(57)【要約】      （修正有）【課題】被検出物質と特異的に結合し且つ互いに非特異的に吸着し合う蛍光標識を用いる蛍光検出方法およびその検出装置において、非特異的に吸着した蛍光標識およびその単体を簡易的に分離除去して検出精度を向上させる。【解決手段】被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２を含有する試料液Ｓを試料液流路１１３に流下させ、抗原、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２を含有しない混相液Ｇを混相液流路１１４に流下させ、試料液流路１１３および混相液流路１１４より幅が狭い二相流流路１１５において二相流として流下させ、分離流路１１６において、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２の各流下方向を互いに異ならせ、被検出結合物Ｏ１を含有する試料液Ｓの一部を分液し、分液した試料液Ｓに励起光を照射して被検出結合物Ｏ１が発した蛍光の量に基づいて、抗原の存在量を検出する。【選択図】図４
2016065737.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検出物質と、前記被検出物質と特異的に結合し且つ励起光を照射すると蛍光を発する第１のビーズと、被検出物質と特異的に結合し且つ前記第１のビーズとは粒径が異なる第２のビーズとを用意し、
前記第１および第２のビーズの両方が特異的に結合した前記被検出物質からなる被検出結合物と、前記第１のビーズ同士が非特異的に吸着した第１の吸着物と、前記第２のビーズ同士が非特異的に吸着した第２の吸着物と、前記第１のビーズ単体と、前記第２のビーズ単体とを含有する試料液を作製し、
前記試料液を試料液流路に流下させ、
前記被検出物質、前記第１のビーズおよび前記第２のビーズのいずれをも含有しない混相液を混相液流路に流下させ、
前記試料液流路より流下した前記試料液および前記混相液流路より流下した前記混相液を、前記試料液流路および前記混相液流路のいずれの幅よりも狭い二相流流路に導き、前記二相流流路において、前記試料液と前記混相液とからなる二相流を発生せしめ、前記被検出結合物、前記第１の吸着物、前記第２の吸着物、前記第１のビーズ単体および前記第２のビーズ単体を前記二相流流路の一側壁に沿って流下させ、
前記二相流流路より流下された前記試料液を分離流路に導き、前記分離流路において、前記試料液を、前記被検出結合物の流下方向、前記第１の吸着物の流下方向、前記第２の吸着物の流下方向、前記第１のビーズ単体の流下方向および前記第２のビーズ単体の流下方向が互いに異なる状態で流下させ、
前記被検出結合物の流下方向下流において、前記試料液より前記被検出結合物を含有する前記試料液の一部を分液し、
前記分液された試料液に前記励起光を照射し、
前記励起光の照射により発生した前記蛍光を検出し、
前記検出した蛍光の量に基づいて、前記被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法。
【請求項２】
前記分離流路として、下流に向けて幅が連続的に拡大する流路を用いる請求項１に記載の蛍光検出方法。
【請求項３】
前記混相液流路として、前記試料液流路の幅以上の幅を有する流路を用いる請求項１または２に記載の蛍光検出方法。
【請求項４】
前記二相流流路として、１５μｍ以上１００μｍ未満の幅を有する流路を用いる請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項５】
前記第１および第２のビーズとして、粒径が１μｍ以上５μｍ未満のビーズを用いる請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項６】
前記第１のビーズの粒径と前記第２のビーズの粒径との差が１μｍ以上４μｍ未満である請求項５に記載の蛍光検出方法。
【請求項７】
前記第１の吸着物、前記第２の吸着物、前記第１のビーズ単体および前記第２のビーズ単体を含有し且つ前記被検出結合物を含有しない第２の試料液と前記混相液とを用いて検出される前記蛍光の量を予め記憶し、
前記被検出物の存在量を検出する工程において、前記検出した蛍光の量と前記予め記憶した蛍光の量との差に基づいて、前記被検出物質の存在量を検出する請求項１〜６のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項８】
前記第２のビーズとして、前記励起光の照射により前記第１のビーズが発する蛍光とは波長の異なる蛍光を発するビーズを用い、
前記励起光の照射により、前記第１のビーズが発した蛍光と前記第２のビーズが発した蛍光の両方を検出し、前記両方の蛍光の量に基づいて、前記被検出物質の存在量を検出する請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛍光検出方法。
【請求項９】
前記第１のビーズが励起される波長および前記第２のビーズが励起される波長が、前記励起光の波長帯域に含まれる請求項８に記載の蛍光検出方法。
【請求項１０】
