(57)【要約】【課題】天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体を提供し、更にこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体を提供すること。【解決手段】（ａ）天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体、及び；（ｂ）上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体：を含む、治療又は診断のための試薬キット。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される化合物。
【化１】
2016027006.tif 000042
（式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、ＹはＣ又はＳを示し、ＺはＯ、Ｓ又はＮＨを示し、ＶはＳ又はＳ+−Ｏ-を示し、ｎは０又は１の整数を示し、ｍは１から１０の整数を示し、Ｗは−ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ2）pＣＯＯＨ、又は−ＮＨ（ＣＨ2）qＣ（ＮＨ2）ＣＯＯＨを示す。ここでｐ及びｑはそれぞれ独立に１から１０の整数を示す）。
【請求項２】
ｎが０である、下記式（２）で示される、請求項１に記載の化合物。
【化２】
2016027006.tif 000043
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ、Ｚ、Ｖ、ｍ、及びＷは請求項１と同義である）
【請求項３】
以下の何れかの化合物。
【化３】
2016027006.tif 000044
【請求項４】
配列番号３から１２の何れかに記載のアミノ酸配列を含む、ストレプトアビジン変異体。
【請求項５】
請求項４に記載のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４に記載のストレプトアビジン変異体に抗体を結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体−抗体結合物。
【請求項７】
請求項６に記載のストレプトアビジン変異体−抗体結合物を含む、治療剤又は診断剤。
【請求項８】
（ａ）請求項６に記載のストレプトアビジン変異体―抗体結合物；及び（ｂ）請求項１から３の何れかに記載の化合物で標識した診断用又は治療用物質：を含む治療又は診断キット。
【請求項９】
（ａ）天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体、及び；
（ｂ）上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体：
を含む、治療又は診断のための試薬キット。
【請求項１０】
（ａ）天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体と抗体との結合物、及び
（ｂ）上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体で標識した診断用又は治療用物質：
を含む治療又は診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチン改変体、スレプトアビジン変異体およびそれらの利用に関する。より詳細には、本発明は、天然ビオチンとの親和性を低減させたスレプトアビジン変異体、上記スレプトアビジン変異体と親和性を有するビオチン改変体、並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10-15 から10-14M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン - ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている（Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67）。アビジンは卵白由来の塩基性糖タンパクで、等電点は１０を超える。一方、ストレプトアビジンは放線菌（Streptomyces avidinii）由来で、等電点は中性付近で糖鎖は含まない。両タンパク質とも、４量体を形成し、１つのサブユニット当たり1分子のビオチンと結合する。分子量は60kDa程度である。
【０００３】
近年このアビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組合わせしたドラッグデリバリーの方法、プレターゲティング法が考案されている（Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302）。しかしながら、ニワトリ由来のアビジンや微生物由来のストレプトアビジンは人体に対し高い免疫原性を示すため、人体に投与後、早期に抗アビジン／ストレプトアビジン抗体が産生されることが問題となりプレターゲティング法の実用化を妨げている原因の１つとなっている（Paganelli, (1991),  Cancer Res., 51, 5960-5966）。上記問題を解決するための低免疫原性ストレプトアビジンが報告されている（国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133;
【非特許文献２】Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67
【非特許文献３】Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302
【非特許文献４】Paganelli, (1991),  Cancer Res., 51, 5960-5966）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記したような低免疫原性ストレプトアビジンは、人体に対する免疫原性が低下しているという特徴を有するものであるが、人体に内在するビオチンに対する親和性を有するため、診断用途の場合にはバックグラウンドが高くなるという問題や、治療用途の場合にも疾患に特異的に薬効を発揮できない可能性があるという懸念がある。そこで、本発明は、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体を提供し、更にこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体を提供することを解決すべき課題とした。更に本発明は、上記ストレプトアビジン変異体とビオチン改変体との組み合わせを用いた診断薬・治療薬、上記ストレプトアビジン変異体とビオチン改変体との組み合わせを用いた診断キット・治療キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討し、国際公開ＷＯ２０１０／０９５４５５に記載された低免疫原性ストレプトアビジン変異体に対して更に所定のアミノ酸変異を導入することにより、天然ビオチンに対する親和性が低減したストレプトアビジン変異体を得ることに成功した。同時にビオチンの構造の一部を改変することによって各種ビオチン改変体を合成した。そして上記ストレプトアビジン変異体と上記ビオチン改変体の親和性を調べた結果、互いに親和性を有する組み合わせを見出し、本願発明を完成するに至った。
【０００８】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  下記式（１）で示される化合物。
【化１】
2016027006.tif 000002
（式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、ＹはＣ又はＳを示し、ＺはＯ、Ｓ又はＮＨを示し、ＶはＳ又はＳ+−Ｏ-を示し、ｎは０又は１の整数を示し、ｍは１から１０の整数を示し、Ｗは−ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ2）pＣＯＯＨ、又は−ＮＨ（ＣＨ2）qＣ（ＮＨ2）ＣＯＯＨを示す。ここでｐ及びｑはそれぞれ独立に１から１０の整数を示す）。
【０００９】
［２］  ｎが０である、下記式（２）で示される、［１］に記載の化合物。
【化２】
2016027006.tif 000003
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ、Ｚ、Ｖ、ｍ、及びＷは［１］と同義である）
【００１０】
［３］  以下の何れかの化合物。
【化３】
2016027006.tif 000004
【００１１】
［４］  配列番号３から１２の何れかに記載のアミノ酸配列を含む、ストレプトアビジン変異体。
［５］  ［４］に記載のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡ。
［６］  ［４］に記載のストレプトアビジン変異体に抗体を結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体−抗体結合物。
［７］  ［６］に記載のストレプトアビジン変異体−抗体結合物を含む、治療剤又は診断剤。
［８］  （ａ）［６］に記載のストレプトアビジン変異体―抗体結合物；及び（ｂ）［１］から［３］の何れかに記載の化合物で標識した診断用又は治療用物質：を含む治療又は診断キット。
【００１２】
［９］（ａ）天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体、及び；
（ｂ）上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体：
を含む、治療又は診断のための試薬キット。
【００１３】
［１０］（ａ）天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体と抗体との結合物、及び
（ｂ）上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体で標識した診断用又は治療用物質：
を含む治療又は診断キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、免疫原性が低減すると同時に天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体と、上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体の組み合わせが提供される。本発明のストレプトアビジン変異体とビオチン改変体の組み合わせは、プレターゲティング法に基づく診断法・治療法において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ストレプトアビジン変異体組換えタンパク質の粗精製の結果を示す。
【図２】図２は、ビオチン−ＨＲＰ標識体との競合解析の結果を示す。
【図３】図３は、シッティングドロップ蒸気拡散法を示す。
【図４】図４は、LISA314およびLISA314-V21の結晶構造を示す。
【図５】図５は、LISA314およびLISA314-V21の結晶構造を示す。(A)LISA314とbiotinの共結晶構造。（Ｂ）LISA314-V21とiminobiotin long tailの共結晶構造。サブユニットAおよびCをline ribbon、BおよびDをFlat ribbonで表示した。
【図６】図６は、巻戻しタンパク質の精製の一例を示す。
【図７】図７は、ビオシチンとＬＩＳＡ３１４  ＷＴとの相互作用をＳＰＲ分析した際のセンサーグラムを示す。
【図８】図８は、ビオシチンとＬＩＳＡ３１４  Ｖ２１との相互作用をＳＰＲ分析した際のセンサーグラムを示す。
【図９】図９は、化合物２９とＬＩＳＡ３１４  Ｖ２１との相互作用をＳＰＲ分析した際のセンサーグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）ビオチン改変体
本発明のビオチン改変体は、下記式（１）で示される化合物であり、好ましくは式（１）においてｎが０である場合である式（２）で示される化合物である。
【化４】
2016027006.tif 000005
【化５】
2016027006.tif 000006
（式中、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、ＹはＣ又はＳを示し、ＺはＯ、Ｓ又はＮＨを示し、ＶはＳ又はＳ+−Ｏ-を示し、ｎは０又は１の整数を示し、ｍは１から１０の整数を示し、Ｗは−ＯＨ、−ＮＨ（ＣＨ2）pＣＯＯＨ、又は−ＮＨ（ＣＨ2）qＣ（ＮＨ2）ＣＯＯＨを示す。ここでｐ及びｑはそれぞれ独立に１から１０の整数を示す）。
【００１７】
式（１）及び式（２）において、下記構造：
【化６】
2016027006.tif 000007
で示される部分は好ましくは、
【化７】
2016027006.tif 000008
の何れかであるが、これらに限定はされない。
【００１８】
ｍは１から１０の整数を示し、好ましくは２から１０の整数、より好ましくは２から８の整数、より好ましくは２から６の整数、特に好ましくは４を示す。
ｐ及びｑはそれぞれ独立に１から１０の整数を示し、好ましくは２から１０の整数、より好ましくは２から８の整数、より好ましくは２から６の整数、特に好ましくは４又は５を示す。
【００１９】
本発明の式（１）又は式（２）の化合物は、以下の実施例１に記載の合成方法により合成することができる。実施例１における化合物１１、１９、２１、２３、２４、２７、２９、３１、３６及び３７は、本発明の式（１）又は式（２）の化合物である。
