(57)【要約】【課題】抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法を提供する。【解決手段】本発明に記載される抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法は、形質細胞表面に発現する標識により、融合細胞が分泌する目的抗体が該融合細胞表面に結合することができ、さらに標記物を含む抗原で該融合細胞と反応し、抗原特異性を有する融合細胞をスクリーニングする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法であって、
形質細胞表面に発現される標識により、融合細胞が分泌する目的抗体は該融合細胞と結合し、さらに標記物を含む抗原で該融合細胞と反応することで、抗原特異性を有する融合細胞をスクリーニングする抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項２】
該目的抗体と該標識との間に少なくとも２つの抗体により連結され、かつ該２つの抗体の間は１つの連結分子により連結される請求項１に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記抗体は、
前記連結分子と結合する第１結合分子と、前記融合細胞の細胞表面における前記標識と結合する第１抗原結合点とを有する第１抗体と、
前記連結分子と結合する第２結合分子と、前記目的抗体と結合する第２抗原結合点とを有する第２抗体と、を含む請求項２に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記第１結合分子はビオチンである請求項３に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記第２結合分子はビオチンである請求項３に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記連結分子はアビジン、ストレプトアビジン及びシグナル・ペプチダーゼからなる群から選択される請求項２に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記第２抗体及び前記目的抗体は異なる動物から由来する請求項３に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記標記物は蛍光物質及び磁性物質からなる群から選択される請求項１に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記標識はＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）で命名される分子標識である請求項１に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記標識はＣＤ１３８である請求項９に記載の抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はモノクローナル抗体の調製に関し、特に、抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７５年の研究にはハイブリドーマ(Hybridoma)でモノクローナル抗体を調製する技術が記載しており、該技術は、主に、抗原を動物体に複数回に注射することで、該動物が免疫反応を発生し、抗体を生じ、さらに該動物の脾臓細胞をポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）で骨髄腫細胞と融合反応を行う。骨髄腫細胞及び脾臟脾細胞の特徴、例えば、体外の生存寿命、核酸の生合成の能力により、かつＨＡＴ培地（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ、Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ、Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を配合して、脾臓細胞と骨髄腫細胞とが融合した細胞をスクリーニングし、さらにスクリーニングした融合細胞を単一化させ、最後に酵素結合免疫吸着測定法で抗原の特異性を検出する。一般的には、動物が免疫反応により抗体を産生するのは少なくとも一ヶ月が必要があり、融合反応を行うのは約１日が掛って、ＨＡＴ培地で融合細胞をスクリーニングするのは数週間が掛って、融合細胞を単一化するのは１ヶ月が掛って、最後に抗原特異性を検出するのは１ヶ月が掛る必要がある。
