(57)【要約】【課題】パターン照射装置を精度良く較正する技術を提供する。【解決手段】パターン照射装置１００は、較正パターンを標本Ｓに照射し（ステップＳ１０）、較正パターンが照射された標本Ｓの画像を深さ位置毎に取得する（ステップＳ２０）。さらに、取得した複数の画像から較正パターンが照射された照射深さ位置を特定し（ステップＳ３０）、特定された照射深さ位置に所望のパターンを形成するためのパターン照射装置１００の較正データを、照射深さ位置の画像データと較正パターンに基づいて生成する（ステップＳ４０）。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
波面変調器を備えたパターン照射装置の較正データ生成方法であって、
標本の深さ方向と直交する２次元の目標パターンを含む較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を、前記標本に照射し、
前記光が照射された前記標本の画像データを、深さ位置毎に生成し、
生成した複数の画像データに基づいて、２次元の照射パターンが形成された深さ位置である照射深さ位置を特定し、
前記照射深さ位置の画像データと前記目標パターンに基づいて、前記照射深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項２】
請求項１に記載の較正データ生成方法において、
前記照射深さ位置にパターンを形成するための前記較正データを生成することは、
前記照射深さ位置の画像データに基づいて、前記照射深さ位置に形成された前記照射パターンの３次元座標情報を取得することと、
前記照射パターンの３次元座標情報と前記目標パターンの３次元座標情報に基づいて、前記照射深さ位置にパターンを形成するための前記較正データを生成すること、を含む
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項３】
請求項２に記載の較正データ生成方法において、
前記目標パターンを異なる複数の深さ位置に含む前記較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を、前記標本に光を照射し、
前記複数の画像データに基づいて、２次元の照射パターンが形成された複数の照射深さ位置を特定し、
前記複数の照射深さ位置の複数の画像データに基づいて、前記複数の照射深さ位置に形成された複数の照射パターンの３次元座標情報を取得し、前記複数の照射パターンの３次元座標情報と深さ位置の異なる複数の目標パターンの３次元座標情報に基づいて、前記複数の照射深さ位置にパターンを形成するための複数の較正データを生成し、
前記複数の較正データを補間して、前記複数の照射深さ位置以外の第１の深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項４】
請求項２に記載の較正データ生成方法において、
前記目標パターンを異なる複数の深さ位置に含む前記較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を、前記標本に光を照射し、
前記複数の画像データに基づいて、２次元の照射パターンが形成された複数の照射深さ位置を特定し、
前記複数の照射深さ位置の複数の画像データに基づいて、前記複数の照射深さ位置に形成された複数の照射パターンの３次元座標情報を取得し、前記複数の照射パターンの３次元座標情報と深さ位置の異なる複数の目標パターンの３次元座標情報に基づいて、前記複数の照射深さ位置にパターンを形成するための複数の較正データを生成し、
前記複数の照射パターンの３次元座標情報を補間して生成した前記複数の照射深さ位置以外の第１の深さ位置に形成される照射パターンの３次元座標情報に基づいて、前記第１の深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項５】
請求項３又は請求項４に記載の較正データ生成方法において、
前記較正パターンは、２次元座標情報が等しく強度分布が異なる前記複数の目標パターンを含む
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項６】
請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の較正データ生成方法において、
前記照射深さ位置にパターンを形成するための前記較正データは、前記照射深さ位置の２次元座標変換情報と、前記照射深さ位置にパターンを形成するための深さ位置の補正量を含む
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の較正データ生成方法において、
前記目標パターンは、２つ以上の集光点を含む２次元のパターンである
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項８】
請求項１乃至請求項７のいずれか１項に記載の較正データ生成方法において、
前記複数の画像データの各々のコントラスト値を算出し、算出した複数のコントラスト値に基づいて前記照射深さ位置を特定する
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項９】
請求項１乃至請求項８のいずれか１項に記載の較正データ生成方法において、
前記波面変調器は、ＬＣＯＳを備えた空間光変調器、または、デフォーマブルミラーである
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項１０】
請求項１乃至請求項９のいずれか１項に記載の較正データ生成方法において、
前記標本は、３次元蛍光標本である
ことを特徴とする較正データ生成方法。
【請求項１１】
波面変調器を含み、標本の深さ方向と直交する２次元の目標パターンを含む較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を前記標本に照射する照射手段と、
