(57)【要約】      （修正有）【課題】血液中等に存在する遊離ＤＮＡを用いて、非侵襲的方法で卵巣明細胞腺癌の診断方法の提供。【解決手段】被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上、12番染色体上及び20番染色体上の各々の特定の遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、3番染色体上の特定の遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失、4番染色体上の特定の遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失、並びに／又は、22番染色体上の特定の遺伝子及びその遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法。被験者から取得した染色体DNAのうち、正常な染色体由来のDNAをCas9-sgRNA複合体で切断し、卵巣癌の発症と関連する変異を有する染色体由来のDNAの存在比率を上昇させ、該変異の有無を検出することを含む、卵巣癌の診断方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のADAM5遺伝子及びADAM3A遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、8番染色体上のANK1遺伝子及びMYST3遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域の少なくとも一部の増幅、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失、並びに／又は、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法。
【請求項２】
被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
【請求項３】
被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のADAM5遺伝子及びADAM3A遺伝子を含む領域、8番染色体上のANK1遺伝子及びMYST3遺伝子を含む領域、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域、及び、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域からなるグループから任意に選択される３領域において、各３領域の少なくとも一部の増幅を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
【請求項４】
被験者から取得した染色体DNAにおいて、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域、及び、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域からなるグループから任意に選択される１領域において、該１領域の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
【請求項５】
前記増幅又は欠失の検出を、該当領域を含むDNAコピー数の変化を検出することによって行う、請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記DNAコピー数の変化を、PCR法、FISH法、CGH法、ISH法、定量PCR法、デジタルPCR法又はシーケンシング法によって検出することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
被験者から取得した染色体DNAが、被験者の腫瘍組織、子宮頸部・内膜細胞診サンプル、脳脊髄液、血液又は尿から抽出したものであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
被験者から取得した染色体DNAのうち、正常な染色体由来のDNAをCas9-sgRNA複合体で切断し、卵巣癌の発症と関連する変異を有する染色体由来のDNAの存在比率を上昇させ、該変異の有無を検出することを含む、卵巣癌の診断方法。
【請求項９】
前記卵巣癌が、卵巣明細胞腺癌であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異がPIK3CA遺伝子座における1047番目のヒスチジンがアルギニンに置換されている変異であることを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験者から取得した染色体DNAが、被験者の腫瘍組織、子宮頸部・内膜細胞診サンプル、脳脊髄液、血液又は尿から採取したものであることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、卵巣癌、特に、卵巣明細胞腺癌の診断方法に関する。より具体的には、患者由来の染色体の特定領域における増幅又は欠失、並びに、特定遺伝子の体細胞性変異を検出することにより、卵巣癌（特に、卵巣明細胞腺癌）の罹患の有無、あるいは、予後の評価を含む、卵巣癌（特に、卵巣明細胞腺癌）の診断方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
上皮性卵巣癌は、米国において９番目に多い癌であり、日本においては、１４番目に多く、徐々に患者数が増加している。上皮性卵巣癌は主として４つの組織学的なサブグループから構成されている。すなわち、漿液性腺癌、粘液性腺癌、類内膜腺癌及び明細胞腺癌である。なかでも、明細胞腺癌は北米及び欧州においては、２番目に多く、その罹患率は１−１２％と見積もられており、日本においては１５−２５％の罹患率である。さらに、日本では、過去２０年間、５０歳以上の年齢層において、４つのサブグループのうち明細胞腺癌の増加率が最も高かった。また、明細胞腺癌患者は、初期段階（I又はII）で診断され、その腫瘍は無痛性であるのに対し、進行期（III又はIV）の患者は、通常、予後が悪く（非特許文献１及び非特許文献２）、早期発見の必要性の高い癌の一つである。
また、最近の報告によれば、子宮内膜症が、明細胞腺癌及び子宮内膜腺癌のリスクを増加させることが明らかとなっている（非特許文献３）。
【０００３】
上皮性卵巣癌の組織型における疫学的な相違に加えて、分子学的特徴の相違も報告されている。ARID1A腫瘍抑制遺伝子の変異及び、ARID1Aがコードするタンパク質であるBAF3250aの機能喪失が、明細胞腺癌の４６％に、子宮内膜癌及び類子宮内膜癌の３０％に確認されているが、漿液性腺癌ではそのような報告はない。この結果に鑑みるに、体細胞性の突然変異のいくつかが、子宮内膜症から明細胞腺癌又は子宮内膜腺癌へと移行する引き金となっていることが示唆される。また、染色体CGH（Comparative Genomic Hybridization）法を用いて、染色体の特定領域の増幅又は欠失が子宮内膜癌の予後と関連性があることを見出し、その結果を利用して、子宮内膜癌の予後の診断を行うことが可能であることなども報告されている（特許文献１、非特許文献４）。
その他、遺伝学的解析あるいはゲノム解析により、明細胞腺癌においてTP53突然変異は比較的低いが（非特許文献５）、進行度の高い漿液性腺癌ではほぼ全ての腫瘍においてTP53の突然変異が生じていること、また、頻度は低いが統計的に有意なものとして、NF1、BRCA1、BRCA2、RB1、CDK12の突然変異が生じていることなどが報告されている(非特許文献６)。
【０００４】
現在、卵巣癌の診断は、超音波診断によって卵巣の腫大が確認された場合、血液検査と画像診断に基づいて行われている。血液検査においては、腫瘍マーカーの確認も行われており、代表的な腫瘍マーカーとしてCA125が用いられている。CA125は、卵巣癌に罹患している者の約８割が陽性を示すが、腹膜や子宮内膜にも発現しており、子宮内膜症などの場合にも陽性を示すため、悪性の卵巣癌に特異的とまでは言えないマーカーである。また、卵巣癌の場合において、早期がんや明細胞腺癌においては、CA125の上昇が乏しいため、卵巣癌の早期発見、あるいは、卵巣明細胞腺癌の診断には、より特異性の高い腫瘍マーカーが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開2000-166557
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Takanoら, Br J Cancer 94:1369?1374 2006
【非特許文献２】Mizunoら, J Surg Oncol 94:138?143 2006
【非特許文献３】Pearceら, Lancet Oncol. 13:385-394 2012
【非特許文献４】Okamotoら, PLoS One. 6;10(2):e0116977. doi: 10.1371/journal.pone.0116977. eCollection 2015.
