(57)【要約】【課題】Ｋｌｆ４発現誘導方法およびＫｌｆ４発現誘導剤を提供する。【解決手段】細胞をカルボニル化合物に接触させる工程を備えるＫｌｆ４発現誘導方法、およびカルボニル化合物を含むＫｌｆ４発現誘導剤。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をカルボニル化合物に接触させる工程を備える、Ｋｌｆ４発現誘導方法。
【請求項２】
前記カルボニル化合物が１分子中に少なくとも２個のカルボニル基を有する、１分子中に少なくとも２個のホルミル基を有する、または１分子中に少なくとも１個のカルボニル基と少なくとも１個のホルミル基とを有する、請求項１に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
【請求項３】
前記カルボニル化合物が下記式（Ａ）で表される化合物である、請求項１または２に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
【化１】
2016174561.tif 000006
ただし、式（Ａ）中、Ｒは、水素原子、または１つ以上の水素原子がヒドロキシ基またはハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基もしくは炭素数２〜１０のアルケニル基を表す。
【請求項４】
前記カルボニル化合物がメチルグリオキサール、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサールおよびイソプロピルグリオキサールからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
【請求項５】
前記細胞が上皮系細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
【請求項６】
前記上皮系細胞が上皮細胞、内皮細胞および中皮細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
【請求項７】
前記細胞が中皮細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
【請求項８】
カルボニル化合物を含むＫｌｆ４発現誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｋｌｆ４発現誘導方法およびＫｌｆ４発現誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、胚が不要であることから、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に比べて倫理的問題が少ない、また、患者自身の細胞から樹立することができることから、移植した際の拒絶反応が少ない、というメリットがあり、特に再生医療分野で注目を集めている。
【０００３】
ヒト細胞に山中因子と呼ばれるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの４遺伝子を導入し強制発現させることによって、遺伝子発現やエピジェネティック修飾プロファイルがＥＳ細胞とほぼ同等のｉＰＳ細胞を樹立できることが報告された（非特許文献１）。後に、がん遺伝子ｃ−Ｍｙｃを除いた３遺伝子を導入することによってもｉＰＳ細胞を作製できることが明らかとなった（非特許文献２）。
【０００４】
また、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを代替しうる遺伝子の探索も行われており、例えば、特許文献１には、Ｋｌｆ４を代替しうる因子として、Ｏｖｏｌファミリーに属する遺伝子などが開示されている。
【０００５】
しかしながら、レトロウイルスを用いて遺伝子を導入することによる細胞がん化のリスクは残ることから、化学物質を作用させることにより、遺伝子を導入しないで、あるいは導入する遺伝子の数を減らして、ｉＰＳ細胞を作製することが研究されている。
【０００６】
例えば、非特許文献３には、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤であるバルプロ酸（ＶＰＡ，ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ、ＣＡＳ  Ｎｏ．９９-６６-１）を用いることにより、Ｏｃｔ４とＳｏｘ２の２遺伝子のみを導入することによりヒトｉＰＳ細胞を作製したことが開示され、非特許文献４には、サイクリン依存キナーゼ阻害剤であるケンパウロン（ＣＡＳ  Ｎｏ．１４２２７３−２０−９）を用いることにより、Ｋｌｆ４は導入せず、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびとｃ−Ｍｙｃの３遺伝子だけでｉＰＳ細胞を作製したことが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１４１１８１号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Takahashi, K.、外６名、「Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.」、Cell、2007年11月30日、第131巻、第5号、ｐ．861−872
【非特許文献２】Nakagawa, M.、外９名、「Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts.」、Nature Biotechnology、2008年1月、第26巻、第1号、ｐ．101−106
【非特許文献３】Huangfu1, D.、外７名、「Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only Oct4 and Sox2」、Nature Biotechnology、2008年11月、第26巻、第11号、ｐ．1269−1275
