(57)【要約】      （修正有）【課題】抗腫瘍活性を示す化合物である、グリオキサラーゼＩ阻害剤の提供。【解決手段】以下の式で代表される化合物を含むグリオキサラーゼＩ阻害剤及び抗腫瘍剤。2016204320.tif 000016【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）で表される化合物を含むグリオキサラーゼＩ阻害剤。
【化１１】
2016204320.tif 000012
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、＊は不斉炭素を表す。）
【請求項２】
Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は水素原子を表し、Ｒ９及びＲ１１はメチル基を表す、請求項１に記載のグリオキサラーゼＩ阻害剤。
【請求項３】
以下の式（１）で表される化合物を含む抗腫瘍剤。
【化１２】
2016204320.tif 000013
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、＊は不斉炭素を表す。）
【請求項４】
Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は水素原子を表し、Ｒ９及びＲ１１はメチル基を表す、請求項３に記載の抗腫瘍剤。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載のグリオキサラーゼＩ阻害剤を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項６】
以下の式（１）で表される被験化合物及びその誘導体から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
【化１３】
2016204320.tif 000014
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、＊は不斉炭素を表す。）
【請求項７】
さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性を有することが肯定された前記被験化合物についてガン細胞に対する抗増殖活性を評価する工程、を備える、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性と抗増殖活性を有することが肯定された前記被験化合物について、当該被験化合物の存在下において前記ガン細胞の分泌するメチルグリオキサール量を評価する工程、を備える、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
グリオキサラーゼＩ阻害剤の製造方法であって、
ゲニステイン又はその誘導体を原料として、ゲニステインの８位炭素にプレニル基が導入されたプレニル基付加体を経て、前記プレニル基と７位の水酸基との間の閉環反応により、以下の式（１）で表される化合物をラセミ体として取得する工程と、
【化１４】
2016204320.tif 000015
前記ラセミ体を光学分割する式（１）で表される化合物を分離する工程と、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、グリオキサラーゼＩ阻害剤及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗腫瘍活性を示す化合物として、例えば、グリオキサラーゼＩ阻害活性を有する、フラボン化合物が知られている（特許文献１、２）。グリオキサラーゼＩ（GLO I：Glyoxalase I）は、細胞内の嫌気的糖代謝過程で生じるメチルグリオキサール（MG：methylglyoxal）とグルタチオン（GSH：glutathione）からＳ−Ｄ−ラクトイルグルタチオン（S-D-lactoylglutathione）を生成させる酵素である。ＭＧは解糖系の代謝副産物であるが、蓄積することでタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を非可逆的に修飾し、細胞死（アポトーシス）を誘発することが知られている。すなわち、ＭＧは細胞死誘導活性を有していると考えられている。
【０００３】
ガン細胞内は、一般に嫌気的環境であるため、エネルギー産生は嫌気的な解糖系に依存しており、このためＭＧが生成する。そして、ガン細胞では、こうして生成したＭＧを解毒するためのＧＬＯＩの発現が亢進している。正常細胞においてはＧＬＯＩ活性が低いため、ＧＬＯＩ阻害剤は、ガン細胞に特異的に作用して、ガン細胞におけるＭＧの蓄積を促進し、ガン細胞のアポトーシスを誘導することが期待される（特許文献２）。
【０００４】
また、ＧＬＯＩ阻害活性を有するイソフラボン化合物として、マメ科植物由来の化合物がいくつか報告されている（非特許文献１）。エリポエギンＫは、不斉炭素を１つ有しており、光学異性体が存在する。植物から単離されたエリポエギンＫは、２種類の光学異性体を等量含有するラセミ体であることが報告されている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２１９３８４号公報
【特許文献２】特開２０１３−１５９６００号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J Nat Med.(2014) 68:636-642
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１、２及び非特許文献１に開示されるフラボン化合物及びイソフラボン化合物は、フラボノイドの一種である。フラボノイドは、広く植物界に分布するフェニルクロマン環に近い構造のＣ６−Ｃ３−Ｃ６炭素骨格からなる化合物であり、フラボン、イソフラボン、フラバノール等を始めとする多種多様な骨格及び置換様式を包含している。このため、フラボノイドの有する構造とＧＬＯＩ活性の相関は全く知られておらず、予測することも困難であった。
