(57)【要約】【課題】うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合した人肌改善用組成物を提供することを目的とする。特に、非可食部分、すなわち主に骨部分及び頭部分より、安価に高効率にセラミド含有コラーゲンを配合した人肌改善用組成物を提供することを目的とする。【解決手段】うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合してなる人肌改善用組成物。前記の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする人肌改善用食品。前記の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする人肌改善用おにぎり。前記の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする経口用人肌改善用経口物。【選択図】図１４
2016160204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合してなる人肌改善用組成物。
【請求項２】
前記請求項１に記載の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする人肌改善用食品。
【請求項３】
前記請求項１に記載の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする人肌改善用おにぎり。
【請求項４】
前記請求項１に記載の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする経口用人肌改善用経口物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合してなる人肌改善用組成物に関するものである。特に、人肌改善に優れたうなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合してなる人肌改善用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、コラーゲンは人間の肌、特に真皮を構成する主要な成分であり、加齢によりコラーゲンが減少すると保水性や弾力性が失われることが知られている。そのため、コラーゲンは、化粧品や栄養補助食品（サプリメント）等に広く使用されている。
これまでに、動物実験において、コラーゲンの経口摂取によって経時的な皮膚の加齢が抑制されることや、皮膚の線維芽細胞の密度が上昇することが報告されている。
このことから、コラーゲンを経口摂取することで、皮膚の弾力や強度など、肌の改善効果が期待されているが、明らかな根拠は示されていない。
コラーゲンの原料物質としては、一般的には牛、豚等が使用されているが、狂牛病が問題となって以来、安全性の高いコラーゲン原料が求められている。
一方で、うなぎはコラーゲン豊富な原材料として知られているが、うなぎから安価に効率よくコラーゲンを抽出する方法については課題が残っていた。
また、セラミドは、うなぎにおいて細胞膜に高い濃度で存在することが知られており、細胞膜においてセラミドはスフィンゴミエリンを構成する脂質の一つであり、脂質二重層を構成することが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１１−２３６１３１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合した人肌改善用組成物を提供することを目的とする。特に、非可食部分、すなわち主に骨部分及び頭部分より、安価に高効率にセラミド含有コラーゲンを配合した人肌改善用組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は以下の特徴を有する。
（１）本発明の人肌改善用組成物は、うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合してなることを特徴とする。
（２）本発明の人肌改善用食品は、上記（１）の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする。
（３）本発明の人肌改善用おにぎりは、上記（１）の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする。
（４）本発明の人肌改善用経口物は、上記（１）の人肌改善用組成物を含有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合した人肌改善用組成物を安価に高効率に提供することができる。特に、うなぎの骨部分及び頭部分より、うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合した人肌改善用組成物を安価に高効率に提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の実施形態において得られたうなぎ由来のセラミド含有コラーゲンの成分表である。
【図２】うなぎ頭部脂質の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析による概観を示した図である。
【図３】（ａ）はＨＰＬＣ／ＭＳシステムによるうなぎ頭部セラミドの質量分析であり、サンプル３に含まれる物質を高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳシステム）により分析した結果を示すグラフであり、（ｂ）は各ｍ／ｚ値の分子種のクロマトグラムを示すイオンクロマトグラムである。
【図４】質量分析計内に微量導入したヘリウムガスにセラミドイオンをぶつけて分解して構成成分の分析をするタンデムマススペクトルと呼ばれる方法で分析した結果を示すグラフである。
【図５】うなぎ頭部のセラミド（Ｃｅｒ（ＡＳ））の検出結果である。
【図６】（ａ）はうなぎ頭部セラミドＣ４０の２本鎖の化学構造を示す図であり、（ｂ）は１本鎖の組み合わせの内訳を示す図である。
【図７】うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）のオンラインタンデム質量分析による構造の同定を示す図である。
【図８】うなぎ頭部で検出したセラミドについてまとめた図である。
【図９】うなぎ頭部１個あたりのセラミドＣｅｒ（ＮＳ）の含有量を示したグラフである。
【図１０】実施例１における検査項目一覧である。
【図１１】実施例１における検査項目一覧である。
【図１２】実施例１における試験参加者の追跡フローチャートである。
【図１３】実施例１における試験参加者の試験食品摂取率（うなぎコラーゲン入りおにぎり群及びデキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図１４】実施例１における肌評価（ロボスキンアナライザー）（うなぎコラーゲン入りおにぎり群）のデータである。
