(57)【要約】      （修正有）【課題】がん細胞や、骨粗しょう症、リウマチ、ウイルス性疾患、炎症性疾患等のＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞が関与する疾患に対して選択的に殺細胞活性を示す疾患治療用改変ウイルスの提供。【解決手段】Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質又は特定の配列で示されるアミノ酸配列からなる改変Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするＥ４ｏｒｆ６を有する改変アデノウイルスを含む抗腫瘍アデノウイルス製剤（図１においてｄｌ３５５と記載）。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質又は配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる改変Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするＥ４ｏｒｆ６を有する改変アデノウイルスを含む抗腫瘍アデノウイルス製剤。
【請求項２】
Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質のアミノ酸配列の１５８番目からＣ末端までを欠失させたタンパク質である、請求項１に記載の抗腫瘍アデノウイルス製剤。
【請求項３】
Ｅ１Ａ遺伝子又はＥ１Ｂ遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置にＡＵ−リッチエレメント配列が導入された、請求項１又は２に記載の抗腫瘍アデノウイルス製剤。
【請求項４】
自己の増殖に必須のウイルス遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置にＡＵ−リッチエレメント配列が導入された疾患治療用改変ウイルスを含む、ＡＵリッチエレメント配列を含むｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞が関与する疾患を治療するための疾患治療用ウイルス製剤（ただしウイルスがアデノウイルスである抗腫瘍ウイルス製剤を除く）。
【請求項５】
疾患が悪性腫瘍、骨粗しょう症、リウマチ、ウイルス性疾患又は炎症性疾患である、請求項４に記載の疾患治療用ウイルス製剤。
【請求項６】
ウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス及びエンテロウイルスよりなる群から選択されるウイルスである、請求項４又は５に記載の疾患治療用ウイルス製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞に対する特異的な殺細胞活性を有する改変アデノウイルス、特定の宿主細胞に対する特異的な殺細胞活性を有する、ゲノムにＡＵ−リッチエレメントが組み込まれた疾患治療用改変ウイルス及びこれらを含むウイルス製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療において、がん細胞を選択的に攻撃し、正常な細胞は攻撃しない又は患者に重い副作用を与えない薬学的治療法の開発は、依然としてニーズがあり、かつ解決が難しい課題である。この課題に対するこれまでのアプローチの多くは、がん細胞において特徴的に発現しているタンパク質などを分子標的とした低分子化合物又は特異抗体を提供することであった。
【０００３】
近年、かかる分子標的アプローチとは異なる治療方法が実用化に向けて検討されている。その一つが、いわゆる腫瘍溶解ウイルスを用いたがん治療である。この治療方法は、がん細胞においてのみ増殖するように改変された改変病原性ウイルスを用い、がん細胞を選択的に死滅させることによって腫瘍を縮退させる方法と表すことができる。
【０００４】
腫瘍溶解ウイルスの代表例は、Ｏｎｙｘ−０１５とよばれる、Ｅ１Ｂ５５Ｋをコードする遺伝子を欠失したアデノウイルスベクターである（非特許文献１）。このウイルスは、Ｅ１Ｂ遺伝子によってコードされる５５キロダルトンのタンパク質（Ｅ１Ｂ５５Ｋ）を発現することができないウイルスであり、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３が正常に機能しない宿主細胞（変異ｐ５３を発現している細胞を含む）に対して殺細胞効果を示す。
【０００５】
ｐ５３が正常に機能しない宿主細胞に対してＯｎｙｘ−０１５が殺細胞効果を示すメカニズムは、現在、次のように考えられている。アデノウイルスに感染した細胞は、ｐ５３の活性化を通じてアポトーシスに陥り死滅することでウイルスの増殖を抑制しようとするのに対して、アデノウイルスのＥ１Ｂ５５Ｋはｐ５３と結合してアポトーシスを抑制するので、感染細胞はアポトーシスに陥ることなくＳ期へと移行し、その結果、アデノウイルスの増殖がもたらされる。しかしながら、Ｅ１Ｂ５５Ｋを発現することができないアデノウイルスであるＯｎｙｘ−０１５は、正常細胞ではｐ５３によるアポトーシスを抑制することができずに増殖することができないが、ｐ５３が正常に機能しない細胞では野生型と変わりなく増殖することができるので、最終的に感染細胞に対して殺細胞効果を発揮することになる。
【０００６】
このように、Ｏｎｙｘ−０１５は、ｐ５３が正常に機能しない細胞、典型的にはがん細胞に対して殺細胞効果を示すことが理論的に期待され、また実証的にも確認されている。近年では、Ｏｎｙｘ−０１５について頭頚部扁平上皮がんに対する臨床試験も進められている（非特許文献２）。
