(57)【要約】【課題】  改変された抗体の製造方法を提供する。【解決手段】  以下のｉ）〜ｉｉｉ）によりモノクローナル抗体を製造する。ｉ）当初のモノクローナル抗体（０）のＨ鎖遺伝子に変異を導入し、それを当初のモノクローナル抗体（０）のＬ鎖遺伝子と掛け合わせて発現させ、目的の性能を有する変異体（Ｈ１）をスクリーニングで選択する。ｉｉ）当初のモノクローナル抗体（０）のＬ鎖遺伝子に変異を導入し、それを当初のモノクローナル抗体（０）のＨ鎖遺伝子と掛け合わせて発現させ、目的の性能を有する変異体（Ｌ１）をスクリーニングで選択する。ｉｉｉ）上述のｉ）で選択された変異体（Ｈ１）のＨ鎖遺伝子と、上述のｉｉ）で選択された変異体（Ｌ１）のＬ鎖遺伝子とを掛け合わせ、モノクローナル抗体（ＨＬ）を発現させる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のｉ）〜ｉｉｉ）の工程を有することを特徴とする、改変されたモノクローナル抗体の製造方法。
ｉ）当初のモノクローナル抗体（０）のＨ鎖遺伝子に変異を導入し、それを当初のモノクローナル抗体（０）のＬ鎖遺伝子と掛け合わせて発現させ、目的の性能を有する変異体（Ｈ１）をスクリーニングで選択する。
ｉｉ）当初のモノクローナル抗体（０）のＬ鎖遺伝子に変異を導入し、それを当初のモノクローナル抗体（０）のＨ鎖遺伝子と掛け合わせて発現させ、目的の性能を有する変異体（Ｌ１）をスクリーニングで選択する。
ｉｉｉ）上述のｉ）で選択された変異体（Ｈ１）のＨ鎖遺伝子と、上述のｉｉ）で選択された変異体（Ｌ１）のＬ鎖遺伝子とを掛け合わせ、モノクローナル抗体（ＨＬ）を発現させる。
【請求項２】
エラープローンＰＣＲ法により変異を導入する請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
当初のモノクローナル抗体（０）がウサギに由来するものである、請求項１又は請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
当初のモノクローナル抗体（０）がテストステロンとの反応性を有するものである、請求項１〜請求項３いずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４いずれかに記載の製造方法によって得られる改変されたモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性能が改変された抗体の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物には、生体を外敵から守るための免疫系が備わっている。免疫系とは、体内へ侵入した病原体などの異物を認識して攻撃し、排除する生体保護システムである。ここで重要な役割を果たしているのが、抗体である。抗体は主に血液中にあり、血流にのって体の中を循環している。そして体内に異物が侵入すると成熟し、抗原に対する親和性や特異性が向上する。そのため、たとえ微量の異物でもそれが体内へ侵入すると、抗体によって即座に捕捉される。
免疫診断試薬は、抗体が持つこのような特性を利用し、生体サンプル中の特定物質を検出して病気の診断を行うものである。免疫診断試薬として利用するモノクローナル抗体には、抗原に対する高い親和性と特異性が必要である。しかし、性能の良い抗体がいつも簡単に単離できるわけではない。特に低分子化合物は抗体と相互作用する部位が小さい。そのためこのような分子は免疫原性が低く、実験動物に免疫を行ってもなかなか抗体価が上昇しない。
【０００３】
低分子化合物の中でも特にステロイドホルモンは、体内で複雑に代謝されている。その結果、類似の構造を持つ化合物が数多く存在している。例えば以下の式（１）であらわされるテストステロンは体内で代謝され、式（２）〜（５）で表される化合物へと変化する。
【０００４】
【化１】
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【０００５】
【化２】
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【０００６】
【化３】
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【０００７】
【化４】
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【０００８】
【化５】
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そのため、血中のテストステロンをを精度よく検出するためには、僅かな構造の違いを見分けられる抗体が必要となる。しかし低分子化合物を抗原とした場合、抗体の単離自体がそもそも難しい。このような状況において、水素原子数個の有無を見分けられる程の特異性をもつ抗体の単離は非常に困難であり、まして高い親和性を有する抗体の単離はさらに困難であった。
