(57)【要約】      （修正有）【課題】糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法及びそのキットを提供する。【解決手段】被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose]polymerase 14、などから成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を設ける。【選択図】図１７
2016188761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法であって、
被験者の尿を含む試料を用い、
afamin、alpha-1-acid  glycoprotein  1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin  III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig  alpha-1  chain  C  region、NADPH:adrenodoxin  oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose]  polymerase  14、probable  E3  ubiquitin-protein  ligase  TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal  protein  S27a、WAP  four-disulfide  core  domain  protein  2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有する
ことを特徴とする糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法。
【請求項２】
糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法であって、
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、antithrombin  III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig  alpha-1  chain  C region、WAP  four-disulfide  core  domain  protein  2、alpha-1-acid  glycoprotein  1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有する
請求項１に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法。
【請求項３】
糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出するキットであって、
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain  C  region、NADPH:adrenodoxin  oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose]polymerase  14、probable  E3  ubiquitin-protein  ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal  protein  S27a、WAP  four-disulfide  core  domain  protein  2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備える
ことを特徴とする糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。
【請求項４】
糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出するキットであって、
被験者の尿を含む試料を用い、afamin、antithrombin  III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid  glycoprotein  1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。
【請求項５】
afamin、alpha-1-acid  glycoprotein  1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin  III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig  alpha-1  chain  C  region、NADPH:adrenodoxin  oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose]polymerase  14、probable  E3  ubiquitin-protein  ligase  TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal  protein  S27a、WAP  four-disulfide  core  domain  protein  2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。
【請求項６】
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain  C region、NADPH:adrenodoxin  oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose]polymerase  14、probable E3  ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal  protein  S27a、WAP
four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの生物活性を測定する試薬を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。
【請求項７】
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain  C region、NADPH:adrenodoxin  oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose]polymerase  14、probable E3  ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S ribosomal  protein S27a、WAP four-disulfide core domain protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を備える
請求項３に記載の糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法と、その検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多くの国で糖尿病患者数が年々急増している。糖尿病腎症から腎不全となって透析導入となる患者が増加傾向にあり、透析導入の原因疾患の中で45％と第一位を占めている。透析療法の導入は、糖尿病患者のQOLを著しく低下させるばかりでなく、生命予後も不良となる。
