(57)【要約】【課題】  本発明は、従来よりも反応性が向上した新規のタグペプチドとして用いることができるペプチド及び該ペプチドを用いたタンパク質の精製・検出方法を提供することを目的とする。【解決手段】  配列番号１に記載のアミノ酸配列又はそのうちの１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を含むことを特徴とするオリゴペプチドを付加したタンパク質を、前記オリゴペプチドと結合する物質と結合させ、次いで遊離させてタンパク質を精製する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のアミノ酸配列又はそのうちの１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を含むことを特徴とする、オリゴペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質を、前記オリゴペプチドと結合する物質と結合させ、次いで遊離させることを特徴とする、タンパク質の精製方法。
【請求項３】
請求項１に記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質を、前記オリゴペプチドと結合する物質と結合させ、得られた結合物を検出することを特徴とする、タンパク質の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴペプチド及びタンパク質の精製・検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的にタンパク質を作製する場合は、タグペプチドとよばれるペプチドをタンパク質に融合させ、そのペプチドと結合する物質（例えば抗体など）で精製・検出・固定化を行なう方法が知られている。
【０００３】
従来から知られているタグペプチドの例として、ＦＬＡＧタグ（特許文献１及び２）、Ｍｙｃタグ（非特許文献１）、Ｈｉｓが６個結合したＨｉｓタグ（特許文献３及び４）、Ｅタグ、ＨＡタグ、Ｔ７タグ、Ｐｋタグ、ＨＳＶタグ、ＶＳＶ−Ｇタグなどの、正常細胞内には本来存在しない、ウイルス、ファージ、癌遺伝子由来のタンパク質の部分領域や、同じアミノ酸配列の繰り返しからなる、１０アミノ酸程度のペプチドがあげられる。前述の９種類のタグペプチドの中で、ＦＬＡＧタグは高性能なタグとして知られている。しかしながら、近年の実験の高感度化に伴い、反応性がさらに向上したタグペプチドが要求されている。
【０００４】
一方、ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（以下、ｈＢＮＰとする）の一部のアミノ酸配列をタグペプチドとして用いた例は知られているが（特許文献５、６）、ｈＢＮＰのＣ末端部分やリング状部分をタグとして用いるものであった。また従来、ヒトＣペプチドの一部の配列をタグペプチドとして用いた例はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第４７０３００４号明細書
【特許文献２】特許第２６６５３５９号公報
【特許文献３】特開昭６３−２５１０９５号公報
【特許文献４】米国特許第５３１０６６３号明細書
【特許文献５】国際公開第２０１１／０７１０２１号パンフレット
【特許文献６】特開２０１２−１４０３３１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】東ソー研究報告、５２、３−９（２００８）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
一般的にタグペプチドはタンパク質のＮ末端又はＣ末端に導入することが多い。Ｃ末端にタグペプチドを導入することで、Ｃ末端まで翻訳が完結し、プロテアーゼなどでＣ末端が切断されていないタンパク質のみを検出することができることから、比較的よく利用されている。しかし、シグナルペプチドが本来の位置で切断され、タンパク質のＮ末端が分解されていないかを判断できるようなＮ末端に導入できるタグペプチドは、ＦＬＡＧペプチド以外は知られていない。ＦＬＡＧペプチドは分泌シグナルの直下に結合され、シグナルペプチドが切断されると、Ｎ末端にＦＬＡＧのエピトープが出現する。そのＮ末端アスパラギン酸のαアミノ基がフリーであることを要求するモノクローナル抗体（Ｍ１）によりタンパク質のＮ末端を検出することができる。この抗体は、シグナルペプチドが切断される前のフラグメントには結合せず、またシグナルペプチドが切断された後のタンパク質から、Ｎ末端のアミノ酸が欠失した場合も結合しない。つまり、ＦＬＡＧペプチドは、シグナルペプチドの切断がうまく行き、Ｎ末端の欠失がおこっていないフラグメントのみを検出することができる特徴があるタグである。しかし、発現させるタンパク質の種類によっては、ＦＬＡＧペプチドが発現しにくい場合もあるため、Ｎ末端タグペプチドとして利用できる高性能な他のタグペプチドが求められていた。
【０００８】