【０００７】
しかしながら、ｐ５３が正常に機能しないがん細胞は、がん種全体の約５０％といわれており、Ｏｎｙｘ−０１５の適用範囲はこれらのがん種に制限されるという問題が指摘される。また、上記のような理論的メカニズムに拘わらず、Ｏｎｙｘ−０１５はｐ５３が野生型である一部の細胞でも増殖が認められる一方、ｐ５３が正常に機能しない型のがん細胞の一部で増殖が認められないなどの現象も報告されている。こうしたことから、ｐ５３とは別の機構による、がん細胞において特異的に増殖して殺細胞効果を示すウイルスの開発も行われている。
【０００８】
特許文献１には、３’非翻訳領域に異種の不安定化因子が挿入されたＥ１Ａ遺伝子を含む改変アデノウイルスである腫瘍溶解ウイルスが開示されている。異種の不安定化因子が導入されたＥ１Ａ遺伝子を有する改変アデノウイルスは、当該遺伝子から転写されるｍＲＮＡは正常な宿主細胞では不安定化されるので増殖することができないが、Ｐ−ＭＡＰＫ活性が亢進したがん細胞内では不安定化は解消されて増殖するので、殺細胞活性を示すことができる。この改変アデノウイルスは、ｐ５３の変異には依存しない腫瘍溶解ウイルスの一つである。
【０００９】
また特許文献２には、Ｅ１Ａタンパク質のＲｂ結合部位及びＥ４ｏｒｆ６／７の両方に変異が導入された改変アデノウイルスが開示されている。この改変アデノウイルスは、Ｅ２Ｆ及び細胞周期チェックポイントの制御を欠くがん細胞又はＲｂ／ｐ１６腫瘍抑制経路が不活性化されたがん細胞において選択的に増殖することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６年、第２７４巻、第３７３−３７６ページ
【非特許文献２】Ｇａｎｌｙら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００年、第６巻、第７９８−８０６ページ
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２００４／０４２０１５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１４／１５３２０４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、がん細胞に対して選択的に殺細胞効果を示す、ｐ５３に依存しない腫瘍溶解ウイルス、さらには特定の疾患に関連する細胞に対して選択的に殺細胞活性を示す改変ウイルスを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするＥ４ｏｒｆ６を有するアデノウイルスが、がん細胞に対して殺細胞活性を示すことに着目し、また正常細胞に対する殺細胞活性がより抑制されたウイルスの構築に取り組み、下記の各発明を完成させた。
【００１４】
（１）Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質又は配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる改変Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするＥ４ｏｒｆ６を有する改変アデノウイルスを含む抗腫瘍アデノウイルス製剤。
（２）Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質が、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質のアミノ酸配列の１５８番目からＣ末端までのアミノ酸を欠失させたタンパク質である、（１）に記載の抗腫瘍アデノウイルス製剤。
（３）Ｅ１Ａ遺伝子又はＥ１Ｂ遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置にＡＵ−リッチエレメント配列が導入された、（１）又は（２）に記載の抗腫瘍アデノウイルス製剤。
（４）自己の増殖に必須のウイルス遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置にＡＵ−リッチエレメント配列が導入された疾患治療用改変ウイルスを含む、ＡＵリッチエレメント配列を含むｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞が関与する疾患を治療するための疾患治療用ウイルス製剤（ただしウイルスがアデノウイルスである抗腫瘍ウイルス製剤を除く）。
（５）疾患が悪性腫瘍、骨粗しょう症、リウマチ、ウイルス性疾患又は炎症性疾患である、（４）に記載の疾患治療用ウイルス製剤。
（６）ウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス及びエンテロウイルスよりなる群から選択されるウイルスである、（４）又は（５）に記載の疾患治療用ウイルス製剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、ｐ５３の変異を有するがんに限らずより多種のがんに適用可能であり、且つがん細胞に対して高められた特異性を示す腫瘍溶解ウイルスを含む抗腫瘍ウイルス製剤を提供することができる。また、本発明の疾患治療用ウイルス製剤は、がん、骨粗しょう症、リウマチ、ウイルス性疾患又は炎症性疾患などに対して、これまでにない作用機序を有する治療薬となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の改変アデノウイルスの一つであるｄｌ３５５の、ＨｅＬａ細胞に対する選択的な殺細胞活性を示すグラフである。
