(57)【要約】【課題】グリセロール骨格の２位に高度不飽和脂肪酸が結合したリン脂質を効率よく製造する方法の提供。【解決手段】水と相分離する溶媒中で、ランダム型リパーゼの存在下にリン脂質と高度不飽和脂肪酸とを反応させることを含む、高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水と相分離する溶媒中で、ランダム型リパーゼの存在下にリン脂質と高度不飽和脂肪酸とを反応させることを含む、高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質の製造方法。
【請求項２】
上記高度不飽和脂肪酸が、遊離脂肪酸、アルキルエステルもしくはグリセリドの形態であるか、またはそれらの混合物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記高度不飽和脂肪酸が、炭素数１６以上の高度不飽和脂肪酸を遊離脂肪酸換算で５０質量％以上含む組成物である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記リン脂質が脱水処理されたリン脂質である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記反応におけるアシル基比が１〜１５である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記反応の反応時間が１〜１００時間である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記水と相分離する溶媒がヘキサンまたはジエチルエーテルである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ランダム型リパーゼがキャンディダ属に属する菌類由来のランダム型リパーゼである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記キャンディダ属に属する菌類がキャンディダ・ルゴサまたはキャンディダ・シリンドラセである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記反応で得られた生成物が、グリセロール骨格の２位に結合した構成脂肪酸の５０％が高度不飽和脂肪酸であるリン脂質である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
グリセロール骨格の２位に結合した構成脂肪酸の５０％が高度不飽和脂肪酸であるリン脂質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
α−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）などの高度不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ：ＰＵＦＡ）は様々な生理活性を有することが知られており、例えば、ＤＨＡは、抗肥満作用や抗腫瘍作用を有することが知られている。
【０００３】
しかし、ＰＵＦＡは二重結合を有していて非常に酸化されやすく、有害な過酸化脂質を生成したり、また酸化によって生理活性の消失や、異味異臭、変色を起こすなどの問題を生じていた。ＰＵＦＡの酸化防止のため、α−トコフェロールやアスコルビン酸等の抗酸化剤が用いられているがその効果は限定的であった。
【０００４】
リン脂質は、グリセロリン酸骨格において、グリセロール骨格の１位と２位に脂溶性の脂肪酸がエステル結合し、３位にはリン酸を介して塩基が結合している両親媒性の分子である。リン脂質は、生体内では細胞膜の構成脂質として大量に含まれているほか、乳化剤として医薬品や食品、化粧品に配合されて使用されている。また、リン脂質は、脳機能改善、コレステロール低下、脂質代謝機能改善などの様々な生理活性を有することも明らかになっている。
【０００５】
上記のようなＰＵＦＡとリン脂質の生理活性を併せ持つ分子として、ＰＵＦＡを構成脂肪酸とするリン脂質（ＰＵＦＡ−リン脂質）が提案されている。ＰＵＦＡ−リン脂質は、トリグリセリド型や脂肪酸型のＰＵＦＡに比べ、安定性が高く、生体への吸収性が良いことが明らかになっている。さらに、リン脂質のグリセロール骨格の２位にＰＵＦＡが結合したもの（２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質）は、酸化安定性が高く、ＰＵＦＡの生理活性の発現に重要であることが知られている（特許文献１〜２）。
【０００６】
