(57)【要約】      （修正有）【課題】オガタエア属酵母の機能未知な遺伝子を不活性化することで、異種タンパク質の分泌生産性を向上させる新たな手段の提供。【解決手段】オガタエア属酵母の特定の遺伝子を不活性化することにより異種タンパク質の分泌生産性が向上したオガタエア属酵母及び該遺伝子を不活性化するためのベクター。更に、該オガタエア属酵母を宿主として用いる完全ヒト型化抗ＴＮＦ−αＦａｂ抗体等の異種タンパク質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの遺伝子：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されたオガタエア属酵母。
【請求項２】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することにより得られる請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを形質転換することにより得られる請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項５】
さらに、以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかの遺伝子：
（ｅ）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｇ）配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｈ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化された請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項６】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項５に記載の酵母。
【請求項７】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項６に記載の酵母。
【請求項８】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項６に記載の酵母。
【請求項９】
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる請求項６に記載の酵母。
【請求項１０】
オガタエア属酵母が、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ  ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又はオガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の群より選ばれる少なくとも１種である請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１１】
請求項３又は４に記載の酵母及び／又は請求項７〜９のいずれか１項に記載の酵母を培養して、異種タンパク質を回収する工程を含む異種タンパク質の製造方法。
【請求項１２】
炭素原として、グルコース、グリセロール、及び／又はメタノールを用いて培養することを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の遺伝子を不活性化することにより異種タンパク質の分泌生産性が向上した新規オガタエア属酵母、該遺伝子を不活性化するためのベクター、該新規オガタエア属酵母を宿主として用いた異種タンパク質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子組換え法によって異種タンパク質を生産するための宿主として、ＣＨＯ等の動物細胞や、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、大腸菌や酵母などの微生物が用いられている。中でも、酵母は安価な培地で大規模高密度培養が可能であり、タンパク質を低コストで生産することができる。また、シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌発現も可能なためタンパク質の精製過程も容易となる。特に、酵母は真核生物であるため糖鎖付加などの翻訳後修飾も可能であるという長所が期待でき、様々な研究が行われている。
【０００３】
例えば、非特許文献１には、メタノール資化性酵母を用いて、緑色蛍光タンパク質、ヒト血清アルブミン、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒト上皮成長因子、ヒルジンなどを生産する方法が報告されている。また、非特許文献２には、アルコールオキシダーゼ（Ａｌｃｏｈｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ、ＡＯＸ）プロモーターの下流に低分子化抗体をコードする塩基配列を連結した遺伝子を酵母に導入し、低分子化抗体を生産する方法が報告されている。上述のように、遺伝子組換え法によってタンパク質を生産する宿主として酵母を使用した場合、その生産性の向上のために、異種タンパク質をコードする遺伝子へのシグナル配列の付加、強力なプロモーターの利用、コドン改変、シャペロン遺伝子の共発現、宿主の培養条件の検討など様々な試みがなされている。
【０００４】
一方、培養液中への異種タンパク質分泌生産においては、上述の育種改良の他に、遺伝子の不活性化による生産性向上が報告されている。
例えば、特許文献１には、宿主酵母由来のプロテアーゼ遺伝子及びＶＰＳ遺伝子（Ｖａｃｕｏｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）の不活性化による生産性向上が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１２４５６７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ｄｅｃ；５４（６）：７４１−５０．
【非特許文献２】Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３  Ｄｅｃ；１３４（６）：８１３−７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、オガタエア属酵母の機能未知な遺伝子を不活性化することで、異種タンパク質の分泌生産性を向上させる新たな手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、オガタエア属酵母の染色体ＤＮＡの塩基配列の網羅的解析により、ある機能未知な遺伝子を不活性化することで異種タンパク質の分泌生産性が向上したオガタエア属酵母を見出した。また、前記遺伝子とは異なる機能未知な遺伝子をさらに不活性化することで異種タンパク質の分泌生産性がより向上したオガタエア属酵母を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）
以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの遺伝子：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されたオガタエア属酵母。
（２）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することにより得られる（１）に記載の酵母。
（３）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを形質転換することにより得られる（１）又は（２）に記載の酵母。
（４）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる（１）又は（２）に記載の酵母。
（５）
さらに、以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかの遺伝子：
（ｅ）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｇ）配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｈ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化された（１）〜（４）のいずれか１項に記載の酵母。
（６）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる（５）に記載の酵母。
（７）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られる（６）に記載の酵母。
（８）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる（６）に記載の酵母。
（９）
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られる（６）に記載の酵母。
（１０）
