(57)【要約】      （修正有）【課題】種子を用いるF1純度検定でみられるイチゴ種子からDNA抽出をできるだけ簡易・安全に行ない、その結果、F1純度検定コストが低い、イチゴF1種子の純度検定法の提供。【解決手段】イチゴＦ１種子の純度検定法であって、（１）有機溶媒を含有しない抽出液中でイチゴ種子を破砕することによって、イチゴ種子からDNA粗抽出液を調製する工程、（２）DNA粗抽出液を鋳型として用いるPCR反応において、イチゴの品種・系統識別用SSRマーカー用のプライマーによりＤＮＡの増幅を行う工程、（３）該マーカーの増幅の有無を電気泳動により検出する工程、及び、（４）検出された該SSRマーカーの繰り返し回数により該SSRマーカーが父親又は母親由来のいずれかであるかを決定し、それによってイチゴ種子が自殖種子又はＦ１種子のいずれかであるかを識別する工程、を含む前記純度検定法。【選択図】図３
2016002005.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イチゴＦ１種子の純度検定法であって、
（１）有機溶媒を含有しない抽出液中でイチゴ種子を破砕することによって、イチゴ種子からDNA粗抽出液を調製する工程、
（２）DNA粗抽出液を鋳型として用いるPCR反応において、イチゴの品種・系統識別用SSRマーカー用のプライマーによりＤＮＡの増幅を行う工程、
（３）該マーカーの増幅の有無を電気泳動により検出する工程、及び、
（４）検出された該SSRマーカーの繰り返し回数により該SSRマーカーが父親又は母親由来のいずれかであるかを決定し、それによってイチゴ種子が自殖種子又はＦ１種子のいずれかであるかを識別する工程、
を含む前記純度検定法。
【請求項２】
抽出液が簡易抽出液(組成：20mM Tris-HCl,pH8.0、100mM NaCl、5mM EDTA、0.1% SDS、0.2mg/ml Proteinase K)であることを特徴とする、請求項１記載の純度検定法。
【請求項３】
９６穴PCRプレートの各穴に夫々１粒のイチゴ種子を入れ、そこに注入した抽出液中でイチゴ種子を破砕することを特徴とする、請求項１又は２に記載の純度検定法。
【請求項４】
イチゴ種子を滅菌蒸留水中で一晩転倒混和した後に、抽出液中でイチゴ種子を破砕することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の純度検定法。
【請求項５】
PCR反応においてにおけるサイクル数が３０〜３５回であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の純度検定法。
【請求項６】
PCR反応においてにおけるサイクル数が３３回であることを特徴とする、請求項５に記載の純度検定法。
【請求項７】
以下のプライマーセット：
（SSRマーカー：ＦＶＥＳ１２３０用）
Forward primer：GATGATGGGTCTTCTTGCGT（配列番号１）及び
Reverse primer： AGAGTTTTGATCGCCTCGAA（配列番号２）、並びに／又は
（SSRマーカー：ＦＡＥＳ０１０７用）
Forward primer： ACCCTGGAGGATCTGCTCTT（配列番号３）及び
Reverse primerr： CAGAGGCTAAAACAAGAAGGGA（配列番号４）、
