(57)【要約】      （修正有）【課題】神経細胞の生存を促すこと、及び／又は腸の神経細胞の神経細胞死を制限若しくは予防すること、並びに修復プロセスにとって重要である神経細胞の増殖を促すことにより、腸内の神経系の保護を可能にする天然の成分に基づき組成物の提供。【解決手段】ラクトフェリンがラクトフェリンの豊富な乳画分又はホエイ画文として提供される、ラクトフェリンを少なくとも０．１ｇ／１００ｋｃａｌの濃度で含む食品組成物を、少なくとも０．０１ｇラクトフェリン／ｋｇ体重／日の摂取に相当する量で成人及び／又は高齢者に摂取させることのできる食品組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを成人及び／又は高齢者に投与されるべき少なくとも０．１ｇ／１００ｋｃａｌ組成物の濃度で含む摂取可能組成物。
【請求項２】
食料製品、動物食料製品、医薬組成物、栄養配合物、栄養補助食品、飲料、食品添加物、補給調合乳からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ラクトフェリンが、ラクトフェリンが豊富な、乳画分又はホエイ画分として提供される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
タンパク質供給源、脂質供給源及び炭水化物供給源を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
タンパク質供給源が、２ｇ／１００ｋｃａｌ組成物〜６ｇ／１００ｋｃａｌ組成物の間の量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
タンパク質供給源の５０重量％超がホエイタンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
脂質供給源が、組成物の総エネルギーの３０％〜５５％の間を占め、及び／又は炭水化物供給源が、組成物の総エネルギーの３５％〜６５％の間を占める、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ラクトフェリンが、約０．０１ｇ〜１００ｇ／１００ｋｃａｌ、好ましくは０．１ｇ〜５０ｇ／１００ｋｃａｌ、さらにより好ましくは２ｇ〜２５ｇ／１００ｋｃａｌの範囲の濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも約７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸、総脂肪酸の重量に関して少なくとも約０．１％のオメガ−３脂肪酸、及び／又は総脂肪酸の重量に関して少なくとも約０．２５％のオメガ−６脂肪酸をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも０．０１ｇラクトフェリン／ｋｇ体重／日の摂取に相当する量で投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
腸のニューロパシー及び腸のニューロパシーに関連する障害の治療又は予防において使用するための、ラクトフェリン又は請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
腸神経系の損傷の治療又は予防において使用するための、ラクトフェリン又は請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
腸神経系の修復において使用するための、ラクトフェリン又は請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
腸神経系の損傷に関連する障害の治療又は予防において使用するための、ラクトフェリン又は請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
障害が、低い消化力及び／若しくは吸収力、栄養不良、胃食道逆流、腸の運動不全、緩慢な腸の通過、便秘、慢性腸偽閉塞、便失禁、弱い腸バリアの機能、経腸栄養補給不耐性、腸の不快感、並びに／又は硬い大便からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、神経細胞の健康及び神経細胞の保護の分野に関する。本発明の一実施形態は、腸神経系の保護及び／又は修復のために使用することができる組成物に関する。腸神経系の損傷に関連する障害を、本発明によるラクトフェリン含有組成物の投与により治療又は予防することができる。
【背景技術】
【０００２】
神経系は、神経細胞及びグリア細胞から構成される極めて複雑なネットワークである。神経系は、全ての哺乳動物種に存在する。神経系は、中枢神経系（脳及び脊髄）、並びに末梢神経系（体性神経系、自律神経系及び腸神経系）から構成される。中枢神経系は、認知機能（記憶、注意、知覚、行為等）を推進する。
【０００３】
中枢神経系は、認知機能（記憶、注意、知覚、行為等）を推進する。中枢神経系は、末梢神経系と一緒になって、行動の制御における根本的な役割を担う。体性神経系は、（意識的な制御下の）身体の動作の協調に関与する。自律神経系は、意識的な制御を受けない身体活動（心拍数等）におけるホメオスタシスを維持する。最後に、消化管の機能、例として、腸バリア、運動性、吸収、消化及び分泌を直接制御する腸神経系は、したがって、自律神経系の一部と一緒になって、多岐にわたる腸の保護及び消化の快適さに寄与する。
【０００４】
神経系は、妊娠の間に発達し、次いで、生後期間の間には成熟した機能的ネットワークに精緻化する。
【０００５】
加齢と共に、又は腸のニューロパシーが伴う任意の病理学的状況（例えば、糖尿病、ＩＢＤ、ＩＢＳ等の腸の炎症、パーキンソン病、化学療法による治療に関連する腸の粘膜炎等）において、腸内の神経系が、例えば、環境要因又はストレスにより攻撃され、神経細胞の喪失が発生する。その結果として、腸神経系の損傷が生じ得る。
【０００６】
そのような腸神経系の損傷は、腸の機能障害、例として、栄養不良に寄与する低い消化力／吸収力、腸の運動不全（より緩慢な腸の通過から、便秘又は慢性腸偽閉塞まで）、弱い腸バリアの機能、経腸栄養補給不耐性（したがって、非経口栄養サポートが必要となる）、より硬い大便を伴う腸の不快感、及び感染の危険性の増加を起こす恐れがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現況技術を改善し、天然の成分に基づき、腸内の神経系の保護を可能にする組成物を提供することが本発明の目的であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的を、独立請求項の主題により達成した。
【０００９】
本発明者らは、ラクトフェリン、例えば、ラクトフェリンを補充した組成物を使用して、腸の神経細胞を保護することができることを実証し得た。
【００１０】
さらに、本発明者らは、ラクトフェリン、例えば、ラクトフェリンを補充した組成物を使用して、神経細胞の修復プロセスに有利に働き得る神経細胞の増殖を促すことができることも実証し得た。
【００１１】
ラクトフェリンの投与により、神経細胞の密度及び神経細胞の生存の増加が可能になることもさらに示すことができた。
【００１２】
また、ラクトフェリン（ＬＦ）は、ラクトトランスフェリン（ＬＴＦ）としても公知であり、抗菌活性を示し、先天的防御の一部を、主として、粘膜においてなすことが公知である球状の多機能性タンパク質である。
