(57)【要約】【課題】マレイミド基を導入した細胞培養基材と、細胞接着因子であるタンパク質を共有結合させることによって細胞を接着させる方法を提供すること。【解決手段】マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介して細胞を接着させる方法を提供することで前記課題を解決する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介して細胞を接着させる方法。
【請求項２】
前記マレイミド基を導入した細胞培養基材が、マレイミド化デンドリマー化合物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞接着因子がタンパク質であることを特徴とする請求項１および２記載の方法。
【請求項４】
マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介して細胞を接着させた後、培養する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の固定化に用いる表面修飾材料およびそれを用いた細胞接着タンパク質の固定化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を固体表面に固定化する技術は微細な反応場を提供する酵素の固定化や、タンパク質の持つ特異的性質を利用した分離、接着足場材等、多岐に渡って利用されている。
【０００３】
バイオ関連産業では接着性を持つ動物細胞が培養され、培養細胞を用いた医療への応用が行われている。接着性を持つ動物細胞を培養する際には、細胞培養基材として従来ポリスチレン等の平板基材を用いることにより、基材表面に接着させて培養する方法が知られている。また、接着性を持たない動物細胞を培養する際には、細胞接着因子として接着機能を持つタンパク質を用いることが知られている。
【０００４】
この接着機能をもつタンパク質として、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等が知られている。これら接着機能をもつタンパク質を使用することによって細胞を培養する基材表面に固定化したり、被覆したりする事で細胞接着性を高めている。また、フィブロネクチンについては、先行技術に示されているように、生産性が高い、大腸菌を使った異種タンパク質発現系が報告されている。（非特許文献３、４）
細胞培養基材にタンパク質等の細胞接着因子を固定化する方法として、物理的吸着や、共有結合を用いる方法等、多くの方法が試みられている。しかしながら、固定化されるタンパク質の割合や活性の維持率等は、タンパク質の性質や細胞培養基材の基材表面の影響を受けるため、個々の目的物の性質に大きく左右されることが知られている。
【０００５】
再生医療に用いる動物細胞、特にヒト由来細胞のうち、接着性の細胞を培養する際に用いる培養基材表面を修飾する方法として、これまでに多数の技術が報告されている。この培養基材表面の修飾技術の一つとして、デンドリマー化合物を用いる方法が知られている。（特許文献１、２、３、非特許文献１）しかしながら、デンドリマー化合物はタンパク質を固定化するには、アミノ酸残基の側鎖に含まれる官能基との反応性が低いという課題があった。
【０００６】
また、タンパク質固定化技術の一つとして、マレイミド化合物を用いる方法が知られている。（特許文献４、非特許文献２）しかしながら、細胞培養基材として用いるポリスチレン表面等の化学的に安定な基材表面に、マレイミド官能基を導入することは困難であった。
【０００７】
その他、細胞培養基材の基材表面の改質を目的とした表面修飾を施したのち、細胞に直接作用するタンパク質、たとえば細胞接着タンパク質を修飾基材表面に固定化するには、修飾表面の物理・化学的性質を反映しながら、固定化されたタンパク質の持つ生化学的性質を利用する必要があった。さらに、培養する細胞同士の方向性を定め、なおかつ細胞基材に細胞を接着させて培養させるということは困難であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００５−１９２４０６号公報
【特許文献２】特開２００５−２４５２２４号公報
【特許文献３】特開２０１０−２００７４５号公報
【特許文献４】特開２０１３−１７２６５５号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍ．  Ｋｉｎｏ−ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８  （２００７）  １６８０−１６８８
【非特許文献２】Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ  “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”９４０−９５０
【非特許文献３】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｌｅ  ＣＦ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ，  １５：１０２１−４
