(57)【要約】【課題】本発明は、非侵襲的に脂肪肝疾患の患者を検査する方法及び非侵襲的に脂肪肝疾患の患者を検査するためのキットを提供することを課題とする。【解決手段】斯かる課題を解決する手段として、脂肪肝炎を検査する方法であって、脂肪肝を有する被験者から採取された試料において抗PCLO自己抗体を検出する工程を含む方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪肝炎を検査する方法であって、脂肪肝を有する被験者から採取された試料において抗PCLO自己抗体を検出する工程を含む、方法。
【請求項２】
脂肪肝炎が非アルコール性脂脂肪肝炎であり、脂肪肝が非アルコール性脂肪肝疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者から採取された試料が、患者から採取された血液、血清、又は血漿である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
抗PCLO自己抗体の検出結果を評価し、評価結果が予め設定したカットオフ値以上である場合、当該患者が脂肪肝炎を発症していると判定する工程をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ELISA法により抗PCLO抗体を検出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
抗PCLO自己抗体を検出する手段を含む、脂肪肝炎を検査するためのキット。
【請求項７】
下記の工程を含む、脂肪肝炎の治療薬のスクリーニング方法：
（１）被験者から採取された試料において抗PCLO自己抗体を評価する工程、
（２）抗PCLO自己抗体陽性である被験者に、治療薬の候補物質を投与する工程、及び
（３）脂肪肝炎の治療効果が認められる候補物質を脂肪肝炎の治療薬として判定する工程。
【請求項８】
被験者が脂肪肝を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
治療薬の候補物質が糖尿病治療薬である、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
下記の工程を含む、糖尿病治療薬の治療効果を予測する方法：
（１）被験者から採取された試料において抗PCLO自己抗体を評価する工程、
（２）抗PCLO自己抗体陽性である被験者は、治療薬が治療効果を奏する可能性が高いと予測する方法。
【請求項１１】
被験者が脂肪肝を有する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪肝疾患の患者を検査する方法及び脂肪肝疾患の患者を検査するためのキットに関する。本発明はまた、脂肪肝炎の治療薬のスクリーニング方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）は、有病率が人口の数%から10%と高く、肝細胞がん、肝硬変、肝不全へと移行して死因となりうる重要な疾患であるが、NASHに対する有効な治療法は確立されていない。この原因の一つに、NASHの非侵襲的診断方法がないことが挙げられる。
【０００３】
NASHは非アルコール性脂肪肝疾患（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）の重症病型と考えられている。非アルコール性脂肪肝疾患の診断は、主に腹部超音波検査により実施されている。典型的には、超音波検査の所見において、肝腎エコーコントラスト陽性、高輝度肝を認める場合に、非アルコール性脂肪肝疾患と診断される。しかしながら、非アルコール性脂肪肝疾患は、予後良好の単純性脂肪肝（Simple steatosis）と予後不良のNASHを含んでおり、これを非侵襲的に診断するためのバイオマーカーが必要とされている。
【０００４】
従前、アルコール性脂肪肝とは、脂肪肝のうち、アルコールの過剰摂取が原因と考えられるものを指し、非アルコール性脂肪肝とは、脂肪肝のうち、アルコールの過剰摂取以外が原因であると考えられるものを指すとされていた。しかしながら、アルコール性脂肪肝と診断された患者において、アルコールの過剰摂取が必ずしも主たる発症原因ではないとの指摘もあり、アルコール性と非アルコール性との区別をしないことも提唱されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Hamaguchi M et al. World J Gastroenterol 2012. 18(2): 156-167
【非特許文献２】Hamaguchi M et al.World J Gastroenterol 2013. 19(32): 5393-5394