【０００８】
また、非特許文献１に開示されるエリポエギンＫはラセミ体であるが、そのＧＬＯＩ阻害活性が、光学異性体のいずれかにあるのか又は双方の異性体においてあるかどうかは当業者といえども予測することができなかった。
【０００９】
本明細書は、より実用的なＧＬＯＩ阻害剤及びその利用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、植物から単離したラセミ体であるエリポエギンＫについて、各光学異性体を分離することに成功した。そこで、エリポエギンＫの各光学異性体について各種の検討を行ったところ、Ｓ体のみがＧＬＯＩ阻害活性を有しており、ＧＬＯＩ阻害活性の本体はＳ体エリポエギンＫであるという知見を得た。本明細書は、これらの知見に基づき以下の手段を提供する。
【００１１】
（１）以下の式（１）で表される化合物を含むグリオキサラーゼＩ阻害剤。
【化１】
2016204320.tif 000002
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、＊は不斉炭素を表す。）
（２）Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は水素原子を表し、Ｒ９及びＲ１１はメチル基を表す、（１）に記載のグリオキサラーゼＩ阻害剤。
（３）以下の式（１）で表される化合物を含む抗腫瘍剤。
【化２】
2016204320.tif 000003
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、＊は不斉炭素を表す。）
（４）Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は水素原子を表し、Ｒ９及びＲ１１はメチル基を表す、（３）に記載の抗腫瘍剤。
（５）（１）又は（２）に記載のグリオキサラーゼＩ阻害剤を有効成分として含有する、医薬組成物。
（６）以下の式（１）で表される被験化合物及びその誘導体から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備える、抗腫瘍剤のスクリーニング方法。
【化３】
2016204320.tif 000004
（上記式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換されていてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表し、＊は不斉炭素を表す。）
（７）さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性を有することが肯定された前記被験化合物についてガン細胞に対する抗増殖活性を評価する工程、を備える、（６）に記載のスクリーニング方法。
（８）さらに、グリオキサラーゼＩ阻害活性と抗増殖活性を有することが肯定された前記被験化合物について、当該被験化合物の存在下において前記ガン細胞の分泌するメチルグリオキサール量を評価する工程、を備える、（７）に記載のスクリーニング方法。
（９）グリオキサラーゼＩ阻害剤の製造方法であって、
ゲニステインを原料として、ゲニステインの８位炭素にプレニル基が導入されたプレニル基付加体を経て、前記プレニル基と７位の水酸基との間の閉環反応により、上記式（１）で表される化合物をラセミ体として取得する工程と、
前記ラセミ体を光学分割する式（１）で表される化合物を分離する工程と、
を備える、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】天然エリポエギンＫ及び合成エリポエギンＫ（ラセミ体）のＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖抑制活性を示す図である。
【図２】キラルカラムによる（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫの光学分割を示す図である。
【図３】キラルカラムによる光学分割の純度を示す図である。
【図４】（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫのＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖抑制活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書の開示は、フラボノイドと総称される化合物群に包含されるイソフラボン骨格を有する化合物（以下、イソフラボン化合物という。）又はその薬学的に許容される塩を含有するＧＬＯＩ阻害剤及びその利用に関する。
【００１４】
本明細書に開示されるある種のイソフラボン化合物（以下、本イソフラボン化合物という。）は、ＧＬＯＩ阻害活性を示すことができる。また、本イソフラボン化合物は、好ましくは、ガン細胞に対してＧＬＯＩ阻害活性に基づく抗増殖活性も示すことができる。ＧＬＯＩは正常細胞ではほとんど発現されていないのに対してガン細胞での過剰発現が認められることから、ＧＬＯＩ阻害剤は、ガン細胞に対して高い選択性で作用し細胞死を誘導することができる。
【００１５】
本イソフラボン化合物は、従来知られているエリポエギンＫのＳ体及びその誘導体である。本イソフラボン化合物は、天然には、その光学異性体であるＲ体とのラセミ体として存在するが、Ｒ体には抗腫瘍活性は認められず、Ｓ体のみが抗腫瘍活性を有している。したがって、エリポエギンＫのＳ体及びその誘導体は、有用なＧＬＯＩ阻害剤であるほか、ＧＬＯＩ阻害剤及び抗腫瘍剤のリード化合物とすることができる。