【図２】本発明の改変アデノウイルスの一つであるｄｌ３５５の、ヒト非小細胞肺がん細胞（Ｈ１２９９細胞）に対する殺細胞活性を示すグラフである。
【図３】本発明の改変アデノウイルスの一つであるｄｌ３５５の、ヌードマウスに移植されたＨｅＬａ細胞の生育に対する抑制効果を示すグラフである。
【図４】本発明の改変アデノウイルスの一つであるｄｌ３５５の、各がん細胞株におけるウイルス生産量を示すグラフである。
【図５】改変アデノウイルスの一つであるＡＲＥＴの、ヒト非小細胞肺がん細胞（Ｈ１２９９細胞）に対する殺細胞活性を示すグラフである。
【図６】改変アデノウイルスの一つであるＡＲＥＴの、ヌードマウスに移植されたＨｅＬａ細胞の生育に対する抑制効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜ΔＥ４ｏｒｆ６＞
本発明は、第一の態様として、Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質又は配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる改変Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするＥ４ｏｒｆ６を有する改変アデノウイルスを含む抗腫瘍ウイルス製剤を提供する。以下、第一の態様にかかる改変アデノウイルスをΔＥ４ｏｒｆ６と表す。
【００１８】
本発明者は、アデノウイルスの初期遺伝子産物の一つであるＥ４ｏｒｆ６の遺伝子産物（Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質）が、そのＣ末端領域においてｐｐ３２タンパク質と相互作用すること、Ｃ末端領域に存在するαヘリックスが前記相互作用に関与すること、及びこの相互作用を介してＥ４ｏｒｆ６タンパク質とｐｐ３２は、ＡＵ−リッチエレメントに直接結合するＨｕＲタンパクを介して、３’非翻訳領域にＡＵ−リッチエレメントを含むｍＲＮＡと結合し、ＣＲＭ１非依存的に、強制的、恒常的にＡＵ−リッチエレメントを含むｍＲＮＡを核外に輸送しかつ安定化することを見いだした（Ｈｉｇａｓｈｉｎｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００５年、第１７０巻、第１５号）。
【００１９】
ＡＵ−リッチエレメント（ＡＵ−Ｒｉｃｈ  Ｅｌｅｍｅｎｔ、ＡＵ−リッチ配列とも呼ばれる、以下ＡＲＥと表す）は、ｍＲＮＡの３’末端非翻訳領域におけるアデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）に富んだ塩基配列ないし領域である。ＡＲＥは、増殖因子又はサイトカインなどをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの３’非翻訳領域に高頻度で存在することが知られている。以後、ＡＲＥを含むｍＲＮＡをＡＲＥ−ｍＲＮＡと表す。
【００２０】
ＡＲＥ−ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｓｔｅｔｒａｐｒｏｌｉｎ（ＴＴＰ）、Ｚｆｐ３６Ｌ１、Ｚｆｐ３６Ｌ２、ＡＵＦ１、ＫＳＲＰなどがＡＲＥを認識して結合することで、速やかに分解されることが知られている。また、様々なストレス例えば熱ショックによって発現が誘導されるＨｕＲタンパク質がＡＲＥ−ｍＲＮＡに結合することで、ＡＲＥ−ｍＲＮＡは上記の速やかな分解から免れ、安定化される。
【００２１】
以下の推論に拘束されるものではないが、ΔＥ４ｏｒｆ６は、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質によってＡＲＥ−ｍＲＮＡを安定化することができないため、正常な宿主細胞では増殖することができないが、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞、例えば腫瘍細胞では、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質によるＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化は必要ではなくなり、したがって改変アデノウイルスは増殖することができ、腫瘍細胞に対して殺細胞活性を示すものと推察される。
【００２２】
このように、本発明の第一の態様にかかるΔＥ４ｏｒｆ６は、ｐ５３の変異には依存しない腫瘍溶解ウイルスの一つとして理解されることができる。
【００２３】
本発明におけるＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進しているとは、熱ショックその他の様々なストレスによって一過性にＡＲＥ−ｍＲＮＡが安定化されている状態ではなく、例えばがん細胞のように、前記のような刺激を要することなく恒常的に細胞内においてＡＲＥ−ｍＲＮＡが安定化され得る状態を意味する。
【００２４】
ΔＥ４ｏｒｆ６の具体的な例の一つは、Ｅ４ｏｒｆ６にコードされるアミノ酸配列の１５８番目からＣ末端までをコードする領域を欠失させたアデノウイルスであるｄｌ３５５（Ｈａｌｂｅｒｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８５年、第５６巻、第１号）である。後の実施例に示すように、ｄｌ３５５はがん細胞に対して殺細胞活性を示す一方、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進していない正常細胞に対しては殺細胞活性を殆ど示さない。
【００２５】
