(57)【要約】【課題】本発明が解決しようとする課題は、長時間にわたる生体試料の状態変化を、化学発光を利用して解析可能とする方法を提供することである。【解決手段】実施形態に係る解析方法は、ルシフェラーゼとルシフェリンとルシフェリン再生酵素とを含んだ部分を備えた生体試料を経時的に撮像して、複数の発光画像を取得することと、前記複数の発光画像の各々の前記部分に対応した領域の明るさと、前記部分の状態又は前記生体試料の状態とを関連付けることとを含む。実施形態に係るルシフェリン再生酵素タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。実施形態に係る核酸は、配列番号２に記載の塩基配列を有するルシフェリン再生酵素遺伝子を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼとルシフェリンとルシフェリン再生酵素とを含んだ部分を備えた生体試料を経時的に撮像して、複数の発光画像を取得することと、
前記複数の発光画像の各々の前記部分に対応した領域の明るさと、前記部分の状態又は前記生体試料の状態とを関連付けることと
を含む解析方法。
【請求項２】
前記生体試料は、細胞、胚、組織または個体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生体試料は、前記生体試料中における前記ルシフェラーゼによる発光量を調節するための因子をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ルシフェラーゼが、前記生体試料中に導入されたルシフェラーゼ遺伝子から発現し、且つ前記因子が、前記ルシフェラーゼ遺伝子の上流に配置されたプロモーターである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記因子は、前記ルシフェラーゼによって触媒される発光反応に必須な補因子である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料は、識別可能な発光反応を触媒する２種以上のルシフェラーゼを含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ルシフェラーゼは第１のタンパク質と融合しており、且つ前記生体試料は、標識された、第１のタンパク質とは異なる第２のタンパク質をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のタンパク質は、選択的タンパク質分解反応に関連するマーカー、タンパク質相互作用を示すタンパク質の全体またはその一部から成るマーカー、リガンド検出タンパク質の全体またはその一部から成るマーカー、胚発生のマーカー、神経分化マーカーまたはＥＳ細胞分化マーカーである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するルシフェリン再生酵素タンパク質。
【請求項１０】
配列番号２に記載の塩基配列を有するルシフェリン再生酵素遺伝子を含む核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料の解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内のシグナル伝達や遺伝子発現といった生体内の活動の解析に、ルシフェラーゼの存在下で生じるルシフェリンの化学発光が利用されている。この化学発光を利用した解析は、励起光による細胞のダメージが生じない、自家発光の問題が生じない、および定量性に優れているといった利点を有する。
【０００３】
一般に、上記の化学発光を利用した解析では、最初に、ルシフェラーゼ遺伝子を導入した細胞またはルシフェラーゼと解析の対象とするタンパク質との融合タンパク質を導入した細胞を準備し、この細胞を溶解して細胞溶解液を作製し、その後、この細胞溶解液にルシフェリンおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等を添加し、光電子増倍管を用いたルミノメーターで発光量を測定する。すなわち、発光の測定は、細胞を溶解した後に行われる。このため、ある時点での発光量は、測定に使用した全細胞の平均値として得られる。
【０００４】
オキシルシフェリンをルシフェリンへと変換する酵素が見つかっている（非特許文献１）。オキシルシフェリンとは、ルシフェリンが化学発光する反応、すなわちルシフェリンの酸化の進行に伴って生じる物質である。この酵素は、ルシフェリン再生酵素（ＬＲＥ）と名付けられている。このＬＲＥを、ルシフェラーゼが触媒する化学発光反応を生じる溶液中に添加すると、発光量が増大することがわかっている（非特許文献１のＦＩＧ．８）。
【０００５】
ＬＲＥの発光量を増大させるという利点を利用して、ＬＲＥを利用した生体内物質の測定方法が検討されている。特許文献１には、ＬＲＥを利用したＡＴＰ量の測定方法が開示されている。この方法では、ルシフェラーゼが誘起するルシフェリンの発光を計測する手段として、ルミノメーター、シンチレーションカウンター、光度計およびフォトエマルジョンフィルムが示されている（段落００２３）。また、特許文献２には、ＬＲＥを利用した細胞内ＡＴＰおよび／または遺伝子発現の測定方法が開示されている。この方法では、ルシフェリンの発光を計測する手段として、ルミノメーターが使用されている（段落００９４および００９５）。したがって、いずれの場合も、発光量は、測定に使用した全細胞についてのある時点における平均値として得られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３９８３０２３号明細書
【特許文献２】特表２００５−５０９４２６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J.Biol.Chem.，２００１年  ９月，Vol.276，p.36508-36513
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明が解決しようとする課題は、長時間にわたる生体試料の状態変化を、化学発光を利用して解析可能とする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
実施形態に係る解析方法は、ルシフェラーゼとルシフェリンとルシフェリン再生酵素とを含んだ部分を備えた生体試料を経時的に撮像して、複数の発光画像を取得することと、前記複数の発光画像の各々の前記部分に対応した領域の明るさと、前記部分の状態又は前記生体試料の状態とを関連付けることとを含む。
【００１０】
実施形態に係るルシフェリン再生酵素タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
実施形態に係る核酸は、配列番号２に記載の塩基配列を有するルシフェリン再生酵素遺伝子を含む。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、個々の生体試料の状態変化を、長時間にわたって解析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、インビトロにおいて、実施形態に係るルシフェリン再生酵素が、ルシフェラーゼの発光量の経時変化に与える影響を示すグラフである。
【図２】図２は、インビトロにおいて、実施形態に係るルシフェリン再生酵素が、ルシフェラーゼの発光量の積算値に与える影響を示すグラフである。
【図３】図３は、インビボにおいて、実施形態に係るルシフェリン再生酵素が、ルシフェラーゼの発光量の積算値に与える影響の予想を示すグラフである。
【図４】図４は、インビボにおいて、実施形態に係るルシフェリン再生酵素が、ルシフェラーゼの発光量の経時変化に与える影響の予想を示すグラフである。
【図５】図５は、ルシフェラーゼの発光量の積算値に与える影響に関する、実施形態に係るルシフェリン再生酵素と従来のルシフェリン再生酵素との間の比較の予想を示すグラフである。
【図６】図６は、ルシフェラーゼの発光量の経時変化に与える影響に関する、実施形態に係るルシフェリン再生酵素と従来のルシフェリン再生酵素との間の比較の予想を示すグラフである。
【図７ａ】図７ａは、実施形態に係るルシフェリン再生酵素を用いた、時計遺伝子の発現の変動の測定結果の予想を示すグラフである。
【図７ｂ】図７ｂは、実施形態に係るルシフェリン再生酵素を用いて、時計遺伝子の発現の変動の測定結果の予想を示すグラフである。
【図８】図８は、実施形態に係る方法において、発光する細胞を撮像した予想を示す画像である。
【図９ａ】図９ａは、実施形態に係る方法において、発光する細胞を撮像した予想を示す画像である。
【図９ｂ】図９ｂは、実施形態に係る方法によって、細胞ごとの発光量を経時的に測定した予想を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１実施形態は、解析方法である。
【００１５】
実施形態に係る解析方法は、ルシフェラーゼとルシフェリンとルシフェリン再生酵素とを含んだ部分を備えた生体試料を経時的に撮像して、複数の発光画像を取得することと、これら発光画像の各々の上記部分に対応した領域の明るさと、上記部分の状態又は生体試料の状態とを関連付けることとを含む。なお、「発光画像」は、ルシフェリンの化学発光によって生じる明るさの分布を含んだ画像である。
【００１６】
この解析方法では、例えば、ルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素を含む生体試料を作製する第１工程と、生体試料の発光画像を経時的に撮像する第２工程と、撮像によって得られた複数の発光画像に基づいて、生体試料の発光量の経時変化を調べる第３工程とを順次行う。
【００１７】
