(57)【要約】      （修正有）【課題】体系的で信頼性のある光安全性試験を提供する。【解決手段】（１）被験物質のＵＶ吸収スペクトル測定を行い、光毒性及び光アレルギー性試験の実施の要否を決定し、（２）皮膚感作性評価において、被験物質試験群が、対照物質試験群に対して３倍の皮膚感作性を示す前記被験物質の濃度の算出を行い、（３）光毒性評価において、（３−ｉ）前記（２）で算出した前記被験物質濃度において、光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験の２通りのＵＶ照射方法で光毒性試験を行い、より感作性の高い試験方法を選択し、（３−ｉｉ）選択された前記ＵＶ照射方法において、前記被験物質について光毒性試験を行い、皮膚感作及び光毒性を生じない最高濃度を決定し、（４）光アレルギー性評価において、前記（３−ｉ）において選択されたＵＶ照射方法を用い、前記（３−ｉｉ）において決定された濃度で、前期被験物質の光アレルギー性を評価する光安全性試験方法。【選択図】図１
2016102722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記ステップ（１）〜（４）、
（１）被験物質のＵＶ吸収スペクトル測定を行い、前記被験物質の最大吸収波長におけるモル吸光係数が１０００以上の場合に、次のステップ（２）を行うことを決定し、そして、モル吸光係数が１０００未満の場合に、ＵＶ吸収が無いものとして光毒性及び光アレルギー性陰性と評価することにより、次の（２）以後のステップの光毒性及び光アレルギー性試験の実施の要否を決定するステップ、
（２）皮膚感作性評価において、被験物質試験群が、対照物質試験群に対して３倍の皮膚感作性を示す前記被験物質の濃度の算出を行うステップ、
（３）光毒性評価において、
（３−ｉ）前記ステップ（２）で算出した前記被験物質濃度において、光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験の２通りのＵＶ照射方法で光毒性試験を行い、より感作性の高い試験方法を選択するステップ、
（３−ｉｉ）前記（３−ｉ）において選択されたいずれか１つの前記ＵＶ照射方法において、前記被験物質について光毒性試験を行い、皮膚感作及び光毒性を生じない最高濃度を決定するステップ、
（４）光アレルギー性評価において、前記（３−ｉ）において選択されたＵＶ照射方法を用い、前記（３−ｉｉ）において決定された皮膚感作及び光毒性の生じない濃度で、前記被験物質の光アレルギー性を評価するステップ、
からなる、光安全性試験方法。
【請求項２】
前記ステップ（２）における前記皮膚感作性評価が、ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９に準拠したＬＬＮＡ試験により行われ、被験物質に対する対照物質試験群に対し３倍の増殖刺激係数（ＳＩ）値を示す被験物質の濃度（ＥＣ３）の算出を行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（３）におけるＵＶ照射量が１０Ｊ／ｃｍ２乃至２０Ｊ／ｃｍ２であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（３）における前記光毒性評価が、マウスにおける耳介厚さの増加を指標とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（４）における前記光アレルギー性評価が、ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９に準拠したＬＬＮＡ試験により行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
下記ステップ（１）〜（４）、
（１）被験物質のＵＶ吸収スペクトル測定を行い、前記被験物質の最大吸収波長におけるモル吸光係数が１０００以上の場合に、次のステップ（２）を行うことを決定し、そして、モル吸光係数が１０００未満の場合に、ＵＶ吸収が無いものとして光毒性及び光アレルギー性陰性と評価することにより、次の（２）以後のステップの光毒性及び光アレルギー性試験の実施の要否を決定するステップ、
（２）皮膚感作性評価において、被験物質試験群が、対照物質試験群に対して３倍の皮膚感作性を示す前記被験物質の濃度の算出を行うステップ、
（３）光毒性評価において、
（３−ｉ）前記ステップ（２）で算出した前記被験物質濃度において、光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験の２通りのＵＶ照射方法で光毒性試験を行い、より感作性の高い試験方法を選択するステップ、
（３−ｉｉ）前記（３−ｉ）において選択されたいずれか１つの前記ＵＶ照射方法において、前記被験物質について光毒性試験を行い、皮膚感作及び光毒性を生じない最高濃度を決定するステップ、
（４）光アレルギー性評価において、前記（３−ｉ）において選択されたＵＶ照射方法を用い、前記（３−ｉｉ）において決定された皮膚感作及び光毒性の生じない濃度で、前記被験物質の光アレルギー性を評価するステップ、
からなる、光安全性試験における光増殖刺激係数（ｐＳＩ：ｐｈｏｔｏ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）比、ｐＳＩ差、傾き比及び光アレルギーファクター（ＰＡＦ：Ｐｈｏｔｏ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｆａｃｔｏｒ）を用い、光アレルギー性の強度を定量化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体系的な光安全性試験法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品の開発において実施される毒性試験の一つに、光毒性試験がある。この具体的試験方法については、例えば、非特許文献１には、標準的な光毒性試験の試験方法の指標が記載されている。
【０００３】
そして、２０１４年には非特許文献２において、医薬品の光安全性評価ガイドラインについての以下の問題点及び提言が通知されている。
