(57)【要約】【課題】  気体または液体試料中に含まれるアセトン、ノネナール等を高感度、高選択、優れた応答性で検出すること。【解決手段】  本発明のバイオセンサは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量の減少を検出することで試料中の化学物質を検出するバイオセンサシステムであって、光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ；前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜；並びに、前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが励起されて発生した蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器を含むことを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量の減少を検出することで試料中の化学物質を検出するバイオセンサシステムであって、
該バイオセンサシステムが、
光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ；
前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜；並びに
前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが励起されて発生した蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器
を含むことを特徴とする、バイオセンサシステム。
【請求項２】
膜に固定された酵素が、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いてケトンまたはアルデヒドを還元する酵素である、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項３】
膜に固定された酵素が、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いてアセトンまたはノネナールを還元する酵素である、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項４】
膜に固定された酵素が、二級アルコール脱水素酵素（Ｓ−ＡＤＨ）又はエノン還元酵素（ＥＲ１）である、請求項１に記載のバイオセンサシステム。
【請求項５】
検出される化学物質がアセトンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
【請求項６】
検出される化学物質がノネナールである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
【請求項７】
試料が液体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
【請求項８】
前記酵素が固定化された膜が、前記光ファイバプローブの先端に装着されていることを特徴とする、請求項７記載のバイオセンサシステム。
【請求項９】
試料が気体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオセンサシステム。
【請求項１０】
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む緩衝液を循環させるためのフローセルをさらに含み、該フローセルは前記酵素が固定化された膜を含み、気体試料と該緩衝液とが前記酵素が固定化された膜を介して隔てられていることを特徴とする、請求項９記載のバイオセンサシステム。
【請求項１１】
試料中の化学物質を検出する方法であって、
対象の試料を準備する工程、
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜と試料とをＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下で接触させる工程、
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量を測定する工程、ならびに
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量の減少に基づき試料中の化学物質を検出する工程、
を含む方法。
【請求項１２】
ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を調整することにより、試料中の化学物質の検出濃度範囲を調整する工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
尿を検体とした糖尿病性ケトアシドーシスの非侵襲的な診断を補助するためのシステムであって、
該システムが、請求項７または８に記載のバイオセンサシステムを含み、
尿中のアセトンの計測を行うことにより、診断を補助することを特徴とする、システム。
【請求項１４】
呼気計測によりヒトの脂質代謝を評価するためのシステムであって、
該システムが、請求項９または１０に記載のバイオセンサシステムを含み、
呼気中のアセトンの計測を行うことにより、脂質代謝を評価することを特徴とする、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサシステムに関する。詳細には、アセトンなどのケトン類またはノネナールなどのアルデヒド類を検出するバイオセンサシステムに関する。さらに詳細には、補酵素として利用されるＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの減少を検出して、アセトンなどのケトン類またはノネナールなどのアルデヒド類を検出するバイオセンサシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病診断や代謝能の評価では血液検査法が一般的であるが、採血では精神的・身体的な負担のみならず、連続的な測定が困難などの課題がある。近年、呼気中に含まれる揮発性有機成分を分析・測定することで代謝機能を調べたり、疾病を簡易検査する方法が研究されている（非特許文献１）。
【０００３】
呼気には肺でのガス交換に基づき、血液中の揮発性物質が含まれており、これらの成分を非侵襲かつ連続的に計測可能である。例えば、呼気中にはアセトンガスが含まれており、糖尿病患者においては健常者より高濃度で含まれることや、空腹時、運動後において濃度が増加することが知られている（非特許文献２）。
【０００４】
空腹時には体内の糖質のエネルギー源が不足しており、さらに運動負荷により脂肪組織から血液中に放出された遊離脂肪酸のβ酸化によりアセチルＣｏＡが産生し、肝細胞に取り込まれ、ケトン体であるアセトンやアセト酢酸、β−ヒドロキシ酪酸が生成されエネルギーとして利用される。アセトンは血液を介して呼気や尿として体外へ排泄され、生成されるケトン体の濃度を測定することで、運動時のケトーシス状態や脂質代謝などを評価することができる。また糖尿病においてはインスリンが不足することで、空腹状態と同じ代謝状態となり易く、エネルギー源として脂肪酸が優先的に使用される。そのため脂質代謝の指標として呼気中アセトン濃度を測定することにより、糖尿病の進行度合、脂肪燃焼状況の評価が可能であると報告されている（非特許文献３）。しかしながら、ガスクロマトグラフなど既存の装置では試料の前処理が必要で、簡便性や連続計測に適していないなどの課題があり、選択性に優れた高感度なアセトンガス用センサが求められている。
【０００５】
また、近年、先進国では、加齢臭によるスメルハラスメントや、自身のニオイを過剰に意識してしまう自臭症などの問題から、生体臭に関する関心が年々高まっている。その一方で、臭いには快・不快といった感覚を与えるだけでなく、体調管理の面で重要な役割を担う可能性のある成分が含まれている。
【０００６】
加齢臭を含む生体由来の臭気成分は、疾患や体調機能と密接に結びついており、体調に異常がある場合や、疾患の疑いがある場合、体からは健常時と異なる臭気がするため、体調や疾患の重要な診断基準となり得る。
【０００７】
ノネナールは、４０歳を過ぎると発生する臭気として知られる「加齢臭」の原因物質として近年注目されている。ノネナールは青臭さと油臭の混ざり合った強い臭気成分であり、アルデヒド基とその隣にα，β−不飽和結合を持つ不飽和アルデヒド類に分類される。
【０００８】
ノネナールは加齢に伴う代謝機能の低下が原因となり発生する。加齢に伴い細胞の老化が進むと、体内で活性酸素が発生し、体内の脂質を連鎖的に酸化分解することで過酸化脂質が生成される。この過酸化脂質が、脂肪酸の一種である９−ヘキサデセン酸を分解することでノネナールが生成される。この９−ヘキサデセン酸は、若年者では代謝によって分解され、体外に排出されるため、ノネナールが生成することはほとんどない。しかし、加齢に伴い基礎代謝が低下することにより分解されなくなり、体内に蓄積され、皮脂腺から排出されるようになる。したがって、ノネナール発生の原因である過酸化脂質と９−ヘキサデセン酸は若年時にはほぼ見られないことから、ノネナールの存在は人体における基礎代謝機能低下の指標となり得る。すなわち、人体から発生するノネナールガスを定量することで、加齢に伴う代謝機能の変化を評価することが可能になると考えられる（非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−１６８６７１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Manolis, A., 1983. The Diagnostic Potential of Breath Analysis. Clin Chem 29(1), 5-15.
【非特許文献２】Schubert, R., Schwoebel, H., Mau-Moeller, A., Behrens, M., Fuchs, P., Sklorz, M., Schubert, J.K., Bruhn, S., Miekisch, W., 2012. Metabolic monitoring and assessment of anaerobic threshold by means of breath biomarkers. Metabolomics 8(6), 1069-1080.
