(57)【要約】      （修正有）【課題】中枢神経細胞保護剤、及び中枢神経変性疾患の予防又は治療剤の提供。【解決手段】式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグ。2016210738.tif 000008（Ｒ１はＨ、アルキル基、アラルキル基等；Ｒ２は−ＯＲ４又は−ＮＲ５Ｒ６；Ｒ４〜Ｒ６は各々独立に、Ｈ、アルキル基、又はアリール基；Ｒ５及びＲ６がアルキル基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して環構造を形成していてもよい）【選択図】図２
2016210738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有する、中枢神経細胞保護剤。
【化１】
2016210738.tif 000006
（式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、又は−Ｓｉ（Ｒ３）３を示し、Ｒ３はそれぞれ独立に、アルキル基又はアリール基を示す。Ｒ２は、−ＯＲ４又は−ＮＲ５Ｒ６を示し、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、アルキル基、又はアリール基を示す。Ｒ５及びＲ６がアルキル基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して環構造を形成していてもよい。）
【請求項２】
下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有する、中枢神経変性疾患の予防又は治療剤。
【化２】
2016210738.tif 000007
（式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、又は−Ｓｉ（Ｒ３）３を示し、Ｒ３はそれぞれ独立に、アルキル基又はアリール基を示す。Ｒ２は、−ＯＲ４又は−ＮＲ５Ｒ６を示し、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、アルキル基、又はアリール基を示す。Ｒ５及びＲ６がアルキル基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して環構造を形成していてもよい。）
【請求項３】
前記中枢神経変性疾患は、グルタミン酸興奮毒性が関与する疾患である、請求項２に記載の中枢神経変性疾患の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経細胞保護剤、及び中枢神経変性疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸は、中枢神経系における興奮性神経伝達物質の１つであり、興奮性シナプス後電位、長期増強等の現象に関与する。他方、グルタミン酸は、内因性興奮毒としても作用し、過剰に遊離されたグルタミン酸が神経細胞死を誘発することが知られている。グルタミン酸興奮毒性は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の中枢神経変性疾患の危険因子の１つとしても注目されている（例えば、非特許文献１〜６参照）。
【０００３】
グルタミン酸による培養神経細胞の細胞死は、グルタミン酸受容体アンタゴニストの添加により減少する。このことは、グルタミン酸受容体及びその下流の機構が活性化することによってグルタミン酸興奮毒性が引き起こされることを示唆している。したがって、グルタミン酸受容体アンタゴニストは、グルタミン酸興奮毒性が関与する中枢神経変性疾患の治療剤の候補化合物となり得る。
【０００４】
しかし、グルタミン酸受容体アンタゴニストは、ヒトにおいて精神異常が発現するという報告や齧歯類において異常な自発運動活性を引き起こすという報告があり、臨床応用はそれほど進んでいない。このため、グルタミン酸興奮毒性に対して保護作用を示す新たな中枢神経保護剤の開発が望まれていた。
【０００５】
一方、シトリニン（citrinin）は、ペニシリウム（Penicillium）属菌、アスペルギルス（Aspergillus）属菌、モナスカス（Monascus）属菌等が産生するマイコトキシンである。シトリニンは、高濃度（例えば、１００μＭ程度）の場合に毒性を示すが、低濃度の場合の薬理作用については解明されていない点が多い。これまで、シトリニン又はその誘導体の薬理作用としては、アルドースレダクターゼに対する阻害活性が知られている（例えば、特許文献１参照）。しかし、シトリニン又はその誘導体が中枢神経細胞に対する保護作用を示すことは知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平４−９３３２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Van Den Bosch et al., Biochimica et biophysica acta, 1762, 1068-1082 (2006)
【非特許文献２】Shaw, C.E. et al., Current neurology and neuroscience reports, 1, 69-76 (2001)
【非特許文献３】Schubert, D. et al., The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience, 21, 7455-7462 (2001)
【非特許文献４】Dong, X.X. et al., Acta pharmacologica Sinica, 30, 379-387 (2009)
【非特許文献５】Blandini, F. et al., Molecular neurobiology, 12, 73-94 (1996)
