(57)【要約】      （修正有）【課題】肺アスベルギルス症の治療に用いる、エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びpHに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができる新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼインヒビター及びエラスターゼの水解活性インヒビター、並びに前記ポリペプチドをコードする新規DNAの提供。【解決手段】A.fumigatus由来エラスターゼ、A.flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（a）及び（b）のいずれかであるポリペプチドなど。（a）特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド（b）特定のアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも1種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（a）及び（b）のいずれかであることを特徴とするポリペプチド。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項２】
Aspergillus oryzae由来である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有する請求項１から２のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチドを含有することを特徴とするエラスターゼインヒビター。
【請求項５】
請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチドを含有し、エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害することを特徴とするエラスターゼの水解活性インヒビター。
【請求項６】
A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（a）から（d）のいずれかであることを特徴とするDNA。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（c）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNA。
（d）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エラスターゼに対する阻害活性を有する新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼインヒビター、及びエラスターゼの水解活性インヒビター、並びに前記ポリペプチドをコードする新規DNAに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺アスペルギルス症は、深在性真菌症の中でも最も頻度が高く、中でも慢性型であるアスペルギローマと慢性壊死性肺アスペルギルス症が多数を占めている。これらの疾病において、日和見感染性Aspergillus sp.が産生するエラスターゼが病原因子となっていることが明らかになっている。例えば、これらのエラスターゼは健康なモルモットの肺に強い出血性肺炎を誘起し、マウス肺胞マクロファージの活性を抑制する。
【０００３】
そこで肺アスペルギルス症患者に対し、抗真菌剤に加え、エラスターゼ阻害剤であるウリナスタチンを併用することにより、喀血・血痰などの臨床症状が早期に改善することが明らかになっている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、ウリナスチンのエラスターゼ阻害活性には限度があり、高濃度でも50％阻害程度であったため、より微量で有効な新規エラスターゼインヒビターの探索が行われている。
【０００４】
これまでに、本発明者らによって、日和見感染性Aspergillus sp.より、新規エラスターゼインヒビターが見出され、その諸性質が明らかにされている（例えば、非特許文献２参照）。しかしながら、Aspergillus (A) fumigatusやAspergillus (A) flavusは、病原性を有し、P2レベルに属すため、それに即した設備を要し、また大量に培養する際、所轄官庁への届出と判断が必要になるという問題がある。また、仮にこれらの菌株の漏出により、何らかのトラブルが起きた場合、大きな問題になりかねないという問題もある。
【０００５】
そこで本発明者らはGRAS（Generally Recognized As Safe）として米国FDAより、その安全性が認定されており、実際に清酒、醤油、味噌などの醸造に用いられ、塩麹などとして食されている他、食品用酵素剤の給源として利用されるなど、極めて安全性の高い微生物である麹菌A. oryzaeより新規なエラスターゼインヒビターを単離した。（特許文献１参照）これをAOEIと呼ぶ。AOEIは生産量が少なかったので、そのアミノ酸配列より、コード遺伝子を単離し、高発現プロモーター下では高生産を試みたが、目的を達成できなかった。
【０００６】
また、先に述べた日和見感染性Aspergillus sp.のエラスターゼは、エラスチンを分解する以外にも、ヒトフィブリノーゲンやコラーゲンを水解する活性も有している。前記ヒトフィブリノーゲンが水解されると、組織からの出血の際、止血しないという問題があり、コラーゲンが水解されると、コラーゲンは人体構成タンパク質であるため、人体組織が崩壊しやすくなるという問題がある。そのため、該エラスターゼの水解活性をも阻害することができるエラスターゼインヒビターも必要とされている。
【０００７】
したがって、エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができるエラスターゼインヒビターの速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開2015-39317号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jpn. J.  Med.  Mycol.  2006, 47,  171-178
【非特許文献２】J. Med.  Microbiol. 2008, 57, 803-808
