(57)【要約】【課題】卵黄や卵白の卵の各部位に含有されるコラーゲンを構成するアミノ酸を非破壊かつ定量的に測定できる卵の検査方法を提供する。【解決手段】卵の卵黄および／または卵白に含有されるコラーゲンを定量する方法であって、卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンを近赤外分光法の測定結果に基づいて定量化することを特徴とする。卵の卵白および卵黄に含まれるコラーゲンを定量的に把握することができる。しかも、卵の卵白や卵黄を破壊しないので、卵の卵白や卵黄に含まれるコラーゲンの状態を的確に把握することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵の卵黄および／または卵白に含有されるコラーゲンを定量する方法であって、
卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンを近赤外分光法の測定結果に基づいて定量化する
ことを特徴とする卵の検査方法。
【請求項２】
コラーゲンを定量化する検量線を、１７２４ｎｍの波長の吸光度を用いて形成した
ことを特徴とする請求項１記載の卵の検査方法。
【請求項３】
卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンを構成するアミノ酸について定量化する
ことを特徴とする請求項１または２記載の卵の検査方法。
【請求項４】
前記アミノ酸が、
アラニン、グリシン、プロリンである
ことを特徴とする請求項３記載の卵の検査方法。
【請求項５】
卵の卵黄および／または卵白を乾燥させた乾燥物を測定する
ことを特徴とする請求項１、２、３または４記載の卵の検査方法。
【請求項６】
前記乾燥物は、
卵の卵黄および／または卵白を乾燥させた乾燥膜である
ことを特徴とする請求項５記載の卵の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、人体に好ましい食材、例えば、体の調子を整える機能がある食品が注目されており、市場では、消費者庁から認可を受けた「特定保健用食品」が多数販売されている。「特定保健用食品」は、体の生理学的機能などに影響を与える保健機能成分を含み、人体に対する特定の効能が認められたものであり、その効能を表示することができる。また、今後は、野菜や魚や肉などの生鮮品でも、「機能性食品」として、所定の効能を有する成分を含有し、健康機能を公的機関が具体的データとして得た場合には、消費者庁に届け出ることでその成分と効能を表示することが認められる方向となっている。
【０００３】
所定の効能を有する成分として、従来からコラーゲンが注目されており、コラーゲンを含有した食品が販売されている。「特定保健用食品」にも、コラーゲンを濃縮した粉末等が販売されている。しかし、「特定保健用食品」等として、コラーゲンを含有する食品が販売される場合、通常、特別なサプリメントとして提供される場合が多い。サプリメントで摂取する場合には、所定量を確実に、かつ簡単に摂取できるという利点はあるものの、通常の食事以外にサプリメントを摂取することになるのでその分費用と手間がかかる。したがって、日常的に使用される食材にコラーゲンが含まれていれば、それを食することで安価にかつ簡便にコラーゲンを摂取できる。
【０００４】
日常的に使用される食材として、卵がある。卵は非常に安価であり、一般的な家庭では日常の食材として使用されている。かかる卵に含まれるコラーゲン量を増加させ、その含有量を測定したものを提供できれば、日常的に食する卵からコラーゲンを摂取することが可能となり、美味しく食べて且つ健康効果を得ることができる。しかし、通常の卵には、食材となる卵黄や卵白中のコラーゲンについて分析された結果がない。
【０００５】
一方、卵黄や卵白にコラーゲンを含有させた場合、コラーゲンの効能を評価するには、その含有量を把握する必要がある。コラーゲンの効能は、コラーゲンを構成する複数のアミノ酸（アラニン、グリシン、プロリン等）に起因すると考えられるので、卵黄や卵白に含まれるアミノ酸の種類と量の把握が必要になる。
【０００６】