【非特許文献５】Kuoら, Am J Pathol. 174:1597-1601 2009
【非特許文献６】Bellら, Nature 474:609-615 2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記事情に鑑み、本発明は、染色体の構造変化に基づき、卵巣明細胞腺癌の発症の有無または発症の可能性、卵巣明細胞腺癌の悪性度もしくは予後の診断方法の適用を目的とする。
さらに、本発明は、血液中などに存在する遊離DNAを用いた、非侵襲的方法（腫瘍組織を用いない方法）による、卵巣癌の診断方法をも提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、卵巣明細胞腺癌患者由来の染色体（または染色体DNA）に対し、アレイCGH（Comparative Genomic Hybridization）法を用いて解析を行ったところ、いくつかの染色体DNA領域における増幅又は欠失が卵巣明細胞腺癌の発症、悪性度、予後等と関連性を有することを初めて明かにした。さらに、これらの増幅又は欠失領域の有無を、血液由来のDNAサンプルを用いて確認することに成功し、生体への負担の少ない非侵襲的な方法により、卵巣癌の罹患の有無等の診断が可能であることを明かにした。
【０００９】
発明者らは、卵巣明細胞腺癌の患者由来の腫瘍組織からDNAを採取し、これを用いて、高解像度のアレイCGH法により、卵巣明細胞腺癌細胞において有意に増幅又は欠失している染色体上の領域を調べた。
その結果、卵巣明細胞腺癌細胞において、8番染色体上のADAM5遺伝子/ADAM3A遺伝子を含む領域（「領域１」とする）、8番染色体上のANK1遺伝子/MYST3遺伝子を含む領域（「領域２」とする）、8番染色体上のPLAT遺伝子/IKBKB遺伝子/POLB遺伝子/DKK4遺伝子/VDAC遺伝子/SLC20A2遺伝子/SMIM19遺伝子を含む領域（「領域３」とする）、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域（「領域４」とする）、及び、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域（「領域５」とする）の増幅が、高い頻度で観察された。
さらに、8番染色体上のPLAT遺伝子/IKBKB遺伝子/POLB遺伝子/DKK4遺伝子/VDAC遺伝子/SLC20A2遺伝子/SMIM19遺伝子を含む領域における増幅は、日本人の卵巣明細胞腺癌患者において、無増悪生存期間が短いことと関連性を有していた。また、上記領域１〜５のうち、増幅領域が２つの領域以下の症例と３つ以上の領域にわたり増幅している症例では、３つ以上の領域にわたり増幅している症例おいて、無増悪生存期間（PFS; Progression Free Survival）及び全生存期間（OS: Over All Survival）が有意に短いことが分かった。
【００１０】
また、卵巣明細胞腺癌細胞において、3番染色体上のBC073807遺伝子（非コード領域）を含む領域（「領域６」とする）、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域（「領域７」とする）、及び22番染色体上のGSTT1遺伝子/LOC391322遺伝子を含む領域（「領域８」とする）の欠失が高い頻度で観察された。
さらに、3番染色体上のBC073807遺伝子（非コードRNA）を含む領域における欠失は、日本人の卵巣明細胞腺癌患者において、無増悪生存期間が短いことと関連性を有していた。また、3番染色体上のBC073807遺伝子（非コードRNA）を含む領域に欠失を有する子宮内膜症合併症例では、無増悪生存期間が有意に短いことが分かった。さらにまた、上記領域６〜８のうち、いずれか１つの領域に欠失を有する日本人患者の症例では、無増悪生存期間が短い傾向にあり、上記領域６又は領域７のいずれかの領域において欠失を有する日本人患者の症例では、無増悪生存期間が短い傾向にあった。
【００１１】
これらの結果は、上記の特定の染色体領域の異常が、卵巣明細胞腺癌の発症の有無もしくは発症の可能性を診断するための指標となること、また、卵巣明細胞腺癌の悪性度もしくは予後の予測を行うための指標となることを示している。
【００１２】
また、発明者らは、CRISPR/Casシステム（sgRNA-Cas9複合体を利用したシステム）を用いることで、卵巣明細胞癌患者のPIK3CA遺伝子に高頻度で認められる突然変異（P p.H1047R)変異；IK3CAの1047番目のヒスチジンがアルギニンに変わっている）を卵巣明細胞腺癌患者の血液及び子宮頚部・内膜細胞診由来のDNAサンプルから検出することに成功した。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１１）である。
（１）被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のADAM5遺伝子及びADAM3A遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、8番染色体上のANK1遺伝子及びMYST3遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域の少なくとも一部の増幅、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失、並びに／又は、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法。
（２）被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域の少なくとも一部の増幅を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
（３）被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のADAM5遺伝子及びADAM3A遺伝子を含む領域、8番染色体上のANK1遺伝子及びMYST3遺伝子を含む領域、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域、及び、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域からなるグループから任意に選択される３領域において、各３領域の少なくとも一部の増幅を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
（４）被験者から取得した染色体DNAにおいて、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域、及び、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域からなるグループから任意に選択される１領域において、該１領域の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法。
（５）前記増幅又は欠失の検出を、該当領域を含むDNAコピー数の変化を検出することによって行う、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記DNAコピー数の変化を、PCR法、FISH法、CGH法、ISH法、定量PCR法、デジタルPCR法又はシーケンシング法によって検出することを特徴とする上記（５）に記載の方法。
（７）被験者から取得した染色体DNAが、被験者の腫瘍組織、子宮頸部・内膜細胞診サンプル、脳脊髄液、血液又は尿から抽出したものであることを特徴とする上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法。
（８）被験者から取得した染色体DNAのうち、正常な染色体由来のDNAをCas9-sgRNA複合体で切断し、卵巣癌の発症と関連する変異を有する染色体由来のDNAの存在比率を上昇させ、該変異の有無を検出することを含む、卵巣癌の診断方法。
（９）前記卵巣癌が、卵巣明細胞腺癌であることを特徴とする上記（８）に記載の方法。
（１０）前記変異がPIK3CA遺伝子座における1047番目のヒスチジンがアルギニンに置換されている変異であることを特徴とする上記（８）又は（９）に記載の方法。
（１１）前記被験者から取得した染色体DNAが、被験者の腫瘍組織、子宮頸部・内膜細胞診サンプル、脳脊髄液、血液又は尿から採取したものであることを特徴とする上記（８）乃至（１０）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、卵巣癌、特に、卵巣明細胞腺癌の早期発見、悪性度もしくは予後の予測が可能となる。卵巣明細胞腺癌などの卵巣癌の悪性度もしくは予後予測が可能になることから、術前又は術後の療法の選択の幅が広がり、より適切な治療を行うことができる。
【００１５】
また、本発明により、卵細胞明細胞腺癌などの卵巣癌に有意に認められる変異を、血液サンプルなどを使用し、非侵襲的かつ迅速に検出することができ、卵巣癌の早期発見が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】8番染色体におけるSCNAsの増加の頻度を示す。  染色体コピー数の増加の頻度（%）は、中心軸より右側にピークが出現する。ADAM5/ADAM3A遺伝子領域（領域１）、ANK1/MYST3遺伝子領域（領域２）及びPLAT/IKBKB/POLB/DKK4/VDAC/SLC20A2/SMIM19遺伝子領域（領域３）にピークが確認された。
【図２】12番染色体におけるSCNAsの増加の頻度を示す。  20p13.3-13.2領域（領域４）にピークが確認された。
【図３】20番染色体におけるSCNAsの増加の頻度を示す。  ZNF217遺伝子領域（領域５）にピークが確認された。
【図４】3番染色体におけるSCNAsの欠失の頻度を示す。  BC073807遺伝子を含む領域（領域６）にピークが確認された。
【図５】4番染色体におけるSCNAsの欠失の頻度を示す。  UGT2B17遺伝子を含む領域（領域７）にピークが確認された。
