(57)【要約】      （修正有）【課題】軟骨細胞における異化過程を阻害し、かつ軟骨及び／又はECMの変性を低下させる化合物を同定する方法及び手段を提供する。【解決手段】細胞外マトリックス（ECM）及び／又は軟骨変性過程を低下させる化合物を、ポリペプチド又はその機能的断片と、ポリペプチドが化合物に結合できる条件下で接触させることと、ECM及び／又は軟骨の変性の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定することとを含む、化合物を同定する方法。【選択図】図１
2016053575.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ECM及び／又は軟骨変性を阻害する化合物を同定する方法であって：
（a）化合物を、配列番号39及び40、並びにその断片からなる群から選択されるアミノ
酸配列を含むポリペプチドと接触させること；
（b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること；
（c）前記ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃
度の結合親和性を呈する化合物と接触させること；及び
（d）炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物であって、MMP13の発現
及び／又は活性を低下させる前記化合物を同定することを含む、前記方法。
【請求項２】
炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物を同定する方法であって：
（a）化合物を、配列番号39及び40からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを発現する哺乳類細胞の集団であって、1以上の炎症誘発性因子と接触されるこ
とによって活性化されている該細胞の集団と接触させること；
（b）前記細胞からのMMP13の発現を決定すること；及び
（c）炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物を、該細胞からのMMP13
の放出を抑制する化合物として同定することを含み、
前記化合物が、配列番号39及び40の群から選択されるアミノ酸に対して、少なくとも10
マイクロモル濃度の結合親和性を呈する、前記方法。
【請求項３】
前記工程（a）における1以上の炎症誘発性因子が、TNF-アルファ、IL-1、オンコスタチ
ンM（OSM）、IL-6、エンドセリン、ブラジキニン、リゾホスファチジン酸（LPA）、ロイ
コトリエン、プロスタグランジン、リポ多糖（LPS）又は他のTLRリガンドから選択される
、請求項２記載の方法。
【請求項４】
炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物を同定する方法であって：
（a）化合物を、配列番号39及び40からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドと接触させること；
（b）該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する該化合物の能力を決定すること；
（c）前記ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活
性を有意に阻害する化合物と接触させること；及び
（d）炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物であって、MMP13の発現
及び／又は活性を低下させる前記化合物を同定することを含む、前記方法。
【請求項５】
前記方法が、軟骨細胞の異化過程を阻害する化合物を同定するために用いられる、請求
項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
試験されるべき化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、請求項１〜５のいずれか
一項記載の方法。
【請求項７】
前記対照が、前記ポリペプチドが前記化合物と接触しなかった場合のものである、請求
項６記載の方法。
【請求項８】
前記化合物を対照と比較する工程を追加的に含み、ここで、該対照が、前記ポリペプチ
ドを発現しない哺乳類細胞の集団である、請求項２又は４記載の方法。
【請求項９】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物、並びに配列番号39及び40
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する結合親和性を有する
化合物からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、ファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーにおける
ペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症並びに／又は軟骨組織及び／若しくは細胞外マトリックス（ECM）の変
性を包含する医学的研究、炎症、軟骨生理学、及び疾患の分野に関する。より具体的には
、本発明は、薬剤及び化合物が軟骨細胞における異化過程を阻害し、かつ軟骨及び／又は
細胞外マトリックスの変性を低下させるであろう前記薬剤、及び前記化合物を同定するた
めの方法に関する。また、本発明は、その修飾がECM及び／又は軟骨の変性の低下を結果
的に生じ、かつ炎症を低下させる標的にも関する。加えて、本発明は、ECM及び／又は軟
骨の変性並びに炎症を特徴とする容態を治療する上での組成物及びその使用方法に関する
。また、本発明は、変形性関節症の治療において有用な化合物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は、その軟骨細胞が主要な細胞構成要素である無血管性組織である。正常な関節の
軟骨における軟骨細胞は、組織体積のおよそ5％を占めるのに対し、細胞外マトリックス
は、組織の残部の95％を構成する。軟骨細胞は、マトリックスの構成要素、主としてプロ
テオグリカン及びコラーゲンを分泌し、該構成要素が順に、軟骨細胞に、機械的ストレス
の下での生存に好適な環境を供給する。軟骨において、II型コラーゲンは、タンパク質IX
型コラーゲンとともに、優れた機械的強度を軟骨に提供する固形原線維様構造で配置され
る。プロテオグリカンは、水を吸収することができ、軟骨の弾性特性及び衝撃吸収特性の
原因となる。
【０００３】
関節における軟骨の機能的役割の1つは、骨が互いに関して潤滑に関節でつながること
ができることである。関節の軟骨の損失はそれゆえ、骨を互いに対して擦れさせ、疼痛及
び可動性の損失をもたらす。軟骨の変性は、種々の要因を有することができる。関節リウ
マチのような炎症性関節炎において、例えば、軟骨の変性は、炎症を受けた組織（例えば
、炎症を受けた滑膜）によるプロテアーゼ（例えば、コラゲナーゼ）の分泌によって生じ
る。また、軟骨の変性は、事故若しくは手術、又は過度の負荷若しくは「摩滅」による、
軟骨の損傷の結果でもあり得る。また、軟骨の変性は、軟骨合成（同化）過程及び軟骨変
性（異化）過程における不均衡の結果でもあるかもしれない。このような傷害後に軟骨組
織が再生する能力は限られている。損傷を受けた軟骨における軟骨細胞はしばしば、低い
同化活性及び／又は高い異化活性を示す。損傷、疾患、又は手術後に軟骨が自己修復する
限られた能力は、変性している関節表面及び半月状軟骨に対する損傷のリハビリテーショ
ンにおける主要な制限因子である。
【０００４】
軟骨の変性は、種々の疾患の顕著な特徴であり、該疾患のうち、関節リウマチ及び変形
性関節症が最も顕著である。
【０００５】
変形性関節症（OA又は摩滅関節炎ともいう。）は、関節炎の最も普遍的な形態であり、
骨の肥大及び疼痛としばしば関連した関節軟骨の損失を特徴とする。該疾患は主として、
手、並びに膝、股、及び脊椎など、重量支持関節に影響を及ぼす。この過程は、軟骨を薄
くさせる。表面積が、菲薄化により消失すると、グレードI変形性関節症に到達し；接線
方向の表面積が消失すると、グレードIIの変形性関節症に到達する。変性及び破壊のさら
なるレベルがあり、該レベルは、肋軟骨下骨と境界を接する深部にある石灰化した軟骨層
に影響を及ぼす。変形性関節症に関する広範な総説について、本発明者らは、Wielandら
の文献（2005）を引用する。
【０００６】
関節リウマチ（RA）は、慢性関節変性疾患であり、関節構造の炎症及び破壊を特徴とす
る。該疾患がチェックされていないと、関節の機能性の損失による実質的な能力障害及び
疼痛、並びに早期の死亡さえもたらす。RA治療法の目的はそれゆえ、該疾患を衰えさせる
ことではなく、関節の破壊を停止させるために寛解を果たすことである。該疾患の結果の
重症度のほかに、RAの高い有病率（成人の〜0.8％が世界規模で影響を受けている。）は
、高い社会‐経済的衝撃を意味する（RAに関する総説について、本発明者らは、Smolen及
びSteinerの文献（2003）；Lee及びWeinblattの文献（2001）；Choy及びPanayiの文献（2
001）；O'Dellの文献（2004）並びにFiresteinの文献（2003）を引用する。）。
【０００７】
変形性関節症の容態の発達に関する臨床的徴候は、大きな関節体積、疼痛をもたらす捻
髪音及び機能的能力障害、並びに低い関節可動性である。疾患がさらに発達すると、安静
時における疼痛が現れる。容態が、矯正及び／又は治療法なしで持続すれば、関節は、破
壊され、能力障害をもたらす。そこで、全体的な人工関節との交換手術が必要となる。
【０００８】
成熟関節軟骨において、軟骨細胞は、軟骨特異的マトリックス表現型を維持する。OAの
初期の徴候には、II型コラーゲンに対する損傷によるプロテオグリカンアグリカンの関節
軟骨からの漸増的損失を含む。このタンパク質は、健常個体における関節軟骨において認
められる主要な構造コラーゲンを表す。関節の正常なリモデリングの間の触媒酵素による
II型コラーゲンの産生とこのタンパク質の変性との間には通常、厳密な均衡がある。OAな
どの病理学的容態は、高いタンパク質変性によるこの均衡の損失を特徴とする。
【０００９】
一般的に、MMPの高い発現は、軟骨及び／又は細胞外マトリックスの変性と関連してい
るが、すべてのプロテアーゼが必ずしも、未変性コラーゲンを変性できるわけではない。
マトリックスメタロプロテアーゼのうち、MMP1、MMP8、MMP13、およびMMP14は、II型コラ
ーゲンを変性する最高能力を示す。MMP‐1（コラゲナーゼ‐1）及びMMP‐13の発現及び含
有量（Mitchelらの文献（1996）；Shlopovらの文献（1997））。MMP‐8の発現（コラゲナ
ーゼ‐2）、並びにコラゲナーゼ活性（Billinghurstらの文献（1997）、Dahlbergらの文
献（2000））は、ヒトOA軟骨において上方制御されている。特に、コラゲナーゼ‐3とし
ても公知もMMP‐13は、種々の観察によって示されるように、関節軟骨において、及び特
にOAにおいてII型コラーゲン変性における重要な役割を担っていると考えられる（Billin
ghurstらの文献（1997）、Mitchellらの文献（1996）、Dahlbergらの文献（2000）、Bill
inghurstらの文献（2000））。1）MMP13の発現は、半月板切除術のような関節炎に起因す
る手術に供されたOA患者の及び動物の軟骨において高い（Appletonらの文献（2007））。
2）関節軟骨におけるMMP1及びMMP13の局在は、軟骨切断によって誘発される新生エピトー
プを明らかにする抗体によって明らかにされるように、軟骨の破壊の一と一致するように
見える（Wuらの文献（2002））。3）トランスジェニックマウスの軟骨におけるMMP13の過
剰発現は、OA様軟骨破壊表現型をもたらした（Neuholdらの文献（2001））。4）II型コラ
ーゲンは、MMP‐13について好ましい基質である（Billinghurstらの文献（1997）；Mitch
ellらの文献（1996））。ひとまとめに考えると、MMP13は、OA誘発性の軟骨及びECMの変
性における鍵となる担い手として十分認められる。
【００１０】
変形性関節症疾患の間に現れる関節軟骨病変の矯正のための治療方法は開発されてきた
が、これまで、該方法のいずれも、関節軟骨の再生をインサイツ（in situ）及びインビ
ボで仲介することはできなかった。
【００１１】
変形性関節炎は、治療するのが困難である。目下、治癒は得られず、治療は、疼痛を緩
和すること、及び影響を受けた関節が変形するのを防止することに焦点を当てている。普
遍的な治療には、非ステロイド性抗炎症薬（NSAID）の使用を含む。コンドロイチン及び
硫酸グルコサミンなどの栄養補助食品が、変形性関節炎の治療及び寛解のための安全かつ
有効な選択肢として唱道されてきたが、近年の臨床治験は、両治療が、変形性関節炎と関
連した疼痛を低減しないことを明らかにした（Cleggらの文献（2006））。ひとまとめに
考えると、疾患を改変する変形性関節炎薬は入手可能ではない。
【００１２】
重症の場合、関節交換は必要かもしれない。このことは特に、股及び膝に対して真であ
る。関節が極度に有痛であり、交換できない場合、関節は融着し得る。この手順は疼痛を
停止させるが、関節機能の永続的な損失を結果として生じ、歩行及び屈曲が困難となる。
【００１３】
別の可能な治療は、培養された自己軟骨細胞の移植である。ここで、軟骨細胞材料は、
患者から採取され、実験室に送られ、そこで増殖される。次に、材料が損傷を受けた組織
に移植され、組織の欠陥を保護する。
【００１４】
別の治療には、滑液のレオロジーを一時的に改良する物質であるHylan G‐F 20（例え
ば、Synvisc（登録商標）、Hyalgan（登録商標）、Artz（登録商標））の関節内滴下注入
を含み、自由な動作のほぼ即時的な感覚及び疼痛の顕著な低下を生じる。
【００１５】
他の報告された方法には、腱、骨膜、筋膜、筋肉、又は軟骨膜の移植片の適用；フィブ
リン又は培養軟骨細胞の移植；コラーゲン、カーボンファイバーなどの合成マトリックス
の移植；電磁場の投与を含む。これらのすべては、最小かつ不完全な効果を報告しており
、重量のかけられた負荷を支持することもできず、正常な動作による関節の機能の修復も
できない質の乏しい組織を結果として生じる。
【００１６】
同化過程の刺激、異化過程の遮断、又はこれら2つの組み合わせは、軟骨の安定化、及
びおそらくは損傷の復帰さえを結果として生じ得、それゆえ、前記疾患のさらなる進行を
防止する。
【００１７】
本発明は、本発明者らによって同定された選択されたタンパク質（以後、「TARGETS」
と呼ぶ。）の機能と、軟骨及び／又は細胞外マトリックス（ECM）の変性の阻害並びに炎
症の阻害との間の関連性に関する。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、細胞外マトリックス（ECM）及び／又は軟骨変性過程を低下させる化合物を
、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（以後「TA
RGETS」）又はその機能的断片と、該ポリペプチドが化合物に結合できる条件下で接触さ
せることと、ECM及び／又は軟骨の変性の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測
定することとを含む、該化合物を同定する方法に関する。特定の実施態様において、化合
物‐ポリペプチド特性は、炎症性サイトカイン、例えば、IL‐1b、IL‐6、IL‐8、IL‐11
、TNFα、及び／又はLIFのレベルである。具体的な実施態様において、測定される化合物
‐ポリペプチド特性は、軟骨変性タンパク質又はコラゲナーゼなどのプロテアーゼの発現
レベルである。特定の実施態様において、測定される化合物‐ポリペプチド特性は、MMP1
、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4の発現レベルである。具体的な実施態
様において、測定される化合物‐ポリペプチド特性は、MMP13発現レベルである。
【００１９】
本方法の態様には、TARGETに相応するポリペプチド又はその断片（このような断片は、
配列番号22〜42の配列によって説明されるアミノ酸配列の断片である。）を用いる化合物
のインビトロアッセイ、及びTARGET阻害が、例えばTARGET発現レベル、TARGET酵素活性、
及び／又はMMP13レベルを含む有効性の指標を観察することによって追随される細胞アッ
セイを含む。
【００２０】
また、本発明は、
（1）アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA（siRNA）の群
から選択されるポリヌクレオチドを含む発現阻害薬（この中で、該ポリヌクレオチドは、
TARGETポリペプチドをコードする天然のポリヌクレオチド配列と相補的なまたは前記ポリ
ヌクレオチド配列から操作された核酸を含み、該ポリヌクレオチド配列は、配列番号1〜2
1からなる群から選択される配列を含む。）並びに
（2）ECM変性及び／又は変形性関節炎などの軟骨変性を特徴とする疾患の治療又は予防
において有用な、該薬剤を含む医薬組成物にも関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、有効なTARGET発現阻害量の発現阻害薬又は有効なTARGET活性阻害
量の活性阻害薬を含む医薬組成物を投与することによる、軟骨及び／又はECMの変性、骨
及び／又は関節の変性と関連した容態に罹患している又は罹患しやすい対象における前記
容態の治療又は予防の方法である。特定の実施態様において、容態は変形性関節炎である
。
【００２２】
本発明の別の態様は、有効なTARGET発現阻害量の発現阻害薬又は有効なTARGET活性阻害
量の活性阻害薬を含む医薬組成物を投与することによる、炎症と関連した容態に罹患して
いる又は罹患しやすい対象における炎症と関連した容態の治療又は予防の方法である。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、対象におけるTARGET発現及び／又は活性のレベルの指標の測
定を含む、軟骨及び／又はECM変性と関連した容態の診断のための方法である。
【００２４】
本発明のさらなる態様は、対象におけるTARGET発現及び／又は活性のレベルの指標の測
定を含む、炎症と関連した容態の診断のための方法である。
【００２５】
本発明の別の態様は、軟骨及び／又はECM変性を包含する疾患の治療に有用な、治療方
法、医薬組成物、及びこのような組成物の製造における、本明細書に開示されたTARGETを
阻害する薬剤の使用に関する。特に、本方法は、関節の変性を特徴とする疾患、特に異常
なMMP13発現を特徴とする疾患の治療におけるTARGETを阻害する薬剤の使用に関する。薬
剤は、変形性関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、痛風性関節炎
、化膿性又は感染性関節炎、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、有痛性骨
萎縮症、ティーツェ症候群又は肋軟骨炎（costal chondritis）、線維筋痛症、骨軟骨炎
、神経原性又は神経障害性関節炎, 関節症、地方性変形性骨軟骨関節症のような風土性形
態の関節炎、 ムセルニ病（Mseleni disease）、及びハンディゴデュ病（Handigodu dise
ase）；線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、強皮症、強直性脊椎炎、遺伝性軟骨溶解
、軟骨異形成症、及び偽軟骨異形成（pseudoachondrodysplasias）を含む先天性軟骨形成
異常、並びに先天性軟骨形成異常、例えば小耳症、無耳症、及び骨幹端軟骨異形成症から
結果として生じる変性を含むがこれらに限定されない軟骨変性を包含する疾患の寛解又は
治療に有用である。特定の実施態様において、疾患は、変形性関節炎、関節リウマチ、及
び炎症性関節炎から選択される。特定の実施態様において、疾患は変形性関節炎である。
【００２６】
本発明の別の態様は、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、自己免疫疾患、
移植片拒絶、クローン病、関節リウマチ、乾癬、若年性特発性関節炎、大腸炎、及び炎症
性腸疾患を含むがこれらに限定されない炎症を包含する疾患の治療に有用な治療方法、医
薬組成物、及びこのような組成物の製造における、本明細書に開示されたTARGETを阻害す
る薬剤の使用に関する。
【００２７】
また、さらなる態様において、本発明は、軟骨組織のインビトロでの製造のための方法
にも関する。
【００２８】
本発明の別のさらなる態様は、治療的に有効な軟骨及び／又はECM変性阻害量のTARGET
阻害薬又はその医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒和物、若しくはプロドラッグを、
医薬として許容し得る担体と混合して含む医薬組成物である。また、本ポリヌクレオチド
及びTARGET阻害薬化合物は、ECM変性、軟骨変性、及び／又は炎症を包含する容態の治療
のための医薬の製造にも有用である。
【００２９】
さらに、また、本発明は、診断方法にも関する。
【００３０】
他の目的および利点は、以下の実例となる図とともに採用される以下の説明に関する考
慮から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、正常ヒト関節軟骨細胞（NHAC）におけるMMP13アッセイについての一般的なスクリーニングプロトコールの原理を示す。
【００３２】
【図２】正常ヒト関節軟骨細胞におけるMMP13アッセイの模式図。
【００３３】
【図３】正常ヒト関節軟骨細胞におけるMMP13アッセイについて説明されるスクリーニングプロトコールを用いて試験した対照プレートの能力に関する代表的な例。
【００３４】
【図４】SilenceSelect（登録商標）回収物のスクリーニングバッチのうちの１つの間に得られたデータの例。
【００３５】
【図５Ａ】3MOI再スクリーン試行についての典型的なレイアウト。
【００３６】
【図５Ｂ】3MOIの再スクリーンにおいて得られた結果の例。
【００３７】
【図６】スクリーニングの間に得られた摩滅及びより詳細に分析された的中物の選択を示すスキーム。
【００３８】
【図７】表4は、SYBR（登録商標）Green定量的リアルタイムPCRに用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを列挙する。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（詳細な説明）
以下の用語は、下記に表された意味を有するよう意図され、本発明の明細書及び意図さ
れた範囲を理解する上で有用である。
【００４０】
用語「薬剤」は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化学物質の化合物、及び低
分子を含む任意の分子を意味する。特に、用語薬剤には、試験化合物又は薬剤候補化合物
などの化合物を含む。
【００４１】
用語「アゴニスト」は、最も広範な意味でリガンドが結合する受容体を刺激するリガン
ドを指す。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「アンタゴニスト」は、受容体への結合の際に生物学的
応答自体を惹起しないが、アゴニスト仲介性応答を遮断若しくは減弱させ、又はアゴニス
トの結合を防止若しくは低下させ、それによりアゴニスト仲介性応答を予防若しくは低下
させる化合物を示すために用いられる。
【００４３】
用語「アッセイ」は、薬剤の具体的な特性を測定するために用いられる任意のプロセス
を意味する。「スクリーニングアッセイ」は、薬剤の集まりからその活性に基づいて薬剤
を特徴付けまたは選択するために用いられるプロセスを意味する。
【００４４】
用語「結合親和性」は、2つ以上の化合物が、非共有結合関係において互いにどのよう
に強く会合しているかを示す特性である。結合親和性は、定性的に（「強い」、「弱い」
、「高い」、又は「低い」）又は定量的に（KDを測定することなど）特徴づけることがで
きる。
【００４５】
用語「担体」は、医薬組成物に媒介物、容積、及び／又は使用可能な形態を提供するた
めに医薬組成物の製剤において用いられる非毒性材料を意味する。担体は、賦形剤、安定
化剤、又は水性pH緩衝溶液など、このような材料の1つ以上を含み得る。生理学的に許容
し得る担体の例には、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸を含めた水性の又は固体の緩衝
成分；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清
アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンな
どの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリシンな
どのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の
炭水化物；EDTAなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；
ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／あるいはTWEEN（登録商標）、ポリエチレン
グリコール（PEG）、及びPLURONICS（登録商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられ
る。
【００４６】
用語「複合体」は、2つ以上の化合物が互いに結合し、接触し、又は会合する場合に作
られる実体を意味する。
【００４７】
用語「化合物」は、本発明のアッセイと関連して説明される「試験化合物」又は「薬剤
候補化合物」の文脈で本明細書で用いられる。このように、これらの化合物は、合成的に
、組換えで、又は天然源に由来する、有機化合物または無機化合物を含む。
【００４８】
化合物には、ポリヌクレオチド、脂質、又はホルモン類似体などの無機化合物又は有機
化合物を含む。他の生体ポリマー有機試験化合物には、約2〜約40のアミノ酸を含むペプ
チド、及び約40〜約500のアミノ酸を含むより大きなポリペプチドを含み、これには、ポ
リペプチドリガンド、酵素、受容体、チャネル、抗体、又は抗体抱合体を含む。
【００４９】
用語「容態」又は「疾患」は、症状（すなわち、病気）の明白な提示又は異常な臨床的
指標（例えば、生化学的指標又は診断指標）の顕在化を意味する。あるいは、用語「疾患
」は、遺伝的リスク若しくは環境的リスク又はこのような症状若しくは異常な臨床指標を
発達させる傾向を指す。
【００５０】
用語「接触する」又は「接触すること」は、インビトロの系であろうとインビボの系で
あろうと、少なくとも2つの部分を互いにまとめることを意味する。
【００５１】
用語「ポリペプチドの誘導体」は、ポリペプチドの連続したアミノ酸残基のひと続きを
含み、かつタンパク質、例えば、ポリペプチドの天然の形態のアミノ酸配列と比較してア
ミノ酸突然変異を有するポリペプチドの生物活性を保有する該ペプチド、オリゴペプチド
、ポリペプチド、タンパク質、及び酵素に関する。誘導体はさらに、ポリペプチドの天然
の形態のアミノ酸配列と比較して、追加的な天然の、変化した、グリコシル化した、アシ
ル化した、又は非天然のアミノ酸残基を含み得る。また、誘導体は、ポリペプチドの天然
の形態のアミノ酸配列と比較して、1つ以上の非アミノ酸置換基又は異種性のアミノ酸置
換基、例えば、アミノ酸配列に共有結合した又は非共有結合したリポーター分子又は他の
リガンドを含み得る。
【００５２】
