(57)【要約】      （修正有）【課題】放射性核種診断(RD)、放射性核種療法(RNT)又は放射免疫療法(RIT)を必要とする神経内分泌腫瘍に対する診断又は処置において使用されるペプチド受容体放射性核種療法(PRRT)の腎臓毒性副作用に対する治療薬の提供。【解決手段】α1-ミクログロブリン(A1M)のＲＤ、ＲＮＴ又はＲＩＴとの併用処置剤として使用する方法。放射性核種で標識された化合物が、ソフトスタチン類似体であることが好ましい、ＡＩＭの使用方法。ＡＩＭの腎臓組織の保護効果を生かす、使用方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性核種診断(RD)、放射性核種療法(RNT)または放射免疫療法(RIT)を必要とする悪性病変のそれぞれ診断または処置において使用するためのα1-ミクログロブリン(A1M)であって、A1Mが、RD、RNTまたはRITとの併用処置剤として用いられるα1-ミクログロブリン(A1M)。
【請求項２】
A1Mが、RD、RNTまたはRITで観察される腎臓関連副作用を低減する、請求項１に記載の使用のためのA1M。
【請求項３】
RD、RNTまたはRITが、放射性核種で標識された化合物を用いることにより行われる、請求項１または２に記載の使用のためのA1M。
【請求項４】
放射性核種で標識された化合物が、受容体リガンド、アフィボディ分子、ダイアボディ、抗体断片および／またはその他の小分子からなる群より選択される、請求項３に記載の使用のためのA1M。
【請求項５】
化合物が、放射性核種で標識される、請求項３または４に記載の使用のためのA1M。
【請求項６】
放射性核種で標識された化合物が、ソマトスタチン類似体である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の使用のためのA1M。
【請求項７】
ソマトスタチン類似体が、オクトレオチド、ランレオチド、Tyr3-オクトロチド、Tyr3-オクトロテート、DOTADOC、DODATATE、DOTA-ランレオチド、パシレオチド、ドパスタチンおよびオクトレオチドLARからなる群より選択される、請求項６に記載の使用のためのA1M。
【請求項８】
悪性病変ががんである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのA1M。
【請求項９】
悪性病変が神経内分泌腫瘍である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのA1M。
【請求項１０】
放射性核種診断(RD)および放射性核種療法(RNT)または放射免疫療法(RIT)を必要とする悪性病変のそれぞれ診断または処置において使用するためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１１】
A1Mが、RD、RNTまたはRITで観察される腎臓関連副作用を低減する、請求項10に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１２】
放射性核種で標識された化合物が、受容体リガンド、アフィボディ分子、ダイアボディおよび抗体断片からなる群より選択される、請求項10または11に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１３】
放射性核種で標識された化合物が、放射性核種放出放射線と結びついたペプチドである、請求項10〜12のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１４】
放射性核種で標識された化合物が、ソマトスタチン類似体である、請求項10〜13のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１５】
ソマトスタチン類似体が、オクトレオチド、ランレオチド、Tyr3-オクトロチド、Tyr3-オクトロテート、DOTADOC、DODATATE、DOTA-ランレオチド、パシレオチド、ドパスタチンおよびオクトレオチドLARからなる群より選択される、請求項10〜14のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１６】
悪性病変ががんである、請求項10〜15のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１７】
悪性病変が神経内分泌腫瘍である、請求項10〜16のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１８】
放射性核種で標識された化合物が、RD、RNTまたはRITを必要とする対象者にｔ=０の時点で投与され、A1Mが、前記対象者にｔ=-60分からｔ=約30分の間の時点で投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mまたは請求項10〜17のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項１９】
放射性核種で標識された化合物が、RD、RNTまたはRITを必要とする対象者にｔ=０の時点で投与され、A1Mが、前記対象者にｔ=-30分からｔ=約30分の時点で投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mまたは請求項10〜17のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項２０】
放射性核種で標識された化合物が、RD、RNTまたはRITを必要とする対象者にｔ=０の時点で投与され、A1Mが、前記対象者にｔ=-10分からｔ=約10分の時点で投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mまたは請求項10〜17のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項２１】
A1Mと放射性核種で標識された化合物とが、本質的に同時に投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mまたは請求項10〜17のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項２２】
A1Mと放射性核種で標識された化合物とが、同時に投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mまたは請求項10〜17のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mおよび放射性核種で標識された化合物。
【請求項２３】
A1Mが、放射性核種注射後の最初の１週間に１日あたり複数回用量で投与される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのA1Mまたは請求項10〜17のいずれか１項に記載の使用のための放射性核種で標識された化合物。
【請求項２４】
腎臓損傷の処置で使用するためのA1M。
【請求項２５】
腎臓損傷が、RNTまたはRITに関連する影響である、請求項24に記載の使用のためのA1M。
【請求項２６】
腎臓損傷が、連鎖球菌感染、大腸菌感染(eHUS)、自己免疫病(SLE)、糖尿病などに関連する影響である、請求項24に記載の使用のためのA1M。
【請求項２７】
放射性核種診断(放射性核種イメージング)での望ましくない生物学的影響を低減することにおいて使用するためのA1M。
【請求項２８】
放射性核種診断(放射性核種療法)においてALARA原理を充足することにおいて使用するためのA1M。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性核種で標識された小分子を用いる神経内分泌腫瘍のような悪性病変の処置中の放射性核種診断(RD)、放射性核種療法(RNT)および放射免疫療法(RIT)において観察される腎臓関連副作用を低減するための、アルファ-１-ミクログロブリン(A1M)の使用に関する。小分子は、受容体リガンド(例えばソマトスタチン誘導体)、アフィボディ、ダイアボディおよび抗体断片(Fab、Fv、scFvなど)を含む。
さらに、本発明は、急性および／または慢性の腎臓損傷の処置における、A1Mの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去15年間に、ペプチド受容体放射性核種療法(PRRT)を用いて、転移性神経内分泌腫瘍の処置が成功している[1]。治療用放射性核種で標識されたオクトレオチドのようなソマトスタチン類似ペプチドを用いて、ソマトスタチン受容体陽性腫瘍を処置する[2]。しかし、腎臓毒性および慢性腎臓機能不全は、PRRTの典型的な副作用である。正荷電アミノ酸の注入のような保護方策にもかかわらず、近位尿細管再吸収および間質での滞留による腎臓機能の遅延型喪失が、PRRTを受けた患者において観察されている[1]。よって、腎臓は、PRRTにおける用量制限臓器である177Lu-DOTATATEで処置された患者は、１年あたり3.8%、90Y-DOTATOCで処置された患者は１年あたり7.3%のクレアチニンクリアランス喪失に苦しむことが観察されている[3]。候補小分子を用いる療法についての別のアプローチは、抗体のアフィボディ分子、ダイアボディおよび断片ならびにイムノコンジュゲート(すなわちFab、scFvなど)である。これらは、前臨床および臨床研究の両方において、高い腎臓放射活性と関連する高い腎臓蓄積を有することが示されている。
【０００３】
