(57)【要約】【課題】細胞の大量培養を目的とする工業的応用にも適する細胞剥離方法を提供する。【解決手段】剥離槽２と、剥離槽に細胞が付着した担体を含む培地１４を供給する培地供給ライン３と、剥離槽に剥離液を供給する剥離液供給ライン５と、記剥離槽の下部に設けられ、細胞よりも大きく担体よりも小さい網目を有するフィルター９と、フィルターの下方で剥離槽に接続された廃液ライン６と記剥離槽内の剥離液を撹拌する撹拌装置８とを具備し、廃液ラインを介して培地を排出した剥離槽内に剥離液供給ラインから剥離液を供給し、撹拌装置によって担体から細胞を剥離させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が付着した担体を含む培地を剥離槽に供給する第１の工程と、
前記培地から前記担体を分離する第２の工程と、
前記第２の工程によって分離された担体に剥離液を適用する第３の工程と、
前記剥離槽内の前記担体を含む前記剥離液を撹拌する第４の工程と、
前記第４の工程によって前記担体から剥離された前記細胞を当該担体から分離する第５の工程と、
を備える細胞剥離方法。
【請求項２】
剥離槽と、
当該剥離槽に細胞が付着した担体を含む培地を供給する培地供給機構と、
前記培地を前記担体から分離して前記剥離槽外に排出する排出機構と、
前記剥離槽内に前記担体から前記細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構と、
前記剥離槽内の前記担体と前記剥離液とを撹拌する撹拌装置と、
前記撹拌装置による撹拌の後、前記担体から剥離された細胞を当該担体から分離して前記剥離槽外に送出する送出機構と、
を備える細胞剥離装置。
【請求項３】
前記撹拌装置は前記剥離槽内の前記担体と前記剥離液を当該剥離槽外から撹拌する、請求項２記載の細胞剥離装置。
【請求項４】
前記撹拌装置は前記撹拌層を揺動させる、請求項３記載の細胞剥離装置。
【請求項５】
前記撹拌装置は前記剥離槽内の前記担体と前記剥離液とを当該剥離槽内で直接撹拌する、請求項２記載の細胞剥離装置。
【請求項６】
前記撹拌装置は前記剥離装置の下部で回転する回転羽根を有する、請求項５記載の細胞剥離装置。
【請求項７】
前記排出機構は、前記剥離槽の下部に設けられ、前記細胞よりも大きく前記担体よりも小さい網目を有するフィルターによって、前記担体を前記培地から分離し、
前記回収機構は、当該フィルターによって、前記細胞を含む剥離液を前記担体から分離する、請求項２記載の細胞剥離装置。
【請求項８】
細胞導入装置と、
細胞培養装置と、
請求項２乃至７のいずれか１項に記載の細胞剥離装置と、
細胞回収装置と、
を備え、
前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に細胞が付着した担体を導入し、
前記細胞培養装置が前記担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、
前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記培地に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、
前記細胞回収装置が前記剥離された細胞を回収する、
細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の浮遊培養後、細胞の付着性基盤から付着細胞を剥離する細胞剥離方法、細胞剥離装置、及び、細胞培養システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞、植物細胞等の細胞には、それぞれ培養の際に増殖用の足場を必要とする付着性の細胞と、増殖用の足場を必要としない浮遊性の細胞とがある。培養された細胞は有用物質の生産等に広く使用されている。
【０００３】
