(57)【要約】【課題】ヒトの慢性鼻副鼻腔炎に対して実際に治療効果を示す抗炎症剤を有効成分とする慢性鼻副鼻腔炎治療剤の提供。【解決手段】下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又は下記式（２）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される１種以上を有効成分とすることを特徴とする、慢性鼻副鼻腔炎治療剤。［化１］2016169178.tif 000008【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）
【化１】
2016169178.tif 000006
で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又は下記式（２）
【化２】
2016169178.tif 000007
で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される１種以上を有効成分とすることを特徴とする、慢性鼻副鼻腔炎治療剤。
【請求項２】
鼻腔又は副鼻腔の線維芽細胞の増殖抑制作用を有する、請求項１に記載の慢性鼻副鼻腔炎治療剤。
【請求項３】
鼻腔又は副鼻腔の線維芽細胞のアポトーシス誘導作用を有する、請求項１に記載の慢性鼻副鼻腔炎治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗菌作用がなく、抗炎症作用を有するジヒドロシュードエリスロマイシン誘導体を有効成分とする慢性鼻副鼻腔炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性鼻副鼻腔炎は、副鼻腔中の粘膜に生じる慢性的な炎症である。炎症の慢性化により、膿が副鼻腔中に溜まったり、鼻茸（炎症性増殖性の腫瘤）が形成される。慢性鼻副鼻腔炎に対する治療剤としては、ステロイド剤よりも重篤な副作用の心配が少なく、かつ他の抗生物質に比べて細菌増殖抑制作用や抗炎症作用が強いマクロライド系抗生物質が主に用いられる。
【０００３】
鼻茸等の慢性鼻副鼻腔炎の治療に使用されるマクロライド系抗生物質としては、主に、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン等の１４員環マクロライドが使用されている。しかし、これらの１４員環マクロライドは、抗炎症作用に加えて抗菌作用も有しており耐性菌の誘発リスクがあるため、抗炎症剤としては使用しにくい。この問題を解決するために、抗菌作用を有さず抗炎症作用を有する１２員環のシュードエリスロマイシン誘導体（学校法人北里研究所  ＥＭ７００シリーズ、特許文献１及び２参照）が報告されている。
【０００４】
前記シュードエリスロマイシン誘導体は、酸によって一部が分解し比較的不安定であったため、経口投与でその薬理作用が十分に発揮されない可能性があるという問題点があった。そこで、前記シュードエリスロマイシン誘導体の酸に対する安定性を高めるために、還元してジヒドロ体とすることが報告されている（特許文献３及び非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００２／１４３３８号
【特許文献２】国際公開第２００４／３９８２３号
【特許文献３】特許第５１１８９７３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｕｇａｗａｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２０１２，ｖｏｌ．６５，ｐ．４８７−４９０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ヒトの慢性鼻副鼻腔炎に対して実際に治療効果を示す抗炎症剤を有効成分とする慢性鼻副鼻腔炎治療剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ジヒドロシュードエリスロマイシン誘導体のうち、特定の化合物が、ヒトの鼻茸から採取された線維芽細胞に対して、増殖抑制作用及びアポトーシス誘導作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤は、下記［１］〜［３］である。
［１］  下記式（１）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩、又は下記式（２）で表される化合物若しくはその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される１種以上を有効成分とすることを特徴とする、慢性鼻副鼻腔炎治療剤。
【００１０】
【化１】
2016169178.tif 000002
【００１１】
［２］  鼻腔又は副鼻腔の線維芽細胞の増殖抑制作用を有する、前記［１］の慢性鼻副鼻腔炎治療剤。
［３］  鼻腔又は副鼻腔の線維芽細胞のアポトーシス誘導作用を有する、前記［１］の慢性鼻副鼻腔炎治療剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤は、抗炎症作用を有するが抗菌作用を示さないジヒドロシュードエリスロマイシン誘導体のうち、ヒトの鼻茸由来の線維芽細胞に対して、増殖抑制作用及びアポトーシス誘導作用を有する化合物を有効成分とするため、慢性鼻副鼻腔炎に対して非常に有効な治療剤である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、コントロ−ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）の細胞数（ＡＴＰ量）を１００％とした各薬物処理群の相対細胞数（％）の算出結果を示した図である。
