(57)【要約】【課題】網膜色素上皮細胞の保護及び加齢黄斑変性症の予防又は治療。【解決手段】ビタミンＢ６の一つであるピリドキサミンを含有した医薬品を提供する。ピリドキサミンが網膜色素上皮細胞の保護をすることにより、加齢黄斑変性症の予防又は治療を可能とするものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリドキサミンを有効成分として含有する網膜色素上皮細胞保護薬。
【請求項２】
請求項１に記載の網膜色素上皮細胞保護薬を含有する加齢黄斑変性症の予防又は治療のための医薬組成物。
【請求項３】
ピリドキサミンがリポフスチンの形成阻害をすることにより、網膜色素上皮細胞を保護する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ピリドキサミンが網膜色素上皮細胞上のタンパク質におけるリポフスチンの形成阻害をする、請求項３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、網膜色素上皮細胞保護薬及び加齢黄斑変性症の予防又は治療するための医薬組成物の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】  特許文献１には、エステル化されていないルテインとゼアキサンチンとビタミンＣとビタミンＥと亜鉛と銅とを必須成分とする眼性血管新生症および黄斑変性の処置に有用な組成物が記載されている。さらに、ビタミンＢ６を追加的成分として加える記載がある。
特許文献２には、ピリドキサミンを有効成分とする糖尿病合併症治療薬が記載されている。
非特許文献１には、加齢に伴う眼疾患の予防に必要な栄養成分について抗酸化ビタミン、ミネラル、不飽和脂肪酸、カロテノイドなどが記載されている。
非特許文献２には、レチノイドサイクルに関連する網膜変性疾患について記載されている。
非特許文献３には、葉酸、ピリドキシン、及びシアノコバラミンの併用により加齢黄斑変性症の発症リスクが軽減されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特表２００８−５２０５７６号公報
【特許文献２】特表２００２−５２７４７１号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】大平明弘、加齢に伴う眼の疾病と予防のための栄養成分、食品と開発、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．３、ｐ．１０（２０１４）
【非特許文献２】前田忠郎他、網膜変性疾患とレチノイドサイクル、日本眼科學会雜誌、Ｖｏｌ．１１３、Ｎｏ．２、ｐ．８３−９４（２００９）
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｅｎ  ＷＧ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１６９（４）：３３５−４１（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】  加齢黄斑変性症は、加齢に伴い網膜中心部の黄斑に障害が生じることで視力低下を引き起こし、深刻な場合では視力の喪失をもたらす難治性疾患である。欧米では成人の失明原因の第１位であり、日本でも５０歳以上の約１％が罹患しており、高齢化社会の到来とともに患者数が急増している。
加齢黄斑変性症は、主として網膜色素上皮細胞、ブルッフ膜、脈絡膜毛細血管板の加齢変化に関係した黄斑変性の総称である。血管新生があり脈絡膜に由来する滲出型（ｅｘｕｄａｔｉｖｅ  ｔｙｐｅ）と血管新生なく網膜色素上皮細胞や脈絡膜毛細血管板の萎縮を呈する萎縮型（ｄｒｙ  ｔｙｐｅ）がある。【０００６】  加齢黄斑変性症の治療は、現在滲出型に対してのＶＥＧＦ阻害薬やレーザーによる治療法が選択できる。これらは、新生血管の増殖抑制による二次障害の進行抑制が主眼で、病態の根治療法ではないこと、薬剤に反応しない患者の存在など、これらの治療法にも課題がある。また、萎縮型に対しての有効な治療法は確立されておらず、以下の予防法が勧められる。【０００７】  加齢黄斑変性症の予防法は、（１）禁煙（２）サプリメント（３）食事によるものが日本眼科学会によって推奨されており、以下に詳細を列記する。
喫煙している人はしていない人に比べて加齢黄斑変性になる危険性が高いことが分かっており、喫煙している人には禁煙が勧められる。ビタミンＣ、ビタミンＥ、βカロチン、亜鉛などを含んだサプリメントを飲むと加齢黄斑変性の発症が少なくなることが分かっており、加齢黄斑変性の発症が少なくなるが、完全に抑えることはできない。加齢黄斑変性になっていない人にも勧められるが、一方の目に加齢黄斑変性が発症した人にはサプリメントの内服が強く勧められる。緑黄色野菜はサプリメントと同様に加齢黄斑変性の発症を抑えると考えられ、肉中心の食事より、魚中心の食事のほうがよい。【０００８】  網膜色素上皮細胞は、脈絡膜と視細胞の間にあって、外側血液網膜関門（ＢＲＢ）として網膜への物質移動制限作用を有し、レチノイドサイクルに関与しており視物質の再生、食作用を有し、さらに、光受容の役割を終えて更新される杆状体・錐状体細胞外節の貪食と消化作用（ファゴサイトーシス）を有する。
加齢黄斑変性症の一様態は、網膜色素上皮細胞での視細胞の分解生成物の輸送能の低下によってリポスフチンが網膜色素上皮内、網膜色素上皮下に蓄積しドルーゼンと呼ばれる点状病変が出現する（非特許文献１）。
また、網膜色素変性症は眼科疾患の一つで、中途失明の３大原因の一つで数千人に一人の頻度で起こるとされている。その一様態は視細胞に密着している網膜色素上皮細胞に特異的に働いている遺伝子の異常によって起こり、網膜色素上皮細胞にて行われるレチノイドサイクルに関わる分子異常が様々な網膜変性を引き起こす（非特許文献２）。
