(57)【要約】      （修正有）【課題】煩雑な前処理技術を用いず、且つ、製造時間の長時間化を伴わない、安価で信頼性の高い、熱処理を伴う生化学的反応に用いられる分析チップ、及び該分析チップの製造方法を提供する。【解決手段】分析チップの反応室２ｄ内に、熱処理を伴う生化学的反応に用いられる反応試薬２ｅの成分の一部又は全部があらかじめ収容されている。反応試薬２ｅは、温度によって相変化し、且つ、常温以下での保存において離水しないゲル状を呈する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱処理を伴う生化学的反応に用いられる反応試薬の成分の一部又は全部があらかじめ反応室に収容され、
前記反応試薬は、温度によって相変化し、且つ、常温以下での保存において離水しないゲル状を呈することを特徴とする分析チップ。
【請求項２】
前記反応試薬は、反応温度域において液状を呈することを特徴とする請求項１に記載の分析チップ。
【請求項３】
前記反応試薬は、３０℃よりも低い温度域においてゲル状又は固体状を呈することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の分析チップ。
【請求項４】
前記反応試薬は、温度によって相変化する成分として、多糖類、ポリウロン酸、たんぱく質、若しくは合成高分子からなるゲル化剤を少なくとも１種以上含むことを特徴とする請求項１から請求項３の何れか１項に記載の分析チップ。
【請求項５】
前記反応試薬に含まれるゲル化剤の含有量は、０．１ｗｔ％以上３．０ｗｔ％以下の範囲であることを特徴とする請求項４に記載の分析チップ。
【請求項６】
前記反応試薬は、検出対象の遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する核酸、核酸増幅酵素、若しくはエンドヌクレアーゼからなる群から選択される物質を少なくとも１以上含むことを特徴とする請求項１から請求項５の何れか１項に記載の分析チップ。
【請求項７】
前記反応試薬は、検出対象のたんぱく質、若しくは検出対象の物質に結合されたたんぱく質を抗原として認識する抗体を含むことを特徴とする請求項１から請求項６の何れか１項に記載の分析チップ。
【請求項８】
前記反応試薬は、蛍光性化合物、発光性化合物、又は放射性同位体を含むことを特徴とする請求項１から請求項７の何れか１項に記載の分析チップ。
【請求項９】
前記生化学的反応に伴い、電気化学的反応、発熱反応、蛍光反応、発光反応、及び呈色反応のうち少なくとも一つの反応が生じ、前記少なくとも一つの反応に基づいて前記生化学的反応が検出されることを特徴とする請求項１から請求項８の何れか１項に記載の分析チップ。
【請求項１０】
チップ基材に、複数種類の前記反応試薬のうちいずれかの成分の一部又は全部が収容された複数の反応室、前記複数の反応室の各々に連結された流路、及び前記流路に連結された試料注入口を有し、前記試料注入口に一括して供給した試料溶液を、前記流路を通じて前記各反応室へと配液することで、複数種類の前記反応試薬にて一括で処理することを特徴とする請求項１から請求項９の何れか１項に記載の分析チップ。
【請求項１１】
請求項１から請求項１０の何れか１項に記載の分析チップを用いることを特徴とする生化学的分析方法。
【請求項１２】
分析チップの製造方法であって、温度によって相変化する反応試薬を、該反応試薬が液状を呈する温度域に保たれるように、チップ基材の所定の位置に、加温しながら分注することを特徴とする分析チップの製造方法。
【請求項１３】
前記反応試薬を加温しながら分注する際の温度が、３０℃以上１００℃以下の範囲であることを特徴とする請求項１２に記載の分析チップの製造方法。
【請求項１４】
分析チップの製造方法であって、温度によって相変化する反応試薬を、該反応試薬が液状を呈する温度域に保たれた状態で、冷水中へ滴下することによって、液滴状ゲルを形成しつつ、チップ基材の所定の位置に散布することを特徴とする分析チップの製造方法。
【請求項１５】
