(57)【要約】      （修正有）【課題】カフェインに結合することができるＤＮＡ分子、及びこれらのＤＮＡ分子をスクリーニングする方法、並びにこれらのＤＮＡ分子を用いてカフェインを検出する方法の提供。【解決手段】特定の塩基配列を有するカフェインと結合することができるＤＮＡ分子、及び特定の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子、並びに前記ＤＮＡ分子を表面に担持してなるバイオセンサーチップを備える、カフェイン検出システム。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６７の塩基配列を有する、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
【請求項２】
配列番号６９の塩基配列と８０％以上同一である塩基配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３】
配列番号６７または配列番号６９の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号６７または配列番号６９の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、請求項３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
配列番号６９の塩基配列を有する、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項６】
配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかと８０％以上同一である塩基配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
【請求項７】
配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかに対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、請求項３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項８】
配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかに対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項９】
配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかを有する、請求項６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１０】
配列番号９と８０％以上同一である塩基配列を有する、請求項６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１１】
配列番号９または配列番号４６の配列を有する、請求項１０に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１２】
配列番号９に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、請求項７に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１３】
配列番号９に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、請求項１２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１４】
配列番号９に対して、配列番号９の１７番目のシトシンから１９番目のチミンまでの３塩基のいずれか１以上の塩基の置換、および／または、
上記１７番目のシトシンと１８番目のチミンとの間および／または１８番目のチミンと１９番目のチミンとの間に数塩基の挿入を有する塩基配列を有し、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
【請求項１５】
予測二次構造中で、ステムループ構造を形成し、ＤＮＡ分子の５’末端から２塩基と３’末端から２塩基との間で塩基対を形成する、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１６】
カフェインとの結合に関するＫｄ値が５μＭ以下である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１７】
カフェインとの結合に関するＫｄ値が１μＭ以下である、請求項１６に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１８】
配列番号７０または配列番号７１の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
【請求項１９】
配列番号７０または配列番号７１ の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、請求項１８に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２０】
配列番号７０または配列番号７１の塩基配列を有する、ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
カフェインとの結合を完全には阻害しないリンカーＤＮＡ配列またはアダプターＤＮＡ配列をさらに含んでなる、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を表面に担持してなる、バイオセンサーチップ。
【請求項２３】
請求項２２のバイオセンサーチップを備える、カフェイン検出システム。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子を含んでなる、試料中のカフェインの検査薬または検査キット。
【請求項２５】
サンプル中のカフェインを検出する方法であって、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子とサンプルとを接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２６】
サンプルが、飲料である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
飲料が、カフェインレス飲料である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載のバイオセンサーチップ、請求項２３に記載のカフェイン検出システム、または請求項２４に記載の検査薬若しくは検査キットを用いてカフェインを検出することを特徴とする、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
カフェインに結合するＤＮＡ分子をスクリーニングする方法であって、
（i）配列番号６７、７０、および７１の塩基配列のいずれかと８０％以上同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供するか、配列番号６７、７０、および７１の塩基配列のいずれかに対して５塩基以下の挿入、置換または欠失を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供するか、または、リンカーＤＮＡをさらに含んでなるこれらの配列を有するＤＮＡ分子を提供することと、
（ii）ＤＮＡ分子とカフェインとを接触させることと、
（iii）ＤＮＡ分子とカフェイン分子との結合を検出することと、
を含んでなる、方法。
【請求項３０】
カフェインとの結合に関するＫｄ値が５００μＭ以下であるＤＮＡ分子をスクリーニングする、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カフェインに結合することができるＤＮＡ分子およびこれらのＤＮＡ分子をスクリーニングする方法、並びにこれらのＤＮＡ分子を用いてカフェインを検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リガンドとの結合能を有するＲＮＡ分子（すなわち、ＲＮＡアプタマー）が発見され、その特に柔軟な立体構造と改変や設計が容易という特性を兼ね備えたＲＮＡ分子を用いたアプタマーの開発が大きく発展している。
【０００３】
