(57)【要約】【課題】長い食経験から安全性や味覚性に優れていることを実証された成分で構成され、長期間の摂取が可能な肝臓の線維化の抑制剤や、肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防剤などの提供を課題とする。【解決手段】タンパク質の50重量%がα-ラクトアルブミンであり、タンパク質の50重量%がカゼインである飼料を投与されたラットでは、タンパク質の100重量%がカゼインである飼料を投与された場合に比べて、肝臓の線維化が抑制され、肝硬変の指標である血清中のALT（アラニン・アミノ・トランスフェラーゼ）、AST（アスパラギン酸・アミノ・トランスフェラーゼ）、総ビリルビン、MMP（マトリックス・メタロ・プロテイナーゼ）-2の上昇が抑制されることを確認した。このような知見から、α-ラクトアルブミンを投与することにより肝臓の線維化を抑制できることが見出された。また、肝臓の線維化に起因する疾患を治療および／または予防できる可能性が見出された。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
α‐ラクトアルブミンを有効成分として含む、肝臓の線維化の抑制剤。
【請求項２】
肝臓の線維化が、肝細胞の損傷によるものである、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
肝細胞の損傷が、肝細胞の核酸のメチル化に起因するものである、請求項２に記載の剤。
【請求項４】
α‐ラクトアルブミンを有効量で含む単位包装形態からなる、請求項１〜３のいずれかに記載の剤。
【請求項５】
α‐ラクトアルブミンの有効量が、少なくとも４．６７ｇ／ｋｇ／日である、請求項４に記載の剤。
【請求項６】
α‐ラクトアルブミンを有効成分として含む、肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防剤。
【請求項７】
肝臓の線維化に起因する疾患が、肝硬変、肝細胞癌、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬剤性肝障害、自己免疫性肝炎、胆汁うっ滞、胆道閉鎖症、ポルフィリン症、ウィルソン病からなる群より選択される、請求項６に記載の剤。
【請求項８】
α‐ラクトアルブミンを有効量で含む単位包装形態からなる、請求項６または７に記載の剤。
【請求項９】
α‐ラクトアルブミンの有効量が、少なくとも４．６７ｇ／ｋｇ／日である、請求項８に記載の剤。
【請求項１０】
α‐ラクトアルブミンを有効成分として飲食品に配合する工程を含む、飲食品に肝臓の線維化の抑制効果を付与する方法。
【請求項１１】
肝臓の線維化が、肝細胞の損傷によるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
肝細胞の損傷が、肝細胞における核酸のメチル化に起因するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
α‐ラクトアルブミンを有効成分として飲食品に配合する工程を含む、飲食品に肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防効果を付与する方法。
【請求項１４】
肝臓の線維化に起因する疾患が、肝硬変、肝細胞癌、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬剤性肝障害、自己免疫性肝炎、胆汁うっ滞、胆道閉鎖症、ポルフィリン症、ウィルソン病からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、α-ラクトアルブミンを含む肝臓の線維化の抑制剤などに関する。また、本発明は、α-ラクトアルブミンを飲食品に配合する工程を含む、飲食品に肝臓の線維化の抑制効果を付与する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
非ステロイド性の抗炎症剤（NSAIDs）は、シクロオキシゲナーゼ2（COX-2）を阻害し、抗炎症剤として有用である。しかし、NSAIDsは肝臓で代謝されることから、肝臓への負担が大きい。そのため、肝硬変などの肝疾患の患者はNSAIDsを服用できない。一方、特許文献１には、α-ラクトアルブミン（α-La）は、COX-2を選択的に阻害し、抗炎症剤として有用であることが記載されている。
【０００３】
α-Laの加水分解物を含む組成物は幾つか知られている。例えば、特許文献２には、α-Laを加水分解して得られるペプチド分解物の製造法や、このペプチド分解物を含む肝疾患の患者用の栄養補給組成物が記載されている。また、特許文献３には、α-Laの加水分解物を含む肝疾患の患者用の栄養組成物が記載されている。しかし、特許文献２と特許文献３には、α-Laそのものの用途は記載されていない。
【０００４】
また、特許文献４には、α-Laの生物活性を持つ複合体を、肝臓癌などの治療に使用することが記載されている。しかし、特許文献４には、α-Laの複合体は変異体であると記載されており、α-Laそのものの用途は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2008/140041
【特許文献２】特開平05-276896
【特許文献３】特表2006-515287
【特許文献４】特表2007-524708
【特許文献５】特開平09-110686
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、肝硬変の患者数は増加傾向にある。肝硬変は肝炎などの肝障害において、肝臓の線維化が進行することで発症する。肝炎などの肝障害が起こると、肝星細胞が活性化し、コラーゲン線維が合成される。肝障害が慢性化すると、肝星細胞が常に活性化され、肝臓にコラーゲン線維が蓄積し、肝臓の線維化がさらに進行する。肝臓の線維化は肝硬変を引き起こし、肝硬変がさらに悪化すると、肝細胞癌になる可能性がある。したがって、肝臓の線維化の抑制方法、肝硬変などの肝疾患の有効な治療方法や予防方法の確立が求められている。
【０００７】
本発明は、このような現状に鑑みてなされたものであり、長い食経験から安全性や味覚性に優れていることが実証され、長期間の摂取が可能なα-Laを含む、肝臓の線維化の抑制剤などを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を行った。具体的には、DMN（ジメチルニトロソアミン）を短期間で経口投与された肝硬変モデルラットに対し、α-Laを投与し、肝臓の線維化の抑制効果や、肝細胞の損傷によって生じた肝硬変の抑制効果などについて検討した。ここで、α-Laは肝臓への負担が小さいため、肝疾患の患者も服用できる可能性が考えられた。
