(57)【要約】【課題】特有の細胞形態を維持した状態で、簡便に、長期間の培養が可能な神経系細胞の培養方法の提供。【解決手段】内部に平板基板を有する培養容器を用いて、前記平板基板と、前記培養容器との間隙において神経系細胞を培養することを特徴とする、神経系細胞の培養方法；前記神経系細胞は、グリア細胞であることが好ましい；前記培養容器は、その内部に液体培地を備え、前記平板基板が前記液体培地内に沈降していることが好ましい；前記平板基板の下面と、前記培養容器の底面との間隙において神経系細胞を培養することが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部に平板基板を有する培養容器を用いて、前記平板基板と、前記培養容器との間隙において神経系細胞を培養することを特徴とする、神経系細胞の培養方法。
【請求項２】
前記神経系細胞がグリア細胞である、請求項１に記載の神経系細胞の培養方法。
【請求項３】
前記培養容器がその内部に液体培地を備え、
前記平板基板が前記液体培地内に沈降している、請求項１又は２に記載の神経系細胞の培養方法。
【請求項４】
前記平板基板の下面と、前記培養容器の底面との間隙において神経系細胞を培養する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の神経系細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特有の細胞形態を維持した状態で、長期間の培養が可能な神経系細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医用工学、再生医療等の分野において、神経系細胞を用いた様々な研究や技術開発がなされている。神経系細胞は、情報伝達を主に担う神経細胞（ニューロン）と、神経系を構成する神経細胞以外の細胞であるグリア細胞とに大別される。グリア細胞はさらに、形態や機能によって、アストロサイト（星状膠細胞）、オリゴデンドロサイト（希突起神経膠細胞）、ミクログリア（小膠細胞）及び上衣細胞に主に分類される。
グリア細胞は、「神経細胞間の区間を埋める物質」を語源とすることからも明らかなように、古来、神経細胞の構造的な支持、神経細胞周囲の環境保全等の役割のみを担っていると考えられていた。しかしながら近年の研究により、グリア細胞が、神経細胞のシナプス形成や、神経細胞の活性の制御に関与する重要な役割を担うことが示唆されている。
【０００３】
近年では、各種の単一細胞や細胞群（組織）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで好適に培養するための様々な培養技術が開発されている。例えば、特許文献１には、ヒト大脳皮質からアストロサイトを単離、培養する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００３−５２４３９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら特許文献１によれば、単離及び培養されたアストロサイトは多角扁平状の形態を示している。これは生体内でアストロサイトが取りうる多数の突起及び該突起からの多数の分岐を有する星状やスポンジ状の形態とは異なっている。
特許文献１に記載の技術に限らず、グリア細胞単独の培養において、グリア細胞特有の細胞形態を維持した状態で、簡便に培養を行う方法は確立されていなかった。
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、特有の細胞形態を維持した状態で、簡便に長期間の培養が可能である神経系細胞の培養方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、神経系細胞を培養する培養容器内に、平板基板を配し、平板基板と培養容器との間隙において神経系細胞を培養することにより、神経系細胞特有の細胞形態を維持した状態で、簡便に長期培養が可能であることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は下記の特徴を有する神経系細胞の培養方法を提供するものである。
（１）内部に平板基板を有する培養容器を用いて、前記平板基板と、前記培養容器との間隙において神経系細胞を培養することを特徴とする、神経系細胞の培養方法。
（２）前記神経系細胞がグリア細胞である、前記（１）の神経系細胞の培養方法。
（３）前記培養容器がその内部に液体培地を備え、
前記平板基板が前記液体培地内に沈降している、前記（１）又は（２）の神経系細胞の培養方法。