ＲＮＡ分子はその立体構造の柔軟性から低分子化合物の検出に用いられてきた。例えば、特許文献１は、テオフィリンなどの低分子化合物に結合するＲＮＡアプタマーを開示する。また、非特許文献１は、０．５〜５ｍＭのカフェインを検出できるＲＮＡアプタマーを開示する。しかしながら、ＲＮＡ分子は、構造的に柔軟である一方で、不安定な分子であり、また、試料に意図せず混入するＲＮａｓｅによる分解を受けやすいことから実用性の面で難点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平９−５０２３５４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ferguson A. et al., Nucleic Acids Research, 32 (5): 1756-1766, 2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、カフェインに結合することができるＤＮＡ分子およびこれらのＤＮＡ分子をスクリーニングする方法、並びにこれらのＤＮＡ分子を用いてカフェインを検出する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、カフェインに結合するＤＮＡ分子を取得し、さらにその塩基配列の改変によりカフェインに結合し、配列に相同性を有するＤＮＡ分子を取得することに成功した。本発明はこのような知見に基づくものである。
【０００８】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）配列番号６７の塩基配列を有する、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
（２）配列番号６９の塩基配列と８０％以上同一である塩基配列を有する、上記（１）に記載のＤＮＡ分子。
（３）配列番号６７または配列番号６９の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
（４）配列番号６７または配列番号６９の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、上記（３）に記載のＤＮＡ分子。
（５）配列番号６９の塩基配列を有する、上記（２）に記載のＤＮＡ分子。
（６）配列番号１〜６６の塩基配列 のいずれかと８０％以上同一である塩基配列を有する、上記（１）に記載のＤＮＡ分子。
【０００９】
（７）配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかに対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、上記（３）に記載のＤＮＡ分子。
（８）配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかに対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、上記（７）に記載のＤＮＡ分子。
（９）配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかを有する、上記（６）に記載のＤＮＡ分子。
（１０）配列番号９と８０％以上同一である塩基配列を有する、上記（６）に記載のＤＮＡ分子。
（１１）配列番号９または配列番号４６の配列を有する、上記（１０）に記載のＤＮＡ分子。
【００１０】
（１２）配列番号９に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、上記（７）に記載のＤＮＡ分子。
（１３）配列番号９に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、上記（１２）に記載のＤＮＡ分子。
（１４）配列番号９に対して、配列番号９の１７番目のシトシンから１９番目のチミンまでの３塩基のいずれか１以上の塩基の置換、および／または、
上記１７番目のシトシンと１８番目のチミンとの間および／または１８番目のチミンと１９番目のチミンとの間に数塩基の挿入を有する塩基配列を有し、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
（１５）予測二次構造中で、ステムループ構造を形成し、ＤＮＡ分子の５’末端から２塩基と３’末端から２塩基との間で塩基対を形成する、上記（１０）〜（１４）のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
【００１１】
（１６）カフェインとの結合に関するＫｄ値が５μＭ以下である、上記（１）〜（１５）のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
（１７）カフェインとの結合に関するＫｄ値が１μＭ以下である、上記（１６）に記載のＤＮＡ分子。
【００１２】
（１８）配列番号７０または配列番号７１ の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有する、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子。
（１９）配列番号７０または配列番号７１ の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有する、上記（１８）に記載のＤＮＡ分子。
（２０）配列番号７０または配列番号７１の塩基配列を有する、ＤＮＡ分子。
【００１３】
（２１）カフェインとの結合を完全には阻害しないリンカーＤＮＡ配列またはアダプターＤＮＡ配列をさらに含んでなる、上記（１）〜（２０）のいずれかに記載のＤＮＡ分子。
（２２）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ分子を表面に担持してなる、バイオセンサーチップ。
（２３）上記（２２）のバイオセンサーチップを備える、カフェイン検出システム。
（２４）上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含んでなる、試料中のカフェインの検査薬または検査キット。
【００１４】
（２５）サンプル中のカフェインを検出する方法であって、上記（１）〜（２１）のいずれかに記載のＤＮＡ分子とサンプルとを接触させることを含んでなる、方法。
（２６）サンプルが、飲料である、上記（２５）に記載の方法。
（２７）飲料が、カフェインレス飲料である、上記（２６）に記載の方法。
（２８）上記（２２）に記載のバイオセンサーチップ、上記（２３）に記載のカフェイン検出システム、または上記（２４）に記載の検査薬若しくは検査キットを用いてカフェインを検出することを特徴とする、上記（２５）〜（２７）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
（２９）カフェインに結合するＤＮＡ分子をスクリーニングする方法であって、
（i） 配列番号６７、７０、および７１の塩基配列のいずれかと８０％以上同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供するか、配列番号６７、７０、および７１の塩基配列のいずれかに対して５塩基以下の挿入、置換または欠失を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供するか、または、リンカーＤＮＡをさらに含んでなるこれらの配列を有するＤＮＡ分子を提供することと、
（ii）ＤＮＡ分子とカフェインとを接触させることと、
（iii）ＤＮＡ分子とカフェイン分子との結合を検出することと、
を含んでなる、方法。
（３０）カフェインとの結合に関するＫｄ値が５００μＭ以下であるＤＮＡ分子をスクリーニングする、上記（２９）に記載の方法。
【００１６】
本発明によれば、カフェインに結合するＤＮＡは、高感度にカフェインを検出および／または定量することに用いることができる。これにより、カフェイン含有飲料やカフェインレス飲料中のカフェインの検出に用いることが可能となる。本発明では、カフェインに結合する分子はＤＮＡなので、化学的安定性を有し汎用性に優れる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、配列番号１〜６の塩基配列を有するＤＮＡ分子のカフェイン結合能を示す図である。
【図２】図２は、配列番号９〜４８の塩基配列を有するＤＮＡ分子のカフェイン結合能を示す図である。
【図３】図３は、配列番号４９〜６６の塩基配列を有するＤＮＡ分子のカフェイン結合能を示す図である。
【図４】図４は、配列番号４６の塩基配列を有するＤＮＡ分子のカフェイン結合能を示す図である。
【図５】図５は、配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡ分子のカフェイン結合能を示す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーグラムである。
【図６】図６は、配列番号９の塩基配列の予測二次構造を示す図である。塩基対が５’末端からナンバリングされている。
【図７】図７は、金ナノ粒子を用いた配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡ分子によるカフェインの検出結果である。図７Ａは、０〜４００ｐｐｍのカフェインを含む試料（緩衝液）の吸光スペクトルを示し、図７Ｂは、５２４ｎｍと６６４ｎｍまたは８００ｎｍの吸光の比を示す。図７Ｃは、０〜２０ｐｐｍのカフェインを含む試料（お茶）におけるカフェインの検出結果を示す。図７Ｄは、お茶中の５ｐｐｍのカフェインの検出結果を示す。
【図８】図８は、酸化還元ＤＮＡザイムを連結したカフェイン結合性アプタマーの検出結果を示す。図８Ａは、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中でのカフェインの検出結果を示し、図８Ｂは、デカフェインの緑茶に添加されたカフェインの検出結果を示す。
