(57)【要約】【課題】芽胞形成細菌の芽胞の増殖を抑制しつつ、脂肪酸エステルの添加量を削減できる容器詰め食品の製造方法を提供する。【解決手段】芽胞形成細菌の芽胞を発芽させる所定の発芽温度範囲に食品材料の温度を維持する発芽工程Ａと、前記食品材料および脂肪酸エステルを収容容器に充填した後、前記収容容器を密封する密封工程Ｂと、密封した前記収容容器を加熱および加圧することで殺菌処理を行うレトルト殺菌工程Ｃと、を有する容器詰め食品の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
芽胞形成細菌の芽胞を発芽させる所定の発芽温度範囲に食品材料の温度を維持する発芽工程と、
前記食品材料および脂肪酸エステルを収容容器に充填した後、前記収容容器を密封する密封工程と、
密封した前記収容容器を加熱および加圧することで殺菌処理を行うレトルト殺菌工程と、を有する容器詰め食品の製造方法。
【請求項２】
前記発芽工程の前に、前記食品材料を前記発芽温度範囲より高い所定の予熱温度範囲に維持して前記食品材料を予熱する予熱工程を有する請求項１に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項３】
前記発芽工程の前に、前記芽胞形成細菌の芽胞の発芽誘起剤を添加する添加工程を有する請求項１または２に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項４】
前記芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌である請求項１〜３の何れか一項に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項５】
前記高温偏性嫌気性菌がモーレラ属の細菌である請求項４に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項６】
前記モーレラ属の細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である請求項５に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項７】
前記発芽温度範囲が５５〜６５℃である請求項１〜６の何れか一項に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項８】
前記予熱温度範囲が９０〜１１０℃である請求項２に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項９】
前記発芽誘起剤がＬ−セリンおよびＬ−アラニンの少なくとも何れかである請求項３に記載の容器詰め食品の製造方法。
【請求項１０】
前記食品材料が乳成分含有飲料である請求項１〜９の何れか一項に記載の容器詰め食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、容器詰め食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の中には、芽胞を形成する細菌が存在する。芽胞形成細菌は、生存に良好な環境では活発に分裂し増殖するが、環境の栄養分が減少したり、乾燥するなど、増殖に不利な環境になると芽胞を形成する。芽胞は極めて高い耐久性を持っており、さらに環境が悪化して通常の細菌が死滅する状況に陥っても生き残ることが可能である。しかし、芽胞の状態では細菌は新たに分裂することはできず、その代謝も限られている。
【０００３】
芽胞は栄養細胞の中に形成される耐久型細胞であり、水分が非常に低く、殆ど代謝せず、いわば休眠状態にある。この状態のときは種々のストレスに強い耐性を示し、加熱に対する抵抗性も強く、殺滅には１００℃以上で所定時間以上の加熱が必要である。休眠状態にある芽胞は、生き残った芽胞が再びその細菌の増殖に適した環境に置かれると、当該芽胞が発芽して、通常の増殖・代謝能を有する菌体が作られる。
【０００４】
芽胞は耐熱性が強いために、加熱殺菌によって微生物の制御をしている容器詰め食品では、その存在が問題となる。芽胞は、容器詰め食品にとって最も重要な生物学的危害要因で、加熱殺菌の指標となっている。
【０００５】
芽胞を作る代表的な細菌としては、好気性または通性嫌気性の有芽胞グラム陽性桿菌であるバチルス属の細菌や、偏性嫌気性の有芽胞グラム陽性桿菌であるクロストリジウム属やモーレラ属等の細菌が知られている。
【０００６】
モーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）は高温偏性嫌気性菌であり、増殖適温は５５〜６５℃であって３５℃では増殖しない。多くの芽胞形成細菌と同様に土壌菌であり、食品材料の汚染源は主に砂糖や増粘多糖類であるといわれている。食品材料の炭水化物や脂肪等が分解されて風味が悪くなり食用に適さなくなることを変敗というが、モーレラ・サーモアセティカを原因とする変敗はフラットサワー様で、ガス発生せず酸を生成するタイプである。モーレラ・サーモアセティカを原因とする変敗事例を有する食品として、これまでにミルクコーヒー、ミルクティー、ココア飲料、ドリンクスープ、しるこドリンク等が知られている。モーレラ・サーモアセティカの芽胞の耐熱性は極めて高く、１２０℃でのＤ値（Decimal reduction value）が４０分以上であり、加熱殺菌処理のみでの変敗防止は極めて困難である。
【０００７】
容器詰め食品のうち飲料製造において、例えば乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。乳成分含有飲料が自動販売機などにおいて低温保存状態で販売ないし貯蔵される場合には、残存した耐熱性芽胞形成細菌の芽胞は発芽・増殖し難く、品質上の問題が生じることは殆どない。しかし、例えば５５℃の加温状態に置かれた場合には、残存した高温耐熱性芽胞形成菌の芽胞が発芽・増殖して、飲料内容物に変敗を生じさせる結果、飲食適性（商品性）が失われる虞がある。
【０００８】
そのため、例えば特許文献１には、乳成分含有飲料においてレトルト殺菌処理を行なった後に高温状態で保存した場合に耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が発芽・増殖することを抑制するため、ショ糖脂肪酸エステル等の乳化剤を添加することが開示してある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開平１０−１６５１５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
容器詰め食品において行われるレトルト加熱等の加熱処理は、その温度や時間が過剰となれば、食品材料の風味などの品質に対して悪影響を及ぼし、さらにエネルギー消費の面で負担が大きい。また、特許文献１にて使用されるショ脂肪酸エステルは、添加量によっては食品材料の風味に悪影響を与える虞があるため、使用量は少ない方がよい。
【００１１】
従って、本発明の目的は、芽胞形成細菌の芽胞の増殖を抑制しつつ、脂肪酸エステルの添加量を削減できる容器詰め食品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［１０］に示す発明を提供する。
［１］芽胞形成細菌の芽胞を発芽させる所定の発芽温度範囲に食品材料の温度を維持する発芽工程と、前記食品材料および脂肪酸エステルを収容容器に充填した後、前記収容容器を密封する密封工程と、密封した前記収容容器を加熱および加圧することで殺菌処理を行うレトルト殺菌工程と、を有する容器詰め食品の製造方法。
［２］前記発芽工程の前に、前記食品材料を前記発芽温度範囲より高い所定の予熱温度範囲に維持して前記食品材料を予熱する予熱工程を有する［１］に記載の容器詰め食品の製造方法。
［３］前記発芽工程の前に、前記芽胞形成細菌の芽胞の発芽誘起剤を添加する添加工程を有する［１］または［２］に記載の容器詰め食品の製造方法。
［４］前記芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌である［１］〜［３］の何れか一項に記載の容器詰め食品の製造方法。
［５］前記高温偏性嫌気性菌がモーレラ属の細菌である［４］に記載の容器詰め食品の製造方法。
［６］前記モーレラ属の細菌がモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）である［５］に記載の容器詰め食品の製造方法。
［７］前記発芽温度範囲が５５〜６５℃である［１］〜［６］の何れか一項に記載の容器詰め食品の製造方法。
［８］前記予熱温度範囲が９０〜１１０℃である［２］に記載の容器詰め食品の製造方法。
［９］前記発芽誘起剤がＬ−セリンおよびＬ−アラニンの少なくとも何れかである［３］に記載の容器詰め食品の製造方法。
［１０］前記食品材料が乳成分含有飲料である［１］〜［９］の何れか一項に記載の容器詰め食品の製造方法。
【００１３】
脂肪酸エステルは休眠芽胞に殆ど作用せず、発芽した後の芽胞に作用すると考えられる。休眠芽胞が発芽した後、コートやコルテックスが分解され、水がコアに侵入するようになり、脂肪酸エステルも芽胞内膜に到達する。脂肪酸エステルが膜に結合するときには、膜のリン脂質二重膜に脂肪酸エステルの脂肪酸部分が入り込むことにより膜に欠損を生じ、コア内容物が漏出する。その結果、増殖できなくなり、死滅すると考えられる。
【００１４】