ＰＵＦＡ−リン脂質の製造方法としては、リン脂質と脂肪酸または脂肪酸エステルにリパーゼなどの酵素を作用させて改質する方法（特許文献３）が知られている。しかしながら、リパーゼを用いた従来の方法では、グリセロール骨格の１位に選択的にＰＵＦＡが結合するため、２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質を効率よく製造することができない。２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質の製造方法としては、カラム精製した１−アルケニル−２−リゾリン脂質を触媒下でＰＵＦＡと反応させる方法（特許文献１）、リゾリン脂質にホスホリパーゼＡ２を用いて、２位選択的にＰＵＦＡを導入する方法（特許文献２）などが知られている。しかし、特許文献１や２の方法は原料としてリゾリン脂質を用意する必要があり、また、特許文献２の方法は高価なホスホリパーゼＡ２を用いるため、コストが非常に高いという問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−３１９０号公報
【特許文献２】特許第４９７８７５１号公報
【特許文献３】特開平４−１４８６９１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、リン脂質のグリセロール骨格の２位に特定のＰＵＦＡが結合した２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質を効率よく生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
多くのリパーゼは、膵臓リパーゼに代表されるように、グリセロール骨格の１位と３位のアシル基の結合を、２位に比べて優位に触媒するという特異性があり、一方ホスホリパーゼＡ２は、グリセロール骨格の２位のアシル基の結合を特異的に触媒する。一方、リパーゼの中には、基質に対する位置特異性がなく、グリセロール骨格のどの位置のアシル基も同じように触媒するランダム型のリパーゼが存在する。従来、２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質を得る方法としては、２位に特異性を有するホスホリパーゼＡ２を用いて、リン脂質の２位アシル残基とＰＵＦＡを直接エステル交換する方法が主に提案されてきた。しかし、ホスホリパーゼＡ２では期待するほどの２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質が得られないことや、取扱いに難点があることが報告されている。
【００１０】
そこで本発明者らは鋭意研究を行った結果、水と相分離する溶媒中で、ランダム型のリパーゼの存在下、リン脂質とＰＵＦＡとのエステル交換反応を行うと、意外なことに、リン脂質のグリセロール骨格の２位に高効率にＰＵＦＡが導入され、簡便に高い収量で２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質が得られることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、水と相分離する溶媒中で、ランダム型リパーゼの存在下にリン脂質と高度不飽和脂肪酸とを反応させることを含む、高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、生理活性が高い２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質を効率よく生産することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
リン脂質は、一般的に、グリセロール骨格を有するグリセロリン脂質と、スフィンゴシンを骨格とするスフィンゴリン脂質とに大別される。本明細書において、単に「リン脂質」という場合は、グリセロリン脂質を指す。グリセロリン脂質は、グリセロール骨格の１位と２位に脂溶性の脂肪酸がエステル結合し、３位にはリン酸を介して塩基が結合している両親媒性の分子である。
【００１４】
本明細書において、「高度不飽和脂肪酸」（ＰＵＦＡ）とは、炭素数が１６以上、より好ましくは１８以上、さらに好ましくは２０以上であり、かつ不飽和結合数が３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上である長鎖脂肪酸をいう。ＰＵＦＡの例としては、アラキドン酸（ＡＡ，２０：４）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：５）、ドコサペンタエン酸（ＤＨＡ、２２：５）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、２２：６）などが挙げられる。
