(57)【要約】【課題】環境水などの試料中に含まれるリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを、鋭敏かつ迅速に検出する方法を提供すること。【解決手段】ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列と、該プロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列とを有する発現カセットが導入されたマクロファージ系細胞を、試料存在下で培養することを含む方法を用いると、前記試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを簡便かつ高感度に検出することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列と、該プロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列とを有する発現カセットが導入されたマクロファージ系細胞を、試料存在下で培養することを含む、前記試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを検出する方法。
【請求項２】
マクロファージ系細胞が、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列と、該プロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列とを有する発現カセットがさらに導入された細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が橙色発光ルシフェラーゼ遺伝子であり、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、河川水や湖沼水などの環境水の汚染度を調査する際などに有用な、特定の物質を簡便に検出する方法に関する。より具体的には、特定の細胞株を用いることにより、試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
河川水や湖沼水などの環境水は、近年、様々な化学物質や病原性微生物などにより汚染されてきている。その汚染によって人体への影響も懸念されることから、人々の関心は非常に高く、汚染度に関する情報が求められている。
【０００３】
環境水の汚染度を測定する方法としては、化学物質による汚染についてはＧＣやＬＣなどの機器分析による方法が、一方微生物による汚染については、培養による生菌種、数を評価する方法が一般的に行われている。近年、それらに加えて、生体反応を利用する方法が提案され、その一部は実用化されている。
【０００４】
リムルステスト（ＬＡＬ法）は、カブトガニの血液を用いたエンドトキシンの特異的な検出方法であり、すでに日本薬局方の一般試験方法としても認定された方法である。この方法は、環境水のエンドトキシン検査にも用いられており、使用する試薬が市販されていて手軽に試験できる点は優れているが、検出可能な毒性物質がエンドトキシンに限定されているため、環境水の汚染度を総合的に評価する上ではまだ課題が残されている。
【０００５】
近年、遺伝子操作によって育種した微生物を用いることで、毒性物質の検出を行う方法が提案されている。例えば、特定の酵母遺伝子のプロモーターにマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを作動可能に連結したポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質転換し、この細胞を被検試料と接触させて、マーカータンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を検出することで、被検試料中の様々な毒性化合物を検出する方法が開示されている（特許文献１参照）。
【０００６】
また本発明者らは、化学物質の免疫毒性発現機序の分子レベルの知見に基づいて、免疫毒性を示す化学物質を検出できる哺乳類細胞株を樹立したことを報告している（特許文献２参照）が、樹立した複数種の細胞株により、いくつかの免疫毒性物質の検出が可能であるという事実の指摘に留まっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ０３／０１８７９２号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２／００２５０７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、環境水などの試料中に含まれるリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを、鋭敏かつ迅速に検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、前記特許文献２で示したように、種々の免疫毒性物質の評価に有用な哺乳類細胞株を複数種樹立してきた。これらの細胞株の利用について鋭意検討したところ、そのうち、ＩＬ−８遺伝子を評価用遺伝子として導入した細胞株を用いることで、試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを検出できることを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（４）に関する。
