(57)【要約】【課題】微細藻類の培養において、至適条件より水温が高い場合に培養速度の低下を抑制する。【解決手段】微細藻類の至適温度より高い水温で培養する場合に、培地の栄養塩濃度およびｐＨを調整して、培養速度の低下を抑制する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類の培養において、
前記微細藻類の至適温度より高い温度において、
窒素原子当量で５０ｍｇ／Ｌ以上およびリン原子当量で２ｍｇ／Ｌ以上の濃度の栄養塩を含む培地で行う培養方法。
【請求項２】
前記培地が７未満のｐＨを有し、窒素原子当量で５０ｍｇ／Ｌ〜３５０ｍｇ／Ｌ、リン原子当量で２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの栄養塩を含むことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項３】
前記培地が７〜８のｐＨを有し、窒素原子当量で５０ｍｇ／Ｌ〜７００ｍｇ／Ｌ、リン原子当量で２ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの栄養塩を含むことを特徴とする請求項１に記載の培養方法。
【請求項４】
前記微細藻類の至適温度を超え前記至適温度より１０℃高い温度までの温度域で行うことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の培養方法。
【請求項５】
前記微細藻類は、緑藻網、プラシノ藻網、トレボウクシア藻網に属する藻類およびこれらの組み合わせの群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記微細藻類は、トレボウクシア藻網に属する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記微細藻類は、クロロコッカムリトラーレである請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細藻類の培養方法に関する。詳細には、微細藻類の至適温度より高い水温で培養する場合に、培地の栄養塩濃度およびｐＨを調整して、培養速度の低下を抑制させた微細藻類の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
二酸化炭素は，地球温暖化の原因となる温室効果ガスの一つとして排出量削減が課題とされている。二酸化炭素を削減する手段として、植物の光合成を利用する方法がある。植物の中でも，特に微細藻類は陸生植物と比較して高い増殖力を有するため，有望な二酸化炭素の削減手段として注目されている（特許文献１等参照）。例えば、油成分を内部で生成し蓄積する微細藻類を用いて、発電所や工場で二酸化炭素の排出量を抑えながら燃料を合成するプロセスが検討されているほか、微細藻類の光合成を利用した二酸化炭素有効利用装置が提案されている（特許文献２等参照）。
【０００３】
二酸化炭素の固定に用いられる微細藻類には淡水性のものと海産性のものがある。海産性の藻類では、たとえばクロロコッカムリトラーレのように高濃度の二酸化炭素でも培養可能で、かつ脂質を生成するものがある（非特許文献１等参照）。二酸化炭素の耐性が高いと燃料電池などの高濃度二酸化炭素を排出する装置からの直接導入が可能となるばかりか、その濃度では生存できない他の微生物のコンタミネーションを避けることができるという利点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−３１３１４１号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０９５８８号
【特許文献３】特開２０１５−２６８３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】M.Ota et.al., Bioresource Technology 100 (2009) 5237-5242
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
微細藻類の培養速度は大きければ大きいほど二酸化炭素固定量あるいは脂肪酸生産量を増加させることができる。しかしながら培養速度は水温に大きな影響を受けることが知られている。
【０００７】
微細藻類の種類により至適温度は異なるが、至適温度より低温あるいは高温での培養は、培養速度が著しく減少する。そのため、培養速度を高いレベルで維持するには水温の制御が必要となるが、光合成に必要な光源を太陽光で賄う屋外培養においては水温の制御には大きなエネルギーが必要となる。そこで、水温制御を必要とせず、かつ培養速度の低下を抑制する培養方法が求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明に係る培養方法はクロロコッカムリトラーレなどの微細藻類の培地の栄養塩濃度およびｐＨを調整することで、至適温度より高い水温での培養において培養速度の低下を抑制する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【０００９】
上記記載の微細藻類の培養方法によれば、至適温度より高い水温において培養速度の低下をある程度抑制することが可能となる。そのため、太陽光を光源として屋外で培養する場合に、特に夏場の水温冷却のための大きな電力を使用することなく培養することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】水温２７℃における増殖速度の培地栄養塩濃度依存性
【図２】水温２７℃における増殖速度の培地ｐH依存性（栄養塩濃度１０倍の場合）
【図３】水温２７℃およびｐH８における増殖速度の培地栄養塩濃度依存性
