(57)【要約】      （修正有）【課題】脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞中から、脂溶性生理活性物質を、特殊な脱水、乾燥設備を用いることなく、また溶媒と菌体成分との分離性悪化による収率低下を招くことなく操作上簡単に抽出し、安定的かつ効率的に工業生産できる製造法の提供。【解決手段】脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞または微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、及びポリエーテル型界面活性剤から選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤と、アルカリ存在下に加温処理したのちに、有機溶媒と混合して脂溶性生理活性物質を抽出する、脂溶性生理活性物質の製造方法。加温処理時の混合液がｐＨ７．５以上で、ＮａＯＨ又はＫＯＨをアルカリとして少なくとも使用し、温度を５５〜１００℃の範囲で処理する脂溶性生理活物質の製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、及びポリエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤と、アルカリ存在下に加温処理したのちに、有機溶媒と混合して脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする、脂溶性生理活性物質の製造方法。
【請求項２】
加温処理時の混合液のpHが７．５以上であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
加温処理時に使用するアルカリとして、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを少なくとも使用する、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
加温処理時の温度が55℃〜100℃の範囲内であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
脂溶性生理活性物質が、補酵素Ｑ１０であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
補酵素Ｑ１０が、還元型補酵素Ｑ１０、又は、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物であることを特徴とする請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
非イオン性界面活性剤が、少なくともポリエーテル型の界面活性剤もしくはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤の添加量が、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に対して、０．０１〜１重量％であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
有機溶媒が、疎水性有機溶媒であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
さらに親水性有機溶媒を併用することを特徴とする請求項９に記載の製造方法。 
【請求項１１】
抽出は、連続抽出であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
さらに連続抽出において上記非イオン性界面活性剤を各抽出槽に添加することを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂溶性生理活性物質の製造方法に関する。詳しくは、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞またはその微生物細胞破砕物の水性懸濁液から脂溶性生理活性物質を抽出することによる脂溶性生理活性物質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体に有用な脂溶性生理活性物質は数多く知られている。そのうち、補酵素Qは、細菌から哺乳動物まで広く生体に分布する必須成分であり、生体内の細胞中におけるミトコンドリアの電子伝達系構成成分として知られている。補酵素Qは、ミトコンドリア内において酸化と還元を繰り返すことで、電子伝達系における伝達成分としての機能を担っているほか、補酵素Qのうち還元型補酵素Qは抗酸化作用を持つことが知られている。ヒトでは補酵素Qの側鎖が繰り返し構造を10個持つ補酵素Q10が主成分であり、生体内においては通常、40〜90%程度が還元型として存在している。補酵素Q10の生理的作用としては、ミトコンドリア賦活作用によるエネルギー生産の活性化、心機能の活性化、細胞膜の安定化効果、抗酸化作用による細胞の保護効果等が挙げられている。
補酵素Q10のうち、酸化型補酵素Q10は、従来、鬱血性心不全薬や健康食品として用いられており、近年ではより高い生理活性作用をもつ還元型補酵素が知られるようになってきている。
【０００３】
補酵素Q10などの脂溶性生理活性物質は、例えば、合成、発酵、天然物から抽出することなどによって得られる。また、必要に応じ、得られた抽出物をクロマトグラフィにより精製したり、晶析により結晶化して、より純度の高いものを得ることができる。例えば、補酵素Q10を得るにあたっては、補酵素Q10を産生する微生物を培養し、その微生物の懸濁液から有機溶媒を用いて微生物中の補酵素Q10を抽出する方法が一般的である。
【０００４】
従来、微生物細胞中に含まれている有用成分を抽出する操作においては、培養した微生物の水性懸濁液を脱水し、湿菌体としたうえで有機溶媒に接触させる方法、水性懸濁液を脱水後さらに乾燥し、乾燥菌体として有機溶媒に接触させる方法、水性懸濁液をそのまま有機溶媒に接触させ、液−液間で抽出する方法が知られている。
【０００５】
微生物の水性懸濁液を脱水、乾燥することなく抽出した例として、培養した微生物の破砕懸濁液をそのままヘキサン、２−プロパノール等の有機溶媒と接触させ、菌体内の補酵素Q10を抽出した例が知られている（特許文献１）。このような液−液抽出操作においては、微生物を脱水、乾燥することなく、高い収率、大きな処理量にて目的物質の抽出が可能であるが、微生物細胞または該細胞破砕物の水性懸濁液、特に該細胞破砕物の水性懸濁液、とりわけ物理的処理による該細胞破砕物の水性懸濁液から有機溶媒を用いて抽出する場合、一部タンパク質等の細胞成分の存在により乳化現象が生じやすく、微生物細胞の破砕懸濁液中に目的物質を含んだ有機相がトラップされ、有機相が効率よく分離できなくなり、収率低下を招くだけでなく、使用した抽出溶媒の回収率が低いという問題も生じる。また、疎水性有機溶媒のほかにも親水性有機溶媒をある程度以上の量を使用する必要がある等、操作の煩雑化、コストの増大が問題であった。
【０００６】
また、従来、界面活性剤を液−液抽出に使用した場合では、界面効果により水相と有機溶媒相の親和性が高くなるため、均相化が生じやすく、水相と有機溶媒相の分離に長時間を要したり、または長時間かけても分離しないことが多く、場合によっては遠心分離等の操作により強制的に分離させる必要があった。そのため、一般的な液−液抽出では、抽出工程における界面活性剤の使用は好ましくはないと考えられていた。
【０００７】
それに対し、特許文献２では、補酵素Q10等の脂溶性生理活性物質の液−液抽出において、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型等の特定の界面活性剤を使用することで、比較的高い抽出率と操作安定性を確認している。しかし、特許文献１の方法と比較して操作安定性は高いものの、効果的な抽出操作を行うために必要な界面活性剤の添加量は比較的多く、微生物細胞または該細胞破砕物の水性懸濁液の保存状態や培養条件によっては、抽出操作が不安定になる可能性もあり、より確実に運転が可能で、かつ低コストな液−液抽出方法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００８−２５３２７１号公報