糖尿病の国内患者は710万人、潜在的には推計2210万人であり、患者の90％以上を占める2型糖尿病がインスリン分泌低下及びインスリン抵抗性が合併して発症する多因子性疾患である。
糖尿病腎症の治療においては、腎機能障害の軽度の段階で治療を開始しなければ、腎機能不全が治療の有無に関わらず進行するが、自覚症状が全くないために治療可能な時期を逸することが多い。糖尿病腎症の診断には、尿検査が重要であるが、一般的な尿検査でタンパク尿が出た時には腎機能障害が既に進行していて完治することは不可能である。
【０００３】
糖尿病性腎症は、糖尿病によって腎臓の糸球体が細小血管障害のため硬化して減少していく病気であり、次の第１期〜第５期に分類される。
第1期（腎症前期）：糸球体濾過量が増加する。第2期（早期腎症）：微量のアルブミンが尿に漏れ出す。第3期（顕性腎症）：持続的にタンパク尿になる。
第4期（腎不全期）：糸球体濾過量が減少し、血清クレアチニンが増加する。第5期（透析療法期）。
【０００４】
最近、尿中の微量アルブミンを測定して、初期腎症を診断する検査が行われるようになったが、現時点では糖尿病腎症による腎不全を減少させるまでは至っていない。
微量アルブミン尿は、動脈硬化性疾患との関連性が指摘されていて、糖尿病腎症の特異的なマーカーであるかは明らかではない（非特許文献１）。また、抗体非反応性アルブミン・酸化型アルブミン・質量の異なるアルブミンの存在が明らかとなり、免疫学的測定法にて把握しきれない尿中アルブミンの質的な変化が問題になりつつある。
微量アルブミン以外の尿マーカーとしては、IV型コラーゲンが既に臨床の現場で使われ出しているが、腎症の早期診断マーカーとしての意義は未だ十分には確立していない。
【０００５】
近年、質量分析計等の分析機器の進歩によって、生体試料のような多種類のタンパク質の混合物であるサンプルから微量タンパク質を検出して同定することが可能となった。このプロテオーム解析の技術を用いて様々な疾患の患者から採取した血清、組織等の臨床検体を試料として、その中に含まれるタンパク質を網羅的に同定することによって、疾患の病態の変動、治療に対する反応などの指標となるバイオマーカーの探索が盛んに行われている。
しかし、血液（血清または血漿）や尿タンパク質のプロテオーム解析では、タンパク質濃度のダイナミックレンジが広いことや高濃度タンパク質の存在が解析の障害となる。また、質量分析装置は、存在量の多いタンパク質から優先的に測定するという特徴を有するため、尿プロテオーム解析ではアルブミン、IgGなどをはじめとする多量タンパク質が多く同定されてしまう傾向にある。実際、CE-MSを用いた尿中ペプチドマーカーを探索した報告では、273ものペプチドバイオマーカーのうち74%がコラーゲン断片であることが報告されている（非特許文献２）。
【０００６】
そのため、ショットガンプロテオミクスによるバイオマーカー探索アプローチでは、機能性タンパク質に多く見られるng/mLオーダー以下の低濃度で存在する新規関連タンパク質を同定することは困難であり、二次元電気泳動 (非特許文献３、４）とSELDI-TOF
(非特許文献５)を用いた少数のタンパク質の検出・同定しか行われていない。
【０００７】
糖尿病腎症に関連する従来技術には、特許文献１〜５もあるが、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する有用な手段は得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０１３−５２７４３１「腎機能障害、糸球体濾過速度、呼吸困難、急性心不全、左心室肥大、心線維症、子癇前症、妊娠関連蛋白尿のバイオマーカーとしてのＬＴＢＰ２」
【特許文献２】特表２００８−５２７９７７「２型糖尿病に関連する新規遺伝子とマーカー」
【特許文献３】特表２００６−５０２４１８「疾病の診断および監視」
【特許文献４】特開２００６−３８８７７「腎臓病の検出方法」
【特許文献５】特表２００２−５３３６８０「腎臓病の検出及び処置」
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Deckert et al. Diabetes Care (1992)15, 1181-1191
【非特許文献２】Protepmics Clin Appl 2011, 5:  367-374
【非特許文献３】Sharma et al. Proteomics (2005)5, 2648-2655
【非特許文献４】Rao et al. Diabetes Care (2007) 30, 629-637
【非特許文献５】Dihazi et al. Clin Chem (2007) 53, 1645-1653
【非特許文献６】J. Proteome Res., 2008, 7: 731-740
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明は、糖尿病腎症の発症または発症リスクの指標となる低濃度の尿タンパク質を同定し、糖尿病腎症の発症または発症リスクの検出方法及びそのキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出する方法は、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する工程を有することを特徴とする。
【００１２】
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid  glycoprotein  1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用である。
【００１３】
本発明の糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出するキットは、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備えることを特徴とする。
【００１４】
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid  glycoprotein  1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用である。
【００１５】
ここで、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を具備させてもよい。
【００１６】
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの生物活性を測定する試薬を具備させてもよい。
【００１７】
afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの抗体を具備させてもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、糖尿病腎症の発症または発症リスクが早期に容易に検出されるので、その予防や治療に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】解析に用いた２型糖尿病患者（Ｔ２ＤＭ）、糖尿病腎症病期２期患者（ＤＮ２）、及び、健常者対照群（Ｈ）の臨床像を示す表
【図２】ＤＮ２群にてＨ群と比較して増加した尿タンパク質スポットを示す写真
【図３】ＤＮ２群にてＨ群と比較して減少した尿タンパク質スポットを示す写真
【図４】Ｈ群と比べてＤＮ２群にて有意に増加した尿タンパク質を示す表
【図５】Ｈ群と比べてＤＮ２群にて有意に減少した尿タンパク質を示す表
【図６】Ｔ２ＤＭ群と比べてＤＮ２群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表
