(57)【要約】      （修正有）【課題】目的の細胞を特異的に吸着しつつ、非特異的な吸着を抑制可能な分離する細胞の品質を向上させることが可能な細胞の分離膜の提供。【解決手段】支持体１と、支持体１に固定され、温度により構造が変化する高分子部位２ａ，２ｂ，２ｃと、高分子部位２ａ，２ｂ，２ｃに結合しているとともに外表面に露出可能であり、目的の細胞２０を含む被処理液に接触させたときに目的の細胞２０を特異的に吸着可能な細胞吸着部位３ａ，３ｂ，３ｃと、外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位４ａ，４ｂ，４ｃと、を備え、細胞吸着部位３ａ，３ｂ，３ｃにおいて、目的の細胞２０の２種類以上の膜タンパクと吸着可能である細胞分離膜１０。【選択図】図１
2016163550.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、
前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、
前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出可能であり、目的の細胞を含む被処理液に接触させたときに前記目的の細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、
外表面に露出し、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備え、
前記細胞吸着部位において、前記目的の細胞の２種類以上の膜タンパクと吸着可能である
ことを特徴とする細胞分離膜。
【請求項２】
前記高分子部位は、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すことを特徴とする請求項１に記載の細胞分離膜。
【請求項３】
前記高分子部位は、所定温度より高い温度で親水性を示し、該所定温度より低い温度で疎水性を示すことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞分離膜。
【請求項４】
前記高分子部位は、結合している前記細胞吸着部位の種類毎に相転移温度が異なることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか一項に記載の細胞分離膜。
【請求項５】
前記細胞吸着部位は、外表面に露出した状態と、前記親水性部位の中に埋没した状態と、のいずれの状態もとることが可能であることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか一項に記載
【請求項６】
前記高分子部位は、ポリアミノ酸を含んで構成されることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか一項に記載の細胞分離膜。
【請求項７】
前記高分子部位は、少なくとも一部に螺旋構造を有していることを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか一項に記載の細胞分離膜。
【請求項８】
前記親水性部位は、ポリエチレングリコールを含んで構成されることを特徴とする請求項１ないし請求項７のいずれか一項に記載の細胞分離膜。
【請求項９】
前記支持体は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んでいることを特徴とする請求項１ないし請求項８のいずれか一項に記載の細胞分離膜。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の細胞分離膜を細胞分離手段として備えることを特徴とする細胞分離装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的の種類の細胞のみを回収する細胞分離膜及びこれを備える細胞分離装置の技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
再生医療では、皮膚、神経、骨、血管等のもとになる細胞（幹細胞）を用いて病気や怪我で故障した組織や臓器の機能回復を行う。幹細胞の種類は主に（１）体性幹細胞、（２）ＥＳ細胞、（３）ｉＰＳ細胞があり、それぞれ以下の性質を持つ。
【０００３】
（１）体性幹細胞
体性幹細胞は、骨髄・脂肪・血液等に微量で含まれている未成熟の細胞である。体性幹細胞は、体の骨髄や脂肪等にあり、一定の種類の細胞に分化する。成長すると血液細胞になるものを造血幹細胞、骨細胞や脂肪細胞等になるものを間葉系幹細胞、脳の神経になるものを神経幹細胞という。体性幹細胞は患者自身から採取されるので、体性幹細胞を用いた再生医療は拒絶反応が起きないという利点を有する。
【０００４】
（２）ＥＳ細胞
ＥＳ細胞は、受精卵の一部から作られ、体のあらゆる細胞になる機能を持っている。
【０００５】
（３）ｉＰＳ細胞は、皮膚等の細胞に遺伝子を入れて作られる。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様にあらゆる細胞になるとされる。
【０００６】
例えば、再生医療においては、体内から採取した未分化の角膜細胞や口腔細胞の幹細胞を増殖培養し、適切に重層化及び／又は分化誘導することにより作成された細胞シートを治療に用いることができる。
上記幹細胞はいずれも採取される量が少ないため、採取された細胞は培養により十分な量に増殖させ適切な細胞へ分化誘導を行う必要があるが、分化誘導の過程で、一部の細胞が、目的の細胞と異なる細胞に分化誘導することがある。特に医療目的に使用する細胞では、目的以外の細胞の混入は大きな課題となっている。
【０００７】
これらの事情に鑑み、特許文献１に記載の技術が知られている。特許文献１には、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すポリマーが結合された不織布を有する処理部と、前記所定温度より高い温度で、前記生理活性物質を前記ポリマーに疎水結合させた状態で、細胞を含む液を前記処理部に導入する液導入部と、前記処理部の液温を調節する液温調節部と、前記処理部から液を排出する液排出部とを備え、前記ポリマーには、対象となる細胞と結合する生理活性物質が疎水結合可能であり、前記生理活性物質が、前記細胞に特異的に結合する抗体であり、前記処理部は、前記細胞を前記生理活性物質に捕捉させて該液から分離し、前記ポリマーを前記所定温度より低い温度にして親水化させることによって、前記捕捉細胞および前記生理活性物質を前記ポリマーから離脱させることができ、前記液排出部は、前記離脱した細胞を回収可能に構成され、前記ポリマーがポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）であることを特徴とする細胞の分離回収装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４２８８３５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献１に記載の技術においては、目的の細胞に特異的に吸着する生理活性物質（抗体）が、ポリマーに結合している。そして、この表面に目的の細胞を含む溶液を接触させることで、溶液中の目的の細胞が生理活性物質に特異的に吸着する。生理活性物質に目的の細胞が吸着した後、ポリマーを水に溶解させて親水性とすることで、目的の細胞および生理活性部質をポリマーから脱離し、目的の細胞および生理活性部質が溶液から分離回収されるようになっている。