を用いて、各イチゴの品種・系統識別用SSRマーカーの増幅を行うことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の純度検定法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イチゴ種子のDNA粗抽出液を用いたイチゴF1種子の純度検定法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに、DNAマーカーによりF1品種の純度検定を行う様々な技術が開発されている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、合成オリゴヌクレオチドを用いてスイカＦ１品種を識別する発明が記載されている。より具体的には、スイカ種子の播種後に得られる根部から抽出したＤＮＡに対して、特定の合成オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲにより、850bpバンドの増幅物が得られるか否かによって、Ｆ１種子を種子親とを区別する方法である。
【０００４】
又、特許文献２には、ハイブリッド種子の判定方法及び純度検定方法が記載されている。より具体的には、維持系統および稔性回復系統のイネのミトコンドリアに存在し、細胞質雄性不稔系統のイネのミトコンドリアでは欠失しているＤＮＡの存在の有無をＰＣＲにより検査することにより、該イネ種子或いは該イネ実生がハイブリッドであるか否かを判定する方法である。
【０００５】
同様に、特許文献３には、イネＢＴ型雄性不稔細胞質と正常細胞質とを簡便に判別する方法が記載されている。より具体的には、正常細胞質には存在するがＢＴ型雄性不稔細胞質には存在しないＤＮＡの存在の有無をＰＣＲにより検査することにより、雄性不稔性系統（ＢＴ型雄性不稔細胞質）と維持系統（正常細胞質）を識別する方法である。
【０００６】
又、DNAマーカーとして、通常、２〜４塩基程度のから成る配列が数回〜１００回程度繰り返される、単純反復配列（Simple Sequence Repeat：SSR、または、「マイクロサテライト」)マーカーが知られている。このSSRマーカーはPCRによる増幅が安定し、かつ２つ以上の対立遺伝子座を単一のマーカーで検出することができる。このSSRマーカーを用いたＦ１種子検定の例として、メロン品種間で多型を検出する200のSSRマーカーセットが開発されている（非特許文献１）。
【０００７】
更に、実生のDNAを抽出、２つのRFLPマーカーで検出する方法も開発されている（非特許文献２）。
【０００８】
イチゴは全国で栽培され、生産総額は作物の中で第５位である。世界の生産状況と比較すると、生産量は国別で第７位、単価は第１位であり、生産額ではアメリカについで2位と経済的にも重要な農作物といえる。イチゴはランナーによる栄養繁殖で種苗を増殖するのが一般的である。しかし、ランナー増殖は種苗の増殖効率が低く、農家の大きな負担となっていた。この状況を打開すべく種子繁殖型のF1品種の開発が試みられている。種子繁殖型品種は種苗の増殖効率が極めて高く、種から実生を得ることで病虫害に感染していない苗を容易に得られるという利点がある。さらにF1品種であることから品種の違法コピーが起こりにくく、品種育成者の権利を容易に保護することができる。
【０００９】
イチゴは他殖性植物であり、母親と父親の系統を混植し、蜂などの虫媒により交配することでF1品種の採種を行う。しかし、母親の柱頭に適切なタイミングで父親の花粉が受粉されなかった場合、母親自身の花粉が受粉して自殖種子となることがある。自殖個体は植物体や果実が小さくなるなどF1個体とは異なる形質を発現する。そのため、自殖種子の混入は種子の品質を落とすこととなるので自殖個体をF1個体から識別する必要がある。
【００１０】
しかしながら、F1個体と自殖個体の形質の違いを幼苗の段階で判別するのは困難であり、形質の違いをもって自殖種子の混入割合を判断するためには成苗を得るまでの数ヶ月間が必要である。しかし、DNAマーカーにより種子から抽出したDNAで遺伝子型の判別を行えば、採種直後に自殖種子の混入程度を判別することができる。
【００１１】
上記のように、従来、種子を用いたF1純度検定の報告があるのは比較的種子のサイズが大きい作物に限られている。これは個々の種子、または実生毎にDNAを抽出して検定を行うのにある程度のコストが必要となるため、比較的単価の高い大型の種子の作物でないと検定コストを種子単価にのせることが出来ないという事情があるためである。
