(57)【要約】      （修正有）【課題】新規なヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）融合遺伝子及び新規なヒトＳＡＡ融合タンパク質等の提供。【解決手段】ヒトＳＡＡ３は、ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質として発現することを見出した。更に、このヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質をコードする転写産物において、ヒトＳＡＡ２のエクソン３が、ヒトＳＡＡ３のエクソン１に結合していることが新たに明らかとなった。ＳＡＡ３が関連する疾患の特定、及びその診断、予防又は治療において有効である。【選択図】図１
2016002053.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２で表されるDNA配列を含む、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）融合遺伝子及び新規なヒトＳＡＡ融合タンパク質等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＡＡは、続発性アミロイドーシスで組織に沈着するアミロイドＡタンパクの血中の前駆体として知られている。このＳＡＡには、マウス、ウサギ、ウマ等においてＳＡＡ１、ＳＡＡ２、ＳＡＡ３およびＳＡＡ４という４種類のアイソタイプが存在することが知られている。これらのうち、ＳＡＡ１及びＳＡＡ２は、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の炎症性サイトカインに応答する急性相反応物質である。また、ＳＡＡ１、ＳＡＡ２及びＳＡＡ４は、高比重リポタンパク（ＨＤＬ）の構成タンパクである。
【０００３】
一方、ＳＡＡ３はトール様受容体４（ＴＬＲ４）に認識され、核因子κＢ（ＮＦκＢ）を介した免疫応答シグナルを活性化する結果、癌の転移が促進されることが知られており、さらに、癌細胞を皮下移植した担癌マウスに抗ＳＡＡ３抗体を投与すると、この一連のシグナル経路（Ｓ１００Ａ８−ＳＡＡ３−ＴＬＲ４）が遮断され、癌の転移が抑制されることが確認されている。ＴＬＲ４は自然免疫系の受容体としてリポポリサッカライド（ＬＰＳ）などの毒素を認識し、感染からの防御を担っている。このことは、本来は感染防御を担う自然免疫系により形成された炎症様の環境が癌細胞の遊走を促進していることを示唆している（非特許文献１）。このようにマウスにおいては、ＳＡＡ３が癌の転移に関連することが示唆されている。
【０００４】
ヒトＳＡＡ３は、マウス等のＳＡＡ３のアミノ酸配列との相同性等から、そのアミノ酸配列が推測されていたが（特許文献１）、実際にヒト生体内でのタンパク発現は確認されていなかった。
また、ヒトＳＡＡ３遺伝子の塩基配列も部分的に知られていたが、やはり実際にヒト生体内でのタンパク発現は確認されていなかったことから、ヒトＳＡＡ３遺伝子は偽遺伝子であると考えられ、ゲノムデータベースにおいてノンコーディングRNAに分類されてきた（非特許文献２）。
このような知見に対し、ヒトＳＡＡ３に対するヒトＳＡＡ３抗体を作製してこれを用いることにより、ヒト癌患者の血清中にＳＡＡ３が存在することが明らかにされた（特許文献２）。しかしながら、ヒト癌患者の血清中にＳＡＡ３が存在することまでは明らかにされたものの、特許文献１で推測されていたヒトＳＡＡ３タンパク質のアミノ酸配列の同定は困難を極め、これまで、ヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列は依然として確認されていなかった。
そのため、偽遺伝子であると考えられてきたヒトＳＡＡ３遺伝子は、依然として、その機能が不明であり、機能を解明する有効な手段さえ確立できずにいた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００６−５１６１９４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／０４０１３３号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Sachie  Hiratsuka,  Akira  Watanabe,  Yoshiko  Sakurai,  Sachiko  Akashi-Takamura,  Sachie  Ishibashi,  Kensuke  Miyake,  Masabumi  Shibuya,  Shizuo  Akira,  Hiroyuki  Aburatani  and  Yoshiro  Maru.  Nature  Cell  Bioll10  1349-1355(2008).