前記反応試薬を、冷水中に滴下する際の滴下量が、１μＬ以上１０μＬ以下の範囲であることを特徴とする請求項１４に記載の分析チップの製造方法。
【請求項１６】
分析チップの製造方法であって、反応試薬の成分の一部若しくは全部をチップ基材に分注した後に、該反応試薬を温度によって相変化させる成分を含む溶液を、前記チップ基材に分注された前記反応試薬と混合するように分注することを特徴とする分析チップの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱処理を伴う生化学的反応に用いられる分析チップ及び分析チップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、従来は実験室規模で行われていた生化学的反応を、微小な流路や混合室、反応室等を備えたチップ上で行うＭｉｃｒｏ−ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）若しくはＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐと呼ばれる技術が研究され、実現しつつある。これにより、これまで大量に試薬を必要としていた実験が、非常に少量の試薬で行えるようになりつつある。
【０００３】
生化学的反応の例としては、酵素反応による核酸増幅反応が挙げられる。一般的に、核酸を用いた各種の検出反応には、採取した血液や組織片等から抽出した核酸を検体として用いるが、血液や組織片等の試料は大量に入手することが困難であることが多い。そのため、酵素反応による核酸増幅反応を用いた検体核酸の調製が広く用いられている。試料中に含まれる微量の核酸を増加させる方法の代表的なものとして、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ポリメラーゼ連鎖反応）が知られている。
【０００４】
また、上記の生化学反応の他の例として、既知の配列を有するプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法によって検体核酸の配列を検出する方法がある。核酸配列決定の中でも特に、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，一塩基多型）の検出法として、インベーダー（登録商標）法（非特許文献１参照）、タックマン（登録商標）ＰＣＲ法（非特許文献２参照）をタイピング工程に用いる方法が知られている。
【０００５】
上記のＤＮＡ検出反応を実施する方法として、ガラスや樹脂等の材質からなる基盤にプローブ核酸やＰＣＲプライマー等のオリゴＤＮＡを固定したチップ上で反応を行う方法や、チップ上に設けたウェルと呼ばれる微小な穴や窪みを反応室として用いる方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。
オリゴＤＮＡを基板上に固定する方法としては、塩又はカチオン性界面活性剤で基盤表面をコーティングして、その表面に核酸を非共有結合的に結合させる方法が開示されている（例えば、特許文献２参照）。また、別の方法として、固定化しようとする核酸及び基盤表面の両方を誘導体化して共有結合させる方法が提案されている（例えば、特許文献３、４参照）。更に、フォトリソグラフィ技術を用いて、基板上にオリゴＤＮＡを１塩基ずつ合成する技術が知られている（例えば、特許文献５参照）。
【０００６】
ウェルを反応室として用いる場合、該ウェルは微量の試薬を充填後、反応に必要とされる緩衝液等の残余の成分やサンプルとの混合場としても利用することができる。この場合、複数のウェルに連結する流路構造をチップに形成して、複数の反応を同時に行う方法が好適に用いられる（例えば、特許文献６参照）。ウェルに試薬を充填する方法としては、オリゴＤＮＡをビーズ状等の固相支持担体に結合させた後に充填する方法や、オリゴＤＮＡを含む液状試薬をウェル内に分注して乾燥固着させる方法（例えば、特許文献７、８参照）が知られている。
【０００７】
上記の技術を用いて製造される分析チップによって、生化学反応を用いた試験に必要な試薬量は大幅に低減されてきた。しかし、分析チップの製造面においては、コストの低減が依然として求められている。