オガタエア属酵母が、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ  ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、又はオガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の群より選ばれる少なくとも１種である（１）〜（９）のいずれか１項に記載の酵母。
（１１）
（３）又は（４）に記載の酵母及び／又は（７）〜（９）のいずれか１項に記載の酵母を培養して、異種タンパク質を回収する工程を含む異種タンパク質の製造方法。
（１２）
炭素原として、グルコース、グリセロール、及び／又はメタノールを用いて培養することを特徴とする（１１）に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、本発明に記載の遺伝子を不活性化することにより異種タンパク質の分泌生産性が向上したオガタエア属酵母及び該遺伝子を不活性化するためのベクターが提供される。さらに、該オガタエア属酵母を宿主として用いる異種タンパク質の製造方法が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下に、本発明を、好ましい実施形態を用いて詳細に説明する。
本発明のオガタエア属酵母は、
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のいずれかの遺伝子：
（ａ）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｃ）配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｄ）配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されていることを特徴とする。
【００１２】
本発明において「オガタエア属酵母」とは、オガタエア・アングスタ（Ｏｇａｔａｅａ  ａｎｇｕｓｔａ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・パラポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐａｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が好ましい。これら３つは近縁種であり、いずれも、別名ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、または別名ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）でも表される。
具体的に使用できる菌株として、オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５（ＡＴＣＣ１４７５４）、オガタエア・ポリモルファ８Ｖ（ＡＴＣＣ３４４３８）、オガタエア・パラポリモルファＤＬ−１（ＡＴＣＣ２６０１２）などの菌株が挙げられる。これらの菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション等から入手することができる。また、本発明においては、これらオガタエア属酵母の菌株からの誘導株も使用でき、例えばロイシン要求性株であれば、ＮＣＹＣ４９５由来のＢＹ４３２９、８Ｖ由来のＢＹ５２４２、ＤＬ−１由来のＢＹ５２４３などが挙げられ、これらはＮａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔから分譲可能である。
【００１３】
本発明において「不活性化」とは、遺伝子の機能が失われている状態、または機能が減少している状態を指し、当該遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡや翻訳産物であるポリペプチドの発現量が低下している状態やｍＲＮＡやタンパク質として正常に機能しない状態も包含する。なお、ｍＲＮＡの発現量はリアルタイムＰＣＲ法、ノーザンハイブリダイゼーション又はＤＮＡアレイを利用したハイブリダイゼーション法等を用いて定量することができ、ポリペプチドの発現量は、ポリペプチドを認識する抗体やポリペプチドと結合性を有する染色化合物等を用いて定量することができる。また、上記に挙げた定量方法以外にも、当業者で用いられている従来法であってもよい。
【００１４】
不活性化させる手段としては、薬剤や紫外線を用いたＤＮＡ変異処理、ＰＣＲを用いた部分特異的変異導入、ＲＮＡｉ、プロテアーゼ、相同組み換え等を利用することができ、遺伝子を不活性化させる場合は、当該遺伝子のＯＲＦ内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）、及び／又はプロモーター領域、エンハンサー領域、ターミネーター領域などの転写開始または停止を制御する領域内の塩基配列の改変（欠失、置換、付加、挿入）により行う。なお、前記欠失、置換、付加、挿入を行う部位や、欠失、置換、付加、挿入される塩基配列は、当該遺伝子の正常な機能が欠損し得る限り、特に限定されない。
【００１５】
本発明における「塩基配列の改変」とは、相同組換えを利用した遺伝子の挿入や部位特異的変異導入の手法を使用して実施することができる。例えば、遺伝子上流プロモーターのより活性の低いプロモーターへの置換や、宿主細胞に適していないコドンへの改変等、また、欠失させたい遺伝子の上流配列、選択マーカー遺伝子配列及び欠失させたい遺伝子の下流配列を連結させたベクターの導入などが挙げられる。
【００１６】
本発明において発現量低下の度合は、異種タンパク質の分泌生産性が向上すれば特に限定されないが、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上低下していることが好ましい。なお、発現量が低下していなくとも、上述のとおり、遺伝子産物の正常な機能が欠損し得る限り、不活性化することができることは、当業者であれば周知であるから、発現量の低下の度合は、あくまで不活性化の判断基準の１つにすぎない。
【００１７】
本発明において「配列番号２７に示す塩基配列」は、オガタエア・アングスタの染色体ＤＮＡの網羅的解析により見出された遺伝子であり、該遺伝子を不活性化させることで異種タンパク質の分泌生産性が向上する。例えば、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化する例として、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の上流に位置するプロモーターの８０ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号２５の１〜８０番目の塩基配列）及び、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の下流に位置するターミネーターの相補配列８０ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、塩基配列２６の１〜８０番目の塩基配列）をそれぞれプライマー１６および１７の内部配列として用いてＰＣＲ産物を調製し、該ＰＣＲ産物をベクターとしてオガタエア属酵母に形質転換する方法が挙げられる。
また、配列番号２７に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子、配列番号２７に示す塩基配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子も不活性化させることで、配列番号２７に示す塩基配列の場合と同様に異種タンパク質の分泌生産性が向上する。
【００１８】
本発明において「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、例えば、コロニーまたはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡの塩基配列を挙げることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡの塩基配列のことを指す。
【００１９】
本発明において「配列同一性」とは、２つ以上の塩基配列を整列（アラインメント）させ、必要に応じてギャップを導入して、両者の塩基一致度が最も高くなるようにしたときの、ギャップ部分も含んだ塩基配列において同一部位に同一の塩基が出現する頻度を％で表示した値である。なお、配列同一性は、当業者に周知の方法、配列解析ソフトウェア等を使用して求めることができ、例えばＢＬＡＳＴアルゴリズムのｂｌａｓｔｎプログラムやＦＡＳＴＡアルゴリズムのｆａｓｔａプログラムが挙げられる。
【００２０】
本発明において「配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子」とは、配列番号３１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコドン表に基づいて設計される塩基配列からなる遺伝子のことを指し、例えば、配列番号２７に示す遺伝子が挙げられる。そして、当該遺伝子を不活性化させることで、異種タンパク質の分泌生産性を向上させることができる。
【００２１】
また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することにより得られることを特徴とする。
