(57)【要約】【課題】グァバ果実及びトレハロースからなる２型糖尿病を改善する飲食用組成物を提供する。【解決手段】本発明のグァバ果実及びトレハロースからなる２型糖尿病を改善する飲食用組成物は、低酸化還元電位を有するろ液にろ過することができるフィルターで恒温研磨したグァバパルプをろ過し、低酸化還元電位を有する上、グァバポリフェノールを含むグァバジュースを取得し、そのグァバジュースにトレハロースを添加してトレハロース入りグァバジュースを形成する。本発明のトレハロース入りグァバジュースを経口摂取することにより、２型糖尿病によって腎臓及び膵臓に引き起こされる酸化ストレス及び炎症反応を低下させることができる。また、グァバジュースの嗜好性を高めることができる。【選択図】図６
2016182110.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グァバ果実及びトレハロースからなる２型糖尿病を改善する飲食用組成物であって、
有効成分としてグァバ由来のグァバポリフェノール及び海藻由来のトレハロースを含むことを特徴とする飲食用組成物。
【請求項２】
前記グァバポリフェノールは、クェルセチン、エラグ酸、ナリンゲニン及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の飲食用組成物。
【請求項３】
前記飲食用組成物は、２μｇ／ｍＬを超えるクェルセチンを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の飲食用組成物。
【請求項４】
前記飲食用組成物は、０．２ｇ／ｋｇを超えるトレハロースを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の飲食用組成物。
【請求項５】
グァバ由来のグァバポリフェノール及び海藻由来のトレハロースが使用されて製造される２型糖尿病を改善する飲食用組成物の使用。
【請求項６】
前記グァバポリフェノールは、
（ａ）グァバを恒温化で研磨してグァバパルプを形成するステップと、
（ｂ）低酸化還元電位を有するろ液にろ過することができるフィルターで前記グァバパルプをろ過し、低酸化還元電位を有する上、グァバポリフェノールを含むグァバジュースを取得するステップと、から製造されることを特徴とする請求項５に記載の飲食用組成物の使用。
【請求項７】
前記使用は、アポトーシス、オートファジー、炎症性細胞死又は細胞の酸化障害を低下させる飲食用組成物を製造することであることを特徴とする請求項６記載の飲食用組成物の使用。
【請求項８】
前記グァバポリフェノールは、クェルセチン、エラグ酸、ナリンゲニン及びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項５乃至７に記載の飲食用組成物の使用。
【請求項９】
前記飲食用組成物は、２μｇ／ｍＬを超えるクェルセチンを含むことを特徴とする請求項５乃至７記載の飲食用組成物の使用。
【請求項１０】
前記飲食用組成物は、０．２ｇ／ｋｇを超えるトレハロースを含むことを特徴とする請求項５乃至７記載の飲食用組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてグァバポリフェノール及びトレハロースが使用され、生体細胞中の酸化傷害、アポトーシス、オートファジー及び炎症性細胞死を低下させるグァバ果実及びトレハロースからなる２型糖尿病を改善する飲食用組成物及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
２型糖尿病（Ｔｙｐｅ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｔ２ＤＭ）は、現在広く流行している代謝症候群である。研究によると、２０３０年には、２型糖尿病の患者数が３．６６億人に達すると予測されている。台湾衛生署の統計によると、近年台湾では、糖尿病が死因の第４位となっており、糖尿病患者が１００万人に達すると見られている。糖尿病患者中、９割以上がインスリン非依存型（２型糖尿病）に属する。糖尿病の症状として、高血糖濃度及び顕著な糖尿のほか、最も恐ろしいのが網膜症、ネフローゼ、神経障害、脳障害、循環器系障害などの合併症である。このため、血糖を制御し、合併症の発症を防止することが、糖尿病を制御する際の大原則となっている。糖尿病の治療は、基本的に（１）：食事療法、（２）：運動療法及び（３）：薬物療法の３つの方法が用いられる。この中で、食事療法が最も基本であり、最も重要な療法である。統計によると、約５０％以上の患者が適切な食事療法によって病状を改善することができる。そのほか、薬物療法を行う際、適切な食事療法を組み合わせない場合、薬物効果が発揮されない。このため、糖尿病患者にとって適切な食事療法によって血糖濃度を良好に制御することは、最も基本であり、最も重要な課題となっている。
【０００３】