前記照射手段によって前記光が照射された前記標本の画像データを、深さ位置毎に生成する画像データ生成手段と、
前記画像データ生成手段で生成した複数の画像データに基づいて２次元の照射パターンが形成された深さ位置である照射深さ位置を特定し、特定された前記照射深さ位置の画像データと前記目標パターンに基づいて前記照射深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する較正データ生成手段と、を含む
ことを特徴とするパターン照射装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、波面変調器を備えたパターン照射装置の較正データ生成方法、及び、パターン照射装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、対物レンズの瞳位置と光学的に共役な位置に配置された位相変調型の空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）などの波面変調器を用いて光のパターン照射を行うパターン照射装置が知られている。
【０００３】
一般に、パターン照射装置で光のパターン照射を行う場合、標本に形成すべき光のパターンの形状や照射位置は、標本の画像が表示された画面上で指定される。しかしながら、実際には、光学系の調整不足や誤差により画面上で指定したどおりの形状や位置にパターン照射が行われない場合がある。このため、画面上で指定したどおりにパターン照射が行われるように、パターン照射装置を較正する技術が求められている。
【０００４】
特許文献１には、ユーザによって指定された光のパターンと実際に照射された光のパターンとに基づいて算出した補正パラメータを用いて、位相変調型のＳＬＭの変調量を補正することで、光学装置を較正する技術が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１１２１２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１には、蛍光板などの平板上に光のパターンを照射して補正パラメータを算出する例が示されていて、対物レンズの光軸方向（以降、深さ方向と記す）へのパターンのシフトについては考慮されていない。しかしながら、実際には、光のパターンは指定した深さ位置に形成されるとは限らず、深さ方向へパターンがシフトしてしまうことがある。
【０００７】
以上のような実情を踏まえ、本発明は、パターン照射装置を精度良く較正する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様は、波面変調器を備えたパターン照射装置の較正データ生成方法であって、標本の深さ方向と直交する２次元の目標パターンを含む較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を、前記標本に照射し、前記光が照射された前記標本の画像データを、深さ位置毎に生成し、生成した複数の画像データに基づいて、２次元の照射パターンが形成された深さ位置である照射深さ位置を特定し、前記照射深さ位置の画像データと前記目標パターンに基づいて、前記照射深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する較正データ生成方法を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の較正データ生成方法において、前記照射深さ位置にパターンを形成するための前記較正データを生成することは、前記照射深さ位置の画像データに基づいて、前記照射深さ位置に形成された前記照射パターンの３次元座標情報を取得することと、前記照射パターンの３次元座標情報と前記目標パターンの３次元座標情報に基づいて、前記照射深さ位置にパターンを形成するための前記較正データを生成すること、を含む較正データ生成方法を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、第２の態様に記載の較正データ生成方法において、前記目標パターンを異なる複数の深さ位置に含む前記較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を、前記標本に光を照射し、前記複数の画像データに基づいて、２次元の照射パターンが形成された複数の照射深さ位置を特定し、前記複数の照射深さ位置の複数の画像データに基づいて、前記複数の照射深さ位置に形成された複数の照射パターンの３次元座標情報を取得し、前記複数の照射パターンの３次元座標情報と深さ位置の異なる複数の目標パターンの３次元座標情報に基づいて、前記複数の照射深さ位置にパターンを形成するための複数の較正データを生成し、前記複数の較正データを補間して、前記複数の照射深さ位置以外の第１の深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する較正データ生成方法を提供する。
【００１１】
本発明の第４の態様は、第２の態様に記載の較正データ生成方法において、前記目標パターンを異なる複数の深さ位置に含む前記較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を、前記標本に光を照射し、前記複数の画像データに基づいて、２次元の照射パターンが形成された複数の照射深さ位置を特定し、前記複数の照射深さ位置の複数の画像データに基づいて、前記複数の照射深さ位置に形成された複数の照射パターンの３次元座標情報を取得し、前記複数の照射パターンの３次元座標情報と深さ位置の異なる複数の目標パターンの３次元座標情報に基づいて、前記複数の照射深さ位置にパターンを形成するための複数の較正データを生成し、前記複数の照射パターンの３次元座標情報を補間して生成した前記複数の照射深さ位置以外の第１の深さ位置に形成される照射パターンの３次元座標情報に基づいて、前記第１の深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する較正データ生成方法を提供する。
