(57)【要約】【課題】抗血管新生を有するキメラタンパク質を提供する。【解決手段】ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン及びＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインを有し、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質、該キメラタンパク質をコードするＤＮＡ、該キメラタンパク質をコードするＤＮＡを有するベクター、該キメラタンパク質を発現する細胞、及び該キメラタンパク質を含む薬学的組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン及びＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインを有し、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質。
【請求項２】
ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインがＡＬＫ１細胞外ドメインである、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインがＦＬＴ１細胞外ドメインである、請求項１又は２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
ＦＬＴ１細胞外ドメイン中のＩｇ２ドメインを有する、請求項１から３の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
ＡＬＫ１細胞外ドメイン及びＦＬＴ１細胞外ドメイン中のＩｇ２ドメインを有する、請求項１から４の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
さらに二量体化ドメインを有する、請求項１から５の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
二量体化ドメインが免疫グロブリンドメインである、請求項６に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、又はＩｇＧの軽鎖である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合している、請求項１から９の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合している、請求項１から９の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかである、請求項１から１１の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
【請求項１３】
アセチル修飾またはポリエチレングリコール修飾を受けている、請求項１から１２の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
二量体化している、請求項１から１３の何れか１項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
【請求項１６】
以下の（ｄ）又は（ｅ）の何れかのＤＮＡ。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のベクターを有するウイルス。
【請求項１９】
請求項１７に記載のベクター又は請求項１８に記載のウイルスを有する細胞。
【請求項２０】
細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から成る群から選択される細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１９又は２０に記載の細胞を培養する工程を含む、請求項１から１４の何れか１項に記載のキメラタンパク質を製造する方法。
【請求項２２】
請求項１から１４の何れか１項に記載のキメラタンパク質、請求項１５又は１６に記載のＤＮＡ、請求項１７に記載のベクター、請求項１８に記載のウイルス、あるいは請求項１９又は２０に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
ＶＥＧＦ阻害剤である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
抗血管新生剤である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
抗腫瘍剤である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管新生作用を有するキメラタンパク質に関する。本発明はさらに、上記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ、ベクター、ウイルス、細胞、上記キメラタンパク質の製造方法、並びに薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、新しい血管を形成するというプロセスであり、多くの正常な生理学的状態および異常な病理学的状態において非常に重要な役割を果たす。正常な生理学的条件下における血管新生は、例えば、創傷治癒、胎児および胚の発達、ならびに、黄体、子宮内膜および胎盤の形成においてみられる。
【０００３】
適切にコントロールされない血管新生が様々な疾患の発症ならびに進行の原因となっている。例えば、腫瘍の成長には新しく形成された血管により供給された酸素と栄養分が必要であるため、血管新生が関与する。また、関節リウマチ、網膜症、血管腫、乾癬などでも血管新生が認められる。コントロールされない血管新生が存在する多様な病理学的疾患状態が血管新生関連疾患として分類されている。
【０００４】
血管は血管内皮細胞から形成される管腔から形成され、血管新生においては血管内皮細胞の活性化が起こる。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の結合によるＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ１）及びＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）の活性化は、血管内皮細胞の成長、移動及び生存にとって極めて重要であり、血管新生及び脈管形成に必須のプロセスである。ＶＥＧＦシグナルを阻害して血管新生を阻害する薬剤は、異常な血管新生を伴う疾患に対して効果を発揮する。例えば、アバスチン（登録商標）（ベバシズマブ）は、ＶＥＧＦに結合するモノクローナル抗体であり、様々ながんの処置において用いられている。ＶＥＧＦに結合するアプタマーであるマクジェン（登録商標）、可溶性ＶＥＧＦＲ−Ｆｃキメラタンパク質であるアイリーア（登録商標）は加齢性黄斑変性の処置において用いられている。
【０００５】
一方でトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βファミリーのリガンドの一つである骨形成因子（ＢＭＰ）−９は血管新生に関与していることが報告されている（非特許文献１）。ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体はＡＬＫ１であり、ＡＣＶＲＬ１及びＡＣＶＲＬＫ１としてもまた知られている。ＡＬＫ１は、ＢＭＰ−９及びＢＭＰ−１０に対する親和性も備えている（非特許文献２）。
【０００６】
ＡＬＫ１は血管内皮細胞選択的に発現していることが知られている。マウスにおいて、ＡＬＫ１遺伝子の機能喪失変異は発達途中の血管系における様々な異常を引き起こす（非特許文献３）（非特許文献４）。
【０００７】
ヒトでは、ＡＬＫ１遺伝子における機能喪失変異は遺伝性出血性毛細管拡張症（オースラー・ウェーバー・レンデュ症候群、ＨＨＴ） に関連している。ＨＨＴ患者の典型的な症状には、繰り返される鼻血、胃腸出血、皮膚および粘膜皮膚の毛細血管拡張症、ならびに、肺、脳または肝臓の血管系における動静脈奇形が含まれる（非特許文献５）。
【０００８】
