(57)【要約】【課題】免疫賦活効果の強いＴＬＲ２アゴニストを提供することを目的とする。【解決手段】３−ヒドロキシ−２Ｓ−ヒドロキシプロピル−Ｒ−システイニル−Ｓ−セリンを母核にした誘導体を作製し、体内動態の改善を図るために脂溶性を指標として、種々の検討を行った。その結果、セリン残基の水酸基を糖で修飾することにより、親水性が向上すると共に、ＴＬＲ２作動活性が大幅に上昇することを見出した。これら誘導体をＴＬＲ２アゴニストとして使用することにより、ガン疾患治療薬あるいはアレルギー疾患治療薬、あるいは良好な免疫賦活化促進剤として使用できることが示された。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（２）
【化３】
2016160193.tif 000013
［式中、Ｒ１は、置換又は無置換の分枝状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基、
あるいは置換基で置換された直鎖状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基を表す。Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。
Ｒ３は、水素原子、単糖類または二糖類を表す。
Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜４の脂肪族アシル基を表す。］
で表されることを特徴とする、ジペプチド誘導体。
【請求項２】
Ｒ３が、単糖類または二糖類であることを特徴とする、請求項１に記載のジペプチド誘導体。
【請求項３】
上記単糖類が、グルコシル基、フルクトシル基またはガラクトシル基であることを特徴とする、請求項２に記載のジペプチド誘導体。
【請求項４】
上記単糖類がグリコシル基であることを特徴とする、請求項２に記載のジペプチド誘導体。
【請求項５】
Ｒ２が、炭素数１〜４の低級アルキル基であることを特徴とする、請求項１に記載のジペプチド誘導体。
【請求項６】
上記炭素数１〜４の低級アルキル基が、メチル基であることを特徴とする、請求項５に記載のジペプチド誘導体。
【請求項７】
Ｒ４が、炭素数１〜４の脂肪族アシル基であることを特徴とする、請求項１に記載のジペプチド誘導体。
【請求項８】
上記炭素数１〜４の脂肪族アシル基が、アセチル基であることを特徴とする、請求項７に記載のジペプチド誘導体。
【請求項９】
Ｒ１は、分枝状の置換又は無置換の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基であることを特徴とする、請求項１に記載のジペプチド誘導体。
【請求項１０】
上記分枝状の置換又は無置換の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基が、α位に側鎖アルキル基を持つアシル基であることを特徴とする、請求項９に記載のジペプチド誘導体。
【請求項１１】
上記α位の側鎖アルキル基が、ｎブチル基、ｎヘプチル基またはｎオクチル基であることを特徴とする、請求項１０に記載のジペプチド誘導体。
【請求項１２】
Ｒ１が、置換基で置換された直鎖状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基であることを特徴とする、請求項１に記載のジペプチド誘導体。
【請求項１３】
上記置換基が、水酸基又は炭素数１〜４の低級アルコキシ基であることを特徴とする、請求項１２に記載のジペプチド誘導体。
【請求項１４】
上記炭素数１〜４の低級アルコキシ基がメトキシ基またはエトキシ基であることを特徴とする、請求項１３に記載のジペプチド誘導体。
【請求項１５】
Ｒ２がメチル基、Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水素原子であることを特徴とする、請求項１に記載のジペプチド誘導体。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれかに記載のジペプチド誘導体を有効成分とする、ＴＬＲ２作動薬。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれかに記載のジペプチド誘導体を有効成分とする、医薬組成物。
【請求項１８】
上記医薬が、ガン疾患治療薬またはアレルギー疾患治療薬であることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
