(57)【要約】【課題】医薬品等の原料として有用なタンパク質モノマーを、高収率かつ高純度で得ることができるタンパク質凝集体の除去方法を提供する。【解決手段】タンパク質のモノマーおよびタンパク質の凝集体を含む溶液を、強陽イオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムに通液することにより、前記タンパク質のモノマーおよび前記タンパク質の凝集体を前記カラムに吸着させる工程と、前記タンパク質のモノマーおよび前記タンパク質の凝集体を吸着した前記カラムに、緩衝液とイオン性緩衝液との混合液からなる移動相を通すことにより、前記タンパク質のモノマーを選択的に溶出させる工程と、を有することを特徴とするタンパク質凝集体の除去方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質のモノマーおよびタンパク質の凝集体を含む溶液を、強陽イオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムに通液することにより、前記タンパク質のモノマーおよび前記タンパク質の凝集体を前記カラムに吸着させる工程と、
前記タンパク質のモノマーおよび前記タンパク質の凝集体を吸着した前記カラムに、緩衝液とイオン性緩衝液との混合液からなる移動相を通すことにより、前記タンパク質のモノマーを選択的に溶出させる工程と、
を有することを特徴とするタンパク質凝集体の除去方法。
【請求項２】
前記緩衝液の濃度が、１ｍＭ〜１００ｍＭであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【請求項３】
前記緩衝液のｐＨが、２〜９であることを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【請求項４】
前記緩衝液と前記イオン性緩衝液との混合液における無機塩の濃度が、５０ｍＭ〜２５０ｍＭであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【請求項５】
前記硬質多孔性高分子自己支持構造物を構成するモノマーが、メタクリレート類またはアクリレート類であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【請求項６】
前記硬質多孔性高分子自己支持構造物の通液方向の厚さが、１ｍｍ〜１００ｍｍであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【請求項７】
前記移動相の流速が２ＣＶ／分以上であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質モノマーおよびタンパク質凝集体を含む溶液からタンパク質凝集体を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫グロブリンやサイトカイン等のタンパク質を医薬として用いた治療法が拡大している。これらのタンパク質はバイオ医薬と呼ばれ、その市場も拡大している。中でも、免疫グロブリンを用いた抗体医薬は、自己免疫疾患やがん等の治療薬として既に用いられている。抗体医薬の市場は、今後さらに拡大していくことが期待されている。
【０００３】
医薬用タンパク質は、夾雑物を多量に含む細胞培養液から高度に精製される必要がある。精製の方法としては、クロマトグラフィー等が用いられる。
しかしながら、精製されたタンパク質が二量体、三量体等の凝集体を形成し、不純物となることがある。タンパク質凝集体の形成は、薬効の低下や免疫原性の発現等、医薬品にとって有害な影響をもたらすことが懸念されている。そのため、不純物であるタンパク質凝集体を有害な影響がなくなる程度まで除去することが望まれている。
以上をふまえ、医薬用タンパク質、特に抗体タンパク質等を精製することを目的として、クロマトグラフィーによってタンパク質凝集体を除去する方法が多数開示されている。
【０００４】
クロマトグラフィーによってタンパク質凝集体を除去する方法としては、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー等を単独で用いる方法、これらのクロマトグラフィーを複数用いる方法、これらのクロマトグラフィーを複数種混合した混合モードクロマトグラフィー等が挙げられる。これらの方法は、いずれもビーズ状の多孔質高分子担体を用いたクロマトグラフィーによる方法である。タンパク質凝集体とタンパク質モノマーの僅かな相互作用の違いを利用して両者を分離するためには、分離条件を精密に制御し、優れた分離能を発揮することが要求される。しかし、ビーズ状の多孔質高分子担体を用いたクロマトグラフィーでは、高流速になると分離能が低下することが知られている。したがって、ビーズ状の多孔質高分子担体を用いたクロマトグラフィーでは、高流速で通液して、タンパク質凝集体とタンパク質モノマーを迅速に分離することが困難であった。
【０００５】