【００１２】
本発明の第５の態様は、第３の態様又は第４の態様に記載の較正データ生成方法において、前記較正パターンは、２次元座標情報が等しく強度分布が異なる前記複数の目標パターンを含む較正データ生成方法を提供する。
【００１３】
本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第５の態様のいずれか１つに記載の較正データ生成方法において、前記照射深さ位置にパターンを形成するための前記較正データは、前記照射深さ位置の２次元座標変換情報と、前記照射深さ位置にパターンを形成するための深さ位置の補正量を含む較正データ生成方法を提供する。
【００１４】
本発明の第７の態様は、第１の態様乃至第６の態様のいずれか１つに記載の較正データ生成方法において、前記目標パターンは、２つ以上の集光点を含む２次元のパターンである較正データ生成方法を提供する。
【００１５】
本発明の第８の態様は、第１の態様乃至第７の態様のいずれか１つに記載の較正データ生成方法において、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を算出し、算出した複数のコントラスト値に基づいて前記照射深さ位置を特定する較正データ生成方法を提供する。
【００１６】
本発明の第９の態様は、第１の態様乃至第８の態様のいずれか１つに記載の較正データ生成方法において、前記波面変調器は、ＬＣＯＳを備えた空間光変調器、または、デフォーマブルミラーである較正データ生成方法を提供する。
【００１７】
本発明の第１０の態様は、第１の態様乃至第９の態様のいずれか１つに記載の較正データ生成方法において、前記標本は、３次元蛍光標本である較正データ生成方法を提供する。
【００１８】
本発明の第１１の態様は、波面変調器を含み、標本の深さ方向と直交する２次元の目標パターンを含む較正パターンに基づいて前記波面変調器で波面が変調された光を前記標本に照射する照射手段と、前記照射手段によって前記光が照射された前記標本の画像データを、深さ位置毎に生成する画像データ生成手段と、前記画像データ生成手段で生成した複数の画像データに基づいて２次元の照射パターンが形成された深さ位置である照射深さ位置を特定し、特定された前記照射深さ位置の画像データと前記目標パターンに基づいて前記照射深さ位置にパターンを形成するための較正データを生成する較正データ生成手段と、を含むパターン照射装置を提供する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、パターン照射装置を精度良く較正する較正データを生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１に係るパターン照射装置１００の構成を示した図である。
【図２】パターン照射装置１００で行われる処理の流れを示すフローチャートである。
【図３】較正パターン照射処理の流れを示すフローチャートである。
【図４】較正パターン照射処理において設定される目標パターンを例示した図である。
【図５】較正パターンの照射方法の一例について説明するための図である。
【図６】較正パターンの照射方法の別の例について説明するための図である。
【図７】画像取得処理の流れを示すフローチャートである。
【図８】画像データの取得方法について説明するための図である。
【図９】照射深さ位置特定処理の流れを示すフローチャートである。
【図１０】画像データの深さ位置とコントラスト値の関係の一例を示した図である。
【図１１】較正データ生成処理の流れを示すフローチャートである。
【図１２】照射パターンの３次元座標情報の補間方法について説明するための図である。
【図１３】目標パターンの深さ位置と画像データの深さ位置の関係の一例を示した図である。
【図１４】実施例２に係るパターン照射装置２００の構成を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２１】
図１は、本実施例に係るパターン照射装置１００の構成を示した図である。図１に示されるパターン照射装置１００は、標本Ｓに光を照射して任意の光のパターンを形成するパターン照射機能と光のパターンを補正して装置を較正する較正機能とを備えた装置である。パターン照射装置１００は、顕微鏡と、顕微鏡を制御するコンピュータ１５と、コンピュータ１５に接続されたモニタ１６及び入力装置１７と、を備えている。
【００２２】
パターン照射装置１００を構成する顕微鏡は、レーザー１と、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４と、対物レンズ１１とを有する顕微鏡であって、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４でレーザー光の波面を変調することで標本Ｓに任意のレーザー光のパターンを形成する。なお、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４は、ＬＣＯＳ（Liquid Crystal On Silicon）を備えた位相変調型の空間光変調器であり、レーザー光の波面を変調する波面変調器である。
【００２３】
