(57)【要約】      （修正有）【課題】定量的にも標準化ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスの提供。【解決手段】ゲノム全体にわたってランダムに分布するトランスポゾンのメチル化レベルがゲノム全体のメチル化レベルを反映する結果を利用するプロセス。具体的には、ａ）ＤＮＡにおけるトランスポゾン又はその断片の存在の定量的測定；ｂ）前記トランスポゾン又はその断片内における、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１個のメチル化が異なるＣの存在の定量的測定；及びｃ）工程ａ）及びｂ）で測定された値による、標準化ＤＮＡメチル化レベルの決定；の工程を含むプロセス。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標準化ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスであって、
ａ）トランスポゾンまたはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩未処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマーが前記トランスポゾンのメチル化の異なる部位を含まない増幅、または、亜硫酸水素塩処理トランスポゾンもしくはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマーが前記トランスポゾンのメチル化の異なる部位を含まない増幅、を含むＤＮＡにおけるトランスポゾンまたはその断片の存在の定量的測定；
ｂ）前記トランスポゾンまたはその断片に特異的な、少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマー対は前記トランスポゾンの少なくとも１つのメチル化が異なる部位を含むプライマーを少なくとも１つ含む増幅、を含む前記トランスポゾンまたはその断片内における、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１個のメチル化が異なるＣの存在の定量的測定；および
ｃ）工程ａ）およびｂ）において形成された増幅産物の比率によって、標準化ＤＮＡメチル化レベルを決定すること、を含む標準化ＤＮＡメチル化レベルの決定；
の工程を含むプロセス。
【請求項２】
前記トランスポゾンまたはその断片が、ＬＩＮＥエレメント、ＬＩＮＥ−１エレメント、Ａｌｕエレメント、ＨＥＲＶエレメント、からなる群より選択される、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
前記トランスポゾンまたはその断片が、ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域である、請求項１記載のプロセス。
【請求項４】
工程ｂ）の前記プライマー対の両プライマーが前記トランスポゾンの少なくとも１つのメチル化が異なる部位を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
工程ｂ）の前記プライマーが前記トランスポゾンの２、３または４個のメチル化が異なる部位を含む、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
前記プライマーが前記トランスポゾンのメチル化が異なる部位を、その３’末端に含む、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
工程ｂ）の前記少なくとも１個のプライマーが配列番号３〜１０４８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
工程ａ）およびｂ）の前記増幅がリアルタイムＰＣＲによって行われる、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
相対ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスであって：
d）請求項１〜請求項８のいずれか１項の工程ａ）〜ｃ）による、第１のＤＮＡおよび第２のＤＮＡに対するメチル化レベルの測定；および
ｅ）前記第１および第２のＤＮＡに対して測定されたメチル化レベルの比による、相対ＤＮＡメチル化レベルの決定；
の工程を含むプロセス。
【請求項１０】
ＤＮＡメチル化の変化と関連した疾患の診断のための、請求項９記載のプロセスであって、前記第１のゲノムＤＮＡが標準試料であり、前記第２のゲノムＤＮＡが試験対象の試料に由来するものである、プロセス。
【請求項１１】
前記疾患が腫瘍である、請求項１０記載のプロセス。
【請求項１２】
工程ｂ）における、前記少なくとも１つのプライマーが、配列番号３〜配列番号１４１５からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項９〜請求項１１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１３】
工程ｂ）における、前記少なくとも１つのプライマーが、配列番号３〜配列番号４３６および／または配列番号１０４９〜配列番号１２２７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＤＮＡメチル化レベルの決定
本発明はエピジェネティクス、特にＤＮＡメチル化の分野に属する。本発明は、特に臨床診断に関わるエピジェネティックな変化の検出のための増幅プロセスを提供する。さらに、本増幅プロセスのための特異的なプライマーが提供される。
【背景技術】
【０００２】
エピジェネティックな機構は遺伝子のコード配列の変化を伴わずに遺伝子発現の変化を引き起こすが、例えば有糸分裂的に、遺伝しうる。ＤＮＡメチル化パターンは親細胞から娘細胞に複製と連動する形式で伝達される。こうして、エピジェネティックな情報が確実に遺伝する。高等真核生物において、ＤＮＡメチル化は、ＲＮＡと関連したサイレンシングやヒストン修飾とともに、最も研究されているエピジェネティックな機構である（Ｓｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｌｌ  Ａｎｔｈｒｏｐｏｌ．  ２００６；  ３０（３）：６６５−７１）。
【０００３】
完全に分化した正常な細胞において、ヒトゲノムは、特異的で実質的に不変なＤＮＡメチル化パターンを有しており、これが遺伝子発現の協同的な決定において決定的な役割を担う。転写の調節機能を有するゲノム領域は多くの場合メチル化されていないが、転写的に不活発なゲノムセグメントはメチル化されている。
【０００４】
ＤＮＡメチル化は、核酸のシトシン残基、好ましくはシトシン−グアニン配列を有するジヌクレオチド（ＣｐＧ）において生ずる。メチル化の中で真核生物において最も重要な塩基修飾はシトシンの５’位におけるメチル化である。
【０００５】
他と比べ増殖速度が大きく、遺伝子発現が変化しており、また染色体が異常であることで特徴付けられる腫瘍細胞においては、ゲノムのメチル化様式が異常である（Ｓｃｈｕｌｚ，  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．  １９９８；  １５１−６７）。この技術的な分野における多くの関連するレビューにおいては、これらのエピジェネティックな変化が診断および予後診断と関連した計り知れないほどの可能性を有しており、その活用が癌の早期発見、癌の予後診断、および経過観察のための近代的な方法をもたらしうるということについて明確に一致した意見が唱えられている。
【０００６】
しかし、染色体異常が腫瘍組織に発生するため、すなわちこの組織は正常組織と比較して異なるゲノムセッティングを有しているため、基本的な問題として、このような異常なＤＮＡメチル化を、定性的にのみでなく、定量的にも、標準化された方法を用いて決定する必要がある。このような決定によってのみ、一方が染色体異常を有している可能性のある２者の試料間の直接的な比較が可能となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によると、請求項１記載のプロセスにより、また従属請求項の有利な実施形態およびさらなる実施形態により、この目的が達成される。これらの問題を解決するため、本発明は、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化の決定のための方法、および少なくとも２個の試料間で相対ＤＮＡメチル化レベルを決定するための方法を提供する。
【０００８】
第１の態様において、前記標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルを決定するプロセスが開示され、該プロセスは：
ａ）ＤＮＡにおけるトランスポゾンまたはその断片の存在の定量的測定；
ｂ）前記トランスポゾンまたはその断片内における、少なくとも１個の、ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が異なるＣ（ｅｉｎｅｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｅｌｌ  ｍｅｔｈｙｌｉｅｒｔｅｎ  Ｃ  ｅｉｎｅｓ  ＣｐＧ  Ｄｉｎｕｋｌｅｏｔｉｄｓ）の存在の定量的測定；および
ｃ）工程ａ）およびｂ）で測定された値に基づく標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルの決定；
という工程を含む。
【０００９】
本発明は、ゲノム全体にわたってランダムに分布するトランスポゾンのメチル化レベルがゲノム全体のメチル化レベルを反映すると考えることが出来るという、驚くべき結果を利用するものである。本発明の原理は、第１の工程における、例えば試料由来の、ＤＮＡ内のトランスポゾン（またはその断片）の存在の定量的測定；およびさらなる工程における、同一のＤＮＡ内の同一のトランスポゾン（またはその断片）内の少なくとも１個の、メチル化が異なるＣｐＧジヌクレオチドのシトシンの存在の定量的測定；にある。そして、ゲノム全体を反映する標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルを、測定された値同士の比率によって決定することが出来る。
【００１０】
ＤＮＡのメチル化は、真核生物における遺伝子調節において、極めて重要な複製後のエピジェネティックな機構である。真核生物において、シトシンピリミジン塩基の５番目の炭素原子にメチル基が付加され、５−メチルシトシン（５ｍＣ）が形成されることには、重要な役割がある。このメチル基付加は、生体内において、メチル基のＳ−アデノシルメチオニン（メチル基供与体）からシトシン（メチル基受容体）へのＤＮＡメチラーゼ（ＤＮＭＴｓ）による転移によって触媒され、好ましくはグアニンの５’側に位置するシトシン（ＣｐＧ）で起こる。
【００１１】
脊椎動物のゲノムにおいて、５ｍＣはＣｐＧジヌクレオチドにおいてのみ生じ（Ｂｅｓｔｏｒ．  Ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｓ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００；  ２３９５−２４０２）、ヒトゲノムにおいて、多くの場合、パリンドローム型のＣｐＧジヌクレオチドの両シトシンはメチル化されている。
【００１２】
進化学的なメカニズム、およびメチルシトシンが自然に脱アミノ化されやすい傾向を有することにより、ＣｐＧジヌクレオチドは少なくとも哺乳類ゲノムにおいては極めて過小であって、０．８％という頻度となっており（ヒトの平均ＧＣ含量は約４０％であり、ここからＣｐＧジヌクレオチドの計算上の頻度は４％となるであろう）、通常、遺伝子の５’−または３’−ＮＴＲにしばしば局在する「ＣｐＧアイランド」においてのみ、より多く生ずる（Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇａｒｄｅｎ  ＆  Ｆｒｏｍｍｅｒ．  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄｓ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｇｅｎｏｍｅｓ．  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９８７；  ２６１−２８２）。非コード領域への限定が存在する理由は、おそらく５ｍＣのチミンへの脱アミノ化による点突然変異のリスクが増加することにある（Ｌａｉｒｄ  ＆  Ｊａｅｎｉｓｃｈ．  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １９９６；  ４４１−４６４）。
【００１３】
ＣｐＧアイランドは、５００ｂｐ〜４ｋｂのサイズと、＞５５％という高いＧＣ含量を有する。ＣｐＧアイランドにおけるジヌクレオチド５’−ＣｐＧ−３’の頻度は１０〜２０倍増加している。ヒトの全遺伝子（約２５，０００個）のうち３／４超はその開始領域にＣｐＧアイランドを有する。
