(57)【要約】【課題】皮膚型リーシュマニア症を採血と比べて非侵襲的な手段で、簡便、迅速、かつ高い精度で診断することができる皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット、及び前記皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用いた皮膚型リーシュマニア症の検査方法を提供すること。【解決手段】リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを含み、皮膚試験によりＩ型アレルギー反応の有無を検査するために用いられる皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット、及び前記皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用い、非ヒト動物の皮膚にリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる工程を含む皮膚型リーシュマニア症の検査方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを含み、
皮膚試験によりＩ型アレルギー反応の有無を検査するために用いられることを特徴とする皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット。
【請求項２】
皮膚試験が貼付試験である請求項１に記載の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット。
【請求項３】
ペルオキシレドキシンが、組換えペルオキシレドキシンである請求項１から２のいずれかに記載の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用い、非ヒト動物の皮膚にリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる工程を含むことを特徴とする皮膚型リーシュマニア症の検査方法。
【請求項５】
ペルオキシレドキシンが、組換えペルオキシレドキシンである請求項４に記載の皮膚型リーシュマニア症の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット、及び皮膚型リーシュマニア症の検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リーシュマニア症は、リーシュマニア原虫に感染することを原因として発症する感染症である。リーシュマニア症は、熱帯から亜熱帯に至る世界８８カ国に蔓延しており、３億５千万人が常時その感染の危機に曝されている。
【０００３】
リーシュマニア原虫の形態は、鞭毛を有するプロマスティゴートと、鞭毛を有さないアマスティゴートとがある。リーシュマニア原虫は、サシチョウバエの中腸内でプロマスティゴートとして生育し、サシチョウバエが吸血することにより脊椎動物宿主内に入ったプロマスティゴートは、マクロファージ内でアマスティゴートとなり増殖する。宿主にはヒトのほか、イヌやげっ歯類も含まれる。したがって、リーシュマニア症は、人獣共通感染症であり、媒介昆虫性感染症である。
【０００４】
リーシュマニア症はその病型から、皮膚型リーシュマニア症、内蔵型リーシュマニア症に大別される。皮膚型リーシュマニア症は年間１００万人〜１５０万人、内蔵型リーシュマニア症は年間５０万人の新規患者が発生しているとされている。
【０００５】
皮膚型リーシュマニア症を引き起こす主な原虫種としては、旧大陸における皮膚型リーシュマニア症では、Ｌ． ｍａｊｏｒなどのＬ． ｍａｊｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘが知られており、新大陸における皮膚型リーシュマニア症では、Ｌ． ｍｅｘｉｃａｎａなどのＬ． ｍｅｘｉｃａｎａ  ｃｏｍｐｌｅｘが知られている。
皮膚型リーシュマニア症では、サシチョウバエに吸血された部分に皮膚病変が形成される。
皮膚型リーシュマニア症は、単独で死に至ることはないものの、患者の分布が広く、また患者数が多いという問題がある。
【０００６】
これまでにリーシュマニア症に対する治療薬として有用な抗リーシュマニア薬が提案されている（例えば、特許文献１〜２参照）。
しかしながら、リーシュマニア症などの原虫病のコントロールには、診断、治療、及び予防の全てが重要であり、リーシュマニア症を採血と比べて非侵襲的な手段で、簡便、迅速、かつ高い精度で診断することができる検査方法の速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０５３４０８号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０５３２３２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、皮膚型リーシュマニア症を採血と比べて非侵襲的な手段で、簡便、迅速、かつ高い精度で診断することができる皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット、及び前記皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用いた皮膚型リーシュマニア症の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞  リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを含み、
皮膚試験によりＩ型アレルギー反応の有無を検査するために用いられることを特徴とする皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットである。
＜２＞  前記＜１＞に記載の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用い、非ヒト動物の皮膚にリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる工程を含むことを特徴とする皮膚型リーシュマニア症の検査方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、皮膚型リーシュマニア症を採血と比べて非侵襲的な手段で、簡便、迅速、かつ高い精度で診断することができる皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット、及び前記皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用いた皮膚型リーシュマニア症の検査方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、試験例１のウエスタンブロッティングの結果を示す図である。
