(57)【要約】【課題】多能性幹細胞の品質を簡易に検証する方法を提供する。【解決手段】多能性幹細胞の品質を評価する方法であって、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の品質を評価する方法であって、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法。
【請求項２】
成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む、多能性幹細胞の品質評価キット。
【請求項３】
前記手段が、成熟ｍｉＲ３６９に対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項２記載のキット。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、支持体に固定されたものである、請求項３記載のキット。
【請求項５】
ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する、非ヒトノックアウト動物。
【請求項６】
ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する、抗がん剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の品質診断方法及び診断キット、抗がん剤並びに疾患モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ 細胞）その他の多能性幹細胞の、医薬や創薬モデルとしての応用が期待されている。
【０００３】
しかしながら、その作製プロセスは複雑であり、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で満足な細胞が高効率で得られるとは限らない。
【０００４】
したがって、これらの多能性幹細胞を利用するにあたっては、品質を検証することが不可欠となるが、簡易に検証する方法は未だ確立されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、多能性幹細胞の品質を簡易に検証する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ｍｉＲ３６９が、胎生期において発現上昇して、スプライシング因子であるＨＮＲＮＰＡ２／Ｂ１（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ２／Ｂ１）をコードする遺伝子の３’ＵＴＲに結合し、そのタンパク質発現を亢進する役割を果たしていることを初めて見出した。ＨＮＲＮＰＡ２／Ｂ１が発現上昇すると、オルタナティブスプライシング調節によりピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ）アイソフォームのうちＰＫＭ２のタンパク質発現量が相対的に上昇する。これにより、正常酸素分圧下におけるにもかかわらず、細胞内の代謝形態が、好気的解糖経路から嫌気的解糖経路に変換する（いわゆるＷａｒｂｕｒｇ効果）。
【０００７】
また、本発明者らは、ｍｉＲ３６９をノックアウトした非ヒト動物が、組織の変性疾患を呈することを見出した。さらに、本発明者らは、ｍｉＲ３６９を投与することにより、腫瘍の転移を抑制できることを見出した。
【０００８】
本発明者らは、かかる知見に基づきさらなる試行錯誤を重ねることにより本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、下記の態様を含む。
項１．
多能性幹細胞の品質を評価する方法であって、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法。
項２．
成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む、多能性幹細胞の品質評価キット。
項３．
前記手段が、成熟ｍｉＲ３６９に対して特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、項２記載のキット。
項４．
前記ポリヌクレオチドが、支持体に固定されたものである、項３記載のキット。
項５．
ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する、非ヒトノックアウト動物。
項６．
ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する、抗がん剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、多能性幹細胞の品質を簡易に検証できる。また、組織の変性疾患を呈する非ヒトノックアウト動物を提供できる。さらに、本発明によれば、腫瘍を抑制する手段を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ｍｉＲ３６９のリプログラミングへの影響を調べた実験結果を示す図である。
【図２】ｍｉＲ３６９のターゲット探索を調べた実験結果を示す図である。
【図３】ｍｉＲ３６９の機能を調べた実験結果を示す図である。
【図４】ｍｉＲ３６９ノックアウトマウスの作成方法を示す図である。
【図５】ｍｉＲ３６９ノックアウトマウスの表現型解析結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．  多能性幹細胞の品質を評価する方法
本発明の、多能性幹細胞の品質を評価する方法は、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する方法である。
【００１３】
被検多能性幹細胞は、特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、人工多能性幹細胞様細胞（ｉＰＳ様細胞）、
胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖系列幹細胞（ｍＧＳ細胞）、単為発生幹細胞、核移植幹細胞及びがん幹細胞等が含まれる。
【００１４】