【非特許文献３】Hashimoto Y et al. J Gastroenterol Hepatol. 2014 Sep 19. doi: 10.1111/jgh.12786.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、従来困難であった、非侵襲的に脂肪肝疾患の患者を検査する方法及び非侵襲的に脂肪肝疾患の患者を検査するためのキットを提供することを目的とする。本発明はまた、脂肪肝炎の治療薬のスクリーニング方法を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、脂肪肝疾患の患者から採取された試料において抗PCLO抗体を検出することで、上記の目的を達成できることを見出した。本発明は、斯かる知見に基づいてさらに検討を重ねることにより完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を包含する。
【０００９】
項１、脂肪肝炎を検査する方法であって、脂肪肝を有する被験者から採取された試料において抗PCLO自己抗体を検出する工程を含む、方法。
【００１０】
項２、脂肪肝炎が非アルコール性脂脂肪肝炎であり、脂肪肝が非アルコール性脂肪肝疾患である、項１に記載の方法。
【００１１】
項３、患者から採取された試料が、患者から採取された血液、血清、又は血漿である、項１又は２に記載の方法。
【００１２】
項４、抗PCLO自己抗体の検出結果を評価し、評価結果が予め設定したカットオフ値以上である場合、当該患者が脂肪肝炎を発症していると判定する工程をさらに含む、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【００１３】
項５、ELISA法により抗PCLO抗体を検出する、項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００１４】
項６、抗PCLO自己抗体を検出する手段を含む、脂肪肝炎を検査するためのキット。
【００１５】
項７、下記の工程を含む、脂肪肝炎の治療薬のスクリーニング方法：
（１）被験者から採取された試料において抗PCLO自己抗体を評価する工程、
（２）抗PCLO自己抗体陽性である被験者に、治療薬の候補物質を投与する工程、及び
（３）脂肪肝炎の治療効果が認められる候補物質を脂肪肝炎の治療薬として判定する工程。
【００１６】
項８、被験者が脂肪肝を有する、項７に記載の方法。
【００１７】
項９、治療薬の候補物質が糖尿病治療薬である、項７又は８に記載の方法。
【００１８】
項１０、下記の工程を含む、糖尿病治療薬の治療効果を予測する方法：
（１）被験者から採取された試料において抗PCLO自己抗体を評価する工程、
（２）抗PCLO自己抗体陽性である被験者は、治療薬が治療効果を奏する可能性が高いと予測する方法。
【００１９】
項１１、被験者が脂肪肝を有する、項１０に記載の方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、非侵襲的に、脂肪肝疾患の患者を非侵襲的に検査することが可能となる。本発明の方法は、簡便でありながら、高い陽性率及び特異性をもって、脂肪肝炎の発症又は発症の可能性を検出することができる。
【００２１】
本発明で見出した抗体を標的とした脂肪肝疾患の治療薬の開発も期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の態様の一例を模式的に示す。
【図２】単純脂肪肝患者及びNASH患者の血清中の抗PCLO抗体レベルの測定結果を示す。
【図３】ROC曲線を示す。縦軸は、感度（sensitivity）（陽性率、positive rate）及び横軸は1-特異性（1-specificity）（偽陽性率、false positive rate）をそれぞれ示す。モデルの性能評価の指標となる曲線下面積(AUC: area under the curve)は、0.77（95%信頼区間：0.61-0.92）であった。
【図４】ProtoArray解析の結果を示す。各ドットは１種類の自己抗体を示している。横軸軸は、NASH群における自己抗体価と単純性脂肪肝群（simple steatosis）の自己抗体価で除して、Log2変換し表示している（Fold change NASH/Simple steanosis）。縦軸は、NASH群と単純性脂肪肝群の自己抗体価の違いをP値で算出し-Log10で変換し表示している（Log10 P value）。PCLO抗体のドットを図示した。PCLO抗体は有意にNASH群で単純性脂肪肝群より高値に発現していると判断できる。
【図５】各臓器におけるPCLO遺伝子の発現量を測定結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