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びpHに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができる新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼインヒビター及びエラスターゼの水解活性インヒビター、並びに前記ポリペプチドをコードする新規DNAを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、GRAS（Generally Recognized As Safe）として米国FDAより、その安全性が認定されており、実際に清酒、醤油、味噌などの醸造に用いられ、塩麹などとして食されている他、食品用酵素剤の給源として利用されるなど、極めて安全性の高い微生物である麹菌A. oryzaeより、新たに、エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドを単離し、前記ポリペプチドが新規なエラスターゼインヒビター（以下、「AOEI2」と称することがある）であることを確認した。更に、前記ポリペプチドが、A. fumigatus由来エラスターゼ、及びA. flavus由来エラスターゼのみならず、ヒト好中球エラスターゼに対しても阻害活性を有することも確認した。また本ポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、高発現プロモーター下でAOEI2を高生産できることを確認した。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては以下の通りである。即ち、
＜1＞  A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも1種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（a）及び（b）のいずれかであることを特徴とするポリペプチドである。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜2＞  前記＜1＞に記載のポリペプチドを含有することを特徴とするエラスターゼインヒビターである。
＜3＞  前記＜1＞に記載のポリペプチドを含有し、エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害することを特徴とするエラスターゼの水解活性インヒビターである。
＜4＞  A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（a）から（d）のいずれかであることを特徴とするDNAである。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（c）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNA。
（d）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びpHに対して安定であり、かつ、安全性に優れ、更には、エラスターゼが有する水解活性をも阻害することができる新規ポリペプチド、前記ポリペプチドを含むエラスターゼインヒビター及びエラスターゼの水解活性インヒビター、並びに前記ポリペプチドをコードする新規DNAを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、MALDI/TOF-MSにより製造例1で得られたエラスターゼインヒビターの分子質量を測定した結果を示す図である。
【図２Ａ】図２Ａは、試験例5-1のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、試験例5-2のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、試験例6-1のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である（コラーゲンtypeI）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、試験例6-2のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である（コラーゲンtypeI）。
【図４Ａ】図４Ａは、試験例6-1のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である（コラーゲンtypeIII）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、試験例6-2のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である（コラーゲンtypeIII）。
【図５Ａ】図５Ａは、試験例6-1のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である（コラーゲンtypeIV）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、試験例6-2のSDSスラブ電気泳動の結果を示す図である（コラーゲンtypeIV）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（ポリペプチド）
本発明のポリペプチドは、A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも1種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（a）及び（b）のいずれかである。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１６】
前記「数個のアミノ酸」の数個とは、前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1個〜9個が挙げられる。
また、アミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加される位置としては、前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１７】
