(57)【要約】【課題】ハイブリダイズ反応をする際の、核酸増幅反応後の反応液にハイブリダイズ反応用のバッファーを一定量分注し添加する工程、あるいは、核酸増幅反応後の反応液から増幅したＤＮＡを取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程の短縮化を実現する。【解決手段】核酸増幅反応後の反応液と接触する部分に、少なくともハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部を形成させる。【選択図】図２
2016034247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸マイクロアレイを用いてハイブリダイズ反応を行う反応部と、
少なくとも、上記ハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部とを備え、
核酸増幅反応後の反応液が前記成分固相化部に接触することを特徴とする、ハイブリダイズ反応装置。
【請求項２】
前記成分固相化部は、前記反応部に形成されたことを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項３】
前記核酸マイクロアレイを搭載することができる治具を更に備えることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項４】
前記成分固相化部は、前記治具に形成されたことを特徴とする請求項３記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項５】
前記反応部は、核酸マイクロアレイを載置する凹部と、前記凹部に連結した流路とを備え、前記流路を介して前記凹部に対して溶液を供給することを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項６】
前記成分固相化部は、前記凹部又は前記凹部に溶液を供給する前記流路に形成されたことを特徴とする請求項５記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項７】
前記反応部は、核酸マイクロアレイを載置する凹部と、前記凹部に載置した前記核酸マイクロアレイを覆うカバーとを備えることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項８】
前記成分固相化部は、前記凹部又は前記カバーに形成されたことを特徴とする請求項７記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項９】
前記成分固相化部は、核酸増幅反応後の反応液を分注する分注チップ内に形成されたことを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項１０】
前記成分固相化部は、核酸増幅反応後の反応液を撹拌する撹拌手段に形成されたことを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項１１】
前記反応部は、溶液を収容することができる容器と、当該容器に収容された溶液を所望の温度に調整できる温度調整部とを備えることを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項１２】
前記成分固相化部は、前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を更に含むことを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項１３】
前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片固相化部を更に含み、核酸増幅反応後の反応液が前記成分固相化部及び前記ＤＮＡ断片固相化部に接触することを特徴とする請求項１記載のハイブリダイズ反応装置。
【請求項１４】
基板と、
前記基板の一主面に固定されたプローブ分子と、
少なくとも、上記ハイブリダイズ反応に用いる塩を前記基板の一主面に含む成分固相化部とを備える核酸マイクロアレイ。
【請求項１５】
前記プローブ分子は位置スポット用ＤＮＡを含み、
前記成分固相化部は、前記位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を更に含むことを特徴とする請求項１４記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項１６】
前記プローブ分子は位置スポット用ＤＮＡを含み、
前記位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を前記基板の一主面に含むＤＮＡ断片固相化部を更に含むことを特徴とする請求項１４記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項１７】
核酸マイクロアレイを用いたハイブリダイズ反応を含む遺伝子検査方法であって、
前記ハイブリダイズ反応の前に、核酸増幅反応後の反応液を、ハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部に接触させる工程を含むことを特徴とする遺伝子検査方法。
【請求項１８】
前記成分固相化部は、前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を更に含むことを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検査方法。
【請求項１９】
前記核酸増幅反応後の反応液を前記成分固相化部に接触させる工程では、前記核酸増幅反応後の反応液を前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片固相化部に接触させることを特徴とする請求項１７記載の遺伝子検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリダイズ反応装置及び核酸マイクロアレイ（核酸チップとも呼ばれる）並びにそれらを用いた遺伝子検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム解析の進展により、種々の生物の生理反応に関与する生体関連分子が解明されてきた。これら生体関連分子には、ＤＮＡなどの核酸、蛋白質、糖鎖などがあり、これらのうち機能や構造等が解明されたものは、創薬や臨床検査、食品検査、環境検査などの各種産業用途に利用される。
【０００３】
臨床検査を始めとする検査では、以下の方法が一般的によく採用される。すなわち、検出したい生体関連分子（以下、アナライトと呼称する）と特異的に結合するプローブ分子（以下、リガンドと呼称する）を担体上に固定したデバイスに検体を接触させると、検体にアナライトが存在する場合、リガンドとの結合によりアナライトが担体上に捕捉される。担体上に捕捉されたアナライトを検出することで、上述した検査が行われる。
【０００４】
