(57)【要約】【課題】  セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）を、キシランやリグニンを含む安価な誘導物質から効率よく生産することが可能なトリコデルマ・リーセイ変異株と、それを用いたセロビオハイドラーゼの製造方法を提供する。【解決手段】  リン酸膨潤セルロースとキシロース５ｇ／Ｌ存在下で形成されるクリアゾーンの幅が、キシロース非存在下で形成されるクリアゾーンの幅に対し、５０％以上である特徴を持つトリコデルマ・リーセイ変異株およびそれを培養することによるセロビオハイドラーゼの製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロース抑制が解除されたトリコデルマ・リーセイ変異株であって、以下の組成の寒天培地で２８℃、１４日間培養した時に形成されるクリアゾーンの幅をＸａ（ｍｍ）、以下の組成にキシロースを終濃度５ｇ／Ｌとなるように加えた寒天培地で、暗条件下、２８℃、１４日間培養した時に形成されるクリアゾーンの幅をＸｂ（ｍｍ）とした場合、（Ｘｂ／Ｘａ）×１００≧５０である、トリコデルマ・リーセイ変異株。
組成（寒天培地当たり）：
リン酸膨潤セルロース  ２５０ｍｇ
酵母エキス  ２０ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４  ４ｍｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２．８ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｍｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．６ｍｇ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２０μＬ
微量元素水溶液（０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．３ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２を含む。）  ２０μＬ
寒天粉末  ０．４５ｇ
水  １５ｍＬ
【請求項２】
前記変異株が、トリコデルマ・リーセイ  ＰＣ３−７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）またはトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ♯３１３２９）由来の変異株である、請求項１に記載のトリコデルマ・リーセイ変異株。
【請求項３】
前記変異株を、乾燥重量でキシランを１５重量％以上含むバイオマスと共に培養する、セロビオハイドラーゼの製造方法。
【請求項４】
前記変異株を、乾燥重量でキシランを２０重量％およびリグニンを８重量％以上含むバイオマスと共に培養する、セロビオハイドラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリコデルマ・リーセイ変異株および該変異株によるセロビオハイドラーゼの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、セルロース系バイオマスを原料とした各種汎用化学品やバイオ燃料などを生産するため、セルロース系バイオマスを分解し、糖を効率的に遊離させる方法が探索されている。この分解法の１つには、セルラーゼと呼ばれる酵素を用いてセルロース系バイオマスを加水分解する酵素分解法が挙げられるが、酵素にかかるコストが高いため、これを削減することが求められている。
【０００３】
トリコデルマ・リーセイは、多様なセルラーゼおよびヘミセルラーゼ混合物を多く生産する糸状菌である。これらは、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、キシラナーゼ、β―グルコシダーゼなどを含む。トリコデルマ・リーセイが生産するセルラーゼにおいて、セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）の占める割合は最も高く、ＣＢＨは結晶セルロースの還元末端から分解するＣＢＨ  Ｉ（ＥＣ  ３．２．１．−）と非還元末端から分解するＣＢＨ  ＩＩ（ＥＣ  ３．２．１．９１）の２種が存在する。
