(57)【要約】      （修正有）【課題】一回の校正作業で得た校正値を適正な校正値に補正する微小流路デバイスの温度校正方法を提供する。【解決手段】少なくとも１種類の既知の温度で信号を発する試薬を微小流路に投入し、試薬の信号を基に時間と温度の関係を求める工程と、校正の対象とする微小流路の試薬信号が得られた時点の少なくとも隣接流路の温度を推定する工程と、対象とする微小流路と隣接する微小流路の温度差から抵抗値変動分を得る工程と、得られた抵抗値変動分を対象とする微小流路の抵抗値に対して補正する工程と、補正後の抵抗値を用いて対象とする微小流路の流路内温度と抵抗体抵抗値の関係を校正する工程とを有する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の微小流路を有する微小流路デバイスの温度校正方法であって、複数の微小流路および微小流路毎に近接する抵抗体を設け、抵抗体に電流を流して微小流路の温度を上昇させて前記抵抗体の抵抗値から温度を算出することを特徴とする微小流路デバイスの温度校正方法であって、
少なくとも１種類の既知の温度で信号を発する試薬を微小流路に投入し、既知のレートで温度を高め、前記試薬から信号が発せられた抵抗値を前記温度と見なすことを特徴とし、
各微小流路に対して試薬の信号を基に時間と温度の関係を求める工程と、
校正の対象とする微小流路の試薬信号が得られた時点の少なくとも隣接流路の温度を推定する工程と、
対象とする微小流路と隣接する微小流路の温度差から抵抗値変動分を得る工程と、
得られた抵抗値変動分を対象とする微小流路の抵抗値に対して補正する工程と、
補正後の抵抗値を用いて対象とする微小流路の流路内温度と抵抗体抵抗値の関係を校正する工程とを有することを特徴とする微小流路デバイスの温度校正方法。
【請求項２】
微小流路デバイス中の微小流路中の試薬の信号を取得する領域において、領域中の流路の長さよりも抵抗体が長いことを特徴とする、請求項１の温度校正方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のヒータを内蔵するチップの温度校正方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、１枚のチップ上で化学・生化学分析に必要な全ての要素を組み込むマイクロトータルアナリシスシステム（μ‐ＴＡＳ）と呼ばれる技術についての研究開発が盛んである。チップはマイクロ流路、温度制御機構、濃度調整機構、送液機構、反応検出機構などから構成され、一般にマイクロ流体デバイスと呼ばれている。
【０００３】
その中でも特に、ヒトゲノムの１塩基多型（ＳＮＰ）などの遺伝情報の検査を目的としたＤＮＡ分析デバイスに注目が集まっており、研究が盛んに行われている。
【０００４】
ＤＮＡを分析する工程は２つある。（１）ＤＮＡを増幅する工程と（２）ＤＮＡを判定する工程である。
【０００５】
（１）のＤＮＡを増幅する工程では、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が一般的に用いられる。これは増幅対象のＤＮＡの一部に対して相補的なプライマと酵素等とを混合し、サーマルサイクルをかけることでＤＮＡを増幅させる手法である。本工程では、正確かつ反応時間短縮のための高速な温度制御が要求される。そのため、マイクロ流路に近接してヒータが構成されるチップが好適である。
【０００６】
図１０から図１２にマイクロ流路に近接したヒータを内蔵したチップを説明するための構成例の図を示した。図１０はチップの全景を示しており、図中１０１はマイクロ流路、１０２はヒータ、１０３は電極パット、１０４は電極パット１０３とヒータ１０２を結ぶリードである。
【０００７】
図１１は図１０中のＡ−Ａ’断面において、ヒータ１０２とマイクロ流路１０１の関係を説明する図である。ここで、図１０ではマイクロ流路１０１が合計で８本あったが、以下では隣接するマイクロ流路間の影響による課題を説明するので代表して２つのチャネルを示した。マイクロ流路１０１とヒータ１０２は一定のピッチで並べられている。次に図１２に実際の駆動方法を説明するために１つのチャネルのみ抜き出して上面図として示した。ヒータ１０２はリード１０４で電極パット１０３と接続されている。ヒータ１０２上にはマイクロ流路１０１が配置されており、ヒータ１０２のほぼ中央に位置する領域に観察領域１０５を設定する。