抗体の性能を改変する方法としてはこれまで、Ｈ鎖とＬ鎖の遺伝子を繋いでからその配列に変異を導入する方法などがある（特許文献１−４、非特許文献１）。しかしこの方法では、望ましい性能を有する変異体がスクリーニングで得られた場合でも、繋がれていたＨ鎖とＬ鎖の遺伝子を元に戻してそれぞれ個別に発現させた時にその性能が発揮されないこともあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５２２３４０９号明細書
【特許文献２】米国特許第５８２１０４７号明細書
【特許文献３】米国特許第５８８５７９３号明細書
【特許文献４】米国特許第５９６９１０８号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】豊田中央研究所Ｒ＆Ｄレビュー  ３４， ３１−３８，  （１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、改変された抗体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）以下のｉ）〜ｉｉｉ）の工程を有することを特徴とする、改変されたモノクローナル抗体の製造方法。
ｉ）当初のモノクローナル抗体（０）のＨ鎖遺伝子に変異を導入し、それを当初のモノクローナル抗体（０）のＬ鎖遺伝子と掛け合わせて発現させ、目的の性能を有する変異体（Ｈ１）をスクリーニングで選択する。
ｉｉ）当初のモノクローナル抗体（０）のＬ鎖遺伝子に変異を導入し、それを当初のモノクローナル抗体（０）のＨ鎖遺伝子と掛け合わせて発現させ、目的の性能を有する変異体（Ｌ１）をスクリーニングで選択する。
ｉｉｉ）上述のｉ）で選択された変異体（Ｈ１）のＨ鎖遺伝子と、上述のｉｉ）で選択された変異体（Ｌ１）のＬ鎖遺伝子とを掛け合わせ、モノクローナル抗体（ＨＬ）を発現させる。
（２）エラープローンＰＣＲ法により変異を導入する（１）に記載の製造方法。
（３）当初のモノクローナル抗体（０）がウサギに由来するものである、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）当初のモノクローナル抗体（０）がテストステロンとの反応性を有するものである、（１）〜（３）いずれかに記載の製造方法。
（５）上述の（１）〜（４）いずれかに記載の製造方法によって得られる改変されたモノクローナル抗体。
【００１３】
以下、本発明について図１を用い更に詳細に説明する。
【００１４】
本発明において「モノクローナル抗体」とは、特に断らない限り、Ｈ鎖とＬ鎖の遺伝子が一つに繋がれていない別個の状態で発現されたモノクローナル抗体を意味する。
【００１５】
本発明において、当初のモノクローナル抗体（０）は特に限定されるものではなく、例えばテストステロン、プロゲステロン、コルチゾールなどのステロイド化合物などの低分子化合物、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）や前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などのタンパク質、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）やインスリンなどのペプチドとの反応性を有する抗体があげられる。
【００１６】
また当初のモノクローナル抗体（０）の種類には特に限定はなく、例えばウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヒトなどの哺乳類の動物に由来する抗体や、アフリカツメガエルなどの両生類の動物に由来する抗体、ニワトリなどの鳥類に由来する抗体や、魚類に由来する抗体等があげられる。なお本発明において用いられるモノクローナル抗体（０）は、目的とする性能により近いものを用いることが好ましい。
【００１７】
本発明において、工程ｉ）、ｉｉ）を行う順序には特に限定はなく、どちらが先でもよく、また同時に行ってもよい。また工程ｉ）、ｉｉ）において変異を導入する方法には特に限定はなく、例えばエラープローンＰＣＲ法を用いることができ、それ以外にも、ターゲットとしている遺伝子配列に変異を導入できる手法であればどのようなものでもよい。具体的には、塩酸ヒドロキシルアミンなどの化学物質を用いる方法や、紫外線を照射する方法、そして、遺伝子に変異導入が頻発するよう改変された大腸菌を用いる方法などがある（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ３８８，  ７１−８０  （２００９）、Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，  ９，  ２７１−２８８  （２００９））。
【００１８】
本発明では、スクリーニングにより目的とする性能を有するモノクローナル抗体を選択するが、このときの性能としては特に限定されるものではなく、例えば感度、特異性などがあげられる。また工程ｉ）、ｉｉ）において同じ性能に基づいてスクリーニングしてもよく、また異なる性能に基づいてスクリーニングしてもよい。スクリーニングの方法には特に限定はなく、例えばＥＬＩＳＡ等が用いられる。
