(57)【要約】【課題】脊髄損傷の慢性期(受傷後長期間を経過した状態)の治療につながるような機能改善作用を有する生薬等を提供することにある。【解決手段】脊髄損傷マウスにおいて、受傷後１か月後から生薬エキスを投与しその運動機能改善作用を検討した。その結果、苦参および連翹のエキス並びに苦参の成分の一つであるマトリンに運動機能改善作用が認められた。苦参および連翹並びにマトリンは、脊髄損傷の慢性期における機能改善剤として有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
苦参もしくは苦参に含有される化合物および／または連翹もしくは連翹に含有される化合物を有効成分として含有する脊髄損傷慢性期の運動機能改善剤。
【請求項２】
苦参および連翹が、それそれのエキスである請求項１に記載の運動機能改善剤。
【請求項３】
マトリンを有効成分として含有する脊髄損傷慢性期の運動機能改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生薬およびその成分を有効成分とする脊髄損傷慢性期の機能改善剤に関する。より具体的には、苦参エキスおよび苦参に含有される化合物並びに連翹エキスおよび連翹に含有される化合物を有効成分として含有する脊髄損傷慢性期の機能改善剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
我が国では脊髄損傷の患者が既に10万人以上おり、さらに毎年約5千人が新たに生まれていると推定されている。
脊髄損傷では、外傷性に挫滅あるいは離断した脊髄内で神経細胞や髄鞘が破壊され脳と末梢を繋ぐ信号が断裂される。結果、損傷脊髄部位およびその下位脊髄が支配する体幹・上下肢の運動と感覚が機能不全に陥る。
比較的損傷が軽度な場合は、リハビリテーションによる残存機能の強化で機能改善が見られる場合もあるが失われた神経機能を補うものではないため治療効果は望めない。
【０００３】
脊髄損傷のヒトでの病態は、受傷から数時間までの急性期、数週間までの亜急性期、そして数か月以上の慢性期に分類される。
亜急性期まではある程度の組織修復と自発的回復が達成されるが、慢性期以降は、損傷部位で強固に形成されたグリア瘢痕により、破綻した神経回路の再構築が阻害され回復が困難となる（非特許文献１）。
【０００４】
グリア癩痕は、慢性期の脊髄損傷において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）などの軸索抑制因子を放出する。そのため負の側面がクローズアップされてきた。一方で、グリア癖痕を形成するアストロサイトには、積極的に軸索伸展を促す神経成長因子（BDNF、NGF、NT3など）の分泌、シナプス間隙のグルタミン酸クリアランスによる神経細胞死の保護といった正の作用も備わっている。
【０００５】
発明者らは、和漢薬を対象にして、脊髄損傷改善作用の薬理活性を、細胞モデルと脊髄損傷動物モデルにおいて多面的に検討を行ってきた。その結果、苦参および連翅に軸索伸展活性があること見出した。すなわち、損傷から31日までのマウスにおいて、苦参、連翹エキスを経口投与すると、運動機能の改善が見られ、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコーティング上の培養神経細胞に対する軸索伸展の促進が見られたことを報告した（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Neurotrauma 2005; 22(5), 544-558.
【非特許文献２】J. Trad. Med., 30(suppl.), 64, 2013.
【非特許文献３】Stem Cells 2007; 25: 2066-2075.
