(57)【要約】【課題】安全かつ有効な慢性骨髄性白血病（CML）治療薬を提供すること。【解決手段】N-((4-([1,2,4]トリアゾロ[1,5-α]ピリジン-6-イル)-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾル-2-イル)メチル)-2-フルオロアニリン（TEW-7197）又はその塩と、3-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-{4-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}ベンズアミド（ポナチニブ）又はその塩とを組み合わせてなる、CML治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
N-((4-([1,2,4]トリアゾロ[1,5-α]ピリジン-6-イル)-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾル-2-イル)メチル)-2-フルオロアニリン（TEW-7197）又はその塩と、3-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-{4-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}ベンズアミド（ポナチニブ）又はその塩とを組み合わせてなる、慢性骨髄性白血病（CML）治療剤。
【請求項２】
CMLがチロシンキナーゼ阻害薬（TKI）に対して抵抗性である、請求項１記載の剤。
【請求項３】
TKIに対する抵抗性がBCR-ABLのT315I変異に基づくものである、請求項２記載の剤。
【請求項４】
経口投与又は静脈内投与用である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【請求項５】
ポナチニブ又はその塩の経口投与量が15〜30mg/日である、請求項４記載の剤。
【請求項６】
TEW-7197又はその塩の経口投与量が30〜200mg/2〜4日である、請求項４又は５記載の剤。
【請求項７】
TEW-7197又はその塩の投与開始に先立ってポナチニブの投与を開始することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性骨髄性白血病（以下、「CML」ともいう）治療剤に関する。より詳細には、本発明は、EW-7197とポナチニブとを組み合わせてなるCML、特にチロシンキナーゼ阻害薬抵抗性CMLの治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（CML）は、造血幹細胞を発症起源とする骨髄増殖性疾患であり、数年の慢性期の後、移行期を経て重篤な病態を呈する急性転化期へと進行する。CMLの治療においては、慢性期に徹底した治療を行って急性転化期への移行を防ぐことが重要となる。CML患者ではフィラデルフィア染色体とよばれる染色体転座t(9;22)(q34;q22)がみられ、この転座により、恒常的に活性化されたチロシンキナーゼBCR-ABL融合蛋白質を発現することが、CMLの発症の原因として知られている。BCR-ABLチロシンキナーゼは細胞内基質や自己をリン酸化し、細胞増殖、形質転換、アポトーシス抑制に関わる様々な細胞内シグナル伝達を活性化することにより、CML発症に深く関与する。
【０００３】
CMLの治療薬としてABLに対するチロシンキナーゼ阻害薬（以下、「TKI」ともいう）メシル酸イマチニブ（以下、「イマチニブ」ともいう）が開発され、CML患者の治療成績を著しく改善した。イマチニブは、チロシンキナーゼのATP結合部位に競合的に結合し、基質リン酸化に続くシグナル伝達を阻害することにより、細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導してCML細胞を選択的に傷害する。このイマチニブや、さらに治療効果の高い、第二世代TKIのニロチニブ、ダサチニブがCML患者の治療に用いられている。
しかし、イマチニブなどのTKI治療後のCML患者において、TKIが効かなくなったCML（治療抵抗性の再発CML）が臨床上の重大な問題となっている。近年、この再発のメカニズムとして、T315I（イマチニブ結合部位である315番目のスレオニン残基がイソロイシンに置換されている）に代表されるTKI抵抗性のBCR-ABLの点突然変異が出現することが明らかとなった（非特許文献１）。
【０００４】
TKI耐性BCR-ABL1を発現するCML患者の治療薬として、マルチキナーゼ阻害薬ポナチニブが開発され（非特許文献２）、米国及びEUにおいて、前治療のTKIに抵抗性又は不耐容となったCMLを対象に承認されている（商品名：Iclusig）。しかし、TKI抵抗性CML細胞の増殖源となるCML幹細胞を完全には排除できないため、ポナチニブ治療を中止すると再発の懸念がある。そのため、患者はポナチニブ治療を継続し続けなければならなくなる。また、TKI抵抗性CML幹細胞を発生起源として、さらに複数の遺伝子変異（コンパウンド変異）を持つCML幹細胞が発生すると、さらなるポナチニブ抵抗性を引き起こす原因ともなる（非特許文献３）。したがって、CMLを根治するためには、CML幹細胞を根絶する治療方法の開発が必要である。
