(57)【要約】【課題】試薬、培地成分や添加物の濃度勾配をつける培地の作製方法と調整方法の提供、この方法を用いて得られる培地の提供とこの培地を用いた微生物分離、培養ないしスクリーニング方法の提供、ならびに濃度勾配をつける技術を用いた食品製造方法とその方法により製造された食品の提供。【解決手段】様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつける。この作製方法を利用して培地を調整する。この調整方法で調整した培地を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法。前記作製方法を利用して食品を製造する。様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用する。この食品製造方法により製造された食品を提供できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつけることを特徴とする培地の作製方法。
【請求項２】
請求項１に記載の培地の作製方法を利用して培地を調整することを特徴とする培地の調整方法。
【請求項３】
様々な試薬、培地成分、添加物、抗菌剤、薬品や栄養分などの成分の抗菌性試験、耐性試験、要求性試験などに利用できることを特徴とする請求項２記載の培地の調整方法。
【請求項４】
混合比率を均一に変化させるために、基礎培地として、寒天濃度０．５％〜１．０％で調整後、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジと濃度勾配をつける成分を入れて寒天濃度０．５％〜１．０％に調整して、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする請求項２記載の培地の調整方法。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の培地の調整方法を用いて得られることを特徴とする微生物の選抜を行うための培地。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項に記載の培地の調整方法を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法。
【請求項７】
請求項１に記載の培地の作製方法を利用して食品を製造することを特徴とする食品製造方法。
【請求項８】
様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用することを特徴とする請求項７記載の食品製造方法。
【請求項９】
混合比率を均一に変化させるために、濃度勾配をつける成分などを入れて、または入れずに寒天濃度０．５％〜１．０％で調整後、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジと他の濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度０．５％〜１．０％に調整して、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする請求項７記載の食品製造方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の食品製造方法により製造されたことを特徴とする食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の分離、培養、抗菌性、塩濃度や薬剤などへの耐性試験、生育因子の要求性試験の際に、様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた培地を簡単に作製する方法と調整方法およびこの方法を用いて得られる微生物の選抜を行うための培地とこの培地を用いて微生物を選抜する微生物分離、培養ないしスクリーニング方法に関する。
【０００２】
また、寒天、ゼリー、ゼラチン、グルコマンナンなどを用いた、粘度がある寒天状の食品などを製造する際に、様々な色、味、添加物などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた寒天状の食品を簡単に製造する方法とその方法により製造された食品に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、微生物は地球上に存在する１％程度しか分離できていないとされ、残りの９９％は、「生きているけれども培養できない」状態にあることを指すＶＮＣ（ｖｉａｂｌｅ  ｂｕｔ  ｎｏｎ−ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ）状態と呼ばれ、培養不能状態、培養不能菌や難培養性微生物として理解されている。このような状態は、未知の生育因子を要求するものなど、純粋培養が不可能もしくはきわめて困難な微生物も多く存在していることになる。そのため、微生物学の分野において、様々な生育因子の濃度や培養条件の設定が重要な課題である。
【０００４】
また、抗菌性、薬剤耐性などの試験においても、様々な濃度での設定を個々にしなければならないことが課題である。
【０００５】
従来、微生物の分離や抗菌性、薬剤耐性などの試験において、濃度を勾配ではなく、各段階濃度において、それぞれの濃度に培地を調整して試験をするなど、手間やコストがかかるという問題が多かった。
【０００６】
濃度勾配培地として、培地を作製するシャーレや容器などを傾斜させておき、そこに一定濃度に調整した培地を分注、凝固（下層）の後に、このシャーレや容器などを水平状態に戻し、そこにさらに培地を分注、凝固（上層）して、下層と上層の培地厚さ（距離）を利用した濃度勾配をつける重層法が提案されている（図１）（特許文献１，２、非特許文献１，２参照）。
【０００７】
一方、寒天、ゼラチンなどを利用する場面として、食品がある。現在、寒天、ゼリー、ゼラチン、グルコマンナンなどを用いた、粘度がある寒天状の食品は、子供向けのお菓子や食品および高齢者の嚥下食としての利用が増加してきている。
【０００８】