【非特許文献２】Kluve-Beckerman B, Drumm ML, Benson MD (1991) Nonexpression of the human serum amyloid A three (SAA3) gene.DNA Cell Biol.10:651-61.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これまで、ヒトＳＡＡ３の機能に関しては十分な解明がなされておらず、ヒトＳＡＡ３の機能を解明するための有効な手段すら見出されていなかった。
本発明は、ヒトＳＡＡ３のアミノ酸配列を明らかにするとともに、ヒト生体内でのヒトＳＡＡ３の機能を解明するための有効な手段を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ヒトＳＡＡ３は、特許文献１において推測されていたようなアミノ酸配列とは異なり、ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質として発現することを見出した。更に、このヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質をコードする転写産物において、ヒトＳＡＡ２のエクソン３が、ヒトＳＡＡ３のエクソン１に結合していることが新たに明らかとなった。ヒトＳＡＡ３のエクソン１は、ゲノム中、ヒトＳＡＡ２のエクソン３から約130kbp下流に位置しており、ここまで離れた位置に存在する塩基配列同士が結合して１つの転写産物を生成することは、極めて稀であり、当業者の予測をはるかに超える事象である。例えば、UCSCゲノムデータベースには、ヒトＳＡＡ２のエクソン３がリードスルーによりヒトＳＡＡ４のエクソン２と結合した配列情報が寄託されているが、ヒトＳＡＡ４のエクソン２は、ゲノム中、ヒトＳＡＡ２のエクソン３からわずか9kbp下流に位置するものである。
本発明は、このような予想外の配列を有する新規なヒトＳＡＡ融合遺伝子及び新規なヒトＳＡＡ融合タンパク質に関する。
【０００９】
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質が提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるDNA配列を含む。
本発明の一態様において、配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドが提供される。
【００１０】
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターが提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、配列番号２で表されるDNA配列を含むポリヌクレオチド、を含有する組換えベクターが提供される。
本発明の一態様において、配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドを含有する組換えベクターが提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを含む形質転換体が提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、配列番号２で表されるDNA配列を含むポリヌクレオチド、を含有する組換えベクターを含む形質転換体が提供される。
本発明の一態様において、配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを含む形質転換体が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の一態様によれば、LOX-1を活性化するタンパク質を提供することができる。また、本発明の一態様によれば、ERKをリン酸化するタンパク質を提供することができる。更に、本発明の一態様によれば、これまで十分な研究ができなかったヒトＳＡＡ３の機能を解明するための有効な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合遺伝子産物の模式的な構造を示す図である。また、併せて、ヒトＳＡＡ２遺伝子及びヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ４融合遺伝子の模式的な構造を示す。
【図２】抗DYKDDDDK抗体を用いてヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合遺伝子産物等を検出したウエスタンブロットの結果を示す図である。
【図３】（Ａ）ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質のＣ末端２６ペプチドをヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）に添加し、ERKのリン酸化を検出したウエスタンブロットの結果を示す図である。（Ｂ）（Ａ）においてアスタリスクで示すバンドの相対強度(pERK/ERK)をデンシトメトリー法により定量した結果を示すグラフである。
【図４】ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質のＣ末端２６ペプチドのLOX-1への親和性を示す図である。