【図１５】実施例１における肌評価（ロボスキンアナライザー）（デキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図１６】実施例１における肌評価（ロボスキンアナライザー）（うなぎコラーゲン入りおにぎり群ｖｓデキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図１７】実施例１における自覚症状（リッカートスケール法）（うなぎコラーゲン入りおにぎり群）のデータである。
【図１８】実施例１における自覚症状（リッカートスケール法）（デキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図１９】実施例１における自覚症状（リッカートスケール法）（うなぎコラーゲン入りおにぎり群ｖｓデキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図２０】実施例１における身体測定・理学検査（うなぎコラーゲン入りおにぎり群及びデキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図２１】実施例１における尿検査（うなぎコラーゲン入りおにぎり群及びデキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図２２】実施例１における末梢血液検査（うなぎコラーゲン入りおにぎり群）のデータである。
【図２３】実施例１における末梢血液検査（デキストリン入りおにぎり群）のデータである。
【図２４】実施例１における肌評価（ロボスキンアナライザー）（うなぎコラーゲン入りおにぎり群ｖｓデキストリン入りおにぎり群）（変化量の比較）のデータである。
【図２５】実施例１における自覚症状（リッカートスケール法）（うなぎコラーゲン入りおにぎり群ｖｓデキストリン入りおにぎり群）（変化量の比較）のデータである。
【図２６】実施例２におけるヒト線維芽細胞賦活試験の結果を示すデータである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明のうなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを配合した人肌改善用組成物は、以下の行程を有して製造される。
（１）うなぎの非可食部分と水を加熱すると共に撹拌し粉砕する。
（２）前記（１）の工程の温度よりも冷却した後、酵素を添加し酵素反応させる。
（３）前記（２）の工程の温度よりも加熱して酵素反応を停止させる。
（４）前記（３）の液体をフィルターでろ過してろ液と固形物を分離する。
（５）上記ろ液をセラミド含有コラーゲン成分と脂質とに分離する。
【０００９】
コラーゲンは、生体蛋白の主要な構成成分であり、殆んど全ての動物の体内に含有されている。一般的には、牛皮、豚皮、鳥皮、魚皮など、コラーゲン含有量が多い部位から煮沸抽出するのが一般的である。
本発明において、原料とするうなぎは、一般的に食用に供されるうなぎであり、うなぎ科 Anguillidae はうなぎ属 Anguilla に属する種類を使用することができる。例えば、オオうなぎ、ヨーロッパうなぎ、アメリカうなぎを使用することができる。また、その他、上記の種類には属さないが、一般的にうなぎと呼ばれている種類、例えば、フウセンうなぎ、デンキうなぎ、タうなぎ、ヤツメうなぎ、ヌタうなぎ等を使用することも可能である。
【００１０】
本発明においては、上記の原料において安価な非可食部分を使用することが望ましい。
例えば、うなぎの蒲焼きを調理する際には、頭部、骨部、等の非可食部分は通常廃棄処分される。また、通常、可食部分よりも上記非可食部分の方がセラミド含有コラーゲン含有率が高い。そのため、本発明においては、従来廃棄されていた原料より高効率でセラミド含有コラーゲン抽出が可能となる。
上記非可食部分は、調理過程で食用に供される身の部分を取り除いたものであるが、当然、骨部分や頭部分に身が付いた状態でも差し支えない。また、このような非可食部分は例として骨や頭部が挙げられるが、これに限定されるものではなく、例えば、内臓、鱗、鰭、皮、血液、等が含まれていても構わない。
なお、うなぎ非可食部分が有する臭気成分を除去するため、予め作製した食塩水（例えば１〜１０％程度の濃度）に浸漬処理し、アンモニアやトリメチルアミン等を食塩水中に溶出させることも好ましい。
【００１１】
このようなうなぎ非可食部分（以下、単に非可食部分、あるいは原料という）を、簡単に水で洗浄し、または洗浄無しで、水と共に容器に投入し加熱する。水の量は、例えばうなぎ非可食部分の２〜４倍の重量とすることが好ましい。例えば、うなぎの頭部、骨部等の合わせて５０ｋｇを、水１００〜２００ｋｇに投入し加熱する。
上記加熱処理は、原料を軟化させ、次工程である粉砕処理を容易にすることを目的とするものである。
【００１２】
上記加熱段階において、うなぎ非可食部分は、生の状態でも良いが、冷凍状態であっても構わない。
うなぎ非可食部分を水中で加熱するにあたって、加熱手段としては煮沸等の一般的な加熱手段で良い。本発明において、うなぎ非可食部分が冷凍されている場合には、蒸気加熱（スチーム加熱）を行えば、急速解凍によりうなぎ非可食部分の変質を抑えることができるため好ましい。
うなぎ非可食部分が冷凍状態の場合、この段階における加熱温度及び加熱時間は、うなぎ非可食部分が解凍できれば特に限定されない。例えば、８０〜１００℃で３０〜１２０分間加熱した場合、全体的に解凍状態となるので好ましい。
うなぎ非可食部分が冷凍状態でない場合でも、同様に８０〜１００℃で３０〜１２０分間程度加熱処理することが原料に脆性を与える観点では好ましい。
１００℃以上、あるいは１２０分間以上の加熱処理を施した場合、原料に含有されるコラーゲンが変性する可能性があるため好ましくない。
【００１３】
上記原料は、加熱すると共に撹拌粉砕する。粉砕は、原料が解凍した状態で行っても良いし、冷凍状態のままでも良い。加熱を開始すると同時に、原料が冷凍状態のまま撹拌粉砕した方が、時間的に早く解凍されるので時間短縮となって好ましい。
撹拌粉砕の手段としては、通常使用される手段を使用することができるが、例えばボールミル、エッジミル、ジェットミル等を使用することができる。
この段階で原料を大まかに粉砕しておくことにより、次工程の酵素反応において反応時間を短縮することが可能となる。
粉砕は２段階に分けて行っても良い。例えば、第１粉砕処理として、汎用のミキサーを用いて粗粉砕（粒径１〜２ｍｍ程度）を行い、続いて第２粉砕処理として、専用の粉砕機（例えば、オリエント粉砕機株式会社製を用いて更に細かい微粉砕（粒径２００μｍ以下）を行うこととしても良い。
【００１４】
その後、粉砕した原料を酵素を用いて溶解する。原料の溶解に使用する酵素としては、通常使用されるタンパク質を分解するための酵素（ペプチド結合加水分解酵素）であれば特に限定されず、例えば、プロテアーゼを含む酵素が挙げられる。本発明においてプロテアーゼを含む酵素は、動物系たんぱく質を分解する酵素であり、プロテアーゼ類を含む酵素であれば特に制限はなく、プロテアーゼとしては、例えば、パパイン、ブロメライン、ファイシン、エンドプロティナーゼ、エンドペプチダーゼなどが挙げられる。
酵素反応においては、粉砕した原料の温度を、使用する酵素に適した温度に調整する必要がある。例えば３０℃〜６５℃等の温度において、使用する酵素の至適温度に制御した状態で、所定の時間（例えば３０〜９０分間）維持し、原料の溶解・分解反応を進行させる。
粉砕した原料は、酵素反応に最適なＰＨに調整されていることが好ましいが、本発明においては例えばｐＨ６前後に調整することが好ましい。
【００１５】
次いで、酵素反応を停止させるために、原料の液体を加熱する。加熱温度及び加熱時間は、使用した酵素が失活する温度及び時間を適宜選択することができるが、例えば、９０℃以上で２０〜４０分間維持することにより、酵素が失活し、原料の分解反応が停止する。
続いて、原料の溶液をフィルターでろ過し、上記酵素反応で未溶解の固形物と、ろ液と、を分離する。この工程において、分離された固形物は主にうなぎ骨部分である。未溶解の骨部分は、必要に応じて後の工程で乾燥粉砕してカルシウム原料とし、コラーゲン粉末に添加することも可能である。
【００１６】
ろ過したろ液から、セラミド含有コラーゲン成分及び脂質を分離する。
分離方法としては、例えば遠心分離器により分離することが可能である。あるいは、ろ液を静置して比重により上に分離した脂質のみを除去し、下に沈殿するセラミド含有コラーゲン成分を回収することも可能である。
得られたセラミド含有コラーゲン成分は、そのまま保存する、濃縮する、乾燥して粉末にする、等が可能である。
【００１７】
次に、上記セラミド含有コラーゲン成分を使用したうなぎ由来のセラミド含有コラーゲン粉末の製造方法を説明する。
得られたセラミド含有コラーゲン成分の粘度を調整し粉末化するために、デキストリンを添加する。デキストリンは通常液体の粉末化に際して使用される量を添加すれば良い。例えば、重量比で、セラミド含有コラーゲン成分：デキストリン＝１：２〜３となるように添加することが可能である。
その後、スプレードライ装置などを使用して粉末化することにより、本発明のうなぎ由来のセラミド含有コラーゲン粉末を得ることができる。
【００１８】
また、実施例に用いたうなぎコラーゲン入りおにぎりの製造方法は、米と、上記得られたセラミド含有コラーゲン成分や粉末とを混合し、米表面にセラミド含有コラーゲン成分を均一にコーティングしたものをおにぎりとする。
実施例において使用される米としては通常の食用に供される米の種類、すなわち、うるち米の玄米、精白米、等を挙げることができる。あるいは、黒米、赤米、もち米、等も使用することができる。
【００１９】
以下、本発明のセラミド含有コラーゲンの製造方法を詳細に説明する。
まず、タンク中に冷凍状態のうなぎの頭（非可食部分５０ｋｇ）＋水（１５０ｋｇ）、合計２００ｋｇを投入し、９０℃で３０分スチーム加熱するとともに、タンクのお湯の中で回転羽根によりうなぎの頭を粉砕した。粉砕は、最初は周速５０ｍ／秒で１０秒間粗粉砕し、その後２００メッシュ程度となるまで粉砕を継続した。
次に、粉砕した液体全体を５８℃に冷却し、分解酵素としてプロテアーゼを添加し、２時間攪拌しながら酵素反応させた。
その後、液体を９０℃で３０分加熱し、酵素反応を停止した。この段階で、液体中の固形物はほぼ溶解し、どろどろの状態となった。
次いで、液体をフィルターでろ過し、溶解しなかった固形物を分離した。得られる固形物は主に骨である。固形物を除去した後のろ液の量は約２６０リットル、濃度計で計測したブリックスは約２％であった。
得られたろ液を遠心分離器にかけ、コラーゲン成分（固形）と脂質を分離した。
ろ液２６０リットルからのコラーゲンの取得量は、ブリックス分＝２％で計算した場合、固形分で５．２ｋｇと計算することができる。
上記コラーゲン成分（固形）にデキストリン１０．４ｋｇを添加し混合した。
その後、スプレードライヤ装置で粉末化（ＳＤ粉末）し、うなぎ由来のコラーゲン粉末を得た。得られた粉末量は約１０ｋｇであった。
なお、図１に、本発明において得られたうなぎ由来のセラミド含有コラーゲンの成分表を示す。
【００２０】
＜セラミドの検出＞
本発明のセラミド含有コラーゲンに含有されているセラミドを以下のようにして検出した。
まず、うなぎの一部又は全部を抽出溶媒と接触させて抽出液を得て、抽出液から、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を除去した粗脂質液を得る。この粗脂質液にはうなぎ由来のセラミドが多量に含有されている。
【００２１】
用いる抽出溶媒としては、メタノール、エタノール、含水エタノール、ブタノール、t-ブタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、その他のアルコール類、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエタン、トリクロロエタン、その他のハロゲン系炭化水素、アセトン、酢酸エチル、エーテル、ヘキサン等が用いられるが、これらに限定されない。これらは単独で用いてもよいし、複数を混合して用いてもよい。
また、非極性脂質を除去した粗脂質液を得る方法としては、前記抽出溶媒を用いることもできるが、セラミドを検出するためには非極性脂質を逆相シリカ樹脂に吸着させて除去することが好ましい。
【００２２】
以下、検出方法について、図面を用いて詳細に説明する。
図２は、うなぎ由来の脂質を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によって概観した結果を示した図である。
図２においては、うなぎ頭部一個（約１５グラム）を破砕後、タロロホルム／メタノールを用いない低毒性溶媒（例えば、エタノール、ブタノール、ｔ−ブタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトンなどが挙げられる）で脂質を取り出す抽出処理をしたものを、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析法によって、シリカゲルという微粒子を薄く塗りつけたガラス板の上で脂質を分けて、うなぎ頭部脂質の種類や量を調べた。
【００２３】
図２に示すように、その下方に示す「１」は溶媒での１回目抽出液（サンプル１）であり、「２」は１回目抽出をしたうなぎ頭部からの２回目抽出液（サンプル２）であり、「３」はサンプル１から中性脂肪（ＴＧ）等を除去した抽出液（サンプル３）である。
なお、サンプル２は、１回目のサンプル１より脂質濃度が低いので３．８倍多い容量を塗布した。
また、サンプル３は、中性脂肪、ステロールエステル、ワックスエステルなどの非極性脂質を、シリカ樹脂に吸着させる逆相シリカ樹脂吸着法を用いて除去したもの（粗脂質液という）をサンプル１と同量だけ塗布したものである。
