(57)【要約】【課題】  本発明は、食道アカラシアの感受性遺伝子とそのＳＮＰの検出を利用した発症リスクの判定技術を確立することを目的とするものである。【解決手段】  本発明は、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベースに登録されているｒｓ番号で示される一塩基多型であって、ヒト第２番染色体上のＡＬＫ遺伝子におけるｒｓ１８８１４２０並びにｒｓ３７９５８５０、ヒト第６番染色体上のＰＳＯＲＳ１Ｃ１遺伝子におけるｒｓ１０６３６４６、ヒト第７番染色体上のＡＢＣＢ１遺伝子におけるｒｓ２０３２５８２、ヒト第１７番染色体上のＲＰ５−１１７１Ｉ１０．４又はＲＮＦ４３遺伝子におけるｒｓ２５２６３７４、ヒト第２０番染色体上のＩＴＰＡ遺伝子におけるｒｓ１１２７３５４、ヒトＸ染色体上のＴＩＭＰ１遺伝子又はＳＹＮ１遺伝子におけるｒｓ４８９８遺伝子よりなる群から選択される一以上の一塩基多型及び／又は該一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を検出する工程を含む、食道アカラシアの発症リスクの判定方法に関する。本発明によれば、早期に食道アカラシアの発症リスクを判定することが可能となり、リスクが高い人に関して早期に医療上の指導を与える又は治療を開始することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベースに登録されているｒｓ番号で示される一塩基多型であって、ヒト第２番染色体上のＡＬＫ遺伝子におけるｒｓ１８８１４２０並びにｒｓ３７９５８５０、ヒト第６番染色体上のＰＳＯＲＳ１Ｃ１遺伝子におけるｒｓ１０６３６４６、ヒト第７番染色体上のＡＢＣＢ１遺伝子におけるｒｓ２０３２５８２、ヒト第１７番染色体上のＲＰ５−１１７１Ｉ１０．４又はＲＮＦ４３遺伝子におけるｒｓ２５２６３７４、ヒト第２０番染色体上のＩＴＰＡ遺伝子におけるｒｓ１１２７３５４、ヒトＸ染色体上のＴＩＭＰ１遺伝子又はＳＹＮ１遺伝子におけるｒｓ４８９８遺伝子よりなる群から選択される一以上の一塩基多型及び／又は該一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を検出する工程を含む、食道アカラシアの発症リスクの判定方法。
【請求項２】
ｒｓ３７９５８５０、ｒｓ１０６３６４６、ｒｓ２０３２５８２及び／若しくはｒｓ２５２６３７４の塩基がチミンの場合に、ｒｓ１８８１４２０及び／若しくはｒｓ４８９８の塩基がシトシンの場合に、並びに／又はｒｓ１１２７３５４の塩基がアデニンの場合に、食道アカラシアの発症リスクが高いと判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記ＳＮＰがｒｓ４８９８である、請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項４】
以下のａ）又はｂ）のオリゴヌクレオチドの一種以上を含む、食道アカラシアの発症リスクの判定用キット。
ａ）請求項１〜３のいずれかに記載の一塩基多型及び／又は該一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド
ｂ）請求項１〜３のいずれかに記載の一塩基多型及び／又は該一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型を含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチド
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子多型の検出を含む食道アカラシアの発症リスクの判定方法、並びに該判定用のオリゴヌクレオチドキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食道アカラシアは、下部食道括約筋（Ｌｏｗｅｒ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｓｐｈｉｎｃｔｅｒ、ＬＥＳ）の機能障害の一種であり、食道Ｘ線検査又は上部消化管内視鏡検査において観察される、ＬＥＳの異常収縮及び弛緩不全による食道下部の狭窄と口側の拡張を特徴とする疾患である。組織学的にアウエルバッハ神経叢の減少又は消失が認められる。
【０００３】
食道アカラシアは、食物などを飲み込んでもＬＥＳが弛緩せずに通過障害を起こすので、患者は、物を飲み込みにくい、つかえた感じがする、嘔吐してしまうなどの症状を訴えるようになる。また、食道自体の運動機能も障害されているため、食道が異常収縮を起こし心筋梗塞と間違えるほどの強い胸の痛みを訴えることもしばしばである。
【０００４】
アカラシアの発症率は人口１０万人あたりに１人程度といわれているが、その症状、特に通過障害は患者に対して深刻な問題となる。しかし、その発症原因は解明されておらず、食道やＬＥＳの神経細胞の変性、ウイルス感染、ストレスその他の多数の原因が関与する多因性の疾患であると理解されている。また、上記の外的要因の他に、遺伝子多型特に一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）などの内的要因の関与も指摘されている。
【０００５】
食道アカラシアに関連するとされるＳＮＰとして、ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｎ２２遺伝子（非特許文献１）、ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １遺伝子（非特許文献２）、ＩＬ２３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ遺伝子（非特許文献３）、ＩＬ１０のプロモータ領域（非特許文献４）、ｃ−ｋｉｔ遺伝子（非特許文献５）、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−α（ＬＴＡ）遺伝子及びＴＮＦ−α  ｌｏｃｕｓ（非特許文献６）、ＩＬ３３遺伝子（非特許文献７）などにおけるＳＮＰが報告されている。