その結果、本発明者らは、タンパク質の50重量%がα-Laであり、タンパク質の50重量%がカゼインである飼料を投与されたラットでは、タンパク質の100重量% がカゼインである飼料を投与されたラットに比べて、肝臓の線維化が抑制され、肝硬変の指標である血清中のALT（アラニン・アミノ・トランスフェラーゼ）、AST（アスパラギン酸・アミノ・トランスフェラーゼ）、総ビリルビン、MMP（マトリックス・メタロ・プロテイナーゼ）-2の上昇が抑制されることを明らかにした。このような知見から、α-Laを投与することにより、肝臓の線維化を抑制できることや、肝臓の線維化に起因する疾患を治療および／または予防できることを見出した。さらに本発明者らは、α-Laによる肝臓の線維化の抑制や肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防の過程において、一酸化窒素（NO）が関与している可能性があることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下を提供する。
〔１〕α‐ラクトアルブミンを有効成分として含む、肝臓の線維化の抑制剤。
〔２〕肝臓の線維化が、肝細胞の損傷によるものである、〔１〕に記載の剤。
〔３〕肝細胞の損傷が、肝細胞の核酸のメチル化に起因するものである、〔２〕に記載の剤。
〔４〕α‐ラクトアルブミンを有効量で含む単位包装形態からなる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の剤。
〔５〕α‐ラクトアルブミンの有効量が、少なくとも４．６７ｇ／ｋｇ／日である、〔４〕に記載の剤。
〔６〕α‐ラクトアルブミンを有効成分として含む、肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防剤。
〔７〕肝臓の線維化に起因する疾患が、肝硬変、肝細胞癌、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬剤性肝障害、自己免疫性肝炎、胆汁うっ滞、胆道閉鎖症、ポルフィリン症、ウィルソン病からなる群より選択される、〔６〕に記載の剤。
〔８〕α‐ラクトアルブミンを有効量で含む単位包装形態からなる、〔６〕または〔７〕に記載の剤。
〔９〕α‐ラクトアルブミンの有効量が、少なくとも４．６７ｇ／ｋｇ／日である、〔８〕に記載の剤。
〔１０〕α‐ラクトアルブミンを有効成分として飲食品に配合する工程を含む、飲食品に肝臓の線維化の抑制効果を付与する方法。
〔１１〕肝臓の線維化が、肝細胞の損傷によるものである、〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕肝細胞の損傷が、肝細胞における核酸のメチル化に起因するものである、〔１１〕に記載の方法。
〔１３〕α‐ラクトアルブミンを有効成分として飲食品に配合する工程を含む、飲食品に肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防効果を付与する方法。
〔１４〕肝臓の線維化に起因する疾患が、肝硬変、肝細胞癌、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬剤性肝障害、自己免疫性肝炎、胆汁うっ滞、胆道閉鎖症、ポルフィリン症、ウィルソン病からなる群より選択される、〔１３〕に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明では、α-Laを有効成分とし、肝疾患の患者も服用できる、肝臓の線維化の抑制剤などを提供する。本発明の剤などは、特に、肝細胞の損傷による肝臓の線維化を効果的に抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】DMNの投与から6、13、20日後におけるALTとASTの推移を示すグラフである。
【図２】肝臓の組織像を示す写真である。
【図３】剖検時における血清のALTの濃度を示すグラフである。
【図４】剖検時における血清のASTの濃度を示すグラフである。
【図５】剖検時における血清のALPの濃度を示すグラフである。
【図６】剖検時における血清の総ビリルビンの濃度を示すグラフである。
【図７】剖検時における血清のヒアルロン酸の濃度を示すグラフである。
【図８】剖検時における血清のMMP-2の濃度を示すグラフである。
【図９】正常（Normal）群、DMN-対照群、DMN-αLA群、DMN-LA-LN群、DMN-LN群の5群を対象として、DMNの投与から3および10日後におけるALTの濃度を測定した結果を示すグラフである。統計解析では、DMN-対照群を対照として、Dunnettの検定またはSteelの検定を実施した。
【図１０】正常（Normal）群、DMN-対照群、DMN-αLA群、DMN-LA-LN群、DMN-LN群の5群を対象として、DMNの投与から3および10日後におけるASTの濃度を測定した結果を示すグラフである。統計解析では、DMN-対照群を対照として、Dunnettの検定またはSteelの検定を実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更できる。
【００１３】
本発明は、α-Laを有効成分とする、肝臓の線維化の抑制剤に関する。α-Laは、ホ乳類の乳汁に含まれていることから、長い食経験から安全であると認識されている。そして、実際にα-Laの安全性は科学的に検証されている。また、α-Laは、食品に存在する物質であることから、医薬品としてのみならず、飲食品として加工・流通させることも期待できる。さらに、α-Laは、牛乳などの比較的に安価な原料から得ることができるため、大量生産が可能である。
【００１４】
本発明において、α-Laは、特に由来を問わないが、好ましくは、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマなど）の由来であり、より好ましくは、ヒトまたはウシの由来である。α-Laのアミノ酸配列や塩基配列は既に公知であり、EMBL、DDBJ、NCBIなどのデータベースに登録されている。例えば、ウシの由来のα-Laは、DDBJにACCESSION No.J05147として登録されている。ウシの由来のα-Laの塩基配列を配列番号：１に、アミノ酸配列を配列番号：２に示す。配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、第１位から第１９位はシグナルペプチドである。また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、第２９位のアルギニン（Ｒ）がグルタミン（Ｑ）に置き換わった変異体の存在が知られている（「ミルク総合辞典」p.35、朝倉書店）。牛乳に分泌されるα-Laはシグナルペプチドが切断された成熟ペプチドである。本発明の実施例で用いたα-Laは、上記のウシ成熟ペプチドである。
【００１５】
本発明において、α-Laは、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギなどのホ乳動物の乳などから、硫酸アンモニウム沈殿法（「最新改稿乳業技術便覧」酪農技術普及学会、122-125ページ、1975）、限外ろ過法（特開平5-268879号公報）、イオン交換法（特許第2916047号公報）などの公知技術によって調製することができる。牛乳のα-Laの含有量は、産地、飼料などによって、多少の差異はあるが、通常で約1.2 g/kgであり、牛乳を原料として使用すれば、α-Laを容易に多量で調製することができる。また、アミノ酸配列および塩基配列を基に化学的方法によって、α-Laを合成することができるし、当業者に公知の遺伝子工学的方法によって、α-Laを作製することができる。また、市販のα-La（例えば、ダビスコ社製など）を使用することができる。