【００２０】
化合物１１の合成方法
先ず、(L)-アラビノース（化合物１）のDMF溶液に2,2-ジメトキシプロパンとトルエンスルホン酸一水和物を加えることで、(3aS,7R,7aR)-2,2-ジメチルテトラヒドロ-3aH-[1,3]ジオキソロ[4,5-c]ピラン-6,7-ジオール (化合物2)を得る。化合物2を水及びヘキサンの混合溶媒に溶かし、過ヨウ素酸ナトリウムを加えて撹拌し、炭酸ナトリウムを加えることで、(3aS,6aS)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-オール(化合物3)を得る。化合物3 のDMF溶液に、セライトと二クロム酸ピリジニウムを加えて反応させることにより、(3aS,6aS)-2,2-ジメチルジヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4(3aH)-オン(化合物4)を得る。化合物4の DMF溶液にチオ酢酸カリウムを加えて反応させることにより(3aS,6aR)-2,2-ジメチルジヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4(3aH)-オン(化合物5)を得る。化合物5のTHF溶液に、3-ブテニル-1-マグネシウム ブロミドを加えて反応させることにより、(3aS,6aR)-4-(3-ブテン-1-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-オール(化合物6)を得る。化合物6の CH2Cl2溶液に、トリエチルシラン を加えて攪拌した後、トリフルオロ酢酸 (675 μL, 9.05 mmol) を加えて反応させることにより、(2S,3S,4R)-2-(3-ブテン-1-イル)テトラヒドロチオフェン-3,4-ジオール(化合物7)を得る。化合物7の CH2Cl2溶液に、ピリジン及びトリホスゲンを加えて反応させることにより、(3aS,4S,6aR)-4-(3-ブテン-1-イル)テトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-2-オン(化合物8)を得る。化合物8 を含むCH2Cl2溶液に、アクリル酸ベンジルと第二世代 Hoveyda-Grubbs 触媒を加えて加熱還流することにより、 (E)-ベンジル5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)-2-ペンテノエート (化合物9)を得る。化合物9のエタノール溶液に、パラジウム炭素を加え、水素ガス存在下で撹拌して反応させることにより、ベンジル5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタノエート(化合物10)を得る。化合物10 を含むCH2Cl2溶液に、三臭化ホウ素を加えて反応させることにより、本発明の式（１）で示される((3aS,4S,6aR)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタン酸(化合物11)を得る。
【００２１】
化合物１９の合成方法
化合物13の無水 THF 溶液に、n-ブチルリチウム溶液 (2.6 M ヘキサン溶液) を滴下して撹拌後、化合物 12と HMPA無水 THF溶液を滴下して撹拌することにより、 (R)-tert-ブチル4-((R)-1-ヒドロキシ-6-(4-メチル-2,6,7-トリオキサビシクロ [2.2.2]オクタン-1-イル)-2-ヘキサニル-1-イルyl)-2,2-ジメチルチアゾリジン-3-カルボキシレート(化合物14)を得る。化合物14 を含む無水トルエン溶液に、ヘキサメチルジシラザンリチウム溶液を加えて反応させることにより (1R,7aR)-5,5-ジメチル-1-(5-(4-メチル-2,6,7-トリオキサビシクロ[2.2.2]オクタン-1-イル)-1-ペンチン-1-イル)ジヒドロ-1H-チアゾロ[3,4-c]オキサゾール-3(5H)-オン(化合物15)を得る。化合物15の CH3CNと H2O 混合溶液に、硝酸銀(I)を加えて反応させることにより(E)-3-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-2-メチルプロピル5-((3aR,6aS)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6(6aH)-イリデン)ペンタノエート(化合物16)を得る。化合物16及び酢酸アリルのメタノール溶液に水酸化パラジウム炭素を加え、水素ガス存在下で反応することにより、3-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-2-メチルプロピル 5-((3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ペンタノエート(化合物18)を得る。化合物18の CH3CNと H2Oの混合溶液に、水酸化リチウムを加えて反応させることにより、5-((3aR,6S,6aS)-2-オキサヘキサヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ペンタン酸(化合物19)を得る。
【００２２】
化合物２１の合成方法
ビオチン (化合物20)の酢酸溶液にNaBO3・4H2Oを室温下加え、撹拌した後、チオ硫酸ナトリウムを加え、減圧下にて溶媒を留去することにより、5-((3aS,4S,6aR)-5-オキシド-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタン酸(化合物21)を得る。
【００２３】
化合物２３の合成方法
イミノビオチン(化合物22)の1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール溶液にH2O2水溶液を加えて反応させることにより、5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノ-5-オキシドヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタン酸 (化合物23)を得る。
【００２４】
化合物２４の合成方法
化合物11の1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール溶液にH2O2水溶液を加えて反応させることにより、5-((3aS,4S,6aR)-5-オキシド-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタン酸 (化合物24)を得る。
【００２５】
化合物２７の合成方法
ビオチンメチルエステル (化合物25)のトルエン溶液にLawesson's reagentを加えて反応させることにより、メチル5-((3aS,4S,6aR)-2-チオキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタノエート (化合物26)を得る。化合物26 を含むTHF溶液に水酸化ナトリウム水溶液を添加することにより、5-((3aS,4S,6aR)-2-チオキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタン酸(化合物27)を得る。
【００２６】
化合物２９の合成方法
6-アミノヘキサン酸の dioxaneと H2Oの混合溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を加え、pHが 9 程度になるよう調整する。化合物28を加えて反応させることにより、5-((3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ペンタン酸 (化合物29)を得る。
【００２７】
化合物３１の合成方法
化合物28とNα-Boc-L-lysineのジオキサン/水の混合溶媒を撹拌することにより、
(S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-6-(5-((3aS,4S,6aR,Z)-2-((2,2,2-トリフルオロアセチル)イミノ)ヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサン酸 (化合物30)を得る。化合物30 をジオキサンと H2Oの混合溶液に、塩酸を加え、pHが 3 程度になるよう調整し5 時間撹拌した後、減圧下溶媒を留去して得た固体をdioxaneと H2Oに溶解してアンモニア水を加えることにより、 (S)-2-アミノ-6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサン酸(化合物31)を得る。
【００２８】
化合物３６の合成方法
化合物32の CH2Cl2溶液に、アクリル酸ベンジルと第二世代 Hoveyda-Grubbs 触媒を加えて反応させることにより、(E)-ベンジル 5-((3aS,4S,6aR)-2,2-ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3] ジオキソール-4-イル)-2-ペンテノエート(化合物33)を得る。化合物33のエタノール溶液に、パラジウム炭素 を加え、水素ガス存在下で反応させることにより、ベンジル5-((3aS,4S,6aR)-2,2-ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタノエート(化合物34)を得る。化合物34の CH2Cl2溶液に三臭化ホウ素を加えて反応させることにより5-((2S,3S,4R)-3,4-ジヒドロキテトラヒドロチオフェン-2-イル)ペンタン酸(化合物35)を得る。化合物35の CH3CN溶液に、塩化チオニルを加えて反応させることにより5-((3aS,4S,6aR)-2-オキシドテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3,2]ジオキサチオール-4-イル)ペンタン酸(化合物36)を得る。
【００２９】
化合物３７の合成方法
化合物17をMeOHに溶解し触媒量のPd/Cを用いて水素雰囲気化で撹拌することにより2重結合の還元を行う。続いて得られた化合物のエステル部位をCH3CN、H2O混合溶媒下にLiOHを用いて加水分解することによって4-((3aR,6S,7aR)-2-オキソヘキサヒドロ-2H-チオピラノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ブタン酸 (化合物37)を得る。
【００３０】
（２）ストレプトアビジン変異体
本発明のストレプトアビジン変異体は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、所定のアミノ酸の変異を有し、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下していると同時に、天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低減していることを特徴とする。
【００３１】
野生型（天然）のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示し、これをコードする塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００３２】
本発明のストレプトアビジン変異体としては、具体的には、配列表の配列番号３から１２の何れかに記載のアミノ酸配列を有するものである。
【００３３】
本発明で言う、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下しているとは、ストレプトアビジン変異体をヒトなどの哺乳動物に投与した場合における免疫原性が低下していることを言う。免疫原性が低下していることは、例えば、以下の方法で確認することができる。即ち、本発明のストレプトアビジン変異体について、野生型ストレプトアビジンをカニクイサルに免疫して取得した抗ストレプトアビジン抗血清に対する反応性を解析し、上記の抗ストレプトアビジン抗血清に対する反応性が野生型ストレプトアビジンに比べて低下していれば、野生型ストレプトアビジンと比較して免疫原性が低下していると判断することができる。上記した方法で免疫原性の低下を判断した場合、本発明のストレプトアビジン変異体は、野生型ストレプトアビジンと比較して、免疫原性が好ましくは８０％以下、さらに好ましくは６０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに好ましくは１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、特に好ましくは５％以下に低下している。
【００３４】
本発明で言う天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低減しているとは、ストレプトアビジン変異体と天然ビオチン又はビオシチンとの結合性が、ストレプトアビジンと天然ビオチン又はビオシチンとの結合性と比較して低下していることを意味する。ストレプトアビジン変異体と天然ビオチン又はビオシチンとの親和性・結合性は、ＳＰＲ解析などにより評価することができる。本発明のストレプトアビジン変異体は、野生型ストレプトアビジンと比較して、天然ビオチン又はビオシチンとの親和性が好ましくは８０％以下、さらに好ましくは７０％以下、さらに好ましくは６０％以下、さらに好ましくは５０％以下、さらに好ましくは４０％以下に低下している。
【００３５】
