(57)【要約】      （修正有）【課題】変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法、測定装置および溶離液を提供する。【解決手段】高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）を用いる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）を用いることにより、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法。
【請求項２】
高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）を用いることにより、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法。
【請求項３】
高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）を用いることにより、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法。
【請求項４】
高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）、および、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）からなる群より選択される少なくとも２種の溶離液を組み合わせて送液する、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法。
【請求項５】
下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つに基づいて溶離液を送液する、請求項４に記載の測定方法：
（Ｉ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される、少なくとも１種の溶離液を送液する、または、少なくとも２種の溶離液を混合せずに順番に送液する、
（ＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液を送液する、
（ＩＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される少なくとも１種の溶離液と、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液と、を順番に送液する。
【請求項６】
前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍの少なくとも１つの溶離液と前記溶離液Ｌとを混合してなる少なくとも１種の混合液を送液する、請求項４または請求項５に記載の測定方法。
【請求項７】
前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｌおよび前記溶離液Ｏを混合してなる混合液、ならびに前記溶離液Ｍおよび前記溶離液Ｌを混合してなる混合液を送液する、請求項４〜請求項６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】
測定されるヘモグロビン類は、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、請求項７に記載の測定方法。
【請求項９】
前記溶離液Ｌを用い、前記溶離液Ｌの浸透圧が、３５ｍＯｓｍ以上２００ｍＯｓｍ以下である、請求項１、請求項４〜請求項８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１０】
前記溶離液Ｏを用い、前記溶離液Ｏの浸透圧が、１７０ｍＯｓｍ以上２９０ｍＯｓｍ以下である、請求項２、請求項４〜請求項８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１１】
前記溶離液Ｍを用い、前記溶離液Ｍの浸透圧が、１６０ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下である、請求項３〜請求項８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１２】
前記溶離液Ｌおよび前記溶離液Ｏを混合してなる混合液を用い、前記溶離液の混合比が溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：２〜１：４である、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１３】
前記溶離液Ｍおよび前記溶離液Ｌを混合してなる混合液を用い、前記溶離液の混合比が溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：２〜１：４である、請求項５〜請求項８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１４】
ｐＨ５．３０以上５．４０以下、浸透圧２０４ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ａ）をさらに用いる、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１５】
ｐＨ７．８５以上８．２５以下、浸透圧３５０ｍＯｓｍ以上６００ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ｂ）をさらに用いる、請求項１〜請求項１４のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１６】
ｐＨ７．８５以上８．２５以下、浸透圧３５０ｍＯｓｍ以上６００ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ｂ）およびｐＨ５．３０以上５．４０以下、浸透圧２０４ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ａ）について、混合比が溶離液Ｂ：溶離液Ａ＝１：２〜１：４となるように混合してなる混合液をさらに用いる、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１７】
測定されるヘモグロビン類は、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、請求項１６に記載の測定方法。
【請求項１８】
高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）、および、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）からなる群より選択される溶離液を単独で、または、組み合わせて送液する送液ポンプと、
前記送液ポンプに接続され、前記溶離液が送液される分離用カラムとを備え、ヘモグロビン類を測定する測定装置。
【請求項１９】
前記送液ポンプは、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つに基づいて溶離液を送液する、請求項１８に記載の測定装置：
（Ｉ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される、少なくとも１種の溶離液を送液する、または、少なくとも２種の溶離液を混合せずに順番に送液する、
（ＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液を送液する、
（ＩＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される少なくとも１種の溶離液と、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液と、を順番に送液する。
【請求項２０】
前記溶離液として、ｐＨ５．３０以上５．４０以下、浸透圧２０４ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ａ）、および、ｐＨ７．８５以上８．２５以下、浸透圧３５０ｍＯｓｍ以上６００ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ｂ）の少なくとも１つをさらに送液する、または、前記溶離液Ａおよび前記溶離液Ｂを混合してなる混合液をさらに送液する、請求項１８または請求項１９に記載の測定装置。
【請求項２１】
前記送液ポンプが１つである、請求項１８〜請求項２０のいずれか１項に記載の測定装置。
【請求項２２】
高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である、溶離液（溶離液Ｌ）。
【請求項２３】
高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である、溶離液（溶離液Ｏ）。
【請求項２４】
高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である、溶離液（溶離液Ｍ）。
【請求項２５】
高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）、および、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）からなる群より選択される少なくとも２種の溶離液からなる、溶離液の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、種々のヘモグロビン類を測定する測定方法、測定装置および種々のヘモグロビン類を測定する際に使用する溶離液に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘモグロビン類、なかでもヘモグロビンがグルコースと結合した糖化タンパクであるグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）は、過去１〜２ヶ月間の平均血糖レベルを反映しているため、糖尿病やメタボリックシンドロームを含む生活習慣病の検査および血糖管理などに広く利用されている。そのため、ＨｂＡ１ｃなどのヘモグロビン類を容易かつ高精度に測定する方法が求められている。
ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、酵素法、電気泳動法などが挙げられる。なかでも、ＨｂＡ１ｃの標準測定法として、ＨＰＬＣ法が臨床検査分野で多く採用されている。
【０００３】
ＨＰＬＣ法を用いてヘモグロビン類を分離、測定する方法としては、様々なものが挙げられる。例えば、特許文献１には、カルボキシル基又はカルボキシアルキル基をイオン交換基として備えた分離用カラムに、リン酸系緩衝液を溶離液として供給し試料中のヘモグロビン類を分析する方法において、Ｓ−（カルボキシアルキル）−Ｌ−システインを含みリン酸系緩衝物質を含む液を、上記分離用カラムに供給するヘモグロビン類の分析方法が開示されている。特許文献１の技術では、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０といったヘモグロビン類を分離することが可能であるとされている。
【０００４】
また、特許文献２には、緩衝液として、多糖類を含有する緩衝液を用いているヘモグロビン類の測定方法が開示されている。特許文献２の技術では、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦ、ＨｂＡ２と異常ヘモグロビン（ＨｂＳ、ＨｂＣ）とを測定、分離することが可能であるとされている。さらに、特許文献２では、高速液体クロマトグラフィーを原理とし、上記異常ヘモグロビンの測定を目的とした測定装置は、カラムへ溶離液を送液する送液ポンプを２つ有し、１つの送液ポンプに１種の溶離液タンクを接続し、２種の溶離液の混合比を変化させてカラムへ溶離液を送液するグラジェント方式を用いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２８１２２２号公報
【特許文献２】特開２００９−２３６７６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１の技術では、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０以外のヘモグロビン類の分離は達成できず、特許文献２の技術では、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦ、ＨｂＡ２以外のヘモグロビン類の分離は、ＨｂＳおよびＨｂＣに限定されていた。そのため、上述した先行技術以外に、種々のヘモグロビン類を高精度で測定する測定方法、測定装置および種々のヘモグロビン類を高精度で測定する際に使用する溶離液が求められている。
【０００７】
本発明は、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定することが可能な測定方法、測定装置および溶離液を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するための具体的な手段は、以下の通りである。
＜１＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）を用いることにより、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法である。
【０００９】
