(57)【要約】【課題】神経回路網の破たんに起因する認知機能不全疾患等の予防・治療に有用な医薬及び飲食品を提供すること。【解決手段】骨砕補又は骨砕補の抽出物は、物体認知記憶および物体場所記憶などの記憶改善効果などを有し、認知機能不全に対する神経回路網再構築剤などとして有用である。さらに骨砕補又は骨砕補の抽出物は、記憶力向上を目的とした飲食品などの配合成分として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨砕補（コツサイホ）又は骨砕補の抽出物を有効成分とする神経回路網の再構築・賦活剤。
【請求項２】
骨砕補の抽出物が、水および／またはアルコール、それらの混合物で抽出されるものである請求項１に記載の神経回路網の再構築・賦活剤。
【請求項３】
神経回路網の再構築・賦活が軸索修復および／または軸索伸展による神経回路形成によるものである請求項１または２に記載の神経回路網の再構築・賦活剤。
【請求項４】
神経回路形成により認知記憶機能が改善及び／又は亢進される請求項３に記載の神経回路網の再構築・賦活剤。
【請求項５】
認知記憶が物体認知記憶、物体場所記憶、エピソード記憶のいずれかまたはそれらの組み合わせである請求項４に記載の神経回路網の再構築・賦活剤。
【請求項６】
骨砕補又は骨砕補の抽出物を含む、神経疾患の予防及び／又は治療のための剤。
【請求項７】
骨砕補又は骨砕補の抽出物を含む、神経軸索の修復及び／又は伸展のための剤。
【請求項８】
神経疾患が、アルツハイマー病、認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、脳挫傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症及び多発性脳梗塞から選択された少なくとも１つの神経疾患である請求項６又は７に記載の剤。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の剤を含有する飲食品。
【請求項１０】
サプリメント、健康食品、機能性表示食品、栄養機能食品又は特定保健用食品である請求項９記載の飲食品。
【請求項１１】
錠剤、散剤、顆粒剤又はカプセル剤である請求項９又は１０記載の飲食品。
【請求項１２】
骨砕補又は骨砕補の抽出物を０．０１〜５０重量％含む請求項９〜１１のいずれかに記載の飲食品。
【請求項１３】
食品用添加剤を含む請求項９〜１２のいずれかに記載の飲食品。
【請求項１４】
錠剤又はカプセル剤のサプリメントであり、骨砕補又は骨砕補の抽出物を１〜５０重量％含み、２以上の食品用添加剤を含む請求項９〜１３のいずれかに記載の飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経回路網の破綻に起因する認識機能不全の予防・治療等に有効な生薬を有効成分とする神経回路網の再構築用の医薬および食品、並びに神経回路網を賦活化するための医薬および食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経疾患又は神経変性疾患の病因は様々であるが、神経機能の障害をもたらす直接的な要因は、神経回路網の破綻である。病因を取り除く予防的・進行阻止的治療に加えて重要なのが神経回路網を再構築させることである。
神経回路網を再構築する薬物等については、例えば、インド人参（アシュワガンダ：Ashwagandha）の成分やその代謝物（特許文献１、非特許文献１）や、三七人参・黄耆・菖蒲・茯苓の混合物（特許文献２）が知られている。
【０００３】
一方、生薬の骨砕補（コツサイホ）は、ウラボシ科ハカマウラボシ(Drynaria fortune)の根茎である。骨砕補の伝統的効能としては接骨、止血、駆おけ血、消炎、筋骨の疼痛、耳鳴り、歯痛などが知られている（例えば、特許文献３）ものの、骨砕補と神経疾患との関係については知られていない。
なお、非特許文献２には、高用量の骨砕補エキス（１２０ｇの骨砕補を、一度目を４０分、二度目を２５分で、水で煎じたもの）に蜂蜜を混ぜたものと、八味地黄丸９ｇを長期間処方した結果、認知能力の向上などが確認されたとの記載があるが、投与対象は１人だけであるし、長期に亘る追跡調査の具体的態様も明らかではなく、骨砕補による認知機能の改善効果を確認したものとはいえない。このように、骨砕補と認知機能との関係については、従来知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開2006-176428
【特許文献２】WO2006/068155
【特許文献３】特開2005-330290
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】YAKUGAKU ZASSHI, 128(8), 1159-1167, 2008.
