(57)【要約】【課題】フケ症を評価する新たな方法の提供。【解決手段】  被験者の頭皮常在細菌におけるスタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率を測定する工程を含むフケ症の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の頭皮常在細菌におけるスタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率を測定する工程を含むフケ症の評価方法。
【請求項２】
頭皮常在細菌に対するスタフィロコッカス科細菌の存在比率が、６．６％以下である場合に健常な頭皮であると評価し、５１％以上である場合にフケ症を発症する可能性が高いと評価する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
頭皮常在細菌に対するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率が、５．１％以下である場合に健常な頭皮であると評価し、４２．６％以上である場合にフケ症を発症する可能性が高いと評価する請求項１記載の方法。
【請求項４】
頭皮常在細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のデータ群に基づいて、スタフィロコッカス科細菌に属する塩基配列のデータ数又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓに属する塩基配列のデータ数を求め、頭皮常在細菌全体の塩基配列のデータ数に対する比率を算出する、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フケ症を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フケは頭皮から発生する鱗状の白い老廃物であり、角層表面から剥離された角質細胞の集合体である。フケ症は過剰な皮脂の分泌を伴う症状であることが多く、研究者の多くは軽度から中程度の脂漏性皮膚炎（ｓｅｂｏｒｒｈｏｅｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）をフケ症と定義している（非特許文献１）。しかしながら、前述した鱗状の白い老廃物が頭皮に生じる原因としては、脂漏性皮膚炎以外にも、頭皮の洗いすぎ等によって生じる「肌荒れ」の状態や自己免疫疾患によって生じる乾癬など、複数の原因があるといわれている。フケ状態は、慢性であり、再発し、かつその見た目の悪さのために、精神的な苦痛をしばしば招く。
【０００３】
フケ症には、皮膚常在菌による表皮細胞のターンオーバーの亢進や皮脂分泌の異常が関与すると考えられ、古くから頭皮に常在する真菌に着目して研究が進められてきた。すなわち、１９３０年−１９５０年にかけて、Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）を用いたヒト試験が実施され、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａのヒト頭皮への植菌がフケ症を発生させることが報告され（非特許文献２)、その後、培養法を用いた菌叢解析により、フケ症患者の患部にはＭａｌａｓｓｅｚｉａが多く存在すること（非特許文献３）、さらには、抗真菌剤によりその症状が改善されることより、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａが主たる原因菌として考えられていた。
【０００４】
その後、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａの菌種解析が進み、１９９６年に７種類に分類できることが報告されると（非特許文献４）、２００２年には、ＰＣＲ（ｔＦＬＰ法）を用いて、健常者及び脂漏性皮膚炎患者の頭部菌叢解析により、脂漏性皮膚炎患者にはＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｒｅｓｔｒｉｃｔａ（Ｍ．ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）及びＭａｌａｓｓｅｚｉａ  ｇｌｏｂｏｓａ（Ｍ．ｇｌｏｂｏｓａ）が多く存在すること（非特許文献５）、さらには、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ（特にＭ．ｇｌｏｂｏｓａ）はリパーゼを産生し、皮脂を分解して脂肪酸を遊離することが明らかにされた。
【０００５】
また、フケ症患者の皮脂分析において、抗菌剤によりＭａｌａｓｓｅｚｉａを抑制すると、脂肪酸の増加が抑制されること（非特許文献６）、また、フケ症患者においては、健常者に対して脂肪酸感受性が高く、脂肪酸の塗布によってフケ症状が誘導されることが示された（非特許文献７）。
【０００６】
斯かる知見より、現在では、フケ症にはＭ．ｒｅｓｔｒｉｃｔａ及びＭ．ｇｌｏｂｏｓａが関与し、これらが産生するリパーゼによって皮脂が分解され、生じた脂肪酸によってフケ症状が引き起こされるとの考えが一般的である。
【０００７】
一方、頭皮上にはＭａｌａｓｓｅｚｉａのような真菌以外にも多くの細菌が常在しており、斯かる細菌のフケ症への関与については従来殆ど研究がなされていなかった。最近になって、網羅的遺伝子解析（クローンライブラリー法）によって、健常人とフケ症患者の頭皮に存在する菌叢（細菌及び真菌）について解析がなされ、フケ症患者では、健常人で多く検出されるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓが減少し、Ｍ．ｒｅｓｔｒｉｃｔａに対するＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在比率を測定することにより、フケ症の診断が可能であることが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１４／００９７６４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Dermatology, 2000, 200, 93-98.
