(57)【要約】【課題】筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する新規な方法並びに筋萎縮性側索硬化症の新規な治療剤及び該治療剤をスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法は、被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが特定のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである。筋萎縮性側索硬化症の治療剤をスクリーニングする方法は、特定のｍｉＲＮＡ少なくとも１つの発現量を指標とする。筋萎縮性側索硬化症の治療剤は、特定のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチド又は補充するオリゴヌクレオチドを有効成分とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【請求項２】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが表１、表３及び表５に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、ｍｉＲＮＡの増大が筋萎縮性側索硬化症に罹患している可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが表２、表４及び表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、ｍｉＲＮＡの減少が筋萎縮性側索硬化症に罹患している可能性が高いことを示す、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記試料が血液であり、前記ｍｉＲＮＡが表１及び表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲＮＡが表１中及び表２中の「好適」欄に丸印が付けられているｍｉＲＮＡである請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記試料が脳脊髄液であり、前記ｍｉＲＮＡが表３及び表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍｉＲＮＡが表３中及び表４中の「好適」欄に丸印が付けられているｍｉＲＮＡである請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、筋萎縮性側索硬化症に対する治療を行った被験者から採取された試料である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１中に示す表１〜表６に記載したｍｉＲＮＡ少なくとも１つの発現量を指標とする、筋萎縮性側索硬化症の治療剤をスクリーニングする方法。
【請求項１０】
請求項１中に示す表５に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
【請求項１１】
請求項１中に示す表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを補充するオリゴヌクレオチドを有効成分とする、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法並びに筋萎縮性側索硬化症の治療剤及び該治療剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
認知症を含む神経変性疾患は、一般に進行性であり、脳神経細胞の不可逆的な変性を伴うことから、早期に診断し治療を開始することが重要である。しかし、現時点では有効なバイオマーカーが確立されておらず、血清学的検査による診断法は確立されておらず、また確実な治療法も確立されていない。その結果、疾患は進行し、かつ難治性であるために、日常生活が破壊される状況となり、患者本人の肉体的負担のみならず、家族にも多大の負担を来している。このように、神経変性疾患は患者本人だけでなく、長期にわたり介護者にも多大な負担が及ぶことから、社会全体の活力の大きな損失につながるという実態がある。超高齢化社会が進む我が国では、神経変性疾患対策が国家的な重要課題となってきている。すなわち、（１）高齢化社会における医療福祉行政の基幹的課題であること、（２）認知症による膨大な経済的損失（年間5兆円相当ともいわれる）を軽減すること、（３）医療イノベーションで日本発の革新的治療法の開発を推進し、日本の医薬品輸入赤字（２兆円超）を解消すること、（４）国の5ヵ年計画（2012）で対策が必要な重点疾患（がん、難病・希少疾病、肝炎、感染症、糖尿病、脳心血管疾患、精神神経疾患、小児疾患）に指定されていること、などである。これらの疾患の診断と治療に役立つ新たなバイオマーカーの開発、検査診断薬、治療薬、治療法の開発が緊急の課題となっている。
