(57)【要約】【課題】乳化作用に優れるバイオサーファクタントを効率的に得ることができるバイオサーファクタントの製造方法、およびこの製造方法により得られたバイオサーファクタントを提供すること。【解決手段】炭素源として０．０００６〜６００ｍＭのテトラクロロエチレンを含有する条件で活性汚泥を馴養し、馴養化活性汚泥を得る馴養工程、馴養化活性汚泥を１０℃以下で濾過して濾液を得る濾過工程を含むバイオサーファクタントの製造方法とすることにより、乳化作用に優れるバイオサーファクタントを効率的に得ることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭素源として０．０００６〜６００ｍＭのテトラクロロエチレンを含有する条件で活性汚泥を馴養し、馴養化活性汚泥を得る馴養工程、
馴養化活性汚泥を１０℃以下で濾過して濾液を得る濾過工程
を含むバイオサーファクタントの製造方法。
【請求項２】
馴養する活性汚泥のｐＨが７．０〜９．０、全有機炭素濃度が０．２１〜１．００ｋｇ／ｍ3、カルシウム濃度が２００〜１０００ｍｇ／Ｌである請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
濾過工程が、孔径０．０２５〜０．４５μｍの濾材による濾過を含む濾過工程である請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
バイオサーファクタントのコロイド粒子径が、１００ｎｍ以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
濾液中のタンパク質濃度が、１２０μｇ／ｍＬ以上である請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
炭素源として０．０００６〜６００ｍＭのテトラクロロエチレンを含有する条件で活性汚泥を馴養し、馴養化活性汚泥を得る馴養工程、
馴養化活性汚泥を１０℃以下で濾過して濾液を得る濾過工程
を含む製造方法により製造されたバイオサーファクタント。
【請求項７】
馴養する活性汚泥のｐＨが７．０〜９．０、全有機炭素濃度が０．２１〜１．００ｋｇ／ｍ3、カルシウム濃度が２００〜１０００ｍｇ／Ｌである請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
濾過工程が、孔径０．０２５〜０．４５μｍの濾材による濾過を含む濾過工程である請求項６または７記載のバイオサーファクタント。
【請求項９】
コロイド粒子径が、１００ｎｍ以下である請求項６〜８のいずれか１項にバイオサーファクタント。
【請求項１０】
濾液中のタンパク質濃度が、１２０μｇ／ｍＬ以上である請求項６〜９のいずれか１項に記載のバイオサーファクタント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、馴養された活性汚泥を低温で濾過して濾液を得る工程を含むバイオサーファクタントの製造方法および該製造方法により製造されるバイオサーファクタントに関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでに多くの電子基板工場やドライクリーニング店などで使用されてきた揮発性有機化合物（以下、ＶＯＣ）による土壌および地下水の汚染が問題となっている。主な汚染ＶＯＣとしては、テトラクロロエチレン（以下、ＰＣＥ）、トリクロロエチレン、シス−１，２−ジクロロエチレンなどの揮発性有機塩素化合物が挙げられ、いずれも難分解性である。さらに、ＶＯＣは人体への変異原性や発がん性を有する恐れがあることから、健康被害も懸念される。
【０００３】
ＰＣＥ等の揮発性有機化合物で汚染された土壌や地下水を浄化するための一つの方法として、例えば、微生物を用いたバイオレメディエーションが挙げられる（特許文献１）。このバイオレメディエーションによれば、省エネルギーかつ低コストで土壌や地下水の汚染を浄化することが期待できるが、実際の浄化対象の土壌や地下水の温度、ｐＨや酸素濃度等は様々であり、実験室で発揮されたような微生物の増殖や分解作用が進まないことも多く、結果として浄化に長時間を要することがある。
【０００４】
そこで、本発明者らは、比較的高濃度のＰＣＥを炭素源として好気条件下で馴養して得られた活性汚泥から所定の方法によって調製される揮発性有機化合物分解剤が、土壌や地下水の諸条件に左右されることなく、揮発性有機化合物を分解できることを見出した（特許文献２）。しかし、この揮発性有機化合物分解剤によりＰＣＥを分解することは可能であるが、分解効率には改善の余地がある。