また、さらに、被検多能性幹細胞には、体性幹細胞も含まれる。
【００１５】
被検多能性幹細胞としては、特に、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞が好ましい。
【００１６】
発現量の測定方法は、特に限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、マイクロアレイ及びノーザンハイブリダイゼーション等が挙げられる。検出時間が短い点、及び類似配列を識別できる点において、リアルタイムＰＣＲが特に好ましい。
【００１７】
本発明者らは、被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が少ないと、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で不十分であることを見出した。したがって、特に限定されないが、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で満足な細胞を基準として設定して、その発現量を基準発現量とすることができる。このときの基準発現量を、高品質基準量と呼ぶ。
【００１８】
また、それとは反対に、未分化性、分化能及び増殖能といった品質の点で不十分な細胞を基準として設定して、その発現量を基準発現量とすることもできる。このときの基準発現量を、低品質基準量と呼ぶ。
【００１９】
さらに、上記の高品質基準量と低品質基準量の間の値を基準発現量とすることができる。このときの基準発現量を、中間基準量と呼ぶ。
【００２０】
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量と基準発現量との比較による品質の評価としては、特に限定されないが、以下の態様が挙げられる。
【００２１】
（１）高品質基準量との比較
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、高品質基準量以上であるときに高品質であると評価する。
【００２２】
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、高品質基準量の９０％以上であるときに高品質であると評価する。
【００２３】
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、高品質基準量の８０％以上であるときに高品質であると評価する。
【００２４】
（２）低品質基準量との比較
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、低品質基準量の２００％以上であるときに高品質であると評価する。
【００２５】
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、低品質基準量の１９０％以上であるときに高品質であると評価する。
【００２６】
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、低品質基準量の１８０％以上であるときに高品質であると評価する。
【００２７】
（３）中間基準量との比較
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、中間基準量の２０％以上であるときに高品質であると評価する。
【００２８】
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、中間基準量の３０％以上であるときに高品質であると評価する。
【００２９】
被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量が、中間基準量の４０％以上であるときに高品質であると評価する。
【００３０】
特に限定されないが、本発明の評価方法は、以下の工程（１）及び（２）を含む。
【００３１】
（１）被検多能性幹細胞における成熟ｍｉＲ３６９の発現量を測定する工程；及び
（２）前記工程（１）で得られた測定値を、基準発現量と比較することにより、品質を評価する工程。
【００３２】
２．  多能性幹細胞の品質評価キット
本発明の、多能性幹細胞の品質評価キットは、成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定するための手段を含む。
【００３３】
特に限定されないが、リアルタイムＰＣＲにより成熟ｍｉＲ３６９の発現を測定する場合、以下のポリヌクレオチドを使用する。
ループＲＴプライマー
フォワード・プライマー
リバース・プライマー
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ
【００３４】
また、成熟ｍｉＲ３６９と相補的な捕捉用核酸を固定化した基板を用い、成熟ｍｉＲ３６９をその捕捉用核酸に結合させた上で、定量解析を行ってもよい。このとき、多能性幹細胞の品質評価キットは、成熟ｍｉＲ３６９と相補的な捕捉用核酸を固定化した基板を含む。定量解析の方法は、特に限定されないが、例えば、質量分析、定量的ＰＣＲ法、及びＥＬＩＳＡ法等が挙げられる。
【００３５】
３．非ヒトノックアウト動物
本発明の非ヒトノックアウト動物は、ｍｉＲ３６９の全部または一部の機能を喪失しており、組織の変性疾患を呈する。
【００３６】
組織の変性疾患は、特に限定されず、神経変性疾患及び筋変性疾患が含まれる。特に限定されないが、筋ジストロフィー等が含まれる。
【００３７】
本発明の非ヒトノックアウト動物は、非ヒト動物の生体内に存在するｍｉＲ３６９の全部又は一部がその本来の機能を発揮しないように破壊されているか、又は組み換えがなされている非ヒト動物である。
【００３８】
本発明の非ヒトノックアウト動物は、特に限定されないが、例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム、ＴＥＴ−ＯＦＦシステム及びＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９システム等を使用することにより作出することができる。
【００３９】
非ヒト動物は、特に限定されないが、マウス、ラット、カニクイザル及びコモンマーモセット等が挙げられる。
