(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｎ．メニンギティディスのＴ細胞刺激タンパク質Ｂ（ＴｓｐＢ）に結合する抗体を誘発することができるポリペプチド、および使用方法が提供される。【解決手段】特定の配列と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する連続したアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ＴｓｐＢの完全長成熟アミノ酸配列の長さより少なくとも２００アミノ酸短い、単離されたポリペプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２８と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する連続したアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ナイセリアＴ細胞刺激タンパク質Ｂ（ＴｓｐＢ）の完全長成熟アミノ酸配列の長さより少なくとも２００アミノ酸短い、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記連続したアミノ酸配列が配列番号２３〜３４の一つから選択される、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号４７又は配列番号４８を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号１４または配列番号１７を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２に示されたアミノ酸配列と少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を含む変種群ペプチド（ＶＮ）を含み、変種群ペプチドが前記連続したアミノ酸配列のＣ末端に隣接している、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが担体タンパク質、及び／又は抗原にコンジュゲートしている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが３００又は４００アミノ酸の長さまでである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
配列番号４７又は配列番号４８のアミノ酸配列を有する連続したアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、ナイセリアＴ細胞刺激タンパク質Ｂ（ＴｓｐＢ）の完全長成熟アミノ酸配列の長さより少なくとも２００アミノ酸短い、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記単離されたポリペプチドが配列番号４７のアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記単離されたポリペプチドが配列番号４８のアミノ酸配列からなる、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記連続したアミノ酸配列が配列番号２８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
Ｎ末端又はＣ末端に異種性のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド、および
薬学的に許容される賦形剤
を含む免疫原性組成物。
【請求項１５】
膜小胞を含む、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の免疫原性組成物を対象に、対象において抗体の産生を誘発するのに効果的な量で投与することを含む、対象においてナイセリア−メニンギティディスに対する免疫応答を誘導する方法に使用するための、請求項１４又は１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
前記対象がヒトである、請求項１６に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現する宿主細胞を既知組成培地において培養するステップを含み、
前記既知組成培地がヒト血液成分を含み、前記培養するステップが、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で行われる、方法。
【請求項１９】
前記ヒト血液成分がヒトコーン分画ＩＶを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒト血液成分がヒト血清を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞がナイセリア細菌である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドを含有する小胞を得るステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年１１月６日に出願された米国仮出願第６１／２５９，０３２号の優先権恩典を主張し、その仮出願は、全体として、参照により本明細書に組み入れられている。
【０００２】
連邦支援の研究に関する言明
本発明は、助成金番号Ｒ０１  ＡＩ０６４３１４における政府支援でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ナイセリア−メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）は、ヒト上気道にコロニー形成するグラム陰性細菌であり、最も顕著には髄膜炎および敗血症の、世界的な孤発性および周期性の流行的発生の原因である。発病率および罹患率は、２歳未満の小児で最も高い。他のグラム陰性細菌のように、ナイセリア−メニンギティディスは、典型的には、原形質膜、ペプチドグリカン層、莢膜多糖と共に細菌細胞壁を構成する外膜、および外側の環境へ突き出す線毛を有する。ナイセリア−メニンギティディスの被包性菌株は、小児および若年成人における細菌性髄膜炎および敗血症の主な原因である。侵襲性ナイセリア−メニンギティディス感染症の流行および経済的重要性によって、異なる菌株にわたる、特に異なる血清型または血清亜型を有する遺伝子的に多様なＢ群菌株にわたる免疫を与えることができる効果的なワクチンについての研究が促されている。
【０００４】
Ｔ細胞刺激タンパク質（Ｔｓｐ）は、Ａｌａ’Ａｌｄｅｅｎらによって、鉄除去培地で増殖したナイセリア−メニンギティディスＢ群ＳＤ株の膜において同定された（Ｗｏｏｄｒｉｄｇｅ  ＫＧら、１１ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  １９９８、Ｎｉｃｅ、Ｆｒａｎｃｅ）。ＴｓｐＡおよびＴｓｐＢと名付けられたＴ細胞刺激タンパク質は、その後、膜画分で免疫することによって産生されたウサギ抗血清を用いて、ゲノム発現ライブラリーから同定された（Ｗｏｏｄｒｉｄｇｅ  ＫＧら、前記；Ｋｉｚｉｌ  ＧＩら、１９９９  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ  ６７：３５３３〜３５４１）。ＴｓｐＡおよびＴｓｐＢはどちらもＴ細胞を刺激することが見出されたが、ＤＮＡ配列に関しては無関係である。
【０００５】
ＴｓｐＢは、Ｏｒｆ６と相同であり、Ｏｒｆ６は、疾患を引き起こさない共生単離物のゲノム配列を、疾患を引き起こす侵襲性単離物のゲノム配列と比較した場合、侵襲性髄膜炎菌と関連していることが見出された（Ｂｉｌｌｅ  ＥＪＲら、２００５  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１９０５〜１９１３）。Ｏｒｆ６を不活性化することによって、病原性の関連現象（例えば、ウサギ血清における増殖、Ｔ８４ヒト細胞への接着、免疫不全マウスモデルにおける毒性）について一般的に用いられる実験室アッセイにおいて観察可能な効果は生じなかった（Ｂｉｌｌｅ  ＥＪＲら、２００５、前記）。
【発明の概要】
【０００６】
Ｎ．メニンギティディスのＴ細胞刺激タンパク質Ｂ（ＴｓｐＢ）エピトープを結合する抗体を誘発し、ナイセリアＴｓｐＢがヒトＩｇに結合するのを阻害することができるポリペプチド、および使用方法。
【０００７】
本開示は、ＴｓｐＢの変種ペプチド領域（ＶＮ）を含む単離されたポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、ＴｓｐＢの完全長アミノ酸配列より短い連続したアミノ酸配列を含有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】示されているように、細胞が異なる条件下で培養され、かつ血清または精製ＩｇＧ無しまたは有りでインキュベートされた場合、ナイセリア−メニンギティディスＷ１３５群Ａ２２株の表面に結合したヒトまたはマウスのＩｇＧの存在を検出するように設計されたフローサイトメトリー実験の結果を示す図である。
【図２】２人の異なるドナー由来の血清の存在下で培養されたナイセリア−メニンギティディスＷ１３５群Ａ２２株（パネルＡ）、または単一のドナー由来の血清の存在下での遺伝子的に多様なナイセリア−メニンギティディスＷ１３５群、Ｂ群、Ｃ群の菌株（ＲＧＭ）（パネルＢ）に結合したヒトＩｇＧの存在を検出するように設計されたフローサイトメトリー実験の結果を示す図である。
【図３】示されているように、プロテインＡビーズもしくはプロテインＧビーズから溶出された、ＩｇＧ結合活性を含有する、ヒト血清を追加されたＣＤＭ（ＣＤＭ／ＨｕＳ）中またはＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地中で培養された場合のＭｅｎＷ１３５のＡ２２株から精製されたタンパク質を検出するために染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像の図である。
【図４】Ｍａｓｃｏｔを用いるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量フィンガープリンティングによって同定されたタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。一致したペプチドは下線が引かれている。
【図５】ＮＭＡ０７７６のタンパク質配列を用いて検索されるＮＣＢＩで入手可能な、侵襲性ナイセリア−メニンギティディスＡ群（Ｚ２４９１；ＮＭＡ）、Ｂ群（ＭＣ５８；ＮＭＢ）、およびＣ群（ＦＡＭ１８；ＮＭＣ）、ならびにナイセリア−ゴノレア（ＦＡ  １０９０；ＮＧＯ）のゲノムを含む様々な菌株由来のＴｓｐＢアミノ酸配列のアラインメントの図である。
【図６】変性条件下で精製された、ｐＱＥ３１からのＴｓｐＢ−ＩＧＢ発現からの精製産物（レーンＡ）および周辺質から非変性条件下で精製された、ｐＥＴ２２ｂ（＋）からのＴｓｐＢ−ＩＧＢ発現からの精製産物（レーンＢ）を示す図である。
【図７】ＭＣ５８株ゲノム配列由来の遺伝子ＮＭＢ１５４８によってコードされる完全長ＴｓｐＢのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】ＮＭＡ０７７６も加えた、図５に示されたタンパク質配列のうちの４つのアラインメントの図である。ＩＧＢドメイン、変種ペプチド領域、およびプロリンリッチ領域は、タンパク質配列の範囲に沿って名称が表示されている。
【図９】各群内で高い配列同一性を共有する３つの群の変種ペプチド配列についてのアラインメントを示す図である。変種ペプチドは、ＮＭＡ０７７６のアミノ酸配列も加えた、図５に示されたアミノ酸配列に由来する。
【図１０】パネルＡは、変種ペプチド領域のＮ末端側であるＩＧＢドメインのセグメントのアラインメントの図である。パネルＢは、変種ペプチド領域のＣ末端側であるＩＧＢドメインのセグメントのアラインメントの図である。図１０に示された全ての配列は、図５および図８において前に示された様々なＴｓｐＢ配列に由来する。
【図１１】ＥＬＩＳＡによる、ＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢかまたはＴｓｐＢ６２８ＩＧＢのいずれかを含有するウェルへのヒトＩｇＧの結合を示す図である。
【図１２】顕微鏡スライド上にスポットされ、一晩乾燥された、ＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ（パネルＡ）およびＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢ（パネルＢ）の顕微鏡像の図である。
【図１３】ドナー１血清およびドナー２血清由来のヒトＩｇＧへの様々なナイセリア細菌株の結合を示すフローサイトメトリー実験の図である。
【図１４】ＩｇＧ結合能力についてナイセリア細菌の様々な菌株の選択をモニターする、フローサイトメトリー実験の図である。
【図１５】ＮｍＢのＭＣ５８株（パネルＡ）およびＮｍＡのＺ２４９１株（パネルＢ）への、部分的に変性したＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢで免疫されたマウス由来の血清の結合を示す図である。
【図１６】自然に折り畳まれたＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢ（ｎＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢ）、自然に折り畳まれたＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ（ｎＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ）、または部分的に変性したＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ（ｒｆＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ）で免疫されたマウス由来の追加の血清に関して、図１５と同様の結合実験を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明および本発明の実施形態の特定の例を記載する前に、当然ながら、そのようなものは変化し得るため、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されないことは理解されるべきである。本明細書に用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明の範囲は添付された特許請求の範囲によってのみ限定されるものであるから、限定的であることを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００１０】
値の範囲が提供される場合、文脈上明らかに他の指示がない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値の間のそれぞれの介在する値、およびその述べられた範囲における任意の他の述べられた値または介在する値が本発明内に含まれることは理解されている。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、そのより小さい範囲に独立して含まれることができ、その述べられた範囲における任意の具体的に除外された限界に従って、同様に本発明内に含まれる。述べられた範囲がその限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
【００１１】
他に規定がない限り、本明細書に用いられる全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似または等価の任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法および材料はここで記載されている。本明細書で言及された全ての刊行物は、その引用されている刊行物に関連した方法および／または材料を開示および記載するために参照により本明細書に組み入れられている。
【００１２】
本明細書および添付された特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに他に規定されていない限り、複数の指示対象を含むことは留意されなければならない。したがって、例えば、「１つの抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」への言及は、複数のそのような抗原を含み、「そのタンパク質（ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、１つまたは複数のタンパク質への言及を含むなどである。
【００１３】
本明細書で論じられている刊行物は、ただ単に、本出願の出願日前のそれらの開示として提供されている。本発明が、先発明という理由でそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるべきことは本明細書には存在しない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、その実際の刊行日を別途、確認する必要があり得る。
【００１４】
概要
本開示のポリペプチドは、Ｔ細胞刺激タンパク質Ｂ（ＴｓｐＢ）に由来する（例えば、ＴｓｐＢの連続したアミノ酸配列を含有する）。ＴｓｐＢは、様々なナイセリア株によって発現しており、またＯｒｆ６と相同であり、Ｏｒｆ６は、ヒト髄膜炎菌疾患の大部分を引き起こすことが知られた多くの侵襲性ナイセリア−メニンギティディス株に見出される。
【００１５】
本開示において、ナイセリア細菌の細胞表面でのＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６の発現は、ヒト血清を含有する培地中で培養された場合、増強されることが見出されている。本明細書に提示されたポリペプチドは、ヒトＩｇの抗原特異性に依存せず（例えば、Ｆｃ領域に結合することによって）、ヒトＩｇに結合することができることも見出されている。ＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６のヒトＩｇへの結合は、結果として、ヒト補体の活性化を生じるが、生産的な溶菌またはオプソニン化貪食作用をもたらさない。したがって、ＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６は、ヒト補体活性化を避け、それにより細菌排除を低下させる細菌の能力を促進し得る。
【００１６】
本開示のポリペプチドをワクチンとして用いることは、抗体を誘発することができる。そのような抗体はまた、ＴｓｐＢのヒトＩｇへの結合を防ぎ得る。本明細書に提示されたワクチンによって誘発される抗体は、その後、ヒト血液においてＮ．メニンギティディスの生存にとって重要な機構の不活性化をもたらし得る。
【００１７】
そのようなポリペプチドは、他のワクチン（例えば、ｒ３ＣなどのＨ因子結合タンパク質含有ワクチン）と組み合わせて用いられ、宿主においてそのワクチンによって誘発される抗ナイセリア免疫応答の殺菌活性を増強することができる。
【００１８】
本開示のポリペプチドはまた、他のタンパク質または生体分子とコンジュゲートする場合、担体タンパク質として働き得る。そのようなコンジュゲートは、例えば、タンパク質−多糖コンジュゲートワクチンに用いられ得る。
【００１９】
本開示は、完全長ＴｓｐＢではないが、ＴｓｐＢのアミノ酸配列由来のポリペプチド、ならびにワクチンの調製および抗体（例えば、ヒトＩｇＧのＦｃ領域を結合するなどのＴｓｐＢの機能を遮断する抗体）の誘発におけるそのようなポリペプチドの使用方法を提供する。そのような実施形態の例は下に記載されている。
【００２０】
本ポリペプチドおよび／または完全長ＴｓｐＢを作製するための方法もまた本明細書に提供される。方法は、ヒト血清の１つまたは複数の成分を追加した既知組成培地においてポリペプチドを発現する宿主細胞を培養することを含む。方法はまた、微小胞、外膜小胞、または両方の組み合わせなどの本ポリペプチドおよび／または完全長ＴｓｐＢを有する小胞を作製するために用いることもできる。
【００２１】
定義
ＮＭＡ０７７６、ＮＭＡ１７９７、およびＯｒｆ６などの遺伝子によってコードされるタンパク質と相同のタンパク質としても文献中で知られている、「Ｔ細胞刺激タンパク質Ｂ」（ＴｓｐＢ）は、Ｔ細胞およびＢ細胞の刺激タンパク質である。Ｏｒｆ６は、Ｎ．メニンギティディスによって、特に若年成人において（Ｂｉｌｌｅら、２００８  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ３８８５）、引き起こされる侵襲性疾患と関連づけられているプロファージＤＮＡに見出される９個の遺伝子のうちの１個である（Ｂｉｌｌｅ  Ｅら、２００５  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１９０５〜１９１３）。明確にするために、本開示は、ＴｓｐＢまたはＯｒｆ６を交換可能に用い得る。ＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６の例のアミノ酸配列について図５および図７を参照されたい。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「成熟ＴｓｐＢ」は、リーダーペプチド領域を欠くＴｓｐＢを指す。リーダーペプチドは、天然の未成熟ＴｓｐＢのＮ末端に存在する。
【００２３】
ＴｓｐＢにおけるアミノ酸残基に関して、ＮＭＢ１５４８によってコードされるＢ群ＭＣ５８株の天然のＴｓｐＢ（ＮＰ＿２７４５５５）が、残基番号付けを目的とした参照配列として本明細書で用いられる（例えば、図７参照）。図７に示されているように、このＴｓｐＢアミノ酸配列がリーダーペプチド領域を含有することは留意されたい。ＴｓｐＢの長さは、１つの遺伝子と別の遺伝子とでは５個、１９個、または最高４４個までのアミノ酸残基だけ異なり得るため、ＴｓｐＢタンパク質におけるアミノ酸残基を指すために本明細書で用いられる番号付けシステムは、これらのタンパク質の実際のアミノ酸配列に基づいた番号付けとは異なる場合がある。したがって、例えば、図５におけるＭＣ５８（ＮＰ＿２７４５５５）配列の位置２１６のメチオニン残基（Ｍ）への言及は、ＮＭＣ０２８３（ＹＰ＿９７４４０２）の位置２１１の残基を指す。さらに明確にするために、図５におけるアラインメントを参照されたい。
【００２４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書で交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸の重合体型を指し、それには、遺伝子コード化アミノ酸および非遺伝子コード化アミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変ペプチドバックボーンを有するポリペプチドが挙げられる。その用語は、融合タンパク質を包含し、それには、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するまたは有さない、異種性および相同性リーダー配列を有する融合体；免疫学的タグの付いたタンパク質などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２５】
この本開示を通して、１文字表記または三文字表記によるアミノ酸が参照されることは理解されよう。読者の便宜のために、一文字および三文字アミノ酸表記を下記に提供する：
【００２６】
【表Ａ】
2016104783.tif 000003
【００２７】
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの重合体型を指す。ポリヌクレオチドの非限定的例には、線状および環状核酸、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、ならびにプライマーが挙げられる。
【００２８】
用語「異種性」は、例えば、天然で見出されない核酸またはタンパク質を提供するために、異なる源由来の構造によって定義される２つの成分を指す。例えば、「異種性」がポリペプチドとの関連で用いられる場合、ポリペプチドには、異なるポリペプチドに由来し得る、作動可能に連結したアミノ酸配列（例えば、組換えペプチドで構成される第１の成分、および天然のＴｓｐＢポリペプチド由来の第２の成分）が挙げられる。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの関連における「異種性」には、異なる遺伝子に由来し得る、作動可能に連結した核酸配列（例えば、本明細書に開示された実施形態によるペプチドをコードする核酸由来の第１の成分、および担体ポリペプチドをコードする核酸由来の第２の成分）が挙げられる。本明細書に記載されているような融合ポリペプチドは、異なるポリペプチドに通常見出される、単一ポリペプチドにおけるエピトープの提示を提供する。他の例示的な「異種性」核酸には、（例えば、プロモーター、コード配列、または両方に対して異なる遺伝的起源であり得る関心対象の宿主細胞における発現を提供するために）、コード配列を含む核酸が、コード配列のものとは異なる遺伝的起源由来である制御エレメント（例えば、プロモーター）と作動可能に連結している、発現構築物が挙げられる。例えば、ＴｓｐＢポリペプチドまたはそのドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結したＴ７プロモーターが異種性核酸であると言われる。組換え細胞との関連における「異種性」は、核酸が存在している宿主細胞と異なる遺伝的起源である核酸（またはポリペプチドなどの遺伝子産物）の存在を指し得る。例えば、１つの株のナイセリアアミノ酸配列または核酸配列は、別の株のナイセリア宿主に対して異種性である。
