(57)【要約】      （修正有）【課題】悪性腫瘍その他の血管新生を伴う疾患の治療に有用なＶＥＧＦ結合性ペプチドの提供。【解決手段】スリーフィンガー様スキャフォールドのアミノ酸配列において、ループＩに含まれるＣ１-ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ２-ＣｙｓのＮ末端側７番目のアミノ酸までの領域の配列がＰＬＴＲＶＶであり、ループＩＩに含まれるＣ３-ＣｙｓのＣ末端側２番目のアミノ酸からＣ４-ＣｙｓのＮ末端側４番目のアミノ酸までの領域の配列がＨＧＤＨＨＴＬＳＥＷであり、及びループＩＩＩに含まれるＣ５-ＣｙｓのＣ末端側４番目のアミノ酸からＣ６-ＣｙｓのＮ末端側１番目のアミノ酸までの領域の配列がＥＥＰＴＡＨＶである、アミノ酸配列を含んでなるＶＥＧＦ結合性ペプチド。【選択図】図１６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のアミノ酸配列において、
（ｉ）ループIに含まれるC1-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2-CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域の配列が「PLTRVV（配列番号６）」であり；
（ｉｉ）ループIIに含まれるC3-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4-CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域の配列が「HGDHHTLSEW（配列番号７）」であり；および
（ｉｉｉ）ループIIIに含まれるC5-CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6-CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域の配列が「EEPTAHV（配列番号８）」である、アミノ酸配列を含んでなるVEGF結合性ペプチド。
【請求項２】
配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでなるVEGF結合性ペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸。
【請求項４】
スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のアミノ酸配列に由来する、下記（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を含むVEGF結合性ペプチド；
（１）ループIを形成するアミノ酸配列であって、かつループIに含まれるC1-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2-CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域の配列が「PLTRVV（配列番号６）」であり、環化に関与しないCysが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、
（２）ループIIを形成するアミノ酸配列であって、かつループIIに含まれるC3-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4-CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域の配列が「HGDHHTLSEW（配列番号７）」であり、環化に関与しないCysが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、
（３）ループIIIを形成するアミノ酸配列であって、かつループIIIに含まれるC5-CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6-CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域の配列が「EEPTAHV（配列番号８）」であるアミノ酸配列。
【請求項５】
前記（１）のループIを形成するアミノ酸配列が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列であり、前記（２）のループIIを形成するアミノ酸配列が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列であり、そして、前記（３）のループIIIを形成するアミノ酸配列が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列である、請求項４に記載のVEGF結合性ペプチド。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のアミノ酸配列をコードする核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍その他の血管新生を伴う疾患の治療に有用なVEGF結合性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管内皮細胞増殖因子（VEGF：Vascular Endothelial Growth Factor）は、分子量４万〜４万５千の糖タンパク質で、主として血管内皮細胞で発現する脈管新生、血管新生を促進する成長因子である（非特許文献１）。特に胎生期における脈管形成に必須であり、循環器系など多くの組織の構築に重要な役割を果たしている。成体でも黄体形成、胎盤形成などの他、創傷の治癒においても重要である。一方で、固形癌をはじめ、慢性関節リューマチ、糖尿病性網膜症などに見られる病的血管新生においても中心的な役割を示すことが知られている。特に、固形癌においては、癌細胞がVEGFを過剰発現して、増殖に必要な栄養供給のための血管新生を促進し、この血管を通って転移することが知られている（非特許文献２〜４など）。
【０００３】
また、以前から各種癌細胞を移植した担癌マウスへの投与実験から抗VEGF中和抗体の抗腫瘍効果が知られており（非特許文献５）、虚血性網膜疾患モデルの眼内での病的血管新生の抑制効果（非特許文献６）も知られている。したがって、近年、VEGFとそのレセプターとの結合を阻害するVEGF阻害剤、特に抗VEGF抗体に対し、病的血管新生への強力な抑制効果、及び有効な抗癌剤としての効果が期待され活発な研究開発がなされてきた。
抗VEGFマウス抗体の抗原性を低減するために、ヒト由来の抗VEGFヒト抗体（特許文献１）の開発の他、抗VEGFマウス抗体のキメラ化（非特許文献７）、抗VEGFマウス抗体のCDRを用いたヒト化抗体（非特許文献８）、ヒト抗体そのものを産生するトランスジェニックマウスを用いて免疫する方法（非特許文献９）も提案されている。ヒト化抗VEGF抗体についてはすでにベバシズマブ（ジェネンテック社、登録商標Avastin）という名称で、転移性大腸癌や転移性乳癌用の抗癌剤として実用化されている。そのベバシズマブの親和性Fabフラグメントもラビニズマブ（ジェネンテック社、登録商標Lucentis）で眼内血管新生治療用に販売されている。さらに、ベバシズマブ、その他のヒト化抗体をもとに、そのCDR領域の一部にファージディスプレイ技術などを利用して変異を導入し、さらに有効性の高く副作用の少ない抗VEGF抗体を取得する研究開発も活発に行われている（特許文献２〜４）。
【０００４】
しかしながら、ヒト化抗体の場合は抗原性に基づく副作用（非特許文献１０）の懸念がすべて解消されているわけではない。抗体は、分子量の大きい(150kDa)タンパク質であるため細胞内で働かせることはできず、また糖鎖付加及びジスルフィド結合形成を伴う翻訳後修飾が必要なため微生物での大量生産には不向きであり生産コストがかかるなどの問題がある。特に、固形癌の治療に利用する場合には、分子量の大きいポリペプチドは患部への浸潤性が悪いことが報告されている（非特許文献１１）。
【０００５】
VEGFレセプターの細胞外ドメインは、複数のイムノグロブリン様ドメインが連なった構造をしており、VEGFに対し特異的に高親和性で結合する。しかも、もともとヒト由来ポリペプチドであるため抗原性が低いと考えられるため、可溶性のVEGFレセプター細胞外ドメインは優れたVEGF阻害剤となることが期待されるが、体内で速やかに代謝されてしまうため、実用的ではない。そこで、細胞外ドメイン全長ではなく、第１〜第３イムノグロブリン様ドメインなどの部分的領域を用い、抗体分子などとの融合ポリペプチドを構築することで、VEGFとの親和性を損なわず血中半減期が延長されたVEGF結合性ポリペプチドが提供されている（特許文献５〜７）。しかし、これらのVEGF結合性ポリペプチドは、細胞外ドメイン部分領域ポリペプチドだけでも200以上のアミノ酸残基を有しており、抗体分子などと融合タンパクとするとさらに大きな分子量となるため、前記抗体の場合と同様の問題点を有する。
【０００６】
一般的に分子が抗原性（免疫原性）をもつ確率は、分子サイズが小さくなるにつれて小さくなると言われており、10kDa以上の分子には抗原性が現れ、異種タンパク質を構造要素として含むものはよりリスクが高まる。このような抗原性低下の期待もあり、より分子量の小さなVEGF阻害剤の研究開発が活発に志向されている。
VEGF阻害作用を示す経口投与可能な低分子化合物として、SU6668（非特許文献１２）やPTK787/ZK222584（非特許文献１３）などが報告され、キノリン−インデンインドリン誘導体に関する特許出願もなされている（特許文献８〜１０）。
また、ペプチド医薬においても、分子量をより小さくする志向性があり、分子量の小さな非イムノグロブリンスキャフォールドを利用する研究開発も盛んである。従来から、イムノグロブリン様ドメインと同様に、複数の堅固なフレームワークと、フレームワーク上に配置された標的物質と特異的な結合をするループ領域とを有する天然の非イムノグロブリンドメイン構造を利用し、ループ領域がランダム化された多種類のペプチドライブラリーが知られている。これら非イムノグロブリンスキャフォールドペプチドライブラリーによるVEGF結合性ペプチドを探索する試みも複数行われており、III型フィブロネクチンドメイン(FN3)構造（特許文献１１）や、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造（特許文献１２）を有するVEGF結合性ペプチドが提案されている。FN3は分子内にシステインを含まず約100アミノ酸からなるスキャフォールドなので大腸菌での高生産性が可能で熱やプロテアーゼにも安定である利点はあるが、最も低い解離速度定数（Kd値）でも0.1μM程度のVEGF結合活性であり、抗VEGF抗体のAvastin（Kd=1.1nM）にはとても及ばない。一方、ヘリックス−ループ−ヘリックス構造を有するVEGF結合性ペプチドの場合は、結合活性だけを見ると最も低いものはKd=2.9nMを示すペプチド（特許文献１２、表１８）が取得できているものの、ペプチド単独ではVEGF阻害活性も細胞増殖抑制作用も示さない。VEGF阻害活性及び細胞増殖抑制作用を得るためには、チオレドキシン（105アミノ酸、分子量12kDa）との融合タンパクを構築する必要があることから、分子量が小さいというメリットが十分に生かせないと考えられる。
【０００７】
したがって、単独でも高いVEGF結合活性と共にVEGF阻害活性を有する分子量の小さいVEGF結合性ペプチドであって、免疫原性が低く、かつ血清中での半減期の長い高安定性のペプチドの提供が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平９−３１６０９９号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１４８２２３
【特許文献３】ＷＯ２００９／０７３１６０
【特許文献４】ＷＯ９８／４５３３１
【特許文献５】特開平９−２５５７００
【特許文献６】特開平９−１５４５８８
【特許文献７】ＷＯ９８／３１７９４
【特許文献８】特開２００５−１４５９２８
【特許文献９】特開２００５−２９８４３７
【特許文献１０】ＷＯ２００２／０９４８０９
【特許文献１１】ＷＯ２００９／０２３１８４
【特許文献１２】特開２０１４−４７１５６
【特許文献１３】特許第４９５９２２６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Science, 1989 Dec 8; 246(4935): 1306.
