(57)【要約】【課題】  浮遊細胞への遺伝物質の導入を、高効率で行うことを可能にする遺伝物質導入促進剤を提供する。【解決手段】  細胞接着性分子（Ａ）からなる、浮遊細胞（Ｃ）への遺伝物質導入促進剤。前記（Ａ）は、下記タンパク質（Ａ１）及び／又は（Ａ２）であることが好ましい。タンパク質（Ａ１）：ＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質。タンパク質（Ａ２）：カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニウム基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）により（Ａ１）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞接着性分子（Ａ）からなる、浮遊細胞（Ｃ）への遺伝物質導入促進剤。
【請求項２】
前記細胞接着性分子（Ａ）が、下記タンパク質（Ａ１）及び／又は（Ａ２）である請求項１に記載の遺伝物質導入促進剤。
タンパク質（Ａ１）：ＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質。
タンパク質（Ａ２）：カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニウム基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）により（Ａ１）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質。
【請求項３】
前記タンパク質（Ａ１）が、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が、２〜５０個連続して結合したポリペプチド鎖（Ｙ）を有するタンパク質である請求項２に記載の遺伝物質導入促進剤。
【請求項４】
前記タンパク質（Ａ１）が、ＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列又は前記ポリペプチド鎖（Ｙ）とが、直接又はＲＧＤ配列とポリペプチド鎖（Ｙ）との間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造を含むタンパク質である請求項３に記載の遺伝物質導入促進剤。
【請求項５】
前記タンパク質（Ａ２）１分子中に導入された官能基（Ｋ）の平均個数が１〜１５６個である請求項２〜４のいずれか１項に記載の遺伝物質導入促進剤。
【請求項６】
タンパク質（Ａ１）が配列（２９）で表されるタンパク質である請求項２に記載の遺伝物質導入促進剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝物質導入促進剤の存在下に、培地（Ｆ）中で浮遊細胞（Ｃ）に遺伝物質を導入する工程を有する遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１）の生産方法。
【請求項８】
前記浮遊細胞（Ｃ）が、浮遊細胞集合体を形成している請求項７に記載の生産方法。
【請求項９】
前記浮遊細胞集合体の平均粒子径が、１０〜２００μｍである請求項８に記載の生産方法。
【請求項１０】
前記細胞接着性分子（Ａ）の使用量が、前記（Ｆ）の体積に基づいて０．００１〜１０００μｇ／ｍｌである請求項７〜９のいずれか１項に記載の生産方法。
【請求項１１】
前記浮遊細胞（Ｃ）が、卵巣由来細胞、腎臓由来細胞及び浮遊培養可能な上皮系細胞からなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項７〜１０のいずれか１項に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝物質の導入促進剤及びこれを用いた浮遊細胞の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品は、バイオテクノロジーを用いて生産されるタンパク質を高度に精製した医薬品であり、目的の遺伝子を導入した培養細胞や細菌を大量培養させ、人にとって有用なタンパク質を精製することにより生産されている。特に動物細胞は、生産タンパク質に人と近い糖鎖修飾が可能であるためよく用いられているが、技術的な課題がいくつか存在し、そのひとつとして、培養動物細胞への遺伝子導入効率が低いことが挙げられる。特に大量培養を目的とした浮遊培養中の動物細胞への遺伝子導入効率が低く、改善が試みられている（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２０１２−５２７８７９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、浮遊細胞への遺伝物質の導入を、高効率で行うことを可能にする遺伝物質導入促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意研究を重ねてきた結果、本発明に到達した。すなわち、本発明は、細胞接着性分子（Ａ）からなる、浮遊細胞（Ｃ）への遺伝物質導入促進剤；前記遺伝物質導入促進剤の存在下に、培地（Ｆ）中で浮遊細胞（Ｃ）に遺伝物質を導入する工程を有する遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１）の生産方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の遺伝物質導入促進剤は、浮遊細胞への遺伝物質の導入を高効率で行うことを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の浮遊細胞（Ｃ）への遺伝物質導入促進剤は、細胞接着性分子（Ａ）からなる。
【０００８】
細胞接着性分子（Ａ）は、浮遊細胞（Ｃ）の表面に存在する受容体と結合することができ、浮遊細胞（Ｃ）へ刺激を与えることができる。
【０００９】
本発明における細胞接着性分子（Ａ）としては、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン及びレトロネクチン等が挙げられる。
（Ａ）は１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００１０】
細胞接着性分子（Ａ）としては、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から好ましいのは下記タンパク質（Ａ１）及び／又は（Ａ２）である。
タンパク質（Ａ１）：ＲＧＤ配列及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質。
タンパク質（Ａ２）：カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニウム基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）により（Ａ１）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質。
【００１１】
本発明において、タンパク質（Ａ１）は、天然物から抽出されたものでもよく、人工的に製造されるものでもよいが、動物由来成分を排除する観点から、人工的に製造されるタンパク質が好ましい。また、人工的な製造に用いられる方法としては、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等があり、製造できる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、（Ａ１）を製造できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
タンパク質（Ａ１）は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００１２】
本発明におけるタンパク質（Ａ１）はＲＧＤ配列を有し、タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＲＧＤ配列中のアミノ酸数の割合は、細胞結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、１％〜２０％が好ましく、更に好ましくは１％〜８％である。
タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＲＧＤ配列中のアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。
【００１３】