【００２９】
用語「作動可能に連結した」は、所望の機能を提供するために分子間の機能的連結を指す。例えば、核酸との関連における「作動可能に連結した」とは、転写、翻訳などの所望の機能を提供するための核酸間の機能的連結を指し、例えば、（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイなどの）核酸発現調節配列と、第２のポリヌクレオチドとの間の機能的連結であって、発現調節配列が第２のポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に影響する、機能的連結を指す。ポリペプチドとの関連における「作動可能に連結した」とは、ポリペプチドの記載された活性（例えば、エピトープを特異的に結合する抗体の産生を促進するためのそのエピトープの提示）を提供するための、（例えば、異なるドメインの）アミノ酸配列間の機能的連結を指す。
【００３０】
ポリペプチドの構造との関連において本明細書で用いられる場合、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」は、それぞれ、ポリペプチドの一番端のアミノ端およびカルボキシル端を指し、一方、「Ｎ末端側」および「Ｃ末端側」は、それぞれ、Ｎ末端およびＣ末端の方へのポリペプチドのアミノ酸配列における相対的位置を指し、それには、それぞれ、Ｎ末端およびＣ末端における残基を挙げることができる。「Ｎ末端側へすぐの」または「Ｃ末端側へすぐの」とは、第１のアミノ酸残基の第２のアミノ酸残基に対する位置を指し、第１アミノ酸残基と第２アミノ酸残基は、共有結合して連続したアミノ酸配列を提供している。
【００３１】
アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列との関連における「由来の」（例えば、ＴｓｐＢ「由来の」アミノ酸配列）とは、ポリペプチドまたは核酸が、参照ポリペプチドまたは核酸(例えば、天然のＴｓｐＢまたはコード核酸)の配列に基づいている配列を有することを示すように意図され、タンパク質または核酸が作製される供給源または方法に関して限定的であることを意図するものではない。細菌株との関連における「由来の」とは、菌株が、親株の継代インビボもしくはインビトロ培養によって得られ、および／または親株の改変によって得られた組換え細胞であることを示すように意図される。したがって、例えば、「ＴｓｐＢ由来ポリペプチド」は、天然のＴｓｐＢポリペプチドのアミノ酸配列に基づいたアミノ酸配列を有するポリペプチドを記載するために用いられる。
【００３２】
用語「防御免疫」とは、哺乳動物に投与されるワクチンまたは免疫スケジュールが、ナイセリア−メニンギティディスによって引き起こされる疾患の発生を防ぎ、遅らせ、もしくはその疾患の重症度を低下させ、またはその疾患の症状を減少させ、もしくは完全に除去する免疫応答を誘導することを意味する。防御免疫は、殺菌抗体の産生に付随して起こり得る。ナイセリア−メニンギティディスに対する殺菌抗体の産生が、ヒトにおけるワクチンの防御効果を予測するものとして当分野で受け入れられていることは留意されるべきである（Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９６９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９：１３０７；Ｂｏｒｒｏｗら、２００１  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６９：１５６８）。
【００３３】
句「ナイセリア−メニンギティディスによって引き起こされる疾患」は、ナイセリア−メニンギティディスによるヒトの感染において存在する任意の臨床症状または臨床症状の組み合わせを包含する。これらの症状には、ナイセリア−メニンギティディスの病原株による上気道（例えば、鼻咽頭および扁桃腺の粘膜）のコロニー形成、粘膜および粘膜下血管床への細菌の侵入、敗血症、敗血症性ショック、炎症、出血性皮膚病変、線維素溶解および血液凝固の活性化、腎不全、肺不全、および心不全などの臓器不全、副腎出血および筋肉梗塞、毛細管漏出、浮腫、末梢性肢虚血、呼吸促迫症候群、心膜炎、ならびに髄膜炎が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
句「広域防御免疫」とは、ワクチンまたは免疫スケジュールが、ナイセリア−メニンギティディスの少なくとも１つより多い変種、亜変種、および／または菌株に対して（および少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つの菌株に対して、少なくとも８つ、またはそれ以上の菌株に対してであり得る）「防御免疫」を誘発することを意味する。本開示は、具体的には、任意の莢膜群のメンバー（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｘ、Ｙ、２９Ｅ）によって引き起こされる疾患に対して防御を与えるワクチンまたはワクチン投与計画を企図し、包含し、ナイセリア−メニンギティディスの莢膜群Ｂの菌株によって引き起こされる疾患に対する防御は、この莢膜群に関する疾患を引き起こす菌株の疫学的蔓延および広く効果的なＢ群ワクチンの欠如によって関心をもたれている。例えば、単独での、または関心対象となるエピトープ（複数可）を提示する他の成分と組み合わせての本開示のポリペプチドは、多様な莢膜群にわたって交差反応する殺菌抗体応答を増強するために用いることができる。
【００３５】
用語「宿主」または「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を指すために本明細書で交換可能に用いられ、非ヒト動物は、一般的に、抗ナイセリア抗体の産生との関連において指示され、ヒトは、ナイセリア感染による疾患のリスクを低下させるワクチン接種についての関心対象の宿主である。
【００３６】
抗原（例えば、ポリペプチド抗原）との関連における句「抗体に特異的に結合する」または「に特異的免疫反応性である」とは、他の分子の異種性集団も含む可能性がある試料において抗原の存在に基づく、および／または抗原の存在の証拠となる結合反応を指す。したがって、指定された条件下で、特定化された１つまたは複数の抗体は、試料において特定の１つまたは複数の抗原に結合し、試料に存在する他の分子に有意な量では結合しない。抗原のエピトープ（例えば、ポリペプチドのエピトープ）との関連における「抗体に特異的に結合する」または「に特異的免疫反応性である」とは、他のエピトープの異種性集団も、加えて抗原の異種性集団も含む可能性がある抗原（例えば、ポリペプチド）におけるエピトープの存在に基づく、および／またはエピトープの存在の証拠となる結合反応を指す。したがって、指定された条件下で、特定化された１つまたは複数の抗体は、抗原の特定のエピトープに結合し、その抗原内および／または試料中に存在する他のエピトープに有意な量では結合しない。
【００３７】
句「免疫応答を誘発するのに十分な量で」とは、特定の抗原調製物の投与前と後に測定される免疫応答指標間に検出可能な差があることを意味する。免疫応答指標には、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、殺菌性アッセイ、フローサイトメトリー、免疫沈降法、オークタロニー免疫拡散法；例えば、スポット、ウェスタンブロット、または抗原アレイの結合検出アッセイ；細胞毒性アッセイなどのアッセイによって検出されるような、抗体力価または特異性が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３８】
「表面抗原」は、細胞、特にナイセリア−メニンギティディスなどの細菌の細胞の表面構造に存在する抗原（例えば、外膜、莢膜、線毛など）である。
【００３９】
「単離された」とは、その化合物が、天然に存在する場合には、天然で存在し得る環境とは異なる環境にある関心対象の化合物を指す。「単離された」とは、関心対象の化合物について実質的に濃縮され、および／または関心対象の化合物が部分的もしくは実質的に精製されている試料内にある化合物を含むことを意図される。化合物が天然に存在しない場合、「単離された」とは、化合物が、それが合成手段または組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されていることを示す。
【００４０】
「濃縮された」とは、関心対象の化合物が生体試料（例えば、その化合物が自然発生している試料、またはそれが投与後に存在する試料）などの出発試料、または化合物が作製された（例えば、細菌性ポリペプチド、抗体、キメラポリペプチドなどにおいてのような）出発試料中のその化合物の濃度より高い濃度（例えば、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも６４倍高い、またはそれ以上）で存在するように、試料が非自然的に（例えば、実験者または臨床医によって）操作されることを意味する。
【００４１】
「実質的に純粋な」とは、実体（例えば、ポリペプチド）が、その組成の全内容物（例えば、組成の全タンパク質）の約５０％より多く、典型的には、全タンパク質内容物の約６０％より多くを構成することを示す。より典型的には、「実質的に純粋な」とは、全組成の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上が関心対象の実体である、組成（例えば、全タンパク質についてを指す。好ましくは、そのタンパク質は、組成における全タンパク質の約９０％より多く、より好ましくは約９５％より多くを構成する。
【００４２】
ＴｓｐＢ由来ポリペプチド
本ポリペプチドは、抗体を誘発するのに用いられる。誘発された抗体がＴｓｐＢを結合する場合、抗体は、ＴｓｐＢのヒトＩｇへの結合を阻害し得る。そのようなポリペプチドは、抗ナイセリア免疫応答を促進する抗ＴｓｐＢ抗体を誘発する方法に用いることができる免疫原性組成物の作製に用いられる。
【００４３】
本開示のポリペプチドは、（例えば、免疫原性組成物において提供することができる）抗原性断片としての機能を果たすのに十分な長さのＴｓｐＢ由来の連続したアミノ酸残基を含有する。そのようなポリペプチドは、少なくとも５５アミノ酸残基長、少なくとも６０〜１００アミノ酸残基長、少なくとも６０〜１５０アミノ酸残基長、少なくとも６０〜２００アミノ酸残基長、少なくとも６０〜２５０アミノ酸残基長、少なくとも６０〜３００アミノ酸残基長、または少なくとも６０〜４００アミノ酸残基長であるＴｓｐＢの連続したアミノ酸配列を有し得る。抗原性断片であることに加えて、本開示のポリペプチドはまた、ヒトＩｇの抗原特異性に依存しない（例えば、Ｆｃ領域への結合による）、ヒトＩｇへの結合活性を保持し得る。
【００４４】
本開示のポリペプチドの１つの例は、図５、図７、および図８において区画を定められているような、ＮＭＢ１５４８株由来の免疫グロブリン結合（ＩＧＢ）ドメイン（例えば、配列番号４７）を含有する。本開示のポリペプチドの別の例は、図８に示されているような、ＮＭＢ１６２８などの別の株由来のＩＧＢドメイン（例えば、配列番号４８）を含有する。
【００４５】
用語「ＩＧＢドメイン」はまた、ＴｓｐＢの「球状βシート」ドメインまたは「定常領域」（ＣＲ）とも本明細書で呼ばれる。完全長ＴｓｐＢアミノ酸配列を、図５で整列させており、そこでは、ＩＧＢドメインが区画を定められている。Ｎｍｂ  １５４８  ＴｓｐＢに見出される特定のＩＧＢドメインは図７において区画を定められている。ＴｓｐＢのＩＧＢドメインおよび他のドメインもまた、図８でのＴｓｐＢアミノ酸配列の例において区画を定められている。
【００４６】
ナイセリアＴｓｐＢのアミノ酸配列と実質的に類似しているアミノ酸配列を含むポリペプチドには、ナイセリアＴｓｐＢの約５５アミノ酸から約７５アミノ酸まで、約７５アミノ酸から約１００アミノ酸まで、約１００アミノ酸から約１５０アミノ酸まで、約１５０アミノ酸から約２００アミノ酸まで、約２００アミノ酸から約２５０アミノ酸まで、約２５０アミノ酸から約３００アミノ酸まで、約３００アミノ酸から約３５０アミノ酸まで、約３５０アミノ酸から約４００アミノ酸まで、約４００アミノ酸から約４５０アミノ酸まで、約４５０アミノ酸から約５００アミノ酸まで、約５００アミノ酸から約５５０アミノ酸まで、または約５５０アミノ酸から約５８０アミノ酸までの連続したひと続きと少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２に示されているようなＴｓｐＢ）が挙げられる。
【００４７】
本ポリペプチドは、完全長成熟ＴｓｐＢを含有していなくてもよく、天然の完全長成熟ＴｓｐＢに対して少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸以上までを欠いてもよい。例えば、本ポリペプチドは、リーダーペプチド配列および／またはＮ末端可変ドメインを欠く切断型ＴｓｐＢであってもよい。１つのそのようなポリペプチドは、それが天然の未成熟ポリペプチドの１０４個の最もＮ末端側のアミノ酸残基を欠くというように、切断されている遺伝子ＮＭＢ１５４８によってコードされるＴｓｐＢとして記載することができる。リーダーペプチド配列および／またはＮ末端可変ドメインは、図７および図８に示されているように、免疫グロブリン結合（ＩＧＢ）ドメインよりＮ末端側の配列である。ポリペプチドはまた、プロリンリッチドメインを含むことも、排除することもできる。
【００４８】
本開示のポリペプチドは、図５、図７、および図８において示されているように、ＩＧＢドメインを有するとして記載することができる。ＴｓｐＢのＩＧＢドメインは、セリン１０５から始まり、プロリン３５８で始まるプロリンリッチドメインの前で終わる。ＩＧＢドメインの始まりおよびプロリンリッチドメインの始まりをそれぞれ、特徴づける各ＴｓｐＢにおけるセリンおよびプロリンは、図５および図８において太字で示されている。上記で述べたように、本明細書で参照される場合のアミノ酸残基番号付けシステムは、ＭＣ５８株のＮＭＢ１５４８によってコードされているようなＮＰ＿２７４５５５に基づいている。上記で述べたように、用語「ＩＧＢドメイン」はまた、図７に示されているように球状βシートドメインまたは定常領域（ＣＲ）と同義である。
【００４９】
ＴｓｐＢの各ＩＧＢ領域内に、図５および図８に示された全てのＴｓｐＢ配列にわたって高いアミノ酸配列同一性を共有しないアミノ酸残基の連続したセグメントがある。図８において「変種群ペプチド」と名称を付けられたこのアミノ酸配列の連続したセグメントは、そのＮ末端およびＣ末端の両方において、図５および図８に示されたＴｓｐＢ配列にわたって高度に保存されているアミノ酸配列に隣接している。変種ペプチド領域のアミノ酸配列は、本明細書でＴｓｐＢ群と呼ばれた群に変種ペプチド領域を分類する根拠として用いることができる。変種ペプチド領域のアラインメントにより、各ＴｓｐＢ群内の高度に保存された変種ペプチド配列が示されている。変種ペプチド領域のいくつかの例のそのようなアラインメントは、図９に示されている。
【００５０】
「変種群ペプチド」または「ＶＮ」は、この領域におけるアミノ酸配列の類似性に基づいた「群」にナイセリア株を割り当てるために用いることができる、ＴｓｐＢの連続したアミノ酸配列を指す。図７、図８、および図９に示されているように、ＶＮは、メチオニン２１４（Ｍ２１４）から始まり、リシン２７７（Ｋ２７７）で終わり、それらは、ＴｓｐＢのアミノ酸配列において太字および下線で示されている（図７）。各ＴｓｐＢについて変種群ペプチド領域を始めるメチオニンもまた、図８において太字で示されている。図９に示されているように、変種群ペプチドは、示された３つの群のそれぞれの中で高度に保存されている。
【００５１】
本ポリペプチドは、変種群ペプチド領域の１つまたは多量体（例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ以上）を含有することができ、それぞれは、図９に示された群から非依存的に選択される。例えば、本ポリペプチドは、図９に示されているような配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、または配列番号２２と少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、１００％までの同一性の連続したアミノ酸配列を含有することができる。
【００５２】
本ポリペプチドが１つより多い変種群ペプチドを有する場合、変種群ペプチドは、リンカーによって分離されていてもよい。例えば、ＶＮが３つの変種群ペプチド領域を含有する場合には、それはＶ１−Ｌ１−Ｖ２−Ｌ２−Ｖ３と表され得る。１つより多いリンカーが本ポリペプチドに用いられる場合、用いられる各リンカーは非依存的に選択され、本ポリペプチドにおける他のリンカーと異なってもよい。変種群ペプチドに加えて、本開示のポリペプチドはまた、図５および図８に示されたＴｓｐＢアミノ酸配列において変種ペプチド領域に隣接するＩＧＢドメイン内のアミノ酸配列などのＴｓｐＢにおける他のアミノ酸配列（ＳＮ）を任意で有することができる。
【００５３】
本ポリペプチドが変種ペプチド領域（複数可）に隣接するアミノ酸配列（ＳＮ）を含有する場合、隣接アミノ酸配列は、変種群ペプチド領域よりＮ末端側の（例えば、先行する）ＩＧＢドメインのセグメント（例えば、Ｓ１）、および／または変種群ペプチド領域よりＣ末端側の（例えば、後の）ＩＧＢドメインのセグメント（例えば、Ｓ２）であってもよい。ＴｓｐＢの他の区域由来の連続したアミノ酸セグメントもまた、本ポリペプチドへＳＮ（例えば、ＩＧＢドメイン以外のアミノ酸配列）として組み入れることができる。
【００５４】
変種ペプチド領域よりＮ末端側であるＩＧＢドメインのアミノ酸配列の例（例えば、Ｓ１）は、図１０のパネルＡにおいて、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および配列番号３４として示されている。
【００５５】
変種ペプチド領域よりＣ末端側であるアミノ酸配列の例（例えば、Ｓ２）は、図１０のパネルＢにおいて、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、および配列番号４６として示されている。
【００５６】
したがって、本ポリペプチドの例は、以下の式、Ｓ１−Ｌ１−ＶＮ−Ｌ２−Ｓ２によって表すことができ、式中、ＬＮは、本ポリペプチドにおいてアミノ酸配列を一緒に連結するために任意で存在してもよいし、存在しなくてもよい１つまたは複数のリンカーを指し、ＶＮは、上記のように、変種群ペプチドアミノ酸配列の１つまたは複数を指し、Ｓ１およびＳ２は、また上記のように、隣接アミノ酸配列（例えば、ＩＧＢドメイン由来のアミノ酸配列など）を指す。本ポリペプチドのいくつかの例は、Ｓ１−Ｖ１−Ｌ１−Ｖ２−Ｌ２−Ｖ３−Ｓ２、Ｓ１−Ｖ１−Ｓ２−Ｌ１−Ｓ１−Ｖ２−Ｓ２、またはＳ１−Ｌ１−Ｖ１−Ｌ２−Ｓ２と表すことができる。他の組み合わせおよび順列もまた本明細書で企図される。
【００５７】
変種群ペプチド領域の連続したアミノ酸配列を包含する場合もある、ＩＧＢドメイン由来の連続したアミノ酸配列を有することの他に、本ポリペプチドは、ＴｓｐＢの他のドメインを含有することができる。例えば、本ポリペプチドは、図７および図８において名称が付けられているように、プロリンリッチドメインおよび／または膜貫通アンカードメイン由来の連続したアミノ酸配列をさらに含有することができる。そのようなポリペプチドの例は、Ｖ１−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３によって表すことができ、式中、Ｓ１はＩＧＢドメイン由来の隣接アミノ酸配列を表し、Ｓ２はプロリンリッチドメインを表し、Ｓ３は膜アンカードメインを表す。Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３はまた、それぞれ、ＴｓｐＢまたは他の型のタンパク質の任意のセグメント由来の連続したアミノ酸配列に非依存的に置換することができる。例えば、ポリペプチドは、ＴｓｐＢ以外のタンパク質由来の膜貫通ドメイン（「異種性」膜貫通ドメイン）を含んでもよい。膜貫通ドメインを含有する本ポリペプチドは、本ポリペプチドを小胞内に提供するのに用いることができる。
【００５８】
本開示は、単離されたポリペプチド、ＴｓｐＢの抗原性断片、およびＴｓｐＢの変種を提供する。本ポリペプチドは、天然源から単離されていてもよく、例えば、それの天然の環境以外の環境にある。本ポリペプチドはまた、例えば、遺伝子改変の宿主細胞（例えば、細菌、酵母、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、昆虫細胞など）において、組換えで作製されてもよく、遺伝子改変の宿主細胞は、本ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸で遺伝子改変されている。本ポリペプチドは合成ポリペプチドを含み、例えば、本合成ポリペプチドは、実験室で（例えば、無細胞化学合成により）化学合成される。
【００５９】
本明細書で開示されたポリペプチドには、本明細書で提供された特定の連続したアミノ酸配列のポリペプチド、および１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個、通常には１０個以下、６個以下、または４個以下のアミノ酸置換を有するポリペプチドが挙げられ、その置換は、通常、保存的アミノ酸置換である。「保存的アミノ酸置換」とは、一般的に、以下のグループ内のアミノ酸残基の置換を指す：
１）Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｆ；
２）Ｒ、Ｋ；
３）Ｆ、Ｙ、Ｈ、Ｗ、Ｒ；
４）Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｓ；
５）Ｑ、Ｎ；および
６）Ｄ、Ｅ
【００６０】
本明細書に開示されたペプチドまたはポリペプチドとの関連における保存的アミノ酸置換は、関心対象のエピトープの提示かまたはポリペプチドのＦｃ結合活性のいずれかを保存するように選択される。そのような提示は、置き換えられることになっているアミノ酸の側鎖と類似した酸度、塩基度、電荷、極性、またはサイズの側鎖を有するアミノ酸で置換することによって保存することができる。そのような置換についてのガイダンスは、ＴｓｐＢのアミノ酸配列のアラインメントにおいて導き出され得る。例えば、図５に示されたアラインメントにより、完全に保存されている特定の残基位置（＊）において、置換、欠失、または挿入を許すことはできないが、１個または複数の残基が保存されていない他の位置において、アミノ酸変化が許容され得る。半保存されている残基（．または：）は、電荷、極性、および／またはサイズを保存する変化を許容し得る。
【００６１】
本開示のポリペプチドは、天然の折り畳まれた形、または少なくとも部分的に変性した形（例えば、部分的に変性した、または完全に変性した形）で提供することができる。
【００６２】
一実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも部分的に変性している。ポリペプチドが少なくとも部分的に変性した形をとる場合、ポリペプチドは成熟の完全長ＴｓｐＢまたはその断片であってもよい。部分的に変性したポリペプチドは、ＴｓｐＢに対する抗体を誘発する免疫原として用いることができる。ＴｓｐＢタンパク質またはその断片との関連における「少なくとも部分的に変性した」とは、タンパク質がＴｓｐＢまたはその断片と重合体を形成する能力を減少させるように、タンパク質が、天然のＴｓｐＢまたはその断片に対して三次構造において改変されていることを意味する。部分的変性は、例えば、変性剤（例えば、尿素、還元剤、高塩濃度（例えば、塩化リチウム、過塩素酸ナトリウム））、加熱、界面活性剤などの存在下での精製によって達成することができる。例えば、部分的に変性したポリペプチドは、変性条件下でポリペプチドを精製することによって得ることができる。
【００６３】
少なくとも部分的に変性したＴｓｐＢポリペプチドは、ポリペプチドが重合体を形成する能力を調べることによって同定することができる。例えば、顕微鏡による目に見える重合体の形成、またはＴｓｐＢの水溶液中でのゲルの形成による。
【００６４】
少なくとも部分的に変性したＴｓｐＢポリペプチドは、免疫グロブリンの天然ＴｓｐＢへの結合を遮断する抗ＴｓｐＢ抗体を誘発するそれらの能力によって同定することができる。フローサイトメトリーによる、生きているナイセリア細菌へのＩｇＧ結合を遮断する抗ＴｓｐＢの能力。
【００６５】
本開示の少なくとも部分的に変性したＴｓｐＢまたはその断片での免疫化は、ヒト免疫グロブリンの結合を遮断する抗体を誘発する。そのようなことは、ナイセリアの病原性にとって重要な機構を阻害することができる。部分的に変性したポリペプチドの例には、変性条件下で精製されるＮｍＢ  １６２８（ｒｆ  ＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ）由来のＴｓｐＢのＩＧＢドメインを挙げることができる。
【００６６】
タンパク質コンジュゲート
本開示のポリペプチドは、本明細書に記載されているような本ポリペプチドを含有する融合タンパク質として提供することができる。例えば、上記のようなポリペプチドは、別のタンパク質のＮ末端に融合することができる。
【００６７】
