(57)【要約】【課題】スチルベン誘導体混合物を安定に含有し、且つ、平均粒子径が１〜２００ｎｍであり、生体利用性の高いナノ粒子の製造方法を提供すること。【解決手段】ガレート型カテキンを固形分として０．１重量％以上、（ｉ）ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、（ｉｉ）ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、又は（ｉ）（ｉｉ）の混合物を固形分として０．１重量％以上含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が０．０５〜８．０であり、且つ、スチルベン誘導体を含有し、平均粒子径が１〜２００ｎｍであるナノ粒子を、（ａ）加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程、（ｂ）加温条件下にて前記（ａ）工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程、（ｃ）加温条件下にて前記（ｂ）工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のｐＨを４．２以下にする工程、（ｄ）前記（ｃ）工程で得られる混合物を８０℃以上１００℃未満に加温した後、１５℃以下に冷却する工程を得て製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガレート型カテキンを固形分として０．１重量％以上、
（ｉ）ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、（ｉｉ）ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、又は（ｉ）（ｉｉ）の混合物を固形分として０．１重量％以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が０．０５〜８．０であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が１〜２００ｎｍであるナノ粒子の製造方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を有するナノ粒子の製造方法。
（ａ）加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
（ｂ）加温条件下にて前記（ａ）工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
（ｃ）加温条件下にて前記（ｂ）工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のｐＨを４．２以下にする工程
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られる混合物を８０℃以上１００℃未満に加温した後、１５℃以下に冷却する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガレート型カテキン及び動物性タンパク質という天然物由来の基材からなり、且つスチルベン誘導体を含有するナノ粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物由来のゼラチンは、豚や牛、魚の軟骨成分より抽出したタンパク質であり、食品のゲル化剤、増粘剤、安定剤等としての利用のほかにカプセル等の基材として止血剤等の医療分野でも利用されている。また、前記ゼラチンに臭化カリウムと硝酸銀とを加えた乳化コロイドは感光物質の保護コロイドとして用いられている。また、ゼラチンが水溶性であるという性質を利用し、有機溶媒に滴下することでマイクロカプセルを作製する技術も知られている。
【０００３】
更に、近年ゼラチンをナノ粒子化することにより、医薬品成分を目的の臓器や組織に提供するためのドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）に利用する技術開発が進んでいる。ゼラチンのような食品由来の成分を用いたナノ粒子は安全性の観点から優位性が高いと考えられる。例として、キトサンと併用したナノ粒子の製造方法が挙げられる（特許文献１，２，３）。
【０００４】