【非特許文献２】J. Soc. Cosmet. Chem., 1952, 3, 90
【非特許文献３】J. invest. Dermatol., 1975, 64, 6, 401-405
【非特許文献４】Antonie Leeuwenhoek, 1996, 69, 337-355
【非特許文献５】JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, 2002, 40(9) 3350-3357
【非特許文献６】J Investig Dermatol Symp Proc, 2005, 10, 194-197
【非特許文献７】J Investig Dermatol Symp Proc, 2005, 10, 295-297
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、フケ症に関与する頭皮常在細菌を特定し、フケ症を評価する新たな方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、頭皮上に常在する細菌叢を網羅的に解析しフケ症との関連性を調べたところ、フケ症患者の頭皮細菌菌叢は、スタフィロコッカス科細菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率が健常者に比べて遥かに高く、且つ当該Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓが脂肪酸産生能を有することから、フケ症の原因細菌の一つとなり得ることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、被験者の頭皮常在細菌におけるスタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率を測定する工程を含む、フケ症の評価方法、に係るものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法によれば、簡易にフケ症の発症リスクやフケ症の程度を評価することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）：フケ症の判定及び皮膚常在菌を採取した部位、（ｂ）：フケスコアの判定基準。
【図２】健常な頭皮（Ｎ＝４８）及びフケ症を有する頭皮（Ｎ＝４２）の頭皮常在細菌叢の割合。
【図３】ＯＴＵ５９、ＯＴＵ２３７５、ＯＴＵ２５０９とＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ，Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列の系統樹。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ−１＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＴＣＣ１２２２８（ＡＥ０１５９２９１），Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ−２＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｄｅｒｉｍｉｄｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＲＰ６２Ａ（ＮＣ＿００２９７６），Ｓ．ａｕｒｅｕｓ−１＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００  ｓｔｒａｉｎ  ＦＰＲ３７５７（ＮＣ＿００７７９３），Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ−２＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００  ｓｔｒａｉｎ  ＴＣＨ１５１６（ＮＣ＿０１００７９），Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ−１＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＴＣＣ  ２７８４０Ｔ（ＦＮ５５４７１３），Ｓ．ｃａｐｉｔｉｓ−２＝Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｊ８５（ＦＮ５５４７１３）。アルファベットの小文字ａ〜ｅは同一菌種における異なる１６Ｓ  ｒＲＮＡの配列を意味する。
【図４】ＯＴＵ５９，ＯＴＵ２３７５，ＯＴＵ２５０９とスタフィロコッカス科の存在比率に関する相関。（ａ）はＯＴＵ５９（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）、（ｂ）はＯＴＵ２３７５（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、（ｃ）ＯＴＵ２５０９（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）とスタフィロコッカス科の相関。
【図５】健常な頭皮及びフケ症を有する頭皮における（ａ）スタフィロコッカス科及び（ｂ）ＯＴＵ５９（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ）の比較。
【図６】Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの溶血性及びリパーゼ生産性評価。（ａ）はＬＢ培地、（ｂ）はＬＢ＋５０ｍＭ  Ｔｒｉｏｌｅｉｎを含む培地で培養した結果。左から培養液濁度（ＯＤ６００）、溶血性（％）、遊離脂肪酸量（ｍＭ）の結果。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、「フケ」とは、頭皮から発生する鱗状の白い老廃物であり、角層表面から剥離された角質細胞の集合体を意味し、「フケ症」とは、当該フケが発生した状態、具体的には、図１ｂにおけるフケスコア１〜４に該当する状態を意味する。