【０００３】
周知のように、モノクローナル抗体は診断や、医療などの分野に応用することができ、それが数百億以上のビジネスチャンスをもたらすことができ、そのため、多くのメーカーはいずれもモノクローナル抗体の製造過程の短縮に努力して、それにより効果的なモノクローナル抗体を快速に獲得することが期待している。現在、抗原設計及び免疫過程の２つのステップに改良を行い、それにより、免疫過程に必要である時間を短縮する。抗原特異性抗体のスクリーニングステップのみにおいて、大企業はロボットで高生産性スクリーニングを行うことができる以外に、依然としてモノクローナル抗体のスクリーニング效率を大幅に向上することができない。ロボットでスクリーニングを行う方式は、大量の開発コストがかかって、製品の価格を向上するだけでなく、各規模のメーカーに広くに使用されることができず、実際にはスクリーニングの時間の短縮に対する利益が無い。
【０００４】
それにより、ハイブリドーマ細胞の快速スクリーニング方法を開発することは、現在、生物医学産業の重要な課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の主な目的は、抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法を提供することであり、それは、融合細胞表面における形質細胞(plasma cell)表面発現分子により、融合細胞が分泌するモノクローナル抗体を捕捉し、さらに標記物を有する抗原で該融合細胞と反応し、該融合細胞が該標記物を発現することができる時に、該モノクローナル抗体が該抗原と結合して、抗原特異性の融合細胞をスクリーニングすることができることを示す。
【０００６】
本発明の別の目的は、抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法を提供することであり、それは、モノクローナル抗体を調製する時間を大幅に短縮することができ、かつ、効果的なモノクローナル抗体を開発する效率を増加する。
【０００７】
本発明の次の目的は、抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法を提供することであり、その操作方式は簡単であり、大量のコストをかかって大型の装置を購入する必要がないので、各類の規模の抗体製造会社に適用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、上記目的を実現するために、本発明は抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法を記載し、それは、形質細胞表面で発現する標識により、融合細胞が分泌する目的抗体は該融合細胞表面に結合することができ、さらに標記物を含む抗原で該融合細胞と反応して、抗原特異性を有する融合細胞をスクリーニングする。
【０００９】
好ましくは、該目的抗体は該標識との間に少なくとも２つの抗体で連結して、かつ、該２つの抗体の間に１つの連結分子で連結する。
【００１０】
さらに、該２つの抗体はそれぞれ第１抗体及び第２抗体である。
【００１１】
該第１抗体は、該連結分子と結合することができる第１結合分子と、該融合細胞の細胞表面における該標識に結合することができる第１抗原結合点とを含み、また、該第１結合分子がビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）であるので、よい効果を有している。
【００１２】
該第２抗体は、該連結分子と結合することができる第２結合分子と、該目的抗体と結合することができる第２抗原結合点とを含む。
【００１３】
また、該第２結合分子がビオチンであるので、よい効果を有している。
【００１４】
なお、該第２抗体と該目的抗体とは異なる動物から由来する時によい効果を有している。
【００１５】
該連結分子はアビジン（Ａｖｉｄｉｎ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）又はシグナル・ペプチダーゼ（signalase ）である。
【００１６】
好ましくは、該標記物は蛍光物質や、磁性物質、任意の本発明の当業者に知られるスクリーニング標記物とされるものである。
【００１７】
好ましくは、該標識はＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）で命名する分子標識であり、具体的には、該標識はＣＤ１３８である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施例を示す図である。