【０００３】
検査診断法の疾患関連バイオマーカーが特定され、血清学的診断法により簡便に早期の診断及び病態のモニタリングが実施できるようになれば、早期治療が可能となり、多くの患者の不可逆的なダメージを最小限に抑えることが可能となる。早期診断が可能となれば、患者だけでなく介護者のＱＯＬの向上、ひいては超高齢化を迎えた日本社会全体の活力の維持にも大きく貢献することは間違いない。治療法に関しては、病態改善薬のみならず、進行抑制薬も十分に医療上の意義が高いことから、疾患関連バイオマーカーの神経系に対する機能の解析も重要になっている。
【０００４】
神経変性疾患の発症や病態に関わる生体内因子は、遺伝子から細胞まで広く研究されているが、未解明な部分が非常に多く、未だに診断や治療につながる有用なバイオマーカーは見出されていない。難治性神経変性疾患のうちでも、筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis：ＡＬＳ）は重篤な神経機能障害と死に至る疾患であり、診断と病態管理に有用なバイオマーカーの開発と治療法の開発は緊急の課題となっている。
【０００５】
近年、生体内因子の重要な因子として、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡと略す）が注目されている。ｍｉＲＮＡは、約２２塩基の蛋白質非翻訳ＲＮＡ（small non-coding RNA）であり、ヒトには約2000種類が存在することが示唆されている。ｍｉＲＮＡは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目される。ゲノム上には各ｍｉＲＮＡ遺伝子の領域が存在し、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写され、約数百塩基のｍｉＲＮＡ初期転写産物が形成される。ｍｉＲＮＡ初期転写産物は核内でＤｒｏｓｈａ、細胞質内でＤｉｃｅｒと呼ばれる２種類のＲＮａｓｅ III酵素によってプロセシングされ、成熟ｍｉＲＮＡが形成される。成熟ｍｉＲＮＡは制御タンパク質複合体（RNA-induced silencing complex：ＲＩＳＣ）と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し、遺伝子の発現を抑制することが知られている。
【０００６】
ｍｉＲＮＡはヒト疾患に広く関連が示唆されているが、特にがんとｍｉＲＮＡの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのｍｉＲＮＡの発現様式が異なることから、発がん過程へのｍｉＲＮＡ発現異常の関与が強く示唆され、ｍｉＲＮＡの産業上の利用に関しても、がんの領域での利用が主体であったが、ようやく各種疾患に対する創薬への利用が報告され始めてきた（非特許文献１）。
【０００７】
神経疾患分野においては、損傷後の神経の再生にｍｉＲＮＡを利用する方法（特許文献１）や多能性ストローマ細胞のニューロン分化を刺激する方法（特許文献２）が報告されているほか、本発明者らも神経変性疾患のバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡの開発を進めてきた（特許文献３）。
【０００８】
ＡＬＳにおけるｍｉＲＮＡの関連性の研究はようやく始まったところであり、マウスモデルでmiR-206の不足が病態を悪化させるという報告（非特許文献２）や、TDP-43結合性miRNAのmiR-132-5p, miR-132-3p, miR-143-5p, miR-143-3p、let-7bがＡＬＳ患者血漿中で減少しているという報告（非特許文献３）など少数の報告があるにすぎない。進行性で内因的な因子の関与が大きいと考えられるＡＬＳでは、早期診断バイオマーカーの同定によって疾患の進行を抑制する技術がまず求められるほか、治療薬の標的となる内因性の疾患関連遺伝子を同定することが求められているが、ｍｉＲＮＡはその目的に適った対象因子と考えることができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表2011-515407号公報
【特許文献２】特表2012-530054号公報
【特許文献３】特開2013-138637号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】臨床・創薬利用が見えてきたmicroRNA、遺伝子医学MOOK23  2012.
【非特許文献２】Williams AH et al., Science.2009;326(5959):1549-1554.