これによれば、第一に、化学的試験法を用いた光反応性試験においては、ＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）アッセイが代表的試験方法として挙げられる。しかし、当該試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける直接的な光毒性物質を予見する上での感度が高いことが示されているが、一方で、偽陽性結果の割合が高いことから、特異度は低い。また、陽性結果となったものは、追加的評価を考慮すべき旨が指摘されている。
次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験法を用いた光毒性試験において代表的な３Ｔ３ニュートラルレッド毒性試験（３Ｔ３  ＮＲＵ  ＰＴ）は、水溶性物質に関しては現在最も適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング手法であるとされている。しかし、当該試験において陽性結果が得られた場合は、臨床的な光毒性を必ずしも示唆するものではないが、追加的評価を考慮すべきとしている。
第三に、ヒト皮膚の再構築モデルによる手法については、ヒト皮膚よりも感受性が低いことが指摘された。したがって、使用する試験法の感度の理解と妥当かつ可能な試験法の条件を適宜調整する必要があるといえる。
第四には、全身適用薬のｉｎ  ｖｉｖｏ光安全性試験においては、様々な動物種で実施されているが、未だ標準的試験デザインは確立されていない。さらにまた、経皮適用薬のｉｎ  ｖｉｖｏ光安全性試験において、経皮投与の医薬品の接触光アレルギー・急性光毒性（光刺激性）試験法の正式なバリデーションは行われておらず、当該試験で観察される急性光刺激はヒトにも関係すると考えられているが、ヒトの光アレルギー性試験の予測性は不明であるとされ、未だ一般的に推奨されない方法といえる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「医薬品の製造（輸入）承認申請に必要な毒性試験のガイドラインについて」（平成元年９月１１日、薬審一第２４号、各都道府県衛生主管部（局）長あて厚生省薬務局審査第一・審査第二・生物製剤課長連名通知）
【非特許文献２】「医薬品の光安全性評価ガイドラインについて」（平成２６年５月２１日、薬食審査発０５２１第１号、各都道府県衛生主管部（局）長あて厚生労働省医薬食品局審査管理課長通知）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、光安全性評価の方法は、画一化されておらず、追加的評価等が必要な場合、その判断は、現状では薬剤開発者に委ねられているといえるため、技術的にも実施者間のばらつきを無くすためにも、信頼性ある体系的な評価方法がまさに必要といえる。
さらに、従来の光安全性試験法は、上記に指摘されるとおり、予測性、確実性の他に、試験あたりの費用や時間がかかり、さらに、臨床試験において光毒性が発現すると医薬品の開発方針を変更せざるを得なくなり、さらにコストがかかるという、問題があった。
さらにまた、動物愛護の観点からも、代替法の利用、使用動物数の削減及び苦痛の削減の原則に従って、使用動物数を削減するため、（なお、これまでモルモット試験が一般的に用いられていたがこれを含め、）さらなる信頼性のある効果的な体系的試験法の開発が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、発明者らは鋭意研究を重ね、以下を発明するに至った。
即ち、本発明は、
＜１＞  下記ステップ（１）〜（４）、
（１）被験物質のＵＶ吸収スペクトル測定を行い、前記被験物質の最大吸収波長におけるモル吸光係数が１０００以上の場合に、次のステップ（２）を行うことを決定し、そして、モル吸光係数が１０００未満の場合に、ＵＶ吸収が無いものとして光毒性及び光アレルギー性陰性と評価することにより、次の（２）以後のステップの光毒性及び光アレルギー性試験の実施の要否を決定するステップ、
（２）皮膚感作性評価において、被験物質試験群が、対照物質試験群に対して３倍の皮膚感作性を示す前記被験物質の濃度の算出を行うステップ、
（３）光毒性評価において、
（３−ｉ）前記ステップ（２）で算出した前記被験物質濃度において、光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験の２通りのＵＶ照射方法で光毒性試験を行い、より感作性の高い試験方法を選択するステップ、
（３−ｉｉ）前記（３−ｉ）において選択されたいずれか１つの前記ＵＶ照射方法において、前記被験物質について光毒性試験を行い、皮膚感作及び光毒性を生じない最高濃度を決定するステップ、
（４）光アレルギー性評価において、前記（３−ｉ）において選択されたＵＶ照射方法を用い、前記（３−ｉｉ）において決定された皮膚感作及び光毒性の生じない濃度で、前記被験物質の光アレルギー性を評価するステップ、
からなる、光安全性試験方法。
＜２＞  前記ステップ（２）における前記皮膚感作性評価が、ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９に準拠したＬＬＮＡ試験により行われ、被験物質に対する対照物質試験群に対し３倍の増殖刺激係数（ＳＩ）値を示す被験物質の濃度（ＥＣ３）の算出を行うことを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜３＞  前記ステップ（３）におけるＵＶ照射量が１０Ｊ／ｃｍ２乃至２０Ｊ／ｃｍ２であることを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜４＞  前記ステップ（３）における前記光毒性評価が、マウスにおける耳介厚さの増加を指標とする、＜１＞に記載の方法。
＜５＞  前記ステップ（４）における前記光アレルギー性評価が、ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９に準拠したＬＬＮＡ試験により行われることを特徴とする、＜１＞に記載の方法。
＜６＞  下記ステップ（１）〜（４）、
（１）被験物質のＵＶ吸収スペクトル測定を行い、前記被験物質の最大吸収波長におけるモル吸光係数が１０００以上の場合に、次のステップ（２）を行うことを決定し、そして、モル吸光係数が１０００未満の場合に、ＵＶ吸収が無いものとして光毒性及び光アレルギー性陰性と評価することにより、次の（２）以後のステップの光毒性及び光アレルギー性試験の実施の要否を決定するステップ、
（２）皮膚感作性評価において、被験物質試験群が、対照物質試験群に対して３倍の皮膚感作性を示す前記被験物質の濃度の算出を行うステップ、
（３）光毒性評価において、
