(57)【要約】      （修正有）【課題】低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物中の低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合を高めることができる、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法を提供する。【解決手段】ＥＰＡ含有グリセリドを含有する原料油脂を、リパーゼを用いて２５℃以下で処理して、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を得る工程を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＰＡ含有グリセリドを含有する原料油脂を、リパーゼを用いて２５℃以下で処理して、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を得る工程を含む、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記処理の反応液中における水分含量が０．２質量％以上である、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記処理の反応液は、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上３質量部以下の低級アルコールをさらに含む、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、
前記リパーゼが１，３位特異リパーゼである、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、
前記低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物中の油脂成分に対して、低級アルコール脂肪酸エステル化物を４０質量％以上９０質量％以下含む、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、
前記低級アルコール脂肪酸エステル化物は、低級アルコールＤＨＡエステル化物をさらに含み、
前記低級アルコール脂肪酸エステル化物における、前記低級アルコールＤＨＡエステル化物に対する前記低級アルコールＥＰＡエステル化物のモル比率（低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物）が３．０以上３０以下である、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、
前記ＥＰＡ含有グリセリドから前記低級アルコールＥＰＡエステル化物への転換率が６０％以上である、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、
前記低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物は、低級アルコールＤＨＡエステル化物をさらに含み、
前記低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を蒸留して、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物および前記低級アルコールＤＨＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物の混合物と、該混合物以外の成分とを分離する工程をさらに含む、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法。
【請求項９】
請求項８に記載の製造方法により得られた前記混合物を蒸留して、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物以外の低級アルコール脂肪酸エステル化物を分離することにより、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物を得る工程をさらに含む、低級アルコールＥＰＡエステル化物の製造方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の製造方法により得られた混合物および請求項９に記載の製造方法により得られた前記低級アルコールＥＰＡエステル化物あるいはいずれか一方を使用して食品組成物を得る工程を含む、食品組成物の製造方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の製造方法により得られた混合物および請求項９に記載の製造方法により得られた前記低級アルコールＥＰＡエステル化物あるいはいずれか一方を使用してカプセル剤を得る工程を含む、カプセル剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多価不飽和脂肪酸およびその誘導体は、血中脂肪の低減等の多くの生理活性を有し、古くから医薬品、化粧品、食品等の原料として使用されてきた。そこで、高純度かつ良好な品位の多価不飽和脂肪酸およびその誘導体の精製方法が検討されている。
【０００３】
例えば、特許文献１（特開昭５９−１１３０９９号公報）には、脂肪酸グリセリドを含む油脂を、アルカリ性条件下での処理（以下、単に「アルカリ処理」ともいう。）により、低級アルコール脂肪酸エステル化物を得る方法が記載されている。
【０００４】
油脂に含まれる脂肪酸グリセリドを構成する脂肪酸の種類は通常複数である。このため、油脂をアルカリ処理すると、通常、複数種類の低級アルコール脂肪酸エステル化物の混合物が得られる。該混合物の中から特定の低級アルコール脂肪酸エステル化物を単離するためには、一般に、蒸留処理が用いられる。
【０００５】
しかしながら、蒸留処理によって該混合物の中から特定の低級アルコール脂肪酸エステル化物を単離する場合、該混合物に含まれる複数種類の低級アルコール脂肪酸エステル化物の脂肪酸の構造（例えば、炭素原子数や二重結合の数）が類似するため、複数種類の低級アルコール脂肪酸エステル化物の沸点もまた近似する傾向がある。このため、蒸留の際に沸点が近似する成分が共沸してしまい、特定の低級アルコール脂肪酸エステル化物のみを単離するのが困難である。
【０００６】
このように、前記混合物が複数種類の低級アルコールエステル化物を含む場合、蒸留処理によって特定の低級アルコール脂肪酸エステル化物を単離することが難しく、目的の低級アルコール脂肪酸エステル化物のロスが多いため、製造コストが増大する傾向がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５９−１１３０９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物中の低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合を高めることができる、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者は、ＥＰＡ含有グリセリドを含有する原料油脂を、リパーゼを用いて２５℃以下で処理することで、生成する低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
１．本発明の一態様に係る低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法は、ＥＰＡ含有グリセリドを含有する原料油脂を、リパーゼを用いて２５℃以下で処理して、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を得る工程を含む。
【００１１】
