(57)【要約】【課題】本発明は、体内の脂肪を減少させる物質のスクリーニング物質のスクリーニング方法の提供を目的とする。【解決手段】本発明は、体内の脂肪を減少させる物質のスクリーニング方法であって、（ａ）骨格筋のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物に、高アラニン含有食を与えた後、候補物質を投与し、（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、（ｃ）FGF21の発現量が、候補物質を投与する前と比較して、上昇した場合に、該候補物質は体内の脂肪を減少させる物質であると判定すること、を含む、スクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋線維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、上昇した場合に、該試験物質は肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
体内の脂肪を減少させる物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋線維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、上昇した場合に、該試験物質は体内の脂肪を減少させる候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法。
【請求項３】
試験物質の投与後、前記非ヒト動物を絶食させることを特徴とする、請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記FGF21の発現量を、血中のFGF21タンパク質の量を指標とすることを特徴とする請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記FGF21の発現量を前記非ヒト動物由来の肝臓におけるFGF21 mRNAの存在量を指標とすることを特徴とする請求項１または２に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
骨格筋のGR遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物。
【請求項７】
前記非ヒト動物がマウスである請求項６に記載の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝の調節等に関与する物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタボリック症候群は、肥満による内臓脂肪の増加に伴う、血糖、血中脂質、血圧の上昇が引き金となって発症し、糖尿病・高血圧症・脂質異常症などの生活習慣病の原因にもなっている。これまでに、肥満を改善するために、多くの薬剤や食品が開発され、また、脂肪の効率的な燃焼を目的とするトレーニング方法などが多く提案されているが、根本的かつ普遍的な肥満改善手段は非常に少ないのが現状である。
【０００３】
哺乳動物の体は、複雑に絡み合う様々な代謝系をコントロールしながら調和のとれた身体機能を維持している。そして、体を動かすのに必要なエネルギー源である炭水化物、タンパク質、脂肪などの物質の利用についても、適切に調整されながら、バランスのとれた身体形成が行われている。
エネルギー源の選択および供給を行うにあたり、肝臓、骨格筋および脂肪組織などのエネルギー貯蔵組織において、様々なシグナル伝達系や酵素反応系が、重畳的かつ合理的な組織間情報伝達を行いながら機能している。エネルギー源の選択や貯蔵は、神経系やホルモン系などによって適切にコントロールされていると考えられるが、その正確なメカニズムについては、不明点が多い。
【０００４】
エネルギーの貯蔵組織の１つである骨格筋は、体の総重量の40％を占めており、生体における最も大きなタンパク質貯蔵場所であり、体の運動を制御し、さらに、マイオカインの分泌を介して内分泌の制御装置としても機能している。そして、代謝調節において、骨格筋は、タンパク質の分解によって生じるアミノ酸の供給源として役立っており、心臓、肝臓および脳などの様々な組織により、エネルギーの生産系として利用されている（非特許文献１）。骨格筋を構成するタンパク質の分解は、ユビキチン−プロテアソーム機構およびオートファージ−リソソーム機構などの特定の情報伝達系や転写プログラムによってコントロールされる能動的なプロセスであることが知られている（非特許文献２および３）。
【０００５】
最近、発明者らは、グルココルチコイド受容体（GR: glucocorticoid receptor）が、標的とする遺伝子のうち、ユビキチン−プロテアソーム機構で機能するatrogin-1、MuRF1、オートファージ−リソソーム機構で機能するLC3、Bnip3、並びに、異化作用において重要な役割を果たしているKLF15、FoxOの転写制御を通じて、これら２つのタンパク質分解機構をコントロールしていることを明かにした（非特許文献４）。この知見から、骨格筋におけるタンパク質の分解は、エフェクターとしてグルココルチコイドと骨格筋GRを利用する、視床下部−下垂体−副腎系を介した神経系の制御下にあることが強く示唆された。
しかしながら、骨格筋GRが引き起こす遺伝的プログラムと代謝の適応調整の生理的重要性については、未だに不明な点が残されている。
【０００６】
複雑な代謝系の調節メカニズムを変化させ、エネルギーとして使用される生体物質（炭水化物、脂肪、タンパク質など）の消費される優先順位を変化させることで、肥満症を改善することができれば、生活習慣病の予防およびその根本的な治療効果が期待されるが、現在までのところ、そのような機能を有する治療剤や、治療方法は見出されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zurloら, J Clin Invest 86, 1423-1427, doi:10.1172/JCI114857  1990.
【非特許文献２】Piccirilloら, Dev Dyn 243, 201-215, doi:10.1002/dvdy.24036 2014.
【非特許文献３】Schakmanら, Int J Biochem Cell Biol 45, 2163-2172, doi:10.1016/ j.biocel.2013.05.036 2013.
【非特許文献４】Shimizuら, Cell Metab 13, 170-182, doi:10.1016/j.cmet.2011.01.001 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記事情に鑑み、本発明は、肝臓によるアラニンの取り込みを阻害し（または、低下させ）、体内の脂肪を減少させて、肥満症の改善に役立つ物質のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するために、発明者らは、生体エネルギー代謝調節機構の解明を目的として、骨格筋の筋細胞（筋線維）に存在するGRを特異的にノックアウトしたマウスを作製した。このノックアウトマウス（以下、GRmKOマウスと記す）は、野生型マウスに比べ、脂肪組織の体積、重量が小さく、骨格筋の体積、重量が大きいという特徴を持っている。GRmKOマウスにおいては、エネルギーの利用方法と、骨格筋、肝臓、脂肪組織におけるエネルギー源の貯蔵量が、野生型マウスと根本的に異なっていた。また、GRmKOマウスにおいて、肝臓へのアラニンの供給が低下すると、FGF21 mRNAの肝臓での発現レベルが上昇し、肝臓−脂肪組織間のコミュニケーションの強度を上げる引き金となり、脂肪組織における中性脂肪の分解に機能する遺伝子群の発現が上昇することが明らかとなった。
そこで、発明者らは、タンパク質や脂肪などのエネルギー源の利用と貯蔵が、骨格筋−肝臓−脂肪組織ネットワークのコントロール下にあり、このネットワークは、種々の肥満などの代謝異常に対する治療法の開発の新規ターゲットになることを見出し、本発明を完成させた。
【００１０】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）である。
（１）肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋線維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、上昇した場合に、該試験物質は肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法。