（４）前記平板基板の下面と、前記培養容器の底面との間隙において神経系細胞を培養する、前記（１）〜（３）のいずれかの神経系細胞の培養方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、初代培養、株化細胞培養、ＥＳ細胞培養等において、細胞が凝集してしまい細胞形態の観察等が困難であると考えられていた神経系細胞において、特有の細胞形態を維持した状態で、簡便に長期培養を行うことができる。また、本発明の培養方法により培養された神経系細胞は、特有の形態を維持しているものであるため、形態観察、形態ごとの分画を容易に行うことができる。また、それらの培養細胞を用いて、細胞の性質、薬理効果、細胞の構造化等の各種の検討等を好適に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例１における、培養開始７１日後の免疫染色細胞を観察した蛍光顕微鏡写真図である。
【図２】比較例１における、培養開始７１日後の免疫染色細胞を観察した蛍光顕微鏡写真図である。
【図３】実施例１における、培養開始３７日後の細胞を観察した光学顕微鏡写真図である。
【図４】実施例１における、培養開始３７日後の細胞を観察した光学顕微鏡写真図である。
【図５】実施例１における、培養開始３７日後の細胞を観察した光学顕微鏡写真図である。
【図６】実施例１における、培養開始３７日後の細胞を観察した光学顕微鏡写真図である。
【図７】比較例１における、培養開始３７日後の細胞を観察した光学顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の神経系細胞の培養方法（以下、単に「培養方法」ということがある。）は、内部に平板基板を有する培養容器を用いて、前記平板基板と、前記培養容器との間隙において神経系細胞を培養することを特徴とする。
【００１１】
本発明において神経系細胞とは、生体内で神経系を構成し得る細胞であれば特に限定されるものではなく、例えば神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、上衣細胞等のグリア細胞が挙げられる。また、本発明における神経系細胞は、分化誘導を行うことにより神経系細胞となりうる細胞であってもよく、例えば、神経幹細胞、マトリックス細胞、海綿芽細胞、グリオブラスト（グリア芽細胞）等が挙げられる。
なかでも、本発明の培養方法によれば、生体内において特有の形態を有し、且つｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養で該形態を発現し難いグリア細胞において、特有の形態を形成させることが可能であるため、グリア細胞を用いることが好ましい。
【００１２】
本発明で用いる神経系細胞は、細胞株として樹立された細胞であってもよく、生体から回収、分離した細胞であってもよい。また、本発明で用いる神経系細胞は、単独（１種）の細胞種のみを含むものであってもよく、２以上の細胞種を含むものであってもよい。例えば、グリア細胞として、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア等の混在した生体由来の細胞群を用いてもよい。本発明によれば、各細胞が培養容器内で各々の特有形態を取りうるため、複数種の細胞を共培養した場合であっても個別の検討や分画等が可能となる。
【００１３】
培養容器は、当分野において各種の細胞培養に用いられる容器であれば特に限定されるものではなく、シャーレ、プレート、フラスコ、バッグ等を利用することができる。後述するように、本発明では平板基板を液体培地内に沈降させ、培養容器の内腔側底面と、平板基板下面との間に間隙を設けることが好ましいため、内腔側底面に平板基板を沈降させやすい形状の培養容器が好ましく、シャーレ又はプレートが特に好ましい。
培養容器は、予め内面に親水化処理、細胞接着処理等が施されたものであってもよく、それら処理が施されていない未処理のものであってもよい。
【００１４】
培養容器内に播種を行う細胞数は特に限定されるものではないが、播種された細胞が密集しない（コンフルエントとならない）程度の細胞数とすることが好ましい。例えば液体培養の場合であれば、１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜１×１０８ｃｅｌｌ／ｍＬ（好ましくは１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜５×１０７ｃｅｌｌ／ｍＬ）程度の範囲内で、細胞種に応じて決定することが好ましい。