【特許文献２】ＷＯ２０１２−０１１５８９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述したように、従来の微生物細胞中からの脂溶性生理活性物質などの有用成分の抽出操作においては、抽出前に微生物の脱水や乾燥等に特殊な設備が必要であったり、抽出後において有用成分を含んだ溶媒と菌体成分との分離性が悪く、収率が不十分であったりするほか、複数の溶媒の使用が必要であるなど、操作の煩雑化、コストの増大を招くという問題があった。また、界面活性剤を使用する液−液抽出においても、従来の方法では、収率および安定性の両者を担うことは難しく、界面活性剤添加量のバランスが崩れると分離性や収率に悪影響を及ぼし、運転操作が難しいという問題があった。
【００１０】
本発明は、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞中から、脂溶性生理活性物質を、特殊な脱水、乾燥設備を用いることなく、また、溶媒と菌体成分との分離性悪化による収率低下を招くことなく、操作上簡便に抽出し、安定的かつ効率的に工業生産できる製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、脂溶性生理活性物質を含有した微生物細胞または微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、抽出前に、アルカリと特定の界面活性剤を添加して加温、撹拌する前処理を行い、その後疎水性有機溶媒等を用いて抽出操作を行うことで、液−液抽出においても脂溶性生理活性物質を安定的かつ効率的に抽出でき、工業生産にも適していることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち本発明は、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、及びポリエーテル型界面活性剤からなる群より選択される少なくとも１種類の非イオン性界面活性剤とアルカリ存在下に加温処理したのちに、有機溶媒と混合して脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする、 脂溶性生理活性物質の製造方法である。 ここで、抽出の対象となる脂溶性生理活性物質としては補酵素Ｑ１０が好ましい。また、加温処理時のpHは７．５以上、加温の際の温度は５５〜１００℃が好ましく、抽出時に用いる非イオン性界面活性剤としては、少なくともポリエーテル型界面活性剤又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤を使用するのが好ましい態様である。
【発明の効果】
【００１２】
従来の微生物細胞中からの有用成分の抽出法では、設備、製造コスト面、操作安定性に課題があり、脂溶性生理活性物質の製造方法としても同様の問題を有しているが、本発明の製造方法によれば、液−液抽出操作によって脂溶性生理活性物質の抽出を効率的かつ確実に行うことができ、工業生産にも適している。
更に、本発明で見出した好ましい特定の界面活性剤とアルカリ存在下における加温処理を液−液抽出操作前に行うことで、抽出時に目的物質を含んだ分散相を抽出溶媒中に微細分散化させ、目的物質の抽出溶媒中への移動を促進するとともに、有機相と水相を静置した際の油水分離も速やかに行えるため、安定的に高い収率で脂溶性生理活性物質の製造が可能となる。また、従来、より高収率で目的物質を得るためには、抽出操作に複数種の抽出溶媒が必要であった場合に対しても、本発明では単一溶媒のみでも高収率の操作を行うことができるため、装置、操作の簡素化が図れるうえ、溶媒回収に要するエネルギーの削減、環境負荷低減等の効果も得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は実施例９で使用した装置の概略図である。
【図２】図２は実施例９における各槽の抽出結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下に本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、後述する特定の非イオン性界面活性剤とアルカリ存在下に加温処理した後に、有機溶媒と混合して、有機溶媒相に脂溶性生理活性物質を抽出することを特徴とする、脂溶性生理活性物質の製造方法である。
【００１６】
本発明の製造方法において、抽出の対象となる脂溶性生理活性物質としては、微生物細胞中に産出され、有機溶媒に対して親和性を有し（脂溶性）、生体にとって有用な生理活性物質であれば、特に限定されない。その具体例としては、例えば、補酵素Ｑ１０などの補酵素Ｑ類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥやビタミンＫなどのビタミン類、カロチン、アスタキサンチンやフコキサンチンなどのカロテノイド類、脂溶性ポリフェノール類、フラボノイド類、エルゴステロールなどのステロール類、α−リポ酸、Ｌ−カルニチンなどが挙げられる。なかでも、補酵素Ｑ１０やアスタキサンチン、エルゴステロールなどが好ましく、補酵素Ｑ１０が特に好ましい。
【００１７】
補酵素Ｑ１０には、上述したように、酸化型と還元型が存在する。本発明は、補酵素Ｑ１０として、酸化型補酵素Ｑ１０、還元型補酵素Ｑ１０のいずれをも対象とするが、還元型補酵素Ｑ１０を含む補酵素Ｑ１０、すなわち、還元型補酵素Ｑ１０単独か、還元型補酵素Ｑ１０と酸化型補酵素Ｑ１０の混合物である補酵素Ｑ１０を対象とするのが好ましい。なお、本明細書において、補酵素Ｑ１０とのみ記載した場合は、酸化型補酵素Ｑ１０、還元型補酵素Ｑ１０を問わず、両者が混在する場合には混合物全体も表すものである。
【００１８】
本発明で用いる脂溶性生理活性物質を含有する微生物としては、目的とする脂溶性生理活性物質又はその前駆体を菌体内に産生する微生物又は該物質をもともと一定量以上含んでいる微生物であれば、細菌、酵母、カビのいずれも制限無く使用することができる。中でも脂溶性生理活性物質を菌体内に産生する微生物が好ましい。上記微生物としては、具体的には、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、アセトバクター（Acetobacter）属、アミノバクター（Aminobacter）属、アグロモナス（Agromonas）属、アシドフィラス（Acidiphilium）属、ブレロミセス（Bulleromyces）属、ブレラ（Bullera）属、ブレブンジモナス（Brevundimonas）属、クリプトコッカス（Cryptococcus）属、キオノスファエラ（Chionosphaera）属、カンジタ（Candida）属、セリノステルス（Cerinosterus）属、エキソフィアラ（Exisophiala）属、エキソバシジウム（Exobasidium）属、フィロミセス（Fellomyces）属、フィロバシジエラ（Filobasidiella）属、フィロバシジウム（Filobasidium）属、ゲオトリカム（Geotrichum）属、グラフィオラ（Graphiola）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属、コッコバエラ（Kockovaella）属、クルツマノミセス（Kurtzmanomyces）属、ララリア（Lalaria）属、ロイコスポリジウム（Leucosporidium）属、レギオネラ（Legionella）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ミコプラナ（Mycoplana）属、オースポリジウム（Oosporidium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、シュドジマ（Psedozyma）属、パラコッカス（Paracoccus）属、ペトロミセス（Petromyc）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、リゾモナス（Rhizomonas）属、ロドビウム（Rhodobium）属、ロドプラネス（Rhodoplanes）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、スポロボロミセス（Sporobolomyces）属、スポリジオボラス（Sporidiobolus）属、サイトエラ（Saitoella）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、スポトリクム（Sporotrichum）属、シンポジオミコプシス（Sympodiomycopsis）属、ステリグマトスポリジウム（Sterigmatosporidium）属、タファリナ（Tapharina）属、トレメラ（Tremella）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、チレチアリア（Tilletiaria）属、チレチア（Tilletia）属、トリポスポリウム（Tolyposporium）属、チレチオプシス（Tilletiopsis）属、ウスチラゴ（Ustilago）属、ウデニオミセス（Udeniomyce）属、キサントフィロミセス（Xanthophllomyces）属、キサントバクテリウム（Xanthobacter）属、ペキロマイセス（Paecilomyces）属、アクレモニウム（Acremonium）属、ハイホモナス（Hyhomonus）属、リゾビウム（Rhizobium）属、ファフィア（Phaffia）属、ヘマトコッカス（Haematococcus）属等の微生物を挙げることができる。培養の容易さや生産性の観点からは、細菌または酵母が好ましく、細菌では非光合成細菌がより好ましく、さらには、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、グルコノバクター（Gluconobacter）属等が、酵母ではシゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、サイトエラ（Saitoella）属、ファフィア（Phaffia）属等が特に好ましい例として挙げられる。
【００１９】
なお脂溶性生理活性物質を菌体外に産生する、すなわち培養液中に当該物質を産生する微生物も本発明に包含される。
【００２０】
脂溶性生理活性物質を産生する微生物としては、上記微生物の野生株のみならず、例えば、上記の微生物の目的とする脂溶性生理活性物質の生合成に関与する遺伝子の転写及び翻訳活性、或いは発現蛋白質の酵素活性を、改変或いは改良した変異体や組換え体も使用することができる。
【００２１】
上記微生物を培養することで、補酵素Ｑ１０などの脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞を得ることができる。培養方法は特に限定されず、対象となる微生物に適した、あるいは目的とする脂溶性生理活性物質の産生に適した培養方法が適宜選択しうる。培養期間も特に限定されず、微生物細胞中に所望の量の目的とする脂溶性生理活性物質が産生されればよい。その場合の脂溶性生理活性物質の産生量（含有量）としては、目的により特に限定されないが、例えば培地あたりの脂溶性生理活性物質の含有量として、例えば０．５μｇ／ｍｌ以上、好ましくは１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２μｇ／ｍｌ以上である。
【００２２】
本発明の製造方法においては、上記微生物細胞から脂溶性生理活性物質を抽出する方法として、微生物細胞から直接抽出することもできるが、所望により前記微生物細胞を破砕して微生物細胞破砕物とし、該破砕物から抽出することもできる。細胞の破砕は、微生物細胞中に産生・蓄積された脂溶性生理活性物質の効率的な抽出に寄与する。細胞破砕処理は、細菌では必ずしも必要ではない場合もあるが、酵母やカビの細胞を使用する場合、細胞破砕処理をするのが特に好ましい。酵母やカビの細胞を使用する場合、細胞が破砕されていないと、細胞中に産生・蓄積された脂溶性生理活性物質の回収効率は低下する。
なお、本発明の「破砕」においては、目的とする脂溶性生理活性物質の抽出が可能となる程度に細胞壁等の表面構造が損傷を受ければよく、必ずしも微生物細胞が破れる、或いは断片化される必要はない。
【００２３】
本願において、「微生物細胞又はその微生物細胞破砕物の水性懸濁液」とは、微生物細胞又はその微生物細胞破砕物が水、生理食塩水、緩衝液、培地などの水性溶媒に懸濁されたものであり、好ましくは、水及び／又は培地に懸濁されたものである。
【００２４】
上記細胞破砕の対象となる微生物細胞の形態は、微生物細胞の水性懸濁液、培養液、培養液を濃縮したもの、培養液から微生物細胞を湿菌体として採取したもの、これらを洗浄したもの、湿菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの、前記の湿菌体を乾燥させた乾燥菌体、乾燥菌体を溶媒（例えば、水、生理食塩水、緩衝液等も含む）に懸濁したもの等であってもよいが、好ましくは微生物細胞の水性懸濁液、培養液、培養液を濃縮したものや、これらを洗浄したものであり、操作性等の面から、より好ましくは、培養液、培養液を濃縮したものや、これらを洗浄したものである。
【００２５】
上記微生物細胞の破砕は、以下の１つ又は幾つかの破砕方法を任意の順序で行うことにより行われる。破砕方法としては、例えば、物理的処理、化学的処理、酵素的処理の他、自己消化、浸透圧溶解、原形質溶解等を挙げることができる。
【００２６】
上記物理的処理としては、例えば、高圧ホモジナイザー、回転刃式ホモジナイザー、超音波ホモジナイザー、フレンチプレス、ボールミル等の使用、あるいは、これらの組み合わせを挙げることができる。
上記化学的処理としては、例えば、塩酸、硫酸等の酸（好ましくは強酸）を用いる処理、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム等の塩基（好ましくは強塩基）を用いる処理等や、これらの組み合わせを挙げることができる。
上記酵素的処理としては、例えば、リゾチーム、ザイモリアーゼ、グルカナーゼ、ノボザイム、プロテアーゼ、セルラーゼ等を用いる方法を挙げることができ、適宜これらを組み合わせて用いても良い。
【００２７】
上記自己消化としては、例えば、酢酸エチル等の溶媒による処理を挙げることができる。また、細胞内の塩濃度と異なる溶液で処理することにより、細胞の浸透圧溶解や原形質溶解を引き起こすこともできる。但し、この方法のみでは細胞破砕効果が不十分な場合が多いため、上記のような物理的処理、化学的処理、酵素的処理、自己消化等と合わせて用いるのが好ましい。
本発明において、脂溶性生理活性物質の抽出・回収の前処理としての細胞破砕方法としては、上記破砕方法の中でも、物理的処理、化学的処理（特に酸処理、好ましくは強酸（例えば、水溶液中におけるｐＫａが２．５以下の酸）処理）が好ましく、破砕効率の点から物理的処理がより好ましい。また、物理的処理によって細胞の破砕を行う場合は、後述する本発明の加温処理と同時に行っても良い。一方、化学的処理や酵素処理などにおいては、加温処理で使用するアルカリや界面活性剤の存在が影響を与えることもあることから、破砕処理後に別工程として加温処理を行うのが好ましい。
【００２８】
本発明の製造方法では、前記脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に有機溶媒を混合して使用生理活性物質を抽出する前に、アルカリと特定の非イオン性界面活性剤存在下に加温処理を行う（以下「本発明の加温処理」ともいう）ことが特徴である。本発明において、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液を調製する方法は特に限定されないが、例えば、脂溶性生理活性物質を産生する微生物の培養後の培養液、該培養液を濃縮及び／又は洗浄したものや、該微生物細胞の湿菌体や乾燥菌体を水や水性溶媒に懸濁させて調製する。あるいは微生物細胞の水性懸濁液を上記の方法によって破砕して調製することができる。本発明の製造方法において、加温処理や抽出の対象となる微生物細胞破砕物の水性懸濁液中の菌体濃度は、特に制限されないが、菌体の乾燥重量に換算して通常１〜２５重量％の範囲であり、経済的には１０〜２０重量％の範囲で実施するのが好ましい。
【００２９】