本発明の容器詰め食品の製造方法では、食品材料に混入している芽胞形成細菌の芽胞が発芽した後でレトルト殺菌により加熱殺菌することができる。即ち、レトルト殺菌工程の前に意図的に芽胞形成細菌の芽胞を発芽させる発芽工程（発芽温度範囲が５５〜６５℃）を行って食品材料中に存在する当該芽胞を一斉に発芽させ、芽胞が充分発芽した後に収容容器を密封してレトルト殺菌する。このように本発明の容器詰め食品の製造方法では、芽胞が発芽して耐熱性が低下し、脂肪酸エステルによる作用を受けやすくした状態でレトルト殺菌することができるため、脂肪酸エステルの添加量を低減することができ、当該脂肪酸エステルの添加量を低減したとしても効率よく、確実に芽胞形成細菌の芽胞を死滅させることができる。また、加熱殺菌条件を緩和することも可能となる。
【００１５】
予熱工程では、予熱温度範囲を例えば９０〜１１０℃とすることで、食品材料に混入している芽胞形成細菌の芽胞を予め加熱して活性化することができるため、当該予熱工程を行うことにより、後の発芽工程における芽胞の発芽を確実かつ一斉に行わせることができる。
【００１６】
添加工程では、Ｌ−セリンおよびＬ−アラニンといった発芽誘起剤を添加することにより、芽胞形成細菌の芽胞の発芽を促進することができる。
【００１７】
缶や袋状の収容容器に食品を収容した容器詰め食品のうち飲料製造において、例えば食品材料である乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。特に、芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌であれば、芽胞の耐熱性は極めて高いため、当該高温偏性嫌気性菌の混入をできるだけ避けることができれば好ましい。また、当該高温偏性嫌気性菌のうち、モーレラ属の細菌に分類されるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）を原因とする変敗事例が広く公知であるため、モーレラ・サーモアセティカを検出できる検出剤であれば、汎用性が非常に高くなる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の容器詰め食品の製造方法の手順の概要を示す図である。
【図２】芽胞発育に対する脂肪酸エステルの影響を調べたグラフである。
【図３】脂肪酸エステル作用による芽胞の形態変化の観察結果を示した写真図である。
【図４】脂肪酸エステルが膜に結合する場合の模式図を示した図である。
【図５】本発明の容器詰め食品の製造方法を行って変敗率を調べた結果を示したグラフである。
【図６】ショ糖脂肪酸エステルの濃度を種々変更した場合の変敗率を調べたグラフである（（ａ）０ｐｐｍ、（ｂ）２５ｐｐｍ、（ｃ）５０ｐｐｍ、（ｄ）７５ｐｐｍ、（ｅ）１００ｐｐｍ）。
【図７】比較例において１２５℃における加熱時間を０分とした場合に、ショ糖脂肪酸エステルの添加量を種々変更して変敗率を調べたグラフである。
【図８】変敗率０となるデータをプロットしたグラフである。
【図９】モーレラ・サーモアセティカの発芽誘起について調べた結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。
図１に示したように本発明の容器詰め食品の製造方法は、芽胞形成細菌の芽胞を発芽させる所定の発芽温度範囲に食品材料の温度を維持する発芽工程Ａと、食品材料および脂肪酸エステルを収容容器に充填した後、収容容器を密封する密封工程Ｂと、密封した収容容器を加熱および加圧することで殺菌処理を行うレトルト殺菌工程Ｃと、を有する。
【００２０】
芽胞形成細菌は、栄養細胞の分裂・増殖（対数増殖期）、芽胞形成、芽胞（休眠）、発芽、発芽後生育、及び栄養細胞の対数増殖という一連の生物学的変化を伴う生活環を有しているものであればよい。栄養細胞は、栄養源の枯渇など環境条件の変化によって不等分裂を起こし、母細胞とプレスポア（Prespore）の２つの細胞に分化する。プレスポアは、母細胞内に取り込まれてフォアスポア（Forespore、前芽胞）となる。フォアスポアが成熟し、芽胞（Spore）になると母細胞は自己溶解する。
【００２１】
芽胞は高い耐久性（耐熱性、耐圧性、耐薬品性）と長期休眠能を持つことから、食品や飲料、医薬品などの分野において芽胞の混入を想定した厳しい殺菌操作が必要となる。また、芽胞の耐久性の強さは種類（菌種や菌株）により異なるため、食品材料や製品などに混入した場合、迅速かつ正確に種類を同定し種類に応じた対応をしなければならない。
【００２２】
本発明に適用できる芽胞形成細菌としては限定されるものではないが、例えば、
