(57)【要約】【課題】酸素含有気体源の使用方法を提供することにある。【解決手段】本発明は、血液脳関門浸透性向上用の医薬組成物の調製に用いられ、気体源が少なくとも２０重量％の酸素を含む酸素含有気体源の使用方法である。酸素含有気体源は、血液脳関門浸透性を向上させることができ、操作しやすく高価な機器をいらず、化合物が大脳に伝送された後で血液脳関門の非浸透性が快速に回復できて、外界物質に干渉されないように大脳の環境を保護できるので、本発明の酸素含有気体源を血液脳関門浸透性向上用の医薬組成物の調製に用いることができる。【選択図】図９Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液脳関門浸透性向上用の医薬組成物の調製に用いられ、気体源が少なくとも２０重量％の酸素を含む酸素含有気体源の使用方法。
【請求項２】
前記気体源は、少なくとも１重量％の二酸化炭素を更に含む請求項１に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【請求項３】
前記酸素と前記二酸化炭素との重量体積比は、１:１〜１:２０である請求項２に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【請求項４】
前記気体源は、２０重量％の酸素及び１重量％の二酸化炭素を含む請求項２に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【請求項５】
前記気体源は、２０重量％の酸素及び２０重量％の二酸化炭素を含む請求項２に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【請求項６】
前記気体源は、５重量％の二酸化炭素及び９５重量％の酸素からなる請求項２に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【請求項７】
前記気体源は、１０重量％の二酸化炭素及び９０重量％の酸素からなる請求項２に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【請求項８】
前記気体源は、２０重量％の二酸化炭素及び８０重量％の酸素からなる請求項２に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【請求項９】
前記気体源は、完全に酸素からなる請求項１に記載の酸素含有気体源の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸素含有気体源の使用方法に関し、特に、酸素含有気体源の血液脳関門浸透性向上への使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液脳関門（ｂｌｏｏｄ‐ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ；ＢＢＢ）とは、大脳における毛細血管及び血管を覆う非常に緊密な内皮細胞層である。血液脳関門細胞の間に約２０種類の異なったタイプのタンパク質が交錯して結合し、ほとんど浸透させない接続となる。外部分子は、血液脳関門細胞に入るには、膜内在性タンパク質によってタンパクを輸送し、又はその蝋質外膜を貫通して直接滑り込まなければならない。外部の化合物は中に入ると、高濃度の代謝酵素及び多様な外部物質を解消しようとする広宿主性のタンパクボンプを避けなければならない。前記障害を避けた後、外部分子は、最終に大脳に到着するには、続いて血液脳関門細胞の内膜を貫通しなければならない。
【０００３】
血液脳関門は、大脳組織血液を与える毛細血管から構成され、大脳毛細血管を形成する内皮細胞がボディーの他の組織における内皮細胞と異なっている。大脳の毛細血管内皮細胞は、細胞同士が緊密に接続して結合して、外部分子の血液から大脳及び中枢神経系の他の部分への受動輸送を抵抗する連続的な壁を１層形成する。大脳の毛細血管内皮細胞は、少ない飲小胞を有することにボディーの他の組織における内皮細胞と異なるが、他の組織においては、これらの飲小胞が毛細血管壁を介したある非選択的な運送を許可する。大脳の毛細血管内皮細胞にも細胞の間を無制限に通過させて運行することを許可する連続的な隙間又は通路が欠ける。
【０００４】
血液脳関門の機能は、大脳の環境が常に制御されるように確保することである。血液中の各種の物質（例えば、ステロイド類、アミノ酸及びイオン）のレベルが頻繁且つ微小に変動し、これらの変動が例えば摂食や運動等の活動によることもある。大脳がこれらの血清構成の変化において血液脳関門により保護されなければ、神経活動が制御されなくなる可能性がある。
【０００５】
血液脳関門は、大脳を潜在的な危険から保護するために精密に防御するが、神経学の薬物の大脳中の疾患部位への伝送を妨げ、治療効果を妨害することもある。例えば、感染部位が中枢神経系外にある場合、細菌及び真菌の多数の感染が容易に治療されるが、このような感染が中枢神経系内に発生する場合、非常に危険になることがよくあり、有効量の薬物を感染部位まで伝送できないため治療が非常に難しくなる。同様に、血液脳関門の機能により、大脳癌の治療が中枢神経系の外部における癌の治療よりも難しくなる。有効量の薬物を中枢神経系の中に伝送するためには薬物を中枢神経系の外部に非常に大量に投与してもよいが、中枢神経系の外部（例えば、血液中）における薬物レベルがしばしば非常に高くなって、腎臓、肝臓及び他の重要な器官に有害である毒性レベルにも達してしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の技術では、血液脳関門浸透性の向上方法として、高張溶液の静脈注射や超音波刺激を含み、それらにより化合物の中枢神経系の中への伝送における問題を改善することができる。しかしながら、静脈注射は、侵襲性治療措置であるのでそれなりの潜在的な危険性があるが、超音波刺激は、高価な機器設備を必要とし、普遍に適用されることはできない。また、静脈注射または超音波刺激による血液脳関門開放を問わず、何れにも不良の可逆性があり、且つ制御しにくく、血液脳関門が一旦開口すると非浸透性を回復するにはかなり時間がかかる。
【０００７】
本発明の目的は、酸素含有気体源の使用方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明による一態様は、血液脳関門浸透性向上用の医薬組成物の調製に用いられ、気体源が少なくとも２０重量％の酸素を含む酸素含有気体源の使用方法を提供する。
前述の酸素含有気体源は、血液脳関門浸透性を向上させることができ、操作しやすく高価な機器をいらず、化合物が大脳に伝送された後で血液脳関門の非浸透性が快速に回復できて、外界物質に干渉されないように大脳の環境を保護できるので、本発明の酸素含有気体源を血液脳関門浸透性向上用の医薬組成物の調製に用いることができる。
【０００９】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記気体源は、少なくとも１重量％の二酸化炭素を更に含んでもよい。
【００１０】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記酸素と二酸化炭素との重量体積比は、１:１〜１:２０であってもよい。
【００１１】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記気体源は、２０重量％の酸素及び１重量％の二酸化炭素を含んでもよい。
【００１２】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記気体源は、２０重量％の酸素及び２０重量％の二酸化炭素を含んでもよい。
