(57)【要約】      （修正有）【課題】簡易な操作で短時間にイチゴうどんこ病菌の検出する方法及び他のイチゴ重要病害の病原菌と同時に検出する方法の提供。【解決手段】イチゴ植物体から得たＤＮＡを試料とし、特定の配列を有するプライマーペアを用いてＤＮＡ増幅を行うことにより、イチゴうどんこ病菌を検出する方法、及び上記プライマーペアとイチゴ病原菌検出用プライマーペアを組み合わせて使用し、イチゴうどんこ病菌と、炭疽病菌、萎黄病菌及び疫病菌から選択される１種以上の菌と、を一度に検出する方法の提供。【選択図】図３
2016220651.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、イチゴうどんこ病菌（Sphaerotheca aphanis）の検出方法：
１）イチゴ植物体から得られたＤＮＡと、配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアを用いてＤＮＡを増幅する工程； および
２）得られたＤＮＡ増幅産物を検出する工程。
【請求項２】
配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアを含む、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出用キット。
【請求項３】
以下の工程を含む、イチゴ病害の病原菌の検出方法：
１）イチゴ植物体から得られたＤＮＡ、ａ）配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、および以下のｂ）〜ｅ）からなる群より選択される１種以上のプライマーペアを用いてＤＮＡを増幅する工程：
ｂ）配列番号３もしくは９に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｃ）配列番号４に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｄ）配列番号５に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、および
ｅ）配列番号７に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア； ならびに
２）得られたＤＮＡ増幅産物を検出する工程。
【請求項４】
イチゴ病害の病原菌の検出用キットであって、ａ）配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、ならびに以下のｂ）〜ｅ）からなる群より選択される１種以上のプライマーペアを含むキット：
ｂ）配列番号３もしくは９に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｃ）配列番号４に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｄ）配列番号５に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、および
ｅ）配列番号７に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア。
【請求項５】
イチゴ病害の病原菌が、Fusarium oxysporum、Glomerella cingulata、Phytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorumからなる群より選択される１種以上の菌とSphaerotheca aphanisとを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
イチゴ病害の病原菌が、Fusarium oxysporum、Glomerella cingulata、Phytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorumからなる群より選択される１種以上の菌とSphaerotheca aphanisとを含む、請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、イチゴうどんこ病菌（Sphaerotheca aphanis）の検出方法および該方法に用いるプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
うどんこ病は、炭疽病および萎黄病と共にイチゴの３大重要病害に数えられる。イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）は寄主特異性が高く、イチゴからイチゴにしか感染しない。イチゴうどんこ病は、発病すると葉、茎、果実等に白い粉状の胞子が形成され、空気感染によって急激に感染が広がる難防除病害である。果実にうどんこ病が発生すると、果実の肥大が悪くなり、果色や味が低下するため、商品価値が失われ、生産者にとって大きな被害をもたらし得る。
【０００３】
イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）は比較的低温性の糸状菌である。イチゴの秋定植作型の場合、育苗期である夏期は高温のため、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）に感染していても菌の活動が抑制されて無病徴となるが、育苗が終わり定植した後の低温期において潜在感染株が一気に発病して被害が生じるケースがある。定植前にうどんこ病感染の有無を早期に診断して感染株を排除することが重要であるが、発病していない潜在感染株を目視で検出することは実質的に不可能である。また、従来の植物病害診断法は原因菌の分離や培養等に多くの時間と手技の熟練を必要とする。特に、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）は絶対寄生菌であり人工培養が不可能なため、従来法によるうどんこ病の診断は非常に困難である。
【０００４】
非特許文献１は、イチゴおよびキク病原菌の核ｒＤＮＡ−ＩＴＳ領域の塩基配列と属特異的プライマーの設計について開示している。しかし、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を特異的に検出するプライマーは作成されていない。