ＢＭＰ−９およびＢＭＰ−１０がＡＬＫ１を血管内皮細胞において活性化することで、血管内皮細胞の増殖および遊走を促すことが示されている。ＢＭＰ−９は血管内皮細胞に作用することで、ＶＥＧＦＲ２やＴｉｅ２の発現を誘導する。ＢＭＰ−９の腫瘍細胞における強制発現は腫瘍中の血管密度を増加させることが示されている。（非特許文献６）。
【０００９】
ＢＭＰ−９が腫瘍血管の増加に関与していることから、これと結合しシグナルを抑制するＡＬＫ１Ｆｃキメラタンパク質が開発されている（非特特許文献７）、実際にＡＬＫ１Ｆｃを用いた基礎実験では、ＡＬＫ１Ｆｃはマウス自然膵がん発がんモデルにおいて腫瘍縮小効果を示した（非特許文献８）。また、角膜の血管新生をＡＬＫ１Ｆｃが阻害することが示された（非特許文献９）。
【００１０】
当初、血管内皮細胞を標的とした治療方法では、腫瘍細胞自体を標的とした治療方法と比較して薬剤耐性の獲得により治療抵抗性が生じる可能性は低いと考えられていた。しかし、アバスチン（登録商標）をはじめとした抗血管新生治療の臨床試験の結果、実際に治療抵抗性が確認された例が出現し、ＶＥＧＦＲキナーゼ阻害剤においても同様な治療抵抗性が懸念されている。
【００１１】
血管新生に関与する因子としては、ＶＥＧＦ以外にも種々知られており、前述したＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０以外にも、例えばＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−７、ＳＤＦ−１、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、ＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＭＰ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰｌＧＦ、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎなどが挙げられる。ＶＥＧＦを標的とする薬剤に対する耐性腫瘍の出現するメカニズムの一つとして、ＶＥＧＦ阻害による血管量の低下に伴う低酸素状態が、血管新生因子であるＦＧＦ−２を誘導することが報告されている（非特許文献１０）。また、他の耐性獲得メカニズムとして、腫瘍から放出されるＧ−ＣＳＦが骨髄からＣＤ１１ｂ陽性細胞の動員を促し、この細胞が腫瘍に集積して腫瘍環境中で同様に血管新生因子であるＥＧ−ＶＥＧＦを放出するということも報告されている（非特許文献１０）。
【００１２】
ＶＥＧＦを標的とする抗血管新生治療方法には、ＶＥＧＦに依存しない血管新生を促すバイパス経路の出現により耐性が出現しうるため、バイパス経路を押えて、より広範な治療選択域を示す新たな抗血管新生治療方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Suzuki Y, et al., J Cell Sci. 2010 123:1684-1692
【非特許文献２】Brown MA, et al., J Biol Chem. 2005 280:25111-25118
【非特許文献３】Oh SP, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 97:2626-2631
【非特許文献４】Urness LD, et al., Nat Genet. 2000 26:328-331
【非特許文献５】Shovlin CL, et al.,Thromb Haemost. 1997 78:145-150.
【非特許文献６】Suzuki Y, et al., J Biochem. 2008 143:199-206
【非特許文献７】Mitchell D, et al., Mol Cancer Ther. 2010 9:379-388
【非特許文献８】Cunha SI, et al., J Exp Med. 2010 207:85-100
【非特許文献９】Niessen K, et al., Blood. 2010 115:1654-1661
【非特許文献１０】Shojaei F, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 106:6742-6747
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ＶＥＧＦを標的とした抗血管新生治療方法では効果が現れない、または同治療方法を継続することで耐性を獲得した癌及び異常な血管新生を伴う疾患に対する治療薬を開発することが望まれている。本発明は、抗血管新生を有するキメラタンパク質を提供することを課題とする。本発明はさらに上記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ、ベクター、ウイルス、細胞、上記キメラタンパク質の製造方法、並びに薬学的組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を達成するために鋭意研究を進めたところ、ＶＥＧＦ、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０のいずれとも結合するキメラタンパク質が、腫瘍中の血管新生を抑制し、腫瘍増殖を抑制することを見出した。本発明のキメラタンパク質は、ＶＥＧＦ及びＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０に関連した疾患、例えば癌、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、乾癬、急性及び慢性炎症、アテローム性動脈硬化症並びにリンパ増殖性疾患等の疾患を治療するのに有用であると考えられる。
【００１６】
すなわち本発明は次の（１）〜（２５）に関するものである。
（１）  ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン及びＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインを有し、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質。
（２）  ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインがＡＬＫ１細胞外ドメインである、（１）に記載のキメラタンパク質。
（３）  ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインがＦＬＴ１細胞外ドメインである、（１）又は（２）に記載のキメラタンパク質。
（４）  ＦＬＴ１細胞外ドメイン中のＩｇ２ドメインを有する、（１）から（３）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（５）  ＡＬＫ１細胞外ドメイン及びＦＬＴ１細胞外ドメイン中のＩｇ２ドメインを有する、（１）から（４）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（６）  さらに二量体化ドメインを有する、（１）から（５）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（７）  二量体化ドメインが免疫グロブリンドメインである、（６）に記載のキメラタンパク質。
（８）  免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、又はＩｇＧの軽鎖である、（７）に記載のキメラタンパク質。
（９）  免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメインである、（７）に記載のキメラタンパク質。
（１０）  ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのカルボキシ（Ｃ）末端にＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのアミノ（Ｎ）末端が結合し、ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合している、（１）から（９）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１１）  ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合している、（１）から（９）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１２）  以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかである、（１）から（１１）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