前記検出された両方の蛍光のうち、前記第１のビーズおよび前記第２のビーズが同時に発した蛍光の量に基づいて、前記被検出物質の存在量を検出する請求項８または９に記載の蛍光検出方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の蛍光検出方法に用いられる蛍光検出装置であって、
前記被検出結合物、前記第１の吸着物、前記第２の吸着物、前記第１のビーズ単体および前記第２のビーズ単体を含有する前記試料液を流下させる前記試料液流路と、前記被検出物質、前記第１のビーズおよび前記第２のビーズのいずれをも含有しない前記混相液を流下させる前記混相液流路と、前記試料液流路および前記混相液流路と連通し且つ前記試料液流路および前記混相液流路よりも幅の狭い前記二相流流路と、前記二相流流路と連通し且つ前記試料液を、前記被検出結合物の流下方向、前記第１の吸着物の流下方向、前記第２の吸着物の流下方向、前記第１のビーズ単体の流下方向および前記第２のビーズ単体の流下方向が互いに異なる状態で流下させ、前記被検出結合物の流下方向下流において、前記試料液より前記被検出結合物を含有する試料液の一部を分液する分離流路とを備えた検出用試料セルを収容する収容部と、
前記検出用試料セルに励起光を照射する光照射部と、
前記励起光の照射により前記第１のビーズが発した蛍光と前記第２のビーズが発した蛍光の両方を検出する蛍光検出部と、
前記両方の蛍光のうち、前記第１のビーズおよび前記第２のビーズが同時に発した蛍光の量に基づいて、前記被検出物質の存在量を検出するデータ分析部とを備えた蛍光検出装置。
【請求項１２】
前記蛍光検出部が、前記第１のビーズによる蛍光と前記第２のビーズによる蛍光とを分光する分光部を備えている請求項１１に記載の蛍光検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光検出方法および蛍光検出装置に関する。より詳しくは、被検出物質を特定波長の光に励起されて蛍光を発する蛍光ビーズで標識し、上記特定波長の励起光を照射し、このとき発せられる蛍光を検出し、検出された蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出する蛍光検出方法および蛍光検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、病室や家庭等での検査を可能にするＰＯＣＴ（Point Of Care Testing）検査が注目を集めている。このＰＯＣＴ検査を実現するため、マイクロ流路を備えた検出用試料セルを用いた生化学検査の研究が盛んに行われている。
【０００３】
マイクロ流路を用いた生化学検査としては蛍光法が広く用いられている。蛍光法には、被検出物質が抗原である場合、抗原と特異的に結合する一次抗体が固定された固体表面（固相）をマイクロ流路内に設け、蛍光標識として、抗原抗体反応により抗原と特異的に結合する二次抗体が固定された蛍光ビーズを用い、蛍光ビーズと特異的に結合した抗原を含有する試料液をマイクロ流路に流下させ、固体表面（固相）に捕捉させ、抗原を捕捉した固相に励起光を照射し、蛍光ビーズが発する蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて、抗原の存在量を検出する固相系の検出方法が知られている。
【０００４】
そして、固相系の検出方法として、特定分子と反応する反応物質が一側面に設けられた反応流路内において、特定分子を含有する試料流と試料流以外の他の流体からなる二相流を発生させ、他の流体により試料液を反応物質側の壁面に沿って流下させる技術が提案されている（特許文献１）。
【０００５】
また、固体表面（固相）を用いず、蛍光標識として、一次抗体が固定された蛍光ビーズを用い、抗原と抗体との反応速度を向上させるために両者を液相で反応させる液相系の蛍光検出方法も知られている。ここで、非反応物とは、液相内において、蛍光ビーズ同士が偶然近接して絡み合い、非特異的に吸着した蛍光ビーズの対や抗原と特異的に結合せず、且つビーズ同士で非特異的に吸着しない蛍光ビーズ単体が挙げられる。
【０００６】
この非特異的に吸着した蛍光ビーズ対や蛍光ビーズ単体による蛍光は、ノイズとなり検出精度を低下させる虞があるため、液相系においては、非特異的に吸着した蛍光ビーズ対や蛍光ビーズ単体を分離除去する必要がある。しかしながら、非特異的に吸着した蛍光ビーズ対や蛍光ビーズ単体を分離除去するには、新たな工程や装置が必要になり、簡易的に分離除去する手法は技術的に確立されていない。
【０００７】
なお、微粒子を分級する技術としては、ピンチド流路構造を用いて二相流を発生させ、微粒子を分離・分級する手法が提案されている（特許文献２および非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２０３１５８号公報