チップ基材又は固相支持担体にオリゴＤＮＡを固定する方法では、コーティングや誘導体化といった前処理が必要となる。該前処理は、別途前処理用の薬剤を必要とする他、高度かつ煩雑な製造技術が求められる。更に、固定化効率の問題から、オリゴＤＮＡの必要量の増大が課題となる。基盤上にオリゴＤＮＡを合成する場合も、高度な技術を要する他、所要時間が増大するために、チップが非常に高価となる。液状試薬をウェル内に分注して乾燥固着する方法では、煩雑な操作や使用薬剤の増加は必要ないが、乾燥に時間を要するため、チップ作製の所要時間が増大する。
【０００８】
煩雑な前処理技術を用いずに、且つ、製造工程の長時間化を伴わない分析チップとして、温度によって相変化する、即ち、室温域において試薬はゲル状又は固体状を呈し、所望の反応を実施する温度域では液状に変化するように添加剤を加えた試薬を用いるものが開示されており、代表的なゲル化剤として低温溶融性アガロースを使用している（例えば、特許文献９参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−１４１５９９号公報
【特許文献２】米国特許第５６１０２８７号明細書
【特許文献３】米国特許第５５５４７４４号明細書
【特許文献４】米国特許第５５１４７８５号明細書
【特許文献５】米国特許第５４２４１８６号明細書
【特許文献６】特開２００６−２４７５３３号公報
【特許文献７】特開平１１−２８１００号公報
【特許文献８】特開２０１３−１９８４４３号公報
【特許文献９】特開２００４−３３７０６４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、２００４年、第６巻、第２号、ｐｐ．１３７−１
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００９年、第５７８巻、ｐｐ．２９３−３０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、アガロースゲルは、ゲル形成後の時間経過と共に、ゲルに含まれる水分が脱離し、ゲル表面に滲出する、即ち離水が生じやすいことが一般に知られている。異なるプローブ核酸やＰＣＲプライマーを含む複数の試薬を収容した分析チップにおいて、試薬を保持するゲルからの離水は、分析チップのハンドリングに難しさを伴うだけでなく、試薬の交叉夾雑（コンタミネーション、クロスコンタミネーション）を起こしかねない。これは、該分析チップを用いて実施される試験の信頼性を損ない得るものである。
【００１２】
そこで、以上のような従来技術の問題を鑑みて、本発明は、煩雑且つ高度な前処理技術や製造工程の長時間化を必要とせず、安価で信頼性の高い分析チップ、及び該分析チップの製造方法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記の課題を解決するために、本発明の一態様に係る分析チップは、熱処理を伴う生化学的反応に用いられる反応試薬の成分の一部又は全部をあらかじめ反応室に収容している。反応試薬は、温度によって相変化し、且つ、常温以下での保存において離水しないゲル状を呈する。
本発明の一態様に係る分析チップの製造方法では、温度によって相変化する反応試薬が、該反応試薬が液状を呈する温度域に保たれるように、チップ基材の所定の位置に、加温しながら分注される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の一様態によれば、微小容量の反応試薬をあらかじめ反応室に収容するようにしたことで、交叉夾雑が起きにくく、信頼性の高い分析チップの提供が可能となる。更に、このような分析チップを、煩雑且つ高度な前処理技術を必要とせず、且つ、製造時間の長時間化を伴わずに製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例における分析チップの製造方法のスキーム図である。