（１３）  アセチル修飾またはポリエチレングリコール修飾を受けている、（１）から（１２）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１４）  二量体化している、（１）から（１３）の何れかに記載のキメラタンパク質。
（１５）  以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのキメラタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
（１６）  以下の（ｄ）又は（ｅ）の何れかのＤＮＡ。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
（１７）  （１５）又は（１６）に記載のＤＮＡを含むベクター。
（１８）  （１７）に記載のベクターを有するウイルス。
（１９）  （１７）に記載のベクター又は（１８）に記載のウイルスを有する細胞。
（２０）  細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞から成る群から選択される細胞である、（１９）に記載の細胞。
（２１）  （１９）又は（２０）に記載の細胞を培養する工程を含む、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質を製造する方法。
（２２）  （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を含む、薬学的組成物。
（２３）  ＶＥＧＦ阻害剤である、（２２）に記載の薬学的組成物。
（２４）  抗血管新生剤である、（２２）に記載の薬学的組成物。
（２５）  抗腫瘍剤である、（２２）に記載の薬学的組成物。
【００１７】
さらに本発明によれば、以下の発明が提供される。
（２６）  ＶＥＧＦ阻害に使用するための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞。
（２７）  血管新生の抑制に使用するための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞。
（２８）  腫瘍の予防及び／又は治療に使用するための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞。
（２９）  ＶＥＧＦ阻害剤の製造のための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞の使用。
（３０）  抗血管新生剤の製造のための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞の使用。
（３１）  抗腫瘍剤の製造のための、（１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞の使用。
（３２）  （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を、ＶＥＧＦ阻害を必要とする対象者に投与することを含む、ＶＥＧＦの阻害方法。
（３３）  （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を、血管新生の抑制を必要とする対象者に投与することを含む、血管新生の抑制方法。
（３４）  （１）から（１４）の何れかに記載のキメラタンパク質、（１５）又は（１６）に記載のＤＮＡ、（１７）に記載のベクター、（１８）に記載のウイルス、あるいは（１９）又は（２０）に記載の細胞を、対象者に投与することを含む、腫瘍を抑制する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のキメラタンパク質は、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合する新たなキメラタンパク質であり、ＢＭＰ−９シグナルのみならずＶＥＧＦシグナルも抑制する。本発明のキメラタンパク質は、疾患における血管新生を効果的に抑制し、新規な抗血管新生阻害薬、抗腫瘍剤、抗乾癬剤として期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、Ｆｃ融合ポリペプチドの発現プラスミド、およびレンチウイルス産生用のプラスミド作成の概要を示す。
【図２】図２は、本発明のキメラタンパク質及び比較用のキメラタンパク質によるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いたＢＭＰ−９応答性遺伝子Ｉｄ−１の発現測定によるＢＭＰ−９結合能を示す。縦軸はＩｄ−１の発現量を示す。ＣＭはＨＥＫ２９３Ｔの培養液上清、ｃＦｃはｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ｒｅＡＬＫ１ＦｃはＲ＆Ｄシステムズ社より購入した組み換え体を示す。
【図３】図３は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を用いたＶＥＧＦＡ応答性遺伝子ＥＧＲ３の発現測定によるＶＥＧＦＡ結合能を示す。縦軸はＥＧＲ３の発現量を示す。ＮＴはＶＥＧＦＡを処理しない対照群、ＣＭはＨＥＫ２９３Ｔの培養液上清、ｒｅＦＬＴ１ＦｃはＲ＆Ｄシステムズ社より購入した組み換え体を示す。
【図４】図４は、ヒト膵がん細胞ＢｘＰＣ３に各種Ｆｃ融合ポリペプチドを安定発現させた株のヌードマウス皮下移植モデルにおける腫瘍増殖曲線を示す。縦軸には腫瘍体積、横軸には腫瘍細胞移植後の日数を示す。
【図５】図５は、ヒト膵がん細胞ＢｘＰＣ３に各種Ｆｃ融合ポリペプチドを安定発現させた株のヌードマウス皮下移植モデルにおける腫瘍を腫瘍細胞移植４９日後に回収し、血管内皮細胞マーカーであるＰＥＣＡＭ−１の蛍光免疫染色を行い、観察した一視野を示す。選ばれた視野は平均の血管密度に最も近いものを選択している。
【図６】図６は、ヒト膵がん細胞ＢｘＰＣ３に各種Ｆｃ融合ポリペプチドを安定発現させた株のヌードマウス皮下移植モデルにおける腫瘍を腫瘍細胞移植４９日後に回収し、血管内皮細胞マーカーであるＰＥＣＡＭ−１の蛍光免疫染色を行い、観察した２５視野の陽性領域の平均値を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（１）キメラタンパク質
本発明のキメラタンパク質は、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン及びＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＢ）の細胞膜上受容体の細胞外ドメインを有し、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦ（ＶＥＧＦＡ及びＶＥＧＦＢ）に結合することを特徴とする。
【００２１】
ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインとしては、ＡＬＫ１細胞外ドメイン、ＡＬＫ２細胞外ドメイン、ＡＬＫ３細胞外ドメインなどが挙げられ、特にＡＬＫ１細胞外ドメインが好ましい。
【００２２】
ＡＬＫ１細胞外ドメインとしては、配列番号１で表されるアミノ酸配列、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加にしているアミノ酸配列であって、ヒトＢＭＰ−９との結合能を有するアミノ酸配列を挙げることができる。なお、ＡＬＫ１細胞外ドメインはヒト以外の生物由来のＡＬＫ１細胞外ドメインであってもヒトＢＭＰ−９との結合能を有するものであれば本発明において利用可能である。本発明においてはＢＭＰ−９に対して親和性を示すＩｇ２ドメインを有するアミノ酸配列が好ましい。
【００２３】