より詳細には、顕微鏡は、図１に示されるように、レーザー１と、ビームエクスパンダ２と、プリズム３と、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４と、リレーレンズ５と、ガルバノミラー６と、瞳リレーレンズ７と、結像レンズ８と、ミラー９と、ダイクロイックミラー１０と、対物レンズ１１と、ステージ１２と、リレーレンズ１３と、光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier tube）１４とを備えている。なお、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４とガルバノミラー６は、それぞれ対物レンズ１１の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていることが望ましい。また、ＰＭＴ１４も、対物レンズ１１の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されていることが望ましい。
【００２４】
コンピュータ１５は、例えばプロセッサである演算制御部１５ａと、例えばハードディスクやメモリである記憶部１５ｂを備えていて、顕微鏡の構成要素のうちの少なくとも、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４、ガルバノミラー６、ステージ１２、及び、ＰＭＴ１４に接続されている。コンピュータ１５は、これらの構成要素を制御するとともに、これらの構成要素からの信号を受信し処理するように構成されている。
【００２５】
以上のように構成されたパターン照射装置１００では、レーザー１から出射されたレーザー光は、ビームエクスパンダ２で光束径を調整され、プリズム３を介してＬＣＯＳ−ＳＬＭ４に入射する。ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４は、各々が独立して制御される二次元に配置された複数のピクセル素子を備えていて、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４に入射したレーザー光は、入射したピクセル素子でその位相が変調され、その結果、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４でレーザー光の波面が変調される。この波面変調は、標本Ｓに形成すべきパターンとして入力装置１７から入力されたパターンに基づいて、コンピュータ１５がレーザー光の波面変調量を算出しＬＣＯＳ−ＳＬＭ４に設定することにより行われる。その後、レーザー光はリレーレンズ５、ガルバノミラー６、瞳リレーレンズ７、結像レンズ８を介してミラー９に入射する。レーザー光は、ミラー９で対物レンズ１１の光軸方向に反射し、レーザー光を透過させ且つ蛍光を反射する特性を有するダイクロイックミラー１０を透過して、対物レンズ１１に入射する。そして、対物レンズ１１がレーザー光をステージ１２上に配置された標本Ｓに照射して、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４での波面変調に応じたレーザー光のパターンが標本Ｓ上に形成される。
【００２６】
即ち、パターン照射装置１００では、顕微鏡は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４で変調された光を標本Ｓに照射するパターン照射手段である。
【００２７】
なお、標本Ｓの画像データを生成する場合には、パターン照射装置１００は、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４でレーザー光の波面を変調することなく、標本Ｓにレーザー光を照射する。そして、対物レンズ１１とＬＣＯＳ−ＳＬＭ４の間に配置されたガルバノミラー６が、対物レンズ１１の光軸と直交するＸＹ方向に標本Ｓをレーザー光で走査する。２次元走査が完了すると、ステージ１２が標本Ｓの深さ方向（Ｚ軸方向）に移動し、対物レンズ１１の焦点面が標本Ｓの異なる深さ位置（Ｚ位置）に移動する。その後、再び、ガルバノミラー６が標本Ｓを走査する。これらの処理を所定の深さ範囲内で繰り返す。レーザー光の照射により標本Ｓから生じた蛍光は、対物レンズ１１を介して入射するダイクロイックミラー１０で反射し、リレーレンズ１３を介してＰＭＴ１４に入射する。蛍光を検出したＰＭＴ１４は電気信号をコンピュータ１５へ出力する。コンピュータ１５は、ＰＭＴ１４からの電気信号を受信し、受信した電気信号と走査位置を示すガルバノミラー６の制御情報からＺ位置毎に標本Ｓの画像データを生成する。
【００２８】
即ち、パターン照射装置１００では、ガルバノミラー６は、標本Ｓの画像データを生成するために標本Ｓをレーザー光で走査する走査手段であり、ＰＭＴ１４は、標本Ｓからの観察光である蛍光を検出する検出器であり、コンピュータ１５は、ＰＭＴ１３からの信号とガルバノミラー６の制御情報とに基づいて標本Ｓの画像データを生成する画像データ生成手段である。また、コンピュータ１５は、標本Ｓに形成すべきパターンに応じて波面変調量を算出し、図示しないＳＬＭコントローラに送信する波面変調量制御部であり、後述する較正データを生成する較正データ生成手段である。
【００２９】
図２は、パターン照射装置１００で行われる処理の流れを示すフローチャートである。図２に示すように、パターン照射装置１００は、まず、較正用に設定されたパターン（以下、較正パターンと記す。）を標本Ｓに照射し（ステップＳ１０：較正パターン照射工程）、較正パターンが照射された標本Ｓの画像を深さ位置毎に取得して画像データを生成する（ステップＳ２０：画像取得工程）。さらに、生成した複数の画像データから較正パターンが照射された照射深さ位置を特定し（ステップＳ３０：照射深さ位置特定工程）、特定された照射深さ位置に所望のパターンを形成するためのパターン照射装置１００の較正データを、照射深さ位置の画像データと較正パターンに基づいて生成する（ステップＳ４０：較正データ生成工程）。
【００３０】
以下、図３から図１３を参照しながら、図２に示す各工程について詳細に説明する。
図３は、較正パターン照射処理の流れを示すフローチャートである。図４は、較正パターン照射処理において設定される目標パターンを例示した図である。図５及び図６は、それぞれ較正パターンの照射方法の一例について説明するための図である。図３から図６を参照しながら、較正パターン照射工程について説明する。