＜タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＲＧＤ配列のアミノ酸数の割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ１）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ１）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＲＧＤ配列中のアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＲＧＤ配列中のアミノ酸数の割合＝［｛ＲＧＤ配列の数｝×３］÷｛タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数｝×１００
【００１４】
本発明におけるタンパク質（Ａ１）はＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有し、タンパク質（Ａ１）の熱安定性の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２個以上連続して結合したポリペプチド鎖（Ｙ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）において、タンパク質（Ａ１）の熱安定性及び遺伝物質の導入効率の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の連続する個数は、２〜５０個が好ましく、更に好ましくは２〜３３個であり、特に好ましくは２〜１６個である。
【００１５】
タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合は、熱安定性及び遺伝物質の導入効率の観点から、４０％〜９０％が好ましく、更に好ましくは７０％〜９０％である。
タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合は、ＲＧＤ配列と同様にして以下の数式にて算出する。
タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数に対する全てのＧＡＧＡＧＳ配列（１）中のアミノ酸数の割合＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数｝×６］÷｛タンパク質（Ａ１）中の全アミノ酸数｝×１００
【００１６】
タンパク質（Ａ１）中のＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）との個数比率［（ＲＧＤ配列の個数）÷｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の個数｝］は、熱安定性、浮遊細胞の細胞接着性分子（Ａ）への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、０．００５〜０．５が好ましく、更に好ましくは０．０１〜０．２である。
【００１７】
タンパク質（Ａ１）は、タンパク質（Ａ１）の熱安定性の観点から、ＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に位置することが好ましく、特に好ましくはＲＧＤ配列とポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に位置することである。
【００１８】
タンパク質（Ａ１）は、分岐鎖を有していてもよいし、環状構造を有していてもよいし、一部が架橋していてもよいが、浮遊細胞への結合性という観点から、架橋されていないことが好ましく、更に好ましいのは環状構造有しない構造であり、特に好ましいのは直鎖構造である。尚、直鎖構造には、βシート構造（直鎖状ペプチドが折れ曲がって直鎖ペプチド同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造）も含まれる。
【００１９】
タンパク質（Ａ１）は、タンパク質（Ａ１）の熱安定性及び細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性の観点から、ＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが、必要により直接又はＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）との間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、ＲＧＤ配列の片末端又は両末端に後述するアミノ酸配列（Ｘ）を有するアミノ酸配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）とが交互に化学結合してなる構造であることが更に好ましい。
【００２０】
ＲＧＤ配列のＮ末端に結合するアミノ酸配列（Ｘ）としては、浮遊細胞への接合性の観点から、好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５）、ＧＧＰＡＶＴＧ配列（６）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（７）、ＧＡＡＶＣＥＰＧ配列（８）、ＧＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（９）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１０）、ＳＰＡＳＡＡＶＣＥＰＧ配列（１１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（１２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１３）、ＧＰＡＶＣＥＰＧ配列（１４）、ＧＰＡＬＣＶＳＥＰＧ配列（１５）及びＧＡＡＰＧＡＳ配列（１６）であり、更に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＧＡＡＶＴＧ配列（４）、ＧＬＰＧＰＫＧＤ配列（５）、ＧＧＰＡＶＴＧ配列（６）及びＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＴＧ配列（７）であり、特に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）及びＧＡＡＶＴＧ配列（４）である。
【００２１】
ＲＧＤ配列のＣ末端に結合するアミノ酸配列（Ｘ）としては、浮遊細胞への接合性の観点から、好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（１８）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（１９）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（２０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（２１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（２２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（２３）、ＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（２４）、ＣＤＡＧＹ配列（２５）、ＣＤＡＧＰＶＧＳＰ配列（２６）及びＳＡＧＰＳＡＧＹ配列（２７）であり、更に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）、ＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）、ＳＰＡＳＡＡＬＣＶＳ配列（１８）、ＳＰＡＳＡＡＶＣ配列（１９）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰ配列（２０）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＶＣ配列（２１）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰＧＰＡＬＣＶＳ配列（２２）、ＡＧＰＫＧＡＤＧＳＰ配列（２３）及びＳＰＡＳＡＡＧＰＶＧＳＰ配列（２４）であり、特に好ましいのは（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）、ＲＫＬＰＤＡ配列（３）及びＳＰＡＳＡＡＧＹ配列（１７）である。
【００２２】
ＲＧＤ配列の片末端又は両末端にアミノ酸配列（Ｘ）を有するアミノ酸配列は、アミノ酸配列（Ｘ）を複数個有していてもよく、複数個ある場合のアミノ酸配列（Ｘ）はそれぞれ同一でも異なっていてもよい。
【００２３】
