biomedical, Osaka, Japan）を用いてブロッキングを行った。その後、10%（v/v）Block Ace中で、抗CYP1A1抗体 (sc-25304; Santa Cruz Biotechnology)および抗βアクチン抗体 (sc-47778; Santa Cruz Biotechnology) と共に4°Cで一晩振盪した。0.1％（v/v）Tween 20を含むトリス緩衝生理食塩水（TBS）で洗浄した後、10%（v/v）Block Ace中で西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体（NA931; GE Healthcare, Fairfield, CT）と膜を4℃で一晩振盪した。 再びTween 20を含むTBSで洗浄した後、CYP1A1およびβアクチンシグナルをECL試薬（GE Healthcare）およびLAS-4000mini撮像装置（GE Healthcare）を用いて可視化した。シグナル強度をImageQuant TLソフトウェア（GE Healthcare）を用いて測定し、CYP1A1／βアクチンシグナル比を計算した。対照細胞の値を1.0と設定した。実験は独立して２回行った。
1−3．統計分析
定量的RT-PCRににおいて、対照群と投与群では分散が等しくなかったため、分散分析（ANOVA）の代わりに、Kruskal-Wallis testを行い、引き続きDunnのpost hoc testを行った。p値<0.05を有意と見なした。統計ソフトとしては、GraphPad Prism version 6.0 for Windows（GraphPad Software, San Diego, CA）を用いた。
2．結果
2−2．コーヒーによるCYP1A1 mRNA発現の誘導
HepG2、Caco-2、MCF-7細胞において、代表的なAhR応答性遺伝子であるCYP1A1の発現を調べた。まず、種々のAhR活性化物質および「コーヒー（1）」を添加して4時間後にCYP1A1 mRNAのレベルを測定した（図4）。これら3つの細胞株において、コーヒーは、PBSおよびAHS両者の環境下でMTH、B[a]P、TCDDに比べると弱いながらも、CYP1A1の発現を増強させた。この実験においては、CHがMTHによるCYP1A1誘導を効果的に阻害しない場合もみられた。しかし、コーヒーによって誘導されたCYP1A1の発現はCHによって常に大きく抑制された。
【００３２】
また、HepG2、Caco-2、MCF-7細胞をPBSまたはAHSの環境下で、4ないし24時間処理した後、CYP1A1蛋白レベルをウェスタンブロッティングで評価した。これらの細胞を、既知のAhR活性化物質またはコーヒーを添加ないし非添加した状態のPBSに4または24時間置いた場合、CYP1A1蛋白の発現は検出不可能であった（データは提示せず）。それゆえ、AHSにおいて各刺激を加えた細胞でみられた結果のみを図5に示す。2回の独立した実験を行った（図中で1stおよび2ndと表示）。AhR活性化物質によるCYP1A1蛋白の発現増強の程度は、CYP1A1 mRNAの発現増強（図4）に比べると顕著ではなかった。また、1回目と2回目のウェスタンブロット実験の結果には多少のばらつきがみられた（図5）。CHのAhR拮抗作用も、常に観察されるわけではなかった。既知のAhR活性化物質の中では、MTH（80μM）は3種類全ての細胞株においてCYP1A1蛋白の発現を増強する傾向があり、TCDD（10-6 M）はHepG2細胞におけるCYP1A1蛋白を1回目・2回目とも誘導する傾向がみられたが、B[a]P（10μM）はこれらの細胞株のいずれにおいても一貫した発現誘導因子とは言えなかった。面白いことに、コーヒーは3種類全ての細胞株において、ここで用いたどの既知のAhR活性化物質よりも確実にCYP1A1蛋白の発現を増強した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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