【００２４】
サンプル１及びサンプル２では、抽出液のごく少量をＴＬＣプレートの端から２ｃｍくらいのところに小さく細い帯状に塗りつけ乾燥させた後に、溶媒が底に１ｃｍくらいの高さまで入った蓋付ビンにサンプルを塗った側を下にして入れて立てかけおいた。
脂質は、底の溶媒が徐々にＴＬＣプレートのシリカゲルの中に染み込んでいき、シリカゲルに付着する力が弱い脂質ほど染み込んできた溶媒に速く溶け出しＴＬＣプレート上を上方に進行するので、図１に示すような上下方向において分離したバンド状の模様となる。
これらのバンドはＴＬＣプレートを取り出し乾燥後、酸液中において加熱すると炭化して可視化させることができる。
【００２５】
このようなうなぎ頭部からの脂質の抽出においては、サンプル１に大方の脂質が含まれており、サンプル２に含まれる脂質量は少ない。よって、サンプル２のＴＬＣプレートへの塗布量は、容量にしてサンプル１の３．８倍とした。
【００２６】
図２の分析結果から分かるように、うなぎ頭部には大量の中性脂肪（いわゆる脂身）が含まれていることが分かるが、これらの中性脂肪はセラミドの正確な分析を阻害するので、サンプル３ではこの中性脂肪等を除く処理（シリカ樹脂に吸着させる逆相シリカ樹脂吸着法）をして粗脂質液を得た。
サンプル３の結果から、微量のため可視化されにくいセラミド（Ｃｅｒ（ＮＳ））が視認できていることが分かる。
【００２７】
図３（ａ）は、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムによるうなぎ頭部セラミドの質量分析であり、上記処理（逆相シリカ樹脂吸着法）したサンプル３（粗脂質液）に含まれる物質を高速液体クロマトグラフィー／質量分析（ＨＰＬＣ／ＭＳシステム）により分析した結果を示すグラフである。縦軸の強度（％）が大きいほどセラミド分子量が多いことを示す。
【００２８】
図３（ａ）から分かるように、２本鎖の長さ（炭素数）の和が４０（スフィンゴシンが１６で脂肪酸が２４）のものがもっとも多く（６２０．５２）、２本鎖の長さ（炭素数）の和が３２，３４，３８，４２の長さのものも検出できた。
また、図３（ａ）は、
うなぎ頭部のセラミド（Ｃｅｒ（ＮＳ））の正イオンマススペクトルを示しており、ｍ／ｚ（質量電荷比）＝５１０，５３８，６２０，６４８の４つの分子種を主成分として検出している。
なお、ｍ／ｚ（質量電荷比）＝６０２のイオンは、ｍ／ｚ＝６２０のイオンから水が解離した（−１８）イオンである。
【００２９】
図３（ｂ）は、各ｍ／ｚ値の分子種のクロマトグラムを示すイオンクロマトグラムであり、それぞれの分子種が特異的に溶出される時間を解析できる。
上記４つの分子種は、総炭素数（Ｃ）にすると、それぞれ３２，３４，４０，４２に対応し、図３（ｂ）ではそれらの強度を示しているが、Ｃ４０の分子種がもっとも多いことが分かる。すなわち、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムでは、順相クロマトグラフイーを用いているので、炭素数が多い分子種ほど極性が低くなり早く溶出される傾向が認められる。このＨＰＬＣ／ＭＳシステムでは、セラミドの正イオンはプロトン型［Ｍ＋Ｈ］＋としてイオン化し、負イオンは溶媒中のギ酸の付加体［Ｍ＋ＨＣＯＯ］−としてイオン化するので［Ｍ＋Ｈ］＋より４４大きいｍ／ｚ値になる。
【００３０】
ＨＰＬＣ／ＭＳシステムでは、上記ＴＬＣ分析で用いたよりも細かい球状をしたシリカゲルを、細いステンレス管に詰めたカラムを用いてセラミドと他の脂質とを分けた。このカラムを、細い管でポンプとサンプル注入装置につなぎ、ポンプから適当な溶媒を流すようにした。
ステンレス管の容量に比べて極少量の抽出液を注入装置から注入すると、シリカゲルに付着する力が弱い脂質ほど先に流れ出てくるので、この流れ出てきた液を細い管で質量分析計に導きセラミドの化学構造を分析した。
セラミドは、炭素、水素、酸素、窒素の４原子からなる分子であり、炭素が連なった２本の鎖がつながった構造をしている。一方の鎖をスフィンゴイド塩基といい、他方を脂肪酸という。
原子はそれぞれ決まった値の質量を持っているので、ＨＰＬＣ／ＭＳシステムによりセラミド分子の質量を決定できる。
【００３１】
実際にはセラミドの正や負のイオンしか測定できないが、測定値から分子の質量が分かる。さらに、注入装置内で２本鎖のつながり部分を切断し１本鎖ずつに分解して、それぞれの長さと細かい構造の違いを解析した。
その結果、うなぎ頭部から抽出したセラミド分子には、人型のスフィンゴシン（Ｓ）が主に見られ、長さ（炭素数）１６のものが主であった。さらに、人で最も多い長さ（炭素数）１８のものもかなりの量存在していたことが分かった。
【００３２】
図４、図５は、うなぎ頭部のセラミド（Ｃｅｒ（ＡＳ））の検出結果を示している。その量は微量であり十分にタンデムマス分析の結果が得られていないが、溶出時間と正負イオンのｍ／ｚ値の関係から、正イオンでｍ／ｚ＝６６６と負イオンでｍ／ｚ＝７１０を示す化合物（Ｃ４２のＣｅｒ（ＡＳ）と考えらえる）や、Ｃ４０のＣｅｒ（ＡＳ）分子種も検出した。
【００３３】
なお、Ｃｅｒ（ＮＳ）とは、スフィンゴシンと水酸化されていない脂肪酸からなる動物組織に普遍的に存在するセラミドであり、その構造式は図７、図８に示す。
また、Ｃｅｒ（ＡＳ）はスフィンゴシンと水酸化脂肪酸からなる。通常は水酸基はアルファ位に存在する。
【００３４】
図６（ａ）は、うなぎ頭部セラミドＣ４０の２本鎖の化学構造を示す図である。一方の鎖は人型のスフィンゴシン（Ｓ）で、長さ（炭素数）１６が主であるが、人の主成分である１８もかなり含まれる。他方の鎖の脂肪酸（Ｆ）は、炭素数：二重結合数（炭素と炭素が２本の結合結ばれている箇所の数）で示した。二重結合の位置は今回の測定で決めたものではなく、人で普通に見られる位置（ω９）を示した。
また、１本鎖の組み合わせの内訳を図６（ｂ）に示す。
【００３５】
図７は、質量分析計内に微量導入したヘリウムガスにセラミドイオンをぶつけて分解して構成成分の分析をするタンデムマススペクトルと呼ばれる方法で分析した結果を示すグラフであり、うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）のオンラインタンデム質量分析による構造の同定を示す。
Ａでは、うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）の構造を示しており、プロトン付加型の正イオンは、ヘリウムイオンとの衝突により、スフィンゴシンのアミノ基が脂肪酸側の炭素と形成するＮ−Ｃ結合およぴスフィンゴシン側の炭素と形成するＮ−Ｃ結合が解離すると、それぞれスフィンゴシンイオン（Ｓ）と脂肪酸アミドイオン（Ｆ）が形成される様子を示す。
Ｓは順次脱水してＳ’とＳ’’が形成される。
スフィンゴシンは４位に二重結合を有することから、すぐに３位のＯＨが脱離するので、