【非特許文献２】Journal of Traditional Chinese Medicine, 25(4), 290-291, 2005.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
アルツハイマー病、老年性痴呆、脳血管性痴呆、パーキンソン病などの神経変性疾患は、病因は異なるがいずれも神経回路網の破綻により、記憶・認知に障害を呈する症候を指す。これら有効な治療法の無い疾患に対し、既に神経回路網の障害が進行している状態からでも、神経機能を正常に近づけることのできる治療が、真に求められている。しかも患者の立場を考えると、手術を要する神経細胞移植や遺伝子治療よりは、負担の少ない投薬による治療法がより望ましい。そこで、神経細胞が障害を受けている時、あるいは受けた後からでも神経回路網を再生する薬物の開発が必要である。
【０００７】
筋萎縮性側索硬化症は、大脳皮質運動野の運動ニューロンと脊髄、脳幹の運動ニューロンが脱落することによって手足が動かなくなる難病であり、有効な治療法は存在しない。さらに、大脳皮質運動野の運動ニューロンは、脳出血、脳梗塞、脳腫瘍、脳外傷などによっても障害を受け、身体の麻痺に繋がる。また、外傷性の脊髄損傷では、脊髄の運動ニューロンが障害を受けることにより四肢麻痺が生じる。さらに、多発性脳梗塞は、自己免疫の異常活性化によっておこる中枢神経の脱髄疾患であるが、病態の進行に伴って軸索の脱落が生じ、それが神経回路網の不可逆的な機能不全につながる。いずれの場合も神経回路網の破綻による機能障害であるが、生き残った神経細胞を賦活化して再び神経回路網を形成させることが出来れば、機能の回復が期待できる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記のような事情に鑑み、変性して機能不全になっている脳内の神経軸索の萎縮・変性を改善させる優れた活性を示す成分を生薬等に求め、その作用機序を探ることで、従来の神経変性疾患の病態解析からでは予想できないような、新たな組成物を見出すことができるという考えの下、研究を進めてきた。
その結果、生薬の骨砕補の抽出物に、萎縮した軸索の修復作用を見出した。その作用は記憶障害の改善に有効であることから、神経回路網を再度形成構築する神経回路網の再構築剤として、また、神経回路網の賦活剤として有効であるという新しい知見を得て、さらなる検討を重ね、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、骨砕補（コツサイホ）又は骨砕補の抽出物を有効成分とする神経回路網の再構築・賦活剤（再構築剤及び／又は賦活剤、以下、単に、再構築剤、賦活剤、剤などということがある）に関する。
このような剤において、骨砕補の抽出物は、例えば、水および／またはアルコール、それらの混合物で抽出されるものであってもよい。
【００１０】
本発明の再構築・賦活剤において、神経回路網の再構築・賦活は、軸索（神経軸索）修復および／または軸索（神経軸索）伸展（伸長）による神経回路形成によるものであってもよい。
具体的な態様では、本発明の再構築・賦活剤は、神経回路形成により認知記憶機能（認知機能）が改善及び／又は亢進（又は向上）されるものであってもよい。このような態様において、認知記憶機能は、例えば、物体認知記憶、物体場所記憶、エピソード記憶のいずれかまたはそれらの組み合わせであってもよい。
【００１１】
本発明には、骨砕補又は骨砕補の抽出物を含む、神経疾患の予防及び／又は治療のための剤（神経疾患予防剤及び／又は神経疾患治療剤、神経疾患の予防及び／又は治療用医薬）も含まれる。また、本発明には、骨砕補又は骨砕補の抽出物を含む、神経軸索の修復及び／又は伸展のための剤も含まれる。これらの剤において、骨砕補の抽出物の態様は、前記と同様に、水および／またはアルコール、それらの混合物で抽出されるものであってもよい。
前記神経疾患の予防及び／又は治療のための剤において、神経疾患は、例えば、アルツハイマー病、認知症（例えば、老年性認知症、脳血管性認知症、ピック病、前頭側頭型認知症、レビー小体型認知症、血管性認知症など）、パーキンソン病、ハンチントン病、脳挫傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症及び多発性脳梗塞から選択された少なくとも１つの神経疾患であってもよい。
本発明によれば、軸索の修復及び／又は伸展等を伴うため、認知機能はもちろんのこと、軸索の変性や萎縮等が関与する幅広い神経疾患の予防及び／又は治療に有効である。
【００１２】
本発明には、さらに、前記剤（再構築・賦活剤、神経疾患の予防及び／又は治療のための剤、神経軸索の修復及び／又は伸長のための剤）を含有する飲食品（骨砕補又は骨砕補の抽出物を含有する飲食品）を含む。このような飲食品は、例えば、サプリメント、健康食品、機能性表示食品、栄養機能食品、又は特定保健用食品であってもよい。