【非特許文献３】Freischmidt A et al., Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):42. doi: 10.1186/2051-5960-1-42.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のとおり、難治性のＡＬＳに対する検査法や治療法は確立しておらず、医療上の大きな課題になっている。疾患に関与すると言われているｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子に関して、ＡＬＳにおけるバイオマーカーとなり得るｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子を見出し、その利用方法を確立すれば、新しい検査診断法、病態モニタリング法、さらには治療薬への応用が可能となる。
【００１２】
本発明の目的は、ＡＬＳの検出を補助する新規な方法並びにＡＬＳの新規な治療剤及び該治療剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＡＬＳ患者から採取された試料において、特定のｍｉＲＮＡが健常人と比較して増大したり減少したりしていることを見出し、これに基づいてＡＬＳの検出を補助できることを見出した。また、ＡＬＳ患者において増大しているｍｉＲＮＡを抑制するオリゴヌクレオチドが、ＡＬＳの治療に有効であることに想到した。さらに、これらのｍｉＲＮＡの増減を指標として、ＡＬＳの治療剤をスクリーニングできることに想到した。
【００１４】
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
(1)  被験者から採取した試料中のｍｉＲＮＡを測定する工程を含み、前記ｍｉＲＮＡが表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
【表２】
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【００１７】
【表３】
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【００１８】
【表４】
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【００１９】
【表５】
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【００２０】
【表６】
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【００２１】
(2)  前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが表１、表３及び表５に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、ｍｉＲＮＡの増大が筋萎縮性側索硬化症に罹患している可能性が高いことを示す、(2)記載の方法。
(3)  前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡが表２、表４及び表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つであり、ｍｉＲＮＡの減少が筋萎縮性側索硬化症に罹患している可能性が高いことを示す、(1)記載の方法。
(4)  前記試料が血液であり、前記ｍｉＲＮＡが表１及び表２に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、(1)〜(3)のいずれか１項に記載の方法。
(5)  前記ｍｉＲＮＡが表１中及び表２中の「好適」欄に丸印が付けられているｍｉＲＮＡである(4)記載の方法。
(6)  前記試料が脳脊髄液であり、前記ｍｉＲＮＡが表３及び表４に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つである、(1)〜(3)のいずれか１項に記載の方法。
(7)  前記ｍｉＲＮＡが表３中及び表４中の「好適」欄に丸印が付けられているｍｉＲＮＡである(6)記載の方法。
(8)前記試料が、筋萎縮性側索硬化症に対する治療を行った被験者から採取された試料である、(1)〜(7)のいずれか１項に記載の方法。
(9)  (1)中に示す表１〜表６に記載したｍｉＲＮＡ少なくとも１つの発現量を指標とする、筋萎縮性側索硬化症の治療剤をスクリーニングする方法。
(10)  (1)中に示す表５に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを抑制するオリゴヌクレオチドを有効成分とする、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
(11)  (1)中に示す表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを補充するオリゴヌクレオチドを有効成分とする、筋萎縮性側索硬化症の治療剤。
【００２２】