【図７】Ｈ群と比べてＴ２ＤＭ群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表
【図８】ＤＮ２及び糖尿病腎症病期３期（ＤＮ３）群とＨ及びＴ２ＤＭ群との間における３タンパク質のカットオフ値に対する感度、特異度、ＲＯＣ曲線下面積を示す表
【図９】解析に用いた２型糖尿病患者（Ｔ２ＤＭ）及び健常者対照群の臨床像を示す表
【図１０】ＭＳピークの２次元ゲル画像
【図１１】図１０の２次元ゲル画像におけるＩＤ＝５１２，  ４２４のピークについて、ＤＮ１群とＤＮ３群でのシグナル強度を示すグラフ
【図１２】Ｔ２ＤＭ群に比べてＤＮ３群にて有意な発現変動を示した尿タンパク質の表
【図１３】検証用検体の臨床情報を示す表
【図１４】ＭＲＭ法を用いて尿中相対タンパク質濃度を測定した２５種類のタンパク質の表
【図１５】尿中アルブミン・クレアチニン比と有意な関連を示すタンパク質の表
【図１６】早期腎症以降への進展を基準評価としたＲＯＣ解析の結果を示す表
【図１７】図８及び１６の表中５タンパク質を対象に、糖尿病腎症患者尿を用いてウェスタンブロットした結果を示す写真
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下に、本発明の実施形態を説明する。実施形態は、先行技術文献や従来公知の技術を援用して適宜設計変更可能である。
【００２１】
本発明者は、健常者、２型糖尿病患者、糖尿病腎症患者より採取した尿検体を用いて、糖尿病腎症のバイオマーカータンパク質を同定し評価を行った。
これにより、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知することによって、糖尿病腎症の発症または発症リスクを検出することが可能になった。
【００２２】
上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid  glycoprotein  1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質を用いることが有用であった。
【００２３】
上記タンパク質の認識及び定量には、該当タンパク質そのものでもよいが、該当タンパク質を認識する固有の部分タンパク質やポリペプチドなどでもよい。
【００２４】
なお、ポリペプチドとは、２以上のアミノ酸がペプチド結合で連結されたものであり、比較的短鎖のペプチドまたはオリゴペプチドと呼ばれるものからタンパク質と呼ばれる長鎖のものまでを含み得る。ポリペプチドを検出するために抗体を作製する場合に、ポリペプチドには、遺伝的にコードされている２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸や、修飾されたアミノ酸を含んでもよい。その修飾には、ペプチド結合の主鎖、アミノ酸側鎖、アミノ末端、カルボキシル末端において、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ビオチン化、脂質や脂質誘導体との共有結合、架橋結合の生成、ジスルフィド結合、糖鎖の付加、ＧＰＩアンカーの付加、リン酸化及びプレニル化などが挙げられる。
【００２５】
ポリペプチドは、上記の遺伝子産物におけるアミノ酸置換の他に、ポリペプチドを認識する抗体の抗原として機能する限り、１もしくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、付加されたものであってもよい。抗体が認識するエピトープ以外の部位に、このような変異が含まれていてもよい。
このようなポリペプチドは、化学合成によって直接ペプチドを調製する方法の他に、これらをコードするポリヌクレオチドを部位特異的突然変異誘発法などにより作製し、適当な系で発現させることによって調製することも可能である。
【００２６】
ポリペプチドの検知は、例えば、本発明の抗体を用いたＥＩＡやＥＬＩＳＡなどの免疫学的特異反応を利用する方法、エドマン法を用いた気相シークエンサーなどペプチドのアミノ酸配列分析法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳやＥＳＩ
Ｑ−ＴＯＦ／ＭＳ法などの質量分析によって検出することができる。
【００２７】
本発明の検出キットは、被験者の尿を含む試料を用い、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase, mitochondrial、obscurin、poly [ADP-ribose] polymerase 14、probable E3 ubiquitin-protein ligase TRIP12、protein  AMBP、serotransferrin、ubiquitin-40S  ribosomal protein S27a、WAP four-disulfide core domain  protein 2から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質、上記タンパク質群のうち、特には、afamin、antithrombin III、ceruloplasmin、CD44、alpha-1-antitrypsin、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、WAP four-disulfide core domain protein 2、alpha-1-acid  glycoprotein  1から成るタンパク質群から選択される少なくとも１つのタンパク質について、アルブミン・クレアチニン比の発現変動を検知する手段を備えることを特徴とし、その検知手段としては、該当タンパク質、または、そのタンパク質を認識する固有の部分タンパク質またはポリペプチドの染色剤を具備するか、生物活性を測定する試薬を具備するか、抗体を具備するものが有用に利用できる。
尿による試料は、尿量等によって尿中のタンパク質濃度が影響を受けやすいから、その影響を低減するために、例えば尿中クレアチニン濃度を検知し補正することが好ましい。
【００２８】
上記タンパク質、その部分タンパク質、ポリペプチドの合成には、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成法を使用することができる。
その方法では、例えばタンパク質またはペプチド合成用樹脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、公知の各種縮合方法により所望のアミノ酸配列に順次樹脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくは公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドなどカルボジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。
遊離型のものとして得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で塩に変換することができ、またそれらは塩として得られた場合には、公知の方法またはそれに準じた方法で遊離型のものまたは他の塩に変換することができる。塩としては、生理的に許容されるものまたは医薬として許容されるものが好ましいが、これらに限定されない。その塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、例えば酢酸、ギ酸、マレイン酸、フマール酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩などが挙げられる。また、アンモニウム塩、例えばエチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、ヒドロキシエチルアミンなどの有機塩基との塩なども挙げられる。