加えて、新規診断CML患者を対象とした第III相試験において、ポナチニブはイマチニブと比較して早期により高い有効性を示したものの、ポナチニブを投与された患者で動静脈に重篤な血液凝固症状の発生例が蓄積したため、当該臨床試験は中止となった。そのため、ポナチニブによる治療奏功率を向上させるべく、ポナチニブの有効性を維持しつつその副作用を軽減する方策が求められている。
【０００５】
TEW-7197（N-((4-([1,2,4]トリアゾロ[1,5-α]ピリジン-6-イル)-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾル-2-イル)メチル)-2-フルオロアニリン；「EW-7197」、「EW7197」とも呼ばれる）は、TGF-βI型受容体タンパク質（ALK5）のセリン・スレオニンキナーゼ活性を抑制して、TGF-βに依存するシグナル伝達機構を阻害する（特許文献１、２）。TGFβは腫瘍形成の早期には防御的に働くが、がんの進展に伴って、上皮間葉転換（EMT）の促進、免疫サーベイランスの妨害、がん細胞の増殖促進など、がんの増悪因子として作用する。そのため、ALK5阻害剤であるTEW-7197は、腫瘍細胞の増殖及び転移抑制効果を有し（例えば、特許文献１、２、非特許文献４参照）、米国国立衛生研究所(NIH)の認可を受け、固形がん患者を対象とする臨床第I相試験が既に開始されている。
しかしながら、CMLをはじめとする血液がんに対するTEW-7197の治療効果については、これまでに具体的な報告はなく、TEW-7197とポナチニブとの併用効果についても全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第2012/002680号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第2011/0319408号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gorre, M.E. et al., Science, 293(5531): 876-880 (2001)
【非特許文献２】O'Hare, T. et al., Cancer Cell, 16(5): 401-412 (2009)
【非特許文献３】Zabriskie, M.S. et al., Cancer Cell, 26(3): 428 (2014)
【非特許文献４】Son, J.Y. et al., Mol. Cancer Ther., 13(7): 1704-1716 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、CML幹細胞を抑制することのできる新規CML治療剤を提供することである。また、本発明の別の目的は、ポナチニブと併用することにより、ポナチニブの治療効果を向上させ得る新規CML治療剤、特にTKI抵抗性CMLの治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、TEW-7197は単独投与によりTKI耐性CML幹細胞を顕著に抑制することができること、TEW-7197の単独投与ではin vivoでのCML治療効果は限定的であるものの、TEW-7197とポナチニブとを併用することでポナチニブの治療効果をより高めることができること、並びに、併用投与によりポナチニブの投与量を低減させ得るため、副作用を軽減できることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の通りである。
〔１〕N-((4-([1,2,4]トリアゾロ[1,5-α]ピリジン-6-イル)-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾル-2-イル)メチル)-2-フルオロアニリン（TEW-7197）又はその塩と、3-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-{4-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}ベンズアミド（ポナチニブ）又はその塩とを組み合わせてなる、慢性骨髄性白血病（CML）治療剤。
〔２〕CMLがチロシンキナーゼ阻害薬（TKI）に対して抵抗性である、上記〔１〕記載の剤。
〔３〕TKIに対する抵抗性がBCR-ABLのT315I変異に基づくものである、上記〔２〕記載の剤。
〔４〕経口投与又は静脈内投与用である、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔５〕ポナチニブ又はその塩の経口投与量が15〜30mg/日である、上記〔４〕記載の剤。
〔６〕TEW-7197又はその塩の経口投与量が30〜200mg/2〜4日である、上記〔４〕又は〔５〕記載の剤。