観察領域１０５は概念上のもので、流路自体に観察領域１０５を弁別する構造を設けてはいない。観察領域１０５は不図示の観察系を用いてマイクロ流路１０１からの信号、例えば蛍光強度等を観察する領域であり、この領域の温度を正確に把握し制御する必要がある。ヒータ１０２として一般に金属を用い、通電による温度上昇に従って抵抗値も上昇する特性を有する。つまりヒータ１０２自身の抵抗値の変化を測定することにより、ヒータ１０２自身の温度をモニタすることができる。ヒータ１０２の両端には電圧降下測定用の電極１０６を配置しており、ヒータ１０２に印加する電位をモニタする四端子測定法によりヒータ１０２の抵抗値を安定して精度よく測定することができる。マイクロ流路１０１とヒータ１０２を隔てる絶縁層は厚みが１〜２μｍと薄いため、マイクロ流路１０１の温度はヒータ１０２の温度に良好に追従していると考えられる。そして、ヒータ１０２の抵抗値を測定することでヒータ１０２は加熱の機能のみならず、温度測定の機能も有する。以後、特に断わりなくマイクロ流路の温度と表記した際には、観察領域１０５での温度を指すことにする。
【０００８】
微小流路中の温度の校正方法としては特許文献１の実施例中に開示された方法がある。
【０００９】
図１５と１６を用いて、特許文献１に示される、従来のヒータの温度校正方法について説明する。ヒータに用いる材料は、温度変化に対する抵抗値変化の直線性が良いことから白金がよく用いられる。実際に製造されたヒータはそれぞれに製造誤差を持つため、測定したヒータ抵抗値から精度よく流路温度を求めるためには、ヒータ１０２の設計値から推定されるＴＣＲ（温度抵抗係数：温度変化に対する抵抗変化の割合）を用いたのでは誤差が出るため、校正作業が必要である。校正作業には人工的に合成したＤＮＡ試薬がよく用いられる。すなわち、ＤＮＡに二重螺旋に組み込まれた際にのみ蛍光を発することができる蛍光試薬が市販されているが、これとＤＮＡを混合した試薬を用いる。ＤＮＡの二重螺旋は温度が上昇するに従い徐々に結合が解かれ、二本鎖に分離する。二重螺旋の解離に従って蛍光強度は弱まり、二本鎖に分離したところで完全に消光する。この蛍光が消えて行く温度はＤＮＡの結合強度に依存しており、人工ＤＮＡは既知の特定の温度で消光するように合成されている。図１５はマイクロ流路１０１に２つの異なる温度（Ｔ１，Ｔ２）で蛍光が消光するように合成された２種類の人工ＤＮＡ試薬を混合充填し、ヒータ１０２に印加する電圧を徐々に上昇させるとともに抵抗値変化を測定し、マイクロ流路１０１の温度（横軸）を上昇させながら蛍光強度の変化（縦軸）を記録した結果を示している。本校正作業後には校正作業によって求められた温度係数を用いることになる。図１５を見てわかる通り、蛍光強度自体は温度が上昇すると発光効率が低下するため、緩やかに右下がりのカーブを描く。ここで、人工ＤＮＡの既知の解離温度Ｔ１とＴ２で急峻に蛍光強度が変化している部位がある。図１５で得られた信号を温度に対して一回微分し、符号を反転したものが図１６である。既知の解離温度Ｔ１、Ｔ２においてシャープな信号が得られている。Ｔ１、Ｔ２の信号が得られた時点の対応する抵抗値Ｒ１、Ｒ２を用いて抵抗値とマイクロ流路温度との関係を示す一次式の係数を求める。つまり、Ｔ１とＴ２の温度差とＲ１とＲ２の抵抗値差から一次式の傾きが、傾きを求めた後には一方の値を用いて切片を求めることができる。すなわち温度Ｔ[℃]と抵抗値Ｒ[Ω]の間には
Ｔ＝Ｋ１×Ｒ＋Ｋ２
Ｋ１＝（Ｔ２−Ｔ１）／（Ｒ２−Ｒ１）
Ｋ２＝（Ｒ２・Ｔ１−Ｒ１・Ｔ２）／（Ｒ２−Ｒ１）
が成立する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１３−５１９６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、上記従来の校正方法にはマイクロ流体デバイス特有の課題があった。すなわち、あるチャネルのマイクロ流路は直下のヒータからの熱の供給のみで加熱されるだけでなく、近接して配置した隣接チャネルのヒータからの熱の流入の影響を受けていることである。より具体的に説明すると、校正前にはヒータの抵抗値およびＴＣＲの製造ばらつきがある、すなわち先の係数Ｋ１，Ｋ２がチャネル毎にばらついている可能性がある。校正前にはこれらの数値が正確には不明であるため、校正中のヒータ温度を正確に把握できず、各チャネルの温度を厳密に同じ温度で制御できない。