【００１６】
以下、本イソフラボン化合物を含むＧＬＯＩ阻害剤、抗腫瘍剤及び医薬組成物並びにＧＬＯＩ阻害剤のスクリーニング方法等について説明する。
【００１７】
（ＧＬＯＩ阻害剤）
本イソフラボン化合物は、以下の式（１）で表される。
【化４】
2016204320.tif 000005
【００１８】
式（１）で表される化合物は、不斉炭素を１つ有しているため光学異性体が存在する。式（１）で表される化合物は、Ｓ体である。
【００１９】
式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して水素原子、水酸基又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表すことができる。
【００２０】
置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基は、直鎖状であっても分岐状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。こうしたアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、sec-ブチル基、tert−ブチル基、２，２−ジメトキシエチル基等が挙げられる。好ましくは、エチル基及びプロピル基であり、より好ましくはメチル基及びエチル基であり、さらに好ましくはメチル基である。置換基としては、水酸基、ヒドロキシアルキル基、アルキルエーテル基、アルキルカルボニル基、アミノ基、アルキルアミノ基、ニトロ基、ニトリル基、ハロゲン原子が挙げられる。これら置換基におけるアルキル基は、炭素数１〜４であることが好ましく、より好ましくはメチル基である。
【００２１】
式（１）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、これら１１個の置換基のうち、水素原子が５個以上であってもよく、６個以上であってもよく、７個以上であってもよく、８個以上であってもよく、９個以上であってもよく、全てが水素原子であってもよい。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、これら９個の置換基のうち、水素原子が５個以上であってもよく、６個以上であってもよく、７個以上であってもよく、全てが水素原子であってもよい。
【００２２】
また、式（１）において、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、これら１２個の置換基のうち、メチル基が２個以上であってもよく、３個以上であってもよく、４個以上であってもよく、５個以上であってもよく、６個以上であってもよい。また、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は、これら９個の置換基のうち、水酸基が２個以上であってもよく、３個以上であってもよく、４個以上であってもよく、５個以上であってもよく、６個以上であってもよい。
【００２３】
式（１）において、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、それぞれ独立して水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基を表すことができる。置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキル基については既に説明したとおりである。Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、これら３つの置換基のうち、上記アルキル基が１個以上であってもよく、２個以上であってもよく、全てが上記アルキル基であってもよい。また、Ｒ３、Ｒ６及びＲ１０は、これら３つの置換基のうち、水素原子を１個以上３個以下とすることができる。
【００２４】
式（１）において、Ｒ１〜Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４は水素原子を表し、Ｒ９及びＲ１１はメチル基である化合物は、以下の式（２）で表される。この化合物は、光学活性を有するＳ体である。Ｓ体であるこの化合物とＲ体との混合物であるラセミ体は、マメ科植物であるErythrina poeppigianaに属する植物の樹皮に存在する天然のイソフラボン化合物として取得することができる。以下、Erypoegin（エリポエギン）Kと称する。本イソフラボン化合物はこの天然のイソフラボン化合物エリポエギンＫのＳ体を含み、Ｓ体エリポエギンＫの構造において、その水素原子部位の水酸基や炭素数１〜４のアルキル基等による置換によって一定範囲内で調節された化合物を包含している。なお、式（１）における各種置換基の導入は、当業者であれば、公知の有機合成方法に基づいて容易に実施することができる。
【００２５】
【化５】
2016204320.tif 000006
【００２６】
本イソフラボン化合物は、Erythrina poeppigianaに属する植物の樹皮から取得する式（２）で表される化合物として得られるほか、当該化合物以外の態様は、当該化合物を有機合成的によりあるいは酵素的に適宜修飾して得ることができる。本イソフラボン化合物は、また、全合成によりあるいは天然由来の他の化合物を出発原料として半合成により取得することができる。合成により取得する場合には、ラセミ体として合成しその後光学分割によってＳ体を取得することもできるし、Ｓ体のみを個別に合成することもできる。
【００２７】