【００１６】
本発明において、α-Laは、上記の公知のアミノ酸配列からなるものに限られず、肝臓の線維化の抑制作用を有する限り、上記のアミノ酸配列に変異が存在する変異体のポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドの例として、天然型の変異体、ホモログ、人為的変異体などを挙げることができる。具体的には、α-Laの公知のアミノ酸配列に、1または複数のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入した配列を含むポリペプチドや、α-Laをコードするポリヌクレオチドの相補鎖に、ストリンジェントな条件で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードする、ポリペプチドを挙げることができる。他には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に、1または複数のアミノ酸（例えば2、3、4、5、10、20、30、40、50、または100個）が付加、欠失、置換、挿入した配列を含む、肝臓の線維化の抑制作用を有するポリペプチドを挙げることもできるし、配列番号：１記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチドの相補鎖に、ストリンジェントな条件で、ハイブリダイズするポリヌクレオチドをコードする、肝臓の線維化の抑制作用を有するポリペプチドを挙げることもできる。このとき、当業者に公知の技術によって、これらの変異体ポリペプチドを作製することができる。
【００１７】
本発明は、α-Laを有効成分とする、肝臓の線維化の抑制剤を提供する。一方、本発明は、α-Laを有効成分とする、肝細胞の損傷による肝臓の線維化の抑制剤を提供する。本発明において、肝細胞の損傷とは、肝臓に対する物理的作用、化学物質への曝露などの化学的作用、感染症などの生物学的作用などの何らかの外的作用により、肝臓の構造が変化することや、肝臓の機能が低下することをいう。また、一般に、肝臓の線維化とは、肝細胞の損傷に対する反応の結果である。本発明において、肝臓の線維化とは、肝組織の線維化状態を指す。例えば、肝組織におけるコラーゲンなどの細胞外基質の蓄積、線維芽細胞の活性化などを挙げられるが、これらに限られない。本発明において、肝臓の線維化は、肝細胞の線維化、肝組織の線維化、肝線維化などと表現することもできる。本発明の肝臓の線維化の抑制剤は、肝臓の線維化に加え、上記の肝細胞の損傷そのものを抑制するものであってもよい。すなわち、本発明は、α-Laを有効成分とする、肝細胞の損傷の抑制剤をも提供する。
【００１８】
本発明の剤は、肝臓の線維化を効果的に抑制することができる。本発明において、「線維化を抑制する」とは、線維化が生じた組織における線維化病変を減少や消失させるか、線維化の進行を遅延や阻止する（線維化病変の増大や増加を抑制する）ことをいう。
【００１９】
本発明において、肝臓の線維化の程度は、当業者に公知の方法で評価することができる。例えば、肝生検によって、線維化の所見を評価する方法を挙げることができる。具体的には、肝生検のサンプルを特殊染色（マッソン・トリクローム染色や銀染色など）して、強調された線維化組織の像を、組織学的に評価する方法を挙げることができる。線維化の組織学的な評価は、例えば、Dai K, et al. World J Gactroenterol. 31:4822-4826, 2005、Hillebrandt S, et al. Nature Genetics 37:835-843, 2005に従って、免疫組織学的染色に基づき、各試料の肝細胞の線維化レベルを線維化度数で表すことができる。また、ヒアルロン酸、I型、III型、IV型などのコラーゲン、線維芽細胞、マクロファージなどの肝臓の線維化の指標となるマーカーを用いて、肝臓の線維化の程度を評価することもできるし、血小板数計測検査や腹部超音波検査などの肝画像診断を用いて、肝臓の線維化の程度を評価することができる。さらに、近年、エコセンス社（EcoSence、フランス）によって開発されたトランジエンド・エラストグラフィー技術に基づく非侵襲的な測定機器（Fibro Scan502など）を用いて、肝臓の線維化の程度を評価することもできる。本発明では、これらの方法によって得られる肝臓の線維化の程度の評価に基づいて、肝臓の線維化の抑制の程度を決定することができる。
【００２０】
本発明において、肝細胞の損傷は、肝細胞の核酸のメチル化に起因するものであることが好ましい。肝細胞の核酸のメチル化は、メチル化特異的PCR （MSP）法、HELPアッセイ、ChIP （クロマチン免疫沈降）-on-chipアッセイ、制限酵素ランドマークゲノムスキャニング、メチル化DNA免疫沈降などのように、当業者に公知の手法によって検出することができる。
【００２１】
本発明は、肝臓の線維化が観察される対象に経口投与することができる剤である。すなわち、本発明は、肝臓の線維化が観察される対象に投与するために用いられる、肝臓の線維化の抑制剤を提供する。本発明は、α-Laを有効成分として含む、肝臓の線維化の抑制剤であって、その投与の対象において、肝臓の線維化が発生しているか否かを判定する工程を含み、肝臓の線維化が発生していると判定された対象に経口投与するための剤でもある。なお、本発明では、「投与」を「摂取」と言い換えることもできる。
【００２２】
本発明は、α-Laを有効成分とする、肝臓の線維化や肝細胞の損傷に起因する疾患の治療および／または予防剤を提供する。本発明は、肝臓の線維化に起因する疾患が観察される対象に経口投与する剤でもある。すなわち、本発明は、肝臓の線維化に起因する疾患が観察される対象に経口投与するために用いられる、肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防剤を提供する。本発明は、α-Laを有効成分として含む、肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防剤であって、その投与の対象において、肝臓の線維化に起因する疾患が発生しているか否かを判定する工程を含み、肝臓の線維化に起因する疾患が発生していると判定された対象に経口投与するための剤でもある。なお、本発明では、「投与」を「摂取」と言い換えることもできる。
【００２３】
本発明において、肝臓の線維化に起因する疾患は、肝臓の線維化を伴う疾患であれば、特に限定されないが、慢性肝炎（慢性B型肝炎、慢性C型肝炎など）、肝硬変、肝不全、肝細胞癌などの慢性肝疾患、アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患、薬剤性肝障害、自己免疫性肝炎、胆汁うっ滞、胆道閉鎖症、ポルフィリン症、ウィルソン病、およびこれらの疾患の合併症などを挙げることができ、好ましくは、慢性肝炎（慢性B型肝炎、慢性C型肝炎など）、肝硬変、肝不全、肝細胞癌などの慢性肝疾患を挙げることができる。
【００２４】