ＶＥＧＦＡの細胞膜上受容体の細胞外ドメインとしては、ＦＬＴ１細胞外ドメイン、ＦＬＫ１細胞外ドメイン、ＮＲＰ１細胞外ドメイン、ＮＲＰ２細胞外ドメインなどが挙げられ、特にＦＬＴ１細胞外ドメインが好ましい。ＶＥＧＦＢの細胞膜上受容体の細胞外ドメインとしては、ＦＬＴ１細胞外ドメイン、ＮＲＰ１細胞外ドメイン、などが挙げられ、特にＦＬＴ１細胞外ドメインが好ましい。
【００２４】
ＦＬＴ１細胞外ドメインのアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列であって、ヒトＶＥＧＦとの結合能を有するアミノ酸配列を挙げることができる、なお、ＦＬＴ１細胞外ドメインは、ヒト以外の生物由来ＦＬＴ１細胞外ドメインであってもヒトＶＥＧＦとの結合能を有するものであれば本発明において利用可能である。本発明においてはＶＥＧＦに対して親和性を示すＩｇ２ドメインを有するアミノ酸配列が好ましい。
【００２５】
本発明においてはさらに二量体化ドメインを有するキメラタンパク質がより好ましい。二量体化ドメインにより本発明のキメラタンパク質は二量体化し、血中滞留性の向上が期待できる。
【００２６】
本発明において二量体化ドメインは本発明のキメラタンパク質を二量体化させるものであれば特に限定されない。例えば、免疫グロブリンドメインを使用することができ、具体的には、ＩｇＧのＦｃドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ２のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ３のＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインなど）が挙げられる。また、ＩｇＧの重鎖、又はＩｇＧの軽鎖でもよい。また、ヒト以外の生物由来の免疫グロブリンドメインでもよい。さらに、これらのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなるものでもよい。本発明においてはキメラタンパク質の血中滞留性を向上させる免疫グロブリンドメインを使用することが好ましい。
【００２７】
本発明において使用できる二量体化ドメインの一例としては、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインであって、配列番号３で表されるアミノ酸配列で示されるものである。
【００２８】
本発明のキメラタンパク質において、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメイン（例えば、ＡＬＫ１細胞外ドメイン）とＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメイン（例えば、ＦＬＴ１細胞外ドメイン）の配列順序は特に限定されない。即ち、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合していてもよいし、ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインのＣ末端にＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインのＮ末端が結合していてもよい。また、各ドメインがアミノ酸やペプチド、親水性ポリマーなど、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。
【００２９】
ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインとしてＡＬＫ１細胞外ドメインを含み、ＶＥＧＦの細胞膜上受容体の細胞外ドメインとしてＦＬＴ１細胞外ドメインを含み、さらに免疫グロブリンドメインを含むキメラタンパク質の場合の例としては、ＡＬＫ１細胞外ドメインのＣ末端にＦＬＴ１細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＦＬＴ１細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合しているキメラタンパク質、及びＦＬＴ１細胞外ドメインのＣ末端にＡＬＫ１細胞外ドメインのＮ末端が結合し、ＡＬＫ１細胞外ドメインのＣ末端に免疫グロブリンドメインのＮ末端が結合しているキメラタンパク質を挙げることができる。また、各ドメインがアミノ酸やペプチド、親水性ポリマーなど、何らかのリンカーを介して結合していてもよい。
【００３０】
リンカーがアミノ酸やペプチドの場合は、キメラタンパク質のベクターを構築する際に、各ドメインのＤＮＡ配列とリンカーのＤＮＡ配列を用いてベクターを構築すればよい。リンカーのペプチドとしては、例えば、ＣＧＧ−、ＣＡＡ−、ＣＬＬ−、ＣＶＶ−、ＣＬＡ−、ＣＧ−、ＣＧＧＧ−、ＣＧＧＧＧ−、ＣＧＧＧＧＧ−、（ＧＧＧＧＳ）3、（ＧＧＧＧＳ）6、ＶＣｉｔ、ＡＦ(（Ｇはグリシン、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｖはバリン、Ｓはセリン、Ｃｉｔはシトルリン、Ｆはフェニルアラニンをそれぞれ示す。）などを挙げることができる。また、リンカーの親水性ポリマーとしては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルボキシレート基、ヒドロキシエチル基、ポリオキシエチル基、ヒドロキシプロピル基、ポリオキシプロピル基、アミノ基、アミノエチル基、アミノプロピル基、アンモニウム基、アミド基、カルボキシメチル基、スルホン酸基、リン酸基などの親水性基を有するものを挙げることができ、具体的には、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、デンプン誘導体、カルボキシメチルセルロースおよびそのナトリウム塩、セルロースアセテート、アルギン酸ナトリウム、酢酸ビニル−マレイン酸コポリマー類、スチレン−マレイン酸コポリマー類、ポリアクリル酸類およびそれらの塩、ポリメタクリル酸類およびそれらの塩、ヒドロキシエチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシエチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシピロピルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシプロピルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルメタクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ヒドロキシブチルアクリレートのホモポリマーおよびコポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）類、ヒドロキシプロピレンポリマー類、ポリビニルアルコール類、加水分解度が６０モル％以上、好ましくは８０モル％以上である加水分解ポリビニルアセテート、ポリビニルホルマール、ポリビニルブチラール、ポリビニルピロリドン、アクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、メタクリルアミドのホモポリマーおよびポリマー、Ｎ−メチロールアクリルアミドのホモポリマーおよびコポリマー、アルコール可溶性ナイロン、２，２−ビス−（４−ヒドロキシフェニル）−プロパンとエピクロロヒドリンとのポリエーテルなどを挙げることができるが、ＰＥＧが好ましい。ＰＥＧの分子量は特に限定されず、例えば、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ１００００、ＰＥＧ２００００、ＰＥＧ３００００、ＰＥＧ３５０００などを用いることができる。
【００３１】
本発明のキメラタンパク質の具体例としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのキメラタンパク質を挙げることができる。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
【００３２】
アミノ酸配列の同一性は、例えばＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３））又はＦＡＳＴＡ（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０））等を用いて決定することができる。このＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮとよばれるプログラムが開発されているので（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、このプログラムをデフォルト設定で用いて配列同一性を計算することができる。