【０００６】
しかし、上記のＳＮＰを有しない食道アカラシア患者も存在することから、これら以外にも新しい食道アカラシアに関連する遺伝子（アカラシア感受性遺伝子）のＳＮＰの存在が示唆されていたが、発見されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｎｔｉａｇｏら、Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００７年、第６８巻、第８６７−７０ページ
【非特許文献２】Ｐａｌａｄｉｎｉら、Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ、２００９年、第２１巻、第５９７−６０２ページ
【非特許文献３】ｄｅ  Ｌｅｏｎら、Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ、２０１０年、第２２巻、第７３４−８ページ、ｅ２１８
【非特許文献４】Ｎｕｎｅｚら、Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１１年、第７２巻、第７４９−５２ページ
【非特許文献５】Ａｌａｈｄａｂら、Ｎｅｕｒｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ、２０１２年、第２４巻、第２７−３０ページ
【非特許文献６】Ｗｏｕｔｅｒｓら、  Ｇｕｔ、２０１４年、第６３巻、第１４０１−９ページ
【非特許文献７】Ｌａｔｉａｎｏら、Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１４年、第７５巻、第３６４−９ページ
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、食道アカラシアの感受性遺伝子とそのＳＮＰの検出を利用した発症リスクの判定技術の確立を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、食道アカラシアと臨床的に診断された複数の患者について遺伝子多型の存在を解析することで、食道アカラシアの発症と関連性のある複数のＳＮＰを見いだし、下記の各発明を完成させた。
【００１０】
（１）米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）ＳＮＰデータベースに登録されているｒｓ番号で示されるＳＮＰであって、ヒト第２番染色体上のＡＬＫ遺伝子におけるｒｓ１８８１４２０並びにｒｓ３７９５８５０、ヒト第６番染色体上のＰＳＯＲＳ１Ｃ１遺伝子におけるｒｓ１０６３６４６、ヒト第７番染色体上のＡＢＣＢ１遺伝子におけるｒｓ２０３２５８２、ヒト第１７番染色体上のＲＰ５−１１７１Ｉ１０．４又はＲＮＦ４３遺伝子におけるｒｓ２５２６３７４、ヒト第２０番染色体上のＩＴＰＡ遺伝子におけるｒｓ１１２７３５４、ヒトＸ染色体上のＴＩＭＰ１遺伝子又はＳＹＮ１遺伝子におけるｒｓ４８９８遺伝子よりなる群から選択される一以上のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを検出する工程を含む、食道アカラシアの発症リスクの判定方法。
（２）ｒｓ３７９５８５０、ｒｓ１０６３６４６、ｒｓ２０３２５８２及び／若しくはｒｓ２５２６３７４の塩基がチミンの場合に、ｒｓ１８８１４２０及び／若しくはｒｓ４８９８の塩基がシトシンの場合に、並びに／又はｒｓ１１２７３５４の塩基がアデニンの場合に、食道アカラシアの発症リスクが高いと判定する工程をさらに含む、（１）に記載の判定方法。
（３）前記ＳＮＰがｒｓ４８９８である、（１）又は（２）に記載の判定方法。
（４）以下のａ）又はｂ）のオリゴヌクレオチドの一種以上を含む、食道アカラシアの発症リスクの判定用キット。
ａ）（１）〜（３）のいずれかに記載のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド
ｂ）（１）〜（３）のいずれかに記載のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチド
【発明の効果】
【００１１】
本発明におけるＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、食道アカラシアの発症リスクを判定するためのマーカーとして利用可能である。これにより、早期に食道アカラシアの発症リスクを判定することが可能となり、リスクが高い人に関してより早期に医療上の指導を与える又は治療を開始することができるものと期待される。また、前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを有する各遺伝子は、食道アカラシア感受性遺伝子としてこれらの疾患の検出用マーカー遺伝子として利用可能である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明における一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＳＮＰ）は、ヒトのゲノム配列において、国際標準配列（ＧＲＣｈ３７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｇｅｎｏｍｅ／ａｓｓｅｍｂｌｙ／ｇｒｃ／、又はｈｇ１９、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ？ｄｂ＝ｈｇ１９）と比較して母集団中１％以上の頻度で存在する、一塩基の多様性をいう。本明細書では、ＳＮＰは、ＮＣＢＩのＳＮＰデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｎｐ）のリファレンス番号であるｒｓ番号によって特定される。また、連鎖不均衡とは２つの密に連鎖した遺伝子座における特定の対立遺伝子の組み合わせ出現頻度が、それぞれの遺伝子頻度から推定される期待値と異なる場合をいい、本発明において連鎖不平衡にあるＳＮＰとは、本発明においてｒｓ番号で特定されるいずれかのＳＮＰとの間の連鎖不平衡係数（ｒ２）が０．８以上であるＳＮＰをいう。
