(57)【要約】      （修正有）【課題】糖鎖遊離処理を迅速に行い得る方法の提供。【解決手段】糖タンパク質を含む試料に、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤の存在下で糖鎖分解酵素を作用させ、糖タンパク質をタンパク質と糖鎖とに分解して糖鎖を遊離させる遊離工程を含む、糖タンパク質からの糖鎖遊離方法。このように酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤を用いることによって、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が可能となり、したがって、糖鎖遊離処理にかかる時間を大幅に短縮する方法。前記酸由来型陰イオン界面活剤が、活種隠イオン性界面活性剤を使用できるが、好ましくは、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤であり、更に好ましくは、Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤であり、特に好ましいのは、Ｎ−アシルアミノ酸塩又はＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸塩である、糖鎖を調製する方法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖タンパク質を含む試料に、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤の存在下で糖鎖分解物質を作用させ、前記糖タンパク質をタンパク質と糖鎖とに分解することで前記糖鎖を遊離させる遊離工程を含む、糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項２】
前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤、およびリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群から選ばれる、請求項１に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項３】
前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤である、請求項１に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項４】
前記カルボン酸型陰イオン性界面活性剤が、Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤である、請求項２または３に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項５】
前記Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤が、Ｎ−アシルアミノ酸塩およびＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸塩からなる群から選ばれる、請求項４に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項６】
前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、前記遊離工程の反応液中、０．０１重量％以上３０重量％以下の濃度で用いられる、請求項１から５のいずれか１項に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項７】
前記糖鎖分解物質が、糖鎖分解酵素および塩基性化合物の少なくともいずれかである、請求項１から６いずれか１項に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項８】
前記糖タンパク質が、抗体、ホルモン、酵素、およびこれらを含む複合体からなる群から選ばれる、請求項１から７のいずれか１項に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項９】
前記糖タンパク質が抗体である、請求項８に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項１０】
前記抗体が抗体医薬品候補または抗体医薬品である、請求項９に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法。
【請求項１１】
酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤、糖鎖分解物質、および、キット使用のためのプロトコル情報を含む、糖タンパク質から糖鎖を調製するキット。
【請求項１２】
前記酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤、およびリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の糖タンパク質から糖鎖を調製するキット。
【請求項１３】
糖タンパク質を含む試料を収容すべき反応容器を保持するための容器保持部と、
前記容器保持部に保持されるべき同一の前記反応容器内に液体類を導入する液体導入部と、を含み、
前記液体導入部が、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤を導入する脱糖鎖促進剤導入部と糖鎖分解物質を導入する糖鎖分解物質導入部とを含む、糖タンパク質から糖鎖を調製する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質からの糖鎖遊離方法に関する。特に、迅速な処理が可能な糖タンパク質からの糖鎖遊離方法に関する。具体的には、本発明は、糖タンパク質から遊離を調製する方法、キットおよび装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖タンパク質から糖鎖を遊離するために、糖鎖分解酵素が用いられることが一般的である。しかしながら糖タンパク質におけるタンパク質部分の複雑な三次構造のため、糖鎖分解酵素だけで糖鎖を遊離することは困難である。
【０００３】
そこで、糖鎖の遊離を助けるために、たとえば特開２００６−２６２８２９号公報（特許文献１）に記載のようにタンパク質部分のトリプシン消化がよく行われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２６２８２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、タンパク質部分をトリプシン消化する処理は時間がかかるため、糖鎖遊離処理の迅速性に欠ける。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、糖鎖遊離処理を迅速に行うことができる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記の目的を達成するため、本発明は以下の発明を含む。
【０００８】
（１）
本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法は、糖タンパク質を含む試料に、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤の存在下で糖鎖分解物質を作用させ、糖タンパク質をタンパク質と糖鎖とに分解することで糖鎖を遊離させる遊離工程を含む。