本発明者らも、製造の簡便性及び原料コストでの優位性を見出したゼラチンとガレート型カテキンを組み合わせたナノ粒子の製造方法を提案してきた（特許文献４）。本発明者らの方法はガレート型カテキンをゼラチン等の動物性タンパク質に対するコアセルベーターとして働かせる方法である。これはそれ自体が生理活性を有する物質をナノ粒子形成物質として用いた初めての方法である。即ち、機能性で最も幅広く研究されているのがエピガロカテキンガレートに代表されるガレート型カテキンは、抗肥満作用や循環器系疾患予防作用、抗癌作用等幅広い生理機能を有していることが知られている。また、ガレート型カテキンには脂肪分解酵素であるリパーゼを阻害する作用を有する為、植物性油脂の効率的な抽出に用いる技術が報告されている（特許文献５）。また、本発明者らはガレート型カテキンとゼラチンの複合化によりリパーゼ阻害剤を報告しており（特許文献６）、ナノ粒子形成物質としてのガレート型カテキンの用途のみならず、タンパク質との組み合わせによる生理活性の向上という優位性も見出されている。加えて、本発明者らはガレート型カテキンを組み合わせたナノ粒子により、生理活性物質の安定性を向上させたことも報告している（特許文献７）。
【０００５】
一方、本発明者らはレスベラトロールやピセアタンノール、プテロスチルベンに代表されるスチルベン類より、様々な生理活性を有する新規スチルベン誘導体、及び新規スチルベン誘導体混合物を発明し、報告している。例えば、抗癌活性（特許文献８〜１３）をはじめ、アディポネクチンやサーチュイン賛成促進効果（特許文献１４、１５）、摂食抑制効果（特許文献１６、１７）、白色脂肪細胞の褐色様脂肪細胞化効果（特許文献１８〜２１）、代謝活性化効果（特許文献２２〜２７）遅筋形成や、自発活動向上効果（特許文献２８〜３０）循環器系疾患予防効果（特許文献３１〜３５）、その他、抗肥満や抗炎症効果（特許文献３６〜３８）など多彩な効果が確認されている。しかしながら、これら新規スチルベン誘導体、及び新規スチルベン誘導体混合物の多くは水に難溶性であり、加えてコーン油やオリーブ油等の高級脂肪酸への溶解性も悪いことから、生体への吸収性が低い点が課題であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５５６４２００号公報
【特許文献２】特開２００９−０９０１６０号公報
【特許文献３】米国特許第８，６４２，０８８号明細書
【特許文献４】特願２０１４−１６０７４５号
【特許文献５】特開２０１４−０６２１９２号公報
【特許文献６】特開２０１３−０８２６７３号公報
【特許文献７】特願２０１４−２２３４３２号
【特許文献８】国際公開第２０１２／０７０６５６号公報
【特許文献９】特許第５５２１７８８号公報
【特許文献１０】特開２０１４−０２８７７１号公報
【特許文献１１】特開２０１４−０２８７７２号公報
【特許文献１２】特開２０１４−１２５４６９号公報
【特許文献１３】特願２０１３−１５７６５８号
【特許文献１４】特開２０１２−２４６２４２号公報
【特許文献１５】特開２０１３−０１０７２１号公報
【特許文献１６】特開２０１３−０２８５６０号公報
【特許文献１７】特開２０１４−１２５４３３号公報
【特許文献１８】特開２０１４−１１８３８８号公報
【特許文献１９】特開２０１４−１９６２４９号公報
【特許文献２０】特願２０１３−１５７６５９号
【特許文献２１】特願２０１３−２６７４７３号
【特許文献２２】特開２０１３−１１２６５６号公報
【特許文献２３】特開２０１４−０２８７７６号公報
【特許文献２４】特開２０１４−０７００５２号公報
【特許文献２５】特開２０１４−０７００５３号公報
【特許文献２６】特開２０１４−１６２７８０号公報
【特許文献２７】特願２０１４−１５４１７４号
【特許文献２８】特願２０１３−１５７６６０号
【特許文献２９】特願２０１４−０７１３８６号
【特許文献３０】特願２０１４−２００１０４号
【特許文献３１】特開２０１３−０４７１９４号公報
【特許文献３２】特開２０１４−１０１３４１号公報
【特許文献３３】特開２０１４−１０１３４２号公報
【特許文献３４】特開２０１４−１２５４６４号公報
【特許文献３５】特開２０１４−１４８４７８号公報
【特許文献３６】特開２０１３−０９５６９３号公報
【特許文献３７】特開２０１３−１７７３４０号公報
【特許文献３８】特開２０１４−０８８３５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明は、従来では有用ではあるが体内への吸収性が低かったスチルベン誘導体の吸収性を向上する技術を提供することを目的とし、詳細には、スチルベン誘導体混合物を安定に含有し、且つ、平均粒子径が１〜２００ｎｍであり、生体利用性の高いナノ粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、食品にも利用可能なナノ粒子について鋭意検討した結果、ガレート型カテキン、特定の動物性タンパク質及びスチルベン誘導体を適切な条件下で混合するという非常に簡便な方法で、ガレート型カテキンと前記動物性タンパク質という生体利用性の高い天然物由来機能性成分のコアセルベートを形成させ、これにスチルベン誘導体を安定して含有させて、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子を作製することに成功し、本発明を完成させた。