本発明の飲食品の態様は、特に限定されないが、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤又はカプセル剤であってもよい。このような飲食品において、骨砕補又は骨砕補の抽出物の含有割合は、例えば、０．０１〜５０重量％程度であってもよい。また、このような飲食品は、食品用添加剤を含んでいてもよい。
代表的な飲食品の態様には、例えば、錠剤又はカプセル剤のサプリメントであり、骨砕補又は骨砕補の抽出物を１〜５０重量％含み、２以上の食品用添加剤を含む飲食品などが含まれる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、骨砕補又は骨砕補の抽出物を用いることにより、神経回路網を再構築及び／又は賦活できる。このような再構築や賦活は、通常、軸索の修復及び／又は伸長（伸展）を伴う場合が多い。そのため、本発明の剤や食品は、認知記憶機能の向上又は改善（亢進）をはじめ、軸索の変性や萎縮等を要因とする種々の神経疾患の予防、治療又は改善に有効である。
本発明者らは、このことを具体的に確認しており、例えば、骨砕補又は骨砕補の抽出物は、マウス大脳皮質神経由来の培養細胞系において、Aβ25-35処理により軸索の密度が有意に減少していた細胞の軸索の修復又は伸長作用を有している。また、骨砕補又は骨砕補エキスをアルツハイマー病の病態モデルマウスの一つである5XFADマウスに対して、物体認知記憶および物体場所記憶などの記憶改善効果を有し、神経回路網の再構築剤として有用である。さらに、骨砕補の抽出物には、正常マウスの認知機能における記憶力の向上が認められることから、記憶力向上を目的とした飲食品などの配合成分として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Aβ25-35未処置細胞とAβ25-35細胞とのpNF-H陽性の軸索の長さと、各画像内のＭＡＰ２陽性神経細胞を計測し、1神経細胞あたりの軸索の長さの比較を示す図である。
【図２】正常マウスの物体認知記憶試験の結果を示す図である。
【図３】正常マウスの物体場所記憶試験の結果を示す図である。
【図４】5XFADマウス群および溶媒のみを投与した野生型マウス群の物体認知記憶試験の結果を示す図である。
【図５】5XFADマウス群および溶媒のみを投与した野生型マウス群の物体場所記憶試験の結果を示す図である。
【図６】5XFADマウス群および溶媒のみを投与した野生型マウス群のエピソード記憶試験の結果を示す図である。
【図７】正常マウスの自発運動量試験の結果を示す図である。
【図８】5XFADマウス群および溶媒のみを投与した野生型マウス群の自発運動量試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に用いられる骨砕補（コツサイホ）は、ウラボシ科ハカマウラボシ(Drynaria fortune)の根茎である。
骨砕補は、そのまま用いてもよく、抽出物（エキス）として用いてもよく、これらを組み合わせて用いてもよい。
骨砕補の抽出は、骨砕補またはその破砕物を水もしくはアルコール（メタノール、エタノールなど）またはそれらの混合物を用い、常温または加熱下で常法またはそれに準じた方法で抽出処理した後、抽出物を常温乾燥または凍結乾燥することにより得ることができる。
乾燥させた抽出物は、そのまま使用してもよいが、さらに粉状とすることが好ましい。
【００１６】
骨砕補又は骨砕補の抽出物を薬剤の神経網再形成剤等として利用する場合、当該骨砕補又は抽出物をそのまま用いてもよく、また、錠剤，散剤、顆粒剤、カプセル剤などに製剤化して経口的に投与してもよい。
さらに、坐剤、注射剤、点滴剤、点眼剤、外用剤などに製剤化して非経口的に投与してもよいが、経口剤として投与することが望ましい。
経口剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などを加え錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤を常法により製造することができる。
また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などを添加することができる。
【００１７】
