(57)【要約】      （修正有）【課題】液相合成法における、高収率で高純度のオクトレオチドを製造する方法の提供。【解決手段】式（３）で表わされるアセタール化合物又はその塩を中間体として用いて、アミノ保護基であるＲ１ａを脱離させ、保護アミノ酸との縮合反応をと保護基の脱離とを繰り返し、更に酸化反応を行ってオクトレオチド又はその塩を製造する方法。2016065050.tif 000022【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の式（Ｂ）
【化１】
2016065050.tif 000017
（式中、Ｒ1は、水素原子、アミノ保護基、保護基を有していてもよいアミノ酸残基又は保護基を有していてもよいペプチド残基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、炭素数１４〜３０のアルキル基を示し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアシル基を示す）
で表されるアセタール化合物又はその塩。
【請求項２】
次の式（１）
【化２】
2016065050.tif 000018
（式中、Ｒ1aはアミノ保護基を示す。）
で表されるジオール化合物と式（２）
【化３】
2016065050.tif 000019
（式中、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、炭素数１４〜３０のアルキル基を示し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアシル基を示す）
で表されるベンズアルデヒド化合物とを、酸の存在下に反応させることを特徴とする、式（３）
【化４】
2016065050.tif 000020
（式中、Ｒ1a、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｙ及びＺは前記と同じ）
で表されるアセタール化合物の製造法。
【請求項３】
請求項２記載の製造法により得られたアセタール化合物（３）のアミノ保護基を脱離させ、保護アミノ酸との縮合反応と保護基の脱離とを繰り返し、さらに酸化反応することを特徴とする式（Ａ）
【化５】
2016065050.tif 000021
で表されるオクトレオチド又はその塩の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オクトレオチドの製造法及びその製造中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
持続性ソマトスタチンアナログとして開発されたオクトレオチドは、成長ホルモンや甲状腺刺激ホルモン等の過剰な分泌を抑制する効果を有する。具体的には、消化管ホルモン産生腫瘍（カルチノイド腫瘍，ＶＩＰ産生腫瘍，グルカゴノーマ，インスリノーマ，ガストリン産生腫瘍等）や先端巨大症・下垂体性巨人症に伴う諸症状の改善、更には進行・再発癌患者の緩和医療における消化管閉塞に伴う消化器症状の改善のための薬剤として使用されている。
【０００３】
オクトレオチドは、次式（Ａ）
【０００４】
【化１】
2016065050.tif 000002
【０００５】
で表されるジオール環状オクタペプチドであり、その製造法としては、固相合成法による方法（特許文献１〜３）及び液相合成法（特許文献４、５）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５８８９１４６号明細書
【特許文献２】米国特許第６３４６６０１号明細書
【特許文献３】カナダ特許出願公開第２４５８０８４号
【特許文献４】米国特許第４３９５４０３号明細書
【特許文献５】国際公開第２００７／１１０７６５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
固相合成法の場合には、一般的に粗体純度が低く、大量合成が困難であり、また高価な樹脂を使用していることから、医薬品の工業的生産には不向きである。
一方、液相合成法においては、Ｃ末端のスレオニン残基をジオール化するために、ペプチド合成後に還元反応を行っているが、当該還元反応の収率が低く、工業的に有利な方法とは言えなかった。
従って、本発明の課題は、液相合成法において、高収率で高純度のオクトレオチドを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで本発明者は、液相合成法によるオクトレオチドの合成について種々検討した結果、Ｃ末端残基原料として、ジオール化されたスレオニンを用い、かつジオール部分の保護基としてジ長鎖アルコキシベンズアルデヒドによるアセタール保護基を用いれば、当該アセタール保護化合物の晶析性が高く、固液分離により単離が容易であることを見出した。つまりアミノ保護基の脱離及び保護アミノ酸との縮合反応の繰り返しによるペプチド伸長工程が効率良く進行し、最後に当該アセタール保護基を脱離させ、酸化してジスルフィド結合を形成させれば、液相合成法でオクトレオチドが高収率、高純度で得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔３〕を提供するものである。