【非特許文献３】Toyooka, T., Hiyama, S., Yamada, Y., 2013. A prototype portable breath acetone analyzer for monitoring fat loss. J Breath Res 7(3), 036005.
【非特許文献４】Haze, S., Gozu, Y., Nakamura, S., Kohno, Y., Sawano, K., Ohta, H., Yamazaki, K., 2001. 2-Nonenal newly found in human body odor tends to increase with aging. The Journal of investigative dermatology 116(4), 520-524.
【非特許文献５】Arakawa, T., Miyajima, K., Takahashi, D., Kudo H., and Mitsubayashi, K., 2009. A NADH fiber-optic biosensor for ethanol detection with a UV-LED excitation system. Annual Reports of the Institute of Biomaterials and Bioengineering 43, 37-40.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ケトン類（アセトン等）溶液検出のためのバイオセンサを提供する。また、本発明は、ケトン類ガス濃度を簡便に計測することを可能とするバイオセンサを提供する。さらに、本発明は、液相系および気相系におけるアルデヒド類（ノネナール等）の測定に利用可能なバイオセンサを提供する。また、本発明は、呼気計測により哺乳動物の代謝を評価するためのシステム、尿を検体とした糖尿病性ケトアシドーシスの非侵襲的な診断を補助するためのシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、一つの態様において、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量の減少を検出することで試料中の化学物質を検出するバイオセンサシステムを提供する。
【００１３】
一つの態様において、本発明のバイオセンサは、（ａ）光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ；（ｂ）前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；（ｃ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜；並びに（ｄ）前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが励起されて発生した蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器を含む。
【００１４】
バイオセンサの一つの態様においては、膜に固定された酵素が、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いてケトンまたはアルデヒドを還元する酵素である。本発明の一つの態様における上記酵素は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いてアセトンまたはノネナールを還元する酵素である。より具体的には、上記酵素として、二級アルコール脱水素酵素（Ｓ−ＡＤＨ）又はエノン還元酵素（ＥＲ１）が利用されうる。
【００１５】
一つの態様において、検出される化学物質はアセトンである。また、別の態様において、検出される化学物質はノネナールである。
【００１６】
一つの態様において、試料は液体である。この場合、上記の酵素が固定化された膜は、上記の光ファイバプローブの先端に装着されていてもよい。また、別の態様においては、試料は気体である。この場合、本発明のバイオセンサシステムには、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む緩衝液を循環させるためのフローセルがさらに含まれていてもよく、このフローセルに上記の酵素が固定化された膜が組み込まれており、気体試料と緩衝液とが前記膜を介して隔てられていてもよい。
【００１７】
また、本発明は、一つの態様において、試料中の化学物質を検出する方法を提供する。
【００１８】
一つの態様において、本発明の方法は、（ａ）対象の試料を準備する工程；（ｂ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜と試料とをＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下で接触させる工程；（ｃ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量を測定する工程；ならびに（ｄ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量の減少に基づき試料中の化学物質を検出する工程を含む。また、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を調整することにより、試料中の化学物質の検出濃度範囲を調整する工程をさらに含めてもよい。
【００１９】
本発明の方法の一つの態様においては、膜に固定された酵素が、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いてケトンまたはアルデヒドを還元する酵素である。一つの態様において、上記酵素は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いてアセトンまたはノネナールを還元する酵素である。より具体的には、上記酵素として、二級アルコール脱水素酵素（Ｓ−ＡＤＨ）又はエノン還元酵素（ＥＲ１）が利用されうる。
【００２０】
一つの態様において、検出される化学物質はアセトンである。また、別の態様において、検出される化学物質はノネナールである。
【００２１】
一つの態様において、試料は液体である。この場合、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む緩衝液に試料を直接加えて、試料と酵素が固定化された膜とを接触させてもよい。また、別の態様においては、試料は気体である。この場合、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む緩衝液と気体試料とが上記の酵素が固定化された膜を介して隔てられていてもよい。
【００２２】
また、本発明は、一つの態様において、呼気計測により哺乳動物の代謝を評価するためのシステムを提供する。
【００２３】
一つの態様において、本発明の代謝評価システムは、（ａ）光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ；（ｂ）前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；（ｃ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜；並びに（ｄ）前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが励起されて発生した蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器を含む、バイオセンサを含む。この代謝評価システムには、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む緩衝液を循環させるためのフローセルがさらに含まれていてもよく、このフローセルに上記の酵素が固定化された膜が組み込まれており、気体試料と緩衝液とが前記膜を介して隔てられていてもよい。
【００２４】