【００１９】
本発明の方法は繰り返し行ってもよい。特に２回目以降は性能において異なる観点からスクリーニングを行うと、より目的にあったモノクローナル抗体が得られることもある。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、抗体の性能を容易に確実に改良できるようになった。特に本発明は、抗体のＨ鎖とＬ鎖の遺伝子が一つにつながれていない別個の状態で発現されているので、スクリーニング時の性能が最終的に得られるモノクローナル抗体の性能として反映されやすいという効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の概要を示す図である。
【図２】実施例のアウトラインを示す図である。
【図３】実施例のＥＬＩＳＡによるスクリーニングにおいて、３通りの実験のフォーマットを示す図である。
【図４】実施例のＥＬＩＳＡによるスクリーニングの結果を示す図である。
【図５】実施例における抗体の特異性評価結果を示す図である。
【実施例】
【００２２】
以下、ウサギ抗テストステロン抗体の実施例を用いて本発明について詳細に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。なお、実施例の概要を図２に示す。
（１）ウサギモノクローナル抗体のクローニング
以下の方法により抗テストステロンウサギモノクローナル抗体を取得した（特開２００９−２４０３００号公報、特開２０１３−０８３４４８号公報、特開２０１３−１２４２２４号公報）。まず、テストステロンにリンカーを生やしてＢＳＡと結合させた。そしてこのＢＳＡ−テストステロンを抗原としてウサギに免疫した。その後、免疫を行なったウサギから抗体産生細胞を単離した。そしてこの細胞から抗体遺伝子をクローニングしてテストステロンと反応性のあるモノクローナル抗体を取得した。
（２）抗体遺伝子への変異導入
テストステロンと反応性のある抗体の遺伝子に変異を導入した。実験手順は以下の通りである。
【００２３】
まず、エラープローンＰＣＲバッファ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、７０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％（Ｗ／Ｖ）  ゼラチン）１０μｌとｄＮＴＰ  ｍｉｘ溶液（２ｍＭ  ｄＡＴＰ、２ｍＭ  ｄＧＴＰ、１０ｍＭ  ｄＣＴＰ、１０ｍＭ  ｄＴＴＰ）１０μｌ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２溶液３μｌ、５０μＭ  Ｆｗ／Ｒｖ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｍｉｘ溶液１μｌ、クローニングした抗体遺伝子（Ｈ鎖またはＬ鎖）を含むベクター溶液（１０ｎｇ／μｌ）１μｌ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラ−ゼ溶液（５ｕｎｉｔ／μｌ）１μｌ、滅菌水７４μｌをそれぞれ加えて反応溶液を調製した。そしてこの反応溶液を２０μｌずつ分注してＰＣＲ反応を行い、抗体遺伝子の全長にわたりランダムで変異を導入した。ＰＣＲの反応条件は９４℃、１０秒→９４℃、３０秒→６０℃、１分→７２℃、２分→４℃であり、９４℃、３０秒→６０℃、１分→７２℃、２分の部分を３５回行ってから４℃へ温度を変化させた。そしてＰＣＲ反応終了後にアガロースゲル電気泳動を行い、遺伝子が増幅されていることを確認した。その後分注してある反応液を一つにまとめ、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧＦＸ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＥライフサイエンス社製）でＰＣＲ産物を精製した。
【００２４】
次にこのＰＣＲ産物を制限酵素で処理した。その後、同じ制限酵素で処理した抗体発現ベクター（アンピシリン耐性遺伝子を含む）にこの遺伝子を挿入した。そして抗体遺伝子が挿入された発現ベクターを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。この大腸菌をＬＢ寒天培地（アンピシリン含有）上に播き、３７℃で一晩培養した。培養後にできる大腸菌のコロニーを１個ずつ拾ってＬＢ培地（アンピシリン含有）へ植菌し、３７℃で一晩培養した。そして変異が導入された抗体遺伝子の発現ベクターをアルカリミニプレップ法で精製した。
（３）変異が導入された抗体の発現
作製したベクターをＣＯＳ−１細胞へ遺伝子導入し、変異が導入された抗体を発現させた。実験手順は以下の通りである。
【００２５】
