(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｄ−酒石酸の製造原料である、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する酵素である４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素をコードするＤＮＡが組み込まれたベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体及び、その用途等の提供。【解決手段】４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素である特定な配列からなるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、特定な配列からなる塩基配列からなるＤＮＡから大腸菌等で作られる転写翻訳産物から、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素。２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸に前記４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を作用させて、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する方法。なお、４−ケト−Ｄ−アラボン酸はＤ−グルコースを出発原料として、Ｄ−グルコン酸次に２−ケト−Ｄ−グルコン酸を経て、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を合成して合成する４−ケト−Ｄ−アラボン酸の合成方法。【選択図】図３
2016106620.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを含む４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素；（ａ）配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成するポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のＤＮＡを含む形質転換用ベクター；
（ｃ）配列表の配列番号２の塩基配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を発現するＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号２の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を発現するＤＮＡ。
（ｅ）請求項１記載の（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項４】
前記形質転換体が、大腸菌である請求項３に記載の形質転換体。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載の形質転換体を培養し、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を含む培養物を得る工程を有する４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素の製造方法。
【請求項６】
請求項３または請求項４に記載の形質転換体を、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸に接触させることにより、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【請求項７】
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸と、請求項１に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を用いた４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【請求項８】
前記４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素が、前記形質転換体の無細胞抽出液に含有されている酵素、又は前記無細胞抽出液から得られた酵素である、請求項７に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【請求項９】
Ｄ−グルコースに対して、Ｄ−グルコースからＤ−グルコン酸を生成する酵素、Ｄ−グルコン酸から２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成する酵素、Ｄ−グルコン酸から２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成する酵素、２−ケト−Ｄ−グルコン酸から２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生成する酵素、および、請求項１に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素、を作用させる工程を含む、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−酒石酸は、光学活性を有する物質で、医薬品、農薬などを製造する際の光学分割剤や不斉化合物の原料として用いられると共に、Ｄ−酒石酸誘導体の原料としても工業的に利用されている重要な物質である。一方、アラボン酸類の１つである４−ケト−Ｄ−アラボン酸は、Ｄ−酒石酸の製造原料に利用することができる有用な物質である（特許文献１）。
【０００３】
ところで、４−ケト−Ｄ−アラボン酸は、Ｄ−グルコースを出発材料として、キノプロテイン  Ｄ−グルコース  デヒドロゲナーゼ（ｑｕｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＤＨ）がＤ−グルコースを酸化することによりＤ−グルコン酸を生成し、またフラボプロテイン  Ｄ−グルコネート  デヒドロゲナーゼ（ｆｌａｖｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＡＤＨ）がＤ−グルコン酸を酸化することにより２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成し、さらに２−ケト−Ｄ−グルコネート  デヒドロゲナーゼ（２−ｋｅｔｏ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：２ＫＧＤＨ）が２−ケト−Ｄ−グルコン酸を酸化することにより２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生成し、最終的に２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸が合成される経路が酢酸菌にあることが知られている（非特許文献１、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１７１９２７号公報
【特許文献２】特開２０１２−１３１７６５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ｐｐ．  ２４７−３０１  （１９９４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記の合成経路による４−ケト−Ｄ−アラボン酸の合成は、発酵法や休止菌体反応、あるいは微生物の粗画分を用いて行うことが多く、生産効率が良くない。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する酵素のポリペプチドを取得し、該ポリペプチドを含む４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を量産せしめ、該４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を用いて、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を高効率で安定的に製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明はこの問題点を解決するためになされたものであって、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を著量に産生する目的でなされたものである。そして該目的達成のため、発明者は、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する新たな酵素を発見し、そのアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素が、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造に利用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は下記のものを提供する。
