(57)【要約】【課題】ニホンスイセンを原材料とし、優れたメラニン産生抑制作用を有し、メラニン産生抑制剤、美白剤等として化粧料等として適用可能な製剤（メラニン産生抑制剤）を提供する。【解決手段】  ニホンスイセンの花部、該花部より抽出された抽出液、該抽出液を濃縮した抽出エキス、該抽出エキスの分配移行液、該分配移行液より単離される特定構造の化合物又はその塩を有効成分として含むことを特徴とするメラニン産生抑制剤、及び、該分配移行液より単離される新規なフェニルエタノイド配糖体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニホンスイセンの花部、該花部より抽出された抽出液を有効成分として含むことを特徴とするメラニン産生抑制剤。
【請求項２】
下記の構造式（１）で表される化合物：
【化１】
2016141657.tif 000013
、下記の構造式（２）で表される化合物またはその塩：
【化２】
2016141657.tif 000014
、下記の構造式（３）で表される化合物またはその塩：
【化３】
2016141657.tif 000015
、下記の構造式（４）で表される化合物またはその塩：
【化４】
2016141657.tif 000016
、下記の構造式（５）で表される化合物：
【化５】
2016141657.tif 000017
、下記の構造式（６）で表される化合物：
【化６】
2016141657.tif 000018
及び、下記の構造式（７）で表される化合物：
【化７】
2016141657.tif 000019
からなる群の中から選ばれる１又は２以上を有効成分として含むことを特徴とするメラニン産生抑制剤。
【請求項３】
下記構造式（１）で表されるフェニルエタノイド配糖体。
【化８】
2016141657.tif 000020
【請求項４】
請求項１又は請求項２に記載のメラニン産生抑制剤を配合することを特徴とする美白化粧料。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のメラニン産生抑制剤を配合することを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニホンスイセン（学名：Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｔａｚｅｔｔａ  ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の花部、その花部の抽出液、その抽出液の分画、またはその分画より得ることができる化合物を有効成分（活性成分）として含有するメラニン産生抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ニホンスイセンは、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）に属する多年草である。本植物は、地中海沿岸を原産とし、日本においては、本州以南の比較的温暖な海岸近くで野生化し群生するとともに、観賞用としても広く栽培されている。
【０００３】
本植物の鱗茎は、古くからおたふく風邪、吹き出物、乳腺炎や虫のかみ傷の改善に利用され、特に本植物に含有されるアルカロイド成分には強い抗癌活性があることが非特許文献１に開示されている。また、非特許文献２には、本植物の花が、内服薬として解熱や子宮病の改善を目的に使用されていることが開示されている。
【０００４】
さらに特許文献１には、コウジ酸またはコウジ酸誘導体とスイセン等の植物のエキスを含有する皮膚外用剤が開示されている。しかし特許文献１では、スイセン等の植物のエキスは、メラニンの産生を抑制するコウジ酸またはコウジ酸誘導体の光分解を低減する目的で添加されており、そして、スイセン等の植物のエキスのみでは、色素沈着を防ぐ効果はないことが示されており（段落００３９、表２−１）、美白効果やメラニン産生抑制効果がないことが示唆されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１７８４８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅｖｉｄｅｎｔｅ  Ａ．，Ｋｏｒｎｉｅｎｋｏ  Ａ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ８，ｐ４４９（２００９）
【非特許文献２】上海科学技術出版社編、中薬大辞典、小学館、東京、ｐｐ１３４８−１３４９（１９８５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ニホンスイセンを原材料とし、優れたメラニン産生抑制作用を有し、メラニン産生抑制剤、美白剤等の化粧料等として適用可能な製剤（メラニン産生抑制剤）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前述の課題を解決するために、ニホンスイセンの花部、その抽出液もしくは抽出エキス、又はそれらを含有する成分について、種々の生物活性の検討を鋭意行った。その結果、ニホンスイセンの花部、その抽出液若しくは抽出エキス、又はそれらから調製される分画や単離される化合物の中のあるものは、メラノーマ細胞であるＢ１６  ４Ａ５におけるメラニンの産生を有意に抑制することを見出し、以下に示す態様の発明を完成した。
