(57)【要約】      （修正有）【課題】間葉系幹細胞の組成物を用いた肝疾患の治療方法の提供。【解決手段】肝疾患治療用薬剤製造のための低酸素培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物の使用であって、低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物が、酸素１０％未満の低酸素条件下で自家または同種ＭＳＣを培養することにより取得される、ＭＳＣの使用。適用される肝疾患は、Ｂ型肝炎、自己免疫性肝炎、急性肝不全、原発性胆汁性肝硬変、アルコール性肝障害、肝虚血／再かん流、又は同種移植拒絶等である。該低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物は、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮内注射、又は皮下注射で投与される方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝疾患治療用薬剤製造のための低酸素培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物の使用であって、該低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物が、酸素１０％未満の低酸素条件下で自家または同種ＭＳＣを培養することにより取得される、使用。
【請求項２】
該肝疾患が、自己免疫性肝炎、肝臓虚血／再かん流、肝線維症、肝硬変、急性肝不全、アルコール性肝障害、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肝炎、胆汁鬱滞型肝疾患、肝嚢胞、脂肪肝、ガラクトース血症、胆石、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝臓癌、新生児肝炎、非アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ライ症候群、サルコイドーシス、脂肪性肝炎、チロシン血症、糖原病Ｉ型、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、同種移植拒絶、およびこれらの何れかの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該肝疾患が、Ｂ型肝炎、自己免疫性肝炎、急性肝不全、原発性胆汁性肝硬変、アルコール性肝障害、肝虚血／再かん流、または同種移植拒絶である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
該低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物が、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮内注射、または皮下注射で投与される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
対象におけるＩＬ−１０、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１Ｒａ）、およびリン酸化ＳＴＡＴ３の濃度が、低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物の投与後に増加する、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
リン酸化ＳＴＡＴ１、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ１）、切断型カスパーゼ−３、ＩＦＮ−γの濃度が、低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物の投与後に減少する、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
該低酸素培養されたＭＳＣが、酸素０％〜７％の範囲の低酸素条件下で自家または同種ＭＳＣを培養することにより取得される、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
該低酸素培養されたＭＳＣが、酸素０％〜７％の範囲の低酸素条件下で同種ＭＳＣを培養することにより取得される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
該ＭＳＣが、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、角膜基質、乳歯の歯髄、臍帯組織、または臍帯血由来である、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
該ＭＳＣが骨髄ＭＳＣである、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は主に間葉系幹細胞の組成物を用いた肝疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝疾患は肝臓に損傷を与える多様な要因によって引き起こされ、遺伝するものもある。一般に、肝疾患の原因を分類すると、（ｉ）Ｂ型肝炎やＣ型肝炎、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルスなどウイルス性の原因、（ｉｉ）ヘモクロマトーシスや非アルコール性脂肪肝炎、ウィルソン病など代謝性の原因、（ｉｉｉ）自己免疫性慢性肝炎や原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎など自己免疫反応の原因、（ｉｖ）アルコール性肝障害やニトロフラントイン、アミオダロン、メトトレキサートなど毒素関連の原因、（ｖ）右心不全などその他原因の５つのグループに分けることができる。免疫細胞は、急性および慢性Ｂ型肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、アルコール性肝障害、肝虚血／再かん流傷害、同種移植拒絶など、ヒトにおける複数の肝疾患においてエフェクター細胞として作用する(Lohse et al., Immune−mediated liver injury. J Hepatol 52, 136−144)。免疫が媒介する肝疾患の患者は劇症肝炎と肝不全を合併し、生命を脅かす状態となって肝移植が必要となる。しかしながら、臓器の提供が不足しているため、これら緊急を要する患者に有効な代替治療法の必要性が切迫している。
【０００３】
近年、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は複数の動物モデルにおいて肝障害の治療に有効であるだけでなく(Schwartz et al., 2002, Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte−like cells. J Clin Invest 109, 1291−1302)、免疫抑制の特性を具備していることも分かっている(Uccelli et al., 2006, Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells. Eur J Immunol 36, 2566−2573)。最近では、尾部静脈注射による脂肪組織由来ＭＳＣの自家移植がコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）誘発性肝障害の死亡率および重篤度を低減した(Kubo et al., 2012, Efficacy of adipose tissue−derived mesenchymal stem cells for fulminant hepatitis in mice induced by concanavalin A. J Gastroenterol Hepatol 27, 165−172)。