前記のような検査方法においても、近年、高速化、自動化が求められ、数百〜数万の生体関連分子を同時に網羅的に計測する検出方法が要望されている。そして、生体関連分子固定の集積化技術、いわゆる、ＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）技術を用いたデバイス設計が可能となり、いわゆるマイクロアレイが、創薬研究やバイオ研究における網羅的解析に用いられている。なかでも、担体上に核酸分子、例えばＤＮＡを固定した所謂ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡチップとも呼ばれる）を用いた遺伝子検査が実用化されている。
【０００５】
ＤＮＡマイクロアレイを用いた解析では、先ず、ＤＮＡマイクロアレイ上に、例えば、蛍光物質で予め蛍光標識を行ったＤＮＡを含む溶液を接触させ、担体上に固定されたプローブＤＮＡと蛍光標識されたＤＮＡとを特異的にハイブリダイズさせる。その後、ＤＮＡマイクロアレイを洗浄し、蛍光物質が発する蛍光シグナルを検出測定することによりＤＮＡを同定又は定量する。
【０００６】
ＤＮＡマイクロアレイは、通常、スライドガラス様の大きさで、その上に検体を滴下しプレパラートで覆い反応させる。例えば図１３に示すように、略平板状のプレート１００における凹部領域１０１にＤＮＡマイクロアレイ１０２を載置し、この状態で溶液１０３を滴下し、ＤＮＡマイクロアレイ用カバー１０４により溶液を保持するタイプのものがある。
【０００７】
ＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子検査装置としては、例えば、特許文献１が挙げられる。特許文献１に開示された遺伝子検査装置は、ＤＮＡマイクロアレイのための温度調整部、ＤＮＡマイクロアレイからの光学信号を検出する検出部、ＤＮＡマイクロアレイへの流体を給排する流体輸送部、全体の動作を制御する制御部を備えている。
【０００８】
遺伝子検査装置は、例えば図１４に示すように、ＤＮＡマイクロアレイ２０１と、ＤＮＡマイクロアレイ２０１を固定する担体支持部材２０２を備え、担体支持体に固定されたＤＮＡマイクロアレイ２０１を移動自在としている。また、遺伝子検査装置は、図１４に示すように、検査対象の生物から抽出した核酸としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等により所定の領域を増幅する核酸増幅反応部２０３と、ＰＣＲ等の核酸増幅反応後の反応液に、ハイブリダイズ反応用のバッファーを添加してハイブリダイズ反応を行うハイブリダイズ反応部２０４と、ハイブリダイズ反応後のＤＮＡマイクロアレイ２０１を洗浄する洗浄部２０５と、洗浄後のＤＮＡマイクロアレイ２０１からの蛍光を検出する検出部２０６とを備える。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００４−２８７７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、遺伝子検査においては、負に荷電した核酸分子間の静電的な反発作用を減少させるために、核酸増幅反応後の反応液（以後、核酸増幅反応液）にその核酸と静電的に相互作用をする一価の陽イオン（例えばナトリウムイオン）を含むバッファーを一定量添加し、その後、ハイブリダイズ反応する必要があった。すなわち、遺伝子検査では、ハイブリダイズ反応用の溶液を調製するためのバッファーやバッファーを分注するための機構が必要であり、検査全体のリードタイムが長くなり、また、検査装置としては大型化してしまうといった問題があった。
【００１１】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができるハイブリダイズ反応装置及び核酸マイクロアレイ並びに遺伝子検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）核酸マイクロアレイを用いてハイブリダイズ反応を行う反応部と、少なくとも、上記ハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部とを備え、核酸増幅反応後の反応液が前記成分固相化部に接触することを特徴とする、ハイブリダイズ反応装置。
（２）前記成分固相化部は、前記反応部に形成されたことを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（３）前記核酸マイクロアレイを搭載することができる治具を更に備えることを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（４）前記成分固相化部は、前記治具に形成されたことを特徴とする（３）記載のハイブリダイズ反応装置。
（５）前記反応部は、核酸マイクロアレイを載置する凹部と、前記凹部に連結した流路とを備え、前記流路を介して前記凹部に対して溶液を供給することを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（６）前記成分固相化部は、前記凹部又は前記凹部に溶液を供給する前記流路に形成されたことを特徴とする（５）記載のハイブリダイズ反応装置。
（７）前記反応部は、核酸マイクロアレイを載置する凹部と、前記凹部に載置した前記核酸マイクロアレイを覆うカバーとを備えることを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（８）前記成分固相化部は、前記凹部又は前記カバーに形成されたことを特徴とする（７）記載のハイブリダイズ反応装置。
（９）前記成分固相化部は、核酸増幅反応後の反応液を分注する分注チップ内に形成されたことを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（１０）前記成分固相化部は、核酸増幅反応後の反応液を撹拌する撹拌手段に形成されたことを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（１１）前記反応部は、溶液を収容することができる容器と、当該容器に収容された溶液を所望の温度に調整できる温度調整部とを備えることを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（１２）前記成分固相化部は、前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を更に含むことを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（１３）前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片固相化部を更に含み、核酸増幅反応後の反応液が前記成分固相化部及び前記ＤＮＡ断片固相化部に接触することを特徴とする（１）記載のハイブリダイズ反応装置。
（１４）基板と、前記基板の一主面に固定されたプローブ分子と、少なくとも、上記ハイブリダイズ反応に用いる塩を前記基板の一主面に含む成分固相化部とを備える核酸マイクロアレイ。
（１５）前記プローブ分子は位置スポット用ＤＮＡを含み、前記成分固相化部は、前記位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を更に含むことを特徴とする（１４）記載の核酸マイクロアレイ。