本発明によればさらに、上記した本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡが提供される。本発明のＤＮＡは、野生型（天然）のストレプトアビジンをコードするＤＮＡに対して部位特異的変異誘発により作製することができる。
【００３６】
上記した本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡは、ベクターに組み込んで使用することができる。特に、本発明のストレプトアビジン変異体を製造するためには、本発明のストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを宿主に形質転換することによって、本発明のストレプトアビジン変異体を発現させることができる。
【００３７】
大腸菌を宿主とする場合には、本発明で用いるベクターとしては、複製起点（ori）を有し、さらに形質転換された宿主を選択するための遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子など）を有していることが好ましい。また、発現ベクターの場合には、宿主において本発明のストレプトアビジン変異体を効率よく発現させることができるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーターまたはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpress system」（キアゲン）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21を使用することが好ましい)などが挙げられる。また、ベクターには、本発明のストレプトアビジン変異体の収量をあげるためのシグナル配列などを付加することもできる。
【００３８】
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また、可溶性を向上させるためのタグ、例えばグルタチオンーS−トランスフェラーゼやチオレドキシン、マルトース結合蛋白質をコードする配列が付加されていてもよい。また、精製を容易にすることを目的にした設計されたタグ、例えばポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃエピトープ、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、Ｔ７エピトープ、ＸｐｒｅｓｓタグやＦＬＡＧペプチドタグ、その他の既知のタグ配列をコードする配列が付加されていてもよい。
【００３９】
大腸菌以外にも、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3(インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００４０】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００４１】
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれでもよい。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。
【００４２】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、HeLa細胞、Vero細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5などを用いることができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００４３】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
【００４４】
原核細胞を使用する場合は、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
【００４５】
これらの細胞を、本発明のＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより本発明のストレプトアビジン変異体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。また、細胞の増殖を促進するための成長因子の添加を行ってもよい。
【００４６】
（３）ストレプトアビジン変異体及びビオチン改変体の利用
さらに本発明によれば、本発明のストレプトアビジン変異体に抗体を結合させることにより得られる、ストレプトアビジン変異体―抗体結合物、並びにストレプトアビジン変異体―抗体結合物を含む治療剤又は診断剤が提供される。さらに、上記したストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、本発明のストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変体で標識した診断用又は治療用物質と組み合わせて、治療又は診断キットとして提供することができる。
【００４７】
即ち、本発明においては、癌抗原特異的抗体分子と本発明のストレプトアビジン変異体との融合体を調製し、患者に投与することで、癌細胞に特異的に本発明のストレプトアビジン変異体を集積できることができる。次に、上記ストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変体に結合させた診断用もしくは治療用物質（蛍光色素、化学発光剤、放射性同位元素、低分子化合物、タンパク質など）を患者に投与することによって、癌細胞へ的確に物質を集積させることが可能になる。本発明においては、低免疫原性化により抗体産生が抑制され、抗体による早期の体内からのクリアランス、アナフィラキシーなどのショックを防ぐことができる。
【００４８】
ストレプトアビジン変異体に結合させる抗体は種々の分子を用いることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体はどちらも使用することができる。抗体のサブクラスは特に問わないが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ1が好適に用いられる。また、「抗体」は改変抗体および抗体断片の全てを含む。ヒト化抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の各種動物由来抗体、ヒト抗体と各種動物由来抗体とのキメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ）’2が挙げられるが、これらに限らない。
【００４９】
ストレプトアビジン変異体と抗体の結合物は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。例えば、化学的結合方法（US5,608,060）によって得ることもできるし、ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡを連結し、発現ベクター等を用いて宿主細胞に発現させることにより、融合タンパクとして得ることもできる。ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡとの連結は、リンカーと呼ばれる適当なペプチドをコードするＤＮＡを介しても良い。ストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、抗体と標的分子との特異的結合力を残して作製されることが望ましい。
【００５０】
本発明によれば、
（ａ）天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体、及び；
（ｂ）上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体：
を含む、治療又は診断のための試薬キット、並びに、
（ａ）天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体と抗体との結合物、及び
（ｂ）上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体で標識した診断用又は治療用物質：
を含む治療又は診断キットが提供される。
【００５１】
天然ビオチン又はビオシチンとの親和性を低下させたストレプトアビジン変異体の具体例としては、配列番号２に記載したアミノ酸配列を有するストレプトアビジンにおいて、
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：及び
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
の全ての変異を有し、それに加えてさらに
（７）３３番目のアミノ酸残基のセリンが他のアミノ酸（例えば、アスパラギン）に置換している変異；及び
（８）１１６番目のアスパラギン酸が他のアミノ酸（例えば、アスパラギン）に置換している変異
を有するストレプトアビジン変異体、又は、
上記（１）〜（６）の全ての変異を有し、それに加えてさらに
（７‘）１１番目のアミノ酸残基のアスパラギンが他のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）に置換している変異；
（８’）１５番目のアミノ酸残基のセリンが他のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）に置換している変異：
を有するストレプトアビジン変異体が挙げられる。
【００５２】
さらに、配列番号２に記載したアミノ酸配列を有するストレプトアビジンにおいて、
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
（７‘）１１番目のアミノ酸残基のアスパラギンが他のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）に置換している変異；及び
（８’）１５番目のアミノ酸残基のセリンが他のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸）に置換している変異：
の全ての変異を有し、さらに
（９）３３番目のアミノ酸残基のセリンが、他のアミノ酸（例えば、アラニン、グルタミン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、トレオニン、バリン及びアスパラギン）に置換している変異：
を有するストレプトアビジン変異体を使用することができる。
【００５３】
上記ストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変体としては、本明細書に記載した式（１）で示される化合物（好ましくは、式（２）で示される化合物）を使用することができる。
【００５４】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
実施例１：ビオチン改変体の合成
一般的方法：ＮＭＲスペクトルはJEOL JNM-LA500又はECX500スペクトロメータで記録した（1H NMRについては500 MHz、13C NMR については125.65 MHz）。化学シフトは、内部参照としての残存CHCl3 (δ= 7.26 for 1H NMR、δ=77.0 for 13C NMR)に対するδスケールでｐｐｍで報告した。ESI質量スペクトルは、Waters-ZQ4000で測定した。カラムクロマトグラフィは、シリカゲルMerk 60 (230-400 mesh ASTM)又はシリカゲル60 N (KANTO CHEMICAL, spherical, neutral, 40-100 μm)を使用して行った。無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）はKanto Chemical. Co., Inc.から購入するか、またはPh2CO-Naから新たに蒸留した。他の試薬は、特に明記ない限り市販品をそのまま使用した。
【００５６】
(3aS,7R,7aR)-2,2-ジメチルテトラヒドロ-3aH-[1,3]ジオキソロ[4,5-c]ピラン-6,7-ジオール (2)
【化８】
2016027006.tif 000009
【００５７】
(L)-アラビノース (4g, 26.6 mmol) のDMF 30 mL 溶液に、2,2-ジメトキシプロパン (10 mL, 81.6 mmol) とトルエンスルホン酸一水和物 (60 mg, 0.32 mmol) を室温下加えた。12 時間撹拌した後、炭酸ナトリウムを加え中和した。ろ過後、溶媒を減圧で留去し、2 を含む粗生成物を得た。さらなる精製を行うことなく、次の反応に進んだ。
【００５８】
(3aS,6aS)-2,2-ジメチルテトラヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-オール(3)
【化９】
2016027006.tif 000010
【００５９】
2 を含む粗生成物を水 (40 mL)、ヘキサン (20 mL) の混合溶媒に溶かし、過ヨウ素酸ナトリウム (14.2 g, 66.5 mmol) を加え、2 時間撹拌した。炭酸ナトリウムを加え、さらに1 時間撹拌を続けた後、水を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン-メタノール) で精製すると、標題化合物 2.17g (二段階収率 51%) で得た。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.32 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 4.02 (d, J= 10 Hz, 1H), 4.08 (dd, J= 10, 3.7 Hz, 1H), 4.58 (d, J= 5.8 Hz, 1H), 4.84 (dd, J= 5.8, 3.7 Hz, 1H), 5.42 (s, 1H)
