(57)【要約】【課題】本発明は、３種類のプラスミドを含む、植物の形質転換方法に使用するためのアグロバクテリウム細菌に関する。【解決手段】本発明のアグロバクテリウム細菌は下記の（１）−（３）のプラスミドを含む  （１）下記の構成要素を有するプラスミド；    （ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び    （ｉｉ）複製開始点  （２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド；並びに  （３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド  ここにおいて、（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）−（３）のプラスミドを含むアグロバクテリウム細菌
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド；並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
【請求項２】
（１）プラスミドの（ｉｉ）の複製開始点がＩｎｃＷ複製開始点である、請求項１記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項３】
（１）プラスミドが、さらにｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＥ遺伝子を含む、請求項１又は２記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項４】
（１）プラスミドが、さらにｒｅｐＡ遺伝子を含む、請求項１−３のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項５】
（１）プラスミドが、さらに薬剤選抜マーカー遺伝子を含む、請求項１−４のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項６】
薬剤選抜マーカー遺伝子がゲンタマイシン耐性遺伝子である、請求項５記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項７】
（１）プラスミドが、配列番号１記載の塩基配列を有するｐＶＧＷ９である、請求項１−６のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項８】
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型プラスミドが、ディスアーム型Ｔｉプラスミドである、請求項１−７のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項９】
ディスアーム型ｐＴｉＢｏ５４２を保持しない、請求項１−８のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項１０】
下記のグループ
ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３８５０、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ、Ｃ５８−Ｚ７０７、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ、ＧＶ２２６０、及びＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）
から選択されるアグロバクテリウム細菌に、
（１）プラスミド及び（３）プラスミドを導入することによって製造される、請求項１−９のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
【請求項１１】
下記の（１）−（２）のプラスミドを含むアグロバクテリウム細菌
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
並びに
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド
ここにおいて、（１）及び（２）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
【請求項１２】
請求項１ないし１０のアグロバクテリウム細菌を植物細胞に接触させる、ことを含む、植物の形質転換方法。
【請求項１３】
請求項１１のアグロバクテリウム細菌に（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドを導入し、そして、
当該アグロバクテリウム細菌を植物細胞に接触させる、ことを含む、植物の形質転換方法。
【請求項１４】
植物が被子植物である、請求項１２又は１３に記載の植物の形質転換方法。
【請求項１５】
アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットであって、請求項１−１０又は請求項１１のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌を含む、前記キット。
【請求項１６】
アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットであって、下記の（１）−（３）のプラスミドの組み合わせ
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド；並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
を含む、前記キット。
【請求項１７】
アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットであって、下記の（１）及び（３）のプラスミドの組み合わせ
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）と（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
を含む、前記キット。
【請求項１８】
下記のグループ
ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３８５０、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ、Ｃ５８−Ｚ７０７、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ、ＧＶ２２６０、及びＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）
から選択されるアグロバクテリウム細菌をさらに含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
配列番号１に記載の塩基配列を有するｐＶＧＷ９プラスミド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のプラスミドの、請求項１２−１４のいずれか１項に記載の植物の形質転換方法への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３種類のプラスミドを含む、植物の形質転換方法に使用するためのアグロバクテリウム細菌及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物の形質転換では、一般的に、稔実種子の後代または栄養繁殖体において外来遺伝子を維持・発現させられるような、植物細胞への外来ＤＮＡ導入技術が利用される。この技術を用いて、実際に非常に多くの単子葉植物や双子葉植物が形質転換されてきた。形質転換作物は、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ソルガム、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ジャガイモ、トマトなどは勿論、果物類や他の野菜類でも作出されており、商業上の関心も高い。
【０００３】
植物の形質転換方法には、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などの物理・化学的方法（ＤＮＡの直接導入法）とアグロバクテリウム細菌が持つ機能を利用する生物学的方法（ＤＮＡの間接導入法）が知られている。直接導入法では、目的遺伝子が、断片化されて導入される、多コピー導入されるといった事象が高頻度で生じる。そのため、目的遺伝子が発現しない形質転換体や弱く異常な発現（ジーンサイレンシング）を示す形質転換体が高頻度で出現する。また、プロトプラストを用いる方法では、培養期間が長期化するため、得られた形質転換体において、培養変異による種子不稔や奇形などが生じ易い。これに対し、アグロバクテリウム細菌を介する遺伝子導入法はこのような問題が生じにくい。アグロバクテリウム法では、ＴｉまたはＲｉプラスミドの病原性領域（ｖｉｒ領域）における遺伝子群の発現制御によって目的遺伝子が導入される。ｖｉｒ遺伝子にコードされているタンパク質群により、目的遺伝子は、植物細胞と細菌の相互作用の認識とシグナル伝達、ｖｉｒ遺伝子の発現誘導、タイプＩＶ分泌経路の形成、Ｔ−ＤＮＡボーダー反復配列の認識、Ｔ−ＤＮＡ鎖の形成、Ｔ−ＤＮＡ鎖の植物細胞への移行と核への移行、そして植物核ゲノムへのＴ−ＤＮＡの組み込みなど、多くの過程を経て導入される。そのため、目的遺伝子の導入コピー数は低く保たれ、断片化されて導入されることも少ない。その結果、得られた形質転換体において目的遺伝子が高発現する個体が数多く安定して得られ、直接導入法に比べると、発現量の個体間差が少ないという大きな利点がある。
【０００４】
このようにアグロバクテリウム法は、非常に優れた植物の形質転換方法であるが、形質転換の成否ならびに効率は、植物種、遺伝子型ならびに用いる植物組織に依存して大きく異なるのが実状である（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。未だに十分な効率で形質転換できない植物も多く、多数の形質転換体を容易に得ることができる作物の種類は、現状では一部に限定されている。したがって、このような問題点を解決できる改良手法が強く望まれている。
【０００５】
これまでに様々な形質転換用ベクターが開発され、上述のような問題点を解決するための努力が行われている。以下に、ベクター開発に関わる背景を説明する。元来、野生型アグロバクテリウムのＴｉプラスミドは１９０ｋｂ以上と巨大であるため、標準的な遺伝子工学的手法ではプラスミド上のＴ−ＤＮＡ中に遺伝子を挿入することは困難であった。そのため、Ｔ−ＤＮＡ上に外来遺伝子を挿入するための方法が開発された。まず、腫瘍性のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡから植物成長調節物質合成遺伝子が除去されたディスアーム型Ｔｉプラスミドを有する菌系であるＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、ＧＶ３８５０（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、Ｃ５８−Ｚ７０７（Ｈｅｐｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０（Ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，１９８６）、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ（Ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，１９８６）、ＧＶ２２６０（ＭｃＢｒｉｄｅ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ，１９９０）、ＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）（Ｐａｌａｎｉｃｈｅｌｖａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）などが作成された。
