(57)【要約】      （修正有）【課題】微細藻類を用いた抗しわ剤、腸管保護剤、血糖値上昇抑制剤、及び各種化合物の中間体等に利用される水酸化脂肪酸化合物の製造方法の提供。【解決手段】クロロサルシノプシス属に属する微細藻類を培養し、生成された水酸化脂肪酸化合物を回収し、水酸化脂肪酸化合物の製造方法であって、前記微細藻類が、特定の塩基配列の18S  rDNA、又は、特定の塩基配列に対して90％以上の相同性を有し、かつ特定の塩基配列の349位に相当する塩基がアデニンである18S  rDNA、を有する、水酸化脂肪酸化合物の製造方法。前記水酸化脂肪酸化合物が１０−ヒドロキシオクタデカン酸である製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロサルシノプシス（Chlorosarcinopsis）属に属する微細藻類を培養し、生成された水酸化脂肪酸化合物を回収する、水酸化脂肪酸化合物の製造方法であって、
前記微細藻類が、
配列番号１に示す塩基配列の18S  rDNA、又は、
配列番号１に示す塩基配列に対して90％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に示す塩基配列の349位に相当する塩基がアデニンである18S  rDNA、を有する、
水酸化脂肪酸化合物の製造方法。
【請求項２】
前記微細藻類が、クロロサルシノプシス・バストロピエンシス（Chlorosarcinopsis bastropiensis）、クロロサルシノプシス・アグレガータ（Chlorosarcinopsis aggregata）、クロロサルシノプシス・ディソシアータ（Chlorosarcinopsis dissociata）、クロロサルシノプシス・ミノー（Chlorosarcinopsis minor）、クロロサルシノプシス・アレニコーラ（Chlorosarcinopsis arenicola）、クロロサルシノプシス・エレミ（Chlorosarcinopsis eremi）、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサ（Chlorosarcinopsis gelatinosa）からなる群より選ばれる少なくとも１種の微細藻類である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ、及びクロロサルシノプシス・ミノーが有する18S  rDNAにおいて、
配列番号１に示す塩基配列の434位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の439位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の443位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の444位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の470位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の476位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の477位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の593位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の596位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の627位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の697位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の703位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の707位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1003位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、かつ
配列番号１に示す塩基配列の1316位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンである、
請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記18S  rDNAがさらに、
配列番号１に示す塩基配列の597位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1004位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1005位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1313位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1314位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1315位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1550位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、かつ
配列番号１に示す塩基配列の1551位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシスがクロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株、又は受託番号FERM  BP-22279で特定されるクロロサルシノプシス・バストロピエンシスであり、
前記クロロサルシノプシス・アグレガータがクロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株であり、
前記クロロサルシノプシス・ディソシアータがクロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株であり、
前記クロロサルシノプシス・ミノーがクロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株である、
請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記クロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサが有する18S  rDNAにおいて、
配列番号１に示す塩基配列の1456位に相当する塩基がチミンであり、かつ
配列番号１０に示す塩基配列の1744位に相当する塩基がシトシンである、
請求項２記載の方法。
【請求項７】
前記18S  rDNAがさらに、
配列番号１に示す塩基配列の1660位に相当する塩基がグアニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1661位に相当する塩基がシトシンであり、かつ
配列番号１に示す塩基配列の1662位に相当する塩基がシトシンである、
請求項５に項記載の方法。
【請求項８】
前記クロロサルシノプシス・アレニコーラがクロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株であり、
前記クロロサルシノプシス・エレミがクロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株であり、
前記クロロサルシノプシス・ゲラチノーサがクロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株である、
請求項２、５及び６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記水酸化脂肪酸化合物が10-ヒドロキシオクタデカン酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水酸化脂肪酸化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水酸化脂肪酸化合物は、抗しわ剤、真皮繊維芽細胞賦活剤、腸管保護剤、腸管バリア機能の損傷に起因する疾患の予防または改善剤としての利用や、PPAR（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体）活性化作用、血糖値上昇抑制作用、血中中性脂肪低下作用、耐糖機能改善作用、エネルギー代謝亢進作用などを有する代謝改善剤、機能性食品添加物としての利用が検討されている。また、水酸化脂肪酸化合物は香料、界面活性剤、抗菌剤、乳化剤、樹脂素材、潤滑油、塗料、熱可塑性樹脂の原料としての用途も考えられている。
【０００３】
トウダイグサ(Euphorbiaceae)科トウゴマ(Ricinus)属に属するトウゴマ(Ricinus communis)の種子に、水酸化脂肪酸化合物の１種であるリシノレイン酸が約90％含まれていることが知られている（非特許文献１参照）。
