(57)【要約】【課題】細胞を撮像した蛍光画像に基づいて細胞の分化情報を取得する際、細胞分裂による蛍光の褪色の影響を取り除くことができ、より正確な細胞の分化情報を取得する細胞分化情報取得装置および方法並びにプログラムを提供する。【解決手段】蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得する蛍光画像取得部２２と、撮像領域を撮像した蛍光画像または蛍光画像以外の画像内の細胞の領域を特定する細胞領域特定部２３と、細胞の分裂情報を取得する細胞分裂情報取得部と、細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、分裂情報に基づく第２の補正処理とを細胞の領域の蛍光画像に対して施す蛍光画像補正部２５と、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報に基づいて、細胞の分化情報を取得する分化情報取得部２６とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、
前記撮像領域を撮像した前記蛍光画像または該蛍光画像以外の画像内の前記細胞の領域を特定する細胞領域特定部と、
前記細胞の分裂情報を取得する細胞分裂情報取得部と、
前記細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、前記分裂情報に基づく第２の補正処理とを前記細胞の領域の蛍光画像に対して施す蛍光画像補正部と、
前記第１の補正処理および前記第２の補正処理の施された前記蛍光画像の情報に基づいて、前記細胞の分化情報を取得する分化情報取得部とを備えたことを特徴とする細胞分化情報取得装置。
【請求項２】
前記撮像領域を撮像した位相差画像を取得する位相差像取得部を備え、
前記細胞領域特定部が、前記位相差画像内の前記細胞の領域を特定し、
前記細胞分裂情報取得部が、前記細胞の領域の位相差画像に基づいて、前記細胞の分裂情報を取得する請求項１記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項３】
前記細胞分裂情報取得部が、複数の前記細胞からなる細胞群の大きさ情報、形状の情報またはテクスチャの情報を前記細胞の分裂情報として取得する請求項２記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項４】
前記細胞分裂情報取得部が、前記細胞の数情報を前記細胞の分裂情報として取得する請求項２記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項５】
前記細胞分裂情報取得部が、複数の前記細胞からなる細胞群の積層領域の情報を前記細胞の分裂情報として取得する請求項２記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項６】
前記細胞分裂情報取得部が、時系列に撮像された複数の前記位相差画像の前記分裂情報をそれぞれ取得し、該複数の分裂情報の時間変化を取得する請求項２から５いずれか１項記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項７】
前記蛍光画像補正部が、前記細胞の領域の蛍光画像に対して、前記分裂情報に応じた補正係数を乗算することによって前記第２の補正処理を施す請求項１から６いずれか１項記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項８】
前記蛍光画像補正部が、前記細胞の種類に応じて前記補正係数を変更するものである請求項７記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項９】
前記蛍光画像補正部が、前記蛍光物質の種類に応じて前記補正係数を変更するものである請求項７または８記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項１０】
前記分化情報取得部が、前記細胞の分化状態を判定し、該判定結果を前記分化情報として取得する請求項１から９いずれか１項記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項１１】
前記分化情報取得部が、前記第１の補正処理および前記第２の補正処理の施された前記蛍光画像の輝度情報に基づいて、前記細胞の分化状態を判定する請求項１０記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項１２】
前記分化情報取得部が、前記第１の補正処理および前記第２の補正処理の施された前記蛍光画像の輝度情報の時間変化に基づいて、前記細胞の分化状態を判定する請求項１１記載の細胞分化情報取得装置。
【請求項１３】
蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得し、
前記撮像領域を撮像した前記蛍光画像または該蛍光画像以外の画像内の前記細胞の領域を特定し、
前記細胞の分裂情報を取得し、
前記細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、前記分裂情報に基づく第２の補正処理とを前記細胞の領域の蛍光画像に対して施し、
前記第１の補正処理および前記第２の補正処理の施された前記蛍光画像の情報に基づいて、前記細胞の分化情報を取得することを特徴とする細胞分化情報取得方法。