【０００４】
トリコデルマ・リーセイにおけるＣＢＨ  Ｉの発現は、セルロース、セロビオース、キシロース、ソホロース、ラクトース、キシランにより誘導され、ＣＢＨ  ＩＩの発現は、セルロース、セロビオース、キシロース、ソホロース、キシロビオースにより誘導され、発現が促進されることが判明している（非特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第７６巻、第１，７７０ページ、２０１０年
【非特許文献２】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｂｉｏｆｕｅｌｓ、第６巻、第６２号、２０１３年
【非特許文献３】Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第１４巻、第２３０ページ、２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）を、キシランやリグニンを含む安価な誘導物質から効率よく生産することが可能なトリコデルマ・リーセイ変異株と、それを用いたセロビオハイドラーゼの製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、キシロース抑制が解除されたトリコデルマ・リーセイ変異株に着目し、鋭意検討の結果、リン酸膨潤セルロースとキシロース５ｇ／Ｌ存在下で形成されるクリアゾーンの幅が、キシロース非存在下で形成されるクリアゾーンの幅に対し、５０％以上である特徴を持つ変異株を育種し、該変異株を用いることにより課題を解決できることを見出し、本発明に至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）で構成される。
（１）キシロース抑制が解除されたトリコデルマ・リーセイ変異株であって、以下の組成の寒天培地で暗条件下、２８℃、１４日間培養した時に形成されるクリアゾーンの幅をＸａ（ｍｍ）、以下の組成にキシロースを終濃度５ｇ／Ｌとなるように加えた寒天培地で２８℃、１４日間培養した時に形成されるクリアゾーンの幅をＸｂ（ｍｍ）とした場合、（Ｘｂ／Ｘａ）×１００≧５０である、トリコデルマ・リーセイ変異株。
組成（寒天培地当たり）：
リン酸膨潤セルロース  ２５０ｍｇ
酵母エキス  ２０ｍｇ
ＫＨ２ＰＯ４  ４ｍｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２．８ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．６ｍｇ
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．６ｍｇ
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ２０μＬ
微量元素水溶液（０．３ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、１．３ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、５ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１０ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２を含む。）  ２０μＬ
寒天粉末  ０．４５ｇ
水  １５ｍＬ
（２）前記変異株が、トリコデルマ・リーセイ  ＰＣ３−７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）またはトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ♯３１３２９）由来の変異株である、（１）に記載のトリコデルマ・リーセイ変異株。
（３）前記変異株を、乾燥重量でキシランを１５重量％以上含むバイオマスと共に培養する、セロビオハイドラーゼの製造方法。