１．対象疾患
本発明が検査の対象とする疾患は、脂肪肝炎疾患である。
【００２５】
脂肪肝
脂肪肝（脂肪肝疾患ともいう。）とは、肝臓に脂肪（特に、中性脂肪。）が蓄積した状態を指す。通常は、全肝臓細胞の30％程度以上の細胞において、脂肪の蓄積が認められる状態を、脂肪肝と呼ぶ。
【００２６】
脂肪肝は、例えば、腹部超音波検査（腹部エコー検査）により診断をすることができる。超音波所見において、高輝度肝、肝腎コントラスト、脈管不明瞭化、深部減衰のいずれかが認められる場合に、脂肪肝と診断される。
【００２７】
脂肪肝は、単純性脂肪肝（simple steatosis）と、肝細胞の線維化を伴う脂肪肝炎（steatohepatitis）とを含む。単純性脂肪肝は予後良好であるが、脂肪肝炎は肝硬変、さらには肝がんへと移行する可能性があり、予後不良である。
【００２８】
脂肪肝は、アルコール性脂肪肝（アルコール性脂肪性疾患ともいう。）と非アルコール性脂肪肝（非アルコール性脂肪肝疾患ともいう。）（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）とに分けることができる。アルコール性脂肪肝とは、脂肪肝のうち、アルコールの過剰摂取が原因と考えられるものを指し、非アルコール性脂肪肝とは、脂肪肝のうち、アルコールの過剰摂取以外が原因であると考えられるものを指す。しかしながら、アルコール性脂肪肝と診断された患者において、アルコールの過剰摂取が必ずしも主たる発症原因ではないとの指摘もあり、アルコール性と非アルコール性との区別をしない場合もある（例えば非特許文献１〜３参照）。
【００２９】
脂肪肝炎疾患
脂肪肝炎疾患（単に、脂肪肝炎ともいう。）とは、脂肪肝のうち、肝細胞の線維化を伴うものを指す。脂肪肝炎は、さらに肝細胞がん、肝硬変、肝不全へと移行して、患者の死因となりうる、予後不良の疾患である。従前は非侵襲的な診断方法がなく、肝生検を行い診断を行う必要があった。しかしながら、肝生検は患者及び医療機関の双方に負担の大きいものであった。
【００３０】
脂肪肝炎は、アルコール性肝炎と非アルコール性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）とに分けることもできる。一方で、アルコール性と非アルコール性との区別をしない場合もある。
【００３１】
２．被験対象
本発明が対象とする被験対象（被験者）は、脂肪肝を有するものであれば、特に限定されるものではない。脂肪肝や脂肪肝炎を発症する可能性がある、ヒト、並びに、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ等の非ヒト哺乳類が例示され、特にヒトが好適である。
【００３２】
被験者がヒトである場合、性別、年齢、人種は特に限定されるものではない。
【００３３】
３．試料
本発明の試料としては、被験者由来である血液（全血）、血清、血漿、リンパ液などが挙げられる。試料としては、血液、血清、血漿が好ましく、特に血清が好ましく使用される。
【００３４】
試料は、当業者に公知の方法で採取することができる。例えば、血液は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。なお、採血は、医師、看護師などの医療従事者が行うことが望ましい。血清は、血液から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、血液から血球を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。試料は、被験対象の動脈由来、静脈由来、末梢血管由来のいずれであってもよい。
【００３５】
４．抗PCLO抗体
「抗PCLO抗体」とは、PCLOタンパク質に特異的に結合する抗体が主に意図される。本発明において、「抗体」の好ましい具体例は自己抗体である。「自己抗体」とは、自己の細胞又は組織に対して産生される抗体を意味する。
【００３６】
「抗体」は、「免疫グロブリンタンパク質」と交換可能に用いられる。抗体のアイソタイプは、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA、IgDなどがあるが、特に限定されるものではない。抗体のアイソタイプは、好適にはIgGである。
【００３７】
PCLO（Piccolo）タンパク質は公知のタンパク質である。PCLOタンパク質は、プレシナプスプレシナプス細胞膜マトリックス（presynaptic cytoskeletal matrix（PCM））に局在し、シナプス小胞のエキソサイトーシスおよびエンドサイトーシスに関与することが知られている。しかしながら、脂肪肝や脂肪肝炎との関与は知られていない。
【００３８】
