(57)【要約】【課題】電極表面がハイドロキシアパタイト膜により良好にコーティングされたバイオセンサ、及びその製造方法を提供する。【解決手段】水晶振動子上に金からなる電極を有し、前記電極上に吸着された対象物の質量を測定するバイオセンサであって、前記電極の表面上に、チタンを含む中間層と、結晶化されたハイドロキシアパタイト膜と、を備えることを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水晶振動子上に金からなる電極を有し、前記電極上に吸着された対象物の質量を測定するバイオセンサであって、
前記電極の表面上に、チタンを含む中間層と、結晶化されたハイドロキシアパタイト膜と、を備えるバイオセンサ。
【請求項２】
前記ハイドロキシアパタイト膜の膜厚は２００ｎｍ〜４００ｎｍである、
請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記中間層の膜厚は４０〜５０ｎｍである、
請求項１また２に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
水晶振動子上に金からなる電極を有し、前記電極上に吸着された対象物の質量を測定するバイオセンサを準備する工程と、
前記電極上に、チタンを含む中間層を形成する工程と、
前記中間層上に、ハイドロキシアパタイト膜を形成する工程と、
前記ハイドロキシアパタイト膜を結晶化させる工程と、
を備える、バイオセンサの製造方法。
【請求項５】
前記ハイドロキシアパタイト膜は、スパッタリング法により形成される、
請求項４に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項６】
前記ハイドロキシアパタイト膜の膜厚は２００ｎｍ〜４００ｎｍである、
請求項４または５に記載バイオセンサの製造方法。
【請求項７】
前記中間層の膜厚は４０〜５０ｎｍである、
請求項４〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサの製造方法。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサの製造方法において、
前記ハイドロキシアパタイト膜を結晶化させる工程の後に、さらに、
前記バイオセンサを純水に浸漬させる工程
を備える、バイオセンサの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサ、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、酵素や免疫抗体などの生体物質が特定の化学物質と鋭敏に反応することを利用したセンサであり、従来の物理センサや化学センサでは困難とされていた有機物質の微量検出に主に用いられる。
【０００３】
近年、バイオセンサの方式として、ナノグラムオーダーの極めて微小な質量変化を測定できる水晶振動子マイクロバランス法（ＱＣＭ法）が注目されている。ＱＣＭ法は、水晶の圧電効果を利用したもので、水晶振動子上の作用電極表面に試料ガスや試料溶液を吸着させたときの水晶振動子の共振周波数の変化から対象物質の質量を測定する。
【０００４】
ＱＣＭ型のバイオセンサは、測定に際し、電極表面に測定対象物を吸着させる必要がある。そこで、電極の吸着性を向上させるため、多くの化学物質に対して極めて高い吸着能力を示すハイドロキシアパタイトによって電極表面をコーティングしたバイオセンサが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００６／０２５３５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、バイオセンサの電極としては一般的に金が用いられるため、電極表面を直接ハイドロキシアパタイト膜によりコーティングしようとした場合には、金とハイドロキシアパタイトの結合性が良くないためにハイドロキシアパタイト膜が電極表面に良好に結合せず、ハイドロキシアパタイト膜にクラックが発生したり、ハイドロキシアパタイト膜が剥がれ落ちたりすることがあった。
【０００７】
それ故、本発明の課題は、電極表面がハイドロキシアパタイト膜によって良好にコーティングされたバイオセンサ、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明にかかるバイオセンサによれば、
水晶振動子上に金からなる電極を有し、前記電極上に吸着された対象物の質量を測定するバイオセンサであって、
前記電極の表面上に、チタンを含む中間層と、結晶化されたハイドロキシアパタイト膜と、を備えることを特徴とする。
【０００９】
本発明に用いられるハイドロキシアパタイト（ヒドロキシアパタイト、ＨＡｐ）は、人間の骨や歯の主要構成物質であり、その生体親和性の高さから、人工骨や人工歯根をはじめとするインプラント素材として幅広く用いられている。また、タンパク質、アミノ酸、脂質、糖などの多くの化学物質に対して、極めて高い吸着能力を示すことが知られている。