本開示のポリペプチドは、（例えば、本ポリペプチドに対して異種性のアミノ酸配列を有する）タンパク質および／または担体分子などの、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１つまたは複数の追加のエレメントを含有していてもよい。本ポリペプチドに連結され得る例示的なエレメントには、脂肪酸部分（例えば、脂肪族カルボン酸）および／または担体分子（例えば、担体タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））、オボアルブミン、キーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）、ウシチログロブリン、大豆トリプシンインヒビター、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、サイトカイン、またはｆＨｂｐ、ＮａｄＡ、ＧＮＡ２１３２などの他のワクチン抗原などが挙げられる。そのような追加のエレメントは、リンカー、例えば、可動性リンカーを介してポリペプチドに連結されてもよい。例えば、ポリペプチドは、例えば、投与を促進するために、および／またはＮ．メニンギティディスに対してワクチン接種もしくは処置される対象において免疫原性を増加させるために、担体分子にコンジュゲートされてもよい。追加の部分はまた、免疫原性、もしくはワクチンにおいて別の成分と複合体を形成するのに役に立つことができ、および／または関心対象の細胞もしくは組織への送達を促進することができる。
【００６８】
ポリペプチドはまた、分子模倣体、莢膜多糖、またはその誘導体などの抗原とコンジュゲートするように改変することができる。莢膜多糖は、髄膜炎菌群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｙ、および／またはＸに見出されるものであってもよい。そのようなものの例は、米国特許第４，７２７，１３６号および第６，０３０，６１９号に記載されており、その特許の開示は参照により本明細書に組み入れられている。
【００６９】
本ポリペプチドが多糖誘導体にコンジュゲートしている場合、多糖誘導体は、長鎖炭化水素を含有するものなどのＮ−アセチルまたはデ−Ｎ−アセチルポリシアル酸誘導体の混合物、およびその凝集体であってもよい。多糖は、本ポリペプチドに、Ｎ末端／Ｃ末端の一方および／もしくは両方で、または内部のアミノ酸残基へ付着していてもよい。多糖は、アミノ酸残基に、リンカーを介して、または直接的にコンジュゲートしてもよい。本明細書で企図されるＴｓｐＢコンジュゲートに用いるのに適した多糖誘導体、およびそのような多糖誘導体を作製する方法は、当技術分野において知られている。
【００７０】
融合タンパク質として提供される場合、担体分子は、ＴｓｐＢの球状ドメインの免疫系への提示を促進し、それにしたがって、ヒトＩｇに結合する性質を有する抗Ｎ．メニンギティディス抗体の産生を促進し得る。ポリペプチドは、Ｎ末端に融合することができ、Ｃ末端に融合することができ、またはＴｓｐＢの球状ドメインのアミノ酸配列が担体タンパク質配列に隣接しているようにスキャフォールド内に位置することができる。スキャフォールドはまた、膜表面上でのポリペプチドのディスプレイを促進し得る（例えば、小胞ワクチン）。ポリペプチドは担体タンパク質に対して異種性であり、したがって、天然では見出されない融合ポリペプチドを提供する。
【００７１】
リンカー
上記で述べたように、リンカーは、任意で、本ポリペプチドのコンジュゲート内に存在してもよい。上記で例示された追加のエレメントを含むようにポリペプチドを改変するために用いるのに適したリンカーには「可動性リンカー」が挙げられる。適切なリンカーは、容易に選択することができ、４アミノ酸から１０アミノ酸まで、５アミノ酸から９アミノ酸まで、６アミノ酸から８アミノ酸まで、または７アミノ酸から８アミノ酸までを含む、１アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）から２０アミノ酸まで、２アミノ酸から１５アミノ酸まで、３アミノ酸から１２アミノ酸までなどの適切な様々な長さのいずれかであり得、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、または７アミノ酸であってもよい。
【００７２】
可動性リンカーの例として、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（配列番号５０）およびＧＧＧＳｎ（配列番号６０）、式中、ｎは少なくとも１の整数である）が挙げられる）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当技術分野において知られた他の可動性リンカーが挙げられる。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、これらのアミノ酸のどちらも比較的、構造化されておらず、それゆえに、成分間の中立のつなぎ鎖としての役割を果たし得るため、関心対象となる。グリシンポリマーは、グリシンが、アラニンよりもさえ、有意に大きいφ−ψ空間に到達し、かつより長い側鎖を有する残基よりはるかに制限が少ないため、特に関心対象となる（Ｓｃｈｅｒａｇａ、Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３〜１４２（１９９２）参照）。例示的な可動性リンカーには、ＧＧＳＧ（配列番号５１）、ＧＧＳＧＧ（配列番号５２）、ＧＳＧＳＧ（配列番号５３）、ＧＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＧＧＳＧ（配列番号５５）、ＧＳＳＳＧ（配列番号５６）などが挙げられるが、それらに限定されない。上記の任意のエレメントにコンジュゲートしたポリペプチドの設計は全面的に、または部分的に可動性であるリンカーを含むことができ、それゆえに、リンカーが、可動性リンカーだけでなく、可動性に劣る構造を与える１つまたは複数の部分を含み得ることを、当業者は認識しているであろう。
【００７３】
作製方法
本開示のポリペプチドは、組換え方法および非組換え方法（例えば、化学合成）を含めた任意の適切な方法によって作製することができる。ポリペプチドが化学合成される場合、合成は、液相または固相を介して進行し得る。固相合成（ＳＰＰＳ）は、非天然アミノ酸の取り込み、ポリペプチド／タンパク質バックボーンの改変を可能にする。ＦｍｏｃおよびＢｏｃなどの様々な型のＳＰＰＳが本発明のポリペプチドを合成するのに利用可能である。化学合成の詳細は当技術分野において知られている（例えば、Ｇａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６  Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３〜１０、およびＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら、２００５  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３〜８）。
【００７４】
簡単に述べれば、小さい不溶性多孔性ビーズを、ポリペプチド鎖が構築される機能単位で処理する。結合／脱保護のサイクリングを繰り返した後、付着した固相の遊離Ｎ末端アミンを、単一のＮ−保護化アミノ酸単位に結合させる。その後、この単位は脱保護され、さらなるアミノ酸が付着し得る新しいＮ末端アミンを顕わにする。ポリペプチドは固相に固定化されたままであり、切断される前に濾過工程を受ける。
【００７５】
ポリペプチドが組換え技術を用いて作製される場合、方法は任意の適切な構築物および任意の適切な宿主細胞を含み得、その宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、通常には細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）または大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ’）または酵母宿主細胞であり得る。
【００７６】
本ポリペプチドを作製するために、例えば、ポリペプチドが小胞に基づいたワクチンにおいて提供されることになっている場合、ナイセリア細菌などの細菌細胞を用いてもよい。様々なナイセリア株のいずれも、本開示のポリペプチドを作製する方法に用いることができる。病原性ナイセリア種または病原性ナイセリア種由来の株、特にヒトにとって病原性の株またはヒトにとって病原性もしくは共生の株由来の株が、特に関心対象となる。例示的なナイセリア種として、Ｎ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｎ．フラベセンス（Ｎ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、Ｎ．ゴノレア（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、Ｎ．ラクタミカ（Ｎ．ｌａｃｔａｍｉｃａ）、Ｎ．ポリサッカレア（Ｎ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｅａ）、Ｎ．シネレア（Ｎ．ｃｉｎｅｒｅａ）、Ｎ．ムコーサ（Ｎ．ｍｕｃｏｓａ）、Ｎ．スブフラバ（Ｎ．ｓｕｂｆｌａｖａ）、Ｎ．シッカ（Ｎ．ｓｉｃｃａ）、Ｎ．エロンガータ（Ｎ．ｅｌｏｎｇａｔａ）などが挙げられる。細菌株との関連における「由来の」とは、菌株が、親株のインビボでの継代を通して、もしくはインビトロ培養において得られ、および／または親株の改変によって得られた組換え細胞であることを示すように意図される。
【００７７】
宿主細胞として用いられ得るＮ．メニンギティディス株の例は、任意の血清学的群、血清型または亜型、例えば、血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９−Ｅ、およびＷ−１３５であり得る。血清群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、およびＷ−１３５の株が特に関心対象となる。
【００７８】
本開示のＴｓｐＢ由来ポリペプチドに加えて、本ポリペプチドの発現に用いられるナイセリア宿主細胞は、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）、ＰｏｒＡ、ＧＮＡ２１３２などの関心対象となる他の抗原を自然に発現することができ、またはそれらを発現するように遺伝子改変することができる。宿主細胞へ導入された核酸から発現するポリペプチドは、本明細書で「外因性」であると呼ばれる。宿主細胞が内因性ＴｓｐＢを産生する場合、外因性の本ポリペプチドは、内因性ＴｓｐＢの連続したアミノ酸配列と同じ、または異なるアミノ酸配列を有し得る。宿主細胞の天然ＴｓｐＢをコードする遺伝子は、任意で、例えば、ＴｓｐＢノックアウト株などの、機能的内因性ＴｓｐＢを発現しない宿主細胞を提供するために、改変されてもよい。
【００７９】
ナイセリア細菌はまた、下記のように、ＬＰＳ生合成に欠陥を有するように遺伝子改変されてもよい。例えば、宿主細胞は、ｌｐｘＬ１遺伝子の産物の活性の減少または欠損を提供するように遺伝子改変されてもよく、かつそれは、対象に投与された場合、血清抗ＴｓｐＢ抗体を誘起する小胞を提供するのに十分な、本開示のポリペプチドのレベルを産生する。膜小胞調製およびｌｐｘＬ１遺伝子の発現を減少させることに関する詳細は、後で下文に記載されており、米国特許出願公開第２００９００３５３２８およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８１２５９にも見出すことができ、それらの特許出願の開示は参照により本明細書に組み入れられている。
【００８０】
本開示はまた、ナイセリア宿主細胞がヒト血清の存在下で培養される、本ポリペプチドおよび／または完全長成熟ＴｓｐＢを産生する方法を提供する。本方法を、（例えば、小胞ワクチン用として）小胞内に本ポリペプチドおよび／または完全長成熟ＴｓｐＢを提供するために用いてもよい。方法が小胞内にポリペプチドを提供するために用いられる場合、産生される小胞は、上記のポリペプチドの１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の異なる型を含有することができる。小胞はまた、完全長成熟ＴｓｐＢを単独で、または上記のポリペプチドのいずれかに加えて含んでもよい。用いられる宿主細胞は、任意で、上記のように、内因性ＴｓｐＢ産生が破壊されていてもよい。産生方法は、外膜小胞（ＯＭＶ）および／または微小胞（ＭＶ）を産生するために用いることができ、それらは、小胞に基づいたワクチンにおいて単独かまたは組み合わせてかのいずれかで、免疫原性組成物に用いることができる。小胞ワクチンは、米国特許出願公開第２００８０２４８０６５号に見出すことができ、その特許出願の開示は、参照により本明細書に組み入れられている。例示的な宿主細胞の培養条件は下記で論じられている。
【００８１】
菌血症がヒト血流に現れる条件をシミュレートすることにより、本タンパク質および完全長成熟ＴｓｐＢの産生が向上する。したがって、宿主細胞において本ポリペプチドおよび／または完全長成熟ＴｓｐＢを産生する場合、宿主細胞は、ヒト血液の１つまたは複数の成分を追加した既知組成培地で培養される。「既知組成培地」とは、培地に用いられるたいていの成分が知られており、したがって、未確認の動物血清または未確認の複合天然源に関係している成分を有意な量または検出可能な量を含有しない培地を意味する。本ポリペプチドを産生するために用いられる既知組成培地（または「ＣＤＭ」）は、非ヒト動物の副産物を欠き、血漿、血清、凝固因子、ヒト補体などのヒト血液の１つまたは複数の成分を追加されている。ヒト血液の成分には、コーン分画ＩＶ（Ｃｏｈｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ＩＶ）血清に見出されるもの（例えば、α−グロブリンおよび／またはβ−グロブリン）が挙げられる。ヒトコーン分画ＩＶは、ヒト血漿の分画であり、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ（登録商標）（カタログ番号Ｇ３６３７）などの商業的供給源から得ることができる。宿主細胞として用いられるナイセリア細菌を培養するための既知組成培地は、所望の抗原決定基の発現に適した必要な成分を全て含有し、非ヒト動物の副産物を欠き、ヒト血液の１つまたは複数の成分を含有する。
【００８２】
いくつかの既知組成の合成培地が本開示のポリペプチドを産生するために（例えば、組換えタンパク質の産生および単離、または組換えタンパク質を有する小胞の産生を目的として）、およびＴｓｐＢに対する抗体をスクリーニングするために利用することができる。本方法に用いられ得る培地には、ＮＭＦＭ、Ｗａｔｓｏｎ−Ｓｃｈｅｒｐ、Ｆｒａｎｔｚ、改変Ｆｒａｎｔｚ、ＮＭＦＭ、ＣａｔｌｉｎおよびＣａｔｌｉｎ  ６培地（Ｆｒａｎｔｚ、Ｉ．Ｄ．Ｊｒ．、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９４２）４３：７５７〜７６１；Ｃａｔｌｉｎ、Ｂ．Ｗ．、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．（１９７３）１２８（２）：１７８〜１９４；Ｗａｔｓｏｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎａｔｕｒｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９５８）８１：３３７〜４４；Ｍａｒｃｅｌｏ  Ｆｏｓｓａ  ｄａ  Ｐａｚら、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４（１）Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ  Ｊａｎｕａｒｙ／Ａｐｒｉｌ  ２００３）が挙げられる。菌血症用薬剤において莢膜多糖産生を調節するために様々な組成改変がある他の合成培地はよく知られており、それらには、以下が挙げられるが、それらに限定されない：窒素源として大豆ペプトンを含有する動物成分不含の髄膜炎菌多糖発酵培地（Ｕ．Ｓ．６，９３３，１３７）、およびラージスケールの血清群特異的髄膜炎菌培地調合物（Ｕ．Ｓ．７，４９１，５１７）。同様に、他の細菌についての既知組成培地がよく知られており、本方法に用いることができる（例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｒｏｎａｌｄ  Ｍ．ＡｔｌａｓおよびＪａｍｅｓ  Ｗ．Ｓｎｙｄｅｒ、第２版、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６参照）。同じものが哺乳類細胞に当てはまる（例えば、「Ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ，ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ」、ＨＲ  Ｍａｕｒｅｒ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＳＡ、１９８６；Ｈｅｓｓｅら、（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８（４）：１７３〜１８０；およびＺｈａｎｇら、（２００５）Ｊ  Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４８（１−３）：５９〜７４参照）。
【００８３】
上記で述べたように、宿主細胞が培養される培地は、ヒト血液のコーン分画ＩＶ血清および／または他の成分などの補充物を含む。ヒト血液の成分には、血漿、白血球（バフィーコート）を伴った血漿、血清などが挙げられるが、それらに限定されない。追加成分は、スクリーニング条件および／または評価条件の１つまたは複数のパラメータを改変するために培地へ単独で、または様々な組み合わせで加えることができる。
【００８４】
上記で述べたように、宿主細胞は、本開示のポリペプチドを発現する（例えば、過剰発現する）ように遺伝子改変されてもよい。遺伝物質の宿主細胞への導入の方法には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、コンジュゲーション、リン酸カルシウム方法などが挙げられる。移入のための方法は、本開示のポリペプチドをコードする、導入される核酸の安定な発現を提供するように選択することができる。ポリペプチドコード化核酸は、遺伝性エピソームエレメント（例えば、プラスミド）として提供することができ、またはゲノム的に組み込むことができる。遺伝子形質転換はまた、Ａｍｂｕｒら、２００７（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １８９：２０７７〜２０８５）およびＢａｋｋａｌｉ  Ｍら、２００７（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２：ｅ７４１）に記載されているように、ＤＮＡ取り込み配列（ＤＵＳ）でタグ付けされたポリペプチドコード化核酸を用いて実行することができる。相同組換えもまた、構築物全体を宿主細胞（例えば、ナイセリア株）へ移入させるために用いてもよい。
【００８５】
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供することができ、または宿主細胞ゲノムへの組込みを提供することができる。関心対象となるポリペプチドの産生に用いる様々な適切なベクターは市販されている（例えば、実施例セクションで用いられているようなｐＥＴ）。発現ベクターは、転写制御配列および翻訳制御配列を提供し、誘導性発現または構成的発現を提供することができ、コード領域は、転写開始領域ならびに転写および翻訳終結領域の転写調節下で作動可能に連結されている。一般的に、転写制御配列および翻訳制御配列には、リーダーペプチド配列（例えば、ｐｅ１Ｂ）、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列および転写終止配列、翻訳開始配列および翻訳終止配列、ならびにエンハンサー配列またはアクチベーター配列が挙げられるが、それらに限定されない。本ポリペプチドは、ＴｓｐＢをコードする核酸に対して異種性であり得るプロモーターの調節下で遺伝子によって発現することができる。プロモーターは、構成的発現（例えば、ＲｍｐＭ（還元修飾可能タンパク質（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｉｆｉａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ））のプロモーター、ＰｏｒＡプロモーターなど）、一過性発現、および／またはヒト血清の存在下での発現を提供することができる。例えば、プロモーターは、構成的かまたは誘導性かのいずれかであり得、強力な構成的プロモーター（例えば、Ｔ７、ＰｏｒＡ、ＲｍｐＭなど）であり得る。
【００８６】
本ポリペプチドを産生するために用いることができるベクターの例は、実施例に記載され、かつ当技術分野においても知られたｐＥＴプラスミドである。そのプラスミドは、ｐｅ１Ｂリーダーペプチド、続いて、本ポリペプチドをコードする核酸を有することができる。ポリペプチドコード化核酸は、上記の本ポリペプチド（例えば、ＩＧＢ、続いてプロリンリッチドメイン、その後に、膜アンカードメインが続く）のいずれかをコードし得る。ポリペプチドコード化核酸はまた、後にタンパク質検出および／または精製を促進する任意のタグ（例えば、ｈｉｓタグ）が続くこともできる。
【００８７】
発現構築物は、一般的に、関心対象となるタンパク質をコードする核酸配列の挿入を与えるためにプロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有する。発現宿主において作動する選択マーカーが、ベクターを含有する細胞の選択を容易にするために存在してもよい（例えば、エリスロマイシン選択マーカー）。選択マーカーは、プロモーター（例えば、ＰｏｒＡプロモーター）の前に置かれてもよい。加えて、発現構築物は、追加のエレメントを含んでもよい。例えば、発現ベクターは、１つまたは２つの複製系を有してもよく、それにしたがって、発現ベクターが、生物体において、例えば、発現のための哺乳類細胞または昆虫細胞において、およびクローニングおよび増幅のための原核生物宿主において、維持されることを可能にする。加えて、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択マーカー遺伝子を含有していてもよい。選択遺伝子は当技術分野においてよく知られており、用いられる宿主細胞によって異なる。
【００８８】
ポリペプチドの単離および精製は、当技術分野において知られた方法により達成することができる。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドを発現するように遺伝子改変された細胞の可溶化液から、または合成反応混合物から、免疫親和性精製によって単離することができ、その免疫親和性精製は、一般的には、試料を抗ポリペプチド抗体と接触させること、非特異的に結合した材料を除去するために洗浄すること、および特異的に結合したポリペプチドを溶出することを含む。単離されたポリペプチドは、透析、およびタンパク質精製方法に通常用いられる他の方法によってさらに精製することができる。一実施形態において、ポリペプチドは、金属キレートクロマトグラフィー方法を用いて単離することができる。
【００８９】
本ポリペプチドは、実質的に純粋な、または単離された形（例えば、他のポリペプチドを含まない）で調製することができる。特定の実施形態において、ポリペプチドは、存在する可能性がある他の成分（例えば、他のポリペプチドまたは他の宿主細胞成分）に対してそのポリペプチドについて濃縮されている組成物中に存在する。精製されたポリペプチドは、他の発現したポリペプチドを実質的に含まない、例えば、組成物の９０％未満、通常には６０％未満、より通常には５０％未満が他の発現したポリペプチドで構成される組成物中に、そのポリペプチドが存在するように提供することができる。
【００９０】
コンジュゲートに関する本ポリペプチドの調製について、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通してのコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を通して）、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、無水コハク酸などの二官能価結合剤を用いて、結合を達成することができる。代替として、または加えて、抗原および担体タンパク質を、上記の融合タンパク質として作製してもよい。
【００９１】
核酸
上記で論じたように、本ポリペプチドは、関心対象となるポリペプチドをコードする構築物を提供するように当技術分野において知られた異なるＴｓｐＢの核酸を操作する組換え技術を用いて産生することができる。アミノ酸配列が提供されたならば、当業者はすぐに、遺伝暗号の知識に照らしてそのようなアミノ酸配列をコードする様々な異なる核酸を認識するであろうことは理解されよう。
【００９２】
天然ポリペプチド由来の本ポリペプチドの産生について、ナイセリア細菌の様々な異なるＴｓｐＢをコードする核酸が当技術分野において知られており利用可能であることは留意されたい。Ｔｓｐポリペプチドおよびそれらの核酸の例は、例えば、ＵＳ６，８６１，５０７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｋら、２００５  Ｉｎｆｅｃｔ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ．７３：４６８４〜４６９２；Ｂｉｌｌｅ  Ｅら、２００５  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１９０５〜１９１３；およびＢｉｌｌｅ  Ｅら、２００８  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ３８８５に記載されており、それらの開示は参照により本明細書に組み入れられている。