＜２＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）を用いることにより、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法である。
【００１０】
＜３＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）を用いることにより、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法である。
【００１１】
＜４＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）、および、成分１の含有率が０．４質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）からなる群より選択される少なくとも２種の溶離液を組み合わせて送液する、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定する測定方法である。
【００１２】
＜５＞  本発明の一態様は、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つに基づいて溶離液を送液する、前記＜４＞に記載の測定方法である：（Ｉ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される、少なくとも１種の溶離液を送液する、または、少なくとも２種の溶離液を混合せずに順番に送液する、（ＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液を送液する、（ＩＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される少なくとも１種の溶離液と、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液と、を順番に送液する。
【００１３】
＜６＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍの少なくとも１つの溶離液と前記溶離液Ｌとを混合してなる少なくとも１種の混合液を少なくとも送液する、前記＜４＞または前記＜５＞に記載の測定方法である。
＜７＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｌおよび前記溶離液Ｏを混合してなる混合液、ならびに前記溶離液Ｍおよび前記溶離液Ｌを混合してなる混合液を送液する、前記＜４＞〜前記＜６＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
＜８＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類は、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである前記＜７＞に記載の測定方法である。
【００１４】
＜９＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌを用い、前記溶離液Ｌの浸透圧が、３５ｍＯｓｍ以上２００ｍＯｓｍ以下である、前記＜１＞、前記＜４＞〜前記＜８＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
＜１０＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｏを用い、前記溶離液Ｏの浸透圧が、１７０ｍＯｓｍ以上２９０ｍＯｓｍ以下である、前記＜２＞、前記＜４＞〜前記＜８＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
＜１１＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｍを用い、前記溶離液Ｍの浸透圧が、１６０ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下である、前記＜３＞〜前記＜８＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
【００１５】
＜１２＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌおよび前記溶離液Ｏを混合してなる混合液を用い、前記混合液の混合比が溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：２〜１：４である、前記＜５＞〜前記＜８＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
＜１３＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｍおよび前記溶離液Ｌを混合してなる混合液を用い、前記混合液の混合比が溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：２〜１：４である、前記＜５＞〜前記＜８＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
【００１６】
＜１４＞  本発明の一態様は、ｐＨ５．３０以上５．４０以下、浸透圧２０４ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ａ）をさらに用いる、前記＜１＞〜前記＜１３＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
＜１５＞  本発明の一態様は、ｐＨ７．８５以上８．２５以下、浸透圧３５０ｍＯｓｍ以上６００ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ｂ）をさらに用いる、前記＜１＞〜前記＜１４＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
＜１６＞  本発明の一態様は、ｐＨ７．８５以上８．２５以下、浸透圧３５０ｍＯｓｍ以上６００ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ｂ）およびｐＨ５．３０以上５．４０以下、浸透圧２０４ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ａ）について、混合比が溶離液Ｂ：溶離液Ａ＝１：２〜１：４となるように混合してなる混合液をさらに用いる、前記＜１＞〜前記＜１３＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
＜１７＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類は、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、前記＜１６＞に記載の測定方法である。
【００１７】
＜１８＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）、および、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）からなる群より選択される溶離液を単独で、または、組み合わせて送液する送液ポンプと、前記送液ポンプに接続され、前記溶離液が送液される分離用カラムとを備え、ヘモグロビン類を測定する測定装置である。
＜１９＞  本発明の一態様は、前記送液ポンプは、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つに基づいて溶離液を送液する、前記＜１８＞に記載の測定装置である：（Ｉ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される、少なくとも１種の溶離液を送液する、または、少なくとも２種の溶離液を混合せずに順番に送液する、（ＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液を送液する、（ＩＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される少なくとも１種の溶離液と、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液と、を順番に送液する。
【００１８】
＜２０＞  本発明の一態様は、前記溶離液として、ｐＨ５．３０以上５．４０以下、浸透圧２０４ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ａ）、および、ｐＨ７．８５以上８．２５以下、浸透圧３５０ｍＯｓｍ以上６００ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ｂ）の少なくとも１つをさらに送液する、または、前記溶離液Ａおよび前記溶離液Ｂを混合してなる混合液をさらに送液する、前記＜１８＞または前記＜１９＞に記載の測定装置である。
＜２１＞  本発明の一態様は、前記送液ポンプが１つである、前記＜１８＞〜前記＜２０＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００１９】
＜２２＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である、溶離液（溶離液Ｌ）である。
【００２０】
＜２３＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である、溶離液（溶離液Ｏ）である。
【００２１】
＜２４＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である、溶離液（溶離液Ｍ）である。
【００２２】
＜２５＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類は、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、前記＜２２＞〜前記＜２４＞のいずれか１つに記載の溶離液である。
【００２３】
＜２６＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌの浸透圧が、３５ｍＯｓｍ以上２００ｍＯｓｍ以下である、前記＜２２＞に記載の溶離液である。
【００２４】
＜２７＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｏの浸透圧が、１７０ｍＯｓｍ以上２９０ｍＯｓｍ以下である、前記＜２３＞に記載の溶離液である。
【００２５】
＜２８＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｍの浸透圧が、１６０ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下である、前記＜２４＞に記載の溶離液である。
【００２６】
＜２９＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類が、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、前記＜２２＞〜前記＜２８＞のいずれか１つに記載の溶離液である。
【００２７】
＜３０＞  本発明の一態様は、高速液体クロマトグラフィーにて、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定するための、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）、および、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）からなる群より選択される少なくとも２種の溶離液からなる、溶離液の組み合わせである。
【００２８】
＜３１＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される少なくとも２種の溶離液が非混合状態である、前記＜３０＞に記載の溶離液の組み合わせである。
【００２９】
＜３２＞  本発明の一態様は、以下の（ａ）を満たす溶離液と（ｂ）を満たす混合液とから構成され、前記（ａ）を満たす溶離液および前記（ｂ）を満たす混合液が、非混合状態および混合状態の少なくともいずれか一方に該当する、前記＜３０＞に記載の溶離液の組み合わせである：（ａ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される少なくとも１種の溶離液、（ｂ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液。
【００３０】
＜３３＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌと、前記溶離液Ｌおよび前記溶離液Ｏを混合してなる混合液と、前記溶離液Ｍおよび前記溶離液Ｌを混合してなる混合液とを含む、前記＜３０＞に記載の溶離液の組み合わせである。
【００３１】
＜３４＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類は、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、前記＜３０＞〜前記＜３３＞のいずれか１つに記載の溶離液の組み合わせである。
【００３２】
＜３５＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌを含み、前記溶離液Ｌの浸透圧が、３５ｍＯｓｍ以上２００ｍＯｓｍ以下である、前記＜３０＞〜前記＜３４＞のいずれか１つに記載の溶離液の組み合わせである。