【００１０】
〔１〕次の式（Ｂ）
【００１１】
【化２】
2016065050.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ1は、水素原子、アミノ保護基、保護基を有していてもよいアミノ酸残基又は保護基を有していてもよいペプチド残基を示し；
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、炭素数１４〜３０のアルキル基を示し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアシル基を示す）
で表されるアセタール化合物又はその塩。
〔２〕次の式（１）
【００１３】
【化３】
2016065050.tif 000004
【００１４】
（式中、Ｒ1aはアミノ保護基を示す。）
で表されるジオール化合物と式（２）
【００１５】
【化４】
2016065050.tif 000005
【００１６】
（式中、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、炭素数１４〜３０のアルキル基を示し；
Ｘ、Ｙ及びＺは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアシル基を示す）
で表されるベンズアルデヒド化合物とを酸の存在下に反応させることを特徴とする、式（３）
【００１７】
【化５】
2016065050.tif 000006
【００１８】
（式中、Ｒ1a、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｙ及びＺは前記と同じ）
で表されるアセタール化合物の製造法。
〔３〕前記〔２〕記載の製造法により得られたアセタール化合物（３）のアミノ保護基Ｒ1aを脱離させ、保護アミノ酸との縮合反応と保護基の脱離とを繰り返し、さらに酸化反応を行うことを特徴とする式（Ａ）
【００１９】
【化６】
2016065050.tif 000007
【００２０】
で表されるオクトレオチド又はその塩の製造法。
【発明の効果】
【００２１】
式（３）のアセタール化合物は、晶析性が高く、固液分離により容易に単離できることから、ペプチド鎖形成反応後の各中間体の単離、精製も容易である。また、液相合成法によりペプチド伸長工程を行うため、通常の反応缶で合成可能である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の式（Ａ）で表されるオクトレオチド又はその塩は、次の反応式に従って、液相合成法により製造される。
【００２３】
【化７】
2016065050.tif 000008
【００２４】
【化８】
2016065050.tif 000009
【００２５】
【化９】
2016065050.tif 000010
【００２６】
【化１０】
2016065050.tif 000011
【００２７】
【化１１】
2016065050.tif 000012
【００２８】
（式中、Ｒ4はチオールの保護基を示し、Ｒ5は水酸基の保護基を示し、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｒ1a、Ｒ2及びＲ3は前記と同じ。）
【００２９】
すなわち、オクトレオチド又はその塩は、式（１）で表されるジオール化合物と式（２）で表されるベンズアルデヒド化合物とを酸の存在下に反応させて、式（３）で表されるアセタール化合物を得、当該化合物（３）のアミノ保護基を脱離させ、保護アミノ酸との縮合反応と保護基の脱離を繰り返して式（１８）の化合物を得、次いで酸化反応を行うことにより製造される。ここで、保護アミノ酸の反応は、上記反応式の如く、保護Ｃｙｓ、保護Ｔｈｒ、保護Ｌｙｓ、保護Ｔｒｐ、保護Ｐｈｅ、保護Ｃｙｓ、保護Ｐｈｅの順に反応させることにより行なわれる。
【００３０】
Ｒ1aは、アミノ保護基を示す。アミノ保護基としては、（１）酸で脱離できる保護基（例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基（Ｍｏｚ）、ホルミル基（ＣＨＯ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル基（Ｔｅｏｃ）、１−アダマンチルオキシカルボニル基（Ａｄｏｃ）、２−（ｐ−ビフェニル）イソプロピルオキシカルボニル基（Ｂｐｏｃ）、トリフェニルメチル基（Ｔｒ）、メトキシメチル基（ＭＯＭ））；（２）還元で脱離できる保護基（例えば、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、アリル基（Ａｌｌｙｌ）、Ｎ−ベンジルオキシメチル基（ＢＯＭ））；