(57)【要約】【課題】γ−グルタミルバリルグリシン結晶を効率的に製造できる方法を提供すること。【解決手段】γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得るγ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法であって、前記晶析が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムから選択される少なくとも１つの化合物を含む塩析剤と、前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液とを接触させることを特徴とする、γ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得るγ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法であって、前記晶析が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムから選択される少なくとも１つの化合物を含む塩析剤と、前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液とを接触させることを含む、γ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法。
【請求項２】
前記塩析剤が、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液の溶媒の質量を１００質量％とした場合、前記塩析剤の量が、１質量％〜９０質量％である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液の溶媒が水である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記晶析が、ｐＨ２〜４の範囲で行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記晶析が、
（１）前記塩析剤と、前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液とをｐＨ２〜４にて接触させる接触工程、及び
（２）前記（１）接触工程で得られた溶液を０．５〜４８時間、０〜５０℃で撹拌することによりγ−グルタミルバリルグリシン結晶を晶析する結晶析出工程、
を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記晶析が、さらに
（３）前記（２）結晶析出工程で得られたγ−グルタミルバリルグリシン結晶と溶媒とを分別し、洗浄液で洗浄する分別・洗浄工程、及び
（４）前記（３）分別・洗浄工程で得られたγ−グルタミルバリルグリシン結晶を乾燥する乾燥工程、
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記晶析におけるγ−グルタミルバリルグリシンの晶析率が５５〜９５％である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により製造される、γ−グルタミルバリルグリシン結晶。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法、及び当該方法により得られたγ−グルタミルバリルグリシン結晶に関する。具体的には、本発明は、γ−グルタミルバリルグリシン溶液を、特定の塩析剤を使用して晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得るγ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
γ−グルタミルバリルグリシン（γ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ）は、食品にコク味を与えるペプチドとして知られている（特許文献１）。γ−グルタミルバリルグリシンは、例えば、化学合成法または酵素法により製造される。中でも、酵素法によりγ−グルタミルバリルグリシンを製造する場合、例えば、バリルグリシン又はその塩をγ−グルタミルトランスフェラーゼ（γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、以下、「GGT」とも言う）の存在下にグルタミンのようなグルタミル基供与体を作用させ、γ−グルタミルバリルグリシンを含む溶液を得た後、当該溶液からγ−グルタミルバリルグリシンを得ることが行われる（非特許文献１）。