凝集体を高流速で除去する方法としては、アニオン交換基が固定された多孔膜を用いた抗体モノマーの精製方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この方法では、内容量２ｍＬの中空多孔膜モジュールに対して、流速２ｍＬ／ｍｉｎで通液している。この流速は、市販のビーズ充填型アニオン交換クロマトグラフィーカラム（カラム溶液１ｍＬ）に用いる流速１ｍＬ／ｍｉｎと容積当たりの流速が変わらない。すなわち、この方法では、高流速で通液して、タンパク質凝集体とタンパク質モノマーを迅速に分離することが実現できないため、新たな方法が求められていた。
【０００６】
また、多孔性自己支持構造物を用いたクロマトグラフィーが知られている（例えば、特許文献２参照）。この多孔性自己支持構造物は、ビニルモノマーとポリビニルの混合物から作製され、特定範囲の均一な細孔を多数有し、イオン交換基、疎水性基、親和性リガンド等の官能基を導入した高分子を含む。このような多孔性自己支持構造物は、ビーズ状の多孔質高分子担体や多孔膜に比べて物理的強度に優れ、高流速でも低背圧である。よって、多孔性自己支持構造物は、高流速で通液して、目的とする物質を分離することが可能であると考えられる。しかしながら、従来、多孔性自己支持構造物を用いたクロマトグフラフィーによって、タンパク質凝集体を除去する方法は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−２４１７６１号公報
【特許文献２】特表２００２−５０５４２８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、医薬品等の原料として有用なタンパク質モノマーを、高収率かつ高純度で得ることができるタンパク質凝集体の除去方法を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、タンパク質に含まれるタンパク質凝集体を高速で除去し、モノマーの純度が高いタンパク質を高収率で得ることができるタンパク質凝集体の除去方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、本発明者等は、上記課題を解決するためにタンパク質凝集体の除去方法について鋭意検討を行った。その結果、強陽イオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムを用いてクロマトグラフィーを行うと、カラム容積に対する移動相の流速が早い場合であっても、タンパク質凝集体を高速で除去し、モノマーの純度が高いタンパク質を高収率で得ることができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
［１］タンパク質のモノマーおよびタンパク質の凝集体を含む溶液を、強陽イオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムに通液することにより、前記タンパク質のモノマーおよび前記タンパク質の凝集体を前記カラムに吸着させる工程と、前記タンパク質のモノマーおよび前記タンパク質の凝集体を吸着した前記カラムに、緩衝液とイオン性緩衝液との混合液からなる移動相を通すことにより、前記タンパク質のモノマーを選択的に溶出させる工程と、を有することを特徴とするタンパク質凝集体の除去方法。
【００１１】
［２］前記緩衝液の濃度が、１ｍＭ〜１００ｍＭである［１］に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【００１２】
［３］前記緩衝液のｐＨが、２〜９である［１］または［２］に記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【００１３】
［４］前記緩衝液と前記イオン性緩衝液との混合液における無機塩の濃度が、５０ｍＭ〜２５０ｍＭである［１］〜［３］のいずれかに記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【００１４】
［５］前記硬質多孔性高分子自己支持構造物を構成するモノマーが、メタクリレート類またはアクリレート類である［１］〜［４］のいずれかに記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【００１５】
［６］前記硬質多孔性高分子自己支持構造物の通液方向の厚さが、１ｍｍ〜１００ｍｍである［１］〜［５］のいずれかに記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【００１６】