【０００５】
かかる背景から、簡便な操作で短時間のうちにイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を検出する方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】奈良県農業技術センター研究報告  第32号、9-18頁（2001年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願の目的の一つは、簡易な操作で短時間にイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を検出する方法を提供することである。また、本願の別の目的は、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を他のイチゴ重要病害の病原菌と同時に検出する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願は、イチゴ植物体から得たＤＮＡを試料とし、特定の配列を有するプライマーを用いてＤＮＡ増幅を行うことにより、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を検出する方法を提供する。具体的には、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様１）以下の工程を含む、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出方法：
１）イチゴ植物体から得られたＤＮＡと、配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアを用いてＤＮＡを増幅する工程、および
２）得られたＤＮＡ増幅産物を検出する工程。
【０００９】
また、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様２）配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアを含む、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出用キット。
【００１０】
また、本願は、本願発明の発明者らが開発したイチゴ病原菌検出用プライマー（特許第5522820号に記載）と上記特定の配列を有するプライマーを組み合わせて使用し、イチゴのうどんこ病菌（S. aphanis）、炭疽病菌（Glomerella cingulata）、萎黄病菌（Fusarium oxysporum）および疫病菌（Phytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorum）を一度に検出する方法を提供する。具体的には、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様３）以下の工程を含む、イチゴ病害の病原菌の検出方法：
１）イチゴ植物体から得られたＤＮＡ、ａ）配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、および以下のｂ）〜ｅ）からなる群より選択される１種以上のプライマーペアを用いてＤＮＡを増幅する工程：
ｂ）配列番号３もしくは９に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｃ）配列番号４に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｄ）配列番号５に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、および
ｅ）配列番号７に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア； ならびに
２）得られたＤＮＡ増幅産物を検出する工程。
【００１１】
また、本願は以下に記載する態様を提供する：
（態様４）イチゴ病害の病原菌の検出用キットであって、ａ）配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、ならびに以下のｂ）〜ｅ）からなる群より選択される１種以上のプライマーペアを含むキット：
ｂ）配列番号３もしくは９に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｃ）配列番号４に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
ｄ）配列番号５に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、および
ｅ）配列番号７に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に示すオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア。
【発明の効果】
【００１２】
本願に係るイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出方法により、手技の熟練等を必要とせず、簡易な操作で短時間にイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を特異的に検出することが可能になる。また、病徴が表れる前（潜在感染）のイチゴ植物体からイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を検出することができ、防除や感染株の除去などの対策を早期に行うことが可能になる。さらに、本願に係るイチゴ病害の病原菌の検出方法により、イチゴ重要病害の病原菌である炭疽病菌、萎黄病菌および疫病菌をイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）と同時に検出することができ、イチゴ栽培における病害対策を効率化することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、イチゴうどんこ病発病株の写真である。