【０００５】
また、バイオサーファクタントとは、微生物が生産する高機能界面活性剤であり、より乳化作用に優れたバイオサーファクタントが求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００６−２６２８４２号公報
【特許文献２】特開２０１３−１８４９９４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、所定の活性汚泥に由来し、乳化作用に優れるバイオサーファクタントを効率的に得ることができるバイオサーファクタントの製造方法、およびこの製造方法により得られたバイオサーファクタントを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、炭素源として０．０００６〜６００ｍＭのテトラクロロエチレンを含有する条件で活性汚泥を馴養する馴養工程、馴養された活性汚泥を１０℃以下で濾過して濾液を得る濾過工程を含むバイオサーファクタントの製造方法に関する。
【０００９】
また本発明は、炭素源として０．０００６〜６００ｍＭのテトラクロロエチレンを含有する条件で活性汚泥を馴養する馴養工程、馴養された活性汚泥を１０℃以下で濾過して濾液を得る濾過工程を含む製造方法により製造されたバイオサーファクタントに関する。
【００１０】
活性汚泥のｐＨが７．０〜９．０、全有機炭素（ＴＯＣ）濃度が０．２１〜１．００ｋｇ／ｍ3、カルシウム濃度が２００〜１０００ｍｇ／Ｌであることが好ましい。
【００１１】
濾過工程が、孔径０．０２５〜０．４５μｍの濾材による濾過を含む濾過工程であることが好ましい。
【００１２】
バイオサーファクタントのコロイド粒子径が、１００ｎｍ以下であることが好ましい。
【００１３】
濾液中のタンパク質濃度が、１２０μｇ／ｍＬ以上であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のバイオサーファクタントの製造方法によれば、コロイド粒子径が小さく、乳化作用に優れるバイオサーファクタントを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例１のＨＰＬＣクロマトグラム（２２０ｎｍ）である。
【図２】実施例１のＨＰＬＣクロマトグラム（２８０ｎｍ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明のバイオサーファクタントの製造方法は、所定の馴養工程および濾過工程を含む製造方法である。
【００１７】
馴養工程
馴養工程は、炭素源として０．０００６〜６００ｍＭのＰＣＥを含有する条件で活性汚泥を馴養し、馴養化活性汚泥を得る工程である。
【００１８】
本発明に用いられる活性汚泥としては、特に限定されないが、活性汚泥法を利用する廃水処理施設、例えば下水処理場やその他の産業廃棄物処理場等に由来する活性汚泥を利用することができる。
【００１９】
利用する活性汚泥は、ｐＨが７．０〜９．０、全有機炭素（ＴＯＣ）濃度が０．２１〜１．００ｋｇ／ｍ3、カルシウム（Ｃａ）濃度が２００〜１０００ｍｇ／Ｌであることが、後工程での特定の細菌を含む微生物を含有する馴養化活性汚泥を得やすくなるという理由から好ましい。ここで、ＴＯＣは炭素源（Ｃ源）および窒素源（Ｎ源）を含む。Ｃ源としては、エチレングリコール、ジエチレングリコールあるいはジエチレングリコールモノブチルエーテル等が含まれていることが好ましい。また、Ｎ源としては、硝酸、アンモニア、モノエタノールアミン等が含まれていることが好ましく、なかでもモノエタノールアミンが含まれていることがより好ましい。これらのＣ源もしくはＮ源を含む活性汚泥を用いることにより、後工程での特定の細菌を含む微生物を含有する馴養化活性汚泥を得やすくなる。
【００２０】
さらに、前記活性汚泥は、後工程での特定の細菌を含む微生物を含有する馴養化活性汚泥をより得やすくなるという理由から、上記の成分指標以外にも、汚泥濃度（ＭＬＳＳ）が８Ｋ〜５５Ｋ ｍｇ／Ｌ、有機物濃度（ＭＬＶＳＳ）が３Ｋ〜２０Ｋ ｍｇ／Ｌ、生物化学的酸素要求量（ＢＯＤ）が平均０．１０〜４．２８ｋｇ／ｍ3、全窒素（Ｔ−Ｎ）濃度が０．０２〜１．３７ｋｇ／ｍ3、もしくは活性汚泥の温度が平均１８〜４５℃であることがさらに好ましい。
【００２１】