【００１４】
一般に、高い転写活性を有する遺伝子は非メチル化ゲノム領域内に位置している。一方、メチル化領域においては、転写活性がほとんど、あるいは全く無い遺伝子が存在する。ＤＮＡメチル化とクロマチン凝縮との間には相関があり、これは密に凝縮したヘテロクロマチンにある遺伝子が一般に不活発なためである。クロマチンのこのような密な凝縮はヒストンＨ３およびＨ４の脱アセチル化およびメチル化により誘導され、これがヌクレオソームのＤＮＡへのより強い結合をもたらし、そのため転写機構がＤＮＡにアクセスすることがより難しくなる（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ．  Ｒｅ−ＳＥＴ−ｔｉｎｇ  ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１；  ２６６−２７３）。ＣｐＧ−メチル化ＤＮＡに結合するタンパク質ＭｅＣＰ２はヒストン脱アセチル化酵素をリクルートしてクロマチンの凝縮を開始する（Ｒａｚｉｎ  ＆  Ｒａｚｉｎ．  ＣｐＧ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，  ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ａ  ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９８；  ４９０５−４９０８）。しかし、ヒストンメチル化酵素もＤＮＡメチル基転移酵素をヘテロクロマチン領域に導くことができ、それによりそこでＤＮＡメチル化が誘発される（Ｔａｍａｒｕ  ＆  Ｓｅｌｋｅｒ．  Ａ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１；  ２７７−２８３）。さらに、ヒストンアセチル化はおそらく対象となる遺伝子セグメントの活発な脱メチル化を引き起こす（Ｃｅｒｖｏｎｉ  ＆  Ｓｚｙｆ．  Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ．  Ｌ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２００１；  ４０７７８−４０７８７）。
【００１５】
先に述べたとおり、誤ったＤＮＡメチル化は多くの場合娘細胞に安定に遺伝し、そのため生物体レベルで疾患を引き起こすことが多い。特に、例えば腫瘍細胞は、正常組織とは大きく異なるメチル化パターンを示す場合が多い。従って、メチル化レベルの分析を、例えば診断用途に用いることが考えられる。さらに、メチル化状態を直接に修飾／修正することも遺伝子調節の目的のために考えられる（Ｗｅｉｔｅｒｈｉｎ  ｗｉｒｄ  ａｕｃｈ  ｅｉｎｅ  ｇｅｒｉｃｈｔｅｔｅ  Aｎｄｅｒｕｎｇ／Ｋｏｒｒｅｋｔｕｒ  ｄｅｓ  Ｍｅｔｈｙｌｉｅｒｕｎｇｓｚｕｓｔａｎｄｓ  ｚｕｍ  Ｚｗｅｃｋｅ  ｄｅｒ  Ｇｅｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｅｒｗｏｇｅｎ）。
【００１６】
核酸のメチル化状態、特に特定のＣｐＧ部位のメチル化状態の分析のため、Ｆｒｏｍｍｅｒほか（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９９２；  ８９（５）：１８２７−３１）によって最初に記載された、亜硫酸水素塩処理と、例えばその後の増幅／シーケンシングによる方法が確立されている。亜硫酸水素塩処理により核酸の非メチル化シトシン塩基がウラシル塩基に変換され、一方でメチル化シトシン塩基は変化しないままとなる。核酸のメチル化状態の分析のための各種技術、特に亜硫酸水素塩処理の概論は、Ｆｒａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．  ２００２；  ３３（３）：６３２，  ６３４，  ６３６−４９、およびＬａｉｒｄ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００３；３（４）：２５３−６６に記載されている。従って、出発材料の核酸のメチル化状態に依存して亜硫酸水素塩処理の反応から異なる配列を有する核酸配列が生じ、それを中でもＰＣＲまたはシーケンシングによって分析した後、出発材料の核酸のメチル化状態を決定することができる。
【００１７】
組織または生検試料等の試料のメチル化レベルの分析は、該試料が他の試料と比較され、両試料が異なるゲノム上の背景を有している場合には、従来の方法では常に容易にその限界に達する。すなわち、上述のように、腫瘍細胞は多くの場合アンバランスな染色体異常を有している。これらには、染色体全体、個々の染色体腕、およびより短いＤＮＡ配列セグメントの、獲得や喪失が含まれる。いくつかの研究は、腫瘍細胞のこれらのゲノムの不安定性がＤＮＡのメチル化度が低いことによって引き起こされるという証拠を提供している。ＤＮＡの低メチル化の度合いは、ゲノムの不安定性および腫瘍の悪性度に対して比例的であることが見いだされている。
【００１８】
本発明は、ゲノム全体にわたってランダムに分布するトランスポゾンのメチル化レベルがゲノム全体のメチル化レベルを反映すると考えることが出来るという、驚くべき結果を利用するものである。従って、ゲノムのメチル化レベルの標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅ）された測定は、ゲノムにおけるトランスポゾン「それ自体」の定量的な存在を、該トランスポゾン内の少なくとも１つのメチル化差異の定量的な存在とともに測定すれば可能である。
【００１９】
本明細書で用いられる「トランスポゾン」という語は、ゲノム中のある長さのＤＮＡセグメントのことを指す。トランスポゾンは１または複数個の遺伝子を含み、ゲノム内におけるその位置を変化させることが可能である（トランスポジション）。トランスポゾンは、その移動性中間体がＲＮＡによって構成される因子（レトロエレメント；クラスＩトランスポゾン）でもよいし、またはその移動性中間体がＤＮＡである因子（ＤＮＡトランスポゾン；クラスＩＩトランスポゾン）でもよい。
【００２０】
本明細書で用いられる「トランスポゾン」という語は、このようなトランスポゾンの断片も常に包含する。トランスポゾンのこのような断片は進化過程においてゲノム中に生ずる。なぜなら、「ジャンプした」トランスポゾンは何ら選択圧を受けず、従って、もとの配列がゲノム中で突然変異により変化しうるからである。そのため、完全なトランスポゾンよりも、その部分領域のみがゲノム中に見いだされることが多く、これらは、多くの場合５’領域に局在する他のトランスポゾンの挿入や欠失により生成する。「トランスポゾンの断片」は、好ましくは核酸の連続する領域であって、≧４０ｂｐ、≧８０ｂｐ、≧１００ｂｐ、好ましくは≧１５０ｂｐ、より好ましくは≧２００ｂｐの長さを有し、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、好ましくは９８．５％、９９％、９９．５％、およびさらに好ましくは９９．７％、９９．９％、またはそれよりも高い相同性を、前記トランスポゾンの対応する核酸領域に対して有する領域を意味することを意図している。このような相同性は、例えば、ＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定することができる。「トランスポゾン」および「転位因子」という語は互換的である。
【００２１】
自律的ＤＮＡトランスポゾンはトランスポゼース酵素をコードするＤＮＡ配列からなる。トランスポゼースはトランスポゾンをゲノムから「切り出し」することができ、ゲノム中の新規サイトへ運び、そこでゲノム中へと挿入する。この過程は「保存的トランスポジション（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」と呼ばれる。ＤＮＡトランスポゾンの例としては：Ａｃ（ａｃｔｉｖａｔｏｒ；活性化因子）転位因子（自律的トランスポゾン）およびＤｓ（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ；解離因子）転位因子（自身のトランスポゼースを持たない非自律的トランスポゾン）が挙げられる。
【００２２】
レトロトランスポゾンは真核生物の転位因子の大部分であり、より複雑な構造を有する。これらは宿主細胞にゲノム内部の「正常な」ＤＮＡ配列として認識され、そのため宿主細胞の転写機構によって読み込まれ、ＲＮＡに転写される。しかし、レトロトランスポゾンは逆転写酵素をコードしており、それがこのＲＮＡをＤＮＡへと変換することを可能にしている。トランスポゼースは、生成したＤＮＡの、宿主細胞のゲノム内への挿入も行う。このプロセスは「複製的トランスポジション（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）」とも呼ばれる。従って、レトロトランスポゾンが機能的である限り、ゲノム中にいくつかのコピーが生産される。
【００２３】
生物のゲノム中のアクティブなトランスポゾンの数は、種によって大きく異なる。例えばヒトゲノムにおいては、ごくわずかな割合のトランスポゾンしかアクティブではない。わずか約５０個のＬＩＮＥトランスポゾン（下記参照）がアクティブであり、ＤＮＡトランスポゾンは事実上アクティブではないと考えられ、そのためトランスポゾンの数はヒトの生涯でほぼ一定であると考えることができる。
【００２４】
レトロトランスポゾンには主に２つのタイプがある：ウイルス型および非ウイルス型レトロトランスポゾンである。
【００２５】
ウイルス型レトロトランスポゾンは概してレトロウイルスと極めて似た性質を有する。ウイルス型レトロトランスポゾンの例としては：Ｔｙ転位因子およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｃｏｐｉａ転位因子が挙げられる。
【００２６】
非ウイルス型レトロトランスポゾンは哺乳類の全トランスポゾンの大部分である。例としては、特に：ＬＩＮＥ（ｌｏｎｇ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）  ｅｌｅｍｅｎｔ）、ＳＩＮＥ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ）  ｅｌｅｍｅｎｔ）、およびＡｌｕ因子などが挙げられる。
【００２７】
ヒトゲノムでは、約８５０，０００個のＬＩＮＥおよび１，５００，０００個のＳＩＮＥが存在する。ＳＩＮＥにはＡｌｕ因子が含まれ、これはヒトゲノム内に最も高頻度に存在する転位因子のグループであって、ゲノムの約５％を占める。
【００２８】
ウイルス型レトロトランスポゾンには、ＨＥＲＶ（ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）も含まれる。これらは特徴的なアミノ酸部位に基づいてサブファミリーに分類される（例：ＨＥＲＶ−ＫおよびＨＥＲＶ−Ｗ）。これらはヒトゲノムの８％を占めると見積もられている。これらは、ヒトの進化過程において繰り返し起こった、生殖細胞系列のレトロウイルス感染に由来する。しかし、これらの遺伝因子のほとんどは突然変異や欠失により転写的に不活性になった。少数のもののみがウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含む全長の構成を有している。この場合、これらには調節配列モジュールを含むＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）配列が隣接している。潜在的にアクティブなＨＥＲＶは、正常細胞の遺伝子発現の完全性に干渉しないように、ＤＮＡメチル化によってサイレンシングされている。これに対して、ＨＥＲＶの転写やタンパク質生合成の増進が、各種腫瘍実体において見いだされる。
【００２９】
ここで、「メチル化レベル」という語はＤＮＡの脱メチル化またはメチル化を意味することを意図している。対象となるＤＮＡは、少なくともその１カ所の部位でメチル化、または非もしくは脱メチル化している可能性がある。この状態は２値状態であり、そのため特定部位の脱メチル化およびメチル化は直接お互いに関連しており、メチル化レベルはこの少なくとも１カ所の部位の脱メチル化および／またはメチル化によって決定することができる。従って、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベル、および相対メチル化レベルは、該ＤＮＡのメチル化および／または脱メチル化に基づいて決定することができる。
【００３０】
ここで、「プライマー」および「オリゴヌクレオチド」という語は互換的に用いられる。プライマーが特定の配列に対して特異的であると考えられるのは、その対象となる相補的配列に対して≧７５％、≧８０％、≧８５％、≧９０％、好ましくは≧９５％、≧９７％、より好ましくは≧９９％、または≧９９．５％の配列同一性を有する場合である。特に好ましい実施形態においては、プライマーは対象となる配列またはその相補的配列に対して１００％の配列同一性を有する。他の好ましい実施形態において、プライマーが特定の配列に対して特異的であると考えられるのは、それが高塩条件下で前記配列（またはその相補的配列）にハイブリダイズするであろう場合である。