しかしながら、尾部静脈注射により投与されたＭＳＣはほとんどが肺に滞留し(Lee et al., 2009, Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti−inflammatory protein TSG−6. Cell Stem Cell 5, 54−63)、生理活性を有するＭＳＣが肺を越えて移動することは非常に少ない(Eggenhofer et al., 2012, Mesenchymal stem cells are short−lived and do not migrate beyond the lungs after intravenous infusion. Frontiers in immunology 3, 297)。しかし、ＭＳＣがＣｏｎ Ａ誘発性肝障害を軽減する機序は不明である。さらに、急性肝障害および劇症肝障害を治療するために、臨床条件においては、生体外増幅ＭＳＣの同種移植が自家移植よりも迅速である可能性がある。Ｃｏｎ Ａ誘発性肝炎は最も研究されている免疫誘発肝損傷の実験的マウスモデルである(Tiegs et al., 1992, A T cell−dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A. J Clin Invest 90, 196−203)。Ｃｏｎ Ａ投与後、複数の細胞型が炎症のプロセスに関与しており、複数のサイトカインが放出されて肝臓に損傷を与える。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Lohse et al., Immune−mediated liver injury. J Hepatol 52, 136−144
【非特許文献２】Schwartz et al., 2002, Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte−like cells. J Clin Invest 109, 1291−1302
【非特許文献３】Uccelli et al., 2006, Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells. Eur J Immunol 36, 2566−2573
【非特許文献４】Kubo et al., 2012, Efficacy of adipose tissue−derived mesenchymal stem cells for fulminant hepatitis in mice induced by concanavalin A. J Gastroenterol Hepatol 27, 165−172
【非特許文献５】Lee et al., 2009, Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti−inflammatory protein TSG−6. Cell Stem Cell 5, 54−63
【非特許文献６】Eggenhofer et al., 2012, Mesenchymal stem cells are short−lived and do not migrate beyond the lungs after intravenous infusion. Frontiers in immunology 3, 297
【非特許文献７】Tiegs et al., 1992, A T cell−dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A. J Clin Invest 90, 196−203
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、低酸素培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が肝疾患の治療に有効であるという予期されない発見に基づいている。
【０００６】
従って、本発明の目的は低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物を対象に投与する工程を含む、肝疾患の治療方法を提供することにある。
【０００７】
一態様において、本発明は低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物の肝疾患治療用薬剤製造のための使用を提供し、ここで該低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物は、自家または同種ＭＳＣを酸素１０％未満の低酸素条件で培養することにより取得される。
【０００８】
本発明の一以上の実施形態において、前記肝疾患は、自己免疫性肝炎、肝臓虚血／再かん流、肝線維症、肝硬変、急性肝不全、アルコール性肝障害、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肝炎、胆汁鬱滞型肝疾患、肝嚢胞、脂肪肝、ガラクトース血症、胆石、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝臓癌、新生児肝炎、非アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ライ症候群、サルコイドーシス、脂肪性肝炎、チロシン血症、糖原病Ｉ型、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、同種移植拒絶、およびこれらの何れかの組み合わせからなる群より選択される。
【０００９】
本発明の一以上の好ましい実施形態において、前記肝疾患は、Ｂ型肝炎、自己免疫性肝炎、急性肝不全、原発性胆汁性肝硬変、アルコール性肝障害、肝虚血／再かん流、または同種移植拒絶である。
【００１０】
本発明の一実施形態において、該低酸素培養されたＭＳＣは、酸素０％〜７％の範囲の低酸素条件下で自家または同種ＭＳＣを培養することにより取得される。
【００１１】
本発明の一実施形態において、前記ＭＳＣは、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、角膜基質、乳歯の歯髄、臍帯組織、または臍帯血由来であり、好ましくは骨髄ＭＳＣである。
【００１２】
本発明の上記の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図面を参照しながら読むことでより理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａから図１ＥはＣｏｎ Ａ誘発性肝障害に対するＭＳＣの効果を示す図である。図１Ａは、実験の期間を示し、ここで、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ、２０ｍｇ／ｋｇ）を静脈（ｉ．ｖ．）注射し、続いて４時間後にＭＳＣ（継代４〜６）（２００μＬのＰＢＳ中に１０４または１０５細胞）または２００μＬのＰＢＳを静脈注射した。Ｃｏｎ Ａ投与後６、１２、２４および４８時間後にマウスのすべての群を殺して、標本を採取した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、すべての群のアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の血清中濃度を示す。Ｃｏｎ ＡまたはＭＳＣ処理されていない正常の対照マウスの濃度を０時点に示す（各群ｎ＝６）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヘマトキシリン・エオジン染色の代表的画像（１００倍）である。スケールバー＝１００００μｍ、ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；１０４／１０５ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０４／１０５のＭＳＣが投与されたマウス。
【図１Ｄ】図１Ｄは、Ｃｏｎ Ａ投与の２４時間後の肝臓中のＫｉ−６７に対する免疫組織化学染色の代表的画像（４００倍）である。スケールバー＝５０μｍ、ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。
【図１Ｅ】図１Ｅは、Ｃｏｎ Ａ投与の２４時間後の肝臓中の切断型カスパーゼ−３、８および９に対するＴＵＮＥＬアッセイと免疫組織化学染色を示す。スケールバー＝１００μｍ、ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。平均±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝６、＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群；＊＊：Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ群。
