(57)【要約】      （修正有）【課題】ムチン−１を修飾するＯ型糖鎖を用いて癌を検出する方法を提供する。【解決手段】試料中の癌関連構造の糖鎖を有するムチン−１の量を、癌関連構造の糖鎖（Ａ）を認識する抗体及び癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を認識する抗体を使用して測定し、早期膵臓癌を検出する。（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及びＧａｌＮＡｃα−からなる群より選択される１種以上；（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及びＮｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−からなる群より選択される１種以上【選択図】図８
2016205827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来の試料中に含まれる癌関連構造の糖鎖を有するムチン−１の量を、癌関連構造の糖鎖（Ａ）を認識する抗体及び癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を認識する抗体を使用して測定することを特徴とする、癌の検出方法。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
【請求項２】
癌関連構造の糖鎖がムチン−１のリピート配列（配列番号１）に結合している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の癌が膵臓癌、胃癌、胆管癌又は前立腺癌である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記の癌が早期の膵臓癌である、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
下記の癌関連構造の糖鎖（Ａ）を有するムチン−１を認識する抗体、及び下記の癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を有するムチン−１を認識する抗体を含有することを特徴とする、癌の検出キット。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
【請求項６】
前記の癌が膵臓癌、胃癌、胆管癌又は前立腺癌である、請求項５に記載の癌の検出キット。
【請求項７】
前記の癌が早期の膵臓癌である、請求項５又は６に記載の癌の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖タンパク質ムチンの中でも、修飾されている糖鎖の異なるムチン−１（Ｍｕｃｉｎ−１、以下、「ＭＵＣ１」とも称する）を測定することを特徴とする癌を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムチンの一種であるＭＵＣ１は、腫瘍関連抗原であり、多くの腺癌で発現する高分子量糖タンパク質である。この糖タンパク質は、膜糖タンパク質であり、細胞外ドメインには、セリン、トレオニンおよびプロリンに富む２０個のアミノ酸コア配列（以下「リピート配列」とも称する：ＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ（配列番号１））の３０〜９０タンデム型反復から構成される領域が存在する。リピート配列の反復回数は、個体によって異なり、遺伝的に決定され、サイズ多型を生じる。リピート配列内にはＯ型糖鎖修飾可能なアミノ酸であるセリン、トレオニンが計５個あり、それぞれのアミノ酸にＯ型糖鎖が付加することは可能であるが、付加しているＯ型糖鎖の種類や、付加しているアミノ酸の部位は、癌の種類によって様々な組み合わせがあり、不均一であるといわれている。
【０００３】
一般的に、癌ではＭＵＣ１を修飾するＯ型糖鎖付加量が減少した結果としてペプチド骨格のコア配列が露出することが知られ、露出したペプチド骨格に対する抗体を用いた免疫診断が確立されている。特に、乳癌の腫瘍マーカーとして臨床利用されているＣＡ１５−３は、血流中のＯ型糖鎖付加量の減少したＭＵＣ１を測定する診断マーカーの一例である。しかしながら、ＣＡ１５−３は、早期の乳癌では測定値が上がらないために、早期発見には適さないマーカーと見なされており、乳癌患者に対しては主に治療効果を判定する目的で利用されている。このことは、ＭＵＣ１のＯ型糖鎖付加量の減少という変化は、癌の初期段階では顕著ではないことを示唆している。
【０００４】
