(57)【要約】      （修正有）【課題】ニオブ材料との間に結合を持つペプチド又は蛋白質を用いて機能性を持つ構造や無機材料と有機材料を組み合わせた複合材料を構築するための手段を提供すること。【解決手段】ニオブ材料結合ペプチド、ニオブ材料結合ペプチドと融合したタンパク質、またはニオブ材料結合ペプチドと融合したタンパク質の多量体と、ニオブ材料とを接触させることを含む、ペプチドまたはタンパク質とニオブ材料との吸着方法など。ニオブ材料結合ペプチドとしては、例えば、ＳＮＡＰＮＴＸＶＸＳＸＸのアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつニオブ材料結合活性を有するペプチドが挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニオブ材料結合ペプチド、ニオブ材料結合ペプチドと融合したタンパク質、またはニオブ材料結合ペプチドと融合したタンパク質の多量体と、ニオブ材料とを接触させることを含む、ペプチドまたはタンパク質とニオブ材料との吸着方法。
【請求項２】
水溶液中に溶解したニオブ材料を、前記ペプチド、前記タンパク質、または前記多量体と接触させて、水溶液からニオブ材料を析出させることを含む方法である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ニオブ材料結合ペプチドが、以下（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のペプチドである、請求項１または２記載の方法：
（Ｉ）ＳＮＡＰＮＴＸＶＸＳＸＸ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつニオブ材料結合活性を有するペプチド；あるいは
（ＩＩ）以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＮＧＡＴＡＴＨＭＡＳＩＡ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＨＰＳＨＭＡＭＤＲＳＱＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＤＴＳＴＨＡＰＮＶＰＲＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＡＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＳＡＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＳＮＧＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＳＮＡＡＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＳＮＡＰＡＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＳＮＡＰＮＡＩＶＲＳＭＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＳＮＡＰＮＴＡＶＲＳＭＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１３）ＳＮＡＰＮＴＩＡＲＳＭＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）ＳＮＡＰＮＴＩＶＡＳＭＳ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１５）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＡＭＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１６）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＡＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１７）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＡ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むペプチド；ならびに
１８）配列番号２〜６、９〜２０のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニオブ材料結合活性を有する、ペプチド。
【請求項４】
ＳＮＡＰＮＴＸＶＸＳＸＸ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつニオブ材料結合活性を有するペプチド。
【請求項５】
以下である、請求項４記載のペプチド：
（ｉ）７位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基であり；
（ｉｉ）９位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基、または塩基性アミノ酸残基であり；
（ｉｉｉ）１１位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基であり；あるいは
（ｉｖ）１２位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基である。
【請求項６】
以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＮＧＡＴＡＴＨＭＡＳＩＡ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＤＴＳＴＨＡＰＮＶＰＲＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＡＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＳＡＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＳＮＧＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＳＮＡＡＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＳＮＡＰＡＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＳＮＡＰＮＡＩＶＲＳＭＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＳＮＡＰＮＴＡＶＲＳＭＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１３）ＳＮＡＰＮＴＩＡＲＳＭＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）ＳＮＡＰＮＴＩＶＡＳＭＳ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１５）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＡＭＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１６）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＡＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１７）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＡ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むペプチド；ならびに
１８）配列番号２〜６、９〜２０のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニオブ材料結合活性を有する、ペプチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項記載のペプチドとタンパク質との融合タンパク質であって、
前記ペプチドがタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加された、融合タンパク質。
【請求項８】
（ｉ）ポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分および（ｉｉｉ）請求項４〜６のいずれか一項記載のペプチドの部分を含む、融合タンパク質。
【請求項９】
ポリペプチド部分が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分である、請求項８記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分がＤｐｓである、請求項９記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
標的物質が、金属素材、シリコン素材または炭素素材である、請求項８〜１０のいずれか一項記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
請求項４〜６のいずれか一項記載のペプチド、または請求項７〜１１のいずれか一項記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２記載のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞。
【請求項１５】
融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および請求項４〜６のいずれか一項記載のペプチドの部分を含む、多量体。
【請求項１６】
内腔中に物質を含む、請求項１５記載の多量体。
【請求項１７】
請求項８〜１１のいずれか一項記載の融合タンパク質、または請求項１５または１６記載の多量体を用いて、ニオブ材料と標的物質とを接着させることを含む、ニオブ材料および標的物質を含む複合体の製造方法。
【請求項１８】
ニオブ材料および標的物質を含む複合体が、酸化ニオブで被膜された標的物質である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項８〜１１のいずれか一項記載の融合タンパク質、または請求項１５または１６記載の多量体を介して接着された、ニオブ材料および標的物質を含む複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニオブ材料結合ペプチド、融合タンパク質およびその多量体などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体素材および無機素材または有機素材の複合体を作製し、その複合体を半導体メモリや太陽電池などの高性能な電子デバイスやインプラントやバイオセンサーなどの医療素材へと応用することを目的として、無機素材または有機素材に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニングにより開発されている（特許文献１および２、非特許文献１４）。すなわち、標的となる素材に結合する能力を有するペプチドを得るために、様々な配列のアミノ酸配列からなるペプチドを提示した１０９から１０１０種類のファージライブラリを、標的となる素材でコーティングされた試験管表面や粒子などと緩衝液中で混合することで結合させる。その試験管や粒子を、低濃度の界面活性剤を含む緩衝液で洗浄することで、標的への結合力の弱いペプチドを提示したファージを洗い流す。その後、酸や高濃度の界面活性剤を含む緩衝液で標的素材を洗浄することで、標的素材へ結合していたファージを剥離、回収する。そのファージが提示しているペプチド配列を特定することで、標的素材への結合力を持つペプチドを得る。このような手法を用いて無機物や炭素素材に結合する能力を有するペプチドとして、例えば、酸化チタン（特許文献３、非特許文献１ならびに非特許文献２）、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）およびカーボンナノホン（ＣＮＨ）（特許文献４および５、ならびに非特許文献３）、金（非特許文献４）、酸化亜鉛（非特許文献５）、ならびに硫化亜鉛および硫化カドミウム（非特許文献６）などを認識するペプチドが取得されている。
酸化ニオブは、光学材（特許文献６）、触媒材（特許文献７）、誘電体（特許文献８）、燃料電池電極材（特許文献９、非特許文献７ならびに非特許文献８）、太陽電池電極材（特許文献１０、非特許文献９）およびインプラント材（特許文献１１）としての利用が試みられている。そのため、酸化ニオブにおいてもペプチドなどの生体分子を用いた修飾と加工により、各応用材料としての機能の向上や生体親和性向上が期待できるものの、酸化ニオブへの結合能力を持つペプチド配列は知られていなかった。
また、炭素結晶構造であるＣＮＴやＣＮＨなどのナノ黒鉛構造物は、その電気特性や構造から他のナノ素材との複合体を構築することで電子素材や触媒、光素材および医療技術などへの応用が期待されている。ナノ黒鉛構造物を金属化合物被膜する技術として酸処理や高分子材料処理が知られている（非特許文献１０）。酸処理されたＣＮＴの周囲を酸化ニオブで被膜することで、酸化ニオブ表面に提示されたプラチナの酸化還元触媒活性が向上することが示されていた（非特許文献１１）。また、生体高分子を用いる方法としてＣＮＴ結合ペプチドと酸化チタン結合ペプチドが融合したタンパク質やウイルスを用いてカーボンナノチューブを酸化チタンなどの酸化物でコーティングし、ナノ複合素材を合成する技術（非特許文献１２および１３）が報告されており、それらの方法で合成されたナノ複合体は共に太陽電池電極材として利用されていた。
なお、ＨＰＳＨＭＡＭＤＲＳＱＰ（配列番号４）およびＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ（配列番号６）のペプチドはそれぞれ、非特許文献１５および１６で報告されている。しかし、これらのペプチドがニオブ材料に結合することは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第５８６６３６３号明細書
【特許文献２】米国特許第５４０３４８４号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／０１００３１号
【特許文献４】国際公開第２００６／０６８２５０号
【特許文献５】特開２００４−１２１１５４号公報
【特許文献６】特開２００５−２４９３９号公報
【特許文献７】特開２０１４−３０８０４号公報
【特許文献８】特開２００９−８１４２９号公報
【特許文献９】特開２０１１−０１４５０６号公報
【特許文献１０】特開２０１３−１４９４４６号公報
【特許文献１１】特開２００９−１８９６８３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００５，ｖｏｌ．２１．ｐ．３０９０．
【非特許文献２】Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，２００８，ｖｏｌ．２０．ｐ．１５７８．