【００３３】
＜３６＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｏを含み、前記溶離液Ｏの浸透圧が、１７０ｍＯｓｍ以上２９０ｍＯｓｍ以下である、前記＜３０＞〜前記＜３５＞のいずれか１つに記載の溶離液の組み合わせである。
【００３４】
＜３７＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｍを含み、前記溶離液Ｍの浸透圧が、１６０ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下である、前記＜３０＞〜前記＜３６＞のいずれか１つに記載の溶離液の組み合わせである。
【００３５】
＜３８＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌおよび前記溶離液Ｏを混合してなる混合液を含み、前記混合液の混合比が溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：２〜１：４である、前記＜３０＞〜前記＜３７＞のいずれか１つに記載の溶離液の組み合わせである。
【００３６】
＜３９＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｍおよび前記溶離液Ｌを混合してなる混合液を含み、前記混合液の混合比が溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：２〜１：４である、前記＜３０＞〜前記＜３８＞のいずれか１つに記載の溶離液の組み合わせである。
【００３７】
＜４０＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類が、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、前記＜３０＞〜前記＜３９＞のいずれか１つに記載の溶離液の組み合わせである。
【００３８】
＜４１＞  本発明の一態様は、前記＜３０＞に記載の組み合わせにおいて、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液である。
【００３９】
＜４２＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍの少なくとも１つの溶離液と前記溶離液Ｌとを混合してなる少なくとも１種である、前記＜４１＞に記載の混合液である。
【００４０】
＜４３＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類は、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、前記＜４１＞または前記＜４２＞に記載の混合液である。
【００４１】
＜４４＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌを含み、前記溶離液Ｌの浸透圧が、３５ｍＯｓｍ以上２００ｍＯｓｍ以下である、前記＜４１＞〜前記＜４３＞のいずれか１つに記載の混合液である。
【００４２】
＜４５＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｏを含み、前記溶離液Ｏの浸透圧が、１７０ｍＯｓｍ以上２９０ｍＯｓｍ以下である、前記＜４１＞〜前記＜４４＞のいずれか１つに記載の混合液である。
【００４３】
＜４６＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｍを含み、前記溶離液Ｍの浸透圧が、１６０ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下である、前記＜４１＞〜前記＜４５＞のいずれか１つに記載の混合液である。
【００４４】
＜４７＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｌおよび前記溶離液Ｏを混合してなり、混合比が溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：２〜１：４である、前記＜４１＞〜前記＜４６＞のいずれか１つに記載の混合液である。
【００４５】
＜４８＞  本発明の一態様は、前記溶離液Ｍおよび前記溶離液Ｌを混合してなり、混合比が溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：２〜１：４である、前記＜４１＞〜前記＜４７＞のいずれか１つに記載の混合液である。
【００４６】
＜４９＞  本発明の一態様は、測定されるヘモグロビン類が、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つである、前記＜４１＞〜前記＜４８＞のいずれか１つに記載の混合液である。
【００４７】
＜５０＞  本発明の一態様は、前記溶離液を分離用カラムに送液する、前記＜１＞〜前記＜１７＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
【００４８】
＜５１＞  本発明の一態様は、前記溶離液を前記分離用カラムに送液する際の流速が０．００１ｍｌ／分以上である、前記＜５０＞に記載の測定方法である。
【００４９】
＜５２＞  本発明の一態様は、前記溶離液を前記分離用カラムに送液する際の流速が５．０ｍｌ／分以下である、前記＜５０＞または前記＜５１＞に記載の測定方法である。
【００５０】
＜５３＞  本発明の一態様は、前記混合液を分離用カラムに送液する、前記＜５＞〜＜８＞、＜１２＞、＜１３＞、＜１６＞及び＜１７＞のいずれか１つに記載の測定方法である。
【００５１】
＜５４＞  本発明の一態様は、前記混合液を前記分離用カラムに送液する際の流速が０．００１ｍｌ／分以上である、前記＜５３＞に記載の測定方法である。
【００５２】
＜５５＞  本発明の一態様は、前記混合液を前記分離用カラムに送液する際の流速が５．０ｍｌ／分以下である、前記＜５３＞または前記＜５４＞に記載の測定方法である。
【００５３】
＜５６＞  本発明の一態様は、前記溶離液を前記分離用カラムに送液する際の流速が０．００１ｍｌ／分以上である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００５４】
＜５７＞  本発明の一態様は、前記溶離液を前記分離用カラムに送液する際の流速が５．０ｍｌ／分以下である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００５５】
＜５８＞  本発明の一態様は、前記混合液を前記分離用カラムに送液する際の流速が０．００１ｍｌ／分以上である、前記＜１９＞または前記＜２０＞に記載の測定装置である。
【００５６】
＜５９＞  本発明の一態様は、前記混合液を前記分離用カラムに送液する際の流速が５．０ｍｌ／分以下である、前記＜１９＞、前記＜２０＞及び前記＜５８＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００５７】
＜６０＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムが陽イオン交換カラムである、前記＜１８＞〜前記＜２１＞及び前記＜５６＞〜前記＜５９＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００５８】
＜６１＞  本発明の一態様は、前記陽イオン交換カラムの陽イオン交換基が、スルホ基、カルボキシル基およびリン酸基の少なくともいずれか１つである、前記＜６０＞に記載の測定装置である。
【００５９】
＜６２＞  本発明の一態様は、前記陽イオン交換カラムの陽イオン交換基が、スルホ基である、前記＜６０＞に記載の測定装置である。
【００６０】
＜６３＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムのカラム充填剤が、ポリマーゲルまたは無機系ゲルである、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞〜前記＜６２＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００６１】
＜６４＞  本発明の一態様は、前記カラム充填剤がポリマーゲルであり、前記ポリマーゲルがメタクリル酸−メタクリル酸エステル共重合体である、前記＜６３＞に記載の測定装置である。
【００６２】
＜６５＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムの長さが１ｍｍ以上である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞〜前記＜６４＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００６３】
＜６６＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムの長さが３００ｍｍ以下である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞〜前記＜６５＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００６４】
＜６７＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムの内径が０．１ｍｍ以上である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞〜前記＜６６＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００６５】
＜６８＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムの内径が５０ｍｍ以下である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞〜前記＜６７＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００６６】
＜６９＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムにおけるカラム充填剤の平均粒子径が０．１μｍ以上である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞〜前記＜６８＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【００６７】
＜７０＞  本発明の一態様は、前記分離用カラムにおけるカラム充填剤の平均粒子径が５０μｍ以下である、前記＜１８＞〜前記＜２１＞および前記＜５６＞〜前記＜６９＞のいずれか１つに記載の測定装置である。
【発明の効果】
【００６８】
本発明の一態様によれば、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンから選択される少なくとも１種のヘモグロビンを測定することが可能な測定方法、測定装置および溶離液を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本実施形態に係るヘモグロビン類を測定する測定装置を示す。
【図２】実施例１にて、測定試料として健常人検体を用いた場合の測定結果を示す。
【図３】実施例１にて、測定試料としてＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを含有する検体を用いた場合の測定結果を示す。
【図４】実施例１にて、ＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＨを含有する検体を用いた場合の測定結果を示す。
【図５】実施例２にて、測定試料としてＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを含有する検体を用いた場合の測定結果を示す。
【図６】実施例３にて、測定試料としてＨｂＥを含有する検体および健常人検体を用いた場合の測定結果を示す。
【図７】実施例４にて、測定試料としてＨｂＥを含有する検体および健常人検体を用い、かつ溶離液Ｌの代わりに比較溶離液Ｌを用いた場合の測定結果を示す。
【図８】実施例５にて、測定試料としてＨｂＢａｒｔ’ｓを含有する検体を用いた場合の測定結果を示す。
【図９】実施例６にて、測定試料としてＨｂＢａｒｔ’ｓを含有する検体を用い、かつ溶離液Ｏの代わりに比較溶離液Ｏを用いた場合の測定結果を示す。
【図１０】実施例７にて、測定試料としてＨｂＳ、ＨｂＣを含有する検体およびＨｂＣＳを含有する検体を用いた場合の測定結果を示す。
【図１１】実施例８にて、測定試料としてＨｂＳ、ＨｂＣを含有する検体およびＨｂＣＳを含有する検体を用い、かつ溶離液Ｍの代わりに比較溶離液Ｍを用いた場合の測定結果を示す。
【図１２】溶離液Ｌにおける浸透圧とｐＨとの関係を示す。
【図１３】溶離液Ｌにおける浸透圧と成分２／成分１との関係を示す。
【図１４】溶離液Ｍにおける浸透圧とｐＨとの関係を示す。
【図１５】溶離液Ｍにおける浸透圧と成分２／成分１との関係を示す。
【図１６】溶離液Ｏにおける浸透圧とｐＨとの関係を示す。
【図１７】溶離液Ｏにおける浸透圧と成分２／成分１との関係を示す。
【図１８】溶離液Ｂにおける浸透圧とｐＨとの関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７０】