（１）ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列と、該プロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列とを有する発現カセットが導入されたマクロファージ系細胞を、試料存在下で培養することを含む、前記試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを検出する方法。
（２）マクロファージ系細胞が、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列と、該プロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列とを有する発現カセットがさらに導入された細胞であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が橙色発光ルシフェラーゼ遺伝子であり、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されたレポーター遺伝子が赤色発光ルシフェラーゼ遺伝子であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によると、試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドが、簡便かつ高感度に検出できる。これにより、環境水の汚染度をさらに包括的に、鋭敏かつ迅速に評価することが可能となり、環境水の総合的な評価において有用な手段となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】レポーターアッセイ法の原理を示した図である。
【図２】ＴＨＰ−Ｇ８株の作製方法を示した図である。
【図３】ＴＨＰ−Ｇ８細胞を各種ＴＬＲ刺激物質（リガンド）で刺激した際のＩＬ−８プロモーターの誘導率（ルシフェラーゼ活性）を示した図である。
【図４】ＴＨＰ−Ｇ８細胞に対しＬＰＳの投与濃度を変えて刺激した際のＩＬ−８プロモーターの誘導率（ルシフェラーゼ活性）を示した図である。図の横軸の「１ｆｇ／ｍＬ」、「１０ｆｇ／ｍＬ」、「１００ｆｇ／ｍＬ」、「１ｐｇ／ｍＬ」、「１０ｐｇ／ｍＬ」、「１００ｐｇ／ｍＬ」、「１ｎｇ／ｍＬ」、「１０ｎｇ／ｍＬ」、及び「１００ｎｇ／ｍＬ」は、それぞれ培養液中の大腸菌０２６：Ｂ６（病原性大腸菌）由来のＬＰＳの濃度を示す。なお、図中の「cont」は、大腸菌０２６：Ｂ６（病原性大腸菌）由来のＬＰＳ非存在下で培養したときの結果を示す。各濃度における左側の棒グラフはＳＬＲ発光値（Ｇ３ＰＤＨプロモーター活性値）を示し、右側の棒グラフはＳＬＯ発光値（ＩＬ−８プロモーター活性値）を示し、折れ線グラフの頂点は、ＳＬＯ／ＳＬＲ値（ＩＬ−８プロモーターの誘導率）を示す。
【図５】環境水６サンプル（大倉ダム、岩沼海岸、一般家庭風呂水、広瀬川中流、名取川下流、及び貞山堀；図５の横軸参照）の汚染度をＴＨＰ−Ｇ８細胞を用いて測定した結果を示した図である。なお、図中の「ｄｄｗ」は滅菌水を用いて測定した場合の結果を示す。各サンプルにおける左側及び右側の棒グラフは、それぞれ１μＬ及び１０μＬのサンプルを用いた場合の結果を示す。
【図６】環境水１２サンプル（大倉ダム、岩沼海岸、一般家庭風呂水、広瀬川中流、名取川下流、貞山堀、Ｌａ ２、Ｐａ ３、Ｐａ ４、Ｐａｓｉｇ Ｓｔ２、Ｐａｓｉｇ Ｓｔ４、及びＰａｓｉｇ Ｓｔ６）の汚染度を、ＩＬ−８レポーターアッセイ系とＬＡＬ法とを用いて測定し、得られた結果を示した図である。グラフ縦軸はＩＬ−８レポーターアッセイ系により測定されたＩＬ−８誘導率（ルシフェラーゼ活性）、グラフ横軸はＬＡＬ法により測定されたエンドトキシン活性単位（ＥＵ／ｍＬ）である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の検出方法としては、ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列と、該プロモーター配列の下流に作動可能に連結された第１のレポーター遺伝子配列とを有する発現カセット１が導入されたマクロファージ系細胞（以下、「本件マクロファージ系細胞」ということがある）を、被検用試料存在下で培養することを含む、被検用試料中の特定のＴＬＲ（Toll like receptor）刺激物質、すなわち、リステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを検出する方法であれば特に制限されず、ここで「マクロファージ系細胞」とは、生体内に侵入した細胞や病原体等を貪食、認識することにより活性化され、炎症反応を惹起する動物由来の細胞を意味する。