【０００６】
そしてこれらを用いることにより、所望の遺伝子をアグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中に、あるいは所望の遺伝子を有するＴ−ＤＮＡをアグロバクテリウムに導入する２種類の方法が開発された。このうち一つは、遺伝子操作が容易で所望の遺伝子の挿入が可能であり、大腸菌で複製できる中間ベクターを、アグロバクテリウムのディスアーム型ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中に、三系交雑法（Ｄｉｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０）を介して相同組換えにより導入する方法であり、中間ベクター法と呼ばれる（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。もう一つは、バイナリーベクター法と呼ばれるもので、Ｔ−ＤＮＡの植物への組み込みにｖｉｒ領域が必要であるが、これが機能するためにＴ−ＤＮＡと同じプラスミド上に存在する必要がないという結果（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）に基づいている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｇｅｌｖｉｎ，２００８）。このｖｉｒ領域には、ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧなどが存在する。バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡをアグロバクテリウムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプラスミドに組み込んだものであり、これを、ディスアーム型Ｔｉプラスミドを有するアグロバクテリウムに導入して用いる。アグロバクテリウムへのバイナリーベクターの導入には、エレクトロポレーション法や三系交雑法などの方法を用いることができる。バイナリーベクターには、ｐＢＩＮ１９（Ｂｅｖａｎ，１９８４）、ｐＢＩ２２１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，１９８７）、ｐＧＡ４８２（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）などがあり、これらを基に数多くの新たなバイナリーベクターが構築され、形質転換に用いられている（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｇｅｌｖｉｎ，２００８）。
【０００７】
アグロバクテリウムＡ２８１（Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）は強病原性（ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）の菌株であり、その宿主範囲は広く、形質転換効率も他の菌系より高い（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）。この特性は、Ａ２８１が有するＴｉプラスミドのｐＴｉＢｏ５４２によるものである（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【０００８】
これまでにｐＴｉＢｏ５４２を用いた３つの形質転換システムが開発されている。一つ目は、ｐＴｉＢｏ５４２のディスアーム型のＴｉプラスミドを有する菌系ＥＨＡ１０１（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６）、ＥＨＡ１０５（Ｈｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、ＡＧＬ０（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）またはＡＧＬ１（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）を用いたものである。これらを上述のバイナリーベクターシステムに適用することにより、形質転換能力の高いシステムとして種々の植物の形質転換に利用されている。
【０００９】
二つ目は、スーパーバイナリーベクターシステム（ｓｕｐｅｒ−ｂｉｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）である（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。このシステムは、ｖｉｒ領域（ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ、ｖｉｒＥおよびｖｉｒＧ、ｖｉｒＪのすべて）を持つディスアーム型のＴｉプラスミド、およびＴ−ＤＮＡを有するプラスミドからなることから、バイナリーベクターシステムの一種である。しかしながら、Ｔ−ＤＮＡを有する側のプラスミド、すなわちバイナリーベクターにｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域から切り出された１４．８ｋｂのＫｐｎＩ断片（ｖｉｒＤ１遺伝子の一部，ｖｉｒＢ遺伝子，ｖｉｒＣ遺伝子およびｖｉｒＧ遺伝子）を組み込んだ（Ｋｏｍａｒｉ，１９９０）スーパーバイナリーベクターを用いる点で異なる。このＫｐｎＩ断片は、最初の論文では１５．８ｋｂとされていた（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）が、正確には１４．８ｋｂである。なお、スーパーバイナリーベクターを有するアグロバクテリウムに、所望の遺伝子を組み込んだＴ−ＤＮＡ領域を導入するには、三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として利用できる（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。このスーパーバイナリーベクターシステムは、多くの植物種で非常に高い形質転換効率をもたらすことが明らかとなっている（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。特にトウモロコシの形質転換には、スーパーバイナリーベクターシステムは卓越した効果を示すことが報告されている（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。また、Ｋｈａｎｎａ  ａｎｄ  Ｄａｇｇａｒｄ（２００３）は、強病原性ではないアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４とスーパーバイナリーベクターｐＨＫ２１の組み合わせを用いることにより、ＬＢＡ４４０４と通常のバイナリーベクターｐＨＫ２２の組み合わせで全く得ることができなかったコムギ形質転換体の獲得に成功した。
【００１０】
三つ目は、プラスミド上にｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域から切り出された１４．８ｋｂのＫｐｎＩ断片（ｖｉｒＤ１の一部、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣおよびｖｉｒＧ）を有するプラスミドｐＴＯＫ４７（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）を形質転換効率向上のためのブースターベクター（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）として、バイナリーベクターシステムに追加で導入したシステムである。一般にバイナリーベクターシステムにさらにブースターベクターが追加されているベクターシステムは「ターナリーベクターシステム」と呼ばれるが、このシステムではブースターベクターに上記１４．８ｋｂのＫｐｎＩ断片が含まれていることから、本明細書ではこれを特に「スーパーターナリーベクター（ｓｕｐｅｒ−ｔｅｒｎａｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ）システム」と呼ぶ。このシステムでは、アグロバクテリウム内で共存可能な不和合性グループが異なる複製開始点（ｏｒｉ）を持ったプラスミドがそれぞれ用いられる。それぞれのｏｒｉにはＲｅｐタンパク質（イニシエーター）のコード領域が必須であり、通常は近接させて用いる。ｐＴＯＫ４７を利用したスーパーターナリーベクターシステムは、多くの植物種で高い形質転換効率を示すことが報告されている（Ｗｅｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｔａｎｇ，２００３；Ｄｏｎｇ  ａｎｄ  Ｑｕ，２００５；Ａｒｏｋｉａｒａｊ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ｐＴＯＫ４７の複製開始点（ｏｒｉ）は、ＩｎｃＷ不和合性グループであり、これらのターナリーベクターシステムによる報告例のＴ−ＤＮＡを有するプラスミドには、ＩｎｃＰ不和合性グループに属するｏｒｉが主に用いられている。ブースターベクターｐＴＯＫ４７を用いたスーパーターナリーベクターシステムは、スーパーバイナリーベクターシステムにはやや劣るが、トウモロコシの形質転換に有用であることが報告されている（ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１）。また、ｐＴＯＫ４７と同様に、ｐＴｉＢｏ５４２  ｖｉｒ領域由来の１４．８ｋｂ  ＫｐｎＩ断片を、Ｔ−ＤＮＡを有するプラスミドとは別のプラスミド上に配置したスーパーターナリーベクターシステムを用いて、コムギの形質転換を行った報告がある（Ａｍｏａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。Ａｍｏａｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）およびＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）が用いたベクターシステムは、ＩｎｃＷ  ｏｒｉのみを有するがそのｒｅｐ遺伝子を欠いたｐＧｒｅｅｎ（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ならびにＩｎｃＷのｒｅｐ遺伝子をトランスに有し、かつ、自らの複製に必要なＩｎｃＰのｏｒｉＶを有するｐＳｏｕｐからなる（Ｈｅｌｌｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。すなわち、ｐＳｏｕｐがｐＧｒｅｅｎの複製を補完する形で、アグロバクテリウム中で双方のプラスミドを安定的に維持する仕組みをとっている。そのため、特別にデュアルバイナリーベクターシステムと呼ばれている。しかし、実際には、ディスアーム型Ｔｉプラスミド、バイナリーベクターｐＳｏｕｐ及びターナリーベクターｐＧｒｅｅｎの３種のプラスミドからなるスーパーターナリーベクターシステムといえる。
【００１１】
ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域に関する知見
Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）は、様々な長さのｓｕｐｅｒ−ｖｉｒ（ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域）を付加的にアグロバクテリウムに保持させて、クラウンゴールの形成能力を評価した。この試験には、通常の菌株Ａ３４８とともに、ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒ全領域を有する強病原性菌株Ａ２８１も用いられた。その結果、どちらの菌株においても形質転換能力（クラウンゴール形成能力）向上には、ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒのｖｉｒＢとｖｉｒＧの付加が重要であることが判明した。その一方で、ｖｉｒＤやｖｉｒＥ領域については付加効果は観察されなかった（Ｊｉｎ，  Ｓ．，Ｋｏｍａｒｉ，  Ｔ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｎｅｓｔｅｒ，  Ｅ．Ｗ．（１９８７）．  Ｇｅｎｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｕｐｅｒｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａ２８１．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １６９，４４１７−４４２５．Ｔａｂｌｅ  ３およびＦｉｇｕｒｅ  ３）。
【００１２】
また、Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）は、強病原性菌株Ａ２８１のディスアーム型菌株ＥＨＡ１０１（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）と、通常の病原性（通常のｖｉｒ全領域）を有するがバイナリーベクター上にｓｕｐｅｒ−ｖｉｒの一部（ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＧ）を保持するスーパーバイナリーベクターＬＢＡ４４０４（ｐＴＯＫ２３３）を用いて、イネに対する形質転換能力を比較した。その結果、後者での形質転換効率がより高いことを確認した。このことは、ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒ領域の形質転換用ベクターへの利用に関して、一部の領域（ｖｉｒＢおよびｖｉｒＧ）を用いる方が、全領域を用いるより形質転換能力が高いことを示唆している。
【００１３】
ｖｉｒＤについては、ｖｉｒＤ１とｖｉｒＤ２はボーダー配列に切れ込みを入れ、Ｔ−ＤＮＡを生み出し、特にｖｉｒＤ２はＴ−ＤＮＡと複合体を形成する。ｖｉｒＤ３は保存性が低くＴ−ＤＮＡの移行に不要と考えられている。ｖｉｒＤ４はｖｉｒＢ遺伝子群と共にタイプＩＶ分泌システムを構成する。ｖｉｒＤ５はタイプＩＶ分泌システムのシグナル機能を持つ付属タンパク質であると考えられている（Ｒｅａｍ，  Ｗ．（２００８）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｂｉｌｅ  Ｔ−ＤＮＡ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．  Ｉｎ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ｔ．  Ｔｚｆｉｒａ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，  ｅｄｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，  ＬＬＣ），ｐｐ．２８０−３１３．）。
【００１４】
一般にベクターは、小さい方が所望のＤＮＡを組み込むなどの操作が容易なため、小型の方が好ましい。また、大腸菌が安定的に保持できる外来ＤＮＡは細胞あたり１２００〜１５００ｋｂと推測されている（Ｔａｏ，  Ｑ．，  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．−Ｂ．（１９９８）．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｖｅｒ  ３００ｋｂ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６  ４９０１−４９０９）。よって、大腸菌は一定の大きさ以上のプラスミドを安定に保持することができない。例えばＣｏｌＥ１由来の複製開始点を持つプラスミドは、大腸菌細胞あたり３０〜４０コピー存在するため、３０〜４０ｋｂより大きいサイズのプラスミドを保持することができない。
【００１５】
ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域に関し、特に、ｖｉｒＤ領域及びｖｉｒＪ領域がアグロバクテリウム細菌を用いた形質転換に有用であることを示唆するような知見はなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】WO2007/148819 A1
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Amoah, B.K., Wu, H., Sparks, C., and Jones, H.D. (2001). Factors influencing Agrobacterium‐mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. J Exp Bot 52, 1135-1142
【非特許文献２】An, G., Evert, P.R., Mitra, A., and Ha, S.B. (1988). Binary vectors. In Plant Molecular Biology Manual A3, S.B. Gelvin and R.A. Schilperoort, eds (Dordrecht: Kluwer Academic Press), pp. 1-19
【非特許文献３】Arokiaraj, P., Leelawathy, R., and Yeang, H.Y. (2009). The Supervirulence Plasmid pToK47 from Agrobacterium tumefaciens A281 Improves Transformation Efficiency of Hevea brasiliensis. Am J Biochem Biotechnol 5, 137-141
【非特許文献４】Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res 12, 8711-8721
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
アグロバクテリウム法は、非常に優れた植物の形質転換方法であるが、形質転換の成否ならびに効率は、植物種、遺伝子型ならびに用いる植物組織に依存して大きく異なる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。未だに十分な効率で形質転換できない植物も多く、多数の形質転換体を容易に得ることができる作物の種類は、一部に限定されている。したがって、このような問題点を解決できる改良手法が強く望まれていた。
【００１９】
本発明は、植物への高い遺伝子導入効率及び形質転換効率を可能にする、新規なスーパーターナリーシステムを利用したアグロバクテリウム細菌、及び当該アグロバクテリウム細菌を用いた植物の形質転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
限定されるわけではないが、本発明は、好ましい態様として以下の態様を含む。
［態様１］
下記の（１）−（３）のプラスミドを含むアグロバクテリウム細菌
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド；並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
［態様２］
（１）プラスミドの（ｉｉ）の複製開始点がＩｎｃＷ複製開始点である、態様１記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様３］
（１）プラスミドが、さらにｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＥ遺伝子を含む、態様１又は２記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様４］
（１）プラスミドが、さらにｒｅｐＡ遺伝子を含む、態様１−３のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様５］
（１）プラスミドが、さらに薬剤選抜マーカー遺伝子を含む、態様１−４のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様６］
薬剤選抜マーカー遺伝子がゲンタマイシン耐性遺伝子である、態様５記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様７］
（１）プラスミドが、配列番号１に記載の塩基配列を有するｐＶＧＷ９である、態様１−６のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様８］
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型プラスミドが、ディスアーム型Ｔｉプラスミドである、態様１−７のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様９］
ディスアーム型ｐＴｉＢｏ５４２を保持しない、態様１−８のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様１０］
下記のグループ
ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３８５０、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ、Ｃ５８−Ｚ７０７、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ、ＧＶ２２６０、及びＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）
から選択されるアグロバクテリウム細菌に、
（１）プラスミド及び（３）プラスミドを導入することによって製造される、態様１−９のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌。
［態様１１］
下記の（１）−（２）のプラスミドを含むアグロバクテリウム細菌
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
並びに
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド
ここにおいて、（１）及び（２）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
［態様１２］
態様１ないし１０のアグロバクテリウム細菌を植物細胞に接触させる、ことを含む、植物の形質転換方法。
［態様１３］
態様１１のアグロバクテリウム細菌に（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドを導入し、そして、
当該アグロバクテリウム細菌を植物細胞に接触させる、ことを含む、植物の形質転換方法。
［態様１４］
植物が被子植物である、態様１２又は１３に記載の植物の形質転換方法。
［態様１５］
アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットであって、態様１−１０又は態様１１のいずれか１項記載のアグロバクテリウム細菌を含む、前記キット。
［態様１６］
アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットであって、下記の（１）−（３）のプラスミドの組み合わせ
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド；並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
を含む、前記キット。
［態様１７］
アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットであって、下記の（１）及び（３）のプラスミドの組み合わせ
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）と（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
を含む、前記キット。
［態様１８］
下記のグループ
ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３８５０、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ、Ｃ５８−Ｚ７０７、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ、ＧＶ２２６０、及びＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）
から選択されるアグロバクテリウム細菌をさらに含む、態様１７に記載のキット。
［態様１９］
配列番号１に記載の塩基配列を有するｐＶＧＷ９プラスミド。
［態様２０］
態様１９に記載のプラスミドの、態様１２−１４のいずれか１項に記載の植物の形質転換方法への使用。
【発明の効果】
【００２１】
本発明のシステムを利用したアグロバクテリウム細菌を使用した植物の形質転換方法は、公知のブースターベクターを用いた（スーパー）ターナリーベクターシステムやスーパーバイナリーシステムを使用した場合と比較して、形質転換効率が向上する。特にトウモロコシにおいて顕著な効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｐＶＧＷ９プラスミドの模式図である。
【図２】図２は、本発明のスーパーターナリーベクターシステムの模式図である。
【図３】図３は、ｐＶＧＷ２プラスミドの模式図である。
【図４】図４は、ｐＧＷプラスミドの模式図である。
【図５】図５は、ｐＧＷＬプラスミドの模式図である。
【図６】図６は、ｐＶＧＷ７プラスミドの模式図である。
【図７】図７は、ブースターベクターに付加して用いたｐＴｉＢｏ５４２由来ｖｉｒ領域の模式図である。
【図８】図８は、ｐＬＣ４１ＧＷＨプラスミドの模式図である。
【図９】図９は、ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧプラスミドの模式図である。
【図１０】図１０は、スーパーターナリーベクターシステムによるトウモロコシＡ１８８への遺伝子導入の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
Ｉ．アグロバクテリウム細菌
本発明は、植物の形質転換に用いるためのアグロバクテリウム細菌に関する。
【００２４】
本明細書において、アグロバクテリウム細菌とは、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の中で、植物に対する病原性を持つものの総称であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）及びアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）に分類されていたものを含む。本発明のアグロバクテリウム細菌は、野生型のＴｉプラスミド及び野生型のＲｉプラスミドを含まない。
【００２５】
本発明のアグロバクテリウム細菌は、下記の（１）−（３）の三種類のプラスミドを含むことを特徴とする。
【００２６】
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド；並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
（１）−（３）の３種類のプラスミドベクターを利用することから、スーパーターナリーベクターシステム、と呼称される。特に、ブースターベクターとして使用されるプラスミド（１）は、新規であり、以下の特徴を有する。
【００２７】
（１）ブースターベクター
本明細書において、遺伝子導入効率および形質転換効率を向上させることができ、アグロバクテリウム細菌に付加的に用いることができるベクタープラスミドを、ブースターベクターと呼ぶ。本発明において、下記の構成要素を有するプラスミド（１）をブースターベクターとして用いる。プラスミド（１）は、（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び、（ｉｉ）複製開始点を含む。
【００２８】
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子
Ｔｉプラスミドは、野生型アグロバクテリウムが有する一般に２０万塩基対前後の巨大なプラスミドで、植物に導入されるＴ−ＤＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒＤＮＡ）、ビルレンス領域（ｖｉｒｌｅｎｃｅ領域：ｖｉｒ領域）等を含む。Ｔ−ＤＮＡは、相同組換えにより植物細胞のゲノムに挿入されるＤＮＡ断片であり、植物生長調節因子（オーキシン及びサイトカイニン）合成遺伝子、オパイン合成遺伝子などを含む。ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの植物への組み込みのために必要となるタンパク質群をコードする領域で、ｖｉｒＡ遺伝子、ｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ遺伝子、ｖｉｒＥ遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子等の各遺伝子が含まれる。
【００２９】
強病原性アグロバクテリウム菌株Ａ２８１が有するＴｉプラスミドの「ｐＴｉＢｏ５４２」（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）が有するＴｉプラスミドのｖｉｒ領域は形質転換効率が特に高く、スーパービルレンス領域（ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ領域：ｓｕｐｅｒ−ｖｉｒ領域）と呼ばれる。
【００３０】
本発明のブースターベクターは、ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子の全てを含むことを特徴とする。
【００３１】
ｖｉｒＢ遺伝子については、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６３：５８０４−５８１４に詳細な記載がある。
【００３２】
例えばｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １０：１６５−１７４）などのプラスミドから、常法により調製することができる。ｖｉｒＢ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＡＢ０２７２５５（ｐＳＢ１）の塩基配列のうち、第３４１６から１２８５１番目の塩基として規定される。なお、ｖｉｒＢ領域は、複数の遺伝子から構成されているオペロンであるが、本明細書においては、これを「ｖｉｒＢ遺伝子」と記載する。
【００３３】
ｖｉｒＣ遺伝子については、Ｃｌｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）に詳細な記載がある。例えばｐＳＢ１などのプラスミドから、常法により調製することができる。ｖｉｒＣ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＤＱ０５８７６４の塩基配列のうち、第１６３５７４−１６４８８０番目の塩基として規定される。なお、ｖｉｒＣ領域は、複数の遺伝子から構成されているオペロンであるが、本明細書においては、これを「ｖｉｒＣ遺伝子」と記載する。
【００３４】
ｖｉｒＤ遺伝子は、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＤ４遺伝子及びｖｉｒＤ５遺伝子の５つの遺伝子から構成される。ｖｉｒＤ遺伝子については、例えば、Ｒｅａｍ，  Ｗ．（２００８）．  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍｏｂｉｌｅ  Ｔ−ＤＮＡ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．  Ｉｎ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，  Ｔ．  Ｔｚｆｉｒａ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｃｉｔｏｖｓｋｙ，  ｅｄｓ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ），ｐｐ．２８０−３１３に詳細な記載がある。本発明のブースターベクターは、ｖｉｒＤ遺伝子のうち、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子を含む。ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子及び、ｖｉｒＤ３遺伝子は各々、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＤＱ０５８７６４の塩基配列のうち、第１６５１４９−１６５５９２番目の塩基、第１６５６２６−１６６９００番目の塩基及び第１６６９２０−１６７５５８番目の塩基として規定される。
【００３５】
ｖｉｒＧは、ｖｉｒＢやｖｉｒＥなど他のｖｉｒ遺伝子群の転写調節（活性化）因子である（Ｗｉｎａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  １９８６  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：  ８２７８−８２８２）。ｖｉｒＧ遺伝子の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＤＱ０５８７６４の塩基配列のうち、第１６２６６０−１６３４６３番目の塩基として規定される。
【００３６】
ｖｉｒＪ遺伝子については、Ｐａｎｔｏｊａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）に詳細な記載がある。例えばｐＴｉＢｏ５４２などのプラスミドから、常法により調製することができる。ｖｉｒＪの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＤＱ０５８７６４の塩基配列のうち、第１５０８７３−１５１６１６番目の塩基として規定される。
【００３７】
ｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子として、各々上述した特定の配列またはその相補配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなるＤＮＡであって、各配列の機能を有するＤＮＡからなる遺伝子も利用することができる。これらの塩基配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一の塩基配列を含んでなるＤＮＡであって、各配列の機能を有するＤＮＡからなる遺伝子も利用することができる。しかしながら、これらに限られるものではない。
