(57)【要約】【課題】経皮的免疫に有用な経皮免疫製剤を提供する。【解決手段】本発明の経皮吸収製剤は、基剤表面に抗原もしくは人工合成核酸が積層され、無傷の皮膚への適用によって免疫応答を調節することを特徴とする。典型的な抗原はアレルゲンである。基剤は粘着性を有する親水性ゲルであることが好ましい。特に基剤である親水性ゲルが、ヒアルロン酸、グリセリン、コスモール１３及びＨｉＰＡＳ１０から構成され、これらの重量比がこの順に０．０２：３：４．５：１０であるものが最適であった。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
基剤表面に抗原もしくは人工合成核酸が積層され、無傷の皮膚への適用によって免疫応答を調節することを特徴とする経皮免疫製剤。
【請求項２】
抗原が、アレルゲンである請求項１に記載の経皮免疫製剤。
【請求項３】
アレルゲンが食物アレルゲンである請求項２に記載の経皮吸収製剤。
【請求項４】
食物アレルゲンが牛乳アレルゲンである請求項３に記載の経皮吸収製剤。
【請求項５】
基剤が粘着性を有する親水性ゲルである請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載の経皮免疫製剤。
【請求項６】
親水性ゲルが、アクリル酸メトキシエチル４０〜６０重量％、（メタ）アクリル酸ラウリル３０〜４０重量％及び極性モノマー１０〜２５重量％よりなる共重合体１００重量部、乳酸オクチルドデシル３０〜５０重量部、グリセリン２０〜５０重量部、ヒアルロン酸０．１〜０．５重量部から構成される請求項５に記載の経皮免疫製剤。
【請求項７】
親水性ゲルが、ヒアルロン酸、グリセリン、コスモール１３及びＨｉＰＡＳ１０から構成され、それらの重量比がこの順に０．０２：３：４．５：１０である請求項５に記載の経皮免疫製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、免疫応答を調節するための、経皮的免疫に有用な経皮免疫製剤、その製造方法及びそれを用いた経皮免疫方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  食物アレルギーの治療において、根治を目標にアレルゲン投与による免疫療法が行われている。その投与ルートとしては、皮下注射や舌下あるいは経口が主であるが、有効性と安全性の観点から治療法として未だ確立されていない。例えば経口免疫療法においては、その安全性に問題があり、急速法、緩徐法ともにアレルゲン負荷の増量中ないし維持期に誘発症状が認められ、有害事象発生率は高く、患者に覚悟や決意を促すほどで、現時点では医療に求められる安全性の基準を超えた治療法といえる。また有効性の面においてもアレルゲン負荷を目標値までに増量できない症例が少なからず存在し、患者はその間も誘発症状を繰り返す。増量期だけでなく維持期にも負荷を少なくする必要があるため、増量法の改良では克服できないのが現状である。【０００３】  一方、皮膚の免疫システムを利用した経皮免疫療法は、アレルギー疾患においてはまだ一般的な治療法ではないが、従来の皮下注射法や舌下法、経口免疫療法などに比べて全身性の症状誘発のリスクは低いので、比較的安全で簡便な方法として期待されている。【０００４】  経皮的免疫を成立させるには、抗原が皮膚を通過することと、抗原に対する免疫応答の両方が必要である。抗原は通常１，０００ダルトンよりも大きい高分子物質であり、皮膚を通過することは極めて困難である。そのため、経皮免疫を行うためには、皮膚から角質層を剥離し、角質層を剥離した皮膚に抗原を含んだ製剤を貼付することが行われていた（特許文献１）。しかし、皮膚から角質層を剥離することは抗原投与の手間がかかるばかりでなく剥離部位からの細菌感染などの恐れがあるなどの欠点を有していた。【０００５】  そのため、皮膚から角質層を剥離することなく無傷の皮膚へ貼付し、経皮的免疫が成立する経皮免疫製剤の研究が盛んに行われており、例えば、「１つ以上の抗原とアジュバント成分を含む経皮的免疫のための製剤であって、該成分の少なくとも１つは乾燥型であり、それにより無傷の皮膚への製剤の適用が、抗原に特異的な免疫応答を誘導する製剤及び経皮的免疫のための乾燥製剤の製造であって、（ａ）少なくとも１つの免疫活性成分を提供する工程（ここで製剤は、抗原活性を有する少なくとも１つの免疫活性成分を含有する）；（ｂ）免疫活性成分の少なくとも１つを溶解して、免疫活性液体を作成する工程；（ｃ）包帯等の固体基質上の免疫活性液体を乾燥する工程；そして（ｄ）免疫活性成分を一緒にして製剤を製造する工程を任意の順序で含み、ここで、少なくとも免疫すべき被験体の皮膚に製剤が適用されるまでは、免疫活性成分の少なくとも１つは乾燥型である、上記製造」（特許文献２）が提案されている。【０００６】  無償の皮膚へ適用する経皮免疫製剤はすでに公表されているが、その内容にはいろいろ改善の余地がある（特許文献３）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平１０−３１６５８５号公報