すなわち隣接するチャネルのヒータの温度が揃っていない状態で、図１５の抵抗値と蛍光強度変化の関係を求めることになる。ここで例えばｎ番目と（ｎ＋１）番目のチャネルのヒータ抵抗値のばらつきによる発熱量のばらつきがあった場合、ヒータ内の温度分布が隣接チャネルのヒータとの温度差により異なった分布となる。図１７（ａ），（ｂ），（ｃ）は隣接チャネルの温度が異なった場合の、熱量分布の違いを模式的にあらわした図である。実線の□は注目しているｎ番目のヒータ、点線の□はその両隣の（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のヒータ面を示し、夫々のヒータが発熱し伝搬することによる熱量の分布をグレイスケールの等高線で示している。（ａ）は３つのチャネルを同じ温度で駆動している場合、（ｂ）は（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のチャネルをｎ番目のチャネルよりも低い温度で駆動している場合、（ｃ）は（ｎ−１）番目と（ｎ＋１）番目のチャネルをｎ番目のチャネルよりも高い温度で駆動している場合を示している。ヒータ内の温度分布は、自身の発熱による熱量に加えて隣接ヒータからの熱量により決まる、すなわち図１７（ａ），（ｂ），（ｃ）からわかるように、隣接チャネルとの温度差によってｎ番目のヒータの横方向の温度分布とヒータ長手方向の端部近傍の温度分布が変化する。本構成では流路内の温度をヒータの温度変化による抵抗値変化で観測するが、ヒータ内の温度分布が変わるとそれに伴いヒータ内の抵抗値分布が変化するため、同じ抵抗値に観測されても、温度分布によって観察領域の温度が一義的に決まらないことを示している。従って従来の校正技術で温度と抵抗値の関係（校正値）を求め、その校正値に基づいてヒータを駆動すると、隣接チャネルとの温度差が校正作業時の温度差と異なる可能性があり、ヒータ抵抗値と流路温度との関係に誤差を残していた。これに対して、取得した校正値を使用して再度校正作業を行い、校正値の変動が規程値内に納まるまで繰返すことにより適正な校正値を求めることは可能であるが、校正作業時間が長時間化してしまう問題があった。従って本発明の課題は、一回の校正作業で得た校正値を適正な校正値に補正することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願に掛かる発明は、校正信号取得時の隣接チャネルの温度差を推定することにより、一回の校正作業で取得した校正データの抵抗値を補正し、補正したデータを実動作時の温度制御に使用することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１３】
本願の発明によれば、校正前の状態であっても隣接チャネルの影響を校正後の状態に揃えることで誤差を抑制した校正をすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｎ番目の流路の温度を５０℃、７０℃または９０℃に制御した際の、隣接する（ｎ＋１）番目の流路とｎ番目の流路の間の温度差とｎ番目のヒータに投入されたエネルギーの変化の関係に関するシミュレーション結果を示す。
【図２】隣接流路の温度偏差が与える影響に関するシミュレーション結果を示す。
【図３】ヒータ両端の見誤りの大きさが、（ｎ＋１）番目のチャネルとの温度偏差に応じて常に一定の関係があることを示すシミュレーション結果を示す。
【図４】本実施例の校正作業で用いた人工ＤＮＡの信号を示す図である。
【図５】蛍光信号強度の変化を時間について一回微分した信号である。
【図６】図５の一部を拡大した図である。
【図７】説明の為の模式図である。
【図８】実測に基づくデータを示す。
【図９】本発明の補正の有無のそれぞれの場合の蛍光信号のピーク時の温度誤差を示すグラフである。
【図１０】マイクロ流路に近接したヒータを内蔵したチップを説明するための図である。
【図１１】図１０中のＡ−Ａ’断面において、ヒータ１０２とマイクロ流路１０１の関係を説明する図である。
【図１２】マイクロ流路に近接したヒータを内蔵したチップを説明する１つのチャネルを抜き出した図である。
【図１３】校正用の人工ＤＮＡの温度と蛍光強度の関係を示すグラフである。
【図１４】図１３のグラフを微分し、符号を反転したグラフである。
【図１５】抵抗値と蛍光強度変化の関係を示す図である。
【図１６】抵抗値と蛍光強度変化の微分値の関係を示す図である。
