(57)【要約】      （修正有）【課題】カンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体が効果を有する患者を同定する方法を提供する。【解決手段】メタボローム解析により患者体内のシトルリン／オルニチンの定量比が２以上である被験者をカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体に対する感受性が高いと判定する。カンプトテシン類縁体がイリノテカン、ノギテカン又はＳＮ−３８であって、カンプトテシン類縁体を内包する複合体がＮＫ０１２である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体内のシトルリン／オルニチンの定量比が２以上である被験者をカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体に対する感受性が高いと判定する方法。
【請求項２】
被験者由来のサンプル中のシトルリン及びオルニチンの定量を行うステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験者由来のサンプルをメタボローム解析によりシトルリン及びオルニチンの定量を行うステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験者由来のサンプルが被験者の腫瘍組織及び体液のいずれか一つ以上から選ばれる請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
カンプトテシン類縁体がイリノテカン、ノギテカン又はＳＮ−３８である請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
カンプトテシン類縁体を内包する複合体がＮＫ０１２である請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トポイソメラーゼI阻害剤が効果を有する患者を同定するためのバイオマーカーを提供する。具体的には、本発明は小細胞肺癌、非小細胞肺癌、子宮頚癌、卵巣癌、有棘細胞癌、悪性リンパ腫（非ホジキンリンパ腫）、胃癌、大腸癌、乳癌、食道癌といった悪性腫瘍を有する患者のうち、カンプトテシン類縁体（カンプトテシン、イリノテカン、その加水分解物であるＳＮ−３８、ノギテカン等を含む）、及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体による抗腫瘍効果が高い患者を同定するためのバイオマーカーを提供する。さらに、悪性腫瘍を有する患者の血液、腫瘍組織、組織液等、に含まれる代謝産物を分析する方法を提供する。本発明は上記化合物による抗腫瘍効果が高い患者と低い患者において異なる発現パターンを示す代謝産物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍の治療法の一つに抗腫瘍剤によるものがあるが、癌種・ステージが同一であっても患者により抗腫瘍剤への感受性が異なるという問題があった。特に、抗腫瘍剤の副作用が重篤である場合、感受性の低い患者にとって、効果のない治療を受けることによる心理的、身体的、金銭的な負担はできるだけ回避すべきものである。また、抗腫瘍剤の副作用は薬剤や患者によっては耐え難いものであるため、なおさら、事前に感受性が判断できることが求められている。
【０００３】
イリノテカン（ＣＰＴ−１１）は抗腫瘍性アルカロイドであるカンプトテシンをもとに合成された抗腫瘍剤である。イリノテカンはプロドラッグであり、主に肝臓のカルボキシルエステラーゼにより加水分解され、活性型のＳＮ−３８に変換される。ＳＮ−３８はトポイソメラーゼ−１（ｔｏｐｏ−１）を阻害することで抗腫瘍効果を発揮する。ＳＮ−３８は肝臓内でさらにＵＤＰ−グルクロン酸転位酵素（ＵＧＴ）により抱合代謝を受け、胆汁中から排泄される。
【０００４】
イリノテカンの感受性のバイオマーカーとしては、ｔｏｐｏ−１、ＵＧＴの分子種の一つであるＵＧＴ１Ａ１、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＤ）の報告がある。ｔｏｐｏ−１はその活性が高いとイリノテカンの感受性も高いとされている（非特許文献１）。ＵＧＴ１Ａ１の遺伝子多型のうちＵＧＴ１Ａ１＊２８と＊６は酵素活性が低下し、イリノテカンの副作用（好中球減少や下痢）の発現率が高くなることが報告されている（非特許文献２・３）。このためＵＧＴ１Ａ１＊２８と＊６の測定が日本においては保険適応となっている。一方、ＤＰＤは発現量と効果の相関が完全ではなく、バイオマーカーとしての可能性に留まっている（非特許文献４）。
【０００５】