また、酵素を用いた水酸化脂肪酸の製造方法として、特許文献１には、バチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)由来の水酸化酵素を利用して大腸菌にα−水酸化脂肪酸を生産させる方法が記載されている。特許文献２には、植物由来の酵素を用いて形質転換体を作製し、基質であるオレイン酸から12-ヒドロキシオレイン酸を形質転換体に生産させる方法が記載されている。特許文献３には、乳酸菌由来の酵素を用いて、バイオ変換により水酸化脂肪酸を生産する方法が記載されている。
さらに、非特許文献２には、大型藻類である食用の海藻(Laminaria)に水酸化脂肪酸を生産させる方法が記載されている。
【０００４】
一方で、近年、バイオ燃料生産に有用であるとして微細藻類が注目を集めている。微細藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産できる。しかも、微細藻類は海藻などの食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、微細藻類は、他の植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告や、培養や脂質の抽出が容易であるとの報告もある（特許文献４参照）。
しかし、これまでに、微細藻類を用いた水酸化脂肪酸化合物の製造方法については未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１０−５１１７４号公報
【特許文献２】国際公開第９７／３０５８２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１３／１６８３１０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００７／０２５１４５号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】H．Mutlu  et  al.，Eur．J．Lipid  Sci．Technol.，Vol．112，p．10-30(2010)
【非特許文献２】Proteau，P．J．et  al.，LIPIDS，Vol．28(9)，p．783-787(1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、微細藻類を用いた水酸化脂肪酸化合物の製造方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、藻類の優れた脂質生産性に着目し、水酸化脂肪酸化合物の生産能力を有する微細藻類について鋭意探索を行った。その結果、緑藻綱のクロロサルシノプシス(Chlorosarcinopsis)属に属し、特定の塩基配列の18S  rDNAを有する微細藻類が、水酸化脂肪酸化合物を生産する能力を有することを見出した。そして、当該微細藻類を培養し、生成された水酸化脂肪酸化合物を回収することで、水酸化脂肪酸化合物を製造できることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて完成させるに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、クロロサルシノプシス属に属する微細藻類を培養し、生成された水酸化脂肪酸化合物を回収する、水酸化脂肪酸化合物の製造方法であって、前記微細藻類が、配列番号１に示す塩基配列の18S  rDNA、又は、配列番号１に示す塩基配列に対して90％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に示す塩基配列の349位に相当する塩基がアデニンである18S  rDNA、を有する、水酸化脂肪酸化合物の製造方法に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、微細藻類を用いて水酸化脂肪酸化合物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・バストロピエンシス(Chlorosarcinopsis bastropiensis)KSM-WA152株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムである。
【図２】クロロサルシノプシス・バストロピエンシスKSM-WA152株の顕微鏡写真を示す。
【図３】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムである（図中、矢印が水酸化脂肪酸のシグナルを示す）。
【図４】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・アレニコーラ(Chlorosarcinopsis arenicola)UTEX-1697株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムを示すである（図中、矢印が水酸化脂肪酸のシグナルを示す）。
【図５】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・エレミ(Chlorosarcinopsis eremi)UTEX-B1186株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムである（図中、矢印が水酸化脂肪酸のシグナルを示す）。
【図６】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・ディソシアータ(Chlorosarcinopsis dissociata)UTEX-LB948株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムである（図中、矢印が水酸化脂肪酸のシグナルを示す）。
【図７】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・アグレガータ(Chlorosarcinopsis aggregata)UTEX-B779株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムである（図中、矢印が水酸化脂肪酸のシグナルを示す）。
【図８】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・ミノー(Chlorosarcinopsis minor)UTEX-LB949株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムである（図中、矢印が水酸化脂肪酸のシグナルを示す）。
【図９】GC/MS(EI)分析より得られた、クロロサルシノプシス・ゲラチノーサ(Chlorosarcinopsis gelatinosa)UTEX-B1180株が生産した脂質のフラグメントパターンを示すクロマトグラムである（図中、矢印が水酸化脂肪酸のシグナルを示す）。
【図１０】クロロサルシノプシス属に属する微細藻類１４株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列に対してアライメント処理を行った結果を示す図である。
【図１１】クロロサルシノプシス属に属する微細藻類１４株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列に対してアライメント処理を行った結果を示す図である（図１０の続き）。
【図１２】クロロサルシノプシス属に属する微細藻類１４株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列に対してアライメント処理を行った結果を示す図である（図１１の続き）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の水酸化脂肪酸化合物の製造方法は、クロロサルシノプシス属に属する特定の微細藻類を用いるものである。そして、前記微細藻類は、配列番号１に示す塩基配列の18S  rDNA、又は、配列番号１に示す塩基配列に対して90％以上の相同性を有し、かつ配列番号１に示す塩基配列の349位に相当する塩基がアデニンである18S  rDNAを有する。このような微細藻類を培養し、生成された水酸化脂肪酸化合物を回収することで、水酸化脂肪酸化合物を製造することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本明細書において「水酸化脂肪酸化合物」とは、水酸化脂肪酸単体又はその塩、及び構成脂肪酸として水酸化脂肪酸を含有する化合物を含む概念である。
前記水酸化脂肪酸単体とは水酸基を構造式中に持つ脂肪酸を意味する。その具体例としては、10-ヒドロキシオクタデカン酸（10-hydroxyoctadecane；C20H35O3）が挙げられる。
前記の、構成脂肪酸として水酸化脂肪酸を含有する化合物の具体例としては、例えば水酸化脂肪酸と１価のアルコールとのエステル、水酸化脂肪酸とグリセリンとのエステル（油脂）等が挙げられる。なお、前記「油脂」とは、水酸化脂肪酸とグリセリンとの、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドのような中性脂質をいう。