タンパク質（Ａ１）中のＲＧＤ配列とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｙ）との繰り返し単位の数は、タンパク質（Ａ１）の熱安定性、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、１〜５０が好ましく、更に好ましくは２〜４０、特に好ましくは３〜３０、最も好ましくは４〜２０である。
【００２４】
タンパク質（Ａ１）の好適な例を以下に示す。
ＲＧＤ配列を１３個と（ＧＡＧＡＧＳ）9配列（２８）（Ｙ１）の１３個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する数平均分子量（以下、Ｍｎと略記）約１１万の配列（２９）のタンパク質｛「プロネクチンＦ」、プロネクチン（Ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ）は三洋化成工業（株）の登録商標（日本及び米国）である。三洋化成工業（株）製＜以下同じ＞｝；
ＲＧＤ配列を５個と（ＧＡＧＡＧＳ）3配列（３０）（Ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万の配列（３１）のタンパク質（「プロネクチンＦ２」）；
ＲＧＤ配列を３個と（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）を３個と（ＧＡＧＡＧＳ）3配列（３０）（Ｙ２）の３個とを有し、これらが（ＧＶＰＧＶ）2ＧＧ配列（２）、（ＧＡＧＡＧＳ）3配列（３０）、ＲＧＤ配列の順に並んだ繰り返し単位が化学結合してなる構造を有するＭｎ約１万の配列（３２）のタンパク質（「プロネクチンＦ３」）等。
【００２５】
本発明におけるタンパク質（Ａ２）は、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニウム基及びヒドロキシル基からなる群から選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物（Ｂ）によりタンパク質（Ａ１）中の反応性基を有するアミノ酸残基（Ｚ）を化学修飾して官能基（Ｋ）を導入したタンパク質である。
（Ａ２）は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００２６】
化合物（Ｂ）は、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、アンモニウム基及びヒドロキシル基からなるから選ばれる少なくとも１種の官能基（Ｋ）を有する化合物であれば制限なく使用でき、カルボキシル基を有する化合物（Ｂ１）、スルホ基を有する化合物（Ｂ２）、アミノ基を有する化合物（Ｂ３）、アンモニウム基を有する化合物（Ｂ４）及びヒドロキシル基を有する化合物（Ｂ５）等が挙げられる。
尚、官能基（Ｋ）とは、タンパク質（Ａ１）を化合物（Ｂ）により化学修飾することにより導入される官能基であり、化合物（Ｂ）は１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
カルボキシル基を有する化合物（Ｂ１）としては、炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコール、炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸及び炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミン等が挙げられる。
化合物（Ｂ１）中のカルボキシル基中のプロトンは、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等で置換されていてもよい。
【００２８】
炭素数２〜３０のカルボン酸のハロゲン化物は、ハロゲン化アシル（酸ハロゲン化物）ではなくハロゲン置換カルボン酸であり、フルオロ酢酸、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、２−クロロプロピオン酸、３−クロロプロピオン酸、ω−クロロオクタデカン酸、ω−ブロモエイコサン酸及びω−クロロトリコサン酸等が挙げられる。
【００２９】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアルコールとしては、ヒドロキシ酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、パントテン酸、グルクロン酸、サリチル酸、４−ヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシ基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ及びＴｈｒ）、ω−ヒドロキシオクタデカン酸、ω−ヒドロキシエイコサン酸及びω−ヒドロキシトリコサン酸等が挙げられる。
【００３０】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するスルホン酸としては、スルホ酢酸、スルホコハク酸、ｏ−スルホ安息香酸、ｍ−スルホ安息香酸、ｐ−スルホ安息香酸、２，４−ジスルホ安息香酸、３−スルホフタル酸、３，５−ジスルホフタル酸、４−スルホイソフタル酸、２−スルホテレフタル酸、２−メチル−４−スルホ安息香酸、２−メチル−３，５−ジスルホ安息香酸、４−プロピル−３−スルホ安息香酸、４−イソプロピル−３−スルホ安息香酸、２，４，６−トリメチル−３−スルホ安息香酸、２−メチル−５−スルホテレフタル酸、５−メチル−４−スルホイソフタル酸、５−スルホサリチル酸及び３−オキシ−４−スルホ安息香酸等が挙げられる。
【００３１】
炭素数２〜３０のカルボキシル基を有するアミンとしては、炭素数２〜２０のアミノカルボン酸及び炭素数４〜３０のペプチドが挙げられ、２−アミノ酢酸、３−アミノプロピオン酸、ω−アミノオクタデカン酸、ω−アミノエイコサン酸、アミノ酸｛アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）等｝及びアミノ酸が２〜１５個結合したペプチド等が挙げられる。
【００３２】
これらのカルボキシル基を含有する化合物（Ｂ１）の内、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、カルボン酸のハロゲン化物が好ましく、更に好ましくはクロロ酢酸である。
【００３３】
スルホ基を有する化合物（Ｂ２）としては、炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物（ハロゲン置換スルホン酸）、炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコール、炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸及び炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミン等が挙げられる。
化合物（Ｂ２）中のスルホ基中のプロトンは、アルカリ金属カチオン（ナトリウムイオン及びカリウムイオン等）及びアルカリ土類金属カチオン（カルシウムイオン等）等で置換されていてもよい。
【００３４】
炭素数２〜３０のスルホン酸のハロゲン化物としては、クロロスルホン酸（ＣｌＳＯ3Ｈ）、クロロエタンスルホン酸、フルオロスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、ω−クロロオクタデカンスルホン酸、ω−クロロトリコサンスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩）等が挙げられる。
【００３５】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアルコールとしては、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、３−ヒドロキシプロパンスルホン酸、ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、ω−ヒドロキシオクタデカンスルホン酸、ω−ヒドロキシエイコサンスルホン酸、ω−ヒドロキシトリコサンスルホン酸、スルホエチレングリコール、２−スルホプロピレングリコール、１，２−ジスルホプロピレングリコール、２−スルホブタンジオール、２−スルホヘキサンジオール、１，５−ジスルホヘキサンジオール、２，５−ジスルホヘキサンジオール、１，３，５−トリスルホヘキサンジオール、１，２，４−トリスルホヘキサンジオール、２−スルホウンドデカンジオール、４−スルホウンドデカンジオール、６−スルホウンドデカンジオール、２，４−ジスルホウンドデカンジオール及び２，６，１０−トリスルホウンドデカンジオール等が挙げられる。
【００３６】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するカルボン酸としては、上記のカルボキシル基を有するスルホン酸と同様である。