（３）塩基で脱離できる保護基（例えば、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基（Ｎｐｅｏｃ））；（４）亜鉛末−酢酸などで脱離できる保護基（例えば、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（Ｔｒｏｃ）、Ｎ−ジチアスクシノイル基（Ｄｔｓ）、ベンゾチアゾール−２−スルホニル基（Ｂｅｔｓｙｌ）、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基（ＴｃＢｏｃ）、Ｎ−（ジフェニル−４−ピリジル）メチル基（Ｄｐｐｍ））；（５）パラジウム触媒下、アミンなどで脱離できる保護基（例えば、アリルオキシカルボニル基（Ａｌｌｏｃ））等が挙げられる。これらの保護基のうち、酸で脱離できる保護基、塩基で脱離できる保護基、または還元で脱離できる保護基を使用するのが好ましい。また、前記反応式中のＲ1aはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００３１】
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ炭素数１４〜３０のアルキル基を示す。当該アルキル基としては、直鎖又は分岐鎖アルキル基のいずれでもよく、例えばテトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、ノナデシル基、イコシル基、ヘンイコシル基、ドコシル基、トリコシル基、テトラコシル基等が挙げられる。
【００３２】
Ｘ、Ｙ及びＺは、水素原子、ハロゲン原子、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアシル基を示す。ここで、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子が挙げられる。置換基を有していてもよい炭素数１〜１０の炭化水素基としては、炭素数１〜１０のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等の炭素数１〜６のアルキル基がより好ましい。置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアシル基としては、炭素数２〜１０のアルカノイル基が好ましく、アセチル基、プロピオニル基等の炭素数２〜６のアルカノイル基がより好ましい。
これらのＸ、Ｙ、Ｚとしては、水素原子又はハロゲン原子が好ましく、特に水素原子が好ましい。
【００３３】
Ｒ4は、チオールの保護基であり、具体的には、トリチル（トリフェニルメチル）基、トリアルキルシリル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔ−ブチル基、アセトアミドメチル基等が挙げられる。
【００３４】
Ｒ5は、水酸基の保護基であり、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００３５】
ジオール化合物（１）とベンズアルデヒド化合物（２）との反応は、酸の存在下に行なわれる。用いられる酸としては、カンファースルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸；ｐ−トルエンスルホン酸ピリジニウム等のスルホン酸の塩が挙げられる。
ジオール化合物（１）１モルあたり、０．３〜０．７モル、より好ましくは０．５モルのベンズアルデヒド化合物（２）を用い、０．０１〜０．０５モル、より好ましくは０．０２５モルの酸を添加し、有機溶媒中、１００℃以上で還流させ反応を行うのが好ましい。有機溶媒としては、トルエン、シクロヘキサン等の炭化水素系溶媒が用いられる。反応終了後は、アミンを添加後濃縮し、濃縮残渣にアセトニトリルを加えることによりアセタール化合物（３）を固体として採取することができる。このように容易にアセタール化合物（３）が固体として分離できるのは、ベンズアルデヒド化合物のオルト位及びパラ位に炭素数１４〜３０の長鎖アルコキシ基を有するためである。
【００３６】
アセタール化合物（３）のアミノ保護基の脱離反応は、アミノ保護基（Ｒ1a）の種類による。アミノ保護基の種類により、酸、還元、塩基、亜鉛末−酢酸、パラジウム触媒下アミン等により脱離すればよい。例えば、アミノ保護基がＦｍｏｃの場合には、ジエチルアミン等の塩基を用いてアミノ保護基を脱離させればよい。
【００３７】
