(57)【要約】【課題】  本発明は新規な腎疾患治療薬を提供することを目的とする。本発明は特には、腎臓修復機能を有するが腎臓への低い集積性の問題のために連日投与が必要なＢＭＰ７を改良した新規な腎疾患治療薬を提供することを目的とする。【解決手段】  本発明により糖鎖欠損型のＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンとの融合体からなる融合タンパク質（ここで、ＢＭＰ７変異体とヒトアルブミンは直接または２〜２０のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している）が提供される。本発明によりまた、糖鎖欠損型のＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンと、腎標的ペプチドの融合体からなる融合タンパク質が提供される。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載のヒトＢＭＰ７の１０番目のアスパラギン、２９番目のアスパラギン、および８０番目のアスパラギンが任意のアミノ酸に置換されて糖欠損型のＢＭＰ７であるＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンとの融合体からなる融合タンパク質、ここで、ＢＭＰ７変異体とヒトアルブミンは直接または２〜２０のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している。
【請求項２】
前記ＢＭＰ７変異体が、配列番号２で示されるアミノ酸配列であるＢＭＰ７変異体である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記融合タンパク質が、配列番号３に示される、ＢＭＰ７変異体とヒト血清アルブミンとの融合体からなる融合タンパク質である請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
さらに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、前記融合体のＮ末端側またはＣ末端側に含む、請求項１〜３のいずれか一つに記載の融合タンパク質、ここで前記ペプチドは融合タンパク質中にいずれの向きで含まれていてもよい。
【請求項５】
前記融合タンパク質が、配列番号５に示される、ＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンと、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、との融合体からなる融合タンパク質である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかひとつに記載の融合タンパク質を含む腎疾患治療剤。
【請求項７】
週１回投与されることを特徴とする請求項６に記載の腎疾患治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢＭＰ７変異体とヒト血清アルブミンとの融合体に関し、さらには、該融合体を含む腎疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣病の増加や高齢化社会を背景として慢性腎臓病の患者数は年々増加しており、国内で成人人口の１３％、１３００万人以上にも達し、また、透析患者も約３０万人に達している。慢性腎臓病は、末期腎不全ならびに心血管疾患（例えば、脳卒中や冠動脈疾患）のリスクが高く、その治療法の開発が望まれている。末期腎不全になると、腎線維化が起こり、慢性腎臓病の病態の増悪に重大な影響を与えている。
しかし、慢性腎臓病の進展機序については未解明な点が多く、既存の治療方法では疾患の抑制を十分に達成できていない。例えば、現在、腎疾患に対する薬物治療としては降圧薬やステロイドなどが使用されているが、これらの腎疾患治療薬は予防的側面が強く、病態進行を改善または回復させる薬剤は未だ存在しない。
【０００３】
このような中、腎臓修復機能を有する機能性タンパク質に注目が集まっており、骨形成因子であるＢＭＰ７（Bone Morphogenetic Protein 7）が注目されている。ＢＭＰ７は抗アポトーシス作用や抗炎症作用を示す上に、腎臓の修復に関与する間葉上皮転換誘導作用を示す。事実、腎臓病モデル動物にＢＭＰ７を連日投与することで障害を受けた腎臓が修復され腎機能が回復することが報告されている（非特許文献１）。しかしながら、ＢＭＰ７は血中滞留性が低く、腎臓への集積率が投与量の０．５％以下と低いことが報告されている（非特許文献２）。そのため、連日の繰り返しの静脈内投与が必要となり、患者のＱＯＬの低下をもたらすので、臨床応用に向けてのボトルネックになっている。また、ＢＭＰ７は、骨形成を促進する因子として知られており、例えば、心血管疾患など、その副作用も懸念される。