【図２】図２は、試験例２のＥＬＩＳＡ法の結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例３におけるリーシュマニア原虫の粗抗原を接種したラットの結果を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例３における組換えペルオキシレドキシンを接種したラットの結果を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例４の各試料を接種した部分を説明する図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例４のエバンスブルーを接種し、５分間後のマウスの状態を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、試験例４のマウスの背側の皮膚を裏返しにした状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキット）
本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットは、リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを含み、必要に応じて更にその他の構成を含む。
前記リーシュマニア症の検査用試薬又はキットは、皮膚試験によりＩ型アレルギー反応の有無を検査するために用いられる。
前記Ｉ型アレルギー反応とは、ＩｇＥ抗体が関与する即時型のアレルギー反応である。
【００１３】
＜皮膚試験＞
前記皮膚試験としては、Ｉ型アレルギー反応の有無を検査することができる限り、特に制限はなく、公知の皮膚試験を目的に応じて適宜選択することができ、例えば、貼付試験（以下、「パッチテスト」と称することがある）、プリックテスト、スクラッチテスト、皮内テストなどが挙げられる。これらの中でも、より簡便である点で、パッチテストが好ましい。
【００１４】
＜リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれか＞
前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンは、皮膚試験による皮膚型リーシュマニア症に感染しているか否かを検査するための抗原として用いられる。
前記リーシュマニア症の検査用試薬又はキットは、リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンのうち、リーシュマニア原虫の粗抗原のみを含んでいてもよいし、ペルオキシレドキシンのみを含んでいてもよいし、両者を含んでいてもよい。
【００１５】
＜＜リーシュマニア原虫の粗抗原＞＞
前記リーシュマニア原虫の粗抗原は、リーシュマニア原虫由来の成分を含むものである。
前記リーシュマニア原虫の粗抗原の調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、凍結したリーシュマニア原虫を、凍結融解を行った後、超音波破砕を行い、破砕液を遠心分離して得られた上清をリーシュマニア原虫の粗抗原とすることができる。
【００１６】
前記リーシュマニア原虫としては、皮膚型リーシュマニア症を引き起こす原虫であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍｅｘｉｃａｎａなどが挙げられる。
前記リーシュマニア原虫の形態は、プロマスティゴートであってもよいし、アマスティゴートであってもよい。
【００１７】
前記凍結融解の回数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、６回とすることができる。
【００１８】
前記超音波破砕の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、氷上で、１０秒間ごとに１０秒間の超音波破砕を１分間行うなどが挙げられる。
【００１９】
前記遠心分離の条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、１０，０００×ｇで３０分間などが挙げられる。
【００２０】
＜＜ペルオキシレドキシン＞＞
前記ペルオキシレドキシンは、リーシュマニア原虫が産生するタンパク質である。ペルオキシレドキシンは、後述の試験例で示すように、単一の抗原で顕著なアレルギー反応を起こすため、皮膚試験による皮膚型リーシュマニア症の検査に有用な抗原である。
【００２１】
前記ペルオキシレドキシンは、前記リーシュマニア原虫が産生するペルオキシレドキシンを精製したものを使用してもよいし、組換えペルオキシレドキシンを使用してもよいが、安全性の観点から、組換えペルオキシレドキシンが好ましい。
【００２２】
前記リーシュマニア原虫が産生するペルオキシレドキシンを精製する方法としては、特に制限はなく、公知の精製方法を適宜選択することができる。
前記組換えペルオキシレドキシンを作製する方法としても、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択することができ、例えば、後述する製造例に示すように、ペルオキシレドキシンをコードする核酸を含むベクターを導入した大腸菌などを用いて作製することができる。
【００２３】
前記リーシュマニア原虫が産生するペルオキシレドキシンをコードする塩基配列情報は、公共のデータベースを通じて容易に入手することができる。
例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）では、Ｌ． ｍａｊｏｒが産生するペルオキシレドキシンをコードする塩基配列は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．：  ＸＭ＿００１６８１９７４．１として登録されており、Ｌ． ｍｅｘｉｃａｎａが産生するペルオキシレドキシンをコードする塩基配列は、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．：  ＸＭ＿００３８７３５８１．１として登録されている。
【００２４】
前記リーシュマニア原虫が産生するペルオキシレドキシンのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
【００２５】