（２）体内の脂肪を減少させる物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋線維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、上昇した場合に、該試験物質は体内の脂肪を減少させる候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法。
（３）試験物質の投与後、前記非ヒト動物を絶食させることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載のスクリーニング方法。
（４）前記FGF21の発現量を、血中のFGF21タンパク質の量を指標とすることを特徴とする上記（１）または（２）に記載のスクリーニング方法。
（５）前記FGF21の発現量を前記非ヒト動物由来の肝臓におけるFGF21 mRNAの存在量を指標とすることを特徴とする上記（１）または（２）に記載のスクリーニング方法。
（６）骨格筋のGR遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物。
（７）前記非ヒト動物がマウスである上記（６）に記載の非ヒト動物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する（または低下させる）物質のスクリーニングが可能となり、その結果、体内の蓄積脂肪を減少させ、代謝的な異常を改善する物質のスクリーニングが可能となる。
【００１２】
また、本発明により、上記スクリーニングを行うために利用可能なモデル動物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】骨格筋の筋細胞のGRを特異的にノックアウトしたマウス（GRmKO）の作製方法。Ａ；野生型C57BL/6J（wt）マウスとNr3c1tm2Gsc（flox）マウスのNr3c1 (GR)遺伝子座のエクソン３とエクソン４を含む領域、およびCre酵素による組換えの結果生じたNr3c1遺伝子座領域（KO）の模式図を示す（Ａの左上図）。白抜きの三角はloxPサイトを示す。矢印は、ゲノムPCRに使用したプライマーの位置を示す。骨格筋のGR遺伝子座において、特異的に組換えが生じたことを確認するために、図に示す組織由来のゲノムDNAをPCRで解析した（Ａの右上図及び下図）。遺伝子型ごとに３匹のマウスのデータを示す。Gas；腓腹筋、Liver；肝臓、Heart；心臓、Sol；ヒラメ筋、EDL；長趾伸筋、PT；足底筋、WF；後腹膜脂肪（白色脂肪）、BF；肩甲骨間脂肪（褐色脂肪）、TA；前脛骨筋、Brain；脳、Kidney；腎臓、Lung；肺、Spleen；脾臓。Ｂ；GRf/fマウス（白）およびGRmKOマウス（黒）に由来する各組織におけるGR mRNAの発現レベルを解析した結果である。定量RT-PCR解析によるデータを36B4 mRNAの発現量で正規化し、GRf/fマウスにおける発現量を１として表示した。エラーバーは、SEM (n = 8)を表す。*P < 0.05。Ｃ；図に示した組織における、GRタンパク質の発現量を示した。総タンパク質抽出物をイムノブロッティングで解析した。
【図２】18週齢のGRf/fマウスとGRmKOマウスの骨格筋の肉眼所見とCT画像を示す。Ａ；肉眼所見、Ｂ；CT画像。
【図３】18週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスの各組織の重量を測定した結果を示す。体重に対する組織重量の割合をボックスプロットで示した（n = 16）。Gas；腓腹筋、TA；前脛骨筋、Sol；ヒラメ筋、EDL；長趾伸筋、PT；足底筋。*P < 0.05、**P < 0.01、n.s. P > 0.05。
【図４】血中のグルコースならびに、血漿中のACTHおよびコルチコステロンの濃度の測定結果。  20週齢の雄のGRf/f マウス（白）とGRmKO マウス（黒）を絶食させたのち、血中のグルコース濃度（Ａ）、血漿中のACTH濃度（Ｂ）および血漿中のコルチコステロン濃度（Ｃ）を測定した。エラーバーは、SEM (n = 8)を表す。*P < 0.05。
【図５】20週齢の雄のGRf/fマウス、GRmKOマウスおよび副腎を摘除したC57BL/6Jマウス (ADX)の腓腹筋における、GR標的遺伝子のmRNA発現量を示す。データは、36B4 mRNAの発現量で正規化し、自由摂食させたGRf/fマウス（絶食0時間）における発現量を１として相対値で示した。エラーバーは、SEM (n = 8)を表す。*P < 0.05。
【図６】20週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスの血漿中のアラニン濃度の変動を測定した結果である。GRf/fマウス（白四角）とGRmKOマウス（黒丸）に自由摂食させた場合（左図）と、図に示す時間絶食（ツァイトゲーバー時間（zeitgeber time (ZT)）の12:00から）させた場合（右図）の血漿アラニン濃度を測定した結果を示す。エラーバーは、SEM (n = 4)を表す。*P < 0.05。
【図７】GRmKOマウスにおける脂肪組織体積、重量の減少。Ａ；30週齢の雄のGRf/fマウス（上図）とGRmKOマウス（下図）を自由摂食させた場合のCT画像を示す。図には、後腹膜脂肪（ｒ）、皮下脂肪（ｓ）および第4腰椎（Ｌ４）の位置を示している。Ｂ；30週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスの後腹膜脂肪（左図）と肩甲骨間脂肪（右図）の重量を測定した結果である。データは、体重に対する脂肪組織重量の割合をボックスプロットで示した（n = 8）Ｃ；30週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスの後腹膜脂肪の脂肪細胞の横断面積を測定し、その分布をボックスプロットで示した。*P < 0.05。
【図８】後腹膜脂肪における種々のmRNAの発現を調べた結果を示す。30週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスを絶食させたのち、後腹膜脂肪における種々の遺伝子のmRNAの発現量を調べた。データは36B4 mRNAの発現量で正規化し、自由摂食させたGRf/fマウス（絶食0時間）における発現量を1として示した。エラーバーは、SEM (n = 4)を表す。*P < 0.05。
【図９】GRmKOマウスにおけるFGF21発現量および骨格筋内アラニン含有量の変動。Ａ；自由摂食させた（絶食0時間）、または絶食させた30週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスの血漿中のFGF21タンパク質濃度を調べた結果を示す。データはボックスプロットで示した（n = 8）。*P < 0.05。Ｂ；自由摂食させた（絶食0時間）、または絶食させた30週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスの各組織におけるFGF21 mRNAの発現量を調べた結果を示す。データは36B4 mRNAの発現量で正規化し、自由摂食させたGRf/fマウス（絶食0時間）における発現量を1として示した。エラーバーは、SEM (n = 8)を表す。*P < 0.05。Ｃ；絶食から24時間後（Fasted）または自由摂食させた場合（Fed）のGRf/fマウス（白）とGRmKOマウス（黒）の肝臓における、アラニン、グルコース、グリコーゲン、トリグリセリドおよびBCAA（分岐鎖アミノ酸）の含有量を示す。エラーバーは、SEM (n = 6)を表す。*P < 0.05。
【図１０】肝臓における脂肪代謝に関与する遺伝子の発現状況。自由摂食させた（絶食0時間）、または絶食させた20週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスの肝臓における種々のmRNAの発現量を調べた。データは36B4 mRNAの発現量で正規化し、自由摂食させたGRf/fマウス（絶食0時間）における発現量を1として示した。エラーバーは、SEM (n = 8)を表す。*P < 0.05。