例えば、式（２）で表される化合物を、Erythrina poeppigianaに属する植物の樹皮から得るには、以下の方法を採用できる。前記樹皮を細切し、アセトンにて冷浸し、その後、溶媒を減圧留去し油状物を得る。この油状物を、例えば、ｎ−ヘキサンの疎水性溶媒で洗浄後、ジクロロメタン等の疎水性溶媒と水とで分配し、疎水性溶媒相を減圧留去して残渣を得る。この残渣を、クロロホルム−アセトン（１→１０：１）等を用いシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲル５００ｇ、１０×１３ｃｍ）に付し、各フラクションを取得する。式（２）で表される化合物が含まれている可能性が高いことが推測されるフラクションをベンゼン−酢酸エチル（５：１）等にて、繰り返しシリカゲルカラムクロマトグラフィー（例えば、シリカゲル１５０ｇ、４．５×２４ｃｍを使用後にシリカゲル１０ｇ、１．０×２７ｃｍに付す。）により精製することにより、式（２）で表される化合物とその光学異性体（Ｒ体）との混合物であるラセミ体を含むフラクションを得ることができる。
【００２８】
さらに、このフラクションを逆相ＨＰＬＣで分取することで、式（２）で表される化合物を含むラセミ体を精製することができる。逆相ＨＰＬＣとしては、例えば、逆相ＨＰＬＣカラムとして汎用されるＯＤＳカラムを用い、移動相としては、水：アセトニトリル＝６０〜７０：４０〜３０（体積比）を用いることができる。より具体的には、以下の条件を採用できる。条件Ａは、分離に好適であり、条件Ｂは分取に好適である。式（２）で表される化合物を含むラセミ体として分取した後、後述の方法を用いて光学分割し、Ｓ体である式（２）で表される化合物のみを分離することができる。
【００２９】
＜条件Ａ＞
Column：STR ODS-II 4.6×150 mm（Shinwa Chemical社）×２本連結
Controller：LC-9A（Shimadzu社）
Detector：SPD-10A（254nm; Shimadzu社）
Mobile phase：35% acetonitrile＋65% H2O
Flow rate：1.0 mL/min
Sample volume：10〜100 μL
【００３０】
＜条件Ｂ＞
Column：Develosil ODS-10 20×250 mm（Nomura Chemical社）
Controller：LC-9A（Shimadzu社）
Detector：SPD-10A（254nm; Shimadzu社）
Mobile phase：30% acetonitrile＋70% H2O
Flow rate：6.0 mL/min
Sample volume：250 μL
【００３１】
また、例えば、式（２）で表される化合物を、他の化合物を出発原料として半合成により得るには、以下の方法を採用できる。この方法では、式（２）で表される化合物を含むラセミ体として合成することができる。また、この合成スキームを以下に示す。
【００３２】
【化６】
2016204320.tif 000007
【００３３】
イソフラボンの１つとして知られているゲニステイン（化合物１）を出発原料とし、塩基の存在下においてアシル化剤を反応させ、化合物２を得ることができる。塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン等を用いることができ、好ましくはピリジンを用いることができる。また、アシル化剤としては、ベンゾイルクロリド、２−フロイルクロリド、無水酢酸等を用いることができ、好ましくは無水酢酸を用いることができる。
【００３４】
化合物２に、ハロゲン系溶媒中、プレニルアルコールをトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）及びＤＩＡＤ（Diisopropyl azodicarboxylate）と共に反応させ、プレニル基を付加した化合物３を得ることができる。ハロゲン系溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等を用いることができ、好ましくはジクロロメタンを用いることができる。反応温度は、好ましくは−１０℃〜室温である。
【００３５】
次いで、付加体３のプレニル基の転移生成物である４を得ることができる。例えば、クロロホルムのハロゲン系溶媒中、触媒（Tris(6,6,7,7,8,8,8-heptafluoro-2,2-dimethyl-3,5-octanedionato)  europium）存在下、６０℃にて加温することで化合物４を得ることができる。
【００３６】
この化合物４のアシル基を脱保護した化合物５を得ることができる。アシル基の脱保護は、アシル化に用いた置換基に応じて公知の方法を選択することができる。例えば、メタノール−テトラヒドロフラン中、ＮａＨＣＯ３水溶液を加えアセチル基を脱保護することができる。
【００３７】
次いで、ハロゲン系溶媒中、酸化剤を用いた閉環反応を経て、式（２）で表される化合物とその光学異性体（Ｒ体）とが混合するラセミ体であるエリポエギンＫ（６）を合成することができる。ハロゲン系溶媒としては、ジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等を用いることができ、好ましくはジクロロメタンを用いることができる。また、酸化剤としては、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸、過酢酸、モノペルオキシフタル酸等の有機過酸類、過酸化水素、t-ブチルヒドロペルオキシド等を用いることができ、好ましくはメタクロロ過安息香酸を用いることができる。
【００３８】
（光学分割）
