(57)【要約】【課題】安価で簡便な方法で合成することができるＢＳＨを基本とした構造のＰＥＴ対応のホウ素化合物を提供する。【解決手段】メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）に、０〜３個のアルギニンが連続したアミノ酸配列を付加し、さらに金属配位子を結合させたホウ素化合物、およびそのホウ素化合物に放射性核種を配位させたＰＥＴ用プローブ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）に、０〜３個のアルギニンが連続したアミノ酸配列を付加し、さらに金属配位子を結合させたホウ素化合物。
【請求項２】
金属配位子が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、２−ナフチルエチルトリメチルアンモニウム（ＮＥＴＡ（α−ＮＥＴＡ））、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、（α，α’，α’’，α’’’）−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＭＡ）およびフタル酸ジオクチル（ＤＯＰ３）からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１記載のホウ素化合物。
【請求項３】
アミノ酸配列が、２または３個の連続したアルギニンからなる請求項１または２記載のホウ素化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のホウ素化合物に放射性金属核種を配位させたＰＥＴ用プローブ。
【請求項５】
放射性金属核種が、64Ｃｕ、68Ｇａ、85Ｓｒ、76Ｂｒ、137Ｃｓ、52Ｍｎ、54Ｍｎ、63Ｚｎ、65Ｚｎ、59Ｆｅ、60Ｃｏ、88Ｙおよび89Ｚｒから選択される少なくとも１種の放射性金属核種である請求項４記載のＰＥＴ用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）のための陽電子放出断層画像法（ＰＥＴ：positron emission tomography）用ホウ素化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウ素中性子捕捉療法（ＢＮＣＴ）は、悪性腫瘍細胞を選択的に破壊し、腫瘍周囲の正常細胞に影響を与えないがん放射線治療法として注目されている。ＢＮＣＴは、がん細胞にホウ素（10Ｂ）原子を含む化合物を取り込ませ、人体に無害な低エネルギーの熱／熱外中性子線を体外から照射し、ホウ素（10Ｂ）原子の中性子捕獲および核分裂反応を利用してがん細胞を選択的に破壊する治療方法である。核分裂反応によって高線エネルギー付与のα粒子と、反跳するリチウム（7Ｌｉ）核を産生する（10Ｂ＋１ｎ  →  7Ｌｉ＋4Ｈｅ＋２．４ＭｅＶ）。このα粒子ｔ７Ｌｉ核の飛程は、それぞれ細胞直径より短い１０μｍ以下であるため、放射線の効果は10Ｂを含有する細胞に限定される。それゆえ、10Ｂをあらかじめ腫瘍細胞に選択的に取り込ませ、そこに中性子線照射を行えば、細胞レベルでのガン選択的な治療法となる。
【０００３】
現在のがん治療では、外科手術、放射線療法、化学療法の３つが主に行われており、疾患のレベルにより、これらの手法を組み合わせた集学的治療が行われている。近年、放射線療法におけるサイバーナイフなどの定位放射線治療では、医療機器の発達に伴い、ミリ単位で照射野を制御できるようになっている。しかし、悪性脳腫瘍を例にみると、最も悪性度の高い膠芽腫では、前述のような放射線治療技術の発達にもかかわらず、平均生存期間約１年、５年生存率５％未満と極めて予後が不良である。その理由として、腫瘍が脳内へ浸潤性発育をするという特性が挙げられる。このような高浸潤能をもつ腫瘍は、ＭＲＩ（核磁気共鳴画像法）等の画像上描出される腫瘍領域の外側の正常能に、細胞レベルで多くの腫瘍細胞が散在している。そのため、正常組織に浸潤している腫瘍細胞を正確にイメージングすることが困難であり、細胞レベルでの治療に至っておらず、予後不良の原因となっている。
【０００４】
ＢＮＣＴは前述したように、低毒性のホウ素化合物を用いるため、化学療法のような重篤な副作用はない。また、他の放射線療法のような照射線による正常組織へのダメージも極めて少ない治療法である。これまで中性子源として、原子炉を必要としていたが、加速器を使用した中性子源の開発により、原子炉と同等以上の中性子照射線量が得られており、病院併設型加速器中性子捕捉療法の実現に近づいている。
【０００５】
現在、ＢＮＣＴは、悪性脳腫瘍や悪性黒色腫、頭頸部がん、悪性中皮腫などの治療で臨床研究が盛んにおこなわれている。
【０００６】
安全な中性子源の開発が進んでいる現在において、ＢＮＣＴで最も重要視されているのが、ホウ素製剤の開発である。現在までに臨床応用されている薬剤は、ホウ素フェニルアラニン（ＢＰＡ）と、メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）の２種類である（非特許文献１および２）（下記構造式参照）。
【化１】
2016020316.tif 000002
【０００７】
ＢＰＡは、必須アミノ酸であるフェニルアラニンに10Ｂ原子を１つ結合させた化合物である。ＢＰＡは血液脳関門を通過して脳全体に広がり、特にアミノ酸代謝の高い脳腫瘍に能動的に取り込まれる。また、ＢＰＡについては、18Ｆを結合させた18Ｆ−ＢＰＡを用いて、陽電子放出断層画像法（ＰＥＴ）でのＢＮＣＴ治療前の薬物動態評価が行われている（非特許文献３および４）（下記構造式参照）。しかし、ＢＰＡは化合物１分子あたりに占める10Ｂの割合が４．７％と低く、治療効果を得るには大量のホウ素製剤が必要となる。加えて少量ではあるが正常組織にも取り込まれるため、腫瘍部の10Ｂの取り込みと正常部の取り込みの比を考えた中性子線照射を実施しなければならないという制約がある。
【化２】
2016020316.tif 000003
【０００８】
ＢＳＨは、分子内に10Ｂ原子を１２個含む２０面体の化学構造を有し、化合物１分子あたりに占める10Ｂの割合は５７．４％と高い。ＢＳＨ自身には、腫瘍選択的送達能はないが、高水溶性・低毒性であり、血液脳関門が壊れている脳腫瘍組織においてＥＰＲ（enhanced permeability and retention）効果により蓄積する。しかし、細胞内への取り込み能がないことや、ＰＥＴなどの薬物動態をイメージングする手法が無いため、脳腫瘍以外では用いられていない。
【０００９】