【００６０】
(3aS,6aS)-2,2-ジメチルジヒドロフロ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4(3aH)-オン(4)
【化１０】
2016027006.tif 000011
【００６１】
3 (740 mg, 4.60 mmol) の DMF 20 mL 溶液に、セライトと二クロム酸ピリジニウム (5 g, 18.5 mmol) を加え、12 時間 100℃で撹拌した。反応液を冷却し、フロリジルの短いカラムを用い、酢酸エチルで溶出した。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン-メタノール) で精製すると、標題化合物 520 mg (収率 71%) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.40 (s, 3H), 1.48 (s, 3H), 4.40 (dd, J= 11, 3.7 Hz, 1H), 4.46 (d, J= 11 Hz, 1H), 4.74 (d, J= 5.8 Hz, 1H), 4.87 (dd, J= 5.8, 3.7 Hz, 1H)
【００６２】
(3aS,6aR)-2,2-ジメチルジヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4(3aH)-オン(5)
【化１１】
2016027006.tif 000012
【００６３】
4 (1.3 g, 8.22 mmol) の DMF 40 mL 溶液に、チオ酢酸カリウム (1 g, 9.00 mmol) を加え、3 時間 室温にて撹拌した。冷水を加え反応を停止し、エーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 500 mg (収率 35%, 褐色固体) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.36 (s, 3H), 1.44 (s, 3H), 3.49 (d, J= 13 Hz, 1H), 3.60 (dd, J= 13, 4.6 Hz, 1H), 4.56 (d, J= 4.9 Hz, 1H), 4.81 (dd, J= 4.9, 4.6 Hz, 1H)
【００６４】
(3aS,6aR)-4-(3-ブテン-1-イル)-2,2-ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-オール(6)
【化１２】
2016027006.tif 000013
【００６５】
5 (350 mg, 2.01 mmol) の THF 40 mL 溶液に、3-ブテニル-1-マグネシウム ブロミド (6.05 mmol) を加え、30 分間 -20 oCにて撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 417 mg (収率 90%, 薄黄色油状) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.31 (s, 3H), 1.50 (s, 3H), 2.05 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.05 (m, 2H), 2.90 (d, J= 13 Hz, 1H), 3.27 (dd, J= 13, 4.3 Hz, 1H), 4.38 (d, J= 5.5 Hz, 1H), 5.01 (d, J= 10 Hz, 1H), 5.12 (d, J=17 Hz, 1H) , 5.85-5.94 (m, 1H)
【００６６】
(2S,3S,4R)-2-(3-ブテン-1-イル)テトラヒドロチオフェン-3,4-ジオール(7)
【化１３】
2016027006.tif 000014
【００６７】
6 (417 mg, 1.81 mmol) の CH2Cl2 8 mL 溶液に、トリエチルシラン (2.9 mL, 18.1 mmol) を 0 oCにて加え、15 分間撹拌した後トリフルオロ酢酸 (675 μL, 9.05 mmol) を加え、12 時間撹拌を続けた。飽和重曹水を加え反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 130 mg (収率 42%, 薄黄色固体) が得られた。また副生成物として32（収率25％）が得られている。
化合物7：1H NMR (CDCl3): δ = 1.65-1.74 (m, 1H), 1.89-1.96 (m, 1H), 2.05-2.19 (m, 2H), 2.81 (dd, J= 10, 8.8 Hz, 1H), 3.03 (dd, J= 10, 7.1 Hz, 1H), 3.39-3.45 (m, 1H), 4.10 (t, J= 3.5 Hz, 1H), 4.28-4.33 (m, 1H), 5.00 (d, J= 10 Hz, 1H), 5.06 (d, J=17 Hz, 1H) , 5.75-5.84 (m, 1H)
化合物32：1H NMR (CDCl3): δ = 1.32 (s, 3H), 1.51 (s, 3H), 1.75-1.84 (m, 1H), 1.89-1.97 (m, 1H), 2.15-2.23 (m, 2H), 2.82 (dd, J= 13, 4.0 Hz, 1H), 2.86 (d, J= 12 Hz, 1H), 3.10-3.12 (m, 1H), 4.60 (t, J= 4.3 Hz, 1H), 4.84 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 5.00 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 5.07 (d, J=16 Hz, 1H) , 5.78-5.87 (m, 1H)
【００６８】
(3aS,4S,6aR)-4-(3-ブテン-1-イル)テトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-2-オン(8)
【化１４】
2016027006.tif 000015
【００６９】
7 (6 mg, 0.034 mmol) の CH2Cl2 600 μL 溶液に、ピリジン (8 μL, 0.10 mmol) とトリホスゲン (15.3 mg, 0.052 mmol) を 0 ℃で加えた。30 分間撹拌した後、飽和重曹水を加え反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物はさらなる精製操作を経ずに次の反応に使用した。
【００７０】
(E)-ベンジル 5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)-2-ペンテノエート (9)
【化１５】
2016027006.tif 000016
【００７１】
8 を含む粗生成物の CH2Cl2 600 μL 溶液に、アクリル酸ベンジル (51 μL, 0.34 mmol) と第二世代 Hoveyda-Grubbs 触媒 (2.1 mg, 3.4 μmol) を加え、12 時間加熱還流を行った。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 2.6 mg (二段階収率 23%, 薄黄色油状) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.93-2.02. (m, 1H), 2.03-2.10 (m, 1H), 2.31-2.45 (m, 2H), 2.96 (dd, J= 14, 4.3 Hz, 1H), 3.14 (d, J= 14 Hz, 1H), 3.19-3.23 (m, 1H), 5.03 (dd, J= 6.4, 4 Hz, 1H), 5.18 (s, 2H), 5.27 (dd, J= 6.4, 4.3 Hz, 1H), 5.95 (d, J= 15 Hz, 1H), 6.97 (dt, J=15, 7 Hz, 1H) , 7.32-7.36 (m, 2H), 7.37 (d, J= 4.6 Hz, 3H)
【００７２】
ベンジル5-((3aS,4S,6aR)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタノエート(10)
【化１６】
2016027006.tif 000017
【００７３】
9の EtOH 1 mL 溶液に、パラジウム炭素 (10 w/w% Pd, 15 mol%, 1.0 mg) を加えた。30 atm の水素ガス存在下、100 ℃、3 時間撹拌を続けた。反応液を室温まで冷却し、セライトの短いカラムを用い、エタノールで溶出した。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物はさらなる精製操作を経ずに次の反応に用いた。
【００７４】
((3aS,4S,6aR)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタン酸(11)
【化１７】
2016027006.tif 000018
【００７５】
10 を含む粗生成物の CH2Cl2 600μL 溶液に、1M の三臭化ホウ素 (50 μL, 0.050 mmol)を-78℃ にて加えた。0 ℃、3 時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン-メタノール) で精製すると、標題化合物 1.5 mg (収率 78%, 白色固体) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.50-1.55 (m, 2H), 1.70 (q, J= 7.3 Hz, 2H), 1.74-1.84 (m, 1H), 1.88-1.95 (m, 1H), 2.39 (t, J= 7.4 Hz, 1H), 2.96 (dd, J= 14, 4.3 Hz, 1H), 3.14 (d, J= 14 Hz, 1H), 3.22 (ddd, J= 8.0, 6.7, 4.0 Hz, 1H), 5.05 (dd, J= 6.4, 4.0 Hz, 1H), 5.28 (dd, J= 6.4, 3.7 Hz, 1H)
【００７６】
3-メチルオキシエタン-3-イル)メチル-5-ヘキシノエート(40)
【化１８】
2016027006.tif 000019
5-ヘキシン酸38(5 mL, 44.6 mmol)と3-メチル-3-オキセタンメタノール39(4.5 mL, 44.6 mmol)の CH2Cl2 20 mL 溶液に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩 (10.3 g, 53.5 mmol)と N,N-ジメチル-4-アミノピリジン(545 mg, 4.46 mmol)を0 ℃にて加えた。氷冷下1 時間撹拌した後、水と飽和食塩水を加え、CH2Cl2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル)で精製すると、標題化合物 8.5 g (収率 97%, 無色油状)が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.33 (s, 3H), 1.83-1.89 (m, 2H), 2.04 (s, 1H), 2.27 (td, J= 6.9, 2.9 Hz, 2H), 2.51 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 4.17 (s, 2H), 4.38 (d, J= 5.7 Hz, 2H), 4.51 (d, J= 5.7 Hz, 2H)
【００７７】
4-メチル-1-(4-ペンチル-1-イル)-2,6,7-トリオキサビシクロ[2.2.2]オクタン(13)
【化１９】
2016027006.tif 000020
40(8.5 g, 43.3 mmol)の CH2Cl2 40 mL 溶液に、三フッ化ホウ素エチルエーテル(2.7 mL, 21.7 mmol)を0℃にて滴下した。室温下12 時間撹拌した後、0℃でトリエチルアミン(8 mL)を滴下し、室温で1時間撹拌後、反応液をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル-トリエチルアミン)で精製すると、標題化合物 4.4 g (収率 52%, 無色油状) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 0.79 (s, 3H), 1.66-1.72 (m, 2H), 1.77-1.80 (m, 2H), 2.16 (s, 1H), 2.21 (td, J= 6.9, 2.9 Hz, 2H), 3.88 (s, 6H)
【００７８】
(R)-tert-ブチル4-((R)-1-ヒドロキシ-6-(4-メチル-2,6,7-トリオキサビシクロ [2.2.2]オクタン-1-イル)-2-ヘキサニル-1-イルyl)-2,2-ジメチルチアゾリジン-3-カルボキシレート(14)
【化２０】
2016027006.tif 000021
【００７９】