【非特許文献３】Ｓ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．
【非特許文献４】Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．
【非特許文献５】Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７．ｐ．２５７１．
【非特許文献６】Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．
【非特許文献７】Ｋ．Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｈｅｍ．，  Ｐｙｓ．，２００７，ｖｏｌ．１０．ｐ．１５９．
【非特許文献８】Ｌ．Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｅｒｇｙ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．，  ２０１２，  ｖｏｌ．５，  ｐ．６１５６．
【非特許文献９】Ｐ．Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍ，１９９９，  ｖｏｌ．  ３５１，  Ｎｏ．１−２，  ｐ．２９０．
【非特許文献１０】Ｄ．  Ｅｄｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ２０１０，  ｖｏｌ．１１０，  ｐ．１３４８．
【非特許文献１１】Ｋ．Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＳＣ  Ａｄｖ．，  ２０１４，ｖｏｌ．４，ｐ．９７０１．
【非特許文献１２】Ｘ．  Ｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．  ２０１１，  ｖｏｌ．  ６，  ｐ．３７７．
【非特許文献１３】Ｉ．Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１１，ｖｏｌ．４７，ｐ．１２６４９．
【非特許文献１４】Ｋ．Ｓｈｉｂａ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１０，ｖｏｌ．２１，ｐ．４１２．
【非特許文献１５】Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，２００９，ｉｓｓｕｅ  １，ｐ．１２６．
【非特許文献１６】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０１１，ｖｏｌ．３２，ｐ．４９４３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体分子素材の持つ自己組織化能力と無機物析出能力の両方を活用することで、機能性を持つ構造や無機素材と有機素材を組み合わせた複合素材を構築できる。しかしながら、そのような機能性素材の合成に利用できるペプチドの種類は少ない。例えば、多様な用途への応用が期待されるニオブ材料（例、酸化ニオブ）結合活性、およびニオブ材料析出活性を有するペプチドは知られていなかった。したがって、本発明の目的は、このような活性を有するペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、このような活性を有するペプチドを得ること等に初めて成功し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ニオブ材料結合ペプチド、ニオブ材料結合ペプチドと融合したタンパク質、またはニオブ材料結合ペプチドと融合したタンパク質の多量体と、ニオブ材料とを接触させることを含む、ペプチドまたはタンパク質とニオブ材料との吸着方法。
〔２〕水溶液中に溶解したニオブ材料を、前記ペプチド、前記タンパク質、または前記多量体と接触させて、水溶液からニオブ材料を析出させることを含む方法である、〔１〕の方法。
〔３〕ニオブ材料結合ペプチドが、以下（Ｉ）あるいは（ＩＩ）のペプチドである、〔１〕または〔２〕の方法：
（Ｉ）ＳＮＡＰＮＴＸＶＸＳＸＸ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつニオブ材料結合活性を有するペプチド；あるいは
（ＩＩ）以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＮＧＡＴＡＴＨＭＡＳＩＡ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＨＰＳＨＭＡＭＤＲＳＱＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＤＴＳＴＨＡＰＮＶＰＲＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＡＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＳＡＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＳＮＧＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＳＮＡＡＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＳＮＡＰＡＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＳＮＡＰＮＡＩＶＲＳＭＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＳＮＡＰＮＴＡＶＲＳＭＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１３）ＳＮＡＰＮＴＩＡＲＳＭＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）ＳＮＡＰＮＴＩＶＡＳＭＳ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１５）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＡＭＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１６）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＡＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１７）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＡ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むペプチド；ならびに
１８）配列番号２〜６、９〜２０のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニオブ材料結合活性を有する、ペプチド。
〔４〕ＳＮＡＰＮＴＸＶＸＳＸＸ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつニオブ材料結合活性を有するペプチド。
〔５〕以下である、〔４〕のペプチド：
（ｉ）７位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基であり；
（ｉｉ）９位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基、または塩基性アミノ酸残基であり；
（ｉｉｉ）１１位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基であり；あるいは
（ｉｖ）１２位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基である。
〔６〕以下からなる群より選ばれるペプチド：
１）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＮＧＡＴＡＴＨＭＡＳＩＡ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＤＴＳＴＨＡＰＮＶＰＲＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
６）ＡＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＳＡＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＳＮＧＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＳＮＡＡＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＳＮＡＰＡＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＳＮＡＰＮＡＩＶＲＳＭＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＳＮＡＰＮＴＡＶＲＳＭＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１３）ＳＮＡＰＮＴＩＡＲＳＭＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）ＳＮＡＰＮＴＩＶＡＳＭＳ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１５）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＡＭＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１６）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＡＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１７）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＡ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むペプチド；ならびに
１８）配列番号２〜６、９〜２０のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニオブ材料結合活性を有する、ペプチド。
〔７〕〔４〕〜〔６〕のいずれかのペプチドとタンパク質との融合タンパク質であって、
前記ペプチドがタンパク質のＮ末端またはＣ末端に付加された、融合タンパク質。
〔８〕（ｉ）ポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分および（ｉｉｉ）〔４〕〜〔６〕のいずれかのペプチドの部分を含む、融合タンパク質。
〔９〕ポリペプチド部分が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分である、〔８〕の融合タンパク質。
〔１０〕内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分がＤｐｓである、〔９〕の融合タンパク質。
〔１１〕標的物質が、金属素材、シリコン素材または炭素素材である、〔８〕〜〔１０〕のいずれかの融合タンパク質。
〔１２〕〔４〕〜〔６〕のいずれかのペプチド、または〔７〕〜〔１１〕のいずれかの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１３〕〔１２〕のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
〔１４〕〔１２〕のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞。
〔１５〕融合タンパク質の多量体であって、
内腔を有し、
融合タンパク質が、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分および〔４〕〜〔６〕のいずれかのペプチドの部分を含む、多量体。
〔１６〕内腔中に物質を含む、〔１５〕の多量体。
〔１７〕〔８〕〜〔１１〕のいずれかの融合タンパク質、または〔１５〕または〔１６〕の多量体を用いて、ニオブ材料と標的物質とを接着させることを含む、ニオブ材料および標的物質を含む複合体の製造方法。
〔１８〕ニオブ材料および標的物質を含む複合体が、酸化ニオブで被膜された標的物質である、〔１７〕の方法。
〔１９〕〔８〕〜〔１１〕のいずれかの融合タンパク質、または〔１５〕または〔１６〕の多量体を介して接着された、ニオブ材料および標的物質を含む複合体。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチドは、例えば、ニオブ材料結合剤または析出剤として、タンパク質の精製用タグとして、または本発明の融合タンパク質、多量体または複合体の作製に有用である。
本発明の融合タンパク質、多量体または複合体は、例えば、電気特性および／または触媒活性の向上した新規デバイスの作製、ならびに医療、バイオ研究分野等の分野に有用である。例えば、ニオブ材料に結合し得るペプチド部分およびカーボンナノチューブに結合し得るペプチド部分を含む融合タンパク質の使用により、蓄電池、水素発生装置、燃料電池、太陽電池、半導体などの提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドを提示したカゴ状タンパク質によるニオブ化合物析出を示す図である。
【図２】図２は、酸化ニオブ粒子へのＮｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドを提示したカゴ状タンパク質の吸着を示す図である。
【図３】図３は、変異Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドをそれぞれ提示したカゴ状タンパク質によるニオブ化合物析出活性（各反応液の濁度の経時変化）を示す図である。Ａ：１〜６位のアミノ酸残基の変異体；Ｂ：７〜１２位のアミノ酸残基の変異体。Ｏｒｉｇｉｎａｌ：Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチド；Ｄｐｓ：Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドまたはその変異体を有しないＤｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）（タンパク質有りのコントロール）ｗ／ｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ：タンパク質無しのコントロール。
【図４】図４は、変異Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドをそれぞれ提示したカゴ状タンパク質によるニオブ化合物析出活性（反応開始２００分後の反応液の濁度比較）を示す図である。略号は図３と同様。
【図５】図５は、変異Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドをそれぞれ提示したカゴ状タンパク質の酸化ニオブへの吸着能を示す図である。