また、寒天、ゼラチン、グルコマンナンの他、カラギナン、キサンタンガム、グァーガムやペクチンなど様々な増粘剤が開発され、食品添加物として利用可能となってきている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−２７０００３号公報
【００１０】
【特許文献２】特表２００２−５１６６６１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ディー  イー  ハント（Ｄ．Ｅ．Ｈｕｎｔ），エイチ  ジェー  サンダム（Ｈ．Ｊ．Ｓａｎｄｈａｍ）共著，「インプルーブド  エイガー  グレイディアント−プレート  テクニック（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｇａｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ−Ｐｌａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」，「アプライド  マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」，（米国），１９６９，Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．２，ｐ．３２９−３３０
【００１２】
【非特許文献２】リンチャオ  ルオ（Ｌｉｎｊｉａｏ  Ｌｕｏ），アラビンサン  サミエル  イーディー（Ａｒａｖｉｎｔｈａｎ  Ｓａｍｕｅｌ  ｅｄ．）共著，「メイキング  リニヤー  ケミカル  グレイディアンツ  イン  エイガー（Ｍａｋｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｇｒａｄｉｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｇａｒ）」，「ザ  ワーム  ブリーダーズ  ガゼット（Ｔｈｅ  Ｗｏｒｍ  Ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓ  Ｇａｚｅｔｔｅ）」，（米国），２０１０，Ｖｏｌ．１８  Ｎｏ．３，ｐ．１０−１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、先行技術文献にある重層法では、上層の培地に浸透圧の問題などで浸透しにくい成分では不適となり、下層と上層の培地厚さ（距離）を利用した濃度勾配であるため、浸透性など均一であれば一定な勾配となるが、浸透性が均一とはならず濃度勾配が不均一な状態であった。
【００１４】
このようなことから、微生物の分離、培養、抗菌性、塩濃度や薬剤などへの耐性試験、生育因子の要求性試験の際に、様々な試薬、培地成分や添加物などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた培地を簡単に作製する方法と調整方法および濃度勾配を用いた微生物の選抜を行うための培地が望まれていた。
【００１５】
また、寒天、ゼリー、ゼラチン、グルコマンナンなどを用いた、粘度がある寒天状の食品などを製造する際に、様々な色、味などの成分を連続的に混合比率を変えて、濃度勾配を付けた寒天状の食品を簡単に製造する方法とその方法により製造される食品が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、これらの要望に応えるために開発されたものであって、以下の構成からなる発明である。すなわち、
(1) 様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつけることを特徴とする培地の作製方法である。
(2) 前記(1)に記載の培地の作製方法を利用して培地を調整することを特徴とする培地の調整方法である。
(3) 様々な試薬、培地成分、添加物、抗菌剤、薬品や栄養分などの成分の抗菌性試験、耐性試験、要求性試験、食品製造などに利用できることを特徴とする前記(2)記載の培地の調整方法である。
(4) 混合比率を均一に変化させるために、基礎培地として、寒天濃度０．５％〜１．０％で調整後、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジと濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度０．５％〜１．０％に調整して、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする前記(2)記載の培地の調整方法である。
(5) 前記(2)〜(4)のいずれか１項に記載の培地の調整方法を用いて得られることを特徴とする微生物の選抜を行うための培地である。
(6) 前記(2)〜(4)のいずれか１項に記載の培地の調整方法で調整した培地を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法である。
(7) 前記(1)に記載の培地の作製方法を利用して食品を製造することを特徴とする食品製造方法である。
(8) 様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用することを特徴とする前記(7)記載の食品製造方法である。
(9) 混合比率を均一に変化させるために、濃度勾配をつける成分などを入れて、または入れずに寒天濃度０．５％〜１．０％で調整後、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジと他の濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度０．５％〜１．０％に調整して、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする前記(7)記載の食品製造方法である。
(10) 前記(7)〜(9)のいずれか１項に記載の食品製造方法により製造されたことを特徴とする食品である。
【発明の効果】
【００１７】
請求項１記載の発明によれば、様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分の混合比率を変化させることで連続的に濃度の勾配をつけることを特徴とする培地の作製方法を、新規に提供できる効果がある。
