(57)【要約】【課題】  本発明は、簡便に調製することができかつ低用量の投与で効果を示す、リポソームを有効成分とする免疫抑制剤を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明は、リポソームを含有する免疫抑制剤であって、脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回の前記リポソームが、対象動物に対して１２時間間隔で複数回静脈内投与されるように用いられることを特徴とし、前記リポソームが、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームであるか、又はコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームである、前記免疫抑制剤に関する。本発明は、簡便に調製することができかつ安全性が確認されているリポソームを、対象動物に対して低用量で複数回投与することで、免疫抑制作用を発揮させることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームを含有する免疫抑制剤であって、脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回の前記リポソームが、対象動物に対して１２時間間隔で複数回静脈内投与されるように用いられることを特徴とし、前記リポソームが、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームであるか、又はコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームである、前記免疫抑制剤。
【請求項２】
リポソームを脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回となるように１２時間間隔で対象非ヒト動物に複数回静脈内投与することを特徴とする、対象非ヒト動物内で抑制性マクロファージを誘導する方法であって、前記リポソームが、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームであるか、又はコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低用量が複数回に亘って投与される、リポソームを含有する免疫抑制剤及びかかる免疫抑制剤を用いた抑制性マクロファージを誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージは、細菌等の外来抗原に対する自然免疫を担当する細胞であり、感染防御において重要な役割を有する。近年の研究によると、マクロファージは、ＩＬ−１２などのＴｈ１型免疫応答を誘導する炎症性サイトカインを産生する炎症性マクロファージと、ＩＬ−１０などの抑制性サイトカインを産生して抗炎症的に作用する抑制性マクロファージの２つのサブセットに分化することが明らかにされつつある。
【０００３】
免疫抑制性マクロファージは、臓器移植による拒絶反応の抑制に利用可能である（非特許文献１）一方、腫瘍免疫応答の抑制に関与し化学療法を阻害する（非特許文献２）など、生体における免疫応答制御に深く関与していることが知られている。
【０００４】
本発明者らは、ある種のリポソームが実験動物に対して一過性の免疫抑制作用を示すこと、及びかかるリポソームの投与によって脾臓において抑制性マクロファージが多量に誘導されることを見いだした（非特許文献３）。
【０００５】
非特許文献３に記載の動物実験で明らかになった方法によれば、循環血液量の約２０％に相当する量のリポソーム分散液を血中投与する工程を含む。成人男性の場合、その投与量は１０００ｍＬ程になるが、免疫抑制剤として利用するには前記投与量は過大なものであり、実用的とは言いがたい。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｕｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１１年、第１８７巻、第２０７２−２０７８ページ
【非特許文献２】Ｐａｌｍａら、Ｎａｔｕｒｅ、２０１１年、第４７２巻、第３０３−３０４ページ
【非特許文献３】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１１年、第３３７巻、第１号、第４２−４９ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便に調製することができかつ低用量の投与で効果を示す、リポソームを有効成分とする免疫抑制剤を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、低用量のリポソームを反復投与することで前記目的を達成することができることを見出し、下記の各発明を完成させた。
【０００９】
（１）リポソームを含有する免疫抑制剤であって、脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回の前記リポソームが、対象動物に対して１２時間間隔で複数回静脈内投与されるように用いられることを特徴とし、前記リポソームが、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームであるか、又はコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームである、前記免疫抑制剤。