まず、１０％ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社製）にＣＯＳ−１細胞を懸濁して９６ウェルプレート（ファルコン社製）に１００μｌ／ウェルずつ播いた。このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下に置き、プレート一面に細胞が増殖するまで培養を継続した。細胞がプレート一面に増殖したら、使用していた培地を一旦除去した。そしてここへ新たにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社製）を１００μｌ／ウェルずつ加えた。その後このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下で３時間静置した。
【００２６】
この３時間の静置が終わる３０分前に、以下の作業を行った。まず１２ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に１２０μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ライフテクノロジーズ社製）を加えてよく混和した。そしてこの溶液に１９２０ｎｇの野生型Ｈ鎖遺伝子発現ベクター、または、３８４０ｎｇの野生型Ｌ鎖遺伝子発現ベクターを加えてよく混和した。その後この溶液をそれぞれ５０μｌ／ウェルずつ９６ウェルプレートに分注した。ここに変異を導入したＬ鎖遺伝子発現ベクター（１６ｎｇ／ウェル）、または、変異を導入したＨ鎖遺伝子発現ベクター（８ｎｇ／ウェル）をそれぞれ加え、野生型Ｈ鎖遺伝子×変異型Ｌ鎖遺伝子または変異型Ｈ鎖遺伝子×野生型Ｌ鎖遺伝子の組み合わせとなるように溶液を調整した。その後このトランスフェクション溶液を３７℃で３０分間静置した。
【００２７】
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地へ培地交換を行ってから３時間後、ＣＯＳ−１細胞を培養しているプレートに先程調製したトランスフェクション溶液をそれぞれ５０μｌ／ウェルずつ加えた。その後このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下に置き、１週間培養して抗体を発現させた。
（４）ＥＬＩＳＡによるスクリーニング
抗体遺伝子を導入した細胞から培養上清を回収し、その中にある抗体の性能（感度及び特異性）をＥＬＩＳＡで調べてスクリーニングした。今回の実験は抗原が低分子化合物である。そのため、競合法で抗体の性能評価を行った。この競合法は、アルカリホスファターゼで標識した抗原と、未標識の抗原や交叉物質とを混ぜて反応させる実験系である。この手法で抗体の感度や特異性の性能を評価するためには、３通りの実験フォーマットが必要となる（図３プレートＡ〜Ｃ）。そのため本実験では、トランスフェクションを行ったＣＯＳ−１培養プレート（９６ウェル）１枚に対して３枚のＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）を用意した。そして培養上清をＥＬＩＳＡプレートの対応するウェルにそれぞれ等量ずつ加え、各変異体の性能を評価した。詳細な条件は以下の通りである。
【００２８】
まずヤギ−抗ウサギ抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように固相化バッファ（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、  ３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、  ｐＨ  ９．６）へ溶解した。そしてこれを１００μｌ／ウェルずつＥＬＩＳＡ用プレート（９６ウェル、グライナー社製）に分注した。このプレートを室温で１時間静置した後、洗浄バッファ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、  ７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、  ０．０５％  ｔｗｅｅｎ２０、  ｐＨ  ７．４）で各ウェルを３回洗浄した。その後ブロッキングバッファ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、  １．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、  １３７ｍＭ    ＮａＣｌ、  ２．７ｍＭ  ＫＣｌ、  １％  スキムミルク、  ｐＨ７．５）を２００μｌ／ウェルずつ加えて室温で１時間静置し、洗浄バッファで各ウェルを１回洗浄した。そして、このプレートにインキュベーションバッファ（８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、  １．５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、  １３７ｍＭ  ＮａＣｌ、  ２．７ｍＭ  ＫＣｌ、０．１％  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、  ｐＨ７．５）を７０μｌ／ウェルずつ加えた。その後、培養プレートと対応するウェルの位置に培養上清をそれぞれ３０μｌ／ウェルずつ加えた。尚ここでは、これと同じように培養上清を加えたＥＬＩＳＡプレートを他に２枚複製して作った。次にこれらのプレートを室温で１時間静置し、洗浄バッファで各ウェルを３回洗浄した。
