(57)【要約】【課題】きのこ栽培用の培地として用いるバイオマスが培地として適しているか否かを、簡単かつ精度良く評価できるきのこ栽培用培地の評価方法を提案すること。【解決手段】きのこ栽培用培地の評価方法は、きのこ栽培用の培地として用いるバイオマスについて、未使用の状態（未使用培地）、使用済みの状態（廃培地）、ソフト水熱処理によって再生された状態（再生培地）を分析し、それぞれの培地に固有の成分である特定マーカーを、培地評価用の指標として用いる。培養を経ずに、きのこ培地の品質を評価できる。【選択図】図３−５
2016034262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
きのこ栽培用培地として用いるバイオマスに含まれる成分のうち、水あるいはアセトニトリルに可溶な画分に含まれる特定マーカーを指標とすることを特徴とするきのこ栽培用培地の評価方法。
【請求項２】
前記特定マーカーは、次の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のうち、少なくともいずれか一つの成分である請求項１に記載のきのこ栽培用培地の評価方法。
（ａ）きのこ栽培用培地として使用する前の未接種培地の前記画分と、前記きのこ栽培用培地として使用した後の前記画分を比較した場合に、各培地に固有の成分
（ｂ）きのこ栽培用培地として使用した後の廃培地の前記画分と、前記廃培地にソフト水熱処理を施して再生した再生培地の前記画分を比較した場合に、各培地に固有の成分
（ｃ）きのこ栽培用培地として使用する前の未接種培地の前記画分と、前記きのこ栽培用培地として使用した後の廃培地にソフト水熱処理を施して再生した再生培地の前記画分を比較した場合に、各培地に固有の成分
【請求項３】
きのこ栽培用培地として使用する前の未接種培地の前記画分と、前記廃培地にソフト水熱処理を施して再生した再生培地の前記画分と、きのこ栽培用培地として使用した後の廃培地の前記画分とを比較した場合に、
前記特定マーカーは、次の（１）〜（５）のうち、少なくともいずれか一つである請求項１に記載のきのこ栽培用培地の評価方法。
（１）きのこ栽培で増加した物質であって、前記ソフト水熱処理で除去可能な物質
（２）きのこ栽培で消費された物質であって、前記ソフト水熱処理で再生可能な物質
（３）きのこ栽培で消費された物質であって、前記ソフト水熱処理で部分的に再生可能な物質
（４）きのこ栽培で消費された物質であって、前記ソフト水熱処理で変化しない物質
（５）きのこ栽培で増加した物質であって、前記ソフト水熱処理で増加する物質
【請求項４】
前記特定マーカーは、次の（ｉ）〜（iii）のうち、少なくともいずれか一つである請求項３に記載のきのこ栽培用培地の評価方法。
（ｉ）リグニン由来の芳香族モノマー
（ii）草本系植物由来の芳香族モノマー
（iii）コメヌカ、フスマ、ビート、豆皮等の脂肪酸を含み得る添加栄養素由来の脂肪酸
【請求項５】
前記特定マーカーは、前記画分を液体クロマトグラフィー質量分析を用いてネガティブモードで検出されるマススペクトルにおいて、表Ａに列記する値（ｍ／ｚ）を示す分子のうち、少なくともいずれか一つである請求項１に記載のきのこ栽培用培地の評価方法。
（表Ａ）
保持時間（分）  測定値（ｍ／ｚ）
２．７〜２．８  １５１．０
２．７          １６３．０
２．５          ２３７．１
２．６          ２３７．１
２．３          ３１９．１
３．９          ３２９．２
４．１          ５０３．３
１．９〜２．０  ２０３．１
３．２          ２５９．１
５．０          ３１３．２
５．３          ３１５．２
３．７          ３２７．２
２．７          １３５．０
【請求項６】
前記特定マーカーは、前記画分を液体クロマトグラフィー質量分析を用いてポジティブモードで検出されるマススペクトにおいて、表Ｂに列記する値（ｍ／ｚ）を示す分子のうち、少なくともいずれか一つである請求項１に記載のきのこ栽培用培地の評価方法。
（表Ｂ）
保持時間（分）  測定値（ｍ／ｚ）
２．１          ２３１．２
３．９          １７１．１
３．９          １９５．１
３．９          ２１３．１
３．９〜４．１  ２９５．２
【請求項７】
請求項１ないし６のうちのいずれか一つの項に記載の前記特定マーカーのうち、きのこ栽培で消費される物質を、きのこ栽培用の添加物として用いることを特徴とするきのこ栽培方法。
【請求項８】
きのこ栽培用培地として使用した後の廃培地にソフト水熱処理を施して再生した再生培地に、請求項１ないし６のうちのいずれか一つの項に記載の前記特定マーカーのうち、きのこ栽培で消費される物質であって、前記ソフト水熱処理で部分的にしか再生できない物質あるいは前記ソフト水熱処理で再生できない物質を、添加物として加えることを特徴とするきのこ栽培方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、きのこ栽培用の菌床培地（以下、単に「培地」と呼ぶ場合もある。）として用いるバイオマスが培地として適しているか否かを当該培地に含まれている特定マーカーを用いて評価するきのこ栽培用培地の評価方法に関する。また、本発明は特定マーカーを利用したきのこ栽培方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
きのこの人工栽培は、消費者の健康趣向に伴って、きのこの種類・生産量共に年々増加の傾向にあり、きのこの生産量拡大により使用済きのこ廃菌床培地は飽和状態となってきている。一方、きのこ経営においては、販売価格の低迷、燃料、資材の高騰により、厳しさが増している。
【０００３】
きのこの菌床培地は、その培地基材として、オガ粉、コーンコブミール（トウモロコシ芯の粉砕物）等が用いられ、これに、培地添加材として、コメヌカ、フスマ、マメ皮、コットンハル、ビート等が適宜加えられる。近年、このような菌床培地の資材コスト低減や環境負荷の低減、バイオマス有効利用を目的として、きのこ廃菌床培地（以下、単に「廃培地」と呼ぶ場合もある。）の有効活用への取組み（肥料化、燃料化、飼料、培地として再利用）が、きのこ生産業者のなかで試行されている。しかしながら、未だにあまり進んでいないのが現状である。
【０００４】
すなわち、廃菌床培地の使い廻しは収穫量の低下、品質の低下によりできないことが経験的に分かっているものの、きのこの菌床栽培のメカニズムについては、下記の３つ観点から研究されているもの、未だに解明されていなかった。
（１）菌床培地に添加した栄養素（コメヌカ、フスマ、マメ皮、コットンハル、ビートなど）のきのこ生育に伴う低下、劣化あるいは変質
（２）生物由来のきのこ生育阻害物質
（３）木質由来のきのこ生育阻害物質
【０００５】
きのこ廃菌床培地から有価物の一つとして、きのこ子実体形成促進するサポニン様物質を抽出した先行研究例（特許文献１：特開２００５−１１７９８１）がある。しかし、廃菌床に微量に含有される目的物質を抽出するために多大な費用や労力を要する上、廃菌床培地中のごく一部の微量成分を利用するに留まっており、廃菌床培地をバイオマスとして総活用するには至っていない。
【０００６】