【図２】図２は、イチゴうどんこ病発病株の葉から得たＤＮＡとS. aphanis検出用プライマーペアを用いるＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅産物を示す。
【図３】図３は、５種類の糸状菌ＤＮＡと各糸状菌に特異的なプライマーペアを用いてＰＣＲを行った結果を示す。「菌５種類」はS. aphanis、F. oxysporum、G. cingulata、P. nicotianaeおよびP. cactorumのＤＮＡの混合物を指し、「プライマー８種類」はPapF4、FGC-R、FoxyF6、Gcin1、PnicF2、PnicR1、Pcac1およびPcacR1を指す。
【図４】図４は、５種類の糸状菌ＤＮＡと各糸状菌に特異的なプライマーペアを用いてＰＣＲを行った結果を示す。「菌５種類」はS. aphanis、F. oxysporum、G. cingulata、P. nicotianaeおよびP. cactorumのＤＮＡの混合物を指し、「プライマー８種類」はPapF4、FGC-R、FoxyF6、Gcin1、PnicF2、PnicR1、Pcac1およびPcacR1を指す。
【図５】図５は、イチゴうどんこ病潜在感染株の葉から抽出したＤＮＡを用い、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行ってS. aphanisを検出した実験結果を示す。
【図６】図６は、イチゴうどんこ病潜在感染株の親苗、子苗および孫苗における様々な部位から抽出したＤＮＡを用い、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行ってS. aphanisを検出した実験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
（態様１）イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出方法
本願が提供する態様１は、イチゴ植物体から得られたＤＮＡを試料とし、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅法においてイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）に特異的なＤＮＡ増幅産物をもたらすプライマーペア（以下、「Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペア」とも称する）を用いてＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡ増幅産物を検出することにより、イチゴ植物体におけるうどんこ病菌（S. aphanis）の存在を検出する方法である。
【００１５】
イチゴ植物体からのＤＮＡ取得方法
増幅反応に供するＤＮＡは、公知のＤＮＡ抽出方法（例えばフェノール・クロロホルム法、ＣＴＡＢ法等）を用いて、イチゴ植物体の組織から抽出することができる。これにより、イチゴのＤＮＡと共に、該組織の表面または内部に存在する菌（例えばイチゴうどんこ病菌（S. aphanis））のＤＮＡが抽出される。また、市販のＤＮＡ抽出キット（例えば、illustra DNA Extraction Kit PHYTOPURE (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)を用いてＤＮＡ抽出を行ってもよい。
【００１６】
ＤＮＡ抽出に供する組織は特に限定されず、地上部であっても地下部であってもよい。例えば、葉、茎、果実、ランナー、根、クラウン等からＤＮＡを抽出することができる。また、ＤＮＡ抽出に用いるサンプル量や抽出条件は、抽出の方法や抽出に供する組織に応じて適宜決定できる。
【００１７】
ＤＮＡ増幅方法
本願において用いるＤＮＡ増幅方法は、特定のプライマーペアを用いて、試料中に存在するＤＮＡ分子に含まれる特定の領域（塩基配列）を増幅する方法であれば特に限定されない。典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法、Science, 230:1350-1354,1985)によりＤＮＡを増幅することができる。
反応系におけるプライマーの濃度は、目的のＤＮＡ配列を増幅し得る条件であれば特に制限されない。例えば、プライマーは０．１〜２μＭの濃度で使用することができる。
【００１８】
ＰＣＲの方法および条件
ＰＣＲ法において、温度サイクル、ＤＮＡポリメラーゼおよび反応液の組成（ｄＮＴＰや緩衝液）等の条件は、目的とする配列が増幅される限り、特に限定されない。例えば、次のサイクル条件でＰＣＲ反応を行うことができる： [９４℃で５分］を１回、次いで［９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒］のサイクルを３５回反復し、［７２℃で７分］を１回行った後、４℃に冷却して終了。
ＰＣＲ反応は、当該分野において公知のサーマルサイクラー、例えばTaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(登録商標) TP600 Gradientを用いて行うことができる。
使用し得るＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
ＤＮＡ増幅産物の検出方法
ＤＮＡ増幅工程によって得られたＤＮＡ増幅産物の検出方法は、特に限定されないが、例えば電気泳動法を用いることができる。電気泳動法としては、アガロースゲル電気泳動法の他、キャピラリー電気泳動法等が挙げられる。
【００２０】
一つの好ましい態様において、ＰＣＲ後の反応液をアガロースゲルにアプライして電気泳動を行い、ＤＮＡ染色試薬を用いて該ゲルを染色することにより、目的のＤＮＡ増幅産物を検出することができる。ＤＮＡ染色試薬としては、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲ(登録商標)Ｇｒｅｅｎ等が挙げられるが、これらに限定されない。一方、キャピラリー電気泳動を用いる場合は、通常、染色試薬ではなくＵＶ−ＶＩＳ検出器にてＤＮＡ増幅産物を検出できる。