【００１６】
本発明によるフケ症の評価方法においては、被験者の頭皮常在細菌におけるスタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率（割合）が測定される。
ここで、頭皮常在細菌とは、ヒトの頭皮上に常在する細菌を指し、プロピオニバクテリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、ストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）等の細菌が含まれる。主要細菌種はプロピオニバクテリウム科、スタフィロコッカス科、コリネバクテリウム科の３菌種であり、全細菌の９３％程度を占める。また、健常な頭皮ではプロピオニバクテリウム科細菌が７６％程度を占める。
【００１７】
本発明において、スタフィロコッカス科（ブドウ球菌科）細菌としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓが挙げられ、このうち、フケ症に関与するのはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓである。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓは、糖の資化性や細胞壁組成の違いによりその他のブドウ球菌とは区別されている（Kloos, W.E. and K.H. Schleifer, Int J Syst Bacteriol, 1975. 25(1): p. 62-79.）。一般的にブドウ球菌は、血液凝固作用を示すコアグラーゼの有無により病原性の有無を判断するが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓはコアグラーゼを有さないブドウ球菌（Coagulase -negative staphylococci, CNS）であることが報告されている。
また、後記実施例に示すように、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓは、リパーゼ生産性であり、油脂を分解して脂肪酸を遊離することが確認された。
【００１８】
本発明において、頭皮常在細菌中におけるスタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率を測定する手段は特に限定されないが、好適には、菌叢ゲノムＤＮＡに含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて、頭皮常在細菌中に存在する細菌種を解析する方法が挙げられる。
以下、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいて頭皮常在細菌の菌種を分類、同定する方法を説明する。
１）頭皮常在菌の採取
頭皮常在菌の採取は、例えば生理食塩水を含ませた滅菌ウレタン綿棒を被験者の頭皮（例えば、５ｃｍ×０．６ｃｍ）に対し、２０回往復（前後、左右方向に各１０往復）させることにより行うことができる。検体は、採取後すぐに１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列決定に使用することもできるが、スワブの状態で、−８０℃で凍結保存することも可能である。
【００１９】
２）頭皮常在菌検体からゲノムＤＮＡの抽出
１）で採取された頭皮常在菌検体について、公知の溶菌酵素法（BMC Microbiol.,2004,4:16）やビーズ法（Science, 2008,320,1647-1651）等により、核酸を遊離させた後、ＤＮＡの分離抽出法として知られている公知の方法、例えば、フェノール−クロロホルム法（Mol.Biol.,1986,191,615-624）やグアニジン法（Science,2005,308:1635-1638）等の汎用法を採用することによりゲノムＤＮＡの抽出が行われる。
【００２０】
３）ゲノムＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定
次に、抽出した細菌ゲノムＤＮＡに含まれる１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列が決定される。すなわち、各菌種に特徴的な１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列が決定され、その配列データに基づいて頭皮常在細菌の菌叢構造が解析される。このため、該菌叢構造を反映するように、配列決定を行うべき１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の領域を選択する必要があるが、迅速に解析を行い、配列の読み取りエラーを排除すべく、各菌種の配列の特徴が反映される限り、短い領域の配列を決定して比較することが望ましい。
配列決定を行うべき１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の領域は、ＰＣＲによって増幅されるが、この場合のプライマーは、菌種間で普遍的に保存されている領域に設定することが好ましい。斯かるプライマーとしては、例えば下記表１に示すものの組み合わせが挙げられる（BMC Microbiology,2012,12:66）。
【００２１】
【表１】
2016220634.tif 000002
【００２２】
増幅されたＰＣＲ産物を精製後、配列決定が行われる。配列決定は既知の如何なる方法を用いることができるが、例えば、次世代型超高速シークエンス装置、例えば４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）等を使用すると、迅速に配列決定することができる。
