(57)【要約】【課題】  HIF阻害活性を有する新規な物質を提供する。【解決手段】    下記の一般式(I)2016210687.tif 000012〔式中、R1、R2、R3、及びR4はそれぞれ水素原子、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、N-モルホリルウレア基、若しくはN-(4-アミノフェニル)ウレア基を表すか、又は隣接するもの同士が結合してアルキレンジオキシ基を形成し、R5、R6、R7、R8、及びR9はそれぞれ水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又は隣接するもの同士が結合してアルキレンジオキシ基を形成する。〕で表される化合物。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)
【化１】
2016210687.tif 000011
〔式中、R1、R2、R3、及びR4はそれぞれ水素原子、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、N-モルホリルウレア基、若しくはN-(4-アミノフェニル)ウレア基を表すか、又は隣接するもの同士が結合してアルキレンジオキシ基を形成し、R5、R6、R7、R8、及びR9はそれぞれ水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又は隣接するもの同士が結合してアルキレンジオキシ基を形成する。〕
で表される化合物。
【請求項２】
一般式(I)におけるR6及びR7が結合してアルキレンジオキシ基を形成することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
一般式(I)におけるR6及びR7が結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、又は1,3-n-プロピレンジオキシ基を形成することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物を含有することを特徴とするHIF阻害剤。
【請求項５】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項６】
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物を含有することを特徴とする抗癌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なベンゾフロピラゾール誘導体、並びにそれを用いたHIF阻害剤、医薬組成物、及び抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
HIF-1（hypoxia inducible factor-1）は、血管新生、糖代謝、細胞の増殖と生存、及び固形癌の浸潤に関与する遺伝子の発現を制御する転写因子であることから、癌の進行において低酸素状態への適応反応を制御する主要な因子と考えられている。HIF-1は、低酸素状態誘導性のHIF-1αサブユニットと、恒常的に発現しているHIF-1βサブユニットとからなるヘテロ二量体である。
【０００３】
通常の酸素状態では、HIF-1αの分解は、プロリン水酸化酵素によってプロリン残基がヒドロキシル化されることによって促進される。ヒドロキシル化されたHIF-1αは、フォンヒッペル・リンダウタンパク質を介したユビキチンプロテアソームシステムによって分解される。一方、低酸素状態では、プロリン水酸化酵素の活性が低下するため、HIF-1αのヒドロキシル化は抑制される。分解を免れたHIF-1αは、核内へ移行し、HIF-1βと二量体を形成する。この二量体は、DNA上の低酸素応答領域と呼ばれる特定の領域に結合し、標的遺伝子を活性化する。このような標的遺伝子には、血管内皮増殖因子(VEGF)、エリスロポエチン、グルコーストランスポーター、インスリン様成長因子などの遺伝子が含まれる。
【０００４】
様々なタイプのヒト腫瘍細胞において、HIF-1αが高レベルで検出されることが知られている（Talks, K.L. et al., Am. J. Pathol. 2000, 157, 411-421、Birner, P. et al., Clin. Cancer Res. 2001, 7, 1661-1668、Birner, P. et al., Cancer 2001, 92, 165-171、Giatromanolaki, A. et al., Br. J. Cancer 2001, 85, 881-891、Zagzag, D et al., Cancer 2000, 88, 2606-2918、Birner, P. et al., Cancer Res. 2000, 60, 4693-4696）。この事実は、HIF-1αの阻害剤が抗癌剤の有力な候補になり得ることを示す。実際、PX-478（Koh, M. Y. et al., Mol. Cancer Ther. 2008, 7, 90-100）、PX-866（Le Cras, T. D. et al., Am. J. Pathol. 2010, 176, 679-686）、EZN-2968（Greenberger, L. M. et al., Mol. Cancer Ther. 2008, 7, 3598-3608）などのHIF-1α阻害剤については、現在臨床研究が行われている。また、最近、本発明者は、インデノピラゾール誘導体がHIF-1αの阻害剤であることを報告している（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hidemitsu Minegishi, Shinji Fukashiro, Hyun Seung Ban, Hiroyuki Nakamura, ACS Med. Chem. Lett., 2013, 4 (2), pp 297-301