【非特許文献６】Estrada Sanchez, A.M. et al., Archives of medical research, 39, 265-276 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、シトリニン又はその誘導体を有効成分とする新規な中枢神経細胞保護剤、及び中枢神経変性疾患の予防又は治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための具体的な手段には、以下の実施態様が含まれる。
＜１＞  下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有する、中枢神経細胞保護剤。
【化１】
2016210738.tif 000003
（式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、又は−Ｓｉ（Ｒ３）３を示し、Ｒ３はそれぞれ独立に、アルキル基又はアリール基を示す。Ｒ２は、−ＯＲ４又は−ＮＲ５Ｒ６を示し、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、アルキル基、又はアリール基を示す。Ｒ５及びＲ６がアルキル基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して環構造を形成していてもよい。）
【００１０】
＜２＞  下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグを有効成分として含有する、中枢神経変性疾患の予防又は治療剤。
【化２】
2016210738.tif 000004
（式中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、又は−Ｓｉ（Ｒ３）３を示し、Ｒ３はそれぞれ独立に、アルキル基又はアリール基を示す。Ｒ２は、−ＯＲ４又は−ＮＲ５Ｒ６を示し、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、アルキル基、又はアリール基を示す。Ｒ５及びＲ６がアルキル基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して環構造を形成していてもよい。）
【００１１】
＜３＞  上記中枢神経変性疾患は、グルタミン酸興奮毒性が関与する疾患である、＜２＞に記載の中枢神経変性疾患の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、シトリニン又はその誘導体を有効成分とする新規な中枢神経細胞保護剤、及び中枢神経変性疾患の予防又は治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１（ＭＴＴアッセイ）におけるシトリニンの中枢神経細胞に対する保護作用を示す図である。
【図２】実施例２（核染色アッセイ）におけるシトリニンの中枢神経細胞に対する保護作用を示す図である。
【図３】実施例３（ＭＴＴアッセイ）におけるシトリニンの中枢神経細胞に対する長期毒性を示す図である。
【図４】実施例４におけるシトリニンの興奮性シナプスの数（同図（Ａ））及び抑制性シナプスの数（同図（Ｂ））に対する影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を適用した中枢神経細胞保護剤、及び中枢神経変性疾患の予防又は治療剤の実施形態の一例について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００１５】
＜中枢神経細胞保護剤＞
本実施形態の中枢神経細胞保護剤は、下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又はそれらのプロドラッグ（以下、これらを纏めて「特定化合物」と略記することがある。）を有効成分として含有する。
【００１６】
【化３】
2016210738.tif 000005
【００１７】
上記式（１）中、Ｒ１は、水素原子、アルキル基、アラルキル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、又は−Ｓｉ（Ｒ３）３を示し、Ｒ３はそれぞれ独立に、アルキル基又はアリール基を示す。
【００１８】
Ｒ１がアルキル基である場合、アルキル基の炭素数は１〜２０が好ましい。アルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。また、アルキル基は、環状アルキル部分が含まれていてもよい。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基等が挙げられる。
【００１９】
Ｒ１がアラルキル基である場合、アラルキル基のアリール部分としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。また、アラルキル基のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましい。アルキル部分は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。アラルキル基の具体例としては、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリチル基、フェネチル基、ナフチルメチル基等が挙げられる。
【００２０】
Ｒ１がアルキルカルボニル基である場合、アルキルカルボニル基のアルキル部分の炭素数は１〜１５が好ましい。アルキル部分は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。アルキルカルボニル基の具体例としては、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、２−メチルプロパノイル基、ピバロイル基等が挙げられる。