細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子上には、塩基配列が菌種間で保存されずに、変化に富む領域（Ｖ１〜Ｖ１０）が存在することが知られている。従って、斯かる領域のいずれか、例えば、スタフィロコッカス科を種レベルで分類することが可能であることが報告されているＶ１〜Ｖ３を含む領域（Conlan, S., H.H. Kong, and J.A. Segre, Species-level analysis of DNA sequence data from the NIH Human Microbiome Project. PLoS One, 2012. 7(10): p. e47075.）の塩基配列を決定することが望ましい。
【００２３】
取得された配列データの解析は、得られた塩基配列のデータ群について、Ｑｉｉｍｅ（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）等の解析ソフトを用いて行うことができ、各配列の同定は、Ｔｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（Lan, Y et al, Using the RDP classifier to predict taxonomic novelty and reduce the search space for finding novel organisms. PLoS One 2012. 7:e32491.）の体系に従って行うことができる。また、ＮＣＢＩ  ｎｕｃｌｅａｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅ、ＮＣＢＩ  １６Ｓ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒＲＮＡ  ｄａｔａｂａｓｅ、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ、ＳＩＬＶＡといった遺伝子配列データベースに対するＢＬＡＳＴ  アルゴリズムを用いた相同性検索によっても可能である(J.Mol.Biol.,1990,215(3):403-410)。
各塩基配列間の類似度に基づいたクラスター解析は、例えば１００％塩基配列類似度で形成されるクラスターＯＴＵ（operational taxonomic unit）に分類することにより行うことができる。
【００２４】
実施例１に示すように、細菌の菌叢解析から、頭皮上の主要細菌種はプロピオニバクテリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ）、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の３菌種である。健常な頭皮及びフケを有する頭皮の頭皮菌叢を比較した場合、スタフィロコッカス科が健常な頭皮では１４．８％であるのに対し、フケ症を有する頭皮では４９．４％であった（図２）。
そして、クラスター解析によれば、スタフィロコッカス科は、図３に示すように、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ（ＯＴＵ５９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＯＴＵ２３７５）、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＯＴＵ２５０９）から構成され、さらに、スタフィロコッカス科の存在比率とこれら３菌種の存在比率の相関を比較したところ、ススタフィロコッカス科の多くはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓであり、タフィロコッカス科とＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓは高い相関を示す（図４）。すなわち、フケ症患者の頭皮常在細菌は、スタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率が有意に高いと云える（図５）。
【００２５】
したがって、被験者の頭皮常在細菌に由来する塩基配列のデータ群に基づいて、スタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数、又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの塩基配列のデータ数を算出し、頭皮常在細菌全体の塩基配列のデータ数に対する割合を、被験者の頭皮常在細菌に対するスタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率とし、フケ症リスクの評価に使用することができる。
具体的には、頭皮常在細菌全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するスタフィロコッカス科細菌の塩基配列のデータ数（スタフィロコッカス科細菌の量）の比率（Ｒ）が、６．６％以下である場合には健常な頭皮であると評価でき、５１％以上である場合にはフケ症を発症する可能性が高いと評価できる。また、頭皮常在細菌全体の塩基配列のデータ数（全細菌量）対するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの塩基配列のデータ数（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの量）の比率（Ｒ）が、５．１％以下である場合には健常な頭皮であると評価でき、４２．６％以上である場合にはフケ症を発症する可能性が高いと評価できる。
【００２６】
上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞被験者の頭皮常在細菌におけるスタフィロコッカス科細菌又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率を測定する工程を含むフケ症の評価方法。