〔７〕TEW-7197又はその塩の投与開始に先立ってポナチニブの投与を開始することを特徴とする、上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、TKI治療によれば根絶を免れる可能性のあるCML幹細胞、とりわけ従来のいずれのTKIにも抵抗性を示すCML幹細胞を、効率よく排除することができる。また、TEW-7197とポナチニブとの併用により、CMLの再発を予防し、かつポナチニブの投与量を低減することができ、副作用を軽減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】CMLマウスモデルに対するイマチニブとTEW-7197の併用投与方法の検討結果を示す図である。CML幹細胞移植後、8日目にイマチニブとTEW-7197の投与を同時に開始し、イマチニブとEW-7197ともに連日投与した。
【図２】CMLマウスモデルに対するイマチニブとTEW-7197の併用投与方法の検討結果を示す図である。CML幹細胞移植後、8日目にイマチニブ投与を開始し、15日目にTEW-7197の投与を開始し、イマチニブとEW-7197ともに連日投与した。
【図３】CMLマウスモデルに対するイマチニブとTEW-7197の併用投与方法の検討結果を示す図である。CML幹細胞移植後、8日目にイマチニブ投与を開始し、15日目にTEW-7197の投与を開始し、イマチニブは連日投与し、TEW-7197は3日に1回投与した。
【図４】インビトロでのマウスTKI抵抗性CML幹細胞に対する（Ａ）TEW-7197の抑制効果、及び（Ｂ）TEW-7197とポナチニブとの併用効果を示す図である。
【図５】TKI抵抗性CML幹細胞を移植したマウスの生存率に及ぼすTEW-7197とポナチニブとの併用効果を示す図である。
【図６】TKI抵抗性CML幹細胞を移植したマウスにおけるCML幹細胞の残存率に及ぼすTEW-7197の効果及びTEW-7197とポナチニブとの併用効果を示す図である。
【図７】TKI抵抗性CML幹細胞を移植したマウスの生存率を指標とした、TEW-7197とポナチニブとの併用による、ポナチニブの投与量低減効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明はTEW-7197又はその塩と、ポナチニブ又はその塩とを組み合わせてなる、慢性骨髄性白血病（CML）治療剤（以下、「本発明のCML治療剤」又は「本発明の併用剤」ともいう）を提供する。
ここで「CML治療剤」とは、慢性期のCMLの治療のみならず、急性転化期や移行期のCMLの治療、急性転化の予防、CMLの再発予防、再発CMLの治療をも目的とする意味で用いられる。
【００１４】
本発明に用いられるTEW-7197（N-((4-([1,2,4]トリアゾロ[1,5-α]ピリジン-6-イル)-5-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-イミダゾル-2-イル)メチル)-2-フルオロアニリン）は、TGF-βI型受容体タンパク質（ALK5）のセリン・スレオニンキナーゼ活性を抑制して、TGF-βに依存するシグナル伝達機構を阻害する。TEW-7197の塩としては、医薬上許容される塩であれば特に制限はないが、好ましくは、塩酸塩などの酸付加塩が挙げられる。TEW-7197は、上記特許文献１に記載の方法により製造することができる。
【００１５】
TEW-7197を医薬品として用いるにあたり、そのまま、もしくは公知の薬学的に許容される担体などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的にまたは局所的に、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。好ましくは経口投与又は静脈内投与、より好ましくは経口投与である。
前記の適当な投与剤型は薬理学的に許容される担体等に有効成分を配合することにより製造することができる。薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、水溶性高分子、塩基性無機塩；液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等があげられる。また、必要に応じて、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、発泡剤、香料等の添加物を用いることもできる。
【００１６】
該「賦形剤」としては、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、でんぷん、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、酸化チタン等が挙げられる。
該「滑沢剤」としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク、ステアリン酸等が挙げられる。
【００１７】
該「結合剤」としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム末、ゼラチン、プルラン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００１８】