網膜色素上皮の異常や変性には、色素脱失、萎縮、消失などがある。
そして、本発明の課題は、上記疾患や病態や病変から網膜色素上皮細胞を保護することである。【０００９】
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明の一態様は、ビタミンＢ６化合物の１種であるピリドキサミンを用いて難治性疾患である加齢黄斑変性症の予防又は治療を可能とするものである。特に、食品由来で安全性の高いピリドキサミンを用いることで、より早い段階からの予防療法を可能とする。【００１１】  視細胞及び網膜色素上皮細胞内の視サイクルの中間物質であるａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎａｌ（ａｔＲａｌ）から形成されるリポフスチンは、加齢によるａｔＲａｌの代謝遅延に伴い、網膜色素上皮細胞に蓄積する。
我々は、ピリドキサミンが、ａｔＲａｌからリポフスチンが網膜色素上皮細胞におけるタンパク質で形成される反応を阻害することを確認した。さらに、ａｔＲａｌによるヒト網膜色素上皮細胞のタンパク質中におけるリポフスチンの形成及び細胞死誘導を確認出来る系を確立し、ピリドキサミンによるヒト網膜色素上皮細胞の細胞保護作用及びリポスフチンの形成阻害作用を確認している。【００１２】  本発明の一態様は、ピリドキサミンを有効成分として含有する、網膜色素上皮細胞保護薬である。ピリドキサミンは、塩、エステルなどの形態をとってもよい。剤形（錠剤、カプセル、溶液など）や投与方法（経口、静脈注射、硝子体内注射、点眼など）を限定するものではない。さらに、網膜色素上皮における色素脱失、萎縮、消失等の異常や変性の予防又は治療も、網膜色素上皮細胞の保護に含まれる。また、有効成分のピリドキサミンが食品由来で安全なビタミンであることから、予防的な投与に適しており、この場合の剤型を錠剤、カプセルなどとした経口投与が好ましい。積極的な治療のために高濃度のピリドキサミンの投与をする場合には、硝子体内注射も選択できる。【００１３】  また、ピリドキサミンは、ヒトでの反復投与試験によって２７００ｍｇ／ｄａｙでの安全性が確認されている。また、参考としてビタミンＢ６（ピリドキシン塩酸塩）でのサプリメントとしての投与量の許容上限値は米国ＦＮＢで１００ｍｇ／ｄａｙ、欧州ＥＦＳＡで２５ｍｇ／ｄａｙに設定され、食品からの摂取量は成人男性で２ｍｇ／ｄａｙと報告されている。本発明の様態としてのピリドキサミン投与量は、自由に設定できるが、食品からの摂取量から２ｍｇ／ｄａｙ以上、上限値から２５ｍｇ／ｄａｙ以上、１００ｍｇ／ｄａｙ以上などが設定でき、安全性試験の結果から２７００ｍｇ／ｄａｙ以下、更なる試験を行えば例えば５０００ｍｇ／ｄａｙ以下のような高用量設定も可能である。
ピリドキサミンを経口投与する場合の投与量は一例として２ｍｇ〜５ｇ／ｄａｙ、予防目的で長期間服用する場合は２５〜５００ｍｇ／ｄａｙ、１００〜３００ｍｇ／ｄａｙ、治療目的で投与する場合は１００ｍｇ〜２０００ｍｇ／ｄａｙ、３００〜１０００ｍｇ／ｄａｙが設定できる。
投与期間については、治療目的の場合１日〜１週間程度、予防目的の場合は、数ヶ月〜一生涯の服用が想定される。また、網膜色素上皮細胞での薬剤濃度を考慮し、投与方法、投与量、投与期間を設定できる。【００１４】  本発明の一様態は、ピリドキサミンを有効成分とした、加齢黄斑変性症の予防又は治療のための医薬組成物であり、網膜色素上皮細胞、ブルッフ膜、脈絡膜毛細血管板等での病変の予防又は治療を含むものである。脈絡膜には、毛細血管が平面上に広がる構造の脈絡膜毛細管板があり、ブルッフ膜を隔てて網膜色素上皮と接する構造を取り、網膜外層への酸素、栄養素の補給および代謝、老廃物の輸送の機能を担っている。そして、網膜色素上皮の異常や変性から上記機能が低下し、ブルッフ膜、脈絡膜毛細血管板、毛細血管等の異常や変性を惹起する。
本発明の一様態は、ピリドキサミンを有効成分とした、加齢黄斑変性症の予防のための医薬組成物を含み、特に他に有効な治療方法が無い萎縮型の加齢黄斑変性症の予防に有効である。【００１５】  本発明の一様態は、網膜色素上皮細胞保護薬を含有する医薬組成物であって、当該網膜色素上皮細胞保護薬が加齢黄斑変性症の予防又は治療に作用する、加齢黄斑変性症の予防又は治療のための医薬組成物である。【００１６】  本発明の一態様は、ピリドキサミンが網膜色素上皮細胞上のタンパク質におけるリポフスチンの形成阻害をすることでヒト網膜色素上皮細胞の細胞保護をする網膜色素上皮細胞保護薬である。
本発明の一態様は、ピリドキサミンが網膜色素上皮細胞上のタンパク質におけるリポフスチンの形成阻害をする加齢黄斑変性症の治療又は予防のための医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】参考例１における蛍光顕微鏡での観察写真である。
【図２】参考例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ａｔＲａｌの濃度依存性）の結果を示した図である。
【図３】参考例１におけるＡＲＰＥ−１９細胞の生存率を示したグラフである。
【図４】参考例１におけるＡＲＰＥ−１９細胞への細胞毒性を示したグラフである。
【図５】実施例１における蛍光顕微鏡での観察写真である。
【図６】実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ピリドキサミンの濃度依存性）の結果を示した図である。
【図７】実施例１におけるＡＲＰＥ−１９細胞の生存率を示したグラフである。