【非特許文献２】Cancer Res., 1995 Sep 15; 55(18): 3964-8.
【非特許文献３】Cancer, 1996 Mar 1; 77(5): 858-63.
【非特許文献４】Clin Cancer Res., 1997 Jun; 3(6):861-5.
【非特許文献５】Nature, 1993 Apr 29; 362(6423): 841-4.
【非特許文献６】Arch. Ophthalmol., 114: 66-71(1996).
【非特許文献７】S. L. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A., 81: 6851 (1989).
【非特許文献８】Cancer Res., 1997 Oct 15; 57(20): 4593-9.
【非特許文献９】S. Wagner et al., Nucleic Acid Res., 22: 1389(1994).
【非特許文献１０】Blower 2009 Br. J. Nurs., 18(6): 351-358.
【非特許文献１１】Br. J. Cancer, 1994 Sep; 70(3): 521-5.
【非特許文献１２】Cancer Res., 2000 Aug 1; 60(15): 4152-4160.
【非特許文献１３】Cancer Res., 2000 Apr 15; 60(8): 2178-2189.
【非特許文献１４】Naimuddin, M., et al, Mol. Brain 2011, 4, 2.
【非特許文献１５】Kubo,T., et al., (2002), Program No.137. 16., 32nd Annual Meeting of Society for Neuroscience, Washington, DC, 3rd November, 2002.
【非特許文献１６】Chen et al. JMB (1999) 293:865-881.
【非特許文献１７】Yamaguchi, J., et al, Nucleic Acids Res. 2009, 37, e108.
【非特許文献１８】J Biol Chem. 1991 Jun 25; 266(18): 11947-54.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、分子量の小さいVEGF結合性ペプチドであって、高いVEGF結合活性及びVEGF阻害活性を有し、免疫原性が低く、かつ血清中での半減期の長い高安定性のペプチドを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、VEGF結合性ペプチドの探索に、本発明者らが以前標的物質への結合タンパク質スクリーニング用に開発したスリーフィンガー様スキャフォールド（3F）ペプチドライブラリーを用いたcDNAディスプレイ技術（特許文献１３、非特許文献１４）を利用することを想起した。
ヘビ毒に由来するスリーフィンガー様スキャフォールド（3F）は、60〜70個のアミノ酸で構成され、4〜5個のジスルフィド結合、3〜5個のアンチパラレルβシート、及びスリーフィンガー構造を形成する3つの突起ループからなる極めて安定な構造体である。特に、温度に対しては60〜70℃にも耐えられる熱安定性を示している。また、3Fの代表であるα型神経毒はニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）及びアセチルコリン結合タンパク質（AChBP）に結合し、両者へのリガンド結合を阻害する活性が観察されている。サイズが小さいことに加え、親水性で且つプロテアーゼ耐性のあるヘビ毒由来ペプチドであることから、より抗原として認識されにくく、血清中でのプロテアーゼ分解も受けにくいため、血清中での半減期が長いという特徴を有している。
3Fペプチドライブラリーを用いた先の特許文献１３ではIL6R結合性ペプチドとして、Kd値が55〜115nMという高結合活性のペプチドを3種類取得し、同時にこれらペプチドがチオレドキシンとの融合体を形成しなくてもいずれも高い阻害活性を有する（IC50＝105〜250nM）ことを確認している。
【００１２】
本発明者らは、効率のよいcDNAディスプレイ法の研究開発を行う中で、cDNAディスプレイに用いる新たなピューロマイシンリンカーを開発した。得られたピューロマイシンリンカー（リンカー−Ｎ）は無細胞翻訳系での翻訳効率が高く、収率、収量の高いcDNAディスプレイの合成が可能となるため、効率の良いcDNAディスプレイ法も確立することができた。当該リンカー−Ｎ及びそれを用いたcDNAディスプレイ法については、本出願と同日付で特許出願している。
本発明は、当該cDNAディスプレイ法を、本発明者らの開発した上記3Fペプチドライブラリーに適用し、ストレプトアビジンビーズ表面のビオチン化されたVEGFを用いた７回のセレクション後、Kd＝2.1nMという高い結合活性のVEGF結合ペプチドを60％の高確率で取得することができた。
以上の知見を得たことで、本発明を完成することができた。
【００１３】
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のアミノ酸配列において、
（ｉ）ループIに含まれるC1-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2-CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域の配列が「PLTRVV（配列番号６）」であり；
（ｉｉ）ループIIに含まれるC3-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4-CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域の配列が「HGDHHTLSEW（配列番号７）」であり；および
（ｉｉｉ）ループIIIに含まれるC5-CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6-CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域の配列が「EEPTAHV（配列番号８）」である、アミノ酸配列を含んでなるVEGF結合性ペプチド。
〔２〕配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含んでなるVEGF結合性ペプチド。
〔３〕前記〔１〕又は〔２〕に記載のアミノ酸配列をコードする核酸。
〔４〕スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のアミノ酸配列に由来する、下記（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を含むVEGF結合性ペプチド；
（１）ループIを形成するアミノ酸配列であって、かつループIに含まれるC1-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2-CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域の配列が「PLTRVV（配列番号６）」であり、環化に関与しないCysが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、
（２）ループIIを形成するアミノ酸配列であって、かつループIIに含まれるC3-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4-CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域の配列が「HGDHHTLSEW（配列番号７）」であり、環化に関与しないCysが他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列、
（３）ループIIIを形成するアミノ酸配列であって、かつループIIIに含まれるC5-CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6-CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域の配列が「EEPTAHV（配列番号８）」であるアミノ酸配列。
〔５〕前記（１）のループIを形成するアミノ酸配列が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列であり、前記（２）のループIIを形成するアミノ酸配列が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列であり、そして、前記（３）のループIIIを形成するアミノ酸配列が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列である、前記〔４〕に記載のVEGF結合性ペプチド。
〔６〕前記〔４〕又は〔５〕に記載のアミノ酸配列をコードする核酸。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のVEGF結合ペプチドは、熱に対してもプロテアーゼ分解にも安定なペプチドであり、抗原性もなく血清半減期も長いと考えられる。また、抗VEGF抗体（Kd=1.1nM）と匹敵するほどに高い結合活性（Kd＝2.1nM）を有しており、基本骨格である3Fスキャフォールドの特性から見て、チオレドキシンとの融合体形成なしに単独で高いVEGF阻害活性を有することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のリンカー−Ｎの構造、及びその製造方法。  （ａ）リンカー−Ｎが有する４つの機能特性；T4 RNAリガーゼによるライゲーションのためのライゲーション部位、合成されたタンパク質の共有結合のためのピューロマイシン部位、スペーサー配列及びオリゴdA部位、及び合成cDNAへの逆転写のためのプライミング部位。（ｂ）リンカー−Ｎの製造方法。図中Cは、5-Me-dCを示す。
【図２】（１）mRNAタンパク質融合体、及び（２）cDNAタンパク質融合体（cDNAディスプレイ）形成の概略図。