以下、本発明の一態様の測定方法に係る実施形態について詳細に説明する。
【００７１】
本発明の一態様の測定方法の一形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて、溶離液を単独で、または、複数の溶離液を混合して用いることにより、グリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）、ヘモグロビンＡ０（ＨｂＡ０）、変異ヘモグロビン（変異Ｈｂ）およびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも１種のヘモグロビンを測定することができる。なお、高速液体クロマトグラフィー法としては、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、分配クロマトグラフィー法、逆相分配クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過クロマトグラフィー法等が挙げられる。
【００７２】
ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンがグルコースと結合した糖化タンパクの１種であり、糖尿病診断の指標とされている。また、ＨｂＡ０は、血液試料中のヘモグロビンの大部分を占め、健常人では、ヘモグロビン全体の約９０％を占める。さらに健常人に含まれるヘモグロビンとしてＨｂＦやＨｂＡ２などが存在する。
変異Ｈｂとしては、ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＤ、ＨｂＣなどが挙げられる。溶離液または複数の溶離液を混合してなる混合液のｐＨ、浸透圧、各成分の濃度などに応じて、測定可能な変異Ｈｂは異なる。
【００７３】
また、本発明の一態様の測定方法の一形態では、高速液体クロマトグラフィーにて、溶離液を単独で、または、複数の溶離液を混合して用いることにより、サラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの測定が可能である。サラセミアのマーカーとなるヘモグロビンとしては、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇ（以下、「ＨｂＣＳ」とも称する。）が挙げられる。
【００７４】
なお、以下では、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＦ、ＨｂＡ２、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンを総称して「ヘモグロビン類」と称する。
本発明の一態様の測定方法では、上述したような種々のヘモグロビン類が測定の対象となっている。そして、上記の特許文献１および特許文献２の技術にて分離、測定対象となっていないヘモグロビン類の分離、測定が可能である。
【００７５】
本発明の一態様において使用される試料としては、試料原料から調製したものをいう。試料原料としては、ヘモグロビン類を含む生体試料である。生体試料としては、血液、赤血球成分を含む血液由来物、唾液、髄液等が含まれる。血液としては、生体から採取された血液が挙げられ、好ましくは動物の血液、より好ましくは哺乳類の血液、さらに好ましくはヒトの血液である。赤血球成分を含む血液由来物としては、血液から分離または調製されたものであって赤血球成分を含むものが挙げられ、例えば、血漿が除かれた血球画分、血球濃縮物、血液または血球の凍結乾燥物、全血を溶血処理した溶血試料、遠心分離血液、自然沈降血液などが挙げられる。
【００７６】
本発明の一態様において使用される試料は、試料原料を希釈したものであってもよい。また、試料中の試料原料の濃度（含有量）としては、ヘモグロビンの変性抑制の観点から１質量％以上３０質量％以下であることが好ましい。
【００７７】
（溶離液Ｌ）
本発明の一態様の測定方法に用いる溶離液Ｌは、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液である。
溶離液Ｌを単独または他の溶離液と組み合わせてヘモグロビン類の測定に用いることにより、変異ヘモグロビン、サラセミアのマーカーとなるヘモグロビンなどを測定できる。また、例えば、正常ヘモグロビン、変異ヘモグロビン、およびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも２種のヘモグロビンを同時に測定でき、例えば、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇなどのヘモグロビン類の少なくとも１つを一括して測定することが可能であり、特に、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ、ＨｂＳなどのヘモグロビン類の少なくとも１つを一括して測定することが可能である。溶離液Ｌ単独で、特に、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ等のヘモグロビン類を一括して測定することが可能である。なお、測定対象のＨｂより先に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により、溶出できる。
なお、本発明の一態様に係るヘモグロビン類の測定方法では、試料を分離用カラムに注入した後、溶離液を分離用カラムに供給することにより、供給した溶離液に応じて、試料中に含まれるヘモグロビンを分離、測定する。
【００７８】
また、溶離液Ｌを送液して、例えばＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤを分離する場合、例えば、これらのヘモグロビン類は分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。さらに、溶離液Ｌを送液して、例えばＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＤの分離を行なう場合についても、例えば、これらのヘモグロビン類は分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【００７９】
溶離液Ｌの成分１および成分２の比率としては、上記の数値範囲を満たしていれば限定されないが、成分１の含有率については、０．１５質量％以上０．４０質量％以下が好ましく、０．２０質量％以上０．２９質量％以下がより好ましく、０．２０質量％以上０．２７質量％以下がさらに好ましく、成分２の含有率については、０．３５質量％以上１．０５質量％以下が好ましく、０．６０質量％以上０．７０質量％以下がより好ましい。成分２／成分１は、１．４以上７．０以下が好ましく、２．２以上３．５以下がより好ましい。
【００８０】
溶離液Ｌの浸透圧は、３５ｍＯｓｍ以上２００ｍＯｓｍ以下であることが好ましく、８０ｍＯｓｍ以上１８５ｍＯｓｍ以下であることがより好ましく、１２５ｍＯｓｍ以上１４０ｍＯｓｍ以下であることがさらに好ましい。溶離液Ｌや以下に示す各溶離液の浸透圧は、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）の濃度を変えることによって調整することができる。
【００８１】
溶離液ＬのｐＨは、５．５以上７．４以下であることが好ましく、５．８以上６．７以下であることがより好ましく、６．２以上６．４以下であることがさらに好ましい。
【００８２】
溶離液Ｌは、上述した成分１および成分２以外にその他の添加物を加えて調製することが好ましい。その他の添加物として、例えば、緩衝剤、無機塩類、ｐＨ調整剤、水溶性有機溶媒、防腐剤、ヘモグロビン安定剤、カオトロピックイオンなどを添加してもよい。また、溶離液Ｌは、蒸留水などで希釈してもよい。
【００８３】
溶離液Ｌに添加する緩衝剤としては、例えば、リン酸、ホウ酸、炭酸等の無機物のほか、カルボン酸、ジカルボン酸、カルボン酸誘導体、ヒドロキシカルボン酸、アニリンまたはアニリン誘導体、アミノ酸、アミン類、イミダゾール類、アルコール類等の有機物が挙げられる。また、エチレンジアミン四酢酸、ピロリン酸、ピリジン、カコジル酸、グリセロールリン酸、２，４，６−コリジン、Ｎ−エチルモルホリン、モルホリン、４−アミノピリジン、アンモニア、エフェドリン、ヒドロキシプロリン、ピペリジン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、グリシルグリシン等の有機物でもよい。溶離液Ｌ中の緩衝剤の含有量は、緩衝作用がある範囲であればよく、１ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であることが好ましく、１０ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることがより好ましい。また、上記緩衝剤は、１種でも複数併用してもよく、例えば、有機物および無機物を併用してもよい。
【００８４】
溶離液Ｌに添加する無機塩類としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。無機塩類を溶離液Ｌに添加することにより、ヘモグロビン類のピーク溶出を最適化することができる。これらの無機塩類の濃度は、特に限定されないが、１ｍＭ以上１５００ｍＭ以下であることが好ましい。
【００８５】
溶離液Ｌに添加するｐＨ調整剤としては、公知の酸、塩基が挙げられる。酸としては、例えば、塩酸、リン酸、硝酸、硫酸等が、塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化カルシウム等が挙げられる。これらの酸、塩基の濃度は、特に限定されないが、０．００１ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることが好ましい。
【００８６】
溶離液Ｌに添加する水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、２−フェノキシエタノール、アセトニトリル、アセトン等が挙げられる。これらの水溶性有機溶媒の濃度は、塩等が析出しない程度で用いることが好ましく、好ましい上限は８０％（ｖ／ｖ）である。
【００８７】
溶離液Ｌに添加する防腐剤としては、アジ化ナトリウム、チモール、プロピオン酸ナトリウム等が挙げられる。これらの防腐剤の濃度は、特に限定されず、０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることが好ましい。
【００８８】
また、溶離液Ｌに添加するヘモグロビン安定剤としては、公知の安定剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、グルタチオン、アジ化ナトリウム等の還元剤または酸化防止剤等が挙げられる。これらのヘモグロビン安定剤の濃度は、特に限定されず、０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることが好ましい。
【００８９】
また、溶離液Ｌには、カオトロピックイオンを添加してもよい。カオトロピックイオンとは、化合物が水溶液に溶解したときに解離により生じ、水の構造を破壊し、疎水性物質と水が接触したときに起こる水のエントロピー減少を抑制するイオンである。
【００９０】
溶離液Ｌに添加するカオトロピックイオンとしては、陰イオンおよび陽イオンのカオトロピックイオンがある。陰イオンのカオトロピックイオンとしては、トリブロモ酢酸イオン、トリクロロ酢酸イオン、チオシアン酸イオン、ヨウ化物イオン、過塩素酸イオン、ジクロロ酢酸イオン、硝酸イオン、臭化物イオン、塩化物イオン、酢酸イオン等が挙げられ、陽イオンのカオトロピックイオンとしては、バリウムイオン、カルシウムイオン、リチウムイオン、セシウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、グアニジンイオン等が挙げられる。溶離液Ｌ中のカオトロピックイオンの含有量は、０．１ｍＭ以上３０００ｍＭ以下であることが好ましく、１ｍＭ以上１０００ｍＭ以下であることがより好ましく、１０ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることがさらに好ましい。０．１ｍＭ以上であることにより、ヘモグロビン類の測定において、分離効果が上昇し、３０００ｍＭ以下であることにより、ヘモグロビン類の分離効果を効率的に向上させることができる。
【００９１】
（溶離液Ｏ）
本発明の一態様の測定方法に用いる溶離液Ｏは、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液である。
溶離液Ｏを単独または他の溶離液と組み合わせてヘモグロビン類の測定に用いることにより、例えば、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇなどのヘモグロビン類の少なくとも１つを測定することが可能であり、特に、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ等のヘモグロビン類を測定できる。また、溶離液Ｏ単独で、ＨｂＢａｒｔ’ｓなどのサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンを測定することができる。なお、測定対象のＨｂより先に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により、溶出できる。
【００９２】
