(57)【要約】      （修正有）【課題】視神経保護、並びに視神経再生のための組成物の提供。【解決手段】β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体又はβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体を含み、経口投与又は経口投与に類する投与方法によって投与される、視神経の保護及び視神経再生に有用な組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体を含み、経口投与または経口投与に類する投与方法によって投与される、視神経を保護するための医薬組成物。
【請求項２】
β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体を含み、経口投与または経口投与に類する投与方法によって投与される、視神経を再生するための医薬組成物。
【請求項３】
視神経の軸索を伸長する、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸が、β−ヒドロキシプロピオン酸、β−ヒドロキシ吉草酸、β−ヒドロキシカプロン酸、β−ヒドロキシカプリル酸、β−ヒドロキシカプリン酸およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項５】
β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
β−ヒドロキシ酪酸とβ−ヒドロキシ吉草酸の共重合体を含む、請求項１〜３いずれかに記載の組成物。
【請求項７】
β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体の重量平均分子量が１,０００〜２０,０００,０００である、請求項１〜５いずれかに記載の組成物。
【請求項８】
β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体がスピルリナにより産生されたものである、請求項１〜６いずれかに記載の組成物。
【請求項９】
視神経障害の予防または治療のための、請求項１から８いずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
緑内障、糖尿病網膜症、視神経炎、多発性硬化症に伴う視神経障害、外傷後の後遺症を含む視神経症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性からなる群から選択される疾患の予防または治療のための、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体を、ヒト対象に経口で摂取させることを含む、眼の健康状態を維持する方法(但しヒトに対する医療方法を除く)。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、視神経保護ならびに視神経再生のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国における失明原因は、その多くが網膜や視神経の変性疾患で占められている。眼外傷などの原因による視神経の損傷もまた、視力を失う原因となりうる。損傷を受けた視神経を再生して、失われた視覚機能を取り戻す方法は未だ実現されていない。ｉＰＳ細胞を用いた網膜再生についての臨床試験が開始されたが、視神経の細胞体である網膜神経節細胞の誘導法は確立されていないだけでなく、未だその安全性、有効性は不明である。
【０００３】
短〜中鎖脂肪酸のβ−ヒドロキシ化物を重縮合して得られる重合体は、胃や小腸でほとんど、あるいは少ししか分解されず、その大部分が大腸まで送達される。大腸まで送達された重合体は腸内細菌叢に含まれる細菌によって分解され、水溶性のβ−ヒドロキシ短〜中鎖脂肪酸モノマーまたはオリゴマーとなり、大腸から吸収されて生理作用を発揮する（特許文献１）。短〜中鎖脂肪酸のβ−ヒドロキシ化物を重縮合して得られる重合体を摂取することにより血中のケトン体濃度を穏やかに上昇させることができる(特許文献２)。しかしながら、短〜中鎖脂肪酸のβ−ヒドロキシ化物を重縮合して得られる重合体の視神経に対する作用は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報ＷＯ２００５／０２１０１３