上記マクロファージ系細胞には、脳ミクログリア、肺胞マクロファージ、腹腔マクロファージ、脾臓マクロファージ、肝クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、リンパ組織の洞組織球、単核球細胞、血中マクロファージなどが含まれ、具体的には、ＲＡＷ２６４．７細胞（マウス腹水由来のマクロファージ細胞株）、Ｊ７７４．１細胞（ＢＡＬＢ／ｃマウスの細網肉腫の腹水由来の単球／マクロファージ細胞株）、Ｕ９３７細胞（ヒト組織球性リンパ腫患者由来の単球系細胞株）及びＴＨＰ−１細胞（ヒト急性単球性白血病患者由来の単球系細胞株）を挙げることができる。
【００１４】
上記動物由来の細胞としては、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ等の哺乳類、ニワトリ、ウズラ等の鳥類、サケ、コイ等魚類などの脊椎動物や無脊椎動物由来の細胞を挙げることができ、これらの中でもヒト由来の細胞を好適に例示することができる。
【００１５】
上記ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列としては、ＩＬ−８タンパク質をコードする遺伝子由来のプロモーター配列であり、かつＩＬ−８プロモーター活性、すなわち、ＩＬ−１やＴＮＦ等の炎症性サイトカイン存在下でＩＬ−８プロモーター下流の遺伝子のｍＲＮＡの発現を誘導（増強）する活性を有するものであればよく、例えば、配列番号４で示されるヌクレオチド配列（ヒト由来のＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列）からなるポリヌクレオチド、配列番号４で示されるヌクレオチド配列において、１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなり、かつＩＬ−８プロモーター活性を有するポリヌクレオチド、及び配列番号４で示されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつＩＬ−８プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００１６】
本発明において、「少なくとも８０％以上の同一性」とは、同一性が８０％以上であることを意味し、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を意味する。
【００１７】
本発明において、「１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列」とは、例えば１〜３０個の範囲内、好ましくは１〜２０個の範囲内、より好ましくは１〜１５個の範囲内、さらに好ましくは１〜１０個の範囲内、より好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、より好ましくは１〜２個の範囲内の数のヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列を意味する。１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換及び／又は付加されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（変異ポリヌクレオチド）は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により作製することができる。
【００１８】
本件マクロファージ系細胞としては、データ標準化のための内部標準遺伝子として用いるためのハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列と、かかるプロモーター配列の下流に作動可能に連結された第２のレポーター遺伝子とを有する発現カセット２が導入された細胞が好ましい。かかるハウスキーピング遺伝子としては、Ｇ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）遺伝子、βアクチン遺伝子、ＨＰＲＴ １（hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1）などを挙げることができる。
【００１９】
