(57)【要約】【課題】マルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲの特異性を改善すること。【解決手段】２以上の標的核酸を増幅する方法であって、ＲＴ−ＰＣＲに必要な組成のすべてを含む反応液に試料を添加し、適当範囲での条件設定のもと、マルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲを行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）  試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために必要な組成、および該ｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成のすべてを含む反応液に試料を添加する工程
（ｂ）  ２０℃から６５℃の温度で１分以上インキュベートする逆転写反応工程
（ｃ）  ９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、５０℃から７５℃の間で選ばれるアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う工程
（ｄ）  上記工程（ｃ）に続き、９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、前回サイクルのアニーリング兼伸長反応温度と同等かまたは０．２℃以上低い第二のアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う工程
（ｅ）  工程（ｄ）を少なくとも２０回以上繰りかえし、工程（ｃ）の１回目の熱サイクルのアニーリング兼伸長反応温度よりも少なくとも３℃低くなるようなアニーリング兼伸長反応温度で最終サイクルを行う工程
を含む、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅法。
【請求項２】
２以上の標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）  試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために必要な組成、および該ｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成のすべてを含む反応液に試料を添加する工程
（ｂ）  ２０℃から６５℃の温度で１分以上インキュベートする逆転写反応工程
（ｃ）  ９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、４５℃から７５℃の間で選ばれるアニーリング温度と、５０℃から８０℃の間で選ばれる伸長反応温度（ここで、アニーリング温度は伸長反応温度を超えない。）との間で変化する２サイクル以上の熱サイクリング反応を行う工程（ここで、ｎ回目のサイクルのアニーリング温度はｎ−１回目のアニーリング温度と同等かまたは０．２℃以上低いアニーリング温度である。）
（ｄ） 工程（ｃ）を少なくとも２０サイクル以上繰りかえし、最終サイクルのアニーリング温度が１回目の熱サイクルのアニーリング温度よりも少なくとも３℃低くなるような最終サイクルを行う工程
を含む、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅法。
【請求項３】
試料が核酸抽出の工程を経ることなく得られた試料である、請求項１または２に記載の核酸増幅法。
【請求項４】
工程（ｂ）からＰＣＲの最終サイクルまでが３時間以内に終了する、請求項１から３のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項５】
工程（ａ）の反応液に蛍光インターカーレーターを含む、請求項１から４のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項６】
蛍光融解曲線法により標的ＲＮＡの増幅を検出する、請求項５に記載の核酸増幅法。
【請求項７】
工程（ａ）の反応液に内部標準として増幅される核酸およびそれを増幅するためのプライマーを含む、請求項１から６のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項８】
標的ＲＮＡがＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの全部または一部である、請求項１から７のいずれかに記載の核酸増幅法。
【請求項９】
ＲＮＡウイルスが腸管病原性ウイルスである、請求項８に記載の核酸増幅法。
【請求項１０】
腸管病原性ウイルスがノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスから選ばれる、請求項９に記載の核酸増幅法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための反応液を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲによる核酸増幅法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、遺伝子診断、臨床検査といった医療分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等においても、広く用いられている。
代表的な核酸増幅法はＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）である。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。
【０００３】
検出対象核酸がＲＮＡである場合、たとえば病原性微生物の検出において対象がＲＮＡウイルスである場合、あるいは遺伝子の発現量をｍＲＮＡの定量によって測定する場合などは、逆転写酵素によりＲＮＡをｃＤＮＡに変換する反応（逆転写反応）をＰＣＲの前に行う。