本発明は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を少なくとも１つ含有するベクターを形質転換することで、オガタエア属酵母の染色体上における前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子を不活性化させることができる。また、ベクターは、各々の相同領域を有する塩基配列をすべて組み込んだベクターを用いても良いし、各々の相同領域を有する塩基配列を、それぞれ１つずつ組み込んだベクターを用いても良い。
【００２２】
本発明において「ベクター」とは核酸分子であって、所定の塩基配列（上述した前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかの塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列、後で詳述する（ｅ）〜（ｈ）のいずれかの塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列、或いは、これらの塩基配列のうち複数が連結（適当な長さの他の塩基配列を介して連結する場合を含む）した塩基配列に加えて、１つ以上の制限酵素認識部位を含むクローニングサイト、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＩｎ−ＦｕｓｉｏｎクローニングシステムやＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社のＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  システム等を利用するためのオーバーラップ領域、内在性遺伝子の塩基配列、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、選択マーカー遺伝子（栄養要求性相補遺伝子、薬剤耐性遺伝子など）の塩基配列等を含むことができる。上記ベクターの形態としては、直鎖の塩基配列、プラスミド、人工染色体等が挙げられる。直鎖の塩基配列の例としては、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子やＧ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子の塩基配列を有するＰＣＲ産物、またはプラスミドを適当な制限酵素によって切断し、直鎖状としたものなどが挙げられる。プラスミドの例としては、ＹＥｐ、ＹＲｐ、ＹＣｐなどが挙げられる。オガタエア属酵母の場合はｐＰＩＣＨＯＬＩ、ｐＨＩＰ、ｐＨＲＰ、ｐＨＡＲＳなどが挙げられる。人工染色体の例としては、一般に、セントロメアＤＮＡ配列、テロメアＤＮＡ配列、自律複製配列（ＡＲＳ）を含む人工染色体ベクターを指し、酵母であれば酵母人工染色体（ＹＡＣベクター）などが挙げられ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅやＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどにおいて開発されている。
【００２３】
本発明において「形質転換」とは、上記ベクターを細胞に導入することを指す。ベクターを宿主細胞へ導入する方法は公知の方法を適宜用いることができ、例えば宿主として酵母細胞を用いる場合、エレクトロポレーション法や酢酸リチウム法、スフェロプラスト法などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。例えば、オガタエア・アングスタの形質転換法としては、Ｈｉｇｈｌｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ．（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：３０５．３１０．）に記載されているエレクトロポレーション法が一般的である。
【００２４】
また、本発明において、ベクターをオガタエア属酵母に形質転換する場合、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を用いることが好ましい。選択マーカーは特に限定されないが、オガタエア属酵母であれば、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などの栄養要求性相補遺伝子であれば、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。また、Ｇ４１８耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子であれば、それぞれＧ４１８、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。なお、形質転換する時に用いた栄養要求性選択マーカーは、該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、該選択マーカーを破壊させればよく、その方法は従来法を用いることができる。
【００２５】
また、本発明において、ベクターを染色体に組み込む場合、本実施例のように染色体の相同領域を同時に有するＤＮＡとして作成することが好ましい。染色体上へのベクターの組み込みの方法は、相同領域を利用しない非特異的な組み込みでもよいし、１箇所の相同領域を利用した組み込みでもよいし、２箇所の相同領域を利用したダブルクロスオーバー型の組み込みでもよい。
【００２６】
また、本発明において、相同領域を利用した組み込みの場合、例えば本実施例のように、選択マーカー遺伝子配列の両末端に相同領域が来るようにして形質転換を行うことが出来る。例えば、遺伝子欠失させたい場合、選択マーカー遺伝子の上流に欠失させたい遺伝子のプロモーター、下流には欠失させたい遺伝子のターミネーターを連結させたベクターを利用して組み込むことが出来る。
【００２７】
本発明において、染色体あたりのベクターのコピー数は特に限定されない。また、染色体上にベクターが組み込まれている位置は、本発明の遺伝子が不活性化されている限り、特に限定されない。なお、２コピー以上のベクターが組み込まれている形質転換体の組み込み位置については、同じ位置に複数が組み込まれている状態でもよいし、異なる位置に１コピーずつ組み込まれている状態でもよい。
【００２８】
本発明の「相同領域を有する塩基配列」とは、目的とする塩基配列の少なくとも一部の塩基配列を有し、５０％以上の配列同一性を有する塩基配列であればよく、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは８５％以上、よりさらに好ましくは９０％以上、より特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％である。また、該相同領域を有する塩基配列の長さは、目的とする塩基配列と相同領域を有する２０ｂｐ以上の塩基配列であれば、相同組み換えすることができるため特に限定されないが、具体的には、目的とする塩基配列の長さの０．１％以上が好ましく、０．５％以上、１％以上、１．５％以上、２％以上、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、７％以上、７．５％以上、８％以上、８．５％以上、９％以上、９．５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、１００％が好ましい。
【００２９】
本発明の「（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーター」とは、染色体上で（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の上流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の開始コドンより上流の５０００ｂｐまでの塩基配列を指す。
本発明の「（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーター」とは、染色体上で（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の下流に存在し、該遺伝子産物の発現量を調整する塩基配列であり、具体的には、（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の終始コドンより下流の５０００ｂｐまでの塩基配列を指す。
【００３０】
また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを形質転換することにより得られることを特徴とする。
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列の上流又は下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が配置されたベクターを形質転換することで、異種タンパク質の生産性が向上したオガタエア属酵母を得ることができる。さらに、各々の相同領域を有する塩基配列を含有したベクターに、該塩基配列の上流及び／又は下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を配置することで、形質転換の操作性を向上させることができる。