【００１３】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記気体源は、５重量％の二酸化炭素及び９５重量％の酸素からなってもよい。
【００１４】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記気体源は、１０重量％の二酸化炭素及び９０重量％の酸素からなってもよい。
【００１５】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記気体源は、２０重量％の二酸化炭素及び８０重量％の酸素からなってもよい。
【００１６】
前記酸素含有気体源の使用方法によると、前記気体源は、完全に酸素からなってもよい。
【００１７】
上記した発明の概要は、本開示内容の簡略化された要約を提供することを目的とし、読者に本開示内容を基本的に理解させるためのものである。この発明の概要は、本開示内容の完全な概述ではなく、本発明の実施例の重要／肝心な素子を指摘し又は本発明の範囲を定めることを図るものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ラットの異なった刺激頻度での脳部エバンスブルー（Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ  ｄｙｅ；ＥＢＤ）の浸出を示す特性図である。
【図１Ｂ】運動皮質層におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図１Ｃ】血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図２Ａ】試験群別の模式図である。
【図２Ｂ】新規物体認識テストの流れ模式図である。
【図２Ｃ】テストの当日でＥＢＤが注射された各群のラットは新規物体認識テストにおいて物体と接触する回数の定量分析を示す特性図である。
【図２Ｄ】脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図２Ｅ】テストの当日でＮａＦが注射された各群のラットは新規物体認識テストにおいて物体と接触する回数の定量分析を示す特性図である。
【図２Ｆ】脳中の各領域及び血液中のＮａＦ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図３Ａ】高架式プラットホームテストにおける、ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図３Ｂ】強制水泳テストにおけるラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図３Ｃ】行為活動後の３０分間にまたＥＢＤが注射されたラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図３Ｄ】行為活動テストにおけるラットの脳中の各領域及び血液におけるＮａＦ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図４Ａ】薬物のラットの強制水泳テストでの血液脳関門開放に対する影響を示す特性図である。
【図４Ｂ】ラットの高二酸化炭素血症試験における、脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図４Ｃ】Ｎａ+／Ｈ+トランスポーター（Ｎａ+／Ｈ+  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ；ＮＨＥ）阻害剤が注射されたラットの運動皮質層及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図５Ａ】閉所恐怖テストにおける、ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図５Ｂ】不動化テストにおける、ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図５Ｃ】ストレス関連の行為活動試験における、ラットの体内のコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）濃度の変化を示す特性図である。
【図５Ｄ】ストレス関連の行為活動試験における、ラットの体内のＯ2／ＣＯ2の含有量を示す特性図である。
【図６Ａ】閉所恐怖テストにおける、ラットの脳中の各領域におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図６Ｂ】閉所恐怖テストにおける、ラットの血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図７Ａ】ラットが異なった酸素含有気体源を吸入した場合の脳部のＥＢＤの浸出を示す特性図である。
【図７Ｂ】ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図８Ａ】ラットの異なった換気程度での脳部ＥＢＤの浸出を示す特性図である。
【図８Ｂ】ラットの低換気状況での脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図８Ｃ】換気率を向上させる場合のラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図９Ａ】異なった酸素含有量の気体源を吸入したラットの脳中の各領域におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図９Ｂ】異なった酸素含有量の気体源を吸入したラットの血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図９Ｃ】２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの脳中の各領域におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図９Ｄ】２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図９Ｅ】２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの肝臓中のＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図９Ｆ】２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの脳部のＥＢＤの浸出を示す特性図である。
【図１０Ａ】２０％のカーボゲンを３０分間吸入したラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図１０Ｂ】２０％のカーボゲンを６０分間吸入したラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図１０Ｃ】２０％のカーボゲンを９０分間吸入したラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析を示す特性図である。
【図１１Ａ】ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の体重変化の定量分析を示す特性図である。
【図１１Ｂ】ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の食物摂取量の定量分析を示す特性図である。