近年これらＢＰＡやＢＳＨの弱点を補う10Ｂキャリアとして、アミノ酸や糖類、リポソーム、高分子ミセルといったキャリアの研究・開発が報告されている。本発明者らも、これまでに、抗体結合型・発光イメージングリポソームや細胞膜通過ペプチド（cell-penetrating peptides:ＣＰＰ）を使用したマルチＢＳＨ−ペプチドを開発している（特許文献１、非特許文献５）。しかしながら、ＰＥＴ用に使用できるＢＳＨ製剤の開発はまだ行われていない。
【００１０】
ＰＥＴは、放射性同位体（ＲＩ）を含む薬剤を用いる核医学検査の一種である。対象薬剤にＲＩを標識し、投与後に体内で放出される放射線を特殊なカメラでとらえて画像化する。放出した陽電子が近くの電子と結合して消滅する代わりに透過力の強い放射線を２個生み出し、その場所から互いに１８０℃反対方向へ飛び去る。この一対の放射線をとらえることで、放射線源の存在する部位が計算可能となる。ＰＥＴ検査は全身を一度に調べることができ、悪性腫瘍画像診断や生体内薬剤動態検査に使用されている。ＰＥＴ用のプローブとしては、前述した18Ｆのみならず、11ＣなどのＲＩを結合させたり、金属キレーターに64Ｃｕ、68Ｇａといった核種を標識したペプチドや抗体が利用されている。
【００１１】
また、医薬品開発における新薬開発期間の短縮と開発コストの削減には、医薬品候補からの脱落要因の多くを占める薬物のヒトにおける体内動態を早期に調べることが重要である。日本においても、低用量の被験物質（新薬候補化合物）を健常人へ投与する「マイクロドーズ臨床試験」のガイドラインが作成され、開発早期での低用量（薬効発現量の１／１００以下）の臨床試験の実施が可能となっている。その際、有効なのが、ＰＥＴを中心とした分子イメージングである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平２０１３−０８７０９８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Kato I, Ono K, Sakurai Y, Chmae M, Maruhashi T, Imahori Y, et al. Effectiveness of BNCT for recurrent head and neck malignancies. Appl Radiat Isot 2004; 61: 1069-73
【非特許文献２】Hatanake H. A revised boron-neutron capture therapy for malignant brain tumors. J Neurol 1975; 209: 81-94
【非特許文献３】Oncol Lett 2011; 2:423-7
【非特許文献４】J Nucl Med 1998;39:325-33
【非特許文献５】Biomaterials 2009; 30:1746-55
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ホウ素中性子捕捉療法において、治療するためにどのくらいのホウ素が腫瘍部に取り込まれているかにより、治療に使う中性子線量を決定することが好ましいため、使用するホウ素製剤の体内薬物動態をＰＥＴにより評価することが望まれているが、上述したように、従来のホウ素製剤では、１分子当たりに占める10Ｂ原子の数が少ないといった問題や、ＰＥＴ等の検査に利用できないといった問題がそれぞれある。
【００１５】
そこで、本発明は、安価で簡便な方法で合成することができるＢＳＨを基本とした構造のＰＥＴ対応のホウ素化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、化合物１分子内に10Ｂ原子１２個を含むＢＳＨに、金属配位子を結合させることにより、ＰＥＴ用ホウ素化合物として使用できることを見出し、本発明を完成した。
【００１７】
すなわち、本発明は、メルカプトウンデカハイドロドデカボレート（ＢＳＨ）に、０〜３個の連続したアルギニンからなるアミノ酸配列を付加し、さらに金属配位子を結合させたホウ素化合物に関する。
【００１８】
本発明のホウ素化合物において、金属配位子は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、２−ナフチルエチルトリメチルアンモニウム（ＮＥＴＡ（α−ＮＥＴＡ））、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、（α，α’，α’’，α’’’）−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＭＡ）およびフタル酸ジオクチル（ＤＯＰ３）からなる群より選択される少なくとも１つであることが好ましい。
【００１９】
本発明のホウ素化合物において、アミノ酸配列は、２または３個の連続したアルギニンからなることが好ましい。
【００２０】
本発明はさらに、上記本発明のホウ素化合物に放射性核種を配位させたＰＥＴ用プローブに関する。
【００２１】
本発明のＰＥＴ用プローブにおいて、放射性核種は、64Ｃｕ、68Ｇａ、85Ｓｒ、76Ｂｒ、137Ｃｓ、52Ｍｎ、54Ｍｎ、63Ｚｎ、65Ｚｎ、59Ｆｅ、60Ｃｏ、88Ｙおよび89Ｚｒから選択される少なくとも１種の放射性金属核種であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、本発明のホウ素化合物を放射性同位体金属原子と共に用いることにより、投与後のホウ素製剤のイメージングが可能となり、放射線照射治療において非常に有効な生体内薬物動態情報を得ることができる。このような生体内薬物動態情報を得ることができれば、悪性腫瘍に対するＢＳＨの治療効果をあげることができ、さらには悪性脳腫瘍以外のホウ素中性子捕捉療法へのＢＳＨの適用が可能になる。
【００２３】
本発明のホウ素化合物は、放射性金属核種との錯体を形成できるため、ＰＥＴによる腫瘍の診断、腫瘍の治療効果診断、腫瘍の病態解析または腫瘍の治療のために用いることができる。さらに、ＢＳＨに２または３個のアルギニンが連続したアミノ酸配列を付加することにより、細胞内へのホウ素化合物の導入が効率的になされる。本発明のホウ素化合物に、放射性金属核種を結合させたＰＥＴ用プローブは、ホウ素中性子捕捉療法に必要とされている検査薬剤として、がん治療の評価ならびに他の疾患の検査用試薬として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】参考例１〜３のホウ素化合物（それぞれＢＳＨ−Ｔｍｒ−１Ｒ、ＢＳＨ−Ｔｍｒ−２Ｒ、ＢＳＨ−Ｔｒ−３Ｒ）について、投与からの各培養時間経過時の誘導結合プラズマ発行分光分析データにより定量化した腫瘍細胞内10Ｂ濃度（ｎｇ／１０6細胞）を示すグラフである。