モーレラ属に属する細菌、例えばモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、モーレラ・グリセリニ（Moorella glycerini）、モーレラ・ムルデリ（Moorella mulderi）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Moorella thermoautotrophica）；
クロストリジウム属に属する細菌、例えば破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）；
バチルス属に属する細菌、例えばバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・アンスラシス（Bacillus anthracis）、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）；
ゲオバチルス属に属する細菌、例えばゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）；
アリシクロバチルス属に属する細菌、例えばアリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）;
スポロラクトバチルス属に属する細菌、例えばスポロラクトバチルス・イヌリナス（Sporolactobacillus inulinus；
リシニバチルス属に属する細菌、例えばリシニバチルス・スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus）；
サーモアネロバクター属に属する細菌、例えばサーモアネロバクター・マスラニイ（Thermoanaerobacter mathranii）、サーモアネロバクター・アセトエチリカス（Thermoanaerobacter acetoethylicus）；
サーモアネロバクテリウム属に属する細菌、例えばサーモアネロバクテリウム・サーモサッカロリティカム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）、サーモアネロバクテリウム・アシジトレランス（Thermoanaerobacterium aciditolerans）；
デスルフォトマキュラム属に属する細菌、例えばデスルフォトマキュラム・ニグリフィカンス（Desulfotomaculum nigrificans）、デスルファトマキュラム・サーモアセトキシダンス（Desulfotomaculum thermoacetoxidans）；
が挙げられる。
尚、当業者には周知であるとおり、上記例示した細菌名及び分類は将来的に変更される可能性がある。
【００２３】
本発明においては、上述した芽胞形成細菌であれば、任意の種及び株のものを用いることができる。
【００２４】
缶や袋状の収容容器に食品を収容した容器詰め食品のうち飲料製造において、例えば食品材料である乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。特に、芽胞形成細菌が高温偏性嫌気性菌であれば、芽胞の耐熱性は極めて高いため、当該高温偏性嫌気性菌の混入をできるだけ避けることができれば好ましい。また、当該高温偏性嫌気性菌のうち、モーレラ属の細菌に分類されるモーレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）を原因とする変敗事例が広く公知であるため、モーレラ・サーモアセティカを検出できる検出剤であれば、汎用性が非常に高くなる。
【００２５】
本発明の容器詰め食品の製造方法は、上述した芽胞形成細菌の芽胞を発芽させる所定の発芽温度範囲に食品材料の温度を維持する発芽工程Ａを有する。
【００２６】
食品材料は、自動販売機などにおいて例えば５５〜６５℃程度の加温状態で販売ないし貯蔵される可能性のある食品材料であれば特に限定されるものではない。このような食品材料として、例えばミルクコーヒー、ミルクティー、ココア飲料などの乳成分含有飲料や、ドリンクスープ、しるこドリンク等が挙げられる。
【００２７】
発芽温度範囲は、例えば５５〜６５℃とするのが好ましく、さらに６０〜６５℃とするのが好ましい。高温偏性嫌気性菌であるモーレラ・サーモアセティカの増殖適温は５５〜６５℃であり、上記温度範囲で所定時間維持すれば、食品材料に含まれる高温偏性嫌気性菌（モーレラ・サーモアセティカ）の芽胞を効率よく、一斉に発芽させることができる。さらに６０〜６５℃とすれば、より一層効率よく発芽させることができる。
当該発芽温度範囲は所定時間維持する必要があるが、当該所定時間は例えば３０〜１２０分とすれば大部分の芽胞を発芽させることができ、好ましくは６０〜１２０分程度とすれば大部分の芽胞を確実に発芽させることができる。
【００２８】