該「崩壊剤」としては、（１）クロスポビドン、（２）クロスカルメロースナトリウム（ＦＭＣ−旭化成）、カルメロースカルシウム（五徳薬品）等スーパー崩壊剤と称される崩壊剤、（３）カルボキシメチルスターチナトリウム（例、松谷化学（株）製）、（４）低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（例、信越化学（株）製）、（５）コーンスターチ等が挙げられる。該「クロスポピドン」としては、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）、１−ビニル−２−ピロリジノンホモポリマーと称されているものも含め、１−エテニル−２−ピロリジノンホモポリマーという化学名を有し架橋されている重合物のいずれであってもよく、具体例としては、コリドンＣＬ（ＢＡＳＦ社製）、ポリプラスドンＸＬ（ＩＳＰ社製）、ポリプラスドンＸＬ−１０（ＩＳＰ社製）、ポリプラスドンＩＮＦ−１０（ＩＳＰ社製）等である。
【００１９】
該「水溶性高分子」としては、例えば、エタノール可溶性水溶性高分子〔例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（以下、ＨＰＣと記載することがある）等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン等〕、エタノール不溶性水溶性高分子〔例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（以下、ＨＰＭＣと記載することがある）、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、グアーガム等〕等が挙げられる。
【００２０】
該「塩基性無機塩」としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩が挙げられる。好ましくはマグネシウムおよび／またはカルシウムの塩基性無機塩である。さらに好ましくはマグネシウムの塩基性無機塩である。該ナトリウムの塩基性無機塩としては、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム等が挙げられる。該カリウムの塩基性無機塩としては、例えば、炭酸カリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。該マグネシウムの塩基性無機塩としては、例えば、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、珪酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト〔Ｍｇ６Ａｌ２（ＯＨ）１６・ＣＯ３・４Ｈ２Ｏ〕および水酸化アルミナ・マグネシウム、好ましくは、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム等が挙げられる。該カルシウムの塩基性無機塩としては、例えば、沈降炭酸カルシウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。
【００２１】
該「溶剤」としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油等が挙げられる。
該「溶解補助剤」としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
【００２２】
該「懸濁化剤」としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
【００２３】
該「等張化剤」としては、例えば、ブドウ糖、 Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられる。
該「緩衝剤」としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
【００２４】
該「無痛化剤」としては、例えばベンジルアルコール等が挙げられる。
該「防腐剤」としては、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
【００２５】
該「抗酸化剤」としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロール等が挙げられる。
該「着色剤」としては、例えば、食用黄色５号、食用赤色２号、食用青色２号等の食用色素；食用レーキ色素、ベンガラ等が挙げられる。
【００２６】
該「甘味剤」としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン二カリウム、アスパルテーム、ステビア、ソーマチン等が挙げられる。
該「酸味剤」としては、例えば、クエン酸（無水クエン酸）、酒石酸、リンゴ酸等が挙げられる。
【００２７】
該「発泡剤」としては、例えば重曹等が挙げられる。
該「香料」としては、合成物および天然物のいずれでもよく、例えば、レモン、ライム、オレンジ、メントール、ストロベリー等が挙げられる。
【００２８】