（１）  以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドを含む４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素；
（ａ）配列表の配列番号１のアミノ酸配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成するポリペプチド。
（ｂ）配列表の配列番号１において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成するポリペプチド。
【００１０】
（２）  以下の（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のＤＮＡを含む形質転換用ベクター；
（ｃ）配列表の配列番号２の塩基配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を発現するＤＮＡ。
（ｄ）配列表の配列番号２の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を発現するＤＮＡ。
（ｅ）（１）記載の（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００１１】
（３）  （２）に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【００１２】
（４）  前記形質転換体が、大腸菌である（３）に記載の形質転換体。
【００１３】
（５）  （３）または（４）に記載の形質転換体を培養し、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を含む培養物を得る工程を有する４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素の製造方法。
【００１４】
（６）  （３）または（４）に記載の形質転換体を、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸に接触させることにより、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【００１５】
（７）  ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸と、（１）に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を用いた４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【００１６】
（８）  前記４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素が、前記形質転換体の無細胞抽出液に含有されている酵素、又は前記無細胞抽出液から得られた酵素である、（７）に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【００１７】
（９）  Ｄ−グルコースに対して、Ｄ−グルコースからＤ−グルコン酸を生成する酵素、Ｄ−グルコン酸から２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成する酵素、Ｄ−グルコン酸から２−ケト−Ｄ−グルコン酸を生成する酵素、２−ケト−Ｄ−グルコン酸から２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生成する酵素、および、（１）に記載の４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素、を作用させる工程を含む、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の製造方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素をコードするＤＮＡが組み込まれたベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、および、それらの用途を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】配列番号２記載のＤＮＡとｐＬＥＡＤ４  ＤＮＡとの連結、および組換えベクターＤＮＡを示す。
【図２】配列番号２記載のＤＮＡが導入されたプラスミドを有する大腸菌をテンプレートにしたＰＣＲを行い、１．５％アガロースゲルで電気泳動した図である。レーン１−４はＤＮＡ配列が挿入されたプラスミドであり、レーン５はＤＮＡ配列が挿入されていないプラスミドである。レーン６はＤＮＡマーカーを示す。
【図３】図２に記載の各ベクターで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を培養し、培養後の無細胞抽出液サンプルを、１２．５％ポリアクリルアミドゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動した図である。各レーンは、図２の各クローンに由来するサンプルである。レーン６はマーカータンパク質を示す。
【図４】０．８Ｍ〜２Ｍ硫酸アンモニウム沈澱画分の疎水性相互作用クロマトグラフィーによる溶出結果を示す。
【図５】疎水性相互作用クロマトグラフィーの活性画分の１０％ポリアクリルアミドゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す。レーン１はタンパク質マーカー、レーン２は無細胞抽出液、レーン３は分画番号２、レーン４は分画番号３、レーン５は分画番号４、レーン６は分画番号５、レーン７は分画番号６、レーン８は分画番号７を示す。矢印は分子サイズで４６ｋＤａの位置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
【００２１】
（ポリペプチドおよびＤＮＡ）
本発明にかかる４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むものであり、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を有するものであれば、配列番号１に記載のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含んでもよいし、含まなくてもよい。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド以外にも、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を有するポリペプチドであってもよい。なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、配列番号２に記載の塩基配列から転写翻訳されたアミノ酸配列と１００％の相同性を有する。
【００２２】
配列番号２に記載の塩基配列は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースに登録された、グルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  ３５０４の塩基配列（ｌｏｃｕｓ＿ｔａｇ＝“ＧＬＳ＿ｃ０４２４０”）との間に、１００％の相同性を認める。また、本発明にかかるＤＮＡは、配列番号２に記載の塩基配列からなり、かつ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を発現するＤＮＡ、配列番号２に記載の塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入され、かつ配列番号２に記載の塩基配列と同じ酵素活性を発現するＤＮＡ、または配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００２３】