密封工程は、発芽工程Ａを行った後、食品材料および脂肪酸エステルを収容容器に充填した後、収容容器を密封する。
【００２９】
脂肪酸エステルは、水酸基を有する親水性部と、カルボキシル基を有する脂肪酸である疎水性部とをエステル結合させたものである。
【００３０】
親水性部は、水酸基を有する糖類、アルコール、アスコルビン酸等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。糖類としてはショ糖やトレハロース等、アルコールとしては、三価のアルコールであるグリセリン等を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
疎水性部は、例えば炭素数が８〜１６である脂肪酸を使用することができるが、これらに限定されるものではない。当該脂肪酸は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸の何れであってもよい。
【００３１】
代表的な脂肪酸エステルとして、ショ糖脂肪酸エステルやグリセリン脂肪酸エステルを使用することができるがこれらに限定されるものではない。脂肪酸はパルミチン酸を使用することができるがこれに限定されるものではない。パルミチン酸は、炭素数が１６の飽和脂肪酸である。
【００３２】
脂肪酸エステルの濃度は、発芽工程Ａを行わない場合に比べて約１５〜９２％程度に減少させることができる。後述するレトルト殺菌工程の条件（１０５℃〜１３０℃程度の蒸気又は熱水で１０〜５０分間程度）であれば、約９〜１０８ｐｐｍとすることができる。
【００３３】
収容容器は、高温で加熱殺菌するため耐熱性を有し、常温流通ができる態様であり、酸素ガス、光を遮断するバリア性を有し、密封性および実用強度がある缶状の容器や、袋状・容器状などのレトルトパウチであればよい。当該レトルトパウチは、例えば食品側にはポリプロピレン、外側にはポリエステル（ＰＥＴ）と言った合成樹脂やアルミ箔を積層加工したフィルムで作製される。収容容器の容積は特に限定されるものではないが、１００〜６００ｍＬ程度であればレトルト殺菌の際に扱い易く、レトルト殺菌時間などを考慮すれば５５０ｍＬ程度までの大きさとするのがよい。
【００３４】
このような収容容器は、食品材料および適量の脂肪酸エステルを充填した後、公知の手法により密封することができる。
【００３５】
レトルト殺菌工程は、密封した収容容器を加熱および加圧することで殺菌処理を行う。レトルト殺菌処理とは、加圧加熱処理をいい、耐熱性容器に充填した製品を品温上昇に伴う製品の内圧で容器が破損しないように加圧しながら１０５℃〜１３０℃程度の蒸気又は熱水で１０〜５０分間程度加熱することをいう。レトルト殺菌処理はバッチ式レトルト殺菌装置、連続式レトルト殺菌装置を用いることができる。
【００３６】
具体的な加熱の方法としては、常圧下で食品対象物の内部温度が１１０℃〜１３０に達するまで加熱をすることは困難であるため、加圧条件下で行う。例えば、熱水式の加圧加熱殺菌機や加圧式の圧力釜等を用いるとよい。
【００３７】
食品材料に芽胞形成細菌が混入している場合、当該芽胞形成細菌および脂肪酸エステルは以下の態様により結合すると考えられる。
【００３８】
即ち、脂肪酸エステルは休眠芽胞に殆ど作用せず、発芽した後の芽胞に作用すると考えられる。休眠芽胞が発芽した後、コートやコルテックスが分解され、水がコアに侵入するようになり、脂肪酸エステルも芽胞内膜に到達する。脂肪酸エステルが膜に結合するときには、膜のリン脂質二重膜に脂肪酸エステルの脂肪酸部分が入り込むことにより膜に欠損を生じ、コア内容物が漏出する。その結果、増殖できなくなり、死滅すると考えられる。
【００３９】
容器詰め食品において、例えば乳成分含有飲料は通常レトルト加熱殺菌処理が行なわれるが、この加熱殺菌処理の通常の条件では耐熱性芽胞形成細菌の芽胞が残存する虞がある。
【００４０】
本発明の容器詰め食品の製造方法では、食品材料に混入している芽胞形成細菌の芽胞が発芽した後でレトルト殺菌により加熱殺菌することができる。即ち、レトルト殺菌工程の前に意図的に芽胞形成細菌の芽胞を発芽させる発芽工程Ａを行って食品材料中に存在する当該芽胞を一斉に発芽させ、芽胞が充分発芽した後に収容容器を密封してレトルト殺菌する。このように本発明の容器詰め食品の製造方法では、芽胞が発芽して耐熱性が低下し、脂肪酸エステルによる作用を受けやすくした状態でレトルト殺菌することができるため、脂肪酸エステルの添加量を低減することができ、当該脂肪酸エステルの添加量を低減したとしても効率よく、確実に芽胞形成細菌の芽胞を死滅させることができる。また、加熱殺菌条件を緩和することも可能となる。
【００４１】
上述した発芽工程Ａの前に、食品材料を発芽温度範囲より高い所定の予熱温度範囲に維持して食品材料を予熱する予熱工程Ｄを行ってもよい。