グァバ（Ｇｕａｖａ  Ｆｒｕｉｔ）（Ｐｓｉｄｉｕｍ  ｇｕａｖａ  Ｌ．）は、熱帯性果物の一種であり、台湾ではよく見られる果物の１つである。グァバは、カロリーが低く、１００ｇに３７．３ｋｃａｌしかカロリーが含まれない。また、ビタミンＣ（ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ）、フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ）及びポリフェノール類（ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）を豊富に含む。このため、抗酸化（ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、抗炎症（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）及び抗糖尿病（ａｎｔｉ−ｄｉａｂｅｔｅｓ）（Ｔｈｏｍａｓ  Ｅｉｄｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）の能力が注目を集めている。グァバは、ＳＴＺによって誘発された１型糖尿病のラット中、膵島β細胞が酸化ストレスによって破壊されるのを防止して保護する効果を有し、抗高血糖（ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４９（９）：２１８９−９５）の効果を有する。このほか、グァバは、腎臓に対して抗酸化、抗炎症及び抗糖化反応（ａｎｔｉ−ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）の作用を有する可能性がある（Ｌｉｎ  ａｎｄ  Ｙｉｎ，２０１２，Ｐｌａｎｔ  Ｆｏｏｄｓ  Ｈｕｍ  Ｎｕｔｒ．，６７（３）：３０３−８）。
【０００４】
トレハロース（Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ）は、自然界に存在する二糖類であり、２つのブドウ糖がα，α−１，１グリコシド結合して形成された非還元糖である。メイラード反応（Ｍａｉｌｌａｒｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）が発生しないため、甘味料として頻繁に使用される。甘さは、ショ糖の約４５％である。トレハロースは、消化器官中において小腸のトレハラーゼ（Ｔｒｅｈａｌａｓｅ）によって分解される。トレハロースは、無脊椎動物、酵母、きのこ類などに存在する。トレハロースは、タンパク質の変性を抑制して保護する機能を有し、自然環境の下、抗凍結、抗乾燥、抗脱水及び抗酸化の作用を有する（Ｃｈｅｎ，Ｑ．，ａｎｄ  Ｈａｄｄａｄ，Ｇ．Ｇ．，２００４，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ．２０７（Ｐｔ１８）：３１２５−９）。しかし、保護効果のメカニズムは、未だ解明されていない。トレハロースは、すでに細胞の凍結保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）に運用されている（Ａｌｉ  Ｅｒｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８（２）：１６３−７）。そのほか、研究により、トレハロースは、アルツハイマーにおけるアミロイドβタンパク質（β−ａｍｙｌｏｉｄ）の形成を防止すること（Ｌｉｕ，Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  Ｄｉｓ．，２０（１）：７４−８１）と、ハンチントン病（ｈｕｎｔｉｎｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）におけるポリグルタミン（ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ｐｏｌｙＱ））の形成を減少させること（Ｓｏｖａｎ  Ｓａｒｋａｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２８２：５６４１−５６５２）と、が分かっている。
【０００５】
現在、糖尿病におけるグァバの研究は、進展を見せているが、従来の研究の動物モデルの多くが１型糖尿病である。或いは、グァバ果実の可食部位ではなく、グァバの葉を使用したものである（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓ．，２２（１１）：１４５８−６４；Ｔｈｏｍａｓ  Ｅｉｄｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ．，８９：７４−９）。利便性及び嗜好性を高めるため、本発明は、トレハロース入りグァバジュースの２型糖尿病に対する影響及び作用メカニズムを探求する。本発明の目的は、グァバジュース及びトレハロースからなる特殊な組成物が糖尿病における血糖調整効果と腎臓及び膵臓の保護効果とに与える影響を探求することにある。さらに、本発明の目的は、グァバの有効成分であるクェルセチン及び他の活性成分の糖尿病における血糖調整効果を探求することにある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の第１の目的は、有効成分としてグァバ由来のグァバポリフェノール及び海藻由来のトレハロースを含み、生体細胞中の酸化傷害、アポトーシス、オートファジー及び炎症性細胞死を低下させるグァバ果実及びトレハロースからなる２型糖尿病を改善する飲食用組成物を提供することにある。
本発明の第２の目的は、有効成分としてグァバ由来のグァバポリフェノール及び海藻由来のトレハロースを含み、生体細胞中の酸化傷害、アポトーシス、オートファジー及び炎症性細胞死を低下させるグァバ由来のグァバトレハロース及び海藻由来のトレハロースを使用して製造される２型糖尿病を改善する飲食用組成物の使用を提供することにある。