【００３８】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。
【００３９】
一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
【００４０】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
【００４１】
２つの塩基配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの塩基配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、塩基配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４：  ６７４５，  １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルター���含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００４２】
本発明のブースターベクターにおいて、ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子のベクター上の位置は特段限定されるものではない。例えば、これらの遺伝子を全て含むようなｐＴｉＢｏ５４２由来のｖｉｒ領域断片（図７）を好ましく使用することができる。
【００４３】
（ｉｉ）複製開始点
本発明におけるブースターベクター（（１）プラスミド）は、大腸菌及びアグロバクテリウム細菌で複製可能な複製開始点を含む。限定されるわけではないが、例えば、ＩｎｃＷ不和合性グループの複製開始点、ＩｎｃＰ不和合性グループの複製開始点、ＩｎｃＱ不和合性グループの複製開始点およびｐＶＳ１不和合性グループの複製開始点から適宜選択される複製開始点を利用することができる。
【００４４】
複製開始点は、好ましくはＩｎｃＷ不和合性グループの複製開始点、さらに好ましくはＩｎｃＷの複製開始点である。ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点の分子生物学的諸特性については、Ｏｋｕｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｋａｄｏ（１９９２  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２３５：５５−６３）に詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｕ３０４７１（全長５５００ｂｐ）の第２１７０〜２５５２番目の塩基として規定される。ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点は、ｐＴＯＫ４７（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）などの、ＩｎｃＷプラスミドから、常法により調整することができる。
【００４５】
また、ＩｎｃＷプラスミドの複製開始点を機能させるため、ＲｅｐＡタンパク質（イニシエーター）のコード領域を含むことが好ましい。ｒｅｐＡ遺伝子の塩基配列は、ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡ遺伝子として機能を有する配列であれば、特に限定されない。ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡの分子生物学的諸特性については、Ｏｋｕｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｋａｄｏ（１９９２  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２３５：５５−６３）に詳細な記載があり、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：Ｕ３０４７１（全長５５００ｂｐ）の第１１０８〜２０７９番目の塩基として規定される。      
【００４６】
ＩｎｃＷプラスミドの複製に必要なｒｅｐＡは、ｐＴＯＫ４７（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７）などの、ＩｎｃＷプラスミドから、常法により調整することができる。
【００４７】
（ｉｉｉ）その他の構成要素
本発明のブースターベクター（（１）プラスミド）は、さらに、ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域の他の遺伝子、例えば、ｖｉｒＥ遺伝子、ｖｉｒＤ４遺伝子又はｖｉｒＤ５遺伝子を含んでもよい。
【００４８】
ｖｉｒＥ遺伝子については、Ｃｉｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）に詳細な記載がある。例えばｐＴｉＢｏ５４２などのプラスミドから、常法により調製することができる。ｖｉｒＥの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＤＱ０５８７６４の塩基配列のうち、第１７２５７４−１７６５１０番目の塩基として規定される。なお、ｖｉｒＥ領域は、複数の遺伝子から構成されているオペロンであるが、本明細書においては、これを「ｖｉｒＥ遺伝子」と記載する。
【００４９】
ｖｉｒＤ４遺伝子については、Ｃｈｒｉｓｔｉｅ（２００４）に詳細な記載がある。例えばｐＴｉＢｏ５４２などのプラスミドから、常法により調製することができる。ｖｉｒＤ４の塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＤＱ０５８７６４の塩基配列のうち、第１６７５５５−１６９５１３番目の塩基として規定される。
【００５０】
ｖｉｒＤ５遺伝子については、Ｖｅｒｇｕｎｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）に詳細な記載がある。例えばｐＴｉＢｏ５４２などのプラスミドから、常法により調製することができる。ｖｉｒＤ５塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬアクセッション番号：ＤＱ０５８７６４の塩基配列のうち、第１６９６１４−１７２１２４番目の塩基として規定される。
【００５１】
本発明のブースターベクターは、さらに、薬剤選抜マーカー遺伝子を含んでもよい。薬剤選抜マーカー遺伝子は、公知の遺伝子を使用することができ特に限定されないが、ＴｉプラスミドおよびＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド（バイナリーベクター）に含まれない薬剤選抜マーカー遺伝子であることが好ましい。薬剤選抜マーカー遺伝子の具体例として、好ましくはゲンタマイシン耐性遺伝子を使用することができるが、それには全く限定されない。カナマイシン耐性遺伝子，アンピシリン耐性遺伝子，スペクチノマイシン耐性遺伝子，テトラサイクリン耐性遺伝子，ハイグロマイシン耐性遺伝子をはじめとする多くの薬剤選抜マーカー遺伝子を、目的に応じて好ましく用いることができる。本発明のブースターベクター上およびバイナリーベクター上の薬剤選抜マーカー遺伝子の種類を変更することは、ｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ＰＣＲなどにより、容易に行うことができる。
【００５２】
本発明におけるブースターベクターの全長は、限定されるものではないが、好ましくは１０ｋｂ〜３０ｋｂ、より好ましくは１５ｋｂ〜２５ｋｂである。
【００５３】
（ｉｖ）ｐＶＧＷ９
上記のような条件を満たした、本発明のブースターベクターの一つとしてｐＶＧＷ９が挙げられる。ｐＶＧＷ９は本明細書に添付の配列番号１の塩基配列を有し、全長は２０９７８塩基対である。
【００５４】
ｐＶＧＷ９の模式図を図１に示す。各構成要素は、配列番号１の塩基配列中、以下の位置に相当する。
【００５５】
複製開始点：  配列番号１の第９−２７５８番目の塩基
ｖｉｒＪ遺伝子：  配列番号１の第３００３−３７４６番目の塩基
ｖｉｒＢ遺伝子：  配列番号１の第５２２３−１４６５８番目の塩基
ｖｉｒＧ遺伝子：  配列番号１の第１４７９０−１５５９３番目の塩基
ｖｉｒＣ遺伝子：  配列番号１の第１５７０４−１７０１０番目の塩基
ｖｉｒＤ１遺伝子：  配列番号１の第１７２７９−１７７２２番目の塩基
ｖｉｒＤ２遺伝子：  配列番号１の第１７７５６−１９０３０番目の塩基
ｖｉｒＤ３遺伝子：  配列番号１の第１９０５０−１９６８８番目の塩基
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド
本発明のアグロバクテリウム細菌は、さらに、アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド（本明細書中、「Ｔｉプラスミド」と総称する場合がある）を含む。
【００５６】
Ｒｉプラスミドはアグロバクテリウム細菌のうち特にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの有するプラスミドである。Ｔｉプラスミドと同様に、２０万塩基対前後の巨大なプラスミドで、植物に導入されるＴ−ＤＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒＤＮＡ）、ビルレンス領域（ｖｉｒｌｅｎｃｅ領域：ｖｉｒ領域）等を含む。
【００５７】
なお、アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミドの複製開始点は、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱおよびｐＶＳ１とは、異なる不和合性グループに属する。
【００５８】
「ディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド」とは、野生型Ｔｉプラスミド若しくは野生型ＲｉプラスミドからＴ−ＤＮＡ領域を除去したプラスミドである。好ましくは、アグロバクテリウム細菌のディスアーム型プラスミドは、ディスアーム型Ｔｉプラスミドである。
【００５９】
ディスアーム型Ｔｉプラスミドは、例えば、Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）に記載されている、ｐＡＬ４４０４を利用することができる。ディスアーム型Ｒｉプラスミドは、例えば、Ｊｏｕａｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）に記載されている、ｐＲｉＢ２７８ｂを利用することができる。
【００６０】
あるいは、ディスアーム型Ｔｉプラスミドが元来保持されている公知のアグロバクテリウム菌株を利用することも可能である。本発明のアグロバクテリウム細菌は、好ましくはディスアーム型ｐＴｉＢｏ５４２を含まない。限定されるものではないが、例えばＬＢＡ４４０４、ＧＶ３８５０、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ、Ｃ５８−Ｚ７０７、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０，ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ、ＧＶ２２６０、又はＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）を使用することができる。
【００６１】
（３）バイナリーベクター（所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド）
