(57)【要約】      （修正有）【課題】簡便、迅速かつ高効率にウイルスから核酸を抽出するための試薬、当該試薬を用いた核酸抽出方法、および当該方法を用いた核酸増幅方法を提供すること。【解決手段】インフルエンザウイルス等のエンベロープを有したウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出するための試薬であって、ジメチルスルホキシド、デオキシコール酸ナトリウム等の水溶性有機溶媒を少なくとも含む抽出試薬を用いる。更に、前記核酸の特定塩基配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび前記核酸の特定塩基配列に相同的な第二のプライマーを用いて前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅することで、前記ウイルス核酸を検出する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性有機溶媒を少なくとも含む、エンベロープを有したウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出するための試薬。
【請求項２】
水溶性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
さらに１種類以上の界面活性剤および／または１種類以上の変性剤を含む、請求項１または２に記載の試薬。
【請求項４】
デオキシコール酸ナトリウムを少なくとも含む、請求項３に記載の試薬。
【請求項５】
エンベロープを有したウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１から４のいずれかに記載の試薬。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載の試薬とエンベロープを有したウイルスを含む試料とを接触させることで、当該ウイルス核酸を抽出する方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法で抽出したウイルス核酸を、前記核酸の特定塩基配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび前記核酸の特定塩基配列に相同的な第二のプライマーを用いて前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅することで、前記ウイルス核酸を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、簡便、迅速かつ高効率にウイルスから核酸を抽出するための試薬、当該試薬を用いた核酸抽出方法、および当該方法を用いた核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス科に属するＲＮＡウイルス（ゲノムとしてＲＮＡを有するウイルス）であり、Ａ型、Ｂ型およびＣ型に分類される。さらにＡ型は、ウイルス表面上のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質に基づいて、亜型へと分類される。インフルエンザウイルスのうちＡ型（中でもＨ１Ｎ１亜型およびＨ３Ｎ２亜型）ならびにＢ型は、季節性インフルエンザとして毎年流行を繰り返している。
【０００３】
インフルエンザに対する治療法としては、抗インフルエンザウイルス薬の投与が効果的である。しかしながら抗インフルエンザウイルス薬の多くはウイルスの増殖を阻害する作用機構のため、発症後早期に投与する必要がある。また類似の症状を示す他のウイルスや病原菌に対しては効果がない。従って、季節性インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出することが、臨床上重要である。
【０００４】
インフルエンザウイルスの検出法としては種々の方法が知られており、中でも臨床的にはイムノクロマト法による検出法が最も用いられている。しかしながら、イムノクロマト法による検出法は検出感度が低く、インフルエンザウイルス数が少ない感染初期では検出できないことが課題となっている。
【０００５】
イムノクロマト法よりも高感度にインフルエンザウイルスを検出する方法として、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＴＭＡ法（特許文献１）、ＴＲＣ法（特許文献２、非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法（特許文献３および４）等の核酸増幅法を利用した検出法が知られている。核酸増幅法を利用した検出法は、インフルエンザウイルスＲＮＡを特異的に増幅して検出するため、インフルエンザウイルスを迅速かつ高感度に検出できる可能性を有している。
【０００６】
核酸増幅法を利用した検出法でウイルスの検出を行なう際は、一般にウイルスを含む試料からウイルス核酸を抽出し精製する操作を事前に行なう。核酸を抽出し精製する操作は、ＥＸＴＲＡＧＥＮ  ＩＩ（東ソー製）といった核酸を不溶化させる試薬と遠心分離を利用したキットや、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン製）といったスピンカラムを利用したキットや、Ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｐｒｅｐｉｔｏ（パーキンエルマー製）といった磁性ビーズを利用した自動抽出装置等の、市販のキットや装置を用いて行なうことが多い。しかしながら、前述した方法は、１０分から１時間程度の時間を要し、また作業工数も多いため、より迅速かつ簡便な方法が求められていた。
【０００７】
一方、Ｃｏｌｏｎｙ  ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ（非特許文献２）や非特許文献３に記載の方法のように、核酸を抽出し精製する操作をせずに核酸増幅を行ない標的核酸を検出する方法も知られているが、感度面で不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第２６５０１５９号公報
【特許文献２】特許第３１５２９２７号公報
【特許文献３】特許第３２４１７１７号公報
【特許文献４】特許第４４３８１１０号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）
【非特許文献２】Ｆｒｏｔｈｉｎｇｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４０−４４（１９９１）