上記医薬が、アレルギー疾患治療薬であることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＴＬＲ２作動薬とそれを用いた抗ガン剤又は抗アレルギー剤に関するものである。更には、本発明の新規なＴＬＲ２作動薬をアジュバントとして使用する用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は生体内に存在する異物を感知してそれを排除するシステムであり、自然免疫系と獲得免疫系から成り立っている。自然免疫系は古くから非特異的な応答であると考えられてきたが、この概念を一蹴する引き金となったのはＴｏｌｌ様受容体（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＴＬＲ）の発見である。ＴＬＲは病原体に存在する特有の「分子パターン」と結合し、様々な異物を特異的に感知しうる受容体ファミリーである。ヒトでは、１０種類が同定されており、免疫担当細胞や上皮細胞に存在している。ＴＬＲの各種類のそれぞれが、ウイルスや細菌などの病原微生物の構成成分を特異的に認識し、非自己の認識を司っている。
また、ＴＬＲを介した自然免疫系の活性化は、獲得免疫系の活性化への重要な橋渡しを行い、獲得免疫系の制御を行うため、免疫応答の最初のトリガーとしても重要な役割を担っている。
【０００３】
１０種類のＴｏｌｌ様受容体の内、ＴＬＲ２については、グラム陽性細菌細胞膜成分の認識に関わっていることが分かっている。即ち、ＴＬＲ２は、ＴＬＲ１と２量体化して大腸菌由来のリポ蛋白（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）を認識し、炎症反応物質を産生させて、自然免疫を活性化する。そこで、ＴＬＲ２の作動薬であるＰａｍ３ＣＳＫ４を自然免疫の活性化剤として使用する試みもなされているが、Ｐａｍ３ＣＳＫ４は水溶性が悪く、薬剤として使用することは困難であった。
そこで、Ｐａｍ３ＣＳＫ４の誘導体を作製して物性を改良し、水溶性を向上させて新たなＴＬＲ２作動薬を創出する試みが行われている（特許文献１、非特許文献１〜４）。しかし、現状では、これらの試みは充分なものではなく、更に良好な誘導体の創出が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開公報２０１４−１１３６３４
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１３，５６（１４），５８８５−５９００
【非特許文献２】Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１２，５５（７），３３５３−３３６３
【非特許文献３】Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１１，５４（２３），８１４８−８１６０
【非特許文献４】Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．，２０１０，５３（８），３１９８−３２１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、ＴＬＲ２作動作用を有する新たな誘導体の提供を目的とするものである。更には、本発明の誘導体による新たな抗がん剤や抗アレルギー剤の用途の提供を目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
従来のＴＬＲ２作動薬の報告（非特許文献３）によれば、以下の化学式（１）の化合物（システイン−セリン骨格を有する化合物）が記載され、ヒトＴＬＲ２特異的レポーター遺伝子アッセイのＥＣ５０値が１．９５ｎＭであると記載されている。
【０００８】
【化１】
2016160193.tif 000002
【０００９】
発明者らは、上記化合物（１）のジペプチド母核部分（３−ヒドロキシ−２Ｓ−ヒドロキシプロピル−Ｒ−システイニル−Ｓ−セリン）の誘導体を以下の方針で種々合成した（表1を参照）。
ａ）セリン末端のカルボキシル基をエステル化する。
ｂ）セリンの水酸基を糖化する。
ｃ）システインのアミノ基をアシル化する。
ｄ）システインの置換基（３−ヒドロキシ−２Ｓ−ヒドロキシプロピル基）の３−ヒドロキシ基をアシル化する。
上記の合成検討の結果、セリンの水酸基に糖類を付加した誘導体の場合には、特に顕著に高いＴＬＲ２作動活性を示し、活性も濃度に依存して上昇し、一定濃度で頭打ちにならないことが示された。本発明者らは、以上の知見により本発明を完成した。
【００１０】
本願発明の要旨は以下のとおりである。
（１）以下の式（２）
【００１１】
【化２】
2016160193.tif 000003
【００１２】
［式中、Ｒ１は、置換又は無置換の分枝状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基、
あるいは置換基で置換された直鎖状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基を表す。Ｒ２は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。
Ｒ３は、水素原子、単糖類または二糖類を表す。
Ｒ４は、水素原子、炭素数１〜４の脂肪族アシル基を表す。］
で表されることを特徴とする、ジペプチド誘導体。