本発明のアグロバクテリウム細菌はさらに、所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドを含む。このプラスミドはアグロバクテリウムと大腸菌の両方で複製可能であり、バイナリーベクターと呼ばれる。バイナリーベクターとしては、公知のものを適宜用いることができる。以下に限定されるわけではないが、具体的には、ｐＢｉｎ１９、ｐＢＩ１２１、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ、ｐＬＣ４１、ｐＧｒｅｅｎシリーズのベクター、ｐＣＬＥＡＮ-Ｇシリーズのベクター、ｐＰＺＰシリーズのベクター、ｐＣＡＭＢＩＡシリーズのベクター、ｐＯＲＥＯ１、ｐＧＷＢなどのベクターが挙げられる。
【００６２】
本発明のＴ−ＤＮＡ領域に挿入するＤＮＡは特に限定されない。例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片等、任意のものを利用可能である。好ましくはゲノムＤＮＡ断片、より好ましくは植物由来のゲノムＤＮＡ断片である。限定されるわけではないが、好ましくは導入されるＤＮＡ断片のサイズは、０．１ｋｂ−１００ｋｂ、より好ましくは１ｋｂ−４０ｋｂである。
【００６３】
なお、大断片のＴ−ＤＮＡをバイナリーベクターに挿入する場合、Ｒｉプラスミド（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｆｒａｒｙ，  Ａ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｔａｎｋｓｌｅｙ，  Ｓ．Ｄ．  （１９９６）．  Ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｐｌａｎｔ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３，９９７５−９９７９．）の複製開始点を好ましく用いることができる。
【００６４】
本発明において、（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。バイナリーベクターとブースターベクターが、同じ不和合性グループに属する場合には、両ベクターをアグロバクテリウム中で保持することができない。そのため、これらの複製開始点を異なる不和合性グループとする必要がある。例えば、ＩｎｃＷ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱおよびｐＶＳ１は、それぞれ異なる不和合性グループに属する。「（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する」とは、（１）−（３）の３種類のプラスミドが各々異なる不和合性グループに属する、例えば、各々ＩｎｃＷ、ＩｎｃＰ、ＩｎｃＱと互いに異なる不和合性グループに属すればよい。３種類のプラスミドのうち、２種類でも同じグループに属すると、本要件を満たさない。
【００６５】
本発明のアグロバクテリウム細菌の態様
（１）−（３）の３種類のプラスミドをアグロバクテリウム細菌に導入する順序、導入する方法は特に限定されない。
【００６６】
例えば、ディスアーム型Ｔｉプラスミド（（２）プラスミドに相当する）が元来保持されている公知のアグロバクテリウム菌株を利用することも可能である。限定されるものではないが、例えばＬＢＡ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、ＧＶ３８５０（Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、Ｃ５８−Ｚ７０７（Ｈｅｐｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０（Ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，１９８６），ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ（Ｋｏｎｃｚ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌ，１９８６）、ＧＶ２２６０（ＭｃＢｒｉｄｅ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ，１９９０）、又はＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）（Ｐａｌａｎｉｃｈｅｌｖａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）を使用することができる。これらのアグロバクテリウム菌株に、ブースターベクター（（１）プラスミド）及びバイナリーベクター（（３）プラスミド）を導入してもよい。ブースターベクターとバイナリーベクターは、例えば、エレクトロポレーション法、三系交雑法、凍結融解法などの公知の方法によって導入することが可能である。ブースターベクターとバイナリーベクターの導入順序は特に限定されない。両者を同時に導入してもよい。
【００６７】
本発明の一態様において、アグロバクテリウム細菌は、
下記のグループ
ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３８５０、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ、Ｃ５８−Ｚ７０７、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ、ＧＶ２２６０、及びＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）
から選択されるアグロバクテリウム細菌に、
（１）プラスミド及び（３）プラスミドを導入することによって製造される。
【００６８】
本発明はまた、一態様において、下記の（１）−（２）のプラスミドを含むアグロバクテリウム細菌を含む、
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
並びに
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド
ここにおいて、（１）及び（２）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
【００６９】
（１）及び（２）のプラスミドを含むアグロバクテリウム細菌は、さらに、所望の遺伝子が挿入されたＴ−ＤＮＡを有する（３）バイナリーベクターを導入することが可能であり、広く利用可能である。
【００７０】
ＩＩ．植物の形質転換方法
本発明は、また、本発明のアグロバクテリウム細菌を利用した植物の形質転換方法、植物への遺伝子導入方法に関する。本発明の方法は、本発明のアグロバクテリウム細菌を植物細胞に接触させる、ことを含む。
【００７１】
本発明の方法は一態様において、下記の（１）−（２）のプラスミドを含むアグロバクテリウム細菌
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
並びに
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド
ここにおいて、（１）及び（２）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する
に、（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミドを導入し、そして、
当該アグロバクテリウム細菌を植物細胞に接触させる、ことを含む。
【００７２】
本発明の形質転換方法の対象とされる植物は、特に限定されないが、好ましくは被子植物であり、単子葉植物であっても双子葉植物であってもよい。限定されるわけではないが、本明細書の実施例に記載のとおり、トウモロコシやイネ、トマトに好ましく使用できる。
【００７３】
本発明のアグロバクテリウム細菌を、公知のアグロバクテリウムを介した形質転換方法に使用することにより、形質転換効率を大幅に向上させることができる。
【００７４】
ＩＩＩ．キット
本発明は、さらに、アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットに関する。一態様において、本発明のキットは、本発明のアグロバクテリウム細菌を含む。
【００７５】
本発明は、さらにまた、アグロバクテリウムを介して植物細胞を形質転換する方法に用いるためのキットに関する。一態様において、本発明のキットは、下記の（１）−（３）のプラスミドの組み合わせ
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
（２）アグロバクテリウム細菌のディスアーム型Ｔｉプラスミド若しくはディスアーム型Ｒｉプラスミド；並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）−（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
を含む。
【００７６】
本発明のキットはまた、別の態様において、（１）及び（３）のプラスミドの組み合わせ
（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
並びに
（３）所望のＤＮＡからなるＴ−ＤＮＡ領域を有するプラスミド
ここにおいて、（１）と（３）の各プラスミドは、互いに共存可能な複製機構を有する。
を含む。当該態様において、キットはさらに、下記のグループ
ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３８５０、ＧＶ３ＴｉｌｌＳＥ、Ｃ５８−Ｚ７０７、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０、ＧＶ３１０１：：ｐＭＰ９０ＲＫ、ＧＶ２２６０、及びＮＴＩ（ｐＫＰＳＦ２）
から選択されるアグロバクテリウム細菌を含んでもよい。
【００７７】
ＩＶ．プラスミド
本発明はさらに、（１）下記の構成要素を有するプラスミド；
（ｉ）ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ遺伝子、ｖｉｒＣ遺伝子、ｖｉｒＤ１遺伝子、ｖｉｒＤ２遺伝子、ｖｉｒＤ３遺伝子、ｖｉｒＧ遺伝子及びｖｉｒＪ遺伝子、及び
（ｉｉ）複製開始点
に関する。本発明のプラスミドは、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列を有するｐＶＧＷ９プラスミドである。
【００７８】
本発明はまた、本発明のプラスミドの、態様１２−１４のいずれか１項に記載の植物の形質転換方法への使用に関する。
【００７９】
Ｖ．植物細胞形質転換用ベクターシステム
本発明は、さらにまた、上述した（１）−（３）の三種類のプラスミドを組み合わせて利用する、植物細胞形質転換用ベクターシステム（スーパーターナリーベクターシステム）を提供する。
【００８０】
上述した公知のスーパーバイナリーベクターは、ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒ領域から切り出された１４．８ｋｂのＫｐｎＩ断片（ｖｉｒＤ１遺伝子の一部，ｖｉｒＢ遺伝子，ｖｉｒＣ遺伝子およびｖｉｒＧ遺伝子）を組み込んだアクセプターベクターと、大腸菌でクローニングした所望のＴ−ＤＮＡを有するシャトルベクターの間において相同組換えにより得られるハイブリッドベクターである。したがって、アグロバクテリウムにあらかじめアクセプターベクターを導入しておく必要があるため、アグロバクテリウム菌株を多種類試験したいときなどには、準備に大変手間が掛かる。また、特許文献ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１には、３０ｋｂ〜４０ｋｂの大きなＴ−ＤＮＡを相同組換えで挿入しようとした時、ハイブリッドベクターがアグロバクテリウム内で不安定であったことが報告されている。シャトルベクターの複製開始点が多コピー型のＣｏｌＥ１であることが要因と考えられる。
【００８１】