本発明は、従来よりも反応性が向上した新規のタグペプチドとして用いることができるペプチド及び該ペプチドを用いたタンパク質の精製・検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者はペプチドの安定性の観点から、通常生体内に安定に存在するペプチドのなかから、ＣペプチドのＮ末端の配列をタグペプチドとして使用するという考えに到達した。
【００１０】
即ち本発明は以下のとおりである。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列又はそのうちの１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を含むことを特徴とするオリゴペプチド。
（２）前記（１）に記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質を、前記オリゴペプチドと結合する物質と結合させ、次いで遊離させることを特徴とする、タンパク質の精製方法。
（３）前記（１）に記載のオリゴペプチドを付加したタンパク質を、前記オリゴペプチドと結合する物質と結合させ、得られた結合物を検出することを特徴とする、タンパク質の検出方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明のオリゴペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列又はそのうちの１つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を含むものであり、そのＮ末端及び／又はＣ末端に更にアミノ酸が付加されたものであってもよい。配列番号１に記載のアミノ酸配列はヒトＣペプチドの１−５位（以下ＣＰＮと記載する場合がある）に相当するものである。
【００１２】
本発明のオリゴペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうちの一つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を含むものであってもよい。他のアミノ酸への置換は、公知の部位特異的変異導入法を用いて、親和性及び特異性を確認しながら実施すればよい。このような本発明のオリゴペプチドとして、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＣＰＮを構成するアミノ酸のうち一つのアミノ酸を他のアミノ酸に置換したオリゴペプチド（以下、一置換ＣＰＮとする）があげられる。この一置換ＣＰＮの置換位置および置換アミノ酸の一覧を表１に示した。また、一置換ＣＰＮで得られたいくつかの変異を組み合わせることで、さらに性能を向上させることも可能である。
【００１３】
【表１】
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本発明のオリゴペプチドは、タグペプチドとして有用である。タグペプチドは、それを付加した物質に与える影響を少なくするために、アミノ酸の長さが短く、かつ、タグペプチドに対する特異性及び反応性の高い物質が存在することが要求されるが、本発明のタグペプチドは、これを満たすものである。
【００１４】
本発明のオリゴペプチドは、タグペプチドとしてタンパク質のＮ末端にもＣ末端にもまた配列の途中にも導入することができ、特にシグナルペプチド切断部位の直下に配置することができる。そのため、特にＮ末端に導入されるタグペプチドとして利用できる。シグナルペプチドとしては通常使用されているものを用いることができ、例えば抗体のＨ鎖やＬ鎖のシグナルペプチドが挙げられる。
【００１５】
本発明のオリゴペプチドをタグペプチドとして利用する際には、本発明のオリゴペプチドと結合する物質を使用する。その一例として抗体をあげることができ、例えばモノクローナル抗体・ポリクローナル抗体・抗血清が例示できるが、ロット間差を考慮する必要のないモノクローナル抗体が好ましい。
【００１６】
本発明のオリゴペプチドと結合する抗体の単離方法は通常のペプチド抗体を単離する方法と基本的には変わらない。ただし、本発明のオリゴぺプチドをタンパク質のＮ末端に導入してタグとして用いる場合には、本発明のオリゴペプチドのＮ末端のみに結合できる抗体を単離することが必要である。同様に、本発明のオリゴぺプチドをタンパク質のＣ末端に導入してタグとして用いる場合には、本発明のオリゴペプチドのＣ末端のみに結合できる抗体を単離することが必要である。さらに同様に、本発明のオリゴぺプチドをタンパク質のアミノ酸配列の途中に導入してタグとして用いる場合には、本発明のオリゴペプチドの当該部位のみに結合できる抗体を単離することが必要である。
【００１７】
