(57)【要約】【課題】治療に有効な培養軟骨を作製する際の患者負担を軽減する。【解決手段】本発明の培養軟骨の製法は、軟骨欠損部に移植される培養軟骨の製法であって、（ａ）関節遊離体から骨等の不要組織を除去する工程と、（ｂ）前記関節遊離体から軟骨細胞を採取する工程と、（ｃ）前記関節遊離体から採取した軟骨細胞を培養することにより培養軟骨を作製する工程と、を含むものである。この製法によれば、治療に有効な培養軟骨を作製するにあたり、本来除去される関節遊離体を培養軟骨の細胞源として利用するため、関節遊離体とは別に細胞源として正常細胞を患者から切開等により採取する場合に比べて、患者の負担が軽減される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨欠損部に移植される培養軟骨であって、関節遊離体から採取した軟骨細胞を培養することにより作製された培養軟骨。
【請求項２】
前記関節遊離体が、肘の関節遊離体である請求項１に記載の培養軟骨。
【請求項３】
軟骨欠損部に移植される培養軟骨の製法であって、
（ａ）関節遊離体から骨等の不要組織を除去する工程と、
（ｂ）前記関節遊離体から軟骨細胞を採取する工程と、
（ｃ）前記関節遊離体から採取した軟骨細胞を培養することにより培養軟骨を作製する工程と、
を含む培養軟骨の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者の軟骨欠損部に移植され、関節軟骨の再生医療に利用される培養軟骨及びその製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト細胞を培養した培養組織を病変部に移植する再生医療が知られている。このような再生医療の対象としては、皮膚、軟骨、角膜、心筋等が知られており、多能性幹細胞から分化させて作製する方法と正常部位から得られる体細胞を培養して作製する方法が知られている。
【０００３】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の多能性幹細胞は、様々な細胞種に分化できる可能性を持つため、多くの機関で研究されているが、細胞の安定性や安全性、工程の複雑性など、克服すべき課題が多く存在している。
【０００４】
一方、患者組織を採取し、組織から体細胞を分離、培養して培養組織を作製する方法は、広く確立されており、安定的に製造することができる。このように作製する培養組織は、正常な体細胞を培養する必要があるため、細胞源となる正常組織が重要となる。例えば、特許文献１には、細胞源として、骨盤（腸骨）や手足の長管骨（大腿骨、脛骨）の骨髄及び／又は骨膜、滑膜、脂肪、歯槽骨等の骨髄、口蓋又は歯槽骨等の骨膜等から採取した細胞が挙げられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−２０８２１１（段落００２４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、正常組織を採取することは患者の負担が大きく、異常のない正常部位にメスを入れることについての倫理的な配慮等も必要である。また、必ずしも所望の培養組織が作製できるとは限らず、このような場合には、再度正常組織を採取する必要性があり、肉体的にも精神的にも更なる患者負担が掛かることになる。このような状況も、多能性幹細胞から分化させて作製する方法が、多くの機関で研究されている要因の一つである。
【０００７】
ところで、膝や肘等の関節に痛みを引き起こす可能性のある障害の一つに関節遊離体（関節ねずみ）が知られている。関節遊離体が発生する主な原因としては、スポーツや事故による骨折、骨の変形・異常を伴う病気・疾患（変形性膝関節症、半月板損傷、離断性骨軟骨炎、神経病性関節症（シャルコー関節）、結核性関節炎、滑膜骨軟骨腫症等）がある。関節遊離体が関節の隙間にはさまると激痛や膝が動かなくなるロッキング現象を引き起こすので、関節遊離体を取り除く摘出手術が一般的な治療として行われている。なお、欠損部に対して治療が必要な症例には、モザイクプラスティー法、マイクロフラクチャー法、培養軟骨移植術などが行われている。このような治療において、培養軟骨移植術を選択した場合、関節遊離体を除去するとともに、培養軟骨の細胞源として正常組織を採取する必要があり、患者に負担が掛かる。一方、関節遊離体は病変部として取り扱われるため、培養軟骨の製造に必要な正常細胞の細胞源として認識されない。
【０００８】