【図１１Ｃ】ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の２０日目の自発的な行為活動の定量分析を示す特性図である。
【図１１Ｄ】ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の２２日目の新規物体認識テストの定量分析を示す特性図である。
【図１２Ａ】新規物体認識テストの流れ模式図である。
【図１２Ｂ】テストの１日目のラットの新規物体認識テストでの結果の定量分析を示す特性図である。
【図１２Ｃ】テストの２日目のラットの新規物体認識テストでの結果の定量分析を示す特性図である。
【図１２Ｄ】ラットの新規物体認識テストでの結果を示す特性図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書の開示内容では、酸素含有気体源の新規の用途（使用方法）を提出し、ラットの体内モデルによって酸素含有気体源の血液脳関門開放に対する影響を評価し、酸素含有気体源が血液脳関門浸透性を向上でき、血液脳関門浸透性向上用の医薬組成物として使用することができることを証明する。以下、本明細書に用いる特定の用語を説明する。
【００２０】
「血液脳関門開放」とは、血液脳関門の浸透性を向上させ、もともと血液脳関門外に塞がれる外部物質が血液脳関門を通して大脳の中に入るようにすることである。
【００２１】
「カーボゲン（ｃａｒｂｏｇｅｎ）」は、二酸化炭素及び酸素が混合したガスであり、臨床では既に精神疾患の治療上に用いられている。例えば、４０％のカーボゲン（４０％ＣＯ2：６０％Ｏ2）を５〜２０分間吸入すると、緊張を急性で効果的に解消することができ、又は週間で３０％のカーボゲン（３０％ＣＯ2：７０％Ｏ2）を３〜６回吸入し、全コースで２０〜１５０回吸入した後、多様な神経系疾患を長時間で効果的に治療することができる。
【００２２】
以下、下記具体的な試験例で本発明を更に例示的に説明し、当業者が解読しすぎずに本発明を完全に利用し実践できるようにするためのものであり、これらの試験例を本発明の範囲に対する制限として見てはいけないが、本発明の材料及び方法を如何に実施するかを説明するためのものだけである。
【００２３】
＜試験例＞
［一、血液脳関門開放を影響する要素］
血液脳関門開放に影響する原因が極めて複雑なので、この部分の試験例では、まず、個体のどの生理的条件が血液脳関門開放を制御可能な要素であるかを検討した。
【００２４】
＜１．神経元活動の誘発モデルによる血液脳関門浸透性への影響＞
本試験では、まず、神経元活動の異なった誘発モデルが血液脳関門浸透性を影響するかどうかを評価した。特定な頻度での繰り返した神経元放電により、規則的な神経元活動を励起させることができ、例えば、１秒間内で１００Ｈｚの高頻度刺激（ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ；ＨＦＳ）はシナプス効能の長期増強作用（ｌｏｎｇ‐ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ；ＬＴＰ）を引き起こすことがあり、長期増強作用が空間学習、恐怖制約及び薬物依存症と関連付けられている。また、５〜３０分間内で１〜５Ｈｚの低頻度刺激（ｌｏｗ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ；ＬＦＳ）はシナプス効能の長期抑制作用（ｌｏｎｇ‐ｔｅｒｍ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ；ＬＴＤ）を引き起こすことがあり、長期抑制作用が記憶抽出、奨励渇望及び認知過程と関連付けられている。著しい対照で、０．０２Ｈｚより低い極低頻度刺激（ｖｅｒｙ  ｌｏｗ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ；ＶＬＦＳ）が自発的な神経元活動に類似し、シナプスを変化させることもないし、脳の輸出機能と関連付けることもない。
【００２５】
神経元活動の異なった誘発モデルが血液脳関門の浸透性に影響を与えるかどうかを比較するために、本試験では、異なった刺激頻度で試験動物を刺激し、試験動物の血液脳関門が刺激により開放されるかを観察し、本発明の試験動物は体重２２５〜２７５ｇの雄ＳＤラット（ラスコ（ＬＡＳＣＯ）から購入）であった。
実験ではそれぞれ１分間１２０回の低頻度及び１分間１回の極低頻度で試験動物を刺激し、エバンスブルー色素（Ｅｖａｎｓ  ｂｌｕｅ  ｄｙｅ；ＥＢＤ）によって試験動物の血液脳関門浸透性を観察した。ＥＢＤは、血清アルブミンとの高親和性を持つ水溶性のものであり、６９ｋＤａの大きさのタンパクトレーサーを形成できるので、血管内のタンパクのトレーサーとされてもよい。高頻度刺激の持続時間が短い（通常、１秒間）ので、ＥＢＤを十分に浸出させなくスペクトルの方法で正確に定量できないため、本試験では、高頻度刺激が試験動物の血液脳関門開放に影響を与えるかについてはテストしなかった。
【００２６】
神経元活動の異なった誘発モデルによる血液脳関門浸透性への影響を観察した結果である図１Ａ〜図１Ｃ及び付属書類１を参照されたい。図１Ａ〜図１Ｃは、神経元活動の異なった誘発モデルによる血液脳関門浸透性への影響を観察した結果を示す特性図である。図１Ａは、ラットの異なる刺激頻度による脳部ＥＢＤの浸出図である。図１Ｂは、運動皮質層におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図１Ｃは、血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
付属書類１は、図１Ａの着色図である。
実験では、刺激電極をＥＢＤが注射された麻酔ラットの運動皮層に置いて、また細胞外で記録する記録電極によって神経元活動を確認し、低頻度刺激と極低頻度刺激との電流振幅又はパルス幅が同一であり、同側の大脳半球の反対側の大脳半球に対するＥＢＤ浸出量で刺激による血液脳浸透性の変化を表すことができる。実験の結果より、刺激頻度を増加させることで、刺激される大脳半球の血液脳関門浸透性を向上させることができることが判明され、異なった神経元の活動モデルにより、異なった血液脳関門浸透性が与えられることが判明される。しかし、異なった血液脳関門浸透性の神経元の活動モデルが、静止した脳で自発した極低頻度刺激型ではなく、例えば、脳の関連機能を長時間に抑制し作用する低頻度刺激型となる。
【００２７】
＜２．ラットの意識的な行為活動による大脳の活発領域の血液脳関門の開放＞
前記試験例により、電極で局部の神経元を励起させた活動と神経網活動の整合による意識的行為とはかなり異なることが分かり、本試験例では、代謝に参加すると考えられる大脳領域の血液脳関門が行為活動により開放されるかを更に検討した。実験では、血漿タンパクの浸出をトレースするためのＥＢＤ、又は帯電小分子の外方浸出をトレースするためのフルオレセインナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ；ＮａＦ）の中の１つのトレーサーをラットに注射し、それぞれ新規物体認識テスト、高架式プラットホームテスト及び強制水泳テスト等の３つの行為活動によってテストした。
【００２８】
（ｉ．新規物体認識テスト）
図２Ａ〜図２Ｆを参照されたい。図２Ａ〜図２Ｆは、ラットに対して新規物体認識テストを行った結果である。図２Ａは、試験群別の模式図である。図２Ｂは、新規物体認識テストの流れ模式図である。図２Ｃは、テストの当日でＥＢＤが注射された各群のラットが新規物体認識テストにおいて物体と接触する回数の定量分析図である。図２Ｄは、脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図２Ｅは、テストの当日でＮａＦ注射された各群のラットが新規物体認識テストにおいて物体と接触する回数の定量分析図である。図２Ｆは、脳中の各領域及び血液中のＮａＦ検測量の定量分析図である。