【図２】本発明の実施例における分析チップの模式図の平面図である。
【図３】本発明の実施例における分析チップの模式図の断面図である。
【図４】本発明の実施例及び比較例における分析チップを用いた試験の温度条件を示す図である。
【図５】本発明の実施例及び比較例における試験結果の説明図である。
【図６】比較例２における形成後一昼夜経過したゲルの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜実施形態＞
以下に、本発明の一実施形態について説明する。
（分析チップ）
まず、本実施形態に係る分析チップについて説明する。
本実施形態に係る分析チップは、熱処理を伴う生化学的反応に用いられる反応試薬の成分の一部又は全部があらかじめ反応室に収容されている。
【００１７】
反応試薬は、温度によって相変化し、且つ、常温以下での保存において離水しないゲル状を呈する。なお、反応試薬は、反応温度域において液状を呈し、３０℃よりも低い温度域においてゲル状又は固体状を呈する。反応温度は、３０℃以上１００℃以下が好ましい。１００℃を越えても液状を呈し、反応が進み、検出工程で検出できる状態であれば１００℃を越えた反応温度でも良い。
【００１８】
ここで、反応試薬は、温度によって相変化させる成分として、多糖類、ポリウロン酸、たんぱく質、若しくは合成高分子からなるゲル化剤を少なくとも１種以上含む。反応試薬に含まれるゲル化剤の含有量は、０．１ｗｔ％（ｗｔ％：重量パーセント）以上３．０ｗｔ％以下の範囲である。
なお、反応試薬に含まれる相変化制御成分、即ちゲル化剤としては、所望の生化学的反応を阻害する物質を含まず、且つ経時的な離水を生じないものであれば、どの様な成分でも使用できる。例えば、ゲル化剤成分として、ι（イオタ）カラギーナン、サイリウムシードガム、ネイティブジェランガム、ゼラチン等を使用することができる。但し、上記のゲル化剤成分からは、１度形成したゲルが加熱しても融解しない、不可逆的なゲル化剤を除く。
【００１９】
また、アガロースやκ（カッパ）カラギーナンのような、離水しやすいゲル化剤であっても、離水を抑制するための公知の方法と組み合わせることで、本実施形態に使用することができる。上記の離水を抑制する方法としては、例えば、ローカストビーンガム、キサンタンガム、グアーガム、アルギン酸ナトリウム、ペクチンのような増粘多糖類と併用する方法、若しくは、グルコースやフルクトースのような単糖類、又はマルトース、トレハロース、スクロースのような二糖類、並びにオリゴ糖類を添加する方法、若しくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、又はポリアクリルアミド等の重合高分子を添加する方法が知られている。
【００２０】
上記のゲル化剤は、好ましくは、水への溶解温度が高くないものが用いられる。例えば、６０℃の温水に溶解するιカラギーナン及びゼラチン等が使用される。但し、反応試薬中の成分が分解及び／若しくは失活しないような温度で溶解するゲル化剤であれば、制限なく利用できる。形成されたゲルの融解温度は、ゲル化剤の添加量にもよって変化するので一概には言えないが、上記のιカラギーナンの場合は約６０℃、上記のゼラチンの場合は約３０℃にてゲルが融解して液状を呈する。したがって、利用したい生化学的反応を実施する反応温度によって、適切なゲル化剤を選択することができる。
【００２１】
反応試薬のゲル化剤の添加量は、反応試薬の組成、ｐＨ、塩濃度等によってゲル状又は固体状を呈する温度が異なってくるため一概には言えないが、上記のιカラギーナンの場合、０．５％以上３％以下の範囲が選択され、好ましくは１％以上２％以下の範囲が選択される。
添加量が０．５％より低い場合、反応試薬がゲル化せず、乾燥工程が必要となる。また、添加量が３％より高い場合には、反応試薬の粘度の上昇等の影響によって、反応試薬とサンプル溶液との混合が不充分となり、検出結果が安定しない可能性がある。ゲル化剤としてゼラチンを用いる場合、０．５ｗｔ％以上３．０ｗｔ％以下の範囲が選択され、好ましくは１．０ｗｔ％以上２．０ｗｔ％以下の範囲が選択される。一般的なゲル化剤であるアガロースを使用する場合は、０．１ｗｔ％以上３．０ｗｔ％以下の範囲が選択され、好ましくは０．５ｗｔ％以上２．０ｗｔ％以下の範囲が選択される。