本発明において前記水酸化脂肪酸化合物は、10-ヒドロキシオクタデカン酸、又は10-ヒドロキシオクタデカン酸を構成脂肪酸として含むモノグリセリド、ジグリセリド若しくはトリグリセリドが好ましく、10-ヒドロキシオクタデカン酸がより好ましい。
【００１４】
本発明で用いる微細藻類は、配列番号１に示す塩基配列の18S  rDNA、又は、配列番号１に示す塩基配列に対して90％以上の相同性を有する塩基配列の18S  rDNAを有する。ここで配列番号１に示す塩基配列は、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX1698株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。本発明において、配列番号１に示す塩基配列に対する相同性は91％以上が好ましく、92％以上がより好ましく、93％以上がより好ましく、94％以上がより好ましく、95％以上がより好ましく、96％以上がより好ましく、97％以上がより好ましく、98％以上がさらに好ましく、99％以上が特に好ましい。さらに、配列番号１に示す塩基配列において１若しくは数個、好ましくは１〜１６８個、より好ましくは１〜１５１個、より好ましくは１〜１３４個、より好ましくは１〜１１７個、より好ましくは１〜１００個、より好ましくは１〜８４個、より好ましくは１〜６７個、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜３３個、最も好ましくは１〜１６個、の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されている塩基配列、の18S  rDNAを有する微細藻類も包含する。
本発明において、塩基配列の相同性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，227，p．1435）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Search  homology）プログラムを用いて、パラメーターであるUnit  size  to  compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００１５】
前述した、配列番号１に示す塩基配列に対して90％以上の相同性を有する塩基配列としては、配列番号６〜１２に示す塩基配列が挙げられる。ここで、配列番号６に示す塩基配列は、後述するクロロサルシノプシス・バストロピエンシスKSM-WA152株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。配列番号７に示す塩基配列は、クロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。配列番号８に示す塩基配列は、クロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。配列番号９に示す塩基配列は、クロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。配列番号１０に示す塩基配列は、クロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。配列番号１１に示す塩基配列は、クロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。そして配列番号１２に示す塩基配列は、クロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列である。
なお、配列番号１に記載の塩基配列に対する、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号１、アクセッション番号：DQ009758）、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスKSM-WA152株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号６）、クロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号７、アクセッション番号：AB218695）、クロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号８、アクセッション番号：AB218702）、クロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号９、アクセッション番号：AB049415）、クロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号１０、アクセッション番号：AB218701）、クロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号１１、アクセッション番号：AB218706）、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列（配列番号１２、アクセッション番号：AB218707）の相同性を表１に示す。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
なお、本発明で用いる微細藻類が有する18S  rDNAの塩基配列及びその相同性について、配列番号１に示す塩基配列に基づいて説明した。しかし、配列番号１に代えて、配列番号６〜１２のいずれかで示す塩基配列に基づいて18S  rDNAの塩基配列及びその相同性を規定することもできる。
【００１８】
さらに、本発明で用いる微細藻類が有する18S  rDNAにおいて、配列番号１に示す塩基配列の349位に相当する塩基がアデニンである。後述の実施例で示すように、水酸化脂肪酸化合物の生産能を有するクロロサルシノプシス属に属する微細藻類はいずれも、配列番号１に示す塩基配列の349位に相当する塩基がアデニンである18S  rDNAを有する。
本明細書において「相当する」とは、配列解析プログラムを用いて２以上のDNA配列をアライメントした場合に、特定のDNA配列の特定の位置の塩基に対してアライメントされる他のDNA配列の塩基及びその位置を意味する。配列解析プログラムとしては、好ましくGENETYX  WIN  ver．9.0（商品名、ソフトウエア開発社製）が挙げられる。
【００１９】
前述した18S  rDNAを有し、本発明の水酸化脂肪酸化合物の製造方法に用いることができる微細藻類としては、クロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ、クロロサルシノプシス・ミノー、クロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサが挙げられる。
【００２０】
さらに、前記微細藻類のうちクロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ、及びクロロサルシノプシス・ミノーが有する18S  rDNAは、下記(1)〜(15)を満たすものであることが好ましい。後述の実施例で示すように、これらの微細藻類はいずれも、下記(1)〜(15)を満たす18S  rDNAを有する。
(1)配列番号１に示す塩基配列の434位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである。
(2)配列番号１に示す塩基配列の439位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンである。
(3)配列番号１に示す塩基配列の443位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンである。
(4)配列番号１に示す塩基配列の444位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである。
(5)配列番号１に示す塩基配列の470位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンである。
(6)配列番号１に示す塩基配列の476位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンである。
(7)配列番号１に示す塩基配列の477位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである。
(8)配列番号１に示す塩基配列の593位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(9)配列番号１に示す塩基配列の596位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(10)配列番号１に示す塩基配列の627位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである。
