(57)【要約】      （修正有）【課題】シトシンヌクレオシドアナログ、その中間体、又はプロドラッグを従来の複数工程の合成を短くし、全収率を高め、副反応と副産物含有量を減らし、したがって、生成物の純度及び品質を改善することによって、抗癌性および／または抗ウイルス性の生成物として有用なヌクレオシドアナログの改善された代替的な合成方法の提供。【解決手段】ヌクレオシドホスホリラーゼ酵素、とりわけ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰｙＮＰｓ）、またはプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰｓ）とＰｙＮＰｓの混合物を使用するシトシンヌクレオシドアナログを合成する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのシトシンヌクレオシドアナログ、その中間物、またはプロドラッグを、化学酵素的または酵素的な合成によって産生するためのプロセスであって、
【化１】
2016198075.tif 000023
式中、
Ｚ１は、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり、
Ｚ２は、Ｚ１とは無関係に、Ｏ、Ｃ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）、Ｓ（ＲＳ５）、好ましくは、基ＳＯまたはＳＯ２；Ｎ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｎ（ＲＳ２）、Ｎ（ＲＳ５）であり、
ＲＳ１は、
【化２】
2016198075.tif 000024
から選択される、水素、ＯＨ、そのエーテルまたはエステルであり、
ｎは０または１であり、Ａは酸素または窒素であり、およびそれぞれのＭは、独立して、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＰに随意に結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＰに随意に結合した随意に置換された複素環、または限定されないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容可能な対イオンであり、
ＲＳ２は、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ハロゲン、Ｆ、ＣＮ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３であり、
ＲＳ３は、２’−デオキシリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドに由来するＮＡの場合において、水素であり、あるいは、ＮＡがリボヌクレオシドに由来するときに、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、Ｆ、ＯＣＨ３から選択され、
ＲＳ４は、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ＮＨ２、ハロゲン、Ｆ、ＣＮであり、但し、ＲＳ１およびＲＳ４の両方は、ＯＨ残基のエーテルまたはエステルであったときに異なることを前提とし、
ＲＳ５は、Ｚ２が酸素とは異なるときに、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ＮＨ２またはハロゲンであり、
Ｒ１は、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり、
Ｒ２は、水素、随意に置換されたＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり、
Ｒ３は、水素、随意に置換されたＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり；Ｒ３およびＲ２は、互いに独立しており；但し、少なくとも１つのＲ２またはＲ３が、水素とは異なることを前提とし、
Ｒ４は、水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン；随意に置換されたアルキル鎖；随意に置換されたアルケニル鎖；随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＹに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＹに結合した随意に置換された複素環、および独立して、
【化３】
2016198075.tif 000025
から選択される、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５の任意の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
但し、Ｙが炭素または硫黄の原子であることを前提とし、あるいはＹが窒素原子であることを前提に、Ｒ４は欠けており、
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり、
Ｒ５は、水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７；ＣＨ２−複素環、ＣＮ；
および独立して、
【化４】
2016198075.tif 000026
から選択される、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５の任意の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり、
Ｒ６およびＲ７は、互いに無関係に、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、複素環、または随意に置換されたアリールであり、
Ｒ８は、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアリール、随意に置換された複素環であり、
Ｙは、Ｃ、Ｎ、Ｓであり、
ここで、シトシンヌクレオシドアナログを産生するプロセスは、
（ｉ）置換基Ｒ２およびＲ３として記載される適切な置換基を組み込むために、Ｙ１、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７が上で定義される通りである式ＩＩのシトシン核酸塩基の前駆体を、Ｎ４位置のアミノ基を修飾するための適切な試薬と化学反応させる工程であって、形成される修飾されたシトシン核酸塩基が従来の精製方法によって随意に精製されるか、あるいは、代替的に、該プロセスが式ＩＩの核酸塩基によって表わされる出発生成物から直接始まる、工程：
【化５】
2016198075.tif 000027
（ｉｉ）式ＩＩの前記修飾されたシトシン核酸塩基を、式ＩＩＩの適切なヌクレオシドアナログ基質と生体触媒によって反応させる工程であって、
【化６】
2016198075.tif 000028
式中、
Ｚ１、Ｚ２、ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３、ＲＳ４、ＲＳ５は上の通りに定義され、塩基はウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ヒポキサンチン、キサンチン、チオウラシル、チオグアニン、９−Ｈ−プリン−２−アミン、７−メチルグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシンおよび５−ヒドロキシメチルシトシン、プテリドン、ならびに、これらの任意の置換された誘導体から選択され、
工程ｉｉ）で行われる反応は、適切な反応水性媒体中で、および適切な反応条件下で、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素、又はその組み合わせのいずれかであるヌクレオシドホスホリラーゼ酵素を、式ＩＩのシトシン核酸塩基および式ＩＩＩのヌクレオシドアナログを含む出発物質の混合物に加えることを含む、工程、
（ｉｉｉ）従来の精製方法によってさらに精製された、式Ｉのシトシンヌクレオシドアナログで遊離した一級アミノＮ４を回収するために、シトシンヌクレオシドアナログにおけるＮ４位置でアミノ基を随意に脱保護する工程、
を含む、プロセス。
【請求項２】
ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素によって変換される式ＩＩのシトシン核酸塩基は以下から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【化７】
2016198075.tif 000029
【請求項３】
ヌクレオシドアナログ、その中間物、またはプロドラッグは、カペシタビン、デシタビン、５−アザシチジン、シタラビン、エノシタビン、ゲムシタビン、ザルシタビン、イバシタビン、サパシタビン、２’−Ｃ−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシルシトシン、ガロシタビン、バロプリシタビン、２’−デオキシ−４’−チオシチジン、チアラビン、２’−デオキシ−４’−チオ−５−アザシチジン、およびアプリシタビンから選択される、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
天然のヌクレオシドホスホリラーゼおよびその突然変異または変異の源、あるいは、組み換えヌクレオシドホスホリラーゼの源は、中温性、好熱性、または超好熱性の生物である、請求項１乃至３のいずれかに記載のプロセス。
【請求項５】
天然のヌクレオシドホスホリラーゼおよびその突然変異または変異の源、あるいは、組み換えヌクレオシドホスホリラーゼの源は、古細菌または細菌から選択される、請求項１乃至４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６】
ヌクレオシドホスホリラーゼ酵素は、スルホロブス・ソルファタリカスおよびアエロパイラム・ペルニクスから選択された古細菌から単離される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
ヌクレオシドホスホリラーゼ酵素またはその機能的な部分は、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１、あるいは
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１の補体であるヌクレオチド配列、あるいは、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１で変性したヌクレオチド配列、あるいは、
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１の補体に、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいは、これらの補体に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは、
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは、
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１と少なくとも５９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは、
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、４、６、８、１０、または１２から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列、
から選択されるヌクレオチド配列によってコード化される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
産生されるヌクレオシドアナログはカペシタビンであり、出発物質として用いられるリボヌクレオシドは、５’−デオキシウリジン、５’−デオキシ−５−メチルウリジン、または５’−デオキシ−５−クロロウリジンから選択され、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素によって変換される出発物質としても用いられる核酸塩基は、ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートである、請求項３に記載のプロセス。
【請求項９】
産生されるヌクレオシドアナログはシタラビンであり、出発物質として用いられるリボヌクレオシドは、９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシルであり、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素によって変換される出発物質としても用いられる核酸塩基は、Ｎ−（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ペンタンアミドである、請求項３に記載のプロセス。
【請求項１０】
天然および突然変異または変異の、あるいは、組み換え酵素の、中温性、好熱性、または超好熱性のヌクレオシドホスホリラーゼ酵素またはその機能的な部分；あるいは、適切な宿主内でヌクレオシドホスホリラーゼの発現または過剰発現を配向する１つ以上の制御配列に動作可能に結合した、天然または組み換えの、中温性、好熱性、または超好熱性のヌクレオシドホスホリラーゼまたはその機能的な部分をコード化する配列を含む組み換え発現ベクター；あるいは、抗癌薬または抗ウイルス薬として有用なシトシンヌクレオシドアナログ、その中間物、またはプロドラッグの産生において、微生物または微生物を含む宿主細胞の使用。
【請求項１１】
中温性、好熱性、または超好熱性のヌクレオシドホスホリラーゼ酵素またはその機能的部分は、
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１、あるいは
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１の補体であるヌクレオチド配列、あるいは、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１で変性したヌクレオチド配列、あるいは、
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１の補体に、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいは、これらの補体に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは、
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは、
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１と少なくとも５９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは、
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、４、６、８、１０、または１２から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列、
から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
シトシンヌクレオシドアナログ、その中間物、またはプロドラッグは、カペシタビン、デシタビン、５−アザシチジン、シタラビン、エノシタビン、ゲムシタビン、ザルシタビン、イバシタビン、サパシタビン、２’−Ｃ−シアノ−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシルシトシン、ガロシタビン、バロプリシタビン、２’−デオキシ−４’−チオシチジン、チアラビン、２’−デオキシ−４’−チオ−５−アザシチジン、およびアプリシタビンから選択される、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