なお、本発明の前記エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドは、前記（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドや、前記（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドと配列同一性を有するものであってもよい。前記配列同一性としては、前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、70％以上が好ましく、80％以上がより好ましく、90％以上が更に好ましく、95％以上が特に好ましい。
【００１８】
前記アミノ酸配列の同一性は、Karlin及びAltschulのアルゴリズム（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、及びProc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993）により決定することができる。このようなアルゴリズムを用いたBLASTプログラムがAltschulらによって開発されている（J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990）。これらは、例えば、NCBIタンパク質データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）で利用することができる。
前記アミノ酸配列の同一性を分析するBLASTプログラムとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００１９】
＜エラスターゼに対する阻害活性の確認＞
前記ポリペプチドが、A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも1種のエラスターゼに対する阻害活性を有することを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例4に示すように、発色性合成基質を含む基質溶液と、エラスターゼと前記ポリペプチドとを含む酵素溶液とを反応させた後、吸光度を測定することにより確認することができる。
【００２０】
前記A. fumigatus由来エラスターゼとして、Jap. J. Med. Mycol., 36, 235-243, 1995の記載に基づいて精製したエラスターゼを用いる場合の基質としては、例えば、Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA（p-nitroanilide）(GAAPLNA)（株式会社ペプチド研究所製）を用いることができる。
前記A. flavus由来エラスターゼとして、Jap. J. Med. Mycol., 38, 53-59, 1997の記載に基づいて精製したエラスターゼを用いる場合の基質としては、例えば、GAAPLNA（株式会社ペプチド研究所）を用いることができる。
前記ヒト好中球エラスターゼとして、シグマ社製のエラスターゼを用いる場合の基質としては、例えば、Suc-Ala-Pro-Ala-pNA（株式会社ペプチド研究所）を用いることができる。
【００２１】
前記酵素溶液と、前記基質溶液との反応条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、37℃で30分間などが挙げられる。
【００２２】
＜分子量＞
前記配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのMALDI/TOF-MSで測定した分子質量は、3,604.61である。また、図１のマススペクトルのパターンに示されるように単一の成分である。
なお、前記ポリペプチドが、配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである場合には、分子質量が3,604.61ではないことがあるが、本発明の効果を損なわない限り、分子質量が3,604.61でなくてもよい。
【００２３】
＜由来＞
前記ポリペプチドの由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、糸状菌、酵母、細菌などが挙げられる。これらの中でも、安全性の点で、麹菌が好ましく、黄麹菌Aspergillus oryzaeがより好ましい。
【００２４】
＜水解活性阻害作用＞
前記ポリペプチドは、前記エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有することが好ましい。
【００２５】
−水解活性阻害作用の確認−
前記ポリペプチドが、前記エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有することを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、後述する試験例5-1〜試験例6-2に示すようにして確認することができる。
具体的には、前記エラスターゼが有するヒトフィブリノーゲンの水解活性を阻害する作用を確認する場合には、例えば、ヒト血清フィブリノーゲン（シグマ社製）を含む基質溶液に、A. fumigatus由来エラスターゼのみ、又はA. fumigatus由来エラスターゼと前記ポリペプチドとを混和した混合液を加え、37℃で反応させ、経時的に採取したサンプルを、ポリアクリルアミドを支持体としたSDSスラブ電気泳動を行い、両者の結果を比較することにより、前記エラスターゼが有するヒトフィブリノーゲンの水解活性を阻害する作用を有するか否かを確認することができる。
また、前記エラスターゼが有するI型、III型、及びIV型コラーゲンの水解活性を阻害する作用を確認する場合には、例えば、コラーゲンtypeI、typeIII、typeIV（新田ゼラチン株式会社製）を含む基質溶液に、A. fumigatus由来エラスターゼのみ、又はA. fumigatus由来エラスターゼと前記ポリペプチドとを混和した混合液を加え、37℃で反応させ、経時的に採取したサンプルを、ポリアクリルアミドを支持体としたSDSスラブ電気泳動を行い、両者の結果を比較することにより、前記エラスターゼが有するコラーゲンの水解活性を阻害する作用を有するか否かを確認することができる。
【００２６】
前記ポリペプチドは、後述する試験例2に示すように、100℃で10分間の加熱を行った後でも前記エラスターゼに対する阻害活性が90％以上残っており、熱に対して強固な安定性を有している。
【００２７】
前記ポリペプチドは、後述する試験例3に示すように、pH5〜12の溶液で処理した後でも前記エラスターゼに対する阻害活性がほぼ100％残っており、人体のpH域、即ちpH6〜9の範囲において安定である。