【０００４】
ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属するタンパク質であり、骨の形成、心臓、歯、目、軟骨の形成などの器官の形成において重要な役割を担っている。ＢＭＰは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーと同じく、システイン７個を含むドメインとして産生され、ジスルフィド結合を介して２量体化して活性型タンパク質となる。ＢＭＰ７は、ＯＰ−１（Osteogenic Protein-1；骨誘導因子−１）とも呼ばれ、骨の成長を促すタンパク質として発見された。ＢＭＰ７は、ＢＭＰ７遺伝子がコードするアミノ酸４３１個の前駆タンパク質として合成され、ホモもしくはヘテロ２量体を形成し、糖化された後にプロテアーゼによる切断を受け、Ｃ末端１３９個のアミノ酸からなる２量体を形成し、活性を示す。
【０００５】
組み換えヒトＢＭＰ７として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）によって生産された組み換えヒトＢＭＰ７、原核生物細胞によって産生された組み換えヒトＢＭＰ７のいずれも市販されている。
原核生物細胞によって産生する組み換えヒトＢＭＰは、糖鎖を含まないために培養自体が容易であるとともに、増殖能に優れた原核生物細胞を製造に使用できるという利点がある。さらに、異種真核生物細胞で作られた組み換えヒトＢＭＰの場合に見られるようなヒト型糖鎖と異なる糖鎖によるネガティブな影響を考えなくても良いという利点がある。しかしながら、原核生物細胞で産生された組み換えヒトＢＭＰは、凝集しやすくかつ溶解性が非常に低いという欠点があり、実用化の障害になっている。また、糖鎖を含まない組み換えヒトＢＭＰは、凝集性や溶解性の問題に加えて、貯蔵時の安定性や、生体内での骨の再生や修復という持続的機能に関して課題がある。そのため、原核生物で産生された組み換えヒトＢＭＰを、特定の範囲濃度の塩酸溶液に溶解する工程を含む組み換えＢＭＰを製造する方法が提案されている（特許文献１）。
【０００６】
ＢＭＰ７の骨成長を促す作用を応用して、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）によって生産された組み換えヒトＢＭＰ７が、骨折の修復を促進する医薬品として臨床治療に用いられている。
【０００７】
本発明者らは、ピキア酵母発現系を用いて、ヒト血清アルブミンとチオレドキシンの融合体（ＨＳＡ−Ｔｒｘ融合タンパク質）を作成し、シスプラチン誘導腎症マウスに対する効果を確認し、報告している（非特許文献３）。そこでは、ＨＳＡ−Ｔｒｘ融合タンパク質は、ＨＳＡと同様の薬物動態特性を示したが、Ｔｒｘの半減期の１０倍の半減期を示したことを報告している。また、ＨＳＡ−Ｔｒｘは、他の臓器に比べ、肺及び腎臓により多く見られたことを記載している。
【０００８】
腎臓に対して集積性を有するペプチドとしていくつかのペプチドが報告されている。非特許文献４は、Cys-Leu-Pro-Val-Ala-Ser-Cysというアミノ酸配列を有する腎集積型ペプチドを開示している。非特許文献５は、His-Thr-Thr-His-Arg-Glu-Proというアミノ酸配列を有する腎集積型ペプチドを開示している。特許文献２は、His-Gly-Val-Gln-Ala-Arg-Leu、Arg-Ile-Gly-Gly-Met-Ser-Asn、及びVaol-Met-Ala-Thr-Gly-Gly-Valというアミノ酸配列を有する腎集積型ペプチドを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０９８４２１号公報
【特許文献２】特開２０１３−２２４２８３号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Zeisberg M. et al., Nat. Med. 2003, Jul:9(7): 964-8
【非特許文献２】Vukicevic S. et. al., J Clin Invest. 1998, 102: 202-214
【非特許文献３】Azusa Kodama, et al., Biochem. Biophys. Act 1840 (2014) 1152-1162
【非特許文献４】Renata. Pasquailiniら, Nature, Vol.380, 364-366, (1996)
【非特許文献５】Laura Denbyら,, Human Gene Therapy. November 2004, Vol.15, No.11: 1054-1064