【００３７】
炭素数２〜３０のスルホ基を有するアミンとしては、スルファニル酸、２−アミノエタンスルホン酸、３−アミノプロパンスルホン酸、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、ω−アミノオクタデカンスルホン酸、ω−アミノエイコサンスルホン酸及びω−アミノトリコサンスルホン酸等が挙げられる。
【００３８】
これらのスルホン基を含有する化合物（Ｂ２）のうち、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、スルホン酸のハロゲン化物が好ましく、更に好ましくはクロロエタンスルホン酸である。
【００３９】
アミノ基を有する化合物（Ｂ３）としては、炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物及び炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコール等が含まれる。
【００４０】
炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数２〜１７のハロゲン化（塩素及び臭素等）アルキル基を有するアミンが挙げられ、具体的には、アミノエチルクロリド、Ｎ−メチルアミノプロピルクロリド、ジメチルアミノエチルクロリド、ジエチルアミノエチルクロリド、ジベンジルアミノエチルブロミド、ジメチルアミノプロピルブロミド、ジエチルアミノプロピルクロリド及びジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。
【００４１】
炭素数２〜３０のアミノ基を有するアルコールとしては、炭素数２〜１０のアルカノールアミン［モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノプロパノールアミン、ジプロパノールアミン、トリプロパノールアミン、モノブタノールアミン、ジブタノールアミン、トリブタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン等］及びこれらのアルキル（炭素数１〜１８）置換体［Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエタノールアミン、Ｎ−エチルジエタノールアミン、Ｎ−オクタデシルジエタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’−トリオクタデシル−Ｎ’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等］等が挙げられる。
【００４２】
これらのアミノ基を含有する化合物（Ｂ３）のうち、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物が好ましい。
【００４３】
アンモニウム基を有する化合物（Ｂ４）としては、化合物（Ｂ３）の４級化物が挙げられ、具体的には、化合物（Ｂ３）のアミノ基を４級化剤（メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等）によって４級化したもの等が挙げられる。
アンモニウム基を有する化合物（Ｂ４）の内、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、炭素数２〜３０のアミノ基を有するハロゲン化物を４級化したものが好ましく、更に好ましくはクロロエチルトリメチルアンモニウムクロリドである。
【００４４】
ヒドロキシル基を有する化合物（Ｂ５）としては、炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物及び炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸等が挙げられる。
【００４５】
炭素数２〜３０のアルコールのハロゲン化物としては、２−フルオロエタノール、クロロエタノール、３−ブロモプロピルアルコール、ｐ−クロロフェノール、ω−クロロオクタデシルアルコール、ω−ブロモエイコシルアルコール及びω−クロロトリコシルアルコール等が挙げられる。
【００４６】
炭素数２〜３０のヒドロキシル基を有するカルボン酸としては、カルボキシル基を有するアルコールと同様である。
【００４７】
ヒドロキシル基を含有する化合物（Ｂ５）の内、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、アルコールのハロゲン化物が好ましく、更に好ましくはクロロエタノールである。
【００４８】
化合物（Ｂ）の内、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、カルボキシル基を有する化合物（Ｂ１）及びスルホ基を有する化合物（Ｂ２）が好ましく、更に好ましいのはカルボン酸のハロゲン化物及びスルホン酸のハロゲン化物であり、特に好ましいのはクロロ酢酸、クロロエタンスルホン酸、クロロスルホン酸及びこれらの塩（アルカリ金属塩）であり、最も好ましくはクロロ酢酸、２−クロロエタンスルホン酸及びこれらの塩である。
【００４９】
タンパク質（Ａ２）において、導入される官能基（Ｋ）としては、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、カルボキシル基及びスルホ基が好ましい。
【００５０】
反応性基を有するアミノ酸残基（Ｚ）のアミノ酸残基とは、タンパク質（Ａ１）を構成するアミノ酸のペプチド結合を除いた残基である。（Ｚ）は、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から好ましくはタンパク質（Ａ１）のＮ末端及びＣ末端以外のアミノ酸残基である。
【００５１】
アミノ酸残基（Ｚ）が有する反応性基とは、化合物（Ｂ）と反応することができる反応性基であり、ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基及び第一級又は第二級アミノ基等が挙げられる。
反応性基のうち、化合物（Ｂ）との結合形成の容易さ、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び第一級アミノ基が好ましく、更に好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。
【００５２】
反応性基を有するアミノ酸残基（Ｚ）としては、セリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基等が挙げられる（バイオコンジュゲート  テクニークス、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ発行、１９９６）。
反応性基を有するアミノ酸残基（Ｚ）の内、化合物（Ｂ）との反応性の観点から、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、リシン残基、アルギニン残基、ヒスチジン残基及びトリプトファン残基が好ましく、更に好ましくはセリン残基、トレオニン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基であり、特に好ましくはセリン残基又はトレオニン残基である。
【００５３】
化合物（Ｂ）によりタンパク質（Ａ１）中の反応性基を有するアミノ酸残基（Ｚ）を化学修飾するには、タンパク質（Ａ１）と化合物（Ｂ）との化学反応によって、化学結合｛共有結合、イオン結合及び／又は水素結合等｝を介して、化合物（Ｂ）を結合させることが好ましいが、化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）との物理吸着（ファンデルワールス力による吸着）により化学修飾してもよい。
細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、化学結合を介して化合物（Ｂ）を結合させることが好ましい。
【００５４】
化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）とを化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開２００７−５１１２７号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合の内、結合の強さ、浮遊細胞接着性、再現性及び遺伝物質の導入効率の観点から、共有結合が好ましい。
化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジスルフォキシド、ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン及びこれらの少なくとも１種類を含む混合溶媒等が挙げられる。