【００２８】
＜用途＞
本発明のポリペプチドは、病原因子である日和見感染性AspergillusであるA. fumigatus及びA. flavus由来のエラスターゼのみならず、ヒト好中球エラスターゼに対しても阻害活性を有するので、肺アスペルギルス症のみならず、人体内エラスターゼの亢進により発生する諸疾患に対しても有効であると考えられる。また、前記ポリペプチドは、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用をも有する。したがって、後述する本発明のエラスターゼインヒビター、エラスターゼの水解活性インヒビターや、医薬組成物、化粧料組成物に好適に利用可能である。
【００２９】
＜ポリペプチドの製造方法＞
前記ポリペプチドの製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、培養工程と、採取工程とを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の工程を含む方法が好ましい。
【００３０】
＜＜培養工程＞＞
前記培養工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、麹菌、及び後述する形質転換体の少なくともいずれかを培養する工程が好ましい。
【００３１】
前記麹菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、安全性の点で、黄麹菌A. oryzaeが好ましい。
【００３２】
前記培養は、前記麹菌、及び後述する形質転換体の少なくともいずれか（以下、「生産菌」と称することがある）を培地中に接種し、前記ポリペプチドの生産に良好な条件で培養することによって行われる。
【００３３】
前記培地としては、特に制限はなく、用いる生産菌に応じて適宜選択することができる。前記生産菌として麹菌を用いる場合には、例えば、1質量％のYCB（Yeast Carbon Base）と、1質量％のCasamino acidとを含む液体培地を用いることができる。
【００３４】
前記培養の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、静置培養、振とう培養、タンク培養などが挙げられる。
前記培養の温度としては、前記生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記ポリペプチドを生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができるが、37℃が好ましい。
前記培養液のpHとしては、前記生産菌の発育が実質的に阻害されずに、前記ポリペプチドを生産し得る範囲であれば、特に制限はなく、使用する生産菌に応じて適宜選択することができる。
前記培養の期間としては、特に制限はなく、前記ポリペプチドの蓄積に合わせて適宜選択することができる。
【００３５】
＜＜採取工程＞＞
前記採取工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記培養工程で得られた培養物から本発明のポリペプチドを採取する工程が好ましい。
【００３６】
前記培養物としては、前記培養工程で得られ、前記ポリペプチドを含むものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、液体培養後の培養上清、菌体、固体培養後の固体培地、及びこれらの混合物などが挙げられる。
なお、前記培養物として、前記菌体を用いる場合は、適当な有機溶媒を用いた抽出方法や、菌体破砕による溶出方法などにより、前記ポリペプチドを菌体から抽出し、これを分離及び／又は精製に供してもよい。
【００３７】
前記採取の方法としては、特に制限はなく、微生物の生産する代謝物を採取するのに用いられる方法を適宜選択することができ、例えば、溶媒抽出法、各種吸着剤に対する吸着親和性の差を利用する方法、クロマトグラフ法などが挙げられる。これらの方法を単独又は適宜組み合せて、場合によっては反復使用することにより、分離及び／又は精製された前記ポリペプチドを採取することができる。
例えば、培養上清をろ過した培養ろ液を、透析後、DE-52-celluloseによる処理を繰り返し、活性画分を採取することにより、前記ポリペプチドを採取することができる。
【００３８】
なお、前記採取工程における前記ポリペプチドの精製の程度としては、特に制限はなく、粗精製物であってもよいし、粗精製物を更に精製したものであってもよい。
【００３９】
＜＜その他の工程＞＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、洗浄工程、精製工程などが挙げられる。
前記洗浄工程は、前記培養工程で得られた培養物、又は前記採取工程で得られた前記ポリペプチドを洗浄する工程である。前記洗浄の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して行うことができる。
前記精製工程は、前記採取工程で得られた前記ポリペプチドを精製する工程である。前記精製の方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して行うことができ、例えば、前記採取工程に記載した方法と同様の方法が挙げられる。
【００４０】
（DNA）
本発明のDNAは、A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（a）から（d）のいずれかである。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（c）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNA。
（d）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
【００４１】
前記「数個のアミノ酸」の数個とは、上述のポリペプチドで記載したものと同様である。
【００４２】
前記ストリンジェントな条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ナトリウム濃度が25mM〜500mMが好ましく、25mM〜300mMがより好ましく、温度が42℃〜68℃が好ましく、42℃〜65℃がより好ましい。例えば、5×SSC（83mM  NaCl、83mMクエン酸ナトリウム）、温度42℃が挙げられる。
【００４３】