一方で、癌細胞が癌特異的な糖鎖をもつ糖タンパク質を分泌するため、糖鎖の変化、即ち「癌特異的な糖鎖」を検出することで、癌の診断が可能であることは良く知られている。実際に臨床利用されている糖鎖の変化を利用したマーカーとして、ＣＡ１９−９、ＳＬＸ、ＣＡ７４−２等が挙げられる。このような糖鎖の変化は、癌細胞において糖鎖の生合成に関わる糖転移酵素群の発現・活性調節の変化がおき、結果として健常者には発現しない糖鎖が血流中に出現すると考えられている。このような糖鎖の変化は、癌細胞の置かれている環境に影響を受けて生じる現象であることが強く示唆されており、比較的早期の癌細胞でも起きていると考えられているため、癌の早期発見診断マーカーとして注目されている。ムチンを修飾するＯ型糖鎖も同様に糖転移酵素の発現変化の結果、癌特異的な糖鎖へ変化することが知られ、一般的に健常者では嵩高い構造の糖鎖であるものが、癌患者では１〜３糖で構成される小型の構造の糖鎖となっていると考えられている。前述の糖鎖の変化を利用したマーカー、ＣＡ１９−９、ＳＬＸ、ＣＡ７４−２等は、癌特異的な構造の糖鎖のみを認識する抗体を使用した免疫学的検出法である。従って、癌特異的な糖鎖が付加したタンパク質部分は多様であるため、臓器特異性の低さの一因となっている。
【０００５】
このように、癌の検出においてムチン特にＭＵＣ１の糖鎖に関連した変化を捉えるマーカーが実用化されているが、それぞれ欠点があるといえる。
【０００６】
これらの問題は、ＭＵＣ１上の特定の糖鎖の変化を検出することで、改善する可能性がある。特許文献１にはこのような試みがなされ、ＭＵＣ１の露出したペプチド骨格に対する抗体と、糖鎖に特異的な抗体を組み合わせることで胃癌及び肺癌が検出できるとされている。しかしながら、測定系に使われる一方の抗体は癌の早期には出現しないペプチド骨格が露出したＭＵＣ１を認識する抗体であるため、このような抗体の組み合わせでは早期癌を感度良く検出できないと推定される。
【０００７】
糖鎖を抗原認識部位の一部とするＭＵＣ１を特異的に認識する抗体としては、ＭＹ．１Ｅ１２やＫＬ６が知られている。さらに、特許文献２では、配列番号１で示されたＭＵＣ１のリピート配列中の９番目のトレオニンに特定の糖鎖が付加した場合に結合する、比較的特異性の高い抗体１Ｂ２が提供され、１Ｂ２−１Ｂ２サンドイッチイムノアッセイが行われている。一方、特許文献３では、配列番号１で示されたＭＵＣ１のリピート配列に特定の糖鎖が結合した場合に結合する比較的特異性の高い抗体１２Ｄ１０が提供され、１２Ｄ１０−１２Ｄ１０サンドイッチアッセイが行われている。しかしながらこれらの抗体を使用した癌の診断も、ＭＵＣ１のコア構造を認識する抗体と同様に臓器特異性が低いという問題があり、糖鎖を抗原認識部位の一部とするＭＵＣ１認識抗体を使用した特定の癌に対する性能の良い診断方法は提供されていない。
【０００８】
非特許文献１によれば、膵臓癌もまたＭＵＣ１を発現していると報告がある癌の一つである。膵臓癌は、自覚症状の乏しい癌であるため早期発見の難しい癌の１つである。膵臓癌でよく利用されるＣＡ１９−９抗原もムチン類の糖鎖であると古くから認識されていたが、最近の研究では必ずしもムチン類に結合した構造のみを測定しているわけではないことが明らかとなっている。また膵臓癌は、血中のＯ型糖鎖付加量の減少したＭＵＣ１を測定するＣＡ１５−３では早期発見できないことも知られている。ＭＵＣ１を修飾するＯ型糖鎖の変化を指標とした膵臓癌の診断技術、特に早期の膵臓癌を発見する方法は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０１１−３８９５２号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０５０５２８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１１／１３５８６９号パンフレット
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  （２００４）９１，１６３３−１６３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＭＵＣ１を修飾するＯ型糖鎖を用いて癌を検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は上記課題について鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、以下の通りである。
（１）被検体由来の試料中に含まれる癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１の量を、癌関連構造の糖鎖（Ａ）を認識する抗体及び癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を認識する抗体を使用して測定することを特徴とする、癌の検出方法。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