腎臓毒性に伴う問題は、十分には解決されておらず、PRRTを用いる際の安全性を増加させ、関連する臓器毒性を低減させる手段を同定または開発する必要性がまだ存在する。さらに、反復される放射性核種診断(放射性核種イメージング)中にも、電離放射線からの生物学的影響を低減するための手段を開発することは、ALATA(実行可能な限り低く(As Low As Reasonably Achievable))原理に利益を与え得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ペプチド受容体放射性核種療法(PRRT)は、神経内分泌腫瘍の処置のために臨床的に用いられている。ペプチドの糸球体濾過と、その後の局所的放射線照射およびラジカルの発生とによる腎臓毒性は、この方法の線量および有用性を制限する副作用である。α1-ミクログロブリン(A1M)は、放射線照射により誘導されるインビトロ細胞損傷および周囲の細胞への損傷を妨げることが示されている、ヒトラジカルスカベンジャータンパク質である。A1Mは、肝臓で合成され、血液に分泌され、血管外区画と平衡化され、腎臓でろ過される。
【０００５】
PRRTの腎臓毒性副作用に対するA1Mベースの治療を開発することを目的として、本発明者らは、この概念の第１の証明として、注入された組換えA1Mおよびソマトスタチン類似体オクトレオチドのマウスにおける動態および生体内分布を比較した。これらの分子はともに、主に腎臓に局在し、オクトレオチドと比較してA1Mの動態がより迅速であった。最大で、76%の注入したA1Mおよび46%の注入したオクトレオチドが、腎臓組織１グラムあたりi.v.注射のそれぞれ10および20分後に見出された。重要なことには、A1M分子は、注射の少なくとも60分後までインタクトで全長であることが示された。腎臓のオートラジオグラフィは、標識A1Mおよびオクトレオチドが、10〜60分後に皮質に主に局在したことを示した。免疫組織化学および蛍光顕微鏡により、これら２つの物質が近位尿細管の管腔および上皮細胞に主に共局在化していることが明らかになった。この結果は、A1Mおよびオクトレオチドの非常によく似た薬物動態および生体内分布を示し、よって、PRRT中に腎臓組織を保護するためにA1Mを用いることを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書で報告し、上に簡単に言及する結果に従って、本発明は、放射性核種療法において組み合わせて用いるための、A1MおよびPRRN(ペプチド受容体放射線核種)に関する。
より具体的には、本発明は、以下に関する。
放射性核種療法(RNT)または放射免疫療法(RIT)を必要とする悪性病変の処置において用いるためのα1-ミクログロブリン(A1M)であって、RNTまたはRITの併用処置剤として用いられるA1M、
放射性核種療法(RNT)または放射免疫療法(RIT)を必要とする悪性病変の処置において用いるための、A1Mおよび、放射性核種で標識した化合物、
腎臓損傷の処置において用いるためのA1M、
単回または複数回のイメージングセッションにおける放射性核種診断(核医学イメージング)中の電離放射線からの望ましくない生物学的影響の低減において用いるためのA1M。A1Mは、ALARA原理を達成するため、および患者に対する電離放射線の望ましくない影響を低減するために用いられる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下に記載するように、放射性核種で標識した化合物は、ペプチド受容体リガンド、アフィボディおよび抗体断片からなる群より選択される。放射性核種で標識した化合物は、放射線を放出する放射性核種とカップリングしたペプチドである。
PRRTは、放射線を放出する放射性核種とカップリングした小ペプチドを用いることにより行われる、分子標識療法のある形態である。小ペプチドは、ソマトスタチン類似体である。このような類似体は、オクトレオチド、ランレオチド、Tyr3-オクトレオチド(TOC)、Tyr3-オクトロテート(octrotate)(TATE)およびDOTA+-キレートDOTADOC、DODATATEおよびDOTA-ランレオチドを含む。その他のソマトスタチン類似体は、SOM230 (パシレオチド)、ドパスタチンおよびオクトレオチドLARを含む。ソマトスタチン類似体は、イットリウム-90 (90Y)またはルテチウム-177 (177Lu)のような中および／または高エネルギーベータ粒子を放射する放射性核種で標識され、患者に静脈内(i.v.)投与される。療法は、ソマトスタチン受容体陽性腫瘍を有する患者に対して行われる。神経内分泌腫瘍(NET)の全てではないが多くの形態は、１種以上のソマトスタチン受容体サブタイプを発現する。PRRNの投与後に、PRRNは、腫瘍上に局在化しているソマトスタチン受容体と結合し、PRRNは、腫瘍に保持される。電離放射線を放出する放射性核種の減衰は、組織にエネルギーを堆積させ、高い吸収線量をもたらす。
【０００８】
本明細書の関係では、本発明は、上記のような特定のPRRNに限定されないが、放射性核種標識小分子、アフィボディ分子、ダイアボディ、Fab、Fv、scFv断片およびその他のイムノコンジュゲートまたはその他の受容体リガンドのような、電離放射線を放出できる任意の適切な放射性核種で標識された任意の分子が本発明の範囲内に含まれることを意図する。A1Mの最適な保護効果を達成するために、選択されるPRRNは、A1Mに匹敵する動態で腎臓に分布することが好ましい。
【０００９】
上記のように、A1Mが有用である療法の１つは、神経内分泌腫瘍の処置にある。神経内分泌腫瘍(NET)は、原発腫瘍が転移するまで頻繁に無症状のままであるがんの不均質な群を含む。
他の療法は、腎臓損傷を導き得るものである。このような療法は、連鎖球菌感染、大腸菌(E.coli)感染(eHUS)、自己免疫病(SLE)、糖尿病などの処置を含む。
いずれにせよ、A1Mが腎臓組織に対して保護効果を有することが企図される。
【００１０】
神経内分泌腫瘍は、内分泌系および神経系の細胞から生じる新生物である。この種の腫瘍は、例えば小腸、十二指腸、胃または膵臓から生じるが、大腸もしくは肺またはその他の多くの組織からも生じる胃腸膵管腫瘍(いわゆるDEP-NET)を含む。腸で発生する神経内分泌腫瘍もカルチノイド腫瘍とよばれる。
がんが一旦広がると、処置は難しくなり、外科的切除は難しいかまたは見込みがない。手術、ソマトスタチン類似体、化学療法などを含む、進行NETを処置するためのいくつかの処置オプションが存在するが、これらの多くは、完全寛解のためには最適以下である。療法の選択は、疾患のステージならびに腫瘍のサイズおよび攻撃性により決定される。
PRRTは、進行性NETの制御において高度に効果的であるとみられる。完全奏功率は比較的低いが、処置後に部分寛解し安定疾患を有する患者のパーセンテージは高い。
【００１１】
しかし、上記のように、PRRT処置のオプションは、用量制限腎臓放射性毒性をもたらす腎臓再吸収および放射性標識ペプチドの保持により制限される。放射線による腎障害が、いくらかの患者において記載されている。腎臓の保護を達成するために、PRRNは、正荷電アミノ酸、ウシ-ゼラチン溶液(Gelofusine)またはアルブミン断片と同時投与されている。しかし、最適な解決法はまだ見出されていない。
放射性核種腫瘍療法の機構は、標的組織での細胞死(壊死およびアポトーシス)を含むが、「酸化ストレス」を含む生存細胞に対する非致死的ストレスの様々な形態も含む。酸化ストレスは、溶媒および細胞成分の電離、ならびに電離放射線からの誘導された細胞壊死による２次的酸化ストレスにより誘導される。酸化ストレスは、酸化性化合物の生成とオキシダントの無毒化/酸化された組織の修復との間の不均衡による組織酸化の増加と定義される[4]。酸化ストレスの主要なメディエータは、活性酸素種(ROS)である。ROSおよびフリーラジカルは、タンパク質、DNAおよびその他の分子成分と反応して、ヒト細胞および組織の酸化を引き起こし、このことは、標的分子の望ましくない改変、機能喪失および細胞死を導く。壊死は、主に酸化プロセスの区画化を破壊することにより酸化ストレスを誘導する。放射性核種療法中に、「傍観者効果」、すなわち照射に直接曝露されていない細胞が間接的な損傷に苦しむストレス応答が観察されることがある。傍観者効果は、直接照射された細胞からのストレス因子の伝搬により誘導され、非照射傍観者細胞での細胞死、ゲノム不安定化および遺伝子発現の変化として発現される[4〜7]。オキシダントおよびROSは、傍観者効果のメディエータであると提案されている[8〜10]。
【００１２】
抗酸化剤は、オキシダントを消去するかまたは有害な酸化反応を妨げる保護因子である[4]。ヒト生物体は、酸化ストレスに応答して抗酸化剤を生成できる。このような内因性抗酸化剤は、スーパーオキシド分解性酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)、過酸化水素分解性酵素であるカタラーゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼ、ならびにヘム分解性酵素であるヘムオキシゲナーゼ-１(HO-1)を含む。正常に発生する26 kDaの血漿および組織タンパク質であるα1-ミクログロブリン(A1M)は、ラジカルおよびヘムの両方のスカベンジャーとして、ならびにレダクターゼおよび酸化の阻害剤として機能することにより酸化性組織損傷に対する保護に関与することが最近示された[11〜15]。いくつかの最近の論文は、A1Mが、ミトコンドリアにおいて蓄積し、ミトコンドリア機能を保護することを部分的な理由として[19]、細胞培養物および臓器外植片を酸化的損傷から保護することを証明する[16〜18]。実際に、ヒト組換えA1Mの注入を用いて、動物モデルにおいて、酸化ストレス関連疾患である子癇前症[20]およびヘモグロビン誘導糸球体損傷[21]のインビボ処置が成功した。本発明において特に興味深いことには、A1Mは、照射細胞培養物の傍観者細胞における細胞死、アポトーシスおよびストレス応答遺伝子の上方制御を抑制することが示されている[22、23]。
【００１３】