【００２９】
抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。
なお、抗体としては、上記タンパク質及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗体の単一のものや各種エピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよく、また１価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含むものであり、さらに天然型分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も表すものであり、F(ab')2 , Fab' 及びFab といったフラグメントを包含し、さらに少なくとも二つの抗原またはエピトープ結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、または、例えばクワドローム、トリオームなどの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾または加工などされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合またはハイブリドーマ技術や抗体工学を適用したり、合成または半合成技術を使用して得られた抗体、DNA組換え技術を用いて調製される抗体、標的抗原物質または標的エピトープに関して中和特性を有したりする抗体または結合特性を有する抗体を包含してもよい。
【００３０】
好ましくは抗体は、天然型の上記タンパク質を特異的に識別できるものである。
ポリクローナル抗体として得るためには、免疫源である上記タンパク質またはそのフラグメント、配列の一部のペプチドを、哺乳動物、鳥類などに免疫し、その哺乳動物、鳥類などから抗血清を採取し、その抗血清に含まれるポリクローナル抗体を使用することができる。感作抗原で免疫される哺乳動物としては、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスターなど、さらに、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、サルなどの霊長類、ニワトリなどの鳥類等が使用される。さらに、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい場合もある。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、感作抗原を哺乳動物などの腹腔内または皮下に注射することにより行われる。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。ポリクローナル抗体を含む抗血清は、免疫された動物を所定の期間飼育した後、動物から採血した血液から調製することができる。
【００３１】
モノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインにより抗体分子の産生を提供することのできる公知の方法を用いて産生される。
個々のモノクローナル抗体は、自然に生ずるかもしれない変異体が僅かな量だけ存在しているかもしれないという以外は、同一であるような抗体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それは単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なったエピトープに対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常のポリクローナル抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリン類の夾雑がないかまたは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、その由来や免疫グロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり、または軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、またはヘテロジーニアスなタンパク質と融合させたりして得ることができる。
モノクローナル抗体を製造する方法の例には、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法
、トリオーマ法、EBV-ハイブリドーマ法などが挙げられる。
【００３２】
モノクローナル抗体は、それらが所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるが、一方、鎖の残部は、別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一またはホモローガスであるキメラ抗体（免疫グロブリン) を包含する。
【００３３】
また、哺乳動物由来のハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるものを挙げることができる。
抗体を産生するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術を利用して作製できる。すなわち、上記タンパク質またはそのフラグメントを感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
上記タンパク質またはそのフラグメントの調製方法及び哺乳動物に対する免疫方法等に関しては、上述したポリクローナル抗体を含む抗血清を調製する手法に準じて行うことができる。この場合、特に、哺乳動物に対して免疫した後、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
【００３４】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、哺乳動物のミエローマ細胞を利用できる。免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合などは、基本的には公知の方法、例えば、ケラー及びミルステイン方法等に準じて行うことができる。
モノクローナル抗体は例えば、次のような工程で作製できる。(1) 免疫原性抗原の調製、(2) 免疫原性抗原による動物の免疫、(3) ミエローマ細胞の調製、(4) 抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合、(5)ハイブリドーマの選択及びモノクローン化、(6) モノクローナル抗体の製造。
【００３５】
また、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えば、その他の哺乳動物は、本発明による免疫原ポリペプチド産物に対する抗体を発現するのに用いることができる。
また、こうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ハイブリドーマ株から得られた抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製することも可能である。モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用するなどの公知の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離されたDNAは、発現ベクターに入れ、CHO, COSなどの宿主細胞に入れることができる。DNA は、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、ネコの重鎖や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能である。所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製することが可能である。