【００１０】
しかし、特許文献１に記載の技術は、溶液から目的の細胞および生理活性部質が特異的に吸着した状態でポリマーから離脱させて溶液中から目的の細胞を分離回収する。このため、分離回収した状態の目的の細胞をそのまま使用することはできない。つまり、目的の細胞から生理活性物質（抗体）を分離する必要がある。
【００１１】
このような背景に鑑みて本発明がなされたのであり、本発明は、分離する細胞の品質（純度）を向上させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは前記課題を解決するべく鋭意検討した結果、支持体と、前記支持体に固定され、温度により構造が変化する高分子部位と、前記高分子部位に結合しているとともに外表面に露出し、目的の細胞を含む被処理液に接触させたときに前記目的の細胞を特異的に吸着可能な細胞吸着部位と、外表面に露出可能であり、前記被処理液に接触される親水性部位と、を備え、前記細胞吸着部位において、前記目的の細胞の２種類以上の膜タンパクと吸着可能とすることにより、前記課題を解決できることを見出した。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、分離する細胞の品質を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本実施形態の細胞分離膜の作用を説明する模式図である。
【図２】本実施形態の細胞分離膜の斜視図である。
【図３】細胞の分化誘導と発現する膜タンパクの関係を説明する模式図である。
【図４】本実施形態の細胞分離膜を使用した細胞の分離回収方法のフローチャートである。
【図５】本実施形態の細胞分離膜の作用を説明する模式図であり、抗体と膜タンパクの関係を説明する模式図である（その１）。
【図６】本実施形態の細胞分離膜の作用を説明する模式図であり、抗体と膜タンパクの関係を説明する模式図である（その２）。
【図７】本実施形態の細胞分離膜の作用を説明する模式図であり、抗体と膜タンパクの関係を説明する模式図である（その３）。
【図８】本実施形態の変形例の細胞分離膜を説明する模式図であり、（ａ）は細胞吸着部位の一部が存在しない細胞分離膜であり、（ｂ）は別の親水性部位設けた細胞分離膜であり、（ｃ）は親水性部位の一部が存在しない細胞分離膜である。
【図９】本発明の細胞分離膜を用いて構成される培養装置のブロック図である。
【図１０】本発明の細胞分離膜を用いて構成される培養装置において行われる細胞の分離回収方法のフローチャートである。
【図１１】本実施形態の細胞分離膜と細胞の吸着及び脱離を説明する写真であり、（ａ）は細胞分離膜に細胞を吸着させたときの顕微鏡写真であり、（ｂ）は吸着した細胞を回収した後の細胞分離膜を撮影した顕微鏡写真であり、（ｃ）は（ａ）の写真を模式的に示した図、（ｄ）は（ｂ）の写真を模式的に示した図である。
【図１２】細胞分離膜と細胞選別の関係説明する写真であり、（ａ）は比較例の細胞分離膜に吸着した細胞を撮影した顕微鏡写真であり、（ｂ）、（ｃ）は本実施形態の細胞分離膜に吸着した細胞を撮影した顕微鏡写真である（その１）。
【図１３】細胞分離膜と細胞選別の関係説明する写真であり、（ａ）は比較例の細胞分離膜に吸着した細胞を撮影した顕微鏡写真であり、（ｂ）、（ｃ）は本実施形態の細胞分離膜に吸着した細胞を撮影した顕微鏡写真である（その２）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次に、本発明を実施するための形態（「以下適宜、実施形態」という）について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１６】
＜＜第１実施形態＞＞
本実施形態の細胞分離膜は、図１、図２に示すように、支持体１（不織布）と、支持体１に結合した薄膜５とを含んで構成される。薄膜５は、抗体３１〜３３（ＬＣＳＴ型抗体、ＵＣＳＴ型抗体）とを含んで構成される。
【００１７】
＜支持体１＞
細胞分離膜を構成する支持体（不織布）１は、後記する高分子部位２等を固定するものである。このような支持体１はどのようなものであってもよいが、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）等を化学的に固定できるものであることが好ましい。具体的には、支持体１は、高分子材料及びガラス材料の少なくとも一方を含んで構成されていることが好ましい。
【００１８】
このような材料を用いることで、高分子部位２等を固定するための表面処理が特に容易であり、また、表面処理のために加圧したときの耐久性に優れるという利点がある。
【００１９】
支持体１は、抗体の高分子部位２等を固定可能であれば構成する材料に制限はない。
支持体１を構成する高分子材料としては、例えば、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、表面修飾アガロースゲル等が挙げられる。又、支持体１を構成する材料として、単体の金属、金属酸化物等の金属材料を用いることができる。
【００２０】
支持体１の表面の形状は、抗体の高分子部位２等を固定可能であればどのようになっていてもよく、例えば、平坦形状にすることができる。他にも、支持体１の表面の形状は、ピラー構造や球状構造、多孔形状等とすることもできる。
【００２１】
＜抗体３１〜３３＞
細胞分離膜を構成する抗体３１〜３３は、温度応答性高分子部位２（２ａ、２ｂ、２ｃ、以下、適宜高分子部位２と記載する）、細胞吸着部位３（３ａ、３ｂ、３ｃ）、親水性部位４を含んで構成される。
【００２２】
（温度応答性高分子部位２） 
支持体１に固定される温度応答性高分子部位２は、温度により構造が変化するものである。具体的には、例えば、室温では分子構造が維持されているものの、室温よりも高い所定温度以上では分子構造が崩れるものである。
このような構造変化により、詳細は後記するが、高分子部位２に結合された細胞吸着部位３を親水性部位４の中に埋没させることができ、細胞分離膜から目的の細胞を脱離させ易くなる。
本願において、構造の変化が生じる温度を相転移温度という。
【００２３】
温度応答性高分子部位２の具体的な構造は、温度により構造が変化すれば、特に制限されない。高分子部位２は、少なくとも一部に螺旋構造を有していることが好ましい。
このような構造を有する高分子部位とすることにより、温度によって当該螺旋構造を掌る水素結合を切断させることができ、構造変化（相転移）を生じ易くすることができる。
【００２４】
又、温度応答性高分子部位２は、どのような方法で前記の支持体１に固定されていてもよい。例えば、化学的な結合（共有結合等）や物理的な吸着（抗原抗体反応を用いた吸着等）等の方法が挙げられる。
【００２５】
温度応答性高分子部位２の好適な具体例としては、ポリアミノ酸を含むものである。ポリアミノ酸はアミノ酸が二つ以上重合してなるものである。ポリアミノ酸を構成するアミノ酸は、通常は直鎖状に重合することになる。ポリアミノ酸は、分子内で水素結合が生じることにより、螺旋構造を有している。従って、ポリアミノ酸を用いることにより、前記の構造変化を生じさせ易くなるという利点がある。