＜２＞頭皮常在細菌に対するスタフィロコッカス科細菌の存在比率が、６．６％以下である場合に健常な頭皮であると評価し、５１．０％以上である場合にフケ症を発症する可能性が高いと評価する、上記＜１＞の方法。
＜３＞頭皮常在細菌に対するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの存在比率が、５．１％以下である場合に健常な頭皮であると評価し、４２．６％以上である場合にフケ症を発症する可能性が高いと評価する上記＜１＞の方法。
＜４＞頭皮常在細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、得られた塩基配列のデータ群に基づいて、スタフィロコッカス科細菌に属する塩基配列のデータ数又はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓに属する塩基配列のデータ数を求め、頭皮常在細菌全体の塩基配列のデータ数に対する比率を算出する、上記＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
【００２８】
実施例１  頭皮常在細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡによる菌叢解析
（１）被験者及びフケ症の判定
ヘルシンキ宣言の下、２０〜６０歳代の男女１０名の頭皮９箇所を対象に試料の採取を行った（図１Ａ）。フケ症に関しては、目視による５段階（０〜４）のスコアにより判定し、０は健常な頭皮、１〜４はフケ症を有する頭皮とした（図１Ｂ）。
【００２９】
（２）試料の調製
フケ症を判定した各部位からの頭皮常在菌のサンプリングは、滅菌ウレタン綿棒（カルチャースワブＥＺ，  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｔｓｏｎ）を用いて行った。具体的には、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含ませた滅菌ウレタン綿棒を頭皮（５ｃｍ×０．６ｃｍ）に対し、２０回往復（前後方向に各１０往復）させることにより菌の採取を行った。同一カ所につき、３回（スワブ３本）採取を行い、採取後のサンプルに関してはＤＮＡの抽出を行うまで−８０℃で保存した。
【００３０】
（３）頭皮常在菌ゲノムＤＮＡの抽出
スワブサンプルからのゲノムＤＮＡの抽出は以下の方法で行った。まず、１５ｍＬファルコンチューブにジルコニアビーズ１，２００ｍｇを入れ、さらに１ｍＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール水溶液（２５：２４：１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加し、氷上で冷却した。スワブを５００μＬのＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（終濃度１０ｍＭ）、ＥＤＴＡ（終濃度１ｍＭ）、ＮａＣｌ（終濃度１００ｍＭ）、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（終濃度２％（ｖ／ｖ））、ＳＤＳ（終濃度１％（ｗ／ｖ））］に懸濁し、準備したフェノール入り１５ｍＬファルコンチューブに３００μＬ添加した。Ｃｕｔｅ  Ｍｉｘｅｒを用いて５分間攪拌後、４℃、９，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。水相７００μＬをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール水溶液（２５：２４：１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬを入れたＰｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  Ｇｅｌチューブに混合した。ボルテックスにより５分攪拌後、２０℃、１２，０００ｒｐｍで５分間遠心した後、水相６００μＬを１．５ｍＬ  エッペンドルフチューブに回収し、４μＬの共沈剤（エタ沈メイト、和光純薬工業）及び６０μＬの３Ｍ  酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）を混合した。さらに、イソプロパノールを６００μＬ混合し、転倒混和後、４℃で１０分間インキュベーションした。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した後、上清を除去し、６００μＬの７０％（ｖ／ｖ）エタノールを混合し、タッピングにより洗浄した。再度、１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心した後、上清を除去し、減圧乾燥にてペレットを乾燥させた。最後に２００μＬのＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を用いて溶解し、ＤＮＡ溶液とした。
【００３１】
（４）網羅的細菌菌叢解析
次世代シーケンサーを用いた１６Ｓ  ｒＲＮＡによる菌叢解析は全９０サンプルを１８サンプルごとに５回に分けて解析した。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅は、抽出したＤＮＡを鋳型にして、表２に示すプライマーを用いて増幅した。ＤＮＡポリメラーゼはＥｘ  Ｔａｑ  ＨＳポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）を使用し、表３に示した組成でＰＣＲ反応溶液を調製し、表４に示した条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ後の精製はＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  （ベックマンコールター）及びＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。
【００３２】