【図６】22番染色体におけるSCNAsの欠失の頻度を示す。  GSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域（領域８）にピークが確認された。
【図７】領域３の増幅と、無増悪生存期間との関係を示す。
【図８】領域１〜領域５の増幅と、無増悪生存期間との関係を示す。領域１〜領域５において、３〜５領域に異常がある患者と０〜２領域に異常がある患者の無増悪生存期間の比較を行った結果である。
【図９】領域１〜領域５の増幅と、全生存期間との関係を示す。領域１〜領域５において、３〜５領域に異常がある患者と０〜２領域に異常がある患者の全生存期間の比較を行った結果である。
【図１０】領域６の欠失と、無増悪生存期間との関係を示す。
【図１１】子宮内膜症合併症例において、領域６の欠失と、無増悪生存期間との関係を示す。
【図１２】日本人の子宮内膜症合併症例において、領域６の欠失と、無増悪生存期間との関係を示す。
【図１３】領域６〜領域８の欠失と、無増悪生存期間との関係を示す。領域６〜領域８のいずれか１症域において欠失がある患者群（６〜８）と、いずれの領域にも欠失がない患者群（none）との間で、無増悪生存期間の比較を行った結果である。
【図１４】日本人の健常者のバフィーコートから調製したDNAを用いて、ANK1遺伝子領域におけるSNP（chr8 41747333）の有無を確認した結果を示す。  上図は、当該SNPの位置（chr8 41747333）がAである場合に、下図は、当該SNPの位置がTである場合にポジティブな値を示す。縦軸は、FAM（上図）又はHEX（下図）由来の蛍光の測定値を示す。N1、N6、N7、N8、N9、N10は健常者（normal）由来のサンプル番号を示す。
【図１５】日本人の健常者のうち、染色体8の41747333の位置にSNPを持つ被験者のバフィーコートから調製したDNAを用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41747333の位置がAである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図１６】日本人の健常者のうち、SNPを持つ（染色体8の41747333の位置が、A/Tである）被験者のcfDNA(2.5ng)を用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41747333の位置がAである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図１７】卵巣明細胞腺癌患者のバフィーコートから調製したDNAを用いて、ANK1遺伝子領域におけるSNP（chr8 41747333）の有無を確認した結果を示す。  上図は、当該SNPの位置（chr8 41747333）がAである場合に、下図は、当該SNPの位置がTである場合にポジティブな値を示す。縦軸は、FAM（上図）又はHEX（下図）由来の蛍光の測定値を示す。
【図１８】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の41747333の位置にSNPを持つ患者のバフィーコートから調製したDNAを用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41747333の位置がAである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図１９】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の41747333の位置にSNPを持つ患者の癌部位から調製したDNAを用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41747333の位置がAである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２０】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の41747333の位置にSNPを持つ患者のcfDNA(2.5ng)を用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41747333の位置がAである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２１】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の41658923の位置にSNPを持つ患者の癌部位から調製したDNAを用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41658923の位置がGである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２２】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の41658923の位置にSNPを持つ患者のcfDNA(2.5ng)を用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41658923の位置がGである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２３】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の41850222の位置にSNPを持つ患者の癌部位から調製したDNAを用いて、MYST3遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41850222の位置がCである対立遺伝子とGである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２４】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の41850222の位置にSNPを持つ患者のcfDNA(2.5ng)を用いて、MYST3遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の41850222の位置がCである対立遺伝子とGである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２５】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の42180716の位置にSNPを持つ患者の癌部位から調製したDNAを用いて、IKBKB遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の42180716の位置がCである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２６】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体8の42180716の位置にSNPを持つ患者のcfDNA(2.5ng)を用いて、IKBKB遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体8の42180716の位置がCである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２７】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体20の52208838の位置にSNPを持つ患者の癌部位から調製したDNAを用いて、ZNF217遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体20の52208838の位置がCである対立遺伝子とGである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２８】卵巣明細胞腺癌患者のうち、染色体20の52208838の位置にSNPを持つ患者のcfDNA(2.5ng)を用いて、ZNF217遺伝子の増幅の有無を確認した結果である。  縦軸は、染色体20の52208838の位置がCである対立遺伝子とGである対立遺伝子のコピー数の比を示す。
【図２９】卵巣明細胞腺癌に見られるPIK3CA遺伝子上の変異（H1047R）の近傍配列に結合するsgRNAに使用する標的配列を示す。検討の結果、Fw2配列を含むsgRNAを使用した場合に、最も効率よく野生型配列を切断した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の第１の実施形態は、被験者（卵巣明細胞腺癌の患者、又は、卵巣明細胞腺癌に罹患している可能性のある者など、本発明の方法を適用する対象者）から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のADAM5遺伝子（start position:39237438〜end position:39299582（BEDフォーマットによるポジション、以下同じ）及びADAM3A遺伝子（start position:39299582〜end position:39386158）を含む領域（領域１）の少なくとも一部の増幅、8番染色体上のANK1遺伝子（start position:41640598〜end position:41777845）及びMYST3遺伝子（start position:41777845〜end position:41889042）を含む領域（領域２）の少なくとも一部の増幅、8番染色体上のPLAT遺伝子（start position:42033118〜end position:42101440）、IKBKB遺伝子（start position:42155030〜end position: 42190171）、POLB遺伝子（start position: 42195973〜end position: 42229331）、DKK4遺伝子（start position: 42231586〜end position: 42234674）、VDAC3遺伝子（start position: 42249279〜end position: 42263455）、SLC20A2遺伝子（start