【図２】参考例２（Ａ）および参考例３（Ｂ）のホウ素化合物についての、種々のホウ素化合物濃度による腫瘍細胞内10Ｂ濃度（ｎｇ／１０6細胞）を示すグラフである。
【図３】参考例１〜３のホウ素化合物およびＢＳＨについて、細胞との培養２４時間時点において観察した、（ａ）ＢＳＨ（抗ＢＳＨ抗体：緑）、（ｂ）ペプチド（ＨＬＡ−Ａ：緑）、（ｃ）核（ヘキスト染色：青）を示す共焦点レーザー顕微鏡写真データ（×１２０）である。（ｄ）は（ａ）〜（ｃ）を重ね合せたものである。
【図４】実施例２および実施例３（それぞれＢＳＨ−２Ｒ−ＤＯＴＡ、ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡ）のホウ素化合物のＷＳＲ−１アッセイによる細胞毒性評価を示すグラフである。
【図５Ａ】実施例２および実施例３のホウ素化合物を投与した担がんモデルマウスの腫瘍部の共焦点レーザー顕微鏡写真データ（×１０）である。（ａ）ＢＳＨ（抗ＢＳＨ抗体：赤）、（ｂ）ヒトグリオーマ細胞（抗ＨＬＡ−Ａ抗体：緑）、（ｃ）核（ヘキスト染色：青）を示す。（ｄ）は（ａ）〜（ｃ）を重ね合せたものである。
【図５Ｂ】図５Ａの上段、実施例３のデータの各部分の高倍率（×６０）写真データである。（ａ）ＢＳＨ（抗ＢＳＨ抗体：赤）、（ｂ）ヒトグリオーマ細胞（抗ＨＬＡ−Ａ抗体：緑）、（ｃ）核（ヘキスト染色：青）を示す。（ｄ）は（ａ）〜（ｃ）を重ね合せたものである。
【図６】実施例３（Ａ）および実施例２（Ｂ）のホウ素化合物およびＢＳＨ（Ｃ）の、担がんマウスモデルにおける各組織における10Ｂ濃度（μｇ／ｇ組織）を示すグラフである。10Ｂ濃度は、誘導結合プラズマ発行分光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により測定した。
【図７】実施例４（ＡおよびＣ）および実施例５（ＢおよびＤ）のホウ素化合物の、担がんモデルマウスでの体内分布をＰＥＴカメラで撮像した断層写真である。ＡおよびＢは、上から腫瘍部の冠状断、矢状断、水平断であり、ＣおよびＤは、それぞれＡおよびＢの頭部拡大画像である。
【図８】実施例４（Ａ）および実施例５（Ｂ）のホウ素化合物の、担がんモデルマウスでのＰＥＴデータから算出した各組織における放射能濃度（％ＩＤ／ｃｃ）を示すグラフである。
【図９】実施例４および実施例５のホウ素化合物を投与した担がんモデルマウスの、各組織における放射性濃度（％ＩＤ／ｇ組織）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明のホウ素化合物は、ホウ素源としてＢＳＨを使用し、０〜３個のアルギニンが連続したアミノ酸配列と金属配位子とを結合させたものであり、放射性金属核種との錯体を形成できるため、ＰＥＴによる腫瘍の診断、腫瘍の治療効果診断、腫瘍の病態解析または腫瘍の治療のために用いることができる。
【００２６】
本明細書においては、０〜３個のアルギニンが連続したアミノ酸配列を「ｎＲ（ｎ＝０〜３）」と記載する場合があり、たとえば、「０Ｒ」はアルギニン残基が０個であることを意味し、「１Ｒ」はアルギニン残基が１個、「２Ｒ」はアルギニン残基が２個、「３Ｒ」はアルギニン残基が３個をそれぞれ意味する。
【００２７】
本発明で用いるＢＳＨは、１分子当たりに占める10Ｂの割合が１３．８％であり、アミノ酸型のホウ素製剤であるＢＰＡの４．７％を上回るものであり、ＢＮＣＴに用いるホウ素製剤として望ましい性質を有する。
【００２８】
本発明に用いられる金属配位子としては、特に限定されるものではないが、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、２−ナフチルエチルトリメチルアンモニウム（ＮＥＴＡ（α−ＮＥＴＡ））、１，４，７，１０−テトラアザシクロテトラドデカン−１，４，７，１０−テトラ（メチレンホスホン酸）（ＤＯＴＰ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、（α，α’，α’’，α’’’）−テトラメチル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＭＡ）およびフタル酸ジオクチル（ＤＯＰ３）またはその誘導体など種々のものを使用することができ、これらは二種以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２９】
本発明においては、アルギニン残基は必須ではないが、アルギニンが１〜３個連続したアミノ酸配列が付加されていることが好ましい。本発明のホウ素化合物は、アルギニンが２または３個連続したアミノ酸配列を有することがより好ましく、３個連続したアミノ酸配列とすることが最も好ましい。本発明のホウ素化合物は、アルギニン残基が付加されていなくても、従来のＢＳＨと同等の効果を有し、放射性金属核種との錯体は、ＢＳＨをＰＥＴイメージング可能とする有用なものである。一方、アルギニンが２または３個連続したアミノ酸配列（２Ｒまたは３Ｒ）を有する本発明のホウ素化合物は、細胞内にＢＳＨを導入する有効なＣＰＰであり、３Ｒにおいては、担がんモデル動物の腫瘍内部へＢＳＨを導入できる極めて有効なものである（試験例４）。この３Ｒでの細胞内10Ｂ濃度は、これまでに報告されている１１Ｒでの同様な実験と比較して８倍であり、その他のアミノ酸とＢＳＨとを組み合わせた従来のものよりもはるかに高い細胞内導入量を示す。このような細胞内へのＢＳＨの導入は、細胞外に導入された10Ｂと比較してＢＮＣＴにおける腫瘍殺傷効果は５０〜１００倍高いことが報告されており、これまでのＢＳＨ製剤と比較して高い効果が期待できる。また、ＢＳＨに３ＲおよびＤＯＴＡを付加したホウ素化合物の腫瘍部と正常脳組織との10Ｂ濃度の比（Ｔ／Ｎ）および腫瘍部と血液との10Ｂ濃度の比（Ｔ／Ｂ）は投与後１２時間でそれぞれ７．１、５．３と高く、これまでのＢＳＨのＴ／Ｎ：１．５、Ｔ／Ｂ：２．１と比較して非常に良好な結果である。
【００３０】