【００３１】
較正パターン照射工程では、まず、顕微鏡システム１００の利用者が、標本Ｓをステージ１２上に設置する（ステップＳ１１）。標本Ｓは、例えば、３次元の蛍光標本である。
【００３２】
その後、利用者は、目標パターンを含む較正パターンをパターン照射装置１００に設定する（ステップＳ１２）。目標パターンは、例えば図４に示すような、標本Ｓの深さ方向（Ｚ軸方向）と直交する２次元のパターンであり、２つ以上の集光点を含む２次元のパターンであることが望ましい。なお、図４に示す目標パターンは、４点Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄからなる２次元のパターンである。また、較正パターンは、目標パターンそのものであってもよく、目標パターンを複数の異なる深さ位置に含む３次元のパターンであってもよい。以降では、較正パターンが異なる深さ位置Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４にそれぞれ目標パターンを含むパターンである場合について例に説明する。
【００３３】
ステップＳ１２において、目標パターンを設定し、目標パターンの深さ位置を１つ以上指定することによって、較正パターンが設定されてもよい。この場合、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４で波面変調を行うことなく標本Ｓの２次元画像を取得し、取得した２次元画像を表示しているモニタ１６上で複数点（例えば、図４の点Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を指定することで、目標パターンを設定してもよい。予め記憶部１５ｂに記憶されたパターンを読み出すことで、目標パターンを設定してもよい。また、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４で波面変調を行うことなく標本Ｓの３次元画像を取得し、取得した３次元画像を表示しているモニタ１６上で１つ以上の目標パターンを指定することで、較正パターンが設定されてもよい。
【００３４】
較正パターンが設定されると、パターン照射装置１００は、ステップＳ１２で設定された較正パターンに基づいて波面変調量を算出して、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４（波面変調器）に設定する（ステップＳ１３）。より詳細には、各ピクセル素子での位相変調量を算出し、その位相変調量を各ピクセル素子に設定する。
【００３５】
その後、パターン照射装置１００は、レーザー１からレーザー光を発振して、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４で波面が変調されたレーザー光を標本Ｓに照射する（ステップＳ１４）。即ち、較正パターンに基づいてＬＣＯＳ−ＳＬＭ４で波面が変調された光を標本Ｓに照射する。これにより、標本Ｓに較正パターンに対応するパターンが形成される。ここで、較正パターンに対応するパターンは、一般に較正パターンに近似したパターンであり、パターン照射装置１００が較正されていないことに起因する誤差を含むパターンである。
【００３６】
ステップＳ１３では、複数の目標パターンを含む較正パターンを標本Ｓに同時に（一度に）形成するための波面変調量が算出されてもよく、その場合、ステップＳ１４では、図５に示すように、較正パターンに対応する３次元のパターンが標本Ｓに形成される。また、ステップＳ１３では、深さ位置が異なる複数の目標パターンの各々を標本Ｓ上に形成するための複数の波面変調量が算出されて、それらの波面変調量が順番にＬＣＯＳ−ＳＬＭ４に設定されてもよい。その場合、ステップＳ１４では、図６（ａ）から図６（ｄ）に示すように複数の目標パターンのそれぞれに対応するパターン（照射パターン）が順番に標本Ｓに形成され、全体として較正パターンに対応する３次元のパターンが形成される。
【００３７】
パターン照射装置１００が図３に示す処理を実行することで、標本Ｓに較正パターンに対応する３次元のパターンが形成され、その結果、光が照射された標本Ｓの部位が褪色する。
【００３８】
図７は、画像取得処理の流れを示すフローチャートである。図８は、画像データの取得方法について説明するための図である。図７及び図８を参照しながら、画像取得工程について説明する。
【００３９】
画像取得工程では、パターン照射装置１００は、対物レンズ１１の焦点面を初期深さ位置Ｚ０に移動させて（ステップＳ２１）、標本Ｓの２次元画像データを生成する（ステップＳ２２）。ここでは、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４で位相変調を行うことなく、図８に示すように、ガルバノミラー６によりレーザー光で標本Ｓを走査し、蛍光を検出したＰＭＴ１４からの信号とガルバノミラー６の制御情報とに基づいて標本Ｓの２次元画像データを生成する。
【００４０】
画像データが生成されると、パターン照射装置１００は、焦点面が所定範囲内に位置するかどうかを判定し（ステップＳ２３）、所定範囲内であると判定されると、焦点面を所定距離だけ深さ方向（Ｚ軸方向）に移動させて（ステップＳ２４）、再度、標本Ｓの２次元画像データを生成する（ステップＳ２２）。パターン照射装置１００は、焦点面が所定範囲外に位置するまで以上の処理を繰り返し実行する。なお、所定範囲は、較正パターンに含まれる複数の目標パターンが形成される異なる複数の深さ位置を含んでいる。
【００４１】
パターン照射装置１００が図７に示す処理を実行することで、較正パターン照射工程で光が照射された部位が褪色した標本Ｓの画像データが、深さ位置毎に生成される。
【００４２】