産生されるシトシンヌクレオシドアナログ、その中間物、またはプロドラッグはカペシタビンである、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
産生されるシトシンヌクレオシドアナログ、その中間物、またはプロドラッグはシタラビンである、請求項１２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトシンヌクレオシドアナログ（ＮＡ）の産生、とりわけ、薬学的に関連する抗ウイルス薬や抗癌薬として活性なシトシンＮＡ、その中間物、またはプロドラッグの工業生産の新しい酵素プロセスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヌクレオシドアナログ（ＮＡ）は天然のヌクレオシドと構造的に関連する合成化合物である。こうした構造に関して、ヌクレオシドは３つの重要な要素によって構成されている：（ｉ）ヒドロキシメチル基、（ｉｉ）複素環の窒素塩基部分、および（ｉｉｉ）いくつかの例でヒドロキシメチル基と塩基を正確な方位に示すスペーサとして機能するように思われているフラノース環。
【０００３】
ＮＡは様々に修飾された炭水化物および／またはアグリコンフラグメントを示すことから、大きな構造的多様性を特徴とする。
【０００４】
ＮＡは、抗ウイルス剤や抗癌剤として広く使用されている。これらの分子は、自然発生するヌクレオシドの修飾を可能にするために、複素環塩基および／またはペントース部分上での保護−脱保護反応を含む時間を浪費する複数工程のプロセスを必要とすることが多い様々な化学的方法によって従来は合成されてきた（非特許文献１）。この時間のかかる複数工程のプロセスでは、収率が低くコストがかさむことが多い。実際に、化学的方法では通常、立体正確性と位置正確性の正確な生成物を得ることは困難であり、不純物として副産物が生成される（非特許文献２、非特許文献３）。さらに、化学的方法は、高価で環境に有害な化学試薬や有機溶媒の使用を含んでいる。
【０００５】
ヌクレオシドの酵素的合成は、複素環塩基および糖の縮合を触媒する酵素の使用を含んでおり、それによりグリコシド結合を形成する。一般論として、ヌクレオシドアナログは、２つの異なる種類の酵素：ヌクレオシドホスホリラーゼ（ＮＰまたはＮＰ）とＮ−２’−デオキシリボシルランスフェラーゼ（ＮＤＴまたはＮＤＴ）を使用する塩基交換（トランスグリコシル化（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｉｏｎ）反応）によって調製することができる。ＮＰは、ペントフラノースドナーと核酸塩基受容体についての基質特異性に従って、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．１）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．２）、ウリジンヌクレオシドホスホリラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．３）、およびチミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．４）を含む。しかしながら、シトシンおよびそのヌクレオシド（シチジン、２’−デオキシシチジン）または修飾されたシトシンアナログまたは誘導体およびその対応するヌクレオシドは、これらのＮＰ酵素の基質ではない（非特許文献４）。
【０００６】
逆に、Ｎ−２’−デオキシリボシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．２．６．）は、２−デオキシリボフラノースリン酸塩の中間物を形成することなく、ヌクレオシドと受容体塩基との間でデオキシリボフラノシル部分の直接転移を触媒する。ＮＤＴ基質特異性は、修飾されたプリンに関する広範な耐性や、２−デオキシリボフラノースおよび２，３−ジデオキシリボフラノースの残基の受容体としてのシトシンの優れた基質活性よりも、２−デオキシリボフラノース部分に対する厳密な特異性を含んでいる（非特許文献４）。Ｆｒｅｓｃｏ−Ｔａｂｏａｄａら（非特許文献５）は、シトシンがあらゆる場合で２’−デオキシリボフラノース部分の最良の受容体であることを開示している。
【０００７】
したがって、ＮＰまたはＮＤＴの選択は、受容体塩基およびドナーヌクレオシドの構造に依存する。ＮＰおよびＮＤＴは互いに補完し合い、天然のヌクレオシドとその修飾されたアナログの生体触媒による生成を可能にし、そのほとんどが多くの抗癌薬や抗ウイルス薬の産生に役立つ。
【０００８】
しかしながら、ＮＰまたはＮＤＴのいずれによってもシトシンリボヌクレオシドの産生は可能ではない。というのも、シトシンはＮＰ向けの受容体塩基ではなく、同時に、リボフラノースヌクレオシドドナーはＮＤＴ向けの基質ではないからである。したがって、上記の言及された基質の特異性のためだけではなく、生体触媒調製中に通常存在するシトシンおよびシチジンデアミナーゼ、またはシトシンおよびシチジンデアセチラーゼなどの特定の酵素が基質または最終生成物を分解して、工業目的には非生産的な方法を提供することから、シトシンヌクレオシドアナログの産生は依然として難題である。
【０００９】
Ａｒａｋｉら（特許文献１、特許文献２）は、シトシンに反応するヌクレオシドホスホリラーゼ、または前記酵素活性を有する細菌を使用して、ペントース−１−リン酸塩およびシトシンまたはその誘導体からシトシンヌクレオシド化合物を作る方法を開示した。特に、発明者らは、ピリジン塩基の代わりに基質としてブリン塩基を含む反応をそれ自体で触媒する、エシェリキア属に属する細菌からのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）が、シトシンとペントース−１−リン酸塩からシトシンヌクレオシドの産生を触媒することができることを発見した。しかしながら、開示された酵素活性を有する細菌の存在下でのペントース−１−リン酸塩によるシトシンまたはその誘導体の反応は、ほとんどシトシンまたはその誘導体の脱アミノ化した生成物のみを生成することが分かり、したがって、所望のシトシンヌクレオシド化合物の効率的な蓄積には失敗した。脱アミノ化したシトシン副産物の産生を最小限に抑えるために、言及された特許は、有機溶媒に酵素調製物を接触させて、有効な時間にわたって６０ーＣ乃至９０ーＣの温度で酵素調製物を加熱することによって、基質または最終生成物を分解するデアミナーゼ活性を特異的に減少させるための方法を開示した。
【００１０】
Ａｒａｋｉら（特許文献３）は、大腸菌などの微生物に由来するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）として知られている酵素（シトシンヌクレオシド・ホスホリラーゼ活性も有している酵素）を用いるピリミジン塩基誘導体を使用して、ピリミジンヌクレオシド化合物と新しいピリミジンヌクレオシド化合物を生成する方法を開示した。著者らは、微生物の細菌細胞または処理された酵素を加熱するか、あるいは適切な有機溶媒に接触させて置くことによって、特定の脱アセチル非活性化を克服する。
【００１１】
同じ著者らは、シトシンデアミナーゼ遺伝子とシチジンデアミナーゼ遺伝子の両方を欠いた微生物を作製することによって（特許文献４）、または亜鉛塩によって（特許文献５）、複雑なデアミナーゼ非活性化処置を施すことなく上で言及した化合物を製作するいくつかの方法を開示した。
【００１２】
非特許文献６は、多くのタイプのヌクレオシドの合成を開示した。しかしながら、その開示はシトシンまたはアラビノシドのヌクレオシドを作製することに失敗し、したがって、この特定のタイプのヌクレオシドの合成にＮＰを使用することからはほど遠いものである。
【００１３】
非特許文献７は、基質としてのシチジンについては、ＧｔＰｙＮＰ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓからのＮＰ）の加リン酸分解活性は何も測定されず、ＴｔＰｙＮＰ（サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＭＰ）のごく貧弱な活性しか測定されず（ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ，  ｐ．８４）、シチジンは、ＰＮＰとＡｐＭＴＡＰ（５’−Ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ，ｖｉｄｅ  ｓｕｐｒａ，  ｐ．１１６）によって基質としてかすかに認められるだけであった。
【００１４】
したがって、シトシンヌクレオシドアナログの生体触媒合成は困難なままであり、工業規模でのこの応用は、上に説明したように、生体触媒調製中に存在する競争的な酵素による生成物の分解によって限定される。
【００１５】
抗ウイルス剤または抗癌剤として作用するいくつかの非天然ヌクレオシドが核酸塩基部分としてシトシンを含んでいるため、前記の欠点を克服し、新しいタイプのシトシンヌクレオシドアナログの合成を改善する新規かつ有効な工業用の酵素プロセスの開発を探ることは興味深い。
【００１６】
シトシンＮＡ化学構造を有する周知の抗癌剤であるカペシタビンは、このＮＡの複数の工程の化学合成に関して先行技術で記載された複数のプロセスに従って以前作成されていた（特許文献６、特許文献７）。
【００１７】
上記のプロセスには、特定の欠点：使用される有毒な溶媒または試薬、大規模な生産に適していないクロマトグラフィー精製工程の必要性、グリコシドサブユニット上のヒドロキシル基の保護および脱保護段階を含む複数工程の複雑なプロセス、およびカペシタビン合成の低〜中程度の全収率がある。保護と脱保護の配列はこれらのすべてのプロセスで２つの余計な工程を加え、全収率を低下させ、商業生産の視点から見てプロセスにかかる時間とコストを増加させる。
【００１８】
特許文献８において、カペシタビンを調製するための１工程のプロセスが開示されている。該プロセスは、あらかじめ形成されたヌクレオシド５−フルオロ−５’−デオキシシチジンのヒドロキシル基の従来の保護を必要としないペンチルオキシカルボニル化（ｐｅｎｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ）試薬との５−フルオロ−５’−デオキシシチジンの反応に基づいている。反応は有機溶媒中で起こり、化学触媒（ＨＣｌガスとしての塩基または腐食性鉱酸など）、高温（最大で１１０°Ｃまでの溶剤の還流）、および長い反応時間（通常９〜１０時間）を使用し、中程度の収率（５０〜６７％）のカペシタビンをもたらす。
【００１９】
発明者らは、カペシタビンが高温で熱不安定性に陥り、中性のｐＨで１０時間、９０°Ｃで生成物を加熱した後、生成物の４０％以内が失われることを実証した。したがって、特許文献８に記載されたプロセスは最終生成物の重要な損失に見舞われる。
【００２０】
これに反して、本発明の酵素プロセスは、溶剤として水を用いてより穏やかな条件下で行われ、７０％以上の収集率をもたらす。
【００２１】
Ｋａｎａｎら（特許文献９）は、有機溶媒の存在下で触媒として（ＣＡＬＢ）Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｔｉｃａからのリパーゼアクリル樹脂）を用いるプロセスを開示している。こうしたプロセスは、カペシタビンを供給するために少なくとも４つの工程を必要とする。
【００２２】
ゆえに、癌の処置で先行技術に関連付けられる上記の不都合な点やカペシタビンの重要性に従って、複数の工程を含まず、比較的安い試薬を使用し、高収率で高純度のヌクレオシドアナログ生成物をもたらす、この有効な主成分（Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）（ＡＰＩ）の調製のための改善されたプロセスを進行する大きな必要性がある。
【００２３】
同じことがシタラビン合成で生じる。シタラビンは、カペシタビンとしてシトシンＮＡ化学構造を共有するもう１つの周知の抗癌剤である。Ｍｅｒｃｋの名で初期の特許（１９６４年の特許文献１０、または、非特許文献８という名で）があり、これらは、前述の活性化合物の化学合成について記載しており、カペシタビンに関して記述された同じ欠点が等しく言及されているかもしれない。
【００２４】
驚いたことに、先に引用した生体触媒合成の欠点を回避することができ、シトシンＮＡを７０％以上の変換および９５％以上のアノマー純度で得ることができることが分かった。それは、ヌクレオシドホスホリラーゼ（ＮＰ）、つまり、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、またはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰｙＮＰ）のいずれか、あるいは、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰｙＮＰ）とプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）の酵素の混合物の使用に基づいて、適切な酵素方法を適用することによって可能である。言及された酵素は、驚くことに、適切な化学修飾されたシトシンを認識することができ、脱アミノ化または脱アセチル化の不純物の任意の証拠なく、ドナーヌクレオシドアナログ上でトランスグリコシル化反応を行うことができる。発明者らは、同じ生体触媒反応であるがヌクレオシド受容体として非修飾シトシンを用いる反応では期待された最終生成物がもたらされないことを実証した。本明細書上、本発明のプロセスで使用される好ましい酵素は、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼである。本発明の別の好ましい実施形態は、とりわけ、開始化合物として、プリンヌクレオシド、あるいはその誘導体またはアナログが使用される際の、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰｙＮＰ）とプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）の酵素の混合物の使用である。
【００２５】
一例として、シトシンＮＡとしてカペシタビンまたはシタラビンの産生に適用される本発明のプロセスは、こうしたＮＡの化学合成に関して、および、以下のようなＣＡＬＢ  Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  ４３５を用いる酵素的合成に関して、先行技術で使用されるプロセスを上回る複数の利点を有する。
（ｉ）工程の減少数
（ｉｉ）高い変換率および収率
（ｉｉｉ）砂糖中のヒドロキシル基の保護／脱保護戦略はまったく必要とされない
（ｉｖ）穏やかな反応条件：環境に優しい技術（水または水性媒体、中性のｐＨ）
（ｖ）酵素の工程中の有機溶媒の回避
（ｖｉ）非常に優れた選択性：立体選択性−エナンチオ選択性、ケモ位置選択性
（ｖｉｉ）副反応なし：不純物プロファイル（副産物含有量の減少）
（ｖｉｉｉ）全体的な廃棄物生成の減少
（ｉｘ）プロセスの生産性
（ｘ）生成の全体的なコストの低下
【００２６】
さらに、先行技術で使用される化学プロセスを上回る本発明の生体触媒プロセスの別のさらなる利点がある。とりわけ、ピリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、メタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）として、ＡｒａｓａｋｉらやＫａｍｉｙａらの化学プロセスで、あるいはＫａｎｎａｎら（ピリジン、ジクロロメタン（ＤＣＭ）など）の酵素プロセスで使用される有機溶媒の発明のプロセスにおける不在が関連している。
【００２７】
とりわけ、塩化第２スズなどの金属触媒、シリル化（ｓｙｌｉｌａｔｉｎｇ）剤などの有毒な試薬の発明のプロセスでの不在が関連している。こうしたプロセスの有機溶媒や試薬はすべて、環境に廃棄物を放出する前に、除去または破壊されなければならない。本発明の手順に関して先行技術に記載されるプロセスのさらに不便な点は、先行技術に記載されているプロセスが本発明のより単純な酵素のプロセスに対して保護および脱保護工程を含む複数工程の手順を含んでいる限り、その複雑さにある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２８】