本発明の第３の目的は、有効成分としてグァバ由来のグァバポリフェノール及び海藻由来のトレハロースを含み、飲料又は食品を製造することができ、細胞の酸化傷害、アポトーシス、オートファジー及び炎症性細胞死を低下させるために使用される飲食用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述の課題を解決するために、本発明のグァバポリフェノールは、クェルセチン、エラグ酸、ナリンゲニン及びこれらの混合物からなる群から選択される。
【０００８】
本発明の飲食用組成物は、２μｇ／ｍＬを超えるクェルセチンを含む。
【０００９】
本発明の飲食用組成物は、０．２ｇ／ｋｇを超えるトレハロースを含む。
【００１０】
本発明のグァバポリフェノールは、以下（ａ）及び（ｂ）のステップによって製造される。
（ａ）：グァバを恒温化で研磨してグァバパルプを形成する。
（ｂ）：低酸化還元電位を有するろ液にろ過することができるフィルターでグァバパルプをろ過し、低酸化還元電位を有する上、グァバポリフェノールを含むグァバジュースを取得する。
【００１１】
グァバ由来のグァバポリフェノール及び海藻由来のトレハロースを使用して製造される２型糖尿病を改善する飲食用組成物の使用は、アポトーシス、オートファジー、炎症性細胞死及び細胞の酸化障害を低下させる飲食用組成物を製造することである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のグァバ果実及びトレハロースからなる２型糖尿病を改善する飲食用組成物は、有効成分としてグァバ由来のグァバポリフェノール及び海藻由来のトレハロースを含み、生体細胞中の酸化傷害、アポトーシス、オートファジー及び炎症性細胞死を低下させることができ、２型糖尿病を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明で製造されたグァバジュースのＨ２Ｏ２及びＨＯＣｌに対する抗酸化力を量子化した棒グラフである。
【図２】トレハロースのＨ２Ｏ２及びＨＯＣｌに対する抗酸化力を量子化した棒グラフである。
【図３】本発明で製造されたグァバジュースにショ糖又はトレハロースを異なる比率で混合したもののＨ２Ｏ２及びＨＯＣｌに対する抗酸化力を量子化した棒グラフである。
【図４】ラットにトレハロース水及びブドウ糖水を経口投与した後の血糖変化を示す折れ線グラフである。
【図５】２型糖尿病ラットにグァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースを与えた後の第０週、第２週及び第４週の空腹血糖値の変化を示す棒グラフである。
【図６】２型糖尿病ラットにグァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースを与えた後の第０週、第２週及び第４週の空腹インスリン抵抗性の変化を示す棒グラフである。
【図７】グァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースが２型糖尿病ラットの腎臓に如何に作用するかを示すフリーラジカルを量子化した棒グラフである。
【図８】グァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースが２型糖尿病ラットの血清に如何に作用するかを示すフリーラジカルを量子化した棒グラフである。
【図９】トレハロース入りグァバジュースが腎臓内の４ーＨＮＥ酸化ストレスマーカーに如何に作用するかを示す免疫組織染色写真及びそれを量子化した棒グラフである。
【図１０】トレハロース入りグァバジュースが腎臓内のＩＬー１β炎症マーカーに如何に作用するかを示す免疫組織染色写真及びそれを量子化した棒グラフである。
【図１１】トレハロース入りグァバジュースが腎臓内のｃａｓｐａｓｅ３アポトーシスマーカーに如何に作用するかを示す免疫組織染色写真及びそれを量子化した棒グラフである。
【図１２】トレハロース入りグァバジュースが膵島内のアポトーシス数に如何に作用するかを示す免疫組織染色写真及びそれを量子化した棒グラフである。
【図１３】トレハロース入りグァバジュースが膵臓及び腎臓内のオートファジー及びアポトーシスに如何に作用するかを示すウェスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図１４】トレハロース入りグァバジュースが膵臓及び腎臓内のオートファジー及びアポトーシスに如何に作用するかを示す二重蛍光染色図である。
【図１５】本発明で製造したグァバジュースに含まれるグァバポリフェノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した結果を示すスペクトラム図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的、特徴及び効果を示す実施例を図面に沿って詳細に説明する。
【００１５】
（実施例１）：グァバ果実及びトレハロースからなる飲食用組成物の製造及びその抗フリーラジカル能力
【００１６】
本実施例中、まず、グァバ果実を恒温下において研磨してグァバパルプを製造した。次に、低酸化還元電位を有するろ液にろ過することができるフィルターでグァバパルプをろ過し、低酸化還元電位を有する上、グァバポリフェノールを含むグァバジュースを取得した。上述のフィルターの例としては、台湾特許第Ｉ３３１５４４号（抗酸化効果及び多機能の吸着効果を有するろ過膜及びろ過筒）及び台湾実用新案第Ｍ３７４４６０号（抗酸化水生成器）を参照することができる。
【００１７】