第１工程では、ルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素を含む生体試料を作製する。生体試料とは、例えば、細胞、胚、組織または個体である。細胞とは、例えば、培養細胞、単細胞生物の細胞である。胚には、多細胞生物の発生初期の段階にある種々の細胞または細胞集団が含まれる。組織は、組織切片であってもよい。個体は、単細胞生物の個体および多細胞生物の個体を含む。生体試料が細胞である場合、ルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素が当該細胞中に含まれる。生体試料が胚、組織または個体である場合、ルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素は、これらの生体試料を構成する細胞中に含まれる。生体試料は、２種以上のルシフェラーゼを含んでよい。例えば、生体試料は、識別可能な発光反応を触媒する２種以上のルシフェラーゼを含んでよい。すなわち、このような２種以上のルシフェラーゼは、それぞれ異なる発光色の発光反応を触媒し、それぞれ活性状態を測定することが可能である。
【００１８】
ルシフェラーゼとは、一般に、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を指す。当該酵素の基質となる物質はルシフェリンと呼ばれる。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。ルシフェラーゼは、種々の生物に由来するものを使用することができる。例えば、甲虫目に属するホタル科由来のもの、イリオモテボタル科由来のもの、コメツキ科由来のものを使用することができる。
【００１９】
ルシフェリン再生酵素（ＬＲＥ）とは、反応物としてのオキシルシフェリンからルシフェリンが生成される反応を触媒する酵素である。ＬＲＥは、種々の生物に由来するものを使用することができる。例えば、ゲンジボタル由来のＬＲＥまたはヘイケボタル由来のＬＲＥを使用することができる。さらに、本発明者等によって新規に発見された配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＬＲＥを使用してもよい。すなわち、使用可能なＬＲＥは、既知のものに限られない。
【００２０】
ルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素は、任意の方法によって、生体試料中に導入することができる。例えば、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、生体試料中に遺伝子を導入し、その遺伝子からルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素を発現させることができる。あるいは、例えばマイクロインジェクション法によって、これらのタンパク質を生体試料中に直接導入してもよい。ルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素は、ルシフェラーゼの触媒作用によって酸化したルシフェリン、すなわちオキシルシフェリンが、ルシフェリン再生酵素によって速やかにルシフェリンへと戻るように、互いの近くに位置させることが好ましい。
【００２１】
第２工程では、生体試料の発光画像を経時的に撮像する。撮像に用いる装置としては、発光画像を取得できるものを使用する。特に、顕微鏡を使用することができる。撮像の際には、生体試料を、発光反応が生じ得る環境下に置く。例えば、使用する生体試料に適した培養培地中に適切な量のルシフェリンを添加する。撮像は、任意のタイミングで経時的に行うことができる。例えば、生体試料に対して特定の刺激を与えた後、一定の時間間隔で複数回の撮像を行うことができる。顕微鏡を用いて撮像する場合、視野に単一の細胞のみを入れてもよく、または複数の細胞を入れてもよい。生体試料中の細胞の全体的な状態を確認できるという点で、複数の細胞を含む画像を取得することが好ましい。
【００２２】
第３工程では、撮像によって得られた複数の発光画像に基づいて、生体試料の発光量の経時変化を調べる。具体的には、発光量の数値化を行う。例えば、各発光画像について、発光画像の特定の領域における明るさに対応したデータ（以下、輝度データという）を抽出する。発光量は、例えば、輝度データに対応した値であるか、または、特定の区間における輝度データの積算値に対応した値である。発光画像のうち生体試料に対応した領域について得られる発光量または輝度データは、生体試料中のルシフェラーゼの量を反映していると考えられる。なお、通常、この領域は、撮像素子の複数の画素に対応した広さを有している。したがって、通常、先の領域からは複数の輝度データを抽出し、それらの和を求める。このデータの抽出に用いる手段としては、例えば画像解析用のコンピュータプログラムを使用することができる。当該プログラムを用いて、例えば、いずれかの発光画像の特定の領域を指定し、その発光画像及び他の発光画像から、先の領域における輝度データを抽出する。輝度データを抽出する領域は、画像の中から任意に選択することができる。研究の目的に応じて、例えば、１つ以上の細胞に対応した領域を選択することができる。例えば、１枚目のまたは２枚目以降の発光画像において、特定の形態をとっているかまたは細胞周期において特定の状態にある細胞に対応した領域を選択することができる。単一の細胞に対応した領域を選択して、その領域の輝度データを抽出してもよく、あるいは、複数の細胞にそれぞれ対応した複数の領域を選択し、それら領域の輝度データを合算してもよい。
【００２３】
生体試料は、生体試料中におけるルシフェラーゼの発光量を調節するための因子をさらに含んでいてもよい。
【００２４】
このような因子は、ルシフェラーゼの量を調節する因子であってよい。例えば、この因子によって、撮像の間、常にルシフェラーゼの量が一定となるように調節されていてもよく、あるいは、任意のパターンにそって増減するように調節されていてもよい。例えば、生体試料中にルシフェラーゼ遺伝子を導入して、この遺伝子からルシフェラーゼを発現させる場合、この遺伝子の上流に任意のプロモーターを配置することができる。このようなプロモーターとして、例えば、常に発現を促すプロモーター、外部刺激に応じて発現を促すプロモーター、または細胞内の状態に応じて発現を促すプロモーターを使用することができる。例えば、時計遺伝子のプロモーターを使用することができ、例えばｍＰｅｒ２のプロモーターを使用することができる。このようなプロモーターは、研究の目的に応じて選択することができる。
【００２５】
あるいは、このような因子は、ルシフェラーゼの活性を調節する因子であってよい。このような因子とは、例えば、ルシフェラーゼが触媒する発光反応に必須な補因子である。このような補因子の例は、ＡＴＰやＭｇイオンである。
【００２６】
ルシフェラーゼは、生体試料中において、その他のタンパク質（「第１のタンパク質」と称する）との間で融合されていてもよい。すなわち、生体試料中において、ルシフェラーゼが第１のタンパク質の標識として用いられてもよい。この場合、ルシフェラーゼの量は、生体試料中における第１のタンパク質の発現量を反映する。第１のタンパク質は、細胞の状態を表すマーカーであることが好ましい。すなわち、第１のタンパク質は、細胞において内因的に発現するタンパク質であって、細胞の状態に応じてその発現量が変化するタンパク質であることが好ましい。例えば、第１のタンパク質は、選択的タンパク質分解反応に関連するマーカー、タンパク質相互作用を示すタンパク質の全体またはその一部から成るマーカー、リガンド検出タンパク質の全体またはその一部から成るマーカー、胚発生のマーカー、神経分化マーカーまたはＥＳ細胞分化マーカーであることが好ましい。特に、第１のタンパク質は、選択的タンパク質分解反応に関連するマーカーであることが好ましい。このようなマーカーの発現の状態をルシフェラーゼの発光量として観察することで、細胞の状態を推定することが可能となる。ルシフェラーゼで標識された第１のタンパク質の生体試料への導入は、上述した方法と同様に行うことができる。
【００２７】
生体試料は、標識された、第１のタンパク質とは異なる第２のタンパク質をさらに含んでいてもよい。標識としては、蛍光分子または発光分子を使用することができる。例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ等の蛍光タンパク質を使用することができる。この場合、第２工程にて取得される画像において、第２のタンパク質の発現の有無およびその局在を確認することができる。第２のタンパク質としては、例えば、生体試料内の機能を研究しようとするタンパク質が選択される。生体試料中に、第１のタンパク質と第２のタンパク質とを同時に導入した場合、ルシフェラーゼの発光量に基づいて細胞の状態を推定しつつ、その状態における第２のタンパク質の挙動を観察することが可能となる。あるいは、第２のタンパク質として、第１のタンパク質とは異なるマーカーが選択される。この場合、細胞の状態を推定するために、第１のタンパク質および第２のタンパク質という２つの基準を使用することができる。
【００２８】
さらに、生体試料は、第１のタンパク質および第２のタンパク質とは異なる、１以上のタンパク質を含んでもよい。それらのタンパク質は標識されていてもよい。
【００２９】
ルシフェリンは、第１工程において生体試料に導入してもよい。また、ルシフェリン再生酵素は、第２工程において生体試料に導入してもよい。
【００３０】
従来の技術として、ルシフェラーゼおよびルシフェリン再生酵素を同時に細胞内に発現させてルミノメーター等により細胞全体の発光量を測定する方法が存在する。この方法では、主に、短期的に発光量を増強する目的で、ルシフェリン再生酵素を利用している。また、この方法では、細胞全体の発光量を測定するため、細胞の状態と発光の状態との関連性を細胞毎に調べることはできない。
【００３１】
一方、本発明に係る解析方法では、生体試料またはその一部の状態を、発光画像の各々の上記生体試料またはその一部に対応した領域の明るさと関連付ける。例えば、ルシフェラーゼの発光量の変動と、時計遺伝子によって制御される概日リズムとが関連付けられる。同様に、ルシフェラーゼの発光量の変動と、例えば、細胞周期、胚発生、神経分化またはＥＳ細胞の分化の状態とが関連付けられる。このような関連付けと、発光画像から得られる細胞の形態や細胞内の別のタンパク質の挙動といった情報を結び付けることで、有用な情報を得ることができる。例えば、概日リズムのある段階において、細胞が如何なる形態をとるのか、または細胞内で特定のタンパク質が如何なる挙動をとるのかといったことを研究することができる。実施形態に係る方法によれば、この様な研究を、高感度に、長時間にわたり、詳細に行うことができる。特に、発光像を撮像するために必要な露出時間を短縮でき、従来よりも長時間観察でき、従来よりも時間分解能が高い経時的観察が可能となる。
