(57)【要約】【課題】本発明は、所望の細胞を効率的に選別する方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、（ａ）細胞を培養・増殖して、細胞コロニーを形成させる工程、（ｂ）形成した細胞コロニーに電気的刺激を与える工程、及び（ｃ）所望の細胞コロニーを分離する工程を含む、細胞を選別する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）細胞を培養・増殖して、細胞コロニーを形成させる工程、
（ｂ）形成した細胞コロニーに電気的刺激を与える工程、及び
（ｃ）所望の細胞コロニーを分離する工程
を含む、細胞を選別する方法。
【請求項２】
工程（ａ）において、第一電極を備える基板に接着した細胞を培養・増殖する、請求項１に記載の細胞を選別する方法。
【請求項３】
工程（ｂ）において、第一電極に対向して第二電極を配置し、第一電極を正極、第二電極を負極として細胞コロニーに電気的刺激を与える、請求項２に記載の細胞を選別する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞を選別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオ医薬品の開発が盛んに行われている。バイオ医薬品を製造する場合、目的遺伝子を発現しており、且つ増殖性の高い細胞を選別する必要がある。従来は、ベクター内に目的遺伝子の他に抗生物質耐性遺伝子を組み込み、培養液中に所定の抗生物質を加え、マイクロウェルプレートを用いて経時的に細胞を観察し、ベクターが導入されていない細胞を除去することによって細胞を選別していた。また、増殖性の高い細胞を選別する方法として、限外希釈法により、多量のマイクロウェルプレートを用いて細胞を観察し、大きなコロニーを形成した細胞を選別する方法も知られている。しかし、マイクロウェルプレートを観察することは、非常に手間及び時間がかかる。
【０００３】
最近、細胞を選別する方法として、上記の方法以外の方法も開発されている。例えば、非特許文献１には、抗生物質耐性遺伝子を用いずに、抗体を用いて所望の細胞を選別する方法が記載されている。また、特許文献１には、透光性を有する基板の少なくとも一方の主表面にマイクロウェル層を有し、上記マイクロウェル層は、可視光領域における自家蛍光性を有さない材料からなり、上記マイクロウェル層が有する複数のマイクロウェルは、１つのマイクロウェルに１つの生体細胞のみを収容する形状と寸法を有し、上記マイクロウェルは、その底面が上記生体細胞に無害で、かつ可視光領域における透光性を有するバリア部材の表面からなり、上記バリア部材からなる底面と上記基板の表面との間に磁性部材を有し、上記磁性部材は、上記マイクロウェルの底面を平面視したときに、１又は２以上の開口部を有し、上記バリア部材からなる上記マイクロウェル底面から、上記磁性部材の開口部を経て上記基板の底部面までの部分は、可視光領域における透光性を有する、上記マイクロウェルに収容された細胞から発せられる可視光領域に発光波長ピークを有する蛍光を、基板底部側から上記磁性部材の開口部を介して観察する方法に用いるためのマイクロウェルアレイチップが記載されている。
【０００４】
しかし、上記の非特許文献１の方法及び特許文献１の方法は、一度に多量の増殖性の高い細胞を選別することができないという点で非効率的である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５３６５７３６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Masahiro Kawahara; Hiroshi Ueda; Sumiyo Morita; Kouhei Tsumoto; Izumi Kumagai; Teruyuki Nagamune, Nucleic Acids Research, 2003, Vol.31, No.7 e32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、従来の細胞の選別方法には、その効率性について改善の余地がある。それ故、本発明は、所望の細胞を効率的に選別する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するための手段を種々検討した結果、細胞コロニーに電気的刺激を与えることにより、所望の細胞を効率的に選別することが可能になることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）（ａ）細胞を培養・増殖して、細胞コロニーを形成させる工程、
（ｂ）形成した細胞コロニーに電気的刺激を与える工程、及び
（ｃ）所望の細胞コロニーを分離する工程
を含む、細胞を選別する方法。
（２）工程（ａ）において、第一電極を備える基板に接着した細胞を培養・増殖する、（１）に記載の細胞を選別する方法。
（３）工程（ｂ）において、第一電極に対向して第二電極を配置し、第一電極を正極、第二電極を負極として細胞コロニーに電気的刺激を与える、（２）に記載の細胞を選別する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、所望の細胞を効率的に選別する方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の細胞を選別する方法は、