また、抗体は、縮合剤を用いることを含めた化学的なタンパク合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修飾をすることも可能である。さらに、トリプシン、パパイン、ペプシンなどの酵素により処理して、場合により還元して得られるFab 、Fab'、F(ab')2といった抗体フラグメントにして使用してもよい。
【００３６】
抗体は、公知の検定法、例えば競合的結合検定、直接及び間接サンドイッチ検定、免疫沈降検定に使用することができる。
抗体を検出可能な原子団にそれぞれコンジュゲートするには、公知の方法を使用することができ、標識物を付与する抗体としては、IgG 画分、更にはペプシン消化後還元して得られる特異的結合部Fab'を用いることができる。これらの場合の標識物の例としては、酵素（ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ-D- ガラクトシダーゼなど）、化学物質、蛍光物質または放射性同位元素などがある。
【００３７】
本発明での検知・測定は、免疫染色、例えば組織または細胞染色、免疫電子顕微鏡、免疫クロマトクグラフィー、イムノアッセイ、例えば競合型イムノアッセイまたは非競合型イムノアッセイで行うことができる。好ましくは、放射免疫測定法(RIA), FIA, LIA, EIA, ELISA などを用いることができる。
例えばサンドイッチ型アッセイでは、一方を本発明の上記タンパク質ポリペプチドに対する抗体または上記タンパク質の関連ペプチド断片に対する抗体とし、他方を上記タンパク質のC末端側残基に対する抗体とし、一方を検出可能に標識化する。同じ抗原を認識できる他の抗体を固相に固定化する。検体と標識化抗体及び固相化抗体を必要に応じ順次反応させるためインキュベーション処理し、非結合抗体を分離後、標識物を測定する。測定された標識の量は抗原、すなわちポリペプチド抗原の量と比例する。このアッセイは、不溶化抗体や、標識化抗体の添加の順序に応じて同時サンドイッチ型アッセイ、フォワードサンドイッチ型アッセイまたは逆サンドイッチ型アッセイなどと分類される。
【００３８】
本発明の測定法によれば、測定すべき物質を酵素などで標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬と、担体に結合された抗体とを順次反応させることも同時に反応させることもできる。試薬を加える順序は選ばれた担体系の型により異なる。感作されたプラスチックなどのビーズを用いた場合には、標識した抗血清、精製抗体またはモノクローナル抗体などの標識抗体試薬を測定すべき物質を含む検体試料と共に最初適当な試験管中に一緒に入れ、その後感作されたプラスチックなどのビーズを加えることにより測定を行うことができる。
免疫学的測定法の際の固相担体としては、抗体などタンパク質を良く吸着するポリスチレン製、ポリカーボネイト製、ポリプロピレン製またはポリビニル製のボール、マイクロプレート、スティック、微粒子または試験管などの種々の材料及び形態を任意に選択し、使用することができる。
【００３９】
測定には、至適pH、例えばpH約４〜約９に保つように適当な緩衝液系中で行うことができる。特に適切な緩衝剤としては、例えばアセテート緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、フォスフェート緩衝剤、トリス緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ボレート緩衝剤、グリシン緩衝剤、炭酸塩緩衝剤、トリス−塩酸緩衝剤、ベロナール緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤は互いに任意の割合で混合して用いることができる。抗原抗体反応は約０〜約６０℃の間の温度で行うことが好ましい。酵素などで標識された抗血清、精製抗体、またはモノクローナル抗体などの抗体試薬及び担体に結合させられた抗体試薬、さらには測定すべき物質のインキュベーション処理は、平衡に達するまで行うことができるが、抗原抗体反応の平衡が達成されるよりも早い時点で固相と液相とを分離して限定されたインキュベーション処理の後に反応を止めることができ、液相または固相のいずれかにおける酵素などの標識の存在の程度を測ることができる。
測定操作は、自動化された測定装置を用いて行うことが可能であり、ルミネセンス・ディテクター、ホト・ディテクターなどを使用して基質が酵素の作用で変換されて生ずる表示シグナルを検知して測定することもできる。抗原抗体反応においては、それぞれ用いられる試薬、測定すべき物質、さらには酵素などの標識を安定化したり、抗原抗体反応自体を安定化するように処置することができる。
【００４０】
非特異的な反応を除去し、阻害的に働く影響を減らしたり、または測定反応を活性化したりするため、タンパク質、安定化剤、界面活性剤、キレート化剤などをインキュベーション溶液中に加えることもできる。非特異的結合反応を防ぐための公知のブロッキング処理を施してもよく、例えば、哺乳動物などの正常血清や血清タンパク質、アルブミン、ヘモグロビン、オボアルブミン、スキムミルク、乳発酵物質、コラーゲン、ゼラチンなどで処理することができる。
試料や固相などの洗浄には、緩衝液系や食塩液から適宜適当な液を選択でき、非イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤の他、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤などを添加して使用できる。
【００４１】
キットの基本構成としては、例えば、湿潤状態で物質の移動を可能にする担体に、(a) 検体を適用する部位、(b) 標識抗体を含有した部位、(c) 抗原検出部位、(d) 反応終了判定部位を順次形成してあるものから成る。(i) 標識抗体を含有した部位には、湿潤状態において該担体上を抗原検出部位、反応終了判定部位へと順次移動し得る、上記タンパク質に対する標識した抗体を含有させ、(ii) 検出部位には、固相化したコーキシンに対する抗体を存在させるようにし、(iii)
反応終了判定部位には、標識抗体として使用した抗体に対する第二抗体 を固相化した部位を形成して、検体を適用する部位に検体を適用することにより、検体を担体において移動させ、標識抗体を溶出させ、抗原検出部位の固相化抗体及び反応終了判定部位の第二抗体部位を通過させることにより、検体中の上記タンパク質を検出する。
【００４２】
更に、上記タンパク質またはその構成ドメインをコードする核酸とハイブリダイゼーションする核酸を有効成分として具備させてもよい。
ハイブリダイゼーションする核酸としては、例えばプローブ及びプライマーなどが挙げられる。上記タンパク質遺伝子またはその産物とハイブリダイゼーションするプローブであれば、その目的に合致するかぎり制限なく利用できる。
【実施例１】
【００４３】
本発明者は既に、尿タンパク質の限外濾過による濃縮と尿中アルブミン等の多量タンパク質除去を組み合わせた前処理を行ったサンプルを蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)及び質量分析機で分析すると、2000種前後のタンパク質を比較解析することが可能となる系を確立していた。
この解析系を用いて、現時点で早期腎症として診断可能な微量アルブミン尿を有する病期2期より早い段階の尿中タンパク質を多角的な視野から網羅的に解析することによって、微量アルブミン量より有用な糖尿病腎症の早期マーカーを探索した。