【００１３】
本発明は、ヒト第２番染色体上のＡＬＫ遺伝子におけるｒｓ１８８１４２０並びにｒｓ３７９５８５０、ヒト第６番染色体上のＰＳＯＲＳ１Ｃ１遺伝子におけるｒｓ１０６３６４６、ヒト第７番染色体上のＡＢＣＢ１遺伝子におけるｒｓ２０３２５８２、ヒト第１７番染色体上のＲＰ５−１１７１Ｉ１０．４又はＲＮＦ４３遺伝子におけるｒｓ２５２６３７４、ヒト第２０番染色体上のＩＴＰＡ遺伝子におけるｒｓ１１２７３５４、及びヒトＸ染色体上のＴＩＭＰ１遺伝子又はＳＹＮ１遺伝子におけるｒｓ４８９８遺伝子よりなる群から選択される一以上のＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを検出する工程を含む、食道アカラシアの発症リスクの判定方法に関する。
【００１４】
ヒト第２番染色体上のＡＬＫ遺伝子はＡｎａｐｌａｓｔｉｃ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅを、ヒト第６番染色体上のＰＳＯＲＳ１Ｃ１遺伝子はＰｓｏｒｉａｓｉｓ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  １  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  １を、ヒト第７番染色体上のＡＢＣＢ１遺伝子はＡＴＰ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ，Ｓｕｂ−Ｆａｍｉｌｙ  Ｂ（ＭＤＲ／ＴＡＰ），Ｍｅｍｂｅｒ  １を、ヒト第１７番染色体上のＲＰ５−１１７１Ｉ１０．４はＲｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎを、ＲＮＦ４３遺伝子はＲｉｎｇ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４３を、ヒト第２０番染色体上のＩＴＰＡ遺伝子はｉｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅを、ヒトＸ染色体上のＴＩＭＰ１遺伝子はＴＩＭＰ  ｍｅｔａｌｌｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  １を、ＳＹＮ１遺伝子はｓｙｎａｐｓｉｎ  Ｉを、それぞれコードする遺伝子である。
【００１５】
後の実施例に詳細に説明するように、上記ＳＮＰは、健常人と比較して臨床的に食道アカラシアと診断された患者において高い頻度で存在することが確認されたＳＮＰである。各ＳＮＰの染色体上の位置、ｒｓ番号、塩基置換、アミノ酸置換、患者又は健常人における頻度及びＰ値を表１に示す。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
本発明の判定方法は、具体的にはｒｓ３７９５８５０、ｒｓ１０６３６４６、ｒｓ２０３２５８２及び／若しくはｒｓ２５２６３７４の塩基がチミンの場合に、ｒｓ１８８１４２０及び／若しくはｒｓ４８９８の塩基がシトシンの場合に、並びに／又はｒｓ１１２７３５４の塩基がアデニンの場合に、食道アカラシアの発症リスクが高いと判定するものである。
【００１８】
表１に示されるＳＮＰは、いずれもそれを含む各遺伝子のエクソン領域内に存在することから、この遺伝子にコードされるタンパク質の何らかの変化が食道アカラシアの発症リスク又は発症そのものに関与すると推察される。
【００１９】
本発明において特に好ましいＳＮＰは、ｒｓ４８９８である。ｒｓ４８９８はＴＩＭＰ１遺伝子のエクソン５領域に位置する。この部位は、プレｍＲＮＡのスプライシングに必須であるｓｎＲＮＰの結合部位であり、したがってｒｓ４８９８はＴＩＭＰ１ｍＲＮＡの成熟を阻害するものと推定される。一方、ｒｓ４８９８は同時にＳＹＮ１遺伝子のイントロンに位置する。ＳＹＮ１は神経終末シナプス小胞膜に発現する分子であり、シナプス小胞の神経終末への移動を制御し、シナプス機能の恒常性を維持している。ｒｓ４８９８は、ＳＹＮ１ｍＲＮＡのスプライシングに影響を与え、遺伝子発現を低下させて筋神経叢内シナプスのＳＹＮ１の発現を減少させることにより、食道アカラシアの発症に関与していると推察される。
【００２０】
なお、後述の表２に示されるＳＮＰもまた、健常人と比較して臨床的に食道アカラシアと診断された患者において高い頻度で存在することが確認されたＳＮＰであることから、かかるＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを用いた食道アカラシアの発症リスクの判定方法も本発明の一態様である。
【００２１】
本発明の方法による判定対象は、ヒト、特にアジア人種とりわけ日本人である。また、ＳＮＰの検出は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡのいずれの核酸について行ってもよい。また、かかる核酸は、被験者から採取される任意の生物学的試料、例えば血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、精液、腹腔液等の体液、又はバイオプシー等によって得られる組織細胞等から、常法にしたがって抽出、精製、調製することができる。
