(57)【要約】【課題】細胞内で重要な役割を担う特定の内在遺伝子の転写をライブイメージングできる細胞を、より簡便に作製できる細胞の作製方法および該作製方法で作製された細胞を提供する。【解決手段】細胞の作製方法は、エンドヌクレアーゼで細胞内のゲノムにおける目的の遺伝子座を切断する切断工程と、相同組換え修復により前記ゲノムの切断された部位に第１のＤＮＡを挿入する挿入工程と、前記第１のＤＮＡが転写されたｍＲＮＡに結合する標識されたタンパク質をコードする第２のＤＮＡを前記細胞内に導入する導入工程と、を含む。【選択図】図１
2016198044.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドヌクレアーゼで細胞内のゲノムにおける目的の遺伝子座を切断する切断工程と、
相同組換え修復により前記ゲノムの切断された部位に第１のＤＮＡを挿入する挿入工程と、
前記第１のＤＮＡが転写されたｍＲＮＡに結合する標識されたタンパク質をコードする第２のＤＮＡを前記細胞内に導入する導入工程と、
を含む、
細胞の作製方法。
【請求項２】
前記エンドヌクレアーゼは、
プログラマブルエンドヌクレアーゼである、
請求項１に記載の細胞の作製方法。
【請求項３】
前記プログラマブルエンドヌクレアーゼは、
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅである、
請求項２に記載の細胞の作製方法。
【請求項４】
前記細胞は、
多能性幹細胞である、
請求項１から３のいずれか一項に記載の細胞の作製方法。
【請求項５】
前記第１のＤＮＡの塩基配列は、
ＭＳ２配列が繰り返された塩基配列である、
請求項１から４のいずれか一項に記載の細胞の作製方法。
【請求項６】
前記タンパク質は、
ＭＳ２コートタンパク質である、
請求項５に記載の細胞の作製方法。
【請求項７】
前記遺伝子座は、
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｌｃ２ａ３およびＳｔａｔ３からなる群から選択される遺伝子の遺伝子座である、
請求項１から６のいずれか一項に記載の細胞の作製方法。
【請求項８】
前記第２のＤＮＡは、
トランスポゼースで前記細胞内に導入される、
請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞の作製方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞の作製方法で作製された、
細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の作製方法および該作製方法で作製された細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療への応用の観点から、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）および胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などの多能性幹細胞の多能性維持機構および分化機構の解明が不可欠である。多能性維持機構および分化機構には、特定の遺伝子の働き、特には、遺伝子の発現調節が極めて重要である。
【０００３】
遺伝子の発現は、主に転写の段階で調節される。転写は、遺伝子の上流に存在するプロモーターのみならず、エンハンサーおよびサイレンサーなど種々の因子によって制御されている。このように種々の因子によって複雑に制御される転写の詳細を明らかにする手法として、生きた生体組織または細胞における内在遺伝子の転写のライブイメージングが知られている。
【０００４】
ライブイメージングでは、転写制御を可視化するための蛍光タンパク質などをコードする外来遺伝子を、ゲノムに挿入する遺伝子改変技術が用いられる。外来遺伝子をゲノムに挿入する技術として、相同組換えが知られている。相同組換えでは、外来遺伝子の両側に挿入部位の周辺と相同な塩基配列を有するＤＮＡを細胞に導入することで、相同組換え反応が起こり、外来遺伝子が挿入部位に挿入される。
【０００５】
相同組換え反応の頻度は、生物種あるいは細胞種によって大きく異なる。相同組換え反応の応用は、相同組換え反応の頻度が比較的高い酵母などの単細胞生物またはマウスＥＳ細胞に限られていた。しかし、マウスＥＳ細胞であっても、相同組換え反応の頻度は極めて低い。しかも二倍体であるマウスＥＳ細胞では、両対立遺伝子に外来遺伝子を一度に挿入することは、ほぼ不可能である。また、挿入する外来遺伝子が複雑な繰り返し配列などを含んでいる場合は、挿入の効率が極めて低下する。
【０００６】
