(57)【要約】      （修正有）【課題】キサンチンオキシダーゼ活性の阻害し、尿酸レベルを低下させるための新規方法の提供。【解決手段】培地中でグルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスを培養して得られた組成物を用いて、痛風又は高尿酸血症に羅患している被験者に投与してキサンチンオキシダーゼを阻害し、尿酸レベルを減少させる方法。被験者の尿酸値を低下させるためのグルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスの代謝物を含む組成物と、前記組成物の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地中で酢酸菌を培養して組成物を形成することと、
それを必要とする被験者に前記組成物を尿酸レベルを低下させるのに有効な量で投与することと、
を含み、前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである、被験者における尿酸レベルを低下させる方法。
【請求項２】
前記酢酸菌は、受託番号ＤＳＭ２８９０２で寄託されたグルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６、並びに受託番号ＤＳＭ２８８９３で寄託された酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１；受託番号ＤＳＭ２８８９４で寄託されたＡＨＵ０２；ＡＨＵ０３；およびＡＨＵ０４からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験者は痛風または高尿酸血症に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記投与工程の前に、前記組成物から前記酢酸菌を除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記培地は、Ｍ１Ａ培養液、米エキス、ソルガムエキス、グレープジュース、およびプラムジュースからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、酢またはドリンク剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物を凍結乾燥して粉末を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
培地中で酢酸菌を培養して組成物を形成することと、
キサンチンオキシダーゼを前記組成物と接触させることと、
を含み、前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである、キサンチンオキシダーゼを阻害する方法。
【請求項１０】
前記酢酸菌は、受託番号ＤＳＭ２８９０２で寄託されたグルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６、並びに受託番号ＤＳＭ２８８９３で寄託された酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１；受託番号ＤＳＭ２８８９４で寄託されたＡＨＵ０２；ＡＨＵ０３；およびＡＨＵ０４からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触工程は、キサンチンオキシダーゼを有する被験者に前記組成物を経口投与することによって達成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記培地はＭ１Ａ培養液、米エキス、ソルガムエキス、グレープジュース、およびプラムジュースからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
酢酸菌を培地に接種することと、
前記培地中で前記酢酸菌を培養して組成物を形成することと、
を含み、前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである、被験者の尿酸レベルを低下させるための組成物を製造する方法。
【請求項１４】
前記酢酸菌は、受託番号ＤＳＭ２８９０２で寄託されたグルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６、並びに受託番号ＤＳＭ２８８９３で寄託された酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１；受託番号ＤＳＭ２８８９４で寄託されたＡＨＵ０２；ＡＨＵ０３；およびＡＨＵ０４からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酢酸菌を前記培地から除去することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記培地はＭ１Ａ培養液、米エキス、ソルガムエキス、グレープジュース、およびプラムジュースからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、酢またはドリンク剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記除去工程の前の培養密度が１×１０７〜１×１０８細胞／ｍＬである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
被験者の尿酸レベルを低下させるための組成物であって、
酢酸菌の代謝産物を含み、
前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである、組成物。
【請求項２０】