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
医学が発達した今日おいても癌は依然として致死率の高い疾患である。HIF阻害剤は、癌に対する有効な治療剤になり得ることから、新しいHIF阻害剤の開発が望まれている。このような背景の下、本発明は、HIF阻害活性を有する新規な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ベンゾフロピラゾール骨格を有する化合物が高いHIF阻害活性を有することを見出し、この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（６）を提供するものである。
（１）下記の一般式(I)
【化１】
2016210687.tif 000002
〔式中、R1、R2、R3、及びR4はそれぞれ水素原子、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、N-モルホリルウレア基、若しくはN-(4-アミノフェニル)ウレア基を表すか、又は隣接するもの同士が結合してアルキレンジオキシ基を形成し、R5、R6、R7、R8、及びR9はそれぞれ水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又は隣接するもの同士が結合してアルキレンジオキシ基を形成する。〕
で表される化合物。
【０００９】
（２）一般式(I)におけるR6及びR7が結合してアルキレンジオキシ基を形成することを特徴とする（１）に記載の化合物。
【００１０】
（３）一般式(I)におけるR6及びR7が結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、又は1,3-n-プロピレンジオキシ基を形成することを特徴とする（１）に記載の化合物。
【００１１】
（４）（１）乃至（３）のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とするHIF阻害剤。
【００１２】
（５）（１）乃至（３）のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物。
【００１３】
（６）（１）乃至（３）のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とする抗癌剤。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のベンゾフロピラゾール誘導体は、HIF阻害活性を有することから、HIFと関連する癌などの疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】化合物１３によるHIF-1αタンパク質安定化への影響を表す図。
【図２】化合物１３によるHIF-1αタンパク質の細胞内局在への影響を表す図。左列の図（HIF-1α）はHIF-1αタンパク質の位置を示し、中列の図（DAPI）は核の位置を示し、右列の図（Merge）は左列の図と中列の図を重ね合わせたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において「アルキレンジオキシ基」とは、例えば、式：-O-(CH2)n-O-で表される直鎖状アルキレンジオキシ基である。式中のnは1以上の整数であればよいが、1〜５の整数であることが好ましい。アルキレンジオキシ基の具体例としては、メチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、1,3-n-プロピレンジオキシ基、1,4-n-ブチレンジオキシ基、1,5-n-ペンチレンジオキシ基などを挙げることができる。
【００１７】
本発明において「HIFを阻害する」とは、HIFの転写因子としての機能を阻害することを意味する。ある物質がHIFを阻害するかどうかは、例えば、実施例２に記載したルシフェラーゼアッセイにより判定することができる。本発明において阻害対象とするHIFは、主にHIF-1αであるが、HIF-1βやHIF-1以外のHIFも阻害対象に含まれる。
【００１８】
本発明の化合物は、一般式(I)で表される。
一般式(I)においてR1は水素原子、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、N-モルホリルウレア基、若しくはN-(4-アミノフェニル)ウレア基を表すか、又はR2と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R1は水素原子であることが好ましい。
【００１９】
一般式(I)においてR2は水素原子、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、N-モルホリルウレア基、若しくはN-(4-アミノフェニル)ウレア基を表すか、又はR1若しくはR3と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R2は水素原子であることが好ましい。
【００２０】
一般式(I)においてR3は水素原子、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、N-モルホリルウレア基、若しくはN-(4-アミノフェニル)ウレア基を表すか、又はR2若しくはR4と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R3は水素原子であることが好ましい。
【００２１】