【図６】図６は、Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドとカーボンナノチューブ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質（小さい写真）を用いて周囲特異的にニオブ化合物を析出させたカーボンナノチューブの透過型電子顕微鏡像を示す図である。
【図７】図７は、カーボンナノチューブの周囲特異的に析出したニオブ化合物のニオブ原子のマッピング像を示す図である。左：透過型電子顕微鏡像；右：エネルギー分散型Ｘ線分析マッピング像。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
（ペプチド）
本発明は、ニオブ材料に結合し得るペプチドを提供する。ニオブ材料に結合し得るペプチドは、例えば、生物学的手法により作製することができ、また、有機化学的方法により合成することができる。ニオブ材料に結合し得るペプチドは、単離および／または精製されていてもよい。ニオブ材料に結合し得るペプチドは、人工ペプチドであり得る。
【００１１】
一実施形態では、本発明のペプチドは、ＳＮＡＰＮＴＸＶＸＳＸＸ（配列番号１）のアミノ酸配列〔Ｘは各々独立してアミノ酸残基を表す〕を含み、かつニオブ材料結合活性を有するペプチドである。Ｘで表されるアミノ酸残基は、天然タンパク質を構成する通常のＬ−α−アミノ酸である。このようなアミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、Ｌ−リジン（Ｋ）、およびグリシン（Ｇ）が挙げられる。
【００１２】
好ましくは、Ｘで表されるアミノ酸残基は、以下であってもよい：
（ｉ）７位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基であり；
（ｉｉ）９位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基、または塩基性アミノ酸残基であり；
（ｉｉｉ）１１位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基であり；あるいは
（ｉｖ）１２位のアミノ酸残基Ｘが、中性アミノ酸残基である。
中性アミノ酸残基としては、例えば、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸残基（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸残基（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）が挙げられる。塩基性アミノ酸残基としては、例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられる。
【００１３】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、以下からなる群より選ばれるペプチドのうち、ニオブ材料結合活性およびニオブ材料析出活性を有することが本発明者らにより初めて見出されたものの、物質として偶然に既知であった３）および５）のべプチドを除いたものであってもよい：
１）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
２）ＮＧＡＴＡＴＨＭＡＳＩＡ（配列番号３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
３）ＨＰＳＨＭＡＭＤＲＳＱＰ（配列番号４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
４）ＤＴＳＴＨＡＰＮＶＰＲＡ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
５）ＴＧＮＹＫＡＬＨＰＨＮＧ（配列番号６）のアミノ酸配列を含むペプチド； 
６）ＡＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
７）ＳＡＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含むペプチド；
８）ＳＮＧＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むペプチド；
９）ＳＮＡＡＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１０）ＳＮＡＰＡＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号１３）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１１）ＳＮＡＰＮＡＩＶＲＳＭＳ（配列番号１４）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１２）ＳＮＡＰＮＴＡＶＲＳＭＳ（配列番号１５）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１３）ＳＮＡＰＮＴＩＡＲＳＭＳ（配列番号１６）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１４）ＳＮＡＰＮＴＩＶＡＳＭＳ（配列番号１７）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１５）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＡＭＳ（配列番号１８）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１６）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＡＳ（配列番号１９）のアミノ酸配列を含むペプチド；
１７）ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＡ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むペプチド；ならびに
１８）配列番号２〜６、９〜２０のアミノ酸配列のいずれか一つのアミノ酸配列において１個または２個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加または挿入されたアミノ酸配列を含み、かつ、ニオブ材料結合活性を有する、ペプチド。
【００１４】
本発明では、ニオブ材料結合活性とは、ニオブ材料に結合する能力をいう。本発明では、ニオブ材料とは、ニオブ金属またはニオブ化合物あるいはこれらを含む材料をいう。ニオブ材料は、好ましくはニオブ金属またはニオブ化合物であり、より好ましくはニオブ化合物である。ニオブ化合物としては、例えば、ニオブの酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。ニオブ化合物としては、ニオブの酸化物（酸化ニオブ）が好ましい。酸化ニオブとしては、例えば、Ｎｂ２Ｏ５、ＮｂＯ２、およびＮｂＯが挙げられるが、Ｎｂ２Ｏ５が好ましい。ニオブ材料結合活性の程度は、ニオブ材料に結合する能力を保持する限り特に限定されないが、例えば、元のアミノ酸配列からなるペプチドのニオブ材料結合活性の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または同等以上であってもよい。ニオブ材料結合活性の程度は、例えば、実施例５に記載されるように、ニオブ材料に対するペプチドの吸着度により評価することができる。また、ファージパニングにおいてｐｆｕ値を指標として評価してもよい。好ましくは、ニオブ材料結合活性の程度は、ニオブ材料に対するペプチドの吸着度により評価される。
【００１５】
金属および／または金属化合物に結合し得るペプチドは、金属化合物の析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）活性を有し得ることが知られている（Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７，ｐ．２５７１．）。したがって、ニオブ材料結合活性を有するペプチドは、ニオブ材料析出活性を有していてもよい。ニオブ材料析出活性の程度は、ニオブ材料を析出させる能力を保持する限り特に限定されないが、例えば元のアミノ酸配列からなるペプチドのニオブ材料析出活性の約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上または同等以上であってもよい。ニオブ材料析出活性の程度は、例えば、実施例４、７に記載されるような吸光度（例、６００ｎｍの吸光度）の測定に基づき評価することができる。
【００１６】
上述した１８）のペプチドにおいて、置換、付加または挿入されるアミノ酸残基は、天然タンパク質を構成する通常のＬ−α−アミノ酸である。このようなアミノ酸残基としては、例えば、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−システイン（Ｃ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ）、Ｌ−イソロイシン（Ｉ）、Ｌ−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニン（Ｍ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、Ｌ−チロシン（Ｙ）、Ｌ−バリン（Ｖ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、Ｌ−リジン（Ｋ）、およびグリシン（Ｇ）が挙げられる。
【００１７】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有する塩基性アミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有する酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、中性側鎖を有する中性アミノ酸〔例、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、および非極性側鎖を有するアミノ酸（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）〕、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００１８】
本発明のペプチドは、例えば、ニオブ材料結合剤または析出剤として、タンパク質の精製用タグとして、ならびに本発明の融合タンパク質、多量体または複合体の作製に有用である。
【００１９】
（融合タンパク質）
本発明はまた、本発明のペプチドとタンパク質との融合タンパク質を提供する。本発明において、用語「タンパク質」は、ポリペプチドと同義の表現であり、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は交換可能に使用される。本発明のペプチドと融合されるタンパク質としては、任意のタンパク質を用いることができ、例えば、精製が意図されるタンパク質、多量体を形成し得るタンパク質（例、内腔を有する多量体を形成し得るタンパク質）が挙げられる。タンパク質に対する本発明のペプチドの融合は、タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれか一方または双方で行われる。本発明のペプチドは、ファージパニングにより得られたペプチドである。ファージパニングは、外来ＤＮＡをファージのコートタンパク質をコードする遺伝子中に挿入し、その外来ＤＮＡの産物をコートタンパク質との融合タンパク質としてファージ粒子表面に提示させる方法である。したがって、このような手法により取得された本発明のペプチドは、タンパク質と融合された状態において、その機能を発揮できることが実証されている。
【００２０】
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ｉ）ポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分、および（ｉｉｉ）ニオブ材料に結合し得るペプチド部分を含んでいてもよい。ポリペプチド部分は、上述した用語「タンパク質」と同義である。
【００２１】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、（ｉ’）内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分、ならびに（ｉｉ）標的物質に結合し得るペプチド部分、および（ｉｉｉ）ニオブ材料に結合し得るペプチド部分を含んでいてもよい。
【００２２】
用語「内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分」とは、内部に空間を有する多量体を、ポリペプチド部分の会合によって、形成する能力を有するポリペプチド部分をいう。このようなポリペプチド部分としては、幾つかのタンパク質が知られている。例えば、このようなポリペプチド部分としては、内腔を有する２４量体を形成し得るフェリチン、および内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質が挙げられる。内腔を有する多量体を形成し得るフェリチン様タンパク質としては、例えば、内腔を有する１２量体を形成し得るＤｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。Ｄｐｓは、分子量約１８ｋＤａの単量体単位からなる１２量体を形成することにより、約５ｎｍの直径の内腔を有する外径９ｎｍからなるかご状構造を形成し、この内腔中に、鉄分子を酸化鉄ナノ粒子として貯蔵できる。さらに、フェリチンでは、鉄以外にも、ベリリウム、ガリウム、マンガン、リン、ウラン、鉛、コバルト、ニッケル、クロムなどの金属の酸化物、また、セレン化カドミウム、硫化亜鉛、硫化鉄、硫化カドミウムなどの半導体・磁性体などのナノ粒子を人工的に貯蔵させられることが示されており、半導体材料工学分野や医療分野での応用研究が盛んにおこなわれている（Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２０１０，ｖｏｌ．１８００，ｐ．８４６．）。内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、微生物、植物および動物等の任意の生物に由来する、天然に生じるタンパク質であっても、または天然に生じるタンパク質の変異体であってもよい。以下、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分を、単にポリペプチド部分と称する場合がある。内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分としては、そのＮ末端部およびＣ末端部が多量体の表面に露出し得るものが好ましい。
【００２３】