【０００４】
この逆転写酵素による逆転写反応とＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲは、各々の酵素の至適条件の違いから、先に逆転写反応を行いついで別の反応液に移してＰＣＲが行われることが多い。この煩雑さを解消するために２つの反応を同一反応液中で連続して行う方法、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ法が近年に開発された。（特許文献１）
【０００５】
核酸増幅法の増幅の対象となる遺伝子は目的に応じて様々である。しばしば複数の対象遺伝子を同時に検出する必要が生じる場合もある。たとえば、感染症の原因菌を調査しようとするとき、候補となる複数の病原性微生物の遺伝子を標的としてＰＣＲを行い、得られた標的の種類を判別することで原因菌を判定することがある。あるいは、複数のｍＲＮＡの発現量をひとつの反応液中でＰＣＲし測定することもある。これらの２以上の標的核酸を増幅する方法はマルチプレックスＰＣＲと呼ばれ、反応液に２以上のプライマーペアを含んでいる。（非特許文献１）
【０００６】
さらには、ワンステップＲＴ−ＰＣＲを複数の遺伝子に対して行うためにマルチプレックスＰＣＲと組合せたマルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲが行われている。（非特許文献２、３）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許２９６８５８５
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ３８，  ２６０２−２６１０，  （２０００）
【非特許文献２】Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  １１９，  １３７−１４４，  （２００３）
【非特許文献３】Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｄｉａｇｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  １７，  ２３２−２３８，  （２００５）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的はマルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲの特異性を改善することである。
【００１０】
マルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲは、簡便に複数種の遺伝子を検出することができ、非常に簡便である。しかし、以下に述べるように、ワンステップＲＴ−ＰＣＲにマルチプレックスＰＣＲを適用すること、あるいはマルチプレックスＰＣＲにワンステップＲＴ−ＰＣＲを適用することは、特異性と検出感度を両立させることが困難であり、改善の余地があった。
【００１１】
ワンステップＲＴ−ＰＣＲ法は、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの２つの酵素に対してどちらも活性を発現するような反応組成を構築し、逆転写の次にＰＣＲを連続して反応する方法である。それぞれの酵素の反応至適条件が異なるため、どちらの活性も発現するような反応組成ではパフォーマンスの低下がある。逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼの両方の機能を持った酵素も存在するが、やはり二つの活性を発現する条件が異なるため、若干のパフォーマンスの低下がある。
【００１２】
特に感染症の検査では複数の株や亜種をカバーするため遺伝子上の保存性の高い領域にプライマー位置が限定される。そのため非特異反応を抑制することが難しい場合が多い。多くの場合、ＰＣＲのアニーリングの温度を調節することで特異性を確保しようとするが、それは検出感度とトレードオフの関係にあることが多い。
【００１３】
すなわち、ワンステップＲＴ−ＰＣＲは同一組成中で逆転写反応とＰＣＲを行うため、その組成はそれぞれの至適からずれた条件となっており、非特異反応が多くなる場合がある。また、さらにそれをマルチプレックスＰＣＲで行うと、投入するプライマーの種類が増加し、さらに非特異反応を引き起こしやすくなるという側面がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、マルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲにタッチダウンサイクルを用いると、特異性高く高感度検出を実現できることを見いだし、本発明を成すに至った。
代表的な本願発明は以下の通りである。
【００１５】
すなわち本発明は、
（項１）
２以上の標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）  試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために必要な組成、および該ｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成のすべてを含む反応液に試料を添加する工程
（ｂ）  ２０℃から６５℃の温度で１分以上インキュベートする逆転写反応工程
（ｃ）  ９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、５０℃から７５℃の間で選ばれるアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う工程
（ｄ）  上記工程（ｃ）に続き、９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、前回サイクルのアニーリング兼伸長反応温度と同等かまたは０．２℃以上低い第二のアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う工程
