(57)【要約】【課題】有核赤血球候補細胞を１つずつ確実に基板から取得できる有核赤血球候補細胞の取得方法、および、有核赤血球候補細胞塗抹基板を提供する。【解決手段】母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心分離により濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を調整する濃度調整工程と、濃度調整工程で調整された画分を第１の基板上に塗抹する塗抹工程と、第１の基板上に塗抹された画分から有核赤血球の候補細胞を識別する候補細胞識別工程と、有核赤血球の候補細胞を第１の基板上から取得する取得工程と、を有し、濃度調整工程は、血球濃度を画分１ｍＬあたり１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に調整する有核赤血球候補細胞の取得方法である。また、この方法により作製され、血球細胞の中心間の平均距離が３０μｍ以上１６０μｍ以下である有核赤血球候補細胞塗抹基板である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心分離により濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を調整する濃度調整工程と、
前記濃度調整工程で調整された前記画分を第１の基板上に塗抹する塗抹工程と、
前記第１の基板上に塗抹された前記画分から有核赤血球の候補細胞を識別する候補細胞識別工程と、
前記有核赤血球の候補細胞を前記第１の基板上から取得する取得工程と、を有し、
前記濃度調整工程は、血球濃度を前記画分１ｍＬあたり１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に調整する有核赤血球候補細胞の取得方法。
【請求項２】
前記塗抹工程において、前記第１の基板上に前記画分を塗抹する量は、前記第１の基板１枚に対して１．０μＬ以上４．０μＬ以下である請求項１に記載の有核赤血球候補細胞の取得方法。
【請求項３】
前記塗抹工程は、
前記第１の基板上に、前記画分を滴下する工程と、
前記第１の基板上の前記画分に、第２の基板を、前記第１の基板と前記第２の基板とのなす角度が１０°以上６０°以下であり、かつ、０．５Ｎ以上２．５Ｎ以下の力で接触させる工程と、
前記第２の基板を、前記第１の基板に接触させた状態で保持し、前記第１の基板と前記第２の基板との接触位置に前記画分を広げる工程と、
０．５ｍｍ／ｓｅｃ以上３００ｍｍ／ｓｅｃ以下の速度、前記第１の基板と前記第２の基板を接触させた時の角度および力で、前記第１の基板上で前記第２の基板を移動させることで、前記第１の基板上に前記画分を塗抹する工程と、からなる請求項１または２に記載の有核赤血球候補細胞の取得方法。
【請求項４】
前記濃度調整工程は、血球濃度を前記画分１ｍＬあたり２．０×１０７個以上５．０×１０７個以下に調整する請求項１から３のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の取得方法。
【請求項５】
前記候補細胞識別工程は、細胞の形状および光学特性の少なくともいずれか一方に基づいて識別する請求項１から４のいずれか１項に記載の有核赤血球候補細胞の取得方法。
【請求項６】
母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心分離により濃縮する濃縮工程と、
前記濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を、前記画分１ｍＬあたり１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に調整する濃度調整工程と、
前記濃度調整工程で調整された前記画分を第１の基板上に塗抹する塗抹工程と、
前記第１の基板上に塗抹された前記画分から有核赤血球の候補細胞を識別する候補細胞識別工程と、からなる有核赤血球の候補細胞を塗抹した有核赤血球候補細胞塗抹基板であって、
前記第１の基板上に塗抹された前記画分に含まれる血球細胞の中心間の平均距離が３０μｍ以上１６０μｍ以下である有核赤血球候補細胞塗抹基板。
【請求項７】
前記塗抹工程において、前記第１の基板上に前記画分を塗抹する量は、前記第１の基板１枚に対して１．０μＬ以上４．０μＬ以下である請求項６に記載の有核赤血球候補細胞塗抹基板。
【請求項８】
前記塗抹工程は、
前記第１の基板上に、前記画分を滴下する工程と、
前記第１の基板上の前記画分に、第２の基板を、前記第１の基板と前記第２の基板とのなす角度が１０°以上６０°以下であり、かつ、０．５Ｎ以上２．５Ｎ以下の力で接触させる工程と、
前記第２の基板を、前記第１の基板に接触させた状態で保持し、前記第１の基板と前記第２の基板との接触位置に前記画分を広げる工程と、
０．５ｍｍ／ｓｅｃ以上３００ｍｍ／ｓｅｃ以下の速度、前記第１の基板と前記第２の基板を接触させた時の角度および力で、前記第１の基板上で前記第２の基板を移動させることで、前記第１の基板上に前記画分を塗抹する工程と、からなる請求項６または７に記載の有核赤血球候補細胞塗抹基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有核赤血球候補細胞の取得方法、および、有核赤血球候補細胞塗抹基板に係り、特に、妊娠母体血中の有核赤血球を検査するための有核赤血球候補細胞の取得方法、および、有核赤血球候補細胞塗抹基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
出生前診断として、従来より、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われている。しかしながら、この方法では、流産の可能性のあることが問題として指摘されている。
【０００３】
一方、妊娠母体（以下、単に「母体」ともいう）の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが最近わかってきた。そこで、母体血を用いて、母体血中の胎児細胞の染色体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸：deoxyribonucleic acid）を再現性よく確実に分析することができれば、流産の可能性のない安全な出生前診断を実現することができることとなる。
【０００４】
しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞（有核赤血球）は、母体血数ｍＬ中に１個程度しか存在しない。このように非常に少ない胎児細胞（有核赤血球）を確実に取得することが、母体血を利用した出生前診断を行う上で非常に大きな課題である。また、妊娠した母体血の中には、母体由来の有核赤血球も存在することが知られており、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を分離することも、安全な出生前診断を実現する上で解決すべき課題である。
【０００５】
母体血中から胎児細胞である有核赤血球を取得する方法として、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術がある。また、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術（MACS法：Magnetic activated cell sorting）、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児の有核赤血球を分離する技術（FACS法：Fluorescence activated cell sorting）などを用いて、母体血中の胎児細胞である有核赤血球を取得することが行われている。
【０００６】
これらの方法は、血液中の胎児由来の有核赤血球の濃度を増加させ、目的の細胞を取得する確率を高めるのに有用な技術である。しかしながら、胎児由来の有核赤血球の周りには、依然として母体由来の血液細胞が存在するため、確実に短時間で胎児由来の有核赤血球を取得できていなかった。
