(57)【要約】      （修正有）【課題】パーキンソン病、レストレスレッグス症候群又は高プロラクチン血症の治療または予防に有効な、ドパミンＤ２受容体アゴニスト作用を有し、５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用の少ない化合物の提供。【解決手段】例えば下記表中の２，３等で表される、ウレイドカルボニルオクタヒドロキノリン誘導体。2016160206.tif 000024【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2016160206.tif 000019
〔式中
Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル基であり；
Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基、またはヒドロキシＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ３は、ヒドロキシＣ１−６アルキル基、またはＲ４Ｒ５Ｎ−Ｃ１−６アルキル基であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表すか、或いはＲ４及びＲ５が、それらが結合している窒素原子と一緒になって環状アミノ基を形成し；
環Ａは、
【化２】
2016160206.tif 000020
であり；
波線は隣接する環との結合位置を表し；
但し、Ｒ２が、Ｃ１−６アルキル基の場合、Ｒ３は、Ｒ４Ｒ５Ｎ−Ｃ１−６アルキル基ではない〕
で表される化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項２】
環Ａが、
【化３】
2016160206.tif 000021
〔式中、波線は隣接する環との結合位置を表す〕
である、請求項１記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｒ１が、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ２が、Ｃ１−６アルキル基であり、Ｒ３が、ヒドロキシＣ１−６アルキル基である、請求項２記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項４】
相対配置で表される一般式(II)：
【化４】
2016160206.tif 000022
で表される、請求項１記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項５】
絶対配置で表される一般式(III)：
【化５】
2016160206.tif 000023
で表される、請求項１記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物。
【請求項７】
パーキンソン病、レストレスレッグス症候群又は高プロラクチン血症の治療または予防用である、請求項６記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ドパミンＤ２受容体アゴニスト作用を有する新規なウレイドカルボニルオクタヒドロキノリン誘導体、それを含有する医薬組成物およびそれらの用途に関する。
【０００２】
パーキンソン病は中高年齢者に好発する進行性の神経変性疾患であり、高齢化社会の進展とともにその患者数が増加している。パーキンソン病は、安静時振戦、固縮、無動、姿勢反射障害などの協調性運動機能障害を主症状とする疾患であり、その病因は中脳黒質ドパミン性神経細胞の変性による線条体ドパミンの欠乏に起因すると考えられている。このようなことから、パーキンソン病の治療薬として、Ｌ−ドパ、ドパミンＤ２受容体アゴニストなどが使用されている。
【０００３】
Ｌ−ドパは、ドパミンの前駆物質であり、脳内でドパミンに代謝されて効果を示す薬剤であるが、血中半減期が非常に短い欠点を有する。そのため、Ｌ−ドパは、通常Ｌ−ドパの代謝酵素阻害剤である、末梢性芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤および／またはカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤とともに使用されている。
【０００４】
ドパミンＤ２受容体アゴニストは、線条体におけるドパミンＤ２受容体を直接刺激することにより抗パーキンソン作用を発揮する。またドパミンＤ２受容体アゴニストは、レストレスレッグス症候群、高プロラクチン血症等の治療に有用であることが知られている（例えば、非特許文献１及び２参照）。
【０００５】
ドパミンＤ２受容体アゴニストとして種々の麦角系及び非麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストが知られている（例えば、麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストについては特許文献１〜３、非麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストについては特許文献４〜６を参照）。
【０００６】
非麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストは、麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストに比べて短い血中半減期を有し、作用持続時間が短い欠点を有する（例えば、非特許文献３参照）。さらに非麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストは、前兆のない突発性睡眠や傾眠等の副作用が認められ問題となっている。
【０００７】
麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストは、非麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストに比べて持続的な有効性を示す。しかしながら最近、代表的な麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストであるペルゴリドを高用量、長期間服用すると心臓弁膜症の発現リスクが高まることが報告されたことから、麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストの投与に際しては、定期的な心エコー検査等の監視下での投与が必要とされている。心臓弁膜症の発症原因として５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用による心臓弁膜細胞の増殖刺激によって心臓弁膜症が引き起こされるとの報告がされ、心臓弁膜症と５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用との関連性が強く示唆されている（例えば、非特許文献４参照）。
このようなことから強力かつ持続的なドパミンＤ２受容体アゴニスト作用を有し、５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用の少ない新規なドパミンＤ２受容体アゴニストが望まれている。
【０００８】
ヘテロアリール環を有する、ウレイドカルボニルオクタヒドロキノリン誘導体として、特許文献７または特許文献８記載の化合物が知られている。しかしながら、特許文献７または特許文献８には、本発明のようにウレイドカルボニル基部分にヒドロキシＣ１−６アルキル基を有する化合物は開示も示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４,１６６,１８２号明細書
【特許文献２】米国特許第３,７５２,８１４号明細書
【特許文献３】米国特許第４,５２６,８９２号明細書
【特許文献４】米国特許第４,４５２,８０８号明細書
【特許文献５】米国特許第３,８０４,８４９号明細書
【特許文献６】米国特許第４,８８６,８１２号明細書
【特許文献７】国際公開ＷＯ２０１２／１２４６４９号
【特許文献８】国際公開ＷＯ２０１４／１１２４９２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】S. Happeら，「CNS Drugs」, 2004年, 18(1)巻, p.27-36
【非特許文献２】P. G. Crosignani, 「Eur. J. Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology」, 2006年, 125巻, p.152-164
【非特許文献３】A. Prikhojanら，「J. Neural Transm.」，2000年，107巻，p.1159-1164
【非特許文献４】V. Setolaら, 「Mol. Pharmacol.」， 2003年， 63巻，p.1223-1229
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ドパミンＤ２受容体に対して強力な刺激作用を有し、好ましくは５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用の軽減された、新規な化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、一般式（Ｉ）で表される化合物が、驚くべきことに５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用に比べて極めて強力なドパミンＤ２受容体刺激作用を有することを見出し、当該知見に基づき本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）：
【化１】
2016160206.tif 000002
〔式中
Ｒ１は、Ｃ１−６アルキル基であり；
Ｒ２は、Ｃ１−６アルキル基、またはヒドロキシＣ１−６アルキル基であり；
Ｒ３は、ヒドロキシＣ１−６アルキル基、またはＲ４Ｒ５Ｎ−Ｃ１−６アルキル基であり；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表すか、或いはＲ４及びＲ５が、それらが結合している窒素原子と一緒になって環状アミノ基を形成し；
環Ａは、
【化２】
2016160206.tif 000003
であり；
波線は隣接する環との結合位置を表し；
但し、Ｒ２が、Ｃ１−６アルキル基の場合、Ｒ３は、Ｒ４Ｒ５Ｎ−Ｃ１−６アルキル基ではない〕
で表される化合物又はその薬理学的に許容される塩に関する。
【００１４】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有する医薬組成物に関する。
【００１５】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を含有するパーキンソン病、レストレスレッグス症候群又は高プロラクチン血症の治療又は予防剤に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の化合物はドパミンＤ２受容体に対して強力な刺激作用を有する。また本発明の化合物は５−ＨＴ２Ｂ受容体に対して軽微な刺激作用しか有さず、高い安全性を有する。従って本発明の化合物はパーキンソン病、レストレスレッグス症候群又は高プロラクチン血症の治療又は予防剤として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