【００１８】
請求項２記載の発明によれば、請求項１に記載の培地の作製方法を利用して培地を調整することを特徴とする培地の調整方法を、新規に提供できる効果がある。
【００１９】
請求項３記載の発明によれば、様々な試薬、培地成分、添加物、抗菌剤、薬品や栄養分などの成分の抗菌性試験、耐性試験、要求性試験、食品製造などに利用することを特徴とする請求項２に記載の培地の調整方法を、新規に提供できる効果がある。
【００２０】
請求項４記載の発明によれば、混合比率を均一に変化させるために、基礎培地として、寒天濃度０．５％〜１．０％で調整後、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジと濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度０．５％〜１．０％に調整して、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注すること特徴とする請求項２に記載の培地の調整方法を、新規に提供できる効果がある。
【００２１】
請求項５記載の発明によれば、請求項２〜４のいずれか１項に記載の培地の調整方法を用いて得られることを特徴とする微生物の選抜を行うための培地を、新規に提供できる効果がある。
【００２２】
請求項６記載の発明によれば、請求項２〜４のいずれか１項に記載の培地の調整方法で調整した培地を用いて、微生物を選抜することを特徴とする微生物分離、培養ないしスクリーニング方法を、新規に提供できる効果がある。
【００２３】
請求項７記載の発明によれば、請求項１に記載の培地の作製方法を利用して食品を製造することを特徴とする食品製造方法を、新規に提供できる効果がある。
【００２４】
請求項８記載の発明によれば、様々な添加物、色や味などの成分を粘度がある寒天状の食品などの製造に利用することを特徴とする請求項７に記載の食品製造方法を、新規に提供できる効果がある。
【００２５】
請求項９記載の発明によれば、混合比率を均一に変化させるために、濃度勾配をつける成分などを入れて、または入れずに寒天濃度０．５％〜１．０％で調整後、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジと他の濃度勾配をつける成分などを入れて寒天濃度０．５％〜１．０％に調整して、培地温度５０℃〜７０℃にして入れたシリンジを、濃度勾配ができるように吐出量を変化させながら同時に、氷冷したシャーレや容器に分注することを特徴とする請求項７に記載の食品製造方法を、新規に提供できる効果がある。
【００２６】
請求項１０記載の発明によれば、請求項７〜９のいずれか１項に記載の食品製造方法により製造されたことを特徴とする食品を、新規に提供できる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】重層法による培地概略図である。
【図２】混合比率を変化させることで連続的に濃度勾配をつけた培地の概略図である。
【図３】混合培地に菌を穿刺培養した概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明の好ましい実施の形態について、詳細に説明する。
濃度勾配がつくことを確認するために、基礎培地として黄色の色素を含む寒天培地濃度０．８％に調整し、シリンジに分注した。また、濃度勾配をつける成分として赤色の色素を含む溶液を寒天培地濃度０．８％に調整し、別のシリンジに分注し、温度を６０℃に保ち、モデル４７５グラジェントデリバリーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、試験管を氷冷しながら分注した。
【００２９】
その結果、試験管の底には基礎培地とした黄色の色素濃度１００％から、濃度勾配に応じて混合し、中間点（濃度勾配５０：５０）では中間色のオレンジ色を呈し、試験管上層部では赤色色素濃度１００％になるような濃度勾配培地ができた。
【００３０】
さらに、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の塩分耐性を見る目的で、基礎培地はＮｕｔｒｉｅｎｔ  ｂｒｏｔｈ（Ｏｘｏｉｄ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に寒天濃度０．８％になるように調整し、シリンジに分注した。また、濃度勾配をつける塩分を濃度１０％で寒天濃度０．８％になるように調整し、別のシリンジに分注し、温度を６０℃に保ち、モデル４７５グラジェントデリバリーシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、試験管を氷冷しながら分注した。
【００３１】
上記で調整した濃度勾配培地に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を穿刺し、３７℃、４８時間培養をした。
【００３２】
その結果、塩分濃度０％から７％程度までの範囲で生育が確認でき、７％から１０％付近においては、生育が確認できなかった。
【００３３】
このことから、濃度に勾配を持たせた培地の作製が可能となった。また、塩分耐性試験を行い、塩分による耐性濃度の範囲を特定することが可能となった。
【００３４】
様々な試薬、培地成分、添加物、色や味などの成分を連続的に混合比率を変えて、簡単に濃度勾配を付けた培地を作製する方法は、様々な微生物の分離、培養、抗菌性、塩濃度や薬剤などへの耐性試験、生育因子の要求性試験への適用や同様な作製方法および調整方法が可能な食品製造への応用も期待できる。
【００３５】
そして、前記濃度勾配を付けた培地を作製する方法を微生物選抜を行うための培地の提供ができ、さらに、この培地を利用することで新たな微生物分離、培養やスクリーニング方法への適用や同様な作製方法および調整方法が可能な食品の提供も期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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