本発明は、治療に有効な培養軟骨を作製する際の患者負担を軽減することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の培養軟骨は、軟骨欠損部に移植される培養軟骨であって、関節遊離体から採取した軟骨細胞を培養することにより作製されたものである。ここで、関節遊離体は、肘の関節遊離体であることが好ましい。
【００１０】
本発明の培養軟骨の製法は、軟骨欠損部に移植される培養軟骨の製法であって、
（ａ）関節遊離体から骨等の不要組織を除去する工程と、
（ｂ）前記関節遊離体から軟骨細胞を採取する工程と、
（ｃ）前記関節遊離体から採取した軟骨細胞を培養することにより培養軟骨を作製する工程と、
を含むものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、治療に有効な培養軟骨を作製するにあたり、本来除去される関節遊離体を培養軟骨の細胞源として利用するため、関節遊離体とは別に細胞源として正常細胞を患者から切開等により採取する場合に比べて、患者の負担が軽減される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＥ染色後の遊離体の写真。
【図２】アルシアンブルー染色後の遊離体の写真。
【図３】サフラニンＯ染色後の遊離体の写真。
【図４】アリザリンレッド染色後の遊離体の写真。
【図５】オイルレッドＯ染色後の遊離体の写真。
【図６】それぞれの培養軟骨に種々の染色を行ったときの陽性率を表すグラフ。
【図７】遊離体及び母床組織から作製された培養軟骨のＨＥ染色像。
【図８】遊離体及び母床組織から作製された培養軟骨のアルシアンブルー染色像。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の培養軟骨の製法の手順の一例を以下に示す。
（１）肘遊離体から骨等の不要部位を除去する。
（２）軟骨部位をコラゲナーゼで処理し、軟骨細胞を回収する。
（３）軟骨細胞をコラーゲン溶液と混合し、容器に播種する。
（４）３７℃で載置し、ゲル化させる。
（５）培地を供給し、培養する。
【００１４】
このようにして得られた培養軟骨は、膝の正常部位から採取した軟骨細胞を細胞源として上述した手順の（３）〜（５）を行うことにより得られた培養軟骨と同等であった。一方、関節遊離体が存在していた部位（母床）を細胞源として上述した手順の（３）〜（５）を行うことにより得られた培養軟骨は、膝の正常部位から採取した軟骨細胞を細胞源として上述した手順の（３）〜（５）を行うことにより得られた培養軟骨よりも移植に適さないものが一部で作製された。
【実施例】
【００１５】
離断性骨軟骨炎（ＯＣＤ）の手術時に患者から除去した肘の遊離体について４症例分を入手した。また、遊離体がもともと存在していた場所（母床）と連結した組織（以下「母床組織」という。）について３症例分を入手した。なお、既に移植適正が確認されている膝の正常軟骨組織から得られた軟骨細胞を同様に取扱い比較例とした。
【００１６】
入手した遊離体の評価として、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）（図１参照）、軟骨組織を示すアルシアンブルー染色（図２参照）及びサフラニンＯ染色（図３参照）、骨組織を示すアリザリンレッド染色（図４参照）、脂肪組織を示すオイルレッドＯ染色（図５参照）を行ったところ、繊維性組織に囲まれ、内部では骨が壊死しているような像が確認された。
【００１７】
入手した遊離体及び母床組織は、血液、繊維性組織、下骨等を除去し、消毒した。消毒した遊離体及び母床組織をトリプシン溶液及びコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い、軟骨細胞を分離・回収した。遊離体及び母床組織の回収状況を表１に示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
一般的に、正常組織から回収できる細胞数は１．０×１０6個／ｇ以上といわれており、遊離体及び母床組織から回収された軟骨細胞数は、正常組織と比べても十分な量であることがわかる。したがって、遊離体及び母床組織は培養軟骨の細胞源として利用できることがわかる。
【００２０】