【特許文献１】ＥＰ１２５４９５９
【特許文献２】ＵＳ７６２９４５７
【特許文献３】ＵＳ２００５／００７４８５７
【特許文献４】ＪＰ２００４３４４０２９
【特許文献５】ＪＰ２００４０２４０８６
【特許文献６】ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎａｔｏｒｓ  ａｔ  Ｆ．  Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ  ＡＧ，  Ａｒａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＰ０６０２４５４
【特許文献７】Ｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＰ０６０２４７８
【特許文献８】ＷＯ２０１１／１０４５４０
【特許文献９】ＷＯ  ２０１０／０６１４０２
【特許文献１０】ＮＬ６５１１４２０
【非特許文献】
【００２９】
【非特許文献１】Ｂｏｒｙｓｋｉ  Ｊ．  ２００８．  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  １２：３０９−３２５
【非特許文献２】Ｃｏｎｄｅｚｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００７．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  ｐ．  ４０１−４２３．  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ，  Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ，  Ｉ．  Ａ．  ２００７
【非特許文献３】Ｓｉｎｉｓｔｅｒｒａ，  Ｊ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  Ｅｎｚｙｍｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  ｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  ｐ．  １−２５．  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ，  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，Ｅｄ．  Ｂｙ  Ｍ．  Ｃ．  Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ，  ２０１０
【非特許文献４】Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ，  Ｉ．  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０．  Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ａｃｔａ  Ｎａｔｕｒａｅ，  ２（５），  ３６−５８
【非特許文献５】Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｏｎ  ＮＤＴｓ：  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  ｆｏｒ  ｏｎｅ−ｐｏｔ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２０１３，  ９７，  ３７７３−３７８５
【非特許文献６】Ｄｉｎｇ  Ｑ．  ２０１０．  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｂｙ  ｍｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．  Ｊ．  Ｚｈｅｉｊｉａｎｇ  Ｕｎｉｖ−Ｓｃｉ  Ｂ  （Ｂｉｏｍｅｄ  ＆  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）  １１  （１１）：  ８８０−８８８
【非特許文献７】Ｓｚｅｋｅｒ，  Ｋ．  ２０１２．  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ，  Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｇｅｒｍａｎｙ
【非特許文献８】Ｓａｌｔ  ｌａｋｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  （１９６９）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
ＰｙＮＰまたはＰｙＮＰ／ＰＮＰの酵素を用いる本明細書に記載される本発明のプロセスは、以下のように概説される：
【００３１】
【化１】
2016198075.tif 000002
【００３２】
出願人たちは、驚くことに、適切なＮ４修飾されたシトシンまたはＮ４修飾されたシトシン誘導体が、高い変換率（７０％以上）でシトシンヌクレオシドアナログの調製／産生を可能にし、ヌクレオシドホスホリラーゼ（細菌または古細菌からの天然の、組み換えの、または変異したタンパク質のいずれか）を用いることによって、とりわけ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ（細菌または古細菌からの天然の、組み換えの、または変異したタンパク質のいずれか）を用いることによって、先に引用した先行技術で報告される脱アミノ化または脱アセチル化といった副作用を完全に回避することを実証した。
【００３３】
この位置での、またはシトシンの化学的なバックボーン中の他の位置での化学修飾／置換／保護がヌクレオシドホスホリラーゼに対する基質特異性を修飾することができたという事実を指すいかなる証拠も先行技術では発見されていない。本明細書上、Ｎ４修飾されたシトシン／シトシン誘導体はそれぞれ、Ｎ４置換されたシトシン／シトシン誘導体、またはＮ４保護されたシトシン／シトシン誘導体の同義語である。
【００３４】
本特許明細書上、シトシンまたはシトシン誘導体、ヌクレオシド、中間物、塩基、または核酸塩基との用語はすべてシトシンのバックボーンに由来する化合物として理解されなければならない。とりわけ、本発明のためのシトシンまたはシトシン誘導体として、式ＩＩによって表される。
【００３５】
【化２】
2016198075.tif 000003
【００３６】
本発明の目的である適切な化学修飾は、副作用に関連する不安定性さに係る問題を完全に回避する、ヌクレオシドアナログ合成のより便利で効率的で容易なプロセスを提供する。特に好ましいＮ４修飾は、カルバメート（−ＮＨＣＯＯ−）の形態でアミノ基の修飾を含んでおり、とりわけ、カルバメートは１〜４０の炭素原子のアルキル鎖、１〜４０の炭素原子のアルケニル鎖、または１〜４０の炭素原子のアルキニル鎖（鎖はそれぞれの場合で直鎖であり、分枝鎖であり、または他の官能基によって置換される）、アリール、および／または複素環に結合される。アミドまたは関連するアシル誘導体（−ＮＨＣＯ−）の形態のアミノ基のＮ４修飾により、特にアミド基が４〜４０の炭素原子のアルキル鎖、１〜４０の炭素原子のアルケニル鎖、または１〜４０の炭素原子のアルキニル鎖（鎖はそれぞれの場合で直鎖であり、分枝鎖であり、または他の官能基によって置換される）、アリール、および／または複素環に結合されるとき、同様にトランスグリコシル化反応が可能となる。驚くことに、長いアルキル鎖は、（１乃至３の炭素原子からの）短いアルキル鎖よりも好ましい。なぜなら、行われる実験にしたがって、脱アセチル化の副作用が、ＵＳ２００５／００７４８５７が教示する内容とは異なり、短いアルキル鎖で観察されるからである。本発明によれば、１つの炭素原子のアルキル基を有するアシル基は、脱アセチル化を防がない。
【００３７】
正確に言えば、化学修飾は、本記載にしたがって、Ｎ４（シトシン複素環内の位置４での窒素原子）でシトシンのバックボーンへと導入される。とりわけ、シトシン骨格内で操作された化学修飾は、式ＩＩのＲ２および／またはＲ３部分によって表される化学修飾であり、
【００３８】
【化３】
2016198075.tif 000004
ここで、
Ｒ１はＯ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり、
Ｒ２は水素、随意に置換されたＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルの鎖によってＮと結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮと結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり、
Ｒ３は水素、随意に置換されたＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルの鎖によってＮと結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮと結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６；ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり；Ｒ３およびＲ２は互いから独立したものであり、
ただし、少なくとも１つのＲ２またはＲ３が水素とは異なることを前提とし、
Ｒ４は水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン（好ましくはＦまたはＩ）；随意に置換されたアルキル鎖；随意に置換されたアルケニル鎖；随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル（ｔｒｉｈａｌｏａｌｋｙｌ）、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７、随意に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルの鎖によってＹに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニル、またはアルキニルの鎖によってＹに結合された随意に置換された複素環、および、独立して、以下から選択されたＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、またはＲ５の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
【００３９】
【化４】
2016198075.tif 000005
Ｙが炭素または硫黄の原子であることを前提とし、あるいは、Ｙが窒素原子であることを前提としてＲ４が欠けており、
ここで、
ＸはＯ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり、ＲＢ１はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり、ＲＢ２はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖Ｃ１−５アルキル、フェニルであり、
Ｒ５は水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン（好ましくはＦまたはＩ）、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７；ＣＨ２複素環、ＣＮ；および、独立して、以下から選択されたＲ２、Ｒ３、Ｒ４、またはＲ５の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
【００４０】
【化５】
2016198075.tif 000006
ここで、
ＸはＯ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり、ＲＢ１はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり、ＲＢ２はＨ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖Ｃ１−５アルキル、フェニルであり、
Ｒ６とＲ７は互いに無関係に、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、複素環、または随意に置換されたアリールであり、
Ｒ８は水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアリール、随意に置換された複素環であり、
ＹはＣ、Ｎ、Ｓである。
【００４１】
出願人によって実行され、本記載で示される比較例によって、Ｎ４で適切な修飾を含まないシトシン誘導体は、ヌクレオシドホスホリラーゼ（天然、組み換え型、または変異の酵素）を用いた、とりわけ、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを用いたトランスグリコシル化反応を受けず、したがって、所望のヌクレオシド最終生成物を提供しない。さらに、保護されていないシトシン（塩基または対応するヌクレオシドのいずれか）は、何人かの著者が、有機溶媒を加熱または使用し（特許文献１と特許文献３）、亜鉛塩を加え（特許文献５）、またはシトシンデアミナーゼ遺伝子およびシチジンデアミナーゼ遺伝子の両方を同時に欠いた微生物を用いるなどの洗練された方法を用いる（特許文献４）といった従来の方法で非活性化しようとしている副作用（脱アミノ化または脱アセチル化など）を受けた。先行技術に開示された上記の技術的解決法はすべて、対応する合成プロセスの全収率を劇的に低下させた。本発明は、本明細書に記載の合成プロセスの全収率を減少させた副作用に関する上記の技術的問題を完全にかつ決定的に解決するためのヌクレオシドアナログの合成方法を提供する。
【００４２】
得られた最終生成物のＮ４位置を修飾する／置換する／保護するために使用される官能基は、とりわけ、生成されるそれぞれの最終生成物の化学構造にしたがって、随意に取り除かれてもよい（最終生成物の脱保護）。しかしながら、カペシタビン分子のような特定の場合には、修飾が最終生成物（またはＡＰＩ）中のアミノ基に付いたままであるため、修飾された／置換された／保護されたシトシンＮ４基を脱保護する必要はない。カペシタビン自体については、本発明の酵素の方法は、従来の化学的生産工程が使用される場合にかかる時間を、かなりの程度短くする。
【００４３】
ゆえに、本発明は、従来の複数工程の合成を短くし、全収率を高め、副反応と副産物含有量を減らし、したがって、生成物の純度および品質を改善することによって、抗癌性および／または抗ウイルス性の生成物として有用なヌクレオシドアナログの改善された代替的な合成方法を提供する。
【００４４】
本記載上、以下の用語はさらに以下のように定義される。
【００４５】
「ヌクレオシド」との用語は、複素環塩基が糖に共有結合したすべての化合物を指し、ヌクレオシドの糖に対する特に好ましい結合は、複素環塩基中の炭素原子またはヘテロ原子（典型的には窒素）に対する、糖の炭素原子のＣ１’−（グリコシド）結合を含んでいる。したがって、本文脈では、「ヌクレオシド」の用語は、複素環塩基のグリコシドを意味する。同様に、「ヌクレオチド」との用語は、リン酸基が糖に結合したヌクレオシドを指す。
【００４６】
「ヌクレオシド」との用語は、自然発生しないヌクレオシド、自然発生するヌクレオシ、および他のヌクレオシドアナログを含むように広く使用されてもよい。ヌクレオシドの実例となる例は、デオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドとリボース部分も含むリボヌクレオシドである。こうしたヌクレオシドの塩基に関して、これは、任意の修飾された変異体または任意の起こり得る不自然な塩基と同様に、自然発生する塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルのいずれかであってもよいことが理解されよう。
【００４７】
