(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子解析で腎コロボーマ症候群疾患を検出する為の新たなバイオマーカーの提供。【解決手段】下記の遺伝子異常の内１つ以上を検出する腎コロボーマ症候群の検出方法。具体的には、ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域における１１９番目及び１２０番目の塩基ＧＣの欠失。２１２番目の塩基Ｇが塩基Ｃに置換：５８〜６４番目の塩基「ＧＴＧＡＡＣＣ」が重複挿入：１８７番目の塩基Ｇが塩基Ａに置換：２２４と２２５番目の塩基「ＣＣ」が重複挿入：１０２３番目の塩基Ｃが塩基Ａに置換：ヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコーディング領域２８１４番目の塩基Ｃが塩基Ｔに置換：ヒトＣＨＤ７遺伝子のコーディング領域１５６５番目の塩基Ｇが塩基Ｔに置換：ヒトＳＩＸ４遺伝子のコーディング領域５６９番目の塩基Ｔが塩基Ａに置換：ヒトＫＩＦ２６Ｂ遺伝子のコーディング領域５４８９〜５５１０番目の塩基「ＡＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＧ」が欠失。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（１）及び（２）の遺伝子異常に加えて、あるいは（１）及び（２）の遺伝子異常以外に、下記（Ａ）〜（Ｈ）の遺伝子異常のうち１つ以上を検出することを特徴とする腎コロボーマ症候群の検出方法。
（１）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域の１１９番目及び１２０番目の塩基ＧＣが欠失している。
（２）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域２１２番目の塩基Ｇが塩基Ｃに置換されている。
（Ａ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域５８から６４番目の塩基「ＧＴＧＡＡＣＣ」が重複挿入されている。
（Ｂ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域１８７番目の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている。
（Ｃ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域２２４と２２５番目の塩基「ＣＣ」が重複挿入されている。
（Ｄ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域１０２３番目の塩基Ｃが塩基Ａに置換されている。
（Ｅ）ヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコーディング領域２８１４番目の塩基Ｃが塩基Ｔに置換されている。
（Ｆ）ヒトＣＨＤ７遺伝子のコーディング領域１５６５番目の塩基Ｇが塩基Ｔに置換されている。
（Ｇ）ヒトＳＩＸ４遺伝子のコーディング領域５６９番目の塩基Ｔが塩基Ａに置換されている。
（Ｈ）ヒトＫＩＦ２６Ｂ遺伝子のコーディング領域５４８９から５５１０番目の塩基「ＡＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＧ」が欠失している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子解析による腎コロボーマ症候群の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎コロボーマ症候群は腎の発生異常と眼底の視神経コロボーマ（正常眼球組織の一部欠損）の異常を合併する、常染色体優性遺伝疾患をいう。
なお、この疾患は平成２４年度に奇形症候群分野で難病指定されている。
本発明者らは、これまでに腎コロボーマ症候群の発症者の遺伝子解析において、ＰＡＸ２遺伝子に２種類の変異が認められることを明確にし、特許出願をしている（特許文献１）。
しかし、これまでに集積した２６の症例において上記２種類の遺伝子異常だけでは説明がつかない症例が半数以上あった。
そこで本発明者らは、これまでに腎臓の発生、形成に関与していることが示唆された遺伝子及びそれと関連性があると示唆されている遺伝子群（例えば非特許文献２等）を選び出し、網羅的に遺伝子解析を行い、本発明に至った。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−１１０６０５号公報
【非特許文献１】「腎臓発生の分子機構と再生への展望」，賀来  祐介  他１，生化学  第８４巻  第１２号，ｐ９８５−９９３，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子解析により腎コロボーマ症候群疾患を検出するための新たなバイオマーカーの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、アミノ酸変異を伴う塩基変異であることを前提にし、正常ゲノムでは１％未満でしか見られない遺伝子変異であることを視点にし、臨床的に腎コロボ―マ症候群と診断された２６例の疾患者からＤＮＡを抽出し、次世代シークエンサーを用いて遺伝子変異をスクリーニング及び解析した。
解析に用いた正常なゲノムのデータベースはＵＣＳＣ  Genome Browser［Ｆｅｂ．２００７（ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）］を用いた。
解析の際に正常者のばらつきとして、データベースｄｂＳＮＰ１３７および１０００Genomes Projectを用いた。
具体的には図１に示すように、２６種類の遺伝子に対してエクソン９７．９％をカバーする６１８組のプライマーセットを設計及び作製し、シークエンシングを行った。
ここで一塩基多型ＳＮＰにおいては、先に述べたように正常者で１％未満にしか見られない変異のものを抽出した。
【０００６】
これにより腎コロボーマ症候群の診断に有効なバイオマーカーは下記の（１），（２）及び（Ａ）〜（Ｍ）の遺伝子異常であり、これらの２以上組み合せて診断するのが好ましい。
ここで（１），（２）は特許文献１に開示された遺伝子異常であり、（Ａ）〜（Ｈ）が今回新たに得られたバイオマーカーである。