図９は、照射深さ位置特定処理の流れを示すフローチャートである。図１０は、画像データの深さ位置とコントラスト値の関係の一例を示した図である。図９及び図１０を参照しながら、照射深さ位置特定工程について説明する。
【００４３】
画像取得工程では、まず、パターン照射装置１００は、画像取得工程で生成した複数の画像データの各々のコントラスト値を算出する（ステップＳ３１）。ここで、画像データのコントラスト値は、既知のコントラスト評価法を用いて、画像データを構成するピクセル間の輝度値の差分に基づいて算出される。例えば、ｘ方向にｎピクセル分ずれた位置にある２つのピクセルの輝度値の差分の２乗を画像データ全体で積分した値が、コントラスト値として算出される。
【００４４】
その後、ステップＳ３１で算出した複数のコントラスト値に基づいて、照射深さ位置を特定する（ステップＳ３２）。なお、較正パターンに深さ位置の異なる複数の目標パターンが含まれている場合には、複数の照射深さ位置が特定される。照射深さ位置とは、２次元の照射パターンが形成された深さ位置である。照射深さ位置には、標本Ｓの褪色した部位が存在するため、照射深さ位置の画像データのコントラスト値は、照射深さ位置ではない位置の画像データのコントラスト値よりも高くなる。この特徴を利用して、パターン照射装置１００は、照射深さ位置を特定する。例えば、画像データの深さ位置とコントラスト値が図１０に示すような関係を有する場合であれば、照射深さ位置をコントラスト値が極大（ピーク）となる深さ位置Ｚ１’、Ｚ２’、Ｚ３’、Ｚ４’に特定する。
【００４５】
パターン照射装置１００が図９に示す処理を実行することで、照射パターンが形成された照射深さ位置が確実に特定される。
【００４６】
図１１は、較正データ生成処理の流れを示すフローチャートである。図１２は、照射パターンの３次元座標情報の補間方法について説明するための図である。図１３は、目標パターンの深さ位置と画像データの深さ位置の関係の一例を示した図である。図１１から図１３を参照しながら、較正データ生成工程について説明する。
【００４７】
較正データ生成工程では、まず、パターン照射装置１００は、照射深さ位置の画像データに基づいて照射深さ位置に形成された照射パターンの３次元座標情報を取得する（ステップＳ４１）。複数の照射深さ位置が特定されている場合には、複数の照射深さ位置の複数の画像データに基づいて、複数の照射パターンの３次元座標情報が取得される。
【００４８】
照射パターンの３次元座標情報は、画像データから褪色した部位を特定し、当該部位の座標を算出することで、取得される。例えば、目標パターンが図４に示すように４点からなる場合であれば、画像データから４点の褪色した部位（例えば、Ａ’、Ｂ’、Ｃ’、Ｄ’）が特定され、その４点の２次元座標情報（ＸＹ座標情報）と、照射深さ位置（Ｚ座標情報）とを含む３次元座標情報が取得される。
【００４９】
次に、パターン照射装置１００は、照射パターンの３次元座標情報と目標パターンの３次元座標情報に基づいて、照射深さ位置の較正データを生成する（ステップＳ４２）。照射パターンと目標パターンが複数存在する場合には、複数の照射パターンの３次元座標情報と複数の目標パターンの３次元座標情報に基づいて、複数の照射深さ位置の較正データが生成される。
【００５０】
目標パターンの３次元座標情報は、較正パターン照射工程で設定された情報に基づいて特定される。例えば、目標パターンが図４に示すように４点からなる場合であれば、目標パターンの３次元座標情報は、４点（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の２次元座標情報（ＸＹ座標情報）と、目標パターンの深さ位置（Ｚ座標情報）を含んでいる。
【００５１】
ステップＳ４２で生成される照射深さ位置の較正データは、その照射深さ位置に所望のパターンを形成するための較正データであり、その照射深さ位置の２次元座標変換情報と、その照射深さ位置に２次元のパターンを形成するための深さ方向の補正量を含んでいる。
【００５２】
深さ方向の補正量は、目標パターンの深さ位置（Ｚ座標情報）と照射パターンの深さ位置（Ｚ座標情報）の差である。２次元座標変換情報は、目標パターンの２次元座標情報と照射パターンの２次元座標情報に基づいて算出される変換行列である。
【００５３】
目標パターンと照射パターンがそれぞれ３点の集光点を含む場合であれば、平行移動、回転、拡大・縮小、せん断ひずみが補正可能な、式（１）に示す６パラメータの２次元のアフィン変換行列Ｔを算出することができる。
【数１】
2016133748.tif 000003
【００５４】
この場合、照射パターンの２次元座標（ｘ’、ｙ’）と目標パターンの２次元座標（ｘ、ｙ）の関係は、変換行列Ｔを用いて式（２）で表わされ、式（３）及び（４）のように展開される。
【数２】
2016133748.tif 000004
【００５５】
なお、変換行列Ｔの要素ｄ１とｄ２は、平行移動量を示している。要素ａ１、ｂ１、ａ２、ｂ２からなる２×２の行列は、回転、拡大・縮小、せん断ひずみが合成された変形を示している。この点についてさらに説明する。
２×２の任意の行列Ｓは、式（５）に示すように変形することができる。
【数３】
2016133748.tif 000005
【００５６】
また、回転は式（６）に示す行列Ｘで、拡大・縮小は式（７）に示す行列Ｙで、せん断ひずみは式（８）に示す行列Ｚで表すことができる。ここで、α、β、γ、は、それぞれ式（９）、（１０）、（１１）で表される。また、θは式（１２）及び（１３）を満している。
【数４】
2016133748.tif 000006
【００５７】
さらに、行列Ｓと、行列Ｘ、Ｙ、Ｚは式（１４）に示す関係を有している。
【数５】
2016133748.tif 000007
【００５８】
以上から、変換行列Ｔに含まれる要素ａ１、ｂ１、ａ２、ｂ２からなる２×２の行列は、回転、拡大・縮小、せん断ひずむみが合成された変形を示していることが確認できる。