好ましくは、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分は、Ｄｐｓである。本発明で用いられる用語「Ｄｐｓ（ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｒｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ）」とは、上述したような、内腔を有する１２量体を形成し得るタンパク質をいう。用語「Ｄｐｓ」には、天然に生じるＤｐｓまたはその変異体が含まれる。天然に生じるＤｐｓの変異体としては、天然に生じるＤｐｓと同様に、１２量体を形成したときに、そのＮ末端部およびＣ末端部が１２量体の表面に露出し得るものが好ましい。なお、Ｄｐｓは、それが由来する細菌の種類によってはＮａｐＡ、バクテリオフェリチン、ＤｌｐまたはＭｒｇＡと称呼される場合があり、また、Ｄｐｓには、ＤｐｓＡ、ＤｐｓＢ、Ｄｐｓ１、Ｄｐｓ２等のサブタイプが知られている（Ｔ．Ｈａｉｋａｒａｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ａ．Ｃ．Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｎ，  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，２０１０  ｖｏｌ．６７，ｐ．３４１を参照）。したがって、本発明では、用語「Ｄｐｓ」は、これらの別名で称呼されるタンパク質も含むものとする。
【００２４】
Ｄｐｓが由来し得る微生物としては、Ｄｐｓを産生する微生物である限り特に限定されないが、例えば、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、エスケリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、サーモシネココッカス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、およびデイノコッカス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、ならびにコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌が挙げられる。
リステリア属に属する細菌としては、例えば、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）が挙げられる。スタフィロコッカス属に属する細菌としては、例えば、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ）が挙げられる。バチルス属に属する細菌としては、例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。ストレプトコッカス属に属する細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス  スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）が挙げられる。ビブリオ属に属する細菌としては、例えば、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）が挙げられる。エスケリシア属に属する細菌としては、例えば、エスケリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が挙げられる。ブルセラ属に属する細菌としては、例えば、ブルセラ・メリテンシス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  Ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）が挙げられる。ボレリア属に属する細菌としては、例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  Ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が挙げられる。マイコバクテリウム属に属する細菌としては、例えば、マイコバクテリウム・スメグマティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）が挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）が挙げられる。サーモシネココッカス属に属する細菌としては、例えば、サーモシネココッカス・エロンガタス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  Ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）が挙げられる。デイノコッカス属に属する細菌としては、例えば、デイノコッカス・ラディオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）が挙げられる。パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する細菌としては、例えば、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）が挙げられる。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が挙げられる。
好ましくは、Ｄｐｓは、リステリア・イノキュアまたはエスケリシア・コリ、あるいはコリネバクテリウム・グルタミカムに由来するＤｐｓであり得る。
【００２５】
用語「標的物質に結合し得るペプチド部分」とは、任意の標的物質に対して親和性を有するペプチドを有し、かつ当該標的物質に対して結合できる部分をいう。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られているので、本発明では、このようなペプチドを有する部分を、上記ペプチド部分として用いることができる。標的物質に結合し得るペプチド部分は、任意の標的物質に対して親和性を有する１個のペプチドのみを有していてもよいし、あるいは任意の標的物質に対して親和性を有する同種または異種の複数（例、２個、３個、４個、５個または６個等の数個）のペプチドを有していてもよい。例えば、標的物質に結合し得るペプチド部分が、任意の標的物質に対して親和性を有する異種の複数のペプチドを有する場合、当該ペプチド部分としては、カーボンナノ材料と結合し得るＰ１ペプチドと、チタン材料またはシリコン材料に結合し得るＲ５ペプチドとの融合ペプチドであるＰ１Ｒ５ペプチドを用いることができる（例、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４を参照）。標的物質に結合し得るペプチド部分が上記のような複数のペプチドを有する場合、複数のペプチドは、当該ペプチド部分中に任意の順序で融合され得る。融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。
【００２６】
標的物質としては、例えば、無機材料および有機材料、あるいは導体材料、半導体材料および磁性体材料が挙げられる。具体的には、このような標的物質としては、金属材料、シリコン材料、炭素材料、低分子化合物（例、ポルフィリン等の生体物質、放射性物質、蛍光物質、色素、薬物）、ポリマー（例、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシドまたはポリ（Ｌ−乳酸）等の疎水性有機ポリマーまたは伝導性ポリマー）、タンパク質（例、オリゴペプチドまたはポリペプチド）、核酸（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいはヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）、糖質（例、モノサッカリド、オリゴサッカリドまたはポリサッカリド）、脂質が挙げられる。
【００２７】
金属材料としては、例えば、金属および金属化合物が挙げられる。金属としては、例えば、チタン、クロム、亜鉛、鉛、マンガン、カルシウム、銅、カルシウム、ゲルマニウム、アルミニウム、ガリウム、カドミウム、鉄、コバルト、金、銀、プラチナ、パラジウム、ハフニウム、テルルが挙げられる。金属化合物としては、例えば、金属の酸化物、硫化物、炭酸化物、砒化物、塩化物、フッ化物およびヨウ化物、ならびに金属間化合物が挙げられる。金属の酸化物としては、種々の酸化物が挙げられる。より具体的には、金属化合物としては、上述したようなチタンの酸化物、酸化クロム、酸化亜鉛、酸化鉛、酸化マンガン、ゼオライト、炭酸カルシウム、酸化銅、酸化マンガンカルシウム、酸化ゲルマニウム、酸化アルミニウム、酸化ハフニウム、チタンジルコン酸鉛、砒化ガリウム、硫化亜鉛、硫化鉛、硫化カドミウム、白金鉄、白金コバルト、カドミウムテルルが挙げられる。
【００２８】
シリコン材料としては、例えば、シリコンまたはシリコン化合物が挙げられる。シリコン化合物としては、例えば、シリコンの酸化物（例、一酸化ケイ素（ＳｉＯ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ２））、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、シラン（ＳｉＨ４）、シリコーンゴムが挙げられる。
【００２９】
炭素材料としては、例えば、カーボンナノ材料（例、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ））、フラーレン（Ｃ６０）、グラフェンシート、グラファイトが挙げられる。ＣＮＴとしては、単層ＣＮＴ、および複層ＣＮＴが挙げられる。
【００３０】
標的物質に結合し得るペプチド部分は、上述したような標的物質に対して親和性を有する限り特に限定されない。標的物質に対して親和性を有する種々のペプチドが知られており、また、開発されている。例えば、生体材料および無機材料または有機材料の複合体を作製することを目的として、無機材料または有機材料に対して結合し得るペプチドが、ファージを用いたスクリーニング等の手法により開発されている。このような手法により開発されたペプチドとしては、例えば、チタン（例、チタンの酸化物）ならびに銀（Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）、金（Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，ｖｏｌ．１５．ｐ．２６９．）、酸化亜鉛（Ｋ．Ｋｊａｅｒｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，ｖｏｌ．６６．ｐ．１０．、Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５））、酸化ゲルマニウム（Ｍ．Ｂ．Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２００４，ｖｏｌ．１５．ｐ．１７７６．）、硫化亜鉛および硫化カドミウム（Ｃ．Ｅ．Ｆｌｙｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．，２００３，ｖｏｌ．１３．ｐ．２４１４．）等の金属材料に結合し得るペプチド；シリコンおよびシリコンの酸化物（Ｈ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．，２００６，ｖｏｌ．７８，，ｐ．４８７２、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４、Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、国際公開第２００５／０１００３１号）等のシリコン材料に結合し得るペプチド；カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、カーボンナノホン（ＣＮＨ）等の炭素材料に結合し得るペプチド（Ｓ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔｅｒ．，２００３，ｖｏｌ．２，ｐ．１９６．および特開２００４−１２１１５４号公報）；ならびに疎水性有機ポリマー等のポリマーに結合し得るペプチド（特開２００８−１３３１９４号公報）が挙げられる。したがって、本発明でも、標的物質に結合し得るペプチド部分として、このようなペプチドを使用することができる。
【００３１】
なお、金属に結合し得るペプチドは、金属の析出（ｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）作用を有し得ること、および金属化合物に結合し得るペプチドは、金属化合物の析出活性を有し得ることが知られている（Ｋ．Ｓａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００４，ｖｏｌ．２１，ｐ．３０９０．、Ｍ．Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００５，ｖｏｌ．１７，ｐ．２５７１．）。したがって、標的物質に結合し得るペプチド部分として、金属材料（金属または金属化合物）に結合し得るペプチドを用いる場合、金属材料に結合し得るペプチドは、このような析出活性を有し得る。
【００３２】
ポリペプチド部分およびペプチド部分の融合は、アミド結合を介して達成され得る。融合は、直接的なアミド結合、あるいは１個のアミノ酸残基（例、メチオニン）または数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチド（ペプチドリンカー）が介在したアミド結合により達成され得る。種々のペプチドリンカーが知られているので、本発明でも、このようなペプチドリンカーを使用することができる。
【００３３】
本発明の融合タンパク質において、ポリペプチド部分、ならびに標的物質に結合し得るペプチド部分、およびニオブ材料に結合し得るペプチド部分が融合する順序は、特に限定されず、１）ポリペプチド部分のＮ末端部およびＣ末端部がそれぞれ標的物質に結合し得るペプチド部分、およびニオブ材料に結合し得るペプチド部分のＣ末端部およびＮ末端部またはＮ末端部およびＣ末端部と融合していてもよいし、あるいは２）ポリペプチド部分のＮ末端部が標的物質に結合し得るペプチド部分のＣ末端部と融合し、かつ当該標的物質に結合し得るペプチド部分のＮ末端部がニオブ材料に結合し得るペプチド部分のＣ末端部とさらに融合していてもよく、または３）ポリペプチド部分のＣ末端部が標的物質に結合し得るペプチド部分のＮ末端部と融合し、かつ当該標的物質に結合し得るペプチド部分のＣ末端部がニオブ材料に結合し得るペプチド部分のＮ末端部とさらに融合していてもよい。例えば、ポリペプチド部分としてフェリチンを用いる場合、フェリチンはそのＮ末端部が多量体の表面上に露出され、そのＣ末端部は表面上に露出しないことから、好ましくは、フェリチンは、上記２）の順序で融合される。一方、ポリペプチド部分としてＤｐｓを用いる場合、ＤｐｓはＮ末端部およびＣ末端部の両方が多量体の表面上に露出し得ることから、Ｄｐｓは、上記１）〜３）のいずれかの順序で融合され得る。
【００３４】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ポリペプチド部分のＮ末端側およびＣ末端側またはＣ末端側およびＮ末端側にそれぞれ標的物質に結合し得るペプチド部分、およびニオブ材料に結合し得るペプチド部分（それぞれ、１個または複数）を有し得る。