【図１１】GRmKOマウスにアラニンまたはアラニン誘導体を経口投与したときの影響。Ａ；マウスを4時間絶食させたのち、アラニンを経口投与し、さらに、24時間絶食させた。その後、肝臓におけるFGF21 mRNAの発現量を調べた。FGF21 mRNAの発現量は、36B4 mRNAの発現量で正規化し、アラニン非投与GRf/fマウス（0 g/kg bw）における発現量を1として示した。エラーバーは、SEM (n = 4)を表す。*P < 0.05。Ｂ；GRf/fマウスを4時間絶食させたのち、ビークル（菱形）、0.3（四角）、0.5（三角）および1.0（丸）g/kg体重の3-クロロ-L-アラニン塩酸塩（Cl-アラニン）を経口投与し、経時的に血漿中のアラニン濃度を測定した。エラーバーは、SEM (n = 4)を表す。*P < 0.05（対ビークル投与群）。Ｃ；GRf/fマウスを4時間絶食させたのち、各濃度の3-クロロ-L-アラニン塩酸塩を経口投与し、さらに、24時間絶食させ、肝臓におけるFGF21 mRNA発現量を調べた。FGF21 mRNAの発現量は、36B4 mRNAの発現量で正規化し、ビークル投与群における発現量を1として示した。エラーバーは、SEM (n = 4)を表す。*P < 0.05。
【図１２】GRmKOマウスを高アラニン含有食で飼育したときの影響（１）。12週齢の雄のGRf/fマウスとGRmKOマウスに、固形飼料（NCD: アラニン1.4% 、脂質 13%）、高アラニン含有飼料(HAlaD: アラニン 27% 、脂質 10%)または高脂肪食（HFD: アラニン1.3%、脂質 32%）を3週間自由摂食させた。その後、24時間絶食させた後の血漿中のアラニンの濃度、血漿中のFGF21タンパク質の濃度、血漿中の遊離脂肪酸の濃度および血漿中の3-ヒドロキシブチル酸（3-HBA）の濃度を測定した。エラーバーは、SEM (n = 6)を表す。*P < 0.05。
【図１３】GRmKOマウスを高アラニン含有食で飼育したときの影響（２）。図１２と同じ条件で飼育したマウスを24時間絶食させた後、肝臓および白色脂肪組織におけるFGF21 mRNAの発現量を測定した。FGF21 mRNAの量は、36B4 mRNAの発現量で正規化し、NCDで飼育したGRf/fマウスにおける発現量を1として示した。エラーバーは、SEM (n = 6)を表す。*P < 0.05。
【図１４】GRmKOマウスを高アラニン含有食で飼育したときの影響（３）。図１２と同じ条件で飼育したマウスの典型的なCT画像を示す。生殖腺脂肪（ｇ）、皮下脂肪（ｓ）、腸骨（ｉ）および第6腰椎（Ｌ６）を示す。
【図１５】高アラニン含有食で飼育したGRmKOマウスに、3-クロロ-L-アラニンを投与した場合の血漿FGF21濃度の変動。20週齢の雄のGRmKOマウスに、NCDまたはHAlaDを5週間自由摂食させた。図中に示す量の3-クロロ-L-アラニン塩酸塩（体重30 g あたりの量）を経口投与した。その後24時間絶食させ、腹部大静脈より得た血液から血漿を調製し、ELISA法により血漿FGF21濃度を定量した。データは、各群5頭ずつの平均値±SEMで示した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、骨格筋の筋細胞（筋線維、以下同じ）に存在するGRを特異的にノックアウトした動物、および該動物を使用した、肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する（または低下させる）物質のスクリーニング方法、および、体内の脂肪を減少させる物質をスクリーニングする方法に関するものである。
他方、本発明は、骨格筋の筋細胞に存在するGRを特異的にノックアウトした動物、および該動物を使用した、肝臓によるアラニンの取り込みを促進するする（または上昇させる）物質のスクリーニング方法、および、体内の脂肪を増加させる物質をスクリーニングする方法でもある。
骨格筋のGRを特異的にノックアウトしたマウス（GRmKO）において、骨格筋体積、重量の増加と脂肪体積、重量の減少、インスリン感受性の昂進（いわば、生活習慣病の対極の表現型）が観察された。そのメカニズムに関して、発明者らは、「骨格筋由来アラニン放出の減少→肝臓におけるグルコース−アラニン回路を介した糖新生の減少→FGF21の発現の上昇→脂肪分解の上昇」という、骨格筋−肝臓−脂肪組織臓器間ネットワーク（グルココルチコイド依存性の骨格筋のタンパク質分解が、肝臓を介して脂肪細胞の代謝を調節する仕組み）が重要であることを、初めて見出した。そして、発明者らは、GRmKOの食餌にアラニンを補充すると、肝臓へアラニンが供給され、FGF21の発現が低下すると共に、脂肪体積、重量が野生型と同程度にまで回復することを確認した。
これらの結果から、GRmKOマウスを野生型と同程度に脂肪体積、重量を回復させる量のアラニンを含有する食餌（高アラニン含有食）を与えている状態で、試験物質をGRmKOに投与した場合、体内の脂肪が分解され、FGF21の発現量が上昇すれば、その試験物質は、「骨格筋−肝臓−脂肪組織臓器間ネットワーク」に作用して、エネルギー源を脂肪にシフトさせて消費させる可能性のある物質として判定できることが明らかとなった。また、逆の観点から見ると、試験物質をGRmKOに投与した場合、体内の脂肪分解が抑制され、FGF21の発現量が減少すれば、その試験物質は、「骨格筋−肝臓−脂肪組織臓器間ネットワーク」に作用して、エネルギー源を脂肪から他のエネルギー源（タンパク質、炭水化物等）にシフトさせて脂肪の消費を抑制させる可能性のある物質として判定できることになる。
【００１５】
そこで、本発明の実施形態は、肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋繊維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、上昇した場合に、該試験物質は肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法である。
また、本発明の他の実施形態は、体内の脂肪を減少させる物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋繊維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、上昇した場合に、該試験物質は体内の脂肪を減少させる候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法である。
さらに、本発明の実施形態は、肝臓によるアラニンの取り込みを促進する物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋繊維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、減少した場合に、該試験物質は肝臓によるアラニンの取り込みを促進する候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法である。
あるいは、本発明の他の実施形態は、体内の脂肪を増加させる物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）骨格筋の筋細胞（筋繊維）のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を欠損させた非ヒト動物に高アラニン含有食を与えた後、試験物質を投与し、
（ｂ）該動物の体内のFGF21の発現量を測定し、
（ｃ）FGF21の発現量が、試験物質を投与する前と比較して、減少した場合に、該試験物質は体内の脂肪を増加させる候補物質であると判定すること、
を含む、スクリーニング方法である。
ここで、「試験物質」とは、肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する（または低下させる）または促進するかどうか、または、体内の脂肪を減少させる、または、増加させるかどうかについて調べる対象物質を意味する。また、「候補物質」とは、肝臓によるアラニンの取り込みを阻害するか（低下させる）もしくは促進するか、または、阻害もしくは促進する可能性（低下させる可能性）のある物質のこと、あるいは、体内の脂肪を減少させるかもしくは増加させる、あるいは、体内の脂肪を減少させるかもしくは増加させる可能性のある物質のことを意味する。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法で使用される非ヒト動物は、ヒトを除く動物であれば、特に限定されず、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギなどの実験用動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジなどの家畜、サル、チンパンジーなどの霊長類が上げられる。また、これらの動物を例とする、非ヒト動物の骨格筋のGRを特異的に欠損させたノックアウト動物は、本発明の範囲に含まれる。