【００２２】
ιカラギーナン及びゼラチン以外のゲル化剤を単独若しくは複数種併用する場合、その個々の濃度は一概に言えないが、本実施形態に係る分析チップの保管条件の温度及び常温において反応試薬が流動しない程度のゲル強度を呈する範囲であれば、その目的を達する。
また、反応試薬は、検出対象の遺伝子に対して相補的な塩基配列を有する核酸、核酸増幅酵素、若しくはエンドヌクレアーゼからなる群から選択される物質を少なくとも１以上含む。また、反応試薬は、検出対象のたんぱく質、若しくは検出対象の物質に結合されたたんぱく質を抗原として認識する抗体を含む。また、反応試薬は、蛍光性化合物、発光性化合物、又は放射性同位体を含む。
【００２３】
なお、本実施形態に係る分析チップは、チップ基材に、複数種類の反応試薬のうちいずれかの成分の一部又は全部が収容された複数の反応室、複数の反応室の各々に連結された流路、及び流路に連結された試料注入口を有し、試料注入口に一括して供給した試料溶液を、流路を通じて各反応室へと配液することで、複数種類の反応試薬にて一括で処理することができる。
【００２４】
本実施形態に係る分析チップにおける反応室、即ち反応試薬を保持する容器構造としては、ウェル状、チューブ状、スリット状等、所望の反応温度において液状となった反応混合液を漏洩することなく保持できる構造を持つものであれば、制限なく使用できる。ここでは、ウェルを反応室（以下、反応ウェルと称する。）として用いる。
本実施形態に係る分析チップの具体的な使用形態によれば、円形の分析チップの円周上に配置された反応ウェル内に、ＰＣＲプライマーや核酸増幅酵素をはじめとする複数種類の反応試薬を定着させ、該分析チップを遠心する。これにより、試料注入口から一括供給した試料溶液を、上記の反応ウェルの内側に反応ウェルと試料注入口とを連絡するように形成された流路構造を通じて配液し、その後に熱処理を行うことで、核酸増幅及びＳＮＰ検出反応が実施される。従って、チップ表面に開口部を有し、試料溶液が飛散しないようにシールすることができる容器構造が好適に使用できるが、特にこれに限定されるものではない。
【００２５】
本実施形態に係る分析チップでは、生化学的反応混合液の相変化を伴うため、試料溶液と反応試薬が充分に混合され、且つ反応試薬の使用を少量に抑えられる反応容積が適当である。即ち、本実施形態に係る分析チップに使用される反応容積は、３μＬ以上５０μＬ程度が好適に使用できる。
本実施形態に係る分析チップに使用されるチップ基材には、ガラス、シリコン、セラミック、熱硬化性樹脂、熱可塑性樹種、金属等が使用でき、キレート作用を有する物質、酸性物質、塩基性物質等の、所望の生化学的反応を阻害的する物質を溶出せず、且つ、試料画分や反応試薬を強く吸着せず、且つ、強い自家蛍光等を示さず、検出反応を阻害しない材質であって、所望の反応温度にて反応試薬を保持できるものであれば、どの様なものでも使用できる。
【００２６】
本実施形態に係る分析チップにおける熱処理を伴う生化学的反応としては、特定の塩基配列を有する核酸の増幅、該核酸の検出、特定のアミノ酸配列及び／若しくは立体構造を有するたんぱく質の検出反応等が利用可能である。
特に、ＰＣＲ法やＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法に代表される核酸増幅を伴う遺伝子検出方法が好適に利用可能であるが、前述のゲル化剤が液状を呈する温度域において実施可能な生化学的反応であれば、制限なく利用できる。
【００２７】
なお、本実施形態に係る分析チップを用いた生化学的反応の検出方法には、電気化学的反応に基づく検出方法、蛍光反応及び呈色反応に基づく光学的検出方法のほか、放射性同位体標識によるオートラジオグラフィーに基づく検出方法等が利用可能であるが、所望の対象物質を検出できる方法であれば、制限なく利用可能である。