一般式(I)においてR4は水素原子、メトキシ基、エトキシ基、ヒドロキシ基、N-モルホリルウレア基、若しくはN-(4-アミノフェニル)ウレア基を表すか、又はR3と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R4は水素原子であることが好ましい。
【００２２】
一般式(I)においてR5は水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又はR6と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R5は水素原子であることが好ましい。
【００２３】
一般式(I)においてR6は水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又はR5若しくはR7と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R6はR7と結合してアルキレンジオキシ基を形成することが好ましく、R7と結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、又は1,3-n-プロピレンジオキシ基を形成することがより好ましく、R7と結合して1,3-n-プロピレンジオキシ基を形成することが更に好ましい。
【００２４】
一般式(I)においてR7は水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又はR6若しくはR8と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R7はR6と結合してアルキレンジオキシ基を形成することが好ましく、R6と結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、又は1,3-n-プロピレンジオキシ基を形成することがより好ましく、R6と結合して1,3-n-プロピレンジオキシ基を形成することが更に好ましい。
【００２５】
一般式(I)においてR8は水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又はR7若しくはR9と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R8は水素原子であることが好ましい。
【００２６】
一般式(I)においてR9は水素原子、メトキシ基、ヒドロキシ基、メトキシカルボニル基、カルボキシル基、イソプロピル基、若しくはイソブトキシ基を表すか、又はR8と結合してアルキレンジオキシ基を形成すればよいが、一般式(I)で表される化合物をHIF阻害剤として利用する場合、R9は水素原子であることが好ましい。
【００２７】
一般式(I)においてR1、R2、R3、及びR4は同じ基であっても、異なる基であってもよい。同様に、R5、R6、R7、R8、及びR9も同じ基であっても、異なる基であってもよい。
【００２８】
一般式(I)で表される化合物は、HIFに対する阻害活性以外にも、癌細胞に対する増殖抑制活性、サイクリン依存性キナーゼ（CDK）に対する阻害活性、血小板増殖因子受容体チロシンキナーゼ（PDGFR-TK）に対する阻害活性、上皮成長因子受容体チロシンキナーゼ（EGFR-TK）及び血管内皮細胞増殖因子受容体２チロシンキナーゼ（VEGFR-2-TK）に対する阻害活性、細胞毒性などの生物活性を持つと考えられる。従って、一般式(I)で表される化合物は、HIF阻害剤のほか、細胞増殖抑制剤、CDK阻害剤、PDGFR-TK阻害剤、EGFR-TK及び/又はVEGFR-2-TK阻害剤、細胞毒性薬などとして利用できる。一般式(I)で表される化合物を、細胞増殖抑制剤として利用する場合、R2がメトキシ基であり、R6がメトキシカルボニル基であり、R1、R3-R5、R7-R9が水素原子であることが好ましく、CDK阻害剤として利用する場合、R1がN-モルホリルウレア基であり、R7がメトキシ基であり、R2-R6、R8-R9が水素原子であることが好ましく、PDGFR-TK阻害剤として利用する場合、R2及びR3がメトキシ基であり、R6がフッ素原子であり、R1、R4-R5、R7-R9が水素原子であることが好ましく、EGFR-TK及び/又はVEGFR-2-TK阻害剤として利用する場合、R1がN-(4-アミノフェニル)ウレア基であり、R6とR7が結合してメチレンジオキシ基を形成し、R2-R5、R8-R9が水素原子であることが好ましく、細胞毒性薬として利用する場合、R2がメトキシ基であることが好ましい。
【００２９】
一般式（I）で表される化合物は、酸又は塩基とともに塩を形成する場合がある。このような塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩）、硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩などを挙げることができる。また、一般式（I）で表される化合物は、水又は有機溶媒と混和することなどにより、水和物または溶媒和物を形成する場合がある。このような一般式（I）で表される化合物の塩、水和物および溶媒和物も、一般式(I)で表される化合物に含まれる。
【００３０】
また、一般式（I）で表される化合物には、光学異性体などが存在する場合がある。このような異性体の分離されたもの、又はそれらの混合物も、一般式(I)で表される化合物に含まれる。
【００３１】
一般式（I）で表される化合物の具体例としては、例えば、以下の(I-1)〜（I-40）を挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。なお、構造式中の「Me」はメチル基を示し、「Et」はエチル基を示す。
【化２】
2016210687.tif 000003