一つの態様において、本発明の代謝評価システムは、ヒトの代謝を評価する。一つの態様において、本発明の代謝評価システムは、脂質代謝を評価する。一つの態様において、本発明の代謝評価システムは、呼気中のアセトンの計測を行うことにより、代謝を評価する。
【００２５】
また、本発明は、一つの態様において、尿を検体とした糖尿病性ケトアシドーシスの非侵襲的な診断を補助するためのシステムを提供する。
【００２６】
一つの態様において、本発明の診断補助システムは、（ａ）光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ；（ｂ）前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；（ｃ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜；並びに（ｄ）前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが励起されて発生した蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器を含む、バイオセンサを含む。この診断補助システムにおいては、上記の酵素が固定化された膜が、上記の光ファイバプローブの先端に装着されていてもよい。
【００２７】
一つの態様において、本発明の診断用システムは、尿中のアセトンの計測を行うことにより、診断を補助する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】気体試料の測定に用いられる本発明のバイオセンサシステムの一態様を模式的に示す図面である。
【図２】液体試料の測定に用いられる本発明のバイオセンサシステムの一態様を模式的に示す図面である。
【図３】本発明のバイオセンサシステムの一態様において用いられる、酵素固定化膜及び光ファイバプローブの製造方法を概略的に示す図である。
【図４】本発明のバイオセンサシステムの一態様であるガスセンサの概要を示す図である。
【図５】Ｓ−ＡＤＨ固定化バイオセンサに各濃度のアセトンガスを負荷した際のＮＡＤＨの蛍光出力の減少（減少の差分）と濃度に応じた安定値を示す図である。
【図６】アセトンガスに対する定量特性（検量線）を示す図である。
【図７】アセトンバイオスニファの定量範囲に対するＮＡＤＨ濃度の影響を示す図である。
【図８】ガスセンサに各種ガスを負荷した際の蛍光出力を比較した図である。
【図９】サンプリングバッグを用いた呼気計測システムの概要を示す図である。
【図１０】３人の被験者における空腹時の運動負荷に伴う呼気中アセトンガス濃度の経時変化を調べた結果を示す図である。
【図１１】ＵＶ−ＬＥＤを励起光源としたＮＡＤＨ蛍光検出系の概要を示す図である。
【図１２】ＮＡＤＰＨの蛍光出力に対する定量特性を示す図である。
【図１３】ノネナール溶液用ＥＲ１センサの応答出力（右）とノネナール溶液に対する濃度依存特性（左）を示す図である。
【図１４】ＥＲ１センサにおける基質特異性を示す図である。
【図１５】ノネナールガス計測用ＥＲ１センサの応答出力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下に、本発明を詳細に説明する。本発明者らは、以前に、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量の増加を検出することで試料中の化学物質を検出するバイオセンサシステムを報告しているが（Arakawa et al., 2009. Annual Reports of the Institute of Biomaterials and Bioengineering 43, 37-40.）、バイオセンサシステムにおいては一般に、蛍光の増加の測定に比べて、蛍光の減少は測定が難しいと予想されていた。しかし、予想外なことに、本発明に係るバイオセンサシステムにおいては、蛍光の減少をもとに試料中の化学物質を高感度に検出しうることが見いだされた。また、予想外なことに、従来のバイオセンサで用いられていた蛍光の増加の測定に比べて、減少の測定では大幅に短縮された応答時間を得ることができ、対象試料のリアルタイムでの分析が可能である。さらに、増加を検出する系に比べて、使用するＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を大幅に減らすことができ、また、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を調整することで、対象試料濃度の測定範囲を選択しうることが見いだされた。
【００３０】
本発明のバイオセンサシステムの一態様は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが発する蛍光量の減少を検出することで試料中の化学物質を検出するバイオセンサシステムであって、（ａ）光入射用の光ファイバ及び受光用の光ファイバを含む光ファイバプローブ；（ｂ）前記光入射用の光ファイバに所定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード；（ｃ）ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いる酵素が固定化された膜；並びに（ｄ）前記紫外線発光ダイオードからの入射光によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが励起されて発生した蛍光を前記受光用の光ファイバを通して検出する検出器を含むことを特徴とする。なお、本明細書において「検出」という場合、この用語には「測定」あるいは「計測」が含意されている。
【００３１】
本発明の一つの実施態様であるバイオセンサシステムは、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰＨ（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を補酵素（電子供与体）とする酵素の基質を検出するためのシステムを含む。本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられうる酵素としては、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素（電子供与体）とするものであれば、特に制限はないが、例えば、アラニン脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、イソクエン酸脱水素酵素、ウリジン−５’−ジホスフォ−グルコース脱水素酵素、ガラクトース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、グリセロール脱水素酵素、グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、コレステロール脱水素酵素、サルコシン脱水素酵素、ソルビトール脱水素酵素、炭酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、フルクトース脱水素酵素、６−ホスフォグルコン酸脱水素酵素、ホルムアルデヒド脱水素酵素、マンニトール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ロイシン脱水素酵素等を挙げることができ、特に、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを電子供与体として用いてケトン（アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノンなど）またはアルデヒド（ノネナール、エチルビニルケトンなど）を還元する酵素、より具体的には、二級アルコール脱水素酵素（Ｓ−ＡＤＨ）（二級アルコール脱水素酵素  (secondary alcohol dehydrogenase) EC:1.1.1.x）、エノン還元酵素（ＥＲ１）（エノン還元酵素  (enone reductase type 1, ER1)）等が利用できる。脱水素酵素の逆反応を用いてケトン等の化学物質を高感度に検出できるという本発明者らによる発見は、予想外なことであった。ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素が関与する酵素反応は様々な分野における測定方法として有用であり、さらにＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素（電子供与体）とする反応を利用することで、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素（電子受容体）とする反応に比べて、試薬のコストを低減できるという利点もある。なお、使用する酵素は天然由来のものでも、人工のものであっても良い。酵素が由来する生物種は特に限定されない。使用する酵素は、アミノ酸配列の改変あるいは修飾を含んでいても良い。