また、後述するように、培養容器内に平板基板を配した後に平板基板の上方から細胞を播種する場合であれば、平板基板と培養容器との間隙に播種した神経系細胞の全量が必ずしも存在しないことも鑑みて、比較的多量の神経系細胞を播種することも好ましい。また、多量の神経系細胞を播種した後、間隙内に定着していない細胞を回収してもよい。
【００１５】
神経系細胞を播種する培養容器内には、培地を充填する。培地は、当分野において神経系細胞の培養に用いられる物であれば特に限定されるものではないが、通常液体培地が用いられる。液体培地は合成培地であっても、半合成培地又は天然培地であってもよい。培地の量は培養容器の容量に応じて適宜決定する。
【００１６】
平板基板は、アクリル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリスチレン、ポリエステル、塩化ビニル等の樹脂を主原料とする樹脂基板、ガラス基板等が挙げられ、樹脂基板であることが好ましく、アクリル基板が特に好ましい。
後述するように、本発明では平板基板を液体培地内に沈降させることが好ましい。この観点から、平板基板は用いる液体培地中に沈降可能なものであることが好ましく、液体培地の比重に応じて平板基板の比重及び材料を検討することも必要となる。
【００１７】
平板基板の大きさ、形状は特に限定されるものではないが、培養容器の底面の少なくとも一部を覆うことが可能な大きさ及び形状を有する平板基板が好ましい。具体的には、平板基板下面と培養容器底面との間隙で細胞の培養を行う場合には、培養容器底面面積の好ましくは５０％以上、より好ましくは８０％以上の平面面積を有する平板基板を用いることが好ましい。
【００１８】
平板基板は、予め表面に親水化処理、細胞接着処理等が施されたものであってもよく、それら処理が施されていない未処理のものであってもよい。
【００１９】
平板基板として具体的には、培養容器として直径９０ｍｍの円形シャーレを用いる場合であれば、５０ｍｍ〜８５ｍｍの直径を有する円形平板基板、５０ｍｍ〜８５ｍｍ角の正方形平板基板、５０ｍｍ〜８５ｍｍの長さ及び幅を有する長方形平板基板等を用いることができる。
【００２０】
平板基板は、細胞播種前に培養容器内に配されていてもよく、細胞播種後に培養容器内に配されてもよい。
【００２１】
例えば液体培地を用いる場合であれば、培養容器内に平板基板と液体培地とを入れた後、平板基板の上方から神経系細胞を播種する方法が挙げられる。この場合、播種時においては、神経系細胞の大半は平板基板の上面に存在することとなるが、細胞運動や培養容器内の対流等の影響により、一部の神経系細胞が平板基板の下面側に移動し、平板基板下面と培養容器底面との間隙で培養されることとなる。
【００２２】
また例えば、液体培地を用いる場合であれば、培養容器内に播種された神経系細胞上に、培養容器の上方から平板基板を沈降させることによっても、培養容器内に平板基板を配することができる。沈降させる際は、培養容器内に播種された神経系細胞が底面から剥がれる、底面から浮き上がる等しないように、静かに平板基板を液体培地中の底面に静置することが好ましい。
【００２３】
平板基板は、培養容器内の底面と必ずしも接している必要はなく、底面から浮力により浮上した状態で液体培地中に配されていてもよく、上方から支持された状態で液体培地中に配されていてもよく、支持台等を設けることにより培養容器底面と一定の間隙をもって配されていてもよい。
また、平板基板は、培養容器内に配された時点において、神経系細胞と接している必要はない。
【００２４】
固体培地を用いる場合であれば、固体培地上に播種された神経細胞上に、直接、又は若干の間隙をもって平板基板を静置する。
【００２５】
本発明の培養方法によれば、平板基板と培養容器との間隙で神経系細胞の培養を行うことにより、細胞が凝集してしまい細胞形態の観察等が困難であると考えられていた神経系細胞において、特有の細胞形態を維持した状態で、簡便に長期培養を行うことができる。
【００２６】
上記のような効果が得られる理由は明らかではないが、平板基板が神経系細胞の伸展や形態形成の際の足場となり、神経系細胞の細胞形態が維持される；平板基板によって得られる間隙の大きさが、細胞が重層しない程度の間隙であり、かつ平板基板により加えられた圧力が細胞を破壊しない程度であることにより、２次元的に進展した細胞形態が維持される；神経系細胞と平板基板とが接している場合であれば、平板基板により神経系細胞に加えられた圧力が神経系細胞に何らかの影響を及ぼし、その結果として神経系細胞の細胞形態が維持される；液体培地の場合であれば、平板基板と培養容器底面との間で発生する微弱な対流が神経系細胞に何らかの影響を及ぼし、その結果として神経系細胞の細胞形態が維持される、等の理由が考えられ得る。