（３−ｉ）前記ステップ（２）で算出した前記被験物質濃度において、光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験の２通りのＵＶ照射方法で光毒性試験を行い、より感作性の高い試験方法を選択するステップ、
（３−ｉｉ）前記（３−ｉ）において選択されたいずれか１つの前記ＵＶ照射方法において、前記被験物質について光毒性試験を行い、皮膚感作及び光毒性を生じない最高濃度を決定するステップ、
（４）光アレルギー性評価において、前記（３−ｉ）において選択されたＵＶ照射方法を用い、前記（３−ｉｉ）において決定された皮膚感作及び光毒性の生じない濃度で、前記被験物質の光アレルギー性を評価するステップ、
からなる、光安全性試験における光増殖刺激係数（ｐＳＩ：ｐｈｏｔｏ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）比、ｐＳＩ差、傾き比及び光アレルギーファクター（ＰＡＦ：Ｐｈｏｔｏ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｆａｃｔｏｒ）を用い、光アレルギー性の強度を定量化する方法。
である。
【０００７】
用語の説明
本発明における「被験物質」とは、特に限定はなく、医薬、化粧品、生活用品等としての、ヒトその他生物に用いられ、皮膚と接触する可能性のある全ての化学物質が対象となる。
本発明における「皮膚感作性」とは、遅延性過敏反応のひとつであり、化学物質による過剰な免疫反応により皮膚にかぶれが起こる現象をいう。
本発明における「光毒性」とは、一般的には皮膚内に吸収された薬剤が、光エネルギーによって光化学反応を起こし活性化された結果、毒性を獲得して組織を傷害する性質をいう。
本発明における「光アレルギー性」とは、一般的には、皮膚内に吸収された薬剤が、光エネルギーによって光化学反応を起こし、活性化あるいは構造が変化することによって、免疫原性を獲得し光アレルギー反応を引き起こす、あるいは憎悪する性質をいう。
本発明における「光ハプテン型」とは、薬剤の抗原性獲得機構の１つであり、ＵＶ照射下で、体内で光分解中間体の高エネルギー活性体が生成され、それがタンパクと結合し完全抗原となり、アレルギー反応を引き起こす機構をいう。
本発明における「プロハプテン型」とは、原因物質の光分解又は光酸化により生成した構造変化物がハプテンとなり、タンパクと相互作用して抗原性を持ち、アレルギー反応を引き起こす機構をいう。
本発明における「ローカルリンフノードアッセイ（Ｌｏｃａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ａｓｓａｙ  （ＬＬＮＡ））」とは、ＯＥＣＤ  ＴＧ（経済協力開発機構試験法ガイドライン）４２９に記載の皮膚感作・局所リンパ節試験をいう。
【０００８】
本発明の光安全性試験法は、下記（１）〜（４）の各ステップを有することを特徴とする。
即ち、
（１）被験物質のＵＶ吸収スペクトル測定（光毒性及び光アレルギー性試験の実施の要否を決定するステップ）、
（２）皮膚感作性評価（対照物質試験群に対して３倍の皮膚感作性を示す被験物質の濃度の算出を行うステップ）、
（３）光毒性評価
（３−ｉ）光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験の２通りのＵＶ照射方法で、より感作性の高い試験方法を選択するステップ、
（３−ｉｉ）前記（３−ｉ）において選択されたいずれか１つのＵＶ照射方法において、皮膚感作及び光毒性を生じない最高濃度を決定するステップ、
（４）光アレルギー性評価（皮膚感作及び光毒性を生じない濃度で、被験物質の光アレルギー性を評価するステップ）、
のステップからなる。
また、本発明による光安全性試験の概要を、図１のフロー図に示す。
本発明は、体系的に、かつ、効果的に光安全性試験法を行う方法であり、例えば、ローカルリンフノードアッセイ（Ｌｏｃａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ａｓｓａｙ  （ＬＬＮＡ））に基づき試験することができる。
【０００９】
次に、本発明の方法の各ステップについて述べる。
【００１０】
本発明のステップ（１）は、被験物質のＵＶ吸収スペクトルを測定するステップである。
【００１１】
（１）被験物質のＵＶ吸収スペクトル測定
ＵＶ吸収スペクトルの測定は分光光度計（例えば、島津製作所製）を用い、波長２８０〜４００ｎｍの範囲で測定し、モル吸光係数（ε）を算出する。
【００１２】
測定に使用する溶媒としては、測定波長域においてＵＶ吸収域をもたない乃至少なく測定に支障のない溶媒が用いられ、例えば、エタノール、メタノール、ジメチルホルムアミド等が挙げられるが、これらに限られない。
測定濃度は、被験物質のＵＶ吸収に応じ、また測定装置に用いるセル長さに応じて適宜決定される。測定セルは、通常０．１ｃｍ乃至１０ｃｍの長さのセルが用いられる。
モル吸光係数εは、下記式（Ｉ）により求められる。
ε＝Ａ／（ｃ×ｄ）          ・・・式（Ｉ）
Ａ：吸光度、  ｃ：モル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、  ｄ：セル長さ（ｃｍ）
【００１３】
本発明のステップ（１）によれば、上記εが１０００未満でＵＶ吸収なし、１０００以上でＵＶ吸収ありと判定する。
ＵＶ吸収なしと判定された物質に関しては、光毒性及び光アレルギー性陰性と判定し、ステップ（２）以後の試験は行わない。一方、ＵＶ吸収ありと判定された物質に関しては次の評価ステップである皮膚感作性評価を実施することとする。
【００１４】
本発明のステップ（２）は、皮膚感作性を評価し、陽性と判定されるＳＩ（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）が３を示す用量である被験物質の濃度（ＥＣ３）値を算出するステップである。
【００１５】
（２）皮膚感作性評価ステップ
皮膚感作性評価における、ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９に準拠したＬＬＮＡ試験の実施によるＥＣ３の算出について説明する。ＥＣ３の値は、次のステップ（３）で用いる被験物質濃度とするものである。
【００１６】
ＬＬＮＡ試験とは、被験物質を経皮適用した後、約１週間後に３Ｈ標識チミジンを投与して当該３Ｈ標識チミジンのリンパ節への取り込み量を測定、即ち、リンパ球の増殖を調べる試験方法である。具体的試験はＯＥＣＤ（経済協力開発機構）毒性試験ガイドラインＴＧ４２９に準拠して行われる。