本発明のＤＮＡのホモログとしては、上記のように、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された配列番号２に記載の塩基配列からなり、かつ配列番号２に記載の塩基配列と同じ酵素活性を発現するもの、または配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を有する酵素をコードするＤＮＡを挙げることができる。当業者は、ある塩基配列を元に、適宜欠失、置換、付加および／または挿入の変異を導入することにより、このようなＤＮＡのホモログを得ることができる。例えば、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡに、部位特異的変異導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  （１９８２）  １０：６４８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  （１９８３）  １００：４４８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，  ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；ＰＣＲ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）ｐｐ．２００）などを用いて、任意の変異を導入することができる。
【００２４】
また、あるタンパク質において、近縁種のホモログ配列を持つタンパク質と比較した場合に、各タンパク質間で高度に保存されているアミノ酸残基は、そのタンパク質の機能に必須であることが知られている（マッキー生化学：分子から解き明かす生命、第５章、１３２ページ）。つまり、高度に保存されているアミノ酸残基以外のアミノ酸残基は、欠失・置換・付加および／または挿入が許容されやすい。
【００２５】
例えば、配列番号１のアミノ酸配列をＤＤＢＪのｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐ：／／ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔｐ？ｌａｎｇ＝ｊａ）にクエリし、検出されたホモログ配列から、グルコノバクター  オキシダンス  ＤＳＭ  ３５０４と同じ酢酸菌由来のホモログ配列を抽出し（例えば、
ｔｒ｜Ａ０Ａ０６７Ｚ０Ｘ０｜Ａ０Ａ０６７Ｚ０Ｘ０＿ＧＬＵＯＹ＿Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ＿ｏｘｙｄａｎｓ＿ＤＳＭ＿３５０４＿ＧＮ＝ＧＬＳ＿ｃ０４２４０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｑ５ＦＴＶ９｜Ｑ５ＦＴＶ９＿ＧＬＵＯＸ＿Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ＿ｏｘｙｄａｎｓ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿６２１Ｈ＿＿ＧＮ＝ＧＯＸ０４０４＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｋ７ＳＪＲ４｜Ｋ７ＳＪＲ４＿ＧＬＵＯＹ＿Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ＿ｏｘｙｄａｎｓ＿Ｈ２４＿ＧＮ＝Ｂ９３２＿１９７４＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｔ１ＤＹ２６｜Ｔ１ＤＹ２６＿ＧＬＵＴＨ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ＿ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ＿ＮＢＲＣ＿３２５７＿ＧＮ＝ＮＢＲＣ３２５７＿０５２３＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｍ９Ｍ４Ｚ５｜Ｍ９Ｍ４Ｚ５＿ＧＬＵＴＨ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ＿ｔｈａｉｌａｎｄｉｃｕｓ＿ＮＢＲＣ＿３２５５＿ＧＮ＝ＮＢＲＣ３２５５＿１１７７＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｇ６ＸＬＰ２｜Ｇ６ＸＬＰ２＿９ＰＲＯＴ＿Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ＿ｍｏｒｂｉｆｅｒ＿Ｇ７０７＿ＧＮ＝ＧＭＯ＿２２９１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｖ８Ａ６Ｆ４｜Ｖ８Ａ６Ｆ４＿９ＰＲＯＴ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｓａｉａ＿ｓｐ．＿ＳＦ２．１＿ＧＮ＝Ｐ７９２＿１０８７５＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ａ０Ａ０６０ＱＧ５５｜Ａ０Ａ０６０ＱＧ５５＿９ＰＲＯＴ＿Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ａｓａｉａ＿ｐｌａｔｙｃｏｄｉ＿ＳＦ２．１＿ＧＮ＝ＡＳＡＰ＿２０７９＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｆ７ＶＩＵ３｜Ｆ７ＶＩＵ３＿９ＰＲＯＴ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ＿ＮＢＲＣ＿１０１６５４＿ＧＮ＝ＡＴＰＲ＿３２９２＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｈ１ＵＰＫ４｜Ｈ１ＵＰＫ４＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ｓｕｂｓｐ．＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＬＭＧ＿１２６２＿＝＿ＮＢＲＣ＿１０６４７１＿ＧＮ＝ＡＰＳ＿１１８７＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｈ１ＵＨＸ２｜Ｈ１ＵＨＸ２＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＮＢＲＣ＿１０１６５５＿ＧＮ＝ＡＰＴ＿１７４３＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｓ６Ｄ６Ｘ２｜Ｓ６Ｄ６Ｘ２＿ＡＣＥＰＡ＿Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿３８６Ｂ＿ＧＮ＝ＡＰＡ３８６Ｂ＿１５４７＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７ＪＴＲ０｜Ｃ７ＪＴＲ０＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＩＦＯ＿３２８３−０７＿ＧＮ＝ＡＰＡ０７＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７ＫＭＩ７｜Ｃ７ＫＭＩ７＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＩＦＯ＿３２８３−３２＿ＧＮ＝ＡＰＡ３２＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７ＪＡＵ２｜Ｃ７ＪＡＵ２＿ＡＣＥＰ３＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿ＮＢＲＣ＿３２８３＿／＿ＬＭＧ＿１５１３＿／＿ＣＣＴＭ＿１１５３＿＿ＧＮ＝ＡＰＡ０１＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７ＫＤ７１｜Ｃ７ＫＤ７１＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＩＦＯ＿３２８３−２６＿ＧＮ＝ＡＰＡ２６＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７Ｋ４０２｜Ｃ７Ｋ４０２＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＩＦＯ＿３２８３−２２＿ＧＮ＝ＡＰＡ２２＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７Ｌ６Ｄ９｜Ｃ７Ｌ６Ｄ９＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＩＦＯ＿３２８３−１２＿ＧＮ＝ＡＰＡ１２＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７ＪＪＪ２｜Ｃ７ＪＪＪ２＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＩＦＯ＿３２８３−０３＿ＧＮ＝ＡＰＡ０３＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｃ７ＫＷＶ２｜Ｃ７ＫＷＶ２＿ＡＣＥＰＡ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ＿ＩＦＯ＿３２８３−０１−４２Ｃ＿ＧＮ＝ＡＰＡ４２Ｃ＿００６１０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ａ０Ａ０６３Ｘ５Ｙ８｜Ａ０Ａ０６３Ｘ５Ｙ８＿ＡＣＥＡＣ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ａｃｅｔｉ＿１０２３＿ＧＮ＝ＡＺ０９＿０１１７５＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｆ１ＹＵＦ１｜Ｆ１ＹＵＦ１＿９ＰＲＯＴ＿Ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｐｏｍｏｒｕｍ＿ＤＭ００１＿ＧＮ＝ＡＰＯ＿１５７３＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｆ８ＥＵＺ５｜Ｆ８ＥＵＺ５＿ＺＹＭＭＴ＿Ｍａｊｏｒ＿ｒｏｙａｌ＿ｊｅｌｌｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ＿ｍｏｂｉｌｉｓ＿ｓｕｂｓｐ．＿ｐｏｍａｃｅａｅ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿２９１９２＿／＿ＪＣＭ＿１０１９１＿／＿ＮＢＲＣ＿１３７５７＿／＿ＮＣＩＭＢ＿１１２００＿／＿ＮＲＲＬ、