【非特許文献４】Molecular Brain  2013, 6, 3
【非特許文献５】Pharmacol. Ther., 132(2011) 57-71.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
脊髄損傷の急性期に機能回復に有効な処置、例えば、顆粒球単球コロニー刺激因子（GM-CSF）の投与が、慢性期での投与では無効であることも報告されている（非特許文献３）。また、近年、胚性幹細胞（ES細胞）や人工多能性幹細胞（iPS細胞）を応用した再生医療が次世代の脊髄損傷の治療戦略として有望視され、精力的に基礎研究が進められているが、マウス由来の神経幹/前駆細胞の移植で、受傷後9日後での移植では損傷部での軸索伸展および運動機能の回復が認められるのに対し、受傷後42日後の移植では全く無効である（非特許文献４）。すなわち、脊髄損傷の慢性期は、急性期や亜急性期の単純な延長線上にある現象ではないことは広く理解されている。受傷後の慢性期患者に対する有効な治療戦略は提示されておらず、現状は、慢性期に至った脊髄損傷の機能回復は依然として極めて困難である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
神経軸索の伸展およびグリア細胞の正の作用を高めるような制御の両方に働きかける脊髄損傷の治療(非特許文献５)といった観点から、本発明者らは、さらに研究を進め、苦参エキスおよび連翹エキス、苦参の成分の一つであるマトリンには、急性期のみならず、慢性期においても運動機能を改善する作用があることを見出し、本発明を完成させた。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明に用いられる苦参（クジン）は、マメ科クララSophora flavescensの根を乾燥したものである。また、連翹（レンギョウ）は、モクセイ科レンギョウForsythia suspensaまたはForsythia viridissimaの果実を乾燥したものである。
【００１０】
本発明において、苦参および連翹は、それらの抽出物（以下、「エキス」称する）を用いることが好ましい。
【００１１】
苦参エキスおよび連翹エキスの製造方法としては、苦参または連翹を、例えば、水（温水、熱湯など）によって抽出するか、または有機溶媒を用いて抽出する。有機溶媒としては、例えば、メチルアルコール、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、アセトニトリルなどを用いることができ、これらの有機溶媒を単独、または適宜組み合わせ、一定の比率で混合しで用いることができる。好ましくは、メチルアルコール、エチルアルコール、水、ブチレングリコール、含水アルコールまたはアセトニトリル−水混合溶媒などが好ましい。
【００１２】
水抽出または有機溶媒抽出の方法としては、通常の生薬抽出に用いられる方法を用いることができ、例えば、苦参または連翹1重量部に対し、水または有機溶媒5〜300重量部を用いて、攪拌しながら、その沸点以下の温度で加熱還流することが望ましい。抽出工程は、通常は5分〜７日間、好ましくは10分〜24時間実施すればよい。
【００１３】
抽出工程終了後、濾過または遠心分離などの適当な方法により、水または有機溶媒抽出液から、不溶物を分離して粗エキスを得ることができる。常法による熱水エキスまたは有機溶媒エキスの他に、粗エキスを各種有機溶媒または吸着剤などにより、更に処理した精製エキスも、本発明に用いることができる。これらの粗エキスおよび各種の精製処理を終えた精製エキスは、抽出したままの溶液を用いても、溶媒を濃縮したものを用いても良いし、溶媒を留去し乾燥した粉末を用いることもできる。
【００１４】
本発明に用いられるマトリンは、化学合成によって、または天然物から抽出して精製することによって、調製することができる。また、市販品を用いてもよい。
【００１５】
マトリンを天然物から抽出する場合には、マトリンを含有する植物の全体または一部分（例えば、全草、葉、根、根茎、茎、根皮、花）をそのまま用いて、または加工処理（例えば、乾燥、切断、粉末化など）したもの（例えば、生薬）を用いて抽出する。抽出条件は一般的に植物抽出に用いられる条件ならば特に制限はない。
【００１６】
苦参エキスおよび苦参に含有される化合物並びに連翹エキスおよび連翹に含有される化合物（以下、エキス等と称する。）を、脊髄損傷慢性期の運動機能改善剤として利用する場合、当該エキス等をそのまま用いてもよく、また、錠剤，散剤、顆粒剤、カプセル剤などに製剤化して経口的に投与してもよい。さらに、坐剤、注射剤、点滴剤、外用剤などに製剤化して非経口的に投与してもよいが、経口剤として投与することが望ましい。
経口剤は、必要に応じて結合剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、矯味剤などを加え錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤を常法により製造することができる。
また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、安定化剤などを添加することができる。
【００１７】
エキス等の投与量は、疾患、症状、年齢、併用される治療的措置などにより異なるが、経口剤としてヒトに投与する場合は、抽出物として0.1〜10mg/kgを1日1回〜数回に分けて投与すればよい。
【００１８】