（１６）前記プローブ分子は位置スポット用ＤＮＡを含み、前記位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を前記基板の一主面に含むＤＮＡ断片固相化部を更に含むことを特徴とする（１４）記載の核酸マイクロアレイ。
（１７）核酸マイクロアレイを用いたハイブリダイズ反応を含む遺伝子検査方法であって、前記ハイブリダイズ反応の前に、核酸増幅反応後の反応液を、ハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部に接触させる工程を含むことを特徴とする遺伝子検査方法。
（１８）前記成分固相化部は、前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を更に含むことを特徴とする（１７）記載の遺伝子検査方法。
（１９）前記核酸増幅反応後の反応液を前記成分固相化部に接触させる工程では、前記核酸増幅反応後の反応液を前記核酸マイクロアレイが有する位置スポット用ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片固相化部に接触させることを特徴とする（１７）記載の遺伝子検査方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に係るハイブリダイズ反応装置もしくは核酸マイクロアレイ又は遺伝子検査方法によれば、核酸増幅反応液を非常に簡単にハイブリダイズ反応に適した溶液にできる。したがって、本発明に係るハイブリダイズ反応装置もしくは核酸マイクロアレイ又は遺伝子検査方法を用いることにより、装置を小型化し、低コスト化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】核酸マイクロアレイの平面図である。
【図２】ハイブリダイズ反応装置における核酸マイクロアレイを搭載した治具の要部正面図及び要部側面図である。
【図３】治具に搭載された核酸マイクロアレイを容器に入れた核酸増幅反応液に浸漬した状態を示す要部断面図である。
【図４】ハイブリダイズ反応装置における核酸マイクロアレイを載置した反応部の形態の要部斜視図である。
【図５】プレートとカバーとを備えるハイブリダイズ反応装置の分解斜視図である。
【図６】プレートとカバーとを備えるハイブリダイズ反応装置のプレートの平面図及び断面図である。
【図７】プレートとカバーとを備えるハイブリダイズ反応装置のカバーの斜視図、平面図、断面図及び要部断面図である。
【図８】プレートとカバーとを備えるハイブリダイズ反応装置のプレートにカバーを取り付けた状態の要部断面図である。
【図９】ハイブリダイズ反応装置における核酸増幅反応液を吸い上げるピペット装置とその先端に取り付けたチップとを備える核酸増幅反応液移送用装置の断面図を示す。
【図１０】ハイブリダイズ反応装置におけるハイブリダイズ反応を行う際の撹拌手段の要部断面図である。
【図１１】本発明の比較例及び実施例において用いた核酸マイクロアレイの平面図である。
【図１２】本発明の比較例及び実施例において、ハイブリダイズ反応実施後の蛍光を測定した画像である。
【図１３】従来の核酸マイクロアレイに反応液を滴下し、カバーをかぶせる工程を説明したフロー図である。
【図１４】従来の遺伝子検査装置の概略構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明を適用したハイブリダイズ反応装置は、核酸マイクロアレイを用いて遺伝子検査を行うものであって、核酸マイクロアレイを用いてハイブリダイズ反応を行う反応部と、少なくとも、上記ハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部とを備え、核酸増幅反応液がハイブリダイズ反応までの間に前記成分固相化部に接触することを特徴とするものである。
【００１６】
成分固相化部は、核酸増幅反応液と接触すると液中に溶解することとなる。これより、核酸増幅反応液は、ハイブリダイズ反応に使用できる溶液となる。
【００１７】
よって、核酸増幅反応からハイブリダイズ反応までの間に、（１）所定の塩を含むバッファーを、核酸増幅反応液へ添加する工程、あるいは、（２）核酸増幅反応液から増幅した核酸を取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程、を実施することなく、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができる。
【００１８】
ハイブリダイズ反応装置に使用できる核酸マイクロアレイ１は、特に限定されず、例えば図１に示すように、基板２と、基板２の一主面に固定されたプローブ分子を有するプローブスポット３とを備えている。また、核酸マイクロアレイ１は、基板２の所定の位置に位置スポット用ＤＮＡを固定してなる位置スポット４を備えていても良い。
【００１９】
ここで、プローブスポット３とは、検査対象の遺伝子に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するヌクレオチド、すなわちプローブ分子を固定させた領域を示す。また、位置スポット４とは、任意の塩基配列を有するＤＮＡ断片に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド、すなわち位置スポット用ＤＮＡを固定させた領域を示す。
【００２０】
位置スポット４は、蛍光標識されたＤＮＡ断片が特異的にハイブリダイズすることによって蛍光を発する。よって、位置スポット４の蛍光を参照することで、核酸マイクロアレイ１上のプローブスポット３の位置を特定することができる。また、ハイブリダイズ反応の良否についても確認できる。
【００２１】
プローブ分子は、核酸が好ましく、ＤＮＡがより好ましい。ＤＮＡには二本鎖も一本鎖も含まれるが、一本鎖ＤＮＡが好ましい。プローブ分子は、全体が１７〜２３塩基長のオリゴヌクレオチド、特に２１〜２３塩基長のオリゴヌクレオチドが好ましい。
【００２２】
プローブ分子は、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、ＤＮＡシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
【００２３】
核酸マイクロアレイ１において使用される基板２は、微細な平板状の構造を有するものが好ましい。形状は、長方形、正方形及び丸形など限定されないが、通常、１〜７５ｍｍ四方のものであり、特に１〜１０ｍｍ四方のものが好ましく、更には３〜５ｍｍ四方のものがより好ましい。
【００２４】
基板２の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステン及びそれらの化合物などの貴金属、及びグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、ＳＯＩ（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイド及びポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。特に、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましい。なお、単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