（２）リポソームを脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回となるように１２時間間隔で対象非ヒト動物に複数回静脈内投与することを特徴とする、対象非ヒト動物内で抑制性マクロファージを誘導する方法であって、前記リポソームが、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームであるか、又はコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームである、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、簡便に調製することができかつ安全性が確認されているリポソームを、対象動物に対して低用量で複数回投与することで、免疫抑制作用を発揮させることができる。したがって本発明は、経済性、安全性及び有効性のいずれの点においても優れた免疫抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の免疫抑制剤又は比較例等を投与したラットから調製された脾臓細胞をコンカナバリンＡの存在下で培養したときのリンパ芽球の増殖抑制効果を示す図（写真）である。
【図２】本発明の免疫抑制剤又は比較例等を投与したラットから調製された脾臓細胞をコンカナバリンＡの存在下で培養したときの、細胞の一酸化窒素（ＮＯ）産生能を示す図である。
【図３】本発明の免疫抑制剤又は生理食塩水を投与したラットから調製された脾臓細胞について、ＣＤ１１ｂ／ｃを指標として抑制性マクロファージを検出したフローサイトメトリーの結果を示す図である。
【図４】ジオレオイルホスファチジルコリン、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリン及びコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームの、コンカナバリンＡ存在下におけるラット脾臓細胞の増殖に対する抑制能を示す図である。グラフの縦軸は３Ｈ−ＴｄＲの取込量（ｃｐｍ）である。
【図５】ジオレオイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン又はジパルミトイルホスファチジルコリンを脂質二重膜の構成脂質として含み、コレステロールを含まないリポソームの、コンカナバリンＡ存在下におけるラット脾臓細胞の増殖に対する抑制能を示す図である。グラフの縦軸は３Ｈ−ＴｄＲの取込量（ｃｐｍ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、リポソームを含有する免疫抑制剤であって、脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回の前記リポソームが、対象動物に対して１２時間間隔で複数回静脈内投与されるように用いられることを特徴とし、前記リポソームが、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームであるか、又はコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームである、前記免疫抑制剤に関する。
【００１３】
本発明の免疫抑制剤の態様の一つは、脂質二重膜の構成脂質として４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を含むリポソームに関する。リン脂質から構成される脂質二重膜は、温度変化に応答してゲル相−液晶相の相転移を生じ、環境温度が相転移温度を超えるとゲル相から液晶相への相転移が起こって膜の流動性が向上する一方、相転移温度未満では脂質二重膜の形状は安定化されることが知られている。理論に拘束されるものではないが、本発明の免疫抑制剤として用いられるリポソームは、かかる安定化された形状を持つリポソームであると推察される。
【００１４】
４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ、相転移温度約４１℃）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ、相転移温度約５８℃）、水素添加精製卵黄ホスファチジルコリン（相転移温度５０〜６０℃）、水素添加精製大豆ホスファチジルコリン（相転移温度約５５℃）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（相転移温度４９℃）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（相転移温度４４℃）、ジアラキジノイルホスファチジルコリン、ジドコサノイルホスファチジルコリン、ジテトラコサノイルホスファチジルコリンなどが挙げられ、好ましくはＤＰＰＣが挙げられる。また、リン脂質の極性基は、ホスファチジルコリン以外にも、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールなども挙げられる。４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質は脂質二重膜の総脂質量の約５０〜１００ｍｏｌ％であることが好ましい。
【００１５】
また本発明のもう一つの態様は、コレステロール（ＣＨＯ）を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームに関する。ＣＨＯは脂質二重膜内の脂質分子の運動性を低下させ、脂質膜を安定化させることが知られている。ＣＨＯは脂質二重膜の総脂質量の約１０〜５０ｍｏｌ％であることが好ましい。ＣＨＯを脂質二重膜の構成脂質として含む場合には、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質が構成脂質として含まれていても又は含まれていなくてもよい。
【００１６】