【００１０】
そのため、本発明の構成によれば、電極表面が吸着能力に優れたハイドロキシアパタイト膜でコーティングされているため、少量の物質でも適切に吸着させることができ、センサの検出精度を向上させることができる。また、中間層は、電極に用いられる金との結合性が良いチタンを含んでおり、かつ、ハイドロキシアパタイト膜は、ハイドロキシアパタイトと強固に結合することで知られるチタンを含む中間層上に形成されるため、電極表面をハイドロキシアパタイト膜によって良好にコーティングすることができ、クラックや剥離を抑制できるとともに、ハイドロキシアパタイト膜の耐久性を向上させることができる。
【００１１】
ここで、バイオセンサの電極表面をハイドロキシアパタイト膜によりコーティングする際には、ハイドロキシアパタイト膜の膜厚が重要となる。ＱＣＭ型バイオセンサは、水晶振動子の共振周波数の変化により対象物の質量を測定するため、ハイドロキシアパタイト膜が厚すぎると、ハイドロキシアパタイト膜の重さによって水晶振動子の共振に影響を与え、測定精度が悪化するおそれがある。また逆にハイドロキシアパタイト膜が薄すぎると、測定対象物を適切に吸着できなかったり、電極表面と良好に結合せずクラックや剥離の問題が生じるおそれがある。
【００１２】
そこで、上記の構成にあっては、ハイドロキシアパタイト膜の膜厚は２００ｎｍ〜４００ｎｍであることが好ましい。
【００１３】
このような範囲にあるハイドロキシアパタイト膜は、薄すぎることがないため、対象物を適切に吸着できなかったり、電極表面と良好に結合せずクラックや剥離が生じるといった問題を回避できる。また厚すぎることもないため、ハイドロキシアパタイト膜の重さによって水晶振動子の共振に影響を与えセンサ精度が悪化することを防止できる。
【００１４】
また、上記の構成にあっては、チタンを含む中間層の膜厚は４０〜５０ｎｍであることが好ましい。
【００１５】
このような範囲にある中間層は、薄すぎることがないため、電極表面に適切に結合しなかったり、中間層上に形成されるハイドロキシアパタイト膜と適切に結合しないという問題を回避することができる。また厚すぎることもないため、中間層の重さにより水晶振動子の発振に影響を与えセンサ精度が悪化することを防止できる。
【発明の効果】
【００１６】
以上説明したように、本発明にかかるバイオセンサによれば、電極表面がハイドロキシアパタイト膜によってコーティングされているため、少量の物質でも適切に吸着させることができ、センサの検出精度を向上させることができる。また、ハイドロキシアパタイト膜はハイドロキシアパタイトと結合性の良いチタンを含む中間層を介して電極表面上に形成されているため、ハイドロキシアパタイト膜のクラックや剥離を抑制でき、ハイドロキシアパタイト膜の耐久性を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】第１の実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を模式的に示した図である。
【図２】第２の実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を模式的に示した図である。
【図３】第１及び第２の実施形態にかかるバイオセンサを一方向から見た図である。
【図４】バイオセンサによる対象物の質量測定方法について説明した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、図面を参照して本発明の実施形態について詳述する。但し、これらの実施形態はいずれも例示であり、本発明についての限定的解釈を与えるものではない。なお、図面において、同一の又は対応する部分については同一の符号を付すものとする。
【００１９】
図１は、本実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を模式的に示す図である。以下、その工程を順に説明する。なお、図１、及び後述する図２は、バイオセンサの製造方法を模式的に説明したものであって、これらの図に示した電極、中間層、及びハイドロキシアパタイト膜の形成位置や形成範囲等によって本発明の技術的範囲が制限されるものではない。
【００２０】
（１）バイオセンサ準備工程
まず、図１（ａ）に示すように、バイオセンサ１０を準備する。バイオセンサ１０は、水晶振動子１１の上に金からなる電極１２を有し、電極１２に吸着された測定対象物の質量を水晶振動子１１の共振周波数の変化により測定するＱＣＭ型バイオセンサである。
【００２１】
（２）中間層形成工程
次に、図１（ｂ）に示すように、バイオセンサ１０の電極１２の表面に中間層１３を形成する。中間層１３はチタンを含むため、金からなる電極１２と安定的に結合する。なお、中間層１３は測定対象物を吸着させたい側の電極１２にのみ形成すればよい。
【００２２】