本発明の併用剤におけるTEW-7197の投与量は、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、経口投与の場合には、成人で１日換算のTEW-7197量として、５〜１５００ｍｇ程度、好ましくは１０〜５００ｍｇ程度、より好ましくは３０〜２００ｍｇ程度を、１日１回〜５日に１回、好ましくは２日に１回〜４日に１回、より好ましくは３日に１回投与することができる。後述の実施例および参考例の結果より、TEW-7197はCML幹細胞の分化を促進することによりCML幹細胞を抑制するが、分化した成熟CML細胞を抑制しない可能性があるため、TEW-7197の頻回投与は、却ってCMLの増悪を招くおそれがある。本発明の併用剤は、TEW-7197の単独投与と比較して顕著な併用効果を奏するので、併用剤において用いられるTEW-7197の投与量は、単独投与において通常使用されている量（第Ｉ相試験では、３０／６０／１００／１４０／２００ｍｇ／日（５日間連日投与後２日間休薬のサイクル））よりも減量することができる。
【００２９】
本発明に用いられるポナチニブ（3-(イミダゾ[1,2-b]ピリダジン-3-イルエチニル)-4-メチル-N-{4-[(4-メチルピペラジン-1-イル)メチル]-3-(トリフルオロメチル)フェニル}ベンズアミド）は、BCR-ABLを含む複数のキナーゼ活性を阻害するマルチキナーゼ阻害剤であり（Cancer Cell, 16: 401-412 (2009)）、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ等のTKIが無効なT315I変異BCR-ABL発現CML細胞に対しても有効である。ポナチニブの塩としては、医薬上許容される塩であれば特に制限はないが、好ましくは、塩酸塩などの酸付加塩が挙げられる。
【００３０】
ポナチニブを医薬品として用いるにあたり、そのまま、もしくは公知の薬学的に許容される担体などと混合して医薬組成物として調製することができる。当該医薬組成物は、調製する形態（錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの経口投与剤；注射剤、点滴剤、外用剤、坐剤などの非経口投与剤）等に応じて、全身的にまたは局所的に、経口投与または非経口投与することができる。非経口投与する場合には、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与すること等が可能である。好ましくは経口投与又は静脈内投与、より好ましくは経口投与である。
前記の適当な投与剤型は薬理学的に許容される担体等に有効成分を配合することにより製造することができる。薬理学的に許容される担体としては、TEW-7197と同様のものが挙げられる。
【００３１】
本発明の併用剤におけるポナチニブの投与量は、投与経路、投与対象または患者の年齢、体重、症状などによって異なり一概に規定できないが、通常、経口投与の場合には成人で１日あたりポナチニブ量として、５〜１００ｍｇ程度、好ましくは１０〜５０ｍｇ程度、より好ましくは１５〜３０ｍｇ程度を、１日１回ないし数回に分けて投与することができる。本発明の併用剤は、ポナチニブの単独投与と比較して顕著な併用効果を奏するので、併用剤において用いられるポナチニブの投与量は、単独投与において通常使用されている量（開始用量として４５ｍｇ／日）よりも減量することができる。ポナチニブは、BCR-ABLだけでなくAuroraキナーゼやFLT3など他のキナーゼによるシグナル伝達をも阻害するので、潜在的に副作用のリスクが高く、実際、血栓性イベントの蓄積のため、新規診断慢性期CMLに対する第III相試験は中止となった。TEW-7197との併用によれば、ポナチニブの投与量を減量でき、副作用が低減された、より安全なCML治療剤を提供することができる。
【００３２】
本発明の併用剤において、TEW-7197とポナチニブとは、合剤として、あるいは別個の製剤として同時に、又は経時的に投与されてよい。但し、後述の実施例および参考例の結果より、TEW-7197はCML幹細胞の分化を促進することによりCML幹細胞を抑制するが、分化した成熟CML細胞を抑制しない可能性があるため、ポナチニブと同時もしくはポナチニブ投与に先だってTEW-7197の投与を開始すると、却ってCMLの増悪を招くおそれがある。従って、先ずポナチニブの投与を開始し、成熟CML細胞をある程度抑制して病態を改善した後に、TEW-7197の投与を開始することが好ましい。例えば、ポナチニブ投与開始から3〜14日後、好ましくは5〜10日後、より好ましくは約7日後にTEW-7197の投与を開始することができる。
【００３３】
本発明のCML治療剤の投与対象となるCML患者は、特に限定されないが、望ましくは、急性転化期や移行期へと経過する前の慢性期のCML患者である。TEW-7197はCML幹細胞の除去に特に有用であるので、TEW-7197を含有する本発明のCML治療剤は、特にイマチニブ等のTKIに対して抵抗性となったり、初期不応のCML患者、TKI治療後にCML幹細胞が残存した再発患者等に対して有効である。本明細書においては、特にことわらない限り、「TKIに対して抵抗性である」とは、治療中にTKIに対して抵抗性となった場合だけでなく、初期不応性の場合をも含む意味で用いることとする。
