(57)【要約】【課題】  試料中に含まれる標的物質を磁気信号を利用して測定する方法であって、前記磁気信号を増幅させることで前記標的物質の測定感度を向上させる方法を提供すること。【解決手段】  試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な残留磁気を有した第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な残留磁気を有しない第二の磁性粒子とを用いた、前記標的物質の測定方法により、前記課題を解決する。【選択図】  図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な第二の磁性粒子とを用いた、前記標的物質の測定方法であって、
第一の磁性粒子が残留磁気を有した磁性粒子であり、第二の磁性粒子が残留磁気を有さない磁性粒子である、前記測定方法。
【請求項２】
試料中に含まれる標的物質と、前記標的物質と特異的に結合可能な第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な第二の磁性粒子とを反応させることで、前記第一の磁性粒子−前記標的物質−前記第二の磁性粒子の複合体を形成させる工程と、
前記形成した複合体由来の磁気信号を検出する工程とを含む、前記標的物質の測定方法であって、
第一の磁性粒子が残留磁気を有した磁性粒子であり、第二の磁性粒子が残留磁気を有さない磁性粒子である、前記測定方法。
【請求項３】
第一の磁性粒子が強磁性またはフェリ磁性粒子であり、第二の磁性粒子が超常磁性粒子である、請求項１または２に記載の測定方法。
【請求項４】
試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な残留磁気を有した第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な残留磁気を有しない第二の磁性粒子とを含む、前記標的物質の測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる標的物質を磁気信号を利用して測定する方法に関する。特に本発明は、試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な磁性粒子を用いて、前記標的物質を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体試料中に含まれる標的物質（核酸、タンパク質、抗原、糖鎖等）を測定する方法として、前記標的物質と結合可能な物質（低分子化合物、核酸、タンパク質、抗体、糖鎖、細胞等）を結合させた粒子を用いる方法が知られている。
【０００３】
標的物質が抗原である場合、あらかじめ当該抗原に対する抗体を吸着または化学結合により担体に固定化した後、当該担体と前記標的物質を含む試料とをカップやマイクロタイタープレートに入れ、前記抗体と前記標的物質とを抗体抗原反応させることで前記標的物質を測定する方法が広く用いられている（特許文献１）。例えば、定量したい物質（抗原）と特異的に結合可能な抗体を吸着または化学結合により担体に固定化して得られる抗体固定化担体と、前記抗体とは異なる位置（エピトープ）で前記抗原と特異的に結合可能な酵素等により標識された標識抗体とを準備し、抗原を含んだ試料を前記抗体固定化担体と前記標識抗体とを含む溶液に添加し、前記抗原と前記標識抗体との複合体を前記抗体固定化担体に捕捉させ、前記抗体固定化担体に捕捉されなかった標識抗体を分離し、前記抗体固定化担体に捕捉された標識抗体を標識物質に応じた測定方法で測定することで、試料中に含まれる抗原（定量したい物質）の濃度を測定する方法が広く用いられている。
【０００４】
また近年、試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な物質への標識として、磁性粒子が用いる例が報告されており、前記磁性粒子由来の磁気信号を利用して標的物質を測定することができる。磁気信号を利用した測定方法としては、ＳＱＵＩＤセンサーを用いた方法（特許文献２）やホールセンサーを用いた方法（特許文献３）が知られている。しかしながらこれらの方法は、前述した酵素で標識した場合のように、信号を増幅させることができず、高感度な測定は困難であった。
【０００５】
検出レンジを拡大する方法としては、粒子径の異なる２種類の粒子を用いる方法（特許文献４）やラテックス粒子を用いた方法（特許文献５）が知られている。しかしながら、磁気特性の異なる２種類の粒子を用いて信号を増幅させる方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平１−１７２７５５号公報
【特許文献２】特開２００１−３３４５５号公報
【特許文献３】特開２００５−１８８９５０号公報
【特許文献４】特開２００５−７７３０１号公報