【００１３】
ラクトフェリンは、例えば、乳及びホエイ中、並びに涙及び唾液等の多くの粘膜分泌物中に見出すことができる。したがって、ラクトフェリンは、例えば、乳から精製することもでき、又は組換えにより産生することもできる。
【００１４】
本発明は、任意の供給源から入手可能なラクトフェリンに関する。
【００１５】
乳又はホエイに由来するラクトフェリンは、例えば、食品グレードの組成物から得られた天然の成分であり、その結果、食品組成物の豊富な画分として、さらに精製することなく使用され得る利点を有する。
【００１６】
組換えにより得られたラクトフェリンは、高い濃度で容易に産生され得る利点を有する。
【００１７】
ヒト初乳は、比較的高い濃度のラクトフェリンを有し、人乳、次いで、牛乳が続く。
【００１８】
本発明者らは、ラクトフェリン又はラクトフェリン豊富な組成物を使用して、神経細胞を変性から保護することができることを見出すに至った。そのような変性は、例えば、上記に列挙した状況又は病態に関連する任意のストレスに続く場合がある。ラクトフェリンは、神経細胞の生存を促すこと、及び／又は腸の神経細胞の神経細胞死を制限若しくは予防すること、並びに修復プロセスにとって重要である神経細胞の増殖を促すことが見出された。
【００１９】
成人又は高齢者において、本発明のラクトフェリン及び／又はラクトフェリン含有組成物を使用して、神経系を任意のストレスから保護し、その結果、ストレス誘導型の腸神経の機能障害を制限及び／又は予防することができる。
【００２０】
本発明の目的では、用語「成人」は、１８歳超の人々を含む。
【００２１】
対象が、出生国の平均寿命の最初の半分を超えている場合、好ましくは、出生国の平均寿命の最初の３分の２を超えている場合、より好ましくは、出生国の平均寿命の最初の４分３を超えている場合、最も好ましくは、出生国の平均寿命の最初の５分の４を超えている場合、対象を、「高齢者」とみなす。
【００２２】
ラクトフェリン及び／又は本発明の組成物を、例えば、
成人
高齢の人々
任意のタイプの生理学的若しくは病理学的な状態に関連する腸のニューロパシーを示している任意の成人若しくは高齢の人、及び／又は
腸の機能障害（消化障害、消化器の運動性障害、胃食道逆流、便秘、便失禁、経口栄養補給不耐性、非経口栄養補給）、腸閉塞の病態を示している任意の成人若しくは高齢の人
に投与することができる。
【００２３】
したがって、本発明の一実施形態は、ラクトフェリンが豊富な摂取可能組成物である。
【００２４】
豊富な（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）とは、ラクトフェリンが組成物に添加され、したがって、組成物の結果として生じるラクトフェリン含有量が、ラクトフェリンが添加されていない組成物のラクトフェリン含有量よりも高いこと、又は組成物中の天然ラクトフェリンの含有量を濃縮するための方法で、組成物を処理したことのいずれかを意味する。
【００２５】
また、ラクトフェリンを、純粋な化合物として提供することもできる。
【００２６】
あるいは、ラクトフェリンを、ラクトフェリン豊富な画分、例えば、ラクトフェリン豊富な乳画分又はラクトフェリン豊富なホエイ画分として提供することもできる。
【００２７】
乳又はホエイの供給源として、例えば、牛乳、人乳、ヤギ乳、ラクダ乳、馬乳及び／又はロバ乳を使用することができる。その上、初乳を使用することもできる。
【００２８】
治療的用途では、組成物を、障害及び／又は障害の合併症の症状を少なくとも部分的に治癒する又は停止させるのに十分な量で投与する。症状の少なくとも部分的な治癒又は停止を達成するのに適切な量を、「治療有効用量」と定義する。この目的に有効な量は、当業者に公知のいくつかの要因、例として、障害の重症度、並びに患者の体重及び全身状態に依存する。予防的な適用では、本発明による組成物を、特定の障害に罹患しやすい又は別の場合には特定の障害の危険性がある患者に、障害を発症する危険性を少なくとも部分的に低下させるのに十分な量で投与する。そのような量を、「予防有効用量」と定義する。ここでも、正確な量は、患者に特異的ないくつかの要因、例として、患者の健康状態及び体重に依存する。
【００２９】
ラクトフェリンを、本発明の枠組みにおいて、治療有効用量及び／又は予防有効用量で投与することができる。
【００３０】
典型的なラクトフェリン豊富な組成物は、ラクトフェリンを少なくとも１．６ｇ／Ｌの量で含むことができる。
【００３１】
例えば、本発明の組成物は、ラクトフェリンを少なくとも０．７５％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも１％（ｗ／ｗ）の濃度で含有することができる。
【００３２】
一実施形態では、組成物は、少なくとも０．２５ｇのラクトフェリン／日／ｋｇ体重、好ましくは少なくとも０．５ｇのラクトフェリン／日／ｋｇ体重、より好ましくは少なくとも１ｇのラクトフェリン／日／ｋｇ体重の摂取に相当する量で投与される。
【００３３】
例えば、妊娠中の母親及び／又は授乳中の母親については、組成物を、少なくとも１ｇのラクトフェリン／ｋｇ体重／日の摂取に相当する量で消費することができる。
【００３４】
ラクトフェリンは、組成物中に、１００ｋｃａｌ当たり少なくとも０．０１ｇ、好ましくは１００ｋｃａｌ当たり少なくとも０．１ｇの濃度で存在することができる。例えば、ラクトフェリンは、組成物中に１００ｋｃａｌの組成物当たり、約０．０１ｇ〜１００ｇ、好ましくは０．１ｇ〜５０ｇ、さらにより好ましくは２ｇ〜２５ｇの範囲で存在することができる。
【００３５】
また、ラクトフェリンは、例えば、シアル酸及び／また鉄等のその他の化合物と組み合わせて使用することもできる。
【００３６】
シアル酸は、９個の炭素からなる骨格を有する単糖であるノイラミン酸のＮ−又はＯ−置換誘導体の総称である。
【００３７】
本発明の目的では、任意のシアル酸を使用することができる。しかし、シアル酸が、以下の式を有することが好ましい。
【化１】
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【００３８】
Ｒ１は、Ｈ、アセチル、ラクチル、メチル、硫酸、リン酸、アンヒドロシアル酸、フコース、グルコース及び／又はガラクトースからなる群から選択することができる。
【００３９】
Ｒ２は、Ｎ−アセチル、Ｎ−グリコリル、アミノ、ヒドロキシル、Ｎ−グリコリル−Ｏ−アセチル及び／又はＮ−グリコリル−Ｏ−メチルからなる群から選択することができる。
【００４０】
Ｒ３は、Ｈ、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸及び／又はｎ−グリコリルノイラミン酸からなる群から選択することができる。
【００４１】
Ｒ１位の基は、同一であっても又は相互に異なってもよい。
【００４２】
例えば、シアル酸は、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝Ｎ−アセチル及びＲ３＝ＨであるＮ−アセチルノイラミン酸であり得る。本発明のさらなる実施形態によれば、シアル酸は、２−ケト−５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−ｄ−グリセロ−ｄ−ガラクトノヌロソニン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）又はそれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００４３】