本発明は、特に、肝硬変の治療および／または予防のために有用である剤である。本発明において、肝硬変とは、肝臓に広範な線維化が生じて、正常な肝小葉構造が失われて異常な構造（偽小葉／再生結節）に改築されている肝臓の状態であれば、特に限定されないが、ウイルス性肝硬変、寄生虫性肝硬変、中毒性肝硬変、栄養障害性肝硬変、アルコール性肝硬変、うっ血性肝硬変、肝硬化症、原発性胆汁性肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、単葉性肝硬変、慢性非化膿性破壊性胆管炎から移行した肝硬変、閉塞性肝硬変、胆細管性肝硬変、胆汁性肝硬変、萎縮性肝硬変、壊死後性肝硬変、肝炎後肝硬変、結節性肝硬変、混合型肝硬変、小結節性肝硬変、代償性肝硬変、非代償性肝硬変、大結節性肝硬変、中隔性肝硬変、特発性肝硬変、門脈周囲性肝硬変、門脈性肝硬変などを挙げることができる。なお、肝硬変は、その病因や偽小葉の特性などによって、多くの種類に分類されている。
【００２５】
本発明において、その投与（摂取）を必要とする対象の年齢、症状、体重により、その投与（摂取）量や投与（摂取）方法を選択することができる。本発明にでは、これらに限定されるものではないが、その有効成分であるα-Laを、１日に体重 1 kg 当たりの投与（摂取）量で、例えば、0.002 mg〜10 g、好ましくは0.01 mg〜8 g、より好ましくは0.2 mg〜7 g、さらに好ましくは10 mg〜6 g、特に好ましくは40 mg〜5 gに設定することができる。ただし、α-Laでは、その安全性が科学的に検証されているため、その投与（摂取）量の上限を必ずしも設定しなくてもよい。したがって、本発明では、これらに限定されるものではないが、その有効成分であるα-Laを１日に体重 1 kg 当たりの投与（摂取）量で、例えば、1 mg 以上、より好ましくは20 mg以上、さらに好ましくは1 g以上、特に好ましくは4 g以上（例えば4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5 g以上）で投与する剤を提供することができる。
【００２６】
本発明は、その投与（摂取）時の衛生面や、その輸送時や保管時の取り扱いやすさの観点から、単位量（１回の摂取量）で包装されている（単位包装形態からなる）剤であることが好ましい。したがって、本発明は、単位包装形態からなる肝臓の線維化の抑制のための剤を提供することができる。本発明において、単位包装形態とは、１投与または１食あたりの単位量毎に包装された形態に設定することなどを挙げることができる。本発明では、これらに限定されるものではないが、その有効成分であるα-Laを１投与または１食あたりの単位量で、例えば、5 g〜500 g（または5 mL〜500 mL）、好ましくは10 g〜300 g（または10 mL〜300 mL）、より好ましくは50 g〜200 g（または50 mL〜200 mL）に設定することができる。また、本発明において、その有効成分であるα-Laを１食あたりの単位量として、日用量に設定することができるし、その日用量を小分けして、日用量の１／２〜１／１０などに設定することができる。
【００２７】
本発明は、医薬品（医薬組成物、栄養医薬組成物、薬剤、経腸栄養剤、医薬品添加物（医薬品添加剤）など）、飲食品（飲食品組成物、栄養組成物、特別用途食品、栄養機能食品、健康食品、食品添加物（食品添加剤）など）、化粧品などのいずれの形態でも用いることができる剤である。また、本発明は、医薬品、飲食品、化粧品などに添加（配合）して用いる、および／または医薬品、飲食品、化粧品などと組み合わせて用いることができる剤である。これにより、医薬品、飲食品、化粧品などに、肝臓の線維化の抑制効果（抑制機能）や、肝臓の線維化に起因する疾患の治療効果（治療機能）および／または予防効果（予防機能）などを付与することができる。
【００２８】
本発明の剤を医薬品として使用する（医薬品の形態とする）場合、種々の形態で投与することができる。その投与形態として、例えば、経腸栄養剤、液剤などの医薬品を経口投与または経腸投与（経鼻チューブ、胃ろう、腸ろうなど）することなどを挙げることができる。このとき、本発明の剤を、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの製剤に加工して投与することもできる。そして、これらの各種の製剤として、常法に従って、主剤に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、溶剤、等張化剤などの医薬品の製剤の技術分野における既知の補助剤を用いて製造したものを挙げることができるが、これらに限定されない。また、これらの各種の製剤では、適当量のカルシウムを含むことができ。さらに、適当量のビタミン、ミネラル、有機酸、糖類、アミノ酸、ペプチド類などを含むことができる。
【００２９】
本発明の剤を医薬品として使用する場合、その投与を必要とする対象（患者など）の年齢、体重、投与目的（症状）などに応じて、その投与量や投与方法を選択することができる。このとき、本発明では、これらに限定されるものではないが、その剤の投与量で、1回に患者当たり、例えば0.05 g〜250 g、好ましくは0.5 g〜200 g、より好ましくは1 g〜150 g、さらに好ましくは1.5 g〜125 g、特に好ましくは2.5 g〜100 g で適宜選定することができる。そして、本発明の剤は、その投与量や投与方法として、これらに限定されるものではないが、1回に体重1kg当たり、例えば0.001 mg〜5,000 mg、好ましくは0.01 mg〜4,000 mg、より好ましくは0.02 mg〜3,000 mg、さらに好ましくは0.03 mg〜2,500 mg、特に好ましくは0.05 mg〜2,000 mgを、例えば1日に1回〜6回、好ましくは1日に1回〜5回、より好ましくは1日に1回〜4回、さらに好ましくは1日に1回〜3回で、例えば1週間以上、好ましくは1週間〜12月間、より好ましくは2週間〜6月間、さらに好ましくは3週間〜4月間、特に好ましくは4週間〜3月間に亘って、投与することができる。さらに、本発明の剤は、その投与を必要とする対象（患者など）に、食前、食事後、食間および／または就寝前などにおいて適宜、一括して投与することもできるし、分割して投与することもできる。また、本発明の剤は、実際に対象へ投与した後の状態や肝臓の線維化の程度などを観察しながら、それぞれの対象の状態に応じて、その有効な投与回数を個別に調整することができる。
【００３０】
本発明の剤を飲食品として使用する（飲食品の形態とする）場合、種々の形態で摂取することができる。その摂取形態として、例えば、乳製品、流動食などの飲食品を経口摂取または経腸摂取（経鼻チューブ、胃ろう、腸ろうなど）することなどを挙げることができる。このとき、本発明の剤を、液状、ペースト状、固形状、粉末状などの飲食品に加工して摂取することができるし、各種の飲食品に配合（添加）して摂取する、および／または各種の飲食品と組み合わせて摂取することもできる。そして、これらの飲食品として、好ましくは、飲料、菓子（デザートなどを含む）、乳製品、流動食（栄養価が高い飲食品などを含む）、乳幼児用調合乳、インスタント食品であり、より好ましくは、水、飲料、菓子、乳製品、流動食、乳幼児用調合乳であり、さらに好ましくは、菓子、乳製品、流動食であり、特に好ましくは、乳製品を挙げることができるが、これらに限定されない。つまり、より具体的には、牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、プリン、ゼリー、アイスクリーム、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、栄養食品、冷凍食品、食品組成物、加工食品、その他の市販食品などを挙げることができる。また、これらの各種の飲食品では、各種の学校、介護施設、福祉施設における給食などとして提供することもできる。