細胞の培養方法として、静置培養法や浮遊培養法等がある。例えば、静置培養法により付着性の細胞を培養する場合には、シャーレやＴフラスコ内、或は６〜２４穴のプレートの穴に培養液を導入し、底面に細胞を付着させるか、或は、寒天等により培養液を固化させ、固化させた培養液上に細胞を付着させることで、細胞の培養を行っている。
【０００４】
底面或は固化させた培養液上に細胞を付着させる静置培養法の場合、平面上での培養となるので、１ｃｍ2当り１０4個の細胞しか培養できず、１０8個の細胞を培養する場合には約２０００ｃｍ2もの広さが必要となる。
【０００５】
一方、浮遊培養法により付着性の細胞を培養する場合には、直径が１８０μｍ程度のマイクロキャリア（担体）に細胞を付着させ、ボトル等の容器に導入された培養液中に担体を浮遊させながら細胞の培養を行っている。
【０００６】
浮遊培養法により細胞を培養する場合、１ｍＬ当り１０6個の細胞が培養可能であり、１０8個の細胞を培養する場合でも、１００ｍＬ程度の培養液があればよい。
【０００７】
静置培養法、浮遊培養法の何れでも、培養した細胞を付着対象から剥離させる場合、細胞にＥＤＴＡ液（エチレンジアミン四酢酸）等の剥離液を加え、細胞を剥がれ易くした状態で、作業者がピペットにより吸引、排出を繰返すことで担体と細胞との間に剪断応力を作用させ、細胞を担体から剥離して回収していた。
【０００８】
特許文献１には、分注容器の蓋を開け、収容容器からチップに細胞懸濁液を吸引し、前記分注容器のウェル内に細胞懸濁液を吐出する工程を自動で行う様になっており、細胞懸濁液を吸引する際に前記チップの先端に空気層を形成することで、前記チップからの液だれを防止する送液方法、送液ユニット、及び自動培養システムが開示されている。
【０００９】
特許文献２には、作業空間の内部に、細胞培養のための各種操作が行われる作業テーブルと、パスボックスを通じて持込まれた容器に所定の細胞を植付ける等の所定の作業を自動で行うロボットアームとが設けられ、前記作業空間の確実な滅菌処理が行えると共に、クローズドされた空間において滅菌ガスを無害化することができる細胞自動培養装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−１０２７２３号公報
【特許文献２】特開２０１１−１６７４０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、従来のように、ピペットによって細胞が付着された担体を吸引、排出しながら細胞を担体から剥離するだけでは、細胞の回収に多くの時間と労力を費やさざるを得ず、細胞の大量培養に応用することができなかった。そこで、本発明は、かかる課題を解決することにより、細胞の大量培養を目的とする工業的応用にも適する細胞剥離方法、細胞剥離装置、及び、細胞培養システムを提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するための第１の発明は、細胞が付着した担体を含む培地を剥離槽に供給する第１の工程と、前記培地から前記担体を分離する第２の工程と、前記第２の工程によって分離された担体に剥離液を適用する第３の工程と、前記剥離槽内の前記担体を含む前記剥離液を撹拌する第４の工程と、前記第４の工程によって前記担体から剥離された前記細胞を当該担体から分離する第５の工程と、を備える細胞剥離方法であることを特徴とする。
【００１３】
さらに、第２の発明は、剥離槽と、当該剥離槽に細胞が付着した担体を含む培地を供給する培地供給機構と、前記培地を前記担体から分離して前記剥離槽外に排出する排出機構と、前記剥離槽内に前記担体から前記細胞を剥離するための剥離液を供給する剥離液供給機構と、前記剥離槽内の前記担体と前記剥離液とを撹拌する撹拌装置と、前記撹拌装置による撹拌の後、前記担体から剥離された細胞を当該担体から分離して前記剥離槽外に送出する送出機構と、を備える細胞剥離装置であることを特徴とする。
【００１４】
第１及び第２の発明によれば、細胞が付着された担体を含む剥離液を直接撹拌できるので、担体から細胞を確実に剥離させることができる。
【００１５】