溶離液Ｏの成分１および成分２の比率としては、上記の数値範囲を満たしていれば限定されないが、成分１の含有率については、０．０５質量％以下が好ましく、０．０４質量％以下がより好ましく、０．０３質量％以下がさらに好ましい。また、成分１の含有率の下限としては、特に限定されないが、０．００１質量％以上が好ましく、０．００２質量％以上がより好ましく、０．０１質量％以上がさらに好ましい。さらに、成分２の含有率については、１．４２質量％以上１．７０質量％以下が好ましく、１．４４質量％以上１．６０質量％以下がより好ましい。成分２／成分１は、２５以上が好ましく、４０以上がより好ましく、４８以上がさらに好ましい。また、成分２／成分１の上限としては、１０００以下が好ましく、３００以下がより好ましい。
【００９３】
溶離液Ｏの浸透圧は、１７０ｍＯｓｍ以上２９０ｍＯｓｍ以下であることが好ましく、１９０ｍＯｓｍ以上２２０ｍＯｓｍ以下であることがより好ましく、２００ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下であることがさらに好ましい。
【００９４】
溶離液ＯのｐＨは、５．４以下であることが好ましく、４．８以上５．４以下であることがより好ましく、５．０以上５．３以下であることがさらに好ましい。
【００９５】
成分１および成分２のリン酸系緩衝液以外にも他の添加物を加えて、上記数値範囲を満たす溶離液Ｏを調製することが好ましい。他の添加物としては、上記の溶離液Ｌを調製する場合と同様である。
【００９６】
（溶離液Ｍ）
本発明の一態様のヘモグロビン類の測定方法に用いる溶離液Ｍは、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液である。
溶離液Ｍを単独または他の溶離液と組み合わせてヘモグロビン類の測定に用いることにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＣＳなどの正常ヘモグロビン、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも１種のヘモグロビンを測定することができる。特に、溶離液Ｍ単独で、ＨｂＣなどの変異ヘモグロビンおよびＨｂＣＳなどのサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンを測定することができる。なお、測定対象のＨｂより先に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により、溶出できる。なお、より詳細には、測定可能であるＨｂＣ、ＨｂＣＳなどのヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【００９７】
溶離液Ｍの成分１および成分２の比率としては、上記の数値範囲を満たしていれば限定されないが、成分１の含有率については、０．５質量％以上０．９０質量％以下が好ましく、０．６質量％以上０．８０質量％以下がより好ましく、成分２の含有率については、０．４５質量％以上０．７５質量％以下が好ましく、０．５５質量％以上０．６５質量％以下がより好ましい。成分２／成分１は、０．５以上１．７以下が好ましく、０．７以上１．４以下がより好ましい。
【００９８】
溶離液Ｍの浸透圧は、１６０ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下であることが好ましく、１７０ｍＯｓｍ以上２００ｍＯｓｍ以下であることがより好ましく、１７５ｍＯｓｍ以上１９０ｍＯｓｍ以下であることがさらに好ましい。
【００９９】
溶離液ＭのｐＨは、７．３以下であることが好ましく、６．４以上７．０以下であることがより好ましく、６．５以上６．９以下であることがさらに好ましい。
【０１００】
成分１および成分２のリン酸系緩衝液以外にも他の添加物を加えて、上記数値範囲を満たす溶離液Ｍを調製することが好ましい。他の添加物としては、上記の溶離液Ｌを調製する場合と同様である。
【０１０１】
（溶離液Ａ）
本発明の一態様の測定方法では、ｐＨ５．３０以上５．４０以下、浸透圧２０４ｍＯｓｍ以上２１０ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ａ）をさらに用いてもよい。溶離液Ａは、成分１および成分２の濃度を変えるなどにより、ｐＨおよび浸透圧を調整することで得られる。
【０１０２】
溶離液Ａを単独または他の溶離液と組み合わせてヘモグロビン類の測定に用いることにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つを一括して測定でき、特に、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを一括して測定することが可能である。特に、溶離液Ａ単独で、ＨｂＦおよびＨｂＡ１ｃを一括して測定することが可能である。溶離液Ａは、上述の溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍのいずれかと混合した混合液として用いてもよく、また、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍと組み合わせて、分離用カラムに順番に送液してもよい。溶離液Ａを溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍと組み合わせて送液することにより、ＨｂＡ１ｃと変異Ｈｂとの一括分離、または、ＨｂＡ１ｃとサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンとの一括分離が可能となる。なかでも、溶離液Ｌと溶離液Ａとを組み合わせて送液することにより、ＨｂＡ１ｃおよび変異Ｈｂを一括して測定することができ、有用である。なお、測定対象のＨｂより先に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により、溶出できる。
【０１０３】
（溶離液Ｂ）
本発明の一態様の測定方法では、ｐＨ７．８５以上８．２５以下、浸透圧３５０ｍＯｓｍ以上６００ｍＯｓｍ以下の溶離液（溶離液Ｂ）をさらに用いてもよい。溶離液Ｂは、成分１および成分２の濃度を変えるなどにより、ｐＨおよび浸透圧を調整することで得られる。また、溶離液Ｂの浸透圧としては、３７０ｍＯｓｍ以上５７０ｍＯｓｍ以下が好ましく、４００ｍＯｓｍ以上４８０ｍＯｓｍ以下がより好ましい。
【０１０４】
溶離液Ｂと溶離液Ａとを混合してなる混合液をヘモグロビン類の測定に用いることにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つを一括して測定でき、特に、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを一括して測定することが可能である。また、溶離液Ｂは、上述の溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍのいずれかと混合した混合液として用いてもよい。他にも、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍやこれらの混合液を分離用カラムに順番に送液した後、溶離液Ｂを分離用カラムに送液して、分離用カラム内の試料を洗い流すために用いてもよい。なお、測定対象のＨｂより先に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により、溶出できる。
【０１０５】
上述した溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍ、溶離液Ａおよび溶離液Ｂの溶離液を単独で順番に送液してもよく、あるいは、上述した溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍ、溶離液Ａおよび溶離液Ｂのいずれかを混合してなる混合液を順番に送液してもよく、溶離液および混合液を組み合わせて順番に送液してもよい。溶離液および混合液を組み合わせて送液することにより、種々のヘモグロビン類を一括して測定することができる。
【０１０６】
なかでも、一括して種々のヘモグロビン類を測定する場合には、高速液体クロマトグラフィーにて、リン酸１水素・２アルカリ金属塩（成分１）およびリン酸２水素・１アルカリ金属塩（成分２）を成分とし、成分１の含有率が０．０８質量％以上０．５０質量％以下、成分２の含有率が０．０４質量％以上１．２質量％以下、成分２／成分１が０．４以上１０以下である溶離液（溶離液Ｌ）、成分１の含有率が０．０７質量％未満、成分２の含有率が１．４質量％超２．０質量％以下、成分２／成分１が２０超である溶離液（溶離液Ｏ）、および、成分１の含有率が０．４０質量％以上１．０４質量％未満、成分２の含有率が０．２６質量％超０．８８質量％以下、成分２／成分１が０．２５超２．２以下である溶離液（溶離液Ｍ）からなる群より選択される少なくとも２種の溶離液を組み合わせて送液することが好ましい。なお、測定対象のＨｂより先に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により、溶出できる。
【０１０７】
さらに、ヘモグロビン類を測定する方法としては、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）のいずれか１つに基づいて溶離液を送液することがより好ましい：（Ｉ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される、少なくとも１種の溶離液を送液する、または、少なくとも２種の溶離液を混合せずに順番に送液する、（ＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液を送液する、（ＩＩＩ）前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される少なくとも１種の溶離液と、前記溶離液Ｌ、前記溶離液Ｏおよび前記溶離液Ｍからなる群より選択される２種以上の溶離液を混合してなる少なくとも１種の混合液と、を順番に送液する。これにより、種々のヘモグロビン類を一括して測定することができる。なお、上記（ＩＩＩ）について、溶離液と混合液とを送液する順番は特に限定されず、任意の順番で送液してもよい。そのため、例えば、溶離液を先に送液してもよく、混合液を先に送液してもよく、溶離液および混合液をランダムに送液してもよい。なお、測定対象のＨｂより先に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により、溶出できる。
【０１０８】
複数種の溶離液および混合液を送液する場合、リニアグラジエント方式およびステップグラジエント方式のいずれを採用してもよい。
【０１０９】
各溶離液または各混合液を分離用カラムに送液する際の流速としては、例えば、好ましくは０．００１ｍｌ／分以上、より好ましくは０．０１ｍｌ／分以上、さらに好ましくは０．０５ｍｌ／分以上、さらに好ましくは０．１ｍｌ／分以上、さらに好ましくは０．２ｍｌ／分以上、さらに好ましくは０．３ｍｌ／分以上、さらに好ましくは１．０ｍｌ／分以上、さらに好ましくは１．５ｍｌ／分以上である。また、各溶離液または各混合液を分離用カラムに送液する際の流速としては、例えば、好ましくは５．０ｍｌ／分以下、より好ましくは４．０ｍｌ／分以下、さらに好ましくは３．０ｍｌ／分以下、特に好ましくは２．５ｍｌ／分以下である。
【０１１０】
各溶離液または各混合液を分離用カラムに送液する時間としては、特に限定されず、測定対象となるヘモグロビン類の種類に応じて定めればよい。溶離液Ｌについては、２１秒以上１０５秒以下が好ましく、３０秒以上７０秒以下がより好ましい。これにより、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤなどのヘモグロビン類を好適に測定することができ、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【０１１１】
溶離液Ｏを送液する時間としては、１４秒以上７１秒以下が好ましく、２０秒以上４７秒以下がより好ましい。これにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓを好適に測定することができる。また、溶離液Ｍを送液する時間としては、１８秒以上９５秒以下が好ましく、２７秒以上６３秒以下がより好ましい。これにより、ＨｂＣ、ＨｂＣＳなどのヘモグロビンを好適に測定することができる。
【０１１２】
本発明の一態様のヘモグロビン類を測定する方法としては、溶離液Ｌを少なくとも送液することが好ましい。溶離液Ｌを単独または他の溶離液と組み合わせて送液してヘモグロビン類の測定に用いることにより、例えば、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ、ＨｂＳなどのヘモグロビン類の少なくとも１つを一括して測定することが可能である。溶離液Ｌ単独で、特に、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ等のヘモグロビン類を一括して測定することが可能であり、例えば、正常ヘモグロビンと変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも１種のヘモグロビンの測定に有用である。さらに、溶離液Ｌとともに、他の溶離液である溶離液Ｏまたは溶離液Ｍを組み合わせて送液することがより好ましい。溶離液Ｌと溶離液Ｏとを送液することにより、例えば、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃなどのヘモグロビン類を測定できる。また、例えば、溶離液Ｌと溶離液Ｍとを送液することにより、ＨｂＳを測定することが可能である。なお、測定対象より前に溶出されるＨｂは、必要に応じ他の溶離液により溶出できる。