【００２６】
又、ポリアミノ酸は通常直鎖状であるため、高分子部位の配向を制御し易くなる。このため、支持体１上での所望の位置への疎水性部位の固定が容易になる。更に、後記する細胞吸着部位３を高分子部位２に結合させ易くなるという利点もある。
【００２７】
ポリアミノ酸は、一種のみのアミノ酸により構成されてもよく（単独重合）、二種以上のアミノ酸が任意の比率及び組み合わせにより構成されてもよい（共重合）。
ポリアミノ酸を構成するアミノ酸としては、特に制限されないが、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、グルタミン、システイン、アラニン、ロイシン等が挙げられる。
【００２８】
ポリアミノ酸の数平均分子量は特に制限されないが、通常は５ｋＤａ以上、好ましくは１０ｋＤａ以上、より好ましくは５０ｋＤａ以上である。ポリアミノ酸の数平均分子量がこの範囲であることにより、支持体１にポリアミノ酸をより固定し易くなる。
【００２９】
（細胞吸着部位３） 
細胞吸着部位３は、目的の細胞２０を含む被処理液に接触させたときに目的の細胞２０を特異的に吸着可能なものである。従って、細胞吸着部位３は、分離回収の対象となる目的の細胞に応じて適宜決定して用いればよい。中でも、細胞吸着部位３として、目的の細胞２０を抗原とする抗体を用いることが好ましい。抗体を用いることで、生体組織である細胞に対して、生物反応である抗原抗体反応を利用することができ、特異的に目的の細胞２０を吸着できると共に、脱吸着の制御がより容易になる。
細胞吸着部位３の種類は、２種類以上が好ましく、分離回数、吸着回数、細胞培養条件等に合わせて適宜選択可能である。
【００３０】
本実施形態において適用可能な抗体は、例えば、間葉系幹細胞の骨芽細胞分化での選択に使用する抗体としては、抗ＣＤ２９抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＣＤ９０抗体、抗ＣＤ１０５抗体、抗ＣＤ１６６抗体が挙げられる。これらは、後ほど説明するＵＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合させることが可能である。
【００３１】
間葉系幹細胞の分化誘導においては、間葉系幹細胞から、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞と順に分化していき、成熟した骨芽細胞が最終的に骨細胞へと変化していくため、それぞれに特異的に結合する抗体も本実施形態において適用可能である。本実施形態において適用可能なこれらに特異的に結合する抗体は、例えば、骨芽細胞分化前・中期にはアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）やオステオポンチン（ＯＰＮ）、分化後期にはＯＣＮの他、骨シアロタンパク質（bone sialo-protein：ＢＳＰ）に対する抗体が挙げられる。これらは、後ほど説明するＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合させることが可能である。
【００３２】
又、間葉系幹細胞から、前駆脂肪細胞、成熟脂肪細胞と順に分化していき、成熟した脂肪細胞が最終的に脂肪細胞へと変化していくため、それぞれに特異的に結合する抗体も本実施形態において適用可能である。本実施形態において適用可能なこれらに特異的に結合する抗体は、例えば、脂肪細胞分化前・中期にはＣＤ１０５やＬＰＡ４受容体、分化後期にはアディポネクチンやＦＡＢＰ４(Fatty acid binding protein 4)に対する抗体が挙げられる。これらも、後ほど説明するＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合させることが可能である。
【００３３】
又、細胞吸着部位３は、高分子部位２に結合している。細胞吸着部位３と高分子部位２とは直接結合していてもよいが、リンカーを介して結合していることが好ましい。
【００３４】
リンカーを介して細胞吸着部位３を疎水性高分子部位２に結合させることにより、より確実に、細胞吸着部位３が細胞分離膜１０表面から外側に向かって突出した形態（即ち、外表面に露出した形態）とすることができる。これにより、目的の細胞２０を含む被処理液に細胞分離膜１０を接触させたときに、目的の細胞２０に細胞吸着部位３を一層特異的に吸着させ易くすることができる。
【００３５】
好ましいリンカーとしては、ビオチン−アビジンが挙げられる。ビオチン−アビジンを用いることにより、細胞吸着部位３（例えば抗体）と疎水性高分子部位２（例えばポリアミノ酸）とをより容易に結合することができる。具体的には、細胞吸着部位３をビオチン化すると共に高分子部位２をビオチン化することで、アビジンを介して、細胞吸着部位３と高分子部位２とを容易に結合することができる。
【００３６】
更に、リンカーとしては、プロテインＡやプロテインＧを構成するドメインを用いてもよい。具体的には、プロテインＡやプロテインＧを抗原とし、これらに高分子部位２及び細胞吸着部位３を結合させるようにしてもよい。これにより、ＩｇＧ（免疫グロブリン）抗体を介して、高分子部位２と細胞吸着部位３とを結合させることができ、ビオチン−アビジンを用いた場合と同様の効果が得られる。
【００３７】
温度応答性高分子部位２における細胞吸着部位３の具体的な結合位置は特に制限されない。細胞吸着部位３をより確実に細胞分離膜１０の外表面に露出させる観点から、温度応答性高分子部位２を構成する高分子の末端に結合されることが好ましい。例えば、温度応答性高分子部位２を構成する高分子が直鎖状である場合には直鎖の末端であり、高分子が網目状である場合には網目の末端となる。これらの位置に細胞吸着部位３を結合させることで、細胞吸着部位３をより確実に細胞分離膜１０の外表面に露出させることができる。
【００３８】
（親水性部位４） 
親水性部位４は、細胞分離膜１０の外表面に露出し、目的の細胞２０を含む被処理液に接触（例えば含浸）させたときに、被処理液が接触する部位である。温度応答性高分子部位２（即ち、疎水性高分子部位）及び細胞吸着部位３以外の部位に、外表面に露出するように親水性部位４が設けられることで、疎水性である細胞２０の非特異的な吸着をよりいっそう抑制することができる。
【００３９】
このような親水性部位４としては、例えば親水性官能基、具体的には、ヒドロキシル基やカルボキシル基等を有しているものが挙げられる。親水性部位４のより具体的な例としては、エチレングリコールやその重合体（ポリエチレングリコール）、リン脂質構造を有する分子、リン酸やその重合体（ポリリン酸）等が挙げられる。
中でも、良好な親水性、及び温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）への結合のし易さ等の観点から、親水性部位４は、エチレングリコールが２つ以上重合したポリエチレングリコールを含むことが好ましい。
【００４０】
又、親水性部位４は、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）と独立して設けられていてもよい。しかし、高分子部位２の構造変化をいっそう促す観点から、親水性部位４は、温度応答性高分子部位（２疎水性高分子部位）に結合していることが好ましい。即ち、親水性部位４は、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）と一体になっていることが好ましい。