【０００７】
また、光学的な情報を用いて、細胞の種類を識別し、求める細胞を取得する技術が開示されている。例えば、下記の特許文献１には、細胞核および細胞質を染色して透過可視光の吸収画像を生成し、励起光を照射して核の蛍光画像を形成した後、細胞質と核のコントラスト画像を用いて有核赤血球を判別することが記載されている。特許文献２には、ヘモグロビンの最大吸収波長付近の４１５ｎｍの波長の光を利用して、血球種類を識別する装置が記載されている。
【０００８】
一方、基板上に血液を塗抹する技術について、特許文献３には、基板上の塗抹標本の厚みを均一にし、細胞の分布を均一にするために２つの基板のなす角度と相対移動速度を調節する方法が記載されている。特許文献４には、血液分析装置を用いて検体ごとに粘度などの特性を測定し、試料の滴下量や引きガラスの角度、引き速度を調整することで、良好な塗末標本を作製する方法が記載されている。また、特許文献５には、検体の特性により、塗抹条件を自由に設定することができるコンピューターが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５１４３０４号公報
【特許文献２】特開昭５８−１１５３４６号公報
【特許文献３】特開昭６１−４５７６９号公報
【特許文献４】特開平３−９４１５９号公報
【特許文献５】特開２００６−７８２３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
出生前診断では、母体血中に存在する胎児由来の有核細胞を特定し、この細胞からＤＮＡを抽出して染色体情報から胎児の異常がないかを確認する。したがって、確実に１つの胎児由来の細胞を選択し、遺伝子解析を行う必要がある。特許文献３から５には、細胞の観察による分析に関する記載はあるが、１つの細胞を回収して、分析を行うための条件については検討されていなかった。細胞の塗抹状態が安定せず、細胞の凝集などが見られると、塗抹標本上での細胞の識別を正確に行うことができず、また、識別できたとしても細胞１つずつを選択的に取得できない場合があった。
【００１１】
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、出生前診断を行うにあたり、胎児の遺伝子を確実に抽出して遺伝子解析を実施するために、有核赤血球を選別するための最適な標本を作製し、有核赤血球候補を１つずつ確実に基板から取得することができる有核赤血球候補細胞の取得方法、および、有核赤血球候補細胞塗抹基板を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は上記目的を達成するために、母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心分離により濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を調整する濃度調整工程と、濃度調整工程で調整された画分を第１の基板上に塗抹する塗抹工程と、第１の基板上に塗抹された画分から有核赤血球の候補細胞を識別する候補細胞識別工程と、有核赤血球の候補細胞を第１の基板上から取得する取得工程と、を有し、濃度調整工程は、血球濃度を画分１ｍＬあたり１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に調整する有核赤血球候補細胞の取得方法を提供する。
【００１３】
本発明の有核赤血球候補細胞の取得方法によれば、濃縮工程により濃縮された母体血の画分の血球濃度を１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に調整することで、第１の基板上に塗抹される血球濃度を均一にすることができる。第１の基板上に塗抹される画分の血球濃度を上記範囲で均一にすることで、第１の基板上での血球細胞同士の凝集を防ぐことができるので、目的の細胞の識別を行うことができ、取得工程において、目的の細胞を確実に取得することができる。なお、本発明において、「画分」とは、密度勾配遠心分離により複数の層に分けられた液層のことであり、特に有核赤血球を含む層のことをいう。
【００１４】
本発明の別の態様においては、塗抹工程において、第１の基板上に画分を塗抹する量は、第１の基板１枚に対して１．０μＬ以上４．０μＬ以下であることが好ましい。
【００１５】
この態様によれば、第１の基板上に塗抹する画分の量を、第１の基板１枚に対して、１．０μＬ以上４．０μＬ以下とすることで、第１の基板上に均一に、血球成分を塗抹することができる。
【００１６】
本発明の別の態様においては、塗抹工程は、第１の基板上に、画分を滴下する工程と、第１の基板上の画分に、第２の基板を、第１の基板と第２の基板とのなす角度が１０°以上６０°以下であり、かつ、０．５Ｎ以上２．５Ｎ以下の力で接触させる工程と、第２の基板を、第１の基板に接触させた状態で保持し、第１の基板と第２の基板との接触位置に画分を広げる工程と、０．５ｍｍ／ｓｅｃ以上３００ｍｍ／ｓｅｃ以下の速度、第１の基板と第２の基板を接触させた時の角度および力で、第１の基板上で第２の基板を移動させることで、第１の基板上に画分を塗抹する工程と、からなることが好ましい。
【００１７】
この態様によれば、塗抹工程における第１の基板と第２の基板とを接触させる際の力、角度、および、第１の基板上を第２の基板を移動させる速度を、上記の範囲内とすることで、第１の基板上に均一に血球成分を塗抹することがき、血球細胞の凝集を防止することができる。また、細胞の形状を崩すことなく塗抹を行うことができるので、血球細胞の解析の精度を向上させることができる。したがって、細胞１つずつを確実に識別することができ、目的の細胞を確実に取得することができる。
【００１８】
本発明の別の態様において、濃度調整工程は、血球濃度を画分１ｍＬあたり２．０×１０７個以上５．０×１０７個以下に調整することが好ましい。
【００１９】
この態様は、濃度調整工程における好ましい濃度範囲をさらに規定したものであり、上記範囲とすることで、血球細胞の凝集を抑え、第１の基板上に存在する血球の数も所望の数とすることができる。したがって、有核赤血球の探索を効率良く行うことができ、かつ、細胞の識別、取得を１つずつ確実に行うことができる。
【００２０】
本発明の別の態様においては、候補細胞識別工程は、細胞の形状および光学特性の少なくともいずれか一方に基づいて識別することが好ましい。
【００２１】
この態様は、候補細胞識別工程の識別の方法を限定したものであり、細胞の形状および光学特性の少なくともいずれか一方に基づいて識別を行うことにより、細胞の形状で有核赤血球を、光学特性で赤血球と白血球、または、有核赤血球を母体由来または胎児由来とに、識別することができる。
【００２２】
本発明は上記目的を達成するために、母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心分離により濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を、画分１ｍＬあたり１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に調整する濃度調整工程と、濃度調整工程で調整された画分を第１の基板上に塗抹する塗抹工程と、第１の基板上に塗抹された画分から有核赤血球の候補細胞を識別する候補細胞識別工程と、からなる有核赤血球の候補細胞を塗抹した有核赤血球候補細胞塗抹基板であって、第１の基板上に塗抹された画分に含まれる血球細胞の中心間の平均距離が３０μｍ以上１６０μｍ以下である有核赤血球候補細胞塗抹基板を提供する。
【００２３】
本発明の有核赤血球候補細胞塗抹基板によれば、濃縮工程で濃縮した有核赤血球を含む画分を１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に濃度調整を行い、塗抹基板を作製することで、第１の基板上に塗抹された画分に含まれる血球細胞の中心間の平均距離を３０μｍ以上１６０μｍ以下の距離とすることができる。したがって、細胞１つずつを確実に識別し、有核赤血球候補細胞を確実に取得することができる。なお、「血球細胞の中心の平均距離」とは、塗抹基板に塗抹された細胞の外周を円形近似、または、楕円近似し、その中心間の距離のことをいう。