【００４４】
図１は、解析に用いた2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
健常者(H)8名、2型糖尿病患者(腎症病期1期: T2DM)16名、糖尿病腎症患者(腎症病期2期: DN2)16名から随時尿を採取した。微量アルブミン尿の判定は尿アルブミン／クレアチニン比20mg/g Crを閾値として判定した。採取した尿を限外ろ過にて濃縮し、Albumin  and  IgG Removal  Kit(GE)にてアルブミン、IgGを除去後のサンプルをCyDyeにてラベルし、尿タンパク質プロファイルを2D-DIGE法にて解析した。
【００４５】
ゲルイメージの解析はDeCyderにより行い、各群間で有意に変化したスポットを切り出した。切り出したスポットからトリプシン消化後にペプチドを抽出しエレクトロスプレーイオン源を装備したLCQ-DECA XP Plus(Thermo Electron)にてLC-MS/MS解析を行った。得られたMS/MSスペクトルデータをMASCOTにてデータベース検索し、タンパク質を同定した。
【００４６】
2D-DIGE解析とは独立した患者群（H  14名、T2DM  13名、DN2  15名、糖尿病腎症病期3期(DN3)患者  16名）から採取した尿検体58サンプルを用い、2D-DIGE解析にて同定されたタンパク質を対象にMRM法にて定量解析を行った。
MRM transitionの設定は、2D-DIGE解析にて得られたMSデータに基づきMRM Pilotソフトウェアにて行った。標的ペプチド配列が設定MRM transitionにより同定されているかの確認はenhanced  product  ion(EPI)-MS/MSにより行った。EPI-MS/MSにて標的ペプチド配列が同定できない場合には合成ペプチドを用いたLC-MRMを行い、分析用試料とMRM取得ピーク、溶出時間が一致することを確認した。
【００４７】
尿検体はAlbumin  and  IgG  Removal  Kitにてアルブミン、IgGを除去し、タンパク質変性、システイン残基の還元アルキル化後にトリプシンにて酵素消化した。酵素消化産物に内部標準ペプチドとして安定同位体元素標識ペプチド10 fmolを添加した。MRM解析は、nanoLCを接続した5500QTrap（ABSciex）システムにて行った。MRM測定により得られた各ペプチドのシグナル面積値を内部標準物質より得られたペプチドのシグナル面積値で補正し、相対タンパク質濃度を算出した。
【００４８】
各測定値は平均値±標準偏差で示した。多群間の有意差検定はKruskal-Wallis検定にて行い、p＜0.05を有意とした。重回帰分析、ロジスティック回帰分析、receiver-operating characteristic（ROC）解析はIBM SPSS statistics 20ソフトウェアにて行った。
【００４９】
図２は、DN2群にてH群と比較して増加した尿タンパク質スポットを示す写真であり、図３は、DN2群にてH群と比較して減少した尿タンパク質スポットを示す写真である。
糖尿病腎症患者由来尿タンパクを解析するにあたり、尿の限外濾過にて濃縮後に高含有量タンパク質の除去を行う前処理を行った後に、2D-DIGE法にてディファレンシャル解析を行うとゲル当たり約2000種のタンパク質スポットを検出することが可能となった。この系を用いて、T2DM  16名、DN2  16名、H  8名からの尿検体から尿タンパクを精製し、2D-DIGE法にて解析した。
【００５０】
図４は、H群と比べてDN2群にて有意に増加した尿タンパク質を示す表であり、図５は、H群と比べてDN2群にて有意に減少した尿タンパク質を示す表であり、図６は、T2DM群と比べてDN2群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表であり、図７は、H群と比べてT2DM群にて有意に変動した尿タンパク質を示す表である。
2D-DIGEの結果では、DN2群にてH群由来尿と比較して有意に変動するタンパク質スポットを増加227個、減少85個を認めた。DN2群由来尿とT2DM群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは93個、減少は30個であった。また、T2DM群由来尿とH群由来尿の比較では、有意に増加するタンパク質スポットは58個、減少は9個であった。
これらの有意に変動したタンパク質スポットをゲル内消化後にLC-MS/MSにて解析した結果、HとT2DM,HとDN2,T2DMとDN2の比較にて有意に発現上昇するタンパク質が24種、有意に発現減少するタンパク質が8種同定された。
【００５１】
2D-DIGE解析にて発現変動を示すタンパク質を対象に独立した糖尿病腎症患者由来の尿検体を用いて発現変動の検証を行った。
2D-DIGE解析にて得られたMSデータに基づきMRM transitionを選抜した結果、32タンパク質中30タンパク質(発現上昇タンパク質:23, 発現減少タンパク質:7)がMRM定量解析可能であった。H  17名、T2DM  13名、DN2  15名の尿検体を用いて相対定量解析を行った結果、25タンパク質がH,T2DM,DN2群間で有意な発現変動を示した。
このうち2D-DIGE解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は19種(発現上昇タンパク質:14, 発現減少タンパク質:5)であった。発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、antithrombin-III、ceruloplasmin、complement C4、glutamyl aminopeptidase、haptoglobin、leucine-rich alpha-2-glycoprotein、N-acetylglucosamine-6-sulfatase、plasma alpha-L-fucosidase、serotransferrin、throxine-binding globulin、zinc-alpha-2-glycoproteinであり、発現減少タンパク質は、calbindin、deoxyribonuclease-1、kininogen-1、pancreatic alpha-amylase、polymeric immunoglobulin receptorであった。
【００５２】
糖尿病腎症の早期尿中関連因子を絞り込む目的で、DN3患者16名における30タンパク質の尿中タンパク質濃度を追加測定し先のデータと併せて重回帰分析を行った。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比にafamin(β:0.443,p＜0.001)、antithrombin  III（β:0.286,p＜0.001)、ceruloplasmin(β:0.224,p＝0.002)の3タンパク質が関連することが示された。
【００５３】
これら3タンパク質に、性別、糖尿病罹病期間、BMI、収縮期血圧、トリグリセリド、空腹時血糖、HbA1c、eGFRを説明変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った。
その結果、早期腎症以降への進展に及ぼす因子としてeGFR(オッズ比:0.968;  95%  CI:0.941-0.995;  p＝0.019)、afamin (オッズ比:2.808,  95%  CI:1.223-6.447,  p＝0.015)が選択された。
早期腎症以降への進展を基準評価としたROC解析では、afamin,antithrombin  III,ceruloplasminのROC曲線下面積(AUC)はそれぞれ0.940,0.836,0.903であり、いずれのタンパク質もeGFR(AUC:0.745)に比べて高い診断能を示した。