【００３１】
本発明の剤を飲食品として使用する場合、その摂取を必要とする対象の年齢、体重、摂取目的などに応じて、その摂取量や摂取方法を選択することができる。本発明の剤は、その形態として、乳製品、流動食などを挙げられるが、例えば、フルーツジュース型の飲料、ミルクシェイク型の飲料などであってもよいし、その摂取前に水などに溶解・分散できる粉末状の食品などであってもよい。また、本発明の剤は、その有効な摂取量として、1日当たり、例えば0.05g〜1000g、好ましくは0.05g〜500g、より好ましくは0.1g〜500g、さらに好ましくは1g〜300g、特に好ましくは2g〜200gである。そして、本発明の剤は、その摂取を必要とする対象において、食前、食事後、食間および／または就寝前などにおいて、一括して摂取することもできるし、分割して摂取することもできる。また、本発明の剤は、食事の代わりとして用いることもできるし、食事の補助として用いることもできる。
【００３２】
本発明の剤を含有する飲食品には、栄養学的な組成を調節するために、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類などの栄養素を配合（添加）することができる。具体的には、タンパク質として、例えば、全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、全脂濃縮乳、脱脂濃縮乳、部分脱脂濃縮乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α-カゼイン、β-カゼイン、κ-カゼイン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質などや、これらの分解物、各種の乳由来成分などを用いることができる。そして、カゼインホスホペプチド、アルギニン、リジンなどのペプチドやアミノ酸なども用いることもできる。糖質として、例えば、糖類、加工澱粉（デキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテルなど）、食物繊維などを用いることができる。脂質として、例えば、ラード、魚油など、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油などの動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油などの植物性油脂などを用いることができる。ビタミン類として、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などを用いることができる。ミネラル類として、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどを用いることができるし、天然物由来の微量元素、例えばミネラル酵母の銅、亜鉛、セレン、マンガン、クロム、グルコン酸銅、グルコン亜鉛なども用いることができる。有機酸として、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などを用いることができる。これらの成分は、合成品であっても、天然物由来であっても用いることができ、これらを多く含む食品などを原材料として用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできる。
【００３３】
本発明の剤を飲食品として使用する場合、便臭低減効果があるシャンピニオンエキスを、例えば、0.005%〜0.5重量%、栄養強化効果があるカロチノイド製剤（例えば、α-カロチン、β-カロチン、リコピン、ルテインなどを含む）を、例えば、0.00001%〜0.0002重量%で配合（添加）することもできる。また、抗酸化剤として、カテキン、ポリフェノールなどを配合することもできる。さらに、脂質代謝亢進効果などがあるカルニチンを配合することもできる。カルニチンとは、リジンとメチオニンから肝臓や腎臓で作られる生体微量成分であり、年齢と共に、その生成量は低下することが知られている。カルニチンは、筋肉細胞への長鎖脂肪酸の受け渡しなどで、栄養成分の代謝に重要な働きを示している。
【００３４】
食物繊維は、水溶性食物繊維と不溶性食物繊維に分類され、いずれも本発明の剤に用いることができる。水溶性食物繊維として、難消化性オリゴ糖のラクツロース、ラクチトール、ラフィノースを用いることができる。難消化性オリゴ糖の生理機能として、未消化物のままで、大腸に到達し、腸内ビフィズス菌の活性化や増殖に寄与し、腸内環境を改善する効果などがある。ラクツロースは、ガラクトースとフルクトースからなる合成二糖類であり、高アンモニア血症用の基本的な薬剤として用いられる（Bircher, J. et al., Lancet i: 890, 1965）。慢性肝不全による慢性再発型肝性脳症は、ラクツロースの投与、肝不全用の特殊アミノ酸輸液（Fischer液）などに良く反応する。ラクチトール（β-galactosyl-sorbitol）は、第二世代のラクツロースというべきものであり、慢性肝性脳症の臨床効果では、ラクツロースと同程度であり（Lanthier, PL. and Morgan, M., Gut, 26: 415, 1985; Uribe, M., et al., Dig. Dis. Sci., 32: 1345, 1987; Heredia, D. et al., J. Hepatol, 7: 106, 1988; Riggio, O., et al., Dig. Dis. Sci., 34: 823, 1989）、高アンモニア血症の治療用の薬剤として用いられている。
【００３５】
水溶性食物繊維として、脂質代謝の改善効果（コレステロールの低下作用や中性脂肪の低下作用）を有するペクチン（プロトペクチン、ペクチニン酸、ペクチン酸）、グアーガム酵素分解物、タマリンドシードガムなどを用いることができる。グアーガム酵素分解物には、血糖値上昇の抑制効果やインスリン節約効果もみられる（大和谷一彦ら、日本栄養・食糧学会誌, 46: 199, 1993）。さらに、水溶性食物繊維として、高分子水溶性食物繊維では、こんにゃくグルコマンナン、アルギン酸、低分子アルギン酸、サイリウム、アラビアガム、海藻多糖類（セルロース、リグニン様物質、寒天、カラギーナン、アルギン酸、フコダイン、ラミナリン）、微生物ガム（ウエランガム、カードラン、キサンタンガム、ジェランガム、デキストラン、プルラン、ラムザンガム）、その他のガム（種子由来のローカストビーンガム、タマリンドガム、タラガム、樹液由来のカラヤガム、トラガントガム）など、低分子水溶性食物繊維では、ポリデキストロース、難消化性デキストリン、マルチトールなどを用いることができる。