【０１１３】
また、本発明の一態様のヘモグロビン類を測定する方法としては、溶離液Ｏおよび溶離液Ｍの少なくとも１つの溶離液と溶離液Ｌとを混合してなる混合液を送液することが好ましい。
なかでも、溶離液Ｌと溶離液Ｏとを混合してなる混合液は、ＨｂＡ１ｃとＨｂＦ、サラセミアマーカーであるＨｂＨなどを一括して測定する際に有用であり、溶離液Ｌと溶離液Ｍとを混合してなる混合液は、ＨｂＳなどの変異Ｈｂを測定する際に有用である。
【０１１４】
さらに、本発明の一態様のヘモグロビン類を測定する方法としては、溶離液Ｌ、溶離液Ｌおよび溶離液Ｏを混合してなる混合液、ならびに溶離液Ｍおよび溶離液Ｌを混合してなる混合液を組み合わせて送液することがより好ましい。これにより、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０およびＨｂＡ２、サラセミアマーカーであるＨｂＨと、多くの変異Ｈｂとを一括して測定することができる。測定できる変異Ｈｂとしては、ＨｂＥ、ＨｂＳ、ＨｂＤなどが挙げられる。
【０１１５】
本発明の一態様では、ＨｂＡ１ｃと変異Ｈｂとを一括して測定することができるため、糖尿病診断と変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも１種のヘモグロビンの同定とが一台の測定装置で実現可能である。よって、ＨｂＡ１ｃの測定と変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも１種のヘモグロビンの測定とを別々に行なう場合よりも、コスト削減が可能である。また、変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも１種のヘモグロビンを含む試料を測定した場合に、精度の高いＨｂＡ１ｃの測定結果が得られる。さらに、ＨｂＡ１ｃの測定時に変異ヘモグロビンおよびサラセミアのマーカーとなるヘモグロビンの少なくとも１種のヘモグロビンの有無を確認することができ、その結果を医療分野、臨床検査分野での治療、試験、研究等に利用することができる。
【０１１６】
溶離液Ｌおよび溶離液Ｏを混合してなる混合液について、溶離液Ｌと溶離液Ｏとの混合比は、測定対象とするヘモグロビンに応じて適宜調整すればよい。例えば、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃなどのヘモグロビン類を測定対象とする場合、混合比が溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：２〜１：４であることが好ましく、１：２．５〜１：３．５であることがより好ましい。
溶離液Ｌおよび溶離液Ｏを混合してなる混合液を送液する時間としては、１１秒以上６４秒以下が好ましく、１６秒以上３９秒以下がより好ましい。これにより、ＨｂＨ、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＦを好適に測定することができる。より詳細には、測定可能であるＨｂＨ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦなどのヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【０１１７】
また、溶離液Ｍおよび溶離液Ｌを混合してなる混合液について、溶離液Ｍと溶離液Ｌとの混合比は、測定対象とするヘモグロビンに応じて適宜調整すればよい。例えば、ＨｂＳなどのヘモグロビン類を測定対象とする場合、混合比が溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：２〜１：４であることが好ましく、１：２．５〜１：３．５であることがより好ましい。
さらに、溶離液Ｍおよび溶離液Ｌを混合してなる混合液を送液する時間としては、９秒以上４７秒以下が好ましく、１３秒以上３２秒以下がより好ましい。これにより、ＨｂＳなどのヘモグロビンを好適に測定することができる。
【０１１８】
他にも、本発明の一態様のヘモグロビン類を測定する方法では、溶離液Ｍ、溶離液Ｏ、ならびに溶離液Ｂおよび溶離液Ａを混合してなる混合液からなる群より選択される少なくとも１つの液体を送液することが好ましい。これにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つを測定することができ、特に、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳの少なくとも１つを測定することが可能である。
なかでも、溶離液Ｍおよび溶離液Ｏを順番に送液してヘモグロビン類を測定する、または溶離液Ｂおよび溶離液Ａを混合してなる混合液と溶離液Ｏとを順番に送液してヘモグロビン類を測定することがより好ましい。溶離液Ｍおよび溶離液Ｏを順番に送液することにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つを測定でき、特に、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳのすべてを一括して測定することが可能であり、溶離液Ｂおよび溶離液Ａを混合してなる混合液と溶離液Ｏとを順番に送液することにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つを測定でき、特に、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳのすべてを一括して測定することが可能である。
【０１１９】
また、溶離液Ｂおよび溶離液Ａを混合してなる混合液について、溶離液Ｂと溶離液Ａとの混合比は、測定対象とするヘモグロビンに応じて適宜調整すればよい。例えば、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳなどのヘモグロビン類を測定対象とする場合、混合比が溶離液Ｂ：溶離液Ａ＝１：２〜１：４であることが好ましく、１：２．５〜１：３．５であることがより好ましい。
さらに、溶離液Ｂおよび溶離液Ａを混合してなる混合液を送液する時間としては、１７秒以上８６秒以下が好ましく、２４秒以上５７秒以下がより好ましい。これにより、ＨｂＳ、ＨｂＣ，ＨｂＣＳなどのヘモグロビンを好適に測定することができる。
【０１２０】
複数の溶離液を送液する、複数の混合液を送液する、または、溶離液および混合液を組み合わせて送液する場合において、溶離液、混合液を送液する順番（送液シーケンス）は特に限定されず、任意の順番で溶離液、混合液を送液してよい。送液シーケンスとしては、例えば、以下のような送液シーケンス１〜送液シーケンス５が挙げられる。
【０１２１】
（送液シーケンス１）
溶離液として、溶離液Ｌ、溶離液Ｏおよび溶離液Ｍを送液する場合、上述のとおり、送液する順番は限定されないが、溶離液Ｏ、溶離液Ｌ、溶離液Ｍの順番で送液することが好ましい。これにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＣＳなどのヘモグロビン類の少なくとも１つの測定が可能であり、特に、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ、ＨｂＣ、ＨｂＣＳなどのヘモグロビン類の一括測定が可能である。また、測定可能なヘモグロビン類は、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
また、例えば、溶離液Ｌを送液して、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤを分離する場合や、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＤを分離する場合、これらのヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。さらに、例えば、溶離液Ｍを送液して、ＨｂＣ、ＨｂＣＳを分離する場合、これらのヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【０１２２】
（送液シーケンス２）
（１）溶離液Ｏ、（２）溶離液Ｌの順番で送液する場合、（１）、（２）の間に溶離液Ｌおよび溶離液Ｏを混合してなる混合液を送液してもよい。溶離液Ｌおよび溶離液Ｏを混合してなる混合液を送液することにより、ＨｂＨ、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＦを一括して測定することができる。したがって、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤの少なくとも１つの測定が可能となり、測定可能なヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、それぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【０１２３】
（送液シーケンス３）
次に、（１）溶離液Ｌ、（２）溶離液Ｍの順番で送液する場合、（１）、（２）の間に溶離液Ｍおよび溶離液Ｌを混合してなる混合液を送液してもよい。溶離液Ｍおよび溶離液Ｌを混合してなる混合液を送液することにより、ＨｂＳなどの変異Ｈｂを測定することができる。したがって、ＨｂＡ０、ＨｂＡ２、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣｏｎｓｔａｎｔＳｐｒｉｎｇの少なくとも１つの測定が可能となり、測定可能なヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、それぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【０１２４】
（送液シーケンス４）
さらに、溶離液Ｏ、溶離液Ｌおよび溶離液Ｏを混合してなる混合液、溶離液Ｌ、溶離液Ｍおよび溶離液Ｌを混合してなる混合液、溶離液Ｍの順番で送液することが好ましい。これにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣ、ＨｂＣＳなどのヘモグロビン類の一括測定が可能である。測定可能なヘモグロビン類は、それぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
また、例えば、溶離液Ｌおよび溶離液Ｏを混合してなる混合液を送液してＨｂＨ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＦを分離する場合、これらのヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、測定時間に応じてそれぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【０１２５】
（送液シーケンス５）
他にも、（１）溶離液Ｏ、（２）溶離液Ａ、（３）溶離液Ｌの順番で送液することが好ましい。これにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＨ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＡ２、ＨｂＤなどの一括測定が可能である。例えば、測定可能なヘモグロビン類は、例えば、分離用カラムからの溶出時間が重ならないことにより、それぞれのヘモグロビン類を高精度に分離することができる。
【０１２６】
溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍ、溶離液Ａまたは溶離液Ｂを使用している場合、上述した送液シーケンス１〜５以外の送液シーケンスも本発明の範囲に包含される。
【０１２７】
以下、本発明の一態様の測定装置の構成および測定装置の動作フローについて、図１を用いて説明する。図１は、本発明の一態様の一実施形態に係る測定装置を示す。測定装置１０は、測定試料に含まれているヘモグロビン類を測定するための装置であり、溶離液タンク１、切り替えバルブ２、送液ポンプ３、圧力計４、インジェクションバルブ５、オートサンプラ６、分離用カラム７、検出器８および廃液容器９を備えている。
なお、上述したヘモグロビン類の測定方法は、以下に説明する測定装置を用いて実施することができる。
【０１２８】
溶離液タンク１は、上述した各溶離液を貯留するためのタンクである。溶離液タンク１は、複数設けられており、上述した各溶離液がそれぞれ貯留される。溶離液タンク１に貯留されている溶離液は、流路を介して切り替えバルブ２および送液ポンプ３に供給される。
【０１２９】
切り替えバルブ２を切り替えることにより、送液される溶離液を変更することができる。例えば、設定された送液シーケンスに基づき切り替えバルブ２が駆動して切り替えバルブ２が切り替えられ、シーケンスに基づく溶離液の送液が行なわれる。
【０１３０】
送液ポンプ３により、一定流量の溶離液をインジェクションバルブ５まで送液することができ、圧力計４により、圧力変動なく一定流量の溶離液が送液されていることが確認できる。また送液ポンプ３による送液の際に、切り替えバルブ２を連続的に切り替えることで流路内での各溶離液の混合が可能となる。
【０１３１】
オートサンプラ６により、測定試料はインジェクションバルブ５を通過し、分離用カラム７に注入される。さらに、溶離液もインジェクションバルブ５を通過して分離用カラム７に送液される。そして、送液された溶離液によって分離用カラム７の内部でヘモグロビン類の分離が行なわれ、送液された溶離液の種類に応じたヘモグロビン類が溶出し、分離用カラム７から流出する。