従来、魚の鱗に含まれるコラーゲンを抽出する方法として、特許文献１に記載の方法が開発されている。この方法では、魚鱗に対して脱灰工程を含む前処理を行って粗コラーゲンを生成する粗コラーゲン生成工程と、粗コラーゲン生成工程により生成された粗コラーゲンに対して、過酸化水素を用いて処理する過酸化水素処理工程を含む酸化処理を施す酸化処理工程と、酸化処理工程を施したものからコラーゲンを抽出する抽出工程と、を行って、魚鱗からコラーゲンを抽出する。
【０００７】
そして、特許文献１には、粗コラーゲンに対して酸化処理を施すことで、粗コラーゲン分子同士の架橋構造を除去することができるので、粗コラーゲンから容易にコラーゲンを抽出することが可能となる旨が記載されている。また、粗コラーゲンに酢酸等の酸性水溶液を添加することにより、酸性水溶液にコラーゲンを溶解させて収率良くコラーゲンを抽出することができる旨も記載されている。さらに、コラーゲンが変形や分解等しにくいため、質の高いコラーゲンを抽出することができ、簡易な方法でありながら、収率良く質の高いコラーゲンを得ることができる旨も記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第５０９７８７５号公報
【特許文献２】特許第４２６１２９６号公報
【特許文献３】特開２０１４−２０９１１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかるに、特許文献１の方法は、あくまでも魚の鱗に含まれるコラーゲンを抽出する方法である。したがって、卵の卵黄や卵白に含まれるコラーゲンの抽出や測定に適用できるとは限らない。
【００１０】
しかも、特許文献１の方法によって卵黄や卵白のコラーゲンを抽出した場合、抽出できるコラーゲンの量は、卵黄や卵白に含まれるコラーゲン全体のせいぜい７０％程度であると考えられる。したがって、卵黄や卵白に含まれるコラーゲンの量が多いか少ないかを判断することはできるが、卵黄や卵白に含まれるコラーゲンの量を的確に把握することは難しい。
【００１１】
特許文献１には、この方法ではコラーゲンが変形や分解等しにくいとの記載はあるが、魚の鱗に様々な処理を行っているので、抽出されるコラーゲンの変質は避けられない。つまり、卵黄や卵白に含まれるコラーゲンの抽出に使用した場合、コラーゲンは元の状態から変質している可能性が高い。したがって、特許文献１の方法でコラーゲンを抽出しても、卵黄や卵白のコラーゲンを構成する各アミノ酸の状態は到底把握することはできない。
【００１２】
また、特許文献２には、人の皮膚真皮のコラーゲンの存在量を近赤外吸収スペクトル計測によって測定する方法が開示されている。この方法の場合、特許文献１の方法に比べて、コラーゲンの損傷を抑制して測定できる可能性はある。しかし、特許文献２の方法は、あくまでも皮膚に存在するコラーゲンを測定するものであり、卵の卵黄や卵白に含まれるコラーゲンにそのまま適用したとしても、同様にコラーゲンを測定できるか否かは不明である。しかも、特許文献２では、コラーゲンを構成する各アミノ酸の状態が把握できるか否かについては、何ら記載がない。
【００１３】
一方、卵にコラーゲンが含まれているか否かを測定する技術として、特許文献３の方法が開示されている。この方法の場合、卵を殻のままでコラーゲンの有無を判断できる。しかし、卵黄や卵白に特定してコラーゲンの有無を判断したり、各部位に含まれるコラーゲンの量を測定したりすることは難しい。
【００１４】
本発明は上記事情に鑑み、卵黄や卵白の卵の各部位に含有されるコラーゲンを構成するアミノ酸を非破壊かつ定量的に測定できる卵の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
第１発明の卵の検査方法は、卵の卵黄および／または卵白に含有されるコラーゲンを定量する方法であって、卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンを近赤外分光法によって測定することを特徴とする。
第２発明の卵の検査方法は、第１発明において、コラーゲンを定量化する検量線を、１７２４ｎｍの波長の吸光度を用いて形成したことを特徴とする。
第３発明の卵の検査方法は、第１または第２発明において、卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンを構成するアミノ酸について定量化することを特徴とする。
