(57)【要約】【課題】  インプラントからストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法を与えること。【解決手段】  ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、両者の質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層をインプラント基材上に設ける。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、両者の質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層を基材上に有するインプラント。
【請求項２】
ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを含有する層が、更にポリリン酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％の範囲で含有する請求項１に記載のインプラント。
【請求項３】
ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて、水中において湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造し、該分散液と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、該ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとの質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有するコート液を基材上にコートするインプラントの製造方法。
【請求項４】
メディアミル装置を用いて湿式分散処理する際に、水中において該アパタイトとともに該アパタイトに対して１〜５０質量％の範囲でポリリン酸を加えて湿式分散処理を行う請求項３に記載のインプラントの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ストロンチウムイオンは生体内において骨芽細胞の働きを活性化し、一方で破骨細胞の活動を抑制する作用を有するとされ、実際にストロンチウムイオンの適切な濃度範囲において骨粗鬆症の予防に適用可能である。すでに欧州において医薬品として認可されているストロンチウムラネレートなどの投与により破骨細胞による過剰な骨吸収を抑制し、同時に骨芽細胞の増殖を促して骨形成を促進する効果のあることが知られている（例えば、非特許文献１及び非特許文献２等）。ストロンチウムイオンの上記のような作用を利用する観点から、例えば骨折や骨欠損部などの修復を目的とした整形外科、形成外科等の分野における臨床用途においても、ストロンチウムイオンの好ましい効果を利用することが想定される。具体的には、例えば生体内において用いられるインプラントからストロンチウムイオンが放出されれば、インプラント表面における新生骨の形成を促し、骨伝導性を飛躍的に向上させることが期待される。インプラントとしては、人工関節などに用いられるチタン及びその合金やステンレス鋼等の種々の金属製インプラントや、人工骨などに利用されるリン酸カルシウム系セラミックス材料やバイオガラス、Ａ−Ｗガラスセラミックなどの生体活性ガラス、あるいは骨接合材に利用されるポリ乳酸や脊椎ケージにおけるポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、あるいは人工靱帯に利用されるポリエステル繊維などのプラスチック材料が挙げられ、これらに対しても、これらのインプラントと骨との接合を促進することが求められる用途においては、ストロンチウムイオンの骨形成促進効果を適用することが期待される。
【０００３】
各種インプラントからストロンチウムイオンを徐放するために利用することのできる方法として、例えば、ストロンチウムを含む層をインプラント表面に形成し、この表面層からのストロンチウムイオンの徐放を利用する方法が挙げられる。ストロンチウムを含む表面層を形成する方法として、従来から知られている方法の一つにストロンチウムイオンを溶解して含む疑似体液からの表面析出方法が挙げられる。これは、体液を模した各種電解質を含む水溶液中に適当な濃度でストロンチウムイオンを溶解した水溶液を作製し、これに該インプラントを浸漬することで該水溶液中からストロンチウムを含む層をインプラントの表面に自発的に析出形成させる方法である。
【０００４】
例えば、特許文献１には、生体適合性を有する基材（例えばチタン合金など）の表面に、カルシウムイオンやリン酸イオンを含む疑似体液中に更にストロンチウムイオンを加えた水溶液から自発的にストロンチウムを含むカルシウムアパタイトの被膜を形成する方法が開示されている。この方法は過飽和状態にあるヒドロキシアパタイトが疑似体液である水溶液中から自発的に基材上に析出する現象を利用するものであり、カルシウムアパタイト中にストロンチウムイオンが容易に置換して導入されることから、ストロンチウムを含むカルシウムアパタイトを基材上に形成する方法として用いることができる。しかしながら、こうした方法では、ストロンチウムを含むアパタイトの被膜形成に長時間を要し、かつ被膜の厚みの制御が困難であることから、ストロンチウムイオンを徐放する機能を付与するには、その放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であるとの問題を有していた。
【０００５】
また、特許文献２には、チタンを含む金属からなるインプラントを用い、その表面に予め酸化物層を形成し、更にその上部にストロンチウムを含む沈着物層を形成することで、ストロンチウムイオンを徐放する機能を有するインプラントを得る方法が開示されている。この場合のストロンチウムを含む沈着物層の形成方法は、硝酸ストロンチウム、塩化ストロンチウム、水酸化ストロンチウムなどの水溶性のストロンチウム化合物を溶解した水溶液中に、酸化物層を形成したチタン金属を浸漬する方法で行われる。この方法においても、ストロンチウムを含むアパタイトの被膜形成に長時間を要し、かつ被膜の厚みや結晶性の制御が困難であることから、ストロンチウムイオンを徐放する機能を付与するには、その放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であった。
【０００６】
更に、特許文献３にも同様にストロンチウムイオン以外にも様々な無機成分を含む疑似体液もしくはリン酸緩衝液中にチタン金属基材を浸漬することで、その表面にストロンチウムを含むリン酸カルシウム系アパタイトの層を形成する方法が開示される。
【０００７】
また、非特許文献３には、金属チタン表面に対してストロンチウムイオンを溶解したリン酸水溶液を用いて高温で水熱処理を施すことで、金属インプラント表面にストロンチウムを含む酸化チタン層を形成する方法が示されている。
【０００８】
カルシウムイオンやリン酸イオンを含む疑似体液中から自発的にヒドロキシアパタイトが析出することはよく知られており、上記のような金属チタン以外にも各種プラスチック基板やセラミックスなどの様々な基材表面にヒドロキシアパタイトの層を形成する方法が以前より行われているが、この際に疑似体液中にストロンチウムイオンを導入することで、ストロンチウムに置換されたヒドロキシアパタイトの層を各種基材表面に形成することも行われる。
【０００９】
上記いずれの方法で得られるストロンチウムを含む層も、それらの形成に要する時間に比較的長時間を要し、かつストロンチウムの導入量を制御することが困難である問題があった。更には、形成される層の厚みを制御することが困難であり、その厚みも高々数百ナノメートル程度であり、体内に導入される生体インプラント表面に適用した場合、比較的短時間で該層が溶解消失することで、その効果が失われる問題があった。加えて、基材と該層の界面における接着強度が不十分で、機械的な摩擦により該層が基材との界面から剥離し脱落する問題があった。従って、これらの場合には、ストロンチウムイオンの放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であった。
【００１０】
金属製インプラントに対してその表面に良好な生体適合性を付与するよく知られた方法の一つに、ヒドロキシアパタイトなどのリン酸カルシウム化合物を高温に加熱して基材表面に溶射し、表面コートを行う方法が挙げられる。例えばプラズマスプレー法やフレーム溶射法等が代表的な方法として挙げられる。非特許文献４にはプラズマスプレー法を利用して、金属チタン表面へストロンチウムをドープしたヒドロキシアパタイトをコートする方法について述べられている。また、特許文献４には、ヒドロキシアパタイトなどの生体活性な層を設けたインプラントに対して、イオンビーム注入法によりストロンチウムをヒドロキシアパタイト層に直接導入する方法が開示されている。これらの方法では比較的厚みの増加したストロンチウムを含む層がインプラント表面に形成されることから、目的に応じて比較的多量のストロンチウムを表面層中に導入することが可能である。しかしながらこうした方法の欠点として、高温の溶射法で形成されるアパタイトの結晶性が乏しく、生体内において溶解速度が高いため、耐久性のある表面層が得られない問題や、更には、高温状態でアパタイトの熱分解が生じ、アパタイト以外に酸化カルシウム等の有害な副生成物がアパタイト中に含まれることから安全性に関する問題があった。
【００１１】
更に、上記のプラズマスプレー法やフレーム溶射法等は、基材としてチタンなどの金属を用いる場合には、基材表面を高温にさらしても特に熱的な変性や変形などの問題は生じないが、耐熱性の低いプラスチック材料に対して適用することが困難であり、特にポリエステルやポリ乳酸などの材料を用いた各種インプラントの表面にストロンチウムを導入するための手段としては適用が困難であった。プラスチックを基材として利用するインプラントの利点として、柔軟性を有することや、軽量で適度の力学的強度を有し、成形加工が比較的容易で、曲げ加工や繊維加工など複雑な形状の加工が比較的容易にできることなどが挙げられる。反面、プラスチック材料の表面は一般的に生体親和性に乏しいため、生体内において免疫的反応を誘起し易いことから改良が求められている。特に人工靱帯や脊椎ケージにおけるように、ポリエステルやＰＥＥＫのような合成樹脂においては、これを用いたインプラントの表面を骨と接合させる目的で使用を行った場合、インプラント表面に骨が結合しがたく（骨伝導性に乏しく）、骨とインプラントの界面の接着が不良になることから、生体親和性と骨伝導性の改良が求められているのが現状である。
【００１２】
ストロンチウムイオンを各種インプラントに導入する別の方法として、アクリル系セメント、リン酸カルシウム系セメントや、バイオガラス、Ａ−Ｗガラスセラミックなどの生体活性ガラスなどの製造の際に、これらを製造するための構成成分中に各種ストロンチウム化合物を導入して製造する方法が知られている。これらいずれの場合も、ストロンチウムイオンの骨再生促進効果を利用することで、各種セメントや生体活性ガラス表面の骨伝導性を促進させることが狙いである。非特許文献５には、ストロンチウムで置換したβ−ＴＣＰ（三リン酸カルシウム）と、これを用いて製造されるリン酸カルシウム系セメントについて述べられている。非特許文献６にはストロンチウムイオンを導入したナノサイズの生体活性ガラスの製法と特性が示されている。これらのセラミックス系材料からはストロンチウムイオンが徐放されることが示されており、生体内においてストロンチウムイオンの供給源として用いることが可能であるが、時間とともに次第に上記のセメントや生体活性ガラスが崩壊し、生体内で比較的速やかにこれらが溶解し消失するため、その機能が発揮される前に生体内から排除される問題があった。従って、これらの場合にも、ストロンチウムイオンの放出濃度の制御が困難であり、また長期間に亘りストロンチウムイオンを放出することが困難であった。
【００１３】
特許文献５には、生体適合性に優れるカルシウムアパタイト微粒子と、水性ウレタン樹脂及び自己乳化性イソシアネート化合物を含有する層を基材表面に設けた生体活性インプラントが開示される。この場合、用いられるカルシウムアパタイトとしては従来から公知である種々の方法で製造されるカルシウムアパタイトが用いられ、カルシウム以外の金属成分が含まれている場合であってもその比率は１質量％以下であるため、ストロンチウムをそれ以上の比率で含有するアパタイト微粒子を利用することは意図していない。更に特許文献５に開示される生体活性インプラントは、本発明が目的とするストロンチウムイオンを徐放する機能は有しなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特開２００４−３５８２４９号公報
【特許文献２】特表２０１０−５３３０１２号公報
【特許文献３】特表２０１２−５２５２０１号公報
【特許文献４】特表２００２−５１２０９０号公報
【特許文献５】特開２０１４−１９３２７２号公報
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】P.J.Meunier, et al., New England Journal of Medicine, 350, 459−468 (2004).
【非特許文献２】M.E.Arlot, et al., J.Bone Miner Res, 23(2), 215−222 (2008).
【非特許文献３】J−W.Park, et al., Clinical Oral Implants Research, 21, 398−408 (2010).
【非特許文献４】M.Roy et al., Journal of Biomedical Materials Research Part B, 99B, 258−265 (2011).
【非特許文献５】M.H.Alkhraisat, et al., Biomaterials, 29, 4691−4697 (2008).