本発明のホウ素化合物は、ホウ素源のＢＳＨと金属配位子またはアルギニンとの間や、金属配位子とアルギニンとの間に、それらの結合を容易にするために通常リンカーが用いられる。リンカーは、通常のアルキレン基から成り、そのアルキレン基中には、エーテル結合、エステル結合、チオエステル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、炭素−炭素二重結合、炭素−炭素三重結合、リン酸結合を含むことができる。リンカーを構成する分子の原子数は、０〜５０が好ましく、０〜２０がより好ましい。また、上記共有結合以外にも非共有結合性の連結、たとえば配位子−金属イオン間の相互作用、静電相互作用、疎水性相互作用、ペプチド−ペプチド相互作用、タンパク質−ペプチド相互作用、タンパク質−配位子相互作用が挙げられる。例えば、Ｎ−スクシンイミジル  ４−マレイミドブチレート、ニトロピリジンスルフェニル基などの反応性の側鎖を有するシステイン残基、リシンなどの他のアミノ酸などを用いてもよい。
【００３１】
本発明のホウ素化合物は、ＷＳＴ−１アッセイによって１ｍＭの濃度でも細胞殺傷効果はなく、動物実験において安全に使用できるレベルである。
【００３２】
本発明ホウ素化合物のさらに好ましい点としては、本発明のホウ素化合物は、簡単な手法で合成可能かつ大量生産が可能なことである。本発明のホウ素化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、一般的なアミノ酸の固相合成法から作成することもできる。
【００３３】
たとえば、本発明のホウ素化合物は、金属配位子にアミノ酸残基を結合させ、アミノ基を保護して、ペプチド固相合成に用いる樹脂担体に結合させ、このアミノ酸を用いて、順次必要なアルギニン等のアミノ酸残基を、脱保護、カップリング工程により結合する。その後、ＢＳＨを結合させるためのリンカーを連結し、ＢＳＨとの反応を行うことにより、合成することができる。
【００３４】
保護アミノ酸を結合した金属配位子は、一般的な有機合成の手法により合成することができるが、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−モノアミド−ＤＯＴＡ−トリスtert−ブチルエステルなど、市販されているものを用いることもできる。これをペプチド固相合成に用いられる樹脂担体に結合させる。
【００３５】
ペプチド合成において使用する保護ペプチド樹脂担体としては、特に限定されるものではなく、市販されている種々のものを用いることができ、たとえばベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂などが挙げられる。
【００３６】
ペプチドの固相合成法においては、アミノ酸は、保護基によって分子内のアミノ基をあらかじめ保護して用いられる。保護基としては、たとえば９−フルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、tert−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基などがあげられるが、これらに限定されるものではない。なお、アミノ酸は、必要に応じて、側鎖の官能基を当該官能基に応じた保護基により保護して用いることができる。なお、本願明細書において、アミノ基や側鎖の官能基が保護されているアミノ基を「保護アミノ酸」という。
【００３７】
縮合には、一般的なペプチド合成に用いられる活性化試薬などが用いられる。縮合の際の反応温度は、ペプチド合成において一般的な温度であればよい。通常、反応温度は、約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。所望の細胞膜透過ペプチド配列に相当する配列からなるペプチドを合成した後、ホウ素化合物との結合に使用するための官能基を有するアミノ酸、たとえばシステインを縮合させ、ホウ素化合物との結合に使用する官能基を導入することができる。この際、ホウ素化合物との結合に用いるため、アミノ酸ではないリンカーを連結させることもできる。
【００３８】
得られた生成物がその分子内に保護基を有する場合、定法にしたがって、たとえば酸処理、アルカリ処理、触媒の存在下での水素気流中での接触還元などにより行うことができる。なお、保護基の導入と脱保護に関しては、たとえば、グリーンズ・プロテクティブ・イン・オーガニック・シンセシス第４版［ペーターＧ．Ｍ．ワッツ（Peter G.M. Wuts）およびテオドラＷ．グリーン（Theodora W. Greene）、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis, 2006］に記載の方法にしたがって行うこともできる。
【００３９】
得られた金属配位子−ペプチド−リンカー化合物は、製造後、必要に応じて、得られた生成物の単離や精製を行ってもよい。生成物の単離や精製は、たとえば、逆相高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーによって行うことができる。
【００４０】
得られた金属配位子−ペプチド−リンカー化合物を、純水、または適当な緩衝液または有機溶媒に溶解し、ＢＳＨと反応させ、ＨＰＬＣなどで反応を追跡し、原料の金属配位子−ペプチド−リンカーが消失を確認したのち、分取用ＨＰＬＣにて目的とするホウ素化合物を得ることができる。
【００４１】
本発明のホウ素化合物は、金属配位子に放射性金属核種を配位させ、ＰＥＴ用のプローブとして使用することができる。使用する放射性金属核種としては、特に限定されるものではないが、64Ｃｕ、68Ｇａ、85Ｓｒ、76Ｂｒ、137Ｃｓ、52Ｍｎ、54Ｍｎ、63Ｚｎ、65Ｚｎ、59Ｆｅ、60Ｃｏ、88Ｙおよび89Ｚｒから選択される少なくとも１種などがあげられる。
【００４２】
さらに、本発明のホウ素化合物は、そのままホウ素捕捉療法に用いることができるため、有効成分であるホウ素以外に、腫瘍に対する選択制を高めるために、いわゆる腫瘍マーカーを含有させることができる。このような腫瘍マーカーとしては、特に限定されるものではなく、たとえば腫瘍に多く発現しているＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）やＣＤ１３３（がん幹細胞マーカー）などといった、がん表面に特異的に多く発現しているマーカーに対して結合するペプチド等のリガンドを使用することができる。
【００４３】
本発明のホウ素化合物は、適当な薬学的に許容され得る賦形剤、担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、ｐＨ安定化剤など、本技術分野において通常用いられている添加剤を配合し、ホウ素製剤とすることが出来る。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択される。このようなホウ素製剤は、溶液、懸濁液、注射剤、カプセル、ゲル、軟膏、クリーム、エマルジョンなど、種々の剤形に調製することができる。つまり、生理食塩水、等張液や一般臨床で用いられる注射液用の添加剤と共に注射剤とすること、カプセル化して内服薬やゲル化剤や皮膚科薬剤と混ぜて経皮的導入薬剤などとすることも可能である。