【０００９】
本発明は、その第１の態様として、
ニホンスイセンの花部、該花部より抽出された抽出液を有効成分（活性成分）として含むことを特徴とするメラニン産生抑制剤（請求項１）を提供する。
【００１０】
ここで「花部」とは、雌しべ、雄しべ、花弁、萼、包葉、花軸、花柄等を含むいわゆる花を意味するが、さらに花芽及び蕾等も含む意味である。
【００１１】
花部の抽出液とは、花部を、水、低級脂肪族アルコールやグリコール及び低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等より選ばれる抽出溶媒により抽出した液を言う。以後、この明細書で「抽出液」とは、前記抽出液に加えて、その抽出液を濃縮して得られる抽出エキスや、その抽出液や抽出エキスを分配処理して得られる分配移行液（ｆｒａｃｔｉｏｎ）等も含む意味で用いる。
【００１２】
メラニン産生抑制剤とは、メラノサイトにおけるメラニンの産生を抑制する作用を有する薬剤である。このメラニン産生抑制剤は、メラニンの産生を抑制する作用を有することから、肌の黒化の予防・改善、すなわち肌の美白に寄与し、美白の効果を有する化粧料に好適に用いられる。又、このメラニン産生抑制剤は、ヒトに投与することにより前記の作用を奏するので、ヒト用の医薬や医薬組成物（以後、医薬組成物を含めて医薬と言う。）等として用いることができる。
【００１３】
「有効成分として含む」とは、花部、抽出液自体が、（コウジ酸等の他の成分との組合せではなく）メラニンの産生を抑制する作用を、薬剤または化粧料としての効果が認められる程度まで発揮するように、薬剤または化粧料に配合されることを意味する。後述する第２の態様においても、同じ意味である。
【００１４】
本発明は、その第２の態様として、
下記の構造式（１）で表される化合物：
【００１５】
【化１】
2016141657.tif 000002
【００１６】
、下記の構造式（２）で表される化合物またはその塩：
【００１７】
【化２】
2016141657.tif 000003
【００１８】
、下記の構造式（３）で表される化合物またはその塩：
【００１９】
【化３】
2016141657.tif 000004
【００２０】
、下記の構造式（４）で表される化合物またはその塩：
【００２１】
【化４】
2016141657.tif 000005
【００２２】
、下記の構造式（５）で表される化合物：
【００２３】
【化５】
2016141657.tif 000006
【００２４】
、下記の構造式（６）で表される化合物：
【００２５】
【化６】
2016141657.tif 000007
【００２６】
及び、下記の構造式（７）で表される化合物：
【００２７】
【化７】
2016141657.tif 000008
【００２８】
からなる群の中から選ばれる１又は２以上を有効成分として含むことを特徴とするメラニン産生抑制剤（請求項２）を提供する。
【００２９】
前記式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）又は式（７）で表される化合物（またはそれらの塩）は、ニホンスイセンの花部、該花部より抽出された抽出液に含まれる化合物であり、前記抽出液より単離することができる。本発明者は、前記の抽出液を分離、精製し、含有成分の詳細な探索等を行い、さらにその含有成分のメラニン産生抑制活性について検討を行ったところ、前記の抽出液中には、メラノサイトにおけるメラニンの産生を抑制する作用を有する種々の化合物が含まれており、これらの化合物は、メラニン産生抑制剤として用いることができることを見出した。
【００３０】
そして、それらの化合物について構造の解析を行ったところ、それらの化合物は、前記の式（１）、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）、又は式（７）で表されることを見出し、第２の態様の発明を完成した。
【００３１】
第２の態様における「有効成分として含む」、「メラニン産生抑制剤」の意味は、前記第１の態様における同じ用語の意味と同じである。このメラニン産生抑制剤はメラノサイトにおけるメラニン産生を抑制し、これをヒトに投与することによりメラニンの産生を抑制する。従って、皮膚の黒化の改善または予防剤としての利用が期待できる。又、肌の美白に寄与し、美白の効果を有する化粧料に好適に用いられる。さらに、第２の態様のメラニン産生抑制剤は、ヒトに投与することにより前記の作用を奏するので、医薬や医薬組成物等として用いることができる。
【００３２】
前記の化合物の中で、式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）、又は式（７）で表される化合物は、既知の化合物であり、それぞれ、タゼッチン、３，４−ジヒドロ−３−メトキシ［１，３］ジオキソロ［４，５−ｊ］フェナントリジン、５，６−ジヒドロ−５−メチル［１，３］ジオキソロ［４，５−ｊ］フェナントリジン、２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド、３−フェニルプロピル−β−Ｄ−グルコピラノシド又は３−フェニル−２−プロペニル６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