【００１７】
ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９によれば、使用動物種は、ＣＢＡ／Ｃａ又はＣＢＡ／Ｊ系統の未産経で非妊娠の若齢雌マウスを使用する。試験開始時、動物は８〜１２週齢で体重のばらつきが最小限のものが用いられる。使用動物数は、用量群あたり最低４匹の動物に加えて、被験物質用溶媒のみを処理した陰性対照群を設ける。
【００１８】
なお、被験物質は、適切な溶媒に溶解し、所定の濃度とする。該溶媒としては例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、７０％エタノール及びメチルエチルヘキシル（ＭＥＫ）、その他、アセトン／オリーブ油（４：１  ｖ／ｖ）、プロピレングリコール等が挙げられるが、これらに限定されない。
被験物質の用量は、例えば、１００％、５０％、２５％、１０％、５％、２．５％、１％、０．５％などの一連の濃度から選択される。
【００１９】
試験の実施は、以下の手順によって行われる。
第１日目に、各動物を同定し、体重を記録する。被験物質、溶媒のみの適切な希釈液を２５μＬずつ、両耳背部に適用開始する。
第２日目及び第３日目に、第１日目に実施した適用手順を繰り返す。
第６日目に、動物の個体毎の体重記録及びリンパ節増殖試験試薬をマウス尾静脈から注射し、５時間後、動物を屠殺し、各耳から耳介リンパ節を採取し耳介に取り込まれた試験試薬の活性を測定する。
【００２０】
上記試験において、リンパ節の増殖を評価する方法として、例えば、試験試薬として３Ｈ標識チミジン、その他には、例えば、３Ｈ標識メチルチミジン、１２５Ｉ標識−ヨードデオキシウリジン等が用いられ得るが、かかる放射性同位元素標識化合物を用いる方法以外でも、被験物質の経皮適用後のリンパ球の増殖を評価する試薬及びそれを用いる方法、例えば、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いるＥＬＩＳＡ方法も例示されるが、これらに限定されず、マウス局所リンパ節増殖試験として評価可能な方法であれば、本発明に用いることができる。
【００２１】
このようにして、該ステップ（２）においては、被験物質溶液について、予め決定した複数の試験用量濃度の溶液を試験群とし、被験物質溶液の調製に用いる溶媒（例えば、上記のＤＭＦ等）のみを塗布した動物群を対照群とし、試験を行う。被験物質群が対照群に対して３倍の活性を示す被験物質の濃度、即ちＥＣ３を求める。
【００２２】
ＥＣ３の算出方法について、上記試験の結果、皮膚感作性陽性となった物質については、陽性と判定される増殖刺激係数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ））が３を示すと推定される用量である被験物質濃度をＥＣ３とする。
即ち、ＳＩは、下記式（ＩＩ）により計算される。
ＳＩ＝ｍ／ｍ０    ・・・式（ＩＩ）
ｍ：被験物質溶液を投与したマウスの耳介リンパ節における３Ｈ標識メチルチミジン量
ｍ０：対照物質（溶媒のみ）を投与したマウスの耳介リンパ節における３Ｈ標識メチルチミジン量
算出されたＥＣ３の値、即ち被験物質濃度を、次のステップ（３）の最高濃度に用いることとする。
【００２３】
なお、被験物質のＥＣ３の既知情報がある場合、当該情報を用いて次の評価ステップである光毒性評価を実施するものとする。
【００２４】
本発明のステップ（３）は、ＵＶ照射により光毒性を評価するステップであり、２段階のステップ（３−ｉ）及び（３−ｉｉ）からなり、試験方法及び次のステップ（４）における被験物質の濃度を決定するステップである。
【００２５】
（３）光毒性評価ステップ
（３−ｉ）２通りのＵＶ照射方法で光毒性を評価するステップ
（ＵＶ照射方法の選択）
光アレルギーの原因物質には、ＵＶ照射下でタンパク質と直接反応する光ハプテンと、光分解又は光酸化により生成した構造変化物が抗原となるプロハプテンの２通りがある。したがって、本発明においては２通りの抗原提示に対応すべく、ＵＶ照射方法は、動物に被験物質を塗布してから積算光量、例えば、１０Ｊ／ｃｍ２になるように照射する方法（光ハプテン型）と、被験物質を透明なガラスバイアルに入れ被験物質のみ２４時間照射してから動物に塗布する方法(プロハプテン型)の２通りの試験を実施するものとする。
【００２６】
（３−ｉ）−１  光ハプテン型試験
光ハプテン型試験は、動物に被験物質を塗布してから積算光量が１０Ｊ／ｃｍ２になるようにＵＶ照射する方法である。
光ハプテン型試験における紫外線（ＵＶ）照射用光源としては、例えば、光毒性及び光アレルギー性試験の従来法でも繁用され、真皮まで到達するＵＶＡ領域（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）に極大波長を持つＢＬＢランプ（例えば、東芝製ＦＬ４０Ｓ  ＢＬＢ）を、例えば６灯並列で用いる例が挙げられるが、同様の効果を有する装置及び条件であればこれに限定されるものではない。
光照射量（Ｊ／ｃｍ２）は、例えば、時間（分）×光照射強度（ｍＷ／ｃｍ２）×６０÷１０００という数式により算出される値である。好ましくは、１０Ｊ／ｃｍ２乃至２０Ｊ／ｃｍ２であり、例えば、１０Ｊ／ｃｍ２、２０Ｊ／ｃｍ２等の条件で行われ、最も好ましくは、１０Ｊ／ｃｍ２である。
【００２７】
（３−ｉ）−２  プロハプテン型試験
プロハプテン型試験においては、被験物質を透明なガラスバイアルに入れ被験物質のみ２４時間照射してから動物に塗布する方法を用いるので、上記照射用光源を同様に用いることができる。
【００２８】
動物群その他の基本的取り扱いは、前記ステップ（２）と同様である。そして、目視による一般状態観察、試験開始日と６日目に体重測定、耳介厚さの測定及び耳介リンパ節の重量を測定し判定を行うこととする。
判定方法としては、光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験において、ＵＶ非照射群に対して耳介厚あるいは耳介リンパ節重量の増加が認められた照射方法を有効照射方法として選択する。いずれの照射方法においても変化がない場合は光ハプテン型を選択することとする。
【００２９】
（３−ｉｉ）選択されたＵＶ照射方法で光毒性評価をするステップ
ここでは次のステップ（４）の試験に用いる被験物質の濃度を決定する。
光毒性の評価及は、皮膚感作性陰性の物質に関しては投与できる最大濃度をもって、また、皮膚感作性陽性の物質に関してはＥＣ３を最高濃度として光毒性評価を行うものとする。