本発明者の一人である宮本らは、１５０℃以下の非常にマイルドな水熱プロセス（以下、「ソフト水熱プロセス」と記す。）を用いてきのこ廃菌床培地の再生処理に成功し（特許文献２：特許第５５３４３０９号）、きのこ栽培におけるゼロエミッションに寄与するバイオマスプロセス技術を初めて確立した。すなわち、本発明者等は、特許文献２に記載のソフト水熱プロセスによってきのこの廃培地を再生し、得られた再生菌床培地（以下、単に「再生培地」と呼ぶ場合もある。）を用いて実証栽培を行った。この結果、実用規模で廃培地が再生培地として通常品質、収穫量で、きのこ栽培を行えることを確認した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００５−１１７９８１号公報
【特許文献２】特許第５５３４３０９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
菌床きのこ栽培のメカニズムは未だに判っていない。さらに廃きのこ培地の使いまわしができないことは経験的に分かっていてもそのメカニズムは判っていない。きのこ生産者は通常の新品の培地でも１０回に一回といわないが、１００回に数回は栽培に失敗し、数万瓶（１００円／１瓶）単位の損失を余儀なく強いられている。ましてや再生培地を再利用して使うことなど、これまで誰一人として実行してこなかった。また、膨大な廃培地のほかの用途への利活用も進んでいない。このような背景において、上記のようにソフト水熱プロセス実証機による実証栽培、すなわち実用規模で確かに廃培地が再生培地として通常品質、収穫量できのこ栽培できたことはまさしくエポックメーキングである。ここで、通常の新品の培地と同様に再生培地の利用に当っては、再生処理後の培地の評価を簡単に行うことができないという課題がある。すなわち、従来においては、通常の新品の培地と同様に再生処理後の培地を用いる場合には、６０日乃至９０日程度の培養を経ないと、その培地の良否が判定できない。このために、培地品質のばらつきによる生育不良に対する懸念が、廃培地の円滑な繰り返し再利用の障害となっている。
【０００９】
廃培地の利用効率を高めるためには、廃培地や再生培地のきのこ栽培への適合性を短時間で評価する方法が必須である。これまでに廃培地を再使用したきのこ栽培試験と使用培地中の全炭素、全窒素、ｐＨ、糖（グルコース、グルカンなど）の測定が行われた先行研究例がある。しかしながら、多様な含有成分と、きのこ収穫量との相関が明らかにされておらず、培地の評価方法としては不十分である。
【００１０】
本発明の課題は、このような点に鑑みて、きのこ栽培用培地として用いる培地（バイオマス）の適合性を、簡単かつ精度良く評価できるきのこ栽培用培地の評価方法を提案することにある。
【００１１】
また、本発明の課題は、きのこ栽培用培地の評価方法に用いる特定マーカーを用いたきのこの栽培方法を提案することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、きのこ栽培用の培地として用いるバイオマスについて、未使用の状態（未接種培地）、使用済みの状態（廃培地）、ソフト水熱処理によって再生された状態（再生培地：ソフト水熱処理培地）を分析した。この分析の過程において、本発明者は、ソフト水熱処理による培地再生メカニズムを解明した。そして、分析結果に基づき、それぞれの培地に固有の成分である特定マーカーを見出し、その分子量情報を得た。
【００１３】
さらに、栽培前、栽培後、ソフト水熱処理の前および後等のきのこ培地を分析したところ、培養を経ずに、見出した特定マーカーを指標として、きのこ培地の品質を評価できることを見出した。これに加えて、これらの特定マーカーを、きのこ栽培用の添加物として使用することにより、安定栽培を実現できることを見出した。
【００１４】
本発明のきのこ栽培用培地の評価方法は、上記の知見（特定マーカーの発見、および、その特性を利用した新たな用途である培地評価方法への適用可能性）に基づきなされたものであり、きのこ栽培用培地として用いるバイオマスに含まれる成分のうち、水あるいはアセトニトリルに可溶な画分に含まれる特定マーカーを、きのこ栽培用培地を評価するための指標として用いることを特徴としている。
【００１５】
使用可能な前記特定マーカーは、きのこ栽培用培地として使用する前の未接種培地の可溶性画分と、前記きのこ栽培用培地として使用した後の可溶性画分を比較した場合に、各培地に固有の成分である。
【００１６】
また、使用可能な前記特定マーカーは、きのこ栽培用培地として使用した後の廃培地の前記可溶性画分と、前記廃培地にソフト水熱処理を施して再生した再生培地の前記可溶性画分を比較した場合に、各培地に固有の成分である。
【００１７】
さらに、使用可能な前記特定マーカーは、きのこ栽培用培地として使用する前の未接種培地の前記可溶性画分と、前記きのこ栽培用培地として使用した後の廃培地にソフト水熱処理を施して再生した再生培地の前記可溶性画分を比較した場合に、各培地に固有の成分である。
【００１８】
具体的には、特定マーカーは、本発明者等によるソフト水熱処理による廃培地の再生メカニズムの発見に基づき、次のように決めることができる。すなわち、きのこ栽培用培地として使用する前の未接種培地の前記可溶性画分と、前記廃培地にソフト水熱処理を施して再生した再生培地の前記可溶性画分と、きのこ栽培用培地として使用した後の廃培地の前記可溶性画分とを比較した場合に、前記特定マーカーは、次の傾向（１）〜（５）のいずれか一つの傾向を示す一つあるいは複数の成分とすることができる。また、傾向（１）〜（５）のうちの一つの傾向を示す一つあるいは複数の成分と、傾向（１）〜（５）のうちの他の傾向一つを示す一つあるいは複数の成分との組み合わせからなる複数の成分を特定マーカーとして併用することができる。
（１）きのこ栽培で増加した物質であって、前記ソフト水熱処理で除去可能な物質
（２）きのこ栽培で消費された物質であって、前記ソフト水熱処理で再生可能な物質
（３）きのこ栽培で消費された物質であって、ソフト水熱処理で部分的に再生可能な物質（４）きのこ栽培で消費された物質であって、ソフト水熱処理で変化しない物質
（５）きのこ栽培で増加した物質であって、ソフト水熱処理で増加する物質
【００１９】
例えば、上記（２）の物質はリグニン由来の芳香族モノマーであり、上記（３）の物質は草本系植物由来の芳香族モノマーであり、上記（４）の物質はコメヌカ、フスマ、ビート、豆皮等の脂肪酸を含み得る添加栄養素由来の脂肪酸である。
【００２０】
より具体的には、前記特定マーカーとして、前記可溶性画分を液体クロマトグラフィー質量分析を用いてネガティブモードで検出されるマススペクトルにおいて、以下の表Ａに列記する値（ｍ／ｚ）を示す分子のうちの少なくとも１つを用いることができる。また、複数の特定マーカーを用いることで、より精度良く培地の評価を行うことが可能である。（表Ａ）
保持時間（分）  測定値（ｍ／ｚ）
２．７〜２．８  １５１．０
２．７          １６３．０
２．５          ２３７．１
２．６          ２３７．１
２．３          ３１９．１
３．９          ３２９．２
４．１          ５０３．３
１．９〜２．０  ２０３．１
３．２          ２５９．１
５．０          ３１３．２
５．３          ３１５．２
３．７          ３２７．２
２．７          １３５．０
【００２１】
この代わりに、前記特定マーカーとして、前記可溶性画分を液体クロマトグラフィー質
量分析を用いてポジティブモードで検出されるマススペクトにおいて、以下の表Ｂに列記する値（ｍ／ｚ）を示す分子のうちのすくなくとも１つを用いることができる。