（ｅ）  工程（ｄ）を少なくとも２０回以上繰りかえし、工程（ｃ）の１回目の熱サイクルのアニーリング兼伸長反応温度よりも少なくとも３℃低くなるようなアニーリング兼伸長反応温度で最終サイクルを行う工程
を含む、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅法である。
【００１６】
また、本発明は、
（項２）
前記核酸増幅法において、アニーリングと伸長を同時に行わない方法であってもよい。
すなわち本発明は、２以上の標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）  試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために必要な組成、および該ｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成のすべてを含む反応液に試料を添加する工程
（ｂ）  ２０℃から６５℃の温度で１分以上インキュベートする逆転写反応工程
（ｃ）  ９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、４５℃から７５℃の間で選ばれるアニーリング温度と、５０℃から８０℃の間で選ばれる伸長反応温度（ここで、アニーリング温度は伸長反応温度を超えない。）との間で変化する２サイクル以上の熱サイクリング反応を行う工程（ここで、ｎ回目のサイクルのアニーリング温度はｎ−１回目のアニーリング温度と同等かまたは０．２℃以上低いアニーリング温度である。）
（ｄ） 工程（ｃ）を少なくとも２０サイクル以上繰りかえし、最終サイクルのアニーリング温度が１回目の熱サイクルのアニーリング温度よりも少なくとも３℃低くなるような最終サイクルを行う工程
を含む、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅法である。
【００１７】
また、本発明は、以下のいずれかの形態をとることができる。
（項３）試料が核酸抽出の工程を経ることなく得られた試料である、項１または２に記載の核酸増幅法。
（項４）工程（ｂ）からＰＣＲの最終サイクルまでが３時間以内に終了する、項１から３のいずれかに記載の核酸増幅法。
（項５）工程（ａ）の反応液に蛍光インターカーレーターを含む、項１から４のいずれかに記載の核酸増幅法。
（項６）蛍光融解曲線法により標的ＲＮＡの増幅を検出する、項５に記載の核酸増幅法。
（項７）工程（ａ）の反応液に内部標準として増幅される核酸およびそれを増幅するためのプライマーを含む、項１から６のいずれかに記載の核酸増幅法。
（項８）標的ＲＮＡがＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの全部または一部である、項１から７のいずれかに記載の核酸増幅法。
（項９）ＲＮＡウイルスが腸管病原性ウイルスである、項８に記載の核酸増幅法。
（項１０）腸管病原性ウイルスがノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスから選ばれる、項９に記載の核酸増幅法。
（項１１）項１〜１０のいずれかに記載の核酸増幅法を実施するための反応液を含むキット。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によって、マルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲで、特異性高く高感度検出を達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】マルチプレックス−ツーステップＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルス遺伝子の増幅の結果
【図２】通常サイクルによるマルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルス遺伝子の増幅の結果
【図３】タッチダウンサイクルを用いたマルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルス遺伝子の増幅の結果。内部標準は８５℃、ノロウイルスＧ２陽性は８０℃、ノロウイルスＧ１陽性は７７℃にピークを与える。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
本発明の実施形態のひとつは、２以上の標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ） 試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために必要な組成、および、該ｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成のすべてを含む反応液に試料を添加する工程
（ｂ） ２０℃から６５℃の温度で１分以上インキュベートする逆転写反応工程
（ｃ） ９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、５０℃から７５℃の間で選ばれるアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う工程
（ｄ）  上記工程（ｃ）に続き、９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、前回サイクルのアニーリング兼伸長反応温度と同等かまたは０．２℃以上低い第二のアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う工程
（ｅ）  工程（ｄ）を少なくとも２０回以上繰りかえし、工程（ｃ）の１回目の熱サイクルのアニーリング兼伸長反応温度よりも少なくとも３℃低くなるようなアニーリング兼伸長反応温度で最終サイクルを行う工程
