(57)【要約】      （修正有）【課題】植物由来の新規コラゲナーゼ活性阻害剤の提供。【解決手段】バラ科植物のカリン、好ましくはその果実、望ましくはその果肉の抽出物を有効成分とするコラゲナーゼ活性阻害剤。抽出物は水などの極性溶媒によるものが好ましく、さらには、分子量が３０kDa以上の分画画分を阻害剤として用いるのが望ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリン抽出物及び／又はカリンを有効成分とするコラゲナーゼ活性阻害剤。
【請求項２】
前記カリン抽出物はカリン果実の抽出物である請求項１に記載のコラゲナーゼ活性阻害剤。
【請求項３】
前記カリン抽出物はカリン果実の果肉抽出物である請求項１又は２に記載のコラゲナーゼ活性阻害剤。
【請求項４】
前記カリン抽出物が極性溶媒による抽出物である請求項１〜４のいずれか１項に記載のコラゲナーゼ活性阻害剤。
【請求項５】
分子量３０kDa以上の分画画分を有効成分とする請求項４に記載のコラゲナーゼ活性阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はコラゲナーゼ活性阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化はシワ、タルミ、色素沈着など、外的変化として認識されることから、人にとってコンプレックスとなりやすく、ＱＯＬ（＝quality of life）に大きく影響する。皮膚の老化に大きな影響を示すものとして、コラゲナーゼが挙げられる。
【０００３】
コラゲナーゼは活性中心にＺｎ2+を有するＣａ依存性エンドペプチダーゼ酵素群であり、細胞外マトリックス成分を特異的に分解する。コラゲナーゼは太陽光などの外的因子によって活性化され、真皮におけるコラーゲンの分解に働く。様々なサイトカイン、成長因子、細胞−マトリックス相互作用の変化などの刺激により、コラゲナーゼ活性が亢進する。近年、表皮と真皮の間に分子的なシグナル伝達が存在し、表皮におけるサイトカインやケモカインの分泌だけでなく、コラゲナーゼの活性化も真皮のコラーゲン分解に関わり、皮膚の老化に関わっていることが明らかにされている（非特許文献１）。従って、コラゲナーゼ活性を阻害することで、コラーゲンの分解を阻止し、皮膚の老化が抑制されると考えられる。
【０００４】
これまでコラゲナーゼ活性を阻害する天然由来の成分として、種々の植物由来のポリフェノールが知られている。例えば、特許文献１には竜眼の種子由来のポリフェノール配糖体が、特許文献２にはツキミソウ由来のポリフェノールが、特許文献３にはライチ・チネンシス・ソンの抽出物中のフラボン誘導体が開示されている。また、低分子ポリフェノールとして、例えば特許文献４には五倍子や没食子に含まれるガロタンニンが、特許文献５にはイソフラボノイドが、特許文献６にはカテキン類、プロシアニジン類、マンゴスチン類がコラゲナーゼ活性阻害作用を有することが示されている。
【０００５】
ところで、カリン（Pseudocydonia sinensis）はバラ科の植物であり、その果実は果実酒として利用される。カリン抽出物に関して、特許文献７には肌荒れ防止又は改善効果があること、特許文献８には皮膚賦活効果やニキビ改善効果があること、特許文献９にはメラニン産生抑制作用があること、特許文献１０にはセリンプロテアーゼ活性阻害作用があること、特許文献１１にはシステインプロテアーゼ活性阻害作用があること、特許文献１２にはアンジオテンシン変換酵素の阻害作用があること、特許文献１３には脂肪細胞分化誘導作用があること、特許文献１４にはタイプＩプロコラーゲンの生合成促進効果があることがそれぞれ記載されている。このようにカリンが様々な酵素活性阻害作用や抗老化作用を有することが示されているが、コラゲナーゼ活性阻害作用を有することについては知られていない。
【０００６】