そして作製した３枚のＥＬＩＳＡプレートのうち１つ目には、アルカリホスファターゼで標識したテストステロン（以下、ＣＪとする）を含むインキュベーションバッファを１００μｌ／ウェルずつ加えた。このプレートをプレートＡとする。次に２つ目のプレートには、ＣＪと何も標識されていないテストステロンとを含むインキュベーションバッファを１００μｌ／ウェルずつ加えた。このプレートをプレートＢとする。最後に３つ目のプレートには、ＣＪと何も標識されていない交叉物質（デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩、デヒドロエピアンドロステロン−グルクロナイト、アンドロステロン硫酸塩の混合物）とを含むインキュベーションバッファを１００μｌ／ウェルずつ加えた。このプレートをプレートＣとする。
その後これらのプレートを室温で１時間静置し、洗浄バッファで各ウェルを３回洗浄した。最後にこれらのプレートへ１００μｌ／ウェルずつアルカリホスファターゼバッファ（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  リン酸４−メチルウンベリフェリル、ｐＨ９．８）を加えて３０分静置し、蛍光強度を測定した（励起光  ３６０ｎｍ  ／  蛍光  ４６５ｎｍ）。トランスフェクションを行った全ての培養プレートについて以上の実験を行い、各変異体の性能を評価した。
【００２９】
得られた測定結果を基に、各変異体の性能を以下の通り評価した。まず、プレートＡの各ウェルから発せられる蛍光強度（Ｂ０）をそれぞれ１００％として定義した。そしてこれに対応するプレートＢの各ウェルから発せられる蛍光強度（ｔｅｓｔ  Ｂ）を、プレートＡに対する相対値にそれぞれ変換した［（ｔｅｓｔ  Ｂ／Ｂ０）×１００］。この時、この値が小さいほど、抗体の抗原検出感度が高いことを意味している。またプレートＣについても同様の計算を行い、プレートＡに対する相対的な蛍光強度［（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ／Ｂ０）×１００］を求めた。この時、この値が大きいほど、抗体の特異性が高いことを意味している。以上の計算を行った後、プレートＡの各ウェルから発せられる蛍光強度を円の大きさ、抗原検出感度［（ｔｅｓｔ  Ｂ／Ｂ０）×１００］を横軸、特異性［（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ／Ｂ０）×１００］を縦軸として各ウェルの測定結果を図４にプロットした。そしてこの図を基に各変異体の性能を評価してスクリーニングを行った。実験の結果、変異の導入によって抗体の性能が著しく変化していることを確認できた（図４）。図４において黒丸は、変異を導入していない当初のモノクローナル抗体（野生型Ｈ鎖×野生型Ｌ鎖）を示す。
（５）変異を導入したＨ鎖遺伝子と変異を導入したＬ鎖遺伝子とのかけあわせ
図４に示すように、変異導入の結果、抗体の抗原検出感度や特異性が著しく変化していた。しかし、その２つの性能が同時に向上している変異体は一つも見つからなかった。そこで、感度の性能が向上している変異体と特異性の性能が向上している変異体とを掛け合わせて発現させることにした。そしてこの掛け合わせにより、抗体の抗原検出感度と特異性とを同時に向上させられないか検討した。そこで今回は、ＥＬＩＳＡによるスクリーニングで感度が向上していたＨ鎖変異体と、特異性が向上していたＬ鎖変異体とを掛け合わせて発現させることにした。
【００３０】
まず、１０％ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社製）にＣＯＳ−１細胞を懸濁して６ウェルプレート（ファルコン社製）に１．６ｍｌ／ウェルずつ播いた。このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下に置き、プレート一面に細胞が増殖するまで培養を継続した。細胞がプレート一面に増殖したら、使用していた培地を一旦除去した。そしてここへ新たにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフテクノロジーズ社製）を１．６ｍｌ／ウェルずつ加えた。その後このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下で３時間静置した。
【００３１】
この３時間の静置が終わる３０分前に、以下の作業を行った。まず１．６ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地に１６μｌのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ライフテクノロジーズ社製）を加えてよく混和した。そしてこの溶液に変異型Ｈ鎖遺伝子発現ベクター（図４の感度向上クローン）２６７ｎｇと変異型Ｌ鎖遺伝子発現ベクター（図４の特異性向上クローン）５３２ｎｇとを加えてよく混和した。尚ここではコントロールとして利用するためこれ以外にも、前述の変異型Ｈ鎖遺伝子×野生型Ｌ鎖遺伝子、野生型Ｈ鎖遺伝子×変異型Ｌ鎖遺伝子、野生型Ｈ鎖遺伝子×野生型Ｌ鎖遺伝子の組み合わせで発現ベクターを混ぜた溶液もそれぞれ作製した。そしてこれらの溶液を３７℃で３０分間静置した。