外来遺伝子を細胞に導入する技術として、ＦＲＴ配列とＦＬＰリコンビナーゼとを用いる方法も知られている。例えば、非特許文献１では、ＦＲＴ配列とＦＬＰリコンビナーゼとを用いてゲノムに挿入したＭＳ２配列とＭＳ２コートタンパク質−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）融合タンパク質との結合を検出することで、哺乳類の細胞におけるサイクリンＤ１遺伝子の転写制御を解析している。ＦＲＴ配列とＦＬＰリコンビナーゼを用いる遺伝子の挿入では、ゲノムにＦＲＴ配列が組み込まれている細胞に、部位特異的組換え酵素であるＦＬＰを含むプラスミドＤＮＡとＦＲＴ配列と目的遺伝子を含んだプラスミドＤＮＡとを導入することで、ＦＲＴ配列が組み込まれている部位に目的遺伝子を含むプラスミドＤＮＡの塩基配列を挿入することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｈａｒｏｎ  Ｙｕｎｇｅｒ、外３名、「Ｓｉｎｇｌｅ−ａｌｌｅｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１０年、７、６３１-６３３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１に開示された上記方法でゲノムの目的の位置に外来遺伝子を導入するには、ＦＲＴ配列を当該部位に事前に組み込む必要がある。しかし、ＦＲＴ配列をゲノムの任意の位置に組み込むのは、上述のように、相同組換え反応の頻度が極めて低いため、非常に困難である。特に、哺乳動物など高等生物の細胞を用いる場合、両対立遺伝子にＦＲＴ配列を一度に挿入することはほぼ不可能である。また、ＦＲＴ配列をゲノムに組み込んだ後に、外来遺伝子をゲノムにさらに組み込む必要があるため、操作が煩雑になる。
【０００９】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、細胞内で重要な役割を担う特定の内在遺伝子の転写をライブイメージングできる細胞を、より簡便に作製できる細胞の作製方法および該作製方法で作製された細胞を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の第１の観点に係る細胞の作製方法は、
エンドヌクレアーゼで細胞内のゲノムにおける目的の遺伝子座を切断する切断工程と、
相同組換え修復により前記ゲノムの切断された部位に第１のＤＮＡを挿入する挿入工程と、
前記第１のＤＮＡが転写されたｍＲＮＡに結合する標識されたタンパク質をコードする第２のＤＮＡを前記細胞内に導入する導入工程と、
を含む。
【００１１】
この場合、前記エンドヌクレアーゼは、
プログラマブルエンドヌクレアーゼである、
こととしてもよい。
【００１２】
また、前記プログラマブルエンドヌクレアーゼは、
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅである、
こととしてもよい。
【００１３】
また、前記細胞は、
多能性幹細胞である、
こととしてもよい。
【００１４】
また、前記第１のＤＮＡの塩基配列は、
ＭＳ２配列が繰り返された塩基配列である、
こととしてもよい。
【００１５】
また、前記タンパク質は、
ＭＳ２コートタンパク質である、
こととしてもよい。
【００１６】
また、前記遺伝子座は、
Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｌｃ２ａ３およびＳｔａｔ３からなる群から選択される遺伝子の遺伝子座である、
こととしてもよい。
【００１７】
また、前記第２のＤＮＡは、
トランスポゼースで前記細胞内に導入される、
こととしてもよい。
【００１８】
本発明の第２の観点に係る細胞は、上記本発明の第１の観点に係る細胞の作製方法で作製される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、細胞内で重要な役割を担う特定の内在遺伝子の転写をライブイメージングできる細胞を、より簡便に作製できる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】共焦点レーザー顕微鏡で撮像したＮＭ−Ｇ細胞の画像を示す図である。
【図２】ＲＮＡ−ＦＩＳＨにおいて固定したＮＭ−Ｇ細胞の画像を示す図である。（ａ）は、ＭＣＰ−ＧＦＰのシグナルを撮像した画像を示す図である。（ｂ）は、Ｎａｎｏｇ遺伝子に対するＲＮＡ−ＦＩＳＨのシグナルを撮像した画像を示す図である。（ｃ）は、染色された細胞核を撮像した画像を示す図である。（ｄ）は、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の画像を重ね合わせた画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態および図面によって限定されるものではない。
【００２２】
（実施の形態）
本実施の形態に係る細胞の作製方法は、切断工程と、挿入工程と、導入工程と、を含む。まず、切断工程について説明する。切断工程では、エンドヌクレアーゼで細胞内のゲノムにおける目的の遺伝子座を切断する。エンドヌクレアーゼは、核酸鎖の両端ではないリン酸ジエステル結合を加水分解することで、核酸鎖を切断する核酸分解酵素である。エンドヌクレアーゼとして、特にプログラマブルエンドヌクレアーゼが好ましい。