【特許文献５】特開２００４−１９１３２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、試料中に含まれる標的物質を磁気信号を利用して測定する方法であって、前記磁気信号を増幅させることで前記標的物質の測定感度を向上させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、本発明に到達した。
【０００９】
すなわち本発明の第一の態様は、
試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な第二の磁性粒子とを用いた、前記標的物質の測定方法であって、
第一の磁性粒子が残留磁気を有した磁性粒子であり、第二の磁性粒子が残留磁気を有さない磁性粒子である、前記測定方法。
【００１０】
また本発明の第二の態様は、
試料中に含まれる標的物質と、前記標的物質と特異的に結合可能な第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な第二の磁性粒子とを反応させることで、前記第一の磁性粒子−前記標的物質−前記第二の磁性粒子の複合体を形成させる工程と、
前記形成した複合体由来の磁気信号を検出する工程とを含む、前記標的物質の測定方法であって、
第一の磁性粒子が残留磁気を有した磁性粒子であり、第二の磁性粒子が残留磁気を有さない磁性粒子である、前記測定方法である。
【００１１】
また本発明の第三の態様は、第一の磁性粒子が強磁性またはフェリ磁性粒子であり、第二の磁性粒子が超常磁性粒子である、前記第一または第二の態様に記載の測定方法である。
【００１２】
さらに本発明の第四の態様は、試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な残留磁気を有した第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な残留磁気を有しない第二の磁性粒子とを含む、前記標的物質の測定試薬である。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
本発明における標的物質と第一の磁性粒子および第二の磁性粒子との結合は、前記標的物質に応じて適宜選択すればよく、標的物質が低分子化合物やタンパク質の場合は抗原抗体反応を、標的物質が糖鎖の場合は糖鎖−レクチン結合を、標的物質が核酸の場合は核酸ハイブリダリゼーションを、それぞれ用いることができる。また標的物質にあらかじめアビジンを固定化することでアビジン−ビオチン結合も用いることができる。
【００１５】
本発明における、残留磁気の有する磁性粒子の一例として、フェライトやアルニコ（Ａｌ−Ｎｉ−Ｃｏ）といった強磁性またはフェリ磁性粒子があげられ、より具体的にはＦｅＰｔ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｆｅ、ＭｎＳｂ、ＭｎＡｓ等の磁性材料から構成される磁性粒子があげられる。また本発明における、残留磁気を有さない磁性粒子の一例として、低い磁界で飽和を示すにもかかわらず、ヒステリシスを示さない磁性粒子があげられ、より具体的には超常磁性粒子があげられる。また残留磁気を有さない磁性粒子は、ポリマーに超常磁性粒子を埋抱した態様であってもよく、その具体例として、市販品であるＭａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ（ＪＳＲライフサイエンス社製）があげられる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、試料中に含まれる標的物質と特異的に結合可能な第一の磁性粒子と、第一の粒子と異なる位置で前記標的物質と特異的に結合可能な第二の磁性粒子とを用いた、前記標的物質の測定方法において、第一の磁性粒子が残留磁気を有した磁性粒子であり、第二の磁性粒子が残留磁気を有さない磁性粒子であることを特徴としている。本発明により、前記標的物質と第一の磁性粒子および第二の磁性粒子との複合体より得られる磁気信号が増幅されるため、前記標的物質を高感度に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の測定試薬の構成を示した模式図。
【図２】本発明の測定方法の一例を示した図。
【図３】本発明の測定方法において、第一の磁性粒子−標的物質−第二の磁性粒子複合体由来の磁気信号を測定する装置の一例を示した図。
【図４】実施例３および４ならびに比較例１から３における磁気信号測定結果。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、試料中に含まれる標的物質と第一の磁性粒子および第二の磁性粒子との結合が抗原抗体反応である例を用いて、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１９】