【００１７】
「骨格筋の筋細胞のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を特異的に欠損させる」とは、骨格筋（横紋筋）を構成する筋細胞中のGRが正常な機能を発揮できない状態にすることであり、筋細胞のGR遺伝子が全く発現しない状態、または、GR遺伝子の正常な機能が発揮できない程度にその発現が低下している状態などを挙げることができる。
また、本発明における、骨格筋の筋細胞のGR（グルココルチコイド受容体）遺伝子を特異的に欠損させた非ヒト動物は、いわゆる、骨格筋の筋細胞のGR遺伝子（以下、骨格筋GR遺伝子と記す）のみをノックアウトした動物が好ましく、骨格筋GR遺伝子欠損ヘテロ接合体、より好ましくは、骨格筋GR遺伝子欠損ホモ接合体である。
【００１８】
骨格筋の筋細胞のGR遺伝子を特異的に欠損した動物は、例えば、骨格筋の筋細胞のGR遺伝子の任意のエクソン（例えば、エクソン３）を挟むようにloxPサイトが同方向に挿入されたトランスジェニック動物と、骨格筋の筋細胞特異的に発現する遺伝子（例えば、α−骨格筋アクチン遺伝子など）に由来するプロモーターによってその発現がコントロールされるようにCre遺伝子を導入したトランスジェニック動物とを交配させることで作製することができる。骨格筋GR遺伝子の任意のエクソンを挟むようにloxPサイトが同方向に挿入されたトランスジェニック動物は、公知の方法で作製することが可能で、例えば、Troncheら,Nat Genet 23, 99-103, doi:10.1038/12703 1999に、その作製方法が記載されており、また、α−骨格筋アクチン遺伝子のプロモーター下でCre遺伝子を発現するトランスジェニック動物については、Miniouら, Nucleic Acids Res 27, e27 1999にその作製方法が記載されている。
また、GR遺伝子の遺伝子構造やその配列等は、公知のデータベースなどを使用して、当業者であれば容易に検索することができる。
【００１９】
作製したトランスジェニック動物は、スクリーニングする前に、予め、高アラニン含有食を与えて飼育してもよい。ここで、餌に含有させるアラニンの量は、特に、限定はしないが、アラニンの含有量が多すぎると、トランスジェニック動物の餌の摂取量が減少してしまい、また、アラニンの含有量が少なすぎると、試験物質による影響を検出しにくくなる。そこで、適当量のアラニンを含んだ餌を与えることが望ましい。この場合、餌に含有させるアラニンの適量は、用いるトランスジェニック動物によって、異なるため、予備的な実験により、アラニンの含有量の範囲を検討することが望ましい。動物として、例えば、マウスを使用する場合、通常用いられる餌の１０〜４０％（重量）程度、好ましくは、２０〜３０％（重量）程度、より好ましくは、２５〜３５％（重量）程度のアラニンを含有する餌を与えるとよい。また、高アラニン含有食を与える期間は、特に限定はしないが、用いるトランスジェニック動物によって異なるため、予備的な実験などにより、至適な期間を検討することが望ましい。動物として、マウスを用いる場合は、例えば、１〜２ヶ月程度、好ましくは、２週間から６週間程度、より好ましくは、３週間〜５週間程度である。
【００２０】
トランスジェニック動物への試験物質の投与は、経口投与、または、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射などの非経口投与などの投与経路により行うことができる。試験物質の投与量および投与期間は、当業者であれば適宜選択して、行うことができる。
トランスジェニック動物への試験物質の投与後、FGF21の量の変動を測定する前に、当該トランスジェニック動物を一定期間絶食させてもよい（水は自由に摂取させる）。絶食させる期間は、動物の種類によって異なるが、例えば、１０〜４８時間程度、好ましくは、２０〜２４時間程度である。
【００２１】
骨格筋の筋細胞（筋線維）のGR遺伝子を特異的に欠損した動物を高アラニン含有食で飼育したのち、試験物質を投与した結果、肝臓へのアラニンの取り込みが減少し、および／または、体内の脂肪の分解が促進されると、肝臓におけるFGF21遺伝子の発現が上昇し、その結果、血漿中（または血中、以下同じ）におけるFGF21タンパク質の量が増加する。
従って、試験物質に、肝臓へのアラニンの取り込みを減少させる効果があるかどうか、または、体内の脂肪分解促進効果があるかどうか判定する指標として、血漿中のFGF21タンパク質量の増加、あるいは、肝臓におけるFGF21 mRNA発現量の増加を用いることができる。血漿中のFGF21タンパク質の増加は、試験物質投与前の血漿中のFGF21タンパク質の量と試験物質投与後の血漿中のタンパク質の量を比較することで容易に決定でき、また、肝臓におけるFGF21 mRNAの発現上昇についても、その発現量の変化を候補物質の投与群と非投与群で比較して決定することができる。
血漿中のFGF21タンパク質濃度の増加は、限定はしないが、FGF21の濃度を、例えば、ELISAやイムノブロッティング等の免疫化学的な手法の他、当業者において公知の手法も用いて測定することができる。また、肝臓のFGF21 mRNAの発現量については、例えば、肝臓の組織由来の抽出物を用いて、リアルタイムPCR法、competitive PCR法など、公知の方法により容易に定量することができる。
【００２２】
以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳細な説明を行うが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。以下の実施例では、骨格筋の筋細胞のGRを特異的に欠損させたトランスジェニックマウスを使用したスクリーニング方法を、一例として示している。
【実施例】
【００２３】
１．材料と方法
１−１．試薬
試薬は、特定しない場合には、ナカライテスク（京都）から購入した。
【００２４】
１−２．トランスジェニックマウスの作製、マウスの維持およびマウスの実験概要
すべての動物実験は、所属研究機関における審査委員会による承認を得ており、また、動物実験倫理に関するガイドラインに従って行った。
骨格筋の筋細胞のGRを特異的にノックダウンしたGRmKOを作製するためのB6.129P2-Nr3c1tm2Gsc/Ieg（Troncheら,Nat Genet 23, 99-103, doi:10.1038/12703 1999）(GR-floxed マウス)は、ドイツがん研究所（Heidelberg, Germany）から移譲を受け、
B6.Cg-Tg(ACTA1-cre)79Jme/J（Miniouら, Nucleic Acids Res 27, e27 1999）（skeletal muscle actin (ACTA1)-Creトランスジェニックマウス）は、ジャクソンラボラトリー(Bar Harbor, ME)から購入した。これらのマウスを交配し、産まれた仔には、GRflox/wt（ヘテロ接合型GRflox）マウスと、GRflox/wtACTA1-Cre+（ヘテロ接合型GRmKO）マウスが含まれていた。次に、ヘテロ接合型GRfloxマウスとヘテロ接合型GRmKOマウスを交配させた。産仔には、GRflox/floxACTA1-Cre+（ホモ接合型GRmKO）マウスが含まれていた。系統維持は、ヘテロ接合型GRmKOを、C57BL/6Jマウスに戻し交配して行った。
【００２５】
全てのマウスは、個別のケージにて、12時間毎の明暗光周期下、特定の食餌条件以外では、水と固形餌（CA-1, クレア）は自由摂取できる状態で飼育した。高アラニン含有食（HAlaD）は、粉状にしたCA-1とアラニンを、77:23（重量比率）の比率でよく混合し、同重量のCA-1の20倍のアラニンを含有するものを調製した。32%の脂肪（kcalで）を含む高脂肪食（HFD）は、クレアジャパンから購入した。
【００２６】
デキサメタゾン（DEX; シグマ−アルドリッチ）の投与は、1 kg体重あたり1 mgの用量で７日間毎日腹腔内注射により行った。コントロールとして、ビークル（生理食塩水）を同様に投与した。
アラニン、3-クロロ-L-アラニン塩酸塩（東京化成工業）、または、コントロールとしてのビークル（0.5% (w/v) メチルセルロース 400cP (和光純薬工業)（生理食塩水中））は、使い捨ての給餌針（CL-4596 MZ-1、クレアジャパン）で経口投与した。