【００３０】
前記（３−ｉ）で決定された光ハプテン型試験又はプロハプテン型試験のいずれかの方式で試験を行い、被験物質の試験用量は、（３−ｉ）で行われた濃度より低い濃度で適宜設定される。その他の試験条件は、（３−ｉ）と同様にする。なお、このステップはステップ（３−ｉ）にて、各照射方法で試験用量を複数設定することにより、同時に実施することができる。
そして、目視による一般状態観察、試験開始日と６日目に体重測定、耳介厚さの測定及び耳介リンパ節の重量を測定する。
【００３１】
判定方法としては、体重が試験開始日に対して５％を上回る減少が認められた場合に全身毒性の可能性を有すると判定し、一方、耳介厚さは試験開始日に対して１２５％を上回る増加が認められた場合に光毒性陽性と判定する基準に基づき行う。そして、両耳の耳介厚さが１２５％を下回った濃度を光毒性のない最高濃度として、次のステップ（４）で用いる試験濃度を決定するものとする。
【００３２】
本発明のステップ（４）は、皮膚感作及び光毒性の無い濃度での光アレルギー性を評価するステップである。
【００３３】
（４）光アレルギー性評価ステップ
光アレルギー性の評価は、ステップ（３−ｉｉ）で決定した全身毒性及び光毒性のない最高濃度を試験用量として、媒体及び被験物質投与群それぞれＵＶ照射群と照射無しの群を設定し試験を行う。
【００３４】
動物群その他の基本的取り扱いは、前記ステップ（２）と同様である。
ＵＶ照射はステップ（３−ｉ）光毒性評価の際に決定した有効照射方法で照射し、その他の試験操作及び条件は、ステップ（２）のＴＧ４２９に準拠した方法と同様であり、又は、その他のマウス局所リンパ節増殖試験が用いられ得る。
例えば、被験物質群の各個体のトリチウム標識チミジン（３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）取込量を媒体対照群の平均３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ取込量で除した値を光増殖刺激係数（ｐｈｏｔｏ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ｐＳＩ））とする。
【００３５】
判定方法は、媒体のＵＶ照射有無の群間の３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ取込量に関して有意差検定（ｐ＜０．０５）を行い、有意差が生じないことを試験成立の条件とする。光アレルギー性評価は被験物質のＵＶ照射有無の群間でｐＳＩの有意差検定（ｐ＜０．０５）を実施し、有意差が生じた場合に、光アレルギー性陽性とする。
ＵＶ照射の試験群に関して複数試験用量を設定することにより、ＬＬＮＡ同様ＥＣ３を算出することができる（ｐｈｏｔｏ  ＥＣ３：ｐＥＣ３）。
【００３６】
また、各地域の光パッチテストの既知情報がある物質のｐＳＩの比（ｐＳＩ  ｒａｔｉｏ）を算出し、これを陽性対照とし定量的評価の検討を実施することも可能である。
また、本発明の方法により得られた結果を、さらに次の５つの方法で、定量的評価の検討を実施することも可能である。
（１）光増殖刺激係数比（ｐＳＩ  ｒａｔｉｏ：ｐＳＩ比）を算出する。
即ち、［ＵＶ（＋）］／［ＵＶ（−）］の値をｐＳＩ比とする。
（２）光増殖刺激係数差（ｐＳＩの差）を算出する。
即ち、［ＵＶ（＋）］−［ＵＶ（−）］の値をｐＳＩ差とする。
（３）複数用量で試験した場合、ｐＳＩと試験用量を用いて１次式から傾きを算出し、［ＵＶ（−）］／［ＵＶ（＋）］間の比を算出する。
（４）以下の式から光アレルギーファクター（Ｐｈｏｔｏ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｆａｃｔｏｒ：ＰＡＦ）を算出する。
（４−ｉ）皮膚感作性陽性の場合
ＰＡＦ＝ＥＣ３（ステップ２で算出）/ｐＥＣ３*1
（４−ｉｉ）皮膚感作性陰性の場合
ＰＡＦ＝最大試験濃度/ｐＥＣ３*1
＊１：ｐＳＩが３を超えずに光アレルギー性陽性と判定された場合は、ｐＳＩ間に統計的有意差が認められる最大濃度を用いてもよい。
（５）既知光アレルギー性物質のｐＳＩ比もしくはＰＡＦと比較する。
例えば副作用として薬剤性光線過敏症が重篤なケトプロフェンなどを用いることができるが、その限りではない。
このように、本発明のｐＳＩ比、ｐＳＩ差、ｐＳＩ傾き比及びＰＡＦの結果は、種々の既知情報と相関があるため（後述の表９参照）、光アレルギー性の強度を数値として定量評価をすることも可能である。また、既知物質を陽性対照として光アレルギー性の強度を推定することも可能である。
【００３７】
本発明と従来のモルモットを用いた光安全性試験の手法の比較を、表１に示す。
【００３８】
表１．本発明による方法と従来法との比較．
【表１】
2016102722.tif 000003
注）表中の従来法は以下を参照のこと。
皮膚感作性試験及び光アレルギー性試験：
厚生労働省（１９８９年）薬審一第二四号  医薬品の製造(輸入)承認申請に必要な毒性試験のガイドラインについて。
モルモットを用いた光毒性試験：
鬼頭 暢子, 清岡  昌史, 三善 隆弘, 藤堂  洋三. (２００７年) Ｇａｒｅｎｏｘａｃｉｎのモルモットにおける光毒性試験. 日本化学療法学会雑誌. Ｐ７５−７７。
【発明の効果】
【００３９】
本発明によれば、多くの期間及び費用を必要とするｉｎ  ｖｉｖｏ光安全性試験において、より取り扱いの容易なマウスを、より少ない動物数で実施でき、試験期間も短期間であり、また、試験費用もコストも抑えることができ、効果的に定量的な評価結果を得ることができる（表１参照）。
即ち、本発明の試験結果は、従来の定性的評価のみでなく、定量的評価も可能である利点も有する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明による光安全性試験の概要を示すフロー図である。
【図２】本発明による光安全性試験のステップ（１）で行う、被験物質クロルプロマジン塩酸塩のＵＶ吸収スペクトル図である。
【図３】本発明による光安全性試験のステップ（２）で行う、被験物質としてクロルプロマジン塩酸塩を用いた増殖刺激係数（ＳＩ）の測定結果を示す図である。
【図４】本発明による光安全性試験のステップ（４）で行う、被験物質としてクロルプロマジン塩酸塩を用いた光増殖刺激係数（ｐＳＩ）の測定結果を示す図である。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明する。