（２）Ｒ３が、単糖類または二糖類であることを特徴とする、上記（１）に記載のジペプチド誘導体。
（３）上記単糖類が、グルコシル基、フルクトシル基またはガラクトシル基であることを特徴とする、上記（２）に記載のジペプチド誘導体。
（４）上記単糖類がグリコシル基であることを特徴とする、上記（２）に記載のジペプチド誘導体。
（５）Ｒ２が、炭素数１〜４の低級アルキル基であることを特徴とする、上記（１）に記載のジペプチド誘導体。
（６）上記炭素数１〜４の低級アルキル基が、メチル基であることを特徴とする、上記（５）に記載のジペプチド誘導体。
（７）Ｒ４が、炭素数１〜４の脂肪族アシル基であることを特徴とする、上記（１）に記載のジペプチド誘導体。
（８）上記炭素数１〜４の脂肪族アシル基が、アセチル基であることを特徴とする、上記（７）に記載のジペプチド誘導体。
（９）Ｒ１は、分枝状の置換又は無置換の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基であることを特徴とする、上記（１）に記載のジペプチド誘導体。
（１０）上記分枝状の置換又は無置換の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基が、α位に側鎖アルキル基を持つアシル基であることを特徴とする、上記（９）に記載のジペプチド誘導体。
（１１）上記α位の側鎖アルキル基が、ｎブチル基、ｎヘプチル基またはｎオクチル基であることを特徴とする、上記（１０）に記載のジペプチド誘導体。
（１２）Ｒ１が、置換基で置換された直鎖状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基であることを特徴とする、上記（１）に記載のジペプチド誘導体。
（１３）上記置換基が、水酸基又は炭素数１〜４の低級アルコキシ基であることを特徴とする、上記（１２）に記載のジペプチド誘導体。
（１４）上記炭素数１〜４の低級アルコキシ基がメトキシ基またはエトキシ基であることを特徴とする、上記（１３）に記載のジペプチド誘導体。
（１５）Ｒ２がメチル基、Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水素原子であることを特徴とする、上記（１）に記載のジペプチド誘導体。
【００１３】
（１６）上記（１）〜（１４）のいずれかに記載のジペプチド誘導体を有効成分とする、ＴＬＲ２作動薬。
（１７）上記（１）〜（１４）のいずれかに記載のジペプチド誘導体を有効成分とする、医薬組成物。
（１８）上記医薬が、ガン疾患治療薬またはアレルギー疾患治療薬であることを特徴とする、上記（１７）に記載の医薬組成物。
（１９）上記医薬が、アレルギー疾患治療薬であることを特徴とする、上記（１７）に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明化合物のジペプチド誘導体（２）は、ＴＬＲ２の作動薬としての活性を示し、セリンの水酸基に糖類が付加することにより、水溶性が高くなると共に、顕著に高いＴＬＲ２の作動効果が得られている。また、誘導体の濃度に依存して活性が上昇し、一定濃度で頭打ちにならないと言う特徴的な効果が示されている。
従って、本発明化合物を用いることにより、ガン疾患治療剤あるいはアレルギー疾患治療剤として、新たな薬剤を提供できるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明化合物のジペプチド誘導体（ＴＴＫ−０４３、ＴＴＫ−０４４）に関するＴＬＲ２の作動活性を表した図である。本発明化合物の濃度希釈により、希釈率に応じた作動活性の減弱が見られた。即ち、本発明化合物は用量依存的なＴＬＲ２に対する活性発現が観察されている。なお、ＬＭ−ＭＳ（ｌｉｐｏｍａｎｎａｎ ｆｒｏｍ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）は、評価系が適切に機能していることを示すための標準物質として使用している。ＬＭ−ＭＳはＴＬＲ２アゴニストとして作用するが、用量依存的な活性を示すのではなく、化合物が一定濃度に達すると活性が頭打ちになる。このように、本発明の化合物は、ＬＭ−ＭＳとは異なるＴＬＲ２アゴニスト活性を示すことが明らかになった。
【図２】本発明化合物（ＴＴＫ−０４３、ＴＴＫ−０４４）の構造式を表した図である。
【図３】本発明化合物のＴＬＲ２作動活性の評価方法を表した図である（試験例１を参照）。
【図４】本発明化合物の合成ルートの前半部分を表した図である。本合成ルートで、Ｒ２がメチル基、Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水素原子である本発明化合物を作製する。本化合物を修飾して、更に別途の本発明化合物を作製する。例えば、Ｒ３の水素原子をグルコシル化し、Ｒ４の水素原子をアセチル化することにより、上記図２の構造の本発明化合物を作製できる。