【図５】（Ａ）酵母２ハイブリッド法による、LOX-1へのヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質の結合部位の解析結果を示す図である。（Ｂ）（Ａ）の解析において用いたペプチドのアミノ酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ヒトＳＡＡ２のＮ末端領域由来の７６アミノ酸と、ヒトＳＡＡ３由来の６２アミノ酸とからなる融合タンパク質である。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、所定のヌクレオチド配列によりコードされる。タンパク質のアミノ酸配列が特定されているため、当業者であれば当該ヌクレオチド配列は技術常識に基づいて適宜決定することができる。ここで、本明細書において、「ヌクレオチド」とは、DNAを意味してもよいし、RNAを意味してもよい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、例えば、配列番号２で表されるDNA配列を含むポリヌクレオチドによりコードされる。当該ポリヌクレオチドは、配列番号２で表されるDNA配列以外に、そのＣ末端側に終始コドンと、そのＮ末端側に、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現に影響を与えない範囲内で任意の配列とを含み得る。Ｎ末端側には開始コドンを含まないことが好ましい。
配列番号１で表されるアミノ酸配列を以下に示す。
配列番号１：MKLLTGLVFCSLVLSVSSRSFFSFLGEAFDGARDMWRAYSDMREANYIGSDKYFHARGNYDAAKRGPGGAWAAEVISRMKLSTGIIFCSLVLGVSSQGWLTFLKAAGQGTKDMWKAYSDMKEANYKKFRQILPCLGEL
【００１４】
配列番号２で表されるDNA配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質に対応した塩基配列であり、ヒトＳＡＡ２遺伝子とヒトＳＡＡ３遺伝子とが融合された配列を有する。具体的には、配列番号２で表されるDNA配列は、ヒトＳＡＡ２遺伝子のエクソン１、エクソン２及びエクソン３を含む転写産物のコード領域に相当するDNA配列と、ヒトＳＡＡ３遺伝子のエクソン１及びエクソン２を含む転写産物のコード領域に相当するDNA配列とが融合されたものである（図１参照）。
従来は、ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質及びヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合遺伝子の存在は全く報告されていなかった。これに対し、本発明者らは、ヒト生体内では、ヒトＳＡＡ３はヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質として発現し、当該ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質をコードする転写産物は、ヒトＳＡＡ２遺伝子のエクソン１、エクソン２及びエクソン３並びにヒトＳＡＡ３遺伝子のエクソン１及びエクソン２を含むものであるという新たな知見を得た。なお、この転写産物は、ゲノムデータベース中に登録されているものとは異なるヒトＳＡＡ３遺伝子のエクソン１を含み、かつ以前報告されていたものとは異なるヒトＳＡＡ３遺伝子のエクソン２を含むものであった。具体的には、ヒトＳＡＡ３のエクソン１は147bpのサイズであることが以前報告されていたのに対し、新たに見出された当該転写産物は、5'末端側の52bpを欠いている。以前は、ヒトＳＡＡ３のエクソン２とエクソン３の間にイントロンが存在することが報告されていたが、新たに見出された当該転写産物は、以前報告されていたヒトＳＡＡ３のエクソン２、当該イントロン及びエクソン３に対応する配列をエクソン２として含んでいる。
【００１５】
配列番号２で表されるDNA配列は、このような知見に基づいて初めて想到し得たものであり、従来の技術常識からは到底想到し得ない新規な配列である。
また、ヒトＳＡＡ３のエクソン１は、ゲノム中、ヒトＳＡＡ２のエクソン３から約130kbp下流に位置しており、ここまで離れた位置に存在する塩基配列同士が結合して１つの転写産物を生成することは、極めて稀であり、当業者の予測をはるかに超える事象である。
配列番号２で表されるDNA配列を以下に示す。
配列番号２： 5’-ATGAAGCTTCTCACGGGCCTGGTTTTCTGCTCCTTGGTCCTGAGTGTCAGCAGCCGAAGCTTCTTTTCGTTCCTTGGCGAGGCTTTTGATGGGGCTCGGGACATGTGGAGAGCCTACTCTGACATGAGAGAAGCCAATTACATCGGCTCAGACAAATACTTCCATGCTCGGGGGAACTATGATGCTGCCAAAAGGGGACCTGGGGGTGCCTGGGCCGCAGAAGTGATCAGCAGGATGAAGCTCTCCACTGGCATCATTTTCTGCTCCCTGGTCCTGGGTGTCAGCAGCCAAGGATGGTTAACATTCCTCAAGGCAGCTGGCCAAGGGACTAAAGACATGTGGAAAGCCTACTCTGACATGAAAGAAGCCAATTACAAAAAATTCAGACAAATACTTCCATGCTTGGGGGAACTA-3’
【００１６】
配列番号２で表されるDNA配列は、ヒト細胞のRNAを鋳型としてcDNAの合成を行い、所定のプライマーを用いてPCRを行うことにより調製することができ、また、化学合成により作成することもできる。