【非特許文献６】A.Hoppe, et al., Journal of Non−Crystalline Solids, 387, 41−46 (2014).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、ストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法を与えることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記した本発明の課題は、下記に示す手段により本質的には解決される。
１．ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、両者の質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層を基材上に有するインプラント。
２．ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを含有する層が、更にポリリン酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％の範囲で含有する上記１に記載のインプラント。
３．ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて、水中において湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造し、該分散液と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、該ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとの質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有するコート液を基材上にコートするインプラントの製造方法。
４．メディアミル装置を用いて湿式分散処理する際に、水中において該アパタイトとともに該アパタイトに対して１〜５０質量％の範囲でポリリン酸を加えて湿式分散処理を行う上記３に記載のインプラントの製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、ストロンチウムイオンを長期に亘り濃度を制御して徐放する機能を備え、安全性が高く、生体親和性と骨伝導性に優れたインプラント及びその製造方法が与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】実施例１で得られたストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターン。
【図２】分散剤を使用せずに湿式分散処理を行うことで得られたストロンチウムアパタイト微粒子の走査型電子顕微鏡による拡大画像。
【図３】分散剤を使用せずに湿式分散処理を行うことで得られた分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線。
【図４】水分散型ポリウレタンエマルジョンを添加して作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線。
【図５】ポリリン酸塩を添加して作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線。
【図６】水分散型ポリウレタンエマルジョンを添加して作製した分散液を用いてアクリル板上に形成したコート層の走査型電子顕微鏡写真。
【図７】実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターン。
【図８】実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトのＦＴ−ＩＲスペクトルチャート。
【図９】実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの走査型電子顕微鏡による拡大画像。
【図１０】実施例３の人工靱帯をラット皮下移植後４週間目に取り出した組織断面の顕微鏡写真。
【図１１】実施例４の人工靱帯をラット皮下移植後４週間目に取り出した組織断面の顕微鏡写真。
【図１２】比較例６の人工靱帯をラット皮下移植後４週間目に取り出した組織断面の顕微鏡写真。
【図１３】比較例９で得られたストロンチウムを含むアパタイトの広角Ｘ線回折パターン。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のインプラント及びその製造方法は、基材上に、ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとを含有する層を設けることが基本である。本明細書中、上記ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子を、単に「ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子」又は「アパタイト微粒子」ともいう。
【００２１】
本発明のインプラントは、ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、両者の質量比（該アパタイト微粒子：水分散型ポリウレタンエマルジョン）で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層を基材上に有することを特徴とする。
なお、本発明において、水分散型ポリウレタンエマルジョンの質量とは、水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分の質量を意味する。つまり、本発明におけるストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとの質量比（該アパタイト微粒子：水分散型ポリウレタンエマルジョン）は、該アパタイト微粒子の質量と、水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分の質量との比（アパタイト微粒子：水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分）を意味する。水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分は、より具体的には、本発明のインプラントの製造において、上記層を形成する際に用いられた水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分（樹脂成分）である。
【００２２】
本発明のインプラントは、基材上に、上記ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとを質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する層（以下「ストロンチウムを含む層」とも記載する）が形成されてなる。本発明のインプラントは、通常、上記ストロンチウムを含む層をその表面に有する。つまり本発明のインプラントは、上記ストロンチウムを含む層を表面層として有する。本発明のインプラントにおいては、本発明の効果を損なわない限り、基材と、上記ストロンチウムを含む層との間に、必要に応じて該ストロンチウムを含む層とは別の層が形成されていてもよい。また、インプラントにおいてストロンチウムを含む層が形成されている場所及び範囲は、基材の種類、インプラントの用途等に応じて適宜選択することができる。例えば、ストロンチウムを含む層は、基材の表面全体（インプラントの表面全体）に形成されていてもよく、基材上の一部に形成されていてもよい。
【００２３】
最初にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子について説明を行う。
【００２４】
本発明は、ストロンチウムの前記した骨形成促進作用を利用することで、様々な臨床応用において骨再生を促進する効果を有する新規な生体インプラントを提供することを意図する。そのためには、単に生体インプラントにストロンチウムを導入するだけではなく、生体内におけるストロンチウムイオンの放出濃度を適度な範囲に制御する必要がある。すなわち、ストロンチウムの薬理作用は、量依存性があり、過剰な投与ではむしろ骨の再生に逆効果であることが知られている。従って、骨再生を行うべき生体内の局所的部位において、インプラントから放出されるストロンチウムイオンの濃度が適度な範囲に制御された形で供給されることが好ましい。インプラント表面からストロンチウムイオンが放出される機構として、インプラントの基材上にストロンチウムを含む層を設け、これからストロンチウムイオンが体液中に徐放される機構が好ましく、かかる層に含まれるストロンチウムを含む物質の量とその溶解性を適度にコントロールすることで、放出されるストロンチウムイオン濃度を適度な範囲に制御することが可能となる。こうしたストロンチウムを含む物質の溶解性を制御するための好適な手段として、本発明においてはストロンチウムを含む結晶性を有するアパタイト微粒子が好適であることを見いだした。
【００２５】
本発明において、インプラントの基材上に設けられた層から放出されるストロンチウムイオンの濃度については、目的や用途に応じて様々な範囲に調節が可能である。種々の文献等において記載されるストロンチウムイオンの生体内局所的環境における好ましい濃度範囲としては大略０．０５〜１００ｐｐｍの範囲にあるとされ、これ以下では効果が発揮され難く、また１００ｐｐｍを超えて生体内の局所的部位にストロンチウムイオンが放出された場合、骨再生に関してむしろ逆効果であり、それ以外にも様々な悪影響を及ぼすことが懸念される。従って、好ましい濃度範囲としては０．０５〜１００ｐｐｍの範囲であり、更には０．１〜５０ｐｐｍの範囲においてストロンチウムイオンがインプラントから放出されることが好ましい。また、徐放される期間についても好ましい範囲が想定される。数日間未満の放出期間であれば、骨再生に必要とされる期間に亘ってストロンチウムイオンの効果を持続させることが困難である。あるいは半年から数年もしくはこれ以上の長期において比較的高濃度（５０〜１００ｐｐｍ前後）のストロンチウムイオンの放出が持続した場合、好ましい骨再生促進効果以外に、好ましくない副作用として、例えば骨軟化症を誘起する可能性などが懸念される。従って、最も好ましい徐放期間としては数週間から数ヶ月程度の範囲にあると想定される。このように数週間から数ヶ月程度の長期に亘り、ストロンチウムイオンを濃度０．１〜５０ｐｐｍ程度に制御して徐放することができるインプラントは、本発明のインプラントとして好ましい。本発明においては、これらの好ましい濃度範囲と放出期間を設定し、それらにあわせた層の最適化を実施した。具体的には後述する実施例において詳細に説明を行う。
【００２６】
本発明において用いることの出来るストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子は、明確にアパタイト特有の結晶性を示すことが必要である。具体的には、粉体の状態で広角Ｘ線回折測定を行った場合に、２θが１０〜６０度（°）の範囲においてアパタイトに特徴的なピークが観察されるアパタイトから構成される微粒子である。本発明では特に、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察される場合においてのみ、結晶性を有すると称する。２５度付近の（００２）面からの回折ピークが不明瞭である場合には、結晶性を有しない非晶質のアパタイトであると判断する。
広角Ｘ線解析測定の条件は、後述する実施例に記載する。
【００２７】
本発明において用いることのできるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子として、該アパタイト中に含まれるストロンチウムの割合には必要とされる範囲が存在し、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として、ストロンチウムは１０〜６５質量％の範囲で含まれることが必要である。つまり本発明におけるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子は、ストロンチウムを１０〜６５質量％含む。１０質量％より少ない比率でストロンチウムが含まれている場合、ストロンチウムイオンが徐放されず、本発明の効果が認められない。アパタイト中に含まれる金属イオンが全てストロンチウムイオンである場合は、構造式Ｓｒ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２より計算されるストロンチウムの比率の理論値は５９．２質量％である。これよりストロンチウムの比率が多い場合として、アパタイト中に含まれるリン酸基の一部が炭酸イオンに置き換わった炭酸ストロンチウムアパタイトである場合が挙げられる。この場合においては、６５質量％を超える比率でストロンチウムが含まれる場合には、アパタイト以外の構造を有するストロンチウム塩が含まれる場合があり、これらから生体内において放出されるストロンチウムイオンの濃度が上記の好ましい範囲を上回る場合があり、好ましくない。また、アパタイトにストロンチウム以外の金属イオンが含まれる場合、金属イオンの総モル数に対する比率としてストロンチウムイオンは１０〜１００モル％の範囲で含まれる場合が好ましく、更に２０〜１００モル％の範囲で含まれる場合が最も好ましい。これより少ない比率でストロンチウムイオンが含まれている場合、ストロンチウムイオンが徐放されず、本発明の効果が認められない場合がある。上記アパタイト微粒子に含まれるストロンチウム以外の金属イオンとしては、カルシウムイオンが好ましい。
【００２８】
本発明は更に、安全性の高いインプラントを提供することを意図し、上記したストロンチウムを含む層において、用いる材料の純度を高め、意図しない不純物の混入や加熱等による変性を防止したインプラントとその製造方法を与えることを意図している。具体的な方法については以下に説明を行う。
【００２９】
ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの製造方法として、例えば、特開平５−３１０４１０号公報には、リン酸水素ストロンチウムと水酸化ストロンチウムまたは炭酸ストロンチウムをポットミルで混合、攪拌しメカノケミカル的な反応によりストロンチウムアパタイトの前駆体を得た後に、これを８００℃程度の温度で仮焼する方法が開示されている。あるいは、特開平１１−３４３１９８号公報には、任意のリン酸アパタイトを出発原料に用い、これに水熱処理を施すことで、処理中にアパタイト中に含まれる任意のイオンを別のイオンにイオン交換する方法が開示されている。また加藤らによる均一沈殿法（加藤千晴、藤田一美、松田恵三、日本化学会誌、No.3、321−327、（2002)）には、尿素を用いて、リン酸ストロンチウム塩の前駆体を経てストロンチウムアパタイトを合成する方法が開示されている。これらの方法で得られるストロンチウムを含むアパタイトはいずれも結晶性を有していることから、本発明において好ましく用いることができる。
【００３０】
