(57)【要約】【課題】屋外の培養槽でのユーグレナ培養の増殖速度の低下を抑制し、ユーグレナの生産性を向上可能な培地及び強光阻害抑制方法を提供する。【解決手段】生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えた細胞膜透過性電子メディエーターを含み、ユーグレナの電気化学培養に使用される、ユーグレナの強光阻害を抑制するための培地である。また、電極を備えた培養装置に供給されたこの培地で、ユーグレナを電気化学培養することを特徴とする強光阻害抑制方法である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えた細胞膜透過性電子メディエーターを含み、ユーグレナの電気化学培養に使用される、ユーグレナの強光阻害を抑制するための培地。
【請求項２】
前記メディエーターは、前記生体親和性部位が2-(Methacryloyloxy)ethyl 2-(Trimethylammonio)ethyl Phosphateからなるポリマーであることを特徴とする請求項１記載の培地。
【請求項３】
前記メディエーターは、前記酸化還元活性部位がビニルフェロセンからなり、下記一般式（I）で表されるPoly(MPC-co-VF)であることを特徴とする請求項２記載の培地。
【化１】
2016182063.tif 000005
【請求項４】
電極を備えた培養装置に供給された請求項１乃至３いずれか記載の培地で、ユーグレナを電気化学培養することを特徴とする強光阻害抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユーグレナの培地及び強光阻害抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユーグレナ（属名：Euglena，和名：ミドリムシ）は、燃料，食糧，飼料，医薬品等としての利用が有望視されている。
ユーグレナは、光合成によって二酸化炭素を固定して成長するとき、油脂分を作り出しており、これはバイオ燃料の元として利用可能である。
バイオ燃料は、石油などの化石燃料と違って資源が枯渇する心配がない。また、化石燃料は燃料として使用することで新たに二酸化炭素を排出するが、バイオ燃料は、原料となる植物，藻類が成長する際に二酸化炭素を固定し、それを燃料として排出する。従って、全体で見れば二酸化炭素の排出量が増えないことになり、温暖化の防止に効果があるものと考えられている。
更に、トウモロコシ等、加食部を原料とするバイオ燃料は、バイオ燃料としての用途と食糧としての用途とが競合し、バイオ燃料として用いることにより食糧の不足や値上がりを引き起こす恐れがあるが、ユーグレナは、現状、加食部としての消費がないことから、食糧としての用途との競合が生じない。
【０００３】
また、ユーグレナは、ビタミン，ミネラル，アミノ酸，不飽和脂肪酸など、人間が生きていくために必要な栄養素の大半に該当する５９種類もの栄養素を備え、多種類の栄養素をバランスよく摂取するためのサプリメントとしての利用や、必要な栄養素を摂取できない貧困地域での食糧供給源としての利用の可能性が提案されている。
更に、ユーグレナは、高タンパクで栄養価が高いため、家畜や養殖魚の飼料としての活用も期待されている。
【０００４】
近年の研究により、ユーグレナ由来物質が、保湿作用、創傷の治癒促進作用、皮膚バリア機能改善作用、アレルギー反応抑制作用、糖尿病抑制作用、大腸癌抑制作用等、生体に対して種々の作用を有することも見いだされ、これらの作用を利用した医薬品、健康食品としての利用も提案されている。
このように、ユーグレナは、機能の多様性の観点において卓越しており、燃料，食糧，飼料，医薬品としての利用が有望視されている。鋭意研究の結果、近年、工業的生産が可能となり、ユーグレナ由来物質を含む健康食品等の商品化が実現している。
【０００５】
しかし、ユーグレナは、食物連鎖の最底辺に位置し、捕食者により捕食されることや、光，温度条件，撹拌速度などの培養条件の調整が他の微生物に比べて難しく、ユーグレナ生産の収率はいまだに充分に高いとはいえない。
特に、ユーグレナ由来のバイオ燃料は、化石燃料等他の燃料と比べてコスト競争力に乏しいことが導入普及のネックとなっており、ユーグレナを用いた燃料製造工程のみでなく、ユーグレナ培養工程の収率向上、製造コスト低減の要請がある。
【０００６】
そこで、ユーグレナを低コストで培養可能な培養槽として、撹拌装置を備えた屋外培養槽が提案されている（例えば、非特許文献１）。