【００３６】
不溶性食物繊維として、セルロース、ヘミセルロース、リグニン、キチン、キトサン、大豆食物繊維、小麦ふすま、パインファイバー、コーンファイバー、ビートファイバーなどを用いることができる。不溶性食物繊維の生理機能として、大腸において不消化物のカサを増やし、通過時間を短縮させることで、排便回数を増やし、便量を増加させる効果がある。
【００３７】
本発明の剤は、飲料、乳製品、流動食、経腸栄養剤、医薬などの分野で、当業者に公知の方法で製造することができる。当業者であれば、本発明の剤もしくはそれらの処理物を、他の成分と混合する調合工程、成形工程、殺菌工程、発酵工程、焼成工程、乾燥工程、冷却工程、造粒工程、包装工程などを選択して組み合わせ、所望の飲食品や医薬品を製造することができる。具体的には、例えば、本発明の剤の使用形態が液状の場合、当該剤（原料液）を予め加熱滅菌してから、必要に応じて、冷却した後に、無菌的に容器へ充填する方法（例えば、超高温（UHT）殺菌法（例えば、130〜145℃、1〜10秒間）や高温（HTST）殺菌法（例えば、100〜130℃、1〜60秒間）と無菌（アセプティック）充填（包装）法を併用した方法）や、当該剤（原料液）を容器へ充填してから、容器と共に加熱滅菌する方法（例えば、レトルト法、オートクレーブ法）などを用いることができる。また、本発明の剤の使用形態が液状の場合、当該剤に基づく均質化物（原料液や殺菌液を均質化したもの）を、必要に応じて、再び加熱殺菌（例えば、超高温（UHT）殺菌法や高温（HTST）殺菌法）してから冷却した後に、無菌的に充填する方法や、缶容器やソフトバックなどへ充填してから、容器と共に加熱殺菌する方法などを用いることができる。このとき、本発明の剤の使用形態が酸性の液状の場合、そのpHを2.0〜6.0、好ましくは3.0〜5.0に設定することができる。また、本発明の剤の使用形態が粉末の場合、当該剤に基づく均質化物を、必要に応じて、例えば、真空蒸発濃縮や凍結濃縮した後に、噴霧乾燥や凍結乾燥して粉末を得る方法などを用いることができる。
【００３８】
本発明の剤を各種の乳製品として使用する場合、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、ヨーグルトの場合、乳酸菌を培養などするスターターの調製工程、α-Laを配合（添加）してから、乳成分などを混合する原料乳の調合工程、スターターを原料乳と混合してから所定の温度で保持する発酵工程、発酵乳を所定の温度まで低下させる冷却工程、必要に応じて、香料や風味物質などを配合するフレーバーリング工程、充填工程などを経るような方法で製造することができる。このとき、スターターとして、例えば、Lactobacillus属の乳酸菌およびStreptococcus属の乳酸菌の混合物を用いることができ、好ましくは、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusおよびStreptococcus thermophilusの混合物を用いることができる。また、チーズの場合、例えば、前記のようなスターターの調製工程、前記のような原料乳の調合工程、前記のような発酵工程、レンネットを配合するチーズカードの生成工程、チーズカードの切断工程、チーズホエイの排出工程、加塩工程、熟成工程などを経るような方法で製造することができる。このとき、スターターとして、例えば、Lactobacillus属の乳酸菌を用いることができ、好ましくは、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricusやLactobacillus helveticusを用いることができる。
【００３９】
本発明は、α-Laを有効成分として飲食品に配合する工程を含む、飲食品に肝臓の線維化の抑制効果（抑制機能）を付与する方法を提供する。また、本発明は、α-Laを有効成分として飲食品に配合する工程を含む、飲食品に肝臓の線維化に起因する疾患の治療効果（治療機能）および／または予防効果（予防機能）を付与する方法を提供する。本発明において、α-Laの飲食品への配合方法は、特に限定されず、当業者に公知の方法によって配合することができる。
【００４０】
本発明は、以下（１）〜（２４）のように表現することもできる。
（１）α-Laを対象に投与する工程を含む、肝臓の線維化の抑制方法。
（２）肝臓の線維化の抑制剤の製造における、α-Laの使用。
（３）肝臓の線維化の抑制に使用するための、α-La。
（４）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、肝臓の線維化の抑制剤の製造方法。
（５）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加のためのおよび、肝臓の線維化の抑制のための剤。
（６）α-Laを対象に投与する工程を含む、肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防方法。
（７）肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防剤の製造における、α-Laの使用。
（８）肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防に用いるための、α-La。
（９）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防剤の製造方法。
（１０）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加のためのおよび、肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防のための剤。
（１１）α-Laを対象に投与する工程を含む、肝細胞の損傷の抑制方法。
（１２）肝細胞の損傷の抑制剤の製造における、α-Laの使用。
（１３）肝細胞の損傷の抑制に使用するための、α-La。
（１４）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、肝細胞の損傷の抑制剤の製造方法。
（１５）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加のためのおよび、肝細胞の損傷の抑制のための剤。
【００４１】
（１６）肝臓の線維化の抑制用の組成物の製造における、α-Laの使用。
（１７）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、肝臓の線維化の抑制用の組成物の製造方法。
（１８）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加用および、肝臓の線維化の抑制用の組成物。
（１９）肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防用の組成物の製造における、α-Laの使用。
（２０）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防用の組成物の製造方法。