なお、本発明の前記エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードするDNAは、前記（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA、前記（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA、前記（c）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNA、又は、（d）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAと配列同一性を有するものであってもよい。前記塩基配列の同一性としては、ポリペプチドが前記エラスターゼに対する阻害活性を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて目的に応じて適宜選択することができるが、70％以上が好ましく、80％以上がより好ましく、90％以上が更に好ましく、95％以上が特に好ましい。
前記塩基配列の同一性は、上述したアミノ酸配列の同一性と同様にして決定することができる。
【００４４】
前記DNAの調製方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ハイブリダイゼーション技術を用いる方法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いる方法、前記DNAに対し、site-directed mutagenesis法により変異を導入する方法などが挙げられる。
なお、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。一方、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合もある。本発明のDNAには、このような人工的に調製されたDNA、又は天然の変異DNAが含まれる。
【００４５】
前記DNAの形態としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ゲノムDNA、cDNA、化学合成DNAなどが挙げられる。これらの調製方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。
【００４６】
なお、上記のような塩基配列の配列同一性や、コードするタンパク質のアミノ酸配列の配列同一性を示すようなDNAは、上述のようにハイブリダイゼーションを指標に得ることもできるが、ゲノム塩基配列解析等によって得られた機能未知のDNA群や公共データベースの中から、例えば、前述のBLASTプログラムを用いた検索により発見することも容易である。このような検索は、本技術分野の研究者が通常用いている方法である。
【００４７】
このようにして得られたDNAが前記エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードしていることは、例えば、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養し、得られたタンパク質について、上述したように前記エラスターゼに対する阻害活性を測定することにより確認することができる。
【００４８】
（組換えベクター）
前記組換えベクターは、本発明のＤＮＡを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の構成を含む。
【００４９】
前記ベクターとしては、宿主中で複製可能なものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。
【００５０】
前記その他の構成としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、マーカー遺伝子、制御配列、精製用配列などが挙げられる。
【００５１】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のDNAや、必要に応じて更にその他のDNAを連結若しくは挿入することにより得ることができる。
ベクターに上記DNAを連結若しくは挿入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターDNAの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが挙げられる。
【００５２】
（形質転換体）
前記形質転換体は、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
前記形質転換体は、前記組換えベクターを宿主中に導入することにより得ることができる。
【００５３】
前記宿主としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、麹菌、酵母、大腸菌などが挙げられる。これらの中でも、麹菌であるAspergillus oryzaeが好ましい。
【００５４】
前記組換えベクターを宿主中に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記組換えベクターが宿主に導入されたか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法、定量的RT-PCR法などが挙げられる。
【００５５】
前記形質転換体は、上述したように本発明のポリペプチドの製造に用いることができる。
【００５６】
（エラスターゼインヒビター）
本発明のエラスターゼインヒビターは、本発明のポリペプチドを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記エラスターゼインヒビターは、A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対す阻害活性を有する。
【００５７】
前記エラスターゼインヒビターにおける前記ポリペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記エラスターゼインヒビターは、前記ポリペプチドそのものであってもよい。
【００５８】
−その他の成分−
前記エラスターゼインヒビターにおける前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、添加剤、補助剤、水などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記エラスターゼインヒビターにおける前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