【００２５】
上記の材料により構成される基板２は、表面にカーボン層と化学修飾基とを更に有することが好ましい。例えば基板２として、表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、又はカーボン層からなる基板表面に化学修飾基を有するものが使用される。特に基板２として、単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層及び化学修飾基を有するものを使用することが好ましい。
【００２６】
カーボン層が形成された基板２の表面に化学修飾基を導入することにより、プローブ分子を担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
【００２７】
上記で説明した基板２に、プローブ分子を固定することによってプローブスポット３を形成し、核酸マイクロアレイ１を製造する。例えば、プローブ分子をスポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを９６穴もしくは３８４穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって基板２上にスポッティングし、プローブスポット３を形成することによって核酸マイクロアレイ１を製造する。又は、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
【００２８】
スポッティング後、プローブ分子が基板表面に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常-２０〜１００℃、好ましくは４〜９０℃の温度で、通常０．５〜１６時間、好ましくは１〜２時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度５０〜９０％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、基板に結合していないＤＮＡを除去するため、洗浄液（例えば、５０ｍＭ  ＴＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
【００２９】
本発明を適用したハイブリダイズ反応装置においては、例えば、図２に示すような核酸マイクロアレイ１を搭載した治具５を使用することができる。治具５は、核酸マイクロアレイ１を搭載することができる凹部６を有している。凹部６は、傾斜面８と底面７とにより形成されている。核酸マイクロアレイ１は底面７に搭載される。凹部６の傾斜面８と底面７とは角度９を形成している。底面７からの傾斜面８の立ち上りの角度９は、底面７の延長線（図２（b）に示す破線）と傾斜面８との間の角度である。角度９は、例えば４５°〜７５°とすることが好ましい。
【００３０】
成分固相化部１０は、例えば核酸マイクロアレイ１の下方の傾斜面８に形成することができる。成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイ１を用いるハイブリダイズ反応に使用する塩を傾斜面８上に固相化することで形成される。
【００３１】
ハイブリダイズ反応に用いる塩は、溶液中で解離してＤＮＡ同士の静電的な反発作用を減少する一価の陽イオンを生成することができれば特に制限されない。ハイブリダイズ反応に用いる塩としては、例えば、塩化ナトリウム、サリンソディウムサイトレート（ＳＳＣ；３Ｍ塩化ナトリウム／０．３Ｍクエン酸ナトリウム）、ＳＳＰＥ（ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及びＥＤＴＡを含む）を挙げることができる。
【００３２】
ここで、ハイブリダイズ反応に用いる塩を固相化することは、例えば、ハイブリダイズ反応に用いる塩を溶媒と混合し、得られた混合溶液を成分固相化部１０を形成する部分に所定量供給した後、溶媒を除去することである。溶媒には揮発性の溶媒を使用することが好ましい。溶媒には、水、アルコール等を用いることができるが、これらに限定されない。溶媒は、ハイブリダイズ反応に用いる塩を溶解するものであっても、溶解しないものであっても良い。混合溶液の供給方法には、スプレー法、ディップコート法、スピンコート法、ブレードコーティング法等あるが、これらに限定されない。混合溶液を滴下し、溶媒を乾燥させることによって固相化してもよい。
【００３３】
ここで、固相化する塩の量は、核酸増幅反応液に溶解してハイブリダイズ可能な塩濃度となる量であることが好ましい。例えば固相化する塩の量は核酸増幅反応液の体積に応じて調節することができる。例えば、ハイブリダイズ反応時において反応液の塩の濃度が１ｍｍｏｌ/ｌ〜１０００ｍｍｏｌ/ｌ、好ましくは７５ｍｍｏｌ/ｌ〜６００ｍｍｏｌ/ｌとなるように固相化する塩の量を調節することが好ましい。
【００３４】
また、成分固相化部１０は、上述したハイブリダイズ反応に用いる塩に加えて他の成分を固相化しても良い。他の成分としては、ハイブリダイズ反応の際に使用する塩以外の成分、例えば、表面張力を低減させる界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、融解温度Tm を下げる成分であるホルムアミド及び非特異的結合を最小限にするブロッキング剤などを挙げることができる。ブロッキング剤としては、デンハルト試薬、断片化サケ精子ＤＮＡ、ｔＲＮＡ、およびＣｏｔ１ＤＮＡが挙げられる。ｃＤＮＡ プローブ分子を使用する場合、Ｔ-リッチ配列に結合するポリ（Ａ）＋ＲＮＡ又はポリｄＡヌクレオチドも含まれる。更に、他の成分として、ハイブリダイズ反応に用いる溶液中の見かけ上のプローブ分子濃度を上昇させる効果のある高分子糖類（デキストラン等）がある。
【００３５】
さらに、成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイ１が位置スポット４を有する場合、位置スポット用ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を有していても良い。このＤＮＡ断片は、上述したハイブリダイズ反応に用いる塩を固相化する際に使用する溶媒に溶解又は分散させておき、上述したハイブリダイズ反応に用いる塩と共に固相化することができる。
【００３６】
なお、位置スポット用ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片は、成分固相化部１０とは異なる部分に固相化することもできる。すなわち、ハイブリダイズ反応装置は、図示しないが、位置スポット用ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片を固相化したＤＮＡ断片固相化部を更に備えていても良い。
【００３７】