【請求項１４】
蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、
前記撮像領域を撮像した前記蛍光画像または該蛍光画像以外の画像内の前記細胞の領域を特定する細胞領域特定部と、
前記細胞の分裂情報を取得する細胞分裂情報取得部と、
前記細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、前記分裂情報に基づく第２の補正処理とを前記細胞の領域の蛍光画像に対して施す蛍光画像補正部と、
前記第１の補正処理および前記第２の補正処理の施された前記蛍光画像の情報に基づいて、前記細胞の分化情報を取得する分化情報取得部としてコンピュータを機能させることを特徴とする細胞分化情報取得プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光物質によって標識された細胞を撮像した蛍光画像に基づいて、細胞の分化情報を取得する細胞分化情報取得装置および方法並びにプログラムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＥＳ（Embryonic Stem）細胞およびｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞などの多能性幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の分化状態を判定する方法が提案されている。
【０００３】
ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。
【０００４】
一方、特許文献１において、細胞に蛍光物質を投入して標識し、その蛍光を観察することによって細胞の状態を評価することが提案されている。また、特許文献２においては、幹細胞から発せられる蛍光の経時変化に基づいて、幹細胞の分化状態を判定することが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１６１３２１号公報
【特許文献２】特開２０１４−１７６３６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ここで、たとえば特許文献２のように、蛍光の経時変化に基づいて、幹細胞の分化状態を判定する場合、蛍光物質の蛍光は時間の経過にともなって褪色し、蛍光量は低下する。したがって、このような蛍光の褪色を考慮することなく、細胞の分化状態の判定を行った場合、誤判定を招くおそれがある。
【０００７】
特許文献１においては、蛍光の褪色の影響を取り除くため、細胞領域の蛍光画像をその細胞領域の背景領域の蛍光画像を用いて補正することが提案されている。特許文献１に記載の方法によれば、経時的な化学構造変化による蛍光物質の消失に起因する蛍光の褪色および蛍光物質の励起光の暴露による蛍光の褪色の影響は取り除くことができると考えられる。
【０００８】
しかしながら、蛍光の褪色の原因は、上記のような原因だけでなく、細胞分裂による発光物質の分割によって発生する細胞当たりの蛍光量の低下もある。
【０００９】
特許文献１および特許文献２では、このような細胞分裂に起因する蛍光の褪色については何も考慮されておらず、やはり誤判定を招くおそれがある。
【００１０】
本発明は、上記の問題に鑑み、上述した蛍光物質の消失に起因する蛍光の褪色や励起光の暴露による蛍光の褪色の影響だけでなく、細胞分裂による蛍光の褪色の影響も取り除くことができ、より正確な細胞の分化情報を取得することができる細胞分化情報取得装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の細胞分化情報取得装置は、蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、撮像領域を撮像した蛍光画像または蛍光画像以外の画像内の細胞の領域を特定する細胞領域特定部と、細胞の分裂情報を取得する細胞分裂情報取得部と、細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、分裂情報に基づく第２の補正処理とを細胞の領域の蛍光画像に対して施す蛍光画像補正部と、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報に基づいて、細胞の分化情報を取得する分化情報取得部とを備えたことを特徴とする。
【００１２】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、撮像領域を撮像した位相差画像を取得する位相差像取得部を備えることができ、細胞領域特定部は、位相差画像内の細胞の領域を特定し、細胞分裂情報取得部は、細胞の領域の位相差画像に基づいて、細胞の分裂情報を取得することができる。
【００１３】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、細胞分裂情報取得部は、複数の細胞からなる細胞群の大きさ情報、形状の情報またはテクスチャの情報を細胞の分裂情報として取得することができる。
【００１４】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、細胞分裂情報取得部は、細胞の数情報を細胞の分裂情報として取得することができる。