一般式（Ｉ）で表される化合物において、下記の用語は、特に断らない限り、以下の意味を有する。
【００１８】
「Ｃ１−６アルキル基」とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数１〜６のアルキル基を意味し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、tert−ペンチル基、１−メチルブチル基、２−メチルブチル基、１，２−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、イソヘキシル基などが挙げられる。
【００１９】
「ヒドロキシＣ１−６アルキル基」とは、ヒドロキシ基で置換された炭素数１〜６のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、１−ヒドロキシ−１，１−ジメチルメチル基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシ−１−メチルエチル基、３−ヒドロキシプロピル基などが挙げられる。
【００２０】
「環状アミノ基」としては、環内に−ＮＨ−、−Ｏ−または−Ｓ−を含んでもよい、５〜７員の飽和環状アミンを意味し、例えば、１−ピロリジル基、ピペリジノ基、ピペラジノ基、モルホリノ基、チオモルホリノ基、［１，４］ジアゼパン−１−イル基などが挙げられる。
【００２１】
本明細書の化学名において、「＊」印は不斉炭素原子の相対配置を表す。例えば、(３'Ｒ＊，４'ａＲ＊，８'ａＲ＊)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸エチルは、１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリンの３、４および８位の不斉炭素原子が相対配置であることを示す。
【００２２】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物において１つまたはそれ以上の不斉炭素原子が存在する場合、本発明は各々の不斉炭素原子がＲ配置の化合物、Ｓ配置の化合物、およびそれらの任意の組み合せの化合物のいずれも包含する。またそれらのラセミ化合物、ラセミ混合物、ラセミ固溶体、単一のエナンチオマー、ジアステレオマー混合物が本発明の範囲に含まれる。本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物において幾何学異性が存在する場合、本発明はその幾何学異性体のいずれも包含する。本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物においてアトロプ異性体が存在する場合、本発明はそのアトロプ異性体のいずれも包含する。さらに本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物には、水和物やエタノール等の医薬品として許容される溶媒との溶媒和物も含まれる。
【００２３】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、塩の形態で存在することができる。このような塩としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸との酸付加塩、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、プロピオン酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、酪酸、シュウ酸、マロン酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、炭酸、グルタミン酸、アスパラギン酸等の有機酸との酸付加塩、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等の無機塩基との塩、トリエチルアミン、ピペリジン、モルホリン、リジン等の有機塩基との塩を挙げることができる。
【００２４】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物のひとつの実施態様において、
Ｒ２は、好ましくは、Ｃ１−６アルキル基であり、
Ｒ３は、好ましくはヒドロキシＣ１−６アルキル基であり、
環Ａは、
【化３】
2016160206.tif 000004
〔式中、波線は隣接する環との結合位置を表す〕
である。
【００２５】
一般式（Ｉ）で表される化合物のひとつの実施態様において、一般式（Ｉ）で表される化合物は、好ましくは、以下の相対配置で表される一般式(II)：
【化４】
2016160206.tif 000005
で表される化合物であり、
さらに好ましくは、以下の絶対配置で表される一般式（ＩＩＩ）：
【化５】
2016160206.tif 000006
で表される化合物である。
【００２６】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、スキーム１〜３に示す方法により製造することができる。
【００２７】
【化６】
2016160206.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記と同義であり、Ｒ２０はＣ１−６アルキル基であり、Ａｒはフェニル、２−クロロフェニルまたは４−ニトロフェニルなどのアリール基を表す。）
【００２８】
工程１−１
エステル誘導体（X）を適切な溶媒中、アルカリ加水分解することにより、カルボン酸誘導体が得られる。本反応に用いられる溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、水、テトラヒドロフラン、それらの混合溶媒などが挙げられる。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどが挙げられる。その反応温度は通常、０℃〜還流温度であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１０分〜２４時間である。
カルボン酸誘導体を、不活性溶媒中、縮合剤の存在下にアミン（XI）と縮合させることにより、アミド誘導体（XII）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、例えば、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、およびそれらの混合溶媒などが挙げられる。縮合剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩、アジ化ジフェニルホスホリル、４−(４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル)−４−メチルモルホリニウム塩酸塩などが挙げられる。その反応温度は通常、−２０℃〜１００℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１０分〜２４時間である。
また、アミド誘導体（XII）は、カルボン酸を常法に従ってその反応性誘導体（例えば、酸ハライド、酸無水物、混合酸無水物、ベンゾトリアゾール−１−イルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，５−ジオキサピロリジンエステルなど）に変換後、適切な溶媒中、塩基の存在下または非存在下にアミン（XI）またはその塩と縮合させることによっても得ることができる。この縮合反応に用いられる溶媒としては、例えば、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、およびそれらの混合溶媒などが挙げられる。塩基としては、例えば、炭酸カリウム、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンなどが挙げられる。その反応温度は通常、−２０℃〜還流温度であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１時間〜２４時間である。
また、アミド誘導体（XII）は、エステル誘導体（X）とアミン（XI）とを、適切な溶媒中、マイクロ波を照射させることによっても得ることができる。本反応に用いられる溶媒としては、例えば、エタノール、２−プロパノール、およびそれらの混合溶媒などが挙げられる。その反応温度は通常、１００℃〜２５０℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１時間〜２４時間である。
【００２９】
工程１−２
アミド誘導体（XII）とクロロギ酸アリール（XIII）とを、不活性溶媒中、塩基の存在下に反応させることにより、アリールカルバメート誘導体（XIV）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、例えば、テトラヒドロフランなどが挙げられる。塩基としては、ナトリウムヘキサメチルジシラジド、リチウムヘキサメチルジシラジド、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシドなどが挙げられる。その反応温度は通常、−７８℃〜５０℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１５分〜２４時間である。
【００３０】
工程１−３
アリールカルバメート誘導体（XIV）を、不活性溶媒中、塩基の存在下または非存在下にアミン（XV）またはその塩と反応させることにより、アシルウレア誘導体（XVI）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、２−プロパノール、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、１，４−ジオキサンおよびそれらの混合溶媒等が挙げられる。塩基としては、例えば、炭酸カリウム、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンなどが挙げられる。その反応温度は通常、０℃〜１５０℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１５分〜２４時間である。
【００３１】
工程１−４
アシルウレア誘導体（XVI）を適切な溶媒中、酸加水分解することにより、６−オキソデカキノリン誘導体（XVII）が得られる。本反応に用いられる溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン、塩化メチレン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、水およびそれらの混合溶媒などが挙げられる。酸としては、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられる。その反応温度は通常、−５０℃〜１００℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１０分〜２４時間である。