［７］前記移動相の流速が２ＣＶ／分以上である［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質凝集体の除去方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のタンパク質凝集体の除去方法によれば、医薬品等の原料として有用なタンパク質を、工業的かつ経済的に、高収率かつ高純度で得ることができる。より具体的には、タンパク質に含まれるタンパク質凝集体を高速で除去し、モノマー純度の高いタンパク質を高収率で得る方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】クロマトグラムにおいて、平衡化に用いた緩衝液との混合液による溶出部分、フロースルー部分、イオン性緩衝液による溶出部分を示す。
【図２】実施例の回収率計算のために用いた装置の流路図である。
【図３】実施例の純度計算のために用いた装置の流路図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明のタンパク質凝集体の除去方法の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
【００２０】
［タンパク質凝集体の除去方法］
本発明のタンパク質凝集体の除去方法は、タンパク質のモノマー（以下、「タンパク質モノマー」と言う。）およびタンパク質の凝集体（以下、「タンパク質凝集体」と言う。）を含む溶液を、強陽イオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムに、タンパク質モノマーおよびタンパク質凝集体をカラムに吸着させる工程と、タンパク質モノマーおよびタンパク質凝集体を吸着したカラムに、緩衝液とイオン性緩衝液との混合液からなる移動相を通すことにより、タンパク質モノマーを選択的に溶出させる工程と、を有する方法である。これにより、タンパク質凝集体を除去する。
なお、タンパク質モノマーとは、タンパク質１分子のことを示す。タンパク質凝集体とは、タンパク質モノマーが疎水性相互作用、静電的相互作用、その他の相互作用により可逆または不可逆に吸着、凝集したタンパク質集合体のことである。
【００２１】
＜強陽イオン交換基＞
強陽イオン交換基は、イオン強度の高い陽イオンの交換基である。強陽イオン交換基は、強酸性を示す交換基であることが好ましい。強陽イオン交換基としては、具体的に、スルホ基が挙げられる。なお、スルホ基は、アルキル基やヒドロシキアルキル基等のリンカーを介して、硬質多孔性高分子自己支持構造物に保持されていてもよい。
【００２２】
＜硬質多孔性高分子自己支持構造物＞
硬質多孔性高分子自己支持構造物は、少なくとも２つの重合可能な部分を有するモノマー類、または、少なくとも２種類のモノマー類の重合により得られる高分子の構造体である。また、多孔質であり、その孔は全体にわたって均一な孔径分布を有する、多孔質体である。
硬質多孔性高分子自己支持構造物の形状は、板状、管状、円筒状等、一体構造をなしている。
【００２３】
硬質多孔性高分子自己支持構造物の通液方向の厚さは、１ｍｍ〜１００ｍｍであることが好ましく、２ｍｍ〜７０ｍｍであることがより好ましく、３ｍｍ〜６０ｍｍであることがさらに好ましく、３ｍｍ〜５０ｍｍであることが最も好ましい。
硬質多孔性高分子自己支持構造物の厚さを１ｍｍ以上とすることにより、硬質多孔性高分子自己支持構造物は充分な機械的強度を持つ。硬質多孔性高分子自己支持構造物の厚さを１００ｍｍ以下とすることにより、硬質多孔性高分子自己支持構造物が破壊しない圧力を保ち、ポンプ圧の上昇を防ぐことができる。
【００２４】
硬質多孔性高分子自己支持構造物としては、具体的には、ＣＩＭａｃ（登録商標）  ＳＯ３−０．１  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ（登録商標）  ＳＯ３  ＤＩＳＫ、ＣＩＭ  ＳＯ３−１  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  ＳＯ３−８ｆ  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  ＳＯ３−８０  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  ＳＯ３−８００  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭ  ＳＯ３−８０００  Ｔｕｂｅ  Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭＭｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＳＯ３−１  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭＭｕｌｔｕｓ  ＳＯ３−８  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭＭｕｌｔｕｓ  ＳＯ３−８０  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭＭｕｌｔｕｓ  ＳＯ３−８００  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔ  ｃｏｌｕｍｎ、ＣＩＭＭｕｌｔｕｓ  ＳＯ３−８０００  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔ  ｃｏｌｕｍｎ等が挙げられる。
