(57)【要約】【課題】化学的に不活性であると共に、良好な生体適合性を示し、さらに近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体を提供する。【解決手段】可視領域に発光性を持つ金ナノ粒子と、可視領域に発光性を持たない金ナノ粒子と、前記２種の金ナノ粒子を複合する熱応答性高分子とを有する金ナノ粒子複合体により上記課題を解決する。可視領域に発光性を持つ前記発光性金ナノ粒子は、チオールが表面結合したものであり、可視領域に発光性を持たない前記金ナノ粒子は、チオールで被覆されていない金ナノ粒子であることが好ましい。また、熱応答性高分子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリロイルトリエチレンテトラミン）であることが好ましい。【選択図】図１
2016210853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体であって、可視領域に発光性を持つ金ナノ粒子と、可視領域に発光性を持たない金ナノ粒子と、前記２種の金ナノ粒子を複合する熱応答性高分子とを有することを特徴とする金ナノ粒子複合体。
【請求項２】
可視領域に発光性を持つ前記発光性金ナノ粒子は、チオールが表面結合したものであり、可視領域に発光性を持たない前記金ナノ粒子は、チオールで被覆されていない金ナノ粒子である、請求項１に記載の金ナノ粒子複合体。
【請求項３】
前記熱応答性高分子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリロイルトリエチレンテトラミン）である、請求項１又は２に記載の金ナノ粒子複合体。
【請求項４】
前記熱応答性高分子が、下記化学式２で表されるポリマーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の金ナノ粒子複合体（式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。）。
【化１】
2016210853.tif 000011
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体に関し、さらに詳しくは、可視領域に発光性を持つ金ナノ粒子と、可視領域に発光性を持たない金ナノ粒子と、それらを複合させる高分子とで構成されてなる、近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
金ナノ粒子は、バルクでは見られなかった新しい物性と構造を持っている古くから研究されているナノ粒子であり、ステンドグラスや陶器の無鉛赤色絵具や無機塗料顔料として利用されてきた。こうした金ナノ粒子については、例えば、非特許文献１では、粒径約１３ｎｍ前後の金ナノ粒子にポリアミノ基を有する熱応答性高分子を被覆して凝集状態とすること、及びその凝集状態に熱刺激を与えることにより再び分散状態に戻ること（再分散現象）が報告されている。また、非特許文献２では、金ナノ粒子を種粒子として金(III)イオンを還元し、粒径が５０ｎｍを超える金ナノ粒子やロッド状の金ナノ粒子を作製する方法が提案されている。
【０００３】
また、非特許文献３，４では、可視領域に発光を示す金ナノ粒子が提案されている。これまで報告されている金ナノ粒子は、６５０ｎｍ付近の可視領域に発光バンドを示している。しかし、こうした可視領域の光は、生体透過性に乏しく、生体内部にある癌細胞等の染色には適用できないという難点があった。
【０００４】
ところで、近赤外領域の光は、生体透過性が高く、医療分野で盛んに利用されてきている。これまでは、近赤外領域で発光する無機ナノ粒子として化合物半導体ナノ粒子（量子ドットと呼ばれている。）が知られているだけであった。しかし、化合物半導体ナノ粒子の多くは、セレンやカドミウムといった有害元素から構成されているため、医療分野への応用が困難であった。
【０００５】
なお、特許文献１は、本出願人の関連する技術であり、ドラッグデリバリーシステムや蛍光センサー等に用いられる新規な金ナノ粒子複合体を提案したものである。この技術は、表面に薬剤を吸着した金ナノ粒子と、その金ナノ粒子を被覆してなる熱応答性高分子とを有する金ナノ粒子複合体であり、この金ナノ粒子複合体は、グルタチオン等のチオール化合物の共存下においてのみ熱刺激により薬剤を放出し、ねらった部位で薬物を的確に放出できるドラッグデリバリーシステムを構築することができるというものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T.Shimada,  K.Ookubo,  N.Komuro,  T.Shimizu,  N.Uehara,  Langmuir,  23,  11225-11232(2007)．
【非特許文献２】Liao,H.W;  Hafner,J.H.,  Chem.Mater.,  2005,  17,  4636.
【非特許文献３】J.A.Ho,  H-C Chang,  W-T Su,  Anal.Chem.,  84,  3246-3253(2012).
【非特許文献４】K.B.Male,  J.Li,  C.C.Bun,  S-C Ng,  J.H.T.Luong,  J.Phys.Chem.,  C2008,  112,  443-451.