【化３】
2016210687.tif 000004
【００３２】
上記化合物のうちで、HIF阻害剤として利用する場合に好ましいものとして、I-7（化合物１３）を挙げることができ、細胞増殖抑制剤として利用する場合に好ましいものとして、I-16を挙げることができる。
【００３３】
一般式(I)で表される化合物は、ピラゾロインドールやインデノピラゾールなどと類似した構造を持つので、これらの化合物の公知の製造方法（例えば、Kumar, A.S. et al., Synthesis, 2011, 23, 3878に記載の方法）に改変や修正を加えた方法に従って製造することができる。例えば、下記の一般式(II)で表される化合物と下記の一般式(III)で表される化合物とを反応させ、下記の一般式(IV)で表される化合物を製造し、この一般式(IV)で表される化合物から一般式(I)で表される化合物を製造することができる。
【化４】
2016210687.tif 000005
上記式中、R1〜R9は前記と同じ意味を示す。
【００３４】
一般式(II)で表される化合物と一般式(III)で表される化合物との反応は、以下のように行うことができる。
【００３５】
この反応は、酢酸ナトリウムなどの存在下で行う。酢酸ナトリウムの代わりに酢酸カリウム、酢酸カルシウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどを用いることもできる。
【００３６】
この反応に使用する一般式(III)で表される化合物の量は特に限定されないが、一般式(II)で表される化合物1molに対し、通常0.5〜3 molであり、好適には1〜1.2molである。酢酸ナトリウムなどの量も特に限定されないが、一般式(II)で表される化合物1molに対し、通常0.5〜5 molであり、好適には1〜1.2 molである。
【００３７】
使用する溶媒は、反応を阻害しないものであれば特に限定されず、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノールなどを使用することができる。
【００３８】
反応温度は、特に限定されないが、通常、室温〜150℃であり、好適には、50〜100℃である。
【００３９】
反応時間は、特に限定されないが、通常、1〜60分であり、好適には、5〜15分である。
【００４０】
反応生成物から一般式(VI)で表される化合物の精製は、クロマトグラフィーなどを用いた常法に従って行うことができる。
【００４１】
一般式(IV)で表される化合物から一般式(I)で表される化合物を製造する反応は、以下のように行うことができる。
【００４２】
この反応は、ヨウ化銅(I)など、シクロヘキサン-1,2-ジアミンなど、炭酸カリウムなどの存在下で行う。ヨウ化銅(I)の代わりにヨウ化銅(II)、臭化銅(I)、臭化銅(II)、酢酸銅(I)、酢酸銅(II)、塩化銅(I)、塩化銅(II)、シアン化銅(I)、シアン化銅(II)などを用いることもでき、シクロヘキサン-1,2-ジアミンの代わりにシクロペンタン-1,2-ジアミン、シクロヘプタン-1,2-ジアミン、シクロオクタン-1,2-ジアミン、ビピリジンなどを用いることもでき、炭酸カリウムの代わりに炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、などを用いることもできる。
【００４３】
この反応に使用するヨウ化銅(I)などの量は特に限定されないが、一般式(IV)で表される化合物1molに対し、通常0.05〜1molであり、好適には0.1〜0.2molである。シクロヘキサン-1,2-ジアミンなどの量も特に限定されないが、一般式(IV)で表される化合物1molに対し、通常0.05〜1molであり、好適には0.2〜0.4molである。炭酸カリウムなどの量も特に限定されないが、一般式(IV)で表される化合物1molに対し、通常0.5〜5molであり、好適には1.5〜2molである。
【００４４】
使用する溶媒は、反応を阻害しないものであれば特に限定されず、N-メチル-2-ピロリドン、テトラヒドロフラン、N,N-ジメチルホルムアミド、N,N-ジメチルアセトアミドなどを使用することができる。
【００４５】
反応温度は、特に限定されないが、通常、室温〜150℃であり、好適には、80〜120℃である。
【００４６】
反応時間は、特に限定されないが、通常、1〜60分であり、好適には、5〜10分である。
【００４７】
反応生成物から一般式(I)で表される化合物の精製は、クロマトグラフィーなどを用いた常法に従って行うことができる。
【００４８】
一般式(I)で表される化合物は、HIF阻害活性を有する。HIFは癌などの疾患に関与していると考えられるので、一般式(I)で表される化合物は、医薬組成物、具体的には抗癌剤として使用できる。
【００４９】
一般式(I)で表される化合物を医薬組成物又は抗癌剤として使用する場合、公知の方法に従い薬学的に許容される担体又は希釈剤と混合することにより、この化合物を製剤化することができる。剤型は特に限定されず、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、注射剤、坐剤、徐放剤などとすることができる。投与方法も特に限定されず、経口的又は非経口的（局所、直腸、静脈投与など）に投与することができる。投与量は、投与対象、投与方法などにより異なるが、例えば、抗癌剤として、成人に対して、経口的に投与する場合、１回当たり、一般式(I)で表される化合物が10〜100mgとなるように１日１〜数回に分けて投与することができる。