上記「発現カセット１」としては、第１のレポーター遺伝子配列がＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されているものであれば特に制限されず、ここで「第１のレポーター遺伝子配列がＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されている」とは、ＩＬ−８遺伝子のプロモーター配列が第１のレポーター遺伝子配列の転写を開始することができるように、当該プロモーター配列と当該レポーター遺伝子配列が機能的に結合されていることを意味する。
【００２０】
また、上記「発現カセット２」としては、第２のレポーター遺伝子配列がハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されているものであれば特に制限されず、ここで「第２のレポーター遺伝子配列がハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列の下流に作動可能に連結されている」とは、ハウスキーピング遺伝子のプロモーター配列が第２のレポーター遺伝子配列の転写を開始することができるように、当該プロモーター配列と当該レポーター遺伝子配列が機能的に結合されていることを意味する。
【００２１】
上記「発現カセット１」や「発現カセット２」には、導入するマクロファージ系細胞の種類に応じてターミネータ配列（βグロビンターミネーター配列、ＳＶ４０ターミネータ配列、ＢＧＨターミネータ配列等）、ポリＡ付加シグナル、エンハンサー配列、翻訳増強配列、リンカー配列などをさらに含んでもよい。
【００２２】
上記第１のレポーター遺伝子や第２のレポーター遺伝子としては、発色、発光、又は蛍光を指標として可視化できるタンパク質をコードする遺伝子であればよく、具体的には、ペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ［horseradish peroxidase］）遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子、緑色ルシフェラーゼ（ＳＬＧ）遺伝子、橙色ルシフェラーゼ（ＳＬＯ）遺伝子、赤色ルシフェラーゼ（ＳＬＲ）遺伝子等のルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）遺伝子、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子、を挙げることができ、これらの中でも検出感度が高く、また定量性にも優れていることから、ルシフェラーゼ遺伝子が好ましい。本件マクロファージ系細胞が、発現カセット２がさらに導入された細胞である場合、上記第２のレポーター遺伝子は、通常、第１のレポーター遺伝子と異なる種類のレポーター遺伝子を選択する。例えば、第１のレポーター遺伝子がＳＬＯ遺伝子である場合、第２のレポーター遺伝子は、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子やＧＦＰ遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子を選択してもよいが、検出の効率性を考慮すると、ＳＬＯ遺伝子と同じルシフェラーゼ遺伝子であり、かつＳＬＯと異なる色を発光するＳＬＧ遺伝子やＳＬＲ遺伝子等を選択することが好ましい。
【００２３】
上記発現カセット１や発現カセット２の形態としては、上記発現カセット１や発現カセット２を含むポリヌクレオチド断片であってもよいが、簡便性の面から、プラスミド、コスミド、ＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）等のベクターに挿入されたものが好ましい。また、これらのベクターには、発現カセット１や発現カセット２が導入されたマクロファージ系細胞のスクリーニングのために、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を含んでもよい。
【００２４】
本件マクロファージ系細胞は、上記発現カセット１や発現カセット２を、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）デキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法等の方法を用いてマクロファージ系細胞へ導入することにより得ることができる。
【００２５】
上記被検用試料としては、性質、由来、採取された場所等は特に制限されず、環境水、すなわち、公共用水域（河川、湖、沼、海等）や、住宅・会社の排水・農業用の溜池等の水などであってもよい。
【００２６】