かかるγ−グルタミルバリルグリシンを含む溶液からγ−グルタミルバリルグリシンの結晶を得る方法として、当該溶液を冷却する冷却法、アルコールなどの貧溶媒を添加する貧溶媒添加法、当該溶液中の溶媒を蒸発させる濃縮法等の方法が一般的に用いられる（特許文献２）。しかしながら、冷却による方法や濃縮による方法は、追加の工程が必要となったり、γ−グルタミルバリルグリシンの水への高い溶解度に起因する収率の低下といった問題があった。また、アルコールなどの貧溶媒を添加する方法は、収率を向上できる利点があるものの、アルコールのような危険物の取り扱いに注意を要していた。
そこで、より簡便にγ−グルタミルバリルグリシン溶液からγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得る方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際出願第２００７／０５５３９３号公報
【特許文献２】国際出願第２０１４／０２５０２３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Suzuki, H. et al. (2008) Improvement of the flavor of amino acids and peptides using bacterial γ−glutamyltranspeptidase. In Recent High lights in Flavor Chemistry & Biology. Ed. by Hofmann, T. et al. p.227-232, Deutsche Forschungsanstalt fur Lebensmittelchemie
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、γ−グルタミルバリルグリシン結晶を効率的に製造できる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究を行ったところ、γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得る際、特定の塩析剤をγ−グルタミルバリルグリシン溶液と接触させることにより、効率よくγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
〔１〕γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得るγ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法であって、前記晶析が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムから選択される少なくとも１つの化合物を含む塩析剤と、前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液とを接触させることを含む、γ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法。
〔２〕前記塩析剤が、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの化合物を含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液の溶媒の質量を１００質量％とした場合、前記塩析剤の量が、１質量％〜９０質量％である、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液の溶媒が水である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の方法。
〔５〕前記晶析が、ｐＨ２〜４の範囲で行われる、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載の方法。
〔６〕前記晶析が、
（１）前記塩析剤と、前記γ−グルタミルバリルグリシン溶液とをｐＨ２〜４にて接触させる接触工程、及び
（２）前記（１）接触工程で得られた溶液を０．５〜４８時間、０〜５０℃で撹拌することによりγ−グルタミルバリルグリシン結晶を晶析する結晶析出工程、
を含む、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の方法。
〔７〕前記晶析が、さらに
（３）前記（２）結晶析出工程で得られたγ−グルタミルバリルグリシン結晶と溶媒とを分別し、洗浄液で洗浄する分別・洗浄工程、及び
（４）前記（３）分別・洗浄工程で得られたγ−グルタミルバリルグリシン結晶を乾燥する乾燥工程、
を含む、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記晶析におけるγ−グルタミルバリルグリシンの晶析率が５５〜９５％である、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項に記載の方法。