【００２１】
Ｒ１がアリールカルボニル基である場合、具体例としては、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる。
【００２２】
Ｒ１がアルキルスルホニル基である場合、アルキルスルホニル基のアルキル部分の炭素数は１〜１０が好ましい。アルキル部分は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。アルキルスルホニル基の具体例としては、メチルスルホニル基、エチルスルホニル基、ｎ−プロピルスルホニル基、イソプロピルスルホニル基等が挙げられる。
【００２３】
Ｒ１がアリールスルホニル基である場合、具体例としては、ベンゼンスルホニル基、ナフタレンスルホニル基等が挙げられる。
【００２４】
Ｒ１が−Ｓｉ（Ｒ３）３で表される基である場合、Ｒ３におけるアルキル基の炭素数は１〜６が好ましい。アルキル基は、直鎖状であっても分岐鎖状であってもよい。また、Ｒ３におけるアリール基としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。−Ｓｉ（Ｒ３）３で表される基の具体例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられる。
【００２５】
Ｒ１に含まれるアルキル部分又はアリール部分は、置換基を有していてもよい。
例えば、Ｒ１に含まれるアルキル部分は、置換基として、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）を有していてもよい。
また、Ｒ１におけるアラルキル基のアリール部分は、置換基として、炭素数１〜４のアルキル基、アリール基（フェニル基、ナフチル基等）、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、−ＣＯＯＲ７、−ＯＲ７、−ＮＲ８Ｒ９、又は−ＮＲ１０ＣＯＲ１１を有していてもよい。Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、及びＲ１１はそれぞれ独立に、炭素数１〜１０のアルキル基又はアリール基（フェニル基、ナフチル基等）を示す。
また、Ｒ１におけるアリールカルボニル基及びアリールスルホニル基は、置換基として、炭素数１〜５のアルキル基、ニトロ基、又はトリフルオロメチル基を有していてもよい。
【００２６】
上記式（１）中、Ｒ２は、−ＯＲ４又は−ＮＲ５Ｒ６を示し、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６はそれぞれ独立に、水素原子、アルキル基、又はアリール基を示す。Ｒ５及びＲ６がアルキル基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して環構造を形成していてもよい。
【００２７】
Ｒ４、Ｒ５、又はＲ６がアルキル基である場合、アルキル基の炭素数は１〜１８が好ましい。アルキル基は、直鎖状、分岐鎖状、及び環状のいずれであってもよい。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、シクロペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、シクロヘキシル基等が挙げられる。Ｒ５及びＲ６がアルキル基である場合、Ｒ５とＲ６とが結合して形成される基としては、ピペリジノ基等が挙げられる。また、Ｒ４、Ｒ５、又はＲ６がアリール基である場合、具体例としては、フェニル基、ナフチル基等が挙げられる。
【００２８】
Ｒ２に含まれるアルキル基又はアリール基は、置換基として、ハロゲン原子を有していてもよい。
【００２９】
上記式（１）で表される化合物は、薬理学的に許容される塩の形態であってもよい。例えば、上記式（１）で表される化合物が酸性官能基を有する場合には、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩（カルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモニウム塩などの形態であってもよい。また、上記式（１）で表される化合物が塩基性官能基を有する場合には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩の形態であってもよく、酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩の形態であってもよい。
なお、「薬理学的に許容される塩」には、水、エタノール等の薬理学的に許容される溶媒との溶媒和物も含まれる。
【００３０】
上記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩は、プロドラッグの形態であってもよい。本明細書における「プロドラッグ」とは、生体内において上記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩に変換される化合物を意味する。
上記式（１）で表される化合物がヒドロキシ基を有する場合、プロドラッグとしては、ヒドロキシ基がアシル化、アルキル化、リン酸化、又はホウ酸化された化合物が挙げられる。
また、上記式（１）で表される化合物がカルボキシ基を有する場合、プロドラッグとしては、カルボキシ基がエステル化又はアミド化された化合物が挙げられる。
また、上記式（１）で表される化合物がアミノ基を有する場合、プロドラッグとしては、アミノ基がアシル化、アルキル化、又はリン酸化された化合物が挙げられる。
【００３１】