【図５】本発明化合物のＲ１が脂肪酸で修飾されている化合物（Ｒ２がメチル基、Ｒ３が水素原子、Ｒ４が水素原子）のＴＬＲ２作動活性の結果を示した図である。脂肪酸の炭素数が１２〜１７の範囲において、高いＴＬＲ２作動活性を示すことが分かった。Ｃ７は、ＴＴＫ−００１を表し、Ｃ８はＴＴＫ−００７、Ｃ９はＴＴＫ−００８、Ｃ１０はＴＴＫ−００９、Ｃ１１はＴＴＫ−１０、Ｃ１２はＴＴＫ−１１、Ｃ１３はＴＴＫ−０１３、Ｃ１４はＴＴＫ−１４、Ｃ１５はＴＴＫ−０１５、Ｃ１６はＴＴＫ−０１６、Ｃ１７はＴＴＫ−０１７を表す。
【図６】分枝状又は水酸基を持つ脂肪酸で修飾された本発明化合物（ＴＴＫ−０１２、０１８〜０２７の１１個の化合物）のＴＬＲ２作動活性の評価結果を表した図である。図５で示された本発明化合物以外に、構造式を図示した４つの化合物（ＴＴＫ０１２、０２１、０２６、０２７）にＴＬＲ２作動活性があることを示している。Ｒ１が分岐した脂肪酸である場合と、水酸基が末端に置換した直鎖の炭素数１２〜１３の脂肪酸の場合に、ＴＬＲ２作動活性があることを示している。
【図７】本発明化合物のＴＮＦ−α産生能の評価方法を表した図である（試験例２を参照）。
【図８】図７のＴＮＦ−α産生能評価方法で、本発明化合物の中の４つの化合物（ＴＴＫ−０１２、０２１、０２６、０２７）の評価結果を示した図である。なお、上記化合物の脂溶性（ＣｌｏｇＰ）は、ＴＴＫ０１２で３．０であり、ＴＴＫ０２１で５．０であり、ＴＴＫ０２６で１．２であり、ＴＴＫ０２７で１．７であるので、かなり脂溶性が低下し、親水性（水溶性）が増加している。ＬＭ−ＭＳは上記図１と同じ意味を表す。本発明化合物の上記４つは、ＴＮＦ−α産生能がＬＭ−ＭＳよりも高いことが示された。
【図９】本発明化合物（ＴＴＫ００１〜００９）のＴＬＲ２作動活性の評価結果を表した図である。
【図１０】本発明化合物（ＴＴＫ０１０〜０１８）のＴＬＲ２作動活性の評価結果を表した図である。
【図１１】本発明化合物（ＴＴＫ０４３）のアレルギー反応抑制効果の評価結果を表した図である。
【図１２】本発明化合物（ＴＴＫ０４３）の腫瘍増殖抑制効果（腫瘍サイズ）の評価結果を表した図である。
【図１３】本発明化合物（ＴＴＫ０４３）の腫瘍増殖抑制効果（腫瘍重量）の評価結果を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の「置換又は無置換の分枝状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基」とは、分枝状の炭素数１２〜１７の脂肪酸由来の脂肪族アシル基のことを言い、炭素数１〜８のアルキル基が置換した炭素数３〜１５の脂肪族アシル基を言う。好ましい分枝状の脂肪族アシル基としては、例えば１−ｎブチル−ｎヘプチル基、１−ｎヘプチル−ｎオクチル基等の１位（α位）が分岐した脂肪族アシル基を挙げることができる。
置換基としては、脂溶性を改善するために導入される置換基を挙げることができる。例えば、水酸基や炭素数１〜４の低級アルコシキ基、カルボキシシル基等の親水性置換基を挙げることができる。好ましい置換基としては、水酸基を挙げることができる。
本発明の「置換基で置換された直鎖状の炭素数１２〜１７の脂肪族アシル基」とは、置換基で置換された炭素数１２〜１７の高級脂肪酸由来の脂肪族アシル基のことを言う。例えば、ドデカニル基、テトラデカニル基、ペンタデカニル基、へキサデカニル基、ヘプタデカニル基等を挙げることができる。置換基としては、例えば水酸基、炭素数１〜４の低級アルコシキ基、カルボキシル基等を挙げることができる。好ましい置換基としては、水酸基、メトキシ基、エトキシ基を挙げることができる。
【００１７】
本発明の「単糖類または二糖類」とは、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類、例えばスクロース、マルトース、ラクトース等の二糖類のことを言う。好ましいものとしては、単糖類を挙げることができ、更に好ましくは、グルコースを挙げることができる。本発明のジペプチド誘導体（２）のセリン残基の水酸基がグルコシル化などにより糖付加されて、水溶性がより向上し、活性も顕著に向上することができる。
本発明の「医薬組成物」とは、ＴＬＲ２の作動薬（ＴＬＲ２アゴニスト）である本発明化合物を使用した、免疫を賦活化させるための医薬組成物のことを言う。
本発明の「ガン疾患治療薬またはアレルギー疾患治療薬」とは、例えば、急性白血病、慢性白血病、悪性リンパ腫、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、胆道癌 、腎臓癌、膀胱癌、喉頭癌 、咽頭癌 、舌癌 、胃癌、食道癌 、結腸・直腸癌、大腸癌、乳癌 、子宮癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、肺癌 、脳腫瘍、多発性骨髄腫、骨・軟部腫瘍、皮膚癌等のガン疾患の治療薬のことであり、また、例えばアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、 アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、蕁麻疹等のアレルギー疾患の治療薬のことを言う。