【００９３】
様々なＴｓｐＢについての核酸（およびアミノ酸配列）はまた、遺伝子ＩＤ：ＮＭＡ０７７６、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＩＱＪ２（Ｎ．メニンギティディス血清群Ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＡ１１７３、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＩＲＪ０（Ｎ．メニンギティディス血清群Ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＡ１７９７、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＩＴ０８（Ｎ．メニンギティディス血清群Ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＡ２００５、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＩＴＪ３（Ｎ．メニンギティディス血清群Ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣ００２５、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＫＲ７５（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ、血清型２ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣ０２８３、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＫＲＷ７（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ、血清型２ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣ０９５６、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＫＴＰ２（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ、血清型２ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣ１６６８、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＫＶＥ８（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ、血清型２ａ）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣ１７１５、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＫＶＩ９（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ、血清型２ａ）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣ１８６６、タンパク質アクセッション番号Ａ１ＫＶＸ５（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ、血清型２ａ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣＣ＿０１５１、タンパク質アクセッション番号Ａ９Ｍ０Ａ８（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＣＣ＿０９１９、タンパク質アクセッション番号Ａ９Ｍ２４３（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｃ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＧＫ＿１４８１、タンパク質アクセッション番号Ｂ４ＲＪＡ５（Ｎ．ゴノレア由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＧＫ＿２０２７、タンパク質アクセッション番号Ｂ４ＲＮＫ３（Ｎ．ゴノレア由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＧＯ１１４０、タンパク質アクセッション番号Ｑ５Ｆ７Ｂ３（Ｎ．ゴノレア由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＧＯ１１６７、タンパク質アクセッション番号Ｑ５Ｆ７Ｋ４（Ｎ．ゴノレア由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＢ０４８０、タンパク質アクセッション番号Ｑ７ＤＤＰ６（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｂ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＢ１７４７、タンパク質アクセッション番号Ｑ９ＪＹ４９（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｂ由来）；遺伝子ＩＤ：ＮＭＢ１６２８、タンパク質アクセッション番号Ｑ９ＪＹＤ９（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｂ由来）；および遺伝子ＩＤ：ＮＭＢ１５４８、タンパク質アクセッション番号Ｑ９ＪＹＫ０（Ｎ．メニンギティディス血清群Ｂ由来）などのアクセッション番号としてＧｅｎＢａｎｋに提供されている。他のものと共に、上記の配列の一部はまた、図５、図７、および図８において対応する遺伝子名で提供されている。
【００９４】
本ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、関心対象となる宿主細胞（例えば、大腸菌、Ｎ．メニンギティディス、（ＤＮＡに基づいたワクチンの場合のように）ヒトなど）における発現を促進するためにコドン使用頻度を最適化するように改変されてもよいことは理解されよう。コドン最適化配列の作成方法は、当技術分野において知られている。核酸配列はまた、上記の関心対象となるポリペプチドのいずれをも発現するように改変されてもよい。例として、リーダーペプチド配列およびＮ末端可変ドメインの両方が切断されているＴｓｐＢ、またはＩＧＢドメインを含有するＴｓｐＢのセグメントが挙げられる。核酸が、小胞内にポリペプチドを提供するように宿主細胞において用いられる場合（例えば、小胞に基づいたワクチン）、核酸はまた、完全長成熟ＴｓｐＢ、上記の任意の本ポリペプチド、または両方の組み合わせをコードしてもよい。
【００９５】
製剤
本明細書では、「抗原組成物」、「抗原性組成物」、または「免疫原性組成物」は、便宜上、本明細書に開示されているような、ヒトＩｇのＦｃ領域に結合するポリペプチドを含む組成物を総称的に指すために用いられ、本ポリペプチドは任意で、免疫原性を増強するためにコンジュゲートされてもよく、および／または併用して提供されてもよい。抗Ｎ．メニンギティディス抗体をヒトにおいて誘発するのに有用な組成物が、本開示によって具体的に企図される。
【００９６】
抗原性組成物は、本明細書に記載されているような、２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上の異なるポリペプチドを含有することができ、それぞれの本ポリペプチドは、アミノ酸配列が異なってもよい。
【００９７】
追加の抗原、例えば、ＴｓｐＢに加えての、またはそれ以外の、抗ナイセリア抗体を誘発することができるポリペプチド抗原が、任意で、本組成物に含まれてもよい。例えば、そのポリペプチドは、例えば、ナイセリア疾患に関連した他のタンパク質を結合する抗体の産生を提供するためなど、ｖ．１、ｖ．２、および／またはｖ．３  Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨｂｐ）のアミノ酸配列を含むポリペプチドと組み合わせて提供することができる。
【００９８】
一実施形態において、本ポリペプチドは、ナイセリア抗原ｆＨｂｐ、ＧＮＡ２１３２、ＮａｄＡ、ＧＮＡ２０９１、およびＧＮＡ１０３０、またはそれらの抗原性断片もしくは融合タンパク質の１つまたは複数を含む組成物と組み合わせて（すなわち、同じまたは異なる製剤中で）投与される。例示的な組み合わせには、ｆＨｂｐとＧＮＡ２１３２とＮａｄＡ；およびｆＨｂｐとＧＮＡ２１３２とＮａｄＡとＧＮＡ２０９１とＧＮＡ１０３０が挙げられる。一実施形態において、本開示のポリペプチドは、Ｇｉｕｌｉａｎｉら、２００６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１０８３４〜９に記載されているように、５成分の組換えタンパク質ワクチンと組み合わせて提供される。
【００９９】
本ポリペプチドは、Ｎ．メニンギティディス小胞（例えば、微小胞および／または外膜小胞）を含有する様々な組成物のいずれかと組み合わせて提供することができ、その小胞は、ｆＨｂｐ、特にｖ．１  ｆＨｂｐおよび／またはｖ．２  ｆＨｂｐおよび／またはｖ．３  ｆＨｂｐを発現するＮ．メニンギティディス株から産生される。様々なそのような小胞組成物は当技術分野において知られており、様々な異なる株からのそれらの調製方法はよく知られている。
【０１００】
抗原性組成物は、一般的に、免疫学的有効量の本ポリペプチドを含み、必要に応じて他の適合性の成分をさらに含んでもよい。「免疫学的有効量」とは、単一用量か、または一連の同じもしくは異なる抗原性組成物の一部としてかのいずれかでのその量の個体への投与が、例えば、ナイセリア、具体的にはＮ．メニンギティディスによる感染の症状、または感染によって引き起こされる疾患の処置または予防に有効な抗体応答を誘発および／または増強するのに有効であることを意味する。この量は、処置されるべき個体の健康状態および身体的状態、年齢、抗体を産生する個体の免疫系の能力、望まれる防御の程度、ワクチンの剤形、処置を行う医師による医学的状況の評価、および他の関連因子に依存して変化する。量は、日常的試行によって決定することができる比較的広い範囲に収まるだろうことが予想される。
【０１０１】
製剤中の本ポリペプチドの濃度は、大きく異なり得（例えば、約０．１重量％未満から、通常、約２重量％または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％くらいまたはそれ以上まで）、通常には、主に、液体容量、粘度、および選択された特定の投与様式および患者の要求に応じた患者に基づく因子に基づいて、選択される。
【０１０２】
ポリペプチド組成物は、薬学的に許容される賦形剤中に提供することができ、その賦形剤は、滅菌水溶液などの溶液、多くの場合、食塩水であり得、または粉末の形で提供することができる。そのような賦形剤は、必要に応じて、実質的に不活性であり得る。
【０１０３】
ポリペプチド組成物は、アジュバントを含み得る。ヒトに用いることができる公知の適切なアジュバントの例には、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９（４．３％重量／体積のスクワレン、０．５％重量／体積のＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、０．５％重量／体積のＳｐａｎ  ８５）、ＣｐＧ含有核酸（シトシンが非メチル化されている）、ＱＳ２１、ＭＰＬ、３ＤＭＰＬ、Ａｑｕｉｌｌａからの抽出物、ＩＳＣＯＭＳ、ＬＴ／ＣＴ突然変異体、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、Ｑｕｉｌ  Ａ、インターロイキンなどが挙げられるが、必ずしもそれらに限定されない。実験動物については、フロイント、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰと呼ばれるＣＧＰ  １１６３７）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれるＣＧＰ  １９８３５Ａ）、およびＲＩＢＩ（細菌から抽出された３つの成分である、モノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０乳濁液中に含有する）を用いることができる。アジュバントの効果は、免疫原性抗原またはその抗原性エピトープに対して産生される抗体の量を測定することによって決定することができる。
【０１０４】
組成物の効果を増強するためのさらなる例示的なアジュバントとして、（１）水中油形乳剤（ムラミルペプチド（下記参照）または細菌細胞壁成分などの他の特定の免疫刺激剤と共にまたはなしで）、例えば、（ａ）マイクロ流動化装置を用いてサブミクロン粒子へ製剤化された、５％のスクワレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０、および０．５％のＳｐａｎ  ８５を含有する（任意でＭＴＰ−ＰＥを含有する）ＭＦ５９（商標）（ＷＯ９０／１４８３７；Ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５の１０章）、（ｂ）サブミクロン乳剤へマイクロ流動化されたかまたはより大きい粒子サイズの乳剤を生じるようにボルテックスされたかのいずれかの、１０％のスクワレン、０．４％のＴｗｅｅｎ  ８０、５％のプルロニックブロック化ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％のスクワレン、０．２％のＴｗｅｅｎ  ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））などの１つまたは複数の細菌細胞壁成分を含有するＲＩＢＩ（商標）アジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）；（２）ＱＳ２１もしくはＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）などのサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）などのそれらから作製された粒子を用いてもよい（ＩＳＣＯＭＳは追加の界面活性剤を欠いていてもよい、例えば、ＷＯ００／０７６２１）；（３）完全フロイントのアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントのアジュバント（ＩＦＡ）；（４）インターロイキン（例えば、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（ＷＯ９９／４４６３６）など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン；（５）任意で、肺炎球菌サッカライドと共に用いる場合、ミョウバンの実質的非存在下における（例えば、ＷＯ００／５６３５８）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、例えば、ＧＢ−２２２０２２１、ＥＰ−Ａ−０６８９４５４；（６）例えば、ＱＳ２１および／または水中油乳剤と３ｄＭＰＬの組み合わせ、例えば、ＥＰ−Ａ−０８３５３１８、ＥＰ−Ａ−０７３５８９８、ＥＰ−Ａ−０７６１２３１；（７）ＣｐＧモチーフを含む、すなわち、シトシンが非メチル化されている場合、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含有する、オリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０００、１９、６１８〜６２２；Ｋｒｉｅｇ  Ｃｕｒｒ  ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ２００１  ３：１５〜２４；Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ、１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、８１０−８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ、１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅａｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、２７、２３４０〜２３４４；Ｍｏｌｄｏｖｅａｍｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９６、１５７、５３９４〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；およびＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；国際公開特許出願ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９、およびＷＯ９８／５２５８１）；（８）ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル、例えば、ＷＯ９９／５２５４９；（９）オクトキシノールと組み合わされたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）、またはオクトキシノールなどの少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わされたポリオキシエチレンアルキルエーテルもしくはエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）；（１０）サポニンおよび免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）（ＷＯ００／６２８００）；（１１）免疫賦活剤および金属塩の粒子、例えば、ＷＯ００／２３１０５；（１２）サポニンおよび水中油形乳剤、例えば、ＷＯ９９／１１２４１；（１３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＭ２（任意で＋ステロール）、例えば、ＷＯ９８／５７６５９；（１４）組成物の効力を増強するための免疫賦活剤として働く他の物質が挙げられるが、それらに限定されない。ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−２５アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。ヒトへの投与に適したアジュバントは特に関心対象となる。
【０１０５】
ポリペプチド組成物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、マグネシウム、炭酸塩などの他の成分を含んでもよい。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などの適切な生理的条件に必要とされる薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有していてもよい。
【０１０６】
ポリペプチド含有製剤は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、ゲル、クリーム、ローション、軟膏、エアゾールなどの形で提供することができる。経口投与は、組成物の消化からの保護を必要とし得ることは認められる。これは、組成物を酸性および酵素的加水分解に対して抵抗性にする作用物質との組成物の結合によるか、または適切に抵抗性である担体分子中に組成物をパッケージングすることによるかのいずれかで達成することができる。消化から保護する手段は当技術分野においてよく知られている。
【０１０７】
ポリペプチド含有製剤はまた、投与後の本ポリペプチドの血中半減期を向上させるように提供することができる。例えば、単離されたポリペプチドが注射用に製剤化される場合、ポリペプチドは、リポソーム製剤中に提供され、コロイドとして調製され、または血中半減期を延ばすための他の従来技術を用いて調製することができる。リポソームを調製するために、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、および第４，８３７，０２８号に記載されているような様々な方法が利用できる。調製物はまた、放出制御または持続放出の形で提供されてもよい。
【０１０８】
混合ワクチン
上記で述べたように、本ポリペプチドは、対象においてＮ．メニンギティディスに対する免疫応答を誘発するのに用いられる様々な抗原性組成物のいずれかと組み合わせて提供することができる。本明細書で用いられる場合の「組み合わせ」とは、別々の投与として別々に製剤化される（例えば、キット内に提供することができるような）組成物、および単一の製剤中での投与としての（すなわち、「共製剤化される」）組成物を含むことを意味する。
【０１０９】
上記を考慮すれば、例示的な抗原性組成物は、本開示のポリペプチドの１つまたは複数を、異なるナイセリアタンパク質またはその断片を含む組換えワクチンと共に含み、その組換えワクチンは、単離されたタンパク質として提供されてもよいし、および／または小胞ワクチン内で提供されてもよい。本開示の抗原性組成物に含まれ得る本明細書に記載された様々な成分は、インビトロで、エクスビボで一緒に組み合わされてもよいし、および／または本方法に用いられる宿主細胞によってすでに提供されていてもよい。当業者は、最適な任意の方法を用いてその組み合わせを作製することができる。
【０１１０】
上記で述べたように、抗原性組成物は、本開示のポリペプチドに融合することができる上記のエレメントを含むことができ、または上記のエレメントを組成物中に別々の成分として含むことができる。本ポリペプチドに加えての組成物中に含まれ得る成分の例は、（ＭＣ５８株由来の遺伝子によってコードされる）組換えｆＨｂｐ  ｖ．１、（ＮＺ９８／２５４株由来の遺伝子によってコードされる）ＧＮＡ２１３２、および（２９９６株由来の遺伝子によってコードされる）ＮａｄＡを含有する「ｒ３Ｃ」ワクチンである。特定の実施形態において、その小胞は、５成分組換えタンパク質ワクチン（５Ｃまたはｒ５ＣＶ）と組み合わされてもよい。５成分組換えタンパク質ワクチン（ｒ５Ｃｖ）は、ｆＨｂｐ  ｖ．１と融合したＧＮＡ２０９１、ＧＮＡ１０３０と融合したＧＮＡ２１３２（ＮＺ９８／２５４由来）、およびＮａｄＡを含有する組換えタンパク質ワクチンを指し、Ｇｉｕｌｉａｎｉら、２００６  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：１０８３４〜９に記載されている。
【０１１１】
免疫化
本明細書に記載されたポリペプチドは、一般的に、ナイセリア疾患に罹るリスクがあるヒト対象に、疾患およびその合併症の発生を防ぎ、または少なくとも部分的に停止させるために免疫原性組成物中において投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的有効量」として定義される。用いるのに有効な量は、例えば、免疫原性組成物、投与様式、患者の体重および全身的健康状態、ならびに処方医師の判断に依存する。免疫原性組成物の単一用量または複数回用量は、患者に必要とされ、かつ許容される用量および頻度、ならびに投与経路に依存して投与され得る。
【０１１２】
本明細書に記載されたポリペプチドは、一般的に、宿主において体液性免疫応答を誘発するのに有効な量で投与される。上記で述べたように、免疫化のための量は、様々であり、一般的には、７０ｋｇの患者あたり約１μｇから１００μｇまで、通常には、５μｇ〜５０μｇ／７０ｋｇの範囲であり得る。実質的により高い用量（例えば、１０ｍｇ〜１００ｍｇまたはそれ以上）が適する場合があり、非経口的に（例えば、注射または局所投与により）、または経口経路もしくは経鼻経路によって投与されてもよい。初回投与の後に、同じまたは異なるポリペプチドを含有する抗原性組成物の追加免疫を行うことができる。通常には、ワクチン接種は、少なくとも１回の追加免疫、より通常には２回の追加免疫を含む。
【０１１３】
一般的に、免疫化は、任意の適切な経路による投与によって達成することができ、その投与には、経口で、経鼻で、経鼻咽頭で、経腸で、局所的に、経皮で、皮下に、筋肉内に、望ましい投与経路に適し得るように、錠剤、固体、粉末化、液体、エアゾールの形で、局部的にまたは全身的に、賦形剤の添加有りまたはなしでの組成物の投与が挙げられる。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際的な方法は、当業者に知られているであろう、または明らかであろうし、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９８０）のような刊行物でより詳細に記載されている。
【０１１４】
免疫応答は、公知の方法によって（例えば、初回免疫化の前および後に個体から血清を採取し、個体の免疫状態における変化を、例えば、免疫沈降アッセイ、またはＥＬＩＳＡ、または殺菌アッセイ、またはウェスタンブロット、またはフローサイトメトリーアッセイなどにより示すことによって）評価することができる。
【０１１５】
一実施形態において、抗原性組成物は、ヒト対象に投与することができ、その対象は、ナイセリア−メニンギティディスに関して免疫学的にナイーブであってもよい。特定の実施形態において、対象は、約５歳以下、好ましくは約２歳以下のヒトの子どもであり、抗原性組成物は以下の時点のうちの任意の１時点または複数時点に投与される：生後２週間目、１カ月目、２カ月目、３カ月目、４カ月目、５カ月目、６カ月目、７カ月目、８カ月目、９カ月目、１０カ月目、もしくは１１カ月目、もしくは１年目、もしくは１５カ月目、１８カ月目、もしくは２１カ月目、または２歳、３歳、４歳、もしくは５歳時点。