【００２２】
本発明により特定されるＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰは、当業者に知られた従来の方法にしたがって検出することができる。そのような方法としては、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ等の、ＰＣＲによってＳＮＰを含む増幅断片を利用する方法、ＤＮＡシーケンサーなどを用いたＳＮＰを含む塩基配列を直接決定する方法、ＤＮＡチップ、Ｇｅｎｅチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含むマイクロアレイによる検出方法、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）又はインベーダー法などを挙げることができるが、これらには限定されない。
【００２３】
増幅断片を利用する方法の一つは、目的となるＳＮＰを有する場合にのみ増幅断片が生じるよう、センスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方がそのＳＮＰにハイブリダイズするように設計されたプライマーセットを用いた方法を挙げることができる。かかるプライマーセットを使用することにより、増幅断片が生じたかどうかで目的とするＳＮＰを検出することが可能となる。
【００２４】
また、増幅断片を利用する別の方法は、目的とするＳＮＰを含む領域が増幅されるように設計されたプライマーセットを用いた方法である。かかるプライマーセットを用いたＰＣＲによる増幅断片のサイズ、塩基配列、高次構造などの差異に基づいて、ＳＮＰを検出することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などを用いたときの増幅断片の移動度の違いから、目的とするＳＮＰを検出することができる。
【００２５】
また、制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。例えば、適当なプライマーセットを用いてＳＮＰを含む増幅断片を調製し、目的とするＳＮＰに応じて独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で増幅断片を切断し、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などを用いたときの切断物の移動度の違いから、目的とするＳＮＰを検出することができる。
【００２６】
なお、上記の増幅断片又は切断物の塩基配列を直接決定することによって、目的とするＳＮＰを検出してもよい。また、増幅断片又は切断物を熱変性によって一本鎖ＤＮＡとした後、これをゲル電気泳動によって分離し、塩基配列の変化による移動度の変化を解析する、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）によって目的とするＳＮＰを検出してもよい。
【００２７】
ＳＮＰは、一のＳＮＰに特異的なプローブとのハイブリダイゼーションによって検出することもできる。プローブは、前記のＳＮＰを含み、生物学的試料から調製したＤＮＡ等とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り、いかなるものでもよい。
【００２８】
プローブとしては、例えば前記ＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、ＳＮＰがプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の遺伝子多型の配列とハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。
【００２９】
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、遺伝子多型を区別するのに十分な条件である。例えば、生物学的試料から調製したＤＮＡ等が遺伝子多型の一のアレルである場合にはハイブリダイズするが、他のアレルである場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。
【００３０】
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、遺伝子多型の一のアレルに対応するプローブのみが固定されていても、遺伝子多型の複数のアレルに対応するプローブが固定されていてもよい。
【００３１】
本発明において好ましい方法は、ＰＣＲによる遺伝子増幅を用いた方法、特に操作が簡便で且つ信頼性の高いＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲである。具体的には、目的とするＳＮＰを含む領域を増幅できるプライマーオリゴヌクレオチドセットと、各アレルに相補的な配列を有する、ＳＮＰの塩基変異に対応するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ２種類を用いて、ＰＣＲを行なう。
【００３２】
上記のＳＮＰを検出する方法の多くは、それぞれの原理に応じたオリゴヌクレオチド、例えば遺伝子増幅のためのプライマーオリゴヌクレオチド、またはハイブリダイゼーション用のプローブオリゴヌクレオチドを必要とする。これらは、各方法の原理及び検出対象となるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。本発明にかかる特定のＳＮＰの検出のためのオリゴヌクレオチドもまた、採用される検出方法の原理及び本発明で特定されるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。