【００２４】
本発明の別の態様において、塗抹工程において、第１の基板上に画分を塗抹する量は、第１の基板１枚に対して１．０μＬ以上４．０μＬ以下であることが好ましい。
【００２５】
この態様によれば、第１の基板上に塗抹する画分の量を、第１の基板１枚に対して、１．０μＬ以上４．０μＬ以下とすることで、第１の基板上に均一に、血球成分を塗抹することができる。
【００２６】
本発明の別の態様においては、塗抹工程は、第１の基板上に、画分を滴下する工程と、第１の基板上の画分に、第２の基板を、第１の基板と第２の基板とのなす角度が１０°以上６０°以下であり、かつ、０．５Ｎ以上２．５Ｎ以下の力で接触させる工程と、第２の基板を、第１の基板に接触させた状態で保持し、第１の基板と第２の基板との接触位置に画分を広げる工程と、０．５ｍｍ／ｓｅｃ以上３００ｍｍ／ｓｅｃ以下の速度、第１の基板と第２の基板を接触させた時の角度および力で、第１の基板上で第２の基板を移動させることで、第１の基板上に画分を塗抹する工程と、からなることが好ましい。
【００２７】
この態様によれば、塗抹工程における第１の基板と第２の基板とを接触させる際の力、角度、および、第１の基板上を第２の基板を移動させる速度を、上記の範囲内とすることで、第１の基板上に均一に血球成分を塗抹することがき、血球細胞の凝集を防止することができる。また、細胞の形状を崩すことなく塗抹を行うことができるので、血球細胞の解析の精度を向上させることができる。したがって、細胞１つずつを確実に識別することができ、目的の細胞を確実に取得することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の有核赤血球候補細胞の取得方法、および、有核赤血球候補細胞塗抹基板によれば、基板上に塗抹する前の有核赤血球候補細胞を含む画分の血球濃度を規定することで、有核赤血球を識別するための最適な標本を作製することができ、有核赤血球候補細胞を１つずつ、確実に解析を行い、取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】有核赤血球候補細胞の取得方法の手順を示したフローチャート図である。
【図２】塗抹工程を説明する図である。
【図３】細胞の形状（核の形状）により選別を行う手順を示したフローチャート図である。
【図４】選択したい細胞の形状を示す模式図（ａ）、および、除きたい細胞の形状を示す模式図（ｂ）である。
【図５】還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、添付図面に従って、本発明に係る有核赤血球候補細胞の取得方法、および、有核赤血球候補細胞塗抹基板について説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
【００３１】
図１は、有核赤血球候補細胞の取得方法の手順を示したフローチャート図である。胎児由来の有核赤血球候補細胞の取得方法は、妊娠母体からの母体血を採取する採取工程（ステップＳ１２）と、母体血中の有核赤血球を密度勾配遠心分離により濃縮する濃縮工程（ステップＳ１４）と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を調整する濃度調整工程（ステップＳ１６）と、濃度が調整された有核赤血球を含む母体血の画分を第１の基板上に塗抹する塗抹工程（ステップＳ１８）と、基板上に塗抹された画分から、画像情報（細胞の形状）、光学的情報（光学特性）により、有核赤血球候補細胞を識別する候補細胞識別工程（ステップＳ２０）と、候補細胞識別工程により識別された有核赤血球候補細胞を第１の基板上から選択的に取得する取得工程（ステップＳ２２）と、を有する。本発明の有核赤血球候補細胞の取得方法は、濃縮工程（ステップＳ１４）から取得工程（ステップＳ２２）までの工程である。
【００３２】
＜採取工程（ステップＳ１２）＞
採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。
【００３３】
母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断を行う本実施形態においては、妊娠後６週程度以降の母体の末梢血を検査する。
【００３４】
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、母体の末梢血中には非常に存在確率が少ない。
【００３５】
＜濃縮工程（ステップＳ１４）＞
次に、密度勾配遠心分離による濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行う。
【００３６】
〔密度勾配遠心分離法〕
密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差により分離する方法であり、分離する成分の密度値を挟むように、第１の媒体および第２の媒体を選択することで、遠心分離後の第１の媒体と第２の媒体の間の界面に目的の成分（本実施形態においては、胎児由来の有核赤血球）を集めることができる。そして、この第１の媒体と第２の媒体の間の界面に存在する画分を採取することで、有核赤血球が濃縮された血液を得ることができる。
【００３７】
国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が、１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が、１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が、１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。
【００３８】
積層する媒体（第１の媒体および第２の媒体）の密度は、密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することで、血漿成分、および好酸球、単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第１の媒体と、第２の媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
【００３９】
本実施形態では、密度勾配遠心分離用の密度の異なる第１の媒体および第２の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるＦｉｃｏｌｌ（登録商標）−Ｐａｑｕｅ、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）等の媒体を使用することができる。本実施形態では、Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）、およびＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）を使用することが好ましい。Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）は、密度（比重）１．１３０の製品が市販されており、希釈することで目的とする密度（比重）の媒体を調製することが可能である。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）は、市販されている密度１．０７７の媒体と、密度１．１１９の媒体を用いて、第１の媒体および第２の媒体を所望の密度に調製することが可能である。
【００４０】
＜濃度調整工程（ステップＳ１６）＞
濃度調整工程は、濃縮工程により得られた有核赤血球が濃縮された母体血の画分の血球濃度を調整する工程である。
【００４１】