【００３２】
本発明の第２実施形態は、ルシフェリン再生酵素タンパク質である。
【００３３】
実施形態に係るルシフェリン再生酵素タンパク質は、例えば、節足動物門昆虫綱甲虫目ホタル科に属す生物に由来する。すなわち、実施形態に係るルシフェリン再生酵素タンパク質は、節足動物門昆虫綱甲虫目ホタル科に属す生物から取得されたルシフェリン再生酵素タンパク質またはその変異体である。
【００３４】
実施形態に係るルシフェリン再生酵素タンパク質の具体例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。このルシフェリン再生酵素タンパク質は、日本産のクロマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｆｕｍｏｓａ）から新規に取得されたものである。このタンパク質に関して、既知のタンパク質データーベース検索において６９％以上相同なタンパク質は登録されていない。
【００３５】
このアミノ酸配列は、以下の通りである。
MGPVVEKIEALGNFMVGEGPHWDHQTQALYFVDILGKTIHKYIPSLEKHTSLKVDQAPSFIIPVTGSSDRFVISLEGDIGILTWNGIDSAPTSIKIVGTVDSEPGNENNRINDGKADPLGNLWAGTMAIDADLPVGPVRGTLYSLTPDKQFKSHAKNIAISNGLAWSKDLKKMYYIDSAKRGIDQYDFDASTLSISNCQPLFTFEKHQIPGYPDGQTIDADGNLWVAVFQGNRVIKISTNKPEMLLDTIEIPDHQVTSVAFGGPNLDVLYVTSAGKPLHCSPGSSIYGHLYKVTGLGVNGLPGDTVNI（配列番号１）。
【００３６】
実施形態に係るルシフェリン再生酵素タンパク質の別の例は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の変異体である。この変異体は、例えば、そのアミノ酸配列が野生型のアミノ酸配列との間で６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有し、且つルシフェリン再生酵素としての活性を有する。
【００３７】
実施形態に係るルシフェリン再生酵素タンパク質は、実施形態に係る解析方法に使用することができる。
【００３８】
本発明の第３実施形態は、ルシフェリン再生酵素遺伝子を含む核酸である。
【００３９】
実施形態に係るルシフェリン再生酵素遺伝子は、例えば、節足動物門昆虫綱甲虫目ホタル科に属す生物に由来する。すなわち、節足動物門昆虫綱甲虫目ホタル科に属す生物から取得されたルシフェリン再生酵素遺伝子またはその変異体である。
【００４０】
実施形態に係る核酸の具体例は、配列番号２に記載の塩基配列を有するルシフェリン再生酵素遺伝子を含む。このルシフェリン再生酵素遺伝子は、日本産のクロマドボタル（Ｐｙｒｏｃｏｅｌｉａ  ｆｕｍｏｓａ）から新規に取得されたものであり、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００４１】
この塩基配列は、以下の通りである。
ATGGGACCTGTTGTAGAAAAAATCGAAGCGTTGGGCAATTTTATGGTTGGGGAGGGTCCTCACTGGGACCACCAAACACAAGCTTTATATTTTGTAGATATTTTAGGGAAAACAATTCATAAATACATACCTTCTCTCGAAAAACATACCTCCTTAAAAGTGGACCAAGCGCCTTCATTTATTATTCCTGTTACTGGTTCGTCTGATCGTTTTGTAATCAGTCTCGAAGGAGATATTGGTATCCTTACATGGAATGGTATCGATTCTGCACCAACCAGCATAAAAATAGTTGGTACTGTTGACAGTGAACCTGGAAATGAGAATAACAGAATCAATGATGGTAAAGCAGACCCTCTTGGTAATTTATGGGCAGGTACCATGGCCATTGATGCCGATCTTCCAGTAGGACCAGTAAGAGGCACTTTATATAGTTTAACGCCCGATAAACAATTCAAAAGTCATGCAAAAAATATAGCTATATCGAATGGTCTCGCTTGGAGTAAGGACTTGAAGAAAATGTACTATATTGATTCCGCCAAAAGGGGAATCGATCAGTATGATTTTGATGCTTCTACTTTGTCTATCAGTAATTGTCAGCCGTTATTTACTTTTGAAAAGCACCAAATCCCTGGGTATCCAGATGGTCAAACAATTGATGCGGACGGTAACTTATGGGTAGCTGTTTTCCAAGGAAATAGAGTGATTAAAATCAGTACTAACAAACCTGAAATGTTACTTGATACTATAGAAATACCAGACCATCAGGTGACCTCAGTTGCGTTTGGTGGTCCCAATTTGGATGTTCTCTATGTAACAAGTGCTGGTAAACCGCTTCATTGCAGTCCCGGTAGTTCGATCTACGGGCATCTTTATAAAGTGACTGGTCTAGGTGTCAATGGTTTGCCAGGAGATACAGTGAACATTTGA（配列番号２）。
【００４２】
実施形態に係る核酸の別の例は、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸の変異体である。例えば、この変異体の塩基配列は、野生型のアミノ酸との間で６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上の相同性を有し、且つこの変異体がコードするタンパク質はルシフェリン再生酵素としての活性を有する。
【００４３】
実施形態に係る核酸は、実施形態に係る解析方法に使用することができる。
【実施例】
【００４４】
［例１：日本産ホタル科クロマドボタルに由来するＬＲＥタンパク質遺伝子のクローニング］
日本産ホタル科クロマドボタルに由来するＬＲＥタンパク質遺伝子のクローニングを行った。簡潔には、本生物中から抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを基にｃＤＮＡらイブラリーを作製し、これを鋳型としてＰＣＲの手法を用いて遺伝子をクローニングした。
【００４５】
１．ｃＤＮＡライブラリーの作成
２００７年８月に東京都御岳山周辺で採集したクロマドボタルの幼虫１個体から０．００９ｇの発光器を切り取った。採取した発光器および１ｍＬのトータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン社）を、Ｌｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｄチューブ（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に入れた。このチューブは、組織および細胞のホモジナイズ用のビーズを含む。このチューブを組織細胞破砕装置ＦａｓｔＰｒｅｐ  ２４（ＭＰ−Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）に装着し、振動速度６．５ｍ／ｓおよび振動時間４５秒の条件で、ホタルの発光器を試薬中にて破砕した。完了後、チューブを破砕装置から取り出し、３０分間氷上に置いた。その後、もう一度同じ条件で破砕を実施した。
【００４６】
次に、トータルＲＮＡ抽出試薬ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔの説明書に従って、破砕した溶液からトータルＲＮＡの分離精製を行った。得られたｍＲＮＡ溶液１００μｌを、エタノール沈殿法によって沈殿濃縮した。次に、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（インビトロジェン社）をマニュアルに従って使用して、沈殿濃縮したトータルＲＮＡから完全長ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ溶液２０μｌをホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーとして以下の遺伝子実験に用いた。
【００４７】
２．ホタルＬＲＥ遺伝子の５’末端側の同定
２−１．Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄ（ＲＡＣＥ）法に用いるプライマーの作製
ＬＲＥ遺伝子のクローニングを、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法によって行った。ＰＣＲ法に使用するプライマーを、既知の近縁生物由来のＬＲＥ遺伝子のアミノ酸配列に基づいて、以下の通り作製した。
【００４８】
種々のホタルＬＲＥにおいてよく保存されているアミノ酸領域を確認するために、既に公開されている３種類のホタルＬＲＥのアミノ酸配列を、配列情報解析ソフトウェアＤＮＡＳＩＳ  Ｐｒｏ（日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社）を用いて比較した。比較に用いた近縁生物のアミノ酸配列は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ（登録番号：ＡＢ０６２７８６）、Ｌｕｃｉｏｌａ  ｃｒｕｃｉａｔａ（登録番号：ＡＢ０７２４４８）およびＬｕｃｉｏｌａ  ｌａｔｅｒａｌｉｓ（登録番号：ＡＢ０７２４４７）である。
【００４９】
比較の結果、ＬＲＥのＣ末端付近にあるＶ−Ｔ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号３）およびＮ−Ｄ−Ｇ−Ｋ−Ａ−Ｄ（配列番号４）のアミノ酸配列がよく保存されていることがわかった。これら２つのアミノ酸配列をコードするコドンから塩基配列を予測し、５’末端ＲＡＣＥ  ＰＣＲに用いる１６種類（配列番号５から２０）および４種類（配列番号２１から２４）のＬＲＥ特異的混合プライマーを設計した。これらのプライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託して行った。