本発明の測定試薬の構成を示した模式図を図１に示す。試料中に含まれる標的物質１０と特異的に結合可能な抗体を固定化した第一の磁性粒子２１と、第一の磁性粒子２１とは異なる位置で標的物質１０と特異的に結合可能な抗体を固定化した第二の磁性粒子２２とが、容器３０に収納されている。そして第一の磁性粒子２１は残留磁気を有した磁性粒子である一方、第二の磁性粒子２２は残留磁気を有しない磁性粒子である。なお第一の磁性粒子２１は、測定系での分散性に優れ、かつ測定時に凝集しない粒子または自然沈降しない粒子が好ましい。
【００２０】
次に図１に示す本発明の測定試薬を用いた標的物質の測定方法の一例を図２を用いて説明する。
（Ａ）複合体の形成
試料中に含まれる標的物質１０と、第一の磁性粒子２１に固定化された抗体と、第二の磁性粒子２２に固定化された抗体とが抗原抗体反応により結合することで、第一の磁性粒子２１−標的物質１０−第二の磁性粒子２２の複合体を形成させる。第一の磁性粒子２１および第二の磁性粒子２２に抗体を固定化させる方法としては、物理吸着法、化学結合法、イオン結合法等、従来からよく用いられる方法が利用できるが、固定化後の抗体の離脱がなく安定である点で、化学結合法による固定化法が好ましい。
（Ｂ）複合体の沈降
第一の磁性粒子２１−標的物質１０−第二の磁性粒子２２の複合体を自然沈降させることで、容器３０底面に設けた磁気センサー５１による検出領域の近傍に集める。なお外部磁気による集磁により強制的に沈降させてもよい。また磁界の強さは理論的に距離の二乗に反比例するため、前記複合体は磁気センサー直上に速やかに沈降することが望まれる。したがって第二の磁性粒子２２は自然沈降または磁界による集磁性に優れた粒子が好ましい。
（Ｃ）外部磁界の印加
沈降した第一の磁性粒子２１−標的物質１０−第二の磁性粒子２２の複合体に対して外部磁界４０を印加することで、前記複合体を励磁させる。外部磁界４０を印加する方向は、磁気センサー５１による検出領域面（図２の場合は容器３０の底面）を貫通する方向でもよいし、前記検出領域の面に対して平行または斜め方向でもよい。外部磁界４０としては、例えば永久磁石やコイルを用いることができる。
（Ｄ）磁気信号測定
外部磁界４０の印加を解除し、励磁された第一の磁性粒子２１−標的物質１０−第二の磁性粒子２２の複合体由来の磁気信号を磁気センサー５１で検出する。外部磁界４０の印加解除により、第二の磁性粒子２２由来の磁気は消滅するが、第一の磁性粒子２１由来の磁気は残留している。そのため、第一の磁性粒子２１が第二の磁性粒子２２を励磁し続ける状態となり、残留磁気を有した磁性粒子のみを用いた場合や残留磁気を有しない磁性粒子のみを用いた場合と比較し、高い磁気信号を前記複合体から磁気センサー５１で検出することができる。磁気センサー５１の一例として、ＧＭＲ（巨大磁気抵抗効果）素子、ＴＭＲ（トンネル磁気抵抗効果）素子等のＭＲ（磁気抵抗効果）素子や、ホール素子を利用したセンサーがあげられる。
【００２１】
一方、試料中に標的物質が含まれない場合は、前記（Ａ）の工程で複合体が形成されないため、前記（Ｄ）の工程における、第一の磁性粒子２１による第二の磁性粒子２２への励磁が生じない。したがって、磁気センサー５１による磁気信号の検出はない（図２（Ｅ））。
【００２２】
本発明の測定方法において、第一の磁性粒子−標的物質−第二の磁性粒子の複合体由来の磁気信号を測定する装置の一例を図３に示す。
【００２３】
図３に示す測定装置５０は、磁気センサー５１であるＭＲセンサーと、磁気センサー５１を振動させるための振動源５２および振動信号発生装置５３と、磁気信号を抽出するロックインアンプ５４と、抽出した磁気信号を表示する表示部５５とを備えている。振動源５２および振動信号発生装置５３により振動された磁気センサー５１は、第一の磁性粒子２１−標的物質１０−第二の磁性粒子２２の複合体が発する磁場を通過して、電圧信号が出力される。振動信号発生装置５３の駆動信号を参照信号とし、得られた電圧信号をロックインアンプ５４に入力することにより抽出された磁気信号成分が表示部５５に出力される。
【実施例】
【００２４】
以下、標的物質と第一の磁性粒子および第二の磁性粒子との結合として抗原抗体反応を利用したときの実施例および比較例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
【００２５】
実施例１  第一の磁性粒子の作製
以下の方法によりＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン）を認識する抗体を固定化した第一の磁性粒子を作製した。
【００２６】
（１）フェリ磁性粒子へのリビングラジカル重合開始基の固定化
（１−１）磁性粒子（フェライトナノ粒子１０重量％水溶液、平均粒径４０ｎｍ）１０ｍＬを０．１Ｎ塩酸１０ｍＬに分散させ、超音波洗浄器にて１０分間分散した。
（１−２）遠心分離により磁性粒子を沈降させ、上澄み液を除去後、イオン交換水５０ｍＬにて再分散させた。