本発明にかかるリポソームにおいて、脂質二重膜を構成するその他の脂質の種類は特に限定されず、例えば、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質以外のリン脂質、糖脂質、合成脂質、ＣＨＯ以外のステロール、長鎖脂肪酸、長鎖脂肪族アルコールあるいはグリセリン脂肪酸エステル、カルボン酸型脂質などを挙げることができ、これらのうちのいずれであってもよい。また、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質のいずれであってもよい。
【００１７】
４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質以外のリン脂質としては、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ、相転移温度−２２℃）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ、相転移温度２３℃）、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ、相転移温度−３℃）、１−ステアロイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（相転移温度３０℃）、ジリノレイルホスファチジルコリン（相転移温度−５５℃）などを挙げることができる。
【００１８】
糖脂質としては、スフィンゴミエリン、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシドなどのグリセロ糖脂質又はスフィンゴ糖脂質などを挙げることができる。
【００１９】
ＣＨＯ以外のステロールとしては、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロールなどの動物由来のステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロールなどの植物由来のステロール（フィトステロール）、チモステロール、エルゴステロールなどの微生物由来のステロールなどを挙げることができる。
【００２０】
長鎖脂肪酸、あるいは長鎖脂肪族アルコールとしては、炭素数１０以上の脂肪酸又はそのアルコールを使用することができる。そのような長鎖脂肪酸又は長鎖脂肪族アルコールとしては、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、ドコサン酸、テトラコサン酸などの飽和脂肪酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、アラキドン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などの不飽和脂肪酸、オレイルアルコール、ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、リノリルアルコールなどを挙げることができる。
【００２１】
グリセリン脂肪酸エステルとしては、モノアシルグリセリド、ジアシルグリセリド、トリアシルグリセリドを挙げることができ、これらの１種または２種以上を用いることができる。
【００２２】
カルボン酸型脂質としては１，５−Ｏ−ジヘキサデシル−Ｎ−スクシニル−Ｌ−グルタメート（ＤＨＳＧ）を挙げることができる。
【００２３】
また、本発明にかかるリポソームは、血中滞留性の向上その他の目的のために、ポリアルキレングリコールで、典型的にはポリエチレングリコールで修飾（ＰＥＧ修飾）されていてもよい。リポソームのＰＥＧ修飾は一般的な方法、例えばＰＥＧを結合させた適当な脂質を脂質二重膜の構成脂質としてリポソームを調製することで行うことができる。本発明にかかるリポソームの場合、ＰＥＧ修飾は、ＰＥＧを結合させたＤＳＰＥ（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を脂質二重膜の構成脂質として利用することで行うことが好ましい。
【００２４】
本発明のリポソームの脂質二重膜を構成する好ましい脂質の一例は、ＤＰＰＣ、ＤＨＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥであり、その構成比は、モル比で１０：１：０．０３３である。また本発明のリポソームの脂質二重膜を構成する好ましい脂質のもう一つの例は、ＤＰＰＣ、ＣＨＯ、ＤＨＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥであり、その構成比は、モル比で５：４：０．９：０．０３である。
【００２５】
本発明にかかるリポソームは、複数枚の脂質二重膜からなる多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよく、また、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、その他の一枚膜リポソームであってもよい。またサイズは特に限定されるものではないが、直径１００〜１０００ｎｍであることが好ましく、直径２００〜５００ｎｍであることがさらに好ましい。
【００２６】
本発明のリポソームは、例えば、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて調製することができる。また、リポソームを所定のポアサイズのフィルターを通過させることにより（押出し法）、一定の粒度分布を有するリポソームを調製することができる。また、公知の方法に従って、多重膜リポソームから一枚膜リポソームへの転換、一枚膜リポソームから多重膜リポソームへの転換を行うことができる。
【００２７】
本発明にかかるリポソームの脂質二重膜で閉鎖された空間は、水和法などによってリポソームを調製する際に利用される適当な溶媒で満たされていてもよいが、免疫抑制剤としての機能を妨げない限り、任意の物質を包摂していてもよい。