【図２Ａ】図２Ａから図２Ｆは血清中のＩＬ１０とＩＦＮ−γの濃度、およびＳＴＡＴ１／３経路に対するＭＳＣの影響を示す図である。図２Ａは、対照（Ctrl）群、ＰＢＳ群およびＭＳＣ群の肝臓中のトータルおよびリン酸化シグナル伝達兼転写活性化因子１および３（ｔ／ｐ−ＳＴＡＴ１／３）、インターフェロン調節因子1（ＩＲＦ１）および切断型カスパーゼ−３のウェスタンブロット分析を示す。Ｃｏｎ Ａ投与の１２時間後に肝臓が採取された。
【図２Ｂ】図２Ｂは、３つの群のＣｏｎ Ａ注射の１２時間後の血清中サイトカイン濃度を示す。正常な対照群マウスのものが１（倍差）、ＩＬ：インターロイキン、ＩＦＮ−γ：インターフェロンγ、ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子α、ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子として示された。
【図２Ｃ】図２Ｃは、３つの群のＥＬＩＳＡによる血清ＩＬ１０およびＩＦＮ−γの濃度を示す。血清はＣｏｎ Ａ注射の１２時間後に取得された。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｃｏｎ Ａ注射の６時間後のＭＳＣ投与ありまたはなしの血清中サイトカイン濃度を示す。正常な対照群マウスのものが１（倍差）として示された。
【図２Ｅ】図２Ｅは、Ｃｏｎ Ａ投与の６時間および１２時間後のＰＢＳまたはＭＳＣ処理群の肝臓におけるＩＬ１０およびＩＦＮ−γの転写産物発現を示す。正常な対照群マウスのものが０時点に１（倍差）として示された。
【図２Ｆ】図２Ｆは、Ｃｏｎ Ａ投与の１２時間後のＰＢＳまたはＭＳＣ処理群と、正常な対照のマウス肝臓におけるＩＬ１０およびＩＦＮ−γのウェスタンブロット分析を示す。対照群：Ｃｏｎ ＡまたはＭＳＣ処理なしの正常な対照マウス；ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）＃：ｐ＜０．０５対対照；＃＃：ｐ＜０．０１対対照；＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群；＊＊：Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ群。
【図３Ａ】図３Ａと図３ＢはＣｏｎ Ａ誘発性肝障害に対するＩＬ１０のＭＳＣ媒介効果を示す。図３Ａは、すべての群のアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）血清中濃度を示す。Ｃｏｎ Ａ静脈投与（２０ｍｇ／ｋｇ）の４時間後、ＰＢＳ（ｎ＝７）、リコンビナントマウスＩＬ１０（２μｇ／マウス、ｎ＝７）、ＩｇＧ１アイソタイプ（２５０μｇ／マウス、ｎ＝６）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗ＩＦＮ−γ（２５０μｇ／マウス、ｎ＝６）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃｏ．５１３２０６−５１３２１１）が尾部静脈注射により投与された。Ｃｏｎ Ａ投与の１２時間後、ＡＬＴを測定するために血清が採取された。＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群。
【図３Ｂ】図３Ｂは、すべての群のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の血清中濃度を示す。Ｃｏｎ Ａ静脈投与（２０ｍｇ／ｋｇ）の４時間後、ＰＢＳ（ｎ＝７）、リコンビナントマウスＩＬ１０（２μｇ／マウス、ｎ＝７）、ＩｇＧ１アイソタイプ（２５０μｇ／マウス、ｎ＝６）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗ＩＦＮ−γ（２５０μｇ／マウス、ｎ＝６）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃｏ．５１３２０６−５１３２１１）が尾部静脈注射により投与された。Ｃｏｎ Ａ投与の１２時間後、ＡＳＴを測定するために血清が採取された。＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｃｏｎ Ａ投与の１２時間後に採取された血清試料で測定されたＡＬＴとＡＳＴ濃度の結果を示す。ＩｇＧ１アイソタイプ（２００μｇ／マウス、ｎ＝４）または抗ＩＬ１０（各群５０または２００μｇ／マウス、ｎ＝４）の投与はＣｏｎ Ａ 静脈投与（２０ｍｇ／ｋｇ）の４時間後に尾部静脈注射により行われた。＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．：有意でない。
【図３Ｄ】図３Ｄと図３ＥはＣｏｎ Ａにより損傷を受けた肝臓における肝臓のＩＬ１０発現に対するＩＬ１０の静脈投与の効果を示す。ＰＢＳまたはリコンビナントマウスＩＬ１０（ｒＩＬ１０）で処理されたＣｏｎ Ａ投与マウスの肝臓におけるＩＬ１０の転写産物発現レベルを示す。ＰＢＳ群の発現レベルを１として示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＰＢＳまたはｒＩＬ１０で処理されたＣｏｎ Ａ投与マウスの肝臓中のＩＬ１０およびβ−アクチンのウェスタンブロット画像と定量化を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（ｎ＝１４）にＣｏｎ Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）が尾部静脈注射により投与された。Ｃｏｎ Ａ注射の４時間後、マウスはＰＢＳ（１００μＬ、ｎ＝７）またはｒＩＬ１０（２μｇ、ｎ＝７）で無作為に処理された。Ｃｏｎ Ａ注射の１２時間後、すべてのマウスを殺し、肝臓の標本を定量的ＲＴ−ＰＣＲとウェスタンブロット用に取得した。ｎ．ｓ．はＰＢＳ群と比較して有意でないことを示す。
【図４Ａ】図４Ａから図４Ｃは肺または肝臓におけるＭＳＣの滞留を示す図である。図４Ａは、肺または肝臓凍結切片（５μｍ）の画像（４０倍）である。ＢＡＬＢ／ｃマウスから単離されたカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識ＭＳＣ（１０５細胞）を、ＰＢＳまたはＣｏｎ Ａ（２０ｍｇ／ｋｇ）注射の４時間後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに静脈注射した。切片はＰＢＳまたはＣｏｎ Ａ注射の１２時間後に取得した。スケールバー＝５００μｍ。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝５）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＢＳ処理群またはＭＳＣ処理群におけるＣｏｎ Ａ注射の１２時間後の肺でのＩＬ１０の相対的ｍＲＮＡレベルを示す図である。ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＰＢＳ処理群またはＭＳＣ処理群におけるＣｏｎ Ａ注射の１２時間後の肺でのＩＬ１０のウェスタンブロットである。ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群。
【図５Ａ】図５Ａから図５Ｅはマクロファージスイッチに対するＭＳＣの効果を示す図である。図５Ａは、３つの群の肺における免疫細胞マーカーのｍＲＮＡレベルを示す。正常な対照群マウスのものが１（倍差）として示された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、３つの群の肺におけるＦ４／８０の免疫組織化学染色画像を示す。スケールバー＝１００μｍ。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＰＢＳまたはＭＳＣ処理されたＣｏｎ Ａ損傷マウスの肺におけるＦ４／８０とＩＬ１０の二重染色を示す。スケールバー＝５μｍ。矢印は陽性染色された細胞を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、３つの群の肺における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）およびアルギナーゼ１（Ａｒｇ１）のｍＲＮＡレベルを示す。正常な対照群マウスのレベルが１（倍差）として示された。