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は新規な腎疾患治療薬を提供することを目的とする。本発明は特には、腎臓修復機能を有するが腎臓への低い集積性の問題のために連日投与が必要なＢＭＰ７を改良した新規な腎疾患治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、血中滞留性が改善し生理活性が持続可能な、ＢＭＰ７とアルブミンとの融合体の作製に成功し、本発明を完成した。本発明は以下のものを含む。
（１）配列番号１に記載のヒトＢＭＰ７の１０番目のアスパラギン、２９番目のアスパラギン、および８０番目のアスパラギンが任意のアミノ酸に置換され、糖欠損型のＢＭＰ７であるＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンとの融合体からなる融合タンパク質、ここで、ＢＭＰ７変異体とヒトアルブミンは直接または２〜２０（好ましくは２〜１０）のアミノ酸からなるスペーサーを介して結合している。
（２）前記ＢＭＰ７変異体が、配列番号２で示されるアミノ酸配列であるＢＭＰ７変異体である上記（１）に記載の融合タンパク質。
（３）前記融合タンパク質が、配列番号３に示される、ＢＭＰ７変異体とヒト血清アルブミンとの融合体からなる融合タンパク質である上記（２）に記載の融合タンパク質。
（４）さらに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、前記融合体のＮ末端側またはＣ末端側に含む、上記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の融合タンパク質、ここで前記ペプチドは融合タンパク質中にいずれの向きで含まれていてもよい。
（５）前記融合タンパク質が、配列番号５に示される、ＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンと、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、との融合体からなる融合タンパク質である、上記（４）に記載の融合タンパク質。
（６）前記（１）から（５）のいずれかひとつに記載の融合タンパク質を含む腎疾患治療剤。
（７）週１回投与されることを特徴とする前記（６）に記載の腎疾患治療剤。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、血中滞留性が改善し生理活性が持続可能なＢＭＰ７を含む融合タンパク質が提供される。本発明によりまた、腎臓細胞を標的とした、血中滞留性が改善し生理活性が持続可能なＢＭＰ７を含む融合タンパク質が提供される。これらの融合タンパク質は、低い骨形成活性しか持たないので、副作用の懸念が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、実施例３において、本発明のＢＭＰ７変異体とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質（ＨＳＡ−ＢＭＰ７）の一側尿管結紮（ＵＵＯ）マウスにおける腎保護効果を、組織形態学的観察（マッソントリクローム染色）により確認した結果である。
【図２】図２は、実施例３において、ＨＳＡ−ＢＭＰ７のＵＵＯマウスにおける腎保護効果を、ヒドロキシプロリン量の測定により確認した結果である。
【図３】図３は、実施例４において、ＨＳＡ−ＢＭＰ７のシスプラチン腎症マウスにおける腎保護効果を、血清クレアチニンと血中尿素窒素含量により確認した結果である。
【図４】図４は、実施例４において、ＨＳＡ−ＢＭＰ７のシスプラチン腎症マウスにおける腎保護効果を、腎組織の形態学的観察（ＰＡＳ染色）により確認した結果である。
【図５】図５は、実施例４において、ＨＳＡ−ＢＭＰ７のシスプラチン腎症マウスにおける腎保護効果を、腎組織の形態学的観察（ＴＵＮＥＬ染色）により確認した結果である。
【図６】図６は、実施例５において、ＨＳＡ−ＢＭＰ７の骨形成活性を、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を用いた骨芽細胞への分化誘導モデルにてアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を指標として確認した結果である。
【図７】図７は、実施例６において、ＨＳＡ−ＢＭＰ７によるＢＭＰ７シグナル伝達を、ウェスタンブロットを用いて、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化により確認した結果である。
【図８】図８は、実施例７において、本発明の腎標的ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７の融合タンパク質のＵＵＯマウスにおける腎保護効果を、ヒドロキシプロリン量の測定により確認した結果である。