〔９〕前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１項に記載の方法により製造される、γ−グルタミルバリルグリシン結晶。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、γ−グルタミルバリルグリシン結晶を効率的に製造することができる。特に、本発明により、従来からの冷却法、貧溶媒添加法及び濃縮法と比べて簡便な方法で、かつ、高い収率及び晶析率でγ−グルタミルバリルグリシン結晶を製造することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［１］γ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法
本発明は、γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得るγ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法であって、当該晶析が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムから選択される少なくとも１つの化合物を含む塩析剤と、当該γ−グルタミルバリルグリシン溶液とを接触させること含む、γ−グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法に関する。以下、より具体的に本発明を説明する。
【０００９】
・γ−グルタミルバリルグリシン溶液
本発明で使用され得るγ−グルタミルバリルグリシンは、Ｌ−γ−ｇｌｕｔａｍｙｌ−Ｌ−ｖａｌｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ及びγ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙとも表現される、以下の構造式で示されるペプチドである。
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γ−グルタミルバリルグリシンの７０℃の水への溶解度は、３２．４ｇ／１００ｇ水であり、２５℃の水への溶解度は、１０．２ｇ／１００ｇ水である。例えば、７０℃のγ−グルタミルバリルグリシン飽和水溶液を２５℃まで冷却した場合、γ−グルタミルバリルグリシンの晶析率（％）は、６８．５％となる。ここで、晶析率(％)とは、目的成分と溶媒とを含む溶液から、目的成分のみを選択的に析出・分離（いわゆる「晶析」）する際、晶析前の目的化合物の溶媒に対する濃度がα（ｇ／１００ｇ溶媒）であり、晶析後に析出せずに当該溶液中に残存する目的化合物の溶媒に対する濃度がβ（ｇ／１００ｇ溶媒）であるとすると、以下の式（Ｉ）で求められる値を意味する。
晶析率（％）＝（α−β）／α×１００        ・・・（Ｉ）
ここで、晶析前のγ−グルタミルバリルグリシン溶液中のγ−グルタミルバリルグリシンの量（α（ｇ／１００ｇ溶媒））は、溶媒に対するγ−グルタミルバリルグリシンの飽和量以下であるが、具体的には、γ−グルタミルバリルグリシン溶液中の溶媒の質量を１００ｇとした場合、例えば、１〜４０（ｇ／１００ｇ溶媒）、好ましくは、１０〜３０（ｇ／１００ｇ溶媒）、より好ましくは、１５〜２５（ｇ／１００ｇ溶媒）であることが適当である。
また、晶析後に析出せずにγ−グルタミルバリルグリシン溶液中に残存するγ−グルタミルバリルグリシンの量（β（ｇ／１００ｇ溶媒））は、例えば、γ−グルタミルバリルグリシン溶液中の溶媒の質量を１００ｇとした場合、０〜１０（ｇ／１００ｇ溶媒）、好ましくは、０．５〜８（ｇ／１００ｇ溶媒）、より好ましくは、１〜５（ｇ／１００ｇ溶媒）であることが適当である。
γ−グルタミルバリルグリシンの晶析率は、例えば、５５〜９５％、好ましくは、６０〜９２．５％、より好ましくは、７０〜９０％である。
【００１０】
γ−グルタミルバリルグリシンの晶析中に本発明の塩析剤を加えると、塩析効果により、晶析後のγ−グルタミルバリルグリシンの溶媒に対する濃度（β）、すなわちγ−グルタミルバリルグリシンの溶解度を優位に低下することができ、もって晶析率を向上することができる。
本発明で使用され得るγ−グルタミルバリルグリシン溶液に使用される溶媒としては、例えば、水、水と混和するメタノール、エタノールなどのアルコール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、好ましくは水、水と混和するメタノール、エタノールなどのアルコール、より好ましくは水を挙げることができる。
【００１１】