【００４４】
本発明のホウ素化合物は、経静脈的、経動脈的に投与されることが一般的である。その他、内服薬による投与、筋肉注射による投与、経皮的投与なども有効に使用することができる。
【００４５】
本発明のＰＥＴ用プローブは、上述したように、本発明のホウ素化合物に放射性金属核種を配位させ、金属錯体としたものであり、ＰＥＴによる腫瘍の診断、腫瘍の治療効果診断、または腫瘍の病態解析のために用いることができる。
【００４６】
本発明のＰＥＴ用プローブは、適当な薬学的に許容され得る賦形剤、担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、ｐＨ安定化剤など、本技術分野において通常用いられている添加剤を配合し、製剤化することができる。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択される。このようなＰＥＴ用プローブ製剤は、溶液、懸濁液、注射剤、カプセル、ゲル、軟膏、クリーム、エマルジョンなど、種々の剤形に調製することができる。つまり、生理食塩水、等張液や一般臨床で用いられる注射液用の添加剤と共に注射剤とすること、カプセル化して内服薬やゲル化剤や皮膚科薬剤と混ぜて経皮的導入薬剤などとすることも可能である。
【００４７】
本発明のＰＥＴ用プローブは、経静脈的、経動脈的に投与されることが一般的である。その他、内服薬による投与、筋肉注射による投与、経皮的投与なども有効に使用することができる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４９】
実験材料
ＢＳＨはステラファーマ（株）（大阪）より分与された。５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（以下、Ｔｍｒとも略す）は、シグマ−アルドリッチ（セントルイス、ＭＯ、米国）から、Ｎ−スクシンイミジル  ４−マレイミドブチレート（以下、Ｌｉｎｋとも略す）は、東京化成工業（東京）から、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−モノ−アミド−ＤＯＴＡ−トリス  tert−ブチルエステルは、マクロサイクリクス（Macrocyclics）（ダラス、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。マウス製抗−ＢＳＨモノクローナル抗体は、切畑光統博士（大阪府立大学）より分与された（Doi A, Kawabata S, Iida K, Yokoyama K, Kajimoto Y, et al. Tumor-specific targeting of sodium borocaptate (BSH) to malignant glioma by transferrin-PEG liposomes: a modality for boron neutron capture therapy. J Neurooncol 2008;87:287-94）。ラビット製抗−ＨＬＡ−Ａ（human leukocyte antigen-A）モノクローナル抗体は、アブカム（abcam）（ケンブリッジ、英国）から購入した。
【００５０】
細胞培養
ヒト神経膠腫（グリオーマ）細胞Ｕ８７ΔＥＧＦＲはWebster Cavenee博士（Department of Cellular & Molecular Medicine、カリフォルニア大学、サンディエゴ、ＣＡ、米国）より分与された。１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＧＥヘルスケア、フェアフィールド、ＣＡ、米国）、１００単位／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（和光純薬工業（株）)を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、和光純薬工業（株）)を用いて直径１０ｃｍのプラスチック培養皿（ＢＤ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）中で、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。
【００５１】
参考例１〜３：ＢＳＨ−Ｔｍｒ−ｎＲ（ｎ＝１〜３）の合成
Ｆｍｏｃペプチド固相合成法によりｎＲ−Ｔｍｒ（ｎ＝１〜３）をＦｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＰＥＧ樹脂（渡辺化学工業、広島）上で作製した。樹脂上のアミノ基を保護しているＦｍｏｃ基をピペリジン（和光純薬工業（株）、大阪）で脱保護し、脱保護されたアミノ基とＦｍｏｃ−Ｒ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（渡辺化学工業）をカップリングさせた。同様に必要個数のアルギニンをＦｍｏｃ−Ｒ（Ｐｂｆ）−ＯＨを用いて脱保護−カップリングの工程を繰り返して連結させたのち、Ｆｍｏｃ−Ｋ−ＯＨを用いてリシンを同様に連結させた。次に、リシンのアミノ基を脱保護し、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（Ｔｍｒ）をカップリングさせ、生成物（ｎＲ−Ｔｍｒ（ｎ＝１〜３））を得た。その後、リシン側鎖のε−アミノ基にＮ−スクシンイミジル  ４−マレイミドブチレート（Ｌｉｎｋ）を反応させることにより、リシン側鎖のε−アミノ基の末端をマレイミド基にした。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて樹脂から切り出し、目的とするペプチドを得た。
【００５２】
得られたペプチドとＢＳＨをそれぞれＰＢＳに溶解し、ｐＨ＝７の条件で混合することでＢＳＨをペプチドに結合した。
【００５３】
目的のＢＳＨ−ペプチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で単離・精製し、凍結乾燥して得た。得られた合成物の確認は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ）により行った（参考例１：理論値：［Ｍ＋Ｈ］+＝１０４４．５１、実測値：１０４４．４４；参考例２：理論値：［Ｍ＋Ｈ］+＝１２００．６１、実測値：１２００．３５；参考例３：理論値：［Ｍ＋Ｈ］+＝１３５６．７１、実測値：１３５７．２９）。