【００１２】
即ち、メロン、スイカおよびキュウリなどのウリ科作物は1000粒あたりの種子重が30-50gと大きく、比較的高い単価で市場に流通している。一方、イチゴの種子重は1000粒あたり0.67gであり、市場に流通した場合種子単価は上記のウリ科作物より引き下げられることが予想される。そのため、F1純度検定の一層の低コスト化を図る必要がある。
【００１３】
一方、イチゴではこれまでF1品種の育成がほとんど行われてこなかったこともあり、DNAマーカーを用いてF1純度検定を行った例は報告されていない。
【００１４】
生物学的な観点からみると、イチゴは８倍体という複雑なゲノム構造を有する。これは多くの生物がゲノム（生物が必要とする全ての遺伝情報が含まれた１組）を体細胞内に２セット持つのにたいして、８セットのゲノムを持っていることである。より多くのゲノムセットをもつことで遺伝様式が複雑となり、品種・系統の識別も２倍体の種に比べると困難であった。しかしながら、発明者等により、既に、国内で栽培されている品種を中心とした１２８種類のイチゴ品種・系統を識別する４５種類のSSRマーカーを開発されている（非特許文献３）。
【００１５】
DNA抽出は植物のほとんどの組織から行うことが可能であるが、実際には葉を用いることが一般的である。これは葉以外の組織は試料の粉砕が困難であったり、糖やポリフェノール等の物質が多く含まれているためDNAの精製に手間がかかる場合が多いためである。
【００１６】
F1純度検定は大きくDNA抽出とPCR反応およびPCR反応産物の電気泳動による遺伝子型判別の３工程に分かれる。F1純度検定では種子から直接ＤＮＡを抽出するのが最も簡便であると考えられるが、種子からのDNA抽出も上記のような理由で葉より手間やコストがかかるのが一般的である。種子からのDNA抽出法のために、市販のDNA抽出キット（GM quicker<ニッポンジーン>、DNeasy Plant Mini kit＜QIAGEN>など）があるが、これらのキットを用いる際には、例えば、種子ミルで粉砕した後カラムを通して精製する必要がある等、試料の調製に手間がかかる。又、PCR反応用にDNA粗抽出液を用いた例もあるが、抽出バッファーに人体に有害なフェノール類を使用することが一般的である（非特許文献４）。
【００１７】
また、DNA抽出の手間を省くために、植物組織の一部をPCR反応液に直接入れてPCRを行うダイレクトPCR法も開発されており、市販のキットが複数種類販売されている（MightyAmp（登録商標）DNA Polymerase<タカラバイオ＞、PhirePlant Direct PCR Kit  ＜Thermo scientific>  他）。これらのキットを用いることで検査の手順を簡便化することは可能であるが、キットの価格が高価であることからコストの面で使用に難がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】特開平６−１８９７６４号公報
【特許文献２】特開平１０−２８６０９３号公報
【特許文献３】特開２００４−２４１４１号公報
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】メロンF1種子純度検定および品種識別に利用可能なSSRマーカー (2004)（独）農研機構・成果情報http://www.naro.affrc.go.jp/project/results/laboratory/vegetea/2004/vegetea04-15.html）
【非特許文献２】核DNAのRFLP分析によるキュウリF1品種の種子純度検定法の開発、松浦ら、園芸学雑誌, 63(2):370-383, 1994
【非特許文献３】Isobe et al. (2013) DNA Research, 20 (1):79-92.