【図２】実施例２において、コントロ−ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）のＣａｓｐａｓｅ活性を１００％とした各薬物処理群の相対Ｃａｓｐａｓｅ活性値（％）の算出結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤は、下記式（１）で表される化合物（９−ジヒドロ−シュードエリスロマイシンＡ  ６，９−エポキシド：ＥＭ９００）若しくはその薬理学的に許容される塩、又は下記式（２）で表される化合物（デ（３’−Ｎ−メチル）−３’−Ｎ−（ｐ−クロロベンジル）−９−ジヒドロ−シュードエリスロマイシンＡ  ６，９−エポキシド：ＥＭ９０５）若しくはその薬理学的に許容される塩からなる群より選択される１種以上を有効成分とする。
【００１５】
【化２】
2016169178.tif 000003
【００１６】
ＥＭ９００及びＥＭ９０５において、式（１）又は式（２）中の８位及び９位の立体は特に限定されない。すなわち、ＥＭ９００及びＥＭ９０５には、式（１）又は式（２）中の８位及び９位の立体異性体は全て含まれる。
【００１７】
ＥＭ９００及びＥＭ９０５は、抗炎症作用を有するのみならず、鼻腔又は副鼻腔の線維芽細胞に対する増殖抑制作用及びアポトーシス誘導作用を有する。つまり、ＥＭ９００等により、炎症を起こしている線維芽細胞は、増殖が抑制され、またアポトーシスを起こす結果、炎症が治まり、鼻茸が縮小する。このため、これらの化合物は、慢性鼻副鼻腔炎治療剤の有効成分として好適である。特に、ＥＭ９００及びＥＭ９０５は、継代培養が可能になるように株化された培養細胞株に対してではなく、実際にヒトの鼻茸から分離された線維芽細胞に対して増殖抑制作用及びアポトーシス誘導作用を有するため、本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤は、高い治療効果が期待できる。
【００１８】
ＥＭ９００及びＥＭ９０５の製造方法は、特に限定されないが、例えば、下記に具体的に記載されている方法等によって製造することができる（特許文献３参照。）。当業者は、必要に応じて出発原料、反応条件、反応試薬などを適宜修飾ないし改変することができる。
【００１９】
ＥＭ９００及びＥＭ９０５が形成し得る薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩等の有機酸塩等を挙げることができる。
【００２０】
本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤の有効成分としては、ＥＭ９００及びＥＭ９０５若しくはその薬学上許容される塩の溶媒和物であってもよい。当該溶媒和物を形成する溶媒としては、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル等を挙げることができる。
【００２１】
本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤の有効成分としては、ＥＭ９００、ＥＭ９０５、及びこれらの塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる１又は２以上の物質を用いることができる。本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。
【００２２】
本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤としては、前記有効成分をそのまま患者に投与してもよいが、好ましくは、有効成分と薬理学的及び製剤学的に許容し得る添加物とを含む医薬組成物の形態の製剤として投与すべきである。薬理学的及び製剤学的に許容し得る添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤等を用いることができる。経口投与に適する製剤の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する製剤としては、例えば、粉末噴霧剤、注射剤、点滴剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、吸入剤、坐剤等を挙げることができるが、製剤の形態はこれらに限定されることはない。本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤の剤型としては、服用が比較的容易な経口剤、又は直接患部に適用可能な粉末噴霧剤、軟膏剤、クリーム剤、点鼻剤が好ましい。
【００２３】
経口投与に適する製剤には、添加物として、例えば、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、ハードファット等の基剤を用いることができる。注射又は点滴用に適する製剤には、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性又は用時溶解型注射剤を構成し得る溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ−マンニトール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。
【００２４】
本発明に係る慢性鼻副鼻腔炎治療剤の投与量は、患者の年齢、体重、症状などの条件に応じて適宜増減すべきであるが、一般的には、成人の一日あたりの投与量は、有効成分の量で、経口投与において約０．０５〜５００ｍｇ程度である。一般的には、上記の投与量を一日あたり１回から数回に分けて投与することができるが、数日ごとに投与してもよい。有効成分が２種以上の場合、その合計量が当該範囲内に設定される。