前記ペルオキシレドキシンのアミノ酸配列は、本発明の効果を損なわない限り、そのアミノ酸配列の一部に変異を有していてもよい。前記変異としては、欠失、置換、挿入などが挙げられる。
前記ペルオキシレドキシンは、エピトープのみからなる態様であってもよいし、エピトープの反復配列とした態様であってもよい。また、前記ペルオキシレドキシンは、キャリアタンパク質に結合した態様であってもよい。
【００２６】
前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水溶液の態様などが挙げられる。
【００２７】
前記皮膚試験における前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかの使用量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００２８】
＜その他の構成＞
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、パッチテスト用素材、皮膚洗浄用アルコール、対照用生理食塩水、注射針、木綿針、キットの使用説明書などが挙げられる。
前記パッチテスト用素材としては、特に制限はなく、公知のものを適宜選択することができ、例えば、絆創膏などが挙げられる。
【００２９】
＜対象＞
前記皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットが対象とする種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、イヌなどが挙げられる。
【００３０】
前記皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットは、後述する本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査方法に好適に用いることができる。
【００３１】
（皮膚型リーシュマニア症の検査方法）
本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査方法は、本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用いる。
前記皮膚型リーシュマニア症の検査方法は、非ヒト動物の皮膚にリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる工程（以下、「接触工程」と称することがある）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含む。
【００３２】
＜接触工程＞
前記接触工程は、非ヒト動物の皮膚にリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる工程である。
【００３３】
＜＜非ヒト動物＞＞
前記非ヒト動物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イヌなどが挙げられる。
【００３４】
＜＜リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれか＞＞
前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかは、上述した本発明のリーシュマニア症の検査用試薬又はキットの項目に記載したものと同様である。
【００３５】
前記非ヒト動物の皮膚にリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる方法としては、特に制限はなく、公知の皮膚試験の方法を適宜選択することができる。
前記パッチテストにより検査する場合には、例えば、前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを滴下又は塗布した絆創膏を皮膚に貼り付ける方法などが挙げられる。
前記プリックテスト、又はスクラッチテストにより検査する場合には、例えば、アルコール綿で洗浄した皮膚にわずかに血液が滲む程度に注射針又は木綿針を刺した後、前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを含む液を滴下する方法などが挙げられる。
前記皮内テストにより検査する場合には、例えば、前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを含む液を注射により皮内に接種する方法などが挙げられる。
【００３６】
前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる部位としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、背部、耳、上腕内側、前腕屈側などが挙げられる。前記接触させる部位は、１箇所であってもよいし、複数箇所であってもよい。
【００３７】
前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを皮膚に接触させる時間としては、Ｉ型アレルギー反応の有無を確認することができる限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記Ｉ型アレルギー反応は、前記リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを皮膚に接触させた後、通常、１０分間〜４０分間程度で確認することができる。
【００３８】
＜その他の工程＞
前記その他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、評価工程を含むことが好ましい。
【００３９】
＜＜評価工程＞＞
前記評価工程は、前記接触工程を行った後に、皮膚に変化が生じているか否かを調べ、リーシュマニア症に感染しているか否かを評価する工程である。
【００４０】
前記パッチテストにより検査を行った場合には、例えば、国際皮膚接触炎研究班による判定基準により評価することができ、何も反応がなければ陰性（リーシュマニア症に感染していない）と評価し、絆創膏のリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを滴下又は塗布した部分に紅班や浮腫が出ている場合には陽性（リーシュマニア症に感染している）と評価することができる。
【００４１】
前記プリックテスト、又はスクラッチテストにより検査を行った場合には、例えば、何も反応がなければ陰性と評価し、発赤で１５ｍｍ以上の場合や、膨疹で４ｍｍ以上の場合には陽性と評価することができる。
【００４２】
前記皮内テストにより検査を行った場合には、例えば、何も反応がなければ陰性と評価し、発赤で２０ｍｍ以上の場合や、膨疹で９ｍｍ以上の場合には陽性と評価することができる。