さらに、第３の発明は、細胞導入装置と、細胞培養装置と、既述の細胞剥離装置と、細胞回収装置と、を備え、前記細胞導入装置が前記細胞培養装置に細胞が付着した担体を導入し、前記細胞培養装置が前記担体を培地に浮遊させて細胞を前記担体上で培養し、前記細胞剥離装置が前記細胞培養装置から供給された前記培地に含まれる前記担体から細胞を剥離させ、前記細胞回収装置が前記剥離された細胞を回収する、細胞培養システムであることを特徴とする。この発明によれば、第１及び第２の発明によって、担体から剥離された細胞を回収するために、細胞の回収効率を向上させることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、細胞の大量培養を目的とする工業的応用にも適する細胞剥離方法、細胞剥離装置、及び、細胞培養システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施形態に係る細胞培養のシステム図である。
【図２】本発明に係る細胞剥離装置の第１の実施形態を示す構成図である。
【図３】この細胞剥離装置を用いた細胞剥離処理を説明する工程図である。
【図４】本発明に係る細胞剥離装置の第２の実施形態を示す構成図である。
【図５】この細胞剥離装置の撹拌装置（ファンユニット）の斜視図である。
【図６】ファンユニットの変形例を示す正面図である。
【図７】本発明に係る細胞剥離装置の第３の実施形態を示す構成図である。
【図８】本発明に係る細胞剥離装置の第４の実施形態を示す構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
次に、図面に基づいて、本発明の実施形態について説明する。図１は、細胞の大量培養を目的とした工業的システム（培養システム）２６の一例を示すブロック図である。細胞培養システム２６は、細胞導入装置２７、細胞培養装置１２、細胞剥離装置１、細胞回収装置２８を備え、細胞の導入から培養、剥離、回収迄の一連の処理を行う。実線の矢印は、実線で結ばれる複数のブロックが互いに常時接続されている状態を示し、破線の矢印は、破線で結ばれている各複数のブロックが互いに必要に応じて接続される状態を示している。
【００１９】
細胞導入装置２７は、主に薬液タンク３３、担体供給容器３４、細胞供給部３５、冷蔵庫３６等により冷蔵保存された培地タンク３７から構成されている。担体供給容器３４、細胞供給部３５、培地タンク３７には、それぞれ担体３８、細胞、培地１４が貯溜されており、細胞導入装置２７は、細胞培養装置１２の培養槽３９に培地１４と共に担体３８を供給する。
【００２０】
細胞培養装置１２は、恒温槽４１等により恒温状態が維持される培養槽３９、培地循環ポンプ４２、廃液タンク４３を備える。細胞培養装置１２は、細胞導入装置２７から供給された担体３８を培地１４中に浮遊させ、培地循環ポンプ４２により培地１４を循環させることで、細胞を培地に浮遊させながら培養する。
【００２１】
細胞剥離装置１は、剥離槽２、各種薬液が貯溜された薬液タンク４４（後述する緩衝液供給源１５、剥離液供給源１６）を備え、薬液タンク４４から供給された薬液と撹拌装置から与えられる剪断応力により、剥離槽２内で担体３８から細胞を剥離させる。更に、細胞回収装置２８は、細胞剥離装置１により剥離された細胞を回収する。
【００２２】
図２に、担体３８から細胞を剥離させる剥離行程を行う細胞剥離装置１を示す。剥離槽２は略円筒状の容器であり、下端部が下方に向って縮径する円錐形状となっている。剥離槽２の上端には培地供給ライン３と緩衝液供給ライン４と剥離液供給ライン５とがそれぞれ連通され、剥離槽２の下端には廃液ライン６と細胞回収ライン７とがそれぞれ連通されている。
【００２３】
剥離槽２の下部には、剥離槽２内の剥離液を撹拌するための撹拌装置８が設けられている。この撹拌装置８は剥離槽２の揺動（振盪）機構を備え、剥離槽２の揺動によって剥離液を撹拌することにより剥離液に剪断応力を付与する。剥離槽２内の下部には、メッシュ状のフィルター９が水平に設けられている。揺動には、所要の振幅、周波数により剥離槽２を水平方向、垂直方向に往復動させる動作、剥離槽２を所定の速度で往復円運動させる動作、所要の振幅、周波数により所定の支点を中心に剥離槽２を往復傾斜させる動作等が含まれる。例えば、１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍの範囲で剥離槽２が揺動される。