（２）癌関連構造の糖鎖がＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）に結合している、（１）に記載の方法。
（３）前記の癌が膵臓癌、胃癌、胆管癌又は前立腺癌である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記の癌が早期の膵臓癌である、（１）〜（３）いずれかに記載の方法。
（５）下記の癌関連構造の糖鎖（Ａ）を有するＭＵＣ１を認識する抗体、及び下記の癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を有するＭＵＣ１を認識する抗体を含有することを特徴とする、癌の検出キット。
（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及び
ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、
Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及び
Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−
からなる群より選択される１種以上；
（但し、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸、Ｇａｌはガラクトース、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンを示す）
（６）前記の癌が膵臓癌、胃癌、胆管癌又は前立腺癌である、（５）に記載の癌の検出キット。
（７）前記の癌が早期の膵臓癌である、（５）又は（６）に記載の癌の検出キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法により、癌を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】癌の進展度とＭＵＣ１の糖鎖付加部位、糖鎖構造の変化を模式的に示した図である。
【図２】実施例１で得られた、健常者と前立腺癌患者の血清を１Ｂ２／１２Ｄ１０サンドイッチ測定した結果とＣＡ１５−３測定した結果をそれぞれプロットした図である。
【図３】実施例１で得られた結果の統計解析を示した図である。
【図４】実施例２で得られた、健常女性と乳癌患者の血清からＢ２７．２９抗体もしくは１Ｂ２抗体でＭＵＣ１を免疫沈降したものを、ウエスタンブロット法で解析した結果を示した図である。
【図５】実施例３で得られた、健常者と膵臓癌患者の血清を１Ｂ２／１２Ｄ１０サンドイッチ測定した結果とＣＡ１５−３測定した結果をそれぞれプロットした図である。
【図６】実施例３で得られた結果の統計解析を示した図である。
【図７】実施例３で得られた結果のＲＯＣ解析を示した図である。
【図８】実施例３で得られた膵臓癌患者の血清を１Ｂ２／１２Ｄ１０サンドイッチ測定した結果とＣＡ１５−３測定した結果のうち、病期情報が付与された患者検体を病期分類に従ってプロットした図である。
【図９】実施例４で得られた、膵臓癌、胃癌、胆管癌、前立腺癌患者の血清を１Ｂ２／１２Ｄ１０サンドイッチ測定した結果を示した図である。
【図１０】膵臓癌患者及び前立腺癌患者血清の１Ｂ２／１２Ｄ１０サンドイッチ測定した測定値とＣＡ１５−３測定した測定値の相関性を検討した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を更に詳細に説明する。本発明の検出方法は、上述の方法により癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１を測定し、得られた値から癌を検出することを特徴とするものである。
【００１６】
ここで「癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１」とは、癌組織または癌細胞において高発現している構造の糖鎖を有するＭＵＣ１をいう。この構造は、正常組織や正常細胞において発現量が低いことが知られている。このような癌関連構造の糖鎖としては、例えば、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、ＧａｌＮＡｃα−、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及びＮｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−などを挙げることができる。