ろ過によって形成されたグァバジュースを化学発光（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：ＣＬ）強化剤ｌｕｍｉｎｏｌ及び化学発光解析機（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）によるフリーラジカル測定法により、抽出物中のフリーラジカル含有量を測定した。測定原理は、被測定物中のフリーラジカルに帯びる電子が化学発光強化剤（ｌｕｍｉｎｏｌ）に伝達されると、フリーラジカルが高エネルギーレベル状態から低エネルギーレベルに変わり、エネルギーの転換によって化学発光強化剤が発光し、発生した光子を解析機の光電子増倍菅（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｕｂｅ：ＰＭＴ）で計数値に変換するものである。
【００１８】
本明細書中の数値は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表示した。データの変異分析を行い、コントロール群と腎臓閉塞群との間の全てのパラメータ差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔを使用して比較を行った。各群間の差は、Ｏｎｅ−ｗａｙ分析を使用して作成した。群間は、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｒａｎｇｅテストを使用して比較を行った。差がＰ＜０．０５に到達したものは、有意差があると見なした。
【００１９】
図１に示すように、グァバジュースは、漂白剤であるＨ２Ｏ２及びＨＯＣｌを除去する良好な抗酸化力を有し、体積濃度が５〜４０％の際、非常に顕著な抗酸化力を有した。また、４０％のグァバジュースが最大の抗酸化力を有した。また、Ｐ＜０．０５の統計的有意差を有した。
【００２０】
図２に示すように、トレハロースが抗酸化力を有するか否かを検出すると共に、トレハロース水のイン・ビトロフリーラジカルを検出した。その結果、トレハロース水は、Ｈ２Ｏ２を除去する能力を有し、Ｐ＜０．０５の統計的有意差を有したが、ＨＯＣｌを除去できなかったため、選択的な抗酸化力を有することが分かった。
【００２１】
図３を参照する。２５Ｓは、２５％のグァバジュースに８％のショ糖を加えたものである。２５Ｔは、２５％のグァバジュースに１２％のトレハロースを加えたものである。４０Ｔは、４０％のグァバジュースに１２％のトレハロースを加えたものである。４０Ｂは、４０％のグァバジュースである。上図は、フリーラジカルのソースとしてＨ２Ｏ２を加え、下図は、フリーラジカルのソースとしてＨＯＣｌを加え、グァバジュースの抗フリーラジカル能力を検出した。その結果、糖類を加えたもの、２５％濃度のグァバジュース及び４０％濃度のグァバジュースは、何れもフリーラジカルを除去する能力を有し、４０Ｔがフリーラジカルを最も顕著に低下させることが示された。
【００２２】
上述の結果から、本発明で製造されるグァバジュースは、低酸化還元電位によって漂白剤であるＨ２Ｏ２及びＨＯＣｌを除去する良好な抗酸化力を有することが分かった。また、グァバジュースの体積濃度が５〜４０％の際、非常に顕著な抗酸化力を有した。また、４０％のグァバジュースがＰ＜０．０５の統計的有意差を有する最大の抗酸化力を有し、６０％のグァバジュースに相当した。このことから、本製造工程条件は、グァバジュースの抗酸化能力を保持する作用を有することが示された。本発明は、グァバジュース（２０〜６０％）にトレハロース（１〜１２％）及びグァバジュース（４０％）を組み合わせたものである。
【００２３】
（実施例２）：ブドウ糖負荷試験（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ：ＯＧＴＴ）及び飲食耐量試験
【００２４】
本実施例中、Ｗｉｓｔａｒ系の６〜８週齢の雌ラット（ｒａｔ）を使用して動物実験を行った。ラットの体重は、何れも＞２００ｇであった。各群は８匹以上で、恒温（２２±２℃）で明暗各１２時間の飼育小屋で飼育した。
【００２５】
高果糖によって高血糖を誘発する動物実験方法は、２１％（Ｗ／Ｖ）以上の果糖を含む飲用水（Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を少なくとも８週継続して投与し、Ｈａｒｌａｎ  Ｔａｋｌａｄ社の配合飼料を４週以上継続して投与してインスリン抵抗性を誘発させた。また、腹腔注射Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ（ＮＡ）（２３０ｍｇ／ｋｇ）＋ＳＴＺ（６５ｍｇ／ｄＬ）を組み合わせて高血糖を誘発させた。翌日の空腹時（１７〜２４時間後）に採血して血糖値を測定し、１３ｍＭ（２３０＋１０ｍｇ％）に達するか超えた場合、２型糖尿病を罹患したと見なした。
【００２６】
誘発に成功した後、ＣＯＮ、ＤＭ、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ５及びＢ１の６群に分けて実験を行った。実験群に対しては、長期（２８日間）に渡って強制経口方式でグァバジュース（４０％）と、トレハロース（５％）及びグァバジュース（４０％）と、を毎日投与した。投与量（ｇ／ｋｇ）は、対照群以外、人体への推薦摂取量の１倍、２倍及び５倍である３種の投与量の群を設けた。動物実験の群分けを表１に示す。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