あるいは、更に好ましく用いることのできるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの合成方法として、特開２０１４−１８０４９１号公報及び後述する実施例において示すように、ストロンチウムを含むアパタイトを合成する際に、その前駆体としてリン酸水素ストロンチウム（ＳｒＨＰＯ４）を予め合成し、これをアルカリ条件下で加熱することで、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを得ることができる。更に、前駆体としてストロンチウムとともに種々の割合でカルシウムを含むリン酸水素化合物を合成し、これを用いて同様にアルカリ処理を施すことで、カルシウムとストロンチウムを任意の割合で含む結晶性を有するアパタイトを高純度で得ることができ、これらは本発明に最も好適に用いることができる。
【００３１】
上記のストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトにおいて、更にアパタイト中のリン酸基の一部が炭酸イオンに置換したストロンチウムを含む炭酸アパタイトも本発明において上記ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトとして好適に用いることができる。その具体的な合成方法としては、上記のリン酸水素ストロンチウムを原料に用いて、これと炭酸塩または炭酸水素塩を水中にて混合して反応を行うことでストロンチウムを含み結晶性を有する炭酸アパタイトが高純度で得られる。リン酸水素ストロンチウムと、炭酸塩または炭酸水素塩を水中にて混合して反応を行う際、用いる炭酸塩または炭酸水素塩としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸アンモニウム等の１０℃の水に対する溶解性が１質量％以上である水溶性の高い炭酸塩または炭酸水素塩が特に好ましい。更に、反応の際の条件として室温（２５℃）もしくは室温以上の温度である場合が好ましく、更に４０℃以上である場合が好ましい。反応の際の温度が室温より低い場合には、リン酸水素ストロンチウムが完全に炭酸ストロンチウムアパタイトに変換されずに生成物中に残存する場合がある。反応温度の上限としては１００℃以下であることが好ましく、より好ましくは９０℃以下である。
【００３２】
あるいは、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの別の合成方法として、ストロンチウムイオンとリン酸イオンを含む水溶液中から一段階の反応でストロンチウムを含むアパタイト微粒子を合成することもでき、この場合、ストロンチウムイオンとともに種々の割合でカルシウムイオンを共存させて反応を行うことで、カルシウムイオンとストロンチウムイオンを任意の割合で含むアパタイトを得ることができる。これらのアパタイトは結晶性が比較的低いため、本発明に用いるためには熱処理を行うなどの方法である程度結晶性を高めることで好ましく用いることができる。
【００３３】
本発明におけるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子は、上述したような製造方法により製造される、ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイトを用いて製造することができる。なお上記種々の製造方法において、得られるアパタイト中のストロンチウム含量を調製する方法は公知であり、原料の配合を適宜調整することにより、得られる結晶性を有するアパタイト中のストロンチウムの含量を上記範囲に調整することができる。
【００３４】
本発明において用いることのできるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子には、更にアパタイト中に含まれる全金属イオンに対して１０モル％未満の割合でストロンチウムイオンやカルシウムイオン以外にも、マグネシウムイオンや亜鉛、ナトリウム、カリウム等の低濃度において生体に対する安全性が確認されている様々な金属イオンを含んでいてもよく、また、水酸基に換えて該アパタイト組成中にフッ素や塩素を含んでもよい。あるいは前述したような炭酸イオンを含む炭酸アパタイトであってもよく、あるいはケイ酸イオンを含んでいてもよい。特に、本発明においては、ストロンチウムを含む結晶性の炭酸アパタイトを用いた場合に、生体内において適度な溶解性を示すことから極めて好ましく用いることができる。更に、これらアパタイトには生体に対して安全性が懸念される不純物が含まれていないことで、安全性に優れたインプラントを提供できることから、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子が高純度であることが重要である。
【００３５】
本発明において、上記した様々な方法で得られた、ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイトを用いて、これを更に後述する湿式分散処理を施すことで、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を製造でき、本発明に好適に用いることができる。
【００３６】
本発明においてアパタイト微粒子は、走査型電子顕微鏡により観察されるアパタイト微粒子の一次粒子（個々の粒子として観察される最小単位）の大きさが数平均粒子径で５００ｎｍ未満であることが好ましい。また、一次粒子の大きさが５００ｎｍ以上である粗大粒子が存在している場合であっても、全体に対する割合が、個数において１０％未満であることが好ましい。本発明において、数平均粒子径は、走査型電子顕微鏡を用い、少なくとも５０個以上の一次粒子の大きさ（粒子形状が等方性ではなく異方性を有する場合には、最長の軸方向の長さを計測する。）を計測し、その数平均値を求めたものである。アパタイト微粒子の大きさが数平均粒径で５００ｎｍ以上であったり、あるいは一次粒子の大きさが５００ｎｍ以上の粗大粒子の割合が個数で１０％以上であったりする場合には、基材上にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む層を形成した場合に、該層の厚みが不均一になり、該層と基材との界面における接着性が不十分となり容易に該層が基材から剥離する場合がある。
【００３７】
アパタイト微粒子の大きさについては、更に走査型電子顕微鏡により観察されるアパタイト微粒子の一次粒子の大きさが数平均粒子径で５０ｎｍ以上であることが好ましい。また、一次粒子の大きさが５０ｎｍ未満である微小粒子が存在している場合であっても、全体に対する割合が、個数において２０％未満である場合が好ましい。一次粒子の大きさが５０ｎｍより小さい微粒子が個数において２０％以上であったり、あるいは数平均粒子径が５０ｎｍ未満であったりする場合にはアパタイト微粒子の溶解性が高くなり、体内において数日〜１週間未満の短期間でインプラント表面からのストロンチウムイオンの放出が停止する場合がある。
【００３８】
更には、アパタイト微粒子が分散した状態で光回折法や光散乱法で測定される体積平均粒子径が５０〜５００ｎｍの範囲にある場合が最も好ましい。分散粒子として一次粒子同士が会合して二次粒子を形成し、５００ｎｍより大きな体積平均粒子径を示す場合には、こうした分散液を用いてインプラント表面にコーティングを行う際に、コート液中に含まれる該アパタイト微粒子が時間とともに次第に沈降し、コート液中に分散したアパタイト微粒子の濃度が減少することで、一定の割合で該アパタイト微粒子を含む層が形成できない場合がある。
【００３９】
該アパタイト微粒子が結晶性を有するアパタイトであることが本発明において重要であり、結晶性を有しない場合には生体内においてストロンチウムを含むアパタイトが容易に溶解し、比較的短期間のうちに生体内から消失してその効果が失われる。本発明では、アパタイトが結晶性であることで、該アパタイト微粒子が長期間安定な状態で存在し、該層中に好ましい範囲で長期間残存することができる。更には、層中に含まれる該アパタイト微粒子からのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前述した適度な範囲に制御することが可能である。
【００４０】
次に、基材上に設けられた層にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子とともに含まれる水分散型ポリウレタンエマルジョンについて説明する。本発明においては、アパタイト微粒子を基材上に固定化するためにバインダーとして水分散型ポリウレタンエマルジョンを用いることが特徴である。水分散型ポリウレタンエマルジョンは化学的にきわめて安定で、耐水性及び耐久性に優れ、生体内において長期間分解することなく安定に存在することが特徴の一つであるが、生体親和性に乏しく、その表面において骨伝導性に欠けることが課題であった。本発明により、その課題を解決することができる。
【００４１】
本発明で用いることのできる水分散型ポリウレタンエマルジョンとしては、例えば自己乳化型ポリウレタンが挙げられる。自己乳化型ポリウレタンとしては、ポリウレタン構造中にスルホン酸基、カルボキシ基、水酸基、ポリエチレンオキシ基等の親水性基を有するものが好ましく、市販される各種水分散型ポリウレタンエマルジョンが好ましく使用される。
【００４２】
水分散型ポリウレタンエマルジョンについて更に詳細に説明する。水分散型ポリウレタンエマルジョンは、ポリウレタンの微粒子が水中に安定に分散した懸濁液であり、粒子径としては体積平均粒子径で１μｍ以下である場合が好ましく、更に０．５μｍ（５００ｎｍ）以下である場合にプラスチック基材とアパタイト微粒子を含む層が接着する能力が高くなり、最も好ましく使用することができる。粒子径の下限としては０．０２μｍ（２０ｎｍ）以上であることが好ましい。水分散型ポリウレタンエマルジョンを水中に安定に分散した形で形成するためには種々の製法がとられるが、本発明に好ましく用いることのできる水分散型ポリウレタンエマルジョンとしては、その製法に依るものではなく、ポリウレタン構造を有する樹脂エマルジョンであれば本質的に使用することが可能である。ここでいうポリウレタン構造としては有機ジまたはポリイソシアネートと有機ジまたはポリオールを付加重合して得られるポリウレタン構造を有するものであり、有機ジまたはポリイソシアネートとしては、芳香族ジイソシアネートとして、例えばトルエンジイソシアネート、テトラメチルキシリレンジイソシアネート、ジフェニルメタンジイソシアネート、ｍ−キシリレンジイソシアネート、ナフタレンジイソシアネート等；炭素数２〜１２の脂肪族ジイソシアネートとして、例えばヘキサメチレンジイソシアネート、２，２，４−トリメチルヘキサンジイソシアネート、リジンジイソシアネート；炭素数４〜１８の脂環式ジイソシアネートとして、例えば１，４−シクロヘキサンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート、４，４’−ジシクロヘキシルメタンジイソシアネート、メチルシクロヘキサンジイソシアネート、イソプロピリデンジシクロヘキシル−４，４’−ジイソシアネート等が挙げられ、更にこれら全てのジイソシアネートの変性物として、カーボジイミド、ウレチジオン、ビューレット及び／またはイソシアヌレート変性物等が挙げられる。更に、形成されるポリウレタンを水中に安定に分散するために、自己乳化性イソシアネートとしてアルキレンオキシ基を結合したポリイソシアネート類を使用して水分散型ポリウレタンエマルジョンを得る方法が好ましい例として挙げられる。これらの水分散型ポリウレタンエマルジョンは、それら自体や後述するアパタイト微粒子を含むコート層を形成するためのコート液中では、ポリウレタンが粒子形状を有しているが、コート液が乾燥しコート層を形成した後ではバインダーとして作用するため、粒子形状を維持している必要は無い。本発明におけるストロンチウムを含む層は、このような水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート液から形成されたものであればよく、通常、水分散型ポリウレタンエマルジョンに由来するポリウレタンを含有する。本発明におけるストロンチウムを含む層は、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとして、該エマルジョンに由来するポリウレタンとを、両者の質量比で１０：２〜１０：２０含有するものであればよい。
【００４３】
上記の有機ジまたはポリオールとしては、脂肪族ジオールとして、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、グリセリン、トリメチロールプロパン；芳香族ジオールとして例えばビスフェノールＡ；あるいはポリエーテルポリオールとして、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンオキシプロピレン（ブロックまたはランダム）グリコール、ポリオキシテトラメチレングリコール等が挙げられる。あるいは、ポリオールの他の例として、ポリエステルポリオールを挙げることができる。具体的には、例えば脂肪族ジオールとして、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、１，４−ブタンジオール、グリセリン、トリメチロールプロパン、芳香族ジオールとして例えばビスフェノールＡ等とジカルボン酸（コハク酸、アジピン酸、セバシン酸、テレフタル酸、イソフタル酸等）とを縮合させて得られるポリエステルポリオールや、ポリカプロラクトンポリオール、ポリバレロラクトンポリオール等のポリラクトンポリオール等が挙げられる。更には、ポリブチレンカーボネートジオール、ポリエキサメチレンカーボネートジオール等のようなポリカーボネートジオール等も好ましい例として挙げられる。更に、形成されるポリウレタンを水中に安定に分散するためにポリオール成分としてポリアルキレンオキシ基を有する有機ジオールを使用することも好ましい（例えば米国特許第３，９０５，９２９号明細書、米国特許第５，０４３，３８１号明細書）。
【００４４】
上記のような有機ジまたはポリイソシアネートと有機ジまたはポリオールを付加重合して得られるポリウレタンを水に安定に分散するためには、特公昭５３−３８７６０号公報、特公昭６３−８１４１号公報に記載されるような分子内にカルボキシル基等のアニオン性基を有する末端イソシアネート基含有ウレタンプレポリマーを使用し、第三級アミンで中和することで水中に乳化可能な状態にし、これを鎖伸長して水分散型ポリウレタンエマルジョンを製造する方法や、特願平３−３２７３９３号公報、特開平６−９３０６８号公報等に記載されるような、分子内にカルボキシ基等のアニオン性基を有するポリウレタンを合成し、これをアミン類で中和することで水に乳化分散可能にして水分散型ポリウレタンエマルジョンを得る方法等が挙げられる。
【００４５】
水分散型ポリウレタンエマルジョンの合成は上記のように水中で乳化状態において合成することも可能であり、あるいは水と混和性を有するケトン類、エーテル類等の有機溶剤を使用して重合を行い、その後水を添加し、有機溶剤を溜去することで水分散型ポリウレタンエマルジョンに転換することも好ましく行われる。
【００４６】
本発明において使用できる水分散型ポリウレタンエマルジョンとしては、上記のような種々の方法、原料を使用した水分散型ポリウレタンエマルジョンが好ましく使用できるが、特に好ましい水分散型ポリウレタンエマルジョンとしては、例えばＤＩＣ社から入手可能なハイドランの商品名で表される水分散型ポリウレタンエマルジョンや、三洋化成工業社から入手可能なパーマリン、ユープレン、ユーコート等の商品名で表される水分散型ポリウレタンエマルジョン等が極めて好ましく使用される。
【００４７】
本発明において用いられる前記したストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとの比率については好ましい範囲が存在する。