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」は、ポリヌクレオチドの核酸残基のひと続きを含む
DNA分子、RNA分子、及びオリゴヌクレオチド、例えば、ポリヌクレオチドの天然の形態の
核酸配列と比較して核酸の突然変異を有し得るポリヌクレオチドに関する。誘導体はさら
に、PNA、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ) エチル-ホスホロチオアート、非天然
核酸残基、又はメチル-、チオ-、スルファート、ベンゾイル-、フェニル-、アミノ-、プ
ロピル-、クロロ-、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1つ以上の核酸置換基、あるい
はその検出を容易にするためのリポーター分子など、修飾された骨格を有する核酸を含み
得る。
【００５３】
用語「内在性」は、哺乳類が天然に産生する材料を意味するものとする。用語「プロテ
アーゼ」、「キナーゼ」、「因子」、又は「受容体」に対する言及における内在性は、哺
乳類（例えば、ヒトであって、これに限定されない。）によって天然に産生されるものを
意味するものとする。対照的に、この文脈における用語非内在性は、哺乳類（例えば、ヒ
トであって、これに限定されない。）によって天然には産生されないものを意味するもの
とする。両用語は、インビボの系及びインビトロの系の両方を説明するために利用するこ
とができる。例えば、制限することなく、スクリーニングアプローチにおいて、内在性又
は非内在性のTARGETは、インビトロスクリーニングの系に対する言及であり得る。さらな
る例としてかつ制限することなく、哺乳類のゲノムが非内在性TARGETを含むよう操作され
た場合、インビトロの系による候補化合物のスクリーニングは実現性がある。
【００５４】
用語「発現可能な核酸」は、タンパク質性分子、RNA分子、又はDNA分子をコードする核
酸を意味する。
【００５５】
用語「発現」は、内在性発現及び形質導入による過剰発現の両方を含む。
【００５６】
用語「発現阻害薬」は、細胞内で通常発現される具体的なポリペプチド又はタンパク質
の転写、翻訳及び／又は発現を選択的に干渉するよう設計されたポリヌクレオチドを意味
する。より具体的には、「発現阻害薬」は、具体的なポリペプチド又はタンパク質をコー
ドするポリリボヌクレオチド配列内の少なくとも約15〜30の、特に少なくとも17の連続し
たヌクレオチドと同一の又は相補的なヌクレオチド配列を含むDNA分子又はRNA分子を含む
。典型的な発現阻害分子には、リボザイム、二本鎖siRNA分子、自己相補性一本鎖siRNA分
子（shRNA）、遺伝的アンチセンスコンストラクト、及び修飾され安定化した骨格を有す
る合成RNAアンチセンス分子を含む。
【００５７】
用語「ポリヌクレオチドの断片」は、完全な配列と実質的に類似しているが同一である
必要のない活性を呈する連続した核酸残基のひと続きを含むオリゴヌクレオチドに関する
。特定の態様において、「断片」は、該完全な配列の核酸配列の少なくとも5核酸残基（
好ましくは、少なくとも10核酸残基、少なくとも15核酸残基、少なくとも20核酸残基、少
なくとも25核酸残基、少なくとも40核酸残基、少なくとも50核酸残基、少なくとも60核酸
残基、少なくとも70核酸残基、少なくとも80核酸残基、少なくとも90核酸残基、少なくと
も100核酸残基、少なくとも125核酸残基、少なくとも150核酸残基、少なくとも175核酸残
基、少なくとも200核酸残基、又は少なくとも250核酸残基）の核酸配列を含むオリゴヌク
レオチドを指し得る。
【００５８】
用語「ポリペプチドの断片」は、連続したアミノ酸残基のひと続きを含み、かつ完全な
配列と実質的に類似だが同一である必要のない、機能的な、又は発現活性を呈するペプチ
ド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、モノマー、サブユニット、及び酵素に
関する。特定の態様において、「断片」は、該完全な配列のアミノ酸配列の少なくとも5
アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも10アミノ酸残基、少なくとも15アミノ酸残基、少
なくとも20アミノ酸残基、少なくとも25アミノ酸残基、少なくとも40アミノ酸残基、少な
くとも50アミノ酸残基、少なくとも60アミノ酸残基、少なくとも70アミノ酸残基、少なく
とも80アミノ酸残基、少なくとも90アミノ酸残基、少なくとも100アミノ酸残基、少なく
とも125アミノ酸残基、少なくとも150アミノ酸残基、少なくとも175アミノ酸残基、少な
くとも200アミノ酸残基、又は少なくとも250アミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むペプチ
ド又はポリペプチドを指し得る。
【００５９】
用語「ハイブリダイゼーション」は、一本鎖の核酸が、塩基対形成を通じて相補鎖と結
合する任意のプロセスを意味する。用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補性塩
基間の水素結合の形成によって2つの核酸配列間に形成された複合体を指す。ハイブリダ
イゼーション複合体は、溶液中で形成され得（例えば、C0t又はR0t）、又は溶液中に存在
する1つの核酸配列と固相支持体（例えば、紙、メンブレン、フィルター、チップ、ピン
、若しくははガラススライド、又は細胞若しくは当該核酸が固定された任意の他の適切な
基体）上に固定化された別の核酸配列の間に形成され得る。用語「ストリンジェントな条
件」は、ポリヌクレオチドと要求されたポリヌクレオチドの間でハイブリダイゼーション
を可能にする条件を指す。ストリンジェントな条件は、塩濃度、有機溶媒、例えばホルム
アミドの濃度、温度、及び当技術分野で周知の他の条件によって規定することができる。
特に、遠濃度を低下させること、ホルムアミドの濃度を増大させること、又はハイブリダ
イゼーション温度を上昇させることは、ストリンジェンシーを増すことができる。用語「
標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の両方につ
いて5×SSC及び65℃と実質的に等価の塩条件及び温度条件を指す。しかしながら、当業者
は、このような「標準的なハイブリダイゼーション条件」が、緩衝液中のナトリウム及び
マグネシウムの濃度、核酸配列の長さ及び濃度、パーセントミスマッチ、パーセントホル
ムアミド、及びこれらの類するものによることを認識するであろう。また、ハイブリダイ
ズする2つの配列が、RNA‐RNA、DNA‐DNA、又はRNA‐DNAであるかどうかも、「標準的な
ハイブリダイゼーション条件」の決定において重要である。このような標準的なハイブリ
ダイゼーション条件は、周知の定則に従って当業者によって容易に決定され、この中で、
ハイブリダイゼーションは、予測又は決定されたTm未満で典型的には10〜20℃であり、所
望の場合、より高いストリンジェンシーの洗浄をともなう。
【００６０】
用語「阻害する」又は「阻害すること」は、用語「応答」との関連性において、応答が
、化合物の不在下とは対照的に、化合物の存在下で低下又は予防されることを意味する。
用語阻害又は阻害することは、より一般的には、特に化合物の存在下対化合物の不在下で
、活性又は測定可能な現象の相対的な低下、減少又は防止を指す。
【００６１】
用語「阻害」は、タンパク質又はポリペプチドの発現又は活性の不在又は最小化を結果
的に生じるプロセスの低下、下方制御、又はプロセスに対する刺激の除去を指す。
【００６２】
用語「誘導」は、タンパク質又はポリペプチドの発現又は活性を結果的に生じるプロセ
スの誘導、上方制御、又は刺激を指す。
【００６３】
用語「リガンド」は、内在性の天然の受容体に特異的な内在性の、天然の、又は合成の
、非天然の分子を含む分子を意味する。
【００６４】
用語「医薬として許容し得る塩」は、本明細書に開示されたTARGETSの発現または活性
を阻害する化合物の非毒性の、無機の、及び有機の酸付加塩及び塩基付加塩を指す。これ
らの塩は、本発明において有用な化合物の最終的な単離及び精製の間にインサイツで調製
することができる。
【００６５】
用語「ポリペプチド」は、タンパク質（TARGETSなど）、タンパク質性分子、タンパク
質の断片、モノマー、ポリマータンパク質のサブユニット又は部分、ペプチド、オリゴペ
プチド、及び酵素（キナーゼ、プロテアーゼ、GPCRなど）に関する。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖又は二本鎖の形態における、及びセンス又はアン
チセンスの向きにおけるポリ核酸、ストリンジェントな条件下で特定のポリ核酸とハイブ
リダイズする相補的なポリ核酸、その塩基対の少なくとも約60％で、より具体的には、そ
の塩基対の70％が共通である、最も具体的には90％、及び特定の実施態様においてはその
塩基対の100％で相同であるポリヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドには、ポリ
リボ核酸、ポリデオキシリボ核酸、及びそれらの合成類似体を含む。また、ポリヌクレオ
チドには、ペプチド核酸（PNA）、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチルホスホ
ロチオアートなどの修飾された骨格を有する核酸も含む。ポリヌクレオチドは、長さが変
動し、約10〜約5000塩基、特に約100〜約4000塩基、より具体的には約250〜約2500塩基に
及ぶ配列によって説明される。1つのポリヌクレオチド実施態様は、長さ約10〜約30塩基
を含む。ポリヌクレオチドの特定の実施態様は、約17〜約22ヌクレオチドのポリヌクレオ
チドであり、低分子干渉RNA（siRNA‐二本鎖siRNA分子又は自己相補的な一本鎖siRNA分子
（shRNA））としてより普遍的に説明される。別の特定の実施態様は、ペプチド核酸（PNA
）、ポリシロキサン、及び2'-O-(2-メトキシ)エチルホスホロチオアートなどの修飾され
た骨格を有する核酸、又は非天然の核酸残基、若しくはメチル-カルバヌクレオシド、チ
オ-カルバヌクレオシド、スルファートカルバヌクレオシド、ベンゾイル-カルバヌクレオ
シド、フェニル-カルバヌクレオシド、アミノ-カルバヌクレオシド、プロピル-カルバヌ
クレオシド、クロロ-カルバヌクレオシド、及びメタノカルバヌクレオシドなどの1つ以上
の核酸置換基、若しくはその検出を容易にするリポーター分子を含む核酸である。本明細
書のポリヌクレオチドは、特定の標的DNA配列の異なる鎖と「実質的に」相補的であるよ
う選択される。このことは、ポリヌクレオチドが、その個々の鎖とハイブリダイズするよ
う十分相補的でなければならないことを意味する。それゆえ、ポリヌクレオチド配列は、
標的配列の実際の配列を反映する必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片は、
ポリヌクレオチドの5'末端に結合し得、ポリヌクレオチドの配列の残りは前記鎖と相補的
である。あるいは、非相補的な塩基又はより長い配列は、ポリヌクレオチドに散在するこ
とができ、但し、ポリヌクレオチド配列が、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
するのに、又は伸長産物の合成のためのテンプレートを形成するのに十分な相補性を有す
ることを条件とする。
【００６７】
用語「予防すること（preventing）」又は「予防（prevention）」は、疾患を生じる薬
剤に曝露され得る、又は疾患の発症の前に疾患に罹患しやすくし得る対象において、疾患
又は障害を獲得又は発達させる危険の低下を指す。
【００６８】
用語「予防（prophylaxis）」は、用語「予防（prevention）」と関連し、該用語に包
含され、その目的が疾患を治療又は治癒させるよりもむしろ予防する（prevent）測定又
は手順を指す。予防的（prophylactic）測定に関する制限のない例には、ワクチンの投与
；例えば運動抑制による血栓症についての危険にある入院患者に対する低分子量ヘパリン
の投与；及びマラリアが風土性である又はマラリアにかかる危険性が高い地理的領域への
訪問の前のクロロキンなどの抗マラリア薬の投与を含み得る。
【００６９】
用語「溶媒和物」は、本発明において有用な化合物と1つ以上の溶媒分子との物理的会
合を意味する。この物理的会合には水素結合を含む。ある場合において、溶媒和物は、例
えば、1つ以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子に組み込まれる場合、単離することが
できるであろう。「溶媒和物」は、液相の溶媒和物及び単離可能な溶媒和物の両方を包含
する。代表的な溶媒和物には、水和物、エタノラート（ethanolate）、及びメタノラート
（methanolate）を含む。
【００７０】
用語「対象」には、ヒト及び他の哺乳類を含む。
【００７１】
「治療有効量」は、医師または他の臨床家によって探究されている対象の生物学的応答
又は医学的応答を誘発するであろう薬剤、化合物、発現阻害薬、又は医薬剤の量を意味す
る。
【００７２】
任意の疾患又は障害の用語「治療すること」又は「治療」は、一実施態様において、疾
患又は障害を寛解させること（すなわち、疾患を抑止すること、又はその臨床的症状の少
なくとも1つの徴候、程度、若しくは重症度を低下させること）を指す。別の実施態様に
おいて、「治療すること」又は「治療」は、対象によって認識不可能かもしれない少なく
とも1つの身体的パラメータを寛解させることを指す。さらに別の実施態様において、「
治療すること」又は「治療」は、疾患又は障害を身体的に（例えば、認識可能な症状の安
定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメータの安定化）、又はその両方のいずれかで
調節することを指す。さらなる実施態様において、「治療すること」又は「治療」は、疾
患の進行を遅延させることに関する。
【００７３】
また、用語「べクター」は、プラスミドに、及び組換えウイルスなどのウイルスベクタ
ー、又は組換えウイルスをコードする核酸に関する。
【００７４】
用語「脊椎動物細胞」は、魚、鳥類、爬虫類、両生類、有袋類、及び哺乳類の種を含む
、脊椎構造を有する動物由来の細胞を意味する。好ましい細胞は、哺乳類種由来であり、
最も好ましい細胞はヒト細胞である。哺乳類細胞には、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、
ヒツジ、マウス及びラットなどのブタネズミ、並びにウサギを含む。
【００７５】
用語「TARGET」又は「TARGETS」は、本明細書に説明されたアッセイに従って同定され
かつECM及び／又は軟骨の変性を包含されると決定されたタンパク質を意味する。用語TAR
GET又はTARGETSは、スプライスバリアント、対立遺伝子バリアント、フレームエクソンに
おける代替物、及び代替的な又は成熟前の終止部位又は開始部位などのバリアントを含み
及び予期し、これらには、表1に示されるようなそれらの公知の又は認識されたアイソフ
ォーム又はバリアントを含む。
【００７６】
用語「ECM及び／又は軟骨の変性を特徴とする疾患」は、細胞外マトリックスの分解又
は軟骨における分解を包含する、該分野を少なくとも一部結果として生じる、又は該分野
を含む疾患又は容態を指し、又はこの中で、軟骨及び／又はECMの分解、変性、又は損失
は、軟骨及び／又はECMの生成又は再生を超過する。前記用語には、変形性関節症、関節
リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、痛風性関節炎、化膿性又は感染性関節炎
、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、有痛性骨萎縮症、ティーツェ症候群
又は肋軟骨炎、線維筋痛症、骨軟骨炎、神経原性又は神経障害性関節炎, 関節症、地方性
変形性骨軟骨関節症のような風土性形態の関節炎、 ムセルニ病、及びハンディゴデュ病
；線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、強皮症、強直性脊椎炎、遺伝性軟骨溶解、軟骨
異形成症、及び偽軟骨異形成（pseudoachondrodysplasias）を含む先天性軟骨形成異常、
並びに先天性軟骨形成異常と関連した疾患、例えば小耳症、無耳症、及び骨幹端軟骨異形
成症から結果として生じる変性から選択される典型的な疾患を含むが、これらに限定され
ない。
【００７７】
用語「炎症を特徴とする疾患」は、炎症を包含する、炎症から少なくとも一部結果とし
て生じる、又は炎症を含む疾患を指す。前記用語には、アレルギー性気道疾患（例えば、
喘息、鼻炎）、自己免疫疾患、移植片拒絶反応、クローン病、関節リウマチ、乾癬、若年
性特発性関節炎、大腸炎、及び炎症性腸疾患から選択される典型的な疾患を含むが、これ
らに限定されない。
【００７８】
（TARGETS）
本発明は、TARGETSが、軟骨細胞の異化過程の制御における因子、特に阻害が軟骨及び
／又はECMの異化作用の低下をもたらす因子であるという本発明者らの発見に基づいてい
る。このような疾患は、軟骨及び／又はECMの分解と関連したタンパク質、例えば限定す
るわけではないが、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4、特にMMP13の
発現を追うことによってモニターされ得る。用語「TARGET」又は「TARGETS」は、ECM及び
／又は軟骨の分解の阻害に関与することが下記に説明されているアッセイに従って同定さ
れたタンパク質を意味する。
【００７９】
下記の表1に列挙されたTARGETSは、本明細書において、軟骨の異化作用を制御又は調節
する経路に関与するものとして、特に軟骨の異化作用を阻害することに関与するものとし
て同定され、それゆえ、これらのTARGETSの阻害薬は、軟骨細胞の分解を阻害することが
でき、軟骨の分解を特徴とする疾患の予防及び／又は治療において使用される。
【００８０】
また、TARGETSは、炎症過程における因子であり、特にTARGETSは、炎症誘発性刺激に対
する応答、特にIL1刺激に対する応答の低下に関与するものとして同定され、それゆえ、
これらのTARGETSの阻害薬は、炎症過程を阻害することができ、炎症を特徴とする疾患の
予防及び／又は治療において使用される。
【００８１】
それゆえ、一態様において、本発明は、化合物を配列番号22〜42の配列のポリペプチド
（TARGETS）又はその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、該ポリペプチドが化合
物に結合できる条件下で接触させること、及びポリペプチドと化合物の間の複合体形成を
検出することを含む、ECM及び／又は軟骨の分解を低下させあるいは炎症を阻害する化合
物をアッセイする方法に関する。特に、該方法は、軟骨の分解を阻害する薬剤を同定する
ために用いられる。特に該方法は、軟骨細胞を介した軟骨の分解を阻害する薬剤候補化合
物を同定するために用いられ得る。代替的な実施態様において、方法は、炎症を阻害する
薬剤を同定するために用いられる。代替的な実施態様において、方法は、ECM分解を阻害
する薬剤を同定するために用いられる。複合体形成を測定する1つの好ましい手段は、該
化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定することである。
【００８２】
より具体的には、本発明は、軟骨細胞によるECM及び／又は軟骨の分解を低下させる薬
剤を同定する方法に関し、該方法は下記を含む：
（a）軟骨細胞の集団を、TARGETポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を呈す
る1つ以上の化合物と接触させること、並びに
（b）ECM及び／または軟骨の分解の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定す
ること。
【００８３】
本発明のさらなる態様において、該方法は、例えば、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14
、及び／又はADAMTS4を含む1つ以上の軟骨分解酵素の発現又は活性を調節する化合物を同
定するために用いられる。特に、MMP13発現の阻害が測定され得る。
【００８４】
本発明のさらなる態様において、該方法は、例えばIL‐1b、IL‐6、IL‐8、IL‐11、TN
Fα、及び／又はLIFを含む1つ以上の炎症性サイトカインの発現又は活性を調節する化合
物を同定するために用いられる。
【００８５】
さらなる態様において、本発明は、化合物を配列番号22〜42からなる群から選択される
アミノ酸配列又はその断片を含むポリペプチドと、該化合物が、ポリペプチドの活性又は
発現を調節することのできる条件下で接触させること、及びポリペプチドの活性又は発現
を決定することを含む、軟骨及び／又はECMの分解を阻害する薬剤候補化合物をアッセイ
する方法に関する。特に、該方法は、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAM
TS4の発現を抑制すること、特にMMP13の発現を抑制することができる薬剤候補化合物を同
定するために用いられ得る。特に、該方法は、正常ヒト関節軟骨細胞（NHAC）におけるMM
P1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4、特にMMP13の発現を抑制することが
できる薬剤候補化合物を同定することであり得る。ポリペプチドの活性又は発現を測定す
る1つの特定の手段は、抗体などのポリペプチド結合剤を用いて該ポリペプチドの量を決
定すること、又は生物学的測定若しくは生化学的測定において該ポリペプチドの活性を、
例えば、キナーゼポリペプチドの標的のリン酸化の量、若しくは、酵素による又は酵素の
基質ポリペプチドに関する分解の量を決定することである。
【００８６】
先に言及された化合物‐ポリペプチド特性は、ECM及び／又は軟骨の分解の阻害に関し
、当業者によって選択された測定可能な現象である。測定可能な特性は例えば、ポリペプ
チドTARGETのペプチドドメインに対する結合親和性、又は軟骨細胞による低い異化作用の
いくつかの生化学的マーカーレベルのうちの任意の1つのレベルであり得る。軟骨細胞の
異化作用の阻害は例えば、分解経路の一部として誘導されるタンパク質及び他の分子のレ
ベルを測定することによって測定することができる。特に、MMP13のレベルが測定され得
る。
【００８７】
加えて、ECM及び／又は軟骨分解の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性は、正常
ヒト関節軟骨細胞（NHAC）、SW1353（軟骨肉腫細胞）、線維芽細胞（例えば、滑膜線維芽
細胞）、又は分化した間葉系幹細胞培養物において測定され得る。ある程度まで、このよ
うなタンパク質は、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4発現を含む軟
骨分解酵素の発現を呈する細胞において測定され得る。しかしながらまた、このようなタ
ンパク質は、代替的な細胞系においても測定される。例えば、化合物が本発明のポリペプ
チドに結合する親和性を決定するインサイツ結合アッセイは、ポリペプチドを発現する任
意の細胞種類を用いて実施される。ポリペプチドの発現は外来性又は内在性である。さら
に、化合物‐ポリペプチド特性が生物学的経路の活性化である場合、経路の細胞構成要素
を含む任意の細胞を用いて、化合物‐ポリペプチド特性を測定する。細胞は、これらの構
成要素を本質的に含み得、あるいは1つ以上の構成要素を発現するよう、又は標識され若
しくは測定可能な構成要素のバリアントを発現するよう操作され得る。例えば、NHACのIL
‐1刺激に応じたMMP13の誘導は、軟骨及び／又はECM分解を示す。具体的に、細胞は、MMP
13プロモーターによって活性化されたリポーター分子を含むよう操作することができる。
この方法で、代替的な細胞を用いて、軟骨及び／又はECM分解の阻害を示す特性を測定す
ることができる。
【００８８】
追加的な態様において、本発明は、化合物を、配列番号1〜21からなる群から選択され
る核酸配列又はその断片を含む、TARGETポリペプチドをコードする核酸と、該核酸が化合
物に結合できる又はそうでなければ会合できる条件下で接触させること、及び核酸と化合
物の間における複合体の形成を検出することを含む、軟骨及び／又はECMの分解を阻害す
る薬剤候補化合物をアッセイする方法に関する。特に、該方法は、分解経路の一部として
誘導されるタンパク質及び他の分子のレベルを低下させることのできる薬剤候補化合物を
同定するために用いられ得る。特に、該方法は、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び
／又はADAMTS4のレベルを低下させることのできる薬剤候補化合物を同定するために用い
られ得る。特に、該方法は、MMP13のレベルを低下させることのできる薬剤候補化合物を
同定するために用いられ得る。複合体形成を測定する1つの特定の手段は、該化合物の該
核酸に対する結合親和性、又は複合体の存在を、ヌクレアーゼに対する耐性によって又は
ゲル移動度アッセイによって決定することである。あるいは、複合体形成は、核酸の転写
又は翻訳の阻害によって決定され得る。
【００８９】
本発明は、軟骨及び／又はECMの分解を低下させる化合物を同定する方法に関し、該方
法は下記の工程を含む：表1に列挙されたもののうちの任意の1つのポリペプチド又はその
機能的断片若しくは誘導体を発現する細胞の集団を培養する工程；該細胞の集団における
IL‐1刺激に応じて第一のレベルのMMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4
発現を決定する工程；該細胞の集団を化合物又は化合物の混合物に曝露する工程；該細胞
の集団の化合物又は化合物の混合物への曝露の間又は後に該細胞の集団におけるIL‐1刺
激に応じてMMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4発現のレベルを決定す
る工程；並びに軟骨及び／又はECMの分解の低下を予測するMMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MM
P14、及び／又はADAMTS4の発現を低下させる化合物を同定する工程。具体的な実施態様に
おいて、先の方法において測定された軟骨分解酵素はMMP13である。
【００９０】
より特定には、本発明は、炎症を低下させる薬剤を同定する方法に関し、該方法は下記
を含む：
（a）細胞の集団を、TARGETポリペプチド又はその断片に対する結合親和性を呈する1つ
以上の化合物と接触させること、及び
（b）炎症の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定すること。
【００９１】
一実施態様において、炎症の阻害と関連した化合物‐ポリペプチド特性は、IL1刺激に
対する細胞の応答である。さらなる実施態様において、薬剤は、IL1刺激に対する細胞の
応答を低下させることができる。
【００９２】
また、本発明は、表1に列挙されたポリペプチドの任意の1つの発現及び／又は活性を低
下させる化合物を同定する方法にも関し、該方法は、以下の工程を含む：該ポリペプチド
、又はその断片、若しくはその誘導体を発現する細胞の集団を培養する工程；該ポリペプ
チドの第一レベルの発現及び／又は活性を決定する工程；該細胞の集団を化合物又は化合
物の混合物に曝露する工程；該細胞の集団の化合物又は化合物の混合物への曝露の間又は
後に該ポリペプチドの発現及び／又は活性のレベルを決定する工程；並びに該ポリペプチ
ドの発現及び／又は活性を低下させる化合物を同定する工程。ポリペプチド活性が容易に
測定可能でない場合、化合物の同定は、該細胞の集団を該ポリペプチドのアゴニストに曝
露することを含む余分な工程から利益を得ることができる。さらに、本発明の方法は、該