【０００９】
このように酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤を用いることによって、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が可能となる。したがって、糖鎖遊離処理にかかる時間を大幅に短縮することができる。
【００１０】
なお、本発明において、糖タンパク質の糖鎖分解酵素によって生じるタンパク質は、糖鎖遊離処理対象の糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が切断されていないものである。
【００１１】
（２）
（１）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、酸由来型陰イオン性界面活性剤は、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤、およびリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群から選ばれてよい。
【００１２】
この場合、糖タンパク質から糖鎖がより遊離しやすい。
【００１３】
（３）
（１）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、酸由来型陰イオン性界面活性剤は、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤であってよい。
【００１４】
この場合、糖鎖分解酵素の変性を抑制しやすい。
【００１５】
（４）
（２）または（３）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤が、Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤であってよい。
【００１６】
この場合、糖鎖分解酵素の変性をより抑制しやすい。
【００１７】
（５）
（４）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤は、Ｎ−アシルアミノ酸塩およびＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸塩からなる群から選ばれてよい。
【００１８】
この場合、糖鎖分解酵素の変性をより抑制しやすい。
【００１９】
（６）
（１）から（５）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、酸由来型陰イオン性界面活性剤は、遊離工程の反応液中、０．０１重量％以上３０重量％以下の濃度で用いられてよい。
【００２０】
この場合、糖鎖遊離処理をより迅速に行うことができる。
【００２１】
（７）
（１）から（６）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、糖鎖分解物質は、糖鎖分解酵素および塩基性化合物の少なくともいずれかであってよい。
【００２２】
このように、本発明の糖鎖遊離方法は、糖鎖分解酵素および塩基性化合物といった糖鎖分解物質として知られている物質を用いる場合に広く汎用することができる。
【００２３】
（８）
（１）から（７）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、糖タンパク質は、抗体、ホルモン、酵素、およびこれらを含む複合体からなる群から選ばれてよい。
【００２４】
このように、本発明の糖鎖遊離方法は、様々な糖タンパク質に有用である。これらの糖タンパク質は細胞培養工学的に調製される生理活性物質であることから、得られる糖鎖部分は不均一な状態であり、糖鎖分析の時間を短縮することの意義が特に大きい。
【００２５】
（９）
（８）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、糖タンパク質は、抗体であってよい。
この場合、抗体の活性等に影響を及ぼす糖鎖を迅速に遊離することができる。
【００２６】
（１０）
（９）の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において、抗体は抗体医薬品候補または抗体医薬品であってよい。
【００２７】
抗体医薬品候補から糖鎖遊離を行う場合は、抗体医薬品の開発を迅速化することができ、抗体医薬品から糖鎖遊離を行う場合は、抗体医薬品の品質管理を迅速化することができる。
【００２８】
（１１）
本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製するキットは、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤、糖鎖分解物質、および、キット使用のためのプロトコル情報を含む。
【００２９】
このように酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤を用いることによって、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が可能となる。したがって、糖鎖遊離処理にかかる時間を大幅に短縮することができる。
【００３０】
（１２）
上記（１１）の糖タンパク質から糖鎖を調製するキットは、酸由来型陰イオン性界面活性剤が、カルボン酸型陰イオン性界面活性剤、スルホン酸型陰イオン性界面活性剤、硫酸エステル型陰イオン性界面活性剤、およびリン酸エステル型陰イオン性界面活性剤からなる群から選ばれるものであってよい。
【００３１】
この場合、糖タンパク質から糖鎖がより遊離しやすい。
【００３２】
（１３）
本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製する装置は、容器保持部と、液体導入部とを含む。容器保持部は、糖タンパク質を含む試料を収容すべき反応容器を保持するためのものである。液体導入部は、容器保持部に保持されるべき同一の反応容器内に液体類を導入する。液体導入部は、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤を導入する脱糖鎖促進剤導入部と糖鎖分解物質を導入する糖鎖分解物質導入部とを含む。
【００３３】
このような装置を用いることにより、糖タンパク質を含む試料に対して酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤を加えることで、タンパク質部分の分解処理を行うことなく、糖タンパク質からの糖鎖の遊離が可能となる。したがって、糖鎖遊離処理にかかる時間を大幅に短縮することができる。
【００３４】
なお、糖鎖遊離酵素導入部と糖鎖分解物質導入部とは、別個独立した構成部材として構成されてよい。この場合、糖鎖遊離酵素と糖鎖分解物質とは、この順番で逐次的に導入されてもよいし、同じタイミングで導入されてもよい。あるいは、糖鎖遊離酵素導入部と糖鎖分解物質導入部とは、同一の構成部材として構成されてもよい。この場合、糖鎖遊離酵素と糖鎖分解物質とは混合された状態で導入されてもよいし、この順番でそれぞれ逐次的に導入されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ヒトＩｇＧをペプチド消化してＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトルである（比較例１）。