【００２８】
本発明の免疫抑制剤が投与される対象動物としては、特に限定されるものではなく、例えばヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。好ましい対象動物はヒトである。
【００２９】
本発明にかかるリポソームは、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
【００３０】
本発明にかかるリポソームは、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で保存し、使用時に生理食塩水、リン酸緩衝液、クエン緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液として利用することができる。
【００３１】
本発明の免疫抑制剤は、脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液となる上記リポソームを、患者に対して１２時間間隔で複数回静脈内投与されるように用いられることを特徴とする。
【００３２】
循環血液とは血管系を循環している血液量を意味し、ヒトでは体重のおよそ１／１３（男性で約８％、女性で約７％）と推定されており、例えば、体重７０ｋｇの男性では約５ｋｇ（５０００ｍＬ）と考えられている。
【００３３】
体重７０ｋｇの男性（循環血液量５０００ｍＬ）に対して、脂質重量換算で８ｇ／ｄＬとなるように調製されたリポソーム分散液を使用するときは、循環血液量の１％に相当する５０ｍＬの分散液を１回あたり投与することで、脂質重量換算で０．８ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回のリポソームが投与されることになる。この場合の総脂質投与量は４ｇ／回となる。
【００３４】
本発明の免疫抑制剤は、上記投与量を１２時間間隔で繰り返すことで、一回当たりの投与量を抑制しながら、効果的に対象動物の免疫応答能を抑制することができる。本発明にいう免疫抑制とは、対象動物における免疫応答能を抑制又は低下させる機能をいい、特に対象動物の脾臓において抑制性マクロファージを誘導する活性をいう。誘導された抑制性マクロファージがＴ細胞の増殖又は分化を抑制することで、対象動物における免疫応答能の抑制又は低下が生じるものと推察される。
【００３５】
本発明は、４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質を脂質二重膜の構成脂質として含むリポソーム又はコレステロールを脂質二重膜の構成脂質として含むリポソームを、脂質重量換算で０．５〜１ｍｇ／１ｍＬ循環血液／回となるように１２時間間隔で対象非ヒト動物に複数回静脈内投与することを特徴とする、対象非ヒト動物内で抑制性マクロファージを誘導する方法も提供する。かかる方法を構成する各用語の意義は、前記免疫抑制剤について説明したとおりである。
【００３６】
先に説明したように、本発明の免疫抑制剤を用いることで、対象個体、特にその脾臓において抑制性マクロファージを誘導することができる。したがって、非ヒト動物に対して本発明の免疫抑制剤を上記の態様で投与した後に当該非ヒト動物から脾臓を摘出し、脾臓から得られた細胞を、マクロファージで発現が認められる細胞表面抗原、例えばＣＤ１１ｂ／ｃなどに対する抗体を利用した磁気ビーズ等の手段で精製することにより、容易に大量の抑制性マクロファージを獲得することができる。獲得された抑制性マクロファージは、免疫応答に関わる抑制性マクロファージの役割などの研究に利用することができる。
【００３７】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１＞
１）リポソームの調製
ＤＰＰＣ、ＣＨＯＬ、ＤＨＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを５：４：０．９：０．０３のモル比で含む脂質混合粉末７ｇに生理食塩水９０ｍＬを添加して水和した後、エクストルーダー（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｃ．）を用い、窒素ガス加圧下でポアサイズ０．２２μｍのメンブレンフィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）、日本ミリポア社）を通して前記水和物を押し出すことで、本発明にかかるリポソーム（ＥＶｓと表す）を含む分散液約９０ｍＬを調製した。このＥＶｓの平均粒子径は２５０ｎｍ、分散液の脂質換算濃度は約７ｇ／ｄＬである。
【００３９】
２）ＥＶｓの投与
日本ＳＬＣ社から購入した８〜１２週齢のオスのＷＫＡＨラット（体重２２０ｇ〜３００ｇ）について循環血液量を５６ｍＬ／ｋｇと設定し、その２０％相当量ＥＶｓ（ポジティブコントロール、ＰＣ）、２％相当量ＥＶｓ（比較例１、ＣＥ１）、１％相当量ＥＶｓ（比較例２、ＣＥ２）、１％相当量ＥＶｓ（実施例、ＥＸ）、及び２０％相当量の生理食塩水（ネガティブコントロール、ＮＣ）をそれぞれ投与した。ＥＸについてのみ、一回目の投与から１２時間後に１％相当量ＥＶｓを再度投与した。リポソームの総投与量は、脂質換算でＰＣが０．０１４ｇ／１ｍＬ循環血液、ＣＥ１が０．００１４ｇ／１ｍＬ循環血液、ＣＥ２が０．０００７ｇ／１ｍＬ循環血液、実施例（２回投与合計）が０．００１４ｇ／１ｍＬ循環血液である。
【００４０】
３）リンパ芽球の増殖抑制効果
最初の投与から１８時間後、各ラットから脾臓を摘出し、ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ＩＢＬ社）を用いて赤血球を取り除き、１０％ＦＣＳ及び５０μＭのメルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ培地１６４０で洗浄して、単一細胞浮遊液をそれぞれ調製した。