【実施例】
【００２５】
以下、本発明の実施例及び比較例を示し、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２６】
［合成例１］  ＥＭ９００の合成
ＥＭ９００は、ＥＭＡ（エリスロマイシンＡ）を原料とし、特許文献３に記載の方法で合成した。詳細は以下の通りである。
【００２７】
ＥＭＡ（１０４．４ｇ，１６．９０ｍｍｏｌ）の氷酢酸溶液（７１０．０ｍＬ）を室温で２時間撹拌後、ＮａＨＣＯ３水溶液をゆっくり加え中和した。反応液をＣＨＣｌ３で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後ろ過し、濃縮して粗生成物（９９．３０ｇ）を得た。得られた粗生成物をＣＨＣｌ３（２５０ｍＬ）に溶解しヘキサン（５０ｍＬ）を加えて再結晶し、白色粉末ＥＭ２０１（７４．５０ｇ，７１％）を得た。
【００２８】
ＥＭ２０１；
Ｒｆ＝０．６３（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１５：１：０．２）
【００２９】
ＥＭ２０１（７．６００ｇ，１０．６０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（１５０．０ｍＬ）にＫ２ＣＯ３（１．４００ｇ，１０．６０ｍｍｏｌ）を加え、２時間加熱還流した。室温に戻した後、溶媒を留去し、残渣をＮａＨＣＯ３水溶液に溶解した。反応液をＣＨＣｌ３で抽出し、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後ろ過し、濃縮して粗生成物（９．３００ｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１０：０．５：０．０１−１０：１：０．０５）で分離精製して、白色粉末ＥＭ７０１（５．９００ｇ，７８％）を得た。
【００３０】
ＥＭ７０１；
Ｒｆ＝０．４７（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１５：１：０．２）
【００３１】
酢酸（ＡｃＯＨ；７．０００ｍＬ）にＰｔＯ２（４７６．２ｍｇ，２．１００ｍｍｏｌ）とＣＦ２ＨＣＯＯＨ（２９９．０μＬ，４．７５０ｍｍｏｌ）を加え、Ｈ２雰囲気下、５ａｔｍ、室温で１時間攪拌し、ＥＭ７０１（１．０００ｇ，１．４００ｍｍｏｌ）のＡｃＯＨ溶液（７．０００ｍＬ）を加え、Ｈ２雰囲気下、５ａｔｍ、室温で４時間攪拌した。その後ＣＨ３ＣＯ２ＮＨ４（７．０００ｇ）を加え攪拌後、ろ過し濃縮した。濃縮液をＣＨＣｌ３で抽出し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄した。洗浄した有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥した後ろ過し、濃縮して粗生成物（９６８．４ｍｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝５０：１：０．０２−３０：１：０．０２）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９００（７６７．７ｍｇ，７６％）を得た。
【００３２】
ＥＭ９００；
Ｒｆ＝０．５３（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１５：１：０．２）；
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：７１８．４７６７［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３７Ｈ６８ＮＯ１２：７１８．４７４２［Ｍ＋Ｈ］
【００３３】
［合成例２］  ＥＭ９０５の合成
ＥＭ９０５は、合成例１で製造したＥＭ９００を原料とし、特許文献３に記載の方法で合成した。詳細は以下の通りである。
【００３４】
ＥＭ９００（７０６．３ｍｇ，０．９８４ｍｍｏｌ）のメタノール（ＭｅＯＨ）溶液（９．８４０ｍＬ）に酢酸ナトリウム（ＡｃＯＮａ；４０３．６ｍｇ，４．９２０ｍｍｏｌ）、Ｉ２（４９９．５ｍｇ，１．９６８ｍｍｏｌ）、飽和ＮａＨＣＯ３溶液を加えた後、ユニバーサル試験紙で塩基性であることを確認し、５０℃で２０分攪拌した。攪拌後、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（４００．０ｍｇ）を加え室温まで戻した。反応液からＣＨＣｌ３で抽出、ｂｒｉｎｅとＮＨ４ＯＨ  ａｑの混合溶液で洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（７００．０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１００：１：０．１−３０：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９０１（５４６．５ｍｇ，７９％）を得た。
【００３５】
ＥＭ９０１；
Ｒｆ＝０．５３（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１０：１：０．２）
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：７０４．４６１５［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３６Ｈ６６ＮＯ１２：７０４．４５８５［Ｍ＋Ｈ］
【００３６】