γ−グルタミルバリルグリシン溶液の調製は、例えば、国際公開２０１４／０２５０２３号の段落番号０００９〜００２９並びに実施例（段落００３４以降）に開示された方法により行うことができる。国際公開２０１４／０２５０２３号の実施例３を例にとって説明すると、０．２Ｍのバリルグリシン、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液、及び１７．６ｍｇ／ｍｌの湿菌体（γ−グルタミルトランスフェラーゼ又は同酵素を含有する微生物）を含む懸濁液Ｉを添加した溶液を得る。Ｌ−グルタミンの量は、バリルグリシンに対して、例えば１．０から３．０当量である。溶液のｐＨ調整には、ｐＨ８．０のリン酸カリウム緩衝液及び必要に応じてＫＯＨ水溶液を用いることができる。反応開始時のｐＨを８．０に調製し、反応温度は３７℃、反応時間は１時間として、攪拌混合しながら反応させ、γ−グルタミルバリルグリシンを得ることができる。
【００１２】
・塩析剤
γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得るために、特定の塩析剤を当該γ−グルタミルバリルグリシン溶液と接触させる。ここで、一般的に塩析剤としては、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の無機塩、有機酸塩及びアンモニウム塩から選択される少なくとも１つの化合物が挙げられるが、本発明の塩析剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム及び硫酸アンモニウムから選択される少なくとも１つの化合物を含む塩析剤を使用することが適当である。本発明のより好ましい塩析剤としては、塩化ナトリウム及び硫酸ナトリウムから選択される少なくとも１つの化合物である。γ−グルタミルバリルグリシンに対する塩析効果は、
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の順である。
塩析剤は、上述のγ−グルタミルバリルグリシン溶液に含まれる溶媒の質量に対して、例えば１〜９０質量％、好ましくは、１０〜８７．５質量％、より好ましくは１５〜８５質量％、さらに好ましくは２０〜８０質量％、特に好ましくは４０〜７０質量％の量で使用されることが適当である。
【００１３】
・その他の添加剤
γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析する際、上記塩析剤以外にも、塩析剤による晶析の効果に影響を与えない範囲で、その他の添加剤をγ−グルタミルバリルグリシン溶液に加えてもよい。その他の添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤等を挙げることができる。
例えばｐＨ調整剤としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水、水酸化カルシウム、硫酸、塩酸、酢酸、ギ酸等を挙げることができる。ｐＨ調整剤を添加する場合、ｐＨ調整剤の量は、目的のｐＨに調節するために必要な量であればよく、例えば、ｐＨ２〜４、好ましくはｐＨ２．５〜３．５、より好ましくはｐＨ３．０に調節できる量で添加することが適当である。
【００１４】
本発明の方法により、上述した塩析剤と、上述したγ−グルタミルバリルグリシン溶液とを、例えば、ｐＨ２〜４、好ましくはｐＨ２．５〜３．５、より好ましくはｐＨ３．０にて接触させることにより、γ−グルタミルバリルグリシン溶液を晶析してγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得ることができる。以下、γ−グルタミルバリルグリシン溶液からγ−グルタミルバリルグリシン結晶を晶析するための好ましい製造過程を、各工程に分けて説明する。
（１）接触工程
まず、γ−グルタミルバリルグリシンと溶媒とを含むγ−グルタミルバリルグリシン溶液を準備し、さらに塩析剤を添加し、十分に撹拌して溶解する。この際、任意に上記ｐＨ調整剤を加えて、ｐＨを調整してもよい。任意のｐＨの調整により、例えばｐＨ２〜４、好ましくはｐＨ２．５〜３．５、より好ましくはｐＨ３．０にて接触が行われることが適当である。溶媒の種類及び量、塩析剤の種類及び量等の詳細は、上述したとおりである。
（２）結晶析出工程
得られた溶液は、例えば０．５〜４８時間、好ましくは１〜３６時間、より好ましくは２〜２４時間程度、晶析終了時と同じ温度、例えば０〜５０℃、好ましくは０．５〜４０℃、より好ましくは１〜２５℃で撹拌することによって晶析（結晶析出）を行うことができる。晶析の際、溶媒を更に追加して、γ−グルタミルバリルグリシンの濃度を調節してもよい。ここで、結晶析出工程は、任意のｐＨの調整により、例えばｐＨ２〜４、好ましくはｐＨ２．５〜３．５、より好ましくはｐＨ３．０にて結晶析出が行われることが適当である。
また、得られた溶液をさらに加熱し、その後冷却することによっても晶析することができる。加熱による晶析工程中、任意にエバポレーター等を用いてγ−グルタミルバリルグリシン溶液を濃縮したり、逆に、結晶が晶析してスラリーとなってしまう場合は更に水等の溶媒を添加して、γ−グルタミルバリルグリシンの濃度を調節してもよい。エバポレーターとしては、例えば、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーター等、好ましくはロータリーエバポレーターを用いることができる。