【００３３】
式（１）で表されるフェニルエタノイド配糖体は、新規化合物である。そこで、本発明は、第３の態様として、前記構造式（１）で表されるフェニルエタノイド配糖体（請求項３）を提供する。この新規なフェニルエタノイド配糖体は、メラニン産生抑制剤として用いられる。
【００３４】
第１の態様、第２の態様のメラニン産生抑制剤は、美白剤として化粧料等に用いることができ、又、メラニン産生抑制のための皮膚用外用剤等の医薬として用いることもできる。そこで、本発明の第４の態様として、前記第１の態様、第２の態様のメラニン産生抑制剤を配合することを特徴とする美白化粧料（請求項４）が提供され、本発明の第５の態様として、前記第１の態様、第２の態様のメラニン産生抑制剤を配合することを特徴とする医薬（請求項５）が提供される。
【発明の効果】
【００３５】
第１の態様及び第２の態様のメラニン産生抑制剤は、メラノサイトにおけるメラニンの産生を抑制する作用、メラニン産生抑制作用を示し、ヒトの肌の黒化を抑制する効果がある。従って、美白剤として化粧料等に用いることができ、又、メラニン産生抑制のための皮膚用外用剤等の医薬として用いることもできる。
【００３６】
第３の態様の新規フェニルエタノイド配糖体は、メラニン産生抑制作用を示し、ヒトの肌の黒化を抑制する効果を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
次に、本発明を実施するための形態につき説明するが、本発明の範囲はこの実施の形態のみに限定されるものではない。
【００３８】
第１の態様のメラニン産生抑制剤としては、
１）ニホンスイセン花部を、抽出等の処理を行わずに、そのまま有効成分として用いるもの、
２）ニホンスイセン花部を、水、低級脂肪族アルコールやグリコール又は低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等により抽出した抽出液を有効成分として用いるもの、
３）前記抽出液を濃縮して得られる抽出エキスを有効成分として用いるもの、
４）前記抽出液又は抽出エキスを分配処理して、分配により得られる分配移行液（分画）もしくは分配移行液の濃縮、乾固物を有効成分として用いるもの、
を例示することができる。
【００３９】
花部を用いる場合は、花部をそのまま用いることができるし、又は、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの、又は、乾燥等の調製をしたものを用いることもできる。
【００４０】
抽出液は、ニホンスイセン花部をそのまま又は粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを、水、低級脂肪族アルコールやグリコール及び低級脂肪族アルコールやグリコールの含水物等の抽出溶媒により抽出して得ることができる。抽出効率の点からは、粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったものを用いる方法が望ましい。
【００４１】
抽出溶媒として用いられる低級脂肪族アルコールとしては、炭素数１〜４の低級アルコール類が挙げられ、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール又はこれらの混液等が挙げられる。グリコールとしては、エチレングリコール、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００４２】
抽出溶媒としては、好ましくはこれらのアルコールやグリコール、又はこれらのアルコールやグリコールに３０容量％までの水を含有する含水アルコールや含水グリコールが用いられる。前記のアルコールやグリコールの中でもメタノール及びエタノールが好ましい。これらの抽出溶媒は、抽出材料に対して、１〜５０質量倍程度、好ましくは１０〜３０質量倍程度用いられる。
【００４３】
抽出温度は、室温〜溶媒の沸点の間で任意に設定できるが、５０℃〜抽出溶媒の沸点の温度が好ましい。抽出は、振盪下もしくは非振盪下又は還流下に、前記の抽出材料、即ち、ニホンスイセン花部そのもの、又はそれを粉砕、破砕、切断、すりつぶし等による形状変化を行ったもの等を、前記の抽出溶媒に浸漬することによって行うのが適当である。
【００４４】
好ましい抽出時間は、抽出温度や抽出の際の振盪の有無等により変動し、特に限定されない。例えば、抽出材料を振盪下に浸漬する場合には、３０分間〜１０時間程度行うのが適当であり、非振盪下に浸漬する場合には、１時間〜２０日間程度行うのが適当である。又、抽出溶媒の還流下に抽出するときは、３０分間〜数時間加熱還流するのが好ましい。なお、５０℃より低い温度で浸漬して抽出することも可能であるが、その場合には、前記の時間よりも長時間浸漬するのが好ましい。抽出操作は、同一材料について１回だけ行ってもよいが、複数回、例えば２〜５回程度繰り返すのが好ましい。
【００４５】
前記の抽出工程により得られた抽出液には、ニホンスイセン花部の含有成分が溶出されている。本発明の、第１の態様のメラニン産生抑制剤としては、このようにして得られた抽出液を濃縮して（抽出エキスとして）用いてもよい。濃縮は、低温で減圧下に行うのが好ましい。濃縮する前に濾過して濾液を濃縮してもよい。なお、濃縮等の操作を行わず抽出液をそのまま用いても、メラニン産生抑制剤としての作用を奏する。