【非特許文献３】松村武史、東京大学学位論文、報告番号１２２５９０（２００７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、簡便、迅速かつ高効率にウイルスから核酸を抽出するための試薬、当該試薬を用いた核酸抽出方法、および当該方法を用いた核酸増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは上記課題を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、水溶性有機溶媒を少なくとも含む抽出試薬とウイルスとを接触させることで、複雑な抽出および／または精製操作を行なうことなく、高効率に核酸を抽出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち本発明は以下の態様を包含する：
（Ａ）水溶性有機溶媒を少なくとも含む、エンベロープを有したウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出するための試薬。
【００１３】
（Ｂ）水溶性有機溶媒がジメチルスルホキシドである、（Ａ）に記載の試薬。
【００１４】
（Ｃ）さらに１種類以上の界面活性剤および／または１種類以上の変性剤を含む、（Ａ）または（Ｂ）に記載の試薬。
【００１５】
（Ｄ）デオキシコール酸ナトリウムを少なくとも含む、（Ｃ）に記載の試薬。
【００１６】
（Ｅ）エンベロープを有したウイルスがインフルエンザウイルスである、（Ａ）から（Ｄ）のいずれかに記載の試薬。
【００１７】
（Ｆ）（Ａ）から（Ｅ）のいずれかに記載の試薬とエンベロープを有したウイルスを含む試料とを接触させることで、当該ウイルス核酸を抽出する方法。
【００１８】
（Ｇ）（Ｆ）に記載の方法で抽出したウイルス核酸を、前記核酸の特定塩基配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび前記核酸の特定塩基配列に相同的な第二のプライマーを用いて前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補配列を含む核酸を増幅することで、前記ウイルス核酸を検出する方法。
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２０】
本発明において水溶性有機溶媒とは、任意の条件下で水への溶解度を有する有機溶媒であり、一例として、エタノール、メタノール、アセトン、フェノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が例示できる。中でもＤＭＳＯを水溶性有機溶媒として用いると、本発明の抽出試薬で抽出して得られるウイルス核酸を含む処理液を、そのまま核酸増幅用試料として用いることができる点で好ましい。なお水溶性有機溶媒の含量は、使用する溶媒の溶解度を考慮し、適宜設定すればよい。また水溶性有機溶媒の種類は、一種類でもよいし、複数種類を組み合わせてもよい。水溶性有機溶媒の組み合わせの一例として、ＤＭＳＯとエタノールとの組み合わせが例示できる。
【００２１】
本発明においてエンベロープを有したウイルスとは、ウイルスカプシドが主に脂質から構成されるエンベロープにより覆われたウイルスのことをいい、一例として、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ）があげられる。中でもインフルエンザウイルスは、本発明の抽出試薬における抽出対象ウイルスとして好ましい。
【００２２】
本発明においてウイルスを含む試料とは、単にウイルスを水、生理食塩水や緩衝液に溶解したものや、ウイルスを含んだ生体試料そのものや、前記生体試料を含んだ濾紙、スワブ等があげられる。前記生体試料の一例として、血液、糞便、尿、痰、リンパ液、血漿、射精液、肺吸引物、脳脊髄液、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、うがい液、唾液、涙液があげられる。
【００２３】
本発明の抽出試薬は、水溶性有機溶媒の他に、酵素や、マグネシウム塩、カリウム塩等の塩類や、トレハロース等の糖類や、グリセロール等の糖アルコールや、核酸成分や、界面活性剤や、変性剤等をさらに含んでもよい。中でも界面活性剤や変性剤は、ウイルス核酸の抽出を促進させる効果を有している点で好ましい。本発明の抽出試薬にさらに含ませる界面活性剤の一例として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤や、ＣＨＡＰＳ等の両イオン界面活性剤や、Ｓｐａｎ  ２０（商品名）、ＭＥＧＡ−８（商品名）、ｎ−Ｏｃｔｙｌ−β−ｍａｌｔｏｓｉｄｅ、ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、ＣＡ−６３０（商品名）、Ｂｒｉｊ３５（商品名）、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、Ｓａｐｏｎｉｎ、Ｓｐａｎ８０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ４０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ６０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ  ８０（商品名）等の非イオン界面活性剤があげられる。中でもデオキシコール酸ナトリウムは、ウイルス核酸の抽出を促進させる効果を有し、かつウイルス核酸を抽出した処理液の持ち込みによる核酸増幅反応への影響が少ない点で好ましい。本発明の抽出試薬にさらに含ませる変性剤の一例として、グアニジン塩酸塩、尿素があげられる。なお本発明の抽出試薬に添加する界面活性剤および／または変性剤は、一種類でもよいし、複数種類を組み合わせてもよい。添加する界面活性剤および／または変性剤の組み合わせの一例として、陰イオン界面活性剤であるデオキシコール酸ナトリウムと、非イオン界面活性剤であるＴｗｅｅｎ  ８０（商品名）との組み合わせが例示できる。
【００２４】
本発明の抽出試薬を用いて、エンベロープを有したウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出するには、単に本発明の抽出試薬とエンベロープを有したウイルスを含む試料とを接触させればよい。接触時間はウイルスを含む試料の性状、試料中のウイルス濃度、抽出試薬に含まれる成分等を考慮し、適宜決定すればよいが、多くの場合接触後４分以内で十分にウイルス核酸を抽出でき、接触後すぐに核酸増幅工程等の後工程へ供することもできる。
【００２５】