上記式（１）で表される化合物のうち、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がヒドロキシ基である化合物（シトリニン）は、市販品を入手することができる。また、シトリニン以外の上記特定化合物は、シトリニンを出発原料とし、常法に従ってエーテル化、エステル化、酸アミド化等の工程を経ることによって製造することができる。
【００３２】
上記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩は、中枢神経細胞に対する保護作用を示し、特に、グルタミン酸興奮毒性に基づく神経細胞死を抑制することができる。このため、上記特定化合物を用いることにより、中枢神経細胞保護剤を製造することができる。中枢神経細胞保護剤は、医薬用途に用いるものであってもよく、医薬以外の用途（研究用途等）に用いるものであってもよい。
【００３３】
中枢神経細胞保護剤は、使用態様に応じて、上記特定化合物以外の成分を含有していてもよい。例えば、中枢神経細胞保護剤は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、中枢神経細胞保護剤は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。また、血液脳関門の通過性を向上させるため、中枢神経細胞保護剤は、上記特定化合物がリポソーム等に内包されたものであってもよい。
【００３４】
中枢神経細胞保護剤を医薬用途に用いる場合、中枢神経細胞保護剤の剤形は特に制限されない。中枢神経細胞保護剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
【００３５】
中枢神経細胞保護剤を医薬用途に用いる場合、中枢神経細胞保護剤の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
【００３６】
＜中枢神経変性疾患の予防又は治療剤＞
本実施形態の中枢神経変性疾患の予防又は治療剤は、上記特定化合物を有効成分として含有する。上記特定化合物は中枢神経細胞保護剤の場合と同様であるため、詳細な説明を省略する。
【００３７】
前述したように、上記式（１）で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩は、中枢神経細胞に対する保護作用を示し、特に、グルタミン酸興奮毒性に基づく神経細胞死を抑制することができる。このため、上記特定化合物を用いることにより、中枢神経変性疾患の予防又は治療剤を製造することができる。
なお、「予防」には、中枢神経変性疾患の発症を防ぐことのほか、発症の時期を遅らせることも含まれる。また、「治療」には、中枢神経変性疾患に起因する症状を消失又は軽減させることのほか、症状の進行の度合いを抑制することも含まれる。
【００３８】
中枢神経変性疾患としては、グルタミン酸興奮毒性が関与する疾患が好ましく、具体的には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脳血管障害等の虚血神経障害、小脳失調、エイズ（ＡＩＤＳ）脳症などが挙げられる。
【００３９】
中枢神経変性疾患の予防又は治療剤は、上記特定化合物以外の成分を含有していてもよい。例えば、中枢神経変性疾患の予防又は治療剤は、製剤素材として慣用の有機又は無機の担体を含有していてもよい。この担体は、固形製剤においては、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等として、液状製剤においては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤等として配合される。また、中枢神経変性疾患の予防又は治療剤は、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を含有していてもよい。また、血液脳関門の通過性を向上させるため、中枢神経変性疾患の予防又は治療剤は、上記特定化合物がリポソーム等に内包されたものであってもよい。
【００４０】
中枢神経変性疾患の予防又は治療剤の剤形は特に制限されない。中枢神経変性疾患の予防又は治療剤の剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、トローチ剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、フィルム剤等の経口剤；注射剤、外用剤、坐剤、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）、点眼剤等の非経口剤；などが挙げられる。
【００４１】
中枢神経変性疾患の予防又は治療剤の投与量は、投与対象、投与経路、対象疾患、症状等に応じて適宜決定される。
【００４２】
中枢神経変性疾患の予防又は治療剤を投与対象者に投与することにより、中枢神経変性疾患の予防又は治療方法が提供される。すなわち、上記特定化合物を有効成分として含む医薬組成物を投与することを含む中枢神経変性疾患の予防又は治療方法が提供される。
【実施例】
【００４３】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００４４】
［実施例１：シトリニンの中枢神経細胞に対する保護作用の確認（ＭＴＴアッセイ）］
胎生１８日齢のウィスター系ラットに麻酔を施した後、頭部を切断して脳を取り出し、取り出した脳を氷冷したＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）緩衝塩溶液（Life Technologies Japan製）中に浸漬した。皮質組織をパパイン（Sigma-Aldrich Japan製）で処理し、組織を細分化した後、ポリエチレンイミン（Sigma-Aldrich Japan製）でコートされた９６ウェルプレートに細胞を播種した。そして、３７℃、５体積％ＣＯ２の条件下、Ｂ−２７サプリメント（Life Technologies Japan製）及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Life Technologies Japan製）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies Japan製）中で培養した。