PCLO（Piccolo）タンパク質はアミノ酸配列も公知である。例えば、ヒト（Homo sapiens）のPCLOタンパク質のアミノ酸配列及びこれをコードするmRNAの配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
ヒトPCLO  タンパク質：NP_149015、NP_055325、AAH01304
ヒトPCLO  ｍRNA：NM_033026、NM_014510
Gene ID: 27445。
【００３９】
５．抗体の検出
被験者のサンプルにおいて、抗PCLO抗体を検出する手段は、適宜公知の手法を用いることができる。具体的には、ELISA法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）、ラジオイムノアッセイ法(RIA）などの免疫学的測定方法が好適な例として挙げられる。簡便性と正確性の観点から、特に好ましい抗体を検出する手段としてELISAが挙げられる。
【００４０】
ELISA法の具体的な実施態様として、競合イムノアッセイ、サンドイッチイムノアッセイが挙げられる。
【００４１】
ELISA法により抗PCLO抗体を検出する態様の一つを、図１に示す。
【００４２】
６．脂肪肝炎の検出
本発明において、被験者の試料中における、抗PCLO抗体を指標として、脂肪肝炎の検出を行う。従って、本発明は、上記タンパク質を、脂肪肝炎の検出または診断に用いるためのマーカーとして使用することをも提供する。
【００４３】
本明細書において、「検出」は、「診断」または「判定」と交換可能に用いることができる。「脂肪肝炎の検出」とは、被験者が、脂肪肝炎を発症していることの検出を主に指す。
【００４４】
脂肪肝炎の検出は、通常は、検出結果を評価に基づいて行う。具体的には、抗PCLO抗体が陽性であった場合は、脂肪肝炎被験者は脂肪肝炎であると判定し、抗PCLO抗体が陰性であった場合は、単純脂肪肝であると判定することができる。
【００４５】
本発明の好ましい態様の1つにおいては、抗PCLO抗体が、予め設定されたカットオフ値よりも多く存在する場合、被験者は脂肪肝炎であると判定することができる。上記予め設定するカットオフ値は、当業者が適宜設定することができる。例えば、受信者操作特性（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲線の解析などに基づいた統計解析（より具体的には、Youden indexを用いた方法が例示される。）により、カットオフ値を設定することができる。
【００４６】
かくして、本発明の方法により脂肪肝炎が検出される。脂肪肝炎が検出された患者は、必要に応じて肝生検による詳細な検査を行い、脂肪肝炎の治療及び肝臓を標的とした重点的な経過観察を行うことが望ましい。脂肪肝炎が検出されなかった患者は単純脂肪肝である。単純脂肪肝では肝細胞がんの発がんや肝硬変への進展の可能性は低いが、肝臓以外の癌の発症や心筋梗塞、脳こうそくが多いことが知られており、肝臓以外の臓器に重点を置いた経過観察が必要である（文献：World J Gastroenterol. 2007 Mar 14;13(10):1579-84参照）。
【００４７】
７．キット
本発明は、脂肪肝炎を検出するためのキットをも提供する。本発明のキットは、抗PCLO抗体を検出する手段を含むものであれば特に限定されない。
【００４８】
例えば、抗PCLO抗体を検出する手段は、PCLOタンパク質が固相に結合された、ELISA法を実施するための器具であってもよい。固相の具体例としては、試験管、マイクロタイタープレートのウェル、アガロース粒子、ラテックス粒子などが挙げられる。
【００４９】
また、本発明のキットには、必要に応じて他の成分を含めることができる。他の成分は、例えばサンプルを採取するための道具（例えば、注射器等）、ポジティブコントロール試料及びネガティブコントロール試料などが挙げられるが、これに限定されない
８．スクリーニング方法
本発明はまた、脂肪肝炎（特に、非アルコール性脂肪肝炎）の治療薬のスクリーニング方法をも提供する。具体的には、治療薬の候補物質を被験者に投与し、脂肪肝炎の治療効果が認められる候補物質を脂肪肝炎の治療薬として判定するスクリーニング方法において、被験者が抗PCLO自己抗体陽性であるスクリーニング方法である。また、治療効果が期待される患者の亜群を予測するための方法も提供される。
【００５０】
被験者が抗PCLO自己抗体陽性であることは、例えば、当該被験者から採取された試料において前記の抗PCLO抗体を評価する方法により行うことができる。
【００５１】