中間層１３の形成方法としてはディップ法、スパッタリング法、プラズマ溶射法、レーザーアブレーション法等が例示されるが、緻密な膜を所望の膜厚で成膜でき、かつ大量生産に適しているという観点から、スパッタリング法を用いることが好ましい。
【００２３】
また、中間層１３の膜厚は４０〜５０ｎｍであることが好ましい。これより薄いと電極１２と良好に結合しなかったり、その上に形成されるハイドロキシアパタイト膜１４ａと良好に結合しないおそれがあり、これより厚いと水晶振動子１１の共振に影響しセンサ精度が悪化するおそれがある。
【００２４】
なお、本明細書でいう「チタン」とは、純チタンだけではなく、酸化チタン、水素化チタンなどのチタン化合物や、主成分のチタンに、アルミニウム、クロム、ニッケルなどが添加されたチタン合金をも広く含むものとする。
【００２５】
（３）ハイドロキシアパタイト膜形成工程
次に、図１（ｃ）に示すように、電極１２表面上の中間層１３の上に、ハイドロキシアパタイト膜１４ａを形成する。なお、中間層１３がむき出しになると、中間層１３と対象物質との吸着によりセンサ精度が悪化する恐れがあるため、中間層１３上の略すべてにハイドロキシアパタイト膜１４ａが形成されることが好ましい。
【００２６】
本実施形態にかかる中間層１３に用いられるチタンは、ハイドロキシアパタイトと強固に結合するため、電極１２の表面上に直接ハイドロキシアパタイト膜１４ａを形成した場合と比べて、ハイドロキシアパタイト膜１４ａをより強固に形成することができる。よって、ハイドロキシアパタイト膜１４ａのクラックや剥離を抑制でき、またハイドロキシアパタイト膜１４ａの耐久性を向上させることができる。
【００２７】
ハイドロキシアパタイト膜１４ａの形成方法としてはディップ法、スパッタリング法、プラズマ溶射法、レーザーアブレーション法等が例示されるが、緻密で均一な膜を所望の膜厚で成膜でき、かつ大量生産に適しているという観点から、スパッタリング法を用いることが好ましい。なお、中間層１３とハイドロキシアパタイト膜１４ａを双方ともスパッタリング法により形成する場合は、マルチチャンバ装置を用いることにより単一チャンバでの製造が可能となり、生産性を向上させることができる。
【００２８】
スパッタリング法によるハイドロキシアパタイト膜１４ａの成膜条件として、以下のような条件を用いることができる。
・ＲＦスパッタリング法
・スパッタリング圧力：０．０６Ｐａ
・スパッタリング電力：３００Ｗ
上記条件によれば、成膜レート６．７ｎｍ／ｍｉｎでハイドロキシアパタイト膜１４ａを成膜することができた。
【００２９】
また、ハイドロキシアパタイト膜の膜厚は２００ｎｍ〜４００ｎｍであることが好ましい。これより薄いと電極１２の表面上に形成された中間層１３と十分に結合せずクラックや剥離のおそれがあり、これより厚いと水晶振動子１１の共振に影響しセンサ精度が悪化するおそれがある。
【００３０】
なお、この時点においては、ハイドロキシアパタイト膜１４ａはアモルファス（非晶質）状態であり、また結晶化されていない。
【００３１】
（４）結晶化工程
次に、図１（ｄ）に示すように、電極１２表面の中間層１３上に形成されたハイドロキシアパタイト膜１４ａを結晶化させる。結晶化の方法としては、水熱処理や電気炉による加熱等が挙げられる。この結晶化工程により、それまでアモルファス（非晶質）状態だったハイドロキシアパタイトが結晶化される。ハイドロキシアパタイト膜を結晶化させると表面が帯電するため、測定対象物を吸着しやすくなる。このようにして、結晶化されたハイドロキシアパタイト膜１４ｂにより電極１２表面がコーティングされたバイオセンサ２０を得ることができる。
【００３２】
以上のように製造されたバイオセンサ２０によれば、電極１２表面が多くの化学物質に対して極めて高い吸着能力を持つハイドロキシアパタイト膜１４ｂでコーティングされているため、少量の物質でも適切に吸着させることができ、各種ガス、イオン、アルコール、酵素、タンパク質、ＤＮＡ等の測定において、センサの検出精度を向上させることができる。特に、ハイドロキシアパタイトは生体親和性に優れ、骨や歯の主要構成物質であるため、バイオセンサ２０を骨質シミュレータや歯質シミュレータとして用いることができる。さらに、ハイドロキシアパタイト膜１４ｂはハイドロキシアパタイトとの結合性が良いチタンを含む中間層１３の上に形成されるため、ハイドロキシアパタイト膜１４ｂは電極１２の表面に強固に結合し、クラックや剥離を抑制できるとともに、ハイドロキシアパタイト膜１４ｂの耐久性を向上させることができる。
【００３３】
また、上記に説明したバイオセンサの製造方法によれば、中間層１３およびハイドロキシアパタイト膜１４ａをスパッタリング法により成膜するため、緻密な膜を所望の膜厚で形成できる。これにより、水晶振動子の共振に悪影響を与えることのない所望の膜厚を有した中間層１３及びハイドロキシアパタイト膜１４ａを形成でき、センサ精度の悪化を防止できる。また、スパッタリング法は大量生産に適しているため、バイオセンサ２０の生産性を向上させることができる。
【００３４】
（第２の実施形態）