【００４１】
親水性部位４が温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）に結合していることで、温度変化に伴う温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）の構造変化をいっそう促すことができる。ただし、細胞分離膜１０に備えられる全ての親水性部位４が温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）に結合している必要は無く、適宜アルキル基等を結合することで、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）の温度応答性を制御することができる。
【００４２】
親水性部位４の温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）への結合位置は特に制限されない。温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）が直鎖状である場合には、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）の側鎖に親水性部位４が結合していることが好ましい。これにより、細胞分離膜１０において、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）以外の部位に、親水性部位４を容易に配置することができる。従って、細胞分離膜１０の外表面に、より確実に親水性部位４を露出させることができる。
【００４３】
温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）としてはポリアミノ酸が好ましく、親水性部位４としてはポリエチレングリコールを含むことが好ましい。又、親水性部位４は、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）に結合していることが好ましい。これらを満たす温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）及び親水性部位４として好適な材料としては、例えば、以下の式（１）で表される化合物が挙げられる。
【００４４】
【化１】
2016163550.tif 000003
※ 式（１）中、ｎ及びｘは、それぞれ独立して、２以上の整数である。
【００４５】
＜作用＞
本実施形態の細胞分離膜１０における構成及び作用について、図面を参照しながら説明する。
図２は、本実施形態の細胞分離膜１０の斜視図である。細胞分離膜１０は、マクロの視点で観察すると、支持体１の表面に薄膜５が形成されている。この薄膜５には、図１に示す様に、温度応答性高分子部位２（２ａ、２ｂ、２ｃ）、細胞吸着部位３（３ａ、３ｂ、３ｃ）、親水性部位４（４ａ、４ｂ、４ｃ）等が含まれている。
【００４６】
本実施形態の細胞分離膜１０を構成する抗体は、温度応答性高分子部位２を含む。温度応答性高分子部位２は、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すＵＣＳＴ型(upper critical soluble temperature)、又は、所定温度より高い温度で親水性を示し、該所定温度より低い温度で疎水性を示すＬＣＳＴ型(lower critical soluble temperature)に分類可能である。
【００４７】
本実施形態の細胞分離膜１０は、少なくとも、ＵＣＳＴ型温度応答性高分子部位を含む抗体と、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位を含む抗体と、をそれぞれ一種類以上含むことが好ましい。各抗体の温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）、又は、親水性部位４の相転移温度は、それぞれ異なることが好ましい。各抗体の温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）、又は、親水性部位４は、立体構造が熱可逆的に変化することが好ましい。
【００４８】
細胞２０の細胞膜２１には、様々な種類の膜タンパクが発現している。細胞培養中に分化誘導を行うことで、細胞の種類が変化し、それに伴い発現している膜タンパクの種類も変わっていく（図３等参照）。
【００４９】
ここで、細胞２０表面の膜タンパクＡ（図３に示す２２）と結合する抗体が抗体Ａ（図１に示す３１）であり、同様に、細胞表面の膜タンパクＢ（図３に示す２３）と結合する抗体が抗体Ｂ（図１に示す３２）であり、細胞表面の膜タンパクＣ（図３に示す２４）と結合する抗体が抗体Ｃ（図１に示す３３）として説明する。
【００５０】
又、抗体Ａは、所定温度より高い温度で疎水性を示し、該所定温度より低い温度で親水性を示すＵＣＳＴ型温度応答性高分子部位２ａを含み、抗体Ｂ、Ｃは、所定温度より高い温度で親水性を示し、該所定温度より低い温度で疎水性を示すＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位２ｂ、２ｃを含む抗体として説明する。抗体Ａ、抗体Ｂ、抗体Ｃの相転移温度は異なる。
【００５１】
なお、本実施形態の細胞分離膜は、ＵＣＳＴ型温度応答性高分子部位を含む抗体が２種類以上、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位を含む抗体が３種類以上含んで構成されてもよい。
【００５２】
目的の細胞２０の細胞膜２１には、膜タンパクＡが恒常的に発現している（図３等参照）。目的の細胞２０の細胞膜２１には、分化の進捗に応じて膜タンパクＢ、Ｃが発現する。細胞を増殖させる条件（例えば３７℃）ではタンパクＡと抗体Ａが結合することで（図４Ｓ１、図５）、細胞は不織布（培養容器面）上に結合し、その上で増殖できる（図４Ｓ２）。
【００５３】
増殖の過程で、目的の細胞２０と異なる細胞が発生することがある（図３（ｂ）等参照）。それを除去するために、培養温度を下げることで（例えば、抗体Ｂの相転移温度が３３℃の場合、培養温度を所定温度に下げる）、抗体Ａと膜タンパクＡの結合は解消され、抗体Ｂと膜タンパクＢが結合可能となる（図４Ｓ３、図６）。
【００５４】
目的の細胞２０（標的細胞）であれば、膜タンパクＢ‐抗体Ｂの結合を介して、不織布（培養容器面）上に固定されたままである。しかし、目的の細胞（標的細胞）でない場合（膜タンパクＢが発現していない細胞）、その細胞は培養液中に浮遊する。
培養液の交換を行うことで、目的の細胞２０（標的細胞）でない細胞を取り除くことができる（図４Ｓ４）。その後、増殖培養を続けるために、培養条件を元に戻す（本例の場合、３７℃）（図４Ｓ５）。
【００５５】
更に、分化誘導が進むと、目的の細胞は膜タンパクＣを発現する（図３（ｄ）、図４Ｓ６等参照）。同様にして、培養温度を下げる（例えば、抗体Ｃの相転移温度が２５℃の場合、培養温度を所定の温度に下げる）ことで、抗体Ａと膜タンパクＡの結合は解消され、抗体Ｃと膜タンパクＣが結合可能となる（図４Ｓ７、図７）。