密度勾配遠心分離による濃縮工程により、密度の異なる媒体の界面に集まる有核赤血球候補細胞を取得することができる。濃縮工程により得られる母体血の所望の画分は、血球が主な構成になるが、母体の個人差による粘度などの違い、サンプリングを行う密度媒体の界面の乱れ、作業環境の温度の違いなどにより媒体の粘度が異なる関係で、得られた画分の血球濃度を作業ごとに一定に制御することは非常に難しい。そのため、そのまま基板上に塗抹した場合、細胞の基板上の数が変化し、細胞が重なったり、あるいは、非常に細胞の間隔が大きくなったりし、その後の解析、細胞の取得に支障が出る場合が多くなる。したがって、部屋の温度、患者が異なる場合などの条件においても、血球細胞を均一に塗抹するために、濃縮工程後にサンプリングした血球細胞を含有する母体血の画分の溶液の血球濃度を調整する。母体血の画分の溶液の血球濃度を調整することにより、基板上に塗抹される細胞の画分中の密度を一定に保ち、作製される基板上の血球細胞同士の凝集を防ぎ、均一な基板の作製、確実な解析を実現することができる。また、解析を確実に行うことにより、胎児由来の有核赤血球候補となる細胞を識別することができ、確実に１つずつ基板上から胎児由来の有核赤血球候補となる細胞を取得することができる。
【００４２】
血球濃度の調整は、まず、濃縮工程により赤血球と有核赤血球を分離したサンプルの血球濃度をセルカウンターで測定し、血球濃度が目的の範囲となるように、希釈倍率を算出する。この算出した希釈倍率に基づいて、希釈液を用いて血球濃度の調整を行う。
【００４３】
濃度調整工程により、調整される血球濃度の範囲としては、血球濃度を１ｍＬあたり１．０×１０７個以上８．０×１０７個以下に調整することが好ましく、１ｍＬあたり１．５×１０７個以上５．５×１０７個以下に調整することがより好ましく、１ｍＬあたり２．０×１０７個以上５．０×１０７個以下に調整することが更に好ましい。この範囲に血球濃度を調整することによって、基板上の細胞の平均距離が３０μｍ以上１６０μｍ以下であり、凝集する細胞が少ない基板を実現することが可能となる。したがって、有核赤血球候補の細胞を１つ１つ別々に基板上より取得することが可能となる。
【００４４】
血球濃度を測定する方法として、例えば、バイオラッド社の全自動セルカウンターＴＣ２０を使用することにより測定することができる。母体血の採取後、濃縮した有核赤血球候補が含まれる血液試料をピペットで１０μＬ取得して全自動セルカウンターＴＣ２０専用の測定基板に封入する。この専用基板をＴＣ２０に挿入すると、自動的に血球濃度が測定される。この値を基にして、血球濃度が目的の範囲となるように希釈倍率を算出し、算出した希釈倍率に基づいて、希釈液を用いて血球濃度の調整を行う。
【００４５】
基板上に塗抹する血球を含む溶液の血球濃度の調整に用いる希釈液としては、リン酸緩衝液（ＰＢＳ：Phosphate buffered saline）を使用することが好ましい。
【００４６】
＜塗抹工程（ステップＳ１８）＞
次に、濃度調整工程で濃度が調整された母体血の画分を第１の基板上に塗抹する。塗抹工程としては、引きガラス法（ウエッジ法）、クラッシュ法（押し潰し法）、手伸ばし法、スピン法などにより行うことができ、特に引きガラス法で行うことが好ましい。図２は、引きガラス法により塗抹を行う塗抹工程を説明する図である。塗抹工程は、濃度が調整された母体血の画分１６を滴下手段１４を用いて第１の基板１２上に滴下する工程（図２（ａ））、第１の基板１２上の画分１６に第２の基板１８を接触させる工程（図２（ｂ））、第１の基板１２と第２の基板１８との接触位置に滴下した画分１６を広げる工程（図２（ｃ））、第２の基板１８を所定の速度で第１の基板１２上を移動させることで、第１の基板１２上に画分１６を塗抹する工程（図２（ｄ））を有する。
【００４７】
〔滴下する工程（図２（ａ））〕
まず、濃度調整工程で濃度が調整された画分１６を、滴下手段１４を用いて第１の基板１２の端に滴下する。第１の基板１２としては、透明な基板が好ましく、具体的にはスライドガラスが好ましい。滴下する量は、１枚の第１の基板に対して、１．０μＬ以上４．０μＬ以下が好ましく、更には、１．５μＬ以上２．５μＬ以下がより好ましい。塗抹液として使用する画分（血液）の量が、１．０μＬ以上であると、量が適度に存在するため、後の工程の画分１６に第２の基板１８を接触させ、画分１６を毛細管現象で広げる際に、十分に画分１６が広がり、塗抹を均一に行うことが可能となる。１．０μＬ未満であると、量が少ないため、塗抹領域が第１の基板１２の一部に限られてしまい、第１の基板１２を効率的に使用することができなくなり、検査すべき塗抹基板が増加して、検査に非常に時間がかかる場合があるが、１．０μＬ以上であると、そのような場合は生じない。また、４．０μＬ以下であると、画分の液量を適度の量とすることができ、塗抹工程終了時に、第１の基板１２上に濡れ残った液が存在することなく、塗抹領域の後半部分（第２基板を移動させる方向）に血球成分が均一な塗抹基板が形成される。塗抹領域の後半部分に目的とする有核赤血球が存在する場合にも、細胞の識別、取得を容易に行うことが可能となる。
【００４８】
〔接触させる工程（図２（ｂ））〕
次に、第１の基板１２上の画分１６に第２の基板１８を接触させる。第２の基板１８を接触させる位置は、図２（ｂ）に示すように、第１の基板１２上に滴下された画分１６を広げる方向の端部に接触させる。第２の基板１８としては、第１の基板１６と同様に、透明な基板が好ましく、具体的にはスライドガラスが好ましい。
【００４９】
第２の基板１８は、第１の基板１６に対して、１０°以上６０°以下の角度θをつけて第２の基板１８の先端を接触させることが好ましい。より好ましくは、２５°以上４０°以下である。また、第２の基板１８を第１の基板１６に接触させる力は、０．５Ｎ以上２．５Ｎ以下が好ましく、より好ましくは、１．５Ｎ以上２．０Ｎ以下である。第１の基板１２と第２の基板１８を接触させる際の角度、力を上記範囲とすることで、血球成分を均一に塗抹することができる。また、細胞の形状も維持することができるので、細胞の画像解析の精度を向上させることができ、細胞の取得を行うことができる。
【００５０】
〔広げる工程（図２（ｃ））〕
第２の基板１８を第１の基板１２に接触させた後、その状態で第２の基板１８を保持し、第２の基板１８と第１の基板１２とが接触した接触位置で、第１の基板１２と第２の基板１８とで囲まれた空間に母体血の画分１６を広げる。母体血の画分１６は、押し付けた接触位置（図２において紙面を貫く方向）に沿って広がり、広がる力として毛細管現象を利用することが好ましい。滴下した画分１６を十分に第１の基板１２と第２の基板１８との間に広げるため、２秒から５秒、第２の基板１８を第１の基板１２に接触した状態を維持することが好ましい。
【００５１】
〔塗抹する工程（図２（ｄ））〕
画分１６を第２の基板１８と第１の基板１６との間に広げた後、第２の基板１８を一定の速度で第１の基板１２上を移動させることで、第１の基板１２上に画分１６を広げ、血球を塗抹する。第２の基板１８と第１の基板１２の間に十分に濡れ広がった画分１６を一定速度で移動させることで、第１の基板１２上に血球濃度を調整した母体血の画分１６を均一に塗抹することができる。第２の基板１８の移動速度は、一定速度で移動させることが好ましく、速度の値は、０．５ｍｍ／ｓｅｃ以上３００ｍｍ／ｓｅｃ以下が好ましく、より好ましくは５０ｍｍ／ｓｅｃ以上２５０ｍｍ／ｓｅｃ以下であり、更に好ましくは１００ｍｍ／ｓｅｃ以上２００ｍｍ／ｓｅｃ以下である。
【００５２】
このように作製した基板（図２（ｅ））上では、母体血の画分１６に含まれる血球細胞の中心間の平均距離を３０μｍ以上１６０μｍ以下とすることができる。血球細胞の大きさは、平均して１０数μｍ程度であるため、第１の基板１２上から１つの細胞として取得するために、細胞同士が重なることを避ける必要があり、細胞間の間隔が３０μｍ以上有することが好ましい。さらに、血球細胞の中心間の平均距離が４０μｍ以上１２０μｍ以下であることが好ましい。血球細胞の中心間の平均距離を上記範囲とした塗抹基板を用いることにより、１つ１つの細胞に対して、確実に解析を行うことが可能となり、後述するように、１つの細胞として、確実に有核赤血球の候補細胞を取得することができる。