position: 42273980〜end position: 42317561）及びSMIM19遺伝子（start position: 42396298〜42408140（表１においては、end positionは42543909となっているが、ここでは、遺伝子の存在領域の終点を示した）を含む42543909までの領域（領域３）の少なくとも一部の増幅、12番染色体上の20p13.3-13.2（start position:9637323〜end position:9696948）を含む領域（領域４）の少なくとも一部の増幅、20番染色体上のZNF217遺伝子（start position:52163628〜end position:52215265）を含む領域（領域５）の少なくとも一部の増幅、3番染色体上のBC073807遺伝子（start position:162514534〜end position:162619141）を含む領域（領域６）の少なくとも一部の欠失、4番染色体上のUGT2B17遺伝子（start position:69456442〜end position:69483277）を含む領域（領域７）の少なくとも一部の欠失、並びに／又は、22番染色体上のGSTT1遺伝子/LOC391322遺伝子（start position:24371205〜end position:24390254）を含む領域（領域８）の少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の診断方法である。
【００１８】
ここで、「領域の少なくとも一部の増幅」とは、上記領域１〜領域５の染色体領域の一部の領域が増幅していることであり、もちろん、当該領域の全てが増幅していてもよい。例えば、領域３の少なくとも一部の増幅とは、少なくともPLAT遺伝子（42033118〜42101440）領域の一部が増幅している場合、又は、少なくともIKBKB遺伝子/POLB遺伝子/DKK4遺伝子/VDAC遺伝子/SLC20A2遺伝子/SMIM19遺伝子（42155030〜42543909）領域の一部が増幅している場合などのことであり、もちろん、領域３の全領域であるPLAT遺伝子/IKBKB遺伝子/POLB遺伝子/DKK4遺伝子/VDAC遺伝子/SLC20A2遺伝子/SMIM19遺伝子（42033118〜42543909）の領域が増幅している場合も含まれる。
また、「領域の少なくとも一部の欠失」とは、上記領域６〜領域８の染色体領域の一部の領域が欠失していることであり、もちろん、当該領域の全てが欠失していてもよい。
【００１９】
本発明の第１の実施形態によれば、領域１、領域２、領域３、領域４若しくは領域５の少なくとも一部の増幅、又は領域６、領域７若しくは領域８の少なくとも一部の欠失のうち、いずれか１つでも検出されれば、その染色体が由来する被験者は、卵巣明細胞腺癌に罹患しているか、もしくは、罹患している可能性があると診断することができるが、これらの染色体領域の複数の領域の少なくとも一部が増幅若しくは欠失、又は、増幅及び欠失している場合であっても、被験者の卵巣明細胞腺癌の罹患、又は、罹患の可能性を判断することができる。
【００２０】
また、8番染色体上のPLAT遺伝子/IKBKB遺伝子/POLB遺伝子/DKK4遺伝子/VDAC遺伝子/SLC20A2遺伝子/SMIM19遺伝子を含む領域（領域３）の少なくとも一部の増幅は、日本人において、卵巣明細胞腺癌の予後の無増悪生存期間（PFS; Progression Free Survival）が短いことと関連性を有していた。
さらに、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域（領域６）、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域（領域７）、及び、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域（領域８）からなるグループから任意に選択される１領域における、少なくとも一部の欠失は、日本人において、卵巣明細胞腺癌の予後の無増悪生存期間が短いことと関連性を有していた。特に、領域６の少なくとも一部が欠失している子宮内膜症合併症例、及び、日本人の子宮内膜症合併症例においては、無増悪生存期間が有意に短かった。
【００２１】
従って、本発明の第２の実施形態は、被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域（領域３）の少なくとも一部の増幅、又は、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域（領域６）、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域（領域７）、及び、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域（領域８）からなるグループから任意に選択される１領域における、少なくとも一部の欠失を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法である。
【００２２】
さらに、領域１〜領域５に関して、増幅領域が２つの領域以下の症例と３つ以上の領域にわたり増幅している症例を比較すると、３つ以上の領域にわたり増幅している症例おいて、無増悪生存期間及び全生存期間（OS: Over All Survival）が有意に短いことが分かった。
従って、本発明の第２の実施形態には、被験者から取得した染色体DNAにおいて、8番染色体上のADAM5遺伝子及びADAM3A遺伝子を含む領域（領域１）、8番染色体上のANK1遺伝子及びMYST3遺伝子を含む領域（領域２）、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域（領域３）、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域（領域４）、又は、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域（領域５）からなるグループから任意に選択される３つ以上の領域において、選択された各領域の少なくとも一部の増幅を検出することを含む、卵巣明細胞腺癌の悪性度又は予後の診断方法が含まれる。
【００２３】
本発明の第２の実施形態にかかる診断方法は、上述の通り、卵巣明細胞腺癌の罹患の有無、卵巣明細胞腺癌に罹患した場合の予後の良又は不良を判断する方法として使用可能である。すなわち、本発明の卵巣明細胞腺癌の診断には、特に限定しないが、例えば、卵巣明細胞腺癌の罹患の有無、卵巣明細胞腺癌に罹患している患者又は罹患した場合の被験者における、該卵巣明細胞腺癌の予後を判断することが含まれる。
ここで、癌の「悪性度」とは、医学分野において通常用いられている言葉の意味と、特に異なる意味を表すものではなく、限定はしないが、例えば、癌の予後が良好か、あるいは、予後が不良か等を判断するための癌の状態を意味する。本発明の悪性度の診断方法により判断された悪性度もしくは予後の判断は、当該腫瘍の外科的手術による切除範囲の決定、術前又は術後の補助療法若しくは内科的療法（化学療法剤や、分子標的薬を使用した療法など）の要否などの治療方法の選択を行う上でも有効である。
また、「予後」とは、医学分野において通常用いられている言葉の意味と、特に異なる意味を表すものではなく、限定はしないが、例えば、予想される医学的な状態（健康状態）に関する見解、病気・創傷の将来的な状態のことである。また、疾患が癌等である場合に、予後の評価又は予後の診断としては、例えば、癌のグレード診断、悪性度診断、将来における転移の有無の予測、手術後の症状の悪化の有無の予測、無増悪生存期間の長短の予測等を挙げることができる。そして、予後が不良であるとは、例えば、無増悪生存期間又は全生存期間の短縮、再発リスクの増大及び／又は腫瘍が他の部位に転移している可能性がある場合を指す。
【００２４】
本発明にかかる方法は、上述の染色体領域における少なくとも一部の増幅又は欠失を検出することを特徴とする。ここで、「少なくとも一部」とは、1〜10bp、10bp以上、又は、15bp以上、好ましくは60bp以上、より好ましくは1kb以上、さらに好ましくは100kb以上の連続した配列のことである。
本発明において、染色体上のゲノムDNAの目的領域の増幅又は欠失を検出するには、如何なる方法を用いてもよく、例えば、BAC（bacterial artificial Chromosome） クローン、PAC（P1- derived artificial chromosome）クローンなどのヒトゲノムライブラリーに対する被験者由来のDNAとコントロールのDNA（正常者、すなわち、本発明が対象とする染色体領域の異常を含んでいない者由来のDNA）との競合ハイブリダイゼーション法（例えば、染色体CGH法など）、PCR法、FISH（fluorescence in situ hybridization）法、ISH（in situ hybridization）法、定量PCR法、デジタルPCR法又はシーケンシング法（エクソンシークエンスなど）などにより検出してもよい。
【００２５】
例えば、CGH（Comparative Genomic Hybridization）法は、染色体の欠失と増幅を同時に検出することが可能であるため、簡便な検出方法である。
アレイCGH法は、染色体の欠失、増幅の有無を調べるゲノム領域に対応するDNA配列（プローブと呼ぶ）を、固相（例えば、スライドグラス、又は、ガラス、金属若しくは樹脂製の板状のチップなど）に固定化したもの（アレイ）を使用する。プローブは、例えば、BACクローン、PACクローンなどを使用することができる。アレイは、公知の方法により製造してもよいし、市販のものを購入し、使用説明書に従って、使用してもよい。
CGH法を使用する場合、被験者由来のDNA及びコントロールのDNAをそれぞれ異なる標識物質により標識する。蛍光色素を標識として使用する場合、DNAを直接標識するには、DNAを鋳型としてランダムプライマー法、ニックトランスレーション法などで標識することができる。