細胞の集団において、表1に列挙されたポリペプチドの任意の1つをコードする遺伝子を導
入する工程を含み得る。高処理目的のために、遺伝子を該細胞のゲノムに安定して組み込
ませることは有益であり得る。
【００９３】
好ましい実施態様において、軟骨及び／又はECMの分解の阻害のレベルは、マーカー遺
伝子の発現レベルを測定することによって決定され、この中で、特定のマーカー遺伝子は
、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4をコードする。具体的な実施態
様において、MMP13の発現及び／又は活性が測定される。具体的な実施態様において、MMP
13の発現及び／又は活性は低い。
【００９４】
本発明の特定の実施態様において、TARGETポリペプチドは、表1に列挙された配列22〜4
2からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。本発明の実施態様において、TARGETポ
リペプチドをコードすることのできる核酸は、表1に列挙された配列番号1〜21からなる群
から選択される核酸配列を含む。表1は、2つ以上の受入番号及び配列番号が示されている
認識されたバリアント又はアイソフォームを含むTARGETの典型的なヒト核酸及びタンパク
質配列を提供する。TARGET(S)のアイソフォーム又はバリアントには、フレームエクソン
における代替物、選択的スプライシング又はスプライスバリアント、及び選択的又は成熟
前終止バリアント（termination variant）を有する又は利用する核酸又はタンパク質を
含む。
【表１】
2016053575.tif 000003
2016053575.tif 000004
【００９５】
本発明は、特定の一実施態様において、ポリペプチドがGPCRである新規の化合物を同定
する方法を提供する。もしそうである場合、該GPCRの発現及び／又は活性は好ましくは、
セカンドメッセンジャーのレベルを測定することによって決定される。好ましいセカンド
メッセンジャーは、サイクリックAMP、Ca2+、又はその両方である。典型的には、セカン
ドメッセンジャーのレベルは、セカンドメッセンジャーに応答するプロモーターの制御下
でリポーター遺伝子を用いて決定され、この中で、プロモーターが、サイクリックAMP応
答性プロモーター、NF‐KB応答性プロモーター、又はNF‐AT応答性プロモーターであるこ
とが好ましく、かつこの中で、リポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、GFP、eGF
P、dGFP、ルシフェラーゼ、及びβ‐ガラクトシダーゼからなる群から選択される。GPCR
である典型的なTARGETは、表1に列挙され、GPR34、GPR43、MC3R、及びEDG4を含む。
【００９６】
別の特定の実施態様において、本発明は、ポリペプチドがキナーゼ又はホスファターゼ
である新規の化合物を同定する方法を提供する。好ましくは、該キナーゼ又はホスファタ
ーゼの活性は、該キナーゼ又はホスファターゼの基質のリン酸化のレベルを測定すること
によって決定される。キナーゼである典型的なTARGETSは、表1に列挙されており、MET、S
TK32B、MAP2K2、MAP4K1、EPHA5、及びCSNK1G2を含み、キナーゼである好ましいTARGETSは
、STK32B、EPHA5、及びCSNK1G2からなる群から選択される。キナーゼである特定の好まし
いTARGETSは、EPHA5及びCSNK1G2である。
【００９７】
さらに別の特定の実施態様において、本発明は、ポリペプチドがプロテアーゼである新
規の化合物を同定する方法を提供する。好ましくは、該プロテアーゼの活性は、該プロテ
アーゼの基質の切断のレベルを決定することによって測定される。プロテアーゼである典
型的なTARGETSは、表1に列挙されており、ADAMTS6及びADAM15を含む。
【００９８】
さらに別の特定の実施態様において、本発明は、ポリペプチドがイオンチャネルである
新規の化合物を同定する方法を提供する。イオンチャネルである典型的なTARGETは、表1
に列挙されており、KCNN4である。
【００９９】
セカンドメッセンジャーレベルを決定する方法、リポーター遺伝子及びセカンドメッセ
ンジャー応答性プロモーターの使用、並びにホスファターゼアッセイ及びプロテアーゼア
ッセイは、当技術分野で周知であり、本明細書でさらに詳しく述べることはない。
【０１００】
好ましい実施態様において、ポリペプチドを阻害する化合物は、最高10マイクロモル濃
度のポリペプチドに対する結合親和性を呈する。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様において、ポリペプチドTARGETは、配列番号22〜42からなる
群から選択されるアミノ酸配列を含む（表1）。
【０１０２】
当業者の選択に応じて、本アッセイ方法は、一連の測定として機能するよう設計でき、
その各々は、薬剤候補化合物が、実際にポリペプチドに作用していて、それにより軟骨及
び／又はECMの分解を阻害するかどうか、あるいは炎症を阻害するかどうかを決定するよ
う設計される。例えば、ポリペプチド又はその断片に対する化合物の結合親和性を決定す
るよう設計されたアッセイは、対象に投与される場合、試験化合物が、ECM及び／又は軟
骨の分解を低下させるのに有用であろうかどうかを確かめるために、あるいは試験化合物
が炎症を低下させるのに有用であろうかどうかを確かめるために必要かもしれないが十分
ではないかもしれない。それにもかかわらず、このような結合情報は、生化学的経路へと
さらに上る異なる特性を測定するであろうアッセイ、例えば、下記に説明されるMMP13ア
ッセイ又は軟骨外植片を用いたアッセイにおける使用のための1セットの試験化合物を同
定する上で有用であろう。このような第二のアッセイは、ポリペプチドに対する結合親和
性を有する試験化合物がインビトロ又はインビボで、軟骨及び／又はECMの分解を実際に
低下させること、又は炎症を低下させることを確認するために設計され得る。
【０１０３】
好適な対照は常に、偽陽性の読み取りに対してしかるべき所で保証すべきである。本発
明の特定の実施態様において、スクリーニング方法は、化合物を好適な対照と比較する追
加的な工程を含む。一実施態様において、対照は、試験化合物と接触しなかった細胞又は
試料であり得る。代替的な実施態様において、対照は、TARGETを発現しない細胞であり得
；例えば、このような実施態様の一態様において、試験細胞は、TARGETを天然に発現でき
、対照細胞は、TARGETの発現を阻害又は予防する薬剤、例えばsiRNAと接触し得る。ある
いは、このような実施態様の別の態様において、その未変性状態における細胞は、TARGET
を発現せず、試験細胞は、TARGETを発現するよう操作されており、それにより本実施態様
において、対照は、形質転換されていない未変性細胞であり得る。また又はそうでなけれ
ば、対照は、サイトカイン、例えばIL1、TNFα、OSM、又は他の炎症性メディエーター（
例えば、LPA又は活性酸素種）を用いて処理された細胞など、炎症あるいはECM及び／又は
軟骨の分解の公知のメディエーターを利用し得る。典型的な対照が本明細書で説明されて
いるが、このことは制限として取られるべきではなく；使用されている実験条件について
適切な対照を選択することは当業者の範囲内である。
【０１０４】
これらの測定をする順番は、任意の順番で実施され得る本発明の実施にとって必須であ
ると考えられていない。例えば、ポリペプチドに対する化合物の結合親和性に関して何ら
情報が知られていない1セットの化合物のスクリーニングアッセイが最初に実施され得る
。あるいは、ポリペプチドドメインに対する結合親和性を有するものとして同定された1
セットの化合物、又はポリペプチドの阻害薬であると同定された1クラスの化合物がスク
リーニングされ得る。しかしながら、薬剤候補化合物の究極的な使用にとって本アッセイ
が意味のあるものとなるために、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解に関する直接的な
測定が貴重である。それにもかかわらず、対照を含めた確認試験、及び本発明のポリペプ
チドに対する結合親和性の測定は、任意の治療的又は診断的応用において有用な化合物を
同定する上で有用である。
【０１０５】
当技術分野で認識された方法及びアッセイに基づいた類似のアプローチは、軟骨及び／
又はECMの分解を特徴とする任意の種々の疾患におけるTARGETS及び化合物に関して適用可
能であり得る。1つのアッセイ又はアッセイ類は、TARGETに対する結合親和性を有する試
験化合物が、軟骨及び／又はECMの分解を阻害することを確認するよう設計され得る。1つ
のこのような方法において、コラゲナーゼなどの軟骨分解酵素の発現及び／活性が測定さ
れる。1つの特定のこのような方法において、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／
又はADAMTS4の発現及び／又は活性が測定される。1つの特定のこのような方法において、
MMP13の発現及び／又は活性が測定される。
【０１０６】
当技術分野で認識された方法及びアッセイに基づいた類似のアプローチは、炎症を特徴
とする任意の種々の疾患におけるTARGETS及び化合物に関して適用可能であり得る。1つの
アッセイ又はアッセイ類は、TARGETに対する結合親和性を有する試験化合物が、炎症を阻
害することを確認するよう設計され得る。1つのこのような方法において、コラゲナーゼ
などの軟骨分解酵素の発現及び／又は活性が測定される。1つの特定のこのような方法に
おいて、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4の発現及び／又は活性が
測定される。1つの特定のこのような方法において、MMP13の発現及び／又は活性が測定さ
れる。代替的な方法において、IL‐1b、IL‐6、IL‐8、IL‐11、TNFα、及び／又はLIFか
ら選択される1つ以上の炎症性サイトカインのレベルが測定される。
【０１０７】
本アッセイ方法は、モノマー、ポリマータンパク質の部分又はサブユニット、ペプチド
、オリゴペプチド、及びそれらの酵素活性のある部分を含む、TARGETタンパク質又はその
断片の1つ以上を用いて、インビトロで実施され得る。
【０１０８】
化合物とポリペプチドTARGETとの結合親和性は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー（
Biacore）を用いて、標識した化合物を用いた飽和結合分析によって（例えば、Scatchard
及びLindmo分析）、差次的紫外線分光光度計、蛍光偏光アッセイ、蛍光画像化プレートリ
ーダー（FLIPR（登録商標））システム、蛍光共鳴エネルギー転移、及び生物発光共鳴エ
ネルギー移動によってなど、当技術分野で公知の方法によって測定することができる。ま
た、化合物の結合親和性は、解離定数（Kd）又はIC50又はEC50において表すことができる
。IC50は、ポリペプチドに対する別のリガンドの結合の50％阻害に必要な化合物の濃度を
表す。EC50は、TARGET機能を測定する任意のアッセイにおける最大効果の50％を得るのに
必要な濃度を表す。解離定数Kdは、リガンドがポリペプチドにどれほど十分に結合してい
るかの測定結果であり、ポリペプチドにおける結合部位の実際に半分を飽和させるのに必
要なリガンド濃度と等価である。高い親和性の結合を有する化合物は、低いKd、IC50、及
びEC50を有し、すなわち、100nM〜1pMの範囲にあり；中程度〜低い親和性の結合は高いKd
、IC50、及びEC50に関し、すなわちマイクルモル濃度の範囲にある。
【０１０９】
また、本アッセイ方法は、細胞アッセイにおいても実施できる。TARGETを発現する宿主
細胞は、内在性発現を有する細胞、又は例えば形質導入によってTARGETを過剰発現してい
る細胞であることができる。ポリペプチドの内在性発現が、容易に測定することのできる
ベースラインを決定するのに十分ではない場合、TARGETを過剰発現する宿主細胞を用いて
使用され得る。過剰発現は、TARGET基質末端産物のレベルが、内在性発現による活性レベ
ルよりも高いという利点を有する。従って、現に利用可能な技術を用いてこのようなレベ
ルを測定することはより容易である。1つのこのような細胞アッセイにおいて、TARGETの
生物学的活性は、軟骨構成要素合成の産生を追随することによって測定され得る。
【０１１０】
炎症、ECM及び／又は軟骨の分解を阻害する化合物を同定する本方法の1つの実施態様は
、TARGETポリペプチド又はその断片若しくは誘導体を発現する細胞の集団を培養すること
；細胞の集団の活性化に関して該細胞の集団における第一のレベルのMMP1、MMP3、MMP8、
MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4を決定すること（例えば、IL1を用いた刺激による。）
；該細胞の集団を化合物又は化合物の混合物に曝露すること；該化合物又は該化合物の混
合物への該細胞の集団の曝露と同じ活性化の後、前記曝露の間、又は前記曝露の後、該細
胞の集団における第二のレベルのMMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4
の発現又は活性を決定すること；並びにMMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はAD
AMTS4、特にMMP13の発現及び／又は活性を抑制する化合物を同定することを含む。具体的
な実施態様において、細胞は軟骨細胞である。具体的な実施態様において、細胞は哺乳類
細胞である。具体的な実施態様において、細胞はヒト細胞である。
【０１１１】
MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4の発現及び／又は活性は、本明
細書に説明された方法など、当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
【０１１２】
本発明者らは、「ノックダウン」ライブラリーを用いることによって、炎症、軟骨及び
／ECMの分解の阻害に関与するTARGET遺伝子を同定した。この種類のライブラリーは、siR
NA分子が組換えアデノウイルスによって細胞へと形質導入されたスクリーンであり、前記
siRNA分子は、細胞における具体的な遺伝子の発現並びに相応の遺伝子産物の発現及び活
性を阻害又は抑制する。ウイルスベクターにおける各siRNAは、具体的な天然遺伝子に対
応する。MMP13の発現の抑制によって測定されるように、軟骨の分解を阻害するsiRNAを同
定することによって、具体的な遺伝子発現と炎症、軟骨及び／又はECMの分解を阻害する
ための経路の間に直接的な相関を引くことができる。次に、ノックダウンライブラリー（
本明細書で「TARGET」ポリペプチドと呼ばれるそのタンパク質発現産物）を用いて同定さ
れるTARGET遺伝子は、ECM及び／又は軟骨の分解と関連する疾患の治療に用いることので
きる化合物を同定する本発明の方法において用いられる。実際、表2に列挙された配列（
配列番号43〜57）を含むshRNA化合物は、これらのTARGET遺伝子の発現及び／活性を阻害
し、MMP13の発現を低下させ、軟骨及び／又はECMの分解あるいは炎症をもたらす経路にお
けるTARGETSの役割を確認する。
【表２】
2016053575.tif 000005
【０１１３】
本発明はさらに、炎症並びに／あるいは軟骨及び／又はECMの分解を低下させる化合物
を同定する方法に関し、下記を含む：
（a）化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペ
プチドと接触させること；
（b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること；
（c）該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度
の結合親和性を呈する化合物と接触させること；及び
（d）IL‐1に対する応答を低下させる、あるいはECM及び／若しくは軟骨を分解するよ
う作用する酵素の合成並びに／又は該酵素の存在を示す関連マーカーを低下させる化合物
を同定すること。
【０１１４】
一態様において、アッセイ方法には、該ポリペプチドを発現する細胞を、マイクロモル
濃度の範囲における結合親和性を呈する化合物と接触させることを含む。一態様において
、呈される結合親和性は、少なくとも10マイクロモル濃度である。一態様において、結合
親和性は、少なくとも1マイクロモル濃度である。一態様において、結合親和性は、少な
くとも500ナノモル濃度である。
【０１１５】
アッセイ方法は、酵素活性を含むがこれに限定されないTARGETポリペプチドの特定の発
現又は活性に基づき得る。プロテアーゼTARGET ADAMTS6（配列番号29）、又はADAM15（配
列番号31、32、33、34、35、又は36）についてのアッセイは、プロテアーゼの活性又は発
現に基づき得る。キナーゼTARGETについてのアッセイは、MET（配列番号22）、STK32B（
配列番号23）、MAP2K2（配列番号28）、MAP4K1（配列番号37）、EPHA5（配列番号39又は4
0）、及びCSNK1G2（配列番号41）として同定され、標的タンパク質のリン酸化または脱リ
ン酸化を含むがこれらに限定されないキナーゼ又はホスファターゼの活性又は発現に基づ
き得る。GPR34（配列番号24、25、又は26）、GPR43（配列番号27）、MC3R（配列番号39）
、及びEDG4（配列番号42）として同定されるGPCR TARGETについてのアッセイは、下流の
メディエーター又は活性化因子を含む、GPCRの活性又は発現に基づき得る。KCNN4（配列
番号30）として同定されるイオンチャネルTARGETについてのアッセイは、イオンチャネル
を開閉し、それにより膜を通じて又は細胞内で蛍光色素又はトレーサーの濃度を変化させ
る化合物の能力を測定する古典的なパッチクランプ、高処理量蛍光ベースの、又はトレー
サーベースのアッセイを含む、当業者に周知の技術を用い得る。測定可能な現象、活性、
又は特性は、当業者によって選択（selected）又は選択され（chosen）得る。当業者は、
当技術分野における当業者の知識及び専門的意見を用いて、多くのアッセイフォーマット
、システム、又は設計のうちの任意から選択し得る。
【０１１６】
表1は、同定されたポリペプチドのクラスを含む、下記に説明されたMMP13アッセイにお
ける出願人のノックダウンライブラリーを用いて同定されたTARGETSを列挙する。TARGETS
は、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ、GPCR、及びイオンチャネルを含
むポリペプチドクラスにおいて同定されている。化合物の存在下又は不在下で測定が実施
されるキナーゼによる基質のリン酸化を測定することによって、キナーゼの活性を決定す
る具体的な方法は、当技術分野で周知である。
【０１１７】
プロテアーゼであるポリペプチドによる基質の切断を測定することによって化合物によ
る阻害を決定する具体的な方法は、当技術分野で周知である。古典的には、蛍光基がペプ
チド配列を通じて消光剤に連結された基質が用いられ、前記ペプチド配列は、標的プロテ
アーゼによって切断することのできる基質である。リンカーの切断は、蛍光基及び消光剤
を分離し、蛍光の増大を生じる。
【０１１８】
イオンチャネルは、膜タンパク質複合体であり、その機能は、生体膜を通過するイオン
の拡散を容易にすることである。膜又は脂質二重層は、親水性のかつ帯電した分子に対し
て疎水性の低い誘電性遮蔽を構築する。イオンチャネルは、膜の疎水性の内部を通過する
高い伝導性の親水性経路を提供する。イオンチャネルの活性は、古典的なパッチクランプ
を用いて測定することができる。また、高処理量蛍光ベースの又はトレーサーベースのア
ッセイも、イオンチャネルの活性を測定するために広範に利用可能である。これらの蛍光
ベースのアッセイは、イオンチャネルを開閉のいずれかをし、それにより膜を通じての具
体的な蛍光色素の濃度を変化させる能力に基づいて化合物をスクリーニングする。トレー
サーベースのアッセイの場合、細胞内及び細胞外のトレーサーの濃度の変化は、放射能測
定又は気相吸光分析（gas absorption spectrometry）によって測定される。
【０１１９】
Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、エフェクタータンパク質を活性化することができ
、それにより細胞におけるセカンドメッセンジャーレベルにおける変化を結果的に生じる
。GPCRの活性は、このようなセカンドメッセンジャーの活性レベルを測定することによっ
て決定することができる。細胞における2つの典型的な重要かつ有用なセカンドメッセン
ジャーは、サイクリックAMP（cAMP）及びCa2+である。セカンドメッセンジャーの活性レ
ベルは、当業者に公知の方法によって、ELISA若しくは放射能技術のいずれかによって、
又はCa2+と接触した場合に蛍光シグナル若しくは発光シグナルを生じる基質を用いること
によって直接的に、あるいは、リポーター遺伝子分析によって間接的に測定することがで
きる。1つ以上の二次メッセンジャーの活性レベルは、プロモーターによって制御された
リポーター遺伝子を用いて典型的に決定され得、この中で、プロモーターは、セカンドメ
ッセンジャーに対して応答する。このような目的のための当技術分野で公知の及び用いら
れるプロモーターは、細胞におけるサイクリックAMPレベルに応答するサイクリックAMP応
答プロモーター、及び細胞における細胞質Ca2+レベルに対して感受性のあるNF‐AT応答プ
ロモーターである。リポーター遺伝子は典型的に、容易に検出可能な遺伝子産物を有する
。リポーター遺伝子は、宿主細胞において安定して感染させることができるか、又は一過
性にトランスフェクトされることができるかのいずれかである。有用なリポーター遺伝子
は、アルカリホスファターゼ、増強した緑色蛍光タンパク質、脱安定化した緑色蛍光タン
パク質、ルシフェラーゼ、及びβ-ガラクトシダーゼである。
【０１２０】
ポリペプチドを発現する細胞は、ポリペプチドを天然に発現する細胞であり得、又は細
胞は、先に説明したとおり、ポリペプチドを発現するようトランスフェクトされ得る。ま
た、細胞は、ポリペプチドを過剰発現するよう形質導入され得、又はポリペプチドの非内
在性形態を発現するようトランスフェクトされ得、これらは示差的にアッセイ又は評価す
ることができる。
【０１２１】
1つの特定の実施態様において、本発明の方法はさらに、細胞の集団をポリペプチドの
アゴニストと接触させる工程を含む。これは、細胞のある選択された集団におけるポリペ
プチドの発現が、その活性の適切な検出にとってあまりにも低い方法において有用である
。アゴニストを用いることによって、ポリペプチドが誘発され、化合物がポリペプチドを
阻害する場合、適切な読み出しを可能にし得る。類似の考え方は、炎症性メディエーター
の放出の測定に適用する。特定の実施態様において、本方法において用いられる細胞は、
哺乳類NHACである。NHACは、予期されるアッセイにおいて活性化され得る（例えば、IL1
による刺激による。）。
【０１２２】
炎症又は軟骨及び／若しくはECM分解を阻害する化合物を同定する方法は、下記を含む
：
（a）化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペ
プチド及びその断片と接触させること；並びに
（b）軟骨分解と関連した化合物‐ポリペプチド特性を測定すること。
【０１２３】
本発明の一実施態様において、方法は、軟骨細胞の異化過程を阻害する化合物を同定す
ることに関する。
【０１２４】
本発明の一実施態様において、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解と関連した化合
物‐ポリペプチド特性は、結合親和性である。
【０１２５】
一実施態様において、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解と関連した化合物‐ポリ
ペプチド特性は、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4の発現及び／又
は活性の阻害である。
【０１２６】
一実施態様において、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解と関連した化合物‐ポリ
ペプチド特性は、MMP13の発現及び／又は活性の阻害である。
【０１２７】
一実施態様において、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解と関連した化合物‐ポリ
ペプチド特性は、IL‐1b、IL‐6、IL‐8、IL‐11、TNFα、及び／又はLIFなどの炎症性サ
イトカインの発現である。
【０１２８】
本発明の一実施態様において、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解と関連した化合
物‐ポリペプチド特性は、該ポリペプチドの活性である。特に、一実施態様において、化
合物は、該ポリペプチドの活性を阻害する。
【０１２９】
本発明の一実施態様において、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解と関連した化合
物‐ポリペプチドの特性は、該ポリペプチドの活性である。特に、一実施態様において、
化合物は、該ポリペプチドの発現を阻害する。
【０１３０】
本発明はさらに、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解と関連した化合物を同定する
方法に関し、この中で、該化合物は、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸
と少なくとも中程度の結合親和性を呈し、該方法は下記を含む：
a）化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドを発現する哺乳類細胞の集団と接触させ、この中で、該細胞は活性化されていること
；
b）該細胞からのMMP13の発現を決定すること；及び
c）炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解を阻害する化合物を、該細胞からのMMP13の
放出を抑制する化合物として同定すること。
【０１３１】
1つのこのような方法において、細胞は、炎症誘発性因子と接触していることによって
活性化される。本方法の具体的な実施態様において、炎症誘発性因子は、TNF‐アルファ
、IL‐1、OSM（オンコスタチンM）、IL6、エンドセリン、ブラジキニン、LPA、ロイコト
リエン、プロスタグランジン、LPS（リポ多糖類）、又は他のTLRリガンド、あるいはそれ
らの組み合わせから選択される。
【０１３２】
1つのこのような方法において、化合物は、少なくとも10マイクロモル濃度の配列番号2
2〜42からなる群から選択されるアミノ酸に対する結合親和性を呈する。
【０１３３】
本発明はさらに、炎症又は軟骨及び／若しくはECM分解を阻害する化合物を同定する方
法に関し、該方法は下記を含む：
a）化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドと接触させること；
b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること；
c）該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度の
結合親和性を呈する化合物と接触させること；及び
d）炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解を阻害する化合物を同定すること。
【０１３４】
本発明はさらに、炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解を阻害する化合物を同定する