【００３５】
ポリペプチド部分のＮ末端側に融合されたペプチド部分は、翻訳開始コドンによりコードされるメチオニン、またはメチオニンをＮ末端に含む部分を、そのＮ末端側に有するように設計され得る。このような設計により、本発明の融合タンパク質の翻訳が促進され得る。メチオニンをＮ末端に含むペプチド部分は、数個（例えば２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜２０個、さらにより好ましくは２〜１５個または２〜１０個、最も好ましくは２、３、４または５個）のアミノ酸残基からなるペプチドであり得る。
【００３６】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、標的物質に結合し得るペプチド部分、およびニオブ材料に結合し得るペプチド部分が異なる標的物質に結合し得る。標的物質に結合し得るペプチド部分が結合する標的物質としては、例えば、無機材料および有機材料が挙げられる。より具体的には、このような標的物質としては、例えば、金属材料、シリコン材料、炭素材料が挙げられる。好ましくは、標的物質は、炭素材料またはシリコン材料である。
【００３７】
炭素材料に結合し得るペプチド部分としては、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）またはカーボンナノホン（ＣＮＨ）等のカーボンナノ材料に結合し得るペプチド部分が好ましい。このようなペプチド部分としては、例えば、Ｍ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるペプチド、ならびに特開２００４−１２１１５４号公報に開示されるペプチドが挙げられる。
【００３８】
金属材料に結合し得るペプチド部分としては、例えば、亜鉛または亜鉛化合物（例、酸化亜鉛）等の亜鉛材料に結合し得るペプチド部分が挙げられる。亜鉛材料に結合し得るペプチド部分としては、例えば、Ｕｍｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１７，２５７１−２５７５（２００５）に開示されるペプチドが挙げられる。
【００３９】
シリコン材料に結合し得るペプチド部分としては、シリコンまたはシリコン化合物（例、シリコンの酸化物）に結合し得るペプチド部分が好ましい。このようなペプチド部分としては、例えば、国際公開第２００６／１２６５９５号、およびＭ．Ｊ．Ｐｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，２００６，ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１，ｐ．４０−４４に開示されるペプチドが挙げられる。
【００４０】
（ポリヌクレオチド）
本発明は、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。
【００４１】
（発現ベクター）
本発明は、発現ベクターを提供する。本発明の発現ベクターは、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含む。
【００４２】
本発明の発現ベクターは、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含んでいてもよい。プロモーターとしては、例えば、任意の生物（例、微生物、動物、昆虫、および植物）由来プロモーター、ウイルス由来プロモーター、ならびに人工合成プロモーターが挙げられる。プロモーターとしてはまた、異種タンパク質生産に汎用されるプロモーターを用いてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。
【００４３】
本発明の発現ベクターはまた、上記ポリヌクレオチドの下流にターミネーターをさらに含んでいてもよい。このようなターミネーターとしては、例えば、Ｔ７ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、Ｔ４ターミネーター、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネーター、エシェリヒア・コリｔｒｐＡ遺伝子のターミネーターが挙げられる。
【００４４】
本発明の発現ベクターはまた、開始コドンの上流にリボゾーム結合部位（例、シャイン・ダルガノ配列）をさらに含んでいてもよい。
【００４５】
本発明の発現ベクターはまた、薬剤耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００４６】
本発明の発現ベクターはまた、宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする１以上の領域をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位が一対の相同領域（例、宿主ゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位とは、発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーター（例、同種プロモーター、異種プロモーター）を含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの産生を可能にする単位をいう。発現単位は、上述したようなターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。
【００４７】
本発明の発現ベクターとしては、例えば、宿主においてタンパク質を発現させる細胞系ベクター、およびタンパク質翻訳系を利用する無細胞系ベクターが挙げられる。発現ベクターはまた、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター、または人工染色体であってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、上述の発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターであってもよい。
細胞系ベクターとしては、宿主に適した公知の発現ベクターが用いられる。このようなベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。
無細胞系ベクターとしては、例えば、Ｔ７またはＴ３プロモーターを有する発現ベクター、ＳＰ６プロモーター等を有するｐＥＵ系プラスミド等の小麦無細胞タンパク質合成用ベクター等が挙げられる。
【００４８】
本発明の発現ベクターはまた、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびマルチクローニング部位、ならびに上述したエレメントを含む、タンパク質精製用ベクターであってもよい。この場合、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをマルチクローニング部位に挿入することにより、所望のタンパク質が、本発明のペプチドとの融合タンパク質として発現される。したがって、本発明のペプチドとの親和性を有するニオブ材料を利用することにより、所望のタンパク質を精製することができる。マルチクローニング部位は、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して５’末端側または３’末端側のいずれに存在していてもよい。
【００４９】
（形質転換体）
本発明の形質転換体は、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質を産生できる、または本発明のポリヌクレオチドを発現してペプチドまたは融合タンパク質を産生できる宿主細胞である。具体的には、本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞である。本発明のポリヌクレオチドを含む発現単位を含む宿主細胞としては、例えば、本発明の発現ベクターが細胞質中に導入された宿主細胞、本発明の発現ベクターの全体がゲノムに挿入された宿主細胞、および本発明の発現ベクター中の発現単位がそのゲノムに挿入された宿主細胞が挙げられる。宿主細胞は、本発明のタンパク質を発現できる限り特に限定されない。宿主細胞としては、例えば、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、および微生物が挙げられるが、微生物が好ましい。微生物としては、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌等の細菌、および真菌が挙げられる。細菌は、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。
【００５０】
グラム陽性細菌としては、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、およびコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が挙げられる。
【００５１】
グラム陰性細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）等のパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌、およびエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等のエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌等が挙げられる。
【００５２】
真菌としては、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等のサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌、およびシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等のシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属真菌が挙げられる。
【００５３】
発現単位の宿主細胞への導入（形質転換）は、例えば、発現ベクターを利用した従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、カルシウム処理された菌体を用いるコンピテント細胞法や、エレクトロポレーション法等が挙げられる。また、プラスミドベクター以外にもファージベクターを用いて、菌体内に感染させ導入する方法によってもよい。
【００５４】
本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質は、本発明の形質転換体またはその培養培地から精製されてもよい。本発明の形質転換体は、ソニケーション、リゾチーム処理等の処理により、破砕されてもよい。精製方法としては、例えば、塩析法、および各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。ニオブ材料を用いたアフィニティーカラムにより、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質を精製することができる。その他、イオン交換クロマトグラフィーやゲルろ過クロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせて精製することにより、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質の純度を高めることができる。
【００５５】
（多量体）
本発明はまた、融合タンパク質の多量体を提供する。本発明の多量体は、内腔を有し得る。本発明の多量体を構成する融合タンパク質は、上述したとおりである。本発明の多量体は、本発明の融合タンパク質を発現させることで、自律的に形成され得る。本発明の多量体を構成する単量体単位の数は、本発明の融合タンパク質におけるポリペプチド部分の種類により決定され得る。好ましくは、本発明の多量体は、内腔を有する多量体を形成し得るポリペプチド部分としてＤｐｓを有し得ることから、１２量体であり得る。本発明の多量体は、例えば、本発明のペプチド、または本発明の融合タンパク質について上述したのと同様に、本発明の形質転換体またはその培養培地から精製することができる。
【００５６】
本発明の多量体は、単量体単位として、単一の融合タンパク質から構成されるホモ多量体であってもよいが、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の融合タンパク質から構成されるヘテロ多量体であってもよい。本発明の多量体では、多量体形成の観点から、多量体を構成する融合タンパク質中のポリペプチド部分は単一のポリペプチド部分であることが好ましいが、標的物質に結合し得るペプチド部分、およびニオブ材料に結合し得るペプチド部分は、多量体を構成する融合タンパク質間で異なるものであってもよい。異なる複数の種類の融合タンパク質から構成される多量体は、例えば、異なる種類の融合タンパク質を発現する複数のベクター、または異なる種類の融合タンパク質を発現する単一のベクター（例、ポリシストロニックｍＲＮＡを発現し得るベクター）を、単一の宿主細胞に導入し、次いで、異なる種類の融合タンパク質を単一の宿主細胞中で発現させることにより、得ることができる。このような多量体はまた、単一の融合タンパク質から構成される第１の単量体と、単一の融合タンパク質（第１の多量体を構成する融合タンパク質とは異なる）から構成される第２の単量体とを、同一の媒体（例、緩衝液）中で共存させ、放置することにより、得ることができる。融合タンパク質の単量体は、例えば、本発明の多量体を、低ｐＨの緩衝液下に放置することにより調製することができる。詳細については、例えば、Ｂ．Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，ｖｏｌ．２１，ｐ．４４５６０２を参照のこと。
【００５７】
本発明の多量体は、内腔中に物質を含んでいてもよい。物質は、錯体または粒子（例、ナノ粒子、磁性粒子）のような形態で、本発明の多量体中に内包されていてもよい。当業者は、本発明の多量体の内腔のサイズ、および本発明の多量体における物質の取り込みに関与し得る領域（例、Ｃ末端の領域：Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）中のアミノ酸残基の電荷特性等を考慮することにより、本発明の多量体に内包され得る物質を適切に選択できる。例えば、ポリペプチド部分としてＤｐｓを有する本発明の多量体の場合、Ｄｐｓは、４０〜６０ｎｍ３（直径  約５ｎｍ）の程度の内腔を有する。したがって、このような多量体に内包され得る物質のサイズは、例えば６０ｎｍ３以下、好ましくは４０ｎｍ３以下、より好ましくは２０ｎｍ３以下、さらにより好ましくは１０ｎｍ３以下、最も好ましくは５ｎｍ３以下であり得る。また、多量体における物質の取り込みに関与し得る領域中の電荷特性（例、正または負に荷電し得る側鎖を有するアミノ酸残基の種類および数）を変化させることにより、多量体の内腔中への物質の取り込みをより促進できることが報告されているので（例、Ｒ．Ｍ．Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１２６，ｐ．１３２８２を参照）、本発明においても、電荷特性が変化された領域を有する融合タンパク質の多量体を用いることができる。本発明の多量体に内包され得る物質としては、例えば、上述した標的物質と同様の無機材料が挙げられる。具体的には、本発明の多量体に内包され得る物質としては、上述したような金属材料やシリコン材料が挙げられる。より具体的には、このような物質としては、酸化鉄、ニッケル、コバルト、マンガン、リン、ウラン、ベリリウム、アルミニウム、硫化カドミウム、セレン化カドミウム、パラジウム、クロム、銅、銀、ガドリウム錯体、白金コバルト、酸化シリコン、酸化コバルト、酸化インジウム、白金、金、硫化金、セレン化亜鉛、カドミウムセレンが挙げられる。