【００４０】
４．抗がん剤
本発明の抗がん剤は、ｍｉＲ３６９、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子治療ベクターを含有する。
【００４１】
上記遺伝子治療ベクターは、適当なベクターにアンチｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、得ることができる。
【００４２】
ベクターは、非ウイルスベクターであってもよいし、ウイルスベクターであってもよい。
【００４３】
本発明の抗がん剤には、抗がん剤の増強剤も含まれる。ｍｉＲ３６９を別の抗がん剤と併用投与することにより、その抗がん剤の薬理作用が増強される。
【００４４】
具体的には、特に限定されないが、併用する抗がん剤としては、ＤＮＡ合成阻害、細胞分裂阻害、ＤＮＡ損傷、代謝拮抗及び栄養阻害からなる群より選択される少なくとも一種の作用を有する抗がん剤を用いることができる。特に、ＤＮＡ損傷作用又は代謝拮抗作用を有する抗がん剤が好ましい。
【００４５】
特に限定されないが、ＤＮＡ損傷作用を有する抗がん剤としては、例えば、シスプラチン等の白金製剤等が挙げられる。
【００４６】
代謝拮抗剤としては、特に限定されないが、例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）等が挙げられる。
【００４７】
併用する抗がん剤との投与量の割合は、抗がん剤の種類に応じて適宜設定することができる。
【００４８】
本発明の抗がん剤の増強剤は、他の抗がん剤と併用投与するために用いられるものであってもよいし、他の抗がん剤と一体として製剤化された配合剤の中の有効成分であってもよい。
【００４９】
本発明の抗がん剤は、治療有効量のｍｉＲ３６９又は遺伝子治療ベクターを含有し、さらに必要に応じて賦形剤、安定剤、保存剤、緩衝剤、矯味剤、懸濁化剤、乳化剤、着香剤、溶解補助剤、着色剤及び粘稠剤等を含んでいてもよい。
【実施例】
【００５０】
以下、本発明を実施例及び比較例により具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００５１】
１．ｍｉＲ３６９のリプログラミングへの影響
正常細胞へ山中４因子（Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃ）を導入し、さらにｍｉＲ３６９を導入することで細胞のリプログラミング実験を行いリプログラミング効率の検討を行った。
【００５２】
その結果、ｍｉＲ３６９導入群では対照群（山中４因子のみを導入）に比べリプログラミング効率が２倍程度上昇した（図１）。また、山中４因子にａｎｔｉ−ｍｉＲ３６９を導入するとリプログラミング効率が半分程度まで減少した。
【００５３】
２．ｍｉＲ３６９のターゲット探索
山中４因子（Ｏｃｔ３/４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃＭｙｃ）を導入しさらにｍｉＲ３６９を導入した細胞からタンパク質を抽出し２次元電気泳動を行った。対象群(山中４因子のみを導入)に比べタンパク質量に変化のあるスポットを刳り貫き、質量分析系を用いてタンパク質の同定を行った。
【００５４】
その結果、スプライシングファクターとして知られるＨｎＲＮＰＡ２、ＰＴＢＰ及び解糖系の酵素として知られるＰＫＭのタンパク質量がｍｉＲ３６９導入によって増加することが明らかとなった。
【００５５】
これらのタンパク質量制御がｍｉＲ３６９による直接効果であることを確認するためＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子の３’ＵＴＲ領域をこれらＨｎＲＮＰＡ２、ＰＴＢＰ及びＰＫＭの３’ＵＴＲ領域に組み替えたベクターを作成し、細胞に導入しルシフェラーゼアッセイを行った。
【００５６】
その結果、ＨｎＲＮＰＡ２及びＰＴＢＰの３’ＵＴＲを持つベクター導入群においてｍｉＲ３６９強制発現によりルシフェラーゼ発光量が上昇した（図１）。以上のことからＨｎＲＮＰＡ２及びＰＴＢＰがｍｉＲ３６９の直接のターゲットであると考えられる。
【００５７】
３．ｍｉＲ３６９の機能検討
ｍｉＲ３６９と結合し複合体を形成するタンパク質を同定するため、免疫沈降実験を行った。
【００５８】
Ｄｉｃｅｒノックアウト細胞へｍｉＲ３６９を導入し抗Ｄｉｃｅｒ抗体を用いて免疫沈降実験を行った。Ｄｉｃｅｒタンパク質と共沈してきたタンパク質を質量分析系又はウエスタンブロッティング法を用いて同定した結果Ｆｘｒ１及びＨｎＲＮＰＡ２タンパク質が複合体形成に関与していることが明らかとなった（図３）。
【００５９】
以上のことからｍｉＲ３６９はＤｉｃｅｒ及びＦｘｒ１、ＨｎＲＮＰＡ２と複合体を形成しターゲットのｍＲＮＡに結合していることが示唆された。
【００６０】
４．ｍｉＲ３６９ノックアウトマウスの表現型解析
図４に示したようにＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いてｍｉＲ３６９ノックアウトマウスを作成しその表現型解析を行った。
【００６１】
ｍｉＲ３６９ＫＯマウスの血漿を用いて血液検査を行ったところクレアチンキナーゼの量が野生型に比べ１００倍以上上昇しており（図５）、ｍｉＲ３６９ノックアウトマウスが筋ジストロフィーに似た病態をとることが明らかとなった。
【００６２】
５．ｍｉＲ３６９の癌細胞への効果
ｍｉＲ３６９の癌細胞への効果を検討するために大腸癌細胞株（ＨＴ２９、ＤＬＤ１）への導入実験を行った。
【００６３】
ＭＴＴアッセイを行った結果、ｍｉＲ３６９を導入した細胞は導入していない細胞に比べて既存の抗癌剤（５−ＦＵおよびＣＤＤＰ）への感受性が増し、またＰｒｏｌｉｆｅａｔｉｏｎアッセイにより細胞の増殖能も低下することが明らかとなった。
【００６４】
治療効果の検討のために免疫不全マウスの皮下に大腸癌細胞株を移植し尾静脈からｍｉＲ３６９の投与を行った。その結果非治療群に比べ癌の増殖が遅くなり、治療に一定の効果が見られた。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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