【非特許文献４】マメ類の種子、馬鈴薯等からの簡易DNA抽出法、RAPDマーカーによる解析、北海道成績概要書（平成９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、本発明が解決しようとする課題は、従来の種子を用いるF1純度検定でみられる上記の問題点を解決し、イチゴ種子からDNA抽出をできるだけ簡易・安全に行ない、その結果、F1純度検定コストが低い、イチゴF1種子の純度検定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者は、これまでに開発した１２８のイチゴ品種・系統を識別する４５種類のSSRマーカー用い、且つ、イチゴ種子からのDNA抽出方法及びＰＣＲの条件を検討することによって、上記課題を解決し、本発明を完成した。
【００２２】
即ち、本発明は以下の態様を有する。
［態様１］
イチゴＦ１種子の純度検定法であって、
（１）有機溶媒を含有しない抽出液中でイチゴ種子を破砕することによって、イチゴ種子からDNA粗抽出液を調製する工程、
（２）DNA粗抽出液を鋳型として用いるPCR反応において、イチゴの品種・系統識別用SSRマーカー用のプライマーによりＤＮＡの増幅を行う工程、
（３）該マーカーの増幅の有無を電気泳動により検出する工程、及び、
（４）検出された該SSRマーカーの繰り返し回数により該SSRマーカーが父親又は母親由来のいずれかであるかを決定し、それによってイチゴ種子が自殖種子又はＦ１種子のいずれかであるかを識別する工程、
を含む前記純度検定法。
［態様２］
抽出液が簡易抽出液(組成：20mM Tris-HCl,pH8.0、100mM NaCl、5mM EDTA、0.1% SDS、0.2mg/ml Proteinase K)であることを特徴とする、態様１記載の純度検定法。
［態様３］
９６穴PCRプレートの各穴に夫々１粒のイチゴ種子を入れ、そこに注入した抽出液中でイチゴ種子を破砕することを特徴とする、態様１又は２に記載の純度検定法。
［態様４］
イチゴ種子を滅菌蒸留水中で一晩転倒混和した後に、抽出液中でイチゴ種子を破砕することを特徴とする、態様１〜３のいずれか一項に記載の純度検定法。
［態様５］
PCR反応においてにおけるサイクル数が３０〜３５回であることを特徴とする、態様１〜４のいずれか一項に記載の純度検定法。
［態様６］
PCR反応においてにおけるサイクル数が３３回であることを特徴とする、態様５に記載の純度検定法。
［態様７］
以下のプライマーセット：
（SSRマーカー：ＦＶＥＳ１２３０用）
Forward primer：GATGATGGGTCTTCTTGCGT（配列番号１）及び
Reverse primer： AGAGTTTTGATCGCCTCGAA（配列番号２）、並びに／又は
（SSRマーカー：ＦＡＥＳ０１０７用）
Forward primer： ACCCTGGAGGATCTGCTCTT（配列番号３）及び
Reverse primer：CAGAGGCTAAAACAAGAAGGGA（配列番号４）、
を用いて、各イチゴの品種・系統識別用SSRマーカーの増幅を行うことを特徴とする、態様１〜６のいずれか一項に記載の純度検定法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明方法は従来技術と比較して、特に、以下のような優れた特徴を有する。
（１）イチゴ種子からのＤＮＡ抽出に使用する抽出液（バッファー）は、フェノール・クロロフォルム等の有機溶媒を含まないものであり、一種類である。
（２）抽出液中で種子組織を破壊して得たＤＮＡ粗抽出液をＰＣＲに使用できる。
（３）PCRに用いるTaqポリメラーゼは安価な市販品を用いることが可能であり、一検体（イチゴ種子１粒）あたりに使用するＰＣＲの反応溶液も全量で5μl程度と少量で済むことからＦ１純度検定コストの低減を実現できる。
（４）PCRのサイクル数はPCR反応容器中に微量のコンタミネーションが発生した場合でも偽陽性が検出されないように工夫されたものであり、高い精度で検定を実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】イチゴ種子１粒からのDNA抽出法を示す写真である（図中の番号は文中の各ステップ番号を示す）。