【図１７】熱量分布の違いを説明するための模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、微小流路デバイスの温度校正方法を提供する。本発明の微小流路デバイスは複数の微小流路を有する。本発明の温度校正方法においては、該複数の微小流路と、さらに微小流路毎に近接する抵抗体を設け、該抵抗体に電流を流して微小流路の温度を上昇させて前記抵抗体の抵抗値から温度を算出する。
【００１６】
本発明の温度校正方法においては、少なくとも１種類の既知の温度で信号を発する試薬を微小流路に投入し、既知のレートで温度を高め、前記試薬から信号が発せられた抵抗値を前記温度と見なす。そして、本発明の温度校正方法は各微小流路に対して試薬の信号を基に時間と温度の関係を求める工程と、校正の対象とする微小流路の試薬信号が得られた時点の少なくとも隣接流路の温度を推定する工程と、対象とする微小流路と隣接する微小流路の温度差から抵抗値変動分を得る工程と、得られた抵抗値変動分を対象とする微小流路の抵抗値に対して補正する工程と、補正後の抵抗値を用いて対象とする微小流路の流路内温度と抵抗体抵抗値の関係を校正する工程とを有する。
【００１７】
また、本発明の温度校正方法においては、特に好ましくは、微小流路中の試薬の信号を取得する領域において、領域中の流路の長さよりも抵抗体が長い。
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
【００２０】
発明者はマイクロ流路に近接したヒータを有するマイクロデバイスの熱挙動について鋭意検討を進めた結果、隣接チャネル間の温度差とヒータ抵抗値の間に有用な関係があることを理解するに至った。
【００２１】
図１はｎ番目の流路の温度を５０℃、７０℃または９０℃に制御した際の、隣接する（ｎ＋１）番目の流路とｎ番目の流路の間の温度差とｎ番目のヒータに投入されたエネルギーの変化の関係をシミュレーションによってグラフ化したものである。横軸は（ｎ＋１）番目の流路のｎ番目流路の温度を基準にした温度偏差、縦軸は対応するｎ番目のヒータに投入されるエネルギーを示している。三角で示す記号は５０℃制御時、四角で示す記号は７０℃制御時、ひし形で示す記号は９０℃制御時の結果である。なお、縦軸は検討を行った範囲における最大パワーで規格化した値で示している。グラフから分かる通り、ｎ番目の流路を一定温度に制御している時、（ｎ＋１）番目の流路の温度がｎ番目の流路より高い場合は、ｎ番目のヒータに投入するエネルギーは抑えられている。逆に（ｎ＋１）番目の流路の温度がｎ番目の流路より低い場合には、ｎ番目のヒータには多いエネルギーが投入されている。このことはｎ番目の流路の温度は、直近のヒータの温度だけでは決まらず、隣接する（ｎ＋１）番目のヒータの発熱量にも影響されていることを示している。
【００２２】
さらに隣接流路の温度偏差が与える影響についてシミュレーションにより調べた結果、次のことが分かった。図２はｎ番目のヒータの幅方向中央部の温度についてヒータの長手方向に沿って分布を調べた結果である。横軸はヒータ長手方向の位置を示しており、縦軸はｎ番目と（ｎ＋１）番目の流路のそれぞれの観察領域１０５が同じ９０℃で長手方向の温度分布も同一のプロファイルとなっている時のｎ番目のヒータの温度分布を基準にして、破線は（ｎ＋１）番目の流路が５℃高い場合のｎ番目のヒータとの温度差、実線は（ｎ＋１）番目の流路が５℃低い場合のｎ番目のヒータとの温度差の分布を示している。観察領域１０５は同じ温度であるが、ヒータの端部に近いところでは温度分布に差が現れている。
【００２３】
この温度分布に応じてヒータの抵抗値分布も変化する。すなわち、ヒータの全体の抵抗値を測定して温度モニタしている場合、観察領域は一定の温度が示されるが、実際の温度は（ｎ＋１）番目の流路の温度に応じて、流路内に分布が生じていることを示している。
【００２４】
このように、値としては一定の抵抗値として観測されていながら、実際に流路内で温度分布に差を生じているとき、このバラツキを抵抗値で示した値を「見誤り」と呼ぶこととする。
【００２５】
検討を進めた結果、ヒータ両端の見誤りの大きさは制御する温度目標値に関わらず、（ｎ＋１）番目のチャネルとの温度偏差に応じて常に一定の関係があることを見出した。その関係をグラフ化したものが図３である。横軸に（ｎ＋１）番目の流路の温度偏差、縦軸にｎ番目のヒータでの抵抗値の見誤り値を示した。
【００２６】