本発明において使用するシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を含み、Ｎ−アセチルノイラミン酸は、以下の同義語及び略語を有する。すなわち、ｏ−シアル酸；５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロソニン酸；５−アセトアミド−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトヌロソニン酸；アセノイラム酸；Ｎ−アセチル−ノイラミネート；Ｎ−アセチルノイラミン酸；ＮＡＮＡ及びＮｅｕ５Ａｃ。
【００４４】
特定の好ましいラクトフェリン含有組成物は、シアル酸を、１００ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物〜１０００ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物の範囲、例えば、５００ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物〜６５０ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物の範囲の量で含有することができる。
【００４５】
本発明の組成物は、例えば、少なくとも約０．００１重量％のシアル酸を含むことができる。本発明のさらなる実施形態では、組成物は、少なくとも約０．００５重量％又は少なくとも約０．０１重量％のシアル酸を含むことができる。
【００４６】
あるいは又はさらに、ラクトフェリン含有組成物は、鉄を、約１ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物〜５０ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物、例えば、１０ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物〜３０ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）組成物の範囲の量で含有することができる。
【００４７】
１つのラクトフェリン含有組成物が、例えば、約８５２ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）のシアル酸及び２２ｍｇ／１００ｇ（ｗ／ｗ）の鉄を含有することができる。
【００４８】
本発明のラクトフェリン含有組成物は、３０ｋｃａｌ／１００ｇ組成物〜１０００ｋｃａｌ／１００ｇ組成物、好ましくは５０ｋｃａｌ／１００ｇ組成物〜４５０ｋｃａｌ／１００ｇ組成物の範囲のカロリー密度を有することができる。本発明のラクトフェリン含有組成物は、例えば、約４００ｋｃａｌ／１００ｇのカロリー密度を有することができる。
【００４９】
組成物の性質は、特に限定されない。組成物は、好ましくは、経口投与、経腸投与又は非経口投与のための組成物である。
【００５０】
組成物は、例えば、食料製品、動物食料製品、医薬組成物、栄養配合物、栄養補助食品、飲料、食品添加物、栄養サプリメント及び高齢の人々のための補給調合乳からなる群から選択することができる。
【００５１】
本発明の１つの典型的な実施形態では、組成物は、タンパク質供給源、脂質供給源及び炭水化物供給源を含有する。
【００５２】
非経口適用の形態では、組成物が、タンパク質供給源、脂質供給源及び炭水化物供給源を同時には含有しないことが好ましい場合がある。代わりに、非経口投与の間には、炭水化物供給源を、タンパク質供給源及び／又は脂質供給源と別個に投与して、詰まりの危険性を低下させる。
【００５３】
組成物は、１．４ｇ／１００ｋｃａｌ組成物〜１００ｇ／１００ｋｃａｌ組成物の間、好ましくは２ｇ／１００ｋｃａｌ組成物〜６ｇ／１００ｋｃａｌ組成物の間の範囲で存在することができるタンパク質供給源を含む。ラクトフェリンは、タンパク質であり、タンパク質供給源の一部とみなすべきである。
【００５４】
タンパク質のタイプが、本発明にとって重要な意味をもつとは考えられない。したがって、例えば、ホエイ、カゼイン及びそれらの混合物に基づくタンパク質供給源を使用することができる。ホエイタンパク質に関しては、酸ホエイ若しくはスイートホエイ又はそれらの混合物を使用することができ、さらに、何らかの比率のアルファ−ラクトアルブミンとベータ−ラクトグロブリンも望ましい。ホエイタンパク質は、加工スイートホエイであり得る。スイートホエイは、容易に入手可能な、チーズを作製する際の副産物であり、牛乳に基づく栄養調合乳の製造において頻繁に使用される。しかし、スイートホエイは、カゼイノ−グリコ−マクロペプチド（ＣＧＭＰ）と呼ばれる、望ましくないレベルでスレオニンに富み、トリプトファンが不足する構成成分を含む。スイートホエイからのＣＧＭＰの除去により、人乳のスレオニン含有量により近いスレオニン含有量を有するタンパク質が生じる。次いで、ＣＧＭＰを除去した加工スイートホエイ中では含有量が低いアミノ酸（主に、ヒスチジン及びトリプトファン）を、この加工スイートホエイに補充することができる。スイートホエイからＣＧＭＰを除去するためのプロセスが、ＥＰ８８０９０２に記載されており、ＣＧＭＰを除去した加工スイートホエイに基づく栄養調合乳が、国際公開第０１／１１９９０号パンフレットに記載されている。タンパク質は、未変化のタンパク質、又は加水分解されたタンパク質、又は未変化のタンパク質と加水分解されたタンパク質との混合物であり得る。（２％〜２０％の間の加水分解の程度の）部分的に加水分解されたタンパク質を、例えば、牛乳アレルギーを発症する危険性があると考えられる対象に供給するのが望ましい場合がある。加水分解されたタンパク質を必要とする場合、加水分解プロセスを、要望及び当技術分野で公知であるところに従って実施することができる。例えば、ホエイタンパク質の加水分解産物を、ＥＰ３２２５８９の記載に従う２工程で、ホエイ画分を酵素により加水分解することによって調製することができる。広範に加水分解されたタンパク質のためには、ホエイタンパク質に対して、５５℃で、Ａｌｃａｌａｓｅ２．４Ｌ（ＥＣ９４０４５９）、次いで、Ｎｅｕｔｒａｓｅ０．５Ｌ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ｆｅｒｍｅｎｔ  ＡＧから入手可能）、及び次いで、パンクレアチンを使用する三重加水分解を行うことができる。出発材料として使用するホエイ画分が、実質的にラクトースを含有しない場合、このホエイタンパク質は、加水分解プロセスの間には、はるかにより少ないリジンの阻害を被ることが見出されている。実質的にラクトースを含有しないことにより、リジンの阻害の程度を、総リジンの約１５重量％〜約１０重量％未満のリジン、例えば、約７重量％のリジンに低下させることができ、こうした低下は、タンパク質供給源の栄養の質を大幅に改善する。
【００５５】
ホエイタンパク質がいくつかの健康上の利益をもたらすことは公知である。例えば、ホエイタンパク質は容易に消化できる。ホエイ中のタンパク質画分（ホエイ内の総乾燥固体のおよそ１０％）は、いくつかのタンパク質画分、例えば、ベータ−ラクトグロブリン、アルファ−ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン及び免疫グロブリンを含む。一実施形態では、タンパク質供給源の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８５重量％が、ホエイタンパク質である。