【図２】リアルタイムPCRの結果を示す。
【図３】母・父のDNAを用いたFAES0107およびFVES1230の蛍光フラグメントアナライザー解析結果を示す。縦軸は蛍光強度、×1、×343は希釈倍率を示す。
【図４】父親のDNAを用いたFAES0107およびFVES1230の蛍光フラグメントアナライザー解析結果を示す。縦軸は蛍光強度、×1、×343は希釈倍率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
イチゴＦ１種子の純度検定法は、以下の工程を有する。
（１）有機溶媒を含有しない抽出液中でイチゴ種子を破砕することによって、イチゴ種子からDNA粗抽出液を調製する工程、
（２）DNA粗抽出液を鋳型として用いるPCR反応において、イチゴの品種・系統識別用SSRマーカー用のプライマーによりＤＮＡの増幅を行う工程、
（３）該マーカーの増幅の有無を電気泳動により検出する工程、及び、
（４）検出された該SSRマーカーの繰り返し回数により該SSRマーカーが父親又は母親由来のいずれかであるかを決定し、それによってイチゴ種子が自殖種子又はＦ１種子のいずれかであるかを識別する工程、
を含む前記方法。
【００２６】
ここで、工程（１）においてイチゴ種子からのＤＮＡ抽出に使用する抽出液はフェノール・クロロフォルム等の有機溶媒を含まないことを特徴とする。その組成に特に制限はないが、例えば、実施例に記載されている「簡易抽出液」のように、Tris-HCl等のバッファー（pH７．５〜８．０程度）、NaCl、EDTA、SDS、及びタンパク質分解酵素等を適量含む抽出液が好ましい。
【００２７】
イチゴ種子は抽出液中で適当な手段・方法で破砕することが出来る。例えば、９６穴PCRプレートの各穴に夫々１粒のイチゴ種子を入れ、そこに注入した抽出液中で、例えば、爪楊枝の頭又はピペット等の適当な手段を用いてつぶす等により、イチゴ種子を破砕することが出来る。
【００２８】
イチゴ種子を抽出液中で破砕する前に、例えば、滅菌蒸留水中で一晩程度、転倒混和する等の当業者に公知の適当な手段を用いて、水で種子表面を洗浄するとともにイチゴ種子を予めふやかしておくことが好ましい。
【００２９】
工程（１）において調製されたDNA粗抽出液を用いるPCR反応において、発明者等によって開発されたイチゴの品種・系統識別用SSRマーカー用のプライマーによりＤＮＡ（DNA粗抽出液に存在する該マーカー）を増幅する。尚、PCR反応に用いる際に、イチゴ種子の種類等に応じて、適宜、DNA粗抽出液を、例えば、１０〜２０倍程度に希釈してもよい。
【００３０】
イチゴの品種・系統識別用SSRマーカーは、F1検定時に父及び母両方の自殖を容易に否定できるように、まず、検定対象となるＦ１種子の両親が同じサイズのアリルを持たないマーカーを用いる必要がある。更に、例えば、反復結果の再現性、アリル判定のしやすさ、エクストラバンドの少なさ、F1ヘテロアリル間のピーク高さの均一性等の観点から、マーカーの選別を行うことが好ましい。又、各SSRマーカーの増幅用のプライマーセットは、染色体において各SSRマーカーが含まれる周辺の塩基配列に基づき、当業者が適宜、設計・調製することが出来る。
【００３１】
純度検定の精度を上げるには、複数のSSRマーカーを使用することが好ましい。本発明で使用することができるイチゴの品種・系統識別用SSRマーカー及び該SSRマーカーの増幅用のプライマーセットの塩基配列の代表例として、非特許文献３に記載されているものを挙げることができる。更に、SSRマーカー及び該マーカーの検出用プライマーの具体的な塩基配列等の詳細については、  本出願人である、公益財団法人かずさＤＮＡ研究所のサイトに公開されている（http://vim.kazusa.or.jp/Strawberry）。具体的には、非特許文献３に記載されている４５種類のSSRマーカーは以下の通りである。
【表１】
2016002005.tif 000003
【００３２】