【化３】
2016020316.tif 000004
【００５４】
実施例１〜３：ＢＳＨ−ｎＲ−ＤＯＴＡ（ｎ＝０、２、３）の合成
Ｆｍｏｃペプチド固相合成法により、Ｌｎｋ−ｎＲ−ＤＯＴＡ（ｎ＝０、２、３）を、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−ＰＥＧ樹脂上で作製した。樹脂上のアミノ基を保護しているＦｍｏｃ基をピペリジンで脱保護し、アミノ基とＦｍｏｃ−Ｋ−モノアミド−ＤＯＴＡ−トリス（tert−ブチルエステル）をカップリングさせた。Ｆｍｏｃ−Ｒ（Ｐｂｆ）−ＯＨおよびＬｉｎｋとの脱保護−カップリングの工程を繰り返し、Ｌｉｎｋ−ｎＲ−ＤＯＴＡを得、ＴＦＡを用いて樹脂から切り出した。
【００５５】
得られたＬｉｎｋ−ｎＲ−ＤＯＴＡおよびＢＳＨをそれぞれＰＢＳで溶解し、ｐＨ＝７の条件で混合してＢＳＨをペプチドに結合した。
【００５６】
目的のＢＳＨ−ペプチドはＨＰＬＣで単離・精製し、凍結乾燥して得た。
得られた合成物の確認は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ）により行った（実施例１：理論値：［Ｍ＋Ｈ］+＝８６２．５１、実測値：８５９．９９；実施例２：理論値：［Ｍ＋Ｈ］+＝１１７４．７１、実測値：１１７６．４１；実施例３：理論値：［Ｍ＋Ｈ］+＝１３３０．８１、実測値：１３３１．３８）。
【化４】
2016020316.tif 000005
【００５７】
実施例４および５：64Ｃｕ標識ＢＳＨ−ｎＲ−ＤＯＴＡ（ｎ＝３、０）の合成
サイクロトロン、ＰＥＴ装置等の使用は、おかやまメディカルイノベーションセンター（ＯＭＩＣ）分子イメージング部門等利用要項に基づき、承認された（承認番号：ＯＭ２５−２０）手順にしたがい行った。また、ＲＩの使用は、岡山大学自然生命科学研究センター光・放射線情報解析部門鹿田施設放射線障害予防規定に基づき、承認された（許可承認番号：２５０５６）手順にしたがい行った。
【００５８】
小型サイクロトロン（ＣＹＰＲＩＳ−ＨＭ１２、住友重機械工業（株）、東京）を用いた64Ｃｕの製造および精製にはＯＭＩＣの設備を利用した。精製後の64Ｃｕ（５０ｍｏｌ）と実施例３のホウ素化合物（ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡ）（２５〜３５ｎｍｏｌ）および実施例１のホウ素化合物（ＢＳＨ−０Ｒ−ＤＯＴＡ）（５０ｎｍｏｌ）のそれぞれとを４０℃の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．５、１００μＬ）中で３０分間反応させた。目的の64Ｃｕ標識ＢＳＨ−ペプチドはＨＰＬＣで精製し、実施例４（ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡ−64Ｃｕ）および実施例５（ＢＳＨ−０Ｒ−ＤＯＴＡ−64Ｃｕ）を、それぞれ収率０．６％で得た。
【００５９】
試験例１：腫瘍細胞の10Ｂ濃度測定
参考例１〜３で得られたホウ素化合物（参考例１（ＢＳＨ−Ｔｍｒ−１Ｒ：アルギニン１個）；参考例２（ＢＳＨ−Ｔｍｒ−２Ｒ：アルギニン２個）；参考例３（ＢＳＨ−Ｔｍｒ−３Ｒ：アルギニン３個））または対照としてペプチドを付加していないＢＳＨを用いてグリオーマ細胞Ｕ８７ΔＥＧＦＲへの10Ｂ導入を検討した。Ｕ８７ΔＥＧＦＲをφ３５ｍｍディッシュ中（ＢＤ）で２４時間培養後（２×１０5個細胞／ディッシュ)、培養液を、各ホウ素化合物を含む同量の培養液に置換した（終濃度１０μＭ）。設定した時間（１、２、４、１２、２４、４８、７２時間）経過後、培養液を除去し、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４、１ｍＬ）で２回洗浄した。各ディッシュに６１％（ｖ／ｖ）硝酸（ＨＮＯ3、ボロン測定グレード、和光純薬工業（株））を３００μＬ加え、室温で３０分間溶解させた。水を２．７ｍＬ加え、孔径０．２μｍのフィルター（Ｆ２５１３−１６、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）、ウォルサム、ＭＡ、米国）で異物を除去した。得られたサンプルに含まれる10Ｂ量、すなわち、細胞内10Ｂ濃度を誘導結合プラズマ発光分光分析装置（ＩＣＰ−ＡＥＳ、ＶＩＳＴＡ−ＰＲＯ、セイコーインスツル（株）、千葉）で測定した。結果を図１に示す。また、０．１、１μＭの各濃度で、参考例２のホウ素化合物（ＢＳＨ−Ｔｍｒ−２Ｒ）および参考例３のホウ素化合物（ＢＳＨ−Ｔｍｒ−３Ｒ）を使用して同様の実験を行い、２、１２、２４時間インキュベート後に同様の操作で10Ｂ濃度を測定した。結果をそれぞれ図２のＡおよびＢに上記１０μＭでの結果とあわせて示す。
【００６０】
図１より、アルギニンが２または３個連続したアミノ酸配列を有する参考例２のホウ素化合物および参考例３のホウ素化合物では10Ｂは細胞内に導入された。これらの細胞内10Ｂ濃度は経時的に増加しており、２４時間経過時の細胞内10Ｂ濃度は、それぞれ３５４．３±１５７．３、１７５７．５±２６１．２ｎｇ10Ｂ／１０6個細胞（ｎ＝４）であった。一方、対照のＢＳＨおよび参考例１のＢＳＨ−Ｔｍｒ−１Ｒでは10Ｂはごく少量しか細胞内に導入されておらず、２４時間での細胞内濃度はそれぞれ７４．２±９１．５、５７．１±５２．５ｎｇ10Ｂ／１０6個細胞（ｎ＝４）であった（図１）。
【００６１】
また、参考例２のＢＳＨ−Ｔｍｒ−２Ｒ、参考例３のＢＳＨ−Ｔｍｒ−３Ｒの低用量での実験では、２時間の時点では両ペプチド共に細胞内への導入は認められなかった。１２および２４時間の長時間の培養では導入が観測されたが、参考例３のＢＳＨ−Ｔｍｒ−３Ｒでの細胞内10Ｂ濃度は、それぞれ９０．１±７３．９、２４８．１±５１．０ｎｇ10Ｂ／１０6個細胞（ｎ＝４）であり、１０μＭにおける細胞内濃度、１７５７．５±２６１．２ｎｇ10Ｂ／１０6個細胞（ｎ＝４）と比較して有意に低かった（図２のＡおよびＢ）
【００６２】
試験例２：Ｕ８７ΔＥＧＦＲ細胞の免疫染色