【００５６】
本発明の組成物は、脂質供給源を含有することができる。脂質供給源は、任意の脂質であり得る。好ましい脂肪供給源は、乳脂肪、パームオレイン、高オレインヒマワリ油及び高オレイン紅花油を含む。また、必須脂肪酸のリノール酸及びα−リノレン酸を、魚油又は微生物油等、高い分量のあらかじめ形成されたアラキドン酸及びドコサヘキサエン酸を含有する少量の油として添加することもできる。脂質供給源は、好ましくは約５：１〜約１５：１、例えば、約８：１〜約１０：１の、ｎ−３脂肪酸に対するｎ−６脂肪酸の比を有する。
【００５７】
脂質供給源が存在する場合、脂質供給源は、組成物の総エネルギーの３０％〜５５％の間を占めることができる。
【００５８】
本発明の組成物は、炭水化物供給源を含有することができる。ラクトース、ショ糖、マルトデキストリン、デンプン及びそれらの混合物等の任意の炭水化物供給源を使用することができる。
【００５９】
炭水化物供給源は、組成物の総エネルギーの３５％〜６５％の間を占めることができる。
【００６０】
例えば、本発明の組成物は、約１．８〜３．０ｇ／１００ｋｃａｌの範囲のタンパク質、約４．４〜６．５ｇ／１００ｋｃａｌの範囲の脂質、及び／又は約１．７〜１２ｇ／１００ｋｃａｌの範囲の炭水化物を含むことができる。
【００６１】
組成物は液体である場合、組成物のエネルギー密度は、６０ｋｃａｌ／１００ｍｌ〜７５ｋｃａｌ／１００ｍｌの間であり得る。
【００６２】
組成物は固体である場合、組成物のエネルギー密度は、６０ｋｃａｌ／１００ｇ〜７５ｋｃａｌ／１００ｇの間であり得る。
【００６３】
また、本発明の組成物は、１日の食餌として、かつ栄養的に顕著な量で必須であると理解されている全てのビタミン及び鉱物を含有することもできる。特定のビタミン及び鉱物について、最小必要量が確立されている。組成物中に場合により存在する鉱物、ビタミン及びその他の栄養素の例として、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、葉酸、イノシトール、ナイアシン、ビオチン、パントテン酸、コリン、カルシウム、亜リン酸、ヨウ素、鉄、マグネシウム、銅、亜鉛、マンガン、塩化物、カリウム、ナトリウム、セレニウム、クロム、モリブデン、タウリン及びＬ−カルニチンが挙げられる。鉱物は通常、塩の形態で添加する。特定の鉱物及びその他のビタミンの存在及び量は、多数の要因、例として、組成物を投与する人又は動物の年齢、体重及び状態に応じて変化する。
【００６４】
また、組成物は、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株も含むこともできる。プロバイオティクスは、微生物細胞の調製物又は微生物細胞の構成成分であり、宿主の健康又は生活状態に対して有益な作用を示す。適切なプロバイオティクス細菌株として、フィンランドのＶａｌｉｏ  Ｏｙから、登録商標ＬＧＧの下で入手可能であるラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）ＡＴＣＣ５３１０３、ラクトバチルス・ラムノサスＣＧＭＣＣ１．３７２４、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＣＮＣＭ  Ｉ−２１１６、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）ＡＴＣＣ５５７３０、及びＢｉｏＧａｉａ  ＡＢから入手可能であるラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１７９３８、とりわけ、デンマークのＣｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｈａｎｓｅｎ  ｃｏｍｐａｎｙにより、登録商標Ｂｂ１２の下で販売されているビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）ＣＮＣＭ  Ｉ−３４４６、日本のＭｏｒｉｎａｇａ  Ｍｉｌｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄにより、登録商標ＢＢ５３６の下で販売されているビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−９９９が挙げられる。同様に、プロバイオティクスが存在する場合、プロバイオティクスの量も、好ましくは、人又は動物の年齢に応じて変化する。一般的にいえば、プロバイオティクスの含有量を、乳幼児の年齢の増加と共に、例えば、１０３ｃｆｕ／ｇ調合乳〜１０１２ｃｆｕ／ｇ調合乳、より好ましくは、１０４ｃｆｕ／ｇ調合乳〜１０８ｃｆｕ／ｇ組成物（乾重量）の間で増加させることができる。
【００６５】
また、組成物は、少なくとも１つのプレバイオティクスも０．３〜１０％の量で含有することもできる。プレバイオティクスは、結腸内の１つ又は限定された数の細菌の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することによって宿主に有益な影響を及ぼし、したがって、宿主の健康を改善する、消化されない食品成分である。そのような消化されない成分は、胃又は小腸において分解及び吸収されず、したがって、未変化で通過し、結腸に達するという意味においては未消化であり、結腸では、有益細菌により選択的に発酵する。プレバイオティクスの例には、特定のオリゴ糖、例として、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）が挙げられる。プレバイオティクスの組合せ、例として、９０％ＧＯＳと１０％の短鎖フルクト−オリゴ糖との組合せ、すなわち、登録商標ラフチロース（Ｒａｆｔｉｌｏｓｅ）（登録商標）の下で販売されている製品等、又は９０％ＧＯＳと１０％イヌリンとの組合せ、すなわち、登録商標ラフチリン（Ｒａｆｔｉｌｉｎｅ）（登録商標）の下で販売されている製品等を使用することができる。
【００６６】
特に好ましいプレバイオティクスは、ガラクト−オリゴ糖（複数可）とＮ−アセチル化オリゴ糖（複数可）とシアル酸付加オリゴ糖（複数可）との混合物であり、この混合物中では、Ｎ−アセチル化オリゴ糖（複数可）は、オリゴ糖混合物の０．５〜４．０％を構成し、ガラクト−オリゴ糖（複数可）は、オリゴ糖混合物の９２．０〜９８．５％を構成し、シアル酸付加オリゴ糖（複数可）は、オリゴ糖混合物の１．０〜４．０％を構成する。この混合物を以下、「ＣＭＯＳ−ＧＯＳ」と呼ぶ。好ましくは、本発明に従って使用するための組成物は、乾燥物質に基づいて２．５〜１５．０ｗｔ％のＣＭＯＳ−ＧＯＳを含有する。但し、組成物は、少なくとも０．０２ｗｔ％のＮ−アセチル化オリゴ糖、少なくとも２．０ｗｔ％のガラクト−オリゴ糖、及び少なくとも０．０４ｗｔ％のシアル酸付加オリゴ糖を含む。
【００６７】