【００１５】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、細胞分裂情報取得部は、複数の細胞からなる細胞群の積層領域の情報を細胞の分裂情報として取得することができる。
【００１６】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、細胞分裂情報取得部は、時系列に撮像された複数の位相差画像の分裂情報をそれぞれ取得し、複数の分裂情報の時間変化を取得することができる。
【００１７】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、蛍光画像補正部は、細胞の領域の蛍光画像に対して、分裂情報に応じた補正係数を乗算することによって第２の補正処理を施すことができる。
【００１８】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、蛍光画像補正部は、細胞の種類に応じて補正係数を変更することができる。
【００１９】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、蛍光画像補正部は、蛍光物質の種類に応じて補正係数を変更することができる。
【００２０】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、分化情報取得部は、細胞の分化状態を判定し、判定結果を分化情報として取得することができる。
【００２１】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、分化情報取得部は、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の輝度情報に基づいて、細胞の分化状態を判定することができる。
【００２２】
また、上記本発明の細胞分化情報取得装置においては、分化情報取得部は、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の輝度情報の時間変化に基づいて、細胞の分化状態を判定することができる。
【００２３】
本発明の細胞分化情報取得方法は、蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得し、撮像領域を撮像した蛍光画像または蛍光画像以外の画像内の細胞の領域を特定し、細胞の分裂情報を取得し、細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、分裂情報に基づく第２の補正処理とを細胞の領域の蛍光画像に対して施し、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報に基づいて、細胞の分化情報を取得することを特徴とする。
【００２４】
本発明の細胞分化情報取得プログラムは、蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得する蛍光画像取得部と、撮像領域を撮像した蛍光画像または蛍光画像以外の画像内の細胞の領域を特定する細胞領域特定部と、細胞の分裂情報を取得する細胞分裂情報取得部と、細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、分裂情報に基づく第２の補正処理とを細胞の領域の蛍光画像に対して施す蛍光画像補正部と、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報に基づいて、細胞の分化情報を取得する分化情報取得部としてコンピュータを機能させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の細胞分化情報取得装置および方法並びにプログラムによれば、蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得し、撮像領域を撮像した蛍光画像または蛍光画像以外の画像内の細胞の領域を特定する。そして、細胞の分裂情報を取得し、細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、分裂情報に基づく第２の補正処理とを細胞の領域の蛍光画像に対して施し、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報に基づいて、細胞の分化情報を取得する。
【００２６】
このように第１の補正処理と第２の補正処理とを蛍光画像に施すことによって、上述した蛍光物質の消失に起因する蛍光の褪色や励起光の暴露による蛍光の褪色の影響だけでなく、細胞分裂による蛍光の褪色の影響も取り除くことができ、より正確な細胞の分化情報を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明の細胞分化情報取得装置の一実施形態を用いた細胞分化評価システムの概略構成を示すブロック図
【図２】図１に示す細胞分化評価システムにおける撮像装置の概略構成を示す図
【図３】位相差画像の一例を示す図
【図４】分裂段階と補正係数とを対応づけたテーブルの一例を示す図
【図５】本発明の細胞分化情報取得装置の一実施形態を用いた細胞分化評価システムの作用を説明するためのフローチャート
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の細胞分化情報装置および方法並びにプログラムの一実施形態を用いた細胞分化評価システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、細胞分化評価システム１の概略構成を示すブロック図である。