マウスの解剖は、体重1kgあたり75mgのペントバルビタールナトリウム（共立製薬）を腹腔内投与してから行った。
血液は、ヘパリン処理したサンプルチューブに回収した。血中グルコースレベルは、Glucose Pilot Blood Glucose Monitoring System (Aventir Biotech)を用いて測定し、血漿は、全血の遠心分離により血沈と分離し液体窒素中で凍結後、使用するまで-80℃で保存した。
切除した組織を、液体窒素で冷やしたイソペンタン中にて瞬間凍結させた後、液体窒素で予め冷やしておいたクライオプレス（マイクロテック）を用いて破砕するか、または、厚さ10μmの連続凍結切片の作製に供した。
【００２７】
１−３．ゲノムPCR解析
ゲノムDNAはマウスの尻尾の先端からの生検（生後21日目の仔）、または破砕組織（成体）より、Wizard Genomic DNA Purification Kit（プロメガ）を用いて抽出した。PCRは、KOD FX（東洋紡）を使用して行った。
ゲノムPCR解析に使用したプライマー配列は、以下の通りである。
Cre1: 5'-aaatactctgagtccaaaccgggcccc-3'（配列番号１）
Cre2: 5'-cagtgcgttcgaacgctagagcctgtt-3'（配列番号２）
G1: 5'-ggcatgcacattacggccttct-3'（配列番号３）
G4: 5'-gtgtagcagccagcttacagga-3'（配列番号４）
G8: 5'-ccttctcattccatgtcagcatgt-3'（配列番号５）
【００２８】
１−４．定量RT -PCR（qRT-PCR）解析
トータルRNAは、Sepasol（登録商標）-RNA I Super Gを用いて破砕組織から抽出し、SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（インビトロジェン）およびoligo-dT プライマー（インビトロジェン）を用いた逆転写反応の鋳型として使用した。定量PCRは、Thunderbird Probe qPCR Mix（東洋紡）、Universal ProbeLibrary Sets （ロシュ）およびCFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)を用いて行った。
各遺伝子mRNAの相対的発現レベルは、それぞれの遺伝子について個別に作製した標準曲線に基づいて計算した。このとき、36B4 mRNAの発現レベルを内部標準として使用した。
qRT-PCR解析に使用したプライマー配列は、以下の通りである。
36B4: 5’-actggtctaggacccgagaag-3’（配列番号６） および5’-ctcccaccttgtctccagtc-3’（配列番号７）
GR: 5'-tgacgtgtggaagctgtaaagt-3'（配列番号８）および5'-catttcttccagcacaaaggt-3'（配列番号９）
KLF15: 5’-acaggcgagaagcccttt-3’（配列番号１０）および5’-catctgagcgggaaaacct-3’（配列番号１１）
FoxO1: 5’-cttcaaggataagggcgaca-3’（配列番号１２）および5’-gacagattgtggcgaattga-3’（配列番号１３）
FoxO3a: 5’-gctaagcaggcctcatctca-3’（配列番号１４）および5’-ttccgtcagtttgagggtct-3’（配列番号１５）
FoxO4: 5’-aaggacaagggtgacagcaa-3’（配列番号１６）および5’-ctgtgcaaggacaggttgtg-3’（配列番号１７）
MuRF1: 5’-cctgcagagtgaccaagga-3’（配列番号１８）および5’-ggcgtagagggtgtcaaact-3’（配列番号１９）
atrogin-1: 5’-agtgaggaccggctactgtg-3’（配列番号２０）および5’-gatcaaacgcttgcgaatct-3’（配列番号２１）
Bnip3: 5’-cctgtcgcagttgggttc-3’（配列番号２２）および5’-gaagtgcagttctacccaggag-3’（配列番号２３）
LC3: 5’-catgagcgagttggtcaaga-3’（配列番号２４）および5’-ccatgctgtgctggttga-3’（配列番号２５）
REDD1: 5’-ccagagaagagggccttga-3’（配列番号２６）および5’-ccatccaggtatgaggagtctt-3’ （配列番号２７）
Fkbp5: 5’-aaacgaaggagcaacggtaa-3’（配列番号２８）および5’-tcaaatgtccttccaccaca-3’（配列番号２９）
HSL: 5'-ccatagtcaagaaccccttca-3'（配列番号３０）および5'-ccatagtcaagaaccccttca-3'（配列番号３１）
ATGL: 5'-tgaccatctgccttccaga-3'（配列番号３２）および5'-tgtaggtggcgcaagaca-3'（配列番号３３）
SREBP1c: 5'-cgggacagcttagcctctac-3'（配列番号３４）および5'-ggtacgggccacaagaagta-3'（配列番号３５）
FASN: 5'-gcagtcctgagcagctttgt-3'（配列番号３６）および5'-cgaggtctcggatgccta-3'（配列番号３７）
DGAT2: 5’-ggcgctacttccgagactac-3’（配列番号３８）および and 5’-tggtcagcaggttgtgtgtc-3’ （配列番号３９）
PGC-1α: 5’-gaaagggccaaacagagaga-3’ （配列番号４０）および5’-gtaaatcacacggcgctctt-3’ （配列番号４１）
Ucp1: 5’-ggcctctacgactcagtcca-3’（配列番号４２）および5’-taagccggctgagatcttgt-3’（配列番号４３）
Cidea: 5’-aaaccatgaccgaagtagcc-3’（配列番号４４）および5’-aggccagttgtgatgactaagac-3’（配列番号４５）
FGF21: 5'-cacaccgcagtccagaaag-3'（配列番号４６）および5'-tgacacccaggatttgaatg-3'（配列番号４７）
GPT1: 5'-ccttcaagcagtttcaagca-3'（配列番号４８）および5'-gctccgtgagtttagccttg-3'（配列番号４９）
GPT2: 5'-tatgcgttccctcggattc-3'（配列番号５０）および5'-ggagccattttatgggactg-3'（配列番号５１）
cpt1a: 5'-gcagtcgactcacctttcct-3'（配列番号５２）および5'-atttctcaaagtcaaacagttcca-3'（配列番号５３）
cpt1b: 5'-cccaaaacagtatcccaatcat-3'（配列番号５４）および5'-taagagaccccgtagccatc-3'（配列番号５５）
cpt2: 5'-ccaaagaagcagcgatgg-3'（配列番号５６）および5'-tagagctcaggcagggtga-3'（配列番号５７）
CACT: 5'-ttgtacaaagggttcaatgcag-3'（配列番号５８）および5'-ggcaatttcaaagccaagg-3'（配列番号５９）
Fatp1: 5'-aaggttcttgcatcctatgctc-3'（配列番号６０）および5'-tggatcttgaaggtgcctgt-3'（配列番号６１）
TAT: 5'-ggaggaggtcgcttcctatt-3'（配列番号６２）および5'-gccactcgtcagaatgacatc-3'（配列番号６３）
Pck1: 5'-gatgacattgcctggatgaa-3'（配列番号６４）および5'-cgttttctgggttgatagcc-3'（配列番号６５）
【００２９】
１−５．イムノブロッティング