適切なＮ−アセチル化オリゴ糖として、ＧａｌＮＡｃα１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、及びＧａｌβ１，６ＧａｌＮＡｃα１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃが挙げられる。Ｎ−アセチル化オリゴ糖は、グルコサミニダーゼ及び／又はガラクトサミニダーゼの、Ｎ−アセチル−グルコース及び／又はＮ−アセチルガラクトースに対する作用により調製することができる。等しく、この目的では、Ｎ−アセチル−ガラクトシルトランスフェラーゼ及び／又はＮ−アセチル−グリコシルトランスフェラーゼも使用することができる。また、Ｎ−アセチル化オリゴ糖は、それぞれの酵素（組換え若しくは天然）及び／又は微生物発酵を使用する発酵技術により産生することもできる。後者の場合、微生物に、微生物の天然の酵素及び基質を発現させること、又は微生物を、それぞれの基質及び酵素を産生するように工学的に作製することのいずれもが可能である。単一微生物の培養物又は混合培養物を使用することができる。Ｎ−アセチル化オリゴ糖の形成を、アクセプター基質により、ＤＰ＝１以上の任意の重合度（ＤＰ）から出発して開始することができる。Ｗｒｏｄｎｉｇｇ，Ｔ．Ｍ．；Ｓｔｕｔｚ，Ａ．Ｅ．（１９９９）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３８：８２７〜８２８に記載されているように、別の選択肢は、遊離の又はオリゴ糖（例えば、ラクツロース）に結合しているケト−ヘキソース（例えば、フルクトース）の、Ｎ−アセチルヘキソサミン又はＮ−アセチルヘキソサミン含有オリゴ糖への化学的変換である。
【００６８】
適切なガラクト−オリゴ糖として、Ｇａｌβ１，６Ｇａｌ、Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＧａｌβ１，６Ｇａｌβ１，６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，３Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ  Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、及びＧａｌβ１，４Ｇａｌβ１，４Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃが挙げられる。合成ガラクト−オリゴ糖、例として、Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＧａｌβ１，６Ｇａｌβ１，６Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、及びＧａｌβ１，３Ｇａｌβ１，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、Ｇａｌβ１，４Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、及びＧａｌβ１，４Ｇａｌβ１，４Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、及びそれらの混合物が、登録商標ヴィヴィナール（Ｖｉｖｉｎａｌ）（登録商標）及びＥｌｉｘ’ｏｒ（登録商標）の下で市販されている。オリゴ糖のその他の供給元は、Ｄｅｘｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、及びＫｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．である。あるいは、特定のグリコシルトランスフェラーゼ、例として、ガラクトシルトランスフェラーゼを使用して、中性オリゴ糖を産生することもできる。
【００６９】
適切なシアル酸付加オリゴ糖として、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ、及びＮｅｕＡｃα２，６Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃが挙げられる。これらのシアル酸付加オリゴ糖は、クロマトグラフィー技術又はろ過技術により、動物乳等の天然の供給源から単離することができる。あるいはまた、適切なシアル酸付加オリゴ糖は、特定のシアリルトランスフェラーゼを使用する生物工学によって、酵素（組換え若しくは天然の酵素）に基づいた発酵技術、又は微生物発酵技術のいずれかにより産生することもできる。後者の場合、微生物に、微生物の天然の酵素及び基質を発現させること、又は微生物を、それぞれの基質及び酵素を産生するように工学的に作製することのいずれもが可能である。単一微生物の培養物又は混合培養物を使用することができる。シアリル−オリゴ糖の形成を、アクセプター基質により、ＤＰ＝１以上の任意の重合度（ＤＰ）から出発して開始することができる。
【００７０】
組成物は場合により、有益な作用を示すことができるその他の物質、例として、ヌクレオチド、ヌクレオシド等を含有することもできる。
【００７１】
本発明において使用するための組成物は、任意の適切な様式で調製することができる。例えば、栄養調合乳は、タンパク質供給源、炭水化物供給源及び脂肪供給源を適切な比率で一緒にブレンドすることによって調製することができる。乳化剤を使用する場合、乳化剤は、ブレンド中に含めることができる。ビタミン及び鉱物を、この時点で添加することができるが、通常は、熱分解を回避するために、後から添加する。任意の親油性ビタミン、乳化剤等を、ブレンドする前に脂肪供給源中に溶解させることができる。次いで、水、好ましくは、逆浸透に曝してある水を、混入して、液体混合物を形成することができる。次いで、液体混合物を熱処理して、細菌量を低下させることができる。例えば、液体混合物を、約８０℃〜約１１０℃の範囲の温度まで、約５秒〜約５分かけて迅速に加熱することができる。加熱は、蒸気噴射により、又は熱交換器、例えば、プレート熱交換器により実施することができる。次いで、液体混合物を、例えば、急冷法により、約６０℃〜約８５℃まで冷却することができる。次いで、液体混合物を、例えば、第１の段階の約７ＭＰａ〜約４０ＭＰａ及び第２の段階の約２ＭＰａ〜約１４ＭＰａの２段階でホモジナイズすることができる。次いで、ホモジナイズした混合物を、さらに冷却して、任意の熱感受性の構成成分、例として、ビタミン及び鉱物を添加することができる。ホモジナイズした混合物のｐＨ及び固体含有量を、この時点で標定するのが好都合である。ホモジナイズした混合物を、適切な乾燥装置、例として、噴霧乾燥機又は凍結乾燥機に移し、粉末に変換する。粉末は、約５重量％未満の水分含量を有すべきである。プロバイオティクス（複数可）の添加が望まれる場合、プロバイオティクスを、任意の適切な方法に従って培養し、例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥により調製して、栄養調合乳に添加することができる。あるいは、食料製品に添加するのに適切な形態であらかじめ調製されている細菌調製物を、専門の供給元、例として、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｈａｎｓｅｎ及びＭｏｒｉｎａｇａから購入することもできる。そのような細菌調製物は、粉末の栄養調合乳に、空練りにより添加することができる。
【００７２】
ラクトフェリンは、上記の手順の間の任意の段階で添加することができるが、好ましくは加熱ステップの後に添加する。
【００７３】
本発明は、腸神経系の保護のため、並びに腸神経系の損傷に関連する障害の治療及び／又は予防のための組成物の調製のためのラクトフェリンの使用にも及ぶ。