ｔｒ｜Ａ９ＨＢＥ２｜Ａ９ＨＢＥ２＿ＧＬＵＤＡ＿Ｍａｊｏｒ＿ｒｏｙａｌ＿ｊｅｌｌｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿４９０３７＿／＿ＤＳＭ＿５６０１＿／＿ＰＡｌ５＿＿ＧＮ＝ＧＤＩ０８６１＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｂ２ＩＧ０２｜Ｂ２ＩＧ０２＿ＢＥＩＩ９＿Ｐｕｔａｔｉｖｅ＿ｍａｊｏｒ＿ｒｏｙａｌ＿ｊｅｌｌｙ−ｌｉｋｅ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ＿ｉｎｄｉｃａ＿ｓｕｂｓｐ．＿ｉｎｄｉｃａ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿９０３９＿／＿ＤＳＭ＿１７１５＿／＿ＮＣＩＢ＿８７１２＿＿ＧＮ＝Ｂｉｎｄ＿、
ｔｒ｜Ｇ２Ｉ５Ｚ４｜Ｇ２Ｉ５Ｚ４＿ＧＬＵＭＮ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｍｅｄｅｌｌｉｎｅｎｓｉｓ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿ＮＢＲＣ＿３２８８＿／＿ＢＣＲＣ＿１１６８２＿／＿ＬＭＧ＿１６９３＿／＿Ｋｏｎｄｏ＿５１＿＿ＧＮ＝ＧＬＸ＿１１２９０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝、
ｔｒ｜Ｂ２ＳＺＸ５｜Ｂ２ＳＺＸ５＿ＢＵＲＰＰ＿Ｐｕｔａｔｉｖｅ＿ｍａｊｏｒ＿ｒｏｙａｌ＿ｊｅｌｌｙ−ｌｉｋｅ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ＿ｐｈｙｔｏｆｉｒｍａｎｓ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿ＤＳＭ＿１７４３６＿／＿ＰｓＪＮ＿＿ＧＮ＝Ｂｐｈｙｔ＿００８８＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｗ５ＹＡＬ５｜Ｗ５ＹＡＬ５＿ＫＯＭＸＹ＿Ｍａｊｏｒ＿ｒｏｙａｌ＿ｊｅｌｌｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｘｙｌｉｎｕｓ＿Ｅ２５＿ＧＮ＝Ｈ８４５＿２２９６＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｆ３ＳＣＤ８｜Ｆ３ＳＣＤ８＿９ＰＲＯＴ＿Ｍａｊｏｒ＿ｒｏｙａｌ＿ｊｅｌｌｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｓｐ．＿ＳＸＣＣ−１＿ＧＮ＝ＳＸＣＣ＿０３６７０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ａ０Ａ０７０Ａ６１２｜Ａ０Ａ０７０Ａ６１２＿９ＰＲＯＴ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ＿ｒｈａｅｔｉｃｕｓ＿ＡＦ１＿ＧＮ＝ＧＬＵＣＯＲＨＡＥＡＦ１＿０７１２０＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ａ０Ａ０２３Ｄ８Ｖ５｜Ａ０Ａ０２３Ｄ８Ｖ５＿ＡＣＩＭＴ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ＿ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ＿ＮＢＲＣ＿１０４４３５＿ＧＮ＝Ａｍｍｅ＿１７２＿０２３＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、
ｔｒ｜Ｈ８ＫＺＱ８｜Ｈ８ＫＺＱ８＿ＦＲＡＡＤ＿Ｇｌｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎａｓｅ＿ＯＳ＝Ｆｒａｔｅｕｒｉａ＿ａｕｒａｎｔｉａ＿＿ｓｔｒａｉｎ＿ＡＴＣＣ＿３３４２４＿／＿ＤＳＭ＿６２２０＿／＿ＮＢＲＣ＿３２４５＿／＿ＮＣＩＭＢ＿１３３７０＿＿ＧＮ＝Ｆｒａａｕ＿００６９＿ＰＥ＝４＿ＳＶ＝１、などのホモログ配列）、アミノ酸配列のアライメントを得ることにより、上記の保存されているアミノ酸残基を決定することができる。
【００２６】
配列番号１のアミノ酸配列を含む上記のホモログ配列間で、高度に保存されているアミノ酸残基、つまり上記の全てのホモログ配列間において保存されているアミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸配列において、グルタミン（４２番目のアミノ酸残基）、アラニン（４８番目のアミノ酸残基）、フェニルアラニン（５０番目のアミノ酸残基）、プロリン（５３番目のアミノ酸残基）〜グリシン（５７番目のアミノ酸残基）、アルギニン（６５番目のアミノ酸残基）、フェニルアラニン（６７番目のアミノ酸残基）、フェニルアラニン（７０番目のアミノ酸残基）〜アラニン（７４番目のアミノ酸残基）、ヒスチジン（７７番目のアミノ酸残基）、ロイシン（８２番目のアミノ酸残基）、グルタミン酸（８４番目のアミノ酸残基）、プロリン（１４４番目のアミノ酸残基）、プロリン（１４６番目のアミノ酸残基）、セリン（１５１番目のアミノ酸残基）、プロリン（１５３番目のアミノ酸残基）、ロイシン（１６２番目のアミノ酸残基）、セリン（１６４番目のアミノ酸残基）、ヒスチジン（１６６番目のアミノ酸残基）、グリシン（１６７番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（１７１番目のアミノ酸残基）、グリシン（１７４番目のアミノ酸残基）、トリプトファン（１７７番目のアミノ酸残基）、イソロイシン（１７９番目のアミノ酸残基）〜リジン（１８３番目のアミノ酸残基）、グリシン（１８６番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（１８９番目のアミノ酸残基）〜グリシン（１９３番目のアミノ酸残基）、アラニン（２０４番目のアミノ酸残基）、アルギニン（２１０番目のアミノ酸残基）〜ロイシン（２１２番目のアミノ酸残基）、フェニルアラニン（２２４番目のアミノ酸残基）、グリシン（２３０番目のアミノ酸残基）、プロリン（２３２番目のアミノ酸残基）、プロリン（２３７番目のアミノ酸残基）、プロリン（２４０番目のアミノ酸残基）、グリシン（２４５番目のアミノ酸残基）、グリシン（２４６番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（２４８番目のアミノ酸残基）、ロイシン（２６４番目のアミノ酸残基）、アルギニン（２６７番目のアミノ酸残基）〜チロシン（２７０番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（２７９番目のアミノ酸残基）、ロイシン（２８７番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（２９３番目のアミノ酸残基）、グリシン（２９５番目のアミノ酸残基）、リジン（２９７番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（３０１番目のアミノ酸残基）〜ロイシン（３０３番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（３０６番目のアミノ酸残基）、アルギニン（３１０番目のアミノ酸残基）、チロシン（３１２番目のアミノ酸残基）、トレオニン（３１４番目のアミノ酸残基）、グルタミン酸（３１７番目のアミノ酸残基）〜アスパラギン酸（３１９番目のアミノ酸残基）、イソロイシン（３２１番目のアミノ酸残基）、アルギニン（３２４番目のアミノ酸残基）、グリシン（３２８番目のアミノ酸残基）、アスパラギン酸（３３６番目のアミノ酸残基）、アルギニン（３３８番目のアミノ酸残基）、プロリン（３４２番目のアミノ酸残基）〜イソロイシン（３４５番目のアミノ酸残基）、チロシン（３５３番目のアミノ酸残基）、グリシン（３５７番目のアミノ酸残基）〜トリプトファン（３５９番目のアミノ酸残基）、アルギニン（３６１番目のアミノ酸残基）、ロイシン（３６２番目のアミノ酸残基）、グリシン（３６８番目のアミノ酸残基）、アルギニン（３７２番目のアミノ酸残基）、プロリン（３７５番目のアミノ酸残基）、チロシン（３７６番目のアミノ酸残基）、ロイシン（３７８番目のアミノ酸残基）、プロリン（３８２番目のアミノ酸残基）、である。つまり、配列番号１に記載のこれらのアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を、欠失・置換・付加および／または挿入の対象としてもよいし、しなくてもよい。