【００２４】
フィルター９は、細胞を通し、担体３８は通さない大きさの網目を有する。ここで、担体３８はセファロース、ポリスチレン、セラミック等からなるマイクロキャリアであり、直径は１８０μｍ程度となっている。又、フィルター９上には、担体３８の流動層１１が形成される。
【００２５】
培地供給ライン３は、細胞を培養する細胞培養装置１２と上流側で接続され、中途部に培地供給ポンプ１３が設けられている。細胞培養装置１２は、培地供給ポンプ１３を介して、培地供給ライン３から細胞の付着した担体３８を含む培地１４を剥離槽２内に供給する。
【００２６】
緩衝液供給ライン４は、上流側で緩衝液供給源１５と接続され、緩衝液供給ライン４を介して、剥離槽２内にＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）等の緩衝液を供給する。剥離液供給ライン５は、上流側で剥離液供給源１６と接続され、剥離液供給ライン５を介して、剥離槽２内にＥＤＴＡ液（エチレンジアミン四酢酸）等の剥離液を供給する。
【００２７】
廃液ライン６は、余剰となった培地１４等を排出する廃液タンク４３（図１参照）と下流側で接続されている。廃液ライン６の中途部には廃液ポンプ１７が設けられ、廃液ポンプ１７を駆動させることで剥離槽２内の液体が廃液タンク４３に排出される。
【００２８】
細胞回収ライン７は、無菌コネクタ１８を介して下流側で細胞導入ライン１９と接続されている。細胞回収ライン７の中途部には回収ポンプ２１が設けられ、回収ポンプ２１を駆動することで剥離槽２内の細胞が細胞導入ライン１９を介して細胞回収容器２２に回収される。細胞回収容器２２は、細胞回収装置２８の一部を構成している。
【００２９】
細胞回収容器２２は、例えば遠沈管であり、内部には予め培地１４が導入されており、蓋体２３により閉塞されている。蓋体２３には細胞導入ライン１９が貫通し、細胞導入ライン１９は細胞回収容器２２の内部に延伸し、細胞回収容器２２の底部近傍で開口している。蓋体２３にはエア給排ライン２４が接続されている。エア給排ライン２４は、培地１４の液面よりも上方で開口し、中途部にエアフィルタ２５が設けられている。
【００３０】
次に、図３の工程図を用いて、細胞剥離装置１を用いた細胞剥離処理について説明する。
【００３１】
ＳＴＥＰ：０１
細胞剥離処理が開始されると、先ず培地供給ポンプ１３を駆動させ、培地供給ライン３を介して、細胞培養装置１２で培養された細胞を含む培地１４が剥離槽２内に供給される。この時、剥離槽２内に供給される培地１４の流量は、回収する細胞の個数により決定される。
【００３２】
ＳＴＥＰ：０２
剥離槽２内に所望の流量の培地１４が供給されると、培地供給ポンプ１３を停止し、廃液ポンプ１７を駆動させて、剥離槽２内の培地１４を、廃液ライン６を介して廃液タンク４３に排出する。この時、フィルター９の網目の大きさは担体３８の直径よりも小さくなっているので、培地１４が濾過され、フィルター９上には培地１４中に含まれていた担体３８が濾別される。
【００３３】
ＳＴＥＰ：０３
培地１４を排出すると、次に、緩衝液供給ライン４を介して剥離槽２内にＰＢＳを供給し、細胞付きの担体３８に付着した培地１４を洗浄する。剥離槽２内に供給されるＰＢＳの流量は、担体３８の洗浄に充分な流量、例えば、培地１４と同程度の流量とする。
【００３４】
ＳＴＥＰ：０４
ＰＢＳを剥離槽２内に所定時間留めた後、廃液ポンプ１７を駆動させ、剥離槽２内から廃液ライン６を介してＰＢＳを排出する。尚、担体３８に付着した培地１４を充分に洗浄できる様、ＳＴＥＰ：０３とＳＴＥＰ：０４の２工程を複数回繰返すことが望ましい。
【００３５】
ＳＴＥＰ：０５