【非特許文献４】Lyssiotis, C. A.、外１５名、「Reprogramming of murine fibroblasts to induced pluripotent stem cells with chemical complementation of Klf4.」、Proceedings of National Academy of Sciences of the USA、2009年6月2日、第106巻、第22号、ｐ．8912−8917
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｋｌｆ４を導入せずにＫｌｆ４高発現細胞を作製することができれば有用である。
そこで、本発明は、Ｋｌｆ４発現誘導方法およびＫｌｆ４発現誘導剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、細胞をカルボニル化合物に接触させるとＫｌｆ４を発現誘導することができて、Ｋｌｆ４高発現細胞を作製することができることを知得し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
本発明は、以下に掲げるものである。
（１）細胞をカルボニル化合物に接触させる工程を備える、Ｋｌｆ４発現誘導方法。
（２）カルボニル化合物が１分子中に少なくとも２個のカルボニル基を有する、１分子中に少なくとも２個のホルミル基を有する、または１分子中に少なくとも１個のカルボニル基と少なくとも１個のホルミル基とを有する、（１）に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
（３）カルボニル化合物が下記式（Ａ）で表される化合物である、（１）または（２）に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
【化１】
2016174561.tif 000003
ただし、式（Ａ）中、Ｒは、水素原子、または１つ以上の水素原子がヒドロキシ基またはハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基もしくは炭素数２〜１０のアルケニル基を表す。
（４）カルボニル化合物がメチルグリオキサール、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサールおよびイソプロピルグリオキサールからなる群から選択される少なくとも１種である、（１）〜（３）のいずれか１つに記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
（５）細胞が上皮系細胞である、（１）〜（４）のいずれか１つに記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
（６）上皮系細胞が上皮細胞、内皮細胞および中皮細胞からなる群から選択される少なくとも１種である、（５）に記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
（７）細胞が中皮細胞である、（１）〜（６）のいずれか１つに記載のＫｌｆ４発現誘導方法。
（８）カルボニル化合物を含むＫｌｆ４発現誘導剤。
（９）カルボニル化合物が１分子中に少なくとも２個のカルボニル基を有する、１分子中に少なくとも２個のホルミル基を有する、または１分子中に少なくとも１個のカルボニル基と少なくとも１個のホルミル基とを有する、（８）に記載のＫｌｆ４発現誘導剤。
（１０）カルボニル化合物が下記式（Ａ）で表される化合物である、（８）または（９）に記載のＫｌｆ４発現誘導剤。
【化２】
2016174561.tif 000004
ただし、式（Ａ）中、Ｒは、水素原子、または１つ以上の水素原子がヒドロキシ基またはハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基もしくは炭素数２〜１０のアルケニル基を表す。
（１１）カルボニル化合物がメチルグリオキサール、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサールおよびイソプロピルグリオキサールからなる群から少なくとも１種選択される、（８）〜（１０）のいずれか１つに記載のＫｌｆ４発現誘導剤。
（１２）さらに、製薬学的に許容しうる担体を含む、（８）〜（１１）のいずれか１つに記載のＫｌｆ４発現誘導剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｋｌｆ４発現誘導方法およびＫｌｆ４発現誘導剤を提供することができる。
また、本発明によれば、Ｋｌｆ４高発現細胞を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はＫｌｆ４およびＣｄｋｎ１ａの遺伝子発現量を示すグラフである。
【図２】図２はメチルグリオキサール（ＭＧＯ）投与による腹膜中皮細胞の形態変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、「高発現」とは、遺伝子発現量が対照群に比べて多いことをいう。
本発明において、遺伝子シンボルは、全ての文字を大文字で表すべき場合であっても、語頭のみ大文字で、残りを小文字で表す。タンパク質名は遺伝子シンボルと同じだが、全ての文字を大文字で表す。
【００１５】
［Ｋｌｆ４発現誘導方法］
本発明のＫｌｆ４発現誘導方法は、細胞をカルボニル化合物に接触させる工程を備える点に特徴を有する。以下では、本発明のＫｌｆ４発現誘導方法について、詳細に説明する。
【００１６】
〈カルボニル化合物〉
本発明のＫｌｆ４発現誘導方法に用いるカルボニル化合物は、１分子中に少なくとも１個のカルボニル基または少なくとも１個のホルミル基を有する化合物であれば特に限定されず使用することができる。