第４発明の卵の検査方法は、第３発明において、前記アミノ酸が、アラニン、グリシン、プロリンであることを特徴とする。
第５発明の卵の検査方法は、第１、第２、第３または第４発明において、卵の卵黄および／または卵白を乾燥させた乾燥物を測定することを特徴とする。
第６発明の卵の検査方法は、第５発明において、前記乾燥物は、卵の卵黄および／または卵白を乾燥させた乾燥膜であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１６】
第１発明によれば、卵の卵白および卵黄に含まれるコラーゲンを定量的に把握することができる。しかも、卵の卵白や卵黄を破壊しないので、卵の卵白や卵黄に含まれるコラーゲンの状態を的確に把握することができる。
第２発明によれば、コラーゲン測定に適した検量線を用いて定量化するので、卵の卵白および卵黄に含まれるコラーゲンの量を適切に把握することができる。
第３または第４発明によれば、コラーゲンを構成するアミノ酸を定量的に把握するので、各アミノ酸の量やその比率に基づいて、卵を産む鶏の状態（飼育環境や餌等）を把握することができる。すると、品質の高い卵の生産やかかる卵の産む鶏の開発などに利用できるデータを得ることができる。
第５または第６発明によれば、卵の卵白や卵黄の取り扱い性を向上できるので、コラーゲン量やコラーゲンを構成するアミノ酸の量を正確に定量することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】吸光度スペクトルの説明図である。
【図２】ポリアクリルアミドゲルをMALDI-TOF-MSによって質量分析した結果である。
【図３】卵の各部位を乾燥させた膜のFT-IRスペクトル象を示した図である。
【図４】実験４において作成された検量線である。
【図５】卵の各部位のコラーゲン量を示した図である。
【図６】卵黄・卵白中のタンパク質構成アミノ酸量を比較したグラフである。
【図７】（Ａ）は対照区とネッカリッチ区の卵黄中のコラーゲン量を相対比較したグラフであり、（Ｂ）は対照区とネッカリッチ区の卵黄中のコラーゲン構成アミノ酸量を相対比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
つぎに、本発明の実施形態を図面に基づき説明する。
本発明の卵の検査方法は、卵の卵黄および／または卵白に含有されるコラーゲンを測定する方法、より詳しくは、コラーゲンやアミノ酸を測定する方法であって、非破壊でコラーゲンの量やコラーゲンを構成するアミノ酸の量を定量的に測定できることに特徴を有している。
【００１９】
（本発明の卵の検査方法によって得られる効果）
本発明の卵の検査方法を採用することによって、卵を機能性畜産物として認定することも可能となる。機能性畜産物を開発し実用化する上では、機能性畜産物の品質をどのように保証するかが重要であり、所定の効能を発揮する各種成分が実際に含まれているか、また、各種成分が所定の量含まれているか、を検査できなければならない。本発明の卵の検査方法が開発されたことによって、卵の卵黄および／または卵白のコラーゲンの量やコラーゲンを構成するアミノ酸の量、つまり、所定の効能を発揮する成分を定量的に把握できる。すると、卵が機能性畜産物としての基準を満たしているか否かの検査が可能となるので、卵を機能性畜産物として認定することも可能となる。
【００２０】
また、本発明の卵の検査方法の結果を用いることで、産卵鶏の飼育環境を適切な指標に基づいて改善を実現できる可能性がある。卵の卵黄および／または卵白に含まれるアミノ酸の定量的な測定ができれば、その結果に基づいて、各種成分の由来を含めた卵の分析（つまり卵の評価）ができる。卵に含まれるアミノ酸の成分や各アミノ酸の量は、卵を産む鶏の状態に依存する。つまり、鶏が食べる餌や鶏の飼育環境（健康状態）の影響を受ける。したがって、卵に含まれるアミノ酸の由来が把握できれば、どのような飼料が卵の成分に影響を与えているか（あるいは与えている飼料が適切であるか）、また、鶏の飼育環境が適切であるか（例えば鶏がストレスを受けていないか）等を検証できる可能性がある。すると、産卵鶏が適切な環境で飼育されているか否かを把握したり、優れた品質の卵（つまり、機能性畜産物として認定できる卵）を鶏に産ませることができる環境がどのようなものであるかを把握したりすることが可能となる可能性がある。