ＥＭ９０１（２０．００ｍｇ，０．０２８０ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３溶液（２８０．０μＬ）にｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（２４．４０μＬ，０．１４ｍｍｏｌ）、ｐ−ＣｌＢｎＢｒ（ｐ−クロロベンジルブロマイド：２８．８０ｍｇ，０．１４００ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ２雰囲気下、室温で２時間攪拌した。攪拌後飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（７．０００ｍＬ）を加え、ＣＨＣｌ３で抽出、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（２４．１０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１００：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９０５（２１．６０ｍｇ，９３％）を得た。
【００３７】
ＥＭ９０５；
Ｒｆ＝０．５９（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝３０：１：０．２）
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：８２８．４６５７［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４３Ｈ７１ＮＯ１２Ｃｌ：８２８．４６６５［Ｍ＋Ｈ］
【００３８】
［比較合成例１］  デ（３’−ジメチルアミノ）−３’−モルホリノ−９−ジヒドロ−シュードエリスロマイシンＡ  ６，９−エポキシド（ＥＭ９１４）の合成
ＥＭ９１４は、合成例２で製造したＥＭ９０１を原料とし、特許文献３に記載の方法で合成した。詳細は以下の通りである。
【００３９】
【化３】
2016169178.tif 000004
【００４０】
Ｎａ（２１．８０ｍｇ，０．９４８０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ溶液（１５．８０ｍＬ）を０℃まで冷却し、ＥＭ９０１（１１１．５ｍｇ，０．１５８０ｍｍｏｌ）、Ｉ２（２００．５ｍｇ，０．７９００ｍｍｏｌ）を加え、Ａｒ雰囲気下、４０分間０℃で攪拌した。攪拌後Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１００．０ｍｇ）を加え室温に戻した。反応液からＣＨＣｌ３で抽出、ｂｒｉｎｅとＮＨ４ＯＨ  ａｑの混合溶液で洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（１００．０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１００：１：０．１−１０：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９０３（９８．４０ｍｇ，９０％）を得た。
【００４１】
ＥＭ９０３；
Ｒｆ＝０．４３（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１０：１：０．２）
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：６９０．４４３１［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３５Ｈ６４ＮＯ１２：６９０．４４２９［Ｍ＋Ｈ］
【００４２】
ＥＭ９０３（２４．２０ｍｇ，０．０３５０ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ溶液（７．０００ｍＬ）にＡｒ雰囲気下ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（６１．００μＬ，０．３５００ｍｍｏｌ）、ビス（２−ブロモエチル）エーテル（４４．００μＬ，０．３５００ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で２０時間攪拌した。攪拌後ｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（６１．００μＬ，０．３５００ｍｍｏｌ）、ビス（２−ブロモエチル）エーテル（４４．００μＬ，０．３５００ｍｍｏｌ）を追加し、８０℃で６時間攪拌した。攪拌後飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（７．０００ｍＬ）を加え、ＣＨＣｌ３で抽出、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（３６．５０ｍｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１００：１：０．１−３０：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９１４（２３．６０ｍｇ，８９％）を得た。
【００４３】
ＥＭ９１４；
Ｒｆ＝０．４４（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝３０：１：０．２）
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：７６０．４８８５［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３９Ｈ７０ＮＯ１３：７６０．４８４７［Ｍ＋Ｈ］