【図３】cDNAディスプレイに導入された遺伝子構築物。図中、SP6はSP6プロモーター及びキャップ部位、UTRはXenopusβ−グロビンの5'非翻訳領域、Spcはスペーサー配列を表し、Y-tag配列の3'末端にはさらにリンカーとハイブリダイズするための配列を含む。
【図４】PDO（3F, 6R14, BDA） mRNA及びリンカー−Ｎ（比率、1:1）とのライゲーション反応。  （ａ）PDO-mRNAとリンカー−Ｎのライゲーション後のFITCの蛍光検出。図中、Mはサイズマーカーを表し、10min、20min、40minはそれぞれライゲーション反応時間を表す。（ｂ）同Sybr Goldによる全核酸成分の検出。（ｃ）3F、6R14及びBDA mRNAとリンカー−Ｎの10分間ライゲーション後の全核酸成分のSybr Green染色、図中左側の3Fは、サイズマーカーとして用いた3F-mRNA。
【図５】PDO（3F, 6R14, BDA） mRNA及びリンカー−Ｎとのライゲーション効率
【図６】リンカー−ＮにおけるオリゴdAの長さの検討。  （ａ）リンカー−Ｎ（18個のA残基）（ｂ）リンカー−Ｎ−１０Ａ（10個のA残基）（ｃ）リンカー−Ｎ−０Ａ（0個のA残基）。
【図７】ウサギ網状赤血球翻訳系におけるオリゴdAの長さの違いによるタンパク質融合体の形成能比較。（ａ）電気泳動分析（Fluorescein蛍光画像）。（ｂ）融合割合（％）比較。
【図８】小麦胚芽抽出液翻訳系におけるオリゴdAの長さの違いによるタンパク質融合体の形成能比較。  （ａ）リンカー−Ｎを用いた場合のタンパク質融合体の形成能に及ぼす高濃度塩存在下での成熟効果。図中、０；10分間翻訳後サンプリング、１；高濃度の塩非存在下1時間成熟化、２；高濃度の塩存在下30分成熟化、３；高濃度の塩存在下1時間成熟化した画分を示す。（ｂ）リンカー−Ｎ−１０Ａ及びリンカー−Ｎ−０Ａを用いた場合のタンパク質融合体の形成能。（ｃ）融合割合（％）比較。
【図９】リンカー内のオリゴdAの存在の効果を示す概念図。  （ａ）リボソームのサイズ。（ｂ）オリゴdAが無い場合（リンカー−Ｎ−０Ａ）。（ｃ）オリゴdAがある場合（リンカー−Ｎ）。（ｄ）タンパク質合成後の溶液内のリボソームの位置の変化に対応し、リンカー−Ｎ内のオリゴdAの「幹」構造が、スペーサーの柔構造の可動域を増大させる効果を示す模式図。
【図１０】cDNAタンパク質融合体のHis-タグを利用した精製。図中、F.T.は通過画分、E1は溶出液1、E2は溶出液2をそれぞれ示し、PDOは逆転写反応していないmRNAタンパク質（PDO）融合体に対応する。mRNAタンパク質融合体はcDNAタンパク質融合体よりも泳動が遅い。そのためPDOのレーンは、濃度比較のために下方にずらして表示している。
【図１１】リンカー−Ｎを用いたcDNAディスプレイ及びそのインビトロセレクションのハイスループットに関する証明。（ａ）小麦胚芽ライセートを用いたcDNAディスプレイを機能させるために必須な工程とその所要時間を示す概略図。テンプレートDNAをmRNAに転写してこれを精製して定量する工程（〜1.5時間）。mRNAをリンカー−Ｎにライゲートする工程（0.2時間）。小麦胚芽ライセート系で翻訳し、高濃度塩の条件下で成熟してディスプレイタンパク質（mRNAタンパク質融合体）とする工程（〜1時間）。Ni-NTA磁性ビーズ上で、mRNAタンパク質融合体を精製し、逆転写を行い、かつcDNAタンパク質融合体の精製を行った後に溶出する工程（0.5時間）。ストレプトアビジン（SA）マトリックス上に固定化されている標的タンパク質に対しセレクション後、溶出させ、標的タンパク質に対応するDNAを増幅する工程（〜2時間）。PCR増幅物の分析工程（〜1時間）。全工程は6〜8時間で完了できる。（ｂ）PDO及び3F、6R14、BDAのディスプレイタンパク質を用いたインビトロセレクション。非結合性のPDOと結合性のBDAあるいは3Fあるいは6R14の20:1混合物を、(1)BDAに結合するIgG、(2)3Fに結合するAChBP、及び(3)6R14に結合するIL6Rを結合させたSAビーズを用いたセレクション画分をPCR後、電気泳動。（ｃ）（ｂ）で得られたセレクション画分それぞれの、セレクション前後の比率の変化からセレクション効率を「フォールドエンリッチメント数」として表した。
【図１２】8-merペプチドライブラリーからのFLAG-タグ配列セレクション。  （ａ）8-merペプチドライブラリー調製用のDNA構築物。（ｂ）セレクションサイクル。0.1％のFLAG-タグ配列を含む8-merペプチドライブラリー複合混合物を転写のセレクションサイクルプロセスに付し、リンカー−Ｎにライゲーションし、WGE中で翻訳してmRNA融合タンパク質を合成し、His-タグを用いて固相上で、精製し、逆転写してcDNA融合タンパク質を合成後精製し、抗-FLAG M2抗体マトリックス上でセレクションして、PCR増幅する。増幅産物を更に同一プロセスを2サイクル行い、クローニング及び配列決定する。（ｃ）3回のセレクションサイクルの後のPCR増幅産物中のFLAG-タグ配列の比率。比較として示した「puro-Linker」では、同一の複合混合物を非特許文献１３のセレクション手順に適用して、3回セレクションを行った。
【図１３】スリーフィンガー（3F）の構造及び3Fライブラリーの遺伝子構築物。
【図１４】VEGFを標的とする3Fライブラリーを用いたVEGF親和性タンパク質のインビトロセレクションの7ラウンド後のcDNAタンパク質融合体（R7）の結合アッセイ。  （ａ）(1)R7の1/3画分をストレプトアビジンビーズ（SA）に、(2) R7の1/3画分をVEGF固定化ビーズに、(3)R7 cDNA（R7を翻訳せずに逆転写したもの）をVEGF固定化ビーズに、及び(4) R7の1/3画分をFc固定化ビーズに結合させた後、溶出した画分をPCR増幅してゲル電気泳動で分析した。（ｂ）(1)、(2)及び(4)の結合工程の後のそれぞれの溶出画分にELISAを適用してビーズへの結合性を450nm波長吸収量で検出した。
【図１５】短期化を可能にする新規リンカーによる進化工学プロセス  創薬のリード化合物を見いだすための全自動化ハイスループットシステムが、1ラウンド約8時間であり、8〜10ラウンドで行っても約2週間でリード化合物を得ることができることを示している。
【図１６】VEGF結合性ペプチドの推定立体構造図
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．本発明のVEGF結合性ペプチドについて
（１−１）本発明の3F骨格を有するVEGF結合性ペプチド
本発明のVEGF結合性ペプチドは、後述する「スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）」を利用した3Fランダムペプチドライブラリーに対して進化工学的なインビトロセレクション法を用いて進化させたペプチド分子であるので、（特許文献１３、非特許文献１４）に記載された「スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）」と同様の基本骨格を有している。そして、その突起ループ領域ループI、ループII及びループIIIの特定部分のアミノ酸配列が、それぞれ「PLTRVV（配列番号７）」、「HGDHHTLSEW（配列番号８）」及び「EEPTAHV（配列番号９）」である。
すなわち、本発明のVEGF結合性ペプチドの１つの態様は、3F骨格を有するVEGF結合性ペプチドであり、以下の様に表現することができる。
スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のアミノ酸配列において、
（ｉ）ループIに含まれるC1-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC2-CysのN末端側7番目のアミノ酸までの領域の配列が「PLTRVV（配列番号６）」であり；
（ｉｉ）ループIIに含まれるC3-CysのC末端側2番目のアミノ酸からC4-CysのN末端側4番目のアミノ酸までの領域の配列が「HGDHHTLSEW（配列番号７）」であり；および
（ｉｉｉ）ループIIIに含まれるC5-CysのC末端側4番目のアミノ酸からC6-CysのN末端側1番目のアミノ酸までの領域の配列が「EEPTAHV（配列番号８）」である、アミノ酸配列を含んでなるVEGF結合性ペプチド。
ここで、スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のアミノ酸配列において、ジスルフィド結合を形成する保存システインを、N末端側から順番にそれぞれC1〜C8と称し、C1とC2の間、C3とC4の間、およびC5とC6の間の領域を、それぞれループI、ループII、およびループIIIと称する。
【００１７】
スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）とは、（特許文献１３、非特許文献１４）に記載されている通り、ヘビ毒由来のα型神経毒（α-neurotoxin）のいくつかに共通して見いだされる60〜70個アミノ酸という小さいサイズの構造であり、4〜5個のジスルフィド結合、3〜5個のアンチパラレルβシート及びスリーフィンガー構造を形成する3つの突起ループを含む構造をいう。極めて安定性が高い。特に熱安定性が高く60〜70℃にも耐えられる（Biochemistry. 2000 Aug 1;39(30):8705-10）。また、サイズが小さいことから、抗原として認識されにくく、プロテアーゼ分解も受けにくいと考えられるので、血清中での半減期が長いことが予測される。
本発明で、「3Fペプチドライブラリー」、又は「3Fランダムペプチドライブラリー」というとき、（特許文献１３、非特許文献１４）において構築された、スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）のループI、ループII及びループIIIの特定の領域のアミノ酸を同時にランダム化したランダムペプチドライブラリーを指す。典型的には、コンビナトリアルライブラリーとして用いることが可能なように、3Fペプチドライブラリーを構成する各ペプチドが、それぞれのペプチドをコードするポリヌクレオチド（cDNA）と対応する形で存在しているライブラリー（cDNAディスプレイともいう。）を指す。しかし、当該cDNAディスプレイを製造するために用いたランダム化された3FペプチドライブラリーをコードするmRNAまたはcDNAで構成される3Fポリヌクレオチドライブラリーを含めて「3Fペプチドライブラリー」と称する。