【図９】図９は、アプタマーアレイ法によるカフェイン結合性アプタマーのスクリーニング結果を示す図である。
【図１０】図１０は、得られたカフェイン結合性アプタマー（配列番号７０）によるカフェインの検出結果とそのアプタマー部分の予測二次構造を示す図である。
【図１１】図１１は、得られたカフェイン結合性アプタマー（配列番号７１）によるカフェインの検出結果とそのアプタマー部分の予測二次構造を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明のＤＮＡ分子を表面に担持したバイオセンサーチップを備えたカフェイン検出システムの模式図である。
【図１３】図１３は、イムノクロマト法の原理をアプタマーに応用したカフェイン検出用ストリップの模式図である。
【発明の具体的な説明】
【００１８】
本発明のある側面では、「カフェイン結合性ＤＮＡアプタマー」または単に「カフェイン結合性アプタマー」とも呼ばれるカフェインと結合することができるＤＮＡ分子が提供される。
【００１９】
カフェインは以下の化学式で示される構造を有する。
【化１】
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【００２０】
本発明によれば、配列番号９の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列：
【化２】
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をカフェインＤＮＡアプタマーとして取得し、この塩基配列を改変することにより、カフェインに対して高い結合能を有するＤＮＡ分子の塩基配列として、配列番号６７の塩基配列を同定し、カフェインに対して特に高い結合能を有するＤＮＡ分子の塩基配列として、配列番号６９の塩基配列を同定した。
【００２１】
従って、本発明のある態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号６７の塩基配列を有するＤＮＡ分子である。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号６８の塩基配列、好ましくは配列番号６９の塩基配列を有するＤＮＡ分子である。
【００２２】
本発明によれば、カフェインに対して特に高い結合能を有するＤＮＡ分子の塩基配列として、配列番号１〜６６の塩基配列を同定した。従って、本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜６６の塩基配列のいずれかを有するＤＮＡ分子とすることができる。以下、本発明のカフェインに結合できるＤＮＡ分子の塩基配列である、配列番号１〜７２の塩基配列が表にまとめられている。
【表１】
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【００２３】
本発明によれば、配列番号９または配列番号４６の塩基配列を有するＤＮＡ分子はカフェインに対して特に高い結合能を有する。従って、本発明のある態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号９または配列番号４６の塩基配列を有するＤＮＡ分子であり、好ましくは、配列番号４６の塩基配列を有するＤＮＡ分子である。
【００２４】
本発明によれば、配列番号９の塩基配列を改変して得られた様々なＤＮＡ分子においてカフェイン結合能が見出された。特に、１塩基置換または２塩基置換後も多くのＤＮＡ分子がカフェイン結合能を有していた。従って、本発明によれば、カフェインに結合するＤＮＡ分子であって、その塩基配列が改変され、かつ、カフェイン結合能を有するＤＮＡ分子が提供される。ここでＤＮＡ分子がカフェインとの結合能を有しているか否かは、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ法）に従って、またはビーズに固定化したカフェインに対するＤＮＡ分子の結合量を測定することにより評価することができる。ＤＮＡ分子がカフェインとの結合能を有しているか否かは、例えば、下記の本発明のカフェインの検出方法または実施例２〜５に記載された手順に従って評価することができる。
【００２５】
本明細書では「改変」とは、塩基の挿入、欠失または置換であり、複数の改変が導入されたときは改変の種類は同一であっても異なっていてもよい。例えば、本発明のある態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号９の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子である。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号９に対して、挿入、置換および欠失から選択される２塩基の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子である（例えば、配列番号４９〜５８）。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号９に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子である（例えば、配列番号１０〜４８）。
【００２６】
特に、配列番号９の塩基番号１７〜１９で示される塩基はカフェインとの結合能を失いにくく、改変の自由度が高い。従って、本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子は、
配列番号９において、１７番目のシトシンから１９番目のチミンまでの３塩基のいずれか１以上の塩基の置換、および／または、
上記１７番目のシトシンと１８番目のチミンとの間および／または１８番目のチミンと１９番目のチミンとの間に数塩基の挿入を有する、塩基配列を有するＤＮＡ分子が提供される。数塩基とは、例えば、１〜５塩基、１〜４塩基、１〜３塩基、１若しくは２塩基、または１塩基を意味する。複数の箇所に数塩基の挿入がある場合、それぞれの箇所に挿入される塩基数は同じであっても異なっていてもよい。ある態様では、本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号９の塩基番号１７〜１９に対応する塩基がループを形成する（塩基番号１７〜１９に塩基の挿入がある場合はその挿入された塩基を含めてループを形成する）。
【００２７】
例えば、本発明のある態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号４６の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子である。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号４６に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子である。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号４６に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子である。特に、配列番号４６の塩基番号１７〜１９はカフェインとの結合能を失いにくく、改変の自由度が高い。従って、本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子は、
配列番号４６において、１７番目のシトシンから１９番目のチミンまでの３塩基のいずれか１以上の塩基の置換、および／または、
上記１７番目のシトシンと１８番目のチミンとの間および／または１８番目のチミンと１９番目のチミンとの間に数塩基の挿入を有する、塩基配列を有するＤＮＡ分子が提供される。ある態様では、本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号４６の塩基番号１７〜１９に対応する塩基がループを形成する（塩基番号１７〜１９に塩基の挿入がある場合はその挿入された塩基を含めてループを形成する）。
【００２８】
配列番号９の塩基配列は、その５’末端および３’末端は必須ではなく、５’末端および３’末端を欠失した配列番号６２の塩基配列を有するＤＮＡ分子もカフェインと結合することができる。配列番号９の塩基配列はまた、その５’末端および３’末端に更なる塩基配列を付加してもよく、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡ分子もカフェインと結合することができる。さらに、配列番号１の塩基配列の一部を改変してもよく、配列番号２〜６の塩基配列を有するＤＮＡ分子もカフェインと結合することができる。このように、本発明によれば、配列番号１または配列番号９の塩基配列は、改変可能である。従って、配列番号９の塩基配列と共通する配列からなる配列番号６２の塩基配列についても、その塩基配列の改変が可能である。改変は、塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される２塩基の改変とすることができ、好ましくは挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変とすることができる。