【特許文献２】特開２００５−２０５３８７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】山田真澄、関実  真空  Vol.49 No.7, 2006 pp.404-408  「マイクロ流路を用いた粒子の分級」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献２および非特許文献１が提案する技術は、微粒子を粒径に応じて分級するものではあり、例えば蛍光ビーズ同士が非特異的に吸着した微粒子の対への適用までを開示するものではない。そして、特許文献１は、単に二相流によって試料液を他の流体で案内することを開示しているに過ぎず、試料液に含有される特定分子が非特異的に吸着して対を形成することや、形成された特定分子の対を分離除去することを提言するものでもない。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑み、非特異的に吸着する蛍光標識および蛍光標識単体を簡易的に分離除去して、検出精度を向上させる蛍光検出方法および蛍光検出装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明に係る蛍光検出方法は、被検出物質と、被検出物質と特異的に結合し且つ励起光を照射すると蛍光を発する第１のビーズと、被検出物質と特異的に結合し且つ第１のビーズとは粒径が異なる第２のビーズとを用意し、第１および第２のビーズの両方が特異的に結合した被検出物質からなる被検出結合物と、第１のビーズ同士が非特異的に吸着した第１の吸着物と、第２のビーズ同士が非特異的に吸着した第２の吸着物と、第１のビーズ単体と、第２のビーズ単体とを含有する試料液を作製し、試料液を試料液流路に流下させ、被検出物質、第１のビーズおよび第２のビーズのいずれをも含有しない混相液を混相液流路に流下させ、試料液流路より流下された試料液および混相液流路より流下された混相液を、試料液流路および混相液流路のいずれの幅よりも狭い二相流流路に導き、二相流流路において、試料液と混相液とからなる二相流を発生せしめ、被検出結合物、第１の吸着物、第２の吸着物、第１のビーズ単体および第２のビーズ単体を二相流流路の一側壁に沿って流下させ、二相流流路より流下された試料液を分離流路に導き、分離流路において、試料液を、被検出結合物の流下方向、第１の吸着物の流下方向、第２の吸着物の流下方向、第１のビーズ単体の流下方向および第２のビーズ単体の流下方向が互いに異なる状態で流下させ、被検出結合物の流下方向下流において、試料液より被検出結合物を含有する試料液の一部を分液し、分液された試料液に励起光を照射し、励起光の照射により発生した蛍光を検出し、検出した蛍光の量に基づいて被検出物質の存在量を検出する。
【００１３】
ここで、上記「ビーズ単体」とは、被検出物質と特異的に結合することもなく、且つビーズ同士で非特異的に吸着することもなく、ビーズ１個として存在する状態を意味する。また、上記「第１のビーズおよび第２のビーズのいずれも含有しない」とは、ビーズ単体だけではなく、ビーズ同士が吸着した吸着物も含有しないことを意味する。また、上記「照射により蛍光標識が発する蛍光」とは、励起光の照射により蛍光標識が直接若しくは間接的に励起されて生じる蛍光を意味する。また、上記「被検出物の存在量を検出する」とは、被検出物の存在有無の検出を含み、その存在量を定量的に検出する意味である。
【００１４】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、分離流路として、下流に向けて幅が連続的に拡大する流路を用いることが望ましい。
【００１５】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、混相液流路として、試料液流路の幅以上の幅を有する流路を用いることが望ましい。
【００１６】
また、本発明に係る蛍光検方法は、二相流流路として、５μｍ以上１００μｍ未満の幅を有する流路を用いることが望ましい。
【００１７】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、第１および第２のビーズとして、粒径が１μｍ以上５μｍ未満のビーズを用いることが望ましい。
【００１８】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、第１のビーズの粒径と第２のビーズの粒径との差が１μｍ以上４μｍ未満であることが望ましい。
【００１９】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、第１の吸着物、第２の吸着物、第１のビーズ単体および第２のビーズ単体を含有し且つ被検出結合物を含有しない第２の試料液と混相液とを用いて検出される蛍光の量を予め記憶し、被検出物の存在量を検出する工程において、検出した蛍光の量と予め記憶した蛍光の量との差に基づいて被検出物質の存在量を検出することが望ましい。
【００２０】
ここで、上記「検出した蛍光の量と予め記憶した蛍光の量との差」とは、試料液および混相液を用いて検出された蛍光の量より、予め記憶された第２の試料液および混相液を用いて検出された蛍光の量を差し引いた量を意味する。
【００２１】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、第２のビーズとして、励起光の照射により第１のビーズが発する蛍光とは波長の異なる蛍光を発するビーズを用い、励起光の照射により、第１のビーズが発した蛍光と第２のビーズが発した蛍光の両方を検出し、両方の蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出することが望ましい。