【００５６】
目的の細胞（標的細胞）であれば、膜タンパクＣ‐抗体Ｃの結合を介して、不織布（培養容器面）上に固定されたままである。しかし、目的の細胞２０（標的細胞）でない場合（膜タンパクＣが発現していない細胞）、その細胞は培養液中に浮遊する。
培養液の交換を行うことで、目的の細胞２０（標的細胞）でない細胞を取り除くことができる（図４Ｓ８）。
【００５７】
目的の細胞２０（標的細胞）の膜タンパク２２、２３、２４に合わせて、相転移温度の異なるより多くの種類の抗体を利用することで、１つの細胞分離膜１０で不要細胞の除去をより効率よく行なうことができる。
又、目的の細胞２０の吸着方法は、浸漬に限られず、培養液を細胞分離膜１０に流しても、かけてもよく、目的を達する限り適宜選択可能である。
【００５８】
更に詳細に本実施形態の細胞分離膜１０の作用を説明する。
図１は、本実施形態の細胞分離膜１０の作用を説明するための図であり、加熱前の状態の状態を示す図である。図５〜図７は、細胞分離膜１０の加熱後の状態を示す図である。本実施形態では、細胞分離膜１０を加熱することで、温度応答性高分子部位２（疎水性高分子部位）の構造が変化（破壊）されるようになっている。
【００５９】
図５に示すように、本実施形態においては、薄膜５には、螺旋状の温度応答性高分子部位（疎水性高分子部位）２ａと、温度応答性高分子部位２ａに結合した細胞吸着部位３ａと、温度応答性高分子部位２ａに結合した親水性部位４ａとが含まれている。各温度応答性高分子部位２ａ、２ｂ、２ｃ（図示の例では３つ）には、それぞれ、細胞吸着部位３ａ、３ｂ、３ｃが結合されている。又、支持体１の表面において、温度応答性高分子部位２ａ、２ｂ、２ｃと親水性部位４ａ、４ｂ、４ｃとが交互に配置されている。即ち、支持体１の表面は、細胞吸着部位３ａ、３ｂ、３ｃで覆われた温度応答性高分子部位２ａ、２ｂ、２ｃの部分以外は、親水性部位４ａ、４ｂ、４ｃにより覆われていることになる。
【００６０】
そして、本実施形態においては、細胞吸着部位３ａ、３ｂ、３ｃに目的の細胞（標的細胞）２０が吸着した後（図５）、細胞分離膜１０を加熱することにより温度応答性高分子部位２ａの構造が変化し、細胞吸着部位３ａに吸着した目的の細胞が脱離するようになっている（図６）。
【００６１】
なお、図示の例では、便宜上、一つの細胞吸着部位３ａに一つの目的の細胞２０を吸着させているが、二つ以上の目的の細胞部位３に一つの目的の細胞２０が吸着されるようにしてもよい。
【００６２】
図５の状態から図６の状態に変化するときの作用について説明する。
加熱前の温度応答性高分子部位２ａにおいては、螺旋構造が維持されている。又、細胞吸着部位３ａには、目的の細胞２０が吸着している（図５）。そして、この状態で細胞分離膜１０を加熱すると、熱エネルギにより温度応答性高分子部位２ａの螺旋構造が破壊されランダム構造に変化し、外表面に露出していた細胞吸着部位３ａが、親水性部位４ａの中に埋没する（図６）。
【００６３】
これにより、細胞吸着部位３ａと目的の細胞２０の吸着が、ランダム構造に変化した温度応答性高分子部位２ａの立体障害により、遮断されることになる。更に、細胞吸着部位３ａが親水性部位４ａの中に埋没すると、親水性部位４ａで覆われた支持体１上に、目的の細胞２０が載置されている状態になる。そうすると、疎水性である目的の細胞２０は、親水性部位４ａから容易に回収可能な状態になる。
【００６４】
図５の状態から図６の状態に変化する温度（相転移温度）は、温度応答性高分子部位２ａの構造により制御が可能である。
例えば、温度応答性高分子部位２ａが長い螺旋構造を有している場合、水素結合の数も多くなるため、それらを切断して構造を変化させるために必要な熱エネルギも大きくなる。そのため、構造変化をさせるための温度も高くなる傾向となる。一方、含まれる螺旋構造が短い場合には、水素結合の数も少ない。そのため、構造変化をさせるための温度は低くなる傾向となる。更に、温度応答性高分子部位２ａに親水性部位４ａが結合している場合は、親水性部位４ａの構造によっても制御が可能である。
【００６５】
これまでの説明では、所定の温度以上で螺旋構造がランダム構造に変化する構造したが、所定の温度以下ではランダム構造であるが、所定の温度以上では螺旋構造になるようにしてもよい。この場合には冷却により構造変化が生じ、目的の細胞２０が回収可能な状態になる。
【００６６】
（変形例）
本実施形態の細胞分離膜１０は、図示の内容や前記の説明の内容に限定されるものではない。例えば、図８（ａ）に示すように、全ての温度応答性高分子部位２に細胞吸着部位３が結合している必要はなく、一部の温度応答性高分子部位２にのみ細胞吸着部位３が結合する細胞分離膜１０Ａとしてもよい。このようにすることで、被処理液に含まれる目的の細胞の数が少ないときでも、効率よく目的の細胞を回収することができる。
【００６７】
温度応答性高分子部位２に結合している親水性部位４に加えて、隣接する親水性部位４間であって支持体１が露出している部位に、別の親水性部位４ｄを設けた細胞分離膜１０Ｂとしてもよい（図８（ｂ）参照）。このようにすることで、非特異的な吸着をより確実に防止することができる。
又、温度応答性高分子部位２に親水性部位４は結合していないが、温度応答性高分子部位２に隣接する位置に別の親水性部位４ｄを設けた細胞分離膜１０Ｃとしてもよい（図８（ｃ）参照）。このようにしても、非特異的な吸着をより確実に防止することができる。
【００６８】
＜＜第２実施形態＞＞
次に、細胞分離膜１０の製造方法について説明する。本方法は、ＬＣＳＴ型抗体１種類を用いた場合を説明するが、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位２を含む抗体が複数種類と、ＵＣＳＴ型温度応答性高分子部位を含む抗体を細胞分離膜１０上に固定する場合も同様にして行なうことができる。
【００６９】
本実施形態の細胞分離膜１０の製造方法は、特に制限事項はない。例えば、以下の方法により細胞分離膜１０を製造することができる。
なお、以下の説明では、細胞分離膜１０の製造方法の一例として、親水性部位４が温度応答性高分子部位２に結合した細胞分離膜１０を製造する場合を挙げて説明する。
【００７０】
まず、親水性部位４を結合させた温度応答性高分子部位２（任意の方法で調製可能である）が、例えば、スピンコート、ディップ法、気相蒸着法等により、支持体１の表面に固定される。固定の方法は、可逆反応により温度応答性高分子部位２そのものが脱離しない化学結合が好ましい。可逆反応により温度応答性高分子部位２そのものが脱離しない化学結合としては、例えば、アミド結合、エステル結合、シラノール結合、マレイミド、チオエステル結合、Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応による化学結合、クリック反応による化学結合、あるいは、用途によっては金−チオール結合、イミン結合等が挙げられる。
【００７１】
ここで、温度応答性高分子部位２の固定に際して、親水性部位４は支持体１に固定されてもよく、固定されなくてもよい。
ただし、温度応答性高分子部位２を支持体１に固定すれば、側鎖に結合した親水性部位４は、固定せずとも支持体１の表面に十分に配置することができる。その後、固定されなかった温度応答性高分子部位２は、適切な溶媒により除去される。