（表Ｂ）
保持時間（分）  測定値（ｍ／ｚ）
２．１          ２３１．２
３．９          １７１．１
３．９          １９５．１
３．９          ２１３．１
３．９〜４．１  ２９５．２
【００２２】
次に、本発明のきのこ栽培方法は、上記のように見出された特定マーカーのうち、きのこ栽培で消費される成分を、きのこ栽培用培地の添加物として用いることを特徴としている。
【００２３】
例えば、ソフト水熱処理によって得られた再生培地の場合には、特定マーカーとして、きのこ栽培で消費され、ソフト水熱処理で部分的にしか再生されない物質（リグニン、および草本系植物由来の芳香族モノマー）を添加物として用いることができる。また、添加物として用いる特定マーカーとして、きのこ栽培で消費され、ソフト水熱処理で変化しない（再生されない）物質（コメヌカ、フスマ、ビート、豆皮等の脂肪酸を含み得る添加栄養素由来の脂肪酸）を添加物として用いることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、きのこ栽培用の培地（バイオマス）としての適合性を、培地から抽出される特定マーカーを指標として用いることで、事前に評価することができる。よって、きのこ栽培用培地を用いたきのこ栽培の収穫量、品質を担保でき、毎年、数十万トン排出される廃培地の繰り返し再利用が広く普及することが期待される。
【００２５】
また、本発明では、培地から抽出した特定マーカーのうち、きのこ栽培によって消費される物質であって、ソフト水熱処理によって部分的にしか再生できない物質あるいはソフト水熱処理によって再生できない物質を特定し、このような特定マーカーを、きのこの菌床培地栽培に必要な添加物として、きのこ栽培用培地に添加物している。これにより、きのこ栽培の品質、収量の安定化・向上を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】ＬＣ／ＭＳ（ネガティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図１−２】ＬＣ／ＭＳ（ネガティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図１−３】ＬＣ／ＭＳ（ネガティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図１−４】ＬＣ／ＭＳ（ネガティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図２−１】ＬＣ／ＭＳ（ネガティブモード）の測定結果の主成分分析結果を示すグラフである。
【図２−２】クラスター分析結果を示すグラフである。
【図３−１】ソフト水熱処理培地と廃培地を比較して得られるイオンピーク（特定マーカー）の抽出を示すグラフである。
【図３−２】ソフト水熱処理培地と廃培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図３−３】ソフト水熱処理培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図３−４】ソフト水熱処理により変化した成分を示すマスクロマトグラムである。
【図３−５】ピーク面積のグラフである。
【図３−６】ピーク面積のグラフである。
【図３−７】ピーク面積のグラフである。
【図３−８】ピーク面積のグラフである。
【図３−９】ピーク面積のグラフである。
【図３−１０】ピーク面積のグラフである。
【図３−１１】ピーク面積のグラフである。
【図３−１２】ピーク面積のグラフである。
【図３−１３】ピーク面積のグラフである。
【図４−１】未接種培地と廃培地を比較して得られるイオンピーク（特定マーカー）の抽出を示すグラフである。
【図４−２】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図４−３】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図４−４】ピーク面積のグラフである。
【図４−５】ピーク面積のグラフである。
【図４−６】ピーク面積のグラフである。
【図４−７】ピーク面積のグラフである。
【図４−８】ピーク面積のグラフである。
【図４−９】ピーク面積のグラフである。
【図４−１０】ピーク面積のグラフである。
【図４−１１】ピーク面積のグラフである。
【図４−１２】ピーク面積のグラフである。
【図４−１３】ピーク面積のグラフである。
【図４−１４】ピーク面積のグラフである。
【図４−１５】ピーク面積のグラフである。
【図５−１】ソフト水熱処理培地と未接種培地を比較して得られるイオンピーク（特定マーカー）の抽出を示すグラフである。
【図５−２】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図５−３】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図５−４】ピーク面積のグラフである。
【図５−５】ピーク面積のグラフである。
【図５−６】ピーク面積のグラフである。
【図５−７】ピーク面積のグラフである。
【図５−８】ピーク面積のグラフである。
【図５−９】ピーク面積のグラフである。
【図５−１０】ピーク面積のグラフである。
【図５−１１】ピーク面積のグラフである。
【図５−１２】ピーク面積のグラフである。
【図５−１３】ピーク面積のグラフである。
【図５−１４】ピーク面積のグラフである。
【図５−１５】ピーク面積のグラフである。
【図６−１】ＬＣ／ＭＳ（ポジティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図６−２】ＬＣ／ＭＳ（ポジティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図６−３】ＬＣ／ＭＳ（ポジティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図６−４】ＬＣ／ＭＳ（ポジティブモード）の測定結果を示すクロマトグラムである。
【図７−１】ＬＣ／ＭＳ（ポジティブモード）の測定結果の主成分分析結果を示すグラフである。
【図７−２】クラスター分析結果を示すグラフである。
【図８−１】ソフト水熱処理培地と廃培地を比較して得られるイオンピーク（特定マーカー）の抽出を示すグラフである。
【図８−２】ソフト水熱処理培地と廃培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図８−３】ソフト水熱処理培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図８−４】ピーク面積のグラフである。
【図８−５】ピーク面積のグラフである。
【図８−６】ピーク面積のグラフである。
【図８−７】ピーク面積のグラフである。
【図８−８】ピーク面積のグラフである。
【図８−９】ピーク面積のグラフである。
【図８−１０】ピーク面積のグラフである。
【図８−１１】ピーク面積のグラフである。
【図９−１】未接種培地と廃培地を比較して得られるイオンピーク（特定マーカー）の抽出を示すグラフである。
【図９−２】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図９−３】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図９−４】ピーク面積のグラフである。