【０１３２】
流出したヘモグロビン類は紫外・可視吸光光度計などの検出器８によって検出される。検出器８の検出結果に基づき、クロマトグラムが描画され、表示装置（図示せず）に表示される。検出器８による検出後、ヘモグロビン類を含む液体は、廃液として廃液容器９に注入される。
【０１３３】
ヘモグロビン類を測定する測定装置としては、特に限定されず、市販されている高速液体クロマトグラフィーシステムを用いることができる。
【０１３４】
分離用カラムとしては、例えば、陽イオン交換カラムが挙げられる。陽イオン交換カラムは、例えば、陽イオン交換基として、スルホ基、カルボキシル基およびリン酸基の少なくともいずれかを含むことが好ましく、陽イオン交換基としてスルホ基を含むことがより好ましい。
【０１３５】
分離用カラムについては、カラム基材であるカラム充填剤を充填したものを用いればよい。カラム充填剤としては、例えばメタクリル酸−メタクリル酸エステル共重合体やアクリル酸−アクリル酸エステル共重合体などのポリマーゲル、または、シリカゲルなどの無機系ゲルなどが挙げられ、中でもメタクリル酸−メタクリル酸エステル共重合体が好ましい。
【０１３６】
分離用カラムの長さとしては、例えば、好ましくは１ｍｍ以上、より好ましくは５ｍｍ以上、さらに好ましくは１０ｍｍ以上である。また、分離用カラムの長さとしては、例えば、好ましくは３００ｍｍ以下、より好ましくは２００ｍｍ以下、さらに好ましくは１５０ｍｍ以下、さらに好ましくは１００ｍｍ以下、さらに好ましくは７５ｍｍ以下、さらに好ましくは５０ｍｍ以下、さらに好ましくは４０ｍｍ以下、さらに好ましくは３５ｍｍ以下、さらに好ましくは３０ｍｍ以下である。
【０１３７】
分離用カラムの内径（φ）としては、例えば、好ましくは０．１ｍｍ以上、より好ましくは０．２ｍｍ以上、さらに好ましくは０．３ｍｍ以上、さらに好ましくは０．５ｍｍ以上、さらに好ましくは１ｍｍ以上、さらに好ましくは２ｍｍ以上、さらに好ましくは３ｍｍ以上である。また、分離用カラムの内径としては、例えば、好ましくは５０ｍｍ以下、より好ましくは３０ｍｍ以下、さらに好ましくは２０ｍｍ以下、さらに好ましくは１０ｍｍ以下、さらに好ましくは５ｍｍ以下である。
【０１３８】
分離用カラムにおけるカラム充填剤の平均粒子径は、例えば、好ましくは０．１μｍ以上、より好ましくは０．５μｍ以上、さらに好ましくは１μｍ以上、特に好ましくは３μｍ以上である。また、分離用カラムのカラム充填剤の平均粒子径は、例えば、好ましくは５０μｍ以下、より好ましくは２０μｍ以下、さらに好ましくは１０μｍ以下である。
【０１３９】
分離用カラムにおけるカラム充填剤の平均粒子径の変動係数値（ＣＶ値）は特に限定されないが、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１５％以下である。なお、ＣＶ値は、以下の式により求められる数値を意味する。
ＣＶ値（％）＝（粒子径の標準偏差／平均粒子径）×１００
【０１４０】
また、ヘモグロビン類を測定する測定装置は、送液ポンプを１つ有していることが好ましい。１つの送液ポンプで各溶離液または各溶離液を混合した混合液を順番に分離用カラムに送液する構成とすれば、測定装置のサイズダウンおよびコストダウンが可能である。なお、ヘモグロビン類を測定する測定装置は、送液ポンプを２つ以上有し、１つの送液ポンプに１種の溶離液タンクを接続し、２種以上の溶離液の混合比を変化させて分離用カラムへ溶離液を送液するグラジェント方式としてもよい。
【実施例】
【０１４１】
次に、本発明の一態様の測定方法により、各ヘモグロビン類を測定した結果について、以下の実施例に基づき説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。なお以下の説明において、特に断りがない限り、「％」は全て「質量％」を意味する。
【０１４２】
〔測定条件〕
以下の各実施例および各比較例では、以下の測定条件に基づき、ヘモグロビン類の測定を行なった。
・液体クロマトグラフシステム：グリコヘモグロビン分析装置（アークレイ社製）
・分離用カラム：φ４．６×２０ｍｍ  ゲル（カラム充填剤）：メタクリル酸−メタクリル酸エステル共重合体
・流速：２．１ｍｌ／ｍｉｎ
・溶離条件：シングルポンプによる低圧ステップグラジェント
【０１４３】
〔実施例１〕
実施例１のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍおよび溶離液Ｂを、単独で、あるいは以下の送液シーケンスに示すような混合比で混合して用いた。本実施例で用いた測定試料および溶離液Ｂは、以下に示すとおりであり、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、および溶離液Ｍは、以下の表１に示すとおりである。
・測定試料：（１）健常人検体、（２）ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを含有する検体（複数の血液を混合して調製した血液検体）、（３）ＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＨを含有する検体
・溶離液Ｂ：ｐＨ：８．０５、浸透圧：５４７ｍＯｓｍ
【０１４４】
【表１】
2016027326.tif 000002
【０１４５】
測定試料として上記（１）〜（３）の検体を用い、以下（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の順番で各溶離液および各混合液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。
・測定試料として上記（１）の検体を用いた場合の送液シーケンス：（Ｉ）溶離液Ｏを１秒送液、（ＩＩ）溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：３の混合比で混合した混合液を６４秒送液、（ＩＩＩ）溶離液Ｌを４９秒送液、（ＩＶ）溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：３の混合比で混合した混合液を２２秒送液、（Ｖ）溶離液Ｍを１５秒送液、（ＶＩ）溶離液Ｂを４秒送液、（ＶＩＩ）溶離液Ｏを１５秒送液
・測定試料として上記（２）の検体を用いた場合の送液シーケンス：（Ｉ）溶離液Ｏを１秒送液、（ＩＩ）溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：３の混合比で混合した混合液を３２秒送液、（ＩＩＩ）溶離液Ｌを４９秒送液、（ＩＶ）溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：３の混合比で混合した混合液を２２秒送液、（Ｖ）溶離液Ｍを５５秒送液、（ＶＩ）溶離液Ｂを４秒送液、（ＶＩＩ）溶離液Ｏを１５秒送液
・測定試料として上記（３）の検体を用いた場合の送液シーケンス：（Ｉ）溶離液Ｏを１秒送液、（ＩＩ）溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：３の混合比で混合した混合液を３２秒送液、（ＩＩＩ）溶離液Ｌを４９秒送液、（ＩＶ）溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：３の混合比で混合した混合液を２２秒送液、（Ｖ）溶離液Ｍを１５秒送液、（ＶＩ）溶離液Ｂを４秒送液、（ＶＩＩ）溶離液Ｏを１５秒送液
【０１４６】
実施例１の測定結果を図２〜図４に示す。図２は、測定試料として（１）健常人検体を用いた場合の測定結果であり、図３は、測定試料として（２）ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを含有する検体（複数の血液を混合して調製した血液検体）を用いた場合の測定結果であり、図４は、測定試料として、（３）ＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＨを含有する検体を用いた場合の測定結果である。図２〜図４ともに、縦軸は吸光度を示し、横軸は測定時間（秒）を示している（以下、図５〜図１１においても同様）。図２〜図４から、いずれの溶離液、または混合液を送液した場合に、どのヘモグロビン類が測定可能であるかがわかる。
【０１４７】
図２に示すように、上記（ＩＩ）にてＨｂＦが測定された後、ＨｂＡ１ｃが測定され、上記（ＩＩＩ）にてＨｂＡ０が測定された後、ＨｂＡ２が測定された。したがって、上記送液シーケンスにより、ＨｂＡ１ｃと他Ｈｂとを一括して分離可能であることが示された。
【０１４８】
次に、図３に示すように、上記（Ｉ）にてＨｂＢａｒｔ’ｓが測定され、上記（ＩＩ）にてＨｂＦが測定され、上記（ＩＩＩ）にてＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤの順番でヘモグロビン類が測定され、上記（ＩＶ）にてＨｂＳが測定され、上記（Ｖ）にてＨｂＣが測定された後、ＨｂＣＳが測定された。したがって、上記送液シーケンスにより、変異ＨｂとサラセミアのマーカーであるＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＣＳとを一括して分離可能であることが示された。
また、図４に示すように、上記（Ｉ）にてＨｂＢａｒｔ’ｓが測定され、上記（ＩＩ）にてＨｂＨが測定された。
【０１４９】
〔実施例２〕
実施例２のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ａおよび溶離液Ｂを、単独で、あるいは以下の送液シーケンスに示すような混合比で混合して用いた。本実施例で用いた測定試料および溶離液Ａ、溶離液Ｂは、以下に示すとおりであり、溶離液Ｌおよび溶離液Ｏは、以下の表２に示すとおりである。
・測定試料：ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを含有する検体（複数の血液を混合して調製した血液検体）
・溶離液Ａ：ｐＨ：５．３５、浸透圧：２０７ｍＯｓｍ
・溶離液Ｂ：ｐＨ：８．０５、浸透圧：４６９ｍＯｓｍ
【０１５０】
【表２】
2016027326.tif 000003
【０１５１】
測定試料として上記検体を用い、以下（Ｉ）〜（ＶＩ）の順番で各溶離液および混合液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。
・送液シーケンス：以下（Ｉ）〜（ＶＩ）の順番で各溶離液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。（Ｉ）溶離液Ｏを１秒送液、（ＩＩ）溶離液Ａを２０秒送液、（ＩＩＩ）溶離液Ｌを５０秒送液、（ＩＶ）溶離液Ｂ：溶離液Ａ＝１：３の混合比で混合した混合液を４０秒送液、（Ｖ）溶離液Ｂを８秒送液、（ＶＩ）溶離液Ｏを１５秒送液
【０１５２】
実施例２の測定結果を図５に示す。図５は、測定試料としてＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦ、ＨｂＡ１ｃ、ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤ、ＨｂＳ、ＨｂＣおよびＨｂＣＳを含有する検体を用いた場合の測定結果である。図５に示すように、上記送液シーケンスにより、ＨｂＡ１ｃ、変異Ｈｂ、ＨｂＢａｒｔ’ｓなどを一括して分離可能であることが示された。
【０１５３】
〔実施例３、４〕
実施例３のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍおよび溶離液Ｂを、単独で、あるいは以下の送液シーケンスに示すような混合比で混合して用いた。実施例４のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｌの代わりに比較溶離液Ｌを用い、以下の送液シーケンスにおける溶離液Ｌを比較溶離液Ｌに変更した。これら実施例で用いた測定試料および溶離液Ｂは、以下に示すとおりであり、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍおよび比較溶離液Ｌは、以下の表３に示すとおりである。
・測定試料：（１）ＨｂＥを含有する検体、（２）健常人検体
・溶離液Ｂ：ｐＨ：８．０５、浸透圧：５４７ｍＯｓｍ
【０１５４】
【表３】
2016027326.tif 000004
【０１５５】
測定試料として上記検体をそれぞれ用い、以下（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の順番で各溶離液および混合液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。
・送液シーケンス：以下（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の順番で各溶離液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。（Ｉ）溶離液Ｏを１秒送液、（ＩＩ）溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：３の混合比で混合した溶離液を６４秒送液、（ＩＩＩ）溶離液Ｌを４９秒送液、（ＩＶ）溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：３の混合比で混合した混合液を２２秒送液、（Ｖ）溶離液Ｍを１５秒送液、（ＶＩ）溶離液Ｂを４秒送液、（ＶＩＩ）溶離液Ｏを１５秒送液
【０１５６】
実施例３の測定結果を図６に示す。図６は、測定試料としてＨｂＥを含有する検体および健常人検体を用いた場合の測定結果である。図６に示すように、上記送液シーケンスにより、ＨｂＡ１ｃと変異Ｈｂとを一括して分離可能であることが示された。