【００５０】
これらのプライマーの名称および配列は以下の通りである（プライマー配列中のＹおよびＮは混合塩基を示す）：
ＬＲＥ−Ｒ１−ＡＡ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCTGTTAC-3’：配列番号５）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＴＡ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCTGTAAC-3’：配列番号６）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＧＡ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCTGTCAC-3’：配列番号７）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＣＡ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCTGTGAC-3’：配列番号８）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＡＴ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCAGTTAC-3’：配列番号９）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＴＴ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCAGTAAC-3’：配列番号１０）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＧＴ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCAGTCAC-3’：配列番号１１）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＣＴ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCAGTGAC-3’：配列番号１２）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＡＣ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCGGTTAC-3’：配列番号１３）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＴＣ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCGGTAAC-3’：配列番号１４）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＧＣ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCGGTCAC-3’：配列番号１５）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＣＣ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCGGTGAC-3’：配列番号１６）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＡＧ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCCGTTAC-3’：配列番号１７）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＴＧ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCCGTAAC-3’：配列番号１８）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＧＧ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCCGTCAC-3’：配列番号１９）、
ＬＲＥ−Ｒ１−ＣＧ（5’-CCYTTNACNCCNARNCCCGTGAC-3’：配列番号２０）、
ＬＲＥ−Ｒ２−ＡＡ（5’-TCnGCYTTnCCATCATT-3’：配列番号２１）、
ＬＲＥ−Ｒ２−ＧＡ（5’-TCnGCYTTnCCGTCATT-3’：配列番号２２）、
ＬＲＥ−Ｒ２−ＡＧ（5’-TCnGCYTTnCCATCGTT-3’：配列番号２３）、および
ＬＲＥ−Ｒ２−ＧＧ（5’-TCnGCYTTnCCGTCGTT-3’：配列番号２４）。
【００５１】
２−２．５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによる、ホタルＬＲＥ遺伝子の５’末端側のクローニング
上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、上述の通り作製したＶ−Ｔ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号３）に基づいて作製した１６種のプライマーおよびＮ−Ｄ−Ｇ−Ｋ−Ａ−Ｄ（配列番号４）に基づいて作製した４種類の特異的混合プライマーと、５’末端特異的プライマーであるＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＧＡ  ＣＴＧ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＴ  ＧＡ−３’：配列番号２５）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＴＡ−３’：配列番号２６）とを用いて５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲおよびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲによって効率的にＬＲＥ遺伝子を増幅させるため、一度ＰＣＲによって増幅した遺伝子を鋳型にし、内側のプライマー対でさらに特異的に遺伝子増幅させるｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００５２】
Ｖ−Ｔ−Ｇ−Ｌ−Ｇ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号３）に基づいて作製した１６種のプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒとを用いて、一度目の５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲをマニュアルに沿って実施した結果、明瞭な遺伝子の増幅を確認することができなかった。このＰＣＲ産物を鋳型として２度目のＮｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを実施した。
【００５３】
Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲは、Ｎ−Ｄ−Ｇ−Ｋ−Ａ−Ｄ（配列番号４）に基づいて作製した４種類のプライマーとＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとを用いて実施した。その結果、ＬＲＥ−Ｒ１−ＧＡ（配列番号７）またはＬＲＥ−Ｒ１−ＣＴ（配列番号１２）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’Ｐｒｉｍｅｒとの組み合わせで実施したＰＣＲの産物を鋳型とし、ＬＲＥ−Ｒ２−ＡＡ（配列番号２１）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ５’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒとの組み合わせをプライマーとして実施したｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによって、約０．５ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅した。
【００５４】
２−３．５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
５’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
【００５５】
ゲル抽出の手法を用いて約０．５ｋｂｐ付近の遺伝子を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９）  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＣＡＣ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  Ｃ−３’：配列番号２７）とＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅ（５’−ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＡＧＧ−３’：配列番号２８）とから成るプライマー対を用いた。
【００５６】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行った。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させた。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させた。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させた。この溶液を９４℃２分間の熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとした。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ）を用いて塩基配列を読み取った。塩基配列の解析方法はマニュアルに従って実施した。