ΔＥ４ｏｒｆ６のもう一つの例は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる改変Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするＥ４ｏｒｆ６を有する改変アデノウイルスである（Ｋｕｒｏｓｈｉｍａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０１１年、第３０巻、第２９１２−２９２０ページ）。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、野生型のＥ４ｏｒｆ６タンパク質の２４５位のロイシンがプロリンに置換されたアミノ酸配列に相当する。この置換によってＥ４ｏｒｆ６のＣ末端側に存在するα−ヘリックス構造が崩壊し、ｐｐ３２タンパク質との相互作用に関するＥ４ｏｒｆ６の機能が実質的に失われる。したがってかかる改変アデノウイルスも、ｄｌ３５５と同様に、がん細胞に対して殺細胞活性を示す一方、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進していない正常細胞に対しては殺細胞活性を殆ど示さないと推察される。
【００２６】
ΔＥ４ｏｒｆ６は、上記ｄｌ３５５を含め、例えばタカラバイオ社から提供されている市販のアデノウイルスベクターｐＡｘｃｗｉｔを元に、通常の遺伝子工学的手法によって作製し、使用することができる。また、ΔＥ４ｏｒｆ６を含むウイルス製剤、特に抗腫瘍剤としての当該ウイルス製剤の利用は、前記非特許文献１又は２に記載の方法に準じて又は当業者の通常の能力によってこれらを改変した方法により、行うことができる。
【００２７】
＜ＡｄＡＲＥＴ＞
本発明の第二の態様は、Ｅ１Ａ遺伝子又はＥ１Ｂ遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置に導入されたＡＲＥを有する改変アデノウイルスを含む、抗腫瘍アデノウイルス製剤を提供する。以下、第二の態様の改変アデノウイルスをＡｄＡＲＥＴと表す。
【００２８】
先に説明したように、ＡＲＥはＴＴＰ等と共にこれを含むｍＲＮＡの速やかな分解を促す機能を有する。したがって、ＡＲＥをＥ１Ａ遺伝子又はＥ１Ｂ遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置に導入することで、かかる遺伝子から転写されるｍＲＮＡを不安定化させることができる。以下の推論に拘束されるものではないが、ＡｄＡＲＥＴは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡが速やかに分解される通常の細胞ではＥ１Ａタンパク質又はＥ１Ｂタンパク質が発現しないので増殖することができないが、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞、例えば腫瘍細胞ではＥ１Ａタンパク質又はＥ１Ｂタンパク質は安定的に発現するので増殖することができ、腫瘍細胞に対して殺細胞活性を示すものと推察される。
【００２９】
このように、本発明の第二の態様にかかるＡｄＡＲＥＴは、ΔＥ４ｏｒｆ６と同様に、ｐ５３の変異には依存しない腫瘍溶解ウイルスの一つとして理解されることができる。
【００３０】
本発明の第二の態様において、ＡＲＥは、先に言及した機能、すなわちＡＲＥ−ｍＲＮＡの分解を促進するタンパク質又はＡＲＥ−ｍＲＮＡを安定化させるタンパク質との関係において細胞内におけるＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定性を制御する機能を有するものであればよい。ＡＲＥは、ｃ−ｆｏｓ遺伝子、ｃ−ｍｙｃ遺伝子、ＴＮＦ−α遺伝子、ｃｏｘ−２遺伝子その他の、動物細胞の増殖、分化誘導又は免疫応答に関与する様々な遺伝子の３’非翻訳領域に存在することが知られており、多種類の塩基配列が報告されている。本発明は、そのようなＡＲＥであればいずれも利用することができるが、特にヒト遺伝子に存在するＡＲＥの利用が好ましい。また導入されるＡＲＥは、単一の、複数個の又は複数種類のＡＲＥであってもよい。
【００３１】
また、本発明の第二の態様におけるＡＲＥには、ＲＮＡ分子中のＡとＵに富んだ塩基配列ないし領域の他に、ＤＮＡ分子におけるＡＲＥに相当するＡ及びＴ（チミン）に富んだ塩基配列ないし領域も含まれる。したがって、「ＡＲＥが含まれる」は、ＲＮＡ分子中にＡＲＥが含まれる他、ＤＮＡ分子中にＡＲＥに相当するＡ及びＴ（チミン）に富んだ塩基配列ないし領域が含まれる場合にも使用される。また「ＡＲＥが導入される」は、転写産物であるｍＲＮＡ分子中にＡＲＥが含まれるように、遺伝子をコードするゲノム又はＤＮＡ分子にＡＲＥに相当するＡ及びＴ（チミン）に富んだ塩基配列ないし領域を組み込むことを意味する。
【００３２】
本発明の第二の態様において、ＡＲＥはＥ１Ａ遺伝子及び／又はＥ１Ｂ遺伝子の３’非翻訳領域内又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置に導入される。特に、ＡＲＥはＥ１Ａ遺伝子のＯＲＦの終始コドンの後ろからポリＡ配列が始まるまでの位置に導入されることが好ましい。また前記遺伝子の３’末端非翻訳領域に隣接する位置とは、Ｅ１Ａ遺伝子又はＥ１Ｂ遺伝子からＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡが転写される際に、ＲＮＡポリメラーゼのリードスルーによってｍＲＮＡの３’末端にＡＲＥが含まれるような位置を意味する。
【００３３】