（４）前記変異株を、乾燥重量でキシランを２０重量％およびリグニンを８重量％以上含むバイオマスと共に培養する、セロビオハイドラーゼの製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により示される特徴をもつ変異株を用いることにより、キシランやリグニンを含む安価な誘導物質から効率よくセロビオハイドラーゼ生産することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】リン酸膨潤セルロースを含む寒天培地へトリコデルマ・リーセイの胞子を接種させ、暗条件下にて培養した写真である。なお、Ａはトリコデルマ・リーセイの菌塊であるコロニー、Ｂはトリコデルマ・リーセイから分泌されたセルラーゼによりリン酸膨潤セルロースが分解された領域であるクリアゾーンを示している。また、Ｃはクリアゾーンの幅を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
セロビオハイドラーゼ（ＣＢＨ）とは、トリコデルマ・リーセイが作るセルラーゼの主要な成分を占め、グルコースがβ１，４−結合したセルロース鎖を末端からエキソ型に分解してセロビオースを産生する酵素であり、ｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ラクトピラノシド（ｐＮＰ−Ｌａｃ）を基質として活性を測定することができる。また、セロビオハイドラーゼには、還元末端からセルロース鎖を分解するセロビオハイドラーゼ  Ｉ（ＣＢＨ  Ｉ）と非還元末端からセルロース鎖を分解するセロビオハイドラーゼ  ＩＩ（ＣＢＨ  ＩＩ）が知られている。本発明のトリコデルマ・リーセイ変異株は、キシロースによるセルラーゼ生産の抑制が解除されることで、親株よりもセロビオハイドラーゼを高生産するようになったトリコデルマ・リーセイ変異株であり、本明細書では「キシロース抑制解除変異株」とも言う。
【００１２】
トリコデルマ・リーセイと主にキシランを主成分とするヘミセルロースを含有するバイオマスを培養した場合、培養液中へキシロースが遊離し、通常、この遊離したキシロースによってトリコデルマ・リーセイのＣＢＨの生産が抑制される。前記キシロース抑制解除変異株は、キシロース存在下でもＣＢＨの生産が抑制されないことを特徴とする。
【００１３】
トリコデルマ・リーセイ変異株（キシロース抑制解除株）は、以下の表１に示すキシロース未添加のリン酸膨潤セルロース混合寒天培地上で増殖したコロニー周囲に形成されるクリアゾーンをＸａｍｍ、以下の表１に示すリン酸膨潤セルロース培地に終濃度５ｇ／Ｌになるようキシロースを添加した寒天培地上で増殖したコロニー周囲に形成されるクリアゾーンをＸｂｍｍとする場合、（Ｘｂ／Ｘａ）×１００が５０以上を示す能力を有する変異株である。
【００１４】
【表１】
2016106538.tif 000002
【００１５】
クリアゾーンとは、寒天培地上で増殖したトリコデルマの菌塊であるコロニー（図１−Ａ）から分泌されたセルラーゼによって寒天培地中に含まれるリン酸膨潤セルロースが分解された透明な領域（図１−Ｂ）のことを示す。また、クリアゾーンの幅とは、寒天培地上で増殖したトリコデルマの菌塊の外周端から、クリアゾーン外周端までの距離（図１−Ｃ）を示す。クリアゾーンの幅は、セルラーゼ、特にＣＢＨとエンドグルカナーゼ（ＥＧ）の活性の指標である。
【００１６】
クリアゾーンの形成試験をハロアッセイとも言う。ハロアッセイは、１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理を行った表１組成の寒天培地２０ｍＬを直径９０ｍｍ、高さ１５ｍｍのプラスチック製シャーレで固化させ、胞子（２．０×１０５）を２μＬの生理食塩水に懸濁した状態で寒天培地の中央へスポットし、２８℃の恒温槽にて、暗条件および加湿条件下にて１４日間培養を行い、クリアゾーンの測定を行う。
【００１７】
ハロアッセイに用いられるリン酸膨潤セルロースは、例えば、微結晶セルロースである“Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ”（Ｍｅｒｃｋ）が用いられる。“Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ”１０ｇに対してリン酸３００ｍＬを少量ずつ添加し、微結晶セルロースが玉にならぬよう乳鉢ですり潰した後、４℃にて一晩処理を行う。続いて、蒸留水４．５Ｌへすり潰した微結晶セルロースを徐々に添加し充分に混合させた後、５，０００×ｇ、１０分間、４℃にて遠心分離を行い、沈殿したセルロースを回収する。続いて、遠心分離した際に得られた上清のｐＨが５になるまで、この操作を繰り返し行い、洗浄したものをリン酸膨潤セルロースとする。また、最終的に３００ｍＬの蒸留水にてセルロースを懸濁させたものをリン酸膨潤セルロース溶液とする。