イマチニブ抵抗性はBCR-ABL依存性と非依存性の機序が考えられている。前者としてはBCR-ABL遺伝子の増幅、点突然変異（例、キナーゼドメイン中のリン酸結合ループ(p-ループ)(例、G250E、Q252H、Y253F、Y253H、E255K、E255V等)、イマチニブ結合部位(例、T315I、T315A、F317L、F317V等)、活性化ループ、触媒ループ）が挙げられる。一方、後者としては、BCR-ABLシグナル下流の活性亢進、BCR-ABLに関与しないシグナル伝達経路の活性亢進、多剤耐性（MRD）タンパク質によるイマチニブの排出亢進、イマチニブ結合タンパク質（α1-酸性糖タンパク質）の増加等が挙げられる。これらのうち、キナーゼドメインの点突然変異によるものが主であると報告されているが（Cancer Cell, 2: 117-125 (2002)）、TEW-7197は、CML幹細胞を抑制できるため、変異BCR-ABL発現CMLだけでなく、いかなる機序による治療抵抗性CMLに対しても有効であり得る。
BCR-ABLの点突然変異のうち、キナーゼドメインのN末端側であるp-ループにおける変異は、急性転化期や移行期の患者に多く見られ、予後を悪化させるとの報告があるので（Blood, 102(1): 276-283 (2003)）、本発明のCML治療剤は、p-ループ中に変異を有するBCR-ABL発現CMLに対する治療剤、急性転化阻止剤、予後改善剤等として、特に有用である。
ポナチニブは、BCR-ABLのイマチニブ結合部位である315番目のスレオニン残基がイソロイシンに置換されたT315I変異BCR-ABL発現細胞に対しても有効であることが示されているが、細胞遺伝学的な完全寛解に至る症例は限定的であり、T315I変異BCR-ABL発現CML細胞に対するより強力な治療薬、ポナチニブの治療効果を補完し得る併用薬の開発が望まれていた。一方、TEW-7197は、T315I変異BCR-ABLを発現するイマチニブ抵抗性CML幹細胞に対して、単独で顕著な増殖抑制効果を示すが、生存率の改善を指標としたin vivoでのCML治療効果については限定的である可能性がある。しかし、TEW-7197をポナチニブと併用することにより、ポナチニブを単独投与した場合よりも、さらにCML幹細胞の増殖を抑制し得るので、ポナチニブ抵抗性のCML幹細胞の出現を顕著に抑制することができ、それによりポナチニブの治療効果をさらに高めることができる。従って、従来極めて難治性であったT315I変異BCR-ABL発現CMLに対して、本発明の併用剤は特に有効である。
また、TEW-7197は、がん微小環境を模倣した培養条件下で、単独投与及びポナチニブとの併用投与のいずれにおいても優れたCML幹細胞の増殖抑制効果を奏する。がん微小環境（ニッチ細胞）から産生されるTGF-βは、CML幹細胞の生存及びイマチニブ抵抗性の獲得に寄与していると考えられるので、本発明の併用剤は、CML幹細胞でのBCR-ABLに関与しないシグナル伝達経路の活性亢進に基づくイマチニブ抵抗性CMLに対しても、特に有効な治療薬となり得る。
【００３４】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。
【参考例１】
【００３５】
TKIとの併用治療におけるTEW-7197の投与方法の検討
CML発症マウスに対するTKIとTEW-7197の併用治療において、最も有効なTEW-7197の併用投与の方法を検討した。
BCR-ABL1-GFP遺伝子を導入した造血幹細胞を移植してCMLを発症したマウスに対して、
1) 移植8日後からイマチニブ(ノバルティス社製、100mg/kg/日)とTEW-7197 (5 mg/kg/日)の連日投与による併用治療(図１)、
2) 移植8日後からイマチニブ(100mg/kg/日)、加えて移植15日後からTEW-7197 (2.5 mg/kg/日)の連日投与による併用治療(図２)、並びに
3) 移植8日後からイマチニブ(100mg/kg/日)、加えて移植15日後からTEW-7197 (2.5 mg/kg/3日)の3日に一回投与による併用治療(図３)
による治療効果を解析した。
その結果、イマチニブとTEW-7197の同日投与開始による治療（図１）と比較して、イマチニブ投与開始7日後のTEW-7197の遅延投与ではCMLの再発を改善させる効果が認められた(図２)。さらに、イマチニブ投与開始7日後のTEW-7197遅延投与において、TEW-7197の連日投与(図２)と比較して、TEW-7197の3日に一回投与(図３)によって、CMLの再発を有効に抑制できることが明らかとなった。
このTKIとの併用治療におけるTEW-7197の投与開始時期の遅延、並びに投与回数の減少による併用治療効果の向上は想定外の結果である。このような併用治療効果が得られた理由として、TEW-7197はCML幹細胞から成熟CML細胞への分化を促進する効果を有することが想定され、TEW-7197治療に先だってTKI治療を行うことで、TKIとTEW-7197の併用効果を相乗的に高めることが考えられる。さらに、TKIとTEW-7197の併用治療期間中においても、CML幹細胞の抑制効果(すなわち、成熟CML細胞への分化促進効果)は、3日に一回の投与で、充分な治療効果をあげられると考えられる。
以上の結果より、以下のポナチニブとTEW-7197とのin vivo併用投与試験においては、イマチニブ(100mg/kg/日)をポナチニブ(100mg/kg/日)に置き換える以外は、上記3)の投与プロトコルを採用することとした。
【実施例１】
【００３６】
in vitroでのマウスTKI耐性CML幹細胞に対するTEW-7197の効果 