【００１７】
このとき、Ｎｅｕ５ＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸であり、Ｇａｌはガラクトースであり、ＧａｌＮＡｃはＮ−アセチルガラクトサミンである。
【００１８】
さらに、本明細書において、糖鎖の結合様式について、Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌは、Ｎｅｕ５Ａｃの２位とＧａｌの３位とがα−グリコシド結合することを示し、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃは、Ｇａｌの１位とＧａｌＮＡｃの３位とがβ−グリコシド結合することを示し、Ｎｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃは、Ｎｅｕ５Ａｃの２位とＧａｌＮＡｃの６位とがα−グリコシド結合することを示し、Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃは、Ｎｅｕ５Ａｃの２位とＧａｌＮＡｃの６位がα−グリコシド結合したＧａｌＮＡｃの３位とＧａｌの１位とがβ−グリコシド結合することを示す。
【００１９】
本発明において「癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１」として、より好ましくは、癌関連構造の糖鎖として（Ａ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα−、及びＧａｌＮＡｃα−から選択される１種以上の糖鎖及び、癌関連構造の糖鎖として（Ｂ）Ｎｅｕ５Ａｃα２→３Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、Ｇａｌβ１→３（Ｎｅｕ５Ａｃα２→６）ＧａｌＮＡｃα−、及びＮｅｕ５Ａｃα２→６ＧａｌＮＡｃα−から選択される１種以上の糖鎖のそれぞれを同一分子内に有するＭＵＣ１である。
【００２０】
このとき前記糖鎖（Ａ）及び前記糖鎖（Ｂ）は、還元末端側のＧａｌＮＡｃを介してＭＵＣ１のアミノ酸残基に結合している。特に前記糖鎖（Ａ）は、ＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）に結合していることが好ましく、具体的にはリピート配列のセリン残基又はトレオニン残基に結合していることが好ましい。中でもリピート配列（配列番号１）の９番目のトレオニンに結合していることがさらに好ましい。また前記糖鎖（Ｂ）もＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）に結合していることが好ましい。
【００２１】
癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１の測定方法として、本発明では前記糖鎖（Ａ）を認識する抗体及び前記糖鎖（Ｂ）を認識する抗体を組み合わせて用いる。但し、その２種類の抗体の少なくとも一方は、ＭＵＣ１のアミノ酸をも認識する抗体を用いることができる。また両方の抗体がＭＵＣ１のアミノ酸配列をも認識してもよい。これにより前記糖鎖（Ａ）及び前記糖鎖（Ｂ）を同一分子内に有するＭＵＣ１を確実に測定することができる。
【００２２】
このような２種類の抗体を用いた測定方法としては、例えば２種類の抗体を用いたサンドイッチ法や、一方の抗体で免疫沈降させ、次いで他方の抗体で免疫染色する免疫沈降／免疫染色法などをあげることができる。
【００２３】
ここで前記「サンドイッチ法」とは、抗原に対して特異的に結合する２つの抗体を抗原に反応させて抗原を追跡する方法である。例えば、使用される抗体の一方を担体に結合した状態にし、試料中の抗原と反応させて抗原を補足し、またもう一方の抗体も抗原に反応させて、抗原抗体複合体を形成する方法である。形成された抗原抗体複合体は、少なくとも１つの抗体を標識するか、または二次抗体を反応させることによって検出される。ＭＵＣ１のように抗原エピトープが多価の分子を検出する場合は、同一の抗体を用いてサンドイッチすることも可能である。抗原に対して２つの抗体を同時に反応させる方法や、順次反応させる方法等があるが、順次反応させる方法の方が好ましい。
【００２４】
また前記「免疫沈降／免疫染色法」の「免疫沈降」法とは、抗体によって目的の抗原を、溶液中から特異的に沈降せしめる方法のことをいう。例えば、抗体をセファロースなどの高分子からなる粒子状の担体と結合して使用することで、容易に抗原を精製及び検出することができる方法である。また前記「免疫沈降／免疫染色法」の「免疫染色法」とは、タンパク質を電気泳動等によって分子量や等電点などのタンパク質の性質に応じて分離した後に、疎水性の高い膜に転写されたタンパク質を抗体によって検出する免疫学的手法のことをいう。本発明ではこれらの免疫沈降法と免疫染色法とを組み合わせて用いることができる。