【００２１】
さらに、本発明の卵の検査方法の結果を、優れた卵を産む産卵鶏の開発に利用できる可能性がある。卵の品質は、鶏の個体の性質によっても変化する。つまり、同じ環境で飼育された鶏であっても、卵の品質（卵黄および／または卵白のコラーゲンの量やコラーゲンを構成するアミノ酸の量等）は異なると考えられる。すると、卵に含まれるアミノ酸の成分や各アミノ酸の量を適切に把握できれば、優れた品質の卵を産む鶏を特定できる可能性がある。言い換えれば、卵に含まれるアミノ酸の成分や各アミノ酸の量に基づいて優れた品質の卵を産む鶏を選別すれば、優れた品質の卵を産む鶏を開発できる可能性がある。
【００２２】
（本発明の卵の検査方法）
本発明の卵の検査方法は、卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンやコラーゲンを構成するアミノ酸を、非破壊で定量的に測定できる方法である。
【００２３】
ここでいう非破壊とは、卵を割らないという意味ではなく、卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンを破壊しないという意味である。つまり、本発明の卵の検査方法は、熱処理や酸による処理のように、卵の卵黄および／または卵白の状態を大幅に変化させることなく、コラーゲンの量やコラーゲンを構成するアミノ酸の量を測定できる。
【００２４】
本発明の卵の検査方法では、近赤外線分光光度計を用いて、卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲンの量や、コラーゲンを構成する各種アミノ酸の量を定量的に測定している。つまり、卵の卵黄および／または卵白に近赤外線を照射してその透過光や反射光を検出し、その検出された光をスペクトル解析することによって、コラーゲンを構成する各種アミノ酸の量を測定している。
【００２５】
例えば、卵の卵黄および／または卵白を近赤外線分光光度計にセットすれば、近赤外線が卵の卵黄および／または卵白に照射されるので、その反射光および／または透過光を検出することができる。すると、検出された反射光および／または透過光に含まれる各波長成分の強度（吸光度）を算出できるから、波長と吸光度の関係が得られる。
【００２６】
図１に示すように、横軸に波長、縦軸に吸光度をとったグラフでは、コラーゲンが存在すれば、所定の波長に吸光度のピークが形成される。このピークの山の高さ（吸光度）がコラーゲンの量を表すので、吸光度を算出することによって、そのコラーゲンの量を把握することができる。
【００２７】
具体的には、既知の量のコラーゲンを含有する物質を使用して、その波長における吸光度とコラーゲン量の関係を示す検量線を形成しておく（図４参照）。すると、卵の卵黄および／または卵白に近赤外線を照射した際におけるその波長の吸光度に基づいて、卵の卵黄および／または卵白に含まれるコラーゲン量を定量的に把握することができる。
なお、検量線を形成するために使用する物質は、コラーゲンの含有量が既知の物質であればよく、とくに限定されない。卵のコラーゲン量を定量化するための検量線を形成する場合であれば、鶏の真皮由来コラーゲンタイプＩ試薬(株式会社ニッピ  PSC-1-300-10)が好ましい。
【００２８】
検量線を形成する波長は、コラーゲンの量と相関がある波長であればとくに限定されないが、できるだけ高い相関を示す波長が好ましい。本発明の方法におけるコラーゲン量の測定には、１７２４ｎｍの波長の吸光度を使用すれば、コラーゲン量と高い相関を示すので、コラーゲン量を精度よく測定することができる。
【００２９】
また、近赤外線を照射した卵の卵黄および／または卵白に所定のアミノ酸が存在すれば、そのアミノ酸に特有の波長に吸光度のピークが生じる（図１参照）。すると、卵の卵黄および／または卵白に近赤外線を照射した際におけるその波長の吸光度に基づいて、所定のアミノ酸の量を把握することも可能となる。つまり、その波長において、吸光度と所定のアミノ酸の量との関係を示す検量線を形成しておく。すると、その波長の吸光度を算出することによって、所定のアミノ酸の量を把握することができる。