（１−３）再び遠心分離により磁性粒子を沈降させ、上澄み液を除去後、イオン交換水５０ｍＬにて再分散させた。
（１−４）遠心分離により磁性粒子を沈降させ、上澄み液を除去後、純水１０ｍＬを用いて磁性粒子を２００ｍＬの３口フラスコへ回収した。
（１−５）回収した磁性粒子が入ったフラスコへ、メタノール５０ｍＬ、リビングラジカル重合開始基を有するカップリング剤（３−（トリメトキシシリルプロピル）−２−ブロモ−２−メチルプロピオネート、ＧＥＬＥＳＴ社製、ＳＩＴ８３９７）１ｍＬをメタノール３０ｍＬで希釈した溶液、およびトリエチルアミン４ｍＬを加え、６０℃で２４時間反応させた。
（１−６）反応終了後、遠心分離により磁性粒子を回収した。
【００２７】
（２）フェリ磁性粒子への高分子電解質のコーティング
（２−１）５０ｍＬシュレンク管へスチレンスルホン酸リチウム（ＬｉＳＳ）（スピノマーＬｉＳＳ（純度８５％）、東ソー有機化学社製）３３．５ｇを入れ、窒素置換を行なった。
（２−２）ＬｉＳＳが入ったシュレンク管へ、あらかじめ窒素バブリングにより脱酸素処理した純水４６ｍＬおよびメタノール１６ｍＬを加え、ＬｉＳＳを溶解させた。
（２−３）溶解したＬｉＳＳが入ったシュレンク管へ、（１）で作製した磁性粒子３５０ｍｇを加え、超音波洗浄器で５分間分散させた後、別途調製した遷移金属錯体溶液（臭化銅（Ｉ）３６０ｍｇ、２，２’−ビピリジル７８０ｍｇ、純水５ｍＬ、メタノール５ｍＬ）を全量加えた。
（２−４）さらにフリーのリビングラジカル重合開始種である、２−ブロモイソ酪酸エチル７５μＬを添加し、３０℃の恒温水槽中にて２０時間振とう撹拌を行なうことで重合反応させた。
（２−５）重合反応終了後、遠心分離により磁性粒子を沈降させた。上澄み液を除去し、純水およびメタノールを加えて再分散し、再び遠心分離により磁性粒子を沈降させて、磁性粒子から未反応物や触媒を除去した。
【００２８】
得られた磁性粒子の一部を窒素気流下で乾燥し、熱重量分析装置ＴＧ／ＤＴＡ６２００（セイコーインスツル社製）を使用し、磁性粒子１０ｍｇを４０℃から６００℃に昇温（昇温速度１０℃／分）したときの重量変化から高分子電解質含有量ΔＴＧ（％）を算出した。結果、ΔＴＧ＝１６．１％であった。
【００２９】
また重合反応液を一部採取し、フリーの高分子電解質の数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ）を、ゲル浸透クロマトグラフィー（装置：ＨＬＣ−８０２０（東ソー社製）、カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ｓｕｐｅｒＡＷＭ−Ｈ（東ソー社製）×２本、溶離液：５０ｍＭ硫酸リチウム水溶液／アセトニトリル＝７０／３０（ｖｏｌ％）、温度：４０℃、流速：０．６ｍＬ／分、検出：ＲＩ−８０２０（東ソー社製））を用いて測定し、ポリ（エチレンオキシド）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を標準物質として換算することで求めた。結果、数平均分子量Ｍｎ＝４４０００であり、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．４４であった。
【００３０】
（３）重合末端のアジ化反応
（３−１）３００ｍＬシュレンク管へ、（２）で得られた磁性粒子３００ｍｇ、純水２５ｍＬおよびメタノール２５ｍＬを入れ、超音波洗浄器で１０分間分散させた。
（３−２）分散させた磁性粒子の入ったシュレンク管へ、アジ化ナトリウム０．４７ｇを加え、３０℃の恒温水槽中で２４時間振とう撹拌することで、ＬｉＳＳ重合末端をアジ化させた。
（３−３）アジ化反応終了後、遠心分離により磁性粒子を沈降させた。上澄み液を除去し、純水およびメタノールを加えて再分散し、再び遠心分離により磁性粒子を沈降させて、磁性粒子から未反応物を除去した。
【００３１】
（４）官能基の導入
（４−１）３００ｍＬシュレンク管へ、（３）で得られた磁性粒子３００ｍｇ、純水２５ｍＬおよびメタノール２５ｍＬを入れ、超音波洗浄器で１０分間分散させた。
（４−２）分散させた磁性粒子の入ったシュレンク管へ、別途調製した遷移金属錯体溶液（臭化銅（Ｉ）１４ｍｇ、２，２’−ビピリジル３１ｍｇ、純水５ｍＬ、メタノール５ｍＬ）を５ｍＬを加え、さらに４−ペンチン酸２４ｍｇおよびプロパギルアルコール２６６ｍｇを純水１ｍＬおよびメタノール１ｍＬで希釈した溶液を加え、３０℃の恒温水槽中で２４時間振とう撹拌を行なうことで、磁性粒子に官能基を導入させた。
（４−３）反応終了後、遠心分離により磁性粒子を沈降させた。上澄み液を除去し、純水およびメタノールを加えて再分散し、再び遠心分離により磁性粒子を沈降させて、磁性粒子から未反応物を除去した。
【００３２】
得られた磁性粒子を０．０１ｍｇ／ｍＬで分散させ、当該分散液を、動的光散乱装置ＥＬＳＺ（大塚電子社製）により、７０回積算した際のＭａｒｑｕａｒｄｔ法によって得られる個数分布のピーク値から粒径を算出した。結果、粒径は２４９ｎｍであった。