【００１５】
本明細書において、「高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質（またはＰＵＦＡ−リン脂質）」とは、リン脂質のグリセロール骨格に高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が結合したリン脂質をいう。また本明細書において「２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質」とは、ＰＵＦＡがグリセロール骨格の２位に結合しているＰＵＦＡ−リン脂質をいう。
【００１６】
本発明の高度不飽和脂肪酸結合型リン脂質の製造方法では、ランダム型リパーゼの触媒作用の下でリン脂質とＰＵＦＡとをエステル交換反応させ、２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質を優位に製造する。
【００１７】
本発明の方法において、ＰＵＦＡ−リン脂質の原料となるリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、レシチンなどの公知のリン脂質を用いることができる。本発明の方法において、これらのリン脂質は、いずれか単独で、または複数を混合して用いることができる。さらに、原料入手の容易性の観点から、本発明の方法で使用されるリン脂質は、精製されたリン脂質の形態で供給されてもよいが、リン脂質とともにトリグリセリドや脂肪酸などの他の成分を含む組成物の形態で供給されてもよい。したがって、本発明の方法で使用されるリン脂質供給源としては、合成されたリン脂質や、天然物等から抽出されたリン脂質がいずれも利用でき、または市販品のリン脂質を用いてもよい。好適には、大豆由来のリン脂質、菜種由来のリン脂質などが挙げられる。また好ましくは、本発明の方法で使用されるリン脂質供給源は、リン脂質を６０質量％以上、さらに好ましくは７０質量％以上含む組成物である。
【００１８】
リン脂質は吸湿しやすい性質を有している。そのため、本発明の方法で使用されるリン脂質中に微量の水分が含まれて、それがＰＵＦＡとのエステル交換反応に影響することがある。したがって、本発明の方法で使用されるリン脂質は、予め脱水されていることが好ましい。リン脂質の脱水の方法としては、アセトン、ジエチルエーテル等の脱水用溶媒を用いる方法、加熱して脱水する方法、有機溶媒とともにモレキュラーシーブス、ゼオライト等を用いる方法等の公知の方法を採用できる。これらの中では、アセトンを用いて脱水する方法が好ましい。
【００１９】
本発明の方法において、ＰＵＦＡ−リン脂質の原料となるＰＵＦＡとしては、特に限定されないが、生体に対する生理活性を有するＰＵＦＡが好ましい。本発明の方法で使用されるＰＵＦＡの好ましい例としては、ＥＰＡ（２０：５）およびＤＨＡ（２２：６）が挙げられる。本発明の方法において、上記に挙げたＰＵＦＡは、いずれか単独でまたは複数を混合して用いることができる。
【００２０】
本発明の方法において、上記ＰＵＦＡは、遊離脂肪酸の形態で用いることもできるが、低級アルコールとのアルキルエステル形態で用いてもよく、グリセリンと結合したグリセリド（モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリドいずれも含む）の形態で用いてもよく、あるいはそれらの混合物であってもよい。ＰＵＦＡのアルキルエステル化のための低級アルコールとしては、炭素数１〜６の直鎖状または分岐鎖状のアルコールが挙げられ、好ましくはエタノールであり、また好ましいアルキルエステル形態としては、メチルエステルおよびエチルエステルが挙げられる。さらに、原料入手の容易性の観点から、本発明での方法で使用されるＰＵＦＡの供給源は、動物または植物由来のトリグリセリドや脂肪酸の混合物のように、目的とするＰＵＦＡとともに、それ以外の脂肪酸や、それらを構成脂肪酸とするトリグリセリドなどが混合された組成物（例えば、植物油、魚油、または市販のＰＵＦＡ高含有油脂）であってもよい。
【００２１】
あるいは、本発明の方法で使用されるＰＵＦＡ供給源は、遊離脂肪酸、脂肪酸アルキルエステル、または脂肪酸グリセリドを含む油脂組成物であり得る。好ましくは、該油脂組成物は、上述したＰＵＦＡを、遊離脂肪酸換算で５０質量％以上、より好ましくは６０質量％以上含む。さらに好ましくは、該油脂組成物は、遊離脂肪酸換算で、ＥＰＡおよびＤＨＡを合計で５０質量％以上、なお好ましくは６０質量％以上含む。当該油脂組成物中において、ＰＵＦＡは、好ましくはアルキルエステル形態、さらに好ましくはエチルエステル形態で存在している。