【００７４】
腸のニューロパシーに、したがって、腸神経系の損傷に関連する障害として、例えば、栄養不良に寄与する低い消化力及び／又は吸収力、胃食道逆流、腸の運動不全（より緩慢な腸の通過から、便秘又は慢性腸偽閉塞まで、便失禁）、胃食道逆流、弱い腸バリアの機能、経腸栄養補給不耐性（したがって、非経口栄養サポートが必要となる）、より硬い大便を伴う腸の不快感、並びに感染の危険性の増加が挙げられる。
【００７５】
本発明の別の実施形態では、ラクトフェリン含有組成物を使用して、神経細胞移動の遅延を治療又は予防することができる。
【００７６】
本発明の組成物を使用して、神経細胞密度及び／又は神経細胞の生存を増加させることができる。
【００７７】
本発明において使用するためには、組成物が、ラクトフェリン又は消費されてラクトフェリンをもたらす化合物を含有することが必須である。組成物は、ラクトフェリンが豊富な必要はないが、ラクトフェリンが豊富なことが、より多くのラクトフェリンをより小さな体積で投与することができることから、好ましい場合がある。
【００７８】
ラクトフェリンを使用して、任意の種類の組成物を調製することができる。しかし、ラクトフェリンを、上記の記載に従う組成物として提供するのが好ましい。
【００７９】
組成物は、成人及び／又は高齢者に投与することができる。
【００８０】
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の全ての特徴を、開示する本発明の範囲から逸脱することなく自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明において使用するために記載した特徴は、本発明の組成物及び／又はラクトフェリンに適用することができ、逆もまたしかりである。
【００８１】
本発明のさらなる利点及び特徴が、以下の実施例及び図から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】基礎条件（未処理の細胞）における、並びに細胞を、神経栄養因子ＣＮＴＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）又は異なる濃度のラクトフェリンが豊富な牛乳画分のいずれかを用いて処理した後における、神経突起の伸長について陽性のＮＳ２０Ｙ細胞のパーセントを示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭであり、群により、ｎ＝３〜７である（基礎、ｎ＝７；ＣＮＴＦ、ｎ＝３；１ｕｇ／Ｌ、ｎ＝３；１０ｕｇ／Ｌ、ｎ＝７；１００ｕｇ／Ｌ、ｎ＝３；１ｍｇ／Ｌ、ｎ＝３；１０ｍｇ／Ｌ、ｎ＝５；１００ｍｇ／Ｌ、ｎ＝７；１ｇ／Ｌ、ｎ＝６）。データを、スチューデントｔ検定を用いて、基礎の未処理群と比較した。Ｐ＜０．０５の場合、差を有意であるとみなした。
【図２】腸内神経細胞を初代培養し、続いて、Ｈ２Ｏ２により誘発し、牛乳ラクトフェリンを用いて予防した、神経細胞に特異的なエノラーゼ（ＮＳＥ）の放出を示すグラフである。エノラーゼ（ＮＳＥ）は、神経細胞の細胞死のマーカーである。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８である。Ｐ＜０．０５の場合、差を有意であるとみなした。
【図３】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培養し、続いて、０．００１ｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌの範囲の異なる濃度の牛乳ラクトフェリンの存在下又は非存在下で、Ｈ２Ｏ２を用いて誘発した場合の、７−ＡＡＤ陽性細胞のパーセントを示すグラフである。
【図４】ＤＡＰＩ染色後の海馬のＣＡ２〜ＣＡ３の分野における核の形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
［実施例］
ラクトフェリンが豊富な牛乳画分の生物学的活性：インビトロにおける神経突起の伸長に関する作用
神経突起の伸長のプロセスは、神経細胞からの軸索の伸長を含み、神経突起の伸長のプロセスは、神経細胞の発達の一部である。ラクトフェリンが豊富な牛乳画分の、神経突起の伸長に対する影響を、十分に確立され、一般に使用されているインビトロにおけるバイオアッセイを使用して測定した。
【００８４】
手短に述べると、ＮＳ２０Ｙマウスの神経芽細胞腫細胞（ＤＳＭＺ）を、低温貯蔵から解凍し、組織培養用に処理されたフラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中に、およそ２７×１０３細胞／ｃｍ２の密度で蒔き、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）の存在下で拡大増殖した。プレーティングの２日後、細胞を、フラスコから機械的撹拌（フラスコを軽くたたくこと）により脱離させ、懸濁液を火炎処理したガラス製ピペットに数回通すことによって、単一細胞の懸濁液を得た。次いで、細胞を、１３ｍｍの円形カバーガラス上に、１０％ＦＣＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するＤＭＥＭの存在下、２，０００細胞／カバーガラスの密度で蒔いた。翌日、培地を、０．５％ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、及び試験しようとする異なる濃度の乳画分を含有するＤＭＥＭに切換えた。１日後、細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて固定し、カバーガラスをスライド上にマウントした。
【００８５】
全てのカバーガラスの画像を、Ａｘｉｏｐｌａｎ２顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて撮影した。デジタル画像を、２５個の規定された視野から、カバーガラスの直径にわたって撮影した（２０×の対物、Ａｘｉｏｃａｍ  ＭＲｃ、Ｚｅｉｓｓ）。細胞を、カバーガラスの端の第１の視野から、カバーガラスを横切って、１００個の細胞を数えるまで系統的に数えた。細胞を、神経突起の伸長について、陽性又は陰性のいずれかに関してスコア化した。細胞体から発する、軸索に類似する突起が、細胞体を超える長さに達する場合に、細胞が、神経突起の伸長について陽性であるとみなした。
【００８６】
スチューデントｔ検定を使用して、各群において、１つの対照の参照集団から得られた平均と、全てその他の処理から得られた平均との間で、平均の差を比較した。
【００８７】
以下の濃度のラクトフェリンが豊富な牛乳画分を試験した。すなわち、１μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１００μｇ／Ｌ、１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、１００ｍｇ／Ｌ及び１ｇ／Ｌ。異なる神経細胞集団の神経突起の伸長を促すことが以前に報告された周知の神経栄養因子である陽性対照（ＣＮＴＦ、毛様体の神経栄養因子、１００ｎｇ／ｍＬ）を設けた（Ｏｙｅｓｉｋｕ及びＷｉｇｓｔｏｎ、１９９６（Ｏｙｅｓｉｋｕ  ＮＭ、Ｗｉｇｓｔｏｎ  ＤＪ：Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｎｅｕｎｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ  ｆｒｏｍ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｎｅｕ−  ｒｏｎｓ、Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９９６；３６４：６８〜７７））。基礎対照は、未処理の細胞からなった。結果を、図１に示す。