２．上記１に記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法において、前記処理の反応液中における水分含量が０．２質量％以上であることができる。
【００１２】
３．上記１または２に記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法において、前記処理の反応液は、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上３質量部以下の低級アルコールをさらに含むことができる。
【００１３】
４．上記１ないし３のいずれかに記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法において、前記リパーゼが１，３位特異リパーゼであることができる。
【００１４】
５．上記１ないし４のいずれかに記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法において、前記低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の油脂成分に対して、低級アルコール脂肪酸エステル化物を４０質量％以上９０質量％以下含むことができる。
【００１５】
６．上記１ないし５のいずれかに記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法において、前記低級アルコール脂肪酸エステル化物は、低級アルコールＤＨＡエステル化物をさらに含み、前記低級アルコール脂肪酸エステル化物における、前記低級アルコールＤＨＡエステル化物に対する前記低級アルコールＥＰＡエステル化物のモル比率（低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物）が３．０以上３０以下であることができる。
【００１６】
７．上記１ないし６のいずれかに記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法において、前記ＥＰＡ含有グリセリドから前記低級アルコールＥＰＡエステル化物への転換率が６０％以上であることができる。
【００１７】
８．上記１ないし７のいずれかに記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法において、前記低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物は、低級アルコールＤＨＡエステル化物をさらに含み、前記低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を蒸留して、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物および前記低級アルコールＤＨＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物の混合物と、該混合物以外の成分とを分離する工程をさらに含むことができる。
【００１８】
９．本発明の一態様に係る低級アルコールＥＰＡエステル化物の製造方法は、上記８に記載の製造方法により得られた前記混合物を蒸留して、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物以外の低級アルコール脂肪酸エステル化物を分離することにより、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物を得る工程をさらに含む。
【００１９】
１０．本発明の一態様に係る食品組成物の製造方法は、上記８に記載の製造方法により得られた混合物および上記９に記載の製造方法により得られた前記低級アルコールＥＰＡエステル化物あるいはいずれか一方を使用して食品組成物を得る工程を含む。
【００２０】
１１．本発明の一態様に係るカプセル剤の製造方法は、上記８に記載の製造方法により得られた混合物および上記９に記載の製造方法により得られた前記低級アルコールＥＰＡエステル化物あるいはいずれか一方を使用してカプセル剤を得る工程を含む。
【発明の効果】
【００２１】
上記１ないし８のいずれかに記載の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法によれば、ＥＰＡ含有グリセリドを含有する原料油脂を、リパーゼを用いて２５℃以下で処理して、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を得る工程を含むことにより、生成する低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合を高めることができる。これにより、得られた該組成物を蒸留することによって、低級アルコールＥＰＡエステル化物を単離する際に、低級アルコールＥＰＡエステル化物の収率を高めることができる。これにより、ロスが少なくなるため、製造コストを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、図面を参照しつつ、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「部」は「質量部」を意味し、「％」は「質量％」を意味する。ただし、グリセリドにおける各種構成脂肪酸の「比率」および「％」、ならびに低級アルコール脂肪酸エステル化物における各種脂肪酸エステル化物の「比率」および「％」は、それぞれ構成する脂肪酸の「モル比率」および「モル％」を意味する。
【００２４】
＜低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法＞
本発明の一実施形態に係る低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法（以下、単に「製造方法」ともいう。）は、ＥＰＡ（エイコサペンタエン酸、Ｃ２０：５）グリセリドを含有する原料油脂を、リパーゼを用いて２５℃以下で処理して、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（以下、「本実施形態に係る組成物」ともいう。）を得る工程を含む。
【００２５】
＜低級アルコール：定義＞
本発明において、「低級アルコール」とは、炭素原子数が１、２または３のアルキル基を有するモノアルコール（メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール）をいう。
【００２６】
＜低級アルコール脂肪酸エステル化物：定義＞
また、本発明において、「低級アルコール脂肪酸エステル化物」とは、脂肪酸を構成するカルボキシル基（−ＣＯ２Ｈ）が低級アルコールにてエステル化された化合物をいい、脂肪酸低級アルキルエステルともいう。
【００２７】
＜低級アルコールＥＰＡエステル化物＞
また、本発明において、「低級アルコールＥＰＡエステル化物」とは、ＥＰＡを構成するカルボキシル基（−ＣＯ２Ｈ）が低級アルコールにてエステル化された化合物をいう。加えて、本発明において、「低級アルコールＤＨＡエステル化物」とは、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸、Ｃ２２：６）を構成するカルボキシル基が低級アルコールにてエステル化された化合物をいう。
【００２８】
＜グリセリドの定義＞
また、本発明において、「グリセリド」とは、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステルの概念である。
【００２９】
＜ＥＰＡ含有グリセリドの定義＞