本発明の抽出試薬で得られた、ウイルス核酸を含む処理液は、前記核酸の特定塩基配列に相補的な配列を有する第一のプライマーおよび前記核酸の特定塩基配列に相同的な第二のプライマーを含む核酸増幅試薬を添加し、各核酸増幅法（例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、ＴＲＣ法）に適した温度条件にさらすことで、前記特定塩基配列または前記特定塩基配列の相補鎖を含む核酸を増幅し、前記核酸を検出することができる。なおここでいう特定塩基配列とは、第二のプライマーとの相同領域の５’末端から第一のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列のことをいう。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は水溶性有機溶媒を少なくとも含むことを特徴とした、エンベロープを有したウイルスを含む試料から当該ウイルス核酸を抽出するための試薬に係る発明であり、当該ウイルス核酸の抽出を簡便かつ迅速に行なうことができる。また本発明の抽出試薬で抽出したウイルス核酸を含む処理液は、さらなる精製操作を行なうことなく、そのまま核酸増幅試薬に添加することで核酸増幅反応が行なえるため、前記ウイルス核酸の増幅／検出を簡便かつ迅速に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例２で作製したインターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの構造。Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は塩基を示す。なお、３’末端側−ＯＨからの伸長反応を防止するために３’末端側−ＯＨはグリコール酸修飾がなされている。
【実施例】
【００２８】
以下、エンベロープを有したウイルスとしてインフルエンザウイルスを用いたときの実施例および参考例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例により限定されるものではない。
【００２９】
実施例１  インターカレーター性蛍光色素標識核酸プローブの作製
Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６））により、配列番号１に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７２４番目から７４６番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から１７番目のＴと１８番目のＴの間、および配列番号２に記載の配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＣＹ１１５１８４の４６３番目から４８３番目までの塩基配列の相補配列）の５’末端から８番目のＡと９番目のＴの間のリン酸ジエステル部分にリンカーを介してオキサゾールイエローを結合させ、インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（以下、ＩＮＡＦプローブと表記）を調製した（図１）。
【００３０】
参考例１  スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出
以下の方法により、スピンカラムを用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出を試みた。
（１）表１に示すインフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水を用いて１．４×１０３ＴＣＩＤ５０／ｍＬに希釈し、ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて当該キットのマニュアルに従い抽出することで、インフルエンザウイルスＲＮＡを得た。当該インフルエンザウイルスＲＮＡを、必要に応じて注射用水で希釈し、これをウイルスＲＮＡ試料とした。
【００３１】
【表１】
2016182112.tif 000002
（２）以下の組成からなる反応液１９．５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注した後、前記ウイルスＲＮＡ試料２．５μＬを添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号３）が付加されている。
【００３２】
【表２】
2016182112.tif 000003
反応液の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
９０ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製）（配列番号１および２）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
（３）上記の反応液を４６℃で４分間保温後、以下の組成からなる開始剤８μＬを添加した。
【００３３】
開始剤の組成：濃度は開始剤添加後（３０μＬ中）の最終濃度
２１．２ｍＭ  塩化マグネシウム
１０２．７ｍＭ  塩化カリウム
１．２％  グリセロール
１１．５％  ジメチルスルホキシド
０．０５％（ｗ／ｗ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。開始液添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
【００３４】
結果を表３に示す。スピンカラムを用いた核酸抽出法では、概ね３．５×１０−４ＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔのインフルエンザウイルスを検出できることを確認した。
【００３５】
【表３】
2016182112.tif 000004
実施例２  本発明の抽出試薬を用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出
以下の方法により、本発明の抽出試薬を用いた核酸抽出によるインフルエンザウイルスの検出を試みた。
（１）表１に示すＡ型（Ｈ３Ｎ２亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で１．４×１０１ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１．４×１００ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１．４×１０−１ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、１．４×１０−２ＴＣＩＤ５０／ｍＬにそれぞれ希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料７．５μＬを、以下の組成からなる水溶性有機溶媒を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）７．５μＬに添加し、撹拌することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
【００３６】
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ  塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ  塩化カリウム
２．３％  グリセロール
２３．０％  ジメチルスルホキシド