−−添加剤又は補助剤−−
前記添加剤又は前記補助剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、殺菌剤、保存剤、粘結剤、増粘剤、固着剤、結合剤、着色剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、等張化剤、溶剤、酸化防止剤、紫外線防止剤、結晶析出防止剤、消泡剤、物性向上剤、防腐剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００６０】
前記エラスターゼインヒビターは、前記ポリペプチドを含むため、前記エラスターゼに対する優れた阻害活性を有し、熱及びpHに対して安定であり、かつ、安全性に優れるので、医薬組成物、化粧料組成物などとして、好適に利用可能である。
なお、前記エラスターゼインヒビターは、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せて使用されてもよい。また、前記エラスターゼインヒビターは、他の成分を有効成分とする医薬組成物中に、配合された状態で使用されてもよい。
【００６１】
（エラスターゼの水解活性インヒビター）
本発明のエラスターゼの水解活性インヒビターは、本発明のポリペプチドを少なくとも含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
前記エラスターゼの水解活性インヒビターは、Aspergillus fumigatus由来エラスターゼ、Aspergillus flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも1種のエラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する。
【００６２】
前記エラスターゼの水解活性インヒビターにおける前記ポリペプチドの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記エラスターゼの水解活性阻害剤は、前記ポリペプチドそのものであってもよい。
【００６３】
−その他の成分−
前記エラスターゼの水解活性インヒビターにおける前記その他の成分としては、本発明の効果を損なわない限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記エラスターゼインヒビターで記載したその他の成分と同様のものが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記エラスターゼの水解活性インヒビターにおける前記その他の成分の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００６４】
前記エラスターゼの水解活性インヒビターは、前記ポリペプチドを含むため、前記エラスターゼが有する水解活性を阻害することができ、熱及びpHに対して安定であり、かつ、安全性に優れるので、医薬組成物、化粧料組成物などとして、好適に利用可能である。
なお、前記エラスターゼの水解活性インヒビターは、単独で使用されてもよいし、他の成分を有効成分とする医薬組成物と併せて使用されてもよい。また、前記エラスターゼの水解活性インヒビターは、他の成分を有効成分とする医薬組成物中に、配合された状態で使用されてもよい。
【実施例】
【００６５】
以下、製造例及び試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの製造例及び試験例に何ら限定されるものではない。
【００６６】
（製造例1：エラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチド）
A. oryzae  RIB40株（独立行政法人酒類総合研究所より入手）をPDA（Poteto dexitrose Agar Difco社製）斜面培地で30℃、5日間培養した後、1質量％のYCB（Yeast Carbon Base Difco社製）と、1質量％のCasamino acid（和光純薬工業株式会社製）とを含む液体培地100 mLに3白金耳接種し、37℃で2週間静置培養した。
培養4日目に培養液を採取し、Dismic 25CSフィルター（ADNANTEC社製）でろ過し、滅菌したろ液を精製に用いた。
前記培養ろ液を、0.01M Tris-HCl（pH7.2）を用いて、4℃で一晩透析した後、DE-52-celluloseカラム（Whatman  Biochemical社製）にアプライした。次に、0.01M Tris-HCl（pH7.2）で素通り画分を溶出させた後、0.5Mの NaClを含む同緩衝液を流し、吸着画分を溶出させ、エラスターゼ阻害活性が強くみられたFractionを集め、DE52-Celluloseに再度アプライした。素通り画分を溶出後、NaCl濃度を0.5Mまで直線的に上昇させた。エラスターゼ阻害活性が強くみられたFractionを再度集めた。
【００６７】
＜各画分のエラスターゼに対する阻害率の確認＞
前記分画した各画分のエラスターゼに対する阻害率（以下、「エラスターゼ阻害率」と称することがある）を以下のようにして調べた。
Jap. J. Med. MycoL., 36, 235-243, 1995の記載に基づいて精製したA. fumigatus由来のエラスターゼと、前記各画分の粗酵素液の等量混合液0.1 mLとを37℃で15分間反応させた後、この混合液に、50 mM  Tris-HCl（pH7.5）を0.9 mL、基質液（50ｍM Glu-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA（株式会社ペプチド研究所）を20μL加えた。これを37℃で30分間反応させた後、10％  トリクロロ酢酸（TCA）溶液1 ｍLを加えて反応を止めた。この反応液に0.１％  亜硫酸ナトリウム溶液、0.5％  スルファミン酸アンモニウム溶液、及び0.1％  N-ナフチルエチレンジアミン溶液を0.2 ｍLずつ、ボルテックスでよく攪拌しながら、この順番で加え、10分間後、550ｎｍの吸光度を測定した。
また、前記エラスターゼインヒビターを加えない場合をブランクとして同様にして測定した。
前記測定の結果から、以下の式（1）より、エラスターゼ阻害率を求めた。
エラスターゼ阻害率（％）＝｛（A−B）/A｝｝×100  ・・・  式（1）
A：エラスターゼインヒビターを加えなかった場合の吸光度
B：エラスターゼを加えた場合の吸光度