天然物からの抽出により又は合成によって取得した、式（２）で表される化合物とその光学異性体との混合物であるラセミ体は、公知の方法を用いて光学分割することができる。例えば、クロマトグラフィーを利用した光学分割方法、再結晶を利用した優先晶出法又は酵素反応を利用した光学分割方法等を挙げることができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、ＣＨＩＲＡＬシリーズ（ダイセル社製）等のキラルカラムを用いることができ、移動相としては、イソプロパノール等の両親媒性の有機溶媒とｎ−ヘキサン等の非極性溶媒とを組み合わせて用いることができる。
【００３９】
また、式（２）で表される化合物を合成により取得する場合には、Ｓ体のみを個別に合成することもできる。Ｓ体を光学特異的に合成する方法としては、例えば、上記合成反応において、閉環反応を行う際に、ＡＤ−ｍｉｘ−αの酸化剤を用いることができる。
【００４０】
本化合物の薬学的に許容される塩は、例えば薬学的に許容される酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。
【００４１】
薬学的に許容される酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、薬学的に許容される金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、薬学的に許容されるアンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、薬学的に許容される有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、薬学的に許容されるアミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等の付加塩が挙げられる。
【００４２】
本化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、公知の方法で測定することができるほか、後述の実施例に開示される方法で測定することができる。本化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、少なくともin vitroにおいて、通常程度に精製されたＧＬＯＩに対する阻害活性を意味している。その活性程度は特に限定しないが、後述する実施例に準じて得られるＩＣ５０は、既知のＧＬＯＩ阻害剤であるＳ−ｐ−ブロモ−ベンジルグルタチオン（ＢＢＧ）（式（３）においてＲ＝Ｈである）の５０％以上であることが好ましく、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上である。
【００４３】
【化７】
2016204320.tif 000008
【００４４】
また、本イソフラボン化合物のＧＬＯＩ阻害活性は、さらに、ガン細胞の抗増殖活性を意味していてもよい。ガン細胞の抗増殖活性は、公知の方法を用いて評価できるほか、後述する実施例に準じてヒト白血病細胞株ＨＬ−６０に対する抗増殖活性として評価できる。この方法における抗増殖活性は、ＩＣ５０が好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは７．５μＭ以下、さらに好ましくは５μＭ以下、一層好ましくは３μＭ以下、より一層好ましくは２μＭ以下、より一層好ましくは１μＭ以下、さらに一層好ましくは０．５μＭ以下である。
【００４５】
本化合物は、ＧＬＯＩ阻害剤として使用できるほか、アポトーシス誘導剤（特にガン細胞の）や抗腫瘍剤としても用いることができる。特に、本化合物がＧＬＯＩ阻害活性の一態様としてガン細胞のアポトーシスを誘導し、抗増殖活性を有するときには抗腫瘍剤として有用である。
【００４６】
本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物は、有効成分である本イソフラボン化合物のほか、賦形剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、稀釈剤、担体、溶解助剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤、コーティング剤などの添加成分や水などを含むものであってもよい。
【００４７】
本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物は、経口投与、非経口投与いずれの投与方法をも採用することができ、それぞれに適した医薬製剤の形態とすることができる。医薬製剤としては、例えば、液剤、シロップ剤、注射剤、液状吸入剤、乳剤等の液状剤、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、軟膏剤、固形吸入剤、座剤等の固形剤などを挙げることができる。
【００４８】
本明細書に開示される抗腫瘍剤及び医薬組成物における本イソフラボン化合物の含有量は、用途、剤型、配合目的等によって異なるが、一般的には、組成物全量中１〜１００質量％が好ましく、より好ましくは１０〜５０質量％である。
【００４９】
本発明の抗腫瘍剤及び医薬組成物等の投与量は、投与対象者の年齢、体重、投与方法などに応じて適宜決めればよい。例えば、通常成人１日、体重１ｋｇあたり、本イソフラボン化合物０．００１ｍｇ以上１００ｍｇ以下、好ましくは、０．０１ｍｇ以上１０ｍｇ以下を１日１回又は数回に分けて投与することができる。
【００５０】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、式（１）で表される化合物（本イソフラボン化合物）及びその誘導体である被験化合物から選択される１種以上のグリオキサラーゼＩ阻害活性を評価する工程を、備えることができる。ＧＬＯＩ阻害活性は、ＧＬＯＩ阻害活性に基づく抗腫瘍剤の基本的な活性である。このスクリーニング方法によれば、式（１）で表される被験化合物及びその誘導体からシード化合物としてより有用な抗腫瘍剤（リード化合物）をスクリーニングできる。