【００２９】
新規物体認識テストは、操作記憶機能のテストに幅広く適用されている。実験の１日目、まず実験しようとするオープンスペースにラットを置いて３０分間適応させ、実験の２日目にラットが既に適応したオープンスペースに２つの同一の物体（玩具Ａ,Ａ）を置き、ラットが５分間内で２つの物体に触れる時間を測定し、個体活動差異又は時間の不足による認知・記憶不可能なことがないように、何れの物体に触れる時間が５秒間より短いラットを淘汰した。
実験の３日目に、最初に置かれた２つの同一の物体（玩具Ａ,Ａ）の中の１つを新しい物体（玩具Ｂ）に取り替えた後、新規物体（玩具Ｂ）を旧い物体（玩具Ａ）よりも長時間触れるようにラットを訓練し、ラットが３０分間で２つの物体に触れる時間を測定した。
試験群別は合計で３群であり、対照群である群別１では、実験の３日目にスペース内に２つの同一の物体（玩具Ａ,Ａ）を置いた。実験群は２群であり、何れも実験の３日目にスペース内に２つの異なった物体（玩具Ａ,Ｂ）を置いたが、群別２ではテストの前にジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）をラットの体内に注射したが、群別３ではテストの前にコルチコステロン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｎｅ）をラットの体内に注射した。
【００３０】
図２Ｄ及び図２Ｆの結果より、記憶抽出のタスクにおいて、ＥＢＤの検測量からラットの血漿タンパクが浸出することはなかったことが分かるが、ＮａＦの検測量から帯電小分子が海馬状隆起（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ；ＨＰ）に著しく外方浸出したことが分かり、海馬状隆起が大脳における記憶抽出の関連領域であるため、海馬状隆起の血液脳関門開放とこの大脳領域の新規物体認識の肝心作用とは一致であることが判明される。テストの前にコルチコステロンをラットの体内に注射して、スペース記憶抽出を中断させてストレスによる記憶障害をまねても、血液脳関門の浸透性も弱くなることを発見することもできる。
【００３１】
（ｉｉ．高架式プラットホームテスト）
高架式プラットホームテストは、修飾された高架式十字迷路であり、ラットを焦慮状態にし、実験ではまずトレーサーをラットの体内に注射し、ラットが半透明の高架式プラットホームにおいてスペース環境を探索すると強制した。図３Ａ〜図３Ｄを参照されたい。図３Ａは、高架式プラットホームテストにおける、ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図３Ｃは、行為活動後の３０分間にまたＥＢＤが注射されたラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図３Ｄは、行為活動テストにおけるラットの脳中の各領域及び血液におけるＮａＦ検測量の定量分析図である。
高架式プラットホームテストでは、特に、前頭前皮質層（ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ；ＰＳＦ）、尾状核／被殻（ｃａｕｄａｔｅ／ｐｕｔａｍｅｎ；ＣＰ）、海馬状隆起及び小脳（ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ；ＣＣ）において、ラットの血漿タンパク（ＥＢＤによりトレースされる）及び帯電小分子（ＮａＦによりトレースされる）に対する血液脳関門浸透性が著しく向上し、ただし、小脳が帯電小分子（ＮａＦ）に対する血液脳関門浸透性しか向上しなかった。前頭前皮質層及び海馬状隆起の血液脳関門開放が空間学習と一致であるが、バランスを保ってプラットホームから落ちらないように、尾状核／被殻及び小脳の血液脳関門開放が運動協調と一致であった。
本試験の結果が神経元活動の試験結果と一致であり、血液脳関門開放が神経元活動に対する依存性を有することが判明され、また図３Ｃの結果より、行為活動後の３０分間後でＥＢＤをラットの体内に注射すると血液脳関門開放が見られないことが判明され、血液脳関門開放が一時的に制限されると推定される。
【００３２】
（ｉｉｉ．強制水泳テスト）
強制水泳テストでは、ラットをスペース情報に限りがある、水槽直径４３ｍｍ、高さ５４ｍｍ、深さ２９ｍｍの非透明の水槽で水泳すると強制した。
図３Ｂ〜図３Ｄを参照されたい。図３Ｂは、強制水泳テストにおけるラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図３Ｃは、行為活動後の３０分間にまたＥＢＤが注射されたラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図３Ｄは、行為活動テストにおけるラットの脳中の各領域及び血液におけるＮａＦ検測量の定量分析図である。
強制水泳テストでは、ラットの運動輸出関連の大脳領域‐運動皮質層及び尾状核／被殻における血液脳関門通透性が著しい向上し、前頭前皮質及び小脳の血液脳関門の帯電小分子（ＮａＦ）に対する浸透性の向上が見られた。本試験の結果が神経元活動の試験結果と一致であり、また行為活動後の３０分間後でＥＢＤをラットの体内に注射すると血液脳関門開放が見られなかった。
【００３３】
上記行為活動試験のデータをまとめると、血液脳関門浸透性が各行為の使用する脳中領域において、著しく向上する。また、行為活動後の３０分間で血液脳関門が開放されていないことが見られ、行為活動による血液脳関門の開放現象が短時間であることが判明される。
【００３４】
＜３．機能性鬱血と血液脳関門開放とが類似な媒体を共用＞
細胞代謝により部分的な高二酸化炭素血症／酸中毒を引き起こすことがあり、このような領域的なＣＯ2／Ｈ+の向上が例えば、心臓のような周囲の器官の機能性鬱血の主要な媒体であると考えられる。大脳には、例えばＮ‐メチル‐Ｄ‐アスパラギン酸受容体（Ｎ‐ｍｅｔｈｙｌ‐Ｄ‐ａｓｐａｒｔａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＮＭＤＡＲ）調節による一酸化窒素の釈放のような神経元特異性メカニズム、星状膠細胞特異性メカニズム及び外被細胞特異性メカニズムによって機能性脳鬱血を触発してもよい。
本試験例では、ＮＭＤＡＲ経路が血液脳関門開放に寄与するかについて検討する。高架式プラットホームテスト及び強制水泳テストがラットに対してはストレスであり、高架式プラットホームテスト及び強制水泳テストでＲＵ４８６感知受容体を刺激すると、ＮＭＤＡＲ信号の伝達を向上させ、更に大脳機能に影響を与えることができる。そこで、ストレスがわりに小さい新規物体認識テストに対して、高架式プラットホームテスト及び強制水泳テストではより著しい血液脳関門開放が観察される原因が判明される。
【００３５】
図４Ａ〜図４Ｃを参照されたい。図４Ａは、薬物のラットの強制水泳テストでの血液脳関門開放に対する影響である。図４Ｂは、ラットの高二酸化炭素血症試験における、脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図４Ｃは、Ｎａ+／Ｈ+トランスポーター（Ｎａ+／Ｈ+  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ；ＮＨＥ）阻害剤が注射されたラットの運動皮質層及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
【００３６】