空腹血糖値の測定は、高血糖の動物を被験体とし、翌日の空腹血糖値を測定した。尾静脈の血液を採取し、バイエル血糖測定器で測定した。
【００２９】
ブドウ糖負荷試験は、翌日の空腹時（１０〜１４時間後）に、ラットにブドウ糖を２ｇ／ｋｇ経口投与し、０．５ｇ／ｋｇ静脈注射した。ラットにブドウ糖を経口投与する前及び投与後の３０分後、６０分後、９０分後及び１２０分後に血糖値を測定すると共に、インスリン濃度を測定した。また、ラットにブドウ糖を静脈注射する前及びした後の１分後、２分後、５分後、１０分後、２０分後、３０分後及び５０分後に血糖値を測定すると共に、インスリン濃度を測定した。飼育試験の開始時、中期及び後期に上記測定を各１回ずつ行い、対照群と比較した。血糖変化及びインスリン変化の曲線下面積（ＡＵＣ及び△ＡＵＣ）を示す。
【００３０】
飲食耐量試験は、正常な動物及び高血糖を誘発した動物を使用し、まず正常な飼料を投与した後、空腹時（１０〜１４時間後）に、強制経口方式で試験サンプルを添加した試験飲食量を投与した。血糖値測定及びインスリン測定方式は、上述のＯＧＴＴと同一である。
【００３１】
図４に示すように、トレハロース水及びブドウ糖水を経口投与する方式で血糖変化を観察した。経口投与後、１分後、５分後、１０分後、２０分後、３０分後及び５０分後において、ブドウ糖水を投与した血糖がトレハロース水を投与した血糖より顕著に高かった。また、Ｐ＜０．０５の統計的有意差を有した。
【００３２】
図５に示すように、グァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースを投与した後の第０週、第２週及び第４週の空腹血糖値の変化図（ｇｌｕｃｏｓｅ＝２ｇ／ｋｇ  ＢＷ）中、Ｔ１、Ｔ２及びＴ５の第４週の空腹血糖が顕著に下降したことが観察された。*ｐ＜０．０５ｖｓ．ｗｅｅｋ０。♯ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＭ４。ＣＯＮは、正常群である。ＤＭは、２型糖尿病群である。Ｂ１は、グァバジュースを飲用した群である。Ｔ１は、１倍のグァバジュースにトレハロースを加えたものを飲用した群である。Ｔ２は、２倍のグァバジュースにトレハロースを加えたものを飲用した群である。Ｔ５は、５倍のグァバジュースにトレハロースを加えたものを飲用した群である。
【００３３】
（実施例３）：インスリン抵抗性（Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）測定
【００３４】
高果糖でインスリン抵抗性を誘発する動物実験方法は、上述の高果糖で高血糖を誘発する動物実験方法と同一である。
【００３５】
試験期間の前期、中期及び後期に空腹血漿を採取し、インスリン濃度の変化を検出した。Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｈｏｍａ  ＩＲ）ｉｎｄｅｘを計算することによってインスリン抵抗性の状況を検査することができる。この測定値は、２型糖尿病が発生する前のインスリン抵抗性が誘発された初期を観察するのに感度の高い指標である。Ｈｏｍａ  ＩＲ  ｉｎｄｅｘは、１９８５年にＭａｔｔｈｅｗｓら（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）によって提供されたものである。２型糖尿病の前、インスリン抵抗性が徐々に発生し、血糖濃度が上がると、膵臓β細胞がさらに多くのインスリンを代償的に分泌し、血糖を正常に維持する。従って、初期においては、空腹血糖値を測定するだけでは、徐々に誘発される２型糖尿病を観察することができない。しかし、Ｈｏｍａ  ＩＲ値によって空腹血糖値及びインスリン数値を使用してインスリン抵抗性を算出することができる。その公式は、ｉｎｓｕｌｉｎ（μＵ／ｍＬ）×ｇｌｕｃｏｓｅ（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５である。
【００３６】
図６に示すように、グァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースを投与した第０週、第２週及び第４週の空腹インスリン抵抗性の変化図から、Ｔ１、Ｔ２及びＴ５は、第４週の空腹インスリン抵抗性が顕著に下降したことを観察することができる。*ｐ＜０．０５ｖｓ．ｗｅｅｋ０。♯ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＭ４。
【００３７】
（実施例４）：グァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースの２型糖尿病ラットの生体腎臓のフリーラジカルへの作用
【００３８】
腎臓生体のフリーラジカルの測定方法は、ラットにＭＣＬＡ（２−Ｍｅｔｈｙｌ−６−（４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−３，７−ｄｉｈｙｄｒｏｉｍｉｄａｚｏ−［１，２−ａ］−ｐｙｒａｚｉｎ−３−ｏｎｅ−ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（０．２ｍｇ／ｍｌ／ｈ，ＴＣＩ−Ａｃｅ，Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｓｅｉ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，  Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を静脈注射し、化学発光分析システム（ＣＬＤ−１１０，Ｔｏｈｏｋｕ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎ．Ｃｏ．，Ｓｅｎｄａｉ，Ｊａｐａｎ）で腎臓生体のフリーラジカルを検出した。