本明細書で使用されるような「ヌクレオシドアナログ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ）」、「ヌクレオシドアナログ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇ）」、「ＮＡ」「ＮＡｓ」との用語は、糖が好ましくはリボフラノースまたはアラビノフラノースではなく、および／または、複素環塩基が自然発生する塩基（例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｉなど）でない、すべてのヌクレオシドを指す。
【００４８】
本明細書でさらに使用されているように、「糖」との用語はすべての炭水化物およびその誘導体を指し、特に企図される誘導体は、糖に欠失、置換、または、追加、あるいは糖の化学基または原子を含んでいる。例えば、特に企図される欠失は、２’−デオキシ、３’−デオキシ、５’−デオキシ、および／または２’，３’−ジデオキシ−糖を含んでいる。特に企図される置換は、環酸素の硫黄またはメチレンとの置換、またはヒドロキシル基のハロゲン、アジド、アミノ基、シアノ基、スルフヒドリル基−、またはメチル基との置換を含み、特に企図される追加は、メチレンホスホネート基を含んでいる。さらに企図される糖は、糖アナログ（すなわち、自然発生しない糖）、特に炭素環系をさらに含む。本明細書で使用されるような「炭素環系」との用語は、複数の炭素原子が環を形成する任意の分子を指し、特に企図される炭素環系では、環は３、４、５、または６つの炭素原子から形成される。
【００４９】
用語「化学酵素的（ｃｈｅｍｏ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ）な合成」は、化学的および生体触媒的工程の組み合わせを介した化合物の合成方法を指す。本発明の特定の目的のために、本発明の好ましい実施形態のうちの１つにおいて、反応段階の順序は以下のとおりでなければならない：１）シトシン塩基の化学修飾、２）ＮＰ酵素を使用する生体触媒によるトランスグリコシル化、３）最終生成物におけるシトシン−Ｎ４の随意のさらなる脱保護。
【００５０】
「酵素的合成」との用語は、適切な酵素（ＮＰ）によって行われる、生体触媒工程のみを含むプロセスによる化合物の合成の方法を指す。したがって、本明細書に記載の合成プロセスの他の好ましい実施形態は、すでに調製された、または市場で市販されている、一般的な式ＩＩによって表される先に言及されたもののようなシトシン誘導体、とりわけ、本発明に従って、シトシン複素環のＮ４位置でＲ２および／またはＲ３を示すようなシトシン誘導体から出発する完全な生体触媒プロセスであり、ゆえに、前述のシトシンバックボーンの化学修飾の工程１を省いている。
【００５１】
「複素環」または「複素環塩基」または「塩基」または、「核酸塩基」との用語は、本明細書では交換可能に用いられ、複数の原子が複数の共有結合によって環を形成している任意の化合物を指し、ここで、環は炭素原子以外の少なくとも１つの原子を含んでいる。特に企図されている複素環塩基は、非炭素原子（例えば、イミダゾール、ピロール、トリアゾール、ジヒドロピリミジン）として窒素、酸素、および硫黄からそれぞれが独立して選択される少なくとも１〜４つのヘテロ原子を含有する５および６員環を含んでいる。さらに企図される複素環は、別の環または複素環に融合（すなわち共有結合）されてもよく、したがって、本明細書で使用されるように「融合複素環」または「融合複素環塩基」と称される。とりわけ企図される融合複素環は、６員環に融合された５員環（例えば、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン）、および別の６員またはそれ以上の環に融合された６員環（例えば、ピリド［４，５−ｄ］ピリミジン、ベンゾジアゼピン）を含んでいる。これらのおよびさらに好ましい複素環塩基の例が以下に与えられる。またさらに企図される複素環塩基は芳香族であることもあれば、あるいは１つ以上の二重または三重結合を含むこともある。さらに、企図される複素環塩基と融合複素環は、１つ以上の位置でさらに置換されることもある。環の任意の１つは、ハロゲン、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アミノ、モノ−またはジＣ１−６アルキルアミノ、アジド、メルカプト、ポリハロＣ１−６アルキル、ポリハロＣ１−６アルコキシ、およびＣ３−７シクロアルキルからなる群からそれぞれ独立して選択された１つ、２つ、または３つの置換基で随意に置換される。
【００５２】
「核酸塩基」との用語は自然発生しない核酸塩基と同様に自然発生する核酸塩基も包含する。「自然発生しない」と以前は考えられてきた様々な核酸塩基がその後自然で見つかっていることは当業者には明らかなはずである。したがって、「核酸塩基」は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環のアナログ（Ｎ−置換された複素環など）やその互変異性体も含んでいる。核酸塩基の典型的な例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、２−クロロアデニン（ｃｈｌｏｒｏａｄｅｎｉｎｅ）、２−フルオロアデニン（ｆｌｕｏｒｏａｄｅｎｉｎｅ）、ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２，ジヒドロピリミジン（ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎ）−４−イル）カルバメート、シトシン、Ｎ−アルキルカルバメート、シトシンＮ−アルキルエステル、５−アザシトシン、５−ブロモビニルウラシル（ｂｒｏｍｏｖｉｎｙｌｕｒａｃｉｌ）、５−フルオロウラシル、６−メトキシ−９Ｈ−プリン−２−アミン、および（Ｒ）−３，６，７，８−テトラヒドロイミダゾ［４，５−ｄ］［１，３］ジアゼピン−８−オール（ｏｌ）である。
【００５３】
用語「核酸塩基」は、こうした例だけでなく、そのアナログや互変異性体や位置異性体をすべて包含する。本明細書のために、こうした「核酸塩基」を本明細書にもある他の複素環塩基と区別するために、「核酸塩基」との用語は、式ＩＩによって表されるシトシン塩基を主として指す。しかしながら、「塩基」との用語は、本明細書のために、式ＩＩＩによって表されるヌクレオシド中に存在する塩基を主に指す。
【００５４】
「互変異性体」または「互変異性型」との用語は、低エネルギー障壁によって相互転換できる、異なるエネルギーの構造異性体を指す。例えば、陽子互変異性体（プロトトロピック（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ）互変異性体としても知られている）は、ケト−エノールおよびイミン−エナミン異性化などのプロトンの移動による相互転換を含む。原子価互変異性体は結合電子のいくつかの再編成による相互転換を含んでいる。
【００５５】
「位置異性体」との用語は、その原子が異なる結合順序で結合した同じ分子式の分子を指すという意味では、構造異性体（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｓｏｍｅｒまたはｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｉｓｏｍｅｒ）を指す。
【００５６】
「変換」との用語は、生成物、すなわち、予想される最終生成物、副産物、あるいは分解生成物にさえ転換される出発物質の割合である。
【００５７】
「収率」との用語は、出発分子の数当たりの生成物の合成された分子の数である。複数工程の合成では、収率はすべての単一工程の収率の増殖によって計算することができる。
【００５８】
「アノマー純度」との用語は、混合物中に存在する化合物のすべてのアノマーの合計量で割ったその化合物の特定のアノマーの量に１００％を掛けたものである。
【００５９】
「シトシン修飾／置換／保護」との用語は、シトシンの元々のバックボーン上の少なくとも１つの位置（位置１の窒素以外）が、ラジカルＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｘおよび／またはＹとして記載されるような官能基によって置換される任意のヌクレオシドアナログを指し、こうした基の各々の１つは他のものから独立している。
【００６０】
「位置Ｎ４で修飾された／置換された／保護されたシトシン」との用語は、位置４のアミノ基の少なくとも１つのプロトンがラジカルＲ２および／またはＲ３と記載されるような官能基（こうした置換基のそれぞれ１つは互いに独立している）によって置換されたシトシンバックボーンを含む塩基を指し、前述の置換基の少なくとも１つが水素とは異なるということを証明している。
【００６１】
「中間物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）」または「中間物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）」との用語は、適切な追加の化学反応によってヌクレオシドの構造の医薬品有効成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）（ＡＰＩ）に転換されることもある任意のヌクレオシドアナログタイプの化合物を指す。したがって、中間物はＡＰＩ前駆体と見なされることもある分子である。本明細書上、Ｎ４で修飾されたシトシンまたはシトシン誘導体または中間物に適用される際の「前駆体」との用語は、式ＩＩの化合物によって意味され、Ｎ４に結合する部分はＲ２またはＲ３によって表されるモノ以外の化学基である。
【００６２】
本文脈全体で使用されるような「プロドラッグ」との用語は、エステル、アミド、カルバメート、およびリン酸塩などの薬理学的に許容可能な誘導体を意味し、したがって、結果として生じる誘導体の生体内の生体内変換生成物は式（Ｉ）の化合物で定義されるような活性な薬物である。プロドラッグについて一般に記載したＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎによる文献  （Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  ｅｄ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  １９９２，  ’’Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ’’，  ｐ  １３−１５）は本明細書に組み込まれる。プロドラッグは好ましくは、水溶解度に非常に優れ、バイオアベイラビリティを増加させ、生体内で活性な阻害剤に容易に代謝される。本発明の化合物のプロドラッグは、修飾がルーチン処置によりまたは生体内で親化合物に開裂されるような方法で、化合物中の官能基の修飾することによって調製されてもよい。
【００６３】
好ましいプロドラッグは、生体内で加水分解性であり、かつ、ヒドロキシまたはアミノ基を有する式Ｉの化合物に由来する、薬学的に許容可能なエステル、アミド、およびカルバメートである。生体内の加水分解性のエステル、アミド、およびカルバメートは、ヒトまたは動物の体内で加水分解され、親の酸またはアルコールを生成する、エステル、アミド、またはカルバメートの基である。アミノ基に適切な薬学的に許容可能なエステル、アミド、およびカルバメートは、Ｃ１−６アルコキシメチルエステル、例えば、メトキシメチル、Ｃ１−６アルカノイルオキシメチル（ａｌｋａｎｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）エステル、例えば、ピバロイルオキシメチル（ｐｉｖａｌｏｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）、フタリジルエステル、Ｃ３−８シクロアルコキシカルボニルオキシＣ１−６アルキルエステル、例えば、ｌ−シクロヘキシルカルボニルオキシエチル；１，３−ジオキソレン（ｄｉｏｘｏｌｅｎ）−２−オニルメチル（ｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）エステル、例えば、５−メチル−ｌ，３−ジオキソレン−２−オニルメチル；およびＣ１−６アルコキシカルボニルオキシエチルエステル、例えば、１−メトキシカルボニル−オキシエチルを含み、これらは本発明の化合物中の任意のカルボキシ基で形成されてもよい。
【００６４】
ヒドロキシ基を含む式（Ｉ）の化合物の生体内の加水分解性エステルは、親ヒドロキシ基を与えるためにエステル分解の生体内の加水分解の結果として、リン酸エステルやα−アシルオキシアルキルエーテルなどの無機エステル、および関連化合物を含んでいる。α−アシルオキシアルキルエーテルの例としては、アセトキシメトキシ、および２，２−ジメチルプロピオニルオキシ−メトキシが挙げられる。ヒドロキシのための基を形成する生体内の加水分解性エステルの選択は、アルカノイル、ベンゾイル、フェニルアセチル、ならびに置換されたベンゾイルおよびフェニルアセチル、アルコキシカルボニル（炭酸アルキルエステルを提供するため）、ジアルキルカルバモイルおよびＮ−（ジアルキルアミノエチル）−Ｎ−アルキルカルバモイル（カルバメートを提供するため）、ジアルキルアミノアセチル、およびとカルボキシアセチルを含む。ベンゾイル上の置換基の例としては、環窒素原子からメチレン基を介してベンゾイル環の３−または４−の位置に結合したモルホリノやピペラジノが挙げられる。
【００６５】
治療用途のために、式（Ｉ）の化合物の塩は対イオンが薬学的に許容可能な塩である。しかしながら、薬学的に許容可能ではない酸や塩基の塩も、例えば、薬学的に許容可能な化合物の調製または精製において利用法を見つけられることもある。すべての塩は、薬学的に許容可能であろうとなかろうと、本発明の範囲内に含まれる。
【００６６】
上記のような薬学的に許容可能な酸付加塩および塩基付加塩は、式（Ｉ）の化合物が形成することができる、治療上活性な無毒の酸付加塩および塩基付加塩の形態を含むよう意図している。薬学的に許容可能な酸付加塩は、こうした適切な酸で塩形態を処理することによって都合よく得ることができる。適切な酸は、例えば、ハロゲン化水素酸（例えば、塩化水素または臭化水素酸）、硫酸、硝酸、リン酸、および類似の酸といった無機酸；あるいは、例えば、酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸（すなわち、エタン二酸）、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタンニ酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸（すなわちヒドロキシブタンニ酸）、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモン酸、および類似の酸といった有機酸を含む。
【００６７】
反対に、前記の塩形態は、適切な塩基を用いる処理によって遊離塩基形態へと変換させることができる。
【００６８】
酸性のプロトンを含む式（Ｉ）の化合物も、適切な有機塩基と無機塩基を用いる処理によって、無毒な金属またはアミン付加塩形態に変換されることもある。適切な塩基塩形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリおよび土類アルカリ金属塩、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩など、有機塩基を含む塩、例えば、ベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）の塩、およびアミノ酸を含む塩、例えば、アルギニン、リジンなどを含む。
【００６９】
上記に使用されるような付加塩との用語は、式（Ｉ）の化合物とその塩が形成することができる溶媒和物をさらに含む。こうした溶媒和物は例えば水化物、アルコラート、およびその他同種のものである。
【００７０】