【００４２】
当該予熱温度範囲は、例えば９０〜１１０℃とするのが好ましく、さらに１００〜１０５℃とするのが好ましい。この予熱工程Ｄでは、食品材料に混入している芽胞形成細菌の芽胞を予め加熱して活性化することができるため、当該予熱工程Ｄを９０〜１１０℃で行うことにより、後の発芽工程Ａにおける芽胞の発芽を一斉に行わせることができ、さらに１００〜１０５℃で行うことにより、確実に一斉に行わせることができる。
当該予熱温度範囲は所定時間維持する必要があるが、当該所定時間は例えば２〜２０分とすれば芽胞の発芽を十分に行わせることができ、好ましくは５〜１０分程度とすれば、短時間で予熱を完了することができる。
【００４３】
さらに、上述した発芽工程Ａの前に、芽胞形成細菌の芽胞の発芽誘起剤を添加する添加工程Ｅを行ってもよい。
【００４４】
発芽誘起剤は、例えばアミノ酸とすることができ、特にＬ−セリンおよびＬ−アラニンの少なくとも何れかとするのがよい。Ｌ−セリンおよびＬ−アラニンは、それぞれ単独で添加してもよいし、これらを含有する培地（例えばトリプチケースペプトン）を添加してもよい。Ｌ−セリンおよびＬ−アラニンの濃度は、それぞれ０．０１〜０．２％、好ましくは０．０１〜０．０５％となるように添加すればよい。このような発芽誘起剤を添加する添加工程Ｅを行うことにより、芽胞形成細菌の芽胞の発芽を促進することができる。
【実施例】
【００４５】
〔実施例１〕
モーレラ・サーモアセティカの芽胞の調製を行った。
菌株は変敗ミルクコーヒー缶詰から分離した２４−１株とした。培養は変法チオグリコレート寒天培地（ｐＨ７．０、日水製薬株式会社製）の混釈培養法で、５５℃、１０〜１４日間の条件で嫌気培養した。コロニーを採取し、滅菌希釈水に懸濁して菌懸濁液を調製して、１００℃、５分の加熱処理およびリゾチーム処理を行って栄養細胞を選択的に溶解させた。その後、ＳＤＳ処理により純度９５％以上の精製芽胞液を得た。芽胞は直径約１μｍの球形であった。
【００４６】
得られた発芽の挙動を観察した。
発芽の評価は、一般的に濁度低下や耐熱性消失を経時的に測定することで行われている。モーレラ・サーモアセティカの芽胞の発芽を変法チオグリコレート培地中、５５℃で調べた。濁度（ＯＤ650）は１２０分で７０％低下した（結果は示さない）。
耐熱性消失は、経時的にサンプリングし、芽胞を１００℃、５分で加熱処理し、生残したものを耐熱性芽胞数とし、混釈法で５５℃、７日間の条件で嫌気培養した後、形成されたコロニー数で調べた。耐熱性芽胞数は１２０分で９１％低下した（結果は示さない）。
位相差顕微鏡（オリンパス株式会社製）による観察を行った（休眠芽胞は白くキラキラ光って見え、発芽芽胞は暗色化し黒く見える）。０分では大部分の芽胞が休眠状態で２０分、６０分、１２０分と時間経過につれて、暗色化した芽胞数が増加し、発芽しているものと認められた（結果は示さない）。
このように濁度低下、耐熱性消失、位相差顕微鏡観察の３つの方法で、発芽の時間経過はほぼ同じで、２０分で発芽し始め、１２０分で発芽はほぼ完了しているものと認められた。
【００４７】
〔実施例２〕
芽胞の発育に対する脂肪酸エステルの影響を調べた。
（１）培地の脂肪酸エステル濃度と芽胞の発育との関係
芽胞発育に対する脂肪酸エステルの影響を調べた。実施例１で得た精製芽胞を１００℃、５分の条件で加熱活性化した後、脂肪酸エステルを０〜１００ｐｐｍ含有した変法チオグリコレート培地に接種し、５５℃の嫌気条件のもと、経時でサンプリングし、波長６５０ｎｍにおける濁度を分光光度計（株式会社日立製作所製）で測定した。
【００４８】
脂肪酸エステルの濃度が０，１，１０，１００ｐｐｍである場合の濁度変化を図２に示した。脂肪酸エステルの濃度が０，１ｐｐｍでは最初の数時間で濁度低下があるが、これは発芽段階に相当すると考えられた。２４時間以降の濁度増加は栄養増殖に相当すると考えられた。
【００４９】
一方、脂肪酸エステルの濃度が１０，１００ｐｐｍでは、最初の数時間での濁度低下は脂肪酸エステルの濃度が０，１ｐｐｍの場合と同様で、発芽は起こっていると考えられた。しかし２４時間以降の濁度増加は認められず、発芽後の増殖は確認されなかった。よって、脂肪酸エステルの濃度が１０ｐｐｍ以上では発芽段階には影響しないが、増殖はできなくなると考えられた。
【００５０】
（２）脂肪酸エステル作用による芽胞の形態変化
上述したように、脂肪酸エステル１０ｐｐｍでは完全に増殖が抑制されていると認められた。そこで脂肪酸エステル１０ｐｐｍを含有する変法チオグリコレート培地において一定時間インキュベートした芽胞を、透過電子顕微鏡（日本電子株式会社製）で観察した。電子顕微鏡のサンプル作製は凍結置換法で行い、ミクロトームで７０−８０ｎｍの超薄切片を作製した。観察結果を図３に示した。
【００５１】