【０００９】
本発明の要旨は、
ガレート型カテキンを固形分として０．１重量％以上、
（ｉ）ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、（ｉｉ）ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、又は（ｉ）（ｉｉ）の混合物を固形分として０．１重量％以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が０．０５〜８．０であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が１〜２００ｎｍであるナノ粒子の製造方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程：
（ａ）加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
（ｂ）加温条件下にて前記（ａ）工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
（ｃ）加温条件下にて前記（ｂ）工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のｐＨを４．２以下にする工程
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られる混合物を８０℃以上１００℃未満に加温した後、１５℃以下に冷却する工程
を有するナノ粒子の製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、平均粒子径１〜２００ｎｍであるうえに、スチルベン誘導体を含有していることから、スチルベン誘導体の体内への吸収性に優れ、しかもガレート型カテキン及び動物性タンパク質という天然物由来の機能性成分の生体利用性がより向上したナノ粒子を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１で作製したスチルベン誘導体含有ナノ粒子（本発明品）、０．５％（ｗ／ｗ）カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）水溶液に分散させたスチルベン誘導体（比較品１）、及び乳化剤により水溶液中に乳化分散させたスチルベン誘導体（比較品２）を摂取したラットの、スチルベン誘導体の平均血中濃度を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１３】
本発明のナノ粒子の製造方法は、
ガレート型カテキンを固形分として０．１重量％以上、
（ｉ）ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、（ｉｉ）ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、又は（ｉ）（ｉｉ）の混合物を固形分として０．１重量％以上
含有し、前記ガレート型カテキンの固形分と前記動物性タンパク質の固形分の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が０．０５〜８．０であり、且つ、
スチルベン誘導体を含有し、
平均粒子径が１〜２００ｎｍであるナノ粒子の製造方法であって、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を有することを特徴とする。
（ａ）加温条件下で前記動物性タンパク質と水、含水溶媒又は有機溶媒とを混合する工程
（ｂ）加温条件下にて前記（ａ）工程で得られる混合物に前記スチルベン誘導体を混合する工程
（ｃ）加温条件下にて前記（ｂ）工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のｐＨを４．２以下にする工程
（ｄ）前記（ｃ）工程で得られる混合物を８０℃以上１００℃未満に加温した後、１５℃以下に冷却する工程
【００１４】
本発明で得られるナノ粒子の平均粒子径は、１〜２００ｎｍであり、体内への吸収性及び、製造性が良好である観点から、好ましくは１０〜１５０ｎｍであり、より好ましくは１０〜１００ｎｍであり、特に好ましくは、１０〜９０ｎｍである。
前記ナノ粒子の平均粒子径は、後述の実施例に記載のように、ゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、商品名「ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ」）にて測定することができる。