本発明の第二の態様にかかるＡｄＡＲＥＴの具体的な例の一つは、Ｅ１Ａ遺伝子の３’非翻訳領域にヒトＴＮＦ−α遺伝子に含まれるＡＲＥ（５’−ｇｔｇａｔｔａｔｔｔ  ａｔｔａｔｔｔａｔｔ  ｔａｔｔａｔｔｔａｔ  ｔｔａｔｔｔａｃａｇ−３、配列番号２）を導入したアデノウイルス（以下、ＡＲＥＴと表す）である。後の実施例に示すように、ＡＲＥＴはがん細胞株に対して殺細胞活性を示す一方、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進していない正常細胞に対しては殺細胞活性を殆ど示さない。
【００３４】
ＡｄＡＲＥＴは、例えばタカラバイオ社から提供されている市販のアデノウイルスベクターｐＡｘｃｗｉｔを元に、通常の遺伝子工学的手法によって作製し、使用することができる。
【００３５】
＜ＡｄＡＲＥＴ／ΔＥ４ｏｒｆ６＞
本発明の第三の態様は、上記第一及び第二の態様に関連して、Ｃ末端領域を欠失させたＥ４ｏｒｆ６タンパク質をコードするＥ４ｏｒｆ６並びに３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置にＡＲＥが導入されたＥ１Ａ遺伝子及び／又はＥ１Ｂ遺伝子を有する改変アデノウイルスを含む、抗腫瘍アデノウイルス製剤を提供する。本発明の第三の態様におけるＡＲＥは、第二の態様において説明したとおりである。以下、本発明の第三の態様にかかる改変アデノウイルスをＡｄＡＲＥＴ／ΔＥ４ｏｒｆ６と表すこととする。
【００３６】
本発明の第三の態様にかかるＡｄＡＲＥＴ／ΔＥ４ｏｒｆ６は、ΔＥ４ｏｒｆ６におけるがん細胞に対する選択性及びＡｄＡＲＥＴにおけるがん細胞に対する選択性の両方を併せ持つことにより、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進していない細胞に対する殺細胞活性がより確実に抑制され、その結果としてＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞に対する殺細胞活性の選択性が高められている点で有利である。
【００３７】
ＡｄＡＲＥＴ／ΔＥ４ｏｒｆ６は、例えばタカラバイオ社から提供されている市販のアデノウイルスベクターｐＡｘｃｗｉｔを元に、又はΔＥ４ｏｒｆ６の例であるｄｌ３５５を元に、通常の遺伝子工学的手法によって作製することができる。具体的には、任意のＡＲＥに相当する塩基配列を有するＤＮＡを合成し、種々の遺伝子工学的手法を用いて、アデノウイルスベクター上の所望の位置に前記ＤＮＡを組み換えることで、作製することができる。
【００３８】
＜ＣＲＶ−ＡＲＥ＞
本発明の第四の態様は、自己の増殖に必須のウイルス遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置に導入されたＡＲＥを有する疾患治療用改変ウイルスを含む、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞が関与する疾患を治療するためのウイルス製剤（ただしウイルスがアデノウイルスである抗腫瘍ウイルス製剤を除く）に関する。以下、本発明の第四の態様にかかる疾患治療用改変ウイルスを、Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＲＶ−ＡＲＥ）と表す。
【００３９】
先に説明したように、ＡＲＥはＴＴＰ等と共にこれを含むｍＲＮＡの速やかな分解を促す機能を有する。したがって、ＡＲＥをウイルスの増殖に必須の遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置に導入することで、かかる遺伝子から転写されるｍＲＮＡを不安定化させることができる。以下の推論に拘束されるものではないが、本発明の第四の態様にかかるＣＲＶ−ＡＲＥは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡが速やかに分解される通常の細胞では前記必須遺伝子にコードされるタンパク質が発現しないので増殖することができないが、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞、例えば腫瘍細胞では前記タンパク質は安定的に発現するので増殖することができ、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞に対してウイルスが本来有する毒性、具体的には殺細胞活性を示すものと推察される。
【００４０】
以上から、本発明の第四の態様にかかるＣＲＶ−ＡＲＥは、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している宿主細胞で増殖し、当該宿主細胞を選択的に死滅させることができる改変ウイルスであり、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞が関与する疾患を治療するためのウイルス製剤として利用可能である。なお、本発明において、ウイルスの増殖はウイルスの複製と交換可能に用いられる。
【００４１】
本態様にかかるＣＲＶ−ＡＲＥは、普通に増殖するならばヒトの細胞を溶解又は死滅することのできるウイルスを元に、そのウイルスの増殖に必須の遺伝子の３’非翻訳領域内に又は当該３’非翻訳領域に隣接する位置にＡＲＥを導入することによって作製することができる。
【００４２】
ＣＲＶ−ＡＲＥとしては、適切に増殖するならば、ヒト宿主細胞を死滅させることのできるウイルスであればよい。そのようなウイルスの例としては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、インフルエンザウイルス、ワクシニアウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス及びエンテロウイルスなどを挙げることができるが、これらには限定されない。特に、アデノウイルスの利用が好ましい。