ハイブリダイズ反応装置は、上述のように構成された治具５を、核酸マイクロアレイ１を搭載した状態で、図３に示すように容器に入れた核酸増幅反応液に浸漬する。治具５を容器１１内の核酸増幅反応液に浸漬すると、成分固相化部１０が核酸増幅反応液と接触し、ハイブリダイズ反応に用いる塩が溶解する。これにより、核酸増幅反応液をハイブリダイズ反応に適した塩濃度の溶液とすることができる。
【００３８】
なお、図２に示した例では、成分固相化部１０を傾斜面８上に形成したが、成分固相化部１０の位置はこれに限定されるものではない。また、成分固相化部１０は、１箇所に形成されていても、２箇所以上に形成されていても良い。成分固相化部１０は、治具５を容器１１内の核酸増幅反応液に浸漬した状態で核酸増幅反応液に接触できる位置であれば良い。例えば、成分固相化部１０は、底面７、治具５の先端、容器１１の内面等、如何なる位置であっても良い。
【００３９】
本発明を適用したハイブリダイズ反応装置では、上述のように調製したハイブリダイズ反応用の溶液を使用して、ハイブリダイズ反応を実施することができる。ハイブリダイズ反応の温度条件は特に限定されないが、例えば４５〜６５℃とすることができる。
【００４０】
ハイブリダイズ反応後、核酸マイクロアレイ１のプローブスポット３上のプローブ分子や位置スポット４上の位置スポット用ＤＮＡとハイブリダイズしなかった核酸等を、洗浄液を使用して洗浄・除去する。核酸マイクロアレイ１を洗浄後又は洗浄し乾燥後、検出器によりプローブ分子にハイブリダイズした被検核酸を解析する。
【００４１】
検出器としては例えばレーザー等を用いて励起光を核酸マイクロアレイ１に照射し、得られる蛍光の強度を検出するものがある。核酸増幅反応において蛍光標識を増幅核酸に取り込ませ、得られた増幅核酸を被検核酸として核酸マイクロアレイ１上のプローブ分子にハイブリダイズさせ、洗浄後又は洗浄し乾燥後、核酸マイクロアレイ１に励起光を照射すると、プローブ分子にハイブリダイズした被検核酸に由来する蛍光が検出される。これを検出することにより、ハイブリダイズ反応を検出することができる。
【００４２】
以上より、本発明を適用した図２及び３に示したような治具５を有するハイブリダイズ反応装置を使用することによって、核酸増幅反応からハイブリダイズ反応までの間に、（１）所定の塩を含むバッファーを、核酸増幅反応液へ添加する工程、あるいは、（２）核酸増幅反応液から増幅した核酸を取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程、を実施することなく、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができる。
【００４３】
ところで、本発明を適用したハイブリダイズ反応装置は、図２及び３に示したものに限定されず、例えば図４に示すような、核酸マイクロアレイ１を載置した反応部１２から構成される。反応部１２は、核酸マイクロアレイ１を載置する凹部１３と、凹部１３に連結した流路１４、１５とを備える。
【００４４】
成分固相化部１０は、例えば凹部１３の内壁に形成することができる。成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイ１を用いるハイブリダイズ反応に使用する塩を、上記治具５において固相化した条件と同様の条件で、凹部１３の内壁に形成することができる。
【００４５】
反応部１２においては、核酸増幅反応液は、流路１４から凹部１３内に注入される。核酸増幅反応液を凹部１３に注入する時には、流路１５からの核酸増幅反応液の排出を抑える。核酸増幅反応液は凹部１３を満たすよう注入されると、成分固相化部１０は核酸増幅反応液と接触し、ハイブリダイズ反応に用いる塩が溶解する。このとき、流路１４、１５、核酸マイクロアレイ１及び凹部１３により形成される空間容積に応じて、核酸増幅反応液をハイブリダイズ反応に適した塩濃度の溶液とするよう、成分固相化部１０の塩の量を調整することが好ましい。
【００４６】
なお、図４に示した例では、成分固相化部１０を凹部１３の内壁に形成したが、成分固相化部１０の位置はこれに限定されるものではない。また、成分固相化部１０は、１箇所に形成されていても、２箇所以上に形成されていても良い。成分固相化部１０は、凹部１３が核酸増幅反応液によって満たされた状態で核酸増幅反応液に接触できる位置であれば良い。例えば、成分固相化部１０は、凹部１３に溶液を供給する流路１４、凹部１３から溶液を排出する流路１５等、如何なる位置であっても良い。核酸増幅反応液は流路１４から注入されるため、成分固相化部１０は凹部１３又は流路１４に形成されることが好ましい。
【００４７】
以上より、本発明を適用した図４に示したような反応部１２を有するハイブリダイズ反応装置を使用することによって、核酸増幅反応からハイブリダイズ反応までの間に、（１）所定の塩を含むバッファーを、核酸増幅反応液へ添加する工程、あるいは、（２）核酸増幅反応液から増幅した核酸を取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程、を実施することなく、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができる。
【００４８】
図２〜４に示したハイブリダイズ反応装置の他の形態として、図５〜８に示すハイブリダイズ反応装置１６がある。ハイブリダイズ反応装置１６は、核酸マイクロアレイ１を載置した凹部２０を有するプレート１８と、核酸マイクロアレイ１を覆うカバー１９と、カバー１９に形成されたハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部１０とから構成される。
【００４９】
プレート１８は、図６（a）に示すように、略矩形の平板であって、一主面１７の略中心部に略円形の凹部２０を有している。核酸マイクロアレイ１は、凹部２０に着脱可能に載置される。核酸マイクロアレイ１を載置する凹部２０は、凹部２０の底面に核酸マイクロアレイ１の外形に対応したガイドが形成されたものであってもよい。
【００５０】
図６においては、核酸マイクロアレイ１を載置したプレート１８の一対の切欠き部２１において切断した場合の断面図（図６（b）に示す）で示すように、核酸マイクロアレイ１の厚みと凹部２０の深さは同じとしている。核酸マイクロアレイ１の厚みと凹部２０の深さは、後述する図８に示したカバー１９をプレート１８に取り付けた状態において、核酸マイクロアレイ１の一主面とカバー１９との間に所定の間隔が形成されれば、制限されない。例えば、核酸マイクロアレイ１の厚みを凹部２０の深さより厚くすることも又は薄くすることもできる。
【００５１】
プレート１８は、詳細を後述するカバー１９を位置決めして取り付けるために、長手方向の両側面に形成された一対の切欠き部２１を有することが好ましい。図６（a）においては、位置決め手段として一対の切欠き部２１を示したが、位置決め手段はこのような構成に限定されるものではない。
【００５２】
なお、プレート１８は、特に、長手方向の一方端部が先端に向かって幅狭になる形状となっている。これにより、プレート１８に載置した核酸マイクロアレイ１の方向を特定することができ、これにより、核酸マイクロアレイ１表面の特定の位置にスポットしてある位置決めスポットの場所を特定することが可能となる。