【００２７】
タンパク質においてアミノ酸残基を置換する場合、特に、側鎖の化学的性質が類似したアミノ酸による置換、いわゆる保存的なアミノ酸置換を行うことが好ましい。アミノ酸は、それらの側鎖の化学的性質に従い、例えば、次のように分類される：
（１）中性疎水性側鎖（アラニン、トリプトファン、バリン、フェニルアラニン、プロリン、メチオニン、ロイシン）；
（２）中性極性側鎖（アスパラギン、グリシン、グルタミン、システイン、セリン、チロシン、トレオニン）；
（３）塩基性側鎖（アルギニン、ヒスチジン、リシン）；
（４）酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸）；
（５）脂肪族側鎖（アラニン、イソロイシン、グリシン、バリン、ロイシン）；
（６）脂肪族水酸基側鎖（セリン、トレオニン）；
（７）アミン含有側鎖（アスパラギン、アルギニン、グルタミン、ヒスチジン、リシン）；
（８）芳香族側鎖（チロシン、トリプトファン、フェニルアラニン）；および
（９）硫黄含有側鎖（システイン、メチオニン）。
【００２８】
すなわち、これらの各群を構成するアミノ酸残基の相互の置換を、保存的置換と言う。本発明において、「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入」するアミノ酸の数や場所は、上記のポリペプチドあるいはＤＮＡがコードする酵素が２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性を有し、かつ上記の保存されたアミノ酸残基以外のアミノ酸残基であれば、特に制限はされない。変異が許容されるアミノ酸残基の数は、典型的には全アミノ酸の１０％以内、好ましくは全アミノ酸の５％、さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内である。より具体的には、配列番号１のアミノ酸配列において、通常４０以内、好ましくは２０以内、より好ましくは４以内のアミノ酸残基の変異は、許容される。アミノ酸残基の変異数が、上記の数値より大きくなると、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性が低下する可能性がある。
【００２９】
また、配列番号１に記載のアミノ酸配列は、１番目のメチオニン残基〜２８番目のアラニン残基に、Ｔｗｉｎ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（Ｔａｔ）  ｓｉｇｎａｌを有する。このようなシグナル配列を有するタンパク質は、例えばグラム陰性菌を宿主とした場合、ペリプラズムに移行後の成熟タンパク質では、シグナル配列が切断される（化学と生物、Ｖｏｌ．３８、Ｎｏ．４、ｐ２１４−２１５、２０００）。よって、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１番目のメチオニン残基〜２８番目のアラニン残基を、欠失・置換・付加および／または挿入の対象としてもよいし、しなくてもよい。
【００３０】
ポリペプチドあるいはＤＮＡによってコードされる酵素のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の欠失・置換・付加および／または挿入があった場合でも、元の酵素の生物学的活性（２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性）を有していればよい。ここで、生物学的活性とは、元の酵素が触媒する少なくとも一つの反応を触媒する能力を言う。また、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失・置換・付加および／または挿入において、元の酵素の生物学的活性を維持することがより好ましい。「活性の維持」には、同じ活性レベルのみならず、より高い活性も含まれる。また、活性のレベルが低下する場合であっても、実質的に同等の活性であれば、活性の維持に含まれる。実質的に同等とは、元の活性に対して、例えば２０％以上、通常５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、もっとも好ましくは９５％以上の活性を言う。元の活性に対して、上記の数値より小さくなると、酵素の単位活性が悪くなり、同じ量の酵素を用いても、４−ケト−Ｄ−アラボン酸の収率が悪くなる。なお、本発明における酵素の生物学的活性、すなわち２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸から４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成する活性の評価方法は以下に述べる。
【００３１】
（ベクター、形質転換体、酵素生産方法）
本発明にかかるベクターは、本発明にかかる４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素をコードするＤＮＡが組み込まれたものである。ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が用いられ、使用の目的に応じて適宜選択される。
【００３２】
本発明の組換えベクターは、分子生物学、生物工学および遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて構築することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７）参照）。微生物等を宿主として、本発明のＤＮＡを発現させるためには、まず、当該微生物中において安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクター中に該ＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのためには、通常、プロモーターを本発明のＤＮＡの５’側上流に配置する。プロモーターは、転写・翻訳を制御するユニットである。
【００３３】
そして本発明のＤＮＡの３’側下流には、ターミネーターを配置するのが好ましい。プロモーターおよびターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能するものを選択することができる。各種微生物において利用可能なベクター、プロモーターおよびターミネーター等の制御配列は、「微生物学基礎講座８遺伝子工学」（共立出版）などで参照することができる。また、本発明のベクターは、好ましくは、挿入された本発明のＤＮＡの発現に必要とされる制御配列の全ての構成成分を含むものである。さらに、本発明のベクターは、該ベクターが導入された宿主細胞を選択するための選択マーカーを含むことができる。
【００３４】
本発明においては、本発明のＤＮＡに、シグナルペプチドをコードする配列を付加することもできる。シグナルペプチドの付加によって、宿主細胞内で発現されたタンパク質を小胞体内腔に移行させることができる。あるいは、グラム陰性菌を宿主とする場合には、シグナルペプチドによって、宿主細胞内で発現されたタンパク質を、ペリプラズム内、または細胞外へと移行させることができる。利用する宿主細胞において機能することができる任意のシグナルペプチドを利用することができる。従って、宿主にとって異種由来のシグナルペプチドを利用することもできる。さらに必要に応じ、本発明のＤＮＡのベクターへの導入に当たって、リンカー、開始コドン（ＡＴＧ）、終止コドン（ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）等を付加することもできる。
【００３５】