【００４３】
上記ウイルスのゲノム構造は既に解明されており、また各ウイルスにおける増殖に必須な遺伝子もまた、具体的な塩基配列と共に、各ウイルスに関する研究において多数特定されている。本態様におけるＡＲＥを導入すべき遺伝子は、かかる遺伝子の中から適宜選択することができる。
【００４４】
ＡＲＥが導入される好ましい遺伝子の例としては、アデノウイルスではＥ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子、ヘルペスウイルスではＩＣＰ３４．５遺伝子、ＩＣＰ４７遺伝子、ＩＣＰ６遺伝子、麻疹ウイルスではＭタンパク遺伝子、ムンプスウイルスではＰタンパク遺伝子、インフルエンザウイルスではＮＳ１タンパク遺伝子、ワクシニアウイルスではチミジンキナーゼ遺伝子、その他各ウイルス自身の複製に必要なポリメラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
【００４５】
ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している宿主細胞の例は、がん細胞である（Ｈａｌｂｅｒｔら、１９８５年、Ｊ．Ｖｉｏｌ．、第５６巻、第２５０−２５７ページ）。したがって、本発明の第四の態様にかかるＣＲＶ−ＡＲＥを含むウイルス製剤（ただしウイルスがアデノウイルスである抗腫瘍ウイルス製剤を除く）は、抗腫瘍ウイルス製剤として利用可能である。
【００４６】
ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している宿主細胞の別の例は、破骨細胞である。破骨細胞では、その活性化に必須な破骨細胞分化誘導因子（ＯＤＦ／Ｒａｎｋ１）が異常亢進しているが、そのｍＲＮＡは３’末端非翻訳領域にＡＲＥを含むＡＲＥ−ｍＲＮＡである。したがって、ＯＤＦ／Ｒａｎｋ１が異常亢進している破骨細胞に本発明のＣＲＶ−ＡＲＥを感染させることによって当該破骨細胞を選択的に死滅させ、骨粗しょう症の進行ないし悪化を抑制することができるものと期待される。このように、本発明の第四の態様にかかるＣＲＶ−ＡＲＥを含むウイルス製剤は、骨粗しょう症の治療用ウイルス製剤として利用可能である。
【００４７】
ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している宿主細胞のまた別の例は、リウマチ患者における末梢単核球及び滑膜細胞（Ｔｈｉｅｌｅら、Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．、２００６年、第３１２巻、第１２号）である。リウマチ患者の末梢単核球では、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの分解を促進するＴＴＰの発現は健常人に比較して大きく低下している一方、ＡＲＥ−ｍＲＮＡから翻訳されるＴＮＦ−αの発現が異常亢進していることが知られており、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進していると推察される。したがって、末梢単核球及び滑膜細胞に本発明のＣＲＶ−ＡＲＥを感染させることによって当該末梢単核球を選択的に死滅させてＴＮＦ−αの発現を、合わせて炎症による破骨細胞の誘導をも抑制し、さらに炎症の標的となる滑膜細胞の増殖を抑制することで、リウマチの進行ないし悪化を抑制することができるものと期待される。このように、本発明の第四の態様にかかるＣＲＶ−ＡＲＥを含むウイルス製剤は、リウマチの治療用ウイルス製剤として利用可能である。
【００４８】
＜ウイルス製剤＞
本発明のウイルス製剤は、本発明にかかる改変ウイルスの少なくとも１つを含む。さらにまた、本発明のウイルス製剤は、本発明にかかる改変ウイルスに加えて、任意の他のウイルス、治療上有効な薬剤、薬学的に許容される成分、緩衝液、賦形剤、アジュバント、防腐薬、充填剤、安定化剤、増粘剤及び／又は製剤に通常使用される任意の成分を含むことができる。
【００４９】
薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十六改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。また、改変ウイルス含む製剤で利用されている各種の成分を利用することが好ましい。
【００５０】
本発明のウイルス製剤は、投与に適した任意の形態、例えば溶液、凍結乾燥粉末、エマルジョン、懸濁液、錠剤、ペレット、カプセルなどの固体形、半固体形又は液体形であることができるが、これらには限定されない。通常、ウイルス製剤は、注射剤、点滴剤などの非経口製剤の形態で用いられる。非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトールなどを含む等張液といった、製剤において通常用いられる水性担体が挙げられる。
【００５１】
上記の形態のウイルス製剤は、例えば前記非特許文献１又は２に記載の腫瘍溶解ウイルスその他のウイルスベクターを含む従来のウイルス製剤を製造する方法又は当業者の通常の能力によってこれらを改変した方法により、製造することができる。
【００５２】
本発明のウイルス製剤は、ペット、家畜、生産動物及びヒトよるなる群から選択される動物、特にヒトに対象として投与される。対象へのウイルス製剤の投与は、例えば前記非特許文献１又は２に記載の腫瘍溶解ウイルスその他のウイルスベクターを含む従来のウイルス製剤に倣って行うことができる。投与経路としては、製剤の形態、疾患、疾患部位及びその他の薬剤を投与する際に考慮される種々の因子に配慮して、当業者によって決定される。