【００１５】
本発明でいう天然物由来の機能性成分とは、原料である、ガレート型カテキン及び動物性タンパク質がともに天然物を由来とする成分であることを示す。なお、前記原料として試薬等を使用する際にも、その試薬が天然物由来であればよい。
【００１６】
以下に、製造方法の各工程について説明する。
【００１７】
（ａ）工程
本工程では、加温条件下で（ｉ）ゼラチン、コラーゲン、及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、（ｉｉ）ホエイタンパク、卵白タンパク質及びこれらの分解物から選ばれる少なくとも１種の動物性タンパク質、又は（ｉ）及び（ｉｉ）の混合物と、水又は含水溶媒又は有機溶媒とを混合する。具体的には、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させて、動物性タンパク質含有液を作製する。
【００１８】
本工程において加温条件下とは２０〜１００℃に加温することをいう。
中でも、本工程では、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させる観点から、前記溶媒の温度を２０〜９０℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、前記の温度範囲に加温できればよく、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記動物性タンパク質や溶媒を添加して加熱したり、前記動物性タンパク質や溶媒を容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
【００１９】
前記動物性タンパク質として用いるゼラチンの由来は、牛、豚、魚、ニワトリ等、及び遺伝子組み換え体のいずれかであればよい。なお、牛骨又は豚骨由来の動物性タンパク質は、５００ｎｍ以下の粒子が一部形成されるものの、凝集及び沈殿が起こりやすいため、本発明では使用することが難しい。ただし、牛骨又は豚骨由来のタンパク質が含まれている動物性タンパク質であっても、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子が作製できれば、特に限定はなく使用することができる。また、動物性タンパク質として、ゼラチンを分解したコラーゲンやさらに分解したコラーゲンペプチドであってもよい。
また、動物性タンパク質としては、牛乳を原料にしたホエイタンパク、卵を原料にした卵白タンパク及びこれらの分解物も使用できる。
これらの動物性タンパク質は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、前記動物性タンパク質は、乳化されていてもよい。
【００２０】
前記溶媒として使用する水としては、蒸留水、イオン交換水、水道水、ミネラルウォーターなどが挙げられるが、特に限定はない。
前記含水溶媒とは、水と混合する有機溶媒をいう。また、有機溶媒としては水と混合するものであれば特に限定はされないが、得られたナノ粒子の使用用途に適した溶媒を選択することが好ましく、例えば、食品用途に適した溶媒としてはグリセリン、プロピレングリコール、エタノール等が上げられ、医薬品用途に適した溶媒としては上記に加えてメタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。
【００２１】
前記溶媒と前記動物性タンパク質とを混合し、前記動物性タンパク質を前記溶媒に溶解、分散又は膨潤させる手段としては、公知の手段であれば特に限定はない。例えば、前記動物性タンパク質を、前記溶媒に混合することで、溶解、分散又は膨潤させることができる。なお、膨潤とは、動物性タンパク質に水、含水溶媒もしくは有機溶媒を添加してゲル状にすることをいう。
【００２２】
前記動物性タンパク質含有液中の動物性タンパク質の固形分値は、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．１〜１９重量％であることが好ましく、０．１〜１０重量％であることがより好ましいが、所望のナノ粒子が作製できれば、特に限定されることはない。
なお、ゼラチンを使用する場合、前記固形分値が２０重量％以上であれば液の粘度の上昇により扱いにくくなる。
【００２３】
（ｂ）工程
本工程では、加温条件下で、前記（ａ）工程で得られる混合物にスチルベン誘導体を混合する。
【００２４】
本工程において加温条件下とは２０〜１００℃に加温することをいう。