【図９】図９は、実施例７において、本発明の腎標的ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７の融合タンパク質のＵＵＯマウスにおける腎保護効果を、腎組織の形態学的観察（筋繊維芽細胞マーカーであるα−ＳＭＡの免疫染色）により確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を、例示的な実施態様を例として、本発明の実施において使用することができる好ましい方法および材料とともに説明する。
なお、文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。また、本明細書に記載されたものと同等または同様の任意の材料および方法は、本発明の実施において同様に使用することができる。
また、本明細書に記載された発明に関連して本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許は、例えば、本発明で使用できる方法や材料その他を示すものとして、本明細書の一部を構成するものである。
【００１６】
本発明の一つの態様は、配列番号１に記載のヒトＢＭＰ７の１０番目のアスパラギン、２９番目のアスパラギン、および８０番目のアスパラギンが任意のアミノ酸に置換され、糖欠損型のＢＭＰ７であるＢＭＰ７変異体（以下、単に「ＢＭＰ７」という場合がある）と、ヒト血清アルブミン（以下、「ＨＳＡ」という場合がある）との融合体からなる融合タンパク質（以下、「ＨＳＡ−ＢＭＰ７」という場合がある）である
本発明の他の一つの態様は、配列番号２に示されるＢＭＰ７変異体、ヒト血清アルブミンとの融合体からなる融合タンパク質である。
配列番号２に示されるＢＭＰ７変異体は、１３９アミノ酸からなるヒトＢＭＰ７の配列において、糖鎖の結合部位である１０番目のアスパラギン、２９番目のアスパラギン、および８０番目のアスパラギンをグルタミンに変更した配列である。これにより、ＢＭＰ７変異体は糖鎖欠損型となる。
ＢＭＰ７変異体とヒト血清アルブミンとの結合は、直接結合しても、両者の間にペプチドのスペーサーを介して結合してもよいが、スペーサーを介して結合するのが好ましい。スペーサーとしては、アミノ酸数、２〜２０，好ましくは２〜１０の長さのペプチドが用いられ、アミノ酸としては主としてグリシンから構成されるのが好ましい。具体的には、−（Ｇｌｙ）ｎ−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）ｎ−で表されるペプチドが好ましく用いられ、ｎは、それぞれ独立に、１〜１０、好ましくは２〜５、特に好ましくは４である。
【００１７】
ＢＭＰ７変異体とヒト血清アルブミンとの融合タンパク質は、例えば、配列番号３に示される配列のように、ヒト血清アルブミンの配列−スペーサー配列−ＢＭＰ７変異体配列のアミノ酸配列をコードする遺伝子をもつベクターを作製し、それを例えば酵母に形質転換して、酵母に発現させ、次いでそれを精製することにより得ることができる。
融合タンパク質の発現系としては、原核生物細胞または真核生物細胞を用いた公知の発現系を適宜用いることができるが、好ましくは、ピキア酵母発現系である。ピキア酵母発現系での融合タンパク質の作製は、公知の方法、例えば、生田らの報告（S. Ikuta et al., J. Control. Release 147 (2010) 189-195）や本発明者らによる報告（非特許文献３）に基づいて行うことができる。
【００１８】
なお、融合タンパク質におけるＢＭＰ７とＨＳＡの配置は、Ｎ末端−ＨＳＡ−ＢＭＰ７−Ｃ末端であっても、Ｎ末端−ＢＭＰ７−ＨＳＡ−Ｃ末端であっても良いが好ましくは、Ｎ末端−ＨＳＡ−ＢＭＰ７−Ｃ末端である。
【００１９】
本発明の別の態様は、配列番号１に記載のヒトＢＭＰ７の１０番目のアスパラギン、２９番目のアスパラギン、および８０番目のアスパラギンが任意のアミノ酸に置換され、糖欠損型のＢＭＰ７であるＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンと、配列番号４に示されるアミノ酸配列のペプチドが融合した融合タンパク質である（以下「ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７」という場合がある）。
本発明のもう一つの別の態様は、配列番号２に示されるＢＭＰ７変異体と、ヒト血清アルブミンと、配列番号４に示されるアミノ酸配列のペプチドが融合した融合タンパク質である。
配列番号２に示されるＢＭＰ７変異体、及びＢＭＰ７とＨＳＡを融合するためのペプチドのスペーサーについては、前記の通りである。
配列番号４に示されるアミノ酸配列のペプチドは、腎標的ペプチドとして本発明者らにより発見されたペプチド（以下、腎標的ペプチドという場合がある）である。配列番号４のペプチドは、いずれの向きで融合タンパク質中に配置されてもよい。例えば、ペプチド（His-Gly-Val-Gln-Ala-Arg-Leu）−ＨＳＡ−ＢＭＰ７であっても、ペプチド（Leu-Arg-Ala-Gln-Val-Gly-His）−ＨＳＡ−ＢＭＰ７であってもよい。また、融合タンパク質中の、ペプチド、ＨＳＡ，ＢＭＰ７の配列順は、ペプチドがＮ末端側またはＣ末端側に配置されていれば、それ以外はいずれの配置でもよい。