【００５４】
図８は、DN2及びDN3患者群とH及びT2DM群との間における３タンパク質のカットオフ値に対する感度、特異度、ROC曲線下面積を示す表である。
afamin, antithrombin III, ceruloplasminのそれぞれのカットオフ値に対する感度、特異度は、eGFRのカットオフ値を76.8とした場合の感度、特異度に比べていずれも高値を示した。
そのため、尿中アルブミン・クレアチニン比に関連するこの３タンパク質は、早期腎症以降への進展をeGFRよりも高い精度で判別したので、糖尿病腎症の発症及び進展をより早期に検出する診断及び予測マーカーとして使用可能である。
【実施例２】
【００５５】
本発明者は、非標識定量法を用いた定量プロテオミクスにより尿中関連タンパク質の同定を行った。
非標識定量法を用いた定量プロテオミクスは、測定したサンプルのLC-MSデータをretention time, m/z, シグナル強度の3次元に集約し比較解析する方法であり、多検体の比較解析に有用な方法である。この方法では、比較サンプル群間で有意な変動を示すピークを拾い出し、拾い出したピークに標的を絞ってタンパク質同定を行うため、網羅的なショットガンプロテオミクス法では同定されにくいタンパク質を優先的に同定することが可能となる。
【００５６】
2型糖尿病患者、顕性タンパク尿を呈する糖尿病腎症患者から採取した尿検体を用いて非標識定量プロテオミクス解析を行い、両群間で発現変動を示すタンパク質群を同定した。独立した集団にて発現変動が検証されたタンパク質を対象に尿中アルブミン・クレアチニン比と関連するタンパク質を解析した結果、これまでに2型糖尿病や糖尿病腎症との関連が報告されていないタンパク質1種を含む6タンパク質の同定に成功した。
【００５７】
図９は、解析に用いた2型糖尿病患者及び健常者対照群の臨床像を示す表である。
微量アルブミン尿を呈していない2型糖尿病患者(T2DM, 男性4名、女性2名)、腎症病期3期の糖尿病腎症患者(DN3, 男性4名、女性2名)から採取した随時尿を探索用検体とした。検証用検体として、T2DM群（男性9名、女性10名）、DN3群（男性10名、女性5名）に加え、腎症病期2期の糖尿病腎症患者（DN2, 男性10名、女性10名）から採取した随時尿を解析対象とした。また、男性15名、女性9名より随時尿を採取し、検証用検体における健常者対照群（H）とした。
【００５８】
患者より採取した随時尿検体は、3000×g、10分、4℃で遠心分離を行い、不純物を取り除いたのち速やかに凍結し解析に用いるまで-80℃にて保管した。各群の検体は、3 kDa cut offのAmicon Ultrafreeの限外ろ過で脱塩と濃縮を行った後にAlbmin&IgG  Drpletion SpinTrap (GE Healthcare) にて尿中多量タンパク質を除去した。再び、3  kDa  cut offのAmicon  Ultrafreeの限外ろ過で脱塩と濃縮を行い乾固した後に12  mM  sodium  deoxycholate(SDC)/12  mM  sodium  N-lauroylarcosinate(SLS)にて溶解し、95℃5分の変性、ならびに37℃にてLys-C、トリプシンによる酵素消化を行った。さらにDTTを加え37℃、1時間、ヨードアセトアミドで暗室1時間反応させ還元アルキル化を行った。界面活性剤の除去はPhase Transfer  Surfactant法（非特許文献６）にて行い、Mono Spin  C18(GE  Healthcare)にて精製後、得られたペプチドをLC-MS解析用サンプルとした。
【００５９】
断片化された尿ペプチドサンプルの測定は、QSTAR Elite system（Applied Biosystems）にPAL/Paradigm LC system（ARM）を接続した装置を用いた。カラムは0.3×5mm L-trap column  と0.1×150mm  L-column（財団法人化学物質評価研究機構）を用いて、流速300nL/min、A溶媒（2%  CAN  and0.1%FA）、B溶媒（90%  CAN  and  0.1%FA）で175min間（グラジエント5−30%  B,20min);30−95% B,1  min;95% B,3min;95−5%  B,1min;5%  B,10min）測定を行った。
質量分析器のピーク検出と正規化、定量化は2DICALソフトウェア（三井情報株式会社）を用いた。ピークのターゲットは、保持時間（RT）10-100min、ピークの最大強度30以上、P値0.05未満のピークを選出した。選出されたピークはT2DM群とDN3群で強度比に差のあるピークを目視により選別しLC-MS/MS測定を行った。
【００６０】
タンパク質の同定に当たっては、2DICALのピーク情報をもとにm/zとRTをinclude listに設定しLC-MS/SM測定を行った。得られたターゲットピーク情報からSwissProtデータベースとMascotソフトウェア（Matrix science）を用いてタンパク質同定を行い、2DICAL上のピークに対応させた。Mascotソフトウェアの検索パラメーターには、MS の許容誤差0.1Da、MS/MSの許容誤差0.1Da、固定修飾carbamidomethyl (C)、可変修飾acetyl (N-term)、deamidated (NQ)、oxidation (M)、価数2+, 3+, 4+を用いた。T2DM群とDN3群の発現差異を認めるピークの選定には、（１）DN3群のピーク定量値がT2DM群のピーク定量値に対して3倍以上または3分の1以下、（２）RATIO  P値＜0.05、（３）Mann-Whitney  U検定によるP値＜0.05、（４）Mascot  Score≧20の指標を用いた。
【００６１】
H群、T2DM群、DN2群、DN3群から構成される尿検体78サンプルを用いて、非標識定量解析にて同定された発現変動タンパク質群の検証を行った。
バイオマーカー候補タンパク質群の相対タンパク質濃度はMRM法により算出した。MRM transitionには、Mascotデータからペプチドの親イオンのm/zをQ1とし、フラグメントイオンのm/zをQ3とし設定した。また、Enhanced Product Ion（EPI）-MS/MSにてタンパク質の同定を行い、設定したMRM transitionにより標的ペプチド配列が同定されることを確認した。
【００６２】
なお、EPI-MS/MSにて同定できないペプチド配列に関しては、合成ペプチドを用い分析用試料と同時測定してMRM取得ピーク、溶出時間が一致することを確認した。尿検体の酵素消化産物に内部標準ペプチドとして安定同位体元素標識ペプチド30fmolを加え、分析用試料としてMRM測定を行った。MRM定量解析は、4000QTrap（ABSciex）にLC800 HPLC system （ジーエルサイエンス）を接続したシステムを用いて行った。カラムはACQUITY UPLC BET C18 カラム（Waters）を用いて流速100nl/min, 0%-30% Bで90分直線濃度勾配にて溶出した。Multiquant Software 2.0（AB Sciex）にてMRM測定により得られた各ペプチドのシグナル面積値を内部標準物質より得られたペプチドのシグナル面積値で補正し、相対タンパク質濃度を算出した。
【００６３】
各測定値は平均値±標準偏差で示した。2群間の有意差検定はMann-Whitney  U  testにて、多群間の有意差についてはKruskal-Wallis検定にて行い、p＜0.05を有意とした。重回帰分析、receiver-operating  characteristic（ROC）解析はIBM  SPSS  statistics  20ソフトウェアにて行った。
【００６４】