【００３２】
工程１−５
６−オキソデカキノリン誘導体（XVII）とマロノニトリルとを、不活性溶媒中、硫黄および塩基の存在下または非存在下に反応させることにより、本発明のウレイドカルボニルオクタヒドロキノリン誘導体（Ia）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、例えば、エタノール、メタノール、１，４−ジオキサンなどが挙げられる。塩基としては、モルホリン、ピペリジン、トリエチルアミンなどが挙げられる。その反応温度は通常、０℃〜還流温度であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１５分〜２４時間である。
【００３３】
【化７】
2016160206.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は前記と同義である。）
【００３４】
工程２−１
６−オキソデカヒドロキノリン誘導体（XVII）とチオウレアとを、不活性溶媒中、ヨウ素の存在下に反応させることにより、本発明のウレイドカルボニルオクタヒドロキノリン誘導体(Ib）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、例えば、エタノール、２−プロパノールなどが挙げられる。その反応温度は通常、５０℃〜還流温度であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１２時間〜４８時間である。
【００３５】
工程２−２
６−オキソデカヒドロキノリン誘導体（XVII）と化合物（XVIII）とを、不活性溶媒中、反応させることにより、７−[(ジメチルアミノ)メチリデン]−６−オキソデカヒドロキノリン誘導体（XIX）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、例えばトルエン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。その反応温度は通常、室温〜１２０℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、３０分〜４８時間である。
【００３６】
工程２−３
７−[(ジメチルアミノ)メチリデン]−６−オキソデカヒドロキノリン誘導体（XIX）とヒドラジン(XX)とを、不活性溶媒中、反応させることにより、本発明のウレイドカルボニルオクタヒドロキノリン誘導体（Ic）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、例えばエタノールなどが挙げられる。その反応温度は通常、０℃〜８０℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１時間〜２４時間である。
【００３７】
【化８】
2016160206.tif 000009
（式中、「Chiral」の記号を付した化合物は絶対配置であることを示し、Ｒ１およびＲ２０は前記と同義である。）
【００３８】
工程３−１
１、４−シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール（XXI）、アミン（XXII）、および２−（ブロモメチル）アクリル酸エステル（XXIII）を、不活性溶媒中で縮合させることにより化合物（XXIV）が得られる。本反応に用いられる不活性溶媒としては、例えば、トルエン、ベンゼンなどが挙げられる。その反応温度は通常、−５０℃〜還流温度であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１時間〜２４時間である。
【００３９】
工程３−２
化合物（XXIV）を、適切な溶媒中、酸の存在下にシアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を用いて還元させることにより、化合物（X）が得られる。本反応に用いられる溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノール、酢酸エチル、１，４−ジオキサンおよびそれらの混合溶媒などが挙げられる。酸としては、例えば、硫酸、塩酸、酢酸などが挙げられる。その反応温度は通常、−５０℃〜５０℃であり、反応時間は使用する原料物質や溶媒、反応温度等により異なるが、通常、１０分〜１２時間である。
【００４０】
工程３−３
化合物（X）を、結晶化による光学分割法（例えば、優先晶出法、ジアステレオマー塩法、包接錯体法および優先富化など）、酵素反応法またはキラルカラムクロマトグラフィーを用いた直接光学分割法を実施することにより、光学活性化合物（Xa）および(Xb)が得られる。
キラルカラムクロマトグラフィーを用いた直接光学分割法に用いられるキラルカラムとしては、例えば、キラルパック（登録商標）ＡＹ−Ｈカラム、ＡＤ−Ｈカラム、ＩＡカラム（株式会社ダイセル）などが挙げられる。溶出溶媒としては、ヘキサン、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ジエチルアミンおよびそれらの混合溶媒などが挙げられ、その溶出速度は０．５ｍＬ／ｍｉｎ〜１０ｍＬ／ｍｉｎである。溶出温度は通常、１０℃〜６０℃であり、検出波長は２００ｎｍ〜２７０ｎｍである。
【００４１】
上記に示したスキームは、本発明の化合物またはその製造中間体を製造するための方法のいくつかの例示であり、当業者には容易に理解され得るようにこれらのスキームの様々な改変が可能である。
【００４２】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物、および当該化合物を製造するために使用される中間体は、必要に応じて、当該分野の当業者には周知の単離・精製手段である溶媒抽出、結晶化、再結晶、クロマトグラフィー、分取高速液体クロマトグラフィーなどの操作を行うことにより、単離・精製することができる。
【００４３】
このようにして製造される本発明の化合物は、優れたドパミンＤ２受容体刺激作用を有するのでドパミンＤ２受容体が介在する種々の疾患の治療または予防薬として有用である。例えば、本発明の化合物は、パーキンソン病、レストレスレッグス症候群又は高プロラクチン血症等の治療または予防薬として有用であり、特にパーキンソン病の治療または予防薬として有用である。
【００４４】
また、本発明の化合物は、必要に応じて、他の抗パーキンソン病薬と組み合わせて使用してもよい。このような他の抗パーキンソン病薬としては、例えば、Ｌ−ドパ；ドパミンＤ２受容体アゴニスト（カベルゴリン、メシル酸ブロモクリプチン、テルグリド、塩酸タリペキソール、塩酸ロピニロール、メシル酸ペルゴリド、塩酸プラミペキソール、ロチゴチン、アポモルフィンなど）；抗コリン剤（例えば、プロフェナミン、塩酸トリヘキシフェニジル、塩酸マザチコール、ピペリデン、塩酸ピロヘプチン、塩酸メチキセンなど）；アデノシンＡ２Ａ受容体拮抗剤（例えば、イストラデフィリンなど）；ＮＭＤＡ受容体拮抗剤（例えば、ブジピンなど）；モノアミンオキシダーゼＢ阻害剤（例えば、塩酸セレギリン、メシル酸ラサギリン、メシル酸サフィナミドなど）；ＣＯＭＴ阻害剤（エンタカポンなど）；芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ阻害剤（カルビドパ、ベンセラジドなど）；ドロキシドパ、メレボドパ、スレオドプス；ゾニサミド；塩酸アマンタジンなどが挙げられる。
【００４５】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する医薬組成物は、用法に応じ種々の剤型のものが使用される。このような剤型としては例えば、散剤、顆粒剤、細粒剤、ドライシロップ剤、錠剤、カプセル剤、注射剤、液剤、軟膏剤、坐剤、貼付剤などを挙げることができ、経口または非経口的に投与される。
【００４６】
これらの医薬組成物は、その剤型に応じ製剤学的に公知の手法により、適切な賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、緩衝剤、等張化剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤、溶解補助剤などの医薬品添加物と適宜混合または希釈・溶解することにより調製することができる。
【００４７】
一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩の投与量は、患者の年齢、性別、体重、疾患および治療の程度等により適宜決定されるが、経口投与の場合、成人１日当たり、約０．１ｍｇ〜約３００ｍｇの範囲、好ましくは約０．５ｍｇ〜約３０ｍｇの範囲で、非経口投与の場合は、成人１日当たり約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇの範囲、好ましくは約０．０５ｍｇ〜約１０ｍｇの範囲で、一回または数回に分けて適宜投与することができる。
【００４８】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩と、他の抗パーキンソン病薬とを組み合わせてなる医薬は、これらの有効成分を一緒に含有する製剤、またはこれらの有効成分の各々を別々に製剤化した製剤として投与することができる。別々に製剤化した場合、それらの製剤を別々にまたは同時に投与することができる。また、別々に製剤化した場合、それらの製剤を使用時に希釈剤などを用いて混合し、同時に投与することができる。
【００４９】
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩と、他の抗パーキンソン病薬とを組み合わせてなる医薬において、薬剤の配合比は、患者の年齢、性別、および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせなどにより、適宜選択することができる。
【００５０】
本発明の内容を以下の参考例、実施例および試験例でさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの内容に限定されるものではない。
【実施例】
【００５１】
各参考例、各実施例で用いている記号のうち、１Ｈ−ＮＭＲは水素核核磁気共鳴スペクトル、ＣＤＣｌ３はクロロホルム−ｄ、ＭｅＯＨ−ｄ４はメタノール−ｄ４をそれぞれ示。また、ＭＳは質量分析を示し、ＥＳＩはエレクトロスプレーイオン化法により測定したことを示す。また、表中「Chiral」の記号を付した構造式は絶対配置であることを示す。
【００５２】
参考例１
１'−メチル−２'，３'，４'，５'，７'，８'−ヘキサヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸エチル
２−（ブロモメチル）アクリル酸エチル(20.42g)およびトルエン(320mL)の混合物に、氷冷撹拌下にて４０％メチルアミン−メタノール溶液（24.1mL）およびトルエン（80mL）の混合物を滴下して、３分間撹拌した。この混合物に、同条件下にて１，４−シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール（14.00g）およびトルエン（100mL）の混合物を加え、ディーン・スターク装置で４．５時間加熱還流した。室温に冷却し、混合物をセライト（登録商標）層を通して濾過し、濾液を減圧下濃縮した。残渣をアミノプロピルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−４０％酢酸エチル／ヘキサン，グラジエント溶出）で精製して表題化合物(22.92g)を得た。構造式を表1に示した。