これに対して、本発明のスーパーターナリーベクターシステムは、ブースターベクターをディスアーム型Ｔｉプラスミドが保持されているアグロバクテリウム菌株に導入しておき、そこに所望の遺伝子が挿入されたＴ−ＤＮＡを有するバイナリープラスミドをエレクトロポレーション法などで導入すれば、植物の形質転換に用いることができる。すなわち、種々の植物で広く用いられているバイナリーベクター菌株に、本発明のブースターベクターをエレクトロポレーション法などにより導入するだけで、スーパーターナリーベクターシステムを容易に構築することができ、これにより格段に高い効率で形質転換植物体を獲得することが可能である。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【００８３】
実施例１  スーパーターナリーベクターシステムの構築
本実施例は、本発明の３種類のプラスミドを利用するベクターシステム（スーパーターナリーベクターシステム）の構築について記載する。
【００８４】
ｐＴＯＫ４７には、ＩｎｃＷ  ｏｒｉとｐＢＲ３２２のｏｒｉの双方が含まれ、全長はおよそ２８ｋｂである（Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。また、ｐＡＬ１５４（Ａｍｏａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）の全長は、２４ｋｂである。これらのブースターベクターは、アグロバクテリウム内での複製保持に不要な配列を多く含む長いプラスミドである。スーパーターナリーベクターシステムのブースターベクターとして用いるベクターは、サイズが小さくｖｉｒ領域断片の組み込みが容易で、大腸菌でのクローニングも可能なシャトルベクターであることが望まれる。特許文献ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１には、これらの目的に合致するベクターｐＶＧＷ２が開示されている。ｐＶＧＷ２は、ＩｎｃＷ  ｏｒｉとｐＢＲ３２２のｏｒｉの双方が含まれ、ゲンタマイシン耐性遺伝子を有している（図３）。本実施例では、このｐＶＧＷ２を基にｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒｕｌｅｎｃｅ領域を有するブースターベクターの構築を行った。
【００８５】
まず、ｐＶＧＷ２をテンプレートにｐＳａ５’ＥｃＴ２２Ｉ（５’−ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＡＡＣ  ＡＧＡ  ＡＴＣ  ＴＧ−３’）（配列番号２）とＭ１３（−２０）Ｆｗ（５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  Ｇ−３’）（配列番号３）のプライマーセットでＰＣＲを行い、得られたフラグメントをセルフライゲーションさせて新規クローニングベクター「ｐＧＷ」を作成した（図４）。なお、ＰＣＲ試薬にはＦｉｄｅｒｉｔｙの高い「ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ」（ＴａＫａＲａ）を用いた。以下、コンストラクションに関わるすべてのＰＣＲでこの試薬を用いた。
【００８６】
ブースターベクターｐＶＧＷ７の作成
ｖｉｒ遺伝子群としてｐＴＯＫ４７およびｐＡＬ１５４に保持されている１４．８ＫｂのＫｐｎＩ  断片を含むブースターベクターｐＶＧＷ７の作成を行った。まずクローニング時の作業効率を高めるため、ｐＧＷにｐＵＣ１９のラクトース・オペロンを組み込むことにした。ｐＵＣ１９をＳａｐＩ＋ＡａｔＩＩで消化して得られたラクトース・オペロン断片をｐＧＷのＮｓｉＩ−ＮｈｅＩサイトに挿入し、新規クローニングベクター「ｐＧＷＬ」を得た（図５）。このｐＧＷＬのＫｐｎＩサイトにｐＳＢ１をＫｐｎＩで消化して得られた断片を挿入してｐＶＧＷ７（図６、図７）を得た。
【００８７】
ブースターベクターｐＶＧＷ９の作成
ブースタープラスミドに挿入するｐＴｉＢｏ５４２由来ｖｉｒ遺伝子群の領域をさらに広げることにより、形質転換能力がさらに向上するかどうか試験を行うこととした。ｐＴｉＢｏ５４２を鋳型にあらかじめリン酸化しておいたプライマー、ｐＴｉＢｏ５４２：１５０６４１Ｆｗ（５’−ａａａ  ａａｃ  ｔａｇ  ｔｃａ  ｇａｇ  ｃｃａ  ｃｃｃ  ｃａｔ  ｃａｇ  ｇａａ  ｔａｔ  ｃｇｃ  ｃｃａ  ｔｔｃ  ｃｇｔ  ｃａｔ  ｃａｇ  ｃｇｔ  ｇｇｔ  ｇａｃ−３’）（配列番号４）およびｄｅｌＤ２−３’Ｒｖ（５’−ｔｃｃ  ａａａ  ｇａｔ  ｃｇｇ  ｃｃｃ  ｃｔｔ  ｇａｔ  ｇｃｇ  ａｃｔ  ｇｔａ  ａｃｇ  ｃｔｇ  ｃａｇ  ａｔａ  ａｃ−３’）（配列番号５）でＰＣＲを行い、その増幅産物をＳｍａＩにより開環され脱リン酸化処理されたｐＧＷベクターの両末端へライゲーションした。その結果、ｖｉｒＢ、ｖｉｒＣ、ｖｉｒＤ１、Ｄ２、Ｄ３、ｖｉｒＧおよびｖｉｒＪ遺伝子の全領域を含む目的のコンストラクトｐＶＧＷ９（図１、図７）を得た。ｐＶＧＷ９の塩基配列を配列表の配列番号１に記載した。
【００８８】
ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧの作成
特許文献ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１に記載されているコスミドベクターｐＬＣｌｅｏ（別名ｐＬＣ４１ＧＷＨ）は、ＩｎｃＰプラスミドであり複製開始点ｏｒｉＶを有する（図８）。ｏｒｉＶは大腸菌およびアグロバクテリウムの双方で機能する。また、Ｔ−ＤＮＡ領域中にトウモロコシのユビキチン遺伝子の第一イントロンを含むプロモーターで制御されるハイグロマイシン耐性遺伝子を有している。このｐＬＣ４１ＧＷＨのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターで制御されヒマのカタラーゼ第一イントロンが介在するＧＵＳ遺伝子（Ｐ３５Ｓ：Ｉｃａｔ：ＧＵＳ：Ｔ３５Ｓ）を挿入するため、ｐＬＣ４１ＧＷＨおよびｐＳＢ３４（Ｈｉｅｉ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｒｉ，２００６）をＨｉｎｄＩＩＩで消化。消化サンプルは０．７％  ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧアガロースで電気泳動し、目的のバンドを切り出してＱＩＡＥＸ  ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ社）によりゲルからＤＮＡを抽出・精製した。ベクター断片と挿入断片をライゲーションし（１６℃、一晩）、反応液をエタノール沈殿処理してＭｉｌｌｉＱ水で再溶解したものをエレクトロポレーションで大腸菌ＧｅｎｅＨｏｇｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へ導入した。抗生物質カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＬＢ寒天培地上で培養し、得られたコロニーからプラスミドを精製した。これらのクローンに関して塩基配列を決定し、目的の挿入領域を有していることが確認されたものをバイナリーベクターｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧと命名した（図９）。
【００８９】
バイナリーベクター菌株およびスーパーターナリーベクター菌株の作成
ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４、ＧＶ２２６０、ＧＶ３８５０に導入し、抗生物質カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含んだＡＢ寒天培地上で培養し、３種類のバイナリーベクター菌株を得た。次にブースターベクターｐＶＧＷ７をエレクトロポレーションにより、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）へ導入し、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含んだＡＢ寒天培地上で培養し、スーパーターナリーベクター菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ７）を得た。さらに、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）各菌株に、ブースターベクターｐＶＧＷ９をエレクトロポレーションにより導入、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含んだＡＢ寒天培地上で培養し、スーパーターナリーベクター菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）、ＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）を得た。またＬＢＡ４４０４（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）（Ｈｉｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）に、ブースターベクターｐＶＧＷ９をエレクトロポレーションにより導入、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含んだＡＢ寒天培地上で培養し、スーパーターナリーベクター菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＩＧ１２１Ｈｍ／ｐＶＧＷ９）を得た。
【００９０】
実施例２  スーパーターナリーベクターシステムによるトウモロコシＡ１８８への遺伝子導入
本実施例では、実施例１で作成したスーパーターナリーベクター菌株ＬＢＡ４４０４を用いてトウモロコシＡ１８８への遺伝子導入を行った。
【００９１】
材料および方法
大きさ約１．２ｍｍのトウモロコシ未熟胚（品種：Ａ１８８）を温室栽培した植物から無菌的に取り出し、アグロバクテリウム懸濁用液体培地ＬＳ−ｉｎｆ  （Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に浸漬した。４６℃、３分間の熱処理後、同液体培地で未熟胚を１回洗浄した。次に２０，０００Ｇで１０分間（４℃）の遠心処理を行った後、未熟胚を実施例１で作成したＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）およびＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）、ＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）の各菌株を約１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で懸濁したアセトシリンゴン１００μmＭを含むＬＳ−ｉｎｆ培地に浸漬後、共存培地ＬＳ−ＡＳ（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に置床した。２５℃、暗黒下で３日間培養後、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）によって未熟胚のＧＵＳ活性を調査した。
【００９２】
結果および考察
各種菌株をＡ１８８未熟胚に接種し、共存培養３日目にＧＵＳ遺伝子の一過性の発現を観察した。対照のＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）およびＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）を接種した未熟胚では、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）を接種した場合のみわずかにＧＵＳ活性が認められた。ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）およびＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）では、ほとんど遺伝子導入が生じなかった（図１０）。