本明細書で先に使用されるような「第四級アミン」との用語は、式（Ｉ）の化合物が、式（Ｉ）の化合物の塩基性窒素と適切な四級化剤、例えば、随意に置換されたハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、またはハロゲン化アリールアルキル（例えばヨウ化メチル、ベンジルヨージド）との間の反応によって形成することができる第四級アンモニウム塩を定義する。優れた脱離基を含む他の反応物、例えば、アルキルトリフルオロメタンスルホン酸塩（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）、アルキルメタンスルホン酸塩（ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅｓ）、およびアルキルｐ−トルエンスルホン酸塩などが使用されてもよい。第四級アミンは正電荷の窒素を有する。薬学的に許容可能な対イオンは、クロロ、ブロモ、ヨード、トリフルオロ酢酸、および酢酸を含んでいる。最適な対イオンはイオン交換樹脂を用いて導入することができる。
【００７１】
本化合物のＮ−オキシド形態は、１つまたは複数の窒素原子がいわゆるＮ−オキシドに酸化した、式（Ｉ）の化合物を含むように意図される。
【００７２】
式（Ｉ）の化合物は、金属結合、キレート化、があるかもしれないことは認識される、複雑な形成特性を有することもあり、したがって、金属複合物または金属キレートとして存在することもある。式（Ｉ）の化合物のそのようなメタレート化した誘導体は、本発明の範囲内に含まれるように意図されている。
式（Ｉ）の化合物のいくつかは互変異性型で存在することもある。
【００７３】
上記の式に明確には示されていないが、こうした形態は、本発明の範囲内に含まれるように意図されている。
【００７４】
本明細書で使用されるように「アルキル」との用語は、すべての炭素炭素結合が単結合である、直鎖、分枝鎖、または環状の炭化水素を指す。
【００７５】
「アルケニル」および「置換されていないアルケニル」との用語は本明細書で交換可能に使用され、少なくとも１つの炭素炭素二重結合を含む直鎖、分枝鎖、または、環状のアルキルを指す。
【００７６】
さらに、本明細書で使用されるような「アルキニル」との用語は、少なくとも１つの炭素炭素三重結合を含む直鎖、分枝鎖、または、環状のアルキルまたはアルケニルを指す。
【００７７】
本明細書で使用されるような「アリール」との用語は、任意の芳香族の環状アルケニルまたはアルキニルを指し、基または基の一部としてフェニルまたはナフタレニルであり、それぞれ随意に、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、カルボキシル、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アミノ、モノ−またはジＣ１−６アルキルアミノ、アジド、メルカプト、ポリハロＣ１−６アルキル、およびポリハロＣ１−６アルコキシから選択された１つ、２つ、または３つの置換基で置換される。アリールがアルキル、アルケニル、またはアルキニルに共有結合される場合、「アルカリル」との用語が採用される。
【００７８】
本明細書で使用されるような用語「置換される（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」は、官能基による原子または化学基（例えば、Ｈ、ＮＨ２、またはＯＨ）の置換を指し、特に企図される官能基は、求核基（例えば−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＣなど）を含み、求電子基（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｘ）ＯＨなど）、極性基（例えば、−ＯＨ）、非極性基（例えば、アリール、アルキル、アルケニル、アルキニルなど）、イオン基（例えば−ＮＨ３＋）およびハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ）、ならびにこれらのすべての化学的に合理的な組み合わせを含む。ゆえに、「官能基」との用語や「置換基」との用語は本明細書では交換可能に使用され、求核基（例えば、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＣ、−ＣＮなど）、求電子基（例えば、Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｃ（Ｘ）ＯＨ、Ｃ（ハロゲン）ＯＲなど）、極性基（例えば−ＯＨ）、非極性基（例えば、アリール、アルキル、アルケニル、アルキニルなど）、イオン基（例えば−ＮＨ３＋）、およびハロゲンを指す。
【００７９】
本記載上、「ヌクレオシドホスホリラーゼ」または「ＮＰ」または「ＮＰｓ」との用語は、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素、またはＰｙＮＰｓおよびＰＮＰ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素）のＰｙＮＰ（ＰｙＮＰｓ）酵素または混合物を含む。こうした酵素は、自然発生する微生物、中温菌、好熱菌、超好熱菌、または好極限性細菌のいずれかから得られることもある。本記載上、生物またはＮＰ酵素（中温菌または中温性）は、４０−５５°Ｃの最適温度範囲を含む１８−６０°Ｃまでの温度で、機能するまたはＮＰ活性を実行することができるものである。生物またはＮＰ酵素（好熱菌または好熱性）は、６０°Ｃ以上、最大で８０°Ｃまでの温度で、機能するまたはＮＰ活性を実行することができるものである。生物またはＮＰ酵素（超好熱菌または超好熱性）は、８０−９５°Ｃの最適温度範囲を含む８０°Ｃ以上、最大で１００°Ｃまでの温度で、機能するまたはＮＰ活性を実行することができるものである。加えて、本発明で使用される酵素は、遺伝的組み換え技術によって得られ、それぞれのコード化核酸配列を実行する対応ベクターで形質転換した宿主細胞中で発現されるクローン化酵素であってもよい。
【００８０】
本発明に従ってＮＰ酵素をコード化する核酸分子は好ましくは以下から選択される：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１、あるいは
ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１の補体であるヌクレオチド配列、あるいは、
ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１で変性したヌクレオチド配列、あるいは、
ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１に、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１の補体に、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１に由来するハイブリダイゼーションプローブに、あるいは、これらの補体の組み合わせに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは、
ｄ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは、
ｅ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１、２、５、７、９、または１１と少なくとも５９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、あるいは、
ｆ）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３、４、６、８、１０、または１２から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
【００８１】
本発明の意味でのストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９），  １．１０１１．１０４に記載されるものとして定義される。これに従って、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、陽性のハイブリダイゼーションシグナルは、５５°Ｃで、好ましくは６２°Ｃで、最も好ましくは６８°Ｃで１ｘＳＳＣ緩衝液と０．１％ＳＤＳで１時間洗浄した後に、とりわけ、５５°Ｃで、好ましくは６２°Ｃで、最も好ましくは６８°Ｃで０．２ｘＳＳＣ緩衝液と０．１％ＳＤＳで１時間洗浄した後に依然として観察される。
【００８２】
さらに、本記載の意味において、本発明はヌクレオチドまたはアミノ酸の配列も包含しており、これは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の値について、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２（ヌクレオチド）またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４（アミノ酸）で示されたヌクレオチドまたはアミノ酸の配列に対して、それぞれ少なくとも５９％、特に好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性を有している。同一性のパーセント以下の方程式によって決められる：
Ｉ＝（ｎ／Ｌ）ｘ１００
ここで、Ｉは、同一性の百分率であり、Ｌは塩基性配列の長さであり、ｎは塩基性配列に対するある配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の差の数である。
【００８３】
【表１】
2016198075.tif 000007
【００８４】
【表２】
2016198075.tif 000008
【００８５】
本発明のまた別の主題は、発現制御配列と動作可能に結合した、上に定義されるような核酸分子の少なくとも１つのコピーを含む組み換えベクターである。ベクターは任意の原核生物または真核生物のベクターであってもよい。原核生物のベクターの例は、バクテリオファージ（例えば、バクテリオファージλ）などの染色体ベクター、およびプラスミドなどの染色体外ベクターである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １−４を参照）。ベクターは真核生物のベクター、例えば、酵母ベクターまたはより高度な細胞に適したベクター、あるいはプラスミドベクター、ウイルスベクター、または植物ベクターであってもよい。適切な真核生物のベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｓｕｐｒａ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １６に記載されている。本発明は、上に記載されているような核酸または組み換えベクターで形質転換した組み換え型の細胞にも関する。細胞は任意の細胞、例えば、原核細胞または真核細胞であってもよい。原核細胞、とりわけ大腸菌細胞が特に好ましい。
【００８６】
本記載上、本発明は変異体、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１乃至のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の変異体または相同分子種を包含している。
【００８７】
明細書全体にわたって使用されるような「変異体」との用語は、それぞれ核酸のヌクレオチド配列または１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸によって変化したタンパク質またはポリペプチドの核酸配列またはアミノ酸配列を意味することが理解されよう。変異体は「保存的な」変化を有することもあり、ここで、置換されたヌクレオチドまたはアミノ酸は、置き換えられたヌクレオチドまたはアミノ酸に類似する構造または化学的性質を有している。変異体は１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の「非保存的な」変化または欠失および／または挿入も有することがある。この用語は、特定の核酸またはタンパク質またはポリペプチド向けのヌクレオチドまたはアミノ酸の任意の挿入／欠失をその範囲内に含んでいる。「機能的な変異体」は、参照ヌクレオチド配列またはタンパク質またはポリペプチドの機能的能力を保持する変異体を意味することが理解されよう。
【００８８】
本明細書で使用されるような「補体」または「相補的な」との用語は、ＤＮＡやＲＮＡなどの２０の二本鎖の核酸のそれぞれの鎖が、その間の塩基対が２つまたは３つの水素結合によって非共有的に結合されているという点で、他のものに対して相補的であるということを意味することもある。ＤＮＡについては、アデニン（Ａ）塩基はチミン（Ｔ）塩基を補完し、その逆もまた然りであり、グアニン（Ｇ）塩基はシトシン（Ｃ）塩基を補完し、その逆もまた然りである。ＲＮＡでは、アデニン（Ａ）塩基がチミン（Ｔ）塩基の代わりにウラシル（Ｕ）塩基を補完するということを除けば、同じである。ＤＮＡとＲＮＡで見られる塩基のそれぞれについて１つの２５相補的塩基（２５  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｂａｓｅ）しか存在しないため、任意の一本鎖の相補鎖を再度コンストラクトすることができる。
【００８９】
明細書全体で使用されるような用語「相同分子種」は、異なる種で見られる相同染色体またはｍｉＲＮＡ配列として理解されよう。
【００９０】
「組み換えＤＮＡ分子」は、本明細書下では、分子の生物学的処置を受けたＤＮＡ分子として理解される。ゆえに、「組み換えＤＮＡ」との用語は、通常は一緒に生じないＤＮＡ配列を組み合わせることによって作成される、自然には存在しないＤＮＡの形態である。「組み換えＤＮＡ分子」は、いったん宿主細胞に導入されると、宿主細胞により複製される。本明細書の「組み換えタンパク質または酵素」は、「組み換えＤＮＡ分子」を採用する方法によって作成されたタンパク質または酵素を意味し、したがって、本記載上、組み換え型の酵素または組み換えタイプの酵素はとの用語は、組み換えＤＮＡに由来するタンパク質または酵素として理解されるはずである。
【００９１】
本明細書上、変異酵素とは、自然発生した、または、遺伝子操作を含むヒトの操作によって引き起こされた、少なくとも１つの変異を示す任意の酵素を意味する。
【００９２】
これに反して、天然、自然、または自然発生の酵素は、すべてが同意後としてとらえられる本明細書の目的のために、その以前のアミノ酸配列を保護する酵素を意味し、変異なしで、主に自然に広まっていることが分かる。
本発明の酵素の機能部分は、全酵素配列のそのすべての生体触媒特性を発揮する能力を維持する、元の酵素の又はそれをコード化するＤＮＡ断片の任意の配列フラグメントを意味する。
【００９３】
用語、シトシンヌクレオシドアナログは、本明細書の目的のために、シトシンのヌクレオシドアナログまたはシトシン誘導体のヌクレオシドアナログのいずれかを意味する。同じように、用語、シトシン塩基は、本明細書に制約されるものとして、塩基シトシンまたはその誘導体を意味する。同様に、用語、修飾されたシトシン塩基は、本明細書で使用されるように、式ＩＩによって表わされる化合物を包含し、ここでシトシン塩基の骨格は、位置４、５または６で置換される。
【００９４】
本記載は、医薬品有効成分（ＡＰＩ）、その中間物またはプロドラッグ、例えば、これらのＡＰＩまたはその中間物、以下の式Ｉのヌクレオシドアナログ（ＮＡ）として特に有用な、シトシンヌクレオシドアナログを産生するための酵素プロセスを開示し：
【００９５】
【化６】
2016198075.tif 000009
式中、
Ｚ１は、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｚ２は、Ｚ１とは無関係に、Ｏ、Ｃ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）、Ｓ（ＲＳ５）、好ましくは、基ＳＯまたはＳＯ２；Ｎ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｎ（ＲＳ２）、Ｎ（ＲＳ５）であり；
ＲＳ１は、
【００９６】
【化７】
2016198075.tif 000010