（２１）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加用および、肝細胞の線維化に起因する疾患の治療および／または予防用の組成物。
（２２）肝細胞の損傷の抑制用の組成物の製造における、α-Laの使用。
（２３）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、肝細胞の損傷の抑制用の組成物の製造方法。
（２４）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加用および、肝細胞の損傷の抑制用の組成物。
【００４２】
なお、本発明者らは、α-LAによる肝臓の線維化の抑制や肝臓の線維化に起因する疾患の治療および／または予防において、一酸化窒素の産生が必要であることを明らかにした。つまり、α-LAには、合成が阻害された一酸化窒素の合成改善効果もしくは合成回復効果、または、一酸化窒素の合成促進効果を有する可能性がある。したがって、本発明は、以下の発明をも提供する。
（１０１）α-Laを有効成分として含む、合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための剤。
（１０２）α-Laを有効量で含む単位包装形態からなる、１０１に記載の剤。
（１０３）α-Laの有効量が、少なくとも４．６７ｇ／ｋｇ／日である、１０２に記載の剤。
（１０４）α-Laを有効成分として飲食品に配合する工程を含む、飲食品に阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させる効果、または一酸化窒素の合成を促進する効果を付与する方法。
（１０５）α-Laを対象に投与する工程を含む、合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための方法。
（１０６）合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための剤の製造における、α-Laの使用。
（１０７）合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるために、または一酸化窒素の合成を促進するために使用するための、α-La。
（１０８）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための剤の製造方法。
（１０９）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加のためのおよび、合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための剤。
（１１０）合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための組成物の製造における、α-Laの使用。
（１１１）α-Laと薬学的に許容される担体を配合する工程を含む、合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための組成物の製造方法。
（１１２）α-Laを含む、医薬組成物または飲食品への添加用および、合成が阻害された一酸化窒素の合成を改善もしくは回復させるための、または一酸化窒素の合成を促進するための組成物。
【００４３】
なお、本明細書において引用された全部の先行文献は、参照として、本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００４４】
１．実施例１
動物実験
［実験方法］
7週齢のSD系雌性ラット（日本SLC社）を実験に用いた。このとき、ラットの平均体重が等しくなるように、正常群、DMN-対照群、DMN-αLA群の3群（各群： n=9）に群分けした。ラットの入荷後から、昼夜12時間のサイクルの設定下で、正常群と DMN-対照群には、AIN-93M飼料を給与し、DMN-αLA群には、AIN-93M飼料のタンパク質の50重量%を α-ラクトアルブミン（α-La）で置換した飼料（飼料の全量の α-La：7重量%）を給与した。なお、今回の動物実験では、ラットの1日当たりの飼料の摂取量は平均で20 gであった。したがって、ラットの1日当たりのα-Laの摂取量は約1.4 gであった。用いたラットの平均体重は約300 gであったので、ラットの1日当たりのα-Laの摂取量は、約4.67 g／kg体重となった。
【００４５】
ラットの入荷の1週間後から、正常群には、生理食塩水を1 mL/kgで経口投与し、DMN-対照群とDMN-αLA群には、ジメチルニトロソアミン（DMN）の生理食塩水溶解液（1重量%）を1 mL/kgで経口投与した。このとき、DMN-対照群と DMN-αLA群では、DMNの生理食塩水を連続して3日間／週の頻度で、3週間に亘って経口投与することで、肝硬変モデルラットを作製した。なお、DMNには、肝細胞中の核酸などの生体高分子に対して、メチル化を引き起こして細胞を損傷させる作用がある。そして、DMNを実験動物に短期間で経口投与すると、肝硬変モデル動物を作製できることが知られている。
【００４６】
そして、各週の最終投与日の3日後に、ラットの尾静脈より75 μLを採血し、DMNの最終投与日の12日後に剖検した。さらに、実験期間の終了時に、イソフルラン麻酔下で、腹部の大動脈より全採血し、失血死させた後に解剖して、各臓器（肝臓、腎臓、脾臓）の重量を測定した。また、肝臓の組織の染色用に、肝臓の組織をホルマリン（10 %）固定して保存した。このとき、血液を遠心分離（3000 rpm、10分間）し、血清を採取した。なお、飲水には、試験期間を通じて、UV殺菌水を自由摂取させた。
【００４７】
血清や臓器のパラメーターの測定
血清中のALT（アラニン・アミノ・トランスフェラーゼ）、AST（アスパラギン酸・アミノ・トランスフェラーゼ）、ALP（アルカリ・ホスファターゼ）、ビリルビンは、富士ドライケムNX500（富士フィルム社）で測定し、ヒアルロン酸は、ELISAキット（Biotech Trading Partners）で測定し、MMP（マトリックス・メタロ・プロテイナーゼ）-2は、蛍光法キット（Biotech Trading Partners）で測定した。
【００４８】
肝臓の組織の染色
ヘマトキシリンエオジン染色とマッソントリクローム染色を実施した。
【００４９】
統計解析
各臓器の重量、ALT、AST、ALP、ビリルビン、ヒアルロン酸、MMP-2の測定値では、統計解析ソフトウェア「Stat Light」（ユックムス社）を用いて、Bartlett検定により、等分散性を確認した。ここで、等分散性が認められた場合には、Dunnet検定を実施した。等分散性が認められなかった場合には、Steel検定を実施した。そして、肝臓の組織像をグレード分けしたデータでは、累積χ二乗検定（尤度比検定）を実施した。
【００５０】
［実験結果］
DMNの投与後におけるALTとASTの推移
DMNの投与から6、13、20日後の、ASTとALTの推移を図１に示した。正常群、DMN-対照群、DMN-αLA群の何れでも、ALTとASTが経時的に上昇した。DMN-αLA群では、DMN-対照群と比較して、ALTとASTが抑制され、DMNの投与から13日後において、この現象は特に顕著であった。よって、α-Laの給与により、ALTとASTを抑制できることが明らかとなった。