基材上に形成された層に、アパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとが、両者の質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含まれる場合において、基材に対するアパタイト微粒子を含む層の接着性や耐久性が良好である効果が発揮できる。該アパタイト微粒子に対するバインダーの比率が上記の範囲より少ない場合には、基材表面に設けた層が崩壊しやすくなり、生体内で容易に層が剥離しやすく、特に応力や摩擦が加わった場合に簡単に基材表面から剥離する。あるいは、該アパタイト微粒子に対するバインダーの比率が上記の範囲を超えて用いられる場合には、基材上に設けた層中に該アパタイト微粒子が埋没して表面に露出せず、従ってこれから放出されるストロンチウムイオン濃度が極めて小さくなることから本発明の効果が現れない。ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と、水分散型ポリウレタンエマルジョンの比率を上記した範囲に設定することで、ストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前記した適度な範囲に制御することが可能となる。
【００４８】
上記の水分散型ポリウレタンエマルジョンとストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の組み合わせで基材上に該アパタイト微粒子を含むコート層を強固に結合することが可能であるが、長期に亘り該アパタイト層を基材上に保持し、耐久性を更に高める目的で、該アパタイトを含む層中に自己乳化性イソシアネート化合物が併せて含まれることが好ましい。こうした目的で用いることのできる自己乳化性イソシアネート化合物としては、エチレンオキサイドの繰り返し単位を有し、更に２個以上のイソシアネート基を結合した化合物が好ましく、例えば、特公昭５５−７４７２号公報（米国特許第３，９９６，１５４号明細書）、特開平５−２２２１５０号公報（米国特許第５，２５２，６９６号明細書）、特開平９−７１７２０号公報、特開平９−３２８６５４号公報、特開平１０−６００７３号公報等に記載されるような自己乳化性イソシアネートを指す。具体的には、例えば、脂肪族あるいは脂環族ジイソシアネートから形成される環状三量体骨格のイソシアヌレート構造を分子内に有するポリイソシアネートや、ビューレット構造、ウレタン構造等を分子内に有するポリイソシアネートをベースポリイソシアネートとし、これに片末端エーテル化したポリエチレングリコール等をポリイソシアネート基の内一部のみに付加させて得られる構造のポリイソシアネート化合物が極めて好ましい例として挙げられる。こうした構造のイソシアネート化合物の合成法については上記の各種公報中に記載されている。こうしたイソシアネート化合物の具体的な例としては、ヘキサメチレンジイソシアネート等を出発原料とした環状三量化によるポリイソシアネートをベースポリイソシアネートとしたものが市販されており、例えば、旭化成工業社からデュラネートの名称で各種のタイプの自己乳化性イソシアネート化合物が入手可能である。これらの自己乳化性イソシアネート化合物は親水性が高く体液に対する濡れ性を向上させる効果も有することから、インプラントの表面に設けられた該層中に、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとともに使用することで、表面をより親水性が高い状態に保ち、付着性細胞の初期接着を高める効果を有する場合もある。
【００４９】
上記の該アパタイト微粒子を含む層中における自己乳化性イソシアネート化合物の割合については好ましい範囲が存在し、使用する水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分質量に対して１〜５０質量％の範囲であることが好ましく、５〜４０質量％の範囲で用いる場合がより好ましい。
【００５０】
本発明に用いられる該アパタイト微粒子を含む層には、更に必要に応じて各種水溶性ポリマーを含有しても良い。用いることのできる水溶性ポリマーとしては、例えば、ゼラチン、ゼラチン誘導体（例えば、フタル化ゼラチン等）、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキシド、キサンタン、カチオン性ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン、デンプン、各種変性デンプン（例えばリン酸変性デンプン等）等を挙げることができる。水溶性ポリマーの水分散型ポリウレタンエマルジョンに対する質量比率として、これを上回らない量の範囲で添加することが好ましい。水溶性ポリマーの添加量が、水分散型ポリウレタンエマルジョンより多い場合には、これをインプラントの表面に該アパタイトとともに層を形成した場合、該層のインプラントに対する接着性と耐久性が低下する場合がある。
【００５１】
上記ストロンチウムを含む層は、上記アパタイト微粒子及び水分散型ポリウレタンエマルジョン並びに必要に応じて添加される水溶性ポリマー以外の成分を含有してもよい。例えば、ストロンチウムを含む層は、後述する分散剤を含有してもよく、例えば、ポリリン酸を含有することが好ましい。好ましい態様においては、上記ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と分散型ポリウレタンエマルジョンとを含む層は、更にポリリン酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％（より好ましくは１〜３０質量％）の範囲で含有する。ポリリン酸をこのような範囲で含有することにより、該層を有するインプラントからのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を、上記した好適な範囲に制御しやすくなる。
【００５２】
本発明において、上記ストロンチウムを含む層は、本発明の効果を損なわない限り、上述したようなストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子及び水分散型ポリウレタンエマルジョン以外の成分を含んでもよいが、該層１００質量％におけるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子及び水分散型ポリウレタンエマルジョンの含量が６５質量％以上であることが好ましい。
【００５３】
次に、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子をバインダーとともに含んで形成される層を有するインプラントの製造方法について説明する。
本発明のインプラントの製造方法は、ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて、水中において湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造し、該分散液と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、該ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとの質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有するコート液を基材上にコートすることを特徴とする。このように本発明の製造方法は、水中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを、メディアミル装置を用いて湿式分散処理することでストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造する工程と、該分散液（アパタイト微粒子が水中に分散された分散液）と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを含むコート液を用いて基材上にコートする２つの工程を含む。
本発明の製造方法により、上記した本発明のインプラントを製造することができる。
【００５４】
ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを分散するための媒体としては水が最も好ましいが、水に対して２０質量％未満の添加量であれば、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類；１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等の環状エーテル類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等の極性溶媒等、水と混和性のある種々の溶剤を添加して用いることもできる。ただし、本発明で与えられるインプラントの製造方法ではコーティング工程において基本的に有機溶剤を使用しなくてもよいことから、インプラントへの有機溶剤による汚染や変形、あるいは変性などの不具合が発生せず、例えば有機溶剤に対する耐性の低い各種プラスチックとして、アクリル樹脂やポリスチレン樹脂、ポリ乳酸樹脂等の種々のプラスチックからなるインプラントあるいは生化学関連材料に対しても本発明の製造方法が適用され、これらの表面にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む層を形成できる利点を有する。
【００５５】
本発明で用いることのできるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造するためには、湿式分散処理を行うことが必要である。具体的には、ストロンチウムを、アパタイト中に含まれる全元素の総質量に対する比率として１０〜６５質量％含み、結晶性を有するアパタイトについて、水中において湿式分散処理を行う。これにより、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造する。
【００５６】
好ましい湿式分散処理の方法としては、分散処理用のメディアを利用したメディアミル装置を利用した湿式分散方式が特に好ましく、具体的には、水中に上記のストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト紛体を導入し、メディアとしてガラスビーズやアルミナビーズ、その他のセラミックビーズ等を加えて振盪や攪拌を行い、該アパタイト粉体と該ビーズが機械的に衝突し、微粉砕されることで該アパタイト粉体の微粒化を行う方法が好ましい。メディアを用いない装置、例えば超音波照射下で湿式分散処理を行った場合には、分散が十分に進行せず、粗大粒子が混在するため用いることができない。あるいは、ホモジナイザーなどの高速撹拌装置を使用した場合でも、同様に粗大粒子が混在することから用いることができない。
【００５７】
メデイアミル装置の具体的な例を挙げると、少量をバッチ方式で湿式分散処理を行う場合には、ペイントコンディショナーを使用して数時間に亘る振盪を行うことで湿式分散処理を行うことができる。またメディアミル装置として、ダイノーミル（ＷＡＢ社製）に代表される横型ビーズミルのような連続方式での湿式分散処理が可能である装置を用いて、これを複数台用いて直列に配置して１パスで湿式分散処理を行っても良く、あるいは１台のメディアミルを用いて複数回処理を繰り返すことも好ましく行うことができる。このような湿式分散処理を行うことで、水中においてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造することができる。メディアミル装置としては、これら以外にも様々な形状、タイプの装置が市販されるが、いずれの場合も、装置がメディアを用いて水中において湿式分散処理を行うことのできる装置であれば基本的には使用することができる。
【００５８】
上記したメディアミル装置を用いてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトの湿式分散処理を行う場合に、使用するメディアはセラミックビーズを用いることが好ましい。特に、ビーズが研磨されるなどしてビーズ由来の不純物が分散液中に混入することを防止することが好ましく、仮に、微細に粉砕されたビーズ由来の成分が混入した場合であっても、これが生体内において安全性が確認されていることが好ましい。こうした目的で利用できるセラミックビーズとして、具体的にはＺｒＯ、立方晶ジルコニア、イットリウム安定化ジルコニア、ジルコニア強化アルミナなどのジルコニアを含有するセラミックビーズを最も好ましく用いることができる。また、メディアの平均直径は０．０１〜１０ｍｍの範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．１〜５ｍｍである。こうしたメディアを使用したメディアミルを用いる湿式分散処理の条件は、通常行われる室温での処理であり、特に処理時間や温度等に関する制限は無い。また、パス回数については１回で十分である場合もあるが、２〜７回程度のパス回数で処理を行うことで、より粒子径分布が狭く、かつ分散安定性に優れたストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造することができる。
【００５９】
上記の方法を用いてストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液を製造する際に、前記した水分散型ポリウレタンエマルジョンを添加して湿式分散処理を行うこともできる。水中で安定に分散した水分散型ポリウレタンエマルジョンが、湿式分散処理工程において該アパタイトの微粒化を促進するとともに、微粉砕された該アパタイト微粒子の再凝集を防止することで、該アパタイト微粒子の分散液を安定して製造し、長期に保持できる利点を与える。ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散液の製造における水分散型ポリウレタンエマルジョンの添加量は、例えば水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分が、該アパタイト微粒子に対して、１〜５０質量％であることが好ましく、１〜３０質量％であることがより好ましい。
【００６０】
あるいは、水分散型ポリウレタンエマルジョン以外にも、分散剤として様々な化合物を添加して湿式分散処理を行うことも好ましく行うことができる。特に、上記の湿式分散処理を行った後に、得られる分散液を直ちに使用して、後述するインプラントへのコートを行う場合には、特に水分散型ポリウレタンエマルジョンや分散剤を用いることなく湿式分散処理を行ってアパタイト微粒子の分散液を製造し、これを用いて本発明のインプラントを製造することが可能であるが、実際には上記の分散液中に含まれる該アパタイト微粒子の沈降や凝集を防止し、ある程度の分散安定性を確保することが好ましく、その場合、水分散型ポリウレタンエマルジョンやこれ以外の分散剤を用いることで分散液中に含まれる該アパタイト微粒子の分散安定性を向上させることができる。この場合、用いる分散剤の該アパタイト微粒子に対する割合は、質量比で該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％の範囲が好ましく、更に１〜３０質量％の範囲が好ましい。この比率を超えて分散剤を用いた場合、分散剤の影響により水分散型ポリウレタンエマルジョンの特質である耐久性が損なわれ、インプラントからのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前記した適度な範囲に制御することが困難となる場合がある。