一般式(I)で表される化合物は、環中に酸素原子を含むことから、インデノピラゾール誘導体よりも水に溶けやすいと考えられる。また、一般式(I)で表される化合物は、HIF-1αの核内への移行を妨げないことから、HIF-1αの分解を促進するLW6のようなHIF阻害剤よりも毒性が低いと考えられる。これらの性質から、一般式(I)で表される化合物は、既知のHIF阻害剤よりも医薬に適したものであると考えられる。
【実施例】
【００５０】
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５１】
〔実施例１〕  1-フェニル-1H-ベンゾフロ[2,3-c]ピラゾール誘導体の製造
【化５】
2016210687.tif 000006
上記の1-フェニルベンゾフロピラゾール骨格を持つ化合物を以下のように製造した。
（１）2-クロロベンゾフラン-3-カルバルデヒド（化合物２）の合成
【化６】
2016210687.tif 000007
ベンゾフラン-2(3H)-オン（化合物１）（1.063 g, 7.9 mmol）とジメチルホルムアミド（DMF; 1.8 mL, 23.7 mmol）をクロロホルム（10 mL）に溶かし、0℃でPOCl3（1.7 mL, 18.2 mmol）を加え５分撹拌した。その後、反応混合物を一晩加熱還流を行い、室温まで冷やした。2N 水酸化ナトリウム水溶液を加え、pH = 7とした後、塩化メチレンで抽出した。得られた有機層を水で洗った後、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で溜去後シリカゲルカラムクロマトグラフ（ヘキサン：酢酸エチル＝80:1）で精製し、化合物２を0.675g (3.74 mmol)で得た（収率47%）。1H NMR (400 MHz; CDCl3)δ10.2 (s, 1H), 8.18-8.15 (m, 1H), 7.52-7.51 (m, 1H), 7.50-7.42 (m, 2H).
【００５２】
（２）(3,4-ジヒドロ-2H-ベンゾ[b][1,4]ジオキセピン-7-イル)ヒドラジン塩酸塩（化合物５）の合成スキーム
【化７】
2016210687.tif 000008
＜化合物３の合成方法＞
4-ニトロベンゼン-1,2-ジオール(0.296 g, 1.9 mmol)をDMF (10 mL)に溶かし、炭酸カリウム (1.31 g, 9.5 mmol)、並びに1,3-ジブロモプロパン(0.3 mL, 2.85 mmol)を順に加え、反応混合物を110℃で一晩撹拌した。反応混合物を室温まで冷やした後、酢酸エチル（20 mL）を加え、水で洗った後、飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で溜去後、化合物３を粗収量0.29g (1.49 mmol, 収率78%)で得た。1H NMR (400MHz; CDCl3): δ 7.87-7.82 (m, 2H), 7.03 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.40 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.34 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.30 (quint, J = 6.0 Hz, 2H).
【００５３】
＜化合物４の合成方法＞
得られた化合物３（0.29 g, 1.49 mmol）をメタノール（10 mL）とTHF (5 mL)の混合溶媒に溶かした後、Pd/C (0.106 g)を加えて、水素雰囲気下室温で一晩撹拌した。パラジウム触媒をセライト濾過し、溶媒を減圧下で溜去することで、化合物４を粗収量0.225g (1.36 mmol, 収率91%)で得た。1H NMR (400 MHz; CDCl3) δ 6.82 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.37 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.29 (dd, J = 8.4, 2.7 Hz, 1H), 4.17 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 4.11 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 3.49 (bs, 2H), 2.16 (quint, J = 5.4 Hz, 2H).
【００５４】
＜化合物５の合成方法＞
化合物４（0.225 g, 1.36 mmol）に6 N 塩酸を加え、0℃で撹拌しながら、0.5 mLの水に溶かしたNaNO2（0.112 g, 1.63 mmol）を加えた。濃塩酸1 mLに溶かしたSnCl2・2H2O（0.614 g, 2.72 mmol）を加え30分間撹拌後、水酸化ナトリウム水溶液で反応を停止した。反応混合物を酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で溜去後、ジエチルエーテルに溶かし、1N塩酸のエーテル溶液を加えることで、化合物５を固体で得た。1H NMR (400 MHz; CDCl3) δ 7.02 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.71 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 6.66 (dd, J = 8.4, 2.7 Hz, 1H), 4.14 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 4.10 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.11 (quint, J = 5.4 Hz, 2H).