【００４５】
培養開始後１５日目に、シトリニンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したシトリニン溶液を、シトリニンの終濃度が０．１μＭとなるように培地中に添加し、２１時間培養した。その後、グルタミン酸の終濃度が３０μＭとなるように培地中にグルタミン酸水溶液を添加し、更に３時間培養した。このときの培養後の細胞を「シトリニン投与群」とする。また、シトリニン溶液の代わりにシトリニン投与群と同量のＤＭＳＯを添加する対照群と、シトリニン溶液及びグルタミン酸水溶液の代わりにシトリニン投与群と同量のＤＭＳＯ及び水を添加する対照群とを準備した。
【００４６】
その後、シトリニン投与群及び対照群の細胞について、ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット（Millipore製）を用いてＭＴＴアッセイを行った。具体的には、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）を溶解した溶液を、ＭＴＴの終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように培地中に添加し、３７℃、５体積％ＣＯ２の条件下で１時間培養した。その後、培地を除去し、ホルマザンを溶解するために１００μＬのＤＭＳＯを添加した。そして、マイクロプレートリーダー（Molecular Devices製）を用い、対照波長６３０ｎｍとして波長５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞の生存率を求めた。
【００４７】
ＭＴＴアッセイで測定された細胞の生存率を図１に示す。図１において、生存率は「平均値±標準誤差」で示している。ただし、シトリニン溶液及びグルタミン酸水溶液の代わりにＤＭＳＯ及び水を添加した対照群における平均値が１．０となるように、各群の平均値を正規化している。対照群のサンプル数ｎはいずれもｎ＝１８であり、シトリニン投与群のサンプル数ｎはｎ＝１２である。
図１から分かるように、グルタミン酸（３０μＭ）を添加した場合には、グルタミン酸を添加しない場合と比較して細胞の生存率が有意に低下した（ｐ＜０．０１）。しかし、グルタミン酸（３０μＭ）に加えてシトリニン（０．１μＭ）を添加した場合には、シトリニンを添加しない場合と比較して細胞の生存率が有意に上昇した（ｐ＜０．０１）。この結果から、シトリニンは中枢神経細胞に対する保護作用を示すことが分かる。
【００４８】
［実施例２：シトリニンの中枢神経細胞に対する保護作用の確認（核染色アッセイ）］
実施例１と同様にして、胎生１８日齢のウィスター系ラットの脳から細胞を採取し、Ｂ−２７サプリメント（Life Technologies Japan製）及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Life Technologies Japan製）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies Japan製）中で培養した。
【００４９】
培養開始後１５日目に、シトリニンをＤＭＳＯに溶解したシトリニン溶液を、シトリニンの終濃度が０．１μＭとなるように培地中に添加し、２１時間培養した。培地を取り除き、０．０１質量％のＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（（株）同仁化学研究所製）を含有するＰＢＳ溶液で細胞を１分間処理した後、細胞をＰＢＳで洗浄した。取り除いた培地を戻し、グルタミン酸の終濃度が３０μＭとなるように培地中にグルタミン酸水溶液を添加し、更に３時間培養した。このときの培養後の細胞を「シトリニン投与群」とする。また、シトリニン溶液の代わりにシトリニン投与群と同量のＤＭＳＯを添加する対照群と、シトリニン溶液及びグルタミン酸水溶液の代わりにシトリニン投与群と同量のＤＭＳＯ及び水を添加する対照群とを準備した。
【００５０】
その後、０．０５質量％のＰＩ（ヨウ化プロピジウム）（AnaSpec製）を細胞に添加し、１０分間処理した。ＰＩ処理後の細胞をＰＢＳで洗浄し、４質量％のパラホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍのリン酸バッファーで固定化した。固定化された細胞に退色防止剤入りの蛍光法組織染色用水系封入剤（Fluoromount/Plus、Diagnostic BioSystems製）をマウントし、デジタル冷却ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ（CoolSNAP HQ2、Photometrics製）を備えた蛍光顕微鏡（Eclipse TE2000-E、（株）ニコン製）を用いて蛍光像を取得した。ＤＡＰＩで核染色された細胞（ＤＡＰＩ陽性細胞）はグルタミン酸の処理前に死んでいる細胞であるため、細胞数の計測に際して除外した。死細胞は、細胞形状で確認するほか、核がＰＩで染色され、且つ、ＤＡＰＩで染色されていないことを基準として確認した。生細胞は、ＰＩ及びＤＡＰＩのいずれによっても核が染色されていないことを基準として確認した。そして、生細胞数を全細胞数（ＤＡＰＩ陽性細胞を除く）で除することにより、生存率を求めた。
【００５１】