(11)配列番号１に示す塩基配列の697位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(12)配列番号１に示す塩基配列の703位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(13)配列番号１に示す塩基配列の707位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(14)配列番号１に示す塩基配列の1003位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(15)配列番号１に示す塩基配列の1316位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンである。
【００２１】
さらに前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ、及びクロロサルシノプシス・ミノーが有する18S  rDNAは、下記(21)〜(28)を満たすものであることが好ましい。後述の実施例で示すように、これらの微細藻類はいずれも、下記(21)〜(28)を満たす18S  rDNAを有する。
(21)配列番号１に示す塩基配列の597位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンである。
(22)配列番号１に示す塩基配列の1004位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(23)配列番号１に示す塩基配列の1005位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンである。
(24)配列番号１に示す塩基配列の1313位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである。
(25)配列番号１に示す塩基配列の1314位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンである。
(26)配列番号１に示す塩基配列の1315位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンである。
(27)配列番号１に示す塩基配列の1550位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである。
(28)配列番号１に示す塩基配列の1551位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである。
【００２２】
本発明で用いることができる微細藻類としては、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株、クロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株、クロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株、クロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカ合衆国テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The  University  of  Texas  at  Austin，The  Culture  Collection  of  Algae（UTEX）、University  Station  A6700，Austin，TX  78712-0183，U．S．A．）より入手することができる。
【００２３】
本発明で用いることができる別の微細藻類としては、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスKSM-WA152株と命名し、受託番号FERM  BP-22279で特定されるクロロサルシノプシス・バストロピエンシスが挙げられる。受託番号FERM  BP-22279で特定されるクロロサルシノプシス・バストロピエンシスは、２０１４年１０月２日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
受託番号FERM  BP-22279で特定されるクロロサルシノプシス・バストロピエンシスは、藻類学上の下記の（ｉ）〜（ｖ）の性質を有し、かつ水酸化脂肪酸化合物を生産する能力を有する。
（ｉ）核の有無：有
（ｉｉ）鞭毛装置の有無：無
（ｉｉｉ）細胞サイズ：５μｍ〜１０μｍ（図２参照）
（ｉｖ）細胞の色：緑色
（ｖ）コロニーの色：濃緑色（寒天培地上）
さらに、受託番号FERM  BP-22279で特定されるクロロサルシノプシス・バストロピエンシスは、配列番号６に示す塩基配列の18S  rDNAを有する。
【００２４】
前記微細藻類のうちクロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサが有する18S  rDNAは、下記(31)及び(32)を満たすものであることが好ましい。後述の実施例で示すように、これらの微細藻類はいずれも、下記(31)及び(32)を満たす18S  rDNAを有する。
(31)配列番号１に示す塩基配列の1456位に相当する塩基がチミンである。
(32)配列番号１０に示す塩基配列の1744位に相当する塩基がシトシンである。
【００２５】
さらに前記クロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサが有する18S  rDNAは、下記(41)〜(43)を満たすものであることが好ましい。後述の実施例で示すように、これらの微細藻類はいずれも、下記(41)〜(43)を満たす18S  rDNAを有する。
(41)配列番号１に示す塩基配列の1660位に相当する塩基がグアニンである。
(42)配列番号１に示す塩基配列の1661位に相当する塩基がシトシンである。
(43)配列番号１に示す塩基配列の1662位に相当する塩基がシトシンである。
【００２６】
本発明で用いることができる微細藻類としては、クロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株、クロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株、クロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカ合衆国テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The  University  of  Texas  at  Austin，The  Culture  Collection  of  Algae（UTEX）、University  Station  A6700，Austin，TX  78712-0183，U．S．A．）より入手することができる。
【００２７】
本明細書において、「水酸化脂肪酸化合物の生産能力」とは、培養液及び藻体を合わせて、乾燥藻体1g当たり、遊離水酸化脂肪酸に換算して200μg以上、好ましくは1mg以上、より好ましくは5mg以上の水酸化脂肪酸化合物を生産できる能力を言う。
【００２８】
本発明において、微細藻類の培養は、一般的な培養条件により行うことができる。例えば適当な淡水用の培地中で、光照射下、微細藻類の培養に用いられる一般的培養手段により、本発明の微細藻類の培養を行うことができる。
培地は適宜選択することができ、具体例としてはAF6培地、C培地、URO培地、VT培地及びWA培地が挙げられる。例えば、C培地をベースに、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類等を添加した培地を使用することができる。ここで、窒素源としては、NaNO3、Ca(NO3)2などが挙げられる。リン源としては、グリセロリン酸ナトリウムなどが挙げられる。金属塩としては、KCl、MgSO4、H3BO3、MnCl2、FeCl3、CoCl2などが挙げられる。ビタミン類としては、Biotin、Vitamin  B12、Thiamine-HClなどが挙げられる。好ましい培地としては、後述の実施例に示すＷＡ培地が挙げられる。
上記の培地は、適当な酸又は塩基を加えることによりpHを7.0〜8.0の範囲内に調整することが好ましい。また、オートクレーブ等により殺菌又は精密ろ過等により除菌して使用することが好ましい。
【００２９】
培地に接種する微細藻類の量は適宜設定することができる。例えば、培養培地当りの接種量は1.0〜10.0%（vol/vol）が好ましく、1.0〜5.0%（vol/vol）がより好ましい。
培養温度は、微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲で適宜設定することができる。例えば、一般的には10℃以上30℃以下で行うのが好ましく、15℃以上25℃以下がより好ましい。また、屋外施設において培養する場合は成り行きであってもよい。
【００３０】
本発明の微細藻類の培養では光合成をできるように、光照射をしながら微細藻類を培養することが好ましい。この場合の光源としては、人工光又は太陽光の何れでもよい。また、光照度は、1,000ルクス以上5,000ルクス以下が好ましく、2,000ルクス以上4,000ルクス以下がより好ましい。