上述のように、平板基板による圧力が神経系細胞の形態に影響する可能性も考えられるが、その場合、平板基板により神経系細胞に加えられる圧は、２．０〜８．０Ｐａ程度が好ましく、２．５〜５Ｐａ程度がさらに好ましい。
【００２７】
神経系細胞の培養は、通常の方法で行うことができる。具体的には、２８℃〜４０℃（好ましくは３５〜３８℃）、飽和蒸気圧、１〜１０％（好ましくは５〜１０％）のＣＯ２濃度に設定したインキュベータ内で神経系細胞を培養する。なお、培養時において、培養容器内の全神経系細胞が平板基板と培養容器との間隙に存在する必要はなく、観察や実験等に必要な最低限の神経系細胞が間隙に存在していればよい。
【００２８】
本発明の培養方法によれば、長期培養後、例えば培養開始１〜２ヶ月後においても、神経系細胞に特有の細胞形態を維持させることが可能となる。長期培養時には、常法により培地交換、継代等を適宜行うことが好ましい。また、培地交換や継代の際は、可能な限り、平板基板を動かさないように行うことが好ましい。
【実施例】
【００２９】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３０】
[実施例１、比較例１]
ラット胎児大脳皮質より採取した１×１０７個／ｍＬのグリア細胞溶液１ｍＬを、平板基板として６０ｍｍ角、３ｍｍ厚の表面未処理アクリル板を配した９０ｍｍφのポリスチレン製培養シャーレ（細胞接着表面処理未処理、親水処理済）に播種した。培地はＤ−ＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ、５％  ＨＳ、５％  Ｇｌｕｔａｍａｘ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））６ｍＬ中を用いた。
その後、３７℃、５％ＣＯ２、飽和蒸気圧下で静置培養を行った。１週間後に観察したところ、平板基板とシャーレとの間隙に、複数種の特有の細胞形態のグリア細胞が観察された。培養開始１週間後から、週に１〜２回、培地の半量を交換し、培養を継続した。その結果、培養開始２ヶ月後においても、グリア細胞は様々な特有の細胞形態を維持した状態であった。
【００３１】
上記実施例１の方法により培養された培養開始７１日後のグリア細胞を用いて、免疫染色を行った。具体的には、４％パラホルムアルデヒド溶液を用いて細胞の固定処理を行った後、常法により免疫染色を行った。一次抗体には、抗ＧＦＡＰ抗体（ＢＩＯＳＳ社製）を用いた。ＧＦＡＰは、グリア細胞であるアストロサイトに特異的に存在するマーカータンパクである。併せて、ＤＡＰＩ染色を行った。
染色後のグリア細胞を２００倍の蛍光顕微鏡により観察した。異なる視野における顕微鏡写真を、図１のＡ〜Ｃに示す。
【００３２】
また、比較例１として、平板基板（アクリル板）を設置しなかった以外は、上記実施例１と同様にグリア細胞の培養を行った。その後、上記同様に培養開始７１日後に免疫染色を行ったグリア細胞の顕微鏡写真図（２００倍観察）を、図２に示す。
【００３３】
図１〜２に示す写真図では、抗ＧＦＡＰ抗体による細胞の染色が確認され、視野中の細胞がグリア細胞の一種であるアストロサイトであることが確認された。
本発明の培養方法を採用した図１では、特異的な細胞形態を示すグリア細胞が確認された。一方、平板基板を用いていない図２では、細胞が凝集してしまい、細胞形態が維持されていなかった。
【００３４】
また、図３〜６に、上記実施例１の方法により培養された培養開始３７日後のグリア細胞を、２００倍の光学顕微鏡で観察した結果を示す。
図７には、上記比較例１の方法における、培養開始３７日後のグリア細胞を、２００倍の光学顕微鏡で観察した結果を示す。
図３のＡ〜Ｂでは、細胞層の上に載った足を伸ばしているように見える細胞群が特徴的であり；図４〜５のＡ〜Ｂでは、網目状のネットワーク構造を形成する細胞が特徴的であり；図６のＡ〜Ｂでは、一定方向に伸展している細胞が特徴的であり（線維芽細胞ではない）った。
一方、平板基板を用いていない図７では、細胞が密集し、細胞形態が維持されていなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３５】
本発明によれば、神経系細胞において、特有の細胞形態を維持した状態で、簡便に長期培養を行うことができるため、医用工学、再生医療等の分野で広く利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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