ＮＭＤＡＲ経路が血液脳関門開放に寄与するかについてテストするために、実験ではラットに対してそれぞれ下記のように処理した。ラットを３群に分け、ＤＭＳＯを皮下注射された群別１のラットを対照群とした。１ｍｇ／ｋｇのＮＭＤＡＲ遮断剤ＭＫ８０１を腹腔内注射されたラットを群別２（従来の検討によりＭＫ８０１が代謝性鬱血を抑制できることが分かった）とした。１０ｍｇ／ｋｇのＲＵ４８６を皮下注射されたラットを群別３（従来の検討によりＲＵ４８６がストレスによるＮＭＤＡＲ機能向上を防止できることが分かった）とした。
図４Ａの結果より、ＭＫ８０１またはＲＵ４８６で処理されたラットを問わず、強制水泳テストでの血液脳関門開放と対照群のには、著しい差異はないことが判明される。従って、グルココルチコイド受容体とＮＭＤＡ受容体との何れも、強制水泳関連の血液脳関門開放と関連付けられていない。
【００３７】
大脳には、神経元活動が組織液の酸性化延長を誘導することもあり、酸性化の延長現象が数分間持続し、ＣＯ2／Ｈ+の機能性脳鬱血の後期段階での作用が判明される。その前の一時的なアルカリ化のため、酸性化が一般に鬱血の発生より遅れるので、酸中毒が代謝性鬱血の早期段階に寄与することの可能性はほとんどない。ＣＯ2／Ｈ+が血液脳関門開放を触発できるかをテストするために、実験では、ＥＢＤが注射されたラットを、普通の空気又は高炭酸空気が充填されたキャビティ内に３０分間置いて、またラットの脳中の各領域及び血液中のＥＢＤ浸出量を検測した。
図４Ｂの結果より、高二酸化炭素血症のラットにはＥＢＤが明らかに広範に浸出されることが判明され、全脳の血液脳関門が開放されることが判明される。この結果から、機能性の血液脳関門開放をＣＯ2／Ｈ+によって調節でき、またＣＯ2／Ｈ+が同様に周囲の器官の機能性鬱血及び大脳鬱血の後期段階の媒体にもなることが推定できる。
【００３８】
代謝性酸中毒は、数多くの酸感知イオン通路又は陽子トランスポーターによってその効果を発揮する。具体的には、内皮細胞のＮａ+／Ｈ+トランスポーターが内皮細胞の体積や形態の調節に関わるため、ＮＨＥが血液脳関門の完全性の実行者である可能性もある。ＮＨＥがストレス活動期間中の代謝性血液脳関門開放に寄与するかをテストするために、実験では、それぞれＥＢＤで処理されたラットの体内に、担体（ＤＭＳＯ）を腹腔内注射し又はＮＨＥ阻害剤を腹腔内注射し、また強制水泳テストを３０分間行った後、ＥＢＤの脳中ヘの浸出量を検測した。また本試験において、選定されたＮＥＨ阻害剤はエチルイソプロピルアミロリド（Ｅｔｈｙｌｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  ａｍｉｌｏｒｉｄｅ；ＥＩＰＡ）及びゾニポリド（ｚｏｎｉｐｏｒｉｄｅ）である。ＥＩＰＡ及びｚｏｎｉｐｏｒｉｄｅが２つの異なった種類のＮＨＥ阻害剤を代表し、かつ重ね合わせた非特異性目標はないからである。ＥＩＰＡ及びｚｏｎｉｐｏｒｉｄｅのラットの体内ヘの注射量は、それぞれ５ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇであった。
また、従来の検討により、ＥＩＰＡ及びその誘導体の前脳神経元及び哺乳動物の星状膠細胞上のＮａ+／Ｈ+交換に与える影響は少なく又はないことが分かるが、それらが内皮細胞のＮａ+／Ｈ+交換及びＮＨＥにより調節された内皮細胞の体積変化に激しく影響する。
図４Ｃの結果より、強制水泳テストでは、２つのＮＥＨ阻害剤の何れもＥＢＤの運動皮質層への浸出を低下させることができることが判明される。
【００３９】
＜４．行為活動関連のストレスが急性の血液脳関門開放に寄与しない＞
ストレスが血液脳関門開放を遅らせる要素の１つとして知られており、これにより湾岸戦争の復員軍人で観察された中枢薬物の副作用も解釈される。前記試験例において、高架式プラットホームテスト及び強制水泳テストが試験動物にストレスを与えることが分かったので、本試験例では更にストレス自体が血液脳関門開放に寄与するかについて検討する。
【００４０】
図５Ａ〜図５Ｄを参照されたい。図５Ａ〜図５Ｄは、ストレス関連の行為活動試験結果である。図５Ａは、閉所恐怖テストにおける、ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図５Ｂは、不動化テストにおける、ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図５Ｃは、ストレス関連の行為活動試験における、ラットの体内のコルチコステロン濃度の変化である。図５Ｄは、ストレス関連の行為活動試験における、ラットの体内のＯ2／ＣＯ2の含有量である。
【００４１】
実験では、ラットに対してそれぞれ閉所恐怖テスト及び不動化テストを行い、この２つのストレステストをする場合、運動活動が制限され且つスペース観察が禁止されることで、ラットには閉所恐怖ストレス及び束縛ストレスが感じられる。しかしながら、図５Ａ及び図５Ｂの結果より、閉所恐怖テスト及び不動化テストにおいて、実験群のラットは、脳中の各領域におけるＥＢＤ検測量が対照群のラットと特別な差異はないことが判明される。図５Ｃの結果より、ラットは、閉所恐怖テスト及び不動化テストにおいて発生した上昇のコルチコステロンが高架式プラットホームテスト又は強制水泳テストで発生したものとほぼ同じ、コルチコステロンがストレス激素の指標であることが判明される。
厳しいストレス（束縛ストレスを含む）が各種のストレス源に長時間及び／又は長い間に露出されることで生じたが、厳しいストレスが遅らせるように血液脳関門を開放させることが分かった。しかし、図５Ａ及び図５Ｂの結果ではラットの血液脳関門が急性閉所恐怖ストレス又は束縛ストレスで開放することは発見されなかった。
従って、上記データから、高架式プラットホームテスト及び強制水泳テストにおいて、急性血液脳関門開放が単にストレスによるものではないことを推定できる。
【００４２】
従来の検討では、プロスタグランジン及びセロトニンがストレスによる血液脳関門開放と関わりがあることが分かった。実験ではｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ又はｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅをラットの体内に腹腔内注射し、また強制水泳テストを行って、プロスタグランジン及びセロトニンの血液脳関門開放に対する影響を検討した。
その結果、ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎがプロスタグランジンの合成を減少させることができ、ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅがシナプス後受容体部分に作用し、セロトニンと競争対抗した。ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ及びｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅの注射量がそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ及び１５ｍｇ／ｋｇであった。
しかしながら、ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎで処理されたラットには強制水泳テストの過程中で動かないままに保つものが２匹（２／６）であり、ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅで処理されたラットには動かないままに保つものは４匹（４／６）であり、ＤＭＳＯ（担体）及びＥＩＰＡで処理されたラットには動かない状況はなかった（０／６）。
ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ及びｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅの本試験に用いる投薬量がラットに著しい鎮静作用を果たしたことに対して、担体及びＥＩＰＡ（５ｍｇ／ｋｇ）の投薬量がラットに鎮静作用を果たしなかったことが判明される。
従って、従来の検討でのｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ及びｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅの血液脳関門開放に対する抑制作用が、前記試験例における神経元活動の依存性とは一致であり、血液脳関門開放の抑制は、プロスタグランジン又はセロトニンを抑制した直接な結果ではない。
【００４３】
＜５．酸素呼吸がＣＯ2／Ｈ+により調節される血液脳関門開放を可能にする＞
血液脳関門の感度は、浸透圧の変化及びＮＨＥの機能性血液脳関門開放での作用（図４Ｃ参照）によって決まり、本試験では血液ガス／電解質分析装置によってラットの血液中のＮａ＋レベル及び浸透圧を測定し、結果については下記表１、下記表２及び図５Ｄを参照されたい。
**はＰ＜０．０１を表し、***はＰ＜０．００１を表し、#はＰ＜０．０５を表し、##はＰ＜０．０１を表す。
【００４４】
【表１】
2016204354.tif 000003
【００４５】
【表２】
2016204354.tif 000004
【００４６】
実験の結果より、本試験例でテストした行為活動の何れにもラットのＮａ+レベル及び浸透圧の変化が見られなかったことが判明される。
予想外に、血液ガスのデータによると、高架式プラットホームテスト及び強制水泳テストを行われたラットは、血液中の酸素分圧（ｐＯ2）の何れも向上した（高架式プラットホームテストＰ＞０．０５；強制水泳テストＰ＜０．０００１）ことが判明される。また表２のデータより、ｐＯ2の向上が経時に減衰するようなものである（高架式プラットホームテストＰ＝０．０４７６；強制水泳テストＰ＝０．２７７５）ことが判明される。
従って、本試験例では、更にｐＯ2を増加させる場合直接血液脳関門浸透性に影響を与える可能性について検討する。
【００４７】
図６Ａ、図６Ｂを参照されたい。図６Ａ、図６Ｂは、ｐＯ2の増加による血液脳関門浸透性への影響の結果である。図６Ａは、閉所恐怖テストにおける、ラットの脳中の各領域におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図６Ｂは、閉所恐怖テストにおける、ラットの血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。実験では、ラットを空気室に置いて、普通の空気又は純酸素（１００％のＯ２）を呼吸させ、ラットに対して閉所恐怖テストを行った。
図６Ａの結果より、純酸素を呼吸したラットは、ＥＢＤの運動皮質層、尾状核／被殻及び海馬状隆起に浸出した量が向上したことが判明され、血液脳関門浸透性が向上したことが判明されたが、向上の結果が著しくなかった（Ｐ＞０．０５）。この結果より、ｐＯ2の増加だけで、行為活動で観察された血液脳関門浸透性の差異は解釈されないことを推定できる。
【００４８】
図４Ｂの結果より、ＣＯ2／Ｈ+によって血液脳関門開放を触発することができることが分かり、本試験例では、更にｐＯ2が向上する場合に高二酸化炭素によって血液脳関門を開放させることができるかを確認する。実験では、ウレタン（ｕｒｅｔｈａｎｅ）でラットに麻酔をかけて行為活動を一時的に停止させ、またラットを群に分けた後で、それぞれ異なった酸素含有気体源を９０分間呼吸させ、ラットの脳中の各領域のＥＢＤの浸出量を検測した。
酸素含有気体源としてそれぞれ普通の空気（２０％のＯ2）、１００％のＯ2、２０％のＣＯ2を入れた空気（２０％ＣＯ2：２０％のＯ2）及び２０％のカーボゲン（２０％ＣＯ2：８０％のＯ2）を用いた。
【００４９】
下記表３、図７Ａ、図７Ｂ及び付属書類２を参照されたい。
表３では、ラットが異なったガスを吸入した後でｐＯ2、二酸化炭素分圧（ｐＣＯ2）及び血液中のｐＨ値に与える影響を、血液ガス分析によって証明する。
図７Ａ、図７Ｂは、ラットが高二酸化炭素の酸素含有気体源を吸入した後で血液脳関門浸透性に与えた影響の結果である。図７Ａは、ラットが異なった酸素含有気体源を吸入した場合の脳部のＥＢＤの浸出図である。図７Ｂは、ラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
付属書類２は、図７Ａの着色図である。
【００５０】
【表３】
2016204354.tif 000005
【００５１】
表３の結果より、単にｐＯ2だけでは血液脳関門浸透性に影響を与えないことが判明されたが、図７Ａ及び図７Ｂに示すＥＢＤ浸出の結果より、ｐＯ2がＣＯ2／Ｈ+により調節される血液脳関門開放を可能にすることが判明される。
【００５２】
部分的な代謝性酸中毒は、局部の脳活動により引き起こされるが、全脳に渡る代謝性酸中毒は、低換気により誘導されることがある。前記試験例から、血液ｐＯ2を向上させると、ＣＯ2／Ｈ+により調節される血液脳関門開放の効果を大幅に向上させることができることが分かり、本試験例では、次に更に低換気の場合にｐＯ2を向上させることで血液脳関門を開放させるかについて検討する。実験では、まずＥＢＤをラットの体内に注射した後で、ラットに対して異なる換気程度で呼吸処理を行い、またラットの脳中の各領域及び血液中のＥＢＤ浸出量を検測した。呼吸処理として、それぞれ生理的速度、低換気及び常規換気等の３つがあり、気管切開術によって生理的速度の呼吸数を約９０ＢＰＭ（ｂｒｅａｔｈ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ；１分間の呼吸回数）、常規換気の呼吸数を８０ＢＰＭにし、低換気の呼吸数を５０ＢＰＭにし、また低換気のラットを２群に分け、１群に普通の空気を呼吸させ、別の１群に１００％のＯ2を呼吸させた。
【００５３】
下記表４、図８Ａ〜図８Ｃ及び付属書類３を参照されたい。
表４は、異なる換気程度でのラット動脈中の血液ガス及び電解質の含有量である。
図８Ａ〜図８Ｃは、異なった換気程度による血液脳関門浸透性への影響の結果である。図８Ａは、ラットの異なった換気程度での脳部ＥＢＤの浸出図である。図８Ｂは、ラットの低換気状況での脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図８Ｃは、換気率を向上させる場合のラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
付属書類３は、図８Ａの着色図である。
【００５４】
【表４】
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【００５５】
表４、図８Ａ及び図８Ｂの結果より、低換気の場合に１００％のＯ2を呼吸するラットでは、ｐＯ2及びｐＣＯ2が同時に向上し且つ血液脳関門を開放させたが、低換気の場合に普通の空気を呼吸するラットでは、ｐＣＯ2しか向上せず、且つ正常呼吸の群別に比べ、低換気の場合に普通の空気を呼吸すると血液脳関門浸透性に影響を与えないことが判明される。
同様に、図８Ｃの結果より、換気率を向上させるとＯ2の吸入による血液脳関門の開放が弱くなることが判明されるので、血液脳関門を開放させるには低換気期間中に全身のＣＯ2／Ｈ+の累積が必要であることが確認される。