【００６１】
上記の目的で使用できる分散剤としては、各種界面活性剤や、水に可溶性である様々な合成ポリマー及び天然物由来ポリマーなどを用いることができるが、生体に対する安全性が確認されている素材であり、不純物が含まれず高純度であることが好ましい。用いることのできる分散剤の特に好ましい例としてポリリン酸（塩）を挙げることができる。この場合、得られるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の分散物中に含まれる微粒子の大きさが体積平均粒子径にして５０〜５００ｎｍの範囲にある微粒子に分散され、生体に対する安全性が高く、高純度で分散安定性に優れた該アパタイト微粒子分散物が得られることから、極めて好ましく用いることができる。
【００６２】
上記で用いることのできるポリリン酸（塩）の例として、ピロリン酸（ナトリウム）、トリポリリン酸（ナトリウム）、テトラポリリン酸（ナトリウム）、直鎖状のポリリン酸（ナトリウム）のような直鎖状のポリリン酸（塩）及びこれらの水和物が挙げられ、あるいは環状化合物であるヘキサメタリン酸（ナトリウム）などを含み、実際には高分子化合物であるメタリン酸（ナトリウム）や、あるいは、直鎖状骨格のみならず、分岐構造を含むウルトラリン酸（ナトリウム）及びこれらの水和物などを挙げることができる。これらの種々のポリリン酸（塩）は複数の種類を任意の割合で混合して用いても良い。なおここでポリリン酸（塩）とは、ポリリン酸あるいはこれらの塩であることを意味する。
【００６３】
上記分散剤を使用した場合には、得られるインプラントにおけるストロンチウムを含む層は、該分散剤を含むものとなる。好ましい態様の一例においては、本発明のインプラントが有する、上記ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとを含有する層は、更にポリリン酸を該アパタイト微粒子に対して１〜５０質量％（より好ましくは１〜３０質量％）の範囲で含有する。
【００６４】
上記のように、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイトを水中で湿式分散処理を行うことにより該アパタイト微粒子の分散液を得ることができる。このようにして作製した微粒子の分散液を水分散型ポリウレタンエマルジョンとともに用いることで、本発明に好適に用いることのできるコート液が得られ、これを用いて基材上にコートすることで、本発明の目的とするストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子を含む層を設けたインプラントが製造できる。本発明の製造方法は、基材にコートしたコート液を乾燥させる乾燥工程等を含んでもよい。
【００６５】
本発明の製造方法で用いられるコート液は、上記のストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンとの質量比で１０：２〜１０：２０の範囲で含有する。上記コート液は、上述した自己乳化性イソシアネート化合物を、水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分質量に対して１〜５０質量％（より好ましくは５〜４０質量％）含むことが好ましい。該コート液を基材上にコートすることにより、上記ストロンチウムを含む層が形成される。上記コート液の製造方法は特に限定されず、上記のアパタイト微粒子の分散液と、水分散型ポリウレタンエマルジョンとを、該アパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンの質量比が上記範囲となるように混合すればよい。上記自己乳化性イソシアネート化合物を含むコート液を製造する場合には、上記アパタイト微粒子の分散液及び水分散型ポリウレタンエマルジョンに加えて、自己乳化性イソシアネート化合物を、該水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分質量に対して好ましくは１〜５０質量％（より好ましくは５〜４０質量％）となるように添加して混合すればよい。なお、アパタイト微粒子の分散液の製造に水分散型ポリウレタンエマルジョンを使用した場合に、得られた分散液に水分散型ポリウレタンエマルジョンが上記割合で含まれる場合には、該分散液をそのままコート液として使用することもできる。
【００６６】
本発明において基材上にコートする目的に好適であるための条件として、上記の水中に分散したアパタイト微粒子の分散液の分散安定性が良好であり、長持間（例えば室温において２４時間の静置条件下）の保存に際してもアパタイト微粒子の凝集や沈降が発生しない場合が好ましい。
【００６７】
本発明において基材上に形成される層の厚みには好ましい範囲が存在する。層の厚みを表す尺度として、単位面積あたりにコートされたアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョン及びその他含まれる固形分全体を足し合わせた質量を以て表した場合、好ましい範囲は単位平方メートル当たり０．０５〜５０ｇの範囲にある場合が好ましく、更に０．５〜５０ｇの範囲にある場合が更に好ましい。このような場合において、ストロンチウムイオンが前記した好ましい濃度範囲を保った状態で徐放されることから極めて好ましく用いることができる。
【００６８】
インプラントの基材上にストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート液を用いてコートを行う方法としては、インプラントの大きさや形状にあわせて種々の好適な方法を用いることができる。例えば、一つの方法として、コート液中にインプラントを浸漬して引き上げ、余分なコート液を除いた後、コート液を乾燥して表面層を形成する方法や、あるいは該コート液をスプレー噴霧やカーテン塗布などの方法でインプラント表面にコート液を満遍なく付着させてコートを行い、その後に乾燥を行って表面層を形成する方法など、既知の様々なコーティング方法を利用することが可能である。
上記ストロンチウムを含む層を形成する基材の部位及び範囲は、基材の形状、インプラントの用途等に応じて適宜設定することができる。例えば、基材の表面全体に層を形成してもよく、基材の表面の一部に層を形成してもよい。
【００６９】
上記のコート液中に含まれる全体の固形分濃度については好ましい範囲が存在し、０．１〜３０質量％の範囲に含まれることが好ましく、この範囲より低い濃度で固形分を含むコート液を用いて基材上に層を形成した場合に、層の厚みを上記した好ましい範囲に制御することが困難である場合がある。また、３０質量％を超える濃度でアパタイト微粒子が含まれる場合、コート液の粘度が高くなり、基材上に均一にコートすることが困難になる場合があることから、得られるインプラントからのストロンチウムイオンの放出濃度と放出期間を前記した適度な範囲に制御することが困難となる場合がある。
【００７０】
本発明のインプラントに使用される基材の構成材料は、医療分野等で使用されるものであればよく、特に限定されない。
インプラントの基材として、例えば人工靱帯などに利用されるポリエステルや、あるいはＰＥＥＫ製の脊椎ケージなどのような様々なプラスチック基材を挙げることができる。これらの基材は、必要に応じて、その表面にガンマ線処理やプラズマ処理、放電処理などの様々な表面加工を施しておくことで、先の表面層と基材の界面での接着性を一層強固にし、耐久性を高めることができる。プラスチック基材へのコートの際に重要であるのは、コートした後に加熱乾燥を行う場合、乾燥温度としては基材であるプラスチックの軟化点以下の温度で加熱を行うことが好ましく、これ以上の温度で加熱処理を行った場合、基材の変形や変質及び劣化を来す場合がある。
【００７１】
基材として、例えばリン酸カルシウム系のセラミックスからなる人工骨などの基材に対して、本発明のストロンチウムを含む層を形成することで、安全性に優れ、ストロンチウムイオンを徐放する性質を備えた生体適合性と骨伝導性を改良したインプラントが与えられる。この場合には、コートを行った後に、加熱処理を行うことも好ましく行うことが可能であり、加熱温度としては１００℃を超えて加熱することや、あるいは数百℃から千℃前後の高温に加熱することで、バインダーである水分散型ポリウレタンエマルジョンを熱分解除去し、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子のみを基材表面に固着して表面層を形成することも好ましく行うことができる。
【００７２】
更に、人工関節などに用いられるチタンなどの金属基材に対して本発明のストロンチウムを含む層を形成することで、安全性に優れ、ストロンチウムイオンを徐放する性質を備えた生体適合性と骨伝導性を改良したインプラントが与えられる。この場合には、チタン基材表面は予め種々の表面処理を施した後にコートを行うことが好ましく、その場合に表面処理方法として、サンドブラストなどで表面を適度に粗面化する方法や、アルカリ処理による表面の活性化や、酸化チタン層の形成などの公知の種々の方法で表面処理を行うことで、本発明の表面層を強固に基材表面に接着することが可能である。更に好ましくは、チタン等の基材表面に予めプラズマ溶射法やフレーム溶射法などの種々の方法でヒドロキシアパタイトの層を形成しておき、そのヒドロキシアパタイト層の上部に本発明のストロンチウムを含む結晶性のアパタイト微粒子を含む層を設ける方法も好ましく用いることができる。
【００７３】
本発明のインプラントは、上記した製造方法により製造され、その後に滅菌処理されることで安全性の確保された生体インプラントとしての使用が可能である。滅菌方法としては、従来から行われているオートクレーブを用いた加熱滅菌処理や、エチレンオキサイドガスによる化学的滅菌処理、あるいはガンマ線照射や電子線照射による放射線滅菌処理方法など、いずれの方法によっても滅菌処理が可能である。
本発明のインプラントは、例えば、歯科分野、整形外科、形成外科等の外科分野において用いられる、生体内に埋入するインプラントとして好適に使用される。
【００７４】
以下に実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、実施例中の百分率及び成分の比率は断りのない限り質量基準である。
【実施例】
【００７５】
実施例及び比較例において、広角Ｘ線回折は以下の装置及び条件で行った。
Ｘ線回折装置：リガク社製、型式ミニフレックス
Ｘ線源  ：Ｃｕ−Ｋα線（波長  ０．１５４１８ｎｍ）、Ｋβフィルター使用
スリット系：受光スリット０．３ｍｍ、散乱スリット４．２°、発散スリット可変
測定範囲：２θ＝１０°〜６０°
スキャン速度：２．０°／ｍｉｎ
出力：３０ｋＶ、１５ｍＡ
なお、測定前後の重量を計測して、測定前後の試料粉末の重量変化が０．１質量％以内であることを確認した。
【００７６】
実施例１
（リン酸水素ストロンチウムの合成）
特開２０１４−１８０４９１号公報に記載される方法に従ってストロンチウムを含む結晶性を有するアパタイトを合成した。塩化ストロンチウム六水和物２６７ｇ（１モル）を１リッターの三角フラスコ内に秤取り、蒸留水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍｌのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム１３２ｇ（１モル）を秤取り、蒸留水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウム水溶液を導入した三角フラスコを５０℃に調整した水浴上に移し、攪拌しながら滴下漏斗を用いて、リン酸水素二アンモニウムを溶解した水溶液を１時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。水浴上から三角フラスコを移し、室温まで冷却した後、グラスフィルターを用いて吸引濾過を行った。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返し蒸留水で洗浄を行った後、６０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。この白色の粉体（生成物）を、広角Ｘ線回折装置を用いて解析を行ったところ、リン酸水素ストロンチウム（α−ＳｒＨＰＯ４）に由来するピークのみが観察され、それ以外のピークは認められなかった。収量測定より収率９５％で高純度のリン酸水素ストロンチウムが得られていることが判った。
【００７７】
（リン酸水素ストロンチウムのアルカリ処理によるストロンチウムアパタイトの合成）
上記で得られたリン酸水素ストロンチウムの全量を１０００ｍｌ三角フラスコへ移し、純水６００ｇを加えて攪拌を行いながら、水酸化ナトリウムを３５ｇ添加した。反応系のｐＨは１３であった。これをホットプレート上で攪拌しながら反応系の温度を７０℃に上昇し、この温度で３時間加熱攪拌を行った。その後室温まで冷却し、吸引濾過を行って生成物をグラスフィルター上に回収した。純水により十分に洗浄を行った後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜加熱乾燥を行い白色の粉体を得た。この白色の粉体について広角Ｘ線回折により解析を行い、ストロンチウムを含むアパタイト（ストロンチウムアパタイト）であることを確認した。図１は実施例１で得られたストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターンを示す。図１に示す回折パターンより、ストロンチウムアパタイト以外の不純物の存在は認められず、また各回折ピークの半値幅も比較的狭い、鋭く高いピーク形状を示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察されたことから、高純度で結晶性の良好なストロンチウムアパタイトが得られていることが明らかとなった。また、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）による測定により求められたストロンチウムアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は６０．０％であり、構造式Ｓｒ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２より計算される値５９．２％にほぼ合致する値が得られた。
【００７８】
（ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の製造と平均粒子径の測定結果）