を含む、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅法（タッチダウン熱サイクルによるワンステップＲＴ−ＰＣＲ法）である。
【００２１】
前記本発明の核酸増幅法の実施形態は、アニーリングと伸長を同時に行わない方法であってもよい。
すなわち本発明は、２以上の標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）  試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために必要な組成、および該ｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成のすべてを含む反応液に試料を添加する工程
（ｂ）  ２０℃から６５℃の温度で１分以上インキュベートする逆転写反応工程
（ｃ）  ９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、４５℃から７５℃の間で選ばれるアニーリング温度と、５０℃から８０℃の間で選ばれる伸長反応温度（ここで、アニーリング温度は伸長反応温度を超えない。）との間で変化する２サイクル以上の熱サイクリング反応を行う工程（ここで、ｎ回目のサイクルのアニーリング温度はｎ−１回目のアニーリング温度と同等かまたは０．２℃以上低いアニーリング温度である。）
（ｄ） 工程（ｃ）を少なくとも２０サイクル以上繰りかえし、最終サイクルのアニーリング温度が１回目の熱サイクルのアニーリング温度よりも少なくとも３℃低くなるような最終サイクルを行う工程
を含む、ワンステップＲＴ−ＰＣＲによる核酸増幅法（タッチダウン熱サイクルによるワンステップＲＴ−ＰＣＲ法）である。
【００２２】
本発明の核酸増幅法が適用される試料は、標的ＲＮＡが含まれる可能性のある材料であればその由来は特に限定されない。
例えば、実験生物、培養細胞、ヒトや動物などの臨床検査に供される検体（たとえば尿、糞便、全血、血漿、唾液、口腔内擦過物、鼻腔液、鼻腔ぬぐい液、膣ぬぐい液、尿道擦過物など）、衛生管理に供される検体（たとえば吐しゃ物、ふき取りサンプル、食品材料など）、また環境測定に供される検体（たとえば河川水、海水、土壌、空気からの捕集物など）、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２３】
本発明における標的核酸はＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの全部またはその一部であってもよい。ＲＮＡウイルスとはゲノムをＲＮＡとして持つウイルスで、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、腸管病原性ウイルス（ノロウイルス、サポウイルス、ロタウイルスなど）、インフルエンザウイルスなど病原性を持つものも数多くある。これらが病原因子と疑われる場合、ゲノムＲＮＡを標的としたＰＣＲによる検査が行われる。
これらの検査は多くの検体を短時間に処理する必要があり、そのためワンステップＲＴ−ＰＣＲは非常に有効な手法である。一方で、これらのＲＮＡウイルスゲノムは多数の型が存在するため、それぞれの型に対しプライマー対を設計し、これら複数のプライマー対を同一反応組成内に投入するマルチプレックスＰＣＲが有効な手法である。本発明によれば、これまで実用化に多くの労力を必要としていたワンステップＲＴ−ＰＣＲとマルチプレックスＰＣＲを組み合わせたマルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲが簡便に実現される。
【００２４】
前記材料は、採取したものを核酸抽出の工程を経ることなくそのまま用いても良いし、核酸抽出および物理化学的な前処理のうち少なくともいずれかを施したものであっても良い。
前記核酸抽出には、シリカなどの核酸吸着体に核酸を吸着させ他の物質と分離回収する方法、フェノールなどの有機溶媒と接触させ核酸を水相に回収することで他の物質と分離する方法、エタノールなどのアルコール類を添加し核酸を不溶化し不溶物を回収することによって他の物質と分離する方法、などが挙げられるがこれらに限定されない。
前記物理化学的な前処理には、加熱処理、アルカリ性液へ浸漬しその後で中和する方法、物理的に破砕・粉砕する方法、酵素処理（たとえば、タンパク質分解酵素、多糖類分解酵素などによる処理）、あるいはこれらを２つ以上組合せた処理、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２５】
本発明の核酸増幅法における反応液には、逆転写反応からＰＣＲまでを行うためのすべての組成が含まれていればその組成は特に限定されない。すなわち、前記反応液には、試料中のＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するために必要な組成、および、該ｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分を増幅するために必要な組成をすべて含んでいれば良い。前記反応液の一例としては、逆転写酵素、逆転写プライマー、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰ、２価イオン、１価イオン、及び緩衝液を含む反応液が挙げられる。
本発明の核酸増幅法における反応液には、これらに加え、有機溶媒、有機酸、界面活性剤、アミノ酸、糖、ＤＮＡ結合タンパク質、などが添加剤として含まれることもある。
【００２６】
本発明の核酸増幅法における反応液には、上記のほかにキャリーオーバー汚染を防止するための組成として、ウラシルグリコシダーゼ、ｄＵＴＰが含まれていてもよい。ウラシルグリコシダーゼはＤＮＡ配列中に存在するウラシルを特異的に切り出し、ＤＮＡの分解を起こす酵素である。反応液にｄＵＴＰが含まれる組成でＰＣＲを行い得られるＤＮＡ断片はウラシルを含んでおり、ウラシルグリコシダーゼで分解される。一方、天然のＤＮＡはウラシルを含まないため、分解されない。これを利用したキャリーオーバー汚染を防止する方法が知られている。