13 (4.8 g, 24.4 mmol) の無水 THF 50 mL 溶液に、n-ブチルリチウム溶液 (2.6 M ヘキサン溶液 15 mL, 38.9 mmol) を -78 ℃にて滴下し、0 ℃まで昇温し、1 時間撹拌した。その後 12 (2.9g, 11.8 mmol)（Duthaler, O. D. Angew. Chem. 1991, 103, 729に従って合成したもの）と HMPA (6 mL)の無水 THF 50 mL溶液を-78℃にて滴下し、2時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加え反応を停止し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製し、14 を含む粗生成物が得られた。
【００８０】
(1R,7aR)-5,5-ジメチル-1-(5-(4-メチル-2,6,7-トリオキサビシクロ[2.2.2]オクタン-1-イル)-1-ペンチン-1-イル)ジヒドロ-1H-チアゾロ[3,4-c]オキサゾール-3(5H)-オン(15)
【化２１】
2016027006.tif 000022
【００８１】
14 を含む粗生成物の無水 toluene 40 mL 溶液に、ヘキサメチルジシラザンリチウム溶液 (1 M THF 溶液 7.88 mmol) を加えた。120℃、12 時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 1.82 g (二段階収率 42%, 薄黄色油状) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 0.79 (s, 3H), 1.68 (s, 3H), 1.70-1.75 (m, 4H), 1.80 (s, 3H), 2.28 (td, J= 7.5, 1.7 Hz, 2H), 2.39 (t, J= 7.4 Hz, 1H), 2.96 (dd, J= 14, 4.3 Hz, 1H), 3.87 (s, 6H), 4.57-4.62 (m, 1H), 5.16 (d, J= 7.5 Hz, 1H)
【００８２】
(E)-3-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-2-メチルプロピル5-((3aR,6aS)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6(6aH)-イリデン)ペンタノエート(16)
【化２２】
2016027006.tif 000023
【００８３】
15 (150 mg, 0.41 mmol) の CH3CN (2.7 mL) と H2O (2.7 mL) 混合溶液に、硝酸銀(I) (50 mg, 0.30 mmol) を加えた。9 時間撹拌した後、セライトでろ過し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 16 が 44 mg (収率 31%, 薄黄色油状) 得られた。また、副生成物として 17 が 35 mg (収率 25%, 薄黄色油状) 得られた。
1H NMR (CD3OD): δ = 0.93 (s, 3H), 1.79 (quin, J= 7.5 Hz, 2H), 2.16-2.31 (m, 2H), 2.40 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 3.02 (d, J= 12 Hz, 1H), 3.25 (dd, J= 12, 5.2 Hz, 1H), 3.48 (dd, J= 18, 11 Hz, 4H), 4.03 (s, 2H), 4.64 (t, J= 5.2 Hz, 1H), 5.47 (d, J= 10 Hz, 1H), 5.93 (t, J= 7.5 Hz, 1H)
【００８４】
3-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-2-メチルプロピル 5-((3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ペンタノエート(18)
【化２３】
2016027006.tif 000024
【００８５】
16 (11 mg, 0.032 mmol) 、酢酸アリル (344μL, 3.2 mmol)の MeOH 1 mL 溶液に水酸化パラジウム炭素 (10 w/w% Pd, 40 mol%, 0.013 mmol) を加えた。25 atm の水素ガス存在下、50 oC、4 時間撹拌を続けた。反応液を室温まで冷却し、セライトの短いカラムを通し、メタノールでセライトを洗浄した。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン-メタノール) で精製すると、標題化合物 4.2 mg (収率 37%, 無色油状) が得られた。
1H NMR (CD3OD): δ = 0.94 (s, 3H), 1.50-1.58 (m, 2H), 1.67-1.80 (m, 4H), 1.85-1.94 (m, 2H), 2.41 (t, J= 7.2 Hz, 2H), 2.76 (d, J= 13 Hz, 1H), 2.97 (dd, J= 13, 4.5 Hz, 1H), 3.29-3.32 (m, 1H), 3.48 (dd, J= 18, 11 Hz, 4H), 4.03 (s, 2H), 4.56 (dd, J= 6.7, 4.5 Hz, 1H), 5.09 (dd, J= 6.7, 4.0 Hz, 1H)
【００８６】
5-((3aR,6S,6aS)-2-オキサヘキサヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ペンタン酸(19)
【化２４】
2016027006.tif 000025
【００８７】
18 (1.1 mg, 3.2μmol) の CH3CN (500μL) と H2O (500μL) の混合溶液に、水酸化リチウム (5μmol) を加えた。12 時間撹拌した後、1 M の塩酸で反応を停止し、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーに通し、メタノールで洗浄した。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン-メタノール) で精製すると、標題化合物 700μg (収率 92%, 白色固体) が得られた。
1H NMR (CD3OD): δ =1.47-1.55 (m, 2H), 1.65-1.74 (m, 4H), 1.85-1.94 (m, 2H), 2.38 (t, J= 7.5 Hz, 2H), 2.76 (d, J= 13 Hz, 1H), 2.98 (dd, J= 13, 4.6 Hz, 1H), 3.29-3.32 (m, 1H), 4.56 (dd, J= 6.9, 4.6 Hz, 1H), 5.08 (dd, J= 6.9, 4.0 Hz, 1H)
【００８８】
5-((3aS,4S,6aR)-5-オキシド-2-オキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタン酸(21)
【化２５】
2016027006.tif 000026
【００８９】
ビオチン (20) (50 mg, 0.21 mmol)の酢酸1 ml溶液にNaBO3・4H2O (94.6 mg, 0.62 mmol)を室温下加えた。1時間20分室温で撹拌した後、チオ硫酸ナトリウム(160 mg)を加え、減圧下にて溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン-メタノール-水）で精製した後、さらに逆相カラムクロマトグラフィー（メタノール）にて精製し標題化合物51.6 mg (収率97％、薄黄色油状)を得た。
1H NMR (CD3OD): δ =1.49-1.63 (m, 2H), 1.63-1.75 (m, 2H), 1.83-1.95 (m, 2H), 2.26 (m, 2H), 3.06 (dd, J= 13, 2.1 Hz, 1H), 3.12-3.16 (m, 1H), 3.50 (dd, J= 13, 2.1 Hz, 1H), 4.60 (dd, J= 8.9, 5.2 Hz, 1H), 4.67 (dd, J= 8.9, 2.1 Hz, 1H)
【００９０】
5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノ-5-オキシドヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタン酸 (23)
【化２６】
2016027006.tif 000027
【００９１】
イミノビオチン(22) (5.0 mg, 0.021 mmol)の1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール100 μL溶液に30％ H2O2水溶液(5 μL)を室温下加えた。20分室温で撹拌した後、溶媒を減圧留去し、標題化合物5.2 mg (収率98％、ジアステレオ混合物 dr = 1:1.6、白色固体)を得た。
1H NMR (CD3OD): δ =1.55-1.82 (m, 10.4H), 1.84-1.93 (m, 3.2H), 2.00-2.11 (m, 2H), 2.19-2.31 (m, 5.2H), 2.96 (dd, J= 14, 7.5 Hz, 1H), 3.01 (dd, J= 16, 6.9 Hz, 1H), 3.15 (dd, J= 13, 5.8 Hz, 1.6H),3.23-3.28 (m, 1.6H), 3.48 (d, J= 16 Hz, 1H), 3.60 (dd, J= 14, 1.7 Hz, 1.6H), 4.86-4.91 (m, 2.6H), 4.95 (dd, J= 8.6, 6.3 Hz, 1.6H), 5.08 (dd, J= 8.6, 6.3 Hz, 1H)
【００９２】
5-((3aS,4S,6aR)-5-オキシド-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタン酸 (24)
【化２７】
2016027006.tif 000028
【００９３】
11(0.6 mg, 0.002 mmol)の1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール100 μL溶液に30％ H2O2水溶液(5μL)を室温下加えた。10分室温で撹拌した後、溶媒を減圧留去し、標題化合物0.6 mg (収率100％、ジアステレオ混合物 dr = 1:1.1、白色固体)を得た。
1H NMR (CD3OD): δ =1.60-1.80 (m, 8.4H), 1.90-2.18 (m, 4.2H), 2.33-2.39 (m, 4.2H), 3.03-3.10 (m, 2.1H), 3.20 (dd, J= 14, 5.8 Hz, 1H), 3.30-3.40 (m, 1.1H), 3.69 (d, J= 16 Hz, 1.1H), 3.96 (dd, J= 14, 1.2 Hz, 1H), 5.47 (dd, J= 7.4, 5.5 Hz, 1H), 5.53-5.58 (m, 2.1H), 5.73 (dd, J= 7.1, 5.5 Hz, 1.1H)
【００９４】
メチル5-((3aS,4S,6aR)-2-チオキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタノエート (26)
【化２８】
2016027006.tif 000029
【００９５】
ビオチンメチルエステル (25) (5.0 mg, 0.019 mmol)のトルエン200 μL溶液にLawesson's reagent (5.3 mg, 0.013 mmol) を加えた。100 ℃にて13時間撹拌した後、室温に冷却し溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン-メタノール）で不溶性化合物を除き粗生成物3.8 mg (白色固体)を得た。
【００９６】
5-((3aS,4S,6aR)-2-チオキソヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタン酸(27)
【化２９】
2016027006.tif 000030
【００９７】
26 を含む粗生成物2.4 mgのTHF溶液100 μLに20％水酸化ナトリウム水溶液100 μLを室温下加えた。60 ℃にて1時間撹拌した後、室温まで冷却し1 M塩酸500 μLを滴下し、溶媒を減圧留去した。得られた粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン-メタノール）で精製し、標題化合物0.7 mg（白色固体）を得た。
1H NMR (CD3OD): δ =1.42-1.51 (m, 2H), 1.57-1.72 (m, 3H), 1.75-1.82 (m, 1H), 2.28-2.34 (m, 2H), 2.79 (d, J= 13 Hz, 1H), 2.96 (dd, J= 13, 4.6 Hz, 1H), 3.25-3.28 (m, 1H), 4.48 (dd, J= 8.3, 4.6 Hz, 1H), 4.67 (dd, J= 4.3, 8.3 Hz, 1H)
【００９８】
5-((3aR,6S,6aS)-2-オキソヘキサヒドロチエノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ペンタン酸 (29)
【化３０】
2016027006.tif 000031
【００９９】