さらに、本発明において「ＥＰＡ含有グリセリド」とは、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステル化物を構成する脂肪酸残基の一部または全部がＥＰＡである化合物をいい、ＥＰＡモノグリセリド、ＥＰＡジグリセリドおよびＥＰＡトリグリセリドを含む概念である。本発明において「ＤＨＡ含有グリセリド」とは、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含むグリセリン脂肪酸エステル化物を構成する脂肪酸残基の一部または全部がＤＨＡである化合物をいい、ＤＨＡモノグリセリド、ＤＨＡジグリセリドおよびＤＨＡトリグリセリドを含む概念である。
【００３０】
＜図１の説明＞
図１は、本実施形態に係る製造方法のフローチャートを示す。本実施形態に係る製造方法では、まず、ＥＰＡ含有グリセリドを含有する原料油脂を、リパーゼを用いて処理して（図１のステップＳ１）、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む本実施形態に係る組成物を得る。
【００３１】
＜酵素処理（リパーゼを用いた処理）＞
本実施形態に係る製造方法において、前記酵素処理の反応液は、原料油脂および酵素（固定化酵素を使用する場合は固定化酵素）を含む。本実施形態に係る製造方法では、ＥＰＡ含有グリセリドを含む原料油脂を酵素（リパーゼ）で処理する。これにより、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む多価不飽和脂肪酸エステル化物を含む組成物を得ることができる。
【００３２】
より具体的には、２５℃以下の反応液中で、ＥＰＡ含有グリセリドを含む原料油脂をリパーゼ及び低級アルコールと接触させて、該ＥＰＡ含有グリセリドにリパーゼを作用させることにより、該ＥＰＡ含有グリセリドを低級アルコールＥＰＡエステル化物へと選択的に変換させることができるため、低級アルコールＥＰＡエステル化物を高収率にて得ることができる。
【００３３】
＜反応温度＞
酵素処理は、該組成物中の低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合（例えば、低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物）を高めることができる点で、反応液の温度を、通常２５℃以下（２０℃以下、より好ましくは１０℃以下）、一方、−２０℃以上、好ましくは−１０℃以上、より好ましくは−５℃以上にて行うことができる。
【００３４】
＜原料油脂＞
本実施形態に係る製造方法で使用する原料油脂は、ＥＰＡを構成脂肪酸として含むグリセリン脂肪酸エステル（ＥＰＡ含有グリセリド）を含む油脂であればよく、脂肪酸組成中のＥＰＡの含有量が１２質量％以上（通常、２０質量％以下）である油脂が好ましい。
【００３５】
なお、原料油脂には、ＤＨＡ（Ｃ２２：６）等、ＥＰＡ以外の脂肪酸を構成脂肪酸として含有するグリセリドを含んでいてもよい。原料油脂が、ＤＨＡを構成脂肪酸として含有するグリセリドを含む場合、脂肪酸組成中のＤＨＡの含有量が１５質量％以下である油脂が好ましい。また、原料油脂に含まれる、ＥＰＡ以外の脂肪酸トリグリセリドは、多価不飽和脂肪酸のトリグリセリドであってもよい。多価不飽和脂肪酸とは、炭素数１６以上でかつ分子内に二重結合を２個以上有する不飽和脂肪酸をいい、上述のＥＰＡやＤＨＡのほか、アラキドン酸（Ｃ２０：４）、ドコサペンタエン酸（Ｃ２２：５）、ステアリドン酸（Ｃ１８：４）、リノレン酸（Ｃ１８：３）、リノール酸（Ｃ１８：２）等が挙げられる。
【００３６】
＜油脂＞
「油脂」とは、通常、トリグリセリドを意味するが、本発明では、油脂は、ジグリセリド、モノグリセリド等、酵素（リパーゼ）が作用するその他のグリセリドも含んでいてもよい。
【００３７】
＜原料油脂＞
原料油脂としては、例えば、魚油、魚油以外の動物油、植物油、藻類、微生物が生産する油、これらの混合油脂、またはこれらの廃油が挙げられる。本発明で使用する原料油脂中のトリグリセリドの割合は、通常７０質量％以上１００質量％以下であり、８０質量％以上１００質量％以下であることが好ましい。
【００３８】
魚油としては、イワシ油（ＥＰＡ８質量％以上２０質量％以下）、マグロ油（ＥＰＡ３質量％以上１０質量％以下）、カツオ油（ＥＰＡ５質量％以上１０質量％以下）、タラ肝油（ＥＰＡ５質量％以上１５質量％以下）、サケ油（ＥＰＡ５質量％以上１５質量％以下）、イカ油（ＥＰＡ１０質量％以上１８質量％以下）、メンヘーデン油(ＥＰＡ５質量％以上質量％以下)が挙げられる。
【００３９】
ここで、各魚油におけるＥＰＡの含有量は、該魚油においてグリセリドを構成する脂肪酸としてＥＰＡを含む割合をいう。植物油は通常ＥＰＡやＤＨＡを含有しないが、例えば、遺伝子組み換え技術によりＥＰＡやＤＨＡを含有する、大豆油、菜種油、パーム油、オリーブ油等を原料油脂として用いることができる。藻類、微生物由来油としては、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ等によるアラキドン酸含有油、クロメ、アラメ、ワカメ、ヒジキ、ハバノリ、ヒバマタの一種によるＥＰＡ含有油、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｍａｒｉｎｕｓ、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌等によるＤＨＡ含有油等、魚油以外の動物油としては、例えば、鯨油、羊脂、牛脂、豚脂、乳脂肪、卵黄油等が挙げられる。
【００４０】
なお、原料油脂は水分を含むものであってもよい。また、本発明において、「廃油」とは、使用済みの魚油、植物性油脂、または動物性油脂であり、水分が含まれていてもよい。原料油脂がＥＰＡおよびＤＨＡの両方を含む場合、得られる低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合をより高めることができる点で、原料油脂に含まれる脂肪酸グリセリドを構成する脂肪酸におけるＥＰＡとＤＨＡのモル比率は、ＥＰＡ／ＤＨＡ＝０．５以上６以下であることが好ましく、１以上３以下であることがより好ましい。
【００４１】
＜酵素＞
本実施形態に係る製造方法で使用する酵素の性状は、粗精製、部分精製、精製のいずれでもよい。また遊離型でもよいし、固定化されていてもよいが、再利用可能である点、酵素処理後の後処理が簡便である点で、前記リパーゼが固定化された固定化酵素であることが好ましい。固定化酵素は、酵素を担体に固定化されたものであってもよい。
【００４２】
＜リパーゼ＞
エステル交換を触媒する作用を有する点で、酵素は、例えば、リパーゼであることが好ましい。リパーゼは「リパーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．１．３）」と国際酵素分類を示すことで、科学的に特定される。
【００４３】
＜リパーゼの種類＞
本実施形態に製造方法で使用するリパーゼは、１，３位−特異的であっても、非特異的であってもよい。本実施形態に係る組成物において低級アルコールＥＰＡエステルのモル比率を高くすることができる点で、リパーゼは、１，３位特異リパーゼ、すなわち、トリアシルグリセロールの１，３位にのみ特異的作用する酵素または２位よりも１，３位に優先的に作用する酵素であることが好ましい。
【００４４】
＜リパーゼの具体例＞