前記酢酸菌は、受託番号ＤＳＭ２８９０２で寄託されたグルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６、並びに受託番号ＤＳＭ２８８９３で寄託された酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１；受託番号ＤＳＭ２８８９４で寄託されたＡＨＵ０２；ＡＨＵ０３；およびＡＨＵ０４からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
食品成分をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
食品である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１４年８月２１日に出願された米国出願番号１４／４６５０９４号の優先権を主張する。その出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、酢酸菌、およびそれらの発酵代謝産物によるキサンチンオキシダーゼ活性の阻害に関する。
【背景技術】
【０００３】
尿酸は、体内のプリン代謝の最終産物である。血中の尿酸の高いレベルは、関節、腎臓および他の臓器における尿酸結晶の形成および堆積につながる。血中の尿酸濃度が７ｍｇ／ｄＬよりも高い場合は高尿酸血症であるとみなされる。
【０００４】
高尿酸血症は、痛風、高血圧、心血管疾患、糖尿病、および腎臓病と関連する一般的な代謝障害である。１９９３年から２００８年にかけて台湾で行われた疫学調査では、男性患者と女性患者はそれぞれ２１．６％と９．５７％の割合で高尿酸血症を示した。
【０００５】
キサンチンオキシダーゼは、尿酸の合成における重要な酵素である。その結果、キサンチンオキシダーゼ活性の阻害は、尿酸の産生を減少させることができる。実際には、キサンチンオキシダーゼ阻害剤であるウリカーゼは、血中の尿酸濃度を低下させるのに効果的である。ウリカーゼは、ヒトでは見られない酵素である。一般的には、組換哺乳類タンパク質として単離され、静脈内注入によって投与される。それなりに、製造するのに高価であり、管理が困難であり得る。
【０００６】
アロプリノールもキサンチンオキシダーゼ阻害剤である。この化合物は、より低い血清尿酸値に臨床的に投与される。しかし、アロプリノールは、特定の場合に致死性のあるアレルギー反応、胃腸の不快感、白血球減少症および血小板減少症、肝炎、腎症、および６−メルカプトプリン毒性などの副作用を持っている。
【０００７】
高尿酸血症のための既存の治療の欠点に鑑みて、多くのバイオ医薬品企業が新しい尿酸降下薬の開発に焦点を当てた。例えば、Ｉｚｕｍｉｄａらがジャーナル抗生物質（Ｊ．  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）５０：９１６−９１８には、海洋細菌アグロバクテリウムアウランチアカム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）から、尿酸値を下げることができる化合物、すなわちヒドロキシアカロン（ｈｙｄｒｏｘｙａｋａｌｏｎｅ）を単離した。
【０００８】
他の微生物種も、尿酸を低下させる能力を有することが示されている、例えば、酢酸菌アセチ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ）、酢酸菌パステウリアナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、酢酸菌ペルオキジダンス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐｅｒｏｘｙｄａｎｓ）、クルイベロミセス・フラジリス、枯草菌、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ペントサス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・オリス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、およびサッカロマイセス・セレビシエ、の菌株。参考として、米国特許出願公開２０１０／０３１６６１８、２０１１／００１４１６８および２０１３／０３３０２９９、欧州特許出願公開２４５７５７６および１６４９８６３、中国特許出願公開ＣＮ１０２３７０８５９、そして、韓国特許出願公開ＫＲ２０１３００９９６５３およびＫＲ２０１３０００４４５６が挙げられる。
【０００９】
容易に製造され、安全に投与することができ、天然源からの新しいキサンチンオキシダーゼ阻害剤を開発する必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１０】
この必要性に応え、被験者における尿酸レベルを低下させるための方法が開示されている。前記方法は、培地中で酢酸菌を培養して組成物を形成し、尿酸のレベルを低下させるのに有効な量で組成物を被験者に投与する工程を含む。前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイ（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）または酢酸菌パステウリアナス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）である。
【００１１】
また、キサンチンオキシダーゼを阻害するための方法も開示されている。前記方法は、培地中で酢酸菌を培養して組成物を形成し、キサンチンオキシダーゼを前記組成物と接触させる工程を含む。ここでも、前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである。
【００１２】
また、被験者における尿酸レベルを低下させるための組成物を製造する方法もまた、本発明の範囲内のものである。
【００１３】