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、微細藻類の至適温度より高い水温で培養する場合に、培地の栄養塩濃度およびｐＨを調整して、培養速度の低下を抑制させた微細藻類の培養方法に関する。以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、以下に示す実施形態は、本発明の単なる一例であって、当業者であれば、適宜設計変更可能である。
【００１２】
（微細藻類）
本発明に用いることのできる微細藻類は、脂肪酸を藻体内に蓄積することができるものである。
【００１３】
本発明において、「藻類」とは、光合成を行う生物のうち、陸上植物（コケ植物、シダ植物、種子植物）を除いたものの総称であり、「微細藻類」とは、人の肉眼では、その個々の存在が識別できないような微小な藻類をさす。微細藻類の分類としては、二酸化炭素を吸収し、脂肪酸を藻体内に蓄積することができるものであれば特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれであってもよい。
【００１４】
本発明において、微細藻類は淡水性藻類および海洋性藻類のいずれも用いることができるが、海水で培養可能な海洋性藻類が好ましい。また、本発明の方法に用いられる微細藻類は、二酸化炭素耐性が強いものが好ましい。
【００１５】
本発明の一実施態様において、本発明の方法に用いられる微細藻類は緑色植物門に属する。好ましくは、緑藻網、プラシノ藻網、トレボウクシア藻網に属する藻類およびこれらの組み合わせの群から選択される。本発明の方法に用いられる微細藻類は、より好ましくはトレボウクシア藻網に属する藻類であり、さらに好ましくはクロロコッカムリトラーレ（Chlorococcum littorale）である。
【００１６】
本発明の一実施態様において、微細藻類は、このなる微細藻類の種の混合物であってもよい。他の実施態様では、微細藻類は、単一の微細藻類の種であってもよい。さらに、本発明の方法に用いることのできる微細藻類には、野生型、変異型（天然または誘導されたもの）または遺伝子改変された微細藻類が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
（培養方法）
本発明の微細藻類の培養は、以下のような条件下、微細藻類の培養方法として一般的に知られている方法を用いることができる。例えば、トレボウクシア藻網に属する微細藻類を培養できる公知の方法を用いることができる。具体的には、これに限定されないが、液体培地を入れた偏平フラスコ等の培養容器に該微細藻類を接種して、藻体が沈殿しない程度に緩やかに攪拌しながら光照射下で通気培養することにより行うことができる。また、太陽光を光源として、屋外貯水池で培養してもよい。
【００１８】
（温度）
本発明において、培養温度は当該微細藻類が生育するのに適した公知の培養温度（至適温度）より高い。好ましくは至適温度を超え至適温度より１０℃高い温度までの温度域で培養され、より好ましくは至適温度を超え至適温度より５℃高い温度までの温度域で培養される。例えば、クロロコッカムリトラーレを培養する場合、至適温度は２２℃であるから、２２℃＜Ｔ≦３２℃の範囲で培養するのが好ましい。
【００１９】
（塩濃度）
本発明に用いられる液体培地としては、当該微細藻類を培養できる液体培地として公知のものを希釈した溶液を使用できる。例えば、海洋性微細藻類を用いる場合には、天然海水および／または人工海水を希釈した溶液を培地として用いることができる。人工海水は、天然海水に含まれる塩類を模した塩類である。該人工海水の所定量を蒸留水に溶解することで、天然海水を模した海水成分をもつ水溶液を作製することができる。
【００２０】
本願発明に用いることのできる培地として、ダイゴＩＭＫ培地、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地等を挙げることができる。これらのうち、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ダイゴＩＭＫ培地がさらに好ましい。
【００２１】
本発明は、さらに栄養塩を添加し、栄養塩濃度を通常使用される培地中の濃度よりも高くして培養する。本発明において、栄養塩とは窒素、リン、および／またはケイ素を含む塩をいう。栄養塩の例には、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ3）、塩化アンモニウム（ＮＨ4Ｃｌ）、リン酸ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4）、リン酸カリウム（Ｋ2ＨＰＯ4）が含まれる。
【００２２】
本発明の培地中の栄養塩濃度は、通常使用される培地中の濃度の２〜２０倍である。すなわち、通常の海産微細藻用培地に含まれる栄養塩濃度を１００部とした場合、本発明の培地は２００部〜２０００部の栄養塩濃度を有する。より具体的には、通常培地中の硝酸ナトリウム塩濃度が０．２ｇ／Ｌであった場合、本願発明の培地は硝酸ナトリウムを０．４ｇ／Ｌ〜４ｇ／Ｌの濃度で含有してもよい。
【００２３】
例えば、培地中における窒素の含有量は、好ましくは、窒素原子当量で５０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１５０ｍｇ／Ｌ以上である。また、培地中に含まれるリンの含有量は、好ましくはリン原子当量で２ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは５ｍｇ／Ｌ以上である。
【００２４】
（ｐＨ）
本発明の培養方法は、ｐＨ６〜８を有する液体培地を用いて行われる。液体培地のｐＨが６より低くなると、培養速度が低下する。また、ｐＨが８以上では炭酸カルシウムなどの塩が析出し、培地が白濁化するため、培養に適さない。
【００２５】
一方、栄養塩濃度が高度に上昇すると、培地のｐＨは酸性に傾くため、栄養塩濃度による培養速度への寄与を相殺するおそれがある。例えば、栄養塩濃度が通常使用される培地の濃度の２０倍を超えると、ｐＨは５．５を下回る。