因みに、実施例に記載されているように、「系統２３号」（香川県、三重県、千葉県および（独）農業・食品産業技術研究機構九州沖縄農業研究センターによる共同育成系統、平成２６年１月１０日に品種登録出願。品種登録出願番号第２８８４４号。品種登録出願時の名称は「よつぼし」）のＦ１種子の検定用には、上記の手法で選抜した結果、F. ananassa EST由来のFAES0107とF.vesca EST由来のFVES1230がSSRマーカーとして良好であったため、以下に示したプライマーこれらのマーカーを用いてイチゴF1種子の純度の検定を実施した。
【００３３】
以下のプライマーセット：
（SSRマーカー：ＦＶＥＳ１２３０用）
Forward primer：GATGATGGGTCTTCTTGCGT（配列番号１）及び
Reverse primer： AGAGTTTTGATCGCCTCGAA（配列番号２）、並びに／又は
（SSRマーカー：ＦＡＥＳ０１０７用）
Forward primer： ACCCTGGAGGATCTGCTCTT（配列番号３）及び
Reverse primer： CAGAGGCTAAAACAAGAAGGGA（配列番号４）
【００３４】
DNA粗抽出液を用いるPCR反応におけるＰCRのサイクル数は、リアルタイムＰＣＲによる検討の結果、好ましくは、３０〜３５回の範囲、より好ましくは約３３回にすることによって、PCR反応容器中に微量のコンタミネーションが発生した場合でも偽陽性が実質的に検出されず、高い精度で検定を実施することができることが確認された。PCR反応におけるその他の手法・条件等は、対象となるイチゴＦ１種子の種類、ＳＳＲマーカーの種類、PCR反応装置等に応じて、当業者が適宜、設定することが出来る。
【００３５】
工程（２）で得られたＰＣＲ産物は、当業者に公知の適当な条件で電気泳動にかけ、蛍光色素をラベルしたプライマーを使用することによって蛍光等の適当な手段により、該マーカーの増幅の有無を検出することが出来る。
【００３６】
工程（３）で該SSRマーカーが検出された場合には、電気泳動の位置に基づき得られた該SSRマーカーの繰り返し回数により、該SSRマーカーが父親又は母親由来のいずれかであるかを決定し、それによって試料として用いたイチゴ種子が自殖種子又はＦ１種子のいずれかであるかを識別することが出来る。
【００３７】
尚、イチゴＦ１種子の「純度」とは、  F1遺伝子型を有する種子数の割合を意味し、その値は、例えば、F1遺伝子型を有する種子の数/検定により遺伝子型が判明した全種子数のようにして求めることが出来る。なお、F1遺伝子型を有しない種子には、自殖により父親の遺伝子型を有しない種子が該当する。
【００３８】
以下、実施例を参照して本発明を説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれら実施例の記載に限定されるものではなく、これら記載に基づき当業者が適宜変更・修正したものも本発明に含まれる。
【実施例】
【００３９】
三重県農業研究所で複数時期（24の異なる採種日）に採種をした系統23号のF1種子を用いて、検定Ｆ１種子純度の検定認を行った。ＰＣＲにおけるSSRマーカーに用いたのはFVES1230及びFAES0107の2マーカーである。各採種日のサンプルより96粒を１反復としてDNAを抽出し、合計3反復の検定を行った。検定を行った種子の全数は6912粒（24採種日×96粒×3反復）である。以上の結果から、系統23号のF1種子の純度は、９９，９４％であることが判明した。
【００４０】
（１）DNA抽出（図１）。
以下のプロトコールでDNA抽出を実施した。
１．滅菌蒸留水にイチゴの種子を入れ一晩ゆっくり転倒混和した。
２．96well PCR plateに簡易抽出液(組成：20mM Tris-HCl,pH8.0、100mM NaCl、5mM EDTA、0.1% SDS、0.2mg/ml Proteinase K)を50μl加え種一粒を入れ、爪楊枝の頭で潰した（潰すと種から白い繊維が出て溶液が少し濁った）。
３．PCR装置に入れ 60℃ 10min. → 98℃ 2min.の温度でインキュベートした。
４．軽く混ぜてから  4,000rpm 10min. 遠心し、上清は清澄化した。
５．種子残渣を吸わないよう慎重に上清を採取し別のPCR plateに移した。