本発明のオリゴペプチドを利用することで、タンパク質をアフィニティー精製することができる。アフィニティー精製は、本発明のオリゴペプチドを付加したタンパク質を前記オリゴペプチドと結合する物質と結合させ、次いで遊離させるものであり、このとき、本発明のオリゴペプチドと結合する物質を適当な担体に固定化して用いてもよく、このとき本発明のオリゴペプチドと結合する物質は、本発明のオリゴペプチドを付加したタンパク質との結合性を保持した状態で固定化させればよい。本発明のオリゴペプチドを付加したタンパク質は、本発明のオリゴペプチドと結合する物質と結合させた後、遊離させるが、その方法には特に限定はなく、例えばｐＨを変化させて遊離させればよいが、ｐＨ変化に対して不安定なタンパク質を精製する場合は、使用した本発明のオリゴペプチドを大過剰添加して遊離させてもよい。
【００１８】
本発明のオリゴペプチドをタンパク質に付加する方法としては特に限定はなく、例えば遺伝子工学的方法で付加する方法があげられる。具体的には、発現させるタンパク質のポリヌクレオチドに本発明のオリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加すればよい。その際、両者を直接付加してもよいし、相互作用を避けるための任意のリンカーを介して付加してもよい。
【００１９】
タンパク質に本発明のオリゴペプチドを付加する別の方法として、化学的に付加する方法があげられる。例えば、タンパク質とＳＭＣＣ（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）などの試薬とを反応させることで前記タンパク質にマレイミド基を導入後、本発明のオリゴペプチドと反応させて、化学的に導入する方法があげられる。タンパク質と本発明のオリゴペプチドとの結合方法にはこれ以外にも、例えば、ポリエチレングリコールやポリエチレンイミンなどの高分子を介して付加してもよいし、マレイミド基以外の官能基を介して化学的に付加してもよい。マレイミド基以外の官能基としては、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）、ヒドラジド（ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）、ヒドロキシメチルホスフィン（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）、イミドエステル（ｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）、イソシアネート（ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ）、ブロモアセテート（ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ）、ＮＨＳエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ）、ピリジルジスルフィド（ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）、ソラレン（ｐｓｏｒａｌｅｎ）等があげられる。
【００２０】
一方、本発明のオリゴペプチドを付加したタンパク質を、前記オリゴペプチドと結合する物質と結合させ、それをウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫沈降、免疫組織化学、表面プラズモン共鳴分析等の各種手法により検出することにより、タンパク質を検出することができる。
【００２１】
免疫測定試薬でしばしば問題になるのは、異好性抗動物抗体である。たとえば、ウサギ由来ポリクローナル抗体（抗原認識）と抗ウサギ抗体（水不溶性担体に固定化）とが反応系の中に含まれる場合、測定検体の中に抗ウサギ抗体が存在すると、検体中の抗ウサギ抗体により、本来想定している量のウサギ由来ポリクローナル抗体が水不溶性担体に捕捉されなくなり、正確な測定値が得られなくなってしまう。そこで、ウサギポリクローナル抗体に本発明のオリゴペプチドを付加し、水不溶性担体に本発明のオリゴペプチドを認識する抗体を固定化することで、異好性抗動物抗体の影響をなくした測定系が構築できる。
【００２２】
本発明のオリゴペプチドは、前述したタンパク質の精製・検出のほかに、タンパク質を担体へ固定化する目的で使用することもできる。タンパク質を水不溶担体に直接固定化すると、立体構造の変化がおきやすく、活性が失われる場合が多い。そこで、本発明のオリゴペプチドと結合する物質を水不溶性担体に固定化し、それとタンパク質に付加した本発明のオリゴペプチドを結合させることにより、タンパク質を立体構造の変化がおきにくい状態で固定化することができる。
【発明の効果】
【００２３】
本発明のオリゴペプチドは、タグペプチドとして、特にＮ末端タグペプチドとして有用であり、従来知られているＦＬＡＧタグと比較して、タグペプチドに結合する物質との反応性を向上させることができる。本発明のオリゴペプチドによれば、非常に短いアミノ酸配列からなるペプチドに対しても、タグペプチドとして使用することができ、付加するペプチドやタンパク質への影響をより低減することができると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例３で、モノクローナル抗体とＣＰＮタグとの結合性を示す図である。