リパーゼとしては、例えば、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ムコール属(Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ，Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ)、アスペルギルス属(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ)、リゾプス属(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ.)、ペニシリウム属(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ，Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ)、サーモマイセス属(Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ)等に属する糸状菌、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）等に属する酵母、シュードモナス属(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ.)、アクロモバクター属(Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ.)、ブルクホルデリア属(Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｓｐ．)、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、シュードザイマ属(Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ｓｐ．)等に属する細菌、豚膵臓等の動物に由来するリパーゼが挙げられる。市販のリパーゼも用いられる。例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅのリパーゼ（リパーゼＤＦ：天野エンザイム社製）、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ（リパーゼＯＦ：名糖産業社製）およびＰｓｅｕｄｏｍａｎａｓ属のリパーゼ（リパーゼＰＳ、リパーゼＡＫ：天野製薬社製）が挙げられ、固定化酵素としては、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ（リポザイムＩＭ６０：ノボザイムズ社製、リポザイムＲＭＩＭ：ノボザイムズ社製）、Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａのリパーゼ（ノボザイム４３５：ノボザイムズ社製）が挙げられる。
【００４５】
＜酵素の使用量＞
反応に使用する酵素の量は、反応温度や時間等により決定されるため特に規定されないが、遊離型の酵素の場合、一般的には反応液１ｇ当たり１単位(Ｕ)以上１０，０００Ｕ、好ましくは５Ｕ以上１，０００Ｕ添加すればよく、適宜設定することができる。ここでの酵素活性の１Ｕとは、リパーゼの場合はオリーブ油の加水分解において１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離する酵素量である。固定化酵素を用いる場合は、反応液の質量に対して固定化した酵素が０．１質量％以上２００質量％以下、好ましくは１質量％以上２０質量％以下（担体の質量を含む質量）になるように添加すればよい。
【００４６】
＜水分含量＞
本発明者らは、前記酵素処理の反応液中における水分含量を０．２質量％以上とすることにより、前記反応液の温度が２５℃以下にて酵素処理を行う場合であっても、得られる組成物中の低級アルコール脂肪酸エステル化物の割合（本発明において「エステル化率」ともいう。）をより高めることができることを見出した。
【００４７】
また、エステル化率をより高めることができ、かつ、低級アルコールＥＰＡエステル化物の生成量を維持できる点で、前記酵素処理の反応液中における水分含量は、０．３質量％以上であることが好ましく、０．５質量％以上であることが好ましく、また、２０質量％以下であることが好ましく、１０質量％以下であることがより好ましい。なお、水は、反応液中に逐次的に添加してもよいし、連続して添加してもよいし、または一括して添加してもよい。
【００４８】
＜低級アルコール＞
脂肪酸をエステル化してエステル化物を得、かつ、水および油脂の双方と混和することならびに生成する低級アルコール脂肪酸エステル化物を溶解させることにより酵素反応を円滑に進行させることができる観点から、前記酵素処理の反応液は、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上３質量部以下の低級アルコールをさらに含むことができる。また、酵素反応を円滑に進行させることができる観点から、前記反応液における低級アルコールと水の比率（質量比）は１以上５０以下であることが好ましく、２以上であることがより好ましく、一方、２０以下であることがより好ましい。
【００４９】
本実施形態に係る製造方法における原料油脂の酵素処理において、低級アルコール（炭素原子数１、２または３のアルコール）は、低級アルコールＥＰＡエステル化物のエステル部位として利用されることができる。
【００５０】
生成する低級アルコールＥＰＡエステル化物を溶解させることにより、反応液を均一に保持することができ、かつ、酵素活性を維持できる点で、前記酵素処理の反応液における前記低級アルコールの含有量は、前記原料油脂９．５質量部に対して０．１質量部以上（好ましくは、０．３質量部以上）であることが好ましく、一方、前記原料油脂９．５質量部に対して３質量部以下（好ましくは、２．５質量部以下、さらに２質量部以下）であることが好ましい。なお、低級アルコールは、反応液中に逐次的に添加してもよいし、連続して添加してもよいし、または一括して添加してもよい。
【００５１】
＜低級アルコールの具体例＞
低級アルコールとしては、水との混和性に優れている点で、メタノールおよび／またはエタノールであることが好ましく、エタノールであることがより好ましい。
【００５２】
＜反応時間＞
酵素処理における反応液の温度は、用いる酵素の種類により決定すればよい。また、反応時間は、通常２時間以上４８時間以下、好ましくは４時間以上３６時間以下である。
【００５３】
＜エステル化率＞
前記酵素処理により得られる低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第１組成物）は、前記低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物中の油脂成分に対して、低級アルコール脂肪酸エステル化物を４０質量％以上９０質量％以下含むことができ、さらに５０質量％以上８０質量％以下含むことができる。この場合、「油脂成分」としては、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、低級アルコールエステル脂肪酸エステル化物、及び遊離脂肪酸を含む概念である。酵素処理で得られる低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物に含まれる油脂成分の割合は通常、８０質量％以上約１００質量％以下であり、９０質量％以上であることが好ましい。本発明において、該第１組成物中における低級アルコール脂肪酸エステル化物の割合は「エステル化率」（質量％）として規定される。すなわち、エステル化率が高いほど、原料油脂からの低級アルコール脂肪酸エステル化物への変換が進行していることを意味する。低級アルコールＥＰＡエステル化物の生成量の増加は、エステル化率の上昇に寄与することができる。本発明において、エステル化率は、後述する実施例に記載の方法によって算出することができる。なお、エステル化率の速度低下を防止できる点から、カルシウム酸化物又はその塩、及びマグネシウム酸化物又はその塩の含有量は、前記原料油脂に対して０．４質量％以下であるとよく、さらに０．０８質量％以下、０．０１質量％未満であるとよい。
【００５４】
＜低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物＞