から選択される、水素、ＯＨ、そのエーテルまたはエステルであり、ｎは０または１であり、Ａは酸素または窒素であり、および各Ｍは、独立して、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＰに随意に結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＰに随意に結合した随意に置換された複素環、または限定されないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容可能な対イオンであり；
ＲＳ２は、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ハロゲン、好ましくは、Ｆ、ＣＮ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３であり；
ＲＳ３は、２’−デオキシリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドに由来するＮＡの場合において、水素であり、あるいは、ＮＡがリボヌクレオシドに由来するときに、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン、好ましくは、Ｆ、ＯＣＨ３から選択され；
ＲＳ４は、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ＮＨ２、ハロゲン、好ましくは、Ｆ、ＣＮであり；
但し、ＲＳ１およびＲＳ４の両方は、ＯＨ残基のエーテルまたはエステルであったときに異なることを前提とし；
ＲＳ５は、Ｚ２が酸素とは異なるときに、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ＮＨ２またはハロゲン、好ましくは、Ｆであり；
Ｒ１は、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｒ２は、水素、随意に置換されたアルキル鎖、好ましくはＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり；
Ｒ３は、水素、随意に置換されたアルキル鎖、好ましくはＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり；Ｒ３およびＲ２は、互いに独立しており；但し、少なくとも１つのＲ２またはＲ３が、水素とは異なることを前提とし；
Ｒ４は、水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン（好ましくはＦまたはＩ）；随意に置換されたアルキル鎖；随意に置換されたアルケニル鎖；随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＹに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＹに結合した随意に置換された複素環、および独立して、
【００９７】
【化８】
2016198075.tif 000011
から選択される、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５の任意の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
但し、Ｙが炭素または硫黄の原子であることを前提とし、あるいはＹが窒素原子であることを前提に、Ｒ４は欠けており；
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ５は、水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン（好ましくはＦまたはＩ）、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７；ＣＨ２−複素環、ＣＮ；
および独立して、
【００９８】
【化９】
2016198075.tif 000012
から選択される、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５の任意の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ６およびＲ７は、互いに無関係に、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、複素環、または随意に置換されたアリールであり；
Ｒ８は、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアリール、随意に置換された複素環であり；
Ｙは、Ｃ、Ｎ、Ｓであり；
ここで、シトシンヌクレオシドアナログを産生するプロセスは、本発明のプロセスの化学酵素的に好ましい実施形態が利用されたときに、以下の工程を含む：
（ｉ）式ＩＩの中間化合物中の置換基Ｒ２およびＲ３として記載される適切な置換基を組み込むために、シトシン塩基をシトシン誘導体中のＮ４位置でアミノ基を修飾するための適切な試薬と化学反応させる工程であって、以下の式ＩＩの中間化合物が、従来の精製方法によって本工程の終わりに随意に精製され；
代替的に、本発明のプロセスが、市場で入手可能な又は前に合成された、式ＩＩによって表わされる出発生成物（修飾されたシトシン塩基）から直接始めることができる、工程：
【００９９】
【化１０】
2016198075.tif 000013
（ｉｉ）上記の修飾されたシトシン塩基を適切なヌクレオシドアナログの出発物質と反応させる工程であって、その反応が、適切な反応水性媒体中で、および適切な反応条件下で、ヌクレオシドホスホリラーゼ酵素（ＮＰ）、好ましくはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ酵素（ＰｙＮＰ）を、式ＩＩのシトシン誘導体および以下の式ＩＩＩのヌクレオシドアナログを含む出発物質の混合物に加えることを含み：
【０１００】
【化１１】
2016198075.tif 000014
式中、
Ｚ１は、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｚ２は、Ｚ１とは無関係に、Ｏ、Ｃ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｓ（ＲＳ２）、Ｓ（ＲＳ５）、好ましくは、基ＳＯまたはＳＯ２；Ｎ（ＲＳ２ＲＳ５）、Ｎ（ＲＳ２）、Ｎ（ＲＳ５）であり；
ＲＳ１は、
【０１０１】
【化１２】
2016198075.tif 000015
から選択される、水素、ＯＨ、そのエーテルまたはエステルであり；
ｎは０または１であり、Ａは酸素または窒素であり、および各Ｍは、独立して、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＰに随意に結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＰに随意に結合した随意に置換された複素環、または限定されないが、ナトリウム、カリウム、アンモニウムまたはアルキルアンモニウムなどの薬学的に許容可能な対イオンであり；
ＲＳ２は、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ハロゲン、好ましくは、Ｆ、ＣＮ、ＮＨ２、ＳＨ、Ｃ≡ＣＨ、Ｎ３であり；
ＲＳ３は、２’−デオキシリボヌクレオシドまたはアラビノヌクレオシドに由来するＮＡの場合において、水素であり、あるいは、ＮＡがリボヌクレオシドに由来するときに、ＯＨ、ＮＨ２、ハロゲン（好ましくはＦ）、ＯＣＨ３から選択され；
ＲＳ４は、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ＮＨ２、ハロゲン、好ましくは、Ｆ、ＣＮであり；
但し、ＲＳ１およびＲＳ４の両方は、ＯＨ残基のエーテルまたはエステルであったときに異なることを前提とし；
ＲＳ５は、Ｚ２が酸素とは異なるときに、水素、ＯＨまたはそのエーテルまたはエステルの残基、ＮＨ２またはハロゲン、好ましくはＦであり；
Ｒ１は、Ｏ、ＣＨ２、Ｓ、ＮＨであり；
Ｒ２は、水素、随意に置換されたアルキル鎖、好ましくはＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり；
Ｒ３は、水素、随意に置換されたアルキル鎖、好ましくはＣ４−４０アルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＮに結合した随意に置換された複素環、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ７、ＣＮ、ＳＲ６、ＳＯ２Ｒ６、ＳＯ２Ｒ６Ｒ７、ＣＮ、Ｐ（Ｏ）アリール、Ｐ（Ｏ）複素環、Ｐ（Ｓ）アリール、Ｐ（Ｓ）複素環、Ｐ（Ｏ）Ｏ２Ｒ８であり；Ｒ３およびＲ２は、互いに独立しており；但し、少なくとも１つのＲ２またはＲ３が、水素とは異なることを前提とし；
Ｒ４は、水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン（好ましくはＦまたはＩ）；随意に置換されたアルキル鎖；随意に置換されたアルケニル鎖；随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＹに結合した随意に置換されたアリール、随意に置換されたアルキル、アルケニルまたはアルキニルの鎖によってＹに結合した随意に置換された複素環、および独立して、
【０１０２】
【化１３】
2016198075.tif 000016
から選択される、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５の任意の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
但し、Ｙが炭素または硫黄の原子であることを前提とし、あるいはＹが窒素原子であることを前提に、Ｒ４は欠けており；
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ５は、水素、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ハロゲン（好ましくはＦまたはＩ）、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、トリハロアルキル、ＯＲ６、ＮＲ６Ｒ７、ＣＮ、ＣＯＲ６、ＣＯＮＲ６Ｒ７、ＣＯ２Ｒ６、Ｃ（Ｓ）ＯＲ６、ＯＣＯＮＲ６Ｒ７、ＯＣＯ２Ｒ６、ＯＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＮＨＣＯＮＲ６Ｒ７、ＮＨＣＯ２Ｒ６、ＮＨＣ（Ｓ）ＯＲ６、ＳＯ２ＮＲ６Ｒ７；ＣＨ２−複素環、ＣＮ；
および独立して、
【０１０３】
【化１４】
2016198075.tif 000017
から選択される、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４またはＲ５の任意の随意に置換された複素環または随意に置換されたアリールであり、
式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｎ−ＲＢ２、Ｓｅであり；ＲＢ１は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、直鎖または分枝鎖のＣ１−１０アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｘ−ＲＢ２、−Ｃ≡Ｃ−ＲＢ２、ＣＯ２ＲＢ２であり；ＲＢ２は、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ２、直鎖または分枝鎖のＣ１−５アルキル、フェニルであり；
Ｒ６およびＲ７は、互いに無関係に、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、複素環、または随意に置換されたアリールであり；
Ｒ８は、水素、随意に置換されたアルキル鎖、随意に置換されたアルケニル鎖、随意に置換されたアルキニル鎖、随意に置換されたアリール、随意に置換された複素環であり；
Ｙは、Ｃ、Ｎ、Ｓである、工程；
（ｉｉｉ）従来の精製方法によってさらに精製された、式Ｉのシトシンヌクレオシドアナログで遊離した一級アミノＮ４を回収するために、シトシンヌクレオシドアナログにおけるＮ４位置でアミノ基を随意に脱保護する工程。
【０１０４】
好ましくは、出発物質の式ＩＩＩにおいて塩基を構成する複素環は、ウラシル、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ヒポキサンチン、キサンチン、チオウラシル、チオグアニン、９−Ｈ−プリン−２−アミン、７−メチルグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシンおよび５−ヒドロキシメチルシトシン、並びにそれらの任意の置換された誘導体から選択される。
【０１０５】
さらに、式ＩＩの対応する核酸塩基を得るために修飾される遊離したシトシンまたはシトシン誘導体は、好ましくは以下から選択される：
【０１０６】
【化１５】
2016198075.tif 000018
さらに、式Ｉのヌクレオシドアナログにおけるシトシン核酸塩基は、好ましくは以下から選択される：
【０１０７】
【化１６】
2016198075.tif 000019
【０１０８】
本明細書に記載されるプロセスによって、産生されるＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、以下から選択される：カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、イバシタビン、サパシタビン（Ｓａｐａｃｉｔａｂｉｎｅ）、２’−Ｃ−シアン−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）、ガロシタビン、バロプリシタビン（Ｖａｌｏｐｒｉｃｉｔａｂｉｎｅ）（ＮＭ２８３）、２’−デオキシ−４’−チオシチジン、チアラビン（Ｔ−ａｒａＣ）、２’−デオキシ−４’−チオ−５−アザシチジンまたはアプリシタビン（Ａｐｒｉｃｉｔａｒａｂｉｎｅ）（ＡＴＣ）。
【０１０９】
より好ましくは、産生されるＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）から選択され、さらにより好ましくは、記載されたプロセスは、特にカペシタビンまたはシタラビンの工業生産に向けられている。
【０１１０】
さらに、本明細書に記載されるプロセスを実施する１つのより好ましい実施形態では、産生されるＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、カペシタビンである（模式図２）。
【０１１１】
【化１７】
2016198075.tif 000020
【０１１２】
カペシタビンの酵素的または化学酵素的な合成のいずれかの生体触媒工程（酵素の工程）を、好ましくは２０−１２０℃の範囲の温度で実行した。
【０１１３】
さらに、本明細書に記載されるプロセスを実施する１つのより好ましい実施形態では、産生されるＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、シタラビンである（模式図３）。
【０１１４】
【化１８】
2016198075.tif 000021
【０１１５】
本記載の生体触媒プロセスを行う目的のために、出願人は、ＮＰ酵素または単離されたＮＰ酵素を含有している生物、好ましくは、両方の場合において、ＰｙＮＰ酵素または酵素のＰｙＮＰ／ＰＮＰ混合物を選択し、ここで、それらを含有している酵素または微生物のいずれかは、それらが、４０−５５℃の最適温度範囲を有する、１８℃から６０℃までの範囲の温度で、作用することができる且つヌクレオシドトランスフェラーゼ活性を実行することができるという意味で、中温菌または中温性であった。生物またはＮＰ酵素、特にＰｙＮＰ酵素、好熱菌、または好熱性は、６０℃から８０℃までの範囲の温度で、作用することができるか、またはヌクレオシドトランスフェラーゼ活性を実行することができる。生物またはＮＰ酵素、特にＰｙＮＰ酵素、超好熱菌、または超好熱性は、８０−９５℃の最適温度範囲を有する、８０℃から１００℃までの温度で、作用することができる且つヌクレオシドトランスフェラーゼ活性を実行することができる。
【０１１６】