【特許文献２】特表２００３−５２３９３７号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ２００８−１０５５０４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  我々の体を覆っている皮膚は、常に外界からの病原体侵入という危険に曝されている。これに対して生体は、角質層という物理的バリアーと表皮層に存在するランゲルハンス細胞を中心とした免疫バリアーとを備える事で、第一線の防御機構を形成している。従って、角質層を透過させて表皮層に十分な抗原蛋白質を送達させることが出来れば、免疫系の司令塔であるランゲルハンス細胞によって抗原蛋白質が捕捉され、効率良く抗原特異的免疫応答を惹起出来るものと考えられる。しかし、蛋白質等の生体高分子の角質層透過性は極めて乏しく、単に溶液製剤を皮膚に塗布するだけでは、表皮層にまで抗原蛋白質を送達することは出来ない。【０００９】  本発明が解決しようとする課題は、簡便な手法により、角質層を透過させて表皮層にまで抗原蛋白質を送りこむパッチ製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明の経皮免疫製剤は、基剤表面に抗原が積層され、無傷の皮膚への適用によって免疫応答を調節することを特徴とする。
本発明において“調節する”とは正の調節、すなわち免疫系を賦活、促進する調節導と、負の調節、すなわち免疫系を抑制する調節の両方を意味する。【００１１】  本発明は、これまでに我々が感染症予防における効果的な経皮ワクチン製剤、即ち「貼るワクチン製剤」のデバイスとして開発してきた親水性ゲルパッチをアレルギー疾患の経皮免疫療法に適応しようとするものである。【００１２】  経皮免疫製剤は抗原を免疫系の細胞まで運搬し、アジュバンドの助けを必要とせずに免疫応答が誘導されると考えられる。抗原は、皮膚の正常な防御的外層（例えば、角質層）を通過し、直接又はＴリンパ球に、処理した抗原を提示する抗原提示細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、皮膚樹状細胞、Ｂリンパ球、またはクッパー細胞）を介して、免疫応答を誘導する。場合により抗原は、毛嚢または皮膚の小器官（例えば、汗腺、脂腺）を介して角質層を通過してもよい。【００１３】  ここに抗原とは、生物の免疫細胞に提示された時、特異的免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、単一の免疫原性エピトープ又はＢ細胞受容体（即ち、Ｂ細胞の膜上の抗体）若しくはＴ細胞受容体により認識される複数の免疫原性エピトープを含んでよい。【００１４】  上記抗原としては、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される生物を感染することができる病原体由来の抗原、細胞（例えば、腫瘍細胞又は正常細胞）を感染することができる病原体由来の抗原があげられる。
また、抗原としては、腫瘍関連抗原又は自己抗原があげられる。さらに抗原としては、例えば、花粉、動物のふけ、カビ、ほこりのダニ、ノミ抗原、唾液アレルゲン、草、食物（例えば、ピーナツと他のナッツ類）、Ｂｅｔｖ１等のアレルゲンがあげられる。【００１５】  化学的には、抗原は、炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリペプチド又はこれらの化学的または組換え型結合体でもよい。抗原は、組換え手段、化学合成又は天然起源からの精製により得られ、タンパク質性抗原、または多糖との結合体が好適である。抗原は少なくとも部分的に精製された無細胞型である。あるいは抗原は、生きたウイルス、弱毒化した生きたウイルス、または不活性化ウイルスの型で提供される。抗原は、適宜抗原をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）でもよい。