【００３３】
本発明は、食道アカラシアの発症リスクの判定用キットを提供し、該キットは、ａ）前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む塩基配列を選択的に増幅することができるプライマー用オリゴヌクレオチド、又はｂ）前記ＳＮＰ及び／又は該ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含む連続する少なくとも１０塩基対からなる塩基配列に相補的な塩基配列を有するプローブ用オリゴヌクレオチドを含む。
【００３４】
本発明のキットに含まれるオリゴヌクレオチドは、ＳＮＰの検出方法において説明したように、採用される検出方法の原理及び本発明で特定されるＳＮＰの具体的な塩基配列に基づいて、当業者が適宜設計し、合成することができる。
【００３５】
本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドの他に、遺伝子多型を検出する各方法に適した試薬、反応成分その他を含んでいてもよい。例えば、酵素緩衝液、ｄＮＴＰ、コントロール用試薬（例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど）、標識用又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また、上記オリゴヌクレオチドは、支持体に固定化されたマイクロアレイとしてキットに含まれてもよい。
【００３６】
本発明の食道アカラシアの発症リスクの判定用キットにより、被験者の発症リスクを簡便かつ迅速に判定することが可能となり、その結果に応じて適切な医療上の処置を施すことができる。
【００３７】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１＞
上部消化管内視鏡又はＸ線造影によって食道下部の狭窄、口側の拡張及び食道内圧測定で食道蠕動波の消失が認められるとして食道アカラシアと診断された患者２１名、及び健常人２０名からそれぞれから末梢血８ｍＬを採取し、Ｆｉｃｏｌｌ比重遠心法により単核球を分離後、シリカゲルカラムを用いてＤＮＡを抽出、精製した。なお、上記患者及び健常人はいずれも、ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針を準拠し、旭川医科大学の倫理委員会で審査され承認された本研究の内容を理解し、研究協力に同意した者である。
【００３９】
炎症性腸疾患、膵疾患、肝疾患症、血液疾患及び金属代謝疾患の各疾患との関連性が報告されている遺伝子、ならびに前記各疾患に関連する代謝、免疫又はシグナル伝達に関連する遺伝子を選出し、ここから重複する遺伝子及びアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）の設定が不可能な遺伝子を削除した計１０３１遺伝子を、ＳＮＰを解析する対象遺伝子として決定した。対象遺伝子の全エクソン領域をカバーするように、計１２６０９個のアンプリコンに分割し、それぞれに対するプライマーセットを作成した。
【００４０】
５０ｎｇのＤＮＡをテンプレートとし、５つのプライマープールを用いてＰＣＲを行ってアンプリコンを作成した後、製造者のプロトコルに従って高出力シークエンサーＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を利用してＤＮＡ配列を解析し、上記１０３１遺伝子に関するＳＮＰ解析を行った。解析にあたって、予備的シークエンスを２回施行し、各アンプリコンの解析長と被覆率が検討に十分なことを確認した。
【００４１】
全サンプルで国際標準配列（リファレンス）とシークエンス配列とを比較し、患者群と健常人群において計４７５０のリファレンスとの相違を検出した。この相違から、患者と健常人との遺伝子異常の出現頻度の差をフィッシャー検定におけるｐ値＜０．０５を有意として、表２に示す計４６種類のＳＮＰが候補として抽出された。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
表２に示されるＳＮＰのうち、遺伝子のエクソン領域内に位置するＳＮＰ（表中の〇印）からｓｔｒａｎｄ  ｂｉａｓが０．５５未満であるＳＮＰを有意な多型として抽出し、さらにＨａｐｍａｐ  ＪＰＴ（ｈｔｔｐ：／／ｈａｐｍａｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ．ｊａ、東京在住の日本人８６人の遺伝子配列を集積したリファレンス）を参照して日本人固有のＳＮＰと考えられるｒｓ１６３５４９８を除くことで、前記表１に示される計７種類のＳＮＰを選出した。
【００４４】
さらに、前記精製ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行って上記７種類の各ＳＮＰを含む増幅断片を調製し、シーケンシングしたところ、ｒｓ４８９８について、高出力シーケンサーでＳＮＰが検出された患者個体１６名全員がホモ又はヘテロで同じ多型を有することが確認された。患者群及び健常人群の性別とｒｓ４８９８のアレルとの関係を表３に示す。
【００４５】
【表３】
2016178899.tif 000004
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明は、食道アカラシアの発症リスクの判定方法としての利用可能性を有し、これにより、発症リスクが高い人に関して早期に医療上の指導を与える又は治療を開始することができるものと期待される。