【００２２】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、第１のビーズが励起される波長および第２のビーズが励起される波長が、励起光の波長帯域に含まれることが望ましい。ここで、「励起される波長」とは、励起光の照射により励起され、蛍光を発する波長を意味する。
【００２３】
また、本発明に係る蛍光検出方法は、両方の蛍光のうち、第１のビーズおよび第２のビーズが同時に発した蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出することが望ましい。
【００２４】
また、本発明に係る蛍光検出装置は、本発明に係る蛍光検出方法に用いられる蛍光検出装置であって、被検出結合物、第１の吸着物、第２の吸着物、第１のビーズ単体および第２のビーズ単体を含有する試料液を流下させる試料液流路と、被検出物質、第１のビーズおよび第２のビーズのいずれをも含有しない混相液を流下させる混相液流路と、試料液流路および混相液流路と連通し且つ試料液流路および混相液流路よりも幅の狭い二相流流路と、二相流流路と連通し且つ試料液を、被検出結合物の流下方向、第１の吸着物の流下方向、第２の吸着物の流下方向、第１のビーズ単体の流下方向および第２のビーズ単体の流下方向が互いに異なる状態で流下させ、被検出結合物の流下方向下流において、試料液より被検出結合物を含有する試料液の一部を分液する分離流路とを備えた検出用試料セルを収容する収容部と、検出用試料セルに励起光を照射する光照射部と、励起光の照射により第１のビーズが発した蛍光と第２のビーズが発した蛍光の両方を検出する蛍光検出部と、両方の蛍光のうち、第１のビーズおよび第２のビーズが同時に発した蛍光の量に基づいて、被検出物質の存在量を検出するデータ分析部とを備えるものであってよい。
【００２５】
また、本発明に係る蛍光検出装置において、蛍光検出部が、第１のビーズによる蛍光と第２のビーズによる蛍光とを分光する分光部を備えていることが望ましい。
【発明の効果】
【００２６】
本発明に係る蛍光検出方法は、試料液流路および混相液流路のいずれの幅よりも狭い二相流流路において、試料液と混相液とからなる二相流を発生せしめ、被検出結合物、第１の吸着物、第２の吸着物、第１のビーズ単体および第２のビーズ単体を二相流流路の一側壁に沿って流下させ、分離流路において、試料液を、被検出結合物の流下方向、第１の吸着物の流下方向、第２の吸着物の流下方向、第１のビーズ単体の流下方向および第２のビーズ単体の流下方向が互いに異なる状態で流下させ、被検出結合物の流下方向下流において、試料液より被検出結合物を含有する試料液の一部を分液することにより、第１および第２の吸着物が分離除去された試料液の一部を用いて、被検出物の存在量を検出できるため、簡易的に検出精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】蛍光検出装置の模式図
【図２】蛍光検出装置のブロック図
【図３】試料液内の被検出結合物および吸着物の態様示す模式図
【図４】マイクロ流路の部分拡大図
【図５】蛍光検出装置の一部を示す模式図
【図６】第二の実施形態における蛍光検出装置の一部を示す模式図
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、図面を参照して本発明の一実施形態を詳細に説明する。本実施形態は、被検出物質としての抗原Ａを検出する方法である。図１は本発明の実施形態に用いられる蛍光検出装置１の模式図である。図２は蛍光検出装置１のブロック図である。
【００２９】
蛍光検出装置１には、抗原Ａを含有する検体液を収容する検体容器ＫＢ、試料液Ｓおよび混相液Ｇを流下させる検出用試料セル１００およびノズルチップＮＣが装着される。検体液は、例えば血清、血漿、尿等であり、抗原Ａとしては、例えばｈＣＧが挙げられる。
【００３０】
蛍光検出装置１は、ノズルチップＮＣ等を駆動させる検体処理部１１、検出用試料セル１００に励起光を照射する光照射部１２、励起光の照射により発生した蛍光を検出する蛍光検出部１３、検出した蛍光の量を計測して抗原Ａの存在量を分析するデータ分析部１４、検出用試料セル１００を収容する収容部１５を備えている。
【００３１】
検出用試料セル１００は、マイクロ流路１１０が形成された基材１００ａ、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２を含有する試薬を収容する試薬セル１２０、混相液Ｇを収容する混相液セル１３０、試料液Ｓを注入する注入ウェル１４０、混相液Ｇを注入する注入ウェル１５０、混相液Ｇを排出する排出ウェル１６０が形成された蓋材１００ｂを備えている。
【００３２】
基材１００ａには、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンを含む非晶性ポリオレフィン（ＡＰＯ）等の樹脂を用いることが望ましい。
【００３３】
蛍光標識Ｆ１は、抗原Ａと特異的に結合し且つ励起光が照射されると励起されて蛍光を発するものである。蛍光標識Ｆ１は、蛍光ビーズＦＢと蛍光ビーズＦＢに固定された一次抗体Ｂとで構成される。なお、蛍光標識Ｆ１が特許請求の範囲における「第１のビーズ」に対応する。
【００３４】