破砕した組織は、1 mM DTT、100 nM MG132（シグマ−アルドリッチ）、動物細胞抽出物用プロテアーゼ阻害剤カクテルおよび、ホスファターゼ阻害剤カクテルを添加したRIPAバッファー（50 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane, pH 7.6; 150 mM sodium chloride; 1% Nonidet P-40; 0.5% sodium deoxycholate (シグマ−アルドリッチ); 0.1% sodium dodecyl sulfate）に溶解させた。可溶性画分を回収し、総タンパク質抽出物として使用した。各サンプルのタンパク質濃度は、BCA protein assay kit（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて測定した。各サンプルをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、PVDF膜（ミリポア）に転写し、次に示すそれぞれのタンパク質に対する抗体を用いてブロッティングした；GR (sc-1002)、S6K1 (sc-230)、（サンタクルーズバイオテクノロジー)；GAPDH (G6545)、アクチン (A2103) (シグマ−アルドリッチ)；4E-BP1 (#9452)、p-S6K1 (T389, #9205)、p-4E-BP1 (T37/46, #2855)、p-mTOR (S2448, #5536)、mTOR (#2972) （セルシグナリングテクノロジー）。
タンパク質は、HRP標識二次抗体（GEヘルスケア）、Signal Enhancer HIKARI、 Chemi-Lumi One SuperおよびLuminoimage Analyzer LAS-1000mini（富士フイルム）を用いて可視化し、定量を行った。
【００３０】
１−６．間接蛍光染色および蛍光イメージング
筋肉の凍結切片はカバーガラスに貼り付け、5% ヤギ血清/1% BSA（PBS中）でブロッキングを行い、以下のそれぞれのタンパク質に対する抗体とインキュベートした；コラーゲンタイプIV （AB756P、ミリポア、1:200）、タイプIIB ミオシン重鎖（BF-F3、1:5）、タイプI  ミオシン重鎖（BA-D5、1:60）。標本は、PBSで洗浄した後、Alexa Fluor 488またはAlexa Fluor 568で標識された二次抗体（インビトロジェン）とインキュベートし、DAPIを含んだVectashield Mounting Medium for Fluorescence（ベクターラボラトリーズ）存在下でスライドガラスにマウントした。
免疫染色像は、蛍光顕微鏡Biozero BZ-8000 system（キーエンス）を用いて撮影した。筋線維の横断面積は、Image J software（NIH）で定量した。
【００３１】
１−７．コンピューター断層撮影（CT）
マウスをイソフルラン（DSファルマアニマルヘルス）で麻酔し、in vivo micro X-ray CT system R_mCT2（リガク）を用いて解析した。
【００３２】
１−８．血漿の生化学的分析
副腎皮質刺激ホルモン（ACTH、EK-001-21、Phoenix Pharmaceuticals）、コルチコステロン（YK240、矢内原研究所）およびイリシン（EK-067-16、Phoenix Pharmaceuticals）の血漿濃度は、EIA法による市販の測定キットとiMark Microplate Absorbance Reader（Bio-Rad）を使用し、説明書に従って測定した。
インスリン（MS303、森永生化学研究所）、C-ペプチド（AKRCP-031、シバヤギ）、FGF21 （MF2100、R&D Systems）およびアディポネクチン（AKMAN-011、シバヤギ）の血漿濃度は、ELISA法による市販の測定キットとiMark Microplate Absorbance Readerを使用し、説明書に従って測定した。
アラニン（K652-100、BioVision）、遊離脂肪酸（K612-100、BioVision）および3-ヒドロキシブチル酸（Ketone Test B "Sanwa" Liquid、三和化学研究所）の血漿濃度は、比色分析法による市販の測定キットとNanoDrop 2000c（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用し、説明書に従って測定した。
【００３３】
１−９．マウス組織中の代謝物の定量
アラニンおよびピルビン酸（K652-100, BioVision）、遊離脂肪酸、グルコースおよびグリコーゲン（K646-100、BioVision）、トリグリセリド（K622-100、 BioVision）ならびに分岐鎖アミノ酸（BCAA、K564-100、BioVision）は、比色分析法による市販の測定キットとNanoDrop 2000cを使用し、説明書に従って測定した。
【００３４】
１−１０．アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）活性
肝臓抽出物中のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性（K752-100、BioVision）は、比色分析法による市販の測定キットとiMark Microplate Absorbance Readerを使用し、説明書に従って測定した。
【００３５】
１−１１．副腎の摘除（ADX: adrenalectomy）
マウスにペントバルビタールナトリウム（体重1 kgあたり50 mg）を腹腔内投与して麻酔を行った。背中に0.5 cmの切れ込みを入れ、切れ込みの両側の皮膚を広げ、各副腎の上端の後腹膜壁に2 mmの切れ込みを入れた。血流を止めるために、滅菌したリング鑷子（A-26、夏目製作所）で1分間、副腎全体をクランプし、その後摘除した。皮膚の切れ込みは針付き縫合糸（ER12-50B2、夏目製作所）で縫合した。各マウスは、個別にケージに入れ、35℃のヒーターマットの上で覚醒して動き回るまで回復させた。回復後、餌と0.9% NaClを含む水を、自由摂取させた。実験は、副腎摘除から７日後に行った。
【００３６】
１−１２．握力の測定
握力は、MK-380CM/R（室町機械）を用いて測定した。マウスの前肢と後肢を、張力計に接続した金網の上にのせ、金網から肢が離れるまでゆっくりと後ろへ引っ張った。マウスの握りが離れた時点における最大の握力を測定した。
【００３７】
１−１３．受動的ワイヤハングテストおよびトレッドミル運動テスト
マウスをケージの上にのせ、ケージごとひっくり返し、ケージにぶら下げ、マウスが落ちるまでの時間を記録した。75秒を超えた個体のスコアは、75秒とした。
トレッドミル運動テストには、MK-680AT/02M（室町機械）を用いた。マウスを5 m/minの速さで1分間ウォーミングアップさせた。その後、1分毎に速さを2 m/minずつ上げて、最大15 m/minとした。その後、45分間、あるいは「疲労」するまで走らせた。「疲労」とは、電気的刺激を繰り返し与えても規則的なトレッドミル運動を続けられなくなった状態をさす。走行時間を測定し、走った距離を算出した。
【００３８】
１−１４．グルコース、インスリン、ピルビン酸およびアラニンの負荷テスト
グルコース負荷テストについては、マウスに水だけは自由に摂取させ、16時間絶食させた。マウスにグルコース（1 kg体重あたり1 g）を腹腔内投与し、尾静脈の血中グルコースレベルを、Glucose Pilot Blood Glucose Monitoring Systemを用いて、0, 10, 20, 30, 60, 90, および120分後に測定した。
インスリン負荷テストについては、マウスを水だけは自由に摂取させ、4時間絶食させた。マウスにインスリン（1 kg体重あたり0.75 U）を腹腔内投与し、尾静脈の血中グルコースレベルを、0, 30, 60, 90, および120分後に測定した。
ピルビン酸負荷テストについては、マウスを水だけは自由に摂取させ、4時間絶食させた。マウスにピルビン酸ナトリウム（1 kg体重あたり23 mmol）またはNaCl（1 kg体重あたり23 mmol、コントロール）を腹腔内投与し、尾静脈の血中グルコースレベルを、0, 10, 20, 30, 60, 90, および120分後に測定した。
アラニン負荷テストについては、マウスを水だけは自由に摂取させ、4時間絶食させた。マウスに、0.5%(w/v)メチルセルロース400cPに溶解したアラニン（1 kg体重あたり23 mmol）または0.5%(w/v)メチルセルロース400cPのみを、使い捨ての給餌針（CL-4596 MZ-1, CLEA Japan）を用いて経口投与し、尾静脈の血中グルコースレベルを、0, 10, 20, 30, 60, 90, および120分後に測定した。
【００３９】
１−１５．統計的解析