【００５３】
本発明のウイルス製剤の好ましい投与経路は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、腫瘍内又はその近傍への局所投与などの非経口投与である。好ましい態様の一つにおいて、本発明のウイルス製剤は、静脈内投与又は腫瘍内若しくはその近傍への局所投与により対象に投与される。投与は、単回投与であっても、反復投与であってもよい。
【００５４】
対象、特にヒトに対して本発明のウイルス製剤を投与する場合、その用量範囲は、例えば、ヒト対象１人あたり、１×１０３〜１×１０１４、好ましくは１×１０５〜１×１０１２、より好ましくは１×１０６〜１×１０１１、最も好ましくは１×１０７〜１×１０１０のプラーク形成単位（ｐ．ｆ．ｕ．）であることができる。
【００５５】
本発明のウイルス製剤を用いた疾患治療は、単独でも有効であるが、任意の他の治療、例えば旧来の治療と本発明のウイルス製剤を用いた治療とを併用してもよい。例えば、がん治療の場合に、他の抗がん剤を用いた化学療法、がん免疫療法又は放射線治療などを併用してもよい。
【００５６】
以下、非限定的な実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。実施例において、市販のキットを用いた操作はキット製造者のプロトコルに従って行った。なお本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、動物種及び属、コンストラクト並びに試薬に限定されるものではなく、これらは適宜変更することができるものであることは当業者に容易に理解されるものである。また、ΔＥ４ｏｒｆ６であるｄｌ３５５はプリンストン大学、Ｔ．Ｓｈｅｎｋ博士から、また腫瘍溶解ウイルスであるＯｎｙｘ−０１５（ｄｌ１５２０）はカリフォルニア大学、Ａ．Ｂｅｒｋ博士より分与された株をそれぞれ使用した。
【実施例】
【００５７】
＜実施例１＞  ｄｌ３５５のＨｅＬａ細胞株に対する殺細胞活性
１）ウイルス液の調製
Ｗ１６２細胞／ＤＭＥＤ（１０％ＦＢＳ）培地を１０ｃｍディッシュに５×１０６個／ウェルとなるように播いて２４時間培養した後、１０ＭＯＩのｄｌ３５５を加えて感染させた。感染４８時間後、細胞を培地ごと回収し、凍結融解を３回繰り返して感染細胞からウイルスを放出させた。遠心分離で細胞残渣等を除去した上澄み液をウイルスストック液として回収し、−８０℃で保存し、以下の実験に使用した。
【００５８】
２）殺細胞活性の確認
３×１０３個のＨｅＬａ細胞及びヒト正常細胞であるＢＪ細胞をそれぞれ、１００μＬのＤＭＥＤ（１０％ＦＢＳ）培地を含む９６ウェルディシュに接種して、３７℃で培養した。培地を除去し、新たに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を１００μＬ加え、さらに実施例１で調製した１、１０、１００ＭＯＩのｄｌ３５５又は１００μＬのＤＭＥＤ（１０％ＦＢＳ）培地（ｍｏｃｋ）を加えて、３７℃で７２時間インキュベーションした。
【００５９】
培養開始から７２時間後に、Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ社）を用いたＸＴＴアッセイを行って、細胞生存率を測定した。この結果を図１に示す。この実験により、ｄｌ３５５はＨｅＬａ細胞に対して殺細胞活性を示す一方、正常細胞であるＢＪ細胞には殆ど殺細胞活性を示さないことが確認された。
【００６０】
＜実施例２＞  ｄｌ３５５のＨ１２９９細胞に対する殺細胞活性
ヒト非小細胞肺がん細胞（Ｈ１２９９細胞）に対するｄｌ３５５の殺細胞活性を、実施例１と同様にし、ただしウイルス液を加えて培養を開始した直後を０日とし、培養開始から１日後、３日後、５日後及び７日後にＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ社）を用いたＸＴＴアッセイを行って、細胞生存率を測定した。また、ポジティブコントロールとしてＯｎｙｘ−０１５を用いて同様の実験を行った。その結果を図２に示す。ｄｌ３５５は、Ｈ１２９９細胞に対してはＯｎｙｘ−０１５を上回る殺細胞活性を示すことが確認された。
【００６１】
＜実施例３＞ｄｌ３５５のヌードマウスにおける腫瘤の成長に対する抑制効果
１）細胞培養
１０ｍＬのＤＭＥＤ（１０％ＦＢＳ）培地／１０ｃｍディッシュ中で３７℃、３日間培養したＨｅＬａ細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシンで遊離させた。１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを加えてトリプシンを失活させた後、細胞を沈殿させ、ハンクスバッファーを加えて細胞を再懸濁した。沈殿と懸濁を３回繰り返して細胞を洗浄した後、１×１０６個／１００μＬの細胞懸濁液を調製した。
【００６２】
２）移植及びウイルス製剤投与
日本チャールズリバー社から購入して２週間順化させたヌードマウス（Ａｔｈｙｍｉｃ  ＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ、ｎ＝５）の右後足付け根の皮下に、上記１）で調製した細胞懸濁液１００μＬを注入し、腫瘤が長径、短径ともに５ｍｍ程度になるまで飼育した。
【００６３】