非特許文献１の培養槽は、屋外に設置されるため、初期投資、運転コストとも低くすることができ、大規模かつ低コストの培養が可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】“日立プラントテクノロジー技報No.6”、[online]、平成１２年１月発行、株式会社日立プラントテクノロジー、[平成27年3月16日検索]、インターネット(URL : http://www.hitachi.co.jp/products/infrastructure/product_site/randd/article/pdf/2012/gihou_201201.pdf)、p.38
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、非特許文献１のような培養槽で屋外で培養する場合、夜間の藻体重量減少量が大きく、屋内で培養した場合に比較して、増殖速度が遅く、生産性が低い。また、屋外培養における収率の低さは、温度や日射エネルギーの影響も一因であると考えられている。
【０００９】
本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、屋外でのユーグレナ培養の増殖速度の低下を抑制し、ユーグレナの生産性を向上可能な培地及び強光阻害抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、屋外でユーグレナを培養したときの収量を向上するために鋭意研究したところ、生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えた細胞膜透過性電子メディエーターを含む培地で、ユーグレナの電気化学培養を行うことにより、光過剰な条件下における強光阻害を抑制でき、その結果、屋外の培養槽でのユーグレナ培養の増殖速度の低下を抑制し、ユーグレナの生産性を向上できることを見出し、本発明に到達した。
【００１１】
つまり、前記課題は、本発明によれば、生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えた細胞膜透過性電子メディエーターを含み、ユーグレナの電気化学培養に使用される、ユーグレナの強光阻害を抑制するための培地により解決される。
このとき、前記メディエーターは、前記生体親和性部位が2-(Methacryloyloxy)ethyl 2-(Trimethylammonio)ethyl Phosphateからなるポリマーであると好適である。
【００１２】
また、前記メディエーターは、前記酸化還元活性部位がビニルフェロセンからなり、下記一般式（I）で表されるPoly(MPC-co-VF)であると好適である。
【００１３】
【化１】
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【００１４】
また、前記課題は、本発明によれば、電極を備えた培養装置に供給された本発明の培地で、ユーグレナを電気化学培養することを特徴とする強光阻害抑制方法により解決される。
【００１５】
ここで、強光阻害とは、光過剰な条件下において、光が、光合成生物の光化学系II（ＰＳII）の損傷を起こし、光合成活性及び光合成効率の低下を導く現象をいう。
本明細書において、強光とは、光過剰な条件と同義であり、光合成生物の光飽和点を超える強度の光をいう。
光飽和点とは、光の強度を上げても光合成生物の光合成速度が上昇しなくなるときの光の強度をいう。光飽和点は、光合成生物によって異なる。
ユーグレナ等の微細藻類を含む光合成微生物では、光飽和点より低い光強度において、光強度の増加と共に増殖速度が上昇するが、光強度が光飽和点以上になると増殖速度が低下する性質を有するものがある。
光合成生物において、光飽和点より光強度の低い弱光下においては、光によって生じる還元力はNADPHとなり、CO2を固定・還元する代謝回路であるカルビンサイクルによって消費される。しかし、強光下においては、光による還元力の生成速度は増大し、カルビンサイクルによるCO２固定反応の速度を上回ってしまう。その結果、図７に示すように、過剰となった還元力は酸素分子に伝達され、一重項酸素（1O2）や、スーパーオキシドアニオン（O2−）、下流反応として過酸化水素（H2O2）、といった活性酸素種が生成される（Foyer, C.H., et al., Physiol. Plant. 92, 696-717 (1994)）。これらの活性酸素種は反応性が高く、タンパク質や脂質、ＤＮＡにダメージを与え、光合成生物の成長、増殖を阻害する強光阻害を起こす。