【００３１】
以下、「高塩条件」という語は、高塩濃度緩衝液、好ましくはカオトロピック塩を含有する高塩濃度緩衝液を意味することを意図する。高塩、好ましくはカオトロピック塩を含有する高塩は、水における核酸の溶解度を減少させる。その理由は、水素結合の断裂により、水中の核酸の二次および三次構造の安定性が減少することにある。そこで、もし極性表面が水素結合ドナーとして提供されれば、核酸はこの表面に結合する。なぜなら該核酸はそこで水中で存在するよりも良好な安定性で存在するためである。塩濃度が減少した場合、水は再び極性表面よりも良好な水素結合ドナーとなり、前記核酸は該表面から再び分離されうる。
【００３２】
特に、しかし限定されることなく、「高塩濃度緩衝液」は、好ましくは≧１００ｍＭ、より好ましくは≧５００ｍＭ、さらに好ましくは≧１Ｍの高い塩（好ましくはカオトロピック物質）濃度を有する緩衝液を意味すると理解される。
【００３３】
特に、しかし限定されることなく、「カオトロピック物質」または「カオトロピック塩」という語は、タンパク質および／または核酸の二次、三次および／または四次構造を変える物質であって、少なくとも一次構造をそのまま残し、極性物質の水中への溶解度を減少させ、および／または疎水性相互作用を高める物質を意味すると理解される。好ましいカオトロピック物質としては、塩酸グアニジン、（イソ）チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、および／または尿素などが挙げられる。
【００３４】
「増幅」または「増幅反応」の語は、対象となる核酸配列の濃度を少なくとも倍増させることを可能にするプロセスを意味することが意図される。
【００３５】
等温および熱サイクル増幅反応は互いに区別される。前者において温度はプロセスを通じて一定であるが、後者は、反応および増幅を制御する手段である熱サイクルを経て行われる。
【００３６】
好ましい等温増幅反応としては、例えば：
・ループ媒介等温増幅（ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＬＡＭＰ）、
・核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＮＡＳＢＡ）、
・ローリングサークル連鎖反応（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＣＣＲ）もしくはローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＲＣＡ）、および／または
・転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ＴＭＡ）
が挙げられる。
【００３７】
好ましい熱サイクル増幅反応としては、例えば：
・リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＬＣＲ）、および／または
・ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）
が挙げられる。
【００３８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）という語は、例えばＢａｒｔｌｅｔｔ  ＆  Ｓｔｉｒｌｉｎｇ  （２００３）に記載のような、核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅のためのプロセスを意味することが意図される。
【００３９】
「リガーゼ連鎖反応」（ＬＣＲ）という語は、微量の核酸の検出工程であって、ポリメラーゼ連鎖反応と類似の様式で機能するが異なる酵素（ポリメラーゼではなくリガーゼ）を用いる検出工程、を意味することが意図される。ＤＮＡ鎖あたり２種のプローブを連結して１つのプローブにする。１サイクルで生成した増幅産物は３０〜５０ｂｐの長さしかないことが多く、それ自身が以降のサイクルで補充されるプライマーのための開始点として働く。
【００４０】
「ループ媒介等温増幅」（ＬＡＭＰ）は等温核酸増幅のための方法であって、標的配列上の特定の領域を認識してそこに結合する６種の異なるプライマーが用いられる方法、を意味することが意図される。ＬＡＭＰは鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを利用し、約６５℃の等温で進行する。標的配列の増幅および置換は単一工程で行われる。
【００４１】
「核酸配列ベース増幅」（ＮＡＳＢＡ）はＲＮＡの増幅のための方法（Ｃｏｍｐｔｏｎ  １９９１）を意味することが意図される。この方法では、ＲＮＡ鋳型が反応混合液に添加され、第１のプライマーが鋳型の３’末端の領域内の相補的配列に結合する。次いで、前記鋳型に相補的なＤＮＡ鎖が逆転写酵素により重合される。そして、前記ＲＮＡ鋳型はＲＮａｓｅ  Ｈ（ＲＮａｓｅ  ＨはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを消化し、一本鎖ＲＮＡは消化しない）により消化される。次に、第２のプライマーがＤＮＡ鎖の５’末端に結合する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼがそれを前記ＤＮＡ鎖に相補的なＲＮＡ分子の合成のための開始点として利用し、次いで該ＲＮＡ分子を再び開始鋳型として利用することができる。ＮＡＳＢＡは通常４１℃の等温で行われ、特定の状況では、ＰＣＲと比べ、より速く、より良好な結果をもたらす。
【００４２】
「転写媒介増幅」（ＴＭＡ）は米国企業Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅにより開発された等温増幅法であって、ＮＡＳＢＡに類似し、ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素も用いられる方法（Ｈｉｌｌ，２００１）を意味することが意図される。
【００４３】
「ローリングサークル連鎖反応」（ＲＣＣＲ）または「ローリングサークル増幅」（ＲＣＡ）は、ローリングサークル原理による通常の核酸複製を模倣した増幅法についてであり、特に米国特許５，８５４，０３３号に記載されている。
【００４４】
定量ＰＣＲまたはｑＰＣＲとも呼ばれる「リアルタイムＰＣＲ」（逆転写ＰＣＲと混同しないこと）という語は、公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の原理に基づき、さらに増幅されたＤＮＡの定量を可能にする方法を意味することが意図される。定量はＰＣＲサイクルの最中に行われる蛍光測定によっておこなわれる（「リアルタイム」の名称の由来）。蛍光はＰＣＲ産物の量に対して比例的に増加する。反応（数サイクルからなる）終了時、ＰＣＲの対数期において、得られた蛍光シグナルで定量がなされる。ＰＣＲの対数期（反応中の少数のサイクルに該当）にのみ、正確な定量が可能であり、それはこの段階で最適な反応条件が優勢であるためである。このように、この方法は、ＰＣＲ（競合ＰＣＲ等）完了後にのみ最初の評価を行い、多くの場合ＰＣＲ断片のゲル電気泳動による分離を行う、他の定量的ＰＣＲ法とは異なる。
【００４５】
検出には、エチジウムブロマイドおよびＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ等の色素や、ＦＲＥＴプローブ、またはいわゆるＤｏｕｂｌｅ−ｄｙｅオリゴ（ＴａｑＭａｎプローブとも呼ばれる）を使用してもよい。
【００４６】
「Ｃｔ値」（閾値サイクル）という語は、増幅産物が初めて検出されうるＰＣＲサイクルのことを指し、通常、蛍光が測定され、この蛍光が初めて有意にバックグラウンド蛍光よりも高くなるサイクルをＣｔという。
【００４７】
ＰＣＲ反応の最初の段階では、鋳型（すなわち増幅されるＤＮＡ）の量はまだ限られているが、増幅の最終段階では、産物の量はこれら産物による阻害が発生する程度まで増加し、産物の断片はますます互いにハイブリダイズするようになり、遊離体（ｅｄｕｃｔ）はゆっくりと消費される。中間段階においてのみ、増幅サイクル数と増幅産物の量との間に指数関数的な関係が存在する（「対数期」）。対数期が開始する時間の決定のため、上述のＣｔ値が利用される。
【００４８】
さらに、低いＣｔ値は、少ない回数のＰＣＲサイクルでバックグラウンドノイズを超える蛍光の有意な上昇が初めて起こるのに十分である（すなわち、比較的多量の鋳型が存在した）ことを意味し、一方で同様に、高いＣｔ値はこれに多くのＰＣＲサイクルが必要であること（すなわち、比較的少量の鋳型が存在した）を意味する。
【００４９】
第１の態様において、本発明は、
ａ）ＤＮＡにおけるトランスポゾンまたはその断片の存在の定量的測定；
ｂ）同一のトランスポゾンまたはその断片内における、少なくとも１個の、メチル化が異なるＣｐＧジヌクレオチドのＣの存在の定量的測定；および
ｃ）工程ａ）およびｂ）で測定された値に基づく標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルの決定；
の工程を含む、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルの測定のためのプロセスに関する。
【００５０】
従って、本発明によると、特定のＤＮＡ（生検試料から単離されたもの等）内のトランスポゾンの存在が第１の工程で定量的に測定される。この工程は、試験したＤＮＡ中における前記トランスポゾンの密度／頻度（用いたＤＮＡに対する）または数、すなわち、例えば試験したＤＮＡ中に存在するトランスポゾンのコピー数、に関する情報を提供する値を生成する。好ましい一実施形態において、この測定は、あらかじめ亜硫酸水素塩処理したＤＮＡで行われる。
【００５１】
そして第２の工程において、第１の工程で検出されたトランスポゾン内における、少なくとも１個の、メチル化が異なるＣｐＧジヌクレオチドのシトシンの存在が定量的に測定される。好ましい一実施形態において、第１の工程においては同一のＤＮＡがここで用いられる。例えば、試料から単離されたＤＮＡを、好ましくはそれぞれ等量のＤＮＡを含んだ２つに分割することができる。他の好ましい一実施形態においては、第２工程のこの測定は亜硫酸水素塩処理したＤＮＡに対して行われる（この工程は以下でより詳細に論じる）。このように、得られた値は、ゲノム中の多数の異なるランダムな位置に分布するメチル化または非メチル化シトシンの存在に関する情報を提供する。すなわち、この第２工程は第１工程において測定されたトランスポゾン内のメチル化の異なるシトシンの数／量に関する情報を提供する。従って、試験されたトランスポゾン内のシトシンのメチル化の違いの程度を決定することができる。
【００５２】
トランスポゾンはゲノム全体にランダムに分布するため、次の工程では、得られた前記２つの値によって標準化を行うことができ、ここで第１および第２工程で測定された値は相互の関係で評価される。ゲノム中にはトランスポゾンは多数存在するため、大きなサンプルサイズが得られる。そのため、得られた標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化の値は、対象のそれぞれのゲノムに対して標準化されたものと考えることができる、メチル化の相違（ｄｅｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｅｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｙｌｉｅｒｕｎｇ）の値を反映する。
【００５３】
さらなる実施形態において、第１および第２工程は順序が逆になってもよく、または同時に、例えばリアルタイムＰＣＲによって行われてもよい。
【００５４】
ここで、「定量的測定」とは、トランスポゾンの存在またはメチル化の相違（ｅｉｎｅｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｅｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｙｌｉｅｒｕｎｇ）の存在の検出を意味することが意図される。前記検出は単に定性的であるだけでなく、すなわちトランスポゾンまたはメチル化の相違（ｅｉｎｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｅｌｌｅｎ  Ｍｅｔｈｙｌｉｅｒｕｎｇ）が試験対象のＤＮＡ中に存在するか否かという疑問に答えるだけではなく、このような存在の定量も（例えば量、コピー数等を示すことにより）行われる。
【００５５】