【００３０】
そして、コラーゲンを構成する各種アミノ酸について、それぞれ検量線を形成しておけば、卵の卵黄および／または卵白に近赤外線を照射した際の吸光度に基づいて、コラーゲンを構成する各種アミノ酸の量を把握することもできる。すると、これらのアミノ酸の量を合算することによって、コラーゲンの量を把握することも可能となる。
【００３１】
例えば、アラニンであれば、赤外線領域において１０３３ｃｍ-1、１００４ｃｍ-1に吸光度のピークを有する。この波長の倍音・結合音から推測される、近赤外線領域で相関が高いと考えられる波長について検量線を形成しておけば、その波長の吸光度に基づいてアラニンの量を把握することが可能となる。また、プロリンであれば、赤外線領域において１５８６ｃｍ-1、９２１ｃｍ-1、８５８ｃｍ-1に吸光度のピークを有する。この波長の倍音・結合音から推測される、近赤外線領域で相関が高いと考えられる波長について検量線を形成すれば、その波長の吸光度に基づいてプロリンの量を把握することが可能となる。グリシンも同様な方法でその量を把握することができる。
【００３２】
とくに、上記３つのアミノ酸（アラニン、グリシン、プロリン）は、コラーゲンの大部分を構成するので、これら３つのアミノ酸の量を把握するだけでも、コラーゲンの量を推定することが可能となる。
【００３３】
そして、各アミノ酸の量やその比率が把握できれば、コラーゲンの量を把握できるだけでなく、上述したように、所定の効能を発揮する成分を定量的に把握できるので、卵が機能性畜産物としての基準を満たしているか否かの検査が可能となる。
また、各アミノ酸の量やその比率に基づいて、卵を産む鶏の状態（飼育環境や餌等）を把握すれば、品質の高い卵の生産やかかる卵の産む鶏の開発することも可能となる。
【００３４】
（検査対象の処置）
本発明の卵の検査方法では、検査対象となる卵白や卵黄は、卵から取り出したものをそのまま使用することもできる。つまり、卵黄と卵白に分けるだけで、それぞれをそのまま測定することもできる。すると、熱処理や酸による処理をする場合のような卵黄や卵白に含まれる成分の変質が生じない。したがって、卵黄や卵白に含まれるコラーゲン量やコラーゲンを構成するアミノ酸の量を正確に定量することが可能となる。
【００３５】
また、以下のように処理すれば、卵白や卵黄に含まれる成分の変質などを抑制しつつ、卵白や卵黄の取り扱い性を向上できる。すると、卵から取り出したものをそのまま使用する場合よりも、コラーゲンの量やコラーゲンを構成するアミノ酸の量をより正確に定量することが可能となる。
【００３６】
卵白や卵黄は、卵から取り出した後、乾燥させて検査用の試料を形成する。例えば、卵白や卵黄をスライドグラス等の上に載せて、そのままインキュベータ等によって乾燥する。すると、卵白や卵黄から検査に不要な水分が除去され、シート状や膜状となった検査用の試料を形成することができる。
【００３７】
このように乾燥させた検査用の試料は、薄膜化されているので、近赤外線を照射した際の測定精度を向上させることができる。しかも、インキュベータ等によって乾燥すれば、卵白や卵黄に含まれる成分の変質を抑制することができるので、卵白や卵黄に含まれる各種成分を精度よく測定することが可能となる。
【００３８】
（検査装置）
本発明の卵の検査方法に使用される測定装置は、近赤外線を測定対象に照射してその反射光または透過光を測定でき、所定の波長の強度を測定できるものであればよく、とくに限定されない。例えば、市販されているフーリエ変換赤外分光分析装置（ＦＴ−ＮＩＲ）を使用することができる。
【実施例】
【００３９】
以下では、本発明の卵の検査方法によって、卵の卵黄や卵白に含まれるコラーゲンの量を定量的に測定できることを確認した。
【００４０】
（実験１）
卵の卵黄や卵白にコラーゲンが含まれていることは、従来把握されていなかったので、まず、卵の卵黄や卵白にコラーゲンが含まれているか否かを確認した。
【００４１】
実験では、特許文献１に記載されている方法（魚鱗からのコラーゲン抽出法）と同等の方法を用いて、卵の卵黄や卵白からコラーゲンを抽出することを試みた。
【００４２】
コラーゲンの抽出は、以下の方法で行った。