加熱は、例えば５０〜１００℃、好ましくは６０〜９０℃、より好ましくは７０〜８０℃の温度であることが好ましい。
【００１５】
目的の濃度となった加熱後のγ−グルタミルバリルグリシン溶液は、次いで冷却され、γ−グルタミルバリルグリシンの結晶を得る（晶析）。冷却の最終温度は、例えば０〜５０℃、好ましくは０.５〜４０℃、より好ましくは１〜２５℃であることが適当である。冷却は最終温度まで一度に冷却しても良いし、複数の段階、例えば２〜４段階にわけて冷却しても良い。例えば、冷却開始温度が７０℃であるとすると、冷却開始から１時間後に６０℃とし、２時間後に５０℃とし、そのまま５〜１５時間、好ましくは１０時間程度５０℃に維持し、さらに冷却開始から１５〜２０時間経過後に２５℃とするような３段冷却法としてもよい。
冷却の最終温度に達しても晶析しない場合は、別途準備したγ−グルタミルバリルグリシン結晶を種結晶として当該冷却後のγ−グルタミルバリルグリシン溶液に添加し、結晶化を促進しても良い。種結晶の量は、γ−グルタミルバリルグリシン溶液の溶媒の質量に対して、例えば０．０１〜１０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％、より好ましくは０．１〜１質量％程度であることが好適である。
【００１６】
（３）分別・洗浄工程
冷却して晶析したγ−グルタミルバリルグリシンの湿潤結晶と溶媒とを分別する。分別は、吸引濾過、遠心分離機等を用い、当該湿潤結晶と母液（溶媒を含む）とを濾別しても良い。分別したγ−グルタミルバリルグリシンの湿潤結晶は、さらに洗浄液で洗浄する。洗浄液としては、メタノール、エタノールなどのアルコール、アセトン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、水等を使用することができる。当該洗浄液は、上記冷却の最終温度と同じ温度に冷却されていてもよい。
【００１７】
（４）乾燥工程
分別されたγ−グルタミルバリルグリシンの湿潤結晶は、さらに乾燥され、γ−グルタミルバリルグリシンの乾燥結晶を得ることができる。乾燥は、例えば、減圧乾燥機を用い、２５〜１００℃、好ましくは４０〜８０℃、より好ましくは４０〜６０℃の温度で、減圧下で行われていても良い。
【００１８】
［２］γ−グルタミルバリルグリシン結晶
本発明は、上述のような方法により製造されるγ−グルタミルバリルグリシン結晶にも関するものであり得る。
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。以下、特に断らない限り、濃度(質量％)は、溶媒としての水の質量を１００質量％とした場合の対象成分の質量の割合を示すものとする。
【実施例】
【００１９】
［試験１］各塩析剤の塩析効果確認
２０ｍＬのガラス製バイアル瓶に、和光純薬工業社製（製品番号または製品名：グルタミルバリルグリシン標準品、製品コード077-06391、メーカー表示純度９９．０質量％以上）のγ−グルタミルバリルグリシンの結晶２ｇを秤量した。ここで、γ−グルタミルバリルグリシンは、CAS 38837-70-6、Gluvalicineとも呼ばれ、以下の構造式を有する。
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以下表１の各種塩析剤（例１〜１１）につき、表１の各塩析剤の「塩濃度」の欄に記載された量の塩を当該バイアル瓶に加え、さらに５ｇの水を加えて懸濁した。ｐＨ調整剤として以下の表１記載のｐＨ調整剤を用い、最終的に溶液のｐＨがγ−グルタミルバリルグリシン等電点であるｐＨ３．０となるように調整した。得られたγ−グルタミルバリルグリシン溶液(スラリー状)に、当該溶液全体が１２ｇとなるまでさらに水を加えた。得られた溶液を２５℃恒温槽中で２４時間、スターラーを用いて撹拌した。撹拌後、０．４５μｍφのフィルターを用いて溶液を濾別し、濾液中の上清をサンプリングした。当該サンプリング液中のγ−グルタミルバリルグリシン濃度を、下記表２の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した。
【００２０】
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【００２１】
使用した試薬は以下のとおり。すべて特級グレードに相当する品質の試薬を使用した。
硫酸ナトリウム                            ：純正化学社製
硫酸アンモニウム                          ：純正化学社製
塩化ナトリウム                            ：純正化学社製
塩化カリウム                              ：ナカライテスク社製
塩化アンモニウム                          ：純正化学社製
リン酸カリウム                            ：純正化学社製