【００３９】
図７に示すように、ＤＭ群の腎臓生体のフリーラジカルが他の群よりも顕著に高く、グァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースが２型糖尿病のラット生体腎臓のフリーラジカルを低下させることを観察することができた。*：ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣＯＮ，♯ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＭ。
【００４０】
（実施例５）：グァバジュース及びトレハロース入りグァバジュースの２型糖尿病のラットの血清のフリーラジカルへの作用
【００４１】
イン・ビトロ血清のフリーラジカルの測定方式は、ラット血液２００μＬを磁石攪拌されるステンレス鋼の反応槽（ｄｉｓｈ）中に入れ、化学冷光分析器中に投入し、１００秒静止させた後、５００μＬのｌｕｍｉｎｏｌ（２ｍｇのｌｕｍｉｎｏｌを４５．５ｍＬの０．９％生理食塩水中に溶かしたもの）を加え、３００秒経過した後、測定を停止し、全てのｃｏｕｎｔ面積を計算し、ｂａｓｅｌｉｎｅ面積を除去して結果を取得した。
【００４２】
図８に示すように、ＤＭ群の血清のフリーラジカルが他の群より顕著に高いことを観察することができた。*：ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣＯＮ，♯ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＭ，^ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｂ１。
【００４３】
（実施例６）：切片染色
【００４４】
（１）：免疫切片染色：酸化ストレスの増加によって炎症、アポトーシス、オートファジー及びｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓが発生する可能性がある。腎臓組織及び膵臓組織のパラフィン包埋切片中、３−ｎｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ（３−ＮＴ）によって酸化ストレスが発生した位置を位置決め評価し、ＬＣ３−IIによってオートファジーを染色し、ＴＵＮＥＬ法によってアポトーシスを評価し、ＩＬ−１βによる染色によってｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓを評価した。一部の腎臓及び膵臓は、１０％のホルマリンで固定し、パラフィンで包埋し、脱蝋及び再水和を行い、１：５０の比率で希釈したポリクローン抗体３−ＮＴ（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，ＵＳＡ）によって免疫組織化学染色を行った。
【００４５】
（２）：Ｍａｓｓｏｎ’ｓ染色：腎臓及び膵臓の組織切片に脱蝋工程を行った後、室温下でＢｏｕｉｎ’ｓ溶液中に４０分間浸漬し、水道流水で１０分間洗浄した。次に、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ溶液に５分間浸漬し、取り出した後、水道流水で１０分間洗浄した。次に、０．７５％のＯｒａｎｇｅ  Ｇで１分間染色し、取り出した後、１％の酢酸に５分間浸漬した。次に、Ｍａｓｓｏｎ  Ｂで１分間染色した後、１％の酢酸に５分間浸漬した。次に、２．５％のｐｈｏｓｐｈｔｕｎｇｓｔｉｃに１５分間浸漬した後、１％の酢酸に５分間浸漬した。最後に、Ａｎｉｌｉｎ  ｂｌｕｅで５分間染色した後、１％の氷酢酸に５分間浸漬して色を固定した。脱水後、切片を封止して保存した。
【００４６】
（３）：蛍光染色：まず、組織をホルマリンで固定し、次に、パラフィン中に包埋し、パラフィン切片機で切片にし、６０℃のオーブンで乾燥させ、脱蝋（アセトン中に５分間浸漬する作業を３度行った）し、再水和（９９．９％のエタノールに５分間浸漬し、９５％のエタノールに５分間浸漬し、７５％のエタノールに５分間浸漬した）した。次に、抗原賦活化（Ａｇ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を行った。スライドガラスをクエン酸ナトリウム修復液中に浸漬し、１０分間煮沸した。２０分間冷却した後、ＰＢＳに１０分間浸漬した。次に、５％のＢＳＡで１時間培養し、非特異性の結合を阻害した。一次蛍光抗体によって４℃で１８時間培養し、その後、ＰＢＳで５分間洗浄する作業を３度行った。再びＰＢＳでｈｅｏｃｈｓｔを１０００倍に希釈し、室温中で１時間培養した。次に、ＰＢＳで５分間洗浄する作業を３度行い、最後に、包埋剤（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）で封止した。
【００４７】
図９に示すように、トレハロース及びグァバジュースが共に摂取されると、腎臓の酸化ストレス及び炎症反応が低下することを観察することができた。このため、トレハロース入りグァバジュースは、腎臓内の４−ＨＮＥ酸化ストレスを低下させ、グァバジュースの２型糖尿病に対する保護効果を高めることできることが分かった。*：ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣＯＮ，♯ｐ＜０．０５ｖｓ．Ｂ１。