【００２５】
本発明において、抗体とは、天然型の抗体、その断片、及び／又はその化学修飾誘導体を含むものである。
【００２６】
本発明に用いられる抗体は特に限定されるものではないが、公知の手法（例えば特許文献１，２に記載の方法）で作製することができる。中でも、ＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）の９番目のトレオニンに前記糖鎖（Ａ）が結合した構造を認識する抗体が好ましく、このような抗体の一例として、特許文献１に抗体１Ｂ２が記載されている。またＭＵＣ１のリピート配列（配列番号１）に前記糖鎖（Ｂ）が結合した構造を認識する抗体が好ましく、このような抗体の一例として特許文献２に抗体１２Ｄ１０が記載されている。
【００２７】
本発明に用いられる被検体由来の試料は特に限定されるものではないが、例えば血清、血漿、腹水、リンパ液、髄液等があげられるが、特に癌が疑われる患者の体液（血清、血漿等）が好ましい。
【００２８】
本発明の方法により、膵臓癌、胃癌、胆管癌、又は前立腺癌を検出することができる。例えば、予め算出されたカットオフ値よりも被検体の癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１量の値が大きいとき、被検体が膵臓癌、胃癌、胆管癌、前立腺癌のいずれかに罹患しているもしくはその可能性がある、と検出（又は決定）することができる。
【００２９】
より具体的には、被検体由来の試料中に含まれる癌関連構造の糖鎖を有するＭＵＣ１の量を、前記癌関連構造の糖鎖（Ａ）を認識する抗体及び前記癌関連構造の糖鎖（Ｂ）を認識する抗体を使用して測定する工程およびその測定値がカットオフ値よりも大きい場合に前記試料が膵臓癌、胃癌、胆管癌又は前立腺癌患者由来であるとする工程を含む、膵臓癌、胃癌、胆管癌又は前立腺癌の検出方法があげられる。ここで、前記のカットオフ値としては７．６３Ｕ／ｍｌを例示することができる。
【００３０】
特に膵臓癌に関しては、本発明の方法により早期の膵臓癌を検出することができる。また前立腺癌に関しても、本発明の方法により早期の前立腺癌を検出することができる。ここで、早期の膵臓癌とはステージ１の段階の膵臓癌を意味する。
【００３１】
本発明には前記糖鎖（Ａ）を有するＭＵＣ１を認識する抗体、及び前記糖鎖（Ｂ）を有するＭＵＣ１を認識する抗体を含むキットも含まれる。本キットを用いることで癌の検出を容易に行うことが可能となる。
【００３２】
一般的に、腺癌といわれる癌を罹患した患者では、血液中のＣＡ１５−３抗原量が増加することが知られている。体外診断薬メーカーから市販されているＣＡ１５−３抗原の測定に利用される免疫診断試薬を構成する成分である抗ＣＡ１５−３抗体の認識部位は、Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．（１９９８）１９，Ｓｕｐｐｌ  １：１−２０にまとめられている。この報文によれば、ＣＡ１５−３の測定に利用される抗体の多くが、糖タンパク質ＭＵＣ１の母核構造のペプチド部分を認識する抗体であるとされている。即ち、癌患者の血液中におけるＣＡ１５−３量増加のメカニズムは、癌組織の進展度に応じてＭＵＣ１を修飾するＯ型糖鎖の付加量が減少することにより、抗ＣＡ１５−３抗体の認識エピトープつまりタンパク質母核構造部分が露出したＭＵＣ１が血液中に増加することである。ＣＡ１５−３の測定値は、癌の早期には上昇しないことから、臨床的には治療効果のモニタリング用途として利用されることが多い。この事実は、早期の癌細胞が発現するＭＵＣ１のＯ型糖鎖付加量が「減少していない」状態であり、Ｏ型糖鎖不可量の減少はより進行した癌を持つ患者で起きる現象であるということが可能である。
【００３３】
一方で、組織の癌性変化に伴ってＭＵＣ１上のＯ型構造の糖鎖が変化していることも、良く知られている事実である。ＰＮＡＳ（２０１４）１１１、Ｅ４０６６−Ｅ４０７５によれば、癌の進展応じてＭＵＣ１のＯ型構造の糖鎖自体が、健常者もしくは正常な組織に発現するＭＵＣ１に比べて小型化している（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ということが知られている。即ち、健常者もしくは正常な組織に発現するＭＵＣ１のＯ型糖鎖は、コア２型構造をもつＯ型糖鎖に代表される分岐構造や伸長した嵩高い構造の糖鎖であるのに対し、癌患者では１から３糖程度で構成されたコア１型Ｏ型構造の糖鎖が増加すると広く知られている。この癌性変化の結果、ＭＵＣ１上のＯ型構造の糖鎖は、一般的に癌関連構造の糖鎖として知られているＳＴｎ抗原やＴ抗原、Ｔｎ抗原となる。