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１２−１８０３０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記した金ナノ粒子は、表面プラズモン共鳴による優れた発色特性及び良好な生体適合性を示すことから、金ナノ粒子を用いる生体関連物質のＳＰＲセンサーや比色センサーが盛んに研究されている。こうした金ナノ粒子は、その粒子サイズが２ｎｍを下回ると、発光特性が発現することが見出されている。そうした金ナノ粒子は、良好な生体適合性に加えて、有機蛍光分子にはない耐光性、化学的不活性性、長寿命等の特性を備えており、医療分野における発光プローブやイメージング材料としての応用が期待されている。しかしながら、これまでに報告されている金ナノ粒子の発光波長は生体透過性に乏しい可視域に位置しており、ｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングには適さない。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるイメージングを効果的に行うためには、生体透過性が良好である近赤外光を発する金ナノ粒子が必要とされている。
【０００９】
本発明は、こうした要請に応えるために成し得たものであって、その目的は、生体透過性が良好な近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するための本発明に係る金ナノ粒子複合体は、近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体であって、可視領域に発光性を持つ金ナノ粒子と、可視領域に発光性を持たない金ナノ粒子と、前記２種の金ナノ粒子を複合する熱応答性高分子とを有することを特徴とする。
【００１１】
この発明によれば、上記した２種の金ナノ粒子と熱応答性高分子とを複合させることにより、近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体を実現できる。この金ナノ粒子複合体は、化学的に不活性であると共に、良好な生体適合性を示し、さらに生体透過性のある近赤外域における発光を示すので、医療分野で応用できる。
【００１２】
本発明に係る金ナノ粒子複合体において、可視領域に発光性を持つ前記金ナノ粒子は、チオールが表面結合したものであり、可視領域に発光性を持たない前記金ナノ粒子は、チオールで被覆されていない金ナノ粒子であることが好ましい。
【００１３】
本発明に係る金ナノ粒子複合体において、前記熱応答性高分子が、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリロイルトリエチレンテトラミン）であることが好ましい。
【００１４】
本発明に係る金ナノ粒子複合体において、前記熱応答性高分子が、下記化学式２で表されるポリマーであることを特徴とする。式中、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、ｎは１〜４である。
【００１５】
【化１】
2016210853.tif 000003
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る金ナノ粒子複合体によれば、化学的に不活性であると共に、良好な生体適合性を示し、さらに近赤外域における発光を示すので、医療分野で応用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係る金ナノ粒子複合体の概略図である。
【図２】可視領域に発光性を持つ金ナノ粒子の発光スペクトル（Ａ）とＴＥＭ像（Ｂ）の一例である。
【図３】可視領域に発光性を持たない金ナノ粒子の消光スペクトル（Ａ）とＴＥＭ像（Ｂ）の一例である。
【図４】ポリマーを添加しない場合と、添加した場合（本発明に係る金ナノ粒子複合体）の発光スペクトルの一例である。
【図５】加熱処理（加熱：９０℃、３０分→２０℃、３０分）を１回施すことで、８４０ｎｍにおける発光強度の著しい増加が観測された例を示すグラフである。
【図６】本発明に係る金ナノ粒子複合体による発光のモデルである。
【図７】本発明に係る金ナノ粒子複合体と培養したＨｅｌａ細胞の位相差イメージ及び蛍光イメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明に係る金ナノ粒子複合体について、図面を参照しつつ説明する。
【００１９】
［金ナノ粒子複合体］
本発明に係る金ナノ粒子複合体は、近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体であって、図１の概略図に示すように、可視領域に発光性を持つ金ナノ粒子（以下、可視領域発光性金ナノ粒子という。）と、可視領域に発光性を持たない金ナノ粒子（以下、可視領域非発光性金ナノ粒子という。）と、それら２種の金ナノ粒子を複合する熱応答性高分子とを有する。この金ナノ粒子複合体は、２種の金ナノ粒子と熱応答性高分子とを複合させることにより、近赤外領域に発光を示す金ナノ粒子複合体である。この金ナノ粒子複合体は、化学的に不活性であると共に、良好な生体適合性を示し、さらに生体透過性のある近赤外域における発光を示すので、医療分野で応用できる。以下、各構成要素について説明する。
【００２０】
（金ナノ粒子）
金ナノ粒子として、可視領域発光性金ナノ粒子と可視領域非発光性金ナノ粒子とを用いる。金ナノ粒子は無機ナノ粒子の一種であり、その粒子サイズは数ｎｍ〜１００ｎｍ程度のものを指している。金ナノ粒子は、量子効果により発現した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が顕著であり、分散状態では赤色、凝集状態では青色を呈している。このような特徴を有する金ナノ粒子は、その粒子サイズが２ｎｍを下回ると、可視領域での発光特性が発現する。この２ｎｍという粒子サイズを境として、光学的特性が大きく変化する。
【００２１】
粒子径が数十ナノメートルの金ナノ粒子は、表面プラズモン共鳴に起因する消光バンドを有している。この消光バンドは、粒子サイズが小さくなるにつれて、ブルーシフトを起こす。そして、その粒子サイズが電子のフェルミ波長と同程度の２ｎｍになると、表面プラズモン共鳴に起因する消光バンドは消滅し、エネルギー準位が離散することにより、発光特性が発現する。可視領域発光性金ナノ粒子の発光波長は、粒子を構成する金原子の個数によって異なる。一例として、８個又は２５個の金原子から構成される可視領域発光性金ナノ粒子は、およそ、４５０ｎｍ又は６５０ｎｍにそれぞれ発光バンドを示す。まお、図３に示す可視領域発光性金ナノ粒子は、６５０ｎｍに発光を示すものである。
【００２２】