【００１８】
本発明の医薬組成物は、非経口的または経口的に投与することができる。
経口投与用の製剤としては、例えば、カプセル剤、散剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤等を挙げることができ、非経口投与用の製剤としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、直腸内投与剤、吸入剤、噴霧剤（スプレー剤、エアゾル剤、または吸入器もしくは通気器用カートリッジ噴霧用の水剤／懸濁剤等）、ローション剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、点耳剤、テープ剤、経皮パッチ製剤、湿布剤、外用散剤等を挙げることができる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、許容される通常の担体、賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定剤、崩壊剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、界面活性剤、防腐剤、香料等を含有することができ、２種以上の製剤用添加物を適宜用いることができる。
経口投与用製剤のうち、乳剤及びシロップ剤等の液体製剤は、水；ショ糖、ソルビット、果糖等の糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；ストロベリーフレーバー、ペパーミントフレーバー等のフレーバー類等の製剤用添加物を用いて製造することができる。カプセル剤、錠剤、散剤及び顆粒剤等の固形製剤は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット賦形剤；デンプン、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤等を用いて製造することができる。
【００１９】
医薬組成物中における本発明化合物の含有量は、特に限定されるものではない。例えば非経口剤の場合、1回の投与当たり、通常０．０１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜３００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇ〜１５０ｍｇとなるように製剤化されていれば良い。
非経口投与用製剤のうち、注射剤、点滴剤等の形態の液体製剤は、好ましくは滅菌された等張の液体製剤として調製できる。例えば、注射剤は塩溶液、ブドウ糖溶液、又は塩水とブドウ糖溶液との混合物からなる水性媒体を用いて調製することができる。
本発明化合物の投与方法としては、経口投与および非経口投与のいずれでも良い。非経口投与の場合、皮下注射、持続皮下注射、皮内注射、静脈注射、動脈注射、筋肉注射、腹腔内投与、経皮投与、経粘膜投与、経鼻投与等が挙げられる。
【００２０】
本発明化合物は、癌抗原蛋白質もしくは癌抗原ペプチドと共に投与して、癌免疫療法剤として用いることができる。あるいは、ウイルスもしくは細菌ワクチンと共に投与して、ウイルスもしくは細菌感染症治療／予防剤（ワクチン増強剤）として用いることができる。
癌免疫療法剤として用いる場合、癌の種類には特に限定は無く、上記各種の癌疾患が挙げられる。好ましくは、肺癌、膀胱癌などが挙げられる。
微生物感染症としては、ウイルス、細菌、真菌、原虫等の微生物感染症が挙げられる。本発明における微生物感染症としては、日和見感染症と呼ばれる、癌や後天性免疫不全症候群 (AIDS)に罹患した患者や加齢等に伴うその他の後天性の免疫不全状態の患者におこる感染症等が挙げられる。
具体的なウイルス感染症として、具体的には、サイトメガロウイルス感染症、ヘルペスウイルス感染症、呼吸器多核体ウイルス感染症などが挙げられる。細菌感染症として、具体的には、クレブシエラ肺炎、結核等が挙げられる。真菌感染症として、具体的には、クリプトコッカス感染症、カンジダ等が挙げられる。原虫感染症として、具体的には、トキソプラズマ感染症等が挙げられる。
【実施例】
【００２１】
以下、実施例および試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２２】
実施例１：３−ヒドロキシ−２Ｓ−ヒドロキシプロピル−Ｒ−システイニル−Ｓ−セリン母核化合物の新規な３−ヒドロキシ基誘導体の合成
（１）合成対象化合物と合成方法
公知のＴＬＲ２アゴニストである化学式（１）の化合物の脂溶性を改善し水溶性を高めると共に、アゴニスト活性を増強するため、ジペプチド母核化合物の修飾を行った。まず、３−ヒドロキシ基誘導体を合成するため、脂肪酸基の改変を試みた。具体的には図４に記載の合成方法で、以下の表１〜表９の３−ヒドロキシ基誘導体を合成した。更に、システイン残基のアミノ基についても、アセチル化した誘導体を合成した。