【００７２】
次いで、固定した温度応答性高分子部位２の末端に、化学結合により、細胞吸着部位３が結合される。このとき、細胞吸着部位３は、必ずしも温度応答性高分子部位２の末端に結合している必要は無い。従って、細胞吸着部位３が、細胞分離膜１０の外表面に露出していれば、温度応答性高分子部位２のどの部分に結合していてもよい。
このようにすることで、親水性部位４を表面に露出させた、細胞分離膜を製造することができる。
【００７３】
なお、温度応答性高分子部位２の支持体１への結合は、温度応答性高分子部位２を必要に応じて溶媒に分散させ、例えばスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の各種方法により、支持体１の表面に塗布してもよい。このような方法によっても、支持体１に温度応答性高分子部位２を配置することができる。
【００７４】
＜＜第３実施形態＞＞
次に、細胞分離膜１０の用途について、図面を参照しながら説明する。本発明の細胞分離膜１０は、どのような用途にも適用可能である。細胞分離膜１０の好適な用途として、細胞２０の培養装置１００を例に挙げて説明する。
【００７５】
本実施形態の細胞の培養装置１００（以下、適宜、単に「培養装置１００」という）は、細胞分離膜１０を備えるものである。そして、この培養装置１００により、被処理液に含まれる目的の細胞２０の分離回収が行われる。以下、培養装置１００の具体的な装置構成と、培養装置１００を用いた細胞２０の分離回収方法について説明する。
【００７６】
図９は、本発明の細胞分離膜１０を用いて構成される培養装置１００のブロック図である。培養装置１００は、細胞分離膜１０と、目的の細胞２０を含む被処理液に細胞分離膜１０を含浸（接触）させる含浸装置１０２ｂ（接触装置）と、細胞分離膜１０を加熱する加熱装置１０４（加熱冷却装置）と、細胞分離膜１０に吸着した目的の細胞を回収する細胞回収装置１０５とを備えるものである。
【００７７】
又、培養装置１００は、これらのほかにも、細胞分離膜に非特異的に吸着した細胞を洗浄する洗浄液１００ｂと、目的の細胞を培養するための培地試薬１００ｃと、培地試薬１００ａを保管する保冷庫１００ａと、洗浄液１００ｂや培地試薬１００ｃを恒温室１０２に供給する送液システム１０１とを備えている。
【００７８】
更に、培養装置１００には恒温室１０２が備えられ、恒温室１０２内の培養装置１０２ａ内の目的の細胞２０を含む培養液に、細胞分離膜１０が含浸されるようになっている。又、培養装置１０２ａ内の雰囲気は、ガス交換装置１０３により、制御されるようになっている。
【００７９】
培養装置１００を用いた、細胞２０の分離回収方法について、図１０を参照しながら説明する。
なお、以下の説明においては、細胞２０を細胞分離膜に吸着させて培養した後に回収しているが、培養せず、吸着後にすぐに回収するようにしてもよい。
【００８０】
まず、培養装置１０２ａに、目的の細胞２０を含む被処理液が供給される（供給工程Ｓ１１）。その後、含浸装置１０２ｂは、目的の細胞２０を含む被処理液に細胞分離膜１０を含浸（接触）させて、被処理液中の目的の細胞２０を細胞分離膜１０に吸着させる（接触工程Ｓ１２）。その後、細胞分離膜１０は洗浄液１００ｂにより洗浄されることで非特異的に吸着した細胞を洗い流し（洗浄工程Ｓ１３）、特異的に吸着した目的の細胞２０が培養される（培養工程Ｓ１４）。このようにすることで、目的の細胞２０を効率よく培養することができる。
【００８１】
次いで、含浸装置１０２ｂは、含浸させた細胞分離膜１０を被処理液から取り出し（取出工程Ｓ１５）、その後、加熱装置１０４により、細胞分離膜１０が加熱される（加熱冷却工程Ｓ１６）。これにより、細胞分離膜１０の温度応答性高分子部位２の構造が変化し、特異的に吸着した目的の細胞２０（培養された目的の細胞２０）が容易に剥離可能となる。そして、細胞回収装置１０５は、この状態の細胞分離膜１０の表面に対して細胞回収液１０５ａを供給する（剥離回収工程Ｓ１７）。これにより、細胞分離膜１０の表面から、培養された目的の細胞２０が剥離される。剥離された目的の細胞は、細胞回収装置１０５により回収される。
【００８２】
以上の方法によれば、従来、通常の培地や従来の培養シートを使用するときに生じてきた剥離による細胞２０への損傷や、回収時に化学薬品の使用を抑えることが可能となる。これにより、目的の細胞２０の回収率の低下を抑制することができる。
【００８３】
相転移温度の異なる温度応答性高分子部位２を含む抗体３１〜３３が複数ある場合は、培養温度を変えて上記の工程を繰り返し行なえばよい。
細胞分離膜１０は、平面シート状で使用してもよく、管状（筒状）にして使用してもよい。
【００８４】
なお、前記の例では、加熱により目的の細胞２０が剥離するようにしたが、温度応答性高分子部位２等の構造を変化させることで、冷却により目的の細胞２０が脱離するようにしてもよい。この場合、加熱装置１０４に代えて、細胞分離膜１０を冷却する冷却装置を適用すればよい。
【実施例】
【００８５】
以下、製造例１〜３を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
【００８６】
＜製造例１＞
（ＰＥＧ修飾ポリリジンの調製） 
まず、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及びカルボン酸末端のポリエチレングリコール（前記式（１）においてｘ＝３）を純水に溶解させ、この溶液を４℃に冷却、撹拌しながら、ポリリジン（種々の分子量が混在）を加えた。そして、常温で２時間撹拌し、ポリリジン（疎水性高分子高分子部位２）の側鎖にポリエチレングリコール（親水性部位４）が結合したＰＥＧ修飾ポリリジンを得た。
【００８７】
次いで、透析膜ゲルろ過クロマトグラフィー法を用いてさらに２４時間撹拌し、未反応低分子物を除去した。透析膜の種類により、かつ、５ｋＤａ以上の数平均分子量を有するＰＥＧ修飾ポリリジン（ＰＥＧ１）、１２０ｋＤａ以上の数平均分子量を有するＰＥＧ修飾ポリリジン（ＰＥＧ２）、２５５０ｋＤａ以上の数平均分子量を有するＰＥＧ修飾ポリリジン（ＰＥＧ３）の３種類を分離した。以下、特に指定しない限り、「ポリリジン」との記載は、調製した「ＰＥＧ修飾ポリリジン」を表すものとする。
【００８８】
（支持体１に対するポリリジンの固定化）
合成したポリリジン（ＰＥＧ１〜３）を、それぞれ、表面にアミノ基処理を施した樹脂プレート（ポリスチレン製の支持体）上に以下の手順に従って共有結合させた。１ｍｏｌ％のポリリジン水溶液に、１−エチル−３−カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を加え、各プレートを浸漬した。
その後、室温で２時間反応させた。これにより、ポリリジンを結合させた支持体１を得た。
その後、純水で各プレートを３回洗浄した。
【００８９】
（ポリリジンに対するプロテインＡの結合） 
合成したポリリジン（ＰＥＧ１〜３）を結合させた３種のプレートを、炭酸緩衝液で希釈した２％グルタルアルデヒドに浸漬し、３７℃で２時間静置した。反応後の各プレートをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。そして、濃度０．１ｗｔ％のプロテインＡ水溶液(ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を使用)を調製し、このプロテインＡ溶液に各プレートを浸漬して、プロテインＡをポリリジンに結合させた。