本発明の加温処理時に用いるアルカリとしては、特に限定されないが、水酸化アルミニウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化鉄、水酸化銅(II)などが挙げられ、これらの２種以上併用することもできるが、原料費の面から踏まえると、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムを少なくとも使用するのが好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。また、本発明の加温処理で使用するアルカリの量としては、使用するアルカリの種類や濃度にもより特に限定されないが、加温処理時の微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液のｐＨが７．５以上となる量が好ましく、ｐＨ８以上となる量であるのがより好ましい。
【００３０】
また、本発明の加温処理においては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤、ショ糖脂肪酸エステル類、又はポリエーテル型界面活性剤を使用することが必要である。またこれらの非イオン性界面活性剤を２種以上併用することもできるし、これらの非イオン性界面活性剤とそれ以外の界面活性剤を併用してもかまわない。
【００３１】
上記ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤としては、ポリプロピレングリコールの両端に酸化エチレンを付加させて得られるブロックコポリマーである、エチレンオキサイド（ＥＯ）鎖の間に、プロピレンオキサイド（ＰＯ）鎖を有するもの（ＥＯｘＰＯｙＥＯｚ）の他、リバースタイプのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、エチレンジアミン型ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーなども含まれる。
【００３２】
上記エチレンオキサイド（ＥＯ）鎖の間に、プロピレンオキサイド（ＰＯ）鎖を有するポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとしては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のプルロニックＬシリーズ（Ｌ−３１、Ｌ−３４、Ｌ−４４、Ｌ−６１、Ｌ−６２、Ｌ−６４、Ｌ−７１、Ｌ−７２、Ｌ−１０１、Ｌ−１２１）、プルロニックＰシリーズ（Ｐ−６５、Ｐ−８４、Ｐ−８５、Ｐ−１０３、Ｐ−１０５、Ｐ−１２３）、プルロニックＦシリーズ（Ｆ−６８、Ｆ−１０８、Ｆ−１２７）やＢＡＳＦ社製のプルロニックＰＥシリーズ等が挙げられる。
【００３３】
上記リバースタイプのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとしては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のプルロニックＲシリーズ（２５Ｒ−１、２５Ｒ−２、１７Ｒ−２、１７Ｒ−３、１７Ｒ−４）やＢＡＳＦ社製のプルロニックＲＰＥシリーズ等が挙げられる。上記エチレンジアミン型ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーとしては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のプルロニックＴＲシリーズ（ＴＲ−７０１、ＴＲ−７０２、ＴＲ−７０４）やＢＡＳＦ社製のテトロニックシリーズ（ポロキサミン）等が挙げられる。さらに、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤と類似の構造を持つ、２つのエチレンオキサイド（ＥＯ）鎖の間に、ブチレンオキサイド（ＢＯ）鎖を有するトリブロックコポリマー型の界面活性剤（ＥＯｘＢＯｙＥＯｚ）も、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤と同様、本発明の製造方法において使用できる。
【００３４】
上記これらのポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤（及びその類似体）のなかでも、質量平均分子量が５００〜８０００の範囲にある界面活性剤が好ましく、質量平均分子量が１０００〜４０００の範囲にある界面活性剤がより好ましい。
【００３５】
上記ショ糖脂肪酸エステル類としては、ショ糖の水酸基の１つ以上に炭素数が各々６〜１８、好ましくは６〜１２の脂肪酸をエステル化したものが挙げられる。具体的には、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等が挙げられる。
【００３６】
上記ポリエーテル型の界面活性剤としては、例えば、株式会社ＡＤＥＫＡ製のアデカノールＬＧシリーズ（ＬＧ−１０９、ＬＧ−１２６、ＬＧ−２９４、ＬＧ−２９５Ｓ、ＬＧ−２９９、ＬＧ−８０５）等や、サンノプコ社製のＳＮデフォーマＰＣ，ＳＮデフォーマ４４４，ＳＮデフォーマ４７０，ＳＮデフォーマ４８５等が挙げられる。
【００３７】
上記これらのポリエーテル型の界面活性剤（及びその類似体）のなかでも、質量平均分子量が５００〜８０００の範囲にある界面活性剤が好ましく、質量平均分子量が１０００〜４０００の範囲にある界面活性剤がより好ましい。
【００３８】
言うまでもなく、ここで示した非イオン性界面活性剤は２種以上を合わせて使用することもできるし、効果を損なわない範囲で上記以外の界面活性剤と組み合わせて使用することもできるが、操作性や原料費を加味すれば、１種類であることが好ましい。上記非イオン性界面活性剤の中でも、ポリオキシエチレンーポリオキシプロピレンブロックコポリマー型の界面活性剤かポリエーテル型の界面活性剤を使用するのが好ましく、ポリエーテル型の界面活性剤がより好ましい。
【００３９】
本発明の加温処理における上記特定の非イオン性界面活性剤の使用量は、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に対する濃度として、０．０１重量％以上であることが好ましく、０．１重量％以上であることがより好ましい。上記界面活性剤の添加量が０．０１重量％未満の場合、その後の抽出工程において、有機溶媒中における水性懸濁液の微細分散化が進まず、十分な抽出効率を確保できないことがある。非イオン性界面活性剤の使用量の上限は特に限定されないが、５重量%以下が好ましく、１重量％以下がより好ましい。上記界面活性剤の添加量が５重量％を超える場合、その後の抽出工程において、有機溶媒と水性懸濁液の親和性が必要以上に高くなるため、混合状態にある有機溶媒と水性懸濁液を静置した際の油水分離性が悪化することがある。本発明においては、本加温処理を行うことで、従来の界面活性剤を使用した液−液抽出方法と比較して、上記界面活性剤の添加量が１重量%以下と少ない場合でも確実に抽出操作が行えることから、原料価格の観点においてもより優れている。
【００４０】
本発明の加温処理は、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液を、上記特定の非イオン性界面活性剤とアルカリ存在下に、加温することで実施される。本工程において、上記特定の非イオン性界面活性剤とアルカリは微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液に同時に添加されてもよく、別々に添加されてもよい。操作性の観点からは、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液にアルカリを添加、混合して所定のｐＨとなったのを確認した後に、特定の非イオン性界面活性剤を添加してさらに混合するのが好ましい。また、本発明の加温処理時の加温温度としては、特に制限されないが、通常４０℃以上が好ましく、５０℃以上がより好ましく、５５℃以上がさらに好ましく、６０℃以上が特に好ましい。上限は特に限定されないが、通常１００℃以下、好ましくは７０℃以下の範囲で実施できる。
また、本発明の加温処理は、通常、攪拌状態で実施される。
【００４１】
このような加温処理を行うことで、後述する抽出工程における脂溶性生理活性物質の抽出効率を向上させることができるだけでなく、加温処理時に特定の非イオン性の界面活性剤を用いることで、後の抽出工程において、有機溶媒と水性懸濁液の親和性が向上するだけでなく、混合・静置後には、確実に油水分離が速やかに進むことがわかった。従って本発明の製造方法では、安定的により高い収率で目的物質である脂溶性生理活性物質の溶解した有機溶媒相を回収することができる。