【００５５】
化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）とを共有結合させる方法としては、例えば、タンパク質（Ａ１）に含まれる反応性基を有するアミノ酸残基の側鎖に有する反応性基がヒドロキシル基の場合、化合物（Ｂ）のうち、カルボン酸のハロゲン化物、スルホン酸のハロゲン化物又はアルコールのハロゲン化物（以下、ハロゲン化物と略する）を使用してエーテル化反応（ウイリアムソン合成法）する方法、化合物（Ｂ）のうち、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、カルボキシル化合物と略する）を使用してエステル化反応する方法が挙げられる。
【００５６】
タンパク質（Ａ１）に含まれる反応性基を有するアミノ酸残基の側鎖に有する反応性基がカルボキシル基の場合、カルボキシル基を有するアミン又はスルホ基を有するアミンを使用してアミド化反応する方法、カルボキシル基を有するアルコール又はスルホ基を有するアルコールを使用して、エステル化反応する方法等が挙げられる。
【００５７】
化合物（Ｂ）とタンパク質（Ａ１）とをイオン結合させる方法としては、例えば、タンパク質（Ａ１）に含まれる反応性基を有するアミノ酸残基の反応性基が有する官能基がアミノ基の場合、カルボキシル基を有するスルホン酸、スルホ基を有するカルボン酸又はヒドロキシル基を有するカルボン酸（以下、酸化合物と略する）を用いて中和反応する方法、アミノ基を塩酸等の酸を用いてアンモニウム塩にしてから、酸化合物を使用してイオン交換反応する方法が挙げられる。
【００５８】
タンパク質（Ａ２）において、反応性基を有するアミノ酸残基の化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数は、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、タンパク質（Ａ２）１分子あたり１〜１５６個が好ましく、更に好ましくは１０〜１２０個、特に好ましくは３０〜１１５個、最も好ましくは６０〜９０個である。
【００５９】
官能基（Ｋ）の平均個数は、ハロゲン化物を使用してエーテル化反応により化学修飾した場合、用いた化学修飾前のタンパク質（Ａ１）及び化学修飾されたタンパク質（Ａ２）について、ポストラベル法によるＨＰＬＣ測定による各アミノ酸のピーク面積から算出することができる。
【００６０】
＜ハロゲン化物により化学修飾されたタンパク質（Ａ２）中の官能基（Ｋ）の平均個数＞
タンパク質（Ａ２）中の官能基（Ｋ）の平均個数は、ポストラベル法によるＨＰＬＣ測定による各アミノ酸のピーク面積から、下記式により求めることができる（タンパク質に塩酸等の酸を加え加熱することにより、タンパク質をアミノ酸に加水分解してからオルトフタルアルデヒド又はニンヒドリンを用いてラベル化したアミノ酸をＨＰＬＣにより、アミノ酸のピーク面積を求める方法）。
尚、化学修飾されないグリシンのピークを標準として用いる。
タンパク質（Ａ２）中の官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βa÷αa）÷（β0÷α0）×γ｝
α0：タンパク質（Ａ１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β0：タンパク質（Ａ１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αa：タンパク質（Ａ２）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βa：タンパク質（Ａ２）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ：タンパク質（Ａ１）中の各アミノ酸の数
【００６１】
ハロゲン化物以外の化合物（Ｂ）により化学修飾した場合、官能基（Ｋ）の平均個数は、用いた化学修飾前のタンパク質（Ａ１）及び化学修飾されたタンパク質（Ａ２）について、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを測定し、ｍ／ｚ値およびそのピーク強度を求め、下記式により求めることができる。
【００６２】
＜ハロゲン化物以外の化合物（Ｂ）により化学修飾されたタンパク質（Ａ２）中の官能基（Ｋ）の平均個数＞
タンパク質（Ａ２）中の官能基（Ｋ）の平均個数＝｛［Σ（Ｍn×Ｎn）÷１００］−Ｍ0｝÷Ｌ
Ｍ0：タンパク質（Ａ１）のｍ／ｚ値
Ｍn：タンパク質（Ａ２）のｍ／ｚ値
Ｎn：タンパク質（Ａ２）の全ピーク強度の和を１００％とした場合のＭnのピーク強度の割合（％）
Ｌ：化合物（Ｂ）がタンパク質（Ａ１）中のアミノ酸残基（Ｚ）に結合した際に増加する分子量
Ｌは、例えば、化合物（Ｂ）がパントテン酸であり、パントテン酸のヒドロキシル基とタンパク質（Ａ１）に含まれるアミノ酸残基（Ｚ）の側鎖に有するカルボキシル基（反応性基）とを脱水縮合反応させた場合、下記のように計算できる。
Ｌ＝２１９（パントテン酸の分子量）−１８（水の分子量）＝２０１
したがって、この場合、Ｌは２０１である。
【００６３】
本発明の遺伝物質導入促進剤は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。
滅菌方法としては、特に限定されないが、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、プラズマ滅菌、γ線滅菌、アルコール滅菌、オートクレーブ滅菌及びろ過滅菌等が挙げられる。
【００６４】
本発明の遺伝物質導入促進剤を用いて浮遊細胞（Ｃ）に遺伝物質を導入することで、遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１）を効率的に得ることができる。
【００６５】
本発明の遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１）の生産方法は、本発明の遺伝物質導入促進剤の存在下に、培地（Ｆ）中で浮遊細胞（Ｃ）に遺伝物質を導入する工程を有していても良いする。本発明の生産方法は、遺伝物質導入促進剤が浮遊細胞（Ｃ）に結合することにより、細胞外の物質を取り込む作用が促進され、標的物質（Ｅ）中に含まれる遺伝物質の浮遊細胞質内への取り込みが促進され、効率よく遺伝物質を導入した浮遊細胞（Ｃ１）を生産することができる。したがって、本発明の生産方法により得られる浮遊細胞（Ｃ１）は、遺伝物質が高効率で導入されている。
【００６６】
本発明の遺伝物質導入促進剤は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００６７】
本発明における浮遊細胞（Ｃ）としては、卵巣由来細胞（ＣＨＯ細胞等）、腎臓由来細胞（ＨＥＫ細胞等）及び浮遊培養可能な上皮系細胞（ＭＤＣＫ細胞等）等が挙げられる。（Ｃ）は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００６８】
（Ｃ）の内、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、卵巣由来細胞、腎臓由来細胞及び上皮系細胞胞が好ましく、更に好ましいのは卵巣由来細胞、腎臓由来細胞及び上皮系細胞である。
【００６９】
本発明における培地（Ｆ）としては、無血清培地及び血清培地が好ましい。
（Ｆ）は１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００７０】
無血清培地としては、Ｇｒａｃｅ培地、ＩＰＬ−４１培地、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ培地、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭTMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴTM培地、ＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
【００７１】
これらの内、浮遊細胞の安定性の観点から、Ｏｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭTMＩ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＣＤ−ＣＨＯ培地、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＣＤ−ＣＨＯ  ＡＧＴTM培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地が好ましく、さらに好ましくはＯｐｔｉ−ＰＲＯTMＳＦＭ培地、ＶＰ−ＳＦＭ培地、ＣＤ２９３培地、２９３ＳＦＭＩＩ培地、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅTM２９３培地、ＤＭＥＭ培地及びこれらの混合培地である。