【００２２】
本発明の方法で用いる酵素は、リン脂質に対して位置特異性のないエステル交換が可能なランダム型リパーゼである。本発明の方法で用いることができるランダム型リパーゼの例としては、キャンディダ・ルゴサ（Candida rugosa）またはキャンディダ・シリンドラセ（Candida cylindracea）等のキャンディダ属に属する菌類由来のランダム型リパーゼ、ゲオトリカム・キャンディダム（Geotrichum candidum）等のゲオトリカム属に属する菌類由来のランダム型リパーゼなどを例示できる。ランダム型リパーゼは市販されており、例えば、キャンディダ・ルゴサ（またはキャンディダ・シリンドラセ）由来の「リパーゼＯＦ」（名糖産業（株）製、）、ならびにキャンディダ・ルゴサ（またはキャンディダ・シリンドラセ）由来の「リパーゼＡＹ」（天野製薬（株）製）などを利用できる。
【００２３】
本発明の方法において、上記のリン脂質とＰＵＦＡと酵素を用いたエステル交換反応は、水と相分離する溶媒中で行う。水と相分離する溶媒とは、水と混合しても自発的に２層に分離する溶媒をいう。そのような溶媒としては、ペンタン、ヘキサン等の炭化水素、ジエチルエーテル、エチルメチルエーテル等のエーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等が挙げられ、好ましくは、ヘキサンおよびジエチルエーテルが挙げられる。
【００２４】
本発明の方法において、上記エステル交換反応のための反応液には、水は添加されていない。あるいは水が混入している場合でも、通常は、上記の水と相分離する溶媒の存在により、混入した水は反応液中から分離されるため、酵素反応へ悪影響を及ぼすことはほとんどない。しかし、反応液中に混在する微量の水分が酵素反応に影響することがある。例えば、高温多湿の雰囲気条件で反応を行う場合は相分離しないほど極微量の水分が溶媒中に混在し、それが酵素反応に影響することがある。したがって好ましくは、上記水と相分離する溶媒は、予めモレキュラーシーブや活性炭などを用いて水分を除去されているとよい。
【００２５】
本明細書において、エステル交換反応の反応液中における、リン脂質に含まれるアシル基数に対するＰＵＦＡに含まれるアシル基（または脂肪酸）数の比を、「アシル基比」という。グリセロール骨格の１位と２位にアシル基が結合したリン脂質１分子のアシル基数は２であり、ＰＵＦＡが遊離脂肪酸形態の場合、脂肪酸数は１、ＰＵＦＡがトリグリセリド形態の場合、アシル基数は３である。すなわち、原料リン脂質とＰＵＦＡを共に１分子ずつ反応させた場合において、ＰＵＦＡが遊離脂肪酸形態またはエステル形態の場合は、アシル基比＝１／２であり、ＰＵＦＡがトリグリセリド形態の場合は、アシル基比＝３／２である。
【００２６】
本発明の方法において、上記エステル交換反応における好ましいアシル基比は、原料のリン脂質の種類、ＰＵＦＡの種類、形態（遊離脂肪酸、エステル、トリグリセリド）によっても異なるが、１〜１５程度、好ましくは３〜１０程度である。
【００２７】
本発明の方法において、上記エステル交換反応における反応条件としては、用いる原料、溶媒、リパーゼの種類などによって好ましい条件を適宜設定することができるが、リパーゼの至適ｐＨおよび至適温度を考慮して設定することが好ましい。しかしながら、上述したとおり、水の存在は酵素反応に影響を及ぼすため、水分の添加を要するｐＨ調整は行わなくてもよい。
【００２８】
例えば、本発明の反応は、原料のリン脂質とＰＵＦＡ、あるいは上述したそれらの供給源をフラスコや反応槽等に入れ、そこに水と相分離する溶媒を投入して原料を溶解させる。その後、ランダム型リパーゼを投入して、反応液の温度およびｐＨを適宜調整し、１〜１００時間、好ましくは３〜４８時間反応させる。反応終了後はメタノール等の酵素失活剤を加えてリパーゼを失活させた後、ろ別し、次いで溶媒を除去することにより反応物を得る。得られた反応物から、さらに各種溶媒による分液手段、蒸留手段、クロマトグラム手段等を用いてリン脂質画分を精製してもよい。
【００２９】
本発明の製造方法で得られた生成物は、ＰＵＦＡ−リン脂質を豊富に含み、特に、有用な２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質を多く含む。具体的には、本発明の製造方法で得られる生成物は、グリセロール骨格の２位に結合した構成脂肪酸の５０％（脂肪酸組成比％、本段落において以下同じ）以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上がＰＵＦＡであるリン脂質である。また好ましくは、本発明の製造方法で得られる生成物は、グリセロール骨格の２位に結合した構成脂肪酸の４０％以上、好ましくは５０％以上がＥＰＡまたはＤＨＡあるリン脂質である。本発明により製造されたＰＵＦＡ−リン脂質は、医薬品の薬理成分として利用することもでき、または各種生理活性のための有効成分として、各種の健康食品や飼料等に配合することもできる。