図１０は、MSピークの2次元ゲル画像であり、図１１は、図１０の２次元ゲル画像におけるID=512, 424のピークについて、T2DM群とDN3群でのシグナル強度を示すグラフである。
T2DM群及びDN3群の各6名ずつの検体から尿中タンパク質を精製しプロテアーゼ消化を行った。2DICALを用いた解析により合計3,334ピークが得られ、そのうち保持時間（RT）10-100min、ピークの最大強度30以上、P値0.05未満のピークは234であった。その全てのMSピークの2次元ゲル画像が図１０である。m/zをX軸、RTをY軸とし、最大強度30以上あった234ピークを赤色で強調した。選出された234ピークのなかで、DN1群とDN3群で強度比に有意な差のある107ピークを、図１１に示すように目視により選別した。
【００６５】
図１２は、T2DM群に比べてDN3群にて有意な発現変動を示した尿タンパク質の表である。
その107ピークのLC-MS/MS測定により、T2DM群に対してDN3群で3倍以上、または3分の1以下の有意な発現変動を示すタンパク質が30種類同定された。
【００６６】
図１３は、検証用検体の臨床情報を示す表である。
図１４は、MRM法を用いて尿中相対タンパク質濃度を測定した25種類のタンパク質の表である。
2DICALにて選出された30種類のタンパク質のなかで、メチオニンの酸化もしくは、miss cleavageの存在が推定された5種類のタンパク質を除く25種類のタンパク質(発現上昇タンパク質：20、発現減少タンパク質：5)について、一斉分析が可能な定量解析法であるMRM法を用いて尿中相対タンパク質濃度を測定した。
【００６７】
MRM法のtransition設定は以下に従って行った。すなわち、Mascotデータからペプチドの親イオンのm/zをQ1とし、フラグメントイオンのm/zをQ3の値とした111組のtransitionで測定した。EPI-MS/MS測定により、12種類の標的ペプチド配列が同定され、残り13種類のタンパク質については合成ペプチドを用いてMRM transitionの確認を行った。25種類のタンパク質を標的とするMRM transitionを用いて、T2DM群19名、DN3群15名の検体の尿中相対タンパク質濃度を測定した。
その結果、25種類のタンパク質中19種類のタンパク質が、T2DM群、DN3群間で有意な発現変動を示した。このうち非標識定量解析と同様の発現変動が検証されたタンパク質は16種類(発現上昇タンパク質：13、発現減少タンパク質：3)であった（図１４）。
発現上昇タンパク質は、afamin、alpha-1-acid glycoprotein 1、alpha-1-antichymotrypsin、alpha-1-antitrypsin、alpha-1B-glycoprotein、epiplakin、Ig alpha-1 chain C region、NADPH:adrenodoxin oxidoreductase,mitochondrial、obscurin、poly[ADP-ribose] polymerase 14、probable E3  ubiquitin-protein  ligase  TRIP12、protein  AMBP、serotransferrinであり、発現減少タンパク質は、CD44、ubiquitin-40S  ribosomal  protein  S27a、WAP  four-disulfide  core  domain  protein  2であった。
【００６８】
図１５は、尿中アルブミン・クレアチニン比と有意な関連を示すタンパク質の表である。
糖尿病腎症の早期尿中関連因子を絞り込む目的で、H群24名、DN2群20名における25タンパク質の尿中相対タンパク質濃度を追加測定し、尿中アルブミン・クレアチニン比との関連をステップワイズ多重回帰法にて解析した。
その結果、尿中アルブミン・クレアチニン比は、afamin(β:0.33,p＝1.8×10-7)、CD44  antigen（β:-0.17,p＝1.5×10-3)、alpha-1-antitrypsin (β:0.21,p＝7.5×10-5)、epiplakin(β:0.21,p＝4.9×10-6)、Ig  alpha-1  chain  C  region（β:0.15,p＝1.5×10-3)、WAP  four-disulfide  core  domain  protein  2 (β:-0.15,p＝6.4×10-3)、alpha-1-acid  glycoprotein  1(β:0.12,p＝0.027)の7タンパク質と有意に関連することが示された。
【００６９】
図１６は、早期腎症以降への進展を基準評価としたROC解析の結果を示す。
epiplakinを除くafamin (AUC:93.5%)、CD44 antigen（AUC:90.7%)、alpha-1-antitrypsin (AUC:81.4%)、Ig alpha-1 chain C region（AUC:75.2%)、WAP four-disulfide core domain protein 2 (AUC:77.3%)、alpha-1-acid glycoprotein 1 (AUC:87.6%)の6タンパク質が良好な診断能を示した。なお、腎機能評価に用いられるeGFRのROC曲線下面積は64.9％であり、本発明での検証集団における判定能はeGFRよりも上記6タンパク質の方が優れていた。
【００７０】
さらに上記6タンパク質に加えて性別、糖尿病罹病期間、BMI、収縮期血圧、トリグリセリド、空腹時血糖、HbA1c、eGFRを説明変数とした多重ロジスティック回帰分析を行った。その結果、早期腎症以降への進展に及ぼす因子として、afamin (オッズ比:1.71; 95% CI:1.16-2.52; p＝0.007)と、CD44 (オッズ比:0.98,95%  CI:0.96-0.99,p＝0.004)が選択された。
【００７１】
なお、afaminは、糖尿病及び糖尿病性血管合併症に関する血清・尿プロテオーム解析にてその発現が上昇することが報告されているものの、その機能や意義についての報告はなかった。CD44は、ヒアルロン酸をはじめとする細胞外マトリックスと結合する接着分子であり、(1)リンパ球ホーミング、(2)リンパ球活性化、(3)細胞-細胞間接着及び細胞-基質間接着、(4)細胞運動、(5)癌細胞増殖・転移などに深く関与していることが報告されている。CD44の機能は発現量だけでなく、alternative  splicing  variant  isoformsの発現、糖鎖付加やリン酸化等の翻訳後修飾によっても制御される。CD44は癌幹細胞マーカーとしての役割ばかりでなく、糖尿病腎症モデルであるOVE26マウス腎尿細管、ラット虚血腎モデルでの浸潤炎症細胞、腎移植後の急性拒絶反応時の尿においても発現上昇するとの報告がある。
【００７２】
図１７は、図８及び１６の表中５タンパク質を対象に、糖尿病腎症患者尿を用いてウェスタンブロットした結果を示す写真である。
前記実施例１及び２において認められた発現上昇タンパク質及び発現減少タンパク質と同様の結果が検証された。なお、CD44, ceruloplasminについては、アミノ酸配列から予想される分子量よりも低分子量のバンドが検出され、細胞外ドメインが切断されたshedding formである可能性がある。これらのshedding formの発現変動が、2型糖尿病や糖尿病腎症の発症・進展と関連するとの報告はこれまでにない。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によると、尿を試料とする簡便な手段で糖尿病腎症を検知でき、早期治療や予防に有効であり、産業上有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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