【００２７】
本発明の核酸増幅法における逆転写反応は逆転写酵素によって行われる。逆転写酵素はＭＭＬＶ、ＡＭＶ、ＨＩＶなどのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが一般的であるが、これらに限定されず、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの機能を併せ持つ酵素であっても良い。これらの酵素は金属イオンをその活性発現に要求することが知られており、反応液にはたとえばマグネシウムイオンなどを含むべきである。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼなどの場合はマンガンイオンの方がＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の効率がよいため、これを含んでも良い。
【００２８】
本発明の反応液には、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を含んでいてもよい。ＲＮＡ分解酵素阻害剤はヒト胎盤由来のものが使われているが、これに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の核酸増幅法における逆転写反応のプライマー（逆転写プライマーとも記載）は、標的ＲＮＡに特異的なプライマー、ランダムプライマー、ｄＴプライマーなどが使用されうる。特異的プライマーはＰＣＲのプライマーと共通とすることもできる。また、これらのプライマーを２種以上混合して使用することもできる。
【００３０】
本発明の核酸増幅法における逆転写反応の反応温度は特に限定されない。好ましい温度範囲は用いられる逆転写酵素とプライマーに依存し、例えば２０℃から６５℃の間で行われる。
ウイルス由来の酵素はその活性至適温度は下限は３０℃付近、上限は４５℃付近であるが、その範囲外であっても酵素が実用上十分な活性を示す温度であれば、逆転写反応温度を適宜設定することができる。例えば、用いるプライマーにあわせて下限は２０℃、上限は５５℃の範囲で使用することが好ましい。ランダムプライマーを用いる場合は下限は２０℃、上限は３０℃、ｄＴプライマーを用いる場合は下限は２５℃、上限は４２℃、特異的プライマーを用いる場合は下限は３７℃、上限は５５℃がそれぞれ好ましい。
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を利用するような場合は、酵素活性の至適温度が５０℃以上になるので、下限は５０℃、上限は６５℃が好ましい。この場合、そのアニーリング温度から特異的プライマーの使用が望ましく、ランダムプライマーやｄＴプライマーは不適当である。
【００３１】
本発明における逆転写反応の時間は１分以上であれば特に限定されない。好ましい下限は２分である。好ましい上限は３０分、さらに好ましい上限は１０分である。
【００３２】
本発明の核酸増幅法においては、前記逆転写反応によって得られたｃＤＮＡの少なくとも一部の配列部分をＰＣＲによって増幅する。
本発明の核酸増幅法におけるＰＣＲは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼで触媒されることが好ましい。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは現在、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｂｓｔなど種々のものが入手可能であるがこれらに限定されない。これらはホットスタート機能を組み込まれたものであればなお好ましい。ホットスタート法は非特異反応を抑制するのに有効であり、本発明の目的を達するためには、ポジティブに作用する。
【００３３】
前記ＰＣＲにおけるプライマー（ＰＣＲプライマーとも記載）は、標的ｃＤＮＡに特異的なプライマーが使用される。これは上記逆転写反応に用いた特異的プライマーと同一であってもよい。また、これらのプライマーは、標的となる核酸の数に応じて２種以上混合して使用することもできる。また、フォワードまたはリバースのいずれかのプライマーを共通とすることもできる。
【００３４】
本発明におけるＰＣＲにより得られた増幅断片の解析は、電気泳動法、蛍光融解曲線法、各種プローブ法（Ｑプローブ、スコーピオンプローブ、ハイブリプローブなど）などが適用できる。また、温度昇降機能と蛍光測定機能を備えた機器であればＴａｑＭａｎプローブ、蛍光色素法などを用いれば、反応中にリアルタイムに増幅生成したＤＮＡ断片を検出識別することができる。これらを実施するための蛍光色素や蛍光標識プローブが反応液中に含まれていても良い。蛍光色素とは蛍光融解曲線解析を行うためのインターカーレーター色素であり、ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ、ＥｖａＧｒｅｅｎなどが市販されている。
【００３５】
本発明における反応液には、ＰＣＲの反応内部標準となる鋳型とプライマーを含んでいても良い。材料から核酸を分離精製せずに反応液に添加した場合、脂肪、多糖類、タンパク質などＰＣＲを阻害する物質も同時に添加される場合がある。これらによりＰＣＲが阻害された場合、真に標的となる核酸が含まれなかった場合と区別ができない。これを回避するため、反応が正常に進行すれば標的核酸がなくても増幅産物が得られる内部標準核酸とそのプライマーを反応液に添加する方法が知られている。本発明においてもこれを実施しうる。
【００３６】
本発明における前記ＰＣＲ増幅工程においては、マルチプレックスＰＣＲを行う。
例えば、前記逆転写反応で得られた２以上の標的核酸に対応する２以上のｃＤＮＡを、前記ｃＤＮＡに対応する２以上のプライマーペアを含む反応液中で増幅させる。