【００４３】
なお、本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットは、ヒトを対象とする皮膚型リーシュマニア症の検査方法にも用いることができる。前記ヒトを対象とする皮膚型リーシュマニア症の検査方法は、上述した本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査方法における非ヒト動物をヒトとする以外は、同様にして行うことができる。
【００４４】
また、本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットは、ヒトを含む動物における皮膚型リーシュマニア症の感染の有無の診断を補助するために用いることもできる。即ち、本発明は、ヒトを含む動物における皮膚型リーシュマニア症の感染の有無の診断を補助するための方法にも関する。
前記ヒトを含む動物における皮膚型リーシュマニア症の感染の有無の診断を補助するための方法は、本発明の皮膚型リーシュマニア症の検査方法と同様にして行うことができる。
【実施例】
【００４５】
以下に試験例、製造例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの試験例、製造例に何ら限定されるものではない。
【００４６】
（試験例１：ＩｇＥ抗体が認識する原虫抗原の検討）
＜原虫粗抗原の調製＞
リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原（以下、「ＳＬＡ」と称することがある）を以下のようにして調製した。
定常（Ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ）期のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ培養プロマスティゴート（ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）をフラスコより回収し、ＰＢＳ（−）（ｐＨ  ７．２）で３回洗浄した後、１ｍＬのＰＢＳ（−）で懸濁し、−８０℃で凍結した。凍結融解を６回繰り返した後、Ｂｉｏｒｕｐｔｕｒｅ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（コスモ・バイオ株式会社製）を用いて、懸濁液を氷上で１０秒間ごとに１０秒間の超音波破砕を１分間行った。破砕液を１つのチューブにまとめ、１０，０００×ｇで３０分間遠心した。上清を回収し、リーシュマニア原虫の粗抗原とした。
ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ社製）をスタンダードとして、ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で前記粗抗原のタンパク質濃度を計測した後、−８０℃で凍結保存した。
【００４７】
＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング＞
前記ＳＬＡについて、以下のようにしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
前記粗抗原をＳＤＳサンプルバッファー（１％  ＳＤＳ、  ５％  メルカプトエタノール、  １０％  グリセロール、  ０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ６．８、  １０％  ブロモフェノールブルー）で懸濁し、１００℃で５分間加熱した後、０．１％  ＳＤＳ／１０％  ポリアクリルアミドゲル上に１レーンあたり１０μＬずつ注いだ。ＢＥ−２３０又はＢＥ−２４０  ｇｅｌ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｃｒａｆｔ社製）を用いて３０ｍＡの定電流で６５分間泳動した。
【００４８】
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、以下のようにして、ウエスタンブロッティングを行った。結果を図１に示す。
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−ＰＶＤＦ、  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）に定電圧２５ｍＶで１時間転写した後、４％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅに浸して４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−Ｔで１０分間ずつ３回洗浄した後、膜を細分化した。
マウスの血清サンプルを、０．４％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＰＢＳ−Ｔで２，０００倍（ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ用）又は５００倍（ＩｇＥ用）に希釈した。
膜を希釈した血清中でそれぞれ２時間室温放置した後、１０分間ずつＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。抗体は、ＨＲＰ標識のヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）抗体、抗ＩｇＧ１（γ１特異的）抗体、抗ＩｇＧ２ａ（γ２ａ特異的）抗体、抗ＩｇＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃ社製）を用いて検出した。抗ＩｇＥ抗体は０．４％  Ｂｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＰＢＳ−Ｔで１，０００倍希釈、その他の抗体は５，０００倍に希釈した。
膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＥＣＬ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）で可視化し、ＬＡＳ−３０００  ｍｉｎｉ（富士フイルム株式会社製）で解析した。
なお、前記ウエスタンブロッティングに用いた抗体は、以下の通りである。
［一次抗体］
・  Ｌ． ｍａｊｏｒを感染させ、１６週間後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清。
［二次抗体］
・  抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）製）