脂肪肝炎の治療効果が認められることは、公知の手法により判定をすることができる。例えば、肝生検を受けた症例では肝生検を反復し、組織学的重症度の改善を確認することで評価することができる。また、肝生検を受けていない症例では、CAP値（Controlled Attenouation Parameter）、肝硬度（E値）等の肝臓のパラメータの改善；血清マーカー（例えば、AST（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ALT（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、GGT（ガンマグルタミルトランスフェラーゼ）、4型コラーゲン、ヒラルロン酸、血小板数）の改善などを指標として判定することができる。肝臓のパラメータは、Transient Elastography (Fibroscan)、Real-Time Elastography (RTE)、Acoustic Radiation Force Impulse (ARFI)などの測定方法で測定することができる。
【００５２】
治療薬の候補物質としては、糖尿病（特に、II型糖尿病）の治療薬が例示される。特に、ピオグリタゾン塩酸塩などのチアゾリン誘導体；シダグリプチン、ビダグリプチン、アログリプチン、リナグリプチンなどのジペプチジルペプチダーゼIV（dipeptidyl peptidase IV, DPP-4)阻害薬；リラグルチド、エキセナチドなどのグルカゴン様ペプチド−１（Glucagon-like peptide-1; GLP-1）アナログ；メトホルミン、ブホルミンなどのビグアナイド（BG）類などの糖尿病治療薬が例示されるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
先行する臨床試験において、ピオグリタゾン塩酸塩などのチアゾリン誘導体は、脂肪肝炎の治療効果が認められる個別の患者（奏功例）は認められたものの、治療薬として認められる程度の顕著に優れた治療結果は認められなかった（下記参考文献１〜４）。BG類も同様に個別の奏功例は認められたものの、大規模臨床試験で治療薬として認められる程度の顕著に優れた治療効果が認められなかった（下記参考文献５〜６）。
【００５４】
これらの試験結果は、チアゾリン誘導体やBG類は、脂肪肝炎に対する治療効果の奏功例があるものの、脂肪肝炎全症例に効果的であるわけではないことを示している。斯かる状況において、本発明は、治療薬として認められる程度の顕著に優れた治療結果を得るためのスクリーニング方法を提供する。
【００５５】
本発明を束縛するものではないが、本発明は以下のような機序に基づくと考えられる。抗PCLO抗体陽性であることは、免疫反応が起こっていることを意味していると考えられる。また、上記の臨床研究の亜群解析からも炎症の強い症例に関しては上記薬剤が奏功する可能性が示されていた。すなわち、抗PCLO自己抗体陽性被験者は免疫・炎症反応が起こっているため、治療薬が奏功すると考えられる。
【００５６】
またDPP-4阻害薬および GLP-1アナログは動物モデルにおいて脂肪肝炎に対する抗炎症免疫症作用が認められている（下記参考文献７〜８）。すなわち、今後の脂肪肝炎の臨床試験において、被験者が抗PCLO自己抗体陽性であるスクリーニング方法を用い、治療効果が期待できる亜群を指摘し、効果的に臨床試験を実施することができる。
【００５７】
［参考文献］
1;Randomized, placebo-controlled trial of pioglitazone in nondiabetic subjects with nonalcoholic steatohepatitis.Aithal GP, Thomas JA, Kaye PV, Lawson A, Ryder SD, Spendlove I, Austin AS, Freeman JG, Morgan L, Webber J.Gastroenterology. 2008 Oct;135(4):1176-84. doi: 10.1053/j.gastro.2008.06.047. Epub 2008 Jun 25.
2;A placebo-controlled trial of pioglitazone in subjects with nonalcoholic steatohepatitis.Belfort R, Harrison SA, Brown K, Darland C, Finch J, Hardies J, Balas B, Gastaldelli A, Tio F, Pulcini J, Berria R, Ma JZ, Dwivedi S, Havranek R, Fincke C, DeFronzo R, Bannayan GA, Schenker S, Cusi K.N Engl J Med. 2006 Nov 30;355(22):2297-307.