【００４２】
１．実験材料
１．１  使用動物
雌性ＣＢＡ／Ｃａマウス(日本エスエルシー)の８乃至１０週齢を用いた。
１．２  被験物質及び媒体
使用した被験物質を表２に示す。
ステップ（１）のＵＶ吸収スペクトルの測定では、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（和光純薬工業株式会社製、純度１００％）、メタノール（和光純薬工業株式会社製、純度１００％）あるいは２８０〜４００ｎｍの波長にＵＶ吸収をもたない溶媒を適宜用いた。
その他のステップの試験ではＤＭＦ、７０％エタノール及びメチルエチルヘキシル（ＭＥＫ）（和光純薬工業株式会社製、純度１００％）の３種から適宜選択して用いた。
【００４３】
表２．被験物質一覧．
【表２】
2016102722.tif 000004
【００４４】
（実施例１）
被験物質として、下記クロロプロマジン塩酸塩（以下、ＣＰＺとする。）（東京化成工業株式会社製、純度９９．５％）を用い、図１の流れに基づき、光安全性試験の各ステップを行った。
【化１】
2016102722.tif 000005
【００４５】
ステップ（１）ＵＶ吸収スペクトルの測定
ＵＶ吸収スペクトルの測定は、分光光度計（島津製作所製、ＢｉｏＳｐｅｃ−ｍｉｎｉ）を用い、被験物質クロルプロマジン塩酸塩をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解しメタノールに溶解し、０．１ｍＭの濃度とし、分光光度計（島津製作所）を用い、２８０〜４００ｎｍの範囲でＵＶ吸収スペクトルを測定した。ＵＶ吸収スペクトルを図２に示す。図２に示すように、ＣＰＺは、３１２ｎｍに吸収極大が認められたので、この３１２ｎｍにおけるモル吸光係数（ε）を算出した。
ＣＰＺのモル吸光係数（ε）は、計算式（Ｉ）により、モル吸光係数：４８６０であった。
したがって、εが１０００未満でＵＶ吸収なし、１０００以上でＵＶ吸収ありとの判定基準に従い、ＵＶ吸収ありと判定したものは次の評価ステップである皮膚感作性評価を実施することとしているため、ＣＰＺに関しては次の評価ステップに進むことにした。
【００４６】
ステップ（２）皮膚感作性評価
皮膚感作性評価は、ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９に準拠したＬＬＮＡによるＥＣ３の算出を行った。
被験物質ＣＰＺは、ＤＭＦに溶解し溶液とし、対照物質としてＤＭＦを用いた。
被験物質溶液で以下の各試験用量濃度の溶液を試験群とし、被験物質溶液の調製に用いた溶媒（ＤＭＦ）のみを塗布した動物群を対照群とし、そして、被験物質群の各個体のトリチウム標識チミジン（３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）（製造者：Ｍｏｒａｖｅｋ社、販売者：第一クラリティより入手可能）取込量が対照群に対して３倍の活性を示す被験物質の濃度、即ちＥＣ３を算出した。
即ち、被験物質ＣＰＺは、皮膚感作性陽性と判定されたので、陽性と判定される増殖刺激係数（Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＳＩ））が３を示すと推定される用量であるＥＣ３を算出し、結果を表３及び図３に示す。これにより、ＥＣ３の濃度は、２．４％と算出され、この値を、次のステップ（３）の最高濃度に決定した。
【００４７】
表３．クロルプロマジン塩酸塩（ＣＰＺ）のＬＬＮＡ結果まとめ．
【表３】
2016102722.tif 000006
ＤＰＭ：Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ（壊変毎分）
ＳＩ：Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（増殖刺激係数）
ＥＣ３：被験物質溶液の調製に用いる溶媒のみを塗布した動物群を対照群とし、対照群に対して３倍の活性を示す被験物質の濃度
対照群：被験物質溶液の調製に用いた溶媒であるＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を投与した。
【００４８】
ステップ（３）  光毒性評価
ステップ（３−ｉ）ＵＶ照射方法の選択
以下の光ハプテン型試験及びプロハプテン型の試験を実施の２通りを実施した。
（３−ｉ）−１の光ハプテン型試験においては、ＵＶ照射方法は、動物に被験物質を塗布してから積算光量が１０Ｊ／ｃｍ２になるように照射する方法であり、被験物質を塗布してから３０分後にマウスを専用の容器に入れ、厚さ３ｍｍのガラス板でフタをして照射した。塗布及びＵＶ照射の期間は連続して３日間、１日１回塗布及びＵＶを照射した。塗布開始日、被験物質塗布直前に体重及び耳介厚さを測定した。耳介厚さはマイクロメーター（ミツトヨ、ＭＤＣ−２５ＭＪ）を用いて測定した。被験物質の塗布はマイクロピペットを用い、片耳２５μＬずつ塗布した。塗布開始から６日目に体重、耳介厚さを測定した後、頚椎脱臼による安楽致死処置後、耳介リンパ節を採取し、秤量した。
なお、紫外線（ＵＶ）照射用光源としては、光毒性及び光アレルギー性試験の従来法でも繁用され、真皮まで到達するＵＶＡ領域（３２０ｎｍ〜４００ｎｍ）に極大波長を持つＢＬＢランプ（ＦＬ４０Ｓ  ＢＬＢ，東芝）を６灯並列で用いた。  
また、（３−ｉ）−２のプロハプテン型試験は、被験物質を透明なガラスバイアル（スクリュー管ビン、アズワン株式会社製）に入れ被験物質のみ２４時間照射してから動物に塗布する方法であり、照射後回収した被験物質を動物の耳介に塗布した。
この時、動物にはＵＶを照射しなかった。照射以外の操作は光ハプテン型試験と同様にした。
試験期間中、目視による一般状態観察、塗布開始日と６日目に体重測定、耳介厚さの測定及び耳介リンパ節の重量を測定した。その結果を表４に示す。
光毒性の判定方法として、体重は試験開始日に対して５％を上回る減少が認められた場合に全身毒性の可能性を有すると判定し、耳介厚さは試験開始日に対して１２５％を上回る増加が認められた場合に光毒性陽性と判定する基準に従い、ＵＶ照射法の判定方法として、光ハプテン型試験及びプロハプテン型試験において、塗布開始日に対して光毒性陽性あるいは耳介リンパ節重量の増加が認められた照射方法を有効照射方法として選択する基準に従い、ＣＰＺについては、耳介厚さのより増加があり光毒性が認められた光ハプテン型の試験方法を選択することとした。
【００４９】