【００３２】
本発明のバイオシステムを用いて検出することの可能な基質は、上記酵素の基質となる化合物である。例えば、酵素として二級アルコール脱水素酵素（Ｓ−ＡＤＨ）を用いる場合、アセトン、２−ブタノン、２−ペンタノンなどを検出、定量することができる。また、酵素としてエノン還元酵素（ＥＲ１）を用いる場合、ノネナール、エチルビニルケトンなどを検出、定量することができる。
【００３３】
酵素、基質と、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨとの反応により、基質濃度に依存してＮＡＤ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）又はＮＡＤＰ＋（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）が生成する。本発明の実施に係るバイオセンサシステムにおいては、そのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度減少を測定することにより基質の濃度を測定する。本発明の一態様においては、紫外線発光ダイオード（ＵＶ−ＬＥＤ）から入射した紫外線による励起から生じる蛍光を検出し、その減少を測定することにより、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度低下を測定する。
【００３４】
次に、本発明のバイオセンサシステムの実施態様について図面を参照しつつ説明する。
【００３５】
Ａ．ガス用バイオセンサ（バイオスニファ）システム
図１は、本発明のガス用バイオセンサ（バイオスニファ）システムの一態様を模式的に示す図面である。このガス用バイオセンサシステムは、光入射用の光ファイバ１１１と、受光用の光ファイバ１１２とを接続してなる光ファイバプローブ１１３を有する。このようなプローブ１１３としては、市販されているものを用いてもよく、例えば、Ocean Optics Inc.（米国）から市販されている2 in 1 Optical fiber assembly（ＢＩＦ６００−ＵＶ／ＶＩＳ）とＦ１００−９００９（Ocean Optics Inc.社製）とを組み合わせたもの等を用いることができる。
【００３６】
光入射用の光ファイバ１１１には、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード１１４が接続されている。また、図１に示すバイオセンサシステムにおいては、紫外線発光ダイオード１１４と光ファイバプローブ１１３との間には帯域フィルター（バンドパスフィルター）１１６が接続されている。本発明のバイオセンサシステムにおいては、光源として紫外線発光ダイオード１１４を用いることができ、光源として水銀ランプを用いた場合よりも、装置を簡素化して安価に製造することができる。また、携帯用としても用いることが可能となる。
【００３７】
ＮＡＤＨを補酵素（電子供与体）とする酵素の場合について説明すると、ＮＡＤＨは３４０ｎｍの紫外線を吸収するが、ＮＡＤ＋は３４０ｎｍの紫外線を吸収しないという性質を利用するものであり、従って、紫外線発光ダイオードとしては、３００〜３７０ｎｍ、好ましくは３４０ｎｍ付近の波長の紫外線を励起するものが用いられる。従って、図１に示すように、紫外線発光ダイオード１１４と光ファイバプローブ１１３との間には帯域フィルター１１６を接続することが好ましい。帯域フィルターとは、光源からの光のうち、特定の波長のものだけを透過するフィルターのことを意味し、本発明の一態様においては、例えば、入射光として３３０〜３５０ｎｍの紫外線を通過させるものが用いられる。このような帯域フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。ＮＡＤＰＨとＮＡＤＰ＋についても同様である。
【００３８】
図１に示すバイオセンサシステムにおいては、受光用の光ファイバ１１２には、紫外線発光ダイオード１１４から入射した入射光により励起されて発生した蛍光を検出する検出器１２０が接続されている。検出器１２０は、具体的には、光電子増倍管、フォトダイオード検出器などを含む分光光度計が用いられる。励起により生じる蛍光は、ＮＡＤＨの場合、４５０〜５１０ｎｍ、より具体的には４９１ｎｍ付近であり、従って、図１に示すように、特定の波長よりも大きい波長の蛍光のみを透過させる長波長透過フィルター（ロングパスフィルター）１１８を配置することが好ましい。図１においては、４００ｎｍ以上の波長の蛍光を透過させる長波長透過フィルター（ロングパスフィルター）が用いられている。このような長波長透過フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。また、図１のバイオセンサシステムにおいては、長波長透過フィルター１１８を用いているが、長波長透過フィルター（ロングパスフィルター）に代えて、帯域フィルターを用いてもよい。この場合、例えば、４５０〜５１０ｎｍの波長の蛍光のみを透過させる帯域フィルターを用いる。
【００３９】
図１に示すバイオセンサシステムにおいては、検出器１２０で受信したデータを解析するためのコンピュータシステムがさらに接続されていてもよく、そのようなコンピュータシステムを接続させることにより、データの解析が容易となる。
【００４０】
次に、図１に示すバイオセンサシステムにおいて用いられる光ファイバプローブ１１３について説明する。この光ファイバプローブ１１３は、その先端に、酵素固定化膜１４４を装着した気液隔膜フローセル１４０が取り付けられている。このフローセル１４０は、図１に示すように、シリコンチューブ１４１とＰＭＭＡパイプ１４２を含んでいてもよく、その液相部には、緩衝液流路１５１を通してＮＡＤＨを含む緩衝液が循環するように構成されている。酵素固定化膜１４４は、図１に示されるように、Ｏ−リング１４３によってＰＭＭＡパイプ１４２に固定されていてもよい。図１に示されるように、気体試料と緩衝液とは、酵素固定化膜１４４を介して隔てられる。
【００４１】
次に、酵素を固定化してなる膜について説明する。本明細書において、酵素固定化膜と記載する場合は、酵素を固定化してなる膜を意味する。酵素固定化膜は、膜材料である担体上に酵素が固定化されたものである。用いられる担体としては、従来より酵素を固定化するために用いられている材料のものを特に制限なく用いることができる。このような材料としては、例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリジメチルシロキサン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン等が挙げられる。このような担体の厚みは、特に限定されないが、好ましくは１００ｎｍ〜２００μｍであり、更に好ましくは１０μｍ〜１００μｍである。本発明のバイオセンサシステムにおいて使用可能な酵素固定化膜の作製法は、例えば、特開２００９−１６８６７１号公報に記載されており、その内容は参照によって本明細書にも取り込まれる。
【００４２】