前記酵素処理により得られる低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第１組成物）において、前記低級アルコールＤＨＡエステル化物に対する前記低級アルコールＥＰＡエステル化物のモル比率（低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物）は３．０以上３０以下であることができ、より具体的には、３．０以上２０以下であってもよく、３．０以上１５以下であってもよい。上記モル比率は、後述する実施例に記載の方法によって算出することができる。上記モル比率の高さは、低級アルコールＥＰＡエステル化物の収率向上に寄与する大きな要因であり、上記モル比率が高いほど、後述する精密蒸留工程において低級アルコールＥＰＡエステル化物を単離する際のロスを少なくすることができる。
【００５５】
＜ＥＰＡ転換率＞
前記酵素処理により得られる低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第１組成物）において、前記ＥＰＡ含有グリセリドから前記低級アルコールＥＰＡエステル化物への転換率（本発明において「ＥＰＡ転換率」ともいう。）が６０％以上であることができ、７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい（通常、１００％以下である）。上記ＥＰＡ転換率は、後述する実施例に記載の方法によって算出することができる。
【００５６】
ここで、ＥＰＡ転換率が高いほど、ＥＰＡ含有グリセリドから低級アルコールＥＰＡエステル化物へとより効率的に変換されたことを意味する。すなわち、ＥＰＡ転換率の高さは、低級アルコールＥＰＡエステル化物の収率向上に寄与することができる。
【００５７】
＜酸価＞
前記酵素処理では、酵素の安定性をより高めることができる観点で、該酵素処理の反応液の酸価が２以上であることが好ましく、２．２以上１２以下であることがより好ましい。
【００５８】
本発明において、反応液の酸価は、以下の方法により測定及び算出された値である。前記酵素処理の反応液の酸価が２以上（好ましくは２．２以上１２以下）であることは、該反応液中の遊離脂肪酸の濃度が高いことを意味する。本発明において、「遊離脂肪酸」とは、脂肪酸エステル化物として存在していない脂肪酸（非エステル結合型脂肪酸）をいう。
【００５９】
＜酸価の測定方法＞
酸価の値は、公益社団法人日本油化学会制定の基準油脂分析試験法（日本油化学会規格試験法委員会編、基準油脂分析試験法（Standard methods for the analysis of fats, oils and related materials）：日本油化学会制定、２０１３年版、１．５  抽出油の酸価）により測定することができる。
【００６０】
具体的には、まず、試料（反応終了後の反応液）をその推定酸価に対応する採取量に準じて三角フラスコに正しく測り取り、エタノール／ジエチルエーテル＝１／１（ｗ／ｗ）の混合溶媒１００ｍＬを加え、試料を完全に溶解させた。次いで、０．１ｍｏｌ／Ｌのエタノール性水酸化カリウムで滴定し、指示薬として加えたフェノールフタレイン溶液の変色が３０秒間以上続いた点を終点とする。酸価は以下の式（３）により算出された。
酸価＝５．６１１×Ａ×Ｆ／Ｂ  ・・・・（３）
（式中、Ａは、０．１ｍｏｌ／Ｌのエタノール性水酸化カリウムの使用量（ｍＬ）であり、Ｂは、試料採取量（ｇ）であり、Ｆは、エタノール性水酸化カリウムのファクターである。）
【００６１】
＜分子蒸留＞
次に、本実施形態に係る製造方法では、酵素処理（リパーゼを用いた処理）（図１のステップＳ１）で得られた、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を蒸留する工程（いわゆる、分子蒸留（一次蒸留）、図１のステップＳ２）をさらに含むことができる。
【００６２】
分子蒸留（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎ）は、高真空度下で行われる蒸留である。分子蒸留工程により、低級アルコールＥＰＡエステル化物および低級アルコールＤＨＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物の混合物と、該混合物以外の成分（低級アルコール脂肪酸エステル化物以外の脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドおよび脂肪酸トリグリセリド）とを分離することができる。なお、前記混合物以外の脂肪酸モノグリセリド、脂肪酸ジグリセリドおよび脂肪酸トリグリセリドを利用して、低級アルコールの存在下で再度エステル化することにより、低級アルコールＤＨＡエステル化物を得ることもできる。
【００６３】
分子蒸留は通常、後述する精密蒸留における真空度よりも高い真空度で行なうことができる。
【００６４】
例えば、分子蒸留における温度は、８０℃以上２００℃以下（好ましくは１５０℃以上２００℃以下）であり、真空度は０．００１Ｔｏｒｒ以上５Ｔｏｒｒ以下（好ましくは０．０１Ｔｏｒｒ以上１Ｔｏｒｒ以下）であり、より具体的には、温度１４０℃以上１６０℃以下でかつ真空度０．０１Ｔｏｒｒ以上０．１Ｔｏｒｒ以下である。
【００６５】
分子蒸留は、通常、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物および前記低級アルコールＤＨＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物の混合物と、該混合物以外の成分とを分離することができる装置を用いて行われ、より具体的には、一般的に市販の分子蒸留装置を使用して行うことができ、例えば、遠心式分子蒸留機、ショートパス蒸留機、流下膜式蒸留機等を用いることができる。特に、ショートパス蒸留機が好ましい。分子蒸留装置では、蒸発管を通して被処理物を揮発させた後、冷却器内に通すことで、液化する低分子成分と、液化しない高分子成分とに分けることができる。
【００６６】
また、分子蒸留は、後述する精密蒸留の前に行うことが好ましい。
【００６７】
＜混合物の組成＞
また、後述する精密蒸留で得られる低級アルコールＥＰＡエステル化物の純度をより高めることができる観点で、前記混合物（第２組成物）は、低級アルコール脂肪酸エステル化物を９０質量％以上含み、前記低級アルコール脂肪酸エステル化物は、低級アルコールＥＰＡエステル化物および低級アルコールＤＨＡエステル化物を以下のモル比率で含むことがより好ましい。
３．０≦（低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物）≦３０。
【００６８】
より好ましくは、３．０≦（低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物）≦２０である。
【００６９】
本実施形態に係る製造方法によれば、上記酵素処理によって、ＥＰＡ含有グリセリドを低級アルコール脂肪酸エステル化物へと選択的に変換させることができるため、上記分子蒸留工程によって、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物および前記低級アルコールＤＨＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物と、他の成分（低級アルコール脂肪酸エステル化物以外の脂肪酸グリセリド、グリセリン）とを、一般的な分離処理にて比較的容易に分離することができる。これにより、後述する精密蒸留工程によって、純度の高い低級アルコールＥＰＡエステル化物を簡便な方法にて効率良く得ることができる。
【００７０】
＜精密蒸留＞
次に、本実施形態に係る製造方法では、分子蒸留（図１のステップＳ２）で得られた、低級アルコールＥＰＡエステル化物および低級アルコールＤＨＡエステル化物を含む混合物（第２組成物）を蒸留して（精密蒸留、図１のステップＳ３）、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物以外の低級アルコール脂肪酸エステル化物を分離することにより、低級アルコールＥＰＡエステル化物（好ましくは純度９６．５質量％以上、より好ましくは９８質量％以上約１００質量％以下）を得る工程をさらに含むことができる。