中でも、本工程では、前記（ａ）工程で得られる混合物にスチルベン誘導体を効率よく混合する観点から、前記混合物の温度を２０〜９０℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、前記の温度範囲に加温できればよく、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記（ａ）工程で得られる混合物やスチルベン誘導体を添加して加熱したり、前記（ａ）工程で得られる混合物やスチルベン誘導体を容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
【００２５】
本発明に用いられるスチルベン誘導体とは、スチルベンを基本骨格とする化合物であり、スチルベンを構成する炭素原子に結合する水素原子が別の基に置換されている化合物をいう。
例えば、スチルベン誘導体としては、レスベラトロール、プテロスチルベン、ピセアタンノール、及び、これらの化合物より発明者が以前に提案した誘導体類（特許文献８〜１２）などが挙げられる。また、特許文献１３、２０、２１、２７に記載されるように、例えば、以下の式（１）〜（４）：
【００２６】
【化１】
2016124804.tif 000002
【００２７】
【化２】
2016124804.tif 000003
【００２８】
【化３】
2016124804.tif 000004
【００２９】
【化４】
2016124804.tif 000005
【００３０】
に示される化合物や、これらの化合物を２種以上含む混合物も前記スチルベン誘導体に含まれる。また、前記スチルベン誘導体を含有する組成物もスチルベン誘導体として使用することができる。また、前記スチルベン誘導体は市販品を用いてもよく、例えば、ピセアタンノールを含有する丸善製薬社製のノブドウエキスやレスベラトロールを含有するビーエイチエヌ社製のビネアトロールなどが挙げられる。
【００３１】
前記スチルベン誘導体は、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３２】
前記スチルベン誘導体は、固体状のものを前記（ａ）工程で得られる混合物に混合してもよいが、前記混合を効率よく行う観点から、スチルベン誘導体を、水又は含水溶媒又は有機溶媒に溶解又は分散させて、スチルベン誘導体含有液を作製し、このスチルベン誘導体含有液を前記（ａ）工程で得られる混合物に混合するのが好ましい。
【００３３】
前記溶媒としては、前記（ａ）工程で使用される溶媒であればよく、特に限定はない。なお、前記（ａ）工程で使用した溶媒とは同一の溶媒でもよいし、異なっていてもよい。
【００３４】
前記溶媒に前記スチルベン誘導体を混合させる手段としては、公知の混合手段であれば特に限定はない。例えば、前記スチルベン誘導体を、前記溶媒に添加して、混合させることができる。
【００３５】
前記スチルベン誘導体含有液中のスチルベン誘導体の固形分値は、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．００１〜２５重量％であることが好ましいが、所望のナノ粒子が作製できればよく、特に限定されることはない。
【００３６】
また、本工程で得られる混合物中のスチルベン誘導体の固形分値は、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０１〜１重量％であることがより好ましい。
【００３７】
（ｃ）工程
本工程では、加温条件下にて前記（ｂ）工程で得られる混合物にガレート型カテキンを混合し、溶液のｐＨを４．２以下にする。
【００３８】
本工程において加温条件下とは２０〜１００℃に加温することをいう。また、前記溶解又は分散させる際には、ガレート型カテキンの溶解性の観点から、前記混合物の温度を２０〜９０℃に調整しておくことが好ましい。
加温手段としては、例えば、ヒーターなどの加温装置が接続した加温可能な容器に前記（ｂ）工程で得られる混合物やガレート型カテキンを添加して加熱したり、前記前記（ｂ）工程で得られる混合物やガレート型カテキンを容器に添加しておき、この容器を加熱装置で加温することが挙げられるが、特に限定はない。
【００３９】
本発明で用いるガレート型カテキンとしては、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、カテキンガレート（Ｃｇ）等が挙げられる。前記ガレート型カテキンは、非重合体でも重合体でもよく、それらを混合しても、単独で使用してもよい。効率的な粒子形成の観点よりＥＧＣｇ及び／又はＥＣｇを含有することが好ましい。また、ガレート型カテキンを含む組成物も使用することができ、例えば、前記ガレート型カテキンを含む茶抽出物やコーヒー抽出物等が挙げられる。また、ナノ粒子の作製を効率よく行う面から、ガレート型カテキンを含む組成物中のガレート型カテキン量が２０重量％以上のものが好ましく、３０重量％以上のものがより好ましく、６０重量％以上のものがさらに好ましい。