in vitroにおいて、生体内でCML幹細胞を支持する微小環境を模倣して、TEW-7197の抑制効果、並びにTEW-7197とポナチニブとの併用効果の解析を行うため、マウス間葉系細胞株OP-9細胞との共培養実験によりTKI耐性マウスCML幹細胞の維持に及ぼす影響を解析した。
まず、マウス間葉系細胞株OP-9細胞100,000細胞を24ウェルプレートで１日間単層培養した。この細胞上にTKI耐性マウスCML幹細胞（T315I変異BCR-ABL1-GFP+cKit+lineage-Sca1+（KLS）CML-MPPs（Naka K, et al. Nature. 2010;463:676-680））1,000細胞を加えた。さらに、この培養液にTEW-7197 (MedPacto社より供与、最終濃度5 μM) を添加し、3日間、3%酸素濃度条件下、37℃で培養を行った。同様に、対照として、メシル酸イマチニブ (Axon Medchem社より購入、最終濃度1 μM) を添加し、3日間、3%酸素濃度条件下、37℃で培養を行った。
【００３７】
上述のTEW-7197またはメシル酸イマチニブの処理を行ったT315I変異CML細胞を回収し、リン酸緩衝液を用いて残存する阻害剤を洗浄後、メチルセルロース半固形培地（GFM3434; Stem cell technology社製）中で、3%酸素濃度条件下、37℃で一週間培養して、コロニー形成能を評価した。
その結果、想定通り、イマチニブ処理はTKI耐性マウスCML幹細胞のコロニー形成能の抑制効果を認めなかった。一方、TEW-7197はTKI耐性マウスCML幹細胞に対する抑制効果が認められた（図４Ａ）。
【実施例２】
【００３８】
in vitroでのマウスCML幹細胞に対するTEW-7197とポナチニブとの併用効果
TKI耐性マウスCML幹細胞に対するTEW-7197とポナチニブとの併用効果の解析を行うため、上述のマウス間葉系細胞株OP-9細胞上でマウスCML幹細胞の共培養を実施した。
まず、マウス間葉系細胞株OP-9細胞100,000細胞を24ウェルプレートで1日間単層培養した。この細胞上にTKI耐性マウスCML幹細胞1,000細胞（ポナチニブを処理しないウェル）、または3,000細胞（ポナチニブを処理するウェル）を加えた。この培養液に最終濃度5 μMでTEW-7197を添加し、1日間3%酸素濃度条件下、37℃で培養した。さらに、この培養液に最終濃度1 μMでポナチニブ (Selleck Chemicals社製) を添加し、2日間、3%酸素濃度条件下、37℃で培養した（併せて3日間）。細胞を回収し、リン酸緩衝液を用いて残存する阻害剤を洗浄後、メチルセルロース半固形培地（GFM3434; Stem cell technology社製）中で、3%酸素濃度条件下、37℃で一週間培養して、コロニー形成能を評価した。
その結果、ポナチニブとTEW-7197との併用は、ポナチニブの単独投与に比べてコロニー形成能を抑制した（図４Ｂ）。則ち、TEW-7197はTKI耐性CML幹細胞に対して抑制効果を有していると考えられる。
【実施例３】
【００３９】
in vivoでのTKI耐性マウスCML幹細胞に対するTEW-7197とポナチニブとの併用効果
マウス生体内での、TEW-7197のTKI耐性CML幹細胞に対する治療効果を解析するため、T315I CMLを発症したマウスに対して、TEW-7197の単独投与、ポナチニブの単独投与、並びにTEW-7197とポナチニブの併用投与を行って、マウスの生存期間、及び治療終了後の再発の評価を行った。
上述のT315I BCR-ABL1-GFP遺伝子を導入した造血幹細胞を移植してTKI耐性のCMLを発症したマウスに対して、移植8日後から60日後まで、コントロール投与(人工胃液；900 ml二回蒸留水、 2.0 g NaCl、 7 ml conc. HCl、 3.2 g pepsin含有)、またはポナチニブ（15 mg/kg/日, AP24534, Selleck Chemicals社製）(人工胃液に溶解)の経口投与を行った。これらのポナチニブ投与マウスを2群に分け、1群には200 μlの人工胃液、もう1群にはTEW-7197(0.2 mg/ml)を含む200 μl人工胃液を、TEW-7197最終濃度2.5 mg/kg/3日で、移植後15日目から60日まで3日毎に経口投与した。これらマウスの生存期間、及びポナチニブ投与後のポナチニブ抵抗性の再発を、移植後100日まで解析した。この解析により、ポナチニブに抵抗性TKI耐性CML幹細胞の維持におけるTEW-7197投与の治療効果を検討した。
その結果、TEW-7197とポナチニブの併用投与群では、ポナチニブ単独投与群に比べて、ポナチニブ治療終了後のCMLの再発が改善した（図５）。従って、TEW-7197はin vivoにおいてポナチニブ抵抗性のCML幹細胞に対する抑制効果を有しており、ポナチニブの治療効果を増強できると考えられる。
【実施例４】
【００４０】
in vivoでのTKI耐性CML幹細胞に対するTEW-7197の効果
マウス生体内で、TKI耐性CML幹細胞に対するTEW-7197の治療効果、並びにポナチニブに対して抵抗性を示すTKI耐性CML幹細胞への抑制効果を解析するため、T315I CMLを発症したマウスに対して、TEW-7197の単独投与、並びにTEW-7197とポナチニブの併用投与を行って、残存するTKI耐性CML幹細胞の評価を行った。