このような定量的測定を行うための各種方法は当業者に公知である。好ましい一実施形態において、このような定量的測定は、増幅、およびそれに続く生成された増幅産物の量の測定により達成される。より好ましい一実施形態において、前記増幅はＰＣＲである。さらに好ましい一実施形態において、前記定量的測定はリアルタイムＰＣＲでＣｔ値を決定することにより達成される。さらなる一実施形態において、前記定量的測定はマーカーを付加したプローブ（例えば核酸プローブ）のハイブリダイゼーションと、それに続く、前記マーカーにより生成されたピークの高さを（直接または間接的に）測定することにより達成される。さらなる一実施形態においては、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ等）が行われ、その後、前記マーカーによって生成されたピークの高さが測定される。このような定量的測定のための他の方法としては、５−メチルシトシン特異的抗体を用いた検出や、メチル化ＤＮＡに結合する因子の特異的抗体を用いた間接的な検出などが挙げられる。このような因子としては、例えば、ゲノムの対称的にメチル化されたＣｐＧ部位に結合する核内抑制因子ＭｅＣＰ２、ならびにＭＢＤ１、ＭＢＤ２およびＭＢＤ４などが挙げられる。
【００５６】
さらなる実施形態において、前記ＤＮＡは生物、組織、細胞、生検材料または試料に由来するものである。好ましくは、前記ＤＮＡは単離されたＤＮＡである。一実施形態において、単離されたＤＮＡはゲノムおよび／または真核生物ＤＮＡである。好ましくはこのＤＮＡは脊椎動物、より好ましくはヒトのＤＮＡである。さらなる好ましい一実施形態において、前記ＤＮＡの提供はサンプリングそのものを含まず、既に得られたサンプル材料を基盤としたものである。さらなる好ましい一実施形態において、前記ＤＮＡが由来する組織、細胞、生検材料または試料は、正常な被検者または罹病した被検者もしくは患者からのものである。
【００５７】
さらなる実施形態において、前記試料は血液試料、組織試料、唾液試料、尿試料、塗抹および糞便試料からなる群より選択される。好ましい一実施形態において、前記試料は尿試料である。これは特に、膀胱および／または前立腺癌の検出に有利である。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態において、前記トランスポゾンはＬＩＮＥエレメント、Ａｌｕエレメント（Ａｌｕコンセンサス配列；Ｋａｒｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ．  １９８７；５３（１）：１−１０）、ＨＥＲＶエレメントおよびこれらの断片からなる群より選択される。特定の一実施形態において、前記トランスポゾンはＬＩＮＥ−１エレメント（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ８０３４３）またはその断片である。より好ましくは、前記トランスポゾンの断片はトランスポゾンのプロモーター領域である。これにはＣｐＧが高頻度で存在するという利点があり、メチル化レベルを測定するのが容易である。最も好ましい実施形態において、前記トランスポゾンの断片はＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域である。
【００５９】
ここで、「メチル化の相違」とは、異なる可能な形式で存在する、あるＤＮＡのメチル化状態を意味することが意図される。「シトシン（Ｃ）のメチル化の相違」という場合、対象となるシトシンのメチル化状態のことを意味する。二者択一的に、それはメチル化した、すなわち前記シトシンが５ｍＣの、状態であってもよく；あるいはそれは非メチル化（もしくは脱メチル化）の、すなわち対象となるシトシンが５’メチル基を有していない、状態であってもよい。
【００６０】
メチル化の相違の存在（またはシトシンのメチル化の相違の存在）を測定するための好ましい１つの方法は、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理し、続いて生産された亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの分析することに基づくものである。
【００６１】
単離されたＤＮＡから亜硫酸水素塩変換ＤＮＡを得るためには、その単離されたＤＮＡを当業者に周知の亜硫酸水素塩反応により変換する。この反応において、ＤＮＡの非メチル化シトシンは亜硫酸水素塩によりウラシルに変換される。この変換の結果、変換された核酸の各種バリアントが、このような核酸の非メチル化シトシンの数に依存して存在しうる。例えば、２個のシトシンを含む核酸は、これらシトシンのメチル化状態次第で亜硫酸水素塩処理後に４種の異なるバリアントを生じうる。なぜなら、第１、第２または両方のシトシンが非メチル化状態であってウラシルに変換されるか、あるいは両方とも非メチル化状態でないことがありうるからである。好ましい一実施形態において、これらの各種バリアントは特異的プライマーまたはプライマーのセットを用いて検出することができる。一実施形態において、前記変換後に亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの精製の工程をさらに行っても良い。さらなる一実施形態において、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理は本発明のプロセスの他の工程に含められてもよく、好ましくは、第１の工程として、またはＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が異なるシトシンの存在の定量的測定の前に、含められる。
【００６２】
さらなる特に好ましい一実施形態において、工程ａ）は、トランスポゾンもしくはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩未処理ＤＮＡの増幅、または、亜硫酸水素塩処理トランスポゾンもしくはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマーは前記トランスポゾンのメチル化の異なる部位を含まない、すなわちＣｐＧジヌクレオチドのＣもしくは変換されたＵ／Ｔを含まない、増幅を含み；さらに工程ｂ）は、前記トランスポゾンまたはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対（工程ａ）で決定したもの）による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅を含み、該プライマー対は前記トランスポゾンのメチル化が異なる少なくとも１つの部位を含むプライマーを少なくとも１つ含み、すなわちメチル化されたＣｐＧの少なくとも１個のＣと、亜硫酸水素塩処理された非メチル化ＣｐＧの少なくとも１個のＵ／Ｔとを区別することができ；さらに工程ｃ）は、工程ａ）およびｂ）において形成された増幅産物の比率によって、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルを決定することを含む。
【００６３】
言い換えると、前記ＤＮＡは亜硫酸水素塩未処理（すなわち、例えば試料からの単離直後）のものであっても、工程ａ）における測定のために既に亜硫酸水素塩処理されていてもよい。前者のケースでは、トランスポゾンに特異的などのようなプライマーでもその増幅に用いてもよく、後者のケースでは、メチル化の異なる部位を含まない（すなわちＣｐＧジヌクレオチドのシトシンを含まない）プライマーを用いるように留意すべきである。好ましい一実施形態において、工程ａ）およびｂ）には同じ量のＤＮＡが用いられ、ここで前記ＤＮＡは、好ましくは１つの試料から一度の操作で単離されたものである。より好ましくは、等量のＤＮＡが工程ａ）およびｂ）で用いられる。この場合も、該ＤＮＡは、好ましくは１つの試料から一度の操作で単離されたものである。
【００６４】
常に亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを用いて行われる工程ｂ）においては、状況は逆になる；少なくとも１つのプライマーが工程ａ）において増幅されたトランスポゾンのメチル化が異なるサイト（すなわち、少なくとも１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシン）を含んでいる必要がある。前記の少なくとも１つのプライマーが特異的な、前記の少なくとも１個のメチル化が異なるサイトは、センス鎖であってもアンチセンス鎖であっても問題ない。よって、このプライマーを使用し、出発ＤＮＡのメチル化の有無を、対象となる試験部位において検出することができる。ＣｐＧに特異的なプライマーを用いて増幅産物が得られた場合、もとのＤＮＡでは対象となるサイトにメチル化が存在したことになる。これは、亜硫酸水素塩反応で変換が起こらなかったためである。もし亜硫酸水素塩処理ＣｐＧに特異的なプライマーを用いて増幅産物が得られた場合、もとのＤＮＡでは対象となるサイトにメチル化が存在しなかった（脱メチル化が存在した）ことになる。従って、用いたプライマーの種類によってメチル化または脱メチル化を検出できる。
【００６５】
本発明によるメチル化レベルの測定のため、トランスポゾンのＤＮＡのメチル化または脱メチル化のいずれを測定してよい。これら２つの状態は直接的な対応関係にあるためである。従って、ＣｐＧ特異的プライマー対が使用された場合、ＤＮＡメチル化レベルはメチル化を用いて測定される。亜硫酸水素塩処理ＣｐＧ特異的プライマー対が使用された場合、ＤＮＡメチル化レベルは脱メチル化を用いて測定される。
【００６６】
好ましい一実施形態において、前記の少なくとも１つのプライマー対の少なくとも１個のプライマーは、前記トランスポゾンの少なくとも１個のメチル化の異なる部位に対して特異的であり；より好ましくは、前記の少なくとも１つのプライマー対の両プライマーは前記トランスポゾンの少なくとも１個のメチル化の異なる部位に対して特異的である。これは、より良好な特異性と改善された増幅とが達成される利点を有する。
【００６７】
さらに好ましい実施形態において、使用されるプライマーは、複数のメチル化の異なる部位に対して特異的である。このようなプライマーはＣｐＧまたは亜硫酸水素塩処理ＣｐＧの複数のシトシンに対して特異的である。特に好ましい実施形態において、前記プライマーは２、３、４または４超の個数のメチル化の異なる部位に対して特異的である。
【００６８】
さらに、前記プライマーはトランスポゾンに対して特異的であることから、これらは好ましい一実施形態においてＬＩＮＥエレメント、Ａｌｕエレメント、ＨＥＲＶエレメント、ＨＥＲＶ−Ｋエレメントまたはその断片に対して特異的である。特に好ましい一実施形態においては、前記プライマーはＬＩＮＥ−１エレメントまたはその断片に対して特異的である。より好ましくは、前記プライマーはトランスポゾンのプロモーター領域に対して特異的である。これはＣｐＧの存在頻度が高く、そのためメチル化レベルの測定が容易であるという利点を有する。最も好ましい実施形態において、前記プライマーはＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域に対して特異的である。
【００６９】
他の一実施形態において、使用される前記プライマーは少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２５超のヌクレオチドの長さを有する。プライマー対には異なる長さを有するプライマーが含まれてよい。好ましい一実施形態において、前記プライマーは１８〜３５ヌクレオチドの長さを有し、より好ましい実施形態においては、前記プライマーは２０〜３０ヌクレオチドの長さを有する。
【００７０】
好ましい一実施形態において、プライマー対の前記プライマーは少なくとも１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシンに対してのみ特異的であるか、または少なくとも１個の亜硫酸水素塩処理ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンに対してのみ特異的である。
【００７１】
前記プライマーは任意の部位、すなわち、プライマーオリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、またはその間のいずれかの部位、のメチル化の異なる部位に対して特異的な、前記の少なくとも１個のヌクレオチドを含みうる。特に好ましい一実施形態において、メチル化の異なる部位に特異的な前記の少なくとも１個のヌクレオチドは、プライマーヌクレオチドの３’末端に位置する。これは、特異性が高いという利点を有する。
【００７２】
さらなる特に好ましい一実施形態において、工程ａ）および工程ｂ）で用いられる前記プライマー対はトランスポゾンの増幅された領域上で直接に近接する。「直接に近接する」という語は、≦６０００ｂｐ、≦５０００ｂｐ、≦４０００ｂｐ、≦３０００ｂｐ、≦２０００ｂｐ、≦１０００ｂｐ、≦８００ｂｐ、≦６００ｂｐ、≦５００ｂｐ、より好ましくは≦４００ｂｐまたは≦３００ｂｐ、およびさらに好ましくは≦２００ｂｐまたは≦１００ｂｐの距離が工程ａ）および工程ｂ）で増幅されたトランスポゾンの領域間に存在することを意味することが意図される。さらに好ましい実施形態において、この距離は≦８０ｂｐ、≦５０ｂｐ、または≦１０ｂｐである。さらになお好ましい実施形態において、この距離は０ｂｐであるか、または増幅された領域同士が重複する。
【００７３】