Ｓイオンは観察されず、微量のＳ’イオンと豊富なＳ’’イオンが形成されるので、スフィンゴシンの同定に用いる。
Ｓ’’イオンのｍ／ｚ値とＦイオンのｍ／ｚ値が、元の分子種のｍ／ｚ値と矛盾無ければ構造を確実に同定することができる。
【００３６】
また、Ｂに示すように、うなぎ頭部Ｃｅｒ（ＮＳ）には、一般型の炭素数Ｃ１８のスフィンゴシンとＣ１６のスフィンゴシンが含まれていることが分かる。さらに、微量ではあるが、Ｃ１８で４位以外に二重結合のあるｄｉｅｎｉｎｅも存在することが分かる。これは、人血清や脳にも検出されるものである。
【００３７】
図８は、うなぎ頭部で検出したセラミドについてまとめたものである。なお、Ｃｅｒ（ＡＳ）についてはタンデムマススペクトルでさらに確認する必要がある。
【００３８】
図９は、上記分析の結果、うなぎ頭部１個あたりのセラミドＣｅｒ（ＮＳ）の含有量を示したグラフである。すなわち、抽出脂質液に、決まった量のうなぎ頭部にはほとんど含まれないセラミドを基準として混ぜて測定して、図２に見られるようなうなぎ頭部セラミドの各ピークの高さと基準セラミドのピークの高さを比較してセラミド含有量を算出した。
このセラミド含有量を算出方法においては、抽出脂質液に内部標準としてオレイン酸を含有するＣｅｒ（ＮＳ）Ｃ１８：１を添加して、サンプル１全量２５０ｍｌに存在するＣｅｒ（ＮＳ）量を計算した。
内部標準は脂質抽出後に添加したので、抽出中のロスなどを無視しており、ＴＬＣ分析ではサンプル２の脂質量はかなり少ないので、その中のＣｅｒ（ＮＳ）量も無視している。
したがって、セラミド含有量の算出は、少なめに評価していることになるが、少なくともうなぎ頭部１個あたり０．７ｍｇのスフィンゴシン型のセラミドが含まれている。そのうち、Ｃ４０のセラミドが５０％以上を占めていた。
【００３９】
以前は、スフィンゴシンは炭素数Ｃ１８以外はあまり無いと考えられていたが、人やマウスでも、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１９、Ｃ２０などのスフィンゴシンが検出されているので、炭素数のバラエティは普遍的なことと考えられる。ただ、うなぎの場合は、動物よりＣ１６の比率が高いとはいえる。
【実施例】
【００４０】
＜実施例１＞
以下、本発明のうなぎ由来のセラミド含有コラーゲンを入れたおにぎりを摂取した場合の肌改善試験について説明する。なお、本実施例において、「うなぎコラーゲン」とは、うなぎ由来のセラミド含有コラーゲンをいう。
【００４１】
＜背景＞
“うなぎコラーゲン”は、うなぎから抽出したセラミド含有コラーゲンを有効成分とした機能性食品である。
コラーゲンは肌、特に真皮を構成する主要な成分であり、加齢により保水性や弾力性が失われることが知られている。
これまでに、動物実験において、コラーゲンの経口摂取によって経時的な皮膚の加齢が抑制されることや、皮膚の繊維芽細胞の密度が上昇することが報告されている。
このことから、コラーゲンを経口摂取することで、皮膚の弾力や強度など、肌の改善効果が期待される。
そこで本試験で“うなぎコラーゲン”の摂取による肌の改善効果を検証する。肌が荒れていると実感している日本人女性を対象としてうなぎコラーゲンを８週間摂取させ、その有効性について検討を行った。
【００４２】
＜目的＞
うなぎコラーゲン入りおにぎりを摂取することによる人肌改善効果を検証する。
＜試験デザイン＞
試験種別: 安全性・有効性
デザイン: 二重盲検試験
試験群数:２群
検査回数: ２回
摂取前、摂取８週後検査
目標症例数:１４名 
割付比:１対１
【００４３】
＜試験参加者＞
適格性の評価
登録基準としては、肌の悩みを自覚している２０歳以上の日本人女性である。
除外基準としては、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞の治療の既往歴がある者；心房細動、不整脈、肝障害、腎障害、脳血管障害、リウマチ、糖尿病、脂質異常症、高血圧、その他の慢性疾患、医薬品 (漢方薬を含む)・サプリメント を常用している者；アレルギー (医薬品・試験食品関連食品) がある者；肌にアレルギー症状がある者；妊娠中、授乳中、あるいは試験期間中に妊娠する意思のある者；とした。
試験食品として、うなぎコラーゲン入りおにぎりとし、比較食品としてプラセボ（デキストリン）入りおにぎりとした。
観察期間は、８週間とした。
【００４４】
用法・用量として、試験食品のうなぎコラーゲン入りおにぎり及び比較食品のデキストリン入りおにぎりを１日３個を任意のタイミングで摂取した。
試験食品組成表は、以下のとおりである。
水分：５．３ｇ（１００ｇあたり、以下同じ）
タンパク質：４４．６ｇ
脂質：０．１ｇ
炭水化物：４７．２ｇ
灰分：２．９ｇ
ナトリウム：５８０ｍｇ
カルシウム：８ｍｇ
カリウム：５９０ｍｇ
鉄：０．４ｍｇ
亜鉛：０．２ｇ
ヒドロキシプロリン：１９６０ｍｇ
【００４５】
評価項目としては下記のとおりである。
主要アウトカム: 肌評価 (ロボスキンアナライザー)
水分値・油分値・明るさ・色素沈着数・色素沈着総面積・毛穴数・シワ数・シワ総長さ・シワ総面積・きめ
副次的アウトカム: 自覚症状
実施内容: リッカートスケール法を用い、自覚症状を評価する
調査項目:「化粧のノリが良い」「肌に弾力がある」「肌に潤いがある」「肌がべとつかない」「肌のキメが良い」「くすみのない、透き通った肌である」「肌にツヤがある」「肌にニキビや吹き出物がない」「肌にシミが多い」「肌が乾燥している」「シワが気になる」「たるみが気になる」「血色が悪い」「便秘気味である」「睡眠不足である」
安全性項目
身体測定・理学検査として、身長、体重、BMI、体脂肪率、血圧、心拍数とした。
尿検査として、蛋白質、ブドウ糖、ウロビリノーゲン、ビリルビン、ケトン体、pH、潜血を検査した。
末梢血液検査として、静脈血を15 ml採血する。
血液学検査として、白血球数、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット値、血小板数、MCV (平均赤血球容積)、MCH (平均赤血球色素量)、MCHC (平均赤血球色素濃度)、白血球像
血液生化学検査として、
AST (GOT)、ALT (GPT)、γ-GTP、ALP、LD (LDH)、LAP、総ビリルビン、直接ビリルビン、間接ビリルビン、コリンエステラーゼ、ZTT、総蛋白、尿素窒素、クレアチニン、尿酸、CK、ナトリウム、カリウム、クロール、カルシウム、無機リン、血清鉄、血清アミラーゼ、総コレステロール、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、トリグリセリド (TG: 中性脂肪)、遊離脂肪酸、グルコース、ヘモグロビンA1c (HbA1c: NGSP)、グリコアルブミン
【００４６】
試験結果を以下のようにして解析した。
＜群間比較＞
摂取前の測定値を共変量に投入し、摂取後の測定値を対象とし、1要因ANCOVAを用いて摂取8週後の測定値を対象とした群間比較を行った。
集計単位は平均値と標準偏差とする。