蛍光ビーズＦＢは、蛍光色素分子を、この蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する材料で内包するビーズであることが望ましい。具体的に、蛍光ビーズＦＢは、ポリスチレン粒子を調液したポリスチレン溶液、蛍光色素分子の蛍光色素溶液をそれぞれ作製し、混合・エバポレートしながら含浸させた後、遠心分離を施して作製される。
【００３５】
作製された蛍光ビーズＦＢの粒径はポリスチレン粒子の粒径と同一である。また、各蛍光ビーズＦＢの粒径は均一であり、その粒径は１μｍ以上５μｍ未満であることが望ましい。蛍光ビーズＦＢとして、例えばＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社製の粒径３μｍ、励起波長が４４０ｎｍ、蛍光波長が４８０ｎｍのビーズを用いることができる。
【００３６】
一次抗体Ｂは、抗原抗体反応により抗原Ａと特異的に結合するものである。一次抗体Ｂは、抗原Ａの種類に応じて適宜調整可能であり、例えばｈＣＧである抗原Ａに対しては、抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ｈＣＧ 5008 ＳＰ−５，Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いることができる。
【００３７】
また、一次抗体Ｂは、蛍光ビーズＦＢをカルボキシル基で表面修飾し、一次抗体Ｂの末端をアミノ基化してアミノカップリング法を施すことにより、蛍光ビーズＦＢに固定される。
【００３８】
標識Ｆ２は、抗原抗体反応により抗原Ａと特異的に結合するものである。標識Ｆ２は、励起光が照射されると蛍光を発するものであってもよいが、本実施形態においては蛍光を発しないものとする。標識Ｆ２は、補助ビーズＳＢと補助ビーズＳＢに固定された二次抗体Ｃとで構成される。ここで、標識Ｆ２が特許請求の範囲における「第２のビーズ」に対応する。
【００３９】
補助ビーズＳＢには、蛍光色素分子を有さないポリスチレン粒子を用いることができる。また、補助ビーズＳＢの粒径は、ポリスチレン粒子の粒径と同一である。また、各補助ビーズＳＢの粒径は均一であり、その粒径は１μｍ以上５μｍ未満であることが望ましい。
【００４０】
補助ビーズＳＢは蛍光ビーズＦＢと粒径が異なるものである。蛍光ビーズＦＢと補助ビーズＳＢと粒径差は１μｍ以上４μｍ未満が望ましい。本実施形態において、補助ビーズＳＢの粒径は２μｍとする。なお、蛍光ビーズＦＢと補助ビーズＳＢとの大小関係は特に限定されるものではない。
【００４１】
二次抗体Ｃは、抗原抗体反応により抗原Ａと特異的に結合するものである。二次抗体Ｃは、抗原Ａの種類に応じて適宜調整可能であり、例えばｈＣＧである抗原Ａに対しては、抗ｈＣＧモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−Ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ 6601 ＳＰＲ−５，Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を用いることができる。
【００４２】
二次抗体Ｃは、補助ビーズＳＢをカルボキシル基で表面修飾し、二次抗体Ｃの末端をアミノ基化してアミノカップリング法を施すことにより、補助ビーズＳＢに固定される。
【００４３】
試料液Ｓは、検体容器ＫＢよりノズルチップＮＣが検体液を抽出し、試薬セル１２０内で混合・撹拌することにより作製される。試料液Ｓは、図３が示すように、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２の両方が抗原Ａと特異的に結合した被検出結合物Ｏ１を含有する。
【００４４】
また、試料液Ｓは、偶然近接して絡みあい、蛍光標識Ｆ１同士が非特異的に吸着した吸着物Ｏ２，標識Ｆ２同士が非特異的に吸着し合った吸着物Ｏ３をも含有し、抗原Ａと特異的に結合せず、且つ標識同士で非特異的に吸着しない蛍光標識Ｆ１の単体、標識Ｆ２の単体も含有する。ここで、試料液Ｓ内において、被検出結合物Ｏ１の最大寸法Ｅ１、吸着物Ｏ２の最大寸法Ｅ２、吸着物Ｏ３の最大寸法Ｅ３、蛍光標識Ｆ１の最大寸法Ｅ４、標識Ｆ２の最大寸法Ｅ５は、標識Ｆ２、蛍光標識Ｆ１、吸着物Ｏ３、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２の順に大きくなる。
【００４５】
上記最大寸法は、構成するビーズの粒径の総和により決定される。したがって、本実施形態において、最大寸法Ｅ１が５μｍ、最大寸法Ｅ２が６μｍ、最大寸法Ｅ３が４μｍ、最大寸法Ｅ４が３μｍ、最大寸法Ｅ５が２μｍとなる。なお、図３および後述する図４は、理解を容易にするため、各最大寸法を、抗原Ａ、一次抗体Ｂおよび一次抗体Ｃを含む寸法で図示しているが、抗原Ａ、一次抗体Ｂおよび一次抗体Ｃの各寸法を含むものではない。
混相液Ｇは、抗原Ａ、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２を含有しない溶液である。具体的に、混相液Ｇとして、生理食塩水 が挙げられる。なお、吸着物Ｏ２および吸着物Ｏ３が特許請求の範囲の「第１の吸着物」および「第２の吸着物」にそれぞれ対応する。
【００４６】