本発明により、ＡＬＳの検出を補助する新規な方法並びにＡＬＳの新規な治療剤及び該治療剤をスクリーニングする方法が提供された。本発明の方法によれば、被験者試料を対象にした簡便な遺伝子検査方法により、ＡＬＳの検出を補助することができる。好ましくは、ＡＬＳの進行に伴う病態を把握することができる。また、本発明におけるｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子を同疾患の検査診断並び治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】下記実施例において測定された、ＡＬＳ患者の血漿中、ＣＳＦ中、ＦＦＰＥ中で検出された同種ｍｉＲＮＡの発現変動値の散布図である。ＦＦＰＥ中のｍｉＲＮＡの変動を正から負にプロットし、それに対応する同種の血漿中ｍｉＲＮＡとＣＳＦ中のｍｉＲＮＡを対応させてプロットしてある。３種の間では明確な相関は見られず、血漿では変動幅は小さく、ＣＳＦとＦＦＰＥでは変動幅は大きい。
【図２】下記実施例において実験的に確認された、ＦＦＰＥ中で変動したｍｉＲＮＡを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の検出方法では、ＡＬＳを検出するバイオマーカーとして、上記表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを使用する。これらは好ましくはＡＬＳの進行に伴う病態把握用のバイオマーカーに用いることができる。該ｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物は、単独の使用も、複数の使用も、いずれも可能である。精度を高めるためには、複数を組み合わせて使用する方が好ましく、また、公知のｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物を組み合わせて利用することもできる。
【００２５】
表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡは、いずれも下記実施例において、下記実施例に記載する方法により実験的に確認されたものである。上記表１は、ＡＬＳ患者血漿中で増大しているｍｉＲＮＡ、表２はＡＬＳ患者血漿中で減少しているｍｉＲＮＡ、表３は、ＡＬＳ患者ＣＳＦ中で増大しているｍｉＲＮＡ、表４は、ＡＬＳ患者ＣＳＦ中で減少しているｍｉＲＮＡ、表５は、ＡＬＳ患者脳運動野で増大しているｍｉＲＮＡ、表６はＡＬＳ患者脳運動野で減少しているｍｉＲＮＡを示している。なお、ここで、「増大」及び「減少」は、表１〜表４では、健常人と比較してそれぞれ「増大」及び「減少」しているという意味であり、表５及び表６では、ＡＬＳ患者の非疾患部分と比較してそれぞれ「増大」及び「減少」しているという意味である。健常人との比率が大きいほど、検出の感度が高いと考えられるので、増大している場合には、健常人又は非疾患部位との比率が1.10以上、さらには1.20以上のものが好ましく、減少している場合には、健常人又は非疾患部位との比率が0.90以下、さらには0.80以下のものが好ましい。
【００２６】
図1に示すように、ＡＬＳの臨床検査には血漿とＣＳＦが利用できるが、血漿の方が明らかに利便性が高い。ただし、血漿中のｍｉＲＮＡの変動は全身状態を現していると考えられるので、より神経変性及び神経筋接合部を反映するＣＳＦのｍｉＲＮＡと同様の挙動をするｍｉＲＮＡに絞るのが好ましい。
【００２７】
表１は血漿中で増大したｍｉＲＮＡと共通するＣＳＦ中ｍｉＲＮＡをまとめたもの、表２は血漿中で減少したｍｉＲＮＡ共通するＣＳＦ中ｍｉＲＮＡをまとめたものであるが、表中で「好適」と示したものは、血漿中とＣＳＦ中で共通した増減の変動をしたｍｉＲＮＡであり、中枢神経系の異常をより反映していると思われるので、これらをＡＬＳの血漿バイオマーカーとして用いるのが好ましい。
【００２８】
表３はＣＳＦ中で増大したｍｉＲＮＡと共通するＦＦＰＥ中ｍｉＲＮＡをまとめたもの、表４はＣＳＦで減少したｍｉＲＮＡと共通するＦＦＰＥ中ｍｉＲＮＡをまとめたものであるが、表中で「好適」と示したものは、ＣＳＦ中とＦＦＰＥ中で共通した増減の変動をしたｍｉＲＮＡであり、脳病巣部位の異常をより反映していると思われるので、これらをＡＬＳのＣＳＦ中バイオマーカーとして用いるのが好ましい。
【００２９】
表１〜表４のｍｉＲＮＡを組み合わせて測定することにより、より高精度にＡＬＳを検出できる。
【００３０】
また、表５に記載の増大したｍｉＲＮＡを減少させる作用を有するオリゴヌクレオチド類の核酸医薬を投与して過剰なｍｉＲＮＡの作用を抑制することは、ＡＬＳの治療に有用な薬剤を提供することができる。
【００３１】
あるいは、表６に記載の減少したｍｉＲＮＡと同様の作用を有するオリゴヌクレオチド類の核酸医薬を投与して減少したｍｉＲＮＡの作用を補充することは、ＡＬＳの治療に有用な薬剤を提供することができる。
【００３２】
表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡの配列は公知のデータベース（miRBase：http://www.mirbase.org/）から入手することができる。それぞれの名称とＩＤを表１〜表６に示した。