本発明において、２以上の標的核酸には、内部標準核酸も含まれる。例えば、内部標準核酸は、標的ＲＮＡが含まれる可能性のある材料に予め添加され、そのようにして得られた試料が本発明の核酸増幅法に供される。または、内部標準は反応液に予め含ませておいても良い。
このように、本発明におけるマルチプレックスＰＣＲには、標的となる核酸が１種類、内部標準核酸が１種類、合計２種類の核酸を標的とする場合も包含される。
【００３７】
ＰＣＲは変性（本明細書においては熱変性とも呼ぶ。）、アニーリング、伸長の３つの温度ステップのサイクルで構成される。以下に例を挙げて説明する。
本発明の核酸増幅法においては、変性は二本鎖ＤＮＡを解離させるのに十分な温度であれば特に限定されず、好ましい熱変性温度の下限は９０℃、上限は１００℃である。アニーリングは解離したＤＮＡにプライマーをアニーリングするステップで、その際の温度（アニーリング温度）は特に限定されないが、好ましいアニーリング温度の下限は４５℃であり、さらに好ましくは５０℃である。
一方好ましい上限は７５℃であり、さらに好ましくは７０℃である。伸長はＤＮＡポリメラーゼで相補鎖を合成するステップで、その際の温度（伸長温度）は特に限定されないが、好ましい伸長温度の下限は５０℃であり、上限は８０℃である。
前記サイクルにおいて、アニーリング温度は伸長反応温度を超えない。
【００３８】
前記のＰＣＲサイクルの例では、以下に例示するタッチダウン熱サイクルを採用する。
下記に示す工程（ｃ）を少なくとも２０サイクル以上繰りかえし、最終サイクルのアニーリング温度が１回目の熱サイクルのアニーリング温度よりも少なくとも３℃低くなるような最終サイクルを行う。
工程（ｃ）：前記熱変性温度と、前記アニーリング温度と、前記伸長反応温度との間で変化する２サイクル以上の熱サイクリング反応を行う（ここで、ｎ回目のサイクルのアニーリング温度はｎ−１回目のアニーリング温度と同等かまたは０．２℃以上低いアニーリング温度である。）。
【００３９】
また、前記の例において、アニーリングと伸長のステップは同一の温度条件および時間条件で同時に行われてもよい。この場合、温度サイクルは変性とアニーリングおよび伸長反応の２つのステップの温度の行き来になるのでシャトルＰＣＲと呼ばれることもある。その際の温度（アニーリング兼伸長温度）は特に限定されないが、好ましいアニーリング兼伸長温度の下限は５０℃であり、上限は７５℃である。
このＰＣＲサイクルの例では、以下に例示するタッチダウン熱サイクルを採用する。
工程（ｃ）：９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、５０℃から７５℃の間で選ばれるアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う。
工程（ｄ）：上記工程（ｃ）に続き、９０℃から１００℃の間で選ばれる熱変性温度と、前回サイクルのアニーリング兼伸長反応温度と同等かまたは０．２℃以上低い第二のアニーリング兼伸長反応温度との間で変化する１または複数サイクルの熱サイクリング反応を行う。
工程（ｅ）：工程（ｄ）を少なくとも２０回以上繰りかえし、工程（ｃ）の１回目の熱サイクルのアニーリング兼伸長反応温度よりも少なくとも３℃低くなるようなアニーリング伸長反応温度で最終サイクルを行う。
【００４０】
なお、本明細書において、前記シャトルＰＣＲは、２ステップＰＣＲとも呼ぶ。これに対し前記のアニーリングと伸長を同時に行わない方法は３ステップＰＣＲとも呼ぶ。
【００４１】
本発明におけるタッチダウン熱サイクルについて、さらに詳述する。
タッチダウン熱サイクルとは、初期のサイクル反応ではアニーリング温度を比較的高く設定して行い、サイクルが進行するに従ってアニーリング温度を徐々に下げていく方法である。また、アニーリングと伸長反応を同一の温度で行う場合においては、アニーリング兼伸長温度を徐々に下げていく方法である。
本明細書の００４１〜００４３段落において、「アニーリング温度」とは「アニーリング兼伸長反応温度」も含むものとする。
【００４２】
本発明におけるアニーリング温度を下げるパターンのひとつは、１サイクルごとに順次下げていく方法である。たとえば一つの態様として、アニーリング温度の１サイクル目：６０℃、２サイクル目：５９．５℃、３サイクル目：５９．１℃  とする方法である。この場合、各サイクルにおける温度の下がり幅は０．２℃以上であれば同一であっても同一でなくてもよい。最初のサイクルと最後のサイクルの温度差は２から１０℃となるのが好ましい。ＰＣＲのサイクル数としては２０−６０の間が好ましい。
【００４３】
また、他の態様としてはサイクル反応をブロックに分け、ブロックごとにアニーリング温度を下げる方法がある。たとえば、第一のブロック（１から５サイクル）：６０℃、第２のブロック（６から１５サイクル）：５８℃、第３のブロック（１６から３０サイクル）：５６℃とすることができる。このときブロックごとのサイクル数は任意であり、またブロック間のアニーリング温度の差も０．２℃以上であれば同一であっても同一でなくてもよい。最初のサイクルと最後のサイクルの温度差が２から１０℃となるのが好ましい。ＰＣＲのサイクル数としては２０−６０の間が好ましい。
【００４４】
本発明の核酸増幅法においては、逆転写反応工程からＰＣＲの最終サイクルまでが３時間以内に終了することが好ましい。
【００４５】
また、本発明の別の実施形態のひとつは、上記で説明した核酸増幅法を実施するための反応液を含むキットである。本発明のキットの形態は特に限定されない。
前記キットは、１つの組成物に上記で説明した核酸増幅法を実施するために必要なすべての物質を含むものであっても良いし、２種類以上の複数の組成物を組合せたものであって、使用時に適宜混合することで核酸増幅法を実施するための反応液を調製できるよう構成されているものであっても良い。その際に各組成物の構成は溶液であっても固形物（粉末、凍結乾燥品など）であっても良い。固形物の場合は使用時に精製水または予め調製された別の溶液組成物に溶解して調製できるよう構成されていれば良い。
【実施例】
【００４６】