前記方法は、培地に酢酸菌を接種し、前記培地中で前記酢酸菌を培養する工程を含む。前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである。
【００１４】
また、被験者における尿酸レベルを低下させるための組成物も提供される。前記組成物は、酢酸菌の代謝物を含む。前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである。
【００１５】
また、被験者における尿酸レベルを低下させるための医薬組成物および食品も開示されている。
【００１６】
前記医薬組成物は、酢酸菌の代謝物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とが含まれている。前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである。
【００１７】
前記食品は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスの代謝物を含む酢、ドリンク剤、ヨーグルト、飲料、アイスクリーム、サワーミルク、ビオザイム、またはチーズである。
【００１８】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、下記の説明、図面および実施例において記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、いくつかの実施形態の詳細な説明から、また特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書に引用される全ての刊行物および特許文献は、その全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、酢酸菌菌株のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す棒グラフである。
【図２】図２は、異なる培地で増殖させた酢酸菌パステウリアナス株ＡＨＵ０２のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す棒グラフである。
【図３】図３は、一定期間において異なる容量の培地で増殖させた酢酸菌パステウリアナス株ＡＨＵ０２のキサンチンオキシダーゼ阻害活性を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
上述したように、培地中で酢酸菌を、すなわちグルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスを培養して組成物を形成する工程を含む、被験者における尿酸レベルを低下させるための方法が開示されている。前記酢酸菌は、それぞれ、受託番号ＤＳＭ２８８９３およびＤＳＭ２８８９４で寄託された酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１およびＡＨＵ０２から選択することができる。また、前記酢酸菌パステウリアナス菌株は菌株ＡＨＵ０３およびＡＨＵ０４であってもよい。特定の実施形態では、前記酢酸菌は、受託番号ＤＳＭ２８９０２で寄託されたグルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６である。
【００２１】
培養工程は、培地中で行われる。前記培地は、Ｍ１Ａ培養液、米エキス、ソルガムエキス、グレープジュース、およびプラムジュースであってもよいが、これらに限定されない。前記培地は、リンゴジュースを含まないものである。特定の実施形態において、前記方法は、培養後および組成物を投与する前に、培地から前記酢酸菌を除去する工程を含む。
【００２２】
前記組成物は、酢やドリンク剤であってもよい。特定の実施形態において、前記方法は、前記組成物を凍結乾燥して粉末を形成する工程を含む。
【００２３】
実施形態において、組成物は、被験者に経口投与される。特定の実施形態において、被験者は、痛風または高尿酸血症に罹患している。
【００２４】
投与される組成物の量は、被験者における尿酸レベルを低下させるのに有効な量である。当業者は、例えば、被験者の血液中の尿酸の濃度の変化を測定することによって、有効量を容易に決定することができる。
【００２５】
キサンチンオキシダーゼを阻害する方法も提供される。上記のような方法では、培地中で酢酸菌を培養して組成物を形成することが必要である。前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスであってもよい。一つの実施形態では、前記酢酸菌は酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１、ＡＨＵ０２、ＡＨＵ０３、およびＡＨＵ０４から選択される。別の実施形態では、前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６である。
【００２６】
上述したように、培養工程は、培地中で行われる。前記培地は、Ｍ１Ａ培養液、米エキス、ソルガムエキス、グレープジュース、およびプラムジュースであってもよいが、これらに限定されない。前記培地は、リンゴジュースを含まないものである。特定の実施形態において、前記方法は、培養後および組成物をキサンチンオキシダーゼと接触させる前に、培地から前記酢酸菌を除去する工程を含む。
【００２７】
一つの実施形態において、接触工程は、インビトロで行ってもよい。例えば、キサンチンオキシダーゼの調製は、前記組成物と一緒に一つの容器内で行ってもよい。別の実施形態において、接触工程は、キサンチンオキシダーゼを有する被験者に組成物を経口投与することによって達成される。
【００２８】