可視領域発光性金ナノ粒子の調製法としては、グルタチオン（「ＧＳＨ」と略す。）やウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」と略す。）等の生体関連物質を用いる手法が挙げられる。これらの手法においては、ＧＳＨ又はＢＳＡが金イオンの還元及び形成した金ナノ粒子の保護という二種類の役割を果たしており、特別な還元剤や保護剤を添加する必要がない。そのため、これらの可視領域発光性金ナノ粒子は、生体適合性が極めて良好である。加えて、可視領域発光性金ナノ粒子は、耐光性、化学的不活性性、長寿命等の無機ナノ粒子特有の特性を備えており、医療分野における発光プローブやイメージング材料としての応用が可能であり、生物学的アプリケーションへの応用も可能である。こうした特徴を活かした例としては、ＢＳＡを用いて調製した可視領域発光性金ナノ粒子を用いるｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍のイメージングや、肝臓及び脾臓等の細網内皮系へ過度の吸収を抑制して効果的に目的の腫瘍部位に蓄積させること等が提案されているが、いずれの場合も、可視領域発光性金ナノ粒子の発光波長はおよそ７００ｎｍであり、生体透過性はそれほど高くない。
【００２３】
本発明の特徴は、生体透過性が高く、より高効率なイメージングに利用できるように、近赤外光を発する金ナノ粒子複合体を提供するものであり、サイズの異なる２種の金ナノ粒子、すなわち、可視領域発光性金ナノ粒子と可視領域非発光性金ナノ粒子とを用いていることにある。可視領域発光性金ナノ粒子は、２ｎｍ未満で且つ可視領域に発光性を示す金ナノ粒子であり、可視領域非発光性金ナノ粒子は、２ｎｍ以上で且つ可視領域に発光性を示さない金ナノ粒子である。
【００２４】
特に、可視領域発光性金ナノ粒子が、チオール、特にグルタチオン（ＧＳＨ）が表面結合したものであり、可視領域非発光性金ナノ粒子が、チオールで被覆されていない金ナノ粒子であることが好ましい。
【００２５】
これら２種の金ナノ粒子の形状は特に限定されず、種々の形状のものを用いることができるが、粒形状又は球形状であることが望ましい。なお、金ナノ粒子の粒径は、その調製方法に依存し、各種の粒径のものを得ることができることから、その調製方法により、２ｎｍ未満で且つ可視領域に発光性を示す可視領域発光性金ナノ粒子と、２ｎｍ以上で且つ可視領域に発光性を示さない可視領域非発光性金ナノ粒子とを得ることができる。なお、可視領域発光性金ナノ粒子は、１ｎｍ以上、２ｎｍ未満の範囲内であることが好ましく、１．２ｎｍ以上、１．８ｎｍ以下の範囲内であることがより好ましい。また、可視領域非発光性金ナノ粒子は、２ｎｍ以上、８ｎｍ以下の範囲内であることが好ましく、４ｎｍ以上、６ｎｍ以下の範囲内であることがより好ましい。こうした粒径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）での観察結果から求めることができる。
【００２６】
サイズの異なる各金ナノ粒子は、金ナノ粒子溶液として調製することができる。この金ナノ粒子溶液の調製は、クエン酸ナトリウム還元により行うことができ、具体的には、所定量のテトラクロロ金酸水溶液に、クエン酸三ナトリウム水溶液を添加して調製する例を挙げることができる。また、市販の所定の大きさからなる金ナノ粒子を用いてもよい。サイズのコントロールは、還元に用いるクエン酸ナトリウムの濃度を調整することによって行うことができるので、上記した、２ｎｍ未満で且つ可視領域に発光性を示す可視領域発光性金ナノ粒子と、２ｎｍ以上で且つ可視領域に発光性を示さない可視領域非発光性金ナノ粒子とを容易に調製することができる。
【００２７】
また、テトラヒドロホウ酸ナトリウム溶液を用いる方法等で製造することができる。具体的には、塩化金酸溶液にポリオキシエチレン溶液を添加した後に水を加え、ｐＨ調整した後にＮａＢＨ４（テトラヒドロホウ酸ナトリウム）溶液を添加し、その後反応させて合成することができる。なお、ポリオキシエチレン溶液としては、テトラエチレングリコール等を挙げることができる。こうした合成方法においては、サイズのコントロールは、ＮａＢＨ４の濃度、及び、ポリオキシエチレンの種類とその濃度を調整することによって行うことができるので、上記した、２ｎｍ未満で且つ可視領域に発光性を示す可視領域発光性金ナノ粒子と、２ｎｍ以上で且つ可視領域に発光性を示さない可視領域非発光性金ナノ粒子とを容易に調製することができる。
【００２８】
（熱応答性高分子）
熱応答性高分子としては、少なくともＮ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマー、ポリ（メチルビニルエーテル）、又はヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
【００２９】
熱応答性高分子のうち、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド類を構成単位として含むポリマーの例としては、下記一般式１〜６に記載のものを例示することができる。
【００３０】
【化２】
2016210853.tif 000004
【００３１】
上記化学式１のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）類である。化学式１において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。ｎは１０００〜１０００００の整数である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ３を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）は「Ｐ−ＮＩＰ」で表す。
【００３２】
【化３】
2016210853.tif 000005
【００３３】
上記化学式２のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）類である。化学式２において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、好ましくは９０／１０〜８５／１５の範囲である。ｎは１〜４である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。
【００３４】