なお、これらの硬質多孔性高分子自己支持構造物は全てグリシジルメタクリレートとエチレンジメタクリレートの共重合体である。
【００２５】
これらの硬質多孔性高分子自己支持構造物は、静置したとき、その形状を自己支持できる機械的強度を有する。すなわち、ビーズ状の多孔質高分子担体や、多孔膜とは物理的構造が異なる。
【００２６】
硬質多孔性高分子自己支持構造物を構成するためのモノマーとしては、強陽イオン交換基を有するモノマーまたは強陽イオン交換基の基となる官能基を有するモノマーが用いられ、例えば、ポリビニルモノマーおよびモノビニルモノマーが挙げられる。
【００２７】
ポリビニルモノマーとしては、ジビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルピリジン、メタクリレート類、アクリレート類、ビニルエステル類、ジビニルエーテル等のビニルエーテル類、エチレンビスアクリルアミドやプロピレンビスアクリルアミド等のアルキレンビスアクリルアミド類またはメタクリルアミド類およびそれらの混合物が用いられる。
メタクリレート類としては、グリシジルメタクリレート、エチレングリコールジメタクリレートやプロピレングリコールジメタクリレート等のアルキレンジメタクリレート類、ヒドロキシエチルメタクリレートやヒドロキシプロピルメタクリレート等のヒドロキシアルキルメタクリレート類、ペンタエリトリトールジ−、トリ−もしくはテトラメタクリレートトリメチロールプロパントリメタクリレートまたはアクリレートが用いられる。
アクリレート類としては、エチレングリコールジアクリレート類、ペンタエリトリトールジ−、トリ−もしくはテトラアクリレートが用いられる。
【００２８】
モノビニルモノマーとしては、例えば、スチレン、置換スチレン（但し、置換基は、クロロメチル基、炭素原子数１〜１８のアルキル基、水酸基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、ハロゲン基、ニトロ基、アミノ基、保護水酸基またはアミノ基を包含する）、ビニルナフタレン、アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、酢酸ビニルおよびピロリドン、並びに、これらの混合物が挙げられる。メタクリル酸エステルの一例として、グリシジルメタクリレートが挙げられる。
【００２９】
硬質多孔性高分子自己支持構造物を構成するためのモノマーとしては、好ましくはメタクリレート類、アクリレート類、より好ましくはグリシジルメタクリレート、アルキレンジメタクリレート類、さらに好ましくはグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体を、スルホ基を有する化合物で変性したものである。
【００３０】
グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体は、ポロゲンと重合開始剤の存在下で、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの混合物から製造される。
ポロゲンとは、多孔を形成するための添加物質であり、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、エステル類、アルコール類、ケトン類、エーテル類、可溶性高分子溶液、およびそれらの混合物のような異なる種類の材料等が用いられる。ポロゲンは、好ましくはノルマルヘキサンである。
【００３１】
重合開始剤としては、フリーラジカル発生開始剤が用いられる。具体的には、アゾビスイソブチロニトリルや２，２’−アゾビス（イソブチルアミド）ジヒドレート等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイルや過酸化ジプロピル二カルボン酸エステル等の過酸化物が用いられる。種類の異なる重合開始剤を用いると、形の異なる孔構造を形成することができる。重合開始剤の量は、モノマー重量に対して、好ましくは０．５質量％〜４質量％である。
【００３２】
グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体を製造するとき、ポロゲンとして、可溶性高分子が添加されていてもよい。可溶性高分子が添加されていると、孔構造がより多く形成される。可溶性高分子の量は、共重合体全体の質量に対して、好ましくは１０質量％〜４０質量％である。
ポロゲンや重合開始剤を含むグリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの混合物は、成形型の中に入れる前に、窒素またはアルゴンのような不活性ガスを用いて脱気することが好ましい。成形型は、空気汚染を防ぐために密封することが好ましい。
【００３３】