特許文献１〜４にはイリノテカンを内包する複合体が記載されている。また、カンプトテシンをもとに合成された抗腫瘍剤であるノギテカン（トポテカン）を内包する複合体が特許文献５に記載されている。
【０００６】
イリノテカンの副作用の発生の頻度を調べる手段としては、グルクロン酸抱合酵素の遺伝子多型を検出することによるイリノテカンの副作用の発生危険度を判定する方法（特許文献６・７）が知られている。
【０００７】
これまでにも診断時に抗腫瘍剤への感受性が簡便に判断できるバイオマーカーの提案がある（特許文献８、非特許文献５）。これらは悪性腫瘍を有する患者で特異的に高発現であるか又は低発現である遺伝子や、その遺伝子産物（種々のＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド等を含む）、特定の癌遺伝子と言われる遺伝子中の変異などである。例えばｅｒｂＢ−２遺伝子がハーセプチン（登録商標）の、分化抗原ＣＤ２０がリツキサン（登録商標）の、変異したＥＧＦＲ遺伝子がタルセバ（登録商標）のバイオマーカーとして利用されている。
【０００８】
バイオマーカーとして報告がされても、その効果が認められないとされるものもある（非特許文献６・７）。また、遺伝子発現の強度や病態と抗腫瘍剤への感受性が関連していないことも多い。２万個強とされているヒトの遺伝子の中から、感受性の高い患者を同定するのに適した遺伝子やその遺伝子産物を見出すことは困難であった。
【０００９】
このような状況から、新たなバイオマーカー探索手段としてメタボローム解析（代謝産物の解析）が行われている。メタボローム解析は遺伝子解析やタンパク質解析に比較して、解析対象が数千個と少なく、低分子である。また、解析対象であるメタボロームは種を問わず共通であり、生体内の変化がそのままメタボロームの変化につながる特徴がある。この特徴を利用して、メタボローム解析は疾患のバイオマーカーや新規薬剤の探索、副作用発現の予測など（特許文献８〜１１）に用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００４／０３９８６９号
【特許文献２】特表２００１−５２４５１２号
【特許文献３】特表平１０−５０７４５４号
【特許文献４】特開平１１−３３５２６７号公報
【特許文献５】特開２００３−３４２１６７号公報
【特許文献６】特開２００８−０７２９１３号公報
【特許文献７】特開２０１０−００００１８号公報
【特許文献８】国際公開第２００８／１１４６７２号
【特許文献９】特開２００３−５３０１３０号公報
【特許文献１０】特開２０１１−２４７８６９号公報
【特許文献１１】特開２０１３−５２２６４９号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｐｏｍｍｉｅｒ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．：Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．Ｕｐｄａｔ．２（５）：ｐ．３０７−３１８，１９９９
【非特許文献２】安藤雄一：最新医学  ６０，ｐ．１８７０（２００５）
【非特許文献３】Ｓａｉ  Ｋ．，Ｓａｅｋｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７５，ｐ．５０１（２００４）
【非特許文献４】Ｋｏｏｐｍａｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４５（１１）：ｐ．１９９９−２００６，２００９
【非特許文献５】Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＣＯ，２７：ｐ．２２６１−８，２００９
【非特許文献６】Ｓｃｈｗａｂ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２６（１３）：ｐ．２１３１−２１３８，２００８
【非特許文献７】Ｄｕｃｒｅｕｘ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．７０（３）：ｐ．２２２−２３０，２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、トポイソメラーゼI阻害剤、中でもカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体が効果を有する患者を同定するためのバイオマーカーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明はメタボローム解析を用いてカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体が効果を有する患者を同定するための新たなバイオマーカーを得たことに基づく。