【図２】ヒトＩｇＧを、ペプチド消化せずかつ脱糖鎖促進剤を用いずにＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトルである（比較例２）。
【図３】ヒトＩｇＧを、ペプチド消化せずかつＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（終濃度０．２重量％）を含む脱糖鎖促進剤を用いてＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトルである（実施例１）。
【図４】ヒトＩｇＧを、ペプチド消化せずかつＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（終濃度１．５重量％または１．０重量％）またはＳＤＳ（終濃度１．０重量％）を含む脱糖鎖促進剤を用いてＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトル（ａ），（ｂ），（ｃ）である（それぞれ、実施例２，３，４）。
【図５】ヒトＩｇＧを、ペプチド消化せずかつ各種有機溶剤を含む緩衝液を用いてＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトルである（比較例３）。
【図６】ヒトＩｇＧを、ペプチド消化せずかつ各界面活性剤を含む緩衝液を用いてＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトルである（比較例４）。
【図７】ヒトＩｇＧを、ペプチド消化せずかつＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（終濃度０．２重量％から０．６重量％）を含む脱糖鎖促進剤を用いてＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトルである（実施例５）。
【図８】ヒトＩｇＧを、ペプチド消化せずかつＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（終濃度０．２重量％から０．３重量％）を含む脱糖鎖促進剤を用いてＰＮＧａｓｅＦで処理した場合に得られたＨＰＬＣスペクトルのピーク面積の比較である（実施例６）。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
［１．糖タンパク質から糖鎖を調製する方法］
［１−１．遊離工程］
本発明のタンパク質から糖鎖を調製する方法は、脱糖鎖促進剤の存在下で糖タンパク質に糖鎖分解物質を作用させて糖鎖を遊離する遊離工程を含む。遊離工程には、タンパク質の断片化工程を含まない。遊離工程から除外されるタンパク質の断片化工程には、化学的断片化および酵素学的断片化の両方が含まれる。
【００３７】
［１−２．糖タンパク質を含む試料］
［１−２−１．糖タンパク質］
糖タンパク質は、少なくとも糖鎖を複合成分として含むタンパク質であればよい。
糖タンパク質のタンパク質部分は、変性前の状態において、糖鎖部分をその内部に取り込むようにフォールディングしていてよい。このようなタンパク質部分の分子量は、たとえば１ｋＤａ以上、さらには１０ｋＤａ以上であってよい。タンパク質部分の分子量範囲内の上限は特に限定されないが、たとえば１０００ｋＤａであってよい。
【００３８】
糖鎖部分は、Ｎ−結合型であってもよく、Ｏ−結合型であってもよい。また、糖鎖部分は、天然の構造を有していてもよいし、人工的に改変されていてもよい。糖鎖部分は、中性糖鎖であってもよいし、酸性糖鎖であってもよい。さらに、糖タンパク質における糖鎖結合部位も、天然物と同じ部位であってもよいし、天然物では糖鎖が結合していない部位であってもよい。
【００３９】
具体的には、糖タンパク質は、抗体、ホルモン、酵素、およびこれらを含む複合体からなる群から選ばれる生理活性物質であってよい。複合体としては、抗原と抗体との複合体、ホルモンと受容体との複合体、および、酵素と基質との複合体が挙げられる。
特に糖タンパク質が抗体である場合は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を問わない。さらにこの場合、糖タンパク質は、抗体医薬品候補または抗体医薬品であってよい。抗体医薬品候補は、抗体医薬品の開発途上にある物質であり、抗体医薬品としての活性および安全性等の評価に基づく篩分けに供される物質である。
【００４０】
［１−２−２．糖タンパク質を含む試料の調製および組成］
糖タンパク質を含む試料は、タンパク質部分が均一かつ糖鎖部分が非均一である、糖タンパク質のバリエーションの混合物であってよい。具体的には、培養化学工学的な糖タンパク質の調製物であってよい。この糖タンパク質の調製物は、培養液から糖タンパク質の精製が行われたものであってよい。精製の手法としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー等が挙げられる。
【００４１】
糖タンパク質を含む試料は、水または緩衝液中に糖タンパク質を含む状態で用意されてよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム・炭酸水素アンモニウム・塩化アンモニウム・クエン酸水素二アンモニウム・カルバミン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤、リン酸塩などが挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５以上１０以下であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であることは、糖鎖分解酵素の活性を保つ点で好ましい。糖タンパク質を含む試料において、水または緩衝液中に含まれる糖タンパク質以外の成分としては、金属塩などの塩類、グリセロールなどのタンパク質の安定化剤などが挙げられる。
【００４２】
糖タンパク質を含む試料における糖タンパク質の濃度としては特に限定されないが、たとえば、０．１μｇ／ｍｌ以上５０ｍｇ／ｍｌ以下であってよい。上記下限値以上であることは、検出の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
【００４３】
［１−３．脱糖鎖促進剤］
脱糖鎖促進剤には、酸由来型陰イオン性界面活性剤が含まれる。酸由来型陰イオン性界面活性剤は、有機酸から誘導される陰イオン性界面活性剤である。たとえば、カルボン酸型界面活性剤、スルホン酸型界面活性剤、硫酸エステル型界面活性剤、およびリン酸エステル型界面活性剤が挙げられる。
【００４４】
［１−３−１．酸由来型陰イオン性界面活性剤−カルボン酸型界面活性剤］
カルボン酸型界面活性剤としては、Ｒ１−ＣＯＯＸ（Ｒ１は有機基、Ｘは水素原子または陽イオンを示す。）で示されるカルボン酸およびカルボン酸塩、ならびに、Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸ（Ｒ１は有機基、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−はアミノ酸残基、Ｘは水素原子または陽イオンを示す。）で示されるアミノ酸およびその塩（Ｎ−アシルアミノ酸系界面活性剤）が挙げられる。
【００４５】
陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオンなどが挙げられる。なお、以下の全ての酸由来型陰イオン性界面活性剤の例示において、「塩」は少なくともナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、アンモニウム塩を例示するものとする。