6-アミノヘキサン酸(3 mg, 0.023 mmol) の dioxane (500 μL) と H2O (500 μL) の混合溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を加え、pHが 9 程度になるよう調整した。28 (10 mg, 0.023 mmol)（市販品） を加え12 時間撹拌した後、エーテルを加え有機層を除去した。水層に対し塩酸で中和し、ろ過した。残渣をアセトンで洗浄し、減圧下溶媒を留去した。得られた固体をdioxane (500μL) と H2O (500μL)に溶解し、29% アンモニア水を加え、3 時間撹拌した。減圧で溶媒を留去し、得られた結晶をジクロロメタン-メタノールの混合溶媒で洗浄することで、標題化合物 4 mg (収率 49%, 白色固体) を得た。
MS (ESI) m/z 357 (M+H)+
【０１００】
(S)-2-((tert-butoxycarbonyl)amino)-6-(5-((3aS,4S,6aR,Z)-2-((2,2,2-trifluoroacetyl)imino)hexahydro-1H-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanamido)hexanoic acid (30)
【化３１】
2016027006.tif 000032
【０１０１】
28 (10 mg, 0.023 mmol) とNα-Boc-L-lysine(5 mg, 0.023 mmol)のジオキサン/水の混合溶媒を18 時間撹拌した後、エーテルを加え有機層を除去した。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物はさらなる精製操作を経ずに次の反応に用いた。
【０１０２】
(S)-2-アミノ-6-(5-((3aS,4S,6aR)-2-イミノヘキサヒドロ-1H-チエノ[3,4-d]イミダゾール-4-イル)ペンタンアミド)ヘキサン酸(31)
【化３２】
2016027006.tif 000033
【０１０３】
30 を含む粗生成物の dioxane (500 μL) と H2O (500 μL) の混合溶液に、塩酸を加え、pHが 3 程度になるよう調整した。5 時間撹拌した後、減圧下溶媒を留去した。得られた固体をdioxane (500 μL) と H2O (500μL)に溶解し、25% アンモニア水を加え、3 時間撹拌した。減圧で溶媒を留去し、得られた結晶をジクロロメタン-メタノールの混合溶媒で洗浄することで、標題化合物 3.1 mg (二段階収率 35%, 白色固体) を得た。
MS: 371.80
【０１０４】
(E)-ベンジル 5-((3aS,4S,6aR)-2,2-ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3] ジオキソール-4-イル)-2-ペンテノエート(33)
【化３３】
2016027006.tif 000034
【０１０５】
32 (10 mg, 0.047 mmol)の CH2Cl2 500 μL 溶液に、アクリル酸ベンジル (70 μL, 0.47 mmol) と第二世代 Hoveyda-Grubbs 触媒 (3 mg, 4.7 mmol) を加え、12 時間撹拌を続けた。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 10 mg (62%, 黄色油状) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.31 (s, 3H), 1.49 (s, 3H), 1.83-1.92. (m, 1H), 1.96-2.03 (m, 1H), 2.32-2.38 (m, 2H), 2.83 (dd, J= 13, 4.3 Hz, 1H), 2.87 (d, J= 13 Hz, 1H), 3.06-3.11 (m, 1H), 4.59 (t, J= 5.5 Hz, 1H), 4.84 (t, J= 4.6 Hz, 1H), 5.18 (s, 2H), 5.93 (d, J= 16 Hz, 1H), 7.01 (dt, J=16, 7 Hz, 1H) , 7.32-7.36 (m, 2H), 7.37 (d, J= 4.6 Hz, 3H)
【０１０６】
ベンジル5-((3aS,4S,6aR)-2,2-ジメチルテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタノエート(34)
【化３４】
2016027006.tif 000035
【０１０７】
33(10 mg, 0.028 mmol)の EtOH 1 mL 溶液に、パラジウム炭素 (10 w/w% Pd, 10 mol%, 5.0 mg) を加えた。30 atm の水素ガス存在下、70 ℃、2 時間撹拌を続けた。反応液を室温まで冷却し、セライトの短いカラムを用い、エタノールで溶出した。減圧で溶媒を留去し、得られた粗生成物はさらなる精製操作を経ずに次の反応に用いた。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ヘキサン-酢酸エチル) で精製すると、標題化合物 6.5 mg (67%, 薄黄色油状) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.31 (s, 3H), 1.49 (s, 3H), 1.47-1.50 (m, 2H), 1.65-1.75 (m, 3H), 1.80-1.86 (m, 1H), 2.37 (t, J= 7.0 Hz, 2H), 2.80 (dd, J= 13, 3.5 Hz, 1H), 2.85 (d, J= 13 Hz, 1H), 3.06-3.10 (m, 1H), 4.58 (t, J= 4.3 Hz, 1H), 4.88 (t, J= 4.3 Hz, 1H), 5.11 (s, 2H), 7.32-7.37 (m, 5H)
【０１０８】
5-((2S,3S,4R)-3,4-ジヒドロキテトラヒドロチオフェン-2-イル)ペンタン酸(35)
【化３５】
2016027006.tif 000036
【０１０９】
34(2.5 mg, 7.1μmol)の CH2Cl2 600 μL 溶液に、1M の三臭化ホウ素 (36 μL, 0.050 mmol)を-78℃ にて加えた。0℃、3 時間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン-メタノール) で精製すると、標題化合物 1.2 mg (収率 76%, 無色油状) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.43-1.50 (m, 2H), 1.65-1.75 (m, 3H), 1.80-1.88 (m, 1H), 2.38 (t, J= 7.3 Hz, 2H), 2.81 (t, J= 11 Hz, 1H), 3.03 (dd, J= 11, 7.0 Hz, 1H), 3.38-3.43 (m, 1H), 4.11 (t, J= 3.3 Hz, 1H), 4.31 (td, J= 9.1, 3.3 Hz, 1H)
【０１１０】
5-((3aS,4S,6aR)-2-オキシドテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3,2]ジオキサチオール-4-イル)ペンタン酸(36)
【化３６】
2016027006.tif 000037
【０１１１】
35(1.2 mg, 5.4 μmol)の CH3CN 400μL 溶液に、塩化チオニル (0.5μL, 7.2μmol)を-78℃にて加えた。0℃、3 時間撹拌した後、飽和食塩水を加え、CH2Cl2で抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し乾燥後、減圧で溶媒を留去した。得られた粗生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー (ジクロロメタン-メタノール) で精製すると、標題化合物 700μg (収率 48%, ジアステレオ混合物, dr = 2:1, 白色固体) が得られた。
1H NMR (CDCl3): δ = 1.50-1.74 (m, 12H), 1.85-1.95 (m, 6H), 2.39 (t, J= 7.4 Hz, 6H), 3.08 (dd, J= 14, 5.8 Hz, 1H), 3.14 (dd, J= 14, 2.1 Hz, 1H), 3.31-3.37 (m, 4H), 3.64 (br, 1H), 4.27-4.31 (m, 2H), 5.19 (dd, J= 5.5, 4.3 Hz, 1H), 5.33-5.36 (m, 1H), 5.36 (dd, J= 5.5, 4.3 Hz, 2H), 5.54-5.57 (m, 2H)
【０１１２】
4-((3aR,6S,7aR)-2-オキソヘキサヒドロ-2H-チオピラノ[3,4-d]オキサゾール-6-イル)ブタン酸 (37)
【化３７】
2016027006.tif 000038
【０１１３】
化合物17をMeOHに溶解し触媒量のPd/Cを用いて水素雰囲気化で撹拌することにより2重結合の還元を行う。続いて得られた化合物のエステル部位をCH3CN、H2O混合溶媒下にLiOHを用いて加水分解することによって37を得る。
【０１１４】
実施例２：変異体ストレプトアビジンの製造
（１）発現ベクターの構築
野生型コアストレプトアビジンをコードする遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。また、本発明では、低免疫原性（改変体）ストレプトアビジンとして国際公開ＷＯ２０１０／０９４５５に記載されているｍｃＳＡ３１４（本明細書中、ＬＩＳＡ３１４ＷＴ又はＬＩＳＡ３１４とも称する）を使用した。ｍｃＳＡ３１４は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において以下の変異の全てを有する、ストレプトアビジン変異体である。
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：及び
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
【０１１５】
発現ベクターは、上記の野生型ストレプトアビジンおよび改変体ストレプトアビジンと精製用タグであるズブチリジンプロドメイン部分の融合体タンパク質が発現するように設計を行った。N’末端側にズブチリジンプロドメイン遺伝子配列が組み込まれたベクター、ｐＰＡＬ７ベクター（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を利用しコドンを合わせ野生型ストレプトアビジンもしくは改変体ストレプトアビジンがC末端側に融合するタンパク質を発現するベクターを調製した。
具体的には、上記の配列を鋳型にし、５’端側にＨｉｎｄＩＩＩサイト、３’端側にＥｃｏＲＩサイトをＰＣＲにより付加する下記のプライマー１及び２を用い、ＰＣＲ後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩにて処理を行った。
プライマー１: GCTCTTCAAAGCTTTGGCCGAAGCTGGTATCACTG  （配列番号１３）
プライマー２：CTCGAGGAATTCTTAGCTAGCAGCAGAAGGCTTAAC  （配列番号１４）
【０１１６】
制限酵素処理をしたサンプルは電気泳動の後、ゲル精製を行った。同様にｐＰＡＬ７ベクター（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）も酵素処理を実施し、ゲル精製を行った。精製したベクターおよびＰＣＲ産物は２xＲａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  BｕｆｆｅｒとＴ４ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（供にＰｒｏｍｅｇａ社）を用いて指定の方法でライゲーションを実施した。大腸菌のトランスフォーメーションは５０マイクロリットルのDH５αコンピテントセル（TOYOBO社製）に対し、２マイクロリットルのライゲーション産物を添加し実施した。プラスミドの抽出はＭｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて実施し、得られたプラスミドについてシーケンス解析により配列の確認を実施した。
【０１１７】
（２）変異株の作成
各バリアント作製に用いたオリゴDNAは５’側が１５塩基オーバーラップするように、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）の説明書に従い設計した。下記のプライマーを使用し、 ＬＩＳＡ３１４が挿入されたpＣｏｌｄ TF ベクターを鋳型とし、ＳｉｔｅーＤｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。その後、制限酵素ＤｐｎＩにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
【０１１８】
プライマー：
S45N Fw: TATGAAAACGCCGTGGGTAATGCGGAA  （配列番号１５）
S45N Rv: CACGGCGTTTTCATAGGTGCCGGTCAG  （配列番号１６）
D128N Fw: CGTTGGCGGTGCTGATGCTCGTATCAACAC  （配列番号１７）
D128N Rv: GGTGCTGATGCTAAGATCAACACTCAGTGG  （配列番号１８）
【０１１９】
S45Nとは、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸残基のセリン（Ｓ）がアスパラギン（Ｎ）に置換している変異を意味する。