マイクロ流路１１０の構造および作用について説明する。図４はマイクロ流路１１０の部分拡大図を示す図である。マイクロ流路１１０は、注入ウェル１４０（図１参照）と連通して試料液Ｓを流下させる試料液流路１１３、注入ウェル１５０（図１参照）と連通して混相液Ｇを流下させる混相液流路１１４、試料液流路１１３の下流端および混相液流路１１４の下流端と連通する二相流流路１１５、二相流流路１１５の下流端と連通する分離流路１１６、分離流路１１６の下流端とそれぞれ連通して試料液Ｓの一部を分液する５つの分岐流路１１７Ａ，１１７Ｂ，１１７Ｃ，１１７Ｄ，１１７Ｅ、５つの分岐流路１１７Ａ，１１７Ｂ，１１７Ｃ，１１７Ｄ，１１７Ｅのそれぞれの下流端に設けられ、分液された試料液Ｓの一部を貯留する貯留部１１８Ａ，１１８Ｂ，１１８Ｃ，１１８Ｄ，１１８Ｅおよび分離流路１１６の下流端と連通し混相液Ｇを排出ウェル１６０に導く排出流路１１９を備えている。
【００４７】
試料液流路１１３と二相流流路１１５とは角度θ１をなして連通し、混相液流路１１４と二相流流路１１５とは角度θ２をなして連通している。また、試料液流路１１３の下流端、混相液流路１１４の下流端、二相流流路１１５の上流端とは互いに連通している。
【００４８】
試料液流路１１３、混相液流路１１４および二相流流路１１５はそれぞれ一定幅の流路であり、二相流流路１１５の幅ｄ３は、試料液流路１１３の幅ｄ１および混相液流路１１４の幅ｄ２のいずれよりも狭くなっている。
【００４９】
分離流路１１６の幅は下流方向に向けて幅ｄ３より拡大している。分離流路１１６の両側壁１１６ａ，１１６ｂは角度θ３をなしている。このように、試料液流路１１３、混相液流路１１４、二相流流路１１５および分離流路１１６は、いわゆるピンチド流路構造を構成するものである。５つの分岐流路１１７Ａ，１１７Ｂ，１１７Ｃ，１１７Ｄ，１１７Ｅは互いに異なる方向に延びている。
【００５０】
検体処理部１１が、試料液Ｓを注入ウェル１４０、混相液Ｇを注入ウェル１５０にそれぞれ注入して排出ウェル１６０に負圧を掛けることにより、試料液Ｓおよび混相液Ｇが同一の流速で試料液流路１１３および混相液流路１１４をそれぞれ流下する。試料液流路１１３において、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２は、層流の作用により試料液流路１１３の中央部分に偏って流下される。そして、試料液流路１１３を流下した試料液Ｓと混相液流路１１４を流下した混相液Ｇが二相流流路１１５に同時に導かれる。
【００５１】
二相流流路１１５において、試料液Ｓおよび混相液Ｇは、試料液Ｓが側壁１１５ａ側、混相液Ｇが反対の側壁１１５ｂ側にそれぞれ沿って二相流として流下する。そして、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２は、いわゆるピンチドフローフラクショネーション法の原理により、側壁１１５aにそれぞれ押し付けられながら流下される。
【００５２】
二相流流路１１５より流下された試料液Ｓおよび混相液Ｇが分離流路１１６に導かれる。分離流路１１６において、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２は、各最大寸法Ｅ１〜Ｅ５に応じて、互いに異なる流下方向に流下される。そして、最大寸法が小さいものほど、側壁１１６ａに近接する方向に流下される。
【００５３】
本実施形態では、前述の通り、各最大寸法Ｅ１〜Ｅ５は、標識Ｆ２、蛍光標識Ｆ１、吸着物Ｏ３、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２の順に大きくなるため、分離流路１１６において、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２は、図４に示すように、標識Ｆ２、蛍光標識Ｆ１、吸着物Ｏ３、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２の順で側壁１１６ａに近接する方向にそれぞれ流下される。
【００５４】
そして、分岐流路１１７Ａ，１１７Ｂ，１１７Ｃ，１１７Ｄ，１１７Ｅは、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１、標識Ｆ２の上記流下方向と略平行な方向にそれぞれ延びている。したがて、分離流路１１６を流下した試料液Ｓは、被検出結合物Ｏ１を含有する試料液Ｓの一部が分岐流路１１７Ａに、吸着物Ｏ２を含有する試料液Ｓの一部が分岐流路１１７Ｂに、吸着物Ｏ３を含有する試料液Ｓの一部が分岐流路１１７Ｃに、蛍光標識Ｆ１を含有する試料液Ｓの一部が分岐流路１１７Ｄ、標識Ｆ２を含有する試料液Ｓの一部が分岐流路１１７Ｅに導かれて分液される。
【００５５】
試料液Ｓの一部は、分岐流路１１７Ａ，１１７Ｂ，１１７Ｃ，１１７Ｄ，１１７Ｅをそれぞれ流下し、貯留部１１８Ａ，１１８Ｂ，１１８Ｃ，１１８Ｄ，１１８Ｅにそれぞれ貯留される。また、二相流流路１１５を流下した混相液Ｇは、分離流路１１６を流下した後に排出流路１１９に導かれ、排出流路１１９を流下した後に排出ウェル１６０から排出される。
【００５６】