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２００８／１２０７７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本願は、視神経を保護し、また視神経を再生させる物質を提供することを目的とする。本願はまた、視神経障害の予防または治療に有用な物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体を含み、経口投与または経口投与に類する投与方法によって投与される、視神経を保護するための組成物を提供する。
【０００７】
本発明はまた、β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体を含み、経口投与または経口投与に類する投与方法によって投与される、視神経を再生させるための組成物を提供する。
【０００８】
本発明の組成物は、視神経の保護並びに視神経の再生作用を有する。特に、視神経細胞の軸索の伸長を促進する。よって、本発明の組成物により、視神経障害の処置、特に緑内障、糖尿病網膜症、視神経炎、多発性硬化症に伴う視神経障害、視神経症（外傷後の後遺症を含む）、網膜色素変性症、加齢黄斑変性等の視神経障害を伴う疾患を処置することが可能である。よって本発明はさらに、当該疾患を処置するための医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】実施例１の視神経挫滅前後の光干渉断層計による網膜断面のイメージング。Normalは神経挫滅前のマウスの、「−」および「＋」はそれぞれ対照群、試験群の視神経挫滅後２週間のマウスより得た網膜である。矢印部はGanglion Cell Complex（ＧＣＣ）と呼ばれる、内境界膜から内網状層までの部分を示す。
【図１Ｂ】図1Ａに示すＧＣＣの厚みを比較したグラフ。縦軸はnormalを100%とした場合の比率を示す。ｐ＜０．００１
【図２Ａ】実施例１の神経挫滅前後の網膜の断面をヘマトキシリンエオジン染色した写真。Normalは神経挫滅前のマウスの、「−」および「＋」はそれぞれ対照群、試験群の視神経挫滅後２週間のマウスより得た網膜である。スケールバーは５０マイクロメートル。ＧＣＬは網膜神経節細胞層、ＩＮＬは内顆粒層、ＯＮＬは外顆粒層を示す。
【図２Ｂ】図２Ａにおいて一方の鋸状縁から視神経を通りもう一方の鋸状縁までの間の網膜断面のＧＣＬ内神経細胞数を示す。＊ｐ＜０．０１
【図３Ａ】視神経挫滅２週間後の視神経の長軸方向の切片写真。観察の３日前に眼球内に投与した蛍光色素付きコレラ毒素Ｂ（ＣＴＢ）を利用して、挫滅後の視神経軸索を観察した。矢印は再生した軸索を、アスタリスクは挫滅部位を示す。「−」および「＋」はそれぞれ対照群、試験群を示す。
【図３Ｂ】図３Ａにおいて、挫滅部位から１００、２５０および５００マイクロメートル地点における再生軸索の数を数値化したグラフ。白が対照群、黒が試験群を示す。＊ｐ＜０．０５
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本願の「β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体」を構成する炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸としては、β−ヒドロキシプロピオン酸、β−ヒドロキシ吉草酸、β−ヒドロキシカプロン酸、β−ヒドロキシカプリル酸およびβ−ヒドロキシカプリン酸が例示され、β−ヒドロキシ酪酸とβ−ヒドロキシ吉草酸の共重合体が特に好適に用いられる。以下明細書において、「β−ヒドロキシ酪酸の単独重合体およびβ−ヒドロキシ酪酸と炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸との共重合体からなる群から選択される重合度１０以上の水不溶性重合体」を「本願のβ−ヒドロキシ酪酸重合体」と記載する。
【００１１】
本願のβ−ヒドロキシ酪酸重合体は、胃や小腸でほとんど、あるいは少ししか分解されず、その大部分が大腸まで送達される。大腸まで送達された重合体は腸内細菌叢に含まれる細菌によって分解され、水溶性のβ−ヒドロキシ酪酸や炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸のモノマーまたはオリゴマーとなり、大腸から吸収されて生理作用を発揮する（特許文献１）。
【００１２】
本願のβ−ヒドロキシ酪酸重合体にはβ−ヒドロキシ酪酸を含む炭素数３〜１２のβ−ヒドロキシ飽和脂肪酸またはそのオリゴマーの生理作用を妨げない限り、他のモノマー単位を含んでいてもよい。
【００１３】
本願のβ−ヒドロキシ酪酸重合体は、水不溶性であればその重合度の上限は特に限定的ではない。重合体が水溶性であれば、経口投与されるとそのままの形で、あるいは胃や小腸における酸、アルカリ条件下で加水分解された形で大腸へ到達する前に吸収され、本発明の効果を発揮することができない。