【図５Ｅ】図５Ｅは、３つの群の肺におけるｉＮＯＳおよびＡｒｇ１の免疫組織化学染色画像を示す。スケールバー＝１００μｍ。対照群：Ｃｏｎ ＡまたはＭＳＣ処理なしの正常な対照マウス；ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。ＰＢＳおよびＭＳＣ群で、標本はＣｏｎ Ａ注射の１２時間後に取得された。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）＃：ｐ＜０．０５対対照；＃＃：ｐ＜０．０１対対照；＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群；＊＊：Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ群。
【図６Ａ】図６Ａから図６ＦはＣｏｎ Ａ誘発性肝障害に対するＩＬ１ＲａをノックダウンしたＭＳＣの効果を示す図である。図６Ａは、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定されたＰＢＳおよびＭＳＣ群の肺における示された分子のｍＲＮＡレベルの相対的倍差を示す。ＩＤＯ：インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ、ＴＳＧ−６：腫瘍壊死因子α−誘導タンパク質６、ＩＬ１Ｒａ：インターロイキン１受容体アンタゴニスト、ＣＯＸ−２：シクロオキシゲナーゼ−２、ＴＧＦ−β：トランスフォーミング増殖因子−β、ＨＧＦ：肝細胞増殖因子。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）＊＊：Ｐ＜０．０１対ＰＢＳ群。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＢＳとＭＳＣ群の肺におけるＩＬ１Ｒａのウェスタンブロットを示す。ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。標本はＣｏｎ Ａ注射の１２時間後に取得された。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）＊：Ｐ＜０．０５対ＰＢＳ群。
【図６Ｃ】図６Ｃは、スクランブルＭＳＣおよびｓｈＮＡ_ＩＬ１ＲａノックダウンＭＳＣにおけるＩＬ１Ｒａのタンパク質発現を示す。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝３）＊＊：Ｐ＜０．０１対スクランブルＭＳＣ。
【図６Ｄ】図６Ｄは、肝臓のヘマトキシリン・エオジン染色およびＴＵＮＥＬアッセイを示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の血清中濃度、インターロイキン１０（ＩＬ１０）血清中濃度を示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にスクランブルＭＳＣ（１０５細胞）（スクランブル群）またはＩＬ１ＲａノックダウンＭＳＣ（１０５細胞）（ｓｈ_ＩＬ１Ｒａ群）で処理されたマウスのＩＬ１０、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、アルギナーゼ１（Ａｒｇ１）のｍＲＮＡ発現を示す。Ｃｏｎ Ａ投与（２０ｍｇ／ｋｇ／マウス）の１２時間後に標本が採取された。（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）＊：Ｐ＜０．０５対スクランブル群；＊＊：Ｐ＜０．０１対スクランブル群。
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＳＣがＩＬ１Ｒａ依存的にＭ２マクロファージのスイッチングを促進することを示す図である。ＭＨＳ細胞が無血清ＲＰＭＩ−１６４０中で２時間断食された後、無処理またはＣｏｎ Ａ（１μｇ／ｍｌ、２４時間培養）あるいはＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理されるか、またはＩＬ１ＲａノックダウンあるいはスクランブルｓｈＲＮＡトランスフェクションＭＳＣありまたはなしで間接的に共培養された（１０５細胞、孔サイズ０．４μｍのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌで）。ＭＳＣまたはＩＬ４がＣｏｎ Ａ処理の４時間後に添加された。Ｃｏｎ Ａ処理の２４時間後、ＭＨＳ細胞が採取され、ＣＤ１１ｃ（Ｍ１マーカー）とＣＤ２０６（Ｍ２マーカー）で染色された。＊Ｐ＜０．０５、Ｃｏｎ Ａ処理あり、およびＩＬ４またはＭＳＣ処理なしの群と比較（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）。
【図７Ｂ】図７Ｂから図７ＤはＭＳＣまたはＩＬ１Ｒａが、Ｃｏｎ Ａで刺激されたマクロファージからのＩＬ１０産生を増加させることを示す図である。図７Ｂは、無処理またはＣｏｎ Ａ（１μｇ／ｍｌ、２４時間培養）あるいはＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理されるか、またはＩＬ１ＲａノックダウンあるいはスクランブルＭＳＣありまたはなしで間接的に共培養された（１０５細胞、孔サイズ０．４μｍのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌで）、１２ウェルプレート中のＭＨＳ細胞（１０５細胞／ウェル）の上清のＩＬ１０濃度を判定するためのＥＬＩＳＡアッセイ結果を示す。ＭＳＣまたはＩＬ４がＣｏｎ Ａ処理の４時間後に添加された。Ｃｏｎ Ａ、ＩＬ４、ＭＳＣなしで培養された群のＩＬ１０濃度を１で示した。＊：Ｐ＜０．０５、Ｃｏｎ ＡおよびＩＬ１ＲａノックダウンＭＳＣで処理された群と比較（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＥＬＩＳＡアッセイにより、Ｃｏｎ Ａ（１μｇ／ｍｌ、２４時間培養）処理されたＭＨＳ細胞において、異なる投与量のＩＬ１Ｒａを添加後、ＭＨＳ細胞によるＣｏｎ Ａ誘発性ＩＬ１０分泌が増加したことが示されたことを示す。Ｃｏｎ Ａあり、ＩＬ１Ｒａなしで培養された細胞のＩＬ１０濃度を１で示した。＊／＊＊：Ｐ＜０．０５／０．０１、Ｃｏｎ Ａあり、ＩＬ１Ｒａなしで培養された群と比較（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）。
【図７Ｄ】図７Ｄは、１２ウェルプレートに１０５細胞／ウェルの密度で播種され、無血清ＲＰＭＩ−１６４０で２時間断食後、Ｃｏｎ Ａ（１μｇ／ｍｌ）で処理され、Ｃｏｎ Ａ処理の４時間後にＩＬ１Ｒａ（１ｎｇ／ｍｌ）ありまたはなしで培養された後に採取され、その後、マクロファージサブタイプＣＤ１１ｃ（Ｍ１マーカー）およびＣＤ２０６（Ｍ２マーカー）に対する抗体で染色されたＭＨＳ細胞の蛍光抗体染色結果を示す。蛍光抗体染色がＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Becton−Dickinson Co., Franklin Lakes, NJ）により分析された。＊Ｐ＜０．０５（平均±Ｓ．Ｅ．ｎ＝６）。
【図８】図８は、Ｃｏｎ Ａ誘発性肝障害に対するＭＳＣ静脈投与の治療効果の潜在的機序を示す図である。Ｃ５７Ｂ６マウスに尾部静脈注射により投与されたＣｏｎ Ａが、１５分後に類洞内皮細胞（ＳＥＣ）に結合し、ＳＥＣ膜の破壊を引き起こす。ＳＥＣの離脱によりＣｏｎ Ａがクッパー細胞（ＫＣ）に結合する。活性化されたＫＣがＴ細胞に修飾ペプチドを提示する。ＫＣおよびＴ細胞から分泌されるサイトカインによって４時間内に肝臓のアポトーシスと壊死が生じ、血清中アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）とアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）が上昇する。ＢＡＬＢ／ｃマウスからの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をＣ５７Ｂ６マウスの尾部静脈に注射した後、投与されたＭＳＣはほとんどが肺に滞留し、Ｃ５７Ｂ６マウスの肺のマクロファージと相互作用して、マクロファージのＭ２スイッチにつながり、それが血清ＩＬ１０の増加をまねいた。ＩＬ１０は肝臓においてインターフェロンγを減少させ、リン酸化ＳＴＡＴ３を増加させて、リン酸化ＳＴＡＴ１、インターフェロン調節因子１、カスパーゼ３の下方制御を生じ、それが肝臓の壊死、アポトーシス、その後の血清ＡＬＴ／ＡＳＴにおける減少を軽減した。