まず、卵を割り、カラザを切り卵黄と卵白を丁寧に取り除く。なお、卵黄３個で１検体とする。
この卵黄と卵白を、１Lの１０倍希釈塩酸に２４時間浸す。すると、卵黄中のカルシウムなどミネラル分が除去される。
ついで、ミネラル分が除去された卵黄と卵白を、１Lの１０倍希釈水酸化ナトリウムに２４時間浸す。すると、卵黄と卵白に含まれる非コラーゲンタンパク質が除去される。
非コラーゲンタンパク質が除去されたものを、１０％過酸化水素水に２４時間浸す。すると、コラーゲンタンパク質が酸化される。
酸化されたコラーゲンタンパク質を、１Lの１０倍希釈酢酸に４８時間浸す。すると、コラーゲンタンパク質酢酸溶液が形成される。
このコラーゲンタンパク質酢酸溶液を吸引濾過して不純物を除去し、不純物が除去されたコラーゲンタンパク質酢酸溶液に食塩(２５０ｇ)を溶かす。そして、４８時間かけてコラーゲンタンパク質を塩析する。
塩析により発生した浮遊物を５００μl抽出して、１０００μlエッペンドルチューブに入れる。そして、１００％エタノールを同量混ぜて、１００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃の条件で遠心分離する。
遠心分離された液に、さらに１００％エタノールを１０００μl加えて、１００００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃の条件で遠心分離する。
最後に、遠心分離された液から上澄みを取り除き、沈殿物を乾燥させた。
そして、比色法を用いて乾燥物中のコラーゲン量を測定したところ、コラーゲンの存在が確認され、コラーゲン量を定量化することができた。
【００４３】
この結果より、卵黄と卵白にコラーゲンが含まれていること、および、特許文献１に記載されている方法を卵黄と卵白に含まれるコラーゲン抽出に適用できることが確認された。
【００４４】
（実験２）
上記実験１で、卵の卵黄や卵白にコラーゲンが含まれていることが確認されたが、以下の方法でも、卵黄卵白中のコラーゲンの有無を確認した。
【００４５】
コラーゲンの有無は、Matrix-assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometer(MALDI-TOF-MS)(Bruker Daltonics K.K.,Massachusetts,USA)を用いて、卵黄中のヒドロキシプロリンを測定することによって確認した。
【００４６】
MALDIとはマトリックス支援レーザー脱離イオン化法と呼ばれ、不揮発性物質をイオン化させることにより揮発させる技術である。
TOF-MSとは飛行時間型質量分析計と呼ばれ、物質に一定の電圧をかけ発生したイオンを細長い管の中を加速させ、反対側にある検出器までの到達時間によって質量を分析させる方法である。
【００４７】
実験では、まず、卵黄５００μｌをスライドガラス上に乗せて、インキュベータ（エスペック株式会社製、製品名：熱風乾燥器ＬＣ−１１２）によって３７℃で２４時間乾燥して、試料（乾燥した卵黄）を作成した。
【００４８】
この試料に、コラーゲナーゼ（コラーゲンを分解する酵素）溶液を５ｍｌ加えて、３７℃恒温器内で保存した。この溶液の上澄液を５００μｌとり、同量の１０倍希釈2-メルカプトエタノールを加えて１００℃で５分間加熱し、電気泳動（Sodium dodecyl sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)を行ったのち、MALDI-TOF-MSによって質量分析した。
【００４９】
結果を図２に示す。
添付のSDS-PAGEによる電気泳動では、４本(赤矢印)のバンドが得られ、これをMALDI-TOF-MSで質量分析するとヒドロキシプロリンが含まれていることが判明した。
【００５０】
この結果より、卵黄中にはコラーゲン固有の構成物であるヒドロキシプロリン(アミノ酸)が存在することが証明され、卵黄にはコラーゲンが存在することが明確に証明された。
【００５１】
（実験３）
実験１、２により、卵の卵黄および卵白にコラーゲンが存在することが確認できたので、添加飼料（商品名：ネッカリッチ（宮崎みどり製薬製））を配合飼料に加えて鶏に与えた場合（ネッカリッチ区、実施例２）と、前記添加飼料を含まない配合飼料を鶏に与えた場合（対照区、比較例２）について、卵黄に含まれるタンパク質の量が変化するか否かを確認した。