【非特許文献４】Ｍａｒｄｏｎ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３４０：１９７−２０１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
すなわち本発明の目的は、マレイミド基を導入した細胞培養基材と、細胞接着因子であるタンパク質を共有結合させることによって細胞を接着させる方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、前記の課題に対し、鋭意検討した結果、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介して細胞を接着させる方法。
（２）前記マレイミド基を導入した細胞培養基材が、マレイミド化デンドリマー化合物であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）前記細胞接着因子がタンパク質であることを特徴とする（１）および（２）記載の方法。
（４）マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介して細胞を接着させた後、培養する方法。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明によって得られるマレイミド基を導入した細胞培養基材は、デンドリマー化合物の分子鎖先端にマレイミド基を持つ、マレイミド化デンドリマー化合物を例示することができる。
【００１３】
細胞培養基材の出発材料は、動物細胞用の培養基材であれば材質は特に限定されない。例示としてポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネイト等のプラスチックやガラス製の培養容器が挙げられる。本発明では、好ましい例としてポリスチレン製の培養プレートを用いる。また、表面にタンパク質吸着防止等の特殊加工をしていないポリスチレン培養プレートが特に好ましい。
【００１４】
デンドリマー形成を開始する方法として、直接固相に合成してもよい。またポリスチレンを使用する場合、表面は化学的な修飾を受けにくいため、カリウムｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）によりＯＨ基を導入することがより好ましい例として挙げられるがこの限りではない。
【００１５】
マレイミド化デンドリマー化合物のうち、デンドリマー化合物としては、特に限定されず、例えば、公知のポリアミドアミンデンドリマーや、先行特許文献１〜３および非特許文献１に示されているポリイミノアミンデンドリマーなどが挙げられる。デンドリマー末端は、タンパク質結合の為の官能基を導入するためにアミノ基であることが好ましく、より好ましくは、トリス（２−アミノエチル）アミン（トリスアミン）を用いることが例示できる。また、培養表面に提示したヒドロキシル基と前記トリスアミンを架橋するための物質は、ヒドロキシル基およびアミノ基と反応するものであれば特に限定されないが、特にアルデヒド構造を２か所に持つグルタルアルデヒドが好ましい。
【００１６】
先行特許文献３に示されるように、デンドリマー化合物はグルタルアルデヒドとトリスアミンによるアミン形成反応を繰り返し行い、デンドリマー化合物の層を形成してもよい。この場合、グルタルアルデヒドとトリスアミンの反応１回ずつを行った化合物を世代数１（Ｇ１）とし、繰り返し反応を行うたびに、世代数２、３、４、５（Ｇ２、３，４、５）と増加させる。
【００１７】
デンドリマー鎖は、酸化等の影響を受けやすく、化学的に不安定な二重結合が生成する。これを化学的に安定な状態とするため、水素化ホウ素ナトリウムによる水素化還元で水素付加、二重結合の還元を行うことが好ましい。
【００１８】
本発明に用いるマレイミド化合物は、細胞培養基材にマレイミド基を導入する際に用いられる。マレイミド基を有する化合物であれば特に限定されず、マレイミド基を細胞培養基材に導入する際に使用される化合物としてはＮ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−  （ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）  マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（  Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］コハク酸イミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、（コハク酸イミジル−４−マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、Ｎ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオン酸を例示できる。本発明においては、デンドリマー末端のアミノ基との反応性を担保し、かつマレイミド基を先端に導入できるＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオン酸が特に好ましい。
【００１９】