【００４４】
［比較合成例２］  デ（３’−Ｎ−メチル）−３’−Ｎ−（ｐ−クロロベンジル）−デ（３−Ｏ−クラジノシル）−９−ジヒドロ−３−ケト−シュードエリスロマイシンＡ  ６，９−エポキシド  １２，１３−カーボネート（ＥＭ９３９）の合成
ＥＭ９３９は、合成例１で製造したＥＭ９００を原料とし、特許文献３に記載の方法で合成した。詳細は以下の通りである。
【００４５】
【化４】
2016169178.tif 000005
【００４６】
ＥＭ９００（５．００４ｇ，６．９７５ｍｍｏｌ）のＥｔＯＡｃ溶液（６９．８０ｍＬ）にＮａＨＣＯ３（８．７９０ｇ，１０４．６ｍｍｏｌ）を加え、ＣｂｚＣｌ（ベンジルオキシカルボニルクロライド：１４．９３ｍＬ，１０４．６ｍｍｏｌ）を滴下し、７０℃まで昇温し２時間攪拌した。攪拌後、Ｅｔ３Ｎを加え室温まで戻した。反応液からＥｔＯＡｃで抽出、ｂｒｉｎｅで洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物７．０００ｇを得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝５０：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９３０（６．３６５ｇ，９４％）を得た。
【００４７】
ＥＭ９３０；
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：９９４．５１７０［Ｍ＋Ｎａ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ５２Ｈ７７ＮＯ１６Ｎａ：９９４．５１４０［Ｍ＋Ｎａ］
【００４８】
ＥＭ９３０（５．０８１ｇ，５．２３０ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ溶液（１０４．６ｍＬ）に１．０Ｎ  ＨＣｌ  ａｑ（５２．３０ｍＬ）を加え４時間攪拌した。攪拌後飽和ＮａＨＣＯ３溶液（４００．０ｍＬ）を加え、ＣＨＣｌ３で抽出、ｂｒｉｎｅで洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（４．３１２ｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝５０：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９３１（４．０２８ｇ，９５％）を得た。
【００４９】
ＥＭ９３１；
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：８１４．４３８４［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４４Ｈ６４ＮＯ１３：８１４．４３７８［Ｍ＋Ｈ］
【００５０】
ＥＭ９３１（２．０２７ｇ，２．４９２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（４９．８０ｍＬ）をＮ２雰囲気下−７８℃まで冷却し、ピリジン（２．４２０ｍＬ，２９．９０ｍｍｏｌ）を加え、トリホスゲン（１．４７９ｇ，４．９８４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（９９．７０ｍＬ）を滴下し、−７８℃から室温まで昇温し０．５時間攪拌した。攪拌後飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液（４００．０ｍＬ）を加え、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（１．９００ｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１００：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９３６（１．８８２ｇ，９０％）を得た。
【００５１】
ＥＭ９３６；
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：８６２．４０００［Ｍ＋Ｎａ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４５Ｈ６１ＮＯ１４Ｎａ：８６２．３９９０［Ｍ＋Ｎａ］
【００５２】
ＥＭ９３６（１．７１８ｇ，２．０４７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２溶液（４０．８０ｍＬ）にＮ２雰囲気下Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ  ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ（４．３４３ｇ，１０．２４ｍｍｏｌ）を加え、１．５時間攪拌した。攪拌後飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（３００．０ｍＬ）を加え、ＣＨＣｌ３で抽出、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液、飽和ＮａＨＣＯ３溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（１．７００ｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝５０：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９３７（１．６６８ｇ，９７％）を得た。
【００５３】
ＥＭ９３７；