（ａ）細胞を培養・増殖して、細胞コロニーを形成させる工程、
（ｂ）形成した細胞コロニーに電気的刺激を与える工程、及び
（ｃ）所望の細胞コロニーを分離する工程
を含む。
【００１３】
工程（ａ）においては、細胞を培養・増殖して、細胞コロニー（細胞集団）を形成させる。本発明では、細胞を培養・増殖して形成した細胞コロニーの電気的刺激に対する応答性の違いを利用することによって、所望の細胞を選別することができる。
【００１４】
本発明に用いられる細胞は、血球系細胞やリンパ系細胞等の浮遊細胞でもよいし接着性細胞でもよいが、好ましくは、基板への接着性の観点から、接着性細胞が用いられる。本発明に用いられる細胞としては、例えば、肝がん細胞、グリオーマ細胞、結腸がん細胞、腎がん細胞、膵がん細胞、前立腺がん細胞、大腸がん細胞、乳がん細胞、肺がん細胞、卵巣がん細胞等のがん細胞、肝臓の実質細胞である肝細胞、クッパー細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞等の内皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、破骨細胞、歯根膜由来細胞、表皮角化細胞等の表皮細胞、気管上皮細胞、消化管上皮細胞、子宮頸部上皮細胞、角膜上皮細胞等の上皮細胞、乳腺細胞、ペリサイト、平滑筋細胞や心筋細胞等の筋細胞、腎細胞、卵巣細胞、膵ランゲルハンス島細胞、末梢神経細胞や視神経細胞等の神経細胞、軟骨細胞、骨細胞等が挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、あるいは、それらを何代か継代させたものでもよい。さらに、これらの細胞は、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞、単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞、分化が終了した細胞のいずれであってもよい。また、これらの細胞は、遺伝子組換え（ノックイン、ノックアウト、トランスジェニック）等により遺伝的に改変された細胞であってもよい。また、細胞は単一種を培養してもよいし２種以上の細胞を共培養してもよい。本発明に用いられる具体的な細胞としては、例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（マウス胎仔線維芽細胞）、３Ｔ３−Ｓｗｉｓｓ  ａｌｂｉｎｏ細胞（マウス胎仔線維芽細胞）、Ａ５４９細胞（ヒト肺腺がん細胞）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部類上皮腫細胞）、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル正常腎細胞）、２９３（ヒト胎児腎細胞）、３Ｔ３−Ｌ１（マウス線維芽細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝がん由来細胞）、ＭＣＦ−７（ヒト乳がん由来細胞）、Ｖ７９（チャイニーズハムスター由来線維芽細胞）、ＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎臓由来細胞）、ＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣由来細胞）、ＷＩ−３８（ヒト肺線維芽細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎由来細胞）、ＭＲＣ−５（正常肺線維芽細胞）、ウシ血管内皮細胞等が挙げられる。
【００１５】
工程（ａ）において、好ましくは、細胞を基板上に播種し、接着させ、基板に接着した細胞を培養・増殖する。基板に接着した細胞には、容易に電気的刺激を与えることができる。
【００１６】
本発明において、基板上への細胞の播種方法については特に制限はなく、例えば、朝倉書店発行「日本組織培養学会編組織培養の技術（１９９９年）」２６６〜２７０頁等に記載されている方法が使用できる。また、本発明において、浮遊性細胞を用いる場合には、基板に接着性材料を用いること等によって、細胞を基板に接着することができる。
【００１７】
本発明において、基板上への細胞の播種量は、播種した細胞が細胞コロニーを形成することができる量であれば特に制限はないが、好ましくは、５．０×１０３個／基板１ｃｍ２以下の量であり、より好ましくは、２．０×１０３個／基板１ｃｍ２以下の量である。基板上への細胞の播種量が、５．０×１０３個／基板１ｃｍ２以下であると、播種した細胞が細胞コロニーを容易に形成することができる。
【００１８】
細胞の培養に用いる培養液としては、当技術分野で通常用いられる細胞培養用培地であれば特に制限なく用いることができる。例えば、用いる細胞の種類に応じて、ＭＥＭ培地、ＢＭＥ培地、ＤＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＩＭＤＭ培地、ＥＳ培地、ＤＭ−１６０培地、Ｆｉｓｈｅｒ培地、Ｆ１２培地、ＷＥ培地及びＲＰＭＩ１６４０培地等、朝倉書店発行「日本組織培養学会編  組織培養の技術第三版」５８１頁に記載されているような基礎培地を用いることができる。さらに、基礎培地に血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）等）、各種増殖因子、抗生物質、アミノ酸等を加えてもよい。また、Ｇｉｂｃｏ無血清培地（インビトロジェン社）等の市販の無血清培地等を用いることができる。