【００５３】
＜候補細胞識別工程（ステップＳ２０）＞
次に、第１の基板１６上に塗抹した母体血の血球細胞に対して、解析を実施して、有核赤血球候補細胞を識別する。候補細胞識別工程により、有核赤血球候補細胞が第１の基板上に存在することを確認することで、有核赤血球候補細胞が塗抹された有核赤血球候補細胞塗抹基板を作製することができる。
【００５４】
本発明において、好ましい解析法としては、細胞の形態、細胞核の形態から、有核赤血球を解析する方法や、３８０ｎｍ〜４２０ｎｍの波長域に大きな吸収を持つ赤血球の細胞質に存在するヘモグロビンの情報から、白血球と赤血球を分離する方法や、胎児特有のグロビンの光学情報を利用した分離方法、胎児グロビンに特異的に相互作用する抗胎児ヘモグロビン抗体を標識化して分離する方法などを用いた解析を行うことが好ましい。
【００５５】
以下に、解析法の一態様として、画像解析により、有核赤血球候補を識別する方法について説明する。本態様においては、細胞の形状による情報で選別した後、光学特性により選別することで、有核赤血球候補細胞を選別する。
【００５６】
（細胞の形状の情報による選別）
細胞の形状による選別としては、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合い、核領域の面積、核の明度、核のつぶれ方、などを挙げることができる。なかでも、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、および、核の円形度合いを満たす条件を有する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。細胞質の面積、及び核領域の面積は、分析用の標本の観察される面における面積である。
【００５７】
図３は、有核赤血球選別工程における細胞の形状（核の形状）により選別を行う工程の一例の手順を示したフローチャート図である。
【００５８】
細胞の形状による選別は、まず、細胞を抽出する（ステップＳ３２）。細胞であるか否かの判断は、２値化画像を用いて行われる。白色光光源を用いて分析用の標本を撮影して得られた画像の輝度情報を所定の閾値を用いて２値化画像を生成し、生成された２値化画像から点状および島状の連続領域を有するもの、すなわち、任意の閉曲線で閉じられている領域を細胞として抽出する。なお、２値化した画像は、Ｅｒｏｓｉｏｎ・Ｄｉｌａｔｉｏｎなどのモルフォロジー処理を施して、連続領域の形状を整えた上で、大きさを求めてもよい。
【００５９】
次に、ステップＳ３２で抽出した細胞を核の有無により選別する（ステップＳ３４）。核の有無は、細胞内に核（点状物）が存在するかにより選別する。核の有無の判断にも２値化画像を用いることができる。細胞として抽出された領域の中に、細胞として抽出された領域未満の面積を有する任意の閉曲線で閉じられている領域が存在する場合には、当該領域を核として抽出することができる。
【００６０】
次に、細胞の核の大きさ（点状および島状の連続領域の大きさ）が、１〜５μｍのものを抽出する（ステップＳ３６）。１〜５μｍの大きさの核を有する細胞を選択することは有核赤血球を選別するのに有効である。なお、「点状および島状の連続領域の大きさ」とは、核の外形を表す閉曲線を円形、又は楕円形に近似し、核の外形を近似した円形の直径、又は細胞の外形を近似した楕円形の長径とすることができる。
【００６１】
核の外形を近似した円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する円形のうち直径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した楕円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する楕円形のうち長径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した円形の直径、または、核の外形を近似した楕円形の長径が１〜５μｍのものを抽出する。
【００６２】
次に、核の形状により細胞を選別する（ステップＳ３８）。図４（ａ）は、選択したい細胞の形状を示す模式図であり、図４（ｂ）は除きたい細胞の形状を示す模式図である。核の形状による選別の具体例として、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合により選別を行う方法、および、核の円形度合いにより選別を行う方法を説明する。細胞質の面積に対する核領域の面積の割合が、下記（１）式を満たす場合に、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。細胞の細胞質の面積をＣ、細胞の核の面積をＮとした場合、Ｃに対するＮの割合が０．２５を超え１．０未満の核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。
０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０      （１）
【００６３】
また、核の円形度合いの選択条件を満たす場合としては、下記（２）式を満たす場合が挙げられる。核の直径又は核の長径をＬとしたとき、核の直径又は核の長径の平方に対する核の面積の割合が０．６５を超え０．７８５未満である核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。なお、核の直径又は核の長径としては、ステップＳ４４で核の大きさを求めた場合と同様の方法により求めることができる。
０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５      （２）
【００６４】
細胞の形状の情報を用いて胎児由来の有核赤血球の候補なる有核赤血球を選別するシステムの構成例としては、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理ＰＣ（ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、制御ＰＣ、ディスプレイを装備しているシステムを挙げることができる。光学搬送系は、対物レンズとＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）カメラを備え、画像処理ＰＣは、データ解析、データ記憶を行う処理系を備える構成が挙げられる。制御ＰＣは、スライドガラス用のステージの位置制御や、全体の処理を制御する制御系を備える構成が挙げられる。
【００６５】
（光学特性による選別）
光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用することができる。図５は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である（特開２０１４−１４８５号公報に記載）。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図５に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
【００６６】
光学特性による選別においては、胎児由来の有核赤血球が、母親の赤血球、および、わずかに存在する母体由来の有核赤血球に対して、ヘモグロビンの酸素親和性が異なることを利用して母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球と、を選別することができる。例えば、ガラス基板上に塗布された血液成分を用いることにより、有核赤血球と、この有核赤血球の近傍に存在する赤血球との分光特性の差異を利用して、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別するものである。
【００６７】