【００３１】
本発明において「異種タンパク質」とは、微生物由来の酵素類、多細胞生物である動物や植物が産生するタンパク質等である。例えば、フィターゼ、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、アミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、グルタミナーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼ、オキシダーゼ、ラクターゼ、キシラナーゼ、トリプシン、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、蛍光タンパク質などが挙げられるが、これらに限定はされない。特に、ヒト及び／又は動物治療用タンパク質が好ましい。
【００３２】
ヒト及び／又は動物治療用タンパク質として、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、ヒルジン、抗体、ヒト抗体、部分抗体、ヒト部分抗体、血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、上皮成長因子、ヒト上皮成長因子、インシュリン、成長ホルモン、エリスロポエチン、インターフェロン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、トロンボポエチン、ＩＬ−１、ＩＬ−６、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、レプチン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などが挙げられる。
【００３３】
ここで「抗体」とは、Ｌ鎖とＨ鎖の各２本のポリペプチド鎖がジスルフィド結合して構成されるヘテロテトラマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
【００３４】
ここで「部分抗体」とは、Ｆａｂ型抗体、（Ｆａｂ）２型抗体、ｓｃＦｖ型抗体、ｄｉａｂｏｄｙ型抗体や、これらの誘導体等のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。Ｆａｂ型抗体とは、抗体のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ−Ｓ結合で結合したヘテロマータンパク質、または抗体のＬ鎖とＦｄ鎖がＳ−Ｓ結合を含まず会合したヘテロマータンパク質のことを指し、特定の抗原に結合する能力を有していれば、特に限定されない。
上記異種タンパク質を構成するアミノ酸は天然のものでもよいし、非天然のものでもよいし、修飾を受けていてもよい。また、タンパク質のアミノ酸配列は、人為的な改変が施されていてもよいし、ｄｅ−ｎｏｖｏで設計されたものでもよい。
【００３５】
また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することで、異種タンパク質の生産性が向上したオガタエア属酵母を得ることができる。さらに、不活性化するベクターと異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを別にすることで、該異種タンパク質をコードする塩基配列を含有するベクターを前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の位置以外に１コピー以上導入して発現量を増大させること、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が１コピー以上存在するプラスミドや人工染色体を導入して発現量を増大させること、また、育種改良において前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の不活性化に用いた栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子の破壊時に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列も同時に破壊させてしまうことを防ぐため、効率よく異種タンパク質の生産性を向上させることができる。
【００３６】
さらに、本発明のオガタエア属酵母は、
以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）のいずれかの遺伝子：
（ｅ）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子；
（ｆ）配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子；
（ｇ）配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子；
（ｈ）配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子；
が不活性化されたことを特徴とする。
【００３７】
本発明において「配列番号３０に示す塩基配列」は、オガタエア・アングスタの染色体ＤＮＡの網羅的解析により見出された遺伝子であり、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されたオガタエア属酵母に対して、さらに該遺伝子を不活性化させることで異種タンパク質の分泌生産性がより向上する。なお、配列番号３０に示す塩基配列のみを不活性化させても、異種タンパク質の分泌生産性は向上せず、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と併せて不活性化させることで分泌生産性が向上するという特異性を有す。配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化する例としては、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の上流に位置するプロモーターの８０ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号２８の１〜８０番目の塩基配列）及び、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の下流に位置するターミネーターの相補配列７８ｂｐと１００％の配列同一性を有する塩基配列（例えば、配列番号２９の１〜７８番目の塩基配列）をそれぞれプライマー１８および１９の内部配列として用いてＰＣＲ産物を調製し、該ＰＣＲ産物をベクターとしてオガタエア属酵母に形質転換する方法が挙げられる。なお、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子を１つのベクターに組み込んでも良いし、それぞれ別々のベクターに組み込んでも良い。
また、配列番号３０に示す塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなる遺伝子、配列番号３０に示す塩基配列と８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子も配列番号２７に示す塩基配列と併せて不活性化させることで、配列番号３０に示す塩基配列の場合と同様に異種タンパク質の分泌生産性がより向上する。
【００３８】
本発明において「配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列からなる遺伝子」とは、配列番号３２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコドン表に基づいて設計される塩基配列からなる遺伝子のことを指し、例えば、配列番号３０に示す遺伝子が挙げられる。そして、当該遺伝子と前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子を併せて不活性化させることで、異種タンパク質の分泌生産性をより向上させることができる。
【００３９】
また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列と前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列を別々のベクターに組み込んで形質転換することによって、染色体上に離れて存在する前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子を同時に且つ効率的に不活性化することができる、つまり別々のベクターにする事で一方の遺伝子のみが不活性化された形質転換体を選択する可能性を軽減することができるため好ましい。
【００４０】
また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターと前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターをそれぞれ形質転換することによって、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の位置に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを導入し、生育や分泌生産等に必須な他の遺伝子を不活性化させることがないため効率よく異種タンパク質を分泌生産することができる。