表４．クロルプロマジン塩酸塩（ＣＰＺ）の各照射方法における耳介厚さ測定結果．
【表４】
2016102722.tif 000007
注）表４中の＊：  ２．４％を上限として、複数用量で光ハプテン型の両照射方法を検討。２．４％では過剰な刺激が認められたため、ここでは１％の実験結果を示す。
【００５０】
ステップ（３−ｉｉ）  光毒性評価
光毒性の評価及は皮膚感作性陰性の物質に関しては投与できる最大濃度、皮膚感作性陽性の物質に関してはＥＣ３を最高濃度として、ステップ（３−ｉ）で選択された試験方法を用い評価を行った。
被験物質ＣＰＺの試験用量を表５のように変化させた以外は、ステップ（３−ｉ）の光ハプテン型試験方法と同様にして実施した。なお、このステップはステップ（３−ｉ）にて、各照射方法で試験用量を複数設定することにより、同時に実施することができる。
そして、目視による一般状態観察、塗布開始日と６日目に体重測定、耳介厚さの測定及び耳介リンパ節の重量を測定した。結果を表５に示す。
体重は試験開始日に対して５％を上回る減少が認められた場合に全身毒性の可能性を有すると判定し、耳介厚さは試験開始日に対して１２５％を上回る増加が認められた場合に光毒性陽性と判定する基準に従い、表５より、両耳の耳介厚さが１２５％を下回った０．１％の濃度を光毒性のない最高濃度として、次のステップ４で用いる試験濃度と決定した。
【００５１】
表５．クロルプロマジン塩酸塩（ＣＰＺ）の光ハプテン型光感作後の耳介厚さ測定結果．
【表５】
2016102722.tif 000008
【００５２】
ステップ（４）  光アレルギー性評価
光アレルギー性の評価は、ステップ（３−ｉｉ）で決定した全身毒性及び光毒性のない最高濃度をＣＰＺ  ０．１％及び０．０１％を試験用量として媒体及び被験物質投与群それぞれＵＶ照射群と照射無しの群に分けて行った。
ＵＶ照射はステップ（３−ｉ）光毒性評価の際に決定した有効照射方法で照射し、その他の試験操作及び条件は、ＯＥＣＤ  ＴＧ４２９に準拠しステップ（２）と同様に実施した。
被験物質群の各個体のトリチウム標識チミジン（３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）取込量は、媒体対照群の平均３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ取込量で除した値を光増殖刺激係数（ｐｈｏｔｏ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ（ｐＳＩ））として求めた。
なお、他の具体的手技はステップ２に準拠し行った。
媒体のＵＶ照射有無の群間の３Ｈ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ取込量に関して有意差検定（ｐ＜０．０５）を行い、有意差が生じないことを試験成立の条件とした。
光アレルギー性評価は被験物質のＵＶ照射有無の群間でｐＳＩの有意差検定（ｐ＜０．０５）を実施し、有意差が生じた場合光アレルギー性陽性とした。
また、得られたｐＳＩの結果から、光増殖刺激係数比（ｐＳＩ比）、光増殖刺激係数差（ｐＳＩ差）、傾き比及び光アレルギーファクター（ＰＡＦ）を算出した。結果を表６及び図４に示す。
【００５３】
表６．クロルプロマジン塩酸塩（ＣＰＺ）の光アレルギー性評価結果．
【表６】
2016102722.tif 000009
注）表６中、＊：Ｐ＜０．０５  ＊＊：Ｐ＜０．０１（対応するＵＶ（−）群のｐＳＩに対して）
【００５４】
表６及び図４より、ＣＰＺのｐＳＩ（ＵＶ＋）はｐＳＩ（ＵＶ−）と比較して統計的に有意な増加を確認した。よって、被験物質ＣＰＺは光アレルギー性陽性（対応のないｔ検定（Ｕｎｐａｉｒｅｄ−ｔ  ｔｅｓｔ）、ｐ＜０．０１）と判定された。
【００５５】
実施例２〜８
ＣＰＺの代わりに、表２に示す被験物質及び表７に示す試験用量を用いた以外は実施例１と同様に、本発明の（１）乃至（４）のステップに基づき試験した。
但し、被験物質を溶解する溶媒は、夫々、ステップ１は全物質の試験においてメタノールを用い、ステップ２以降の溶媒は６−ＭＣは７０％エタノール、ＴＣＳＡはＭＥＫ、その他の被験物質はＤＭＦを用いた。
結果を表７に示す。
【００５６】
表７．本発明による光安全性ＬＬＮＡ試験結果まとめ．
【表７】
2016102722.tif 000010
注）
ｐＳＩ：ｐｈｏｔｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ
Ｐ：陽性
Ｎ：陰性
表７中、＊：Ｐ＜０．０５  ＊＊：Ｐ＜０．０１（対応するＵＶ（−）群のｐＳＩに対して）
ｐＳＩ（ＵＶ−）＝（ＵＶ（−）の各動物のＤＰＭ）／（ＵＶ（−）の対応する対照溶媒の平均ＤＰＭ）
ｐＳＩ（ＵＶ＋）＝（ＵＶ（＋）の各動物のＤＰＭ）／（ＵＶ（＋）の対応する対照溶媒の平均ＤＰＭ）
【００５７】
また、表８に、本発明の試験方法による実施例１乃至８の被験物質の試験結果を、従来法による結果と比較する一覧を示す。
表８の結果から、本発明による光安全性試験の結果は、いずれも既報と一致した結果が得られた。
【００５８】
表８．本発明による試験結果の従来法との比較．
【表８】
2016102722.tif 000011
Ｎ：陰性、Ｐ：陽性、−：報告例なし
（既報：下記＊２参照）
【００５９】
また、世界各地域の光パッチテストの既知情報（下記＊２参照）があるＣＰＺ、６−ＭＣ及びＴＣＳＡに関して、ｐＳＩの比（ｐＳＩ比）、ｐＳＩ差、傾き比及びＰＡＦを算出し、定量的評価の検討を行った。結果を表９に示す。
表９より、実施例１、７及び１１の被験物質の試験結果と、従来報告されている光パッチテスト陽性率との比較から、本発明による光安全性試験の結果（ｐＳＩ比、ｐＳＩ差、傾き比及びＰＡＦ）は、世界各地で行われている従来の光パッチテストの陽性率の結果とよく相関する結果であることが示された。
【００６０】
表９．本発明による試験結果と、各地域における光パッチテストとの比較．
【表９】
2016102722.tif 000012
【００６１】
なお、従来法の試験結果は、下記の報告（＊２）を参照のこと。
＊２：既報
1.   Lujuan G, Yue H, Chunya N, Yu X, Li M, Shuxian Y,and Xia D. (2014) Retrospective Study of Photo Patch Testing in a Chinese Population During a 7-year Period. Dermatitis. 25, 22-26.