ヒト細胞のRNAの単離は、本願出願時の技術水準に基づいて行うことができる。
cDNAの合成には、配列番号３で表されるヒトＳＡＡ３特異的プライマーを用いてもよいし、オリゴdTプライマーを用いてもよい。また、cDNAの合成は、本願出願時の技術水準に基づいて行うことができる。
cDNAを鋳型として配列番号２で表されるDNA配列を増幅するPCRにおいて、プライマーとしては、例えば、フォワードプライマーとして配列番号４で表されるプライマー及びリバースプライマーとして配列番号５で表されるプライマーを用いることができる。
配列番号３〜５で表されるDNA配列を以下に示す。
配列番号３： 5’-TTCAGTAACTGTAGGTCAAC-3’
配列番号４： 5’-GGTACCATGAAGCTTCTCACGGGCCTGGTTTTCTG-3’
配列番号５： 5’-CTCGAGTAGTTCCCCCAAGCATGGAAGTATTTGTCTG-3’
【００１７】
PCRの条件については、本願出願時の技術水準に基づいて、変性、アニーリング、伸長の各ステップの温度と時間、DNAポリメラーゼの種類と濃度、バッファーの組成とPH、dNTP濃度、プライマー濃度、塩化マグネシウム濃度、鋳型ヌクレオチド量等の条件を適宜変更することができる。
また、PCRにおいて、当該技術分野においてよく知られている種々の薬剤を使用することができる。例えば、ポリメラーゼの伸長性を増加させるための薬剤、ポリメラーゼを安定化するための薬剤、プライマーの非特異的なハイブリダイゼーションを低下させるための薬剤、及びDNAの複製の効率を増加させるための薬剤等を使用することができる。PCRに使用する機器としては、当該技術分野において利用できる公知のPCR用機器を使用することができる。
【００１８】
本発明において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、典型的には、塩濃度が約1.5M Naイオン未満、典型的には、約0.01〜1.0M Naイオン濃度(または他の塩)で、pHが7.0〜8.3であり、短いプローブ(例えば10〜50ヌクレオチド)については温度が少なくとも約30℃であり、長いプローブ(例えば50ヌクレオチドより長いもの)については温度が少なくとも約60℃であるものである。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することにより達成することができる。模範的な低ストリンジェンシー条件には、37℃で、30〜35％ホルムアミド、1M NaCl、1％SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)を有するバッファー溶液でハイブリダイゼーションし、50〜55℃で、1×〜2×SSC(20× SSC=3.0M NaCl／0.3Mクエン酸三ナトリウム)で洗浄することが含まれる。模範的な中程度のストリンジェンシー条件には、37℃で、40〜45％ホルムアミド、１M NaCl、1% SDSでのハイブリダイゼーション、および50℃〜55℃で、0.5×〜1×SSCでの洗浄が含まれる。模範的な高ストリンジェンシー条件には、37℃で、50％ホルムアミド、１M NaCl、1% SDSでのハイブリダイゼーション、および60℃〜65℃で、0.1×SSCでの洗浄が含まれる。
【００１９】
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、レクチン様酸化低密度リポタンパク質受容体（LOX-1）のリガンドとして用いられ得る。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むLOX-1結合剤（アゴニスト）、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をLOX-1と結合させて細胞内シグナル伝達を活性化する方法が本発明により提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）をリン酸化するために用いられ得る。例えば、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含むERKリン酸化剤、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いてERKをリン酸化する方法が本発明により提供される。
【００２０】
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列である、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質及び当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列である、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が提供される。
配列番号６及び７で表されるアミノ酸配列を以下に示す。
配列番号６：MWKAYSDMKEANYKKFRQILPCLGEL
配列番号７：RMKLSTGIIFCSLVLGVSSQGWLTFLKAAGQGTKDMWKAYSDMKEANYKKFRQILPCLGEL
【００２１】