骨砕補又は骨砕補の抽出物の投与量は、疾患、症状、年齢、併用される治療的措置などにより異なるが、経口剤としてヒトに投与する場合は、固形分又は抽出物として０．１〜５０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜３０００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは５〜１０００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１０〜８００ｍｇ／ｋｇ）、特に３０〜１０００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１００〜８００ｍｇ／ｋｇ）を、特別な場合には0.1〜10mg/kgを1日1回〜数回に分けて投与すればよい。
【００１８】
本発明では、骨砕補又は骨砕補の抽出物を含有した飲食品にすることもできる。ここで、「飲食品」とは、飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品をも含むものであり、更にサプリメント（栄養補助食品）、飼料、食品添加物等も本発明の飲食品に包含される。また、飲食品は、特定の対象者用［例えば、高齢者用、患者又は病者用（例えば、神経疾患（前記例示の神経疾患など）を有する患者用）など］の飲食品であってもよい。
骨砕補又は骨砕補の抽出物を飲食品に使用するには、そのまま、または種々の栄養成分等とともに加工肉、清涼飲料などの飲食品の原料に混ぜて飲食品を製造することができる。
また、骨砕補の抽出物を健康食品、栄養補助食品などとして使用する場合、例えば慣用の手段を用いて、錠剤、カプセル（ソフトカプセル、ハードカプセルなど）、散剤、顆粒、液剤（懸濁剤、シロップ剤など）、乳剤、ゼリー、スティック状などの形態に調製することができる。また、錠剤には、崩壊錠（口腔内崩壊錠）も含まれる。
【００１９】
飲食品は、骨砕補又は骨砕補の抽出物を含んでいる限り、食品添加剤（食品用添加剤）を含んでいてもよい。食品添加剤としては、特に限定されないが、例えば、賦形剤（例えば、コムギデンプン、トウモロコシデンプン、セルロース、乳糖、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、アルファー化デンプン、カゼイン、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、ケイ酸カルシウムなど）、結合剤（例えば、アルファー化デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど）、崩壊剤（例えば、セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプンなど）、流動化剤（例えば、軽質無水ケイ酸、ショ糖脂肪酸エステルなど）、油（例えば、大豆油、ゴマ油、オリーブ油、亜麻仁油、エゴマ油、ナタネ油、ココナッツ油、トウモロコシ油などの植物油又は動物・魚由来の油）、栄養素（例えば、各種ミネラル、各種ビタミン、アミノ酸）、香料、甘味料、矯味剤、着色料、溶媒(エタノール)、塩類、界面活性剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、抗酸化剤、安定化剤、ゲル化剤、増粘剤、滑沢剤、カプセル化剤、懸濁剤、コーティング剤、防腐剤などが挙げられる。
食品添加剤は、単独で又は２種以上組み合わせてもよく、特に２種以上用いてもよい。なお、２種以上の添加剤を用いる場合、同系統の添加剤から２以上の成分（例えば、賦形剤に分類される成分から２以上の成分）を選択してもよく、異種の添加剤を２以上組み合わせて（例えば、賦形剤と結合剤とを組み合わせて）もよく、これらの両方を選択してもよい。特に、添加剤は、異種の添加剤を組み合わせてもよい。
また、錠剤などの形態の飲食品では、上記の中でも、特に、賦形剤、結合剤、及び崩壊剤から選択された少なくとも２以上の添加剤を少なくとも使用してもよい。
【００２０】
骨砕補又は骨砕補の抽出物を食品添加物として用いる場合、飲食品としては、特に限定されないが、例えば、食品［例えば、麺類（そば、うどん、中華麺、即席麺など）、菓子類（飴、キャンディー、ガム、チョコレート、スナック菓子（ポテトチップなど）、ビスケット、クッキー、グミ、ゼリー、ジャム、バター、クリーム（シュークリームなど）、ケーキなど）、パン類、水産又は畜産加工食品（かまぼこ、ハム、ソーセージなど）、乳製品（加工乳、発酵乳など）、油脂および油脂加工食品（サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシングなど）、調味料（ソース、たれなど）、レトルト食品（カレー、シチュー、丼、お粥、雑炊など）、冷菓（アイスクリーム、シャーベット、かき氷など）、揚げ物（コロッケ、フライドポテト、フライドチキンなど）など］、飲料（茶飲料、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料など）などが挙げられる。
【００２１】