【００１６】
本発明の培地及び強光阻害抑制方法によれば、生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えた細胞膜透過性電子メディエーターが、ユーグレナの細胞内で生じた過剰の電子を、細胞外電子伝達によって光合成電子伝達系から細胞外電極へと伝達するため、強光によって発生する過剰な還元力を解消し、強光阻害を抑制できる。
従って、屋外でユーグレナを培養する場合でも、変動する太陽光強度によってユーグレナの収率が増減することを、抑制できる。
また、本発明の細胞膜透過性電子メディエーターは、従来の電子メディエーターが備えていた酸化還元活性部位だけでなく、生体親和性部位も備えているので、ユーグレナの細胞膜を破壊せずに、ユーグレナの細胞内から細胞外電極へ細胞外電子伝達が可能となる。
更に、本発明の培地及び強光阻害抑制方法によれば、ユーグレナ培養における強光阻害を抑制できるため、設備設置コストの低い屋外培養槽を用いたユーグレナの大量生産において、生産性を向上でき、ユーグレナ由来のバイオ燃料や食品又は医薬品素材等に用いられる有用物質生産の収率を向上できる。
また、細胞膜透過性メディエーターによって細胞外に取り出された余剰還元力を利用することもできる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えた細胞膜透過性電子メディエーターが、ユーグレナの細胞内で生じた過剰の電子を、細胞外電子伝達によって光合成電子伝達系から細胞外電極へと伝達するため、強光によって発生する過剰な還元力を解消し、強光阻害を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一実施形態に係るユーグレナの強光阻害抑制方法が実施される培養装置を示す説明図である。
【図２】ユーグレナの細胞外電子移動を介した光電流の照射光強度依存性のグラフである。
【図３】強光下においてPoly(MPC-co-VF)（以下、「ＰＭＦ」という。）を添加した又は無添加の培地でユーグレナを培養したときの増殖のグラフである。
【図４】弱光下においてＰＭＦを添加した又は無添加の培地でユーグレナを培養したときの増殖のグラフである。
【図５】ユーグレナ培養におけるＰＭＦの電気化学培養の効果を確認するための参考実験結果であって、強光下（Ａ）及び弱光下（Ｂ）において抗酸化剤を添加した又は無添加の培地でユーグレナを培養したときの増殖のグラフである。
【図６】ユーグレナ培養におけるＰＭＦの電気化学培養の効果を確認するための参考実験結果であって、ユーグレナ添加後に電子伝達阻害剤ＤＢＭＩＢを添加したときの光電流値を示すグラフである。
【図７】強光阻害のメカニズムの概略説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、ユーグレナ（Euglena）属の培地及び強光阻害抑制方法に関する。以下、本発明に係る培地及び強光阻害抑制方法について、詳細に説明する。
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同様の意味を有する。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。
【００２０】
＜ユーグレナ＞
本発明の「ユーグレナ」とは、動物学や植物学の分類でユーグレナ属（Euglena）に分類される植物、その変種、その変異種のすべてを含み、かつα−グルコシダーゼ活性の阻害作用を有する成分を含むすべての植物を意味する。
【００２１】
ここで、ユーグレナ属（Euglena）の微生物とは、動物学では原生動物門（Protozoa）の鞭毛虫綱（Mastigophorea）、植物鞭毛虫亜綱（Phytomastigophorea）に属するミドリムシ目（Euglenida）のユーグレノイディナ亜目（Euglenoidina）に属する微生物である。一方、ユーグレナ属の微生物は、植物学ではミドリムシ植物門（Euglenophyta）のミドリムシ藻類綱（Euglenophyceae）に属するミドリムシ目（Euglenales）に属している。
【００２２】