分光特性とは、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンとの吸収係数の差異の存在する波長域で差を検出するものである。成人の赤血球中のヘモグロビンは、４量体α２β２（ＨｂＡ）である。一方、胎児の赤血球中のヘモグロビンは、２本のα鎖と２本のγ鎖によって作られた４量体α２γ２（ＨｂＦ）であり、生後、大部分を占めるＨｂＡと少数のＨｂＦからなるＨｂＡ２に置き換わっていくことが知られている。胎盤中では、血液中の妊娠母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）から酸素の提供を受けることで、胎児のヘモグロビンは酸素を得ている。そして、成人の血液中の赤血球に含まれるヘモグロビン（ＨｂＡ）は、４量体α２β２であるが、胎児型のヘモグロビン（ＨｂＦ）はα２γ２であり、ＨｂＡに比べて酸素親和性が高いという特徴を有する。出生前診断においては、血液試料として妊娠母体の末梢血を採取し、検査を行うことが好ましい。末梢血は、通常、静脈から採取するものであり、静脈中の血液の酸素の量は、動脈中の酸素の量より乏しくなる。健常人では、中心静脈血の酸素飽和度は、６０〜８０％が正常値といわれており、この値は、全身の酸素需要により上下する。ＨｂＡとＨｂＦは、酸素親和性が異なるため、静脈血中においても、ＨｂＡとＨｂＦの酸素結合量が異なり、ＨｂＦの酸素結合量がＨｂＡの酸素結合量よりも高くなるという特徴を有している。
【００６８】
母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）と胎児のヘモグロビン（ＨｂＦ）においても、静脈中で酸素親和性に差があり、図５に示すように、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンは、吸収係数に差が生じるので、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球の吸光度の差を用いて選別する。吸光度の測定には、４００〜６５０ｎｍの光波長域が適用される。この光波長域から選択される波長を有する少なくとも１つの単色光を用いて吸光度が測定される。 
【００６９】
また、吸光度の測定は、異なる波長の複数単色光を用いて、各波長の吸光度を測定し、各波長の測定値の割合を検出することでより確実に有核赤血球の選別を行うことができる。好ましくは、４００〜５００ｎｍの光波長域から選択された波長の単色光を用いる態様であり、より好ましくは４５０ｎｍを超え４８０ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。また、光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。２種類以上の異なる単色光により測定した吸光度の割合を導出することで、個々の細胞間に、細胞の厚みや面積などの細胞間に起因する吸光度の誤差を排除することができる。これらの光波長域は、図５に示すように、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）と還元ヘモグロビン（Ｈｂ）とで、吸収係数の差が大きいので、この光波長域を用いることで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球のとの選別を確実に行うことができる。
【００７０】
また、光学特性により選別する光波長域は、図５に示すグラフの吸収係数が還元ヘモグロビンの吸収係数と酸化ヘモグロビンの吸収係数の大きさが逆転する波長を挟んでそれぞれの光波長域の波長で測定することが好ましい。すなわち、胎児由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が高い）の吸収係数が、母体由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が低い）の吸収係数より高い第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸収係数が胎児由来の有核赤血球の吸収係数より高い第２の光波長域の波長と、で吸光度を測定する。そして、第１の光波長域の波長で測定した吸光度と、第２の光波長域の波長で測定した吸光度の割合を求め、比較することで、胎児由来の有核赤血球の割合と母体由来の有核赤血球の割合の差を大きくすることができるので、胎児由来の有核赤血球の選別を確実に行うことができる。
【００７１】
第１の光波長域としては、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。また、第２の光波長域としては、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。
【００７２】
また、各光波長域で、複数の波長で吸光度を測定し、それら吸光度の平均値を用いて選別を行うこともできる。吸光度の平均値により選別することで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
【００７３】
分光特性により、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とを選別する方法として、選別対象の有核赤血球の周囲に存在する核を有さない赤血球を参照赤血球とし、この参照赤血球と比較することで、選別対象の有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球かを選別する。参照赤血球を、選別対象の有核赤血球と同じ波長の単色光で吸光度を測定し、その割合を求め、選別する有核赤血球の吸光度の割合と、参照赤血球の吸光度の割合を比較することで、より確実に選別対象の有核赤血球の中から胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
【００７４】
＜取得工程（ステップＳ２２）＞
図１に戻って、取得工程は、候補細胞識別工程で胎児由来の有核赤血球候補細胞、および、母体由来の有核赤血球として識別した有核赤血球候補細胞を、第１の基板上から選択的に１つずつ取得する工程である。細胞の取得には、レーザーマイクロダイセクション装置や、マイクロマニュピュレータを使用することができる。
【００７５】
（レーザーマイクロダイセクション）
レーザーマイクロダイセクションとは、例えば市販されているZeiss社のPALM Micro Beamなどの顕微鏡とレーザーを組み合わせて微小領域の切断、加工を行うことができる装置システムのことである。レーザーダイセクションでは、基板（スライドガラス、もしくはガラス上にポリマーコートを付与したスライドガラスでもかまわない）に塗沫されたサンプルの目的の部位のみを選択的にレーザーで切り取り採取することができる装置である。このため、基板に均一に細胞もしくは組織が塗布されていることが好ましい。これにより、目的の単一細胞のみを取得することが可能となる。
【００７６】
有核赤血球候補細胞を基板上から取得する取得工程では、分光特性により分別した基板上の細胞の位置情報をあらかじめ取得しておき、レーザーマイクロダイセクション装置へその位置情報を入力する。レーザーマイクロダイセクション装置に基板をセットすると、装置は位置情報を基に目的の位置に自動的に移動し、あらかじめ登録しておいたレーザー出力条件によって目的の細胞のみをレーザーで取得し、専用の回収チューブに細胞を分取する。
【００７７】
（マイクロマニピュレータ）
マイクロマニピュレータは，顕微鏡下で細胞をハンドリングすることが可能な装置である。例えば、市販の顕微鏡システムにアドオンできる形でナリシゲ社のマイクロインジェクションシステムやマイクロマニピュレータシステムなどを使用する。顕微鏡下で目的の細胞を塗沫したサンプル基板から、任意の単一細胞を取得することが可能である。
【００７８】
有核赤血球候補細胞を基板上から取得する取得工程では、上記レーザーマイクロダイセクションと同様に分光特性により分別した基板上の細胞の位置情報をあらかじめ取得しておき、マイクロマニピュレータシステムに位置座標を入力する。マイクロマニピュレータシステムにセットした基板は位置情報を基に目的の細胞の取得位置まで移動する。その後マニピュレータを動作させ、目的の細胞のみを取得し、細胞回収液を入れたチューブに封入する。チューブに封入した細胞のＤＮＡを解析する場合には、細胞回収液は、ＤＮＡフリーである細胞回収液であることが好ましい。