（１）被験者におけるカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体に対する感受性の高さを判定する方法。
（２）前記方法において、生体内のシトルリン／オルニチンの定量比が２以上である被験者をカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体に対する感受性が高いと判定する方法。
（３）前記方法において、被験者由来のサンプル中のシトルリン及びオルニチンの定量を行うステップを含む前記方法。
（４）被験者由来のサンプルのメタボローム解析により得られたシトルリン定量値及びオルニチン定量値からシトルリン／オルニチンの定量比を算出するステップを含む前記方法。
（５）被験者由来のサンプルが被験者の腫瘍組織及び体液のいずれか一つ以上から選ばれる前記方法。
（６）カンプトテシン類縁体がイリノテカン、ノギテカン又はＳＮ−３８である前記方法。
（７）カンプトテシン類縁体を内包する複合体がカンプトテシン類縁体を親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロックコポリマーである前記方法。
（８）被験者が肺癌に罹患している前記方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のバイオマーカーを用いれば、被験者にカンプトテシン類縁体又はカンプトテシン類縁体を内包する高分子結合体の投与を考慮する際、迅速かつ簡便に感受性を予測することができる。特に、体液をサンプルとした場合に被験者の心理的・身体的負担が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＮＫ０１２及びＣＰＴ−１１（イリノテカン）低感受性又は高感受性の腫瘍を移植したマウスの腫瘍中のシトルリン／オルニチン比を示す。ＮＣＩ−Ｈ４６０は低感受性の腫瘍、ＮＣＩ−Ｈ１２９９及びＮＣＩ−Ｈ６９は高感受性の腫瘍である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において「カンプトテシン類縁体」とはカンプトテシン、及びカンプトテシンを元に合成されたイリノテカン、ノギテカン、ＤＢ６７、ＢＮＰ１３５０、エキサテカン、ルートテカン、ＳＴ１４８１、ＣＫＤ６０２を含む。また、「カンプトテシン類縁体」はさらにイリノテカンの加水分解物であるＳＮ−３８の他、「カンプトテシン類縁体」の薬理学的に許容される塩も含む。
本明細書において「カンプトテシン類縁体を内包する複合体」とはカンプトテシン類縁体をリポソーム内に封入したもの、カンプトテシン類縁体とリン脂質との複合体、カンプトテシン類縁体をポリマーミセル内に封入したもの、カンプトテシン類縁体を親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロックコポリマーで封入したものなどを含む。カンプトテシン類縁体を親水性セグメントと疎水性セグメントからなるブロックコポリマーで封入したものとしては例えば、下記一般式（Ｉ）で表されるカンプトテシン類の高分子誘導体（ＮＫ０１２）が挙げられる。
【００１７】
【化１】
2016169945.tif 000002
［式中、Ｒ１は水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、ｔは５〜１１５００の整数を示し、Ａは結合基を示し、ｄ＋ｅ＋ｆは３〜２００の整数を示し、Ｒ２は水素原子、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基又は置換基を有していてもよいシリル基を示し、Ｒ３は水素原子又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を示し、Ｒ４は同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）アルコキシル基、置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基、置換基を有していてもよいジ（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基又は置換基を有していてもよい（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１〜Ｃ２０）アルキルアミノ基を示し、Ｐは水素原子、（Ｃ１〜Ｃ６）アシル基又は（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシカルボニル基を示す］