上述のように、被験者の尿酸レベルを低下させるための組成物を製造する方法は、特に、培地に酢酸菌を接種する工程を含む。前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスである。一つの実施形態において、前記酢酸菌は酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１、ＡＨＵ０２、ＡＨＵ０３、およびＡＨＵ０４から選択される。特定の一つの実施形態では、前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６である。
【００２９】
前記方法はまた、培地中で前記酢酸菌を培養して組成物を形成する工程を含む。前記培地は、Ｍ１Ａ培養液、米エキス、ソルガムエキス、グレープジュース、およびプラムジュースであってもよいが、これらに限定されない。前記培地は、リンゴジュースを含まないものである。
【００３０】
特定の実施形態において、前記方法は、培養後および組成物を投与する前に、培地から前記酢酸菌を除去する工程を含む。好ましい実施形態では、前記除去工程の前の前記酢酸菌の培養密度が１×１０７〜１×１０８細胞／ｍＬである。
【００３１】
培地中で前記酢酸菌を培養して得られた組成物は、低温殺菌、放射線照射、オートクレーブ、および濾過等の方法によって滅菌してもよいが、これらの方法に限定されない。例えば、組成物を０．２μｍのフィルターを通して濾過することにより滅菌することができる。特に好ましい実施形態では、滅菌液体培養液は、濾過や遠心分離で細菌を除去してから、次いで濃縮される。
【００３２】
このように形成された組成物は、酢やドリンク剤としての食品であってもよい。さらなる実施形態において、前記組成物は、ヨーグルト、飲料、アイスクリーム、サワーミルク、ビオザイム（発酵した果実または野菜から抽出された酵素混合物）、またはチーズであってもよい。一つの特定の実施形態では、前記方法は、前記組成物を凍結乾燥して粉末を形成する工程を含む。
【００３３】
被験者における尿酸レベルを低下させるための組成物もまた、開示されている。前記組成物は、グルコン酢酸菌ハンセニイまたは酢酸菌パステウリアナスの代謝産物を含む。上記のように、前記酢酸菌は酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１、ＡＨＵ０２、ＡＨＵ０３、およびＡＨＵ０４から選択されうる。一つの実施形態において、前記酢酸菌は、グルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６である。前記組成物は、粉末の形態であってもよい。
【００３４】
上述の組成物は、１つまたは複数の食品成分、例えば、着色剤、酸性度調節剤、固化防止剤、酸化防止剤、増量剤、担体、乳化剤、風味増強剤、艶出し剤、防腐剤、安定剤、甘味料、増粘剤、栄養添加剤、および香味剤、を含むことができる。
【００３５】
特定の実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【００３６】
本明細書で使用される用語「担体」または「賦形剤」は、それ自体は治療薬ではなく、（ｉ）被験者への治療薬の送達のために、（ii）製剤に添加しその取扱いまたは貯蔵特性を改善するために、および／または（iii）投与単位の組成物を、経口投与に適するカプセルまたは錠剤などの離散粒子を容易に形成するために、担体、希釈剤、補助剤、またはビヒクルとして使用される任意の物質を意味する。
【００３７】
適切な担体または賦形剤は、医薬製剤または食品を製造する当該技術分野で知られている。
【００３８】
担体または賦形剤は、例えば、緩衝液、希釈剤、崩壊剤、結合剤、接着剤、湿潤剤、ポリマー、潤滑剤、流動促進剤、不快な味や臭いを隠すまたは中和するために添加した物質、調味料、着色剤、香料、及び組成物の外観を改善するために添加した物質、として含んでもよいが、これらに限らない。
【００３９】
許容される担体または賦形剤は、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸、炭酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、アカシアガム、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、デキストリン、マンニトールのナトリウムおよびカルシウム塩、ソルビトール、ラクトース、スクロース、デンプン、セルロース系材料（例えば、アルカン酸およびセルロースアルキルエステルのセルロースエステル）、低融点ワックス、カカオバター、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化ナトリウムまたは他の塩、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、グリセロールまたは粉末、ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびポリエチレングリコール）、および他の薬学的に許容される物質を含む。前記担体は、治療薬の薬理学的活性を破壊することがなく、また薬剤の治療量を送達するのに十分な用量で投与した場合に非毒性である。
【００４０】
別の実施形態において、前記組成物は、前記酢酸菌の代謝物以外に、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、およびサッカロミセス属等のプロバイオティク微生物を含めることもできるが、これらに限らない。例えば、乳酸菌ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、乳酸菌ペントサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、乳酸菌ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、乳酸菌オリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｏｒｉｓ）、ビフィズス菌ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の一つ以上を組成物中に含ませてもよい。特定の態様において、前記組成物は、上記のプロバイオティク微生物と、酢酸菌の代謝物との一つ以上を含み、前記酢酸菌は酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１、ＡＨＵ０２、ＡＨＵ０３、ＡＨＵ０４、およびグルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６から選択される。