薬物動態研究に基づいて、本発明者らは、A1Mおよびソマトスタチン類似体ベースのPRRNがともに、投与後に腎臓に迅速に行きわたることを見出した。A1Mの保護作用に必要なことは、タンパク質が腎臓に局在化した後に迅速に分解されないことである。本明細書の実施例において証明されるように、腎臓において見出されるA1Mの大部分は、i.v.注射の少なくとも60分後にまだインタクトであった。よって、A1Mは、PRRTにより引き起こされる腎臓ダメージに対して保護効果を発揮できる。
本発明者らは、i.v.投与された125Ｉ-標識A1Mの＞30%が、数分以内に腎臓に局在化されたことを示した。本発明者らの観察および放射線誘発組織ダメージに対するA1Mの示された保護特性に基づいて、本発明者らは、A1M注入を、腎臓毒性を低減することによりPRRTを改善するための方法として用いることを提案する。このようなA1Mベースの方法に必要なことは、治療用A1Mおよびオクトレオチドの高度の共局在化である。本明細書中の実験の部分において、組換えヒトA1Mおよびオクトレオチドの動態および生体内分布を、臓器および細胞レベルで調べた。
治療用A1Mの注入がPRRTを受ける患者で観察される副作用に対して保護できるかを評価するために、A1Mとこれらの腫瘍の治療において用いられるソマトスタチン類似体との動態および分布を研究および比較することが重要である。臓器および細胞の両方のレベルで、これらの分子の共局在化の程度は、特に興味の対象であり、いくつかのイメージング技術を用いて本明細書中の実験の部分で報告するように、その程度を十分に調べた。
【００１４】
行った生体内分布研究は、A1Mおよびオクトレオチドのそれぞれの注射の10および20分後の最大取り込み、ならびにクリアランス段階中のオーバーラップする動態とともに、両方の分子について腎臓における高い特異的取り込みを示した(図１)。このことは、任意の保護A1Mの注入がオクトレオチド注入と同時またはそのすぐ後に行われるべきであることを示唆する。腎臓からのA1Mの迅速なクリアランスは、腎臓を完全に保護するためにA1Mの数回の注入が必要であり得ることも示唆する。
生体内分布の結果を反映して、非侵襲性SPECTイメージングは、両方の分子について腎臓での高い取り込みを示す。オクトレオチドおよびA1Mの両方のより高い濃度が、髄質と比較して腎臓皮質で観察でき、このことは、これらの領域で20分後にすでに共局在化があることを示唆する。
【００１５】
A1Mの保護作用に必要なことは、もちろん、タンパク質が、腎臓への局在化の直後に分解されないことである。よって、本発明者らは、腎臓ホモジネート中のタンパク質のサイズを調べた。図２から明らかなように、腎臓で見出されるA1Mの大部分は、注射後少なくとも60分まで全長サイズを示す。腎臓でのA1Mの自然な経路は、ほとんどの血漿小タンパク質と同様に、原尿への血液からの糸球体濾過と、その後の近位尿細管上皮における再吸収およびリソソーム分解とである[29、30]。少量のA1Mは、まだ尿中で見出されることがある[24]。よって、大部分は近位尿細管細胞で分解されるが、著しい量のA1Mが尿細管再吸収および分解を逃れることができ、最初の10〜60分間の間にインタクトで機能的なままで残ると推測できる。
【００１６】
α1-ミクログロブリン-全般的な背景
A1Mは、高い割合で肝臓で合成され、血流中に分泌され、血管壁を横切って全ての臓器の血管外区画に輸送される。このタンパク質は、他の組織(血液細胞、脳、腎臓、皮膚)でも合成されるが、より低い割合である。サイズが小さいために、遊離のA1Mは、血液から腎臓中に迅速に濾過される。
A1Mは、動物、植物および細菌からのタンパク質の一群であり、保存された３次元構造を有するが多様な機能を有するリポカリンスーパーファミリーのメンバーである。各リポカリンは、内部が疎水性のβバレルポケットに折り畳まれる160〜190アミノ酸の鎖からなる。少なくとも12のヒトリポカリン遺伝子が知られている。A1Mは、今までのところ哺乳動物、鳥類、魚類およびカエルにおいて同定されている26 kDaの血漿および組織タンパク質である。Ｘ線結晶構造解析により決定されたA1Mの３次元構造を図３に示す。A1Mは、高い割合で肝臓で合成され、血流中に分泌され、血管壁を横切って全ての臓器の血管外区画に迅速に(T1/2 = ２〜３分)輸送される。A1Mは、遊離の単量体の形およびより大きい分子(IgA、アルブミン、プロトロンビン)との共有的複合体の形の両方で、血液および間質組織において見出される。サイズが小さいために、遊離のA1Mは、血液から腎臓中に迅速に濾過される。大部分は次いで再吸収されるが、著しい量が尿中に排出される。
【００１７】
A1Mの配列および構造の特性
ヒトA1Mの全長配列は、知られている。このタンパク質は、183アミノ酸残基を有するポリペプチドからなる。多くのさらなるA1M cDNAおよび／またはタンパク質が、他の哺乳動物、鳥類、両生類および魚類から検出、単離および／または配列決定されている。A1Mのペプチド鎖の長さは、主にＣ末端での変動により種間でわずかに異なる。異なる推定アミノ酸配列のアラインメント比較は、同一性のパーセンテージがげっ歯類または肉蹄類(ferungulates)とヒトとの間でおよそ75〜80%変動し、魚類と哺乳動物との間でおよそ45%まで下がることを示す。34位の遊離システイン側鎖は、保存されている。この基は、酸化還元反応(以下を参照されたい)、その他の血漿タンパク質との複合体形成、および黄色-茶色色素との結合に関与することが示されている。A1Mの３次元構造は、C34が溶媒に曝露され、リポカリンポケットの開口部付近にあることを示す(図３を参照されたい)。
【００１８】
本明細書の関係では、「α1-ミクログロブリン」との用語は、配列番号１(ヒトA1M)および配列番号２(ヒト組み換えA1M)で同定されるα1-ミクログロブリンならびに同様の治療活性を有するそのホモログ、断片またはバリアントをカバーすることを意図する。よって、本明細書で用いるA1Mは、配列番号１または配列番号２と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を意味することを意図する。好ましくは、本明細書で用いるA1Mは、配列番号１または配列番号２と少なくとも90％の配列同一性を有する。さらにより好ましくは、本明細書で用いるA1Mは、配列番号１または配列番号２と少なくとも95％、例えば99％または100％の配列同一性を有する。好ましい態様では、α1-ミクログロブリンは、本明細書で同定する配列番号１または２のとおりである。図12では、ヒトA1Mおよびヒト組換えA1Mのアミノ酸配列(それぞれ配列番号１および２)ならびに対応するヌクレオチド配列(それぞれ配列番号３および４)の配列表を示す。しかし、以下で同定するタンパク質の重要な部分を有するA1Mのホモログ、バリアントおよび断片も、本明細書で用いる用語A1Mに含まれる。
上記のように、A1Mのホモログを、本明細書の記載に従って用いることもできる。理論的に、魚類(プレイス)からである現在のところ見出された最も原始的なものを含む全ての種からのA1Mを、本明細書に記載する目的のために用いることができる。A1Mは、ヒト、オランウータン、リスザル、ラット、ハダカデバネズミ、マウス、ウサギ、モルモット、ウシ、カエル、ニワトリ、セイウチ、マナティおよびプレイスからの単離形でも利用可能である。
【００１９】
もしA1Mとビクニンとが同じ前駆体を有するとしても、それらは異なるアミノ酸組成を有し、且つ異なる性質を有することに留意することが重要である。A1Mはいわゆるリポカリンファミリーに属するのに対して、ビクニン(ウリナスタチンとも表される)はプロテアーゼインヒビタースーパーファミリーに属する。
【００２０】
A1Mのホモログ、バリアントおよび断片を考慮して、以下のものは、抗酸化効果のためにタンパク質の重要な部分として同定されている:
Y22 (チロシン、22位、塩基対64〜66)
C34 (システイン、34位、塩基対100〜102)
K69 (リジン、69位、塩基対205〜207)
K92 (リジン、92位、塩基対274〜276)
K118 (リジン、118位、塩基対352〜354)
K130 (リジン、130位、塩基対388〜390)
Y132 (チロシン、132位、塩基対394〜396)
L180 (ロイシン、180位、塩基対538〜540)
I181 (イソロイシン、181位、塩基対541〜543)
P182 (プロリン、182位、塩基対544〜546)
R183 (アルギニン、183位、塩基対547〜549)
(本書面全体を通してのアミノ酸およびヌクレオチドの番号付けは、配列番号１および３に言及する、図３および４も参照されたい。他の種からのその他のA1M、A1M類似体またはその組み換え配列を用いるならば、当業者は、活性部位または酵素活性を担う部位のアミノ酸をどのようにして同定するかを知っている)。
よって、A1Mが例えば配列番号１または２と80％(または90％または95％)の配列同一性を有する場合は、上記のアミノ酸は当該分子中の適切な位置に存在することが好ましい。
【００２１】
ヒトA1Mは、３つの位置にてオリゴ糖で置換されており、N17およびN96に連結する２つのシアリル化複合型でおそらく二分岐の炭水化物と、T5に連結するもう１つの単純オリゴ糖である。異なる種からのA1Mタンパク質の炭水化物含量は、しかし、ツメガエル(Xenopus leavis)における全く糖鎖修飾なしから異なる糖鎖修飾パターンの範囲まで大きく変動する。しかし、ヒトにおけるN96に相当する１つの糖鎖修飾部位は哺乳動物において保存されており、この特定の炭水化物が機能的に重要であり得ることを示唆する。
A1Mは、血漿または尿から精製すると黄色-茶色に着色する。この色は、主にポケットの入口にある様々なアミノ酸側鎖基と共有結合している不均質な化合物により引き起こされる。これらの改変は、A1Mによりインビボで共有的に捕捉される有機オキシダント、例えばヘム、キヌレニンおよびチロシル基の酸化分解生成物を表す。