１H-NMR（CDCl3）δppm： 1.20-1.35(4H, m), 1.70-1.85(2H, m), 1.95-2.10(1H, m), 2.15-2.35(4H, m), 2.60(3H, s), 2.75-3.00(2H, m), 3.10-3.20(1H, m), 3.85-4.05(4H, m), 4.15(2H, q, J=7.1Hz)
【００５３】
参考例２
(３'Ｒ＊，４'ａＲ＊，８'ａＲ＊)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸エチル
１'−メチル−２'，３'，４'，５'，７'，８'−ヘキサヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸エチル（参考例１）(22.92g)、テトラヒドロフラン（260mL）およびメタノール(65mL)の混合物に、氷冷撹拌下にて4mol/L塩化水素−ジオキサン溶液（21.4mL）、次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウム（6.14g）を加え、１０分間撹拌した。混合物を減圧下濃縮し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した。分取した有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−２２％メタノール／酢酸エチル，グラジエント溶出）で精製して表題化合物(8.33g)を得た。構造式を表１に示した。
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：1.10-1.30(4H, m), 1.30-1.75(6H, m), 1.75-1.85(1H, m), 1.85-2.00(1H, m), 2.00-2.10(1H, m), 2.17(1H, t, J=11.6Hz), 2.30(3H, s), 2.60-2.75(1H, m), 3.05-3.15(1H, m), 3.93(4H, s), 4.12(2H, q, J=7.1Hz)
【００５４】
参考例３
(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸エチル
(３'Ｒ＊，４'ａＲ＊，８'ａＲ＊)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸エチル（参考例２）(14.4g) をキラルパック（登録商標）ＡＹ−Ｈ（株式会社ダイセル）カラム（２５０ｍｍ×２０ｍｍＩ．Ｄ．）を用い、以下の条件：
溶出溶媒；ヘキサン：エタノール：ジエチルアミン＝５０：５０：０．１（Ｖ／Ｖ）
検出波長；２２０ｎｍ
流速；５．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラムオーブン温度；４０℃
にてクロマトグラフィーを繰り返し、第２溶出成分を集め、濃縮することによって表題化合物(6.9g)を得た。構造式を表1に示した。
１H-NMR（CDCl3）δ ppm： 1.10-1.30(4H, m), 1.30-1.75(6H, m), 1.75-1.85(1H, m), 1.85-2.00(1H, m), 2.00-2.10(1H, m), 2.17(1H, t, J=11.6Hz), 2.30(3H, s), 2.60-2.75(1H, m), 3.05-3.15(1H, m), 3.93(4H, s), 4.12(2H, q, J=7.1Hz)
[α]Ｄ２９＝-11.50°(c=1.06, MeOH)
【００５５】
【表１】
2016160206.tif 000010
表1における参考例２の構造式は相対配置を示し、参考例３の構造式は絶対配置を示す。
【００５６】
参考例４−１
(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチル−Ｎ−プロピルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボキサミド
(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸エチル（参考例３）(1.995g)およびエタノール(35mL)の混合物に、室温撹拌下、5mol/L水酸化ナトリウム水溶液(7.06mL)を加え、８０℃に昇温して１．５時間撹拌した。氷冷後、6mol/L塩酸(5.88mL)を加えて中和した。混合物を減圧下濃縮して(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸を得た。
(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボン酸、１−プロピルアミン(0.638mL)、トリエチルアミン (2.16mL)および塩化メチレン(54mL)の混合物に、室温撹拌下、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.19g)、次いで１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩(1.49g)を加え、１１時間撹拌した。混合物をセライト（登録商標）層に通し、濾液を減圧下濃縮した。残渣をアミノプロピルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−５％メタノール／酢酸エチル，グラジエント溶出）で精製して表題化合物(1.812g)を得た。構造式を表２に示した。
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.91(3H, t, J=7.4Hz), 1.25-1.70(9H, m), 1.70-1.85(2H, m), 2.00-2.10(1H, m), 2.20-2.35(4H, m), 2.40-2.50(1H, m), 2.90-3.05(1H, m), 3.15-3.25(2H, m), 3.85-4.00(4H, m), 5.30-5.50(1H, m)
[α]Ｄ２８＝-8.00°(c=0.30, MeOH)
【００５７】
（３’Ｒ，４’ａＲ，８’ａＲ）−１’−メチルオクタヒドロ−１’Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６’−キノリン]−３’−カルボン酸エチルおよび１−プロピルアミンの代わりに対応するデカヒドロキノリン−３−カルボン酸エステルおよびアミンを用い参考例４−１と同様の方法により、参考例４−２〜参考例４−３を合成した。これらを表２に示した。
【００５８】
【表２】
2016160206.tif 000011
表２における参考例４−１及び参考例４−２の構造式は絶対配置を示し、参考例４−３の構造式は相対配置を示す。
【００５９】
参考例４−２〜参考例４−３の物性値を以下に示した。
【００６０】
参考例４−２
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：1.13(3H, t, J=7.2Hz), 1.25-1.90(9H, m), 2.00-2.10(1H, m), 2.20-2.35(4H, m), 2.35-2.50(1H, m), 2.90-3.10(1H, m), 3.20-3.40(2H, m), 3.85-4.00(4H, m), 5.39(1H, brs)
[α]Ｄ２７＝-20.25°(c=0.32, MeOH)
【００６１】
参考例４−３
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.07(6H, s), 0.91(9H, s), 1.25-1.85(11H, m), 2.00-2.10(1H, m), 2.20-2.35(4H, m), 2.35-2.50(1H, m), 2.95-3.05(1H, m), 3.30-3.45(2H, m), 3.72(2H, t, J=5.7Hz), 3.94(4H, s), 6.00-6.10(1H, m)
【００６２】
参考例５−１
Ｎ−{[(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−イル]カルボニル}−Ｎ−プロピルカルバミン酸フェニル
(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチル−Ｎ−プロピルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボキサミド（参考例４−１）(1.816g)およびテトラヒドロフラン(31mL)の混合物に、−４２℃にて1mol/Lナトリウムヘキサメチルジシラジド−テトラヒドロフラン溶液（7.97mL)を加えた。同温度にて２０分撹拌した後、混合物にクロロギ酸フェニル(0.999mL)を加えて１．５時間撹拌した。室温に昇温した後、水および酢酸エチルを加えた。分取した有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、減圧下濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−１５％メタノール／酢酸エチル，グラジエント溶出）で精製して表題化合物(2.402g)を得た。構造式を表３に示した。
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.95(3H, t, J=7.5Hz), 1.15-1.50(3H, m), 1.50-1.85(7H, m), 1.90-2.10(2H, m), 2.29(3H, s), 2.38(1H, t, J=11.3Hz), 2.95-3.05(1H, m), 3.65-3.80(1H, m), 3.80-3.95(6H, m), 7.10-7.20(2H, m), 7.25-7.35(1H, m), 7.35-7.50(2H, m)
【００６３】
(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチル−Ｎ−プロピルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−カルボキサミドおよびクロロギ酸フェニルの代わりに対応するアミドおよびクロロギ酸アリールを用い参考例５−１と同様の方法により、参考例５−２〜参考例５−３を合成した。これらを表３に示した。
【００６４】
【表３】
2016160206.tif 000012
表３における参考例５−１及び参考例５−２の構造式は絶対配置を示し、参考例５−３の構造式は相対配置を示す。
【００６５】
参考例５−２〜参考例５−３の物性値を以下に示した。
【００６６】
参考例５−２
MS(ESI, m/z):448(M+H)+
【００６７】
参考例５−３