なお、これらの誘導体は、上記特許文献１と非特許文献１〜４に記載の方法に準じて合成することもできる。
また、水溶性を高めて、ＴＬＲ２アゴニスト活性を増強するために、図２に示されるように、セリン残基側鎖のヒドロキシメチル基にグリコシル化を行い、糖で修飾することを行った。なお、グリコシル化方法は、公知の向山法（チオホルムイミダート基を脱離基とする糖誘導体合成法）を使用することができる。
【００２３】
（２）３−（１−ｎ−ブチル−オクチリック）−オキシ−２Ｓ−ヒドロキシプロピル−Ｒ−（アセチル）システイニル−Ｓ−（グリコシル）−セリンメチルエステル（ＴＴＫ−００４３とＴＴＫ−００４４）の合成
特許文献１と非特許文献１〜４に記載の方法に準じてＴＴＫ−０２８を合成し、グリコシル化試剤として、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ベンゾイル−α−Ｄ−グルコピラノシルｐ−トリフルオロメチルベンジルチオ−ｎ−（ｐ−トリフルオロメチルフェニル）ホルムイミダートを使用して、グリコシル化を行った。得られたグリコシル化生成物のベンゾイル基を、公知方法に基づいて脱保護することにより、ＴＴＫ−００４３とＴＴＫ−００４４を得た。これらの化合物は、カラムで分離して、ＴＴＫ−００４３とＴＴＫ−００４４を分離精製した。
【００２４】
【表１】
2016160193.tif 000004
【００２５】
【表２】
2016160193.tif 000005
【００２６】
【表３】
2016160193.tif 000006
【００２７】
【表４】
2016160193.tif 000007
【００２８】
【表５】
2016160193.tif 000008
【００２９】
【表６】
2016160193.tif 000009
【００３０】
【表７】
2016160193.tif 000010
【００３１】
【表８】
2016160193.tif 000011
【００３２】
【表９】
2016160193.tif 000012
【００３３】
（試験例１）本発明化合物の生物活性（ＴＬＲ２の活性化能）の評価方法
（１）９６穴マイクロプレートへのサンプルの塗布
ａ）本発明化合物の塗布
図３に示すように、本発明化合物（ＴＴＫ００１〜０４４）を９６穴のマイクロプレートに塗布する。即ち、本発明化合物のメタノール溶液（１μｇ／１μＬ）を１穴（ｗｅｌｌ）に２０μＬ注入し、乾固する。上記の発明化合物の塗布量を１として、更に１／３ずつ段階希釈し、１穴（ｗｅｌｌ）に２０μＬ注入し、乾固したマイクロプレートを作製した。これらのプレートを希釈率に合わせて、１／１、１／３、１／９、１／２７、１／８１、１／２４３で表すことにする。
ｂ）ＬＭ−ＭＳ（スメグマ菌由来のリポマンナン）の塗布
上記のように、９６穴のマイクロプレートにＬＭ−ＭＳの水溶液（０．０１μｇ／１μＬ）を１穴（ｗｅｌｌ）に２０μＬ注入し、乾固する。更に、上記のＬＭ−ＭＳの塗布量を１として、更に１／３ずつ段階希釈し乾固したマイクロプレートを作製した。
ｃ）ＬＭ−ＢＣＧ（ＢＣＧ菌由来のリポマンナン）の塗布
上記のように、９６穴のマイクロプレートにＬＭ−ＢＣＧの水溶液（１μｇ／１μＬ）を１穴（ｗｅｌｌ）に２０μＬ注入し、乾固する。更に、上記のＬＭ−ＢＣＧの塗布量を１として、更に１／３ずつ段階希釈し乾固したマイクロプレートを作製した。
【００３４】
（２）ＴＬＲ２活性化能力の評価
ヒトＴＬＲ２で安定的にコトランスフェクトされたＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬＲ２細胞を用いて、ＮＦ−κＢプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子の発現を評価した。
まず、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬＲ２細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を分散させて１０×１０４個細胞／ｍＬとし、この分散溶液を上記９６穴のマイクロプレートの１ウェル当たり２００μＬを注入した。注入後、５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で２４時間培養した。
分泌されるＳＥＡＰレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてアッセイした。ＳＥＡＰの産生量を６５５ｎｍの光の透過度で表した。
この結果を図１と図５〜６、図９〜１０に示す。
【００３５】
（試験例２）本発明化合物の生物活性（ＴＮＦ−αの産生能）の評価方法
（１）マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７の培養