【００２３】
プログラマブルエンドヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）は、ゲノム上の任意の標的配列の位置で該ゲノムを切断する。プログラマブルエンドヌクレアーゼは、特に限定されないが、例えば、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（以下、単に「ＴＡＬＥＮ」とする）、ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（以下、単に「ＺＦＮ」とする）およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ  ａｎｄ  Ｃｒｉｓｐｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）システムなどである。
【００２４】
ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ切断ドメインからなるポリペプチドである。ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインの結合部位において一対のＤＮＡ切断ドメインが近接して二量体を形成することによって、二本鎖ＤＮＡを切断する。ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールを繰り返して含み、それぞれのＤＮＡ結合モジュールが、ＤＮＡの特定の塩基対を認識するため、ＤＮＡ結合モジュールを適切に設計することによって、標的とする塩基配列を特異的に切断できる。
【００２５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムでは、ゲノム上のＰＡＭ配列に隣接する標的の塩基配列に相補的な塩基配列を有するガイドＲＮＡと、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと、を使用する。ゲノム上の標的とする塩基配列に結合したガイドＲＮＡを認識したＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡを切断する。
【００２６】
「目的の遺伝子座」とは、任意の遺伝子座、特には、内在の転写をライブイメージングしようとする遺伝子の遺伝子座である。切断工程では、遺伝子座の任意の部位を切断すればよいが、該遺伝子の確実な転写をライブイメージングするために、該遺伝子の近傍、特に下流（３’末端側）の部位を切断するのが好ましい。この場合、プログラマブルエンドヌクレアーゼは、当該部位近傍の塩基配列に応じて、公知の方法で設計される。
【００２７】
好ましくは、切断工程で切断する遺伝子座は、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４、Ｓｌｃ２ａ３およびＳｔａｔ３からなる群から選択される遺伝子の遺伝子座である。これらの遺伝子のうち、ＮａｎｏｇとＯｃｔ４は、多能性の獲得および多能性の維持に重要な遺伝子であるため、これらの遺伝子の転写をライブイメージングできれば、多能性の獲得または多能性の維持と当該遺伝子の転写制御との関係を解明することができる。
【００２８】
切断工程でゲノムが切断される細胞は、特に限定されず任意の細胞である。細胞は、初代培養細胞でも、継代した細胞株であってもよい。細胞は、大腸菌、酵母などの単細胞生物の細胞であっても、哺乳類など高等生物の細胞であってもよい。切断工程でゲノムを切断される細胞は、好適には、人為的にゲノムを改変されていない細胞であってもよいし、既にゲノムを改変された細胞であってもよい。好ましくは、当該細胞は、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞などの多能性幹細胞である。
【００２９】
切断工程では、例えば、エンドヌクレアーゼを発現するベクターを、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法およびリポフェクション法などの公知の方法で細胞に導入する。例えば、エンドヌクレアーゼとしてＴＡＬＥＮを発現するベクターを二倍体の細胞に導入する場合、ゲノムＤＮＡの二本鎖各々の標的とする塩基配列に応じて設計されたＴＡＬＥＮ発現ベクターを用いる。こうすることで、標的とする塩基配列の位置で、二本鎖ＤＮＡを切断することができる。発現ベクターは、公知のＤＮＡトランスフェクション法などで細胞に導入すればよい。
【００３０】
二本鎖ＤＮＡの切断は、多くの遺伝情報の損失またはガン化の原因になるため、細胞内で極めて迅速に修復される。修復の主な経路は、鋳型を利用せずに切断された末端同士を繋ぎ合わせる非相同末端結合修復、および姉妹染色分体あるいは相同なＤＮＡ領域を鋳型として切断された二本鎖ＤＮＡを修復する相同組換え修復である。
【００３１】