本発明にかかる形質転換体は、本発明にかかるベクターで形質転換されたものである。また、本発明にかかる４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素の製造方法は、本発明にかかる形質転換体を培養して本発明にかかる４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を産生させる工程を含むものである。宿主細胞としては、形質転換用のベクターに適合し形質転換され得るものであればよく、その具体例としては、細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が挙げられる。本発明の好ましいベクターとしては、これに限定されるわけではないが、例えば、大腸菌における発現ベクターｐＬＥＡＤに４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素をコードするＤＮＡを発現可能に挿入した大腸菌  ＪＭ１０９等が挙げられる。
【００３６】
この形質転換体を培養して遺伝子発現させることで、その培養液から本発明にかかる４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を得ることができる。前記培養液は、例えば、当業分野で汎用される、ガラスビーズ、超音波、フレンチプレス、凍結融解、あるいは浸透圧ショック処理等により細胞を破砕し、未破砕の細胞を除去するために遠心分離処理により無細胞系（例えば、無細胞抽出液）とすることができる。分離・精製の手間を省く観点から、前記形質転換体の無細胞抽出液に含有されている状態の前記４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を４−ケト−Ｄ−アラボン酸の合成に使用してもよいが、工業的利用の観点から、前記４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を分離・精製することが好ましい。
酵素の分離・精製は、例えば、当業分野で汎用される硫酸アンモニウム沈澱、ポリエチレングリコール沈澱、酸性沈澱、および、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等の、タンパク質化学において通常使用される方法によって行うことができる。なお、化学合成によって本発明にかかる４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を得ることも当然可能である。
【００３７】
（４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素活性）
本発明では、生成物の定量による４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素の酵素活性を、高速液体クロマトグラフィーを用いて以下のとおりに測定する。
【００３８】
酵素活性は、反応液中に生成した４−ケト−Ｄ−アラボン酸を次のように定量する。移動相として１０％  アセトニトリルを含む２ｍＭ  過塩素酸水溶液を流速０．７  ｍｌ／分で流し、２本のショウデックス  ＲＳｐａｋ  ＤＥ−６１３カラム（６．０ｍｍ内径×１５０ｍｍ長、ショウデックス社製）を直列に用いて、紫外線（ＵＶ）検出器（ＵＶ−８０２０、東ソー社製）を用いて２１０ｎｍの波長で高速液体クロマトグラフィー（ＤＰ−８０２０、東ソー社製）（本文中以下、「ＨＰＬＣ」と記載する）分析を行い、４−ケト−Ｄ−アラボン酸を定量する。比較対照として“酵素なし”の反応液で検出された４−ケト−Ｄ−アラボン酸の量を差し引いた値を該酵素による４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生成量とした。４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素活性は１ｍｇのタンパク質あたり、３時間で生成する４−ケト−Ｄ−アラボン酸のモル数と定義する。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を示して本発明の詳細を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
＜細菌およびベクター＞
形質転換用の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）としてＪＭ１０９株（タカラバイオ株式会社製）を用い、タンパク質発現用ベクターとしてｐＬＥＡＤ４、ｐｒｅ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ（株式会社ニッポンジーン社製）を使用した。
【００４０】
＜大腸菌による異種宿主発現系構築および組換え酵素の発現・精製＞
グルコノバクター  オキシダンス由来の４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素遺伝子を大腸菌  ＪＭ１０９において異種宿主発現させるため、以下の手順により発現用プラスミドを構築した。
１．配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡを、フォワードプライマー１（５’−ＧＴＡＴＧＡＡＧＣＧＡＣＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＧＣ−３’）およびリバースプライマー１（５’−ＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＣＴＧＣＧ−３’）のプライマーセットを用いて、次のＰＣＲ条件で増幅を行った。ＰＣＲ反応用チューブの１チューブあたり、５μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋プラス）、各４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ（タカラバイオ株式会社製）、５μｌの１０μＭフォワードプライマー１と５μｌの１０μＭリバースプライマー１、３μｌの７８．３ｎｇ／μｌ  配列番号２記載のＤＮＡを含むテンプレート、０．２５μｌの２５０Ｕ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製）、および２７．７５μｌの滅菌蒸留水を加えた５０μｌの反応液を、予め９４℃で余熱したサーマルサイクラー（エッペンドルフ株式会社製）を用いて９４℃で４分間、９８℃間で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で９０秒間の処理を３０回繰り返して、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後、アガロース電気泳動により期待する長さのインサートが増幅されていることを確認した。
【００４１】
２．次に、得られた各インサートＤＮＡをｐＬＥＡＤ４ベクターのＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素サイトに挿入するために、メーカーのマニュアルに従って、ｐＬＥＡＤ４  ＤＮＡ、およびインサートＤＮＡを以下のように加工した。ｐＬＥＡＤ４  ＤＮＡは１０μｌの０．２μｇ／μｌ  ｐＬＥＡＤ４  ＤＮＡ、２μｌの１０×Ｍバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭジチオトレイトール、５００ｍＭ  ＮａＣｌ）、２μｌの１Ｕ／μｌ  ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ株式会社製）からなる２０μｌの混合液を３７℃で２時間、インキュベーションによりＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素処理を行い、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ  ダイアグノスティックス株式会社製）で精製し、得られたｐＬＥＡＤ４  ＤＮＡは１０μｌの滅菌蒸留水に溶解して、２００ｎｇ／μｌの溶液を調製した。一方、ＰＣＲ増幅反応で得たインサートＤＮＡもＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、９５．９ｎｇ／μｌのインサートＤＮＡ溶液を得た。得られたインサートＤＮＡはブランチング  バッファー中、ＫＯＤ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡株式会社製）により７２℃で２分間、平滑化を行い、得られた反応液をＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、続いてＭバッファー中で、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ制限酵素により３７℃で２時間、消化し、得られた反応液はＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔで精製し、さらに１ｍＭ  ＡＴＰを含むＴ４  ポリヌクレオチド  キナーゼ  バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）中で、５Ｕ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ株式会社製）により３７℃で３０分間、リン酸化し、そのリン酸化処理液はメーカーのマニュアルに従って濃縮・精製を行った。最後に、得られた各インサートは１０μｌの滅菌蒸留水に溶解して、９５．９ｎｇ／μｌのインサート溶液を得た。