休眠状態の芽胞では、中心部がコアで、その周りに厚いコルテックスやコートの層が観察される（図３（ａ））。変法チオグリコレート培地に脂肪酸エステルを添加しない場合（０ｐｐｍ）、６時間後ではコアは膨潤し、コルテックスやコートは消失し、発芽が完了した。発芽後生育を経て、２４時間後では分裂が始まっており、分裂中の栄養細胞が観察された（図３（ｂ）〜（ｄ））。
【００５２】
変法チオグリコレート培地に脂肪酸エステルを１０ｐｐｍ添加した場合では、６時間後でコルテックスやコートはほぼ消失し、コアが膨潤している点は０ｐｐｍの場合（図３（ｃ））と類似しているが、芽胞の膜の一部に欠損を生じていると認められた（図３（ｅ））。１２時間後では、内部が淡くなっていると認められた（図３（ｆ））。２４時間後では、膜欠損部が大きくなり、内部がさらに淡くなり、コア内容物が漏出していると認められた（図３（ｇ））。
【００５３】
（３）脂肪酸エステルの作用機構（考察）
これまでに得られた実験結果から脂肪酸エステルの作用機構について考察すると、脂肪酸エステルは休眠芽胞に殆ど作用せず、発芽した後の芽胞に作用すると考えられる。休眠芽胞が発芽した後、コートやコルテックスが分解され、水がコアに侵入するようになり、脂肪酸エステルも芽胞内膜に到達する。脂肪酸エステルが膜に結合し、膜に欠損を生じ、コア内容物が漏出する。その結果、増殖できなくなり、死滅すると考えられる。休眠芽胞と発芽芽胞では膜の物理的状態が異なることが知られている。休眠状態での膜は凝縮状態にあるが、発芽しコアが膨潤すると容積も大きくなり、膜が緩んだ状態になる。この状態が細胞膜の通常の状態で、栄養細胞の膜も類似した状態である。本来の細胞膜機能を発揮するには、緩んだ状態でなければならないと考えられる。
【００５４】
従って、脂肪酸エステルが芽胞に作用する段階は発芽以降であり、発芽後生育が起こるまでの間と推測される。また脂肪酸エステルは膜に結合していると考えられる。図４に膜脂肪酸エステルが膜に結合する場合の模式図を示す。膜のリン脂質二重膜に脂肪酸エステルの脂肪酸部分が入り込むと考えられる。比較的少量の脂肪酸エステルの結合では、修復できると思われるが、その修復に長時間を要し、増殖開始が遅れると推測される。脂肪酸エステルの結合量が、ある一定以上になると欠損を生じ、コア内容物も漏出し、増殖できなくなると考えられる。
【００５５】
〔実施例３〕
本発明の容器詰め食品の製造方法（発芽工程Ａ、密封工程Ｂ、レトルト殺菌工程Ｃ）を行い、変敗率を調べた。
【００５６】
食品材料はミルクコーヒーを調製したものを使用した。調製は、コーヒー（Ｂｘ１．４）６４３ｍＬ、牛乳１００ｍＬ、砂糖６５ｇ，重曹０．４ｇ、水２５７ｍＬを混合して行った（最終のコーヒーＢｘ０．９）。脂肪酸エステルは、ショ糖脂肪酸エステル（Ｐ−１６７０（ＳＥ）：３８０ｐｐｍ）（三菱化学フーズ）を使用した。
【００５７】
発芽工程Ａの前に１００℃、５分間の予熱工程Ｄを行った。発芽工程Ａは５５℃で１２０分行い、レトルト殺菌工程Ｃは、加熱温度を１２５℃とし、加熱時間を５〜５０分の間で５分毎に変更したサンプルを使用した。変敗率は、レトルト殺菌後、５５℃の嫌気条件下で１０日間培養し、モーレラ・サーモアセティカの芽胞の増殖の有無をｐＨの測定値によって判断した。
【００５８】
発芽工程を行わず、その他の条件は同じとした比較例についても変敗率を調べた。結果を図５に示した。
【００５９】
その結果、本発明の容器詰め食品の製造方法（本発明例）では、加熱時間５〜１５分にかけて変敗率が１から０．４まで急激に減少し、加熱時間２０分以降は変敗率が０となった。一方、比較例では、変敗率が０．２まで低下するのに３０分の加熱時間を要し、さらに変敗率が０まで低下するのに４０分の加熱時間を要した。これより、本発明例は比較例に比べて変敗率を０とするのに要するレトルト殺菌の加熱時間を半分にすることができ、加熱殺菌条件を緩和することができたと認められた。
【００６０】
尚、本実施例では、発芽工程Ａは５５℃で１２０分行った場合のみを示したが、５５℃で３０分行った場合でも同様の結果が得られた（結果は示さない）。さらに、発芽工程Ａを６０℃、６５℃で行った場合についても同様の結果が得られた（結果は示さない）。
また、予熱工程Ｄを１００℃で５分間行った場合のみを示したが、１００℃で２分、１０分、２０分行った場合でも同様の結果が得られた（結果は示さない）。さらに、予熱工程Ｄを９０℃、１０５℃、１１０℃で行った場合についても同様の結果が得られた（結果は示さない）。
【００６１】
〔実施例４〕
実施例３ではショ糖脂肪酸エステル（Ｐ−１６７０（ＳＥ））３８０ｐｐｍの場合の変敗率を調べた。本実施例では、ショ糖脂肪酸エステルを０，２５，５０，７５，１００ｐｐｍとした場合の変敗率を調べた。ショ糖脂肪酸エステルの濃度以外の諸条件は実施例３に準じて行った。結果を図６（ａ）〜図６（ｅ）に示した。