上述のT315I BCR-ABL1-GFP遺伝子を導入したTKI耐性CML発症マウスに対して、移植8日後から30日後まで、ポナチニブ（15 mg/kg/日, AP24534, Selleck Chemicals社製）の経口投与を行った。このポナチニブ投与マウスを2群に分け、1群には200 μlの人工胃液 (900 ml二回蒸留水、 2.0 g NaCl、 7 ml conc. HCl、 3.2 g pepsin含有)、もう1群にはTEW-7197(0.2 mg/ml)を含む200 μl人工胃液を、TEW-7197最終濃度2.5 mg/kg/3日で、移植後15日目から30日まで3日毎に経口投与した。これらマウスの骨髄から骨髄単核球を分離し、T315I BCR-ABL1を発現するGFP陽性白血病細胞中のKLS細胞の頻度を解析した。
その結果、TEW-7197を投与したマウスではT315I BCR-ABL1発現KLS細胞の頻度が著しく低下していた (図６Ａ上段右、図６Ｂ左から2番目の棒グラフ)。則ち、TEW-7197単剤投与によりTKI耐性CML幹細胞を治療できると考えられる。実施例３では、TEW-7197単剤投与によるマウスの生存率の改善は限定的であり、投与終了後においては未治療群と同等であったことを考慮すると、この結果は予想外のことである。TEW-7197は成熟CML細胞を抑制しない可能性が想定され、既にTKI耐性CML幹細胞から分化が進行したCML細胞の増殖など、TKI耐性CML幹細胞の維持以外の何らかの要因が生存率の改善を妨げたものと考えられる。
一方、ポナチニブ単独投与群では、T315I BCR-ABL1発現KLS細胞が残存したことから、ポナチニブ抵抗性のTKI耐性CML幹細胞が存在しており、この細胞を排除できないと考えられる (図６Ａ下段左、図６Ｂ左から3番目の棒グラフ)。
しかし、TEW-7197とポナチニブ併用投与群では、ポナチニブ単独投与群に比べて、残存するポナチニブ抵抗性のTKI耐性CML幹細胞が減少した (図６Ａ下段右、図６Ｂ左から4番目の棒グラフ)。従って、TEW-7197はin vivoにおいてポナチニブ抵抗性のTKI耐性CML幹細胞の出現を抑制する効果を有しており、それによりポナチニブの治療効果を増強できると考えられる。
【実施例５】
【００４１】
TEW-7197との併用によるポナチニブ投与量の減少効果
TKI耐性CML発症マウスの治療において、ポナチニブ単独投与と比較し、TEW-7197とポナチニブの併用投与を行うことで、ポナチニブの投与量を抑制できないか検討した。TKI耐性CML発症マウスに、ポナチニブ(15mg/kg/日) 単独投与、並びにポナチニブ (3mg/kg/日)とTEW-7197 (2.5mg/kg/3日)の併用投与を行い、生存期間を解析した。
上述のT315I BCR-ABL1-GFP遺伝子を導入した造血幹細胞を移植してTKI耐性のCMLを発症したマウスに対して、移植8日後から60日後まで、1) コントロール投与(人工胃液；900 ml二回蒸留水、 2.0 g NaCl、7 ml conc. HCl、 3.2 g pepsin含有)、2) ポナチニブ（15 mg/kg/日, AP24534, Selleck Chemicals社製）(人工胃液に溶解)、 並びに3) ポナチニブ（3 mg/kg/日）の経口投与を行った。さらに、移植後15日目から60日まで、1) コントロール投与マウス、及び 2) ポナチニブ(15mg/kg/日) 投与マウスには200 μlの人工胃液、3) ポナチニブ（3 mg/kg/日）投与マウスにはTEW-7197(2.5 mg/kg/3日)を追加で経口投与を行った。これらマウスの生存期間、及びポナチニブ投与後のポナチニブ抵抗性の再発を、移植後100日まで解析した。この解析により、TEW-7197併用投与によるポナチニブ投与量の低減効果を検討した。
その結果、ポナチニブ(15mg/kg/日)単独投与群とTEW-7197とポナチニブ(3mg/kg/日)の併用投与群のマウスの生存期間に有意差は認められなかった（図７）。従って、TEW-7197はポナチニブの治療効果を増強し、それによってポナチニブの投与量を減少することができると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
TEW-7197投与によれば、ポナチニブ治療によれば根絶できないポナチニブ抵抗性のTKI耐性CML幹細胞（T315I変異BCR-ABL1発現CML幹細胞を含むTKI抵抗性CML幹細胞）を、効率よく排除することができる。従って、TEW-7197とポナチニブとの併用により、より治療奏功性を高めることができ、CMLの再発の予防効果をもたらすとともに、ポナチニブの投与量を低減することができ、副作用を軽減させる点できわめて有用である。さらに、これまで有効な治療方法の確立されていない再発CML患者に対する新たな治療方法となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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