【００６８】
前記分画した各画分のエラスターゼに対する阻害率の確認により集められた活性画分をpH8.3のポリアクリルアミドゲルでディスク電気泳動をおこなったところ単一なバンドが得られたため、これを最終標品とした。
【００６９】
（試験例1：エラスターゼインヒビターの分子質量）
前記エラスターゼインヒビターを含む画分を逆相HPLCにアプライし、活性ピーク画分を凍結乾燥し、前処理としてサンプルを0.1体積％TFA（trifluoro Acetic Acid）水溶液50μLで溶解した後、マトリックス（Sinapinic Acid）と混和した。MALDI/TOF-MS（matrix-assisted laser desorotion/ionization-time of fright mass spectrometry, Applied Biosystems社製）による分子質量の測定を行った結果、前記エラスターゼインヒビターの分子質量は3,604.61であることが分かった（図１参照）。
【００７０】
（試験例2：エラスターゼインヒビターの熱安定性）
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビターを10 ｍＭ  Tris-HCl（pH7.2）にて4℃で、一晩透析し、約60 ng/mLに調製した。これを500μL容のマイクロチューブに加え、各温度で10分間保持した後、氷冷し、前記製造例1に記載の方法に従って、エラスターゼ阻害率を測定した結果、37℃の際の値を100％とした場合、100℃においても90％以上の阻害活性があった。このことから耐熱性を有していることが分かった。
【００７１】
（試験例3：エラスターゼインヒビターのpH安定性）
得られたエラスターゼインヒビターを生理食塩水で透析した後、pH5からpH12の緩衝液（M広域緩衝液）を、加え、4℃で24時間静置した。
前記各pH緩衝液と、前記製造例1で得られたエラスターゼインヒビター（10 ｍM Tris-HCl（pH 7.2）溶液；約50 ng/mL）との等量混合溶液を４℃で一晩放置した後、これを10 ｍM  Tris-HCl（pH 7.2）で2時間透析した。
前記透析処理液のエラスターゼ阻害活性を、前記製造例1に記載の方法と同様にして、エラスターゼ阻害率を測定した結果、少なくともpH6〜9では阻害活性がほぼ100％残存しており、この範囲のpH（人体のpH域に相当）では安定であることが分かった。
【００７２】
（試験例4：エラスターゼインヒビターの特異性）
前記製造例1で得られたエラスターゼインヒビターの各種エラスターゼに対する阻害活性を以下のようにして調べた。
−基質溶液の調製−
表１に記載の基質を50 mMになるようにDNSO（Dmetyl  sulhoxide）で溶解し、これを基質溶液とした。
−酵素溶液の調製−
表１に記載のエラスターゼ（約500 ng/mL）と、前記エラスターゼインヒビター（約50 ng/mL）との等量混合液0.1 mLを37℃で15分間反応させた後、前記混合液に50 mM Tris-Hcl（pH7.5）0.9 mLを加え、これを酵素溶液とした。
なお、A. fumigatus由来エラスターゼは、Jap. J. Med. MycoL.36, 235-243, 1995の記載に基づいて精製したエラスターゼであり、A. flavus由来エラスターゼは、Jap. J. Med. Mycol., 38, 53-59 1997の記載に基づいて精製したエラスターゼである。
【００７３】
−阻害活性測定−
前記酵素溶液に20 μLの前記基質溶液を加え、37℃で30分間反応させた後、10％TCA（トリクロロ酢酸）を1 mL加えて反応を停止させた。前記反応を停止させた溶液に、0.1％亜硫酸ナトリウム溶液と、0.5％スルファミン酸アンモニウム溶液とをこの順番に加え、溶液をボルテックス等で十分混和した後、0.1％  N-ナフチルエチレンジアミン溶液を加えた後、約10分間後の550 nmの吸光度を測定した。
また、前記エラスターゼインヒビターを加えない場合をブランクとして同様にして測定した。
前記測定の結果から、前記式（1）より、エラスターゼ阻害率を求めた。結果を表１に示す。
【００７４】
【表１】
2016204266.tif 000002
【００７５】
前記表１の結果から、前記エラスターゼインヒビターは、A. fumigatus由来のエラスターゼやA. flavus、及び好中球（Human leukocytes）エラスターゼに対しても阻害活性を示した。一方、ブタ膵臓（Porcine pancreas）エラスターゼに対してはほとんど阻害活性を示さなかった。
【００７６】
（試験例5-1：エラスターゼの水解活性を阻害する作用-1-1）
前記製造例１で得られたエラスターゼインヒビター（AOEI2）が、エラスターゼの水解活性を阻害するか否かを、OuyangとTengの方法（Biochem. Biophys. Acta. 42, 298-308，1974）に準拠し、以下のようにして試験した。
ヒト血清フィブリノーゲン（シグマ社製）を0.1質量％になるよう生理食塩水に溶解したものを基質溶液とした。
前記基質溶液1 mLに、試験例4と同様にして調製したA. fumigatus由来エラスターゼを100μＬ加え、37℃で反応させ、経時的（0分間、5分間、10分間、20分間、30分間、60分間）に50μＬずつ取り、等量の反応停止液（4％ SDS, 4％ メルカプトエタノール、及び10 mM  尿素を含有する10 mM  リン酸緩衝液）を加え、37℃で１時間インキュベートした。
これらをサンプルとして、12％ポリアクリルアミドを支持体としたSDSスラブ電気泳動を行った。結果を図２Ａに示す。
【００７７】
（試験例5-2：エラスターゼの水解活性を阻害する作用-1-2）
前記試験例5-1において、エラスターゼ100μLを基質溶液に加えていた点を、以下のようにして調製した、エラスターゼと、エラスターゼインヒビターとの混合液の100μLを基質溶液に加えた以外は、試験例5-1と同様にして試験した。結果を図２Ｂに示す。
−混合液の調製−
前記製造例1で得られたエラスターゼインヒビター100μＬ（約50 ng/mL）と、試験例4と同様にして調製したA. fumigatus由来エラスターゼ100μＬ（約500 ng/mL）とを混和し、37℃で15分間インキュベートし、エラスターゼと、エラスターゼインヒビターとの混合液とした。
【００７８】
図２Ａ及び図２Ｂでは、左から順に、マーカー（Std.）、0分間（0）、5分間（5）、10分間（10）、20分間（20）、30分間（30）、60分間(60)の結果を示す。図2A及び図2Bの結果から、エラスターゼは時間の経過とともにヒト血清フィブリノーゲンを水解したが、AOEI2の存在下ではその水解は阻害された。