【００１９】
細胞を培養する時間は、細胞が細胞コロニーを形成する時間等に左右されるが、通常１２時間〜１４日間、好ましくは２日間〜１０日間である。培養する温度は、通常３７℃である。ＣＯ２細胞培養装置等を利用して、５％程度のＣＯ２濃度雰囲気下で培養するのが好ましい。
【００２０】
本発明において、基板は、細胞を播種し、接着させ、培養・増殖するために用いられる。基板は、好ましくは、基材と、基材上に配置された第一電極とを備える。第一電極に電圧を印加することにより、基板上の細胞コロニーに電気的刺激を与えることができる。本発明の一つの実施形態では、工程（ａ）において、第一電極を備える基板に接着した細胞を培養・増殖して、細胞コロニーを形成させる。
【００２１】
本発明の基板に用いられる基材としては、基材上に第一電極を配置可能なものであれば特に制限されない。例えば、ガラス、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、アルミナ、サファイア、セラミックス、フォルステライト、感光性ガラス、シリコン、エラストマー、プラスチック（例えば、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される無機材料や有機材料等を挙げることができる。導電性の基材を第一電極として使用してもよい。その形状も限定されず、例えば、平板、平膜、フィルム、多孔質膜等の平坦な形状、ディッシュ、フラスコ、シリンダ、スタンプ、マルチウェルプレート、マイクロ流路等の立体的な形状、並びに表面に凹凸が形成された形状が挙げられる。フィルムを使用する場合、その厚さは特に制限されないが、通常０．１μｍ〜１０００μｍ、好ましくは１μｍ〜５００μｍ、より好ましくは１０μｍ〜２００μｍである。
【００２２】
本発明の基板に用いられる第一電極としては、導電性の物質であれば特に制限されず、例えば、金属（金、銀、銅、白金等）、金属酸化物（酸化インジウム錫（ＩＴＯ）、酸化インジウム亜鉛(ＩＺＯ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）等）、導電性ナノファイバー（カーボンナノチューブ等)、導電性の有機材料（ポリエチレンジオキシチオフェン（ＰＥＤＯＴ）等）が挙げられる。細胞を観察する観点から、電圧印加後も透明である透明電極を使用することが好ましい。透明電極としては、例えば、ＩＴＯ、ＩＺＯ、ＺｎＯ等の金属酸化物、ＰＥＤＯＴ等の導電性高分子、Ａｇナノワイヤーやカーボンナノチューブをバインダーに分散させた材料、Ａｇ等の金属材料を格子状に形成して開口部を持たせた膜等が挙げられる。
【００２３】
透明電極は一般的に金属電極と比べて抵抗が大きい。本発明の基板に用いられる透明電極の抵抗は、例えばＩＴＯの場合は、膜質・膜厚・透過率にもよるが、通常、シート抵抗が１Ω／□〜１０００Ω／□であり、具体的には５Ω／□〜５００Ω／□、より具体的には１０Ω／□〜２０Ω／□である。膜厚１５０ｎｍでシート抵抗が１５Ω／□の場合、電気抵抗率は、２．２５×１０−６Ω・ｍとなる。シート抵抗や電気抵抗率は、例えば、三菱化学アナリテック（株）のロレスタを用いて測定することができる。
【００２４】
第一電極は、金属酸化物膜、金属微粒子や金属ファイバーがバインダーに分散された膜、金属が絶縁体物に埋め込まれた膜等の透明電極膜であることが好ましい。第一電極の膜の厚さは、通常、単分子膜〜１００μｍ程度であり、好ましくは２ｎｍ〜１μｍ、より好ましくは５ｎｍ〜５００ｎｍである。
【００２５】
第一電極は電極材料を基材上に成膜することにより形成することが好ましい。あるいは、第一電極は、電極材料を基材上に成膜した後、パターニングすることにより形成することもできる。基材上への第一電極材料の成膜は、公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＥＣＲＣＶＤ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖａｐｏｒ  ｄｅｐｏｓｉｔ）法、ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ）法、直流スパッタリング法、ＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）、スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザー蒸着法、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｂｅａｍ）蒸着法、抵抗加熱蒸着法等が挙げられる。成膜は、塗布により実施してもよい。スピンコートや各種の印刷方式も使用できる。
【００２６】
工程（ｂ）においては、工程（ａ）で形成した細胞コロニーに電気的刺激を与える。細胞コロニーに電気的刺激を与えると、増殖性の高い細胞からなる大きな細胞コロニーでは細胞の生存率が高いが、増殖性の低い細胞からなる小さな細胞コロニーでは細胞の生存率が低いため、細胞コロニーの電気的刺激に対する応答性の違いを利用して、所望の細胞を選別することができる。