前記微細藻類の培養において、連続して光照射を行ってもよいし、明暗周期を設定して光照射を行ってもよい。明暗周期を設定して光照射を行う場合、光照射の間隔は適宜設定することができる。例えば、24時間のうち明暗周期を設定することが好ましい。具体的には、24時間のうち、明期は好ましくは8時間以上24時間未満、より好ましくは10時間以上18時間以下、さらに好ましくは12時間である。
【００３１】
培養時のpHは適宜設定することができ、一般的には6.5以上8.0以下であり、好ましくはpH7.0以上8.0以下である。
培養期間は適宜設定することができ、水酸化脂肪酸化合物を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖するよう適宜設定することが好ましい。例えば7日以上120日以下、好ましくは7日以上30日以下、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養すればよい。
前記微細藻類の培養装置は、屋内装置及び屋内施設のいずれであってもよい。また、回分培養、連続培養等のから任意の培養形式を選択することができる。そして、本発明の微細藻類が増殖可能な装置、施設及び培養形式を選択して、前記微細藻類を培養することができる。
【００３２】
培養終了後、遠心分離法や濾過などの常法により、藻体を分離し、分離藻体をそのままもしくは超音波やダイノミル等によって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール、メタノール、酢酸エチル等の有機溶剤による溶剤抽出を行うことにより、水酸化脂肪酸化合物を回収することができる。
なお、構成脂肪酸として水酸化脂肪酸を含有する化合物から水酸化酸を分離するには、常法により混合脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの状態とした後、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法あるいは超臨界クロマトグラフィー法などにより濃縮採取することにより行うことができる。
【００３３】
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の、水酸化脂肪酸化合物の製造方法を開示する。
【００３４】
＜１＞クロロサルシノプシス属に属する微細藻類を培養し、生成された水酸化脂肪酸化合物を回収する、水酸化脂肪酸化合物の製造方法であって、
前記微細藻類が、
配列番号１、及び６〜１２のいずれかで示す塩基配列の18S  rDNA、又は、
配列番号１、及び６〜１２のいずれかで示す塩基配列に対して90％以上、好ましくは91％以上、より好ましくは92％以上、より好ましくは93％以上、より好ましくは94％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは96％以上、より好ましくは97％以上、さらに好ましくは98％以上、特に好ましくは99％以上、の相同性を有し、かつ配列番号１に示す塩基配列の349位に相当する塩基がアデニンである18S  rDNA、を有する、
水酸化脂肪酸化合物の製造方法。
【００３５】
＜２＞前記微細藻類が、クロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ、クロロサルシノプシス・ミノー、クロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサからなる群より選ばれる少なくとも１種の微細藻類である、前記＜１＞項記載の方法。
【００３６】
＜３＞前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ、及びクロロサルシノプシス・ミノーが有する18S  rDNAにおいて、
配列番号１に示す塩基配列の434位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の439位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の443位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の444位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の470位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の476位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の477位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の593位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の596位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の627位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の697位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の703位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の707位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1003位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、かつ
配列番号１に示す塩基配列の1316位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンである、
前記＜２＞項記載の方法。
＜４＞前記18S  rDNAがさらに、
配列番号１に示す塩基配列の597位の塩基又はそれに相当する塩基がグアニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1004位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1005位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1313位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1314位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1315位の塩基又はそれに相当する塩基がシトシンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1550位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンであり、かつ
配列番号１に示す塩基配列の1551位の塩基又はそれに相当する塩基がチミンである、
前記＜３＞項記載の方法。
＜５＞前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシスがクロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株、又は受託番号FERM  BP-22279で特定されるクロロサルシノプシス・バストロピエンシスであり、前記クロロサルシノプシス・アグレガータがクロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株であり、前記クロロサルシノプシス・ディソシアータがクロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株であり、前記クロロサルシノプシス・ミノーがクロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株である、前記＜２＞〜＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞受託番号FERM  BP-22279で特定される前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシスが下記の（ｉ）〜（ｖ）の性質を有する、前記＜５＞項記載の方法。
（ｉ）核の有無：有
（ｉｉ）鞭毛装置の有無：無
（ｉｉｉ）細胞サイズ：５μｍ〜１０μｍ
（ｉｖ）細胞の色：緑色
（ｖ）コロニーの色：濃緑色（寒天培地上）
＜７＞前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株が、配列番号１に示す塩基配列の18S  rDNAを有し、
受託番号FERM  BP-22279で特定される前記クロロサルシノプシス・バストロピエンシスが、配列番号６に示す塩基配列の18S  rDNAを有し、
前記クロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株が、配列番号７に示す塩基配列の18S  rDNAを有し、
前記クロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株が、配列番号８に示す塩基配列の18S  rDNAを有し、