かかる活性汚泥を、０．０００６〜６００ｍＭのＰＣＥを炭素源として含有する条件で馴養することにより、特定の細菌を含む微生物を含有する馴養化活性汚泥が得られる。馴養時の活性汚泥の量としては、馴養期間を通して撹拌や曝気が可能な程度であれば特に限定されないが、例えば、１Ｌの水に対して、乾燥重量で５〜１０ｇの範囲が好ましい。また、馴養時のＰＣＥの濃度としては、ＰＣＥを分解し得る微生物を効率的に選択する観点から、０．００６〜１８０ｍＭの範囲が好ましく、０．０６〜６０ｍＭの範囲がより好ましい。
【００２２】
活性汚泥を馴養する期間としては、特に限定されないが、１〜２４週間の期間が好ましい。馴養時の他の条件、例えば温度、溶存酸素濃度、ｐＨとしては、以下の範囲が好ましい。温度としては、１０〜４０℃の範囲が好ましく、１５〜３０℃の範囲がより好ましい。馴養時の溶存酸素濃度としては特に限定されないが、空気、酸素等を供給しながら馴養を実施する程度でよい。従って、馴養に用いる装置としては、曝気手段を備えたものが好ましい。さらに、馴養時のｐＨとしては、馴養時の温度において、例えば６．０〜１０．０の範囲が好ましく、７．０〜９．０の範囲がより好ましい。
【００２３】
濾過工程
濾過工程は、馴養された活性汚泥（馴養化活性汚泥）を１０℃以下で濾過して濾液を得る工程である。
【００２４】
前記馴養化活性汚泥を１０℃以下の条件で濾過することにより、コロイド粒子径の小さいバイオサーファクタントを効率的に回収することができる。そして、コロイド粒子径が小さいバイオサーファクタントは、ＰＣＥなどの汚染物質に対する接触頻度が高いことから汚染物質の乳化作用に優れ、その結果、分解剤による分解効率を向上させることができる。
【００２５】
１０℃以下での濾過は、濾過に供する馴養化活性汚泥の温度を１０℃以下の所定の設定温度に調整後、濾過すればよい。濾過を行う環境の温度も所定の設定温度であることが好ましいが、活性汚泥の温度調整後、直ちに濾過を行えばよい。
【００２６】
濾過方法としては、所定の孔径を有する濾材を用いた濾過方法とすることができる。濾材としては、特に限定されず、メンブレンフィルター、セルロースフィルター、ガラス繊維フィルターなどを用いることができる。なかでも、精密濾過膜であり、孔径が小さく菌体を除去しやすいという理由からメンブレンフィルターが好ましい。
【００２７】
濾材の孔径は、一般的に最も小さい菌の幅長が０．３μｍ前後という理由から０．０２５〜０．４５μｍが好ましく、０．１０〜０．２２μｍがより好ましい。
【００２８】
濾液
濾過工程により得られた濾液は、本発明に係るバイオサーファクタントを含む濾液である。
【００２９】
本発明に係るバイオサーファクタントは、他の製造方法により得られたバイオサーファクタントに比べてコロイド粒子径が小さいことを特徴とする。コロイド粒子径が小さい本発明に係るバイオサーファクタントは、油滴や汚染物質に対する接触頻度が高く、汚染物質の乳化作用に優れる。さらには、汚染物質の乳化作用に優れるため、揮発性有機化合物分解剤と併用することにより揮発性有機化合物の分解効率を向上させることができる。
【００３０】
本発明に係るバイオサーファクタントのコロイド粒子径は、５０ｎｍ以下が好ましく、１５ｎｍ以下がより好ましい。５０ｎｍを超える場合は分解剤による分解効率の向上効果が不十分となる傾向がある。また、コロイド粒子径の下限は特に限定されないが、コロイドの一般的な定義である１ｎｍ以上であればよい。なお、バイオサーファクタントのコロイド粒子径は、Malvern Instruments社製のゼータサイザーなどの動的光散乱型粒子径測定装置により測定される平均一次粒子径である。
【００３１】
前記濾過工程により得られた濾液中のタンパク質濃度は、１２０μｇ／ｍＬ以上が好ましく、１４０μｇ／ｍＬ以上がより好ましく、１６０μｇ／ｍＬ以上がより好ましい。当該タンパク質濃度が１２０μｇ／ｍＬ未満の場合は、バイオサーファクタントの回収効率が不十分となる傾向がある。なお、本発明に係るバイオサーファクタントは、２２０ｎｍ付近および２８０ｎｍ付近に極大波長のピークが認められ、Ｃによってクロロホルム：メタノール＝５：１で展開するとニンヒドリンでＲｆ値０．９８付近に発色スポットが認められ、リンモリブデン酸や硫酸では発色が認められなかったことから糖脂質ではなく、アミノ基を有するリポペプチド型である可能性が示唆されたアミノ基を有するリポペプチド型であり、かつ、タンパク質定量キットのQubitで測定した濃度と油膜排除活性と相関があることから、濾液中のタンパク質濃度が濾液中のバイオサーファクタント濃度の目安となる。
【００３２】
バイオサーファクタントの精製
本発明のバイオサーファクタントの製造方法は、前記の馴養工程および濾過工程に加え、濾過工程で得られた濾液中のバイオサーファクタントを精製する精製工程を含んでいてもよい。
【００３３】