上記で得られたストロンチウムアパタイトを用いて湿式分散処理を行う際に、３種類の条件で湿式分散処理を行い、それぞれの条件で得られた分散液中のアパタイト微粒子の平均粒子径の比較を行った。最初の条件として、ストロンチウムアパタイト２０ｇを２００ｍｌのポリプロピレン容器に移し、これにイオン交換水を１２０ｇ及び平均直径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１６０ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して連続して激しく振とう（シェイク）しながら６時間湿式分散処理を行うことで作製した分散物を（Ａ）とした。次いで、同じくストロンチウムアパタイト２０ｇを２００ｍｌのポリプロピレン容器に移し、これに水分散型ポリウレタンエマルジョン（ハイドランＡＰ−４０Ｆ、固形分濃度２２．５質量％、体積平均粒子径０．１５μｍ、ＤＩＣ社製）を固形分で２ｇとイオン交換水を１１１ｇ及び平均直径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１６０ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して連続して激しく振とう（シェイク）しながら６時間湿式分散処理を行うことで作製した分散物を（Ｂ）とした。３つめの条件として、ストロンチウムアパタイト２０ｇにポリリン酸塩としてピロリン酸ナトリウム十水和物（和光純薬工業社製）を４ｇ添加し、これにイオン交換水を１１６ｇ及び平均直径０．３ｍｍのジルコニアビーズを１６０ｇ加えて密閉し、ペイントコンディショナーを使用して連続して激しく振とう（シェイク）しながら６時間湿式分散処理を行うことで作製した分散物を（Ｃ）とした。その後、濾布を使用してそれぞれの分散物（Ａ）〜（Ｃ）からジルコニアビーズを分離し、分散液（Ａ）〜（Ｃ）を得た。得られた各々の分散液（Ａ）〜（Ｃ）をイオン交換水で希釈し、顕微鏡観察用のカバーグラス表面に薄くキャストして乾燥を行い、カバーグラス上に分布しているアパタイト微粒子の大きさを、走査型電子顕微鏡を用いて倍率１０万倍の拡大画像から測定を行った。図２は（Ａ）の分散剤を使用せずに湿式分散処理を行うことで得られたストロンチウムアパタイト微粒子の走査型電子顕微鏡による拡大画像（倍率は１０万倍）を表す。この画像から一次粒子同士が重ならずに個別に形状が確認できる粒子についてその大きさ（最長の軸方向の長さ）とその個数の分布を、拡大画像の中から６０個の粒子をピックアップして計算し、数平均粒子径として７０ｎｍと求められた。粒子の大きさが５００ｎｍを超える大きさの粒子の存在は確認されなかった。また、大きさが５０ｎｍ未満である粒子の個数は３０％未満であった。（Ｂ）及び（Ｃ）の分散液についても同様にして走査型電子顕微鏡による拡大画像を元に数平均粒子径を計算したところ、両者とも（Ａ）の場合とほぼ同一の結果が得られた。更に、（Ａ）〜（Ｃ）の分散液を用いて、分散しているストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布を光散乱回折式粒度分布計（粒度分布測定装置ＬＡ−９２０、堀場製作所社製）を使用して測定し、図３〜図５に示す結果を得た。図３は、（Ａ）の分散剤を使用せずに湿式分散処理を行うことで得られた分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線を表す。求められた体積平均粒子径は、メジアン径で９３７ｎｍであった。図４は、（Ｂ）の水���散型ポリウレタンエマルジョンを添加して作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線を表す。求められた体積平均粒子径は、メジアン径で４７５ｎｍであった。図５は、（Ｃ）のポリリン酸塩を添加して作製した分散液中のストロンチウムアパタイト微粒子の粒子径分布曲線を表す。求められた体積平均粒子径は、メジアン径で１１２ｎｍであり、粒子径分布として全体の１００％が粒子径の範囲として５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲に含まれていた。上記で得られたそれぞれの分散液に含まれるストロンチウムアパタイト微粒子の分散安定性を評価するために、分散液（Ａ）〜（Ｃ）を透明ガラス製容器内に入れて２４時間室温で静置しておき、静値後の分散液の様子を目視で観察したところ、（Ｂ）と（Ｃ）はともに沈殿物や凝集物の発生もなく、安定に分散していることが確認された。（Ａ）については、容器の底面に沈殿物の堆積が認められ、分散液の上部が清透になり、透明な上清液とその下部に白色の分散液に分離していたが、再度撹拌を行うと容易に再分散し、数時間程度であれば液の分離は観察されず安定な分散状態を保っていた。
【００７９】
（ストロンチウムアパタイト微粒子のアクリル板へのコーティング及びコート層の均一性と粒子サイズの観察）
上記で得られた（Ａ）〜（Ｃ）の分散液の各々に、水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分がストロンチウムアパタイト微粒子１０質量部に対して２質量部になるよう水分散型ポリウレタンエマルジョン（ハイドランＡＰ−４０Ｆ、ＤＩＣ社製）を追加し、更に自己乳化性イソシアネート化合物（デュラネートＷＢ４０−８０、固形分濃度８０質量％、旭化成工業社製）を、その固形分が水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分１０質量部に対して３質量部になるよう加えた。次いで、該アパタイト微粒子を合わせた全体の固形分濃度が８質量％になるようイオン交換水で希釈して（Ａ）〜（Ｃ）のコート液を作製した。このコート液を用いてアクリル板（１４ｍｍφ×厚み１ｍｍ）上に固形分質量が１平方メートル当たり１８ｇになるよう塗布及び乾燥を行って、ストロンチウムを含む層（コート層）を表面に形成したアクリル板を得た。乾燥後にコート層を観察したところ、（Ａ）〜（Ｃ）のいずれの場合も、透明である均一な塗布膜が形成されていることが確認された。蛍光Ｘ線測定装置を用いて、アクリル板表面のコート層中に含まれるストロンチウムの量を定量した結果、１平方メートル当たり８．５ｇであり、ほぼコート膜中に含まれるストロンチウムアパタイトの比率から計算される値に近い数値であることが確認された。更に、アクリル板表面のコート層の様子を、共焦点光学顕微鏡を用いて観察した結果、表面粗さは高々０．５マイクロメートル未満の凹凸であり、平滑性の高い均一なコート層が形成されていることが確認された。図６は、（Ｂ）のコート液を用いてアクリル板上に形成したコート層の走査型電子顕微鏡写真であり、倍率は１０万倍である。コート層中に含まれるストロンチウムアパタイト微粒子はバインダーである水分散型ポリウレタンエマルジョン中に埋没することなく表面に露出していることが確認された。これよりストロンチウムアパタイト微粒子の大きさは平均粒子径で７０ｎｍの微粒子であることが明確となった。また、同様にして（Ａ）及び（Ｃ）の分散液を用いて作製したコート層についても走査型電子顕微鏡を用いて観察したが、（Ｂ）の場合と同様な拡大画像が得られ、ほぼ同一の大きさの微粒子を含むことが確認された。
【００８０】
（表面層を設けたアクリル板からのストロンチウムイオンの徐放性）
上記で得られた（Ａ）〜（Ｃ）のコート液の内、（Ｂ）のコート液で作製した、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート層を表面に形成したアクリル板を１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてアクリル板表面のコート面を上にして完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を蛍光Ｘ線測定装置（蛍光Ｘ線測定装置ＺＳＸ primus、リガク社製）を用いて定量した。すなわち、該アクリル板を２４時間浸漬した疑似体液を３０μｌ採取し、これを点滴濾紙（マイクロキャリー）の中央部に滴下して乾燥させた試料を用いて蛍光Ｘ線測定を行った。その結果、該アクリル板から、最初の液交換直前から１４日間の間で０．４（１４日後）〜０．８ｐｐｍ（最初の液交換直前）の範囲でストロンチウムイオンが放出され、期間を通して徐々に放出されるストロンチウムイオン濃度が減少することが明確となった。
【００８１】
（実施例１の細胞培養評価）
上記の（Ｂ）のコート液で作製した、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート層を表面に形成したアクリル板を用いて、以下のようにして細胞培養評価を行った。細胞培養評価はｎ＝２で行った。すなわち、１２ウェルの細胞培養容器内に各々１枚ずつ表面コートを行ったアクリル板を、コート面を上にしてセットし、培地として、１５質量％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＭＥＭ：minimal essential medium、ナカライテスク社製）に抗生剤抗生剤としてペニシリン１００Ｕ／ｍｌ（ナカライテスク社製）とストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ナカライテスク社製）を添加した培養液２ｍｌを加えて、ラット骨髄（Ｆ３４４、７週目、オス）から採取した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞密度は１×１０４個／ｃｍ２で播種し、培養器内を３７℃、５％ＣＯ２に維持し、この中で上記アクリル板表面に播種した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞播種翌日から、培地として、１５質量％ウシ胎児血清含有細胞培養液に上記抗生剤を添加した細胞培養液に、デキサメサゾン１０ｎＭ（Sigma社製）、アスコルビン酸８２μｇ／ｍｌ（和光純薬工業社製）及びβ−グリセロリン酸１０ｍＭ（Sigma社製）を添加した培養液を用いて細胞培養を継続し、光学顕微鏡を用いて細胞接着及び細胞増殖の様子を観察した。細胞の増殖の様子は、アクリル板表面で盛んに増殖する様子が観察された。培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定も行った。更に、この細胞培養系においても培地中に含まれるストロンチウムイオン濃度を先と同様にして測定し、該表面コート層を設けたアクリル板から２週間の間０．４〜０．８ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され続けることを確認した。下記に示す、アクリル板を使用せず、培養容器のウェル底面のポリスチレン表面を培養に使用した比較例１と、ストロンチウムを含まないヒドロキシアパタイトを含む層を表面に形成したアクリル板を使用した比較例２からは、培地中にはストロンチウムイオンは検出されなかった。
【００８２】
培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定は、細胞を培養した培養液に分泌されたオステオカルシン量を、市販のオステオカルシンＥＬＩＳＡキットＤＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を使用して測定した。
【００８３】
比較例１
（比較例１の細胞培養評価）
比較例１として、上記のアクリル板を使用せず、培養容器のウェル底面のポリスチレン表面を比較としてｎ＝２で使用し、上記と同様の細胞培養評価を並行して実施した。この場合においても、上記の場合と同様に、細胞播種翌日からウェル底面に接着した細胞が光学顕微鏡を用いて観察できた。この場合も培養日数の経過とともに細胞が増殖していく様子が観察できた。
【００８４】
比較例２
（比較例２の作製と細胞培養評価）
比較例２として、ストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子の代わりに、医療用グレードのヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ−１００、太平化学産業社製）を用いた以外は実施例１の（Ｂ）のコート液を用いた場合と同様にしてアクリル板上に水分散型ポリウレタンエマルジョンとともに層を形成し、比較例２の試料とした。この場合もｎ＝２で使用し、上記と同様の細胞培養評価を実施した。この場合においても、上記の場合と同様に、細胞播種翌日からアクリル板表面に接着した細胞が光学顕微鏡を用いて観察できた。この場合も培養日数の経過とともに細胞が増殖していく様子が観察できた。
【００８５】
実施例１及び比較例１と２において、培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定を行ったところ、培養日数とともにオステオカルシンの分泌量が増大し、特に上記のストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート層を形成した実施例１のアクリル板を細胞培養担体として用いた場合にその分泌量が顕著に増大することが判明した。すなわち、培養日数１４日目において測定された培養液中に分泌されたオステオカルシンの量は、実施例１の場合平均２０ｎｇ／ｍｌであり、コート層を有しない比較例１の場合の１ｎｇ／ｍｌ及びヒドロキシアパタイトを用いた比較例２の２ｎｇ／ｍｌと比較して約１０倍以上の高い分泌量が測定された。
【００８６】
本実施例から、アクリル板表面に本発明のストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含む層を設けることで、該層の表面において骨芽細胞前駆体細胞の増殖と分化誘導が促進され、骨分化マーカーであるオステオカルシンの分泌量も比較例に対して顕著に増大した。このことから、各種プラスチック基材等の基材からなるインプラントに対して、本発明のストロンチウムを含むアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含む層を設けることでインプラント表面の骨伝導性を高めることが可能であることが強く示唆された。更には、表面層からストロンチウムイオンが１４日間に亘って安定的に放出され、ストロンチウムを含む層が生体内で長期に亘って安定して存在することが可能であることが実証された。
【００８７】
実施例２
（ストロンチウムを含む炭酸アパタイトの合成）
実施例１と同様にして合成したリン酸水素ストロンチウム（０．５モル）を１０００ｍｌ三角フラスコへ移し、イオン交換水６００ｇを加えて攪拌を行いながら、炭酸ナトリウムを２７ｇ（０．２５モル）添加した。反応系のｐＨは９．５であった。これをホットプレート上で攪拌しながら反応系の温度を８０℃に上昇し、この温度で３時間加熱攪拌を行った。その後室温まで冷却し、吸引濾過を行って生成物をグラスフィルター上に回収した。イオン交換水により十分に洗浄を行った後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜加熱乾燥を行い白色の粉体を得た。得られた粉体は広角Ｘ線回折により解析を行った。広角Ｘ線回折による解析から、得られた白色の粉末は、ストロンチウムを含む炭酸アパタイト（炭酸ストロンチウムアパタイト）であることを確認した。図７には実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの広角Ｘ線回折パターンを示す。図７に示す回折パターンより、炭酸ストロンチウムアパタイト以外の不純物の存在は認められず、また各回折ピークの半値幅も比較的狭い、鋭く高いピーク形状を示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察されたことから、高純度で結晶性の良好な炭酸ストロンチウムアパタイトが得られていることが明らかとなった。図８には、実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトのＦＴ−ＩＲスペクトルチャートを示す。図中において矢印で示した１４６０ｃｍ−１，１４０５ｃｍ−１及び８７０ｃｍ−１付近の吸収は何れも炭酸アパタイトに含まれる炭酸イオンに特徴的な吸収であることから、生成物は炭酸ストロンチウムアパタイトであることが分かった。更に、実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率（質量％）について、Feathersotone等の方法（J.D.B.Featherstone, Caries Res., 18, 63−66 (1984)）に従い、１００１ｃｍ−１付近のリン酸基に基づく吸収ピーク強度に対する１４０５ｃｍ−１の炭酸イオンに基づく吸収ピーク強度の比率から定量を行った結果、炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率として１０．０質量％の値が得られた。