【００３３】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡ又はその標的遺伝子のｍＲＮＡを使用する場合、それ自体公知の遺伝子検査方法、例えば、核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法や、ＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ法により、測定することができる。測定機器で言えば、マクロアレイ、マイクロビーズ、イメージスキャナー、次世代シークエンサー、質量分析装置などが用いられる。
【００３４】
また、本発明の検出方法においてバイオマーカーとしてｍｉＲＮＡの標的遺伝子がコードするポリペプチドを使用する場合、それ自体公知のタンパク質分析方法、例えば、抗体を用いる免疫学的分析方法、電気泳動等の生化学的分析方法や質量分析方法により実施することができ、臨床検査用の自動分析機を使用することもできる。
【００３５】
本発明方法で用いる試料としては、例えば、脳疾患部位、脳脊髄液、血液試料（例えば、末梢血、血漿、血清）、唾液、涙液、鼻汁、尿、リンパ液、その他の体液、好ましくは、脳疾患部位やその周辺部位（脳脊髄液等）を用いることができる。さらには生検で採取された臓器組織、病理組織、細胞、又はそれらからの抽出成分も利用できる。
本発明の検出方法においてＡＬＳバイオマーカーとして用いる表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡは、ＡＬＳの患者に対して行う各種治療の効果を判定するために使用することもできる。
【００３６】
本発明の治療効果判定方法は、ＡＬＳに対する治療を行った対象から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ及び／又はその標的遺伝子の遺伝子産物を測定する工程を含む。
【００３７】
本発明の治療効果判定方法において、ＡＬＳ患者に対する治療効果を判定する場合には次のような手順で行うことができる。表１に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者血漿中では、そのｍｉＲＮＡ濃度が健常者よりも高い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ濃度が、治療を行うことにより低下した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても低下しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ濃度が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。
【００３８】
また、ＡＬＳ患者に対する治療効果を判定する場合には、次のような手順で行うことができる。表２に記載のＡＬＳ検出用ｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして用いる場合、当該治療を行う前のＡＬＳ患者血漿中では、そのｍｉＲＮＡ濃度が健常者よりも低い数値を示す傾向がある。当該ｍｉＲＮＡ濃度が、治療を行うことにより上昇した場合、その治療は効果があったと判定することができる。一方、治療を行っても上昇しなかった場合には、その治療は効果がなかったと判定することができる。ただし、ｍｉＲＮＡは複数種で個々に標的遺伝子の発現制御を行っていることが推定されるので、個々のｍｉＲＮＡ値が協調的に変動せずともよく、臨床症状の状態を勘案して治療効果が判定される。
【００３９】
本発明の治療方法では、表１、表３、表５に示した、ＡＬＳ患者血漿中で増大しているｍｉＲＮＡを患者体内において抑制することにより、ＡＬＳを治療することができる。
【００４０】
また、本発明の治療方法では、表２、表４、表６に示した、ＡＬＳ患者血漿中で減少しているｍｉＲＮＡを補充するなどして患者体内において増大させることにより、ＡＬＳを治療することができる。なお、本明細書において、用語「治療」には、疾患発症後の患者を処置する狭義の「治療」と、疾患発症前の患者を処置する「予防的療法」が含まれる。
【００４１】
生体内のｍｉＲＮＡを抑制する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、例えば、対象ｍｉＲＮＡの全長または一部とハイブリダイズ可能な相補的配列を含むオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を投与することによって行うことができる。
【００４２】