本発明のバイオセンサシステムは、その一態様において、紫外線発光ダイオードから入射した励起光によりＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが励起されて発生した蛍光によってＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの濃度を定量し、その濃度減少を指標としてＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の基質を検出するものである。したがって、気体試料中の基質と酵素固定化膜中の酵素とが、補酵素の存在下に反応する必要がある。図１に示されるバイオセンサシステムでは、気体流路１５２を通して流れる試料気体と、緩衝液流路１５１を通して流れるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む緩衝液との間に、酵素固定膜１４４を介在させる構成とすることにより、補酵素であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの存在下で酵素と基質とが反応できるようになっている。したがって、酵素固定化膜を構成する担体は多孔性であることが好ましい。担体の孔のサイズには、酵素反応を可能とする限り特に制限はないが、通常は、直径が０．１〜１μｍ程度であり、好ましくは０．２μｍ程度でよい。また、担体の空隙率は６０〜９０％であることが好ましい。
【００４３】
本発明のガス用バイオセンサ（バイオスニファ）システムの一態様においては、図１に示されるように、気体試料の調製、制御のためのコンプレッサー１３１、活性炭フィルター１３２、気体発生装置１３３、マスフローコントローラ１３４が含まれていてもよい。測定対象の気体試料は、気体流路１５２を通って流れ、気液隔膜フローセルに含まれる酵素固定膜と接触させられる。この際、試料に含まれる酵素基質が酵素によって還元されると、緩衝液中に含まれるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが酸化されて消費され、蛍光の減少が生じることにより、酵素基質となる化学物質の量を測定することができる。
【００４４】
前記酵素固定化膜は、酵素が担体に固定化されてなるものであるが、酵素を、例えばポリマーと混合して担体上に塗布し乾燥して製造される。このようなポリマーとしては、従来より酵素固定化膜を製造するために用いられているものを特に制限なく用いることができ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール又はポリビニルアルコールにＳｂＱの光官能基を組み合わせたＰＶＡ−ＳｂＱ、ＳＰＰ−Ｈ１３、ホスホリルコリン基を含むポリマー等が挙げられる。
上記の中でも、ホスホリルコリン基を含むポリマーである、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と他のモノマーとの共重合体を用いた場合、酵素を固定化した後の脱塩処理をする必要がないので好ましい。
また、酵素を担体に固定化する方法としては、他に、グルタルアルデヒドの架橋による方法を用いてもよいが、本発明においては、方法は特に限定されない。
【００４５】
このような共重合体を製造するために用いられるモノマーとしては、例えば、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、アミル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、オクチル（メタ）アクリレート、ノニル（メタ）アクリレート、デシル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、ヘキサデシル（メタ）アクリレート、オクタデシル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレート、エチレングリコールメチルエーテル（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレート、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル（メタ）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、酢酸ビニル、γ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、γ−メタクリルオキシプロピルトリエトキシシラン、ビニルトリス（２−メトキシエトキシ）シラン、メチルトリビニルメチルジエトキシシラン等が挙げられる。このような共重合体は、ＭＰＣと上記モノマーとのラジカル共重合によって得ることができる。
【００４６】
上記共重合体としては、例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）と２−エチルヘキシルメタクリレート（ＥＨＭＡ）との共重合体が挙げられる。この共重合体は、下記一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーである。
【００４７】
【化１】
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【００４８】
一般式（１）において、ａ、ｂは繰り返し単位の比率を表し、ａは０．１〜０．９であり、好ましくは０．１〜０．４である。また、ｂは０．１〜０．９であり、好ましくは０．６〜０．９である。
【００４９】
一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーを得るには、公知の方法により反応させて行う。使用する溶媒としては、モノマーを溶解することのできるものであれば制限なく用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、クロロホルム、及びこれらの混合物などが挙げられる。
【００５０】
また、重合開始剤としては、通常に用いられるラジカル開始剤を特に制限なく用いることができ、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスバレロニトリル等の脂肪族アゾ化合物や、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウロイル、加硫酸アンモニウム、加硫酸カリウム等の有機過酸化物等が挙げられる。
【００５１】
一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーの分子量は、通常、５，０００〜３，０００，０００程度である。なお、一般式（１）で表わされる繰り返し単位を有するポリマーとしては、市販されているものを用いてもよく、例えば、日本油脂（株）製、Lipidure（登録商標）シリーズ等が使用可能である。
【００５２】
次に、上記酵素固定化膜の製造方法について図面を参照しつつ説明する。図３は、本発明のバイオセンサシステムにおいて用いられる、酵素固定化膜及び光ファイバプローブの製造方法を概略的に示す図である。
まず、担体３１に、ポリマー及び酵素の混合溶液３２を塗布する。ポリマーとしては上述したものが用いられ、酵素も上述したものが用いられる。ポリマー及び酵素を溶解して混合溶液とするための溶媒としては、例えば、エタノール等が挙げられる。混合溶液中の酵素及びポリマーの濃度に特に制限はないが、通常は、酵素を、担体１ｃｍ２あたり５０ユニット程度、ポリマーを、担体１ｃｍ２あたり１μＬ（濃度：１０重量％）程度用いることが好ましい。次いで、担体上に塗布した混合溶液３２を乾燥して酵素を担体３１に固定化し、酵素固定化膜３３を得る。乾燥は、通常、０〜８℃程度の温度で０．５〜６時間行なう。
【００５３】
Ｂ．液体試料用バイオセンサシステム
図２は、本発明の一態様である液体試料用バイオセンサシステム１０を模式的に示す図面である。本発明のバイオセンサシステムは、一つの態様として、光入射用の光ファイバ１１と、受光用の光ファイバ１１’とを接続してなる光ファイバプローブ１２を有する。このようなプローブ１２としては、上記のように、市販されているものを用いてもよい。
【００５４】