「3Fペプチドライブラリー」におけるループI、ループII及びループIIIの特定の領域のランダム化のための方法は、既知であり、例えば（特許文献１３、非特許文献１４）にも詳細に記載されている。
【００１８】
スリーフィンガー様スキャフォールド（3F）は、構成するアミノ酸が異なっていても、3次元的な構造は高度に保存されているため、例えば（特許文献１３）の［表１］に列記されている種々の起源生物由来のスリーフィンガー様スキャフォールド（3F）を利用して構築されたライブラリーであってもよいが、特に、下記(式１)で示されるMicrurus corallinus由来のCTx3ペプチドライブラリー（配列番号１５）が好ましい。
（式１）
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１５）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸残基である。）
【００１９】
すなわち、本発明の最も好ましいVEGF結合ペプチドのアミノ酸配列は、下記（式２）で表される。
（式２）
LVCYPLTRVVPGTLETCPDDFTCVHGDHHTLSEWTQYCSHACAIPEEPTAHVCCQTDKCNG（配列番号１６）
【００２０】
（１−２）VEGF結合性ペプチドのサイズの最適化
本発明で用いられたスリーフィンガー様スキャフォールド（3F）は、例えば、CTx3由来の3Fの場合、全長61アミノ酸残基から構成されているが、ループI、ループII及びループIIIという3つのループが存在し、それぞれのループは、その末端領域にあたるS-S結合によりしっかり固定された構造となっている。したがって、各ループ構造の末端部S-S結合を形成するためのCysを残して切断した12〜25アミノ酸残基という小さなサイズのペプチド「1Fスキャフォールド」も、もとの立体構造を保持している。そして、非特許文献１４では、ループIを含む1Fのペプチドにおいて、本来の3Fで示したと同様の阻害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性が保たれていることが実証されている。
本発明のVEGF結合性ペプチドについても、3F構造を構成し得る全長ペプチドである必要はなく、ループI、ループII及びループIIIのいずれかを含み、少なくとも「1Fスキャフォールド」を構成し得るペプチドであれば、3F構造を有する全長のVEGF結合性ペプチドと同様のVEGF結合活性を有し、かつVEGF阻害活性が期待できる。そして、全長ペプチドと比較して、小さいサイズであることによって、合成のしやすさに加え、抗原性のなさ、血清半減期の長さなど、サイズの小さいメリットが発揮される。
【００２１】
以上のことから、本発明のVEGF結合性ペプチドは、さらにサイズを小さくする最適化が施されることが好ましく、本発明の他の態様は、下記（式３）〜（式５）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであるということができる。特に、（式３）〜（式５）のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであって、（式２）の部分ペプチドである場合がより好ましい。その際、1Fを構成するアミノ酸のうちで、環化に関与しないCysは、他のアミノ酸に変更することが好ましく、非特許文献１４に倣い、（式３）及び（式４）では、途中のCysをGlyに置換している。また、環化に用いられる両端のCysの外側のアミノ酸、例えば（式３）におけるN末側の「Leu-Val」及びC末側の「Val」は他のアミノ酸に置き換えることもできる。
（式３）
LVCYPLTRVVPGTLETGPDDFTCV（配列番号１７）
（式４）
ETCPDDFTGVHGDHHTLSEWTQYCS（配列番号１８）
（式５）
ACAIPEEPTAHVC（配列番号１９）
【００２２】
２．本発明の「VEGF結合性ペプチド」にとっての標的物質となる「VEGF」について
VEGF（血管内皮細胞増殖因子）は、脈管形成、血管新生などに関与する増殖因子であり、ヒトを含む哺乳類ではVEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及びPIGFの5種が知られており、VEGF-Aが最も強力に血管新生を亢進する。ヒトVEGF-Aは、成熟体全長が189アミノ酸残基からなるが、VEGF-A遺伝子の異なるスプライシングに基づき複数のアイソファームが知られており、エクソン6が欠如した165アミノ酸残基からなる「VEGF 165」は、全長「VEGF 189」と同等の生物学的活性を有している（非特許文献１８）。
また、「VEGF 165」は、体内で主として発現しているVEGFであり、固形癌での発現量が多いことでも知られているので、本発明における「VEGF結合性ペプチド」のスクリーニング用には最も好ましい「標的VEGF」であるといえる。実施例では、配列番号２０に示される「VEGF 165」の2量体からなる市販VEGF（PeproTech社製, London）を用い、既知の方法によりビオチン化して、ストレプトアビジンで被覆された磁気性ビーズに固定化した。
【００２３】
３．本発明のcDNAディスプレイ法でcDNAディスプレイとして用いる3F-cDNAタンパク質融合体ライブラリーの製造方法
（３−１）リンカー−Ｎの構造及び合成方法
本発明で用いたリンカー−Ｎは以下の様に構成される。通常のT字型ピューロマイシンリンカーオリゴヌクレオチドの場合と同様に、水平方向のDNA鎖を主鎖、垂直方向のピューロマイシンを有するDNA鎖を側鎖と称すると、主鎖の5'末端側から、mRNAとの「ライゲーション部位」及びmRNAとの「ハイブリダイゼーション領域」及び逆転写のための「プライマー部位」で構成され、側鎖は、付け根部分から、「オリゴdA」、「スペーサー配列」及びピューロマイシンとで構成され、リンカー内にはビオチン分子は含まれない（図１ａ）。
側鎖の「スペーサー配列」は、化学式「PO4(CH2CH2O)5CH2CH2PO4」で表される「Sp.18（Spacer 18 Phosphoramidite）」分子を用い、FITCを結合させた「(Sp.18×1)(T-FITC)(Sp.18×3)」の配列を用いた。
本発明で用いたリンカー−Ｎの合成は、以下の方法で行った。
5'-ライゲーション部位／ハイブリダイゼーション領域とピューロマイシン−オリゴdA含有スペーサー配列とが5-Me-dCで連結された図１（ｂ）に記載の「5'-CCCCCCCGCCGCCCCCCG (5-Me-dC) A18 (Spec18) (Spec18) (Spec18) (F-dT) (Spec18) CC (Puro) -3'」をDNAシンセサイザーなどで合成する。ここで、(F-dT)は(T-FITC)を表す。5-Me-dCのレブリニル保護基を除去後、プライマー配列、例えば「5'-CCTTG-3'」を5-Me-dCに繋ぐことで、簡単に本発明のリンカー−Ｎを製造することができる。「リンカー−Ｎ」が生成できたことは、TOF-MSでもゲル電気泳動でも確認できる。
【００２４】
（３−２）3F-mRNA−リンカー−Ｎ連結体
次いで、リンカー−Ｎと連結させる3F-mRNAライブラリーを、以下の様に調製する。
テンプレートDNAとしては、3FポリペプチドライブラリーをコードするDNA（特許文献１３）遺伝子をコードする配列の他に、翻訳反応促進に必要な配列及びHisタグ配列、さらにその他の配列が含まれ、かつ最も3'末端側にはリンカー−Ｎの主鎖に相当するプライマー部位及びハイブリダイゼーション領域に相補的な塩基配列が含まれる（図３）。
mRNAとリンカーとの連結は、公知の手法によりハイブリダイゼーションによるアニーリングの後にT4 RNAリガーゼを用いてライゲーションによる連結を行わせる。
【００２５】
（３−３）3F-mRNAタンパク質融合体の調製
得られたmRNA−リンカー−Ｎ連結体を小麦胚芽抽出物（WGE）と接触させることによって、そのリボソームA内でタンパク質の合成を行うと同時に、ピューロマイシンを介して翻訳されたタンパク質とmRNA−リンカー−Ｎ連結体を融合させ、mRNA−リンカー−Ｎ−タンパク質融合体（以下、3F-mRNAタンパク質融合体ともいう。）を構築する。
小麦胚芽抽出物（WGE）としては、Promega社（Madison, WI, USA）で市販のキットが利用できる。
【００２６】
（３−４）3F-cDNA−リンカー−Ｎ−タンパク質融合体（以下、3F-cDNAタンパク質融合体という。）の作製と精製
本発明のmRNAタンパク質融合体の精製、逆転写反応によるcDNAタンパク質融合体の作製、及び得られたcDNAタンパク質融合体の精製は、全て同一の市販Ni-NTA磁性ビーズ（Qiagen社）を用いる。
本発明の実施例では、mRNAを分解せずに、mRNA/cDNAタンパク質融合体のまま用いているが、RNaseH（Ambion, Austin, TX, USA）などによりmRNAを分解して用いてもよく、その場合はNi-NTA磁性ビーズ上で分解することができる。一般にcDNAディスプレイというとき、mRNA/cDNAタンパク質融合体及びcDNAタンパク質融合体のいずれの場合も指すので、本発明においても両者を区別せずに、cDNAタンパク質融合体という。
得られた3F-cDNAタンパク質融合体のランダムペプチドライブラリーを、cDNAディスプレイとして用い、cDNAディスプレイ法に適用して進化工学的なスクリーニングに供する。
【００２７】
４．本発明で用いたcDNAディスプレイ法によるインビトロセレクション
（４−１）標的物質となる「VEGF」の調製、固定化
本発明のcDNAディスプレイ法により、3F-cDNAタンパク質融合体のランダムペプチドライブラリーを用いて作製したcDNAディスプレイをVEGFへの相互作用の強さでスクリーニングし、VEGF高親和性タンパク質をハイスループットスクリーニングする。