【００４１】
また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクターと、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有し、該塩基配列の上流または下流に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターをそれぞれ形質転換することによって、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子の位置に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを導入し、生育や分泌生産等に必須な他の遺伝子を不活性化させることがないため効率よく異種タンパク質を分泌生産することができる。
【００４２】
また、本発明のオガタエア属酵母は、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターとを形質転換することにより得られることを特徴とする。
上記とおり、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子と相同領域を有する塩基配列、前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のプロモーターと相同領域を有する塩基配列、及び／又は前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子のターミネーターと相同領域を有する塩基配列のいずれかを少なくとも１つ含有するベクター、及び異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターをそれぞれ形質転換することによって、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列を含有するベクターを前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子の位置以外や前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子の位置以外に１コピー以上導入して発現量を増大させること、異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列が１コピー以上存在するプラスミドや人工染色体を導入して発現量を増大させること、また、育種改良において前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の遺伝子や前記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかに記載の遺伝子の不活性化に用いた栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子の破壊時に異種タンパク質のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列も同時に破壊させてしまうことを防ぐため、効率よく異種タンパク質を分泌生産することができる。
【００４３】
本発明の異種タンパク質の製造方法は、上記ベクターにより形質転換された酵母を培養し、培養物から異種タンパク質を回収する工程を含む。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞、培養菌体、または細胞若しくは菌体の破砕物を意味する。よって、本発明の形質転換酵母を用いて異種タンパク質を生産する方法としては、上記の形質転換酵母を培養し、その菌体中または培養上清中に蓄積させる方法が挙げられる。
【００４４】
形質転換酵母を培養する方法は、その酵母の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。酵母の場合、培養する培地としては、酵母が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、形質転換酵母の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、該酵母が資化し得るものであればよく、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等が挙げられ、窒素源としては、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等が挙げられ、無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、培養はバッチ培養や連続培養のいずれでも可能である。
本発明の好ましい態様として、酵母にオガタエア属酵母を用いた場合、上記炭素源は、グルコース、グリセロール、メタノールの１種でもよく、または２種以上であってもよい。また、これらの炭素源は培養初期から存在していてもよいし、培養途中に添加してもよい。
形質転換体の培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、酵母の場合、ｐＨ２．５〜１０．０、温度範囲１０℃〜４８℃の範囲で、好気的に１０時間〜１０日間培養することにより行うことができる。
【００４５】
本発明の形質転換酵母を用いて生産された異種タンパク質は、培養上清に存在する状態であってもよいし、菌体内に蓄積している状態であってもよいし、そこから任意の方法で回収したものでもよい。培養上清や菌体内からの異種タンパク質の回収は、公知のタンパク質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、まず、当該形質転換酵母を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除く。得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該培養上清から異種タンパク質を回収する。
回収された異種タンパク質は、そのまま使用することもできるが、その後ＰＥＧ化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用してもよい。
異種タンパク質を菌体外に分泌させる場合には、該異種タンパク質遺伝子の５’末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入すればよい。シグナル配列をコードする塩基配列は、酵母が分泌発現できるシグナル配列をコードする塩基配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  α（ＭＦα）やオガタエア・アングスタの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、コマガタエラ・パストリスの酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）、サッカロマイセス・セレビシエのＰＬＢ１、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列などが挙げられる。
【００４６】
本発明における異種タンパク質のプロモーターは、形質転換酵母内において異種タンパク質を発現させるプロモーターであれば特に限定されない。好ましくはメタノール誘導性プロモーターである。
本発明のメタノール誘導性プロモーターは、炭素源がメタノールの際に転写活性を有するプロモーターであれば特に制限されないが、好ましくはＡＯＸ１プロモーター、ＡＯＸ２プロモーター、ＣＡＴプロモーター、ＤＨＡＳプロモーター、ＦＤＨプロモーター、ＦＭＤプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＭＯＸプロモーターなどが挙げられる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）。
【００４８】
また、以下の実施例において、酵母の形質転換に用いるプラスミドは、構築した抗体発現ベクターを大腸菌Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ社製）にそれぞれ導入し、得られた形質転換体を培養して増幅することによって調製した。プラスミド保持株からのプラスミドの調製は、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。
【００４９】
抗体発現ベクターの構築において利用したＭＯＸプロモーター（配列番号１）、ＭＯＸターミネーター（配列番号２）、ＬＥＵ２遺伝子（配列番号３）は、オガタエア・ポリモルファ  ８Ｖ株の染色体ＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。Ｍａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル遺伝子（ＭＦα、配列番号４）は、サッカロマイセス・セレビシエＳ２８８ｃ株の染色体ＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。