挿入工程では、上述の相同組換え修復を利用する。挿入工程では、相同組換え修復によりゲノムの切断された部位に第１のＤＮＡを挿入する。挿入工程において、該第１のＤＮＡは、切断工程で切断された部位に挿入される。このため、切断工程において、目的の遺伝子座、特にはタンパク質をコードするコーディング領域の下流でゲノムを切断することで、第１のＤＮＡを転写のライブイメージングに好適な部位に挿入することができる。
【００３２】
挿入される第１のＤＮＡの塩基配列は、例えば、ＭＳ２配列が繰り返された塩基配列（以下、単に「ＭＳ２リピート」とする）である。ＭＳ２配列が転写されたｍＲＮＡには、ＭＳ２コートタンパク質が結合する。このため、挿入工程において、上記切断工程で切断された部位に、ＭＳ２リピートを挿入することで、蛍光タンパク質などで標識されたＭＳ２コートタンパク質の存在下で、ＭＳ２リピートの転写のライブイメージングが可能となる。
【００３３】
ＭＳ２リピートにおいてＭＳ２配列は、２〜５０回、１０〜４０回、または２０〜３０回繰り返されてもよい。好適には、ＭＳ２リピートは、ＭＳ２配列が２４回繰り返された塩基配列である。
【００３４】
挿入される第１のＤＮＡの塩基配列は、上述のＭＳ２リピートの他には、該塩基配列が転写されたｍＲＮＡの塩基配列に、タンパク質が結合するものであれば、任意である。例えば、挿入される第１のＤＮＡの塩基配列と、該第１のＤＮＡが転写されたｍＲＮＡに結合するタンパク質との組み合わせは、ｂｏｘＢ配列とラムダＮタンパク質、およびＰＰ７配列とＰＰ７コートタンパク質である。なお、ｍＲＮＡに結合するタンパク質には、ペプチドも含まれる。
【００３５】
なお、ゲノムに第１のＤＮＡが挿入された細胞を選抜するために、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、およびピューロマイシンなどの抗生物質に対する耐性遺伝子を、切断された部位に挿入してもよい。
【００３６】
挿入工程では、例えば、挿入する第１のＤＮＡを含むベクターを、公知の方法で細胞に導入すればよい。
【００３７】
続いて、導入工程について説明する。導入工程では、上記第１のＤＮＡが転写されたｍＲＮＡに結合する標識されたタンパク質をコードする第２のＤＮＡを細胞内に導入する。タンパク質は、該ｍＲＮＡに結合するものであれば任意である。例えば、挿入される第１のＤＮＡの塩基配列がＭＳ２リピートの場合、ＭＳ２リピートが転写されたｍＲＮＡに結合するタンパク質は、ＭＳ２コートタンパク質である。
【００３８】
挿入される第１のＤＮＡの塩基配列がｂｏｘＢ配列の場合、細胞内に導入される第２のＤＮＡがコードするタンパク質は、ラムダＮタンパク質である。また、挿入される第１のＤＮＡの塩基配列がＰＰ７配列の場合、細胞内に導入される第２のＤＮＡがコードするタンパク質は、ＰＰ７コートタンパク質である。
【００３９】
細胞内への第２のＤＮＡの導入には、公知の導入法を用いればよい。導入法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、およびＤＥＡＥデキストラン法などが挙げられる。
【００４０】
導入工程では、好ましくは、第２のＤＮＡは、トランスポゼースで細胞内に導入される。トランスポゼースを用いる場合、例えば、トランスポゼースを発現するベクターと、細胞内に導入する第２のＤＮＡを含むベクターとを、細胞に公知の方法で導入すればよい。細胞内に導入する第２のＤＮＡを含むベクターにおける、細胞内に導入する第２のＤＮＡの両端に、トランスポゼースが認識する逆向き配列を付加しておけば、トランスポゼースが第２のＤＮＡを切り出し、効率良くゲノム中に導入することができる。
【００４１】
上記タンパク質は、好ましくは、緑色蛍光タンパク質で標識される。緑色蛍光タンパク質で標識するには、該タンパク質と緑色蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードする第２のＤＮＡを細胞内に導入すればよい。タンパク質の標識には、緑色蛍光タンパク質に限らず、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子および近赤外蛍光タンパク質（ｉＲＦＰ）遺伝子などのレポーター遺伝子を用いてもよい。
【００４２】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る細胞の作製方法によれば、エンドヌクレアーゼで切断された部位に挿入された第１のＤＮＡが転写されたｍＲＮＡを標識できるので、内在遺伝子の転写をライブイメージングできる細胞が得られる。上記切断工程では、エンドヌクレアーゼでゲノムを切断するので、ゲノムへの特定配列の事前の組み込みなどの操作が不要であるため、広い細胞種を対象として、ゲノムに第１のＤＮＡを簡便に挿入できる。
【００４３】
また、切断工程において、エンドヌクレアーゼでゲノムを切断するため、二本鎖ＤＮＡを切断できる。これにより、挿入工程で、両対立遺伝子に第１のＤＮＡを一度に挿入することができ、作業効率が向上する。