このようなカルボニル化合物としては、特に限定するものではないが、例えば、プロパノン（アセトン）、２−ブタノン（エチルメチルケトン）、３−ペンタノン（ジエチルケトン）、２，４−ペンタンジオン（アセチルアセトン）、シクロヘキサノン、４−ヘキセン−２−オン、４−オキソペンタン酸、２−メチルシクロペンタノン、３−ブテン−２−オン（メチルビニルケトン）、アセトフェノン（メチルフェニルケトン）、プロピオフェノン（エチルフェニルケトン）、ベンゾフェノン（ジフェニルケトン）、カルコン（フェニル（２−フェニルエテニル）ケトン）、３−メチル−３−シクロヘキセノン、５−イソプロピル−２−メチル−２−シクロヘキセノン、２−メチル−３−ペンタノン、２，３−ブタンジオン（ジアセチル、ＤＡ）、２，３−ペンタンジオン（ＰＤ）、メタナール（ホルムアルデヒド）、エタナール（アセトアルデヒド）、２−ヒドロキシアセトアルデヒド（グリコールアルデヒド）、プロパナール（プロピオンアルデヒド）、２−ヒドロキシプロパナール、２，３−ジヒドロキシプロパナール（グリセルアルデヒド）、ブタナール（ブチルアルデヒド）、３−メチルブタナール、３−クロロプロパナール、３−ヒドロキシブタナール、２−プロペナール（アクロレイン）、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、シクロペンタンカルボアルデヒド（ホルミルシクロペンタン）、２−シクロヘキセンカルボアルデヒド、ベンゼンカルボアルデヒド（ベンズアルデヒド）、２−ヒドロキシベンズアルデヒド（サリチルアルデヒド）、４−メトキシベンズアルデヒド（アニスアルデヒド）、３−ホルミル安息香酸メチル、エタンジアール（グリオキサール、ＧＯ）、プロパンジアール（マロンジアルデヒド）、１，５−ペンタンジアール（グルタルアルデヒド）、２−ペプテン−１，７−ジアール、ｐ−ベンゼンジカルボアルデヒド（テレフタルアルデヒド）、１，２−シクロヘキセンジカルボアルデヒド、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサール、イソプロピルグリオキサール、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）、３，４−ジデオキシグルコソン−３−エンなどを挙げることができる。
【００１７】
また、本発明のＫｌｆ４発現誘導方法に用いるカルボニル化合物は、１分子中に少なくとも２個のカルボニル基を有する化合物、１分子中に少なくとも２個のホルミル基を有する化合物および１分子中に少なくとも１個のカルボニル基と少なくとも１個のホルミル基とを有する化合物からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
上記１分子中に少なくとも２個のカルボニル基を有するカルボニル化合物としては、特に限定するものではないが、例えば、２，３−ブタンジオン（ジアセチル、ＤＡ）、２，３−ペンタンジオン（ＰＤ）等を挙げることができる。
上記１分子中に少なくとも２個のホルミル基を有するカルボニル化合物としては、特に限定するものではないが、例えば、エタンジアール（グリオキサール、ＧＯ）、プロパンジアール（マロンジアルデヒド）、１，５−ペンタンジアール（グルタルアルデヒド）、２−ペプテン−１，７−ジアール、ｐ−ベンゼンジカルボアルデヒド（テレフタルアルデヒド）等を挙げることができる。
上記１分子中に少なくとも１個のカルボニル基と少なくとも１個のホルミル基とを有するカルボニル化合物としては、特に限定するものではないが、例えば、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサール、イソプロピルグリオキサール、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）、３，４−ジデオキシグルコソン−３−エン等を挙げることができる。
【００１８】
また、本発明のＫｌｆ４発現誘導方法に用いるカルボニル化合物は、下記式（Ａ）で表されるカルボニル化合物からなる群から選択される少なくとも１種がより好ましい。
【００１９】
【化３】
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【００２０】
ただし、式（Ａ）中、Ｒは、水素原子、または１つ以上の水素原子がヒドロキシ基またはハロゲン原子で置換されていてもよい炭素数１〜１０のアルキル基もしくは炭素数２〜１０のアルケニル基を表す。
式（Ａ）で表されるカルボニル化合物としては、特に限定するものではないが、例えば、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサール、イソプロピルグリオキサール、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）等を挙げることができる。
【００２１】
本発明のＫｌｆ４発現誘導方法に用いるカルボニル化合物は、エタンジアール（グリオキサール、ＧＯ）、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサール、イソプロピルグリオキサールおよび３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）からなる群から選択される少なくとも１種がさらに好ましく、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）、エチルグリオキサール、ｎ−プロピルグリオキサールおよびイソプロピルグリオキサールからなる群から選択される少なくとも１種がいっそう好ましい。
【００２２】
上記カルボニル化合物は、当該カルボニル化合物を有効成分として含むＫｌｆ４発現誘導剤の形で、細胞と接触させてもよい。Ｋｌｆ４発現誘導剤については後述する。
【００２３】
〈細胞〉