【００５３】
次にカバー１９について説明する。カバー１９は、図７（a）及び（b）に示すように、上述したプレート１８に取り付けられた姿勢においてプレート１８と空間部を形成する凹部２３と、凹部２３内であって、プレート１８に取り付けられた姿勢で核酸マイクロアレイ１に対向する位置に形成され、核酸マイクロアレイ１の一主面と略同形の平面を有する凸部２２と、凸部２２に形成された成分固相化部１０とを備えている。カバー１９は、プレート１８に取り付けられた姿勢において形成される空間部（凹部２３と凹部２０で構成される空間部）に核酸マイクロアレイ１を収容することとなる。
【００５４】
凸部２２の高さは、カバー１９をプレート１８に取り付けた姿勢において、プレート１８に取り付けられた核酸マイクロアレイ１の一主面との間隔を考慮して設計することができる。図７（c）及び（d）に示すように凸部２２は、カバー１９をプレート１８に取り付けた姿勢において、カバー１９におけるプレート１８との接触面２４よりも低い位置となるように設計している。これにより、核酸マイクロアレイ１の一主面がプレート１８の一主面１７と同じ高さ位置である場合、凸部２２と核酸マイクロアレイ１との間に所定の間隔（図８のＤ）を形成することができる。換言すれば、凸部２２と核酸マイクロアレイ１との間に所定の間隔を形成することができれば、凸部２２の高さはプレート２との接触面２４と同じ又はより高い位置となるように設計しても良い。
【００５５】
カバー１９には、上述したプレート１８に位置決めして取り付けるための位置決め手段を有していることが好ましい。位置決め手段としては、図７（a）及び（b）に示すように、板部材の両端部に形成された凸状の縁部２５に形成された一対の嵌合凸部２６とすることができる。これら一対の嵌合凸部２６は、上述したプレート１８に形成された一対の切欠き部２１に対応する位置及び形状とされる。カバー１９に形成される位置決め手段としては、このような一対の嵌合凸部２６に限定されず、上述したプレート１８に形成された位置決め手段に応じて、変更することができる。
【００５６】
成分固相化部１０は、上記で説明したカバー１９の凸部２２上に形成されている。成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイ１を用いるハイブリダイズ反応に使用する塩を、上記治具５において固相化した条件と同様の条件で、形成することができる。
【００５７】
以上のように構成されたハイブリダイズ反応装置１６では、核酸増幅反応液は以下のようにして保持される。
【００５８】
まず、核酸増幅反応液をカバー１９の凸部２２に滴下する。その後、核酸増幅反応液が蒸散を防ぐために直ちに、カバー１９をプレート１８に取り付ける。カバー１９をプレート１８に取り付けた状態を図８に示す。図８に示すように、カバー１９をプレート１８に取り付けると、プレート１８の一主面１７とカバー１９の接触面２４が密着し、核酸マイクロアレイ１の一主面とカバー１９の凸部２２との間に所定の間隔Ｄ（以後、間隔Ｄ）が形成される。その結果、核酸マイクロアレイ１を載置したプレート１８の凹部２０と、カバー１９の凹部２３と、間隔Ｄとによって空間が形成される。カバー１９における凸部２２上に滴下された核酸増幅反応液は、まず間隔Ｄによって形成される空間に保持されることとなる。間隔Ｄによって形成される空間容積以上の核酸増幅反応液は、その後、凸部２２の外方、すなわちカバー１９の凹部２３と核酸マイクロアレイ１を載置したプレート１８の凹部２０で構成される空間部へ流動する。
【００５９】
成分固相化部１０は、カバー１９に形成されているため、核酸増幅反応液をカバー１９の凸部２２に滴下した段階で、ハイブリダイズ反応に用いる塩が核酸増幅反応液に溶解する。これにより、核酸増幅反応液はハイブリダイズ反応に適した塩濃度の溶液となる。
【００６０】
上記核酸増幅反応液の保持においては、核酸増幅反応液を核酸マイクロアレイ１上に滴下してからカバー１９を取り付けても良い。この場合は、成分固相化部１０はカバー１９をプレート１８に取り付けた時に核酸増幅反応液と接触し、ハイブリダイズ反応に用いる塩が核酸増幅反応液に溶解する。
【００６１】
また、上記説明の通り成分固相化部１０はカバー１９をプレート１８に取り付けた後すぐに核酸増幅反応液と接触し溶解するので、成分固相化部１０の厚みは特に制限されることはない。成分固相化部１０の厚みは間隔Ｄ以下であることが好ましい。
【００６２】
なお、図５〜８に示した例では、成分固相化部１０をカバー１９の凸部２２に形成したが、成分固相化部１０の位置はこれに限定されるものではない。また、成分固相化部１０は、１箇所に形成されていても、２箇所以上に形成されていても良い。成分固相化部１０は、カバー１９を核酸マイクロアレイ１を載置したプレート１８に取り付けた状態で、核酸増幅反応液に接触できる位置であれば良く、すなわち、成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイ１を載置したプレート１８の凹部２０と、カバー１９の凹部２３と、間隔Ｄとによって形成される空間に形成することができる。例えば、成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイ１を載置したプレート１８の凹部２０、カバー１９の凹部２３等、如何なる位置であっても良い。
【００６３】
また、図示はしないが、プレート１８に凹部２０を設けずに核酸マイクロアレイ１を載置し、カバー１９に凹部を設けてここに成分固相化部１０を形成し、カバー１９の凹部に核酸増幅反応液を滴下してハイブリダイズ反応を行なうことも可能である。
【００６４】
以上より、本発明を適用した図５〜８に示したようなハイブリダイズ反応装置１６を使用することによって、核酸増幅反応からハイブリダイズ反応までの間に、（１）所定の塩を含むバッファーを、核酸増幅反応液へ添加する工程、あるいは、（２）核酸増幅反応液から増幅した核酸を取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程、を実施することなく、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができる。
【００６５】
図２〜８において説明した装置以外においても、本発明を適用したハイブリダイズ反応装置は、例えば図９に示す溶液移送装置又は図１０に示す撹拌手段を有するものであっても良い。
【００６６】
図９には、核酸増幅反応液を吸い上げるピペット装置２７と、ピペット装置２７の先端に取り付けた分注チップ２８とからなる溶液移送装置を示す。成分固相化部１０は、例えば分注チップ２８の内側の壁面に形成されている。
【００６７】