図２は、本実施形態にかかるバイオセンサの製造方法を模式的に示す図である。第２の実施形態にかかる製造方法は、上述の第１の実施形態における「（４）結晶化工程」の後に、さらに次の工程を備えるものである。
【００３５】
（５）洗浄工程
図２（ｄ）に示すバイオセンサ２０は、第１の実施形態により製造されたものである。このバイオセンサ２０を、図２（ｅ）に示すように、純水４０に浸漬させる。このようにすることで、ハイドロキシアパタイト膜１４ａの結晶化の際に溶出するＣａＯ等の不純物を電極表面から除去することができ、電極表面の不純物に起因するセンサ精度の悪化を防止することができる。なお、結晶化工程に水熱処理を用いる場合は、洗浄工程を省略することができる。この場合、製造工程を簡素化でき、生産性を向上させることができる。
【００３６】
純水４０への浸漬時間は、純水の温度等の条件にもよるが、結晶化により溶出した不純物を十分に除去するという観点から、２４時間以上であることが好ましい。
【００３７】
なお、洗浄工程に用いられる液体は必ずしも純水４０に限られるものではなく、結晶化の際に溶出する不純物を適切に除去でき、かつ、洗浄後バイオセンサとして使用する際にその性能に悪影響を与えないものであれば、純水４０以外の液体を用いてもよい。また、洗浄後は、自然乾燥等の一般的な乾燥方法を用いてバイオセンサ２０を乾燥させることができる。
【００３８】
以上説明したように、第２の実施形態にかかるバイオセンサの製造方法によれば、電極１２表面に不純物の付着がなく、精度が良好なバイオセンサ３０を製造することができる。
【００３９】
図３は、上述の製造方法により製造されたバイオセンサ２０、３０を一方向から見た図である。バイオセンサ２０、３０は、水晶振動子１１の両面に電極１２ａ、１２ｂを備える。中間層１３、及び結晶化されたハイドロキシアパタイト膜１４ｂは、少なくとも一方の電極表面上に形成される。ハイドロキシアパタイト膜１４ｂは、ハイドロキシアパタイトと強固に結合することで知られるチタンからなる中間層１３を介して形成されるため、バイオセンサ２０、３０の電極１２表面はハイドロキシアパタイト膜１４ｂにより良好にコーティングされる。
【００４０】
（測定方法）
上述の製造方法により製造されたバイオセンサ２０、３０による対象物の質量測定方法について、図４を用いて説明する。
【００４１】
水晶振動子１１の電極１２に、電源、発振回路等（図示せず）を用いて交流電圧を印加すると、圧電効果により水晶振動子１１が共振振動する。測定対象物を電極１２表面に滴下する前に、この時点（図４中のａ点）における水晶振動子１１の共振周波数ｆ１を測定しておく。
【００４２】
次に、測定対象物を電極１２表面に滴下し吸着させると、図４に示すように、吸着量に応じて水晶振動子１１の共振周波数が低下する。ある時間が経過すると、水晶振動子１１の共振周波数が収束するので、この時点（図４中のｂ点）における共振周波数ｆ２を測定する。
【００４３】
電極表面の質量変化と水晶振動子の共振周波数との関係は、下記の式により表される。
[式１] Ｓａｕｅｒｂｒｅｙの式
2016065726.tif 000003
ΔＦ：共振周波数変化量
Ｆ：水晶振動子の固有周波数
Ａ：電極の表面積
Δｍ：電極表面の質量変化量
【００４４】
そこで、電極１２表面への測定対象物の吸着により生じた水晶振動子１１の共振周波数変化量Δｆ（ｆ２−ｆ１）を用い、前述のＳａｕｅｒｂｒｅｙの式によって電極１２表面の質量変化量Δｍを求める。これにより、電極１２表面に吸着された測定対象物の質量を測定することができる。
【００４５】
なお、測定対象物のｐＨを調整し安定な測定条件とするために、測定対象物の滴下前に、緩衝溶液を電極１２表面に滴下してもよい。緩衝溶液として、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、ＣＡＰＳ緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液等が挙げられる。
【００４６】
緩衝溶液を用いる場合には、緩衝溶液の滴下によっても水晶振動子１１の共振周波数は変化するため、この周波数変動が収束してから測定対象物を滴下するようにし、水晶振動子１１の共振周波数変化量ΔＦは、緩衝溶液を滴下した後に収束した共振周波数（ｆ１）を、測定対象物を滴下した後に収束した共振周波数（ｆ２）から差し引くことにより求める。このΔＦを前述のＳａｕｅｒｂｒｅｙ式を用いて電極１２表面の質量変化量Δｍを求めれば、電極１２表面に吸着された測定対象物の質量を測定することができる。
【符号の説明】
【００４７】
１０，２０，３０ バイオセンサ
１１ 水晶振動子
１２（１２ａ，１２ｂ） 電極
１３ 中間層
１４ａ ハイドロキシアパタイト膜（アモルファス状態）
１４ｂ ハイドロキシアパタイト膜（結晶状態）
４０ 純水
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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