【００４８】
図１０に示すように、トレハロース及びグァバジュースが共に摂取されると、腎臓の炎症反応が低下することを観察することができた。このため、トレハロース入りグァバジュースは、腎臓内のＩＬ−１β炎症マーカーを低下させ、グァバジュースの２型糖尿病に対する保護効果を高めることできることが分かった。*：ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣＯＮ，♯ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＭ。
【００４９】
図１１に示すように、トレハロース及びグァバジュースが共に摂取されると、腎臓が傷害を受けるのが低下することを観察することができた。このため、トレハロース入りグァバジュースは、腎臓内のｃａｓｐａｓｅ３によって制御されるアポトーシスマーカーを低下させ、グァバジュースの２型糖尿病における腎臓、腎糸球体及び腎細菅に対する保護効果を高めることできることが分かった。*：ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣＯＮ，♯ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＭ。
【００５０】
図１２に示すように、トレハロース及びグァバジュースが共に摂取されると、膵臓が２型糖尿病によって傷害を受ける程度が低下することを観察することができた。このため、トレハロース入りグァバジュースは、膵島内のアポトーシス数を低下させ、グァバジュースの２型糖尿病における膵臓に対する保護効果を高めることできることが分かった。*：ｐ＜０．０５ｖｓ．ＣＯＮ，♯ｐ＜０．０５ｖｓ．ＤＭ。
【００５１】
図１３に示すように、トレハロース入りグァバジュースは、腎臓内のアポトーシス数及びオートファジー数を低下させ、グァバジュースの２型糖尿病における腎臓に対する保護効果を高めることができることを観察することができた。トレハロース及びグァバジュースを合わせて摂取すると、腎臓が２型糖尿病によって傷害を受ける程度を低下させることができることが分かった。
【００５２】
図１４に示すように、トレハロース入りグァバジュースは、腎臓内のアポトーシス数及びオートファジー数を低下させ、グァバジュースの２型糖尿病における腎臓に対する保護効果を高めることができることを観察することができた。トレハロース及びグァバジュースを合わせて摂取すると、腎臓が２型糖尿病によって傷害を受ける程度を低下させることができることが分かった。
【００５３】
（実施例７）：グァバジュース内のグァバポリフェノールの有効成分を測定するＨＰＬＣ条件及びＨＰＬＣ測定工程
【００５４】
ＨＰＬＣ測定工程：
2016182110.tif 000004
【００５５】
使用したＨＰＬＣ条件：
2016182110.tif 000005
【００５６】
図１５に示すように、ＨＰＬＣ分析によって「グァバポリフェノール」の成分は、主にクェルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）であり、エラグ酸（ｅｌｌａｇｉｃ  ａｃｉｄ）、ナリンゲニン（ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）などの他の成分の含有量は、少なく、ｒｏｓｍａｒｉｎｉｃ  ａｃｉｄ及びｆｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄは、測定されなかった。
【００５７】
上述の複数の実施例から、飲食耐量試験中、グァバジュース及びトレハロースの投与量の増加は、血糖変化に影響を与えないことを観察することができたため、トレハロース入りグァバジュースを強制経口投与した後の血糖反応は、穏やかであることが示される。トレハロース入りグァバジュースを４週連続して強制経口投与した後、２型糖尿病の血糖制御に顕著な効果が見られなかったのは、トレハロース入りグァバジュースを投与した期間が短すぎたためであると考えられる。糖尿病の後期においては、膵島細胞が破壊され、インスリンが正常に分泌されない。しかし、図５から、Ｔ５群のインスリン分泌量がＤＭ群より高いことが観察され、トレハロース入りグァバジュースの摂取によって膵島細胞が保護され、インスリンを分泌させたように観察される。しかし、インスリンの分泌が血糖に顕著な影響を与えているわけではない。イン・ビトロフリーラジカル中において、グァバジュースに顕著な抗酸化効果があることは、従来の研究に符合する。グァバジュースを４週摂取した後、血清中のフリーラジカルも顕著に低下した。このことから、摂取されたグァバジュース中の抗酸化物質が血液中のフリーラジカルを除去できることが証明された。また、トレハロース水の抗酸化能力は、グァバジュースに及ばず、濃度と正相関しないが、トレハロース入りグァバジュースを摂取した後の血清のフリーラジカルは、グァバジュースのみを摂取した群よりも低かった。このことから、トレハロースは、ラットに吸収された後、血液のフリーラジカルの除去に一定の補助効果があると推測される。本発明の実施例中の免疫切片及び蛍光染色の結果は、何れもトレハロース入りグァバジュースが抗酸化、抗炎症、抗ｐｙｒｏｐｔｏｓｉｓ、抗ａｕｔｏｐｈａｇｙ及び抗ａｐｏｐｔｏｓｉｓの効果がある上、投与量と正相関することが示された。