【００３４】
以上の事実から、癌患者血液中のＭＵＣ１の糖鎖付加部位並びに糖鎖の構造およびその変化は、癌の進行過程において図１のように変化すると考えられている。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００３６】
実施例１  前立腺癌患者血清中のＭＵＣ１の糖鎖付加部位と糖鎖の変化に関する検討
図１の考え方の妥当性を確認するために、早期癌をとらえることが可能な前立腺癌患者血清検体を使用して検討を行った。検討用の試料として、トータルＰＳＡ値が３−１０ｎｇ／ｍｌの前立腺がん患者血清検体と、前立腺癌ではないことが確認されている健常者検体を使用した。試料中のＣＡ１５−３量の測定は、市販のＣＡ１５−３免疫測定試薬（東ソー（株）製）を使用した。癌関連構造の糖鎖をもつＭＵＣ１に特異的な測定は、ＭＵＣ１上の特定の構造の糖鎖を特異的に認識して結合することが明らかとなっている１Ｂ２抗体（国際公開第２０１０／０５０５２８号パンフレット）と１２Ｄ１０抗体（国際公開第２０１１／１３５８６９号パンフレット）を使用して、以下の微粒子免疫測定方法を用いて測定した。
【００３７】
［微粒子免疫測定方法］
以下に上記の抗体を固定化した磁性微粒子と磁性微粒子自動処理装置Ｋｉｎｇ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｆｌｅｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を使用した微粒子免疫測定方法と評価法を示す。１Ｂ２抗体固定化磁性微粒子は、ＪＳＲ社製磁性微粒子（ＭＫ２３０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）１μｇ（乾燥重量）の表面に露出するカルボキシル基をＥＤＣで活性化し、６ｎｇの１Ｂ２抗体のアミノ基を介して共有結合することで調製した。磁性微粒子は抗体を固定化した後に、ＢＳＡを含む緩衝液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁しブロッキングを行った。
【００３８】
調製した１Ｂ２抗体固定化磁性微粒子を、磁性微粒子換算で０．２μｇ（乾燥重量）相当を１００μｌの反応希釈液（１％ＢＳＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）に懸濁して、専用の９６穴マイクロタイタープレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に添加した。次に、そのプレートから磁性微粒子だけ磁石を使用して取り出し、測定試料を分注した９６ウェルプレートの各ウェルに移動した。測定試料中で磁性微粒子を２０分間懸濁して抗原抗体反応をした後に、磁性微粒子のみを２００μｌの洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）に移動し、１分間懸濁して磁性微粒子を洗浄した。
【００３９】
次に、磁性微粒子を２００μｌの検出抗体が含まれる反応希釈液中に移し、２０分間懸濁することにより抗原抗体反応を行った。検出抗体として１Ｂ２抗体を使用する場合は、ＨＰＲ標識１Ｂ２抗体を１ウェルあたり５０ｎｇになるように反応希釈液に添加して調製した。検出抗体として１２Ｄ１０抗体を使用する場合は、ビオチン化した１２Ｄ１０抗体を１ウェルあたり５０ｎｇ、ｐｏｌｙＨＲＰ８０−ストレプトアビジン（ステレオスペシフィック  デテクション  テクノロジーズ社製）を１ウェルあたり２０ｎｇと混合して反応希釈液に添加して調製した。検出抗体と抗原抗体反応を行った磁性微粒子は、２００μｌの洗浄液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）に移動し洗浄した。
【００４０】
この洗浄操作を３回行った後に、洗浄された磁性微粒子は、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（ＫＰＬ社製）中に移され、懸濁しながら５分間酵素反応した。酵素反応終了後、磁性微粒子はＴＭＢ溶液から除かれ、発色した反応液のうち５０μｌを当量の１Ｍのリン酸溶液に添加することで発色し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４１】
なお、この微粒子免疫測定方法において、１Ｂ２抗体と１２Ｄ１０抗体とを用いた測定系（１Ｂ２／１２Ｄ１０）での測定結果の単位は、以下の通り定義した。即ち、市販のＣＡ１５−３測定試薬の標準品（東ソー（株）製）に、１Ｂ２／１２Ｄ１０に反応するＭＵＣ１が含まれていることを確認した上で、この標準品のＣＡ１５−３抗原が１Ｕ／ｍｌ含まれる溶液を、上述の微粒子免疫測定方法で１Ｂ２／１２Ｄ１０測定系で測定した場合に得られる値を１Ｕ／ｍｌと定義した。測定値の変換は、ＣＡ１５−３抗原の希釈系列試料を同様に測定して得られる値から、検量線を作成して行った。