【００７１】
精密蒸留（ｒｅｃｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は上記の分子蒸留と比べて低真空度下で行われる蒸留であって、具体的には、塔内で液と蒸気を向流接触させると共に、適当な還流を行い、液の蒸発と蒸気の凝縮を繰り返すことによって分離の度合いを高める連続蒸留操作であり、液体混合物の分離精製に最も多く用いられる蒸留である。精密蒸留工程により、複数種類の脂肪酸のエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物から、任意の低級アルコール脂肪酸エステル化物を分離することができる。したがって、本実施形態に係る精密蒸留工程では、前記分子蒸留工程により得られた、複数種類の低級アルコール脂肪酸エステル化物の中から、低級アルコールＥＰＡエステル化物を選択的に得ることができる。
【００７２】
精密蒸留は通常、上記の分子蒸留における真空度よりも低い真空度で行うことができる。
【００７３】
例えば、精密蒸留における温度は、１５０℃以上２５０℃以下（好ましくは１６０℃以上２３０℃以下）であり、真空度は０．０１Ｔｏｒｒ以上１０Ｔｏｒｒ以下（好ましくは０．１Ｔｏｒｒ以上５Ｔｏｒｒ以下）であり、より具体的には、温度１７０℃以上２２０℃以下でかつ真空度０．５Ｔｏｒｒ以上３Ｔｏｒｒ以下である。
【００７４】
精密蒸留は、通常、前記低級アルコールＥＰＡエステル化物以外の低級アルコール脂肪酸エステル化物を前記低級アルコールＥＰＡエステル化物と分離することができる装置を用いて行われ、より具体的には、精留塔を有する蒸留装置又は流下膜式の蒸留装置を使用して行うことができ、精留塔としては、例えば、棚段式、充填式、又はスプリング式等を用いることができ、特に、棚段構造を有する棚段式又は充填式の蒸留装置を使用することが好ましい。棚段構造を有する蒸留装置では、揮発した物質が上昇するが、物質の種類によって滞留する棚段が異なるため、排出口が付いている棚段まで目的物質が上昇するように棚段が設定されている。また、加熱方式としては、比較的加熱履歴の少ない流下型薄膜式が好ましい。また、精密蒸留の蒸留法としては、バッチ式または連続式のいずれでもよいが、連続式が好ましい。なお、精留塔の理論段数は適宜設定できるが、２段以上、好ましくは５段以上（通常２段以上１０以下）が好ましい。
【００７５】
また、精密蒸留の回数は限定されない。すなわち、精密蒸留を２回以上（通常２回以上４回以下）行ってもよい。
【００７６】
＜低級アルコールＥＰＡエステル化物の具体例＞
低級アルコールＥＰＡエステル化物は、医薬品、化粧品、食品等の原料として使用することができる。低級アルコールＥＰＡエステル化物としては、例えば、ＥＰＡメチルエステル、ＥＰＡエチルエステル、ＥＰＡｎ−プロピルエステル、ＥＰＡイソプロピルエステルが挙げられ、このうち、ＥＰＡエチルエステル（本明細書において、「ＥＰＡＥＥ」ともいう。）は、例えば高脂血症、閉塞性動脈硬化症等の循環器系疾患治療薬として用いられている。したがって、低級アルコールＥＰＡエステル化物はＥＰＡＥＥであってもよく、低級アルコールＤＨＡエステル化物はＤＨＡエチルエステル（本明細書において、「ＤＨＡＥＥ」ともいう。）であってもよい。
【００７７】
＜低級アルコールＥＰＡエステル化物の用途＞
また、低級アルコールＥＰＡエステル化物および低級アルコールＤＨＡエステル化物は、サプリメント等の食品組成物およびカプセル剤の原料として使用することができる。
【００７８】
＜作用効果−公知の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法＞
本実施形態に係る製造方法の作用効果を説明するにあたり、まず、公知の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法について説明する。
【００７９】
＜公知の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法＞
公知の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法（特許文献１）では、まず、複数の脂肪酸を低級アルコール脂肪酸エステル部位に有する脂肪酸グリセリドを含む原料油脂を、アルカリ性条件下でアルコールと処理することで、脂肪酸グリセリドとアルコールとのエステル交換反応によって、低級アルコール脂肪酸エステル化物を得る。この方法によれば、複数種類の低級アルコール脂肪酸エステル化物の混合物が得られる。
【００８０】
また、アルコールと脂肪酸エステル化物とのエステル交換反応は通常、水の含有量が少ない条件下（例えば、特許文献１の実施例に記載される、水分含量０．１％）でアルコールと脂肪酸エステル化物とを反応させる。その理由として、脂肪酸エステル化物のエステル結合が水によって加水分解されるのを防ぐためであることが挙げられる。
【００８１】
＜公知の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物の製造方法の課題＞
複数種類の低級アルコール脂肪酸エステルの混合物から所望の低級アルコール脂肪酸エステルを分離するためには、例えば、条件（例えば、真空度、加熱温度、加熱方法、加熱時間）を非常に厳密に制御した蒸留を行う必要がある。このように、条件の厳しい蒸留を行うことは、製造プロセス上、負担が大きい。
【００８２】
ＥＰＡとＤＨＡとは炭素数や二重結合数が近似するため、低級アルコールＥＰＡエステル化物および低級アルコールＤＨＡエステル化物（例えば、ＥＰＡＥＥおよびＤＨＡＥＥ）の一方のみを単離することが困難である。例えば、ＥＰＡ含有グリセリドおよびＤＨＡ含有グリセリドを含む油脂をアルカリ性条件下でエステル交換反応を行った場合、次の蒸留工程において、蒸留時にロスが生じる傾向がある。また、得られる低級アルコールＥＰＡエステル化物と低級アルコールＤＨＡエステル化物とを分離するためには、非常に精密に制御された条件下で蒸留することが必要とされ、製造プロセス上、非常に負担が大きい。
【００８３】
また、蒸留は一般に、大規模な装置を必要とすることが多く、製造コストが増大する傾向がある。また、蒸留操作には、多大な加熱エネルギーを必要とする。さらに、アルカリ処理を行う場合、使用するアルカリ性液が廃液として生じるため、該廃液を処理する必要が生じるという問題がある等、いずれも環境負荷が大きい。
【００８４】
＜本実施形態に係る製造方法の作用効果＞
酵素反応では一般に、反応温度が低いほど反応の進行が低下する。これに対して、本発明者らは、酵素処理の際の反応液の温度を２５℃以下にすることにより、目的物である低級アルコールエステル化物の収率（より具体的には、低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物の比率）を高めることができることを見出した。また、この場合において、前記酵素処理の反応液中における水分含量を０．２質量％以上にすることにより、前記反応液の温度を２５℃以下に設定した場合であっても、酵素反応の低下をより確実に抑制することができ、これによって、エステル化率をさらに高められることを見出した。
【００８５】
（ｉ）すなわち、本実施形態に係る製造方法によれば、第１に、ＥＰＡ含有グリセリドを含有する原料油脂を２５℃以下で酵素処理（リパーゼを用いた処理）して、低級アルコールＥＰＡエステル化物を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を得る工程を含むことにより、低級アルコールＥＰＡエステル化物を高収率で得ることができる（ＥＰＡ転換率が高められる）とともに、生成する低級アルコール脂肪酸エステル化物中の低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合（具体的には、低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物の比率）を高めることができる。