本発明において、「ＴＬＲ」とは、ある種の病原体を感知することで自然免疫を作動させる機能を持つ、動物の細胞表面にある受容タンパク質である。そのリガンドとしては、大腸菌由来リポタンパク質、リステリア属細菌、ウイルスＲＮＡを模倣する合成二本鎖ＲＮＡアナログ、大腸菌由来リポポリサッカライド、ネズミチフス菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、大腸菌由来リポポリサッカライドなど、これまで多くの物質が知られている。
【００２７】
本発明の検出方法は、被検用試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを特異的に検出することができる。
【００２８】
上記リステリア菌としては、リステリア・イノキュア（L. innocua）、リステリア・シリゲリ（L. seeligeri）、リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）、リステリア・ウェルシュメリ（L. welshimeri ）、リステリア・イバノビ（L. ivanovii）、リステリア・グレイー（L. grayi）などを挙げることができ、リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）が好ましい。
【００２９】
また、上記サルモネラ属細菌としては、ネズミチフス菌（S. Typhimurium）、サルモネラ・エンテリティディス（S. Enteritidis）、チフス菌（S. Typhi）、パラチフス菌（S. Paratyphi A）などを挙げることができ、ネズミチフス菌（S. Typhimurium）が好ましい。
【００３０】
また、上記マイコプラズマ属細菌としては、マイコプラズマ・ガリセプティクム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasa genitalium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（M. hyopneumoniae）、マイコプラズマ・ミコイデス（M. mycoides）、マイコプラズマ・ニューモニエ（M. pneumoniae）などを挙げることができる。
【００３１】
また、上記病原性細菌由来のリポポリサッカロイドとしては、Ｏ１、Ｏ２６、Ｏ１１１、Ｏ１２１、Ｏ１２８、Ｏ１５７等の病原性大腸菌、サルモネラ菌、シュードモナス属細菌、腸内細菌科細菌などグラム陰性菌由来のリポポリサッカロイドを挙げることができ、これらの中でも病原性大腸菌由来のリポポリサッカロイドが好ましい。
【００３２】
本発明の検出方法において、本件マクロファージ系細胞を被検用試料存在下で培養する方法としては、被検用試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドが、ＩＬ−８遺伝子のプロモーターに作用し、第１のレポーター遺伝子のｍＲＮＡの発現が誘導され、かかるｍＲＮＡがコードするタンパク質（第１のレポータータンパク質）が発現するのに十分な時間、本件マクロファージ系細胞の培養に適した条件下で培養すればよく、時間、温度、培養液の種類等の培養条件は、本件マクロファージ系細胞や被検用試料の特性を考慮して適宜選択することができる。培養時間は、通常５分〜４８時間の範囲内、好ましくは３０分〜２４時間の範囲内、より好ましくは１〜１２時間の範囲内、さらに好ましくは３〜９時間の範囲内、特に好ましくは４分〜７時間の範囲内である。また、培養温度は、通常２０〜３８℃の範囲内であり、好ましくは３５〜３７℃の範囲内である。培養液としては、通常０．１〜３０（ｖ／ｖ）％の範囲内で血清（ＦＢＳ、ＣＳ等）を含有する動物細胞培養用基礎培養液（ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｆ−１０、Ｍ−１９９等）を用いる。
【００３３】
本発明の検出方法において、被検用試料中のリステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを検出する方法としては、レポーター遺伝子の種類に応じて任意の方法で検出すればよく、例えば、レポーター遺伝子がアルカリホスファターゼ遺伝子である場合、アルカリホスファターゼの基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｐ−ＮＰＰ）を添加し、反応させた後、波長４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）を測定することにより検出する方法を挙げることができ、また、レポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である場合、ルシフェラーゼの基質であるＤ−ルシフェリンを添加し、反応させた後、発光波長に応じた吸光度を測定することにより検出する方法を挙げることができ、また、レポーター遺伝子がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ遺伝子である場合、β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質であるＯＮＰＧ（o-nitrophenol-β-D-galactopyranoside）や、ＣＰＲＧ（chlorophenol redβ-D-galactopyranoside)や、Ｘ−Ｇａｌ（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside）を添加し、反応させた後、波長４０５ｎｍの吸光度（ＯＤ４０５）（ＯＮＰＧ）や、波長５７５ｎｍの吸光度（ＯＤ５７５）（ＣＰＲＧ）や、青色色素（Ｘ−Ｇａｌ）を測定することにより検出する方法を挙げることができる。