腫瘤に実施例１の１）で調製した１００μＬのｄｌ３５５（９．０×１０９ＶＰ／ｍＬ）を２日間隔で２〜３回程度注射しながら、さらに２８日間飼育を続け、（長径×短径）２／２で計算される腫瘤の大きさを経時的に測定した。また、ｄｌ３５５に代えてＰＢＳ１００μＬを注射したコントロールとして、同様に腫瘤の大きさを測定した。その結果（５匹の平均値）を図３に示す。
【００６４】
図３に示されるように、ｄｌ３５５はヌードマウスに移植されたがん細胞による腫瘤の成長を抑制した。また、上記実験を計２回行ったところ、いずれの実験でも腫瘤が完全に消失したマウスが１例ずつ観察された。
【００６５】
＜実施例４＞
ＤＭＥＤ（１０％ＦＢＳ）培地に懸濁したＭＣＦ−７（ヒト乳腺がん細胞）、Ｈ１２９９、Ｕ２ＯＳ（ヒト骨肉腫細胞）、Ｓａｏｓ−２（ヒト骨芽細胞様骨肉腫細胞）、Ａ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）、ＭＢＡ−ＭＤ−２３１（ヒト乳腺がん細胞）、ＰＣ３（ヒト前立腺がん細胞）、ＨＳＣ３（ヒト舌がん細胞株）、Ｃ３３Ａ（ヒト子宮頸がん細胞）及びＨｅＬａ細胞それぞれを、１２ウェルディッシュに５×１０４個／ウェルとなるように播種して２４時間培養後、１ＭＯＩのｄｌ３５５及びＯｎｙｘ−０１５を別々に感染させた。感染から４８時間後に各細胞を培地ごと回収し、凍結融解を３回繰り返して感染細胞からウイルスを放出させた。遠心分離で細胞残渣等を除去した上澄み液をウイルスストック液として回収し、アデノウイルス生産量測定キット（Ａｄｅｎｏ−Ｘ  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ、ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、各がん細胞株におけるウイルス生産量（Ｖｉｒｕｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ）を測定した。その結果を図４に示す。
【００６６】
ｄｌ３５５は、Ｏｎｙｘ−０１５と比較して、使用したがん細胞株全てについて良好に増殖することが確認された。
＜実施例５＞  ＡＲＥＴの構築
プリンストン大学、Ｔ．Ｓｈｅｎｋ博士より供与された、大腸菌ベクターｐＢＲ３２２にアデノウイルスのＥ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を含むＥ１領域が挿入されたプラスミドであるｐＸｈｏＩＣ（Ｌｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ２，  ５２７−５３２，１９８４）を、制限酵素ＨｐａＩで開環させた。これに、ヒトＴＮＦ−α遺伝子に含まれるＡＲＥ（５’−ｇｔｇａｔｔａｔｔｔ  ａｔｔａｔｔｔａｔｔ  ｔａｔｔａｔｔｔａｔ  ｔｔａｔｔｔａｃａｇ−３、配列番号２）に相当する塩基配列及びその相補鎖からなる合成二本鎖ＤＮＡ断片を組み込んで、Ｅ１Ａ遺伝子の３’非翻訳領域に前記ＡＲＥが導入されたＥ１領域を含むプラスミドであるｐＸｈｏＩＣ−ＡＲＥＴＮＦを構築した。
【００６７】
ｐＸｈｏＩＣ−ＡＲＥＴＮＦを鋳型とし、両端にＣｌａＩ制限部位を含むように設計されたプライマーセット（フォワードプライマー：５’−ｇｃｇａｔｃｇａｔｔｇａｃｇｔｇｔａｇｔｇｔａｔｔｔａｔａｃｃｃ−３’、配列番号３、リバースプライマー：５’−ｇｇｔａｔｃｇａｔｔｔｃａｔｇｇｔｃａｔｇｔｃａａａｃａｃ−３’、配列番号４）を用いたＰＣＲを行い、ＡＲＥが導入されたＥ１領域の増幅断片を調製した。この増幅断片を、Ｅ１Ａ遺伝子及びＥ１Ｂ遺伝子を欠いたアデノウイルスゲノムを含むｐＡｘｃｗｉｔ（タカラバイオ）のＣｌａＩ制限部位に組み込んで、Ｅ１Ａ遺伝子の３’非翻訳領域にＡＲＥが導入されたアデノウイルスゲノムを含むプラスミトとしてｐＡｘ−ＡＲＥＴＮＦを構築した。
【００６８】
ｐＡｘ−ＡＲＥＴＮＦを制限酵素ｐａｃＩで切断して得られる鎖状ＤＮＡを、Ｈｉｌｙｍａｘ（同仁化学研究所社）を用いて２９３細胞に感染させることで組換えアデノウイルスのストックを調製し、さらにＦａｓｔ−Ｔｒａｐ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｐｏｒｅ社）を用いて、精製ウイルス（９．０×１０９ウイルス粒子数／ｍＬ）を調製した。以後、このウイルスをＡＲＥＴと表す。
【００６９】
＜実施例６＞ＡＲＥＴのＨ１２９９細胞に対する殺細胞活性
ｄｌ３５５を実施例５のＡＲＥＴに代えた他は実施例２と同様の操作を行って、ＡＲＥＴのＨ１２９９細胞に対する殺細胞活性をＸＴＴアッセイによって確認した。その結果を図５に示す。
【００７０】
図５に示されるように、ＡＲＥＴはＯｎｙｘ−０１５と比較して、Ｈ１２９９細胞に対して優れた殺細胞活性を示した。
【００７１】
＜実施例７＞ＡＲＥＴのヌードマウスにおける腫瘤の成長に対する抑制効果
ｄｌ３５５を実施例５のＡＲＥＴに代えた他は実施例３と同様の操作を行って、マウスに移植されたＨｅＬａ細胞による腫瘍の生育に対するＡＲＥＴの抑制効果を確認した。その結果を図６に示す。
【００７２】
図６に示されるように、ＡＲＥＴはヌードマウスに移植されたがん細胞による腫瘤の成長をほぼ完全に抑制した。また、腫瘤が完全に消失したマウスが１例観察された。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のウイルス製剤は、がん、骨粗しょう症、リウマチ等の、ＡＲＥ−ｍＲＮＡの安定化が亢進している細胞が関与する疾患の治療薬としての利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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