【００８８】
ストレスからの神経細胞の保護
ラットの腸管神経細胞の初代培養物をウエル中に播種し、異なる濃度のウシラクトフェリン豊富な画分と共に４８時間インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（無菌のＰＢＳ、３７℃）を用いて３回洗浄した後、ラクトフェリンが存在しない、Ｈ２Ｏ２又はビヒクル（対照）を含有する細胞の培地中で１２時間インキュベートした。ラクトフェリンの、Ｈ２Ｏ２誘導型の神経細胞の細胞死に対する保護作用を、細胞の培地中で、神経細胞に特異的なエノラーゼ（ＮＳＥ）の放出を測定することにより評価した。酸化ストレスの後、異なる群の培地を、収集し、１２，０００ｒｐｍ（４℃）で１０分間遠心分離した。上清を収集し、培地中に放出したＮＳＥを、免疫放射線測定法により定量化した。結果を、ｎｇ／ｍＬで表す。図２に示すように、Ｈ２Ｏ２が、培地中のＮＳＥの有意な増加を誘発した（ｐ＜０．０５、ｎ＝８）。初代腸内神経細胞の、ラクトフェリン豊富な画分を用いた処理は、図２に示すように、Ｈ２Ｏ２誘導型のＮＳＥの放出を有意に予防した（ｐ＜０．０５、ｎ＝８）。
【００８９】
ウシラクトフェリンの神経保護特性を、ヒト神経細胞様細胞系（ＳＨ−ＳＹ５Ｙ−神経芽細胞腫細胞）を使用して確認した。手短に述べると、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を蒔き、２４時間放置し、異なる濃度のウシラクトフェリン豊富な画分を細胞の培地に添加し、続いて、４８時間放置した。Ｈ２Ｏ２、６時間、又は細胞の培地に直接添加したビヒクル（対照）と共に。最後に、細胞を０．１Ｍ  ＰＢＳを用いて洗浄してから、トリプシン−ＥＤＴＡを用いて収集した。次いで、細胞懸濁液を、上清と共にプールし、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、ペレットを、５００マイクロリットルのＰＢＳ０．１Ｍ中に再懸濁した。膜透過性を、フローサイトメトリーにより、７−ＡＡＤを蛍光マーカーとして使用して評価した。この評価のために、２００マイクロリットルの細胞懸濁液を、７−ＡＡＤと共に１０分間インキュベートしてから、ＢＤ  ＦＡＣＳアレイ（Ａｒｒａｙ）（商標）バイオアナライザーを使用して獲得を行った。７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を使用する、このフローサイトメトリーによるアッセイにより、生きた（７−ＡＡＤ陰性の）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞と、酸化ストレスに応答した遅発アポトーシス性／壊死性の（７−ＡＡＤ陽性の）ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞とを区別することが可能になった。図３に示す結果は、７−ＡＡＤ陽性細胞／細胞の総数のパーセントとして表した。図３に示すように、Ｈ２Ｏ２は、７−ＡＡＤ陽性細胞のパーセントの有意な増加を誘発した（ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞の、ラクトフェリンを用いた処理は、図３に示すように、７−ＡＤＤ陽性細胞のパーセントの、Ｈ２Ｏ２誘導型の増加を予防した。
【００９０】
ラクトフェリンは、神経細胞の密度及び神経細胞の生存を改善する
【００９１】
形態学的な検査を、ＭＲ獲得後に実施した。線条体、背側及び外側の海馬のレベルにおける近接切片を収集して、皮質及び海馬の構造、並びに白質の傷害を評価した。特定の細胞応答を決定するために、特定の細胞型を、免疫組織化学的検査を使用して標識した。白質の有髄化のマーカー（ＭＢＰ）と併せて、神経細胞（ＮｅｕＮ）、アストロサイト（ＧＦＡＰ）及び放射状グリア（ネスチン）の特異的標識化を実施した。手短に、方法論を以下に示した。
【００９２】
Ｐ７及びＰ２１のそれぞれにおいて、各群からの仔に、ケタラール（５０ｍｇ／ｍｌ；０．２〜０．５ｍｌ、ｉ．ｐ．）を使用して深部麻酔を施した。動物の心臓内に、０．９％ＮａＣｌ、次いで、４％パラホルムアルデヒドを灌流した。脳を取り出し、秤量し、４％パラホルムアルデヒド中で一晩、次いで、３０％スクロース中で最低限２４時間後固定し、−８０℃で切片化まで保存した。冠状切片（１０μｍ）を、背側の海馬のレベルで、クリオスタット（Ｍｉｃｒｏｍ  Ｃｒｙｏ−Ｓｔａｒ  ＨＭ  ５６０Ｍ、Ｍｉｃｒｏｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ドイツ）上で切断した。２００μｍ間隔の３つの切片を、各動物から収集した。
【００９３】
免疫組織化学的検査：ＭＢＰ（１：４００、ｂｒａｎｄ  ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ）に対する免疫反応性のために、アビジン−ビオチンのペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、米国）を使用して、脳組織を処理した。切片を、４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｂｒａｎｄ  ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ）中でブロックし、次いで、一次抗体と共に４℃で２４時間インキュベートし、その後、二次抗体（１：２００、ｂｒａｎｄ  ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ）、次いで、アビジン−ビオチンの複合体（１：２００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、米国）と共にインキュベートした。切片を、０．０１％過酸化水素中で、色素原である３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ、ｂｒａｎｄ  ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ）と反応させ、次いで、カバーガラスで覆った。
【００９４】
同じプロトコールを使用して、ネスチン（１：５００、ｂｒａｎｄ  ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ）、ＧＦＡＰ（１：４００、ｂｒａｎｄ  ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ）、及びＮｅｕＮ（１：２００、ｂｒａｎｄ  ｃｉｔｙ  ｃｏｕｎｔｒｙ）について、蛍光免疫組織化学的検査を行った。但し、切片は、アビジン−ビオチンの複合体中及びＤＡＢ中でインキュベートしなかった。
【００９５】
各実験群及び実験群のそれぞれの対照を、同時に染色した。一次抗体による処理を除くと、染色が生じなかった。
【００９６】