【０１１６】
一般的には、疾患症状の最初の兆候前に、または（例えば、ナイセリアによる暴露または感染による）感染もしくは疾患への可能性のある、もしくは実際の暴露の最初の兆候時点で、免疫化を開始することが望ましくあり得る。
【０１１７】
スクリーニングアッセイ
本開示はまた、効果的なワクチンについてスクリーニングする方法、および候補作用物質（例えば、抗体）、それをコードする核酸、または抗血清を誘発するのに効果的な免疫原についてスクリーニングする方法を特徴とする。
【０１１８】
例えば、方法は、抗体のＦｃ部を介する結合と、抗原特異的部分の結合（すなわち、抗体の抗原結合領域を通してＴｓｐＢに結合する能力）との両方の点から抗体結合を評価するために用いることができる。そのようなアッセイ方法は、結合が抗原特異性に依存しない（例えば、Ｆｃ領域への結合による）、ＴｓｐＢのヒトＩｇへの結合を阻害することができる候補作用物質をスクリーニングするのに用いられる。方法は、ナイセリアタンパク質の機能（例えば、ＴｓｐＢのヒトＩｇＧへの結合）を阻害する抗体を同定するために抗体をスクリーニングすることを包含し得る。例えば、ＴｓｐＢのヒトＩｇまたはその断片（例えば、Ｆｃ部）に対する親和性と比較して少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍、約１０００倍以上までの結合活性（例えば、５０ｎＭ対５０ｐＭ）でＴｓｐＢに結合する候補作用物質が、ＴｓｐＢのヒトＩｇへの結合を阻害するために用いられる候補として選択されるであろう。
【０１１９】
本方法は、ＴｓｐＢのヒトＩｇへの結合を阻害するための候補である可能性がある候補作用物質（例えば、抗体）を分析するステップであって、その結合がＩｇの抗原特異性に依存しない（例えば、Ｆｃ領域における結合による）、ステップを含む。任意で、方法は、非ヒト動物をワクチン（例えば、ＴｓｐＢのエピトープを含有するポリペプチド）で免疫するステップ、そのような免疫化動物から血清抗体を採取するステップ、およびＴｓｐＢのＩｇへの結合を阻害する能力について血清をスクリーニングするステップを含んでもよい。
【０１２０】
本明細書に用いられる場合の用語「候補作用物質」は、任意の分子、例えば、タンパク質または小分子化合物を記載する。したがって、候補作用物質は、典型的には、有機分子、好ましくは、５０ダルトンより大きく、約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小さい有機化合物であるが、多数の化学的クラスを包含する。候補作用物質は、タンパク質との構造的相互作用、例えば、水素結合を促進する官能基を含み、アミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含むことができる。候補作用物質は、上記の官能基の１つまたは複数で置換される環式炭素構造もしくは複素環式構造および／または芳香族構造もしくは多環芳香族構造を含む場合が多い。候補作用物質はまた、生体分子の間で見出され、それには、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造的類似体、または組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。候補作用物質は、合成または天然の化合物のライブラリーを含めた幅広い種類の供給源から得ることができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含めた、幅広い種類の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性合成に多数の手段が利用できる。
【０１２１】
あるいは、細菌、真菌、植物、および動物の抽出物（ＴｓｐＢの機能に影響を及ぼす内因性因子を同定するためのヒト組織からの抽出物を含む）の形をとる天然化合物のライブラリーが入手でき、または容易に作製される。加えて、天然の、または合成的に作製されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的、および生化学的手段を通して容易に改変され、コンビナトリアルライブラリーを作製するのに用いることができる。既知の薬理学的物質を、アセチル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向性またはランダム化学修飾に供して、構造的類似体を生成してもよい。
【０１２２】
上記で述べたように、候補作用物質の分析を、無細胞アッセイかまたは細胞に基づいたアッセイのいずれかにおいて、候補作用物質の存在下で、ＴｓｐＢのヒトＩｇまたはその断片（例えば、Ｆｃ断片）に結合する能力を評価することによって行ってもよい。ヒトＩｇまたはその断片（例えば、Ｆｃ断片）と比較して何倍も増加したＴｓｐＢに対する親和性を示す候補について選択するために段階希釈実験を行うことができる。アッセイに用いられるＴｓｐＢには、ナイセリア細菌から単離された、合成的に作製された、組換えで作製された、および／またはナイセリア細菌の細胞表面上に存在する、完全長またはその断片を挙げることができる。候補作用物質をまた、当技術分野において知られた、および下記の実施例に記載された方法を用いて殺菌活性を促進するその能力について評価してもよい。
【０１２３】
用いられるアッセイ形式に依存して、本スクリーニング方法において、ヒトＩｇ（またはその断片）を含有するポリペプチド、ＴｓｐＢタンパク質、および／または本ポリペプチドが標識され得る。ＴｓｐＢ、本ポリペプチド、および／またはヒトＩｇもしくはその断片（例えば、Ｆｃ部）を含有するポリペプチドは、任意で、共有結合性または非共有結合性付着を通して支持体に固定化することができる。例示的なスクリーニングアッセイは、競合的結合アッセイであってもよく、そのアッセイにおいて、ヒトＩｇまたはその断片（例えば、Ｆｃ領域）を含有するポリペプチドが検出可能に標識され、固定化ＴｓｐＢに結合することができる。その後、この検出可能に標識された試薬の結合したＴｓｐＢからの転置が、候補作用物質の存在下で評価される。
【０１２４】
検出可能な標識には、直接的に検出可能なシグナル（例えば、フルオロフォア）または間接的に検出可能なシグナル（例えば、検出可能な標識を有する二次抗体の使用）を提供するものが挙げられる。例えば、放射性標識、蛍光標識、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば、磁気粒子など。様々な方法（例えば、親和性捕獲など）を通して単離を促進するために追加のエレメント（例えば、ビオチンタグ、ＨＡタグ、ポリヒスチジンタグ、免疫学的に検出可能なタグ）を提供することができる。特異的結合分子には、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンと抗ジゴキシンなどのペアが挙げられる。特異的結合メンバーについて、相補的メンバーが、通常、公知の手順に従って、検出を提供する分子で標識される。
【０１２５】
候補作用物質をまた、関心対象となる細菌細胞に対するその親和性について評価してもよい。スクリーニングのための細菌細胞は、大腸菌Ｋ１、大腸菌Ｋ９２、任意のナイセリア細菌（例えば、ナイセリア−メニンギティディス血清群Ｂ、ナイセリア−メニンギティディス血清群Ｃ、ナイセリア−メニンギティディス血清群Ｘ、ナイセリア−メニンギティディス血清群Ｙ、ナイセリア−メニンギティディス血清群Ｗ−１３５など）から選択することができる。
【０１２６】
候補作用物質が抗体である場合、それは抗体集団内に提供され、方法は、細菌細胞を結合し、ＴｓｐＢを結合し、および／またはＴｓｐＢのヒトＩｇへの結合を阻害する、抗体集団由来の１つまたは複数の抗体を単離するステップを含むことができる。そのようなスクリーニングによって同定された単離抗体は、細菌細胞に対する殺菌活性を、例えば、ヒト血液中の細菌の生存率を減少させる能力がある、補体媒介性殺菌活性および／またはオプソニン化貪食作用活性を促進することによって、促進することができる。
【０１２７】
本方法に用いるために、ＴｓｐＢまたは本ポリペプチドを細菌おいて製造する場合、細菌細胞を、ヒト血液の１つまたは複数の成分を追加した既知組成培地中で培養する。ヒト血清を追加している既知組成培地が、細菌細胞が培養される条件および／または候補作用物質結合（例えば、抗体結合）が遂行される条件として本スクリーニング方法に用いられる。したがって、本開示のスクリーニング方法は、ヒトにおける菌血症および／または腫瘍症をシミュレートする条件下で実行される。
【０１２８】
本明細書に記載された本スクリーニングアッセイに関連して用いられる場合、「既知組成培地」とは、非ヒト動物の副産物を欠く培地であることを意図される。本開示に用いられるナイセリア−メニンギティディスについての既知組成培地は、所望の抗原決定基の発現に適した既知の成分を含有し、非ヒト動物の副産物を欠き、ヒト血液の１つまたは複数の成分をさらに追加されている。
【０１２９】
ヒト血液の成分には、血漿、白血球を含む血漿、補体、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フィブリン、プラスミノーゲンなどの凝固因子、α−グロブリン、β−グロブリンなどが挙げられるが、それらに限定されない。ヒト血液成分が血漿である場合、血漿を、内因性補体活性を不活性化するために熱失活させる。アッセイが特定のヒト抗体への結合を検出することを含む場合、その特定の抗体またはその特定のクラスの抗体（例えば、ＩｇＧ）を血漿から除去する。血漿はまた、関心対象となるＮ．メニンギティディスに対する内因性殺菌活性を欠損するドナーから得られる。上記で述べたように、ヒト血液成分の例は、ヒトコーン分画ＩＶ血清であり、それは商業的供給源から入手することができる。
【０１３０】
スクリーニングおよび／または評価はさらに、ウシ血清などの１つまたは複数の非ヒト動物の副産物を含有する培地などの未知組成培地中で増殖した細菌細胞への候補作用物質（例えば、抗体）の結合を比較するステップを含んでもよい。この目的に適した多くの未知組成培地が知られている。例えば、ナイセリア−メニンギティディス細胞の増殖および／または生存能を援助するための未知組成培地の例には、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ培地などが挙げられるが、それらに限定されない。認識されているように、既知組成培地および／または未知組成培地で培養された細菌細胞への作用物質の結合を比較する本方法のステップの順序は変えることができ、したがって、所定の最終用途のためにユーザーによって選択され得る。
【０１３１】
本開示はまた、上記の方法によって作製された単離抗体、および方法により作製された単離抗体を産生する能力がある単離細胞系を提供する。細胞系における単離および産生は、当技術分野において知られたいくつもの手順によってでも実施することができる。
【０１３２】
本開示はまた、ＴｓｐＢ（例えば、ＮｍＢ１６２８のＩＧＢドメインなどのそのＩＧＢドメイン）の重合体構造の形成への候補作用物質の効果を検出することによって、ＴｓｐＢとＩｇの結合を阻害するのに効果的な候補作用物質（例えば、抗体）をスクリーニングするための方法を提供する。候補作用物質が抗体である場合、その抗体は、候補抗原の投与によって誘発されてもよい。その方法は、ＴｓｐＢポリペプチドの重合体構造へ凝集する傾向、およびＴｓｐＢのＩｇ結合活性を阻害する抗体に接触した場合に分散するそれらの能力を利用している。例えば、方法は、候補作用物質（例えば、抗血清中の抗体）をＴｓｐＢに接触させるステップ、ならびにそのような接触後に形成される反応混合物において重合体構造の存在および／または量を検出するステップを含む。重合体構造の検出は、任意の適切な手段、例えば、光学顕微鏡を用いる反応混合物における凝集体の検出によって達成することができる。反応混合物は、水溶液中および／またはゲル中に提供することができる。候補作用物質が、候補作用物質の非存在下での凝集と比較して本ポリペプチドの凝集を分散および／または阻害する場合、その候補作用物質は、ＴｓｐＢのＩｇ結合活性の阻害のための候補として同定される。
【０１３３】
キット
本明細書に開示された組成物を用いるための、および上記のように方法を実施するためのキットもまた本発明によって提供される。キットは、Ｎ．メニンギティディスに対する（例えば、予防的または治療的）ワクチンの投与のために提供されてもよい。キットは、本明細書に開示されたポリペプチドまたはコード化核酸の１つまたは複数を含むことができ、それは滅菌容器内に提供されてもよく、対象への投与のための薬学的に許容される賦形剤と製剤化して提供することができる。ポリペプチドは、抗ＴｓｐＢ抗体の産生を与える抗Ｎ．メニンギティディスワクチンの製剤（例えば、組換えＴｓｐＢ断片を含有する製剤、ヒト血清と培養されたＴｓｐＢ発現株由来の小胞など）と共に提供することができ、本開示のポリペプチドは、そのようなワクチンと別々に製剤化されてもよいし、組み合わせて製剤化されてもよい。
【０１３４】
上記の成分に加えて、キットはさらに、本方法を実施するためにキットの成分を用いることについての使用説明書を含むことができる。本方法を実施するための使用説明書は、一般的に、適切な記録媒体上に記録される。例えば、使用説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷されてもよい。それとして、使用説明書は、パッケージ挿入物としてキット内に、キットまたはその成分の容器のラベル付けにおいて（すなわち、パッケージングまたはサブパッケージングに付随して）など、存在してもよい。他の実施形態において、使用説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスケットなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態において、実在の使用説明書はキット内に存在しないが、リモート供給源から使用説明書を入手するための手段、例えば、インターネットを介する手段が提供される。この実施形態の例は、使用説明書を見ることができ、および／または使用説明書がダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。使用説明書と同様に、使用説明書を入手するためのこの手段は、適切な基材上に記録されている。
【実施例】
【０１３５】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、例示を目的とするのみであること、およびそれを鑑みての様々な改変または変化が当業者に示唆されるであろうし、本出願の精神および権限内、ならびに添付された特許請求の範囲の範囲内に含まれ得ることは、理解されている。本明細書に引用された全ての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１３６】
材料および方法
以下の方法および材料を下記の実施例に用いた。
【０１３７】
Ｃａｔｌｉｎ  ６培地の調製。Ｃａｔｌｉｎ  ６培地（ＣＤＭ）の組成をＦｏｓｓａ  ｄａ  Ｐａｚ（Ｆｏｓｓａ  ｄａ  Ｐａｚら、２００３  Ｂｒａｚｉｌ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏ．３４：２７〜３２）から適応させた。アミノ酸、塩、グルコース、および鉄のあらかじめ作製されたストック溶液を混合することによって、各実験の前に新鮮に培地を調製した。下記のように調製された５６℃で熱失活させた５パーセントのＩｇＧ除去血清をＣＤＭに追加した（ＣＤＭ−ｄＨｕＳ）。２Ｍのグルタミンを加えること（ＵＣＳＦ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙ）が、ＣＤＭ中で培養された、いくつかのＮｍ株の倍加時間を減少させることが観察され、それゆえに、ＣＤＭの調製に含まれた。システインをＣａｔｌｉｎ  ６製剤から排除し、それは、システインを含まないＣａｔｌｉｎ培地が、システインを含む培地よりたいていのＮｍ株についてより一貫した増殖率を生じることが見出されたからである。
【０１３８】
ＩｇＧを除去されたヒト補体の調製。５ｍｌのプロテインＧカラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）に、カラムの先端および底に滅菌されたルアーロックバルブおよび２つの１０ｍｌのシリンジを装着した。Ｃａ＋およびＭｇ＋、０．５％グルコースを含む２５ｍｌの滅菌濾過されたＤｕｌｂｅｃｃｏｓ緩衝食塩水（ＤＰＢＳ＋ｇｌｕ）を用いて、カラムを洗浄し、その後、それを４℃で２０分間、冷却した。血清を−８０℃の貯蔵から取り出し、氷上で解凍した。５．５ｍｌの血清をカラムに負荷し、５分間、４℃に置いた。その後、ＤＰＢＳ＋ｇｌｕをカラムにアプライして、ＩｇＧを除去された血清と置き換えた。約５ｍｌの除去された血清を収集し、すぐに氷上に置いた。追加の５ｍｌのＤＰＢＳ＋ｇｌｕを、通過画分が完全に透明になるまでカラムにアプライした。プロテインＧに結合したＩｇＧを、０．１Ｍ酢酸ヒスチジン、ｐＨ２．７、０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０でカラムから溶出した。最初の１．５ｍｌの通過画分を捨てた。その後の１５ｍｌを収集し、緩衝液をＰＤ  １０サイズ排除カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、０．００２％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２４ｍＭスクロースを含有する２ｍＭヒスチジン、ｐＨ６と交換し、その後、凍結乾燥した。
【０１３９】
フローサイトメトリーによるヒトＩｇＧのＮｍ株への結合の検出
髄膜炎菌株（Ｗ１３５群Ａ２２株、Ｂ群ＮＭＢ株、Ｃ群４２４３株）を、０．２５％（重量／体積）グルコースを含むＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ；ＢＤ）培地、Ｃａｔｌｉｎ  ６（ＣＤＭ）培地（９）、または５％（重量／体積）ヒト血清（ＨｕＳ）もしくはマウス血清（ＭｏＳ）を追加したＣａｔｌｉｎ  ６培地中で約０．６のＯＤ６２０ｎｍまで増殖させた。ヒトドナー由来の血清を、上記のように、その血清を５６℃で３０分間、インキュベートすることによって熱失活させ（ＨｕＳ）、プロテインＧカラムにその血清を通過させることによってＩｇＧを除去した（ｄＨｕＳ）。細胞をペレット化し、洗浄し、ブロッキング緩衝液（１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ緩衝液（Ｓｉｇｍａ））中に最初の体積の８０％に再懸濁した。細胞の混合物を、周期的に穏やかに撹拌しながら４℃で１時間、インキュベートした。細胞をペレット化し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）連結型ヤギ抗ヒト二次抗体のブロッキング緩衝液中１：２００希釈溶液の２００μｌに再懸濁した。ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２およびＩｇＭに対するＦＩＴＣ連結型抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。二次抗体を加えた後、チューブを、周期的に穏やかに撹拌しながら４℃で１時間、インキュベートした。細胞を、ペレット化し、新鮮に作製されかつ濾過された４００μｌの０．５％ホルムアルデヒド（重量／体積）含有ＰＢＳ（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に再懸濁した。試料をすぐに、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって分析した。
【０１４０】
マウス抗血清の収集。ＣＤ１マウス（６〜８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）の群を、５０％生理食塩水／５０％フロイント完全アジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）乳濁液中、または３．２５ｍｇ／ｍｌアルハイドロゲル（ミョウバン）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）もしくは生理食塩水単独中の合計１μｇ、５μｇ、１０μｇ、もしくは２５２μｇ、または１０μｇのＴｓｐＢ−ＩＧＢ（すなわち、ＴｓｐＢ−ＩＧＢワクチン）で腹腔内注射によって免疫した。各注射から４０日後、顔面静脈のランセットにより血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡによって試験した。
【０１４１】
追加免疫用量を、不完全フロイントアジュバント（Ｐｉｅｒｃｅ）、ミョウバン、または生理食塩水単独と共に２８日後に与え、免疫後１４日目に採取された抗血清の力価を評価した。抗血清力価をＥＬＩＳＡによって決定した。個々のマウス由来の抗血清をプールし、全てのさらなる実験を、プールされた抗血清を用いて行った。各ＴｓｐＢ−ＩＧＢを１：２００で希釈してＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌにし、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＩ  ＨＢ）へウェルあたり１００μｌを加えることによってＥＬＩＳＡプレートを調製した。プレートを使用前に４℃で一晩、貯蔵した。プレートをＰＢＳ緩衝液で５回、洗浄し、１％（重量／体積）のＢＳＡを含有するＰＢＳ緩衝液（ブロッキング緩衝液）で、周囲温度で１時間、ブロッキングした。抗血清をブロッキング緩衝液中に１：１００希釈で加え、続いて、３倍段階希釈を行った（２連）。４℃での一晩のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ緩衝液で５回、洗浄し、ブロッキング緩衝液中に１：３０００希釈したウサギ抗マウスアルカリフォスファターゼ連結型抗体（Ｚｙｍｅｄ）を加えた。さらに１時間、周囲温度でインキュベートした後、プレートをＰＢＳ緩衝液中で（５回）洗浄し、結合した抗体を、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９中の１ｍｇ／ｍｌ  リン酸ｐ−ニトロフェニル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって検出した。周囲温度での３０分間のインキュベーション後の４０５ｎｍにおける吸光度を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３４０マイクロタイタープレートリーダーを用いて測定した。抗血清をＴｓｐＢ−ＩＧＢに対して試験した。
【０１４２】
天然条件下でのＴｓｐＢ  ＩＧＢおよびＩＧＢｐｒｏの精製。２５０ｍｌの細胞培養物からの凍結細胞ペレットを解凍し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）の２０ｍｌと、０．１ｍＭフッ化フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ）および１０μｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳの２０ｍｌに溶解した、０．５％（重量／体積）オクチルグルコピラノシド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中に再懸濁した。１８Ｇ針および一定の長さのＴｅｆｌｏｎ管を取り付けたシリンジを用いて、溶液を、針を通して強制的に繰り返し、往復させることによって、混合物をホモジナイズした。ホモジナイズされた溶液を、周囲温度で２０分間、ロッキングプラットフォーム上で撹拌し、その後、２０，０００ｘｇで１０分間、遠心分離した。上清を捨て、ペレットを、１０ｍｌのＴＢＳと、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび１０μｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼを含有するＰＢＳの１０ｍｌ中に溶解した、０．５％（重量／体積）ＥｍｐｉｇｅｎＴＴ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に懸濁した。ホモジナイズされた溶液を、上記のように、周囲温度で２０分間、ロッキングプラットフォーム上で撹拌し、その後、遠心分離した。生じた上清を新しいチューブに移し、一方、ペレットは、０．５％ＥｍｐｉｇｅｎＴＴ含有溶液中で２回目の抽出を行い、再びペレット化する前に周囲温度で５分間、ロッキングプラットフォーム上で撹拌した。生じた上清を、最初のＥｍｐｉｇｅｎＴＴ抽出由来の上清と混合し、固体イミダゾールを１０ｍＭの最終濃度まで加え、その溶液を０．２μフィルター（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）を通して濾過した。その後、濾過された溶液を、溶解緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、および１％（体積／体積）ＥｍｐｉｇｅｎＴＴを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８）で平衡した５ｍｌ  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨｉｓＴｒａｐ高性能ＨＰカラム（ＧＥ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に通過させた。カラムを、５０ｍｌの洗浄緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、および１％（体積／体積）ＥｍｐｉｇｅｎＴＴを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８）で洗浄し、ＴｓｐＢタンパク質を、最初に１２５ｍＭイミダゾール（１４ｍｌ）、その後２５０ｍＭイミダゾール（１６ｍｌ）を含有する溶出緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％（体積／体積）ＥｍｐｉｇｅｎＴＴを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８）で段階溶出した。２ｍｌの画分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。精製されたＴｓｐＢ誘導体を含有する画分を混合し、０．９％ＮａＣｌに対して透析し、ＹＭ−１０濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて０．２〜２ｍｇ／ｍｌタンパク質まで濃縮した。