【００５８】
本発明の多量体の内腔中への物質の内包は、周知の方法により行うことができ、例えば、フェリチンまたはＤｐｓ等のフェリチン様タンパク質の多量体の内腔中への物質の内包方法（例、Ｉ．Ｙａｍａｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．，ｌｅｔｔ．，２００５．ｖｏｌ．３３，ｐ．１１５８を参照）と同様にして行うことができる。具体的には、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の緩衝液中に、本発明の多量体（または本発明の融合タンパク質）および内包されるべき物質を共存させ、次いで適切な温度（例、０〜３７℃）で放置することにより、本発明の多量体の内腔中に物質を内包させることができる。
【００５９】
本発明の多量体は、内腔中に物質を含む場合、異なる複数の種類（例、２種、３種、４種、５種または６種）の物質を含む、異なる複数の種類の多量体のセットとして提供されてもよい。例えば、本発明の多量体が２種の物質を含む２種の多量体のセットとして提供される場合、このようなセットは、各々別々に調製された、第１の物質を内包する第１の多量体と、第２の物質（第１の物質とは異なる）を内包する第２の多量体とを、組み合せることにより、得ることができる。上述したような融合タンパク質の多様なパターンと、内包物質の多様なパターンとを適宜組み合せることにより、非常に多様性に富む本発明の多量体を得ることができる。
【００６０】
（吸着方法）
本発明は、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体と、ニオブ材料とを接触させることを含む、ペプチド、タンパク質または多量体とニオブ材料との吸着方法を提供する。
【００６１】
本発明の吸着方法は、適切な水溶液（例、緩衝液）中で行うことができる。本発明のペプチドは、ニオブ材料と強く結合することができる。本発明の融合タンパク質、および本発明の多量体もまた、本発明のペプチドを有するので、ニオブ材料と強く結合することができる。したがって、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体、およびニオブ材料を用いることで、本発明の吸着方法を良好に行うことができる。ニオブ材料としては、例えば、上述したものが挙げられる。
【００６２】
本発明の吸着方法は、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体をカラム等の支持体に固定して用いることにより、ニオブ材料の精製に利用することができる。本発明の吸着方法はまた、ニオブ材料をカラム等の支持体に固定して用いることにより、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体の精製に利用することができる。本発明の吸着方法が、このような精製に用いられる場合、吸着物を支持体から遊離させる必要がある。この場合、遊離溶液中の塩濃度の変更、遊離剤としての本発明のペプチドまたはニオブ材料の利用などにより、吸着物を支持体から遊離させることができる。
【００６３】
本発明の吸着方法はまた、ニオブ材料の析出方法として用いることもできる。本発明の析出方法によれば、水溶液中に溶解したニオブ材料を、本発明のペプチド、本発明のタンパク質、または本発明の多量体と接触させることにより、水溶液からニオブ材料を析出させることができる。したがって、本発明では、用語「吸着」とは、固形物（非溶解物）に対する結合のみならず、水溶液中に溶解した物質（イオン性または非イオン性）に対する結合もまた意図される。
【００６４】
本発明の析出方法で用いられる水溶液としては、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体と、水溶液中に溶解したニオブ材料との結合によるニオブ材料の析出を可能にする、ニオブ材料を含有する任意の水溶液を利用することができる。このような水溶液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等の緩衝液（例、ＰＨ６．０〜８．０）が挙げられる。ニオブ材料は、塩または非塩の形態で水溶液中に溶解されてもよい。水溶液中のニオブ材料の濃度としては、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体により析出可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば０．００１〜１００重量％、好ましくは０．０１〜５０重量％、より好ましくは０．１〜２０重量％、さらにより好ましくは０．５〜１０重量％であってもよい。具体的には、本発明の析出方法における接触は、ニオブ材料を含有する水溶液中に、本発明のペプチド、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体を、適温（例、４℃〜６０℃）で所望の時間（例、１０分間〜２４時間）浸すことにより達成することができる。本発明の析出方法は、例えば、水溶液からのニオブ材料の回収、およびニオブ材料による標的物質の被覆に有用である。
【００６５】
（ニオブ材料および標的物質を含む複合体およびその製造方法）
本発明はまた、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体を用いて、ニオブ材料と標的物質とを接着させることを含む、ニオブ材料および標的物質を含む複合体の製造方法を提供する。
【００６６】
ニオブ材料および標的物質を含む複合体の本発明の製造方法は、適切な水溶液（例、緩衝液）中で行うことができる。本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体は、このような方法に用いられる場合、ニオブ材料に結合し得る本発明のペプチドに加えて、標的物質に結合し得るペプチド部分を有する。これにより、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体がリンカーとして作用し、ニオブ材料と標的物質とを接着することができる。したがって、ニオブ材料および標的物質を含む複合体として、ニオブ材料で被膜された標的物質を得ることができる。ニオブ材料および標的物質としては、例えば、上述した材料が挙げられる。
【００６７】
また、ニオブ材料が溶解された水溶液（例、緩衝液）を用いて、標的物質の表面にニオブ材料を析出させることで、ニオブ材料で被膜された標的物質を得ることができる。
【００６８】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体を介して接着された、ニオブ材料および標的物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体は、上記方法により製造することができる。本発明の複合体は、好ましくは、ニオブ材料で被膜された標的物質（被膜が、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体を介してなされたもの）である。
【００６９】
一実施形態では、上述の方法により製造され得る本発明の複合体は、ニオブ材料で被覆された標的物質である。好ましくは、このような複合体は、ニオブ材料で被覆された炭素材料である。より好ましくは、このような複合体は、ニオブ材料で被膜されたカーボンナノ材料（例、カーボンナノチューブ、カーボンナノホン）である。ニオブ材料としては、上述したようなニオブ金属およびニオブ化合物ならびにそれらを含む材料が挙げられるが、ニオブ金属およびニオブ化合物が好ましく、ニオブ化合物がより好ましく、ニオブの酸化物（酸化ニオブ）が特に好ましい。酸化ニオブとしては、上述したものが挙げられるが、Ｎｂ２Ｏ５が好ましい。したがって、上記複合体の製造に用いられる、本発明の融合タンパク質、または本発明の多量体は、好ましくは、このような標的物質に結合し得るペプチド部分を有する。
【００７０】
本発明の複合体は、光触媒活性または電気特性等に優れたデバイスおよび材料等の開発に有用である。例えば、本発明の複合体は、光電変換素子（例、色素増感太陽電池等の太陽電池）、水素発生素子、半導体メモリ素子の作製における材料または構成要素として、有用である。
【実施例】
【００７１】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７２】
実施例１：酸化ニオブ結合ペプチドのスクリーニング（ファージパニング）
五酸化ニオブ吸着ペプチドのスクリーニングは、Ｐｈ．Ｄ．ＴＭ−１２  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．、米国）を用いた。すなわち、五酸化ニオブ粉末（Ｎｂ２Ｏ５、Ｎｉｏｂｉｕｍ  Ｏｘｉｄｅ、和光純薬）を終濃度１０．０ｍｇ／ｍｌで含有するＴＢＴ０１緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌに、最終的なファージ濃度が１０１３個／ｍｌとなるようにＰｈ．Ｄ．ＴＭ−１２  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓのファージ溶液を添加し、室温で２時間回転放置した。反応後、五酸化ニオブ粉末を遠心回収し、ＴＢＴ０１緩衝液１ｍｌに再度懸濁した。この五酸化ニオブ粉末を遠心回収し、新たな緩衝液１ｍｌに懸濁する工程を、合計１０回実施した。その後、遠心回収された五酸化ニオブ粉末をグリシン緩衝液（０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ２．２））１ｍｌに懸濁し、室温で１０分間回転放置した。反応度、五酸化ニオブ粉末を遠心除去し、上清に中和用のトリス緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．１））０．１５ｍｌを加え、４℃で保存した。
【００７３】
続いて、このファージ溶液をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に感染させプラークを形成させた。すなわち、濁度０．１まで、３７℃で培養されたＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に、適当に希釈されたファージ液を０．０１ｍｌ加えた。その溶液を溶解させたＴＯＰ  Ａｇａｒ（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １０．０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５．０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５．０ｇ／ｌ、ａｇａｒｏｓｅ  ７．０ｇ／ｌ）３ｍｌに加え、ＬＢ／ＩＴＰＧ／Ｘｇａｌ寒天培地にまき３７℃で一晩放置した。その後、形成された青色プラークに含まれるファージからＤＮＡを回収し、配列を決定すると共に、１ｍｌ  ＬＢ培地（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  １．０ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ）を加え、ＴＯＰ  Ａｇａｒごと全プラークを削り取って１５ｍｌ遠沈管に回収した。その懸濁液を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離することで、ファージが含まれる上清を回収した。
【００７４】
ファージＤＮＡを回収するために、ＥＲ２７３８が播種されたＬＢ培地１ｍｌに爪楊枝を用いてファージの青色プラークからファージを播種した。３７℃で５時間培養した後、ヨウ素溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、４Ｍ  ＮａＩ）を用いてＤＮＡを回収し、配列（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号３３））を用いてペプチドライブラリーをコードする塩基配列を解読した。
【００７５】
その全プラークから回収されたファージ液に含まれるファージを増幅するために、ファージ液をＥＲ２７３８が播種されたＬＢ培地２０ｍｌに加え、３７℃で５時間培養した。培養後、５０ｍｌ遠沈管に回収し、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を回収した。この溶液１８ｍｌにＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２０容量％  ＰＥＧ８０００、２．５Ｍ  ＮａＣｌ）３ｍｌを加え、４℃で一晩静置した。放置後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿を回収した。この沈殿をＴＢＴ０１緩衝液０．７ｍｌに懸濁した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液を０．３ｍｌ加え、４℃で１時間静置した。その後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、沈殿をＴＢＳＡ（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ３）１ｍｌに懸濁した。その後１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ファージが含まれる上清を回収し、これをファージ溶液とした。
【００７６】
このファージ溶液を用いて上記ファージパニング工程の二回目を行うことで、より強固に五酸化ニオブに結合できるファージを取得した。このとき五酸化ニオブ結合工程でのファージの最終濃度は１０８個／ｍｌであり、五酸化ニオブ粉末の終濃度は１０．０ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０１緩衝液１ｍｌを用いた。五酸化ニオブ粉末の洗浄は、ＴＢＴ０１緩衝液１ｍｌで１０回行った。得られたファージが結合した五酸化ニオブ粉末から、上記と同様にファージを回収した。そのファージをＥ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に感染させ、寒天培地を用いて培養し、形成されたプラークを回収した。そして、上記と同様にして、各プラーク内のファージが提示したペプチドをコードする塩基配列を解読すると共に、全ファージを増幅し、ファージ溶液を得た。
【００７７】