また、非特許文献２や３には、バラ科植物がコラゲナーゼ活性阻害作用を有することが示されている。しかし、これらの文献には、バラ科植物の中にはコラゲナーゼ活性阻害作用があるものとないものがあることが示されており、カリンがコラゲナーゼ活性阻害作用を有することは示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−２４７４７１号公報
【特許文献２】特開２００３−１２８５１１号公報
【特許文献３】特表２００４−５３５３７６号公報
【特許文献４】特開平０４−６６５２４号公報
【特許文献５】特開２００８−１８９６７５号公報
【特許文献６】特開２００３−２５２７４５号公報
【特許文献７】特開平０３−１２７７１４号公報
【特許文献８】特開平０３−１８８００８号公報
【特許文献９】特開平０８−１１９８４３号公報
【特許文献１０】特開２０００−１３６１４６号公報
【特許文献１１】特開２００３−３３５６４８号公報
【特許文献１２】特開平０４−１２４１４０号公報
【特許文献１３】特表２０１２−５３２０９８号公報
【特許文献１４】特表２００９−５２３７８５号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】正木仁、皮膚の老化メカニズム研究の現状と課題、フレグランスジャーナル、40(9)、18−24、2012
【非特許文献２】大林恵ら、植物抽出物の細胞外マトリックス分解酵素に対する阻害作用、JSCCJ、Vol.32、No.3、 272−279、1998
【非特許文献３】川上晃ら、ハーブ水抽出物のアンジオテンシンI 変換酵素及びコラゲナーゼ阻害能、信州大学農学部紀要、第31巻2号、97−107、1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、植物由来の新しいコラゲナーゼ阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明に係るコラゲナーゼ活性阻害剤は、カリン及び／又はカリン抽出物を有効成分とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、新規なコラゲナーゼ活性阻害剤が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係るコラゲナーゼ活性阻害剤は、カリン及び／又はカリン抽出物を有効成分とする。使用されるカリンの部位は限定されず、葉であり、枝であり、樹皮であり、花であり、果実であり、根であり得る。また、使用される部位は１の部位に限られず、２以上の部位でもあり得る。コラゲナーゼ活性阻害作用の観点からは、好ましくは果実であり、望ましくは果実の果肉である。
【００１３】
抽出物は、採取した部位をそのままあるいは乾燥後、必要に応じて切断、粉砕した後に、種々の抽出溶媒を用いて得られる。抽出溶媒は、水、メタノールやエタノール、プロピルアルコール、ブタノール、イソブタノール等の炭素数１〜９の低級アルコール、プロピレングリコールや１，３−ブチレングリコール，グリセリン等の多価アルコール、アセトン等のケトン類，酢酸エチルや酢酸ブチル等のエステル類、ベンゼンやヘキセン、トルエンなどの芳香族炭化水素類、ヘキサンやペンタン、ヘキサン、シクロヘキサンなどの脂肪族炭化水素類などが例示される。抽出溶媒はこれらの溶媒の１種又は２種以上の混液であり得る。また、好ましい抽出溶媒は極性溶媒であり、当該極性溶媒は水であり、水と親和性を示すメタノールやエタノールなどの有機溶媒であり、これらの混液であり得る。
【００１４】
抽出方法も特に制限されるものでなく、常法に従い、室温又は加温下において抽出溶媒と接触させる。また、超臨界抽出法なども利用され得る。
【００１５】
得られた抽出液はそのまま使用されるか、必要に応じて、常法による濃縮や精製（粗精製も含む。）が行われる。精製は、例えば、液液抽出や、濃縮物に溶媒を加えて行う液固抽出による方法であり、樹脂を用いる方法であり、分子量による分画操作であり得る。樹脂にはイオン交換樹脂や吸着樹脂が例示される。
【００１６】