【００１４】
本願のβ−ヒドロキシ酪酸重合体においては、重合度がほぼ１０以上となると水不溶性となる。従って例えばβ−ヒドロキシ酪酸単独重合体であれば重量平均分子量が１,０００以上のもの、特に重量平均分子量が１,５００以上のものが好適に用いられる。重合体分子量の上限としては特に限定的ではなく、重合体として製造できるものであればいずれも本発明に用いることができる。例えば。微生物により重量平均分子量２０，０００，０００以上のβ−ヒドロキシ酪酸重合体を得たという報告がある（Appl.Microbiol.Biotechnol.,47,140-143(1997))。本発明で用いられる本願のβ−ヒドロキシ酪酸重合体として、好ましくは重合体の重合度２０〜１００，０００、より好ましくは重合度２０〜２０，０００のものが例示される。
【００１５】
本発明の重合体は、公知のいかなる方法を用いて調製してもよい。具体的な本願のβ−ヒドロキシ酪酸重合体の調製法は例えば、原料となるβ-ヒドロキシ飽和脂肪酸のモノマーを脱水重縮合する常套のポリエステル合成方法により得ることができる。
【００１６】
また、本発明の重合体としては、微生物あるいは高等生物により産生されるβ-ヒドロキシ酪酸重合体を用いてもよい。
【００１７】
β-ヒドロキシ酪酸重合体を産生する多くの細菌が知られている（Microbiol.Rev.,54,450-472(1990)およびBiotechnol.Bioeng.,49,1-14(1996)、これらの文献は引用により本願に含まれる）。かかる細菌により産生されるものも好適に用いられる。細菌により産生されたβ-ヒドロキシ酪酸重合体は、菌体から分離して用いても、菌体と共に用いてもよい。細菌は一般に蛋白質の含有率が高く、本発明の組成物を飼料や機能性食品として採用する場合には、蛋白源としても有用である。
【００１８】
公知の微生物の中でもラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)、アルカリゲネス・ラタス（Alcaligenes latus）はβ−ヒドロキシ酪酸重合体を大量に生産することが知られている。特にラルストニア・ユートロファ(Ralstonia eutropha)は、過去に微生物蛋白として検討されたが、菌体自体の成分に占める蛋白質含有率が高く、また、従来成長促進のために添加されているセリンやグリシン等のアミノ酸含有率も多い。したがって、β−ヒドロキシ酪酸重合体などを提供するためのみならず、蛋白源としても有効性が高く、飼料や食品へ配合する場合には特に好ましい。
【００１９】
本発明のβ-ヒドロキシ酪酸重合体はスピルリナにより産生されたものであってもよい。スピルリナは、熱帯や亜熱帯地域の淡水に生息する藍藻類であり、アフリカのChad湖やメキシコのTexcoco湖などでは古くから原住民によって食用にされてきた。今では高い栄養価（高蛋白・高ミネラル・高ビタミン）を特徴とする健康食品としても市販されている。
【００２０】
健康食品として市販されているスピルリナは通常、その乾燥重量中０．１重量％程度以下のβ−ヒドロキシ酪酸重合体しか含有しない。本発明においては培養条件を調節する等によりβ−ヒドロキシ酪酸重合体含有量を増したスピルリナ（例えばJ.Biotechnol.,172,2791-2792(1990)参照、本文献は引用により本願に含まれる）が好適に用いられる。本発明の組成物においてβ-ヒドロキシ酪酸重合体としては、スピルリナから単離したものを用いても、スピルリナをそのまま配合してもよい。
【００２１】
β-ヒドロキシ酪酸重合体含有量を増したスピルリナとしては、β-ヒドロキシ酪酸重合体、特にβ−ヒドロキシ酪酸重合体を乾燥重量中０．２重量％以上、好ましくは１重量％以上、より好ましくは３重量％以上含有するものが好適に用いられる。スピルリナに含有されるβ-ヒドロキシ酪酸重合体の量としては、多いほど好ましく、培養条件の調節等により含有量を増やすことができれば特に上限は無い。例えばスピルリナ乾燥重量中２０重量％以上、さらに例えば４０重量％までのβ−ヒドロキシ酪酸重合体を含有するものを用いてもよい。
【００２２】
また、ヒドロキシ脂肪酸重合体を元来生産しない微生物や植物に遺伝子組換えの技術を用いてヒドロキシ脂肪酸重合体を生産可能とする技術が開発されている（J.Bacteriol.,170,4431-4436、5837-5847(1988)およびScience,256,520-523(1992)、これらの文献は引用により本願に含まれる）。本発明において用いるβ-ヒドロキシ酪酸重合体としては、かかる遺伝子組換技術により得られる微生物や植物が産生する重合体を用いてもよい。重合体は微生物や植物から単離して用いても、あるいは該重合体を含有する微生物や植物自体を用いてもよい。