当業者はその専門知識により、トランスポゾンの少なくとも１個のメチル化が異なる部位に対して特異的な、本発明の広範なプライマーを生産することができる。これはＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域を対象として以下に記載される。
【００７４】
ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｍ８０３４３）は：
ggggggaggagccaagatggcCGaataggaacagctcCGgtctacagctcccagCGtgag
CGaCGcagaagaCGgtgatttctgcatttccatctgaggtacCGggttcatctcactagg
gagtgccagacagtgggCGcaggccagtgtgtgtgCGcacCGtgCGCGagcCGaagcagg
gCGaggcattgcctcacctgggaagCGcaaggggtcagggagttccctttctgagtcaaa
gaaaggggtgaCGgtCGcacctggaaaatCGggtcactcccaccCGaatattgCGctttt
cagacCGgcttaagaaaCGgCGcaccaCGagactatatcccacacctggctCGgagggtc
ctaCGcccaCGgaatctCGctgattgctagcacagcagtctgagatcaaactgcaaggCG
である。配列中、ＣｐＧは大文字で強調されている。
【００７５】
従って、このプロモーター配列が完全にメチル化され、その後亜硫酸水素塩処理されると、次の核酸配列（配列番号１）になるはずである。
ggggggaggagTTaagatggTCGaaTaggaaTagTtTCGgtTtaTagTtTTTagCGtgag
CGaCGTagaagaCGgtgatttTtgTatttTTatTtgaggtaTCGggttTatTtTaTtagg
gagtgTTagaTagtgggCGTaggTTagtgtgtgtgCGTaTCGtgCGCGagTCGaagTagg
gCGaggTattgTTtTaTTtgggaagCGTaaggggtTagggagttTTTtttTtgagtTaaa
gaaaggggtgaCGgtCGTaTTtggaaaatCGggtTaTtTTTaTTCGaatattgCGTtttt
TagaTCGgTttaagaaaCGgCGTaTTaCGagaTtatatTTTaTaTTtggTtCGgagggtT
TtaCGTTTaCGgaatTtCGTtgattgTtagTaTagTagtTtgagatTaaaTtgTaaggCG
配列中、メチル化ＣｐＧ、および亜硫酸水素塩処理によりＣからＵ（またはＴ）に変換されたヌクレオチドは大文字で記載されている。
【００７６】
このプロモーター配列が完全に脱メチル化され、その後亜硫酸水素塩処理されると、次の核酸配列（配列番号２）になるはずである。
ggggggaggagTTaagaTggTTGaaTaggaaTagTTTTGgTTTaTagTTTTTagTGTgagTGaTGTagaagaTGgTgaTTTTTgTaTTTTTaTTTgaggTaTTGggTTTaTTTTaTTagggagTgTTagaTagTgggTGTaggTTagTgTgTgTgTGTaTTGTgTGTGagTTGaagTagggTGaggTaTTgTTTTaTTTgggaagTGTaaggggTTagggagTTTTTTTTTTgagTTaaagaaaggggTgaTGgTTGTaTTTggaaaaTTGggTTaTTTTTaTTTGaaTaTTgTGTTTTTTagaTTGgTTTaagaaaTGgTGTaTTaTGagaTTaTaTTTTaTaTTTggTTTGgagggTTTTaTGTTTaTGgaaTTTTGTTgaTTgTTagTaTagTagTTTgagaTTaaaTTgTaaggTG
配列中、脱メチル化（および変換された）ＣｐＧ、および亜硫酸水素塩処理によりＣからＵ（またはＴ）に変換されたヌクレオチドは大文字で記載されている。
【００７７】
このように、配列番号１および配列番号２に基づき、少なくとも１個のサイトで異なるメチル化を受けたＤＮＡ同士を区別するためにプライマーを選択することができる。もちろん、当業者は示されたセンス鎖に対応するアンチセンス鎖も存在するという事実を熟知している。アンチセンス鎖においては、前記５’−ＣｐＧ−３’ジヌクレオチドに対応する５’−ＣｐＧ−３’ジヌクレオチドが存在しており、これも異なるメチル化を受ける。従って、プライマーはアンチセンス鎖の配列情報に基づいて選択されてもよい。
【００７８】
センスおよびアンチセンス鎖は亜硫酸水素塩処理後にはもはや相補的ではないため、１カ所のメチル化が異なる部位が存在する場合、４種の異なる特異的プライマーがまず生成されうる：１）同一の配列であって変換されたセンス鎖に特異的なもの；２）相補的であって変換されたセンス鎖に特異的なもの；３）同一の配列であって変換されたアンチセンス鎖に特異的なもの；４）相補的であって変換されたアンチセンス鎖に特異的なもの。メチル化が異なる部位は２つの状態でありうるため、８種の可能なプライマーが存在する。
【００７９】
例として、まず２本鎖ＤＮＡ配列：
５’−ＡＧＣＡＣＧＴ−３’（センス）
３’−ＴＣＧＴＧＣＡ−５’（アンチセンス）
から出発する。
【００８０】
亜硫酸水素塩処理後、これがそれぞれ、メチル化状態により、もはや相補鎖ではない鎖を生ずる：
メチル化：５’−ＡＧＵＡＣＧＴ−３’  および  ３’−ＴＵＧＴＧＣＡ−５’；
脱メチル化：５’−ＡＧＵＡＵＧＴ−３’  および  ３’−ＴＵＧＴＧＵＡ−５’。
【００８１】
ここで、これら４つの配列に対し、同一の配列を有するプライマー、およびその配列に相補的なプライマーが生成される。すなわち：
メチル化：
５’−ＡＧＵＡＣＧＴ−３’  および  ５’−ＡＣＧＴＡＣＴ−３’、
５’−ＡＣＧＴＧＵＴ−３’  および  ５’−ＡＡＣＡＣＧＴ−３’、
脱メチル化：
５’−ＡＧＵＡＵＧＴ−３’  および  ５’−ＡＣＡＴＡＣＴ−３’、
５’−ＡＵＧＴＧＵＴ−３’  および  ５’−ＡＡＣＡＣＡＴ−３’。
【００８２】
トランスポゾンの１または複数個の（亜硫酸水素塩処理された）ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンに対して、従って少なくとも１個のメチル化が異なる部位に対して特異的なこのようなプライマーの例およびさらに好ましい実施形態を、配列番号３〜１０４８または表１〜１２において示す。これらのうち、表１〜４にはＬＩＮＥ−１エレメントに対する特に好ましいプライマーを記載し、表５〜８にはＡｌｕエレメントに対する特に好ましいプライマーを記載し、表９〜１２にはＨＥＲＶ−Ｋエレメントに対する特に好ましいプライマーを記載する。前記プライマーは５’から３’の方向で記載されている。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明のプロセスにおける、これらオリゴヌクレオチドの以下のもの、およびその使用に関する。
【００８４】
ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化センスまたはアンチセンス鎖に対して特異的な、同一の配列または相補的なプライマー配列、すなわち、配列番号３〜４３６；より好ましくは配列番号３〜１１２、または配列番号１１３〜２２０、または配列番号２２１〜３３６、または配列番号３３７〜４３６；さらに好ましくは配列番号３〜５７、または配列番号５８〜１１２、または配列番号１１３〜１６６、または配列番号１６７〜２２０、または配列番号２２１〜２７８、または配列番号２７９〜３３６、または配列番号３３７〜３８６、または配列番号３８７〜４３６。
【００８５】
Ａｌｕエレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化センスまたはアンチセンス鎖に対して特異的な、同一の配列または相補的なプライマー配列、すなわち、配列番号４３７〜６１２；より好ましくは配列番号４３７〜４７６、または配列番号４７７〜５２２、または配列番号５２３〜５７０、または配列番号５７１〜６１２；さらに好ましくは配列番号４３７〜４５６、または配列番号４５７〜４７６、または配列番号４７７〜４９９、または配列番号５００〜５２２、または配列番号５２３〜５４６、または配列番号５４７〜５７０、または配列番号５７１〜５９１、または配列番号５９２〜６１２。
【００８６】
ＨＥＲＶ−Ｋエレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化センスまたはアンチセンス鎖に対して特異的な、同一の配列または相補的なプライマー配列、すなわち、配列番号６１３〜１０４８；より好ましくは配列番号６１３〜７０８、または配列番号７０９〜７９６、または配列番号７９７〜９２２、または配列番号９２３〜１０４８；さらに好ましくは配列番号６１３〜６６０、または配列番号６６１〜７０８、または配列番号７０９〜７５２、または配列番号７５３〜７９６、または配列番号７９７〜８５９、または配列番号８６０〜９２２、または配列番号９２３〜９８５、または配列番号９８６〜１０４８。
【００８７】
表１：ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」のプライマー配列
【００８８】
【表１】
2016019526.tif 000002
【００８９】
表２：ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「相補的」プライマー配列
【００９０】
【表２】
2016019526.tif 000003
【００９１】
表３：ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」のプライマー配列
【００９２】
【表３】
2016019526.tif 000004
【００９３】
表４：ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「相補的」プライマー配列
【００９４】
【表４】
2016019526.tif 000005
【００９５】
表５：Ａｌｕエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」のプライマー配列
【００９６】
【表５】
2016019526.tif 000006
【００９７】
表６：Ａｌｕエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「相補的」プライマー配列
【００９８】
【表６】
2016019526.tif 000007
【００９９】
表７：Ａｌｕエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」のプライマー配列
【０１００】
【表７】
2016019526.tif 000008
【０１０１】
表８：Ａｌｕエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「相補的」プライマー配列
【０１０２】
【表８】
2016019526.tif 000009
【０１０３】
表９：ＨＥＲＶ−Ｋエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」のプライマー配列
【０１０４】
【表９】
2016019526.tif 000010
【０１０５】
表１０：ＨＥＲＶ−Ｋエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「相補的」プライマー配列
【０１０６】
【表１０】
2016019526.tif 000011
【０１０７】
表１１：ＨＥＲＶ−Ｋエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」のプライマー配列
【０１０８】
【表１１】
2016019526.tif 000012
【０１０９】
表１２：ＨＥＲＶ−Ｋエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済のメチル化または脱メチル化「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「相補的」プライマー配列
【０１１０】
【表１２】
2016019526.tif 000013
当業者は、表１〜１２に記載されるオリゴヌクレオチド配列のそれぞれがコア配列としてのみ理解されるべきであると認識しており、該コア配列は５’末端から、および／または３’末端から、短縮または伸長していてよい。これは本発明に開示される全てのオリゴヌクレオチド／プライマーに適用される。好ましい一実施形態において、表１〜１２に示すオリゴヌクレオチドは５’末端および／または３’末端から、１〜２０ヌクレオチド伸長している。より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは５’末端から、および／または３’末端から、５〜１５ヌクレオチド伸長している。他の一実施形態においては、前記オリゴヌクレオチドは５’末端から、および／または３’末端から、全部で５ヌクレオチドまで短縮しており、その際、該オリゴヌクレオチドは常に少なくとも１個のＣｐＧまたは亜硫酸水素塩処理ＣｐＧに対して特異的なままである。