【００５１】
なお、式（１）で表される化合物（本イソフラボン化合物）及びその誘導体は、天然由来の化合物のほか、合成によって取得されたものでもよい。本イソフラボン化合物の誘導体の範囲は特に限定しないが、例えば、式（１）における各種Ｒにつき、式（１）で規定される以外の置換基への修飾を含むことができる。
【００５２】
ＧＬＯＩ阻害活性は、公知の方法のほか、後述する実施例において開示する方法を採用して評価することができる。この評価工程において、ＧＬＯＩ阻害活性は、例えば、コントロールとしてのＢＢＧのＧＬＯＩ阻害活性と対比することで評価することができる。典型的には、ＢＢＧの５０％以上、より好ましくは７０％以上であり、さらに好ましくは８０％以上のＧＬＯＩ阻害活性があれば、ＧＬＯＩ阻害活性を有すると肯定的に評価できる。
【００５３】
本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、さらに、ＧＬＯＩ阻害活性を有することが肯定された被験化合物についてガン細胞に対する抗増殖活性を評価する工程を備えることができる。こうした評価工程を備えることで、より実用的な抗腫瘍剤又はそのリード化合物をスクリーニングすることができる。ガン細胞の抗増殖活性は、例えば、ガン細胞に対して被験化合物を供給し、一定時間培養後の生細胞又は死細胞に関する指標を測定することによって行う。より詳細には、被験化合物の添加濃度を異ならせてＩＣ５０を測定してもよい。この評価工程において、被験化合物のガン細胞の抗増殖活性を確認できる場合には、抗増殖活性を有すると肯定的に評価できる。
【００５４】
なお、本明細書に開示される抗腫瘍剤のスクリーニング方法は、ＧＬＯＩ阻害活性とガン細胞抗増殖活性を有すると肯定された被験化合物について、当該被験化合物の存在下において前記ガン細胞の分泌するＭＧ量を評価する工程と、を備えることもできる。ＭＧ量評価工程を備えることで、ガン細胞におけるＧＬＯＩ阻害によってガン細胞の増殖が阻害されていることを確認できる。ＭＧ量の評価は、この種の化合物に対するＨＰＬＣなど公知の方法を採用することができる。例えば、ガン細胞の培養液に対してｏ−フェニレンジアミンを加えてＭＧを２−メチルキノキサリンに変換後、ＨＰＬＣに負荷して検出波長３１５ｎｍで検出することができる。
【００５５】
（ＧＬＯＩ活性阻害剤の製造方法）
本明細書に開示されるグリオキサラーゼＩ阻害剤の製造方法は、ゲニステイン又はその誘導体を原料として、ゲニステインの８位炭素にプレニル基が導入されたプレニル基付加体、ついで酸化によるエポキシ体を経て、７位の水酸基との閉環反応により、上記式（１）で表される化合物をラセミ体として取得する工程と、前記ラセミ体を光学分割により式（１）で表される化合物を分離する工程と、を備えることができる。式（１）で表される化合物は、上記したように以下の式で表されるゲニステイン又はその誘導体からラセミ体として合成し、その後光学分割することによっても得ることができる。
【００５６】
【化８】
2016204320.tif 000009
【００５７】
ラセミ体合成工程におけるゲニステインの誘導体とは、式（１）で表される本イソフラボン化合物におけるＲ１〜Ｒ７及びＲ１４で置換された態様を含むことができる。
【００５８】
ゲニステイン又はその誘導体については、イソフラボン構造における８位炭素原子（以下、同様。）にプレニル基を導入する。このためには、既述のように、必要に応じて７位炭素原子に結合した水酸基をアシル化等により保護した後、５位の炭素原子の水酸基にプレニル基を導入する。その後、公知の転位反応を利用してプレニル基を８位の炭素原子に転位させることができる。
【００５９】
その後、７位炭素原子に結合した酸素原子の保護基を脱離させて水酸基とする。７位の水酸基と８位炭素原子に結合したプレニル基のエポキシ化によるエポキシとの間の環化反応を行うことで、エリポエギンＫのラセミ体を得ることができる。得られたラセミ体は、式（２）で表される本イソフラボン化合物（Ｓ体）とその鏡像体であるＲ体を含んでいる。
【００６０】
次に、このラセミ体を公知の方法で光学分割して、本イソフラボン化合物である式（２）で表されるエリポエギンＫ（Ｓ体）を得ることができる。光学分割については既述のように、公知の種々の方法を用いることができる。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６２】
（エリポエギンＫ（ラセミ体）の合成）
本実施例では、ゲニステインを出発材料として、以下に示すエリポエギンＫのＲ体及びＳ体からなるラセミ体を合成した。また、この合成スキームを以下に示す。
【００６３】
【化９】
2016204320.tif 000010
【００６４】
【化１０】
2016204320.tif 000011
【００６５】
ゲニステイン（１）１ｇに対し、ピリジン中、室温にて無水酢酸７００μｌを２４時間反応させ、Ｃ７及びＣ４’の水酸基をアセチル化し、アセチル体である化合物２（１．２ｇ、収率９２％）とした。アセチル体２（１．２ｇ）に塩化メチレン３０ｍｌ中、プレニルアルコール５２０μｌ、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）１．６ｇ及びＤＩＡＤ（Diisopropyl azodicarboxylate）１．２ｍｌを、−１０℃〜室温にて２時間反応させ、付加体３（１．２４ｇ、収率８７％）とした。化合物３（１．２ｇ）をクロロホルム６ｍｌ中、触媒（Tris(6,6,7,7,8,8,8-heptafluoro-2,2-dimethyl-3,5-octanedionato)  europium）３００ｍｇ存在下、６０℃にて２０時間加温し、転位生成物４（０．８ｇ、収率６８％）を得た。この化合物４（０．７６ｇ）をメタノール−テトラヒドロフラン（１４ｍｌ）中、１０％ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍｌ）を加え、６０℃で６時間反応させ、脱保護し、化合物５（０．５ｇ、収率８４％）を得た。次いで、Ｋ２ＣＯ３（６５０ｍｇ）及びジクロロメタン（１８ｍｌ）中、メタクロロ過安息香酸（３８０ｍｇ）の反応を経て、エリポエギンＫ（６）を得た（０．３ｇ、収率５７％）。