配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、所定のヌクレオチド配列によりコードされる。配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、所定のヌクレオチド配列によりコードされる。これらのタンパク質のアミノ酸配列は特定されているため、当業者であれば、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列を技術常識に基づいて適宜決定することができる。
また、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、化学合成により作成され得る。
【００２２】
本発明の一態様において、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、LOX-1のリガンドとして用いられ得る。例えば、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、LOX-1結合剤（アゴニスト）、及び配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をLOX-1と結合させて細胞内シグナル伝達を活性化する方法が本発明により提供される。
本発明の一態様において、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、ERKをリン酸化するために用いられ得る。例えば、配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を含む、ERKリン酸化剤、及び配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質又は配列番号６又は７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を用いて、ERKをリン酸化する方法が本発明により提供される。
【００２３】
上記LOX-1結合剤（アゴニスト）及びERKリン酸化剤は、医薬的に許容される担体、例えば適当な液体ビヒクルまたは賦形剤を含んでもよい。また、上記LOX-1結合剤（アゴニスト）及びERKリン酸化剤は、当該技術分野において知られている補助剤又は添加剤を含んでもよい。
上記LOX-1結合剤（アゴニスト）及びERKリン酸化剤は、投与形態を問わず、経口又は非経口でヒトや哺乳類等の対象に投与し得る。
上記LOX-1を活性化する方法及びERKをリン酸化する方法において、どのように上記所定のタンパク質用いるかは限定されないが、例えば、細胞に上記所定のタンパク質を添加することを含んでもよく、又はヒトや哺乳類等の対象に上記所定のタンパク質を投与することを含んでもよい。
LOX-1は、内皮機能障害及びアテローム形成に関係していると報告されている。従って、上記所定のタンパク質は、内皮機能障害若しくはアテローム形成の診断、予防又は治療に応用できると考えられる。
【００２４】
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターに含有させることができる。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、配列番号２で表されるDNA配列を含むポリヌクレオチド、をベクターに含有させることができる。
本発明の一態様において、配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドをベクターに含有させることができる。
本発明において使用し得るベクターとしては、当該断片を機能的に挿入することができ、宿主細胞内で異種核酸断片の複製又は発現をもたらすよう当該断片を宿主細胞内に運搬することができるものであればよく、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、及びウイルスが挙げられる。
本発明において使用し得る宿主細胞としては、原核細胞、例えば大腸菌であってもよく、又は真核細胞、例えば酵母や哺乳動物細胞であってもよい。
【００２５】
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを含む形質転換体が提供される。
本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、配列番号２で表されるDNA配列を含むポリヌクレオチド、を含有する組換えベクターを含む形質転換体が提供される。
本発明の一態様において、配列番号２で表されるDNA配列からなるポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを含む形質転換体が提供される。
ここで、形質転換体とは、異種核酸断片を導入された宿主細胞のことを意味する。形質転換用核酸断片は、細胞のゲノム内に組み入れられてもよく、また組み入れられていなくてもよい。例えば、形質転換用核酸断片はエピソーム、例えばプラスミドにおいて維持されてもよい。
【００２６】