Ｕ８７ΔＥＧＦＲをポリエチレンイミンでコートされたカバーグラス（旭硝子（株）、東京）上で２４時間培養後（１×１０4cells／ディッシュ）、培養液をＢＳＨ−ペプチド（ＢＳＨ−Ｔｍｒ−１Ｒ：アルギニン１個（参考例１）；ＢＳＨ−Ｔｍｒ−２Ｒ：アルギニン２個（参考例２）；ＢＳＨ−Ｔｍｒ−３Ｒ：アルギニン３個（参考例３））またはペプチドを付加していないＢＳＨを含む同量の培養液に置換した（終濃度１０μＭ）。２４時間後、培養液を除去し細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ、和光純薬工業（株））を加え、室温で３０分間細胞を固定した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４、１ｍＬ）で洗浄後、０．２５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００を加えた。それから、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロッキングし、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む抗ＢＳＨ抗体溶液（１μｇ／ｍＬ）にカバーグラスを室温で２時間浸した。洗浄後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ ４８８を標識したロバ製抗マウス製抗体（ライフテクノロジーズ、カールズバッド、ＣＡ、米国）溶液（２μｇ／ｍＬ）に室温で２時間浸した。洗浄後、ヘキスト３３３４２（（株）同仁化学研究所、熊本）で核染色し、プレパラートを作製後、共焦点レーザー顕微鏡（ＦｌｕｏＶｉｅｗ、オリンパス（株）、東京）でＢＳＨの細胞内局在を観察した。結果を図３に示す。
【００６３】
ＢＳＨは抗ＢＳＨ抗体（緑）にて免疫し、核染色（青）を追加した。共焦点レーザー顕微鏡にて観察したところ、ＢＳＨ−Ｔｍｒ−２Ｒ（参考例２）およびＢＳＨ−Ｔｍｒ−３Ｒ（参考例３）は細胞質領域および核内にＢＳＨの局在が認められた。また、ＢＳＨ−ペプチドに結合しているＴｍｒ（赤）も共局在していることより、ＢＳＨ−ペプチドが細胞内で分解されず安定していることを示している。一方、ＢＳＨおよびＢＳＨ−Ｔｍｒ−１Ｒ（参考例１）では、蛍光は観察されないか、観察されてもごく微量であったため、細胞内への導入は、ほとんどないと考えられた（図３）。
【００６４】
試験例３：細胞増殖アッセイ (Water-Soluble Tetrazolium: WST-1 assay)
実施例２のＢＳＨ−２Ｒ−ＤＯＴＡおよび実施例３のＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡならびにＢＳＨの毒性をＷＳＴ−１アッセイで評価した。Ｕ８７ΔＥＧＦＲを９６ウェルプレート（ＢＤ）中で２４時間培養後（５×１０3cells／ウェル）、培養液をＢＳＨ−２Ｒ−ＤＯＴＡ、ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡまたはＢＳＨを含む同量の培養液に置換した（終濃度１０、５０、１００、２００μＭ）。対照としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、同仁化学研究所）を使用した。２４時間後、Cell Proliferation Reagent WST-1（ロシュ、バーゼル、スイス）を１０μＬ／ウェル加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｅｎｔ ＸＳ、ＤＳファーマバイオメディカル、大阪）で各サンプルの吸光度（４５０ｎｍおよび６９０ｎｍ）を測定した。結果を図４に示す。
【００６５】
ＢＳＨ−２Ｒ−ＤＯＴＡ（実施例２）およびＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡ（実施例３）のいずれも、対照であるＤＭＳＯおよびＢＳＨと同程度の３．６〜３．９（ｎ＝４）の吸光度を示し（図４）、ＢＳＨ−２Ｒ−ＤＯＴＡ（実施例２）およびＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡ（実施例３）は共に、高濃度域においても、毒性を示さなかった。
【００６６】
試験例４：脳腫瘍モデルマウスでの10Ｂ生体内分布
本実験に関する動物の飼育、保管、使用は岡山大学動物実験委員会に承認された（承認番号:ＯＫＵ‐２０１３０５８）手順にしたがい当該技術分野において一般的な方法で行った。担がんモデルマウスは、ヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ／ｎｕ、メス、７〜９週齢、１６〜２０g、日本エスエルシー（株）、静岡）に、Ｕ８７ΔＥＧＦＲ細胞懸濁液（１×１０5個細胞／μＬ）３μＬを脳内に直接注入して作製した。１２日後、２００μＬの実施例２および３（ＢＳＨ−２Ｒ−ＤＯＴＡ、ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡ）の２種類およびＢＳＨ（２００ｎｍｏｌ／マウス）を尾静脈より投与した。
【００６７】
投与後、２４時間にてマウス脳を４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡでかん流固定後に摘出し、３０％（ｗ／ｖ）スクロース（和光純薬工業（株））で脱水した。脳を凍結後、１０μｍの厚さに裁断し、凍結切片を作製した。Ｍ．Ｏ．Ｍ．キット（ベクターラボラトリーズ（VECTOR LABORATORIES）、バーリンゲーム、ＣＡ、米国）を用いてマウスＩｇＧをブロッキングし、洗浄後、０．３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む抗ＢＳＨ抗体（１μｇ／ｍＬ）および抗ＨＬＡ−Ａ抗体溶液に室温で２時間浸した。洗浄後、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５を標識したロバ抗マウス抗体（ライフテクノロジーズ）およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８を標識したヤギ抗ラビット抗体（ライフテクノロジーズ）溶液（２μｇ／ｍＬ）に室温で２時間浸した。洗浄後、ヘキスト３３３４２で核染色し、プレパラートを作製後、共焦点レーザー顕微鏡でＢＳＨの局在を観察した。結果を図５Ａに、そして図５Ａの実施例３に関する図を高倍率で確認したものを図５Ｂに示す。
【００６８】