上記の抑制性オリゴヌクレオチドを患者に投与する方法としては、それ自体公知の方法に従って実施することができ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、リン脂質膜をもつリポソームに封入する方法、エキソソームを模倣したリポソームに封入する方法、コラーゲンとの複合体として徐放化させる方法、ＲＮＡの糖部分のＯ(酸素) をＳ (硫黄) で置き換えた４’−チオＲＮＡ化による化学修飾体の利用、オリゴヌクレオチドの糖の部分を２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルに修飾した化学修飾体の利用、などで生体内において安定的に補充する核酸補充法として実施することができる。同時に、ｍｉＲＮＡは複数分子で標的遺伝子を制御する可能性が高いため、上記の核酸補充法に関しても、複数の核酸カクテルによる補充を好んで用いることができる。これらは、本発明における医薬組成物である。
【００４３】
本発明の医薬組成物は、ＡＬＳの治療に用いることができ、有効成分として、表１、表３、表５に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（その全長または一部）に対する抑制性オリゴヌクレオチド、表２、表４、表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つ（その全長または一部）と同様の作用を有するオリゴヌクレオチド（好ましくはｍｉＲＮＡ）から選んだ、少なくとも１つを含むことができ、所望により、製薬学的に許容される担体を更に含むことができる。
【００４４】
本発明の検出方法においてバイオマーカーとして用いる表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡ、特に表５、表６に記載の標的遺伝子の遺伝子産物は、ＡＬＳの治療薬をスクリーニングするために使用することができる。
【００４５】
本発明において、ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物を標的とする候補物質（例えば化合物）をスクリーニングする方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、直接標的分子に結合する候補物質を分光学的な変化や表面プラズモン共鳴で調べる方法（いわゆるハイスループットスクリーニング）や培養細胞に候補物質を暴露させて培養細胞中の標的（ｍｉＲＮＡまたはその標的遺伝子の遺伝子産物）の発現を調べる方法などが適用される。さらにｉｎ  ｖｉｖｏでは、神経変性モデル動物において、ＡＬＳ症状またはＡＬＳ病理像の改善を指標とした方法などが適用される。
【００４６】
例えば、本発明のスクリーニング方法の内、表１〜表６に記載の標的遺伝子でコードされるポリペプチドを利用する態様では、前記の各種ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて実施することができる。本態様では、例えば、当該ポリペプチド又はそれを発現する細胞、組織、若しくは動物個体（特には非ヒト動物）と、候補物質とを接触させる工程、および前記候補物質とポリペプチドとの結合、前記ポリペプチドの発現量変化若しくは活性変化、又は動物固体における症状変化を分析する工程を含む方法により、実施することができる。
【００４７】
また、本発明のスクリーニング方法の内、表１〜表６に記載のｍｉＲＮＡの標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を指標とする態様では、例えば、候補物質を培養細胞、組織、又は動物個体（特には、非ヒト動物）に投与する工程、前記個体から試料を採取する工程、および前記試料中のｍｉＲＮＡ又はｍＲＮＡを測定する工程を含む方法により、実施することができる。
【００４８】
本発明のスクリーニング方法で評価する候補物質は、特に限定されるものではないが、各種化合物に加え、各種抽出物、例えば、微生物の培養上清、各種生物若しくはその組織由来の天然成分若しくは抽出物を挙げることができる。また、使用する細胞は、組織から分離された培養細胞、樹立された培養細胞株、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが、非ヒト動物においては、特定遺伝子のノックアウトあるいはノックインの処理を施したモデルマウス、モデルラットなどを挙げることができる。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法において、表１、表３、表５に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を減少させることができる物質をＡＬＳの治療薬の候補として選択することができる。又は表２、表４、表６に記載のｍｉＲＮＡの少なくとも１つを測定する場合、そのｍｉＲＮＡ量を増大させることができる物質をＡＬＳの治療薬の候補として選択することができる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【００５１】
《実施例１：ＡＬＳ患者検体中のｍｉＲＮＡの測定と解析》