担体３８の洗浄が完了すると、次に、剥離液供給ライン５を介して剥離槽２内にＥＤＴＡ液を供給する。担体３８にＥＤＴＡ液が作用することにより、細胞と担体３８との界面の状態が担体３８から細胞が剥がれやすい状態になる。剥離槽２内に供給するＥＤＴＡ液の流量は、フィルター９上に堆積した担体３８が、スラリー状の流動層１１となるのに適した流量とする。例えば、ＥＤＴＡ液の液位がフィルター９の上方５ｍｍ程度であり、ＥＤＴＡ液中の担体３８の濃度を５ｇ／Ｌ〜２０ｇ／Ｌ程度とすることで、流動層１１が撹拌に適した、流動性を有するスラリー状となる。
【００３６】
ＳＴＥＰ：０６
ＥＤＴＡ液の供給後、撹拌装置８を駆動させ、剥離槽２を揺動させる。例えば、回転数を１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍとして剥離槽２を水平方向に往復動させる。剥離槽２の往復動により流動層１１が撹拌され、担体３８と細胞との間に撹拌による剪断応力、及び、担体３８同士の衝突による衝撃を及ぼすことができることにより、担体３８から細胞を剥離させる。尚、剥離槽２を往復動させる時間は、ＥＤＴＡ液が細胞に悪影響を与えない程度の、例えば５分程度とするのが望ましい。
【００３７】
ＳＴＥＰ：０７
担体３８から細胞を剥離させた後、回収ポンプ２１を駆動させ、細胞回収ライン７、細胞導入ライン１９を介して、細胞をＥＤＴＡ液と共に細胞回収容器２２内の培地１４中に導入し、細胞剥離処理を終了する。細胞剥離処理終了後は、細胞回収ライン７を無菌コネクタ１８から取外し、細胞回収容器２２を種々の用途に用いることができる。
【００３８】
この時、フィルター９の網目の大きさは、細胞よりも大きく、担体３８よりも小さいので、担体３８のみがフィルター９上に残留し、細胞のみが細胞回収容器２２内に回収される。細胞回収容器２２内には、予めＥＤＴＡ液の１０倍程度の培地１４が導入されており、ＥＤＴＡ液が細胞に悪影響を及さない濃度にまで希釈される。
【００３９】
エア給排ライン２４にシリンジを接続し、シリンジにより細胞の回収を行ってもよい。シリンジにより細胞の回収を行う場合には、回収ポンプ２１を省略することができる。
【００４０】
既述の実施形態は、剥離槽２内のフィルター９上に担体３８を堆積させ、剥離液であるＥＤＴＡ液を供給してスラリー状の流動層１１とし、流動層１１を撹拌させて細胞を担体３８から剥離させ、細胞を回収しているため、ピペットを必要とすることなく容易且つ一度に大量の細胞を回収することができ、工業的な応用に適用されることができる。
【００４１】
既述の実施形態は、担体３８から細胞を剥離させ、回収する為のロボット等を必要としないので、装置構成の簡易化及び小型化を図ることができ、製作コストの低減を図ることができる。
【００４２】
さらに、細胞を剥離させる際に、供給するＥＤＴＡ液の流量を、担体３８がスラリー状となる程度の最小限の流量としているので、ＥＤＴＡ液を細胞回収容器２２内の培地１４により希釈でき、ＥＤＴＡ液による細胞への影響を抑止することができる。
【００４３】
さらにまた、細胞剥離装置１の小型化を図ることで、細胞導入装置２７、細胞培養装置１２、細胞回収装置２８を含む細胞培養システム２６全体の小型化を図ることができる。
【００４４】
次に、細胞剥離装置１の第２の実施形態について説明する。図４に第２の実施形態に係る細胞剥離装置１を示す。この細胞培養装置が第１の実施形態の細胞剥離装置（図１）と異なる点は、撹拌装置８を変更した点である。第１の実施形態の細胞剥離装置では、撹拌装置８は揺動機構によって剥離槽２を外から撹拌しているのに対して、第２の実施形態の細胞剥離装置では、剥離槽２内に撹拌装置８を置いて直接剥離液を撹拌できるようにしたことである。こうすることによって、担体から細胞を剥離するための剪断応力を効果的に担体に適用できるようになって、細胞の回収率を向上させる。
【００４５】