【００６６】
（合成エリポエギンＫ及び天然エリポエギンＫの物理化学的同等性）
合成したエリポエギンＫ及び天然エリポエギンＫの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを比較したところ、合成エリポエギンＫ及び天然エリポエギンＫのスペクトルにおけるケミカルシフトはすべて一致した。
【００６７】
以下に、エリポエギンＫの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを記載する。
エリポエギンＫの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Me2CO-d6）：δ 1.26 (3H, s, H-6”), 1.30 (3H, s, H-5”), 3.27 (1H, dd, J = 15.4, 9.5 Hz, H-3”), 3.32 (1H, dd, J = 15.4, 8.1 Hz, H-3”), 3.84 (1H, s, 4’-OH or 4”-OH), 4.87 (1H, dd, J = 9.5, 8.1 Hz, H-2”), 6.22 (1H, s, H-6), 6.91 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3’ and H-5’), 7.45 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2’ and H-6’), 8.19 (1H, s, H-2), 8.57 (1H, brs, 4’-OH or 4”-OH), 13.24 (1H, s, 5-OH)
【００６８】
（合成エリポエギンＫ及び天然エリポエギンＫの生物学的同等性）
また、合成したエリポエギンＫ及び天然エリポエギンＫのヒト白血病細胞株ＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖抑制活性を比較した。なお、ポジティブコントロールとして、ＧＬＯＩの既知の阻害剤であるＳ−ｐ−ブロモ−ベンジルグルタチオン（ＢＢＧ）のシクロペンチルエステル体である、Ｓ−ブロモベンジルグルタチオンシクロペンチルエステル（ＢＢＧＣ）を用いた。ＢＢＧは、細胞膜透過性が乏しく、培養液への添加では効果を示さないと考えられる。そこで、膜透過性を増大させるため、ＢＢＧＣを用いた。ＢＢＧＣは、細胞膜透過後、細胞内でエステル基が加水分解され、ＢＢＣに変換されると考えられる。
【００６９】
ＨＬ−６０細胞を９６ウェルプレートに１．２×１０4個／ウェルに播き、３７℃で２４時間プレインキュベートした。合成エリポエギンＫ、天然エリポエギンＫ及びＢＢＧＣ（すべてＤＭＳＯに溶解）を添加し、３７℃で４８時間培養後、ＭＴＳ試薬（CellTiter 96 AQueous Solution Cell Proliferation Assay、プロメガ）を加え、室温で１〜３時間反応後、マルチプレートリーダーを用いて、４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果を図１に示す。
【００７０】
図１に示すように、合成エリポエギンＫ及び天然エリポエギンＫのＩＣ５０はいずれも０．１８μＭで完全に一致した。また、合成エリポエギンＫ及び天然エリポエギンＫは、ＢＢＧＣと比較して高い細胞増殖抑制活性を示した。
【００７１】
以上の結果から、合成したエリポエギンＫと天然標品とは、物理化学的及び生物学的に完全に同等であることが明らかとなった。
【実施例２】
【００７２】
（合成エリポエギンＫ（ラセミ体）の光学分割）
本実施例では、エリポエギンＫ（ラセミ体）を、キラルカラムを用いて（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫに光学分割した。
【００７３】
（キラルカラムによる分割）
実施例１の方法で合成したエリポエギンＫ（ラセミ体）３０ｍｇにイソプロパノール：エタノール（１：１）３０ｍＬを加え、６５℃にて溶解した。溶解物を耐有機溶媒性フィルター（０．４５μｍ）で濾過後、以下の条件でＨＰＬＣを実施した。
【００７４】
＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：CHIRALPAK AD-H（ダイセル）
カラムサイズ：１ｃｍＩ．Ｄ．×２５ｃｍＬ
移動相：イソプロパノール／ｎ−ヘキサン＝３：７
流速：４ｍＬ／ｍｉｎ
検出：２５４ｎｍ
温度：室温
【００７５】
ＨＰＬＣの結果を図２に示す。図２に示すように、２つのピークが確認され、合成エリポエギンＫ（ラセミ体）をキラルカラムで２つのピーク、すなわち、ピーク１（保持時間１１．４分）及びピーク２（保持時間１８分）に分離することに成功したことがわかった。
【００７６】
ピーク１及びピーク２の各画分の分取クロマトグラフィーを実施し、ロータリーエバポレーターにて３０℃で有機溶媒を減圧留去し、それぞれ１２ｍｇを分取した。これらの分取物につき、上記ＨＰＬＣ条件でクロマトグラフィーを実施して、純度を確認した。結果を図３に示す。
【００７７】
図３に示すように、それぞれのピーク１及びピーク２の分取物の各クロマトグラムには、それぞれピーク１及びピーク２のピークのみを確認し、他のピークを確認しなかった。