標識したDNAは、繰り返し配列等をブロックするために、ブロック用のDNA（例えば、Cot-1DNA）を〜100μg程度加え、周知の方法により標識されたDNAを調製する。ハイブリダイゼーションを行う条件は、CGHアレイの状況等に依存するが、例えば、50%ホルムアミド、2×SSC（標準クエン酸緩衝液）、10%硫酸デキストラン、4%SDS、100mg/ml 酵母tRNA、pH7.0などの溶液中にて、例えば、37℃で60分間インキュベートすることで、繰り返し配列等のブロッキングが可能となる。
【００２６】
また、上述の染色体領域における少なくとも一部の増幅又は欠失を検出する場合に、目的領域に存在するSNP（Single Nucleotide Polymorphism：一塩基多型）に着目し、そのSNPを含む領域の増幅又は欠失をデジタルPCR法やシーケンシング法により検出してもよい（SNPに着目する方法として、例えば、Dhallanら, Lancet 369:474-481 2007；Loら, Proc. Natl. Acad. Sci. 104:13116-13121 2007；Chiuら, Proc. Natl. Acad. Sci. 105:20458-20463 2008；Tsuiら, Blood 117:3684-3691 2011を参照のこと）。
【００２７】
上述した各方法を用いる場合、被験者由来のDNAの他に、必要に応じてコントロールとして、正常細胞（調べるDNA領域に変異を有さない染色体のみからなる細胞）由来のDNAを取得する。この場合、被験者由来のDNAは、被験者から手術により摘出した腫瘍組織、病理組織切片、バイオプシーにより取得した組織（例えば、子宮頸部細胞診サンプル、子宮内膜細胞診サンプルなど）の他、被験者由来の脳脊髄液、尿又は血液中の遊離DNAを公知の一般的な方法により単離精製することができる。
【００２８】
また、本発明の他の実施形態においては、8番染色体上のADAM5遺伝子及びADAM3A遺伝子を含む領域（領域１）、8番染色体上のANK1遺伝子及びMYST3遺伝子を含む領域（領域２）、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域（領域３）、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域（領域４）、及び、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域（領域５）から選択される１以上の染色体領域の少なくとも一部の増幅、あるいは、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域（領域６）、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域（領域７）、及び、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域（領域８）から選択される１以上の染色体領域の少なくとも一部の欠失を検出するための、当該領域に存在する塩基配列に相補的な塩基配列を有する１種以上のプローブ、又はプライマーを含むキットであって、卵巣明細胞腺癌の診断方法、卵巣明細胞腺癌の悪性度の診断方法など、本発明にかかる方法を実施するためのキットが提供される。
【００２９】
CGHアレイ法で使用するプローブは、上記染色体領域の増幅又は欠失を検出するために利用可能な核酸、又は核酸誘導体であれば如何なるものであってもよく、その塩基配列情報は、すでに公知のヒトゲノム情報から入手することができる。プローブの長さは、特に限定しないが、例えば、好ましくは15ベース以上、より好ましくは60ベース以上、100ベース以上である。
また、目的の領域の増幅をSNPの増幅を指標にして行う場合に使用するプローブは、指標となるSNPの位置を含む領域にアニールするプローブであって、FAM、HEXなどの蛍光標識やTAMRAなどのクエンチャーが結合されていてもよい。さらに、当該プローブには、必要に応じて、2', 4'-Bridged Nucleic Acid（LNA）などの人工塩基が含まれていてもよい。SNPを指標として増幅を検出するためのプローブの長さは、特に限定はしないが、例えば、5〜20ベース程度であってもよい。
【００３０】
また、本発明にかかるキットには、8番染色体上のADAM5遺伝子及びADAM3A遺伝子を含む領域（領域１）、8番染色体上のANK1遺伝子及びMYST3遺伝子を含む領域（領域２）、8番染色体上のPLAT遺伝子、IKBKB遺伝子、POLB遺伝子、DKK4遺伝子、VDAC遺伝子、SLC20A2遺伝子及びSMIM19遺伝子を含む領域（領域３）、12番染色体上の20p13.3-13.2を含む領域（領域４）、20番染色体上のZNF217遺伝子を含む領域（領域５）、3番染色体上のBC073807遺伝子を含む領域（領域６）、4番染色体上のUGT2B17遺伝子を含む領域（領域７）、又は、22番染色体上のGSTT1遺伝子及びLOC391322遺伝子を含む領域（領域８）の全部又は一部をPCR法（定量PCR法など）により増幅して該当領域の増幅を検出するためのプライマーペアが含まれていてもよい。
さらに、本発明のキットには、目的の染色体領域の増幅を、SNPを指標にして行う場合に、デジタルPCR法やシーケンシング法によって検出するためのプライマーペアも含まれる。
【００３１】
さらに、本発明にかかるキットには、上記1種以上のプローブが支持体上に固定された、例えば、アレイなどが含まれていてもよい。その他、検出を行うために必要な緩衝液、洗浄液等、さらに、コントロールとなる正常ヒト由来DNAなどが適宜含まれていてもよい。
【００３２】
本発明の第３の実施態様は、被験者から取得したサンプル中の正常な染色体由来のDNAを、Cas9-sgRNA複合体で切断し、卵巣癌の発症と関連する変異を有する染色体由来のDNAの存在比率を上昇させ、該変異の有無を検出することを含む、卵巣癌の診断方法
である。
ここで、「卵巣癌の発症と関連する変異」とは、卵巣癌（例えば、漿液性腺癌、粘液性腺癌、類内膜腺癌及び明細胞腺癌）患者の腫瘍部位由来の染色体DNAにおいて、高頻度で認められる変異のことである。変異が高頻度であるとは、卵巣癌患者の5%以上、10％以上、より好ましくは、30%以上において、当該変異が認められる場合をさす。卵巣癌の発症頻度と関連性を有する変異は、すでに公知となっている変異であっても、新規に見出された変異であってもよく、公知の変異としては、例えば、卵巣明細胞腺癌と関連性を有する変異として、ARID1A遺伝子の変異（頻度；40-57%）、PIK3CA遺伝子の変異（頻度；33%）、PPP2RIA遺伝子の変異（頻度；7%）、KRAS遺伝子の変異（頻度；5%）などを例示することができる。
また、「変異」は、特に限定されないが、例えば、置換、挿入、欠失、付加などの変異を挙げることができる。
「正常な染色体由来のDNA」とは、検出目的の変異を含まない染色体由来のDNAのことである。例えば、卵巣明細胞腺癌と関連性を有する変異として、PIK3CA遺伝子上に存在する変異に着目した場合、当該着目した変異を有さない染色体由来のDNAは全て、ここでいうところの「正常な染色体由来のDNA」である。すなわち、着目していない変異を有していたとしても、着目する変異を有していなければ、ここでは「正常な染色体由来のDNA」である。なお、本明細書においては、染色体由来のDNAを鋳型として、PCR法などで増幅したDNA断片も「染色体由来のDNA」に含まれるものとする。
【００３３】
CRISPR/Casシステムと称される技術は、Cas9とsgRNAの複合体を用いて、部位特異的にDNAを切断する技術で、ゲノムの編集などに用いられている。詳細については、例えば、Maliら, Science 339:823-826 2013、Sapranauskasら, Nucleic Acids Res., 2011, 1-8 doi:10. 1093/nar/gkr606、Wangら, Cell 153:910-918 2013、Jinekら, Science 337:816-821 2012などを参照のこと。
ここで、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）とは、短い繰り返し配列を含むDNA配列のことであり、細菌や古細菌に見られる。CRISPRの近傍にはCas(CRIPR-associated)蛋白ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。細菌や古細菌に外部から侵入した外来性DNAは、Cas蛋白ファミリーによって断片化される。Cas蛋白ファミリーのうちCas9はヌクレアーゼで、外来性DNA上のPAM（Proto-spacer adjacent motif）と呼ばれる配列を認識し、その上流を切断し宿主（細菌など）のCRISPR配列に挿入する。Cas9は、単独では切断活性を示さず標的部位（切断を行うDNA上の部位）の認識に関わる1本鎖のガイドRNA(sgRNA)との相互作用で活性化する。sgRNAは、標的部位と相補的な配列を有しており、Cas9とsgRNA複合体は、この相補的な部分を利用して標的部位に結合し、標的部分を切断する。PAM配列から10〜12塩基の領域において、1塩基でも、sgRNAとのミスマッチが存在していると、Cas9による切断活性は消失する。
発明者らは、sgRNA-Cas9複合体によるDNA切断活性を利用することで、正常な染色体由来のDNAのみを選択的に切断することができると考えた。PAM配列は、用いるCas9によって異なるが、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）由来のCas9の場合、PAM配列は、NGGであり、グアニンが２つ並んだ配列さえあれば、その上流近傍をsgRNA-Cas9複合体で切断することができる。つまり、切断したい正常な染色体由来のDNAの標的領域（切断する部位を含む）の近傍のNGG配列を見つけ、適当なsgRNAを作製すれば、正常な染色体由来のDNAを切断することができることになる。
検出目的の変異が存在する領域の正常なDNA配列を標的として、sgRNAを作製し、sgRNA-Cas9複合体で処理を行えば、正常な染色体由来のDNAのみ変異の生じる部位で切断され、変異を有する染色体由来のDNAは切断されずに残るため、サンプル中の変異を有する染色体由来のDNAの存在比率を上昇させることが可能となる。
【００３４】