例えば、このような方法には、エチジウムブロマイド、サイバーグリーン又はピコグリーン等のインターカレーターを用いた蛍光値の検出によって、ＰＣＲでの遺伝子の増幅量を検出する方法がある。また、前述のインベーダー法やタックマンＰＣＲ法によるＳＮＰの検出方法も好適に利用可能であるが、本実施形態に係る分析チップを用いた生化学的反応の検出方法は、特にこれらに限定されるものではない。
【００２８】
本実施形態に係る分析チップでは、生化学的反応に伴い、電気化学的反応、発熱反応、蛍光反応、発光反応、及び呈色反応のうち少なくとも一つの反応が生じ、生じた反応に基づいて生化学的反応が検出される。
本実施形態に係る分析チップの製造工程においては、温度によって相変化する反応試薬を、液状を呈する温度に加温しながら扱う方法として、液体の定量的ハンドリング方法と併用できるものであれば、公知の熱制御機構を制限なく利用できる。
【００２９】
上記の液体の定量的ハンドリング方法としては、マイクロピペットを用いた分注、圧空又はシリンジ等によって制御されるノズルを用いた吸引及び吐出による分注等が例示される。但し、定量的に液体を所定の位置に移動させることができる公知の技術であれば、特にこれに限定されるものではない。
したがって、本実施形態に係る分析チップの製造工程においては、温度によって相変化する反応試薬を、該反応試薬が液状を呈する温度域に保たれるように、チップ基材の所定の位置に、加温しながら分注する。反応試薬を加温しながら分注する際の温度は、３０℃以上１００℃以下の範囲である。なお、実際には、チップ内の溶液自体の温度を測るのは難しいため、この温度は加温手段の設定温度で良い。
【００３０】
若しくは、温度によって相変化する反応試薬を、該反応試薬が液状を呈する温度域に保たれた状態で、冷水中へ滴下することによって、液滴状ゲルを形成しつつ、チップ基材の所定の位置に散布しても良い。
分析チップの反応容量としては、数μＬから数十μＬのものが多く、好ましくは１μＬ以上１０μＬ以下の反応試薬がチップ基材上にあらかじめ収容される。反応試薬を冷水中に滴下する際の滴下量は、１μＬ以上１０μＬ以下の範囲である。
【００３１】
若しくは、反応試薬の成分の一部若しくは全部をチップ基材に分注した後に、該反応試薬を温度によって相変化させる成分を含む溶液を、チップ基材に分注された反応試薬と混合するように分注しても良い。
以上、本発明の実施形態を詳述してきたが、実際には、上記の実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の変更があっても本発明に含まれる。
【実施例１】
【００３２】
本実施形態に従う分析チップの例を以下に説明する。核酸増幅反応であるＰＣＲ法とＳＮＰ検出反応であるインベーダー法とを同一反応液中で連続して実施するインベーダープラス法を用いて、血液凝固に関する酵素であるＶＫＯＲＣ１の遺伝子の増幅及び検出を実施例として示すが、本実施形態はこれに限定されるものではない。
（チップ基材）
円形状のポリプロピレン成型品であり、円周上に沿って容積５μＬの井戸状の反応ウェルを複数個形成し、且つチップ中央に設けた試料注入口と、上記の反応ウェルと連絡するように流路構造を有するチップ基材（以下、ＰＰ基材と表記）を造形した。また、樹脂シーラントを備えたアルミニウム製シートを、上記のポリプロピレン（ＰＰ）成型品と貼り合わせて熱溶着できるように、円形に抜き加工して蓋材（以下、ＡＬ蓋材と表記）を形成した。
【００３３】
（反応試薬）
増幅対象のＤＮＡと相補的な配列を有する２種のプライマー、及びインベーダー法でプローブとして機能する２種のオリゴＤＮＡ及び１種の蛍光標識されたオリゴＤＮＡ、即ちアレルプローブ、インベーディングプローブ及びＦＲＥＴカセット、及び核酸増幅酵素であるＤＮＡポリメラーゼ、及びエンドヌクレアーゼであるクリベース、及びｄＮＴＰミックス、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ＭＯＰＳバッファー、並びにトレハロースから成る反応試薬を、表１に示す濃度にて調製した。