本試験例のデータより、有酸素運動の場合に血液ｐＯ2の向上により代謝性酸中毒による血液脳関門開放を強くすることができることが判明されるので、無酸素運動により僅かな血液脳関門開放しか達成できない原因も明らかになる。
【００５６】
［二、酸素含有気体源による血液脳関門浸透性の向上］
第一部分の試験例より、個体の有酸素運動の場合に血液ｐＯ2を向上させると血液脳関門開放を達成できることが分かった。次に、この部分の試験例では、酸素含有気体源が血液脳関門開放を如何に調節するか、血液脳関門を開放させた後で可逆であるか、酸素含有気体源を吸入すると個体に悪影響を与えるか、及び酸素含有気体源が確実に生物剤の大脳への伝送に寄与するかについて更に検討する。
【００５７】
＜１．酸素含有気体源を吸入して分圧及び接触時間に依存するように血液脳関門を開放＞
血液脳関門を効果的に開放させるには酸素含有気体源を吸入する場合の分圧の必要性を確認するために、実験では、ラットを酸素含有気体源が充填された空気室内に置いて、ＥＢＤをラットの体内に静脈注射し、酸素含有気体源を９０分間吸入した後の脳実質部分におけるＥＢＤ浸出量を測って、血液脳関門浸透性を定量した。９０分間の時間は、光学及びスペクトルによるＥＢＤ浸出量の定量分析には充分であった。
本試験例において、酸素含有気体源として、それぞれ普通の空気、５％のカーボゲン（５％のＣＯ2：９５％Ｏ2）、１０％のカーボゲン（１０％のＣＯ2：９０％Ｏ2）及び２０％のカーボゲン（２０％のＣＯ2：８０％Ｏ2）を用いた。
【００５８】
ラットが酸素含有気体源を吸入する場合の血液脳関門開放に対する影響である図９Ａ〜図９Ｆ及び付属書類４を参照されたい。
図９Ａ〜図９Ｆは、ラットが酸素含有気体源を吸入する場合の血液脳関門開放に対する影響を示す特性図である。
図９Ａは、異なった酸素含有量の気体源を吸入したラットの脳中の各領域におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図９Ｂは、異なった酸素含有量の気体源を吸入したラットの血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
図９Ｃは、２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの脳中の各領域におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。図９Ｄは、２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
図９Ｅは、２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの肝臓中のＥＢＤ検測量の定量分析図である。図９Ｆは、２０％のカーボゲンに異なる時間で接触したラットの脳部のＥＢＤの浸出図である。
付属書類４は、図９Ｆの着色図である。
【００５９】
図９Ａの結果より、ラットが５％のカーボゲンを吸入した場合、血液脳関門を僅かに開放させたことが判明される。しかしながら、２０％のカーボゲンを吸入したラットでは、ＥＢＤの脳部への浸出現象が著しく、血液脳関門が明らかに開放されるので、カーボゲンが分圧に依存するように（Ｐ＜０．０００１）血液脳関門のＥＢＤに対する浸透性を向上させることを推論できる。また、図９Ｂの結果より、酸素含有気体源を吸入する場合、ラットの血液におけるＥＢＤ濃度に影響を与えないことが判明される。
【００６０】
従って、本試験例では、カーボゲンの吸入の血液脳関門開放の速度に対する影響を更に検討する。実験では、まずＥＢＤをラットの体内に注射し、またラットをそれぞれ２０％のカーボゲンを充填した空気室に３０、６０及び９０分間置いて、２０％のカーボゲンに接触した後ですぐに飼育箱に戻し、ＥＢＤを注射した後の９０分間でＥＢＤ浸出量を検測した。
図９Ｃ、図９Ｆ及び付属書類４の結果より、２０％のカーボゲンに３０分間接触したラットはＥＢＤが僅かに脳中に浸出されるが、２０％のカーボゲンに９０分間接触したラットは脳部にＥＢＤが著しく浸出されたことが判明され、ＥＢＤ浸出が時間依存性を有することが判明されるので、カーボゲンにより調節される血液脳関門開放は接触時間依存性（Ｐ＜０．０００１）を持つことを推論できる。
また、図９Ｄ及び図９Ｅの結果より、カーボゲンが血液中のＥＢＤの含有量又はＥＢＤの肝臓への浸出に影響を与えず、その血液脳関門浸透性に対する影響の効果と相反することが判明される。
【００６１】
＜２．酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放が快速に回復可能＞
従来の技術において、治療関連の血液脳関門開放の最大の問題は、可逆性が悪いことにあり、例えば、頸動脈を介して高張溶液を注射することで血液脳関門を開放させる場合、ラットには５時間を超えた回復時間が必要であるが、ヒトには６時間を超えた回復時間が必要である。静脉処理による血液脳関門の開放は、耐久性が変わりやすいので制御しにくく、これは化学療法薬物が中枢神経系において伝送される場合に実験室結果と臨床結果との間に差異がある原因でもある。
【００６２】
酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放が可逆であるかを確認するために、実験では、実験群を９群にし、まずラットを３群に分け、それぞれ２０％のカーボゲンを３０分間、６０分間及び９０分間吸入させ、また各群のラットを３群に分け、その１群としてカーボゲンを吸入させた後すぐにＥＢＤをラットの体内に注射し、１群としてカーボゲンを吸入させた後の１時間でＥＢＤをラットの体内に注射し、別の群としてカーボゲンを吸入させた後の２４時間でＥＢＤをラットの体内に注射した。ＥＢＤを注射した後の９０分間でまたＥＢＤ浸出量を検測した。対照群として普通の空気を吸入させた後でＥＢＤを注射し、ＥＢＤを注射した後の９０分間でＥＢＤ浸出量を検測した。
【００６３】
図１０Ａ〜図１０Ｃを参照されたい。図１０Ａ〜図１０Ｃは、酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放の可逆性試験の結果である。
図１０Ａは、２０％のカーボゲンを３０分間吸入したラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
図１０Ｂは、２０％のカーボゲンを６０分間吸入したラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。
図１０Ｃは、２０％のカーボゲンを９０分間吸入したラットの脳中の各領域及び血液におけるＥＢＤ検測量の定量分析図である。実験の結果より、酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放は快速で可逆であることが判明され、ラットが炭素・酸素の混合ガスを充填された空気室から離れた後、カーボゲンによる血液脳関門開放がすぐに回復できることが観察される。
図１０Ａの結果より、カーボゲンに３０分間接触したラットは、血液脳関門の浸透性が１時間内で１５０％から１００％の基準線レベルまで回復できることが判明される。
図１０Ｂの結果より、カーボゲンに６０分間接触したラットは、血液脳関門の浸透性が２４時間内で２５０％から１００％の基準線レベルまで回復できることが判明される。
図１０Ｃの結果より、カーボゲンに９０分間接触したラットは、血液脳関門の浸透性が１時間内で４００％から１００〜１５０％の基準線レベルまで回復できることが判明される。
【００６４】
＜３．酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放が代謝及び認知欠陥を引き起こさない＞