D128Nとは、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において１１６番目のアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に置換している変異を意味する。
【０１２０】
上記により、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
（７）３３番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギンに置換している変異；及び
（８）１１６番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換している変異
を有する変異体ストレプトアビジン（本書中、ＬＩＳＡ３１４  Ｎ４５  Ｎ１２８とも称する）を産生する大腸菌を作成した。配列番号２に記載のアミノ酸配列において上記（１）〜（８）の変異を有するアミノ酸配列を配列番号３に示す。
【０１２１】
（３）組換えタンパク質の発現
変異体ストレプトアビジンの遺伝子配列を組み込んだｐＰＡＬ７発現ベクターを大腸菌BL２１（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に常法に従いトランスフェクションを行った。タンパク質の発現は以下のように実施した。すなわち、大腸菌培養液の細胞密度がＯＤ（６００ｎｍ）０．５−０．７となるまで３７度にて培養を行い、最終濃度１mMになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−D−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、タンパク質発現を誘導し、１０℃〜３０℃好ましくは１６℃にて２４時間以上の培養を行った。培養の後、菌体を遠心分離により細胞を集め、タンパク質精製までマイナス２０℃で保存した。
【０１２２】
（４）組換えタンパク質の粗精製
組換えタンパク質（ＬＩＳＡ３１４−Ｖ１１）の粗精製は、改変ズブチリジンとズブチリジンプロドメインとの結合性を利用したアフィニティークロマトグラフィーを行った。具体的には、改変ズブチリジンをSperflow 6% agarose ビーズに固定したカラム（Bio-Scale Mini Profinity eXact Cartridge, BIO-RAD社）を使用した。
大腸菌の調製は細胞溶解液として10mM sodiumn phosphate, pH7.2 - 5.6、10xBugBuser reagent (Novagen)、核酸分解酵素（Benzonase） を添加し細胞の溶解を行った。溶解は室温で行い、溶解した液は35,000xg、30分間の遠心分離をおこなった。遠心分離後上清を総可溶性タンパク質とした。
【０１２３】
結合バッファー・洗浄バッファー１：10 mM リン酸ナトリウム、洗浄バッファー２：10 M リン酸ナトリム, 300 mM、溶出バッファー：10 M 酢酸ナトリウム, 100 mM フッ化ナトリウム、カラム再生バッファー：100 mM リン酸、カラム保存バッファー：10 mM リン酸ナトリウムを精製に使用した。なおバッファーpHについては天然型ストレプトアビジンの精製では、pH6.1、改変体ストレプトアビジンの精製ではpH6.8に調製した。
【０１２４】
精製は以下の手順でおこなった。
10カラムボリュームのバッファーでカラムを平衡化した。次に、大腸菌の総可用性タンパク質を2ml/minの流速でカラムへアプライした。カラムへのアプライ後10カラムボリュームの洗浄バッファー１でカラムを洗浄した。次に10カラムボリュームの洗浄バッファー２でカラムの洗浄を行った。その後、１カラムボリュームの溶出バッファーを注入し30分間室温でインキュベーションを行った。インキュベーションの後、溶出バッファー3カラムボリュームでタンパク質の溶出を行った。その後、５カラムボリュームのカラム再生バッファーでカラムの再生を行った。最後に５カラムボリュームのカラム保存バッファーでカラムを洗浄し精製を終了した。
精製の結果を図１に示す。
【０１２５】
（５）粗精製された組換えタンパク質の高純度化精製
以降、バッファーのpHについては、改変体ストレプトアビジンはpH7.0とする。
粗精製された組換えタンパク質は、セラミックハイドロキシアパタイトカラムによる精製の準備として10,000 MWCOの限外ろ過膜を使用し遠心ろ過にて濃縮をした。濃縮後、脱塩カラム用い、5 mM リン酸ナトリム溶液にバッファーを置換した。セラミックハイドロキシアパタイトカラムはCHT2-1(BIO-RAD社)を使用し、すべての作業の流速は2ml/minで行った。初めに10カラムボリュームの５ｍMリン酸ナトリムでカラムの平衡化を行った。次にバッファー置換された粗精製サンプルをアプライしカラムへ吸着させた。洗浄を6カラムボリューム行った後、5mM リン酸ナトリウム、500mM 塩化ナトリムバッファーでタンパク質の溶出を行った。
【０１２６】
実施例３：ビオチン−ＨＲＰ標識体との競合解析
ＥＬＩＳＡ用プレートＨ（住友ベークライト）に精製された変異体タンパク質を５μｇ／ｍＬ、１００μｌ、４℃オーバーナイトの条件で固相化を行った。固相化の後、ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ  Ｂｌｏｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（サーモサイエンティフィック社）を用いて２００μｌ／ウエル、５分間のブロッキングを行った。その後、１０μＭ、１００μｌ／ウエルで実施例１に記載の化合物１１(即ち、(3aS,4S,6aR)-2-オキソテトラヒドロチエノ[3,4-d][1,3]ジオキソール-4-イル)ペンタン酸）を１時間、室温で反応させた。洗浄の後、１２．５ｎＭ、１００μｌ／ウエル、１時間、室温でＢｉｏｔｉｎ−ＨＲＰ標識体を反応させた。洗浄後、１００μｌ／ウエル、室温、３０分で反応させた。発色の度合いを比較した結果（図２）、化合物１１と標識体が競合している様子が確認された。
【０１２７】
実施例４：LISA314バリアントの製造
（１）LISA314バリアントの発現ベクターの調製
各バリアント作製に用いたオリゴDNAは５’側が１５塩基オーバーラップするように、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）の説明書に従い設計した。下記のプライマーを使用し、 ＬＩＳＡ３１４が挿入されたpＣｏｌｄ TF ベクターを鋳型とし、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。その後、制限酵素ＤｐｎＩにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
プライマー：
LISA314 V21 Fw: TGGAGCgatCAGCTGGGCgatACCTTT（配列番号１９）
LISA314 V21 Rv: CAGCTGatcGCTCCAGGTGCCGGTAAT  （配列番号２０）
【０１２８】
LISA314バリアントであるLISA314 V21は、LISA314に対してさらに、N23D、S27Dの変異を有する。N23Dとは、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において１１番目のアミノ酸残基のアスパラギン（Ｎ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換している変異を意味する。S27Dとは、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において１５番目のアミノ酸残基のセリン（Ｓ）がアスパラギン酸（Ｄ）に置換している変異を意味する。
【０１２９】
即ち、LISA314 V21は、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において、
（１）１０番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（２）７１番目のアミノ酸残基のチロシンがセリンに置換している変異：
（３）７２番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（４）８９番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換している変異：
（５）９１番目のアミノ酸残基のアルギニンがリジンに置換している変異：
（６）１０４番目のアミノ酸残基のグルタミン酸がアスパラギンに置換している変異：
（７）１１番目のアミノ酸残基のアスパラギンがアスパラギン酸に置換している変異；
（８）１５番目のアミノ酸残基のセリンがアスパラギン酸に置換している変異：
を有する変異体ストレプトアビジンであり、このアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【０１３０】
（２）組換えタンパク質の発現
各ミュータントタンパク質の発現は  ｐＣｏｌｄ  TFベクター（タカラバイオ）のマニュアルに従い実施した。具体的には、発現ベクターを大腸菌BL２１（タカラバイオ）に常法に従いトランスフォーメーションを行い、大腸菌培養液の細胞密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝  ０．５−０．７となるまで３７度で培養を行い、その後１５度で１時間静置し最終濃度１mMになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−D−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、タンパク質発現を誘導し、１５度で２４時間の培養を行った。培養の後、菌体を遠心分離により細胞を集め、タンパク質精製までマイナス２０℃で保存した。
【０１３１】
（３）組換えタンパク質の粗精製
組換えタンパク質の粗精製は、６xHｉs−ｔａｇを使用したアフィニティークロマトグラフィーを行った。具体的にはＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）を担体として使用した。
大腸菌の調製は細胞溶解液としてＢ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＴＩＦＩＣ）、Ｌｉｓｏｎａｓｅ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ＲｅａｇｅｎｔをＢ−ＰＥＲ１ｍＬあたり３ｍＬ添加し細胞の溶解を行った。溶解は室温で行い、溶解した液は２７，０００ｘｇ、２０分間の遠心分離を行った。遠心分離後、上清を総可溶性タンパク質とした。
１０カラムボリュームの結合／洗浄バッファー（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）でカラムの平衡化およびサンプルアプライ後のカラムの洗浄を行った。また、３カラムボリュームの溶出バッファー（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４００mＭ  イミダゾール、ｐＨ８）で結合タンパク質の溶出を行った。
【０１３２】
（４）TFタグの切断および除去
５μｇの粗精製タンパク質に対し、５ＵのＨＲＶ  ３Ｃ  Ｐｒｏｔｅａｓｅを使用しタグの切断を行った。４℃で２４時間反応後、変性バッファー（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌ、６Mグアニジン塩酸塩、５００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で変性を行い、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  を使用したアフィニティークロマトグラフィーを行った。
【０１３３】
実施例５：結晶構造解析
（１）結晶化条件
LISA314―ビオチン
シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて, 20 ℃で結晶化を行った(図３)。蛋白質溶液は, 9 mg/ml LISA314, 15 mM tris-HCl pH7.5, 150 mM NaClとした。ビオチンは, LISA314精製途中に過剰量添加した。結晶化母液(60 μl)には, 0.2 M Ammonium Sulfate, 0.1 M Sodium acetate trihydrate pH5.2, 22% (w/v) Polyethylene glycol 4000を用い, 結晶化内液は蛋白質溶液0.5 μl, 結晶化母液0.5 μlを混合したものとした。
【０１３４】
LISA314-V21―iminobiotintail
シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて, 20 ℃で結晶化を行った。蛋白質溶液は, 10 mg/ml LISA314-V21, 20 mM tris-HCl pH7.5, 250 mM NaClとした。Iminobiotintail（実施例１の化合物２９、以下に構造を示す）は, LISA314-V21精製途中に過剰量添加した。
【０１３５】
【化３８】
2016027006.tif 000039
【０１３６】
結晶化母液(60 μl)には、0.1 M Sodium acetate trihydrate pH4.5, 30% (w/v) Polyethylene glycol 1500を用い, 結晶化内液は蛋白質溶液0.5 μl, 結晶化母液0.5 μlを混合したものとした。
【０１３７】
（２）結果