エキス等を、該エキス等含有した飲食品にすることもできる。ここで、「飲食品」とは、飲食品全般を意味するが、いわゆる健康食品を含む一般食品の他、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品をも含むものであり、更にサプリメント、飼料、食品添加物等も本発明の飲食品に包含される。
エキス等を飲食品に使用するには、そのまま、または種々の栄養成分とともに加工肉、清涼飲料などの飲食品の原料に混ぜて飲食品を製造することができる。
また、エキス等を健康食品、栄養補助食品などとして使用する場合、例えば慣用の手段を用いて、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、懸濁剤、シロップ剤などの形態に調製することができる。
上記の飲食品におけるエキス等の配合量は、添加形態及び投与形態によっても異なり広い範囲から選択できるが、通常、0.01〜10重量％配合するのが望ましい。
【発明の効果】
【００１９】
苦参エキス、連翹エキスおよびマトリンは、軸索抑制因子のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン存在下においても、軸索の伸長作用を有し、脊髄損傷の急性期のみならず、慢性期における機能改善剤、特に運動機能改善剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】薬物投与前後の後肢運動機能改善を示す図である。図1Ａは、ＢＭＳ（バッソマウススケール）で評価した結果、図1Ｂは、ＴＭＳ（トヤママウススケール）で評価した結果である。図中の白カラムは薬物投与前、黒カラムは、投与84日目である。
【図２】CSPGコーティング有無によるpNF-H陽性の軸索の長さの比較の図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜苦参水エキスおよび連翹水エキス＞
連翹水エキスは連翹（栃本天海堂、大阪）に20倍量の水を加え、煎じ器（ウチダ和漢薬、東京）を用いて抽出を行った。生薬に加えた水が沸騰するまで強火で加熱し（10〜15分）、その後、とろ火での加熱を総加熱時間1時間になるまで続けた。ろ液を濾した後、熱時綿栓濾過し、ろ液を室温で放冷後、液体窒素で凍結させた。凍結乾燥器にて乾燥させた粉末をエキス粉末とし、生理食塩水に溶解して連翹エキス（収率21.9％、実施品１、n=8）を得た。苦参水エキスも連翹水エキスと同様の方法で調製した（収率30.7％、実施品２,n=10 ）。
【００２２】
＜マトリン＞
マトリンは、市販品（東京化成工業、東京）を生理食塩水に溶解した（実施品３, n=6）。
【００２３】
＜脊髄損傷（ＳＣＩ）マウス＞
8週齢の雌のddYマウス（ＳＬＣ）に処置を施し、挫傷を発生させた。すなわち、常法に従ってマウスの第9〜10腰椎を切除し、第12〜13胸髄へ定位固定装置（ナリシゲ社製）を用いて高さ2cmから6.5gの重りを一度落下させることにより挫傷を発生させた。その後、常法に従って縫合などの外科的処置を施した。以下、このマウスをＳＣＩモデルマウスと称する。
なお、ＳＣＩモデルマウスは、餌と水を自由に摂取できる状態で、一定の環境条件（22±2℃、50±5％湿度、午前7時から開始される12時間の明暗サイクル）下で維持した。
【００２４】
＜ＴＭＳによる後肢運動機能の評価＞
エキス等の投与後のマウスを個別にオープンフィールド（42cm×48cm×15cm）に移動させ、5分間観察し、後肢運動機能を評価した。脊髄損傷のモデル試験における後肢の運動機能を評価する基準として一般的に用いられるバッソマウススケール（Basso Mouse Scale:ＢＭＳ、Engesser-Cesar C, Anderson AJ, Basso DM et al. (2005).）と、試験の精度を高めるために本発明者らがＢＭＳに改変を加えた0〜30ポイントのトヤママウススケール（Toyama Mouse Scale、ＴＭＳ）を用いて、オープンフィールドにおける移動行動を評価とした。
ＴＭＳのスコア表を表１に示した。なお、表中、括弧内の数字が点数であり、項目毎に点数を判定し、加算して評価する。
【００２５】
【表１】
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【実施例】
【００２６】
実施例１
苦参水エキス、連翹水エキスおよびマトリンの慢性期脊髄損傷マウスでの後肢機能へ及ぼす影響について試験を実施した。
挫傷を与えた30日後、マウスを無作為に抽出し、各試験区に分類して投与試験を実施した。
連翹水エキスおよび苦参水エキスの投与量は、500mg/kg/日、マトリンの投与量は100μmol/kg/日（＝24.8mg/kg/日）で、1日１回、脊髄損傷マウスに経口投与で投与した。経口投与する薬液の量は、10mL/kg体重とした。初回の投与は挫傷30日後に行い、その後毎日1回、84日間投与した。このマウスに対し、後肢運動機能評価を実施した。対照群には生理食塩水を経口投与した(n=8)。
結果を図1に示した。連翹水エキス、苦参水エキス、マトリンを経口投与したマウスでは、いずれも薬物投与前（実施例１、図１の白カラム）と比較して84日間の投与後では有意に後肢運動機能が改善した（実施例１、図１の黒カラムで表された群）。
【００２７】
実施例２