【００５１】
肝硬変が進行すると、肝細胞が損傷を受けることによって、ALP、ASTが上昇することが知られている。したがって、α-Laの給与により、肝細胞の損傷により生じる肝硬変の進行を抑制できることが明らかとなった。
【００５２】
剖検時における臓器の重量
剖検時における臓器の重量を表１に示した。DMN-対照群、DMN-αLA群では、正常群と比較して、体重、肝臓重量、相対肝臓重量が減少し、脾臓重量、相対脾臓重量、相対腎臓重量が増加した。DMN-αLA群では、DMN-対照群と比較して、相対肝臓重量の減少が抑制されると共に、脾臓重量、相対脾臓重量の増加が抑制された。
【００５３】
肝硬変では、肝細胞が損傷を受けて死滅し、肝組織の全体が縮小するため、体重や肝臓の重量が減少する。また、肝臓内の血流が悪化し、門脈圧が増大し、その結果、脾臓への血流量が増加し、脾臓が肥大することが知られている。したがって、DMNの投与による肝硬変モデルが妥当であることと、α-Laの給与により、肝硬変を抑制できることが明らかとなった。
【００５４】
【表１】
2016204356.tif 000002
【００５５】
肝臓の組織の所見
線維化を指標にして、肝硬変の組織の所見をグレード分けした結果を表２に示した。また、代表的な各群の組織像を図２に示した。DMNの作用により、線維化が増悪していたが、α-Laの給与により、線維化の増悪を有意に抑制できることが明らかとなった。
【００５６】
【表２】
2016204356.tif 000003
【００５７】
剖検時における血清のALT、AST、ALP、総ビリルビン、ヒアルロン酸、MMP-2
剖検時における 血清のALT、AST、ALP、総ビリルビン、ヒアルロン酸、MMP-2の濃度を測定して、その結果を図３〜図８に示した。DMNの作用により、ALT、AST、総ビリルビン、ヒアルロン酸、MMP-2が上昇したが、α-Laの給与により、総ビリルビン、MMP-2の上昇を抑制できることが明らかとなった。
【００５８】
肝硬変が進行すると、肝細胞が損傷を受けることによって、ALP、AST、ALP、総ビリルビンが上昇することが知られている。また、肝臓の線維化が進行すると、ヒアルロン酸、MMP-2が上昇することが知られている。したがって、α-Laの給与により、肝細胞の損傷により生じる肝硬変の進行を抑制できることと、肝臓の線維化の進行を抑制できることが明らかとなった。
【００５９】
２．実施例２
目的
実施例１では、ジメチルニトロソアミン（DMN）肝硬変モデルラットにおいて、α-LAが肝硬変の抑制効果を示すことが明らかとなった。α-LAには、シクロオキシゲナーゼ-2阻害を介した抗炎症作用、一酸化窒素（NO）産生（合成）を介した抗炎症作用、抗酸化作用が有ることが知られている。実施例２では、NO産生に着目して、肝硬変の抑制効果の作用機構について検討した。具体的には、α-LAと共に、NO合成阻害剤のN-ニトロ-L-アルギニン メチルエステル（L-NAME）を投与して、α-LAの肝硬変の抑制効果の阻害作用について検討した。
【００６０】
方法
6週齢のSD系雄性ラット（日本SLC社）を実験に用いた。RA-2飼料を自由摂取させて、1週間で馴化した。このとき、ラットの平均体重が等しくなるように、正常（Normal）群、DMN-対照群、DMN-αLA群、DMN-LA-LN群、DMN-LN群（5群、正常群：n = 6、正常群以外の4群：n = 9）に群分けした。ラットの入荷後から、昼夜12時間のサイクルの設定下で、正常群、DMN-対照群、DMN-LN群には、AIN-93M飼料を給与し、DMN-αLA群、DMN-LA-LN群には、AIN-93M飼料のタンパク質の50重量%をα-Laで置換した飼料（飼料の全量のα-La：7重量%）を給与した。
ラットを馴化した（1週間）後から3日間に亘り、正常群には、生理食塩水を1 mL/kgで経口投与し、 正常群以外の4群には、生理食塩水のDMN溶解液（1重量%）を1 mL/kgで経口投与した（最初の投与）。そして、ラットを馴化した（1週間）後の1週間（2週間）後から3日間に亘り、同様に経口投与した（2回目の投与）。
また、試験期間を通じて、正常群、DMN-対照群、DMN-αLA群には、UV殺菌水を自由摂取させて、DMN-LA-LN群、DMN-LN群には、L-NAMEの水溶液（0.2 mg/mL）を自由摂取させた。
そして、最初の投与日の3日後と、2回目の投与日の3日後（最初の投与日の10日後）に、ラットの尾静脈より75 μLを採血し、実施例１と同じ方法で、ALTとASTを測定した。
【００６１】
結果
図９にALTの濃度を、図１０にASTの濃度を示した。
灰色の正常（Normal）群に比べて、白色のDMN-対照群では、ALTとASTが増加（上昇）していることから、DMNを投与すると、肝機能が悪化することを確認できた。
これに対し、白色のDMN-対照群に比べて、黒色のDMN-αLA群では、ALTとASTが減少（下降）していることから、DMNを投与しても、α-Laを投与すると、肝機能が改善されることを確認できた。
一方、灰色の正常群に比べて、太い網掛で示したDMN-LN群では、ALTとASTが増加（上昇）していることから、DMNとともに、L-NAMEを投与すると、肝機能が悪化することを確認できた。
これに対し、太い網掛で示したDMN-LN群に比べて、細い網掛で示したDMN-LA-LN群では、ALTとASTが減少（下降）しなかったことから、DMNと共に、L-NAMEを投与すると、α-Laを投与しても、肝機能が改善されないことを確認できた。
【００６２】
以上より、α-LAを投与すると、DMNに起因する肝機能の悪化を改善したが、NO合成阻害剤として知られているL-NAMEを投与すると、α-Laを投与しても、DMNに起因する肝機能の悪化を改善しなかった。つまり、α-LAの肝機能の改善効果には、NO合成が関与している可能性が示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明に基づいて提供されたα-Laを含む剤を摂取することにより、肝臓の線維化や肝細胞の損傷を抑制することができる。また、本発明に基づいて提供されたα-Laを含む剤を摂取することにより、肝臓の線維化に起因する疾患を治療および／または予防することができる。本発明に基づいて提供されたα-Laを含む剤は、長い食経験から安全性や味覚性に優れていることを実証された成分で構成されており、身体的な負担が小さく、長期間にわたり、それを摂取することができる。
【図１】
2016204356.tif 000004
【図３】
2016204356.tif 000005
【図４】
2016204356.tif 000006
【図５】
2016204356.tif 000007
【図６】
2016204356.tif 000008
【図７】
2016204356.tif 000009
【図８】
2016204356.tif 000010
【図９】
2016204356.tif 000011
【図１０】
2016204356.tif 000012
【図２】
2016204356.tif 000013
【配列表】
2016204356000001.app