2.   Sai Yee Chuah, Yung Hian Leow, Anthony Teik Jin Goon, Colin Thiam Seng Theng,and Wei-Sheng Chong. (2013) Photo patch testing in Asians: a 5-year experiience in Singapore. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine 29,116-120.
3.  Paolo Daniele Pigatto, Gianpaolo Guzzi, Donatella Schena, Marcella Guarrera, Caterina Foti, Stefano Francalanci, Antonio Cristaudo, Fabio Ayala,and Colombina Vincenzi. (2008) Photopatch test: an Italian multicentre study from 2004 to 2006. Contact Dermatitis 59,103-108.
4. Jose Carlos Cardoso, Maria Miguel Canelas, Margarida Goncalo,and Americo Figueiredo. (2009) Photo patch testing with an extenede series of photoallergens: a 5-year study. Contact Dermatitis 60,325-329.
5.  Leigh Ann Scalf, Mark D.P. Davis, Audrey L. Rohlinger,and Suzanne M. Connolly. (2009) Photo patch Testing of 182 Patients: A 6-Year Experience at the Mayo Clinic. Dermatitis. 20, 44-52.
6.  Vinod K Sharma, Gomathy Sethuraman,and Arika Bansal(2007) Evaluation of 
photopatch test series in India. Contact Dermatitis 56,168-169.
7.  J de la Cuadra-Oyanguren, A Perez-Ferriols, M Lecha-Carrelero, AM Gimenez-Arnau, V Femandez-Redondo, FJ Ortiz de Frutos, JF Silvestre-Salvador,and E Serra-Baldrich. (2007) Results and Assessment of Photopatch Testing in Spain: Towards a New Standard Set of Photoallergens. Actas Dermosifiliogr 98, 96-101.
8.  A.M. Bryden, H. Moseley, S.H. Ibbotson, M.M.U. Chowdhury, M.H. Beck, J. Bourke, J. English, P. Farr, I.S. Foulds, D.J. Gawkrodger, S. George, D.I. Orton, S. Shaw, J. McFadden, P. Norris, P. Podmore, S. Powell, L.E. Rhodes, J. Sansom, M. Wilkinson, H. van Weelden,and J. Ferguson. (2006) Photo patch testing of 1155 patients: results of the U.K. multicentre photopatch study group. British Joumal of Dermatology 155,737-747.
9.  F. Leonard, H. Adamski, A. Bonnevalle, A. Bottlaender, J.-L. Bourrain, C. Goujon-Henry, D. Leroy, J.-R. Mancitet, M.-C.Marguery, J.-L. Peyron, P.Plantin, H. Roger, J.-L. Schmutz, G. Terrier, M. Vigan,and P. Bernard. (2005) Etude prospective multicentrique 1992-2001 de la batterie standard des photopatch-tests de la Societe Francaise de Photodermatologic. Ann Dermatol Venereol 132,313-320.
10.  Rohan B Crouch, Peter A Foley,and Christopher S Baker. (2002) Letter to the editor. The results of photopatch testing 172 patients to sunscreening agents at the photobiology clinic, St Vincent's Hospital, Melbourne. Australasian Journal of Dermatology 43, 74.
11.   Berit Berne,and Anne-Marie Ros. (1998) 7 years experience of photo patch testing with sunscreen allergens in Sweden. Contact Dermatitis. 38, 61-64.
12.   Vincent A. DeLeo, Sylvia M. Suarez, and Martha J. Maso. (1992) Results of Photo patch Testing in New York, 1985 to 1990. Arch Dermatol 128 1513-1518
13.   E. Holzle, N. Neumann, B. Hausen, B. Przybilla, S. Schauder, H. Honigsmann, A. Bircher, and G. Plewig. (1991) Photo patch testing: The 5-year experience of the German, Austrian, and Swiss Photopatch Test Group. Journal of the American Academy of Dermatology. 1, 59-68.
【００６２】
以上、本発明の実施例について詳述したが、本発明は、かかる特定の実施態様に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨の範囲において、種々の改良・変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明によれば、多くの期間及び費用を必要とするｉｎ  ｖｉｖｏ光安全性試験において、より取り扱いの容易なマウスを、より少ない動物数で実施でき、試験期間も短期間であり、また、試験費用もコストも抑えることができ、効果的に定量的な評価結果を得ることができる。
即ち、本発明の試験結果は、従来の定性的評価のみでなく、定量的評価も可能である利点も有する。
したがって、種々の医薬品、化粧品、生活用品その他の製品に対する光安全性試験に応用可能である。
【図１】
2016102722.tif 000013
【図２】
2016102722.tif 000014
【図３】
2016102722.tif 000015
【図４】
2016102722.tif 000016