【００４６】
また、濃縮は乾固するまで行ってもよく、粉末状又は凍結乾燥品等として用いてもよい。濃縮する方法、粉末状及び凍結乾燥品とする方法は当該分野での公知の方法を用いることができる。
【００４７】
分配は、前記抽出液（水層）に、酢酸エチル、ブタノール、ヘキサン、ジエチルエーテル、イソプロピルエーテル等の水に対して層を形成する任意の溶媒を加えて、前記抽出液中の成分を前記溶媒中に抽出・移行させ、分配移行液（分配抽出液・分画）を得る操作である。また、分配時の水溶液の液性を、例えば、酢酸や炭酸水素ナトリウムを使用して酸性またはアルカリ性にして分配することもできる。
【００４８】
前記のようにして得られる抽出液（抽出エキス、分配により得られる分配移行液等も含む）は、精製処理に付し、含有されている各成分に分離することができる。前記の、構造式（１）〜（７）のいずれかで表される化合物は、この精製、分離により得ることができる。
【００４９】
精製処理は、例えば、クロマトグラフ法、イオン交換樹脂を使用する溶離法、溶媒による分配抽出等を単独、又は組み合わせて採用することができる。クロマトグラフ法としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、遠心液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができ、これらのいずれか、又はそれらを組み合わせて行う方法が挙げられる。この際の担体、溶出溶媒等の精製条件は、各種クロマトグラフィーに対応して適宣選択することができる。
【００５０】
前記のように、本発明の第１の態様のメラニン産生抑制剤を含有させることにより、ヒト用の医薬を製造することができる。本発明のメラニン産生抑制剤が、ヒト用の医薬として用いられる場合は、ニホンスイセン花部そのもの、ニホンスイセン花部の抽出液、もしくは前記式（１）〜（７）で表される化合物を、そのままの状態で又は適当な媒体で希釈して、医薬品等の製造分野における公知の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、クリーム又は液剤等の種々の形態にして用いられる。
【００５１】
これらの形態においては、適当な媒体を添加してもよい。適当な媒体としては、医薬的に許容される賦形剤、例えば結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガント又はポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば乳糖、砂糖、トウモロコシ澱粉、リン酸カルシウム、ソルビトール又はグリシン）、錠剤用滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール又はシリカ）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。
【００５２】
錠剤とする場合は、通常の製薬における周知の方法でコートしてもよい。液体製剤とする場合は、例えば水性又は油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ又はエリキシルの形態であってもよい。又、使用前に水や他の適切な賦形剤と混合する乾燥製品として提供してもよい。
【００５３】
液体製剤は、通常の添加剤、例えば、ソルビトール、シロップ、メチルセルロース、グルコースシロップ、ゼラチン水添加食用脂等の懸濁化剤、レシチン、ソルビタンモノオレエート、アラビアゴム等の乳化剤（食用脂を含んでもよい）、アーモンド油、分画ココヤシ油又はグリセリン、プロピレングリコールやエチレングリコールのような油性エステル等の非水性賦形剤、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル又はソルビン酸等の保存剤を含んでもよく、さらに所望により着色剤又は香料等を含んでもよい。
【００５４】
本発明の医薬における、抽出液、前記式（１）〜（７）で表される化合物の使用量は、濃縮、精製の程度、活性の強さ等、使用目的、対象疾患や自覚症状の程度、使用者の体重、年齢等によって適宣調整される。例えば、医薬として成人について使用する場合は、１回の投与毎に、抽出エキスや分画の場合では、１ｍｇ〜２０ｇ程度の範囲で使用し、この範囲内で精製度や水分含量等に応じて調整することが適当な場合が多い。又、前記式（１）〜（７）で表される化合物を使用する場合は、１ｍｇ〜１ｇ程度が適当な場合が多い。
【実施例】
【００５５】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下の実施例では、特に記載がない限り、以下に示す各種溶媒、濾紙、クロマトグラフィー用担体及びＨＰＬＣカラムを用いた。また、特に明記しない試薬については、和光純薬工業社製試薬（特級）を用いた。
【００５６】
［溶媒］
メタノール：ナカライテスク社製、一級
ＨＰＬＣ用メタノール：ナカライテスク社製、特級
【００５７】
［濾紙］
アドバンテック社製：Ｎｏ．２
【００５８】
［クロマトグラフィー用担体］
順相シリカゲルカラムクロマトグラフ用担体：関東化学社製、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ
逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフ用担体：富士シリシア社製、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ  ＯＤＳ１０２０Ｔ
【００５９】
［ＨＰＬＣカラム］
ナカライテスク社製、Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、２０ｍｍ（ｉ．ｄ．）×２５０ｍｍ
【００６０】
実施例１
和歌山県由良町産のニホンスイセン（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｔａｚｅｔｔａ  ｖａｒ．  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の乾燥花部（４．７ｋｇ）を、メタノール（ＭｅＯＨ、１０Ｌ）で３時間熱時抽出し、抽出液を濾取した。残渣にメタノールを加え、同様の抽出操作を計３回行った。得られたメタノール抽出液を合わせ、減圧下溶媒を留去し、ＭｅＯＨ抽出エキス（収量３４８ｇ、収率８．１４％）（以下、括弧内で収量及び／又は収率を表す場合は、「収量」、「収率」を略して示す。なお、「収率」とは、ニホンスイセン乾燥花部の質量に対する収量の割合：（単離）収率である。）を得た。
【００６１】
このＭｅＯＨ抽出エキス（２９１ｇ）を、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）と３％（ｗ／ｖ）酒石酸水溶液（１：１）で分配し、ＥｔＯＡｃ移行部（３５．８ｇ、１．０％）と酒石酸水溶液移行部を得た。酒石酸水溶液移行部にＮａＨＣＯ３を加えてアルカリ性（ｐＨ９）にした。アルカリ性にした酒石酸水溶液移行部から、ＣＨＣｌ３（酒石酸水溶液移行部に対して容積比で１：１の割合）にて分配抽出しＣＨＣｌ３移行部（８．１２ｇ、０．２３％）を得た。さらにこのアルカリ性にした酒石酸水溶液移行部を、ｎ−ブタノール（ｎ−ＢｕＯＨ）（酒石酸水溶液移行部に対して容積比で１：１の割合）で分配し、ｎ−ＢｕＯＨ移行部（４０．１ｇ、０．２３％）を得た。
【００６２】
ＣＨＣｌ３移行部（６．５０ｇ）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィ−［１９５  ｇ、ＣＨＣｌ３→（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ→１０：１→５：１→３：１→１：１，ｖ／ｖ）  →ＭｅＯＨ］で分画し、Ｆｒ．Ｃ１（４１９．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ２（５０．８ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ３（４１．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ４（８４．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ５（１４２．９ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ６（２８７．３  ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ７（８２４．７ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ８（７１４．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｃ９（８６４．０ｍｇ）およびＦｒ．Ｃ１０（８１５．５ｍｇ）を得た。
【００６３】
Ｆｒ．Ｃ４（８４．１ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２５４  ｎｍ）、ＭｅＯＨ−０．０３％ａｑ．Ｅｔ２ＮＨ（６０：４０，ｖ／ｖ）］で分離精製し、分離精製物Ａ（４．８ｍｇ、０．０００５８％）および分離精製物Ｂ（３．４ｍｇ、０．０００４１％）を得た。Ｆｒ．Ｃ６（２８７．３ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２５４ｎｍ）、ＭｅＯＨ−０．０３％ａｑ．Ｅｔ２ＮＨ（６０：４０，ｖ／ｖ）］で分離精製し、分離精製物Ｃ（４３．０ｍｇ、０．００５２％）を得た。
【００６４】
ｎ−ＢｕＯＨ移行部（３５．１ｇ）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィ−［１０５０ｇ、（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ→１５：３：０．３→１０：３：０．４→７：３：０．５→６：４：１→５：５：１，ｖ／ｖ／ｖ）→ＭｅＯＨ］で分画しＦｒ．Ｂ１（１５４．３  ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ２（４４４．６ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ３（１．４３ｇ）、Ｆｒ．  Ｂ４（６０７．４ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ５（１．９５ｇ）、Ｆｒ．Ｂ６（３．８４ｇ）、Ｆｒ．Ｂ７（１９．１６ｇ）、Ｆｒ．Ｂ８（５．８４  ｇ）、Ｆｒ．Ｂ９（２．３７ｇ）およびＦｒ．Ｂ１０（８１８．７ｍｇ）を得た。