【００２１】
態様１において用い得るプライマーの特徴を以下に記載する。
Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペアとしては、ａ１）配列番号１に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号１において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、ａ２）配列番号２に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せが挙げられる。一つの好ましい態様において、Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペアは、配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。
【００２２】
Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペアは、真菌のｒＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）およびその内部転写スペーサー（ＩＴＳ）領域、より具体的には18S rDNA、ITS I、5.8S rDNA、ITS IIおよび26S rDNAからなる領域（以下、「rDNA-ITS領域」とも称する）に含まれる塩基配列を増幅するよう設計されている。
【００２３】
イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）のＤＮＡを試料とし、上記Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペア（例えば配列番号１に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチド）を用いてＤＮＡ増幅を行うと、通常、１６６ｂｐの増幅産物が得られる。イチゴ植物体から得たサンプルにおいて検出されたＤＮＡ増幅産物が当該サイズ（塩基配列長）を有していれば、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）が存在すると結論付けることができる。但し、同一種内におけるstrain間の変異等により増幅産物のサイズは変動し得るため、１６６ｂｐには限定されない。目的とする領域（イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）のrDNA-ITS領域）内の配列が増幅されたかどうかは、ＤＮＡ増幅産物の配列を解読することにより確認できる。
【００２４】
（態様２）イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出用キット
本願が提供する態様２は、上記態様１と同じSphaerotheca aphanis検出用プライマーペアを用いてイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を検出するためのキットである。具体的使用方法としては、キットに含まれるSphaerotheca aphanis検出用プライマーペアを、試料ＤＮＡ（例えばイチゴ植物体から得られたもの）と共にＤＮＡ増幅反応に供して、得られたＤＮＡ増幅産物を検出することにより、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を検出することができる。
該キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液等のＰＣＲ反応液を通常構成する各種成分をさらに含むものであってもよい。あるいは、該キットは、上記態様１に用いるSphaerotheca aphanis検出用プライマーペアのみからなるものであってもよい。
【００２５】
（態様３）イチゴ病害の病原菌の検出方法
本願が提供する態様３は、イチゴ植物体から得られたＤＮＡを試料とし、２種以上の病原菌検出用プライマーペアを用いてＤＮＡを増幅し、得られたＤＮＡ増幅産物を検出することにより、イチゴ植物体における２種以上の病原菌の存在を検出する方法である。
より具体的には、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅法において萎黄病菌（Fusarium oxysporum）に特異的なＤＮＡ増幅産物をもたらすプライマーペア（以下、「Fusarium oxysporum検出用プライマーペア」とも称する）、炭疽病菌（Glomerella cingulata）に特異的なＤＮＡ増幅産物をもたらすプライマーペア（以下、「Glomerella cingulata検出用プライマーペア」とも称する）、疫病菌（Phytophthora nicotianae）に特異的なＤＮＡ増幅産物をもたらすプライマーペア（以下、「Phytophthora nicotianae検出用プライマーペア」とも称する）、および別の疫病菌（Phytophthora cactorum）に特異的なＤＮＡ増幅産物をもたらすプライマーペア（以下、「Phytophthora cactorum検出用プライマーペア」とも称する）から選択される１種以上のプライマーペアを、上記Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペアと組み合わせて用いることにより、上記萎黄病菌（F. oxysporum）、炭疽病菌（G. cingulata）および疫病菌（P. nicotianae、P. cactorum）のうち１種以上と、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）とを同時に検出することができる。
【００２６】