ここで、標的物質となる「VEGF」とは、VEGFと結合してVEGF受容体との結合阻害するペプチドを取得できる必要があるため、上述のヒトVEGF、特にヒトVEGF-Aであり、VEGF特異的なエピトープ配列、とりわけVEGF受容体との結合に関わる領域を一部もしくは全てを含むアミノ酸配列である。これらを本発明では単に「VEGF」と称する。なお、本実施例では、典型的な配列番号２０に示される165アミノ酸残基からなるヒトVEGF-Aの市販ヒトVEGF 165（PeproTech社製, London）を用いた。
本発明においては、磁気性ビーズなど固相表面に固定化した本発明のcDNAディスプレイとの結合反応を、水溶液中で観察する。
標的物質と磁気性ビーズとの結合は、ビオチン化したVEGFを、あらかじめ磁気性ビーズに結合したストレプトアビジンとの親和性を利用して、結合させる。
【００２８】
VEGFをビオチン化する方法は公知の方法が適用でき、ビオチンを結合し得る塩基（例えば、デオキシチミン（dT））もしくはビオチンが結合した塩基（例えば、ビオチン−デオキシチミン（Biotin-dT））、アミノ基によって修飾された塩基（例えば、アミノ修飾デオキシチミン（例、Amino-Modifier C6-dT:Glen Research Search社製））、カルボキシ基によって修飾された塩基（例えば、カルボキシ修飾デオキシチミン（Carboxy-dT））、チオール基によって修飾された塩基（例えば、チオール修飾デオキシチミン（4-Thio-dT））等でビオチン化することができる。市販のEZ-Link Sulfo-NHS-SS-ビオチン（Pierce, Rockford, USA）を用いることもできる。
ストレプトアビジンを結合した磁気性ビーズは、Ni-NTA磁性ビーズなどビーズ表面に公知の方法でストレプトアビジンを被覆して調製できるが、市販のストレプトアビジン被覆ビーズ（Magnotex-SA（タカラバイオ）又はMagnosphereTM MS300/Streptavidin(タカラバイオ)）を用いても良い。
【００２９】
（４−２）相互作用の測定方法と、得られたディスプレイタンパク質の同定方法
本発明のcDNAディスプレイ法において、ディスプレイされているタンパク質とVEGFとが相互作用しているか否かの測定は、両分子間の相互作用に基づいて発生される信号の変化を測定、検出することにより行う。
そのような測定手法としては、例えば、表面プラズモン共鳴法（Cullen D.C., et al., Biosensors, 3(4), 211-225 (1987-88)）、エバネッセント場分子イメージング法（Funatsu T., et al., Nature, 374, 555-559 (1995)）、蛍光イメージングアナライズ法、固相酵素免疫検定法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)：Crowther J.R., Methods in Molecular Biology, 42 (1995)）、蛍光偏光解消法（Perran J., et al., J. Phys. Rad., 1, 390-401 (1926)）、及び蛍光相関分光法（Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)：Eigen M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 5740-5747 (1994)）等が挙げられる。
【００３０】
本発明cDNAディスプレイ法において、VEGFと相互作用していると判断されたタンパク質-VEGF結合体中のディスプレイタンパク質の同定は、cDNAタンパク質融合体中のcDNAをPCR増幅し、塩基配列を解析して行う。標的物質の同定は、あらかじめ標識しておいた標識を利用して、NMR、IR、各種質量分析等を用いて行うことができる。標識物質がタンパク質であれば、通常のアミノ酸配列シークエンサーで行うこともできる。
【００３１】
（４−３）インビトロセレクションの全工程図（参考）
本発明のリンカー−Ｎを用いたcDNAディスプレイ法を用いたインビトロセレクションは、以下の手順に限られる分けではないが、図１１ａに従って説明する。
（ａ）テンプレートDNA（例えば、ランダムペプチドライブラリー）をmRNAに転写してこれを精製し、必要に応じ適宜し定量する工程（mRNAライブラリー）：〜1.5時間。
（ｂ）mRNAをリンカー−Ｎにライゲートする工程（mRNA−リンカー−Ｎ）：0.2時間。
（ｃ）小麦胚芽ライセート翻訳系で翻訳後、高濃度塩の条件下で成熟する工程（mRNA-タンパク質融合体）：〜1時間。
（ｄ）Ni-NTA磁性ビーズ上で、mRNAタンパク質融合体を精製し、逆転写を行い、かつcDNAタンパク質融合体の精製を行った後に溶出する工程（cDNAタンパク質融合体）：0.5時間。
（ｅ）SAビーズなどに固定化された標的タンパク質にcDNAタンパク質融合体を結合させ、洗浄後、溶出させる工程：〜2時間。
（ｆ）溶出したcDNAタンパク質融合体のcDNAをPCR増幅し、DNA配列を決定する工程、又はテンプレートDNAを調製して再度工程（ａ）に供する工程：
全工程は6〜8時間で完了できる。
【実施例】
【００３２】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した先行技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
【００３３】
（参考例１）本発明の核酸リンカー（リンカー−Ｎ）の合成
多機能性の基を組み込んだ、5’-CCCCCCCGCCGCCCCCCG (5-Me-dC) A18 (Spec18) (Spec18) (Spec18) (F-dT) (Spec18) CC (Puro) -3’からなるピューロマイシン−オリゴヌクレオチドを、BEX社（日本）に委託してDNAシンセサイザーABI394(Applied Biosystem, Japan)で合成した。上記ピューロマイシン−オリゴヌクレオチドの5'末端はアセチル化により保護した。式中、記号(5-Me-dC)は5'-ジメトキシトリチル-N4-(O-レブリニル-6-オキシヘキシル)-5-メチル-2'-デオキシシチジン（Glen Research社製）を示す。(Spec18)はC18スペーサーホスホロアミダイトを、(F-dT)はフルオレセイン-dTを、そして(Puro)はピューロマイシンCPGを示す。
5-Me-dCのレブリニル保護基を1:1のピリジン／酢酸中の0.5Mのヒドラジン水和物で除去して、カラムをさらにピリジン／酢酸（1:1）で、次いでアセトニトリルで洗浄した。プライマー配列5'-CCTTG-3'をピューロマイシン−オリゴヌクレオチド中の5-Me-dCに繋ぎオリゴヌクレオチド鎖を分岐させた。得られたピューロマイシン−分岐オリゴヌクレオチドをメタノール中のK2CO3でカラムから切断して5'末端のアセチル基を脱保護した。この脱保護を完全にするために25%の水酸化アンモニウム中、65℃で1.5時間の反応を実施し、逆相HPLCで精製して本発明のピューロマイシン−リンカーオリゴヌクレオチド（以下、「リンカー−Ｎ」と称す。）を得た（図１）。「リンカー−Ｎ」が生成できたことは、TOF-MS及びゲル電気泳動で確認した。修飾のために用いた全てのホスホロアミダイト試薬はGlen Research社(Sterling, VA, USA)から入手した。
【００３４】
（参考例２）リンカー−Ｎのライゲーション効率
（２−１）テンプレートDNA構築物の調製
リンカー−Ｎのライゲーション効率を調べるために、リンカー−Ｎと繋ぐmRNAのテンプレートDNAを、既知のプロテインAのB-ドメイン（BDA：Gouda, H., et al, Biochemistry 1992, 31, 9665.）、Oct-1のPouドメイン（PDO：Dekker, N., et al, Nature 1993, 362, 852-855.）、スリーフィンガー（3F：非特許文献１４）及びIL6レセプター（6R14：非特許文献１４）をコードするDNAを用いて調製した。
「BDA（プロテインAのB-ドメイン）」は、非特許文献２０に記載のpEFZZ18プロテインA融合ベクター（GE Healthcare社）から増幅し、「PDO（Oct-1のPouドメイン）」は、非特許文献２１に従って合成した。そして、非特許文献１４に従って、「3F（スリーフィンガー））は、南アメリカサンゴヘビMicrurus coralinusからクローンし、「6R14」（ヒトIL6レセプターαと結合活性のある3Fペプチド）は、非特許文献２２に記載のpBADThio/TOPOベクターIL6R10-14から得た。
これらDNAの5'末端側に、非特許文献２２に記載の「SP6プロモーターを含むオリゴヌクレオチド／キャップ部位／Xenopus β-globin5'非翻訳領域(UTR)」及び翻訳開始コドン(ATG)を繋ぎ、そして3'末端側には、「スペーサー(G3S)2／His-タグ配列（6×His）／スペーサー(G3S)／Y-タグ配列」を付加してPCRで増幅し、テンプレートDNA構築物を得た（図３）。ここで、スペーサー(G3S)は、「GGGS（G＝グリシン；S＝セリン）」である。PCR増幅は20秒の変性(94℃)工程、15秒のアニーリング(60℃)工程及び30秒のエクステンション工程(72℃)によって実施した。
【００３５】
（２−２）リンカー−Ｎと各種mRNAとのライゲーション
（２−１）で得られた4種類のテンプレートDNA構築物を、それぞれRiboMAX Large Scale Production System(Promega, Madison, WI, USA)において37℃で1時間SP6 RNAポリメラーゼによって転写してキャップ付転写産物を産生し、RNeasy 精製キット(Qiagen)で精製して、BDA-mRNA, PDO-mRNA, 3F-mRNA, 6R14-mRNAを得、260nmの吸光度によって定量した。
次いで、各mRNAとリンカー−Ｎとを比率1:1（50pmol）で、94℃で15〜30分間加熱下アニールした後、4℃まで徐冷した。3UのT4キナーゼ(NEB, USA)及び20UのT4RNAリガーゼ(Takara, Japan) を用い、25℃で10分間、20分間及び40分間ライゲーションを実施した。RNA−リンカー複合体が生成されたことは、DNAとハイブリッドしているmRNAをRNase H(Ambion, Austin, TX, USA)で分解し、変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することで確認できる。