【００３３】
アミノ酸残基の置換は、あるアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される保存的置換でもよい。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基含有側鎖を有するアミノ酸（セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（システイン、メチオニン）を挙げることができる。
【００３４】
本明細書において「アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加している」における数個とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。
【００３５】
本発明のキメラタンパク質は、アセチル修飾またはポリエチレングリコール修飾を受けているものでもよい。真核生物のタンパク質のN末端にあるαアミノ酸はアセチル化される場合があり、生細胞内で、タンパク質の翻訳後修飾としてアセチル化が行われる場合がある。また、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合すると、タンパク質分解が抑制されることにより薬効の持続期間を延長したり、副作用を軽減することが可能になる。タンパク質のアセチル修飾またはポリエチレングリコール修飾は当業者に公知の手法により行うことができる。
【００３６】
本発明のキメラタンパク質は、二量体化したキメラタンパク質でもよい。本発明の二量体化キメラタンパク質としては、二量体化ドメインにより二量体化したもの、ペプチドリンカーによって二量体化された本発明のキメラタンパク質、化学結合により二量体化された本発明のキメラタンパク質を含む。
【００３７】
（２）ＤＮＡ
本発明は、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦ（好ましくは、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１０及びＶＥＧＦ）に結合するキメラタンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明のＤＮＡはｃＤＮＡであることが好ましい。具体的には、ＢＭＰ−９のＩ型細胞表面受容体の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を有するをコードするｃＤＮＡ配列が本発明に含まれる。さらにＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列とＦＬＴ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列を有するｃＤＮＡ配列が好ましい。上記ｃＤＮＡ配列におけるＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列とＦＬＴ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列の配列順序は特に限定されない。本発明のＤＮＡは、免疫グロブリンドメインをコードするＤＮＡをさらに有することが好ましい。
【００３８】
ＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするＤＮＡ配列としては、配列番号５で表されるＤＮＡ配列、及び配列番号５で表されるＤＮＡ配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加しているＤＮＡ配列であって、ＢＭＰ−９との結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。なお、ＡＬＫ１細胞外ドメインのＤＮＡ配列はヒト以外の由来のものであってもＢＭＰ−９との結合能を有するポリペプチドを発現させるものであれば本発明において利用可能である。
【００３９】
ＦＬＴ１細胞外ドメインのＤＮＡ配列としては、配列番号６で表されるＤＮＡ配列、及び配列番号６で表されるＤＮＡ配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加しているＤＮＡ配列であって、ヒトＶＥＧＦとの結合能を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。なお、ＦＬＴ１細胞外ドメインのＤＮＡ配列はヒト以外の由来のものであってもＶＥＧＦとの結合能を有するポリペプチドを発現させるものであれば本発明において利用可能である。
【００４０】
本明細書において「ＤＮＡ配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している」又は「塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している」における数個とは、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜３個を意味する。
【００４１】
本発明において二量体化ドメインをコードするＤＮＡは、例えば配列番号７で表されるＤＮＡ配列からなるヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。
【００４２】
本発明のＤＮＡの具体例としては、以下の（ａ）〜（ｃ）の何れかのキメラタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。
（ａ）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるキメラタンパク質；
（ｂ）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；又は
（ｃ）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加しているアミノ酸配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質；
【００４３】
本発明のＤＮＡの更なる具体例としては、以下の（ｄ）又は（ｅ）の何れかのＤＮＡを挙げることができる。
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｅ）配列番号８で表される塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換及び／又は付加している塩基配列からなり、ＢＭＰ−９及びＶＥＧＦに結合するキメラタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
【００４４】
（３）ベクター、ウイルス、細胞、及びキメラタンパク質の製造方法
本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を含むベクターに関する。本発明のベクターとしては、任意のプラスミドにＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）、及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を組み込むことにより得られるベクターが挙げられる。さらに本発明のベクターとしては、任意のプラスミドにＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）、ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）、及び二量体化ドメインをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を組み込んだものを挙げることができる。プラスミドは例えばｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐｃＲＩＩ−Ｔｏｐｏ、ｐＥＮＴＲ２０１などが挙げられる。
【００４５】