化学式２のポリマーの右側の側鎖は、エチレンイミン鎖の繰り返し単位を含むアクリロイルアミン（以下、ＡＣという。）である。より具体的には、右側の側鎖のエチレンイミン鎖の繰り返し単位であるｎ＝０の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルエチレンジアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＥＤＡ））という。］となり、ｎ＝１の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルジエチレントリアミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＤＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝２の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））という。］となり、ｎ＝３の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルテトラエチレンペンタミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＰＡ））という。］、ｎ＝４の場合には、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルペンタエチレンヘキサミン）［以下、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＰＥＨＡ））という。］となる。特に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリロイルトリエチレンテトラミン）であることが好ましい。
【００３５】
【化４】
2016210853.tif 000006
【００３６】
上記化学式３のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−シスタミン）類である。化学式３において、Ｒ１とＲ２及びＲ７とＲ８はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４及びＲ５とＲ６はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙ／ｚは９５／２．５／２．５〜８０／１０／１０である。Ｒ１とＲ２及びＲ７とＲ８をメチル基とし、Ｒ３とＲ４及びＲ５とＲ６を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−Ｃｙｓ」で表す。
【００３７】
【化５】
2016210853.tif 000007
【００３８】
上記化学式４のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アラニン）類である。化学式４において、Ｒ１とＲ２及びＲ５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９０／１０〜８０／２０である。Ｒ１とＲ２及びＲ５をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＡＣ」で表す。
【００３９】
【化６】
2016210853.tif 000008
【００４０】
上記化学式５のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−グリシジルメタクリル酸−乳酸）類である。化学式５において、Ｒ１とＲ２及びＲ５はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に水素又はメチル基、好ましくは水素を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜８０／２０である。Ｒ１とＲ２及びＲ５をメチル基とし、Ｒ３とＲ４を水素としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−アミン）は「ｐＮＩＰ−ＧＭＡ−乳酸」で表す。
【００４１】
【化７】
2016210853.tif 000009
【００４２】
上記化学式６のポリマーは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−（メタ）アクリル酸）類である。化学式６において、Ｒ１とＲ２はそれぞれ独立にアルキル基、好ましくは炭素数１〜４程度の直鎖状のアルキル基、より好ましくはメチル基を表す。Ｒ４は水素又はメチル基を表す。また、ｘ／ｙは９５／５〜７０／３０であり、好ましくは９０／１０〜８５／１５の範囲である。Ｒ１とＲ２をメチル基とし、Ｒ４をメチル基としたポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−メタクリル酸）は「ｐＮＩＰ−ＭＡ」で表す。
【００４３】
なお、この化学式６で表されるポリマーのように、カルボキシル基等のアニオン基を含む熱応答性高分子は、前述の特許文献１に記載の金ナノクラスターと熱応答性高分子との混合溶液から金ナノ粒子を調製するという製法には用いることができない。
【００４４】
また、熱応答性高分子ではないポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリアクリルアミドは、金ナノ粒子を製造できない。
【００４５】
上記化学式１〜６のポリマーの分子量は、重量平均分子量で８０００以上１０００００以下のものを用いることができ、１００００以上２００００以下のものが好ましい。また、各ポリマーは、通常それぞれ単独で用いられるが、２以上を併せて用いてもよい。また、本発明の趣旨の範囲内であれば、上記化学式１〜６のポリマーと同様の効果を奏する他の熱応答性高分子、例えば、ポリ（メチルビニルエーテル）、ヒドロキシプロピルセルロース等を用いてもよい。
【００４６】
上記化学式１〜６のポリマーは、後述する実験例に示す方法で合成することができる。例えば、化学式１のポリマーは、モノマー成分であるＮ−イソプロピルアクリルアミド類を水に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して得ることができる。また、化学式２〜６のポリマーも、重合させるモノマー成分を溶媒に溶解し、重合開始剤と重合促進剤を加えて重合し、生成物を精製し、その後凍結乾燥して各ポリマーを得ることができる。
【００４７】
（金ナノ粒子複合体の調製）
金ナノ粒子複合体は、可視領域発光性金ナノ粒子と、可視領域非発光性金ナノ粒子と、熱応答性高分子とを混合して調製される。好ましい金ナノ粒子複合体は、上記したように、チオール、特にグルタチオン（ＧＳＨ）が表面結合した可視領域発光性金ナノ粒子と、チオールで被覆されていない可視領域非発光性金ナノ粒子と、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−アクリロイルトリエチレンテトラミン）からなる熱応答性高分子とを混合して調製したものである。
【００４８】
混合溶液には、可視領域発光性金ナノ粒子が４×１０−４質量％以上１．６×１０−３質量％以下の範囲で含まれることが好ましく、可視領域非発光性金ナノ粒子が６×１０−４質量％以上２．４×１０−３質量％以下の範囲で含まれることが好ましい。また、熱応答性高分子は、使用する熱応答性高分子の種類によっても左右されるが０．０２５質量％以上０．１質量％以下の範囲で含まれることが好ましい。