【００５７】
シークエンシングによって得られた遺伝子配列は次の通りである：
ATTCTTATAATAATTAATTTAATAAGCAGTCGTGCACCGGATCCTGACAAAGTAAAAGGCAGTTATTTAAAGTGTAGTTTCGAATAGAGAAATACCATCATCAGTGGATCGTTGAAGGSTACAACAAATTGTAAAACCTACATGAAGAGGCAAAGGTGGTAATATGGGCCCTGAGGGTGATATGGCCCCCGTCGGAAACACGAATACAAATAACGTGGTTTGACACCAAGGCTATTCATAACGCGTCGTTGACTTGTAGTTTCGCATCGCGTTCATTCCGAGTTCAAAGCTGACAGAGATAGTGACCAGTATAAGTCATTAGTTTTTTTCCGCTCCGAAAAAGGTTTGTTAGGCAGTCAATCTAATTCAGACCAATATGGGACCTGTTGTAGAAAAAATCGAAGCGTTGGGCAATTTWATGGTTGGGGAGGGTCCTCACTGGGACCACCAAACACAAGCTTTATATTTTGTAGATATTTTAGGGAAAACAATTCATAAATACATACCTTCTCTCGAAAAACATACCTCCTTAAAAGTGGACCAAGCGCCCTCACTTATTATTCCTGTTACTGGTTCGTCTGATCGTTTTGTAATCAGTCTCGAAGGAGATATTGGTATCCTTACATGGAATGGTATCGATTCTGCACCAACCAGCATAAAAATAGTTGGTACTGTTGACAGTGAACCTGGAAATGAGAATAACAGAATCAATGATGGAAAAGCAGA（配列番号２９）。
【００５８】
この配列をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （以下ＮＣＢＩと略す）が提供するｂｌａｓｔｘサーチを利用して相同性検索を実施し、既知ＬＲＥの塩基配列と相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ＬＲＥ遺伝子の５’末端側であると決定した。
【００５９】
３．ＬＲＥ遺伝子の３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲおよび完全長ｃＤＮＡの取得
３−１．３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲに用いるプライマーの設計
５’Ｒａｃｅ  ＰＣＲの実験で得られたＬＲＥ遺伝子の５’末端側非翻訳領域の配列を基にして、３’ＲＡＣＥに用いる２つのプライマーを作製した（５’−ＡＧＧＣＡＧＴＣＡＡＴＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＣ−３’：配列番号３０、および５’−ＡＧＧＣＡＧＴＣＡＡＴＣＴＡＡＴＴＣＡＧＡＣＣＡＡＴＡＴＧＧＧ−３’：配列番号３１）。プライマーの合成はライフテクノロジーズジャパン株式会社に委託した。
【００６０】
３−２．ホタルＬＲＥ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ取得のための３’Ｒａｃｅ  ＰＣＲ
上述の通り作製したホタル完全長ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用い、目的とするホタルＬＲＥの５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製した２つのプライマーと、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３２）およびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３３）とを用いて３’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲおよび３’−Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。ＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  ＰｒｉｍｅｒおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒは、完全長ｃＤＮＡ合成試薬ＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（インビトロジェン社）に含まれているものを使用した。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。
【００６１】
５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマー（配列番号３０）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３２）とから成るプライマー対を用いてＬＲＥ遺伝子の増幅を行った。このＰＣＲ産物を鋳型として５’末端側非翻訳領域の塩基配列から作製したプライマー（配列番号３１）とＧｅｎｅＲａｃｅｒ３’  Ｎｅｓｔｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒ（配列番号３３）とを用いて３’−Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。その結果、約１．２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅していることを確認した。
【００６２】
３−３．３’−Ｒａｃｅで増幅した遺伝子の塩基配列の決定
３’−ＲＡＣＥで増幅した遺伝子の塩基配列を読み取るため、ゲル抽出によるＰＣＲ産物の精製、サブクローニングおよびダイレクトシークエンスを実施した。詳細を以下に示す。
【００６３】
約１．２ｋｂｐ付近に効率よく遺伝子が増幅したバンドをゲル抽出の手法を用いて遺伝子片を回収した。ゲル抽出はＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。ＴＡクローニングの手法を用いて、ゲルから抽出したＰＣＲ産物のサブクローニングを実施した。ＴＡクローニングはｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。その後、このベクターＤＮＡを大腸菌（ＤＨ５α株）に形質転換し、青・白スクリーニングの手法を用いてインサートポジティブコロニーを選択した。選択されたコロニーをダイレクトコロニーＰＣＲに供し、遺伝子が導入されていることを確認した。ダイレクトコロニーＰＣＲには、Ｍ１３−Ｆ（−２９）  ＰｒｉｍｅｒとＭ１３  Ｒｅｖｅｒｓｅとから成るプライマー対を用いた。
【００６４】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行った。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製した。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行った。シークエンスに用いたプライマーはベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いた。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施した。
【００６５】
シークエンシングによって完全長ＬＲＥ遺伝子を獲得した。この塩基配列は、次の通りであった：
AGGCAGTCAATCTAATTCAGACCAATATGGGACCTGTTGTAGAAAAAATCGAAGCGTTGGGCAATTTTATGGTTGGGGAGGGTCCTCACTGGGACCACCAAACACAAGCTTTATATTTTGTAGATATTTTAGGGAAAACAATTCATAAATACATACCTTCTCTCGAAAAACGTACCTCCTTAAAAGTGGACCAAGCGCCTTCATTTATTATTCCTGTTACTGGTTCGTCTGATCGTTTTGTAATCAGTCTCGAAGGAGATATTGGTATCCTTACATGGAATGGTATCGATTCTGCACCAACCAGCATAAAAATAGTTGGTACTGTTGACAGTGAACCTGGAAATGAGAATAACAGAATCAATGATGGTAAAGCAGACCCTCTTGGTAATTTATGGGCAGGTACCATGGCCATTGATGCCGATCTTCCAGTAGGACCAGTAAGAGGCACTTTATATAGTTTAACGCCCGATAAACAATTCAAAAGTCATGCAAAAAATATAGCTATATCGAATGGTCTCGCTTGGAGTAAGGACTTGAAGAAAATGTACTATATTGATTCCGCCAAAAGGGGAATCGATCAGTATGATTTTGATGCTTCTACTTTGTCTATCAGTAATTGTCAGCCGTTATTTACTTTTGAAAAGCACCAAATCCCTGGGTATCCAGATGGTCAAACAATTGATGCGGACGGTAACTTATGGGTAGCTGTTTTCCAAGGAAATAGAGTGATTAAAATCAGTACTAACAAACCTGAAATGTTACTTGATACTATAGAAATACCAGACCATCAGGTGACCTCAGTTGCTTTTGGTGGTCCCAATTTGGATGTTCTCTATGTAACAAGTGCTGGTAAACCGCTTCATTGCAGTCCCGGTAGTTCGATCTACGGGCATCTTTATAAAGTGACTGGTCTAGGTGTCAATGGTTTGCCAGGAGATACAGTGAACATTTGAAATAAAAAGTACGCACTTAAAAATGTATAAGTAATAAACTATAAATTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（配列番号３４）。
【００６６】