【００１６】  抗原の分子量が１，０００ダルトン以下であると親水性高分子物質からなる基剤上に溶液状態で滴下した時内部に吸収されがちであり、抗原が基剤の表面上に充分濃縮されないので、抗原の分子量は１０００ダルトンより大きいことが好ましい。【００１７】  上記基剤は、水及び／又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質により構成される粘着性を有する親水性ゲルが好ましい。上記抗原は水及び／又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁されるので、その水溶液若しくは懸濁液を水及び／又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質からなる基剤に滴下すると親水性高分子物質が水及び／又は含水アルコールを吸収するので基剤表面に濃縮された抗原層が積層される。【００１８】  上記親水性高分子物質としては、例えば、ポリアクリル酸アルコキシアルキル系高分子物質、でんぷん‐アクリル酸グラフト系高分子物質、ポリアクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルアルコール系高分子物質、酢酸ビニル‐アクリル酸塩系高分子物質、ポリビニルピロリドン系高分子物質、イソブチレン‐マレイン酸系高分子物質、Ｎ−ビニルアセトアミド系高分子物質等があげられる。【００１９】  親水性高分子物質は架橋していると、水及び／又は含水アルコールの吸収によって膨潤しても高分子物質の強度の低下は全くないか、あっても少ないので架橋されているのが好ましい。架橋方法は、従来公知の任意の方法が採用されればよく、例えば、公知の多官能性イソシアネート、アルミニウムアセチルアセトネートなどの金属錯体を架橋剤として親水性高分子物質に添加すればよい。【００２０】  基剤は、親水性高分子物質である、アクリル酸メトキシエチル４０〜６０重量％、（メタ）アクリル酸ラウリル３０〜４０重量％及び極性モノマー１０〜２５重量％よりなる共重合体１００重量部と、乳酸オクチルドデシル２〜１５重量部、グリセリン２〜１０重量部、ヒアルロン酸０．０１〜０．１部から構成されるものが好ましい。【００２１】  上記極性モノマーとしては、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、（メタ）アクリル酸、アクリル酸２−ヒドロキシエチル等があげられる。共重合体中のアクリル酸メトキシエチルの含有量は多くなると、重合中にゲル化を起こし不溶性になりやすく、得られた粘着剤の粘着性が低下する傾向がある。又、（メタ）アクリル酸ラウリ���の含有量は少なくなると、得られた粘着剤の粘着性が低下する傾向がある。更に、極性モノマーの含有量は少なくなると、得られた粘着剤の凝集力が低下する傾向があり、多くなると、皮膚に貼付するのに適当な粘着性が得られなくなる傾向があるので、アクリル酸メトキシエチル、（メタ）アクリル酸ラウリル及び極性モノマーの比率は上記範囲が好ましい。乳酸オクチルドデシル、グリセリン及びヒアルロン酸は上記親水性高分子物質の親水性をさらに向上し水の吸収性を高めるとともに皮膚への接着性を良好にして皮膚貼付性を上げる効果を有するものであり、少量では効果が小さく多量になると親水性高分子物質が柔らかくなりすぎて実用性が低下するので上記範囲が好ましい。【００２２】  本発明の経皮免疫製剤は基剤表面に抗原層が積層されているが、基剤の厚さは特に限定されないが、薄すぎると抗原の水及び／又は含水アルコール水溶液若しくは懸濁液の水及び／又は含水アルコールを充分に吸収できなくなり、厚すぎると柔軟性が失われて皮膚への接触性が低下するので２０〜５，０００μｍが好ましく、より好ましくは５０〜２，０００μｍである。基材の形状は特に限定されるものではないが、パッチ状であるのが好ましい。又、基剤及び抗原層の表面には、離型シートやポリエチレンフィルム、ポリプロピレンフィルム、ポリエチレンテレフタレートフィルム、ウレタンフィルム等の支持フィルムが積層されていてもよい。【００２３】  上記基剤は、水及び／又は含水アルコールの吸収性を向上させるために親水性高分子物質と相溶する可塑剤を含有することが好ましい。