【００５２】
実験には、６０６日齢のジュリア種を使用し、１３２日間給餌した後に産卵した卵を使用して卵黄に含まれるタンパク質の量を測定した。
【００５３】
タンパク質の量は、以下の方法で測定した。
まず、卵黄５００μｌをスライドガラス上に乗せて、インキュベータ（エスペック株式会社製、製品名：熱風乾燥器ＬＣ−１１２）によって３７℃で２４時間乾燥した。乾燥した卵黄に、コラーゲナーゼ（コラーゲンを分解する酵素）溶液を５ｍｌ加えて、３７℃恒温器内で保存した。２日後、可視光線（２２０〜８００nm）を利用した分光光度計（島津製作所製、製品名：Bio Spec-nano）を用いて、卵黄に含まれるタンパク質の濃度を測定した。
【００５４】
結果としては、対照区の卵黄に含まれるタンパク質は1.49ｘ10―６mol/Lであり、ネッカリッチ区の卵黄に含まれるタンパク質は1.73ｘ10―６mol/Lであった。
この結果より、飼料にネッカリッチを加えることによって、卵黄に含まれるタンパク質の量が増加することが確認できた。コラーゲンはタンパク質の一種であり、上記結果より、飼料にネッカリッチを加えることによって、卵の卵黄に含まれるコラーゲンが増加したことを示唆していると考えらえる。
【００５５】
（実験４）
実験３とほぼ同様の方法で得られた卵について、卵のコラーゲン量の相違を本発明の方法により測定できるか否かを確認した。
実験では、卵の各部位（例えば、卵黄５００μｌ）をスライドガラス上に乗せて、インキュベータ（エスペック株式会社製、製品名：熱風乾燥器ＬＣ−１１２）によって３７℃で２４時間乾燥後、スライドガラス上に形成された膜（サンプル）について、ＦＴ−ＩＲ（日本分光株式会社製、ＦＴ／ＩＲ−６７０Ｐｌｕｓ）を用いて測定した。
【００５６】
なお、測定は室温で行い、窓枠にはＫＢｒプレートを用い、２枚のＫＢｒプレートでサンプルを挟んで固定したものを用いた(液膜法)。
また、コラーゲンＩの同定には、「化石タンパク質の構造」（堀田進、地球科学、第２２巻４号、ＰＰ．１７９−１８５、１９６８年）に従い、アミドＩ吸収帯(Ｃ＝０伸縮振動)である１６３０ｃｍ-1〜１６９０ｃｍ-1、アミドＩＩ吸収帯(Ｎ−Ｈ変角振動、Ｃ−Ｎ伸縮振動)である１５２５ｃｍ-1〜１５６０ｃｍ-1、アミドIII吸収帯(Ｃ−Ｎ伸縮振動、Ｎ−Ｈ変角振動)(１２２５ｃｍ-1〜１２７５ｃｍ-1)を用いた。
【００５７】
結果を図３に示す。
図３に示すように、ＦＴ−ＩＲスペクトル像では、コラーゲンの構造（アミドＩ〜III）に由来する吸収帯（３か所の網掛け部分）が観察された。このことから、本発明の方法でも、卵黄に含まれるコラーゲンを検出することができること、および、コラーゲンを構成するアミノ酸自体を検出できることが確認された。なお、図３は、ネッカリッチ区の卵から形成された膜のみの測定結果である。
【００５８】
また、同じ膜について、ＦＴ−ＮＩＲ（日本分光株式会社製、ＦＴ／ＩＲ−６７０Ｐｌｕｓ）を用いて測定したところ、コラーゲン量を定量化することができた。
【００５９】
ＦＴ−ＮＩＲによる測定に先立って、分光光度計の測定値とタンパク質の濃度の関係を確認し、検量線を作成した。
検量線は、濃度が既知のコラーゲン試薬であるニワトリ真皮由来Ｉ型コラーゲン(株式会社ニッピ  PSC-1-300-10)を測定した際の測定値に基づいて作成した。
【００６０】
具体的な検量線の作成方法を以下に示す。
まず、コラーゲン試薬をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で希釈し、ＦＴ−ＮＩＲを用いて拡散反射による計測を行った。１０００〜２５００ｎｍの波長の吸光度を分解能１６ｃｍ-1間隔で測定し、１測定当り３２回の積算を行った。
得られた波長を多変量解析における変数減少法により解析を行ったところ、１７２４ｎｍのピークが高い相関を示したため、この波長の吸光度を用いて検量線を作成した。
【００６１】
結果を図４示す。
図４に示すように、１７２４ｎｍの波長の吸光度を使用することによって、９５％の信頼係数をもって、コラーゲン量を測定できることが確認された。
【００６２】