光入射用の光ファイバ１１には、特定の波長の紫外線を入射する紫外線発光ダイオード１４が接続されている。また、図２に示すバイオセンサシステムにおいては、紫外線発光ダイオード１４と光ファイバプローブ１２との間には帯域フィルター（バンドパスフィルター）１６が接続されている。本発明のバイオセンサシステムにおいては、光源として紫外線発光ダイオード１４を用いることができ、光源として水銀ランプを用いた場合よりも、装置を簡素化することができ、また、安価で製造できる。さらに、携帯用としても用いることが可能となる。
【００５５】
上述のとおり、ＮＡＤＨは３４０ｎｍの紫外線を吸収するが、ＮＡＤ＋は３４０ｎｍの紫外線を吸収しない。ＮＡＤＰＨとＮＡＤＰ＋についても同様である。したがって、図２に示すように、紫外線発光ダイオード１４と光ファイバプローブ１２との間には帯域フィルター１６を接続することが好ましい。本発明においては、例えば、３３０〜３５０ｎｍの紫外線を通過させるものを用いることができる。このような帯域フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。
【００５６】
図２に示すバイオセンサシステムにおいては、受光用の光ファイバ１１’には、紫外線発光ダイオード１４から入射した入射光により励起されて発生した蛍光を検出する検出器２０が接続されている。検出器２０は、具体的には、光電子増倍管、フォトダイオード検出器などを含む分光光度計が用いられる。励起された蛍光は、ＮＡＤＨの場合、４５０〜５１０ｎｍ、より具体的には４９１ｎｍ付近であり、従って、図２に示すように、特定の波長よりも大きい波長の蛍光のみを透過させる長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）１８を配置することが好ましい。図２においては、４００ｎｍ以上の波長の蛍光を透過させる長波長透過フィルターが用いられている。このような長波長透過フィルターとしては市販のものを特に制限なく用いることができる。
また、図２のバイオセンサシステムにおいては、長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）１８を用いているが、長波長透過フィルター（ハイパスフィルター）に変え、帯域フィルターを用いてもよい。この場合、例えば、４５０〜５１０ｎｍの波長の蛍光のみを透過させる帯域フィルターを用いる。
【００５７】
図２に示すバイオセンサシステムにおいては、検出器２０で受信したデータを解析するためのコンピュータシステム２２が接続されている。このようなコンピュータシステム２２を接続させることにより、データの解析が容易となる。
【００５８】
次に、図２に示すバイオセンサシステムにおいて用いられる光ファイバプローブ１２について説明する。光ファイバプローブ１２は、その先端に、酵素を固定化してなる膜が密着されている。
【００５９】
光ファイバプローブの先端への酵素固定化膜の密着について説明すると、図３を参照して明らかなように、光ファイバプローブ１４の先端に、酵素固定化膜３３を密着させる際、例えば、シリコンチューブリング３５により、酵素固定化膜３３を光ファイバプローブ１４の先端に固定してもよい。
【００６０】
次に、本発明の液体試料用バイオセンサシステムを用いて、酵素の基質となる化合物を検出する方法の例について、図２を参照しつつ説明する。
図２に示されるバイオセンサシステム１０を用いて、酵素の基質となる化合物を検出するには、光ファイバプローブ１２を試料溶液に浸す。この試料溶液には、酵素の補酵素となるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨが含まれている。
【００６１】
光ファイバプローブ１２の先端には、上述した酵素固定化膜（酵素を固定化してなる膜）が密着しており、試料溶液中の基質が、補酵素であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨと共に、酵素固定化膜中に浸入し、酵素固定化膜に固定化されている酵素と基質とが反応し、補酵素であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨは、それぞれＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋に変化する。そのために消費されたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量を蛍光の減少を測定することにより検出する。補酵素としてＮＡＤＨを用いる酵素の場合について説明すると、紫外線発光ダイオード１４から照射される、中心波長３３５ｎｍの紫外線を、帯域フィルター１６を通過させ、波長３３０〜３５０ｎｍの紫外線のみを通過させ、励起した蛍光を長波長透過フィルター１８を通過させ、４００ｎｍ以上の波長の蛍光のみを通過させたのち、検出器２０により、波長４９１ｎｍの蛍光強度を測定する。検出器２０により測定したデータは、コンピュータ２２によって解析される。
【００６２】
本発明のバイオセンサシステムによって、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の基質となる化合物を検出（定量）するには、最初にＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの標準液を用いて蛍光強度を測定し、検量線を作成した後に試料の測定を実施し、既知量のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを含む試料について蛍光を測定し、消費されたＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量から、試料中に含まれている酵素の基質となる化合物の量を求めることができる。
【００６３】
本発明のバイオセンサシステムは、光源として紫外線発光ダイオード（ＵＶ−ＬＥＤ）を用いることで、従来用いられている水銀ランプよりも安価に製造することができる。また、紫外線発光ダイオードは水銀ランプよりも重量が小さいため、携帯用として用いることも可能である。本発明のバイオセンサシステムは、例えば、微小化学物質分析システム（μＴＡＳ）に用いることができる。
【００６４】
Ｃ．尿を検体とした糖尿病性ケトアシドーシスの診断等を補助するためのシステム
本発明のバイオセンサを利用することで、尿を検体とした糖尿病性ケトアシドーシスの非侵襲的な診断を補助するためのシステムを構築することが可能である。まず、糖尿病性ケトアシドーシスの疑われる被検者から尿を採取する。尿試料は分析に先だって前処理を行っても、行わなくても良い。試料を図２または図１１に示される系と同様なバイオセンサシステムで分析し、尿中のアセトンを定量する。上記システムは、定量結果を表示する表示装置を含んでいてもよい。また、上記システムは、医療従事者等による診断を補助するために定量結果を分析するコンピュータを含んでいてもよい。健常者の尿中アセトン濃度は２０ｍｇ／ｄｌ以下である。
【００６５】
Ｄ．ヒトの脂質代謝等を評価するためのシステム
本発明のバイオセンサは、妊婦糖尿病を有する又はそれが疑われる被検者、１型糖尿病を有する又はそれが疑われる被検者、太らない体質を有する又はそれが疑われる被検者、等を対象とした測定に利用可能である。特に、本発明のバイオセンサは、ケトアシドーシスの診断に利用可能である。ケトアシドーシスの診断では、アセト酢酸、３−ヒドロキシ酪酸、アセトンが測定対象となりうる。利用可能な酵素としては、３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（3-hydroxybutyrate dehydrogenase）、２−オキソプロピルＣｏＭレダクターゼ（2-oxopropyl-CoM reductase）、アセト酢酸デカルボキシラーゼ（acetoacetate decarboxylase）などが挙げられる。
【００６６】
実施例
以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。
【実施例１】
【００６７】
アセトンガス用の光ファイバ型バイオスニファの構築