【０１１１】
他の好ましい一実施形態において、プライマー対の前記プライマーはほぼ同一のＴｍＳを有し、互いのＴｍＳのずれは、好ましくは≦３℃、≦２℃、≦１℃、≦０．５℃、≦０．２℃または≦０．１℃である。
【０１１２】
他の好ましい一実施形態において、前記プライマーに囲まれた配列領域は、≧１かつ≦３０００ｂｐ、好ましくは≧１０かつ≦２０００ｂｐ、さらに好ましくは≧３０かつ≦８００ｂｐ、最も好ましくは≧５０かつ≦３００ｂｐの長さを有する。
【０１１３】
当業者は、プライマーは１対のみに限られず、複数対を用いてもよいことを認識しているであろう。従って、他の一実施形態において、前記プロセスは、トランスポゾンまたはその断片に特異的な２、３、４、５または５超の個数のプライマー対であって、それぞれが少なくとも１個のＣｐＧジヌクレオチドのシトシンまたはＣｐＧジヌクレオチドの亜硫酸水素塩処理済シトシンに対して特異的な少なくとも１個のプライマーを含むプライマー対、を用いて行われてもよい。好ましくは、これらのいくつかのプライマー対はほぼ同一のＴｍＳを有する。
【０１１４】
さらに、工程ａ）において、亜硫酸水素塩未処理ＤＮＡを、少なくとも１つの、同じトランスポゾンまたはその断片の領域に対して特異的なプライマーのプライマー対で増幅するか；または亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを、少なくとも１つの、同様にトランスポゾンに特異的なプライマー対であるが、そのプライマーが該トランスポゾンのメチル化が異なる部位を含まないプライマー対で増幅する。好ましい一実施形態においては、前記トランスポゾンの常に非メチル化されている領域に対して特異的なプライマーが使用される。予備的な配列分析により、当業者は、あるゲノム内のどの部位が常に非メチル化されているか決定することができる。すなわち、５ｍＣは脊椎動物ではＣｐＧジヌクレオチドにのみ生ずるため、このようなＣｐＧ配列のシトシンを含まない領域をそのような場合に選択することができる。
【０１１５】
表１３〜１８は標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｕｎｇ  ｗｉｅｄｅｒ）のためのこのようなオリゴヌクレオチドの好ましいものを示したものであり、該オリゴヌクレオチドは前記プロセスの工程ａ）のために、そして亜硫酸水素塩処理ＤＮＡが使用される場合に、用いてよい。表１３〜１４はＬＩＮＥ−１エレメントのための好ましいプライマーを開示するものであり、表１５〜１６はＡｌｕエレメントのための好ましいプライマーを開示するものであり、そして表１７〜１８はＨＥＲＶ−Ｋエレメントのための好ましいプライマーを開示するものである。そして、この増幅工程で産生される増幅産物を本発明による標準化のために使用することができる。
【０１１６】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明のプロセスにおける、標準化のためのこのようなオリゴヌクレオチドの以下のもの、およびその使用に関する。
【０１１７】
ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のセンスまたはアンチセンス鎖に対して特異的な、同一の配列または相補的なプライマー配列、すなわち、配列番号１０４９〜１２２７；より好ましくは配列番号１０４９〜１１４５、または配列番号１１４６〜１２２７；さらに好ましくは配列番号１０４９〜１０９６、または配列番号１０９７〜１１４５、または配列番号１１４６〜１１９２、または配列番号１１９３〜１２２７。
【０１１８】
Ａｌｕエレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のセンスまたはアンチセンス鎖に対して特異的な、同一の配列または相補的なプライマー配列、すなわち、配列番号１２２８〜１２５７；より好ましくは配列番号１２２８〜１２４３、または配列番号１２４４〜１２５７；さらに好ましくは配列番号１２２８〜１２３７、または配列番号１２３８〜１２４３、または配列番号１２４４〜１２５０、または配列番号１２５１〜１２５７。
【０１１９】
ＨＥＲＶ−Ｋエレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済のセンスまたはアンチセンス鎖に対して特異的な、同一の配列または相補的なプライマー配列、すなわち、配列番号１２５８〜１４１５；より好ましくは配列番号１２５．８〜１３２３、または配列番号１３２４〜１４１５；さらに好ましくは配列番号１２５８〜１２８９、または配列番号１２９０〜１３２３、または配列番号１３２４〜１３７１、または配列番号１３７２〜１４１５。
【０１２０】
表１３：ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済の「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」および「相補的」プライマー配列。
【０１２１】
【表１３】
2016019526.tif 000014
【０１２２】
表１４：ＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域における、亜硫酸水素塩で変換済の「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」および「相補的」プライマー配列。
【０１２３】
【表１４】
2016019526.tif 000015
【０１２４】
表１５：Ａｌｕエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済の「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」および「相補的」プライマー配列。
【０１２５】
【表１５】
2016019526.tif 000016
【０１２６】
表１６：Ａｌｕエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済の「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」および「相補的」プライマー配列。
【０１２７】
【表１６】
2016019526.tif 000017
【０１２８】
表１７：ＨＥＲＶ−Ｋエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済の「センス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」および「相補的」プライマー配列。
【０１２９】
【表１７】
2016019526.tif 000018
【０１３０】
表１８：ＨＥＲＶ−Ｋエレメントにおける、亜硫酸水素塩で変換済の「アンチセンス」鎖に対して特異的な、好ましい「同一配列」および「相補的」プライマー配列。
【０１３１】
【表１８】
2016019526.tif 000019
【０１３２】
当業者は上記で説明したスキームに従い、任意の他のトランスポゾンまたはその断片のためのプライマーを提供することも可能であろう。
【０１３３】
本発明によると、前記標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルの決定は、前記の２つの増幅工程（工程ａ）およびｂ））で形成された増幅産物の比率に基づいて行われる。特定の実施形態において、該比率は、形成された増幅産物の量に基づき、より好ましくは増幅サイクルあたりの形成された増幅産物の増加に基づき、さらに好ましくはリアルタイムＰＣＲ中のサイクル閾値（Ｃｔ）に基づき、決定される。
【０１３４】
一実施形態においては、形成された２つの増幅産物の総量が同一回数の増幅サイクルの後に測定され、相互の関係において評価される。形成された増幅産物を測定するための各種方法は当業者に公知であり、その方法としては分光法、エチジウムブロマイドまたは銀による染色、デンシトメトリーによる測定、および、放射標識とその後のシンチレーション測定等による測定などが挙げられる。
【０１３５】
好ましい一実施形態において、前記の２つの増幅工程で形成された増幅産物の測定は、該増幅産物そのものの形成中にリアルタイムＰＣＲによって達成される。他の好ましい一実施形態において、前記の２つの増幅工程で形成された増幅産物の測定は、同時にリアルタイムＰＣＲ中に行われる。
【０１３６】
前記の２つの増幅工程で形成された増幅産物の測定後、第２の増幅工程（工程ｂ））の増幅産物の数値は、第１の増幅工程（工程ａ））の増幅産物の数値を用いて、例えば測定された値の除算または減算により、標準化される。このように、試験されたＤＮＡ領域の出現全体に対して標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベル（すなわち、標準化された（脱）メチル化）が決定され、これは全ゲノムのメチル化レベルを反映していると仮定することができる。
【０１３７】
好ましい一実施形態において、工程ａ）およびｂ）の増幅、ならびに形成された増幅産物の測定は、リアルタイムＰＣＲによって達成される。すなわち、前記トランスポゾンのメチル化が異なる少なくとも１個の部位に特異的なプライマー対（工程ｂ）、Ｃｔｍ）；および、前記トランスポゾンのメチル化が異ならない領域に特異的なプライマー対（工程ａ）、Ｃｔｋ）；の両者に対してサイクル閾値（Ｃｔ）を決定する。Ｃｔ値とは、蛍光が初めてバックグラウンド蛍光よりも高くなるＰＣＲのサイクルを記述するものであり、従ってＰＣＲの対数期の開始を示すものである。その後、工程ａ）のＣｔ値を工程ｂ）のＣｔ値から減算し、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベル（ΔＣｔ）が得られる。従って、ΔＣｔは次のように算出することができる：ΔＣｔ＝Ｃｔｍ−Ｃｔｋ。
【０１３８】
前述の通り、本発明のプロセスは、異なるゲノム上の背景（例えば、腫瘍細胞に部分的に起こる個々の染色体の複製の誤り；トリソミー等、におけるもの）を有する２つのゲノムのメチル化レベル同士を比較することも可能にする。「正常ゲノム」（コントロール）からのＤＮＡの標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルが患者からのものと比較される場合、この２つのゲノム間のメチル化レベルの相違が疾患の指標となりうる。よって、相対ＤＮＡメチル化レベルを測定するための本発明のプロセスは、（臨床）診断に対して極めて重要である。
【０１３９】
従って、本発明の第２の態様は、相対ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスに関するものであり、該プロセスは：
ａ）第１のＤＮＡおよび第２のＤＮＡに対する、本発明の第１の態様の工程ａ）〜ｃ）による標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルの測定；および
ｂ）第１および第２のＤＮＡに対して測定された標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルの比に基づく、相対ＤＮＡメチル化レベルの決定；
という工程を含む。
【０１４０】
言い換えると、本発明の第１の態様の上記プロセスを、例えば、異なる（臨床）試料に由来するものであってよい２種の異なるＤＮＡに対して行い、得られた前記２種のＤＮＡの標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルを互いに除算する。その後、前記２つのメチル化レベルの比から、例えば癌に関して判定を行い、および／または診断を行うことができる。
【０１４１】
一実施形態においては、２種を超えるＤＮＡの相対メチル化レベルが決定される。他の一実施形態においては、試験すべき少なくとも１種のＤＮＡのメチル化レベルを、複数の「正常ゲノム」のメチル化レベルの平均値で除算する。このように、例えば、≧１０、≧５０、または≧１００の正常被検者の標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルを測定し、そこから算出された平均値を用いて、患者の標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルから比を算出する。他の一実施形態においては、患者の標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルを用いて、個々の試料の標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルから、またはいくつかの試料／ＤＮＡ（好ましくは≧１０、≧５０、または≧１００）の平均標準化ＤＮＡメチル化レベルから、比を算出し、ここで、これら後者の試料は疾患のメチル化パターンを有するＤＮＡを含む。
【０１４２】