本発明のベクターはクローニングした、または、購入したＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメイン、ＶＥＧＦ受容体細胞外ドメイン及び二量体化ドメインそれぞれのＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）を用いて作製することができる。任意のプラスミドに各ドメインのｃＤＮＡを組み込む順序に制限はない。本発明のベクターの作成手順に制限はないが、例えば、二量体化ドメインを含む本発明のキメラタンパク質のベクターを作成する場合、クローニングしたＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメイン及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインの各ＤＮＡをマルチクローニングサイトでタンデム発現できるようにサブクローニングし、該サブクローニングされたＢＭＰ−９Ｉ型受容体細胞外ドメイン及びＶＥＧＦ受容体細胞外ドメインの各ｃＤＮＡを二量体化ドメインのｃＤＮＡ配列を有するベクターに組み込むことで得られる。二量体化ドメインのＤＮＡ配列を有するベクターは市販のベクター、例えばＩｎｖｉｖｏｇｅｎ社から販売されているｐＦＵＳＥ−Ｆｃシリーズなどを利用してもよい。
【００４６】
本発明のベクターは、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターでもよい。本発明の発現ベクターは、上記した本発明のベクターから、本発明のキメラタンパク質をコードするＤＮＡを切り出し、任意のプロモーター領域を有するベクターに組み込むことで得ることができる。プロモーター領域を有するベクターとしては、例えばｐｃＤＮＡ、ｐＧＬ、ｐＣＳＩＩ−ＥＦ−ＲｆＡが挙げられる。
【００４７】
本発明は、本発明のベクターを有するウイルスに関する。本発明のウイルスとしては、本発明のベクター（好ましくは発現ベクター）により形質転換されたウイルスを挙げることができる。具体的には、本発明の発現ベクターを、後記する本発明のキメラタンパク質産生細胞の宿主細胞の形質転換に適したウイルスに組み込むことによって、本発明のウイルスを得ることができる。用いられるウイルスは特に限定されないが、例えばアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス属のウイルスが挙げられる。
【００４８】
本発明はさらに、本発明のベクター又は本発明のウイルスを有する細胞に関する。本発明の細胞は、宿主細胞を、本発明のベクター又は本発明のウイルスにより形質転換することにより得ることができる。好ましくは、本発明の細胞は、本発明のキメラタンパク質を産生する細胞である。本発明の細胞の宿主細胞は、本発明のキメラタンパク質の発現に適した細胞であれば制限はなく、例えば、大腸菌、酵母、昆虫細胞、又は哺乳動物細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としてはＭＤＡ−ＭＢ−２３１Ｄ、ＣＯＳ若しくはＣＨＯなどが挙げられる。本発明の細胞は、各宿主細胞に適した公知の培養方法により継代される。
【００４９】
本発明の細胞は、電子穿孔、リポフェクション、又はリン酸カルシウム媒介トランスフェクション等により細胞へ本発明のベクターを導入することで得ることができる。また、本発明の細胞は、本発明のウイルスを感染させることにより得ることができる。
【００５０】
本発明は、上記した本発明の細胞を培養することによって、本発明のキメラタンパク質を製造する方法にも関する。本発明のキメラタンパク質の製造方法は、上記した本発明のキメラタンパク質産生細胞を用いて行われる。
【００５１】
任意の本発明のキメラタンパク質産生細胞により産生された本発明のキメラタンパク質は、活性を保持することのできる任意の方法によって精製される。例えば、これらに限定されないが、可溶性タンパク質又は封入体として細胞からキメラタンパク質を回収してもよく、細胞から８Ｍのグアニジン塩酸塩及び透析によって定量的に抽出してもよい。キメラタンパク質をさらに精製するために、これらに限定されないが、従来のイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、様々な糖クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ又はゲル濾過を含む任意数の精製法を使用してもよい。
【００５２】
（４）薬学的組成物
本発明はさらに、上記した本発明のキメラタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、ウイルス又は細胞を含む、薬学的組成物に関する。本発明の薬学的組成物は、ＶＥＧＦ阻害剤、抗血管新生剤、又は抗腫瘍剤として使用することができる。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、少なくとも本発明のキメラタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、ウイルス又は細胞を含み、必要に応じて担体、その他成分を含む。本発明のキメラタンパク質は標的化分子（例えば抗体、ホルモン、成長因子等）と連結させたり、又はリポソーム、マイクロカプセルに組み込んでもよい。担体としては、滅菌水、生理食塩水、リン酸バッファー又はデキストロース溶液等が挙げられるがこれらに制限されない。担体は固体（例えばワックス） 又は半固体（例えばゲル状）でもよい。その他成分は薬学的に許容された任意の成分であって、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、被覆剤、矯味剤、可溶化剤等である。
【００５４】
本発明の薬学的組成物の投与経路には限定がなく、全身又は局所から適宜選択される。本発明の薬学的組成物の投与経路は静脈内、髄腔内、動脈内、鼻内、経口、皮下、腹腔内、又は局所の注射若しくは外科的移植を含む。本発明の薬学的組成物の剤型は特に制限がなく、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、注射剤、座剤等、任意の剤型から選ばれる。
【００５５】
本発明の薬学的組成物の投与量は、性別や体重、年齢、人種、症状等に応じて当業者により適宜決定される。有効成分であるキメラタンパク質、ＤＮＡ、ベクター、ウイルス又は細胞の投与量は、例えば、０.００１μｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇから適宜調整される。
【００５６】
本発明は、遺伝子療法を含む。遺伝子療法としては、例えば、本発明のＤＮＡ、発現ベクター、ウイルス又はキメラタンパク質産生細胞を生体に移植することによって生体内で本発明のキメラタンパク質を産生させるようにすることを含む。
【００５７】
遺伝子療法において本発明のＤＮＡ配列を用いる場合、例えば、ｎａｋｅｄ  ＤＮＡの直接注射、脂質若しくは細胞表面受容体と親和性のあるタンパク質などでコーティングされた、リポソーム、微粒子、若しくはマイクロカプセル、又は核移行性ペプチド等に連結して投与することが挙げられる。
【００５８】
遺伝子療法において本発明のＤＮＡを含む発現ベクターを用いる場合、ベクターとしては欠損、弱毒化レトロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスなどが挙げられるがこれに限られない。
【００５９】
遺伝子療法のために本発明のＤＮＡを導入することができる細胞は、上皮細胞、血管内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞； Ｔ―リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞； 様々な幹細胞又は前駆細胞、特に例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる造血幹細胞又は前駆細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００６０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６１】
実施例１：本発明のｃＤＮＡ配列の調製及び本発明のベクターの調製