【００２０】
ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７からなる融合タンパク質は、上記と同様にして、例えば、配列番号５に示される融合タンパク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子をもつベクターを作製し、それを酵母に形質転換して、酵母に発現させ、次いでそれを精製することにより得ることができる。
【００２１】
本発明の融合タンパク質であるＨＳＡ−ＢＭＰ７またはペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７の投与量は、疾患の程度、症状などにより異なり、疾患の程度、症状、患者の状態、投与方法により適宜選択される。例えば、これに限定されないが、全身投与では、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜ｍｇ／患者、好ましくは０．１ｍｇ〜６０ｍｇ／患者の範囲である。投与方法は、限定されないが、好ましくは間歇投与であり、特には１回／数日〜２週が好ましく、さらには１回／週が好ましい。なお、投与方法及び投与量は、患者の性別、年齢、体重、ならびに症状や状態により適宜選択される。
本発明の融合タンパク質は、良好な血中滞留性と生理活性の持続性を有するので、週１回程度の投与でも十分な効果が発揮できる。また、ＢＭＰ７に由来する骨形成活性がＢＭＰ７に比べて低いので、副作用の懸念が少なく、ＢＭＰ７に比べて高用量および／または長期の投与が可能である。
【実施例】
【００２２】
以下、実施例を例に本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２３】
（材料および方法）
全ての動物事件は、熊本大学の実験動物指針に従って行った。
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＵＳＡ）から購入した。
シスプラチンは、日本化薬から購入した。
【００２４】
（実施例１）ＨＳＡ−ＢＭＰ７融合タンパク質の作製
ＨＳＡ−ＢＭＰ７融合タンパク質の作製は、生田らの方法に従って行った。具体的には、配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだｐＰＩＣ９ベクターにより形質転換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓをＢＭＧＹ培地で培養した後、ＢＭＭＹ培地に交換後、タンパク質発現誘導因子、炭素源およびメタノールを添加してさらに培養を続けた。メタノールは毎日添加してタンパク質発現誘導効果を維持した。融合タンパク質の精製は、アフィニティカラムを用い、次いで、疎水性カラムを用いたクロマトグラフィーにより行った。精製した融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い分子量により確認した。
【００２５】
（実施例２）ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７融合タンパク質の作製
実施例１と同様にして行った。但し、配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだｐＰＩＣ９ベクターにより形質転換したＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを用いた。
【００２６】
（実施例３）一側尿管結紮（ＵＵＯ）マウスによる腎保護効果の確認
４週齢のＩＣＲ雄マウスを用い、尿管（左腎側）を２箇所結束して（一側尿管結紮（ＵＵＯ）により）マウス腎間質線維化モデルを作製した。線維化の程度は、ＵＵＯ処置７日後と１４日後の組織形態学的観察（マッソントリクローム染色）と１４日後のヒドロキシプロリン量の測定により評価した。
結束時点（０日目）および７日目に、実施例１で調製したＨＳＡ−ＢＭＰ７、ＨＳＡまたはＢＭＰ７のそれぞれをマウスに、１００  ｎｍｏｌ／ｋｇにて静脈内投与した。対照として、生理食塩水のみを投与した。また、尿管結束をしていないマウスをｃｏｎｔｒｏｌとした。
ＵＵＯ処置１４日後のマッソントリクローム染色の結果を図１に示す。生理食塩水投与群で観察された膠原繊維（青く染まる）は、ＨＳＡ−ＢＭＰ７投与群では顕著に抑制された。一方、ＨＳＡまたはＢＭＰ７投与群では膠原繊維の抑制効果は観察されなかった。
ヒドロキシプロリン量の測定結果を図２に示す。ＨＳＡ−ＢＭＰ７により、有意に低下しているのが判る。