【００４６】
［１−３−１−１．カルボン酸およびカルボン酸塩］
Ｒ１−ＣＯＯＸで示されるカルボン酸塩において、有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基が挙げられる。
【００４７】
高級アルキル基および高級不飽和炭化水素基の炭素数は６以上１８以下であってよい。このような高級アルキル基または高級不飽和炭化水素基を有するカルボン酸型界面活性剤の具体例としては、オクタン酸塩、デカン酸塩、ラウリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、オレイン酸塩、リノール酸塩などが挙げられる。また、上記の高級アルキル基および高級不飽和炭化水素基は置換されていてもよく、置換基は炭素数がたとえば１以上３０以下のアルキル基またはアルコキシカルボニル基であってよい。
【００４８】
オキシアルキレン基が介在した炭化水素基においては、１以上のオキシアルキレン基が主鎖に含まれていてよい。オキシアルキレン基は、オキシエチレン基、オキシn−プロピレン基、オキシイソプロピレン基などが挙げられる。オキシアルキレン基が介在している炭化水素基は、たとえば、Ｒ４−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｒ５−で示される基であってよい。
【００４９】
Ｒ４は、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、もしくは、置換または無置換のアリール基であってよい。高級アルキル基および高級不飽和炭化水素基の炭素数は６以上１８以下であってよい。アリール基としては、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖または分岐のアルキル基であってよく、当該直鎖または分岐のアルキル基の炭素数は１以上３０以下であってよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてよい。ｎは、１以上１０以下であってよい。Ｒ５は、シグマ結合、または、エチレン基、メチレン基、n−プロピレン基などのアルキレン基であってよい。
このようなカルボン酸塩の具体例としては、ラウレスカルボン酸塩（たとえば、ラウレス−４カルボン酸塩、ラウレス−６−カルボン酸塩）トリデセスカルボン酸塩（たとえば、トリデセス−４カルボン酸塩、トリデセス−６カルボン酸塩）などが挙げられる。
【００５０】
フッ素置換された高級アルキル基においては、１以上の水素原子がフッ素原子で置換されている。フッ素置換された高級アルキル基は、全ての水素原子がフッ素で置換されたペルフルオロアルキル基であってよい。また炭素数は、６以上１８以下であってよい。このようなペルフルオロアルキルカルボン酸およびペルフルオロアルキルカルボン酸塩の具体例としては、ペルフルオロオクタン酸、ペルフルオロノナン酸、ペルフルオロオクタン酸塩、ペルフルオロノナン酸塩などが挙げられる。
【００５１】
［１−３−１−２．アミノ酸またはアミノ酸塩］
Ｒ１ＣＯＮ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯＸで示されるアミノ酸またはアミノ酸塩において、有機基Ｒ１および陽イオンＸは、上記のカルボン酸またはカルボン酸塩における有機基Ｒ１および陽イオンＸと同様である。
【００５２】
Ｒ２は、水素原子またはアルキル基（たとえば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基など）である。Ｒ３は、置換または無置換のエチレン基、メチレン基、n−プロピレン基などであってよいし、Ｎ末端側の窒素原子と共に環を形成していてもよい。したがって、−Ｎ（Ｒ２）−Ｒ３−ＣＯＯ−で示されるアミノ酸残基は、α−アミノ酸残基、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基などであってよく、天然アミノ酸由来の残基でもよいし、非天然アミノ酸由来の残基であってもよい。例えば、サルコシン残基、グルタミン酸残基、グリシン残基、アスパラギン酸残基、プロリン残基、β−アラニン残基などのアミノ酸由来の残基が挙げられる。
【００５３】
Ｒ２が水素原子である場合の当該アミノ酸またはアミノ酸塩（つまりＮ−アシルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ−ラウロイルアスパラギン酸塩、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸、Ｎ−ラウロイルグルタミン酸塩、Ｎ−ミリストイルグルタミン酸塩、Ｎ−ココイルアラニン塩、Ｎ−ココイルグリシン塩、Ｎ−ココイルグルタミン酸塩、Ｎ−パルミトイルグルタミン酸塩、Ｎ−パルミトイルプロリン、Ｎ−パルミトイルプロリン塩、Ｎ−ウンデシレノイルグリシン、Ｎ−ウンデシレノイルグリシン塩、Ｎ−ステアロイルグルタミン塩等が挙げられる。
【００５４】
Ｒ２がアルキル基である場合の当該アミノ酸またはアミノ酸塩（つまりＮ−アシル−Ｎ−アルキルアミノ酸系界面活性剤）の具体例としては、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−ココイル−Ｎ−メチルアラニン塩、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−ミリストイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−ミリストイルサルコシン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルアラニン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−イソプロピルグリシン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチル−β−アラニン、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−エチル−β−アラニン塩、Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ラウロイルサルコシン塩、Ｎ−ココイルサルコシン、Ｎ−ココイルサルコシン塩、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチル−β−アラニン塩、Ｎ−オレオイルサルコシン、Ｎ−オレオイルサルコシン塩、Ｎ−リノレイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−パルミトイル−Ｎ−メチル−β−アラニン、Ｎ−パルミトイルサルコシン塩等が挙げられる。
【００５５】
［１−３−２．酸由来型陰イオン性界面活性剤−スルホン酸型界面活性剤］
スルホン酸型界面活性剤は、Ｒ１−ＳＯ３Ｘ（Ｒ１は有機基、Ｘは水素原子または陽イオンを示す。）で示されるスルホン酸またはスルホン酸塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基、置換または無置換のアリール基、二価の連結基（たとえば、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−など）が介在した高級アルキル基または高級不飽和炭化水素基などが挙げられる。