【００４９】
混合溶液に含有させる熱応答性高分子は、通常、１種の熱応答性高分子であるが、金ナノ粒子複合体を製造することが可能であれば２種以上の熱応答性高分子であってもよい。また、混合溶液のｐＨは含有させる熱応答性高分子の種類にもよるが、通常、４以上８以下の範囲であることが好ましい。
【００５０】
こうして得られた金ナノ粒子複合体は、少なくとも７５０ｎｍ以上８５０ｎｍ以下の範囲の近赤外領域で発光している。また、その生成条件をコントロールすることにより、７００ｎｍ以上８８０ｎｍ以下の広い範囲の近赤外領域での発光を示すことができる。なお、発光する近赤外領域の範囲は、主に、ポリマーの種類とその濃度、添加するチオールの種類と濃度等によって変化し、中でもポリマーの種類の影響により、発光する近赤外領域の範囲をコントロールすることができる。
【００５１】
また、発光強度については、上記混合溶液を加熱することにより変化させることができる。例えば、後述の実施例で示すように、４０℃以上５０℃以下の範囲では加熱処理を繰り返すごとに蛍光強度が高まるという結果が得られている。一方、６０℃以上７０℃以下の範囲では加熱処理が５回から６回までは蛍光強度が高まるが、それ以上の回数加熱処理を行うと蛍光強度が低下するという結果も得られている。また、８０以上９０℃以下の範囲では１回の加熱処理で最大の蛍光強度を示したが、２回以上加熱処理を行うと蛍光強度は減少するという結果も得られている。
【実施例】
【００５２】
以下の実験によって、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５３】
［装置及び試薬］
まず、本実施例において用いた装置及び試薬は以下のとおりである。消光スペクトルの測定には、光路長１ｃｍの石英ガラスセル及び紫外可視分光光度計（日本分光株式会社製のＥＨＣ−７１６型ペルチェセルホルダを搭載した日本分光株式会社製のＶ−５６０型紫外可視分光光度計）を使用した。励起スペクトル及び発光スペクトルの測定には、光路長１ｃｍの四面透過石英ガラスセル及び分光蛍光光度計（日本分光株式会社製のＥＨＣ−５７３Ｔ型ペルチェセルホルダを搭載した日本分光株式会社製のＦＰ−６３００型分光蛍光光度計）を使用した。ｐＨの測定には、ｐＨ−ＭＥＴＥＲ（株式会社堀場製作所製、Ｆ−５３）を使用した。
【００５４】
合成した熱応答性高分子の凍結乾燥には、オイルミストトラップ（アルバック機工株式会社製、ＯＭＴ−０５０Ａ型）を備え付けた油回転真空ポンプ（アルバック機工株式会社製、直結型）、低沸点溶媒用ガラスコンデンサ（５００ｍＬ、東京理化器械株式会社製）を備え付けたユニトラップ（東京理化器械株式会社製、ＵＴ−１０００型）及び水分トラップ（東京理化器械株式会社製、ＣＦＷ−１型）を装備した凍結乾燥機（東京理化器械株式会社製、ＦＤ−５Ｎ型）を使用した。合成した熱応答性高分子の元素分析には、元素分析装置（Ｆｉｓｏｎｓ製、ＥＡ１１０８型）を使用した。合成した金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像の測定には、電界放出型透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製、ＪＥＭ−２１００Ｆ）を使用した。
【００５５】
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ，Ｆｗ：１１３．１６、和光純薬株式会社製）は、ヘキサン（関東化学株式会社製，Ｆｗ：８６．１８）を用いて再結晶してから使用した。トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ，Ｆｗ：１４６．２４）、α，α’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ，Ｆｗ：１６４．２１）、ピロガロール（Ｆｗ：１２６．１１）、ジエチルエーテル、１，４−ジオキサン、ペルオキソ二硫酸カリウム（Ｆｗ：２７０．３２）、水酸化ナトリウム（Ｆｗ：４０．００）、水酸化カリウム（Ｆｗ：５６．１１）、二硫化炭素（Ｆｗ：７６．１４）、還元型グルタチオン（Ｆｗ：３０７．３２）、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ，Ｆｗ：１９４．２３）、テトラヒドロホウ酸ナトリウム（Ｆｗ：３７．８３）及びテトラクロロ金酸四水和物（Ｆｗ：４１１．８５）は、関東化学株式会社製のものを使用した。メタノールは、関東化学株式会社製のものを蒸留して使用した。塩酸は、関東化学株式会社製の原子吸光分析用塩酸を使用した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ，Ｆｗ：１１６．２１）、塩化アクリロイル（ＡＣ，Ｆｗ：９０．５１）及びシリカゲル（４５〜７５ｍｍ）は、和光純薬株式会社製のものを使用した。ＴＥＭ測定に用いるグリッドは、ハイレゾリューションカーボン支持膜（グリッドピッチ：１００ｍｍ、応研商事株式会社製）を使用した。実験に使用する水は、蒸留及びイオン交換した後に、超純水製造装置（抵抗値：１８ＭＷ・ｃｍ、ＯＲＧＡＮＯ製）で精製したものを用いた。
【００５６】
［熱応答性高分子の合成］
＜ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）の合成＞
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰｏｌｙＮＩＰＡＡｍ。「ＰＮＩＰＡＡｍ」と略す。）は、ラジカル重合により合成した。合成手順としては、先ず、５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）３０ｇを秤りとり、水３００ｍＬで溶解した。次いで、脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％ＮａＯＨ溶液１００ｍＬ）を通した窒素をフラスコ内に通気し、窒素雰囲気下で３０分間脱酸素を行った。その後、重合促進剤として、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）１．５ｍＬ及び重合開始剤としてペルオキソ二硫酸カリウム１．０ｇを添加し、氷浴中で窒素雰囲気下において４時間重合した。重合終了後、メタノール１００ｍＬを加えてポリマーを沈殿させた。次いで、析出物を取り出し、メタノール１００ｍＬに溶解した。次いで、この溶液に水１００ｍＬを加え、析出したポリマー取り出して水１００ｍＬに溶解した。この操作を二回繰り返し行うことで、ポリマーを精製した。二回目の精製終了後に、沈殿させたガム状のＰＮＩＰＡＡｍを水に溶解し、凍結乾燥を行った。
【００５７】
［ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）の合成］