【０１５７】
実施例４の測定結果を図７に示す。図７は、測定試料としてＨｂＥを含有する検体および健常人検体を用い、かつ溶離液Ｌの代わりに比較溶離液Ｌを用いた場合の測定結果である。図７に示すように、上記送液シーケンスでは、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＦの溶出位置（ピーク１）が重なり、また、ＨｂＡ０およびＨｂＥの溶出位置（ピーク２）が重なっていた。
【０１５８】
図６、７の結果から、比較溶離液Ｌを用いた場合には、ＨｂＡ１ｃおよびＨｂＦの溶出位置ならびにＨｂＡ０およびＨｂＥの溶出位置が重なってしまうが、溶離液Ｌを用いた場合には、これらヘモグロビン類の溶出位置が重ならないことがわかる。よって、溶離液Ｌを用いることでより多くのヘモグロビン類を測定時間に応じて高精度に分離することが可能である。
【０１５９】
〔実施例５、６〕
実施例５のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍおよび溶離液Ｂを、単独で、あるいは以下の送液シーケンスに示すような混合比で混合して用いた。実施例６のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｏの代わりに比較溶離液Ｏを用いており、以下の送液シーケンスにおける溶離液Ｏを比較溶離液Ｏに変更した。これら実施例で用いた測定試料および溶離液Ｂは、以下に示すとおりであり、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍおよび比較溶離液Ｏは、以下の表４に示すとおりである。
・測定試料：ＨｂＢａｒｔ’ｓを含有する検体
・溶離液Ｂ：ｐＨ：８．０５、浸透圧：５４７ｍＯｓｍ
【０１６０】
【表４】
2016027326.tif 000005
【０１６１】
測定試料として上記検体を用い、以下（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の順番で各溶離液および混合液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。
・送液シーケンス：以下（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の順番で各溶離液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。（Ｉ）溶離液Ｏを１秒送液、（ＩＩ）溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：３の混合比で混合した溶離液を３２秒送液、（ＩＩＩ）溶離液Ｌを４９秒送液、（ＩＶ）溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：３の混合比で混合した混合液を２２秒送液、（Ｖ）溶離液Ｍを１５秒送液、（ＶＩ）溶離液Ｂを４秒送液、（ＶＩＩ）溶離液Ｏを１５秒送液
【０１６２】
実施例５の測定結果を図８に示す。図８は、測定試料としてＨｂＢａｒｔ’ｓを含有する検体を用いた場合の測定結果である。図８に示すように、上記送液シーケンスにより、ＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＦが一括して分離可能であることが示された。
【０１６３】
実施例６の測定結果を図９に示す。図９は、測定試料としてＨｂＢａｒｔ’ｓを含有する検体を用い、かつ溶離液Ｏの代わりに比較溶離液Ｏを用いた場合の測定結果である。図９に示すように、上記送液シーケンスでは、ＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＦの溶出位置が重なっていた。
【０１６４】
図８、９の結果から、比較溶離液Ｏを用いた場合には、ＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＦの溶出位置が重なってしまうが、溶離液Ｏを用いた場合には、ＨｂＢａｒｔ’ｓおよびＨｂＦの溶出位置が重ならないことがわかる。よって、溶離液Ｏを用いることでより多くのヘモグロビン類を測定時間に応じて高精度に分離することが可能である。
【０１６５】
〔実施例７、８〕
実施例７のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍおよび溶離液Ｂを、単独で、あるいは以下の送液シーケンスに示すような混合比で混合して用いた。実施例８のヘモグロビン類の測定方法では、溶離液Ｍの代わりに比較溶離液Ｍを用いており、以下の送液シーケンスにおける溶離液Ｍを比較溶離液Ｍに変更した。これら実施例で用いた測定試料および溶離液Ｂは、以下に示すとおりであり、溶離液Ｌ、溶離液Ｏ、溶離液Ｍおよび比較溶離液Ｍは、以下の表５に示すとおりである。
・測定試料：（１）ＨｂＳ、ＨｂＣを含有する検体、（２）ＨｂＣＳを含有する検体
・溶離液Ｂ：ｐＨ：８．０５、浸透圧：５４７ｍＯｓｍ
【０１６６】
【表５】
2016027326.tif 000006
【０１６７】
測定試料として上記検体を用い、以下（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の順番で各溶離液および混合液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。
・送液シーケンス：以下（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の順番で各溶離液を分離用カラムに送液し、ヘモグロビン類を測定した。（Ｉ）溶離液Ｏを１秒送液、（ＩＩ）溶離液Ｌ：溶離液Ｏ＝１：３の混合比で混合した溶離液を３２秒送液、（ＩＩＩ）溶離液Ｌを４９秒送液、（ＩＶ）溶離液Ｍ：溶離液Ｌ＝１：３の混合比で混合した混合液を２２秒送液、（Ｖ）溶離液Ｍを５５秒送液、（ＶＩ）溶離液Ｂを４秒送液、（ＶＩＩ）溶離液Ｏを１５秒送液
【０１６８】
実施例７の測定結果を図１０に示す。図１０は、測定試料として（１）ＨｂＳ、ＨｂＣを含有する検体および（２）ＨｂＣＳを含有する検体を用いた場合の測定結果である。図１０に示すように、上記送液シーケンスにより、ＨｂＳおよびＨｂＣを一括して測定することができ、かつＨｂＣＳを、ＨｂＳおよびＨｂＣと異なる溶出位置で測定することができた。
【０１６９】
実施例８の測定結果を図１１に示す。図１１は、測定試料として（１）ＨｂＳ、ＨｂＣを含有する検体および（２）ＨｂＣＳを含有する検体を用い、かつ溶離液Ｍの代わりに比較溶離液Ｍを用いた場合の測定結果である。図１１に示すように、上記送液シーケンスでは、ＨｂＣおよびＨｂＣＳの溶出位置が重なっていたが、ＨｂＳおよびＨｂＣを一括して測定することは可能であった。
【０１７０】
次に、成分１および成分２の含有率を変更することにより、各溶離液における成分２／成分１、浸透圧およびｐＨの好ましい範囲を求めた実験の結果を示す。
【０１７１】
〔実験１〕
まず、成分１および成分２を様々な含有率で混合して、溶離液Ｌの成分２／成分１、好ましい浸透圧および好ましいｐＨの範囲を求めた。その結果は、表６、図１２および図１３に示すとおりである。図１２は、溶離液Ｌにおける浸透圧とｐＨとの関係を示し、図１３は、溶離液Ｌにおける浸透圧と成分２／成分１との関係を示す。なお、表６のＬ液は、実施例１で調製した溶離液Ｌと同じ組成の溶離液である。
【０１７２】
【表６】
2016027326.tif 000007
【０１７３】
表６、図１２および図１３の判定の基準は、以下のとおりである。
○・・・好適にＨｂＡ０、ＨｂＥ，ＨｂＤを分離できる
△・・・ＨｂＡ０，ＨｂＥ、ＨｂＤを分離できるがピークが接近しすぎているか、あるいはその分離に多くの時間を要する
×・・・ＨｂＡ０、ＨｂＥ、ＨｂＤのうち、２種類を分離できる
【０１７４】
図１２において、一点鎖線で表される最も広い枠は、溶離液Ｌの浸透圧およびｐＨの好ましい範囲を示しており、破線で表される枠は、溶離液Ｌの浸透圧およびｐＨのより好ましい範囲を示しており、点線で表される最も狭い枠は、溶離液Ｌの浸透圧およびｐＨのさらに好ましい範囲を示している。
【０１７５】
図１３において、一点鎖線で表される最も広い枠は、溶離液Ｌの成分２／成分１の範囲および浸透圧の好ましい範囲を示しており、破線で表される枠は、溶離液Ｌの成分２／成分１の好ましい範囲および浸透圧のより好ましい範囲を示しており、点線で表される最も狭い枠は、溶離液Ｌの成分２／成分１のより好ましい範囲および浸透圧のさらに好ましい範囲を示している。
【０１７６】
〔実験２〕
次に、成分１および成分２を様々な含有率で混合して、溶離液Ｍの成分２／成分１、好ましい浸透圧および好ましいｐＨの範囲を求めた。その結果は、表７、図１４および図１５に示すとおりである。図１４は、溶離液Ｍにおける浸透圧とｐＨとの関係を示し、図１５は、溶離液Ｍにおける浸透圧と成分２／成分１との関係を示す。なお、表７のＭ液は、実施例１で調製した溶離液Ｍと同じ組成の溶離液である。
【０１７７】
【表７】
2016027326.tif 000008
【０１７８】
表７、図１４および図１５の判定の基準は、以下のとおりである。
○・・・好適にＨｂＣ、ＨｂＣＳを分離できる
△・・・ＨｂＣ、ＨｂＣＳを分離できるがピークが接近しすぎているか、あるいはその分離に多くの時間を要する
×・・・ＨｂＣ、ＨｂＣＳを分離できない
【０１７９】
図１４において、一点鎖線で表される最も広い枠は、溶離液Ｍの浸透圧およびｐＨの好ましい範囲を示しており、破線で表される枠は、溶離液Ｍの浸透圧およびｐＨのより好ましい範囲を示しており、点線で表される最も狭い枠は、溶離液Ｍの浸透圧およびｐＨのさらに好ましい範囲を示している。
【０１８０】
図１５において、一点鎖線で表される最も広い枠は、溶離液Ｍの成分２／成分１の範囲および浸透圧の好ましい範囲を示しており、破線で表される枠は、溶離液Ｍの成分２／成分１の好ましい範囲および浸透圧のより好ましい範囲を示しており、点線で表される最も狭い枠は、溶離液Ｍの成分２／成分１のより好ましい範囲および浸透圧のさらに好ましい範囲を示している。
【０１８１】
〔実験３〕
次に、成分１および成分２を様々な含有率で混合して、溶離液Ｏの成分２／成分１、好ましい浸透圧および好ましいｐＨの範囲を求めた。その結果は、表８、図１６および図１７に示すとおりである。図１６は、溶離液Ｏにおける浸透圧とｐＨとの関係を示し、図１７は、溶離液Ｏにおける浸透圧と成分２／成分１との関係を示す。なお、表８のＯ液は、実施例１で調製した溶離液Ｏと同じ組成の溶離液である。
【０１８２】
【表８】
2016027326.tif 000009
【０１８３】
表８、図１６および図１７の判定の基準は、以下のとおりである。
○・・・好適にＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦを分離できる
△・・・ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦを分離できるがピークが接近しすぎているか、あるいはその分離に多くの時間を要する
×・・・ＨｂＢａｒｔ’ｓ、ＨｂＦを分離できない
【０１８４】
図１６において、一点鎖線で表される最も広い枠は、溶離液Ｏの浸透圧およびｐＨの好ましい範囲を示しており、破線で表される枠は、溶離液Ｏの浸透圧およびｐＨのより好ましい範囲を示しており、点線で表される最も狭い枠は、溶離液Ｏの浸透圧およびｐＨのさらに好ましい範囲を示している。
【０１８５】
図１７において、一点鎖線で表される最も広い枠は、溶離液Ｏの成分２／成分１の範囲および浸透圧の好ましい範囲を示しており、破線で表される枠は、溶離液Ｏの成分２／成分１の好ましい範囲および浸透圧のより好ましい範囲を示しており、点線で表される最も狭い枠は、溶離液Ｏの成分２／成分１のより好ましい範囲および浸透圧のさらに好ましい範囲を示している。
【０１８６】
〔実験４〕
次に、溶離液Ｂの浸透圧およびｐＨの範囲を求めた。その結果は、表９、図１８に示すとおりである。図１８は、溶離液Ｂにおける浸透圧とｐＨとの関係を示す。なお、表９のＢ液は、実施例１で用いた溶離液Ｂと同じ組成の溶離液である。
【０１８７】
【表９】
2016027326.tif 000010
【０１８８】
表９、図１８の判定の基準は、以下のとおりである。
○・・・溶離液Ａと混合して送液した際に、好適にＨｂＳ，ＨｂＣ，ＨｂＣＳを分離できる
△・・・溶離液Ａと混合して送液した際に、ＨｂＳ，ＨｂＣ，ＨｂＣＳのうち少なくとも２種類を分離できる
【０１８９】
図１８において、溶離液Ｂの浸透圧およびｐＨの範囲を示している。
【０１９０】
なお、上記実施例の効果は、上記実施例で用いたものとは別種のカラムでも同様の効果が得られる。
【０１９１】
上記液体クロマトグラフシステムにおいて、「測定できる」とは、溶出でき、かつ他のＨｂと分離していることにより可能であるところ、実施例によれば、上記溶離液を用いて所定のヘモグロビンを測定可能である。
【符号の説明】
【０１９２】
１    溶離液
２    切り替えバルブ
３    送液ポンプ
４    圧力計
５    インジェクションバルブ
６    オートサンプラ
７    分離用カラム
８    検出器
９    廃液容器
１０  測定装置
【図１】
2016027326.tif 000011
【図２】
2016027326.tif 000012
【図３】
2016027326.tif 000013
【図４】
2016027326.tif 000014
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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