【実施例１】
【０１４３】
ヒト血清の存在下で培養された髄膜炎菌株によるヒトＩｇＧ結合の検出
ナイセリア−メニンギティディスＷ１３５群（ＮｍＷ１３５）Ａ２２株の表面へのヒトＩｇＧの結合に影響を及ぼす可能性がある細菌細胞の増殖条件を同定するためにフローサイトメトリー実験を行った。精製ヒトＩｇＧが特定の試料に加えられる結合実験に加えて、対照の場合は、マウス血清を加えない場合および加える場合を含んだ。
【０１４４】
ＮｍＷ１３５のＡ２２株の結果は図１に示されている。黒色のヒストグラムは、示された試験条件についての結果を示し、白色のヒストグラムは添加物無しの陰性対照である。Ａ２２細胞をＭＨ培地単独またはＣＤＭ単独中で増殖させ、かつ試験株に対する内因性血清殺菌活性を欠くドナー（ドナー１）由来の精製ヒトＩｇＧを結合実験中に加えた場合、ＩｇＧの結合は検出されず、またはわずかに検出された（それぞれ、図１Ａ、Ｂ）。その結果より、血清から精製された抗体と反応性である、細菌によって発現される抗原は、いずれの培養条件下においてもないことが示されている。再び、細菌を、精製ＩｇＧの同じドナー源（ドナー１）由来のｄＨｕＳを追加したＭＨ中で培養した場合（図１Ｃ）、わずかなＩｇＧ結合が観察された。しかしながら、細菌を、ｄＨｕＳを追加したＣＤＭ中で培養した場合、細胞の部分集団の蛍光が右へシフトし（図１Ｄ）、ＩｇＧの９９％より多くが血清から除去されている（除去および希釈後、［ＩｇＧ］＞２μｇ／ｍｌ）にもかかわらず、結合したヒトＩｇＧの存在を示している。ＣＤＭ／ｄＨｕＳ（Ｄ列）と比較して、ＭＨ／ｄＨｕＳ（Ｃ列）中で培養した細胞についてのはるかに低いＩｇＧ陽性細胞集団により、ヒト血清により誘導されるＩｇ結合活性の発現が、ＭＨ培地において抑制されることが示唆されている。マウス血清を追加したＣＤＭ（ＣＤＭ／ＭｏＳ）中で培養された細胞は、マウスＩｇＧの結合を示さなかった（図１Ｅ）。また、細菌をＭｏＳの存在下で培養し、かつ精製ヒトＩｇＧを加えた場合には、ヒトＩｇＧの結合が観察されなかった（図１Ｆ）。その結果より、Ｉｇ結合活性の発現を誘発するヒト血清中の因子がマウス血清中に存在しないことが示されている。しかしながら、細菌をヒト血清の存在下で培養し、その後、マウス血清とインキュベートした場合には、マウスＩｇＧの結合が観察されたが、蛍光はより弱い（図１Ｇ）。したがって、Ｉｇ結合活性は、ヒトＩｇＧに対して完全に特異的というわけではないが、Ｉｇ結合活性の発現を引き起こすためにヒト血清因子を必要とする。
【０１４５】
観察されたＩｇ結合活性が、細菌をヒト血清の存在下で培養した場合に発現した抗原のみを免疫ＩｇＧが認識するという結果ではないことを示すために、細菌を、蛍光タグで修飾されている（ポリクローナルヒトＩｇＧから調製された）精製ヒトＦｃ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡから入手された、ＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）を追加したＣＤＭＨｕＳ中で増殖させた。図１Ｈに示されているように、細菌は、Ｆｃドメインのみに結合する。Ｆｃドメインは、培地中に存在する無傷ヒトＩｇＧと競合するため、結合がより弱く、またはＦｃドメインがエピトープ全体を表すわけではないため、より弱い可能性があるが、ＨｕＦｃ−ＦＩＴＣの存在下でｄＨｕＳを含まないＣＤＭ中で増殖した細菌の陰性対照（白色のヒストグラム）と比較して、それは明らかに増加している。Ｆｃ断片は結合性部位を欠くため、観察された結合は、抗体の抗原への結合の結果ではなく、むしろ、抗原のＦｃドメインへの結合の結果であり得る。さらに、Ｉｇ結合の証拠は、下記の実施例２に提供されており、実施例２において、そのタンパク質が同定され、そのタンパク質の組換えサブドメイン（すなわち、上記のＩＧＢドメイン）がヒトおよびマウスのＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを結合することが示されている。
【０１４６】
図２Ａは、２人のドナー（ドナー１およびドナー３）由来のｄＨｕＳを用いる結合実験、ならびにＷ１３５群Ａ２２株、Ｍ９２６２株、および４３８３株に加えて遺伝的かつ抗原的に多様なＢ群（ＮＭＢ）およびＣ群（４２４３）の株によるヒトＩｇＧ結合（図２Ｂ）を示す。結果より、ＩｇＧ結合タンパク質のＨｕＳ依存性発現が特定のドナーに特有ではないこと、およびＩｇＧ結合タンパク質発現がＡ２２株に限定されないことが示されている。株の遺伝的および抗原的多様性、ならびにドナーおよび特にマウスの侵襲性Ｎｍ株への可能性の低い暴露を考慮すれば、ドナー血清が、細菌がヒト血清の存在下で培養された場合のみに発現する、共通の抗原に反応性の抗体を含有することは可能性が低い。
【実施例２】
【０１４７】
ナイセリア−メニンギティディス細菌によって発現されたヒトＩｇＧ結合タンパク質の親和性精製および同定
ヒトＩｇＧ結合タンパク質の親和性精製。ＮｍＷ１３５のＡ２２株の細胞をＭＨまたはＣＤＭＨｕＳ中、３７℃で増殖させた。各培養条件について、７ｍＬの５つの培養を０．１５（ＭＨ）または０．２（ＣＤＭＨｕＳ）のＯＤ６２０ｎｍから開始した。ＯＤ６２０ｎｍが約０．６に達したとき、５つの培養物を混合し、６５ｍＬのそれぞれの培地をさらに加えて、合計１００ｍＬにし、ＯＤ６２０ｎｍ＝０．６までインキュベーションを続けた。細胞を１０，０００ｘｇで３０分間、遠心分離し、細胞をペレット化した。細胞ペレットを、１０ｍＬのフィルター処理（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）されたＰＢＳ緩衝液中で２回、洗浄した（緩衝液中に再懸濁し、遠心分離した）。最終洗浄後、２ｍＬのアリコート中の細胞をペレット化し、ドライアイス上で凍結させた。
【０１４８】
１つの２ｍＬ細胞アリコートを解凍し、ＰＢＳで２回、洗浄した。洗浄後、細胞ペレットを２ｍＬの可溶化緩衝液（１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（重量／体積）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．２％（重量／体積）デオキシコール酸ナトリウム、および０．１％（重量／体積）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．８）中に再懸濁し、３７℃で６０分間、インキュベートした。試料を４５，０００ｘｇで２０℃、６０分間、遠心分離した。上清を、プロテインＡまたはプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂビーズ（Ｓｉｇｍａ）（プロテインＡ：５０μＬのＰＢＳ中にあらかじめ膨潤した３〜４ｍｇのビーズ、プロテインＧ：ＰＢＳ中で３回、洗浄された５０μＬのビーズを用いた）を含有するマイクロチューブに移した（免疫沈降あたり１ｍＬ）。試料およびビーズの混合物を、４℃でロッキングさせながら、一晩、インキュベートした。ビーズを、２分間の遠心分離を用いて可溶化緩衝液で５回、洗浄して、各洗浄後、ビーズをペレット化した。最終の洗浄後、ビーズを、２−メルカプトエタノールを含まない７５μＬの試料緩衝液中に懸濁し、１００℃で５分間、インキュベートして、結合した免疫グロブリンおよびタンパク質を遊離させた。試料を、上記のように３分間、遠心分離して、ビーズをペレット化し、上清を新しいチューブに移した。２μＬの２−メルカプトエタノールを加え、上清を１００℃で５分間、加熱した。ビーズから溶出されたタンパク質を、４％〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＮｏｖｅｘプレキャストゲル）上で分解し、それを製造会社の使用説明書に従ってＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で染色し、ゲル中のバンドを、図３に示されているように、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲ撮像装置（Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ）を用いて検出した。
【０１４９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量フィンガープリント分析によるナイセリアのヒトＩｇＧ結合タンパク質の同定。上記のように免疫沈降されたＩｇＧ結合抗原を含有するＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの部分を、清潔な安全かみそりの刃を用いて切り取り、シリコン処理されたチューブ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で切り刻んだ。ボルテクサー上で撹拌しながら１０分間、４０％（体積／体積）アセトニトリルを含有する２００ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液で３回、洗浄することによってゲル小片から染色を取り除いた。ゲル小片を減圧下で３０分間、乾燥させ、その後、トリプシン（１２ｎｇ／μｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＮＪ）を含有する最小量の２５ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液中で再水和させ、３７℃で一晩、インキュベートした。緩衝溶液と、５０％（体積／体積）アセトニトリル中の０．１％（体積／体積）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でゲル小片中から抽出されたトリプシンペプチドを混合した。溶出されたペプチドをｓｐｉｎ−ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）内で乾燥させた後、その残留物を、４μｌの０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル中に再懸濁した。１μｌのこの溶液を、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Fremont、CA）で飽和した３μｌの０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリルに加えた。０．５μｌの試料／マトリックス溶液を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のためにステンレススチール標的プレート（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上へスポットした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ａｕｔｏｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を、陽イオンリフレクターモード（３０ショットＮ２レーザー）で行った。質量スペクトルを、外部ペプチド標準（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて較正した。観察された質量の誤差は、≦０．１％であると推定される。観察されたペプチド質量のセットを、Ｍａｓｃｏｔ（ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ；Ｐｅｒｋｉｎｓ  ＤＮら、１９９９  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０：３５５１〜３５６７）を用いて分析した。いったんタンパク質が同定されたならば、タンパク質分解性断片の予想質量を、ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓ（Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＭＲら、１９９７  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０：３５５１〜３５６７）を用いて計算した。
【０１５０】
図３に示されているように、ある範囲の分子量を有するタンパク質が、ＣＤＭ／ｄＨｕＳ中で増殖した可溶化細胞とインキュベートされたプロテインＡおよびＧから溶出されたが、ＭＨ中では溶出されなかった。しかしながら、ゲルから単離された各タンパク質バンド由来のトリプシンペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析した場合、それらの全てが類似した一連の質量を含有し、単一のタンパク質の存在が、変動する移動度でゲル内を移動したことを示している（図３）。Ｍａｓｃｏｔを用いる質量フィンガープリント分析によって決定されたタンパク質のアイデンティティ（図４）は、６４の確率に基づいたＭｏｗｓｅスコア（５０より大きい値が有意である）および０．００２６の対応する期待値（０．０５未満の値が有意である）を以て、ＮｍＡのＺ２４９１株ＮＭＡ０７７６遺伝子によってコードされたものであることが見出された。ＮｍＡのＺ２４９１株ゲノム由来のＮＭＡ０７７６および相同性遺伝子のＮＭＡ１７９７は、Ａｌａ’Ａｌｄｅｅｎおよび共同研究者（Ｋｉｚｉｌ  ＧＩら、１９９９  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：３５３３〜３５４１；米国特許第６８６１５０７号）によって同定されたＴ細胞およびＢ細胞の刺激タンパク質Ｂ、ならびにＢｉｌｌｅ  Ｅら、２００５  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１：１９０５〜１９１３およびＢｉｌｌｅ  Ｅら、２００８  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３：ｅ３８８５によって同定されたＯｒｆ６と配列相同性を共有する。
【実施例３】
【０１５１】
ナイセリアのヒトＩｇＧ結合タンパク質の配列分析および構造モデル。
ＮＭＡ０７７６の翻訳タンパク質配列およびＮＣＢＩ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｕｔｉｌｓ／ｇｅｎｏｍ＿ｔａｂｌｅ．ｃｇｉ）で利用可能な１３個のナイセリア科ゲノムのＢＬＡＳＴ配列相同性検索を用いて、相同性タンパク質配列が侵襲性髄膜炎菌Ａ群（Ｚ２４９１）、Ｂ群（ＭＣ５８）、およびＣ群（ＦＡＭ１８）、ならびにナイセリア−ゴノレア（ＦＡ１０９０）株および非侵襲性ナイセリア−ラクタミカ（ＡＴＣＣ  ２３９７０）株に見出された。推定ＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６タンパク質をコードする遺伝子の数は、１個の部分配列（ラクタミカ株ＡＴＣＣ  ２３９７０）から４個の完全長配列（髄膜炎菌Ｂ群ＭＣ５８、Ｃ群ＦＡＭ１８およびＮ．ゴノレアＦＡ１０９０株）までの範囲であった。Ａ群、Ｂ群、およびＣ群の株由来の翻訳されたタンパク質配列を比較した場合、パターンが現れた。
【０１５２】
図５に示されているように、そのタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端の配列は、多岐にわたるが、比較的保存されているコア領域がある。可変アミノ末端配列は、新生タンパク質を細胞の外へ輸送されるように方向づける機能的リーダーペプチド配列の可能性がある。そのタンパク質のカルボキシル末端において、可変配列は、一般的に、機能的に等価であるために同じ配列を有する必要はない可能性がある疎水性膜貫通セグメントである。保存された内部ドメインに関しては、後にプロリンリッチセグメントが続く、二次構造予測に基づいたβシート構造で主に構成されている典型的な球状ドメインがある。プロリンリッチセグメントは、伸長したヘリカル構造をとることが知られている（Ｂｕｔｃｈｅｒ  ＤＪら、１９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：６９８〜７０３）。
【０１５３】
分析により、少なくともいくつかのＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６遺伝子は、細菌表面へ運び出され得るタンパク質をコードする。そのタンパク質は、超可変Ｎ末端ドメイン、続いて、可変膜貫通セグメントによって膜に繋ぎ止められているプロリンリッチヘリカルセグメントの末端で膜から外へ伸びる球状ドメインを含有する。この構造モデルに基づいて、球状セグメントおよび／またはプロリンリッチセグメントは、それらが高度に保存されているため、いくつかの機能活性を有するが、可変Ｎ末端ドメインは、抗体応答を崩壊させるための不必要な「偽装」としての役割を果たすことは明らかである。したがって、ＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６を標的とする抗体を誘発するために設計されるワクチンは、一方または両方の保存ドメインのみを含有するものでもよい。
【実施例４】
【０１５４】
ナイセリアのヒトＩｇＧ結合タンパク質の定常領域ドメインを含有する様々なＩｇ結合性構築物のクローニングおよび発現
保存された球状ドメイン（ＣＲ）を、下記のようにクローン化した（本明細書ではＴｓｐＢ−ＩＧＢと呼ぶ）。ゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、製造会社の使用説明書に従って、ＭＣ５８株から調製した。ＴｓｐＢ−ＩＧＢをコードするＤＮＡを、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＧ−３’（配列番号４９）および５’−ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＣＧＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号５０）。ＰＣＲは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）社製のＰｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、および緩衝液を用いるＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅサーモサイクラーでの９５℃での変性、５０℃でのアニーリング、および７２℃での伸長の３０サイクルからなった。ＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用い、製造会社の使用説明書に従って精製し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いて、２０℃で一晩、プラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へライゲーションした。ライゲーション反応産物を用いて、大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）およびＢｌｕｅ  Ｗｈｉｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔスクリーニング試薬（Ｓｉｇｍａ）を含有するＬＢ寒天プレートに蒔いた。Ｑｉａｇｅｎミニプラスミドプレップキットを用いてプラスミドを白色コロニーから調製し、ＴｓｐＢ−ＩＧＢ  ＤＮＡ断片の存在を下記のように確認した。
【０１５５】
プラスミドを、まず、Ｅｃｏ  ＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、挿入断片のサイズを確認した。クローニングに用いられる断片を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ  ＩＩＩ、続いてＢａｍ  ＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。生じた断片を、ＴＢＥ緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）中の０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する１％（重量／体積）アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＳ）ゲルにおける電気泳動によって単離した。予想されたサイズのＴｓｐＢ−ＩＧＢ  ＤＮＡ断片に対応するバンドを、ゲルから切り取ることによって単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製した。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／ＢａｍＨＩ  ＴｓｐＢ−ＩＧＢ  ＤＮＡ断片を従来通り、上記のように前もって同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、エビアルカリフォスファターゼ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）で処理し、アガロースゲル電気泳動によって精製したプラスミドｐＱＥ３１（Ｑｉａｇｅｎ）およびｐＥＴ２１ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ  ｎｏｗ  ＥＭＤ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ）へライゲーションした。ライゲーション反応からのＤＮＡ産物を用いてＢＬ（ＤＥ３）株を形質転換し、それを、上記のように、ＬＢ寒天／アンピシリンプレート上に蒔いた。プラスミドＤＮＡを形質転換体から調製し、正しい挿入断片の存在を、制限エンドヌクレアーゼ消化およびＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１５６】
プラスミドｐＱＥ３１は、アミノ末端に（６個のヒスチジン残基を含有するセグメントである）Ｈｉｓタグを有するＴｓｐＢ−ＩＧＢの高レベルの細胞内発現を可能にした。他方、プラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）からの発現は、ＴｓｐＢ−ＩＧＢのカルボキシル末端にＨｉｓタグ、およびＴｓｐＢ−ＩＧＢのアミノ末端に、タンパク質を周辺質への分泌へと方向づけるｐｅｌＢリーダーペプチドを組み込むであろう。プラスミドｐＱＥ３１の利点には、非常に高いレベルのタンパク質発現が挙げられ、一方、プラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）は、細胞外の細胞膜周辺腔内での天然の折り畳みを可能にする。ＴｓｐＢ−ＩＧＢ含有プラスミド構築物を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ形質転換した。個々のコロニーを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する５０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で一晩、振盪インキュベータ内で増殖させた。次の日、一晩の培養物を用いて、振盪インキュベータ内、３７℃で、５００ｍｌの２ｘ  ＹＴ培地に播種した。ｐＱＥ３１−ＴｓｐＢ−ＩＧＢ構築物を含有する細胞についてＯＤ６２０ｎｍが０．５から１の間になったとき、ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）を１ｍＭの最終濃度まで、およびアンピシリンを２００μｇ／ｍｌまで加えた。培養を３時間、続け、細胞を８０００ｘｇで２０分間の遠心分離によって収集し、上清を捨て、細胞ペレットを、下記のように処理するまで、−８０℃で凍結させた。ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＴｓｐＢ−ＩＧＢプラスミドを含有するＢＬ２１（ＤＥ３）の培養物を、ＯＤ６２０ｎｍが約０．６である時点で、２２℃まで冷却した。ＩＰＴＧおよびアンピシリンをそれぞれ、１ｍＭおよび２００μｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、培養を２２℃で一晩、続けた。細胞を遠心分離によって回収し、下記のように用いるまで凍結させた。
【０１５７】