上記のモノマーの重合は、例えば、４０時間〜５０時間、５０℃〜９０℃の温度で加熱して行うことができる。
重合後、管を洗浄し、かつポロゲンとして用いた溶媒や可溶性高分子を除去する。洗浄のための溶媒としては、メタノール、エタノール、ベンゼン、トルエン、アセトン、テトラヒドロフラン等が用いられる。洗浄工程は複数回繰り返してもよい。
共重合体を修飾するとき、二硫酸１，４−ジオキサン混合物を用いて強陽イオン交換基を導入することができる。
【００３４】
＜カラム＞
カラムは、強陽イオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含んでなる。すなわち、カラムは、板状、管状、円筒状等の形状をなす硬質多孔性高分子自己支持構造物のみから構成されていてもよく、所定量の硬質多孔性高分子自己支持構造物を、筒状の容器に収容（保持）してなるものであってもよい。
【００３５】
カラムの大きさ（体積）は、特に制限されず、吸着させるタンパク質モノマーおよびタンパク質凝集体の量に応じて適宜調整される。
【００３６】
＜タンパク質＞
本発明のタンパク質凝集体の除去方法によって、タンパク質凝集体を除去できるタンパク質は、特に制限されない。本発明のタンパク質凝集体の除去方法によって、タンパク質凝集体を除去できるタンパク質としては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等のイムノグロブリン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＨＦ−β、アディポカイン、ＮＧＦ等のサイトカイン、ヒト成長ホルモン、インスリン、グルカゴン等のタンパク質ホルモン、血液凝固因子、アルブミン、リゾチーム、ＲＮａｓｅＡ、シトクロムｃ等が挙げられる。
タンパク質凝集体とは、タンパク質モノマーが疎水性相互作用、静電的相互作用、その他の相互作用により可逆的または不可逆的に吸着、凝集したタンパク質複合体のことである。
【００３７】
＜吸着＞
タンパク質モノマーおよびタンパク質凝集体を、緩衝液に溶解させて溶液を調製し（以下、この溶液を「タンパク質溶液」と言う。）、このタンパク質溶液をカラムに通液することにより、このタンパク質溶液に含まれるタンパク質（タンパク質モノマー、タンパク質凝集体）を、硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムに吸着させることができる。
【００３８】
緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が用いられる。これらの中でも、緩衝能を有する使用ｐＨ範囲の点から、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液が好ましい。
緩衝液の濃度は、特に制限されないが、１ｍＭ〜１００ｍＭであることが好ましく、２ｍＭ〜５０ｍＭであることがより好ましく、５ｍＭ〜３０ｍＭであることがさらに好ましい。
緩衝液のｐＨは、タンパク質を吸着および溶出できる範囲であれば特に制限されないが、ｐＨ２〜ｐＨ９であることが好ましく、ｐＨ３〜ｐＨ８であることがより好ましく、ｐＨ４〜ｐＨ７．５であることがさらに好ましい。
【００３９】
タンパク質溶液における、タンパク質の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、０．１ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．２ｍｇ／ｍＬ〜３ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
タンパク質の濃度を上記の範囲内とすることにより、タンパク質溶液に含まれる全てのタンパク質を、硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムに吸着させることができる。
【００４０】
タンパク質をカラムに吸着させる前に、カラムに緩衝液を通して平衡化しておくことが好ましい。
カラムの平衡化に用いられる緩衝液としては、種類、濃度およびｐＨが、タンパク質を溶解する緩衝液と同様のものが用いられる。
カラムの平衡化に要する緩衝液の量は、特に制限されないが、１ＣＶ（カラム容積倍数）以上であることが好ましく、２ＣＶ以上であることがより好ましく、４ＣＶ以上であることがさらに好ましい。
【００４１】
カラム内におけるタンパク質溶液の流速は、カラムにタンパク質を吸着させることができれば、特に制限されないが、２ＣＶ／分〜１２．５ＣＶ／分であることが好ましく、２．５ＣＶ／分〜５ＣＶ／分であることがより好ましい。
【００４２】
カラムにタンパク質を吸着させる際、カラムおよびタンパク質溶液の温度は、特に制限されないが、２℃〜５０℃であることが好ましく、４℃〜４０℃であることがより好ましく、８℃〜３０℃であることがさらに好ましい。カラムおよびタンパク質溶液の温度を、前記の範囲にすることにより、タンパク質溶液の凍結、タンパク質の破壊を防ぐことができる。