この塩基配列（配列番号３４）はアミノ酸に翻訳すると、Ｒ４９の位置にＰＣＲエラーが存在すると予想されたため、変異導入用プライマー（５’−ＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＧＡＡＡＡＡＣａＴＡＣＣＴＣＣＴＴＡＡＡＡＧＴＧＧＡＣ−３’：配列番号３６）を用いてＲ４９Ｈの変異を導入した。変異の導入は文献の記載に基づいて行った（Ａｓａｋｏ  Ｓａｗａｎｏ  ａｎｄ  Ａｔｓｕｓｈｉ  Ｍｉｙａｗａｋｉ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，  Ｖｏｌ．２８，  Ｎｏ．１６）。塩基配列（配列番号２）またはアミノ酸（配列番号１）へ翻訳した配列について、ＮＣＢＩが提供するｂｌａｓｔｘまたはｂｌａｓｔｐサーチを利用して相同性検索を実施した。それぞれの検索で既知ホタルＬＲＥの塩基配列と相同性を示すことを確認した。以上の実験および解析で得られた塩基配列を新規ホタルＬＲＥ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列であると決定した。
【００６７】
以下、この新規のＬＲＥをクロマドボタル由来ＬＲＥと称する。
【００６８】
［例２：クロマドボタル由来ＬＲＥの精製］
ＬＲＥ遺伝子を大腸菌でタンパク質発現させるため、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクター（インビトロジェン）に導入した。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従って実施した。その後、構築した遺伝子発現ベクターを大腸菌に形質転換し、該タンパク質を発現させた後、ニッケルアフィニティー精製の手法を用いて該タンパク質の精製を実施した。精製した該タンパク質の発光増強効果を測定した。詳細を以下に示す。
【００６９】
１．新規ホタルＬＲＥ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ＬＲＥ遺伝子を、ｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣを含むプライマー（５’−ＧＣＧｇｇａｔｃｃＣａｃｃＡＴＧＧＧＡＣＣＴＧＴＴＧＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣＧ−３’：配列番号３７）、並びに終始コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマー（５’−ＧＣＧｇａａｔｔｃＴＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＣＴＧＴＡＴＣＴＣＣＴＧＧＣ−３’：配列番号３８）を作製した。このプライマー対を用いて、ＬＲＥ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行った。ＰＣＲにはポリメラーゼＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施した。制限酵素サイトを含むＰＣＲ産物とｐＲＳＥＴ−Ｂベクターを制限酵素処理し、ライゲーションキット（タカラバイオ株式会社）を用いてｐＲＳＥＴ−Ｂベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入した。得られたライゲーションサンプルを大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に形質転換し、コロニーを形成させた。ここからＬＲＥ遺伝子を発現する大腸菌ＪＭ１０９を抽出した。
【００７０】
２．ＬＲＥタンパク質の精製
ＬＲＥ遺伝子を発現する大腸菌ＪＭ１０９のコロニーをピックアップし、２ｍｌスケールのＬＢ培地を用いて３７℃で２４時間プレ培養した。プレ培養した培養液を３０ｍＬのＬＢ培地に移し変え２６℃で２４時間培養を行った。培養の後、遠心分離で菌体を回収し、プロテアーゼインヒビターコンプリート（Ｒｏｃｈｅ）を含むＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０），  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ）に再度懸濁して超音波破砕した。プロテアーゼインヒビターコンプリート（Ｒｏｃｈｅ）は３０ｍＬのＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒに対して１錠加えた。菌体破砕液を遠心分離（１００００ｇ、１０分、４℃）し、沈査を除去して上清を回収した。Ｎｉレジン（Ｒｏｃｈｅ）１ｍＬを用いてアフィニティー精製を実施した。上清の全量がカラムを通過するまでの間の操作は全て４℃の条件で行った。４００ｍＭイミダゾールを含むＬｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、ＬＲＥを溶出した。溶出されたサンプルをゲルろ過カラムＰＤ−１０（ＧＥヘルスケア）でろ過し、脱塩した。脱塩後のサンプルを限界ろ過（１０ｋ）して濃縮した。
【００７１】
３．発光増強効果の測定
測定のための装置としてＬｕｍｉＦｌＳｐｅｃｔｒｏＣａｐｔｕｒｅ（ＡＴＴＯ）を用いて、測定間隔２分間で１２時間の実験条件で発光量の経時変化を測定した。測定は３．３μｇのＬＲＥと精製したＣＢＲルシフェラーゼ（プロメガ社）とを含むＡ液、および基質を含むＢ液を測定の直前に混ぜ合わせた。Ａ液は８ｍＭ  Ｄ−システイン、４ｍＭ  ＡＴＰ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０），  ２０ｍＭ  ＮａＣｌ）である。Ｂ液は２ｍＭ  Ｄ−ルシフェリンを含む５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ８．０），  ２０ｍＭ  ＮａＣｌ）である。コントロールとしてＬＲＥを含まないＣ液およびルシフェラーゼを含まないＤ液を作製し、それぞれ基質を含むＢ液を測定の直前に混ぜ合わせて発光量を測定した。測定結果を図１および図２に示す。
【００７２】
Ａ液＋Ｂ液（ＣＢＲ＋Ｋｕｒｏｍａｄｏ−ＬＲＥ）、Ｃ液＋Ｂ液（ＣＢＲ）、およびＤ液＋Ｂ液（Ｋｕｒｏｍａｄｏ−ＬＲＥ）のそれぞれの発光量の経時変化を図１に示し、１２時間の発光積算量を図２に示す。図１より、ＬＲＥを添加した発光反応はＬＲＥを添加していない発光反応よりも安定した発光反応を示すことがわかる。図２より、該ＬＲＥを加えることによって、１２時間の積算値において既知ルシフェラーゼの発光活性を少なくとも１．３倍以上の増強させることがわかる。また、ＬＲＥだけでは発光を呈しない。
【００７３】
［例３：新規ＬＲＥの細胞内での発光増強効果］
ホタルＬＲＥ遺伝子を哺乳類細胞でタンパク質発現させるため、その遺伝子をｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロジェン）に導入する。遺伝子発現ベクターの構築は標準的な方法に従って実施する。その後、構築した遺伝子発現ベクターを哺乳類細胞へ遺伝子導入し、該タンパク質を発現させた後、細胞中での発光を増強する効果を測定する。詳細を下記に示す。
【００７４】
１．新規ホタルＬＲＥ遺伝子の遺伝子発現ベクターへの導入
ＬＲＥ遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターの制限酵素サイトＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ間に導入するため、開始コドンおよびその前に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列ＧＧＡＴＣＣとＫｏｚａｋ配列を含むプライマー（配列番号３７）、並びに終始コドンおよびその後ろに制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列ＧＡＡＴＴＣを含むプライマー（配列番号３８）を作製する。このプライマー対を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子の両端に上述の制限酵素認識部位を含んだ断片の増幅を行う。ＰＣＲにはポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績株式会社）を用いて、マニュアルに従って実施する。
【００７５】
最終濃度が等倍の１０×ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が１．０ｍＭのＭｇＳＯ４、最終濃度が０．０２Ｕ／μｌのＴＯＹＯＢＯ  ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（１Ｕ／μｌ）、最終濃度がそれぞれ０．３μＭのプライマー対を含む２０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型としてＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩの認識配列を持たないＬＲＥ遺伝子（配列番号２）の溶液を０．４μｌ加える。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５５℃３０秒および６８℃２分を３０サイクル繰り返し、最後に６８℃５分間の伸長反応を行う。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察する。遺伝子増幅が認められる場合、このＰＣＲ反応溶液を通常のエタノール沈殿法により沈殿濃縮し、制限酵素処理用１０×Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを４μｌ、制限酵素ＢａｍＨＩ（東洋紡績株式会社）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績株式会社）を各２μｌならびに滅菌脱イオン水３２μｌを加えて溶解し、３７℃で２時間保温して制限酵素処理する。その後、この反応溶液をエタノール沈殿法により沈殿濃縮した後、滅菌脱イオン水に溶解する。この溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色を行う。紫外線照射下において確認されるＤＮＡバンドを含むゲルを、ナイフを用いて切り出す。この切り出したゲルからＷｉｚａｒｄ（Ｒ）  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出する。これらの操作はマニュアルに従って実施する。その後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ（ニッポンジーン）をマニュアルに従って用いて、あらかじめ同様の方法で制限酵素ＢａｍＨＩと制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに抽出したＤＮＡを導入する。このベクターＤＮＡをＤＨ５α株に形質転換し、コロニーを形成させる。