一実施形態において、前記２種のＤＮＡのうち少なくとも一方は試料に由来し；好ましくは、該ＤＮＡはこの試料から単離されたものである。好ましい一実施形態においては、両者ＤＮＡがそれぞれの試料に由来する。他の好ましい一実施形態において、第１の試料は正常被検者からの試料であり、一方、第２の試料は患者からの試料である。さらに好ましい一実施形態において、第１の試料は少なくとも１個の腫瘍細胞を含む試料であり、第２の試料は患者からの試料である。従って、第１の試料／ＤＮＡはこれと患者からの試料とが比較されるネガティブまたはポジティブコントロールの役割をする。他の一実施形態において、前記ポジティブコントロールはＨＴ１３７６ＤＮＡである。
【０１４３】
他の一実施形態において、前記２種のＤＮＡのうちの一方の標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルの測定は、第２のＤＮＡの標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルの測定の１日、１週間、１ヶ月または１年前に行われる。
【０１４４】
他の一実施形態において、前記２種の試料のうちの少なくとも一方は、血液試料、組織試料、唾液試料、尿試料、塗抹および糞便試料からなる群より選択される。好ましい一実施形態において、前記試料は尿試料である。
【０１４５】
本発明のプロセスの他の一工程においては、相対ＤＮＡメチル化レベルの決定が、第１および第２のＤＮＡの標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルの比率によって、例えば測定された数値を除算または減算することにより、行われる。
【０１４６】
好ましい一実施形態においては、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）メチル化レベルの測定は上記のようにリアルタイムＰＣＲによって行われる。例えば試験される患者試料に由来してもよい、第２のＤＮＡのΔＣｔ値（ΔＣｔ２）と、例えば標準試料に由来してもよい、第１のＤＮＡのΔＣｔ値（ΔＣｔ１）との相違が、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ２−ΔＣｔ１として計算される場合、前記第２のＤＮＡの相対メチル化レベルは２−ΔΔＣｔとして示すことができる。このように、第２のＤＮＡの第１のＤＮＡに対する相対的なメチル化は、ＣｐＧのシトシンに対して特異的なプライマーが増幅に使用された場合に算出され、相対的な脱メチル化は、亜硫酸水素塩処理されたＣｐＧのシトシンに対して特異的なプライマーが増幅に使用された場合に算出される。
【０１４７】
前記の２つの増幅工程で形成された増幅産物の比率を、プロセスの正確さを高めるために、反復的な測定および平均値の生成によって決定することができるということは、当業者に公知である。従って、本発明の一実施形態においては、増幅産物のいくつかの量、またはＤＮＡに対して測定されたＣｔ値、の平均値が算出される。
【０１４８】
他の一実施形態において、本発明は変化したＤＮＡメチル化と関連する疾患の検出または診断のためのプロセスを開示する。好ましい一実施形態において、このような疾患は腫瘍である。他の好ましい一実施形態においては、標準試料からのＤＮＡの相対メチル化レベル、および試験する試料からの（例えば患者からの尿または唾液試料といった、上述の試料のうちの１つからの）ＤＮＡの相対メチル化レベルが決定される。好ましい一実施形態においては、前記腫瘍は、患者、または患者からの試料において、診断／検出される。
【０１４９】
本発明の一実施形態においては、前記標準試料は正常被検者に由来するものであり、および／または、そこから得られた前記ＤＮＡは腫瘍が存在しない場合に優位であることが知られるメチル化レベルを有する。本発明の他の実施形態において、前記標準試料は、腫瘍に罹患する患者に由来するものであり、および／または、腫瘍が存在する場合に優位であることが知られるメチル化レベルを有する。本発明の好ましい一実施形態においては、前記標準試料は、その腫瘍疾患が型が分類されている罹病被検者に由来するものである。前記標準試料は、培養された、好ましくは型が分類されている腫瘍細胞、例えばＨＴ１３７６細胞からなっていてもよい。上述のように、いくつかの標準試料の平均値を前記標準試料に使用してもよい。
【０１５０】
本発明の一実施形態において、被検者からの試料の採取は本発明のプロセスの一部であり、本発明の他の特定の一実施形態においては、被検者からの試料の採取は本発明のプロセスの一部ではない。
【０１５１】
患者試料の標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルが標準試料の標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルからずれている場合、すなわち、相対ＤＮＡメチル化レベルを生成するための前記２つの数値を除算したものが、例えば１に等しくない数値を生じた場合、これは変化したＤＮＡメチル化と関連する疾患、好ましくは腫瘍、の存在の指標となる。
【０１５２】
一実施形態においては、標準試料からのＤＮＡとの比較した際の、試料からのＤＮＡにおけるＤＮＡメチル化の減少、ＤＮＡ脱メチル化の減少、ＤＮＡメチル化の増加、またはＤＮＡ脱メチル化の増加は、このような疾患の存在を示す。
【０１５３】
好ましい一実施形態においては、標準試料からのＤＮＡとの比較した際の、試料からのＤＮＡにおけるＤＮＡメチル化の減少またはＤＮＡ脱メチル化の増加は、腫瘍の存在を示す。本発明のより好ましい一実施形態においては、ＤＮＡメチル化の減少またはＤＮＡ脱メチル化の増加における相違は、前記腫瘍の悪性度と相関する。
【０１５４】
さらなる好ましい実施形態において、この腫瘍は：膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、乳癌、気管支癌、白血病、腸癌、精巣腫瘍、鼻咽腔癌、子宮頸癌、膵癌および／または胃癌からなる群より選択される。
【０１５５】
さらなる一態様において、本発明は、例えば本発明のプロセスの増幅工程におけるプライマーとして使用することのできる、オリゴヌクレオチドに関する。
【０１５６】
一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドはトランスポゾンまたはその断片に対して特異的であり、前記トランスポゾンはＬＩＮＥエレメント、Ａｌｕエレメント、ＨＥＲＶエレメント、ＨＥＲＶ−Ｋエレメントまたはその断片からなる群より選択される。特定の一実施形態において、前記トランスポゾンはＬＩＮＥ−１エレメントまたはその断片である。より好ましくは、前記トランスポゾンの断片はＬＩＮＥエレメントのプロモーター領域である。特定の一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは亜硫酸水素塩処理トランスポゾンのセンスまたはアンチセンス鎖に対して同一の配列を有するか、または相補的であり、少なくとも１個の、該トランスポゾンのメチル化が異なる部位を含む。さらに好ましい一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは亜硫酸水素塩処理トランスポゾンのセンスまたはアンチセンス鎖に対して同一の配列を有するか、または相補的であり、該トランスポゾンのメチル化が異なる部位を含まない。
【０１５７】
好ましい一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの、前記トランスポゾンのメチル化が異なる部位を含む。さらなる一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは常に非メチル化されているトランスポゾンの領域に対して；好ましくはＣｐＧジヌクレオチドのシトシンを含まない領域に対して；特異的である。
【０１５８】
さらに好ましい一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは≧１５ヌクレオチド；好ましくは≧１８、≧１９、≧２０、≧２１、≧２２、≧２３、≧２４または２５≧ヌクレオチドの長さを有する。さらに好ましい一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは≧１８かつ≦３５ヌクレオチドの長さを有し；より好ましくは≧２０かつ≦３０ヌクレオチドの長さを有する。
【０１５９】
他の一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号３〜１４１５からなる群より選択される配列を有する。
【０１６０】
さらなる一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号３〜１０４８からなる群より選択される配列を有し、該配列は５’末端および／または３’末端から短縮または（個々のトランスポゾンによって）伸長していてよい。好ましい一実施形態において、本発明の前記オリゴヌクレオチドは５’末端および／または３’末端から１〜２０ヌクレオチド伸長しており；より好ましくは、前記オリゴヌクレオチドは５’末端および／または３’末端から５〜１５ヌクレオチド伸長している。他の一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは５’末端および／または３’末端から全部で５ヌクレオチドまで短縮しており、その場合、該オリゴヌクレオチドは常に少なくとも１個のＣｐＧまたは亜硫酸水素塩処理ＣｐＧに対して特異的なままである。
【０１６１】
さらなる一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、前記オリゴヌクレオチド内の任意の部位、すなわち、前記オリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、またはその間のいずれかの部位、のメチル化が異なる部位に対して特異的な、前記の少なくとも１個のヌクレオチドを含む。特に好ましい一実施形態において、メチル化が異なる部位に対して特異的な前記の少なくとも１個のヌクレオチドは、前記ヌクレオチドの３’末端に位置する。これは、特異性が高いという利点を有する。
【０１６２】
さらなる一実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号３〜４３６からなる群より選択され；より好ましくは配列番号３〜１１２、または配列番号１１３〜２２０、または配列番号２２１〜３３６、または配列番号３３７〜４３６；さらに好ましくは配列番号３〜５７、または配列番号５８〜１１２、または配列番号１１３〜１６６、または配列番号１６７〜２２０、または配列番号２２１〜２７８、または配列番号２７９〜３３６、または配列番号３３７〜３８６、または配列番号３８７〜４３６である。
【０１６３】
さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号４３７〜６１２からなる群より選択され；より好ましくは配列番号４３７〜４７６、または配列番号４７７〜５２２、または配列番号５２３〜５７０、または配列番号５７１〜６１２；さらに好ましくは配列番号４３７〜４５６、または配列番号４５７〜４７６、または配列番号４７７〜４９９、または配列番号５００〜５２２、または配列番号５２３〜５４６、または配列番号５４７〜５７０、または配列番号５７１〜５９１、または配列番号５９２〜６１２である。
【０１６４】
さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号６１３〜１０４８からなる群より選択され；より好ましくは配列番号６１３〜７０８、または配列番号７０９〜７９６、または配列番号７９７〜９２２、または配列番号９２３〜１０４８；さらに好ましくは配列番号６１３〜６６０、または配列番号６６１〜７０８、または配列番号７０９〜７５２、または配列番号７５３〜７９６、または配列番号７９７〜８５９、または配列番号８６０〜９２２、または配列番号９２３〜９８５、または配列番号９８６〜１０４８である。
【０１６５】
さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは１０４９〜１２２７からなる群より選択され；より好ましくは配列番号１０４９〜１１４５、または配列番号１１４６〜１２２７；さらに好ましくは配列番号１０４９〜１０９６、または配列番号１０９７〜１１４５、または配列番号１１４６〜１１９２、または配列番号１１９３〜１２２７である。
【０１６６】
さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１２２８〜１２５７からなる群より選択され；より好ましくは配列番号１２２８〜１２４３、または配列番号１２４４〜１２５７；さらに好ましくは配列番号１２２８〜１２３７、または配列番号１２３８〜１２４３、または配列番号１２４４〜１２５０、または配列番号１２５１〜１２５７である。
【０１６７】
さらなる実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは配列番号１２５８〜１４１５からなる群より選択され；より好ましくは配列番号１２５８〜１３２３、または配列番号１３２４〜１４１５；さらに好ましくは配列番号１２５８〜１２８９、または配列番号１２９０〜１３２３、または配列番号１３２４〜１３７１、または配列番号１３７２〜１４１５である。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】本発明の好ましい一実施形態による、異なる希釈段階における腫瘍ＤＮＡ（および正常な尿路上皮）の相対ＤＮＡメチル化の測定の結果を示す。