【００５５】
（３）1-フェニル-1H-ベンゾフロ[2,3-c]ピラゾール誘導体（化合物１３〜１６）の合成スキーム
【化８】
2016210687.tif 000009
＜化合物９の合成方法＞
化合物２（0.081 g, 0.45 mmol）及び化合物５（0.115 g, 0.53 mmol）をエタノール(1.5 mL)に溶かし、酢酸ナトリウム（0.043 g, 0.53 mmol）を加え、80℃でマイクロウェーブ照射を10分行った。固体を濾過後、溶媒を減圧下で溜去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（ヘキサン：酢酸エチル＝15:1）で精製し、化合物９を0.099 g (0.29 mmol)で得た（収率64%）。1H NMR (400 MHz; CDCl3) δ 8.27 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.82 (s, 1H), 7.63 (s, 1H), 7.47-7.37 (m, 3H), 6.99 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.85 (d, J = 2.9 Hz, 1H), 6.70 (dd, J = 8.6, 2.9 Hz, 1H), 4.26 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 4.19 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.22 (quint, J = 5.4 Hz, 2H).
【００５６】
＜化合物１０の合成方法＞
化合物９の合成と同様の方法により、化合物２（0.068 g, 0.38 mmol）及び化合物６（0.093 g, 0.46 mmol）から、化合物１０を収率55%（0.07 g, 0.21 mmol）で得た。1H NMR (400MHz; CDCl3) δ 8.27 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.81 (bs, 1H), 7.46-7.36 (3H, m), 6.85 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.77 (bs, 1H), 6.60 (bs, 1H), 4.32-4.27 (m, 4H).
【００５７】
＜化合物１３の合成方法＞
化合物９（0.099 g, 0.29 mmol）をN-メチル-2-ピロリドン(NMP, 0.5 mL)に溶かし、ヨウ化銅(I) (6 mg, 0.03 mmol)、(1R,2R)-シクロヘキサン-1,2-ジアミン (7 μL, 0.06 mmol)、炭酸カリウム（0.08 g, 0.58 mmol）を加え、100℃でマイクロウェーブ照射を10分行った。反応混合物を室温まで冷却後、水（10 mL）を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を減圧下で溜去後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフ（ヘキサン：酢酸エチル＝20:1）で精製し、化合物１３を収率19%（0.017 g, 0.054 mmol)で得た。1H NMR (400 MHz; CDCl3) δ 8.02 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.87 (s, 1H), 7.69 (d, J = 8.0 Hz 1H), 7.58-7.51 (m, 3H), 7.36-7.29 (m, 3H); 13C NMR (100 MHz; CDCl3) δ160.0, 156.4, 138.0, 131.1, 129.5, 126.1, 124.1, 124.1, 121.7, 120.2, 118.0, 112.5, 109.5.
【００５８】
＜化合物１４の合成方法＞
化合物１３の合成と同様の方法により、化合物１０（0.07 g, 0.21 mmol）から、化合物１４を収率13%（0.0083 g, 0.028 mmol）で得た。1H NMR (400 MHz; CDCl3) δ 7.84 (s, 1H), 7.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 7.57-7.56 (m, 2H), 7.50 (dd, J = 2.5, 8.7 Hz, 1H), 7.35-7.32 (m, 2H), 7.03 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.35 (s, 4H); 13C NMR (100 MHz; CDCl3) δ 160.0, 144.0, 142.0, 132.0, 130.7, 124.0, 123.9, 121.8, 120.2, 117.8, 112.4, 111.5, 109.2, 107.8.
【００５９】
＜化合物１５の合成方法＞
化合物９の合成と同様の方法により、化合物２（0.1 g, 0.55 mmol）及び化合物７（0.124 g, 0.66 mmol）から化合物１１を得た後、化合物１３の合成方法と同様にして、化合物１５を２工程収率3%（0.0046 g, 0.016 mmol）で得た。1H NMR (400MHz; CDCl3): δ 7.84 (s, 1H), 7.71-7.69 (m, 1H), 7.58-7.54 (m, 2H), 7.54-7.48 (m, 1H), 7.47-7.31 (m, 2H), 6.96 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.07 ( s, 2H).
【００６０】
＜化合物１６の合成方法＞
化合物1５の合成と同様、化合物２（0.1 g, 0.55 mmol）および化合物８（0.054 g, 0.55 mmol）から化合物１６を２工程収率31%（0.04 g, 0.17 mmol）で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.85 (s, 1H), 7.71-7.67 (m, 2H), 7.60-7.56 (m, 2H), 7.37-7.31 (m, 2H), 7.14 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.33 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 4.28 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 2.27 (quint, J = 5.6 Hz, 2H).