ＡＬＫ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号５）及びＶＥＧＦＡの受容体であるＦＬＴ１細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列（配列番号６）はヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）ｃＤＮＡをもとにクローニングした。ＡＬＫ１細胞外ドメインは配列番号９及び配列番号１０に示すプライマーにて、ＦＬＴ１細胞外ドメインは配列番号１１及び配列番号１２に示すプライマーにてＰＣＲ法によって増幅し、クローニングした。クローニングした各ｃＤＮＡ配列をｐＣＲＩＩ−Ｔｏｐｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込んだ。次いでｐＥＮＴＲ２０１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイト（ｍｃｓ）に配列番号５および配列番号６で表されるｃＤＮＡ配列を組み込んだ（図１参照）。次いで本発明のｃＤＮＡ配列をｍｃｓでタンデム発現できるようにサブクローニングするため、ｐＥＮＴＲ２０１ベクターから切り出した配列番号５および配列番号６で表されるｃＤＮＡ配列をｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）のｈＩｇＧ１−ＦｃのｃＤＮＡ配列（配列番号７）のＮ末側に組み込み、本発明のキメラタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号８）及び本発明のベクター（ｐＥＮＴＲ２０１  ＡＬＫ１ＦＬＴ１（Ｉｇ２）−Ｆｃ）を得た（図１参照）。
【００６２】
比較例１：比較用キメラタンパク質のベクターの調製
配列番号１３で表されるＦＬＴ１細胞外ドメイン及び細胞外移行シグナルドメインを含むｃＤＮＡ配列を配列番号１４及び配列番号１２に示すプライマーにてＰＣＲ法によって増幅した。次いで増幅されたｃＤＮＡ配列と実施例１で増幅された配列番号５で表されるｃＤＮＡ配列をそれぞれｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社）のｈＩｇＧ１−ＦｃのｃＤＮＡ配列（配列番号３）の５’末側に組み込み、比較用キメラタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列及び比較用ベクター（ｐＥＮＴＲ２０１  ＡＬＫ１−Ｆｃ及びｐＥＮＴＲ２０１  ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃ）を得た。
【００６３】
実施例２：本発明の発現ベクター調製
実施例１で得られた本発明のベクターからクローニングした本発明のｃＤＮＡ配列をｐＣＳＩＩ−ＥＦ−Ｒｆａ（理化学研究所より分与）へＬＲ反応を用いて組み込み、本発明の発現ベクターを得た（図１参照）。
【００６４】
比較例２：比較用キメラタンパク質の発現ベクターの調製
比較例１で得られた比較用キメラタンパク質のベクターを用いて実施例２と同様にして比較用発現ベクターを得た。
【００６５】
実施例３：本発明のウイルスの調製
実施例２で得られた本発明の発現ベクターと、パッケージング用プラスミドのｐＣＡＧ−ＨＩＶ（理化学研究所より分与）及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ（理化学研究所より分与）をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトして、３７℃２日間培養した後に培地を回収した。得られた培地を３０００ｒｐｍ、１０分間遠心を行うことで、レンチウイルスを含む培養上清を分離した。
【００６６】
比較例３：比較用ウイルスの調製
比較例２で得られた本発明の発現ベクターを用いて実施例３と同様にして、比較用レンチウイルスを含む培養上清を得た。
【００６７】
実施例４：本発明のキメラタンパク質の作製
１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）３×１０6個を直径１０ｃｍ  ｄｉｓｈに撒きこみ、一晩培養したのちにＦｕｇｅｎｅＨＤ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて実施例２で得られた本発明の発現ベクターを２０μｇトランスフェクトし、本発明のキメラタンパク質産生細胞を得た。得られた本発明のキメラタンパク質産生細胞を４時間、３７℃で培養した後に培地を除去し、ＦＢＳを含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地に置き換えて、２４時間インキュベーター内で培養し、培養上清を回収した。回収した上清は０．２２μｍのポアサイズのフィルターを用いてろ過し、本発明のキメラタンパク質を含む培養上清液を得た。本発明のキメラタンパク質の濃度はヒトＩｇＧＦｃＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用いて測定した結果、５００ｎｇ／ｍＬであった。
【００６８】
比較例４：比較用キメラタンパク質の作製
比較例２で得られた比較用発現ベクター（配列番号１３のｃＤＮＡ配列を含む）を用いて実施例４と同様にして、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃ産生細胞を得、培養上清を回収した。回収した上清は０．２２μｍのポアサイズのフィルターを用いてろ過し、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃ）含む培養上清液を得た。ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）−Ｆｃの濃度はヒトＩｇＧＦｃＥＬＩＳＡキット（Ｂｅｔｈｙｌ社）を用いて測定した結果、６００ｎｇ／ｍＬであった。
【００６９】
実施例５：本発明のキメラタンパク質のＢＭＰ−９結合能の確認
ＡＬＫ１のリガンドであるＢＭＰ−９によって発現が誘導されるＩｄ−１遺伝子の誘導阻害作用を見ることにより本発明のキメラタンパク質のＢＭＰ−９結合能を確認した。１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ上にＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社）を用いてＨＵＶＥＣを１×１０5個撒き、一晩培養して培地を除去した後に、ＦＢＳを含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ中にコントロールとしてＨＥＫ２９３Ｔの培養液上清、実施例４で得られた本発明のキメラタンパク質を含んだ培養上清、ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）、又は、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＡＬＫ１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社；以下「ｒｅＡＬＫ１Ｆｃ」）、及び終濃度１０ｎｇ／ｍＬとなるようヒトＢＭＰ−９を添加して、細胞に処理した。処理から４時間後に、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収を行った。回収したＲＮＡは濃度を測定後、各処理群で同量のＲＮＡを使用してＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。定量的ＰＣＲには、得られたｃＤＮＡを水で２５倍に希釈し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社）によってＩｄ−１及びＧＡＰＤＨの発現量を測定した。Ｉｄ−１の発現量はＧＡＰＤＨの発現量を用いて補正を行った。
【００７０】
精製を行っていない培養上清中に含まれる本発明のキメラタンパク質がＢＭＰ−９に結合することを確認した（図２参照）。結合能はｒｅＡＬＫ１Ｆｃと同程度であった。
【００７１】
実施例６：キメラタンパク質のＶＥＧＦＡ結合能の確認