方法に関し、該方法は下記を含む：
a）化合物を、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプ
チドと接触させること；
b）該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する化合物の能力を決定すること；
c）該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、ポリペプチドの発現又は活性を有
意に阻害する化合物と接触させること；及び
d）炎症又は軟骨及び／若しくはECMの分解を阻害する化合物を同定すること。
【０１３５】
本発明の特定の態様において、先に説明した方法には、試験されるべき化合物を対照と
比較する追加的な工程を含み、ここで、対照は、試験化合物と接触しなかった細胞の集団
である。
【０１３６】
本発明の特定の態様において、先に説明した方法には、試験されるべき化合物を対照と
比較する追加的な工程を含み、ここで、対照は、該ポリペプチドを発現しない細胞の集団
である。
【０１３７】
ハスループッット目的のために、抗体断片ライブラリー、ペプチドファージディプレイ
ライブラリー、ペプチドライブラリー（例えば、LOPAP（商標）、Sigma Aldrich）、脂質
ライブラリー（BioMol）、合成化合物ライブラリー（例えば、LOPAC（商標）、Sigma Ald
rich、BioFocus DPI）、又は天然化合物ライブラリー（Specs、TimTec、BioFocus DPI）
などの化合物のライブラリーが用いられ得る。
【０１３８】
好ましい薬剤候補化合物は、低分子量化合物である。すなわち、500ダルトン以下の分
子量を有する低分子量化合物は、生物システムにおいて良好な吸収及び透過を有するよう
であり、結果的に、500ダルトンを上回る分子量を有する化合物よりも成功する薬剤候補
である可能性が高い（Lipinskiらの文献（2001））。ペプチドは、薬剤候補化合物の別の
好ましいクラスを含む。ペプチドは、妊孕性ホルモン及び血小板凝集阻害薬など、商業的
に価値のあるペプチドの複数の例がある。天然産物は、薬剤候補化合物の別の好ましいク
ラスである。このような化合物は、天然源に認められており、天然源から抽出され、その
後合成され得る。脂質は、薬剤候補化合物の別の好ましいクラスである。
【０１３９】
薬剤候補化合物の別の好ましいクラスは、抗体である。また、本発明は、TARGETSに対
して指向する抗体を提供する。これらの抗体は、細胞内のTARGETSに結合するよう内在的
に産生され得、組織に付加して、細胞の外側に存在するTARGETポリペプチドに結合し得る
。これらの抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本発明に
は、キメラ抗体、一本鎖抗体、ドメイン抗体、ラクダ抗体、及びヒト化抗体、並びにFAb
断片及びFAb発現ライブラリーの産物、並びにFv断片及びFv発現ライブラリーの産物を含
む。抗体は、中和抗体あるいは、TARGETの活性を阻害する、又はTARGETに対するリガンド
の若しくは別のタンパク質に対するTARGETの結合を遮断若しくは阻害する抗体であり得る
。
【０１４０】
ある実施態様において、ポリクローナル抗体は、本発明の実施において使用され得る。
当業者は、ポリクローナル抗体を調製する方法を知っている。ポリクローナル抗体は、例
えば免疫化剤及び所望の場合アジュバントの1回以上の注射によって、哺乳類において上
昇することができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントは、複数回の皮下注
射又は腹腔内注射によって哺乳類において注射されるであろう。また、抗体は、未処置の
TARGETタンパク質若しくはポリペプチドに対して、又は断片、抱合体を含む誘導体、若し
くは細胞膜に移入されたTARGETなど、TARGETタンパク質若しくはポリペプチドの他のエピ
トープ、又はファージディスプレイライブラリーなどの抗体可変領域のライブラリーに対
して生じ得る。
【０１４１】
免疫化されている哺乳類において免疫原性であることが公知のタンパク質に免疫化剤を
抱合することは有用であり得る。このような免疫原性のタンパク質の例には、キーホール
リンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリン、及びダイズトリプシン
阻害剤を含むが、これらに限定されない。採用され得るアジュバントの例には、フロイン
ト完全アジュバント及びMPL‐TDMアジュバント（モノホスホリルリピドA、合成トレハロ
ースジコリノミコラート）を含む。過度の実験なしに、当業者は、免疫化プロトコールを
選択し得る。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナ
ル抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて調製され得る。本発明のモノクローナル抗体
は、ヒト化されて、宿主が抗体に対する免疫応答を展開するのを防止し得る。「ヒト化抗
体」は、相補性決定領域（CDR）並びに／又は軽鎖及び／若しくは重鎖可変ドメインフレ
ームワークの他の部分が、非ヒト免疫グロブリンに由来するが、分子の残りの部分が、1
つ以上のヒト免疫グロブリンに由来するものである。また、ヒト化抗体には、ドナー若し
くはアクセプターの修飾されていない軽鎖若しくはキメラ軽鎖と会合したヒト化重鎖を特
徴とする抗体、又はその逆も含む。抗体のヒト化は、当技術分野で公知の方法によって達
成され得る（例えば、Mark及びPadlanの文献（1994）参照）。トランスジェニック動物を
用いて、ヒト化抗体を発現し得る。
【０１４３】
また、ヒト化抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野で公知の
種々の技術を用いて作製することができる（Hoogenboom及びWinterの文献（1991）；Mark
sらの文献（1991)）。また、Coleら及びBoernerらの技術も、ヒトモノクローナル抗体の
調製に利用可能である（Coleらの文献（1985）；Boernerらの文献（1991））。一本鎖抗
体の作製のための当技術分野で公知の技術は、TARGETSに対する一本鎖抗体を作製するの
に適用させることができる。抗体は、一価の抗体であり得る。一価の抗体を調製する方法
は当技術分野で周知である。例えば、1つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び修飾された
重鎖の組換え発現を包含する。重鎖は、重鎖架橋を防止するよう、Fc領域における任意の
地点で一般的に切断されている。あるいは；関連性のあるシステイン残基は、別のアミノ
酸残基と置換され、又は欠失され、それにより架橋を防止する。
【０１４４】
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対する、及び好ましくは細胞表面の
タンパク質又は受容体又は受容体サブユニットに対する結合特異性を有するモノクローナ
ル抗体、好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。この場合において、結合特異性のう
ちの1つは、TARGETの1つのドメインに対するものであり；もう1つは、同じか又は異なるT
ARGETの別のドメインに対するものである。
【０１４５】
二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で公知である。伝統的に、二重特異性抗
体の組換え作製は、2つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいており、ここ
で、2つの重鎖は異なる特異性を有する（Milstein及びCuelloの文献（1983））。免疫グ
ロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に分類されるので、これらのハイブリドーマ（クアドロー
マ）は、10の異なる抗体分子の可能性のある混合物を生じ、そのうちたった1つが正確な
二重特異性構造を有する。アフィニティクロマトグラフィー工程は通常、正確な分子の精
製を達成する。類似の手順は、Trauneekerらの文献（1991）に開示されている。
【０１４６】
別の好ましい実施態様によると、アッセイ方法は、TARGETに対する結合親和性を有する
ものとして同定された薬剤候補化合物を用い、及び／又は相対して1つ以上のTARGETに対
するアンタゴニスト活性などの下方制御活性を有するものとして既に同定されている。
【０１４７】
関節炎若しくは変形性関節症の又は炎症若しくは炎症性疾患のインビボ動物モデルは、
インビボでのTARGET調節をさらに評価することを含む、本発明において同定された薬剤又
は化合物をさらに又は追加的にスクリーニング、評価、及び／又は検証するために、当業
者によって利用され得る。このような動物モデルには、潰瘍性大腸炎モデル、多発性硬化
症モデル（EAE、リゾレシチン誘発性を含む。）、関節炎モデル、アレルギー性喘息モデ
ル、気道炎症モデル、及び急性炎症モデルを含むが、これらに限定されない。変形性関節
症モデルには、例えば、膝前十字靱帯の切断後のウサギにおいて、及び内側側副靱帯の断
裂後のラットにおいて誘発された実験的変形性関節症を含む。
【０１４８】
本発明はさらに、軟骨細胞を、配列番号1〜21からなる群から選択されるヌクレオチド
配列を含む、ポリリボヌクレオチドの少なくとも約17のヌクレオチドを補完するポリヌク
レオチド配列を含む発現阻害薬と接触させることを含む、該細胞の同化刺激を誘導し、又
は該細胞の分解を低下させる方法に関する。
【０１４９】
本発明の別の態様は、該細胞を、TARGETポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチ
ドの細胞における翻訳を阻害する発現阻害薬と接触させることを含む、炎症又は軟骨及び
／若しくはECMの分解を阻害する方法に関する。特定の実施態様は、薬剤をTARGET mRNAと
対形成するよう機能する少なくとも1つのアンチセンス鎖を含むポリヌクレオチドを含み
、それによりTARGETポリペプチドの発現を下方制御又は遮断する組成物に関する。阻害薬
は好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、及び低分子干渉RNA（siRNA
）を含み、この中で、該薬剤は、配列番号22〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列
を含むポリペプチドの一部をコードする天然のポリヌクレオチド配列と相補的な、又は前
記ポリヌクレオチド配列から操作された核酸配列を含む。好ましい実施態様において、発
現阻害薬は、配列番号1〜21からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と相補的で
ある。特に好ましい実施態様において、発現阻害薬は、配列番号43〜57からなる群から選
択されるポリヌクレオチド配列と相補的である。
【０１５０】
本発明の実施態様は、発現阻害薬が、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシ
ヌクレオチド（ODN）、配列番号22〜42の配列をコードするポリリボヌクレオチドを切断
するリボザイム、siRNA、好ましくはshRNAが、TARGETポリリボヌクレオチドのTARGETポリ
ペプチドへの翻訳に干渉するよう配列番号22〜42の配列をコードするポリリボヌクレオチ
ドの一部と十分に相補的な低分子干渉RNA（siRNA、好ましくはshRNA）からなる群から選
択される方法に関する。好ましくは、発現阻害薬は、アンチセンスRNA、リボザイム、ア
ンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、又は配列番号1〜21からなる群から選択される
ヌクレオチド配列と相補的なsiRNA、好ましくはshRNAである。特に好ましい実施態様にお
いて、発現阻害薬は、配列番号43〜57からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補
的である。
【０１５１】
本発明の特別な実施態様は、発現阻害薬が、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデ
オキシヌクレオチド（ODN）、配列番号22〜42の配列をコードするポリリボヌクレオチド
を切断するリボザイム、siRNA、好ましくはshRNAが、TARGETポリリボヌクレオチドのTARG
ETポリペプチドへの翻訳に干渉するよう配列番号22〜42の配列をコードするポリリボヌク
レオチドの一部と十分に相補的な低分子干渉RNA（siRNA、好ましくはshRNA）を発現する
核酸である。好ましくは、ヌクレオチド配列は、配列番号1〜21からなる群から選択され
るポリヌクレオチドと相補的である。特に好ましい実施態様において、ヌクレオチド配列
は、配列番号43〜57からなる群から選択されるポリヌクレオチドと相補的である。
【０１５２】
アンチセンス核酸を用いた遺伝子発現の下方制御は、翻訳レベル又は転写レベルで達成
することができる。本発明のアンチセンス核酸は、好ましくは、TARGETポリペプチド又は
相応するメッセンジャーRNAをコードする核酸のすべて又は部分と特異的にハイブリダイ
ズすることのできる核酸断片である。加えて、主要転写産物のスプライシングを阻害する
ことによってTARGETポリペプチドをコードすることのできる核酸配列の発現を減少させる
アンチセンス核酸が設計され得る。アンチセンス配列の任意の長さは、TARGETSをコード
する核酸の発現を下方制御又は遮断することができる限り、本発明の実施に好適である。
好ましくは、アンチセンス配列は、長さ少なくとも約17ヌクレオチドである。アンチセン
ス核酸の調製及び使用、アンチセンスRNAをコードするDNA、並びにオリゴ及び遺伝的アン
チセンスの使用は、当技術分野で公知である。
【０１５３】
発現阻害薬の一実施態様は、配列番号1〜21の配列を含む核酸に対するアンチセンスで
ある核酸である。例えば、アンチセンス核酸（例えば、DNA）は、配列番号1〜21の配列を
含む核酸の細胞での発現を阻害する遺伝子治療法として、インビトロで細胞に導入され得
、又はインビボで対象に投与され得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは好ましくは、
約17〜約100のヌクレオチドを含む配列を含み、より好ましくは、アンチセンスオリゴヌ
クレオチドは、約18〜約30を含む。アンチセンス核酸は、配列番号1〜21からなる群から
選択される核酸配列と相補的な約10〜約30の連続したヌクレオチドから調製され得る。
【０１５４】
アンチセンス核酸は好ましくは、オリゴヌクレオチドであり、デオキシリボヌクレオチ
ド、修飾されたデオキシリボヌクレオチド、又はその両方の何らかの組み合わせから完全
になり得る。アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドであることができる。オリゴ
ヌクレオチドは、化学的に修飾され、所望の場合、安定性及び／又は選択性を改良し得る
。オリゴヌクレオチドは、細胞内ヌクレアーゼによる分解を受けやすいので、修飾には、
例えば、ホスホジエステル結合の遊離酸素を置き換えるための硫黄基の使用を含むことが
できる。この修飾は、ホスホロチオアート結合と呼ばれる。ホスホロチオアートアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドは、水溶性であり、多価陰イオン性であり、内在性ヌクレアーゼ
に対して耐性である。加えて、ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドがそ
のTARGET部位とハイブリダイズする場合、RN202‐315NA二本鎖は、内在性酵素リボヌクレ
アーゼ（RNase）Hを活性化し、これがハイブリッド分子のmRNA構成要素を切断する。
【０１５５】
加えて、ホスホラミダイト及びポリアミド（ペプチド）結合を有するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドが合成できる。これらの分子は、ヌクレアーゼ分解に対して非常に耐性が
あるべきである。さらに、化学基は、糖部分の2'炭素及びピリミジンの5炭素（C‐5）に
付加され、安定性を増強し、アンチセンスオリゴヌクレオチドのそのTARGET部位への結合
を容易にすることができる。修飾には、2'-デオキシ、O-ペントキシ、O-プロポキシ、O-
メトキシ、フルオロ、メトキシエトキシホスホロチオアート、修飾された塩基、及び当業
者に公知の他の修飾を含み得る。
【０１５６】
TARGETSのレベルを低下させることのできる別の種類の発現阻害薬は、リボザイムであ
る。リボザイムは、個別の触媒ドメイン及び基質結合ドメインを有する触媒性RNA分子（R
NA酵素）である。基質結合配列は、ヌクレオチド相補性及びおそらくは、そのTARGET配列
との非水素結合相互作用によって組み合わせる。触媒部分は、特異的部位でTARGET RNAを
切断する。リボザイムの基質ドメインは、指定されたmRNA配列に配向するよう操作するこ
とができる。リボザイムは相補性塩基対形成を通じてTARGET mRNAを認識した後、前記標
的mRNAを結合する。一旦、正確なTARGET部位に結合すると、リボザイムは、酵素的に作用
して、TARGET mRNAを切る。リボザイムによるmRNAの切断は、相応のポリペプチドの合成
を扱う前記mRNAの能力を破壊する。一旦、リボザイムがそのTARGET配列を切断すると、前
記標的配列が放出され、他のmRNAにおいて反復して結合及び切断することができる。
【０１５７】
リボザイムの形態には、ハンマーヘッドモチーフ、ヘアピンモチーフ、デルタ型肝炎ウ
イルス、グループIイントロンモチーフ若しくは（RNA誘導配列と会合した）RNaseP RNAモ
チーフ又はパンカビVS RNAモチーフを含む。これらの触媒RNA分子が、真核生物プロモー
ターから細胞内で発現することができるので、ハンマーヘッド又はヘアピン構造を有する
リボザイムは容易に調製される（Chenらの文献（1992））。本発明のリボザイムは、適切
なDNAベクターから真核細胞において発現することができる。所望の場合、リボザイムの
活性は、第二のリボザイムによる主要転写産物からの放出によって増大し得る（Ventura
らの文献（1993））。
【０１５８】
リボザイムは、オリゴデオキシリボヌクレオチドを、転写後にTARGET mRNAとハイブリ
ダイズする配列によって隣接されたリボザイム触媒ドメイン（20ヌクレオチド）と組み合
わせることによって化学的に合成され得る。オリゴデオキシリボヌクレオチドは、基質結
合配列をプライマーとして用いることによって増幅される。増幅産物は、真核生物発現ベ
クターへとクローニングされる。
【０１５９】
リボザイムは、DNA、RNA、又はウイルスベクターへと挿入された転写単位から発現する
。リボザイム配列の転写は、真核生物RNAポリメラーゼI（pol（I）、RNAポリメラーゼII
（pol II）、又はRNAポリメラーゼIII（pol III））についてのプロモーターから駆動さ
れる。pol IIプロモーター又はpol IIIプロモーターからの転写産物は、すべての細胞に
おいて高レベルで発現するであろうし；所与の細胞種類における所与のpol IIプロモータ
ーのレベルは、近くの遺伝子調節配列によるであろう。また、原核生物RNAポリメラーゼ
プロモーターも使用され、但し、原核生物RNAポリメラーゼ酵素が、適切な細胞において
発現するという条件付きである（Gao及びHuangの文献（1993））。これらのプロモーター
から発現したリボザイムが哺乳類細胞において機能することができることは示されている
（Kashani-Sabetらの文献（1992））。
【０１６０】
特に好ましい阻害薬は、低分子干渉RNA（siRNA、好ましくはshRNA）である。siRNA、好
ましくはshRNAは、発現停止したRNAと配列において類似している二本鎖RNA（dsRNA）によ
る遺伝子サイレンシングの転写後プロセスを仲介する。本発明に従ったsiRNAは、配列番
号1〜21の配列において説明された配列の群から、好ましくは配列番号43〜57の配列にお
いて説明された配列の群から選択された連続した17〜25のヌクレオチド配列と相補的な又
は前記ヌクレオチド配列と類似した17〜25のヌクレオチドのセンス鎖と、センス鎖に相補
的な17〜23のヌクレオチドのアンチセンス鎖とを含む。典型的な配列は、配列番号43〜57
と相補的な配列として説明されている。最も好ましいsiRNAは、互いに及びTARGETポリヌ
クレオチド配列と100パーセント相補的なセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。好ましく
は、siRNAはさらに、センス鎖及びアンチセンス鎖を連結するループ領域を含む。
【０１６１】
本発明に従った自己相補性一本鎖siRNA分子ポリヌクレオチドは、ループ領域リンカー
によって接続されたセンス部分とアンチセンス部分とを含む。好ましくは、ループ領域配
列は、4〜30ヌクレオチド長、より好ましくは5〜15ヌクレオチド長、最も好ましくは8又
は12ヌクレオチド長である。具体的な実施態様において、リンカー配列は、UUGCUAUA（配
列番号81）である。代替的な具体的実施態様において、リンカー配列は、GUUUGCUAUAAC（
配列番号58）である。自己相補性一本鎖siRNAは、ヘアピンループを形成し、通常のdsRNA
よりも安定である。加えて、自己相補性一本鎖siRNAは、ベクターからより簡単に作製さ
れる。
【０１６２】
アンチセンスRNAに類似して、siRNAは、核酸分解に対する耐性を確実にし、又は活性を
亢進し、又は細胞分布を亢進し、又は細胞の取り込みを亢進するよう修飾することができ
、このような修飾は、修飾されたヌクレオシド間連結、修飾された核酸塩基、修飾された
糖及び／又はsiRNAの1つ以上の部分若しくは抱合体への化学的連結からなり得る。ヌクレ
オチド配列は、これらのsiRNA設計則に従わないヌクレオチド配列と比較して、TARGET配
列の改良された縮小（reduction）を与えるsiRNA設計則に従って選択される（これらの法
則及び、siRNAの調製の例に関する論議については、WO2004／094636、及びUS2003／01986
27が引用により本明細書により組み込まれている。）。
【０１６３】
また、本発明は、軟骨の分解を阻害することのできるポリヌクレオチドを発現すること
のできるDNA発現ベクターを含み、発現阻害薬として先に説明された組成物、及び該組成
物を用いる方法にも関する。
【０１６４】
これらの組成物及び方法の特別な態様は、TARGETポリペプチドと選択的に相互作用する
ことのできる細胞内結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの誘導された発現によ
る、TARGETポリペプチドの発現の下方制御又は遮断に関する。細胞内結合タンパク質には
、発現する細胞においてポリペプチドと選択的に相互作用することのできる又は結合する
ことのできる、及びポリペプチドの機能を中和することのできる任意のタンパク質を含む
。好ましくは、細胞内結合タンパク質は、配列番号22〜42の配列のTARGETポリペプチドの
エピトープに対する結合親和性を有する中和抗体又は中和抗体の断片である。
【０１６５】
この組成物の特別な実施態様は、アンチセンスRNA、アンチセンスオリゴデオキシヌク
レオチド（ODN）、配列番号22〜42の配列をコードするポリヌクレオチドを切断するリボ
ザイム、及び配列番号22〜42の配列をコードするポリリボヌクレオチドの一部と十分に類
似しており、それによりsiRNAが、TARGETポリリボヌクレオチドのTARGETポリペプチドへ
の翻訳に干渉する低分子干渉RNA（siRNA）からなる群から選択される発現阻害薬を含む。
【０１６６】
発現阻害薬を発現するポリヌクレオチドは、ベクター内に特に含まれる。ポリ核酸は、
核酸配列の発現を可能にするシグナルに作用可能に連結され、好ましくは、一旦ベクター
が細胞に導入されるとアンチセンス核酸を発現するであろう組換えベクターコンストラク
トを利用する細胞へと導入される。アデノウイルスベクターシステム、レトロウイルスベ
クターシステム、アデノ随伴ウイルスベクターシステム、レンチウイルスベクターシステ
ム、単純ヘルペスウイルスベクターシステム、又はセンダウイルス（sendaviral）ベクタ
ーシステムを含む種々のウイルスベースの系が利用可能であり、すべて、TARGET細胞にお
ける発現阻害薬についてのポリヌクレオチド配列を導入及び発現するために用いられ得る
。
【０１６７】
好ましくは、本発明の方法において用いられるウイルスベクターは、複製欠損である。
このような複製欠損ベクターは通常、感染した細胞におけるウイルスの複製に必要な少な
くとも1つの領域を欠失するであろう。これらの領域は、当業者に公知の任意の技術によ
って、（全体において又は部分において）除去されるか又は非機能的にされるかのいずれ
かであることができる。これらの技術には、（複製に）必須の領域に対する1つ以上の完
全な除去、置換、部分的な欠失又は塩基の付加を含む。このような技術は、遺伝子操作の
技術を用いて又は突然変異原性剤を用いた処理によって、インビトロで（単離されたDNA
に関して）又はインサイツで実施され得る。好ましくは、複製欠損ウイルスは、ウイルス
粒子をカプシド形成するのに必要な前記複製欠損ウイルスのゲノムの配列を保有する。
【０１６８】
好ましい実施態様において、ウイルスエレメントは、アデノウイルス由来である。好ま
しくはビヒクルには、アデノウイルスカプシドにパッケージされたアデノウイルスベクタ
ー、又はその機能的部分、誘導体、及び／若しくは類似体を含む。また、アデノウイルス
生物学は、分子レベルで比較的周知である。アデノウイルスベクターについての多くのツ
ールは、開発されており及び開発され続けており、従って、アデノウイルスカプシドを、
本発明のライブラリーにおいて組み込むのに好ましいビヒクルにする。アデノウイルスは
、広範な種々の細胞を感染させることができる。しかしながら、異なるアデノウイルス血
清型は、細胞に対する異なる優先性を有する。好ましい実施態様において、本発明のアデ
ノウイルスカプシドが入ることのできるTARGET細胞集団を組み合わせかつ広げるために、
ビヒクルには、少なくとも2つのアデノウイルスに由来するアデノウイルス線維タンパク
質を含む。好ましいアデノウイルス線維タンパク質配列は、血清型5、17、45、及び51で
ある。これらのキメラベクターの技術又は構築及び発現は、US 2003／0180258及びUS 200
4／0071660に開示されており、引用により本明細書により組み込まれている。
【０１６９】
好ましい実施態様において、アデノウイルス由来の核酸には、アデノウイルス後期タン
パク質又はその機能的部分、誘導体、及び／若しくは類似体をコードする核酸を含む。ア
デノウイルス後期タンパク質、例えば、アデノウイルス線維タンパク質は、ビヒクルをあ
る細胞に標的化する（TARGET）ために、又は細胞へのビヒクルの高い送達を誘導するため
に好ましく用いられ得る。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸は、本質的にすべ
てのアデノウイルス後期タンパク質をコードし、アデノウイルスカプシド全体又はその機
能的部分、類似体、及び／若しくは誘導体の形成を可能にする。好ましくは、アデノウイ
ルスに由来する核酸には、アデノウイルスE2A又はその機能的部分、誘導体、及び／若し
くは類似体をコードする核酸を含む。好ましくは、アデノウイルスに由来する核酸には、
細胞におけるアデノウイルス由来核酸の複製を少なくとも一部容易にする、少なくとも1
つのE4領域タンパク質又はその機能的部分、誘導体、及び／若しくは類似体をコードする