図６に示すように、ＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中に、５×１０５個細胞／ｍＬとなるようにＲＡＷ２６４．７を分散させ、その分散液１００μＬを９６穴のマイクロプレートの各ウエル（穴）に注入した。その後、５％の炭酸ガス雰囲気下、３７℃にて4時間培養した。
（２）評価サンプル溶液の作製
本発明化合物として、ＴＴＫ００９を使用し、１００μＬ／ｍＬとなる評価溶液を作製した。更に、上記の溶液濃度を１として、更に１／３ずつ段階希釈した本発明化合物の評価溶液を作製した。
本発明化合物として、ＴＴＫ０１２、０１８−０２７を使用し、１０μＬ／ｍＬとなる評価溶液を作製した。更に、上記の溶液濃度を１として、更に１／３ずつ段階希釈した本発明化合物の評価溶液を作製した。
ＬＭ−ＭＳとして、１０μＬ／ｍＬとなる評価溶液を作製した。更に、上記の溶液濃度を１として、更に１／３ずつ段階希釈したＬＭ−ＭＳの評価溶液を作製した。
（３）ＴＮＦ−αの産生能の評価
ＲＡＷ２６４．７の培養後、各ウェルの上澄みを除去し、本発明化合物等の評価溶液２００μＬをそれぞれのウェルに添加した。５％炭酸ガス雰囲気下で３７℃２０時間培養した。培養液の上澄み１６０μＬを分取し、ＥＬＩＺＡキト（Ｒ 
＆Ｄ  ＳＹＳＴＥＭＳ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて産生されるＴＮＦ−αをＥＬＩＺＡで評価した。
その結果を図８に示す。
【００３６】
（試験例３）本発明化合物（ＴＴＫ−０４３）のアレルギー抑制効果
（１）１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＤＮＦＢ）の誘発接触性皮膚炎マウスモデルの作製
ＢＡＬＢ／ｃ  ＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ系雌性マウス（８週令）を約1週間の馴化飼育を行う。その後、動物の左耳の耳介中央部の厚さを、ダイアル厚さゲージ（ＰＥＡＣＯＣＫ  Ｇ−１Ａ、尾崎製作所）で測定した。耳介中央部の厚さを測定後、腹部を剃刀で剃毛し、腹部に０．２％ＤＮＦＢアセトン溶液を２０μＬ塗布した（一次感作）。翌日、腹部に０．２％ＤＮＦＢアセトン溶液を２０μＬを再び塗布した。一次感作の５日後に、動物の左耳の耳介中央部の厚さを測定し、各群の耳の厚さの平均値ができるだけ等しくなるように群分けを行った。動物の各左耳に０．２％ＤＮＦＢアセトン溶液を１０μＬ塗布し、接触性皮膚炎を惹起し、皮膚炎モデルマウスを作製した。初回感作５日後に０．２％ＤＮＦＢアセトン溶液１０μＬを左耳に塗布し、接触性皮膚炎が惹起された２４時間後には、IV型アレルギー反応のよる遅延型反応が発現され、抗原塗布した耳に浮腫が認められた。Ｖｅｈｉｃｌｅ群の耳介の浮腫（３３１．７±９．３７ｍｍ）はＳｈａｍ群（７３．３±１２．２ｍｍ）に比べ有意に増加した。
【００３７】
（２）被験試剤の調整
ａ）外用剤の作製
外用剤基剤の調製として、モノカプリル酸プロピレングリコール、２−｛２−［２−（２−ドデシルオキシエトシン）エトキシ］エトキシ｝エタノール（ポリオキシエチレン（２）ラウリルエーテル）及びプロピレングリコールをそれらの重量比で１：１：８となるように混合して、基剤を作製した。
本発明化合物（ＴＴＫ−０４３）を１００ｍｇ／ｍＬの濃度で基剤に溶解し、高濃度塗布群の投与液を調製した（１ｍｇ／１０μＬ／ｈｅａｄ)。１００ｍｇ／ｍＬ溶液を基剤と１：１で混和し、中濃度塗布群の投与液を調製した（０．５ｍｇ／１０μＬ／ｈｅａｄ）。更に基剤と１：１で混和し、低容量塗布群の投与液を調製した（０．２５ｍｇ／１０μＬ／ｈｅａｄ）。
ｂ）静脈注射用液剤の作製
本発明化合物（ＴＴＫ−０４３）を２０μｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解し、高濃度静脈内投与群の投与液を調製した（１００μｇ／５ｍＬ／ｋｇ）。２０μｇ／ｍＬ溶液を生理食塩水と１：１で混和し、中濃度静脈内投与群の投与液を調製した（５０μｇ／５ｍＬ／ｋｇ）。さらに生理食塩水と１：１で混和し、低容量静脈内投与群の投与液を調製した（２５μｇ／１０μＬ／ｈｅａｄ）。
【００３８】
（３）試験方法
上記接触性皮膚炎モデルマウスに対して、０．２％ＤＮＦＢアセトン溶液（８０％アセトン、２０％オリーブ油）の耳への塗布２時間前及び２時間後に、上記外用剤と基剤をマウスの左耳に１０μＬ或いは１０ｍｇ塗布した。また、上記静注用液剤の場合には、０．２％ＤＮＦＢアセトン溶液の耳への塗布直前に当該液剤を尾静脈内に投与した。
（４）評価方法
０．２％ＤＮＦＢアセトン溶液の耳への塗布２４時間後に動物の左耳の耳介中央部の厚さをダイアル厚さゲージ（ｄｉａｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｇａｕｇｅ）を用いて測定した。
【００３９】
（５）評価結果