定量的解析を、メタモルフ（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）（登録商標）画像法システム（Ｍｅｔａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国）を使用して実施した。各動物についての値をプールし、各群について、平均±ＳＥＭの平均を計算した。解析の終わりまで開示されないコードを用いて観察者には分からないようにコード化したスライドを測定した。
【００９７】
結果を、以下及び図４に示す。
【００９８】
組織学的解析から、Ｐ７では、ＬＦ補充Ｄｅｘの仔（ｎ＝５）は、ＤＥＸ対照の仔と比較して、海馬のＣＡ２〜ＣＡ３の分野において核の形態及び神経細胞の密度を有意に増加させるに至ることが明らかになった。Ｐ７での皮質における神経細胞密度の減少は、神経細胞の喪失を示唆している。神経細胞密度は、正常な対照ビヒクル群に類似する（図４）。この特定の発達の時間枠内に投与したラクトフェリンは、海馬における、及び低栄養状態及びストレスに関連がある異常により、非常に損傷を受けやすい領域における神経細胞密度に影響を及ぼす。この結果は、ＬＦ投与が、神経細胞の生存及び神経細胞の保護を、例えば、若年のＩＵＧＲラットにおいて増加させることを示している。
【図１】
2016020357.tif 000003
【図２】
2016020357.tif 000004
【図３】
2016020357.tif 000005
【図４ａ】
2016020357.tif 000006
【図４ｂ】
2016020357.tif 000007
【図５】
2016020357.tif 000008
【図６】
2016020357.tif 000009
【図７】
2016020357.tif 000010
【図８】
2016020357.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月2日(2015.9.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトフェリンを少なくとも０．１ｇ／１００ｋｃａｌの濃度で含む食品組成物を、少なくとも０．０１ｇラクトフェリン／ｋｇ体重／日の摂取に相当する量で成人及び／又は高齢者に摂取させることを含む、成人及び／又は高齢者の腸神経細胞をストレスから保護するための食品組成物提供方法（医療行為を除く）。
【請求項２】
前記食品組成物が、食料製品、栄養配合物、栄養補助食品、飲料、食品添加物及び補給調合乳からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ラクトフェリンが、ラクトフェリンが豊富な、乳画分又はホエイ画分として提供される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記食品組成物が、タンパク質供給源、脂質供給源及び炭水化物供給源を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記食品組成物が、前記タンパク質供給源を、２ｇ／１００ｋｃａｌ〜６ｇ／１００ｋｃａｌの間の量で含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質供給源の５０重量％超がホエイタンパク質である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記脂質供給源が、前記食品組成物の総エネルギーの３０％〜５５％の間を占め、及び／又は前記炭水化物供給源が、前記食品組成物の総エネルギーの３５％〜６５％の間を占める、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記食品組成物が、ラクトフェリンを、０．１ｇ〜１００ｇ／１００ｋｃａｌの範囲の濃度で含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記食品組成物が、少なくとも７０ｍｇ／Ｌの総シアル酸、総脂肪酸の重量に関して少なくとも０．１％のオメガ−３脂肪酸、及び／又は総脂肪酸の重量に関して少なくとも０．２５％のオメガ−６脂肪酸をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月17日(2015.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
【図１】基礎条件（未処理の細胞）における、並びに細胞を、神経栄養因子ＣＮＴＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）又は異なる濃度のラクトフェリンが豊富な牛乳画分のいずれかを用いて処理した後における、神経突起の伸長について陽性のＮＳ２０Ｙ細胞のパーセントを示すグラフである。データは、平均±ＳＥＭであり、群により、ｎ＝３〜７である（基礎、ｎ＝７；ＣＮＴＦ、ｎ＝３；１ｕｇ／Ｌ、ｎ＝３；１０ｕｇ／Ｌ、ｎ＝７；１００ｕｇ／Ｌ、ｎ＝３；１ｍｇ／Ｌ、ｎ＝３；１０ｍｇ／Ｌ、ｎ＝５；１００ｍｇ／Ｌ、ｎ＝７；１ｇ／Ｌ、ｎ＝６）。データを、スチューデントｔ検定を用いて、基礎の未処理群と比較した。Ｐ＜０．０５の場合、差を有意であるとみなした。
【図２】腸内神経細胞を初代培養し、続いて、Ｈ２Ｏ２により誘発し、牛乳ラクトフェリンを用いて予防した、神経細胞に特異的なエノラーゼ（ＮＳＥ）の放出を示すグラフである。エノラーゼ（ＮＳＥ）は、神経細胞の細胞死のマーカーである。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝８である。Ｐ＜０．０５の場合、差を有意であるとみなした。
【図３】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を培養し、続いて、０．００１ｇ／Ｌ〜１ｇ／Ｌの範囲の異なる濃度の牛乳ラクトフェリンの存在下又は非存在下で、Ｈ２Ｏ２を用いて誘発した場合の、７−ＡＡＤ陽性細胞のパーセントを示すグラフである。
【図４ａ】身体に対する脳の比を示すグラフである。
【図４ｂ】Ｐ７での身体に対する脳の比を示すグラフである。
【図５】海馬における各マーカーの存在を示すグラフである。
【図６】皮質における各マーカーの存在を示すグラフである。
【図７】ＤＡＰＩ染色後の海馬のＣＡ２〜ＣＡ３の分野における核の形態を示す図である。
【図８】ＢＤＮＦの遺伝子発現を示すグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
結果を、以下及び図７に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
組織学的解析から、Ｐ７では、ＬＦ補充Ｄｅｘの仔（ｎ＝５）は、ＤＥＸ対照の仔と比較して、海馬のＣＡ２〜ＣＡ３の分野において核の形態及び神経細胞の密度を有意に増加させるに至ることが明らかになった。Ｐ７での皮質における神経細胞密度の減少は、神経細胞の喪失を示唆している。神経細胞密度は、正常な対照ビヒクル群に類似する（図７）。この特定の発達の時間枠内に投与したラクトフェリンは、海馬における、及び低栄養状態及びストレスに関連がある異常により、非常に損傷を受けやすい領域における神経細胞密度に影響を及ぼす。この結果は、ＬＦ投与が、神経細胞の生存及び神経細胞の保護を、例えば、若年のＩＵＧＲラットにおいて増加させることを示している。
【外国語明細書】
2016020357000001.pdf