(57)【要約】【課題】非免疫原性又は低免疫原性の抗原に対しても、抗体価の高い抗血清や抗体産生細胞を取得可能な方法を提供する。【解決手段】抗原（例えば甲状腺ホルモンであるサイロキシン）とステロイド骨格を有する物質（例えばプロゲステロン）とを、キャリアタンパク（例えばＢＳＡ）を介して間接的に結合させた物質を用いて、ヒト以外の動物（例えばウサギ）を免疫し、当該動物から抗血清又は抗体産生細胞を回収することにより、抗血清又は抗体産生細胞を得る。【選択図】    図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原とステロイド骨格を有する物質とを直接又は間接的に結合させた物質を用いて、ヒト以外の動物を免疫することを特徴とする免疫方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、抗原とステロイド骨格を有する物質とをキャリアタンパクを介して間接的に結合させた物質を用いて免疫を行う方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法において、免疫動物がウサギである方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の方法において、ステロイド骨格を有する物質がプロゲステロンである方法。
【請求項５】
請求項２から４のいずれかに記載の方法において、キャリアタンパクがＢＳＡである方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の方法において、抗原が甲状腺ホルモンである方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の方法において、抗原がサイロキシンである方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法で免疫し、当該動物から抗血清又は抗体産生細胞を回収することを特徴とする、抗血清又は抗体産生細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物の免疫方法及び抗血清又は抗体産生細胞の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗体又は抗血清は、その特異性と親和性の高さから、実験用試薬としてだけでなく、免疫診断などの分野でも幅広く利用されている。抗血清は一般的に、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの動物に抗原を免疫することで得られる。抗原の免疫原性が低い場合には、抗体価の上昇が低く、目的性能の抗血清が得られない場合があった。
【０００３】
免疫原性は抗原の分子量に依存することが知られている。ハプテンと呼ばれる低分子は、単独で免疫を行っても免疫原性が低いため、タンパク質などの高分子に結合させて抗原性を高めて免疫を行う必要がある。
【０００４】
また、免疫原性は抗原物質の分子構造にも大きく依存する。例えば、ハプテンの一種である低分子ペプチドを免疫する場合、そのペプチド鎖の配列が免疫対象の動物個体中に初めから存在するアミノ酸配列に近い場合、そのペプチド鎖を非自己として認識できないため、抗体価が上昇し難いことは容易に予測できる。一方でハプテンの一種であるステロイドは、キャリアタンパクに結合させてウサギに対して免疫を行うことで、抗体価の高い抗血清が取得可能なことが報告されている（特許文献１、非特許文献１）。
【０００５】
このように、抗体価の上昇は抗原の免疫原性に依存することが多く、抗原の種類によっては、目的の性能を有する抗血清を得られないという問題があった。
【０００６】
免疫原性の低い物質に対して高い抗体価を有する抗血清を得る手段として、低免疫原性の物質を架橋した重合体を免疫する方法（特許文献２）が報告されている。この方法では、インスリン（ペプチドホルモン）などの水溶性の物質を免疫する際には有用であるが、水溶性の低い物質を架橋重合した際には、架橋重合物自体が不溶化してしまい、免疫に適さず、すべての抗原に対して適応できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−２４０３００号公報
【特許文献２】特公平７−５３７５４号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＳＴＥＲＯＩＤＳ．、３１、３５７；１９７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、物質の水溶性、脂溶性に関わらず、免疫原性の低い抗原に対する抗体価を上昇させる免疫方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑みてなされた本発明は、以下の態様を包含する。
（１）抗原とステロイド骨格を有する物質とを直接又は間接的に結合させた物質を用いて、ヒト以外の動物を免疫することを特徴とする免疫方法。