Fusarium oxysporum検出用プライマーペアとしては、ｂ１）配列番号３もしくは９に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号３もしくは９において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、ｂ２）配列番号２に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せが挙げられる。一つの好ましい態様において、Fusarium oxysporum検出用プライマーペアは、配列番号３に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。別の好ましい態様において、Fusarium oxysporum検出用プライマーペアは、配列番号９に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。
【００２７】
Glomerella cingulata検出用プライマーペアとしては、ｃ１）配列番号４に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号４において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、ｃ２）配列番号２に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号２において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せが挙げられる。一つの好ましい態様において、Glomerella cingulata検出用プライマーペアは、配列番号４に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号２に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。
【００２８】
Phytophthora nicotianae検出用プライマーペアとしては、ｄ１）配列番号５に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号５において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、ｄ２）配列番号６に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号６において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せが挙げられる。一つの好ましい態様において、Phytophthora nicotianae検出用プライマーペアは、配列番号５に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号６に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。
【００２９】
Phytophthora cactorum検出用プライマーペアとしては、ｅ１）配列番号７に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号７において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、ｅ２）配列番号８に示すオリゴヌクレオチド、または配列番号８において１個、２個もしくは３個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとの組合せが挙げられる。一つの好ましい態様において、Phytophthora cactorum検出用プライマーペアは、配列番号７に示すオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に示すオリゴヌクレオチドからなるものである。
【００３０】
態様３におけるイチゴ植物体からのＤＮＡ取得方法、ＤＮＡ増幅方法（ＰＣＲの方法および条件を含む）、およびＤＮＡ増幅産物の検出方法は態様１と同様である。温度サイクル条件中のアニーリング温度は、ＤＮＡ増幅反応に用いる複数のプライマーペアの全てについて目的のＤＮＡ増幅産物が得られるよう設定する。当該技術分野における通常の知識に基づけば、用いる各プライマーのＴｍ値を考慮して適切なアニーリング温度を決定することができる。
【００３１】
態様３において用い得る各プライマーペアは、rDNA-ITS領域を増幅のターゲットとし、Sphaerotheca aphanis、Fusarium oxysporum、Glomerella cingulata、Phytophthora nicotianaeおよびPhytophthora cactorumの各々に特異的なＤＮＡ増幅産物をもたらすよう設計されている。該プライマーペアを用いて得られるＤＮＡ増幅産物のサイズ（塩基配列長）が、これら病原菌の種類に対応する。検出対象の病原菌、好適なプライマーペア、および典型的な増幅産物のサイズの対応関係を表１に示す。また、好適なプライマーの配列を表２に例示する。
【００３２】
【表１】
2016220651.tif 000003
【００３３】
【表２】
2016220651.tif 000004
【００３４】
表１に示す通り、本願において用いる病原菌検出用プライマーペアは、ＤＮＡ増幅産物を通常の条件で電気泳動した場合に検出されるバンドのサイズが重ならないよう設計されているため、表１に示す５種類の病原菌を一度に検出することができる。
なお、増幅産物のサイズは同一種内におけるstrain間の変異等により変動し得るため、表１に示すサイズには限定されないが、他の種の病原菌に由来する増幅産物と区別できるサイズである限り、病原菌の検出には影響しない。目的とする領域（対象病原菌のrDNA-ITS領域）内の配列が増幅されたかどうかは、ＤＮＡ増幅産物の配列を解読することにより確認できる。
【００３５】
（態様４）イチゴ病害の病原菌の検出用キット
本願が提供する態様４は、上記態様３と同じ病原菌検出用プライマーペアを用いて、萎黄病菌（F. oxysporum）、炭疽病菌（G. cingulata）および疫病菌（P. nicotianae、P. cactorum）のうち１種以上と、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）とを同時に検出するためのキットである。具体的使用方法としては、キットに含まれる病原菌検出用プライマーペアを、試料ＤＮＡ（例えばイチゴ植物体から得られたもの）と共にＤＮＡ増幅反応に供して、得られたＤＮＡ増幅産物を検出することにより、上記イチゴ病害の病原菌を検出することができる。