【００６１】
〔実施例２〕  細胞増殖阻害活性評価及びルシフェラーゼアッセイ
細胞増殖阻害活性評価は以下のように行った。
96穴マルチウェルプレートにてHeLa細胞を5x103 cells/100μlの密度で6時間培養した後、RPMI-1640培地で化合物を60-0.2μMの濃度に希釈し、100μlを細胞に加え、72時間、37 oCで培養した。その後、PBSに溶かしたMTT（sigma）試薬溶液（5 mg/ml）を加え、2時間培養した。2時間後上清を取り除きDMSOを100μl加えて、プレートリーダによって595 nmの吸光度を測定した。薬剤を投与していない細胞の吸光度を100%として、細胞増殖を50%阻害する濃度を片対数グラフにより算出し、IC50値として示した（表１）。
【００６２】
ルシフェラーゼアッセイは以下のように行った。
96穴マルチウェルプレートを用いて、HRE-ルシフェラーゼを安定発現させた HeLa 細胞を5x103 cells/100 μlの密度で、低酸素条件下（1% O2, 94% N2, 5% CO2）様々な化合物濃度（0.03〜30 μM）を含むRPMI-1640培地で16時間培養した後、培養上清を取り除いた。その後、Luciferase Assay SystemTM（Promega）を用いて付属のプロトコールに従いルシフェラーゼアッセイを行った。薬剤を投与していない細胞のルシフェラーゼ活性を100%として、ルシフェラーゼ活性を50%阻害する濃度を片対数グラフにより算出し、IC50値として示した（表１）。
【表１】
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【００６３】
表１に示すように、ベンゾフロピラゾール誘導体は、既知のHIF阻害剤であるYC-1と同等のHIF阻害活性を示した。特にベンゼン環にアルキレンジオキシ基を結合させ、環状化させた化合物１３及び１４は高い阻害活性を示した。
【００６４】
〔実施例３〕  ウエスタンブロット
12穴マルチプレートに2.5 x 105 cells/1 mlの濃度でHeLa細胞を播種し、化合物１３あるいはLW6を加えたのちに有酸素雰囲気下（20% O2）で1時間培養後し、低酸素雰囲気下（1% O2）で4時間培養した。培地を取り除き、lysis buffer (20 mM HEPES, pH 7.4, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 5 mM sodium fluoride, 2.5 mM p-nitrophenylene phosphate, 10 μg/ml phenylmethylsulfonylfluoride, 1 mM sodium vanadate, and 10 μg/ml leupeptin)を80 μl加えて細胞を溶解し、sample buffer (50 mM Tris, pH 7.4, 20% SDS, 50% glycerol, 20% 2-thioethanol, 50 μg/ml bromophenol blue)を20μl加えて、超音波、熱変性処理を行った。細胞ライセートを10% SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によってタンパク質を分離し、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）メンブレンに転写した。メンブレンを抗HIF-1α抗体（BD Transduction Laboratories, Lexington, KY）、抗チューブリン抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）で処理し、さらにHRP結合2次抗体で処理した。メンブレンをECL kit（GE healthcare Buckinghashire , UK））で処理し、タンパク質をMolecular Imager ChemiDoc XRS System (Bio-Rad, Hercules,CA)で可視化した（図１）。
図１に示すように、LW6は30μM濃度において、低酸素条件下でHIF-1αタンパク質の集積を阻害したのに対し、化合物１３はHIF-1αタンパク質の集積には影響を与えなかった。
【００６５】
〔実施例４〕  免疫染色
カバーガラス上に1x104 cells/100μlの濃度でHeLa細胞を撒き、35 mmディッシュに入れ2時間培養した後、培地を1 ml加えて12時間培養した。化合物を加えて8時間処理し、培地を取り除き4%パラホルムアルデヒド溶液で15分間処理して細胞を固定化した。その後0.4% Triton Xで5分間、イムノブロック（DSファーマバイオメディカル株式会社）で5分間処理した。抗HIF-1α抗体を加えて12時間、FITC結合2次抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.）で4時間、DAPI（和光純薬）で5分間処理した。ProLong（登録商標） Gold antifade reagent（Invitrogen）で封入し、蛍光顕微鏡で観察した（図２）。
図２に示すように、HIF-1αタンパク質は、有酸素条件下（20% O2）では分解されたが、低酸素条件下（1% O2）では、安定化され核内へと移行した。この結果は、化合物１３が低酸素条件下おけるHIF-1αタンパク質の核内移行を阻害しないことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、医薬品として利用可能な物質に関するものなので、製薬産業などの産業分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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