【００２９】
本実施形態の細胞分化評価システム１は、図１に示すように、撮像装置１０と、細胞分化情報取得装置２０と、表示装置３０と、入力装置４０とを備えている。
【００３０】
撮像装置１０は、蛍光標識されて培養された細胞の蛍光画像および位相差画像を撮像するものである。また、撮像装置１０は、上述した細胞を経時的に複数回撮像する、いわゆるタイムラプス撮影を行うものである。撮像対象の細胞としては、具体的には、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞、幹細胞から分化誘導された神経、皮膚、心筋および肝臓の細胞、並びに人体から取り出された皮膚、網膜、心筋、血球、神経および臓器の細胞などがある。そして、これらの撮像対象の細胞は蛍光物質によって標識されている。蛍光物質としては、フルオレセイン、ローダミンおよび緑色蛍光タンパク質（GFP(Green Fluorescent protein)）などを用いることができる。
【００３１】
図２は、本実施形態の撮像装置１０の概略構成を示す図である。本実施形態の撮像装置１０は、図２に示すように、白色光を出射する白色光源１１と、リング形状のスリットを有し、白色光源１１から出射された白色光が入射されて、いわゆる位相差計測のためのリング状の照明光Ｌ１を出射するスリット板１２と、スリット板１２から射出されたリング状の照明光Ｌ１が入射され、その入射されたリング状の照明光Ｌ１を、細胞群Ｓを含む撮像領域に対して照射する対物レンズ１３とを備えている。
【００３２】
スリット板１２は、白色光源１１から出射された白色光を遮光する遮光板に対して白色光を透過するリング形状のスリットが設けられたものであり、白色光がスリットを通過することによってリング状の照明光Ｌ１が形成される。
【００３３】
また、撮像装置１０は、蛍光標識された細胞群Ｓを含む撮像領域に対して、励起光Ｌ２を照射するものである。具体的には、励起光Ｌ２を出射する励起光源１８と、励起光源１８から出射された励起光Ｌ２を平行光とするコリメートレンズ１９とを備えている。励起光源１８としては、たとえば発光ダイオード、レーザダイオード、高圧水銀光源およびハロゲン光源などを用いることができる。励起光源１８から射出される励起光Ｌ２は、白色光源１１から出射される白色光とは異なる分光特性を有する光であり、細胞群Ｓに標識された蛍光物質を励起して蛍光を発生させる光である。
【００３４】
また、撮像装置１０は、位相差レンズ１４と、ハーフミラー１５と、結像レンズ１６と、撮像素子１７とを備えている。
【００３５】
位相差レンズ１４は、対物レンズ１４ａおよび位相板１４ｂを備えている。位相板１４ｂは、照明光Ｌ１の波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板１２のスリットの大きさは、この位相リングと共役な関係にある。
【００３６】
位相リングは、入射された光の位相を１／４波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相リングに入射された直接光は、位相リングを通過することによって位相が１／４波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、細胞群Ｓによって回折された回折光は大部分が位相板１４ｂの透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。
【００３７】
位相差レンズ１４は、図示省略した光学系駆動部によってＺ方向（矢印Ａ方向）に移動するものである。この位相差レンズ１４のＺ方向への移動によってオートフォーカス制御が行われ、撮像素子１７によって撮像される画像のコントラストが調整される。
【００３８】
ハーフミラー１５は、位相差レンズ１４を通過した回折光および直接光並びに蛍光を透過し、かつ励起光Ｌ２を細胞群Ｓの方向に反射する光学特性を有するものである。
【００３９】
結像レンズ１６は、ハーフミラー１５を通過した回折光および直接光並びに蛍光が入射され、これらを撮像素子１７に結像するものである。
【００４０】
撮像素子１７は、結像レンズ１６によって結像された回折光および直接光並びに蛍光を検出して位相差画像および蛍光像を撮像するものである。撮像素子１７としては、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどが用いられる。撮像素子としては、ＲＧＢ（Red Green Blue）のカラーフィルタが設けられた撮像素子を用いてもよいし、モノクロの撮像素子を用いるようにしてもよい。
【００４１】
対物レンズ１３と位相差レンズ１４との間に、ステージ５１が設けられている。そして、このステージ５１上に、細胞群Ｓおよび培養液Ｃが収容された培養容器５０が設置される。ステージ５１は、図示省略したステージ駆動部によって互いに直交するＸ方向およびＹ方向に移動するものである。培養容器５０としては、シャーレ、ディッシュまたはウェルプレートなどを用いることができる。また、培養容器５０およびステージ５１は、照明光Ｌ１および励起光Ｌ２並びに蛍光物質から発せられた蛍光を透過する材料から形成されるものであり、たとえばガラスまたは透明な樹脂などから形成されるものである。
【００４２】