【図８】参考例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（ａｔＲａｌの濃度依存性）を示した図である。
【図９】参考例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果（経時変化）を示した図である。
【図１０】実施例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ピリドキサミンの濃度依存性）の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００１８】（参考例１）
ＡＲＰＥ−１９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２３０２：ヒト網膜色素上皮細胞）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ナカライテスク）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク）を含有させたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ−１２培地（ナカライテスク）で培養した。
μ−Ｓｌｉｄｅ  ８  ｗｅｌｌ（ｉｂｉｄｉ）中でセミコンフルエントまで培養したＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地でさらに２４時間培養した。培地交換後に無血清培地中にａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｒｅｔｉｎａｌ（ａｔＲａｌ：ナカライテスク）溶液（終濃度０〜５０μＭ）を加え、２４時間培養した。培地を除去後にＰＢＳで細胞を３回洗浄した後にＨＳオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察（Ｅｘ４９０ｎｍ，Ｅｍ５２５ｎｍ）を行った（図１）。
６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈにセミコンフルエントになるまで培養したＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地でさらに２４時間培養した。培地交換後に無血清培地中にａｔＲａｌ溶液（終濃度０〜１５０μＭ）を加え、２４時間培養した。デカンテーションで培地を捨て、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した後、細胞を回収し、ＢＣＡアッセイ（プロテインアッセイビシンコニン酸キット、ナカライテスク）によってタンパク質定量を行い、サンプル間のタンパク質量をそろえた後に、遮光下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いタンパク質を分離した。ゲルを超純水で洗浄後にＦＬＡ−７０００によって蛍光検出（Ｅｘ４９０ｎｍ，Ｅｍ５２５ｎｍ）（図２左側）、ＣＢＢ染色によってタンパク質の検出（図２右側）を行った。
ａｔＲａｌの濃度に依存したリポスフチンのタンパク質付加体の形成が確認できる。
９６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈにセミコンフルエントになるまで培養したＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地でさらに２４時間培養した。培地交換後に無血清培地中にａｔＲａｌ溶液（終濃度０〜１５０μＭ）を加え、２４時間培養した。生細胞数測定試薬Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライテスク）を培地に添加し、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した（図３  ｎ＝８、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
ａｔＲａｌが５０μＭ以上の濃度でヒト網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ−１９細胞生存率が有意に低下していることが確認できる。
９６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈにセミコンフルエントになるまで培養したＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地でさらに２４時間培養した。培地交換後に無血清培地中にａｔＲａｌ溶液（終濃度０〜１５０μＭ）を加え、２４時間培養した。培養上清を採取し、ＬＤＨ−細胞毒性テストワコー（和光純薬）と混合し、マイクロプレートリーダーを用い、５７０ｎｍの吸光度を測定した（図４  ｎ＝８、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
ａｔＲａｌが５０μＭ以上の濃度で細胞毒性が有意に増加していることが確認できる。
【実施例１】
【００１９】  μ−Ｓｌｉｄｅ  ８  ｗｅｌｌ（ｉｂｉｄｉ）中でセミコンフルエントまで培養したＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地でさらに２４時間培養した。培地交換後に無血清培地中にａｔＲａｌ（ナカライテスク）溶液（終濃度５０μＭ）とピリドキサミン（東京化成工業株式会社）終濃度０〜５００μＭ）を加え、２４時間培養した。培地を除去後にＰＢＳで細胞を３回洗浄した後にＨＳオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察（Ｅｘ４７３ｎｍ，Ｅｍ５８０ｎｍ）を行った（図５）。