この回収されたファージ溶液を用いて、上記ファージパニング工程の三回目を行った。このとき五酸化ニオブ結合工程でのファージの最終濃度は１０６個／ｍｌであり、五酸化ニオブ粉末の終濃度は１０．０ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０１緩衝液１ｍｌを用いた。五酸化ニオブ粉末の洗浄は、ＴＢＴ０１緩衝液１ｍｌで１０回行った。得られたファージが結合した五酸化ニオブ粉末から、上記と同様にファージを回収し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に感染させ、プラークを形成、回収した。そして、上記と同様にして、各プラーク内のファージが提示したペプチドをコードする塩基配列を解読すると共に、全ファージを増幅し、ファージ溶液を得た。
【００７８】
この回収されたファージ溶液を用いて、上記ファージパニング工程の四回目を行った。このとき五酸化ニオブ結合工程でのファージの最終濃度は１０９個／ｍｌであり、五酸化ニオブ粉末の終濃度は１０．０ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０２緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．３容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌを用いた。五酸化ニオブ粉末の洗浄も、ＴＢＴ０２緩衝液１ｍｌで１０回行った。得られたファージが結合した五酸化ニオブ粉末から、上記と同様にファージを回収し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に感染させ、プラークを形成、回収した。そして、上記と同様にして、各プラーク内のファージが提示したペプチドをコードする塩基配列を解読すると共に、全ファージを増幅し、ファージ溶液を得た。
【００７９】
この回収されたファージ溶液を用いて、上記ファージパニング工程の五回目を行った。このとき五酸化ニオブ結合工程でのファージの最終濃度は１０９個／ｍｌであり、五酸化ニオブ粉末の終濃度は１０．０ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０３緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．６容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌを用いた。五酸化ニオブ粉末の洗浄も、ＴＢＴ０３緩衝液１ｍｌで１０回行った。得られたファージが結合した五酸化ニオブ粉末から、上記と同様にファージを回収し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に感染させ、プラークを形成、回収した。そして、上記と同様にして、各プラーク内のファージが提示したペプチドをコードする塩基配列を解読すると共に、全ファージを増幅し、ファージ溶液を得た。
【００８０】
この回収されたファージ溶液を用いて、上記ファージパニング工程の六回目を行った。このとき五酸化ニオブ結合工程でのファージの最終濃度は１０９個／ｍｌであり、五酸化ニオブ粉末の終濃度は１０．０ｍｇ／ｍｌであった。また、反応溶液としてＴＢＴ０４緩衝液（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．９容量％  ｔｗｅｅｎ−２０含有）１ｍｌを用いた。五酸化ニオブ粉末の洗浄も、ＴＢＴ０４緩衝液１ｍｌで１０回行った。得られたファージが結合した五酸化ニオブ粉末から、上記と同様にファージを回収し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＥＲ２７３８に感染させ、プラークを形成、回収した。そして、上記と同様にして、各プラーク内のファージが提示したペプチドをコードする塩基配列を解読すると共に、全ファージを増幅し、ファージ溶液を得た。
【００８１】
今回得られた酸化ニオブ結合ペプチドの候補配列を表１に示す。３回ファージパニング工程により得られた数百個のサンプルから１０個のサンプルを抽出したところ、配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを提示したファージが１０サンプル中１０サンプルを占めていた。また、３回目のスクリーニング工程と条件を変えて４回目のスクリーニング工程を行い、４回目のスクリーニング工程により得られたサンプルから数個のサンプルを抽出したところ、配列番号２のアミノ酸配列のみならず、配列番号３、４および５のアミノ酸配列からなるペプチドを提示したファージが確認された。５回目のスクリーニング工程後にも、抽出されたサンプルにおいて、配列番号３および４のアミノ酸配列からなるペプチドを提示したファージが確認された。また、６回目のファージパニング工程で得られたサンプルから数個のサンプルを抽出したところ、配列番号３、４、６のアミノ酸配列からなるペプチドを提示したファージが確認された。
【００８２】
【表１】
2016149969.tif 000002
【００８３】
実施例２：酸化ニオブ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の構築
酸化ニオブ結合ペプチドの候補（Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ）がＣ末端に融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性タンパク質Ｄｐｓを下記の手順により構築した。
はじめに、Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａのＤｐｓ遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０（Ｋ．Ｉｗａｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．ｌｅｔｔ．，２００７，ｖｏｌ．１９，ｐ．３１０５を参照）を鋳型ＤＮＡとして以下のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして組み合わせてＰＣＲを実施した。
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号７）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＡＧＡＣＡＴＡＧＡＣＣＴＡＡＣＡＡＴＣＧＴＡＴＴＡＧＧＡＧＣＡＴＴＣＧＡｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃｃａａｇ−３’（配列番号８）
【００８４】
また、Ｎ末端に炭素素材結合ペプチドＮＨＢＰ−１が融合され、Ｃ末端に酸化ニオブ結合ペプチドＮｂ−Ｏｒａｎｇｅが融合されたＤｐｓ（ＣＤＮｂと呼ぶ）を構築するために、ＣＤＴ１遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０（Ｉ．Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０１１，ｖｏｌ．４７．ｐ．１２６４９を参照）を鋳型ＤＮＡとして以下のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして組み合わせてＰＣＲを実施した。
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号８）
５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣｔｔａＡＧＡＣＡＴＡＧＡＣＣＴＡＡＣＡＡＴＣＧＴＡＴＴＡＧＧＡＧＣＡＴＴＣＧＡｔｔｃｔａａｔｇｇａｇｃｔｔｔｔｃｃａａｇ−３’（配列番号８）
【００８５】
得られた各ＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社、日本）に形質転換し、Ｃ末端に酸化ニオブ結合ペプチドが融合されたＤｐｓをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ、ｐＥＴ２０−ＣＤＮｂ）を保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って各ベクターを精製し、搭載された変異Ｄｐｓ遺伝子配列を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、Ｄｐｓ−Ｎｂ−ＯｒａｎｇｅとＣＤＮｂの発現を確認でき、タンパク質発現用株を得ることができた。
【００８６】
実施例３：酸化ニオブ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の精製
発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ、ｐＥＴ２０−ＣＤＮｂ）のどちらかを保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を５０ｍＬのＬＢ培地（１００ｍｇ／Ｌ  アンピシリンを含む）にて３７℃で振とう培養した。培養開始２４時間後、得られた菌体を遠心分離（６０００ｒｐｍ、５分間）により回収し、５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）  １０ｍＬで懸濁した。次に、その懸濁液にＩｎｓｏｎａｔｏｒ２０１Ｍ（ＫＵＢＯＴＡ社、日本）を使い超音波パルス（１３０Ｗ）を５分間与えることで、菌体を破砕した。その溶液を６０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上清画分を回収した。回収された溶液を６０℃で２０分間加熱し、加熱後は速やかに氷上で冷却した。冷却された溶液を６５００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、再度、上清を回収（約１０ｍＬ）した。その溶液をディスクフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＰ  ０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＵＳＡ）で粗い粒子を除去し、タンパク質粗抽出液を得た。
【００８７】
続いて、そのタンパク質粗抽出液をそのタンパク質溶液からイオン交換クロマトグラフィーを用いて、目的タンパク質画分を精製した。すなわち、そのタンパク質粗抽出液を５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化されたＨｉＬｏａｒｄ  ２６／１０  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＵＳＡ）に注入した。そして、流速２．０ｍｌ／分、０ｍＭから５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で塩濃度勾配をかけることで、分離精製を行い、各蛋白質に相当する画分を回収した。その後、限外ろ過膜（ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０、１０，０００  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ）を用いて濃縮し、タンパク質溶液の溶媒を水あるいは５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に置換した。溶液中のタンパク質濃度はＬｏｗｒｙ法により決定した。
【００８８】
実施例４：ニオブ化合物析出能力の評価
Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅペプチドのニオブ化合物析出能力を評価するために、Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅと融合したＤｐｓのニオブ化合物析出能力を評価した。すなわち、変異型Ｄｐｓ（Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ）と野生型Ｄｐｓを各々終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｎｉｏｂａｔｅ（Ｖ）  ｏｘａｌａｔｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国）を終濃度２．５重量％、そしてアンモニアを終濃度８２．５ｍＭとなるように加えた１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、室温で放置した。そして一時間ごとに、６００ｎｍの吸光を測定した。反応容量は１．０ｍｌとして実験を行った。各々５サンプル実験をおこなった。
【００８９】
その結果、反応開始６時間後には、Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅが融合されたＤｐｓにおいて、野生型Ｄｐｓと比較して約２倍高い吸光度を観察でき、多くのニオブ化合物が析出していた（図１）。すなわち、Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅはニオブを認識し、ニオブ化合物の析出活性を持つことが示唆された。
【００９０】
実施例５：酸化ニオブ結合能力の評価
Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅを用いてＮｂ−Ｏｒａｎｇｅの酸化ニオブ結合能力を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）解析により評価した。
はじめに、ＴＥＭ解析で観察しやすくするために、Ｄｐｓ−Ｎｂ−ＯｒａｎｇｅとＤｐｓの内腔に鉄コアを形成させた。すなわち、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅあるいは野生型Ｄｐｓを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、硫酸アンモニウム鉄（ＩＩ）を終濃度２ｍＭとなるように加えた１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）を４℃で１時間放置した。その後、遠心で大きな粒子を除去し、緩衝液を水で置換し、鉄コアを持つＤｐｓを得た。続いて、鉄コアを持つ各Ｄｐｓを終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、五酸化ニオブ（Ｎｂ２Ｏ５、和光純薬、日本）を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌとなるように加えた５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を使い超音波パルス（２０％  Ｄｕｔｙ、１秒／ＯＮ、３秒／ＯＦＦ、ＯＮ合計５分間）を与えた。その後、遠心で沈殿を回収し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄した後、３％リンタングステン酸（ＰＴＡ）染色でＴＥＭ解析した。
【００９１】