尚、ここまでの説明では常に片側の隣接チャネルとの関係を議論してきた。相互作用は両側の隣接チャネルとの間で生じるため、補正は両側のチャネルに対して行う必要がある。また、更に１つのチャネルを超えた隣接チャネルも最隣接チャネルと比較して影響は弱まるものの、温度差に応じて補正できると、より精度が向上するものと考える。
【００２７】
次に実際に観測された数字を例示しながら、本発明の温度校正方法について説明する。図４と５は本実施例の校正作業で用いた人工ＤＮＡの信号に関する図である。図４、５と図１３、１４は、同じ実験に基づく結果だが、図１３、１４では横軸が温度で示されている一方、図４、５は時間で示されている点において異なる。
【００２８】
図４は蛍光強度をグラフ化したものである。本図で用いられた人工ＤＮＡは７０℃と９０℃で融解するよう設計・製作された。図４の横軸は一定温度勾配で加熱した際の時間を、縦軸は蛍光の輝度についても規格化した値を示す。
【００２９】
図５は蛍光信号強度の変化を時間について一回微分した信号を示す。図６は図５の一部を拡大したものである。微分カーブのピークを比較すると、ｎ番目のチャネルに対して（ｎ＋１）番目のチャネルは少し後の時間にピークがずれている。
【００３０】
図７は説明の為の模式図である。左側の実線の丸で囲んだ点では、流路の観察領域１０５における、人工ＤＮＡの信号ピークがＴ１であり、このとき、時間がｔ１であったことを示す。右側の実線の丸で囲まれた点は、（ｎ＋１）番目の流路から温度がＴ１になったことを示すシグナルが時間ｔ２に観測されたことを示す。時間ｔ２の際、ｎ番目の流路は、既にＴ１よりも高い温度になっている。逆の見方をすると、ｎ番目の流路が温度Ｔ１であるとき、（ｎ＋１）番目の流路は温度Ｔ１よりも低い温度であったことを示している（破線の丸）。このような状態では抵抗値は見誤りを含むことになる。
【００３１】
そこで、本発明においては、補正作業は流路の温度を時間の関数として記述して、ｎ番目の流路のデータを補正する際に、隣接する（ｎ＋１），（ｎ−１）番目の流路の温度を推定し、推定した温度偏差から求まる抵抗値の読み取り誤差を補正する。
【００３２】
図８は実際に観測されたデータを示す。このデータにおいて人工ＤＮＡは７０℃と９０℃で信号を出す試薬が用いられている。「ピークが観測された時間」は各チャネルにおいて、人工ＤＮＡの蛍光ピークが観測された時間を示す。Ｔ１は７０℃、Ｔ２は９０℃である。
【００３３】
各流路について得られたピークの時間から、流路温度の時間に対する一次関数の式を求め、ｎ番目のチャネルがピークシグナルを示した時間（７０℃では２７．２３５９７秒、９０℃では４７．３８９２９秒）での流路温度をその一次関数に当てはめることによって求めた。その結果、例えば、ｎ番目の流路が７０℃の時、（ｎ−１）番目の流路は同時刻に７０．０６６５４℃、（ｎ＋１）番目の流路は７０．２３２８０℃であったと分かる。このことから、ｎ番目の流路が７０℃の時、（ｎ−１）番目のチャネルとは０．０６６５４℃、（ｎ＋１）番目のチャネルとは０．２３２８０℃の温度偏差があったことが分かる。
【００３４】
本実施例での流路ディメンジョンでは隣接流路の温度差に対応する抵抗値の見誤り量は、
ｄＲ＝−０．００１５ｄＴ＋０．０００６
と分かっているので温度偏差を抵抗値の見誤り量に換算する。
【００３５】
補正量は両隣の影響を合計し、蛍光信号のピークが観測された時点での抵抗値に補正を加える。補正された抵抗値と人工ＤＮＡが示す既知の流路内温度から、流路内温度とヒータ抵抗値との関係式の係数を求める。
【００３６】
校正作業を８つのチャネルを持つチップに対して、補正有りと補正無しで比較した。補正無しで流路内温度とヒータ抵抗値との関係式を求めて、確認の為の校正作業を実施した。校正後の蛍光信号のピークは既知の温度に観測されるはずであるが、いくらかの誤差を持っている。並行して同じデータを本発明の補正方法を用いて補正し、流路内温度とヒータ抵抗値の関係を求めた。図９は横軸に補正無しで校正した際の、二度目の校正作業で観測された蛍光信号のピーク時の温度誤差を横軸に、本発明の補正を行って校正した場合の蛍光信号のピーク時の温度誤差を縦軸にグラフを描いた。本発明の補正方法によって誤差が低減されている様子が分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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