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.04(6H, s), 0.86(9H, s), 1.20-1.50(3H, m), 1.50-1.75(4H, m), 1.75-1.95(4H, m), 1.95-2.10(1H, m), 2.29(3H, s), 2.36(1H, t, J=11.3Hz), 2.95-3.05(1H, m), 3.65-3.80(3H, m), 3.85-4.00(6H, m), 7.30-7.40(2H, m), 8.25-8.35(2H, m)
【００６８】
参考例６−１
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−{[(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−イル]カルボニル}−１−プロピル尿素
Ｎ−{[(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−イル]カルボニル}−Ｎ−プロピルカルバミン酸フェニル（参考例５−１）(1.405g) 及び２−プロパノール(14mL)の混合物に、室温撹拌下、２−アミノエタノール(0.82mL)を加え、１３時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮した。残渣をアミノプロピルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−１０％メタノール／酢酸エチル，グラジエント溶出）で精製して表題化合物(0.942g)を得た。構造式を表４に示した。
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.94(3H, t, J=7.4Hz), 1.30-1.50(3H, m), 1.50-1.90(8H, m), 2.00-2.15(1H, m), 2.32(3H, s), 2.36(1H, t, J=11.3Hz), 2.50(1H, brs), 2.85-3.10(2H, m), 3.40-3.50(2H, m), 3.60-3.85(4H, m), 3.90-4.00(4H, m), 9.55(1H, brs)
【００６９】
Ｎ−{[(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−イル]カルボニル}−Ｎ−プロピルカルバミン酸フェニル及び２−アミノエタノールの代わりに対応するフェニルカルバメート及びアミンを用い参考例６−１と同様の方法により、参考例６−２〜参考例６−７を合成した。これらを表４に示した。
【００７０】
【表４】
2016160206.tif 000013
表４における参考例６−１〜６−５の構造式は絶対配置を示し、参考例６−６〜６−７の構造式は相対配置を示す。
【００７１】
参考例６−２〜参考例６−７の物性値を以下に示した。
【００７２】
参考例６−２
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.94(3H, t, J=7.4Hz), 1.30-1.50(3H, m), 1.50-1.80(9H, m), 1.80-1.90(1H, m), 2.00-2.15(1H, m), 2.32(3H, s), 2.36(1H, t, J=11.2Hz), 2.85-3.10(3H, m), 3.44(2H, q, J=6.2Hz), 3.55-3.85(4H, m), 3.90-4.00(4H, m), 9.41(1H, brs)
【００７３】
参考例６−３
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：1.25(3H, t, J=6.8Hz), 1.35-1.50(3H, m), 1.50-1.90(6H, m), 2.00-2.15(1H, m), 2.32(3H, s), 2.36(1H, t, J=11.2Hz), 2.49(1H, br), 2.90-3.10(2H, m), 3.40-3.50(2H, m), 3.70-4.00(8H, m), 9.55(1H, brs)
【００７４】
参考例６−４
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：1.20(3H, d, J=6.8Hz), 1.25(3H, t, J=6.9Hz), 1.30-1.50(3H, m), 1.50-1.90(6H, m), 2.00-2.15(1H, m), 2.32(3H, s), 2.36(1H, t, J=11.2Hz), 2.50-2.75(1H, m), 2.90-3.10(2H, m), 3.56(1H, dd, J=10.9, 6.8Hz), 3.69(1H, dd, J=10.9, 3.5Hz), 3.75-4.10(7H, m), 9.30-9.50(1H, m)
【００７５】
参考例６−５
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：1.20(3H, d, J=6.8Hz), 1.24(3H, t, J=7.1Hz), 1.35-1.50(3H, m), 1.50-1.90(6H, m), 2.00-2.15(1H, m), 2.25-2.40(4H, m), 2.65(1H, br), 2.90-3.10(2H, m), 3.56(1H, dd, J=11.0, 6.7 Hz), 3.69(1H, dd, J=11.0, 2.6Hz), 3.80-4.10(7H, m), 9.40(1H, brs)
【００７６】
参考例６−６
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.07(6H, s), 0.90(9H, s), 1.30-1.50(3H, m), 1.50-1.90(8H, m), 2.00-2.10(1H, m), 2.24(6H, s), 2.28(3H, s), 2.36(1H, t, J=11.3Hz), 2.43(2H, t, J=6.5Hz), 2.85-2.95(1H, m), 3.05-3.20(1H, m), 3.30-3.45(2H, m), 3.67(2H, t, J=6.0Hz), 3.75-4.00(6H, m), 9.26(1H, brs)
【００７７】
参考例６−７
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.06(6H, s), 0.90(9H, s), 1.30-1.50(3H, m), 1.50-1.90(10H, m), 2.00-2.10(1H, m), 2.21(6H, s), 2.25-2.40(6H, m), 2.85-2.95(1H, m), 3.05-3.20(1H, m), 3.25-3.35(2H, m), 3.67(2H, t, J=6.0Hz), 3.70-4.00(6H, m), 9.23(1H, brs)
【００７８】
参考例７−１
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−[(３Ｒ，４ａＲ，８ａＲ)−１−メチル−６−オキソデカヒドロキノリン−３−カルボニル]−１−プロピル尿素
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−{[(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−イル]カルボニル}−１−プロピル尿素（参考例６−１）(0.940g)及びテトラヒドロフラン(2.5mL)の混合物に2mol/L塩酸(12.3mL)を加え、その混合物を室温にて１４時間撹拌した。反応混合物にtert−ブチルメチルエーテルを加えて洗浄後、水層に炭酸カリウムを加えてアルカリ性にした。混合物を酢酸エチルにて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮し、表題化合物(0.752g)を得た。構造式を表５に示した。
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.95(3H, t, J=7.4Hz), 1.45-1.70(3H, m), 1.70-1.90(2H, m), 1.95-2.10(1H, m), 2.20(1H, t, J=13.7Hz), 2.25-2.55(9H, m), 2.90-3.10(2H, m), 3.40-3.50(2H, m), 3.60-3.85(4H, m), 9.50(1H, brs)
【００７９】
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−{[(３'Ｒ，４'ａＲ，８'ａＲ)−１'−メチルオクタヒドロ−１'Ｈ−スピロ[１，３−ジオキソラン−２，６'−キノリン]−３'−イル]カルボニル}−１−プロピル尿素の代わりに対応するケタールを用い参考例７−１と同様の方法により、参考例７−２〜参考例７−７を合成した。これらを表５に示した。
【００８０】
【表５】
2016160206.tif 000014
表５における参考例７−１〜７−５の構造式は絶対配置を示し、参考例７−６〜７−７の構造式は相対配置を示す。
【００８１】
参考例７−２〜参考例７−７の物性値を以下に示した。
【００８２】
参考例７−２
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：0.94(3H, t, J=7.4Hz), 1.45-1.90(8H, m), 1.95-2.10(1H, m), 2.20(1H, t, J=13.7Hz), 2.30-2.55(8H, m), 2.80-3.10(3H, m), 3.45(2H, q, J=6.2Hz), 3.55-3.85(4H, m), 9.36(1H, brs)
【００８３】
参考例７−３
MS(ESI, m/z)：326(M+H)+
【００８４】
参考例７−４
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：1.21(3H, d, J=6.8Hz), 1.26(3H, t, J=7.0Hz), 1.45-1.65(2H, m), 1.70-1.90(2H, m), 1.95-2.10(1H, m), 2.15-2.25(1H, m), 2.30-2.55(8H, m), 2.57(1H, t, J=5.5Hz), 2.95-3.15(2H, m), 3.50-3.65(1H, m), 3.65-3.75(1H, m), 3.75-3.95(2H, m), 3.95-4.10(1H, m), 9.35(1H, brs)
【００８５】
参考例７−５
１H-NMR（CDCl3）δ ppm：1.21(3H, d, J=6.8Hz), 1.26(3H, t, J=7.0Hz), 1.45-1.65(2H, m), 1.70-1.90(2H, m), 1.95-2.10(1H, m), 2.15-2.25(1H, m), 2.30-2.55(8H, m), 2.57(1H, t, J=5.4Hz), 2.95-3.15(2H, m), 3.50-3.65(1H, m), 3.65-3.75(1H, m), 3.80-3.95(2H, m), 3.95-4.10(1H, m), 9.35(1H, brs)
【００８６】
参考例７−６
MS(ESI, m/z)：383(M+H)+
【００８７】
参考例７−７
MS(ESI, m/z)：397(M+H)+