【００４１】
当業者は、さらに詳述することがなくても、本明細書の開示に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。
【００４２】
したがって、以下の具体例は、単に説明的なものとして解釈すべき、いかなる様式でも本開示の残りの部分を制限するものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：酢酸菌によるキサンチンオキシダーゼの阻害活性
５１個の酢酸菌の菌株を個々にＭ１Ａプレート（２．５％マンニトール、０．５％酵母エキス、０．３％ペプトン、２％寒天）に接種し、プレートを３０℃で２日間培養しコロニーを形成した。
【００４４】
次のようにキサンチンオキシダーゼ阻害活性の測定を行った。
【００４５】
まず、各菌株の１０μＬを、Ｍ１Ａプレートからこすり取り９６ウェルプレートのウェルに添加した。その後１５０μＬの５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、８０μＬの１５０μＭキサンチンを各ウェルに加えた。２９０ｎｍの（ＯＤｂｅｆｏｒｅ）の初期吸光度の値は、各ウェルに１０μＬのキサンチンオキシダーゼ（０．１Ｕ）を追加する前に測定した。２５℃でプレートを３０分間培養した後、２９０ｎｍで（ＯＤａｆｔｅｒ）で吸光度を再び測定した。各サンプルのキサンチンオキシダーゼ阻害活性は、以下の式に従って計算した。
【００４６】
【数１】
2016065039.tif 000002
【００４７】
結果を図１に示す。５１個の異なる酢酸細菌株を検討した中で、７株だけはキサンチンオキシダーゼを３０％以上阻害した。特に、酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１は７３．６％のキサンチンオキシダーゼ活性を阻害した。
【００４８】
本出願人は、ブダペスト条約の条項の下で２０１４年６月５日に、酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１およびＡＨＵ０２を、国際寄託当局ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ−ドイツ微生物・細胞培養コレクション（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｒａｉｎ  Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ  Ｌｅｉｂｎｉｚ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＤＳＭＺ−Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）インホフェン街７Ｂ，Ｄ−３８１２４ブラウンシュヴァイク  ドイツに、寄託した。酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１とＡＨＵ０２はそれぞれ、受託番号ＤＳＭ２８８９３およびＤＳＭ２８８９４を割り当てられた。また、出願人は、２０１４年６月５日に受託番号ＤＳＭ２８９０２でグルコン酢酸菌ハンセニイ菌株ＡＨＵ０６を上記寄託当局に寄託した。
【００４９】
実施例２：酢酸菌によるキサンチンオキシダーゼ阻害に対する培地の影響
酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０２をＭ１Ａプレートに接種し、４日間３０℃で培養した。各プレートを、７ｍＬの無菌Ｍ１Ａシード培養液で洗浄した。２５０ｍＬの三角フラスコ内でシード培養液を含む細胞（１ｍＬ）を各種５０ｍＬの培地に接種した。接種した培地は、７日間３０℃で、１２５ｒｐｍで振とうしながら培養した。各培地のサンプルは、キサンチンオキシダーゼ阻害について上記のように分析を行った。結果を図２に示す。
【００５０】
酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０２は、キサンチンオキシダーゼ阻害活性の最高レベルを示し、６０％阻害に達した。
【００５１】
これに対して、リンゴジュースで酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０２を成長させた後に、キサンチンオキシダーゼ活性の阻害は検出されなかった。
【００５２】
ソルガム、グレープジュース、米エキスとプラムジュースで酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０２を培養したところ、１５％から５０％までの中間レベルの範囲の活性阻害を示した。
【００５３】
実施例３：酢酸菌によるキサンチンオキシダーゼ阻害に対する培養の時間および体積の影響
上記の実施例２に記載したように酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０２を含むシード培養液を調製した。１Ｌの三角振とうフラスコ内で、シード培養液を２％ｖ／ｖで、２００、３００、および４００ｍＬのＳＰＳ培地（１％スクロース、１％ペプトン、１％大豆ペプトン、０．２％硝酸ナトリウム）に入れた。３−１０日間３０℃で、１２５ｒｐｍで振とうしながら培養した。上記実施例１に記載のキサンチンオキシダーゼ阻害の測定を行った。結果を図３に示す。