図４に示すように、撹拌装置８は、剥離槽２の下部の内壁（の形状）に適合した形状の複数の回転羽根を有するファンユニット６２と  回転羽根の回転軸６０と、  回転軸と一体に回転する受動側プーリ５６と、駆動側プーリ５４を有する駆動軸５５と、駆動軸を回転させるモータ５２と、受動プーリ５６と駆動プーリ５４とに巻回されたベルト５８と、を備えている。モータ５２が回転すると駆動プーリ５４が回転し、ベルト５８、受動プーリ５６を介して回転軸６０が回転する。
【００４６】
図５はファンユニット６２の斜視図であって、ファンユニット６２は等間隔に６つの回転羽根６２Ａを有している。ファンユニット６２は、中空の回転軸６３を中心に回転する。回転軸６３の下端６２Ｂには既述のフィルター９が付設されている。また、回転軸６３の上端６２Ｃは回転軸６０と水密に接合されている。回転軸６０は剥離槽２内を上下方向に延伸しながら剥離槽外まで延在し、先端６０Ａが細胞回収ライン７の延長端部と水密に接合されている。回転軸６０も内部が細胞を含む剥離液を通過させることができるようになっている。
【００４７】
剥離槽２内に剥離液が供給されると、モータ５２が回転することによりファンユニット６２が回転する。ファンユニット６２の一部又は全部が剥離液に浸っていることより、ファンユニット６２が回転すると、細胞が付着した担体を含む剥離液が直接撹拌される。剥離液がファンユニット６２によって直接撹拌されることによって、剪断応力が効果的に担体と細胞に与えられ、担体から細胞が十分に剥離されるようになる。ファンユニット６２の回転の態様としては、定速回転の他、回転速度を定期的に或いは不定期に変更する態様、正転と逆転の繰り返しの態様、回転と停止を繰り返す態様等、剪断応力を大きくするための諸態様を採用することができる。なお、剥離液は剥離槽２の底部で担体が浸る程度でよい。
【００４８】
ファンユニット６２を回転させて、担体から細胞が十分に剥離されるとファンユニット６２を停止させて、回収ポンプ２１を駆動させる。ファンユニット６２の先端にはフィルター９が付設され、フィルター９はファンユニット６２の空洞部、回転軸６０の空洞部を介して細胞回収ライン７に連続しているために、回収ポンプ２１が駆動されると、担体から剥離された細胞を含む剥離液が細胞回収容器２２に回収される。
【００４９】
図６は、ファンユニット６２の変形例である。フィルター９の径が拡大されている。これに合わせたファンユニット６２の先端も拡大されている。フィルター９の径が拡大されることにおりフィルターの目詰まりを防止し易くしている。
【００５０】
剥離装置１の第３の実施形態を図７に示す。この実施形態に係る剥離装置は、フィルター９の上の流動層に径が剥離槽の内径よりも僅かに小さく、かつ、流動層１１の高さの範囲に収まる程度の高さを持ったファンユニット６２を備えている。この実施形態によれば、ファンユニット６２の回転によって剪断応力が直接流動層に付与される。
【００５１】
剥離装置１の第４の実施形態を図８に示す。この実施形態に係る剥離装置は、回収ライン７を剥離槽２の上部から剥離槽内をその底部まで延在し、回収ラインとは別に撹拌装置８のファンユニット６２を剥離槽２の底部に設けて、剥離液を直接撹拌している。回収ライン７の剥離槽２の底部側の先端には、フィルター９が設けられている。この実施形態によれば、ファンユニット６２と回収ライン７とが別々であるために、ファンユニット６２の構造の複雑化を避けることができる。
【符号の説明】
【００５２】
１  細胞剥離装置、２  剥離槽、３  培地供給ライン、４  緩衝液供給ライン、５  剥離液供給ライン、  ６  廃液ライン、７  細胞回収ライン、８  撹拌装置、９  フィルター、１４  培地、３８  担体
【図１】
2016036274.tif 000003
【図２】
2016036274.tif 000004
【図３】
2016036274.tif 000005
【図４】
2016036274.tif 000006
【図５】
2016036274.tif 000007
【図６】
2016036274.tif 000008
【図７】
2016036274.tif 000009
【図８】
2016036274.tif 000010