なお、撮像装置１０の構成については、図２に示す構成に限らず、細胞群Ｓに対して照明光Ｌ１および励起光Ｌ２を照射できる構成であって、照明光Ｌ１の照射による位相差画像および励起光Ｌ２の照射による蛍光画像を撮像できる構成であれば、その他の構成を採用するようにしてもよい。
【００４３】
図１に戻り、細胞分化情報取得装置２０は、位相差画像取得部２１と、蛍光画像取得部２２と、細胞領域特定部２３と、細胞分裂情報取得部２４と、蛍光画像補正部２５と、分化情報取得部２６と、表示制御部２７とを備えている。
【００４４】
細胞分化情報取得装置２０は、コンピュータに対して本発明の細胞分化情報取得プログラムの一実施形態がインストールされたものである。
【００４５】
細胞分化情報取得装置２０は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに本発明の細胞分化情報取得プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図１に示すような位相差画像取得部２１、蛍光画像取得部２２、細胞領域特定部２３、細胞分裂情報取得部２４、蛍光画像補正部２５、分化情報取得部２６および表示制御部２７が動作する。
【００４６】
位相差画像取得部２１は、撮像装置１０において経時的に複数回撮像された位相差画像を取得して記憶するものである。蛍光画像取得部２２は、撮像装置１０において経時的に複数回撮像された蛍光画像を取得して記憶するものである。
【００４７】
細胞領域特定部２３は、位相差画像取得部２１によって取得された位相差画像内の細胞の領域を特定するものである。図３は、位相差画像取得部２１によって取得された位相差画像の一例を示すものである。図３において、矩形で示される領域Ｒが撮像領域であり、撮像領域内に示すＳが複数の細胞からなる細胞群である。本実施形態の細胞領域特定部２３は、細胞群Ｓの領域を特定する。細胞群Ｓの領域を特定する方法としては、たとえば位相差画像を２値化画像に変換した後、テンプレートマッチングなどによって細胞群Ｓを自動的に検出するようにすればよい。また、細胞群Ｓの検出方法については、上述した方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。
【００４８】
なお、蛍光画像よりも位相差画像の方がコントラストが高く、細胞群Ｓの領域を特定するために用いる画像としてはより好ましいが、蛍光画像を用いるようにしてもよい。
【００４９】
細胞分裂情報取得部２４は、撮像領域に含まれる細胞群Ｓの細胞の分裂情報を取得するものである。具体的には、本実施形態の細胞分裂情報取得部２４は、細胞領域特定部２３によって特定された細胞群Ｓの領域の位相差画像に基づいて、細胞の分裂情報を取得する。細胞分裂情報取得部２４は、たとえば複数の細胞群Ｓの大きさ情報を細胞の分裂情報として取得することができる。細胞群Ｓの大きさ情報としては、たとえば細胞群Ｓの領域の面積、輪郭の長さ、長径、短径および最長径などがある。また、細胞群Ｓの領域の面積としては、細胞群Ｓの領域の面積でもよいし、細胞群Ｓの領域に含まれる各細胞の面積を加算した値でもよい。細胞群Ｓの領域に含まれる各細胞は、たとえばパターンマッチングなどの公知の手法を用いて検出するようにすればよい。
【００５０】
細胞分裂情報取得部２４は、細胞の分裂情報として、細胞群Ｓの領域の位相差画像のテクスチャの情報を取得することができる。テクスチャの情報としては、細胞群Ｓの領域のエッジ成分の量または均一性などがある。細胞の分裂が進むと細胞の数の増加に応じてエッジ成分が多くなる。したがって、エッジ成分の量を分裂情報として取得することができる。
【００５１】
細胞分裂情報取得部２４は、細胞の分裂情報として、細胞群Ｓの領域の形状の情報を取得することができる。細胞群Ｓの分裂が進むと細胞群Ｓは円形により近くなる。したがって、たとえば細胞群Ｓの円形度を分裂情報として取得するようにしてもよい。
【００５２】
また、細胞分裂情報取得部２４は、細胞の分裂情報として、細胞群Ｓの領域に含まれる細胞の数情報を取得することができる。細胞群Ｓの領域に含まれる各細胞は、たとえばパターンマッチングなどの公知の手法を用いて検出するようにすればよい。また、細胞自体を検出するのではなく、細胞に含まれる細胞核または核小体の数を計測することによって細胞の数情報を取得するようにしてもよい。細胞核または核小体は、位相差画像内では黒く現れ、周囲よりも輝度が低くなるので、たとえば位相差画像の輝度情報に基づいて検出することができる。
【００５３】
また、核小体の数に基づいて細胞の数情報を取得する場合には、核小体の数と細胞の数とは必ずしも１対１ではないので、細胞内に含まれる核小体の数として予め基準細胞内核小体数を記憶しておき、細胞群Ｓの領域の位相差画像から検出された核小体の数を基準細胞内核小体数で除算することによって、細胞の数情報を取得するようにしてもよい。
【００５４】
また、１つの細胞の面積の基準である基準細胞面積を予め記憶しておき、細胞群Ｓの領域の面積を基準細胞面積により除算することによって、細胞の数情報を取得するようにしてもよい。
【００５５】
また、細胞分裂情報取得部２４は、細胞の分裂情報として、細胞群Ｓの積層領域の情報を取得することができる。細胞群Ｓは、細胞の分裂が進行すると細胞が積層された状態となり、積層領域を形成する。したがって、この積層領域の情報を細胞の分裂情報として取得することができる。
【００５６】