【００１８】
本発明のトリコデルマ・リーセイ変異株の親株は特に制限はないが、ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ♯３１３２９）またはＰＣ３−７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）であることが好ましい。
【００１９】
ＱＭ９４１４株を親株として得られたトリコデルマ・リーセイ変異株の具体例としては、本願明細書の実施例に記載のＸＤＲ１株（寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１９４０）が一例として挙げられる
また、ＰＣ３−７株を親株として得られたトリコデルマ・リーセイ変異株の具体例としては、本願明細書の実施例に記載のＸＤＲ２株（寄託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−０１９４１）、ＸＤＲ３株、ＸＤＲ４株、ＸＤＲ５株、ＸＤＲ６株、ＸＤＲ７株が一例として挙げられる。
【００２０】
前記トリコデルマ・リーセイ変異株とキシランを含むバイオマスとともに培養することでセロビオハイドラーゼを製造することができる。
【００２１】
本発明において、バイオマスは、再生可能な生物由来の有機性資源である。具体的には、パルプ、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンハル、稲わら、麦わらなどの草本系バイオマス、樹木、廃建材などの木質系バイオマスなどを例として挙げることができる。これらのセルロース含有バイオマスは、芳香族高分子であるリグニンおよびセルロース・ヘミセルロースを含有していることから、リグノセルロースとも呼ばれる。
【００２２】
セロビオハイドラーゼを製造する場合、バイオマス中には前記トリコデルマ・リーセイ変異株のセロビオハイドラーゼ生産を誘導するキシランが含まれる必要がある。キシランは、バイオマス全乾燥重量に対して１５重量％以上含まれることが好ましく、２０重量％以上含まれることがより好ましい。バイオマス全乾燥重量に対してキシランが１５重量％以上含まれることにより、本発明における変異株のセロビオハイドラーゼの相対活性の低下を防ぐことが可能となる。また、バイオマスに含まれるキシラン重量比率の上限は特に制限はないが、通常、５０重量％以下である。
【００２３】
前記バイオマスには、バイオマスのリグニン含有量に比例し、本発明における変異株のセロビオハイドラーゼの相対活性の低下を防ぐことに繋がるため、さらにリグニンが含まれることが好ましい。リグニンは、バイオマス全乾燥重量に対して８重量％以上含まれることが好ましく、２０重量％以上含まれることが好ましい。バイオマス全乾燥重量に対してリグニンが８重量％以上含まれることにより、本発明における変異株のセロビオハイドラーゼの相対活性の低下を防ぐことが可能となる。また、バイオマスに含まれるリグニン重量比率の上限は特に制限はないが、通常、３０重量％以下である。
【００２４】
前記バイオマスに含まれるセルロースは、バイオマス全乾燥重量に対するキシランとリグニンの総和の重量比率が１００重量％を超えない範囲において、セロビオハイドラーゼの発現を誘導させるため、最低でも３０重量％以上含むことが好ましい。また、バイオマスに含まれるセルロース重量比率の上限は特に制限はないが、重量比率は高い程好ましいが、通常、８０重量％以下である。
【００２５】
セロビオハイドラーゼ製造方法としては、下記の通りである。本願明細書の実施例に記載のキシロース抑制解除変異株であるＸＤＲ１株、ＸＤＲ２株、ＸＤＲ３株、ＸＤＲ４株、ＸＤＲ５株、ＸＤＲ６株、ＸＤＲ７株の胞子を前培養液にて培養する。その前培養液を本培養液へ接種させ、培養を行う。培養は、フラスコ培養や撹拌通気型培養などである。また、栄養源として窒素源や硫黄源などを添加し、セロビオハイドラーゼの発現を誘導するため、バイオマスを使用して培養する。培養後の培養液の液状画分をセロビオハイドラーゼ溶液とする。
【００２６】