【００３４】
本発明の検出方法において、第１のレポータータンパク質が検出された場合、被検用試料は、リステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドで汚染されている可能性が高いと判定することができ、第１のレポータータンパク質が検出されなかった場合、被検用試料は、リステリア属細菌、サルモネラ属細菌由来フラジェリン、マイコプラズマ属細菌由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドで汚染されている可能性が低いと判定することができる。
【００３５】
本発明の検出方法では、これまで検出できなかった、試料中の、リステリア菌、ネズミチフス菌由来フラジェリン、マイコプラズマ由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドを検出できる点が優れている。これにより、環境水の汚染度をさらに包括的に、鋭敏かつ迅速に評価することが可能となり、環境水の総合的な評価において有用な手段となりうる。
【００３６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
１．ＴＨＰ−Ｇ８細胞の樹立
ＩＬ８レポーター細胞株（ＴＨＰ−Ｇ８細胞株）（図２参照）は、ＷＯ２０１２／００２５０７号公報に記載の方法にしたがって、ヒト単球性細胞株ＴＨＰ−１（American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA）に、ＩＬ−８プロモーターの下流に橙色発光ルシフェラーゼ（ＳＬＯ）が挿入されたプラスミドベクター（pIL8-SLO/Neo）と、内部標準としてＧ３ＰＤＨ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターの下流に赤色発光ルシフェラーゼ（ＳＬＲ）が挿入されたプラスミドベクター(pG3PDH-SLR/Pur)を導入し、スクリーニングすることにより樹立した。以下のその手順を示す。
【００３８】
１−１  プラスミドベクターの構築
まず、発光ルシフェラーゼ発現スタンダードタイプベクターpSLR-test及びpSLO-test（東洋紡績社製）のルシフェラーゼ遺伝子、及びそれにつながるｐｏｌｙＡ付加シグナルの下流に、ピューロマイシン若しくはネオマイシンに対する薬剤耐性遺伝子コーディング配列を、マクロファージ系細胞において安定発現可能なようにＳＶ４０プロモーター配列及びＨＳＶｔｋ ｐｏｌｙＡ付加配列とともにそれぞれ挿入し、安定導入用ベクターpSLR-test/Pur及びpSLO-test(Neo)を構築した。
pG3PDH-SLR/Purを作製するために、まず、転写開始点データベースＤＢＴＳＳ（Nucleic Acids Res. 30, 328-331 (2002)）(http://dbtss.hgc.jp/)よりＧ３ＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの５’末端（Reference Sequence No. NM_002046）を転写開始点として想定し、当該複製開始点の上流１，３７３ｂから下流１２８ｂのヌクレオチド配列（配列番号１で示されるヌクレオチド配列）からなるＧ３ＰＤＨプロモーター領域を含むヒトゲノムＤＮＡを抽出した。当該Ｇ３ＰＤＨプロモーター領域をクローニングするために、オリゴヌクレオチドプライマーセット（配列番号２及び３で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を設計し、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによって核酸断片を増幅し、制限酵素Mlu I、及びEcor Iで当該断片とpSLR-test/Purを消化した後、ライゲーション反応を行い、pG3PDH-SLR/Purを構築した。