血清培地としては、上記無血清培地（ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥ培地、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＥＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地、ＡＳＦ１０３培地、ＡＳＦ１０４培地、ＡＳＦ３０１培地、ＴＣ−１００培地、Ｓｆ−９００ＩＩ培地、Ｅｘ−ｃｅｌｌ４０５培地、Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｆｉｖｅ培地、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地及びこれらの混合培地等）に血清を加えたもの等が挙げられる。
血清としては、ヒト血清及び動物血清（ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清及びマウス血清等）等が挙げられる。
【００７２】
培地（Ｆ）としては、必要に応じて血清、細胞増殖因子及び／又は抗菌剤等を添加したものも利用できる。培地、血清及びその使用量、細胞増殖因子及びその使用量、並びに抗菌剤及びその使用量の具体例としては、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものがそのまま利用できる。
【００７３】
本発明における遺伝物質としては、核酸分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ等）等が挙げられる。遺伝物質は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００７４】
本発明の生産方法で用いる浮遊細胞（Ｃ）への遺伝物質の導入は、遺伝物質を含有する標的物質（Ｅ）を用いて行うことができる。（Ｅ）は１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００７５】
標的物質（Ｅ）の重量に対する遺伝物質の重量割合は、細胞毒性及び遺伝物質の導入効率の観点から、標的物質（Ｅ）の重量に基づいて０．００１〜２０重量％が好ましく、更に好ましくは０．０５〜７重量％である。
【００７６】
標的物質（Ｅ）は、遺伝物質以外に、必要により遺伝子導入試薬、緩衝剤及び培地等を含有してもよく、遺伝物質の導入効率の観点から遺伝子導入試薬を含有することが好ましい。
【００７７】
遺伝子導入試薬としては、カチオン性高分子（スペルミン・プルラン等）、カチオン性脂質（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎTM２０００及びＨｉｌｙ  Ｍａｘ等）、リン酸カルシウム、ポリアミン試薬及びポリイミン試薬等が挙げられる。
遺伝子導入試薬は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
遺伝子導入試薬としては、細胞毒性及び遺伝物質の導入効率の観点から、カチオン性高分子、カチオン性脂質及びリン酸カルシウムが好ましい。
【００７８】
標的物質（Ｅ）の重量に対する遺伝子導入試薬の重量割合は、細胞毒性及び遺伝物質の導入効率の観点から、０．１〜１５重量％が好ましく、更に好ましくは０．５〜７重量％である。
【００７９】
緩衝剤としては、溶液内のｐＨを一定に保つ緩衝作用のあるものが含まれ、特に限定されないが、具体的には、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、硫酸、塩酸、クエン酸、乳酸、ピルビン酸、蟻酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、モノエタノールアミン及びジエタノールアミン等が挙げられ、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【００８０】
標的物質（Ｅ）の重量に対する緩衝剤の重量割合は、細胞毒性及び遺伝物質の導入効率の観点から、１〜７０重量％が好ましく、更に好ましくは１０〜５０重量％である。
【００８１】
標的物質（Ｅ）が含有する培地としては、前述の培地（Ｆ）で例示したものと同様のものが挙げられ、好ましいものも同様である。
標的物質（Ｅ）の重量に対する培地の重量割合は、細胞毒性及び遺伝物質の導入効率の観点から好ましくは１〜７０重量％重量％であり、更に好ましくは１０〜５０重量％である。
【００８２】
浮遊細胞（Ｃ）の播取量、培養条件及び培養後の細胞回収方法についても、特開２００５−２１０６号公報に記載されたものがそのまま利用できる。
【００８３】
浮遊細胞（Ｃ）を培養する際の攪拌速度は、（Ｃ）の増殖性の観点から、１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍが好ましく、更に好ましくは２０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍである。
遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１）の生産時の攪拌速度についても同様であり、好ましい範囲も同様である。
【００８４】
遺伝物質導入促進剤を浮遊細胞（Ｃ）に結合させた後、標的物質（Ｅ）を作用させる場合は、浮遊細胞（Ｃ）に標的物質（Ｅ）を直接投与してもよく、標的物質（Ｅ）を培地（Ｆ）で希釈してから投与してもよい。
【００８５】
浮遊細胞（Ｃ）は、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性の観点及び高効率で遺伝物質を導入する観点から浮遊細胞集合体を形成していることが好ましい。
【００８６】
浮遊細胞集合体を形成する方法については、公知の細胞接着性ポリペプチドの代わりに本発明の遺伝物質導入促進剤を使用する以外は同様にして、公知の方法が適用できる。
【００８７】
浮遊細胞集合体を形成する際の攪拌速度は、浮遊細胞（Ｃ）への結合性の観点から、１０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍが好ましく、更に好ましくは２０ｒｐｍ〜１００ｒｐｍである。
浮遊細胞（Ｃ１）の生産時の攪拌速度についても同様であり、好ましい範囲も同様である。
【００８８】
遺伝物質を作用させる時の浮遊細胞集合体の平均粒子径は、浮遊細胞（Ｃ）への遺伝物質の結合性の観点から、１０〜２００μｍが好ましく、更に好ましくは１０〜１００μｍである。
遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１）の集合体の平均粒子径は、浮遊細胞（Ｃ）の生存性の観点から、１０〜３００μｍが好ましく、更に好ましくは５０〜１５０μｍである。
尚、本発明における浮遊細胞集合体の粒子径は、後述の方法により求めることができる。
【００８９】
本発明の遺伝物質導入促進剤は、浮遊細胞（Ｃ）に遺伝物質を作用させる前及び遺伝物質と同時に使用することができる。浮遊細胞（Ｃ）に遺伝物質を作用させる前に使用する場合は、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞（Ｃ）への結合性及び遺伝物質の導入効率の観点から、０．０２〜２４時間前が好ましく、更に好ましくは０．０２〜６時間前、特に好ましくは０．５〜２時間前である。
【００９０】
本発明の生産方法における遺伝物質導入促進剤の使用量は、細胞接着性分子（Ａ）の浮遊細胞への結合性の観点及び高効率で遺伝物質を導入する観点から培地（Ｆ）の体積に基づいて好ましくは０．００１〜１０００μｇ／ｍｌであり、更に好ましくは０．０１〜１００μｇ／ｍｌであり、特に好ましくは０．０１〜１０００μｇ／ｍｌである。
【００９１】
本発明の生産方法における浮遊細胞（Ｃ）の数は、細胞増殖性及び遺伝物質の導入効率の観点から、培地（Ｆ）の体積に基づいて１，０００〜１０，０００，０００個／ｍｌが好ましく、更に好ましくは２，０００〜２００，０００個／ｍｌである。
【００９２】
遺伝物質の使用量は、細胞毒性及び遺伝物質の導入効率の観点から、浮遊細胞（Ｃ）１個当たり０．０００００００１〜０．０１μｇ／個が好ましく、更に好ましくは０．０００００５〜０．０１μｇ／個である。
【００９３】
本発明の生産方法における標的物質（Ｅ）の使用量は、遺伝物質の導入効率の観点から、培地（Ｆ）の重量に基づいて１〜２０重量％が好ましく、更に好ましくは５〜１５重量％である。
【実施例】
【００９４】
以下、実施例及び比較例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００９５】
製造例１［遺伝物質（遺伝子ベクター）の作製］
サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）及びホタルルシフェラーゼをコードする配列からなる１２．５ｋｂのプラスミドＤＮＡを有する大腸菌と、ＱｉａｇｅｎＭａｘｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）とを用いて、遺伝物質であるプラスミドＤＮＡ（ＣＭＶ−ＦＬ）を作製した。
【００９６】
製造例２［遺伝物質を含有する標的物質（Ｅ）の作製］
プラスミドＤＮＡ（ＣＭＶ−ＦＬ）を５０μｇ／ｍＬになるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈した。また、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎTM２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、ＯＰＴＩ−ＭＥＭで等倍希釈した。これらの溶液を等重量ずつ混ぜ合わせ、室温で１５分間放置し、標的物質（Ｅ１）を作製した。
【００９７】
実施例１［細胞接着性分子（Ａ−１）の作製］
特表平３−５０２９３５号公報実験例１−３に記載の方法と同様にして、ＲＧＤ配列を１３個と（ＧＡＧＡＧＳ）9配列（２８）（Ｙ１）の１３個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約１１万の配列（２９）のタンパク質を遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性分子（Ａ−１）を得た。
【００９８】
実施例２［細胞接着性分子（Ａ−２）の作製］
細胞接着性分子（Ａ−１）５０ｍｇとクロロ酢酸（和光純薬株式会社製）２３０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム（和光純薬株式会社製）１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、細胞接着性分子（Ａ−２）を得た。
【００９９】
実施例３［細胞接着性分子（Ａ−３）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエタンスルホン酸ナトリウム（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製）４０５ｍｇ」に変更したこと以外は実施例２と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−３）を得た。
【０１００】
実施例４［細胞接着性分子（Ａ−４）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエタノール（和光純薬株式会社製）９４ｍｇ」に変更したこと以外は実施例２と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−４）を得た。
【０１０１】
実施例５［細胞接着性分子（Ａ−５）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエチルアミン（東京化成工業株式会社製）２８０ｍｇ」に変更したこと以外は実施例２と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−５）を得た。
【０１０２】
実施例６［細胞接着性分子（Ａ−６）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド（和光純薬株式会社製）１５０ｍｇ」に変更したこと以外は実施例２と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−６）を得た。
【０１０３】
実施例７［細胞接着性分子（Ａ−７）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬株式会社製）３８０ｍｇ」に変更したこと以外は実施例２と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−７）を得た。
【０１０４】
実施例８［細胞接着性分子（Ａ−８）の作製］
配列（２９）のタンパク質と同様にして、ＲＧＤ配列を５個と（ＧＡＧＡＧＳ）3配列（３０）（Ｙ２）の５個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するＭｎ約２万の配列（３１）のタンパク質を遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製して細胞接着性分子（Ａ−８）を得た。
【０１０５】
実施例９［細胞接着性分子（Ａ−９）の作製］
細胞接着性分子（Ａ−８）５０ｍｇとクロロ酢酸（和光純薬株式会社製）１６０ｍｇとを４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．５ｍＬに溶解した後、その溶液を攪拌しながら、水酸化ナトリウム（和光純薬株式会社製）１００ｍｇを溶解した４．５Ｍ過塩素酸リチウム水溶液１．３２５ｍＬを一定速度で滴下した。室温（約２５℃）で１時間攪拌したのち、反応液を透析、凍結乾燥して、細胞接着性分子（Ａ−９）を得た。
【０１０６】
実施例１０［細胞接着性分子（Ａ−１０）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエタンスルホン酸ナトリウム（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社製）２８５ｍｇ」に変更したこと以外は実施例９と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−１０）を得た。
【０１０７】
実施例１１［細胞接着性分子（Ａ−１１）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエタノール（和光純薬株式会社製）６５ｍｇ」に変更したこと以外は実施例９と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−１１）を得た。
【０１０８】
実施例１２［細胞接着性分子（Ａ−１２）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「２−クロロエチルアミン（東京化成工業株式会社製）２００ｍｇ」に変更したこと以外は実施例９と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−１２）を得た。
【０１０９】
実施例１３［細胞接着性分子（Ａ−１３）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルクロリド（和光純薬株式会社製）１０５ｍｇ」に変更したこと以外は実施例９と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−１３）を得た。
【０１１０】
実施例１４［細胞接着性分子（Ａ−１４）の作製］
「クロロ酢酸２３０ｍｇ」を「クロロエチルトリメチルアンモニウムクロリド（和光純薬株式会社製）２７０ｍｇ」に変更したこと以外は実施例９と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−１４）を得た。
【０１１１】
＜細胞接着性分子（Ａ−２）中の官能基（Ｋ）の平均個数＞
細胞接着性分子（Ａ−２）１ｍｇを６Ｎ  塩酸２００μＬに加え脱気した。泡が発生しなるまで脱気した溶液を減圧密封下で１１０℃、２２時間の加水分解を行った。次に、エバポレーターを用いて６Ｎ  塩酸（和光純薬株式会社製）を試料希釈液（アミノ酸自動分析用試料希釈液  Ｎａ型  ｐＨ２．２０）に置換した後、２ｍｌになるように試料希釈液で希釈した。希釈した溶液を試料希釈液で更に１０倍希釈し、０．２μｍのフィルターを通し測定用試料とした。
分析はポストラベル法によるＨＰＬＣ測定を用いて行い、ラベル化試薬としてはオルトフタルアルデヒド、スタンダードとしてはアミノ酸混合標準液  Ｈ型を用いて、ＨＰＬＣでの溶出時間からアミノ酸の種類を同定した。
上記において、細胞接着性分子（Ａ−２）に代えて細胞接着性分子（Ａ−１）を用いる以外は同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
カラム：Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  Ａｍｉｎｏ−Ｎａカラム温度：６０℃
移動相：アミノ酸分析移動相セット（Ｎａ  型）（メーカー名：株式会社島津製作所）流速：０．６ｍｌ／ｍｉｎ検出波長：励起波長３５０ｎｍ，測定波長４５０ｎｍ
（Ａ−１）及び（Ａ−２）のＨＰＬＣのピーク面積から、下記式により官能基（Ｋ）の平均個数を算出した。なお、化学修飾されないグリシンのピークを標準として用いた。