・  抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）製）
・  抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）製）
・  抗マウスＩｇＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）製）
【００４９】
図１中、Ｍはマーカーを示し、Ｇは二次抗体として抗マウスＩｇＧ抗体を用いた場合の結果を示し、Ｇ２ａは二次抗体として抗マウスＩｇＧ２ａ抗体を用いた場合の結果を示し、Ｇ１は二次抗体として抗マウスＩｇＧ１抗体を用いた場合の結果を示し、Ｅは二次抗体として抗マウスＩｇＥ抗体を用いた場合の結果を示す。
図１の結果から、二次抗体として抗マウスＩｇＥ抗体を用いた場合には、１８ｋＤａ、２１ｋＤａ、２２ｋＤａ、２３ｋＤａのバンドが検出された。
【００５０】
二次抗体として抗マウスＩｇＥ抗体を用いた場合に検出されたバンドの一部は、リーシュマニア原虫のタンパク質であるペルオキシレドキシン（以下、「Ｐｒｘ」と称することがある）に対するモノクローナル抗体が反応するバンドと一致していた。
【００５１】
（製造例１：組換えペルオキシレドキシンの製造）
Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒのペルオキシレドキシン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．：  ＸＭ＿００１６８１９７４．１）をコードする塩基配列は、以下のプライマーを用い、Ｌ． ｍａｊｏｒ  Ｆｒｉｅｄｌｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲクローニングにより得た。前記ＰＣＲクローニングの増幅産物をＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＥＴ−２８ａ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，  ＵＳＡ）にライゲーションし、インサートを配列決定した。
［プライマー］
フォワード：
５’−ｔｔａｃａｔａｔｇｔｃｃｔｇｃｇｇｔａａｃｇｃｃａａｇ−３’（配列番号：２）
リバース：
５’−ｔｔａａａｇｃｔｔｔｔａｃｔｇｃｔｔｇｃｔｇａａｇｔａｔｃ−３’（配列番号：３）
【００５２】
組換えタンパクを発現させるために、前記ベクターをＥ． ｃｏｌｉ  ＲｏｓｅｔｔａＴＭ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製，  ＵＳＡ）に移入した。前記Ｅ． ｃｏｌｉは、５０μｇ／ｍＬ  カナマイシン及び３４μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコールを添加したＳＯＢ培地で培養した。
【００５３】
組換えタンパクの発現は、最終濃度０．５  ｍＭ  イソプロピル  β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導し、３時間後、前記Ｅ． ｃｏｌｉを２，０００ｇ、２０分間の遠心により回収した。
【００５４】
前記回収物（ペレット）を溶解バッファー（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、  ｐＨ  ８．０）で再懸濁し、Ｂｒａｎｓｏｎ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社製，  ＵＳＡ）を用いて超音波処理により溶解した。
【００５５】
次いで、１０，０００ｇ、３０分間の遠心を行った後、上清中に溶解した組換えタンパク質は、Ｎｉ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  （ＮＴＡ）  ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ社製，  ＵＳＡ）を用い、製品のプロトコールに沿って精製を行った。前記Ｎｉ−ＮＴＡ  ｒｅｓｉｎを用いた精製は、４回繰り返した。
【００５６】
その後、組換えタンパク質を含む抽出画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で２回透析した。透析したタンパク質は、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ  ｓｕｐｐｏｒｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，  ＵＳＡ）でインキュベーションし、Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製，  ＵＳＡ）に加えた。組換えタンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）とＮａＣｌの濃度勾配により抽出し、組換えタンパク質を含む抽出画分をプールし、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で４回透析後、Ａｍｉｃｏｎ  ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｄｅｖｉｃｅ（Ａｍｉｃｏｎ社製，  ＵＳＡ）を用いて濃縮し、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＰ  ０．２２μｍ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製，  ＵＳＡ）でフィルター滅菌した。
【００５７】
組換えタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色により評価し、組換えタンパク質の濃度は、ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎを標準とし、ＤＣ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（ＵＳＡ）製）により測定した。組換えタンパク質は、−８０℃で保管した。
なお、組換えタンパク質（以下、「組換えペルオキシレドキシン」、「ｒＰｒｘ」と称することがある）のアミノ酸配列は、配列番号：１に示す通りである。
【００５８】
（試験例２：ｒＰｒｘに対するＩｇＥ抗体の検出）