図１０には、ハイブリダイズ反応を行う際の撹拌手段を示す。図１０の（a）は、撹拌翼３０と撹拌翼３０に取り付けた軸２９とからなる機構の撹拌手段である。成分固相化部１０は、例えば撹拌翼３０に形成される。図１０の（b）は、磁性体からなる撹拌子３１と内部にて回転動作可能な磁性体を有するスターラー本体３２とからなる機構の撹拌手段である。成分固相化部１０は、例えば撹拌子３１に形成される。図１０の（c）は、アルゴンガスや窒素等の気体を導入するパイプ３３と、パイプ３３に連結した気泡発生部３４とからなる機構の撹拌手段である。成分固相化部１０は、例えば気泡発生部３４の核酸増幅反応液と接触する側の壁面に形成される。図１０の（d）は、ピペット装置３５と、ピペット装置３５の先端に取り付けたチップ３６とからなる機構の撹拌手段である。成分固相化部１０は、例えばチップ３６の先端部の内側及び／又は外側の核酸増幅反応液と接触する部分に形成される。
【００６８】
なお、図９及び図１０に示した成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイ１を用いるハイブリダイズ反応に使用する塩を、上記治具５において固相化した条件と同様の条件で、形成することができる。
【００６９】
また、成分固相化部１０は、図９及び１０に示した部材や位置に限定されず、核酸増幅反応液に接触できる位置であれば如何なる部材、位置でも良い。成分固相化部１０は、１箇所に形成されていても、２箇所以上に形成されていても良い。
【００７０】
以上より、本発明を適用した図９及び１０に示したような装置・手段を有するハイブリダイズ反応装置を使用することによっても、核酸増幅反応からハイブリダイズ反応までの間に、（１）所定の塩を含むバッファーを、核酸増幅反応液へ添加する工程、あるいは、（２）核酸増幅反応液から増幅した核酸を取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程、を実施することなく、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができる。
【００７１】
以上の説明においては、成分固相化部１０は、ハイブリダイズ反応装置内の核酸マイクロアレイ１を除く核酸増幅反応液と接触する位置に形成されているが、成分固相化部１０は、核酸マイクロアレイに形成することもできる。
【００７２】
すなわち、本発明を適用した核酸マイクロアレイは、基板と、前記基板の一主面に固定されたプローブ分子と、少なくとも、上記ハイブリダイズ反応に用いる塩を前記基板の一主面に含む成分固相化部とを備える核酸マイクロアレイである。
【００７３】
成分固相化部を形成させる核酸マイクロアレイは、特に制限されないが、前記ハイブリダイズ反応装置において説明している核酸マイクロアレイを使用することができる。例えば、図１に示す核酸マイクロアレイ１を使用することができる。
【００７４】
成分固相化部は、核酸マイクロアレイのプローブ分子がスポットされた面及び／又はその裏側の面に形成される。成分固相化部は、核酸マイクロアレイを用いるハイブリダイズ反応に使用する塩を、上記治具５において固相化した条件と同様の条件で、形成することができる。また、成分固相化部は、１箇所に形成されていても、２箇所以上に形成されていても良い。
【００７５】
核酸マイクロアレイを核酸増幅反応液に浸漬すると、成分固相化部が核酸増幅反応液と接触し、ハイブリダイズ反応に用いる塩が溶解する。これにより、核酸増幅反応液をハイブリダイズ反応に適した塩濃度の溶液とすることができる。
【００７６】
以上より、本発明を適用した核酸マイクロアレイを使用することによって、使用するハイブリダイズ反応装置に関わらず、核酸増幅反応からハイブリダイズ反応までの間に、（１）所定の塩を含むバッファーを、核酸増幅反応液へ添加する工程、あるいは、（２）核酸増幅反応液から増幅した核酸を取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程、を実施することなく、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができる。
【００７７】
上記において説明したハイブリダイズ反応装置又は核酸マイクロアレイを使用することによって、本発明を適用した遺伝子検査方法を行うことができる。
【００７８】
すなわち、核酸マイクロアレイを用いたハイブリダイズ反応を含む遺伝子を検査する方法であって、ハイブリダイズ反応の前に、核酸増幅反応液をハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部に接触する工程を含む遺伝子検査方法である。
【００７９】
核酸増幅反応後からハイブリダイズ反応までの間に、核酸増幅反応液がハイブリダイズ反応に用いる塩を含む成分固相化部と接触することによって、核酸増幅反応液にハイブリダイズ反応に用いる塩が溶解し、ハイブリダイズ反応に使用できる溶液となる。
【００８０】
よって、核酸増幅反応からハイブリダイズ反応までの間に、（１）所定の塩を含むバッファーを、核酸増幅反応液へ添加する工程、あるいは、（２）核酸増幅反応液から増幅した核酸を取り出し、乾燥後、バッファーに添加する工程、を実施することなく、ハイブリダイズ反応用の溶液を簡単に調製することができ、検査全体のリードタイムを短くすることができる。
【実施例】
【００８１】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８２】
実験準備
１）核酸マイクロアレイの作製
ジーンシリコン（東洋鋼鈑製）に、下記に示すオリゴＤＮＡ（濃度５μＭ）を図１１に示すスポット位置でスポット（ＳＰＢＩＯ２０００  日立ソフト社製）した。その後、インキュベーターにより加温（８０℃×６０分）し、ジーンシリコンとオリゴＤＮＡをアミド結合させて、結合していないオリゴＤＮＡを、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中６０℃で１０分間、２×ＳＳＣ中室温で１０分間、その後、超純水で洗浄して除去し、乾燥させることによって核酸マイクロアレイを作製した。
６種のプローブ分子の配列は、表１に示すとおりである。
【００８３】
【表１】
2016034247.tif 000003
【００８４】
作製した核酸マイクロアレイを、両面テープを使用してハイブリダイズ反応装置にセットした。実施例において使用したハイブリダイズ反応装置は、図５〜図８に示す構成を有するタイプのものである。
【００８５】
２）成分固相化部を形成したカバーの作製
以下の２種類の溶液（i）又は（ii）３．０μＬをそれぞれカバーの凸部に滴下し、１時間放置することにより乾燥させて、成分固相化部を形成したカバーを作製した。
（i）０．７５×ＳＳＣ／０．０７５％ＳＤＳ溶液
（ii）０．７５×ＳＳＣ／０．０７５％ＳＤＳ溶液とプローブ分子と相補的なＣｙ５蛍光標識オリゴＤＮＡとの混合溶液（Ｃｙ５蛍光標識オリゴＤＮＡ濃度  ０．０４μＭ）
評価に使用した３つのカバーを以下に示す。
【００８６】
カバーＡ：固相化なしのカバー。
カバーＢ：（i）溶液３．０μＬを滴下し塩を固相化させたカバー。
カバーＣ：（ii）溶液３．０μＬを滴下し塩を含む組成物を固相化させたカバー。
【００８７】
３）ハイブリダイズ用溶液の作製
以下の３種類のハイブリダイズ用溶液を作製・準備した。
（I）プローブ分子と相補的なＣｙ５蛍光標識オリゴＤＮＡ６種と０．７５×ＳＳＣ／０．０７５％ＳＤＳ溶液との混合溶液（Ｃｙ５蛍光標識オリゴＤＮＡ６種濃度  ０．０４μＭ）