具体的には、たとえば細胞が増殖して積層された状態となった場合、位相差画像の輝度の均一性が高くなり、また凹凸の少ない滑らかな画像となる。したがって、位相差画像の輝度の均一性が高い、または位相差画像が滑らかであるほど細胞分裂が進行しているといえる。したがって、位相差画像の輝度の均一性または平滑性を分裂情報として取得するようにしてもよい。
【００５７】
また、細胞の積層領域は、細胞が密集した状態であるので、散乱光が増えて周囲よりも輝度が高くなる。したがって、予め設定された閾値以上の領域を積層領域と認識し、その積層領域の大きさの情報を分裂情報として取得することができる。
【００５８】
また、細胞分裂情報取得部２４は、細胞の分裂情報として、細胞群Ｓに発生したハロの情報を取得することができる。ハロとは、細胞間を通過した回折光に起因して発生するものである。ハロは、位相差画像内においては白スジとして現れる。したがって、この白スジを検出することによって位相差画像内におけるハロを検出することができる。白スジの検出方法としては、公知の方法を用いることができ、たとえば予め設定された閾値以上の輝度値を有する画素を検出するようにしてもよいし、フィルタ処理などによって白い線を検出するようにしてもよい。
【００５９】
そして、たとえば細胞コロニー内の白スジの画素の数を計測し、白スジの画素の数を分裂情報として取得するようにしてもよい。この場合、白スジの画素の数が多いほど分裂が進行していると考えられる。
【００６０】
なお、撮像領域内に複数の細胞群Ｓが存在する場合には、それぞれの細胞群Ｓの分裂情報の平均値、最大値および最小値などの統計値を取得するようにすればよい。または、細胞群Ｓの大きさに応じて重み付けをして加算平均するようにしてもよい。たとえば細胞群Ｓの大きさがより大きい方に相対的に大きい重み付けをして加算平均するようにしてもよい。
【００６１】
また、細胞分裂情報取得部２４は、現時点で撮像された位相差画像に基づいて、上述した細胞の分裂情報を取得してもよいし、時系列に撮像された複数の位相差画像に基づいて、それぞれ細胞の分裂情報を取得し、その時間変化を最終的な分裂情報として取得するようにしてもよい。
【００６２】
また、本実施形態においては、細胞分裂情報取得部２４が、位相差画像に基づいて分裂情報を取得するようにしたが、必ずしも位相差画像を用いなくてもよく、たとえば培養期間を分裂情報として取得するようにしてもよい。培養期間の情報は、ユーザが入力装置４０を用いて設定入力するようにしてもよいし、細胞分裂情報取得部２４にタイマを設け、そのタイマによって培養期間を計測するようにしてもよい。
【００６３】
蛍光画像補正部２５は、撮像領域内の細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、細胞分裂情報取得部２４によって取得された分裂情報に基づく第２の補正処理とを細胞の領域の蛍光画像に対して施すものである。
【００６４】
ここで、本実施形態においては、蛍光物質から発せられた蛍光を検出した蛍光画像の輝度情報に基づいて細胞の分化状態の判定を行う。しかしながら、上述したように、蛍光物質の蛍光は時間の経過にともなって褪色し、蛍光量は低下する。したがって、このような蛍光の褪色を考慮することなく、蛍光画像に基づいて細胞の分化状態の判定を行った場合、誤判定を招くおそれがある。
【００６５】
そこで、本実施形態では、このような蛍光の褪色の影響を取り除くために、蛍光画像に対して第１の補正処理および第２の補正処理の２つの補正処理を施す。第１の補正処理は、蛍光の褪色のうち、経時的な化学構造変化による蛍光物質の消失に起因する蛍光の褪色および蛍光物質に対する励起光の暴露による蛍光の褪色の影響を取り除くための処理である。
【００６６】
具体的には、本実施形態においては、蛍光画像補正部２５が、細胞領域特定部２３によって特定された細胞群Ｓの領域の情報を取得し、その細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像に基づいて、細胞群Ｓの領域の蛍光画像を補正する。なお、この細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像とは、細胞を蛍光標識する際に培養液Ｃに投与された蛍光物質から発せられた蛍光を検出した画像である。すなわち、培養液Ｃに含まれる蛍光物質およびフィーダ細胞などの分裂しない細胞に標識された蛍光物質から発せられた蛍光を検出した画像である。
【００６７】
第１の補正処理は、たとえば異なる時刻で撮像された２枚の蛍光画像を用いて行われる。
具体的には、２枚の蛍光画像からそれぞれ細胞群Ｓの領域の蛍光画像を抽出し、その２つの細胞群Ｓの蛍光画像の輝度情報の時間変化量を算出する。一方、２枚の蛍光画像からそれぞれ細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像を抽出し、その細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像の輝度情報の時間変化量を算出する。
【００６８】
なお、細胞群Ｓの蛍光画像の輝度情報の時間変化量としては、細胞群Ｓの蛍光画像を構成する画素毎に算出するようにしてもよいし、細胞群Ｓの蛍光画像を構成する画素の平均値、最大値または最小値などの代表値の時間変化量を算出するようにしてもよい。細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像の輝度情報の時間変化量としては、その蛍光画像を構成する画素の平均値、最大値または最小値などの代表値の時間変化量を算出する。