抗原として、前記試験例１と同様にして調製したリーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原（ＳＬＡ）、又は前記製造例１で製造した組換えペルオキシレドキシンを用い、一次抗体として、Ｌ． ｍａｊｏｒを感染させ、１６週間後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清、又はＬ． ｍａｊｏｒに感染していないＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を用い、以下のようにして、ＥＬＩＳＡ法を行った。結果を図２に示す。
９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）に１ウェルあたり前記粗抗原  １μｇを含む０．１Ｍの炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．６）１００μＬ、又は組換えペルオキシレドキシン  ２００ｎｇを加え、４℃で一晩静置した。前記粗抗原、又は組換えペルオキシレドキシンを取り除いた後、Ｎｕｎｃ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｗａｓｈｅｒを用い、０．０５％のＰＢＳ−Ｔを含むリン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄した。１％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＰＢＳ−Ｔ  ２００μＬを加え、室温で１時間静置した。
０．４％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＰＢＳ−Ｔで１００倍希釈したマウス血清サンプルを１ウェルあたり１００μＬずつ加え、室温で１時間静置した。
ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、０．４％のＢｌｏｃｋ  Ａｃｅを含むＰＢＳ−Ｔで２，０００倍希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＥ抗体を二次抗体として加え、室温で１時間静置した。
ＩｇＥを検出するために、０．０１％の過酸化水素を含むｏ−フェニレンジアミン（１ｍｇ／ｍＬ）を１００μＬずつそれぞれのウェルに添加し、室温の遮光したチャンバーの中で一時間静置した。６規定の硫酸をそれぞれのウェルに２０μＬずつ添加し、反応を停止させた。ＥＬＩＳＡ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５９】
図２中、ＳＬＡはリーシュマニア原虫の粗抗原を用いた場合の結果を示し、ｒＰｒｘは組換えペルオキシレドキシンを用いた場合の結果を示し、Ｌ．  ｍａｊｏｒ−ｉｎｆｅｃｔｅｄはＬ． ｍａｊｏｒを感染させ、１６週間後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を用いた場合の結果を示し、ＮａｉｖｅはＬ． ｍａｊｏｒに感染していないＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を用いた場合の結果を示す。データは、ＯＤ値の平均を示し、バーはＯＤ値の標準偏差を示す（ｎ＝４）。
図２の結果から、Ｌ． ｍａｊｏｒを感染させ、１６週間後のＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中に、組換えペルオキシレドキシンに対するＩｇＥ抗体が検出された。
【００６０】
（試験例３：ＰＣＡ（Ｐａｓｓｉｖｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ）反応）
リーシュマニア原虫粗抗原又は組換えペルオキシレドキシンと、ＩｇＥ抗体との反応により、ｉｎ  ｖｉｖｏでアレルギー反応が生じるか否かを検討するために、ＰＣＡ反応を行った。
【００６１】
−試料−
以下の試料を用意した。
・  前記試験例１と同様にして調製したリーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原（ＳＬＡ）
・  前記製造例１で製造した組換えペルオキシレドキシン
・  Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清
・  Ｌ． ｍａｊｏｒに感染していないＢＡＬＢ／ｃマウスの血清
・  ＰＢＳ（−）溶液
・  Ｃ１１Ｃ（Ｌ． ｍａｊｏｒのアマスティゴート及びプロマスティゴートの両者に反応するモノクローナル抗体（国立大学法人  東京大学  農学生命科学研究科  応用免疫学講座  応用免疫学教室で作製）
・  Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清から分離したＩｇＧ抗体（国立大学法人  東京大学  農学生命科学研究科  応用免疫学講座  応用免疫学教室で調製）
・  ＲＡＧ２−／−マウス（国立大学法人  東京大学  農学生命科学研究科  応用免疫学講座  応用免疫学教室で維持繁殖している）
【００６２】
Ｗｉｓｔｅｒラットの皮内に、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清（２倍希釈、１０倍希釈、５０倍希釈、２５０倍希釈、１，２５０倍希釈、６，２５０倍希釈、３１，２５０倍希釈、又は１５６，２５０倍希釈）、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染していないＢＡＬＢ／ｃマウスの血清（２倍希釈、１０倍希釈、５０倍希釈、２５０倍希釈、１，２５０倍希釈、６，２５０倍希釈、又は３１，２５０倍希釈）、ＰＢＳ（−）溶液、Ｃ１１Ｃ（５０μｇ）、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清から分離したＩｇＧ抗体（１００μｇ）、又はＲＡＧ２−／−マウスの血清を１００μＬ接種した。
【００６３】
前記接種の４８時間後に、ラットの尾根部から、リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原（１ｍｇ）又は組換えペルオキシレドキシン（２００μｇ）を１質量％のエバンスブルー（青色色素）とともに接種した。
【００６４】
前記接種の３０分間後にラットを屠殺した。背側の皮膚を裏返しにし、アナフィラキシーを調べた。結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。
【００６５】
図３Ａは、リーシュマニア原虫の粗抗原を接種したラットの結果を示し、図３Ｂは、組換えペルオキシレドキシンを接種したラットの結果を示す。
各図中、右側の図は、ラットの皮膚の状態を示す図である。