保護Ｃｙｓ、保護Ｔｈｒ、保護Ｌｙｓ、保護Ｔｒｐ、保護Ｐｈｅとしては、Ｂｏｃ保護又はＦｍｏｃ保護が好ましい。これらの保護アミノ酸と各ペプチド〔（４）、（６）、（８）、（１０）、（１２）、（１４）、（１６）〕との縮合反応は、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＯ-（ベンゾトリアゾール−１−イル）-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリドｎ水和物（ＤＭＴ−ＭＭ）等の縮合剤の存在下に行うことができる。好ましくは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）等の縮合補助剤、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン等の塩基を添加し行うことが望ましい。具体的には、縮合剤の存在下、ハロゲン系または、エーテル系等の溶媒中、０〜４０℃で１〜４８時間反応させることにより縮合反応を行うことができる。
【００３８】
また、各保護ペプチド〔（５）、（７）、（９）、（１１）、（１３）、（１５）〕の脱保護反応は、前記アセタール化合物（３）の脱保護反応と同様にして行うことができる。
【００３９】
ペプチド（１７）の脱保護反応は、Ｒ1a、Ｒ4、Ｒ5及びアセタール基の全ての保護基を脱離させる反応である。これらの保護基の脱離反応を一工程で行うには、Ｒ1a、Ｒ4、Ｒ5及びアセタール基の全てが同様の処理で脱離できる保護基であるのが望ましい。このような保護基としては、Ｒ1aとして酸で脱離できる保護基、Ｒ4としてトリチル基、Ｒ5としてｔ−ブチル基を選択するのが好ましい。
具体的なペプチド（１７）の脱保護方法としては、酸による脱保護、例えば無機酸やトリフルオロ酢酸等の存在下、エステル系またはエーテル系等の溶媒中、０〜４０℃、１〜４８時間反応させることで脱保護反応を行うことができる。
【００４０】
ペプチド（１８）の酸化反応は、例えば酢酸アンモニウム、活性炭を用いた空気酸化、またはヨウ素等を用いて行うことができる。オクトレオチド（Ａ）の塩としては、酢酸、塩酸、硫酸等の酸付加塩が好ましく、特に酢酸塩が好ましい。
【００４１】
さらに、オクトレオチド（Ａ）の好ましい化学構造は、下記である。
【００４２】
【化１２】
2016065050.tif 000013
【００４３】
また、上記の液相合成反応終了後の保護ペプチド（１７）は、オルト位及びパラ位に長鎖アルコキシ基を有するベンズアルデヒドによるアセタール保護がされているため、容易に結晶化でき、分離・精製が極めて容易である。従って、当該保護ペプチド（１７）を合成した時点で、洗浄、結晶化、再結晶等により、高純度に精製が可能である。
【００４４】
前記反応式において、アセタール保護された中間体は、全て新規化合物である。これらを総合すると、中間体は、式（Ｂ）で表される。
【００４５】
【化１３】
2016065050.tif 000014
【００４６】
（式中、Ｒ1は、水素原子、アミノ保護基、保護基を有していてもよいアミノ酸残基又は保護基を有していてもよいペプチド残基を示し、Ｒ2、Ｒ3、Ｘ、Ｙ及びＺは前記と同じ。）
【００４７】
ここで、保護基を有していてもよいアミノ酸残基、保護基を有していてもよいペプチド残基は、前記反応式中の基に該当する。式（Ｂ）の化合物の具体例としては、前記反応式中の（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、（１６）及び（１７）が挙げられる。このうち、（３）、（４）及び（１７）の化合物が特に合成中間体として重要である。
【００４８】
本発明方法によれば、前記の（３）、（４）、（１７）の化合物の晶析性が良好であるため、洗浄、結晶化、再結晶等により容易に分離精製が可能である。また、本発明方法（液相合成法）によれば、固相合成法に比べ、ジアステレオマーや欠損ペプチドといった除去困難な不純物が生じにくく、またできたとしても、中間工程で除去できる。また、固相合成法に比べ、中間体化合物を単離できるため、スラリー法や再結晶法など、操作が比較的容易で高価な設備投資を要しない濾過的精製法が実施可能であり、高純度の目的物を得ることが容易である。
固相合成法では、塩化メチレン等、使用する溶媒が限定されるのに比べ、液相合成法では、工業化に適した安全で安価な溶媒を使用することが可能である。固相合成法に比べ、大量合成が容易である。固相合成法では最終化合物の精製に「分取ＨＰＬＣ法」（一般的に高額の設備、大量の有機溶媒を要する）を使用することが多いが、粗体純度が低いためにその精製収率は低いものである。本液相合成法では粗体純度が高いため精製収率が高い。
【実施例】
【００４９】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００５０】
略語：
ｂＤまたはｂＤＣＨＯ：ビス（ドコシロキシ）ベンズアルデヒド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物
ＨＢＴＵ：Ｏ-（ベンゾトリアゾール−１−イル）-Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート
ＤＯＤＴ：３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジチオール
ＴＩＰＳ：トリイソプロピルシラン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
【００５１】
実施例
（１）Fmoc-Thr-acetal-bDの合成
【００５２】
【化１４】
2016065050.tif 000015
【００５３】
ｂＤＣＨＯ（３０ｇ；３９．６１ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ＯＬ（２６．０８ｇ；７９．２３ｍｍｏｌ）、カンファースルホン酸（０．４６ｇ；１．９８ｍｍｏｌ）をトルエン（１９８ｍＬ）に溶解させ、ディーンスターク装置を用いて１３０℃で還流した。６時間後、反応液を冷却しＤＩＰＥＡ（０．５１ｇ；３．９６ｍｍｏｌ）を加え、減圧濃縮した。濃縮残渣にアセトニトリル（１．８Ｌ）を加え、析出した固体をろ過により単離し、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ａｃｅｔａｌ−ｂＤ（４３．５９ｇ）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.76 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.63 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 7.40 (dd, J = 7.3, 7.3 Hz, 2H), 7.32 (dd, J = 7.3, 7.3Hz, 2H), 6.50 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1 H), 6.43 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 5.83 (s, 1H), 5.67 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.47 (dd, J = 10.6, 6.9 Hz, 1H), 4.40 (dd, J = 106, 6.9 Hz, 1H), 4.27 (dd, J = 6.9, 6.9 Hz, 1H), 4.18-4.03 (m, 3 H), 4.00-3.85 (m, 4 H), 3.65 (dd, J = 10.1, 1.8, 1H), 1.82-1.70 (m, 4 H), 1.48-1.38 (m, 4H), 1.37-1.13 (m, 75H), 0.88 (dd, J = 6.8, 6.8 Hz, 6H)
【００５４】
（２）H-Thr-acetal-bDの合成
【００５５】
【化１５】
2016065050.tif 000016
【００５６】
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ−ａｃｅｔａｌ−ｂＤ（４３．１６ｇ；４０．５４ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（４０５ｍＬ）、ＤＭＦ（４０５ｍＬ）の溶液にジエチルアミン（５９．３ｇ；８１０．７８ｍｍｏｌ）を加え室温で攪拌した。１時間後、減圧濃縮によりＴＨＦと余剰のジエチルアミンを留去した。アセトニトリル（１．７Ｌ×２）を加えた後、ろ過により粗Ｈ−Ｔｈｒ−ａｃｅｔａｌ−ｂＤ（３１．７ｇ）を単離した。粗体をヘキサン／ＴＨＦ（３：２）の混合液（９５ｍＬ）に溶解させ、シリカゲルカラムにより精製を行った。シリカゲルカラムの移動相はヘキサン／ＴＨＦ（３：２）→（２：３）→（１：４）→１００％ＴＨＦの条件で実施した。濃縮後、濃縮残渣にアセトニトリル（４００ｍＬ）を添加しろ過により精Ｈ−Ｔｈｒ−ａｃｅｔａｌ−ｂＤ（２２．５５ｇ）を２段階収率６８％で得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.48 (d, J = 8.2 Hz, 1 H), 6.47 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz,1 H), 6.41 (d, J = 2.3 Hz, 1 H), 5.81 (s, 1 H), 4.13-4.04 (m, 3 H), 3.97-3.89 (m, 4 H), 2.53 (d, J = 1.4 Hz, 1 H), 1.82-1.70 (m, 4 H), 1.50-1.21 (m, 81 H), 0.88 (dd, J = 6.9, 6.9 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 160.8, 157.2, 127.7, 119.5, 105.3, 99.9, 97.7, 76.0, 74.2, 68.3, 68.1, 49.2, 31.9 (2C), 29.7 (28C), 29.40 (2C), 29.38 (2C), 29.23, 29.21, 26.1, 26.0, 22.7 (2C), 17.9, 14.1 (2C).