【００４０】
前記ガレート型カテキンは、固体状のものを前記（ｂ）工程で得られる混合物に混合してもよいが、前記混合を効率よく行う観点から、前記ガレート型カテキンを、水又は含水溶媒又は有機溶媒に溶解又は分散させて、ガレート型カテキン含有液を作製し、このガレート型カテキン含有液を前記（ｂ）工程で得られる混合物に混合するのが好ましい。
【００４１】
前記溶媒としては、前記（ａ）又は（ｂ）工程で使用される溶媒であればよく、特に限定はない。なお、前記（ａ）又は（ｂ）工程で使用した溶媒とは同一の溶媒でもよいし、異なっていてもよい。
【００４２】
前記溶媒にガレート型カテキンを溶解又は分散させる手段としては、公知の手段であれば特に限定はない。例えば、ガレート型カテキン又はガレート型カテキンを含む組成物を、前記溶媒に添加・混合することで、溶解又は分散させることができる。
【００４３】
前記ガレート型カテキン含有液中のガレート型カテキンの固形分値は、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．１〜２４重量％であることが好ましく、０．１〜２０重量％であることがより好ましい。
【００４４】
また、本工程で得られる混合物中のガレート型カテキンの固形分値は、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子を効率的に作製する観点から、０．０１〜１０重量％であることが好ましく、０．１〜５重量％であることがより好ましい。
【００４５】
また、本工程では、得られる混合物中のガレート型カテキンの固形分と動物性タンパク質の固形分の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が０．０５〜８．０となるように調整することで、後述の（ｄ）工程において、平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子を効率よく得ることができる。
【００４６】
また、本工程で得られる混合物のｐＨは、４．２以下に調整する。
前記ｐＨが４．２を超えると、一時的にナノ粒子を形成するが、凝集、沈殿が生じやすくなる。
【００４７】
前記混合物のｐＨの調整には、ナノ粒子の使用用途に応じて、使用可能な酸であれば特に制限はない。例えば、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸又はフタル酸、トリフルオロ酢酸のような有機酸、塩酸、過塩素酸、炭酸のような無機酸、又は緩衝液、などで調整することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。得られたナノ粒子を医薬品、化粧品、食品等に利用する場合は、それぞれの使用用途に適した酸を選択することが好ましい。
【００４８】
なお、前記混合物のｐＨを調整するには、動物性タンパク質含有液、ガレート型カテキン含有液と、スチルベン誘導体含有液のｐＨを予め調整してもよい。このように予めｐＨを調整することで、これらの３種類の液を混合するだけで、混合液のｐＨを４．２以下に調整することができる。
【００４９】
（ｄ）工程
本工程では、前記（ｃ）工程で得られる混合物を８０℃以上１００℃未満に加温した後、１５℃以下に冷却する。前記のように、一度８０℃以上１００℃未満まで加温した後に、１５℃以下に冷却することで前記（ｃ）工程で得られる混合物中でガレート型カテキンと動物性タンパク質とがコアセルベートを形成し、このコアセルベート中にスチルベン誘導体を含有する平均粒子径１〜２００ｎｍのナノ粒子が形成される。
【００５０】
前記（ｃ）工程で得られる混合物を８０℃以上１００℃未満に加温する方法としては、前記（ａ）工程などと同様に公知の手段であればよく、特に限定はない。
また、加温しておく時間としては、その後の冷却によるナノ粒子形成の観点から、１０〜３０分であればよいが、特に限定はない。
なお、前記（ｃ）工程での加温温度を８０℃以上１００℃未満に調整している場合、前記（ｃ）工程でガレート型カテキンを混合してｐＨを調整した段階した後から（ｄ）工程を同じ温度で続ければよい。また、前記（ｃ）工程での加温温度を８０℃未満に調整している場合、８０℃以上１００℃未満となるように加熱して温度を上昇させることで（ｄ）工程を実施すればよい。
【００５１】
また、冷却する方法としては、例えば、前記（ｃ）工程で得られる混合物が収容された容器を氷水などに入れて、１５℃以下に冷却する方法などが挙げられるが、特に限定はない。
【００５２】