バイオマスに含まれるキシラン、リグニンおよびセルロースの含有量は、以下の［１］〜［３］に記した手法により求めることができる。
［１］１０５℃で乾燥させたバイオマス０．３ｇに７２％硫酸３ｍＬを加え、３０℃で攪拌させながら１時間放置する。この反応液に蒸留水８４ｍＬを添加し、１２０℃で１時間オートクレーブにて加熱分解させる。
［２］加熱分解後、分解液と残渣をろ別し、ろ液に残渣の洗液を加えて１００ｍＬにメスアップした溶液を高速液体クロマトグラフ法により定量し、セルロースおよびキシラン含有量を算定する。
［３］［１］および［２］で記した構成糖分析で得られた残渣を１０５℃で乾燥し重量を計り分解残渣率を算定する。更に、残渣を６００℃で加熱して残る灰分率を測定し、分解残渣率から灰分率を減じることで、リグニン含有率を算定する。
【実施例】
【００２７】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれに限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）トリコデルマ・リーセイ株
トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株（ＮＢＲＣ♯３１３２９）、ＲｕｔＣ−３０株（ＡＴＣＣ＃５６７６５）、ＰＣ３−７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）、そして、トリコデルマ・リーセイ変異株として取得されたＸＤＲ１株、ＸＤＲ２株、ＸＤＲ３株、ＸＤＲ４株、ＸＤＲ５株、ＸＤＲ６株、ＸＤＲ７株を使用した。
【００２９】
ＸＤＲ１株は、トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株に、ニトロソグアニジンおよび紫外線照射によるランダム変異導入を施し、表１に示すリン酸膨潤セルロースを含む培地に、５ｇ／Ｌになるようにキシロースを加えた寒天培地上で大きなクリアゾーンを形成する能力について選択されたＱＭ９４１４株由来の変異株である。
【００３０】
ＸＤＲ２株、ＸＤＲ３株、ＸＤＲ４株、ＸＤＲ５株、ＸＤＲ６株、ＸＤＲ７株は、トリコデルマ・リーセイ  ＰＣ３−７株に、ニトロソグアニジンおよび紫外線照射によるランダム変異導入を施し、同じく表１に示すリン酸膨潤セルロースを含む培地に、５ｇ／Ｌになるようにキシロースを加えた寒天培地上で大きなクリアゾーンを形成する能力について選択されたＰＣ３−７株の変異株である。
【００３１】
（実施例２）胞子の採取
実施例１の各種トリコデルマ・リーセイ株をポテトデキストロース寒天培地上にて、暗条件下、２８℃にて１０日間培養して胞子を形成させた。続いて、１枚の寒天培地につきグリセロールストック溶液（０．８％ＮａＣｌ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０、２０％グリセロール）４ｍＬを添加し、コンラージ棒にて胞子を掻き取り、オートクレーブ滅菌したＭｉｒａｃｌｏｔｈ(R)（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でろ別させた。そのろ液を胞子溶液とした。
【００３２】
（実施例３）クリアゾーン形成試験
表１に示すリン酸膨潤セルロースを含む培地（キシロース非含有培地）、および表１に示すリン酸膨潤セルロースを含む培地に終濃度が５ｇ／Ｌになるようキシロースを添加した培地（キシロース含有培地）へトリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株、ＲｕｔＣ−３０株、ＰＣ３−７株、ＸＤＲ１株、ＸＤＲ２株、ＸＤＲ３株、ＸＤＲ４株、ＸＤＲ５株、ＸＤＲ６株、ＸＤＲ７株のそれぞれ胞子２．０×１０５個を２μＬの生理食塩水に懸濁した状態で寒天培地の中央部へ接種し、暗条件下、２８℃にて１４日間培養を行った。その際、経時的にコロニー周囲に形成されたクリアゾーンを計測した。
【００３３】
培養開始１４日目において、キシロース非含有培地において形成されるクリアゾーンの幅Ｘａｍｍを計測した。また、培養開始１４日目において、キシロース含有培地において形成されるクリアゾーンの幅Ｘｂｍｍを計測した。クリアゾーンの割合は（Ｘｂ／Ｘａ）×１００により決定した（表２、表３）。（Ｘｂ／Ｘａ）×１００で求められる値が、ＱＭ９４１４株では０であったのに対し、ＱＭ９４１４株へキシロース抑制解除能を付与させたＸＤＲ１株においては５６であった（表２）。また、ＰＣ３−７株では２６であったのに対しＰＣ３−７株へキシロース抑制解除能を付与させた変異株においては、ＰＣ３−７株よりも約２倍以上高い株が３株、約３倍以上高い株が３株あった（表３）。また、ＲｕｔＣ−３０株については、キシロース非含有培地においてクリアゾーンが形成されなかったため、（Ｘｂ／Ｘａ）×１００で求められる値は０とした。