【００８８】
図９には、実施例２で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトの走査型電子顕微鏡による拡大画像を示す。拡大倍率は１０万倍である。これにより数平均粒子径として１１０ｎｍであり、５００ｎｍを超える大きさの粗大粒子は認められず、また、大きさが５０ｎｍ未満の微粒子の数も１０％未満であるとの結果を得た。また、ＥＤＳによる測定により求められた炭酸ストロンチウムアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は６２．９％であり、構造式Ｓｒ１０（ＰＯ４）４（ＣＯ３）２（ＯＨ）２より計算される値６２．１％にほぼ合致する値が得られた。
【００８９】
上記で得られた炭酸ストロンチウムアパタイトを用いて実施例１の（Ｂ）と同様に水分散型ポリウレタンエマルジョンを使用して湿式分散処理を行うことで、水中に炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子を含む分散液を製造した。実施例１と同様にして、光散乱回折式粒度分布計を使用して求められた体積平均粒子径は、メジアン径で２５０ｎｍであり、粒子径分布として全体が５０ｎｍから５００ｎｍの範囲に含まれる炭酸ストロンチウム微粒子からなる分散液であることが明らかとなった。また上記で得られた分散液に含まれる炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子の分散安定性を評価するために、分散液を透明ガラス製容器内に入れて２４時間室温で静置しておき、静値後の分散液の様子を目視で観察したが、沈殿物や凝集物の発生もなく、安定に分散していることが確認された。
【００９０】
実施例１と同様にして、上記で得た炭酸ストロンチウムアパタイト微粒子を含む分散液に対して水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分がストロンチウムアパタイト微粒子１０質量部に対して２質量部になるよう水分散型ポリウレタンエマルジョン（ハイドランＡＰ−４０Ｆ、ＤＩＣ社製）を追加し、更に自己乳化性イソシアネート化合物（デュラネートＷＢ４０−８０、固形分濃度８０質量％、旭化成工業株社製）を、その固形分が水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分１０質量部に対して３質量部になるよう加えてコート液を作製した。このコート液を用いてアクリル板上に固形分が平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行って、ストロンチウムを含む層（コート層）を表面に形成したアクリル板を得た。乾燥後にコート層を観察したところ、ほぼ完全に透明である均一な塗布膜が形成されていることが確認された。蛍光Ｘ線測定装置を用いて、アクリル板表面のコート層中に含まれるストロンチウムの量を定量した結果、１平方メートル当たり１２ｇであり、ほぼストロンチウムアパタイトと水分散型ポリウレタンエマルジョンの比率から計算される値に近い数値であることが確認された。更に、アクリル板表面のコート層の様子を、共焦点光学顕微鏡を用いて観察した結果、表面粗さは０．５マイクロメートル未満の凹凸であり、平滑性の高い均一なコート層が形成されていることが確認された。アクリル板上のコート層を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した結果、層中に含まれるストロンチウムアパタイト微粒子の数平均粒子径は１１０ｎｍであり、５００ｎｍを超える大きさの粗大粒子は認められず、また、大きさが５０ｎｍ未満の微粒子の数も１０％未満である結果を得た。
【００９１】
（表面コートしたアクリル板からのストロンチウムイオンの徐放性）
上記で得られたストロンチウムを含む炭酸アパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート層を表面に形成したアクリル板を用いて、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えて該アクリル板が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。実施例１と同様にして２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量した。その結果、該アクリル板から、最初の液交換直前から１４日間の間で０．７（１４日後）〜２．５ｐｐｍ（最初の液交換直前）の範囲でストロンチウムイオンが放出され、期間を通して徐々に放出されるストロンチウムイオン濃度が減少することが明確となった。
【００９２】
（実施例２の細胞培養評価）
上記のストロンチウムを含む炭酸アパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含む層を形成したアクリル板を用いて、実施例１と同様にしてアクリル板上のコート層表面で細胞培養評価を行った。細胞培養評価はｎ＝２で行った。細胞培養液は４８時間毎に交換し、培地交換直前に培地のサンプリングを行った。細胞の増殖の様子は、アクリル板表面で盛んに増殖する様子が観察された。培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定も行った。
【００９３】
培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定は、細胞を培養した培養液に分泌されたオステオカルシン量を、市販のオステオカルシンＥＬＩＳＡキットＤＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を使用して測定した。更に、この細胞培養系においても培地中に含まれるストロンチウムイオン濃度を先と同様にして測定し、該表面コート層を設けたアクリル板から２週間の間０．７〜２ｐｐｍの範囲でストロンチウムイオンが放出され続けることを確認した。下記に示すストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを含む表面コート層を設けたアクリル板を使用した比較例３では、培地中にはストロンチウムイオンは検出されなかった。
【００９４】
比較例３
（比較例３の炭酸アパタイトの合成）
比較例３として、ストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを下記の方法に従い合成し、これを使用した表面層を実施例２と同様にして作製した試料を用いて比較例３を実施した。リン酸水素カルシウム二水和物（以下ＤＣＰＤと略す。和光純薬工業社製）を４３ｇ（０．２５モル）秤量し、還流冷却管とこれに接続した気体のトラップ管を備えた５００ｍＬの三角フラスコへ移し、イオン交換水２００ｇを加えて攪拌を行いながら、炭酸ナトリウムを１６ｇ添加して攪拌を行った。水浴上で攪拌しながら反応系の温度を８０℃に上昇し、この温度で２時間加熱攪拌を行った。反応中炭酸ガスが発生し、トラップ中にバブリングする炭酸ガスの様子を観察することにより、炭酸ガスの発生が停止した時点を反応の終点とした。その後室温まで反応系を冷却し、吸引濾過を行って生成物をグラスフィルター上に回収した。イオン交換水により生成物を十分に洗浄した後、８０℃に調節した乾燥器内で１昼夜加熱乾燥を行うことで白色の粉体を得た。得られた粉体について広角Ｘ線回折により測定を行ったところ、炭酸アパタイトとして予測されるピーク位置に回折ピークを示し、炭酸アパタイト以外の不純物の存在は認められず、高純度で結晶性の良好な炭酸アパタイトが得られていることが明らかとなった。実施例２と同様にして炭酸アパタイト中に含まれる炭酸イオンの比率を求めた結果、１７．６質量％含まれていることが分かった。得られた炭酸アパタイトを用いて、実施例１の（Ｂ）と同様にして水分散型ポリウレタンエマルジョンを加えて湿式分散処理を行い、更に同じ水分散型ポリウレタンエマルジョンを実施例１の場合と同様に用いて、コート液を作製した。このコート液を用いてアクリル板上に固形分が平方メートル当たり２０ｇになるよう塗布及び乾燥を行って、ストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを含む層を表面に形成しアクリル板を得た。
【００９５】
（比較例３の細胞培養評価）
比較例３として、上記のストロンチウムを含まない炭酸アパタイトを含む層を表面層に設けたアクリル板をｎ＝２で使用した上記と同様の細胞培養評価を並行して実施した。この場合においても、細胞播種翌日からアクリル板表面に接着した細胞が光学顕微鏡を用いて観察できた。この場合も培養日数の経過とともに細胞が増殖していく様子が観察できた。
【００９６】
実施例２及び比較例３において、培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定を行ったところ、培養日数とともにオステオカルシンの分泌量が増大し、特に上記のストロンチウムを含む炭酸アパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート層を形成した実施例２のアクリル板を細胞培養担体として用いた場合にその分泌量が顕著に増大することが判明した。すなわち、培養日数１４日目において測定された培養液中に分泌されたオステオカルシンの量は、実施例２の場合平均３０ｎｇ／ｍｌであり、比較例３の場合の１ｎｇ／ｍｌと比較して約３０倍の高い分泌量が測定され、実施例１の場合より更に高いオステオカルシンの分泌量を示した。
【００９７】
実施例３、４及び比較例４〜６
（人工靱帯に対するアパタイト層の形成とストロンチウムイオンの徐放性評価）
生体埋め込み型インプラントの一つとしてポリエステル繊維からなる人工靱帯を選び、これへのストロンチウムを含むアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート層を設け、その表面で骨系細胞培養を行うことでストロンチウムを含むアパタイト微粒子を含む表面層の効果について検証を行う実験を行った。人工靱帯（The Leeds−Keio Artificial Ligaments II、１５ｍｍ×５００ｍｍ、ネオリガメント社（英国）製）を用いて、全長を２０ｍｍずつの小片にカットし、それぞれの小片を用いてこれを、先の実施例１及び２で作製したストロンチウムを含むアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート液中に浸漬し、引き上げて７０℃の乾燥器内に３時間静置することで乾燥を行い、人工靱帯表面にストロンチウムを含むアパタイト微粒子を含む層を形成した各々の実施例３の人工靭帯（ストロンチウムアパタイトを使用）及び実施例４の人工靭帯（炭酸ストロンチウムアパタイトを使用）を作製した。また、比較例２（ヒドロキシアパタイトを使用）及び比較例３（炭酸アパタイトを使用）で作製したそれぞれのストロンチウムを含まないアパタイト微粒子を用いて人工靱帯表面にコート層を作製した各々の比較例４及び比較例５の人工靭帯と、コート層を設けない人工靱帯を用いた比較例６の試料を作製した。このようにしてアパタイト層を形成した人工靱帯はエチレンオキサイドガスを用いて滅菌処理を行った。尚、実際に人工靱帯表面にコートされたアパタイト層の厚みとして、蛍光Ｘ線測定から求められた数値は、実施例３、４及び比較例４、５では全て、固形分が１平方メートル当たり約２ｇの塗布量であった。作製した人工靱帯を用いて、これを疑似体液中に３０日間浸漬し、その間２日ごとに少量の液を採取し、溶出するストロンチウムイオンの濃度を測定した結果、実施例３では最初に３ｐｐｍであり、その後２週間後に１ｐｐｍまで減少し、３０日後には０．５ｐｐｍまで次第に減少する結果が得られた。実施例４では、同様に、最初に６ｐｐｍであったストロンチウムイオン濃度が２週間後には２ｐｐｍまで減少し、３０日後には１．２ｐｐｍまで段階的に減少した。比較例４〜６においては、ストロンチウムイオンの溶出は認められなかった。
【００９８】
（実施例３、４及び比較例４〜６の細胞培養評価）
実施例３、４のストロンチウムを含むアパタイト微粒子の層を形成した人工靱帯と、比較例４、５のストロンチウムを含まないアパタイト微粒子の層を形成した人工靱帯、及び比較例６としてコート層を形成しない人工靱帯を用いて、各々以下のようにして人工靱帯表面で細胞培養評価を行った。細胞培養評価は各々ｎ＝２で行った。すなわち、１２ウェルの細胞培養容器内のウェル内に各々１枚ずつ２ｃｍの長さに裁断した人工靱帯の切片をセットし、培地として、１５％ウシ胎児血清を含む細胞培養液（ＭＥＭ：minimal essential medium：ナカライテスク社製）に抗生剤抗生剤としてペニシリン１００Ｕ／ｍｌ（ナカライテスク社製）とストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ（ナカライテスク社製）を添加した培養液１．５ｍｌを加えて、ラット骨髄（Ｆ３４４、７週目、オス）から採取した骨芽細胞前駆体細胞の培養を行った。細胞は初期培養後にトリプシン処理により作製した１×１０７個／ｃｍ２の細胞浮遊液を人工靱帯表面に静置し、２時間静置後に人工靱帯表面に付着した細胞とともに新しい１２ウェルの細胞培養容器内に移設した。人工靱帯表面の細胞密度は４．５×１０５個／ｃｍ２で播種されており、培養器内を３７℃、５％ＣＯ２に維持し、この中で上記人工靱帯表面に播種した細胞の培養を行った。細胞播種翌日から、培地として、１５％ウシ胎児血清含有細胞培養液に上記抗生剤を添加した細胞培養液に、デキサメサゾン１０ｎＭ（Sigma社製）、アスコルビン酸８２μｇ／ｍｌ（和光純薬工業社製）及びβ−グリセロリン酸１０ｍＭ（Sigma社製）を添加した培養液を用いて細胞培養を継続した。細胞培養液は４８時間毎に交換し、培地交換直前に培地のサンプリングを行った。
【００９９】
培養液中に分泌されるオステオカルシン量の測定は、細胞を培養した培養液に分泌されたオステオカルシン量を、市販のオステオカルシンＥＬＩＳＡキットＤＳ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を使用して測定した。更に、この細胞培養系においても培地中に含まれるストロンチウムイオン濃度を先と同様にして測定し、該表面コート層を設けた実施例３では４週間の間０．６（４週間後）〜３ｐｐｍ（最初の培地交換直前）の範囲で、実施例４の人工靱帯からは４週間の間１．５（４週間後）〜６ｐｐｍ（最初培地交換直前）の範囲でストロンチウムイオンが徐放されることを確認した。比較例４〜６の人工靱帯からのストロンチウムイオンの放出は観察されなかった。オステオカルシンの分泌量測定の結果、培養開始から１２日目で実施例３の人工靱帯からは平均して８０ｎｇ／ｍｌ、実施例４の人工靱帯からは平均して１６０ｎｇ／ｍｌの分泌量が測定されたが、比較例４の人工靱帯からの分泌量は平均して５ｎｇ／ｍｌ、比較例５では１２ｎｇ／ｍｌであった。比較例６の場合、平均して８５ｎｇ／ｍｌまでオステオカルシンの分泌量が増大したが、その後細胞が剥離することでアポトーシス（アノイキス）を引き起こし、オステオカルシンの分泌量は急激に減少した。
【０１００】