うなぎコラーゲン入りおにぎり群と対照群を比較する。
また、対応のあるt検定を用いて摂取前と摂取8週後の測定値を対象とした比較を行った。
リッカートスケール法に限りWilcoxonの符号付順位和検定を用いて摂取前と摂取8週後の測定値を対象とした比較を行った。
集計単位は平均値と標準偏差とする。
ソフトウェアおよび基準としては、統計解析は両側検定で行うものとし、有意水準は5%に設定し、傾向差ありは5%〜10％とした。
【００４７】
＜試験結果＞
図１０及び図１１に検査項目を示す。図１２に試験参加者の追跡フローチャートを示す。
図１３に試験参加者の試験食品摂取率を示した。
本試験は、肌の悩みを自覚している成人日本人女性を１４名募集し、全員が試験参加に同意し試験参加者とした。
試験参加者１４名を割り付けた結果、うなぎコラーゲン入りおにぎり群（７名、４２．７±８．７歳）とデキストリン入りおにぎり群（７名、４１．７±７．１歳）とした。
１４名中１３名が試験を完遂し、１名が試験期間中に自己都合により追跡不能となったため脱落とした。
よって、分析対象者はうなぎコラーゲン入りおにぎり群（６名、４２．５±９．５歳）  とデキストリン入りおにぎり群（７名、４１．７±７．１歳）とした。
【００４８】
＜肌評価 (ロボスキンアナライザー)＞
群内比較 (うなぎコラーゲン入りおにぎり群)
うなぎコラーゲン入りおにぎり群における肌評価の測定値を摂取前と摂取８週後で比較した統計解析の結果を図１４に示した。
有意差が認められた項目は、目尻のしわ総長さ(p=0.016)、赤味評価(面積)(p=0.030)、赤味評価(面積LV1)(p=0.033)、水分値(p<0.001)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して目尻のしわ総長さでは21.8%の上昇(74.0 →90.2 mm)、赤味評価(面積)では61.8%の上昇(1416.0→2291.7mm2)、赤味評価(面積LV 1)では60.0%の上昇(1353.2→2165.2 mm2)、水分値では60.7%の上昇(42.8→68.8)であった。
傾向差が認められた項目は、赤味評価 (数)(p=0.056)、赤味評価(数LV1)(p=0.085)、赤味評価(数LV2)(p = 0.075)、赤味評価(面積LV3)(p=0.067)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して赤味評価(数)では43.0%の上昇(2522.3→ 3607.5個)、赤味評価(数LV1)では39.1%の上昇(2229.8→3101.8個)、赤味評価(数LV2)では69.7%の上昇(287.3→487.5個)、赤味評価(面積LV3)では240.0%の上昇(0.8→2.8 mm2)であった。
【００４９】
＜群内比較 (デキストリン入りおにぎり群)＞
うなぎコラーゲンの比較食品としてデキストリンを用いた。
デキストリン入りおにぎり群における肌評価の測定値を摂取前と摂取８週後で比較した統計解析の結果を図１５に示した。
有意差が認められた項目は、眼下のしわ数(p=0.005)、眼下のしわ本数(右)(p=0.041)、眼下のしわ本数(左)(p= 0.038)、赤味評価(数LV3)(p=0.027)、赤味評価(面積LV2)(p=0.031) であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して眼下のしわ数では32.6%の上昇(12.7→ 16.9本)、眼下のしわ本数(右)では34.9%の上昇(6.1→8.3本)、眼下のしわ本数(左)では30.4%の上昇(6.6→8.6本)、赤味評価(数LV3)では79.7%の上昇(9.1→16.4個)、赤味評価 (面積LV2)では80.6%の上昇(72.1→130.3 mm2)であった。
傾向差が認められた項目は、色あい(p=0.093)、赤味評価(数)(p=0.084)、赤味評価(数LV1)(p=0.090)、赤味評価(数LV2)(p=0.083)、赤味評価(面積)(p=0.061)、赤味評価(面積LV1)(p=0.064)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して色あいは3.2%の低下(56.8→54.9)、赤味評価(数)では48.6%の上昇(1981.7→2945.0個)、赤味評価(数LV1)では43.2%の上昇 (1739.1→2490.7個)、赤味評価(数LV2)では87.6%の上昇(233.4→437.9個)、赤味評価 (面積)では60.4%の上昇(1203.0→1929.4mm2)、赤味評価(面積LV1)では59.3%の上昇 (1126.1→1793.4 mm2)であった。
【００５０】
＜群間比較 (うなぎコラーゲン入りおにぎり群 vs デキストリン入りおにぎり群)＞
うなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群における摂取８週後の測定値を比較した統計解析の結果を図１６に示した。
有意差が認められた項目は、水分値(p=0.003)であり、うなぎコラーゲン入りおにぎり群の測定値はデキストリン入りおにぎり群と比較して高い値を示した。
【００５１】
＜自覚症状 (リッカートスケール法)＞
群内比較 (うなぎコラーゲン入りおにぎり群)
うなぎコラーゲン入りおにぎり群における自覚症状の調査結果を摂取前と摂取8週後で比較した統計解析の結果を図１７に示した。
有意差が認められた項目は、「肌のキメが良い」(p=0.031)、「くすみのない、透き通った肌である」(p=0.031)であった。
また、摂取8週後の平均値は摂取前と比較して「肌のキメが良い」では100.0%の上昇(1.8 →3.7)、「くすみのない、透き通った肌である」では111.1%の上昇 (1.5 → 3.2) であった。
傾向差が認められた項目は、「化粧のノリが良い」(p=0.063)、「肌にツヤがある」(p=0.063)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して「化粧のノリが良い」では64.3%の上昇(2.3 →3.8)、「肌にツヤがある」では83.3%の上昇 (2.0 → 3.7) であった。
【００５２】
群内比較 (デキストリン入りおにぎり群)
比較食品のデキストリン入りおにぎり群における自覚症状の調査結果を摂取前と摂取８週後で比較した統計解析の結果を図１８に示した。
有意差が認められた項目は、「肌のキメが良い」(p=0.031)、「肌にツヤがある」(p=0.031)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して「肌のキメが良い」では43.8%の上昇(2.3 →3.3)、「肌にツヤがある」では50.0%の上昇(2.0→3.0)であった。
傾向差が認められた項目は、「くすみのない、透き通った肌である」(p=0.063)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して「くすみのない、透き通った肌である」では61.5%の上昇(1.9→3.0)であった。
