(57)【要約】【課題】    本発明の目的は、ＮＦ−κＢ遺伝子発現を抑制し、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぎ、さらに、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、免疫性疾患、新規がん治療及びその他ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の予防または治療薬として有効である製剤を得ることにある。【解決手段】  桑枝の抽出物を有効成分として配合すると、上記の目的を達することがわかった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
桑枝の抽出物を含有するＮＦ−κＢ活性化抑制剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＦ−κＢ活性化を抑制し、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぐ。さらに、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、免疫性疾患、新規がん治療及びその他ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の予防または治療薬として有効な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢファミリーのメンバーであるｐ５０、ｐ６５／ＲｅｌＡ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｒｅｌ−Ｂ及びｐ５２の種々の組み合わせから形成される二量体として存在する。このうち、最もよく知られている二量体は、５０ｋＤａサブユニット（ｐ５０）および６５ｋＤａサブユニット（ｐ６５）から成るヘテロダイマーである。
当該へテロダイマーは、通常は細胞質内においてｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ（ＩκＢ）と結合して不活性な状態で存在しているが、炎症性サイトカインや細胞増殖因子等により細胞が刺激されると、ＡＫＴシグナル伝達経路などを介してＩκＢキナーゼが活性化され、これがＩκＢのリン酸化を引き起こし、リン酸化されたＩκＢは、ユビキチン化を受けてプロテアソームにより分解され、その結果、ＮＦ−κＢはＩκＢから離れて核内に移行し、ＮＦ−κＢ応答配列に結合して様々な標的遺伝子の転写を活性化する。
【０００３】
当該標的遺伝子には、炎症や免疫反応に関わるものが多く含まれており、ＮＦ−κＢの活性化は、関節リウマチ、変形性関節症、炎症性腸疾患、アトピー性皮膚炎、喘息などの疾患に関与することが知られている。
また、ＨＩＶなどの種々のウイルスが宿主細胞においてＮＦ−κＢを活性化することが知られており、ＮＦ−κＢがウイルスの感染に寄与していると考えられている。
【０００４】
さらに近年では、種々の腫瘍において、ＮＦ−κＢが恒常的に活性化されている場合が多いことが知られており、ＮＦ−κＢが、発がん、転移、アポトーシス抵抗性や細胞増殖など、がんの進展や抗がん剤治療に対する抵抗性に関わる種々の遺伝子の発現誘導にも関与している可能性があると考えられている。
【０００５】
また、ＮＦ−κＢが、虚血性心疾患、アルツハイマー病、敗血症やメタボリックシンドロームなどの疾患にも関与していることが知られている。
さらには、ＮＦ−κＢの過剰な発現は、皮膚内のＭＭＰ−１産生を促進しコラーゲンを分解することなど、皮膚を著しく老化させることが知られている。
従って、ＮＦ−κＢを阻害する化合物は、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、免疫性疾患、新規がん治療及びその他ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の予防または治療薬として有用であり、コラーゲンの分解を抑制するので、ＮＦ−κＢ阻害剤は盛んに開発がされている。（非特許文献１〜１１）
【０００６】
また、ＮＦ−κＢは終末糖化産物（ＡＧＥ）の存在によっても活性化される。
ＡＧＥは老化によって生じる物質で、これが皮膚に沈着し、くすみや黒ずみの原因となって肌の透明感は失われる。
ＡＧＥは、ＲＡＧＥ(Receptor for AGE)を介して細胞内酸化ストレスを増強し、酸化ストレス依存的にＲａｓ／ＭＡＰキナーゼ経路を介して転写因子ＮＦ−κＢを活性化すると考えられている。
このようにＡＧＥによっても、ＮＦ−κＢの活性化するが、ヒト血管内で加齢に伴ってＡＧＥが生成・蓄積されることが知られていおり、メタボリックシンドローム、糖尿病、高血糖、耐糖能異常、高脂血症、高中性脂肪血症、高コレステロール血症、高血圧、肥満、動脈硬化等に起因する血管障害の予防又は改善にもＮＦ−κＢの活性化抑制が有効なことが知られている。（特許文献１）
【０００７】
【特許文献１】特開２００７−２０４３６８号公報
【非特許文献１】Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1997, 17, 3-9
【非特許文献２】N. Engl. J. Med. 1997, 336, 1066-1071
【非特許文献３】Nature 1987, 326, 711-713
【非特許文献４】Semin. Cancer Biol. 1997, 8, 121-129
【非特許文献５】Oncogene 1999, 18, 6938-6947
【非特許文献６】Cell Death Differ. 2006, 13, 738-747
【非特許文献７】Nat Med. 1997, 3, 894-899
【非特許文献８】J. Neural Transm. Suppl. 1997, 49, 125-134
【非特許文献９】J Crit Care. 1995, 10, 198-212
【非特許文献１０】Obes Res. 2004, 12, 180-186.