可塑剤は親水性であればよく、液体可塑剤が好ましく、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、乳酸ドデシルオクチル、ソルビタンモノオレート、ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート等があげられる。【００２４】  又、上記基剤は抗原の経皮吸収を促進させるために、化学吸収促進剤を含有するのが好ましい。上記化学的吸収促進剤は、従来公知の任意の化学的吸収促進剤が使用可能であり、例えば、メンソール、カンフル、セチルアルコール等のアルコール類；パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸イソプロピル等の脂肪酸エステル；モノラウリン酸グリセリン、モノオレイン酸グリセリン等のグリセリンエステル；ラウリン酸ジエタノールアミド等の酸アミド；ポリエチレングリコールジラウリルエーテル等の中性界面活性剤などがあげられる。化学的経皮吸収促進剤の添加量は、少なすぎると経皮吸収効果が向上せず、多すぎると基剤の粘着性が低下するので、基剤１００重量部に対して３〜４０重量部が好ましい。【００２５】  更に、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等の酵素を基剤中に含有させることによりそれらの酵素が皮膚角質層に作用し、抗原の経皮透過を更に促進することができる。プロテアーゼとしては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、エンドプロテナーゼ、プロナーゼ等が挙げられ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン及びコラゲナーゼがあげられる。リパーゼは動物すい臓から抽出精製して使用できるが、市販品を用いてもよい。【００２６】  本発明の経皮免疫製剤はアジュバンドを含有する必要はないが、抗原層又は基剤がアジュバンドを含有していてもよい。アジュバントとは、抗原に対する免疫応答の誘導を助ける物質であり、ある物質が、免疫刺激及び特異的抗体応答またはＴ細胞応答を誘導することにより、アジュバント及び抗原の両方として作用することがある。【００２７】  経皮免疫製剤は、抗原を水及び／又は含水アルコールに溶解若しくは懸濁させた水溶液若しくは懸濁液を、基剤表面に滴下し、水及び／又は含水アルコールを基剤中に吸収させることにより製造できる。抗原は基剤表面に濃縮され抗原層を形成する。【００２８】  抗原を溶解若しくは懸濁させる水又は含水アルコールとしては、水、水を含有するメタノール、エタノール等のアルコールあるいはこれらの緩衝液を好適に用いることができる。緩衝液としては、例えば、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋の無リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、正常な食塩水（１５０ｍＭＮａＣｌ水溶液）、トリス緩衝液等があげられる。【００２９】  抗原は、一般に水又は含水アルコール及びその緩衝液に溶解しない抗原は、１０ｍＭの酢酸で可溶化し、次に中性の水、含水アルコール、緩衝液で所望の容量に希釈すればよい。また、酸性ｐＨでのみ溶解する抗原は、希酢酸で可溶化した後、酸性ｐＨで酢酸−ＰＢＳを希釈剤として希釈すればよい。抗原がそれ自体不溶性である疎水性抗原（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、膜を横切るドメインを含有するポリペプチド等）は界面活性剤で懸濁化してもよい。【００３０】  次に、得られた水溶液若しくは懸濁液を、前記基剤表面に滴下し、水又は含水アルコールを基剤中に吸収させる。上記基剤は水及び／又は含水アルコールを吸収し膨潤する親水性高分子物質からなるので、水溶液若しくは懸濁液中の水及び／又は含水アルコールは容易に基剤（親水性高分子物質）に吸収され、基剤（親水性高分子物質）表面に抗原が取り残され濃縮した抗原層が形成される。【００３１】  上記経皮免疫製剤の無傷の皮膚への適用する前に、抗原の経皮透過を促進するために無傷の皮膚を酵素処理するのが好ましい。酵素としては、前述のプロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等の酵素があげられる。酵素処理方法は、特に限定されるものではなく、例えば、酵素を適当なｐＨに調整した精製水等に溶解させた酵素水溶液を皮膚部位に適用する方法があげられる。その際、酵素水溶液をろ紙やその他多孔質単体にしみ込ませて適用すると実用上便利である。