（２）上述（１）に記載の方法において、抗原とステロイド骨格を有する物質とをキャリアタンパクを介して間接的に結合させた物質を用いて免疫を行う方法。
（３）上述（１）又は（２）に記載の方法において、免疫動物がウサギである方法。
（４）上述（１）〜（３）のいずれかに記載の方法において、ステロイド骨格を有する物質がプロゲステロンである方法。
（５）上述（２）〜（４）のいずれかに記載の方法において、キャリアタンパクがＢＳＡである方法。
（６）上述（１）〜（５）のいずれかに記載の方法において、抗原が甲状腺ホルモンである方法。
（７）上述（１）〜（６）のいずれかに記載の方法において、抗原がサイロキシンである方法。
（８）上述（１）〜（７）のいずれかに記載の方法によって免疫し、当該動物から抗血清又は抗体産生細胞を回収することを特徴とする、抗血清又は抗体産生細胞の製造方法。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
（１）抗原
本発明で対象となる抗原は特に限定されるものではないが、非免疫原性又は低免疫原性の物質であり、抗原物質のみを免疫した場合には、実用上十分な性能を有する抗血清が得られない抗原に対して大きな効果を発揮するため、対象として好ましい。具体的にはトリヨードサイロニンやサイロキシンなどの甲状腺ホルモン、インシュリン、ソマトスタチンなどのペプチドホルモン及びタンパク質抗原などがあげられる。
【００１３】
（２）免疫抗原調製
本発明における免疫抗原は、抗原とステロイド骨格を有する物質とを直接又は間接的に結合することで調製することができる。抗原とステロイド骨格を有する物質とを直接又は間接的に結合させる方法は特に限定されず、共有結合によって結合させればよい。また、抗原とステロイド骨格を有する物質とを間接的に結合させる方法としては、例えばキャリアタンパクを介して結合させる方法があげられる。キャリアタンパクとしては特に限定はないが、例えばＢＳＡなどがあげられる。キャリアタンパクへの結合方法には特に限定はないが、例えば抗原のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、ステロイド骨格を有する物質のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、キャリアタンパクに対して同時に反応させることで、キャリアタンパクを介して抗原とステロイド骨格を有する物質を結合させてもよい。
【００１４】
（３）ステロイド骨格を有する物質
本発明において、抗原に結合させるステロイド骨格を有する物質の種類は特に限定されず、ステロイド骨格を有してさえいればよい。一例として、エストロン、エストラジオール、エストリオール、プロゲステロン、テストステロンなどのステロイドホルモンや、ジゴキシン、メチルジゴキシンなどのステロイド骨格を有する強心配糖体などがあげられる。特に本発明では、ステロイドホルモンが好ましく、その中でもプロゲステロンが好ましい。
【００１５】
（４）キャリアタンパク
キャリアタンパクとして特に限定されるものではないが、免疫原性を有する高分子が好ましい。具体的には、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、ブルーキャリアプロテイン（ＢＣＰ）、オブアルブミン（ＯＶＡ）などがあげられる。特に本発明では、ＢＳＡが好ましい。
【００１６】
（５）免疫動物
免疫動物は、ヒト以外であって、通常、抗体取得のために用いられる動物種で行えばよく、特に限定されない。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどがあげられる。特に本発明では免疫動物としてウサギを用いることが好ましく、他の動物を用いた場合よりも抗体価の高い抗血清が得られやすい。
【００１７】
（６）免疫方法
免疫方法は、腹腔内投与、皮下注射、筋肉注射など一般的な動物免疫法で行われている方法で行えばよく、特に限定されない。
【００１８】
免疫抗原量は、免疫動物個体の大きさに応じて増減させればよい。具体的には１回の免疫抗原量として、マウスには５０〜１００マイクログラム、ウサギには０．５〜１ミリグラムを免疫すればよい。
【００１９】
また、必要に応じて、抗原性増強のため、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）等のアジュバントを使用してもよい。
【００２０】
免疫回数は、抗原の種類及び免疫動物への応答性によって変動があるため、ＥＬＩＳＡ法などによって、抗体価を解析し、免疫回数を決定するのが好ましい。
【００２１】
（７）抗血清又は抗体産生細胞の回収
上述のような本発明の方法でヒト以外の動物に免疫を行い、当該動物から抗血清又は抗体産生細胞を適宜回収することで、抗体価の高い抗血清又は抗体産生細胞を得ることができる。
【発明の効果】
【００２２】