核酸を含む。本用途の例において用いられるアデノウイルスベクターは、本治療方法発明
において有用なベクターの典型である。
【０１７０】
本発明のある実施態様は、レトロウイルスベクターの系を用いる。レトロウイルスは、
分裂中の細胞に感染する組み込みウイルスであり、前記ウイルスの構築は、当技術分野で
公知である。レトロウイルスベクターは、MoMuLV（「モロニーマウス白血病ウイルス」）
MSV（「モロニーマウス肉腫ウイルス」）、HaSV（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；SNV（「
脾壊死ウイルス」）；RSV（「ラウス肉腫ウイルス」）、及びフレンドウイルスなど、異
なる種類のレトロウイルスから構築することができる。また、レンチウイルスベクターの
系も、本発明の実施において使用され得る。
【０１７１】
本発明の他の実施態様において、アデノ随伴ウイルス（「AAV」）が利用される。AAVウ
イルスは、安定したかつ部位特異的な様式で、感染した細胞のゲノムへと組み込む比較的
小さなサイズのDNAウイルスである。AAVウイルスは、細胞の増殖、形態、又は分化に何ら
影響を誘導することなく、広範な細胞に感染することができ、かつヒトの病態に関与する
ようには見えない。
【０１７２】
ベクター構築において、本発明のポリヌクレオチド剤は、1つ以上の調節領域に連結さ
れ得る。適切な調節領域又は領域類の選択は、当業者のレベル内で慣例のことである。調
節領域にはプロモーターを含み、エンハンサー、サプレッサーなどを含み得る。
【０１７３】
本発明の発現ベクターにおいて用いられ得るプロモーターには、構成的プロモーター及
び制御的（誘導性）プロモーターの両方を含む。プロモーターは、宿主に応じて原核生物
性又は真核生物性であってよい。本発明の実施の有用な原核生物性（バクテリオファージ
を含む。）プロモーターには、lacプロモーター、lacZプロモーター、T3プロモーター、T
7プロモーター、ラムダPrプロモーター、P1プロモーター、及びtrpプロモーターがある。
本発明の実施に有用な真核生物性（ウイルス性を含む。）プロモーターには、遍在性プロ
モーター（例えば、HPRT、ビメンチン、アクチン、チューブリン）、中間径フィラメント
プロモーター（例えば、デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、GFAP）、治療遺伝
子プロモーター（例えば、MDR型、CFTR、第VIII因子）、組織特異的プロモーター（例え
ば、平滑筋細胞におけるアクチンプロモーター、内皮細胞において活性のあるFlt及びFlk
プロモーター）であり、これらには、組織特異性を呈し、かつトランスジェニック動物に
おいて利用されている動物転写調節領域：膵腺房細胞において活性のあるエラスターゼI
遺伝子調節領域（Swiftらの文献（(1984) Cell 38:639-46）；Ornitzらの文献（(1986) C
old Spring Harbor Symp.  Quant.  Biol.  50:399-409）；MacDonald, (1987) Hepatolo
gy 7:425-515）；膵ベータ細胞において活性のあるインスリン遺伝子調節領域（Hanahan
の文献（(1985) Nature 315:115-22））、リンパ球系細胞において活性のある免疫グロブ
リン遺伝子調節領域（Grosschedlらの文献（(1984) Cell 38:647-58）；Adamesらの文献
（(1985) Nature 318:533-8）；Alexanderらの文献（(1987) Mol. Cell. Biol. 7:1436-4
4））、精巣細胞、乳房細胞、リンパ球系細胞、及びマスト細胞において活性のあるマウ
ス乳房腫瘍ウイルス調節領域（Lederらの文献（(1986) Cell 45:485-95））、肝臓におい
て活性のあるアルブミン遺伝子調節領域（Pinkertらの文献（(1987) Genes and Devel. 1
:268-76））、肝臓において活性のあるアルファ‐フェトプロテイン遺伝子調節領域（Kru
mlaufらの文献（(1985) Mol. Cell. Biol., 5:1639-48）；Hammerらの文献（(1987) Scie
nce 235:53-8））、肝臓において活性のあるアルファ1‐抗トリプシン遺伝子調節領域（K
elseyの文献（(1987) Genes and Devel., 1: 161-71））、骨髄系細胞において活性のあ
るベータ‐グロブリン遺伝子調節領域（Mogramらの文献（(1985) Nature 315:338-40）；
Kolliasらの文献（(1986) Cell 46:89-94））、脳におけるオリゴデンドロサイトにおい
て活性のあるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readheadらの文献（(1987) Cel
l 48:703-12））、骨格筋において活性のあるミオシン軽鎖‐2遺伝子調節領域（Saniの文
献（(1985) Nature 314.283-6））、並びに視床下部において活性のある性腺刺激ホルモ
ン（gonadotropic）放出ホルモン遺伝子調節領域（Masonらの文献（ (1986) Science 234
:1372-8））を含む。
【０１７４】
本発明の実施において用いられ得る他のプロモーターには、分裂中の細胞において優先
的に活性化されるプロモーター、刺激に応答するプロモーター（例えば、ステロイドホル
モン受容体、レチノイン酸受容体）、テトラサイクリン調節性転写修飾因子、サイトメガ
ロウイルス最初期、レトロウイルス末端反復配列、メタロチオネイン、SV-40、E1a、及び
MLPプロモーターを含む。
【０１７５】
追加的なベクター系には、患者へのポリヌクレオチド座位の導入を容易にする非ウイル
ス性システムを含む。例えば、所望の配列をコードするDNAベクターは、リポフェクショ
ンによってインビボで導入することができる。リポソーム仲介性トランスフェクションで
遭遇する困難を制限するよう設計された合成陽イオン性脂質は、マーカーをコードする遺
伝子のインビボトランスフェクション用のリポソームを調製するために使用することがで
きる（Felgnerらの文献（(1987) Proc. Natl. Acad Sci. USA 84:7413-7）；Mackeyらの
文献（(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31）；Ulmerらの文献（(1993) Scie
nce 259:1745-8参照））。陽イオン性脂質の使用は、負に帯電した核酸の封入を促進し得
、また、負に帯電した細胞膜との融合も促進し得る（Felgner及びRingoldの文献（(1989)
Nature 337:387-8））。核酸の転移に特に有用な脂質化合物及び組成物は、WO 95／1886
3及びWO 96／17823において、並びに米国特許第5,459,127号において説明されている。イ
ンビボでの特異的臓器へ外来性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、ある
実際上の利点を有し、特定の細胞種類に対して配向するトランスフェクションは、細胞の
異種性を有する組織、例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び脳において特に有利であろう。脂
質は、ターゲティングの目的のために、他の分子に化学的と共役し得る。標的にされたペ
プチド、例えば、ホルモン若しくは神経伝達物質、及びタンパク質、例えば、抗体、又は
非ペプチド分子は、リポソームと化学的に共役し得る。また、他の分子は、インビボでの
核酸のトランスフェクションを容易にするのに有用であり、例えば、陽イオン性オリゴペ
プチド（例えば、WO95／21931）、DNA結合タンパク質に由来するペプチド（例えば、WO96
／25508）、又は陽イオン性ポリマー（例えば、WO95／21931）である。
【０１７６】
また、むき出しのDNAプラスミドとしてインビボでDNAベクターを導入することも可能で
ある（米国特許第5,693,622号、第5,589,466号、及び第5,580,859号参照）。治療目的の
ためのむき出しのDNAベクターは、所望の宿主細胞へと、当技術分野で公知の方法、例え
ば、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融
合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、又はDNAベクター輸送
体の使用によって導入することができる（例えば、Wilsonらの文献（(1992) J.  Biol. C
hem. 267:963-7）；Wu及びWuの文献（(1988) J. Biol. Chem. 263:14621-4）；Hartmutら
の文献（1990年3月15日に出願されたカナダ国特許出願第2,012,311号；Williamsらの文献
（(1991). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726-30）参照）。リポーター仲介性DNA送達
アプローチも使用することができる（Curielらの文献（(1992) Hum. Gene Ther. 3:147-5
4）；Wu及びWuの文献（(1987) J. Biol. Chem. 262:4429-32））。
【０１７７】
また、本発明は、TARGET阻害薬として同定された1つ以上の有効量の化合物、及び／又
は先に説明された発現阻害薬を含む、生物学的に適合性のある軟骨分解阻害組成物も提供
する。
【０１７８】
生物学的に適合性のある組成物は、本発明の化合物、ポリヌクレオチド、ベクター、及
び抗体が、活性形態で、例えば、生物活性を有効にできる形態で維持される、固体、液体
、ゲル、又は他の形態であり得る組成物である。例えば、本発明の化合物は、TARGETに及
ぼす逆性のアゴニスト活性又はアンタゴニスト活性を有するであろうし；核酸は、メッセ
ージを複製、翻訳でき、又はTARGETの相補的mRNAとハイブリダイズすることができるであ
ろうし；ベクターは、TARGET細胞をトランスフェクトして、先に説明したアンチセンス、
抗体、リボザイム、又はsiRNAを発現することができるであろうし；抗体は、TARGETポリ
ペプチドドメインを結合するであろう。
【０１７９】
好ましい生物学的に適合性のある組成物は、例えば、塩イオンを含む、トリス緩衝液、
リン酸緩衝液、又はHEPES緩衝液を用いて緩衝する水溶液である。通常、塩イオン濃度は
、生理学的レベルに類似しているであろう。生物学的に適合性のある溶液には、安定化剤
及び保存料を含み得る。より好ましい実施態様において、生物適合性のある組成物は、医
薬として許容し得る組成物である。このような組成物は、局所的、経口、非経口、鼻内、
皮下、及び眼内の経路による投与のために製剤することができる。非経口投与は、静脈内
注射、筋肉内注射、動脈内注射又は注入の技術を含む。組成物は、標準的な周知の非毒性
の生理学的に許容し得る担体、アジュバント、及びビヒクルを所望の通り含む薬用量単位
製剤において非経口的に投与され得る。
【０１８０】
本組成物発明の特に好ましい実施態様は、先に説明した治療有効量の発現阻害薬を、医
薬として許容し得る担体との混合物で含む軟骨形成増強医薬組成物である。別の好ましい
実施態様は、炎症又は軟骨及び／若しくはECM分解を包含する容態、あるいは容態に対す
る易罹患性の治療又は予防のための医薬組成物であって、軟骨形成増強に有効な量のTARG
ETアンタゴニスト若しくは逆性アゴニスト、その医薬として許容し得る塩、水和物、溶媒
和物、又はプロドラッグを、医薬として許容し得る担体との混合物で含む前記医薬組成物
である。一態様において、容態は、平均軟骨厚の全身性の又は局所的な減少を包含する。
【０１８１】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に好適な薬用量で、当技術分野で周知の医薬
として許容し得る担体を用いて製剤することができる。このような担体によって医薬組成
物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ剤、スラリー、懸濁剤、及
びこれらの類するものとして、患者による消化のために製剤することができる。経口使用
のための医薬組成物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、結果として生じる
混合物を任意に粉砕すること、及び所望の場合好適な助剤を添加した後、顆粒混合物を加
工して、錠剤又は糖衣錠中心を得ることによって調製することができる。好適な賦形剤は
、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含めた糖類などの炭水化
物又はタンパク質充填剤；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、又は他の植物に由
来するデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はカルボ
キシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；アラビアゴム及びトラガカントゴム
を含めたゴム；並びに、ゼラチン及びコラーゲンなどのタンパク質である。所望の場合、
架橋したポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどの
その塩などの崩壊剤又は可溶化剤を添加し得る。糖衣錠中心は、濃縮糖溶液など、好適な
コーティングとともに用いてよく、前記コーティングはまた、アラビアゴム、滑石、ポリ
ビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン
、ラッカー溶液、及び好適な有機溶媒又は溶媒混合物も含み得る。製品の同定のために、
又は活性化合物の量、すなわち薬用量を特徴付けるために、染料又は色素を錠剤又は糖衣
錠コーティングに添加し得る。
【０１８２】
経口で使用することのできる医薬調製物には、ゼラチンでできた押し込み型（push-fit
）カプセル、並びにゼラチン及びグリセロール又はソルビトールなどのコーティングでで
きた軟質密封カプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトース又はデンプンなどの充
填剤又は結合剤、滑石又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、及び任意に安定化剤
と混合した活性成分を含むことができる。軟質カプセルにおいて、活性化合物は、脂肪油
、液体、又は安定化剤を有する若しくは有さない液体ポリエチレングリコールなどの好適
な液体において溶解又は懸濁され得る。
【０１８３】
好ましい滅菌済みの注射可能な調製物は、非毒性の非経口的に許容し得る溶媒又は希釈
剤における溶液又は懸濁液であることができる。医薬として許容し得る担体の例は、塩類
溶液、緩衝塩類溶液、等張性塩類溶液（例えば、リン酸一ナトリウム若しくはリン酸二ナ
トリウム、ナトリウム、カリウム；塩化カルシウム若しくは塩化マグネシウム、又はこの
ような塩の混合物）、リンゲル溶液、デキストロース、水、滅菌水、グリセロール、エタ
ノール、及びそれらの組み合わせであり、1,3-ブタンジオール及び滅菌済み固定油が、溶
媒又は懸濁媒体として簡便に採用される。合成モノグリセリド又は合成ジグリセリドを含
む刺激の強くない任意の固定油を採用することができる。また、オレイン酸などの脂肪酸
も、注射可能物の調製における使用を提供する。
【０１８４】
本発明の化合物又は組成物は、ポリマー担体、生分解性マトリックス若しくは生物模倣
型マトリックスを用いた投与のために組み合され得、あるいは前記ポリマー、生分解性マ
トリックス若しくは生物模倣型マトリックスにおいて、又は足場において移入され得る。
担体、マトリックス、又は足場は、組成物が組み込まれることができるであろう、かつ発
現することができるであろう任意の材料であり得、細胞の添加と又は細胞の存在下で適合
性であろう。好ましくは、担体マトリックス又は足場は、主に非免疫原性であり、かつ生
分解性である。生分解性材料の例には、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ乳酸（PLA）、ヒ
アルロン酸、腸線縫合材料、ゼラチン、セルロース、ニトロセルロース、コラーゲン、ア
ルブミン、フィブリン、アルギン酸塩、綿、又は他の天然の生分解性材料を含むが、これ
らに限定されない。投与又は移入の前に、例えば、酸化エチレンによる処理によって又は
ガンマ照射若しくは電子線を用いた照射によって、マトリックス又は足場材料を滅菌する
ことが好ましくあり得る。加えて、多くの他の材料が、下記を含むがこれらに限定されな
い足場又はフレームワーク構造を形成するのに用いられ得る：ナイロン（ポリアミド）、
ダクロン（ポリエステル）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリラート、ポリビ
ニル化合物（例えば、ポリビニルクロリド）、ポリカーボネート（PVC）、ポリテトラフ
ルオロエチレン（polytetrafluorethylene）（PTFE、テフロン）、サーマノックス（ther
manox）（TPX）、ポリ乳酸（PLA）、ポリグリコール酸（PGA）、及びポリ乳酸‐グリコー
ル酸（PLGA）などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル類、ポリ無水物類、ポ
リホスファゼン類、及び種々のポリヒドロキシアルカノアート類、並びにこれらの組み合
わせ。好適なマトリックスには、ポリマーメッシュ若しくはポリマースポンジ、及びポリ
マーヒドロゲルを含む。好ましい実施態様において、マトリックスは、経時的に、1年未
満の期間、より好ましくは6ヶ月未満、最も好ましくは、2〜10週間にわたって生分解性で
ある。ポリマー組成物及び製造方法は、分解速度を特定するために用いることができる。
例えば、増大する量のポリ乳酸をポリグリコール酸と混合すると、分解時間が減縮する。
使用することのできるポリグリコール酸のメッシュは、例えば、外科的供給企業（例えば
、Ethicon, N.J.）から商業的に得ることができる。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然
又は合成）が共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋されて3次元の開いた格
子の構造を作る場合に形成される物質として規定され、該構造は水分子を捕捉してゲルを
形成する。一般に、これらのポリマーは、水、緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液など
の、帯電した側鎖基又はその一価のイオン塩を有する水溶液において少なくとも部分的に
可溶性である。組成物媒体は、ヒドロゲルであり得、これは、薬剤吸収スポンジとして作
用することのできる親水性ポリアクリル酸ポリマーなど、任意の生体適合性、又は非細胞
毒性のホモポリマー若しくはヘテロポリマーから調製される。これらのうちの１つもの、
特にエチレン及び／又は酸化プロピレンから得られるものは、市販されている。ヒドロゲ
ルは、例えば外科的介入の間に治療されるべき組織の表面に直接配置することができる。
【０１８５】
本発明の医薬組成物の実施態様は、本発明のポリヌクレオチド阻害剤をコードする複製
欠損組換えウイルスベクターと、ポロキサマーなどのトランスフェクションエンハンサー
とを含む。ポロキサマーの例は、ポロキサマー407であり、市販されており（BASF, Parsi
ppany, N.J.）、非毒性の生体適合性ポリオールである。組換えウイルスを含浸したポロ
キサマーは、例えば外科的介入の間に治療されるべき組織の表面に直接配置してよい。ポ
ロキサマーは、より低い粘度を有しながらも、ヒドロゲルと本質的に同じ利点を有する。
【０１８６】
また、活性のある発現阻害薬は、例えば、界面重合化によって調製されたマイクロカプ
セル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ
-(メチルメタクリラート)マイクロカプセルにおいてそれぞれ、コロイド状薬剤送達シス
テム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルション、ナノ粒子
、及びナノカプセル）において、又はマクロエマルションにおいて封入され得る。このよ
うな技術は、Remingtonの文献「医薬科学（Pharmaceutical Sciences）」（(1980) 第16
版, Osol, A.編）に開示されている。
【０１８７】
徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の好適な例には、マトリックスが、成形さ
れた物品の形態にある、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス、例えば、
フィルム又はマイクロカプセルを含む。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒ
ドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリラート)、又はポリ(ビニルアルコ
ール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸とガンマ-エチル-L-
グルタマートとのコポリマー、非分解性エチレン-ビニルアセタート、LUPRON DEPOT（商
標）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸
ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、及びポリ-D-(-)-3-ヒドロキ
シ酪酸を含む。エチレン-ビニルアセタート及び乳酸-グリコール酸などのポリマーによっ
て100日間超にわたる分子の放出が可能となる一方で、アルヒドロゲルは、より短い期間
タンパク質を放出する。封入された抗体が、長時間にわたって身体にとどまる場合、前記
抗体は、37℃での湿気に対する曝露の結果として変性又は凝集し得、結果的に、生物学的
活性の損失及び免疫原性の起こり得る変化を生じる。包含される機序に応じて安定化のた
めに合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機序が、チオ‐ジスルフィド交
換を通じた分子間S-S結合形成であると発見される場合、安定化は、スルフヒドリル残基
を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分含有量を制御し、適切な添加剤を用い、及び具
体的なポリマーマトリックス組成物を展開することによって達成され得る。
【０１８８】
先に規定したように、治療効果のある用量は、症状または容態を寛解するタンパク質、
ポリヌクレオチド、ペプチド、又はその抗体、アゴニスト、若しくはアンタゴニストの量
を意味する。このような化合物の治療有効性及び毒性は、細胞培養又は実験動物における
標準的な医薬手順、例えば、ED50（集団の50％において治療有効である用量）及びLD50（
集団の50％に対する致死的用量）によって決定することができる。治療効果に対して毒性
である用量比は、治療指数であり、比LD50／ED50として表すことができる。細胞培養アッ
セイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトの使用のための薬用量範囲を処方する上で
用いられる。このような化合物の薬用量は好ましくは、毒性をほとんど又は全く有さない
ED50を含む循環濃度の範囲内に収まる。薬用量は、採用される剤形、患者の感受性、及び
投与の経路に応じて、この範囲内で変動する。
【０１８９】
任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいて又は動物モデル、
通常、マウス、ウサギ、イヌ、又はブタにおいてのいずれかで初期的に概算することがで
きる。また、動物モデルは、所望の濃度範囲及び投与経路を達成するために用いられる。
次に、このような情報は、ヒトにおける投与に有用な用量及び経路を決定するために用い
ることができる。実際の薬用量は、治療されるべき患者を考慮して個々の医師によって選
択される。薬用量及び投与は、十分なレベルの活性部分を提供するために、又は所望の効
果を維持するために調整される。考慮され得る追加的な因子には、患者の疾患状態の重症
度、齢、体重、及び性別；食事、治療の所望の期間、投与方法、投与の回数及び頻度、薬
剤の組み合わせ、反応の感受性、及び治療法に対する耐性／応答を含む。長時間作用性医
薬組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス速度に応じて、3〜4日ごとに、毎週、
又は2週間に1回投与され得る。
【０１９０】
本発明に従った医薬組成物は、種々の方法によって対象に投与され得る。前記医薬組成
物は、TARGET組織に直接添加でき、陽イオン性脂質と複合体形成でき、リポソーム内に封
入でき、又は当技術分野で公知の他の方法によってTARGET細胞に送達できる。所望の組織
への局在性投与は、直接注射、経皮的吸収、カテーテル、注入ポンプ、又はステントによ
って実施され得る。DNA、DNA／ビヒクル複合体、又は組換えウイルス粒子は、治療部位に
局所投与される。送達の代替的な経路には、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、エアロ
ゾル吸入、経口送達（錠剤又は丸剤の形態）、局所送達、全身送達、眼内送達、腹腔内送
達、及び／又はくも膜下腔内送達を含むが、これらに限定されない。リボザイムへの送達
及び投与の例は、SullivanらのWO94／02595において提供される。
【０１９１】
本発明に従った抗体は、急速投与として1回送達され得、経時的に注入され得、又は急
速投与として投与され得かつ経時的に注入され得る。当業者は、タンパク質に対するより
もむしろポリヌクレオチドに対する異なる製剤を採用し得る。同様に、ポリヌクレオチド
又はポリペプチドの送達は、特定の細胞、容態、位置などに特異的であろう。
【０１９２】
先に論議されるように、組換えウイルスは、本発明において有用なポリヌクレオチド剤
をコードするDNAを導入するために用いられ得る。本発明に従った組換えウイルスは一般
的に、約104〜約1014pfuの用量の形態で製剤及び投与される。AAV及びアデノウイルスの
場合、約106〜約1011pfuの用量が好ましくは用いられる。用語pfu（「プラーク形成単位
」）は、ウイルス粒子の懸濁液の感染力に相応しており、適切な細胞培養物を感染させて
、形成されるプラーク数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のpfu力価を
決定するための技術は、従来技術において十分に実証されている。
【０１９３】
また、本発明は、軟骨形成を増強する方法も提供し、該方法は、該対象への治療有効量
の本明細書の発現阻害薬の投与を含む。本発明のさらなる態様は、該対象に、本明細書に
説明された軟骨形成増強医薬組成物を投与することを含む、軟骨細胞の同化刺激を包含す
る疾患を治療又は予防する方法に関する。
【０１９４】
本発明の手段及び方法を用いて治療できるECMの分解を包含する疾患の例には、乾癬性
関節炎、若年性関節炎、初期関節炎、反応性関節炎、変形性関節症、強直性脊椎炎、骨粗
鬆症、腱炎及び歯周病などの筋骨格疾患、癌転移、気道疾患（慢性閉塞性肺疾患、喘息）
、腎線維症及び肝線維症、粥状硬化及び心不全などの心臓脈管系疾患、並びに神経炎症及
び多発性硬化症などの神経学的疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
本発明の手段及び方法を用いて治療可能な軟骨の分解を包含する疾患の例には、変形性