配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、当該タンパク質と結合する又は相互作用する物質をスクリーニングするために用いることができる。従って、本発明の一態様において、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を被検物質と接触させることを含む、当該タンパク質と結合する又は相互作用する物質をスクリーニングするための方法が提供される。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を被検物質と接触させる場合、接触は細胞内で行われても細胞外で行われてもよい。例えば、ウェルプレート等の支持体に配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と被検物質のうちの一方を固定し、もう一方を添加することで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を被検物質と接触させることができる。また、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を発現している細胞に被検物質を添加することで、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を被検物質と接触させてもよい。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質を発現している細胞に被検物質を添加する場合、細胞培養液中に被検物質を添加してもよい。
【実施例】
【００２７】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合遺伝子の作成
ヒト肺がん細胞株LU99よりRNeasy plus キット（キアゲン）を用いてRNAを精製した。このRNAを鋳型として、逆転写酵素プライムスクリプトII（タカラ）およびヒトSAA3特異的プライマー（5’-TTCAGTAACTGTAGGTCAAC-3’）（配列番号：３）を用いてcDNA合成を行った。cDNA合成の手順は逆転写酵素の製造業者のマニュアルに従って行った。
次に、得られたcDNAを鋳型として用い、プライマーとして 5’-GGTACCATGAAGCTTCTCACGGGCCTGGTTTTCTG-3’（配列番号：４）及び 5’-CTCGAGTAGTTCCCCCAAGCATGGAAGTATTTGTCTG-3’（配列番号：５）を用いてPCRを行った。酵素は東洋紡のKOD  FX NEを１反応あたり1ユニット、dNTPを０．4ｍM、プライマー濃度は0.3μMとし、９４度２分の加熱処理の後、98度１０秒−６８度３０秒の２ステップ増幅サイクルを４５回行った。これは、本PCR酵素用の標準的使用条件であり、製造元が推奨する条件である。反応用バッファーは酵素に付属のものを用いた。鋳型は１μgのRNAよりタカラの逆転写酵素プライムスクリプトIIおよび製造元推奨の反応条件により合成されたcDNAのうち２０分の１量を用いた。
得られたPCR反応物を１％アガロースゲル上で電気泳動すると426bpに相当する反応生成物が得られたので、このバンドを切り出し、プロメガのゲル抽出キットを用いてゲルからのDNA断片の回収を行った。回収された産物をプロメガのｐGEM−Teasyベクターと混合し、ｐGEM-Teasyベクター内への組み込みを行った。このベクターをタカラの大腸菌DH5αに形質転換し、アンピシリン含有LB培地プレート上で培養することによりｐGEM-Teasyベクターを含む大腸菌を選択的に培養することができる。得られた大腸菌DH5αより、ｐGEM-Teasyベクターをキアゲンのミニプレップキットで抽出し、インサートのDNA配列をDNAシークエンシング法で確認した。DNAシークエンシング法により、クローニングされた遺伝子配列は、配列番号２で表されるSAA2-SAA3融合遺伝子であることが確認された。
【００２９】
実施例２：ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質の発現
実施例１で作成した遺伝子を含むpGEM-Tプラスミドを制限酵素KpnI及びXhoIで消化し、アガロースゲル上で電気泳動し、426bpのDNA断片（SAA2-SAA3融合遺伝子）をゲルから抽出した。この抽出断片を、予めKpnIとXhoIで制限酵素処理を行っておいたpcDNA3ベクター（ライフテクノロジーズジャパン）に組み込んだ。pcDNA3ベクターには、XhoIサイトの3’側にFLAGタグとその直後のストップコドンをコードするDNA（5’-GACTACAAAGACGATGACGACAAGTAA-3’）（配列番号：８）を組み込んでおき、SAA2-SAA3融合遺伝子をこのベクターに組み込んだ際には、SAA2-SAA3のアミノ酸配列のC末端にLEDYKDDDDK（配列番号９）のアミノ酸配列が付加されるように設計されていることになる。このプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞CHOにトランスフェクションし、翌日に細胞上清を濃縮したものをSDS電気泳動した後、PVDF膜に転写し、マウス抗DYKDDDDK抗体および抗マウス−HRP抗体と化学発光試薬を用いてタンパク質の検出を行った。検出されたバンドの移動度は、ヒトＳＡＡ２−ヒトＳＡＡ３融合タンパク質のアミノ酸配列から予想された移動度とおおむね一致した。結果を図２に示す。
【００３０】
なお、図２において示されるコントロール-FLAGは、インビトロゲンのpcDNA3のXhoIサイトにFLAGタグの部分のみを挿入して得たものである。また、図２において示されるSAA2a-FLAG、SAA2b-FLAG及びSAA2-SAA4-FLAGは、SAA2-SAA3と同様に培養細胞から調製したｃDNAから標的の遺伝子をクローニングしたものであり、SAA2-SAA3と同様の手法により調製した。
【００３１】
実施例３：ERKリン酸化の検証