【００５９】
式（１）に示す変換行列Ｔは、具体的には、次のようにして算出される。まず、目標パターンに含まれる３点（Ａ、Ｂ、Ｃ）の２次元座標から式（１５）に示す行列Ｐを定義する。ここで、点Ａ、Ｂ、Ｃの２次元座標は、以下のとおりである。なお、上付き文字のＴは転置を示している。
【数６】
2016133748.tif 000008
【００６０】
さらに、照射パターンに含まれる３点（Ａ’、Ｂ’、Ｃ’）の２次元座標から式（１６）に示す行列Ｑを定義する。
【数７】
2016133748.tif 000009
【００６１】
式（１５）及び（１６）に示す行列Ｐと行列Ｑの関係は、変換行列Ｔを用いて式（１７）で表わされる。
【数８】
2016133748.tif 000010
【００６２】
行列Ｐは正則行列であり、逆行列が存在することから、変換行列Ｔは、式（１８）により算出される。
【数９】
2016133748.tif 000011
【００６３】
目標パターンと照射パターンがそれぞれ４点の集光点を含む場合であれば、平行移動、回転、拡大・縮小、台形ひずみが補正可能な、式（１９）に示す８パラメータの２次元のアフィン変換行列Ｔを算出することができる。
【数１０】
2016133748.tif 000012
【００６４】
この場合、照射パターンの２次元座標（ｘ’、ｙ’）と目標パターンの２次元座標（ｘ、ｙ）の関係は、変換行列Ｔを用いて式（２０）で表わされ、式（２１）及び（２２）のように展開される。
【数１１】
2016133748.tif 000013
【００６５】
式（１８）に示す変換行列Ｔは、具体的には、次のようにして算出される。まず、目標パターンに含まれる４点（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）の２次元座標から式（２３）に示す行列Ｐを定義する。ここで、点Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの２次元座標は、以下のとおりである。
【数１２】
2016133748.tif 000014
【００６６】
さらに、照射パターンに含まれる４点（Ａ’、Ｂ’、Ｃ’ 、Ｄ’）の２次元座標から式（２４）に示す行列Ｑを定義する。
【数１３】
2016133748.tif 000015
【００６７】
式（２３）及び（２４）に示す行列Ｐと行列Ｑの関係も変換行列Ｔを用いて上記の式（１７）で表わされる。また、行列Ｐに逆行列が存在することから、変換行列Ｔは、上記の式（１８）により算出される。
【００６８】
照射深さ位置の較正データが生成されると、パターン照射装置１００は、照射深さ位置以外の深さ位置（第１の深さ位置）の較正データを補間により算出する（ステップＳ４３）。なお、ここでいう補間には、外挿（いわゆる外挿補間）も含まれてもよい。
【００６９】
第１の深さ位置の較正データは、ステップＳ４２で生成された複数の照射深さ位置の較正データを補間することにより生成されてもよい。この場合、第１の深さ位置の２次元座標変換情報は、複数の照射深さ位置の２次元座標変換情報を補間することにより算出される。より詳細には、変換行列の要素（成分）毎に補間を行うことにより算出される。また、第１の深さ位置のための深さ方向の補正量は、複数の照射深さ位置のための深さ方向の補正量を補間することにより算出される。
【００７０】
また、第１の深さ位置の較正データは、第１の深さ位置に形成される照射パターンの３次元座標情報に基づいて生成されてもよい。第１の深さ位置に形成される照射パターンの３次元座標情報は、ステップＳ４１で取得した複数の照射パターンの３次元座標情報を補間して生成する。以下、図１２及び図１３を参照しながら、照射深さ位置である深さ位置Ｚ２’とＺ３’の間の深さ位置Ｚ５’（第１の深さ位置）の較正データを生成する手順について説明する。
【００７１】
まず、図１２に示すように、深さ位置Ｚ２’に形成される照射パターンの３次元座標情報と深さ位置Ｚ３’に形成される照射パターンの３次元座標情報を補間して、深さ位置Ｚ５’に形成される照射パターンの３次元座標情報を算出する。その後、深さ位置Ｚ５’の３次元座標情報からＸＹ方向に関する２次元座標情報を取得する。取得した２次元座標情報と目標パターンの２次元座標情報に基づいて、深さ位置Ｚ５’の２次元座標変換情報を算出する。さらに、複数の目標パターンの深さ位置（Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４）と複数の照射深さ位置（Ｚ１’、Ｚ２’、Ｚ３’、Ｚ４’）とから、図１３に示すような、目標パターンの深さ位置と画像データの深さ位置の関係を示す関数を算出する。算出した関数に基づいて、画像データの深さ位置Ｚ５’に対応する目標パターンの深さ位置Ｚ５を特定し、深さ位置Ｚ５’のための深さ方向の補正量を算出する。これにより、２次元座標変換情報と深さ方向の補正量とを含む深さ位置Ｚ５’の較正データが得られる。
【００７２】
最後に、パターン照射装置１００は、ステップＳ４２及びステップＳ４３で生成した較正データを記録する（ステップＳ４４）。
【００７３】
以上の処理によって生成された較正データによれば、パターン照射装置１００を精度良く較正することができる。このため、パターン照射装置１００で２次元の光のパターンを任意の深さ位置に精度良く形成することが可能となる。また、パターン照射装置１００で３次元の光のパターンを精度良く形成することが可能となる。
【００７４】
この点について更に説明する。光のパターンが形成される深さ位置毎に装置内を通る光線の経路が異なるため、較正データ（特に、２次元座標変換情報）は深さ位置毎に異なる。このため、深さ方向へのパターンのシフトが十分に考慮されていない場合には、深さ位置を変更して複数の較正データを生成したとしても、光のパターンが実際に形成される深さ位置に対応する較正データを特定することができない。従って、装置を精度良く較正することは困難である。これに対して、パターン照射装置１００では、照射パターンが形成された照射深さ位置を正確に特定した上で各深さ位置の較正データが生成される。このため、使用すべき較正データを正しく特定することが可能であり、その結果、精度良く装置を較正することが可能となる。