該キットは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよび緩衝液等のＰＣＲ反応液を通常構成する各種成分をさらに含むものであってもよい。あるいは、該キットは、上記態様３に用いる２種以上の病原菌検出用プライマーペアのみからなるものであってもよい。
【００３６】
本願の態様１および３の方法は、病原菌特異的プライマーペアを用いるＤＮＡ増幅工程の前に、真菌のrDNA-ITS領域の全部または一部を増幅するプライマーペアを用いてＤＮＡを増幅する工程をさらに含むものであってもよい。
【００３７】
例えば、病徴を示していない潜在感染株から取得したサンプル等、病原菌由来のＤＮＡ量が十分でない場合に、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行って検出感度を増大させることができる。より具体的には、真菌のrDNA-ITS領域の全部または一部を増幅するユニバーサルプライマー、例えばITS5: 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'（配列番号１０）およびITS4: 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（配列番号１１）を用いて第一段階目のＰＣＲを行った後、得られた増幅産物をテンプレートとして病原菌特異的プライマーペアによる第二段階目のＰＣＲを行うことにより、少量のサンプルから病原菌特異的なＤＮＡ増幅産物を得ることができる。
【００３８】
例えば、本願の態様１および３の方法は、１）イチゴ植物体から得られたＤＮＡと真菌のrDNA-ITS領域の全部または一部を増幅するプライマーペアを用いてＤＮＡを増幅する工程、２）工程１）で得られたＤＮＡ増幅産物と病原菌特異的プライマーペアを用いてＤＮＡを増幅する工程、および３）工程２）で得られたＤＮＡ増幅産物を検出する工程を含むものであり得る。
【００３９】
真菌のrDNA-ITS領域の全部または一部を増幅するプライマーペアとしては、例えばITS5（配列番号１０）とITS4（配列番号１１）の組合せ、およびITS1: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'（配列番号１２）とITS4（配列番号１１）の組合せが挙げられる。
【００４０】
病原菌特異的プライマーペアとしては、上記Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペア、または、Fusarium oxysporum検出用プライマーペア、Glomerella cingulata検出用プライマーペア、Phytophthora nicotianae検出用プライマーペアおよびPhytophthora cactorum検出用プライマーペアから選択される１種以上のプライマーペアとSphaerotheca aphanis検出用プライマーペアとの組合せが挙げられ、これらは例えば表１に示されるプライマーペアから選択し得る。
【００４１】
以下、実施例により、本願が提供する態様を説明する。
【実施例】
【００４２】
１．供試試料
イチゴうどんこ病発病株および潜在感染株（感染していても外見上は発病が認められない株）は、徳島県立農林水産総合技術支援センターから入手した。図１は発病株の写真を示す。
【００４３】
２．イチゴうどんこ病発病株からのＤＮＡ抽出
イチゴうどんこ病を発病したイチゴ苗の葉０．２ｇからＤＮＡの抽出を行った。抽出は、植物ＤＮＡ抽出キット illustra DNA Extraction Kit PHYTOPURE (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)を用いて以下のような手順で行った。葉の一部をはさみで切り取り、それをさらに細かく切り、乳鉢に入れた。１，５００μＬのｒｅａｇｅｎｔ １を加え、乳鉢ですり潰した後、７００μＬを採って１．５ｍＬ用マイクロチューブに移した。１．５ｍＬ用マイクロチューブ中の細胞破砕液に２００μＬのｒｅａｇｅｎｔ ２を加え、上下をよく反転し混合後、６５℃に設定したアルミバス中で２０分間インキュベートし、２〜３分ごとによく振って攪拌した。その後、氷中で２０分間静置し、−２０℃の冷クロロホルム５００μＬとＰｈｙｔｏＰｕＲｅ ｒｅｓｉｎを１００μＬ加え、室温で１０分間上下を反転させながら混合した。５，０００ｒｐｍで遠心し、上層（ＤＮＡ層）を滅菌済の新しい１．５ｍＬ用マイクロチューブに移した。冷イソプロパノールを６００μＬ加え、攪拌してＤＮＡを析出させた。ＤＮＡのペレットを得るため、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を捨てた。７０％エタノールを３００μＬ加え、再び１２，０００  ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。真空ポンプで２分間真空状態においてＤＮＡの沈殿を乾燥させた。ＤＮＡの沈殿は５０μＬの０．１×ＴＥ ｂｕｆｆｅｒを加えてピペッティングにより溶解した後、−２０℃で保存した。
【００４４】
３．プライマーの設計
プライマーの設計は、データベースに登録されているイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）のｒＤＮＡおよびそのＩＴＳ領域の配列を基に行なった。既存のイチゴ病原菌検出用プライマー（特許第5522820号に記載）と同程度のＴｍ値を有すること、ならびに、該イチゴ病原菌検出用プライマーと併用した場合に非特異的な増幅産物が生じず、且つ、S. aphanisのＤＮＡから生じる増幅産物の長さがF. oxysporum、G. cingulata、P. nicotianaeおよびP. cactorumのＤＮＡから生じる増幅産物と明確に区別できる長さであることを条件として種々のプライマー配列を検討した。その結果、これらの条件を満たすものとして以下の塩基配列からなるプライマーを見出し、Sphaerotheca aphanis検出用プライマーペアとして以後の実験に用いた。実験に用いたＰＣＲプライマーは日本遺伝子研究所（仙台市）に合成を依頼したものであり、品質はゲルろ過精製品である。