本発明のプロセスに使用されるＮＰ（ＰｙＮＰ）酵素は、中温性の生物、一例として、細菌、特に大腸菌、または中温性、好熱性、または超好熱性の古細菌、特にサーモプロテイ綱（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｉ ｃｌａｓｓ）から選択される、およびより具体的には、ＷＯ２０１１／０７６８９４に開示される属および種から選択される、微生物から単離され得る。さらにより好ましいヌクレオシドホスホリラーゼは、本発明に従って、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）およびアエロパイラム・ペルニクス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）からのものである。
【０１１７】
本発明のさらに別の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２から選択される、核酸配列またはそのフラグメントによってコード化されたアミノ酸配列を含む、組み換えＮＰ酵素の開示されるプロセスでの使用に関する。ＤＮＡ配列の両方は、古細菌、より具体的には、ヌクレオシドホスホリラーゼ酵素に対する相同配列を有している古細菌から単離される。
【０１１８】
本記載の全体にわたって記載されるように、本発明のプロセスを実施するための好ましい実施形態は、塩基転移のワンステップ−ワンポット反応（ｏｎｅ ｓｔｅｐ−ｏｎｅ ｐｏｔ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を実施するための、中温性、好熱性、または超好熱性のＮＰ酵素の生体触媒、即ち、プリンＮＰ（ＰＮＰ）、またはピリミジンＮＰ（ＰｙＮＰ）のいずれか、あるいはその混合物としての使用に基づいている。好ましくは、好熱性または超好熱性のＮＰ酵素は、６０℃から１００℃までの範囲の温度で、より具体的には、本明細書に記載される適切な反応条件で、核酸塩基転移のワンステップ−ワンポット反応を実行することができるＮＰ酵素活性をコード化する、遺伝子配列またはそのフラグメントを含む、組み換えのタイプである。
【０１１９】
本記載の目的のために、本発明の生体触媒プロセスに使用される好ましい酵素、それをクローン化する方法、それをコード化する核酸配列を保持するベクター、前述のベクターで形質転換された宿主細胞のすべては、本発明の発明者のうちの数人の名の下で、ＷＯ２０１１／０７６８９４に開示される（その特許出願の全体の明細書が、引用によって本明細書に完全に包含される）。
【０１２０】
本発明のプロセスの異なる実施形態を実行するための適切な条件は、以下を含む：
ａ）２０℃−１２０℃の範囲の温度
ｂ）１−１０００時間の範囲の反応時間
ｃ）１−１０００ｍＭの範囲の出発物質の濃度
ｄ）１：５から５：１までの範囲の化学量論的なヌクレオシドの出発物質：核酸塩基
ｅ）０．００１−１００ｍｇ／ｍｌの範囲のＮＰ酵素の量
ｆ）反応媒体に加えられた（随意に有機溶媒中に溶解された）核酸塩基
ｇ）随意に４０％までの適切な有機溶媒も含有している水性反応媒体（好ましくは２０％、およびより好ましくは５％まで）。
【０１２１】
随意に、有機溶媒は、反応媒体に加えられ得るか、または事前に核酸塩基を溶解するために使用され得る。極性の非プロトン性溶媒が好ましく、これは好ましくは、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、アセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される。
【０１２２】
本発明によるプロセスはまた、沈澱、ろ過、濃縮または結晶化から選択される標準的な操作手段によって産生されたＮＡの単離及び／又は精製の工程を含む。
【０１２３】
好熱性のＮＰ酵素は、核酸塩基の転移反応を時間および全収率の点でより効率的にする、より高い温度で作用することができる。
【０１２４】
本発明のプロセスは、本発明の実施形態、カペシタビンの産生（模式図２）として具体的に開示され、ここで、出発物質として使用されるリボヌクレオシドは、５’−デオキシウリジン、５’−デオキシ−５−メチルウリジンまたは５’−クロロ−５’−デオキシウリジンから選択される５’−デオキシリボフラノシルヌクレオシドであり；ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質として使用される核酸塩基は、ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートであり、ＰｙＮＰは、細菌から単離された、自然発生の中温性、好熱性、または超好熱性の酵素である。
【０１２５】
本発明のプロセスの代替的な１つの実施形態は、産生されるＡＰＩがカペシタビン（模式図２）であり、出発物質として使用されるリボヌクレオシドが、５’−デオキシウリジン、５’−デオキシ−５−メチルウリジンまたは５’−クロロ−５’−デオキシウリジンであり、ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質としても使用される核酸塩基が、ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートであり、ＰｙＮＰが、組み換えの中温性、好熱性、または超好熱性の酵素であり、そのクローン化されたＤＮＡが細菌から単離された、実施形態である。
【０１２６】
本発明のプロセスのさらなる実施形態は、産生されるＡＰＩがカペシタビン（模式図２）であり、出発物質として使用されるリボヌクレオシドが、５’−デオキシウリジン、５’−デオキシ−５−メチルウリジンまたは５’−クロロ−５’−デオキシウリジンであり、ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質としても使用される核酸塩基が、ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートであり、ＰｙＮＰが、古細菌から単離された、自然発生の中温性、好熱性、または超好熱性の酵素である、実施形態である。
【０１２７】
本発明のプロセスのさらに別の実施形態は、産生されるＡＰＩがカペシタビン（模式図２）であり、出発物質として使用されるリボヌクレオシドが、５’−デオキシウリジン、５’−デオキシ−５−メチルウリジンまたは５’−クロロ−５’−デオキシウリジンであり、ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質としても使用される核酸塩基が、ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートであり、ＰｙＮＰが、古細菌から単離された、組み換えの中温性、好熱性、または超好熱性の酵素である、実施形態である。
【０１２８】
本発明のプロセスはまた、産生されるＡＰＩがシタラビン（模式図３）であり、出発物質として使用されるリボヌクレオシドがアラビノフラノシルウラシルまたはアラビノヌクレオシドであり、ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質としても使用される核酸塩基が、Ｎ−（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ペンタンアミドであり、ＰｙＮＰが、細菌から単離された、自然発生の中温性、好熱性、または超好熱性の酵素である、実施形態によって表わされる。
【０１２９】
本発明のプロセスの実施形態の別の一実施形態は、産生されるＡＰＩがシタラビン（模式図３）であり、出発物質として使用されるリボヌクレオシドがアラビノフラノシルウラシルまたはアラビノヌクレオシドであり、ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質としても使用される核酸塩基が、Ｎ−（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ペンタンアミドであり、ＰｙＮＰが、組み換えの中温性、好熱性、または超好熱性の酵素であり、そのクローン化されたＤＮＡが細菌から単離された、実施形態である。
【０１３０】
本発明のプロセスの更なる実施形態は、産生されるＡＰＩがシタラビン（模式図３）であり、出発物質として使用されるリボヌクレオシドがアラビノフラノシルウラシルまたはアラビノヌクレオシドであり、ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質としても使用される核酸塩基が、Ｎ−（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ペンタンアミドであり、ＰｙＮＰが、自然発生の中温性、好熱性、または超好熱性の酵素であり、そのクローン化されたＤＮＡが古細菌から単離された、実施形態である。
【０１３１】
本発明のプロセスの別の実施形態は、産生されるＡＰＩがシタラビン（模式図３）であり、出発物質として使用されるリボヌクレオシドがアラビノフラノシルウラシルまたはアラビノヌクレオシドであり、ＰｙＮＰ酵素によって変換される出発物質としても使用される核酸塩基が、Ｎ−（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）ペンタンアミドであり、ＰｙＮＰが、組み換えの中温性、好熱性、または超好熱性の酵素であり、そのクローン化されたＤＮＡが古細菌から単離された、実施形態である。
【０１３２】
同じ発明概念の部分を形成して、本記載はまた、上に記載されるような本発明のプロセスのいずれかでの使用のための、組み換えヌクレオシドホスホリラーゼ酵素（ＰＮＰまたはＰｙＮＰのいずれか）を開示する。天然または組み換えのＮＰ酵素は、中温性の生物、より好ましくは細菌および古細菌から；または好熱性の生物、より好ましくは細菌および古細菌から；あるいは超好熱性の生物、より好ましくは細菌および古細菌から単離され得、およびより具体的にはスルホロブス・ソルファタリカスおよびアエロパイラム・ペルニクスから単離され得る。
【０１３３】
また、単一の発明に関連する概念を統合する同じ方針で、本記載はまた、ＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグの産生における中温性、好熱性、または超好熱性のヌクレオシドホスホリラーゼ（ＮＰ ｏ ＰｙＮＰ）、例えば、抗癌または抗ウイルスの薬剤として有用な、それらのＡＰＩ、中間物またはプロドラッグ、シトシンヌクレオシドアナログ（ＮＡ）の使用を開示している。より好ましくは、前に言及された使用は、以前に詳述された、ＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグとしてのＮＡの産生プロセスおよびその変形によって達成される。特に、その前に言及された使用に関連して、組み換えの好熱性のヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ、ＰｙＮＰまたはその混合物）は、ＡＰＩ、例えば、抗癌または抗ウイルスの薬剤として特に有用な、ＡＰＩまたはその中間物、ヌクレオシドアナログ（ＮＡ）の産生に好ましい。
【０１３４】
そのような使用によって産生されたＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグの中で、以下が見られ得る：
カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、イバシタビン、サパシタビン、２’−Ｃ−シアン−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）、ガロシタビン、バロプリシタビン（ＮＭ２８３）、２’−デオキシ−４’−チオシチジン、チアラビン（Ｔ−ａｒａＣ）、２’−デオキシ−４’−チオ−５−アザシチジンまたはアプリシタビン（ＡＴＣ）。
【０１３５】
より好ましくは、本明細書に開示される酵素の使用によって産生されたＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）から選択され、さらにより好ましくは、記載されたプロセスは、カペシタビンまたはシタラビン、およびそれぞれの中間物またはプロドラッグの工業生産に特に向けられている。また、本発明には、適切な宿主内でヌクレオシドホスホリラーゼの発現または過剰発現を配向する１つ以上の制御配列に操作可能に結合されたヌクレオシドホスホリラーゼ酵素活性（ＮＰ）をコード化する配列を含む、組み換え発現ベクターが包含される。本発明による好ましい組み換え発現ベクターは、好熱性および超好熱性の古細菌、好ましくはクレンアーキオータ（Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔｅ）、およびより好ましくはサーモプロテイ綱、例えば、サーモフィルム・ペンデンス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ ｐｅｎｄｅｎｓ）（株Ｈｒｋ５）からの推定タンパク質に対する、Ａ１ＲＷ９０（Ａ１ＲＷ９０ＴＨＥＰＤ）；スルホロブス・ソルファタリカスからの推定タンパク質に対する、Ｑ９７Ｙ３０（Ｑ９７Ｙ３０ＳＵＬＳＯ）；スタフィロサームス・マリヌス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ）（株ＡＴＣＣ ４３５８８／ＤＳＭ ３６３９／ＦＩ）からの推定タンパク質に対する、Ａ３ＤＭＥ１（Ａ３ＤＭＥ１ ＳＴＡＭＦ）；アエロパイラム・ペルニクスからの推定タンパク質に対する、Ｑ９ＹＡ３４（Ｑ９ＹＡ３４ＡＥＲＰＥ）；ハイパーサーマス・ブチリカス（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ ｂｕｔｙｌｉｃｕｓ）（株ＤＳＭ ５４５６／ＪＣＭ ９４０３）からの推定タンパク質に対する、Ａ２ＢＪ０６（Ａ２ＢＪ０６ＨＹＰＢＵ）；およびアシジロバス・サッカロボラン（Ａｃｉｄｉｌｏｂｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｖｏｒａｎｓ）（株ＤＳＭ １６７０５／ＶＫＭ Ｂ−２４７１／３４５）からの推定タンパク質に対する、Ｄ９ＰＺＮ７（Ｄ９ＰＺＮ７ＡＣＩＳ３）、に存在するＮＰ酵素活性をコード化する任意の保持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）、および発現または過剰発現する遺伝子である。
【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
本発明による好ましい組み換え発現ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１、または以下から選択される核酸配列を保持および発現またか過剰発現する：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１の補体であるヌクレオチド配列；または
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１により変性しているヌクレオチド配列；または
ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１に対して；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１の補体に対して；またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１に由来するハイブリダイゼーションプローブに対して；あるいはそれらの補体に対して、高いストリンジェンシーの条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列；または
ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１との少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；または
ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、５、７、９または１１との少なくとも５９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；あるいは
ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、６、８、１０または１２から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列。