異なる酵素処理方法として、酵素を軟膏基剤に溶解させた酵素軟膏を皮膚に適用する方法、水性ゲル中に酵素を溶解させた酵素入り水性ゲルを皮膚に貼付する方法があげられる。
【発明の効果】
【００３２】  現在のアレルゲン免疫療法は、アレルゲンの皮下注射、舌下投与あるいは経口投与が主であるが、発明が解決しようとする課題欄に記載した問題点を有している。さらに注射によるアレルゲン投与は痛みを伴うばかりでなく、投与局所の腫脹や発熱といった副作用の問題を孕んでいる。それに対して、親水性ゲルパッチを用いた経皮アレルゲン免疫療法では、従来の方法に比べて安全性並びに有効性の面で優れている可能性があり、また投与の簡便性および低コストと言った利点を有しており、患者のＱＯＬ向上を達成できる治療法になり得る。また、本発明は食物アレルギーの治療に留まらず、他のアレルギー疾患全般並びに自己免疫疾患などに対する新たな治療法の開発に応用できると予想される。【００３３】  本発明の方法により、濃縮された抗原層を有する経皮免疫製剤を容易に製造方法することができ、本発明の経皮免疫方法により皮膚が炎症を起こしたりすることなく免疫系のバランスを予防・治療に有利なように変更することが出来る。本発明の経皮免疫製剤の構成によれば、アジュバントを含まなくても免疫活性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】経皮アレルゲン免疫療法の結果の図
【発明を実施するための形態】
【００３５】  基剤としては、粘着性を有する親水性ゲルが好ましい。
【００３６】  抗原蛋白質溶液を親水性ゲルに浸み込ませて、このパッチ製剤をマウスの耳介皮膚に貼付するという極めて簡便な手法により、角質層を透過させて表皮層にまで抗原蛋白質を送りこむことができ、抗原特異的抗体産生を誘導出来る事を明らかにした（図１参照）。
またこの抗原特異的抗体産生については、アレルギーの悪化につながるＩｇＥの産生については、注射による投与と同等であったことから（図１参照）、少なくともアレルゲンが血液中に入り、アナフィラキシーショックを起こす恐れのある皮下注射法よりも安全に適用出来ると予想される。さらにこれまでの基礎研究をベースに、破傷風・ジフテリアトキソイドを含有した親水性ゲルパッチについて、ヒトでの安全性・有効性を評価する臨床研究を行ったところ、重篤な副反応を示すことなく、各トキソイドに対する抗体価が上昇することを明らかにしている。即ち本親水性ゲルパッチは、ヒトに対しても安全に適応することが出来、且つアレルゲンを皮膚内にデリバリー出来ることから、皮下注射法よりも優れたアレルゲン免疫療法を可能にするものであり、安全・安心な社会の実現に貢献するコアテクノロジーとなる可能性を有する。
【００３７】  本発明は、独自に開発した親水性ゲルパッチを用いてアレルゲンを経皮的に生体内に送達し、表皮層に存在するランゲルハンス細胞にアレルゲンを捕捉・認識させることによって、抗原特異的免疫応答を効率よく惹起させ、アレルゲンに対する耐性を獲得しようとするものである。ランゲルハンス細胞は免疫系の司令塔として機能する抗原提示細胞であり、皮膚から生体に侵入してきた病原体を捕捉して近傍のリンパ節へと移動し、抗原情報を免疫エフェクター細胞に伝達する。このランゲルハンス細胞の本来的な免疫学的機能を標的として経皮アレルゲン免疫療法を行うには、アレルゲンが皮膚最外層の物理的バリアーである角質層を突破する必要があり、親水性ゲルパッチの適用はアレルゲンの局所的な濃度を高く保つことによって角質層下の皮膚組織へと送達することを可能にする。
【００３８】  本発明の実施例を以下に示すが、本発明は実施例に限定されるわけではない。
【実施例１】
【００３９】（基剤の組成の最適化）
最適の基剤組成を得るため、次の組成と混合重量比を有する５種の基剤を作製した。
基剤１：ヒアルロン酸：グリセリン：コスモール１３：ＨｉＰＡＳ１０＝０．０２：３：４．５：１０。
基剤２：ヒアルロン酸：グリセリン：コスモール１３：ＨｉＰＡＳ１０＝０．００２：０．４：０．４：１０。
基剤３：ＨｉＰＡＳ１０（コスメディ製薬製医用粘着剤）。
基剤４：ＤＴ２２８７（ナショナルスターチ製医用粘着剤）。
基剤５：ＭＡＳＣＯＳ１０（コスメディ製薬製医用粘着剤）。
これらの基剤はいずれも適切な粘着性を有する。