精製工程としては、メタノールなどによる抽出の後、Ｃ１８カラム（例えば、（株）ＹＭＣ製のTriartシリーズ）を装着したＨＰＬＣ（液体クロマトグラフ）、ＯＤＳカラム（例えば、（株）ＹＭＣ製のYMC-DispoPackAT ODS-25）などによる精製を行うことが好ましい。
【００３４】
本発明のバイオサーファクタントは、乳化作用に優れることから従来の界面活性剤と同様に、乳化剤や洗剤などに使用することができる。特に本発明のバイオサーファクタントは、揮発性有機塩素化合物の乳化作用に優れることから、揮発性有機塩素化合物の分解剤と併用することにより、揮発性有機塩素化合物の分解効率を向上させることができる。
【実施例】
【００３５】
本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００３６】
＜各試験用濾液の調製＞
各実施例および比較例の試験用濾液を、下記の馴養工程および濾過工程により調製した。
【００３７】
馴養工程
日本国岐阜県にある電子機器の製造工場に設置された、該工場に由来する廃液を活性汚泥法を利用して処理する施設から、活性汚泥を得た。リービッヒ冷却器を上部に、フラスコ内部を曝気するためのポンプを取り付けた丸底フラスコに、得られた活性汚泥（１０００ｍＬ、乾燥重量は１ｇ）を投入した。
【００３８】
得られた活性汚泥の各種指標を以下に示す。
ＰＨ：８．２
ＴＯＣ濃度：平均０．７５ｋｇ／ｍ3
Ｃａ濃度：５００ｍｇ／Ｌ
ＭＬＳＳ：４０Ｋ ｍｇ／Ｌ
ＭＬＶＳＳ：１６Ｋ ｍｇ／Ｌ
ＢＯＤ濃度：平均１．２ｋｇ／ｍ3
Ｔ−Ｎ濃度：０．３５ｋｇ／ｍ3
温度：２９℃
【００３９】
次いで、炭素源としてのＰＣＥ（和光純薬工業（株）製）のエタノール溶液を、ＰＣＥの終濃度が１２ｍＭとなるように、活性汚泥を投入した丸底ラスコに添加した。該エタノール溶液を一週間ごとに追加し、最終的に丸底フラスコ内のＰＣＥを６０ｍＭの濃度とした。リン源および窒素源としてのリン酸水素二アンモニウムを終濃度が３７．８８ｍＭとなるようにフラスコに添加した。さらに、ミネラル源およびビタミン源としての少量の酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ、細胞培養用）もフラスコに添加した。フラスコ内の温度を２０℃、ｐＨを６．８〜８．０の範囲とし、ポンプから空気をフラスコ内に曝気しながら、好気的条件下で２週間の馴養を行い馴養化活性汚泥を得た。
【００４０】
馴養化活性汚泥の細菌叢の分析
馴養化活性汚泥の細菌叢の分析を、Genome Sequencer FLX（タカラバイオ（株）に委託）により行った。結果を表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
表１に示す結果より、馴養化活性汚泥中の細菌叢はAlcaligenesに属する微生物が支配的であることがわかる。
【００４３】
濾過工程
馴養化活性汚泥をメンブレンフィルター（孔径：０．２μｍ、Advantec製）で濾過することにより試験用濾液（実施例１〜３、比較例１〜５）を調製した。各濾液は表２に示す各温度で活性汚泥を３時間静置後、濾過を行い各試験用濾液を得た。
【００４４】
＜評価＞
得られた試験用濾液に対し、次の評価を行った。
【００４５】
タンパク質濃度測定
各試験用濾液中のタンパク質濃度を濾液タンパク質定量キット（Invitrogen社製のQubit fluorometer）を用いて行った。結果は表２に示す。前述のように濾液中のタンパク質濃度が濾液中のバイオサーファクタント濃度の目安となるため、タンパク質濃度が高いほど効率的に活性汚泥中のバイオサーファクタントが回収できたことを示す。
【００４６】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析
実施例１の試験用濾液２０ｍＬを凍結乾燥させて完全に脱水乾固させた後、２０ｍＬ以上のメタノールに溶解させ、１２０ｒｐｍで一晩振盪抽出した。そして、抽出溶液を５０００×ｇで１０分間遠心分離させ、上清を回収しエバポレーターで乾固させた後、上清と同量の超純水（日本ミリポア（株）製のＤｉｒｅｃｔＱシステムにて製造）に溶解させてＨＰＬＣ分析用サンプルを調製した。
【００４７】
得られた実施例１のＨＰＬＣ分析用サンプルについて下記条件のＨＰＬＣ分析を行った。吸光度２２０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図１に、吸光度２２０ｎｍでのＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。