培養中の細胞におけるオステオカルシン及びアルカリフォスファターゼの分泌量に関して、リアルタイムＰＣＲ法を用いて各々のｍＲＮＡ発現の定量を行った。その結果、オステオカルシンに関しては実施例３、４では０．２±０．０５（ｐｇ／ｐｇ）であり、比較例４、５では０．０２±０．０１（ｐｇ／ｐｇ）、比較例６では０．０５±０．０１（ｐｇ／ｐｇ）となり、実施例３、４は比較例４〜６と比べて有意に発現量が多い結果であった。同様にアルカリフォスファターゼについてのＰＣＲの結果は実施例３、４では１．０±０．２（ｐｇ／ｐｇ）であり、比較例４では０．８±０．１（ｐｇ／ｐｇ）、比較例５では０．４±０．０５（ｐｇ／ｐｇ）、比較例６では０．１±０．０５（ｐｇ／ｐｇ）となり、実施例３、４は比較例４〜６と比べて有意に発現量が多い結果であった。
【０１０１】
（実施例３、４及び比較例４〜６のラット皮下への移植試験）
上記で作製した実施例３、４及び比較例４〜６の人工靱帯を用いて、上記の細胞培養を行った後に、細胞が人工靱帯表面に付着した状態でラット皮下への埋設を行い、４週後に取り出して切片サンプルを作製しＨ−Ｅ染色後に人工靱帯の断面を観察したところ、いずれの場合も人工靱帯周辺部での炎症反応の誘発は認められず組織内に安定的に生着しており、更に実施例３、４の人工靱帯繊維の表面に新生骨が生成している様子が顕著に認められた。図１０は、実施例３の人工靱帯をラット皮下移植後４週間目に取り出した組織断面の顕微鏡写真で、矢印で示した箇所に新生骨の形成が確認された。図１１は、実施例４の人工靱帯をラット皮下移植後４週間目に取り出した組織断面の顕微鏡写真で、矢印で示した箇所に新生骨の形成が確認された。一方、比較例４〜６の人工靱帯では、新生骨の形成は認められなかった。図１２は、比較例６の人工靱帯をラット皮下移植後４週間目に取り出した組織断面の顕微鏡写真で、新生骨は観察されなかった。比較例４、５についても同様の結果であった。以上の結果より、実施例３、４で作製した人工靱帯から定常的に好ましい濃度範囲でストロンチウムイオンが長期に亘り放出され、生体内において高い生体親和性と骨伝導性を示し、新生骨の形成も確認された。
【０１０２】
比較例７
比較例７として、実施例１の（Ｃ）でポリリン酸を加えて湿式分散処理を行うことで作製したストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液を用いて、これに実施例１で用いた水分散型ポリウレタンエマルジョンをアパタイト微粒子１０質量部に対して１質量部添加し、更に自己乳化性イソシアネート化合物（デュラネートＷＢ４０−８０、固形分濃度８０質量％、旭化成工業社製）を、その固形分が水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分１０質量部に対して３質量部になるよう加えてコート液を作製した。実施例１と同様にしてアクリル板表面にコート層を形成し、得られたアクリル板を用いて、これを１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてアクリル板が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日後にアクリル板表面からコート層が剥離するのが認められ、試験を中断した。この結果より、水性ウレタン樹脂のアパタイト微粒子に対する割合が低い場合には、コート層が剥離し本発明の目的には使用できなかった。
【０１０３】
実施例５
実施例５として、実施例１の（Ｃ）でポリリン酸を加えて湿式分散処理を行うことで作製したストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液を用いて、これに実施例１で用いた水分散型ポリウレタンエマルジョンを、該エマルジョンの固形分がアパタイト微粒子１０質量部に対して２０質量部となるように添加し、更に自己乳化性イソシアネート化合物（デュラネートＷＢ４０−８０、固形分濃度８０質量％、旭化成工業社製）を、その固形分が水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分１０質量部に対して３質量部になるよう加えてコート液を作製した。実施例１と同様にしてアクリル板表面にコート層を形成し、得られたアクリル板を用いて、これを１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてアクリル板が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。実施例１と同様にしてアクリル板表面のコート層から疑似体液中に徐放されるストロンチウムイオン濃度を定量した結果、該アクリル板から最初から１４日間の間で０．２（１４日後）〜０．８ｐｐｍ（最初最初の液交換直前）の範囲でストロンチウムイオンが放出されることが確認された。更に実施例１と同様にして細胞培養試験を行い、実施例１と同様に良好な結果を得た。
【０１０４】
比較例８
比較例８として、実施例１の（Ｃ）でポリリン酸を加えて湿式分散処理を行うことで作製したストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液を用いて、これに実施例１で用いた水分散型ポリウレタンエマルジョンを、該エマルジョンの固形分がアパタイト微粒子１０質量部に対して２５質量部となるように添加し、更に自己乳化性イソシアネート化合物（デュラネートＷＢ４０−８０、固形分濃度８０質量％、旭化成工業社製）を、その固形分が水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分１０質量部に対して３質量部になるよう加えてコート液を作製した。実施例１と同様にしてアクリル板表面にコート層を形成し、得られたアクリル板を用いて、これを１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてアクリル板が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。実施例１と同様にしてアクリル板表面のコート層から疑似体液中に徐放されるストロンチウムイオン濃度を定量した結果、該アクリル板から最初の液交換直前に０．５ｐｐｍの濃度のストロンチウムイオンが確認されたが、その後２日目以降ストロンチウムイオンの放出は確認されなかった。
【０１０５】
実施例６
実施例６として、実施例１の（Ｃ）で作製した、ポリリン酸を用いて作製したアパタイト微粒子分散液に水分散型ポリウレタンエマルジョンと自己乳化性イソシアネート化合物を添加したコート液（質量比でアパタイト微粒子：水分散型ポリウレタンエマルジョンの固形分が１０：２）を用いて、これに更にポリリン酸としてピロリン酸ナトリウム十水和物（和光純薬工業社製）をアパタイト微粒子１０質量部に対して３質量部添加（コート液中のポリリン酸の合計量が、アパタイト微粒子１０質量部に対して５質量部）してコート液を作製した。実施例１と同様にしてアクリル板上にコート後、１２ウェルの細胞培養容器内にセットし、疑似体液２ｍｌを加えてアクリル板が完全に疑似体液中に浸漬した状態で３７℃に加熱した加湿器内に静置した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量したところ、試験開始から４日後までは６ｐｐｍ前後の濃度でストロンチウムイオンが放出されるのを確認したが、６日後０．５ｐｐｍまで低下し、以後０．１〜０．２ｐｐｍの濃度で３０日の間ストロンチウムイオンが放出されるのを観察した。更に実施例１と同様にして細胞培養試験を行い、実施例１と同様に良好な結果を得た。
【０１０６】
比較例９
塩化ストロンチウム六水和物（和光純薬工業社製）２７ｇ（０．１モル）と塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）５９ｇ（０．４モル）を１０００ｍｌの三角フラスコ内に移し、イオン交換水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍｌのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム（和光純薬工業社製）４０ｇ（０．３モル）及び炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１６ｇ（０．１５モル）を秤取り、イオン交換水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウムと塩化カルシウムの両方を溶解した水溶液を三角フラスコ内に移し、０℃に調整した氷浴上で攪拌しながら滴下漏斗を用いて、これにリン酸水素二アンモニウム及び炭酸ナトリウムを溶解した水溶液を３時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。滴下終了後更に１時間０℃にて攪拌を行った。その後氷浴上から三角フラスコを移し、室温に戻した後、グラスフィルターを用いて生成した白色沈殿を吸引濾過した。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返しイオン交換水で洗浄を行った後、４０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。生成物（白色の粉体）の収量は、理論収量に対してほぼ５０質量％の収量であった。
【０１０７】
生成物を、広角Ｘ線回折装置を用いて解析を行ったところ図１３に示す回折パターンが得られた。図１３は、比較例９で得られたストロンチウムを含むアパタイトの広角Ｘ線回折パターンである。これより、生成物はブロードな回折パターンを示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが不明瞭であったことから、非晶質のストロンチウムを含むアパタイトであることが確認された。一方、蛍光Ｘ線測定による生成物の元素分析を行ったところ、ストロンチウムとカルシウムの両方の元素がほぼ仕込み通りの１：４のモル比率で含まれていることが判明した。この場合、ＥＤＳによる測定により求められたアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は１６．０質量％であり、金属イオンとしてストロンチウムとカルシウムが１：４のモル比率で含まれているとした場合の理論値である１５．９質量％と良く一致していた。
【０１０８】
上記で得られたストロンチウムを含むアパタイトを用いて実施例１の（Ｃ）と同様にしてポリリン酸を添加して湿式分散処理を行うことで、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液を作製した。得られた分散液中に含まれるストロンチウムを含むアパタイト微粒子の体積平均粒子径は５０ｎｍであり、分散液からの光散乱強度が弱く、透明に近い分散液が得られた。実施例１と同様にして水分散型ポリウレタンエマルジョン及び自己乳化性イソシアネート化合物を添加してコート液を作製し、アクリル板上に実施例１と同様の厚みでコート層を形成した試料を作製した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量したが、ストロンチウムイオン濃度は最初の測定においてのみ２．０ｐｐｍと測定されたが、その後検出限界濃度以下で検出されず、本発明の効果は認められなかった。試料を引き上げて走査型電子顕微鏡を用いて表面を観察したところ、最初表面に存在していたアパタイト微粒子は消失していた。この比較例９の結果から、アパタイトの結晶性が無くなることで培養液中への溶解性が増加し、ストロンチウムイオンを継続して放出する機能が喪失することが判明した。
【０１０９】
比較例１０
塩化ストロンチウム六水和物（和光純薬工業社製）１４ｇ（０．０５モル）と塩化カルシウム二水和物（和光純薬工業社製）６７ｇ（０．４５モル）を１０００ｍｌの三角フラスコ内に移し、イオン交換水３５０ｇを加えて溶解した。これとは別に、５００ｍｌのガラスビーカー内にリン酸水素二アンモニウム（和光純薬工業社製）４０ｇ（０．３モル）及び炭酸ナトリウム（和光純薬工業社製）１６ｇ（０．１５モル）を秤取り、イオン交換水３００ｇを加えて溶解した。上記で作製した塩化ストロンチウムと塩化カルシウムの両方を溶解した水溶液を三角フラスコ内に移し、５０℃に調整した水浴上で攪拌しながら滴下漏斗を用いて、これにリン酸水素二アンモニウム及び炭酸ナトリウムを溶解した水溶液を３時間に亘って徐々に滴下した。反応時の反応系のｐＨは６．５であった。滴下終了後更に４時間５０℃にて攪拌を行った。その後氷浴上から三角フラスコを移し、室温に戻した後、グラスフィルターを用いて生成した白色沈殿を吸引濾過した。フィルター上の白色沈殿は更に繰り返しイオン交換水で洗浄を行った後、４０℃に調節した乾燥器内で１昼夜乾燥を行い、白色の粉体を得た。生成物（白色の粉体）の収量は、理論収量に対してほぼ９０質量％の収量であった。
【０１１０】
生成物を、広角Ｘ線回折装置を用いて解析を行ったところアパタイトに特徴的な回折パターンを示し、２５度付近の（００２）面からの回折ピークが明瞭に観察されたことから結晶性を有していることが確認された。蛍光Ｘ線測定による生成物の解析を行ったところ、ストロンチウムとカルシウムの両方の元素がほぼ仕込み通りの１：９のモル比率で含まれていることが判明した。この場合、ＥＤＳによる測定により求められたアパタイト中に含まれる全元素の総質量に対するストロンチウムの比率は８．３質量％で、１０質量％より低い値であり、金属イオンとしてストロンチウムとカルシウムが１：９のモル比率で含まれているとした場合の理論値である８．３３質量％と良く一致していた。
【０１１１】
上記で得られたストロンチウムを含むアパタイトを用いて実施例１の（Ｃ）と同様にしてポリリン酸を添加して湿式分散処理を行うことで、ストロンチウムを含むアパタイト微粒子の分散液を作製した。得られた分散液中に含まれるストロンチウムを含むアパタイト微粒子の体積平均粒子径は７０ｎｍであった。実施例１と同様にして水分散型ポリウレタンエマルジョン及び自己乳化性イソシアネート化合物を添加してコート液を作製し、アクリル板上に実施例１と同様の厚みでコート層を形成した試料を作製した。２日毎に疑似体液を交換し、交換直前の疑似体液中に溶出したストロンチウムイオン濃度を、蛍光Ｘ線測定装置を用いて定量したが、ストロンチウムイオンは検出限界濃度以下で検出されず、本発明の効果は認められなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明により与えられるストロンチウムを含み結晶性を有するアパタイト微粒子と水分散型ポリウレタンエマルジョンを含むコート層は良好な生体親和性と生体活性を示し、特に骨系細胞の培養に際して、細胞の増殖と活性を高める効果を有することから、本発明に記載される例以外にも各種生体インプラントの表面に該コート層を設けることで、表面において骨系細胞の増殖と活性が増大することが期待される。具体的には歯科材料、整形外科材料、形成外科材料への応用が考えられる。また、ストロンチウムを含むアパタイトへの各種タンパク質やＤＮＡ、その他各種有機物質の吸着を利用することで、本発明のコート層を吸着材料や分離のための材料として利用することも可能である。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図１３】
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【図２】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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