Ｆｌｔ１のリガンドであるＶＥＧＦＡによって誘導されるＥＧＲ３遺伝子の誘導阻害作用を見ることにより本発明のキメラタンパク質のＶＥＧＦＡ結合能を確認した。１２ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ上にＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（Ｌｏｎｚａ社）を用いてＨＵＶＥＣを１×１０5個撒き、一晩培養して培地を除去した後に、ＦＢＳを含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ中にコントロールとしてＨＥＫ２９３Ｔの培養液上清、実施例４で得られた本発明のキメラタンパク質を含んだ培養上清、又は、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＦＬＴ１Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステムズ社：ＦＬＴ１細胞外ドメイン及び細胞外移行シグナルドメインを含む；以下「ｒｅＦＬＴ１Ｆｃ」）、又は、比較例４で得られたＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ、及び終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるように調整したＶＥＧＦＡを培養液中に添加した。１時間培養後、ＲＮｅａｓｙ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収を行った。回収したＲＮＡは濃度を測定後、各処理群で同量のＲＮＡを使用してＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡの合成を行った。定量的ＰＣＲには、得られたｃＤＮＡを水で２５倍に希釈し、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステム社）を用いて、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステム社）によってＥＧＲ３及びＧＡＰＤＨの発現量を測定した。ＥＧＲ３の発現量はＧＡＰＤＨの発現量を用いて補正を行った。
【００７２】
精製を行っていない培養上清中に含まれる本発明のキメラタンパク質がＶＥＧＦＡへの結合することを確認した（図３参照）。なお、本発明のキメラタンパク質はｒｅＦＬＴ１Ｆｃに比較してＶＥＧＦＡシグナル阻害活性が緩やかであった。
【００７３】
実施例７：本発明のキメラタンパク質の腫瘍増殖抑制作用
ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣを用い、ＢＭＰ−９により誘導されるＩｄ−１の阻害及びＶＥＧＦＡによって誘導されるＥＧＲ３の阻害によって確認した。
６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅにＢｘＰＣ３を５×１０5個、１ｍＬの培地量で播種しておき、３７℃一晩培養した後に、実施例３及び比較例３において作成したレンチウイルスを含む培養上清を１ｍＬ処理した。３７℃２４時間培養した後、培養上清を除去して、本発明のキメラタンパク質、ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｆｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ、及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ、それぞれを安定的に発現するＢｘＰＣ３を作成した。これをヌードマウス皮下に５×１０6個移植して、一週間おきに腫瘍堆積を短径と長径を測定することで算出した。腫瘍堆積は以下に示す  堆積（ｍｍ3）＝（長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ））／２  によって算出した。
【００７４】
本発明のキメラタンパク質、ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現ＢｘＰＣ３の腫瘍増殖を観察した結果、本発明のキメラタンパク質を発現ＢｘＰＣ３腫瘍のみが、他のｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現ＢｘＰＣ３腫瘍と比較して有意に増殖が抑制されることが確認された（図４参照）。
【００７５】
実施例８：本発明のキメラタンパク質ド発現ＢｘＰＣ３における血管密度の観察
実施例７で得られたそれぞれｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ及び本発明のキメラタンパク質発現ＢｘＰＣ３細胞をヌードマウス皮下に５×１０6個移植して４９日後にマウスを犠牲死させて、サンプリングした腫瘍塊より凍結切片を作成し、抗ＰＥＣＡＭ−１抗体（ＭＥＣ１３．３：ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、蛍光免疫染色し、観察試料を得た。蛍光顕微鏡を用いて観察試料のネクローシスを起こした領域を除外した２５視野を観察した。図５にはＰＥＣＡＭ−１陽性率の平均値に最も近い視野を選択して表示した。図６には各視野におけるＰＥＣＡＭ−１陽性率及び平均値をプロットした。
【００７６】
ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ、ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ及び本発明のキメラタンパク質発現ＢｘＰＣ３の腫瘍切片中のＰＥＣＡＭ−１陽性率は、ｃｏｎｔｒｏｌＦｃ発現腫瘍に対して、ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ及び本発明のキメラタンパク質発現ＢｘＰＣ３腫瘍が低かった。ＡＬＫ１Ｆｃ、ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現腫瘍間では有意な差はなかったが、ＡＬＫ１Ｆｃ、及びＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）Ｆｃ発現腫瘍と比較して本発明のキメラタンパク質発現腫瘍中のＰＥＣＡＭ−１陽性率は有意に低下した。このことから本発明のキメラタンパク質が血管量を低下させたことで腫瘍増殖が抑制されたと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、異常な血管新生を伴う疾患、例えば腫瘍、関節リウマチ、様々な網膜症、血管腫および乾癬やそれらの合併症に有効な治療が可能になる。このように、本発明は医薬分野における利用可能性が極めて高く有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１：ＡＬＫ１細胞外ドメインのアミノ酸配列
配列番号２：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）のアミノ酸配列
配列番号３：ｈＩｇＧ１Ｆｃのアミノ酸配列
配列番号４：ＡＬＫ１ＦＬＴ１（Ｉｇ２）Ｆｃのアミノ酸配列
配列番号５：ＡＬＫ１細胞外ドメインのｃＤＮＡ配列
配列番号６：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）のｃＤＮＡ配列
配列番号７：ｈＩｇＧ１ＦｃのｃＤＮＡ配列
配列番号８：ＡＬＫ１ＦＬＴ１（Ｉｇ２）ＦｃのｃＤＮＡ配列
配列番号９：ＡＬＫ１細胞外ドメインのフォワードプライマー
配列番号１０：ＡＬＫ１細胞外ドメインのリバースプライマー
配列番号１１：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）のフォワードプライマー
配列番号１２：ＦＬＴ１細胞外ドメイン（Ｉｇ２）／ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）のリバースプライマー
配列番号１３：ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）のｃＤＮＡ配列
配列番号１４：ＦＬＴ１（Ｉｇ１−３）のフォワードプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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