【００５６】
有機基Ｒ１のうち、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基と、陽イオンＸとについては、上記のカルボン酸またはカルボン酸塩における有機基Ｒ１および陽イオンＸと同様である。
【００５７】
具体的には、1-ヘキサンスルホン酸塩、1-オクタンスルホン酸塩、1-デカンスルホン酸塩、1-ドデカンスルホン酸塩；ペルフルオロブタンスルホン酸、ペルフルオロブタンスルホン酸塩、ペルフルオロオクタンスルホン酸、ペルフルオロオクタンスルホン酸塩；テトラデセンスルホン酸塩；アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩（CH3(CH2)nCH(SO3X)COOCH3）など（ｎは、１以上３０以下の整数）が挙げられる。
【００５８】
有機基Ｒ１が置換または無置換のアリール基である場合、アリール基としては、フェニル基、ナフチル基などが挙げられる。置換アリール基の場合、置換基は直鎖または分岐のアルキル基であってよく、当該直鎖または分岐のアルキル基の炭素数は１以上３０以下であってよい。特にフェニル基の場合、当該置換基はスルホニル基に対してパラ位で置換されていてよい。このような芳香属系スルホン酸塩としては、トルエンスルホン酸塩、クメンスルホン酸塩、オクチルベンゼンスルホン酸塩、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、ナフタレンジスルホン酸塩、ナフタレントリスルホン酸塩、ブチルナフタレンスルホン酸塩などが挙げられる。
【００５９】
有機基Ｒ１が、二価の連結基（たとえば、−Ｏ−、−ＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−など）が介在した高級アルキル基または高級不飽和炭化水素基である場合のスルホン酸型界面活性剤としては、当該高級アルキル基または高級不飽和炭化水素基でＯ−置換されたイセチオン酸塩、当該高級アルキル基または高級不飽和炭化水素基でＮ−置換されたタウリン塩等が挙げられる。当該高級アルキル基または高級不飽和炭化水素基の炭素数は、６以上１８以下であってよい。このようなスルホン酸型界面活性剤の具体例としては、ココイルイセチオン酸塩、ココイルタウリン塩、ココイル−Ｎ−メチルタウリン、Ｎ−オレオイル−Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−ステアロイル−Ｎ−メチルタウリン塩、Ｎ−ラウロイル−Ｎ−メチルタウリン塩などが挙げられる。
【００６０】
［１−３−３．酸由来型陰イオン性界面活性剤−硫酸エステル型界面活性剤］
硫酸エステル型界面活性剤は、Ｒ１−ＯＳＯ３Ｘ（Ｒ１は有機基、Ｘは陽イオンを示す。）で示される硫酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同じである。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオンなどが挙げられる。
硫酸エステル塩の具体例としては、ラウリル硫酸塩、ミリスチル硫酸塩、ラウレス硫酸塩（C12H25(CH2CH2O)nOSO3X、ｎは１以上３０以下の整数））、ポリオキシエチレンアルキルフェノールスルホン酸ナトリウム（C8H17C6H4O[CH2CH2O]3SO3X）などが挙げられる。
【００６１】
［１−３−４．酸由来型陰イオン性界面活性剤−リン酸エステル型界面活性剤］
リン酸エステル型界面活性剤は、Ｒ１−ＯＳＯ３Ｘ（Ｒ１は有機基、Ｘは水素原子または陽イオンを示す。）で示されるリン酸エステルまたはリン酸エステル塩である。有機基Ｒ１は、少なくとも炭素を有する基であり、高級アルキル基、高級不飽和炭化水素基、オキシアルキレン基が介在した炭化水素基、フッ素置換された高級アルキル基であり、それぞれ、上述のカルボン型界面活性剤におけるＲ１と同じである。陽イオンＸとしては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属イオン、トリエタノールアミンイオン、アンモニウムイオンなどが挙げられる。
リン酸エステルまたはリン酸エステル塩の具体例としては、ラウリルリン酸、ラウリルリン酸塩が挙げられる。
【００６２】
［１−３−５．脱糖鎖促進剤の組成］
脱糖鎖促進剤は、水または緩衝液中に酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む状態で用意されてよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム・炭酸水素アンモニウム・塩化アンモニウム・クエン酸水素二アンモニウム・カルバミン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤、リン酸塩などが挙げられる。緩衝液は、ｐＨが５以上１０以下であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であることは、糖鎖分解酵素の活性を保つ点で好ましい。脱糖鎖促進剤において、水または緩衝液中に含まれる酸由来型陰イオン性界面活性剤以外の成分としては、界面活性剤以外の金属塩などの塩類が挙げられる。
【００６３】
［１−４．糖鎖分解物質］
糖鎖分解物質としては、糖鎖分解酵素および塩基性化合物が挙げられる。
糖鎖分解酵素としては、ペプチドＮ−グリカナーゼ（PNGase F、PNGase A）、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ(Endo-H、Endo-F、Endo-A、Endo-M)などが挙げられる。
【００６４】
糖鎖分解酵素は、水または緩衝液中に含ませられた状態で用意されてよい。緩衝液は、ｐＨが５以上１０以下であるものが好ましい。緩衝液のｐＨがこの範囲内であることは、糖鎖分解酵素の活性を保つ点で好ましい。糖鎖分解酵素とともに、金属塩などの塩類、グリセロールなどのタンパク質の安定化剤などの成分が当該水または緩衝液中に含まれていてもよい。緩衝液を用いる場合、緩衝剤としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、塩化アンモニウム、クエン酸水素二アンモニウム、カルバミン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のトリス緩衝剤、リン酸塩などが挙げられる。
【００６５】
塩基性化合物としては、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム等の無機塩及び有機塩、並びにこれらの組み合わせが挙げられる。
糖鎖分解物質としての塩基性化合物は、特に、糖タンパク質の糖鎖部分がＯ−結合型である場合に用いられる。
【００６６】
塩基性化合物は、たとえばｐＨが７以上１１未満に調整された水溶液として調製されてよい。塩基性化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化バリウムなどの金属水酸化物；アンモニア：塩化アンモニウム、クエン酸水素アンモニウム、カルバミン酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、テトラブチルアンモニウムヒドロキシドなどのアンモニウム塩などが挙げられる。これらの塩基性化合物は、一種が単独で用いられてもよいし、複数種が組み合わされて用いられてもよい。
【００６７】
［１−５．遊離工程の操作および反応条件］