Ｓ−ＡＤＨはイソプロパノールなどの二級アルコールを基質とするが、その逆反応によりアセトンを還元すると共に、その際に電子供与体である還元型ＮＡＤＨを酸化して消費する。このＮＡＤＨは自家蛍光（吸収波長：３４０ｎｍ，蛍光波長：４９１ｎｍ）を有することから、その減少を調べることでアセトンを測定できる。本発明者らは、図４に概要を示したように、紫外発光ダイオード（ＵＶ−ＬＥＤ，中心波長：３３５ｎｍ）と光電子増倍管（ＰＭＴ）を含んで成る光ファイバ型のＮＡＤＨ蛍光検出系に、Ｓ−ＡＤＨを固定化した酵素膜を取り付けて、アセトンセンサを構築した。Ｓ−ＡＤＨ酵素膜は、多孔質の親水性ポリテトラフルオロエチレン膜に、生体適合性膜ＰＭＥＨを用いて酵素を包括固定化したものである。
【００６８】
本アセトンセンサの構築に際して使用した試薬等の詳細は以下のとおりである。ＮＡＤＨに依存的な二級アルコール脱水素酵素は、株式会社ダイセルから購入した。ＮＡＤＨ（還元型）はオリエンタル酵母工業株式会社から購入した。酵素固定化担体の親水性ＰＴＦＥ（Ｈ−ＰＴＦＥ；空隙率：８０％；孔径：０．２μｍ；ＪＧＷＰ１４２２５）は、米国ミリポア社から購入した。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）とメタクリル酸２−エチルヘキシル（ＥＨＭＡ）の共重合体（ＰＭＥＨ）は、以前に報告されている方法に従って合成した（Kudo, H., Yagi, T., Chu, M.X., Saito, H., Morimoto, N., Iwasaki, Y., Akiyoshi, K., Mitsubayashi, K., 2008. Glucose sensor using a phospholipid polymer-based enzyme immobilization method. Anal Bioanal Chem 391(4), 1269-1274）。ｐＨ７．０、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ＰＢ）は、０．１Ｍのリン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４、９８．０％、１６４−０４３１５、和光純薬工業株式会社）を０．１Ｍのリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、９８％、１６０−０４２７５、和光純薬工業株式会社）に徐々に加え、所望のｐＨ値とすることにより調製した。溶液はすべて、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水製造装置（米国ミリポア社）により得られた脱イオン蒸留水を用いて調製した。循環バッファーとして働く５０μＭのＮＡＤＨ溶液はＰＢ（ｐＨ７．０、０．１Ｍ）を用いて調製した。標準のアセトン蒸気は、標準的なガスジェネレータ（ＰＤ−１Ｂ−２、株式会社ガステック）を用いて調製した。
【００６９】
本アセトンバイオスニファは、励起用光源、光検出器、およびアセトンからＮＡＤ＋を生産するオプトードを含んで成る。励起系としては、米国Sensor Electronic Technology Inc.製のＵＶ−ＬＥＤ（ＵＶＴＯＰ（登録商標）ＢＬ３３５）にＵＶ−ＬＥＤ電源回路（ＧＳ２００、横河電機株式会社）を組み合わせて用いた。光検出器としてはＰＭＴ（Ｃ９６９２、浜松ホトニクス株式会社）を使用した。これらのコンポーネントを２分岐光ファイバアセンブリ（コア径６００±１０μｍ；ＢＩＦ６００−ＵＶ／ＶＩＳ、米国Ocean Optics Inc.）の分離した各端に接続した。光ファイバプローブ（Ｆ１０００−９００）を光ファイバアセンブリの共通端に接続した。バックグラウンドシグナルを減らすために、２つのバンドパスフィルタ（λ＝３４０±１０ｎｍとλ＝４９０±１０ｎｍ、ＢＰＦ、朝日分光株式会社）を励起と検出において使用した。Ｓ−ＡＤＨ感応性オプトードは、Ｓ−ＡＤＨ固定化膜を有するフローセルを光ファイバプローブの末端に取り付けることにより作製した。フローセルは、シリコンチューブ（Ф２ｍｍ）とＰＭＭＡセル（Ф４ｍｍ）により構成され、光ファイバプローブのためのソケットを形成する筒状の構造を有している。ＮＡＤＨ含有ＰＢを供給するマイクロ流路は、図１に示されているように、シリコンとＰＭＭＡの間の境界に形成されている。検出隔壁としてＳ−ＡＤＨ膜をフローセルの端面に取り付けた。Ｓ−ＡＤＨ（０．５ｕｎｉｔ／ｃｍ２）とＰＭＥＨ溶液（１０％、２５μｌ／ｃｍ２）を混合し、Ｈ−ＰＴＦＥ薄膜フィルタ上に慎重に延展した。４℃の冷蔵庫中で３時間、膜を硬化させた。その後、Ｓ−ＡＤＨ固定化膜を２×２ｃｍに切り出し、シリコンＯ−リングを使用してフローセルに固定した。
【００７０】
アセトンガス用の光ファイバ型バイオスニファの特性評価
蛍光検出用の光ファイバ先端にＳ−ＡＤＨ固定化膜を装着した気液隔膜フローセルを取り付け、気相用バイオセンサとして、アセトンガスを計測した。この系では、標準的なガスジェネレータからアセトン蒸気を供給した。流速は、ニードルバルブ付流量計（タイプ：ＲＫ１２００、コフロック株式会社）を用いて制御した。フローセルの液相部には、ＮＡＤＨを含むリン酸緩衝液（ＰＢ）を循環させた。インテリジェントポンプ（株式会社フロム）を用いてＮＡＤＨを含むＰＢをフローセル内に循環させた。Ｓ−ＡＤＨは、過度に乾燥した状態や不適当な温度やｐＨなどのように化学状態が適切でないと、その比活性を失う。ＰＢの流れは、酵素膜を湿った状態に保ち、ＮＡＤＨを供給し、また、反応生成物（ＮＡＤ＋を含む）と過度の基質を効率的に除去する。このように、循環ＰＢを用いて反応条件を最適化した。Ｓ−ＡＤＨ固定化バイオセンサの特性評価では、５０μＭ  ＮＡＤＨを含むＰＢ（ｐＨ７．０，０．１Ｍ）をフローセルに循環させ、標準的なガス発生装置を用いて作製したアセトンガスをセンサ感応部に負荷した際の蛍光出力の変化を調べた。この特性評価では、標準ガスをテフロン（登録商標）チューブを通して検出領域に供給した。まず、高純度空気をテフロン（登録商標）チューブ中に流し、次いで、アセトン蒸気をバイオスニファの分析に適用した。全体的な流速は２００ｍｌ／ｍｉｎに保った。また、高純度空気は、アセトンレベルを調整するための搬送ガスとしても使用した。ＮＡＤＨ蛍光強度の変化は、ＰＭＴを使用して測定した。また、以下に述べるように、本センサの至適ｐＨ、ＮＡＤＨ濃度、アセトンガスに対する選択性なども調べた。
【００７１】
Ｓ−ＡＤＨ固定化バイオセンサに各濃度のアセトンガスを負荷したところ、ＮＡＤＨの蛍光出力の減少と濃度に応じた安定値が得られた。結果を図５に示す。安定値はＮＡＤＨの消費率のバランスによって決定される。安定値の９５％に達するまでの応答時間は３５〜７０秒であった。アセトンガスに対する定量特性を調べたところ、健常者（２００〜９００ｐｐｂ）及び糖尿病患者（＞９００ｐｐｂ）の呼気濃度を含む、２０〜５３００ｐｐｂの濃度範囲でアセトンガスを定量可能（Ｒ＝０．９９９）であった。検量線を図６に示す。本センサの再現性（５００ｐｐｂアセトン，ｎ＝５）を調べたところ、変動係数は２．６２％（ｎ＝５）であった。次にＰＢ溶液のｐＨ（５．５〜８．０）の影響を調べたところ、ｐＨ７．０にて最も高い蛍光出力変化が得られた。この結果は以下の２つの理由によって説明できる。まず第一に、ｐＨは酵素の三次元構造を変化させることができ、その安定性と効力に影響しうるため、Ｓ−ＡＤＨの酵素活性はＰＢのｐＨに依存する。したがって、ｐＨの最適化によって、センサー応答の安定性が高まる。第二に、ＮＡＤＨは弱酸性の条件下では不安定な試薬であり、したがって、ＮＡＤＨの安定性にはｐＨ７．０がより適している。
【００７２】
またフローセルのＮＡＤＨ濃度を変化させたところ、２０μＭのＮＡＤＨにおいて７．０ｐｐｂのアセトンガスの検出が可能で、１００μＭ  ＮＡＤＨとすることで最大１０ｐｐｍまでアセトンの定量が可能であった。つまり、本センサではＮＡＤＨ濃度を選択することで、定量範囲を調整することが可能であった。図７にアセトンバイオスニファの定量範囲に対するＮＡＤＨ濃度の影響を示す。５０μｍのＮＡＤＨの場合、アセトンガスのダイナミックレンジは２０〜５３００ｐｐｂであった。２０μｍのＮＡＤＨの場合、ダイナミックレンジは７〜９００ｐｐｂとなった。低い濃度のＮＡＤＨは、低いバックグランドをもたらす。これは、低濃度のアセトンを測定する場合に重要となる。一方、ＮＡＤＨの濃度を１００μＭに高めると、ダイナミックレンジの上限が改善し、５０〜１００００ｐｐｂにまで広がる。このように、ＮＡＤＨの濃度を調整することにより、７〜１００００ｐｐｂの所望の検出範囲でアセトンガスを測定するようにセンサを調整できる。