結晶構造の解析結果を図４及び図５に示す。
ストレプトアビジンのビオチンと水素結合を作っている23番目（配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において１１番目）のアミノ酸Asn23をAlaに置き換えたN23Aの変異型ストレプトアビジンは、ビオチンとの結合力が大きく低下することが報告されている。また、この変異型ストレプトアビジンのビオチンと複合体を形成した結晶構造も報告されている（PDB ID、1N43。1N43の立体構造およびN23Aの近傍を、我々のLISA314の結晶構造を比較すると、LISA314ではAsn23は近傍のGly26と水素結合を形成し相互作用している（図４右上のLISA314のN23とG26を結ぶ点線、白抜き矢印で示されている）。一方、1N43では、Ala23とGly26にはこれに相当する水素結合は存在していない（図４左下の1N43の黒矢印で示された部分）。このため、LISA314と比較して1N43におけるN23Aの変異はN23からS27にかけてのloop構造を不安定化すると考えられ、N23Dの変異を施すことにより、この23番目（配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において１１番目）のアミノ酸とGly26との水素結合が維持され、N23からS27にかけてのloop構造が安定するのではないかと考えた。実際、図４右下に示すようにN23Dの変異を施したLISA314-V21の結晶構造では、この水素結合が保存されている（白抜き矢印で示された点線）。変異型ストレプトアビジンLISA314-V21はビオチンではなくイミノビオチンとの相互作用が強くなることを期待して作成された。そのため、N23Dの変異に加えてS27Dの変異を施しており、LISA314-V21のAsp27はイミノビオチンのN原子と相互作用している。
【０１３８】
実施例６：ＳＰＲによるアフィニティー解析
（１）発現ベクターの構築（ＬＩＳＡ３１４  V２１；Ｎ２３Ｄ、Ｓ２７など）
Ｂｉａｃｏｒｅによるアフィニティー解析に用いるタンパク質は ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター（ミリポア・メルク社） により発現させ、封入体を巻き戻すことでリコンビナントタンパク質を調整した。具体的には、 ｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクター を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩを用いて直さかを行った。次に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クローンテック社）のマニュアルに従い直鎖化を実施したベクターに合うＰＣＲプライマーを設計し、前述の各バリアントLISA314 V21発現ベクター（ｐＣｏｌｄ  ＴＦ）をテンプレートとしてＰＣＲを実施した。増幅された配列はアガロースゲル電気泳動にて目的のバンドを切り出し、ＤＮＡを抽出して精製を行った。直鎖化されたベクターと精製されたＰＣＲ産物とをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを使用しライゲーションを行った。
プライマー：
For pET21a(+) Fw: AATGGGTCGCGGATCCGCCGAAGCAGGTATTACCGGCAC（配列番号２１）
For pET21a(+) Rv: GGTGGTGGTGCTCGAGGCTGGCCGCGCTCGGTTTAACTTTG（配列番号２２）
【０１３９】
（２）LISA314 V21 バリアント発現ベクターの構築
LISA314 V21の各種バリアント作製に用いたオリゴDNAは５’側が１５塩基オーバーラップするように、ＰｒｉｍｅｒＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）の説明書に従い設計した。以下のプライマーを使用し、上述のLISA314 V21が挿入されたベクターを鋳型とし、Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法により塩基配列の置換によるコドン配列の変更を行いアミノ酸配列の変換を行った。その後、制限酵素ＤｐｎＩにて鋳型プラスミドを切断し、大腸菌の形質転換を行った。
【０１４０】
プライマー
S45A Fw: TATGAAgcaGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号２３）
S45A Rv: CACGGCtgcTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号２４）
S45Q Fw: TATGAAcagGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号２５）
S45Q Rw: CACGGCctgTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号２６）
S45L Fw: TATGAActgGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号２７）
S45L Rv: CACGGCcagTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号２８）
S45I Fw: TATGAAatcGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号２９）
S45I Rw: CACGGCgatTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号３０）
S45H Fw: TATGAAcatGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号３１）
S45H Rv: CACGGCatgTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号３２）
S45T Fw: TATGAAaccGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号３３）
S45T Rw: CACGGCggtTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号３４）
S45V Fw: TATGAAgtgGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号３５）
S45V Rv: CACGGCcacTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号３６）
S45N Fw: TATGAAAACGCCGTGGGTAATGCGGAA（配列番号３７）
S45N Rv: CACGGCGTTTTCATAGGTGCCGGTCAG（配列番号３８）
【０１４１】
S45A、S45Q、S45L、S45I、S45H、S45T、S45V、及びS45Nはそれぞれ、配列番号２に記載のコアストレプトアビジンのアミノ酸配列において３３番目のアミノ酸残基のセリンが、アラニン（Ａ）、グルタミン（Ｑ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、ヒスチジン（Ｈ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）及びアスパラギン（Ｎ）に置換していることを示す。即ち、LISA314 V21に対して更に、上記のS45A、S45Q、S45L、S45I、S45H、S45T、S45V及びS45Nの何れかのアミノ酸変異が導入された変異体が製造される。これらの変異体のアミノ酸配列を配列表の配列番号５〜１２に示す。
【０１４２】
（３）組換えタンパク質の発現
各変異体タンパク質の発現は  目的のバリアント発現遺伝子が挿入されたｐＥＴ−２１ａ（＋）ベクターを大腸菌BL２１（ＤＥ３）（ ミリポア・メルク社）に常法に従いトランスフォーメーションを行い、大腸菌培養液の細胞密度がＯＤ（６００ｎｍ）＝  ０．５−０．８となるまで３７度で培養を行い、最終濃度１mMになるようにＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−D−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、タンパク質発現を誘導した。４−１６時間で培養の後、菌体を遠心分離により細胞を集め、タンパク質精製までマイナス２０℃で保存した。
【０１４３】
（４）組換えタンパク質（封入体）の調整
大腸菌の調製は細胞溶解液としてＢ−ＰＥＲ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＴＩＦＩＣ）、Ｌｉｓｏｎａｓｅ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ＲｅａｇｅｎｔをＢ−ＰＥＲ１ｍＬあたり３ｍＬ添加し細胞の溶解を行った。溶解は室温で行い、溶解した液は２７，０００ｘｇ、２０分間の遠心分離を行った。遠心分離後、上清を破棄しペレットを封入体として回収した。回収した封入体はＭｉｌｌｉＱ水で１０倍希釈したＢ−ＰＥＲ１０mLにて再懸濁し２７，０００ｘｇ、２０分間の遠心分離により再回収する洗浄作業を３回行った。最後に界面活性剤の除去のためにミリQにより再懸濁を行い遠心分離により回収を行った。回収した封入体は小分け分注をしマイナス８０℃にて凍結保存した。
【０１４４】
（５）封入体の巻戻し
封入体の巻戻しは凍結保存した封入体を変性バッファー（２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、６Mグアニジン塩酸塩、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ1.5）で可溶化した。ビオチンの除去を行うために１００倍のボリュームの透析バッファー（変性バッファーと同じ）に対して４時間、２回を実施した。その後、可溶化した液の吸光度２８０ｎmによるタンパク質濃度が４０−５０ｍｇ／ｍＬとなるように濃度を透析バッファーで調節した。巻戻しは、希釈法を用いた。具体的にはスターラーで撹拌している５０ｍＬの希釈バッファー（ ２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に濃度調節したタンパク質溶液１００マイクロリットルを滴下し希釈することで巻戻しを行った。
【０１４５】
（６）巻戻しタンパク質の精製
希釈法により巻き戻したタンパク質は、ｃＯｍｐｌｅｔｅ  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ（ロシュ社）を用いてアフィニティークロマトグラフィーを実施した。これらの精製タンパク質を濃縮しゲル濾過クロマトグラフィーにより４量体画分の分取を実施した。
巻戻しタンパク質の精製の一例を図６に示す。
【０１４６】
（７）ＳＰＲによる化合物とのアフィニティー解析
アフィニティー解析にはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いた。具体的には、ゲル濾過クロマトグラフィーにより分取してきたタンパク質を Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＮＴＡを使用し固定化した。ランニングバッファーは、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０、ＨＢＳ−Ｐ＋を使用した。ニッケルのＮＴＡへの固定化、リガンドのキャプチャーは附属のテンプレートプログラムにより実施した。
【０１４７】
（８）ビアコアアッセイ
センサーチップへのリガンドの固定化量は、マストランスポートリミテーションを抑制するために１６０８ＲＵ〜８０４２ＲＵの範囲に収まるようにした。アナライトにはビオシチンおよび実施例１で合成した化合物２９（構造を以下に示す）を使用した。なお、ビオシチンは、ビオチンの主たる存在形態である。
【０１４８】
【化３９】
2016027006.tif 000040
【０１４９】
アナライトの濃度は、ビオシチンの場合１μMから2倍希釈8系列を調製し、化合物２９の場合１６μMから２倍希釈１２系列を調製した。測定は、流速３０μｌ／分、コンタクトタイムは１２０秒、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅは６００秒で測定を行った。データの解析は、全濃度のセンサーグラムを解析ソフトウエアに取り込み、平衡値解析を行い、解離定数ＫＤの算出を行った。そのグラフを図７〜図９に示し、算出されたＫＤ値を表１に示す。その結果、ＬＩＳＡ３１４Ｖ２１と化合物２９との相互作用はビオシチンとの相互作用の約２倍程度強いことが分った。
【０１５０】
【表１】
2016027006.tif 000041
【図１】
2016027006.tif 000045
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年2月27日(2013.2.27)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、ビオチン改変体、ストレプトアビジン変異体およびそれらの利用に関する。より詳細には、本発明は、天然ビオチンとの親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、上記ストレプトアビジン変異体と親和性を有するビオチン改変体、並びにそれらの利用に関する。