【００７６】
得られたコロニーを鋳型としてダイレクトコロニーＰＣＲを実施し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに導入したＬＲＥ遺伝子を増幅する。ダイレクトコロニーＰＣＲは、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＡ  ＴＡＣ  ＧＡＣ  ＴＣＡ  ＣＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧ−３’：配列番号３９）およびＴ７  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ（５’−ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＣＡＧ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  Ｃ−３’：配列番号４０）のプライマー対を用いて行う。最終濃度が等倍の１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｍｇ２＋ｐｌｕｓ）、最終濃度が各０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）、最終濃度が０．０５Ｕ／μｌのＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）および最終濃度がそれぞれ０．２μＭのプライマーを含む１０μｌのＰＣＲ反応溶液を作製し、そこへ鋳型として少量の大腸菌コロニーを加える。ＰＣＲ反応は、最初に９４℃２分間の熱変性を行った後、９４℃３０秒、５０℃３０秒および７２℃２分を２５サイクル繰り返し、最後に７２℃５分間の伸長反応を行う。ＰＣＲ反応後、１μｌのＰＣＲ反応溶液を、１％ＴＡＥアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、紫外線照射下で増幅遺伝子のバンドを観察する。
【００７７】
増幅が確認できたＰＣＲ反応溶液について、ダイレクトシークエンシング法を用いてその遺伝子の塩基配列の決定を行う。ＰＣＲ産物精製キットＥｘｏＳＡＰ−ＩＴを用いて、ＰＣＲ反応溶液に含まれる余剰なｄＮＴＰおよびプライマーを除去し、ＰＣＲダイレクトシークエンシングのための鋳型を調製する。ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、この鋳型を含むシークエンシング反応溶液を調製し、サーマルサイクラーを用いてシークエンシング反応を行う。シークエンスには、ベクタープライマーまたは遺伝子特異的なプライマーを用いる。ＰＣＲ産物の精製およびシークエンシングはそれぞれマニュアルに従って実施する。シークエンシング反応後、反応産物の精製を次の通りに行う。反応溶液に２．５倍量の１００％エタノールを加え、遠心機を用いて核酸を沈殿させる。次に、上精を取り除いた後、７０％エタノールを加えて沈殿を洗浄し、遠心機を用いて核酸を沈殿させる。最後に、上精を取り除いた後、沈殿を乾燥させる。精製した沈殿にＨｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（アプライドバイオシステムズ）を１５μｌ加え、溶解させる。この溶液を９４℃２分間熱変性させ、更に氷上で急冷して、塩基配列を決定するためのサンプルとする。このサンプルをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザを用いて塩基配列を読み取り、正常に遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に導入されていることを確認する。
【００７８】
２．新規ホタルＬＲＥ遺伝子の哺乳類細胞への導入および発光増強効果の測定
哺乳類細胞中における該ＬＲＥの発光増強効果を測定するために、ｐＧＬ４−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社）と該ＬＲＥ遺伝子とを共発現させて発光活性測定を実施する。具体的には、哺乳類細胞に対し、ｐＧＬ４−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（０．５μｇ）および該ＬＲＥ遺伝子を含むｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（２．５μｇ）を導入する（条件２）。比較として、ｐＧＬ４−ｃｏｎｔｒｏｌベクター（０．５μｇ）およびｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（２．５μｇ）を導入したものを用意する（条件１）。条件２において、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを加えたのは、ｐＧＬ４−ｃｏｎｔｒｏｌベクターの細胞への形質転換能率を揃えるためである。
【００７９】
条件１および２のそれぞれにおいて、３５ｍｍディッシュに播種したＨｅＬａ細胞に遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて遺伝子導入する。方法はマニュアルに従って実施する。２４時間後ＰＢＳで細胞を洗浄する。発光測定のため各ディッシュに５００μＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＤＭＥＭ  ＨＥＰＥＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２ｍｌずつ添加し、クロノス（ＡＴＴＯ）を用いて、３６℃、発光計測時間１０秒、発光観測間隔３分で２０時間連続計測の条件で発光強度を測定する。この測定による結果の予想を、図３および図４に示す。
【００８０】
図３は、発光量を一定時間分積算した値を示す。縦軸は発光量である。図３に示される通り、条件１と比較して条件２において高い発光量が得られ、実施形態に係るＬＲＥは、既知ルシフェラーゼの発光活性を増強する効果を有することが予想される。
【００８１】
図４は、時間の経過に対する発光量の変化を示す。縦軸は発光量である。図４に示される通り、ＬＲＥを発現しない場合は、発光量は非常に低い水準で推移するのに対し、ＬＲＥを発現する場合は、発光量は非常に高い値を示すことが予想される。
【００８２】
以上の結果から、既知ルシフェラーゼと実施形態に係るＬＲＥとを組み合わせることによって、生細胞中においても継続的に発光増強効果を奏することが予想される。
【００８３】
［例４：細胞内での発光増強効果に関する、クロマドボタル由来ＬＲＥと既知ＬＲＥとの比較］
クロマドボタル由来ＬＲＥと既知ＬＲＥとの間で、細胞内における発光増強効果を比較する。既知のＬＲＥとして、特許第０４１５８９５６号に開示されるヘイケボタルのＬＲＥ（Ｌｕｃｉｏｌａ＿ｃｒｕｃｉａｔａ＿ＬＲＥ（ＡＢ０７２４４８）：配列番号４２）および特許第０３８９１３２３号に開示されるゲンジボタルのＬＲＥ（Ｌｕｃｉｏｌａ＿ｌａｔｅｒａｌｉｓ＿ＬＲＥ（ＡＢ０７２４４７）：配列番号４３）を使用する。
【００８４】
１．発現ベクターの作製
上記の例３に示す手法と同様に、ヘイケボタルＬＲＥおよびゲンジボタルＬＲＥをｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ導入し、２種類の既知ＬＲＥ哺乳類発現ベクターを作製する。
【００８５】
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２−ｐＧＬ４ベクター（プロメガ））（配列番号４７）の遺伝子およびＬｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ由来のルシフェラーゼ（配列番号４４および４５）の遺伝子を含む発現ベクターは次の通りに作製する。すなわち、各ルシフェラーゼ遺伝子の開始コドンの直前にＫｏｚａｋ配列を付与し、ｐＦ９Ａ  ＣＭＶ  ｈＲＬｕｃ  ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のマルチクローニングサイトのＳｇｆＩおよびＰｍｅＩのサイト間に挿入する。
【００８６】
２．新規ＬＲＥおよび既知ＬＲＥの細胞内における発光増強効果の測定
それぞれのＬＲＥを、以下のようにルシフェラーゼと組み合わせて細胞中に発現させる：
（条件１）クロマドボタル由来ＬＲＥと高発光型Ｌｕｃｉｄｉｎａ  ａｃｃｅｎｓａ由来ルシフェラーゼとの組み合わせ；
（条件２）ヘイケボタル由来ＬＲＥとＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２−ｐＧＬ４ベクター（プロメガ））との組み合わせ；および
（条件３）ゲンジボタル由来ＬＲＥとＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ由来ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２−ｐＧＬ４ベクター（プロメガ））との組み合わせ。
【００８７】