上記の方法に基づいて、組換えＴｓｐＢを発現するためのいくつかの構築物を作製した。ＮｍＢのＭＣ５８株は、以下の３個のＴｓｐＢ遺伝子を有する：ＮＭＢ１５４８、ＮＭＢ１６２８、およびＮＭＢ１７４７。ＮＭＢ１６２８およびＮＭＢ１７４７  ＴｓｐＢ遺伝子は、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。ＮＭＢ１６２８由来の配列を、（Ｎ末端Ｈｉｓタグを有する）ｐＱＥベクター内でクローン化し、ＮＭＢ１５４８由来の配列を、ｐＱＥベクターおよび（Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する）ｐＥＴベクターの両方へクローン化した。
【０１５８】
作製した追加のバージョンの構築物は以下を含んだ：１）ｐＱＥベクターおよびｐＥＴベクターの両方における、本明細書でＩＧＢｐｒｏおよび完全長ＮＭＢ１６２８と呼ばれる、ＮＭＢ１６２８定常領域およびプロリンリピート。下記の詳細を参照されたい。
【０１５９】
１）ＩＧＢｐｒｏを含有するＮＭＢ１６２８由来のＴｓｐＢ：
ＮＭＢ１６２８の保存された球状ドメイン、続いて保存されたプロリンリッチリピートにわたるＤＮＡ断片を下記のようにクローン化した（本明細書ではＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏと呼ぶ）。ゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、製造会社の使用説明書に従ってＭＣ５８株から調製した。ＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏ（ＮＭＢ１６２８）をコードするＤＮＡを、以下のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＴ−３’（配列番号５１）および５’−ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧ−３’（配列番号５２）。ＰＣＲは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）社製のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、および反応緩衝液を用いるＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅサーモサイクラーでの９５℃での変性、４８℃でのアニーリング、および７２℃での伸長の５サイクル、続いて、９５℃での変性、５２℃でのアニーリング、および７２℃での伸長の２５サイクルからなった。ＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造会社の使用説明書に従って精製した。ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書の通り、ＰＣＲ産物を、プラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へライゲーションし、ライゲーション反応産物を用いて、大腸菌ＴＯＰ  １０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）およびＸ−Ｇａｌ（ブロモ−クロロ−インドリル−ガラクトピラノシド、Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。他の２つのゲノム遺伝子座（ＮＭＢ１５４８およびＮＭＢ１７４７）由来のＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏの増幅および組込みを排除して、正しい挿入断片を含むプラスミドＤＮＡを有する白色コロニーについてスクリーニングするために、検証プライマー５’−ＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＴＣＡＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号５３）および５’−ＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＡＡ−３’（配列番号５４）を用いるコロニーＰＣＲを実施した。その後、プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニ−プラスミドプレップキットを用いて、選択された形質転換体から調製し、ＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏをコードする正しい配列を、ＤＮＡシークエンシングによって検証した。
【０１６０】
挿入断片を有するプラスミドｐＣＲ２．１を、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。生じた断片を、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ酢酸Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の１．５％（重量／体積）アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＳ）ゲルにおける電気泳動によって単離した。電気泳動後、ＤＮＡバンドを、アガロースゲルを０．５％臭化エチジウム溶液（Ｇｉｂｃｏ）中に浸水させることによって可視化した。予想されたサイズのＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏ  ＤＮＡ断片に対応するバンドを、ゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製することにより単離した。Ｂａｍ  ＨＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏ  ＤＮＡ断片を、前もって同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、エビアルカリフォスファターゼ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）で処理した発現プラスミドｐＱＥ３１（Ｑｉａｇｅｎ）へライゲーションした。その後、ライゲーション反応物を用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）株を形質転換し、それを、上記のように、ＬＢ寒天／アンピシリンプレート上に蒔いた。正しい挿入断片を含むプラスミドＤＮＡを有するコロニーを選択するために、検証プライマー５’−ＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＴＧＴＣＡＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号５３）および５’−ＡＴＣＡＡＧＣＡＣＡＧＴＣＡＣＴＧＴＧＡＡ−３’（配列番号５４）を用いるコロニーＰＣＲを実施した。その後、ＤＮＡを、選択された形質転換体から調製し、ＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏをコードする正しい配列をＤＮＡシークエンシングによって検証した。
【０１６１】
２）ＮＭＢ１６２８由来の完全長ＴｓｐＢ（ＴｓｐＢ−ＦＬ）
ＮＭＢ１６２８の完全長オープンリーディングフレーム（開始コドンから停止コドンまで）を下記のようにクローン化した（本明細書ではＴｓｐＢ−ＦＬと呼ぶ）。ゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、製造会社の使用説明書に従ってＭＣ５８株から調製した。ＴｓｐＢ−ＦＬをコードするＤＮＡを、プラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）へクローン化するためにプライマー対５’−ＡＧＣＡＴＡＴＧＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴ−３’（配列番号５５）および５’−ＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＡＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号５６）、プラスミドｐＱＥ３０へクローン化するためにプライマー対５’−ＡＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＧＧＧＡＴＧＴＴＴＴＣＧＧＴＴＡＡ−３’（配列番号５７）および５’−ＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＡＣＧＡＧＡＴＡＣＴＧ−３’（配列番号５８）を用いるＰＣＲによって増幅した。両方の増幅反応についてのＰＣＲは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）社製のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、および反応緩衝液を用いるＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅサーモサイクラーでの９５℃での変性、４８℃でのアニーリング、および７２℃での伸長の５サイクル、続いて、９５℃での変性、５２℃でのアニーリング、および７２℃での伸長の２５サイクルからなった。ＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造会社の使用説明書に従って精製した。ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書の通り、ＰＣＲ産物を、プラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へライゲーションし、ライゲーション反応産物を用いて、大腸菌ＴＯＰ  １０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。形質転換された大腸菌細胞を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）およびＸ−Ｇａｌ（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。Ｑｉａｇｅｎミニ−プラスミドプレップキットを用いて、ＴｓｐＢ−ＦＬ断片の最初の増幅に用いたプライマーでのコロニーＰＣＲ中にＰＣＲ産物を生じた白色コロニーからプラスミドを調製した。正しいＴｓｐＢ−ＦＬ挿入断片配列を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１６２】
プラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ、またはＢａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して、ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）およびｐＱＥ３０、それぞれへクローン化するために用いる断片を遊離させた。生じた断片を、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ酢酸Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の１．５％（重量／体積）アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＳ）ゲルにおける電気泳動によって単離した。電気泳動後、ＤＮＡバンドを、アガロースゲルを０．５％臭化エチジウム溶液（Ｇｉｂｃｏ）中に浸水させることによって可視化した。予想されたサイズのＴｓｐＢ−ＦＬ  ＤＮＡ断片に対応するバンドを、ゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製することにより単離した。Ｎｄｅ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ  ＴｓｐＢ−ＦＬ  ＤＮＡ断片を、前もって同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、エビアルカリフォスファターゼ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）で処理した発現プラスミドｐＥＴ２２ｂ（＋）およびｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）、それぞれへライゲーションした。ライゲーション反応からのＤＮＡ産物を用いて、大腸菌ＴＯＰ  １０Ｆ’株の細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、それを、上記のように、ＬＢ寒天／アンピシリンプレート上に蒔いた。Ｑｉａｇｅｎミニ−プラスミドプレップキットを用いて、上記のようにコロニーＰＣＲ中にＰＣＲ産物を生じた形質転換体からプラスミドを調製した。正しいＴｓｐＢ−ＦＬ挿入断片配列を、再び、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１６３】
３）ＮＭＡ０７７６および１７９７由来のＴｓｐＢ  ＩＧＢ
ＮＭＡ０７７６およびＮＭＡ１７９７によってコードされる保存された球状ドメインＴｓｐＢ−ＩＧＢを、ＭＣ５８におけるＮＭＢ１６２８によってコードされたＴｓｐＢ−ＩＧＢｐｒｏについて上で記載されているように、クローン化した。ゲノムＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、製造会社の使用説明書に従ってＺ２４９１株から調製した。ＮＭＡ０７７６のＴｓｐＢ−ＩＧＢをコードするＤＮＡを、以下のプライマー：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＧＴＡＴＣＣＣＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号５９）および５’−ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＧ−３’（配列番号６０）を用いるＰＣＲによって増幅し、一方、ＮＭＡ１７９７のＴｓｐＢ−ＩＧＢをコードするＤＮＡを、以下のプライマー：５’−ＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＣＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号６１）および５’−ＣＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＣＣＧＣＧＣＴＴＣ−３’（配列番号６２）を用いるＰＣＲによって増幅した。両方の増幅反応についてのＰＣＲは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）社製のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド、および反応緩衝液を用いるＩｄａｈｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ、Ｕｔａｈ）ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅサーモサイクラーでの９５℃での変性、４８℃でのアニーリング、および７２℃での伸長の５サイクル、続いて、９５℃での変性、５２℃でのアニーリング、および７２℃での伸長の２５サイクルからなった。ＰＣＲ断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造会社の使用説明書に従って精製した。ＴＯＰＯ−ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造会社の使用説明書の通り、ＰＣＲ産物を、プラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へライゲーションし、ライゲーション反応産物を用いて、大腸菌ＴＯＰ  １０株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。形質転換された大腸菌を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓｉｇｍａ）およびＸ−Ｇａｌ（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔いた。Ｑｉａｇｅｎミニ−プラスミドプレップキットを用いて、ＮＭＡ０７７６およびＮＭＡ１７９７によってコードされるＴｓｐＢ−ＩＧＢの最初の増幅に用いたプライマーでのコロニーＰＣＲ中にＰＣＲ産物を生じた白色コロニーからプラスミドを調製した。正しいＴｓｐＢ−ＩＧＢ挿入断片配列を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０１６４】
両方のＴｓｐＢ−ＩＧＢ挿入断片配列を有するプラスミドを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍ  ＨＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化して、クローン化するのに用いる２つの断片を遊離させた。生じた断片を、ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ酢酸Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の１．５％（重量／体積）アガロース（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＳ）ゲルにおける電気泳動によって単離した。電気泳動後、ＤＮＡバンドを、アガロースゲルを０．５％臭化エチジウム溶液（Ｇｉｂｃｏ）中に浸水させることによって可視化した。予想されたサイズのＴｓｐＢ−ＩＧＢ  ＤＮＡ断片に対応するバンドを、ゲルから切り取り、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製することにより単離した。Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｂａｍ  ＨＩ  ＴｓｐＢ−ＩＧＢ  ＤＮＡ断片を、前もって同じ制限エンドヌクレアーゼで消化し、エビアルカリフォスファターゼ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）で処理した発現プラスミドｐＱＥ３１（Ｑｉａｇｅｎ）へライゲーションした。ライゲーション反応物を用いて、大腸菌ＴＯＰ  １０Ｆ’株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、それを、上記のように、ＬＢ寒天／アンピシリンプレート上に蒔いた。Ｑｉａｇｅｎミニ−プラスミドプレップキットを用いて、２つのＴｓｐＢ−ＩＧＢ断片の最初の増幅に用いたプライマーでのコロニーＰＣＲ中にＰＣＲ産物を生じたコロニーからプラスミドＤＮＡを調製した。正しいＴｓｐＢ−ＩＧＢ挿入断片配列を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【実施例５】
【０１６５】
組換えＴｓｐＢ−ＩＧＢの精製
ＴｓｐＢ−ＩＧＢタンパク質の精製を、Ｑｉａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ第５版（２００３、Ｑｉａｇｅｎ）に記載されているように、ｐＱＥ３１−ＴｓｐＢ−ＩＧＢ発現プラスミドについては変性条件下で、またはｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＴｓｐＢ−ＩＧＢ発現プラスミドについては非変性条件下で、５ｍｌ  Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨｉｓＴｒａｐ高性能ＨＰカラム（ＧＥ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて実施した。カラムからの画分を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のプレキャストゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、続いて、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＩＲスキャナ（ＬＩ−ＣＯＲ）でゲルをスキャンすることによって記録した。変性条件下で精製されたＴｓｐＢ−ＩＧＢを含有する画分を混合し（合計６ｍｌ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌおよび８Ｍ尿素を含有する１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液、ｐＨ８．０中３０ｍｌに希釈し、１日にわたって、１回に２５ｍｌのＰＢＳ緩衝液を加えることによって、周囲温度でＰＢＳ緩衝液（合計１Ｌ）中、透析した（１ｋＤａカットオフＳｐｅｃｔｒｏｐｏｒ膜、Ｆｉｓｈｅｒ）。最後に、再び折り畳まれたＴｓｐＢタンパク質を、０．００２％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２４ｍＭスクロースを含有する４Ｌの２ｍＭヒスチジン、ｐＨ６中で透析し、凍結乾燥した。非変性条件下で精製されたＴｓｐＢ−ＩＧＢ（ｐＥＴ２２ｂ（＋）−ＴｓｐＢ−ＩＧＢ構築物）を、０．００２％Ｔｗｅｅｎ  ２０および２４ｍＭスクロースを含有する４Ｌの２ｍＭヒスチジン、ｐＨ６中で透析し、凍結乾燥した。
【０１６６】
図６に示されているように、ｐＱＥ３１プラスミドまたはｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドのどちらから発現した精製産物も、上記の両方の方法が、高純度のＴｓｐＢ−ＩＧＢポリペプチドを産生することができることを立証した。図６、レーンＡは、ｐＱＥ３１から発現し、変性条件下で精製され、再び折り畳まれたＴｓｐＢ−ＩＧＢを示している。図６，レーンＢは、ｐＥＴ２１ｂ（＋）から発現し、非変性条件下で周辺質から精製されたＴｓｐＢ−ＩＧＢを示している。
【実施例６】
【０１６７】
組換えＴｓｐＢ−ＩＧＢのＩｇ結合活性
産生され、変性条件下で精製され、その後、再び折り畳まれた、または非変性条件下で精製されたＴｓｐＢ−ＩＧＢポリペプチドを、様々な源由来のＩｇＧに結合するそれらの能力について固相ＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。ＴｓｐＢ−ＩＧＢ（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの濃度で１００μｌ／ウェル）をマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２；Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）に４℃で一晩、吸着させた。ＰＢＳで３回、洗浄した後、プレートを、２５０μｌのブロッキング緩衝液（１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）で、室温で３０〜６０分間、ブロッキングした。プレートをＰＢＳで３回、洗浄した後、４人の異なるドナー（ドナー１、３、４、および５）由来のヒト血清、ドナー３およびドナー１血清から精製されたＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）製の精製ヒトＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ、骨髄腫細胞系から得られた（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｃｏ、ＭＥ）、およびＣＨＯ細胞において産生された（本発明者らの研究室からのｍＡｂ  ＤＡ２）、精製ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、４匹のマウス由来およびＺｙｍｅｄ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）社製のマウス血清、ならびにマウス骨髄腫（全て、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ社製）およびハイブリドーマ（ＳＥＡＭ  １２）細胞系から得られた精製マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＭモノクローナル抗体をウェルに加え、ブロッキング緩衝液中に段階希釈した。次の日、ウェルをＰＢＳで５回、洗浄し、ブロッキング緩衝液中に１：３０００希釈された、１００μl／ウェルのアルカリフォスファターゼ連結型抗ヒトポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）または抗マウスポリクローナル抗体（ＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ；Ｚｙｍｅｄ、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）と周囲温度で１時間、インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで洗浄し、基質緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．８）中に１ｍｇ／ｍｌに希釈された１００μｌの新鮮に調製された基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸；Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに加えた。４０５ｎｍでの吸光度を、約６０分後、測定した。各試料におけるＩｇＧ抗体濃度を、捕獲ＥＬＩＳＡ（マウスについてはＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、およびヒトについてはＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ）によって決定した。下記の表１は結合データを要約する。