関節症、関節リウマチ、乾癬性関節炎、若年性関節リウマチ、痛風性関節炎、化膿性又は
感染性関節炎、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、有痛性骨萎縮症、ティ
ーツェ症候群又は肋軟骨炎、線維筋痛症、骨軟骨炎、神経原性又は神経障害性関節炎, 関
節症、地方性変形性骨軟骨関節症のような風土性形態の関節炎、 ムセルニ病、及びハン
ディゴデュ病；線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、強皮症、及び強直性脊椎炎から結
果として生じる変性が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、遺伝性軟骨溶解、
軟骨異形成症、及び偽軟骨異形成を含む先天性軟骨形成異常を罹患している人々は、軟骨
細胞の同化刺激を結果として生じるプログラムから利益を得る可能性があり、またこれら
の疾患はそれゆえ、本発明の方法及び手段を用いることによって治療され得る。先天性軟
骨形成異常関連疾患の制限のない例は、小耳症、無耳症、及び骨幹端軟骨異形成症である
。
【０１９６】
加えて、また同定された標的はIL‐1シグナル伝達も阻害するので、これらの標的の阻
害薬は、炎症性疾患の治療において使用され得る。本発明の手段及び方法を用いて治療で
きる炎症を包含する疾患の例には、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、自己
免疫疾患、移植片拒絶、クローン病、関節リウマチ、乾癬、若年性特発性関節炎、大腸炎
、及び炎症性腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
一態様において、本発明は、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解を包含する障害を予
防及び／又は治療する方法を提供し、該方法は、対象に、本明細書に開示された治療有効
量の薬剤を投与することを含む。特定の実施態様において、薬剤は、発現阻害薬及び抗体
から選択される。特定の実施態様において、障害は、変形性関節症、関節リウマチ、アレ
ルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、及び自己免疫疾患から選択される。特定の実
施態様において、障害は変形性関節症である。
【０１９８】
また、本発明は、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解を包含する疾患を治療又は予防
するための医薬の製造のための先に説明された薬剤の使用にも関する。特定の実施態様に
おいて、薬剤は、発現阻害薬及び抗体から選択される。本発明の特定の実施態様において
、疾患は、変形性関節症、関節リウマチ、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）
、及び自己免疫疾患から選択される。特定の実施態様において、障害は変形性関節症であ
る。
【０１９９】
また、本発明は、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解を包含する疾患を治療及び／又
は予防する方法も提供し、該方法は、軟骨の分解を包含する疾患を罹患している又は易罹
患性の対象に、本明細書に記載された医薬組成物又は化合物、特に本明細書に同定された
TARGETの発現又は活性を阻害する治療有効量の薬剤を投与することを含む。特定の実施態
様において、障害は、変形性関節症、関節リウマチ、アレルギー性気道疾患（例えば、喘
息、鼻炎）、及び自己免疫疾患から選択される。特定の実施態様において、障害は変形性
関節症である。
【０２００】
また、本発明は、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解を包含する疾患の治療及び／又
は要望における使用のための先に説明された薬剤又は医薬組成物にも関する。特定の実施
態様において、障害は、変形性関節症、関節リウマチ、アレルギー性気道疾患（例えば、
喘息、鼻炎）、及び自己免疫疾患から選択される。特定の実施態様において、障害は変形
性関節症である。
【０２０１】
本発明の薬剤又は医薬組成物の対象患者への投与には、自己投与及び別の人間による投
与の両方を含む。患者は、既存の疾患若しくは医学的容態のための治療の必要にあり得、
又は軟骨分解を特徴とする疾患及び医学的容態についてのリスクを予防又は低下させるた
めに予防的処置を望み得る。本発明の薬剤は、対象患者へ経口的に、経皮的に、吸入、注
射を介して、鼻内に、直腸内に、又は徐放性製剤を介して送達され得る。
【０２０２】
本発明のなおも別の態様は、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解を包含する病理学的
容態を診断する方法であって、生物学的試料における配列番号22〜42からなる群から選択
されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量を決定すること、及び前記量を健常対象のポ
リペプチドの量と比較することを含む前記方法に関し、この中で、健常対象と比較したポ
リペプチドの量の増大は、病理学的容態の存在を示す。特定の実施態様において、障害は
、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、及び自己免疫疾患から選択される。特
定の実施態様において、障害は変形性関節症である。
【０２０３】
本発明のさらに別の態様は、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解を包含する病理学的
容態を診断する方法であって、生物学的試料における配列番号22〜42からなる群から選択
されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性を決定すること、及び前記活性を健常対象
におけるポリペプチドの活性と比較することを含む前記方法に関し、この中で、健常対象
と比較したポリペプチドの活性の増大は、病理学的容態の存在を示す。明確に、本明細書
に開示された標的遺伝子の活性及び／又は発現レベルは、軟骨細胞の同化刺激に及ぼす効
果を有し得る。疾患について診断するために、活性がどのレベルまで上昇すべきであるか
はまだ決定されていないままである。しかしながら、患者、症状を有さない個体、及び明
確に健常な個体において認められたレベルを比較することによって、当業者は、これらの
関連するレベルを容易に決定し得る。当業者はいまや、どのポリペプチドがモニターされ
るべきであるかに気付いているので、本発明は、このような診断についての試験アッセイ
のための新規のツールを提供する。本発明によって提供される知識を用いることによって
制御、チェック、及び診断され得る顕著な疾患は、変形性関節症である。特定の実施態様
において、障害は、関節リウマチ、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、及び
自己免疫疾患から選択される。特定の実施態様において、障害は変形性関節症である。
【０２０４】
本発明のなおも別の態様は、炎症、ECM分解、及び／又は軟骨分解を包含する病理学的
容態を診断する方法であって、対象のゲノムDNA内に配列番号1〜21の配列の遺伝子の少な
くとも1つの核酸配列を決定すること；前記配列を、データベース及び／又は健常対象か
ら得られた核酸配列と比較すること；並びに本明細書に開示された病理学的容態の発症又
は蔓延と関連した任意の差を同定することを含む前記方法に関する。このような差は、本
明細書に開示された類似のマーカー遺伝子を適用するインビトロアッセイにおいてさらに
チェックされ得る。このようなアッセイは、軟骨細胞の同化刺激過程における遺伝子又は
該遺伝子のコードしたポリペプチドの役割を明らかにするであろう。このような突然変異
が同定される場合、この知識はさらに、類似の疾患の診断のための試験キットにおいて活
用することができる。特定の実施態様において、障害は、変形性関節症、関節リウマチ、
アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、及び自己免疫疾患から選択される。特定
の実施態様において、障害は変形性関節症である。
【０２０５】
本明細書の方法において採用されるポリペプチド又はポリヌクレオチドは、溶液中で遊
離し得、固相支持体に固定され得、細胞表面に支持され得、又は細胞内に配置され得る。
前記方法を実施するために、本発明のポリペプチド又は化合物のいずれかを固定化して、
ポリペプチドの複合体形成していない形態から複合体の分離を容易にすること、及びアッ
セイの自動化を収容することが可能である。本発明のポリペプチドと化合物との相互作用
（例えば、結合）は、反応体を含むのに適した任意の容器において達成することができる
。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、及び微量遠心管を含む
。一実施態様において、ポリペプチドがマトリックスに結合できるドメインを付加する融
合タンパク質を提供することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、「His」タグ
付きであることができ、その後、Ni‐NTAマイクロタイタープレートに吸着させることが
でき、又は本発明のポリペプチドとのProtA融合体がIgGに吸着させることができ、これが
次に細胞溶解物（例えば、(35)S標識済み）及び候補化合物と組み合わさり、混合物を複
合体形成に好ましい条件下で（例えば、塩及びpHについての生理学的条件で）インキュベ
ートされる。インキュベーション後、プレートを洗浄して、任意の結合していない標識を
除去し、マトリックスを固定化する。放射能の量は、直接的に、又は複合体の解離後に上
清中で、決定することができる。あるいは、複合体は、マトリックスから解離され、SDS
‐PAGEによって分離されることができ、本発明のタンパク質に対して結合しているタンパ
ク質のレベルを、標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量する。
【０２０６】
また、マトリックス上にタンパク質を固定化する他の技術は、化合物を同定する方法に
おいて用いることができる。例えば、本発明のポリペプチド又は化合物は、ビオチン及び
ストレプトアビジンの抱合を利用して固定化することができる。本発明のビオチン化タン
パク質分子は、当技術分野で周知の技術を用いてビオチン‐NHS（N-ヒドロキシ-スクシン
イミド）から調製することができ、ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレ
ート（Pierce Chemical）のウェルにおいて固定化することができる。あるいは、本発明
のポリペプチドと反応するが、化合物に対するポリペプチドの結合に干渉しない抗体は、
プレートのウェルへと誘導体化することができ、本発明のポリペプチドは、抗体抱合によ
ってウェルに捕捉することができる。先に説明したように、標識済みの候補化合物の調製
物は、本発明のポリペプチドの存在するプレートのウェルにおいてインキュベートされ、
ウェルに捕捉された複合体の量は定量化することができる。
【０２０７】
本発明の別の実施態様は、エクスビボ培養の間又は移入後のいずれかで細胞又は軟骨の
自家移植のために用いられる軟骨細胞、軟骨細胞前駆細胞、又は間葉系幹細胞の特性を回
復又は安定化することができる化合物の使用のための方法に関する。この回復は、移植片
の中または周りの低レベルのECM及び／又は軟骨分解プロテアーゼの結果となり得る。例
えば、候補化合物は、所望の分子が吸収又は封入されたメンブレン、スポンジ、又は他の
適切な材料の移入を介して局所的に投与され得る。移入デバイスが用いられる場合、デバ
イスは、任意の好適な組織又は臓器へと移入され得、所望の分子の送達は、拡散、時限放
出（timed-release）急速投与、又は持続性投与を介し得る。
【０２０８】
ECM及び／又は軟骨分解の速度は典型的には、培地において軟骨細胞によって産生され
る軟骨、又は軟骨構成要素、又は軟骨含有細胞外マトリックスの沈着を決定することによ
って測定することができる。Walsh G.の文献「タンパク質：バイオテクノロジー及び生化
学（Proteins: Biotechnology and Biochemistry）」（John Wiley and Sons, 2001）に
おいて説明されるもののような、細胞べースのELISA、酵素アッセイ、又は当技術分野で
公知の他の一般的な技術を用いて、軟骨構成要素を測定することができる。
【０２０９】
本発明は、以下の図及び実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【０２１０】
（実施例1：NHACを用いたMMP13アッセイ）
導入において説明したように、MMP13は、変形性関節症患者の影響を受けた関節におけ
る軟骨の分解に至る異化事象に関与する鍵となる担い手のうちの1つとして、変形性関節
症の文献において同定されている。それゆえ、疾患関連誘発因子を用いて活性化された初
代ヒト軟骨細胞におけるMMP13の発現を調節する因子を同定するために、機能的ゲノミク
スの尽力を開始するよう決定した。本アッセイはさらに、「MMP13アッセイ」として本明
細書で言及される。本アッセイにおいて同定された因子は、変形性関節症のための新規の
治療法の開発のための基礎として用いることができる。
【０２１１】
SilenceSelect回収物のスクリーニングのために開発されたMMP13アッセイは、以下の特
有の特色を有する：
・本アッセイは、初代ヒト関節軟骨細胞を用いて実施するが、最小の適用を用いて、初
代軟骨細胞、軟骨細胞前駆細胞、又は軟骨細胞細胞株の任意の他の源について用いられ得
る。
・本アッセイは、用いられる初代ヒト軟骨細胞が、可能な限り多くの正常環境（軟骨マ
トリックス）に類似した環境にあるよう実施される。細胞は、三次元培養において増殖し
、培養容器への細胞接着を回避する。
・本アッセイは、機能的ゲノミクス目的のために整列したアデノウイルス回収物を用い
た使用のために最適化されている。
・最小の適用を用いて、本アッセイはまた、化合物又は化合物回収物をスクリーニング
することができる。
・本アッセイは、高処理モードで実施することができる。
【０２１２】
正常ヒト関節軟骨細胞（NHAC）を用いたMMP13アッセイは、下記により詳細に説明され
ている。まず、開発されたMMP13 ELISAのプロトコールは、第1節に説明されている。次に
、初代軟骨細胞の培養及び維持は、第2節に説明されている。NHACを用いたMMP13アッセイ
のスクリーニングプロトコールは、第3節に説明されている。対照プレートの組成及び性
能は、第4節に示されている。SilenceSelect回収物のスクリーニングの性能に関する例は
、第5節に示されている。
【０２１３】
NHACにおけるMMP13アッセイは、NHACにおけるshRNAの発現を仲介する10946の異なる組
換えアデノウイルスの整列した回収物に対してスクリーニングされている。これらのshRN
Aは、RNA干渉（RNAi）として公知の機序によって、相同的配列を含む遺伝子の発現レベル
の低下を生じる。整列した回収物において含まれる10946のAd-siRNAは、6308の異なる転
写産物を標的とする。平均して、いずれの転写産物も、2〜3の独立したAd-siRNAによって
標的とされる。スクリーニングの原理を図１に説明し、下記のより詳細に説明する。
【０２１４】
（1.1  MMP13 ELISAプロトコール）
培養されたNHACによって産生されるMMP13量を検出するのに十分な感度でELISAを展開す
るために、種々の抗体及び基質を試験した。MMP13の測定についての384ウェルフォーマッ
トELISAを展開した。種々の一次抗体を試験し、及び種々のELISAプロトコールは、384ウ
ェルプレートにおけるMMP13レベルの測定について以下の検証されたプロトコールをもた
らした。黒色マキシソルブ384ウェルプレート（Nunc 460518）を5μg／mL抗MMP13抗体MAB
511（R＆D System）で被覆する。抗体を炭酸‐重炭酸被覆緩衝液（1.59g Na2CO3（Sigma 
S‐7795）及び2.93g NaHCO3（Sigma S‐5761））含有1LミリQ、pH9.6に調整）で希釈する
。4℃で一晩インキュベーション後、プレートを100μL PBST（80g NaCl、2g KCl（Sigma
）、11.5g Na2HPO4・7H2O、及び2g KH2PO4含有10LミリQ；pH7.4＋0.05％Tween‐20（Sigm
a））で3回洗浄し、100μL／ウェルのブロッキング緩衝液（5％無脂肪ドライミルク含有P
BS）でブロッキングする。室温で2時間のインキュベーションの後、プレートを100μLのP
BSTで3回洗浄する。次に、PBSTを除去し、35μLの試料をELISAプレートに移す。4℃で一
晩インキュべ−ションの後、プレートをPBSTで3回洗浄し、35μL／ウェルの1.5mM APMAと
ともに37℃で1時間インキュベートする。10mM APMAストック溶液（前日に調製）を4℃で
保存する（35.18mg APMA（Sigma A‐9563）含有10mL 0.1M NaOH（Merck 1.06469.1000）
）。10mM APMAストック溶液をAPMA緩衝液（10×APMA緩衝液：500mMトリス（Roche 708976
）、50mM CaCl2（Sigma C‐5080）、500μM ZnCl2（Sigma Z‐0173）、1.5M NaCl（Calbi
ochem 567441）、0.5％Brij35（Sigma 430 AG‐6）、及びpH7.0に調整）において1.5mMに
希釈する。APMAによるMMP13の活性化後、プレートを100μL PBST／ウェルで再度3回洗浄
する。OmniMMP Fluorescent基質（Biomol P‐126）をOmniMMP緩衝液（10×OmniMMP緩衝液
：500mM Hepes（Sigma H4034）、100mM CaCl2（Sigma C5080）、0.5％Brij35（Sigma 430
AG‐6；pH7.0に調整））に溶解し、0.01mMの終濃度にする。この基質35μLを各ウェルに
添加する。37℃での一晩のインキュベーション後、試料中の活性のあるMMP13は基質を切
断し、蛍光を放出する。読み出しを、320nm励起／405nm発光フィルターを用いるEnVision
（Perkin Elmer）において実施する。
【０２１５】
（1．2  初代軟骨細胞の維持）
正常ヒト関節軟骨細胞（NHAC）継代1を商業源から獲得した（カタログ番号CC‐2250、C
ambrex Verviers, BE）。実験ごとについて、ウイルス含有初代NHACを製造元のプロトコ
ールに従って解凍し、細胞を標準的な条件（37℃、5％CO2）下で軟骨細胞増殖培地（CGM
、カタログ番号CC3216、Cambrex、Verviers）においてT80細胞培養容器において単層で培
養する。この培養がコンフルエンスに到達すると、細胞を製造元のプロトコールに従って
トリプシン処理し（試薬パックカタログ番号CC‐3233、Cambrex、Verviers、BEを使用）
、新たなT175培養容器（1×10E＋05個の細胞／T175フラスコ）に転移させた。これらの培
養物がコンフルエンスに到達すると、細胞をトリプシン処理し、MMP13アッセイに供した
。それゆえ、MMP13アッセイに用いた細胞は、解凍後2回の継代について継代したのみであ
った。
【０２１６】
（1．3．スクリーニング手順）
最適なスクリーニングプロトコールは、以下のとおりである：96ウェル組織培養プレー
トを、5％FBS並びに100単位／mLペニシリン（Invitrogen）及び100μg／mLストレプトマ
イシン（Invitrogen）の混合物を補充したDMEM‐F12培地（この培地はさらに、「アッセ
イ培地」と呼ばれる。）において調製された50μLの1.5％低融点アガロースで被覆する。
NHACをトリプシン処理し、5％FBS並びにペニシリン及びストレプトマイシンの混合物を含
むDMEM‐F12において7500個の細胞／20μL／ウェルの密度でポリプロピレン96ウェルプレ
ートに蒔種する（細胞接着を回避するため）。次に、細胞をヒトコクサッキー／アデノウ
イルス受容体（hCAR）の発現を仲介するアデノウイルスに（およそ250のMOI（感染多重度
、アッセイにおける細胞あたりに用いられるウイルス粒子の量を指す。）で）感染させて
、SilenceSelect回収物に含まれるAd‐SiRNAウイルスによるその後の感染を容易にする。
ヒトコクサッキー／アデノウイルス受容体は、ヒト細胞膜へのアデノウイルスの付着に関
与する共受容体である。細胞におけるこの受容体の発現は、例えばT細胞におけるアデノ
ウイルスによるその後の感染を容易にするために説明されている（Schmidtらの文献（200
0））。翌日、384ウェルプレート（1mLあたり1×109のウイルス粒子の概算力価）に保存
されたSilenceSelect（登録商標）回収物（WO03／020931）の各ウェルからの12μLのAd‐
SiRNAウイルスを96／384チャネルディスペンサーの助力で、NHACを含む96ウェルプレート
の個々のウェルに転移させた。アデノウイルスライブラリーの平均力価が1×109のウイル
ス粒子／mLであるので、このことは、約1600の平均MOIを表す。Ad‐siRNAのウェルへの添
加後、37℃で1時間のインキュベーション工程を実施する。感染を、各ウェルがSilenceSe
lect（登録商標）回収物由来のAd‐siRNAの1つの個々の種類で感染すると、整列した様式
で実施する。次に、8％FBS並びにペニシリン及びストレプトマイシンの混合物を補充した
DMEMF12培地において調製した40μLの0.8％低融点アガロースをウェルに添加する。ウェ
ルの内容物を多重チャネルロボットを用いたピペッティングによって上下にすることによ
って混合し、50μLの混合物をアガロースで被覆した96ウェルプレートに転移させる。ア
ガロースの凝固の速度を上げるために、プレートを4℃でおよそ15分間保存する。150μL
のアッセイ培地をウェルに添加する。次に、感染したNHACを4日間インキュベートし、細
胞におけるshRNA発現を十分なレベルに到達させておき、細胞における遺伝子サイレンシ
ングの機構を完全に刺激しかつ有効にしておく。感染4日後、細胞における培地をアッセ
イ培地で改める。翌日、細胞を、10ng／mL組換えヒトIL1bを含むアッセイ培地の添加によ
って刺激する。誘発因子の添加2日後、上清を回収し、MMP13 ELISAに供するまで−80℃で
保存する。35μLの上清をMMP13 ELISAに供し、MMP13 ELISAを384ウェルプレートフォーマ
ットにおいて実施する。高処理量適合性ELISAに適用されるプロトコールは実施例1.1に説
明されている。感染、培地交換、及び培地回収の工程をTECAN Freedomピペッター（TeMO9
6、TeMO384、及びRoMaを装備したTecan Freedom 200、Tecan AG、Switzerland）を用いて
実施した。
【０２１７】
（1．4．対照プレートの性能）
96ウェル対照プレートを、本アッセイの質を評価するために作製する。対照プレートは
、SilenceSelect（登録商標）回収物と同じ方法で作製する。この対照プレートの複数の
一定分量を生じ、−80℃で保存する。スクリーニングの施行ごとについて、スクリーニン
グプレートの新たな一定分量を解凍し、スクリーニング試行すべての性能を比較させる。
このプレートの組成は以下のとおりである。ウェルを、SilenceSelect（登録商標）アデ
ノウイルス回収物（WO03／020931）と同じ条件下で産生された対照ウイルスで満たす。こ
の対照プレートは、4セットの陽性対照ウイルス（陽性対照ウイルスあたり8ウェル；P1（
Ad5‐R1T1_v5_KD）、P2（Ad5‐SLC26A8_v2_KD）、P3（Ad5‐TRAF6_v4_KD）、P4（Ad5‐NF
KBIA_KI）、列に配置、3セットの陰性対照ウイルス（陰性対照ウイルスにつき16ウェル；
N1（Ad5‐空_KD）、N2（Ad5‐M6PR_v1_KD）、N3（Ad5‐LacZ_KI））で間を配置）を含む
。陰性対照ウイルスをIL1の存在下（8ウェル）又はIL1の不在下（8ウェル）のいずれかで
試験する。陽性対照試料を、文献情報（P3（Ad5‐TRAF6_v4_KD）、P4（Ad5‐NFKBIA_KI）
）に基づいて、又は限定されたAd‐siRNAウイルスの予備スクリーニング（P1（Ad5‐RIT1
_v5_KD）、P2（Ad5‐SLC26A8_v2_KD））に基づいてのいずれかで選択する。TRAF6は、IL1
βの下流のシグナル伝達に必要であることが公知であり（Caoらの文献（1996））、NFKBI
Aの過剰発現は、MMP13の発現に必要であることが公知の転写因子であるNFカッパBを阻害
することが公知である（Karinの文献（1999））。
【０２１８】
対照プレートを、異なるスクリーニング実施の間のSilenceSelect（登録商標）回収物
からの一定分量プレートと同じ条件下で並行して実施する。先に説明したスクリーニング
プロトコールを用いて試験した対照プレートの性能に関する代表的な例を図３に示す。示
されるデータは、対照プレートに含まれるウイルスに感染したNHACによって産生されるMM
P13のレベルを表す。2つの対照プレートの試験から得られたデータの平均を示す。データ
は、細胞のIL1処理によるMMP13発現の明確な上方制御を示す。細胞のIL1処理の際に得ら
れる最大MMP13レベルは、3つのネガティブコントロールに匹敵する。4つのポジティブコ
ントロールはすべて、NHACのIL1応答を低下させ、最大の効果は、P3（Ad5‐TRAF6_v4_KD
）及びP4（Ad5‐NFKBIA_KI）ポジティブコントロールについて観察された。これらのデー
タは、スクリーニングの良好な質を確認する。
【０２１９】
（実施例2：SilenceSelect回収物のスクリーニング）
合計10946のウイルスのSilenceSelect回収物を、実施例1．3において説明されたプロト
コールに従って3次元フォーマットにおけるアガロースにおいて培養した初代NHACに関し
て実施したMMP13アッセイにおいてスクリーニングする。これらの10946ウイルスは、6308
の転写産物を網羅し、SilenceSelect（登録商標）回収物において構築される重複性を反
映する。これらの重複性は、SilenceSelect（登録商標）回収物内に含まれる複数の独立
したAd‐siRNAによって標的とされるほとんどの転写産物を結果として生じる。スクリー
ニングバッチの1つの間に得られるデータを図４に示す。スクリーニングバッチの間、Sil
enceSelect（登録商標）回収物の4384ウェルプレートにおいて含まれる1536のAd‐siRNA
を、MMP13アッセイにおける二つ組においてスクリーニングする。実施例1において与えら
れるNHACに関するMMP13アッセイの説明において記述されているように、NHAC細胞培養、A
d5‐siRNAによる感染、及びIL1による活性化を96ウェルフォーマットにおいて実施する。
このように、SilenceSelect（登録商標）回収物に含まれる384ウェルプレートのあらゆる
四半分を用いて、NHACを含む2つの96ウェルプレートを並行して感染させる。次に、得ら
れた上清を384ウェルプレートに転移させて、実施例1．1に説明されたMMP13 ELISAにおけ
るMMP13レベルを決定する。転移は、二つ組試料が、同じMMP13 ELISAプレートに関して測
定されるよう計画される。データ分析を以下の通り実施する：
【０２２０】
まず、あらゆる384ウェルプレートについて個々に、すべての試料についてのデータを
標準化し、「標準化された値」へと以下の通り変換する。384のデータポイントすべてを
列挙し、5％の最高の及び5％の最低のMMP13シグナルをリストから除去する。次に、平均