【００２３】
本発明の組成物は、経口投与、または経口投与に類する投与方法にて投与することによって、動物における神経保護作用を示す。本明細書において「動物」とはヒトを含む哺乳動物を意味する。
【００２４】
本出願において「経口投与もしくは経口投与に類する投与方法」とは、経口投与に加えて経鼻チューブ投与および胃内投与や大腸内への直接注腸等の消化管内投与を含む投与方法などを意味する。経口投与がより容易で実用上好ましい。特許文献１に示されるように本発明のβ−ヒドロキシ酪酸重合体は動物の体内において腸内細菌によって分解される。従って経口投与した場合でも小腸で吸収されてそのまま血中へ取り込まれるのではなく、大腸まで重合体として送達され、大腸において分解され、利用される。
【００２５】
実施例に示すように、マウス視神経挫滅モデルにおいて、本発明のβ−ヒドロキシ酪酸重合体を経口投与することによって、視神経保護作用並びに視神経再生作用、特に軸索再生作用を確認した。視神経挫滅モデルにおいては、視神経を部分的に挫滅させることによって直接障害されなかった網膜神経節細胞にも二次的な細胞死が誘導され、視神経障害、例えば緑内障や外傷性視神経症のモデルとして有用であることが知られている。
【００２６】
本発明のβ−ヒドロキシ酪酸重合体を経口投与することによって、視神経保護作用、視神経再生作用、特に軸索再生作用が認められることから、β−ヒドロキシ酪酸重合体を含有する組成物は、視神経障害、特に緑内障、糖尿病網膜症、視神経炎、多発性硬化症に伴う視神経障害、視神経症（外傷後の後遺症を含む）、網膜色素変性症、加齢黄斑変性の治療並びに予防に有用である。
【００２７】
一方、特許文献１にて示したように、本発明に用いられるβ−ヒドロキシ酪酸重合体は、長期投与した場合でも身体に対する悪影響は確認されていない。従って、β−ヒドロキシ酪酸重合体を含有する本発明の組成物は視神経障害の予防または治療のため、もしくは視神経障害の進行阻止並びに進行遅延のために長期間投与することができる。
【００２８】
本発明の組成物はまた、健康状態の維持管理や疾病予防を目的とする機能性食品としても好適に用いられる。本出願において「機能性食品」とは、サプリメント、経腸栄養剤、成分栄養剤、医療食および術後食、高齢者用食品や妊産婦・授乳婦用食品、乳幼児用食品あるいはこれらへの添加剤等を含むものとする。本発明の組成物を摂取させることによる、眼の健康状態を維持する方法（但しヒトに対する医療方法を除く）、もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００２９】
本発明の組成物が特定の疾患の治療を目的とする医薬組成物として提供される場合、あるいはヒトを含む動物に対して、特定の疾患の予防や総合的な健康状態を維持乃至向上させるための機能性食品もしくは食品や飼料への添加物として提供される場合も本発明の範囲に含まれる。
【００３０】
本発明の組成物がヒトを含む動物用医薬組成物として提供される場合、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、舌下剤、トローチ、咀嚼可能錠剤、懸濁液等、経口投与により投与されるあるいは経口により摂取されるいかなる形態であってもよい。これらの投与製剤は、常套法により調製することができる。また本発明の組成物は、食品や飲料等へ配合して経口摂取に供してもよい。
【００３１】
本発明の組成物へ、医薬上許容される適当な添加剤を含有させてもよい。添加剤としては特に限定されず賦形剤、希釈剤、増量剤、溶剤、潤滑剤、補助剤、結合剤、崩壊剤、被覆剤、カプセル化剤、乳化剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、保存剤、抗酸化剤、矯味剤、芳香剤、着色剤など、製剤学に関する一般書籍に記載されているものから必要に応じて適宜選択すればよい。
【００３２】
さらに本発明の組成物には、本発明の目的に反しない限り、別種の薬効成分を適宜含有させることができる。
【００３３】
本発明に用いられる重合体が微生物、スピルリナ等の藍藻類あるいは植物等の高等生物によって産生されるものである場合には、β−ヒドロキシ短〜中鎖脂肪酸重合体を含有する微生物、藍藻類、植物等高等生物ごと配合してもよい。かかる場合、微生物、藍藻類、植物等高等生物自体も栄養源として有効に利用される。
【００３４】
本発明の組成物中に含まれるβ−ヒドロキシ酪酸重合体の量としては特に規定はなく、投与対象の種別、体重、性別、健康状態、投与目的等によって適宜決定されるべきである。およその目安としては、１日あたり０．１ｍｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ体重である。１回で与えても良いし複数回に分けて与えることもできる。あるいは飲料や食品に０．０１〜２０重量％、好ましくは０．１〜１０重量％配合して与えてもよい。目的に応じて増減してもよいのは当然である。