【図２】図2は、フローサイトメトリー技術による分析して得られたFSC/SSCの図面であり、そのうち、R-1は選択領域である。
【図３】図3は、選択された細胞における融合細胞の割合について分析された結果。
【図４】図4は、ＧＦＰ蛍光強度の顕著に増強された細胞の割合を示す。
【図５】図5は、ＣＤ138-ＰＥシグナルを有する細胞のの割合を示す。
【図６】図6は、顕微鏡で観察された細胞の形態を示す。
【図７】図7は、蛍光顕微鏡で観察された細胞の形態を示す。
【図８】図8は、本願発明が開示した方法のプロセスの概略図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法を記載しており、それは、融合細胞表面における形質細胞表面発現分子により、融合細胞が分泌するモノクローナル抗体を捕捉し、さらに標記物を有する抗原で該融合細胞と反応し、融合細胞が該標記物を発現するかどうかの特徴を観察することにより抗原特異性の融合細胞をスクリーニングすることができる。本発明に記載される抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法は、周知の技術において酵素結合免疫吸着法で抗原特異性抗体を検出するステップを代わることができ、モノクローナル抗体の調製の時間を大幅に短縮することができ、市場の必要である効果を満たすことができ、かつ本発明に記載される方法は操作が簡単であり、コストが低く、開発コストを低下する効果を実現する。
【００２０】
本発明の明細書及び請求項に記載の用語は、特に定義しない限り、本発明の当業者に理解することができる意義で解釈することができる。
【００２１】
本発明に記載される「融合細胞」又は「ハイブリドーマ細胞」は、２つの異なる種類の細胞を細胞融合法で１つの細胞に合弁する。本発明において、該２つの異なる種類の細胞はそれぞれ抗原免疫された脾細胞、脾細胞から分離するＢ細胞又は形質細胞、及び腫細胞である。
【００２２】
本発明に記載される「細胞融合法」は、化学方法、物理方法、生物方法により２つの異なる細胞を細胞融合法で１つの細胞に結合する。ただし、化学方法は、現在、モノクローナル抗体を調製することに最もよく使われる技術であり、例えば、ポリエチレングリコールの化学試薬により細胞融合を行う。物理方法は例えば、電気パルスの方式で細胞を融合させる。生物方法は不活性化するウィルスで細胞を誘導して融合を行う。
【００２３】
本発明に記載される「抗原免疫」は、モノクローナル抗体を製造することができる第１ステップであり、一般的に、脾細胞、脾細胞から取り出すＢ細胞又は形質細胞は特定の抗体を分泌するために、所定の抗原を動物体に釈放し、そのＢ細胞を誘導して成熟して増殖させ、かつ抗体を産生することができ、この時に、該個体体内には該特定の抗体の生成を発生する。或いは、体外から細胞を培養する過程において、抗原を与えることにより、それを体外免疫反応を行われて、抗体を分泌することができる。
【００２４】
本発明に記載される「腫細胞」は、「がん細胞」とも称され、その特徴は培地に絶えずに分裂する能力を有することであり、現在、大部分が骨髄腫細胞でモノクローナル抗体の調製を行う。例えば、ＮＳ−１骨髄腫細胞、ＳＰ２／０骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１骨髄腫細胞はラットＢＡＬＢ／ｃのがん細胞株であり、或いは、ＲＰＭＩ８２２６骨髄腫細胞、ＭＣ／ＣＡＲ骨髄腫細胞、ＩＭ−９骨髄腫細胞、ＵＣ７２９−６骨髄腫細胞又はＬＴＲ２２８骨髄腫細胞は人類のがん細胞株である。
【００２５】
本発明に記載される「蛍光物質」は、異なる蛍光カラー及び強度をもたらすものであり、生物医学分野において、それを検出、分析、判断、診断する標識分子として使われることが多い。一般的に、細胞が蛍光物質で標識された後に、例えば、レーザーの光源で該細胞を照射して、それを特定の蛍光カラー及び強度を発し、さらに、例えば、フローサイトメトリーなどの装置により蛍光物質を発現する細胞をスクリーニングする。
【００２６】
本発明に記載される「磁性物質」は、磁性細胞分離システムに使用される標記物であり、例えば、抗体と共有結合する磁性ビーズである。細胞が磁性物質で標識された後に、該細胞は磁性を有する分離柱に保ち、さらに磁力を除去し、分離柱から離脱する細胞を収集することで、細胞を分離してスクリーニングする目的を実現する。
【００２７】