【００４２】
３．次に、調製したインサートをマニュアルに従って、ｐＬＥＡＤ４に挿入した。滅菌した１．５ｍｌ容マイクロチューブに１μｇのｐＬＥＡＤ４  ＤＮＡ、０．１μｇのインサートを加えて、１０μｌのＴ４リガーゼハイ（東洋紡株式会社製）を添加して、１６℃で１５分間、静置した。このようにして得られるプラスミドマップを図１に示す。続いて、−８０℃で凍結保存したコンピテント大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ株式会社製）をすばやく解凍し、９０μｌの懸濁液を加えて、氷上で３０分間、静置した。そのあと、４２℃で４５秒間、加温処理し、速やかに氷上で５分間静置した。９００μｌのＳＯＣ培地（タカラバイオ株式会社製）を加えて、チューブをゆっくり転倒させて混合し、３７℃で１時間、ゆっくり振とうした。４℃、６，０００回転で５分間遠心を行い、上清を除去し、細胞ペレットに３００μｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬＢ液体培地を加えて、ピペットでゆっくり懸濁し、５０、２００μｌの懸濁液を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレートに塗布した。プレートは３７℃で１６時間、培養を行った。生育した任意のコロニーを１００μｇ／ｍｌ  アンピシリンを加えたＬＢ寒天プレートに先細のプラスチック製のエーゼで割線するとともに、エーゼに少量残った細胞を下記のコロニーＰＣＲ用反応液に懸濁した：ＰＣＲ用チューブでチューブあたり、１２．５μｌのＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ（登録商標）  ＭＡＸ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭＩＸ（タカラバイオ株式会社製）、１μＭのフォワードプライマー２（ｐＬＥＡＤ−ｆｗｄ：５’−ＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＧＣＴＣＧ−３’）および１μＭのリバースプライマー２（ｐＬＥＡＤ−ｒｅｖ：５’−ＣＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧ−３’）、および１２．４μｌの滅菌蒸留水を加えて２５μｌにした。それらのＰＣＲ用チューブを、予め９４℃で余熱したサーマルサイクラー（エッペンドルフ株式会社製）を用いて９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分間の処理を３０回繰り返してＰＣＲ反応を行った。その後、ＰＣＲ反応液の２μｌ、およびＤＮＡマーカーＭ２４（１００ｂｐ＋１．５Ｋｂｐ、ＳｉｂＥｎｚｙｍｅ  Ｌｔｄ．）を１．５％アガロースゲル電気泳動で分析を行ない、インサートの有無、サイズを確認した。その結果、図２に示すようにインサートを持たないクローン（Ｃ２Ｎ）以外（Ｃ３，Ｃ４，Ｃ７，Ｃ９）は、いずれの形質転換クローンも、予想される約１，４００ｂｐのインサートサイズをもつことが確認され、シーケンスにより挿入された配列が配列番号２に記載されるＤＮＡを含むものであることを確認した。
【００４３】
４．次に、このようにして得られた大腸菌が実際にタンパク質を発現しているかについて、確認を行った。上記と同じように、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレート上で生育しているＣ３，Ｃ４，Ｃ７，Ｃ９の大腸菌ＪＭ１０９形質転換クローン、およびネガティブコントロールとしてＣ２Ｎの細胞を３ｍｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬＢ液体培地入りの試験管で、３７℃、１２０回転で、往復振とう培養を行った培養液を２ｍｌ容マイクロチューブに移し、４℃、１１，０００ｒｐｍで２分間、遠心を行って細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットに１００μｌの細胞破砕バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０中に１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、３０μｇ／ｍｌフッ化フェニルメチルスルホニル、２ｍＭジチオトレイトール）と１００μｌの２×サンプルバッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８中に４％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０２％ブロモフェノールブルー、５ｍＭジチオトレイトール）を添加して、９０℃で２分間加熱した。加熱処理後、１５，０００回転で５分間、遠心を行い、５μｌの上清、およびタンパク質分子量マーカー（ＧＥヘルスケア株式会社製）と一緒に、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ゲル濃度：１５％Ｔ）にロードし、１枚のゲルあたり、１，０００Ｖ、１２ｍＡの条件で約４０分間、泳動を行なった。泳動後、ゲルは固定液（メタノール／酢酸／水＝１００／２０／８０）中、３０分間、ゆっくり往復振とうを行い、続いて、コマシーブリリアントブルー染色液（ＣＢＢクイック  ステイン、和光純薬株式会社製）中で１時間、ゆっくり往復振とうして、染色を行った。その後、ゲルは脱色液中で１時間、ゆっくり往復振とうしながら、脱色液（メタノール／酢酸／水＝１５０／５０／３００）を交換して３回、繰り返した。図３に示すように、インサートを持っている形質転換クローン（Ｃ３，Ｃ４，Ｃ７，Ｃ９）では、インサートを持ってないクローン（Ｃ２Ｎ）に比べて、矢印が示す４６ｋＤａ付近に新しいタンパク質由来のペプチドバンドが観察された。
【００４４】
＜組換え４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素の活性確認＞
組換え４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素の活性確認は以下のとおりに行った。
１．１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレート上で生育しているＣ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ９の大腸菌ＪＭ１０９形質転換クローン、およびネガティブコントロールとしてＣ２Ｎの細胞を３ｍｌの１００μｇ／ｍｌアンピシリンを加えたＬＢ液体培地入りの試験管で、３７℃、１２０回転で、往復振とう培養を行った培養液を２ｍｌ容マイクロチューブに移し、４℃、１１，０００ｒｐｍで２分間、遠心を行って細胞ペレットを得た。得られた細胞ペレットに１５０μｌの細胞破砕バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５緩衝液中に２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、１ｍＭチアミンピロリン酸、５μＭピロロキノリンキノン、５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２ｍＭジチオトレイトール、１０％スークロース）を加えて、超音波破砕機（ｓｏｎｉｃ  ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ  ＵＨ−Ｔ、株式会社エスエムテー社製）で３０秒を３回、超音波処理を行った。処理後、４℃、１５，０００回転で１５分間、遠心を行い、上清を得た。
【００４５】
２．それらの遠心上清を細胞破砕バッファーで８倍希釈した細胞破砕液の７．５μｌを使って、５０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ６．７５緩衝液中に１ｍＭチアミンピロリン酸、５μＭピロロキノリンキノン、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１．１ｍＭフェナジンメトサルフェート、５２ｍＭ  ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を含む混合液を室温（２５℃）でゆっくり３時間振とうして酵素反応を行った。この酵素反応により、生成した４−ケト−Ｄ−アラボン酸は、上記に記載の測定方法に基づいて定量した。実際に測定した酵素活性の結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