【００２６】
そこで本発明者らは、後述するように、栄養塩濃度が高い場合でもｐＨを中性から弱アルカリ性に調整することで培養速度の低下を抑制できることを、さらに見出した（図２および図３参照）。ｐＨの調整は、培養の阻害をするものでなければ任意の塩基性物質の添加により行うことができる。例えば、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムを用いてｐＨを調整してもよい。
【００２７】
塩基性物質を添加しない場合、栄養塩濃度は通常使用される培地の濃度の２〜１０倍であることが好ましい。例えば、窒素原子当量で５０ｍｇ／Ｌ〜３５０ｍｇ／Ｌ、リン原子当量で２ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌであってもよい。
【００２８】
一方、塩基性物質を添加して液体培地のｐＨを７〜８に調整した場合には、栄養塩濃度は、通常の培地に使用される濃度の２〜２０倍であってもよい。例えば、窒素原子当量で５０ｍｇ／Ｌ〜７００ｍｇ／Ｌ、リン原子当量で２ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌであってもよい。
【００２９】
（通気環境）
一実施態様において、本発明の培養方法は、該液体培地に当該微細藻類が生育するのに適した公知の通気量で通気を行うことができる。例えば、１０ｍＬ／分〜５００ｍＬ／分で通気することができる。好ましくは５０ｍＬ／分〜３００ｍＬ／分で通気することができる。本発明の方法において、液体培地は、好ましくは５％〜２０％の二酸化炭素を含む気体で通気される。より好ましくは、５％の二酸化炭素を含む気体で通気される。
【００３０】
（光照射条件）
本発明において、光照射条件は、当該微細藻類の種類および液体培地中の藻体濃度によって適宜調整することができる。例えば、５０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ〜５００μｍｏｌ／ｍ2／ｓの範囲の光強度で行うことができる。光源には、これらに限定されないが、太陽光、蛍光灯、およびＬＥＤを用いることができる。また、光照射は、連続照射および明暗サイクルを有する照射のいずれであってもよい。
【００３１】
［実施例］
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３２】
（実施例１）
下記のとおり調整した培地を用いて、クロロコッカムリトラーレの培養を１０日間行った。培養条件は温度２７℃、光強度１７０μｍｏｌ／ｍ2／ｓ、通気ガス流量１００ｍＬ／分とした。通気ガス組成は二酸化炭素５％、窒素９５％とした。
【００３３】
培地には日本製薬（株）のダイゴ人工海水ＳＰおよびダイゴＩＭＫ培地の混合溶液を用いた。ダイゴ人工海水ＳＰは、２０７２７ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含む海水成分の無機塩を含有する人工海水である（表１）。一方、ダイゴＩＭＫ培地は、表２に記載の濃度で窒素やリンなどの栄養塩を含む培地である。
【００３４】
ダイゴ人工海水ＳＰ由来の無機塩濃度を一定にしたまま、ダイゴＩＭＫ培地由来の栄養塩の濃度を増加して、培地を調整した。ダイゴＩＭＫ培地由来の栄養塩濃度は１倍（以下、通常濃度という）、２倍、５倍、および１０倍に調整した。通常濃度における培地中の窒素含有量は窒素原子当量で３３．６ｍｇ／Ｌ、リン含有量はリン原子当量で１．１５ｍｇ／Ｌであった。増殖特性はシグモイド型の一般的な特性を示し、濃度１倍〜１０倍までは大きな変化は認められなかった。
【００３５】
次いで、各培地について、特許文献３に記載の方法を用いて培養前後の溶液中の細胞濃度を測定し、比培養速度を求めた。結果を図１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
【表２】
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【００３８】
クロロコッカムリトラーレは、至適温度である２２℃で培養すると、比増殖速度が０．１程度であることが分かっている。図１のとおり、至適温度よりも５℃高い２７℃において栄養塩濃度が通常濃度（１倍）の培地を用いて培養した場合には、培養速度の指標となる比増殖速度は至適温度の半分以下となった。
【００３９】
一方、栄養塩濃度が上昇するに従い、比増殖速度の値は上昇し、培養温度２７℃であっても培養速度の低下を抑制できることが明らかとなった。
【００４０】
（実施例２）
実施例１の濃度１０倍の培地を用い、さらにｐHを水酸化ナトリウムで調整して、ｐＨ６（無調整）、ｐＨ７、およびｐH８の培地を調整した。これらの培地を用い、ｐＨ以外、実施例１と同様の培養条件で培養を行った。結果を図２に示す。
【００４１】
図２のとおり、栄養塩濃度が１０倍の場合では、培地のｐＨが中性から弱アルカリ性になるにつれて、比培養速度が上昇することが確認された。
【００４２】
（実施例３）
ｐＨを水酸化ナトリウムで８に調整し、栄養塩濃度を１倍（通常濃度）、１０倍および２０倍に調整した培地を用いた以外は実施例１と同様に培養を行った。結果を図３に示す。
【００４３】
栄養塩濃度が２０倍の培地に水酸化ナトリウムを添加しない場合、ｐＨは５．４となり、培養が進行しなかった。しかしながら、図３のとおり、ｐＨを８に調整した場合には通常の栄養塩濃度（１倍）に比べ、培養速度の低下を抑制する効果があることが認められた。
【００４４】
以上のことから、本発明は、微細藻類の至適温度より高い水温で培養する場合に、培地の栄養塩濃度およびｐＨを調整することによって、培養速度の低下を抑制させることができることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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