【００２２】
A1Mは、電荷およびサイズが不均質でもあり、茶色の着色がより強いA1M分子は、より負に荷電している。この不均質性の可能性のある説明は、異なる側基が異なる基により様々な程度で改変され、改変がタンパク質の正味電荷を変化させることである。共有的に連結された着色物質は、C34およびK92、K118およびK130に局在化し、後者の分子質量は、100〜300Daの間である。トリプトファン代謝産物キヌレニンは、血液透析患者の尿からのA1M中でリジン残基と共有的に付着して見出され、この場合にタンパク質の茶色の供給源であると考えられる[6]。合成ラジカルABTS (2,2'-アジノ-ジ-(３-エチルベンゾチアゾリン)-６-スルホン酸)の酸化断片が、Y22およびY132の側鎖と結合した。
【００２３】
C34は、A1Mの反応中心である。これは、非常に電気陰性になり、このことは、これがK69、K92、K118およびK130の正荷電側鎖の近傍で電子を供与する(これは、硫黄原子の酸化に必須のC34チオール基の脱プロトン化を誘導する)能力が高いことを意味する。予備的なデータは、C34が、既知の最も電気陰性の基の１つであることを示す。
理論的に、A1Mの特徴となるアミノ酸(C34、Y22、K92、K118、K130、Y132、L180、I181、P182、R183)(以下により詳細に記載する)は、別のフレームワーク、例えば同じ全体的な折り畳みを有するタンパク質(別のリポカリン)またはプラスチックポリマー、ナノ粒子もしくは金属ポリマーのような完全に人工の有機または無機分子上に同様の３次元構造で配置できる。
これらのアミノ酸のいくつかの３次元配置(青色の卵型、リジンは「+」で示す)、A1M-フレームワーク(胴部)、電子の流れおよびラジカルの捕捉を図４に示す。
したがって、上記のような反応中心およびその周囲を含む構造を含むホモログ、断片またはバリアントが好ましい。
【００２４】
本開示のポリペプチドの構造に改変および変化を作製して、ポリペプチドと同様の特徴を有する分子をまだ得ることができる(例えば保存アミノ酸置換)。例えば、あるアミノ酸を、認識できる活性の喪失なしで配列中でその他のアミノ酸に置換できる。ポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのは相互作用能力およびポリペプチドの性質であるので、あるアミノ酸配列置換をポリペプチド配列において作製して、それにもかかわらず同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００２５】
このような変化を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮できる。ポリペプチドに相互に作用する生物学的機能を与えることにおけるハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該技術において全般的に理解されている。あるアミノ酸が、同様のハイドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換され、同様の生物学的活性を有するポリペプチドをまだもたらすことができることが知られている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数を割り当てられる。これらの指数は、以下のとおりである:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/システイン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(-0.4);トレオニン(-0.7);セリン(-0.8);トリプトファン(-0.9);チロシン(-1.3);プロリン(-1.6);ヒスチジン(-3.2);グルタミン酸(-3.5);グルタミン(-3.5);アスパラギン酸(-3.5);アスパラギン(-3.5);リジン(-3.9);およびアルギニン(-4.5)。
【００２６】
アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、結果的に得られるポリペプチドの２次構造を決定し、このことが次いでポリペプチドと酵素、基質、受容体、抗体、抗原などのようなその他の分子との相互作用を規定すると考えられている。アミノ酸を、同様のハイドロパシー指数を有するアミノ酸で置換して、機能的に等価なポリペプチドをまだ得ることができることが当該技術において知られている。このような変化において、ハイドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±0.5以内のものがさらにより特に好ましい。
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて行うこともでき、特にそれにより創出される生物学的機能が等価なポリペプチドまたはペプチドを、免疫学的実施形態において用いることを意図する。以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0);リジン(+3.0);アスパラギン酸(+3.0±１);グルタミン酸(+3.0±１);セリン(+0.3);アスパラギン(+0.2);グルタミン(+0.2);グリシン(０);プロリン(-0.5±１);トレオニン(-0.4);アラニン(-0.5);ヒスチジン(-0.5);システイン(-1.0);メチオニン(-1.3);バリン(-1.5);ロイシン(-1.8);イソロイシン(-1.8);チロシン(-2.3);フェニルアラニン(-2.5);トリプトファン(-3.4)。アミノ酸を、同様の親水性の値を有する別のもので置換して、生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なポリペプチドをまだ得ることができることが理解される。このような変化では、親水性の値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましくは、±１以内のものが特に好ましく、±0.5以内のものがさらにより特に好ましい。
【００２７】
上で概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに全般的に基づく。上記の特徴の１つ以上を考慮した置換の例は、当該技術において知られており、それらに限定されないが、以下のものを含む(元の残基:例示的な置換): (Ala: Gly、Ser)、(Arg: Lys)、(Asn: Gln1 His)、(Asp: Glu、Cys、Ser)、(Gln: Asn)、(Glu: Asp)、(Gly: Ala)、(His: Asn、Gln)、(Ile: Leu、Val)、(Leu: Ile、Val)、(Lys: Arg)、(Met: Leu、Tyr)、(Ser: Thr)、(Thr: Ser)、(Trp: Tyr)、(Tyr: Trp、Phe)および(Val: Lle、Leu)。本開示の実施形態は、よって、上記のポリペプチドの機能的または生物学的等価物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態は、興味対象のポリペプチドと約50%、60%、70%、80%、90%および95%の配列同一性を有するバリアントを含むことができる。
【００２８】
本明細書の関係では、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列間の相同性は、「同一性」のパラメータにより記載される。配列のアラインメントおよび相同性スコアの計算は、完全Smith-Watermanアラインメントを用いて行ってよく、タンパク質およびDNAの両方のアラインメントのために有用である。デフォルトスコア行列BLOSUM50および単位行列を、それぞれタンパク質およびDNAアラインメントのために用いる。ギャップにおける最初の残基のペナルティは、タンパク質について-12、およびDNAについて-16であるが、ギャップにおける追加の残基のペナルティは、タンパク質について-２であり、DNAについて-４である。アラインメントは、FASTAパッケージバージョンv20u6を用いて行ってよい。
タンパク質配列の多重アラインメントは、「ClustalW」を用いて行ってよい。DNA配列の多重アラインメントは、タンパク質アラインメントを鋳型として用い、アミノ酸をDNA配列からの対応するコドンで置き換えて行ってよい。
代わりに、アミノ酸配列およびDNA配列を整列させるために異なるソフトウェアを用いることができる。２つのアミノ酸配列のアラインメントは、例えば、EMBOSSパッケージ(http://emboss.org)バージョン2.8.0.からのNeedleプログラムを用いることにより決定する。Needleプログラムは、記述されるグローバルアラインメントアルゴリズムを実行する。用いる置換行列はBLOSUM62であり、ギャップオープンペナルティは10であり、ギャップ伸長ペナルティは0.5である。
【００２９】
アミノ酸配列間、例えば配列番号１と異なるアミノ酸配列(例えば配列番号２)との間の同一性の程度は、２つの配列のアラインメントにおける厳密な一致の数を、「配列番号１」の長さまたは「配列番号２」の長さのいずれか短いほうで除したものとして計算される。結果は、パーセント同一性として表現される。
厳密な一致は、２つの配列がオーバーラップの同じ位置において同一のアミノ酸残基を有する場合に生じる。
適切であれば、２つのヌクレオチド配列間の同一性の程度は、アイデンティティテーブルと以下の多重アラインメントパラメータ:ギャップペナルティ10、およびギャップ長さペナルティ10とでLASER-GENE(商標)MEGALIGN(商標)ソフトウェア(DNASTAR, Inc.、Madison、WI)を用いるWilbur-Lipman法により決定できる。ペアワイズアラインメントパラメータは、Ktuple=３、ギャップペナルティ=３およびウィンドウ=20である。