【００７５】
また、パターン照射装置１００では、任意の深さ位置の較正データを、他の深さ位置の較正データを補間することにより生成することができる。即ち、任意の深さ位置の較正データを生成するために、その都度、実際にパターンを照射する必要がなく、光のパターンを標本に照射する回数を抑えることができる。従って、必要に応じて任意の深さ位置の較正データを容易に追加することができる。
【実施例２】
【００７６】
図１４は、本実施例に係るパターン照射装置２００の構成を示した図である。図２に示されるパターン照射装置２００は、顕微鏡の構成が、実施例１のパターン照射装置１００とは異なっている。
【００７７】
パターン照射装置２００を構成する顕微鏡は、標本Ｓに任意の光のパターンを形成するための照明系（レーザー１、ビームエクスパンダ２、プリズム３、ＬＣＯＳ−ＳＬＭ４、瞳リレーレンズ１８）と、標本Ｓを走査するための光学系（レーザー２１、ビームエクスパンダ２２、ガルバノミラー２３、瞳リレーレンズ２４）と、を別々に備えている点が、パターン照射装置１００の顕微鏡とは異なっている。このため、任意の光のパターンを標本Ｓ上に形成しながら標本Ｓの画像を取得することができる。また、較正パターン照射工程から画像取得工程への切り替えが素早くできる。
【００７８】
また、パターン照射装置２００を構成する顕微鏡は、非共焦点検出系（リレーレンズ１３、ＰＭＴ１４）に加えて、２次元のＣＣＤイメージセンサを備えたＣＣＤカメラ２７で標本Ｓの画像を取得する検出系（ＩＲカットフィルタ２５、結像レンズ２６、ＣＣＤカメラ２７）を備えている点も、パターン照射装置１００の顕微鏡とは異なっている。ＣＣＤカメラ２７で標本Ｓの画像を取得する場合には、ダイクロイックミラー１０は光路外に取り除かれる。
【００７９】
本実施例に係るパターン照射装置２００によっても、実施例１に係るパターン照射装置１００と同様の処理を実行して、較正データを生成することができる。このため、実施例１に係るパターン照射装置１００と同様の効果を得ることができる。
【００８０】
上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。較正データ生成方法及びパターン照射装置は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。
【００８１】
例えば、上述した実施例では、波面変調器として、ＬＣＯＳ−ＳＬＭを例示したが、例えば、デフォーマブルミラーが採用されてもよい。また、上述した実施例では、２光子励起顕微鏡の構成を例示したが、ガルバノミラーの光源側にダイクロイックミラーなどの光分岐素子を配置し、ピンホールとＰＭＴなどの検出器を配置して一光子励起を使った共焦点レーザー顕微鏡に適用してもよい。また、画像データのコントラスト値に基づいて照射深さ位置を特定する例を示したが、コントラスト値の代わりに他の評価値を算出して照射深さ位置を特定してもよい。例えば、褪色した面積が２次元画像上で最小となる位置や褪色した３次元領域の重心位置をもとに照射深さ位置を特定してもよい。また、較正パターンが異なる深さ位置に複数の同じ目標パターンを含む場合を例に説明したが、複数の目標パターンは異なるパターンであってもよい。ただし、３次元座標情報を補間して較正データを生成する場合には、複数の目標パターンは同じパターンであることが望ましい。さらに、深さ位置によって形成されるパターンの強度分布は変化するため、深さ位置に依存して生じる強度分布の変化分を考慮して予め目標パターンを設定してもよい。このため、較正パターンは、２次元座標情報が等しく強度分布が異なる複数の目標パターンを含むように設定されてもよい。
【符号の説明】
【００８２】
１、２１          レーザー
２、２２          ビームエクスパンダ
３                プリズム
４                ＬＣＯＳ−ＳＬＭ
５、１３          リレーレンズ
６、２３          ガルバノミラー
７、１８、２４    瞳リレーレンズ
８、２６          結像レンズ
９                ミラー
１０、１９、２０  ダイクロイックミラー
１１              対物レンズ
１２              ステージ
１４              ＰＭＴ
１５              コンピュータ
１５ａ            演算制御部
１５ｂ            記憶部
１６              モニタ
１７              入力装置
２５              ＩＲカットフィルタ
２７              ＣＣＤカメラ
１００、２００    パターン照射装置
Ｓ                標本
【図１】
2016133748.tif 000016
【図２】
2016133748.tif 000017
【図３】
2016133748.tif 000018
【図４】
2016133748.tif 000019
【図７】
2016133748.tif 000020
【図９】
2016133748.tif 000021
【図１０】
2016133748.tif 000022
【図１１】
2016133748.tif 000023
【図１３】
2016133748.tif 000024
【図１４】
2016133748.tif 000025
【図５】
2016133748.tif 000026
【図６】
2016133748.tif 000027
【図８】
2016133748.tif 000028
【図１２】
2016133748.tif 000029