【００４４】
また、上記エンドヌクレアーゼは、プログラマブルエンドヌクレアーゼであってもよいこととした。ＴＡＬＥＮなどのプログラマブルエンドヌクレアーゼは、ゲノム上の任意の塩基配列に対して設計することができるので、切断工程において所望の部位を確実に切断することができる。
【００４５】
また、本実施の形態に係る細胞の作製方法の対象とする細胞は、多能性幹細胞であってもよいこととした。多能性幹細胞は、再生医療に応用するために、多能性維持機構および分化機構の解明が期待されている。本作製方法で作製される細胞は、内在遺伝子の転写のライブイメージングを可能にするので、多能性維持機構および分化機構の解明に大きく貢献できる。
【００４６】
また、上記第１のＤＮＡの塩基配列は、ＭＳ２リピートであってもよいこととした。さらに、導入工程において、ＭＳ２コートタンパク質をコードする第２のＤＮＡを細胞内に導入すれば、標識されたＭＳ２コートタンパク質が特異的にＭＳ２リピートに結合するので、第１のＤＮＡを挿入した部位の近傍、特に上流にコードされる遺伝子の転写制御の動態を詳細に解析できる。
【００４７】
なお、導入工程において、第２のＤＮＡがトランスポゼースで細胞内に導入されてもよいこととした。トランスポゼースによるＤＮＡの導入は確立されており、効率よく第２のＤＮＡを細胞内に導入することができる。
【００４８】
なお、本実施の形態に係る細胞の作製方法には、適宜、細胞を培養する工程などが含まれてもよい。
【００４９】
別の実施の形態では、本実施の形態に係る細胞の作製方法で作製された細胞が提供される。当該細胞は、上述のように特定の遺伝子の転写制御の動態を詳細に解析するのに有用である。また、当該細胞を被験物質に暴露することで、該被験物質の当該細胞への影響、特に該被験物質の遺伝子の転写に及ぼす作用を調べることができる。このため、本実施の形態に係る細胞の作製方法で作製された細胞は、薬剤スクリーニングの使用に好適である。
【００５０】
例えば、本実施の形態に係る細胞を用いた薬剤スクリーニングでは、切断工程、挿入工程および導入工程を経て作製された疾患に関連する細胞を被験物質に暴露する工程と、該細胞における導入工程で導入された標識されたタンパク質の転写部位への集積を定量する工程と、を含む。これにより、疾患関連マーカー遺伝子の転写制御に与える被験物質の影響を評価することができる。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００５２】
ＮＭ−Ｇ細胞の樹立
両Ｎａｎｏｇ対立遺伝子にＭＳ２配列が２４回繰り返された塩基配列（２４×ＭＳ２リピート）を挿入したマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ、ＮａｎｏｇＭＳ２／ＭＳ２、ＮＭ細胞）を、以下のように樹立した。
【００５３】
約０．５×１０５のＢｒｕｃｅ  ４  Ｃ５７ＢＬ／６  ｍＥＳＣ（Ｍｅｒｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、０．１％ゼラチンでコートした２４ウェルプレートに撒き、２ｉ培地で１２時間培養した。２ｉ培地の組成は、ＳｔｅｍＳｕｒｅ  Ｄ−ＭＥＭ（和光純薬工業社製）、１５％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸（和光純薬工業社製）、２ｍＭ  Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン溶液（和光純薬工業社製）、１０００Ｕ／ｍＬ  ＬＩＦ（和光純薬工業社製）、２０μｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン（和光純薬工業社製）、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、および１μＭ  ＰＤ０３２５９０１である。
【００５４】
培養後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて、１μｇのターゲティングベクターｐＴＶ−ｍＮａｎｏｇ−ＰＭＳ（配列番号１）と、２５０ｎｇのＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｅｃｔｏｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）発現ベクターｐＴＡＬＥＮ５ＣＡＧ−ｍＮａｎｏｇ−Ｌ（配列番号２）と、２５０ｎｇのｐＴＡＬＥＮ５ＣＡＧ−ｍＮａｎｏｇ−Ｒ（配列番号３）とを、ｍＥＳＣに導入した。
【００５５】
導入から２４時間後、細胞を１０ｃｍディッシュへ播き直し、２ｉ培地で７２時間培養した。次に、２ｉ培地にピューロマイシンを終濃度１μｇ／ｍＬになるように加え、薬剤選抜を開始した。２日おきにピューロマイシン含有２ｉ培地を交換した。
【００５６】