６．上清を滅菌蒸留水で10倍希釈してPCRに用いた。
【００４１】
（２）PCR
以下のプロトコールでPCRを実施した。なお、多型の検出は蛍光色素を予めラベルしたプライマーを用い、蛍光フラグメント解析により行った。
PCR溶液は全量5μlで、組成は1x Buffer P（16mM (NH4)2SO4、67mM Tris-HCl (pH 8.8)、0.1% BSA、0.5% Tween20、0.5% PVP 25）、200μM dNTP、3mM MgCl2、0.4μM primer Mix、(シグマ社でR6Gを標識したForward Primerを2%混合)、0.016U/μl BIOTAQ（商標） (BIOLINE社)、0.2μl/μl 10倍希釈DNA溶液である。
【００４２】
PCR反応プログラムは94℃2分に続き、94℃30秒、60℃30秒、72℃45秒のサイクルを33回、72℃10分、4℃で行った。多型の検出は0.5μlのPCR産物を5μlのloading Mix(GeneScan（商標）500LIZ（商標）dye Size StandardをHiDi Formamide で156倍希釈した溶液)に加え、蛍光フラグメントアナライザー（ABI3730）を用いて行った。
【００４３】
検定を行った全種子6912粒のうち4種子が明らかに自殖と判定された。また、19粒が判定不能であった。
【００４４】
尚、上記実施例におけるＰＣＲのサイクル数３３回は以下のようにして設定した。
蛍光フラグメントアナライザー（ABI3730）の感度は高く、サンプル調整時に微量な試料のコンタミネーションが発生した際、DNA抽出量の少ないサンプルでは、偽陽性のバンドが検出されるおそれがあると考えられた。そこでFVES1230マーカーを用い通常のPCR反応に用いる鋳型DNAを343、または2401倍希釈にして、リアルタイムPCRにより微量DNAの検出感度の検定を行った（図２）。その結果、40サイクルでは343倍希釈の一部で希釈なしのDNAと同様の増幅が検出され、2401倍の一部でもピークが見られる可能性が示唆された。一方、33サイクルの時点では、通常量の鋳型DNAは検出に十分な量の増幅産物が得られ、かつ微量のDNAでは検出限界以下の増幅産物しか得られないであろうと思われたため、検定のPCRサイクル数を33回とした。 
【００４５】
また、このサイクル数で仮に母方ホモサンプルに父方のDNAが微量コンタミした場合、判定に影響があるか確認したところ、FVES1230, FAES0107のマーカーでは父型のピークは認められなかった（図３）。続いてNullアリルやDNA抽出不良により、アリルを持つDNAが存在しなかった際に微量コンタミが生じたと仮定し、希釈した父方DNAのみでPCRとFragment解析を行った。希釈したサンプルではピークがノイズと区別できない高さにまで低下し、ピークの検出も行われなかった（図４）。以上の結果からFAES0107, FVES1230共に33サイクルのPCRでは微量コンタミによる擬陽性が結果に影響を及ぼす可能性が低いと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
既に記載したように、イチゴ種子繁殖型品種は従来のランナー増殖に比べて優れた特長を有している。現在、全国の公的機関の育種場所が連携して種子繁殖型品種の育成と栽培を進めており、今後栄養繁殖型品種にかわり種子繁殖型品種がイチゴ品種のスタンダードとなると期待されている。既に、千葉県では、種子繁殖型のF1品種「千葉F-1号」が2011年に国内で初めて育成された。また、民間業者が参入して種苗の生産や流通を行うなど新たな産業を生み出すことが期待されている。
【００４７】
本発明方法は、「発明の効果」の欄に記載されているような利点を有しているために、新たに開発された「千葉F-1号」のような種子繁殖型のF1品種の純度検定を商業ベースで可能ならしめ、イチゴＦ１種子の普及に大いに貢献することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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