本発明化合物（ＴＫＫ０４３）の塗布は抗原惹起２時間前及び２時間後に実施した。図１１に示されるように、本化合物の塗布群はこの遅延型浮腫に対して、抑制作用を示さなかった。一方、ＴＴＫ−０４３の静脈内投与群（２５、５０及び１００μｇ／ｋｇ）はＤＮＦＢ誘発による耳浮腫を抑制した。その抑制率は、それぞれ４２、３８及び３１％でＶｅｈｉｃｌｅ群に比べ有意な抑制を示した。なお、陽性対照薬のタクロリムス塗布群（アステラス製薬０．１％タクロリムス水和物軟膏を使用）は、Ｖｅｈｉｃｌｅ群に比べ７７％の有意抑制を示した。
以上のように、ＴＴＫ−０４３の経皮投与はIV型アレルギー反応である、ＤＮＦＢ誘発接触性皮膚炎に対して、抑制作用を示さなかった。しかし、ＴＴＫ−０４３の静脈内投与はDNFB誘発接触性皮膚炎に対して抑制作用を示し、ＴＴＫ０４３はIV型アレルギー反応を抑制することが判明した。ＴＴＫ０４３はIV型アレルギー反応が進行する過程、即ち、感作リンパ球が耳に塗布されたＤＮＦＢとの反応を抑制することが示された。しかし、経皮投与では抑制を示さなかったのはＴＴＫ０４３の塗布では皮膚からＴＴＫ０４３が血中の移行しないことにより、抑制作用を示さなかったと考えられた。即ち、ＴＲＫ０４３は、IV型アレルギー反応の抑制作用を有することが明らかとなった。
【００４０】
（試験例４）本発明化合物（ＴＴＫ−０４３）の腫瘍増殖抑制効果
（１）材料
評価細胞として、Ｍｅｔｈ−Ａ  ｃｅｌｌ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ，ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ由来，東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター）を購入した。
マウスとして、ＢＡＬＢ／ｃマウス（日本チャールスリバー，ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ，雌性，６週齢）を使用した。
ＴＴＫ−０４３を細胞培養用液体培地のＨＢＳＳ（和光純薬）で２０ｍｇ／ｍＬに調整した。
（２）試験方法
Ｍｅｔｈ−Ａｃｅｌｌを用いたマウスへの腫瘍移植の抑制効果を検討するために、−８０℃で凍結保存していたＭｅｔｈ−Ａｃｅｌｌを起眠して継代培養した。その後、セルカルチャーフラスコで大量培養し、得られた細胞を回収して遠心（１６００ｒｐｍ，５分）後に上清を捨て、ＨＢＳＳに懸濁した。この懸濁細胞液を更に遠心（１６００ｒｐｍ，５分）して上清を捨て、新たにＨＢＳＳを加えて洗浄を行った。再度同様の洗浄操作を行った後、Ｍｅｔｈ−ＡｃｅｌｌをＨＢＳＳに懸濁、細胞液の一部をトリパンブルーにより染色（１／１００希釈）して生細胞数を計測、最終的にＨＢＳＳで細胞数を１６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した。この細胞を腫瘍増殖抑制試験に用いた。
細胞数を調整したＭｅｔｈ−ＡｃｅｌｌとＨＢＳＳまたはＴＴＫ−０４３（２０ｍｇ／ｍＬ）を１：１の比で混和し、このＭｅｔｈ−Ａｃｅｌｌ／製剤混合液をＢＡＬＢ／ｃマウスの右脇腹皮内に接種した（ｎ＝１０、０．１ｍＬ／マウス、皮下注射：ｉ．ｄ．）。Ｍｅｔｈ−Ａｃｅｌｌの接種後、マーカーを用いてマウスにラベリングを行い、定期的にノギスを用いて各マウスの腫瘍径の測定を行った（０，１，２，３週間目）。また、Ｍｅｔｈ−Ａｃｅｌｌ移植３週間後に、ソムノペンチル過麻酔によりＢＡＬＢ／ｃマウスをサクリファイスし、剖検により腫瘍を摘出して腫瘍重量を測定した。
【００４１】
（３）評価結果
図１２に示されるように、ＴＴＫ−０４３投与群においては、Ｍｅｔｈ−Ａ細胞移植の１週間後の腫瘍径はほとんど観察できておらず、コントロール群（ＨＢＳＳ投与）と比較すると、ＴＴＫ−０４３による腫瘍の増殖抑制効果が明瞭に示されている。
また、腫瘍の増加重量で評価すると、図１３に示されるように、Ｍｅｔｈ−Ａ細胞移植の３週間後の腫瘍重量は、コントロール群（ＨＢＳＳ投与）の平均腫瘍重量が１３５８ｍｇであるのに対し、ＴＴＫ−０４３投与群の腫瘍重量は１９６ｍｇであった。この結果は、ＴＴＫ−０４３の投与により、腫瘍重量の増加が約１／７に抑制されたことを示している。
以上のように、ＴＴＫ−０４３は、Ｍｅｔｈ−Ａ腫瘍に対して腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明化合物は、ＴＬＲ２の作動促進薬（アゴニスト）である。特にセリン残基の水酸基に糖が付加した本発明化合物は、ＴＬＲ２作動活性を顕著に向上させることができる。即ち、本発明化合物を用いて効果的に免疫を賦活化させることができることから、本発明化合物を癌や感染症、皮膚アレルギーの予防又は治療剤として提供できるようになった。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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