【００４３】
＜タンパク質モノマーの溶出＞
イオン性の溶質を溶解させた緩衝液であるイオン性緩衝液と、上記の緩衝液とを適当な比率で混合して混合液を調製する。
この混合液を移動相として用いて、タンパク質を吸着させたカラムに、その移動相を通すことにより、タンパク質モノマーを選択的に溶出させることができる。
イオン性緩衝液に用いる溶質は、タンパク質モノマーを選択的に溶出させることができるものであれば制限されないが、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムが好ましい。
上記の緩衝液とイオン性緩衝液との混合液における溶質の濃度は、好ましくは５０ｍＭ〜２５０ｍＭ、より好ましくは７５ｍＭ〜２２５ｍＭ、さらに好ましくは１００ｍＭ〜２００ｍＭである。
無機塩を溶解する緩衝液の種類、濃度およびｐＨは、タンパク質を溶解する緩衝液と同様であってもよいし、異なっていてもよい。
【００４４】
移動相の流速は、カラムに吸着させたタンパク質モノマーを選択的に溶出させることができれば、特に制限されないが、２ＣＶ／分以上であることが好ましく、２ＣＶ／分〜１２．５ＣＶ／分であることがより好ましく、２．５ＣＶ／分〜５ＣＶ／分であることがさらに好ましい。
【００４５】
カラムに移動相を通す際、カラムおよび移動相の温度は、特に制限されないが、２℃〜５０℃であることが好ましく、４℃〜４０℃であることがより好ましく、８℃〜３０℃であることがさらに好ましい。カラムおよび移動相の温度を、前記の範囲にすることにより、タンパク質溶液の凍結、タンパク質の破壊を防ぐことができる。
【００４６】
なお、タンパク質モノマーを溶出した後、上記のイオン性緩衝液のみを移動相として用いて、カラムに、その移動相を通すことにより、カラムに吸着されているタンパク質凝集体を溶出させることもできる。
タンパク質凝集体を溶出させた後、カラムに上記の緩衝液を再び通すことにより、カラムを再生することもできる。
【００４７】
本発明のタンパク質凝集体の除去方法によれば、強陽イオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラムに、タンパク質モノマーおよびタンパク質凝集体を吸着させた後、カラムからタンパク質モノマーのみを選択的に溶出させることにより、タンパク質に含まれるタンパク質凝集体を高速で除去し、タンパク質モノマーの純度が高いタンパク質を高収率で得ることができる。得られたタンパク質モノマーは、医薬品等の原料として有用である。
また、本発明のタンパク質凝集体の除去方法は、タンパク質に含まれるタンパク質凝集体を高速で除去することができる上に、カラムを容易に再生することができるため、工業的かつ経済的にも優れた方法である。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例および比較例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実施例および比較例において、回収率、純度、凝集体含量を次のように定義する。
【００５０】
［回収率］
カラムに吸着させた免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と略す。）の全量、すなわち、ＩｇＧモノマーおよびＩｇＧ凝集体の合計に対する、溶出および精製されたＩｇＧモノマーの比率を、回収率と定義した。
具体的には、クロマトグラム上でイオン性緩衝液と、カラムの平衡化に用いた緩衝液との混合液による溶出部分の面積を、フロースルー部分と混合液による溶出部分とイオン性緩衝液による溶出部分との面積の和で割った値を回収率とする。なお、カラムの平衡化に用いた緩衝液との混合液による溶出部分、フロースルー部分、イオン性緩衝液による溶出部分は図１に示す通りである。
クロマトグラムの作成には、島津製作所社製の液体クロマトグラフシステムコントローラＳＣＬ−１０  ＡＶＰを用いた。本装置では、送液ポンプを介して緩衝液とイオン性緩衝液がオートサンプラーに接続されており、カラムに流れる溶液の濃度を制御することができる。流路図は図２に示す。図２において、符合１は緩衝液、符合２はイオン性緩衝液、符合３は送液ポンプ、符合４はオートサンプラー、符合５は分取カラム、符合６はＰＤＡ検出器、符合７はフラクションコレクターである。単位は％である。
【００５１】
［純度］
回収された試料中のＩｇＧの全量、すなわち、ＩｇＧモノマーおよびＩｇＧ凝集体の合計に対する、ＩｇＧモノマーの比率を、純度と定義した。
具体的には、分析カラムとして昭和電工社製のカラム（ｓｈｏｄｅｘ（登録商標）ＫＷ４０３−４Ｆ）によるサイズ排除クロマトグラフィーを用いてＩｇＧモノマーの比率を測定することにより、純度を求めた。クロマトグラム上でのモノマーのピーク面積をＩｇＧ全量の面積で割った値を純度とする。なお、ＩｇＧ全量の面積は、凝集体のピーク面積とモノマーのピーク面積との和とする。クロマトグラムの作成には、島津製作所社製の液体クロマトグラフ送液ユニットＬＣ２０−ＡＴを用いた。流路図は図３に示す。図３において、符合１は緩衝液、符合３は送液ポンプ、符合４はオートサンプラー、符合６はＰＤＡ検出器、符合８は分析カラムである。単位は％である。