また、pIL8-SLO/Neoの作製は、転写開始点データベースＤＢＴＳＳより、ＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの５’末端（Reference Sequence No. NM_000584）を転写開始点として想定し、当該複製開始点の上流５０５９ｂから下流１４４ｂのヌクレオチド配列（配列番号４で示されるヌクレオチド配列）からなるＩＬ８プロモーター領域を、ヒトゲノムＤＮＡとオリゴヌクレオチドプライマーセット（配列番号５及び６で示されるヌクレオチド配列からなるＤＮＡ）を用いたＰＣＲで増幅し、かかるＰＣＲ増幅産物と発光プローブベクターpSLO-test(Neo)を制限酵素Sal I、及びMlu Iで消化した後、ライゲーション反応を行うことにより構築した。
【００３９】
１−２  プラスミドベクターの細胞への導入
１×１０６個のＴＨＰ−１細胞に対し、まずはpG3PDH-SLR/Pur １μｇを、nucleofector（Lonsa社製）を用いて導入した。ピューロマイシン存在下で１週間培養（一次選択）した後、ＳＬＲの発光値が高い細胞株を選択し、１色安定株ＴＧＣ１７細胞株を樹立した。次にかかるＴＧＣ１７細胞を親株として、pIL8-SLO/Neo １μｇを、nucleofector（Lonza社製）を用いて導入した。ピューロマイシン及びネオマイシン存在下で１週間培養（二次選択）した後、ＳＬＲの発光値とＳＬＯの発光値のバランスが良好な細胞を選択し、２色安定株ＴＨＰ−Ｇ８細胞株を樹立した。
以下実施例２〜５では、かかるＴＨＰ−Ｇ８細胞を用いたＩＬ−８レポーターアッセイ系により解析を行った。
【実施例２】
【００４０】
［Toll like receptorリガンドに対する反応性］
試験前々日又は前日に継代し、培養液を交換したＴＨＰ−Ｇ８細胞を、９６ウェル黒プレート（greiner社製）に５×１０４cells／wellで播種した。１時間培養した後、１１種類のToll-like receptor（ＴＬＲ）リガンド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４［大腸菌由来リポタンパク；ＴＬＲ１／２］、ＨＫＬＭ［リステリア菌〔L. monocytogenes〕；ＴＬＲ２］、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ［ウイルスＲＮＡを模倣する合成二本鎖ＲＮＡアナログ；ＴＬＲ３］、低分子Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ［ＴＬＲ３］、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＬＰＳ［非病原性大腸菌由来リポポリサッカライド；ＴＬＲ４］、S.typhimurium Flagellin［ネズミチフス菌由来フラジェリン；ＴＬＲ５］、ＦＳＬ−１［マイコプラズマ由来リポペプチド；ＴＬＲ６／２］、Imiquimod［ＴＬＲ７］、ｓｓＲＮＡ４０［ＴＬＲ８］、ＯＤＮ２００６［ＴＬＲ９］、及びＥ.ｃｏｌｉ ０２６：Ｂ６ ＬＰＳ［病原性大腸菌由来リポポリサッカライド］）を含有する培養液中で細胞を培養した。６時間後、Tripluc Assay Reagent（登録商標、東洋紡績社製）で処理した後、Phelios（アトー社製）を用いてルシフェラーゼの発光量を測定した。データ取得後、内部標準であるＳＬＲ発光値（Ｇ３ＰＤＨプロモーター活性値）を用い、データの正規化を行い、ＳＬＲ発光値に対するＳＬＯ発光値（ＳＬＯ／ＳＬＲ値；ＩＬ−８プロモーターの誘導率）を算出した。なお、ネガティブコントロールとしてＴＬＲリガンド不含（溶媒のみ）の培養液中で細胞を培養した場合の実験も行った。
【００４１】
その結果、４種類のＴＬＲリガンド（リステリア菌由来のＨＫＬＭ、ネズミチフス菌由来のフラジェリン、マイコプラズマ由来のＦＳＬ−１、及び大腸菌０２６：Ｂ６（病原性大腸菌）由来のＬＰＳ）存在下でＴＨＰ−Ｇ８細胞を培養した場合、いずれもＳＬＯの蛍光（ＩＬ−８プロモーター活性）レベルが顕著に高かった（図３参照）。一方、７種類のＴＬＲリガンド（Ｐａｍ３ＣＳＫ４、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、低分子Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、大腸菌Ｋ−１２（非病原性大腸菌）由来のＬＰＳ、Imiquimod、ｓｓＲＮＡ４０、及びＯＤＮ２００６）存在下でＴＨＰ−Ｇ８細胞を培養した場合、ＳＬＯの蛍光レベルはほとんど検出されなかった（図３参照）。これらの結果により、ＩＬ−８遺伝子を導入したマクロファージ系細胞（ＴＨＰ−Ｇ８細胞）を用いたレポーターアッセイ系（ＩＬ−８レポーターアッセイ系）を用いることにより、試料中のリステリア菌、ネズミチフス菌由来フラジェリン、マイコプラズマ由来リポペプチド、及び病原性細菌由来のリポポリサッカライドを効率よく検出できることが明らかになった。
【実施例３】
【００４２】
［ＬＰＳの定量］