及び標準偏差を個の削減したリストのすべての試料にわたって算出し、これらの平均及び
標準偏差に基づいて、標準化されたデータを式：標準化された値の試料A＝［（生のMMP13
シグナルの試料A−平均）／（標準偏差）］を適用することによって算出する。384ウェル
プレートについてのこのデータの変換によって、異なるスクリーニングバッチの試料の比
較が可能となる。
【０２２１】
次に、閾値を以下の通り的中物喚起（hit calling）させるよう決定する。スクリーニ
ングバッチごとについて、2つの96ウェル対照プレートをSilenceSelect（登録商標）回収
物からの試料と並行して試験し、あらゆる対照プレートは、3つのネガティブコントロー
ルウイルスを含む（ネガティブオントロールウイルスあたり8ウェル）。対照プレートに
含まれる3つのネガティブコントロール（3×16ウェル＝合計48ウェル）についてのMMP13
シグナルの平均及び標準偏差を算出する。このデータに基づいて、種々の閾値を以下の式
を適用することによって標準偏差と関連して表す：閾値＝［（ネガティブコントロールに
わたる平均）−（「カットオフ」回数×ネガティブコントロールにわたる標準偏差）］。
次に、種々の閾値を48のネガティブコントロールに対して試験する。カットオフは、ネガ
ティブコントロールの19％未満がこの閾値よりも低い閾値を規定するよう選択される。Ad
‐siRNAウイルスは、これらのAd‐siRNAについての両方のデータポイント（標準化された
値として表される。）が、最初のスクリーンにおける選択されたカットオフ値を下回って
スコア化した場合、初回的中物として任命した。
【０２２２】
図４において、NHACに関するMMP!3アッセイに対するSilenceSelect（登録商標）回収物
のスクリーニングの間にスクリーニングバッチのうちの1つにおいて得られるデータを示
す。このスクリーニングバッチにおいて、1536のAd‐siRNAを二つ組で試験した。グラフ
において、Ad‐siRNAについて得られた2つのデータポイント（標準化されたMMP13レベル
の点で表される。）を互いに対してプロットする。このスクリーニングバッチについて決
定されたカットオフ（−1.8）を点線で示す。カットオフを下回る2つのデータポイントを
生じ、かつ最初の的中物（36Ad‐siRNA）として任命したAd‐siRNAについてのデータを黒
点として示し、選択されたカットオフを下回る唯一のデータポイントを生じたAd‐siRNA
についてデータを灰色の点として示し、非的中物Ad‐siRNAについてのデータを白色の点
として示す。二つ組のデータポイント（データポイントは、直線の周りに集中している。
）間で観察される対称性は、スクリーニングの良好な質及び再現性を示す。
【０２２３】
図６に示されるスキームは、より詳細に分析された的中物のスクリーニング及び選択の
間に得られる摩擦を示す。スクリーニングされた10946のAd‐siRNAのうち、263を二つ組
でのスコア化として同定された。加えて、最初のスクリーンうちの最大値を抽出するため
に、2つのデータポイントのうちの1つにおいてのみのウイルスのスコア化のリストをさら
に分析して、同一の転写産物を標的とする独立したウイルスを同定した。異なる標的配列
を通じて同じ遺伝子を標的にする2つの独立したAd‐siRNAが、たとえより弱くてもMMP13
アッセイにおいて活性があるという事実は、価値のある情報と考えられる。本分析は、10
6の的中物を最初の的中物リストに付加し、最初の的中物の最終数を369とした。これらの
369の最初の的中物を実施例3において説明される再スクリーン手順においてさらに分析し
た。
【０２２４】
（実施例3：3MOI再スクリーン）
（3．1  再スクリーニングプロトコール）
最初の的中物を確認した的中物にするために、元の的中物Ad‐siRNAを独立して2倍に再
増殖させて、独立したAd‐siRNA材料を生じる。次に、これらの再増殖したウイルスを3MO
IでNHACに関するMMP13 ELISAにおいて試験する。再増殖材料が、SilenceSelect（登録商
標）回収物に含まれる元の最初の的中物と比較して異なる力価を有するウイルス材料を生
じ得るので、元の最初の新たなウイルス材料を3MOIでスクリーニングする。2つの再増殖
物を3MOIで試験すると、6つのデータポイントを、「3MOI再スクリーン」に供したあらゆ
るAd‐siRNAについて生じる。両再増殖材料について少なくとも1MOIをスコア化する的中
物のみが、確認された的中物と考えられる。
【０２２５】
再増殖工程について、最初の的中物をSilenceSelect回収物から拾い、ポジティブコン
トロール及びネガティブコントロールとともに96ウェルプレートにおいて再増殖させる。
3MOI再スクリーンの実施についての考えられるレイアウトを図５Ａに示す。各再増殖プレ
ートは、20の対照ウェルによって取り囲まれる的中物ウイルスを含む40ウェルを有する。
これらの対照ウェルは、ネガティブコントロール（N1（Ad5‐空_KD）；N2（Ad5‐LacZ_KI
）；N3（Ad5‐M6PR_v1_KD）；N4（Ad5‐空_KD））又はポジティブコントロール（P1（Ad5
‐TRAF6_v4_KD）；P2（Ad5‐RIT1_v5_KD）；P6（Ad5‐空_KD）；P7（Ad5‐空_KD））のい
ずれかを含む。増殖のために、SilenceSelect（登録商標）回収物からの的中物Ad‐siRNA
試料の粗可溶化液を拾い、96ウェルプレートにおいて対照とともに配置する。粗可溶化液
の容器は、バーコード（Screenmates（商標）、Matrix technologies）で標識されている
ので、品質チェックをプレートについて実施する。ウイルスを増殖させるために、2.25×
104PER．C6／E2A細胞を、96ウェルプレートの各ウェルにおいて10％の非熱失活FCSを含む
200μLのDMEMに蒔種し、10％CO2で加湿されたインキュベーターにおいて39℃で一晩イン
キュベートする。次に、先に示した96ウェルプレートに配置された各的中物Ad‐siRNA由
来の1μLの粗可溶化液を添加して、96ウェルディスペンサーを用いてPER．C6／E2A細胞の
ウェルを分離する。10％CO2で加湿されたインキュベーターにおけるインキュベーション
の7〜10日後、再増殖プレートを−20℃で凍結し、但し、完全なCPE（ウイルス産生が完全
であることを示す細胞変性効果）が観察され得ることを条件とする。
【０２２６】
次の工程において、再増殖プレートに含まれるAd‐siRNAを、NHACに関するMMP13アッセ
イにおいて試験する。本試験のために、最初のスクリーニングについて実施例2に説明さ
れたものと同じプロトコールを用い、増殖したウイルスの3容積：すなわち8μL、12μL、
及び16μLを用いて、MMP13アッセイに供した軟骨細胞を感染させることが唯一の違いであ
った。次に、2つの感染していないものを除くすべての対照ウェルをIL1で活性化させる。
加えて、P6及びP7対照をスタウロスポリン（5μM終濃度）及びブレフェルジンA（0.5μL
／mL終濃度）で処理する。これらの化合物をIL1誘発因子の添加の前日に、及びIL1誘発因
子の添加とともに翌日に添加する。P6及びP7対照ウェルへのスタウロスポリン及びブレフ
ェルジンAの添加の目的は、NHACによる分泌が完全に遮断される場合（ブレフェルジンA）
又は細胞が細胞毒性化合物で処理される場合（スタウロスポリン）、背景MMP13発現レベ
ルを規定することである。3MOI再スクリーンのデータを以下の通り分析する。
【０２２７】
まず、あらゆるプレートについて、試料データを以下の式を用いて標準化する：
標準化されたMMP13値の試料A＝［（（生のMMP13シグナルの試料A）−（ネガティブコン
トロールにわたるMMP13シグナルの中央値））／（ネガティブコントロールのMMP13シグナ
ルにわたる標準偏差）］。
【０２２８】
同じ基礎を適用して、ポジティブコントロールについての標準化された値を生じる：
標準化されたMMP13値のポジティブコントロール＝［（（ポジティブコントロールにわ
たるMMP13シグナル中央値））−（ネガティブコントロールにわたるMMP13シグナル中央値
）／（ネガティブコントロールのMMP13シグナルにわたる標準偏差）］。
【０２２９】
「3MOI再スクリーン」について、ポジティブコントロールは、IL1により誘導されるMMP
13発現レベルの最大阻害を反映することが期待されるスタウロスポリン及びブレフェルジ
ンA（P6及びP7）で処理したウェルである。試料及びポジティブコントロールについて標
準化されたMMP13値に基づいて、パーセンテージ阻害を、以下の式を適用することによっ
てあらゆる資料について算出する：パーセント阻害試料A＝［（標準化されたMMP13値の試
料A）／（標準化されたMMP13値のポジティブコントロール）×100］。
【０２３０】
3MOI再スクリーンの結果の例を図５Ｂに示す。示される実験は、二つ組で8μLのNHAC M
MP13アッセイにおける1つの96ウェル再増殖プレート（40の最初の的中物AdsiRNA及び適切
な対照を含む。）のスクリーニングの間に得られるデータを表す。データは、IL1により
誘導されるMMP13の発現のパーセント阻害として表される。的中物喚起について選択され
るカットオフは、40パーセントである（点線として表される。）。P6及びP7ポジティブコ
ントロールについての平均パーセント阻害（100％）は、黒色三角形として表され、P1及
びP2ポジティブコントロールについての平均パーセント阻害（48％）は、十字として表さ
れ、N1、N2、N3、及びN4ネガティブコントロールについての平均パーセント阻害（−8.6
％％）は、灰色三角形として表される。的中物喚起基準を厳守するAd‐siRNAについての
データ（2つのデータポイントは、40％カットオフを上回る。）は、白色又は灰色の円と
して示され、的中物喚起基準を厳守していないAd‐siRNAについてのデータは、四角形と
して示される。この再増殖プレートについて及びこのMOIにおいて、40の最初の的中物Ad
‐siRNAのうちの11を確認した。
【０２３１】
13の好ましい標的すべてについて得られた3MOI再スクリーンデータを表3に示す。この
表は、「3MOI再スクリーン」において活性があるものとして同定されたTARGETを示す。
【表３】
2016053575.tif 000006
【０２３２】
再スクリーン実験の結果に関する典型的な例を図６に示す。本再スクリーン手順におい
て、試験した369のノックダウンウイルス的中物のうちの225を確認した。これらのうち、
13を、薬剤能（drugability）、小分子回収物に対する標的のスクリーニングを可能にす
る消耗品の有効性、ヒトオルソログ及び齧歯類オルソログ間の標的配列の保存のレベルと
して、候補標的の種々の特性が分析される「インシリコ（in silico）」分析に基づいた
さらなる検証のために選択した。
【０２３３】
（3．2  標的Ad‐siRNAの品質管理）
的中物Ad‐siRNAの品質及び同一性をPCRによってチェックし、さらに説明されるとおり
配列決定する。標的Ad‐siRNAを96ウェルプレートにおいてPER．C6（登録商標）細胞の誘
導体（Crucell, ライデン、オランダ）を用いて増殖させた後、標的Ad‐siRNAウイルスに
よってコードされるsiRNAを配列決定する。PER．C6／E2A細胞を180μLのPER．C6／E2A培
地において40,000個の細胞／ウェルの密度で96ウェルプレートに蒔種する。次に、細胞を
10％CO2加湿インキュベーターにおいて39℃で一晩インキュベートする。翌日、細胞に、
標的Ad‐siRNAを含むSilenceSelect（登録商標）ストック由来の1μLの粗細胞可溶化液を
感染させる。（典型的には感染7日後、細胞の膨潤及び丸みを帯びることによって明らか
となる）細胞病理効果の出現まで、細胞を34℃、10％CO2でさらにインキュベートする。
上清を回収し、1mg／mLのプロテイナーゼK（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番
号745 723）及び0.45％Tween‐20（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号133546
5）を補充したMgCl2を有する4μLの溶解緩衝液（1×Expand High Fidelity緩衝液）を滅
菌済みPCRチューブに12μLの粗可溶化液に添加することによって、ウイルス粗可溶化液を
プロテイナーゼKで処理する。これらのチューブを55℃で2時間インキュベートした後、95
℃での15分間の失活工程に続く。PCR反応のために、1μLの溶解物を、MgCl2を有する5μL
の10×Expand High Fidelity緩衝液、0.5μLのdNTP混合物（各dNTPにつき10mM）、1μLの
「順方向プライマー」（10mMストック、
【化１】
2016053575.tif 000007
、1μLの「逆方向プライマー」（10mMストック、
【化２】
2016053575.tif 000008
、0.2μLのExpand High Fidelity DNAポリメラーゼ（3.5U／μL、Roche Molecular Bioch
emicals）、及び41.3μLのH2Oから構成されるPCRマスター混合物に添加する。
【０２３４】
PCRをPE Biosystems GeneAmp PCRシステム9700において以下の通り実施する：PCR混合
物（合計50μL）を95℃で5分間インキュベートし；各周期を95℃で15秒間、55℃で30秒間
、68℃で4分間実施し、35周期反復する。68℃における最終インキュベーションを7分間実
施する。5μLのPCR混合物を2μLの6×ゲル負荷緩衝液と混合し、0.5μg／μLの臭化エチ
ジウムを含む0.8％のアガロースゲルに負荷して、増幅産物を分離する。増幅した断片の
大きさは、同じゲルに負荷された標準的なDNAラダーから概算される。期待される大きさ
はおよそ500bpである。配列決定分析のために、標的アデノウイルスによって発現したsiR
NAコンストラクトを、pIPspAdapt6-U6プラスミドのSapI部位を隣接するベクター配列と相
補的なプライマーを用いるPCRによって増幅する。PCR断片の配列を決定し、期待された配
列と比較する。すべての配列は、期待された配列と同一であることが認められる。
【０２３５】
（実施例4：オンターゲット（On target）検証）
siRNA技術の強み及び利点は、本技術が科学界を通じて広がった速度によって十分に認
識され及び立証される。なおも、本技術の使用は、1）siRNAが、部分的な配列のみの相補
性と関連していない遺伝子を非特異的に標的にし得（オフターゲット効果）、かつ2）siR
NAの有効性が予測困難である（Peiらの文献（2006））ので、必要とされる技術及び知識
を要する。このように、独立した設定においてノックダウンウイルススクリーンにおいて
同定された最初の的中物の活性を確認することが重要なままである。この目的のために2
つのアプローチが取られた。第一に、異なる標的配列を通じてある遺伝子の発現を低下さ
せるよう設計された1セットの追加的なノックダウンウイルスを作製した。第二に、合成s
iRNAを購入し（Dharmacon）、軟骨細胞株SW1353における標的検証について用いた。
【０２３６】
（4．1．追加的なノックダウンウイルスを用いるオンターゲット分析）
異なる標的配列を通じて選択された好ましい的中物の発現を低下させるよう設計された
1セットのノックダウンウイルスを作製した。これらのノックダウンウイルスをその後、
ポジティブコントロールウイルス及びネガティブコントロールウイルスとともに、96ウェ
ルプレートに整列させた。3MOI再スクリーン（実施例3）について説明した再増殖プレー
トについて説明したのと同じ対照を用いた。特定の的中物を標的にするすべての追加的な
異なるノックダウンウイルスを、最初のスクリーンの間にこの標的について同定された元
の的中物ノックダウンウイルスとともにプレートにおいて再グループ化した。これらのプ
レートを2回再増殖させた。次に、あらゆる再増殖したプレートの2つのコピーを二つ組で
2回の独立した試行において、最初のスクリーンについて先に説明したNHAC MMP13アッセ
イにおいて、12μLのMOIを用いて試験した。このように、8個のデータポイントをあらゆ
るノックダウンウイルスについて生じた。データを3MOI再スクリーン（実施例3）につい
て先に説明したとおり分析し、データを％阻害に変換した。生じた8個のデータポイント
のうちの4つについて35％のMMP13レベルの低下を生じているノックダウンウイルスを、本
アッセイにおいて検証されたと考えた。このように、NHACにおけるIL1により誘導されるM
MP13発現レベルを低下させる能力を有する1つの追加的なノックダウンウイルスを、以下
の標的について同定し：ADAM15、GRP34、EPHA5、MAP2K2、MET、GPR43、2つの追加的なノ
ックダウンウイルスをADAMTS6について、3つをSTK32Bについて、4つをMC3Rについて同定
した。
【０２３７】
（4．2．合成siRNAを用いたオンターゲット分析）
本実験の目的は、合成siRNA二本鎖を用いてIL1により刺激されたMMP13放出に及ぼすア
デノウイルスshRNA仲介性ノックダウン効果をさらに検証することであった。検証は、IL1
刺激に対する応答におけるMMP13発現を上方制御することがすでに示されている軟骨肉腫S
W1353細胞株において実施した。
【０２３８】
（4．2．1  材料）
ヒト軟骨肉腫SW1353細胞（カタログ番号HTB‐94、ATCC）を37℃の加湿した5％CO2イン
キュベーターにおいて、10％熱失活FBS（Hyclone）及び1×ペニシリン／ストレプトマイ
シンDMEM（カタログ番号15140‐122、Gibco）を補充したDMEM（カタログ番号41966‐029
、Gibco）において増殖させ、トリプシン処理の1週間後に2回経代する（1：5の分岐比）
。
【０２３９】
関心対象の遺伝子についての既製の遺伝子サイレンシングsiRNA二本鎖はDharmaconから
得られ得る。siGENOME SMARTプール（または4のON‐TARGETプラスセット）の凍結乾燥し
たストック試薬を1×siRNA緩衝液（カタログ番号B‐002000‐UB‐015、Dharmacon）で再
構成して、20μM濃度を達成し、一定分量を−20℃で保存する。
【０２４０】
（4．2．2  手順）
最適化された条件下で、siRNA二本鎖をSW1353細胞に送達する。SW1353細胞を、96ウェ
ルプレート（Nunc）において、10000個の細胞／100μLの細胞培地でトランスフェクショ
ンの24時間前に蒔種する。細胞に、本質的に製造元の説明書に従って、1μL／ウェルの終
濃度でINTERFERin（商標）（カタログ番号409‐10、Polyplus‐トランスフェクション）
を用いてsiRNA試薬（30nM又は10nM終濃度）を形質移入する。簡潔には、siRNAストック試
薬を50μLの無血清OptiMEM（カタログ番号51985‐026、Gibco）に希釈し、1μLのINTERFE
Rin（商標）試薬を添加した後、10秒間即時均質化し、室温で10〜45分間インキュベーシ
ョンして、INTERFERin（商標）／siRNA複合体を形成しておいた。複合体形成の間、SW135
3細胞の上部の培地を、抗生物質を含まない100μLのあらかじめ加温しておいた細胞培地
と交換する。次に、50μLの形成されたINTERFERin（商標）／siRNA混合物を細胞に添加し
、プレートを37℃及び5％CO2のインキュベーターに戻す。
【０２４１】
72時間後、細胞の上部の培地を除去し、10ng／mL組換えヒトIL1β（カタログ番号200‐
01B、PeproTech）及び25ng／mL組換えヒトOSM（カタログ番号295‐0M、R＆D Systems）を
含む100μLのあらかじめ加温しておいた培地と交換する。培地は、5％熱失活FBS及び1×
ペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM／F12（カタログ番号11320‐074、Gibco）で
ある。
【０２４２】
サイトカインの添加24時間後、上清を回収し、MMP13 ELISA（実施例1参照）、MMP1 ELI
SA（WO2006／040357において説明されるとおり）、及びTIMP2 ELISA（WO2006／040357に
おいて説明されるとおり）における適切な希釈物に関するその後の分析のために−80℃で
保存する。TIMP2レベルは、誘発因子の添加によって影響されないので、上清に分泌され
るTIMP2の量の変化を用いて、細胞生存率／分泌に及ぼすsiRNA遺伝子特異的二本鎖トラン
スフェクションの効果を評価する。
【０２４３】
MMP13及びMMP1のIL1／OSM仲介性上方制御に及ぼす関心対象の遺伝子についてのsiRNA二
本鎖送達の効果を2つの独立した実験において評価し得る。各実験において、siRNA二本鎖
のトランスフェクションを2つのsiRNA濃度（10nM及び30nM）において二つ組で実施する。
ヒトMMP1を標的とするSMARTpool試薬（siGENOME SMARTpool siRNA MMP1）、並びにヒトTR
AF6遺伝子（4のうちのsiGENOME SMARTpool siRNAセット）及びMMP13遺伝子（4のうちのsi
GENOME SMARTpoolセット）を標的とする4つの選択された個々のsiRNA二本鎖のうちの1つ
をポジティブコントロールとして用いる。siCONTROL非標的化siRNAプール又は30nM及び／
若しくは10nMのGL2．2二本鎖標的ルシフェラーゼを形質移入した細胞をネガティブコント
ロールとして用いる。MMP1分析について、ネガティブコントロールには2つの濃度の両siR
NA試薬を含む。MMP13分析について、ネガティブコントロールには30nM及び10nMの非標的
化siRNA試薬、並びに10nMのGL2．2二本鎖を含む。刺激されていないままのGL2．2対照を
形質移入した追加的なウェルを、刺激されていない対照として含む。ポジティブコントロ
ール、ネガティブコントロール、及び刺激されていない対照は、各96ウェルプレートに含
まれる。4つの異なる96ウェルプレートの回収された上清を、1つの384ウェルELISAにおい
て分析し、結果を以下のとおり分析し得る：
【０２４４】
第一に、各ウェルについてのMMP13及びMMP1数値データを、以下のとおりシグナルのパ
ーセント阻害（％PIN）として再算出する：
％PIN＝100−（（シグナル試料−Avシグナル刺激されていない対照）／（Avシグナルネ
ガティブコントロール−Avシグナル刺激されていない対照）×100）
式中、
Avシグナル刺激されていない対照は、同じ384ELISAに関して分析された4つの96ウェル
プレートすべての刺激されていない対照の平均である。
Avシグナルネガティブコントロールは、同じ384ELISAに関して分析された4つの96ウェ
ルプレートすべての説明されたネガティブコントロールの平均である。
【０２４５】
TIMP2の結果は、以下の式に従ってシグナルのパーセント阻害（％PIN）として表される
：
％PIN＝100−（（シグナル試料−Avシグナル背景）／（Avシグナルネガティブコントロ
ール−Avシグナル背景）×100）
式中、
Avシグナル背景は、TIMP2 ELISAの背景シグナル、すなわちTIMP2の不在下で得られたシ
グナルである。
Avシグナルネガティブコントロールは、同じ384ELISAに関して分析された4つの96ウェ
ルプレートのすべてのネガティブコントロールの平均である。
【０２４６】
次に、個々のウェルは、％PINが35％よりも（MMP1の場合）又は50％よりも（MMP1の場
合）高い場合、正のスコアを有すると言われ得る。これらのカットオフ設定において、ネ
ガティブコントロールは、正のスコアを有するとは認められない。10nM又は30nMでのトラ
ンスフェクションについての結果は、両方の複製物があらかじめ設定されたカットオフを
上回ってスコア化している場合にのみ、1のスコア化値を与えられる。MMP1又はMMP13の発
現の低下が、細胞生存率の損失に起因していないことを確認するために、TIMP2の結果を
考慮に入れる。TIMP2シグナルが両方の複製物について35％超低下すると認められる場合
、MMP1又はMMP13の結果は考慮に入れない。各スクリーンについて、最終的な値は、TIMP2
分析を考慮に入れた後のsiRNA二本鎖の両試験濃度におけるスコア化値の合計であった標
的に割り当てられる。次に、与えられた遺伝子についてのsiRNA二本鎖の効果は、両スク
リーンの最終的な値の合計が2以上である場合、「真の」効果であると考えられる。標的
は、MMP1又はMMP13のいずれかにおいて真の的中物としてスコア化した場合、合成siRNAと
検証されると考えられる。このように、以下の標的を、合成siRNA技術を用いて検証した
と考えられた：ADAMTS6、MC3R、MET、CSNK1G2、EDG4、MAP4K1、KCNN4。
【０２４７】
ひとまとめに考えると、オンターゲット分析を通じて選択された13の的中物についての
オンターゲット検証運動の結果を表3に示す。最初のスクリーンにおいて同定された元の
ノックダウンウイルス的中物の効果を反復できる追加的なノックダウンウイルスの同定を
通じて9の標的が検証され、合成siRNA技術を用いて7（そのうち3は追加的なノックダウン
ウイルスを用いて検証された。）が検証された。初代ヒト軟骨細胞におけるこれらの検証
された標的の発現をさらに評価した（実施例5）。
【０２４８】
（実施例5：好ましい標的のヒト軟骨細胞における発現分析）
好ましい標的として検証されるために、遺伝子は、軟骨細胞において発現すべきである
。このことは、定量的リアルタイムPCRを用いて評価され得る。関節軟骨（NHAC）（Cambr
ex、Verviers、Belgium）由来の正常ヒト軟骨細胞を、5％ウシ胎仔血清（HighClone、Per
bio、Erembodegem、Belgium）を補充したDMEM／F12培地において3百個の細胞／皿で9cm培
養皿へと蒔種する。2日後、培地を、10ng／mLのIL‐1βを有する若しくは有さない5％ウ
シ胎仔血清を補充したDMEM／F12培地によって、又は10ng／mLのIL‐1βを有するか若しく
は有さない軟骨細胞分化培地（CDM、Cell Applications、San Diego、CA）と交換する。
各条件を二つ組で実施する。48時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞を、製
造元の説明書に従ってRNeasy midiキット（Qiagen、Venlo Netherlands）を用いたRNA単
離のために加工し、精製されたRNAを一定分量で−20℃で保存する。
【０２４９】
RNAを製造元の説明書に従ってTaqMan（登録商標）Gold RTキット（Applied Biosystems
、Lennik、Belgium）を用いてcDNAへと逆転写する（1×TaqMan（登録商標）RT緩衝液、5m
M MgCl2、0.5mM dNTP、2.5μMランダムヘキサマー、10U RNase阻害薬、及び25U マルチス
クライブ（multiscribe）逆転写酵素）。
【０２５０】
cDNAを6倍希釈し、5μLを、SYBR（登録商標）Green Universal Mastermix又はTaqMan（
登録商標）Universal Mastermix（両方ともApplied Biosystems製）のいずれかを用いて
、ABI7000機器におけるリアルタイムQPCRのためにPCR反応につき25μLの反応物において
用いる。
【０２５１】
SYBR（登録商標）Green QPCR分析におけるプライマーの開発のために、DNA配列をRefSe
q配列保管所から抽出し、又は利用可能ではない場合、GenBank回収物から抽出する。これ
らの配列から、SYBR（登録商標）Green QPCRに好適なプライマー対を、PrimerExpressソ
フトウェア（Applied Biosystems）を用いて設計する。これらのプライマー対を、Blast