【００５８】
また、上述の実施例から、２０〜６０％のグァバジュース及び１〜１２％のトレハロースからなる飲食用組成物は、血糖を調節できることを観察することができた。その主な作用を以下（１）〜（３）に示す。（１）：空腹血糖を低下させる。（２）：インスリン抵抗性を低下させる。（３）：インスリン生成細胞を保護し、高血糖及び活性酸素から保護し、インスリンの生成を向上させる。トレハロース成分を添加したグァバジュースは、Ｈ２Ｏ２及びＨＯＣｌを除去する抗酸化能力がグァバジュース成分のみの効果より優れる。また、上述の（１）、（２）及び（３）の作用もトレハロース成分を添加したグァバジュースの方がグァバジュース単独より優れる。トレハロース成分を添加したグァバジュースの方がグァバジュース単独より優れる理由は、本発明の飲食用組成物が生体腎臓及び膵臓の細胞の酸化傷害、アポトーシス、オートファジー及び炎症性細胞死を顕著に低下させることができるためである。また、ＨＰＬＣ分析から本発明によって製造されるグァバジュース中の「グァバポリフェノール」の主な活性成分は、クェルセチンであり、「トレハロース」との共同作用の下、グァバジュースの２型糖尿病に対する保護効果を高めることができることが分かった。このため、本発明で製造されるグァバジュース及びトレハロースが合わせて摂取されると、腎臓及び膵臓の酸化ストレス及び炎症反応を低下させることができる。
【００５９】
本発明によって最適な摂取量が体重１ｋｇにつき４ｍｌ（４ｍＬ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）であることが発見された。即ち、体重５０ｋｇの場合、毎日約２００ｍＬが最適量である。また、２倍の摂取量（毎日４００ｍＬ／５０ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）でも相当の効果があった。５倍の摂取量（１０００ｍＬ／５０ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）の場合、毒性作用は見られなかった。このため、本発明のトレハロース及びグァバジュースからなる飲食用組成物は、高摂取量でも無毒性であり、傷害が発生しないことが分かった。
【００６０】
表２に示すように、２型糖尿病患者が飲用するグァバジュースは、濃度が高いほどグァバジュースに含まれる「グァバポリフェノール」が多く、有効成分であるクェルセチンが最も多く含まれ、ＨＰＬＣ量子化の結果、２．５３±０．３１μｇ／ｍＬ（毎日５００μｇ／２００ｍＬのＴ１群）、５．０５±０．８０μｇ／ｍＬ（毎日１０００μｇ／４００ｍＬのＴ２群）及び１２．６３±１．６８μｇ／ｍＬ（毎日２５００μｇ／１０００ｍＬのＴ５群）であった。また、これらの「グァバポリフェノール」であるクェルセチンを含むグァバジュース内には、トレハロースが０．２ｇ／ｋｇ体重（毎日１０ｇ／２００ｍＬのＴ１群）、０．４ｇ／ｋｇ体重（毎日２０ｇ／４００ｍＬのＴ２群）及び１ｇ／ｋｇ体重（毎日５０ｇ／１０００ｍＬのＴ５群）含まれる。本発明のトレハロース及びグァバジュースからなる飲食用組成物は、インスリン分泌を改善することができる。
【００６１】
【表２】
2016182110.tif 000006
【００６２】
本発明は、液体状態であるトレハロース入りグァバジュースを粉末、錠剤などの固体の健康食品に応用することができる。即ち、本発明のグァバ果実及びトレハロースからなる飲食用組成物を食品又は薬学的に使用される液体又は固体のキャリア（例えば、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、付型剤、粘着剤、崩壊剤、潤滑剤など）と混合し、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤などの固形剤、通常液剤、沈殿防止剤、乳剤などの液剤など、如何なる態様にすることができ、何れも本発明の効果を達成することができる。
【００６３】
本明細書で引用した参考文献は、論文、刊行物、特許文献、発表、文字、報道、教科書、冊子、書籍、インターネット上の文章、既刊文章、定期刊行物などの全てを含み、引用方式で本明細書に含まれる。本明細書中の参考資料は、発明者の主張を総括するためのみに使用し、参考資料が構成する従来技術を認めるものではない。
【００６４】
すでに特定の用語、装置及び方法を使用して本発明の実施例を開示したが、実施例は、本発明の説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の特許請求の範囲の主旨を逸脱しない範囲において変更を行うことができる。また、各実施例は、全部又は一部を置換することができる。例を挙げると、実施例中で液体の健康食品又は栄養補助食品を製造する方法を例示したが、本発明は、他の使用方式も含む。即ち、特許請求の範囲の主旨は、本明細書中の態様によって限定されない。
【００６５】
上述の説明から分かるように、本発明は、所望の目的を確実に達成することができ、２型糖尿病が腎臓及び膵臓に引き起こす酸化ストレス及び炎症反応を低下させることができる。また、グァバジュースの嗜好性を高めることができる。本発明は、極めて高い産業上の利用性を有し、法律に基づいて特許申請を行う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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