【００７３】
次に本センサに各種ガスを負荷し、蛍光出力を比較した。結果を図８に示す。アセトンガスの蛍光出力を１００％とした時、２−ブタノンと２−ペンタノンガスに対してそれぞれ１３９％と１１７％であったものの、他のガスにはほとんど出力を示さず、酵素の基質特異性を基づく選択性が得られた。本センサの選択性は、従来の半導体式ガスセンサに比べて大幅に向上していると言える。健常者の呼気中には僅かの２−ペンタノン（０．３８ｐｐｂ）と２−ブタノン（０．３８ｐｐｂ）が含まれるが、アセトンと比して極めて濃度が低いことから影響は少ないと考えられる。なお、２−ブタノンと２−ペンタノンは肺がん患者の呼気に含まれることが報告されており、肺がんスクリーニングとしての応用が考えられる。
【実施例２】
【００７４】
アセトンガス用バイオスニファを用いた呼気計測
Ｓ−ＡＤＨ固定化バイオスニファを呼気中アセトンガスの計測に適用し、運動負荷実験に伴い呼気中アセトン濃度のモニタリングを実施した。本実験の趣旨を説明し同意を得た３名の健常成人（被験者Ａ、ＢおよびＣ）において、食物を６時間摂取しない状態で、エルゴメーターにて５０Ｗ（３０分間）の運動負荷を与え、その後、１５０分間の安静状態とした。呼気ガスは適宜、サンプリングバックに採取し、Ｓ−ＡＤＨ固定化バイオセンサにて呼気中アセトンガスの測定を行った。サンプリングバッグを用いた呼気計測システムの概要を図９に示す。
【００７５】
クロマトグラフ法とは異なり、アセトンバイオスニファは、アセトンガスのリアルタイム計測を可能とする。作製したセンサを用いて、空腹時の運動負荷に伴う呼気中アセトンガス濃度の経時変化を調べた。呼気サンプルをセンサに負荷したところ、標準アセトンガスと同様に、ＮＡＤＨの蛍光出力の減少が得られ、アセトンガス濃度を定量することができた。運動負荷での濃度変化を調べたところ、運動に伴うアセトンガス濃度の上昇が観察され、運動終了後１５分から３０分で最大濃度を示し、その後は漸次減少する様子が確認された。空腹状態での運動負荷により、脂肪組織からの遊離脂肪酸の血中への供給が増加し、遊離脂肪酸のβ酸化により過剰なアセチルＣｏＡが産生した後、ケトン体が生成され、揮発性のアセトンが肺でのガス交換により呼気として放出されることで、呼気濃度が上昇したと考えられる。この実験で得られたデータを図１０に示す。ピークにおけるアセトン濃度は、初期値の１１０〜１４０％に達していた。このように、本センサを用いることで、呼気中のアセトンガスのバイオセンシングが可能であり、脂質代謝を評価可能であることが示された。
【実施例３】
【００７６】
ＥＲ１を用いたノネナール計測用生化学式センサ：ＮＡＤＰＨ蛍光検出系の構築と特性評価
ＥＲ１を用いた生化学式センサにおいては、ＮＡＤＰＨの減少変化を観察することで、ノネナールを検出、計測する。そこで、図１１に示す系と同様な光学系を構築し、ＮＡＤＰＨの蛍光検出システムを開発した。ＮＡＤＰＨ蛍光検出系の評価では、黒色に塗装したキュベット内に１０ｍＭのβ−ＮＡＤＰＨ（オリエンタル酵母工業株式会社より購入）を含む純水を３００μｌ満たし、暗箱内に設置した後、最終濃度が１ｎＭ〜１０ｍＭとなるように純水を滴下した際のＮＡＤＰＨ蛍光強度の変化を計測した。
【００７７】
上記の実験系を用いてＮＡＤＰＨの減少量を測定した。実験の結果、純水の滴下に応じた出力の減少と濃度に伴う安定値が得られ、１００ｎＭ〜１０ｍＭの濃度範囲で蛍光強度の変化を測定することが可能であった（図１２）。
【実施例４】
【００７８】
ノネナール溶液計測用ＥＲ１センサの構築と特性評価
ＥＲ１を用いたノネナール溶液計測用生化学式センサの作製では、図１１に示されるのと同様な光学系を構築し、ＰＴＦＥ膜上にＥＲ１（１．３Ｕ／ｍｇ粉末，株式会社ダイセルより購入）を１．３ｕｎｉｔｓ／ｃｍ２とＰＭＥＨ１０μｌ／ｃｍ２をそれぞれ塗布し作製した酵素膜を光ファイバプローブ先端に固定し、ノネナール溶液計測用ＥＲ１センサとした。ノネナール溶液計測用ＥＲ１センサの特性評価では、キュベット内に１００μＭのβ−ＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．０，１００ｍＭ）を満たし、ノネナールの溶解を十分に可能とする８０％エタノール溶液を用いて、最終濃度が１ｎＭ〜１ｍＭとなるようノネナール溶液を調製し、３分間隔で滴下した際のＮＡＤＰＨ蛍光強度の変化を光電子増倍管にて計測した。
【００７９】
ＮＡＤＰＨ蛍光検出系をもとに、ＥＲ１固定化膜を装着した光ファイバプローブにて、各濃度におけるノネナール溶液を滴下し酵素反応により減少するＮＡＤＰＨの蛍光出力変化を観察した結果、図１３に示すように、濃度に応じた蛍光出力の変化が確認された。今回のノネナール溶液に対する応答性から、ＥＲ１センサにおける濃度依存範囲は１μＭ〜１ｍＭとなった。
【００８０】
次に、ＥＲ１の反応性及び他のアルデヒド成分に対するＥＲ１の基質特異性を調べるため、ノネナール用ＥＲ１センサに、各種のアルデヒド成分（アセトアルデヒド、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナナール、デカナール各１０μＭをそれぞれ８０％エタノールで希釈したもの）と、ＥＲ１の第一基質とされるエチルビニルケトン及びエタノール、アセトンを滴下した際の出力値の比較を図１４に示す。ノネナールの蛍光出力を１００％として、他のアルデヒド類に対して１０％程度の蛍光出力が示されたものの、酵素の基質特異性に基づくＥＲ１の高い選択性がみとめられた。これにより、生体から放出される主なアルデヒド成分（アセトアルデヒド、オクタナール、ノナナール、デカナール）に対し、高い選択性を有することがわかった。
【実施例５】
【００８１】
ノネナールガス計測用ＥＲ１センサの構築と特性評価
ＥＲ１を用いたノネナールガス計測用生化学式センサの作製では、図４に示されるのと同様な系を構築し、ＰＴＦＥ膜上にＥＲ１を１．３ｕｎｉｔｓ／ｃｍ２とＰＭＥＨ１０μｌ／ｃｍ２をそれぞれ塗布し作製した酵素膜をフローセルの端面に固定し、ノネナールガス計測用ＥＲ１センサとした。生化学式ガスセンサの特性評価では、５０μＭのβ−ＮＡＤＰＨを含むリン酸緩衝液（ｐＨ８．０，１００ｍＭ）を１．４ｍｌ／ｍｉｎの流量でフローセル内部に循環させ、サンプリングバッグで作製した標準ノネナールガスを流量１４０ｍｌ／ｍｉｎでセンサ感応部に負荷した際の蛍光出力の変化を観察した。
【００８２】
溶液計測の結果を踏まえ、ノネナールガス用ＥＲ１センサに、標準ノネナールガスを負荷した際の蛍光出力の変化を図１５に示す。
【符号の説明】
【００８３】
１１１  光入射用の光ファイバ
１１２  受光用の光ファイバ
１１３  光ファイバプローブ
１１４  紫外線発光ダイオード
１１６  光入射用の帯域フィルター
１１８  受光用の長波長透過フィルター
１２０  検出器
１３１  コンプレッサー
１３２  活性炭フィルター
１３３  気体発生装置
１３４  マスフローコントローラ
１３５  ＮＡＤＨ緩衝液リザーバー
１４０  気液隔膜フローセル
１４１  シリコンチューブ
１４２  ＰＭＭＡパイプ
１４３  Ｏ−リング
１４４  酵素固定化膜
１５１  緩衝液流路
１５２  気体流路
１０  バイオセンサシステム  
１１  光入射用の光ファイバ
１１’  受光用の光ファイバ
１２  光ファイバプローブ
１４  紫外線発光ダイオード
１６  バンドパスフィルター（帯域フィルター）
１８  長波長透過フィルター（ロングパスフィルター）もしくはバンドパスフィルター
２０  検出器
２２  コンピュータシステム
３１  担体
３２  ポリマー及び酵素の混合溶液
３３  酵素固定化膜
３４  光ファイバプローブ
３５  シリコンチューブリング
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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