（II）プローブ分子と相補的なＣｙ５蛍光標識オリゴＤＮＡ６種のみ溶液（Ｃｙ５蛍光標識オリゴＤＮＡ６種濃度  ０．０４μＭ）
（III）超純水
【００８８】
反応実験
以下の反応手順により実験を行った。
【００８９】
比較例１（従来の方法）
（１）３）において作製した（I）の溶液２μＬと２．２５×ＳＳＣ／０．２２５％ＳＤＳ溶液１μＬとを混合した。
（２）２）において作製したカバーＡの凸部に（１）の溶液を３μＬのせた。
（３）ハイブリダイズ反応装置にセットした核酸マイクロアレイに（２）のカバーＡをかぶせて、インキュベーターにより５２℃×６０分間ハイブリダイズ反応した。
（４）ハイブリダイズ反応装置をインキュベーターより取り出し、カバーＡを取り外した。核酸マイクロアレイを洗浄液（室温、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液）により浸漬洗浄（５分）し、その後、リンス液（室温、２×ＳＳＣ溶液）により軽く手動で搖動洗浄して、乾燥した。
（５）ＦＬＡ−８０００（富士フィルム製スキャナー、ＰＭ＝５０％）により分析を行った。
【００９０】
比較例２
（１）３）において作製した（II）の溶液２μＬと水１μＬとを混合した。
（２）２）において作製したカバーＡの凸部に（１）の溶液を３μＬのせた。
（３）ハイブリダイズ反応装置にセットした核酸マイクロアレイに（２）のカバーＡをかぶせて、インキュベーターにより５２℃×６０分間ハイブリダイズ反応した。
（４）ハイブリダイズ反応装置をインキュベーターより取り出し、カバーＡを取り外した。核酸マイクロアレイを洗浄液（室温、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液）により浸漬洗浄（５分）し、その後、リンス液（室温、２×ＳＳＣ溶液）により軽く手動で搖動洗浄して、乾燥した。
（５）ＦＬＡ−８０００（富士フィルム製スキャナー、ＰＭ＝５０％）により分析を行った。
【００９１】
比較例３
（１）２）において作製したカバーＡの凸部に３）で準備した（III）の超純水を３μＬのせた。
（２）ハイブリダイズ反応装置にセットした核酸マイクロアレイに（１）のカバーＡをかぶせて、インキュベーターにより５２℃×６０分間ハイブリダイズ反応した。
（３）ハイブリダイズ反応装置をインキュベーターより取り出し、カバーＡを取り外した。核酸マイクロアレイを洗浄液（室温、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液）により浸漬洗浄（５分）し、その後、リンス液（室温、２×ＳＳＣ溶液）により軽く手動で搖動洗浄して、乾燥した。
（４）ＦＬＡ−８０００（富士フィルム製スキャナー、ＰＭ＝５０％）により分析を行った。
【００９２】
比較例４
（１）２）において作製したカバーＢの凸部に３）で準備した（III）の超純水を３μＬのせた。
（２）ハイブリダイズ反応装置にセットした核酸マイクロアレイに（１）のカバーＢをかぶせて、インキュベーターにより５２℃×６０分間ハイブリダイズ反応した。
（３）ハイブリダイズ反応装置をインキュベーターより取り出し、カバーＢを取り外した。核酸マイクロアレイを洗浄液（室温、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液）により浸漬洗浄（５分）し、その後、リンス液（室温、２×ＳＳＣ溶液）により軽く手動で搖動洗浄して、乾燥した。
（４）ＦＬＡ−８０００（富士フィルム製スキャナー、ＰＭ＝５０％）により分析を行った。
【００９３】
実施例１
（１）３）において作製した（II）の溶液２μＬと水１μＬとを混合した。
（２）２）において作製したカバーＢの凸部に（１）の溶液を３μＬのせた。
（３）ハイブリダイズ反応装置にセットした核酸マイクロアレイに（２）のカバーＢをかぶせて、インキュベーターにより５２℃×６０分間ハイブリダイズ反応した。
（４）ハイブリダイズ反応装置をインキュベーターより取り出し、カバーＢを取り外した。核酸マイクロアレイを洗浄液（室温、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液）により浸漬洗浄（５分）し、その後、リンス液（室温、２×ＳＳＣ溶液）により軽く手動で搖動洗浄して、乾燥した。
（５）ＦＬＡ−８０００（富士フィルム製スキャナー、ＰＭ＝５０％）により分析を行った。
【００９４】
実施例２
（１）２）において作製したカバーＣの凸部に３）で準備した（III）の超純水を３μＬのせた。
（２）ハイブリダイズ反応装置にセットした核酸マイクロアレイに（１）のカバーＣをかぶせて、インキュベーターにより５２℃×６０分間ハイブリダイズ反応した。
（３）ハイブリダイズ反応装置をインキュベーターより取り出し、カバーＣを取り外した。核酸マイクロアレイを洗浄液（室温、２×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ溶液）により浸漬洗浄（５分）し、その後、リンス液（室温、２×ＳＳＣ溶液）により軽く手動で搖動洗浄して、乾燥した。
（４）ＦＬＡ−８０００（富士フィルム製スキャナー、ＰＭ＝５０％）により分析を行った。
【００９５】
比較例１〜４並びに実施例１及び２の結果を図１２に示す。
図１２に示すように、実施例１及び２では、従来の方法である比較例１と比較して、同等の蛍光の発色を示すことが確認された。以上より、ＳＳＣ／ＳＤＳ、オリゴＤＮＡを固相化しても、ハイブリダイズ反応には影響を与えないことが分かった。
【００９６】
また、ハイブリダイズ反応時にＳＳＣ／ＳＤＳの塩が存在しない比較例２では、比較例１並びに実施例１及び２と比較して、蛍光の発色をほとんど示さないことが確認された。以上より、ハイブリダイズ反応には、ＳＳＣ／ＳＤＳのような陽イオンが影響することが分かった。
【符号の説明】
【００９７】
１…核酸マイクロアレイ、２…基板、３…プローブスポット、４…位置スポット、５…治具、６…凹部、７…底面、８…傾斜面、９…角度、１０…成分固相化部、１１…容器、１２…反応部、１３…凹部、１４…流路、１５…流路、１６…ハイブリダイズ反応装置、１７…プレートの一主面、１８…プレート、１９…カバー、２０…凹部、２１…切欠き部、２２…凸部、２３…凹部、２４…接触面、２５…縁部、２６…嵌合凸部、２７…ピペット装置、２８…分注チップ、２９…軸、３０…撹拌翼、３１…撹拌子、３２…スターラー本体、３３…パイプ、３４…気泡発生部、３５…ピペット装置、３６…チップ
【図１】
2016034247.tif 000004
【図２】
2016034247.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2016034247.tif 000012
【図１０】
2016034247.tif 000013
【図１１】
2016034247.tif 000014
【図１２】
2016034247.tif 000015
【図１３】
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【図１４】
2016034247.tif 000017
【配列表】
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