【００７９】
（試験例6-1：エラスターゼの水解活性を阻害する作用-2-1）
前記製造例１で得られたAOEI2が、エラスターゼの水解活性を阻害するか否かを、以下のようにして試験した。
コラーゲンtypeI、III、又はIV（新田ゼラチン株式会社製）をそれぞれ生理食塩水に溶解し、3 mg/mLとしたものを基質溶液とした。
前記基質溶液900μLに、試験例4と同様にして調製したA. fumigatus由来エラスターゼを100μL加え、３７℃で反応させ、経時的（0分間、30分間、60分間、120分間、180分間）に100μLずつ取り、60℃で20分間加温して反応を停止させた。
これらに、4％ SDS 及び3％ メルカプトエタノールを含む10 ｍＭ  リン酸ナトリウム水溶液（pH7.2）を100μL加え、10％のポリアクリルアミドを支持体としたSDSスラブ電気泳動を行った。結果を図３Ａ（コラーゲンtypeI）、図４Ａ（コラーゲンtypeIII）、及び図５Ａ（コラーゲンtypeIV）に示す。
【００８０】
（試験例6-2：エラスターゼの水解活性を阻害する作用−2−2）
前記試験例6-1において、エラスターゼ100μLを基質溶液に加えていた点を、以下のようにして調製した、エラスターゼ（500 ng/mL）と、AOEI2（約50 ng/mL）との混合液の100μＬを基質溶液に加えた以外は、試験例6-1と同様にして試験した。結果を図３Ｂ（コラーゲンtypeI）、図４Ｂ（コラーゲンtypeIII）、及び図５Ｂ（コラーゲンtypeIV）に示す。
−混合液の調製−
前記製造例1で得られたAOEI2と、試験例4と同様にして調製したA. fumigatus由来エラスターゼとを等量混和し、37℃で15分間インキュベートし、エラスターゼと、AOEI2との混合液とした。
【００８１】
図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図３Ｂ、図４Ｂ、及び図５Ｂでは、左から順に、マーカー（Std.）、0分間（0）、30分間（30）、60分間（60）、120分間（120）、180分間（180）の結果を示す。
図３Ａ、図４Ａ、図５Ａ、図３Ｂ、図４Ｂ、及び図５Ｂの結果から、エラスターゼは時間の経過とともにコラーゲンtypeI、III、IVを水解したが、AOEI2の存在下ではその水解は阻害された。
【００８２】
（試験例7：エラスターゼインヒビターのアミノ酸配列）
前記製造例1で得られたエラスターゼインヒビターのアミノ酸配列を、Model 491 Protein Sequencer/Model 611 PTH Analyzer Online System（Applied Biosystens社製）を用いて解析した。その結果、ネイティブのエラスターゼインヒビターのアミノ酸配列は、Ｎ末端より15残基まで決定された。
前記配列について、独立行政法人酒類総合研究所の麹菌ＥＳＴデータベース（http://nribf21.nrib.go.jp/EST2/1ndex.html）にて確認したところ、機能未知のポリペプチドであるAoEST1310に該当した。前記配列はDB上でもエラスターゼインヒビターと記載されていない。前記エラスターゼインヒビターのアミノ酸配列は、cDNAから決定されたポリペプチドのアミノ酸配列を一部補い、配列番号：１に示した。
【００８３】
本発明の態様としては、例えば、以下のものなどが挙げられる。
＜1＞  A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも1種のエラスターゼに対する阻害活性を有し、下記（a）及び（b）のいずれかであることを特徴とするポリペプチドである。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
＜2＞  Aspergillus oryzae由来である前記＜1＞に記載のポリペプチドである。
＜3＞  エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害する作用を有する前記＜1＞から＜2＞のいずれかに記載のポリペプチドである。
＜4＞  前記＜1＞から＜3＞のいずれかに記載のポリペプチドを含有することを特徴とするエラスターゼインヒビターである。
＜5＞  前記＜1＞から＜3＞のいずれかに記載のポリペプチドを含有し、エラスターゼが有する、ヒトフィブリノーゲンの水解活性、I型コラーゲンの水解活性、III型コラーゲンの水解活性、及びIV型コラーゲンの水解活性の少なくともいずれかを阻害することを特徴とするエラスターゼの水解活性インヒビターである。
＜6＞  A. fumigatus由来エラスターゼ、A. flavus由来エラスターゼ、及びヒト好中球エラスターゼから選択される少なくとも１種のエラスターゼに対する阻害活性を有するポリペプチドをコードし、下記（a）から（d）のいずれかであることを特徴とするDNAである。
（a）配列番号：1で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（b）配列番号：1で示されるアミノ酸配列において、１個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするDNA。
（c）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNA。
（d）配列番号：2で示される塩基配列を含むDNAの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
＜7＞  前記＜6＞に記載のDNAを含有することを特徴とする組換えベクターである。
＜8＞  前記＜7＞に記載の組換えベクターにより形質転換されたことを特徴とする形質転換体である。
＜9＞  前記＜1＞から＜3＞のいずれかに記載のポリペプチドの製造方法であって、
麹菌、及び前記＜8＞に記載の形質転換体の少なくともいずれかを培養する工程と、
前記培養物から前記＜1＞から＜3＞のいずれかに記載のポリペプチドを採取する工程とを含むことを特徴とするポリペプチドの製造方法である。
【図１】
2016204266.tif 000003
【図２Ａ】
2016204266.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2016204266.tif 000011
【配列表】
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