前記クロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株が、配列番号９に示す塩基配列の18S  rDNAを有する、
前記＜５＞又は＜６＞項記載の方法。
【００３７】
＜８＞前記クロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサが有する18S  rDNAにおいて、
配列番号１の18SrDNA配列の1456位に相当する塩基がチミンであり、かつ
配列番号１０に示す塩基配列の1744位に相当する塩基がシトシンである、
前記＜２＞項記載の方法。
＜９＞前記18S  rDNAがさらに、
配列番号１に示す塩基配列の1660位に相当する塩基がグアニンであり、
配列番号１に示す塩基配列の1661位に相当する塩基がシトシンであり、かつ
配列番号１に示す塩基配列の1662位に相当する塩基がシトシンである、
前記＜８＞項記載の方法。
＜１０＞前記クロロサルシノプシス・アレニコーラがクロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株であり、前記クロロサルシノプシス・エレミがクロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株であり、前記クロロサルシノプシス・ゲラチノーサがクロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株である、前記＜２＞、＜８＞及び＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞前記クロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株が、配列番号１０に示す塩基配列の18S  rDNAを有し、
前記クロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株が、配列番号１１に示す塩基配列の18S  rDNAを有し、
前記クロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株が、配列番号１２に示す塩基配列の18S  rDNAを有する、
前記＜１０＞項記載の方法。
【００３８】
＜１２＞前記水酸化脂肪酸化合物が10-ヒドロキシオクタデカン酸、又は10-ヒドロキシオクタデカン酸を構成脂肪酸として含むモノグリセリド、ジグリセリド若しくはトリグリセリド、好ましくは10-ヒドロキシオクタデカン酸、である、前記＜１＞〜＜１１＞項のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞水酸化脂肪酸化合物の生産量が、乾燥藻体1g当たり、遊離水酸化脂肪酸に換算して200μg以上、好ましくは1mg以上、より好ましくは5mg以上、である、前記＜１＞〜＜１２＞項のいずれか１項に記載の方法。
＜１４＞窒素源、リン源、金属塩及びビタミン類を含有する淡水用の培地中で、前記クロロサルシノプシス属に属する微細藻類を培養する、前記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１５＞AF6培地、C培地、URO培地、VT培地及びWA培地からなる群より選ばれる少なくとも１種の培地を用いて前記クロロサルシノプシス属に属する微細藻類を培養する、前記＜１＞〜＜１４＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１６＞連続して光照射を行いながら前記クロロサルシノプシス属に属する微細藻類を培養する、前記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１７＞24時間のうち明暗周期を設定して光照射を行いながら前記クロロサルシノプシス属に属する微細藻類を培養するものであって、24時間のうち、明期を8時間以上24時間未満、好ましくは10時間以上18時間以下、より好ましくは12時間、とする、前記＜１＞〜＜１６＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１８＞前記クロロサルシノプシス属に属する微細藻類の培養時の培地のpHが6.5以上8.0以下、好ましくはpH7.0以上8.0以下、である、前記＜１＞〜＜１７＞のいずれか１項に記載の方法。
＜１９＞前記クロロサルシノプシス属に属する微細藻類の培養時間が7日以上120日以下、好ましくは7日以上30日以下、である、前記＜１＞〜＜１８＞のいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４０】
試験例１
（１）水酸化脂肪酸化合物を生産する能力を有する微細藻類のスクリーニング
下記表２記載の各成分を蒸留水に添加して調製したWA培地2mLと日本全国各地の土壌の小スパチュラ１杯分を24穴マイクロプレート（AGCテクノグラス社製）に投入し、25℃、湿度40%、照度3,000ルクスで、12時間明暗条件にて2週間培養を行い、微細藻類の存在確認を実施した。
微細藻類の存在が確認された培養液500μLを表２記載のWA培地10mLに接種し、試験管にて、同じ培養条件にて培養を行った。培養液10mLより、藻体を遠心分離により回収し、1.5mLのクロロホルム：メタノール（2:1）にて藻体より脂質を抽出した。
【００４１】
【表２】
2016123408.tif 000003
【００４２】
抽出した脂質を常法によりメチル化し、7-ペンタデカノン（Alfa  Aesar社製）を内部標準として、GC/MS（カラム；DB-WAX（J&W  scientific社製）、装置；7890GC/5975MSD（Agilent  technology社製）、カラム温度；50℃  2分→50〜200℃  12.5℃／分  昇温→200〜230℃  1.5℃／分  昇温、注入口温度；250℃、Aux温度；250℃、キャリアガス；He、流速0.7mL/分、サンプル注入量；1μL）により得られた脂質の分析を行った。なお、得られたMSスペクトルについて、AOCS（The  American  Oil  Chemists’Society）のライブラリーを参考に解析を行った。
予備的な解析の結果水酸化脂肪酸を生産している可能性が認められた株を単離し、KSM-WA152株とした。
【００４３】
（２）KSM-WA152株が生産する脂肪酸の確認
単離したKSM-WA152株の培養には、前述のWA培地を用いた。
培養容器に滅菌した100mL容三角フラスコ（PYREX（登録商標）製）と綿栓（アズワン製製、商品名：CS-28）を使用し、フィルターユニット（ナルジェヌンク製）を用いろ過滅菌した培地50mLを三角フラスコに分注した。pHはNaOHにて7.5に調整した。
予め同液体培地により継代培養していたKSM-WA152株の培養液1mLを新しい培地に接種し、20℃、蛍光灯下、照度3,000ルクス、12時間明暗条件下で静置培養した。なお、pHはNaOHにて7.5になるよう適宜調整した。
培養により得られた沈殿画分を80℃にて約3〜16時間乾燥させ、乾燥藻体とした。
【００４４】
得られた乾燥藻体の重量を測定後、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノンを10μL添加後、クロロホルム1.0mL及びメタノール0.5mLを培養液に添加して激しく攪拌後15分間放置した。その後1.5%KCl  0.5mLを添加して攪拌後、3000rpm、15分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層約50μLに窒素ガスを吹き付けて乾固し、テトラヒドロフラン（和光純薬社製）50μL及びナトリウムメトキシド（和光純薬社製）0.5mLを添加し、35℃で90分恒温した。続いてイソオクタン0.4mL及び飽和食塩水0.5mLを添加して攪拌後、3000rpm、10分遠心分離を行い、上層であるイソオクタン層を回収し、脂肪酸エステルを得た。
【００４５】
得られた脂肪酸エステルの同定を行った。脂肪酸エステルの同定は、ガスクロマトグラフ質量分析計（GC/MS）により、下記の条件で行った。また、脂肪酸エステルの同定は、National  Institute  of  Standards  and  Technology（NIST）社及びThe  American  Oil  Chemists’Society（AOCS）社のデータベースに記載の各種脂肪酸のマススペクトル情報を参考に行った。
【００４６】
装置：6890A（Agilent社製）
カラム：DB-WAX  20m×0.1mm×0.1μm（J&W  scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム（流速0.7mL/分）
昇温プログラム：50℃（2分）、200℃（12.5分）、230℃（1.5分）
注入口検出器温度：250℃
注入法：スプリットレスモード
サンプル注入量：1μL
キャリアガス：ヘリウム
【００４７】
GC/MS（EI）分析より得られたクロマトグラム（図１）のフラグメントパターンを上記データベースより検索した結果、試料に含まれる成分として10-ヒドロキシオクタデカン酸が同定された。その結果、KSM-WA152株の培養中に水酸化脂肪酸化合物の生産を確認することができた。なお、得られた10-ヒドロキシオクタデカン酸の収量は、乾燥藻体1gあたり遊離水酸化脂肪酸に換算して12mgであった。