本発明においては、本発明のＫｌｆ４発現誘導方法を適用して、Ｋｌｆ４高発現細胞を作製するための出発材料として、いかなる哺乳動物（例、マウス、ラット、ヒト）由来細胞も用いることができる。例えば、体細胞としては、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、Ｉ型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が、生殖細胞としては、卵原細胞、卵母細胞、精原細胞、精母細胞等が挙げられる。体細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明におけるＫｌｆ４高発現細胞の起源として使用することができる。未分化な前駆細胞の例としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。
【００２４】
体細胞のソースとなる哺乳動物の選択は特に制限されないが、得られるＫｌｆ４高発現細胞、またはその核初期化・分化を誘導することによって得られた移植細胞をヒトの再生医療用途に使用する場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、体細胞は、患者本人の細胞、または患者のＨＬＡ（ヒト白血球抗原、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）型と同一か実質的に同一のＨＬＡ型を有する他人（提供者）から採取した細胞であることが特に好ましい。ここで、「実質的に同一のＨＬＡ型」とは、提供者の体細胞由来のＫｌｆ４高発現細胞、またはその核初期化・分化を誘導することによって得られた移植細胞が、患者に移植されるときに免疫抑制剤などの使用とともに移植され得る程度に、提供者のＨＬＡ型が患者のＨＬＡ型と適合していることを意味する。例えば、実質的に同一のＨＬＡ型は、３つの主要なＨＬＡである、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲが受容者と一致するようなＨＬＡ型を含む。また、ヒトに投与（移植）しない場合でも、例えば、患者の薬剤感受性や副作用を評価するためのスクリーニング用の細胞のソースとして得られたＫｌｆ４高発現細胞、またはその核初期化・分化を誘導することによって得られたスクリーニング用細胞を使用する場合には、同様に患者本人または薬剤感受性や副作用と相関する遺伝子多型が同一である他人から体細胞を採取する必要がある。
【００２５】
〈接触の方法〉
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるカルボニル化合物の体細胞への接触は、カルボニル化合物を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、ヒト、ラットまたはマウスなどの哺乳動物より単離した体細胞の培養に適した培地中に、カルボニル化合物が体細胞においてＫｌｆ４発現を誘導するのに十分で、かつ、細胞が死滅しない範囲となるようにカルボニル化合物溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。カルボニル化合物の接触時濃度は用いる化合物の種類および細胞培養条件によって異なり、適宜選択される。接触期間は細胞のＫｌｆ４発現が誘導されるのに十分な時間であれば特に制限はない。
体細胞の培養に適した培地としては、特に限定されるものではないが、例えば、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、約２０％までの胎仔ウシ血清を含むイーグルＭＥＭ、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地、およびこれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００２６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるカルボニル化合物の体細胞への接触は、カルボニル化合物を、ヒト、ラットまたはマウスなどの哺乳動物に投与することにより実施することができる。投与経路は、特に限定されず、例えば、内用剤としては、経口投与、口腔内投与等が挙げられる。また、注射剤としては、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与等が挙げられる。さらに、外用剤としては、皮膚投与、鼻腔投与、直腸投与、吸入投与等が挙げられる。投与経路は、細胞の種類、哺乳動物の種類、大きさ等、諸条件により適宜選択することができる。例えば、腹膜中皮細胞にカルボニル化合物を接触させる場合には、腹腔内投与が好ましく、線維芽細胞にカルボニル化合物を接触させる場合には、皮内投与が好ましい。
【００２７】
〈Ｋｌｆ４発現誘導の確認方法〉
本発明のＫｌｆ４発現誘導方法により作製した細胞がＫｌｆ４高発現細胞であることは、Ｋｌｆ４またはその下流遺伝子であるＣｄｋｎ１ａの遺伝子発現量を、例えばＰＣＲ、ノーザンブロット、マイクロアレイ法などにより測定し、対照群と比較することで確認することができる。また、抗ＫＬＦ４抗体等を用いて、例えばＥＩＡやウエスタンブロット、免疫染色などの免疫学的手法でタンパク質を検出し、対照群と比較することでも確認できる。また、形態学的には、もともとの細胞形態が紡錘形でない場合には、細胞形態が紡錘形に変化したことによって確認することができる。
【００２８】
［Ｋｌｆ４発現誘導剤］
本発明は、また、カルボニル化合物を有効成分として含むＫｌｆ４発現誘導剤である。
【００２９】
〈カルボニル化合物〉
カルボニル化合物としては、上記「Ｋｌｆ４発現誘導方法」に記載したものを使用することができる。
【００３０】
〈その他の成分〉
本発明のＫｌｆ４発現誘導剤は、投与形態等に応じて、さらに、保存剤や安定剤等の製薬学的に許容しうる担体を含んでもよい。