【００４２】
本発明の製造方法では、上記加温処理後、上記脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液と特定の非イオン性界面活性剤とアルカリの混合液に、さらに有機溶媒を混合して、液−液抽出によって、有機溶媒相に脂溶性生理活性物質を抽出することで、脂溶性生理活性物質の回収を行う。本発明の製造方法において、抽出に用いる有機溶媒としては、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類、アルコール類、脂肪酸類、ケトン類、窒素化合物類（ニトリル類、アミド類を含む）、硫黄化合物類等を挙げることができる。
【００４３】
炭化水素類としては、特に制限されないが、例えば、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、ハロゲン化炭化水素等を挙げることができる。このなかでも脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素が好ましく、脂肪族炭化水素がより好ましい。
【００４４】
脂肪族炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数５〜１２、より好ましくは炭素数５〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、ヘプタン異性体（例えば、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン）、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、２−ペンテン、１−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、１−ノネン、１−デセン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン、シクロヘキセン等を挙げることができる。好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、ノナン、２，２，５−トリメチルヘキサン、デカン、ドデカン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン、ｐ−メンタン等である。より好ましくは、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等であり、さらに好ましくは、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等であり、特に好ましくは、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくはヘキサン、ヘプタンである。
【００４５】
芳香族炭化水素としては、特に制限されないが、通常、炭素数６〜２０、好ましくは炭素数６〜１２、より好ましくは炭素数７〜１０のものが用いられる。具体例としては、例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン、ジペンチルベンゼン、ドデシルベンゼン、スチレン等を挙げることができる。好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、クメン、メシチレン、テトラリン、ブチルベンゼン、ｐ−シメン、シクロヘキシルベンゼン、ジエチルベンゼン、ペンチルベンゼン等である。より好ましくは、トルエン、キシレン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、クメン、テトラリン等である。最も好ましくは、クメンである。
【００４６】
ハロゲン化炭化水素としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、非環状のものが好ましく用いられる。より好ましくは塩素化炭化水素、フッ素化炭化水素であり、さらに好ましくは塩素化炭化水素である。また、炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜４、より好ましくは炭素数１〜２のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，１，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、ペンタクロロエタン、ヘキサクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、１，２−ジクロロプロパン、１，２，３−トリクロロプロパン、クロロベンゼン，１，１，１，２−テトラフルオロエタン等を挙げることができる。好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１−ジクロロエチレン、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。より好ましくは、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、クロロベンゼン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等である。
【００４７】
脂肪酸エステル類としては、特に制限されないが、例えば、プロピオン酸エステル、酢酸エステル、ギ酸エステル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸エステル、ギ酸エステルであり、より好ましくは酢酸エステルである。エステル基としては、特に制限されないが、通常、炭素数１〜８のアルキルエステル、炭素数７〜１２のアラルキルエステルが、好ましくは炭素数１〜６のアルキルエステルが、より好ましくは炭素数１〜４のアルキルエステルが用いられる。
【００４８】
プロピオン酸エステルの具体例としては、例えば、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸イソペンチル等を挙げることができる。好ましくはプロピオン酸エチル等である。
【００４９】
酢酸エステルの具体例としては、例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル、酢酸ベンジル等を挙げることができる。好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、酢酸ｓｅｃ−ブチル、酢酸ペンチル、酢酸イソペンチル、酢酸ｓｅｃ−ヘキシル、酢酸シクロヘキシル等である。より好ましくは、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル等であり、最も好ましくは、酢酸エチルである。
【００５０】
ギ酸エステルの具体例としては、例えば、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸イソプロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ｓｅｃ−ブチル、ギ酸ペンチル等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸メチル、ギ酸エチル、ギ酸プロピル、ギ酸ブチル、ギ酸イソブチル、ギ酸ペンチル等である。最も好ましくは、ギ酸エチルである。
【００５１】