抗原の免疫原性が低い場合、免疫動物の対象抗原に対する抗体価の上昇が低いことがある。本発明は動物に免疫を行う際に、抗原にステロイド骨格を有する物質を直接又は間接的に結合させることで、免疫源の抗原性を高めることができ、容易に高い抗体価の抗血清を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】実施例１及び比較例１で得られた抗血清をＥＬＩＳＡで評価した結果を示す図である。
【図２】実施例１及び比較例１で得られた抗血清をＥＬＩＳＡで評価した結果を示す図である。
【実施例】
【００２４】
実施例１  ステロイドを結合させた免疫抗原の作製及び免疫
サイロキシンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３．５ｍｇと、プロゲステロンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３．５ｍｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）２００μＬに溶解させ、３ｍＬの５０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）に溶解させた２５ｍｇのＢＳＡと混合した。室温で１時間静置した後、ＰＢＳ溶液で透析を行うことで、サイロキシンとプロゲステロンで修飾されたＢＳＡ（サイロキシンとプロゲステロンとをＢＳＡを介して結合させたもの：Ｔ４−ＢＳＡ−ｐｒｏｇ）を得た。
【００２５】
免疫動物はウサギ（日本白色種）のメスを使用した。初回免疫はフロイント完全アジュバント、二次免疫以降はフロイント不完全アジュバントを用い、免疫抗原溶液と等量のアジュバントを混合後、エマルジョンを作製した後に１週間間隔で免疫した。抗原免疫量は、初回１ｍｇで二次免疫以降は０．５ｍｇである。
【００２６】
採血は８回目の免疫終了の１週間後に、耳静脈から行い、抗血清約３ｍＬを得た。
【００２７】
比較例１  免疫抗原の作製（ステロイド非修飾）及び免疫
サイロキシンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３．５ｍｇをＤＭＳＯ（２００μＬ）に溶解させ、３ｍＬの５０ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ８．５）に溶解させた２５ｍｇのＢＳＡと混合した。室温で１時間静置した後、ＰＢＳ溶液で透析を行うことで、サイロキシンで修飾されたＢＳＡ（Ｔ４−ＢＳＡ）を得た。作製したＴ４−ＢＳＡを用いて、実施例１と同様の方法でウサギに免疫を行い、抗血清を得た。
【００２８】
実施例２  抗血清の抗体価評価
以下に示す２種のＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）で実施例１及び比較例１で得た抗血清の抗体価を評価した。
（１−１）サイロキシンのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをＢＣＰと反応させることで得た、Ｔ４−ＢＣＰ（１μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（１−２）抗血清の希釈系列を作製し、ＥＬＩＳＡプレート上のＴ４−ＢＣＰと反応させた。Ｂ／Ｆ分離を行った後、Ｔ４に結合したウサギ抗体と、アルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を結合させた。
（１−３）Ｂ／Ｆ分離を行った後、酵素基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００２９】
結果を図１に示す。図の縦軸は蛍光強度、横軸には抗血清の希釈倍率を示す。結果から明らかなように、比較例１に比べて、実施例１の抗血清の方が高希釈倍率でも抗原との反応を示す、抗体価の高い抗血清であることが分かった。
【００３０】
（２−１）抗ウサギＩｇＧ抗体（０．５μｇ／ｍＬ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化後、１％スキムミルクでブロッキングした。
（２−２）抗血清の希釈系列を作製し、ＥＬＩＳＡプレート上の抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた。Ｂ／Ｆ分離を行った後、アルカリホスファターゼ標識Ｔ４を反応させた。
（２−３）Ｂ／Ｆ分離を行った後、酵素基質である４−メチルウンベリフェリルリン酸（４−ＭＵＰ）を分注し、蛍光強度を測定することで検出した。
【００３１】
結果を図２に示す。図の縦軸は蛍光強度、横軸には抗血清の希釈倍率を示す。結果から明らかなように、比較例１に比べて、実施例１の抗血清の方が高希釈倍率でも抗原との反応を示す、抗体価の高い抗血清であることが分かった。
【００３２】
以上のＥＬＩＳＡの結果から、実施例１の抗血清は、比較例１に比べて抗体価が高いことが示された。
【図１】
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【図２】
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