【００９０】
（抗体ＣＤ４０の結合）
続いて、以下の手順に従い、各プレートに固定されたプロテインＡ（抗原）に対し、抗体ＣＤ４０を結合させた。抗体ＣＤ４０はチャイニーズハムスター卵巣細胞に特異的に結合可能な抗体である。まず、各プレートを洗浄バッファ（２００μｌ）で３回洗浄した後、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を５０μｌずつ加え、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。これにより、プロテインＡにＩｇＧが結合した。
【００９１】
その後、４℃に保ちながら洗浄バッファ（２００μｌ）を用いて、各プレートを３回洗浄した。
その後、抗体ＣＤ４０の溶液に各プレートを浸漬し、抗体ＣＤ４０をＩｇＧに結合させた。
以上の操作により、合成したポリリジン（ＰＥＧ１〜３）を含む細胞分離膜１０（試験体１〜３）を作製した。
【００９２】
（細胞吸着の選択率の評価）
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を１対１で含む緩衝水溶液を、細胞分離膜１０（試験体１〜３）にそれぞれ４℃で滴下し、インキュベートした。細胞分離膜１０の抗体ＣＤ４０には、ＭＳＣは吸着せず、ＣＨＯ細胞が特異的に吸着する。
【００９３】
その後、緩衝水溶液で各プレートを３回洗浄することで、非特異的に吸着したＭＳＣを洗い流した。洗い流されたＭＳＣは回収し、フローサイトメータにより、細胞数を確認した。
なお、フローサイトメータにおけるＣＨＯ細胞とＭＳＣ細胞との区別は、ＭＳＣ細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１０５抗体で蛍光標識することで行った。
【００９４】
次に、緩衝水溶液中で各プレートを３７℃に加熱し、ポリリジンの構造を変化させることにより、特異的に吸着していたＣＨＯ細胞を脱離させた。脱離したＣＨＯ細胞は緩衝水溶液を用いて回収した。そして、回収されたＣＨＯ細胞の細胞数をフローサイトメータで確認した。
【００９５】
回収されたＭＳＣの細胞数及びＣＨＯ細胞の細胞数に基づき、以下の式（２）を用いて、細胞の選択率を算出した。
（細胞の選択率）＝（細胞分離膜１０で回収した細胞の数）／（回収前の細胞の数）×１００[％]  ・・・式（２）
【００９６】
ＣＨＯ細胞及びＭＳＣを１対１で含む緩衝水溶液を用いたこと以外は試験体１〜３と同様にして細胞分離膜１０（試験体１〜３）を作製し（試験体４）、選択率を評価した。
なお、細胞分離膜１０の抗体ＣＤ４０には、ＭＳＣは吸着せず、Ｂ細胞が特異的に吸着する。
【００９７】
血中循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及びＭＳＣを１対１で含む緩衝水溶液を用いたこと以外は試験体１〜３と同様にして細胞分離膜１０を作製し（試験体５）、選択率を評価した。
なお、細胞分離膜１０の抗体ＣＤ４０には、ＭＳＣは吸着せず、ＣＴＣが特異的に吸着する。
【００９８】
＜比較例１＞ 
「カルボン酸末端のポリエチレングリコール」を用いなかったこと（即ち、親水性部位４を含まないこと）、及び、ポリリジン（親水性部位４を含まないポリリジン）の数平均分子量を７ｋＤａとしたこと以外は試験体１〜３と同様にして、細胞分離膜を作製した（試験体２１）。そして、この細胞分離膜について、試験体１〜３と同様にして選択率の評価を行った。
【００９９】
＜評価結果１＞ 
試験体１〜５及び試験体２１の選択率を以下の表１に示す。
【０１００】
【表１】
2016163550.tif 000004
【０１０１】
表１に示すように、親水性部位４を含む細胞分離膜１０（試験体１〜５）においては、数平均分子量（大きさ）や目的の細胞２０の種類によらず、いずれも良好な選択率を示した。従って、親水性部位４が細胞分離膜１０に含まれることにより、細胞の非特異的な吸着が抑制され、目的の細胞２０を効率よく分離回収することが
できることがわかった。
【０１０２】
一方で、親水性部位４を含まない試験体２１においては、数平均分子量や目的の細胞２０の種類は試験体１〜５とほぼ同じであるにも関わらず、選択率は実施例１の約半分であった。従って、親水性部位４を含まない細胞分離膜を用いると、非特異的な吸着が増加し、選択率が著しく低下することがわかった。
【０１０３】
又、実施例１の細胞分離膜１０に対して細胞を吸着させた後の表面と、細胞を分離回収（脱離）させた後の表面とについての、顕微鏡写真を図１１に示す。
【０１０４】
図１１は、（ａ）は細胞分離膜１０に細胞２０を吸着させたときの顕微鏡写真であり、（ｂ）は吸着した細胞を回収した後の細胞分離膜１０を撮影した顕微鏡写真であり、（ｃ）は（ａ）の写真を模式的に示した図、（ｄ）は（ｂ）の写真を模式的に示した図である。
【０１０５】
図１１（ａ）に示すように、細胞分離膜１０の表面には細胞２０が吸着しているが、細胞分離膜１０の加熱により、図８（ｂ）に示すように、細胞分離膜１０表面から細胞２０が完全に脱離していることがわかった。
【０１０６】
＜製造例２＞
細胞分離膜１０を構成する抗体の種類を変えて、細胞選択率の違いを確認した。具体的には、抗体を使用しない場合、抗体を１種類使用する場合、抗体を２種類使用する場合における細胞２０の選択率の違いを確認した。
【０１０７】
製造例２は、次の３種類を準備した。
・通常の接着細胞用６ウェルプレート（比較例：試験体２５）
・ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗ＣＤ２９抗体（相転移温度３０℃）と、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗骨シアロタンパク質抗体（相転移温度２５℃）とを６ウェル上に物理吸着させたプレート（実施例：試験体１１）
・ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗ＣＤ２９抗体（相転移温度３０℃）と、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗骨シアロタンパク質抗体（相転移温度２５℃）と、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗アルカリホスファターゼ抗体（相転移温度１５℃）とを６ウェル上に物理吸着させたプレート（実施例：試験体１２）
【０１０８】
（細胞の調製）
間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をウシ血清入のＭＳＣＧＭ培地を用いてコンフレント（培養床に隙間なく細胞が埋まった状態）になるまで培養した。９０％コンフレントに達した細胞をリン酸緩衝生理食塩水液（ＰＢＳ；phosphate buffered saline）で３回洗浄し、０．０２％トリプシンを加えインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２、＞９０％湿度）で約５分間静置した。顕微鏡下で細胞２０の剥離を確認した後、トリプシンインヒビターを加え、６００×ｇで５分間遠心し、細胞２０を沈降させた。アスピレーターによりトリプシン、トリプシンインヒビターを含む上澄み液を取り除き、目的の細胞密度になるように培地を加え、上記３種の６ウェルプレートに播種し、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２、＞９０％湿度）で培養した。