【００５３】
＜群間比較 (うなぎコラーゲン入りおにぎり群 vs デキストリン入りおにぎり群)＞
うなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群における摂取８週後の調査結果を比較した統計解析の結果を図１９に示した。
いずれの項目も有意差が認められなかった。
（１）身体測定・理学検査
＜群内比較 (うなぎコラーゲン入りおにぎり群)＞
うなぎコラーゲン入りおにぎり群における身体測定・理学検査の測定値を摂取前と摂取８週後で比較した統計解析の結果を図２０に示した。
いずれの項目も有意差が認められなかった。
（２）群内比較 (デキストリン入りおにぎり群)
デキストリン入りおにぎり群における身体測定・理学検査の測定値を摂取前と摂取８週後で比較した統計解析の結果を図２０に示した。
有意差が認められた項目は、体重(p=0.010)、BMI(p=0.023)、体脂肪率 (p=0.001)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して体重では1.1%の上昇 (47.9→48.4kg)、BMIでは1.1%の上昇(19.9→20.1kg/m2)、体脂肪率では9.2%の上昇(24.3→26.6%)であった。
【００５４】
＜尿検査＞
うなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群における尿検査の結果を図２１に示した。
いずれの試験参加者においても、試験食品の摂取に伴う医学的に問題のある変化は認められなかった。
＜末梢血液検査＞
群内比較 (うなぎコラーゲン入りおにぎり群)
うなぎコラーゲン入りおにぎり群における末梢血液検査の測定値を摂取前と摂取8週後で比較した統計解析の結果を図２２に示した。
有意差が認められた項目は、ヘモグロビン(p=0.019)、MCHC(p=0.001)、総蛋白(p = 0.045)、クレアチニン(p=0.014)、HDL-コレステロール(p=0.027)、グリコアルブミン(p=0.034)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較してヘモグロビンでは5.1%の上昇(12.2→12.8 g/dl)、MCHCでは2.7%の上昇(31.6→32.4%)、総蛋白では4.7%の上昇(6.8→7.1g/dl)、クレアチニンは摂取前と比較して4.4%の低下(0.68→0.65mg/dl)、HDL-コレステロールでは14.7%の上昇(69.0→79.2mg/dl)、グリコアルブミンでは摂取前と比較して3.2%の低下 (14.7→14.3 %) であった。
傾向差が認められた項目は、血小板数(p=0.072)、ALP(p=0.070)、総ビリルビン(p=0.076)、尿酸(p=0.074)、クロール(p=0.091)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して血小板数では5.5%の上昇(21.5→22.7×104/μl)、ALPでは9.0%の上昇 (146.5 → 159.7 IU/l/37℃)、総ビリルビンでは7.0%の上昇(0.7→0.8mg/dl)、尿酸では9.9%の上昇(3.7→4.1mg/dl)、クロールは摂取前と比較して1.4%の低下(104.0 → 102.5 mEq/l) であった。
【００５５】
群内比較 (デキストリン入りおにぎり群)
デキストリン入りおにぎり群における末梢血液検査の測定値を摂取前と摂取8週後で比較した統計解析の結果を図２３に示した。
有意差が認められた項目は、ヘモグロビン(p=0.035)、MCH(p=0.012)、コリンエステラーゼ (ChE)(p=0.020)、尿素窒素(p = 0.009)、尿酸(p = 0.030)、グリコアルブミン(p = 0.030)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して、ヘモグロビンでは3.7%の上昇(12.0→12.5g/dl)、MCHでは2.1%の上昇(28.8→29.4pg)、コリンエステラーゼ (ChE)では4.5%の上昇(252.0 → 263.4 IU/l/37℃)、尿素窒素は摂取前と比較して14.1%の低下(12.1→10.4 mg/dl)、尿酸は摂取前と比較して14.9%の低下(4.1→3.5 mg/dl)であった。
傾向差が認められた項目は、好中球率(p=0.064)、好酸球率(p=0.066)、好中球数(p=0.073)、好酸球数(p=0.081)、AST(GOT)(p=0.062)、クレアチニン(p=0.085)、無機リン(p=0.052)、血清アミラーゼ(p = 0.058)であった。
また、摂取８週後の平均値は摂取前と比較して、好中球率では9.2%の上昇(51.2→55.9 %)、好酸球率は摂取前と比較して54.7%の低下 (3.5 → 1.6 %) 、好中球数では23.3%の上昇(2240.3→2762.9)、好酸球数は摂取前と比較して43.5%の低下(138.2→78.0)、AST (GOT)では11.2%の上昇(17.9→19.9IU/l/37℃)、クレアチニンは摂取前と比較して6.4%の低下(0.61→0.57mg/dl)、無機リンは摂取前と比較して9.5%の低下(3.9→3.5mg/dl)、血清アミラーゼでは8.2%の上昇(67.9→73.4 IU/l/37℃)であった。
【００５６】
＜試験結果 (追加解析)＞
統計解析手法
肌評価 (ロボスキンアナライザー)
Welchのt検定を用いてうなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群の摂取前から摂取８週後にかけての変化量を比較した。
自覚症状 (リッカートスケール法)
Mann-WhitneyのU検定を用いてうなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群の摂取前から摂取８週後にかけての変化量を比較した。
追加解析結果
肌評価 (ロボスキンアナライザー)
うなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群における摂取８週後の測定値を比較した統計解析の結果を図２４に示した。
有意差が認められた項目は、色素沈着  小 (数)(p=0.045)、色素沈着  小 (面積)(p= 0.049)、水分値(p=0.001)であった。
うなぎコラーゲン入りおにぎり群の色素沈着  小 (数) と色素沈着  小 (面積) の変化量は、デキストリン入りおにぎり群と比較して低値を示したした。
また、水分値はデキストリン入りおにぎり群と比較して高値を示したした。
【００５７】
自覚症状 (リッカートスケール法)
うなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群における摂取8週後の調査結果を比較した統計解析の結果を図２５に示した。
いずれの項目も有意差が認められなかった。
【００５８】
＜考察：うなぎコラーゲン入りおにぎりの摂取による肌改善効果＞
本試験では、うなぎコラーゲン入りおにぎりの摂取による肌の改善効果をロボスキンアナライザーにより網羅的に検証した。
肌評価の結果からうなぎコラーゲン入りおにぎり群は、デキストリン入りおにぎり群と比較して肌の水分値が有意に上昇した。
従って、うなぎコラーゲンの経口摂取が皮膚角質水分量増加に有効であると考えられる。
コラーゲンを経口摂取した際、アミノ酸まで分解されずにプロリルヒドロキシプロリンといったジペプチドの状態、いわゆるコラーゲンペプチドとして吸収されることが報告されている。
加えて、コラーゲンペプチドの摂取は、皮膚角質水分量を増加するといった報告もある。
コラーゲンペプチドのようなオリゴペプチドは、アミノ酸の吸収機構とは異なりオリゴペプチドトランスポーターによって輸送されジペプチドやトリペプチド特異的に吸収される。
吸収されるに当たり、血中へ移行することも報告されている。
さらに、血中のヒドロキシプロリンを含むジペプチドやトリペプチドは、皮膚繊維芽細胞へ作用しヒアルロン酸産生を増加させる。
ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスとして水分保持機能が示されている。
よって、うなぎコラーゲンの経口摂取は、ヒアルロン酸を増加させることにより水分量を増加及び保持する可能性が示唆された。
摂取前と摂取８週後の変化量をうなぎコラーゲン入りおにぎり群とデキストリン入りおにぎり群で比較すると水分値の他に色素沈着 小 (数・面積) に有意差が認められた。
色素沈着 小 (数・面積) は、各群内で有意に変動していないが、うなぎコラーゲン入りおにぎり群が摂取期間を通じて低下していることに対しデキストリン入りおにぎり群では上昇していた。
この結果から、うなぎコラーゲンの経口摂取による色素沈着抑制効果が考えられる。
色素沈着、いわゆるシミは、紫外線を浴びたことによりメラニン産生が促され、表皮に留まることにより形成される。
表皮は、下層から基底層、有棘層、顆粒層、角質層の4層からなり基底層から徐々に上層へ流動する過程をターンオーバーという。
このターンオーバーによりメラニンは最終的に分解されるが、加齢によりこの過程は崩れてしまう。
基底層に存在する基底膜は細胞外マトリックスの1つでありコラーゲンを有している。
このコラーゲンは加齢や紫外線によって減少するため、歳を重ねることや紫外線を過剰に浴びことでメラニンのターンオーバーが衰えてしまう。
よって、うなぎコラーゲンの摂取は、基底膜のコラーゲンを補充もしくは修復し、ターンオーバーを正常に促すことでシミ形成を抑制する働きがあると考えられる。
【００５９】
＜うなぎコラーゲン入りおにぎりの摂取による自覚症状の変化＞
本試験では、うなぎコラーゲン入りおにぎりの摂取による肌の改善効果を自覚するかどうかをリッカートスケール法により検証した。
うなぎコラーゲン入りおにぎり群は、「肌のキメが良い」や「くすみのない、透き通った肌である」といった肌に関する項目で有意に上昇し、肌の改善を自覚していた。
しかし、デキストリン入りおにぎり群と比較した際、有意差が認められなかった。
本試験は、肌に悩みがある者を募集したが、「どのような悩みがあるか」まで掘り下げた募集を行う必要があるかもしれない。
本試験の結果、うなぎコラーゲン入りおにぎりの摂取による水分量の上昇と色素沈着の抑制が示唆された。
【００６０】
うなぎコラーゲン入りおにぎりの安全性
身体測定・理学検査、尿検査および末梢血液検査の結果、試験食品の摂取に伴うとみられる医学的に問題のある変動は認められなかった。
また、試験食品の摂取が原因と考えられる有害事象について、いずれの試験参加者からも報告はなかった。
以上より、うなぎコラーゲン入りおにぎりの８週間の継続摂取に関しては、安全性に問題はないと考えられる。
また、本試験の結果、うなぎコラーゲンの摂取が肌の水分量増加及び色素沈着の抑制に効果を示すこと定量的に示した。
よって、うなぎコラーゲンは肌環境の改善に有効である可能性が示された。
【００６１】
＜実施例２＞
実施例２として、本発明のうなぎ由来のコラーゲン及びセラミドを含んだパウダー（試験品）を用いて、ヒト皮膚線維芽細胞への賦活作用の検証試験を行った。
試験方法としては、試験品を培養液で希釈した溶液（試験品溶液）の細胞賦活性および毒性濃度を、正常ヒト線維芽細胞を用いたMTT 法により検討した。
試験品を培養液に希釈調整したもの（試験品溶液）を検体として、３９．１〜５０００μｇ／ｍｌの濃度になる条件で添加培養した。
４８時間後の細胞内脱水素酵素活性値をＭＴＴ法により測定することで、以下のようにして細胞賦活性および毒性濃度の検討を行った。
使用細胞：正常ヒト線維芽細胞（NEDF）；Lonza社
陽性対照：アスコルビン酸リン酸マグネシウム１０ｍＭ
（１０ｍＭ＝約２８９５．４ｍｇ／Ｌ＝２．８９５４ｍｇ／ｍｌ＝２８９５．４μｇ／ｍｌ）
測定試薬：ＭＴＴ試薬（同仁堂化学社）
正常ヒト線維芽細胞を９６穴プレートに２×１０３  cells/wellになるように播種し、２４時間の前培養を行った。（培養条件：37℃、５％ＣＯ２  １０％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ）
試験品を培地に溶解後、０．５％ＦＢＳ含有Ｄ−ＭＥＭ培地に添加し、定められた濃度に調整し添加した。
４８時間培養を行った。
ＭＴＴ Assayにより試験品添加後の細胞内脱水素酵素活性を測定した。
試験品添加前と試験品添加後の細胞内脱水素酵素活性値から細胞増殖率を算出し、比較検討した。
【００６２】
＜結果および考察＞
実施例２は、対照群の測定値を１００％として比較すると、陽性対照であるアスコルビン酸マグネシウム１０ｍＭ（２８９５．４μｇ／ｍｌ）において１３０．２％の細胞増殖を確認できたことから、細胞賦活性評価に適した試験法であるといえる。
図２６に試験結果を示した。
試験結果より、提供試験品は、最低試験濃度（３９．１μｇ／ｍｌ）においても１０４％と、無添加と比較してやや高い生存率を保持した。
また、２５００μｇ／ｍｌ以上では、１２０．０％、５０００μｇ／ｍｌでは１５２．９％であり、陽性対照と同等もしくはそれ以上の細胞賦活効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
うなぎ頭部及び骨部の処理は廃棄物処理としても重要な手段であり、本発明は、未使用資源の有効利用にもなる重要な技術である。本発明はまた、安価に高効率でセラミド含有コラーゲンを配合してなる人肌改善用組成物を製造することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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