事前に、Ｔｒｙｐｓｉｎ（２．５％）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をＰＢＳで１／１０に希釈し、終濃度１ｍＭのＥＤＴＡを加えることで調製したトリプシン溶液８μＬを、Ｕ底９６ウェルプレートに入れ、３７℃になるように温めておいた。一方、ゼラチンコートした平底９６ウェルプレートに２００μＬまたは１００μＬずつ２ｉ培地を入れ、３７℃になるように温めておいた。ここで、２００μＬの２ｉ培地を入れたウェルをウェルＡとし、１００μＬの２ｉ培地を入れたウェルをウェルＢとする。
【００５７】
ピューロマイシン含有２ｉ培地で１４日ほど培養し、上記ディッシュにコロニーが形成されていることを確認した。位相差顕微鏡で観察しながら、チップの先端でコロニーを回収した（８μＬ）。コロニーを上記調整したトリプシン溶液に入れ、よくピペッティングした。最大で４８コロニー分回収した。コロニーを含むトリプシン溶液を、３７℃で２分間インキュベートした。５０μＬに設定した８連ピペットでウェルＡから培地を吸い、トリプシン溶液で処理した細胞をピペッティングにより懸濁し、ウェルＡに戻し、さらによくピペッティングした。続いて、ウェルＡの細胞含有培地５０μＬを、ウェルＢに移した。
【００５８】
ウェルＡおよびウェルＢに含まれる細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で２〜７日ほど培養した。培地が黄色くなりつつあるウェルＡが認められたら、培地を捨て、ゲノム抽出液を５０μＬずつ加えた。ゲノム抽出液の組成は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２％  ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌ  プロテイナーゼＫである。ウェルＡ内の細胞を３７℃で５分間インキュベートしてから、８連ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）チューブに移した。８連ＰＣＲチューブを５５℃で１時間インキュベートし、５０μＬのイソプロパノールを加えてよく撹拌した。次に、当該８連ＰＣＲチューブを４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を捨て、７０％エタノールを加えて、タッピングにより軽く撹拌した。そして、１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、５分間真空乾燥した。続いて、２０μＬのＴＥバッファーを加え、６５℃で１時間インキュベートし、沈殿を溶解した。
【００５９】
ここで、ＫＯＤ  ＦＸ  ｎｅｏ（東洋紡社製）を使用したゲノミックＰＣＲによって、簡易的にターゲティング成否を確認した。ＰＣＲのプライマーをホモロジーアームの外側に設定することにより、ターゲティングの成否に加え、片対立遺伝子のみか、両対立遺伝子でターゲティングされたかを確認できる。ＰＣＲは一反応当たり６μＬのスケールとした。反応液の組成は、１μＬのｄｄＨ２Ｏ、３μＬの２×Ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏ、１．２μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．６μＬの抽出ＤＮＡ、０．０３６μＬのフォワードプライマー（５０μＭ、配列番号４）、０．０３６μＬのリバースプライマー（５０μＭ、配列番号５）、０．１２μＬのＫＯＤ  ＦＸ  Ｎｅｏポリメラーゼである。ＰＣＲの反応条件は、９４℃で２分間、続いて、９８℃で１０秒→６０℃で１５秒→６８℃で１０分を２８サイクル、さらに、６８℃で１０分間とした。ＰＣＲ産物は４℃で保存した。
【００６０】
ＰＣＲ産物およびサイズマーカーを０．５×ＴＢＥ、０．８％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色した。導入されていなければ、およそ３．６ｋｂｐ、導入されていれば７．１ｋｂｐにバンドが出現する。マウスＥＳ細胞は２倍体なので２つのＮａｎｏｇ遺伝子を持っている。そこで、両方のＮａｎｏｇ遺伝子にＭＳ２を含む外来ＤＮＡが導入されたクローンを選択した。選択したウェルＡに対応するウェルＢのクローンを増殖させた。
【００６１】
続いて、ターゲティングの成否を、サザンブロットによって次のように確認した。両対立遺伝子に外来ＤＮＡが導入されたと思われるクローンのみを２４ウェルプレートに移し、培養した。この時、クローンを半分に分けておき、一方を保存用、他方をＤＮＡ回収用とした。
【００６２】
十分に細胞が増殖したら、保存用については、ＰＢＳで洗浄後、２００μＬのトリプシン溶液を加え、２分間３７℃で培養した。その後、２００μＬのＢａｍｂａｎｋｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔ（日本ジェネティクス社製）を加え、よく混ぜ、クライオチューブに移し、−８０℃で保存した。