【図２】実施例４で、Ｃ３２−１２７抗体の認識部位を解析した図である。
【図３】実施例５で、Ｃ３２−１２７抗体のエピトープの長さを解析した図である。
【図４】実施例６で、ＣＰＮタグとＨｉｓタグとの反応性を比較した図である。
【図５】実施例８で、反応性の変化を比較する原理図である。
【図６】実施例８で、１番目のアミノ酸に変異を導入した結果を示す図である。
【図７】実施例８で、２番目のアミノ酸に変異を導入した結果を示す図である。
【図８】実施例８で、３番目のアミノ酸に変異を導入した結果を示す図である。
【図９】実施例８で、４番目のアミノ酸に変異を導入した結果を示す図である。
【図１０】実施例８で、５番目のアミノ酸に変異を導入した結果を示す図である。
【実施例】
【００２５】
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示すが、これら実施例は本発明の一例を示すものであり、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００２６】
［実施例１］タグペプチドを付加したタンパク質の調製
タグペプチドとして、配列番号１からなるＣＰＮを使用した。タグペプチドを付加するタンパク質として、ウサギより単離されたエストラジオールを認識する抗体（以下、抗Ｅ２抗体と略す）（非特許文献１）を使用した。まず、抗Ｅ２抗体の重鎖遺伝子をコードする動物細胞発現用ベクターに、タグペプチドをコードする遺伝子配列を挿入した。ＣＰＮタグをコードする遺伝子は、抗Ｅ２抗体を動物細胞で発現させた際、抗Ｅ２抗体の重鎖ポリペプチドのＮ末端にタグペプチドが付加されるように挿入した。遺伝子挿入はＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（東洋紡績社製）を用いて行なった。得られたタグペプチド付加型抗Ｅ２抗体重鎖遺伝子と抗Ｅ２抗体軽鎖遺伝子を遺伝子導入装置にてチャイニーズハムスター卵巣細胞株に遺伝子導入し、その培養上清中にＣＰＮタグを付加した抗Ｅ２抗体（以下、ＣＰＮタグ結合抗Ｅ２抗体とする）を得た。
【００２７】
［実施例２］ＣＰＮタグを認識する抗体の単離
ＣＰＮを認識する抗体を以下の方法で単離した。
【００２８】
（１）免疫用コンジュゲ−ト液の作製
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＣＰＮを含むペプチドは、業者にペプチド合成を依頼して得た。配列番号２に記載のペプチド溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で溶解したもの）と、マレイミド活性化ＫＬＨ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳで溶解したもの）を、体積比１：１で混和し、室温で２時間撹拌して反応させた。その後、反応液をＰＢＳに対して２日間４℃で透析することにより、免疫用コンジュゲート液を得た。
【００２９】
（２）免疫
上述の免疫用コンジュゲート液（１ｍｇ／ｍｌ）とフロイントの完全アジュバントを等量ずつ混合して乳濁液とし、これをマウス（雌、６週令）の腹腔内に０．１ｍｌずつ１週間間隔で計４回注射した。マウス１匹１回当たりのコンジュゲ−ト投与量は５０μｇであった。更に最終免疫の１週間後に、ブ−スタ−として免疫用コンジュゲート液をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したもの（０．１ｍｌ）を腹腔内に投与した。
【００３０】
（３）細胞融合
ブ−スタ−免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出し、赤血球溶解バッファーにて赤血球を破壊した。残った細胞をＥ−ＲＤＦ培地に懸濁して細胞融合に用いる脾リンパ球とした。次に同じくＥ−ＲＤＦ培地に懸濁したミエローマ細胞０．４×１０７個を脾リンパ球１．６×１０７個と混合し、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去した。細胞沈殿物をマンニトール緩衝液（２５０ｍＭ  マンニトール、１００ｍＭ  塩化カルシウム、１００ｍＭ  塩化マグネシウム）に懸濁し、電気的細胞融合を行なった。電気的細胞融合を行なった細胞懸濁液をＨＡＴ培地（１００μＭ  ヒポキサンチン、０．４μＭ  アミノプテリン、１６μＭ  チミジンを含むＧＩＴ培地）２００ｍｌに懸濁し、３８４ウエル細胞培養プレ−ト１０枚の各ウエルに０．０５ｍｌずつ分注した。約７日後にはハイブリド−マの増殖が認められた。得られたハイブリドーマの中で、ＣＰＮと結合し、配列番号３のアミノ酸配列には結合しない、ＣＰＮと特異的に結合する抗体（以下、ＣＰＮ認識モノクローナル抗体とする）を産生するハイブリドーマが得られた。各ハイブリドーマから得られたＣＰＮ認識モノクローナル抗体をそれぞれＣ３２−１０、Ｃ３２−２４、Ｃ３２−４７、Ｃ３２−１２７、Ｃ３２−１５０、Ｃ３２−１６４とした。
【００３１】
［実施例３］ＣＰＮのタンパク質検出用タグとしての評価