臨床試料は被験者本人の同意の下に採取された。被験者の内訳は下表に示すとおりである。
【００５２】
【表７】
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【００５３】
採血は被験者の上腕静脈から２０ｍＬの末梢血を採取し、速やかに４℃、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心処理し、上清（血漿）を０．６ｍＬずつポリプロピレンチューブに分注して−８０℃で凍結保存した。凍結保存した試料０．３ｍＬから、ＲＮＡを抽出してｍｉＲＮＡを測定した。
【００５４】
ＣＳＦは、被験者に対して腰椎穿刺を行い約３ｍＬを採取した。採取後、速やかに４℃、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心処理し、上清（血漿）を０．６ｍＬずつポリプロピレンチューブに分注して−８０℃で凍結保存した。凍結保存した各群３例から、それぞれＲＮＡ抽出後、マイクロアレイによるｍｉＲＮＡ分析を行った。
【００５５】
マイクロアレイ分析は３Ｄ-ｇｅｎｅチップ（東レ（株）製）を用い、メーカー指定のｍｉＲＮＡ抽出液並びにハイブリダイゼーション試薬セットとHuman miRNA Oligo chip（データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約１８００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載）で行った。
【００５６】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）標本は、確定診断されたＡＬＳ患者の脳運動野病巣部位、及び正常対照群として健常者脳の正常部位を、剖検後に採取し、リン酸緩衝１０％ホルマリン液にて３〜１６週間固定し、パラフィンにて包埋し、サンプルをスライスしてＦＦＰＥ標本とした。５ミクロンスライスのＦＦＰＥ標本からのＲＮＡ抽出は、キシレンにてパラフィンを除去した後、ProteinaseKでタンパク質を分解し、ArcturusR ParadiseR PLUS FFPE RNA Isolation Kit (Life Technologies社, USA)にて行った。マイクロアレイ分析は3D-Geneチップ（東レ（株）製）を用い、メーカー指定のｍｉＲＮＡハイブリダイゼーション試薬セットとHuman miRNA Oligo chip（データベースmiRBase Release17.0から選定したヒト約１８００種のｍｉＲＮＡプローブを搭載）で行った。
【００５７】
マイクロアレイ上のプローブに結合したｍｉＲＮＡのシグナル値は、3D-Gene Scanner （東レ（株）製）で読み取り、3D-Gene Extraction software （東レ（株）製）で標準化（global normalization）して用いた。十分なシグナル/ノイズ値を得るためのカットオフシグナル値を５０として、シグナル値５０以上の検出を集計した。健常対照群に対する患者群のシグナル強度の変化を変動率（Fold change）として求め、変動率はLｏｇ２Ｘ表記で表した。Lｏｇ２Ｘ表記の変動率で「0.1以上」を「増大したｍｉＲＮＡ（upregulated miRNA）」、「-0.1以下」を「減少したｍｉＲＮＡ（downregulated miRNA）」と規定し、検体間の比較を行った。
【００５８】
ｍｉＲＮＡの標的分子から、検出されたｍｉＲＮＡの遺伝子機能発現に対する影響を推定できるため、ｍｉＲＮＡの標的遺伝子予測をオンラインウェッブツールであるmiRmap(http://mirmap.ezlab.org/)を用いて行い、予測された標的遺伝子の機能解析（Gene ontology, Biological process）をパスウェイ解析ソフトMetaCore(ver6.20, Thomson Reuter/GeneGO, http://thomsonreuters.com/metacore/)にて行った。このバイオインフォマティクス解析から、同定されたｍｉＲＮＡがどのような遺伝子を標的として、どのような細胞内イベントや細胞機能に関与しているかが推測できる。
【００５９】
《実施例２：ＡＬＳ患者検体中のｍｉＲＮＡの測定と解析》
実施例１の条件で分析し、検出されたｍｉＲＮＡは、血漿中では２８９種、ＣＳＦ中では２５２種、ＦＦＰＥ中では３６３種であった。これらのうち、３種の検体で共通していたｍｉＲＮＡは１７１種であった。この共通した１７１種の増減の変動も共通していれば、ＡＬＳの脳内病巣におけるｍｉＲＮＡの変動は血漿中ｍｉＲＮＡにも反映されていると考えることが期待できるが、結果は図１のとおりで、３種の検体で異なるプロフィールであった。これは、血漿中ｍｉＲＮＡは全身の病態を反映し、ＣＳＦ中ｍｉＲＮＡは中枢神経組織中の病態を反映し、ＦＦＰＥ中のｍｉＲＮＡは脳病巣部位の変化を反映するからと考えられる。この仮説を調べるために、それぞれの検体で増大したトップ５のｍｉＲＮＡ（ＦＦＰＥはトップ６）を抽出し、それぞれのｍｉＲＮＡの標的遺伝子を予測して、これら遺伝子の機能をオンロジー解析で推定してみると下記表８のとおりであった。すなわち、血漿中のｍｉＲＮＡの発現増大は組織形成・細胞分化や細胞内代謝の制御に及び、ＣＳＦ中のｍｉＲＮＡの発現増大は神経発生・神経組織発達や組織形成の制御に及び、ＦＦＰＥ中のｍｉＲＮＡの発現増大はタンパク質輸送・有機物輸送や神経発達に及ぶということであり、ＡＬＳの病態の反映としては、ＣＳＦとＦＦＰＥのｍｉＲＮＡが最も直接的であることが示唆されている。