本明細書では図２に変異を示すように、ｃ．：coding ＤＮＡの開始コドンの頭から塩基を教え表示する。
なお、図２の表では何番目のエクソンに有する塩基であるかも示した。
（１）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域の１１９番目及び１２０番目の塩基ＧＣが欠失している。
（２）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域２１２番目の塩基Ｇが塩基Ｃに置換されている。
（Ａ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域５８から６４番目の塩基「ＧＴＧＡＡＣＣ」が重複挿入されている。
（Ｂ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域１８７番目の塩基Ｇが塩基Ａに置換されている。
（Ｃ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域２２４と２２５番目の塩基「ＣＣ」が重複挿入されている。
（Ｄ）ヒトＰＡＸ２遺伝子のコーディング領域１０２３番目の塩基Ｃが塩基Ａに置換されている。
（Ｅ）ヒトＳＡＬＬ４遺伝子のコーディング領域２８１４番目の塩基Ｃが塩基Ｔに置換されている。
（Ｆ）ヒトＣＨＤ７遺伝子のコーディング領域１５６５番目の塩基Ｇが塩基Ｔに置換されている。
（Ｇ）ヒトＳＩＸ４遺伝子のコーディング領域５６９番目の塩基Ｔが塩基Ａに置換されている。
（Ｈ）ヒトＫＩＦ２６Ｂ遺伝子のコーディング領域５４８９から５５１０番目の塩基「ＡＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＧ」が欠失している。
【０００７】
ＮＣＢＩが提供する正常な各遺伝子の塩基配列と上記塩基変異との関係を以下説明する。
配列番号１は、ヒトＰＡＸ２の遺伝子の塩基配列を示す。
（１）に示したエクソン２の１１９と１２０番目の塩基ＧＣの欠失は、配列番号１の６６９及び６７０番目の塩基の欠失に相当する。
同様に（２）に示した塩基Ｇは、配列番号１の７６２番目の塩基に相当する。
同様に（Ａ）に示した塩基の重複挿入は配列番号６０７から６１３番目に相当する。
同様に（Ｂ）に示した１８７番目の塩基Ｇは配列番号１の７３７番目の塩基に相当する。
同様に（Ｃ）に示した２２４と２２５番目の塩基「ＣＣ」は、配列番号１の７７４と７７５番目の塩基に相当する。
同様に（Ｄ）に示した１０２３番目の塩基Ｃは配列番号１の１５０５番目の塩基に相当する。
配列番号２は、ＳＡＬＬ４の正常な遺伝子の塩基配列（相補鎖）であり、（Ｅ）に示した２８１４番目の塩基Ｃは配列番号２の４５０番目の塩基に相当する。
配列番号３は、ＣＨＤ７の正常な遺伝子の塩基配列を示し、（Ｆ）に示した１５６５番目の塩基Ｇは２０５６番目の塩基に相当する。
配列番号４は、ＳＩＸ４の正常な遺伝子の塩基配列（相補鎖）を示し、（Ｇ）に示す５６９番目の塩基Ｔは配列番号４の１８３８番目の塩基に相当する。
配列番号５は、ＫＩＦ２６Ｂの正常な遺伝子塩基配列を示し、（Ｈ）に示す欠損部分は配列番号５の５５８９番目の塩基からの欠損「ＡＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＧＧ」に相当する。
【０００８】
次にサンガー法を用いて、変異の確認を行った。
図３にＣＨＤ７，ＳＩＸ４，ＳＡＬＬ４の遺伝子の一塩基変異を確認したチャートを示す。
４種類のｄｄＮＴＰを４色でそれぞれ蛍光標識、生成したフラグメントをキャピラリー電気泳動法で分離しながらＣＣＤカメラ等にて塩基配列のピークデータとして検出し、それをソフトウエアで解析表示したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、腎コロボーマ症候群疾患者のＤＮＡ断片を切り出し、塩基配列を同定したものであり、解析の途中に正常症例では１％未満にしか見られない遺伝子異常であること及び腎臓の発生・形成に関与していることが示唆されている、あるいは、それらに関連することが示唆された遺伝子群から同定したものであることから信頼性の高いバイオマーカーといえる。
よって、本発明は原因不明の腎障害症例を診断する際の効率的な検索法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】シークエンシングの対象とした遺伝子群及びその解析の流れを示す。  １遺伝子，２例に挿入変異、３遺伝子７例に欠失変異、１７遺伝子に４６個の一塩基変異が認められている。
【図２】本発明においてバイオマーカーとなる変異遺伝子の一覧表を示す。
【図３】サンガー法にて同定確認したチャートの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に係る診断方法は、特定の遺伝子異常を検出することにより行われる。
したがって、予め、検出対象となるＤＮＡ断片が得られれば、その方法そのものには制限がない。
しかし、ＰＣＲにて効率的にＤＮＡ断片を取り出し、シークエンシングを行うには、所定のプライマーセットを用いることが好ましい。
例えば、次のような対のプライマーを用いることができる。
フォワードプライマーを［Ｆ］，リバースプライマーを［Ｒ］と表示すると、ヒトＰＡＸ２遺伝子に対しては、
組み合せ（１）［Ｆ］：配列番号６，［Ｒ］：配列番号７
このプライマーセットは（Ａ）の変異の検出に適している。
組み合せ（２）［Ｆ］：配列番号８，［Ｒ］：配列番号９
このプライマーセットは（１）の変異の検出に適している。
組み合せ（３）［Ｆ］：配列番号１０，［Ｒ］：配列番号１１
このプライマーセットは（２），（Ｂ），（Ｃ）の変異の検出に適している。
組み合せ（４）［Ｆ］：配列番号１２，［Ｒ］：配列番号１３
このプライマーセットは（Ｄ）の変異の検出に適している。
ヒトＳＡＬＬ４遺伝子に対しては、
［Ｆ］：配列番号１４，［Ｒ］：配列番号１５
ヒトＣＨＤ７遺伝子に対しては、
［Ｆ］：配列番号１６，［Ｒ］：配列番号１７
ヒトＳＩＸ４遺伝子に対しては、
［Ｆ］：配列番号１８，［Ｒ］：配列番号１９
ヒトＫＩＦ２６Ｂ遺伝子に対しては、
［Ｆ］：配列番号２０，［Ｒ］：配列番号２１
等の組み合せが例として挙げられる。
このようなプライマーセットを用いて前記症例の遺伝子異常を確認することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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