実施例１．  マルチプレックス−ツーステップＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルス遺伝子の増幅
（１）ノロウイルスゲノムＲＮＡ
ＲＮＡポリメラーゼにより人工的に合成したＲＮＡ断片を用いた。ＧＩタイプとＧＩＩタイプのそれぞれを用いた。
（２）糞便サンプル
ノロウイスル陰性であることが確認されている糞便サンプルを１０％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に懸濁した。これを８，０００ｇで３分間遠心分離して得られた上清を糞便サンプルとして以下の検討に用いた。
（３）タンパク質変性処理
グリシン  １０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ５ｍＭを含む水溶液（前処理液）を調製した。
前処理液４  μｌと（２）で処理した糞便液１  μｌとを混合し、８５℃で１分間インキュベートした。
（４）逆転写反応
５Ｘ  ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡）４μｌ、
各１．０ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＴＴＰ、
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー（ＧＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー（ＧＩＩ検出用）、
ＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡）１０ｕｎｉｔ、
人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片２５０コピー
を含む反応液２０μｌを５０℃５分間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。
（５）ＰＣＲ
１０Ｘｂｕｆｆｅｒ（東洋紡）  ５ｕｌ、
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＴＴＰ、
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー（ＧＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー（ＧＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー（ＧＩＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー（ＧＩＩ検出用）、
０．３μＭ  内部標準Ｆプライマー、
０．３μＭ  内部標準Ｒプライマー、
（前記６種３組のプライマーのセットは融解曲線解析により、内部標準は８５℃、ノロウイルスＧ２陽性は８０℃、ノロウイルスＧ１陽性は７７℃にピークを与える。）
０．０１％  ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ（ライフテクノロジー）、
ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）５  ｕｎｉｔ、
ａｎｔｉ  Ｔａｑ  ｈｉｇｈ（東洋紡）１μｌ、
上記（４）の逆転写反応で作製したｃＤＮＡ合成反応液２μｌ、
内部標準プラスミドｐＢＲ３２２  ５０コピー
を含む反応液５０μｌを以下の温度サイクルで反応した。
９５℃  ５分、
９４℃  １０秒−５４℃  ４５秒  ４５サイクル、
（６）融解曲線解析
反応終了後、直ちに７０℃  ０．５℃／秒  ９０℃融解曲線解析に供した。すなわち、７０℃から  ０．５℃／秒  で９０℃まで上昇させた。
（７）結果
図１にその結果を示す。使用したプライマーセットは、ノロウイルスＧ１タイプが存在すると７６℃付近にピークを与えること、ノロウイルスＧ２タイプが存在すると８０℃付近にピークを与えること、内部標準は８５℃付近にピークを与えることがわかっている。
逆転写反応とＰＣＲをそれぞれ至適の条件で行うツーステップＲＴ−ＰＣＲであれば、マルチプレックスＰＣＲにおいても通常のサイクルでノロウイルスＲＮＡを検出できた。
【００４７】
実施例２．  通常サイクルによるマルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルス遺伝子の増幅
（１）ノロウイルスゲノムＲＮＡ
ＲＮＡポリメラーゼにより人工的に合成したＲＮＡ断片を用いた。ＧＩタイプとＧＩＩタイプのそれぞれを用いた。
（２）糞便サンプル
ノロウイスル陰性であることが確認されている糞便サンプルを１０％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に懸濁した。これを８，０００ｇ  ３分間遠心分離して得られた上清を糞便サンプルとして以下の検討に用いた。
（３）タンパク質変性処理
グリシン  １０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ５ｍＭを含む水溶液（前処理液）を調製した。
前処理液４  μｌと（２）で処理した糞便液１  μｌとを混合し、８５℃で１分間インキュベートした。
（４）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ
７５ｍＭ  トリス硫酸（ｐＨ７．５）、
３．７５ｍＭ  硫酸マグネシウム、
０．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＴＴＰ  、
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー（ＧＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー（ＧＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー（ＧＩＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー（ＧＩＩ検出用）、