【００５７】
（３）ペプチド鎖伸長工程
ａ）Ｆｍｏｃ基脱保護工程
Ｆｍｏｃ−ペプチド−アセタール−ｂＤ（１当量）をＴＨＦ／ＤＭＦの混合液（基質濃度５０ｍＭとなる液量；７：３）に溶解後、ジエチルアミン（２０当量）を加え、反応が完結するまで室温で攪拌する。減圧濃縮後、残存するジエチルアミンをＴＨＦ（２×５ｖ／ｗ）で共沸し、Ｈ−ペプチド−アセタール−ｂＤを得る。更なる精製は行わず次の縮合反応に用いる。
【００５８】
ｂ）縮合工程
余剰のジエチルアミンのＴＨＦ共沸による除去後、Ｆｍｏｃ脱保護工程で調製したＨ−ペプチド−アセタール−ｂＤに対しＢｏｃ／Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ（１．２当量）、ＨＯＢｔ・Ｈ2Ｏ（１．２当量）、ＨＢＴＵ（１．２当量）、ＤＩＰＥＡ（４．０当量）、ＴＨＦ（Ｈ−ペプチド−アセタール−ｂＤ濃度５０ｍＭとなる液量）を加える。反応終了後、反応液を減圧濃縮しアセトニトリル（１×６０ｖ／ｗ；３×２０ｖ／ｗ）を加え単離する。
ａ）Ｆｍｏｃ基脱保護工程とｂ）縮合工程を繰り返してアミノ酸を順次結合し、全保護体Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-acetal-bDを合成した。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.06 (m, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.58-7.29 (m, 16H), 7.29-7.06 (m, 27H), 7.06-6.89 (m, 7H), 6.70 (m, 1H), 6.64 (brs, 1H), 6.50 (m, 1H), 6.45-6.38 (m, 2H), 5.80 (s, 1H), 4.90 (m, 1H), 4.61 (m, 1H), 4.35 (m, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.21-4.02 (m, 5H), 4.02-3.82 (m, 7H), 3.37-3.11 (m, 4H), 3.11-2.92 (m, 3H), 2.91-2.74 (m, 2H), 2.60-2.38 (m, 3H), 1.81-1.72 (m, 4H), 1.69 (s, 18H), 1.65 (s, 9H), 1.48-1.20 (m, 82H), 1.18 (s, 9H), 1.14 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.88 (dd, J = 6.6, 6.6 Hz, 6H).
【００５９】
（４）H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OHの合成
Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-acetal-bD →H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH
５℃に冷却したＴＦＡ／１−ｄｏｄｅｃａｎｅｔｈｉｏｌ／ＤＯＤＴ／ＴＩＰＳ／Ｈ2Ｏ(80:9:9:1:1)の混合液１５４ｍＬにＢｏｃ−８ｍｅｒ−ａｃｅｔａｌ−ｂＤ（２０ｇ；７．６９ｍｍｏｌ）を加えた。５分後、反応液を室温まで昇温し、１．５時間攪拌した。ＴＦＡをジクロロメタン（１００ｍＬ）で共沸した後、アセトニトリル（２００ｍＬ）を加え３０分間攪拌しろ過によりｂＤＣＨＯ残渣を除去した。このろ液を減圧濃縮後ジイソプロピルエーテル（２×２００ｍＬ）を加え固体をろ過しH-D Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH（１１．７１ｇ）を得た。
【００６０】
（４）オクトレオチドの合成
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH → octreotide
H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH（７．０ｇ；６．８５ｍｍｏｌ）をTHF（９３１ｍＬ）と０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液（４６９ｍＬ）の溶液に加えた。ここに活性炭（０．７ｇ）を加え室温で攪拌した。反応終了後、活性炭をろ過により除去した。ＴＨＦを減圧濃縮により除き、残渣の水溶液を凍結乾燥し、ＨＰＬＣ純度８５．６％で粗オクトレオチド(７．５ｇ)を得た。これを分取ＨＰＬＣ精製に用いた。
ESI-MS: [M+H]+ 1019