【実施例】
【００７９】
＜実施例１＞
以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【００８０】
（採取工程）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸：ethylenediaminetetraacetic acid）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、母体のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
【００８１】
（濃縮工程）
Ｐｅｒｃｏｌｌ液（登録商標）を使用して、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５ｇ／ｍＬの液１．６ｍｌを添加した。添加後、４℃下に３０分間置き、冷却した。その後、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０ｇ／ｍＬの液２ｍＬを重層し、その後、密度１．０７０ｇ／ｍＬの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍ（回転数毎分）で２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９０ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分を、ピペットを用いて採取した。同様の操作の濃縮工程を、同じ母体から採取した血液に対して行い、ピペットで採取した血液の画分を複数種類準備した。それぞれの血液の画分は全て同じ操作で行ったものである。
【００８２】
（濃度調整工程）
上記濃縮工程で採取した血液の画分を生理食塩水で洗浄した後、再度、遠心分離を行い、画分中の細胞濃度をセルカウンター（血球計算盤、全自動セルカウンター、ＴＣ２０、バイオラッド社）で測定した。測定後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、それぞれ細胞濃度が１ｍＬあたり、０．５×１０７個、１．０×１０７個、４．０×１０７個、８．０×１０７個、１．０×１０８個となるように調整した。また、血球濃度を調整しない未調整の画分についても評価を行った。
【００８３】
（塗抹工程）
第１のスライドガラス基板（第１の基板）を塗抹装置にセットし、その一端に血球濃度を４．０×１０７個／ｍＬに調整した血液の画分２μＬを滴下した。第２のスライドガラス基板（第２の基板）を装置にセットし、第１のスライドガラス基板に対して２５°の角度で、０．５Ｎの接触力で接触させた。第２のスライドガラス基板の接触下面を血液の画分に触れさせ、３秒間その状態を保持することで、毛細管現象により、２枚のスライドガラスに囲まれた空間に血液の画分を広げた。第２のスライドガラス基板と第１のスライドガラス基板との角度を保ったまま、第２のスライドガラス基板を第１のスライドガラス基板の血液の画分を置いた領域と反対の領域の方向に、速度２００ｍｍ／ｓの一定速度で滑らせることで、第１のスライドガラス基板上に血液の画分を均一に塗抹した塗抹基板を作製した。
【００８４】
同様にして、上記で濃度調整した画分、濃度未調整の画分についても、スライドガラス基板上に塗抹を行い、塗抹基板を作製した。
【００８５】
作製した塗抹基板を、メイ・ギュルンワンド染色液に３分浸漬し、リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Ｂｕｆｆｅｒ液で希釈して濃度３％とした）に１０分間浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
【００８６】
このように作製した塗抹基板の細胞間の平均距離を測定した。細胞間の距離は、細胞の外周を円形近似し、その中心間の距離とする。また、細胞は、濃度調整工程で調整した各濃度において、光学顕微鏡下で細胞５０個を選択し、その細胞に最も近接する細胞との距離を測定し、５０個の平均を取ることで、細胞間の平均距離を求めた。また、血球の凝集の程度についても観察した。結果を表１に示す。
【００８７】
【表１】
2016166768.tif 000003
【００８８】
血球濃度を０．５×１０７個／ｍＬに調整した塗抹基板は、スライドガラス上の血球の凝集はないものの、細胞間の距離が大きくなり、細胞が非常にまばらに存在した。血球濃度を小さくすると、スライドガラス上に存在する血球の数が少なくなるため、有核赤血球を探索する効率が低下した。血球濃度を１．０×１０７個／ｍＬに調整することで、基板上の細胞間の距離を短くすることができ、有核赤血球を探索する効率を上げることができた。血球濃度を１．０×１０８に調整したサンプルは、細胞の凝集がところどころ観察され、細胞核が識別不可の細胞が存在し、標的細胞（有核赤血球細胞）を解析できない可能性があることが確認できた。濃度未調整の画分を塗抹したスライドガラスは、血球濃度が高く、細胞の凝集の頻度も高く、観察不可の細胞が非常に多かった。本発明においては、希少細胞である有核赤血球を１つずつ選択的に取得するため、凝集がないことが好ましく、塗抹する前の画分の血球濃度を８．０×１０７個／ｍＬ以下に調整することで、細胞の凝集を少なくできることが確認できた。
【００８９】
また、別の母体から採取した母体血の血液試料を用いて、上記と同様の方法で、塗抹標本を作製した。濃度調整工程における血球濃度は、下記の表２に示す血球濃度で行った。結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
2016166768.tif 000004
【００９１】
表１、２より、スライドガラス上に画分を塗抹する前処理として血球濃度を１．０×１０７個／ｍＬ以上８．０×１０７個／ｍＬ以下の範囲内とすることで、細胞がスライドガラス上に均一に塗抹されていることが確認できた。さらに、血球濃度が５．０×１０７個／ｍＬであれば、凝集のない塗抹標本を作製することができ、血球濃度を５．０×１０７個／ｍＬ以下に調整することが好ましいことが確認できた。
【００９２】
＜同条件で濃度調整した塗抹標本＞
別途、他のボランティアの複数の母体から採血した血液試料を用いて、上記と同様の方法で、濃縮工程まで行った。得られた有核赤血球候補細胞を含む画分を、上記の血球濃度を４．０×１０７個／ｍＬに調整した比率で、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて希釈を行った。その後、上記と同様の方法で、スライドガラス基板に塗抹を行い、塗抹基板を作製し、基板上の細胞を観察した。
【００９３】
各検体を一定の条件で希釈を行った場合、血球濃度が検体ごとに不均一となり、スライドガラス基板上での細胞の均一性にばらつきが生じた。細胞がスライドガラス基板上でまばらになるため、細胞間の距離が広くなり、解析の効率が低下する基板、あるいは、細胞の凝集が観察され解析できない細胞が存在し、血球の解析に支障がでるなど、ある特定の条件で希釈を行っても、一定の細胞間距離で塗抹された塗抹標本は作製できないことが確認された。
【００９４】
＜塗抹時の接触力＞
上記の条件で、第１のスライドガラス基板と第２のスライドガラス基板との接触力を変更して塗抹標本の作製を行った。塗抹時の接触力が、２．５Ｎ以下の場合は、塗抹後の細胞の形態を正常時の円形に維持することができ、塗抹方向に平行に引き伸ばされた形状となることを防止することができる。細胞の形状を円形に維持することで、画像解析により核の形状を測定して判別する場合に、目的の有核赤血球を判定することができ、良好に細胞を識別することが可能であった。また、接触力が０．５Ｎ以上の場合、第１のスライドガラス基板と第２のスライドガラス基板を接触させ、画分（血液）を毛細管現象で広げる動作時に、塗抹液を目的の領域内にうまく広げることができ、目的の領域以外に染み出ることを防止し、細胞を均一に塗抹することができた。また、第２のスライドガラス基板を安定して移動させることができ、細胞が均一に塗抹された標本を作製することができた。