エーテル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数３〜２０、好ましくは炭素数４〜１２、より好ましくは炭素数４〜８のものが用いられる。具体例としては、例えば、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、エチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、フラン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ジヘキシルエーテル、アニソール、フェネトール、ブチルフェニルエーテル、メトキシトルエン、ジオキサン、２−メチルフラン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、エチレングリコールジブチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。より好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール、ジオキサン、テトラヒドロフラン、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノエチルエーテル等である。さらに好ましくは、ジエチルエーテル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル、アニソール等であり、最も好ましくは、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。
【００５２】
アルコール類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に、飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１２、より好ましくは炭素数１〜６である。なかでも、炭素数１〜５の１価アルコール、炭素数２〜５の２価アルコール、炭素数３の３価アルコールが好ましい。
【００５３】
これらアルコール類の具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、アリルアルコール、プロパルギルアルコール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等の１価アルコール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール等の２価アルコール；グリセリン等の３価アルコールを挙げることができる。
【００５４】
１価アルコールとしては、好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、１−ノナノール、１−デカノール、１−ウンデカノール、１−ドデカノール、ベンジルアルコール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−メチルシクロヘキサノール、３−メチルシクロヘキサノール、４−メチルシクロヘキサノール等である。より好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール、１−ヘキサノール、２−メチル−１−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ブタノール、シクロヘキサノール等である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等である。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール等であり、最も好ましくは、２−プロパノールである。
【００５５】
２価アルコールとしては、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール等が好ましく、１，２−エタンジオールが最も好ましい。３価アルコールとしては、グリセリンが好ましい。
【００５６】
脂肪酸類としては、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸等を挙げることができる。好ましくは、ギ酸、酢酸であり、最も好ましくは酢酸である。
【００５７】
ケトン類としては、特に制限されず、炭素数３〜６のものが好適に用いられる。具体例としては、例えば、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、メチルイソブチルケトン等を挙げることができる。好ましくは、アセトン、メチルエチルケトンであり、最も好ましくはアセトンである。
【００５８】
ニトリル類としては、環状、非環状を問わず、又、飽和、不飽和を問わず、特に制限されないが、一般に飽和のものが好ましく用いられる。通常、炭素数２〜２０、好ましくは炭素数２〜１２、より好ましくは炭素数２〜８のものが用いられる。
【００５９】
具体例としては、例えば、アセトニトリル、プロピオニトリル、マロノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、スクシノニトリル、バレロニトリル、グルタロニトリル、ヘキサンニトリル、ヘプチルシアニド、オクチルシアニド、ウンデカンニトリル、ドデカンニトリル、トリデカンニトリル、ペンタデカンニトリル、ステアロニトリル、クロロアセトニトリル、ブロモアセトニトリル、クロロプロピオニトリル、ブロモプロピオニトリル、メトキシアセトニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、トルニトリル、ベンゾニトリル、クロロベンゾニトリル、ブロモベンゾニトリル、シアノ安息香酸、ニトロベンゾニトリル、アニソニトリル、フタロニトリル、ブロモトルニトリル、メチルシアノベンゾエート、メトキシベンゾニトリル、アセチルベンゾニトリル、ナフトニトリル、ビフェニルカルボニトリル、フェニルプロピオニトリル、フェニルブチロニトリル、メチルフェニルアセトニトリル、ジフェニルアセトニトリル、ナフチルアセトニトリル、ニトロフェニルアセトニトリル、クロロベンジルシアニド、シクロプロパンカルボニトリル、シクロヘキサンカルボニトリル、シクロヘプタンカルボニトリル、フェニルシクロヘキサンカルボニトリル、トリルシクロヘキサンカルボニトリル等を挙げることができる。
【００６０】
好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、スクシノニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリル、バレロニトリル、シアノ酢酸メチル、シアノ酢酸エチル、ベンゾニトリル、トルニトリル、クロロプロピオニトリルであり、より好ましくは、アセトニトリル、プロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリルであり、最も好ましくは、アセトニトリルである。
【００６１】
ニトリル類を除く窒素化合物類としては、例えば、ホルムアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等のアミド類やニトロメタン、トリエチルアミン、ピリジン等を挙げることができる。
【００６２】
硫黄化合物類としては、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン等を挙げることができる。
【００６３】
上記有機溶媒の中でも、沸点、融点、粘性等の性質を考慮して選定するのが好ましい。例えば、沸点としては、溶解度を高めるための適度な加温ができ、且つ、湿体からの溶媒の乾燥除去や晶析濾液等からの溶媒回収の行いやすいという観点から、１気圧下、約３０〜１５０℃の範囲であるのが好ましく、融点としては、室温での取り扱い時及び室温以下に冷却した時も固化しにくいという観点から、約０℃以上、好ましくは約１０℃以上、より好ましくは約２０℃以上であり、粘性は２０℃において約１０ｃｐ以下と低い方が好ましい。
【００６４】
上記有機溶媒のうち、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液から、脂溶性生理活性物質を抽出し回収する目的においては、２相系での液−液抽出を行うという観点から、抽出溶媒として疎水性有機溶媒または疎水性有機溶媒を含有するものを用いるのが好ましい。
【００６５】
この場合に使用される疎水性有機溶媒としては、特に制限されず、上述の有機溶媒のうち水と完全に混和せず２相系となる疎水性のものを使用できるが、好ましくは、炭化水素類、脂肪酸エステル類、エーテル類等の疎水性有機溶媒であり、さらに好ましくは炭化水素類、より好ましくは脂肪族の炭化水素類を用いることができる。脂肪族炭化水素類のなかでも、炭素数５〜８のものが好適に用いられる。上記炭素数５〜８の脂肪族炭化水素類の具体例としては、例えば、ペンタン、２−メチルブタン、ヘキサン、２−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、オクタン、２，２，３−トリメチルペンタン、イソオクタン、シクロペンタン、メチルシクロペンタン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン、エチルシクロヘキサン等を挙げることができる。特に好ましくは、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサンであり、最も好ましくは、ヘキサン、ヘプタンである。