【００４２】
図２、３に示したように、前立腺癌患者血清では、ＣＡ１５−３の値の分布は基準値に収まり、健常者の分布と区別することができなかった。一方で１Ｂ２と１２Ｄ１０抗体に反応するＭＵＣ１分子は、前立腺癌患者で健常者と明確に区別することが可能であることが分かる。
【００４３】
以上の結果は、比較的早期の癌状態であるとみなすことができる血清トータルＰＳＡ値の低い前立腺癌の患者血清では、ＣＡ１５−３測定試薬でとらえることが可能な変化、即ち「ＭＵＣ１のＯ型糖鎖付加量の減少」は検出することができないが、癌特異的糖鎖構造の増加は検出可能であることを示している。従って、前述のような癌の進行に伴う糖鎖付加量変化と糖鎖構造変化に関する説明（図１）の妥当性を示すデータであるといえる。
【００４４】
実施例２  ＣＡ１５−３高値乳癌患者血清中でのＭＵＣ１分子種の検討
血中ＣＡ１５−３が高値となる乳癌患者血清検体を使用して、血中のＭＵＣ１の糖鎖付加状態について検討を行った。健常者の血清と乳癌患者の血清から、ＭＵＣ１のペプチド母核構造（配列番号１）のＰＤＴＲＰＡＰ（配列番号２）を認識することが明らかな抗ＭＵＣ１ペプチド抗体（ＳＭ３，アブカム社）と、Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１を認識する１Ｂ２抗体によってＭＵＣ１分子種を免疫沈降させ、ウェスタンブロット法で分析した。
【００４５】
以下にウェスタンブロット法による検討方法を示す。健常者の血清と乳癌患者の血清１０μｌを希釈液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）で１０倍に希釈したものを試料とし、磁性微粒子自動処理装置ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  Ｆｌｅｘを使用して、抗ＭＵＣ１ペプチド抗体または１Ｂ２抗体を固定化したＪＳＲ社製磁性微粒子（ＭＫ２３０／Ｃａｒｂｏｘｙｌ）によってそれぞれの抗体に結合するタンパク質を免疫沈降法により回収した。免疫沈降された抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに懸濁して３分間加温（９６℃）することにより、結合した抗原を微粒子から遊離させ、常法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ウェスタンブロット法により解析した。検出にはビオチン標識した抗ＭＵＣ１ペプチド抗体または１Ｂ２抗体を使用して検出した。
【００４６】
結果を図４に示す。乳癌患者血清を抗ＭＵＣ１ペプチド抗体で免疫検出した結果からは、１Ｂ２抗体で免疫沈降した場合は高分子量のＭＵＣ１画分（高Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１）が検出され、抗ＭＵＣ１ペプチド抗体で免疫沈降した場合は低分子量のＭＵＣ１画分（低Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１）が検出されたことから、乳癌患者血清には分子量的に区別可能な２種類のＭＵＣ１画分が存在し、免疫沈降に供する抗体によって分離されることが明らかとなった。また同じ試料を１Ｂ２抗体で免疫検出した結果からは、抗ＭＵＣ１ペプチド抗体で免疫沈降されたＭＵＣ１、即ち低分子量のＭＵＣ１には、１Ｂ２抗体に反応する糖鎖構造が無いことが明らかとなった。
【００４７】
ＭＵＣ１はタンデムリピートの繰り返し回数が人によって異なる遺伝的多型が確認されている分子であるが、本検討では個別の症例から得られた血清を使用しているため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での分子量の大小は、母核構造（タンパク質部分）の差ではなく、糖鎖付加量の変化を反映していると考えられる。即ち、高分子量のＭＵＣ１と低分子量のＭＵＣ１の差は、糖鎖付加量の変化である。特に、ＭＵＣ１のペプチド母核構造を認識する抗ＭＵＣ１ペプチド抗体では、低Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１が優先的に免疫沈降されてきていることが分かる。
【００４８】
表１に、本検討から明らかとなった高Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１と低Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１の諸性質をまとめた。
【００４９】
【表１】