【０１３８】
本発明はまた、組み換えＮＰの産生または医薬品有効成分（ＡＰＩ）、その中間物またはプロドラッグの産生のいずれかのための、前に言及した組み換え発現ベクターの使用を包含し、これらのＡＰＩまたはその中間物は、抗癌または抗ウイルスの薬剤として特に有用なヌクレオシドアナログ（ＮＡ）である。特に、前述の使用によって産生されたＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、以下から選択される：カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、イバシタビン、サパシタビン、２’−Ｃ−シアン−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）、ガロシタビン、バロプリシタビン（ＮＭ２８３）、２’−デオキシ−４’−チオシチジン、チアラビン（Ｔ−ａｒａＣ）、２’−デオキシ−４’−チオ−５−アザシチジンおよびアプリシタビン（ＡＴＣ）。
【０１３９】
より具体的には、産生されるＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）から選択され：さらにより好ましくは、本明細書に記載される発現ベクターは、カペシタビンまたはシタラビン、その中間物またはプロドラッグの工業生産に特に適している。より好ましくは、ＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグの産生のための前に言及した使用は、前にも詳述された、産生プロセスおよびその変形によって達成される。
【０１４０】
本発明はまた、前に記載された、特に前記宿主細胞が大腸菌であるときの、組み換え発現ベクターを含む宿主細胞を包含する。同じ発明の単一の関連する概念の一部として含まれる、前に記載されたような組み換え発現ベクターを含む宿主細胞の使用も、組み換えＮＰ（ｏ ＰｙＮＰ）の産生のために熟慮される。同様に、医薬品有効成分（ＡＰＩ）、その中間物またはプロドラッグの産生のための、前に記載されたような組み換え発現ベクターを含む宿主細胞の使用も、本発明の一部である（それらのＡＰＩまたはその中間物は、抗癌または抗ウイルスの薬剤として有用なシトシンヌクレオシドアナログ（ＮＡ）である）。それは特に、前に記載されたような組み換え発現ベクターを含む宿主細胞が、以下から選択されるＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグの産生のために使用される場合に当てはまる：カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）、エノシタビン（ＢＨ−ＡＣ）、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、イバシタビン、サパシタビン、２’−Ｃ−シアン−２’−デオキシ−１−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシルシトシン（ＣＮＤＡＣ）、ガロシタビン、バロプリシタビン（ＮＭ２８３）、２’−デオキシ−４’−チオシチジン、チアラビン（Ｔ−ａｒａＣ）、２’−デオキシ−４’−チオ−５−アザシチジンおよびアプリシタビン（ＡＴＣ）。
【０１４１】
より好ましくは、前に記載された、組み換え発現ベクターによって形質転換された、本発明の宿主細胞を使用して産生された、ＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグは、カペシタビン、デシタビン（アザ−ｄＣｙｄまたはＤＡＣ）、５−アザシチジン（アザ−Ｃｙｄ）、シタラビン（アラ−Ｃ）から選択され：さらにより好ましくは、本明細書に記載される形質転換された宿主細胞は、カペシタビンまたはシタラビン、その中間物またはプロドラッグの工業生産に特に適している。
【０１４２】
より好ましくは、前に言及された使用は、以前に詳述された、ＡＰＩ、その中間物またはプロドラッグとしてのＮＡの産生プロセスおよびその変形によって達成される。
【０１４３】
比較例１：修飾されていない５−フルオロシトシンおよびデオキシウリジンから出発する５−フルオロ−５’−デオキシシチジンの合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の２．５ｍＭの５−フルオロシトシンおよび８．０ｍＭの５’−デオキシウリジンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（５．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。予想される生成物５−フルオロ−５’−デオキシシチジンは、ＵＶ−ＤＡＤ（紫外線−ダイオードのアレイ検出）によって検出されなかった。
【０１４４】
比較例２：修飾されていない５−フルオロシトシンおよびクロロ−５’−デオキシウリジンから出発する５−フルオロ−５’−デオキシシチジンの合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の２．５ｍＭの５−フルオロシトシンおよび８．６ｍＭの５−クロロ−５’−デオキシウリジンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（５．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。予想される生成物５−フルオロ−５’−デオキシシチジンは、ＵＶ−ＤＡＤによって検出されなかった。
【０１４５】
比較例３：修飾されていないシトシンおよびアラビノフラノシルウラシルから出発するシタラビンの合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の３．０ｍＭのシトシンおよび１０ｍＭの９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシルの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（４．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。予想される生成物１−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン（シタラビン）は、ＵＶ−ＤＡＤによって検出されなかったが、脱アミノ化を介するシトシン分解からのウラシルが得られた。
【０１４６】
比較例４：修飾されていないシトシンおよびアラビノフラノシルシトシンから出発するシタラビンの合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の３．０ｍＭのシトシンおよび７．６ｍＭの９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（４．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。予想される生成物１−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン（シタラビン）は、ＵＶ−ＤＡＤによって検出されなかったが、アデニンの脱アミノ化からのヒポキサンチンおよび基質の脱アミノ化からの９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ヒポキサンチンが得られた。
【０１４７】
比較例５：修飾されていないシトシンおよびアラビノフラノシルヒポキサンチンから出発するシタラビンの合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の３．０ｍＭのシトシンおよび７．５ｍＭの９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ヒポキサンチンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（４．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。予想される生成物１−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン（シタラビン）は、ＵＶ−ＤＡＤによって検出されなかった。
【０１４８】
比較例６：修飾されていないシトシンおよびアラビノフラノシルグアニンから出発するシタラビンの合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の３．０ｍＭのシトシンおよび８．６ｍＭの９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）グアニンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（４．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。予想される生成物１−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）シトシン（シタラビン）は検出されなかった。
【０１４９】
実施例７：ペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートの合成
不活性雰囲気下で、ペンチルクロロホルマート（５ｇ、１．０等量（ｅｑｕｉｖ））を、無水のピリジン中の５−フルオロシトシン（１．０等量）の撹拌した溶液に加え、反応物を６０℃に加熱した。２時間後、これ以上の変化は観察されず、反応物を室温で冷却することによってクエンチした。その後、粗反応物をＡｃＯＥｔおよびＨＣｌ １Ｎを使用して抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４によって乾燥し、溶媒を蒸発させた。得た白色固形物を、移動相としてＳｉＯ２およびＡｃＯＥｔを使用してクロマトグラフィーで精製し、所望の生成物（８８％）を得た。
【０１５０】
実施例８：Ｎ−（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）−アセトアミドの合成
不活性雰囲気下で、トリエチルアミン（１８．１μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）および塩化アセチル（９．２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を、２５時間室温で、無水のＤＭＦ中のシトシン（１０．０ｍｇ、０、０９ｍｍｏｌ）の撹拌した溶液に加えた。その後、溶媒を蒸発させ、得た帯黄色の固形物を、水で洗浄し、ろ過し、真空内で乾燥して、５５％収率の予想される生成物にした。
【０１５１】
実施例９：ペンチル（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートの合成
不活性雰囲気下で、ペンチルクロロホルマート（０．８ｍｍｏｌ、１．０等量）を、無水のピリジン中のシトシン（０．８ｍｍｏｌ、１．０等量）の撹拌した溶液に滴下で加え、反応物を６０℃に加熱した。２時間後、これ以上の変化は観察されず、反応物を室温で冷却することによってクエンチした。その後、粗反応物をＡｃＯＥｔおよびＨＣｌ １Ｎを使用して抽出し、有機相をＮａ２ＳＯ４によって乾燥し、溶媒を蒸発させた。得た白色固形物を、移動相としてＳｉＯ２およびＡｃＯＥｔを使用してクロマトグラフィーで精製し、所望の生成物を得た。
【０１５２】
実施例１０：ウリジンから出発するＮ４−ペンチルオキシカルボニル−５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（カペシタビン）の合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の２．７ｍＭのペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートおよび８．０ｍＭの５’−デオキシウリジンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（５．０Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。参照の実施例（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｅｘａｍｐｌｅ）１と比較して、予期された生成物Ｎ４−ペンチルオキシカルボニル−５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（カペシタビン）は、６８％の収率で検出され、ここで最終生成物は形成または検出されなかった。
【０１５３】
実施例１１：デオキシウリジンから出発するＮ４−ペンチルオキシカルボニル−５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（カペシタビン）の合成。
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の２．５ｍＭのペンチル（５−フルオロ−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートおよび８．６ｍＭの５’−デオキシウリジンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（５．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。参照の実施例２と比較して、予期された生成物Ｎ４−ペンチルオキシカルボニル−５’−デオキシ−５−フルオロシチジン（カペシタビン）は、７７％の収率で検出され、ここで最終生成物は形成または検出されなかった。
【０１５４】
実施例１２：アラビノフラノシルウラシルから出発する９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル（シタラビン）の合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の２．５ｍＭのペンチル（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートおよび８．６ｍＭの９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシルの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（５．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した。予想された生成物Ｎ４−ペンチルオキシカルボニルシチジンが検出された。
Ｎ４位置は、随意に、９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル（シタラビン）を提供するために脱保護され得る。
【０１５５】
実施例１３：アラビノフラノシルアデニンから出発する９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル（シタラビン）の合成
ｐＨ７での３０ｍＭの水性リン酸緩衝液および１０％のＤＭＳＯ中の２．５ｍＭのペンチル（２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル）カルバメートおよび８．６ｍＭの９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）アデニンの溶液を、３０分間６０℃で加熱した。その後、ＰｙＮＰ（５．４Ｕ／μｍｏｌｂａｓｅ）を加え、反応物を、同じ条件下で４時間６０℃で撹拌した。その後、粗反応物を１０ＫＤａの膜に通してろ過し、一部を希釈して、ＨＰＬＣによって分析した予想された生成物Ｎ４−ペンチルオキシカルボニルシチジンが検出された。
Ｎ４位置は、９−（ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）ウラシル（シタラビン）を与えるために脱保護され得る。
【配列表】
2016198075000001.app
【外国語明細書】
2016198075000001.pdf