【００２９】
同様にして、本発明のある態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜７１の塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子である。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜７１の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有するものとすることができる。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜７１の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有するものとすることができる。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜７１の塩基配列に対して、１塩基の置換を有する塩基配列を有するものとすることができる。
【００３０】
本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号９〜６１、６３または６４の塩基配列、あるいはその少なくとも一部の塩基の改変を有し、かつ、予測二次構造中で、図６に示された予測二次構造における塩基対番号１〜１１の塩基対が維持されているＤＮＡ分子である。２塩基を置換する場合には、予測される二次構造中の塩基対を別の塩基対で置換するように塩基を置換することができる（例えば、配列番号４９〜５６）。特に図６における塩基対番号１および２は塩基対を形成していることが好ましい（例えば配列番号５７〜６１）。従って、本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜６９の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上同一である塩基配列を有し、図６における塩基対番号１および２は塩基対を形成しているＤＮＡ分子である。
【００３１】
本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜６９の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１または２塩基の改変を有する塩基配列を有し、図６における塩基対番号１および２は塩基対を形成しているＤＮＡ分子とすることができる。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜６９の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される１塩基の改変を有する塩基配列を有し、図６における塩基対番号１および２は塩基対を形成しているＤＮＡ分子とすることができる。本発明の別の態様では、カフェインと結合することができるＤＮＡ分子は、配列番号１〜６９の塩基配列に対して、１塩基の置換を有する塩基配列を有し、予測二次構造においてステムループ構造を形成し、ＤＮＡ分子の５’末端から２塩基と３’末端から２塩基との間で塩基対を形成するＤＮＡ分子（すなわち、図６に示されるように塩基対番号１および２で塩基対を形成しているＤＮＡ分子）とすることができる。
【００３２】
本発明によれば、ＤＮＡ分子は、カフェインとの結合を完全には阻害しないリンカーＤＮＡ配列またはアダプターＤＮＡ配列をさらに含んでいてもよい。例えば、配列番号１の塩基配列は、配列番号９の塩基配列を含み、リンカーＤＮＡ配列またはアダプターＤＮＡ配列をさらに含むが、カフェインに結合することができる。具体的には、配列番号９の塩基配列は、塩基配列６２の塩基配列を含み、その５’末端および３’末端に更なる塩基配列を含むが、カフェインに結合することができる。配列番号１の塩基配列は、配列番号９の塩基配列を含み、その５’末端および３’末端に更なる塩基配列を含むが、カフェインに結合することができる。従って、更なるリンカーＤＮＡ配列やアダプターＤＮＡ配列は、好ましくは配列の５’末端および／または３’末端に付加することができる。
【００３３】
本発明では、本発明のＤＮＡ分子、例えば、上記（１）〜（２１）に記載のいずれかのＤＮＡ分子の塩基配列に対する相補的な配列を有するＤＮＡ分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ分子が提供され、カフェインの検出および／または定量に用いることができる。本発明では、前記ＤＮＡ分子は、例えば、２５〜６８塩基長を有するＤＮＡ分子とすることができ、好ましくは３０〜３５塩基長を有するＤＮＡ分子とすることができ、より好ましくは、上記（１）〜（２１）に記載のいずれかの対応するＤＮＡ分子の塩基長と同じ塩基長を有するＤＮＡ分子とすることができる。本明細書において「ハイブリダイズする」とは、あるポリヌクレオチドが標的となるポリヌクレオチドと相補的なそれぞれの塩基同士の水素結合により二本鎖を形成することをいう。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、例えば、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、例えば、ハイブリダイゼーションおよび／またはハイブリダイゼーション反応後の洗浄を低塩濃度溶液（例えば、１．０Ｍ以下のナトリウムイオン濃度を有する反応溶液）で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の一例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中での洗浄条件が挙げられる。
【００３４】
本発明によれば、ＤＮＡ分子は、単離された、精製された、または合成されたＤＮＡ分子とすることができる。本発明によれば、ＤＮＡ分子は、カフェインとの相互作用を完全には阻害しない化学修飾または標識がなされていてもよい。従って、本発明のある態様では、カフェインに結合することができるＤＮＡ分子は、化学修飾されたＤＮＡ分子または標識されたＤＮＡ分子とすることができる。ＤＮＡ分子の化学修飾や標識は、当業者に周知であり適宜好ましいものを選択して用いることができる。本発明で用いられる標識としては、特に限定されないが例えば、蛍光標識（例えば、シアニン、フルオレセイン、フルオレセインイソチアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、およびテキサスレッドなど）、アフィニティータグ標識（例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニンなど）、金ナノ粒子標識、およびラジオアイソトープ標識（ＲＩ標識、例えば、３２Ｐ標識など）が挙げられる。
【００３５】
本発明によれば、本発明のＤＮＡ分子を含んでなる、カフェイン検出用の組成物、カフェイン検出薬またはカフェイン検出キットが提供される。
【００３６】
本発明の別の側面では、サンプル中のカフェインを検出する方法であって、本発明のカフェインと結合することができるＤＮＡ分子とサンプルとを接触させることを含んでなる方法が提供される。
【００３７】
本発明のある態様では、サンプルは、飲料とすることができる。飲料としては、紅茶、緑茶、ウーロン茶、ほうじ茶、番茶、玄米茶および抹茶などのお茶、コーヒー、ココア、コーラ並びに栄養ドリンクが挙げられる。本発明では、μＭオーダーまたはサブμＭオーダーの高感度でカフェインを検出することが可能である。従って、本発明のある態様では、飲料は、カフェインレス飲料である。カフェインレス飲料は、デカフェイン飲料とも呼ばれる。カフェインレス飲料は、例えば、カフェインの９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらにより好ましくは９９．９％以上が除去されている。
【００３８】
カフェインは、当業者に周知の様々な方法により検出され得る。例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により、本発明のＤＮＡ分子とカフェインの結合を検出する方法、金ナノ粒子による比色試験でＤＮＡ分子とカフェインの結合を検出する方法などが本発明の検出に用いられ得る。また、本発明のＤＮＡ分子を固体支持体表面に担持させた場合には、該固体支持体上でＤＮＡ分子とカフェインとが結合したか否かは、ＤＮＡ分子に連結した酸化還元型ＤＮＡザイムの還元剤としての性質を利用して還元力を測定することにより決定することができる。また、カフェインを固体支持体表面に担持させた場合は、該固体支持体上でＤＮＡ分子とカフェインとが結合したか否かは、ビーズに結合したＤＮＡ分子を検出または定量することで決定することができる。カフェインの固体支持体表面への担持は、リンカーを介して常法により行なうことができる。そして、ＤＮＡ分子の定量は、常法に従って行なうことができる。また、ＤＮＡ分子には酸化還元ＤＮＡザイムを連結させて、還元力の有無によりＤＮＡ分子のビーズへの結合を検出してもよい。還元力は、常法により測定することができる。