【００５２】
［凝集体含量］
凝集体が全く含まれない状態を１００としたとき、１００−純度（％）と定義する。なお、純度（％）はクロマトグラムにおける面積比として計算される。
【００５３】
［実施例１］
（１）カラムの平衡化
カラムとして、ＢＩＡ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＣＩＭ（登録商標）  ＳＯ３  ＤＩＳＫ（厚さ：３ｍｍ、直径：１２．０ｍｍ、空隙率：約６０ｖ／ｖ％以上）を用い、このカラムに、２０ｍＭ、ｐＨ５．３のクエン酸緩衝液を５ＣＶ以上通して、このカラムを平衡化した。なお、ＣＩＭ  ＳＯ３  ＤＩＳＫは、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体の変性物であり、一部のグリシジルメタクリレートにスルホ基が保持されている硬質多孔性高分子自己支持構造物である。
【００５４】
（２）ＩｇＧの吸着
２０ｍＭ、ｐＨ５．３のクエン酸緩衝液に、ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶解し、ＩｇＧの濃度が３ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を調製した。この溶液の凝集体含量は、およそ１５−純度％であった。
このタンパク質溶液５０μＬを、（１）で平衡化したカラムに注入し、カラムに、タンパク質溶液に含まれるタンパク質を吸着させた。このとき、カラム体積１ｍＬ当たりのタンパク質負荷量は４５０μｇであった。カラム内におけるタンパク質溶液の流速を１２ＣＶ／分とした。
【００５５】
（３）ＩｇＧモノマーの溶出
２０ｍＭ、ｐＨ５．３のクエン酸緩衝液と、１ＭのＮａＣｌ溶液とを、ＮａＣｌ濃度が１７０ｍＭになるように混合して、混合液を調製した。なお、１ＭのＮａＣｌ溶液は、２０ｍＭ、ｐＨ５．３のクエン酸緩衝液にＮａＣｌを溶解させたものである。
タンパク質を吸着させたカラムに、この混合液を６ｍｌ通すことにより、ＩｇＧモノマーを溶出させた。溶液の流速は１２ＣＶ／分とした。
【００５６】
（４）ＩｇＧ凝集体の溶出
その後、カラムに１ＭのＮａＣｌ溶液を６ｍｌ通すことにより、ＩｇＧ凝集体を溶出させた。溶液の流速は１２ＣＶ／分とした。
なお、実施例１において、カラム、タンパク質溶液および移動相の温度を２５℃とし、カラムの圧力を最大許容圧１．８ＭＰａを超えない範囲とした。
【００５７】
［実施例２］
実施例１の（３）において、ＮａＣｌ濃度を２００ｍＭとした以外は、実施例１と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００５８】
［実施例３］
実施例１の（３）において、ＮａＣｌ濃度を１４０ｍＭとした以外は、実施例１と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００５９】
［実施例４］
（１）カラムの平衡化
カラムとして、ＢＩＡ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＣＩＭＭｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＳＯ３−１  Ｔｕｂｅ（厚さ：６ｍｍ、外径：１８．６ｍｍ、内径：６．７ｍｍ、長さ：４．２ｍｍ、空隙率：約６０ｖ／ｖ％以上）を用い、実施例１と同様にして、このカラムを平衡化した。
なお、ＣＩＭＭｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＳＯ３−１  Ｔｕｂｅは、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体の変性物であり、一部のグリシジルメタクリレートにスルホ基が保持されている硬質多孔性高分子自己支持構造物である。また、装置の構造によりカラムの中心の孔が塞がれるので、インジェクトされた液が中心の孔をそのまま通り抜けることはない。
【００６０】
（２）ＩｇＧの吸着
実施例１と同様にして、ＩｇＧの濃度が３ｍｇ／ｍＬのタンパク質溶液を調製した。この溶液の凝集体含量は、およそ２０−純度％であった。
このタンパク質溶液１００μＬを、（１）で平衡化したカラムに注入し、カラムに、タンパク質溶液に含まれるタンパク質を吸着させた。このとき、カラム体積１ｍＬ当たりのタンパク質負荷量は３００μｇであった。カラム内におけるタンパク質溶液の流速を５ＣＶ／分とした。
【００６１】
（３）ＩｇＧモノマーの溶出
２０ｍＭ、ｐＨ５．３のクエン酸緩衝液と、１ＭのＮａＣｌ溶液とを、ＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭになるように混合して、混合液を調製した。なお、１ＭのＮａＣｌ溶液は、２０ｍＭ、ｐＨ５．３のクエン酸緩衝液にＮａＣｌを溶解させたものである。