【００１８】
本発明において「カンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体に対する感受性」とはカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体を内包する複合体が腫瘍に対して示す抗腫瘍効果の程度を指す。「感受性が高い」とは薬剤による抗腫瘍効果が高いことを意味し、「感受性が低い」とは薬剤による抗腫瘍効果が低いことを指す。
【００１９】
本発明において「シトルリン／オルニチンの定量比」とは任意又は公知の手法により定量された被験者由来のサンプル中のシトルリン定量値及びオルニチン定量値をもとに、測定されたシトルリンの定量値をオルニチンの定量値で割って得られた比をいう。本発明においては主として、メタボローム解析により得られるシトルリン／オルニチンの定量比を算出した。
【００２０】
本発明において「シトルリン」及び「オルニチン」はアミノ酸の一種で、尿素回路を構成するものを指す。「シトルリン」はミトコンドリアで「オルニチン」とカルバモイルリン酸とが反応し、生成する。また細胞質基質においてアスパラギン酸、ＡＴＰと反応し「オルニチン」とＡＭＰ、ピロリン酸に分解される。「オルニチン」はアルギニンの分解により生成する。
【００２１】
本発明において「メタボローム解析」とは生体内の代謝によって生成する代謝物（低分子化合物）の種類や濃度を網羅的に分析する手法を指す。「メタボローム解析」では外部刺激や内部刺激による代謝の変化による組織や体液中に存在する代謝物の種類や濃度の変動を分析する。「メタボローム解析」では、まず、対象サンプルを定法により処理した後、クロマトグラフィー（ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ））、電気泳動、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）といった手法により代謝物を分離する。次いで質量分析（四重極型質量分析計（ＱＭＳ）、イオントラップ型質量分析計（ＩＴＭＳ）、飛行時間型質量分析計（ＴＯＦＭＳ））等によって代謝物を分析する。この分析結果から代謝物の種類や濃度の変動を解析する。対照サンプルを分離する手法、分析する手法、いずれも限定はなく、分析対象・目的に合わせて適宜選択することができる。
【００２２】
本発明において「被験者由来のサンプル」とは正常組織、腫瘍組織、体液などを含む。正常組織はいずれの組織でも限定はない。体液は血液、血清、血漿、組織液、涙液、唾液、汗、尿、リンパ液、髄液、胸水、腹水、精液、膣液、乳汁などの細胞外液、細胞の中に含まれている細胞内液などを含み、限定はない。本発明では腫瘍組織、被験者の負担が少ない血液などが好ましい。
【００２３】
被験者からのサンプルの採取方法は通常の方法であれば限定はない。また、サンプルの採取は分析時ではなくてもよく、適切に保存されたサンプルであれば採取から時間が経過したものでもよい。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されない。
【００２５】
実施例で用いた細胞等の詳細は以下のとおりである。
（マウス）
６週齢雄性マウスＢＡＬＢ／ｃ  ＡＪｃ１−ｎｕ／ｎｕ（日本クレア株式会社）を購入後約１箇月馴化したものを使用した。（腫瘍細胞）
ＮＣＩ−Ｈ４６０（非小細胞肺がん）、
ＮＣＩ−Ｈ１２９９（非小細胞肺がん）、ＮＣＩ−Ｈ６９（小細胞肺がん）
いずれもＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
（移植腫瘍）
腫瘍細胞を推奨されている培地中でそれぞれ増殖させた後にＨＢＳＳにて懸濁し、マウス皮下に移植した。細胞が腫瘍を形成したのち、腫瘍を取り出して腫瘍片を作成し、マウス皮下へ套管針を用いて移植した。同様の操作で移植を繰り返して腫瘍を維持し、移植腫瘍を調製した。
（試薬）
シクロホスファミド水和物
シクロホスファミド水和物は経口用エンドキサン原末（塩野義製薬株式会社）を用いた。シクロホスファミド水和物は生理食塩水で溶解して投与に供与した。
ＮＫ０１２
ＮＫ０１２は特許文献１に開示される製造方法に従い合成した。ＮＫ０１２は、ブドウ糖注射液で溶解して投与した。なお、ＮＫ０１２投与量はＮＫ０１２が内包するＳＮ−３８量を示す。
ＣＰＴ−１１
ＣＰＴ−１１はカンプト（登録商標）注（株式会社ヤクルト本社）を用いた。ＣＰＴ−１１は、生理食塩液で希釈して投与に供与した。
（機器）
卓上型破砕機（ｂｍｓ，ＢＭＳ−Ｍ１０Ｎ２１）
限外ろ過チューブ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，ウルトラフリーＭＣ  ＰＬＨＣＣ，ＨＭＴ，遠心式フィルターユニット５  ｋＤａ）