【図９】図９は、Ｃｏｎ Ａ投与後の肺におけるＣＤ４ Ｔ細胞およびインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）に対するＭＳＣの効果を示す図である。３つの群の肺組織からのＣＤ４およびＩＦＮ−γの二重染色である。対照（Ctrl）群：Ｃｏｎ ＡまたはＭＳＣ処理なしの正常な対照マウス；ＰＢＳ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後にＰＢＳが投与されたマウス；ＭＳＣ群：Ｃｏｎ Ａ注射を受け、Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後に１０５のＭＳＣが投与されたマウス。ＰＢＳ処理群とＭＳＣ処理群で、標本はＣｏｎ Ａ注射の１２時間後に取得された。スケールバー＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
別途定義されている場合を除き、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書で用いる単数形の「a」、「an」、「the」などは、文脈上明確に記載されていない限り、複数形の意味を含む。従って、例えば、「１つの試料(a sample)」には、複数のそのような試料および当業者の知るところである均等物が含まれる。
【００１６】
本発明は、必要とする対象に、低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物の治療的有効量を投与する工程を含む、肝疾患を治療する方法を提供する。
【００１７】
一方で、本発明は低酸素培養された間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物の肝疾患治療用薬剤製造のための使用を提供し、ここで、該低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物は、自家または同種ＭＳＣを酸素１０％未満の低酸素条件下で培養することにより取得される。
【００１８】
本明細書で使用される「肝疾患」または「肝障害」という用語は、肝臓の病気を意味する。一般に、肝疾患は身体の肝臓の形態および（または）機能の完全性が損なわれる結果をもたらすあらゆる症状によって引き起こされる可能性がある。本発明において、前記肝疾患としては、自己免疫性肝炎、肝臓虚血／再かん流、肝線維症、肝硬変、急性肝不全、アルコール性肝障害、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肝炎、胆汁鬱滞型肝疾患、肝嚢胞、脂肪肝、ガラクトース血症、胆石、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝臓癌、新生児肝炎、非アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、ライ症候群、サルコイドーシス、脂肪性肝炎、チロシン血症、糖原病Ｉ型、ウイルス性肝炎、ウィルソン病、同種移植拒絶を含む群から選択される。好ましい実施形態には、Ｂ型肝炎、自己免疫性肝炎、急性肝不全、原発性胆汁性肝硬変、アルコール性肝障害、肝虚血／再かん流、同種移植拒絶が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書で使用される「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、たとえば骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞など、各種の異なる細胞種に分化することができる多能性幹細胞を意味する。間葉系幹細胞またはＭＳＣとしては、骨髄組織、脂肪組織、筋肉組織、角膜基質または乳歯の歯髄、臍帯組織または臍帯血などが含まれるが、これらに限定されない、任意の組織源に由来することができる。本発明の一実施形態において、前記ＭＳＣは骨髄ＭＳＣである。
【００２０】
本明細書で使用される「低酸素」という用語は、酸素１０％未満、好ましくは酸素０％〜７％など、空気の酸素含量が少ない条件を意味する。
【００２１】
本発明の一実施形態において、該低酸素培養されたＭＳＣは、酸素１０％未満、たとえば、酸素０％〜７％の低酸素条件下で、自家または同種ＭＳＣを培養することにより取得される。ＭＳＣは自家または同種ＭＳＣとすることができる。本発明の一実施形態において、前記ＭＳＣは同種ＭＳＣである。
【００２２】
本発明の一以上の実施形態において、前記低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物は、静脈注射、筋肉注射、腹腔内注射、皮内注射、または皮下注射で投与することができる。
【００２３】
「治療的有効量」または「有効量」という用語は、所望の効果（すなわち、予防または治療）を達成するために算出された、予め定められた量を意味する。
【００２４】
本発明の実施形態において、低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物の同種移植は肺に滞留し、肺におけるＭ２マクロファージ活性化を刺激することにより血清中のＩＬ１０濃度を増加させることが証明された。血清ＩＬ１０の増加がＳＴＡＴ１経路の下方制御とＳＴＡＴ３経路の上方制御を生じ、肝細胞アポトーシスとその後の肝臓損傷の減少につながった。肝臓におけるアポトーシス細胞数は低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物の投与を通じて減少された。さらに、低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物の投与後、対象におけるＩＬ−１０、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１Ｒａ）、およびリン酸化ＳＴＡＴ３の濃度が増加し、対象におけるコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、リン酸化ＳＴＡＴ１、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ１）、切断型カスパーゼ−３、ＩＦＮ−γの濃度が減少したことが分かった。低酸素培養されたＭＳＣを含む組成物が肝疾患を治療する可能性があると結論付けることができる。
【００２５】
以下、限定ではなく例示を目的として提供される次の実施例により、本発明についてさらに説明する。
【実施例】
【００２６】
Ｉ．材料および方法
１．動物
ＢｉｏＬａｓｃｏ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．（台湾、台北）から購入した８〜１０週齢の成熟オスＣ５７ＢＬ／６マウスをレシピエントとして用いた。本研究は台北栄民総医院の実験動物委員会により認可され（２０１２年１月１日、ＩＡＣＵＣ  ２０１２−０１６）、かつ米国科学アカデミー（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）により制定された「実験動物管理及び使用指針」に従って実施された。
【００２７】
２．細胞および培養条件
単離された低酸素培養のＭＳＣの作製および性質については先行研究で説明されている（Tsai et al., Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down−regulation of E2A−p21 by HIF−TWIST, Blood, 2011, 117:459−469; Yew et al., Efficient expansion of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow under hypoxic conditions,  Journal of tissue engineering and regenerative medicine, 2013, 7:984−993）。低酸素培養について、ＭＳＣを９４％のＮ２、５％のＣＯ２、１％のＯ２で構成される気体の混合中で培養した。簡単に説明すると、インフォームドコンセント後に治験審査委員会により承認されたプロトコルに基づいて、正常な成人ドナーの腸骨稜から骨髄穿刺液を採取した。有核細胞を密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ；ニュージャージー州ピーパック）により単離し、コンプリート培地［ＣＣＭ：１０．０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを添加したα−ＭＥＭ（α−最小必須培地；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ゲイザースバーグ）］に再懸濁され、週２回ＣＣＭ培地を交換して増殖させた。