【００３３】
また得られた磁性粒子を０．０２ｍｇ／ｍＬで分散させ、当該分散液を光路長１０ｍｍの石英セルに入れた後、３６０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所社製）で測定し（初期磁性粒子吸光度）、その後、透過光側でないセルの両面から永久磁石（ネオマグ社製ネオジム磁石角型１０×１０×５Ｎｉメッキ）で２７０秒間外部磁気を付与した後の３６０ｎｍにおける吸光度を測定し（未凝集粒子吸光度）、未凝集粒子吸光度を初期粒子吸光度で除することで磁性粒子の分散性を求めた。結果、磁気分散性は９０％であり、良好な分散性を示していた。
【００３４】
（５）抗体の固定化
（５−１）（４）で得られた磁性粒子分散液８０５μＬ（粒子量１８ｍｇ）が入ったマイクロチューブに、１μｇ／ｍＬ  ＥＤＣ（１−（３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）と０．５μｇ／ｍＬ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−Ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ）とを含む水溶液３６０μＬを加え、室温で２０分撹拌した。
（５−２）さらに５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）９００μＬと、１６．６ｍｇ／ｍＬ  ＴＳＨ認識抗体溶液２１．７μＬと、アミノ末端を有したＰＥＧ（分子量５０００）であるＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０（ＪＳＲライフサイエンス社製）８１μＬとをマイクロチューブに加え、マイクロチューブミキサーを用いて２時間室温で撹拌した。
（５−３）さらにＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０  ６００μＬを添加し、２時間常温で撹拌した。
（５−４）得られた分散液を室温で一晩放置し、スペクトラム社製フォローファイバーモジュール（ポアサイズ５００ｋＤａ）を用いて、０．１％ＢＳＡを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．２）で十分透析後、未結合の抗体を洗浄することで、ＴＳＨ認識抗体を固定化した第一の磁性粒子を作製した。
【００３５】
得られたＴＳＨ認識抗体を固定化した第一の磁性粒子を含むスラリー２００μＬを乾燥させて重量を求め、スラリー濃度５４ｍｇ／ｍＬの分散液を調製した。
【００３６】
実施例２  第二の磁性粒子の作製
以下の方法によりＴＳＨを認識する抗体を固定化した第二の磁性粒子を作製した。
（１）２０ｍｇ／ｍＬ  Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ  ＭＢ１００／Ｃａｌｂｏｘｙｌ粒子（ＪＳＲライフサイエンス社製）５００μＬをマイクロチューブに入れ、磁気スタンドにセットし、上澄み液を除去後、１００ｍＭ  ＭＥＳ（２−Ｎ−（モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ５．０）１ｍＬで３回洗浄した。
（２）１８．４ｍｇ／ｍＬ  ＴＳＨ認識抗体（第一の磁性粒子に固定化した抗体とは抗原のエピトープが異なる）溶液５．３４μＬをマイクロチューブに加え、マイクロチューブローテーターで３０分間撹拌した。
（３）さらに１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣを含む１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５）１００μＬをマイクロチューブ加え室温で３時間撹拌した。
（４）さらにＢｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ  ＣＥ５１０（ＪＳＲライフサイエンス社製）５０μＬを加え３時間室温で撹拌した。
（５）得られた分散液を磁気スタンドにセットし、上澄み液を除去後、０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）を含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．２）１ｍＬで３回洗浄した。上澄み液を除去した残渣に、０．１％ＢＳＡを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．２）５００μＬで再分散することで、ＴＳＨ認識抗体を固定化した第二の磁性粒子を作製した。
【００３７】
実施例３  磁気信号を利用したＴＳＨ免疫測定