【００６０】
【表８】
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【００６１】
図１に示すように、ＡＬＳでは血漿とＣＳＦでｍｉＲＮＡに変動が見られるため、臨床検査にはこれら変動する血漿とＣＳＦが利用できるが、血漿の方が明らかに利便性が高い。ただし、血漿中のｍｉＲＮＡの変動は全身状態を現していると考えられるので、より神経変性及び神経筋接合部を反映するＣＳＦのｍｉＲＮＡと同様の挙動をするｍｉＲＮＡに絞るのが好ましい。
【００６２】
《実施例３：診断用のＡＬＳ患者血漿中のｍｉＲＮＡの解析》
ＡＬＳの臨床検査には血漿とＣＳＦが利用できるが、血漿の方が明らかに利便性が高い。ただし、血漿中のｍｉＲＮＡの変動は全身状態を現していると考えられるので、より神経変性及び神経筋接合部を反映するＣＳＦのｍｉＲＮＡと同様の挙動をするｍｉＲＮＡに絞るのが好ましい。すなわち、ＣＳＦ中で増大したｍｉＲＮＡと血漿中で増大した同種のｍｉＲＮＡの組み合わせやＣＳＦ中で減少したｍｉＲＮＡと血漿中で減少した同種のｍｉＲＮＡの組み合わせが、臨床検査におけるバイオマーカーとして好ましい。表１は血漿中で増大したｍｉＲＮＡと共通するＣＳＦ中ｍｉＲＮＡをまとめたものであるが、表中で「好適」と示したものは、血漿中とＣＳＦ中で増大したｍｉＲＮＡであり、これらを血漿バイオマーカーとして用いるのが好ましい。
【００６３】
表２は血漿中で減少したｍｉＲＮＡと共通するＣＳＦ中ｍｉＲＮＡをまとめたものであるが、表中で「好適」と示したものは、血漿中とＣＳＦ中で減少したｍｉＲＮＡであり、これらを血漿バイオマーカーとして用いるのが好ましい。
【００６４】
《実施例４：診断用のＡＬＳ患者ＣＳＦ中のｍｉＲＮＡの解析》
ＡＬＳの臨床検査には血漿とＣＳＦが利用できるが、ＣＳＦの方が病態管理の有用性が高い。ただし、ＣＳＦ中のｍｉＲＮＡの変動で脳運動野病巣部のＦＦＰＥのｍｉＲＮＡと同様の挙動をするｍｉＲＮＡに絞れば、より病巣を反映していると考えられる。表３はＣＳＦ中で増大したｍｉＲＮＡと共通するＦＦＰＥ中ｍｉＲＮＡをまとめたものであるが、表中で「好適」と示したものは、ＣＳＦ中とＦＦＰＥ中で増大したｍｉＲＮＡであり、これらを血漿バイオマーカーとして用いるのが好ましい。
【００６５】
表４はＣＳＦ中で減少したｍｉＲＮＡと共通するＦＦＰＥ中ｍｉＲＮＡをまとめたものであるが、表中で「好適」と示したものは、ＣＳＦ中とＦＦＰＥ中で減少したｍｉＲＮＡであり、これらをＣＳＦバイオマーカーとして用いるのが好ましい。
【００６６】
《実施例４：創薬標的となるＡＬＳ患者ＦＦＰＥ中の増大したｍｉＲＮＡの解析》
創薬標的となるｍｉＲＮＡはＦＦＰＥで変動したｍｉＲＮＡを挙げることができる。表５はＦＦＰＥ中で増大した図２はＦＦＰＥ中で変動したｍｉＲＮＡを、表６はＦＦＰＥ中で減少したｍｉＲＮＡの上位５０種をまとめたものであるが、これらはいずれも創薬標的として利用できる。さらにこの中で選ぶとすれば、図２に示したように、検出されたｍｉＲＮＡをシグナル強度順にプロットしたとおり、シグナル値の低い方で大きな変動が起きていることから、増大したｍｉＲＮＡを６種、減少した８種が選定できた。
【００６７】
上記表８は、増大した上位６種のｍｉＲＮＡと予測された標的分子であり、これらの標的遺伝子はｍｉＲＮＡによって抑制されるので、機能低下を起こしている可能性を示唆している。神経筋伝達に関係する遺伝子も多い。治療には、これらｍｉＲＮＡに対するｓｉＲＮＡなどの抑制性核酸の利用や、これらのｍｉＲＮＡを抑制する化合物をスクリーニングして得ることで治療薬への応用が可能となる。
【００６８】
下記表９は減少した上位８種のｍｉＲＮＡと予測された標的分子であり、これらの標的遺伝子はｍｉＲＮＡの抑制が減少するので、機能増大している可能性を示唆している。治療への応用には、こちらのｍｉＲＮＡの補充療法が考えられる。
【００６９】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明は、ＡＬＳの検査診断並びに治療に利用することができる。さらに、同疾患の治療薬となる化合物のスクリーニングに利用することができる。
【図１】
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【図２】
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