【図９−５】ピーク面積のグラフである。
【図９−６】ピーク面積のグラフである。
【図９−７】ピーク面積のグラフである。
【図９−８】ピーク面積のグラフである。
【図９−９】ピーク面積のグラフである。
【図９−１０】ピーク面積のグラフである。
【図９−１１】ピーク面積のグラフである。
【図９−１２】ピーク面積のグラフである。
【図９−１３】ピーク面積のグラフである。
【図１０−１】ソフト水熱処理培地と未接種培地を比較して得られるイオンピーク（特定マーカー）の抽出を示すグラフである。
【図１０−２】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図１０−３】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１０−４】ピーク面積のグラフである。
【図１０−５】ピーク面積のグラフである。
【図１０−６】ピーク面積のグラフである。
【図１０−７】ピーク面積のグラフである。
【図１０−８】ピーク面積のグラフである。
【図１０−９】ピーク面積のグラフである。
【図１１−１】ソフト水熱処理培地と廃培地を比較して得られるイオンピーク（特定マーカー）の抽出結果を示すグラフである。
【図１１−２】ソフト水熱処理培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１１−３】ピーク面積のグラフである。
【図１１−４】ピーク面積のグラフである。
【図１１−５】ピーク面積のグラフである。
【図１１−６】ピーク面積のグラフである。
【図１２−１】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図１２−２】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１２−３】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１２−４】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１２−５】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１２−６】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１２−７】ピーク面積のグラフである。
【図１２−８】ピーク面積のグラフである。
【図１２−９】ピーク面積のグラフである。
【図１２−１０】ピーク面積のグラフである。
【図１２−１１】ピーク面積のグラフである。
【図１２−１２】ピーク面積のグラフである。
【図１２−１３】ピーク面積のグラフである。
【図１３−１】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図１３−２】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１３−３】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１３−４】ピーク面積のグラフである。
【図１３−５】ピーク面積のグラフである。
【図１３−６】ピーク面積のグラフである。
【図１４−１】ソフト水熱処理培地と廃培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図１４−２】ソフト水熱処理培地と廃培地の比較から得られる特定マーカーの構造検索結果を示す図表である。
【図１４−３】ピーク面積のグラフである。
【図１４−４】ピーク面積のグラフである。
【図１４−５】ピーク面積のグラフである。
【図１４−６】ピーク面積のグラフである。
【図１４−７】ピーク面積のグラフである。
【図１４−８】ピーク面積のグラフである。
【図１４−９】ピーク面積のグラフである。
【図１４−１０】ピーク面積のグラフである。
【図１５−１】未接種培地と廃培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図１５−２】ピーク面積のグラフである。
【図１５−３】ピーク面積のグラフである。
【図１５−４】ピーク面積のグラフである。
【図１５−５】ピーク面積のグラフである。
【図１５−６】ピーク面積のグラフである。
【図１５−７】ピーク面積のグラフである。
【図１６−１】未接種培地とソフト水熱処理培地の比較から得られる特定マーカー候補を列記した図表である。
【図１６−２】ピーク面積のグラフである。
【図１６−３】ピーク面積のグラフである。
【図１６−４】ピーク面積のグラフである。
【図１６−５】ピーク面積のグラフである。
【図１６−６】ピーク面積のグラフである。
【図１６−７】ピーク面積のグラフである。
【図１６−８】ピーク面積のグラフである。
【図１６−９】ピーク面積のグラフである。
【図１６−１０】ピーク面積のグラフである。
【図１６−１１】ピーク面積のグラフである。
【図１６−１２】ピーク面積のグラフである。
【図１６−１３】ピーク面積のグラフである。
【図１６−１４】ピーク面積のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下に、図面を参照して、本発明のきのこ栽培用培地の評価方法および、きのこ栽培方法を説明する。
【００２８】
［特定マーカーの解析の概要］
ブナシメジおよびエノキタケの培地として用いるバイオマス混合物であって、使用済みの廃培地、廃培地を条件の異なるソフト水熱プロセスによって再生させた再生培地、および、使用前の未使用培地のそれぞれの状態のサンプルから温水可溶性画分を抽出し、これを、液体クロマトグラフィー質量分析（以下、「ＬＣ／ＭＳ分析」と記す。）に供した。ＬＣ／ＭＳ分析では、ネガティブとポジティブの両モードで分析・検出を行った、
【００２９】
得られた網羅的質量分析データに対し、多変量解析によるデータの統計学的な評価を行なった。具体的には、１）ｓｃｏｒｅｐｌｏｔレベルでのＬＣ／ＭＳ分析データの主成分分析、２）グループ間平均連結法を計算アルゴリズムとして採用したクラスター解析による、同主成分分析結果のグルーピング、３）同一クラスターとしてグルーピングされた分析データのｌｏａｄｉｎｇｐｌｏｔレベルでの主成分分析、およびＳ-ｐｌｏｔによる同結果の可視化、４）相関性上位に位置する分析データ（相関確率（ｐｃｏｒｒ）；ｐ＞｜０．９７５｜）の抽出、から構成される。上記統計学的評価は、ＬＣ／ＭＳ多変量データ解析ソフトウエアであるＭａｒｋｅｒＬｙｎｘＸＳｖｅｒ．４．０．０．２（Ｗａｔｅｒｓ社製）および統計解析ソフトウエアであるＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｖｅｒ．１９（ＩＢＭ社製）を用いて行なった。同評価により各グループに特徴的なイオンピーク、すなわち、特定マーカー抽出、および、それらの組成式、構造式の推定を行った。
【００３０】
その結果、ソフト水熱プロセスの処理強度によって各サンプルの特定の成分が連続的に変化していく傾向が見出された。ネガティブとポジティブモードの各ＭＳ測定における複数の固有の特定マーカー候補が検出された。また、両モードに共通する分子量を持つ物質も含まれていた。さらに、ブナシメジおよびエノキタケに共通する分子量を持つ物質も確認された。これらの特定マーカーとして用いる分子の変化を指標にすることにより、きのこの増殖、ソフト水熱処理によって生じるバイオマスの変化を特徴づけることができた。