マトリンは生理食塩水に溶解した。マウス大脳皮質神経細胞は胎生14日齢のddYマウス（Japan SLC, 静岡）から取り出した胎児をPBSで洗浄後、断頭し、初代培養用に作成した培地［Neurobasal media（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）中に12% 馬血清（Invitrogen）, 2 mM L-グルタミン酸, 0.6% グルコースを溶解］に入れた。培地中で、実体顕微鏡（SZ-61, Olympus, 東京）下で大脳皮質のみを単離した。
【００２８】
大脳皮質を安全キャビネット内で約1mm角に切断した。700 rpmで3分間遠心した後、上清を除去し、沈殿物に0.05% trypsin-0.53 mM EDTA solution（ライフテクノロジーズ）を2 mL加え、懸濁した。37℃で15分間、5分置きに攪拌しながらインキュベーションし、培地を4 mL加え、700 rpmで3分間遠心して上清を除去し、沈殿に600 U/mL DNaseI(ライフテクノロジーズ)-0.03% trypsin inhibitor(ライフテクノロジーズ)-PBS溶液を2 mL加え、懸濁した。さらに、37℃で15分間、5分置きに攪拌しながらインキュベーションし、培地を4 mL加え、700 rpmで3分間遠心した。沈渣にカルシウム・マグネシウム不含Hank’s balanced salt solution（HBSS)を4 mL加え700 rpmで3分間遠心した。沈渣に培地を4 mL加えた。
【００２９】
先端を炙りなめしたパスツールピペットで細胞塊が見えなくなるまで穏やかに懸濁した後、70 μm nylon cell strainer（Falcon, New Jersey, USA）で濾過した。細胞の培養は8-wellチャンバースライド（コーニング）で行った。前日にコーティング［Poly-D-Lysine （PDL, Sigma-Aldrich）をPBSで0.005mg/mLに希釈したものをまき、37℃でインキュベーションしたもの。培養当日に滅菌精製水で2回洗浄。］した後、2μg/mL aggrecan（シグマアルドリッチ）―ＨＢＳＳ溶液を入れ37℃で5時間インキュベートしその後培地で1度洗浄し、これをCSPGコーティングを施したwellとした。37℃、10% CO2、飽和水蒸気下で培養を開始し、翌日に培地を全量、馬血清の代わりにB-27 supplement (Invitrogen)を含む新しい培地で交換した。この際にマトリンあるいは溶媒を培地中に加え、さらに4日後に免疫染色を実施した。
【００３０】
免疫染色は、薬物処置期間終了後、培地を除いてPBSで洗浄し、4% paraformaldehyde (PFA, 和光純薬) -PBS溶液を加え、2時間室温で静置し、細胞を固定した。0.3% triton X-100(和光純薬)-PBS溶液で5分間の洗浄を2回行った。その後、1次抗体溶液［0.3% triton X-100-PBS溶液、1% normal goat serum（NGS, 和光純薬）、1次抗体］を加え、4℃で一晩反応させた。1次抗体には、マウス抗リン酸化型NF-Hモノクローナル抗体（1:500）（COVANCE, Emeryville, CA, USA）、ウサギ抗MAP２ポリクローナル抗体（1:1000）（abcam, Cambridge、英国）を用いた。翌日、1次抗体溶液を除き、0.3% triton X-100-PBS溶液で5分間の洗浄を2回行った後、2次抗体溶液［0.3% triton X-100-PBS溶液,  Alexa Fluor 594 標識 ヤギ抗マウス IgG抗体（1:200）（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）、Alexa Fluor 488 標識 ヤギ抗ウサギ IgG抗体（1:200）（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）］を加え、遮光下の室温で2時間反応させた。反応後、2次抗体溶液を除き、PBSで5分間、2回洗浄し、DAPI染色で核を染めた後、Aqua Poly Mount（Polysciences, Warrington, USA）で封入した。
【００３１】
蛍光顕微鏡（BX-61, Olympus）を用いて、各薬物処置を施したwellから648μm×860μmで10枚の画像をデジタル画像撮影装置DP70（Olympus）を用いて取得した。それらの画像について、画像解析ソフトNeurocyte Image Analyzer ver.1.5（Kurabo, 大阪）を用いて、画面全体のpNF-H陽性の軸索の長さを測定し、さらに各画像内のMAP2陽性神経細胞を数え、１神経細胞あたりの軸索の長さを算出した。
【００３２】
結果を図2に示した。CSPGコーティングしていない培養皿上と比較して、CSPGコーティングした培養皿上では、軸索の長さが有意に減少していたが、マトリン処置によって用量依存的に軸索の伸長が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
脊髄損傷モデルマウスにおいて、苦参および連翹のエキス並びに苦参の成分の一つであるマトリンに運動機能改善作用が認められた。苦参および連翹並びにマトリンは、脊髄損傷の慢性期における運動機能改善剤として有用である。
【図１】
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【図２】
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