【００６３】
一方、ＤＮＡ回収用については、５００μＬのＰＢＳで洗浄後、５００μＬのゲノム抽出液を加え、３７℃で１０時間インキュベートし、細胞を溶解した。その後、得られた溶液を１．５ｍＬチューブに移し、５００μＬのイソプロパノールを加え、よく混ぜた。次に、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ゲノムＤＮＡを沈殿させた。上清を廃棄し、５００μＬの７０％エタノールを加え、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、再度７０％エタノールで洗浄した。次に、上清を捨て、１０分間、室温でインキュベートし、エタノールを蒸発させた。
【００６４】
沈殿したゲノムＤＮＡに５０μＬのＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、軽く混ぜ、６５℃で１時間インキュベートした。そして、ＤＮＡ量を定量し、５００ｎｇ／μＬになるようにＤＮＡ溶液を調製した。
【００６５】
サザンブロットで使用したプローブは、塩基配列を配列番号６に示すｐＢＳＫΔＢ−ｍＮａｎｏｇ５ｐｒｏｂｅおよび配列番号７に示すｐＢＳＫΔＢ−ｍＮａｎｏｇ３ｐｒｏｂｅを鋳型として調製した。５’プローブの作製のために、ｐＢＳＫΔＢ−ｍＮａｎｏｇ５ｐｒｏｂｅを鋳型として、塩基配列を配列番号８に示すフォワードプライマーおよび塩基配列を配列番号９に示すリバースプライマーを用いた。また、３’プローブの作製のために、ｐＢＳＫΔＢ−ｍＮａｎｏｇ３ｐｒｏｂｅを鋳型として、塩基配列を配列番号１０に示すフォワードプライマーおよび塩基配列を配列番号１１に示すリバースプライマーを用いた。Ａｍｐプローブは、ｐＢＳＫΔＢ−ｍＮａｎｏｇ５ｐｒｏｂｅを鋳型とし、塩基配列を配列番号１２に示すフォワードプライマーおよび塩基配列を配列番号１３に示すリバースプライマーを用いて作製した。プローブの作製にはＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用した。
【００６６】
サザンブロットは、ＤＩＧ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を使用して行った。上記で調整したゲノムＤＮＡ  １０μｇ分を、制限酵素ＥｃｏＮＩとＡｆｌＩＩで一晩処理した。その他の操作はキットの説明書に従った。１つのプローブで現像後、リプローブし、その他のプローブでも同様に現像した。５’プローブを使用した場合、ターゲティングが起こっていれば２．３ｋｂ、ターゲティングが起こっていなければ３．７ｋｂのバンドが得られる。一方、３’プローブを使用した場合、ターゲティングが起こっていれば４．５ｋｂ、ターゲティングが起こっていなければ３．７ｋｂのバンドが得られる。
【００６７】
また、Ａｍｐプローブを使用した場合、バンドが見られれば、ランダムインテグレーションで予期せずにプラスミドＤＮＡ断片がゲノム中に取り込まれている可能性がある。
【００６８】
そこで、Ａｍｐプローブでバンドが検出されたクローンを以降の実験から排除した。５’プローブを使用した場合に２．３ｋｂのバンドが得られ、かつ３’プローブを使用した場合に４．５ｋｂのバンドが得られたクローン、すなわち所望の相同組換えが起こっていたクローンをＴＰ細胞（ＮａｎｏｇＴＰ−ＭＳ２／ＴＰ−ＭＳ２）と名付けた。
【００６９】
ＴＰ細胞を培養し、約０．５×１０５個のＴＰ細胞を０．１％ゼラチンでコートした２４ウェルプレートに撒き、２ｉ培地で一晩培養した。１２時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ２０００を用いて５００ｎｇのＣｒｅリコンビナーゼ発現ベクターｐＣＡＧ−Ｃｒｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  １３７７５）をＴＰ細胞に導入した。導入から２４時間後、トリプシン溶液で細胞を剥がして回収し、その１／１００量をゼラチンコートした１０ｃｍディッシュに撒き直した。
【００７０】
撒いてから４日後に２μＭのガンシクロビルを含む２ｉ培地でＴＰ細胞を培養した。一日おきにガンシクロビルを含む新しい培地に交換し、１０日間培養した。８つの形成されたコロニーを上述のように回収し、上記と同様にゲノミックＰＣＲによって、ｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が除去されたか否かを確認した。細胞にＣｒｅリコンビナーゼを発現させることで、ｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が効率よく除去され、ＰＣＲ産物のサイズが４．６ｋｂとなる。
【００７１】
さらに、ｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が除去されたクローンを増殖させ、上記と同様にサザンブロッティングを行った。