図４は、例としてPDO-mRNAとリンカーとをRNase H存在下もしくは非存在下で10分、20分、及び40分間ライゲーション反応を起こさせ、また10分間ライゲーション反応したものをRNase H処理したものも合わせて変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（6％のゲル及び8Mの尿素）で分離したものである。なお、その結果はリンカー−Ｎに組み込まれたFITCによる蛍光画像（図４ａ）及びSybr Gold(Molecular Probes, USA)による核酸染色画像（図４ｂ）をフルオロイメイジャー(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)を用いて取得した。図４ｃには、PDO以外の3F-mRNA, 6R14mRNA及びBDAmRNAとリンカー−Ｎとの10分後のライゲーション結果を同様に示す(Sybr Gold染色)。
次いでそれぞれのライゲーション効率を以下の式で計算したところ、PDO  96±4％、3F  91±5％、6R14  95±3％、BDA  96±2％、という結果を得た（図５）。
ライゲーション％＝（Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００
（式中のＡはライゲートされた産物のバンド強度で、Ｂは残余mRNAの強度である。）。
以上の結果は、リンカー−Ｎが従来のピューロマイシンリンカーなどのcDNAディスプレイ用又はmRNAディスプレイ用の核酸リンカーと比較して、低いリンカー：mRNA比と高いライゲーション効率を共に達成していることを示している。
【００３６】
（参考例３）各種無細胞翻訳系でのタンパク質翻訳効率からみたリンカー−Ｎにおける「オリゴdA」の長さの最適化
（３−１）オリゴdAの長さの異なるmRNA-リンカーの合成
リンカー−ＮにおけるオリゴdAの長さを、18個、10個、0個に変えて、前記実施例１と同様にリンカー−Ｎ（18A）、リンカー−Ｎ−１０Ａ（10A）及びリンカー−Ｎ−０Ａ（0A）を合成した（図６）。各リンカーを用いて、前記参考例２（２−２）と同様に、各リンカー毎にmRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−リンカー融合体を作製した。
【００３７】
（３−２）ウサギ網状赤血球翻訳系
各mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−リンカー融合体をそれぞれ、ウサギ網状赤血球ライセート（Rabbit Reticulocyte Lysate）IVTキット（Ambion, Austin, TX, USA）（以下、RRLと称す。）に供して、各mRNAの翻訳を行い、mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−タンパク質融合体を作製した。
具体的には、非特許文献１３及び２２に従い、mRNA-リンカーの融合体100nMをRRL反応系25μl（ライゼート16.75μl、80mM酢酸カリウム、0.5mM酢酸マグネシウム、10mMクレアチンリン酸、各0.05mMアミノ酸（メチオニン及びロイシンは各々0.025mM））でタンパク質合成反応を30℃で10分間実施した。その後、タンパク質融合体（すなわち、タンパク質のピューロマイシン部分への共有結合）を37℃で2時間65mMのMgCl2及び750mMのKClの存在下で成熟させた。電気泳動分析のサンプリングは10分時点で行った（図７ａ）。
融合体形成の効率は下記の式により計算し、それぞれのmRNAについてリンカー−Ｎ（18A）、リンカー−Ｎ−１０Ａ（10A）及びリンカー−Ｎ−０Ａ（0A）での値はPDO（18A, 60±5；10A, 30±2；OA, 20±3）、BDA（18A, 65±3；10A, 35±3；0A, 22±2）、3F（18A, 50±4；10A, 30±3；0A, 18±3）、6R14（18A, 55±5；10A, 35±4；0A, 20±2）であった。
融合体形成％＝（Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００
（ここで、Ａはタンパク質融合体（mRNA−リンカー−タンパク質）のバンド強度で、Ｂは残余mRNA−リンカーのバンド強度である。）
各mRNA−リンカーの融合体形成の能力を図７ｂに示す。
いずれのmRNAの場合もリンカー中のオリゴdAの長さが長いほど翻訳効率が高まることがわかった。
【００３８】
（３−３）小麦胚芽抽出液翻訳系
各mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）とリンカー−Ｎとの融合体について、小麦胚芽抽出液（Wheat Germ Extract(Promega, Madison, WI, USA）（以下、WGEと称す。）に供して、上記（３−２）と同様に、各mRNAの翻訳を行い、mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）−タンパク質融合体を作製した。
WGE内での翻訳は、mRNA-リンカーの融合体100nMをWGE反応系25μl（ライゼート12.5μl、その他製品プロトコルに従う）でタンパク質合成反応を25℃で10分間実施した後、25℃で１時間65mMのMgCl2及び750mMのKClを添加してタンパク質融合体を成熟させた。高濃度塩の効果を検証するためにコントロールとして、高濃度塩非存在下で1時間成熟させた場合も行った。
電気泳動分析は、10分時点（すなわち高濃度塩の添加前）、30分及び1時間時点（高濃度塩の添加後）にサンプリングを行った（図８ａ）。図８ａ中、0画分は10分翻訳した後にサンプリングした画分を示し、1画分は高濃度の塩なしで1時間培養したコントロール画分を示し、2画分は高濃度の塩と30分、3画分は1時間それぞれ培養した画分を示す。この結果、翻訳工程での高濃度の塩の添加は有効であり、1時間の成熟工程も有効であることがわかる。
次いで、各mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）とリンカー−Ｎ−１０Ａ及びリンカー−Ｎ−０Ａとの融合体を用いて、同様にWGE内で25℃、10分間実施した後、高濃度塩存在下で1時間成熟させた（図８ｂ）。
各mRNAタンパク質融合体形成％を上記式に従って計算したところ、それぞれのmRNAについてリンカー−Ｎ（18A）、リンカー−Ｎ−１０Ａ（10A）及びリンカー−Ｎ−０Ａ（0A）での値はPDO（18A, 90±5；10A, 65±3；0A, 30±4）、BDA（18A, 95±4；10A, 60±6；0A, 35±4）、3F（18A, 85±4；10A, 60±4；0A, 30±4）、6R14（18A, 90±6；10A, 60±5；0A, 35±5）であった（図８ｃ）。
【００３９】
WGEを翻訳系として選択した場合（図８ｃ）と、RRLを翻訳系として用いた場合（図７ｂ）とのそれぞれのタンパク質融合体形成％を比較してみると、リンカー−Ｎでの値がRRLでは50〜65％であるのに対して、WGEでは90〜95％という極めて高い値を示している。
1ml(4μM)あたり、2.5×1015個で、RRL翻訳系での1ml(0.2μM)あたり、1.2×1014個という形成量からみて1オーダーもの差異を示している。
これらの結果から、WGEでの翻訳においても、リンカー内のオリゴdAの長さが長いほど翻訳効率が高まることが実証され、少なくともオリゴdAとして10以上、好ましくは12以上のdA（デオキシアデニン）の個数が必要であることがわかった。
リンカー−Ｎにおける「オリゴdA」が、図９ｄにあるように、柔軟なスペーサー配列を介してピューロマイシンをリボソームＡのPサイト付近に適切に配置するのに寄与していることが裏付けられた。
【００４０】
（参考例４）mRNA（PDO, BDA, 3F, 6R14）タンパク質融合体の精製及び逆転写
本発明の各タンパク質融合体は、逆転写（RT）の前に、タンパク質にあらかじめ設けられたHisタグを利用して、IMAC (Immobilized metal affinity chromatography)の担体の一種であるNi-NTA磁性ビーズ(Qiagen)上に25℃で10分間固定して精製した。
ビーズを1X PBS緩衝液で洗浄して、M-MLV逆転写酵素（Takara, Japan）の20Uを加えて42℃で10分間RTを実施して氷の上に置いた。
数回洗浄した後、融合体を2回、250mMのイミダゾールを用いて25℃で5分間溶出した。
得られた各cDNAタンパク質融合体をRNaseH(Ambion, Austin, TX, USA)と37℃で30分間反応させてmRNA/cDNAの二本鎖を形成しているmRNAを分解除去した。例としてPDO-mRNAタンパク質融合体を用いた場合を図１０として示す。各試料は、8M尿素含有12％SDS-PAGEにより分離しフルオロイメイジャーでバンドを確認した。磁気性ビーズからの1回目(E1)及び2回目(E2)溶出液いずれからの逆転写産物からmRNAを除去したものが極めて純度が高いことが見て取れる（図１０）。
このことはHis-タグを利用した簡便なIMACによって、mRNAタンパク質融合体を磁気性ビーズ表面に結合させた状態で、mRNAタンパク質融合体の精製、逆転写、mRNAの分解除去、及びcDNAタンパク質融合体の精製の全工程を効率よく短時間で行うことができ、しかも高純度かつ高収率でcDNAタンパク質融合体を精製することができたことを意味する。
なお、図中、F.T.は濾過画分、E1及びE2は溶出液1及び2を逆転写後RNaseH処理によりmRNAを除去したものであり、PDOはmRNAタンパク質融合体に対応するが、cDNAタンパク質融合体との量比を示すためにPDOバンドの位置を上方にずらして表示している。
【００４１】
（参考例５）インビトロセレクション