以下、本発明の１つの好ましい実施例を例として、かつ図面を参照して後述のように説明する。
【００２８】
図１を参照し、本発明の好ましい実施例は抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法（１０）を記載しており、それは、
【００２９】
抗原免疫される形質細胞（２０）と骨髄腫細胞（３０）を取り、細胞融合法で融合細胞（４０）を調製し、該融合細胞の細胞表面には形質細胞表面抗原ＣＤ１３８（４１）を有するステップ１０１と、
【００３０】
ビオチン共役抗ＣＤ１３８のモノクローナル抗体（５０）、アビジン（６０）、ビオチン抗マウス免疫グロブリンのモノクローナル抗体（７０）を取り、それぞれ順次に該融合細胞（４０）を含む環境に加入して、培養するステップ１０２と、
【００３１】
蛍光抗原（８０）を取り、ステップ１０２の該融合細胞を含む環境に加入して反応し、ただし、該抗原（８０）はステップ１０１で形質細胞を誘導して免疫反応を発生するものと同じであるステップ１０３と、
【００３２】
フローサイトメトリーで蛍光を発現する融合細胞（４０）をスクリーニングするステップ１０４と、を含む。
【００３３】
上記方法により、該融合細胞（４０）の細胞表面に形質細胞表面抗原ＣＤ１３８（４１）を発現し、さらに異なる抗体及び化合物を添加して該融合細胞（４０）と反応し、それにより、該ビオチン共役抗ＣＤ１３８のモノクローナル抗体（５０）はその抗原結合点で該表面抗原ＣＤ１３８（４１）と結合し、さらに該アビジン（６０）で該ビオチン共役抗ＣＤ１３８のモノクローナル抗体（５０）及び該ビオチン抗マウス免疫グロブリンのモノクローナル抗体（７０）に連結し、それにより、該２つのモノクローナル抗体（５０）（７０）は該アビジン（６０）に鎖形構造に直列連結する。該鎖形結構の一端は該表面抗原ＣＤ１３８（４１）に連結し、他端は該ビオチン抗マウス免疫グロブリンのモノクローナル抗体（７０）の抗原結合点により該融合細胞（４０）が分泌する目的抗体（４２）を捕捉する。該目的抗体（４２）は該蛍光抗原（８０）との間に特異性結合を発生するので、該鎖形構造の他端が該目的抗体（４２）と結合する時に、該目的抗体（４２）により該蛍光抗原（８０）と結合し、該融合細胞は蛍光を発現することができ、該融合細胞（４０）には蛍光を有するかどうかを観察することにより、装置により抗原特異性モノクローナル抗体を分泌する融合細胞を容易にスクリーニングすることができる。
【００３４】
さらに、該標記物は蛍光物質に限定されず、いずれかの本発明の当業者に知られる標記物、磁性ビーズに代わられても、本発明の効果を実現することもできる。
【００３５】
また、本発明の主な特徴は、融合細胞の細胞表面における発現分子、例えば、抗原により、該目的抗体を該融合細胞と結合し、従って、該融合細胞と該目的抗体の抗体、化合物及びその両者の組合せを連結し、それは、本発明の当業者に知られる一般的な知識により変化して、置換することができ、例えば、ストレプトアビジン又はシグナル・ペプチダーゼでアビジンを代わることができることである。
【００３６】
本発明及びその効果をさらに説明するために、実例を例として図面を配合して後述のように説明する。
【００３７】
実例：融合反応
【００３８】
ＧＦＰのクローンするＮＳ１細胞を取って、培養する。融合する前の１日に、ＮＳ１細胞を継代培養して、１日おきの細胞の数量のフルスケール（Full scale）が５０〜６０％になるように制御する。培養が完了するＮＳ１細胞を１０００ｒｐｍで遠心分離させ、上清を廃棄した後に、ＮＳ１細胞の細胞数量を計算する。
【００３９】
免疫が完了済みのマウスを融合前の３日に免疫予増幅（ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ）を行う。融合反応を行う日に、イソフルランでマウスを麻酔し、脾臟を取り出して、５ミリリットルの無血清ＤＭＥＭを入れる６センチの培養盤に放置し、２００メッシュのスチール・ふるいで脾臟を均質させる。５ミリリットルの脾臓細胞懸濁液を取り、７０μｍのスクリーンを５０ｍｌの遠心分離管に入れて、脾臓細胞の懸濁液を７０μｍスクリーンを通過させた後に、１０ミリリットルの無血清ＤＭＥＭでスクリーンを洗い、かつ１０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、上清を廃棄し、５ミリリットルの赤血球分解緩衝液を加入して、５分反応する。反応後、３５ミリリットルの無血清ＤＭＥＭで赤血球分解緩衝液を希釈し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、上清を廃棄し、２０ミリリットルの無血清ＤＭＥＭを加入して脾細胞を懸濁させて、細胞数量を計算する。