【００３９】
また、アプタマーとカフェインとの結合は、蛍光試薬を用いて検出することができる。例えば、ＤＮＡの構造を認識して蛍光強度を変化させる試薬が知られている。そのような試薬の例として、二本鎖ＤＮＡにインターカレートできるSYBR Green I、二本鎖ＤＮＡよりも一本鎖ＤＮＡに強く結合するSYBR Green II、およびＧ−クアドロデュプレックス構造に結合して蛍光を発するチアゾールオレンジおよびチオフラビンＴが挙げられ、本発明においてカフェインを検出することに用いることができる。アプタマーは、カフェインとの結合の前後で立体構造を変化させ、二本鎖部分と一本鎖部分の比率が変化する。従って、上記のＤＮＡの一本鎖と二本鎖を染色できる蛍光色素は、アプタマーとカフェインとの結合の検出に用いることができる。また、ＤＮＡにＧ−クアドロデュプレックス構造を導入した配列（例えば、配列番号７０および７１）では、ＤＮＡとカフェインとが結合すると、Ｇ−クアドロデュプレックス構造が変化し、これにより蛍光色素の発光スペクトルが変化する。従って、このような配列では、カフェインはチアゾールオレンジおよびチオフラビンＴを用いて検出することができる。例えば、チアゾールオレンジは、還元剤存在下では約５１０ｎｍに最大吸収波長を有し、約５５０ｎｍに最大放出波長を有し、励起すると蛍光（オレンジ色）を発する。従って、チアゾールオレンジの比色によりカフェインの結合を検出することができる。本発明のＤＮＡ分子もこのような方法によりカフェインとの結合能を確認することができる。結合は、適切な緩衝液中で検出することができる。従って、本発明によれば、カフェインの検出方法は、
（ａ１）本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子と、ＤＮＡの一本鎖または二本鎖のいずれかに優先的に結合することができる蛍光色素とを含む反応溶液を提供することと、
（ｂ１）サンプルを反応溶液に添加することと、
（ｃ１）サンプルを反応溶液に添加する前後で溶液中の蛍光色素の発する蛍光の波長と蛍光強度を確認することと、を含んでなる。そして、適切な対照と比較してカフェイン添加の前後で溶液中の蛍光色素の蛍光スペクトル（すなわち、波長と蛍光強度）が変化した場合には、サンプル中にカフェインが含まれていると決定することができる。
【００４０】
また、上述の通りＤＮＡとカフェインとの結合は、金ナノ粒子を用いた比色試験によっても検出することができる。例えば、金ナノ粒子を用いた比色試験は、Jing Wang, Lihua Wang, Xingfen Liu, Zhiqiang Liang, Shiping Song, Wenxin Li, Genxi Li, and Chunhai Fan  Advanced Materials, 19 (2007)に記載されており、当業者であれば適宜実施することができる。具体的には以下の通りである。金ナノ粒子は水溶液中で負に帯電しており、高塩濃度条件下では凝集する。この凝集の過程では、溶液の色が赤色（金ナノ粒子の分散状態を示す）から紫色（金ナノ粒子の凝集状態を示す）に変化する。ここで、水溶液中にＤＮＡが存在するとき、核酸も負に帯電しているため、金ナノ粒子の凝集状態が影響を受け、その結果、溶液の色が変化する。一般的原則として、ＤＮＡは二本鎖と一本鎖とで分子内の帯電状態が変化するが、これによりＤＮＡと金ナノ粒子との相互作用が変化するため、金ナノ粒子の凝集状態と色が変化する。すなわち、金ナノ粒子溶液の色の変化を観察することでＤＮＡの立体構造変化を検出することができるのである。核酸がアプタマーである場合には、アプタマーがそのリガンドと結合すると、核酸の立体構造に変化が生じるから、金ナノ粒子溶液の比色によりアプタマーがリガンドに結合したか否かを評価することが可能である。すなわち、アプタマーヘのそのリガンドの結合の有無により金ナノ粒子の凝集状態が変化するので、アプタマーとそのリガンドとの結合は、溶液の色の変化として検出することができる。アプタマーの帯電状態の変化は、その相補鎖が存在するときに大きくなる。従って、本発明では、カフェインの検出方法は、本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子を含む金ナノ粒子溶液にカフェインを含むと疑われる試料を接触させることと、金ナノ粒子溶液の色変化を指標として試料中のカフェインの有無および／または濃度を決定することとを含んでなる。より具体的には、本発明のカフェインの検出方法は、
（ａ２）金ナノ粒子と本発明のカフェインに結合することができるＤＮＡ分子と該ＤＮＡ分子の相補配列と塩を含んでなる反応溶液を提供することと、
（ｂ２）サンプルを反応溶液に添加することと、
（ｃ２）サンプルを反応溶液に添加する前後で溶液の色を確認することと、
を含んでなる。そして、適切な対照と比較してカフェイン添加の前後で溶液の色が変化した場合には、サンプル中にカフェインが含まれていると決定することとを含んでなる。
【００４１】
本発明の別の側面では、本発明のＤＮＡ分子を表面に担持してなるバイオセンサーチップが提供される。本発明のＤＮＡ分子は、好ましくは、リンカーＤＮＡを介してバイオセンサーチップの表面に固定化することができる。ＤＮＡ分子は当業者に周知の技術により表面に固定化することができる。本発明のバイオセンサーチップは、カフェインの検出や定量に用いることができる点で有用である。
【００４２】
本発明の別の側面では、図１２に示されるように、本発明のバイオセンサーチップ１０を備えたカフェイン検出システム１００が提供される。本発明のカフェイン検出システム１００は、本発明のバイオセンサーチップ１０と、バイオセンサーチップの表面１０ａにサンプルを添加する添加手段４０とを備える。
【００４３】
本発明のある態様では、イムノクロマト法の原理を応用して、標的分子（具体的には、カフェイン）結合分子として抗体の代わりに本発明のＤＮＡ分子を用いたカフェインの検出方法並びにカフェインの検出キットおよび検出薬が提供される。このようなカフェインの検出キットおよび検出薬としては、例えば、カフェイン検出用ストリップなどが挙げられる。
【００４４】
イムノクロマト法は、妊娠検査薬やインフルエンザ検査薬として周知の技術であり、当業者であれば、イムノクロマト法の抗体に代えて本発明のＤＮＡ分子を用いて適宜カフェインを検出することができる。具体的には、図１３に示されるように、カフェイン検出用ストリップ２０は、サンプルパッド２１、コンジュゲートパッド２２、テストライン２３、コントロールライン２４および吸収パッド２５を備えたメンブレン２６を有し、サンプル液をサンプルパッド２１に滴下すると、毛細管現象によりサンプル液は、サンプル液を吸収する吸収パッド２５に向けてメンブレン上を移動する。コンジュゲートパッド２２に存在するＤＮＡアプタマーとサンプル液が接触するとサンプル中のカフェインとＤＮＡアプタマーとが複合体を形成する。この複合体はメンブレン上を移動する際に、カフェインとＤＮＡアプタマーとの結合を検出する検出部位２３（テストライン）と、必要に応じてＤＮＡアプタマーを検出する部位２４（コントロールライン）とに結合したＤＮＡを可視化して、サンプル液中のカフェインを検出することができる。検出部位２３にカフェインに特異的に結合することができる抗体やＤＮＡなどの分子を固定しておけば、カフェインと結合したＤＮＡアプタマーのみがカフェインを介して検出部位２３に結合し、検出部位２３において検出される。また、別の態様では、ＤＮＡアプタマーに対して、相補的な配列を有するＤＮＡ分子をハイブリダイズさせておくことも可能である。この態様のＤＮＡアプタマーは、カフェインと結合すると立体構造が変化してハイブリダイズしたＤＮＡ分子を解離させることができるので、解離したＤＮＡ分子を検出部位２３で、例えば、その分子と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ分子を検出部位２３に固定化することにより、検出することができる。この場合、前記相補的な配列を有するＤＮＡ分子を標識しておくこともできる。テストラインとコントロールラインに結合したＤＮＡの可視化は、例えば、標識を検出することにより容易に行なうことができる。
【００４５】
本発明によれば、カフェインに結合するとして得られたＤＮＡ分子と一定の配列同一性を有するＤＮＡ分子は、カフェインに結合する可能性が高い。従って、本発明の別の側面では、カフェインに結合するとして得られたＤＮＡ分子と一定の配列同一性を有するＤＮＡ分子からカフェインに結合することができるＤＮＡ分子をスクリーニングする方法が提供される。
【００４６】
本発明のスクリーニング方法は、カフェインに結合するＤＮＡ分子をスクリーニングする方法であり、
（i）ＤＮＡ分子を提供することと、
（ii）ＤＮＡ分子とカフェインとを接触させることと、
（iii）ＤＮＡ分子とカフェイン分子との結合を検出することと、
を含んでなる。(iii)におけるＤＮＡ分子とカフェイン分子との結合の検出は、上記で説明したカフェインの検出方法により行なうことができる。
【００４７】
本発明によれば、カフェインに結合するＤＮＡ分子として得られた分子に類似する配列を有する分子には、カフェインへの結合能が高い分子が多く含まれていた。従って、本発明のスクリーニング方法では、本発明のカフェインに結合するＤＮＡ分子と配列同一性の高いＤＮＡ分子をスクリーニングすることができる。