【００２８】
３．Ｃｏｎ Ａ誘発性肝障害
コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）の投与はマウスにおいて用量依存的な肝損傷を引き起こす（Tiegs et al., 1992, A T cell−dependent experimental liver injury in mice inducible by concanavalin A. J Clin Invest 90, 196−203）。先行研究に基づき、Ｃｏｎ Ａ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、セントルイス）２０ｍｇ／ｋｇの用量を２００μｌのパイロジェンフリーリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させて尾部静脈に静脈注射することにより、急性肝障害を誘発した(Erhardt et al., 2007, IL−10, regulatory T cells, and Kupffer cells mediate tolerance in concanavalin A−induced liver injury in mice. Hepatology 45, 475−485)。Ｃｏｎ Ａ投与の４時間後、２つの用量の間葉系幹細胞（継代４〜６）（２００μＬのＰＢＳ中に１×１０４、１×１０５、１×１０６細胞）（ＭＳＣ群）または２００μＬのＰＢＳ（ＰＢＳ群）を尾部静脈から投与するためにマウスが無作為に分けられた。しかし、１×１０６ＭＳＣの投与は、細胞移植後数分以内にほとんどのマウスを肺塞栓で死亡させた。薬物投与されていないマウスの一群が正常の対照群とされた（ｎ＝６）。Ｃｏｎ Ａ投与の６、１２、２４および４８時間後、すべての群のマウス（各群ｎ＝６）を殺した。実験の時間枠を図１Ａに示す。
【００２９】
４．血液の生化学的測定
上述の実験で取得された血清のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）を、Ｒｏｃｈｉ／Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ、マンハイム）により測定した。
【００３０】
５．血清中サイトカインの測定
血清中のマウス腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＮＦ−γ）、インターロイキン−２、４、５、６、１０、１７Ａ（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、エオタキシンの量を、マルチプレックスサイトカインアッセイ（ＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ハイデルベルク）を使用して、メーカーのプロトコルに従って測定した。ＩＮＦ−γおよびＩＬ−１０の濃度はＥＬＩＳＡ法（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州サンタクララ）により再測定した。
【００３１】
６．ＴＵＮＥＬアッセイ
ＴＵＮＥＬアッセイを、インサイチュウ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、マンハイム）を使用して実施した。１スライド当たり少なくとも７つの視野で肝細胞核をカウントした。
【００３２】
７．リアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）
ＲＮＡｚｏｌ  Ｂｅｅ試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、テキサス州フレンズウッド）を使用してトータルＲＮＡを肝臓および肺の試料から単離した。各５０ｍｇの試料が１ｍＬのＲＮＡｚｏｌ  Ｂｅｅ試薬で均質化され、２００μＬのクロロホルムが添加された。１５分間ボルテックスにかけた後、均質化された溶液を１２０００ｇにて、４℃で１０分間遠心分離した。その後、３００μＬの上清を、−２０℃にて７００μＬのイソプロパノール溶液とともに３０分間インキュベートした。続いて、この溶液を再度遠心分離した。上清を除去した後、１ｍＬの７５％エタノールを添加した。その後試料を再度遠心分離し、乾燥させた後、ＲＮａｓｅフリー水で処理した。ＲＮＡの純度および濃度を分光法で測定した。相補的ＤＮＡを、ＭＭＬＶ逆転写酵素第一鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＭＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、１μｇのトータルＲＮＡの逆転写により合成した。ｃＤＮＡ溶液を１００μＬに希釈し、−２０℃にてアッセイまで貯蔵した。本研究で用いたプライマーのヌクレオチド配列を表１に示す。量的遺伝子発現を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フォスターシティ）でＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ技術を使用して実行した。
【００３３】
【表１】
2016138092.tif 000002
【表２】
2016138092.tif 000003
【００３４】
８．ウェスタンブロット分析
肝臓の一部をそれぞれ切り取り、氷上でポッター型テフロンガラスホモジナイザーを使用して、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１.０％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム含有）、ホスファターゼ阻害剤カクテル１（Ｐ−２８５０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．、ミズーリ州セントルイス）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ−８３４０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）、ホスファターゼ阻害剤カクテル２（Ｒ−５７２６、Ｓｉｇｍａ  Ｃｏ．）を含む溶液中で均質化した。細胞を激しい撹拌と超音波処理により可溶化した。均質化溶液中の不溶性物質を、１００００ｇで１５分間遠心分離した。その後、上清を１２０００ｇで１５分間遠心分離した。各試料のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法で測定した。精製されたタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析し、ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州）にウェット式エレクトロブロッティングで転写した。メンブレン上の非特異的な部位をＴＢＳＴ中５％無脂肪乳乾燥粉末を用いてブロッキングした。ブロットを表２に示す一次抗とともにインキュベートした。さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ウェストグローブ）を用いて高感度ケミルミネッセンス法（ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、英国アマーシャム）で検出した。
【００３５】
【表３】
2016138092.tif 000004
【００３６】
９．組織学的検査