【０１６９】
【図２】本発明の好ましい一実施形態による、正常被検者との比較における４つの患者試料の相対ＤＮＡ脱メチル化測定の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１７０】
実施例１
尿路上皮癌細胞株ＨＴ１３７６からのＤＮＡ、尿路上皮癌からのＤＮＡおよび正常な膀胱上皮からのＤＮＡを市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ；ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ｂｌｏｏｄ  ｋｉｔ）を用いて単離した。尿路上皮癌細胞株のＤＮＡを、正常な膀胱上皮からのＤＮＡを用いて、各種希釈段階で希釈した。次いで、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて各種組成中のＤＮＡの亜硫酸水素塩処理を行った。次に、本発明による個々の試料の相対メチル化レベルの測定を、前記の正常な膀胱上皮からのＤＮＡとの比較において行った。
【０１７１】
各試料に対して、各値を３回測定し、平均値を算出した。
【０１７２】
増幅をリアルタイムＰＣＲによって行った。プライマーは次のＬＩＮＥ−１プロモーター配列に特異的なものを用いた：
フォワードプライマーに、
５’−ＧＣＧＣＧＡＧＴＣＧＡＡＧＴＡＧＧＧＣ；
リバースプライマーに
５’−ＣＴＣＣＧＡＡＣＣＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＣＴＣＧ。
【０１７３】
これら２つのプライマーはＬＩＮＥ−１エレメントの１９３ｂｐの領域を挟むもので、メチル化ＤＮＡに特異的である。
【０１７４】
常に非メチル化されている領域に対しては、次の配列を有するプライマーを用いた：
フォワードプライマーに、
５’−ＡＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＧＴＡＧＧＧＴＡＴＡＧ；
リバースプライマーに、
５’−ＣＣＣＣＴＡＣＴＡＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＡＡＡＣ。
【０１７５】
ＰＣＲを次の条件（反応あたり）で行った：
【０１７６】
【表１９】
2016019526.tif 000020
試薬
容量（μｌ）
Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ）
１２．５
５’プライマー、１０ｐｍｏｌ／ｍｌ
１
３’プライマー、１０ｐｍｏｌ／ｍｌ
１
ＤＮＡ（１０ｎｇ）
１
水
１０．５
計
２５
【０１７７】
【表２０】
2016019526.tif 000021
サイクラー条件
９５℃  １５分間
９５℃  ５５秒間
５４℃  ３０秒間    ３５×
７２℃  ３０秒間
４℃  ∞
【０１７８】
メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いた試験の結果を図１に示す。正常な尿路上皮からのＤＮＡとの１：１０混合物からの、２ｎｇの腫瘍ＤＮＡの信頼性の高い検出が達成されうることが分かる。
【０１７９】
実施例２
脱メチル化ＬＩＮＥ−１配列に対して特異的なプライマーを用いて実施例１が繰り返された。
【０１８０】
これらのプライマーは次の配列であった：
フォワードプライマーに、
５’−ＧＴＧＴＧＴＡＴＴＧＴＧＴＧＴＧＡＧＴＴＧＡＡＧＴＡＧＧＧＴ
リバースプライマーに、
５’−ＡＣＣＣＴＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＡＴＣＴＣＡ
【０１８１】
これら２つのプライマーはＬＩＮＥ−１エレメントの２０７ｂｐの領域を挟み、脱メチル化ＤＮＡに特異的である。
【０１８２】
しかし、正常被検者および尿路上皮癌患者からの尿試料を試料として用いた。１ｍｌの尿および１０ｎｇの亜硫酸水素塩処理ＤＮＡを用いた。
【０１８３】
図２にこの実験の結果を示す。６のコントロール試料と比較して有意な低メチル化を、尿路上皮癌患者からの４試料のうち３試料で検出することができたことが分かる。
【０１８４】
実施形態
Ｅ１．
標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスであって、
ａ）ＤＮＡにおけるトランスポゾンまたはその断片の存在の定量的測定；
ｂ）前記トランスポゾンまたはその断片内における、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１個のメチル化が異なるＣの存在の定量的測定；および
ｃ）工程ａ）およびｂ）で測定された値による、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルの決定；
の工程を含むプロセス。
【０１８５】
Ｅ２．
前記トランスポゾンまたはその断片が、ＬＩＮＥエレメント、ＬＩＮＥ−１エレメント、Ａｌｕエレメント、ＨＥＲＶエレメント、および好ましくはＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域からなる群より選択される、実施形態Ｅ１記載のプロセス。
【０１８６】
Ｅ３．
工程ａ）および／または工程ｂ）の前記ＤＮＡが亜硫酸水素塩処理ＤＮＡである、実施形態Ｅ１記載のプロセス。
【０１８７】
Ｅ４．
実施形態Ｅ３記載のプロセスであって、
工程ａ）が：トランスポゾンまたはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩未処理ＤＮＡの増幅、または、亜硫酸水素塩処理トランスポゾンもしくはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマーが前記トランスポゾンのメチル化の異なる部位を含まない増幅；を含み、
工程ｂ）が：前記トランスポゾンまたはその断片に特異的な、少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマー対は前記トランスポゾンの少なくとも１つのメチル化が異なる部位を含むプライマーを少なくとも１つ含む増幅；を含み、
工程ｃ）が：工程ａ）およびｂ）において形成された増幅産物の比率によって、標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）ＤＮＡメチル化レベルを決定すること；を含む、
プロセス。
【０１８８】
Ｅ５．
工程ｂ）の前記プライマー対の両プライマーが前記トランスポゾンのメチル化が異なる部位を少なくとも１個含む、実施形態Ｅ４記載のプロセス。
【０１８９】
Ｅ６．
工程ｂ）の前記プライマーが前記トランスポゾンの２、３または４個のメチル化が異なる部位を含む、実施形態Ｅ４記載のプロセス。
【０１９０】
Ｅ７．
前記プライマーがその３’末端に前記トランスポゾンのメチル化が異なる部位を有する、実施形態Ｅ４記載のプロセス。
【０１９１】
Ｅ８．
工程ｂ）の前記の少なくとも１個のプライマーが配列番号３〜１０４８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｅ４記載のプロセス。
【０１９２】
Ｅ９．
工程ａ）およびｂ）の前記増幅がリアルタイムＰＣＲによって行われる、実施形態Ｅ４記載のプロセス。
【０１９３】
Ｅ１０．
相対ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスであって：
ｄ）請求項１の工程ａ）〜ｃ）による、第１のＤＮＡおよび第２のＤＮＡに対するメチル化レベルの測定；および
ｅ）前記第１および第２のＤＮＡに対して測定されたメチル化レベルの比による、相対ＤＮＡメチル化レベルの決定；
の工程を含むプロセス。
【０１９４】
Ｅ１１．
ＤＮＡメチル化の変化と関連した疾患の診断のための、実施形態Ｅ１０記載のプロセスであって、前記第１のＤＮＡが標準試料であり、前記第２のＤＮＡが試験対象の試料に由来するものである、プロセス。
【０１９５】
Ｅ１２．
前記疾患が腫瘍である、実施形態Ｅ１１記載のプロセス。
【０１９６】
Ｅ１３．
配列番号３〜配列番号１４１５からなる群より選択され、、好ましくは配列番号３〜配列番号４３６および／または配列番号１０４９〜１２２７、のオリゴヌクレオチド。
【０１９７】
Ｅ１４．
標準化（ｎｏｒｍｉｅｒｔｅｎ）および／または相対ＤＮＡメチル化レベルの測定のための、少なくとも１個の実施形態Ｅ１３記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【図１】
2016019526.tif 000022
【図２】
2016019526.tif 000023
【配列表】
2016019526000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月31日(2015.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標準化ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスであって、
ａ）ＤＮＡにおけるトランスポゾンまたはその断片の存在の定量的測定；
ｂ）前記トランスポゾンまたはその断片内における、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１個のメチル化が異なるＣの存在の定量的測定；および
ｃ）工程ａ）およびｂ）で測定された値による、標準化ＤＮＡメチル化レベルの決定；
の工程を含むプロセス。
【請求項２】
前記トランスポゾンまたはその断片が、ＬＩＮＥエレメント、ＬＩＮＥ−１エレメント、Ａｌｕエレメント、ＨＥＲＶエレメント、および好ましくはＬＩＮＥ−１エレメントのプロモーター領域からなる群より選択される、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
工程ａ）および／またはｂ）の前記ＤＮＡが亜硫酸水素塩処理ＤＮＡである、請求項１記載のプロセス。
【請求項４】
請求項３に記載のプロセスであって、
工程ａ）が：トランスポゾンまたはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩未処理ＤＮＡの増幅、または、亜硫酸水素塩処理トランスポゾンもしくはその断片に特異的な少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマーが前記トランスポゾンのメチル化の異なる部位を含まない増幅；を含み、
工程ｂ）が：前記トランスポゾンまたはその断片に特異的な、少なくとも１つのプライマー対による亜硫酸水素塩処理ＤＮＡの増幅であって、前記プライマー対は前記トランスポゾンの少なくとも１つのメチル化が異なる部位を含むプライマーを少なくとも１つ含む増幅；を含み、
工程ｃ）が：工程ａ）およびｂ）において形成された増幅産物の比率によって、標準化ＤＮＡメチル化レベルを決定すること；を含む、
プロセス。
【請求項５】
工程ｂ）の前記プライマー対の両プライマーが前記トランスポゾンの少なくとも１つのメチル化が異なる部位を含む、請求項４記載のプロセス。
【請求項６】
工程ｂ）の前記プライマーが前記トランスポゾンの２、３または４個のメチル化が異なる部位を含む、請求項４記載のプロセス。
【請求項７】
前記プライマーが前記トランスポゾンのメチル化が異なる部位を、その３’末端に含む、請求項４記載のプロセス。
【請求項８】
工程ｂ）の前記少なくとも１個のプライマーが配列番号３〜１０４８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項４記載のプロセス。
【請求項９】
工程ａ）およびｂ）の前記増幅がリアルタイムＰＣＲによって行われる、請求項４記載のプロセス。
【請求項１０】
相対ＤＮＡメチル化レベルの決定のためのプロセスであって：
d）請求項１の工程ａ）〜ｃ）による、第１のＤＮＡおよび第２のＤＮＡに対するメチル化レベルの測定；および
ｅ）前記第１および第２のＤＮＡに対して測定されたメチル化レベルの比による、相対ＤＮＡメチル化レベルの決定；
の工程を含むプロセス。
【請求項１１】
ＤＮＡメチル化の変化と関連した疾患の診断のための、請求項１０記載のプロセスであって、前記第１のゲノムＤＮＡが標準試料であり、前記第２のゲノムＤＮＡが試験対象の試料に由来するものである、プロセス。
【請求項１２】
前記疾患が腫瘍である、請求項１１記載のプロセス。
【請求項１３】
配列番号３〜配列番号１４１５からなる群より選択される、オリゴヌクレオチドであって、好ましくは配列番号３〜配列番号４３６および／または配列番号１０４９〜１２２７である、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
標準化および／または相対ＤＮＡメチル化レベルの測定のための、少なくとも１個の請求項１３記載のオリゴヌクレオチドの使用。