実施例１で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第一の磁性粒子と、実施例２で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第二の磁性粒子とを用いて、図２に示す本発明の測定方法を行なうことで、溶液中に含まれるＴＳＨを測定した。
（１）３００μＬ容のチューブ３０に、実施例１で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第一の磁性粒子（２０μＬ、粒子量１ｍｇ相当）、実施例２で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第二の磁性粒子（６０μＬ、粒子量１．２ｍｇ相当）、ならびに１００μＩＵ／ｍＬ  ＴＳＨと５％ゼラチン（新田ゼラチン製）とを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）１００μＬを入れ、３７℃で３０分で撹拌することで、第一の磁性粒子−ＴＳＨ−第二の磁性粒子の複合体を形成させた。
（２）外部磁界４０を磁気センサー５１の検出領域（チューブ３０の底面）に対して平行に印加し、（１）で形成した複合体中の磁気粒子を励磁させることで、前記複合体由来の磁気信号を測定し、これをＴＳＨがある（抗原＋）ときの磁気信号とした。
（３）（１）で加える、ＴＳＨとゼラチンとを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を、５％ゼラチンを含む２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１００μＬとした他は、（１）から（２）と同様に実施し、得られた磁気信号をＴＳＨがない（抗原−）ときの磁気信号とした。
【００３８】
実施例４
実施例１で作製したＴＳＨ認識抗体を結合した第一の磁性粒子の量を３ｍｇとし、実施例２で作製したＴＳＨ認識抗体を結合した第二の磁性粒子の量を２．５ｍｇとした他は、実施例３と同様な方法で磁気信号を測定した。
【００３９】
比較例１
（１）実施例１（５）で加える、ＴＳＨ認識抗体溶液を、１８．４ｍｇ／ｍＬ  ＴＳＨ認識抗体（第一の磁性粒子に固定化した抗体とは抗原のエピトープが異なる）溶液５．３４μＬとした他は、実施例１と同様に実施することで、ＴＳＨ認識抗体を固定化した第二の磁性粒子を作製した。
（２）３００μＬ容のチューブ３０に加える磁性粒子を、実施例１で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第一の磁性粒子（粒子量１ｍｇ相当）、および（１）で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第二の磁性粒子（２０μＬ、粒子量１ｍｇ相当）とした他は、実施例３と同様な方法で磁気信号を測定した。
【００４０】
比較例２
３００μＬ容のチューブ３０に加える磁性粒子を、実施例２で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第二の磁性粒子（６０μＬ、粒子量１．２ｍｇ相当）のみとした他は、実施例３と同様な方法で磁気信号を測定した。
【００４１】
比較例３
３００μＬ容のチューブ３０に加える磁性粒子を、実施例１で作製したＴＳＨ認識抗体を固定化した第一の磁性粒子（２０μＬ、粒子量１ｍｇ相当）のみとした他は、実施例３と同様な方法で磁気信号を測定した。
【００４２】
実施例３および４、ならびに比較例１から３の結果をまとめたものを図４および表１に示す。第一の磁性粒子として残留磁気を有した磁性粒子を、第二の磁性粒子として残留磁気を有さない磁性粒子を、それぞれ用いることで、標的物質（抗原）の有無による磁気信号の変化を確認することができた（実施例３および４）。また第一および第二の磁性粒子の使用量を増やすことで、磁気信号の絶対値が増加し、Ｓ／Ｎ比（抗原＋／抗原−の磁気シグナル比）も向上していることがわかる（実施例４）。一方、第一および第二の磁性粒子がともに残留磁気を有した磁性粒子を用いた場合、磁気信号は標的物質（抗原）の有無にかかわらず３ｍＶと、標的物質（抗原）の有無による磁気信号変化は確認できなかった（比較例１）。なお、第一の磁性粒子のみ、または第二の磁性粒子のみで磁気信号を測定したときも１ｍＶ以下の磁気信号しか検出できなかった（比較例２および３）。
【００４３】
【表１】
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【符号の説明】
【００４４】
１０：標的物質
２１：第一の磁性粒子
２２：第二の磁性粒子
３０：容器
４０：外部磁場
５０：測定装置
５１：磁気センサー
５２：振動源
５３：振動信号発生装置
５４：ロックインアンプ
５５：表示部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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