臨床適用において安全性の問題は非常に重要であり、従来の検討では短時間の血液脳関門開放が神経系の損傷を引き起こさないことが分かった。しかし、血液脳関門開放を引き起こす実行過程が不良であれば個体にとって有害となる可能性がある。例えば、高張溶液を動脈注射することで血液脳関門を開放させることは、化学療法薬物を伝送する常用プログラムであるが、これらの薬物を注射するにはハイテク要求の侵襲性手術が必要であり、臨床上の誤差が発生すれば脳損傷になる可能性がある。超音波刺激により血液脳関門を開放させてもよいため侵襲性手術しなくてもよいが、不適当な超音波の使用により微小血管損傷や組織出血を引き起こす可能性もある。
従来の方法に比べ、酸素含有気体源を吸入するのは、より安全な取替方法により調節される血液脳関門開放である。カーボゲンによる中枢神経疾患の治療方法の大部分が他のより効果的な治療方法に取り替えられたが、カーボゲンに急性的に繰り返して接触すれば、臨床に悪影響を与える記載がある。
【００６５】
カーボゲンの吸入がラットに不良影響を与えるかを確認するために、実験では、ラットを群に分け、それぞれ２０％のカーボゲンを３０分間、６０分間及び９０分間吸入させ（０日目）、ラットの−４日目、０日目、７日目及び１８日目での体重、０日目、７日目、１４日目及び２０日目での食物摂取量、２０日目での自発的な行為活動、及び２２日目での学習及び記憶様態（新規物体認識テスト）を測定した。本試験例において、トレーサー定量上の技術制限で、定量の血液脳関門開放を取得するように、実験ではラットを少なくとも２０％のカーボゲンに３０〜９０分間接触させた。カーボゲンに対するより短い接触時間でも血液脳関門を開放させる可能性を除外することはできず、例えば、従来の技術では、既に精神診療所に施されたカーボゲンに対するより短い吸入時間でもよい。
【００６６】
図１１Ａ〜図１１Ｄを参照されたい。図１１Ａ〜図１１Ｄは、酸素含有気体源の吸入によるラットの代謝や認知機能への影響である。
図１１Ａは、ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の体重変化の定量分析図である。図１１Ｂは、ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の食物摂取量の定量分析図である。図１１Ｃは、ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の２０日目の自発的な行為活動の定量分析図である。図１１Ｄは、ラットが２０％のカーボゲンを吸入した後の２２日目の新規物体認識テストの定量分析図である。
【００６７】
図１１Ａ及び図１１Ｂの結果より、カーボゲンを３０分間吸入した後で体重や食物摂取量が対照群のラットと比べ何の影響も受けないことが判明される。それに対して、カーボゲンを６０や９０分間吸入すれば、ラットの１週目の食物摂取量を向上させるが、ラットが２週目で正常の行為モデルに回復した。
図１１Ｃの結果より、カーボゲンに３０分間、６０分間又は９０分間接触するにもかかわらず、ラットの自発的な活動行為には影響を与えないことが判明され、自発的な行為活動によりラットが焦慮するかどうかを評価することができる。
図１１Ｄの結果より、カーボゲンを吸入したラット群別と対照群とが新規物体認識テストでの様態がほぼ同じであることが判明され、カーボゲンの吸入がラットの学習や記憶様態に影響を与えないことが判明される。
【００６８】
＜４．酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放が記憶除去ペプチドの中枢神経系への伝送に寄与＞
酸素含有気体源の吸入により調節される血液脳関門開放の生物剤の伝送での有効性を評価するために、実験では記憶除去ペプチドＺＩＰをラットの体内に注射し、ラットに酸素含有気体源を（２０％のカーボゲン）６０分間吸入させ、また新規物体認識テストによってラットの記憶回復を評価した。新規物体認識テストの工程は、試験例一の２のｉに示すようなものであるが、ここでまた詳しく説明しない。
実験の時、ラットを３群にランダムに分け、テストの１日目の新規物体認識テストを行う前にまず下記処理を行った。群別１として生理食塩水をラットの体内に腹腔内注射して酸素含有気体源を吸入させ、群別２としてラットにＺＩＰを腹腔内注射しただけで酸素含有気体源を吸入させなく、群別３としてＺＩＰをラットの体内に腹腔内注射して酸素含有気体源を吸入させた。
【００６９】
図１２Ａ〜図１２Ｄを参照されたい。図１２Ａ〜図１２Ｄは、酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放がＺＩＰの大脳への伝送に寄与する結果である。
図１２Ａは、新規物体認識テストの流れ模式図である。図１２Ｂの部分は、テストの１日目にラットの新規物体認識テストでの結果の定量分析図である。図１２Ｃの部分は、テストの２日目のラットの新規物体認識テストでの結果の定量分析図である。図１２Ｄの部分は、ラットの新規物体認識テストでの結果図である。
【００７０】
実験の結果より、この３群のラットは、訓練の当日（０日目）に玩具をいじる（識別）行為で特に差異（データ無し）ないことが判明されるが、図１２Ｂ及び図１２Ｄの結果より、試験の当日（１日目）に、群別１（生理食塩水を注射して酸素含有気体源を吸入させた）及び群別２（ＺＩＰを注射しただけ）のラットは、旧い玩具よりも新しい玩具を好むことに対して、群別３（ＺＩＰを注射して酸素含有気体源を吸入させた）のラットは、新しい玩具や旧い玩具の何れにも偏愛を現さなかったことが判明される。テストの１日目が終了すると、新しい玩具でも旧い玩具でも、群別３のラットにとって何れも旧い玩具になると推定する。従って、酸素含有気体源及び／又はペプチドがラットの新しい記憶に対する学習を阻止するかを評価するために、図１２Ａの流れ図に示すように、テストの２日目に各群のラットを２番目の新しい玩具のあるスペースに置いた。
図１２Ｃ及び図１２Ｄの結果より、ＺＩＰで処理されたラットにも関わらず、２番目新しい玩具を明確に認識できることが判明され、この結果が従来の検討で見られたものと一致であり、ＺＩＰを海馬状隆起に注射すれば旧い記憶を解消することができるが、新しい記憶の形成を阻止しない。
【００７１】
以上をまとめると、本発明は、酸素含有気体源の用途（使用方法）を提供する。前記酸素含有気体源は、血液脳関門浸透性を向上させることができ、酸素含有気体源により調節される血液脳関門開放が臨床上の安全性を持ち、個体の代謝や認知の欠失を引き起こすことなく、操作しやすく高価な機器を必要とせず、生物剤の大脳への伝送に寄与する。そして、その快速な可逆性のため、生物剤が大脳に伝送された後で血液脳関門の非浸透性が快速に回復して、大脳の環境を外界物質に干渉されないように保護できるので、本発明の酸素含有気体源を血液脳関門浸透性向上用の医薬組成物の調製に用いることができる。
【００７２】
本発明を複数の実施形態によって以上のように開示したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者であれば、本発明の精神及び範囲から逸脱しない限り、各種の変更及び修飾を行うことができる。本発明は、特許請求の範囲の記載によって限定される。
【図１Ａ】
2016204354.tif 000007
【図１Ｂ】
2016204354.tif 000008
【図１Ｃ】
2016204354.tif 000009
【図２Ａ】
2016204354.tif 000010
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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