【０１０９】
（骨芽細胞への分化誘導）
無血清培地で培養した細胞を骨芽細胞誘導培地（骨芽細胞への分化誘導因子デキサメサゾン、アスコルビン酸、Glycerophosphate含有）中で２週間培養し、骨芽細胞に分化した割合を評価した。骨芽細胞誘導培地は３〜４日おきに交換した。骨芽細胞の確認にはアルカリフォスファターゼ染色を利用した。
【０１１０】
試験体２５に関しては、培養期間中３７℃一定で培養した。
試験体１１に関しては、培養１週間目で、温度を２０℃で３時間静置し、培地交換の後、温度を３７℃に戻し、その後一定の温度で培養した。
試験体１２に関しては、培養１週間目で、温度を２０℃で３時間静置し、培地交換の後、温度を３７℃に戻し、その後一定の温度で培養し、培養１０日目で、温度を１０℃で３時間静置し、培地交換の後、温度を３７℃に戻し、その後一定の温度で培養した。
【０１１１】
＜評価結果２＞ 
結果を図１２に示す。骨細胞は染色により黒く染まる。
試験体２５に関しては、染色されている細胞がまばらで、骨細胞でない細胞が多く存在することがわかる。試験体１１に関しては、プレート１より多くの割合で骨細胞に分化していることがわかる。試験体１２に至っては、すべての細胞が骨細胞であることがわかる。
このように、分化誘導過程で細胞を選別することにより、純度の高い細胞を得ることができる。
【０１１２】
＜製造例３＞
製造例２と同様に、間葉系幹細胞の脂肪細胞分化での選択について検討を行った。
【０１１３】
製造例３は、次の３種類を準備した。
・通常の接着細胞用６ウェルプレート（比較例：試験体２５）
・ＵＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗ＣＤ２９抗体（相転移温度３０℃）と、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗ＣＤ１０５抗体（相転移温度１５℃）とを６ウェル上に物理吸着させたプレート（実施例：試験体１３）
・ＵＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗ＣＤ２９抗体（相転移温度３０℃）と、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗ＣＤ１０５抗体（相転移温度１５℃）と、ＬＣＳＴ型温度応答性高分子部位に結合した抗アディポネクチン（相転移温度２５℃）とを６ウェル上に物理吸着させたプレート（実施例：試験体１４）
【０１１４】
（細胞の調製）
間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）をウシ血清入のＭＳＣＧＭ培地を用いてコンフレント（培養床に隙間なく細胞が埋まった状態）になるまで培養した。９０％コンフレントに達した細胞をリン酸緩衝生理食塩水液（ＰＢＳ；phosphate buffered saline）で３回洗浄し、０．０２％トリプシンを加えインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２、＞９０％湿度）で約５分間静置した。顕微鏡下で細胞の剥離を確認した後、トリプシンインヒビターを加え、６００×gで５分間遠心し、細胞を沈降させた。アスピレーターによりトリプシン、トリプシンインヒビターを含む上澄み液を取り除き、目的の細胞密度のなるように培地を加え、上記３種の６ウェルプレートに播種し、インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２、＞９０％湿度）で培養した。
【０１１５】
（脂肪細胞への分化誘導）
９６穴プレート上で各条件の培地でｈＭＳＣを２週間培養した。その後、培養していた培地を脂肪細胞分化誘導培地（脂肪細胞への分化誘導因子ＩＢＭＸ（3-isobuthyl-1-methyl xanthine）、デキサメサゾン、インシュリン及びインドメタシン含有）に換えた。３日間培養した後、脂肪細胞分化維持培地に換え、３日間培養した。その後、再び脂肪細胞分化誘導培地に交換した。このように３日おきに脂肪細胞分化誘導培地と脂肪細胞分化維持培地を交換しながら、２週間分化誘導を行った。脂肪細胞の分化の確認にはオイルレッドＯ染色を利用した。
【０１１６】
試験体２５に関しては、培養期間中３７℃一定で培養した。
試験体１３に関しては、培養１週間目で、温度を２０℃で３時間静置し、培地交換の後、温度を３７℃に戻し、その後一定の温度で培養した。
試験体１４に関しては、培養１週間目で、温度を２０℃で３時間静置し、培地交換の後、温度を３７℃に戻し、その後一定の温度で培養し、培養１０日目で、温度を１０℃で３時間静置し、培地交換の後、温度を３７℃に戻し、その後一定の温度で培養した。
【０１１７】
＜評価結果３＞
結果を図１３に示す。脂肪細胞は染色により赤く染まる。試験体２５に関しては、染色されている細胞がまばらで、脂肪細胞でない細胞が多く存在することがわかる。試験体１３に関しては、試験体２５より多くの割合で脂肪細胞に分化していることがわかる。試験体１４に至っては、ほぼすべての細胞が脂肪細胞であることがわかる。このように、分化誘導過程で細胞を選別することにより、純度の高い細胞を得ることを確認した。
【０１１８】
以上、本発明に係る細胞分離膜、これを備える細胞分離装置について最良の実施の形態、及び、実施例を示して詳細に説明した。本発明の内容は、前記実施形態、及び、実施例に限定されず、その趣旨を逸脱しない範囲内において適宜改変・変更等することができることはいうまでもない。
【符号の説明】
【０１１９】
１  支持体
２、２ａ、２ｂ、２ｃ  温度応答性高分子部位（疎水性高分子部位）
３、３ａ、３ｂ、３ｃ  細胞吸着部位
４、４ａ、４ｂ、４ｃ  親水性部位
５  薄膜
１０  細胞分離膜
２０  細胞（標的細胞）
２１  細胞膜
２２  膜タンパクＡ
２３  膜タンパクＢ
２４  膜タンパクＣ
２５  膜タンパクＸ
２６  膜タンパクＹ
３１  抗体Ａ
３２  抗体Ｂ
３３  抗体Ｃ
１００  培養装置
１０２ｂ  含浸装置
１０４  加熱装置
１０５  細胞回収装置
１０５ａ  細胞回収液
【図１】
2016163550.tif 000005
【図２】
2016163550.tif 000006
【図３】
2016163550.tif 000007
【図４】
2016163550.tif 000008
【図５】
2016163550.tif 000009
【図６】
2016163550.tif 000010
【図７】
2016163550.tif 000011
【図８】
2016163550.tif 000012
【図９】
2016163550.tif 000013
【図１０】
2016163550.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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