遊離工程では、糖鎖分解物質の至適条件（温度およびｐＨ）が満たされた、糖タンパク質と酸由来型陰イオン性界面活性剤と糖鎖分解酵素との反応液が調製されればよい。したがって、糖タンパク質を含む試料、脱糖鎖促進剤、および糖鎖分解物質はどのような操作手順で混合されてもよい。
【００６８】
たとえば、糖タンパク質を含む試料と、脱糖鎖促進剤と、糖鎖分解物質とを同じタイミングで互いに混合して反応液を調製してよい。当該反応液を至適温度に設定して、糖タンパク質から糖鎖を分解する反応を行う。この場合、反応時間はたとえば５秒以上２４時間以下であってよい。
あるいは、糖タンパク質を含む試料と、酸由来型陰イオン性界面活性剤とを先に混合して糖タンパク質のタンパク質部分を変性させた後に、糖鎖分解物質と混合してもよい。この場合、変性時間はたとえば５秒以上２４時間以下、糖鎖分解時間はたとえば５秒以上２４時間以下であってよい。
【００６９】
糖タンパク質を含む試料、脱糖鎖促進剤、および糖鎖分解物質を含む反応液において、糖タンパク質の濃度は、たとえば０．１μｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下、好ましくは１μｇ／ｍｌ以上１０ｍｇ／ｍｌ以下であってよい。反応液中の糖タンパク質の濃度が上記下限値以上であることは、検出性の点で好ましく、上記上限値以下であることは、定量性の点で好ましい。
糖タンパク質は、１の反応液につき０．００１μｇ以上１００ｍｇ以下となるスケールであってよい。
【００７０】
糖タンパク質を含む試料、脱糖鎖促進剤、および糖鎖分解物質を含む反応液において、酸由来型陰イオン性界面活性剤の濃度は、たとえば０．０１重量％以上３０重量％以下、好ましくは０．２重量％以上１．０重量％以下、さらに好ましくは０．２重量％以上０．３重量％以下、より一層好ましくは０．２２重量％以上０．２７重量％以下であってよい。あるいは、酸由来型陰イオン性界面活性剤は、糖タンパク質１μｇに対して０．００１μｇ以上１００ｍｇ以下となるように用いてもよい。
酸由来型陰イオン性界面活性剤の使用量を上記の範囲に設定することによって、糖鎖分解物質の活性維持の点および遊離糖鎖の回収量の点で良好となり、かつ、回収量の安定性の点でも良好となる。また、たとえば遊離糖鎖の精製を固相担体によって行う場合に、乾燥時間の冗長を防止する点でも好ましい。
【００７１】
糖タンパク質を含む試料、脱糖鎖促進剤、および糖鎖分解物質を含む反応液において、糖鎖分解酵素の濃度は、たとえば０．００１μＵ／ｍＬ以上１０００ｍＵ／ｍＬ以下、好ましくは０．０１μＵ／ｍＬ以上１００ｍＵ／ｍＬ以下であってよい。あるいは、糖タンパク質１μｇに対して０．００１μＵ以上１０００ｍＵ以下となるように用いてもよい。
糖鎖分解酵素の使用量を上記の範囲に設定することによって、効率的な糖鎖遊離が可能となる。
【００７２】
反応ｐＨは、糖鎖分解物質の至適ｐＨに合わせればよいが、たとえば５以上１０以下であってよい。反応温度も、糖鎖分解物質の至適温度に合わせればよいが、たとえば４℃以上９０℃以下であってよい。反応時間は、糖タンパク質のスケール糖にもよるが、たとえば５秒以上２４時間以下であってよい。
【００７３】
［１−６．反応生成物］
遊離工程では、酸由来型陰イオン性界面活性剤により糖タンパク質のタンパク質部分の変性により三次構造が変化し、糖鎖分解物質が分解標的部位に作用しやすくなる。これによって、糖部分が容易に分解されて遊離する。
遊離工程による反応生成物として、遊離した糖鎖と、タンパク質とが得られる。タンパク質は、糖タンパク質を構成していたタンパク質部分におけるアミノ酸残基間のペプチド結合が切断されていない。
【００７４】
遊離した糖鎖は、適宜精製されてよい。
たとえば、ヒドラジド基を有するポリマーなどを固相担体として用い、当該固相担体に反応生成物（タンパク質および遊離糖鎖）を含む混合液を接触させる。混合液中では、遊離糖鎖は環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡状態を生じており、このアルデヒド基−ＣＨＯとヒドラジド基−ＮＨ−ＮＨ２とが特異的に反応し、安定的な結合−Ｃ＝Ｎ−ＮＨ−を形成する。これによって、固相担体に遊離糖鎖が捕捉することができる。
【００７５】
捕捉した糖鎖は、再遊離させられてよい。再遊離の手法としては、酸と有機溶媒との混合溶媒または酸と水と有機溶媒の混合溶媒を固相担体に接触させて反応させることができる。当該混合溶媒のｐＨはたとえば２以上９以下、好ましくは２以上７以下、より好ましくは２以上６以下であってもよく、弱酸性から中性付近で反応させる場合は、シアル酸残基の脱離など糖鎖の加水分解を抑制することができる点で好ましい。しかしながら、さらにｐＨが低い強酸条件も許容する。
【００７６】
再遊離させた糖鎖は、低分子化合物を修飾試薬に用いて修飾することができる。低分子化合物は、分析手法に応じて適宜選択することができる。
たとえば、オキシルアミノ基またはヒドラジド基を有する低分子化合物が挙げられる。オキシルアミノ基またはヒドラジド基を有する低分子化合物は、たとえば、アルギニン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、チロシン残基、システイン残基、リジン残基などのアミノ酸残基を含むことができる。アルギニン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定時にイオン化促進され、検出感度が向上する点で好ましい。トリプトファン残基を含む場合、当該残基は蛍光性かつ疎水性であることから、修飾された糖鎖の逆相ＨＰＬＣ検出時に、分離性が向上および蛍光検出感度が向上する点で好ましい。フェニルアラニン残基および／またはチロシン残基を含む場合、修飾された糖鎖のＵＶ吸収による検出に適する点で好ましい。システイン残基を含む場合、当該残基の−ＳＨ基を標的としてICAT試薬（米国ABI社）などのラベル化試薬によるラベル化ができる。リジン残基を含む場合、当該残基のアミノ基を標的としてiTRAQ試薬（米国Applied Biosystems社）、ExacTag試薬（米国Perkin社）などのラベル化試薬によるラベル化ができる。トリプトファン残基を含む場合、当該残基のインドール基を標的としてNBS試薬（日本国、島津製作所）によるラベル化ができる。
またたとえば、アミノ基を有する芳香族化合物が挙げられる。アミノ基を有する芳香族化合物では、還元アミノ化による修飾が行われる。アミノ基を有する芳香族化合物は、紫外可視吸収特性または蛍光特性を有するため、ＵＶ検出または蛍光検出での検出感度が向上する点で好ましい。
【００７７】
［２．キット］
本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製するキットは、上記の本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法を実施するためのキットである。本発明のキットには、酸由来型陰イオン性界面活性剤を含む脱糖鎖促進剤、糖鎖分解物質、および、キット使用のためのプロトコル情報を含むことができる。脱糖鎖促進剤および糖鎖分解物質については、上記の本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法において説明した通りである。キット使用のためのプロトコル情報は、上述の本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法が示された印刷物であってもよいし、当該方法が示されたウェブ上の情報へのアクセスを可能とするアクセス情報であってもよい。