該反応試薬にゲル化剤としてゼラチンが終濃度にて１％となるように添加し、１０分間、６０℃で振盪しながら加温し、ゼラチン粉末が塊とならないように溶解した。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
（試料）
検出対象の遺伝子を含む試料溶液を、ヒトゲノムＤＮＡ、塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウムが、終濃度にて各々０．１０ｎｇ／μＬ、１５．０ｍＭ、及び６．２５ｍＭとなるように調製した。
【００３６】
（チップ製造）
図１は、分析チップの製造方法のスキーム図である。図２は、反応試薬をゲル化して定着させたＰＰ基材の模式図の平面図である。図３は、該ＰＰ基材の模式図の断面図である。
図１に示すスキームに従い、本実施例における分析チップを製造した。
【００３７】
図２、図３に示すＰＰ基材２ａの反応ウェル２ｄ内に、反応試薬２ｅを３μＬ分注した後、４℃にて３０分間冷却し、該反応試薬２ｅをゲル状に固化させた。
その後、当該ＰＰ基材２ａと、上記のＡＬ蓋材とを熱溶着して貼り合わせることで、試料注入口２ｂのみが開口した分析チップを製造した。
熱溶着条件は、ＡＬ蓋材とＰＰ基材が密着し、反応試薬に悪影響を与えない条件で行えば良い。
【００３８】
（核酸増幅及びＳＮＰ検出）
上記の分析チップを用いて、核酸の増幅及び検出を行うため、インベーダープラス法による試験を行った。上記の試料溶液を上記の分析チップの試料注入口から注入し、該分析チップを遠心して、試料流路２ｃを経て反応ウェルに該試料溶液を配液した後、図４に示す温度条件にて熱処理し、インベーダープラス法に供した。
【００３９】
まず、ＰＣＲによる核酸の増幅を行った。図４における４ａの範囲に示したように、初期変性工程として９３℃で１２０秒間保持した。
次に、図４における４ｂの範囲に示したように、９３℃で３１秒間保持して試料中の２本鎖ＤＮＡを熱変性させた（分鎖工程）後、４ｃの範囲で示したように、６６℃で１６秒間保持してプライマーのアニーリング及び伸長を行った。
【００４０】
次に、図４における４ｄの範囲で示した熱変性、アニーリング及び伸長工程を３０サイクル繰り返すことで、目的のＶＫＯＲＣ１に対応する遺伝子の配列を増幅した。
その後、図４における４ｅの範囲に示したように、９９℃まで昇温して１２０秒間保持することで、核酸増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼを失活させた（ＤＮＡポリメラーゼ失活工程）。
【００４１】
続いて、インベーダー法によって、増幅されたＤＮＡの検出を行った。図４における４ｆの範囲に示したように、６１℃で保持しながら２０秒間に１度、蛍光強度の測定を行い、該蛍光強度測定を３０回繰り返し行った。
（比較例）
本実施形態に従う分析チップの比較例として、ゲル化剤を使用しない反応試薬を収容した分析チップを用いて、上記の実施例と同様にインベーダープラス法による試験を行った。
【００４２】
ゼラチンを添加しない他は上記の実施例と同様となるように、表１に示した組成で試薬を調製した。上記の実施例と同様のＰＰ基材に前期試薬を分注した後、３０℃で一昼夜、オーブン中に静置して該試薬を乾燥固着させた。
その後、前期試薬が乾燥固着されたＰＰ基材と、上記のＡＬ蓋材とを貼り合わせて、上記の実施例と同様の条件で熱溶着させることで、本比較例の分析チップを製造した。
【００４３】
本比較例の分析チップに、上記の実施例と同様の組成となるように調製した試料溶液を注入し、遠心して上記の反応ウェルに該試料溶液を配液した。
その後、上記の実施例と同様に、図４に示す温度条件にて熱処理し、核酸の増幅及び検出を行った。
（試験結果）
図５に、上述の実施例及び比較例の試験結果を示す。図５における５ａで示した実線は、本実施形態に従う実施例の分析チップで得られた試験結果である。更に、図５における５ｂで示した破線は、上述の比較例の分析チップで得られた試験結果である。図５における５ｃの範囲で示したＰＣＲの後、５ｄの範囲で示したインベーダー反応において、上記の５ａ及び５ｂは、ともに速やかな蛍光強度の立ち上がりが見られた。