【非特許文献１１】Tanaka K, Hasegawa J, Asamitsu K, and Okamoto T: J Pharmacol Exp Ther315:624-630,2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は  本発明は、ＮＦ−κＢ活性化を抑制し、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぐ。さらに、慢性炎症性疾患、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、免疫性疾患、新規がん治療及びその他ＮＦ−κＢ活性化に起因する疾患の予防または治療薬として有効である製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが鋭意検討した結果、桑枝の抽出物にＮＦ−κＢの活性を抑制する作用があることがわかった。
なお、メイラード反応を起こしたコラーゲン（以下ＡＧＥｓコラーゲンと称する。）を添加し、ＮＦ−κＢ活性を促進させた線維芽細胞を用いて、ＮＦ−κＢ活性化抑制効果を確認した。
以下に詳細を記す。
桑枝は抽出効率を考え、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物（海藻）に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
【００１０】
これらの抽出物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。
【００１１】
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。
【００１２】
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。
【００１３】
レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。
【００１４】
赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、シソ紫蘇、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ホウノキ、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、 ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。
【００１５】
馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。
【００１６】
パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００１７】
これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。
桑枝の抽出物の製剤への配合量は、固形分として好ましくは０．００００１〜１０重量％、さらに好ましくは０．０００１〜１．０重量％である。
【００１８】
実施例
桑枝（乾燥品）１０ｇに５０％エタノール３００ｍｌを加えて、時々撹拌しつつ５日間放置した。これを濾過後、エバポレートした後、凍結乾燥した。
【００１９】
実施例について以下の実験を行った。
6ウェルプレートへヒト正常線維芽細胞（クラボウ）を播種し、コンフルエントになったらＡＧＥ化コラーゲンを０．５mg/mlと実施例０．５mg/mlを作用させた。
５時間作用後、細胞を回収し核を抽出した。核抽出物を用いて、NF-κBの量をNF-κB(p65) Transcription factor assay kit（CayMan Chemical)用いて、測定した。
なお、対照としてＡＧＥ化コラーゲン、実施例いずれも添加しない系と、ＡＧＥ化コラーゲンのみ添加した系の試験を実施した。
なお、ＡＧＥｓコラーゲンの作成方法は以下のようにおこなった。
５０mgのコラーゲンを１mM ＨＣｌで溶解し、sodium cyanoborohydrideを1.42gとglyoxylic acidを0.715gを溶解したＰＢＳ（25ml）へ加えた。
３７℃２４時間反応させた後、限外濾過（分子量３００００）し、凍結乾燥したものを用いた。
結果を図１に示す。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＮＦ−κＢ活性化抑制試験の結果であり、ＡＧＥｓコラーゲンによって発現が増加したＮＦ−κＢを実施例が濃度に依存して抑制することを示す図である。  なお、結果は、ＡＧＥｓコラーゲンを添加し、実施例を添加していない実験のＮＦ−κＢの発現量を１として表した。
【図１】
2016204363.tif 000002