ＣＥ−ＴＯＦＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣＥ−ＴＯＦＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
Ｃａｐｉｌｌａｒｙ：Ｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｉ．ｄ．
５０μｍ×８０ｃｍ
【００２６】
試験例１  カンプトテシン類縁体の抗腫瘍効果
マウス皮下で継代維持したＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ１２９９及びＮＣＩ−Ｈ６９を、各マウスの背側部皮下に套管針を用いて移植した。なお、ＮＣＩ−Ｈ６９を移植するマウスについては、腫瘍移植の約２４ｈｒ前に２０ｍｇ／ｍＬシクロホスファミド溶液を腹腔内投与（１６０ｍｇ／ｋｇ）した。
各薬剤投与群に無投与群を加えて、異種移植片モデル各群４〜５匹にて抗腫瘍試験を行なった。腫瘍体積が概ね２００〜５００ｍｍ３に達したときに、各薬剤の投与を開始した。各薬剤の投与量及び用法は、ＮＫ０１２は３．７５ｍｇ／ｋｇの用量を４日間隔で３回、ＣＰＴ−１１は６６．７ｍｇ／ｋｇの用量を４日間隔で３回、いずれの薬剤も尾静脈内に投与した。
腫瘍の計測は、投与開始日から観察期間終了まで週２回行い、腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｗ）をノギスで測定した。腫瘍体積は、式（Ｌ×Ｗ２×１／２）から算出した。投与開始から２１日目における各群の相対腫瘍体積は，投与開始日の腫瘍体積を１として求め、Ｔ／Ｃ（％）は、式（投与群相対腫瘍体積／無投与群相対腫瘍体積×１００）により算出した。投与開始から２１日目のＴ／Ｃ（％）を表１に示した。
【００２７】
【表１】
2016169945.tif 000003
【００２８】
この結果から、ＮＣＩ−Ｈ４６０はＮＫ０１２及びＣＰＴ−１１に対して感受性が低く、ＮＣＩ−Ｈ１２９９及びＮＣＩ−Ｈ６９はＮＫ０１２及びＣＰＴ−１１に対して感受性が高いことがわかる。
【００２９】
実施例１  シトルリン／オルニチン比とカンプトテシン類縁体及びカンプトテシン類縁体内包物への感受性の相関
套管針を用いて腫瘍細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ６９）をマウスの背側部皮下に移植した。生着後、目安として腫瘍が８０〜３００ｍｇになった時点で腫瘍を摘出し（日内変動を考慮し１６時から１８時の間に摘出した）、３ｍｍ角の腫瘍断片を作成した。腫瘍断片は液体窒素にて凍結後−８０℃にて保存した。
採取した試料に７５０μＬの５０％アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）（内部標準物質を含む）を加え、冷却下、卓上型破砕機にて破砕（１，５００ｒｐｍ，１２０秒×３回）した。次いでビーズ式細胞破砕装置を用いて試料をさらに破砕（４，０００ｒｐｍ，６０秒×３〜７回）した。７５０μＬの５０％アセトニトリル溶液（ｖ／ｖ）を破砕した試料に加えて撹拌後遠心分離（２，３００×ｇ，４℃，５分）し、上層を限外ろ過チューブに４００μＬ×２本移しとった。これをさらに遠心（９，１００×ｇ，４℃，１２０分）し、限外ろ過処理を行った。ろ液を乾固させ、再び５０μＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解したものを用いてシトルリン及びオルニチン量をＣＥ−ＴＯＦＭＳ（キャピラリー電気泳動−飛行時間型質量分析計）にて定量した。データの処理は自動積分ソフトウェアのＭａｓｔｅｒＨａｎｄｓ  ｖｅｒ．２．１３．０．８．ｈ（慶応義塾大学開発）を用いて自動抽出し、ピーク情報として質量電荷比（ｍ／ｚ）、ピーク面積値、及び飛行時間を得た。定量は内部標準法にて実施した。結果を図１に示す。
【００３０】
腫瘍中のシトルリン（Ｃｉｔ）の定量値及びオルニチン（Ｏｒｎ）の定量値、Ｃｉｔ／Ｏｒｎ比を試験例１のＴ／Ｃ（％）と合わせて表２及び図１に示す。
【００３１】
【表２】
2016169945.tif 000004
【００３２】
個体ごとにみると低感受性株を移植した群ではＣｉｔ／Ｏｒｎ比が１未満であるのに対し、高感受性株を移植した群ではいずれもＣｉｔ／Ｏｒｎ比は２以上を示した。このことからＣｉｔ／Ｏｒｎ比と腫瘍細胞のカンプトテシン類縁体への感受性に相関関係があることがわかる。このことから臨床においてもＣｉｔ／Ｏｒｎ比がカンプトテシン類縁体への感受性の指標となることが明らかである。
【図１】
2016169945.tif 000005