【００８６】
このように、本実施形態に係る製造方法において、低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合が高められており、かつ、低級アルコール脂肪酸エステル化物中における低級アルコールＥＰＡエステル化物の比率が高い組成物を得ることができる。
【００８７】
精密蒸留工程における低級アルコールＥＰＡエステル化物の収率を高めるためには、（１）低級アルコールＥＰＡエステル化物／低級アルコールＤＨＡエステル化物の比率を高めること、ならびに、（２）ＥＰＡ転換率を高めることによって達成することができる。したがって、本実施形態に係る製造方法によって、低級アルコールＥＰＡエステル化物の割合が高められており、かつ、低級アルコール脂肪酸エステル化物中における低級アルコールＥＰＡエステル化物の比率が高い組成物を得ることができるため、続いて行われる、該組成物を用いた精密蒸留工程において、低級アルコールＥＰＡエステル化物と低級アルコールＤＨＡエステル化物とを分離する際に、蒸留時のロスを少なくすることができる。よって、低級アルコールＥＰＡエステル化物をより多く得ることができるため、製造コストを低減し、環境負荷を減ずることができる。
【００８８】
（ｉｉ）第２に、本実施形態に係る製造方法では、前記酵素処理における水分含量を０．２質量％以上とすることにより、前記反応液の温度を２５℃以下に設定した場合であっても、酵素反応の低下をより確実に抑制することができ、かつ、エステル化率をより高めることができる。その結果、最終的に得られる低級アルコールＥＰＡエステル化物をより多く得ることができる。
【００８９】
（ｉｉｉ）第３に、上記本実施形態に係る製造方法では、上記酵素処理を用いることにより、アルカリを用いる場合のような廃液処理の問題が生じないため、環境に与える影響が少ない。また、上記酵素処理では、酵素の繰り返し使用が可能になるため、製造コストのさらなる低減および省資源化を図ることができる。したがって、前記酵素処理は、再利用性、取扱性および経済性に優れていることから、小規模スケールでの処理のみならず、大規模スケールでの処理に好適である。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【００９１】
［調製例１（固定化酵素の調製）］
サーモマイセス・ラヌギノーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）の４００ｇの溶液（９４０ＫＬＵ／ｍＬ）を、大川原製作所製流動層造粒装置を用いて１ｋｇのセライト５４５（ジョンマンビル社、粒径０．０２−０．１ｍｍ）上に噴霧した。前記リパーゼ溶液はペリスタポンプ（東京理化器械株式会社製）を経由して供給した。１００ｍ３／時の空気流により吸い込み口の空気の温度は５７℃であり、そして固定化産物の温度は約４０℃であった。固定化終了後、流動層中で更に５分間乾燥して、粒子状の固定化酵素（平均粒子径６００μｍ、比重２）を得た。
【００９２】
［調製例２（固定化酵素の調製）］
ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）７０質量％とメタクリル酸グリシジル１５質量％とＤＥＡＥメタクレート１５質量％を通常の方法で共重合し、粒子状の樹脂担体を得た。この樹脂担体の平均細孔径は１１．５ｎｍで細孔容積は０．５ｃｍ３／ｇ、平均粒子径は０．５ｍｍ、比重０．２であった。得られた樹脂担体１ｋｇにＲｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐ.由来のリパーゼＦＡＰ−１５（天野エンザイム（株）製１５５,０００ｕ／ｇ）の２質量％水溶液１０Ｌを加え、３時間２５℃で攪拌しながら固定化を行った。濾過、洗浄後、真空乾燥器で２時間乾燥し、固定化酵素を得た。
【００９３】
［実施例１（酵素処理）］
精製魚油（イワシ油、トリグリセリド９０質量％以上、ＥＰＡ約１８質量％、ＤＨＡ約１２質量％）１ｋｇをセパラブルフラスコ（容量３Ｌ）に入れ、エタノール５２．５ｇを添加した。フラスコを混ぜ、エタノールを魚油中に均一に分散させた。次に、水３．１６ｇ（反応液中の水分含量：０．３質量％）を入れ、撹拌し、水を魚油−エタノール混合物中に分散させて、反応液を調製した。次いで、調製例１で調製した固定化酵素１０５ｇを添加し、サンプル瓶中の大気を窒素で置換してから、撹拌機を使用し、サンプルを１５０ｒｐｍ、１５℃で２２時間にて反応させて、ＥＰＡＥＥおよびＤＨＡＥＥを含む、試験番号６の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第１組成物）を得た。反応開始から２２時間の時点でそれぞれ、反応液２００μＬ採取し、成分分析（低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物中の低級アルコール脂肪酸エステル化物の含有量（質量％）、低級アルコール脂肪酸エステル化物中のＥＰＡＥＥの含有量（モル％）、低級アルコール脂肪酸エステル化物中のＤＨＡＥＥの含有量（モル％）、ＥＰＡＥＥ／ＤＨＡＥＥ（モル比率）、エステル化率（質量％）およびＥＰＡ転換率（質量％））を行った（表１参照）。
【００９４】
また、反応液中の水分含量および反応温度を表１に示す各条件に変更して、試験番号１ないし２７の低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第１組成物）を得た。また、表１に示す一部の例において、反応開始から３０時間または４６時間の時点まで反応を行った反応液について上記の方法と同様の成分分析を行った結果を表２および表３に示す。
【００９５】
上述した実施形態に記載された方法により測定および算出された試験番号５ないし２７の反応液の酸価もいずれも２．２以上１２以下の範囲内であった。
【００９６】
表１ないし４において、ＥＰＡＥＥ／ＤＨＡＥＥ（モル比率）が６を超える場合を「Ａ」、４以上６以下の場合を「Ｂ」、４未満の場合を「Ｃ」と評価した結果を示し、エステル化率が７０質量％を超える場合を「Ａ」、５０質量％以上７０質量％以下の場合を「Ｂ」、５０質量％未満の場合を「Ｃ」と評価した結果を示し、ＥＰＡ転換率が７０質量％を超える場合を「Ａ」、６０質量％以上７０質量％以下の場合を「Ｂ」、６０質量％未満の場合を「Ｃ」と評価した結果を示す。
【００９７】
なお、実施例１において、成分分析は後述するＴＬＣ−ＦＩＤまたはＧＣ分析により測定された値である。また、エステル化率およびＥＰＡ転換率は以下の式により算出された。
【００９８】
エステル化率（質量％）＝（脂肪酸エチルエステルのピーク面積／試料の全ピーク面積）×１００
【００９９】
ＥＰＡ転換率（質量％）＝エステル化率(質量％)×［（低級アルコール脂肪酸エステル化物中のＥＰＡＥＥの割合（質量比））／（原料油脂中において、脂肪酸グリセリドの構成脂肪酸として含まれるＥＰＡの含有量（質量比））］
【０１００】
上記ＥＰＡ転換率の式において、「低級アルコール脂肪酸エステル化物中のＥＰＡＥＥの割合（質量比）」は、低級アルコール脂肪酸エステル化物の質量に対する、ＥＰＡＥＥの質量の比であり、「原料油脂中において、脂肪酸グリセリドの構成脂肪酸として含まれるＥＰＡの含有量」は、原料油脂の質量に対する、ＥＰＡの質量の比である。
【０１０１】
１）脂質組成分析（ＴＬＤ−ＦＩＤ）