【００６６】
本発明の製造方法では、界面活性剤存在下に抽出を行うことで、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液と上記疎水性有機溶媒との親和性を向上させ、十分な抽出効率を得ることが可能であるが、抽出時に使用される有機溶媒として上記疎水性有機溶媒に加えて、親水性有機溶媒を補助的に併用することで、有機溶媒中での水性懸濁液の更なる微細化の促進と、静置時においては高い油水分離の安定性向上を付加することができ、より好ましい場合がある。本発明の製造方法において、疎水性有機溶媒と組み合わせて用いられる親水性有機溶媒としては、特に制限されず、上述の有機溶媒のうち親水性のものを使用しうるが、好ましくは、アルコール類である。アルコール類のなかでも、炭素数１〜５の１価アルコールが好適に用いられる。これらの具体例としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、イソブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール、１−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、２−メチル−１−ブタノール、イソペンチルアルコール、ｔｅｒｔ−ペンチルアルコール、３−メチル−２−ブタノール、ネオペンチルアルコール等を挙げることができる。特に好ましくは、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールであり、最も好ましくは、２−プロパノールである。
【００６７】
本発明の製造方法において、抽出溶媒として使用する疎水性有機溶媒の使用量としては、特に制限はされないが、抽出時の濃度として、抽出系の全溶液（微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液、抽出溶媒、アルカリ、非イオン性界面活性剤などの混合溶液）の容量に対して、２５〜８０容量％の範囲で使用するのが好ましく、５０〜７５容量％の範囲で使用するのがより好ましい。また、上記のように親水性有機溶媒を併用する場合の親水性有機溶媒の使用量は、２相系が維持できる範囲であれば特に限定されないが、全溶液の容量に対して０．１〜５０容量％の範囲で使用するのが好ましく、０．１〜１０容量％の範囲で使用するのがより好ましく、０．２〜５容量％の範囲で使用するのがさらに好ましい。親水性有機溶媒の使用量が、全溶液の容量に対して０．２〜２容量％といったごくわずかの量であっても、本発明においてはその効力を発揮しうる。
本発明の製造方法において、抽出時の温度は、特に制限されないが、通常０〜６５℃、好ましくは２０〜５５℃の範囲で実施できる。
【００６８】
抽出方法としては、回分抽出、連続抽出のどちらの方法でも行うことができるが、工業的には連続抽出が生産性の面で好ましく、連続抽出の中でも図１に示されるような向流多段抽出が特に好ましい。回分抽出の場合の撹拌時間は、特に制限されないが、通常５分以上であり、連続抽出の場合の平均滞留時間は、特に制限されないが、通常１０分以上である。また、回分抽出や連続抽出を行う場合、抽出工程において、さらに本発明の加熱処理で使用される特定の非イオン性の界面活性剤を適宜追加添加してもよい。例えば向流多段抽出においては上記非イオン性界面活性剤を各抽出槽に添加するのがより好ましい。その場合、より抽出効率を高めることができる。
【００６９】
本発明の製造方法においては、通常、微生物細胞又は該細胞破砕物の水性懸濁液と有機溶媒、及び上記界面活性剤を所定時間混合して抽出を実施した後、これら混合液を静置させ、水相と、脂溶性生理活性物質を含んだ有機溶媒相とを分離させるが、油水界面の分離が著しく遅い場合においては、遠心分離機、連続遠心機、液体サイクロン等を用いて強制的に分離させることもできる。
【００７０】
上記のような本発明の製造方法を採用することで、微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液中に含まれる脂溶性生理活性物質を高い効率で抽出することが可能である。本発明の製造法における抽出率は、通常７５％以上であり、より好ましくは８５％以上である。ここでいう抽出率は、抽出前の微生物細胞又は微生物細胞破砕物の水性懸濁液中に含まれる脂溶性生理活性物質の総量に対する、抽出操作終了後の抽出液に含まれる脂溶性生理活性物質の割合であり、具体的には後述する実施例のようにして求めることができる。
【００７１】
本発明の製造方法においては、以上の操作によって、脂溶性生理活性物質を含有する微生物細胞又は微生物細胞破砕物から、有機溶媒中に脂溶性生理活性物質を抽出することで脂溶性生理活性物質を単離・回収できる。得られた脂溶性生理活性物質を含む有機溶媒溶液は、そのまま利用することもできるし、引き続き通常の精製方法に付すことによりさらに高度に精製することができる。例えば、活性炭や白土等の吸着剤で精製した後、有機溶媒を留去して、脂溶性生理活性物質を含む抽出物あるいは脂溶性生理活性物質の精製物とすることもできる。また通常使用されるカラムクロマトグラフィーや液液分配などの精製処理に付してもよい。なお、これらの精製処理は、単独もしくは数種組み合わせて行うこともできる。また必要に応じて、鹸化、酸化、還元、その他合成反応処理などの工程を加えることもできる。また晶析操作等で目的とする脂溶性生理活性物質を結晶体として得ることもできる。例えば、目的とする脂溶性生理活性物質が補酵素Ｑ１０の場合には、本発明の製造方法によって、補酵素Ｑ１０を含有する微生物細胞又はその微生物細胞破砕物から、有機溶媒中に補酵素Ｑ１０を抽出し、得られた補酵素Ｑ１０を含有する抽出液を、自体公知の方法により精製し補酵素Ｑ１０を得ることができる。例えば、所望により活性炭や白土等の吸着剤処理やカラムクロマトグラフィーにより精製し、その前後で必要に応じて酸化又は還元処理を行い、晶析操作を用いて、高純度の補酵素Ｑ１０の結晶を取得することもできる。
【実施例】
【００７２】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００７３】
各実施例における抽出率は以下のようにして算出した。抽出を行う前の補酵素Ｑ１０含有微生物細胞破砕液１ｍｌに、メタノール−クロロホルム（３：１）混合液を加えて総量５０ｍｌとし、２５℃で３０分攪拌後、菌体由来の固形物を固液分離し、得られた液層部分の補酵素Ｑ濃度を下記ＨＰＬＣ条件で測定して、抽出対象の微生物細胞破砕液中に含まれていた補酵素Ｑ量を算出した。同様に、抽出操作後の抽出液中の補酵素Ｑ濃度を下記ＨＰＬＣ条件で測定し、抽出された補酵素Ｑ量を算出し、以下の式により抽出率を求めた。
抽出率（％）＝抽出液に含まれる補酵素Ｑの重量／抽出前の微生物細胞破砕液中に含まれていた補酵素Ｑの重量×１００
【００７４】
（HPLC測定条件）
カラム：YMC-Pack ODS-A（YMC. Co.,Ltd製）
オーブン温度：30℃
移動相：メタノール／ヘキサン＝85/15（容積比）
送液速度：1.0 ml/min
検出：ＵＶ２７５ｎｍ
【００７５】
（実施例１）
補酵素Ｑ１０を産生するサイトエラ・コンプリカタ（Saitoella complicata）ＩＦＯ１０７４８株を、１０Ｌの培地（ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス３ｇ／Ｌ、マルトエキス３ｇ／Ｌ、グルコース２０ｇ／Ｌ、ｐＨ６．０）を用いて、好気的に２５℃で１６０時間培養した。得られた微生物菌体を含む培養液を遠心分離により濃縮し、圧力式ホモジナイザーにより破砕圧力８０ＭＰａで２回破砕し、補酵素Ｑ１０を含有する微生物細胞破砕液を調製した。
【００７６】