【００６９】
そして、細胞群Ｓの蛍光画像の時間変化量から細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像の時間変化量を減算することによって第１の補正処理が施される。
【００７０】
なお、時間変化量の取得方法としては減算に限らず、除算するようにしてもよい。すなわち、２つの細胞群Ｓの蛍光画像の輝度情報の比と、２つの細胞群Ｓ以外の蛍光画像の輝度情報の比とを時間変化量として算出し、さらにこれらの２つの比を除算して第１の補正処理を行うようにしてもよい。
【００７１】
また、第１の補正処理の方法としては、上記の方法に限らず、たとえば第１の時刻に撮像された蛍光画像から細胞群Ｓの領域の蛍光画像と細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像とを抽出し、細胞群Ｓの領域の蛍光画像の輝度情報と細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像の輝度情報との差を算出する。また、第１の時刻とは異なる第２の時刻に撮像された蛍光画像から細胞群Ｓの領域の蛍光画像と細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像とを抽出し、細胞群Ｓの領域の蛍光画像の輝度情報と細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像の輝度情報との差を算出する。そして、第１の時刻における細胞群Ｓとそれ以外の領域の輝度情報の差と、第２の時刻における細胞群Ｓとそれ以外の領域の輝度情報の差との差分を算出することによって第１の補正処理を施すようにしてもよい。
【００７２】
一方、蛍光の褪色の原因としては、上述したようなものだけでなく、細胞の分裂による発光物質の分割によって発生する細胞当たりの蛍光量の低下もある。第２の補正処理は、この細胞分裂に起因する蛍光の褪色を補正する処理である。
【００７３】
蛍光画像補正部２５は、上述したように細胞分裂情報取得部２４によって取得された分裂情報に基づいて、細胞群Ｓの領域の蛍光画像に対して第２の補正処理を施す。本実施形態の蛍光画像補正部２５は、具体的には、分裂情報として取得された値が、予め設定された閾値範囲内であるか否かを判定することによって細胞群Ｓに含まれる細胞の分裂の有無を判定し、細胞群Ｓに含まれる細胞が分裂していると判定した場合には、上述した第１の補正処理が施された細胞群Ｓの蛍光画像の時間変化量に対して、予め設定された補正係数Ｋを乗算することによって第２の補正処理を施す。補正係数Ｋは、０＜Ｋ＜１を満たす値であって、予め実験などによって取得した値である。補正係数Ｋは、１つの値に限らず、たとえば細胞の種類に応じた補正係数Ｋを複数記憶したり、蛍光物質の種類に応じた補正係数を複数記憶したりして、細胞の種類および蛍光物質の種類の少なくとも１つに応じて補正係数Ｋを変更するようにしてもよい。細胞の種類および蛍光物質の種類については、たとえばユーザが入力装置４０を用いて設定入力すればよい。
【００７４】
また、細胞の分裂の有無を判定する際に用いる閾値範囲についても、細胞の種類に応じて変更するようにしてもよい。
【００７５】
また、本実施形態においては、分裂情報として取得された値が、予め設定された閾値範囲内であるか否かを判定することによって細胞群Ｓに含まれる細胞の分裂の有無を判定するようにしたが、これに限らず、分裂情報として取得された値の大きさに応じた分裂段階を判定し、その分裂段階に応じた補正係数を取得するようにしてもよい
具体的には、たとえば図４に示すような分裂段階１，２，３，・・・と補正係数Ｋ１，Ｋ２，Ｋ３，・・・とを対応づけたテーブルを予め記憶し、分裂情報として取得された値に基づいて分裂段階を判定し、その分裂段階に応じた補正係数を乗算するようにしてもよい。また、分裂段階と補正係数とを対応づけたテーブルについても、細胞の種類に応じたテーブルを複数記憶したり、蛍光物質の種類に応じたテーブルを複数記憶したりして、細胞の種類および蛍光物質の種類の少なくとも１つに応じてテーブルを変更するようにしてもよい。
【００７６】
また、２枚の蛍光画像のうちの後に撮像された蛍光画像が撮像されたときの培養期間に応じて補正係数またはテーブルを変更するようにしてもよい。培養期間については、ユーザが入力装置４０を用いて設定入力してもよいし、蛍光画像補正部２５にタイマを設け、そのタイマによって計測するようにしてもよい。
【００７７】
なお、本実施形態においては、細胞群Ｓの領域の蛍光画像に対して第１の補正処理を施した後に第２の補正処理を施すようにしたが、逆に、第２の補正処理を施した後に第１の補正処理を施すようにしてもよい。また、細胞群Ｓの領域を特定するために蛍光画像を用いる場合には、第１の補正処理と第２の補正処理を分別せず、１つとして補正処理を施すようにしてもよい。
【００７８】