ユーグレナ属の微生物としては、具体的には、Euglena acus、Euglena caudata、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis、Euglena granulata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena oxyuris、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena viridis、Euglena vermiformis、Euglena intermedia, Euglena pirideなどが挙げられる。このうち特に、広く研究に利用されているユーグレナ  グラシリス（Euglena gracilis）が好適である。特に、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株が挙げられる。
また、そのほか、ユーグレナ・グラシリス・クレブス，ユーグレナ・グラシリス・バルバチラス等の種や、ユーグレナ・グラシリス（E. gracilis）Ｚ株の変異株ＳＭ−ＺＫ株（葉緑体欠損株）や変種のvar. bacillaris、これらの種の葉緑体の変異株等の遺伝子変異株を用いてもよい。また、その他のユーグレナ類、例えばAstaia longaを用いてもよい。
ユーグレナ属は、池や沼などの淡水中に広く分布しており、これらから分離して使用してもよく、また、すでに単離されている任意のユーグレナ属を使用してもよい。
【００２３】
本発明のユーグレナ属は、その全ての変異株を包含する。また、これらの変異株の中には、遺伝的方法、たとえば組換え、形質導入、形質転換等により得られたものも含有される。
【００２４】
＜ユーグレナの培地＞
本実施形態のユーグレナの培地は、ユーグレナの培養に必要な栄養源を含む培養液に、生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えた細胞膜透過性電子メディエーターが添加されてなる。
ユーグレナの培養に必要な栄養源とは、例えば、窒素源，リン源，ミネラルなどの栄養塩類をいう。
ユーグレナの培養に必要な栄養源を含む培養液とは、ユーグレナの培養に一般的に用いられる公知の培養液をいい、例えば、改変Cramer-Myers培地（（ＮＨ４）２ＨＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ３ｍｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  １．８ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．４ｍｇ／Ｌ，Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０２ｍｇ／Ｌ，チアミン塩酸塩（ビタミンＢ１）  ０．１ｍｇ／Ｌ，シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、（ｐＨ３．５））を用いることができる。なお、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４は、（ＮＨ４）２ＳＯ４やＮＨ３ａｑに変換することも可能である。
【００２５】
また、そのほか、ユーグレナ  生理と生化学（北岡正三郎編、株式会社学会出版センター）の記載に基づき調製される公知のHutner培地，Koren-Hutner培地（以下、ＫＨ培地という。），ユーグレナの従属栄養培地として一般的に使用されるKoren-Hutner培地からグルコース、リンゴ酸、アミノ酸等の従属栄養成分を除いた独立栄養培地であるＡＹ培地等を用いてもよい。
【００２６】
培養液のｐＨは好ましくは２以上、より好ましくは３以上、更に好ましくは３．５以上であり、また、その上限は、好ましくは７以下、より好ましくは６．５以下、更に好ましくは４．５以下である。ｐＨを酸性側にすることにより、光合成微生物は他の微生物よりも優勢に生育することができるため、コンタミネーションを抑制することができる。
【００２７】
本実施形態の細胞膜透過性電子メディエーターは、生体親和性部位と酸化還元活性部位を備えたリン脂質ポリマーである。
生体親和性部位は、蛋白質吸着に対する強い抵抗性により高い生体適合性を備えた部位であり、好適には、2-(Methacryloyloxy)ethyl 2-(Trimethylammonio)ethyl Phosphate（以下、「ＭＰＣ」という。）から構成される。