本実施形態においては、血液中などに存在する遊離DNA（cfDNA）を用いて、卵巣癌への罹患の有無、あるいは、卵巣癌への罹患の可能性を診断する方法を提供する。血液中に存在する遊離DNAには、腫瘍部位由来のDNA以外に、正常細胞由来のDNAが多数含まれており、量的に僅かな腫瘍部位由来のDNAに存在する変異を検出することは、これまでの技術では困難であった。
このような状況において、本発明者らは、CRISPR/Casシステムを利用し、Cas9とsgRNA複合体で変異を有さない正常細胞由来のDNAを特異的に切断し、変異を有するDNAのサンプル中における存在比率を上昇させることで、検出感度を顕著に高められることを見出した。
【００３５】
sgRNAは、自ら調製してもよく、市販のキット（例えば、Clontech）などを使用して、調製してもよい。また、Cas9についても、市販品を購入して使用してもよい。sgRNA-Cas9複合体で処理した被験者由来のサンプルは、検出目的の変異を含むDNA（すなわち、腫瘍部位由来の染色体DNA、または、該染色体DNAを鋳型として増幅したDNA断片）の存在比率が上昇しており、このサンプルを用いて、例えば、PCR法、FISH法、CGH法、ISH法、定量PCR法、シデジタルPCR法又はシーケンシング法により変異の有無を確認することができる。
その結果、検査対象である卵巣癌の発症と関連する変異が検出された場合、検査対象の被験者は、当該卵巣癌に罹患しているか、あるいは、罹患する可能性があると判断することができる。例えば、卵巣明細胞腺癌での既知の体細胞変異である3番染色体上の遺伝子PIK3CAのp.H1047R（PIK3CA遺伝子の1047番目のアミノ酸がヒスチジンからアルギニンに変わっている変異）を被験者の染色体上から検出された場合、当該被験者は、卵巣明細胞腺癌に罹患しているか、あるいは、罹患する可能性があると診断できる。
【００３６】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
１．実験方法
１−１．被験者
本発明に係る、卵巣明細胞腺癌と関連性を有する体細胞性コピー数変化（SCNAs; somatic copy number alterations）を検出するための研究は、慈恵大学、治験委員会のバイオメディカルリサーチ倫理委員会により承認されたものである。また、卵巣明細胞腺癌と診断された患者由来の外科的サンプルは、慈恵大学（東京、日本）、新潟大学大学院医歯学総合研究科（新潟、日本）、鳥取大学医学部（鳥取、日本）、京都大学大学院医学系研究科（京都、日本）、韓国成均館大学校医科大学（ソウル、韓国）、シャリテ大学病院（ベルリン、ドイツ）から提供頂いた。アフィメトリックス  マッピング  アレイ（アフィメトリック社）によるデータは、ピーター・マッカラン癌センター（メルボルン、オーストラリア）から取得し、国による差異に関する所見を確認するために使用した。
【００３８】
１−２．試料
腫瘍サンプルは、全て、患者のインフォームドコンセントを得た上で外科的手法により取得した。全てのサンプルは、凍結材料として集めた。癌細胞を80%以上含むクリオスタット切片を、顕微解剖し（Okamotoら, Clin Cancer Res. 11:6030-6039 2005）、DNAを抽出した。
【００３９】
１−３．アレイCGH法（Array comparative genomic hybridization）
体細胞性コピー数変化を検出するために、ヒトゲノムCGH 244A Oligo Microarray Kit (Agilent Technologie社)を使用した。染色体DNAの切断、標識及びハイブリダイゼーションは、キットに付属のプロトコルに従って行った。すなわち、腫瘍サンプル由来のDNA (2 μg) とコントロールDNA (2 μg)を、Rsa I及びAlu Iで切断し、各々、Cy5-dUTP及びCy3-dUTPで標識し、混合した。DNAの混合物をヒトゲノムCGH 244K  マイクロアレイにハイブリダイズした。ハイブリダイズ後、スライドガラスをDNAマイクロアレイスキャナー（Agilent Technologies社）でスキャンした。データは、スキャンイメージからFeature Extraction software, version 10.7.3.1 (Agilent Technologies社)を用いて抽出した。
【００４０】
１−４．統計処理
ゲノム上に存在する異常な染色体領域の浸透率とDNAのコピー数の異常は、Agilent Genomic Workbench 7.0  (Agilent Technologie社)のAberration Detection Method 2 quality-weighted interval score algorithmを用いて表した。遺伝子の位置は、National Center for Biotechnology Information (NCBI) build 36 (hg 19)で検索を行った。
検出されたコピー数の変化について、条件によりフィルターをかけた。染色体上の隣接するオリゴヌクレオチドが３又はそれ以上連続する領域の変化であって、増幅についてはLog２Ratio≧０．９、欠失についてはLog２Ratio≧１．５である場合にその遺伝子座における染色体数の変化を有意とした。
無増悪生存期間（PFS; progression-free survival、）及び全生存期間（OS; overall survival）は、Kaplan-Meier法を用い、ログランクテストにより、体細胞性コピー数変化による比較を行った。全ての統計的解析は、StatView-J 5.0を使用して行った。P<0.05の場合に統計的に有意であるとした。
【００４１】
１−５．SNPを利用した染色体DNAの増幅の確認実験
まず、国際ハップマッププロジェクト(Hapmap)からヒトゲノムに関するSNP（Single Nucleotide Polymorphism）の情報を入手した。遺伝子型を調べるにあたり日本人でヘテロ接合型の割合が大きいものを選択した。本実施例においては、8番染色体のANK1遺伝子の増幅を確認するために、ANK1遺伝子のエクソン１とエクソン２の間に存在するPosition 41747333のSNP(rs1532940)を選択した。このSNPに関する遺伝子型はAA、AT、TTの3種類であるが、Hapmapによると、日本人では、AA 46.7%、AT 53.3%、TT 0%とATの割合がAAやTTと比較して大きいことが確認できた。
当該SNPの遺伝子型を識別するための検査は、デジタルPCR法により行った（BioRad  装置：QX200TMDroplet DigitalTM PCR システム）。まず、それぞれの対立遺伝子に対し人工塩基を用いたプローブを作成した（Aである対立遺伝子対するプローブ；蛍光FAM  CA+C+C+A+GTGCT：Tである対立遺伝子に対するプローブ（配列番号１）；蛍光HEX  CA+C+C+T+GTGCT、＋は人工塩基（LNA；ロックト核酸。クエンチャーは、いずれのプローブにおいても3IABLFQを使用）（配列番号２）を示す。人工塩基を使用することでミスマッチとエキストラマッチのTm値の差を10℃以上広げることができ、より正確な検出が可能である。このプローブがアニールする位置を中心とした領域が、DNAが断片化された場合でも増幅可能なように、アンプリコン（PCR増幅産物）が、100bp以下になるように以下のプライマーを作成した。
Forward；5’-GCTTAGATACTTGCAAGCTTTATTG-3’  （配列番号３）
Reverse；5’-GCAAAGTTAGGAAGCCCTTT-3’  （配列番号４）
この場合、アンプリコンは、88bpとなる。
バフィーコート（Buffy coat、血液を遠心分離して生じる白血球の層)、又は、正常部位から回収したDNAについて、ANK1遺伝子の遺伝子型が、いずれであるかをデジタルPCR法により決定した。ここで、A:FAMとT:HEXの蛍光を測定し、PCR産物由来の振幅（Amplitude）がFAMについて、0と100（%）のいずれであるか（100であればA/A）、HEXについて0と100のいずれであるか（100であればT/T）、又は、FAMとHEXについて、50と50であるか(50、50であればA/T)のいずれの結果を示すかを確認した。
【００４２】
確認の結果、SNPを有することが分かった被験者（すなわち、A:T=50:50であるDNAサンプルが由来する被験者）の癌組織由来のDNA、又は、末梢血から調製した遊離DNA（cfDNA）を用いて、デジタルPCR解析を行った。SNPを有するANK1遺伝子領域の増幅の有無は、Aである対立遺伝子のコピー数とTである対立遺伝子のコピー数の比が、１からずれている場合に、増幅が生じていると判断することができる。
その他のSNPについても同様の判断を行うことができる。
【００４３】
上記Position 41747333のSNP(rs1532940)の他、表１に示すSNPを利用して、目的遺伝子の増幅の有無を確認した。各SNPの遺伝子型の検出において使用したプローブおよびプライマーの配列を表１にまとめた。
【表１】
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【００４４】
１−６．CRISPR/Casシステムを用いたPIK3CA遺伝子に存在する変異の検出
まず、PIK3CA遺伝子上の1047番目の変異部位（PIK3CA H1047R；ヒスチジンがアルギニンへ置換）近傍にPAM配列を認識するsgRNAを作製した。PAM配列の長さや塩基配列は細菌腫によってさまざまであり、例えば、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）ではNGG、サーモフィラス菌（Streptococcus thermophilus）ではNGGNGまたはNNAGAAWである。本実施例のPAM配列は、-NGG-である。
図２９に、H1047R変異の存在部位近傍の配列（配列番号２５）を示す。この領域には２つのPAM配列が存在しており、各配列に隣接する２０塩基（Fw1（配列番号２６）及びFw2（配列番号２７））及び１８塩基（Fw3（配列番号２８）及びFw4（配列番号２９））を標的配列として、各々に対するsgRNAを作製した（Clontech Laboratories, Inc. のGuide-itTM sgRNA InVitro Transcription and Screening Systemsを使用した）。ここで作製した４つのsgRNAのうち、Fw2を含むsgRNAを用いた場合に、変異型配列と野生型配列の切断効率の差が大きかったため、以後、このsgRNAを実験に使用した。