その結果、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅと混合された五酸化ニオブ粒子では、粒子の周囲にコアを持つ直径９ｎｍのカゴ状タンパク質が多数吸着している様子が確認できた。一方、Ｄｐｓと混合された五酸化ニオブでは、五酸化ニオブ粒子の周囲にカゴ状タンパク質は確認できなかった（図２）。すなわち、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅは五酸化ニオブへの吸着能力を持つことが示唆された。
【００９２】
実施例６：変異型酸化ニオブ結合ペプチドを提示したカゴ状タンパク質の構築
Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ（ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２））の酸化ニオブ認識能力に必要なアミノ酸を特定すべく、ＳＴ１ペプチド配列内のアミノ酸をそれぞれアラニン（Ａ）あるいはグリシン（Ｇ）に置き換えられた配列を持つペプチドがＣ末端に融合されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａの金属内包性タンパク質Ｄｐｓを下記の手順によりそれぞれ構築した。各変異ＤｐｓがＣ末端に持つペプチド配列と構築に用いた特異的プライマーを表２に示す。
【００９３】
はじめに、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ遺伝子が搭載されたｐＥＴ２０を鋳型ＤＮＡとして、５’−ｔｔｔＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＴＣＧ−３’（配列番号７）と表２に示す各ヌクレオチド配列からなる特異的プライマーオリゴヌクレオチドを組み合わせてＰＣＲを実施した。
【００９４】
得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）で精製し、制限酵素ＤｐｎＩとＢａｍＨＩで消化した。制限酵素で消化されたＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を用いてセルフライゲーションさせた。セルフライゲーションされたＰＣＲ産物をＥＣＯＳＴＭ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポンジーン社、日本）に形質転換し、Ｃ末端に各チタン結合ペプチドが融合されたＤｐｓをコードする遺伝子が搭載された発現プラスミド（ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１Ｇ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−２Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−３Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−４Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−５Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−６Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−７Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−８Ｇ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−９Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１０Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１１Ａ、ｐＥＴ２０−Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１２Ａ）を保持したＢＬ２１（ＤＥ３）を構築した。その形質転換株からＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＵＳＡ）を使って各ベクターを精製し、搭載された変異Ｄｐｓ遺伝子配列を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−２Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−３Ｇ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−４Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−５Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−６Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−７Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−８Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−９Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１０Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１１Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１２Ａｓの発現を確認でき、タンパク質発現用株を得ることができた。得られたタンパク質はＤｐｓ−Ｎｂ−ＯｒａｎｇｅやＣＤＮｂと同様にして精製し、濃縮後、濃度決定された。
【００９５】
【表２】
2016149969.tif 000003
【００９６】
実施例７：ニオブ化合物析出活性の評価２
先に構築された変異型Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ（Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ：ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２））ペプチド配列内のアミノ酸がそれぞれ１つずつ、アラニン（Ａ）あるいはグリシン（Ｇ）に置き換えられた配列を持つペプチドがＣ末端に融合されたＤｐｓ）のニオブ化合物析出能力を評価した。
【００９７】
すなわち、各変異型Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅを各々終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｎｉｏｂａｔｅ（Ｖ）  ｏｘａｌａｔｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国）を終濃度２．５重量％、そしてアンモニアを終濃度１２４ｍＭとなるように加えた１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に加え、室温で放置した。そして１０分ごとに、６００ｎｍの吸光を測定した。反応容量は０．１ｍｌとして実験を行った。各々５サンプル実験をおこなった。
【００９８】
その濁度の経時変化を図３ＡおよびＢに、反応開始２００分後の濁度の比較を図４にそれぞれ示す。それらの結果から、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−９Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１１Ａ、そしてＤｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１２Ａでは高いニオブ化合物析出活性を維持しており、それらのアミノ酸残基はＮｂ−Ｏｒａｎｇｅのニオブ認識活性にはあまり重要でないことが示唆された。一方、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−２Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−３Ｇ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−４Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−５Ａ、Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−８Ａ、およびＤｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ−１０Ａの置換により若干ニオブ化合物析出活性が低下しており、これらのアミノ酸残基が複合的にＮｂ−Ｏｒａｎｇｅのニオブ認識活性に寄与していることが示唆された。すなわち、少なくともＮｂ−Ｏｒａｎｇｅのニオブ認識には、ＳＮＡＰＮＴＸＶＸＳＸＸ（配列番号１）のモチーフが必要であることが示唆された。析出活性が大幅に低下したことから、特に４番目のプロリンと１０番目のセリンが認識には重要なのかもしれない。
【００９９】
実施例８：酸化ニオブへの結合活性の評価２
先に構築された変異型Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ（Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅ：ＳＮＡＰＮＴＩＶＲＳＭＳ（配列番号２））ペプチド配列内のアミノ酸がそれぞれ１つずつ、アラニン（Ａ）あるいはグリシン（Ｇ）に置き換えられた配列を持つペプチドがＣ末端に融合されたＤｐｓ）の酸化ニオブへの結合活性を評価した。
【０１００】
すなわち、各変異型Ｄｐｓ−Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅを終濃度０．１ｍｇ／ｍｌ、五酸化ニオブ（Ｎｂ２Ｏ５、和光純薬、日本）を終濃度０．１ｍｇ／ｍｌとなるように加えた５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）にＤｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を使い超音波パルス（２０％  Ｄｕｔｙ、１秒／ＯＮ、３秒／ＯＦＦ、ＯＮ合計５分間）を与えた。その後、遠心で沈殿を回収し、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）で２回洗浄した後、３％リンタングステン酸（ＰＴＡ）染色でＴＥＭ解析した。
【０１０１】
その結果、Ｎｂ−Ｏｒａｎｇｅの配列のうち後半７つのアミノ酸残基がそれぞれ置換された変異株と混合された五酸化ニオブ粒子では、粒子の周囲に直径９ｎｍのカゴ状タンパク質が多数吸着している様子が確認でき、これらのアミノ酸残基は酸化ニオブへの結合活性への寄与が小さいことが示唆された（図５  Ｔ６ＡからＳ１２Ａ）。一方、前半５つのアミノ酸残基がそれぞれ置換された変異株と混合された五酸化ニオブ粒子の周囲へのカゴ状タンパク質の吸着は観察されなかったことから、これらのアミノ酸残基は酸化ニオブへの結合活性への寄与が大きいことが示唆された（図５  Ｓ１ＡからＮ５Ａ）。すなわち、少なくともＮｂ−Ｏｒａｎｇｅのニオブ認識には、前半のＳＮＡＰＮのモチーフが重要であることが示唆された。これら５つアミノ酸配列はニオブ化合物の析出に重要であることが示唆されており、このＮｂ−Ｏｒａｎｇｅにおいて最も重要な配列であることが示唆された。
【０１０２】
実施例９：ＣＮＴ／ＣＤＮｂ／Ｎｂ複合体の調製例
ＣＮＴとＣＤＮｂとのナノ複合体を形成するために、ＣＮＴとＣＤＮｂとを含むリン酸カリウム緩衝液［１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ６．０）、０．１ｍｇ／ｍＬのＣＤＮｂ、及び０．１ｍｇ／ｍＬ  ＣＮＴ（Ｓｉｇｍａ社、５１９３０８，  ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅ，  ｓｉｎｇｌｅ  ｗａｌｌｅｄ）を各々終濃度で含む］を調製した。ＣＤＮｂを含むリン酸カリウム緩衝液に、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ社、ＵＳＡ）を用いて、氷上で、３秒間隔で１秒間の超音波パルス（２００Ｗ、Ｄｕｔｙ  ２０％）を合計５分間加えた。超音波処理されたＣＤＮｂ−ＣＮＴ混合溶液を遠心分離（５０００ｒｐｍ、５分間）し、上清を回収した。続いて、８００００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、回収された沈殿を２ｍｌの純水に懸濁した（ＣＮＴ／ＣＤＮｂ複合体液）。
【０１０３】
続いて、終濃度２．５ｗｔ％Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｎｉｏｂａｔｅ（Ｖ）  ｏｘａｌａｔｅ（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社、米国）、終濃度８２．５ｍＭアンモニアとなるように撹拌しながら混合した１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にＣＮＴ／ＣＤＮｂ複合体液を加え、室温（２４℃）で放置した。そして、反応を開始して６時間後のサンプルを遠心分離（８００００ｒｐｍ、５分間）して、沈殿を回収した。得られた沈殿を水で４回洗浄し、最後に水に懸濁した。得られたＣＮＴ／ＣＤＮｂ／Ｎｂ複合体を、３％リンタングステン酸（ＰＴＡ）で染色し、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ３１００−ＦＥＦ、３００ｋＶ）にて、電子顕微鏡解析した。
【０１０４】
電子顕微鏡解析の結果を図６に示す。図６は、ＣＤＮｂとＣＮＴとの複合体にニオブ化合物前駆体を添加して得られた黒い析出物の透過型電子顕微鏡像を示す図である。すなわち、繊維状のＣＮＴの周囲にカゴ状タンパク質ＣＤＮｂが吸着し、全体を黒いマトリックスが覆っているロット状の構造物を観察することができた。
【０１０５】
この得られたロット状構造物を、透過型電子顕微鏡（ＪＥＭ３１００−ＦＥＦ、３００ｋＶ）を用いて、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）マッピングによる組成分析を行った。今回ＰＴＡ染色された像に対してマッピングを行った。結果を図７（左：通常の電子顕微鏡像；右：ニオブ原子のマッピング像）を示す。
【０１０６】
ニオブ原子のマッピング像では、左写真でロッド状に観察された部分が白く観察され、ニオブ原子が存在することを確認できた。この結果から、ニオブ化合物前駆体が添加されたＣＮＴ／ＣＤＮｂナノ複合体溶液を観察したときに見られるロッド状の構造物には少なくとも、ニオブ原子が含まれていることが分かった。この結果は、ＣＮＴと結合したＣＤＮｂの析出活性を利用することで、ＣＮＴ／ＣＤＮｂナノ複合体の周囲をニオブ化合物で被膜し、ＣＮＴ／ＣＤＮｂ／Ｎｂナノ複合体が合成できることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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