実施例２で得られたＣＰＮ認識モノクローナル抗体を用いて、ＣＰＮタグを付加したタンパク質の検出が可能か評価した。
【００３２】
抗ウサギ抗体をＥＬＩＳＡプレートに１μｇ／ウエルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。ウエルを洗浄後、実施例１で得られたＣＰＮタグ結合抗Ｅ２抗体を含む培養上清をＰＢＳで３倍希釈して、当該溶液１００μＬをウエルに添加して反応させた。コントロールとして、タグがついていない以外は配列が同じ抗Ｅ２抗体を１マイクログラム反応させた。ウエルを洗浄後、実施例２で得られたハイブリドーマを培養し得られたＣＰＮ認識モノクローナル抗体を１μｇ／ｍｌになるように希釈し、１００μｌ添加し反応させた。ウエルを洗浄後、市販の抗マウス抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートをウエルに添加し、１時間反応させた。反応後、定法に従いアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図１に示す。ＣＰＮタグ結合抗Ｅ２抗体が存在する場合だけ有意にシグナルが高いことから、ＣＰＮ認識モノクローナル抗体がＣＰＮタグ結合抗Ｅ２抗体と特異的に結合できることを確認した。
【００３３】
［実施例４］ＣＰＮ認識モノクローナル抗体の認識部位の決定
実施例２で得られたハイブリドーマより取得した、ＣＰＮ認識モノクローナル抗体のうち、Ｃ３２−１２７についてエピトープ分析を下記の方法で行なった。
【００３４】
ストレプトアビジンを０．５μｇ／ｍｌとなるように固相化用緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で希釈し、１００マイクロリットルを９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを室温で１時間反応し、ストレプトアビジンをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温で反応することで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。
【００３５】
該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で１回洗浄した後、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで、Ｃ末端がビオチン化されたペプチド（配列番号４）を０．１μｇ／ｍｌになるように希釈したものを１００マイクロリットル添加した。室温で１時間反応させた後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。その後、各種配列のペプチドを１０μｇ／ｍｌで共存させた状態で、０．１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ｃ３２−１２７を室温で１時間反応させた。共存させたペプチドの配列は、配列番号３（ヒトＣペプチドのマイナス２−８位に相当）、配列番号５（ヒトＣペプチドの１−１０位に相当）、配列番号６（ヒトＣペプチドの２−１１位に相当）、配列番号７（ヒトＣペプチドの３−１２位に相当）、配列番号８（ヒトＣペプチドの５−１４位に相当）である。その後、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した後、ＡＬＰ標識された抗マウス抗体を添加した。室温で１時間反応させた後、該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄し、４−ＭＵＰ溶液（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ４−ＭＵＰ）を添加し、３０分間室温でインキュベートした。該ＥＬＩＳＡプレートの蛍光強度（励起波長３６０ｎｍ、発光波長４６５ｎｍ）をプレートリーダーで測定した。結果を図２に示す。この結果から、配列番号５のアミノ酸配列（ヒトＣペプチドの１−１０位に相当）がモノクローナル抗体Ｃ３２−１２７のエピトープであることが分かった。
【００３６】
［実施例５］モノクローナル抗体Ｃ３２−１２７の認識部位の確認（エピトープの長さ）
ストレプトアビジンを０．５μｇ／ｍｌとなるように固相化用緩衝液（１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で希釈し、１００マイクロリットルを９６ウエルのＥＬＩＳＡプレートに添加した。これを１時間室温で反応し、ストレプトアビジンをＥＬＩＳＡプレートに固相化した。該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液（２０ｍＭ  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した後、１％スキムミルクを含むＰＢＳを添加し、１時間室温で反応することで該ＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした。