本実施例では、BDAが認識するIgG、3Fが認識するAChBP及び6R14が認識するIL6Rをモデルとして磁気性ビーズに固定化し、それぞれの標的タンパク質が本発明のBDA, 3F及び6R14 cDNAタンパク質融合体と共に、コントロールとしてPDO cDNAタンパク質融合体を用い、本発明のインビトロセレクション効率を評価する。
【００４２】
（５−１）ビオチン標識された標的タンパク質を固定化した磁気性ビーズの調製
セレクションに用いる標的タンパク質のうち、免疫グロブリンG(IgG)はSigma社から、インターロイキン−６受容体（IL6Rα）及びVEGF（ヒトVEGF165）はPero Tech社(London, UK)から購入した。アセチルコリン結合タンパク質（AChBP）cDNAはAplysia kurodai[manuscript in preparation]からクローニングし、組換え大腸菌で発現させて精製した。
これらの標的タンパク質を磁気性ビーズに固定化するために、EZ-Link Sulfo-NHS-SS-ビオチン（Pierce, Rockford, USA）をモル比1:10で用いてビオチニル化した。未反応のビオチンは1MのTris-HCl(pH8)で不活性化して4℃で16時間透析して除去した。ビオチニル化された各標的タンパク質をSDS-PAGE及びストレプトアビジン-HRP（GE Healthcare）を用いるウェスタンブロットで確認した。定量的な固定化を、ストレプトアビジビンを被覆した磁性ビーズ（Takara, Japan）の一定量に対して25℃で30分間滴定してチェックした。上澄み液を保管して固定化した標的タンパク質を100mMのジチオスレイトール（DTT; Wako, Japan）を用いて25℃で10分間溶出した。
【００４３】
（５−２）インビトロセレクション
次いで、PDO及びBDA, 3F, 6R14の各cDNAタンパク質融合体を、上記（５−１）で調製した標的タンパク質（IgG, IL6R, AChBP）を固定化した磁気性ビーズに対して反応させる。
非結合性のPDOと結合性のBDA（又は3F, 6R14）のmRNA−（リンカー−Ｎ）複合体を20:1の比率で混合し、実施例４と同様の工程により翻訳、修飾されてcDNAディスプレイタンパク質とした。
ここで、3F及び6R14のようなジスルフィドが豊富なリガンドの場合は、非特許文献２３に従い、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（PDI）（インプットテンプレートに対して70％以上の融合体が形成されると仮定して、cDNAディスプレイに対して1:1のモル比）で、10mMの酸化グルタチオン（GSSG）及び1mMの還元グルタチオン（GSH）を存在させて翻訳、リフォールディング及び成熟工程に供した。
実施例４と同様にHis-タグで溶出した各サンプルそれぞれ50μlを150μlのセレクション緩衝液（SB；1×PBS、100mMのNaCl及び0.1％のTween-20）と混合して、25℃で30分間、IgG, IL6R及びAChBPを固定化した磁気性ビーズと共にインキュベートした。なお、各セレクション用に用いる緩衝液からはジチオスレイトール（DTT）を全て除いておく。
同じ緩衝液200μlでビーズを10回洗浄した後、100mMのDTTで溶出し（マイクロ−スピンカラム、GE Healthcare）、脱塩（10mM TrisHCl pH7）した。
「セレクション前」の画分と溶出された「セレクション後」の画分を、それぞれ下記の0.2mMのPS及びPv3Aプライマー（グライナー社に合成依頼）を用いて25サイクル増幅した（変性（94℃）、20秒；アニーリング（60℃）、15秒；延長（72℃）、20秒）。
P S：5'-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCT-3'（配列番号１）及び
Pv3 A：5’-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGAT-3’（配列番号２）
変性ゲル電気泳動（4.5％のゲル及び8Mの尿素）を行い、Sybr Gold染色によって各モデルタンパク質をコードするDNAの量を定量分析した。
これら一連の工程を図１１ａとして示す。最初のテンプレートDNAからmRNAへの転写工程から、最後の分析工程までのそれぞれの平均的所要時間も付記した。このように、各工程が極めて短時間で行われており、本発明のスクリーニング方法がハイスループットに行われることを実証するものでもある。
モデルとした(1)PDO/BDAとIgGの組み合わせではBDAが、(2)PDO/3FとAChBPの組み合わせではAChBPが、また(3)PDO/6R1とIL6Rとの組み合わせではIL6Rが、それぞれ混合したPDOと比較して選択的に増幅された（図１１ｂ）。(1)〜(3)それぞれのセレクション前後での定量的PCRでの値の変化比率である「フォールドエンリッチメント（Fold Enrichment）数」は、(1)40±5％、(2)30±3％、（3）35±2％であった（図１１ｃ）。
【００４４】
（参考例６）FLAG-タグ配列に対応した8-merペプチド混合物のライブラリーを用いたセレクション
FLAG-タグが抗FLAGM2抗体と結合するために必要な「DYKDDDDK（配列番号３）」に対応する8-merペプチドがランダム化された混合物である8-merペプチドライブラリーを以下の様に調製した。
8-merペプチドライブラリーは、相補する「オーバーラップ配列」を持つ２本のオリゴヌクレオチドを使って構築した。即ち
（１）上流プライマー；最も5'側にはSP6プロモーター及びキャップを有し、それに続いて5'-UTR, Kozak及びATGに続き「オーバーラップ配列」があるオリゴヌクレオチド、
（２）下流プライマー；「オーバーラップ配列」がランダム領域の3'末端側に設けられ、5'末端にHis-タグ及びY-タグ配列を有するように構築されたオリゴヌクレオチド断片
の混合物である（図１２ａ）。
ここで、「オーバーラップ配列」とは、２本のセンスプライマーとランダム配列を入れたアンチセンスプライマーとなる合成オリゴヌクレオチドの3'側の十数ベースを相補的にオーバーラップさせ、PCRでお互いに5'側から3'側に伸長させながらライブラリーを構築する手法である。
ここで用いた２種類のプライマーは、以下の通りである。
上流センスプライマー：（配列番号４）
5’-ATTTAGGTGACACTATAGAATACAAGCTTGCTTGTTCTTTTTGCAGAAGCT
CAGAATAAACGCTCAACTTTGGCAGATCTACCATGG-3’
下流アンチセンスプライマー：（配列番号５）
5’-TTTCCCCGCCGCCCCCCGTCCTGCTTCCGCCGTGATGATGATGGTGGTGAG
ACCCTCCGCCTGAGCCTCCACCSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNTGAACCTCCCATGGT-3’
ランダム領域は、NNSコドン（N=A, T, C又はG；S=C又はG）でコードして、下流プライマーに含めた。
この２つのプライマー断片を、変性（94℃）を20秒、アニーリング（60℃）を15秒及び延長（72℃）を30秒のオーバーラップPCR 15サイクルで結合した。
タグ構築物は、ランダムな領域をFLAG-タグ配列で置き換えた以外は同じ方法で調製した。
【００４５】
8-merペプチドライブラリーのmRNAを、参考例（２−２）と同様に、参考例１で得られたリンカー−Ｎにライゲーションして8-merペプチドライブラリーmRNA−リンカー−Ｎを調製した。10pmolの8-merペプチドライブラリーmRNA−リンカー−Ｎを、同様に調製した10fmolのFLAG-タグmRNA−リンカーと混合した。
実施例（３−３）と同様に、小麦胚芽抽出物翻訳系（WGE）中に供して翻訳及び成熟によりmRNAタンパク質融合体を得、参考例４と同様にHis-タグによる精製後に逆転写して溶出し、cDNAタンパク質融合体のライブラリーを得た。
一方、比較のために非特許文献１７に記載の「puro−リンカー」を上記8-merペプチドライブラリーに適用して、当該文献のプロトコルに従ってcDNAタンパク質融合体のライブラリーを調製した。
【００４６】
上記２種類のcDNAタンパク質融合体ライブラリーを、それぞれ実施例（５−１）と同様の手法で磁気性ビーズに固定化させた200nMの抗−FLAG M2抗体（Sigma社製）と共に、200μlのDTTが除かれた緩衝液（SB）中で混合し、25℃で30分間反応させた。実施例（５−２）と同様に、ビーズを等容量の緩衝液（SB）で5回（ラウンド1）、8回（ラウンド2）及び10回（ラウンド3）洗浄して100mMのDTTで溶出した後脱塩した。
溶出した画分をPCR増幅して次のラウンドへ進め、合計3サイクル選択を行った。ラウンド3の後、PCR産物をクローン化して（TAクローニング、Invitrogen）、ランダムピッキングで20クローンを選択し配列決定した。
これらの一連の工程の概念図は図１２ｂに示す。
本発明のリンカー−Ｎを用いた場合と、非特許文献１７のPuro−リンカーを用いた場合のセレクション結果を図１２ｃに示す。
リンカー−Ｎを用いた場合には、3サイクル後には80％がDYKDDDDK（配列番号３）のFLAG-タグ配列を選択できたが、従来のPuro−リンカー（非特許文献１７）を用いた場合は選択されたFLAG-タグ配列は20％に留まった。
【００４７】
このことは、本発明のセレクション工程中では、「ノイズ」となる余剰mRNA−リンカー−Ｎ連結体、mRNAタンパク質融合体などを系から効率よく除去でき、S/N比が減少できたことを示している。
【００４８】
（実施例１）3FライブラリーからのVEGF結合タンパク質スクリーニング
（実１−１）3FのcDNAタンパク質融合体ライブラリーの調製
まず、非特許文献１４に従って、下記のスリーフィンガー（3F）のLoop1、Loop2及びLoop3をランダム化させた3Fライブラリー（MicTx-3鋳型：図１３）からmRNAライブラリーを調製した。
なお、「3F」のアミノ酸配列は下記の通りであり、そのランダム領域を最初から順にLoop1、Loop2、Loop3と称する。
LVCY(X)6PGTLETCPDDFTCV(X)10TQYCSHACAIP(X)7CCQTDKCNG（配列番号１５）