【００６５】
Ｆｒ．Ｂ２（４４４．６ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２５４ｎｍ）、ＭｅＯＨ−１％ａｑ．ＡｃＯＨ（４５：５５，ｖ／ｖ）］で分離精製し、分離精製物Ｄ（９．１ｍｇ、０．００１１％）を得た。
【００６６】
Ｆｒ．Ｂ７（１９．１６ｇ）を逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィ−［５７０ｇ、Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（１０：９０→２０：８０→３０：７０→６０：４０→８０：２０→９０：１０，ｖ／ｖ）→ＭｅＯＨ→ａｃｅｔｏｎｅ］で分画しＦｒ．Ｂ７−１（７．６３ｇ）、Ｆｒ．Ｂ７−２（７３１．１ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ７−３（１６３．０ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ７−４（４５０．２ｍｇ）、Ｆｒ．Ｂ７−５（７．１８ｇ）およびＦｒ．Ｂ７−６（２．６２ｇ）を得た。
【００６７】
Ｆｒ．Ｂ７−４（４５０．２ｍｇ）を逆相ＨＰＬＣ［Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ、ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＵＶ（２３０ｎｍ）、ＭｅＯＨ−１％ａｑ．ＡｃＯＨ（３０：７０，ｖ／ｖ）］で分離精製し、分離精製物ｎｔ−４（６８．０  ｍｇ、０．００７８％）および分離精製物Ｆ（１０．６  ｍｇ、０．００１２％）および分離精製物Ｇ（８．６ｍｇ、０．００１０％）を得た。
【００６８】
前記で得られた分離精製物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ｎｔ−４、Ｆ及びＧについて、旋光度［α］Ｄ、質量分析、ＵＶスペクトル、ＩＲスペクトル及び１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲの測定を、以下に示す測定装置、条件により行った。分離精製物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧについては、旋光度［α］Ｄ、質量分析、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲデータを文献値あるいは標品と比較し同定した結果、それぞれ以下に示すように、前記構造式（２）、（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）のいずれかで表される既知の化合物であることがわかった。
【００６９】
分離精製物Ａ：３，４−ジヒドロ−３−メトキシ［１，３］ジオキソロ［４，５−ｊ］フェナントリジン（式（３）の化合物）
分離精製物Ｂ：５，６−ジヒドロ−５−メチル［１，３］ジオキソロ［４，５−ｊ］フェナントリジン（式（４）の化合物）
分離精製物Ｃ：タゼッチン（式（２）の化合物）
分離精製物Ｄ：３−フェニルプロピルβ−Ｄ−グルコピラノシド（式（６）の化合物）
分離精製物Ｆ：２−（３，４−ジメトキシフェニル）エチル６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式（５）の化合物）
分離精製物Ｇ：３−フェニル−２−プロペニル６−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（式（７）の化合物）
【００７０】
［旋光度］［α］Ｄ
堀場高感度ＳＥＰＡ−３００デジタルポラリメーター（ｌ＝０．５）（堀場製作所社製）を用いて測定した。
【００７１】
［質量分析］
高分解能質量分析（高分解能ＦＡＢ−ＭＳ）及び質量分析（ＦＡＢ−ＭＳ）は、日本電子社製ＪＭＳ−ＳＸ  １０２型質量分析装置を用いて測定した。
【００７２】
［ＩＲスペクトル］
Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＦＴ−ＩＲ  ＤＲ−８０００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（島津製作所社製）を用いて測定した。
【００７３】
［核磁気共鳴スペクトル］
１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲは、日本電子社製のＪＮＭ−ＬＡ５００（５００ＭＨｚ）を用い、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）を内部標準として用いて、測定した。
【００７４】
［高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）］