【００４８】
例えば、本発明のある態様では、スクリーニング方法の（i）で配列番号６７、６９、７０、および７１の塩基配列のいずれかと８０％以上同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供するか、配列番号６７、６９、７０、および７１の塩基配列のいずれかに対して、挿入、置換および欠失から選択される５塩基以下の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供する。本発明のある態様では、スクリーニング方法の（i）で配列番号６７、６９、７０、および７１の塩基配列のいずれかと９０％以上、好ましくは９５％以上同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供する。本発明の別の態様では、スクリーニング方法の（i）で配列番号６７、６９、７０、および７１の塩基配列のいずれかに対して。挿入、置換および欠失から選択される４塩基以下の改変、好ましくは３塩基以下の改変、より好ましくは２塩基の改変、さらに好ましくは１塩基の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供する。
【００４９】
本発明のある態様では、スクリーニング方法の（i）で配列番号９または４６と８０％以上同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供するか、配列番号９または４６の塩基配列に対して挿入、置換および欠失から選択される５塩基以下の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供する。本発明のある態様では、スクリーニング方法の（i）で配列番号９または４６の塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上同一である塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供する。本発明の別の態様では、スクリーニング方法の（i）で配列番号９または４６の塩基配列に対して、挿入、置換および欠失から選択される４塩基以下の改変、好ましくは３塩基以下の改変、より好ましくは２塩基の改変、さらに好ましくは１塩基の改変を有する塩基配列を有するＤＮＡ分子を提供する。
【００５０】
本発明のある態様では、本発明のスクリーニング方法は、カフェインとの結合に関するＫｄ値が５００μＭ以下、より好ましくは５０μＭ、さらに好ましくは５μＭ以下、さらにより好ましくは１μＭ以下であるＤＮＡ分子をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００５１】
実施例１：カフェインアプタマーとしてのＤＮＡ分子の取得
本実施例では、カフェイン結合ビーズを用いてカフェインに結合することができるＤＮＡ分子の取得を試みた。
【００５２】
まず、カフェイン固定化ビーズは、リンカーを介してビオチン化したカフェインをストレプトアビジン被覆ビーズ（Life Technologies社、Dynabeads MyOne Streptavidin C1）に結合させて得た。このビーズは磁性体であり、市販のマグネットによりビーズと溶液を容易に分離することが可能である。以下の実施例では、ＤＮＡ分子は、このビーズを用いて取得した。リンカーを介してビオチン化したカフェインは、以下の化学式で示される。
【化３】
2016002041.tif 000007
【００５３】
スクリーニングするＤＮＡ分子群は、３０ヌクレオチドのランダム配列（約１×１０１５種類の配列）を有するＤＮＡ分子のプール（２０００ｐｍｏｌ）とし、溶液中でビーズと接触させて、ビーズに固定化したカフェインに結合した分子をカフェインに結合することができるＤＮＡ分子としてスクリーニングした。得られたＤＮＡ分子の配列を同定するために、３０ヌクレオチドのランダムＤＮＡのそれぞれには、ＰＣＲプライマーと相補的なアダプター配列を付加し、得られたＤＮＡ分子は、ＰＣＲとＴＡクローニングの後に、配列解読に供した。具体的には以下の通りである。
【００５４】
まず、アダプターを結合させたランダムＤＮＡは、
【化４】
2016002041.tif 000008
で表される塩基配列を有する（ここで、それぞれのＮは、独立してＡ、Ｔ、ＧまたはＣである）。
【００５５】
（１）ＤＮＡのフォールディング
このランダムＤＮＡのプール１００μＬを50 mM 酢酸緩衝液 (pH 6.0)（50 mM KCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2および 0.05% Tween20を含有する）に溶解し、９５℃で３分間加熱してから室温で３０分〜２時間冷却して、ＤＮＡをフォールディングさせた。
【００５６】
（２）カフェイン結合性ＤＮＡのスクリーニング
次に、カフェインを固定化していないビーズと上記ＤＮＡプールとを室温で３０分間接触させて、ビーズに非特異的に吸着するＤＮＡ分子を除去した。次いで、回収したＤＮＡプールを上記で得られたカフェイン固定化ビーズと接触させ、室温で５〜３０分間インキュベートした。インキュベート後、磁石を用いて溶液を除去し、ビーズに結合したＤＮＡを回収した。ＤＮＡは、４Ｍ尿素を含有する50 mM 酢酸緩衝液 (pH 6.0)（10 mM EDTAおよび0.05% Tween20を含有する）中で８０℃で１０分間加熱するか、または、カフェインを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加することによりビーズから解離させ、カフェインに結合したＤＮＡ分子を回収した。
【００５７】
（３）カフェイン結合性ＤＮＡの増幅
得られたＤＮＡ分子をフォワードプライマー（配列番号７３）およびリバースプライマー（配列番号７４）を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（フナコシ社製、製品番号：Ｅ００００７）を用い、９４℃３０秒、５６℃３０秒、７２℃２０秒のサイクル条件で増幅させて行なった。
【化５】
2016002041.tif 000009
但し、リバースプライマーは、５’末端をビオチン化させて用いた。
【００５８】
得られたＰＣＲ産物をビーズに結合後、０．１Ｍ  ＮａＯＨで１０分間アルカリ処理した。上清に含まれる1本鎖ＤＮＡを回収したのち、エタノール沈殿により１本鎖ＤＮＡライブラリーを得た。本実施例の上記（１）〜（３）のサイクルを１３回繰り返して、得られたＤＮＡ分子をフォワードプライマー（配列番号７３）およびリバースプライマー（配列番号７５）を用いてＰＣＲ増幅した。
【化６】
2016002041.tif 000010
【００５９】
得られたＤＮＡは、常法および製造者マニュアルに従って、TOPO  TA  Cloning  Kit  For  Sequencing（Life Technologies社製）を用いてクローニングし、その後、塩基配列を決定した。
【００６０】
実施例２：得られたＤＮＡ分子のカフェイン結合能の評価
本実施例では、実施例１において取得されたＤＮＡ分子のカフェイン結合能を評価した。
【００６１】
方法Ａ
まず、結合能の評価は、高い定量性を求める場合には、カフェイン固定化ビーズに結合したＤＮＡ分子の量を常法に従ってリアルタイムＰＣＲで定量することにより行なった。負の対照としてカフェインを固定化していないビーズを用いた。具体的には、50 mM 酢酸緩衝液 (pH 6.0)（50 mM KCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2および 0.05% Tween20を含有する）中に最終濃度０．０３μＭ、０．１μＭ、０．３μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭまたは３０μＭとなるように各種ＤＮＡ分子を添加して９５℃で３分間加熱してＤＮＡ分子をフォールディングさせた。次いで、得られたＤＮＡ分子の溶液を実施例１で得られたカフェイン固定化ビーズおよびカフェインを固定化していないビーズそれぞれと接触させ、室温で３０分間静置した。但し、カフェインを固定化していないビーズと接触させる場合にはＤＮＡ分子の最終濃度は３μＭとした。その後、リアルタイムＰＣＲによりカフェインビーズに結合したＤＮＡ分子の量を定量した。
【００６２】
方法Ｂ
50 mM 酢酸緩衝液 (pH 6.0)（50 mM KCl, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2および 0.05% Tween20を含有する）中に最終濃度１０μＭとなるように各種ＤＮＡ分子を添加して９５℃で３分間加熱してＤＮＡ分子をフォールディングさせた。次いで、得られたＤＮＡ分子の溶液を実施例１で得られたカフェイン固定化ビーズおよびカフェインを固定化していないビーズそれぞれと接触させ、室温で３０分間静置した。ビーズに結合したＤＮＡ分子を製造者マニュアルに従ってSYBR Green II(タカラバイオ社製)と室温で２０分反応させて染色し、蛍光プレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）を用いてサンプルの蛍光強度を測定（励起波長：497 nm、検出波長：544 nm）し、回収した溶液内に含まれるＤＮＡ含量を、カフェインを固定化していないビーズと比較して評価した。