細胞接着因子は特に限定されないが、接着細胞培養用に培養表面を改質するには、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン等の細胞接着性を有するタンパク質が好ましく、特にフィブロネクチンがより好ましい。フィブロネクチンは非特許文献３、４に示されているように、遺伝子組換え大腸菌を利用した大量発現系が既に知られており、活性型のタンパク質を大量に得ることが可能である。
【００２０】
マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介して接着させる、または培養する細胞としては特に限定されない。たとえばｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、間葉系幹細胞といったヒト由来接着性細胞のほか、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、マウス線維芽細胞３Ｔ３等の哺乳類細胞などが例示できる。また血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞（生細胞）や、体内あるいは環境中に存在する微生物、原虫等が例示できる。
【００２１】
なお、本発明によれば、細胞接着因子としてタンパク質を例に挙げられるが、前記タンパク質の特定の残基と細胞培養基材との結合を行う際に、前記タンパク質の配向を制御しつつ細胞培養基材に前記タンパク質の固定を行なうことができる。例示として、システインのようなチオール官能基を持つタンパク質を、マレイミド官能基との共有結合で固定化することができる。その他、たとえばリジンのような、側鎖にアミノ基を持つアミノ酸残基とマレイミド官能基を共有結合させることもできる。これ以外にも、マレイミド基とチオール結合できるような物質を細胞接着因子として、もしくは細胞接着因子に付加することによってマレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介して細胞を接着できれば特に制限はない。
【００２２】
細胞培養に用いる培地は、動物細胞が培養できる成分を含有するものであれば特に限定されないが、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）が好ましく、また、栄養源供給の観点から、ウシ血清（ＦＢＳ）のほか、Ａｌａ−Ｇｌｎのようなジペプチドを含有させるとよい。また、汚染防止を目的としたカナマイシン、ネオマイシン等の抗生物質を含有してもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によって得られる細胞培養基材は、デンドリマー化合物の分子鎖先端にマレイミド基を持つ、マレイミド化デンドリマーである。本発明によれば、前述の通り化学的に比較的安定なポリスチレン等の基材表面にデンドリマー化合物による修飾を行うことができる。また、本発明により得られる細胞培養基材表面は、動物細胞の接着性を担保し、増殖に悪影響を与えないという特徴がある。
【００２４】
本発明によって得られたマレイミド基を導入した細胞培養基材を用いた方法は、前記細胞培養基材と細胞接着因子の共有結合の位置をあらかじめ設計することによって細胞培養基材表面に細胞接着因子を介して細胞の方向性を制御して接着することができる。また、本発明により得られるマレイミド基を導入した細胞培養基材を用いると、細胞の方向性を制御しつつ細胞培養が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】マレイミド化デンドリマー修飾表面の合成過程。・各工程の反応１  ＰＳ面に対してｔ−ＢｕＯＫによるヒドロキシル基導入２  α−グルタルアルデヒドによるアルドール結合３  トリス（２−アミノエチル）アミン導入４  水素化ホウ素ナトリウムによる、二重結合還元５  Ｎ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオン酸によるマレイミド  基の導入
【図２】細胞接着タンパク質フィブロネクチンを結合したマレイミド化デンドリマー培養表面を用いてマウス線維芽細胞３Ｔ３を培養した場合の培養写真。星形に伸張している細胞が観察された。これら伸張した細胞は培養表面に接着している。
【図３】フィブロネクチンを結合していないマレイミド化デンドリマー培養表面を用いてマウス線維芽細胞３Ｔ３を培養した場合の培養写真。球形の浮遊した細胞のみ観察された。
【実施例】
【００２６】
実施例１  細胞培養基材の培養表面の作製
先行技術文献（特許文献３）に記載の方法で、培養表面にデンドリマー修飾を行った。デンドリマー修飾を行う、培養用表面を持つ培養容器としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネイトなどのプラスチック表面であれば特に限定されないが、好ましくはポリスチレン表面、本発明においてはコーニング社製１２ウェル  プレートｃｏｓｔｅｒ３５１３を用いた（丸型ウェル直径２２．１ｍｍ、底面積３．８ｃｍ２、最大  ６．９  ｍＬ／ｗｅｌｌ）。
【００２７】
この平面培養基材表面にヒドロキシル基を提示させるために、５０μｍｏｌ／ｍｌのカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）水溶液を１．５ｍｌウェルに添加し、室温で１  時間静置した。その後、ｔ−ＢｕＯＫ水溶液を除去後、前記ウェルを滅菌水で１  回洗浄した。