【００３１】
具体的には、以下に列記するトレンドを持つ特定マーカー候補を抽出することができた。
第１候補群：きのこ栽培で増加した物質（老廃物、代謝物等の可能性あり）であって、
ソフト水熱処理で除去可能な物質
第２候補群：きのこ栽培で消費された物質（栄養素等の可能性あり）であって、
ソフト水熱処理で再生可能な物質
第３候補群：きのこ栽培で消費された物質（栄養素等の可能性あり）であって、
ソフト水熱処理で部分的に再生可能な物質
第４候補群：きのこ栽培で消費された物質であって、ソフト水熱処理で変化しない物質
第５候補群：きのこ栽培で増加した物質（老廃物、代謝物等の可能性あり）であって、
ソフト水熱処理で変化しない、あるいは、更に増加する物質
【００３２】
［解析結果の概要と考察］
（Ｉ）菌床きのこ（シメジ、エノキタケ）の増殖のための栄養源として利用され、かつソフト水熱処理で再生可能な成分は、主に「芳香族モノマー（バニリンやシナピン酸に類縁の化合物）様化合物」であると推定された。本物質は、リグニンに由来する可能性が高い。
リグニン由来の芳香族モノマーはきのこ子実体形成のトリガーとして機能すること、バクテリア（雑菌）への抗菌作用を持つことが知られている。
菌床きのこの増殖の栄養として利用されず、かつソフト水熱処理により増加する成分にも同様の芳香族モノマーが含まれていると推定されるため、未使用培地と比較して、芳香族モノマーの組成は変化している。
（II）菌床きのこの増殖によって消費されるが、ソフト水熱処理で部分的に再生される物質は、「芳香環置換基の少ない芳香族モノマー（クマル酸や安息香酸などに類縁の化合物）」であると推定された。本物質は、栽培前後の量変化も大きいため、再生培地の使用に際し、添加補充することが好ましいと考えられる。上記を多く含む物質のうち、きのこ培地に使用されるものに「草本系植物（ムギやイネに由来するヌカ、ワラ、フスマ等）」が挙げられる。
（III）菌床きのこの増殖によって消費されるが、ソフト水熱処理では変化（再生）しない物質は、「脂肪酸様の化合物」であると推定された。本物質は、栽培前後の減少量も大きいため、再生培地の使用に際し、添加補充することが好ましいと考えられる。遊離脂肪酸を多く含む物質のうち、きのこ培地に使用されるものにコメヌカ、フスマ、ビート、豆皮等が挙げられる。
（IV）きのこ栽培で増加した物質（老廃物、代謝物等の可能性あり。）に関しては、多成分が少量ずつ混在している。
【００３３】
［特定マーカーの解析例１］
以下に、本発明者等が行った特定マーカー解析例１を述べる。
【００３４】
（解析用サンプル）
表１には、使用したブナシメジ培地の種類およびサンプル名を示す。この表１に示すように、測定用のサンプルとして、未使用のブナシメジ培地「未接種培地」と、使用済みのブナシメジ培地「廃培地」とを用意した。また、廃培地として、ソフト水熱処理を行わないもの（処理前）と、異なる処理強度でソフト水熱処理を施したもの（ソフト水熱処理培地）を用意した。具体的には、ソフト水熱処理の処理強度として、飽和水蒸気温度が１２０℃、１３０℃、１４０℃および１５０℃で、処理時間が３０分および６０分の場合のサンプルを調製した。
【００３５】
【表１】
2016034262.tif 000003
【００３６】
（サンプルからの温水抽出およびアセトニトリル可溶性画分の分画）
各サンプルを、９０℃で６時間乾燥後、ワンダーブレンダーＤ３Ｖ−１０（大阪ケミカル社製）で１分間粉砕し粉末を得た。本粉末４ｇに対し、１０倍容量の純水４０ｍＬを加えて懸濁した。本懸濁液を６０℃で３時間静置することにより抽出物を得た。これを８０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、遠心上清を固相抽出カートリッジカラム（Ｏａｓｉｓ  ＷＡＸ、Ｗａｔｅｒｓ社製）に供した。固相抽出カートリッジカラムを２％ギ酸水溶液で洗浄し、カラム担体に吸着した成分を、２８％アンモニア水とアセトニトリルを５：９５（Ｖ／Ｖ）で混合した溶媒を用いて溶離させた。固相抽出カートリッジカラムからの溶出液を回収し、窒素気流下で乾固した後、２０％のアセトニトリル水溶液に再度溶解した。本溶解液を「温水可溶性画分」とし、ＬＣ／ＭＳ分析に用いた。
【００３７】
（ＬＣ／ＭＳ分析）   
各サンプルから抽出した温水可溶性画分を、以下に述べる条件で、ＬＣ／ＭＳ分析に供した。
送液装置  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  Ｈ―ｃｌａｓｓ（Ｗａｔｅｒｓ社製）
移動層Ａ液：２ｍＭ酢酸アンモニウム、０．０５％Ｖ／Ｖ  ギ酸、Ｂ液：９５％Ｖ／Ｖ
アセトニトリル  分析カラム逆相モード：ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８
Ｃｏｌｕｍｎ、１３０オングストローム、１．７μｍ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、２．１ｍｍ Ｉ．ｄ．×１００ｍｍ  Ｌ．
送液：０−５分  ５％Ｖ／Ｖ−９５％Ｖ／Ｖ  Ｂ液、５−７分  ９５％Ｖ／Ｖ  Ｂ液、
カラム温度：４０℃
流速：０．４ｍｌ／ｍｉｎ
検出  飛行型精密質量分析装置（Ｘｅｖｏ  Ｇ２  Ｑ―ＴＯＦ、Ｗａｔｅｒｓ社製）、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、  Ｎｅｇａｔｉｖｅ／Ｐｏｓｉｔｉｖｅモード、検出質量範囲１００−１０００  Ｄａ、データ取得スキャン間隔１．０秒、デソルベーションガス温度５００℃、イオンソース温度１５０℃、コーン電圧４５Ｖ
【００３８】
（１）ＬＣ／ＭＳ分析結果：ネガティブモード
ａ）図１−１〜図１−４には、各サンプルの温水可溶性画分のＬＣ／ＭＳ分析（ネガティブモードでの分析）によって得られた網羅的質量分析データ（クロマトグラム）を示す。
【００３９】
ｂ）データ解析による特定マーカーの抽出および定量
網羅的質量分析データに対して、図２−１、図２−２に示すように、ＬＣ／ＭＳ多変量データ解析ソフトウエアであるＭａｒｋｅｒＬｙｎｘ  Ｖｅｒ．４．０．６．２（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いた主成分分析を行い、同結果はｓｃｏｒｅｐｌｏｔレベルで可視化した。同結果のデータ間相関性導出には、統計解析ソフトウエアであるＳＰＳＳｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｖｅｒ．１９を用いてグループ間平均連結法を計算アルゴリズムとして採用
したクラスター解析を行い、３グループ（未接種培地、廃培地およびソフト水熱処理培地の３グループ）の抽出を行った。
【００４０】
ｃ）ソフト水熱処理培地と廃培地の比較