【００６２】
この結果、本発明例では、ショ糖脂肪酸エステルを０，２５，５０，７５，１００ｐｐｍとした場合に変敗率０となる１２５℃における加熱時間は、それぞれ２０，２０，１５，１０，５分であった。一方、比較例では、ショ糖脂肪酸エステルを０，２５，５０，７５，１００ｐｐｍとした場合に変敗率０となる加熱時間は、それぞれ３５，３０，２５，１５，５分であった。
【００６３】
また、比較例において、１２５℃における加熱時間を０分とした場合に、ショ糖脂肪酸エステルの添加量を種々変更して変敗率を調べた。結果を図７に示した。この結果、変敗率が０となるショ糖脂肪酸エステルの添加量は１５０ｐｐｍ以上であると認められた。
【００６４】
この変敗率０となるデータをプロットしたグラフを図８に示した。この結果、本発明例における直線近似式はｙ＝−６．６０１９ｘ＋１４０．９４となり、比較例における直線近似式はｙ＝−３．７７１２ｘ＋１３５．８１となった。
【００６５】
これら直線近似式に基づき、ショ糖脂肪酸エステルの変動に伴う加熱時間比（本発明例/比較例）の変動、および、加熱時間の変動に伴うショ糖脂肪酸エステル比（ＳＥ比：本発明例/比較例）の変動について算出した。結果を表１，２に示した。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
【表２】
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【００６８】
この結果、表１より、本発明の容器詰め食品の製造方法（本発明例）において、変敗率０とするのに必要な加熱時間は、比較例に比べて約６０〜６５％に低減でき、加熱殺菌条件を緩和することが可能となると認められた。また、表２より、本発明例において、変敗率０とするのに必要なショ糖脂肪酸エステルは、加熱時間の長短で低減効果が大きく変化（約９〜１０８ｐｐｍ：ＳＥ比約１５〜９２％）するものの、添加量を低減することができると認められた。
【００６９】
〔実施例５〕
モーレラ・サーモアセティカの発芽誘起について調べた。
トリプチケースペプトン（ＢＢＬ）溶液をＴＬＣ分画して、得られた３分画のそれぞれの画分からの熱水抽出液を用いた発芽試験を行い、画分Ｂ（Ｒｆ０．０８−０．３０）が他のＡ，Ｃ画分に比べて高い発芽率であった（結果は示さない）。
【００７０】
発芽試験は、ｍＴＧＣ培地（日水製薬製）を用いて行い、当該ｍＴＧＣ培地での濁度低下を１００とした相対百分率で発芽度を評価した。
【００７１】
画分Ｂをさらに３分画して発芽試験した結果、画分Ｂのサブ画分３（Ｒｆ０．２１−０．３０）に高い発芽能が認められた。サブ画分３に存在する化合物をＲｆ値や標品アミノ酸のＴＬＣで調べた結果、アミノ酸としてＬ−アラニン，Ｌ−セリン，Ｌ−アスパラギン酸，Ｌ−プロリン，グリシン，Ｌ−スレオニンが含まれることが判明した。これら６つのアミノ酸すべてをYeast extract−Ｌ−シスチン−チオグリコール酸ナトリウム混合液にそれぞれ０．０５％加えて発芽試験したところ、８０％の濁度低下を示した。結果を図９に示した（図９  ６ＡＡ）。図９は、ｍＴＧＣ培地での発芽程度を１００とした相対値を示す。この結果、これらの６つのアミノ酸が発芽に関与していると推測された。
【００７２】
次に上述した６つのアミノ酸についてオミッションテストを行った。当該オミッションテストは、６種のアミノ酸のうち１つずつ除去して残り５つのアミノ酸をYeast extract−Ｌ−シスチン−チオグリコール酸ナトリウム混合液に加えた液を使用して発芽試験を行った。結果を図９に示した。図９に記載されたアミノ酸名は、そのアミノ酸が除去され、残りの５つのアミノ酸が添加された液を使用したことを示す。
【００７３】
この結果、Ｌ−セリン，Ｌ−アラニンをオミットすると濁度が低下せず、発芽しないことを示した。そのため、この２つのアミノ酸が発芽に大きく関与しているものと認められた。尚、本実施例ではアミノ酸を０．０５％加えて発芽試験を行ったが、０．０１〜０．２％とした場合であっても、同様の結果が得られた（結果は示さない）。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明は、容器詰め食品の製造方法に利用できる。
【符号の説明】
【００７５】
Ａ        発芽工程
Ｂ        密封工程
Ｃ        レトルト殺菌工程
Ｄ        予熱工程
Ｅ        添加工程
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図６】
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