このように、本実施形態によれば、試料液Ｓは、被検出結合物Ｏ１を主に含有するもの、吸着物Ｏ２を主に含有するもの、吸着物Ｏ３を主に含有するもの、蛍光標識Ｆ１単体を主に含有するもの、標識Ｆ２単体を主に含有するものにそれぞれ分液されるため、特に新たな装置や処理を用いずに、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３および蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２の各単体を簡易的に分離除去できる。
【００５７】
また、二相流流路１１５に導く混相液Ｇの量は、二相流流路１１５に導く試料液Ｓの量よりも多くすることが望ましい。これにより、二相流流路１１５において、試料液Ｓの幅が混相液Ｇの幅よりも狭くなり、被検出結合物Ｏ１，吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２が側壁１１５ａにより強く押し付けられ、分離流路１１６において、被検出結合物Ｏ１，吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２の各流下方向の差がより明確になり、吸着物Ｏ２および吸着物Ｏ３を精度よく分離除去できる。具体的には、混相液流路１１４の幅ｄ２を試料液流路１１３の幅ｄ１よりも広くすることが望ましい。
【００５８】
また、二相流流路１１５において、二相流が発生し易くするため、試料液流路１１３と二相流流路１１５とのなす角度θ１と混相液流路１１４と二相流流路１１５とのなす角度θ２とは等しいことが望ましい。また、角度θ１および角度θ２は１１０〜１６０度の範囲であることが望ましい。また、分離流路１１６の両側壁のなす角度θ３は９０度〜１３０度の範囲であることが望ましい。
【００５９】
また、二相流流路１１５の幅ｄ３は、被検出結合物Ｏ１、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２が立体的な障害となり、二相流流路１１５において、試料液Ｓおよび混相液Ｇの流下が困難となることを回避するため、１５μｍ以上とすることが望ましい。また、二相流流路１１５の幅ｄ３は、前述の通り、試料液流路１１３の幅ｄ１および混相液流路１１４の幅ｄ２のいずれの幅よりも狭いため、１００μｍ未満とすることが望ましい。
【００６０】
また、試料液流路１１３の幅ｄ１および混相液流路１１４の幅ｄ２は、５０μｍ以上２ｍｍ未満とすることが望ましい。なお、試料液流路１１３、混相液流路１１４、二相流流路１１５、分離流路１１６、分岐流路１１７Ａ，１１７Ｂ，１１７Ｃ、貯留部１１８Ａ，１１８Ｂ，１１８Ｃおよび排出流路１１９は、それぞれ均一な深さを有し、その深さは互いに等しいものである。
【００６１】
次に分液された試料液Ｓの一部を用いて抗原Ａの存在量の検出について説明する。図５は蛍光検出装置１の一部構成を示す図である。光照射部１２が、貯留部１１８Ａに対して、励起光Ｌを照射する。蛍光ビーズＦＢが励起されて蛍光を発する波長は、励起光Ｌの波長帯域に含まれている。なお、蛍光ビーズによる蛍光の波長は、励起光Ｌの波長帯域には含まれていない。
【００６２】
蛍光検出部１３は、貯留部１１８Ａを挟み、光照射部１２の反対側に設けられている。蛍光検出部１３は、蛍光ビーズＦＢが蛍光を発すると、蛍光ビーズＦＢによる蛍光の波長のみを透過させるフィルタ１３１を用いて励起光Ｌを遮断し、蛍光ビーズＦＢによる蛍光を蛍光信号として検出する。蛍光検出部１３としては、例えばフォトダイオード、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等を用いることができる。
【００６３】
データ分析部１４が、蛍光検出部１３より蛍光信号を受け取り、蛍光信号に基づいて検出画像を作成し、検出画像内の所定面積当たりの蛍光量を計測して抗原Ａの存在数を分析する。データ分析部１４は、試料液Ｓおよび混相液Ｇを流下させ、所定時間（例えば１分〜２０分）経過した後に、抗原Ａの存在数を分析してもよいし、試料液Ｓおよび混相液Ｇを流下させつつ、蛍光信号を一定間隔（例えば５分間）でサンプリングすることにより、蛍光強度の時間変化率に基づいて抗原Ａの存在数を分析してもよい（レート法）。
【００６４】
本実施形態によれば、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２が分離除去された、試料液Ｓの一部を用いることにより、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２を分離除去しない試料液Ｓと比較してＳ／Ｎ比を１００倍程度に向上させ、検出精度を高めることを実現した。
【００６５】
しかしながら、貯留部１１８Ａには、二相流流路１１５および分離流路１１６を用いても、何らかの原因により、分離除去できなかった吸着物Ｏ２や蛍光標識Ｆ１単体が混入している可能性がある。混入した吸着物Ｏ２や蛍光標識Ｆ１単体による蛍光はノイズ信号となり検出精度を低下させる。以下に、上記ノイズ信号の影響を低減させる方法として本実施形態の変形例を説明する。
【００６６】
本変形例は、吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１および標識Ｆ２を含有し且つ抗原Ａを含有しない試料液Ｓ２を作製し、試料液Ｓ２および混相液Ｇを用いた検出を前もって行い、データ分析部１４が試料液Ｓ２と混相液Ｇを用いて得られた蛍光信号をノイズ信号として予め記憶しておき、試料液Ｓおよび混相液Ｇを用いて得られた蛍光信号から予め記憶したノイズ信号を差し引き、予め記憶したノイズ信号が差し引かれた蛍光信号に基づいて、抗原Ａの存在量を検出する方法である。これにより、混入した吸着物Ｏ２および蛍光標識Ｆ２単体によるノイズ信号の影響を低減させることができる。なお、試料液Ｓ２が特許請求の範囲における「第２の試料液」に相当する。