【００７８】
また、本発明のキットには、遊離工程を行うための反応容器を含んでいてもよい。遊離工程を行うための反応容器は、カラム、マルチウェルプレート、フィルタープレート、マイクロチューブなどであってよいが、好ましくはスピンカラムである。また、本発明のキットは、コレクションチューブ、コレクションプレートなどの回収容器を含んでいてもよい。さらに、本発明のキットは、標識試薬および精製用固相担体の少なくともいずれかを含んでいてもよい。
【００７９】
［３．装置］
本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製する装置は、上記の本発明の糖タンパク質から糖鎖を調製する方法を実施するための装置である。本発明の装置は、容器保持部と、液体導入部とを含む。さらに、本発明の装置は、固液分離部および温度調節部の少なくともいずれかを含んでよい。
【００８０】
容器保持部は、糖タンパク質を含む試料を収容すべき反応容器を保持するためのものである。当該容器は、遊離工程を行うために用いられる。容器保持部が容器を保持する態様は特に限定されず、たとえば、容器保持部の保持穴または保持孔に容器の大部分を嵌入させて保持する態様、容器保持部の係合凸部（係合凹部）に容器の係合凹部（係合凸部）を係合させて保持する態様、容器保持部の挟持部で容器を挟持保持する態様などが挙げられる。
【００８１】
液体導入部は、容器保持部に保持された反応容器内に液体類を導入するためのものである。液体導入部は、少なくとも、遊離工程で用いられる脱糖鎖促進剤を導入する脱糖鎖促進剤導入部と、糖鎖遊離酵素を導入する糖鎖遊離物質導入部とを含む。脱糖鎖促進剤導入部および糖鎖遊離物質導入部は、同一の反応容器内に脱糖鎖促進剤と糖鎖遊離物質とを添加する。液体導入部が反応容器内へ液体を導入する態様は特に限定されず、送液すべき液体が貯留されている送液源から管状部材を介して反応容器内へ送液する態様、管状部材中に採取した液体を反応容器内へ注入する態様などが挙げられる。
【００８２】
脱糖鎖促進剤導入部と糖鎖遊離物質導入部とは、別個独立した構成部材として構成されてよい。この場合、脱糖鎖促進剤と糖鎖遊離物質とは、この順番で逐次的に導入されてもよいし、同じタイミングで導入されてもよい。糖鎖遊離物質導入部は自動制御されてよい。
【００８３】
あるいは、脱糖鎖促進剤導入部と糖鎖遊離物質導入部とは、同一の構成部材として構成されてもよい。この場合、脱糖鎖促進剤と糖鎖遊離物質とは混合された状態で導入されてもよいし、この順番でそれぞれ逐次的に導入されてもよい。
【００８４】
さらに、液体導入部は、標識試薬を導入するための標識試薬導入部を含んでもよい。この場合、標識試薬が送液されるタイミング、つまり液体導入部を標識試薬導入部として機能させるタイミングは、遊離工程に要する反応時間などに基づいて制御されてよい。
【００８５】
本発明の装置が固液分離部を含む場合、固液分離部は、容器中に含まれる収容物から固体と液体とを分離する。固液分離部は、たとえば、遊離させた糖鎖を固相担体に捕捉させる場合、当該捕捉された糖鎖を固相担体から遊離させる場合に用いられる。この場合、容器としては、固液分離可能なフィルタを具えるもの（たとえばスピンカラム、フィルタ付きマイクロプレートなど）が用いられる。さらにこのような容器は、回収容器（たとえばコレクションチューブ、コレクションプレートなど）が装着されて用いられてよい。さらにこの場合、容器保持部は、容器に装着された回収容器を保持する回収容器保持部を含んで構成されてよい。
【００８６】
固液分離部の具体的な分離形式としては特に限定されず、遠心ろ過、減圧ろ過、加圧ろ過のいずれであってもよい。固液分離部は、遊離工程および標識工程が行われる容器保持部から独立した構成部材として構成されてよい。この場合、本発明の装置は、容器保持部から固液分離部へ、反応容器を自動移送させる容器移送部を含んでよい。容器移送部は、反応容器の移送において、反応容器のみが移送されるように構成されてもよいし、反応容器が回収容器を装着した状態で移送されるように構成されてもよい。容器移送部は、反応容器を直接的または間接的に（つまり回収容器を介して）把持および開放し、かつ移動するように作動するアームと、当該アームの作動を制御するアーム制御部とを含んで構成されてよい。
【００８７】
固液分離部を作動させることで、液体が回収容器に回収される。したがって、たとえば脱糖鎖促進剤と糖鎖遊離物質とを導入することによって得られた反応容器中の反応物（つまり反応後の反応容器の収容物）から、減圧ろ過、加圧ろ過、遠心分離等によって、糖鎖を固相担体に捕捉した状態で得ることができ、さらに、固相担体に捕捉された糖鎖を遊離させて糖鎖を含む分離液を回収容器中に回収することができる。
【００８８】
また、本発明の装置が固液分離部を有する場合、上述の液体導入部が、さらに洗浄液を反応容器内に導入可能となるように構成されてよい。これによって、容器に洗浄液を通液することができる。
【００８９】
本発明の装置が温度調節部を含む場合、温度調節部は、少なくともヒータ機能を有していればよい。温度調節部は、反応容器を、少なくとも遊離工程に必要な温度に加温する。
【００９０】
本発明の装置は、作動しうる構成部分（たとえば、液体導入部、アーム、固液分離部、温度調節部、液体移送部）の少なくともいずれか、好ましくは全てが自動制御されてよい。これによって、糖タンパク質の糖鎖の調製をより迅速に行うことができる。
【実施例】
【００９１】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９２】
［比較例１：トリプシン消化による糖鎖遊離］
水中に５０ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（シグマ社製）を含む抗体液１０μＬに１Ｍ  重炭酸アンモニウム水溶液を１μＬと１２０ｍＭ  ジチオスレイトール水溶液１μＬを加え、６０℃、３０分間静置し、その後１２０ｍＭ  ヨードアセトアミド水溶液を２μＬ加え、室温（２５℃）、遮光下で６０分間静置し、３ｍｇ/ｍＬのトリプシン液（シグマ社製）４μＬを加え、３７℃１６時間、トリプシン消化を行った。その後１００℃、５分間処理しトリプシンを失活させたのち、純水を１０８μＬ加えた。そのトリプシン消化物５μＬと、０．５ｍＵ／ｍＬのＰＮＧａｓｅＦ液（Ｔａｋａｒａ社製）２．５μＬ、１２．５μＬの０．１Ｍ  重炭酸アンモニウムを混合し、５０℃で１０分間、糖鎖分解反応を行い、糖鎖を遊離させた。反応後の混合液を、糖鎖精製キットBlotGlyco(R)（住友ベークライト製）ビーズを用いて遊離糖鎖を捕捉し、その後、再遊離および２−アミノベンズアミドによる蛍光修飾を行った。トリプシン消化から修飾された遊離糖鎖を得るまでにかかった時間は約３０時間であった。
【００９３】
修飾された遊離糖鎖を、ＨＰＬＣで検出した。得られたＨＰＬＣスペクトルを図１に示す。図１では、それぞれのピークの同定結果も示す。図１に示されるように、種々のシアロ糖鎖および中性糖鎖のピークが検出された。シアロ糖鎖の中でも、特に矢印で示されるシアロ糖鎖のピークが検出された。
【００９４】
［比較例２］
トリプシン消化を行わなかったことを除き、比較例１と同様の操作を行い、ＨＰＬＣによる検出を行った。得られたＨＰＬＣスペクトルを図２に示す。図２に示すように、図１において矢印で示したシアロ糖鎖のピークが検出されなかった。
【００９５】
［実施例１］