【００９５】
＜第２のスライドガラス基板の移動速度＞
また、上記の条件で、第１のスライドガラス基板上を、第２のスライドガラス基板を移動させる速度を変更して塗抹基板の作製を行った。第２のスライドガラス基板を移動させる速度が３００ｍｍ／ｓ以下であると、画分（血液）を均一に第一のスライドガラス基板上に広げることができ、細胞がまばらになることを防止することができ、均一に塗抹することが可能であった。また、０．５ｍｍ／ｓ以上とすると、第２のスライドガラス基板側に、血球が多く引っ張られることを防止し、塗抹領域の後半部分に血球成分が偏った塗抹状態となるような現象がなくなり、均一な塗抹標本が得られることがわかった。
【００９６】
第１のスライドガラス基板上に血球が均一に広がらず、凝集が生じ、その凝集部分に希少細胞である胎児由来の有核赤血球があると、その胎児由来の有核赤血球の取得、解析が困難になる。したがって、細胞は均一に、凝集が生じないように塗抹されていることが好ましい。画像検出、および、細胞単離を効率的に実施するためには、細胞が均一に塗抹されることが好ましく、第２のスライドガラス基板を第１のスライドガラス基板上を移動させる速度を、０．５ｍｍ／ｓ以上３００ｍｍ／ｓ以下とすることが好ましい。
【００９７】
（細胞の形状に基づき選別する工程）
上記で、血球濃度を４．０×１０７個／ｍＬに調整してガラス基板上に塗抹した濃縮工程後の血液から、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別するため、電動二次元ステージ（以下、ＸＹステージと記載する。）と、対物レンズ、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、垂直方向（以下、Ｚ方向と記載する）移動機構を制御するＺ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上記のように準備した塗抹基板をＸＹステージに乗せて、ガラス基板上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。
【００９８】
画像解析は、以下の式（１）、式（２）の条件を満たす細胞を検出し、解析対象の画像に直交する二軸からなる座標系を設定し、二軸の一方をＸ軸、二軸の他方をＹ軸とした場合の、検出された細胞のＸ方向の細胞の位置、及びＹ方向の位置を記録した。
０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０      （１）
０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５      （２）
【００９９】
ここで、Ｃは、画像解析を行う細胞の細胞質の面積（解析に用いられる画像における細胞質を表す領域の面積）、Ｎは、画像解析を行う細胞の核の面積（解析画像における細胞の核を表す領域の面積）、Ｌは、画像解析する細胞の核の長径又は直径（解析画像における細胞の核を表す領域を楕円形に近似した際の楕円形の長径、又は解析画像における細胞の核を表す領域を円形に近似した際の円形の直径）、即ち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径または円形の直径と定義する。これら（１）、（２）を満たすスライドガラス基板上に存在する胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選択し、次の工程の胎児由来の有核赤血球の候補とした。
【０１００】
（光学特性に基づき有核赤血球を選別する工程）
形状の情報により選択された胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の１０個について、顕微分光装置を用いて、光学特性の解析を行った。スライドガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球１０個を特定し、そのうちの１つの有核赤血球に対して、波長が４６０ｎｍの単色光の吸光度１、および波長が５６０ｎｍの単色光の吸光度２を測定し、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算した。次に、その有核赤血球の近傍位置にある、当該有核赤血球からの距離の短い順に参照赤血球として、核のない赤血球を５個選択し、同様にして一つ一つの参照赤血球に対して、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算し、平均値を計算した。
【０１０１】
同様の方法で、ガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の残りの９個の細胞に対しても同様の計算を行った。この計算結果から、（有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比の平均値）を求め、この値が「１」からの差が一番大きく異 なる細胞を胎児由来の有核赤血球と見なして細胞Ａとし、「１」からの差が一番小さい細胞を母体由来の有核赤血球と見なして細胞Ｂとした。
【０１０２】
（細胞単離工程）
上記工程で決定された細胞Ａ、細胞Ｂを、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。マイクロマニュピュレータは、オリンパスの自動ステージ付きの顕微鏡を搭載したナリシゲ社のマイクロインジェクションシステムをベースにした専用のマイクロマニュピュレータを用いた。上記工程で決定した細胞Ａ、細胞Ｂが存在する塗抹標本をマイクロマニュピュレータのステージにセットし、取得しておいた細胞Ａ、細胞Ｂの位置座標をマイクロマニュピュレータの自動ステージに読み込ませ、細胞取得位置まで移動させた。移動後、顕微鏡観察下で、マイクロマニュピュレータを動かし、細胞を取り出し、５μＬのＤＮＡフリーの細胞回収液を入れたチューブに取得した細胞を封入した。
【０１０３】
（増幅工程［ＤＮＡ増幅工程］）
マイクロマニュピュレータを用いて回収した細胞Ａと細胞Ｂを用いて、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なＤＮＡを約１００万倍に増幅した。
【０１０４】
（確定工程［母体由来または胎児由来の確定工程］）
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を等分割してその一方を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番染色体のC1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のＳＮＰ（SNP  ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740）を比較することで、細胞Ａと細胞ＢのＳＮＰが異なることが確認出来た。この結果から、それぞれの細胞が、１つずつスライドガラスから取得できていることが確認できた。
【０１０５】
別途、スライドガラス上の白血球と予想される細胞Ｃをマイクロマニュピュレータで回収し、細胞Ａ、細胞Ｂと同様にしてＳＮＰを調べたところ、細胞ＢのＳＮＰと一致することが確認された。以上より、細胞Ａが胎児由来の有核赤血球、細胞Ｂが、母親由来の有核赤血球であることが確認された。
【０１０６】
以上のようにして、胎児由来の有核赤血球のＤＮＡを取得し、解析することにより、出生前の診断が可能になることが判明した。
【符号の説明】
【０１０７】
１２…第１の基板、１４…滴下手段、１６…画分、１８…第２の基板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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