測定装置：（株）島津製作所製のＬＣ−２０１０ＡＨＴ
カラム：（株）ＹＭＣ製のTriart C18カラム（長さ２５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ、粒径５μｍ）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２２０ｎｍ、２５６ｎｍ、２８０ｎｍ
カラム温度：４０℃
注入量：２０μＬ
移動相（Ａ）：水
移動相（Ｂ）：メタノール
【００４８】
コロイド粒子径（平均一次粒子径）測定
各濾液中のコロイド粒子の平均一次粒子径をMalvern Instruments社製のゼータサイザーナノＺＳにより測定した。結果は表２に示す。
【００４９】
油膜排除試験
ガラスシャーレ（直径８．５ｃｍ）に純水１５ｍＬを入れ、水面が安定した後に原油５０μＬを水面に滴下して油膜を形成させた。そして、油膜の中央に各試験用濾液５μＬを滴下し、油膜が除去されることにより形成された円の面積を画像解析ソフト（三谷商事（株）製のＷｉｎＲＯＯＦ）にて測定し、各実施例および比較例について試験を３回行いその平均値を下記の基準に基づいて評価した。結果は表２に示す。
◎：２０％以上
○：１０％以上、２０％未満
△：１％以上、１０％未満
×：１％未満
【００５０】
塩素化エチレン乳化試験
実施例１〜３ならびに比較例１および２の各試験用濾液を各バイアル瓶（２０ｍＬ容量）に５ｍＬずつ入れ、テフロン（登録商標）コートのブチルゴム栓およびアルミキャップにて密栓した。各試験用濾液について３本ずつのバイアル瓶を用意し、それぞれに「テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）」、「トリクロロエチレン（ＴＣＥ）」および「シス−１，２−ジクロロエチレン（ｃＤＣＥ）」のそれぞれを終濃度が１００ｍｇ／２０ｍＬとなるように添加後、２０℃の恒温層内にて１５０ｒｐｍで２４時間振盪させた。なお、コントロールとして、濾液に替えて超純水（日本ミリポア（株）製のＤｉｒｅｃｔＱシステムにて製造）を５ｍＬを入れたこと以外は、実施例と同様の操作を行ったサンプルを調製した。
【００５１】
・気相の分析
振盪後のバイアル瓶内の気相から１００μＬの気体をシリンジにてサンプリングし、下記条件でガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製のＧＣ−ＦＩＤ）による分析を行い、気相全体中の塩素化エチレン濃度を算出した。
【００５２】
・液相の分析
気相のサンプリング後、各バイアル瓶に３０％のＮａＣｌを添加し、６０℃で６０分間加温後、バイアル瓶内の気相から１００μＬの気体をシリンジにてサンプリングし、下記条件でガスクロマトグラフ（（株）島津製作所製のＧＣ−ＦＩＤ）による分析を行い、液相全体中の塩素化エチレン濃度を算出した。
【００５３】
気相および液相の分析結果、および液相中の塩素化エチレンの存在率（液相中の量／液相中の量＋気相中の量）を表２に示す。液相中の塩素化エチレンの存在率が高いほど、より気相中の塩素化エチレンを液相中に乳化させたこと、つまり乳化作用に優れることを示す。さらに、振盪後の各濾液中のコロイド粒子の平均一次粒子径をMalvern Instruments社製のゼータサイザーナノＺＳにより測定した結果、セル内部に塩素化エチレンが取り込まれ、振盪前の結果（前記コロイド粒子径の測定結果）に比べて大きくなっていることを確認した。
【００５４】
・ガスクロマトグラフ分析条件
カラム：ＧＣキャピラリーカラムＲｔ−Ｑ−ＢＯＮＤ（３０ｍ×０．５３ｍｍ×２０μｍ）
カラム初期温度：１２０℃
カラム昇温速度：１５℃／ｍｉｎ
カラム最終温度：２２０℃
カラム最終温度保持時間：１４．０ｍｉｎ
検出器温度：２４０℃
気化室温度：２００℃
キャリアガス：Ｈｅ（０．５５ｋｇ／ｃｍ2）
Ｈ2圧：０．５６ｋｇ／ｃｍ2
空気圧：０．４１ｋｇ／ｃｍ2
【００５５】
【表２】
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【００５６】
表２に示す結果より、本発明の製造方法により製造されたバイオサーファクタントが、コロイド粒子径が小さく、油滴に対する乳化作用および各種塩素化エチレンに対する乳化作用に優れることがわかる。
【図１】
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【図２】
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