【００５４】
酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０２は、３００ｍＬまたは４００ｍＬの培地中で増殖させた菌株と比べて、２００ｍＬの培養容量で増殖させた各時点におけるキサンチンオキシダーゼ阻害活性が最高レベルを示した。培養の際、培養容積が少ない場合にはより効率的に培地が酸素化することが知られている。特定の理論に縛られることではないが、酢酸菌パステウリアナスによるキサンチンオキシダーゼ阻害活性の効率的な生産は、酸素の高いレベルを必要とする可能性が高い。
【００５５】
キサンチンオキシダーゼ阻害活性の最高レベルは、２００ｍＬの容積中に酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０２を３日間培養した後に得られた。このレベルは、培養時間を延ばすにつれて減少し、培養１０日後にはおよそ６５％まで低下した。３００ｍＬおよび４００ｍＬの培養物においても、同様にキサンチンオキシダーゼ阻害活性の経時的な低下が観察された。
【００５６】
実施例４：酢酸菌によってキサンチンオキシダーゼ阻害活性の産生に対するグルコース濃度の影響
上記の実施例２に記載したように酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１を含むシード培養液を調製した。２５０ｍＬの三角フラスコに、０．５ｍＬのシード培養液を、それぞれ８％〜１６％（ｗ／ｖ）の範囲内の異なる濃度のグルコースを含む５０ｍＬの培地に接種した。グルコースの他に、培地は１．５％の大豆ペプトン及び３％の酵母抽出物を含んでいた。３０℃で培養物を７日間１５０ｒｐｍで振とうしながら培養した。
【００５７】
キサンチンオキシダーゼ阻害活性は、以下の手順でＨＰＬＣによって測定した。反応管に、８８０μＬのキサンチン（５０μｇ／ｍＬ、１００ｍＭ  ＰＢＳ中）と、４０μＬの５０ｍＭ  ＰＢＳまたは４０μＬの培養液上清と、を予備混合して、そして８０μＬのキサンチンオキシダーゼ（０．１Ｕ）を加えて反応を開始させた。３０℃で３０分間反応させて、その後等容積の無水エタノールを加えて反応を停止した。反応終了液を、０．２２μｍのメンブランフィルターでろ過し、反応中のキサンチンの含量をＨＰＬＣによって分析した。次のようにサンプルのキサンチンオキシダーゼ阻害活性を計算した：
【００５８】
【数２】
2016065039.tif 000003
【００５９】
得られた結果を下記の表１に示す：
【００６０】
【表１】
2016065039.tif 000004
【００６１】
ａの値は、培地中のグルコースをｗ/v％で表している。
【００６２】
ｂの値は、キサンチンオキシダーゼ活性の阻害をパーセントで表している。
【００６３】
明確な相関関係は、増殖培地のグルコース含量と、培地で増殖させた酢酸菌パステウリアナスによって生成されるキサンチンオキシダーゼ活性阻害レベルと、の間に存在する。
【００６４】
実施例５：実験尿酸血症の治療
酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１を、Ｍ１Ａプレートに接種し、３０℃で２日間培養した。このプレートを、シード培養液として滅菌水７ｍＬで洗浄した。２５０ｍＬの三角フラスコ中で、シード培養液０．５ｍＬを５０ｍＬのカスタム培地（１％の大豆ペプトン、０．２％酵母エキス、３％グルコース、０．２％麦芽エキス、及び３％のフルクトース）に接種し、１５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で７日間培養した。次いで、培地を回収し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を回収し、凍結乾燥し、動物実験で使用するための固体発酵物を形成するために、凍結乾燥した。
【００６５】
ＩＣＲマウスを実験動物として使用した。ウリカーゼ阻害剤であるオキソン酸カリウムを、マウスの血清中の尿酸の高いレベルを誘導するために使用した。マウスを１時間絶食させた後、供給管を介して生理食塩水またはオキソン酸カリウム（４００ｍｇ／ｋｇ）を与えた。１時間後、オキソン酸カリウムで処置したマウスに、生理食塩水、アロプリノール（１０ｍｇ／ｋｇ）、または上記のように調製した酢酸菌パステウリアナス菌株ＡＨＵ０１の発酵産物を（マウスあたり１５０ｍｇまたは２００ｍｇ、生理食塩水に再懸濁した）を与えた。各実験群および対照群に１０匹の動物を使用した。動物は、１時間後に屠殺し、血清中の尿酸のレベルを分析した。結果を下記の表２に示す。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
ａマウス（条件当たりＮ＝１０）に生理食塩水または所定の化合物を総体積２００μＬ与えた。
【００６８】
その他の実施形態
本明細書に開示された特徴のすべては、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示された各特徴は、同じ等価な、または類似の目的を果たす代替の特徴で置き換えてもよい。従って、特に明記しない限り、開示された各特徴は、等価または類似の特徴の一般的な群の一例に過ぎない。
【００６９】
上記の説明から、当業者は容易に本発明の本質的な特徴を確認することができ、また、その精神および範囲から逸脱することなく、種々の用途および条件に適合させるために様々な変更および本発明の修正を行うことができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【外国語明細書】
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2016065039000002.pdf
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