【００２８】
次いで、各ウェルに１．０ｍＬの０．３６Ｍ  グルタルアルデヒド水溶液を添加し、室温で１  時間静置した。その後、グルタルアルデヒド水溶液を除去し、１．５ｍＬの滅菌水で３回洗浄した。
【００２９】
前記ウェルに０．３６Ｍトリス（２−アミノエチル）アミン水溶液（ｐＨ９．０）を添加して室温で１  時間静置した。その後、トリス（２−アミノエチル）アミン水溶液を除去し、１．５ｍＬの滅菌水で３回洗浄した。
前記ウェルに０．５μｍｏｌ／ｍｌの水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）  を添加して１６時間、室温に静置した。この方法により、デンドリマー修飾培養表面を得た。
【００３０】
実施例２  マレイミド化デンドリマー化合物の作製
実施例１の方法により得られたデンドリマー修飾培養表面に、マレイミドを提示させるために、５ｍｇ／ｍＬのＮ−スクシンイミジル３−マレイミドプロピオン酸のジメチルスルホキシド溶液を、各ウェルに１．０ｍＬずつ添加し、４時間、３５℃の恒温器内で静置した。その後、前記マレイミド化合物溶液を除去した後、１．５ｍｌの７０％エタノール水溶液で３回洗浄した。エタノール水溶液を除去したのち、室温で乾燥させた。この方法により、マレイミド化デンドリマー修飾培養表面を得た。実施例１〜２に記載の方法により調製されるマレイミド化デンドリマー修飾面について、形成過程の構造を図１に示す。
【００３１】
実施例３  細胞培養基材と細胞接着因子の固定
先行技術文献（非特許文献３、４）に示されている方法で、細胞接着因子である細胞接着タンパク質フィブロネクチンを調製した。
【００３２】
次いで、フィブロネクチンを反応用緩衝液内に調製した。反応用緩衝液の組成は、Ｄ−ＰＢＳ（−）、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、０．１Ｍ  ＥＤＴＡの混合液とした。フィブロネクチンが０．２ｍｇ／ｍｌとなるように溶液中の濃度を調整した。
【００３３】
実施例１および２の方法で得られたマレイミド化デンドリマー修飾培養表面を持つ培養ウェルを１．５ｍｌのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。その後、前記フィブロネクチン溶液を培養ウェルに１．０ｍＬずつ添加し、室温で１５時間静置した。その後、フィブロネクチン溶液を除去し、１．５ｍｌのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。
【００３４】
前記フィブロネクチン結合プレートのウェルに対し、α−チオグリセリン  １００μｇ／ｍＬ，Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液を添加し、室温で３時間静置した。その後、チオグリセリン溶液を除去し、１．５ｍｌのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。これにより、フィブロネクチンが結合していないマレイミドにチオグリセリンが結合して、マレイミドの反応性をブロックした。
【００３５】
この方法により、細胞接着性タンパク質結合マレイミド化デンドリマー修飾培養表面を得た。
【００３６】
実施例４  マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介したマウス繊維芽細胞の接着及び培養
実施例１〜３に示した方法により得られた細胞接着性タンパク質結合マレイミド化デンドリマー修飾培養表面を用いてマウス繊維芽細胞（３Ｔ３細胞）を培養し、細胞接着性を評価した。培地として、Ｄ−ＭＥＭ培地に、２ｍＭ  Ａｌａ−Ｇｌｎ（たとえばシグマアルドリッチＧ８５４１）を添加した培地を用いた。５×１０＾４細胞／ｍｌとなるよう調整して、各ウェルに１．０ｍｌずつ播種した。培養した細胞の写真を図２に示す。星形に伸張した接着細胞が観察され、培養面に固定化されたフィブロネクチンを介して３Ｔ３細胞が接着していることが観察された。
【００３７】
従って、マレイミド基を導入した細胞培養基材であるマレイミド化デンドリマー化合物を用いることにより、細胞接着因子を介して細胞が細胞培養基材に接着し、培養が可能となった。
【００３８】
比較例１  細胞接着性タンパク質を結合しないマレイミド化デンドリマー修飾培養表面を用いたマウス繊維芽細胞の培養
実施例１〜２に示した方法により得られたマレイミド化デンドリマー修飾培養表面に対し、α−チオグリセリン  １００μｇ／ｍＬ，Ｄ−ＰＢＳ（−）溶液を添加し、室温で３時間静置した。その後、チオグリセリン溶液を除去し、１．５ｍｌのＤ−ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。これにより、マレイミドにチオグリセリンが結合して、マレイミドの反応性をブロックした。
【００３９】
実施例４と同様の方法で３Ｔ３細胞を培養すると、浮遊している球形の細胞のみが観察された。すなわち、マレイミド基を導入した細胞培養基材に、細胞接着因子を介さなければ細胞が接着しないことが観察された。培養した細胞の写真を図３に示す。
【図１】
2016198022.tif 000002
【図２】
2016198022.tif 000003
【図３】
2016198022.tif 000004