酵素反応後の試料（反応液）を８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して水相を除去し、得られた油相（油脂成分）の１％ヘキサン溶液を調製して、Ｉａｔｒｏｓｃａｎ ＭＫ−６（三菱化学メディエンス社製）を用いたＴＬＤ−ＦＩＤ分析に供した。一次展開はトルエン：クロロホルム：酢酸（５０：３０：０．７５，／ｖ／ｖ／ｖ）を溶媒に用いて約６０％、二次展開はヘキサン：ジエチルエーテル（６５：５，ｖ／ｖ）を溶媒に用いて１００％行った。当該脂質組成分析により、反応液中に存在する脂質の組成（より具体的には、脂肪酸エチルエステルの割合）を同定することができる。これにより、上記エステル化率を算出することができる。
【０１０２】
２）ＧＣ（ガスクロマトグラフィー）分析
シリカゲル０．５５ｇを充填した１ｍＬ容量のカラムを、溶媒（ヘキサン：ジエチルエーテル（９５：５，ｖ／ｖ））４ｍＬで平衡化した。酵素反応後の試料（反応液）を８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、水相を除去して得られた油相を、減圧処理でエタノール等の低分子成分を留去して得られた本試料（油脂成分）０．１ｍＬをカラムに負荷し、同溶媒４ｍＬで、脂肪酸エチルエステルを含む画分を溶出、回収した。本画分をＧＣ分析に供した。
【０１０３】
前記画分の脂肪酸組成は、Ｏｍｅｇａｗａｘ ２５０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、３０ｍ、０．２５ｍｍ、０．２５μｍ）を接続したガスクロマトグラフＧＣ  ６８９０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で前記画分を分析することにより行われた。カラムオーブン温度は５０℃、２分；４℃／分，２２０℃、１５分保持した。注入口と検出口はそれぞれ２５０℃、２６０℃に設定した。
【０１０４】
前記画分のＧＣ分析により、低級アルコール脂肪酸エステル化物中のＥＰＡＥＥの割合およびＤＨＡＥＥの割合（モル％）、ならびに、ＥＰＡＥＥ／ＤＨＡＥＥ（モル比率）を同定することができる。また、上述のエステル化率およびこれらの値から、表１に示されるＥＰＡ変換率を算出することができる。
【０１０５】
【表１】
2016182046.tif 000002
【０１０６】
【表２】
2016182046.tif 000003
【０１０７】
【表３】
2016182046.tif 000004
【０１０８】
表１〜３によれば、反応液の温度を２５℃以下にすることにより、反応液におけるＥＰＡＥＥの含有量／ＤＨＡＥＥ含有量の値を高めることができることが理解できる（試験番号５ないし２７）。また、反応液における水分含量を０．２質量％以上にすることで、ＥＰＡ転換率ならびにエステル化率を高めることができることが理解できる（試験番号２ないし４、６ないし９、１１ないし２７）。
【０１０９】
［実施例２（酵素処理）］
精製魚油（イワシ油、トリグリセリド９０質量％以上、ＥＰＡ約１８質量％、ＤＨＡ約１２質量％）４．７５ｇ、反応開始時及び反応開始から２時間の時点でそれぞれエタノール０．２５ｇ、固定化酵素ＲＭＩＭ（ノボザイムズ社製）０．５ｇ、水０．１ｇ（反応液中の水分含量：２％）をねじ口バイアル瓶に添加し、往復振盪しながら５℃、１５℃、３５℃で２４時間反応を行い、ＥＰＡＥＥおよびＤＨＡＥＥを含む、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第１組成物）を得た。その結果を表４に示す。表４によれば、反応温度が２５℃以下の場合（試験番号２８および２９）、反応温度が２５℃を超える場合と比較して（試験番号３０）、ＥＰＡＥＥ／ＤＨＡＥＥが高いことが理解できる。
【０１１０】
上述した実施形態に記載された方法により測定および算出された、試験番号２８および２９の反応液の酸価はそれぞれ２．２以上１２以下の範囲内であった。
【０１１１】
【表４】
2016182046.tif 000005
【０１１２】
［実施例３］
反応液の温度を０℃、−５℃、−１０℃に変更した以外は実施例１と同様の処理を行い、ＥＰＡＥＥおよびＤＨＡＥＥを含む、低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第１組成物）を得た。
【０１１３】
［実施例４（分子蒸留処理）］
実施例１で得られた第１組成物を、ショートパス蒸留機（株式会社神鋼環境ソリューション製）を使用して、真空度０．１Ｔｏｒｒ以下で８０℃以上２００℃以下の温度にて蒸留し（分子蒸留（一次蒸留））、低級アルコールＥＰＡエステル化物（ＥＰＡＥＥ）および低級アルコールＤＨＡエステル化物（ＤＨＡＥＥ）を含む低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（第２組成物）を得た。
【０１１４】
実施例４で得られた第２組成物に含まれる低級アルコール脂肪酸エチルエステルの含有量はほぼ１００質量％であり、ならびに、第２組成物におけるＥＰＡＥＥ／ＤＨＡＥＥ（モル比率）は６．０であった。
【０１１５】
［実施例５（精密蒸留処理）］
実施例４で得られた第２組成物を、流下型薄膜式の精密蒸留機（株式会社旭製作所製）を使用して、真空度３Ｔｏｒｒ以下、１５０℃以上２５０℃以下の温度、理論段数５段にて蒸留（精密蒸留（二次蒸留））して、ＥＰＡＥＥ（第３組成物、純度：ほぼ１００質量％）を得た。
【０１１６】
［実施例６（食品組成物：クッキー）］
下記配合にてクッキーを調製した。ショートニングおよび実施例４で得られた低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物を攪拌機（Ｋｉｔｃｈｅｎ  Ａｉｄ社製Ｋｉｔｃｈｅｎ  Ａｉｄ  Ｋ５ＳＳ）に投入し速度調節レバー６で１分間混ぜ合わせてクリーム状にし、粉末全卵、砂糖を加えミキシングを行った。次に、除々に清水を加え比重を０．８ｇ／ｍｌに調整し、予め混合してから篩った小麦粉とベーキングパウダーを加えてから３０秒間攪拌を続けて生地を調製した。得られた生地を冷蔵庫で２時間ねかせた後、厚さ３〜５ｍｍ程度に延ばし、型を抜き、１８０℃のオーブンで１３〜１５分間焼成し、クッキーを得た。
【０１１７】
＜配合＞
小麦粉                                                  ２００ｇ
ベーキングパウダー                                          １ｇ
低級アルコール脂肪酸エステル化物含有組成物（実施例４）      １ｇ
ショートニング                                          １２０ｇ
上白糖                                                    ８０ｇ
粉末全卵                                                  １２ｇ
清水                                                      ２４ｇ
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合計                                                    ４３８ｇ
【０１１８】
［実施例７（ソフトカプセル）］
実施例５で得られたＥＰＡＥＥを使用して、内容物が下記の配合であるソフトカプセルを製した。
【０１１９】
＜配合割合＞
ＥＰＡＥＥ（実施例５）              ２０％
オリーブ油                          ５０％
ミツロウ                            １０％
中鎖脂肪酸トリグリセリド            １０％
乳化剤                              １０％
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合計                              １００％
【図１】
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