【００３４】
【表２】
2016106538.tif 000003
【００３５】
【表３】
2016106538.tif 000004
【００３６】
（実施例４）ＱＭ９４１４株およびＱＭ９４１４株由来キシロース抑制解除変異株（ＸＤＲ１株）によるバイオマスを用いたフラスコ培養評価
（前培養）
トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株、ＸＤＲ１株の胞子を１．０×１０７／ｍＬになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液０．１ｍＬを５０ｍＬバッフル付フラスコに入れた表４に記した組成で構成される前培養液１０ｍＬへ接種させた。接種させた前培養液を２８℃、１６０ｒｐｍの培養条件にて３日間培養を行った。
【００３７】
【表４】
2016106538.tif 000005
【００３８】
（バイオマスの前処理）
セルラーゼ誘導物質であるセルロース含有バイオマスとして、Ａｒｂｏｃｅｌ(R)（Ｊ．Ｒｅｔｔｅｎｍａｉｅｒ＆Ｓｏｈｎｅ）、前処理であるアンモニア処理を施したエリアンサス、コーンハル（秦皇島流涌農産品加工有限公司）を用いた。
【００３９】
エリアンサスは以下のようにしてアンモニア処理（前処理）を施した。エリアンサスを小型反応器ＴＶＳ−Ｎ２３０ｍＩ（耐圧硝子工業）に投入し、液体窒素で冷却させた。この反応器にアンモニアガスを流入し、エリアンサスを完全に液体アンモニアに浸漬させた。リアクターの蓋を閉め、室温で１５分程放置した。次いで１５０℃のオイルバス中にて１時間処理した。処理後、反応器をオイルバスから取り出し、ドラフト中で直ちにアンモニアガスをリークした後、更に真空ポンプで反応器内を１０Ｐａまで真空引きし、アンモニア処理物を乾燥させた。このアンモニア処理物（前処理物）をミラクロースで包み、大量の純水を用いて洗浄した後、風乾させた。次いでアンモニア前処理エリアンサスおよびコーンハルは、「家庭用臼式  お茶粉末器  まるごと緑茶  ＥＵ６８２０Ｐ」（パナソニック株式会社）を用いて粉砕を行った。粉砕後、ふるいにて粒径を測定した結果、粉末化させたアンモニア処理エリアンサス（粉末エリアンサス）は平均粒径５０μｍ、コーンハル（粉末コーンハル）は平均粒径１５μｍであった。
【００４０】
（本培養）
トリコデルマ・リーセイ  ＱＭ９４１４株、ＸＤＲ１株の前培養液１ｍＬをそれぞれ５０ｍＬバッフル付フラスコに入れた表５に示した本培養液１０ｍＬへ接種させ、２８℃、１６０ｒｐｍの培養条件にて１０日間培養を行った。バイオマスは、Ａｒｂｏｃｅｌ(R)、アンモニア処理粉末エリアンサス、または粉末コーンハルをそれぞれ使用した。
【００４１】
【表５】
2016106538.tif 000006
【００４２】
（培養液の採取）
培養開始より２日おきに５００μＬずつ培養液を採取した。そして、１５，０００×ｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液を培養上清液とした。
【００４３】
（酵素活性の測定）
培養開始１０日目の培養上清液に対して酵素活性を測定した。セロビオハイドロラーゼ活性は、基質としてシグマアルドリッチジャパン社製のｐ−ニトロフェニルβ−Ｄ−ラクトピラノシド（４−ニトロフェニル  β−Ｄ−ラクトピラノシド）を用い、酵素分解によって生じた４−ニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度の増加にて定量を行った。具体的には、基質溶液〔１ｍＭ  ４−ニトロフェニル  β−Ｄ−ラクトピラノシド、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）〕９０μＬに蒸留水にて２０倍希釈した培養上清液１０μＬを加えて３０℃にて正確に６０分間反応させた。続いて、反応停止液（２Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３）１０μＬを加えてよく混合し、反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度測定を行った。１単位のＣＢＨ活性は、３０℃、６０分間の反応条件下で、１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを遊離させる酵素量として表した。