【００３５】
以下本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。以下の実施例は本発明をいかなる意味においても限定するものではない。
【実施例１】
【００３６】
マウス視神経挫滅モデルにおける視神経保護作用並びに視神経再生作用
使用動物：７週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（入手元  日本クレア株式会社）
基礎飼料：市販粉末飼料（ＣＥ−２  日本クレア（株）製）
被検飼料：基礎飼料にβ−ヒドロキシ酪酸重合体（重量平均分子量＝８３９，０００（ポリスチレン換算：ＧＰＣ測定））を５重量％添加
給水：自由摂取
飼育環境：温度２３℃、湿度５０％、毎日８時〜２０時に蛍光灯点灯。
Normal群４匹、試験群８匹、対照群４匹のマウスを用いた。試験群には基礎飼料に５質量％のβ−ヒドロキシ酪酸重合体を配合した飼料を給餌した。Normal群と対照群には基礎飼料をそのまま与えた。３週間飼育した後、視神経挫手術を行った。
【００３７】
視神経挫滅の方法：マウスをペントバルビタールナトリウムによる全身麻酔下に置き結膜を切開し、視神経を露出した。眼球の後方0.5〜1.0ミリの部位の視神経をピンセットで５秒間把持して挫滅した。この処置によって軸索は障害されるが、視神経が切断されることはないため、その後の視神経再生が観察可能である。
【００３８】
神経挫滅手術後も試験群、対照群共に同じ飼料を給餌しつづけた。神経挫滅手術の１１日後に、蛍光色素付きＣＴＢを眼球内投与した。
視神経挫滅手術の１４日後にマウスを全身麻酔下に置き、光干渉断層計による網膜イメージングを行った（図１）。次に各動物を４％パラホルムアルデヒドにて還流固定し、視神経を含む網膜切片を作成した。視神経を含む切片について、ヘマトキシリンエオジン染色を行い、一方の鋸状縁からもう一方の鋸状縁までの間に存在するＧＣＬ内の神経細胞数をカウントした（図２）。視神経切片については蛍光顕微鏡にてCTBを観察し、視神経挫滅部位から１００、２５０および５００マイクロメートル地点における再生軸索の数をカウントした。有意差の有無はStudent's t-testによって判定した。
結果を図１〜３に示す。
【００３９】
図１Ａは視神経挫滅前後の光干渉断層計による網膜断面のイメージング。Normalは神経挫滅前のマウスの、「−」および「＋」はそれぞれ対照群、試験群の視神経挫滅後２週間のマウスより得た網膜である。矢印部はGanglion Cell Complex（ＧＣＣ）と呼ばれる、内境界膜から内網状層までの部分を示す。図１ＢはNormal、試験群、対照群のＧＣＣの厚みを比較したグラフである。
視神経挫滅によりＧＣＣの厚みの減少が認められるが、試験群では対照群と比して有意にＧＣＣが厚く、本発明の組成物による視神経保護作用が確認された。光断層干渉計はin vivoにおける網膜生体イメージングを可能にしており、信頼性が高いと考えられる。
【００４０】
図２Ａは神経挫滅前後の網膜の断面をヘマトキシリンエオジン染色した写真。Normalは神経挫滅前のマウスの、「−」および「＋」はそれぞれ対照群、試験群の視神経挫滅後２週間のマウスより得た網膜である。スケールバーは５０マイクロメートル。ＧＣＬは網膜神経節細胞層、ＩＮＬは内顆粒層、ＯＮＬは外顆粒層を示す。
図２Ｂは一方の鋸状縁から視神経を通りもう一方の鋸状縁までの間の網膜断面のＧＣＬ内神経細胞数を示す。＊ｐ＜０．０１
視神経挫滅によりＧＣＬ中の神経細胞数の減少が認められるが、試験群では神経挫滅によるＧＣＬ中の神経細胞数の減少が抑制されており、本発明の組成物による視神経保護作用が確認される。
【００４１】
図３Ａは視神経挫滅２週間後の視神経の長軸方向の切片写真。観察の３日前に眼球内に投与した蛍光色素付きCTBを利用して、挫滅後の視神経軸索を観察した。矢印は再生した軸索を、アスタリスクは挫滅部位を示す。「−」および「＋」はそれぞれ対照群、試験群を示す。
図３Ｂは図３Ａにおいて、挫滅部位から１００、２５０および５００マイクロメートル地点における再生軸索の数を数値化したグラフ。＊ｐ＜０．０５
一旦消失した視神経の軸索が本発明の組成物の摂取により再生したことが確認される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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