【００３７】
該ＥＬＩＳＡプレートを洗浄用緩衝液で１回洗浄した後、０．１％スキムミルクを含むＰＢＳで、Ｃ末端がビオチン化されたペプチド（配列番号４）を０．１μｇ／ｍｌになるように希釈したものを１００マイクロリットル添加した。室温で１時間反応させた後、洗浄用緩衝液で３回洗浄し各種配列のペプチドを１０μｇ／ｍｌで共存させた状態で、０．１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体Ｃ３２−１２７を室温で１時間反応させた。共存させたペプチドの配列は、配列番号５（ヒトＣペプチドの１−１０位に相当）、配列番号９（ヒトＣペプチドの１−９位に相当）、配列番号１０（ヒトＣペプチドの１−８位に相当）、配列番号１１（ヒトＣペプチドの１−７位に相当）、配列番号１２（ヒトＣペプチドの１−６位に相当）、配列番号１（ヒトＣペプチドの１−５位に相当）、配列番号１３（ヒトＣペプチドの１−４位に相当）である。その後、実施例４と同様にして検出した。結果を図３に示す。この結果モノクローナル抗体Ｃ３２−１２７のエピトープは、配列番号１（ヒトＣペプチドの１−５位に相当）であることわかった。
【００３８】
［実施例６］従来のタグペプチドとの性能比較
タグペプチドとして従来から広く利用されているＨｉｓタグ（Ｈｉｓが６つ連続した配列）との性能を比較した。
【００３９】
ストレプトアビジンを０．５マイクログラム／ｍｌの濃度で１００マイクロリットルＥＬＩＳＡプレートに固定化した。その後、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液で１時間ブロッキングした。洗浄後、Ｎ末端がビオチン化された配列番号１４のペプチド（Ｃ末端がＨｉｓタグに相当）又はＣ末端がビオチン化された配列番号４のペプチド（Ｎ末端がＣＰＮ、即ち本発明のオリゴペプチドに相当）の３倍希釈列を反応させた。その後、Ｎ末端がビオチン化された配列番号１４のペプチドの場合は抗ヒスタグ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製  ｃｌｏｎｅ  ＢＭＧ−Ｈｉｓ−１）を、Ｃ末端がビオチン化された配列番号４のペプチドの場合はＣ３２−１２７を１ｕｇ／ｍｌの濃度で反応させた。その後市販の抗マウス抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲートをウエルに添加し、１時間反応させた。反応後、定法に従いアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図４に示す。図４に示すように、本発明のＣＰＮ−タグは通常使用されるＨｉｓタグよりも高感度に検出された。
【００４０】
［実施例７］ＣペプチドのＮ末端の配列（ＣＰＮ）の一置換体を結合させた抗体の調製
一置換ＣＰＮの結合性能を評価するため、一置換ＣＰＮを結合させた抗体を調製した。
（１）遺伝子工学的手法で、重鎖（Ｈ鎖）Ｎ末端側に直接ＣＰＮが結合した遺伝子組み換え型ウサギ抗エストラジオールモノクローナル抗体（以下、ＲａＭｏＡｂ）を発現可能なベクターを調製した。
（２）（１）で調製したベクターのうち、ＲａＭｏＡｂのＨ鎖Ｎ末端側に結合させたＣＰＮをコードするオリゴヌクレオチドに対し、ＫＯＤ−ＰＬＵＳ−ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（東洋紡績社製）を用いて表１に記載の変異を導入することで、Ｈ鎖Ｎ末端側に直接一置換ＣＰＮが結合したＲａＭｏＡｂを発現可能なベクター９５種を調製した。
（３）（１）で調製したベクターを用いてＨ鎖Ｎ末端側に直接ＣＰＮが結合したＲａＭｏＡｂ（以下、ＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮ）を、（２）で調製したベクターを用いてＨ鎖Ｎ末端側に直接一置換ＣＰＮが結合したＲａＭｏＡｂ（以下、ＲａＭｏＡｂ−ｍＣＰＮ）を、それぞれ培養上清に発現させた。
【００４１】
［実施例８］変異体の反応性の変化の確認
実施例７で培養上清中に発現したＲａＭｏＡｂ−ｍＣＰＮの濃度は一定でないため、アミノ酸置換体の結合性能を正確に比較するには、濃度補正が必要である。そこで、まず以下の（１）から（３）の方法で培養上清中のＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮの濃度を測定し、（４）から（６）の方法でＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮと抗体の反応性を測定し、その値を用いてＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮの検量線を作成した。次いで同様の方法で培養上清中のＲａＭｏＡｂ−ｍＣＰＮを測定し、同じグラフ上にプロットした。具体的には以下のとおりである。
【００４２】