上記の飲食品における骨砕補又は骨砕補の抽出物の配合量は、添加形態及び投与形態によっても異なり広い範囲から選択できるが、例えば、０．００１〜８０重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％、さらに好ましくは１〜５０重量％（例えば、５〜２０重量％）、通常、０．０１〜５０重量％（例えば、０．０１〜１０重量％）配合するのが望ましい。
なお、飲食品において、骨砕補又は骨砕補の投与量（又は摂取量）は、前記と同様の範囲から選択できる。
【実施例】
【００２２】
以下に、比較例、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。当業者は、以下の参考例及び実施例のみならず本願明細書にかかる特許請求の範囲に様々な変更を加えて本発明を最大限に実施することができ、かかる変更は本願明細書にかかる特許請求の範囲に含まれるものである。
【００２３】
＜骨砕補の水抽出物＞  骨砕補（栃本天海堂、大阪）に20倍量の水を加え、煎じ器（ウチダ和漢薬、東京）を用いて抽出を行った。生薬に加えた水が沸騰するまで強火で加熱し（15〜20分）、その後とろ火での加熱を1時間続けた。ろ液を濾した後、熱時綿栓濾過し、ろ液を室温で放冷後、液体窒素で凍結させた。さらに凍結乾燥器にて乾燥させ、粉末状の骨砕補の抽出物を得た（収率7.8％）。これを、生理食塩水に溶解して骨砕補水エキスとして以下の試験に使用した。
【００２４】
＜統計処理＞  本実施例において、得られた結果は以下の統計処理を行った：
一元配置分散分析(one-way ANOVA)、事後ダネット(Dunnett)検定、及び対応t−検定は、グラフパッド５(Graphpad Prism 5) (グラフパッドソフトウエア(Graphpad Software)社、ラホヤ(La Jolla)、カリフォルニア州、米国)を用いて行った。* P＜0.05,
**P < 0.01, ***P < 0.001は統計学的に有意とし、平均値は標準誤差とともに示す。
【００２５】
＜供試動物＞（１）正常マウス：ddYマウスは、日本ＳＬＣ（浜松、日本）から得た。本実施例においては、正常マウスとして、雄性かつ6週齢のddYマウスを用いた。全てのマウスは、餌と水を自由に摂取させ、22±2℃、50±5%の湿度、午前7時から始まる12時間の明暗サイクルで制御された環境で飼育した。
【００２６】
（２）アルツハイマー病モデルマウス：トランスジェニックマウス（5XFAD）はアルツハイマー病の動物モデルと考えられており、ジャクソン研究所（バーハーバー(Bar Harbor)、メイン州、米国）から入手した。5XFADマウスは、ニューロン特異的マウスThy-1プロモータの転写制御下、スウェーデン(Swedish)（K670NとM671L）、フロリダ(Florida)（I716V）及びロンドン(London)（V717I）に変異を持つヒトAPP695 cDNA、及びヒト PS1 cDNA（M146LとL286Vの変異）を過剰発現している（Oakley,H.ら,J Neurosci,26,10129-10140,2006．）。それらはB6/SJL F1ブリーダーとヘミ接合トランスジェニックマウスを交配することによって維持された。
【００２７】
本実施例においては、5XFADマウスは、6〜8か月齢である雄性および雌性を用い、餌と水を自由に摂取できる状態で、22±2℃、50±5％の湿度、午前7時から始まる12時間の明暗サイクルで制御された環境で飼育した。
【００２８】
＜自発運動量測定＞本参考試験１において、自発運動量測定は以下のように実施した：
試験に供する各マウスについて、オープンフィールドボックスで10分間馴化させた時のマウスの移動経路を、デジタルカメラシステムを用いて追跡した。10分間に動いた距離をEthoVision3.0（ノルダス(Noldus)社、ワゲニンゲン(Wageningen)、オランダ）で移動活動として分析した。
【００２９】
＜物体認知記憶試験＞
物体認知記憶試験とは、動物が新しいものに興味を示す習性を利用した試験である。すなわち、テスト段階において、トレーニング段階で見た物体を覚えているか否かを確認する試験である。試験は、自発運動量測定の翌日、文献（Int J Neurosci, 121, pp.181-190, 2011.、およびInt J Neurosci, 121, pp.641-648, 2011.）の記載にしたがって行った。具体的には、以下のように行った。
試験は比較的照明をおとした部屋（約100ルクス）にて行った。トレーニング段階とテスト段階の間の適切な時間間隔（インターバル）は、別のマウスのグループで予めテストして決めた。試験を行うオープンフィールドボックスの内側の壁には、一切の目印はない。トレーニング段階ではフィールド内に２つの同じ物体を置き10分間の探索行動をさせる。テストの段階では、物体の一つを新しい物体に置き換え、しかし置き場所は変えずに、10分間の探索行動をさせる。マウスが、置き換えた新しい物体に興味を示して探索行動する回数の増加を、物体記憶能力の指標とするものである。