リン酸ナトリウム（2水和物）               ：純正化学社製
塩化リチウム                              ：関東化学社製
カリミョウバン（12水和物）                ：和光純薬工業社製
クエン酸                                  ：和光純薬工業社製
酒石酸                                    ：東京化成工業社製
【００２２】
表２  高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
2016166156.tif 000006
【００２３】
表１中、例１〜４の塩濃度ａは塩析剤を加える前であるので、本発明の参考例である。例１〜４の塩濃度ｂ〜ｆは本発明の実施例であり、例５〜１１は本発明の比較例である。本試験１において硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムを塩析剤として用いた例１〜４の塩濃度ｂ〜ｆにおいてγ−グルタミルバリルグリシンの塩析効果が認められ、特に硫酸ナトリウム及び塩化ナトリウムでは強い塩析効果が認められた。しかし、塩化アンモニウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウムを塩析剤として用いた例５〜７では、γ−グルタミルバリルグリシン溶解度に対する大きな変化は見られなかった。一方、塩化リチウム、カリミョウバン、クエン酸ナトリウム及び酒石酸ナトリウムを塩析剤として用いた例８〜１１は、γ−グルタミルバリルグリシンに対する優位な塩析効果は認められず、代わりに塩溶効果が認められた。
【００２４】
［試験２］塩析剤として硫酸ナトリウム及び塩化リチウムを用いた場合のγ−グルタミルバリルグリシンの晶析効果
・例１２（実施例、硫酸ナトリウム）
１Ｌのビーカーに、上記和光純薬工業社製のγ−グルタミルバリルグリシンの結晶２５ｇを秤量し、さらに７１０．６ｇの水を加えて溶解した。得られたγ−グルタミルバリルグリシン溶液に硫酸ナトリウム（純正化学社製）を２４．８ｇ添加し、更に撹拌して溶解した。得られたγ−グルタミルバリルグリシン溶液のｐＨは３．０であった。次いでロータリーエバポレーターを用いて当該γ−グルタミルバリルグリシン溶液を濃縮し、γ−グルタミルバリルグリシンの濃度が３５．８質量％になるまで濃縮調整を実施した。得られた溶液を、テフロン（登録商標）製半月板型撹拌羽根を備えた３００ｍＬの四つ口フラスコに移し、７０℃に10分間維持した。途中、γ−グルタミルバリルグリシン結晶が析出し、γ−グルタミルバリルグリシン結晶が溶液に懸濁した状態のスラリーが固結したため、さらに水を４２ｇ添加した。上記３０分間の維持の後、γ−グルタミルバリルグリシンの濃度が２０．４質量％であり、硫酸ナトリウムの濃度が２０．４質量％である溶液を得た。当該溶液を、表３に示す冷却パターンで７０℃から２５℃まで冷却し、晶析を実施した。
【００２５】
表３
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＊１：「冷却速度」は、「冷却開始からの時間」から次の「冷却開始からの時間」までの冷却速度を言う。例えば、「冷却開始からの時間」＝２の場合、次の「冷却開始からの時間」である１２時間まで、冷却速度は「−」であるので、温度は５０℃に保持される。
【００２６】
冷却開始から２１時間後、さらに２５℃で４時間保持したスラリーを、吸引ろ過（桐山製作所社製、60mmφ桐山漏斗、濾紙:桐山製作所社製、60mmφ、5C）にかけ、湿潤結晶と濾液（母液）に濾別した。濾別された湿潤結晶を、１０℃に冷却した５０％メタノールを用いて洗浄した（濾別された湿潤結晶１ｋｇ当たり、当該メタノール３Ｌ使用）。ここで使用した洗浄液は後の分析のためにその一部を確保した。洗浄後、得られた結晶を減圧乾燥機（（株）いすゞ製作所製、CVK-11S）を用いて４０℃、減圧下（５０ｈＰａ以下）で一晩（８時間）乾燥し、精製したγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得た。一方で、濾別された上記母液を上記表２に示したＨＰＬＣで分析したところ、母液に残留しているγ−グルタミルバリルグリシンの濃度は４．９質量％であった。
【００２７】
また、γ−グルタミルバリルグリシンの晶析率（％）を前出の式（Ｉ）から求めた。ここで、例１２の晶析前のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度αは、２０．４質量％であり、晶析後のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度βは、４．９質量％である。
晶析率（％）＝（α−β）／α×１００        ・・・（Ｉ）