【００６３】
方法Ｃ
表面プラズモン共鳴法を用いた方法では、フリーのカフェインとＤＮＡ分子との結合を確認することができる。ここでは、ＳＰＲの支持体にビオチン−アビジン結合および１４ヌクレオチドのアデニン（Ａ）を介してＤＮＡ分子を吸着させ、フリーのカフェイン２０ｐｐｍ、５０ｐｐｍまたは１００ｐｐｍを添加して、常法によりＳＰＲ応答を確認した。
【００６４】
実施例１において取得されたＤＮＡ分子は、配列番号１〜６の塩基配列を有するＤＮＡ分子であった。これらの分子は方法Ａを用いて結合能を評価したところ、高い結合能を有することが確認された（図１）。配列番号１の塩基配列のうち、カフェインとの結合能を有する領域を推定した。得られたＤＮＡ配列（配列番号９）を有する分子を合成し、カフェインとの結合能を評価した。すると、図２上に示されるように、カフェインへの結合能が確認された。
【００６５】
配列番号９に対して１塩基置換した塩基配列を有するＤＮＡ分子を合成してカフェインとの結合能を方法Ｂにより確認した。すると図２および表２に示されるＤＮＡ分子はカフェイン結合能を有しており、カフェインを検出するには十分な感度を有していることが分かった（配列番号１０〜４８）。
【００６６】
【表２】
2016002041.tif 000011
2016002041.tif 000012
【００６７】
上記表２において、蛍光量が５０を超え、かつカフェイン存在下で蛍光量が２倍以上に増大する、特に感度の高いＤＮＡ分子の塩基配列をアラインメントすると、遺伝子配列の改変の自由度の高い部分と低い部分が見出された。そこで、これらの特に感度の高いＤＮＡ分子の塩基配列からコンセンサス配列を取得したところ、配列番号６９の塩基配列が得られた。また、配列番号９〜６１の塩基配列からコンセンサス配列として配列番号６７の塩基配列を得た。
【００６８】
また、配列番号９に対して２塩基置換した塩基配列を有するＤＮＡ分子を合成してカフェインとの結合能を方法Ｂにより確認した。この場合でも、図３および表３に示されるようにカフェイン結合能を有する分子が見られた（配列番号４９〜５６）。
【００６９】
【表３】
2016002041.tif 000013
【００７０】
なお、配列番号９の塩基配列の５’末端の２ヌクレオチドと３’末端の２ヌクレオチドを分子内アニーリングにより結合するように構成したものはいずれもカフェインとの結合能を示した（図３、配列番号５７〜６１）。
【００７１】
さらに配列番号９の５’末端の２ヌクレオチドを欠失させ、３’末端の５ヌクレオチドを欠失させた（配列番号６２）が、この場合でもカフェインへの結合能を示した（図３）。
【００７２】
配列番号４および５の塩基配列において、配列番号９の塩基配列と対応する領域をそれぞれ配列番号６３および６４とした。すると、これらの塩基配列を有するＤＮＡ分子もカフェインに結合した（図３）。その他、配列番号６５および６６の塩基配列を有するＤＮＡ分子もカフェインに結合した（図３）。
【００７３】
さらに、カフェイン結合能が特に高いと思われた配列番号４６の塩基配列を有するＤＮＡ分子について、方法Ａにより結合解離定数Ｋｄを求めた。図４に示されるように、配列番号４６の塩基配列を有するＤＮＡ分子は、７００ｎＭのＫｄ値を有し、極めて高感度にカフェインを検出することができることが分かった。なお、高感度と思われた配列番号２９の塩基配列を有するＤＮＡ分子は、５μＭのＫｄ値を有していた（データ非掲載）。
【００７４】
方法Ｃにより配列番号８の塩基配列を有するＤＮＡ分子のＳＰＲ分析を行なった。すると、濃度依存的なカフェインとの結合を示すシグナルが観察された（図５）。すなわち、ＳＰＲ法によってもカフェインとＤＮＡとの結合を検出することができる。
【００７５】
この配列番号９の塩基配列を有するカフェインＤＮＡアプタマー部分の二次構造をＭｆｏｌｄプログラム（ニューヨーク州立大学アルバニー校により提供される；M. Zuker, Nucleic Acid Research, 31 (13):3406-15,2003参照）を用いてデフォルトパラメータを用いて分析したところ、図６に示される二次構造が予測された。また、予測された二次構造において形成された塩基対を、その位置に基づいてナンバリングした（図６中の矢印と数字を参照）。配列番号４９〜５６の名称中の数字は、図６においてナンバリングされた塩基対の位置を示す。この結果からは、予測される二次構造中の塩基対が他の塩基対に置き換わる改変が許容されることが理解される。
【００７６】
実施例３：飲料サンプルに含まれるカフェインの検出
本実施例では、溶液系サンプルの代表例として飲料中に含まれるカフェインの検出を試みた。
【００７７】
本実施例では、まず、緩衝液の系でカフェインの検出を試みた。次いで、２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する）に対して、カフェインを５ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、または４００ｐｐｍ添加して、または添加しないでカフェインを検出した。
【００７８】
カフェインの検出は、金ナノ粒子を用いて行なった。具体的には、配列番号９のカフェインＤＮＡアプタマーと配列番号７６を有するその相補鎖配列のそれぞれが１０μＭになるように２５ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２およびカフェイン（各濃度）を含有する）を調製した（溶液Ａ）。溶液Ａを６０℃で１０分間加熱した後、室温で５分冷却した。次いで金ナノ粒子（BBInternational社, 粒径15 nm）７０μＬに溶液Ａを０．７μＬ添加して、穏やかに攪拌して１分間静置した。さらに、１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ  ６．０）（0.2 M NaClを含有する）を添加して、穏やかに攪拌した。
【００７９】
吸光光度計（BioTek社製）を用いて得られたサンプルの４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の波長スペクトルを計測した結果、カフェイン濃度依存的な吸光スペクトル変化が観察された（図７Ａ）。カフェイン濃度上昇に伴い、５２４ｎｍの吸光が増大し、６６４ｎｍの吸光が減少する（図７Ａ）のでＡ５２４／Ａ６６４およびＡ５２４／Ａ８００を計算し、カフェイン濃度を評価した（図７Ｂ）。吸光スペクトルの変化は、目視により紫から赤への変化として確認することができた（データ非掲載）。
【００８０】
さらに、カフェイン濃度を０〜２０ｐｐｍとして同様の実験を行なった。具体的には、カフェイン添加量を５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍ、または２０ｐｐｍとする以外は同一の方法により緩衝液におけるカフェインの検出を試みた。すると、図７Ｃに示されるようにカフェイン濃度が０〜２０ｐｐｍの場合でも濃度応答性が観察された。
【００８１】
次に、緩衝液をカフェインレスの緑茶に置き換える以外は同一の方法で、カフェインの検出を試みた。カフェインの緑茶への添加量は、１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍまたは１００ｐｐｍとした。すると、この濃度域で緑茶中のカフェインが濃度依存的に検出された（図７Ｄ左）。次に、カフェインの緑茶への添加量を５ｐｐｍとしてカフェインが検出可能かを検証した。すると、吸光スペクトルの違いとして緑茶中の５ｐｐｍのカフェインが有意差を持って検出された（ｐ＜０．０５）。
【００８２】
実施例４：ＳＥＬＥＸ法によるカフェイン結合性アプタマーによるカフェインの検出
ＳＥＬＥＸ法によりカフェイン結合性アプタマーを取得し、得られたアプタマーを用いてカフェインを検出した。
【００８３】
カフェイン結合性アプタマーとしては、ＳＥＬＥＸ法で取得した配列番号８のアプタマーにＤＮＡザイム配列を連結させた配列（配列番号７２）を有するＤＮＡ分子を合成して用いた。。 
【００８４】
次に、カフェインの検出を試みた。
（１）カフェインは、以下の通り検出した。濃度１００μＭのアプタマー溶液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）８０μＬを９０℃で５分間加熱し、その後、１０分間かけて室温に戻した。
（２）次に、得られたアプタマー溶液をサンプルバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２４０μＬで希釈し、２５μＬずつ１２本のエッペンドルフチューブに分注した。
（３）カフェインを０ｐｐｍ、２．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍまたは２０ｐｐｍ含むサンプルバッファーを調製した。また、カフェインレス緑茶に１０×サンプルバッファーを添加して得た緑茶サンプルにも、カフェインを０ｐｐｍ、２．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍまたは２０ｐｐｍとなるよう添加した。得られたカフェイン溶液をそれぞれ７５μＬずつエッペンドルフチューブに添加した。