次に、グループに特徴的なイオンピーク、すなわち、特定マーカー候補の抽出を行うために、上記抽出されたグループに属する分析データに対して、多変量解析ソフトウエアＭａｒｋｅｒＬｙｎｘ  Ｖｅｒ．４．０．６．２（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いてｌｏａｄｉｎg ｐｌｏｔレベルでの主成分分析、およびＳ‐ｐｌｏｔによる同結果の可視化を行なった。マーカーの抽出に際しては、Ｓ‐ｐｌｏｔ上での相関性上位分析データ（相関確率（ｐｃｏｒｒ）；ｐ＞｜０．９７５｜）の抽出を行い、グループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）とした。具体的には、図３−１に示すように、ソフト水熱処理を行った後の廃培地であるソフト水熱処理培地と、ソフト水熱処理を行わなかった廃培地とを比較し、レスポンスおよび相関係数が高く見積もられた、これらのグループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を行った。図３−２は、抽出した特定マーカー候補（ソフト水熱処理培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。一覧表において、太字で示す候補は、ネガティブモードおよび後述のポジティブモードにおいて共通に抽出された候補を表し、網掛けで示す候補は、後述のエノキタケにおける同一条件で抽出された候補と共通する候補を表す。以下の各一覧表において同様である。
【００４１】
さらに、抽出した特定マーカー候補のそれぞれについて、それらの組成式、構造式の推定を行った。図３−３（ａ）、（ｂ）には、選択した３つのピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。
【００４２】
次に、統計解析によって抽出された特定マーカーの定量解析を行った。例えば、図３−４（ａ）、（ｂ）に示すように、特定マーカー候補の一つである２３７．０７６３（ｍ／ｚ）における各サンプルのソフト水熱処理により変化した成分をＭＳクロマトグラムのピーク面積に基づき、比較した。図３−５には、各サンプルの２３７．０７６３（ｍ／ｚ）におけるピーク面積グラフを示す。このグラフから分かるように、２３７．０７６３（ｍ／ｚ）におけるピーク面積は、ソフト水熱処理の処理強度（本例では処理時間および処理温度）に応じて増加している。よって、当該特定マーカー候補を用いて、再生培地の適合性（廃培地の再生度合）を評価できることが分かる。
【００４３】
図３−６、図３−７には、それぞれ、１５１．０３９４（ｍ／ｚ）および１７７．０５４８４（ｍ／ｚ）の各サンプルのピーク面積グラフを示してある。これらの特定マーカー候補もソフト水熱処理の処理強度に応じて増加する特性を示すことが分かる。図３−８〜図３−１３には、その他の特定マーカー候補における各サンプルのピーク面積グラフを示してある。これらの特定マーカー候補の一つを用いることにより、あるいは、ソフト水熱処理の処理強度に応じて異なる方向に変化する特定マーカー候補を組み合わせて用いることにより、培地としての適合性を評価することが可能である。
【００４４】
ｄ）未接種培地と廃培地の比較
グループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を、使用前の未接種培地と使用後の廃培地を比較することで行った。図４−１に示すように、未接種培地と廃培地とを比較し、これらのグループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を行った。図４−２は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。図４−３（ａ）、（ｂ）には、選択した４つのピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。
【００４５】
次に、図４−４〜４−１５には、各特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。これらのグラフから分かるように、特定マーカー候補には、きのこ栽培により減少後ソフト水
熱処理により増加する特性を示すもの、きのこ栽培により減少する特性を示すものが含まれている。
【００４６】
ｅ）ソフト水熱処理培地と未接種培地の比較
グループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を、ソフト水熱処理培地（ソフト水熱処理によって再生した再生培地）と、未接種培地とを比較することで行った。図５−１に示すように、ソフト水熱処理培地と未接種培地とを比較し、これらのグループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を行った。図５−２（ａ）（ｂ）は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側とソフト水熱処理培地側の候補）の一覧表である。図５−３（ａ）、（ｂ）には、選択した４つのピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。
【００４７】
図５−４〜５−７には、選択した４つの特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。これらのグラフから分かるように、特定マーカー候補には、ソフト水熱処理培地と比較して未接種培地に多いもの、および、逆に、未接種培地と比較してソフト水熱処理培地に多いものがある。図５−８〜５−１５には、その他の特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００４８】
（２）ＬＣ／ＭＳ分析結果：ポジティブモード
ａ）図６−１〜図６−４には、各サンプルの温水可溶性画分のＬＣ／ＭＳ分析（ポジティブモードでの分析）によって得られた網羅的質量分析データ（クロマトグラム）を示す。
【００４９】
ｂ）データ解析による特定マーカーの抽出および定量
網羅的質量分析データに対して、図７−１、図７−２に示すように、主成分分析およびクラスター解析によるグルーピング（未接種培地、廃培地およびソフト水熱処理培地の３グループ）を行った。
【００５０】
ｃ）ソフト水熱処理培地と廃培地の比較
グループに特徴的なイオンピーク、すなわち、特定マーカー候補の抽出を行った。まず、図８−１に示すように、ソフト水熱処理を行った後の廃培地であるソフト水熱処理培地と、ソフト水熱処理を行わなかった廃培地とを比較し、これらのグループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を行った。図８−２は、抽出した特定マーカー候補（ソフト水熱処理培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。
【００５１】
さらに、抽出した特定マーカー候補のそれぞれについて、それらの組成式、構造式の推定を行った。図８−３（ａ）、（ｂ）には、選択した３つのピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。
【００５２】
次に、統計解析によって抽出された特定マーカーの定量解析を行った。図８−４〜８−６には、３つの特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。これらのグラフから分かるように、３つの特定マーカー候補は、ソフト水熱処理により増加する特性を示す。図８−７〜８−１１には、その他の特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００５３】
ｄ）未接種培地と廃培地の比較
グループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を、使用前の未接種培地と使用後の廃培地を比較することで行った。図９−１に示すように、未接種培地と廃培地とを比較し、これらのグループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を行った。図９−２（ａ）、（ｂ）は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。図９−３（ａ）、（ｂ）には、選択した３つのピークに