ｐｏｌｙ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイルトリエチレンテトラミン）［ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））］についてもラジカル共重合により合成した。トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）をモノマーとして用いる場合、ＴＥＴＡにビニル基を導入する必要があることから、ＴＥＴＡと塩化アクリロイル（ＡＣ）との反応によりアクリロイルトリエチレンテトラミン（ＡＣ−ＴＥＴＡ）を合成した。合成手順としては、先ず、５００ｍＬ三角フラスコに１，４−ジオキサン「Ｘ」ｍＬ及びＴＥＴＡ  「Ａ」ｇをそれぞれ秤りとり、混合した。さらに、１００ｍＬ分液ロートに１，４−ジオキサン「Ｙ」ｍＬを秤りとった。次いで、この分液ロートに塩化アクリロイル（ＡＣ）「Ｂ」ｍＬを加え、混合した。三角フラスコをアイスバスを用いて冷却しながら、分液ロートから塩化アクリロイル溶液をＴＥＴＡ溶液に滴下した。滴下終了後、白色の沈殿を濾別し、少量のメタノールに溶解した。これにＫＯＨ−メタノール溶液を加えて生成したＫＣｌを濾別し、得られたＡＣ−ＴＥＴＡを含む溶液をＮＩＰＡＡｍとの共重合に用いた。なお、「Ａ」、「Ｂ」、「Ｘ」、「Ｙ」については、表１に示す。
【００５８】
【表１】
2016210853.tif 000010
【００５９】
次いで、５００ｍＬ三つ口セパラブルフラスコにモノマーの供給比（ＮＩＰＡＡｍの物質量：ＴＥＴＡの物質量）がモル比で８０：２０、９０：１０、９５：５及び９９：１（ｍｏｌ％）となるように、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）を秤りとり、そこにＡＣ−ＴＥＴＡを含むメタノール溶液を加えた。オイルバスを用いてフラスコを６０℃に加温し、攪拌しながら脱酸素ライン（５ｗ／ｖ％ピロガロール−１０ｗ／ｖ％ＮａＯＨ溶液１００ｍＬ）に通気した窒素をフラスコ内に通気し、窒素雰囲気下で３０分間脱酸素を行った。その後、重合開始剤としてａ，ａ’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）０．８２１１ｇ（０．００５ｍｏｌ）及び重合促進剤として３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）０．５ｍＬを添加し、窒素雰囲気下で４時間重合を行った。重合終了後、生成物を含むメタノール溶液を冷ジエチルエーテルに１滴ずつゆっくり滴下し、攪拌した。これにより析出したガム状の生成物を回収し、再びメタノール約５０ｍＬに溶解した。この精製を２回行った後、得られたポリマーを水に溶解した。その後、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））を含む溶液に対して限外濾過（ＦＷＣＯ：５０００）を行い、未反応モノマー等を排除した後に凍結乾燥を行った。
【００６０】
［可視領域発光性金ナノ粒子］
（合成）
可視領域発光性金ナノ粒子の合成に使用するガラス器具は、全て王水処理し、洗浄及び乾燥したものを用いた。可視領域発光性金ナノ粒子の合成手順としては、先ず、５０ｍＬスクリューバイアル瓶に２．５ｍｍｏｌ／Ｌ塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）溶液（１０ｍＬ）及び２．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタチオン（ＧＳＨ）溶液（１０ｍＬ）を入れ、３２℃で３２時間攪拌した。次いで、この混合溶液に対して２．５ｍｍｏｌ／Ｌグルタチオン溶液（１０ｍＬ）を添加し、６時間インキュベートした。この混合溶液は、透析膜（ＭＷＣＯ：５００−１０００）を用いて水に対して５日間透析を行い、可視領域発光性金ナノ粒子（金濃度：０．１６ｇＡｕ／Ｌ）を得た。
【００６１】
（消光スペクトル、励起スペクトル及び発光スペクトルの測定と結果）
合成した可視領域発光性金ナノ粒子の消光スペクトル、励起スペクトル及び蛍光スペクトルを測定した。ここで、励起スペクトル及び発光スペクトルの測定時には、蛍光波長及び励起波長をそれぞれ、６５５ｎｍ及び３５４ｎｍとした。また、蛍光光度計には分光素子として回折格子が用いられているため、励起スペクトル及び発光スペクトルにおいて、励起光の２次光に相当するスペクトルバンドが観測される。そこで、２次光をカットするために、励起スペクトル及び発光スペクトルの測定時には、５８０ｎｍより短波長の光をカットするシャープカットフィルタＲ−６０を用いた。以降の検討においても同様に、励起スペクトル及び発光スペクトルの測定時にはシャープカットフィルタＲ−６０を用いた。
【００６２】
合成した可視領域発光性金ナノ粒子の発光スペクトルを図２（Ａ）に示す。なお、吸収スペクトルにおいて、金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴に起因する特徴的な消と励起スペクトルは図示しないが、吸収スペクトルでは光バンドは観測されなかった。これは、金ナノ粒子の粒子径がフェルミ波長と同程度の大きさになった際に生じる現象であると考えられる。また、励起スペクトルにおいても、消光スペクトルと類似した励起スペクトルが観測された。
【００６３】
一方、発光スペクトルでは、可視域（６５５ｎｍ）及び近赤外域（８４０ｎｍ）において、発光バンドが観測された。６５５ｎｍにおける発光バンドは、可視領域発光性金ナノ粒子に固有の発光波長であると考えられる。可視領域発光性金ナノ粒子の固有の発光波長は、その金ナノ粒子を構成する金原子の数によって異なり、一例として、８個又は２５個の金原子から構成される可視領域発光性金ナノ粒子は、およそ、４５０ｎｍ又は６５０ｎｍにそれぞれ発光バンドを示すことは知られている。一方、８４０ｎｍにおける発光バンドは、これまでに報告されておらず、従って、８４０ｎｍにおける発光バンドを有する可視領域発光性金ナノ粒子は、これまで報告されているものとは異なる新たなタイプの金ナノ粒子である。
【００６４】
（透過型電子顕微鏡を用いての形態観察）
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、合成した可視領域発光性金ナノ粒子のＴＥＭ像を撮影した。測定に用いるグリッド試料の調製方法を以下に示す。ろ紙上に置いたグリッドに試料溶液１０ｍＬを滴下し、風乾した。同様の操作を３回繰り返し、グリッド試料を調製した。また、測定は加速電圧２００ｋＶで行った。以降の検討においてもグリッド試料の調製及び測定時の加速電圧は同様とした。
【００６５】