【００６７】
次に本発明の第二の実施形態について説明する。第二の実施形態は、補助ビーズＳＢを励起光Ｌの照射により蛍光を発するビーズに変更する方法である。第二の実施形態において、補助ビーズＳＢは、発する蛍光の波長が蛍光ビーズＦＢの発する蛍光の波長とは異なる蛍光ビーズとする。補助ビーズＳＢと蛍光ビーズＦＢとの波長の差は、特に限定されるものではないが、蛍光ビーズＦＢによる蛍光と補助ビーズＳＢによる蛍光との違いが視認できる程度であることが望ましい。
【００６８】
第二の実施形態における補助ビーズＳＢの好適な粒径範囲、および蛍光ビーズＦＢとの好適な粒径の差は第一の実施形態の補助ビーズＳＢと同じである。また、第二の実施形態における補助ビーズＳＢの作製方法は蛍光ビーズＦＢと同じである。第二の実施形態における補助ビーズＳＢとしては、例えばＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社製の粒径２μｍ、励起波長が４２０ｎｍ、蛍光波長が６５６ｎｍを用いることができる。なお、第二の実施形態においては、吸着物Ｏ３も励起光が照射されると蛍光を発するものとなる。
【００６９】
第二の実施形態に使用される蛍光検出装置について説明する。光照射部１２は、蛍光ビーズＦＢが励起される波長および補助ビーズＳＢが励起される波長の両方をその波長帯域に含む励起光Ｌを照射する。これにより、２つの異なる励起光の光源を備える必要がなく、装置の大型化、設備コストの低減も実現できる。また、蛍光ビーズＦＢによる蛍光の波長および補助ビーズＳＢによる蛍光の波長は励起光Ｌの波長帯域に含まれていない。
【００７０】
第二の実施形態において、蛍光検出部１３は、蛍光ビーズＦＢによる蛍光と補助ビーズＳＢによる蛍光とを分光する分光部１３２を備えている。分光部１３２としては、ダイロックミラー等を用いることができる。
【００７１】
そして、蛍光検出部１３は、蛍光ビーズＦＢによる蛍光および補助ビーズＳＢによる蛍光を透過させるフィルタ１３３を用いて励起光Ｌを遮断する。そして、分光部１３２が、フィルタ１３３を透過した蛍光ビーズＦＢによる蛍光および補助ビーズＳＢによる蛍光を分光する。
【００７２】
そして、蛍光検出部１３は、蛍光ビーズＦＢによる蛍光のみを透過させるフィルタ１３１を用いて蛍光ビーズＦＢによる蛍光を、補助ビーズＳＢによる蛍光のみを透過させるフィルタ１３４を用いて補助ビーズＳＢによる蛍光をそれぞれ蛍光信号として検出する。データ分析部１４は、これらの蛍光信号に基づいて検出画像を作成し、検出画像内の所定面積当たりの蛍光量を計測して抗原Ａの存在量を検出する。
【００７３】
第二の実施形態においては、仮に吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１単体および標識Ｆ２単体が混入した場合であっても、吸着物Ｏ２および蛍光標識Ｆ１単体は蛍光ビーズＦＢによる蛍光のみを発し、吸着物Ｏ３および標識Ｆ２単体は補助ビーズＳＢによる蛍光のみを発する。したがって、データ分析部１４が、被検出結合物Ｏ１のような、検出された蛍光信号のうち、蛍光ビーズＦＢおよび補助ビーズＳＢの両方の蛍光からなる蛍光信号の量に基づいて、抗原Ａの存在量を検出することにより、混入した吸着物Ｏ２および吸着物Ｏ３のノイズ信号を除去でき、検出精度を高めることができる。
【００７４】
また、データ分析部１４が、蛍光ビーズＦＢおよび補助ビーズＳＢの両方が同時に発した蛍光からなる蛍光信号の量に基づいて抗原Ａの存在量を検出することにより、被検出結合物Ｏ１による蛍光を選別し易くなり、さらに検出精度を高めることができる。
【００７５】
さらに、同一検出エリア内に吸着物Ｏ２、吸着物Ｏ３、蛍光標識Ｆ１単体および標識Ｆ２単体が混入している場合を想定し、蛍光ビーズＦＢおよび補助ビーズＳＢの両方が同時且つ近接して発した蛍光からなる蛍光信号の量に基づいて、抗原Ａの存在量を検出してもよい。
【符号の説明】
【００７６】
Ａ        抗原（被検出物質）
Ｆ１      蛍光標識（第１のビーズ）
Ｆ２      標識（第２のビーズ）
Ｇ        混相液
Ｌ        励起光
Ｓ        試料液
１        蛍光検出装置
１２      光照射部
１３      蛍光検出部
１４      データ分析部
１５      収容部
ｄ１      試料液流路の幅
ｄ２      混相液流路の幅
ｄ３      二相流流路の幅
１１３    試料液流路
１１４    混相液流路
１１５    二相流流路
１１６    分離流路
１３２    分光部
【図１】
2016065737.tif 000003
【図２】
2016065737.tif 000004
【図３】
2016065737.tif 000005
【図４】
2016065737.tif 000006
【図５】
2016065737.tif 000007
【図６】
2016065737.tif 000008