官能基（Ｋ）の平均個数＝Σ｛γ−（βa÷αa）÷（β0÷α0）×γ｝
α0：細胞接着性分子（Ａ−１）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
β0：細胞接着性分子（Ａ−１）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
αa：細胞接着性分子（Ａ−２）中のグリシンのＨＰＬＣのピーク面積
βa：細胞接着性分子（Ａ−２）中の各アミノ酸のＨＰＬＣのピーク面積
γ：細胞接着性分子（Ａ−１）中の各アミノ酸の数
【０１１２】
細胞接着性分子（Ａ−２）に代えて細胞接着性分子（Ａ−３）〜（Ａ−７）を用いたこと以外は細胞接着性分子（Ａ−２）の場合と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−３）〜（Ａ−７）について、化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数を求めた。これらの結果を表１に示す。また、細胞接着分子（Ａ−１）に代えて細胞接着分子（Ａ−８）を用い、細胞接着分子（Ａ−２）に代えて細胞接着分子（Ａ−９）〜（Ａ−１４）を用いたこと以外は細胞接着性分子（Ａ−２）の場合と同様にして、細胞接着性分子（Ａ−９）〜（Ａ−１４）について、化学修飾により導入された官能基（Ｋ）の平均個数を求めた。
【０１１３】
【表１】
2016036337.tif 000002
【０１１４】
実施例１５［遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１−１）の作製］
１重量％ポリビニルアルコール（ＪＰ−１８、日本塩ビ・ポバール株式会社製）水溶液をコーティングして細胞が接着しないようにした細胞非接着性スピンナーフラスコ（Ｄｏｕｂｌｅ  ＣｅｌＳｔｉｒ  Ｓｐｉｎｎｅｒ  Ｆｌａｓｋ、Ｗｈｅａｔｏｎ社製）に、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２Ｋ培地（和光純薬株式会社製）８ｍｌ、ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液１ｍｌ（１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）［ＤＳファーマバイオメディカル株式会社製］、細胞接着性分子（Ａ−１）１ｍｌ（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ加え、８０ｒｐｍ、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて、３０分間旋回培養を行い、浮遊細胞集合体を含む培養液を得た。得られた浮遊細胞集合体について、以下の評価方法により求めた平均粒子径は２９μｍ、粒子径の標準偏差は４であった。続いて、浮遊細胞集合体を含む培養液へ標的物質（Ｅ１）を２００μＬ加え、８０ｒｐｍ、３７℃、二酸化炭素濃度５容量％のインキュベーター中にて、４８時間旋回培養を行った。培養後、細胞培地を１５ｍＬ遠心管に移し、４℃、１０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し上清を除去し、沈殿した細胞をＰＢＳ（リン緩衝溶液）１ｍＬで２回洗浄して、遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１−１）を得た。
【０１１５】
＜浮遊細胞集合体の平均粒子径及び粒子径の標準偏差の評価方法＞
得られた浮遊細胞集合体を含む培養液を、Ｕ底９６ｗｅｌｌプレートに１００μｌ添加し、浮遊細胞集合体の顕微鏡画像（倍率４０倍、ＣＫＸ４１、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を取得し、画像解析ソフト（ｉｍａｇｅ  Ｊ、アメリカ国立衛生研究所）及びマイクロメーター（目盛１０μｍ、目盛長１ｍｍ）を用いて解析することにより、得られた浮遊細胞集合体の平均粒子径を測定した。１種の浮遊細胞集合体について３回試験を実施し、３回の測定値の平均値（ｒave）算出した。また３回の測定結果をｒ1、ｒ2、ｒ3としたときの浮遊細胞集合体の粒子径の標準偏差を下記（１）式より算出した。標準偏差が小さいほど、遺伝子導入効率の高い浮遊細胞集合体を得ることができる。尚、画像解析ソフトにより得られる数値の単位が「ピクセル」であるため、マイクロメーターにより画像を計測して、１ピクセルが何μｍに相当するのかを算出し、実際の単位「μｍ」に換算した。
【０１１６】
【数１】
2016036337.tif 000003
【０１１７】
実施例１６〜２８［遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１−２）〜（Ｃ１−１４）の作製］
細胞接着性分子（Ａ−１）を表２のものに変更したこと以外は実施例１５と同様にして、遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１−２）〜（Ｃ１−１４）を得た。また、工程途中で得られた浮遊細胞集合体の粒子径と標準偏差をそれぞれ表２に示す。
【０１１８】
比較例１［比較用の遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１’−１）の作製］
細胞接着性分子（Ａ）を使用しない以外は実施例８と同様にして、比較用の遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１’−１）を得た。また、工程途中で得られた浮遊細胞集合体の粒子径と標準偏差をそれぞれ表２に示す。
【０１１９】
＜浮遊細胞（Ｃ）への遺伝物質の導入効率の評価＞
（１）ルシフェラーゼ活性の測定
遺伝物質が導入された浮遊細胞（Ｃ１）にルシフェラーゼアッセイシステムの細胞可溶化液（プロメガ社製）を５００μＬ加え、浮遊細胞溶解液とした。浮遊細胞溶解液を４℃、１４，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心分離し、その遠心上清の２０μＬとルシフェラーゼアッセイシステムのルシフェラーゼアッセイ溶液（プロメガ社製）１００μＬを混合し、この混合液の発光強度（ＲＬＵ）をルミノメーター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、Ｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７）により測定した。また浮遊細胞溶解液中の浮遊細胞（Ｃ１）のタンパク質の重量（ｍｇ）をＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃２３２３５）で測定した。これらのタンパク質量及び発光強度より、浮遊細胞（Ｃ１）のルシフェラーゼ活性［発光強度／浮遊細胞（Ｃ１）のタンパク質の重量］を求めた。ルシフェラーゼ活性は、１種の浮遊細胞（Ｃ１）について３回測定し、３回の測定結果をＬ1、Ｌ2、Ｌ3とした。
【０１２０】
（２）遺伝物質の導入効率の評価
下記（２）式から、Ｌ1、Ｌ2、Ｌ3のそれぞれに対して遺伝物質の導入効率を算出し、遺伝物質の導入効率の平均値（Ｚave）を算出した。値が大きいほど、遺伝物質の導入効率が高い。また、算出した遺伝物質の導入効率をＺ1、Ｚ2、Ｚ3としたときの、遺伝物質の導入効率の標準偏差を下記（３）式より算出した。標準偏差が小さいほど再現性が高いことを示す。
【０１２１】
【数２】
2016036337.tif 000004
【０１２２】
（２）式中、Ｌ’aveは比較例１で求めたルシフェラーゼ活性の３回の測定結果の平均値である。
【０１２３】
【数３】
2016036337.tif 000005
【０１２４】
実施例１６〜２８及び比較例１で得られた浮遊細胞（Ｃ１−１）〜（Ｃ１−１４）及び（Ｃ１’−１）の遺伝物質の平均導入効率と標準偏差を表２に示す。
【０１２５】
【表２】
2016036337.tif 000006
【０１２６】
表２の結果から、本発明の遺伝物質導入促進剤を用いて遺伝物質を導入した浮遊細胞のルシフェラーゼ活性は、用いない場合と比較して極めて高いことから、本発明の遺伝物質導入材を用いると浮遊細胞に対して高効率で遺伝物質を導入できることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明の遺伝物質導入促進剤は、浮遊細胞や浮遊培養中の細胞といった遺伝物質を導入することが難しい条件に対しても、高効率で遺伝物質を導入できるため、浮遊細胞用の遺伝物質導入促進剤として有効である。また、本発明の生産方法により遺伝物質を導入した浮遊細胞は、目的遺伝子が高効率で発現しており、研究や治療に用いる上で有用である。
【配列表】
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