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：８３８６．４０１２［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ４５Ｈ６０ＮＯ１４：８３８．４０１４［Ｍ＋Ｈ］
【００５４】
ＥＭ９３７（１．４６１ｇ，１．７４５ｍｍｏｌ）にＮ２雰囲気下Ｐｄ（ＯＨ）２（２９２．２ｍｇ）、ＥｔＯＨ（３４．９０ｍＬ）を加え、Ｈ２雰囲気下室温で３時間攪拌した。攪拌後Ｎ２雰囲気下Ｐｄ（ＯＨ）２（２９２．２ｍｇ）を追加しＨ２雰囲気下室温で２．５時間攪拌した。さらに攪拌後Ｎ２雰囲気下Ｐｄ（ＯＨ）２（１４６．１ｍｇ）を追加しＨ２雰囲気下室温で１時間攪拌した。ろ過、濃縮し粗生成物（１．３０２ｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝５０：１：０．１−３０：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９３８（９６７．３ｍｇ，９７％）を得た。
【００５５】
ＥＭ９３８；
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：５７０．３３０７［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ２９Ｈ４８ＮＯ１０：５７０．３２７８［Ｍ＋Ｈ］
【００５６】
ＥＭ９３８（３０３．４ｍｇ，０．５３３ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３溶液（５．３３０ｍＬ）にｉ−Ｐｒ２ＮＥｔ（９２８．４μＬ，５．３３０ｍｍｏｌ）、ｐ−ＣｌＢｎＢｒ（１．０９５ｇ，５．３３０ｍｍｏｌ）を加え、Ｎ２雰囲気下、室温で２時間攪拌した。攪拌後飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液（５０．００ｍＬ）を加え、ＣＨＣｌ３で抽出、飽和Ｎａ２Ｓ２Ｏ３溶液、飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液、ｂｒｉｎｅで洗浄後、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥後ろ過し、濃縮して粗生成物（３５０．１ｍｇ）を得た。得られた粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ：ＮＨ４ＯＨ  ａｑ＝１００：１：０．１）で分離精製して、白色粉末ＥＭ９３９（３４２．５ｍｇ，９３％）を得た。
【００５７】
ＥＭ９３９；
ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ：６９４．３３５３［Ｍ＋Ｈ］＋，Ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  Ｃ３６Ｈ５３ＮＯ１０Ｃｌ：６９４．３３５８［Ｍ＋Ｈ］
【００５８】
［実施例１］
ヒトの鼻茸から分離培養した線維芽細胞の細胞増殖に対する、ＥＭ９００及びＥＭ９０５の影響を調べた。線維芽細胞は一定のＡＴＰを有しており、ＡＴＰ量から線維芽細胞の数（すなわち、細胞野増殖性）を評価した。
【００５９】
＜線維芽細胞の調製＞
線維芽細胞は手術時に摘出した鼻茸から分離培養した。鼻茸を１ｍｍ３以下に切り、ＰＢＳ（リン酸生理食塩水）にて１回、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン（１００  Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、アンホテリシンＢ（２．５ｍｇ／ｍＬ）添加Ｄｕｌｂｅｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ’ＭＥＭ）（ＳＩＧＭＡ社製）培養液にて２回洗浄した後、数切片をビ−カ−に入れ、０．１％のコラゲナ−ゼｔｙｐｅ２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）入りＨａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（ＧＩＢＣＯ社製）３０ｍＬでスタ−ラ−を使用して３時間撹拌した。次いで、遠心器（３０００ｒｐｍ、５分間）で分離して遠枕させた細胞に、培養液を１０ｍＬ加え浮遊させた。同様の操作を４回繰り返し、７５ｃｍ２のフラスコ（ＩＷＡＫＩ社製）で、３７℃、５容量％ＣＯ２下、細胞培養を開始した。数週間培養した後に、７５ｃｍ２のフラスコは線維芽細胞でほぼ満ちた。その後トリプシン処理で継代を変え、実験には第３継代の線維芽細胞を使用した。
【００６０】
＜細胞増殖活性の測定＞
２４穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、線維芽細胞を５×１０４個／ｍＬの濃度で培養液１ｍＬを入れ、３７℃、５容量％ＣＯ２下、２４時間培養した（ｎ＝４）。培養後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた各薬物［ＥＭ９００、ＥＭ９０５、ＥＭ９１４、ＥＭ９３９、ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（ＣＡＭ）、ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（ＥＭ）、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（ＡＭＰＣ）］を、最終濃度が各濃度（２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ）になるように培養液に添加した。コントロ−ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）には、ＤＭＳＯのみを一定量培養液に添加した。４８時間培養した後に、各ウェルの細胞に対してＡＴＰｌｉｔｅ  Ａｓｓａｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を行い、ＡＴＰ量から線維芽細胞の細胞数の変化を評価した。各ウェルのＡＴＰ量は、１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓの多重比較検定を行った。