得られた微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、さらにポリエーテル型界面活性剤（ＳＮデフォーマーＰＣ、サンノプコ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加した。これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３１であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８８．３％であった。
【００７７】
（実施例２）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリエーテル型界面活性剤（ＳＮデフォーマー４４４、サンノプコ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００７８】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３１であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８８．２％であった。
【００７９】
（実施例３）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリエーテル型界面活性剤（ＳＮデフォーマー４７０、サンノプコ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００８０】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８６．１％であった。
【００８１】
（実施例４）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリエーテル型界面活性剤（ＳＮデフォーマー４８５、サンノプコ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００８２】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８４．０％であった。
【００８３】
（実施例５）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリエーテル型界面活性剤（アデカノールＬＧ１２６、アデカ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００８４】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３４であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８５．０％であった。
【００８５】
（実施例６）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリエーテル型界面活性剤（アデカノールＬＧ−１２６、アデカ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００８６】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させた後得られた抽出液を回収し、残った水相に、水相と同量のヘキサンおよび０．５重量％のポリエーテル型界面活性剤（アデカノールＬＧ−１２６、アデカ社製）を添加して抽出した。これを２回繰りかえし、３段バッチ抽出を実施した。その結果、３段ともに速やかな油水分離が確認された。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、３段でのトータルでの補酵素Ｑ１０の抽出率は９７．１％であった。
【００８７】
（実施例７）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型界面活性剤（プルロニックＬ−６２、アデカ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００８８】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３４であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は８８．４％であった。
【００８９】
（実施例８）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％の水酸化ナトリウムをｐＨ７．５となるように添加し、さらにポリエーテル型界面活性剤（アデカノールＬＧ１２６、アデカ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００９０】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３４であった。分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は７９．１％であった。
【００９１】
【表１】
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【００９２】
（実施例９）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリエーテル型界面活性剤（アデカノールＬＧ１２６、アデカ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００９３】
その後、上記加熱処理後の微生物細胞破砕液を２８容量部、ヘキサンを７２容量部の割合で固定し、２段目、３段目にも定期的にポリエーテル型界面活性剤（アデカノールＬＧ１２６、アデカ社製）を添加し、運転期間中各槽の界面活性剤濃度が菌体破砕液に対して０．５重量％となるように、向流３段連続抽出を８時間実施した。この際使用した装置図を図１に示す。運転中は終始安定した分離性、抽出率が確認され、８時間の平均抽出率は９７．０％であった。また各槽における補酵素Ｑ１０の抽出率の経時変化を図２に示した。
【００９４】
（比較例１）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、ポリエーテル型界面活性剤（アデカノールＬＧ１２６、アデカ社製）を０．５重量％の濃度となるように添加した。この微生物培養破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたところ、速やかな油水分離が確認され、全液量に対する抽出残渣の容量比は０．３５であったが、分離したヘキサン相を抽出液として採取し、ＨＰＬＣによる分析を行ったところ、補酵素Ｑ１０の抽出率は６６．１％であった。
【００９５】
（比較例２）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、ポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００９６】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたが油水分離せず均層化し、ヘキサン相を抽出液として採取できなかった。
【００９７】
（比較例３）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、アルキルエーテル型界面活性剤（アデカトールＬＡ７７５、アデカ社製）を０．５重量％となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたが油水分離せず均層化し、ヘキサン相を抽出液として採取できなかった。
【００９８】
（比較例４）
実施例１と同様に調製した微生物細胞破砕液に、４０重量％水酸化ナトリウムをｐＨ８になるように添加した後、デカグリセンオレイン酸エステルを０．５重量％の濃度となるように添加し、これを６０℃条件下で１０分間撹拌した。
【００９９】
上記加熱処理後の微生物細胞破砕液２８容量部に、ヘキサン７２容量部を混合し、５５℃で６０分間の１段回分抽出操作を行った。所定時間混合の後、静置させたが油水分離せず均層化し、ヘキサン相を抽出液として採取できなかった。
【０１００】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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