それぞれの組み合わせにおいて、ルシフェラーゼを含むベクター（０．５μｇ）および各ＬＲＥ遺伝子ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（２．５μｇ）をＨｅＬａ細胞に遺伝子導入する。具体的には、３５ｍｍディッシュに播種したＨｅＬａ細胞に遺伝子導入試薬ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、マニュアルに従って遺伝子導入する。２４時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄する。発光測定のために、各ディッシュに５００μＭ  Ｄ−ルシフェリン／ＤＭＥＭ  ＨＥＰＥＳ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を２ｍｌずつ添加し、クロノス（ＡＴＴＯ）を用いて、３６℃、発光計測時間１０秒、発光観測間隔３分で４８時間連続計測の条件で発光量を測定する。この測定による結果の予想を、図５および図６に示す。
【００８８】
図５に示されるように、既知のルシフェラーゼをクロマドボタル由来ＬＲＥと組み合わせた場合（条件１）、既知のＬＲＥと組み合わせた場合（条件２および３）よりも、非常に高い発光量となることが予想される。
【００８９】
また、図６に示されるように、既知のルシフェラーゼをクロマドボタル由来ＬＲＥと組み合わせた場合（条件１）、既知のＬＲＥと組み合わせた場合（条件２および３）よりも、持続的に高い発光量となることが予想される。
【００９０】
［例５：クロマドボタル由来ＬＲＥを利用した時計遺伝子の解析］
生物には約２４時間周期のリズムを制御する体内時計が存在し、これらを理解するために様々な時計遺伝子のプロモーターアッセイが実施されている。生物発光を用いた時計遺伝子の解析には、安定に発光するだけでなく、時計遺伝子のリズムに合わせたスムーズな発光の減衰も不可欠である。クロマドボタル由来ＬＲＥを利用した発光測定において、発光量を増大させる効果だけでなく、時計遺伝子解析等に求められる位相および振幅の安定化に対する効果を比較する。
【００９１】
１．発現ベクターの作製
時計発振遺伝子ｍＰｅｒ２遺伝子と、ルシフェラーゼ遺伝子のＣ末側にタンパク質分解配列であるｈＣＬ１とｈＰＥＳＴが配置されているホタルルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とを用いて、時計遺伝子のレポーター解析を実施する。すなわち、時計遺伝子ｍＰｅｒ２のプロモーター（ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの認識サイトを含む）（配列番号４８）にルシフェラーゼを連結したレポーター遺伝子ｍＰｅｒ２：：ｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒを作製する。具体的には、例４と同様の手法を用いてベクターの制限酵素サイトであるＮｈｅＩおよびＸｈｏＩの間に、ｍＰｅｒ２遺伝子を導入して発光解析用の発現ベクターを作製する。
【００９２】
２．クロマドボタル由来ＬＲＥを利用した発光プロモーター測定
上記の通り作製したｍＰｅｒ２：：ｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒを、以下の組み合わせで用いる：
（１）ｍＰｅｒ２：：ｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒ（０．５μｇ）とｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（２．５μｇ）との組み合わせ；および
（２）ｍＰｅｒ２：：ｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒ（０．５μｇ）とクロマドボタル由来ＬＲＥ遺伝子ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（２．５μｇ）との組み合わせ。
（１）においてｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを使用したのは、ｍＰｅｒ２：：ｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒの細胞への形質転換能率を揃えるためである。
【００９３】
上記のベクターの組み合わせを用いて、３５ｍｍディッシュに播種したＮＩＨ３Ｔ３細胞に、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をマニュアルに従って用いて遺伝子導入する。遺伝子導入後２４時間の時点において、１００ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔａｚｏｎｅ刺激によって時計遺伝子の発信を同調させる。発光測定は、培養液ＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  （Ｇｉｂｃｏ  ２１０６３−０２９）に最終濃度５００μＭＤ−Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを加え、クロノス（ＡＴＴＯ）を用いて、３６℃、発光計測時間１０秒、発光観測間隔３分で１２３時間連続計測の条件で発光強度を測定する。この測定による結果の予想を、図７ａおよび図７ｂに示す。
【００９４】
図７ａおよび図７ｂは、時間の経過に対する発光量の変化を示す。縦軸は発光量である。図７ａは、観察開始から１２３時間後までの発現量の変化を示し、図７ｂは、図７ａの破線によって囲まれた区間である、観察開始後４０時間から１２３時間の発現量の変化を示す。これらの図より、ＬＲＥを使用したレポーターアッセイ（２）では、Ｄｅｘａｍｅｔａｚｏｎｅ刺激後１２０時間の時点のピーク（振幅）を確認することができるが、ＬＲＥを使用しないレポーターアッセイ（１）では、刺激後６０時間の時点におけるピーク（振幅）までしか確認できない。クロマドボタル由来ＬＲＥを使用することで、長期間にわたって、時計遺伝子発現の振幅および位相を観察できると予想される。
【００９５】
以上の結果から、既存の発光レポーターアッセイにおいてＬＲＥを使用することで、発光量を増大させる効果だけでなく、時計遺伝子解析等に求められる位相と振幅の安定化に対する効果が示されると予想される。
【００９６】
［例６：クロマドボタル由来ＬＲＥを利用した時計遺伝子の発光イメージング解析］
例５において、ＬＲＥを利用した発光レポーターアッセイにおいて、発光シグナルが増強されるだけでなく、位相および振幅の安定化に対する効果が示される。これまで、プロモーター活性量が低いために発光強度が小さい発光試料を顕微鏡により撮像する場合、個々の細胞観察が困難であったり、鮮明な画像を撮影するために露出時間を長くしたりする必要があった。そこで、クロマドボタル由来ＬＲＥを利用して時計遺伝子を発光イメージング解析する。
【００９７】
１．発現ベクターの作製
例５と同様に、ｍＰｅｒ２：：ｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒを作製する。
【００９８】
２．クロマドボタル由来ＬＲＥを利用した発光プロモーター測定
３５ｍｍディッシュに播種したＮＩＨ３Ｔ３細胞にｍＰｅｒ２：：ｐＧＬ４．１２  Ｖｅｃｔｏｒ（０．５μｇ）とクロマドボタル由来ＬＲＥ遺伝子ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（２．５μｇ）とを、遺伝子導入試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をマニュアルに従って用いて遺伝子導入する。遺伝子導入後２４時間の時点で１００ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔａｚｏｎｅ刺激によって時計遺伝子の発振を同調させる。
【００９９】
発光観察のため、培養液ＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ  Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  （Ｇｉｂｃｏ  ２１０６３−０２９）にＤ−ルシフェリン（プロメガ社製：最終濃度５００μＭ）を加え、発光イメージングシステム  ＬＶ２００（オリンパス（株）製）を使って観察する。発光観察は、３０分間隔で２５分間露出を行い、９０時間にわたるｍＰｅｒ２遺伝子発現量を観察する。対物レンズは２０倍、ｂｉｎｎｉｎｇは１×１、ＣＣＤカメラはＩｘｏｎ（Ａｎｄｏｒ（株）製）を用いる。
【０１００】
タイムラプス観察後、撮像した観察画像を保存し、画像解析システム“ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（モレキュラーデバイス（株）製）”を用いてその観察画像から数値データを解析すると共に、解析した数値データのグラフ化を行う。
【０１０１】
取得した画像の予想図を図８に示す。（Ａ）はＬＶ２００による観察３０分後の明視野画像を示し、（Ｂ）はＬＶ２００による観察３０分後の発光画像を示し、（Ｃ）はＬＶ２００による観察３０分後の明視野画像と発光画像との重ねあわせを示す。細胞の形態情報と併せて、１細胞毎のｍＰｅｒ２遺伝子プロモーター活性、すなわちｍＰｅｒ２の発現量を計測することができる。
【０１０２】
図９ａおよび図９ｂは、細胞の発光量を数値化した結果の予想である。図９ａに示されるように、発光画像から７つのＮＩＨ３Ｔ３細胞が選択される。各細胞の発光量の時間に対する変化を図９ｂに示す。
【０１０３】
図９ｂから、細胞ごとに発光量、すなわち時計遺伝子ｍＰｅｒ２の発現量が異なることがわかる。このように、ＬＲＥを使用した発光イメージング観察を行うことで、時計遺伝子のように発現量の弱いプロモーターを用いる場合であっても、細胞ごとにそれらの挙動を観察することができると予想される。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９ｂ】
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【図１】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９ａ】
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【配列表】
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