各図中、左側の図は、前記右側の図において、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染していないＢＡＬＢ／ｃマウスの血清、ＰＢＳ（−）溶液、Ｃ１１Ｃ、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清から分離したＩｇＧ抗体、又はＲＡＧ２−／−マウスの血清を接種した部分を説明する図である。各図中、Ｎは、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染していないＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を接種した部分を示し、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、及びＳ４は、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を接種した部分を示し、ＰＢＳ（−）はＰＢＳ（−）溶液を接種した部分を示し、Ｃ１１ＣはＣ１１Ｃを接種した部分を示し、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ＩｇＧは、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清から分離したＩｇＧ抗体を接種した部分を示し、ＲＡＧ２−／−はＲＡＧ２−／−マウスの血清を接種した部分を示す。また、１：２は２倍希釈を示し、１：１０は１０倍希釈を示し、１：５０は５０倍希釈を示し、１：２５０は２５０倍希釈を示し、１：１２５０は１，２５０倍希釈を示し、１：６２５０は６，２５０倍希釈を示し、１：３１２５０は３１，２５０倍希釈を示し、１：１５６２５０は１５６，２５０倍希釈を示す。
【００６６】
図３Ａ及び図３Ｂの結果から、Ｌ． ｍａｊｏｒに感染しているＢＡＬＢ／ｃマウスの血清を接種した部分が青色に染まっており、エバンスブルーの血管外滲出が見られた。これは、ＳＬＡ及び組換えペルオキシレドキシンがマスト細胞表面に結合した感染マウス血清由来のＩｇＥ抗体と反応することによりアレルギー反応を引き起こし、血管透過性の亢進が起こったためと考えられる。なお、アレルギー反応は、リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原又は組換えペルオキシレドキシンを接種した５分間後に生じていた。
【００６７】
（試験例４：アレルギー反応）
試験例３の結果から、リーシュマニア原虫粗抗原又は組換えペルオキシレドキシンと、ＩｇＥ抗体とが反応することにより、アレルギー反応が引き起こされることが示されたので、Ｌ． ｍａｊｏｒ感染マウスを用い、リーシュマニア原虫粗抗原又は組換えペルオキシレドキシンの接種によりアレルギー反応が生じるか否かを検討した。
【００６８】
−試料−
以下の試料を用意した。
・  前記試験例１と同様にして調製したリーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原（ＳＬＡ）
・  前記製造例１で製造した組換えペルオキシレドキシン
・  ＰＢＳ溶液
・  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
【００６９】
Ｌ． ｍａｊｏｒを感染させ、１０週間後のＢＡＬＢ／ｃマウスの背側の皮膚又は耳に、リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原（背側の皮膚：５０μｇ、耳：２０μｇ）、ＢＳＡ（背側の皮膚：５０μｇ、耳：２０μｇ）、組換えペルオキシレドキシン（背側の皮膚：５０μｇ）、又はＰＢＳ溶液を皮内接種した。
【００７０】
前記接種の後、マウスの尾根部から、１質量％のエバンスブルーを接種した。前記エバンスブルーを接種し、５分間後の状態を図４Ｂに示す。
【００７１】
前記エバンスブルーの接種の３０分間後にマウスを屠殺した。背側の皮膚を裏返しにし、アナフィラキシーを調べた。結果を図４Ｃに示す。
【００７２】
図４Ａは、リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原、ＢＳＡ、組換えペルオキシレドキシン、又はＰＢＳ溶液を接種した部分を示す。
図４Ａ〜図４Ｃ中、ＢＳＡは、ＢＳＡを接種した部分を示し、ＳＬＡは、リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原を接種した部分を示し、ＰＢＳは、ＰＢＳ溶液を接種した部分を示し、ｒＰｒｘは、組換えペルオキシレドキシンを接種した部分を示す。
【００７３】
図４Ｂ及び図４Ｃの結果から、リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原と同様に、組換えペルオキシレドキシンを接種した部分の皮膚が青色に染まっており、エバンスブルーの血管外滲出が見られた。したがって、リーシュマニア原虫（Ｌ． ｍａｊｏｒ）の粗抗原と同様に、組換えペルオキシレドキシンによって、アレルギー反応が生じたと考えられた。
【００７４】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜１＞  リーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを含み、
皮膚試験によりＩ型アレルギー反応の有無を検査するために用いられることを特徴とする皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットである。
＜２＞  皮膚試験が貼付試験である前記＜１＞に記載の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットである。
＜３＞  ペルオキシレドキシンが、組換えペルオキシレドキシンである前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットである。
＜４＞  前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の皮膚型リーシュマニア症の検査用試薬又はキットを用い、非ヒト動物の皮膚にリーシュマニア原虫の粗抗原及びペルオキシレドキシンの少なくともいずれかを接触させる工程を含むことを特徴とする皮膚型リーシュマニア症の検査方法である。
＜５＞  ペルオキシレドキシンが、組換えペルオキシレドキシンである前記＜４＞に記載の皮膚型リーシュマニア症の検査方法である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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