【０１６８】
【表１】
2016104783.tif 000004
【０１６９】
＊ＢＣ、基質での６０分間の発色後の０．５のＯＤ４０５ｎｍを与える抗体の濃度。ストック溶液中の抗体濃度を、Ｉｇ標準を除いて、捕獲ＥＬＩＳＡによって測定し、そのＩｇ標準は製造会社によって提供された。ＤＡ２はＣＨＯ細胞において産生し、ＳＥＡＭ  １２はハイブリドーマ細胞系において産生した。陰性対照はＢＳＡであり、それはデータ点希釈においてのみ二次と同じであった。
【０１７０】
血清中か精製されたかにかかわらず、全てのヒトポリクローナル抗体の調製物は、陰性対照ＢＳＡ単独と比較して、天然ＴｓｐＢ−ＩＧＢおよび再び折り畳まれたＴｓｐＢ−ＩＧＢの両方への結合を示している（表１）。しかしながら、骨髄腫細胞系において産生した、商業的供給源から入手されたヒトおよびマウスのＩｇＧ標準モノクローナル抗体による結合は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから入手されたヒトＩｇＭパラプロテインを除いて、ほとんど結合を示さなかった。対照的に、ＣＨＯ細胞において産生したヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ＤＡ２）およびハイブリドーマ細胞系において産生したマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体（ＳＥＡＭ  １２）について結合が観察された。結果より、組換えＴｓｐＢ−ＩＧＢが、完全長ＴｓｐＢのＩｇＧ結合機能的活性の少なくとも一部を含むこと、およびＴｓｐＢ−ＩＧＢがヒトＩｇＧおよびマウスＩｇＧの両方を結合することができることが示されている。等価のＥＬＩＳＡ読みを与えるＩｇの濃度がヒトＩｇについて５分の１〜１０分の１であったため、ヒトＩｇへの優先度が高い可能性がある。また、マウスＩｇの存在下における細胞の蛍光は、ヒトＩｇの存在下においてより低かった（図１のＤおよびＧを比較する）。商業的に入手されたアイソタイプ標準の一部との明らかな反応性の欠如についての理由は、はっきりしないが、骨髄腫に存在するＦｃグリコフォームにおける違いと関係がある可能性がある（Ｆａｒｏｏｑ  Ｍら、１９９７  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ．１４：４８９〜４９２）。あるいは、ＴｓｐＢ−ＩＧＢには見られない完全長のＴｓｐＢタンパク質の他のドメインが、結合に寄与している可能性がある。例えば、プロリンリッチセグメントは、単量体型より高い結合活性を示すことが予想される多量体の形成を促進する可能性がある。
【０１７１】
ＮＭＢ１６２８コード化ＴｓｐＢ対ＮＭＢ１５４８コード化ＴｓｐＢによるヒトＩｇＧへの結合
精製ヒトＩｇＧの組換えＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢおよびＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢへの結合。アミノ末端にＨｉｓタグを有するｐＱＥプラスミドから発現し、かつ非変性条件下で精製された、ＮＭＢ１６２８およびＮＭＢ１５４８によりコードされるＴｓｐＢ  ＩＧＢを、上記のように、マイクロタイタープレートのウェルに吸着させた（１０μｇ／ｍｌの１００μｌ）。ブロッキング緩衝液でのブロッキング後、ブロッキング緩衝液中での精製ヒトＩｇＧの段階希釈溶液を、ウェルに加え、４℃で一晩、放置しておいた。上記のように、プレートを洗浄し、結合したＩｇＧを検出した。対照として、再び折り畳まれたＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ（ｒＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ）に対する抗血清（ＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢおよびＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢに等しくよく結合する）を用いて、等量のタンパク質がプレート上にコーティングされたことを示した。
【０１７２】
図１１は、ＮＭＢ１６２８によりコードされたＴｓｐＢ  ＩＧＢが精製ヒトＩｇＧに強く結合したが、ＮＭＢ１５４８によりコードされたＴｓｐＢ  ＩＧＢはヒトＩｇＧをあまり結合しなかった。
【０１７３】
精製ＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢの溶液は、ゲル様沈殿物を有することが観察されたが、精製ＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢの溶液は、類似したゲル様物質を含有していないように思われた。それぞれの溶液を顕微鏡スライド上にスポットし、カバーガラスで覆い、一晩、乾燥させた。次の日、スライドを調べると、ＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ試料が、特徴的な重合体構造の広範なネットワークを含有することが顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ）下で観察された。対照的に、ＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢ試料については、少数のより短い重合体構造のみが観察された。２つの誘導体の重合体構造を形成する能力の違いが、ヒトＩｇＧを結合するそれらの能力の違いに関連している可能性がある。図１２は、ＮＭＢ１６２８によりコードされたＴｓｐＢ  ＩＧＢ（図１２、パネルＡ）が凝集して特徴的な重合体構造を形成したが、ＮＭＢ１５４８によりコードされたＴｓｐＢ  ＩＧＢ（図１２、パネルＢ）は限られた重合体構造を形成し、または全く形成しなかったことを示している。したがって、ＴｓｐＢ  ＩＧＢ誘導体の重合体構造を形成する能力を、ヒトＩｇＧを結合する能力に関連づけることができる。
【実施例７】
【０１７４】
ＴｓｐＢを発現する細菌の選択
図１３は、フローサイトメトリーによって決定されたように（実施例１）、２人の異なるドナー（ドナー１およびドナー２）血清由来のヒトＩｇＧを結合する、異なる莢膜群由来のいくつかのＮ．メニンギティディス株の能力を示している。菌株の一部（例えば、ＮｍＣの４２４３株）は、ＩｇＧに強く結合したが、他のもの（例えば、ＮｍＷ１３５のＡ２２株）はほとんど結合しなかったかまったく結合しなかった。ほとんどＩｇＧ結合を示さなかったかまったくＩｇＧ結合を示さなかったＡ２２株、ＮＭＢ株、およびＺ１０９２株を、以下のように、ヒト補体の存在下での選択に供した。
【０１７５】
チョコレート寒天（Ｒｅｍｅｌ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）上で増殖した細菌コロニーを用いて、（材料および方法に記載されているように調製した）５％（体積／体積）の熱失活化したＩｇＧ除去ヒト血清を含有する５ｍｌのＣａｔｌｉｎ  ６培地（ＣＤＭＨｕＳ）に０．１８のＯＤ６２０ｎｍまで播種し、０．７２のＯＤ６２０ｎｍまで３７℃で増殖させた。培養物を遠心分離して細菌を収集し、それを、同体積の培地中に懸濁した。細菌溶液の一部を、２０％（体積／体積）ヒト補体を含有する１ｍｌのＣＤＭ中に１：８０，０００希釈した。細菌を３７℃で一晩、増殖させた。次の朝、細菌を、５ｍｌのＣＤＭＨｕＳ中に０．１８のＯＤ６２０ｎｍまで希釈し、再び、０．７２のＯＤ６２０ｎｍまで増殖させた。その手順を２回、繰り返し、２０％ヒト補体中での一晩の選択の各ラウンド後に得られた細菌を、フローサイトメトリーによってＩｇＧ結合について分析した。
【０１７６】
図１４に示されているように、ＩｇＧ結合について陽性であった細胞の画分は、選択のラウンドごとに増加した。図１４における参照として、選択前のＩｇＧの菌株への結合（図１３）が、白色ヒストグラムで示されている。ＩｇＧの結合活性の発現は、ヒト血清因子の存在下で増殖しなかった細菌においては変化しやすくあり得る。しかしながら、ＩｇＧの結合は、活性補体を含有するヒト血清における繰り返しの培養によって回復した。結合を測定するために用いられた細菌、および下記の実施例に記載された抗ＴｓｐＢ−ＩＧＢの殺菌活性（ＢＣＡ）について用いられ得る細菌は、この実施例に記載された方法を用いて選択された。細菌を、将来用いるために、５ｍｌのＣＤＭＨｕＳ中で増殖した細菌を２００μｌのヒト全血清に懸濁し、その後、ドライアイス上で２０μｌのアリコートを凍結させることによって貯蔵した。細菌アリコートを、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【実施例８】
【０１７７】
抗血清のナイセリア−メニンギティディス細菌への結合の評価
上の材料および方法のセクションに記載されているように免疫されたマウスから抗血清を収集した。マウスを以下で免疫した：
１）変性条件下および非変性条件下で精製された、ｐＱＥに発現したＮＭＢ１６２８ＩＧＢ（ｒｆＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ）
２）ｐＱＥから産生され、かつ非変性条件下で精製されたＮＭＢ１６２８ＩＧＢＰｒｏ（ｎＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ）；ならびに
３）ｐＥＴから産生され、かつ非変性条件下で精製されたＮＭＢ１５４８（ｎＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢ）。
【０１７８】
ＴｓｐＢ−ＩＧＢに基づいたワクチンの、ナイセリアに結合する抗体を誘発する能力を、フローサイトメトリーによって試験した。ＴｓｐＢ／Ｏｒｆ６を発現するように誘導された細胞が、誘導されなかった細胞と比較することができるように、ナイセリア株を、ＣＤＭまたはＣＤＭＨｕＳにおいて約０．６のＯ．Ｄ．６２０まで増殖させた。細胞をペレット化し、洗浄し、ブロッキング緩衝液に最初の体積の８０％で再懸濁した。その後、細菌懸濁液を、最終濃度が５０％の細菌懸濁液、１０％抗血清、および４０％ブロッキング緩衝液になるように、反応混合物に加えた。混合物を、周期的に穏やかに撹拌しながら４℃で２時間、インキュベートした。細胞を、遠心分離によってペレット化し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）連結型ヤギ抗マウス二次抗体のブロッキング緩衝液中の１：３００希釈溶液の１００μｌに再懸濁した。ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２およびＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）、加えてＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ）に対するＦＩＴＣ連結型抗体を用いた。二次抗体を加えた後、チューブを、周期的に穏やかに撹拌しながら４℃で１時間、インキュベートした。細胞をペレット化し、新鮮に作製されかつ濾過された、０．５％ホルムアルデヒド（重量／体積）を含有する４５０μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。その後、試料を、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって分析した。
【０１７９】
図１５は、抗１６２８ＩＧＢのＮｍＢのＭＣ５８株（図１５、パネルＡ）またはＮｍＡのＺ２４９１株（図１５、パネルＢ）への結合のフローサイトメトリー実験を示す。対照として、抗血清の添加なし、またはアジュバントのみの対照血清が挙げられる。両方のパネルにおいて、グラフは右へシフトしており、それは、抗１６２８ＩＧＢの蛍光の増加に対応した。このように、ワクチンによって誘発された抗体は、ＮｍＡ株およびＮｍＢ株の両方に強く結合した。
【０１８０】
図１５のパネルＡおよびＢにおける下の方のパネルは、ヒトＩｇＧの各菌株への結合を示す。ヒトＩｇＧの細菌への結合のレベルは、ｒｆＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢに対する抗血清の存在下で減少し、抗血清が、ヒトＩｇＧの細菌への結合を阻害したことを示唆する。
【０１８１】
図１６は、以下の免疫原によって誘発された抗体の結合が比較されている、ＮｍＢのＭＣ５８株に関する類似した結合実験を示す：
１）ミョウバンアジュバント単独
２）ＴｓｐＢ１５４８ＩＧＢ
３）非変性条件下で精製されたＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ
４）変性条件下で精製され、かつ再び折り畳まれたＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢ（ｒｆＴｓｐＢＩＧＢ１６２８）。
【０１８２】
各実験において、細胞を、ＣＤＭ＋５％Ｃｏｈｎ  ＦＩＶ＋１％精製ヒトＩｇＧ、および示された抗血清の１：２００の希釈溶液中で増殖させた。細胞が０．６のＯＤ６２０ｎｍに達した後、細胞を２つの等しい画分へ分割した。一方の画分を抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ二次抗体で処理し、他方を抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ二次抗体で処理して、それぞれのＩｇＧの結合を検出した。結果より、ｒｆＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢが、ＮｍＢのＭＣ５８株に最も強く結合するＩｇＧ抗体を誘発したことが示されている。また、３つのＴｓｐＢＩＧＢタンパク質によって誘発された抗体が、ヒトＩｇＧ結合を阻害することができ、抗ｒｆＴｓｐＢ１６２８ＩＧＢがヒトＩｇＧ結合を遮断するのに最も効果的であった。ＴｓｐＢ、特にＩＧＢドメインが、ヒトＩｇＧ結合活性を媒介する、Ｎｍ株によって発現されたタンパク質であることが見出された。したがって、ＴｓｐＢＩＧＢに基づいたワクチンによって誘発される抗体は、ヒト血液中でのＮｍ株の生存にとって重要な機構であるヒトＩｇＧ結合を遮断することができる。
【実施例９】
【０１８３】
補体活性化におけるタンパク質沈着についての試験
ＴｓｐＢ  ＩＧＢワクチンでの免疫化によって誘発された抗体の、Ｂ群、Ｃ群、Ｘ群、Ｙ群、およびＷ１３５群細菌の代表的なナイセリア−メニンギティディス細菌へのヒト補体成分の沈着を活性化する能力は、下記のように決定することができる。
【０１８４】
抗体を誘発するために用いられたＴｓｐＢ−ＩＧＢワクチンは、任意のアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ＭＦ５９、フロイントアジュバントなど）と組み合わされたＴｓｐＢ−ＩＧＢポリペプチドを含有していてもよい。ワクチンの抗血清による補体活性化は、Ｗｅｌｓｃｈら（Ｗｅｌｓｃｈら、２００３  Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１８８：１７３０）によって記載されているように決定してもよい。簡単に述べれば、ナイセリア細胞を、ＣＤＭ／ｄＨｕＳ中で約０．６のＯＤ６２０まで増殖させる。細胞をペレット化し、１％（重量／体積）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）（Ｄ−ＢＳＡ）で洗浄し、最初の増殖培地のＤ−ＢＳＡの体積の半分に再懸濁する。Ｄ−ＢＳＡ中に１：２０または１：２００まで希釈した２μｇまたは１０μｇのいずれかで免疫されたマウス由来のプールされた抗血清と細菌（３０μｌ）を混合する。ナイセリア細胞に対する抗体の非存在について試験されたドナー由来のヒト補体を、２００μｌの全体積において５％（体積／体積）の濃度まで加える。時々撹拌しながら、周囲温度で３０分間、反応を進行させる。細胞をペレット化し、２００μｌのＤ−ＢＳＡで洗浄し、ＦＩＴＣ連結型ヒツジ抗ヒトＣ３ｃ抗体（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓａｃｏ、ＭＥ）をＤ−ＢＳＡに加える。時々撹拌しながらの氷上での３０分間のインキュベーション後、細胞をペレット化し、０．５％（重量／体積）ホルムアルデヒドを含有する滅菌濾過されたＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）．によって分析する。
【０１８５】
細胞表面への補体成分の沈着は、細胞の蛍光を増加させ、蛍光ピークにおけるグラフの右へのシフトによって示され得る。抗体活性化は、活性のある補体、または熱失活化補体を含む抗血清に関してのみの細胞の蛍光の欠如によって示され得る。フローサイトメトリーからの細菌をさらにＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）蛍光顕微鏡を用いる顕微鏡法によって分析する。ＮｍＢ細菌の細胞表面への補体因子沈着の活性化は、ナイセリア−メニンギティディスによって引き起こされる疾患からの防御と関連づけられる（Ｗｅｌｓｃｈら、２００３  Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１８８：１７３０）。
【実施例１０】
【０１８６】
血清殺菌アッセイ
補体媒介性殺菌抗体活性。抗ＴｓｐＢ  ＩＧＢ抗血清の、ヒト補体の存在下において溶菌を媒介する能力は、血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ）によって測定することができる。殺菌アッセイを、以前に記載されているように（Ｍｏｅ  Ｇ．Ｒ．ら、２００２  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０：６０２１〜３１）、チョコレート寒天プレート上で一晩増殖し、その後ＣＤＭ／ｄＨｕＳ中で培養された対数増殖中期の細胞を用いて、実施し、またはＴｓｐＢ  ＩＧＢを発現するように誘導されていない細胞と比較するために、０．２５％グルコースを追加されたＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ培地ブロスが用いられる。チョコレート寒天プレートから採取された細胞を、培養を開始するために約０．１８のＯＤ６２０ｎｍまで培地中に希釈し、その後、約０．６２のＯＤ６２０ｎｍまで増殖させる。細菌をペレット化し、その後、１％ＢＳＡ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ）を含む、または含まない、Ｃａ＋およびＭｇ＋含有Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ緩衝食塩水（ＤＢＳ；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ．Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）中で洗浄する。各アッセイに用いられるヒト補体の供給源は、６０％補体の存在下での試験菌株に対する内因性ＳＢＡについて評価される。
【０１８７】
最終反応混合物は、試験血清の異なる希釈溶液、および２０％（体積／体積）ヒト補体を含有する。緩衝液は、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、および１％（重量／体積）ＢＳＡを含有する、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）である。
【０１８８】
補体の供給源は、検出可能な内因性殺菌活性をもたない健康な成人由来のヒト血清である（Ｇｒａｎｏｆｆら、１９９８  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：５０２８〜３６；Ｗｅｌｓｃｈら、２００３  Ｊ．Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．１８８：１７３０）。血清殺菌力価は、０時間目における１ｍｌあたりの対照ＣＦＵと比較して、反応混合物における細菌の６０分間のインキュベーション後の１ｍｌあたりＣＦＵにおける５０％減少を生じる、血清希釈度として定義される。典型的には、陰性対照抗体および補体とインキュベートされた細菌が、６０分間のインキュベーション中にＣＦＵ／ｍＬにおける１５０〜２００％の増加を示す。
【実施例１１】
【０１８９】
乳児ラット防御
乳児ラットにおける受動防御。抗ＴｓｐＢ−ＩＧＢ抗血清は、下記のように、菌血症からの受動防御について試験することができる。この実験の結果は、ＴｓｐＢ−ＩＧＢに基づいたワクチンの、ヒトにおいて侵襲性疾患から防御する能力を決定することができる。
【０１９０】
乳児（生後４〜６日）のウィスターラットを母親から引き離し、それぞれ５匹のラットの群へランダムに分けた。それぞれの子に１％ＢＳＡを含有する滅菌ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）中に１：１０で希釈した１００μｌの抗血清を腹腔内に与え、その後、母親に戻し、同時に、負荷細菌を調製する。ＮｍＢのＭ９８６株またはＮｍＣの４２４３株をＣＤＭ−／ｄＨｕＳ中でＯ．Ｄ．６２０＝約０．６まで増殖させ、洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に再懸濁し、１０４ＣＦＵ／ｍｌまで希釈する。その後、各ラットの子に、最終負荷用量が約１０００ＣＦＵ／ラットであるように、１００μｌの細菌を与える。その後、子を母親に戻す。次の日、子をイソフルランで麻酔し、ヘパリン処理された針を用いて心穿刺により血液を採取する。その動物をＣＯ２無酸素により安楽死させ、１００μｌ、１０μｌ、および１μｌの血液をチョコレート寒天（Ｒｅｍｅｌ）上にプレーティングする。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩、インキュベートした後、コロニーを数える。
【実施例１２】
【０１９１】
髄膜炎菌性菌血症のエクスビボのヒト血液モデルにおける受動防御
代替として、ワクチンによって誘発される抗体の、ナイセリア−メニンギティディスによって引き起こされる疾患から防御する能力を評価することへのアプローチは、抗血清が、エクスビボでのヒト血液中において、ナイセリア−メニンギティディスＢ群を溶解すること、またはその増殖を阻害することができるかどうかを決定することである。試験される抗血清（上記のようにＴｓｐ−ＩＧＢに基づいたワクチンで免疫されたＣＤ１マウス由来のプールされた抗血清）および試験細菌（上記のように、ＣＤＭ／ｄＨｕＳ培地中に新鮮に増殖した約１０００ＣＦＵのナイセリア株）を、下記のように、滅菌ガラスバイアル中で試験菌株に対する抗体を欠くドナーから新鮮に採取されたヒト血液中で混合し、調製し、試験する。
【０１９２】
エクスビボ受動防御アッセイ（ＰＰＡ）。抗凝固剤として組換えヒルジン（レピルジン、２７．８μｇ／ｍｌ最終濃度）を含有するシリンジを用いて健康な成人由来の新鮮な血液を採取する。血液ドナーは、血清が上記の血清殺菌活性を測定するための補体について用いられた人と同じであってもよい。マイクロタイタープレートの各ウェルへ、６５μｌの血液、２５μｌの試験血清、ならびに１５％の加熱補体および１％ウシ血清アルブミン（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ）を含有する１０μｌのＰＢＳ緩衝液、ならびに約４０００ＣＦＵを加える。陽性対照は、関連抗ＰｏｒＡモノクローナル抗体（ＮＩＢＳＣ、Ｐ１．４またはＰ１．１２）、ならびにそれぞれの試験菌株に対する、高い、中位の、または低いオプソニン作用性殺活性（ＰｌｅｓｔｅｄおよびＧｒａｎｏｆｆ  ２００８  Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：７９９〜８０４）および血清殺菌活性をもつヒト血清試料を含み得る。陰性対照血清は、補体ドナー由来の熱失活血清または緩衝液単独であり得る。マイクロタイタープレートを、成分が完全に混合するようにＭＳ  ３デジタル小型振盪機（ＩＫＡ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＮＣ）において１分あたり５００振動で撹拌しながら、５％ＣＯ２中、３７℃で９０分間、インキュベートする。ウェルから試料を取り出し、５％ＣＯ２中、３７℃でインキュベートする、チョコレート寒天プレート上で、定量的培養を実施する。
【０１９３】
次の日、ＣＦＵ／ｍｌを確認し、その結果を、陰性対照試験血清についての時間０におけるそれと比較した、９０分目でのＣＦＵ／ｍｌにおけるｌｏｇ１０変化として計算する。異なる日に実施した同型アッセイの再現性に基づいて、陽性の受動防御活性は、ＣＦＵ／ｍｌにおいて、時間０におけるそれと比較して、≧０．５ｌｏｇ１０減少（すなわち、ＣＦＵ／ｍｌにおける約７０％減少）を与える血清として定義することができる。
【図１】
2016104783.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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