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4;A pilot study of pioglitazone treatment for nonalcoholic steatohepatitis.Promrat K, Lutchman G, Uwaifo GI, Freedman RJ, Soza A, Heller T, Doo E, Ghany M, Premkumar A, Park Y, Liang TJ, Yanovski JA, Kleiner DE, Hoofnagle JH.Hepatology. 2004 Jan;39(1):188-96.
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【実施例】
【００５８】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に述べるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５９】
実施例１
＜材料と方法＞
患者群
調査対象は、インフォームドコンセントを得た後に2013年3月から2013年12月の間、京都府立医科大学医学部消化器内科で募集した。この研究は、京都府立医科大学の倫理委員会の承認の下で行われた。
【００６０】
GST-PCLO融合タンパク質の作製
定法に従い、GST-PCLO融合タンパク質を作製した。具体的には、IPTG誘導可能なバクテリアの発現ベクター及びBL21(DE3)株を使用した。
【００６１】
5'末端にEcoRI切断部位及び3 '末端にBamH1切断部位を付したPCLO cDNA（NCBIアクセッション番号：AAH01304）のコンストラクト1146bpを、pGEX-HTベクターに組み込んだ。作製したPCLO発現ベクターを大腸菌BL21(DE3)株に導入し、形質転換した大腸菌のシングルコロニーを単離した。単離した大腸菌を培養し、IPTG誘導によりGST-PCLO融合タンパク質を発現させた。
【００６２】
GST-PCLO融合タンパク質は、超音波処理した培養液から、抗GSTカラム精製システムを用いて精製した。
【００６３】
ELISA分析
血清中の抗PCLO抗体レベルは、定量的サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定した。各段階での洗浄は、0.05％のTween20を添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（PBS-T）で3回行った。抗GST抗体でコーティングされた96ウェルプレート（Thermo Scientific社製）を、PBSに溶解したGST-PCLO融合タンパク質を65pg/50μL/ウェルで、4℃で一晩コーティングした。その後、プレートを洗浄し、ブロッキング緩衝液（PBS + 1％ウシ血清アルブミン）200μLを用いて、室温（RT）で1時間インキュベートした。
【００６４】
コーティングしたELISAプレート洗浄した後、ブロッキング緩衝液で1/100倍に希釈したヒト血清を各ウェルに添加して、室温で2時間インキュベートした（２試行）。続いて、洗浄後、horseradish peroxidase（HRP）標識抗ヒトimmunoglobulin G（IgG）ヤギ抗体（ブロッキング緩衝液で1/40000倍希釈）を各ウェルに添加して、室温で２時間インキュベートした。
【００６５】
洗浄後、テトラメチルベンジジン（TMB）基質溶液100μLを各ウェルに添加し、室温で3分間インキュベートした。各ウェルに0.18M H2SO4を100μL添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの450nmでの吸光度を測定した。抗PCLO抗体についてのOD値のカットオフレベルは、ヨーデンインデックスに基づいて、＞1.0とした。
【００６６】
統計分析
統計解析は、SPSS statistical package, version 21（SPSS社）を用いて行い、p値<0.05の場合に統計的に有意とみなした。
【００６７】
受信者操作特性（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲線の曲線下面積（area under the curve, AUC）の値の解析により、NASHの診断おける検出率の有意性を決定した。２群間のカテゴリ変数は、マンホイットニーU検定によって評価した。連続値は、中央値±95％信頼区間（confidential intervenes, CI）により表し、２群間はマンホイットニーU検定によって評価した。
【００６８】
＜結果及び考察＞
単純脂肪肝患者（Simple steatosis）15名及びNASH患者30名及びからなるNAFLD患者45名のコホートについて、解析を行った。ELISAにより、45患者全員の血清中の抗PCLO抗体のレベルを測定した。