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【００４７】
表１に示すように、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、確かに４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素としての活性を有していた。
【００４８】
＜４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素遺伝子形質転換株の４−ケト−Ｄ−アラボン酸生成の確認＞
１００  μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレート上で生育しているＣ３、Ｃ４、Ｃ７、Ｃ９、の大腸菌  ＪＭ１０９形質転換クローン、およびネガティブコントロールとしてベクターのみを有するＣ２Ｎの細胞を４  ｍｌの１００  μｇ／ｍｌ  アンピシリンを加えたＬＢ液体培地入り試験管で、３７℃、１６０回転で、７時間、往復振とう培養を行った。２  ｍｌの培養液を２  ｍｌ容マイクロチューブに移し、４℃、１１，０００  ｒｐｍで２分間、遠心を行って細胞ペレットを取得し、１  ｍｌになるように滅菌水を加えて細胞懸濁液を調製した。１５０μｌの１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液、ｐＨ７．０（株式会社  同人化学研究所社製）中に、５μＭ  ピロロキノリンキノン、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、１０４ｍＭ  ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を含む混合液に、終濃度でＡ６００＝２になるように細胞を加えて、１６時間振とうした。生成した４−ケト−Ｄ−アラボン酸は、上記に記載の測定方法に基づいて定量した。実際に測定した４−ケト−Ｄ−アラボン酸の生成量を表２に示す。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
表２に示すように、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡで形質転換された大腸菌は、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を基質として、菌体内で４−ケト−Ｄ−アラボン酸を合成できることが確認できた。
【００５１】
＜組換え大腸菌により大量発現された４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素の精製＞
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ寒天プレート上で生育した４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素遺伝子形質転換株Ｃ９を殺菌済み４ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ液体培地を含む大試験管に植菌し、３７℃、１５５ｒｐｍで往復振とう培養を行った。１７時間後、培養液を殺菌済み１００ｍｌの１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＬＢ液体培地を含む８本の三角フラスコにそれぞれ２ｍｌづつ移植し、３７℃、２３０ｒｐｍで回転振とう培養を行った。８時間後、８００ｍｌの培養液は４℃、８，０００´ｇで１５分間遠心分離を行い、細胞ペレットを収穫した。収穫した細胞は１００ｍｌの殺菌水で懸濁後、再び遠心を行ない、３ｇの洗浄細胞を得た。
【００５２】
３ｇの洗浄細胞は破砕バッファー［１ｍＭチアミンピロリン酸、５μＭピロロキノリンキノン、０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２ｍＭジチオトレイトール、及び２４ｍｇリゾチーム（ＭＰ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ社製）を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５］で１２０ｍｌに成るように懸濁し、氷上で３０分間、ゆっくり振とうを行った。その後、ＫＣｌ、マイドール１０（花王株式会社製）をそれぞれ、終濃度で０．２Ｍ、０．１％（ｗ／ｖ）となるように添加し、氷水中で１回につき３分間、超音波処理を行ない、細胞懸濁液が半透明になるまで３〜５回繰り返した。処理液は４℃、１４，０００´ｇ、２０分間の遠心分離により上清と沈殿物に分け、４−ケト−Ｄ−アラボン酸酵素活性を有する遠心上清から４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素を以下の手順に従って精製した。
【００５３】
１）４−ケト−Ｄ−アラボン酸酵素活性を有する遠心上清の０．８Ｍ〜２Ｍ硫酸アンモニウム沈澱による分画を行った。該分画のタンパク質溶液（７０．５ｍｇタンパク質）を３ｌのバッファーＡ（２０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０、１ｍＭジチオトレイトール、０．１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル）に対して１７時間、透析を行った。
【００５４】
続いて、透析液に０．８Ｍになるよう粉末硫酸アンモニウムを加え、５℃で１時間、ゆっくり撹拌し、４℃、１４，０００´ｇで２０分間遠心を行った。遠心上清はあらかじめ、０．８Ｍ硫酸アンモニウムを含むバッファーＡ（バッファーＢ）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  ＰＨＥ  ６ｍＬ疎水クロマトカラム（アマーシャム・バイオサイエンス  ＡＢ株式会社製）に０．７５ｍｌ／分の流速でロードし、ロード終了後、カラムは非吸着タンパク質が完全に流出し終わるまで、バッファーＢで洗浄した。その後、３４ｍｌのバッファーＢと同量の０．５％（ｗ／ｖ）マイドール１０を含むバッファーＡを用いて、バッファーＢを初発バッファーに用いて、０．５％（ｗ／ｖ）マイドール１０を含むバッファーＡの濃度を直線的に増加させることにより、吸着したタンパク質をチューブあたり４ｍｌづつ分画しながら溶出させた。
【００５５】
溶出終了後、分画した溶出液は３ｌのバッファーＡに対して、一晩透析を行ない、バッファーＡで１６倍希釈した溶出液の４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成酵素活性を調べた。図４に示すように、溶出分画番号３から７に４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成酵素活性が検出され、さらに、それらの溶出画分の１０％ポリアクリルアミドゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行ない、ＣＢＢラピッド染色液（和光純薬工業株式会社製）を用いてタンパク質を染色した。図５で示すように酵素活性を示す溶出分画番号３から７には分子サイズで４６ｋＤａの位置にのみ天然型４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成酵素のペプチドサイズと同じ１つのペプチドが観察され、４−ケト−Ｄ−アラボン酸合成用酵素が電気泳動的に均一に精製されていることが判明した。
【００５６】
それらの活性画分を合わせた酵素溶液のタンパク質含量を標準蛋白質として牛血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、シグマ−アルドリッチ社製）を用いてローリー（Ｌｏｗｒｙ）法［ローリーら（Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）、「ジャーナル、バイオル、ケム（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）」、アメリカン  ソサイアティ  フォ  バイオケミストリー  アンド  モレキュラー  バイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９５１、１９３（１）、ｐ．２６５−２７５］により測定したところ、２２ｍｇのタンパク質が含まれることが判明した。
【図１】
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【図４】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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