データは、対応のないデータに対する両側t検定により解析した。P値が0.05未満の場合、統計的に有意とした。棒グラフおよび折れ線グラフは、平均値±標準誤差で示した。ボックスプロットグラフでは、全てのデータの最小値と最大値を「whisker（ひげ）、ボックスに示してある縦線」で表し、ボックスは、データの平均値の標準偏差の上限と下限を、ボックス中の横線は、データの中央値を示す。
【００４０】
２．結果
２−１．骨格筋特異的なGRをノックアウトしたマウス
グルココルチコイドによって誘導される異化作用の役割を解明するために、GR-floxedマウス（GRf/f）と骨格筋アクチン（ACTA1）-Cre遺伝子導入マウスを交配し、骨格筋の筋細胞特異的なGRノックアウトマウス（GrmKO）を作製した（図１Ａ）。骨格筋の筋細胞に特異的なGRの欠失は、定量RT-PCR（qRT-PCR）（図１Ｂ）とイムノブロッティング（図１Ｃ）により確認した。
作製したGRmKOマウスとGRf/fマウスに対し、合成グルココルチコイドであるデキサメタゾンを腹腔内投与すると、GRf/fマウス由来の腓腹筋においては、多数のGRの標的遺伝子(KLF15, FoxOs, MuRF1, atrogin-1, Bnip3, および LC3)のmRNA発現が顕著に増加したが、GRmKOマウスでは、これら遺伝子mRNA発現の同様な増加は生じなかった。また、肝臓においては、GRの標的遺伝子であるREDD1とFkbp5のmRNA発現のデキサメタゾンによる増加は、GRf/fマウスとGRmKOマウスとでほぼ同等であった。さらに、骨格筋のGRが機能していることの指標とされる、デキサメタゾンによる腓腹筋におけるmTOR (mammalian target of rapamycin)活性の抑制は、GRf/fマウスでのみ観察され、GRmKOマウスでは観察されなかった。さらに、筋線維の横断面積（CSA: cross-sectional area）解析では、７日間のデキサメタゾン処理による腓腹筋の萎縮は、GRf/fマウスでのみ観察され、GRmKOマウスでは観察されなかった。
【００４１】
GRmKOマウスは、雌雄共に、GRf/fマウスよりも体重が重く生育した。肉眼所見（図２Ａ）とCT解析（図２Ｂ）では、GRmKOマウスは、雌雄共に、GRf/fマウスに比して骨格筋量の増加が観察された。
体重で正規化した組織重量を比較したところ、調べたすべての骨格筋、すなわち腓腹筋（Gas）、前脛骨筋（TA）、ヒラメ筋（Sol）、長趾伸筋（EDL）、および足底筋（PT）は、GRf/fマウスに比してGRmKOマウスが重かった一方、心臓、肝臓、脳、腎臓、および肺には有意差がなかった（図３）。
また、GRmKOマウス骨格筋の筋線維、とりわけグルココルチコイド感受性のタイプIIb線維の横断面積は、GRf/fマウスのそれと比較して顕著に大きかった。
【００４２】
次に、骨格筋におけるGRの役割の重要性をいっそう明確にするために、マウス個体において、絶食による代謝状態の変化について調べた。
絶食による、血中のグルコースレベルの減少（図４Ａ）と、血漿中の副腎皮質刺激ホルモン（ACTH: adrenocorticotropic hormone）濃度（図４Ｂ）およびコルチコステロン（図４Ｃ）濃度の増加は、GRf/fマウスとGRmKOマウスにおいて、ほぼ同程度であった。
腓腹筋におけるタンパク質異化に寄与するGRの標的遺伝子mRNAの発現については、絶食状態において、GRf/fマウスでは摂食状態に比して増加していたが、GRmKOマウスでは、GR標的遺伝子のmRNAの絶食による発現増加がほぼ消失しており、副腎を摘除したマウス（ADX: adrenalectomized）すなわち内因性のグルココルチコイドであるコルチコステロンを分泌できないマウスと同様の結果を示した（図５）。
【００４３】
自由摂食下における血漿中のアラニン濃度の日内変動が、GRmKOマウスではほぼ消失していた（図６Ａ）。また、絶食状態での血漿中のアラニン濃度が、GRf/fマウスでは一過性に上昇したが、GRmKOマウスでは変化しなかった（図６Ｂ）。
以上の結果から、絶食によっておこる骨格筋のタンパク質分解は、主としてグルココルチコイドーGRを介した転写プログラムによるものであることが強く示唆される。すなわち、絶食状態での全身へのエネルギー供給において、骨格筋タンパク質の分解は重要な役割を果たしており、その過程は、グルココルチコイド−GRをエフェクターとして使用する、視床下部−下垂体−副腎系によってコントロールされていると考えられる。
さらに、GRmKOマウスでは、アラニンのみならず、ピルビン酸、グルコース、グリコーゲン、トリグリセリドおよび分岐鎖アミノ酸（BCAA）の骨格筋内における含量が、GRf/fマウスに比較して少なくなっていた。また、骨格筋の能力に関しては、最大筋力、筋持久力、有酸素運動能力は、自由摂食させたGRf/fマウスおよびGRmKOマウス間では同等であったものの、絶食状態においては、GRmKOマウスでは、GRf/fマウスよりも、筋持久力と有酸素運動能力が劣っていた。つまり、骨格筋のGRは全身へのエネルギー供給のみならず、骨格筋の能力維持にも必須であると考えられる。
【００４４】
２−２．マウス個体における骨格筋特異的なGRノックアウトが脂肪の代謝へ与える影響
GRmKOマウスの骨格筋からのアラニン供給が低いことが、代謝に対しどのような影響が与えているか検討した。CT解析の結果から、GRf/fマウスと比較して、GRmKOマウスの体脂肪量は減少していた（図７Ａ）。また、主として白色脂肪細胞により構成される後腹膜脂肪と、褐色脂肪細胞によって構成される肩胛骨間脂肪の重量が、GRmKOマウスでは減少しており（図７Ｂ）、また個々の白色脂肪細胞の断面積分布が、GRf/fマウスと比較して、GRmKOマウスにおいて減少していた（図７Ｃ）。
この結果から、GRmKOマウスでは、体内の脂肪の量が少ないことが明かとなった。
【００４５】
後腹膜脂肪細胞における遺伝子発現プロファイル解析から、絶食状態で、中性脂肪分解に寄与する遺伝子（ホルモン感受性リパーゼ(HSL: hormone-sensitive lipase)、脂肪トリグリセリドリパーゼ(ATGL: adipose triglyceride lipase)）mRNAの発現が、GRf/fマウスと比較して、GRmKOマウスにおいて促進されていることが分かった（図８）。脂質合成遺伝子（SREBP1c、脂肪酸合成酵素(FASN: fatty acid synthase) ）mRNAの発現については、絶食状態で、いずれのマウスにおいても、そのmRNAレベルが減少していた（図８）。これらの遺伝子のうち、トリアシルグリセロール合成の律速酵素であるDGAT2は、GRmKOマウスにおいて、より減少していた（図８）。なお、絶食状態のGRmKOマウスにおいて、褐色脂肪細胞のマーカー遺伝子（PGC-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α）、uncoupling protein 1 (Ucp1)及びCidea）のmRNA発現が、著しく上昇しており（図８）、白色脂肪の褐色化を示している。ユビキタスなGR標的遺伝子であるREDD1およびFkbp5のmRNAは、絶食状態で、いずれのマウスにおいても、白色脂肪組織において発現誘導されており、このことから、白色脂肪組織におけるGR機能は正常であることが確認できる（図８）。
【００４６】
また、以上の脂質代謝に関連する遺伝子の発現プロファイルの特徴と一致して、血漿における遊離脂肪酸、３−ヒドロキシブチル酸の濃度が、GRf/fマウスと比較して、GRmKOマウスにおいて顕著に上昇していた。
なお、絶食に応答した血漿中のインスリンとC-ペプチド濃度の減少は、GRf/fマウスとGRmKOマウスで同等であり、また、腹腔内グルコースおよびインスリン耐性テストの結果は、これらのマウスにおいて同等であったことから、グルコース生合成の変動は、GRmKOマウスにおける骨格筋量の増大と脂肪組織量の減少の主たる要因ではないと考えられる。
【００４７】
２−３．マウス個体における骨格筋特異的なGRノックアウトがアラニンの動態とFGF21遺伝子の発現調節機構に与える影響の検討
中性脂肪合成の抑制および中性脂肪分解の促進に関連する血漿中の因子に焦点を絞った場合、GRmKOマウスにおいて、絶食により誘導される血漿FGF21濃度の上昇が特徴的な現象であった（図９Ａ）。FGF21 mRNAの発現は、絶食後に肝臓で促進されることが知られているが、GRmKOマウスにおいて、肝臓におけるFGF21 mRNA発現の絶食による促進は、GRf/fマウスに比してより顕著であった（図９Ｂ）。これに対し、白色脂肪組織と腓腹筋におけるFGF21 mRNAの発現の絶食による促進は、GRf/fマウスとGRmKOマウスとで、同等であった（図９Ｂ）。