０．３μＭ  内部標準Ｆプライマー、
０．３μＭ  内部標準Ｒプライマー、
（前記６種３組のプライマーのセットは融解曲線解析により、内部標準は８５℃、ノロウイルスＧ２陽性は８０℃、ノロウイルスＧ１陽性は７７℃にピークを与える。）
０．０１％  ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ（ライフテクノロジー）、
ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）１０  ｕｎｉｔ、
ａｎｔｉ  Ｔａｑ  ｈｉｇｈ（東洋紡）  １０  ｕｎｉｔ、
ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）  ２．５ｕｎｉｔ、
人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片２５０コピーを含む反応液４５μｌ
を、上記（３）でタンパク質変性処理を行った液５μｌに添加した。
これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃  ５分、
９５℃  ５分、
９４℃  １０秒−５４℃  ４５秒  ４５サイクル、
（５）融解曲線解析
反応終了後、直ちに７０℃  ０．５℃／秒  ９０℃融解曲線解析に供した。
すなわち、７０℃から  ０．５℃／秒  で９０℃まで上昇させた。
（６）結果
図２  にその結果を示す。逆転写反応とＰＣＲを同一の反応液中で連続し行うワンステップＲＴ−ＰＣＲの場合、マルチプレックスＰＣＲでは通常のサイクルでは非特異増幅が多くノロウイルスＲＮＡを検出できなかった。
【００４８】
実施例３．  タッチダウンサイクルを用いたマルチプレックス−ワンステップＲＴ−ＰＣＲによるノロウイルス遺伝子の増幅
（１）ノロウイルスゲノムＲＮＡ
ＲＮＡポリメラーゼにより人工的に合成したＲＮＡ断片を用いた。ＧＩタイプとＧＩＩタイプのそれぞれを用いた。
（２）糞便サンプル
ノロウイスル陰性であることが確認されている糞便サンプルを１０％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に懸濁した。これを８，０００ｇ  ３分間遠心分離して得られた上清を糞便サンプルとして以下の検討に用いた。
（３）タンパク質変性処理
グリシン  １０ｍＭ、ＥＧＴＡ  ５ｍＭを含む水溶液（前処理液）を調製した。前処理液４  μｌと（２）で処理した糞便液１  μｌとを混合し、８５℃で１分間インキュベートした。
（４）ワンステップＲＴ−ＰＣＲ
７５ｍＭ  トリス硫酸（ｐＨ７．５）、
３．７５ｍＭ  硫酸マグネシウム、
０．２５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン、
各０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ，  ｄＧＴＰ，  ｄＣＴＰ，  ｄＴＴＰ  、
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｆプライマー（ＧＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ１Ｒプライマー（ＧＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｆプライマー（ＧＩＩ検出用）、
０．３μＭ  ＣＯＧ２Ｒプライマー（ＧＩＩ検出用）、
０．３μＭ  内部標準Ｆプライマー、
０．３μＭ  内部標準Ｒプライマー、
（前記６種３組のプライマーのセットは融解曲線解析により、内部標準は８５℃、ノロウイルスＧ２陽性は８０℃、ノロウイルスＧ１陽性は７７℃にピークを与える。）
０．０１％  ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ（ライフテクノロジー）、
ｒＴａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）１０  ｕｎｉｔ、
ａｎｔｉ  Ｔａｑ  ｈｉｇｈ（東洋紡）  １０  ｕｎｉｔ、
ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡）  ２．５ｕｎｉｔ、
人工合成したノロウイルス遺伝子ＲＮＡ断片２５０コピーを含む反応液４５μｌ
を、上記（３）でタンパク質変性処理を行った液５μｌに添加した。
これを以下の温度サイクルで反応した。
５０℃  ５分、
９５℃  ５分、
９４℃  １０秒−５８℃  ４５秒  ５サイクル、
９４℃  １０秒−５６℃  ４５秒  １０サイクル、
９４℃  １０秒−５４℃  ４５秒  １５サイクル、
９４℃  １０秒−５２℃  ４５秒  ２０サイクル
（５）融解曲線解析
反応終了後、直ちに７０℃  ０．５℃／秒  ９０℃融解曲線解析に供した。すなわち、７０℃から  ０．５℃／秒  で９０℃まで上昇させた。
（６）結果
図３にその結果を示す。逆転写反応とＰＣＲを同一の反応液中で連続し行うワンステップＲＴ−ＰＣＲの場合、タッチダウンサイクルを用いれば、マルチプレックスＰＣＲでも非特異増幅を抑制しノロウイルスＲＮＡを検出できた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、生命科学研究、臨床診断や食品衛生検査、環境検査等に利用できる。
【図１】
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【図２】
2016019495.tif 000003
【図３】
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【配列表】
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