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癌患者の血液中におけるＭＵＣ１の糖鎖付加および構造変化のメカニズム考えれば、癌を早期発見するにはＯ型糖鎖修飾量が減少していない「高Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１」を分析することが望ましく、高Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１に結合する抗体、糖鎖修飾されたＭＵＣ１を特異的に認識する抗体を使用して血流中のＭＵＣ１を補足することが、免疫測定上有利であることは明らかである。さらにいえば、高Ｏ型糖鎖修飾ＭＵＣ１の中から癌特異的な糖鎖構造を持つＭＵＣ１を検出することで、癌の早期発見が可能となることは明らかである。
【００５０】
実施例３  膵臓癌患者の検出
膵臓癌は組織染色においてはＭＵＣ１分子を発現していることが知られている（非特許文献１）。しかしながら、膵臓癌患者血清においてＣＡ１５−３値が基準値を超えることは少ないため、膵臓癌の診断、治療効果の確認等を目的として臨床的には使用されていない。
【００５１】
実際に市販のＣＡ１５−３免疫測定試薬を使用して測定した膵臓癌患者の血清ＣＡ１５−３値の分布を図５，６に示す。試料中のＣＡ１５−３量の測定は、市販のＣＡ１５−３免疫測定試薬（東ソー（株）製）を使用した。今回使用した検体群の間では有意差のある結果となったが、臨床現場で利用されている基準値（＜２５Ｕ／ｍｌ）をカットオフ値に採用すると膵臓癌の検出率が４６％と低くなり、血清ＣＡ１５−３値では膵臓癌患者を検出することができないことが確認できた。
【００５２】
次に、実施例１に記載した１Ｂ２抗体と１２Ｄ１０抗体を使用した微粒子免疫測定方法で測定した測定値の分布を図５，６に示す。この測定法で得られた値は、膵臓癌患者と健常者の間に有意な差が認められた。健常者分布から設定した基準値（カットオフ値）は、健常者平均値＋２ＳＤから７．６３Ｕ／ｍｌと算出された。また、図５，６に示した測定値からＲＯＣ解析したところ、１Ｂ２抗体と１２Ｄ１０抗体を使用した微粒子免疫測定方法のＡＵＣは０．８８２であったのに対して、ＣＡ１５−３の測定では０．６９４であり、１Ｂ２抗体と１２Ｄ１０抗体を使用した微粒子免疫測定方法の診断性能がＣＡ１５−３の測定よりも高いことが確認された。以上の結果から、本発明の方法によれば、膵臓癌患者と健常者を識別可能であることが確認できた。
【００５３】
図８は、病期ステージ情報の付与された膵臓癌患者検体５８検体を選択し、実施例１の１Ｂ２抗体と１２Ｄ１０抗体を使用した微粒子免疫測定方法の測定値とＣＡ１５−３測定値を、それぞれステージ別にプロットした図である。この結果から、癌関連構造の糖鎖を検出している１Ｂ２／１２Ｄ１０値は、早期癌（ステージ１）の段階から、健常者の分布から設定した基準値を大幅に上回る測定値の上昇がみられる。即ち、１Ｂ２／１２Ｄ１０測定系によって、早期膵臓癌を検出可能であることが示された。ＣＡ１５−３測定値は、臨床基準値を超える検体数は早期膵臓癌では少ないことが確認された。
【００５４】
実施例４  膵臓癌、胃癌、胆管癌、前立腺癌の検出
実施例１に記載した１Ｂ２抗体と１２Ｄ１０抗体を使用した微粒子免疫測定方法で膵臓癌、胃癌、胆管癌、前立腺癌患者から得られた検体を測定した測定値の分布を図９に示す。この測定法で得られた値は、これらの癌患者は、健常者の分布に比べて有意に高く、これらの癌の診断にも有効な測定法であることが確認できた。
【００５５】
図１０は、膵臓癌および前立腺癌患者のＣＡ１５−３値及び１Ｂ２／２Ｄ１０値の相関性をプロットした図である。両測定法はともに、血液中のＭＵＣ１分子を測定対象としているが、両者の値の変化には強い相関性が見られないことが分かる。即ち、癌の進行に関連したＭＵＣ１の２つのＯ型糖鎖に関する変化である「糖鎖付加部位の変化（母核構造の露出）」と「糖鎖の変化」には、密接な関連性はなく独立した事象であることが推定され、図１に示した模式図の妥当性が確認できた。
【００５６】
以上の結果から、ＭＵＣ１を分泌するといわれている腺癌細胞の検出において、ＭＵＣ１の糖鎖の変化を指標に検出することの有用性は高く、特に膵臓癌や前立腺癌では早期癌の検出が可能であることが示された。またＭＵＣ１の糖鎖の変化を免疫学的方法で検出する上では、ＭＵＣ１の母核ペプチドに対する抗体を使用するよりは、癌関連構造の糖鎖で修飾されたＭＵＣ１を認識可能な抗体を使用することが、測定上有利となることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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