得られた軟骨細胞を先浄した後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）／ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ変法イーグル最小必須培地）を加え、細胞懸濁液を７．５×１０6個／ｍＬとなるように調製した。この細胞懸濁液を３％アテロコラーゲンインプラント（高研社製）に１：４の割合になるように混合（包埋）した。この工程によって細胞密度は希釈されるので、細細胞密度は１.５×１０5個／ｃｍ3となる。
【００２１】
培養容器に混合溶液を直径１２ｃｍの円盤状になるように播種（載置）した。播種した混合溶液は、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で０．５〜１時間静置してゲル化させ、ゲル化後に培地を加え、培養を開始した。培地には５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物：Ｃ6Ｈ6Ｏ9Ｐ・３／２Ｍｇ・ｎＨ2Ｏ；日光ケミカルズ株式会社製）及び１００μｇ／ｍＬヒアルロン酸を含むように調整した１０ｖ／ｖ％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）−ＤＭＥＭ培地を使用し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で、３週間培養を行った。３週間の培養後、直径が約１２ｍｍ、厚みが約１ｍｍの培養軟骨が得られた。
【００２２】
これらの培養軟骨を評価するために、生細胞密度、細胞増殖率、軟骨基質濃度、軟骨細胞含有率、アグリカン免疫染色、II型コラーゲン染色、ＣＤ９０免疫染色、アスカリフォスファターゼ染色（ＡＬＰ染色）、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）、アルシアンブルー染色を常法で行った。
【００２３】
生細胞密度、細胞増殖率、軟骨基質濃度、軟骨細胞含有率について、まとめたものを表２に示す。
【００２４】
【表２】
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【００２５】
図６は、それぞれの培養軟骨に対して、軟骨細胞を示すアグリカン免疫染色及びII型コラーゲン染色、線維芽細胞を示すＣＤ９０免疫染色、骨芽細胞を示すアスカリフォスファターゼ染色（ＡＬＰ染色）を行った結果の陽性率を示す。
【００２６】
遊離体から作製した培養軟骨は、バラツキはあるものの膝の正常組織から作製した培養軟骨と比較しても同程度の状態が認められた。一方、母床組織から作製した培養軟骨では、概ね正常組織から作製した培養軟骨と同程度の特性を示しつつも、軟骨細胞含有率が低く、移植に適さないものも観察された。
【００２７】
図７は遊離体及び母床組織から作製された培養軟骨のヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）像、図８はアルシアンブルー染色像を示す。
【００２８】
遊離体から作製された培養軟骨は、正常軟骨で作製した培養軟骨と同様の像が観察されており、移植に適したものであることが分かる。また、母床組織から作製された培養軟骨においても、正常軟骨で作製した培養軟骨と同様の像が観察された。
【００２９】
以上から母床組織は採取時には変性が確認され、母床組織から作製される培養軟骨では軟骨細胞含有率が低く、移植に適さないものが存在する場合が確認されたが、遊離体から作製される培養軟骨は、正常組織から作製される培養軟骨と同等の移植適正を有していることが予測され、母床組織に対して高確率で移植可能な培養軟骨が作製できる。これは、病変部として除去される遊離体が正常組織と同様に培養軟骨作製の細胞源として有用であることを示し、容易に推定できるものではない。殊に、離断性骨軟骨炎は、骨の先端にある軟骨部分が壊死して骨の一部といっしょにはがれることで起こるスポーツ障害であり、関節遊離体が正常組織と同様に培養軟骨の細胞源として利用できることは類推できない。
【００３０】
なお、本発明は上述した実施形態に何ら限定されることはなく、本発明の技術的範囲に属する限り種々の態様で実施し得ることはいうまでもない。
【００３１】
上述した実施形態では、軟骨細胞をコラーゲンに包埋して培養して培養軟骨を作製したが、培養フラスコに軟骨細胞を播種し、これを培養した後、細胞懸濁液の状態で移植する形態の培養軟骨としてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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