本実施例では、総探索時間に対する新たな物体への探索回数の割合（％）を探索指向指数（Preference index）として算出した。
【００３０】
＜物体場所記憶試験（空間記憶試験）＞
物体場所記憶試験（空間記憶試験）は、動物が新しい場所に興味を示す習性を利用した試験である。すなわち、テスト段階において、トレーニング段階で見た物体の場所（空間）を覚えているか否かを確認する試験である。試験は、British Journal of Pharmacology (2009) 157, 1427-1440.の記載を参考にして行った。具体的には、以下のように行った。
試験は比較的照明をおとした部屋（約100ルクス）にて行った。トレーニング段階とテスト段階の間の適切な時間間隔（インターバル）は、別のマウスのグループで予めテストして決めた。試験を行うオープンフィールドボックスの内側の四方の壁のうち、対面する２つの壁に目印となるような特徴的な柄を配した壁紙を貼る。トレーニング段階ではフィールド内にマウスにとって初めて見る２つの同じ物体を置き10分間の探索行動をさせる。テストの段階では、その物体のうち一つの置き場所を変えて、10分間の探索行動をさせる。
マウスが、物は同じでも置き場所が変わった物体に興味を示して探索行動する回数の増加を、空間記憶能力の指標とするものである。
本実施例では、総探索時間に対する場所を変えた物体への探索回数の割合（％）を探索指向指数（Preference index）として算出した。
【００３１】
＜エピソード記憶試験＞
エピソード記憶試験は、動物が新しいものと新しい場所に興味を示す習性を利用し、物体と空間に対する複合記憶を保持しているかどうかを検討する試験である。すなわち、テスト段階において、２回のトレーニング段階で見た物体と場所を覚えているか否かを確認する試験であり、マウスが、自己にとって記憶に新しい「物の配置」でない方に探索行動の回数を増加させる現象を、エピソード記憶能力の指標とするものである。具体的には、以下のように行った。
試験は比較的照明をおとした部屋（約100ルクス）にて行った。トレーニング段階とテスト段階の間の適切な時間間隔（インターバル）は、別のマウスのグループで予めテストし10分と定めた。試験を行うオープンフィールドボックスの内側の四方の壁のうち、対面する2つの壁に目印となるような特徴的な柄を配した壁紙を貼る。トレーニング１ではフィールド内にマウスにとって初めて見る4つの同じ物体を置き10分間の探索行動をさせる。トレーニング２では、別の4つの物体を配するが、うち2つはトレーニング１の置き場所と同じ場所に、残り2つは違う場所に置く。テストの段階では、トレーニング２で設定した4か所の置き場所のうち2か所はそのままトレーニング２の物体を置き、残り2か所には、トレーニング１で用いた物体を配する。いずれも10分間の探索行動をさせる。
本実施例では、総探索時間に対する種類や置き場所を変えた物体への探索回数の割合（％）を探索指向指数（Preference index）として算出した。
【００３２】
実施例１
骨砕補水エキスは滅菌精製水に溶解した。マウス大脳皮質神経細胞は胎生14日齢のddYマウス（Japan SLC, 静岡）から取り出した胎児をPBSで洗浄後、断頭し、初代培養用に作成した培地［Neurobasal media（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）中に12% 馬血清（Invitrogen）, 2mM L-グルタミン酸, 0.6％グルコースを溶解］に入れた。培地中で、実体顕微鏡（SZ-61, Olympus, 東京）下で大脳皮質のみを単離した。
【００３３】
大脳皮質を安全キャビネット内で約1mm角に切断した。700rpmで3分間遠心した後、上清を除去し、沈殿物に0.05％trypsin-0.53 mM EDTA solution（ライフテクノロジーズ）を2mL加え、懸濁した。37℃で15分間、5分置きに攪拌しながらインキュベーションし、培地を4 mL加え、700rpmで3分間遠心して上清を除去し、沈殿に600 U/mL DNase I (ライフテクノロジーズ)-0.03％ trypsin inhibitor(ライフテクノロジーズ)-PBS溶液を2 mL加え、懸濁した。
【００３４】
さらに、37℃で15分間、5分置きに攪拌しながらインキュベーションし、培地を4mL加え、700rpmで3分間遠心した。沈渣にカルシウム・マグネシウム不含Hank’s balanced salt solution（ＨＢＳＳ）を4mL加え700rpmで3分間遠心した。沈渣に培地を4mL加えた。