核染色アッセイで測定された細胞の生存率を図２に示す。図２において、生存率は「平均値±標準誤差」で示している。シトリニン溶液及びグルタミン酸水溶液の代わりにＤＭＳＯ及び水を添加した対照群のサンプル数ｎはｎ＝２０であり、シトリニン溶液の代わりにＤＭＳＯを添加した対照群のサンプル数ｎはｎ＝２１であり、シトリニン投与群のサンプル数ｎはｎ＝１２である。
図２から分かるように、グルタミン酸（３０μＭ）を添加した場合には、グルタミン酸を添加しない場合と比較して細胞の生存率が有意に低下した（ｐ＜０．０１）。しかし、グルタミン酸（３０μＭ）に加えてシトリニン（０．１μＭ）を添加した場合には、シトリニンを添加しない場合と比較して細胞の生存率が有意に上昇した（ｐ＜０．０１）。この結果から、シトリニンは中枢神経細胞に対する保護作用を示すことが分かる。
【００５２】
［実施例３：シトリニンの長期曝露による中枢神経細胞に対する毒性の確認（ＭＴＴアッセイ）］
実施例１と同様にして、胎生１８日齢のウィスター系ラットの脳から細胞を採取し、Ｂ−２７サプリメント（Life Technologies Japan製）及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Life Technologies Japan製）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies Japan製）中で培養した。
【００５３】
培養開始後１５日目に、シトリニンをＤＭＳＯに溶解したシトリニン溶液を、シトリニンの終濃度が０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭ、又は１００μＭとなるように培地中に添加し、１４日間培養した。そして、シトリニン溶液の添加後、１日目、２日目、５日目、及び１４日目の時点で、ＭＴＴ細胞増殖アッセイキット（Millipore製）を用いて、実施例１と同様にＭＴＴアッセイを行った。
【００５４】
ＭＴＴアッセイで測定された細胞の生存率を図３に示す。図３において、生存率は「平均値±標準誤差」で示している。ただし、シトリニン溶液の代わりにシトリニン投与群と同量のＤＭＳＯを添加した対照群における平均値が１．０となるように、各群の平均値を正規化している。対照群及びシトリニン投与群のサンプル数ｎはいずれもｎ＝９である。
図３から分かるように、シトリニンが高濃度（１００μＭ）である場合には生存率が有意に低下したが（ｐ＜０．０１）、シトリニンが低濃度（０．１μＭ〜１０μＭ）である場合には生存率は有意な低下を示さなかった。この結果から、シトリニンの濃度が０．１μＭ〜１０μＭの範囲である場合、少なくとも１４日間は中枢神経細胞に対する毒性を示さないことが分かる。
【００５５】
［実施例４：シトリニンによるシナプス結合への影響の確認］
実施例１と同様にして、胎生１８日齢のウィスター系ラットの脳から細胞を採取し、Ｂ−２７サプリメント（Life Technologies Japan製）及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Life Technologies Japan製）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Life Technologies Japan製）中で培養した。
【００５６】
培養開始後１５日目に、シトリニンをＤＭＳＯに溶解したシトリニン溶液を、シトリニンの終濃度が０．１μＭ、１．０μＭ、又は１０μＭとなるように培地中に添加し、２日間培養した。その後、４質量％のパラホルムアルデヒドを含有する０．１Ｍのリン酸バッファーで細胞を固定化し、ＰＢＳで洗浄した後、５質量％の正常ロバ血清を含有する２×ＰＢＳ溶液でブロッキングを行った。ブロッキング後、各サンプルを１次抗体とともに４℃で一晩反応させ、ＰＢＳで洗浄後、２次抗体とともに室温（２５℃）で１時間反応させた。各サンプルをＰＢＳで洗浄後、細胞に退色防止剤入りの蛍光法組織染色用水系封入剤（Fluoromount/Plus、Diagnostic BioSystems製）をマウントし、デジタル冷却ＣＣＤカメラ（SPOT、Diagnostic Instruments製）を備えた蛍光顕微鏡（Eclipse E800、（株）ニコン製）を用いて蛍光像を取得した。
１次抗体としては、マウス抗ｖＧｌｕＴ１抗体（Synaptic Systems）、ウサギ抗ｖＧＡＴ抗体（Synaptic Systems）、又はニワトリ抗ＭＡＰ２抗体（Merck Millipore）を用いた。ｖＧｌｕＴ１は興奮性シナプスのマーカーであり、ｖＧＡＴは抑制性シナプスのマーカーであり、ＭＡＰ２は樹状突起を識別するためのマーカーである。２次抗体としては、Ａｌｅｘａ色素で標識された２次抗体（Life Technologies Japan製）を用いた。
【００５７】
樹状突起２０μｍ当たりの興奮性シナプスの数及び抑制性シナプスの数をそれぞれ図４（Ａ）、（Ｂ）に示す。図４（Ａ）において、シトリニン濃度が０μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭである群のサンプル数ｎは、それぞれｎ＝６７、ｎ＝３６、ｎ＝４３、ｎ＝３８である。また、図４（Ｂ）において、シトリニン濃度が０μＭ、０．１μＭ、１．０μＭ、１０μＭである群のサンプル数ｎは、それぞれｎ＝１１、ｎ＝１７、ｎ＝１５、ｎ＝１４である。
図４（Ａ）、（Ｂ）から分かるように、シトリニンが低濃度（０．１μＭ〜１０μＭ）である場合には、興奮性シナプスの数及び抑制性シナプスの数は有意な変化を示さなかった。この結果から、シトリニンの濃度が０．１μＭ〜１０μＭの範囲である場合、シナプス結合に影響を与えないことが分かる。
【図１】
2016210738.tif 000009
【図２】
2016210738.tif 000010
【図３】
2016210738.tif 000011
【図４】
2016210738.tif 000012