【００４８】
以上の結果から、本発明で用いる微細藻類は水酸化脂肪酸化合物を生産することがわかる。
【００４９】
（３）KSM-WA152株の形態学的性質
藻類学における分類手法に基づき、取得した水酸化脂肪酸生産能を有するKSM-WA152株の同定を行った。その結果、下記に示した形態より緑色植物門に属する微細藻類であることが推定された。なお、KSM-WA152株の顕微鏡写真を図２に示す。
（ｉ）核の有無：有
（ｉｉ）鞭毛装置の有無：無
（ｉｉｉ）細胞サイズ：5μm〜10μm（培養期間が長くなると細胞のサイズも多少大きくなる
（ｉｖ）細胞の色：緑色
（ｖ）コロニーの色：濃緑色（寒天培地上）
【００５０】
（４）KSM-WA152株の化学分類学的性質
さらに、取得した水酸化脂肪酸生産能を有するKSM-WA152株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列より、化学分類学的性質の検討を行った。
【００５１】
KSM-WA152株を単離培養した試験管から培養液500μLを回収し、NucleoSpin  Soil（商品名、MACEREY-NAGEL社製）を用いてプロトコールに従いゲノムDNAを調製した。
【００５２】
Lim，E．L．et  al.，Appl．Environ．Microbiol.，59(5)，p．1647-1655（1993）、及びK，Romari．et  al.，Limonol．Oceanogr.，49(3)，p．784-798（2004）に記載の情報、並びにNBRC  NITE  Biological  Resource  Center社の18S  rDNA情報を元に塩基配列のアライメントを行い、18S  rDNA遺伝子増幅用のユニバーサルプライマーのデザインを行った。各ユニバーサルプライマーの塩基配列を表３に示す。
【００５３】
【表３】
2016123408.tif 000004
【００５４】
配列番号２及び３のプライマーを用い、KSM-WA152株のDNAをテンプレートとし、18S  rDNAをKOD-Plus-Ver.2（商品名、TOYOBO社製）のプロトコールに従いPCRを行った。具体的には、94℃にて2分間保温した後、98℃にて10秒間、次いで55℃にて30秒間、更に68℃にて2分間保温処理する処理を30サイクル行った後、次操作に供するまで4℃にて保管した。
PCR  product  purification  kit（商品名、Roche社製）を用いて得られたPCR産物の精製を行った。溶出には滅菌水100μLを用いた。
【００５５】
BigDye  Terminator  Cycle  Sequencing  Kit  ver．3.1（商品名、Applied  Biosystems社製）と3100xl  DNA  Sequencer（商品名、Applied  Biosystems社製）を用いて、得られたPCR産物の塩基配列の確認を行った。上記で調製したPCR産物を鋳型として、配列番号３及び４のシークエンスプライマーを用いて反応を行った。精製にはMontage  SEQ96  Sequencing  Reaction  Cleanup  Kit（商品名、MILLIPORE社製）を用いた。塩基配列の解析はGENETYX  WIN  ver．9.0（商品名、ソフトウエア開発社製）を用いた。得られた塩基配列はBLAST（http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）を用いてホモロジー検索を行った。
【００５６】
得られた18S  rDNA遺伝子の塩基配列を指標とした分子系統解析を行ったところ、既知のクロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX1698株の18S  rDNA遺伝子（配列番号１）の17〜1689位の塩基配列と100％一致した。その結果、微細藻類の分類上の特性より得られる同定結果と同じく、単離したKSM-WA152株はクロロサルシノプシス・バストロピエンシスであることが確かめられた。
なお、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスKSM-WA152株は、２０１４年１０月２日付で、受託番号FERM  BP-22279にて独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託されている。
【００５７】
試験例２
前述のクロロサルシノプシス・バストロピエンシスKSM-WA152株と同属株の水酸化脂肪酸の生成能について確認するため、アメリカ合衆国テキサス大学藻類カルチャーコレクション（The  University  of  Texas  at  Austin，The  Culture  Collection  of  Algae（UTEX）、University  Station  A6700，Austin，TX  78712-0183，U．S．A．）よりクロロサルシノプシス同属株１３株（クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株、クロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株、クロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株、クロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株、クロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株、クロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株、クロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株、クロロサルシノプシス・バリアビリス（Chlorosarcinopsis variabilis）UTEX-1599株、クロロサルシノプシス・ディフィシエンス（Chlorosarcinopsis dificiens）UTEX-B1700株、クロロサルシノプシス・センパービレンス（Chlorosarcinopsis sempervirens）UTEX-1703株、クロロサルシノプシス・シュードミノー（Chlorosarcinopsis pseudominor）UTEX-B1702株、クロロサルシノプシス・オーソトロフィカ（Chlorosarcinopsis auxotrophica）UTEX-B723株、及びクロロサルシノプシス・ミヌタ（Chlorosarcinopsis minuta）UTEX-1701株）を入手した。
さらに、独立行政法人国立環境研究所微生物系統保存施設（日本国茨城県つくば市小野川１６−２）よりクロロサルシボプシス同属株１株（クロロサルシノプシス・デリカタ（Chlorosarcinopsis delicata）NIES-153株）を入手した。
入手したこれらの微細藻類の培養を行った。
【００５８】
微細藻類の培養には、前述のWA培地を用いた。
培養容器に滅菌した100mL容三角フラスコ（PYREX（登録商標）製）と綿栓（アズワン製製、商品名：CS-28）を使用し、フィルターユニット（ナルジェヌンク製）を用いろ過滅菌した培地50mLを三角フラスコに分注した。pHはNaOHにて7.5に調整した。
予め同液体培地により継代培養していた前述の微細藻類の培養液1mLを新しい培地に接種し、20℃、蛍光灯下、照度3,000ルクス、12時間明暗条件下で静置培養した。なお、pHはNaOHにて7.5になるよう適宜調整した。
培養により得られた沈殿画分を80℃にて約3〜16時間乾燥させ、乾燥藻体とした。
【００５９】
得られた乾燥藻体の重量を測定後、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノンを10μL添加後、クロロホルム1.0mL及びメタノール0.5mLを培養液に添加して激しく攪拌後15分間放置した。その後1.5%KCl  0.5mLを添加して攪拌後、3000rpm、15分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
得られたクロロホルム層約50μLに窒素ガスを吹き付けて乾固し、テトラヒドロフラン（和光純薬社製）50μL及びナトリウムメトキシド（和光純薬社製）0.5mLを添加し、35℃で90分恒温した。続いてイソオクタン0.4mL及び飽和食塩水0.5mLを添加して攪拌後、3000rpm、10分遠心分離を行い、上層であるイソオクタン層を回収し、脂肪酸エステルを得た。
【００６０】
得られた脂肪酸エステルの同定を試験例１と同様に行った。
クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株、クロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株、クロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株、クロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株、クロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株、クロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株、及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株については、GC/MS（EI）分析より得られたクロマトグラム（図３〜９）のフラグメントパターンを前記データベースより検索した結果、試料に含まれる成分として10-ヒドロキシオクタデカン酸が同定された（矢印を付したピーク）。その結果、クロロサルシノプシス・バストロピエンシスUTEX-B1698株（図３）、クロロサルシノプシス・アレニコーラUTEX-1697株（図４）、クロロサルシノプシス・エレミUTEX-B1186株（図５）、クロロサルシノプシス・ディソシアータUTEX-LB948株（図６）、クロロサルシノプシス・アグレガータUTEX-B779株（図７）、クロロサルシノプシス・ミノーUTEX-LB949株（図８）、クロロサルシノプシス・ゲラチノーサUTEX-B1180株（図９））の培養中に水酸化脂肪酸化合物の生産を確認することができた。
以上の結果から、前述のクロロサルシノプシス同属株７株は、水酸化脂肪酸化合物の生産能を有することが確かめられた。
【００６１】
一方、クロロサルシノプシス・バリアビリスUTEX-1599株、クロロサルシノプシス・ディフィシエンスUTEX-B1700株、クロロサルシノプシス・センパービレンスUTEX-1703株、クロロサルシノプシス・シュードミノーUTEX-B1702株、クロロサルシノプシス・オーソトロフィカUTEX-B723株、クロロサルシノプシス・ミヌタUTEX-1701株、及びクロロサルシノプシス・デリカタNIES-153株については、GC/MS（EI）分析より得られたクロマトグラム（図示せず）からは、水酸化脂肪酸の生成は確認されなかった。
【００６２】
試験例３
試験例２で用いた微細藻類１４株の18S  rDNA遺伝子に対して、下記の方法により塩基配列解析を行った。
【００６３】
National  Center  for  Biotechnology  Information社（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）に登録されている前記微細藻類１４株の18S  rDNAの塩基配列を用い、GENETYX  WIN  ver．9.0（商品名、ソフトウエア開発社製）のParallel  Editor処理により各配列を並べ、さらにMultiple  Alignment処理を行うことで配列のアライメント処理を施した（図１０〜１２参照）。
なお、各微細藻類株の18S  rDNA塩基配列のアクセション番号は以下である。
＜アクセション番号＞
クロロサルシノプシス・アレニコーラ；AB218701
クロロサルシノプシス・バリアビリス；AB218704
クロロサルシノプシス・ゲラチノーサ；AB218707
クロロサルシノプシス・エレミ；AB218706
クロロサルシノプシス・バストロピエンシス；DQ009758
クロロサルシノプシス・アグレガータ；AB218695
クロロサルシノプシス・ディソシアータ；AB218702
クロロサルシノプシス・ミノー；AB049415
クロロサルシノプシス・ミヌタ；AB218698
クロロサルシノプシス・センパービレンス；AB218713
クロロサルシノプシス・ディフィシエンス；AB218697
クロロサルシノプシス・シュードミノー；AB218714
クロロサルシノプシス・オーソトロフィカ；AB218696
クロロサルシノプシス・デリカタ；AB218710
なお、クロロサルシノプシス・オーソトロフィカUTEX-B723株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号１３に示す。また、クロロサルシノプシス・デリカタNIES-153株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号１４に示す。また、クロロサルシノプシス・ディフィシエンスUTEX-B1700株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号１５に示す。また、クロロサルシノプシス・ミヌタUTEX-1701株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号１６に示す。また、クロロサルシノプシス・シュードミノーUTEX-B1702株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号１７に示す。また、クロロサルシノプシス・センパービレンスUTEX-1703株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号１８に示す。また、クロロサルシノプシス・バリアビリスUTEX-1599株の18S  rDNA遺伝子の塩基配列を配列番号１９に示す。
【００６４】
図１０及び下記表４に示すように、水酸化脂肪酸を生産するクロロサルシノプシス属に属する微細藻類はそれぞれ、配列番号１に示す塩基配列の349位の塩基又はそれに相当する塩基がアデニンあることが確認された。当該塩基は水酸化脂肪酸生産能の無い他のクロロサルシノプシス属に属する微細藻類とは異なり、本発明で用いる微細藻類のみが有する性質であることが判明した。
【００６５】
【表４】
2016123408.tif 000005
【００６６】
また、図１０〜１２及び下記表５〜７に示すように、本発明で用いることができるクロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ及びクロロサルシノプシス・ミノーとの間で、配列番号１に示す塩基配列の434位の塩基、439位の塩基、443位の塩基、444位の塩基、470位の塩基、476位の塩基、477位の塩基、593位の塩基、596位の塩基、627位の塩基、697位の塩基、703位の塩基、707位の塩基、1003位の塩基及び1316位の塩基、又はこれらの塩基に相当する塩基が共通していることが確認された。これらの塩基は他のクロロサルシノプシス属に属する微細藻類とは異なり、水酸化脂肪酸化合物生産能を有するクロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ及びクロロサルシノプシス・ミノーが有する共通の性質であることが判明した。
さらに、クロロサルシノプシス・バストロピエンシス、クロロサルシノプシス・アグレガータ、クロロサルシノプシス・ディソシアータ及びクロロサルシノプシス・ミノーとの間で、配列番号１に示す塩基配列の597位の塩基、1004位の塩基、1005位の塩基、1313位の塩基、1314位の塩基、1315位の塩基、1550位の塩基及び1551位の塩基、又はこれらの塩基に相当する塩基が共通していることも確認された。
【００６７】
【表５】
2016123408.tif 000006
【００６８】
【表６】
2016123408.tif 000007
【００６９】
【表７】
2016123408.tif 000008
【００７０】
さらに、図１２及び下記表８に示すように、本発明で用いることができるクロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサとの間で、配列番号１に示す塩基配列の1456位の塩基及び配列番号１０に示す塩基配列の1744位の塩基、又はこれらの塩基に相当する塩基が共通していることが確認された。これらの塩基は他のクロロサルシノプシス属に属する微細藻類とは異なり、水酸化脂肪酸化合物生産能を有するクロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサが有する共通の性質であることが判明した。
さらに、クロロサルシノプシス・アレニコーラ、クロロサルシノプシス・エレミ及びクロロサルシノプシス・ゲラチノーサとの間で、配列番号１に示す塩基配列の1660位の塩基、1661位の塩基及び1662位に相当する塩基、又はこれらの塩基に相当する塩基が共通していることも確認された。
【００７１】
【表８】
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【００７２】
以上のように、水酸化脂肪酸化合物生産能を有するクロロサルシノプシス属に属する微細藻類について、18S  rDNAの塩基配列の性質を特定することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明で用いる微細藻類は、水酸化脂肪酸化合物生産能を有する。したがって、該微細藻類より生産される水酸化脂肪酸化合物は、各種工業用原料として、また医療・健康食品として利用できる。さらに、本発明の製造方法は緑藻を用いるため、二酸化炭素を排出せず、環境負荷のない炭化水素生産システムとして非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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