透過型電子顕微鏡を用いて、可視領域発光性金ナノ粒子の透過型電子顕微鏡像（ＴＥＭ）像を撮影した結果を図２（Ｂ）に示す。撮影したＴＥＭ像から、合成した可視領域発光性金ナノ粒子は分散状態であることが分かる。また、可視領域発光性金ナノ粒子の平均粒子径を算出した結果、２．２±０．６ｎｍであった（ｎ＝１６５）。
【００６６】
［可視領域非発光性金ナノ粒子］
（合成）
可視領域非発光性金ナノ粒子の合成に使用するガラス器具は、全て王水処理し、洗浄及び乾燥したものを用いた。可視領域非発光性金ナノ粒子の合成手順としては、先ず、１００ｍＬメスフラスコに２．４３ｍｍｏｌ／Ｌ塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）溶液（１０ｍＬ）及び１．０質量％テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）溶液（５０ｍＬ）を秤りとり、水を加えて定容とした。次いで、１．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いて、溶液のｐＨを２．５に調整した。この溶液に対して、０．１０ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロホウ酸ナトリウム（ＮａＢＨ４）溶液１ｍＬ（２００μＬ×５）を添加し、６時間インキュベートした。合成した可視領域非発光性金ナノ粒子溶液中の粒子径の大きな金ナノ粒子は、洗浄したシリカゲルを充填したカラムに通液することで排除し、可視領域非発光性金ナノ粒子（金濃度：０．０１２ｇＡｕ／Ｌ）を得た。
【００６７】
（消光スペクトル、励起スペクトル及び発光スペクトルの測定と結果）
合成した可視領域非発光性金ナノ粒子の消光スペクトル、励起スペクトル及び発光スペクトルを測定した。ここで、励起スペクトル及び発光スペクトルの測定時には、蛍光波長及び励起波長をそれぞれ、８４０ｎｍ及び３１０ｎｍとした。
【００６８】
合成した可視領域非発光性金ナノ粒子の消光スペクトルを図３（Ａ）に示す。なお、励起スペクトル及び発光スペクトルは図示していない。一般的に、粒子径数十ｎｍの金ナノ粒子は可視域（〜５２０ｎｍ）に表面プラズモン共鳴に起因する消光バンドを有している。また、金ナノ粒子の消光バンドは、その粒子径の増大するにつれてレッドシフトすることが報告されている。可視領域非発光性金ナノ粒子は、図３（Ａ）に示すように、紫外域（〜３１０ｎｍ）に消光バンドを示す。また、この可視領域非発光性金ナノ粒子は発光をしなかった。このことから、可視領域非発光性金ナノ粒子の粒子径は数ｎｍであり、可視領域発光性金ナノ粒子と比較して大きいものと推測される。
【００６９】
（透過型電子顕微鏡を用いての形態観察）
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、合成した可視領域非発光性金ナノ粒子のＴＥＭ像を撮影した。図３（Ｂ）は、そのＴＥＭ像である。合成した可視領域非発光性金ナノ粒子は分散状態であり、また、可視領域非発光性金ナノ粒子の平均粒子径を算出した結果、３．９±１．８ｎｍであった（ｎ＝４２３）。
【００７０】
［金ナノ粒子複合体］
水溶性高分子を複合化した可視領域発光性金ナノ粒子に可視領域非発光性金ナノ粒子を添加して金ナノ粒子複合体を調製した。
【００７１】
（近赤外領域での発光）
先ず、０．００８ｇＡｕ／Ｌの可視領域発光性金ナノ粒子溶液１ｍＬを充填した四面透過石英セルに、０．０５質量％水溶性高分子溶液５００ｍＬを添加した。次いで、この混合溶液に０．０１２ｇＡｕ／Ｌの可視領域非発光性金ナノ粒子溶液５００ｍＬを添加した。可視領域非発光性金ナノ粒子を添加した時間を０分とし、規定時間毎に溶液の発光スペクトルを測定した。発光スペクトルの測定時には、励起波長を３５４ｎｍとした。
【００７２】
図４は、ポリマーを添加しない場合の発光スペクトル（図の左側）と、熱応答高分子であるポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−ｃｏ−アクリロイル−トリエチレンテトラミン）｛ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ９９．２６−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ０．７４））｝を添加して調整した金ナノ粒子複合体の発光スペクトル（図の右側）である。ここでは、可視領域発光性金ナノ粒子に対して可視領域非発光性金ナノ粒子を添加し、可視領域発光性金ナノ粒子の発光スペクトルに及ぼす可視領域非発光性金ナノ粒子の影響について検討した。可視領域非発光性金ナノ粒子を添加した後の発光スペクトルの経時変化のグラフ（右図上）と、得られた発光スペクトルにおいて、６５５ｎｍ及び８４０ｎｍにおける発光強度を時間の関数としてプロットしたグラフ（右図下）とに示した。
【００７３】
図４の結果より、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ９９．２６−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ０．７４））を添加して複合化することにより、８４０ｎｍにおける発光強度は、時間の経過に伴い増大し、およそ１２時間後に一定となった。ポリマーを加えない場合の例と比較すると、この結果は、可視領域発光性金ナノ粒子に、ポリマー鎖にアミノ基を有する水溶性高分子（熱応答高分子）を複合化することで、可視領域非発光性金ナノ粒子の添加による消光を抑制することができることを示している。
【００７４】
（加熱処理の効果）
次に、金ナノ粒子複合体の消光スペクトル、励起スペクトル及び発光スペクトル及ぼす加熱処理の影響について検討した。１０ｍＬ遠心沈殿管に０．００８ｇＡｕ／Ｌの可視領域発光性金ナノ粒子溶液１ｍＬ、０．０５質量％ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ９９．２６−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ０．７４））５００ｍＬ及び０．０１２ｇ−Ａｕ／Ｌの可視領域非発光性金ナノ粒子溶液５００ｍＬを順次添加した。この溶液を手振りで振とうした後、溶液の消光スペクトル、励起スペクトル及び発光スペクトルを測定した。励起スペクトルの測定時には、蛍光波長を６５５ｎｍ又は８４０ｎｍとした。また、発光スペクトルの測定時には、励起波長を３５４ｎｍとした。次いで、この金ナノ粒子複合体溶液に対して加熱処理｛加熱（各温度，３０分間）→冷却（２０℃，３０分間）｝を施した後に、再度、溶液の消光スペクトル、励起スペクトル及び発光スペクトルを測定した。この操作を１回とし、与えられる発光スペクトルが一定となるまで同様の操作を繰り返した。検討する加熱温度として、２０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃及び９０℃を選択した。また、加熱温度が２０℃、４０℃、５０℃及び６０℃の条件では分光蛍光光度計に搭載したペルチェセルホルダを、７０℃、８０℃及び９０℃の条件ではウォーターバスそれぞれを利用した。