水中に４ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ（シグマ社製）を含む抗体液５μＬと、０．１Ｍの重炭酸アンモニウム緩衝液中に０．３２重量％のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムを含む脱糖鎖促進剤溶液１２．５μＬと、０．５ｍＵ／ｍＬのＰＮＧａｓｅＦ液（Takara社製）２．５μＬと、を混合し、５０℃で１０分間、糖鎖分解反応を行い、糖鎖を遊離させた。反応液中のＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムの終濃度は０．２重量％であった。
【００９６】
反応後の混合液を、糖鎖精製キットBlotGlyco(R)（住友ベークライト製）ビーズを用いて遊離糖鎖を捕捉し、その後、再遊離および２−アミノベンズアミドによる蛍光修飾を行った。糖鎖分解反応から修飾された遊離糖鎖を得るまでにかかった時間は約８時間であった。
【００９７】
修飾された遊離糖鎖を、ＨＰＬＣで検出した。得られたＨＰＬＣスペクトルを図３に示す。図３においては、図１で示した番号６以降のピークが検出される部分を拡大表示している。図３に示すように、本実施例ではペプチド消化を行っていないにもかかわらず、比較例１（図１）と同様、矢印で示されるシアロ糖鎖のピークを含む種々のピークが検出された。
【００９８】
［実施例２］
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを、反応液中の終濃度が１．５重量％となる量で用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。
【００９９】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図４の（ａ）に示す。なお、図４において「control」は、トリプシン消化を行わず、かつ本発明の脱糖鎖促進剤を用いない態様である比較例２に相当する。また、「Ｘ」はＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムを指す（以下の全ての図において同様）。図４（ａ）に示すように、実施例１（図３）と同様の矢印で示されるシアロ糖鎖のピークが検出された。
【０１００】
［実施例３］
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを、反応液中の終濃度が１．０重量％となる量で用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。
【０１０１】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図４の（ｂ）に示す。図４（ｂ）に示すように、実施例１（図３）と同様の矢印で示されるシアロ糖鎖のピークが検出された。
【０１０２】
［実施例４］
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムの代わりにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、反応液中の終濃度が１．０重量％となる量で用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。
【０１０３】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図４の（ｃ）に示す。図４（ｃ）に示すように、実施例１（図３）と同様の矢印で示されるシアロ糖鎖のピークが検出された。ＰＮＧａｓｅＦへの影響およびＳ／Ｎ比を考慮した場合、実施例１から実施例３（図３および図４（ａ），（ｂ））がより好ましい。
【０１０４】
［比較例３：有機溶剤を用いた場合］
糖鎖分解反応において脱糖鎖促進剤の代わりに、０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム緩衝液中に有機溶剤（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，４−ジオキサン、１−ブタノール、２−プロパノール、ジクロロメタン、メチルモルホリンまたはピリジン）を含む有機溶剤液１２．５μＬを用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。当該有機溶剤は、終濃度が５重量％となる量で用いた。
【０１０５】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図５に示す。図５に示されるように、本比較例では、実施例１から４で検出された矢印で示されるシアロ糖鎖のピークが検出されなかった。
【０１０６】
［比較例４：他の界面活性剤を用いた場合］
糖鎖分解反応において脱糖鎖促進剤の代わりに０．１Ｍの炭酸水素アンモニウム緩衝液中に以下の界面活性剤を含む界面活性剤液１２．５μＬを用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。当該界面活性剤は、反応液中が１重量％となる量で用いた。
【０１０７】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図６に示す。図６に示されるように、本比較例では、実施例１から４で検出された矢印で示されるシアロ糖鎖のピークが検出されなかった。
【０１０８】
［実施例５］
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを、反応液中の終濃度が０．２重量％、０．３重量％、０．４重量％、０．５重量％、０．６重量％となる量でそれぞれ用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。
【０１０９】
得られたＨＰＬＣスペクトルを図７に示す。図７に示されるように、いずれの濃度であっても、実施例１（図３）と同様の矢印で示されるシアロ糖鎖のピークが検出された。
【０１１０】
［実施例６］
Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウムを、反応液中の終濃度が０．２重量％、０．２５重量％、０．３重量％となる量でそれぞれ用いたことを除いて、実施例１と同様の操作を行った。この実験を３回行った。
【０１１１】
得られたＨＰＬＣスペクトルにおける番号１〜番号７のピーク面積の比較を行った。その結果を図８に示す。図８においては、縦軸に、図２における番号１から番号７のそれぞれのピーク面積を足し合わせた量を１００％とした場合のピーク面積比率（％）を示し、横軸にピーク番号を示す。また、図８においては、比較例２に相当する態様のcontrolのピーク面積も比較用に示されている。さらに、それぞれの番号のピークにつき、control、ならびにＮ−ラウロイルサルコシンナトリウムが０．２重量％の場合、０．２５重量％の場合、および０．３重量％の場合それぞれの全実験（全３回）の結果を示している。なお、番号７のピーク面積には、実施例１（図３）の矢印で示されるシアロ糖鎖（番号７（図１参照）のピークの糖鎖にわずかに遅れて溶出する糖鎖）のピーク面積も含んでいる。図８の番号７のピーク面積の比較に示されるように、いずれの濃度の場合も、特に実施例１（図３）の矢印で示されるシアロ糖鎖について、回収量の点で良好であり、かつ、３回全てに亘り回収量が安定していることが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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