次いで、本発明のリンカー−Ｎに対し、前記実施例と同様の手法を適用し、ライブラリーmRNA−（リンカー−Ｎ）融合体（200nM）をWGEライセート反応液0.5ml中で翻訳して3F-cDNA融合体を作製した。反応液の組成は次の通りである。
ライブラリーmRNA−リンカー融合体  200nM
WGEライセート(PROMEGA)  250μl
アミノ酸混合液(PROMEGA)  40μl
酢酸カリウム溶液  50mM
RNase inhibitor(PROMEGA)  200unit
Protein Disulfide Isomerase（タカラバイオ）  5μg
酸化型グルタチオン  10mM
還元型グルタチオン  1mM
反応は25℃で15分間行った。
その結果、3F-cDNA融合体として、およそ3×1012分子が得られた。
なお、あらかじめcDNAタンパク質融合体の分子数の見積りを行うために、濃度標準として既知量の上記3F-mRNA−リンカーを用いてSDS-PAGEで行っている。
【００４９】
（実１−２）インビトロセレクション
VEGF（PeproTech社製, London）を参考例（５−１）と同様に磁気性ビーズ（Magnosphere MS300/Streptavidin、タカラバイオ））に固定化した。
上記（実１−１）で得られたcDNAタンパク質融合体を、固定化したVEGFと200μlのSB（selection buffer）緩衝液中、25℃で1時間反応させ、続いてSB緩衝液及びWB（wash buffer）緩衝液（1×PBS, 100mMのNaCl及び0.5％のTween-20）でそれぞれ数回洗浄した。洗浄後のビーズに100mMのDTT溶液を投与し、25℃で10分間放置後cDNAを含む上澄み液を得た。
得られた上澄み液をMicro-spin column（GEヘルスヘルスケア社）により脱塩してPCR増幅した（変性（94℃）を20秒、アニーリング（60℃）を15秒そして延長（72℃）を30秒）。選択圧（selection pressure）を適用するために、VEGFの濃度を1μMから1nMに変化させ、そして洗浄回数をWB洗浄液で漸進的に増大した。7ラウンド（R7）の後に、PCR産物をpCR2.1ベクター（TAクローニング、Invitrogen）にクローンして、ランダムに20クローンを選択し配列決定した。
【００５０】
（実１−３）クローンの配列の分析
得られた20クローンの配列を解析した結果、それぞれがコードしているアミノ酸配列でグループ分けすると、G-1配列が60％、G-2配列及びG-3配列が15％ずつであった。各グループの各Loop1〜3のアミノ酸配列は以下の通りである。
G-1：60%(12／20)
Loop1=PLTRVV（配列番号６）,  Loop2=HGDHHTLSEW（配列番号７）,  Loop3=EEPTAHV（配列番号８）
G-2：15％(3／20)
Loop1＝WEVVLL（配列番号９）,  Loop2=AHSVTLAHGH,（配列番号１０）,
Loop3=TGPGAER（配列番号１１）
G-3：15％(3／20)
Loop1=TLWLSY（配列番号１２）,   Loop2=DVPQSGTNLA（配列番号１３）,
Loop3=ELTHPVD（配列番号１４）
【００５１】
（実１−４）解離定数の測定
非特許文献１４に報告された方法に従って解離定数（Kd）を測定した。一定量の3Fディスプレイタンパク質（〜1nM）を種々の量のVEGF（0.1nM〜1μM）と１時間反応させた。混合物を一定量のVEGF（〜100nM）に適用してさらに30分間培養した。数回洗浄した後、抗His-抗体（R&D systems）を1/2000希釈で加えて１時間反応させた。反応混合物を数回洗浄した後、基質、TMBを加えた。適切なカラー展開の後、0.5MのH2SO4を加えて反応を停止して、450nmの吸収を測定した。
20クローンのG-1, G-2及びG-3グループそれぞれの典型的な配列及びその解離定数（Kd値）を（表１）に示す。特にG-1グループは2.1±0.5nMと、ペプチドとしては極めて低い数値を示し、その親和性は市販の抗VEGF抗体（非特許文献１６）のKd値2.9nMと匹敵している。
【００５２】
【表１】
2016123342.tif 000003
【００５３】
上記G-1グループのペプチド（ペプチドG-1）は、VEGFへの特異性の高いVEGF結合性ペプチドであり、基本骨格としてCTx3（非特許文献１５）由来のCTx3-3F配列を有しているため、下記（式２）のアミノ酸配列で表される。
（式２）
LVCYPLTRVVPGTLETCPDDFTCVHGDHHTLSEWTQYCSHACAIPEEPTAHVCCQTDKCNG（配列番号１６）
【００５４】
（実施例２）結合特異性の評価
（実２−１）
実施例１で得られたR7 mRNA−（リンカー−Ｎ）（200nM）を用い、上記（実１−１）と同様の方法で翻訳してcDNAタンパク質融合体を調製した。
得られたこれらの融合体を３つの部分に分けて、
（１）ストレプトアビジンビーズ（何も結合させていない場合）、
（２）VEGFビーズ（200nM）及び
（４）Fcビーズ（200nM）、（Fc固定化ビーズの調製法はVEGFビーズと同様、実施例（５−１）に記載の方法で調製した。）と共に、200μlのSB（selection buffer）緩衝液中、25℃で30分反応させた。なお、「Fc」としては、ヒトIgG1由来Fc（R&D Systems社）を用いた。
（３）のコントロールとしては、R7mRNA−（リンカー−Ｎ）をタンパク質への翻訳工程なしに逆転写したR7cDNA−（リンカー−Ｎ）の等量（200nM）をVEGFビーズと同様の条件で反応させた。
各ビーズを同じ緩衝液で10回洗浄して100mMのDTTで溶出した。溶出した画分を脱塩して以下の条件でPCR増幅した（PCR条件：変性（94℃）を20秒、アニーリング（60℃）を15秒及び延長（72℃）を30秒）。
【００５５】
上記（１）〜（４）の場合のR7cDNA融合体について溶出画分をPCR増幅し、ゲル電気泳動で分析した（図１４ａ）。なお、電気泳動条件など他の条件も非特許文献１４と同様。
次に、非特許文献１４に従ってELISA法による分析を行った。
R7 cDNA融合体を3つの部分に分けSAビーズ、200nMのVEGFビーズ及び200nMのFcビーズとPBS-BSA(0.01%BSA)中、25℃で1時間インキュベートした。混合物をPBS-T(0.1%Tween)で洗浄し、続いて抗His抗体(R&D system)とPBS-T中、25℃で30分間反応させた。次いで、混合物をPBS-Tで数回洗浄し、続いて基質、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB;Sigma)を添加した。カラー展開の後、0.5MのH2SO4を加えて反応を停止し、サンプルを遠心分離して、450nmの吸収を測定した。
その結果、下記（実２−２）で詳細に述べるように、明らかにR7 cDNA融合体とVEGFビーズとの高い結合性が示された（図１４ｂ）。
得られたVEGF結合性ペプチド（ペプチドG-1：配列番号１６）について、ペプチドG-1とのアミノ酸配列相同性が高く、すでに立体構造解析がなされているスリーフィンガー型ペプチド AdTx1（Dendroaspis angusticeps由来、PDB=4IYE）を鋳型とし、分子構造構築ソフト「Prime」（Schroedinger社）を用いた構造モデリングにより推定立体構造図を作成した（図１６）。
【００５６】
（実２−２）PCRでの分析結果
PCRで分析した結合アッセイにおいて、R7ライブラリータンパク質融合体はVEGFを含んでいないネガティブコントロールに対しては0.2％未満しか結合しない（図１４ａ（１））。一方、VEGFビーズとは有意な結合（2％以上；図１４ａ（２））を示した。核酸アプタマー、すなわち、mRNA/cDNAハイブリッドを介してライブラリーのエンリッチメントの可能性を検証するためmRNA-リンカーの逆転写によってR7mRNA/cDNAハイブリッドを調製して結合の可能性を試験した。その結果、VEGFに対してmRNA/cDNAハイブリッドを介する結合は観察されなかった（0.2％未満；図１４ａ（３））。R7タンパク質融合体もFcに対する親和性を示さず（0.2％未満；図１４ａ（４））、3Fライブラリーの標的（VEGF）特異的エンリッチメントを示唆した。ELISAによる結合アッセイにおいて、R7タンパク質融合体は、VEGFを含まないSAビーズ(1)及びネガティブコントロールとしてFcが固定されたビーズ(4)と比較してVEGFを固定化したビーズに対しては5倍強いシグナルを示した（図１４ｂ）。この結果もこのライブラリーがVEGFに強く特異的であったことを示唆している。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
１．配列番号１：P S primer
２．配列番号２：Pv3 A primer
３．配列番号３：FLAG-tag
４．配列番号４：8-mer peptide library primer(F)
５．配列番号５：8-mer peptide library primer(R)
６．配列番号６：G-1 Loop1
７．配列番号７：G-1 Loop2
８．配列番号８：G-1 Loop3
９．配列番号９：G-2 Loop1
１０．配列番号１０：G-2 Loop2
１１．配列番号１１：G-2 Loop3
１２．配列番号１２：G-3 Loop1
１３．配列番号１３：G-3 Loop2
１４．配列番号１４：G-3 Loop3
１５．配列番号１５：CTx3-3F peptide
１６．配列番号１６：VEGF binding peptide
１７．配列番号１７：1F-Loop I
１８．配列番号１８：1F-Loop II
１９．配列番号１９：1F-Loop III
２０．配列番号２０：hVEGF-A
【図１】
2016123342.tif 000004
【図２】
2016123342.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2016123342.tif 000018
【図１６】
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【配列表】
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