【００３０】
配列番号１のアミノ酸とのまたはそれに対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性のパーセンテージは、ｉ)２つのアミノ酸配列を、BLOSUM62置換行列、ギャップオープニングペナルティ10およびギャップ伸長ペナルティ0.5でNeedleプログラムを用いて整列させ、ii)アラインメント中の厳密な一致の数を計数し、iii)厳密な一致の数を、２つのアミノ酸配列のうちの短いほうの長さで除し、iv) iii)における除法の解をパーセンテージに変換することにより決定してよい。本発明のその他の配列に対するまたは該配列との同一性のパーセンテージは、同様の様式で計算される。
例えば、ポリペプチド配列は、参照配列と同一であってよい(これは、100%同一である)か、または%同一性が100%未満になるように参照配列と比較してある整数までのアミノ酸の変更を含んでよい。このような変更は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換(保存置換および非保存置換を含む)または挿入から選択され、前記変更は、参照ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端の位置にて、またはこれらの末端の位置の間の任意の場所で、参照配列中のアミノ酸のうちに個別に散在して、または参照配列内の１以上の隣接する群のうちに生じることができる。
【００３１】
保存アミノ酸バリアントは、自然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。自然に存在しないアミノ酸は、限定することなく、トランス-３-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-４-ヒドロキシプロリン、トランス-４-ヒドロキシプロリン、Ｎ-メチル-グリシン、アロ-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３-および４-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、２-アザフェニル-アラニン、３-アザフェニルアラニン、４-アザフェニルアラニンおよび４-フルオロフェニルアラニンを含む。自然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込むためのいくつかの方法が、当該技術において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異を抑制するインビトロ系を用いることができる。アミノ酸およびアミノアシル化tRNAを合成する方法は、当該技術において知られている。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写および翻訳は、大腸菌S30抽出物と市販の酵素とその他の試薬とを含む無細胞系で行われる。タンパク質は、クロマトグラフィーにより精製する。第２の方法では、翻訳を、アフリカツメガエルの卵母細胞において、変異mRNAおよび化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより行う。第３の方法では、大腸菌を、置き換えられる自然のアミノ酸(例えばフェニルアラニン)の非存在下、かつ所望の自然に存在しないアミノ酸(例えば２-アザフェニルアラニン、３-アザフェニルアラニン、４-アザフェニルアラニンまたは４-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養する。自然に存在しないアミノ酸が、その自然の対応物の代わりにタンパク質に組み込まれる。自然に存在するアミノ酸残基を、インビトロ化学改変により自然に存在しない種に変換できる。化学改変は、置換の範囲をさらに拡張するために、部位特異的突然変異誘発と組み合わせることができる。A1Mの抗酸化特性を支持するために十分な３次元構造を提供する代わりの化学構造は、その他の技術、例えば人工足場、アミノ酸置換などによりもたらすことができる。さらに、上記ならびに図３および４に示すA1Mの活性部位を模倣する構造は、A1Mと同じ機能を有すると考えられる。
【００３２】
医薬組成物および投与量
本発明は、
ｉ) PRRNを含む医薬組成物と、
ii) A1Mを含む医薬組成物と
を含むキットも提供する。
キットは、上記の２つの組成物を含有する１つのパッケージの形である。
【００３３】
PRRNを含む医薬組成物は、典型的に、既に市場にある組成物である。
A1M(または本明細書で定義するように類似体、断片もしくはバリアント)を含む医薬組成物は、i.v.投与を意図する。したがって、A1Mは、液体、例えば溶液、分散液、乳液、懸濁液などで処方できる。本明細書の実施例からわかるように、i.v.投与に適した賦形剤は、10 mM Tris-HCl、pH 8.0および9.125 M NaClから構成されてもよい。
【００３４】
非経口の使用のために、適切な溶剤は、水、植物油、プロピレングリコールおよびこのような目的のために一般的に認められている有機溶剤を含む。全般的に、当業者は、「Remington's Pharmaceutical Science」Gennaroら編、(Mack Publishing Company)、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」Roweら編(PhP Press)、および特定の製剤タイプのための適切な補形剤および特定の製剤を調製するための方法に関連する公的なモノグラフ(例えばPh.Eur.またはUSP)に手引きを見出すことができる。
A1Mは、放射性核種療法用量と関連して１またはいくつかの用量で投与できる。好ましくは、各用量は、単回用量として、単回用量とその後の60分までの短期間での緩慢注入として、または60分までの短期間での緩慢注入のみとして、i.v.投与される。最初の用量は、放射性核種療法ペプチドと同時に、または放射性核種用量の注射の０〜60分前から０〜30分後までの期間内に投与される。放射性核種処置用量の注射の後に、必須ではないが、さらなるA1Mを加えることができる。各用量は、患者の体重と関連するA1M の量:１〜15 mg A1M/kg患者を含有する。本明細書の実施例に記載の研究では、7 mg/kg(マウスモデル)の用量を採用した。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】正常NMRIマウスにおける125I-A1M (左上)および111In-オクトレオチド(右上)の生体内分布を示す。左下の画像は、腎臓における両方の分子の継時的な取り込みを示す。データは、４匹の動物からの%IA/g±SEMとして表す。
【図２】注射後10、20および60分での腎臓および血清中の正常NMRIマウスにおける全長A1Mの存在を示す。動物に150μgのA1Mをi.v.注射し、血液および腎臓を記載する時点にて回収した。血液を凝固させ、血清を遠心分離により分離した。一方の腎臓を１ml PBS中でホモジナイズし、遠心分離した。１μlの血清および６μlの腎臓ホモジネートからの上清をSDS-PAGEに付し、PVDFメンブレンに移し、抗A1Mを用いてブロットした。各レーンは、別々のマウスを表す。
【図３】A1Mの３次元構造を示す。この図は、PyMOL [Molinspiration, M. v. (2014)]を用いて作成したが、ヒトA1Mの結晶構造から整合させている[Meining, W.およびSkerra, A. (2012) The crystal structure of human α1-microglobulin reveals a potential haem-binding site. Biochem J 445、175〜182]。β鎖およびαへリックスは、緑色のリボンで示す。A1Mの機能活性に関与するC34、K92、K118、K130およびH123の側鎖は、緑色の棒として示し、窒素原子は青色で示す。４つのリポカリンループに#1〜#4のラベルを付す。
【図４】いくつかのアミノ酸(青色の卵型、リジンは「+」で示す)、A1M-フレームワーク(胴部)、電子の流れおよびラジカル捕捉の３次元配置を示す。
【図５−１】図５Ａ〜Ｄは、異なる注射後時間でのA1Mおよびオクトレオチド-A647の尿細管局在化を示す。A1Mおよびオクトレオチド-A647コンジュゲートをi.v.注射し、動物を、注射の20分後(Ａ、Ｃ)および４時間後(Ｂ、Ｄ)に殺した。共局在するA1M (緑色)およびオクトレオチド-A647(赤色)のパーセンテージを、皮質、髄質および集合尿細管での選択された尿細管プロファイルにおいて、共焦点顕微鏡画像(20×/0.8対物)で測定した。細胞核は、DAPI(青色)を用いて視覚化した。代表的なプロファイル(Ａ、Ｂ)は、異なる程度の共局在化(黄色)を示し、全ての調べた試料からの共局在化データは、代表的な領域(Ｃ、Ｄ)の平均±SEMとして表す。尺度バーは、50μmを表す。
【図５−２】図５Ｅ〜Ｆは、異なる注射後時間でのA1Mおよびオクトレオチド-A647の細胞共局在化を示す。A1Mおよびオクトレオチド-A647コンジュゲートをi.v.注射し、動物を、注射の20分後および４時間後(Ｅ、左および右)に殺した。共局在するA1M (緑色)およびオクトレオチド-A647 (赤色)のパーセンテージを、皮質での選択された尿細管プロファイルにおいて、高分解能共焦点顕微鏡画像(63×/1.4対物)で測定した。細胞核は、DAPI (青色)を用いて視覚化した。代表的なプロファイル(Ｅ)は、異なる程度の細胞内共局在化(黄色)を示し、全ての調べた試料からの共局在化データは、代表的な領域(Ｆ)の平均±SEMとして表す。尺度バーは、20μmを表す。