（４）カフェインの検出は、SYBR（商標）Green II Nucleic Acid Stain（タカラバイオ社製）を用いて行なった。SYBR（商標）Green II溶液をサンプルバッファーで希釈し、上記のエッペンドルフチューブに５５０μＬずつ添加した。その後、室温で２０分放置した。
（５）２００μＬずつ９６穴プレートに分注し（ｎ＝３）、蛍光測定を行った（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）。
【００８５】
その結果、カフェイン濃度依存的に蛍光強度の変化が示された（図８）。図８Ａによれば、緩衝溶液系で２．５ｐｐｍ〜２０ｐｐｍにわたり濃度依存的にカフェインが検出された。また、図８Ｂによれば、緑茶系でも２．５ｐｐｍ〜２０ｐｐｍにわたり濃度依存的にカフェインが検出された。
【００８６】
緩衝液系では、サンプルバッファーのｐＨをｐＨ５またはｐＨ６にして上記の実験を実施したが、この場合でも、緩衝溶液系で２．５ｐｐｍ〜２０ｐｐｍにわたり濃度依存的にカフェインが検出された（図８Ａ）。
【００８７】
このように得られたカフェインＤＮＡアプタマーは、カフェインを検出するのに十分な感度を有しており、飲料中のカフェインを高感度に検出することに用いることができることが明らかとなった。
【００８８】
実施例５：アプタマーアレイ法によるカフェイン結合性アプタマーの取得とカフェインの検出
【００８９】
アプタマーアレイ法により、カフェイン結合性ＤＮＡアプタマーの取得を試みた。本実施例では、リガンド非結合時にはＤＮＡザイム部分の一部が分子内ハイブリダイゼーションによって失活しており、カフェインとの結合によりＤＮＡ分子の立体構造が変化し、これに伴いＤＮＡザイム部分の分子内ハイブリダイゼーションが解除され、ＤＮＡザイムの酵素活性が活性化される分子を得ることを目的とした。
【００９０】
そのようなスクリーニング対象のＤＮＡ分子として、カフェインが結合するアプタマー部分、アレイ上での酵素活性の検出のためのＤＮＡザイム部分、および、アプタマー部分とＤＮＡザイム部分とに介在する連結部分の３つのパートからなるＤＮＡ分子群の設計を試みた。ＤＮＡザイムとしては、酸化還元型ＤＮＡザイム（例えば、Teller C., Shimron S., Willner I., Aptamer-DNAzyme hairpins for amplified biosensing. Anal. Chem. (2009) 81:9114-9119を参照）を用いた。
【００９１】
スクリーニング対象のＤＮＡ分子の設計は、以下の制約条件を設けて行った。
（条件１）アプタマー部分が、３０塩基または２０塩基長であること、
（条件２）カフェイン非存在下でステム−ループ構造（ヘアピン構造）を形成すること、
（条件３）ループが３〜７塩基長のヌクレオチドから形成されること、および
（条件４）ステム部分で形成する塩基対の数が３０塩基では６〜９個、２０塩基では５〜８個であること
とした。条件２〜４の二次構造予測は、実施例２に記載の通りに行なった。
【００９２】
二次構造予測により、上記を満たす配列を有する分子を絞り込んだところ、候補分子数が、３０塩基長では約１２，０００種類、２０塩基長では約５，０００種類であった。
【００９３】
スクリーニングは、ＤＮＡザイムの活性化を電気化学的に検出する系を用いて行った。電気化学的な検出には、電気化学検出マイクロアレイ（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製、ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ１２ｋマイクロアレイ、製品番号：１００００８１）および検出器（ＣｕｓｔｏｍＡｒｒａｙ社製、ＥｌｅｃｔｒａＳｅｎｓｅ検出器、製品番号：６１００３６）を用いた。
【００９４】
設計通りに合成したＤＮＡ分子を、１スポット１種類の要領でこのマイクロアレイ上に合成した。合成の際には、上述のＤＮＡ分子の各３’末端にリンカーとして１５塩基のポリＴ配列を付加し、リンカーを介してアプタマーアレイ表面にＤＮＡ分子を担持した。
【００９５】
次にカフェイン存在時または非存在時のＤＮＡ分子のＤＮＡザイム活性を以下の通り測定した。反応バッファーは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％ＤＭＳＯを含む水溶液とした。カフェインは、３０塩基長のＤＮＡ分子の活性測定では、２００ｐｐｍの濃度とし、２０塩基長のＤＮＡ分子の活性測定では、５または１０ｐｐｍの濃度として、上記反応バッファーに添加した。ＤＮＡ分子を反応バッファー中で室温で３０分間インキュベートした。次いでヘミンを最終濃度２．４μＭで、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を最終濃度５ｍＭで添加した。シグナルは、２５℃の温度条件下で、最終濃度５ｍＭのＨ２Ｏ２添加１分後に測定した。各スポットの電気シグナルをカフェイン存在下および非存在下で測定し、電気シグナル比（カフェイン存在下／カフェイン非存在下）を算出した。
【００９６】
３０塩基長ＤＮＡ分子のスクリーニング結果を図９に示した。計測は２回行ない、横軸はカフェイン２００ｐｐｍ添加時の各ＤＮＡ分子の平均シグナル強度、縦軸は無添加時の平均シグナル強度に対する２００ｐｐｍ添加時の平均シグナル強度の比を示す。カフェイン２００ｐｐｍ添加時のシグナル強度が高く、シグナル強度の比が２倍以上の上位３候補（候補１〜３）と、２００ｐｐｍ添加時のシグナル強度は、シグナル強度の比が３倍以上の上位３（候補４〜６）を選択した。候補６について、以下で示す吸光測定法において再現性を確認したところ、カフェイン濃度依存的な吸光の変化を示した（図１０）。候補６の全長配列を配列番号７０として記載した。なお、図１０中の配列は、アプタマー部分のみの予測二次構造を示している。
【００９７】
酸化還元によるＡＢＴＳ吸光スペクトル変化に基づく吸光測定法は以下のように行なった。すなわち、測定バッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．１）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ）に、配列番号７０を有するＤＮＡ分子を１２．５μＭとなるように添加し、ヘミンを０．５μＭ、ＡＢＴＳは５ｍＭとなるように添加した。さらに、カフェインを０ｐｐｍ、２ｐｐｍ、または１０ｐｐｍとなるように添加した。吸光は、最終濃度５ｍＭのＨ２Ｏ２を加えて反応を開始させてから５分後に４１４ｎｍにおけるＡＢＴＳの吸光度を測定した。測定は３回繰り返し行った。
【００９８】
２０塩基長のＤＮＡ分子では、以下の条件を満たす９分子を選択した。
（条件１）シグナル比 (5 ppm/0 ppm1) > 1.5 
（条件２）シグナル比 (10 ppm/0 ppm1) > 2.0
９分子中１分子について、以下で示す蛍光測定法において再現性を確認したところ、カフェイン濃度依存的な蛍光強度の変化を示した（図１１）。なお、図１１は、アプタマー部分のみの予測に次構造を示している。この分子の全長配列を配列番号７１とした。
【００９９】
蛍光測定法は以下の通り実施した。
（１）カフェインは、以下の通り検出した。濃度１００μＭのアプタマー溶液（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）８０μＬを９０℃で５分間加熱し、その後、１０分間かけて室温に戻した。
（２）次に、得られたアプタマー溶液をサンプルバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２４０μＬで希釈し、２５μＬずつ６本のエッペンドルフチューブに分注した。
（３）カフェインレス緑茶に１０×サンプルバッファーを添加して得た緑茶サンプルにも、カフェインを０ｐｐｍ、２．５ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１５ｐｐｍまたは２０ｐｐｍとなるよう添加した。得られたカフェイン溶液をそれぞれ７５μＬずつエッペンドルフチューブに添加した。
（４）カフェインの検出は、チアゾールオレンジ（シグマアルドリッチ）を用いて行なった。１．０μＭチアゾールオレンジを含むサンプルバッファーを調製し、上記のエッペンドルフチューブに５５０μＬずつ添加した。その後、室温で２０分放置した。
（５）２００μＬずつ９６穴プレートに分注し（ｎ＝３）、蛍光測定を行った（励起波長：５１０ｎｍ、蛍光波長：５５０ｎｍ）。
【図６】
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【図７−１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７−２】
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【配列表】
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