【００２８】
酸化還元活性部位は、酸化還元メディエーターからなり、好適には、ビニルフェロセンからなる。
酸化還元活性部位としては、他の酸化還元メディエーター、例えば、キノン骨格を有する化合物、フェロセン骨格を有する化合物、その他の化合物を使用することができる。キノン骨格を有する化合物には、例えば、ベンゾキノン類や、ナフトキノン骨格あるいはアントラキノン骨格を有する化合物が包含される。フェロセン骨格を有する化合物には、ビニルフェロセンのほか、ジメチルアミノメチルフェロセン、１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン、ジメチルフェロセン、フェロセンモノカルボン酸などが包含される。その他の化合物には、例えば、鉄（Ｆｅ）の金属錯体、ニコチンアミド構造を有する化合物、リボフラビン構造を有する化合物、ヌクレオチド−リン酸構造を有する化合物などが包含される。
【００２９】
生体親和性部位がＭＰＣ、酸化還元活性部位がビニルフェロセンである生体親和型のレドックスリン酸ポリマーＰＭＦ（poly(MPC-co-VF)）の例を、一般式（I）に示す。
【００３０】
【化１】
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【００３１】
本実施形態のＰＭＦは、ＭＰＣとビニルフェロセンがほぼ同等の比率でフリーラジカル重合されたものであり、ＰＭＦとビニルフェロセンの比率は、それぞれ、約５２ｍｏｌ％と約４８ｍｏｌ％である。重量平均分子量Ｍｗは、６．６ｋＤａ、多分散度Ｍｗ／Ｍｎは、１．７である。
ＰＢＳ中でのＰＭＦのサイクリックボルタンメトリーでは、可逆の酸化還元波を示し、ポテンシャルの中心は+0.5V vs. SHEであった。従って、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(E0’:-0.3V)やユビキノン(E0’:+0.1V)等の細胞中の酸化還元活性種から電子を受け取ることができる。
本実施形態の細胞膜透過性電子メディエーターは、生体親和性部位を備えているため、長時間の電気化学培養でも細胞膜や生体分子を破壊せず、微細藻類等の微生物から外部の電極へ細胞外電子伝達を起こすことができる。
【００３２】
＜培養装置＞
本実施形態では、図１に示す培養装置１を用いてユーグレナの電気化学培養を行う。
培養装置１は、本実施形態の培地が供給され貯留される培養槽４と、試料電極（作用電極）となる第一電極２と、対電極となる第二電極３と、参照電極となる標準電極５と、第一電極２の電位を制御するポテンショスタット６と、を備える。
本実施形態の培養槽４は、屋外に設置されるオープンポンド方式の培養槽からなる。パドル又はエアリフト等による撹拌装置を備え、サーキット場に似た形式のレースウェイ方式の循環型培養槽が好適に用いられるが、これに限定されない。
第一電極２，第二電極３の材質としては、特に制限されないが、第一電極２として、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極又はグラッシーカーボン（ＧＣ）電極、第二電極３として、白金等が用いられる。
【００３３】
標準電極５としては、特に制限されないが、銀／塩化銀電極等が用いられる。
ポテンショスタット６は、標準電極５に対する第一電極２の電位が設定された値となるように第一電極２の電位を制御する。なお、第一電極２の電位が制御可能であるならば、電位調節手段は本態様の構成に限定されない。標準電極５を備えず、ポテンショスタット６の代わりに、不図示の電圧印加装置を備え、この電圧印加装置で第一電極２と第二電極３との間に所定の値の電圧を印加するように構成してもよい。
【００３４】
＜ユーグレナの電気化学培養＞
本実施形態のユーグレナの強光阻害抑制方法は、本実施形態の培地を供給した図１に示す培養装置１で、ユーグレナを電気化学培養することにより行われる。
電気化学培養では、まず、図１の培養装置１に、本実施形態の培地及びユーグレナを供給する。次いで、ｐＨを２〜４、水深を２０〜３０ｃｍに維持し、パドル及びエアリフト方式で培地を撹拌しながら、培養を行う。このとき、５〜１５％の二酸化炭素を通気してもよい。培養は、日光の出ている昼間の時間帯を含むように行う。
【００３５】
なお、本実施形態では、本発明の培地及び強光阻害抑制方法を適用する微生物として、ユーグレナを挙げたが、光合成を行う微生物であれば、本発明のその他の真核微細藻類を含むその他の光合成微生物にも本発明の培地及び強光阻害抑制方法が適用可能である。