前記のようにして作製されるナノ粒子は、前記ナノ粒子含有液の状態で使用することができる。また、前記ナノ粒子含有液に限外濾過、透析等を施してもよい。透析をすれば、粒子化していない成分を分離してより精製されたナノ粒子とすることができる。限外濾過膜としては例えばペンシル型ＵＦ膜（旭化成社製）、透析膜としてはＳｎａｋｅＳｋｉｎ（ピアス社製）が挙げられる。これ以外にもナノ粒子を失わずに限外ろ過及び透析ができれば特に限定はない。
【００５３】
本発明の製造方法により得られるナノ粒子では、ガレート型カテキンの固形分と動物性タンパク質の固形分の重量比（動物性タンパク質／ガレート型カテキン）が０．０５〜８．０となるように調整されていることで、平均粒子径が１〜２００ｎｍの範囲に調整され、しかもスチルベン誘導体がナノ粒子中に安定に含有されているため、体内への吸収性が優れるという優れた効果が奏される。
【００５４】
前記ナノ粒子は、食品に利用可能な条件で作製した場合は、飲食品に配合してもよい。飲食品としては特に限定されず、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子、機能性食品、健康食品、健康志向食品等が挙げられる。保存性、携帯性、摂取の容易さ等を考慮すると、菓子類が好ましく、菓子類の中でも、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット、チューイングガム等が好ましい。
【００５５】
前記ナノ粒子を飲食品に配合する場合、ナノ粒子の飲食品における含有量は、その生理活性効果が期待できる量であればよい。通常１日あたり１〜１００００ｍｇ、より好ましくは１０〜３０００ｍｇ摂取できるように配合量を決定することが好ましい。例えば、固形状食品の場合には５〜５０重量％、飲料等の液状食品の場合には０．０１〜１０重量％が好ましい。
【００５６】
また、前記ナノ粒子は、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。
【００５７】
前記ナノ粒子は、医薬品に配合してもよい。前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤等の固形製剤、水剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施したりすることもできる。又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。
本発明の製造方法により得られるナノ粒子を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。
【００５８】
前記ナノ粒子は、医薬部外品に配合してもよい。前記医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き、マウスウオッシュ、マウスリンスや、感染症予防等を目的とした滋養強壮系ドリンク剤等が挙げられる。
前記ナノ粒子を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、通常０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。
【００５９】
前記ナノ粒子は、化粧品に配合してもよい。前記化粧品としては、ローション、乳液、クリーム、パック剤、仕上げ化粧品、頭髪用化粧品、洗顔剤、浴剤、制汗剤等が挙げられる。これらの化粧品では、抗酸化効果から美容効果が期待され、抗菌効果から防菌の目的で利用することができる。
また、前記ナノ粒子を化粧品として使用する場合には、化粧品中に０．１ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍの濃度となるようにするのが好ましい。
【００６０】
次に、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。
【実施例】
【００６１】
（実施例１）スチルベン誘導体混合物を含有するナノ粒子の作製
ゼラチン（商品名：Ｇ微粉、新田ゼラチン社製）１ｇ、ホエイタンパク質（商品名：エンラクトＳＡＴ、日本新薬社製）９gを粉体で混合し、これに蒸留水８４０gを添加して５５℃で加温しながら攪拌、溶解させ、動物性タンパク質含有液を得た。
【００６２】
続いて、特許文献２１の方法でスチルベン誘導体混合物を得た。すなわち、トランス−レスベラトロール（（株）ＴＥＣＮＯ  ＳＣＩＥＮＣＥ社製）４０ｇに、１０％炭酸ナトリウム（和光純薬工業（株）社製）水溶液を４００ｍＬ加えて、レスベラトロール含有水溶液（ｐＨ９．９）を得た。このレスベラトロール含有溶液を圧力鍋（ゼロ活力なべ、アサヒ軽金属工業株式会社製）にて１２８℃、１２０分間加熱し、レスベラトロール重合化合物含有溶液を作製した（比較品１）。