製薬学的に許容しうる担体とは、上記カルボニル化合物とともに投与可能な材料を意味する。かかる材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤などを挙げることができる。
【００３１】
界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
【００３２】
以下に、実施例により本発明をさらに詳細に述べるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３３】
［実施例１：遺伝子発現量解析］
（１）材料および方法
ＳＤラット（雄性、５週齢）を対照群、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）投与群およびホルムアルデヒド（ＦＡ）投与群に分け、対照群には酸性透析液（ミッドペリックＬ２５０腹膜透析液（テルモ社製）の組成でｐＨを５．０に調整した後にフィルター滅菌したもの）を、メチルグリオキサール投与群には２０ｍＭメチルグリオキサールを添加した酸性透析液（ミッドペリックＬ２５０腹膜透析液（テルモ社製）の組成液にメチルグリオキサールを添加し、さらにｐＨを５．０に調整した後にフィルター滅菌したもの）を、ホルムアルデヒド投与群には２０ｍＭホルムアルデヒドを添加した酸性透析液（ミッドペリックＬ２５０腹膜透析液（テルモ社製）の組成液にホルムアルデヒドを添加し、さらにｐＨを５．０に調整した後にフィルター滅菌したもの）を、それぞれ１回／日、１０ｍＬ／ｋｇ、２１日間連続腹腔内投与した。
２２日目にラットを安楽死させ、壁側腹膜を採取した。
【００３４】
Ｋｌｆ４およびＣｄｋｎ１ａについて、それぞれの発現レベルをマイクロアレイにより解析した。ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社製）を用いて、壁側腹膜から全ＲＮＡを分離した。分離したＲＮＡに対してアジレント２１００バイオアナライザー（アジレント社製）でＲＮＡの品質を確認した。壁側腹膜から分離した全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  ｃｕｓｏｍ  ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて逆転写した。得られたｃＤＮＡをもとにＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（アンビオン社製）により、ビオチン標識したアンチセンスｃＲＮＡを作製した。得られたｃＲＮＡの長さをバイオアナライザー（アジレント社製）で確認した後、マイクロアレイ（ニンブルジェン社）で解析した。マイクロアレイから得られた蛍光強度を元に、ＲＮＡ（Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ｃｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）アルゴリズムによるデータ補正を行い、解析を行った。
各群のＫｌｆ４およびＣｄｋｎ１ａの遺伝子発現量を対照群に対する相対値（倍）として図１に示す。
【００３５】
（２）結果および解説
図１に示すとおり、Ｋｌｆ４の遺伝子発現量は、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）投与群では、対照群の約１．８倍まで増加していた。このことから、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）およびホルムアルデヒド（ＦＡ）は、いずれも、Ｋｌｆ４の発現を誘導することが示された。
また、図１に示すとおり、Ｋｌｆ４の下流遺伝子であるＣｄｋｎ１ａの発現量は、ＭＧＯ投与群では対照群の約７．１倍にまで増加していた。一方、ＦＡ投与群では対照群と同等レベルであった。このことから、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）は、優れたＫｌｆ４発現誘導物質であると考えられる。
【００３６】
［実施例２：腹膜中皮細胞の形態変化］
（１）材料および方法
ＳＤラット（雄性、５週齢）を対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、およびメチルグリオキサール投与群（ＭＧＯ）に分け、対照群には酸性透析液（ミッドペリックＬ２５０腹膜透析液（テルモ社製）と同じ組成でｐＨを５．０に調整した後にフィルター滅菌したもの）を、メチルグリオキサール投与群には２０ｍＭメチルグリオキサールを添加した酸性透析液（ミッドペリックＬ２５０腹膜透析液（テルモ社製）の組成液にメチルグリオキサールを添加し、さらにｐＨを５．０に調整した後にフィルター滅菌したもの）を、それぞれ１回／日、２１日間連続腹腔内投与した。
２２日目にラットを安楽死させ、腹壁内面の壁側腹膜を採取した。
採取した壁側腹膜は、ホルマリン固定の後、ヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）染色してし、腹膜中皮細胞の顕微鏡観察を行った。結果を図２に示す。
【００３７】
（２）結果および解説
対照群の腹膜中皮細胞は、図２Ａに示すように、敷石状を呈していたのに対し、ＭＧＯ投与群の腹膜中皮細胞は、図２Ｂに示すように、紡錘型に変化していた。
このような細胞の形態変化は、そのメカニズムは不明であるが、実施例１の結果を考慮すれば、メチルグリオキサール（ＭＧＯ）に接触した腹膜中皮細胞がＫｌｆ４を発現したことによるものと考えられる。
また、核は未分化な細胞によく見られる好塩基性を示したことから、これらの細胞は幼若な中皮細胞と推察される。
【図１】
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【図２】
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