なお、sgRNAは、Clontech Laboratories, Inc. のGuide-itTM sgRNA InVitro Transcription and Screening Systemsの使用説明書に従って作製した。sgRNAの作製に用いたForward PCRプライマーを以下に示す。
Forward；5’-gcggcctctaatacgactcactatagggcaaatgaatgatgcacatcagttttagagctagaaatagca-3’
（配列番号３０）
Reverse；Guide-itTM sgRNA InVitro Transcription and Screening Systems中に含まれているものを使用。
【００４５】
検査対象のDNAを含むサンプルは以下のようにして調製した。
１．被験者の血液をBCT採血管（cell-Free DNA BCTTM、Streck社）で回収した。
２．回収した血液を1,600g、20分間、室温で遠心し、上清（血漿）を回収し、さらに16,000g、10分間、室温で遠心し、上清を回収した。
３．回収した上清（血漿）を、−80℃保存した。
４．解凍した血漿から、QIAamp Circulating Nucleic Acid（QIAGEN社）を使用して、cfDNAを回収した。
５．回収したcfDNAを、Qubit（登録商標）2.0 Fluorometer （QubitTM dsDNA HS Assay Kit）で定量した。
６．得られたcfDNA（2.5ng）を、以下のプライマーを用いて、デジタルPCR法によりPre amplificationした。
Forward；5’-actgagcaagaggctttgga-3’（配列番号３１）
Reverse；5’-gcatgctgtttaattgtgtgg-3’（配列番号３２）
７．デジタルPCR法により作製されたドロップレット（微小区画に分割してPCRを行った場合の微小区画中に存在する、PCR産物を含む反応液）からクロロホルム法にてPCR産物を抽出し、MinElute（QIAGEN社）でcfDNAの増幅産物の精製を行った。
８．上記７で精製したcfDNAの増幅産物を用い、Clontech Laboratories, Inc. のGuide-itTM sgRNA InVitro Transcription and Screening Systemsを使用し、添付の使用説明書に従ってH1047R変異を有さないDNAを、CRISPR/Casのシステムを用いて切断を行った。
【００４６】
切断後のDNAサンプルにH1041R変異の存在の有無をデジタルPCR法により確認した。
変異を有さない部位の検出用プローブは以下の通りである。
C+CA TG+A +T+GT G+CA（配列番号３３）（＋は人工塩基）
また、変異を有する部位の検出用プローブは以下の通りである。
C+CA TG+A +C+GT GCA（配列番号３４）（＋は人工塩基）
また、増幅用のプライマーは以下の通りである。
Forward；5’-TTGTGTGGAAGATCCAATCCA-3’  （配列番号３５）
Reverse；5’-GAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT-3’  （配列番号３６）
この場合、アンプリコンは、99bpとなる。
【００４７】
２．結果
２−１．卵巣明細胞腺癌と領域１〜５の増幅との相関について
染色体上の隣接するオリゴヌクレオチドが３又はそれ以上連続する領域であって、コピー数変化がLog２Ratio≧０．９である場合にその遺伝子座における染色体数の増幅を有意とし、領域１〜５が有意に増幅していると判断した。
領域１〜領域５における体細胞性コピー数の増幅の頻度を図１（領域１〜領域３）、図２（領域４）及び図３（領域５）に示した。ピークの部分が、増幅している領域に相当する。領域３については、PLAT遺伝子（42033118〜42101440）領域の増幅、IKBKB遺伝子/POLB遺伝子/DKK4遺伝子/VDAC遺伝子/SLC20A2遺伝子/SMIM19遺伝子領域（42155030〜42543909）の増幅、及びPLAT遺伝子〜SMIM19遺伝子（42033118〜42408140）の領域（領域３の全領域）の増幅と、卵巣明細胞腺癌との相関について確認することができた。
領域１〜５の染色体上の位置と確認した症例数等を表２にまとめた。
【表２】
2016198027.tif 000003
【００４８】
２−２．卵巣明細胞腺癌と領域６〜８の欠失との相関について
染色体上の隣接するオリゴヌクレオチドが３又はそれ以上連続する領域であって、コピー数変化がLog２Ratio≧１．５である場合にその遺伝子座における染色体の欠失を有意とし、領域６〜８が有意に増幅していると判断した。
領域６〜領域８における体細胞性コピー数の欠失の頻度を、図４（領域６）、図５（領域７）及び図６（領域８）に示した。ピークの部分が、欠失している領域に相当する。
領域６〜８の染色体上の位置と確認した症例数等を表３にまとめた。
【表３】
2016198027.tif 000004
【００４９】
次に、患者の生存期間との関連性について検討を行った。
領域３における増幅（PLAT遺伝子〜SMIM19遺伝子の領域）は、無増悪生存期間（PFS）の短縮と有意に関連していた（図７）。また、領域１〜領域５のうち、３つの領域以上で増幅が生じている症例においては、無増悪生存期間（図８）及び全生存期間（図９）のいずれも有意に短縮されることが分かり、予後不良であると判断された。
【００５０】
日本人において領域６において欠失がある群は、無増悪期間が短い傾向にあった（図１０）。また、子宮内膜合併症例（図１１）、または、日本人の子宮内膜合併症例（図１２）では、領域６において欠失がある群は、無増悪期間が有意に短かった。さらに、日本人において領域１〜３のうち１つの領域において欠失がある群は、無増悪期間が短い傾向にあった（図１３）
【００５１】
２−３．血液中の遊離DNAを用いた、ANK1遺伝子領域の増幅の確認
２−３−１．ANK1遺伝子上のSNP（染色体8  41747333、rs1532940）の利用（１）
次に、血液中に存在する遊離DNA（cfDNA）を用いて、領域１〜領域５の増幅の有無を確認できるかどうか、検討を行った。
以下に、領域２のANK1遺伝子の増幅の有無を、日本人由来のDNAサンプルを用いて確認した結果を示す。
まず、健常者のバフィーコート（Buffy coat、血液を遠心分離して生じる白血球の層)、から調製したDNAを用いて、ANK1遺伝子のSNP（chr8 41747333、rs1532940）の遺伝子型が、A/A、A/Tいずれのタイプであるかを確認した。図１４の上図は、ANK1遺伝子のSNP（chr8 41747333、rs1532940）の位置がAである場合に、下図は、Tである場合にポジティブな値を示す。健常者6人中、3人がSNPを有することが分かった（N6、N7、N8）。また、SNPを有する健常者のバフィーコート由来の3つのDNAサンプルを用いて、染色体8の41747333の位置がAであるANK1遺伝子のコピー数と、Tであるコピー数の比を調べたところ、全てのサンプル共に1:1であり、ANK1遺伝子の増幅は確認されなかった（図１５）。
次に、ANK1遺伝子にこのSNPを有する3人の健常者の血液からcfDNAを調製し、上記と同様にANK1遺伝子の増幅の有無を確認したところ、Aである対立遺伝子とTである対立遺伝子のコピー数の比は1であり、cfDNAを用いた場合もANK1遺伝子の増幅は確認されなかった（図１６）。
【００５２】
デジタルPCR法による、健常者由来のDNAを用いたANK1遺伝子の増幅の有無の解析結果を踏まえて、卵巣明細胞腺癌患者由来のDNAを用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した。
まず、卵巣明細胞腺癌患者（17症例）のバフィーコートからDNAを回収し、健常者サンプルの場合と同様にSNPの有無を確認したところ、7症例にSNPが確認された（図１７）。そして、SNPが確認された7症例のバフィーコート由来のDNAについて、染色体8の41747333の位置がAであるANK1対立遺伝子のコピー数と、Tであるコピー数の比を調べたところ、ほぼ1であることも確認された（図１８）。
次に、SNPを保持することが確認された被験者（7例）の癌部位からDNAを調製し、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した。調製したDNAサンプルを用いて、デジタルPCR解析を行ったところ、41747333の位置がTである遺伝子型、すなわち、A/T及びT/Aの対立遺伝子のコピー数の比が≧1.3となって、増幅されていると判断されるものは、3症例であった（症例１５（15T）＝0.131、症例１６（16T）＝8.09、症例１７（17T）＝1.35）（図１９）。
【００５３】
癌部位から調製したDNAサンプルを用いたデジタルPCR解析により、ANK1遺伝子の増幅が確認された3症例について、被験者から抹消血を採取し、抹消血から調製した遊離DNA（cfDNA; cell free DNA）を用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無の確認を行った。
デジタルPCR解析の結果は、各症例における、ANK1対立遺伝子のコピー数の比は、症例１５ではA/T＝0.789、症例１６では1.19、症例１７では1.05であった。すなわち、症例１５に関し、抹消血由来の遊離DNAを用いて、ANK1遺伝子の増幅を確認できた（図２０）。
これら3症例以外の症例について、癌部位由来のDNAを用いたデジタルPCR解析の結果、対立遺伝子のコピー数比（A/T及びT/A）が、≦1.3の症例についても、cfDNAを用いて同様の解析を行ったところ、癌部位由来のDNAで、A/Tのコピー数比が、1.05、0.933、1.03であった症例、つまり、ANk1遺伝子の増幅が確認されなかった症例については、cfDNAを用いた場合において、各々、1.02、0.982、1.09という結果になり、cfDNAを用いた場合でも、ANK1遺伝子の増幅は確認されなかった。