【実施例】
【００３０】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
（参考例１：脂肪酸組成分析）
原料のリン脂質、ＰＵＦＡ、および製造したリン脂質の脂肪酸組成は、構成脂肪酸を予めメチルエステル化した後、ガスクロマトグラフィーにかけて定量分析した。
メチルエステル化では、各測定試料を２０倍量の０．５Ｍ水酸化カリウム−メタノール溶液に懸濁し、１００℃、５分間加熱した。ここに塩酸：メタノール＝４：１（ｖ／ｖ）を０．５Ｍ水酸化カリウム−メタノール溶液の約半量加え、１００℃で１５分間加熱した。加熱後、イオン交換水とヘキサンをそれぞれ測定試料の４０倍量加え、撹拌後、２層に分離するまで静置した。水層を除去し、さらに数回油層をイオン交換水で洗浄し、最後に無水硫酸ナトリウムで油層を脱水した。
油層に含まれる各種脂肪酸のメチルエステルを、下記条件でガスクロマトグラフィーに供し、脂肪酸組成を分析した。
（ガスクロマトグラフィー条件）
カラム：ＨＲ-ＳＳ-１０結合型キャピラリ―カラム
カラム温度（ＤＨＡの場合）：１２５℃→１７０℃→１８６℃→２００℃
キャリアーガス：ヘリウム
注入口温度：２５０℃
検出器：水素炎イオン検出器（ＦＩＤ）
【００３２】
（参考例２：位置特異的脂肪酸組成分析）
生成したリン脂質の２位に結合する脂肪酸を同定した。ホスホリパーゼＡ２を用いて、生成したリン脂質の２位の脂肪酸を選択的に加水分解し、次いで得られた脂肪酸を参考例１記載の手順でガスクロマトグラフィーに供することで、リン脂質の２位に結合する脂肪酸を同定した。さらに、加水分解後の残りのリゾリン脂質の１位の脂肪酸の組成を、参考例１記載の脂肪酸組成分析の手順に従って分析した。なお、ホスホリパーゼＡ２の加水分解の効率に起因して、脂肪酸組成分析の手法で得られる分析値と、ホスホリパーゼＡ２による加水分解後の分析値に若干の変動があった。
【００３３】
（実施例１）
原料リン脂質として大豆リン脂質（ベイシスＬＳ−６０：日清オイリオ製；アシル基の脂肪酸組成：エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）０％、ヘンイコサペンタエン酸（ＨＰＡ）０％、ドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）０％、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）０％，パルミチン酸２２．８％、ステアリン酸２．９％、オレイン酸１０．８％、リノール酸５７．３％、リノレン酸６．１％）を用いた。
原料ＰＵＦＡとして、ＤＨＡ高含有油（トリグリセリド形態、ＰＵＦＡ組成：ＥＰＡ純度１１．７％、ＤＨＡ純度３３．３％）、ＤＨＡエチルエステル（エステル形態、ＰＵＦＡ組成：ＥＰＡ純度１３．８％、ＨＰＡ純度７．６％、ＤＰＡ純度１０．１％、ＤＨＡ純度６８．５％）、または遊離ＤＨＡ（遊離脂肪酸形態、ＰＵＦＡ組成：ＥＰＡ純度１１．７％、ＨＰＡ純度８．１％、ＤＰＡ純度９．２％、ＤＨＡ純度７１．０％）を用いた。
リパーゼとしては、ランダム型リパーゼであるリパーゼＯＦ（名糖産業製；キャンディダ・シリンドラセ由来、３６００００Ｕ／ｇ、至適ｐＨ６〜７、至適温度４５〜５０℃）を用いた。
【００３４】
大豆リン脂質と、ＰＵＦＡとしてＤＨＡ高含有油、ＤＨＡエチルエステルまたはＤＨＡを用いて、エステル交換反応を行った。すなわち、フラスコ中に、大豆リン脂質２．０ミリモルと各形態のＰＵＦＡのいずれかをアシル基比３になる量で添加し、次にヘキサン１３ｍＬとリパーゼＯＦ  ２．２×１０5Ｕを加え、得られた溶液を恒温槽で３７℃に維持しながら、マグネチックスターラーを用いて５００ｒｐｍで攪拌しつつ６時間反応させた。反応終了後、反応液にクロロホルム：メタノール＝２：１（ｖ／ｖ）を１５ｍＬ加え、リパーゼをろ別した。減圧下で溶媒を除去し、原料と生成物の混合物を得た。これを薄層クロマトグラフィーで展開し、リン脂質画分を分取した。
【００３５】
（実施例２）
アシル基比を５にした以外は、実施例１と同様の手順で反応を行い、リン脂質画分を分取した。
【００３６】
（実施例３）
アシル基比を７にした以外は、実施例１と同様の手順で反応を行い、リン脂質画分を分取した。
【００３７】
（実施例４）