【００６９】
結果を図２に示す。NASH患者における抗PCLO抗体レベルが、単純脂肪肝患者と比べて有意に高いことが明らかとなった。
【００７０】
抗PCLO抗体をNASHの診断マーカーとして用いることの、モデル性能を評価するために、ROC曲線を作成した。ROC曲線を図２に示す。
【００７１】
ROC曲線のAUCで評価をした結果、抗PCLO抗体のAUCは0.77であった。カットオフ値を1.0とした場合に、感度（陽性率）（図中、縦軸）及び1-特異性（偽陽性率）（図中、横軸）はそれぞれ50.0％および100.0％であった。
【００７２】
以上の結果は、NASHの診断において抗PCLO抗体がマーカーとして有用であることを示している。
【００７３】
参考例１  ProtoArray解析
＜方法＞
ProtoArrayバージョン5.0（Invitrogen）を購入し、製造業者の指示に従って、４名のNASH患者由来の血清（NASH1, NASH2, NASH3, NASH4）及び５名の単純脂肪肝患者由来の血清（SS1, SS2, SS3, SS4, SS5）について解析を行った。
【００７４】
4℃で1時間のブロッキングをした後、水平シェイカー（50 rpm）上、かつ、Quadripermディッシュ（Greiner Bio One社製）中で、washing buffer（0.1% Tween 20 (vol/vol), 1% BSA (wt/vol) in PBS）1で/500倍に希釈した血清を5 ml添加したアレイを4℃で90分間インキュベートした。洗浄後、1/2000倍に希釈したAlexa Fluor 647標識抗ヒトIgGヤギ抗体を、（Invitrogen社）と共にインキュベートし、結合したIgGを検出した。アレイを再び洗浄した後、遠心分離によって乾燥させ、マイクロアレイスキャナー（GenePix Professional 4200A Software、 Molecular Devices社製）を用いて、10μｍの解像度でスキャンした。画像された保存は、GenePixを用いて解析した。各スポットについて、相対蛍光度（Relative fluoresence unit, RFU）で表される正味強度（net intensity）の中央値を取得した。
【００７５】
アレイからのデータを、調整及び正規化した。具体的には、各アレイ中の各抗原について、二重試験のうち値の小さい相対蛍光度（Relative fluoresence unit, RFU）の中央値を、アーチファクトに起因する偽陽性を極力排除するために採用した。また、アレイのロット間での抗原量の相違に基づく反応性についての謝った解釈を防ぐため、販売元が提供するQCデータに矛盾や不足がある抗原は、解析対象から除外した（全抗原の2％が除外された。）。
【００７６】
＜結果及び考察＞
表１に解析結果の一部を示す。また、図４に、抗PCLO抗体の測定結果を示す。抗PCLO抗体の検出は、単純脂肪肝患者（SS1、SS2、SS3、SS4、SS5）と比較して、NASH患者（NASH1、NASH2、NASH3、NASH4）で有意に大きかった。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
参考例２  PCLO遺伝子の発現量
種々の臓器におけるPCLO遺伝子の発現量を測定した。
【００７９】
＜方法＞
Life Technologies社から購入した、膵臓由来cDNAを含むヒトcDNAを用いて、リアルタイムPCR法により、各臓器におけるPCLO遺伝子の発現量を測定した。リアルタイムPCRは、StepOnePlusリアルタイムPCRシステム（Life Technologies社製）を用いて行い、プローブはFAM標識したヒトPCLO遺伝子特異的プローブ、及び、VIC標識したヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ１遺伝子（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1, HPRT1）特異的プローブを使用した。
【００８０】
製造者によるプロトコルに従い、独立した３回の反応を行った。各反応は、2分間、50℃の1サイクル、続いて15秒間95℃、1分間60℃の50サイクルからなる。
【００８１】
得られたデータは、SDS2.3ソフトウェア（Life Technologies社製）を用いて解析した。
【００８２】
＜結果及び考察＞
結果を図５に示す。肝臓における高いレベルでのPCLO遺伝子が確認できた。また、脳での高い発現も確認できた。PCLO遺伝子は、幅広い臓器で発現することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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