フォワード側
PapF4： 5’-AGAACATCCTCTCAAGCCTGA-3’（配列番号１）
リバース側
FGC-R： 5’-TTCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’（配列番号２）
【００４５】
４．ＤＮＡの増幅および検出
（１）ＰＣＲによるＤＮＡ増幅
ＰＣＲキット PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads（GE Healthcare, Buckinghamshire, UK）を用いて酵素やヌクレオチドを含むＰＣＲ反応液を調製した。具体的には、１反応分の試薬を含むビーズが入ったチューブにＤＮＡ抽出液を０．５μＬ、２．５ｐｍｏｌ／μＬ（２．５μＭ）のプライマーを各２．５μＬずつ（最終濃度０．２５μＭ）加え、滅菌水を１９．５μＬ加えて合計で２５μＬになるように混合した。サーマルサイクラーを用いて次の条件でＰＣＲを行った：［変性過程：９４℃で５分］を１回、次に［変性過程：９４℃で３０秒、アニーリング：５５℃で３０秒、伸長反応：７２℃で３０秒］のサイクルを３５回繰り返し、その後、［伸長反応：７２℃で７分］を１回行った後、４℃に冷却して終了させた。サーマルサイクラーは、TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice(登録商標) TP600 GradientまたはTP650 Standard（タカラバイオ、大津市）を用いた。
【００４６】
（２）ＤＮＡ増幅産物の検出（電気泳動）
電気泳動装置Ｍｕｐｉｄ−２（コスモ・バイオ、東京）を用い、ＰＣＲ産物を２．０％のアガロースゲルにアプライし、１×ＴＡＥ ｂｕｆｆｅｒ中を１００Ｖで３０分泳動することにより、ＤＮＡ断片を展開した。このアガロースゲルの作成には Agarose for 150-1500 bp fragment（ナカイラテスク株式会社、京都）を使用した。泳動終了後、１００ｍＬの蒸留水に５ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドを１２μＬ加えた染色液にゲルを移し、２０分静置して染色した。染色後、紫外線を照射し、ＤＮＡ断片の蛍光をデジタルカメラで撮影した。
【００４７】
５．イチゴうどんこ病発病株からの病原菌検出
上記の方法に従い、イチゴうどんこ病発病株から得たＤＮＡ抽出液とプライマーPapF4（配列番号１）およびFGC-R（配列番号２）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ増幅産物を電気泳動してアガロースゲル上で検出した。その結果、単一のバンド（ＤＮＡ増幅産物）が検出された（図２）。このＤＮＡ増幅産物をシーケンスしたところ、rDNA-ITS領域に含まれる長さ１６６ｂｐの配列であった。
一方、GenBankに登録されているS. aphanisのrDNA-ITS領域の配列（配列番号１３、GenBank Accession No. GU942442、18S rDNAと26S rDNAは部分配列）に基づくと、プライマーPapF4およびFGC-Rにより生じる増幅産物の長さは１６５ｂｐであると予測される。そこで、本実施例で用いたイチゴうどんこ病発病株から得たＤＮＡのrDNA-ITS領域（18S rDNAと26S rDNAは部分配列）とGenBank GU942442の塩基配列を比較した。その結果、両者の配列が９９．３％（５３３塩基中５２９塩基）一致したことから、本実施例で検出された病原菌がS. aphanisであることを確認できた。
【００４８】
６．マルチプライマーＰＣＲによる病原菌検出
本実験では、本願のSphaerotheca aphanis検出用プライマーと特許第5522820号に記載のイチゴ病原菌検出用プライマーを併用して、炭疽病菌（G. cingulata）、萎黄病菌（F. oxysporum）および疫病菌２種（P. nicotianaeおよびP. cactorum）の４種を、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）と同時に検出できるかどうかを検証した。
【００４９】
上記病原菌（S. aphanisを除く）をＰＤＡ培地で培養した後、illustra DNA Extraction Kit PHYTOPURE (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)を用いてＤＮＡを抽出した。各菌株のＤＮＡを１０ｎｇ／μＬに調整し、ＰＣＲの反応液に０．５μＬを加えた。また、S. aphanisのＤＮＡ試料として、上記イチゴうどんこ病発病株から得たＤＮＡ抽出液をＰＣＲ反応液に０．５μＬ加えた。使用したプライマーは、Sphaerotheca aphanis検出用プライマーPapF4（配列番号１）およびFGC-R（配列番号２）、Fusarium oxysporum検出用プライマーFoxyF6（配列番号３）、Glomerella cingulata検出用プライマーGcin1（配列番号４）、Phytophthora nicotianae検出用プライマーPnicF2（配列番号５）およびPnicR1（配列番号６）、ならびにPhytophthora cactorum検出用プライマーPcac1（配列番号７）およびPcacR1（配列番号８）であり、各々最終濃度が０．２５μＭとなるように反応液に加えた。ＰＣＲおよび電気泳動の条件は上記「４．ＤＮＡの増幅および検出」に記載したものと同様とした。なお、FGC-RはSphaerotheca aphanis検出用プライマーペア、Fusarium oxysporum検出用プライマーペアおよびGlomerella cingulata検出用プライマーペアに共通である。
【００５０】