大豆リン脂質としてアセトンにより脱水処理したものを用いた以外は、実施例２と同様にして反応を行い、リン脂質画分を分取した。なお、大豆リン脂質の脱水処理は次のように行った：大豆リン脂質２０ｇを少量のヘキサンに分散し、２００ｍＬの冷アセトンを加えて０．５℃の氷浴で１時間静置した後、溶媒を除去し、真空乾燥機で２日間乾燥した。
【００３８】
（試験例１）
参考例１に記載の手順で、実施例１〜４で製造したリン脂質の脂肪酸組成分析を行い、ＤＨＡの組成比を算出した。算出した組成比を、リン脂質へのＤＨＡ導入率（ＰＵＦＡ（ＤＨＡ）−リン脂質生成率）とした。実施例１〜４のリン脂質におけるＤＨＡ導入率を表１に示す。反応時間６時間では、ＰＵＦＡ原料としてＤＨＡ高含有油とＤＨＡエチルエステルを用いた場合、アシル基比が増加するほどＤＨＡ導入率も増加することがわかった。逆に、ＰＵＦＡ原料としてＤＨＡを用いた場合、アシル基比が増加するほどＤＨＡ導入率は低下した。また、脱水処理をしたリン脂質を用いると、導入率が向上した。
【００３９】
【表１】
2016053156.tif 000002
【００４０】
（実施例５〜１３）
リン脂質として脱水処理大豆リン脂質を、ＰＵＦＡとしてＤＨＡエチルエステルを用い、アシル基比を６、７または８、反応時間を２４時間、４８時間または７２時間とした以外は、実施例１と同様にして反応を行い、リン脂質画分を分取した。
【００４１】
（試験例２）
参考例１に記載の手順で、実施例５〜１３で製造したリン脂質の脂肪酸組成分析を行い、ＥＰＡ、ＨＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡそれぞれのＰＵＦＡについて組成比を算出した。算出した組成比を、リン脂質への各ＰＵＦＡの導入率（各ＰＵＦＡ−リン脂質生成率）とした。結果を表２に示す。ＰＵＦＡとしてエチルエステルを用いた場合、反応時間の延長とともに、脂肪酸導入率が向上した。一方、アシル基比については、アシル基比６に比べて７では脂肪酸導入率が向上したが、アシル基比７と８では導入率に大きな差はなかった。したがって、ＰＵＦＡとしてエチルエステルを用い、アシル基比を５〜７、好ましくは６〜７とし、反応時間を２４時間以上、好ましくは４８時間以上とすることで、非常に効率よく多くのＰＵＦＡをリン脂質に導入できることがわかった。
【００４２】
【表２】
2016053156.tif 000003
【００４３】
（試験例３）
参考例２に記載の手順に従って、実施例１０で得られたリン脂質の２位に結合している脂肪酸と１位に結合している脂肪酸の組成を調べた。参考として、天然のＰＵＦＡ−リン脂質源として知られるオキアミ油リン脂質の脂肪酸組成を同様の手順で調べた。結果を表３に示す。実施例１０のリン脂質は、２位結合型ＰＵＦＡ−リン脂質を多く含み、かつ天然に存在するオキアミ油リン脂質に比べても２位選択的かつ高含有量でＰＵＦＡを有するものであった。この結果から、本発明の製造方法によれば、リン脂質の２位に対して極めて選択的に、ＰＵＦＡを導入することができることがわかった。
【００４４】
【表３】
2016053156.tif 000004
【００４５】
（比較例１）
実施例１と同様の手順で、ただし、リパーゼとしてランダム型リパーゼに代えて、リン脂質の２位の脂肪酸を選択的に加水分解するリパーゼであるホスホリパーゼＡ２（ナガセケムテックス（株）製；１１０８１０Ｕ／ｇ、至適ｐＨ９、至適温度５０℃）を用いて、エステル交換反応を行った。
大豆リン脂質には、実施例４記載の方法により調製したアセトンによる脱水処理を施した大豆リン脂質を用いた。原料ＰＵＦＡとしては、ＰＵＦＡ高含有油（トリグリセリド形態、ＰＵＦＡ組成：ＥＰＡ純度２２．９％、ＤＨＡ純度１４．１％）、ＰＵＦＡエチルエステル（エステル形態、ＰＵＦＡ組成：ＥＰＡ純度８．９％、ＨＰＡ純度７．４％、ＤＰＡ純度１１．３％、ＤＨＡ純度７２．４％）、または遊離ＰＵＦＡ（遊離脂肪酸形態、ＰＵＦＡ組成：ＥＰＡ純度１０．２％、ＨＰＡ純度７．６％、ＤＰＡ純度１１．７％、ＤＨＡ純度７０．４％）のいずれかをアシル基比６になる量で添加した。
エステル交換反応を６時間または２４時間行い、リン脂質画分を分取した。次いで、参考例１の方法に従い、製造したリン脂質の脂肪酸組成分析を行い、ＥＰＡ、ＨＰＡ、ＤＰＡ、ＤＨＡのそれぞれについて組成比を算出した。算出した組成比の合計を、リン脂質へのＰＵＦＡ導入率（ＰＵＦＡ−リン脂質生成率）とした。リン脂質中のＰＵＦＡの組成比とＰＵＦＡ導入率を表４に示す。リパーゼとしてホスホリパーゼＡ２を用いた場合は、ランダム型のリパーゼを使用した場合に比してリン脂質へのＰＵＦＡ導入率は低かった。またホスホリパーゼＡ２を用いた場合、反応時間を２４時間まで延長してもＰＵＦＡ導入率は向上しなかった。
【００４６】
【表４】
2016053156.tif 000005