【００４０】
ＮＳ１細胞と脾細胞とを１:１〜１:５の割合で均一に混合し、ゆっくりと１〜２ミリリットルの融合緩衝液（５０％ＰＥＧ−４０００ｉｎＤＭＥＭ,ｓｅｒｕｍｆｒｅｅ）を加入し、さらに７ミリリットルの無血清ＤＭＥＭを加入し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、上清を廃棄し、１０ミリリットルの無血清ＤＭＥＭを加入した後に、細胞を細胞培養箱において培養する。
【００４１】
融合細胞の細胞数量を計算し、かつそれから一部を取って対照群とする。余分の融合細胞を遠心分離管に入れて、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、上清を廃棄し、１ミリリットルのＤＭＥＭ−２０（２０％ＦＢＳ、１ｍＭＳｏｄｉｕｍｐｙｒｕｖａｔｅ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ、１０μｇ／ｍｌｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）で均一に懸濁し、さらに１０μｌ抗体（Ｂｉｏｔｉｎ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＣＤ１３８,Ａｖｉｄｉｎ,Ｂｉｏｔｉｎ−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＧ）を加入して、４°Ｃで１時間反応する。３ミリリットルの染色液（ｓｔａｉｎｉｎｇｂｕｆｆｅｒ;ＰＢＳ,３％ＦＢＳ,０．２２ｍｆｉｌｔｅｒｅｄ）を加入して抗体反応を希釈させ、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、上清を廃棄し、さらに１ミリリットルＤＭＥＭ−２０で均一に懸濁させ、細胞数量を計算し、細胞が５×１０５−１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの間に調整する。
【００４２】
細胞懸濁液を６孔盤に吸い込み、例えば、
2016163574.tif 000003
【００４３】
１０μｌＰＥ−ａｎｔｉｇｅｎを加入して、均一に混合する。１ミリリットルのＤＭＥＭ−２０を各孔に加入し、例えば、
2016163574.tif 000004
【００４４】
３７°Ｃにて２時間以上反応して、３ミリリットルの染色液を加入して反応を希釈させ、細胞を離心管に吸い込み、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離させ、上清を除去し、さらに１ミリリットルの染色剤で均一に懸濁し、かつ細胞懸濁液を７０μｍスクリーンを通過させ、細胞数量を計算する。最後に、蛍光活化フローセルソーターによりスクリーニングする。
【００４５】
図２乃至図７により、選択領域がＲ-1であり、融合細胞が選択された細胞の14.1％であり、ＧＦＰ蛍光強度の顕著に増強された細胞が2.72％であり（図４のＨ-2領域の細胞）、ＣＤ138-ＰＥシグナルを有する細胞が6.12％である（図5のＨ-3領域の細胞）である。上記実例の方法に従って緑色蛍光タンパク質で発現するＮＳ１細胞と正常のマウス脾臓細胞がＣＤ１３８−ＰＥ染色を有した融合する細胞を選択することができ、かつ、図８に示すように、本発明に記載される方法により、抗原特異性モノクローナル抗体を分泌する融合細胞を快速にスクリーニングすることができる。
【００４６】
上述の具体的実施例は本発明を説明するための実施例のみである。本発明における当業者は上述の具体的実施例に対していろんな修正と補助または類似の手段を用いて代替することができるが、本発明の趣旨から離れず、または特許請求の範囲を超えない。
【記号の説明】
【００４７】
（１０）抗原特異性を有するハイブリドーマ細胞のスクリーニング方法
（２０）形質細胞 
（３０）骨髄腫細胞 
（４０）融合細胞 
（４１）形質細胞表面抗原ＣＤ１３８ 
（５０）ビオチン共役抗ＣＤ１３８のモノクローナル抗体 
（６０）アビジン 
（７０）ビオチン抗マウス免疫グロブリンのモノクローナル抗体 
（８０）蛍光抗原 
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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