【実施例】
【００３６】
以下、具体的実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜ユーグレナの前培養＞
ユーグレナの試料として、Euglena gracilis Zを用いた。まず、次の手順により、ユーグレナの前培養を行った。
オートクレーブにより滅菌したＣＭ培地２９ｍｌを、同じくオートクレーブにより滅菌済みのバイアルに導入し、ユーグレナを含む培養液１ｍｌを加えた。この培養液を、３０℃恒温槽中にて、5000lux下（光源は蛍光灯ビオルックスA 20W,NEC）、空気バブリング下にて１週間程度培養した。
使用したＣＭ培地の組成は、(NH4)2HPO4  1 g/L，KH2PO4  1 g/L，MgSO4・7H2O  0.2 g/L，CaCl2・2H2O  0.02 g/L，Fe2(SO4)3・7H2O  3.0 mg/L，MnCl2・４H2O  1.8 mg/L，CoSO4・7H2O  1.5 mg/L，ZnSO4・7H2O  0.4 mg/L，Na2MoO4・2H2O  0.2 mg/L，CuSO45H2O  0.02 mg/L，チアミン塩酸塩（ビタミンB1）  0.1 mg/L，シアノコバラミン(ビタミンB12)  0.001 mg/Lであった。ＣＭ培地はMarianら(1952)の文献を参考にして作製した。また、濃硫酸を加えることによってｐＨを３．５程度に調整した。
【００３７】
＜実験例  光電流の測定による、ユーグレナから細胞外電極への電子伝達の確認＞
ユーグレナ細胞内の光合成電子伝達系と細胞外電極との間に細胞外電子伝達経路が構築されていれば、ユーグレナへ光が照射された際に発生する電子の流れは電極へと伝達され、電流値の増加として観測できるはずである。ここでは、そのような光によって生成される電流・光電流を測定することで、細胞外電子伝達経路の有無を確認した。
【００３８】
◎実験例１  光強度の変化に応じた光電流値の変化の観測
酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極を作用極、白金電極を対極、銀／塩化銀（Ag/AgCl）電極を参照極とし、４ｍＬの培養槽を備えた３電極系電気化学セルに、ＰＭＦ濃度５ｇ／ＬのＣＭ培地を供給した。ＰＭＦの酸化還元電位は、+0.3V vs. Ag/AgClであった。
この培地に、前培養したユーグレナを、初期濃度ＯＤ８００＝３となるように添加して、シールドケース内に電気化学セルをセットした。
作用極である透明電極ＩＴＯ越しに培地中のユーグレナに対し、波長680nmの単波長光を、図２に示すように、155〜1025μmol・m-2・s-1の５段階の光強度で、３０秒間照射し、電流値の上昇を、光電流として測定した（実施例１）。電位は＋0.6V vs SHEに設定した。
また、同様の実験を、ＰＭＦを含まない培地についても行った（対比例１）。また、ＰＭＦ濃度５ｇ／ＬのＣＭ培地にユーグレナを添加しないものについても行った（対比例２）。
【００３９】
結果を、図２の細胞外電子移動を介した光電流の照射光強度依存性のグラフに示す。図２の実施例１では、照射光強度の増加と共に、光電流が大きくなっていた。また、照射光強度の増加に伴う電流値の増加は、系にＰＭＦを加えない対比例１及びユーグレナを加えない対比例２では観測されなかった。これらの結果より、ＰＭＦを介した細胞外電子移動により、ユーグレナ細胞内の光合成の電子伝達系から細胞外電極へと電子が引き抜かれることが分かった。
このように、本実験例では、本発明の一例に係る実施例１の培地及び電気化学培養において、ユーグレナへ光が照射された際に発生する電子の流れは電極へと伝達され、電流値の増加として観測されたことから、ユーグレナ細胞内の光合成電子伝達系と細胞外電極との間に、細胞膜透過性メディエーターによる細胞外電子伝達経路が構築されていることが分かった。
また、実施例１の培地及び電気化学培養では、ユーグレナ細胞内の過剰な電子が、ユーグレナ細胞内の光合成電子伝達系と細胞外電極との間に構築された細胞外電子伝達経路を経て、電極へ取り出されることが分かった。
【００４０】
◎実験例２  増殖阻害に対する抑制効果の検証
本実験例では、強光下及び弱光下において電気化学培養を行った場合と、電気化学を用いずに培養を行った場合のユーグレナの増殖を比較した。
実験例１で用いた３電極系電気化学セルに、ＰＭＦ濃度０．５ｇ／ＬのＣＭ培地を供給した。