肝組織を１０％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２４時間固定した後、脱水し、パラフィン包埋されたものから４μｍ厚の薄切標本を作成し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学染色のため、スライドを表２に示す一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベート後、スライドを二次抗体で３０分間インキュベートした。その後、スライドをＳｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−ＨＯＵＲＰ  ＩＨＣ検出システム（ＢｉｏＧｅｎｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州フリーモント）で染色した後、マイヤーヘマトキシリンで対比染色した。免疫蛍光二重染色のため、組織を濯ぎ、２つの非標識の一次抗体（表２）と共に４℃で一晩インキュベートした。２日目に、組織を蛍光染料で標識された二次抗体とともに１２０分間インキュベートした。蛍光顕微鏡（オリンパス、ＡＸ−８０）またはレーザー走査型共焦点顕微鏡（オリンパスＦＶ１０００）を使用して画像を取得した。
【００３７】
１０．ＭＳＣにおけるインターロイキン１受容体アンタゴニストのノックダウン
ＴＲＣライブラリ用のトランスフェクション品質のＤＮＡを作製するため、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ１Ｒａ）（ＤＲＣＮ６７１５４）の短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をＲＮＡｉコンソーシアム（ＲＮＡｉ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）ｓｈＲＮＡライブラリ（ＲＮＡｉ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂ、台湾、中央研究院）より発注入手した。細菌クローンを画線し、単一コロニーが形成された。１６時間インキュベート後、プラスミドｐＬＫＯ．１（Ａｍｐ＋）を選択されたコロニーから抽出し、配列決定に送った。ＬＫＯ＿ｓｈＲＮＡのフォワードプライマーは、５’−ａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇ−３’（ｓｈＲＮＡのフォワード鎖シーケンシング用）；ＬＫＯ＿ｓｈＲＮＡのリバースプライマーは、５’−ｃｔｇｔｔｇｃｔａｔｔａｔｇｔｃｔａｃ−３’（ｓｈＲＮＡのリバースシーケンシング用）である。その後、プラスミドがレンチウイルス内で構築された。レンチウイルス感染を行うために、５ｍＬのＦＢＳ添加α−ＭＥＭ中の１×１０５ＭＳＣのアリコートを６ｃｍプレートに播種し、一晩インキュベートした（３７℃、５％ＣＯ２、１％Ｏ２）。２日目、培地を新鮮なポリブレン含有（８μｇ／ｍｌ）培地に交換し、細胞を３０分間インキュベートした。その後、９．８μＬの構築されたレンチウイルス（最終感染多重度：３）を培地に添加した。２４時間培養後、感染した細胞を選択するためにピューロマイシン（３μｇ／ｍｌ）を７２時間添加した。ＲＮＡ干渉効果を確認するため、ノックダウンＭＳＣ（ｓｈ_ＩＬ１Ｒａ ＭＳＣ）および野生型ＭＳＣ（ナイーブＭＳＣ）の安定クローンから抽出されたタンパク質溶解物をウェスタンブロットにより定量化した。
【００３８】
統計分析
データはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ）により分析され、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表された。各群の統計的有意性がｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して判定され、事後多重比較がニューマン＝コイルス検定またはスチューデントＴ検定により実行された。パラメトリックテストの基準に違反があった場合、マン・ホイットニーのＵ検定が実行された。有意性はｐ値＜０．０５で判定された。
【００３９】
ＩＩ．結果
１．ＭＳＣがアポトーシスの減少によりＣｏｎ Ａ媒介肝障害を軽減した
１０５または５×１０５ＭＳＣでの細胞療法が、Ｃｏｎ Ａ投与の１２および２４時間後、血清中のアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）／アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）濃度を減少させることが分かった（図１Ｂ）。ＭＳＣ処理されたマウスの肝臓における壊死部分の有意な減少が見られた（図１Ｃ）。陽性のＫｉ−６７染色肝細胞はＭＳＣ処理とＰＢＳ処理マウスの両方で非常に少なかった（図１Ｄ）。しかし、ＭＳＣ処理はアポトーシスを起こした肝細胞の数を有意に減少することが分かった（図１Ｅ）。ＭＳＣ処理後、これらマウスの肝臓におけるカスパーゼ−３、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９の活性型の発現レベルが有意に減少し（図１Ｅ）、これはＭＳＣ処理が抗アポトーシス効果によりＣｏｎ Ａ誘発性肝障害を軽減できることを示している。
【００４０】
２．ＭＳＣ治療が血清ＩＬ１０と肝臓のｐ−ＳＴＡＴ３活性化を増加したが、Ｃｏｎ Ａにより誘発された血清ＩＦＮ−γ上昇と肝臓ＳＴＡＴ１経路の両方を阻害した
シグナル伝達兼転写活性化因子１および３（ＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３）は、肝臓におけるＣｏｎ Ａ誘発アポトーシス媒介において重要な役割を担っていることが報告されている(Hong et al., 2002, Opposing roles of STAT1 and STAT3 in T cell−mediated hepatitis: regulation by SOCS. J Clin Invest 110, 1503−1513)。Ｃｏｎ Ａ障害後、肝臓リン酸化ＳＴＡＴ１、インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ１）、切断型カスパーゼ−３の濃度が有意に増加した（図２Ａ）。ＭＳＣ処理はこれら分子の発現を有意に減少することが分かった。一方で、肝臓リン酸化ＳＴＡＴ３はＭＳＣ処理後増加することが分かった（図２Ａ）。
【００４１】
ＭＳＣ投与後のリン酸化ＳＴＡＴ１／３（ｐ−ＳＴＡＴ１／３）の変化にどのサイトカインが寄与しているかを解明するため、Ｃｏｎ Ａに誘発される炎症に関与しているいくつかの重要な循環性サイトカインの発現レベルが測定された。注意すべきは、Ｃｏｎ Ａ投与の１２時間後にＭＳＣが血清中のＩＬ１０濃度を有意に増加させ、血清ＩＦＮ−γの濃度を有意に減少させた点である（図２Ｂ）。血清ＩＬ１０とＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡは、マルチプレックスサイトカインアッセイにより取得されたデータと類似の結果を示した（図２Ｃ）。より早い時間点（Ｃｏｎ Ａ処理の６時間後）ではＭＳＣ処理後サイトカインプロファイルに変化はなかった（図２Ｄ）。
【００４２】
肝臓では、Ｃｏｎ Ａ投与の１２時間後、両方のｍＲＮＡとタンパク質におけるＩＬ１０の発現レベルはＭＳＣ群とＰＢＳ群間で有意差がなかった。しかし、ＩＦＮ−γの肝臓ｍＲＮＡとタンパク質発現レベルは、ＰＢＳ群と比較してＭＳＣ群で減少した（図２Ｅと図２Ｆ）。これらの発見は、ＭＳＣ処理後、肝臓は血清ＩＬ１０の増加に関与していなかったが、血清ＩＦＮ−γの減少には寄与した可能性があることを示唆している。
【００４３】
３．Ｃｏｎ Ａにより損傷を受けた肝臓に対するＭＳＣの治療効果においてＩＬ１０が主に寄与している
Ｃｏｎ Ａ誘発性肝障害の減少に血清ＩＬ１０とＩＦＮ−γがどの程度寄与するかを判定するため、リコンビナントマウスＩＬ１０の注射または抗ＩＦＮ−γ抗体中和による治療を含む一連の動物実験が実施された。静脈ＩＬ１０処理は血清中のＡＬＴ／ＡＳＴ濃度を有意に減少させた（ｐ＝０．０１１／０．０３７９）（図３Ａ）。しかし、抗ＩＦＮ−γ処理では血清中のＡＬＴ／ＡＳＴ濃度が減少しなかった（ｐ＝０．６２／０．５９）（図３Ｂ）。注意すべきは、ＭＳＣの治療効果が抗ＩＬ１０中和抗体での処理によって有意に減少した点である（図３Ｃ）。さらに、Ｃｏｎ Ａ処理とリコンビナントＩＬ１０投与を受けたマウスの肝臓におけるＩＬ１０のｍＲＮＡとタンパク質発現レベルが測定された（図３Ｄと図３Ｅ）。これらの実験はＭＳＣ処理群に見つかった条件を模擬した。図２Ｄと図２Ｅでの発見と同じように、ＩＬ１０のｍＲＮＡとタンパク質の肝臓中のレベルは外因性ＩＬ１０投与後のＰＢＳ群のそれよりも高くないことが分かった。これらの結果は、循環性ＩＬ１０の増加がＣｏｎ Ａ誘発性肝障害に対するＭＳＣの治療効果において主に寄与しており、Ｃｏｎ Ａ誘発性肝障害は循環性ＩＬ１０のレベルを増加することにより肝臓の内因性ＩＬ１０を上方制御することなく改善可能であることを示唆している。