なお、ＨｉＰＡＳ１０（コスメディ製薬製）は親水性アクリル系の接着剤で、優れた薬剤保持特性を有し、オイルゲル化が可能であり、酸性および中性薬剤に適当な基剤である。ＨｉＰＡＳ１０は、酢酸エチル中でアゾビスイソブチロニトリルを触媒として、アクリル酸メトシキエチル４３．９重量％、アクリル酸ラウリル３６．７重量％、ビニルピロリドン６．１重量％、アクリル酸３．１重量％及びヒドロキシエチルアクリレート１０．２重量％を混合し重合させて得られる。【００４０】  ポリエチレンテレフタレート表面に上記５種の基剤の溶液を乾燥後の基剤層の厚さが１００μｍになるように塗布し、１００℃において５分乾燥し粘着性フィルムを得た。表面を上に固定し、水１００μｌを静かに滴下し、１０分後の滴下水の挙動を観察した
基剤１：水滴が表面濡れにより広がり直径２．３ｃｍとなった
基剤２：水滴はほとんど広がらず直径は０．７ｃｍであった
基剤３：水滴はわずかに縮まり直径は０．６ｃｍであった。
基剤４、基剤５：水滴が縮まり直径は０．５ｃｍ以下であった。【００４１】  基剤１はＨｉＰＡＳ１０が親水性粘着剤であり、しかもグリセリン、コスモール１３等の親水性物質を多量に溶解させたので水との親和性が著しく高い。水との親和性が高いと、抗原水溶液を表面に滴下した時、水分は速やかに基剤中に吸収され、抗原は基剤表面に保持される。すなわち抗原は濃縮されて安定化し、皮膚に貼付したとき抗原が皮膚にスムースに移行できる。
よって、基剤１が最適と結論できる。
【実施例２】
【００４２】  食物アレルギーに対する経皮アレルゲン免疫療法製剤を開発した。
（ＯＶＡの免疫）
ＰＢＳで調製したＯＶＡ溶液を１００μｇ／１０μｌで基剤１のパッチ（１×２ｃｍ２）に吸収させ、室温下でパッチ表面を乾燥させた。このようにして調製したＯＶＡ含有パッチを、マウス耳介皮膚に２４時間、２週間隔で３回貼付した。また、１００μｇのＯＶＡをマウス耳介皮膚に２週間隔で３回皮内免疫し、これを対照群とした。【００４３】（各サンプルの回収）
最終免疫より２週間後に、各サンプルを回収した。血清はヘマトクリット毛細管を用いてマウスの尾静脈より回収した血液を５，０００ｒｐｍで１５分間遠心することで得た。【００４４】（抗体価）
ＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ５０ｍＭ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅに分注し、４℃で一晩放置することで固相化した。固相化したｐｌａｔｅにＰＢＳで２倍希釈したブロックエースを２００μｌ／ｗｅｌｌで加えブロッキングした（３７℃、２時間）。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０／Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＴＢＳ）で１回洗浄後、各濃度に調製したサンプルを加え室温で２時間反応させた。その後ＴＴＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（５０００倍希釈）、ＩｇＧ１（５０００倍希釈）、ＩｇＧ２ａ（２０００倍希釈）を各５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した。室温で２時間反応させた後、ＴＴＢＳで３回洗浄し、ＨＲＰ基質溶液を１００μｌ／ｗｅｌｌで添加した。１５分後、２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ加えることにより反応を停止させ、吸光波長４５０ｎｍ、副波長６５５ｎｍにおける吸光度を測定した。抗体価は非免疫マウスよりも吸光度が０．１以上高い最大希釈倍率をＲｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｌｏｇ２  ｔｉｔｅｒで表した。なお、サンプル、抗体の希釈はＴＴＢＳで１０倍希釈したブロックエースで行った。また、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の産生量はＭｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＯＶＡ  ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔを用いて測定した。【００４５】  測定結果を図１に示す。本発明の親水性ゲルパッチ法は従来の注射法と大差がない効果を示している。
【図１】
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