吸着樹脂を用いる精製には、芳香族系合成吸着樹脂が好ましく用いられる。当該樹脂は、例えば、スチレン−ベンゼン系の樹脂であり得る。このような樹脂の市販品として、ダイヤイオン（登録商標）HP-20、HP-21、セパビーズ（登録商標）SP825、SP850（それぞれ三菱化学社製）等が挙げられる。
【００１７】
吸着樹脂を用いた精製方法は特に制限されないが、例えば、抽出液（濃縮物や粗精製物でもよい）を吸着樹脂に接触させた後に、次いで、樹脂に吸着した成分を溶出させる方法が挙げられる。具体的な方法を例示すると、芳香族系合成吸着樹脂を充填したカラムに１〜９９容量％、好ましくは１０〜９０容量％、より好ましくは１０〜４０容量％メタノール水溶液を十分に通液した後、抽出液を通液させる。その後、吸着時に用いたメタノール濃度よりもメタノール濃度が高い２〜１００容量％、好ましくは５０〜１００容量％メタノール水溶液をカラムに通液させて溶出させる。
【００１８】
分子量による分画操作も公知であり、その方法は特に限定されない。例えばゲルろ過カラムを用いる方法やフィルターを用いる方法が例示される。ゲルろ過カラムに使用されるゲルには、例えばアガロースゲルやデキストリンゲルが例示される。市販品として、例えばSuperdexやSephacryl（それぞれGEヘルスケア社製）等が挙げられる。フィルターを用いる方法としては、例えば、市販品であるアミコンウルトラ（メルクミリポア社製）のようなフィルターろ過システムが例示される。分画操作で得る分画画分は、好ましくは分子量が５００Daを越え、好ましくは１kDa以上、より好ましくは１０kDa以上、望むならば３０ｋDa以上の分画画分である。５００Da以下の成分は皮膚を透過しやすいことから（藤井まき子、経皮吸収促進技術、ファルマシア、49（5）、400-404、2013）、分子量の大きな画分を使用することで表皮における効果やアレルギー症状の抑制が期待されるからである。また、低濃度で高い効果も期待される。
【００１９】
本発明の有効成分であるカリン抽出物はそのまま用いることもできるが、通例、各種の担体などとともに組成物として用いられ、医薬品、医薬部外品、化粧品などの皮膚外用剤として提供される。その剤形も制限されるものではなく、皮膚に適用可能な剤形であればよく、液剤、軟膏剤、硬膏剤、乳液、ローション剤、パック剤などが例示される。その配合量は、通常、製剤中０.００００１質量％以上、好ましくは０.０００１〜１０質量％である。また、本発明のコラゲナーゼ活性阻害剤は、他の効果をもつ原料、例えば保湿剤、美白剤、紫外線防御剤などと併用することも可能である。また、カリンの果実や果実の果肉などのカリンの各部位を組成物中に混合してもよく、カリンの各部位とカリン抽出物を併用しても差し支えない。
【００２０】
次に以下の実施例に基づき、本発明について具体的に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されることのないのは言うまでもない。
【実施例１】
【００２１】
〔カリン抽出物の製造〕
採取した果実から選別された品質良好なカリン果実を果肉と種子の部分に分けた後、それぞれ日陰で乾燥させた。次に、果肉又は種子にそれぞれ質量比で３０倍量の精製水またはエタノールを加えた後、８０〜９０℃で５０分間加熱した。常温まで冷却した抽出液を、濾過布を用いて濾過した後、水を完全に除去して粉末固体状態の抽出物（果肉水・エタノール抽出物収率：各２０〜３４％・２５〜４０％、種子水・エタノール抽出物収率：各１５〜１７％・３６〜３７％）を収得した。
【００２２】
〔コラゲナーゼ活性阻害試験〕
コラゲナーゼ活性阻害を測定するため、後述のように試験を行った。すなわち、コラゲナーゼ、蛍光基質及び上記で得られた果肉抽出物又は種子抽出物を含む溶液（被験溶液）と、コラゲナーゼ及び蛍光基質を含み果肉抽出物や種子抽出物を含まない溶液（対照溶液）についてそれぞれ酵素反応を行った。コラゲナーゼの作用によって分解した蛍光基質の量を測定することで、コラゲナーゼの活性阻害率を求めた。