SAA2-SAA3融合タンパク質のC末端26アミノ酸に相当するペプチド（MWKAYSDMKEANYKKFRQILPCLGEL）（配列番号：６）を化学合成した。このペプチドをヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）培地中に添加し、10分後に細胞を回収し、細胞抽出バッファー（50mM HEPES, 150mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.5% コール酸ナトリウム，pH 7.4）に混合し、遠心分離により、細胞抽出液を得た。タンパク質10μg相当量の細胞抽出液をSDS電気泳動にて泳動し、PVDF膜に転写後、膜を抗ERKまたは抗リン酸化ERK抗体と反応させ、次いで抗ウサギIgG-HRP抗体と化学発光を用いることにより、細胞抽出液に含まれるERKおよびリン酸化ERKタンパク質の検出を行った。更に、pERK/ERKの相対強度をデンシトメトリー法により定量した。結果を図３に示す。この結果から、SAA2-SAA3融合タンパク質のC末端26アミノ酸ペプチドには、HUVEC細胞を刺激し、細胞内情報伝達タンパク質であるERKのリン酸化を引き起こす生理作用が存在することが示された。
【００３２】
実施例４：酸化LDL受容体（LOX-1）に対する結合親和性の検証
96ウェルプレートに組み換え酸化LDL受容体細胞外部位（ヒト酸化LDL受容体タンパク質[Uniprot:P78380 (OLR1_HUMAN)]のうちアミノ酸61-273の部位）をコートし、その後、SAA2-SAA3融合タンパク質のC末端26アミノ酸に相当するペプチドを含む溶液を加え1時間放置した。ウェルを洗浄したのち、ウェルに残ったペプチド（酸化LDL受容体に結合したものと考えられる）をHRPでラベルした抗SAA3抗体で検出した。抗SAA3抗体は、国際公開第２０１１／０４０１３３号に記載の方法に準じて得られたものであった。結果を図４に示す。図４で示されるグラフは、最初に加えたSAA2-SAA3融合タンパク質のC末端26アミノ酸ペプチドの濃度とウェルに残った当該ペプチドの量をプロットしたものである。このグラフの回帰曲線の解析から、SAA2-SAA3融合タンパク質のC末端26アミノ酸ペプチドの酸化LDL受容体（LOX-1）への親和性は206±86nMであることが明らかとなった。この数値は、受容体親和性を示すには十分な値と考えられる。
【００３３】
実施例５：酵母2ハイブリッド法による酸化LDL受容体（LOX-1）へのSAA3の結合部位の解析
MATCHMAKERTM GAL4 Two-Hybrid System 3（タカラ）を用いて、酵母2ハイブリッド法を行った。ベイトベクターとして、pGBKT7（タカラ）のEcoRI-PstIサイトにSAA2-SAA3融合タンパク質のC末端61アミノ酸ペプチドをコードするDNA及びそのC末端欠失体をコードするDNA（図５（Ｂ）参照）を組み込んだものをそれぞれ作成した。一方、プレイベクターとして、pGADT7（タカラ）のBamHI-XhoIサイトに組み換え酸化LDL受容体細胞外部位をコードするDNAを組み込んだものを作成した。
ベイトベクター及びプレイベクターを酵母AH109にトランスフォームすると、ベイトベクターよりトリプトファン合成遺伝子が、プレイベクターよりロイシン合成遺伝子が供給されるため、トリプトファンおよびロイシンを欠損させた栄養培地SD-2上でも生育できる。さらにベイトベクター遺伝子産物とプレイベクター遺伝子産物が相互作用すると、下流遺伝子の活性化がおこり、アデニン、ヒスチジンの合成遺伝子活性化が行われるため、トリプトファン、ロイシン、アデニン、ヒスチジン欠損培地SD-4上でも生育できるようになる。
結果を図５（Ａ）に示す。コロニーの観察においては、10倍ずつ希釈した酵母の系列を用いた。図５（Ａ）中、左端から順に10倍ずつ希釈した酵母を培地に接種して培養したものを示しており、右側に行くに従い、接種する酵母の数が減るためコロニーがまばらになった。図５（Ａ）に示される通り、SD-2培地では全てのクローンが同程度に生育したが、SD-4培地では、SAA3のC末端まで存在するクローンでのみ、酵母が生育していることが示された。このことから、酸化LDL受容体とSAA3との結合は、SAA3のC末端のみで成立していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明によれば、生体内でのヒトＳＡＡ３の機能を解明するための有効な手段が提供され、本発明は、ヒトＳＡＡ３の機能解析の分野等での利用に有益である。
本発明は、これまで未知であったヒトＳＡＡ３の機能を解明するための技術を飛躍的に向上させることができ、ひいてはヒトＳＡＡ３が関連する疾患の特定、及びその診断、予防又は治療において格段の進歩をもたらすものである。
また、本発明によれば、LOX-1結合剤（アゴニスト）やERKリン酸化剤を提供することができ、細胞内シグナル伝達を活性化する方法を提供することができる。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図２】
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【図５】
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【配列表】
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