【００６１】
コントロ−ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）の細胞数（ＡＴＰ量）を１００％とし、各薬物処理群の相対細胞数（％）の算出結果を図１に示す。図１（ａ）は薬物濃度２５μＭのときの結果を、図１（ｂ）は薬物濃度５０μＭのときの結果を、図１（ｃ）は薬物濃度１００μＭのときの結果を、それぞれ示す。各薬物２５μＭの濃度では、ＥＭ９０５はｖｅｈｉｃｌｅと比較して有意にＡＴＰ量 (線維芽細胞数) の低下を認めた（ｐ＜０．０００１）が、ほかの薬物（ＥＭ９００、ＥＭ９１４、ＥＭ９３９、ＣＡＭ、ＥＭ、ＡＭＰＣ）ではＡＴＰ量は低下しなかった（図１（ａ））。各薬物５０μＭの濃度では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較してＥＭ９００（ｐ＜０．０１）とＥＭ９０５（ｐ＜０．０００１）では有意にＡＴＰ量の低下を認めた（図１（ｂ））。各薬物１００μＭの濃度では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較してＥＭ９００（ｐ＜０．０００１）、ＥＭ９０５（ｐ＜０．０００１）、及びＣＡＭ（ｐ＜０．０５）は、有意にＡＴＰ量の低下を認めた（図１（ｃ））。すなわち、ＥＭ９００とＥＭ９０５は、公知のマクロライド系抗生物質ＣＡＭよりも細胞増殖抑制作用が強いことが確認された。
【００６２】
［実施例２］
実施例１と同様にして調製したヒト鼻茸由来線維芽細胞のアポトーシスに対する、ＥＭ９００及びＥＭ９０５の影響を調べた。
【００６３】
２４穴プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製）の各ウェルに、線維芽細胞を５×１０４個／ｍＬの濃度で培養液１ｍＬを入れ、３７℃、５容量％ＣＯ２下、２４時間培養した（ｎ＝４）。培養後、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解させた各薬物［ＥＭ９００、ＥＭ９０５、ＥＭ９１４、ＥＭ９３９、ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（ＣＡＭ）、ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ（ＥＭ）、ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ（ＡＭＰＣ）］を、最終濃度が各濃度（２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ）になるように培養液に添加した。コントロ−ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）には、ＤＭＳＯのみを一定量培養液に添加した。４８時間培養した後に、各ウェルの細胞に対してＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を行い、線維芽細胞のＣａｓｐａｓｅ−３／７活性を評価した。各ウェルのＣａｓｐａｓｅ活性値は、１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの分散分析の後、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓの多重比較検定を行った。
【００６４】
コントロ−ル（ｖｅｈｉｃｌｅ）のＣａｓｐａｓｅ活性値を１００％とし、各薬物処理群の相対Ｃａｓｐａｓｅ活性値（％）の算出結果を図２に示す。図２（ａ）は薬物濃度２５μＭのときの結果を、図２（ｂ）は薬物濃度５０μＭのときの結果を、図２（ｃ）は薬物濃度１００μＭのときの結果を、それぞれ示す。各薬物２５μＭの濃度では、ＥＭ９０５はｖｅｈｉｃｌｅと比較して有意にＣａｓｐａｓｅ−３／７活性の上昇（アポト−シス誘導）を認めた （ｐ＜０．０００１）が、ほかの薬物（ＥＭ９００、ＥＭ９１４、ＥＭ９３９、ＣＡＭ、ＥＭ、ＡＭＰＣ）では誘導しなかった（図２（ａ））。各薬物５０μＭの濃度では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較してＥＭ９０５（ｐ＜０．０００１）では有意にＣａｓｐａｓｅ−３／７活性の上昇を認めた（図２（ｂ））。各薬物１００μＭの濃度では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較してＥＭ９００（ｐ＜０．００１）及びＥＭ９０５（ｐ＜０．０００１）は、有意にＣａｓｐａｓｅ−３／７活性の上昇の低下を認めた（図２（ｃ））。すなわち、ＥＭ９００とＥＭ９０５は、ヒト鼻茸由来線維芽細胞に対するアポトーシス誘導活性を有することが確認された。
【図１】
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【図２】
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