【００３２】
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地へ培地交換を行ってから３時間後、ＣＯＳ−１細胞を培養しているプレートに先程調製した溶液をそれぞれ８００μｌ／ウェルずつ２ウェルに加えた。その後このプレートを３７℃・５％ＣＯ２条件下に置き、１週間培養して抗体を発現させた。
（６）変異を導入した抗体遺伝子同士をかけあわせた抗体の性能評価
抗体の性能を以下の方法で評価した。初めに、抗体の抗原検出感度の評価方法から述べる。まずＣＪを抗ウサギＩｇＧ抗体固定化粒子と混ぜた。次に、テストステロン濃度が既知であるキャリブレーター溶液（Ｃａｌ２−６）を用意してここにそれぞれ一定量加えた。そして更に、抗体を発現させた培養上清をここに加えて１０分間インキュベーションした。その後Ｂ／Ｆ分離を行なった後にＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そしてテストステロンが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、各キャリブレーター（Ｃａｌ２−６）のシグナル（Ｂ）をそれぞれ相対的な値［（  Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。テストステロン濃度を横軸（対数）、Ｂ／Ｂ０（％）を縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した。そして（Ｂ／Ｂ０）×１００＝５０％となる時のキャリブレーター濃度（Ｃ５０）を指標とし、各抗体の抗原検出感度を定量的に評価した（この値が小さいほど、抗原検出感度が高いことを意味している）。尚この一連の操作は、東ソー社製ＡＩＡ―６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行なわれた。以上の方法で各抗体の抗原検出感度を評価したところ、変異導入Ｈ鎖と変異導入Ｌ鎖とを掛け合わせた抗体は、変異導入Ｈ鎖と野生型Ｌ鎖とを掛け合わせた抗体とほぼ同等レベルの抗原検出感度を有することが分かった。
【００３３】
【表１】
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次に、抗体の特異性評価方法について述べる。まずは先程と同様に各抗体の検量線を作成した。その後、Ｃａｌ１に交叉物質（デヒドロエピアンドロステロン硫酸塩、デヒドロエピアンドロステロン−グルクロナイト、または、アンドロステロン硫酸塩）を加えた溶液を作製した。そしてこの溶液をＣＪと一緒に抗ウサギＩｇＧ抗体固定化粒子へ加えた。そして更に抗体を発現させた培養上清をここに加え、１０分間インキュベーションした。その後Ｂ／Ｆ分離を行なった後にＡＬＰの基質を加え、固相に結合しているＣＪから発せられるシグナルを検出した。そしてテストステロンが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、交叉物質を含むキャリブレーターを加えた時のシグナル（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ）をそれぞれ相対的な値［（Ｃｒｏｓｓ  Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。この値を先程作成した検量線上にプロットし、テストステロンとして測定される濃度をそれぞれ求めた。そして、交叉物質に対する各抗体の交叉反応率をそれぞれ計算した。この時、野生型抗体が示す各交叉物質との交叉反応率を１００％と設定した。そして各変異体の交叉反応率を野生型抗体に対する相対的な値に換算して特異性の評価を行った（この値が低いほど特異性が高いことを意味している）。尚この一連の操作は、東ソー社製ＡＩＡ―６００ＩＩを用いて３７℃にて全自動で行なわれた。以上の方法で各抗体の特異性を評価したところ、変異型Ｈ鎖と変異型Ｌ鎖とを掛け合わせた抗体は、野生型Ｈ鎖と変異型Ｌ鎖とを掛け合わせた抗体とほぼ同等レベルの特異性を有することが分かった（図５）。
【００３４】
以上の結果から、変異を導入したＨ鎖遺伝子と変異を導入したＬ鎖遺伝子とを組み合わせることで抗体の性能を改良できる（抗原検出感度と特異性を同時に改良できる）ことが明らかになった。したがって本発明を用いることにより、抗体の性能を容易に改良することが可能になった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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