【００４４】
従って、実施例の分析チップと比較例の分析チップとは、どちらもＰＣＲによる核酸の増幅及びインベーダー反応によるＤＮＡ検出が同様に為されていることが解る。即ち、本実施例では、同様の品質を有する分析チップを製造するのに要する時間を、本実施形態によって一昼夜から３０分間に短縮することができた。これは、分析チップの製造コストの大幅な低減に寄与し得るものである。
【００４５】
（比較例２）
本実施形態では、反応試薬が常温以下での保存において離水しないゲルとしてチップ基材に定着し、温度によって相変化する。本実施形態と先行技術との比較として、ゲル形成後の離水について評価を行った。
本実施形態に従うゲル化剤として、上記の実施例で用いたゼラチン、並びに離水を生じないゲル化剤として知られるιカラギーナンを使用した。
【００４６】
比較例２では、ゲル化剤として、先行技術で例示されているアガロースと同様に一般的なゲル化剤であるκカラギーナンを使用した。
上記のゼラチン、ιカラギーナン、及びκカラギーナンを、１．０ｗｔ％添加した水溶液をそれぞれ調製し、該水溶液を１０分間、７０℃にて振盪しながら加温して、ゲル化剤が塊にならないように溶解した。
【００４７】
その後、４℃にて３０分間冷却し、該水溶液が全てゲル状に固化していることを確認した。
上記のように形成したゼラチン、ιカラギーナン、及びκカラギーナンの１．０ｗｔ％ゲルを、４℃で冷却しながら一昼夜静置した後、離水の発生の有無を確認した。
図６は該ゲルの模式図であり、図６における６ａはゲルを形成した遠沈管を示す。更に、図６における６ｂに示すゼラチンゲル、及び６ｃに示すιカラギーナンゲルは、流動しないゲル状の画分のみから成り、離水は見られなかった。
【００４８】
一方、図６における６ｄに示すκカラギーナンゲルでは、流動しないゲル状の画分の上部に、図６における６ｅに示すように、離水が生じていた。
上記のκカラギーナンゲルから脱離した水分は、形成したゲルの９．３ｗｔ％に及んでいた。この脱離水分は、κカラギーナンやアガロースを使用した分析チップにおいても、保管中に生じ得るものであり、反応試薬の交叉夾雑を引き起こし得るものである。
【００４９】
従って、本実施形態に従う、離水を生じないゲル化剤を用いて反応試薬を定着させた分析チップは、従来技術による分析チップよりも信頼性の向上が為されたと言える。
【符号の説明】
【００５０】
２ａ  実施例及び比較例における分析チップのＰＰ基材
２ｂ  実施例及び比較例における分析チップの試料注入口
２ｃ  実施例及び比較例における分析チップの試料流路
２ｄ  実施例及び比較例における分析チップの反応ウェル
２ｅ  実施例及び比較例における分析チップのゲル状に固化した反応試薬
４ａ  実施例及び比較例における分析チップを用いた試験のＰＣＲでの初期変性工程の範囲
４ｂ  実施例及び比較例における分析チップを用いた試験のＰＣＲでの分鎖工程の範囲
４ｃ  実施例及び比較例における分析チップを用いた試験のＰＣＲでのアニーリング及び伸長工程の範囲
４ｄ  実施例及び比較例における分析チップを用いた試験のＰＣＲでの繰り返し熱処理を実施する範囲
４ｅ  実施例及び比較例における分析チップを用いた試験のＤＮＡポリメラーゼ失活工程の範囲
４ｆ  実施例及び比較例における分析チップを用いた試験のインベーダー反応の範囲
５ａ  実施例における分析チップを用いた試験の結果
５ｂ  比較例における分析チップを用いた試験の結果
６ａ  比較例２における形成後一昼夜経過したゲルの容器
６ｂ  比較例２における形成後一昼夜経過したゼラチンゲルのゲル状画分
６ｃ  比較例２における形成後一昼夜経過したιカラギーナンゲルのゲル状画分
６ｄ  比較例２における形成後一昼夜経過したκカラギーナンゲルのゲル状画分
６ｅ  比較例２における形成後一昼夜経過したκカラギーナンゲルから脱離した水分
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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