【００５０】
抗体遺伝子は、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  抗体の配列（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））の公開配列情報に基づいて、Ｌ鎖遺伝子（配列番号５）、Ｆｄ鎖遺伝子（配列番号６）を化学合成した（特開２００９−０８２０３３）ものをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。
遺伝子不活性化用ベクターの構築において利用したプロモーターで制御されたＧ４１８耐性遺伝子（配列番号７）、プロモーターで制御されたＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子（配列番号８）はオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５株の染色体ＤＮＡ、合成ＤＮＡ等をテンプレートにしてＰＣＲで調製した。
【００５１】
ＰＣＲにはＰｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）等を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。染色体ＤＮＡの調製は、各菌株からＧｅｎとるくん（登録商標）タカラバイオ社製）等を用いて、これに記載の条件で実施した。
【００５２】
（実施例１）完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現ベクターの構築
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＭｕｎＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩのマルチクローニングサイトをもつ遺伝子断片（配列番号９）を全合成し、これをｐＵＣ１９（タカラバイオ社製、Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ３２１９）のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイト間に挿入して、ｐＵＣ−１を調製した。また、ＬＥＵ２遺伝子の両側にＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー１および２（配列番号１０および１１）を用いたＰＣＲにより調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理後にｐＵＣ−１のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−２を調製した。次に、ＭＯＸプロモーターの両側にＢａｍＨＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー３および４（配列番号１２および１３）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ−２のＢａｍＨＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−Ｐｍｏｘを調製した。ＭＯＸプロモーターの両側にＭｕｎＩ認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー５および６（配列番号１４および１５）を用いたＰＣＲにより調製し、ＭｕｎＩ処理後にｐＵＣ−ＰｍｏｘのＭｕｎＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘを調製した。ＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー７および８（配列番号１６および１７）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘのＸｂａＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘＴｍを調製した。ＭＦαの上流にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー９および１０（配列番号１８および１９）を用いたＰＣＲにより調製した。Ｌ鎖の上流にＭＦαの３’末端１９ｂｐを付加し、下流にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー１１および１２（配列番号２０および２１）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにして、プライマー９および１２を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＬ鎖の融合遺伝子の両側にＳｐｅＩ認識配列を付加した遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＳｐｅＩ処理後、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＰｍｏｘＴｍのＳｐｅＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＴｍを構築した。一方、ＭＦαの上流にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片をプライマー１３（配列番号２２）および１０を用いたＰＣＲにより調製した。Ｆｄ鎖の上流にＭＦαの３’末端１９ｂｐを付加し、下流にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片を、プライマー１４および１５（配列番号２３および２４）を用いたＰＣＲにより調製した。これらの遺伝子断片を混合してテンプレートにし、プライマー１３および１５を用いたＰＣＲにより、ＭＦαとＦｄ鎖の融合遺伝子の両側にＢｇｌＩＩ認識配列を付加した遺伝子断片を調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを構築した。このｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。
【００５３】
（実施例２）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターの構築
プロモーターで制御されたＧ４１８耐性遺伝子（配列番号７）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー１６および１７（配列番号２５および２６）を用いたＰＣＲにより調製した。
本ベクターはオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５株の配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の上流８０塩基配列及び下流８０塩基配列を相同領域として、プロモーターで制御されたＧ４１８耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、酵母に形質転換することで配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されるように設計されている。
【００５４】
（実施例３）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターの構築
プロモーターで制御されたＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子（配列番号８）の両側に形質転換のための相同領域を付加した遺伝子断片を、プライマー１８および１９（配列番号２８および２９）を用いたＰＣＲにより調製した。
本ベクターはオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５株の配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の上流８０塩基配列及び下流７８塩基配列を相同領域として、プロモーターで制御されたＺｅｏｃｉｎ（登録商標）耐性遺伝子の両側に付加されたベクターであり、酵母に形質転換することで配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子が不活性化されるように設計されている。
【００５５】
（実施例４）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母の取得