この培地に、前培養したユーグレナを、初期濃度ＯＤ８００＝０．０５となるように添加して、強光下（日光の最大強度の１／１０：5000 lux）、電気化学培養を行い、培養開始後０，２４，４８，７６，９６，１４８時間後の細胞濃度を測定した（実施例２）。印加電圧は、+0.6V vs. SHEとした。
【００４１】
また、同様の実験を、ＰＭＦを含まない培地についても行い、電気化学を用いない培養を行った（対比例３）。
更に、弱光下（日光の最大強度の１／５０：1000 lux）で培養を行った点を除いては同様の手順で、ＰＭＦを含む培地での電気化学培養（対比例４）、ＰＭＦを含まない培地での培養（対比例５）を行った。
【００４２】
結果を、図３，図４の強光下及び弱光下におけるユーグレナ増殖のグラフに示す。
図３の実施例２のように、強光下の培養では、ＰＭＦを培地に含まず電気化学培養を行わなかった対比例３よりもＰＭＦを培地に含み+0.6V vs. SHEで電気化学培養された実施例２の方が、藻体の増殖が有意に速かった。また、図４のように、弱光下の培養では、ＰＭＦを培地に含み+0.6V vs. SHEで電気化学培養された対比例４は、ＰＭＦを培地に含まず電気化学培養を行わなかった対比例５よりも、増殖が遅かった。
従って、強光下において培地にＰＭＦを添加して電気化学培養を行うことにより、藻体の増殖が促進されることが分かった。特に、ＰＭＦを培地に添加することによる増殖促進効果は、弱光下では起こらず、強光下に特有のものであることが分かった。
【００４３】
◎参考実験  抗酸化物質による強光下及び弱光下での増殖促進効果の確認
また、本発明の作用機序を確認するために、培地に抗酸化物質アスコルビン酸を添加して、参考実験を行った。
本実験では、実験例２におけるＰＭＦの代わりに、アスコルビン酸を０．５ｍＭ添加し、強光下及び弱光下において、アスコルビン酸を添加した場合と添加しない場合のユーグレナの増殖を比較した。ＰＭＦの代わりにアスコルビン酸を０．５ｍＭ添加したことを除いては、実験例２と同様の手順で実験を行った。
結果を、図５に示す。図５に示すように、強光下において、アスコルビン酸は、ユーグレナの増殖促進効果を示したが、弱光下では増殖は促進されなかった。
【００４４】
図３〜図５の結果より、抗酸化物質であるアスコルビン酸と同様に、ＰＭＦが強光下においてユーグレナの増殖を促進する効果があることが分かった。また、この増殖促進効果は、抗酸化物質であるアスコルビン酸と同様に、弱光下では、認められなかった。
【００４５】
◎実験例３  電子伝達阻害剤ＤＢＭＩＢ添加の影響の確認
実験例１，２で確認されたＰＭＦを添加した培地での電気化学培養によるユーグレナの増殖促進効果が、ユーグレナの細胞外電子伝達によるものであるかどうかを確認するために、PMFが含まれた系に電子伝達阻害剤ＤＢＭＩＢ（2,5-dibromo-3-methyl-6-isopropyl-p-benzoquinone）を添加し、光流値の推移を確認した。
ＤＢＭＩＢは、シトクロムb６fのプラストキノン結合部位に結合して，還元型プラストキノンの酸化を防ぐことで電子伝達を阻害する。プラストキノンから光化学系Iへの電子供給を阻害するため、光化学系IIの活性測定に用いられている阻害剤である。
【００４６】
本実験例では、実験例１で用いた３電極系電気化学セルに、ＰＭＦ濃度３ｇ／ＬのＣＭ培地を供給し、シールドケース内に電気化学セルをセットして、光電流の測定を開始した。
測定開始後約２１分の時点で、前培養したユーグレナを、初期濃度ＯＤ８００＝０．５となるように添加し、測定開始後約３７分の時点で、ＤＢＭＩＢを、培地中の濃度が１００μＭとなるように添加した。
【００４７】
結果を、図６に示す。図６に示すように、測定開始後約２１分の時点でユーグレナを添加した後、電流値が、約４μＡから約８μＡに上昇したが、測定開始後約３７分の時点で、ＤＢＭＩＢを添加すると、電流値は、再び約４μＡに低下した。
このように、ＤＢＭＩＢにより光電流が抑制されていることから、ＤＢＭＩＢ添加前には、細胞外電子伝達経路が構築されていたことが分かった。
【符号の説明】
【００４８】
１  培養装置
２  第一電極
３  第二電極
４  培養槽
５  標準電極
６  ポテンショスタット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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