【００２３】
（サンプル溶液、酵素溶液及び蛍光基質溶液の調製）
果肉抽出物及び種子抽出物をそれぞれ水に溶解してサンプル溶液を調製した。また、collagenase（Worthington Biochemical Corporatio）を水に溶解して５U/mlとなるように調製し、コラゲナーゼ酵素溶液とした。さらに、１mg/mlのFITC標識Ｉ型コラーゲン（ペプチド研究所製）を蛍光基質溶液とした。
【００２４】
（コラゲナーゼ活性阻害作用測定）
活性阻害作用は永井らの方法（永井ら、コラゲナーゼ活性の簡易微量測定法の開発とその応用 partＩ FITC-標識コラーゲンを用いたコラゲナーゼ活性微量測定法、炎症、vol.4、No.2、123-130）に従って行った。つまり、コラゲナーゼ酵素溶液（10μl）に、蛍光基質溶液（50μl）、0.1M Tris-HCl buffer(pH7.5)（50μl）及び被験試料（90μl）を添加し、37℃にて2時間酵素反応させた。その後、40mM  o-フェナントロリン 50％エタノール溶液（5μl）を添加し反応を停止後、更に1時間37℃にて分解されたコラーゲンを変性させた。その後、未分解コラーゲンはエタノールに沈殿するのに対して分解されたコラーゲンは沈殿しない性質を利用して、分解されたコラーゲンを抽出した。すなわち、抽出用溶液（100％エタノールおよび0.17M Tris-HCl(pH9.5)を7:3の割合で混合）を200μl添加・攪拌後、3000rpmにて10分間遠心した。その後、上清（100μl）を黒色プレートに採取し、蛍光強度（Ex 495nm、Em 520nm）測定した。
【００２５】
対照溶液についても同様の測定を行い、対照溶液におけるコラーゲン分解率に対する、被験溶液におけるコラーゲン分解率の割合を算出し、コラゲナーゼ活性阻害率（％）を求めた。コラゲナーゼ活性阻害率が50％になる濃度をIC50値として算出し、その結果を表１に示した。IC50値は小さいほどコラゲナーゼ活性阻害作用が強く、種子抽出物よりも果肉抽出物の方が活性阻害作用は強かった。
【００２６】
【表１】
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【実施例２】
【００２７】
〔カリン果肉抽出物の分画〕
実施例１で得られたカリン果肉水抽出物をダイヤイオン（登録商標）HP-20（三菱化学社製）とメタノール水溶液を用いて吸着及び脱着を行い、ポリフェノール類を含む溶出液を得た（ポリフェノール画分）。溶出液から溶媒を除去した後、真空乾燥して粉末固体状態の抽出物を収得した（収率9.3〜9.5％）。更に、分子量によるフィルター濾過により３０kDa以上の画分を回収した（収率63〜70％）（高分子ポリフェノール画分）。得られた画分のコラゲナーゼ活性阻害作用と、既知のコラゲナーゼ活性阻害作用を示すとされるポリフェノール類（カテキン、没食子酸、ガロカテキン、プロシアニジンB1、プロシアニジンB2）のコラゲナーゼ活性阻害作用を比較する為、実施例１と同様にコラゲナーゼ活性阻害作用を測定した。その結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
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カリン果肉水抽出物に関しては、スチレン−ベンゼン系の樹脂でポリフェノール類を精製することで活性阻害作用が強められた。更に３０kDa以上の画分はこれらに比べて低濃度で高いコラゲナーゼ活性阻害効果を示した。この３０kDa以上の画分は、真皮へ透過する可能性の高い低分子の成分をほとんど含まず、皮膚における副作用が少なくことが期待される。この画分を用いることで、より安全であり、活性の高いコラゲナーゼ活性阻害剤が提供される。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によると、高いコラゲナーゼ活性阻害作用を示すコラゲナーゼ活性阻害剤が提供される。