ＢＳＨ-ペプチドを抗ＢＳＨ抗体（赤）、マウス脳内へ移植したヒトグリオーマ細胞を抗ＨＬＡ−Ａ抗体（緑）にて染色し、核染色（青）を追加した。共焦点レーザー顕微鏡による脳内ＢＳＨ局在の観察により、低倍率では、ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡ、ＢＳＨ−２Ｒ−ＤＯＴＡは腫瘍部で局在が観察され、正常部ではほとんど認められなかった（図５Ａ）。特にＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡでは強く腫瘍内部に局在が確認された。高倍率においては、ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡは、腫瘍中心部および辺縁部ともに腫瘍細胞内部にＢＳＨの局在が確認された（図５Ｂ）。細胞内部の局在を見たところ、細胞質領域では、ＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡの導入が確認されたが、核への共局在はわずかにみられるだけであった（図５Ｂ）。
【００６９】
また、実施例２および３のホウ素化合物投与後、６、１２、２４、４８時間で腫瘍、正常脳、血液、肝臓、腎臓を摘出した。各組織を６１％（ｖ／ｖ）硝酸２ｍＬ中で９０℃、１．５時間温浸し、その後水を３ｍＬ加えた。孔径０．２μｍのフィルター（Ｆ２５１３−１６、サーモフィッシャーサイエンティフィック）で異物を除去し、ＩＣＰ−ＡＥＳで10Ｂ濃度を測定した。結果を図６に示す。
【００７０】
実施例３および実施例２のいずれのホウ素化合物も腫瘍への取り込み量は他の組織と比較して高く、投与後６時間で実施例３および実施例２ならびに対照のＢＳＨは、それぞれ２．４１±１．９３、２．２３±０．６８、１．５０±０．３２μｇ10Ｂ／ｇ組織（ｎ＝３）であった（図６のＡ〜Ｃ）。一方で、実施例３のホウ素化合物は、腫瘍以外の組織の10Ｂ濃度が特に低く、投与後１２時間での正常脳および血液中の10Ｂ濃度はそれぞれ、０．４８±０．１５、０．６４±０．０５μｇ10Ｂ／ｇ組織（ｎ＝３）であった（図６のＡ）。腫瘍の10Ｂ濃度３．３９±２．１９μｇ10Ｂ／ｇ組織（ｎ＝３）との比率（腫瘍／正常脳：Ｔ／Ｎ、腫瘍／血液：Ｔ／Ｂ）は、それぞれ７．１、５．３であった。
【００７１】
試験例５：ＰＥＴイメージングおよびＲＩ生体内分布測定
本実験に関する動物の飼育、保管、使用は、岡山大学動物実験委員会に承認された（承認番号：ＯＫＵ−２０１３３１４）手順にしたがい行った。
【００７２】
試験例４と同様にして担がんモデルマウスを作製した。担がんモデルマウスに、実施例４および５で得られた各64Ｃｕ標識ホウ素化合物を尾静脈より投与し（各ｎ＝４）、投与後６、１２、２４時間での体内薬物動態を小動物用ＰＥＴカメラ装置（Ｃｌａｉｒｖｉｖｏ、島津製作所、京都）で撮影した。断層写真を図７に、ＰＥＴから算出した腫瘍、正常脳、血液・心臓における放射能濃度を図８に示す。ＰＥＴイメージングから算出するＴ／Ｎ比は、腫瘍部全体と、それに対応する正常部の比をとったものであり、Ｔ／Ｂ比は、血液を設定することができないため、腫瘍／心臓比をとったものである。
【００７３】
実施例４のホウ素化合物は、腫瘍に選択的に取り込まれており、正常脳組織への取り込みは少ない（図７のＡおよびＣ）。一方、実施例５のホウ素化合物では、腫瘍への取り込みもわずかである（図７のＢおよびＤ）。腫瘍での放射能濃度は経時的に増加しており２４時間でそれぞれ、２．９７±０．１５、２．２５±０．３６％ＩＤ／ｃｃ（ＩＤ：注入量）であった（図８のＡおよびＢ）。実施例４のホウ素化合物の正常脳および血液・心臓の放射能濃度は、投与後２４時間で１．０７±０．２６、２．４６±０．３８％ＩＤ／ｃｃ（図８のＡ）であり、Ｔ／Ｎ：２．８、Ｔ／Ｂ（腫瘍／（血液・心臓））：１．２であった。
【００７４】
ここで、64Ｃｕのドープ前の試験例４のＢＳＨ−３Ｒ−ＤＯＴＡおよびＢＳＨのＩＣＰ実測値のＴ／Ｎ比およびＴ／Ｂ比と本試験のＰＥＴイメージング値によるＴ／Ｎ比およびＴ／Ｂ比を、投与後２４時間で比較した結果を表１に示す。
【００７５】
【表１】
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【００７６】
表１より、腫瘍モデルの組織から得た実測値と、ＰＥＴイメージングにより得られた値が近い値を示しており、本発明のＰＥＴプローブが薬物動態を見る上で、非常に正確かつ有用な核種であることを示している。
【００７７】
また、64Ｃｕ標識ホウ素化合物投与後、６、１２、２４および４８時間にて、腫瘍、正常脳、血液、肝臓、腎臓を摘出し、64Ｃｕの体内分布を各組織に含まれる放射能濃度をガンマカウンタ測定することにより確認した。結果を図９に示す。
【００７８】
実施例４および５のホウ素化合物は、双方とも腫瘍中の濃度は他の組織と比較して高く、投与後２４時間でそれぞれ３．７４±２．７５、２．９２±１．１３％ＩＤ／ｇ組織（ｎ＝４）であった（図９）。また、実施例４のホウ素化合物では、正常脳および血液中の濃度は低く、投与後２４時間でそれぞれ、０．４６±０．１４、１．９３±０．４３％ＩＤ／ｇ組織（ｎ＝４）であり、Ｔ／Ｎ：８．１、Ｔ／Ｂ：２．０であった。
【００７９】
上述したように、ＰＥＴイメージングの結果では、実施例４のＴ／ＮおよびＴ／Ｂは、それぞれ２．８および１．２と、組織を直接測定した実測値とは異なるものであるが、これは、ＰＥＴ画像では、中心部のみならず、平均化された周囲も含めて算出しているために値が小さく出るものであること、および実測では測定に用いる採取部による誤差が含まれるためであると考えられる。
【００８０】
また、18Ｆ−ＢＰＡの研究では、低分子化合物であることから、投与直後から腎臓に集積し始め、投与後数時間で体内から排出され、正常脳組織への送達は少なく、Ｔ／Ｎは３〜４程度である。本発明のＰＥＴイメージングにおけるＴ／Ｎは、18Ｆ−ＢＰＡと同等または下回っているが、治療には有効に用いられる程度のものである。また、肝臓の64Ｃｕ濃度は、10Ｂの結果と大きく異なる。ＢＳＨの体内動態をＩＣＰ−ＡＥＳで調べた研究では、静脈から投与直後は肝臓腎臓に多く集積するが、数時間後には腎臓への集積が大半となり、尿中への排泄が９５％以上であることが報告されている。このことは、本願試験例４においても腫瘍以外の臓器にはほとんど集積していないことから、本発明のホウ素化合物やＰＥＴプローブにも当てはまるものと考えられる。したがって、試験例５における、64Ｃｕの肝臓への集積は、腫瘍などに集積した本発明のＰＥＴプローブから、酵素やｐＨ変化の影響により64Ｃｕが脱離し、肝臓に集積したものと考えられるが、このレベルの配位力は治療に十分に用いることができる程度である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図３】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図７】
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