ポンプは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−６ＡＤを、示差屈折計検出器は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＲＩＤ−１０Ａを、紫外可視分光光度計検出器は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＰＤ−１０Ａを用いた。（いずれも島津製作所社製）
【００７５】
分離精製物ｎｔ−４について測定した外観性状、旋光度［α］Ｄ、質量分析、ＵＶスペクトル、ＩＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲの測定結果を以下に示す。この測定結果に基づき構造解析した結果、分離精製物ｎｔ−４は、前記構造式（１）で表される新規化合物であることが判明した。
【００７６】
・外観性状：白色粉末
・旋光度：［α］Ｄ２５−１４．９°（ｃ＝０．５２、ＭｅＯＨ）
・ＵＶ［ＭｅＯＨ、ｎｍ（ｌｏｇε）］：２７６（４．４２）
・ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）：νｍａｘ  ３４２５、１４７３、１２７１、１０７６ｃｍ−１
・ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ＦＡＢ−ＭＳ：  ｍ／ｚ  ４９９［Ｍ＋Ｎａ］＋
・Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｉｏｎ  ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）
Ｃａｌｃｄ．  ｆｏｒ  Ｃ２１Ｈ３２Ｏ１２Ｎａ（Ｍ＋Ｎａ）＋：４９９．１７７５
Ｆｏｕｎｄ                                                ：４９９．１７８６
・１Ｈ−ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ジメチルスルフォキシドｄ６）：測定結果（化学シフトδＨ）は表１に記載
・１３Ｃ−ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ジメチルスルフォキシドｄ６）：測定結果（化学シフトδＣ）は表１に記載
【００７７】
【表１】
2016141657.tif 000009
【００７８】
試験例１
実施例１で得られたＭｅＯＨ抽出エキス、ＣＨＣｌ３移行部、ＥｔＯＡｃ移行部、ｎ-ＢｕＯＨ移行部のメラニン産生抑制作用について、以下に示す方法でメラニン産生抑制試験を行った。その結果を表２に記す。
【００７９】
［メラニン産生抑制試験］
理化学研究所から購入したＢ１６ｍｅｌａｎｏｍａ４Ａ５を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ４５００ｍｇ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で培養（５％ＣＯ２、３７℃）した。
【００８０】
４８穴培養プレート（住友ベークライト社製）に８．０×１０３個／穴（２００μＬ／穴）を播種し、２４時間培養後、６ｍＭテオフィリン含有培地（５０μＬ／穴）および被検サンプル含有培地（５０μＬ／穴）を添加した。なお、被検サンプルはＤＭＳＯに溶解し、培地に添加した（ＤＭＳＯ終濃度０．１  ％（ｖ／ｖ））。
【００８１】
７２時間培養後、培地を除去し、蒸留水１００μＬ／穴を添加し、超音波破砕機により細胞を破砕した。破砕後、破砕液に６Ｎ  ＮａＯＨを加えて細胞を溶解（２０μＬ／穴、８０℃、３０分）し、細胞溶解液を別の９６穴プレートに移して（１００μＬ／穴）、生成したメラニンをマイクロプレートリーダーにて測定した（測定波長：４０５ｎｍ、参照波長：６５５ｎｍ）。
【００８２】
以下の式に従って、生成したメラニンの産生抑制率を算出した。
メラニン産生抑制率（％）＝（（Ａ−Ｂ）／Ａ）ｘ１００
［Ａ：被験試料未添加（対照群）のＯ．Ｄ．値、  Ｂ：被験試料添加のＯ．Ｄ．値］
【００８３】
また、対照群との有意差の検定にはＤｕｎｎｅｔｔの方法により、多重比較検定を行い、ｐ＜０．０５を有意として＊の記号を付した。
【００８４】
【表２】
2016141657.tif 000010
【００８５】
上記の表の結果は、ニホンスイセン花部より調製したＭｅＯＨ抽出エキス及びＣＨＣｌ３移行部は、メラニンの産生を抑制する効果があることを示している。
【００８６】
試験例２
実施例１で得られた構造式（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）で表される化合物のメラニン産生抑制作用について、試験例１で行った方法と同じ方法でメラニン産生抑制試験を行った。その結果を表３に記す。
【００８７】
【表３】
2016141657.tif 000011
【００８８】
また、化粧品に配剤されて美白作用を示す化合物として使用されているアルブチンを陽性対照薬として使用し、試験例１で行った方法と同じ方法でメラニン産生抑制試験を行った。その結果を表４に記す。
【００８９】
【表４】
2016141657.tif 000012
【００９０】
上記の表３および４の結果は、構造式（１）〜（７）の化合物（本発明のメラニン産生抑制剤）は、化粧品に頻用されるアルブチンよりも、強いメラニン産生抑制作用を有することを示している。