【００４４】
４．ＭＳＣは肺に滞留するが肝臓には滞留しない
Ｃｏｎ Ａ肝損傷に対するＭＳＣの治療効果を媒介する根底にある機序を解明するため、注射されたＭＳＣの肝臓および肺への集積（homing）を調査した。標識されたＭＳＣの分布を図４Ａに示す。標識されたＭＳＣは正常またはＣｏｎ Ａ障害マウスの肺に主に滞留した。肝臓ではわずかなＭＳＣが検出されたのみであった。さらに、Ｃｏｎ Ａによる障害が、肺または肝臓のどちらにおいてもより多くのＭＳＣを集めることはなかった（図４Ａ）。
【００４５】
５．ＭＳＣ処理が肺におけるＩＬ１０の発現を増加した
上述の発見は、ＭＳＣのほぼすべてが肺に滞留し、肝臓にはほとんど滞留せず、したがって血清ＩＬ１０の変化は肺自体に起因する可能性が示唆される。興味深いことに、ＭＳＣ群における肺のＩＬ１０は、ＰＢＳ群におけるそれよりも有意に高かった（図４Ｂと図４Ｃ）。
【００４６】
６．ＭＳＣ処理後のマクロファージのＭ２表現型マクロファージへのスイッチング
ＩＬ１０の起源を検出するために、さらに肺免疫細胞集団を定義する研究が行われた。図５Ａに示すように、測定された免疫細胞のマーカーのいずれもＭＳＣ投与後に有意に増加しなかった。しかし、肺のＦ４／８０免疫組織化学染色を実施したとき、Ｃｏｎ Ａ処理後、およびＭＳＣ群でも、マクロファージ数の増加が示された（図５Ｂ）。ＭＳＣがＭ２表現型へのマクロファージスイッチングをもたらすことができることが報告されており、このＭ２表現型マクロファージは体外および体内で大量のＩＬ１０を産生することができる(Nemeth et al., 2009, Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)−dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin−10 production. Nat Med 15, 42−49; Zhang et al., 2010, Human gingiva−derived mesenchymal stem cells elicit polarization of m2 macrophages and enhance cutaneous wound healing. Stem Cells 28, 1856−1868)。従って、肺における誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ、Ｍ１マーカー）とアルギナーゼ１（Ａｒｇ１、Ｍ２マーカー）の発現が測定され、移植されたＭＳＣが肺でマクロファージを再プログラム化し、ＩＬ１０を産生させたか否かが評価された。二重染色画像はＩＬ１０とＦ４／８０の共局在がＭＳＣ群より取得された肺において有意に増加したことを示す（図５Ｃ）。さらに、ＭＳＣ投与はｉＮＯＳのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを有意に減少し、Ａｒｇ１のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを有意に増加した（図５Ｄと図５Ｅ）。総合すると、Ｃｏｎ Ａ処理された肺におけるＭＳＣ処理がＭ１マクロファージからＭ２マクロファージへのスイッチングを引き起こし、それが肺におけるＩＬ１０の産生増加に寄与して、血清中濃度の増加につながった可能性があることが分かった。
【００４７】
７．ＭＳＣがＣｏｎ Ａ処理マウスの肺におけるＩＬ１Ｒａの発現を増加した
先行研究によると、インドールアミン２，３−ジオキシナーゼ、ＴＮＦ−活性化遺伝子６、シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）、腫瘍増殖因子−β、肝細胞増殖因子、ＩＬ１ＲａはＭＳＣの主な傍分泌因子であり、Ｔ細胞およびマクロファージなどの免疫細胞と相互作用することが報告されている(Le Blanc and Mougiakakos, 2012, Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat Rev Immunol 12, 383−396; Ortiz et al., 2007, Interleukin 1 receptor antagonist mediates the antiinflammatory and antifibrotic effect of mesenchymal stem cells during lung injury. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 11002−11007)。従って、肺組織におけるこれら因子の遺伝子発現が比較された。ＩＬ１Ｒａを除き、ＰＢＳ群とＭＳＣ群間でこれら因子のｍＲＮＡ発現に有意な変化はなかった（図６Ａ）。注意すべきは、ＭＳＣ群の肺組織はＰＢＳ群のそれよりも高いＩＬ１Ｒａ ｍＲＮＡ発現を示した点である（図６Ａと図６Ｂ）。
【００４８】
８．ＩＬ１ＲａノックダウンＭＳＣは肺におけるＭ２マクロファージ活性化ができず、Ｃｏｎ Ａ肝障害の動物を治療できない
ｓｈＲＮＡ媒介ＲＮＡ干渉によりＭＳＣのＩＬ１Ｒａ発現がノックダウンされた（図６Ｃ）。ノックダウンＭＳＣがＣｏｎ Ａ障害マウスに投与された。Ｃｏｎ ＡとナイーブＭＳＣで処理されたマウスと比較したとき、Ｃｏｎ ＡとＩＬ１ＲａノックダウンＭＳＣで処理されたマウスは、肝臓の壊死とアポトーシスにおいて有意に高い重篤度（図６Ｄ）、血清中ＡＬＴ／ＡＳＴ濃度（図６Ｅ）、ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡ発現（図６Ｆ）、および有意に低い血清中および肺のＩＬ１０濃度と肺のＡｒｇ１  ｍＲＮＡ発現を示した（図６Ｅと図６Ｆ）。
【００４９】
９．ＭＳＣはマウス肺胞マクロファージのＭ２表現型へのスイッチングでＩＬ１Ｒａに依存する
Ｃｏｎ Ａ処理マウスにおけるＩＬ１Ｒａによる肺マクロファージのスイッチングを再現するため、生体外マウス肺マクロファージ共培養モデルが使用された。フローサイトメトリーの結果では、ＭＳＣｍがＭＨＳ（マウス肺胞マクロファージ細胞株）細胞のＭ２表現型へのスイッチングをＩＬ１Ｒａ依存的に促進できることが示された（図７）。スクランブルｓｈＲＮＡトランスフェクションＭＳＣは、ＩＬ１ＲａノックダウンＭＳＣよりもＭＨＳ細胞からのＩＬ１０産生をより刺激した（図７Ｂ）。スクランブルｓｈＲＮＡトランスフェクションＭＳＣは、Ｍ２表現型を誘導できるメディエーターとして知られるＩＬ４に匹敵する効果を生じた。同様に、ＩＬ１ＲａはクロファージＭ２スイッチングを刺激し、ＩＬ１０産生を増加させた（図７Ｃと図７Ｄ）。これらの発見は、ＩＬ１ＲａがＣｏｎ Ａ処理肺マクロファージのＭＳＣ誘導マクロファージＭ２スイッチングにおいて重要な役割を果たすことを示唆している。総合すると、投与されたＭＳＣがＩＬ１Ｒａを分泌し、宿主の肺マクロファージの再プログラム化を刺激してＩＬ１０を産生させ、血清中のＩＬ１０増加を生じ、これが肝障害の軽減に寄与する可能性がある（図８）。このほか、肺組織におけるＣＤ４とＩＦＮ−γの二重染色は、ＣＤ４細胞数がＣｏｎ Ａ投与後有意に増加し、ＭＳＣ処理後減少したことを示した（図９）。
【００５０】
本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者であれば、さらなる例示の必要なく、上記の説明に基づいて本発明を最大の範囲で利用することが可能であろう。従って、上記の説明および後述の特許請求の範囲は、本発明の範囲をいかなる方法でも限定するためではなく、例示を目的としたものと理解されるべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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【配列表】
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