次いで、比較品１を、４．０ｋｇの合成吸着剤ダイヤイオン（登録商標）ＨＰ−２０（三菱化学株式会社製）に全量供した。蒸留水２４Ｌで洗浄後、１００％エタノール１６Ｌで溶出させた。減圧乾燥にて溶媒を除去し、スチルベン誘導体混合物２２ｇを得た。
得られたスチルベン誘導体混合物中には、式（１）：
【００６３】
【化５】
2016124804.tif 000006
【００６４】
で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００２という。）、式（２）：
【００６５】
【化６】
2016124804.tif 000007
【００６６】
で表される化合物（以下、ＵＨＡ４００３という。）、式（３）：
【００６７】
【化７】
2016124804.tif 000008
【００６８】
で表される化合物（以下ＵＨＡ４０２２という。）であることを、特開２０１１−２５１９１４号公報の実施例２に記載の方法に従って、高分解能Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝撃質量分析）にて測定し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定を行うことで確認した。
【００６９】
得られたスチルベン誘導体混合物１ｇ、プロピレングリコール５ｇ、蒸留水４４ｇを攪拌、混合し、スチルベン誘導体混合物含有溶液を得た。
【００７０】
緑茶抽出物（ガレート型カテキン６４％）１８ｇ、蒸留水８２ｇを攪拌、混合し、ガレート型カテキン含有溶液を得た。
【００７１】
次いで、得られた動物性タンパク質含有液に対し、５５℃で加温、攪拌しながら前記スチルベン誘導体混合物含有溶液を全量混合した後、５５℃で加温、撹拌しながらガレート型カテキン含有溶液を全量混合した。
次いで、得られた動物性タンパク質、スチルベン誘導体、ガレート型カテキン含有溶液に対し、クエン酸５０ｇを粉体で混合したのち、９０℃で加温しながら攪拌して均一化させて、２０分間９０℃で維持した。この時の混合液のｐＨは１．２であった。
次いで、得られた混合物１０００ｇを、攪拌を続けながら氷水にて１０℃になるまで冷却を行い、前記混合物中でナノ粒子を形成させて、ナノ粒子溶液（重量比率：動物性タンパク質／ガレート型カテキン／スチルベン誘導体：１／１．８／０．１）を作製した。得られたナノ粒子溶液の平均粒子径をゼータ電位・ナノ粒子径測定システム（ベックマン・コールター株式会社製、「ＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯ」）にて測定した結果、その平均粒子径は１２０ｎｍであった。
次いで、前記ナノ粒子溶液を透析膜（ピアス社製、商品名「ＳｎａｋｅＳｋｉｎ」）に供し、透析をかけたのち、限外濾過（ミリポア社製「Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３」により濃縮を行った。得られたナノ粒子溶液の平均粒子径をＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯにて測定した結果、その平均粒子径は８２ｎｍであった。
【００７２】
（実施例２）スチルベン誘導体混合物の吸収性評価
スチルベン誘導体の吸収性はラットに対する経口投与試験により検討した。検討には、実施例１で得られたナノ粒子溶液（本発明品）、スチルベン誘導体を０．５％カルボキシメチルセルロース水溶液で分散させたスチルベン誘導体分散液（比較品１）、スチルベン誘導体を乳化剤で分散させたスチルベン誘導体分散液（比較品２）を用いて実施した。比較品１及び比較品２の平均粒子径をＤｅｌｓａＭａｘ  ＰＲＯにて測定した結果、比較品１は１０μｍ以上、比較品２は２０００ｎｍであった。作製した各試料を、ラット３匹に対しスチルベン誘導体混合物として１５ｍｇ／ｋｇとなるように経口投与した。血中に移行したスチルベン誘導体混合物濃度は３種類のスチルベン誘導体（ＵＨＡ４００２、ＵＨＡ４００３、ＵＨＡ４０２２）のうち血中ＵＨＡ４００３濃度を測定することで、スチルベン誘導体混合物の血中濃度の経時変化を比較した。結果を図１に示す。
【００７３】
図１に示すように、本発明品では、比較品１、２と比べると、スチルベン誘導体混合物中のＵＨＡ４００３が投与から２時間以内に速やかに吸収され、投与から７時間の間、高い血中濃度を維持していることがわかる。
したがって、本発明の製造方法で得られるナノ粒子は、担持しているスチルベン誘導体混合物の体内吸収性が顕著に向上されたものであることがわかる。
なお、７時間後に本発明品の血中ＵＨＡ４００３濃度が低下しているのは、吸収されたスチルベン誘導体混合物が体内で代謝されたことが原因であると考える。
【図１】
2016124804.tif 000009