【００７８】
（比旋光度の測定）
エリポエギンＫ(ラセミ体)から得た２つの分取物について、いずれが（Ｒ）−エリポエギンＫであり、いずれが（Ｓ）−エリポエギンＫであるかを明らかにするため、以下の条件で、比旋光度を測定した。
【００７９】
＜測定条件＞
装置：旋光計 P-2200（日本分光）
溶媒：アセトン
濃度：１．９ｍｇ／ｍＬ（０．１９％）
【００８０】
ピーク１の分取物の比旋光度[α]Ｄ２５は−８９°、ピーク２の分取物の比旋光度[α]Ｄ２５は＋８６°であった。エリポエギンＫと類似の構造をもつイソフラボンの文献値（Tahara S., et al., Z. Naturforsch 42c, 1055-1062 (1987)、Morel S., et al., Phytochem. Lett., 6, 498-503 (2013)）から、ピーク１の分取物は（Ｒ）−エリポエギンＫであり、ピーク２の分取物は（Ｓ）−エリポエギンＫであることが明らかとなった。
【００８１】
（（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫのＮＭＲスペクトルの測定）
（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫを以下の条件で、１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲを測定した。
【００８２】
＜測定条件＞
装置：600MHz NMR, Burka
溶媒：重水素置換アセトン
【００８３】
１Ｈ−ＮＭＲにおいて、（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫのケミカルシフトはすべて一致した。また、１３Ｃ−ＮＭＲにおいても、（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫのケミカルシフトはすべて一致した。
【００８４】
以下に、（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、並びに（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを記載する。
１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Me2CO-d6）：δ 1.26 (3H, s, H-6”), 1.30 (3H, s, H-5”), 3.27 (1H, dd, J = 15.4, 9.5 Hz, H-3”), 3.32 (1H, dd, J = 15.4, 8.1 Hz, H-3”), 3.84 (1H, s, 4’-OH or 4”-OH), 4.87 (1H, dd, J = 9.5, 8.1 Hz, H-2”), 6.22 (1H, s, H-6), 6.91 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-3’ and H-5’), 7.45 (2H, d, J = 8.8 Hz, H-2’ and H-6’), 8.19 (1H, s, H-2), 8.57 (1H, brs, 4’-OH or 4”-OH), 13.24 (1H, s, 5-OH)
１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（Me2CO-d6）：δ 181.7 (C-4), 167.7 (C-7), 164.3 (C-5), 158.5 (C-4’), 153.9 (C-2), 153.6 (C-9), 131.2 (C-2’, C-6’), 124.0 (C-3), 123.0 (C-1’), 115.9 (C-3’, C-5’), 106.2 (C-10), 104.8 (C-8), 94.4 (C-6), 92.7 (C-2”), 71.4 (C-4”), 27.1 (C-3”), 26.0 (C-6”), 25.5 (C-5”)
【００８５】
以上の結果から、合成エリポエギンＫ（キラル体）から、キラルカラムを用いて（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫを分離できることが示された。
【実施例３】
【００８６】
（ＨＬ−６０細胞に対する（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫの細胞増殖抑制活性の測定）
ＨＬ−６０細胞に対する（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫの細胞増殖抑制活性を測定した。実施例１で用いたＨＬ−６０細胞に対する細胞増殖抑制活性の測定方法と同様の方法で、実施例２で分離した（Ｒ）−エリポエギンＫ、（Ｓ）−エリポエギンＫ、ポジティブコントロールのＢＢＧＣ（すべてＤＭＳＯに溶解）について測定した。結果を図４に示す。
【００８７】
図４に示すように、（Ｒ）−エリポエギンＫ及び（Ｓ）−エリポエギンＫのＨＬ−６０細胞に対する抗細胞増殖活は、（Ｓ）−エリポエギンＫにのみ活性があり、（Ｒ）−エリポエギンＫには活性は全く見られなかった。また、（Ｓ）−エリポエギンＫのＩＣ５０は０．０９μＭであり、エリポエギンＫ（ラセミ体）（０．１８μＭ）と比較して高い増殖抑制活性を示した。
【図１】
2016204320.tif 000017
【図２】
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【図３】
2016204320.tif 000019
【図４】
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