これらの結果より、１週間に１回の投与でも、ＨＳＡ−ＢＭＰ７により腎繊維化が抑制できることが判った。
【００２７】
（実施例４）シスプラチン腎症マウスによる腎保護効果の確認
４週齢のＩＣＲ雄マウスを用い、シスプラチンを投与する３０分前に、実施例１で調製したＨＳＡ−ＢＭＰ７を１００ ｎｍｏｌ／ｋｇにて静脈内投与した。対照として、生理食塩水のみを投与した。また、シスプラチンを投与していないマウスをｃｏｎｔｒｏｌとした。シスプラチンは、１５ｍｇ／ｋｇにて腹腔内投与した。シスプラチン投与９６時間後に、腎機能および腎組織学的評価を行った。具体的には、血清クレアチニンと血中尿素窒素含量を測定するとともに、腎組織の形態学的観察をＰＡＳ染色およびＴＵＮＥＬ染色により行った。
結果を図３〜図５に示す。ＨＳＡ−ＢＭＰ７投与により、血清クレアチニンおよび血中尿素窒素含量の有意な抑制並びにクレアチニンクリアランスの上昇が観察された。また、組織形態学的観察（ＰＡＳ／ＴＵＮＥＬ染色）からも顕著な腎保護効果が観察された。
【００２８】
（実施例５）骨形成活性の測定
融合タンパク質であるＨＳＡ−ＢＭＰ７の骨形成活性を確認した。
骨形成活性は、常法に従い、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を用いてＢＭＰ７による骨芽細胞への分化誘導モデルにて骨芽細胞への分化の指標であるアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）活性を測定した。結果を図６に示す。ＨＳＡ−ＢＭＰ７は、ＢＭＰ７に比べてＡＬＰ活性を示さないこと、すなわち骨形成活性が低下していることが示された。
【００２９】
（実施例６）ＢＭＰ７シグナル伝達の確認
ヒト尿細管上皮細胞（ＨＫ−２）を用いて、ＢＭＰシグナル伝達に関わるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化をウェスタンブロットにより確認した。
ＢＭＰ７（Ｐｒｏｓｐｅｃ社  ＣＹＴ−２７６：ＣＨＯ細胞由来糖鎖あり）は１０ｎＭの濃度にて、ＨＳＡ−ＢＭＰ７は１００ｎＭの濃度にて培地中に添加した。結果を図７に示す。糖鎖のない本発明の融合タンパク質ＨＳＡ−ＢＭＰ７は、ＢＭＰシグナル伝達に関わるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化活性がＢＭＰ７（糖鎖あり）に比べて低いものの、Ｓｍａｄ１／５／８をリン酸化することが確認できた。このことは、ＢＭＰ７活性がＨＳＡと融合化しても保持されていることを示している。
【００３０】
（実施例７）ＵＵＯマウスによる腎保護効果の確認（ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７）
実施例３と同様にして、実施例２で作製したペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７の腎繊維化の抑制効果を確認した。
結束時点（０日目）および７日目に、ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７、ＨＳＡ−ＢＭＰ７のそれぞれを１００  ｎｍｏｌ／ｋｇにて静脈内投与した。対照として、生理食塩水のみを投与した。また、尿管結束をしていないマウスとｃｏｎｔｒｏｌ（Ｎｏｒｍａｌ）とした。１４日目のヒドロキシプロリン量の測定結果を図８に示す。腎繊維化抑制効果の組織形態学的観察は、筋繊維芽細胞マーカーであるα−ＳＭＡの免疫染色により確認した。その結果を図９に示す。
これらの結果より、ペプチド−ＨＳＡ−ＢＭＰ７は、ＨＳＡ−ＢＭＰ７に比べて高い腎繊維化抑制効果を示した。
【００３１】
以上の知見より、本発明のＢＭＰ７変異体とヒト血清アルブミンとの融合体からなる融合タンパク質は、腎間質線維化の抑制効果とともに腎保護効果を示すことが判った。このような腎疾患治療剤は報告がなく、新しいものであり、新規腎疾患治療剤としての開発が期待され得る。
【００３２】
上記の詳細な記載は、本発明の目的及び対象を単に説明するものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲から離れることなしに、記載された実施態様に対しての、種々の変更及び置換は、本明細書に記載された教示より当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
本発明により提供される融合タンパク質は、腎疾患治療剤として有用である。
【図２】
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【図８】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
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