【００３５】
先端を炙りなめしたパスツールピペットで細胞塊が見えなくなるまで穏やかに懸濁した後、70μm nylon cell strainer（Falcon, New Jersey, USA）で濾過した。細胞の培養は8-wellチャンバースライド（コーニング）で行った。前日にコーティング［Poly-D-Lysine （PDL, Sigma-Aldrich）をPBSで0.005 mg/mLに希釈したものをまき、37℃でインキュベーションしたもの。培養当日に滅菌精製水で2回洗浄。］したものに細胞を播種した。37℃、10％CO2、飽和水蒸気下で培養を開始し、3日後に培地を全量、馬血清の代わりにB-27 supplement (Invitrogen)を含む新しい培地で交換した。この際に、事前に凝集させておいたアミロイドベータ部分配列（Aβ25-35）を10μMになるように加え、その3日後に培地を全量新しいものに換える際に骨砕補水エキスあるいは溶媒を加え、さらに4日後に免疫染色を実施した。
【００３６】
免疫染色は、薬物処置期間終了後、培地を除いてPBSで洗浄し、4％paraformaldehyde (PFA, 和光純薬) -PBS溶液を加え、2時間室温で静置し、細胞を固定した。0.3％triton X-100(和光純薬)-PBS溶液で5分間の洗浄を2回行った。その後、1次抗体溶液［0.3％triton X-100-PBS溶液、 1％normal goat serum（NGS, 和光純薬）、1次抗体］を加え、4℃で一晩反応させた。
【００３７】
1次抗体には、マウス抗リン酸化型NF-Hモノクローナル抗体（1:500）（COVANCE, Emeryville, CA, USA）、ウサギ抗MAP2ポリクローナル抗体（1:2000）（abcam, Cambridge、英国）を用いた。翌日、1次抗体溶液を除き、0.3％triton X-100-PBS溶液で5分間の洗浄を2回行った後、2次抗体溶液［0.3％triton X-100-PBS溶液,  Alexa Fluor 594 標識 ヤギ抗マウス IgG抗体（1:200）（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）、Alexa Fluor 488 標識 ヤギ抗ウサギ IgG抗体（1:200）（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）］を加え、遮光下の室温で2時間反応させた。反応後、2次抗体溶液を除き、PBSで5分間、2回洗浄し、DAPI染色で核を染めた後、Aqua Poly Mount（Polysciences, Warrington, USA）で封入した。
【００３８】
蛍光顕微鏡（BX-61, Olympus）を用いて、各薬物処置を施したwellから648μm×860μmで10枚の画像をデジタル画像撮影装置DP70（Olympus）で取得した。それらの画像について、画像解析ソフトMetaMorph（モレキュラーデバイス, 東京）を用いて、画面全体のpNF-H陽性の軸索の長さと、各画像内のMAP2陽性神経細胞を計測し、１神経細胞あたりの軸索の長さを算出した。
【００３９】
結果を図１に示した。Aβ25-35未処置細胞と比較してAβ25-35細胞では、軸索の密度が有意に減少していたが、骨砕補水エキス（1、10μg/mL）の後処置によって有意な軸索の伸長が認められた。
【００４０】
実施例２
骨砕補水エキスを、生理食塩水に溶解して、投与量を500mg/kg/日として、1日1回、正常マウスに経口投与した。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。投与期間は、7日間とした。このマウスに対し、物体認知記憶試験を実施した。また、トレーニング段階とテスト段階のインターバルは４８時間とした。溶媒のみを投与した対照群と比較すると、骨砕補水エキス投与群では有意に物体認知記憶が亢進した（図２）。
【００４１】
実施例３
骨砕補水エキスを、生理食塩水に溶解して、投与量を500mg/kg/日として、1日1回、正常マウスに経口投与した。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。投与期間は、5日間とした。このマウスに対し、物体場所記憶（空間記憶）試験を実施した。また、トレーニング段階とテスト段階のインターバルは48時間とした。溶媒のみを投与した対照群と比較すると、骨砕補水エキス投与群では有意に物体場所記憶が亢進した(図３)。
【００４２】
実施例４