その結果、例１２のγ−グルタミルバリルグリシンの晶析率（％）は７６．０％であった。なお、硫酸ナトリウムを加えない場合、晶析前のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度αは、２０．４質量％であり、晶析後のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度βは、１０．２質量％であるので、式（Ｉ）から求められる晶析率（％）は５０．０％であった。
【００２８】
さらに、γ−グルタミルバリルグリシン結晶の収率を以下の式（ＩＩ）から求めた。式（ＩＩ）中、Ａは得られた精製したγ−グルタミルバリルグリシン結晶の質量（１６．０ｇ）であり、Ｂは晶析に用いたγ−グルタミルバリルグリシン結晶の質量（２２．５ｇ）である。
収率（％）＝Ａ／Ｂ×１００    ・・・（ＩＩ）
その結果、例１２のγ−グルタミルバリルグリシンの収率は７１．１％となった。
【００２９】
・例１３（比較例、塩化リチウム）
例１２とほぼ同様に例１３の試験を行った。具体的には、３００ｍＬの四つ口フラスコに、上記和光純薬工業社製のγ−グルタミルバリルグリシンの結晶２２．４ｇを秤量し、さらに１１０．０ｇの水を加えて溶解した。得られたγ−グルタミルバリルグリシン溶液に塩化リチウム（関東化学社製）を２２．８ｇ添加し、更に撹拌して溶解した。得られたγ−グルタミルバリルグリシン溶液のｐＨを４Ｎの水酸化ナトリウムで調整してｐＨ３．０とした。ここでγ−グルタミルバリルグリシンの濃度は１９．０質量％、塩化リチウムの濃度は１９．１質量％であった。次いで３００ｍＬの四つ口フラスコ中の溶液を、７０℃に10分間維持した後、表４に示す冷却パターンで７０℃から２５℃まで冷却し、晶析を実施した。
【００３０】
表４
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＊１：「冷却速度」は、「冷却開始からの時間」から次の「冷却開始からの時間」までの冷却速度を言う。例えば、「冷却開始からの時間」＝２の場合、次の「冷却開始からの時間」である１２時間まで、冷却速度は「−」であるので、温度は５０℃に保持される。
【００３１】
冷却開始から２３時間後、さらに２５℃で６時間保持したスラリーを、例１２と同様に吸引ろ過し、洗浄し、減圧乾燥し、精製したγ−グルタミルバリルグリシン結晶を得た。一方で、濾別されたγ−グルタミルバリルグリシン母液を上記表２に示したＨＰＬＣで分析したところ、母液に残留しているγ−グルタミルバリルグリシンの濃度は１７．６質量％であった。
また、γ−グルタミルバリルグリシンの晶析率（％）を前出の式（Ｉ）から求めた。ここで、例１３の晶析前のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度αは、１９．０質量％であり、晶析後のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度βは、１７．６質量％である。
晶析率（％）＝（α−β）／α×１００        ・・・（Ｉ）
その結果、例１３のγ−グルタミルバリルグリシンの晶析率（％）は７．４％であった。なお、塩化リチウムを加えない場合、晶析前のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度αは、１９．０質量％であり、晶析後のγ−グルタミルバリルグリシンの濃度βは、１０．２質量％であるので、式（Ｉ）から求められる晶析率（％）は４６．３％であった。
【００３２】
さらに、γ−グルタミルバリルグリシン結晶の収率を以下の式（ＩＩ）から求めた。式（ＩＩ）中、Ａは得られた精製したγ−グルタミルバリルグリシン結晶の質量（１．４ｇ−０．２ｇ（種晶γ−グルタミルバリルグリシン分）＝１．２ｇ）であり、Ｂは晶析に用いたγ−グルタミルバリルグリシン結晶の質量（２２．４ｇ）である。
収率（％）＝Ａ／Ｂ×１００    ・・・（ＩＩ）
その結果、例１３のγ−グルタミルバリルグリシンの収率は５．３％となった。
【００３３】
・例１２及び例１３のまとめ
例１２及び例１３の結果をまとめると以下の表５のようになる。表５から理解できるように、硫酸ナトリウムを塩析剤として使用した場合(例１２)、硫酸ナトリウムを添加した場合の晶析率（７６．０％）は、硫酸ナトリウムを添加しない場合の晶析率（５０．０％）と比べて２６％も向上している。従って、硫酸ナトリウムを添加することで塩析効果によりγ−グルタミルバリルグリシンの溶解度が低下し、晶析率を向上できることが確認できる。また、塩析剤として塩化リチウムを使用した場合(例１３)、塩化リチウムを添加した場合の晶析率（７．４％）は、塩化リチウムを添加しない場合の晶析率（４６．３％）と比べて約３９％も低下している。従って、塩化リチウムを添加することで塩溶効果によりγ−グルタミルバリルグリシンの溶解度が上昇し、晶析率が低下したことを確認できた。
【００３４】
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