【図６】５MBqの111In-オクトレオチド(ＡおよびＢ)および５MBqの125I-A1M(ＣおよびＤ)を注射し、40分間画像化した正常NMRIマウスの前臨床SPECT/CT画像を示す。ＡおよびＣは、動物全体の再構成した３次元図を示し、ＢおよびＤは、腎臓を通る平面切片を示す。腎臓は、高い取り込みを示し、両方の分子について腎臓皮質での濃縮を見ることができる。125I-A1Mについて、甲状腺におけるわずかな取り込みが観察できる。
【図７】正常マウスの腎臓での111In-オクトレオチドおよび125I-A1Mの取り込みのデジタルオートラジオグラフィ画像を示す。(Ａ) 125I-A1M、20分p.i.、(Ｂ) 125I-A1M、１時間p.i.、(Ｃ) 111In-オクトレオチド、20分p.i.、(D) 111In-オクトレオチド、１時間p.i.。全ての画像は、両方の分子について腎臓皮質での局在化された取り込みを示す。各画像の尺度は、各腎臓区画での放射性核種の相対的分布を最適に表すように調整されていることに注意されたい。
【図８】i.v.注射20分後の腎臓での A1M免疫反応性の分布を示す。A1Mをi.v.注射し、動物を20分後に殺し、A1M免疫反応性を、K323抗A1M抗体を用いて、免疫組織化学を用いて検出した。左のパネルは、皮質(Ａ)、髄質(Ｂ)および集合尿細管(Ｃ)におけるA1M免疫反応性を有する代表的な領域を示す。これらの領域の場所は、Ａ〜Ｃで示し、右のパネルの模式図において箱で強調する。尺度バーは、Ａ〜Ｃにおいて100μmを表す。
【図９】i.v.注射の20分および4時間後の腎臓におけるA1M免疫反応性およびオクトレオチド-A647の分布を示す。A1M免疫反応性は、K323抗A1M抗体を用いて、免疫組織化学(左の欄、明視野顕微鏡観察)または免疫蛍光(中央および右の欄、共焦点顕微鏡観察)を用いて、皮質(Ａ)、髄質(Ｂ)および集合尿細管(Ｃ)において検出した。A1M免疫蛍光(緑色)およびオクトレオチド-A647 (赤色)の分布ならびにそれらの尿細管共局在化(黄色)を、注射の20分後(中央)および４時間後(右)に調べた。細胞核は、DAPI (青色)を用いて視覚化した。尺度バーは、50μmを表す。
【図１０】i.v.注射後のA1M免疫蛍光およびオクトレオチド-A647の細胞共局在化を示す。A1Mおよびオクトレオチド-A647コンジュゲートをi.v.注射し、動物を、注射の20分後に殺した。A1M免疫蛍光(緑色)およびオクトレオチド-A647蛍光(赤色)の細胞内分布を示す高分解能(63×/1.4対物)共焦点顕微鏡画像。細胞核は、DAPI (青色)を用いて視覚化し、ファロイジン-テキサスレッド標識(灰色)を用いて、尿細管プロファイルを描写した。１つの細胞での断続的蛍光(Ａ;矢印)の分解能は、核のすぐ外側での細胞質でのプロファイル(Ｂ;黄色の線)とともに、蛍光強度を測定することにより示し、チャネルあたり８ビット(256強度レベル)での強度プロファイル(Ｄ)と同様の赤色および緑色のチャネル(Ｃ)でのプロファイルに沿った強度を与えた。尺度バーは、10μmを表す。
【図１１】実施例２の結果を示す。
【図１２−１】配列番号１〜４の配列を示す。
【図１２−２】配列番号１〜４の配列を示す。
【図１２−３】配列番号１〜４の配列を示す。
【図１２−４】配列番号１〜４の配列を示す。
【００３６】
【表１−１】
2016204360.tif 000002
【００３７】
【表１−２】
2016204360.tif 000003
【００３８】
【表１−３】
2016204360.tif 000004
【実施例】
【００３９】
実施例１
実験
材料および方法
組換えヒトA1M
Kwasekら[25]に記載されるとおりであるが、さらにイオン交換クロマトグラフィーステップを行って、組換えヒトA1Mを大腸菌で発現させ、精製し、再び折り畳んだ。このクロマトグラフィーステップは、20 mM Tris-HCl、pH8.0で平衡化したDEAE-Sephadex A-50 (GE Healthcare、Uppsala、Sweden)のカラムにA1Mを供することにより行った。A1Mを、直線塩勾配(20 mM Tris-HCl、pH 8.0から20 mM Tris-HCl、0.2 M NaCl)で、１ml/分の流速で溶出した。280 nmでの吸光度に従ってA1M含有画分をプールし、濃縮した。
【００４０】
A1Mの125I標識
125IでのA1Mの放射性標識は、クロラミンＴ法[26]を用いて行った。簡単に述べると、A1Mおよび125I(Perkin-Elmer、NEZ033005MC)を、0.5 Ｍリン酸ナトリウム、pH 7.5中でそれぞれ１mg/mlおよび10 mCi/mlの最終濃度にて混合した。クロラミンＴを0.4 mg/mlまで加え、氷上で２分間反応させ、NaHSO3を0.8 mg/mlまで加えることにより反応を停止した。タンパク質結合ヨウ素を、Sephadex G-25カラム(PD10、GE Healthcare、Buckinghamshire、UK)上でのゲルクロマトグラフィーにより遊離のヨウ素から分離した。およそ50〜200 kBq/μgタンパク質の比活性が得られた。
【００４１】
オクトレオチド
ソマトスタチン類似体ペプチドオクトレオチドを、Mallinckrodt Pharmaceuticals (http://www.mallinckrodt.com/)から購入し、111InおよびAlexa 647 (HiLyte Fluor 647; AnaSpec、Seraing、Belgium)で、販売者の使用説明に従って標識した。これらの化合物は、それぞれ111In-オクトレオチドおよびオクトレオチド-647という。
【００４２】
動物研究
全ての動物実験は、実験動物保護についての国の立法に従い、動物研究についての倫理委員会(Lund University、Sweden)の承認を受けた。６〜８週齢の雄性および雌性のNMRI正常マウス(Taconic、Ry、Denmark)を用いた。
【００４３】
生体内分布
生体内分布研究を行って、125I-A1Mおよび111In-オクトレオチドの薬物動態および生体内分布を決定した。125I-A1M (100 kBq、１μg)および111In-オクトレオチド(100 kBq、10μg)を、NMRIマウス(注射する分子および時点あたりｎ=３)に尾静脈注射によりi.v.投与した。動物を、注射の10、20、40、60分後(A1Mおよびオクトレオチドの両方)、４および24時間後(オクトレオチド)に殺し、血液および臓器を試料採取し、秤量し、NaI(TI)ウェルカウンタ(Wallac Wizard 1480 Wizard、Perkin Elmer)で測定した。臓器特異的取り込みの値は、組織１グラムあたりの注射された活性パーセント(%IA/g)または注射された活性パーセント(%IA)として計算した。
【００４４】
デジタルオートラジオグラフィ
デジタルオートラジオグラフィは、Biomolex 700イメージングシステム(Biomolex AS、Norway)を用いて行った。２群(ｎ=２)の正常マウスに、125I-A1M(0.5 MBq、５μg)および111In-オクトレオチド(0.5 MBq、50μg)をi.v.注射した。腎臓を包埋媒体中でドライアイスを用いて凍結させ、低温保持装置(Leica Microsystems AB、Sweden)において50μmの厚さの切片にし、Biomolexシステムで画像化した。画像は、自前のソフトウェアを用いて再構成した。
【００４５】
ウェスタンブロッティング
SDS-PAGE分析を、非標識A1M (100μl/動物、1.5 mg/ml)をi.v.注射された動物からの腎臓および血清について行った。動物を注射の10、20および60分後に殺し、血液および腎臓を試料採取し、腎臓を洗浄し、１mlのPBS中に入れた。機械的組織ホモジナイズの後に、組織を10,000×gにて10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、以下に記載するようなさらなる分析に用いた。血清は、血液試料から、1,000×gにて10分間の遠心分離により得た。SDS-PAGEゲルは、還元条件下で泳動し、分離したタンパク質を、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレン(Immobilon-P、Millipore、Bedford、MA、USA)に、Trans-Blot Turboトランスファーシステム(Bio-Rad、Delaware、USA)を用いて移した。PVDFメンブレンをその後ブロッキングし、以前に記載されるようにして[28]ウサギポリクローナル抗A1M抗血清のIgG画分(K322、５μg/ml)とともに一晩インキュベートした後に、Alexa Fluor 647ヤギ抗ウサギIgG (3000×に希釈; Molecular Probes)とインキュベートした。メンブレンを、ChemiDoc MPイメージングシステム(BioRad)を用いて現像した。
【００４６】
SPECTイメージング
NanoSPECT/CT(Bioscan、Washington DC、USA)でのイメージング中、動物に２%〜３%のイソフルランガス(Baxter; Deerfield、IL、USA)で麻酔をかけた。動物におよそ５MBqの125I-A1M (およそ30μg)および５MBqの111In-オクトレオチドをi.v.注射し、20分p.i.にてNSP-106マルチピンホールマウスコリメータで画像化した。125Iイメージングについて、20%のエネルギーウィンドウを35 keV光電ピークに集中させ、111Inについて175および241光電ピークに集中させた。SPECTデータは、HiSPECTソフトウェア(SciVis; Goettingen、Germany)を用いて再構築した。CTイメージングは、それぞれの全身SPECTの前に行った。１時間でのSPECTイメージングの後に、腎臓を切除し、Tissue-Tek(登録商標）O.C.T(商標)コンパウンド(Sakura Finetek; Alphen aan den Rijn、The Netherlands)に包埋し、ドライアイス上で凍結させた。Biomolexシステムでのオートラジオグラフィ分析のために、凍結試料を10μmの厚さで低温切片化した。腎臓切片をMayerのヘマトキシリンおよびクロモトロープ2R、Ch2R (ともにHistolab; Gothenburg、Swedenから)で染色し、光学顕微鏡スライドスキャナ(Mirax Midi、Carl Zeiss; Oberkochen、Germany)を用いて走査した。