分化情報取得部２６は、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像に基づいて、細胞の分化情報を取得するものである。具体的には、本実施形態の分化情報取得部２６は、第１および第２の補正処理の施された細胞群Ｓの蛍光画像の時間変化量に基づいて、細胞群Ｓが未分化状態であるのか、分化状態であるのかを判定し、その判定結果を分化情報として取得するものである。上記判定は、たとえば蛍光画像の時間変化量が予め設定された閾値以下である場合には未分化状態と判定し、閾値を超える場合には分化状態であると判定するようにすればよい。なお、本実施形態においては、未分化状態または分化状態であるのかの判定結果を分化情報として取得するようにしたが、判定まで行うことなく、たとえば細胞群Ｓの蛍光画像の時間変化量などの輝度情報を分化情報として取得するようにしてもよい。そして、その輝度情報を表示装置３０に表示するなどしてユーザが未分化状態または分化状態であるのかの判定を行うようにしてもよい。
【００７９】
なお、本実施形態では、上述したように未分化状態であるのか、分化状態であるのかを判定するようにしたが、これに限らず、たとえば細胞群Ｓの分化がどの程度進んでいるのか、すなわち分化状態の段階を判定し、その分化状態の段階を分化状態として取得するようにしてもよい。
【００８０】
表示制御部２７は、分化情報取得部２６によって取得された分化情報を表示装置３０に表示させるものである。具体的には、本実施形態の表示制御部２７は、細胞群Ｓが未分化状態であるのか、分化状態であるのかの判定結果または分化状態の段階を表示装置３０に表示させるものである。また、表示制御部２７は、位相差画像取得部２１によって取得された位相差画像や蛍光画像取得部２２によって取得された蛍光画像を表示装置３０に表示させるものである。
【００８１】
表示装置３０は、上述したように分化情報取得部２６によって取得された分化情報、位相差画像および蛍光画像などを表示するものであり、たとえば液晶ディスプレイなどを備えたものである。また、表示装置３０をタッチパネルによって構成し、入力装置４０と兼用するようにしてもよい。
【００８２】
入力装置４０は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる種々の設定入力を受け付けるものである。本実施形態の入力装置４０は、たとえば上述した細胞の種類の情報や蛍光物質の種類の情報の設定入力を受け付けるものである。
【００８３】
次に、本実施形態の細胞分化評価システム１の作用について、図５に示すフローチャートを参照しながら説明する。
【００８４】
まず、蛍光標識された細胞群Ｓを含む撮像領域を経時的に複数回撮像した位相差画像が位相差画像取得部２１によって取得される（Ｓ１０）。また、上記撮像領域を経時的に複数回撮像した蛍光画像が蛍光画像取得部２２によって取得される（Ｓ１２）。
【００８５】
次に、細胞領域特定部２３によって位相差画像内の細胞群Ｓの領域が特定され、その情報が細胞分裂情報取得部２４および蛍光画像補正部２５に出力される（Ｓ１４）。細胞分裂情報取得部２４は、細胞群Ｓの領域の位相差画像に基づいて、細胞群Ｓの分裂情報を取得し、その分裂情報を蛍光画像補正部２５に出力する（Ｓ１６）。
【００８６】
蛍光画像補正部２５は、細胞領域特定部２３によって特定された細胞群Ｓの領域の情報を取得し、その細胞群Ｓの領域以外の蛍光画像に基づいて、細胞群Ｓの領域の蛍光画像に対して第１の補正処理を施し、さらに分裂情報に基づいて、細胞群Ｓの領域の蛍光画像に対して第２の補正処理を施す（Ｓ１８）。
【００８７】
そして、第１および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報が分化情報取得部２６によって取得され、分化情報取得部２６は、第１および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報に基づいて、細胞群Ｓが未分化状態であるのか、分化状態であるのかの判定を行う（Ｓ２０）。
【００８８】
分化情報取得部２６における判定結果は表示制御部２７に出力され、表示制御部２７は、入力された判定結果を表示装置３０に表示させる。
【００８９】
上記実施形態の細胞分化評価システム１によれば、蛍光物質によって標識された細胞を含む撮像領域を撮像した蛍光画像を取得し、撮像領域を撮像した蛍光画像または蛍光画像以外の画像内の細胞の領域を特定する。そして、細胞の分裂情報を取得し、細胞の領域以外の領域の蛍光画像に基づく第１の補正処理と、分裂情報に基づく第２の補正処理とを細胞の領域の蛍光画像に対して施し、第１の補正処理および第２の補正処理の施された蛍光画像の情報に基づいて、細胞の分化状態を取得するようにしたので、上述した蛍光物質の消失に起因する蛍光の褪色や励起光の暴露による蛍光の褪色の影響だけでなく、細胞分裂による蛍光の褪色の影響も取り除くことができ、より正確な細胞の分化情報を取得することができる。
【符号の説明】
【００９０】
１     細胞分化評価システム
１０   撮像装置
１１   白色光源
１２   スリット板
１３   対物レンズ
１４   位相差レンズ
１４ａ 対物レンズ
１４ｂ 位相板
１５   ハーフミラー
１６   結像レンズ
１７   撮像素子
１８   励起光源
１９   コリメートレンズ
２０   細胞分化情報取得装置
２１   位相差画像取得部
２２   蛍光画像取得部
２３   細胞領域特定部
２４   細胞分裂情報取得部
２５   蛍光画像補正部
２６   分化情報取得部
２７   表示制御部
３０   表示装置
４０   入力装置
５０   培養容器
５１   ステージ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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