また、エネルギー源となる物質の肝臓内含有量を調べてみると、アラニンのみが、GRf/fマウスよりもGRmKOマウスにおいて有意に少なかった（図９Ｃ）。
他方、肝臓におけるグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（GPT1およびGPT2）のmRNAの発現、および、肝臓抽出液中のインビトロにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）活性は、GRf/fマウスとGRmKOマウス間で同等であり、また、腹腔内ピルビン酸負荷テストおよび経口アラニン負荷テストでは、GRf/fマウスとGRmKOマウスで同様な応答が観察されたことから、グルコース−アラニンサイクルに関しては、いずれのマウスにおいても同じように機能しているものと考えられる。
【００４８】
脂肪酸酸化（carnitine palmitoyltransferases (cpt1a, cpt1b, および cpt2)ならびに carnitine/acylcarnitine translocase (CACT)）、中性脂肪分解（ATGL）、脂肪酸取り込み（fatty acid transporter 1 (Fatp1)）に関与する遺伝子の肝臓におけるmRNA発現レベルは、いずれのマウスにおいても上昇していた（図１０）。これらの遺伝子のうち、脂肪酸酸化の律速酵素であるcpt1aとcpt1b、またATGLの発現は、GRmKOマウスにおいて、より促進されていた（図１０）。中性脂肪合成に関与する遺伝子（FASNおよびDGAT2）の発現については、いずれのマウスにおいても、絶食後において、減少しており、DGAT2は、GRmKOマウスにおいて、その減少の度合いが顕著であった（図１０）。
肝臓のGR標的遺伝子（tyrosine aminotransferase (TAT), phosphoenolpyruvate carboxykinase 1 (Pck1), REDD1, および Fkbp5）については、絶食状態で、GRf/fマウスとGRmKOマウスで同等に誘導されていることから、肝臓におけるGRの機能は、いずれのマウスにおいても正常であることが確認できる。
以上の結果から、骨格筋から肝臓への情報伝達として働くアラニンの量が減少すると、中性脂肪分解と脂肪酸の酸化が促進され、トリグリセリドの合成が抑制され、同時に、FGF21遺伝子の発現が肝臓において上昇すると考えられる。
【００４９】
２−４．マウスにアラニン、アラニン誘導体を投与した場合、また高アラニン含有食で飼育した場合の代謝への影響
まず、GRmKOマウスとGRf/fマウスに、アラニンを経口投与した後、24時間絶食させた時に、FGF21 mRNAの発現がどのように変動するかを調べた。
絶食後24時間における肝臓でのFGF21 mRNAの発現は、GRmKOマウスにおいてのみ、与えたアラニンの量に依存して、その発現が抑制され、GRf/fマウスと同程度まで低下した（図１１Ａ）。他方、GRf/fマウスにアラニンのアナログである3-クロロ-L-アラニンを経口投与したところ、用量依存的に、血漿中のアラニン濃度の経時的上昇が観察された（図１１Ｂ）。この3-クロロ-L-アラニンによる血漿中のアラニン濃度の上昇は、3-クロロ-L-アラニンがアラニンと競合し、肝臓によるアラニンの取り込みとその代謝が阻害されたことを反映していると考えられる。また、図１１Ｂの実験と同じ処理をしたGRf/fマウスの、絶食24時間後における肝臓FGF21 mRNAの発現を調べたところ、3-クロロ-L-アラニンの投与量に依存してその発現が増加した（図１１Ｃ）。
これらの結果から、肝臓によるアラニンの取り込みとその利用が低下することが、FGF21遺伝子の発現によって示される肝臓の飢餓応答の重要なシグナルであると考えられる。
【００５０】
次に、肝臓によるアラニンの取り込みの減少が、全身におけるエネルギー代謝の変動の契機となり、体内の脂肪蓄積量が減少するかどうかについて検討を行った。
マウスに通常の固形飼料（NCD: アラニン1.4% 、脂質 13%）、高アラニン含有飼料(HAlaD: アラニン 27% 、脂質 10%)または高脂肪食（HFD: アラニン1.3%、脂質 32%）を３週間与えた。HAlaDを与えたGRmKOマウスは、食餌量が多少減ったが、NCDまたはHFDを与えたGRmKOマウスに比べると、絶食後24時間において、血漿中のアラニン濃度が上昇した（図１２）。また、血漿中のFGF21、遊離脂肪酸、および3-ヒドロキシブチル酸の量は、絶食から24時間後、NCDまたはHFDを与えたGRmKOマウスに比べて、HAlaDを与えたGRmKOマウスでは有意に少なかった（図１２）。
【００５１】
絶食24時間後の各組織におけるFGF21 mRNAの発現に関しては、HAlaDで飼育したGRmKOマウスでは、肝臓においてGRf/fマウスと同等レベルにまで減少していたが、白色脂肪組織においては、NCDまたはHFDを与えたマウスと同等であった（図１３）。また、肝臓におけるcpt1aとcpt1bのmRNAの発現、白色脂肪組織におけるATGLとHSLの発現も、HAlaD飼育GRmKOマウスではGRf/fマウスと同等レベルに減少しているという、肝臓FGF21と同様の傾向であった。
さらに、GRmKOマウスにおいて、HAlaDで飼育したマウスとHFDで飼育したマウスでは、脂肪組織の量が、HFD飼育GRf/fマウスと同等レベルに増加していた（図１４）。
これらの結果から、骨格筋由来のアラニンの肝臓への供給を遮断することが、肝臓におけるFGF21の発現誘導および脂肪細胞における脂肪分解促進、中性脂肪合成抑制、脂肪組織量の減少の引き金となっていると考えられた。さらに、このとき、アラニンの過剰投与などによって、アラニンの肝臓への供給を回復させると、絶食時の肝臓におけるFGF21の発現誘導の鈍化、脂質利用の減少と中性脂肪合成の増加が生じ、HFDで飼育したマウスに観られるような脂肪組織の蓄積がおこると考えられる。
【００５２】
本発明によって開示されるGRmKOマウスは、骨格筋のGRを特異的に欠損させたマウスであり、骨格筋から肝臓へ供給されるアラニンが欠乏している。このGRmKOマウスに一定量のアラニンを含んだ食餌を与えて飼育すると、食餌によって補充されるアラニンが肝臓に供給されることで、FGF21の肝臓での発現および血漿中のFGF21の量は、野生型のマウスとほぼ同等になる。
本実施例で示した結果から、骨格筋のGRを特異的に欠損させた動物、例えば、GRmKOマウスなどに、ある試験物質を投与し、その試験物質が、食餌から摂取されるアラニンの肝臓への供給を阻害するような物質であれば（例えば、3-クロロ-L-アラニンなど）、中性脂肪分解と脂肪酸の酸化が促進され、体内の脂肪組織の量が減少するものと考えられる（すなわち、3-クロロ-L-アラニンのような物質は、体内の脂肪を減少させる候補物質であるといえる）。この点は、HAlaDで飼育したGRmKOマウス（アラニンを外から与えることで肝臓へアラニンが供給される）の脂肪組織の量は、NCDで飼育した GRmKOマウス（GRの欠損により肝臓へのアラニンの供給が抑制されている状態にある）の脂肪組織の量よりも多いことからも理解できる（図１４）。
そして、投与した試験物質が、肝臓へのアラニンの供給を阻害する物質（あるいは、肝臓によるアラニンの取り込みを阻害する物質）であるかどうかは、肝臓におけるFGF21 mRNAの発現上昇、または、血漿中のFGF21のタンパク質の量の上昇を指標にして判断することができる。
実際に、骨格筋のGRを特異的に欠損させた動物の一例であるGRmKOマウスに、肝臓へのアラニンの供給を阻害する3-クロロ-L-アラニンを投与すると、血漿中におけるFGF21タンパク質の量が増加し、体重30gあたり30mg投与すると、NCDで飼育したGRmKOマウスの（vehicle）のFGF21の量とほぼ同じ量になることを確認した（図１５）。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明のスクリーニング方法を使用することで、転写因子または転写因子複合体の活性を特異的に制御する物質を簡便、かつ、効率的に検出することが可能となる。従って、本発明は、生命現象の解明を目的とするあらゆる分野において、利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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