【００４４】
ＸＤＲ１株はＱＭ９４１４株とｐＮＰ−Ｌａｃ分解活性を比較したところ、誘導物質として“Ａｒｂｏｃｅｌ”（登録商標）を用いた場合は１．５倍、粉末コーンハルを用いた場合は５倍以上、粉末エリアンサスを用いた場合では１０倍の活性を示した（表６）。バイオマス中のリグニン含量が高いほど、キシロース抑制解除変異株ではＣＢＨの相対活性が向上した。
【００４５】
【表６】
2016106538.tif 000007
【００４６】
（実施例５）ＰＣ３−７株およびＰＣ３−７株由来キシロース抑制解除変異株によるバイオマスを用いたフラスコ培養評価
実施例４と同様の方法にて、ＰＣ３−７株およびＰＣ３−７株由来キシロース抑制解除変異株（ＸＤＲ２、ＸＤＲ３、ＸＤＲ４、ＸＤＲ５、ＸＤＲ６、ＸＤＲ７株）のフラスコ培養と培養上清液を用いたｐＮＰ−Ｌａｃ分解活性測定を行った。
【００４７】
ＰＣ３−７株の変異株は、ＰＣ３−７株と比較し、粉末エリアンサスをセルラーゼ誘導物質に用いた場合、約１．５倍以上高いｐＮＰ−Ｌａｃ分解活性を示した（表７）。バイオマス中のリグニン含量が高いほど、キシロース抑制解除変異株ではＣＢＨの相対活性が向上した。
【００４８】
【表７】
2016106538.tif 000008
【００４９】
（実施例６）ＱＭ９４１４株由来キシロース抑制解除変異株およびＰＣ３−７株由来キシロース抑制解除変異株によるセロビオハイドラーゼの製造
（前培養）
本発明におけるキシロース抑制解除変異株（ＸＤＲ１株、ＸＤＲ２株、ＸＤＲ３株、ＸＤＲ４株、ＸＤＲ５株、ＸＤＲ６株、ＸＤＲ７株）から実施例２と同様の方法にて胞子採取を行い、実施例４（前培養）と同様の方法にて前培養を行った。
【００５０】
（本培養）
ＸＤＲ１株、ＸＤＲ２株、ＸＤＲ３株、ＸＤＲ４株、ＸＤＲ５株、ＸＤＲ６株、ＸＤＲ７株の前培養液１ｍＬをそれぞれ５０ｍＬバッフル付フラスコに入れた表８に示した本培養液１０ｍＬへ接種させ、２８℃、１６０ｒｐｍの培養条件にて１０日間培養を行った。バイオマスは、アンモニア処理粉末エリアンサス、または粉末コーンハルをそれぞれ使用した。
【００５１】
【表８】
2016106538.tif 000009
【００５２】
（回収）
１０日間培養をした培養液を５０ｍＬの遠沈管（コーニング）に移し、８，０００ｘｇ、４℃の条件下で１０分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、そのろ液をセロビオハイドラーゼ溶液とした。
【００５３】
（参考例１）バイオマスに含有するセルロース、キシランおよびリグニンの割合（セルロース、キシラン、リグニン含有率の測定）
１０５℃で乾燥させたＡｒｂｏｃｅｌ(R)、粉末化したアンモニア処理粉末エリアンサス（粉末エリアンサス）および粉末コーンハルバイオマス０．３ｇにそれぞれ７２％硫酸３ｍＬを加え、３０℃で攪拌させながら１時間放置した。この反応液に蒸留水８４ｍＬを添加し、１２０℃で１時間オートクレーブにて加熱分解させた。加熱分解させた後、分解液と残渣をろ別し、ろ液に残渣の洗液を加えて１００ｍＬにメスアップした溶液を高速液体クロマトグラフ法により定量し、セルロースおよびキシラン含有量を算定した。得られた残渣を１０５℃で乾燥し、重量を計り分解残渣率を算定した。更に、残渣を６００℃で加熱して残る灰分率を測定し、分解残渣率から灰分率を減じることで、リグニン含有率を算定した（表９）。
【００５４】
【表９】
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【産業上の利用可能性】
【００５５】
セルロース系バイオマス、特にエリアンサスやコーンハルなどをセルラーゼ誘導物質としたセルラーゼの高生産が可能となり、セルロース資源の効率的な糖化反応に利用できる。
【図１】
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