（１）抗ウサギ抗体（ミリポア社製、ＡＰ１３２）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウエルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。
（２）実施例７で得られたＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮを含む培養上清を、（１）で得られたＥＬＩＳＡプレートに添加し反応させた。
（３）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）標識したエストラジオールを反応させることで、固相に捕捉されたＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮの量を測定した。以上の反応系を図５横軸側に示した。
（４）抗ウサギ抗体（ミリポア社製、ＡＰ１３２）をＥＬＩＳＡプレートに０．１μｇ／ウエルで固定化し、１重量％スキムミルクでブロッキングした。
（５）実施例７で得られたＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮを含む培養上清を、（１）で得られたＥＬＩＳＡプレートに添加し反応させた。
（６）実施例２で単離したＣ３２−１２７にＡＬＰを結合させたもの（同仁化学社製、ＬＫ１２を使用）を、０．１重量％スキムミルクを含むＰＢＳで１０００倍に希釈し、固相に捕捉されたＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮと反応させた。以上の反応系を図５縦軸側に示した。
【００４３】
その後、（３）で得られた値を横軸とし、（６）で得られた値を縦軸としたグラフ上にスポットし、図５に示す検量線を作成した。
【００４４】
次に、（１）から（３）および（４）から（６）の方法で、前述のＲａＭｏＡｂ−ｍＣＰＮのそれぞれ（計９５種）の培養上清を測定し、同じグラフ上に描いた（図６〜１０）。そうすると、変異体のプロット位置が検量線より上方であれば結合性能が向上するアミノ酸置換であり、下方であれば結合性能が低下するアミノ酸置換であり、検量線と同じであれば、結合性能が変わらないアミノ酸置換であることがわかる（図５グラフ中の矢印参照）。
【００４５】
図６〜図１０に、評価結果を示しているが、図７を例として詳細に説明する。図７のうち、黒丸で示したプロットはＲａＭｏＡｂ−ＣＰＮの希釈系列を用いて得られた検量線で、白丸で示したプロットは実施例７の方法で培養上清に発現させたＲａＭｏＡｂ−ｍＣＰＮの結果である。図７の結果より、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＣＰＮのうち、２番目のアラニン（Ａ）をプロリン（Ｐ）やグリシン（Ｇ）に置換した場合は結合性能に変化はないものの、セリン（Ｓ）に置換すると結合性能が若干低下し、それ以外のアミノ酸に置換すると結合性能がほぼ消失することがわかる。
【００４６】
図６から図１０に示す結果を以下にまとめる。
（ａ）１番目のグルタミン酸（Ｅ）を置換した場合（図６）
アスパラギン酸（Ｄ）に置換すると結合性能が若干低下したが、その他のアミノ酸に置換すると結合性能が完全に消失した。
（ｂ）２番目のアラニン（Ａ）を置換した場合（図７）
プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）に置換した場合は結合活性の変化はなく、セリン（Ｓ）に置換すると結合性が若干低下した。その他のアミノ酸に置換すると結合性能が完全に消失した。
（ｃ）３番目のグルタミン酸（Ｅ）を置換した場合（図８）
他のアミノ酸に置換すると結合性能が完全に消失した。
（ｄ）４番目のアスパラギン酸（Ｄ）を置換した場合（図９）
グルタミン酸（Ｅ）またはグリシン（Ｇ）に置換すると結合性能が若干低下し、その他のアミノ酸への置換は、低下傾向にあった。
（ｅ）５番目のロイシン（Ｌ）を置換した場合（図１０）
いずれのアミノ酸に置換した場合でも、結合活性は変化しなかった。
【００４７】
前記（ａ）から（ｅ）の結果をまとめると、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＣＰＮのうち１番目のグルタミン酸（Ｅ）はアスパラギン酸（Ｄ）に置換可能。２番目のアラニン（Ａ）はプロリン（Ｐ）またはグリシン（Ｇ）に置換可能、３番目のグルタミン酸（Ｅ）は他のアミノ酸に置換することができない。４番目のアスパラギン酸はグルタミン酸（Ｅ）またはグリシン（Ｇ）に置換可能、５番目のロイシン（Ｌ）はすべてのアミノ酸に置換が可能であった。このことから、Ｃ３２−１２７のエピトープは、１番目のアミノ酸から４番目のアミノ酸であることがわかる。
【００４８】
以上のことから、ＥＡＥＤ、ＤＡＥＤ，ＥＰＥＤ，ＥＧＥＤ，ＥＡＥＥ，ＥＡＥＧがタグとして利用可能なことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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