増幅した細菌１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列は、４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて取得した。エマルジョンＰＣＲは、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｅｍＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｌｉｂ−Ｌ）（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行い、シーケンス反応は、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ＰｉｃｏＴｉｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）及びＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。
４５４  ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて取得した配列情報の解析は、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）（Ｕｂｕｎｔｕ  １２．０４）環境下でフリーソフトＱｉｉｍｅ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ）（http://qiime.org/）＜Caporaso et al,. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nat Methods, 2010. 7:335-336.＞を用いて行った。得られた全ての塩基配列情報は、Ｑｉｉｍｅ上でデフォルトのパラメータを用いてクオリティ等を確認し、設定以下のものは、以降のデータ解析から除外した（具体的には平均クオリティスコアが２５以下、ホモポリマーを６以上有する、プライマー配列にミスマッチが存在する、バーコード配列を有さない、配列が２００ｂｐ以下または１０００ｂｐ以上のものを解析対象外とした）。
解析対象とした配列は、Ｑｉｉｍｅ内のソフトを用いて１００％の類似度で形成されるクラスターＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ）に分類した。各配列の同定はＴｈｅ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（http://rdp.cme.msu.edu/）＜Lan, Y et al, Using the RDP classifier to predict taxonomic novelty and reduce the search space for finding novel organisms. PLoS One 2012. 7:e32491.＞の体系に従って行った。
【００３３】
【表２】
2016220634.tif 000003
【００３４】
【表３】
2016220634.tif 000004
【００３５】
【表４】
2016220634.tif 000005
【００３６】
（５）菌叢解析結果
全９０サンプルの細菌菌叢解析から、頭皮上の主要細菌種はプロピオニバクテリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａ，５３％）、スタフィロコッカス科（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ，３２％）、コリネバクテリウム科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，８％）の３菌種であることが明らかとなった。
健常な頭皮（フケスコア＝０，４８サンプル）及びフケを有する頭皮（フケスコア１〜４，４２サンプル）の頭皮菌叢を比較した結果を図２に示す。図２よりスタフィロコッカス科が健常な頭皮では１４．８％であるのに対し、フケ症を有する頭皮では４９．４％であることが判明した（図２）。
本実験で解析対象としている１６Ｓ  ｒＲＮＡのＶ１−Ｖ３領域はスタフィロコッカス科を種レベルで分類することが可能であることが報告されている＜Conlan, S., H.H. Kong, and J.A. Segre, Species-level analysis of DNA sequence data from the NIH Human Microbiome Project. PLoS One, 2012. 7(10): p. e47075.＞。そこで、スタフィロコッカス科として同定された遺伝子配列を抽出し、検出頻度が高かった上位３遺伝子（ＯＴＵ５９，ＯＴＵ２３７５，ＯＴＵ２５０９）の菌種同定を行った。ブドウ球菌の同定に用いた遺伝子情報はＧｅｎｂａｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）より取得した。
【００３７】
各遺伝子のＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒは以下の通りである。
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＴＣＣ１２２２８，  ＡＥ０１５９２９１；
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｄｅｒｉｍｉｄｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＲＰ６２Ａ，  ＮＣ＿００２９７６；
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００  ｓｔｒａｉｎ  ＦＰＲ３７５７，  ＮＣ＿００７７９３； 