骨砕補水エキスを、生理食塩水に溶解して、投与量を50、500mg/kg/日として、1日1回、5XFADマウスに経口投与した。溶媒のみを投与した5XFADマウス群、および溶媒のみを投与した野生型マウス群も設けた。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。投与期間は、21日間とした。このマウスに対し、物体認知記憶試験を実施した。また、トレーニング段階とテスト段階のインターバルは1時間とした。野生型マウスでは物体認知記憶が維持されているのに対し、5XFADマウスの溶媒投与群では、記憶障害が生じている。一方、骨砕補水エキス投与群では用量依存的に記憶障害の改善が示され、50、500mg/kg/日投与群では有意な作用が認められた (図４)。
【００４３】
実施例５
骨砕補水エキスを、生理食塩水に溶解して、投与量を500mg/kg/日として、1日1回、5XFADマウスに経口投与した。溶媒のみを投与した5XFADマウス群、および溶媒のみを投与した野生型マウス群も設けた。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。投与期間は、24日間とした。このマウスに対し、物体場所記憶（空間記憶）試験を実施した。また、トレーニング段階とテスト段階のインターバルは1時間とした。野生型マウスでは物体場所記憶が維持されているのに対し、5XFADマウスの溶媒投与群では、記憶障害が生じている。一方、骨砕補水エキス投与群では用量依存的に記憶障害の改善が示され、500mg/kg/日投与群では有意な作用が認められた (図５)。
【００４４】
実施例６
骨砕補水エキスを、生理食塩水に溶解して、投与量を50、500mg/kg/日として、1日1回、5XFADマウスに経口投与した。溶媒のみを投与した5XFADマウス群、および溶媒のみを投与した野生型マウス群も設けた。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。投与期間は30日間とした。このマウスに対し、エピソード記憶試験を実施した。また、トレーニング１とトレーニング２の間、およびトレーニング２とテストのインターバルはそれぞれ10分間とした。野生型マウスではエピソード記憶が維持されているのに対し、5XFADマウスの溶媒投与群では、記憶障害が生じている。一方、骨砕補水エキス投与群では用量依存的に記憶障害の改善が示され、50、500mg/kg/日投与群では有意な作用が認められた (図６)。
【００４５】
参考例１
骨砕補水エキスを、生理食塩水に溶解して、投与量を500mg/kg/日として、1日1回、正常マウスに経口投与した。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。投与期間は、6日間とした。このマウスの自発運動量を測定したところ、溶媒のみを投与した対照群と、骨砕補水エキス投与群の間に有意な差は見られなかった（図７)。
【００４６】
参考例２
骨砕補水エキスを、生理食塩水に溶解して、投与量を50、500mg/kg/日として、1日1回、5XFADマウスに経口投与した。溶媒のみを投与した5XFADマウス群、および溶媒のみを投与した野生型マウス群も設けた。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。投与期間は27日間とした。これらのマウスに対し、自発運動量を測定したところ、群間に有意な差は見られなかった(図８)。
【００４７】
実施例７
骨砕補水エキス5ｇに、賦形剤として乳糖2ｇとコーンスターチ（トウモロコシデンプン）1ｇ、崩壊剤としてヒドロキシプロピルセルロース（L-HPC）1ｇ、結合剤としてポリビニルピロリドン1ｇを加えて湿式造粒し、乾燥後整粒して顆粒を調製した。
【００４８】
実施例８
骨砕補水エキス5ｇに、賦形剤として乳糖3.5ｇとコーンスターチ（トウモロコシデンプン）1.5ｇを加えよく混合し、更に流動化剤として軽質無水ケイ酸 0.05ｇを添加しよく混合して、散剤を得た。
【００４９】
実施例９
実施例2で得られた散剤0.3ｇを、市販のゼラチンカプセル（（株）ヒルハーフ総合研究所より入手、品番「１号カプセル」）に詰め、カプセル剤を得た。
【００５０】
実施例１０
実施例1で得られた顆粒５gを32メッシュの篩で篩過し、滑沢剤のステアリン酸マグネシウム0.05ｇを加え、約30秒軽く混合した後打錠し、錠剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
骨砕補又は骨砕補の抽出物は、物体認知記憶および物体場所記憶などの記憶改善効果などを有し、神経回路網の再構築剤として有用である。さらに骨砕補又は骨砕補の抽出物は、記憶力向上を目的とした飲食品などの配合成分として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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