【００８８】
実施例１−１
１−[(４ａＲ，６Ｒ，８ａＲ)−２−アミノ−３−シアノ−８−メチル−４，４ａ，５，６，７，８，８ａ，９−オクタヒドロチエノ[３，２−ｇ]キノリン−６−カルボニル]−３−(２−ヒドロキシエチル)−１−プロピル尿素（化合物１−１）
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−[(３Ｒ，４ａＲ，８ａＲ)−１−メチル−６−オキソデカヒドロキノリン−３−カルボニル]−１−プロピル尿素（参考例７−１）(940mg)およびエタノール(28mL)の混合物に、室温撹拌下、マロノニトリル(207mg)、モルホリン(0.29mL)、次いで単体硫黄(94mg)を加え、５５℃に昇温して２時間撹拌した。室温に冷却後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣をアミノプロピルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−７％メタノール／酢酸エチル，グラジエント溶出）で精製して表題化合物(1.023g)を得た。構造式を表６に示した。
１H-NMR（MeOH-d4）δ ppm：0.95(3H, t, J=7.4Hz), 1.49(1H, q, J=12.5Hz), 1.55-1.70(2H, m), 1.70-1.85(1H, m), 2.00-2.25(3H, m), 2.25-2.40(4H, m), 2.42(1H, t, J=11.3Hz), 2.60(1H, dd, J=16.4, 4.7Hz), 2.90-3.05(2H, m), 3.10-3.25(1H, m), 3.37(2H, t, J=5.6Hz), 3.55-3.80(4H, m)
【００８９】
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−[(３Ｒ，４ａＲ，８ａＲ)−１−メチル−６−オキソデカヒドロキノリン−３−カルボニル]−１−プロピル尿素の代わりに対応する６−オキソデカヒドロキノリンを用い実施例１−１と同様の方法により、化合物１−２〜化合物１−７を合成した。これらを表６に示した。
【００９０】
【表６】
2016160206.tif 000015
表６における化合物１−１〜１−５の構造式は絶対配置を示し、化合物１−６〜１−７の構造式は相対配置を示す。
【００９１】
化合物１−２〜化合物１−７の物性値を以下に示した。
【００９２】
化合物１−２
１H-NMR（CDCl3）δppm：0.95(3H, t, J=7.4Hz), 1.45-1.90(6H, m), 1.95-2.15(2H, m), 2.15-2.30(1H, m), 2.30-2.50(5H, m), 2.60-2.75(1H, m), 2.85-3.00(3H, m), 3.00-3.15(1H, m), 3.46(2H, q, J=6.2Hz), 3.60-3.90(4H, m), 4.65(2H, s), 9.39(1H, brs)
【００９３】
化合物１−３
１H-NMR（CDCl3）δppm：1.27(3H, t, J=7.0Hz), 1.45-1.65(1H, m), 1.70-1.90(1H, m), 1.95-2.15(2H, m), 2.15-2.30(1H, m), 2.30-2.55(6H, m), 2.60-2.75(1H, m), 2.90-3.15(3H, m), 3.40-3.55(2H, m), 3.78(2H, t, J=5.0Hz), 3.80-3.95(2H, m), 4.65(2H, s), 9.53(1H, brs)
【００９４】
化合物１−４
１H-NMR（CDCl3）δppm：1.21(3H, d, J=6.9Hz), 1.27(3H, t, J=7.0Hz), 1.45-1.65(1H, m), 1.70-1.90(1H, m), 1.95-2.15(2H, m), 2.15-2.30(1H, m), 2.30-2.50(5H, m), 2.50-2.75(2H, m), 2.90-3.15(3H, m), 3.59(1H, dd, J=10.9, 6.5Hz), 3.70(1H, dd, J=10.9, 3.7Hz), 3.75-4.10(3H, m), 4.65(2H, s), 9.38(1H, brs)
【００９５】
化合物１−５
１H-NMR（CDCl3）δppm：1.22(3H, d, J=6.8Hz), 1.27(3H, t, J=7.1Hz), 1.50-1.65(1H, m), 1.70-1.90(1H, m), 1.95-2.15(2H, m), 2.15-2.30(1H, m), 2.30-2.50(5H, m), 2.55-2.75(2H, m), 2.90-3.15(3H, m), 3.50-3.65(1H, m), 3.65-3.75(1H, m), 3.88(2H, q, J=7.1Hz), 3.95-4.10(1H, m), 4.66(2H, s), 9.38(1H, brs)
【００９６】
化合物１−６
１H-NMR（CDCl3）δppm：1.45-1.65(1H, m), 1.65-1.90(3H, m), 1.95-2.15(2H, m), 2.15-2.30(7H, m), 2.30-2.50(7H, m), 2.60-2.70(1H, m), 2.90-3.00(2H, m), 3.10-3.30(1H, m), 3.35-3.45(2H, m), 3.55-3.65(2H, m), 3.90-4.10(2H, m), 4.65(2H, s), 9.21(1H, br)
【００９７】
化合物１−７
１H-NMR（CDCl3）δppm：1.45-1.60(1H, m), 1.65-1.90(5H, m), 1.95-2.15(2H, m), 2.15-2.50(14H, m), 2.60-2.75(1H, m), 2.90-3.00(2H, m), 3.10-3.20(1H, m), 3.30-3.40(2H, m), 3.60(2H, t, J=5.5Hz), 3.90-4.05(2H, m), 4.67(2H, s), 9.36(1H, brs)
【００９８】
実施例２
１−[(４ａＲ，７Ｒ，８ａＲ)−２−アミノ−５−メチル−４，４ａ，５，６，７，８，８ａ，９−オクタヒドロチアゾロ[４，５−ｇ]キノリン−７−カルボニル]−３−(２−ヒドロキシエチル)−１−プロピル尿素（化合物２）
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−[(３Ｒ，４ａＲ，８ａＲ)−１−メチル−６−オキソデカヒドロキノリン−３−カルボニル]−１−プロピル尿素（参考例７−１）(200mg)および２−プロパノール(5.9mL)の混合物に、室温撹拌下、ヨウ素(164mg)次いでチオウレア(99mg)を加え、１００℃にて１９時間撹拌した。反応混合物にヨウ素(163mg)を加え、１００℃にて１０時間撹拌した。室温に冷却後、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、塩化メチレン／メタノール混合溶媒(塩化メチレン：メタノール＝９：１)にて抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧下濃縮した。残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−１２％メタノール／酢酸エチル，グラジエント溶出）で精製して表題化合物(90mg)を得た。構造式を表７に示した。
１H-NMR（CDCl3）δppm：0.95(3H, t, J=7.4Hz), 1.45-1.75(3H, m), 1.75-1.95(1H, m), 1.95-2.15(2H, m), 2.20-2.55(7H, m), 2.65-2.75(1H, m), 2.90-3.15(3H, m), 3.40-3.55(2H, m), 3.60-3.90(4H, m), 4.72(2H, s), 9.52(1H, brs)
【００９９】
実施例３
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−[(４ａＲ，７Ｒ，８ａＲ)−５−メチル−４，４ａ，５，６，７，８，８ａ，９−オクタヒドロピラゾロ[３，４−ｇ]キノリン−７−カルボニル]−１−プロピル尿素（化合物３）
３−(２−ヒドロキシエチル)−１−[(３Ｒ，４ａＲ，８ａＲ)−１−メチル−６−オキソデカヒドロキノリン−３−カルボニル]−１−プロピル尿素（参考例７−１）(68mg)及びトルエン(1.3mL)の混合物に、室温撹拌下、ｔｅｒｔ−ブトキシビス(ジメチルアミノ)メタン(0.046mL)を加え、１時間還流した。反応混合物にｔｅｒｔ−ブトキシビス(ジメチルアミノ)メタン(0.021mL)を加え、３０分間還流した。反応混合物にｔｅｒｔ−ブトキシビス(ジメチルアミノ)メタン(0.021mL)を加え、３０分間還流した。反応混合物にｔｅｒｔ−ブトキシビス(ジメチルアミノ)メタン(0.021mL)を加え、３０分間還流した。室温に冷却後、反応混合物を減圧下濃縮した。残渣をアミノプロピルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：０％−２０％メタノール／酢酸エチル，グラジエント溶出）で精製して１−{(３Ｒ，４ａＲ，８ａＲ)−７−[(ジメチルアミノ)メチリデン] −１−メチル−６−オキソデカヒドロキノリン−３−カルボニル}−３−(２−ヒドロキシエチル)−１−プロピル尿素(19mg)を得た。
MS(ESI, m/z):395(M+H)+
【０１００】
１−{(３Ｒ，４ａＲ，８ａＲ)−７−[(ジメチルアミノ)メチリデン] −１−メチル−６−オキソデカヒドロキノリン−３−カルボニル}−３−(２−ヒドロキシエチル)−１−プロピル尿素(19mg)およびエタノール(1mL)の混合物に、室温撹拌下、ヒドラジン(0.002mL)を加え、同温度にて２３時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮した。残渣をアミノプロピルシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶出溶媒：５％メタノール／酢酸エチル）で精製して表題化合物(2.3mg)を得た。構造式を表７に示した。
１H-NMR（CDCl3）δppm：0.95(3H, t, J=7.4Hz), 1.45-1.75(3H, m), 1.75-1.95(1H, m), 1.95-2.10(2H, m), 2.20-2.50(6H, m), 2.80-2.95(1H, m), 2.95-3.05(1H, m), 3.05-3.20(2H, m), 3.40-3.55(2H, m), 3.65-3.90(4H, m), 7.33(1H, s), 9.51(1H, brs)
【０１０１】
【表７】
2016160206.tif 000016
表７における化合物２及び化合物３の構造式は絶対配置を示す。
【０１０２】
試験例１
ヒトドパミンＤ２受容体刺激作用確認試験
１）ヒトドパミンＤ２受容体発現プラスミドの作製
Ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｃＤＮＡ（日本ベクトン・ディッキンソン）を鋳型として、配列番号１に示したフォワードプライマー、配列番号２に示したリバースプライマーおよびＨｅｒｃｕｌａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてＰＣＲを実施した。そのＰＣＲ増幅産物をプラスミド（ｐｃＤＮＡ  ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｔｏｐｏ（登録商標）、インビトロジェン）に組み込んだ。その組み込んだプラスミドを大腸菌（ワンショットＴＯＰ１０コンピテントセル、インビトロジェン）に導入した。その大腸菌を50μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にて１日培養した。選択したコロニーを、50μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて、ＰＣＲ増幅産物が組み込まれたプラスミドを精製した。そのプラスミドのタンパク発現部位の塩基配列（配列番号３）は、公知のデータベース（ＮＣＢＩ）にて登録されているヒトドパミンＤ２受容体の塩基配列（NM_000795）と、１塩基以外一致した。また、そのプラスミドの塩基配列（配列番号３）によって翻訳されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩにて登録されているヒトドパミンＤ２受容体のアミノ酸配列 (NM_000795) と完全に一致した。したがって、このプラスミドから得られるタンパク質はヒトドパミンＤ２受容体であることが確認された。配列番号３に示した塩基配列が挿入されたｐｃＤＮＡ  ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｔｏｐｏ（登録商標）を、ヒトドパミンＤ２受容体発現プラスミドとした。
２）ヒトドパミンＤ２受容体発現細胞の調製
（１）細胞培養
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン、最終濃度：ペニシリンとして100U/mL、ストレプトマイシンとして100μg/mL）およびウシ胎児血清（最終濃度：10％）を添加したＤ−ＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）液体培地（低グルコース、ピルビン酸およびＬ−グルタミン含有、インビトロジェン）中で、ＨＥＫ２９３細胞（大日本住友製薬）を５％ＣＯ-２ガスインキュベーター内で３７℃にて培養した。
【０１０３】
（２）細胞の継代
ほぼコンフルエントなＨＥＫ２９３細胞を、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline、インビトロジェン）にて洗い、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ (インビトロジェン)にて剥がし、上記液体培地にて懸濁した。遠心後、上清を取り除き、その細胞を培地にて希釈し、細胞数を計測した。その後、細胞を適切な濃度で播種した。
【０１０４】
（３）ヒトドパミンＤ２受容体安定発現ＨＥＫ２９３細胞の樹立
ヒトドパミンＤ２受容体発現プラスミドを、ＳｃａＩで消化し直鎖状プラスミドにした。その直鎖状プラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にリポフェクション法（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（インビトロジェン）にて導入した。1 mg/mLのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（インビトロジェン）を用い、ネオマイシン耐性細胞を得た後、３）で後述する方法により細胞株を選択した。
【０１０５】
３）ヒトドパミンＤ２受容体安定発現ＨＥＫ２９３細胞の確認と選択
（１）細胞の継代
ほぼコンフルエントなヒトドパミンＤ２受容体安定発現ＨＥＫ２９３細胞を、ＰＢＳにて洗い、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにて剥がし、抗生物質としてＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標） (最終濃度：0.1mg/mL)およびウシ胎児血清(最終濃度：10%)を含んだＤ−ＭＥＭ液体培地(低グルコース、ピルビン酸およびＬ−グルタミン含有)を加えた。遠心後、上清を取り除き、細胞を上記液体培地にて希釈した。その細胞を細胞計測した後、適切な濃度で播種した。
【０１０６】
（２）細胞の準備
ほぼコンフルエントなヒトドパミンＤ２受容体安定発現ＨＥＫ２９３細胞を、ＰＢＳにて洗い、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにて剥がし、ウシ胎児血清(最終濃度：10%)および ＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）Ｉ(インビトロジェン、 最終濃度：2mM)を含んだＤ−ＭＥＭ液体培地(フェノールレッドフリー、低グルコースおよびピルビン酸含有、インビトロジェン)にて懸濁した。その懸濁液をポリＤ−リジンコートした９６ウェルマイクロプレート(ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標）、日本ベクトン・ディッキンソン）に細胞数5×104個/100μL/ウェルで播種した。その播種した細胞を５％ＣＯ２ガスインキュベーター内で３７℃にて培養した。Ｇｉ／ｏ蛋白質に共役するヒトドパミンＤ２受容体のｃＡＭＰ反応をカルシウム反応へ変換するために、その細胞に下記に示す手順でｐＬＥＣ１−Ｇｑｏ５−ＨＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を導入させた。
【０１０７】
（３）ｐＬＥＣ１−Ｇｑｏ５−ＨＡの導入
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉ
ｕｍ（インビトロジェン）を用いて、ｐＬＥＣ１−Ｇｑｏ５−ＨＡを0.008g/Lに、またＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００を0.016g/Lに希釈し、室温にてインキュベートした。インキュベート後、そのｐＬＥＣ１−Ｇｑｏ５−ＨＡ希釈液とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００希釈液を等量混合し、室温にてインキュベートして複合体形成させた。その複合体を上記で準備した細胞に50μL/ウェルずつ分注した。その細胞を５％ＣＯ２ガスインキュベーター内で３７℃にて２日間培養し、細胞内カルシウム濃度の測定に使用した。
【０１０８】
（４）細胞内カルシウム濃度測定による確認
上記の強制発現細胞を用いて、各試験化合物の細胞内カルシウム濃度の測定を行った。各試験化合物の30mMジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液をアッセイバッファー (Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ、インビトロジェン）、20mMＨＥＰＥＳ（インビトロジェン）、1.3mM塩化カルシウム、0.5mM塩化マグネシウムおよび0.4mM硫酸マグネシウム含有、ｐＨ７．４）にて至適濃度に希釈した。
その強制発現細胞をアッセイバッファーにて洗浄し、蛍光カルシウム指示薬 （Ｆｌｕｏ−４  ＮＷ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓＴＭ））100μL/ウェルを添加させ、５％ＣＯ２ガスインキュベーター内で３７℃にてインキュベートした。インキュベート後に、各試験化合物50μL/ウェルを添加させ、細胞内カルシウム濃度をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ＩＩ（モレキュラーデバイス）を用いて蛍光シグナルとして測定した。反応が良好であったヒトドパミンＤ２受容体安定発現ＨＥＫ２９３細胞を、ｈＤ２Ｒ＃７細胞とした。
【０１０９】
４）ｈＤ２Ｒ＃７細胞からの膜破砕物の調製
（１）ｈＤ２Ｒ＃７細胞の継代
ほぼコンフルエントなｈＤ２Ｒ＃７細胞を、ＰＢＳにて洗い、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにて剥がし、抗生物質としてＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（最終濃度：0.1mg/mL)および胎児牛血清（最終濃度：10%)を含んだＤ−ＭＥＭ液体培地（低グルコース、ピルビン酸およびＬ−グルタミン含有)を加えた。遠心後、上清を取り除き、細胞を上記液体培地にて希釈した。その細胞を細胞計測した後、適切な濃度で播種した。
【０１１０】
（２）ｈＤ２Ｒ＃７細胞からの膜破砕物の調製
150mmディッシュ（イワキ）にてコンフルエンスに成長した細胞を、等張溶液（50mMトリス（シグマ）、2mMエチレンジアミン四酢酸（インビトロジェン）、125mM塩化ナトリウム（和光純薬工業）、ｐＨ７．４）にて回収し、４℃、１８８０×ｇで１０分間遠心分離し、細胞沈渣を等張溶液に懸濁した。1回の凍結融解をした後、細胞を４℃、１８８０×ｇで１０分間遠心分離し、細胞沈渣を等張溶液に懸濁した。細胞を４℃、１８８０×ｇで１０分間遠心分離し、細胞沈渣を等張溶液と破砕溶液（10mM炭酸水素ナトリウム（ナカライ）、5mMエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．５）に懸濁した。等張溶液と破砕溶液の体積比率を２とした。細胞を超音波破砕し、４℃、１８８０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を４℃、８００００×ｇで３０分間超遠心分離した。最終細胞沈渣をプロテアーゼインヒビターカクテル（ナカライ）を含む破砕溶液に懸濁し、使用するまで−８０℃で保存した。タンパク濃度をメーカーの説明書に従い、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ピアス）を用いて決定した。
【０１１１】
５）ヒトドパミンＤ２受容体刺激作用の決定