ソフトウェア（NCBI、Entrez）を用いて該プライマー対の標的遺伝子に対する該プライマ
ー対の特異性についてチェックする。好適なプライマー対を発注し（Invitrogen）、0.3
μM濃度で用いる。本プライマー対を表4に示す。
【０２５２】
プライマー対の質を、融点分析によってモニターし、それにより2つ以上の融点を生じ
る対を廃棄し、参照cDNA（Clontech Laboratories、Mountain View、CA）との比較によっ
てモニターし、それにより融点における差は1℃を超えて異なるべきではない。
【０２５３】
SYBR（登録商標）Greenプライマー対が必要条件を満たさない遺伝子については、TaqMa
n（登録商標）アッセイを用いる（注文対応のアッセイ、Applied Biosystems）。
【０２５４】
遺伝子は、全条件にわたる平均Ct値が37以下であった場合に発現するものとして考えら
れる。
【０２５５】
定量的リアルタイムPCRによって得られたようなヒト関節軟骨細胞における好ましい標
的の発現。各Ct値は、実施例5において概略されるように、4つの異なる条件において増殖
した細胞の8の独立したRNA調製物の平均である。結果を表5に示す。
【表４】
2016053575.tif 000009
【０２５６】
25を下回るCt値は高い発現と考えられ、25〜30は良好な発現と考えられ、30〜35は中程
度の発現と考えられ、35超は低い発現と考えられる。それゆえ、初代軟骨細胞における良
好な発現レベルを、ほとんどの標的について示すことができたが、例外は、低い発現レベ
ルを示したGPR34（Ct＝36）であった。しかしながら、低い発現レベルは、GPCRについて
観察でき、この低い発現は、必ずしも常に低い受容体活性を予測するわけではない。
【０２５７】
（実施例6  EPHA5に関するさらなる検証）
典型的な先のTARGET EPHA5を、EPHA5を阻害し、かつNHACにおけるMMP13活性も阻害する
、EPHA5に対して配向する化合物によって検証及び確認した。EPHA5に対する活性は、下記
の実施例6．1及び6．2において説明されるアッセイを用いて試験され得、NHACにおけるMM
P13活性を阻害する能力は、実施例7において説明されるとおり試験され得る。
【０２５８】
（6．1  EPHA5阻害‐生化学的アッセイ）
組換えEpha5（Milliporeカタログ番号14‐639）を、0.1mg／mLのポリ（Glu, Tyr）ナト
リウム塩（4：1）、分子量20000〜50000（Sigmaカタログ番号P0275）含有キナーゼ反応緩
衝液（10mM MOPS pH7.0 、1mM DTT、0.01％Triton‐X100、2.5mM MnCl2、0.5mM Na3VO4、
5mMβ‐グリセロールホスファート、0.5μM非放射性ATP、0.25μCi 33P‐ガンマ‐ATP）
（Perkin Elmer, カタログ番号NEG602K）とともに、5μLの試験化合物又はビヒクル（DMS
O、1％終濃度）を含むか又は含まない終濃度で、総容積25μLで、ポリプロピレン96ウェ
ルプレート（Greiner、V底）においてインキュベートする。30℃で45分後、反応を、25μ
L／ウェルの150mMリン酸を添加することによって停止する。終止したキナーゼ反応物をす
べて、あらかじめ洗浄しておいた（75mMリン酸）96ウェルフィルタープレート（Perkin E
lmerカタログ番号6005177）へと細胞回収機（Perkin Elmer）を用いて転移させる。プレ
ートをウェルあたり300μLの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、プレートの底部を密封する。4
0μL／ウェルのMicroscint‐20を添加し、プレートの上部を密封し、読み出しを、Topcou
nt（Perkin Elmer）を用いて実施する。キナーゼ活性は、ポジティブコントロール阻害薬
（10μMスタウロスポリン）の存在下で得られた1分間あたりの計数（cpm）を、ビヒクル
の存在下で得られたcpmから減算することによって算出する。この活性を阻害する試験化
合物の能力を以下のとおり決定する：
【０２５９】
パーセント阻害＝（（試験化合物の存在した試料について決定したcpm−ポジティブコ
ントロール阻害薬の存在した試料について決定したcpm）／（ビヒクルの存在下で決定し
たcpｍ−ポジティブコントロール阻害薬の存在した試料について決定したcpm））×100％
。
【０２６０】
用量希釈系列を、EPHA5アッセイにおける用量‐応答効果の試験及び各化合物について
のIC50の算出を可能にする化合物について調製する。各化合物を、30μMの濃度で定型的
に試験した後、1％DMSOの終濃度で1／3の連続希釈を8地点（30μM‐6.67μM‐2.22μM‐7
40nM‐247nM‐82nM‐27nM‐9nM）実施する。化合物シリーズの効力が高い場合、より多く
の希釈を調製し及び／又は最大濃度を下げてよい（例えば、5μM、1μM）。
【０２６１】
（6．2  EPHA5阻害‐細胞アッセイ）
本アッセイの原理は、STAT3及びEPHA5で一過性に形質移入したHEK293細胞におけるSTAT
3（Tyr705）リン酸化レベルに関する阻害活性を決定することである。
【０２６２】
HEK293細胞を、10％熱失活ウシ胎仔血清、100U／mLペニシリン、及び100μg／mLストレ
プトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）において維持する。
【０２６３】
70％培養密度のHEK293を標準的なトリプシン処理によって回収する。15,000,000個に6,
250ngのpIPspAdapt6‐STAT3、3,750ngのpIPspAdapt6‐EPHA5、4,000ngのpIPspAdapt6‐eG
FP、及び11,000ngのpBSKを、T175cm2細胞培養フラスコあたり50μLのJet‐PEI（Polyplus
）をトランスフェクション試薬として用いて一過性に形質移入する。形質移入した細胞を
T175cm2細胞培養フラスコにおいて蒔種する。37℃、10％CO2で一晩インキュベーション後
、トランスフェクション培地を除去し、細胞の脱離を回避するよう新鮮な細胞培地を注意
深く添加する。
【０２６４】
トランスフェクションの48時間後、培地を除去する。細胞を、あらかじめ加温しておい
た細胞解離溶液（Sigmaカタログ番号C5914）で脱離させる。ウェルあたり60,000個の細胞
／40μLのDMEMを384ウェルプレートにおいて蒔種する。次に、10μLの化合物希釈液（5×
）含有DMEMを添加する。
【０２６５】
すべての化合物を二つ組で試験し、20μMから出発した後、1／3の連続希釈を8地点（20
μM‐6.6μM‐2.2μM‐740nM‐250nM‐82nM‐27nM‐9nM）で0.2％DMSOの終濃度で実施す
る。
【０２６６】
37℃で5時間インキュベーション後、リン光体‐Stat3（Tyr705）レベルを、AlphaScree
n（登録商標）SureFire（登録商標）Phospho‐STAT3（Tyr705）Assay Kit（Perkin Elmer
製）を用いて決定する。細胞を、15μLの1×溶解緩衝液の添加によって溶解する。プレー
トを室温で20分間穏やかに振蘯する。4μLの可溶化液をプロキシプレートに転移させた後
、アルファ‐ビーズを含む7μL反応緩衝液／活性化緩衝液混合物を添加し、プレートをア
ルミニウムシールで密封し、5分間振蘯し、室温で暗所で16時間インキュベートする。
【０２６７】
プレートを標準的なAlphaScreen設定を用いてEnvisionで読み取る。0.2％DMSOをネガテ
ィブコントロールとして用いる（0％阻害）。ポジティブコントロール及びネガティブコ
ントロールを用いて、z'値及びPIN値を算出する。
【０２６８】
パーセント阻害＝（1−（（試験化合物が存在する試料について決定した値−ポジティ
ブコントロール阻害薬を有する試料について決定した値）／（ビヒクルの存在下で決定し
た値−ポジティブコントロール阻害薬を有する試料について決定した値）））×100％。
【０２６９】
（実施例7  MMP13阻害アッセイ）
本明細書で同定されたTARGETのうちの1つに対して活性があるものとして同定された化
合物を、MMP13阻害アッセイにおいて直接試験し得る。
【０２７０】
正常ヒト関節軟骨細胞（NHAC、Lonzaカタログ番号CC‐2550）を、5％FBS及び1％ペニシ
リン／ストレプトマイシンを含む培地（Gibco、DMEM：F12）において1mLあたり1600000個
の濃度で懸濁する。次に、25μLの細胞懸濁液を、5％血清及び1％ペニシリン／ストレプ
トマイシンを有する培地中の0.8％アガロース25μLとともにプールし、5％血清及び1％ペ
ニシリン／ストレプトマイシンを有する培地における1.5％アガロースの50μLであらかじ
め被覆した96ウェル培養皿のウェルに添加する。アガロースが設定された後、127.5μLの
培地を各ウェルに添加する。次に、細胞を、種々の濃度の7.5μL化合物で1時間処理した
後、15μLの10ng／mL IL‐1bで刺激する（終濃度：1ng／mL）。刺激48時間後、上清を回
収し、MMP13分泌を測定する。各化合物を30μMの濃度で定型的に試験した後、0.3％DMSO
の終濃度で1／3連続希釈を8地点（30μM‐10μM‐3.33μM‐1.11μM‐370nM‐123nM‐41n
M‐14nM）実施する。
【０２７１】
MMP13活性を、抗体捕捉活性アッセイにおいて測定する。この目的のために、384ウェル
プレート（NUNC、P6491、MaxiSorp黒色）を35μLの1.5μg／mL抗ヒトMMP13抗体（R＆D Sy
stems、MAB511）溶液で4℃で24時間被覆する。ウェルをPBS＋0.05％Tweenで2回洗浄した
後、残りの結合部位を100μLの5％無脂肪乾燥乳（Santa Cruz、sc‐2325、Blotto）含有P
BSで4℃で24時間ブロッキングする。次に、ウェルをPBS＋0.05％Tweenで2回洗浄し、MMP1
3を含む35μLの培養上清を添加し、室温で4時間インキュベートする。この後、ウェルをP
BS＋0.05％Tweenで2回洗浄した後、MMP13タンパク質を、35μLの1.5mM 4-アミノフェニル
水銀アセタート（APMA）（Sigma、A9563）溶液の添加及び37℃で1時間のインキュベーシ
ョンによって完全に活性化する。次に、ウェルをPBS＋0.05％Tweenで再度洗浄し、35μL
のMMP13基質（Biomol、P‐126、OmniMMP蛍光発生基質）を添加する。37℃で1時間インキ
ュベーション後、変換した基質の蛍光を、Perkin Elmer Wallac EnVision 2102 Multilab
el Reader（励起波長：320nm、発光波長：405nm）において測定する。
【０２７２】
パーセント阻害＝（（ビヒクルの存在下で決定された蛍光−試験化合物が存在しながら
試料について決定された蛍光）／（ビヒクルの存在下で決定された蛍光−誘発因子なしで
試料について決定された蛍光））×100％。
【０２７３】
GPR43に対する化合物の活性は、下記の説明される実施例8又は9のようなアッセイを用
いて試験され得る。
【０２７４】
（実施例8：GPR43表現型アッセイ‐好中球遊走アッセイ）
8．1  バフィーコートからの好中球の単離
ヒトバフィーコートを等容積の氷冷DPBS（Invitrogenカタログ番号14190169）で希釈す
る。20mLの希釈したバフィーコートダウンを50mLコニカルチューブにおいて、140mMクエ
ン酸、200mMクエン酸ナトリウム、及び220mMデキストロース4mLと穏やかに混合する。12m
Lの6％デキストラン／0.9％NaCl溶液（w／v）含有水を穏やかに添加し、チューブを最高2
0回転倒混和する。次に、総容積を新鮮チューブに転移させ、2相の完全な分離のために、
室温で1時間インキュベートする。次に、黄色の上清を新たなチューブに転移させ、1300r
pmで12分間、標準的な卓上遠心分離機において4℃でブレーキなしで遠心分離する。上清
を廃棄し、残りの細胞ペレットを12mLの氷冷水において上下にピペッティングすることに
よって迅速に再懸濁する。20秒後、4mLの氷冷0.6M KClを添加し、注意深く混合し、1300r
pmで12分間、標準的な卓上遠心分離機において、4℃でブレーキなしで遠心分離する。こ
の手順を赤血球が残らなくなるまで反復する。最終的に、ペレットを15mLのチューブにお
いて4mLのDPBSに再懸濁し、5mLのLymphoprep（商標）（Nycomed Pharma、カタログ番号11
14545）上で層状にする。標準的な卓上遠心分離機において、4℃で低ブレーキで1300rpm
で12分間の遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを10mMのHEPES（Invitrogen、カタ
ログ番号15630）を補充した25mLの走化性緩衝液（RPMI1640（Invitrogen、カタログ番号2
1875））において再懸濁する。
【０２７５】
8．2  遊走アッセイ
遊走アッセイを、5.0μMの孔サイズのポリカーボネートメンブレン（Corningカタログ
番号3387）を有するCorning HTSトランスウェル96透過性支持システムにおいて実施する
。180μLの8.9×106個の細胞／mLの細胞懸濁液を、ポリプロピレン96ウェルV底プレート
において、20μLの化合物溶液含有走化性緩衝液に添加する。細胞を30分間インキュベー
トした15分後に中間的な再懸濁をして、細胞がプレートの底部に定着するのを防止する。
この後、70μLの細胞懸濁液をトランスウェルシステムの上部区画に転移させる。受容ウ
ェルを、化合物及び走化剤を含有する200μLの走化性緩衝液で満たす。37℃で5％CO2にお
いて1時間のインキュベーション後、受容プレートに遊走する細胞の量を溶解と、ルミノ
メーターにおいてATP‐lite（Promega、カタログ番号6016739）を用いて可溶化液のATP含
有量を測定することとによって測定する。
【０２７６】
8．3  データ分析
化合物の効果を、下記式を用いたパーセント阻害として表す：
［（ビヒクル及び走化剤の存在下でのRLU−化合物及び走化剤の存在下でのRLU）／（ビ
ヒクル及び走化剤の存在下でのRLU−走化剤の不在下でのRLU）］×100
RLU＝相対的発光単位。
【０２７７】
（実施例9：GPR43‐カルシウムフラックスアッセイ）
GPR43に対する活性を、下記に説明されるアッセイを用いて試験し得る。
【０２７８】
透明な底部の384ウェルプレート（Corning、参照番号3712）を0.05mg／mLの終濃度でPB
Sに希釈した25μLのポリ‐D‐リジン（Sigma、参照番号P‐6407）でコーティングし、37
℃で30分間インキュベートする。ポリリシンをPBSによる2回の洗浄によって除去する。6
千個のHEK293細胞を、10％FBS、10μg／mLピューロマイシン、及び1％ペニシリン／スト
レプトマイシンで補完した25μLのDMEMにおいて蒔種する。次に、プレートを37℃／5％CO
2で24時間インキュベートする。25μLのカルシウム4色素（Molecular devices、参照番号
R8141）を製造元の説明書に従ってプレートに添加し、プレートを37℃／5％CO2で2時間15
分インキュベートする。次に、10μLの化合物溶液含有HBSS、20mM hepesを添加し、プレ
ートを37℃／5％CO2で15分間インキュベートする。アンタゴニスト活性を、10μLの酢酸
ナトリウム（Sigma、参照番号S2889）含有HBSS、20mM hepesをEC80濃度で添加することに
よって測定する。
【０２７９】
カルシウムシグナル伝達を、Flexステーション3（Molecular Devices）を用いて、蛍光
（励起485nm、発光525nm）を60秒間記録することによって測定する。活性を、酢酸ナトリ
ウムによって生じたカルシウム曲線の最大蛍光と、酢酸ナトリウム添加前に測定された基
線蛍光の間の比として決定する。阻害のパーセンテージを、各プレートに関するネガティ
ブコントロール（ビヒクル添加）及びポジティブコントロール（EC100における酢酸ナト
リウム）を用いて算出する。
【０２８０】
（実施例10：EDG4カルシウムフラックスアッセイ）
EDG4に対する化合物の活性を、下記に説明されるアッセイを用いて試験し得る。
【０２８１】
ウェルあたり1万個のCHO‐EDG4細胞を10％FBS及び10μg／mLピューロマイシンを補完し
た50μLのDMEM／F12に再懸濁した後、透明な底部の384ウェルプレート（Corning、参照番
号3712）において蒔種する。37℃／5％CO2で24時間インキュベーション後、プレートを、
0.1％無脂肪酸BSAを補完した25μLのDMEM／F12で2回洗浄した後、プレートを37℃／5％CO
2で1時間インキュベートする。20mM HEPES（製造元の説明書と比較してさらに1／2希釈）
を補完したカルシウム及びマグネシウムを含むHBSS（Gibco、参照番号14025）に希釈した
Fluo4 Direct Ca色素（Invitrogen、参照番号F10473）25μLをプレートに添加する。次に
、プレートを37℃／5％CO2で1時間インキュベートする。次に、HBSS、20mM hepes、0.1％
無脂肪酸BSA、0.6％DMSOにおける化合物溶液10μLを添加し、プレートを37℃／5％CO2で1
5分間インキュベートする。アンタゴニスト活性を、10μLのオレオイル‐L‐リソホスフ
ァチジン酸ナトリウム塩（LPA、Sigma、参照番号L7260）含有HBSS、20mM hepes、0.1％無
脂肪酸BSA10をEC80濃度で添加することによって測定する。
【０２８２】
カルシウムシグナル伝達を、Flexステーション3（Molecular Devices）を用いて、蛍光
（励起485nm、発光525nm）を60秒間記録することによって測定する。活性を、LPAによっ
て生じたカルシウム曲線の最大蛍光と、LPA添加前に測定された基線蛍光の間の比として
決定する。阻害のパーセンテージを、各プレートに関するネガティブコントロール（ビヒ
クル添加）及びポジティブコントロール（EC100におけるLPA）を用いて算出する。
【０２８３】
CSNK1G2に対する化合物の活性を、下記の実施例11又は12において説明されるアッセイ
を用いて試験し得る。
【０２８４】
（実施例11：CSNK1G2生化学的アッセイ）
0.75mUの組換えCSNK1G2（Milliporeカタログ番号14‐712）を0.1mg／mLカゼイン（Sigm
aカタログ番号C4765）含有キナーゼ反応緩衝液（10mM MOPS pH7.0、0.01％ Triton‐X‐1
00、0.5mM EDTA、1mM DTT、0.5mM Na3VO4、5mMベータ‐グリセロホスファート、10mM MgC
l2、0.5μM非放射性ATP、0.25μCi 33P‐ガンマ−ATP（Perkin Elmer, カタログ番号NEG6
02K）終濃度で、試験化合物又はビヒクル（DMSO、1％終濃度）を5μL含有する又は含有し
ない。）とともに、総容積25μLでポリプロピレン96ウェルプレート（Greiner, V底）に
おいてインキュベートする。30℃で45分後、25μL／ウェルの150mMリン酸を添加すること
によって、反応を停止させる。終止したキナーゼ反応物をすべて、あらかじめ洗浄してお
いた（75mMリン酸）96ウェルフィルタープレート（Perkin Elmerカタログ番号6005177）
へと、細胞回収機（Perkin Elmer）を用いて転移させる。プレートを、ウェルあたり300
μの75mMリン酸溶液で6回洗浄し、プレートの底部を密封する。40μL／ウェルのMicrosci
nt‐20を添加し、プレートの上部を密封し、Topcount（Perkin Elmer）を用いて読み出し
を実施する。
【０２８５】
キナーゼ活性を、ビヒクル存在下で得られた1分間あたりの計数（cpm）から、ポジティ
ブコントロール阻害薬（20μMスタウロスポリン）の存在下で得られたcpmを減算すること
によって算出する。この活性を阻害する試験化合物の能力を以下のとおり決定する：
【０２８６】
パーセント阻害＝（（試験化合物の存在下で使用について決定されたcpm−ポジティブ
コントロール阻害薬を用いて試料について決定されたcpm）／（ビヒクルの存在下で決定
されたcpm−ポジティブコントロール阻害薬を用いて試料について決定されたcpm））×10
0％。
【０２８７】
用量希釈系列を、CSNK1G2アッセイにおける用量‐応答効果の試験及び各化合物につい
てのIC50の算出を可能にする化合物について調製する。各化合物を、30μMの濃度で定型
的に試験した後、1％DMSOの終濃度で1／3の連続希釈を8地点（30μM‐6.67μM‐2.22μM
‐740nM‐247nM‐82nM‐27nM‐9nM）実施する。化合物シリーズの効力が高い場合、より
多くの希釈を調製し及び／又は最大濃度を下げてよい（例えば、5μM、1μM）。
【０２８８】
（実施例12：CSNK1G2細胞アッセイ）
Wntシグナル伝達アッセイにおいて、Wntルシフェラーゼリポーターコンストラクトを、
LRP6及びCSNK1G2についての発現べクターとともにSW1353細胞へと、JetPEIトランスフェ
クション剤（Polyplus Transfection, カタログ番号101‐40）を用いて形質移入する。CS
NK1G2過剰発現は、LRP6により誘導されるWnt‐リポーター活性を増強する。ルシフェラー
ゼリポーター遺伝子のCSNK1G2仲介性及びLRP6仲介性発現を、ルシフェラーゼ基質を用い
て測定する。CSNK1G2活性を阻害する化合物は、リポーター活性を低下させるであろう。
【０２８９】
1日後：SW1353細胞の懸濁液を調製する（密度：30000個の細胞／ウェル／80μL（37500
0個の細胞／mL））。並行して、DNA／トランスフェクション剤混合物を以下の通り調製す
る。
【０２９０】
ウェルあたり添加されるべきDNAの全量をNaClの150mM溶液において10μLに希釈する。
典型的には、以下の量のDNAをウェルあたり形質移入するであろう：Wnt‐lucリポーター
（20ng）、A010800‐CSNK1G2‐WT（20ng）、pCS‐myc‐hLRP（10ng）。ウェルあたりに必
要とされるJetPEIトランスフェクション剤の全量（0.32μL）をNaClの150mM溶液において
10μLに希釈する。次に、JetPEI溶液及びDNA溶液を混合して、ウェルに添加されるべき20
μL DNA／トランスフェクション剤混合物を生じる。この溶液を即時混合し、遠心分離し
、室温で30分間インキュベートする。細胞懸濁液をDNA／トランスフェクション剤混合物
に滴下して添加し、37℃で2時間インキュベートする。次に、試験されるべき化合物を11
μLに希釈して、形質移入された細胞を含むウェルに、自動ディスペンサー（Tecan aquar
ius）を用いて添加し、混合物を16〜24時間インキュベートする。
【０２９１】
2日後：細胞の上部における培地を除去した後、ルシフェラーゼ基質SteadyLite HTS（P
erkin Elmer, カタログ番号550‐070303）を白色96ウェルプレートに添加する（50μL／
ウェル）。暗所で連続的な振蘯をしながら30分間のインキュベーション後、ルミノメータ
ー（Envision, Perkin Elmer）を用いて読み出される読み出しを実施する。
(参考文献)
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【図１】
2016053575.tif 000010
【図２】
2016053575.tif 000011
【図３】
2016053575.tif 000012
【図４】
2016053575.tif 000013
【図５Ａ】
2016053575.tif 000014
【図５Ｂ】
2016053575.tif 000015
【図６】
2016053575.tif 000016
【図７】
2016053575.tif 000017
【配列表】
2016053575000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年12月1日(2015.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ECM及び／又は軟骨変性を阻害する化合物を同定する方法であって：
（a）化合物を、配列番号29（ADAMTS6）のアミノ酸配列、及びその断片を含むポリペプチドと接触させること；
（b）該化合物の該ポリペプチドに対する結合親和性を決定すること；
（c）該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、少なくとも10マイクロモル濃度の結合親和性を呈する化合物と接触させること；及び
（d）炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物を同定することを含む、前記方法。
【請求項２】
炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物を同定する方法であって：
（a）化合物を、配列番号29（ADAMTS6）のアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させること；
（b）該ポリペプチドの発現又は活性を阻害する該化合物の能力を決定すること；
（c）該ポリペプチドを発現する哺乳類細胞の集団を、該ポリペプチドの発現又は活性を有意に阻害する化合物と接触させること；及び
（d）炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性を阻害する化合物を同定することを含む、前記方法。
【請求項３】
前記炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性の阻害が、MMP1、MMP3、MMP8、MMP13、MMP14、及び／又はADAMTS4の発現及び／又は活性を用いて測定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記炎症、又は軟骨及び／若しくはECM変性の阻害が、MMP13の発現及び／又は活性を用いて測定される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ECM及び／又は軟骨変性の阻害が、正常ヒト関節軟骨細胞（NHAC）、SW1353（軟骨肉腫細胞）、線維芽細胞（例えば、滑膜線維芽細胞）、又は分化した間葉系幹細胞培養物において測定される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項６】
軟骨細胞の異化過程を阻害する化合物を同定するために用いられる、請求項１又は２記載の方法。
【請求項７】
試験されるべき化合物を対照と比較する工程を追加的に含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項８】
前記対照が、前記ポリペプチドが前記化合物と接触しなかった場合のものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記化合物を対照と比較する工程を追加的に含み、ここで、該対照が、前記ポリペプチドを発現しない哺乳類細胞の集団である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物が、市販のスクリーニングライブラリーの化合物、並びに配列番号29（ADAMTS6）のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対する結合親和性を有する化合物からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物が、ファージディスプレイライブラリー又は抗体断片ライブラリーにおけるペプチドである、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１２】
実施例を参照して、実質的に本明細書中に記載される方法。