６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈにセミコンフルエントになるまで培養したＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地でさらに２４時間培養した。培地交換後に無血清培地中にａｔＲａｌ溶液（終濃度５０μＭ）とピリドキサミン（終濃度０〜５００μＭ）を加え、２４時間培養した。デカンテーションで培地を捨て、ＰＢＳで細胞を２凹洗浄した後、細胞を回収し、ＢＣＡアッセイによってタンパク質定量を行い、サンプル間のタンパク質量をそろえた後に、遮光下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いタンパク質を分離した。ゲルを超純水で洗浄後にＦＬＡ−７０００によって蛍光検出（Ｅｘ４９０ｎｍ，Ｅｍ５２５ｎｍ）（図６左側）、ＣＢＢ染色によってタンパク質の検出（図６右側）を行った。
ピリドキサミンの濃度に依存した、ヒト網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ−１９におけるリポスフチンのタンパク質付加体の形成阻害が確認できる。
９６  ｗｅｌｌ  ｄｉｓｈにセミコンフルエントになるまで培養したＡＲＰＥ−１９細胞を無血清培地でさらに２４時間培養した。培地交換後に無血清培地中にａｔＲａｌ溶液（終濃度５０μＭ）とピリドキサミン（終濃度０〜５００μＭ）を加え、２４時間培養した。生細胞数測定試薬Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライテスク）を培地に添加し、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した（図７  ｎ＝８、Ｄｕｎｎｅｔｔ検定、＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）。
ピリドキサミン１００μＭ以上の濃度で、ＡＲＰＥ−１９細胞の生存率の回復に有意差がみられ、ピリドキサミンの網膜色素上皮細胞保護作用が確認できる。【００２０】（参考例２）
１．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とａｔＲａｌ（０〜１０ｍＭ）を１０％エタノール−ＰＢＳ中において３７℃、遮光下で３日間インキュベートした後、遮光下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ゲルを超純水で洗浄後にＦＬＡ−７０００（スキャナータイプ画像解析装置、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）によって蛍光検出（Ｅｘ４７３ｎｍ，Ｅｍ５８０ｎｍ）（図８上段）、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によってタンパク質の検出（図８下段）を行った。
１．０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡと５ｍＭ  ａｔＲａｌを１０％エタノール−ＰＢＳ中において３７℃、遮光下で０〜４日間インキュベートした後、遮光下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ゲルを超純水で洗浄後にＦＬＡ−７０００によって蛍光検出（Ｅｘ４７３ｎｍ，Ｅｍ５８０ｎｍ）（図９上段）、ＣＢＢ染色によってタンパク質の検出を行った（図９下段）。
【実施例２】
【００２１】  １．０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とａｔＲａｌ（終濃度１０ｍＭ）とピリドキサミン（終濃度０〜５ｍＭ）を１０％エタノール−ＰＢＳ中において３７℃、遮光下で３日間インキュベートした後、遮光下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。ゲルを超純水で洗浄後にＦＬＡ−７０００（スキャナータイプ画像解析装置、Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）によって蛍光検出（Ｅｘ４７３ｎｍ，Ｅｍ５８０ｎｍ）（図１０上段）、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によってタンパク質の検出（図１０下段）を行った。
ピリドキサミンの濃度に依存したリポスフチンのタンパク質付加体の減少が確認できる。【００２２】（参考例３）
リポスフチンのタンパク質付加体の蛍光性が、タンパク質のＬｙｓ残基とａｔＲａｌとのアミノカルボニル反応に由来するものであるかを確かめるために、ａｔＲａｌとＮα−Ｂｏｃ  Ｌｙｓを３７℃でインキュベートし、蛍光ＨＰＬＣによって分析したところ、反応時間３日間及び５日間でリテンションタイム３７．６分に蛍光性付加体の生成が確認された。この蛍光付加体を分取し、種々の解析を行った。紫外可視吸収スペクトル測定により４３６ｎｍに吸収極大を有し、蛍光スペクトル測定により５６７ｎｍに放出極大を有する。また、ＥＳＩ−ＬＣ／ＭＳ解析によってｍ／ｚ７７７．９に分子イオンピークをもつ物質であり、この分子量はＮα−Ｂｏｃ  Ｌｙｓのリジン残基のアミノ基に二分子のａｔＲａｌが結合したものと一致する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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