おける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。
【００５４】
図９−４〜図９−６には、３つの特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。これらのグラフから分かるように、特定マーカー候補には、きのこ栽培により減少後ソフト水熱処理により増加する特性を示すもの、きのこ栽培により減少する特性を示すものが含まれている。図９−７〜９−１３には、その他の特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００５５】
ｅ）ソフト水熱処理培地と未接種培地の比較
グループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を、ソフト水熱処理培地（ソフト水熱処理によって再生した再生培地）と、未接種培地とを比較することで行った。図１０−１に示すように、ソフト水熱処理培地と未接種培地とを比較し、これらのグループに特徴的なイオンピーク（特定マーカー候補）の抽出を行った。図１０−２は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側とソフト水熱処理培地側の候補）の一覧表である。図１０−３（ａ）、（ｂ）には、選択した３つのピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。
【００５６】
図１０−４〜１０−６には、選択した３つの特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。これらのグラフから分かるように、特定マーカー候補には、ソフト水熱処理培地と比較して未接種培地に多いもの、逆に、未接種培地と比較してソフト水熱処理培地に多いものがある。図１０−７〜１０−９には、その他の特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００５７】
（シメジマーカーと標品とのＭＳスペクトル比較）
上記の解析において特定マーカー候補として抽出された１５１．０３９ｍ／ｚ、１６３．０３９ｍ／ｚ、１９３．０５０ｍ／ｚのイオンピークを与える分子の同定を試みた。これらのうち、１５１．０３９ｍ／ｚおよび１６３．０３９ｍ／ｚの２つの特定マーカー候補は、ブナシメジと後述のエノキタケに共通に表れるものである。
【００５８】
バニリン、ｐ−クマル酸、フェルラ酸それぞれ０．１ｍＭ溶液をＬＣ／ＭＳで測定し、標品のカラムからの溶出時間（リテンションタイム；ＲＴ）とＭＳスペクトル（ネガティブモード）を得ると同時に、ブナシメジ再生培地の抽出液（ソフト水熱処理の処理強度：飽和水蒸気温度１５０℃、処理時間６０分）を、一次（親）イオン抽出幅０．０５Ｄａに設定したＭＳ／ＭＳネガティブモードで再度測定し、標品のスペクトルと比較した。
【００５９】
その結果、ブナシメジ再生培地の抽出液中の１５１．０３９ｍ／ｚ、１６３．０３９ｍ／ｚ、１９３．０５０ｍ／ｚをプレカーサーとするフラグメントイオンのパターンは、バニリン、ｐ−クマル酸、フェルラ酸の分析によって得られるＭＳスペクトルフラグメントパターンと良く一致しており、テンションタイムも各標品と良く一致した。
【００６０】
［特定マーカーの解析例２］
以下に、本発明者等が行った特定マーカー解析例２を述べる。解析例２は、エノキタケ培地について、上記の解析例１と同様な条件により特定マーカーの解析を行った。
【００６１】
（解析用サンプル）
表２には、使用したエノキタケ培地の種類およびサンプル名を示す。この表２に示すように、測定用のサンプルとして、未使用のエノキタケ培地「未接種培地」と、使用済みのエノキタケ培地「廃培地」とを用意した。また、廃培地として、ソフト水熱処理を行わないもの（処理前）と、異なる処理強度でソフト水熱処理を施したもの（ソフト水熱処理培地）を用意した。具体的には、ソフト水熱処理の処理強度として、飽和水蒸気温度が１２
０℃、１３０℃、１４０℃および１５０℃で、処理時間が３０分および６０分の場合のサンプルを調製した。
【００６２】
【表２】
2016034262.tif 000004
【００６３】
（サンプルからの温水抽出およびアセトニトリル可溶性画分の分画）
各サンプルの処理条件は、前述の解析例１の場合と同一であるので説明を省略する。
【００６４】
（ＬＣ／ＭＳ分析）
各サンプルから抽出した温水可溶性画分のＬＣ／ＭＳ分析の条件も前述の解析例１と同一であるので説明を省略する。
【００６５】
（１）ＬＣ／ＭＳ分析結果：ネガティブモード
ａ）ソフト水熱処理培地と廃培地の比較
図１１−１は、抽出した特定マーカー候補（ソフト水熱処理培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。この表において、太線で示すマーカー候補（１３６．０３９８ｍ／ｚ）は後述のポジティブモードにおいても抽出された共通の候補である。また、網掛けで示す候補（１３５．０４４５、１５１．０３９２）は、ブナシメジおよびエノキタケの双方において抽出された共通の候補である。以下の各比較結果の一覧表において同様である。
【００６６】
図１１−２には、抽出した３つのピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。
【００６７】
図１１−３〜図１１−６には、その他の特定マーカー候補における各サンプルのピーク面積グラフを示してある。これらの特定マーカー候補の一つを用いることにより、あるいは、ソフト水熱処理の処理強度に応じて異なる方向に変化する特定マーカー候補を組み合わせて用いることにより、培地としての適合性を評価することが可能である。
【００６８】
ｂ）未接種培地と廃培地の比較
図１２−１は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。図１２−２〜図１２−６には、選択した１０の候補のうち９の候補のピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。図１２−７〜図１２−１３には、各特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００６９】
ｃ）ソフト水熱処理培地と未接種培地の比較
図１３−１は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側とソフト水熱処理培地側の候補）の一覧表である。図１３−２、図１３−３には、選択した４つのピークにおける組成式、構造式の推定結果（検索結果）を示す。図１３−４〜図１３−６には、その他の特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００７０】
（２）ＬＣ／ＭＳ分析結果：ポジティブモード
ａ）ソフト水熱処理培地と廃培地の比較
図１４−１は、抽出した特定マーカー候補（ソフト水熱処理培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。図１４−２〜図１４−１０には、抽出した各特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００７１】