ＴＨＰ−Ｇ８細胞を用いたＩＬ−８レポーターアッセイ系により検出された上記４種類のＴＬＲリガンド（リステリア菌由来のＨＫＬＭ、ネズミチフス菌由来のフラジェリン、マイコプラズマ由来のＦＳＬ−１、及び大腸菌０２６：Ｂ６由来のＬＰＳ）のうち、大腸菌０２６：Ｂ６（病原性大腸菌）由来のＬＰＳについて、どの濃度まで検出可能かについて検討を行った。実施例２に記載の方法にしたがって、１ｆｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの大腸菌０２６：Ｂ６（病原性大腸菌）由来のＬＰＳを含有する培養液中でＴＨＰ−Ｇ８細胞を培養し、ルシフェラーゼの発光量（ＳＬＲ発光値及びＳＬＯ発光値）の測定と、ＳＬＯ／ＳＬＲ値（ＩＬ−８プロモーターの誘導率）の算出を行った。
【００４３】
その結果、大腸菌０２６：Ｂ６（病原性細菌）由来のＬＰＳが少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ以上で存在する場合に、ＴＨＰ−Ｇ８細胞を用いたＩＬ−８レポーターアッセイ系によりリポポリサッカライドを効率よく検出できることが示された（図４参照）。
【実施例４】
【００４４】
［環境水の汚染度の測定］
ＴＨＰ−Ｇ８細胞を用いたＩＬ−８レポーターアッセイ系により、環境水の汚染度を評価できるかどうか検討するために、実施例２に記載の方法にしたがって、２０１４年４月６日に採取した以下の（１）〜（６）に示す環境水６サンプル（図５参照）１μＬ又は１０μＬ存在下でＴＨＰ−Ｇ８細胞を培養し、ＩＬ−８レポーターアッセイ系による解析を行った。
（１）大倉ダム（宮城県仙台市青葉区大倉）
（２）岩沼海岸（宮城県岩沼市下野郷浜）
（３）一般家庭風呂水
（４）広瀬川中流（宮城県仙台市青葉区川内）
（５）名取川下流（宮城県仙台市太白区四郎丸）
（６）貞山堀（宮城県名取市下増田）
その結果、ＩＬ−８レポーターアッセイ系を用いて上記４種類のＴＬＲリガンド（リステリア菌由来のＨＫＬＭ、ネズミチフス菌由来のフラジェリン、マイコプラズマ由来のＦＳＬ−１、及び大腸菌０２６：Ｂ６由来のＬＰＳを検出することにより、環境水の汚染度を測定することが可能であることが示唆された。
【実施例５】
【００４５】
［環境水サンプルを用いたＩＬ−８レポーターアッセイ系とＬＡＬ法との比較］
実施例４で用いた環境水６サンプルに加え、以下の（７）〜（１２）に示す国外で採取した環境水６サンプルの計１２サンプル（図６参照）を用い、ＩＬ−８レポーターアッセイ系とＬＡＬ法とでそれぞれ汚染度を測定し、結果を比較した。ＩＬ−８レポーターアッセイ系は、実施例２と同様に環境水の汚染度をＴＨＰ−Ｇ８細胞を用いて測定した。ＬＡＬ法は、採取した水を１２１ ℃、２気圧下に２０分、オートクレーブ処理したのち、エンドトキシンフリー水で１０００倍希釈し、Toxin SensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit(GeneScript社)を用いて測定した。(環境水とLALを混合し４５分間３７℃でインキュベートする。発色基質を加え６分間３７℃でインキュベートする。ストップソリューションを加え５４５ｎｍの吸光度を測定する。)
なお、本実施例に用いた国外で採取した環境水のサンプルは、２０１２年１２月１３日に以下地点でコニカルチューブに採取し、−２０℃で保存したものとする。
（７）Ｌａ ２（Las Pinas市Pulang Lupa）
（８）Ｐａ ３（Paranaque市La Huerta）
（９）Ｐａ ４（Paranaque市Tambo）
（１０）Ｐａｓｉｇ Ｓｔ２（Manila市Punta）
（１１）Ｐａｓｉｇ Ｓｔ４（Pasig市San Joaquin）
（１２）Ｐａｓｉｇ Ｓｔ６（Pasig市Rosario）
その結果、ＩＬ−８レポーターアッセイ系による測定値とＬＡＬ法による測定値とにはある程度の相関が見られるものの、両法の評価にばらつきが見られた（図６参照）。この点については、ＬＡＬ法で検出できる物質はエンドトキシン（ＬＰＳ）のみであるのに対し、ＩＬ−８レポーターアッセイ系による測定では、ＬＰＳに加えて、３種類のＴＬＲリガンド（リステリア菌由来のＨＫＬＭ、ネズミチフス菌由来のフラジェリン、及びマイコプラズマ由来のＦＳＬ−１）を検出できるため、検出対象が異なったことが原因の１つとして考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によると、これまで検出できなかった、試料中のリステリア菌、ネズミチフス菌由来フラジェリン、マイコプラズマ由来リポペプチド、又は病原性細菌由来のリポポリサッカライドが検出可能となる。これは環境水の総合的な評価において非常に有用な手段となりうる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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