実施例２で構築した配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター及び実施例３で構築した配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５ロイシン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ  ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，  ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム，ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。ベクターは実施例２及び３で調製したものをＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を用いて精製し、溶液を調製した。コンピテントセル溶液６０μｌと配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωのパルスに供した後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、上清９５０μｌを廃棄した。残った溶液で再懸濁し、ＹＰＤＧ４１８選択寒天プレート（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％アガロース、０．０５％Ｇ４１８二硫酸塩（ナカライテスク社製））に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択した。また、コンピテントセル溶液６０μｌと配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター溶液１．５μｌと配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクター溶液１．５μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωのパルスに供した後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、上清９５０μｌを廃棄した。残った溶液で再懸濁し、ＹＰＤＧ４１８Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）選択寒天プレート（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌ��ｃｏｓｅ、１．５％アガロース、０．０５％Ｇ４１８二硫酸塩（ナカライテスク社製）、０．０１％Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択した。これにより、オガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、オガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母を取得した。
【００５６】
（比較例１）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母の取得
実施例３で構築した配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子の不活性化用ベクターを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。オガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５ロイシン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ  ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，  ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。ベクターは実施例３で調製したものをＦａｓｔＧｅｎｅ  Ｇｅｌ／ＰＣＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス社製）を用いて精製し、溶液を調製した。コンピテントセル溶液６０μｌとベクター溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωのパルスに供した後、菌体をＹＰＤ培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、上清９５０μｌを廃棄した。残った溶液で再懸濁し、ＹＰＤＺｅｏｃｉｎ選択寒天プレート（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ、１．５％アガロース、０．０１％Ｚｅｏｃｉｎ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択した。これにより、オガタエア・アングスタ配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母を取得した。
【００５７】
（実施例５）配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母の取得、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母の取得
実施例１で構築したｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を５ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％  ＮａＣｌ）で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを取得した。本プラスミドをＭＯＸターミネーター遺伝子内のＥｃｏＲＶサイトで切断して直鎖状にした。この直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。実施例４で取得したオガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、実施例４で取得したオガタエア・アングスタ配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母、またはオガタエア・アングスタＮＣＹＣ４９５ロイシン要求性株を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ  ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １ｍＭ塩化マグネシウム，  ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。このコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍ  溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωに供した後、菌体を１ｍｌのＹＰＤ培地で懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、室温）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．５％アガロース、２％グルコース）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号��０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母を取得した。
【００５８】
（比較例２）配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母の取得
実施例１で構築したｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を５ｍｌの２ＹＴ培地（１．６％  ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％  ＮａＣｌ）で培養し、得られた菌体からＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを取得した。本プラスミドをＭＯＸターミネーター遺伝子内のＥｃｏＲＶサイトで切断して直鎖状にした。この直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍを用いて、以下のようにオガタエア・アングスタを形質転換した。比較例１で取得したオガタエア・アングスタ配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性酵母を３ｍｌのＹＰＤ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、２％  ｇｌｕｃｏｓｅ）に接種し、３７℃で一晩振盪培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３７℃で振盪培養後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、２５０μｌの１Ｍ  ＤＴＴ（終濃度２５ｍＭ）を含む１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー，ｐＨ７．５に再懸濁した。