【００４７】
腎臓-試料調製およびA1Mの免疫標識
150μg A1M(非コンジュゲート)と100μg Alexa 647-標識オクトレオチド(オクトレオチド-647)との同時i.v.注射の後に、動物を、10、20、40、60分および４時間後に犠牲にした。全ての時点を評価したが、レーザ共焦走査顕微鏡観察および定量的画像解析を含む細胞レベルでの詳細な分析を示す20分および４時間からの腎臓だけを含める。重要なことに、全ての実験は、野生型およびヌードマウスの両方について行って評価し、同じ標識パターンを有することが示された。しかし、野生型データだけを含める。
安楽死の後に、腎臓を取り出し、直ちに凍結し、Tissue Tecに包埋した。組織ブロックを、低温保持装置(Microm、HM 500OM、Walldorf、GmbH)で切片にし、切片(10μm)をSuperFrostプラススライド(Merck、Darm-stadt、Germany)上に回収した。連続切片を作製し、スライドあたり３〜４つの切片を回収し、これらのうち近接するスライドを色原体免疫組織化学(IHC)または免疫蛍光(IF)標識のいずれかのために用いた。切片を、４%パラホルムアルデヒド(PFA、Sigma、St. Louis、MO、USA、PBS、0.1 M、pH 7.4に溶解)中で15分間後固定し、PBS中で２回、５分間すすいだ。
【００４８】
A1Mの単独標識のために、切片を0.03%過酸化水素(H2O2、Merck、Darmstadt、Germany)と５分間、色原体視覚化(IHC)のためにインキュベートした。色原体および蛍光視覚化の両方のために、切片を１%ウシ血清アルブミン(BSA、Sigma、St. Louis、MO、USA; PBSで希釈)と30分間インキュベートした。切片を、次いで、１%BSA、0.02% Triton X-100 (Sigma、St. Louis、MO、USA)を含有するPBS中で1:7500に希釈したウサギ抗ヒトA1M (K:323、IgG)と４℃にて16時間インキュベートした。
A1M色原体視覚化のために、切片を、セイヨウワサビペルオキシダーゼ (HRP、Dako Glostrup、Denmark)とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgGとRTにて20分間インキュベートした。免疫反応を、0.03% H2O2を含有するジアミノベンジジン(DAB)溶液中でRTにて10分間のインキュベーションにより行った。切片を、PBS (２×10分)中ですすぎ、ヘマトキシリン(Mayers、Hematoxylin Mayers Htx Histolab Products AB、Gothenburg、Sweden)を用いて対比染色した後に、一連の勾配アルコール中での脱水および100%キシレンへの浸漬を行った。切片をスライドに載せ、Pertex (Histolab Products AB、Gothenburg、Sweden)中でカバーガラスを被せた。
【００４９】
オクトレオチド-647の同時検出のために用いるA1MのIF標識のために、色原体検出について上に記載するとおりの一次抗体と切片とをインキュベートし、その後、１%BSAを含有するPBS中で1:150に希釈したAlexa Fluor 488 (AF488、Invitrogen、Molecular Probes、USA)とコンジュゲートした二次ヤギ抗ウサギIgGとインキュベートした。インキュベーションをRTにて45分間行った後に、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、核標識、Invitrogen, Molecular Probes、USA)とRTにて15分間インキュベートした。切片の部分集合も、テキサスレッド(Ｆ-アクチンと結合)とコンジュゲートしたファロイジンとRTにて１時間インキュベートして、形態学的に尿細管構造の輪郭を描いた。切片をPBS中ですすぎ、スライドに載せ、退色防止溶液(Prolong Gold、Invitrogen、Molecular Probes、USA)中でカバーガラスを被せた。
【００５０】
腎臓切片でのA1Mおよびオクトレオチド-647の光学的検出
色原体単独標識A1Mを視覚化し、明視野顕微鏡(Leica DMRE)でデジタルで記録した。デジタル画像をLeicaデジタルカメラ(DFC 500)で収集した。図示のために用いた画像は、色のバランス、明るさおよびコントラストについて修正した。
組織学的および細胞のレベルでのIF-標識A1M (A1M-AF488)およびオクトレオチド-647の同時視覚化のために、Zeiss共焦レーザ走査顕微鏡(CLSM、LSM 510 META、Dept. Biology、Lund University)を用いた。切片は、Alexa Fluor 488 (A1M)、HiLyte Fluor 647 (オクトレオチド)、テキサスレッド(Ｆ-アクチン)およびDAPI (細胞核)からの発光を走査することにより調べた。
【００５１】
１つまたはいくつかの光学切片(Z-stacks)であるデジタル画像データを、皮質、髄質および集合尿細管の領域を通して集めた。A1M-AF488およびオクトレオチド-647蛍光の個別の存在および同時の存在の計算のために、画像記録を用いた。記録のために、各切片からの３つの腎臓領域を代表的な領域として選択した(x/y戴物台の位置は印をつけて、獲得ソフトウェアZEN 2009により保存した)。走査(1024×1024のフレームサイズ)を、20×/0.8 Plan Apochromat対物レンズ(約400 nm x/y光学的分解能での1.8μmの厚さの光学切片をもたらす)および63×/1.4油浸Plan Apochromat対物レンズ(約250 nm x/y光学的分解能での0.9μmの厚さの光学切片をもたらす)を用いて行った。光学切片の選択および走査の深さは、走査した視野での核の大部分(DAPI標識)の中心の位置から決定した。AF488、HiLyte Fluor 647、DAPIおよびテキサスレッド蛍光を示すチャネルの連続走査を行った。各チャネルについて、最高の蛍光強度を有する腎臓プロファイルを参照として選択し、そこから収集設定(レーザ出力、PMT検出器ゲイン、デジタルオフセット)を最適化し、全ての走査領域のために用いた。ここで示す画像の図は、定量的測定のために用いた領域／構造を含有する個別の光学切片から選択する。
【００５２】
腎臓切片でのオクトレオチド-647およびA1Mの定量的画像解析。
オクトレオチド-647蛍光およびA1M-AF488 IFのCLSM画像を、定量解析のために用いた。腎臓構造(皮質、髄質および集合尿細管から)におけるおよび管上皮細胞内の詳細な分布を調べた。CLSM画像あたり３つの領域および動物あたり10から20の間の画像を分析した。分析プロトコールを開発して、ImageJソフトウェア(バージョン1.49g、Rasband、W.S. ImageJ、NIH、USA)とともにマクロスクリプトとして用いた。簡単に述べると、CLSM画像を、全てのチャネルが一緒に併合された(AF488、HL647、DAPIおよびテキサスレッドについて)複合を表す「画像の積み重ね(Stack to Images)」で示した。試料領域の選択は、尿細管構造の形態から行い、核および／またはファロイジン標識により示した。測定のための個別の領域は、投げ縄機能を用いて境界を定めた。緑色(A1M-AF488)および赤色(オクトレオチド-647)チャネルを、次いで、入力画像として用い、別々の緑色もしくは赤色画素またはそれらの共局在化の比率を、「共局在化」プラグインを用いて調べた。統計解析は、Origin 9.0ソフトウェア(Microcal、Northampton、MA、USA)を用いて行った。図５のヒストグラムは、各時点にて３つの腎臓から得られ、平均±SEMとしてプロットされた代表的なデータを示す。
【００５３】
結果
生体内分布
図１は、注射の10、20、40および60分後の111In-オクトレオチドのインビボ生体内分布と、注射の10、20、40および60分後ならびに注射の４および24時間後の125I-A1Mのエクスビボ生体内分布とを示す。腎臓での経時的な両方の分子の取り込み(%IA/g)の比較も示す。腎臓での高い取り込みが、111In-オクトレオチドおよび125I-A1Mの両方について観察され、それぞれ注射の10および20分後にピーク値が得られた。注射された非標識A1Mのサイズ分布を、SDS-PAGEおよびウェスタンブロッティングにより血清および可溶化した腎臓で調べた。図２に示すように、A1Mは、均質バンドとして泳動され、見かけの分子質量は、腎臓および血清の両方において常に約25 kDaであり、マイナーな薄いバンドが約50 kDaにある。強いバンドは22.6 kDaの理論的分子質量を有するモノマーA1Mを示し、後者はダイマーの形を示す可能性が最も高い。最も高い量が10分にて見られ、図１の下のパネルに示す125I標識A1Mの動態を支持する。これらの結果は、血液および腎臓で見出されるA1Mがインタクトで全長であり、その分解は無視できることを示す。
【００５４】
SPECT/CT画像解析