【００４１】
各ラットから調製した単一細胞浮遊液１ｍＬ（細胞数２×１０６個）を２４ウェルプレートに播き、コンカナバリンＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を０．３μｇ／ｍＬ又は３．０μｇ／ｍＬとなるように添加して４日間培養した。
【００４２】
培養終了後、各ウェル内の細胞を位相差倒立顕微鏡にて観察し、リンパ芽球（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔ）の増殖状態を観察した。なお、ＮＣから単離した脾臓細胞をコンカナバリンＡ無添加培地で培養したものを、芽球増殖に関する陽性コントロールとして用意した。コンカナバリンＡを３．０μｇ／ｍＬとしたときの観察結果を図１に示す。
【００４３】
図１に示されるように、ＮＣ（生理食塩水の投与）では芽球様細胞の形成が顕著に観察されるが、ＰＣ（循環血液量の２０％相当量ＥＶｓの１回投与）ではこの形成は顕著に抑制される。一方、ＣＥ１（循環血液量の２％相当量ＥＶｓの１回投与）及びＣＥ２（循環血液量の１％相当量のＥＶｓ１回投与）では、ネガティブコントロールと同様に芽球様細胞の顕著な形成が観察されるが、ＥＸ（循環血液量の１％相当量ＥＶｓの２回投与）では、ＮＣ、ＣＥ１及びＣＥ２とは明らかに異なり、芽球様細胞の形成が抑制されることが確認された。
【００４４】
４）ＮＯの産生促進効果
前記３）においてコンカナバリンＡの存在下で４日間培養したＮＣ、ＰＣ、ＣＥ２及びＥＸについて、各培地中のＮＯの産生量を、Ｇｒｉｅｓｓ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｒ６Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、キットのプロトコールにしたがって測定した。その結果を図２に示す。ＮＯの産生促進効果に関しても、本発明の免疫抑制剤であるＥＸ（循環血液量の１％相当量のＥＶｓ２回投与）は、ＣＥ２（循環血液量の１％相当量ＥＶｓの１回投与）と比較してより高い促進能を示した。
【００４５】
５）抑制性マクロファージの検出
前記３）のＮＣ（生理食塩水投与）及びＥＸ（循環血液量の１％相当量ＥＶｓの２回投与）の各単一細胞浮遊液中の細胞を、フィコエリスリン（ＰＥ）をコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｂ／ｃ抗体を用いて染色した後、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ  フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて細胞分画を行った。その結果、ＥＸにおいて明確な抑制性マクロファージの誘導が確認された（図３右上）。
【００４６】
＜実施例２＞
ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ又はＤＰＰＣ、ＣＨＯ、ＤＨＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを５：４：０．９：０．０３のモル比で含む３種類の脂質混合粉末を用意し、実施例１の１）と同様の操作を行い、ＣＨＯを脂質二重膜の構成脂質として含む３種類のリポソームを調製した。
【００４７】
実施例１の２）の操作にしたがってラットに循環血液量の１％相当量の２回投与を行い、実施例１の３）の操作にしたがってコンカナバリンＡ存在下における各ラットの脾臓細胞の増殖に対する抑制能（免疫抑制能）を調べた。増殖能は、培地中に添加した３Ｈ−ＴｄＲの取込量（ｃｐｍ）で測定した。その結果を図４に示す。ＣＨＯを構成脂質とする３種類のリポソームは、いずれもラット脾臓細胞の増殖を抑制する効果を示した。
【００４８】
＜実施例３＞
ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ又はＤＰＰＣ、ＤＨＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥを１０：１：０．０３３のモル比で含む３種類の脂質混合粉末を用意し、実施例１の１）と同様の操作を行い、ＣＨＯを脂質二重膜の構成脂質として含まない３種類のリポソームを調製した。
【００４９】
実施例１の２）の操作にしたがってラットに循環血液量の１％相当量の２回投与を行い、実施例１の３）の操作にしたがってコンカナバリンＡ存在下における各ラットの脾臓細胞の増殖に対する抑制能（免疫抑制能）を調べた。増殖能は、培地中に添加した３Ｈ−ＴｄＲの取込量（ｃｐｍ）で測定した。その結果を図５に示す。ＣＨＯを脂質二重膜の構成脂質として含まず、かつ４１℃以上の相転移温度を有するリン脂質であるＤＰＰＣを構成脂質とするリポソームは、ラット脾臓細胞の増殖を抑制した。一方、ＣＨＯを脂質二重膜の構成脂質として含まず、かつ４１℃未満の相転移温度を有するリン脂質であるＤＯＰＣ又はＤＭＰＣを構成脂質とするリポソームは、いずれも３μｇコンカナバリンＡ刺激によるラット脾臓細胞の増殖に対する抑制効果は示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明の免疫抑制剤は、対象動物に対して低用量を投与することでその効果を発揮することができる免疫抑制剤として、炎症、アレルギー疾患、自己免疫疾患等に対する治療薬としての利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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