【００９３】
これに対し、ブースターベクターｐＶＧＷ９を導入したスーパーターナリーベクター菌株では、いずれの菌株でも未熟胚の胚盤上にＧＵＳ活性が観察された。特にＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）では、高頻度でＧＵＳ発現が観察された（図１０）。
【００９４】
実施例３  スーパーターナリーベクターシステムによるトウモロコシＡ１８８の形質転換
本実施例では、実施例１で作成したスーパーターナリーベクター菌株ＬＢＡ４４０４を用いてトウモロコシＡ１８８の形質転換を行った。
【００９５】
材料および方法
大きさ約１．２ｍｍのトウモロコシ未熟胚（品種：Ａ１８８）を温室栽培した植物から無菌的に取り出し、アグロバクテリウム懸濁用液体培地ＬＳ−ｉｎｆ（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に浸漬した。  ４６℃、３分間の熱処理後、同液体培地で未熟胚を１回洗浄した。次に２０，０００Ｇで１０分間（４℃）の遠心処理を行った後、未熟胚をバイナリーベクターシステムＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、およびターナリーベクターシステムＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ７）、スーパーターナリーベクターシステムＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）およびスーパーバイナリーベクターシステムのＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）（Ｈｉｅｉ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｒｉ，２００６）の各菌株を約１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で懸濁したアセトシリンゴン１００μＭを含むＬＳ−ｉｎｆ培地に浸漬後、共存培地ＬＳ−ＡＳ（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に置床した。なお、ｐＳＢ１３４とｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧのＴ−ＤＮＡ上のプロモーター，ターミネーターを含めた遺伝子構成は同一である。２５℃、暗黒下で３日間培養した。共存培養後の未熟胚をハイグロマイシン（Ｈｍ）含有の選抜培地（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に置床し培養を行った。増殖したカルスを小片に切り取り、Ｈｍを含む再分化培地（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に置床し、照明下で培養した。２週間後、Ｈｍに抵抗性を示す再分化植物の調査を行った。
【００９６】
結果および考察
結果を表１に示す。
【００９７】
【表１】
2016111926.tif 000002
【００９８】
バイナリーベクターシステムＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）のみでは全く形質転換体を得ることができなかった。それ以外のｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ、Ｃ、Ｇを付加したベクターシステムすべてでＨｍ耐性かつＧＵＳ陽性のトウモロコシ形質転換体が得られた（表１）。
【００９９】
各ベクターシステム間の比較では、スーパーバイナリーベクターシステムＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１３４）とスーパーターナリーベクターシステムＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ７）の間では、後者の方がやや形質転換効率が高かった（表１）。特許文献ＷＯ２００７／１４８８１９  Ａ１では、同様にＡ１８８の未熟胚を用いた形質転換試験において、１４．８ｋｂのＫｐｎＩ断片を有するスーパーバイナリーベクターシステムの方が、同様に１４．８ｋｂのＫｐｎＩ断片を有するｐＴＯＫ４７を付加したスーパーターナリーベクターシステムよりわずかに形質転換効率が高かったことを報告している。
【０１００】
これに対し、本発明のスーパーターナリーベクターシステムＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）は、他のベクターシステムより顕著に形質転換効率が高かった（表１）。ｐＴｉＢｏ５４２のｖｉｒＢ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｊの全遺伝子を有するスーパーターナリーベクターシステムは、従来のいずれのベクターシステムより形質転換能力が高いものと考えられる。
【０１０１】
実施例４  スーパーターナリーベクターシステムによるインディカイネＩＲ６４の形質転換
本実施例では、実施例１で作成したスーパーターナリーベクター菌株ＬＢＡ４４０４を用いてインディカイネＩＲ６４の形質転換を行った。
【０１０２】
材料および方法
インディカイネ品種ＩＲ６４の１．５ｍｍ長の未熟胚を無菌的に単離し、ＣＣＭカルス誘導培地に置床し、３０℃暗黒下で１０日間培養した。胚盤から増殖したカルスをさらに３０℃明条件下で２週間培養した。得られたカルスを１−２ｍｍの大きさに切りさらに４日間培養した後、実施例１で作成したＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＬＢＡ４４０４（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）およびＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）、ＬＢＡ４４０４（ｐＩＧ１２１Ｈｍ／ｐＶＧＷ９）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）、ＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）の各菌株を約１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌの濃度で懸濁したアセトシリンゴン１００μＭを含むアグロバクテリウム懸濁用液体培地ＡＡＭ培地（Ｈｉｅｉ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｒｉ，２００８）に浸漬した。その後、共存培地ＮＢ−Ａｓ（Ｈｉｅｉ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｒｉ，２００８）に置床し、２５℃、暗黒下で３日間培養した。共存培養後のカルスをＨｍ含有の選抜培地（Ｈｉｅｉ  ａｎｄ  Ｋｏｍａｒｉ，２００８）に置床し培養を行った。増殖したＨｍ耐性カルスをＸ−Ｇｌｕｃ溶液で処理しＧＵＳ活性を調査した。
【０１０３】
結果および考察
結果を表２に示す。
【０１０４】
【表２】
2016111926.tif 000003
【０１０５】
Ｈｍ耐性かつＧＵＳ陽性カルスは、対照のＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＬＢＡ４４０４（ｐＩＧ１２１Ｈｍ）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）およびＧＶ３８５０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）を接種したカルスからは一切得ることはできなかった（表２）。これに対し、ブースターベクターｐＶＧＷ９を導入したスーパーターナリーベクター菌株では、いずれの菌株でも形質転換カルスが得られ、特にＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）では、供試した９．６％のカルスから形質転換カルスが得られた（表２）。インディカイネは、未熟胚を材料に用いた形質転換は比較的容易に獲得できるが、カルスを材料に用いた場合には大変困難である。従来から用いられてきた様々なバイナリーベクターシステムの菌株に、ブースターベクターｐＶＧＷ９を導入するだけで、形質転換能力が向上し、どの菌株からも容易に形質転換細胞が得られることが実証できた。
【０１０６】
実施例５  スーパーターナリーベクターシステムによるトマト  マイクロトムへの遺伝子導入
本実施例では、実施例１で作成したスーパーターナリーベクター菌株ＬＢＡ４４０４を用いてトマト  マイクロトムへの遺伝子導入を行った。
【０１０７】
材料および方法
トマトのモデル品種マイクロトムの種子を殺菌処理し、寒天培地上で発芽させ、本葉が抽出し始めたばかりの子葉を切り取り、アグロバクテリウムの感染に供試した。方法の詳細は、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）によった。実験に用いた菌株は、実施例１で作成したＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ）およびＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ７）、ＬＢＡ４４０４（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）、ＧＶ２２６０（ｐＬＣ４１ＧＷＨ−ＩＧ／ｐＶＧＷ９）  である。共存培養は、２５℃、暗黒下で３日間行った。共存培養後の葉片をＸ−Ｇｌｕｃ溶液で処理しＧＵＳ活性を調査した。
【０１０８】
結果および考察
結果を表３に示す。
【０１０９】
【表３】
2016111926.tif 000004
【０１１０】
ＧＵＳ遺伝子の一過性の発現を観察したところ、共存培養をアセトシリンゴン存在下で実施した場合には、ブースターベクターの付加効果は小さかったが、アセトシリンゴンを添加しなかった試験区では、ブースターベクターｐＶＧＷ７およびｐＶＧＷ９の付加効果は明瞭であった（表３）。特にｐＶＧＷ９を用いたスーパーターナリーベクターシステムでは、供試したすべての子葉片でＧＵＳ活性が観察された。マイクロトムはもともと形質転換が可能な品種であるが、バイナリーベクターシステム菌株に、ブースターベクターｐＶＧＷ９を導入したスーパーターナリーベクターシステムを用いれば、従来にない高い効率で形質転換体を得られるものと推測された。
【配列表フリーテキスト】
【０１１１】
配列番号１は、ｐＶＧＷ９ベクターの塩基配列である。
【０１１２】
配列番号２は、ＰＣＲプライマーｐＳａ５’ＥｃＴ２２Ｉの塩基配列である。
【０１１３】
配列番号３は、ＰＣＲプライマーＭ１３（−２０）Ｆｗの塩基配列である。
【０１１４】
配列番号４は、ＰＣＲプライマーｐＴｉＢｏ５４２：１５０６４１Ｆｗの塩基配列である。
【０１１５】
配列番号５は、ＰＣＲプライマーｄｅｌＤ２−３’Ｒｖの塩基配列である。
【図１】
2016111926.tif 000005
【図２】
2016111926.tif 000006
【図３】
2016111926.tif 000007
【図４】
2016111926.tif 000008
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016111926.tif 000012
【図９】
2016111926.tif 000013
【図１０】
2016111926.tif 000014
【配列表】
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