この懸濁液を３７℃で１５分インキュベート後、集菌（３０００×ｇ、１０分、２０℃）し、予め氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。洗浄液を集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）し、２５ｍｌの氷冷ＳＴＭバッファーで再度洗浄したのち、集菌（３０００×ｇ、１０分、４℃）した。最終的に、２５０μｌの氷冷ＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。このコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状のｐＵＣ−ＰｍｏｘＬＰｍｏｘＦｄＴｍ  溶液３μｌを混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、７．５ｋＶ／ｃｍ、１０μＦ、９００Ωに供した後、菌体を１ｍｌのＹＰＤ培地で懸濁し、３７℃で１時間静置した。１時間静置後、集菌（３０００×ｇ、５分、室温）し、１ｍｌのＹＮＢ培地（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製））に懸濁後、再度集菌（３０００×ｇ、５分、室温）した。菌体を適当量のＹＮＢ培地で再懸濁後、ＹＮＢ選択寒天プレート（０．６７％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．５％アガロース、２％グルコース）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母を取得した。
【００５９】
（実施例６）完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母の培養
実施例５、比較例２で得られた配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び／又は配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母を２ｍｌのＢＭＧＹ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ、０．４ｍｇ／ｌ  Ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、２％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、また、ＢＭＧＭＹ培地（１％  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ｂａｃｔｏ（Ｄｉｆｃｏ社製）、２％  ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ（日本製薬社製）、０．３４％  ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１％  Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ、０．４ｍｇ／ｌ  Ｂｉｏｔｉｎ、１００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、１％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％  Ｍｅｔｈａｎｏｌ）に接種し、これを３０℃、１７０ｒｐｍ、７２時間振盪培養後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分、４℃）により培養上清を回収した。菌体濃度はＯＤ６００にて測定した。
【００６０】
（実施例７）ＥＬＩＳＡ法による完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体の分泌量の測定
実施例６の培養上清への抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体分泌発現量は、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法により以下に示す方法で行った。ＥＬＩＳＡ用プレート（マキシソープ；ＮＵＮＣ社製）に固定化バッファー（０．１Ｎ重炭酸ナトリウム溶液，ｐＨ９．６）にて２５００倍希釈したＡｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  （Ｆｄ）  Ｓｈｅｅｐ  ＩｇＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ（ＭＢＬ社製）を各ウェル５０μｌずつ添加し、終夜４℃でインキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、イムノブロック（大日本住友製薬社製）２００μｌでブロッキングし、室温で１時間静置した。ＰＢＳＴバッファー（８ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．２ｇ／Ｌ塩化カリウム、１．１５ｇ／Ｌリン酸一水素ナトリウム（無水）、０．２ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム（無水）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、系列希釈した標準Ｆａｂ抗体（Ａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＧ  Ｆａｂ；ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）と希釈した培養上清を各ウェル５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応した。ＰＢＳＴバッファーで４回洗浄後、ＰＢＳＴバッファーにて８０００倍希釈した二次抗体溶液（二次抗体：Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｆａｂ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ）ＨＲＰ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製））を各ウェル５０μｌずつ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴバッファーで４回洗浄後、５０μｌのＴＭＢ−１  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ＳｕｒｅＢｌｕｅ（ＫＰＬ社製）を添加し、室温で２０分静置した。５０μｌのＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＰＬ社製）を添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（ＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｐｌｕｓ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。培養上清中のＦａｂ抗体の定量は、標準Ｆａｂ抗体の検量線を用いて行った。この方法により得られた抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体分泌発現量と各々の菌体濃度（ＯＤ６００）を表１に示した。
【００６１】
その結果、２．配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母は、明らかに、配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化していない１．完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母より高い分泌発現量を示した。３．配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母は、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子を不活性化していない１．完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母と比較して分泌発現量は変わっていない。しかし、４．配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子及び配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母は、明らかに２．配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子不活性／完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α  Ｆａｂ抗体発現酵母より高い分泌量を示した。これは、配列番号３０に示す塩基配列からなる遺伝子が配列番号２７に示す塩基配列からなる遺伝子との二重不活性により特段の効果を得ることを示している。
【００６２】
【表１】
2016146789.tif 000002
【配列表】
2016146789000001.app