ｂ）未接種培地と廃培地の比較
図１５−１は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側の候補と廃培地側の候補）の一覧表である。図１５−２〜図１５−７には、各特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【００７２】
ｃ）ソフト水熱処理培地と未接種培地の比較
図１６−１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、抽出した特定マーカー候補（未接種培地側とソフト水熱処理培地側の候補）の一覧表である。図１６−２〜図１６−１４には各特定マーカー候補のピーク面積グラフを示す。
【図１−１】
2016034262.tif 000005
【図１−２】
2016034262.tif 000006
【図１−３】
2016034262.tif 000007
【図１−４】
2016034262.tif 000008
【図２−１】
2016034262.tif 000009
【図２−２】
2016034262.tif 000010
【図３−１】
2016034262.tif 000011
【図３−２】
2016034262.tif 000012
【図３−３】
2016034262.tif 000013
【図３−４】
2016034262.tif 000014
【図３−５】
2016034262.tif 000015
【図３−６】
2016034262.tif 000016
【図３−７】
2016034262.tif 000017
【図３−８】
2016034262.tif 000018
【図３−９】
2016034262.tif 000019
【図３−１０】
2016034262.tif 000020
【図３−１１】
2016034262.tif 000021
【図３−１２】
2016034262.tif 000022
【図３−１３】
2016034262.tif 000023
【図４−１】
2016034262.tif 000024
【図４−２】
2016034262.tif 000025
【図４−３】
2016034262.tif 000026
【図４−４】
2016034262.tif 000027
【図４−５】
2016034262.tif 000028
【図４−６】
2016034262.tif 000029
【図４−７】
2016034262.tif 000030
【図４−８】
2016034262.tif 000031
【図４−９】
2016034262.tif 000032
【図４−１０】
2016034262.tif 000033
【図４−１１】
2016034262.tif 000034
【図４−１２】
2016034262.tif 000035
【図４−１３】
2016034262.tif 000036
【図４−１４】
2016034262.tif 000037
【図４−１５】
2016034262.tif 000038
【図５−１】
2016034262.tif 000039
【図５−２】
2016034262.tif 000040
【図５−３】
2016034262.tif 000041
【図５−４】
2016034262.tif 000042
【図５−５】
2016034262.tif 000043
【図５−６】
2016034262.tif 000044
【図５−７】
2016034262.tif 000045
【図５−８】
2016034262.tif 000046
【図５−９】
2016034262.tif 000047
【図５−１０】
2016034262.tif 000048
【図５−１１】
2016034262.tif 000049
【図５−１２】
2016034262.tif 000050
【図５−１３】
2016034262.tif 000051
【図５−１４】
2016034262.tif 000052
【図５−１５】
2016034262.tif 000053
【図６−１】
2016034262.tif 000054
【図６−２】
2016034262.tif 000055
【図６−３】
2016034262.tif 000056
【図６−４】
2016034262.tif 000057
【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図８−１０】
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【図８−１１】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図９−８】
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【図９−９】
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【図９−１０】
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【図９−１１】
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【図９−１２】
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【図９−１３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１０−９】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１２−１２】
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【図１２−１３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１４−６】
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【図１４−７】
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【図１４−８】
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【図１４−９】
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【図１４−１０】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１６−９】
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【図１６−１０】
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【図１６−１１】
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【図１６−１２】
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【図１６−１３】
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【図１６−１４】
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