【００７５】
異なる温度で加熱した金ナノ粒子複合体の励起スペクトル、発光スペクトル及び消光スペクトルの変化を加熱処理温度の条件毎に検討した。その結果、金ナノ粒子複合体に対して加熱処理を施すことで、近赤外域における発光強度が増大したことが確認された。特に４０℃以上６０℃以下の処理温度の条件では、処理回数の増加に伴い、近赤外域における発光強度は増大したことが確認された。また、７０℃以上９０℃以下の処理温度の条件では、近赤外域における発光強度は著しく増大した後に減少したことが確認された。また、消光スペクトルに及ぼす処理温度の影響については、処理温度が７０℃を上回ると５２０ｎｍ付近に吸収バンドが発現した。この原因については、現段階では明確になっていないものの、加熱により不溶化した熱応答性高分子は、溶液温度が相転移温度以下になっても再溶解しなくなったためであると推測される。
【００７６】
図５は、加熱処理（加熱：９０℃、３０分→２０℃、３０分）を１回施すことで、８４０ｎｍにおける発光強度の著しい増加が観測された例を示すグラフである。この図に示すように、特に８０℃及び９０℃の処理温度の条件では、処理回数が２回目以降において、発光スペクトルにおける８４０ｎｍ付近の発光強度の減少が観測された。このことから、２回目以降での発光強度の減少は、ナノプロセッシングにより誘起された粒子径の大きい金ナノ粒子による消光が原因であると考えられる。一連の検討の結果から、加熱処理を行わない場合と比較して、金ナノ粒子複合体に対して加熱処理を施すことで近赤外域における発光強度が増大することが示された。また、処理温度が高温になる程、より短い加熱時間で安定な発光スペクトルが与えられることが確認された。
【００７７】
（発光モデルの考察）
図６は、金ナノ粒子複合体による発光のモデルである。溶液中に存在する可視領域発光性金ナノ粒子は、それぞれの粒子が独立に発光しており、およそ６５０ｎｍに極大発光を示す。この波長における発光バンドは、既に報告されている発光性金ナノ粒子の発光バンドと同一である。この可視領域発光性金ナノ粒子にｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））及び可視領域非発光性金ナノ粒子を順次添加すると、可視領域発光性金ナノ粒子と可視領域非発光性金ナノ粒子とが接近して粒子間での干渉が起こる。その結果として、近赤外域における発光が増感する。金ナノ粒子複合体中では、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））がポリマー鎖中のアミノ基により金ナノ粒子表面と強く相互作用して金ナノ粒子を覆っているため、粒子の凝集及び融合は抑制される。このように、金ナノ粒子複合体においては、ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ））により、可視領域発光性金ナノ粒子と可視領域非発光性金ナノ粒子とが凝集及び融合を起こさない距離で寄り集まった集合体が形成され、その集合体における粒子間の干渉により近赤外域の発光が生じると推測できる。さらに、金ナノ粒子複合体に対して加熱処理を施すことで、近赤外域における発光強度は著しく増大した。これは、金ナノ粒子が寄り集まった集合体における金ナノ粒子の空間的配置が、発光に有利な状態になるためであると考えられる。
【００７８】
以上の結果より、本発明においては、可視領域発光性金ナノ粒子と可視領域非発光性金ナノ粒子とを熱応答性高分子で媒介することで、近赤外域（８４０ｎｍ）において発光を示す金ナノ粒子複合体を得ることができた。なお、発光強度に関しては、金ナノ粒子複合体に対して、加熱処理（加熱：９０℃、３０分→２０℃、３０分）を１回施すことで、８４０ｎｍにおける発光強度の著しい増加が観測された。この金ナノ粒子複合体をＨｅｌａ細胞のイメージングに適用した結果、金ナノ粒子複合体はＨｅｌａ細胞にとり込まれ、細胞内で発光していることが観察された。
【００７９】
［応用］
得られた金ナノ粒子複合体を生物学的アプリケーションに応用するため、金ナノ粒子複合体を蛍光プローブとして用い、ＨｅＬａ細胞のイメージングを行った。イメージングに用いる金ナノ粒子複合体は、５倍スケール（０．００８ｇＡｕ／Ｌの可視領域発光性金ナノ粒子溶液５ｍＬ、０．０１２ｇＡｕ／Ｌの可視領域非発光性金ナノ粒子溶液２．５ｍＬ、０．０５質量％ｐｏｌｙ（ＮＩＰＡＡｍ９８．３−ｃｏ−（ＡＣ−ＴＥＴＡ０．１７））２．５ｍＬで調製した溶液に対して加熱処理（９０℃、３０分→２０℃、３０分）を５回施した後に、減圧濃縮したものを用いた。培地はＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）、培養時間は２４時間、励起フィルターは４００ｎｍ〜４４０ｎｍ、蛍光フィルターは「＞５９０ｎｍ」のものを用いた。減圧濃縮した理由は、金ナノ粒子複合体はイメージングに用いる励起光の波長範囲（４００ｎｍ〜４４０ｎｍ）においては光吸収効率が非常に低く、また、緩衝液を用いて蛍光プローブを培地に展開するため、プローブの濃度が希薄になり、それに伴い観測されるシグナルが非常に微弱となる可能性があるためである。
【００８０】
図７は、金ナノ粒子複合体と培養したＨｅｌａ細胞の位相差イメージ及び蛍光イメージである。これより、細胞から発せられるシグナルは非常に微弱であるものの、金ナノ粒子複合体は細胞内に集積し、発光することが示された。これは、イメージングに用いる励起光の波長範囲（４００ｎｍ〜４４０ｎｍ）においては金ナノ粒子複合体の光吸収効率が非常に低いためであると推測される。また、濃縮及び培養操作において、金ナノ粒子複合体中のナノ粒子の凝集が観測された。この凝集により、消光が進行した可能性がある。この凝集を抑制するためには、グルタチオンの添加が有効であると考えられる。
【００８１】
金ナノ粒子複合体は特別な改質をすることなく、癌細胞に取り込まれた。これは、ＥＰＲ効果によるものであると考えられる。ＥＰＲ効果とは、腫瘍組織では、正常組織に比べ血管透過性高分子や微粒子が血管から流出しやすい一方で、リンパ系が発達していないために、腫瘍組織に到達した物質は効果的に蓄積するという特性である。このように、金ナノ粒子複合体は特別な改質をすることなく、癌細胞のイメージングを行うことができる。加えて、金ナノ粒子複合体において観測される発光バンドは近赤外域に位置しているため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの造影剤としての利用や生物医学的応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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