タンパク質を吸着させたカラムに、この混合液を７．５ｍｌ通すことにより、ＩｇＧモノマーを溶出させた。溶液の流速は５ＣＶ／分とした。
【００６２】
（４）ＩｇＧ凝集体の溶出
その後、カラムに１ＭのＮａＣｌ溶液を７．５ｍｌ通すことにより、ＩｇＧ凝集体を溶出させた。溶液の流速は５ＣＶ／分とした。
【００６３】
［実施例５］
実施例４の（３）において、ＮａＣｌ濃度を１００ｍＭとした以外は、実施例４と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００６４】
［実施例６］
実施例４の（３）において、ＮａＣｌ濃度を１３０ｍＭとした以外は、実施例４と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００６５】
［実施例７］
実施例４の（２）〜（４）において、カラム体積１ｍＬ当たりのタンパク質負荷量を１０ｍｇとした以外は、実施例４と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００６６】
［実施例８］
実施例４の（２）〜（４）において、カラム内におけるタンパク質溶液の流速を２ＣＶ／分とした以外は、実施例４と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００６７】
［実施例９］
実施例４の（２）において、カラム内におけるタンパク質溶液の流速を１０ＣＶ／分とした以外は、実施例４と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００６８】
［比較例１］
アニオン交換基が固定された硬質多孔性高分子自己支持構造物を含むカラム、すなわち、ＢＩＡ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ社製のＣＩＭＭｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＱＡ−１  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔ  ｃｏｌｕｍｎ（厚さ：６ｍｍ、外径：１８．６ｍｍ、内径６．７ｍｍ、長さ：４．２ｍｍ、空隙率：約６０ｖ／ｖ％以上）に、実施例１で用いたものと同様のタンパク質溶液を通液させた。
なお、ＣＩＭＭｕｌｔｕｓ（登録商標）  ＱＡ−１  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔ  ｃｏｌｕｍｎは、グリシジルメタクリレートとエチレングリコールジメタクリレートの共重合体の変性物であり、一部のグリシジルメタクリレートに４級アンモニウム基が保持されている硬質多孔性高分子自己支持構造物である。
しかしながら、ＩｇＧは、カラムに吸着することなく、フロースルーとして回収された。そのため、ＩｇＧモノマーの純度を向上させることができなかった。
【００６９】
［比較例２］
カラムを構成する多孔性高分子ビーズとして、ＧＥヘルスケア社製のＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ（平均粒子径９０μｍ）を用い、カラム内におけるタンパク質溶液の流速を１ＣＶ／分とした以外は、実施例６と同様に実施して、ＩｇＧモノマーを選択的に溶出させた。
【００７０】
［比較例３］
カラムを構成する多孔性高分子ビーズとして、ＧＥヘルスケア社製のＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ（平均粒子径９０μｍ）を用い、カラム内におけるタンパク質溶液の流速が２ＣＶ／分となるようにした以外は、実施例６と同様にして、タンパク質溶液をカラムに注入した。その結果、カラム圧が上昇し、カラム許容圧を超え、運用できなかった。
【００７１】
実施例１〜実施例９および比較例１〜比較例３の各種条件と評価結果を表１に示す。
【００７２】
【表１】
2016210705.tif 000003
【００７３】
表１の結果から、実施例１〜実施例９では、ＩｇＧモノマーの純度が９４％以上であった。
一方、比較例１では、ＩｇＧモノマーの回収率が１００％であるものの、ＩｇＧモノマーの純度が８５％であった。
なお、比較例２では、タンパク質溶液の流速を低い値として、実施例と同程度の回収率、純度を達成した。しかし、多孔性高分子ビーズを用いた比較例３では、許容圧力の観点から、流速を２ＣＶ／分以上に速くすることができなかったため、より高速で分離することができるという点で実施例の態様の方が優れている。
【符号の説明】
【００７４】
１  緩衝液
２  イオン性緩衝液
３  送液ポンプ
４  オートサンプラー
５  分取カラム
６  ＰＤＡ検出器
７  フラクションコレクター
８  分析カラム
【図１】
2016210705.tif 000004
【図２】
2016210705.tif 000005
【図３】
2016210705.tif 000006