図３および４に結果を示す。図３のレーン１〜５は、反応液に上記５種類の糸状菌ＤＮＡを混合した状態で、各糸状菌に特異的な１種類のプライマーペアのみを反応液に加えて各々ＰＣＲを行った結果である。図４のレーン１〜５は、各々１種類ずつの糸状菌ＤＮＡを含む反応液に、上記５種類の糸状菌を検出する上記プライマーの全てを混合してＰＣＲを行った結果である。図３および４におけるレーン６は、上記５種類の糸状菌ＤＮＡと全てのプライマーを混合して行ったＰＣＲの結果である。図３および４いずれの場合でも、各菌に特異的な増幅産物が得られ、かつ、非特異的な増幅産物はみられなかったことから、本願のイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）検出用プライマーペアPapF4およびFGC-Rは、マルチプライマーＰＣＲによって他のイチゴ病原菌と同時にS. aphanisを検出できることが示された。
【００５１】
７．潜在感染株からのイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出
うどんこ病潜在感染状態のイチゴでは、発病株とは異なり、イチゴうどんこ病菌（S. aphanis）のＤＮＡがわずかな量しか得られない。そこで、検出感度を上げるためにｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行なった。
【００５２】
具体的には、ＰＣＲ反応を以下の手順で行った。真菌のrDNA-ITS領域の一部を増幅するユニバーサルプライマーITS5およびITS4（White et al. 1990）を用いて１回目のＰＣＲを行った。かかるプライマーの配列は次の通りである。
ITS5： 5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'（配列番号１０）
ITS4： 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'（配列番号１１）
反応終了後、反応液を１０倍希釈したものを２回目のＰＣＲに用いた。２回目のＰＣＲは、Sphaerotheca aphanis検出用プライマー（PapF4とFGC-Rの組み合わせ）を用い、上記「４．ＤＮＡの増幅および検出」に記載した方法で行なった。
【００５３】
図５は、潜在感染が疑われるイチゴ苗４株から葉を採取し、ＤＮＡを抽出して上述のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行った結果を示す。４株ともS. aphanis由来の増幅産物（１６６ｂｐ）が得られた事から、本願のSphaerotheca aphanis検出用プライマーペアを用いたＰＣＲにより潜在感染株からのイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出が可能であることが証明された。
【００５４】
８．垂直感染の検証実験
イチゴうどんこ病潜在感染株を親苗とし、該親苗のランナーから子苗を、さらに該子苗から孫苗を作り、かかる子苗および孫苗に移動したイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を本願のSphaerotheca aphanis検出用プライマーペアを用いたＰＣＲにより検出できるかどうかを検証した。また、これらの苗ではそれぞれ葉、クラウン、根およびランナー（孫苗を除く）を試料としてＤＮＡの抽出を行った。抽出を行った組織の湿重量は次の通りである。
[親苗]  葉：0.06 g、クラウン：0.07 g、根：0.12 g、ランナー：0.13 g
[子苗]  葉：0.06 g、クラウン：0.07 g、根：0.07 g、ランナー：0.07 g
[孫苗]  葉：0.07 g、クラウン：0.05 g、根：0.03 g
【００５５】
ＤＮＡの抽出は上記「２．イチゴうどんこ病発病株からのＤＮＡ抽出」で述べた方法により行った。このＤＮＡ抽出液を用いて、上記「７．潜在感染株からのイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出」で述べたｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによりS. aphanis感染の有無を調べた。
【００５６】
実験の結果、図６に示すように子苗や孫苗でも葉においてS. aphanis特異的ＤＮＡ増幅産物（１６６ｂｐ）が検出されたことから、S. aphanisは潜在感染株からランナーを介して垂直感染することが示された。また、葉以外の組織からもS. aphanisが検出された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本願に係るイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）の検出方法により、手技の熟練等を必要とせず、簡易な操作で短時間にイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を特異的に検出することが可能になる。また、発病前（潜在感染株）の段階でイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）を検出することができ、防除や感染株の除去などの対策を早期に行うことが可能になる。さらに、本願に係るイチゴ病害の病原菌の検出方法により、イチゴ重要病害の病原菌である炭疽病菌（G. cingulata）、萎黄病菌（F. oxysporum）および疫病菌（P. nicotianae、P. cactorum）をイチゴうどんこ病菌（S. aphanis）と同時に検出することができ、イチゴ栽培における病害対策を効率化することが可能となる。
【００５８】
参考文献
White TJ, Bruns T, Lee SB, Taylor J (1990) Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Gelfand M, Sninsky D, White T （eds） PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, pp 315-322.
【図１】
2016220651.tif 000005
【図２】
2016220651.tif 000006
【図３】
2016220651.tif 000007
【図４】
2016220651.tif 000008
【図５】
2016220651.tif 000009
【図６】
2016220651.tif 000010
【配列表】
2016220651000001.app