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＵＳＡ３００  ｓｔｒａｉｎ  ＴＣＨ１５１６，  ＮＣ＿０１００７９；
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  ＡＴＣＣ  ２７８４０Ｔ，  ＦＮ５５４７１３；
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃａｐｉｔｉｓ  ｓｔｒａｉｎ  Ｊ８５，  ＦＮ５５４７１３
【００３８】
これらの菌種とＯＴＵ５９、ＯＴＵ２３７５、ＯＴＵ２５０９の系統樹を図３に示す。  図３よりＯＴＵ５９はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ，  ＯＴＵ２３７５はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，  ＯＴＵ２５０９はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓであることが確認された（図３）。さらに、スタフィロコッカス科の存在比率とＯＴＵ５９、ＯＴＵ２３７５、ＯＴＵ２５０９の存在比率の相関を比較したところ、スタフィロコッカス科とＯＴＵ５９は高い相関を示すことが確認され、今回検出されているスタフィロコッカス科の多くはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓであることが明らかとなった（図４）。
以上の解析から、健常な頭皮と比較して、フケ症を有する頭皮はスタフィロコッカス科またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓ存在比率が有意に高いことが見いだされた（図５）
【００３９】
実施例２  培養法による菌株同定
実際に頭皮に存在する主要菌種がＳ．ｃａｐｉｔｉｓであるかどうかを確認する目的で、無作為に選抜した６サンプルより皮膚常在菌の単離を試みた。具体的には、生理食塩水を用いてスワブを懸濁した培養液を標準寒天培地に塗布し、３７℃で好気培養した。培養２日目に生育したコロニーを１サンプルにつき１６コロニーづつ単離し、２０％グリセロールを用いて凍結保存した。
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列解析により単離した菌株の同定を行った結果、単離した計９６菌株はすべてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓであることが判明した。以上の結果から、次世代シーケンサーで得られた情報と同様に頭皮にはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓが主要細菌として存在していることが明らかとなった。
【００４０】
実施例３  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓの溶血性及びリパーゼ生産性評価
単離したＳ．ｃａｐｉｔｉｓの病原性を検証する目的で、溶血性及びリパーゼ生産性を以下の手順で行った。まず、凍結保存された単離菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓを卵黄マンニット食塩寒天培地（ニッスイ）に塗布し、３７℃で１日間好機培養を行った。各評価のための培養は、寒天培地から集菌した菌体をＬＢ培地または５０ｍＭのＴｒｉｏｌｅｉｎを添加したＬＢ培地に培養液濁度がＯＤ６００＝０．０２となるように植菌することで開始した。３７℃、１８０ｒｐｍ、好気条件下で培養を行い、各時間における培養液濁度、培養液の溶血性、培地中に存在するリパーゼ生産性を評価した。培養液の溶血性は以下の手順にて行った。まず、菌体培養液２５０μＬに５０μＬの緬羊無菌脱繊維血液（コージンバイオ株式会社）を添加し、３７℃で１５分インキュベーションを行った。７５０  ｒｐｍで１５分間遠心した後、上清の吸光度５７６ｎｍを測定することで、赤血球より遊離したヘモグロビン量を測定した。陽性対照として２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液、陰性対照として生理食塩水を用い、陽性対照の数値から陰性対照の数値をひいた値を１００％とする溶血率で結果は表記した。また、リパーゼ生産性に関しては、培養液中に遊離した脂肪酸量をＦｒｅｅ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  Ｈａｌｆ−Ｍｉｃｒｏ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ（ロシュ）にて測定することで確認した。結果を図６に示す。
図６より、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓは、Ｔｒｉｏｌｅｉｎ存在下において、溶血性を示し、またリパーゼを産生することが確認された。
【００４１】
フケ症の原因は、髪の洗い方や回数、不規則な生活習慣、外界からの刺激物等の影響も原因といわれているが、大きな原因として皮膚常在菌の産生するリパーゼにより皮脂が遊離脂肪酸へと分解され起炎性を示すことが考えられている（DeAngelis Ym Fau et al., Isolation and expression of a Malassezia globosa lipase gene, LIP1. Journal of Investigative Dermatology 127:2138-2146.）。
したがって、上記の結果から、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｉｔｉｓはフケ症の原因となるリパーゼを産生し、フケ症を生じる原因となっている可能性が示唆された。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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