【００２７】
細胞コロニーへの電気的刺激は、電極に電圧を印加することで、電極を介して与えることができる。電圧は、例えば、基板平面内の第一電極間（例えば、ＩＴＯとＩＴＯ間）に印加してもよいし、基板平面内に、金属（金、銀、銅、白金等）等の第二電極を第一電極に対向して設けて、第一電極と第二電極の間（例えば、ＩＴＯとＰｔ間）に印加してもよい。また、電圧を精密に制御するため、基板平面内にＡｇ／ＡｇＣｌ等の参照電極を設けてもよい。上記の第二電極や参照電極は、基板平面内でなくてもよい（培養液に電極を浸漬する形態でもよい）。好ましくは、基板の第一電極に対向して第二電極を配置し、第一電極を正極、第二電極を負極として、第一及び第二電極に電圧を印加して細胞コロニーに電気的刺激を与える。
【００２８】
電極への電圧の印加は、細胞コロニーが形成された後であれば特に制限されずに行うことができるが、通常、細胞培養開始の１２時間後〜１４日後、好ましくは、細胞培養開始の２日後〜１０日後に行う。
【００２９】
電極へ印加する電圧は、正電圧であることが好ましい。正電圧を電極に印加することにより、特に電極がＩＴＯ膜からなる場合に黒変するのを防止することができ、細胞コロニーの観察を良好に実施できる。
【００３０】
電極に印加する電圧は、電気的刺激を与える細胞コロニーの大きさによって変わるが、所望の細胞コロニーと他の細胞コロニーの間に電気的刺激に対する応答性の違いを生じさせる電圧以上で、細胞が全て死なない程度に低い電圧を加えるのがよい。電極に印加する電圧は、通常、３Ｖ未満であり、２．５Ｖ未満であることが好ましい。印加する電圧が３Ｖ未満であると、細胞が全て死ぬことを回避することができる。また、電極に印加する電圧は、電極が接している溶媒の種類や、電極の材質、電極の形状によっても適切な値が変わる。電極に電圧を印加する時間は、通常５秒間〜３０分間、好ましくは３０秒間〜５分間である。
【００３１】
工程（ｃ）においては、工程（ｂ）で電気的刺激を与えた細胞コロニーから所望の細胞コロニーを分離する。本発明において、所望の細胞コロニーとは、増殖性の高い細胞からなる細胞コロニーをいい、例えば、電気的刺激を受けた後の細胞生存率が９０％以上、より好ましくは９５％以上である細胞コロニーである。本発明において、電気的刺激を受けた後の細胞生存率とは、電気的刺激を受けた後の細胞数の、電気的刺激を受ける直前の細胞数に対する割合をいう。所望の細胞コロニーは、特に制限されずに、例えば、１００〜１０００個の細胞を含む。所望の細胞コロニーの大きさは、使用する細胞種などにもよるが、例えば、哺乳類の筋芽細胞であれば、平均径２００μｍ〜２ｍｍである。また、所望の細胞コロニーは、好ましくは、電気的刺激を受ける前後でその形態が変化しないものである。
【００３２】
所望の細胞コロニーの分離は、細胞コロニーに電気的刺激を与えた後すぐに行ってもよいし、又は、電気的刺激を与えた細胞コロニーをさらに培養してから行ってもよい。
【００３３】
所望の細胞コロニーの分離は、所望の細胞コロニーを回収して行ってもよく、又は、所望の細胞コロニー以外の細胞コロニーを取り除いて行ってもよい。例えば、細胞コロニーを光学顕微鏡等の顕微鏡で観察して、細胞形態が電気的刺激を受ける前後で変化した細胞コロニーを特定し、この細胞コロニーを取り除くことによって、所望の細胞コロニーを分離することができる。この際、細胞コロニーの細胞形態の確認を容易にするため、細胞コロニーを、ヨウ化プロピジウム等の染色剤を用いて染色してもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３５】
（実施例１）
酸化インジウム錫（ＩＴＯ）（膜厚：１５０ｎｍ、シート抵抗：１５Ω）を成膜したガラスを用いて、ガラスボトムディッシュを作製した。この容器に、マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２を１．０×１０３個／ガラスボトムディッシュ１ｃｍ２で播種した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有したＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下にて４日間培養した後、ガラスボトムディッシュの凹部を上から白金製面電極で覆い、ＩＴＯ膜を電源の正極と、白金製面電極を電源の負極とつなげた。直流電源を用いて電圧を印加（２．０Ｖ、６０秒）した後に死細胞をヨウ化プロピジウムで染色したところ、所望の細胞コロニーでは細胞生存率が９６．８％だったのに対し、その他の細胞コロニーでは細胞生存率が７６．３％であった。
【００３６】
（実施例２）
マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２をチャイニーズハムスター卵巣由来細胞ＣＨＯ−Ｋ１に代えて実施例１と同様の実験を行った。このとき培養は７日間行い、電圧印加条件は２．０Ｖ、４５秒とした。電圧を印加した後に死細胞をヨウ化プロピジウムで染色したところ、所望の細胞コロニーでは細胞生存率が９１．０％だったのに対し、その他の細胞コロニーでは細胞生存率が５８．１％であった。