（３）以下の組成からなる反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお第一のプライマーの５’末端側にはＴ７プロモーター配列（配列番号３）が付加されている。
【００３７】
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
９０ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
２０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製）（配列番号１）
０．２μＭ  第一のプライマー（配列番号４、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の６１８番目から６４３番目までの塩基配列）
０．２μＭ  第二のプライマー（配列番号５、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＫＪ７４１９８９の７６４番目から７９０番目までの塩基配列の相補配列）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。ウイルスＲＮＡ抽出物添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
【００３８】
結果を表４に示す。本発明の抽出試薬を用いた核酸抽出法では、１．１×１０−３ＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔまでのインフルエンザウイルスを検出できることを確認した。本発明の抽出試薬の抽出性能は、スピンカラムによる抽出性能（参考例１）の３０％程度ではあるが、簡便／迅速な抽出法としては十分な性能といえる。
【００３９】
【表４】
2016182112.tif 000005
実施例３  本発明の抽出試薬に添加する物質の検討
以下の方法により、本発明の抽出試薬に添加する物質および濃度を検討した
（１）表１に示すＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルスの溶液（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ製）を注射用水で４．７×１０２ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、４．７×１００ＴＣＩＤ５０／ｍＬ、４．７×１０−１ＴＣＩＤ５０／ｍＬにそれぞれ希釈することでウイルス試料を調製した。
（２）（１）で調製したウイルス試料２．５μＬを、以下の組成からなる水溶性有機溶媒を含む溶液（以下、ウイルス抽出液と表記）１２．５μＬに添加し、撹拌することで、ウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを調製した。
【００４０】
ウイルス抽出液の組成：濃度はウイルス試料添加後（１５μＬ中）の最終濃度
４２．４ｍＭ  塩化マグネシウム
２０５．４ｍＭ  塩化カリウム
２．３％  グリセロール
２３．０％  ジメチルスルホキシド
表５および６に記載の濃度の物質
（３）以下の組成からなる反応液１５μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（ＧｅｎｅＡｍｐ  Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー製）に分注し、４６℃で４分間保温後、（２）で得られたウイルスＲＮＡ抽出物１５μＬを直ちに添加した。なお、第一のプライマーおよび第二のプライマーには、表２に示す配列および濃度からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いた。また第一のプライマーには、表２に示した各配列番号に記載の塩基配列の５’末端側に、Ｔ７プロモーター配列（配列番号３）が付加されている。
【００４１】
反応液の組成：濃度はウイルスＲＮＡ抽出物添加後（３０μＬ中）の最終濃度
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
各２．６ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
３．０６ｍＭ  ＩＴＰ
７０ｍＭ  トレハロース
６．４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素
１４２Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ
各２０ｎＭ  ＩＮＡＦプローブ（実施例１で調製）（配列番号１および２）
表２に記載の濃度の第一のプライマー
表２に記載の濃度の第二のプライマー
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー製）を用い、４６℃で反応させると同時に反応液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。ウイルスＲＮＡ抽出物添加時を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度比で割った値）が１．２を超えた場合を陽性判定とした。
【００４２】
反応液３０μＬ中のＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス濃度が１．２×１００ＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔのときの結果を表５に示す。ジメチルスルホキシドを含む溶液のみでは前記濃度のウイルス試料を検出できなかったが、陰イオン界面活性剤、両イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、変性剤、エタノールのいずれかを添加することで検出することができた。
【００４３】
【表５】
2016182112.tif 000006
またＡ型（Ｈ１Ｎ１亜型）インフルエンザウイルス試料濃度が１．２×１０−２ＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔおよび１．２×１０−３ＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔのときの結果を表６に示す。添加する界面活性剤としてデオキシコール酸ナトリウム（表６［Ｂ］）を用いることで、検出感度が１．２×１０−２ＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔまで向上した。さらにデオキシコール酸ナトリウムとＴｗｅｅｎ  ８０（商品名）とを組み合わせる（表６［Ｈ］）ことで、検出感度が１．２×１０−３ＴＣＩＤ５０／ｔｅｓｔへと、さらに向上した。
【００４４】
【表６】
2016182112.tif 000007
【図１】
2016182112.tif 000008
【配列表】
2016182112000001.app