以下では、上述した検量線を用いて、得られた測定結果からコラーゲン量を算出した。
【００６３】
図５に示すように、測定値に基づいて算出された卵黄のコラーゲン量は、対照区では卵１個当たり（卵黄重１７．７８ｇあたり）１．２３ｇであり、１個当たりのコラーゲン量の標準誤差は±０．０５であった。
一方、ネッカリッチ区では卵１個当たり（卵黄重１９．１８ｇあたり）１．３０ｇとなり、１個当たりのコラーゲン量の標準誤差は±０．０３であった。
そして、対照区のコラーゲン量を１とすると、ネッカリッチ区ではコラーゲンの相対値が1.06となった。
この結果から、鶏にネッカリッチ投与することによって、卵黄そのものの重さも増加し、コラーゲンの相対値も増加することが確認された。
【００６４】
同様に卵白についても、ほぼ同様の結果が得られた。
図５に示すように、対照区では、卵１個当たり（卵白重３５．４５ｇあたり）のコラーゲンの値は２．３９ｇとなった（標準誤差±０．１４）が、ネッカリッチ区では卵１個当たり（卵白重３８．２８ｇあたり）のコラーゲンの値は２．６７ｇ（標準誤差±０．２７）となった。そして、コラーゲンの相対値も対照区を１とすると１．１１まで増加することが確認された。つまり、鶏にネッカリッチ投与することによって、卵白そのものの重さも増加し、卵黄に比べてコラーゲン量の個体差は大きくなる傾向にあるが、コラーゲンの相対値も増加することが確認された。
【００６５】
上記結果から、本発明の方法によって、卵黄や卵白に含まれるコラーゲンの量を定量的に測定できることが確認された。そして、鶏にネッカリッチ投与することによって、卵黄や卵白の重さが増加し、卵黄や卵白に含まれるコラーゲンの量も増加することが確認された。
【００６６】
また、上記分析結果を基に、卵黄重量を基に卵１個当たりの卵黄中コラーゲン量を算出し、t検定によりグループ間比較を行った。統計処理にはStatistical Package for the Social Sciences (SPSS) software(version 10.0 for Windows（登録商標）, SPSS, Inc., Chicago, IL)を使用した。
結果を図７（Ａ）に示す。図７（Ａ）に示すように、卵の
黄において、対照区に比べてネッカリッチ区ではコラーゲンが増加する傾向が見られた。
【００６７】
参考として、対照区およびネッカリッチ区の飼育試験より得られた卵１０個を１検体として、財団法人日本食品分析センターにおいてアミノ酸の測定を行った（図６参照）。測定は、各区それぞれ２検体について実施した。
測定では、卵を卵黄と卵白に分けて、それぞれを混合して、混合したものから２０ｇを摂取した。摂取した２０ｇについてアミノ酸の測定を行い、各アミノ酸を、卵１個当たりの量に換算した。
【００６８】
上記アミノ酸の測定の結果を図６に示す。なお、図６の横軸のアルファベットは、各種アミノ酸名を略したものである。
図６に示すように、対照区に比べて、ネッカリッチ区では、各種アミノ酸が増加する傾向が見られた。コラーゲンを構成する主要なアミノ酸の量は、対照区で0.35g(アラニン147.5mg・グリシン86.9mg・プロリン116.8mg)、ネッカリッチ区で0.37g(アラニン156.1mg・グリシン92.1mg・プロリン124.1mg)であった。
【００６９】
また、対照区の３つのアミノ酸（アラニン・グリシン・プロリン）の合計量と、ネッカリッチ区の３つのアミノ酸（アラニン・グリシン・プロリン）の合計量と、を相対比較した結果を図７（Ｂ）に示している。
図７（Ｂ）の結果と上述した図７（Ａ）の結果を比較すると、両者の結果はほぼ同じであった（図７（Ａ）参照）。このことは、ＦＴ−ＮＩＲの計測に用いた波長がコラーゲン由来のものであることを示しており、ＦＴ−ＮＩＲを用いて、コラーゲンの計測が可能かつ適切であることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の卵の検査方法は、卵に含有されるコラーゲンを非破壊で定量的に測定する方法として適している。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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