ヒトドパミンＤ２受容体の刺激作用を、Newman-Tancredi A.らの方法（Naunyn -Schmiedeberg’s Arch Pharmacol, l999年, 359巻, P.447-453）を一部改変して、［３５Ｓ］‐グアノシン５’‐［ガンマ‐チオ］三リン酸（［３５Ｓ］ＧＴＰgＳ、パーキンエルマー）の結合能を測定することによって決定した。試験化合物または陽性対象としてドパミン塩酸塩（Ｆｌｕｋａ）を、30mMとなるようジメチルスルホキシド（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ）に溶解した。両化合物を、最終濃度が100pM（試験化合物のみ）、1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM（ドパミン塩酸塩のみ）となるように、測定溶液（50mMトリス、100mM塩化ナトリウム、5mM塩化マグネシウム（ナカライ）、1mMエチレンジアミン四酢酸、1mMジチオスレイトール（和光純薬工業）、10μMグアノシンニリン酸（和光純薬工業）、０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ）、ｐＨ７．４）にて希釈した。上述の膜破砕物や［３５Ｓ］ＧＴＰgＳを、それぞれ最終濃度が0.06mg/mLまたは0.6nMとなるように測定溶液にて希釈した。段階希釈した化合物（50μL）、希釈した膜破砕物（50μL）及び希釈した［３５Ｓ］ＧＴＰgＳ（50μL）を、マルチスクリーン９６穴プレート（ミリポア）上で混ぜ、６０分間、室温で軽く震盪した。反応を、氷冷した洗浄溶液（50mMトリス、100mM塩化ナトリウム、5mM塩化マグネシウム、1mMエチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．４）による３回の洗浄と共に吸引濾過によって終了させた。プレート底部を６０℃で乾燥させた後、マイクロシンチ‐４０（パーキンエルマー）（30μL）をプレートに添加した。プレート上部をトップシール‐Ａ（パーキンエルマー）にて密封し、５〜１０分間軽く震盪した後、トップカウントＮＸＴ（登録商標）（パーキンエルマー）にて放射活性を決定した。データをグラフパッドプリズム４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用い、非線形回帰とシグモイドの用量‐反応曲線適合にて分析し、ＥＣ５０（その化合物の最大反応の半分を作り出すその化合物の濃度）を算出した。データをｎ＝２の平均値として示した。比較例として非麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストであるロピニロールを同様に試験した。これらの結果を表８に示した。
【０１１２】
【表８】
2016160206.tif 000017
【０１１３】
これらの試験の結果、本発明の化合物は、ロピニロールに比べて強力なヒトドパミンＤ２受容体刺激作用を示すことが明らかとなった。
【０１１４】
試験例２
ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用確認試験
１）ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体発現プラスミドの作製
Ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ｃＤＮＡ （クロンテック）を鋳型として、配列番号４に示したフォワードプライマー、配列番号５に示したリバースプライマーおよびＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（トウヨウボウ）を用いてＰＣＲを実施した。そのＰＣＲ増幅産物をプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｔｏｐｏ（登録商標））に組み込んだ。その組み込んだプラスミドを大腸菌（ワンショットＴＯＰ１０コンピテントセル）に導入した。その大腸菌を50μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地にて１日培養した。選択したコロニーを、50μg/mLのアンピシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン）を用いて、ＰＣＲ増幅産物が組み込まれた上記プラスミドを精製した。そのプラスミドのタンパク発現部位の塩基配列（配列番号６）は公知のデータベース（ＮＣＢＩ）にて登録されているヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体の塩基配列 (NM_000867) と、完全一致した。したがって、このベクターから得られるタンパク質はヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体であることが確認された。配列番号６に示した塩基配列が挿入されたｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−Ｔｏｐｏ（登録商標）を、ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体発現プラスミドとした。
【０１１５】
２）ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体発現細胞の調製
（１）細胞培養
抗生物質としてペニシリン-ストレプトマイシン溶液（最終濃度：ペニシリンとして100U/mL、ストレプトマイシンとして100μg/mL）およびウシ胎児血清(最終濃度：10％)を含んだＤ−ＭＥＭ液体培地(低グルコース、ピルビン酸およびＬ−グルタミン含有)を用いて、ＨＥＫ２９３細胞を、５％ＣＯ２ガスインキュベーター内で３７℃にて培養した。
【０１１６】
（２）細胞の継代
ほぼコンフルエントなＨＥＫ２９３細胞を、ＰＢＳにて洗い、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにて剥がし、上記液体培地を加えた。遠心後、上清を取り除き、細胞を培地にて希釈した。その希釈した細胞を細胞計測した後、適切な濃度で播種した。
【０１１７】
（３）細胞の準備
ほぼコンフルエントなＨＥＫ２９３細胞を、ＰＢＳにて洗い、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにて剥がし、ウシ胎児血清（最終濃度：10%）及びＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）Ｉ（最終濃度：2mM）を含んだＤ−ＭＥＭ液体培地（フェノールレッドフリー、低グルコースおよびピルビン酸含有）にて懸濁した。その懸濁液をポリＤ−リジンコートした９６ウェルマイクロプレート（ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ（登録商標））に細胞数5×104個/100μL/ウェルで播種した。その播種した細胞を、５％ＣＯ２ガスインキュベーター内で３７℃にて培養した。その細胞を下記に示す手順でヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体発現プラスミドを導入させた。
【０１１８】
（４）ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体プラスミド導入
ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ−Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍを用いて、ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体発現プラスミドを0.008g/Lに、またＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（インビトロジェン）を0.016g/Lに希釈し、室温にてインキュベートした。インキュベート後、そのヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体発現プラスミド希釈液とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００希釈液を等量混合し、室温にてインキュベートして複合体形成させた。その複合体を、上記で準備した細胞に50μL/ウェルずつ分注した。その細胞を５％ＣＯ２ガスインキュベーター内で３７℃にて２日間培養した。培養後、その細胞をヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体強制発現細胞として、細胞内カルシウム濃度の測定に使用した。
【０１１９】
３）ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用の決定
ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体の刺激作用を、細胞内カルシウム濃度を測定することによって決定した。各試験化合物または陽性対象としてセロトニン塩酸塩(シグマ)の30mMジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液をアッセイバッファー( (ＨＢＳＳ)、 20mMＨＥＰＥＳ、1.3mM塩化カルシウム、0.5mM塩化マグネシウムおよび0.4mM硫酸マグネシウム含有、ｐＨ７．４)にて至適濃度に希釈した。
その強制発現細胞をアッセイバッファーにて洗浄し、蛍光カルシウム指示薬 (Ｆｌｕｏ−４  ＮＷ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ)100μL/ウェルを添加させ、５％ＣＯ２ガスインキュベーター内で３７℃にてインキュベートした。インキュベート後に、各試験化合物50μL/ウェルを添加させ、細胞内カルシウム濃度をＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ＩＩ（モレキュラーデバイス）を用いて蛍光シグナルとして測定した。データをグラフパッドプリズム４．０を用い、非線形回帰とシグモイドの用量‐反応曲線適合にて分析し、ＥＣ５０（その化合物の最大反応の半分を作り出すその化合物の濃度）を算出した。データをｎ＝２の平均値として示した。比較例として非麦角系ドパミンＤ２受容体アゴニストであるロピニロールを同様に試験した。これらの結果を表９に示した。
【０１２０】
【表９】
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【０１２１】
これらの試験の結果、本発明の化合物は、ロピニロールに比べて極めて軽微なヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体刺激作用しか示さないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明の化合物は、優れたドパミンＤ２受容体刺激作用を有するので、パーキンソン病、レストレスレッグス症候群又は高プロラクチン血症の治療または予防剤として有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２３】
<配列番号１>
配列番号１は、配列番号３のＤＮＡを増幅するために使用されたフォワードプライマーの配列である。
<配列番号２>
配列番号２は、配列番号３のＤＮＡを増幅するために使用されたリバースプライマーの配列である。
<配列番号３>
配列番号３は、ヒトドパミンＤ２受容体を発現するように配列番号１および２のプライマーを用いて増幅されたタンパク発現部位のＤＮＡ配列である。
<配列番号４>
配列番号４は、配列番号６のＤＮＡを増幅するために使用されたフォワードプライマーの配列である。
<配列番号５>
配列番号５は、配列番号６のＤＮＡを増幅するために使用されたリバースプライマーの配列である。
<配列番号６>
配列番号６は、ヒトセロトニン５−ＨＴ２Ｂ受容体を発現するように配列番号４および５のプライマーを用いて増幅されたタンパク発現部位のＤＮＡ配列である。
【配列表】
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