【００５４】
さらに、ANK1遺伝子上の他のSNP（Gである対立遺伝子とTである対立遺伝子）（chr8 41658923、rs1579274）、MYST遺伝子上のSNP（Cである対立遺伝子とGである対立遺伝子）（chr8 41850222、rs11779404）、IKBKB遺伝子上のSNP（Cである対立遺伝子とTである対立遺伝子）（chr8 421807016、rs10958713）及びZNF217遺伝子上のSNP（Cである対立遺伝子とGである対立遺伝子）（chr20 52208838、rs1075390）のそれぞれのコピー数の比から、患者のcfDNA(2.5ng)を用いて各遺伝子の増幅の有無を確認した（表１）。
【００５５】
２−３−２．ANK1遺伝子上のSNP（染色体8  41658923、rs1579274）の利用（２）
次に、ANK1遺伝子中に存在する他のSNP（chr8 41658923、rs1579274）を利用して、ANK1遺伝子の増幅の有無を検討した。
バフィーコート由来のDNAサンプルを用いてSNPを保持することが確認された被験者（11例）の癌部位からDNAを調製し、ANK1遺伝子の増幅の有無を確認した。調製したDNAサンプルを用いて、デジタルPCR解析を行ったところ、染色体8  41658923の位置がG/T及びT/Gの対立遺伝子のコピー数の比が≧1.3となって、増幅されていると判断されるものは、6症例であった（症例１（1T）＝0.151、症例６（6T）＝1.69、症例１５（15T）＝0.144）、症例１６（16T）＝7.87、症例１８（18T）＝1.4、症例１９（19T）＝0.565）（図２１）。
【００５６】
癌部位から調製したDNAサンプルを用いたデジタルPCR解析により、ANK1遺伝子の増幅が確認された6症例について、被験者から抹消血を採取し、抹消血から調製した遊離DNA（cfDNA; cell free DNA）を用いて、ANK1遺伝子の増幅の有無の確認を行った。
デジタルPCR解析の結果は、各症例における、ANK1対立遺伝子のコピー数の比は、症例１ではG/T＝0.854、症例１５では0.671、症例１９では0.786という結果となり、これらの症例に関し、抹消血由来の遊離DNAを用いて、ANK1遺伝子の増幅を確認できた（図２２）。
【００５７】
２−２−３．MYST3遺伝子上のSNP（染色体8  41850222、rs11779404）の利用
MYST3遺伝子中に存在するSNP（chr8 41850222、rs11779404）を利用して、MYST3遺伝子の増幅の有無を検討した。
バフィーコート由来のDNAサンプルを用いてSNPを保持することが確認された被験者（7例）の癌部位からDNAを調製し、MYST3遺伝子の増幅の有無を確認した。調製したDNAサンプルを用いて、デジタルPCR解析を行ったところ、染色体8  41850222の位置がC/G及びG/Cの対立遺伝子のコピー数の比が≧1.3となって、増幅されていると判断されるものは、2症例であった（症例１５（15T）＝0.119、症例１６（16T）＝8.51）（図２３）。
【００５８】
癌部位から調製したDNAサンプルを用いたデジタルPCR解析により、MYST3遺伝子の増幅が確認された2症例について、被験者から抹消血を採取し、抹消血から調製した遊離DNA（cfDNA; cell free DNA）を用いて、MYST3遺伝子の増幅の有無の確認を行った。
デジタルPCR解析の結果は、各症例における、MYST3対立遺伝子のコピー数の比は、症例１５ではC/G＝0.82であったが、症例１６では判定不能であった。MYST3遺伝子上のSNP（染色体8  41850222、rs11779404）を利用し、患者由来の末梢血由来の遊離DNAを用いた場合には、1症例において、MYST3の増幅が確認できた（図２４）。
【００５９】
２−２−４．IKBKB遺伝子上のSNP（染色体8  42180716、rs10958713）の利用
IKBKB遺伝子中に存在するSNP（chr8 42180716、rs10958713）を利用して、IKBKB遺伝子の増幅の有無を検討した。
バフィーコート由来のDNAサンプルを用いてSNPを保持することが確認された被験者（7例）の癌部位からDNAを調製し、IKBKB遺伝子の増幅の有無を確認した。調製したDNAサンプルを用いて、デジタルPCR解析を行ったところ、染色体8  42180716の位置がC/T及びT/Cの対立遺伝子のコピー数の比が≧1.3となって、増幅されていると判断されるものは、4症例であった（症例５（5T）＝0.563、症例１５（15T）＝7.95、症例１６（16T）=6.89、症例１７（17T）=1.33）（図２５）。
【００６０】
癌部位から調製したDNAサンプルを用いたデジタルPCR解析により、IKBKB遺伝子の増幅が確認された4症例について、被験者から抹消血を採取し、抹消血から調製した遊離DNA（cfDNA; cell free DNA）を用いて、IKBKB遺伝子の増幅の有無の確認を行った。
デジタルPCR解析の結果は、各症例における、IKBKB対立遺伝子のコピー数の比は、症例１５ではC/T＝1.72となり、この症例において、抹消血由来の遊離DNAを用いることにより、IKBKB遺伝子の増幅を確認することができた（図２６）。
【００６１】
２−２−５．ZNF217遺伝子上のSNP（染色体20  52208838、rs1075390）の利用
ZNF217遺伝子中に存在するSNP（chr8 52208838、rs1075390）を利用して、ZNF217遺伝子の増幅の有無を検討した。
バフィーコート由来のDNAサンプルを用いてSNPを保持することが確認された被験者（9例）の癌部位からDNAを調製し、ZNF217遺伝子の増幅の有無を確認した。調製したDNAサンプルを用いて、デジタルPCR解析を行ったところ、染色体20  52208838の位置がC/G及びG/Cの対立遺伝子のコピー数の比が≧1.3となって、増幅されていると判断されるものは、4症例であった（症例５（5T）＝2.04、症例８（8T）＝0.747、症例１７（17T）=0.721、症例２１（21T）=2.12）（図２７）。
【００６２】
癌部位から調製したDNAサンプルを用いたデジタルPCR解析により、ZNF217遺伝子の増幅が確認された4症例について、被験者から抹消血を採取し、抹消血から調製した遊離DNA（cfDNA; cell free DNA）を用いて、ZNF217遺伝子の増幅の有無の確認を行った。
デジタルPCR解析の結果は、各症例における、ZNF217対立遺伝子のコピー数の比は、症例８ではC/G＝0.742となり、この症例において、抹消血由来の遊離DNAを用いることにより、ZNF217遺伝子の増幅を確認することができた（図２８）。
【００６３】
以上の結果から、抹消血などから調製した遊離DNAをサンプルとして使用しても、所望の染色体DNAの領域（例えば、本発明のおける領域１〜５など）の増幅の有無について、確認することが可能であることが明かとなった。なお、遊離DNAをサンプルとして使用する場合には、癌部位由来のDNAの含有率を多くすることで、感度の高い検出が可能になると考えられる。
【００６４】
２−３．PIK3CA遺伝子に存在する変異の検出結果
卵巣明細胞腺癌に高頻度に認められるPIK3CA遺伝子上のH1047Rの変異をsgRNAとCas9の複合体を使用したCRISPR/Casシステムを適用して検出した結果を表３に示す。
PIK3CA H1047R変異を有する４症例に由来するcfDNAを用いて検討をおこなった。変異の検出は、デジタルPCR法を用いて行った。
表４に、Pre-amplificationをせずにcfDNA 5ngを用いてデジタルPCR法により変異を検出した場合、cfDNA 2.5ngをPre-amplificationし、その増幅産物を用いてデジタルPCR法により変異を検出した場合、cfDNA 2.5ngをPre-amplificationし、その増幅産物に対しCRISPR/Casのシステムを用いて正常配列を持つ増幅産物を切断した後、デジタルPCR法により変異を検出した場合の変異の存在比率を示した。
【表４】
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CRISPR/Casのシステムを用いた場合には、Pre-amplificationにおけるアニーリングの時間を、60秒の場合と30秒の場合の２条件で検討をおこなった。各々、２回検討した結果を示す。
【００６５】
例えば、症例OC17の1回目の検討では、cfDNA 5ngをそのまま用いて変異を検出した場合及びcfDNA 2.5ngをPre-ampしてから変異を検出した場合、サンプル中における変異の存在比率は、各々、0.391%及び0.29%であったのに対し、CRISP/Casシステムで正常な配列由来のDNAを切断した場合には、変異の存在比率が、アニーリング60秒で3.29%、アニーリング30秒で1.58%にまで上昇した。他の症例においても同様の結果となった。
以上の結果から、卵巣癌に特有の変異を検出して、卵巣癌への罹患、あるいは、罹患の可能性を診断する場合、血中などに存在する遊離DNA（cfDNA）を用いて変異を検出する場合に、CRISPR/Casのシステム、すなわち、sgRNA-Cas9複合体を用いて変異の生じている配列領域で正常な染色体に由来するDNA断片を切断し、変異を有する染色体に由来するDNA断片の存在比率を上昇させ得ることが示された。このように、cfDNA由来のサンプル中の変異DNAの存在比率を上昇させることにより、非侵襲的で、かつ、感度の高い診断が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明の卵巣明細胞腺癌の診断方法を使用することで、卵巣明細胞腺癌の罹患の有無や、予後の診断を容易に行うことが可能となる。従って、本発明は卵巣明細胞腺癌の診断、さらに、治療分野においてその使用が期待される。
【図２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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