定性的SPECT/CT分析を、111In-オクトレオチドおよび125I-A1Mの両方について行い、腎臓における活性分布を視覚化した。図６のSPECT/CT画像は、両方の分子について腎臓での高い取り込みを証明する。腎臓周辺構造での125I-A1M (図６ＣおよびＤ)の濃度が111In-オクトレオチド(図６ＡおよびＢ)と比較してより高いことが観察されるが、両方の分子は、腎臓皮質に共局在化するとみられる。甲状腺での125I-A1Mのわずかな取り込みも観察できる。膀胱にプールされる活性は、111In-オクトレオチドについて省いた。なぜなら、強いシグナルにより、腎臓における分布および取り込みを証明することが困難になるからである。
【００５５】
デジタルオートラジオグラフィ
図７に示すデジタルオートラジオグラフィの結果は、腎臓皮質における両方の分子の局在化を明確に示し、SPECT/CTの結果を反映する。結果は、注射の20および60分後に同様であることが観察でき、このことは、ペプチドおよびタンパク質の局在化が20分後に完了したことを示す。これらの画像において、さらなる細区画化は観察できない。しかし、活性分布は、皮質において完全に均質でない。最初の２つの画像(７ＡおよびＢ)と次の２つ(７ＣおよびＤ)との間に、コントラストおよび分解能の顕著な差が観察できる。その低エネルギー転換電子(30.6 keV)以外に、125Iも、27.5および27.2 keVにて低エネルギーｘ線光子を放射する。これらの光子は、画像中のノイズに貢献し、転換電子とエネルギーが近いので、該転換電子を最終画像から排除することが困難になる。
【００５６】
蛍光顕微鏡
A1M免疫反応性は、皮質に主に分布し、髄質および集合尿細管への免疫反応性が減少した。また、A1M免疫反応性標識の強度は、皮質で最も高く、髄質でより弱く、集合尿細管で最も弱かった。20分p.i.での腎臓の選択した領域でのA1M免疫反応性の分布を、図８および９(左のパネル)に示す。強い標識が、尿細管構造の部分集合に存在し、近位尿細管および糸球体の部分集合と折り合いをつけるように形態学的に示された。A1Mおよびオクトレオチド-A647の蛍光２重標識は、それらの尿細管共存とともに、高い程度の細胞共局在化を証明した(図５、９および10)。20分p.i.にて髄質および皮質での高い程度の尿細管での共存と、細胞共局在化とを含む両方の分子の強い標識化があった(図10も参照されたい)。４時間p.i.にて両方の分子の蛍光検出が著しく減少し、皮質および髄質にて非常に低く、集合尿細管に存在しなかった(図９)。両方の分子の尿細管局在化の定量的分析は20分および４時間p.i.でのCLSM画像から行い、20分p.i.での共局在化の対応する程度を示した(図５)。尿細管構造での細胞レベルでの共局在化を調べる場合、図５に視覚化して定量するように、皮質において同様の結果が見られた。A1Mおよびオクトレオチド-A647の細胞内共局在化は、指定したプロファイルでの個別の画素についての強度を比較することにより証明された(図５)。
【００５７】
実施例２
PRRTにおけるA1Mでの腎臓の短期間放射線防護
以下に特に明記しないかぎり、実施例１で述べた材料および方法は、実施例２でも用いられる。
【００５８】
目的：A1Mでの処置を含む８日間の177Lu-オクトレオチドPRRT腎臓損傷マウスモデルの初期試験
放射性核種活性：150 MBq 177Lu-DOTATATE (177Lu-DOTA0, Tyr3]オクトレオテート)
放射線防護および安全性：１cmの距離をおいて150 MBq 177Lu-DOTATATEにより7 mSv/hを与える。
A1M投与量: 7 mg/kg (賦形剤２：10 mM Tris-HCl、pH 8.0 + 0.125 M NaClにおいて)
A1M療法のタイムポイント：T=0およびT=+60分。NB、177Lu-DOTATATEおよびA1Mを別個にT=0にて注射した。
【００５９】
分析方法：
１．血液
アルブミンおよびクレアチニン        糸球体濾過率            ELISA
NGAL                                糸球体腎炎              ELISA
サイトカイン                        炎症-                   Luminex-Lund
KIM1                                腎臓損傷分子1           ELISA
A1M                                 酸化ストレス            ELISA
【００６０】
２．尿
NGAL                                                        ELISA
アルブミンおよびクレアチニン        糸球体尿細管損傷        ELISA
ヘプシジン                                                  ELISA
KIM1                                                        ELISA
【００６１】
３．腎臓での遺伝子発現
A1M
NGAL
KIM1
アポトーシス/ネクローシス           測定すべき所定の遺伝子
炎症                                測定すべき所定の遺伝子
マイクロアレイ
【００６２】
４．組織化学                            一般的な組織損傷
５．免疫組織化学
アポトーシス                        TUNEL、カスパーゼ
ガンマH2AX                          二本鎖切断
６．オートラジオグラフィ
７．臓器活性測定
【００６３】
プロトコール：
有効性によって(Lu-177-oct)、グループに次のとおり優先順位を付ける：１日、８日、４日。
【００６４】
【表２】
2016204360.tif 000005
【００６５】
試料の取り扱い
１．血液：
血液をチューブ中に採取する。使用説明に従って遠心分離し、血漿/血清を新しいチューブに移す。−80℃で冷凍する。
２．尿：
すみやかに−80℃で冷凍する。
【００６６】
３．腎臓：
ａ．PCR - １つの腎臓を２片に切断する。２つの異なるチューブ(１つはmRNA用、１つはタンパク質抽出用)に入れ、ドライアイス上に置く。
ｂ．顕微鏡検査およびオートラジオグラフィ
・いくつかの腎臓はコペンハーゲンにて撮像した。
・腎臓を液体窒素ですみやかに乾燥および凍結する。
【００６７】
４．臓器活性：
以前の研究と同じプロトコールに従って、１つの腎臓を活性分析に用いる。下記の項目６も参照。
【００６８】
５．SPECT解析：
８日目にグループ４(少なくとも３匹)について行う。
【００６９】
６．その他の臓器：
可能であれば、肝臓、脾臓、心臓、腸、消化管、脳、膵臓、肺および皮膚も処理し(ドライアイス上に置く)、先のプロトコールに従って活性を分析する。臓器はあとでタンパク質分析に用いられる。
【００７０】
結果
最初の実験において、Balb/c (nu/nu)マウスに150 MBq 177Lu-オクトレオチド(DOTATATE)もしくは150 MBq 177Lu-オクトレオチド(DOTATATE)+150μg A1M、またはバッファーのみ(コントロール)を注射した。マウスを１日又は８日放置した後、上記のとおり血漿および尿を採取して犠牲にした。よって、６グループ(ｎ=４)の試料を採取した：
１．DOTATATE            １日  血漿  尿
２．DOTATATE+A1M        １日  血漿  尿
３．コントロール        １日  血漿  尿
４．DOTATATE            ８日  血漿  尿
５．DOTATATE+A1M        ８日  血漿  尿
６．コントロール        ８日  血漿  尿
【００７１】
腎機能の初期評価として、血漿中のクレアチニンを測定し、尿試料中のアルブミンを測定した(図11)。血漿クレアチニンは糸球体濾過率(GFR)のマーカーであり、結果より、１日後および８日後の両方において、DOTATATE注射によってクレアチニンレベルの顕著な増加、すなわちGFRが低下したことが示唆される。A1Mの同時注入により、GFRはコントロールのレベルにまで戻り、その効果は８日後にきわめて有意である(P<0.01)。蛋白尿を評価すると、尿中のアルブミン濃度は、１日後および８日後の両方においてDOTATATE注射により有意に上昇し、１日後により明白であった。同時のA1M処置により、１日後に蛋白尿は有意に減少したが、８日後はしなかった。
まとめると、177Lu-オクトレオチド注射は腎機能を損なった(糸球体濾過の減少および蛋白尿)が、これはA1Mとの併用処置により治療することができた。
【図１２−１】
2016204360.tif 000006
【図１２−２】
2016204360.tif 000007
【図１２−３】
2016204360.tif 000008
【図１２−４】
2016204360.tif 000009
【図１】
2016204360.tif 000010
【図２】
2016204360.tif 000011
【図３】
2016204360.tif 000012
【図４】
2016204360.tif 000013
【図５−１】
2016204360.tif 000014
【図５−２】
2016204360.tif 000015
【図６】
2016204360.tif 000016
【図７】
2016204360.tif 000017
【図８】
2016204360.tif 000018
【図９】
2016204360.tif 000019
【図１０】
2016204360.tif 000020
【図１１】
2016204360.tif 000021
【配列表】
2016204360000001.app
【外国語明細書】
2016204360000001.pdf