【００７２】
５’プローブを使用した場合、ｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が除去されていれば、５．２ｋｂにバンドが得られる。一方、３’プローブを使用した場合、ｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が除去されていれば、５．２ｋｂのバンドが得られる。５’プローブおよび３’プローブを用いて、ｌｏｘＰ配列に挟まれた領域が除去されたことが確認されたクローンをＮＭ細胞とした。
【００７３】
次に、ＮＭ細胞に核移行シグナル（ＮＬＳ）−ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させるために、約０．５×１０５個の細胞を０．１％ゼラチンでコートした２４ウェルプレートに撒き、２ｉ培地で一晩培養した。１２時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）  ２０００を用いて、２００ｎｇのｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゼース発現ベクターｐＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅ（Ｄｒ．Ｎａｎｃｙ  Ｌ．  Ｃｒａｉｇより提供）と４００ｎｇのｐＬＲ５−ＣＡＧ−ＭＣＰ−ＧＦＰとを、ＮＭ細胞に導入した。ｐＣＭＶ−ｈｙＰＢａｓｅの塩基配列を配列番号１４に示す。ｐＬＲ５−ＣＡＧ−ＭＣＰ−ＧＦＰの塩基配列を配列番号１５に示す。
【００７４】
導入から２４時間後、細胞をトリプシン処理して剥がし、その１／１００量をゼラチンコートした１０ｃｍプレートに撒き直した。巻き直して３日後から２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む２ｉ培地で培養した。二日おきにＧ４１８を含む新しい培地に交換し、１０日間培養した。８つの形成されたコロニーを回収し、ゼラチンコートしたμ−Ｓｌｉｄｅ  ８−ｗｅｌｌ（Ｉｂｉｄｉ社製）に移した。蛍光顕微鏡下でＧＦＰが適度に発現していることが確認されたクローンを、ＮＭ−Ｇ細胞とした。
【００７５】
Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社から購入したＮａｎｏｇイントロンを標的とするＲＮＡ−ＦＩＳＨ用のプローブを用いて、説明書に従ってＮａｎｏｇ遺伝子に対してＲＮＡ−ＦＩＳＨを行った。なお、ＲＮＡ−ＦＩＳＨでは、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：１０００、以下「Ｈｏｅｃｈｓｔ」とする）で細胞核を染色した。なお、ＲＮＡ−ＦＩＳＨ用のプローブの塩基配列は、配列番号１６〜３１に示されている。
【００７６】
（結果）
図１は、共焦点レーザー顕微鏡（ＣＳＵ−Ｗ１共焦点ユニットおよび１．４ＮＡの１００×Ｏｌｙｍｐｕｓ油浸対物レンズを備えるＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８３顕微鏡）によるＮＭ−Ｇ細胞の画像を示す。図中の破線は個々の細胞核を示す。図中の矢印は、Ｎａｎｏｇの転写位置と推測される輝点を示す。なお、スケールバーは５μｍに相当する。３個のＮＭ−Ｇ細胞を観察すると、輝点がないＮＭ−Ｇ細胞、輝点が１個のＮＭ−Ｇ細胞、および輝点が２個のＮＭ−Ｇ細胞が観察された。
【００７７】
図２は、ＲＮＡ−ＦＩＳＨにおいて固定したＮＭ−Ｇ細胞の共焦点レーザー顕微鏡による画像を示す。細胞核内にＭＣＰ−ＧＦＰのシグナルを認めた（図２（ａ）参照）。Ｎａｎｏｇ遺伝子に対するＲＮＡ−ＦＩＳＨのシグナルも細胞核内に認めた（図２（ｂ）参照）。Ｈｏｅｃｈｓｔで染色された細胞核内において（図２（ｃ）参照）、ＲＮＡ−ＦＩＳＨのシグナルと、ＭＣＰ−ＧＦＰのシグナルとの位置が一致していた（図２（ｄ）参照）。したがって、ＭＣＰ−ＧＦＰの輝点は、Ｎａｎｏｇ遺伝子の転写位置を示している。なお、スケールバーは５μｍに相当する。
【００７８】
Ｎａｎｏｇの他に、Ｏｃｔ４、Ｓｌｃ２ａ３、Ｓｔａｔ３遺伝子においても片対立遺伝子にＭＳ２リピートを挿入した細胞株をＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲを利用して樹立した。それぞれの細胞株でＭＣＰ−ＧＦＰの輝点を確認した。本実施例から、本発明によれば、生きた細胞内で特定の遺伝子の転写を可視化することが可能である。
【００７９】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、遺伝子の転写のライブイメージング用の細胞の作製に好適である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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