(57)【要約】【課題】EPAを効率よく生産することができる脂質生産微生物の提供。【解決手段】ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する微生物に、外来のΔ15不飽和化酵素遺伝子が導入されたか、あるいは外来のΔ12不飽和化酵素遺伝子と、外来のΔ15不飽和化酵素遺伝子および外来のΔ17不飽和化酵素遺伝子のいずれか１以上とが導入された変異微生物であって、２０℃以上の条件下で１０日間培養後における脂肪酸組成中のエイコサペンタエン酸含量が２０％以上である、変異微生物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する微生物に外来のΔ15不飽和化酵素遺伝子が導入
された変異微生物であって、２０℃以上の条件下で１０日間培養後における脂肪酸組成中のエイコサペンタエン酸含量が２０質量％以上である、変異微生物。
【請求項２】
ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する微生物に、外来のΔ12不飽和化酵素遺伝子と、
外来のΔ15不飽和化酵素遺伝子および外来のΔ17不飽和化酵素遺伝子のいずれか１以上と
が導入された変異微生物であって、２０℃以上の条件下で１０日間培養後における脂肪酸組成中のエイコサペンタエン酸含量が２０質量％以上である、変異微生物。
【請求項３】
微生物がモルティエレラ（Mortierella）属微生物である、請求項１または２記載の変異微生物。
【請求項４】
微生物がモルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）である、請求項１〜３のいずれか１項記載の変異微生物。
【請求項５】
Δ15不飽和化酵素遺伝子が、トリコデルマ・エスピー（Trichoderma sp.）AM076に由
来する、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異微生物。
【請求項６】
Δ15不飽和化酵素遺伝子が以下のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１〜４
のいずれか１項記載の変異微生物：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列からなり、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５に示されるヌクレオチド配列の相補鎖配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質；あるいは、
（ｅ）配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５で示されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ15不飽和化素活性を有するタンパク質。
【請求項７】
Δ12不飽和化酵素遺伝子が、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）に由来す
る、請求項２〜６のいずれか１項記載の変異微生物。
【請求項８】
Δ12不飽和化酵素遺伝子が以下のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項２〜６
のいずれか１項記載の変異微生物：
（ａ'）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ'）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列からなり、かつΔ
12不飽和化酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ'）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつΔ12不飽和化酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ'）配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７に示されるヌクレオチド配列の相補鎖配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ12不飽和化酵素活性を有するタンパク質；あるいは
、
（ｅ'）配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７で示されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ12不飽和化素活性を有するタンパク質。
【請求項９】
Δ17不飽和化酵素遺伝子が、サプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina）に
由来する、請求項２〜８のいずれか１項記載の変異微生物。
【請求項１０】
Δ17不飽和化酵素遺伝子が下のタンパク質をコードする遺伝子である、請求項２〜８の
いずれか１項記載の変異微生物：
（ａ''）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ''）配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列からなり、かつΔ
17不飽和化酵素活性を有するタンパク質；
（ｃ''）配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつΔ17不飽和化酵素活性を有するタンパク質；
（ｄ''）配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６に示されるヌクレオチド配列の相補鎖配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ17不飽和化酵素活性を有するタンパク質；あるい
は、
（ｅ''）配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６で示されるヌクレオチド配列と８０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ17不飽和化素活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の変異微生物を２０℃以上の条件下で培養することを含む、エイコサペンタエン酸を含有する脂質の生産方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法により生産されたエイコサペンタエン酸を含有する脂質を精製することを含む、エイコサペンタエン酸の生産方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法により生産されたエイコサペンタエン酸を含有する医薬。
【請求項１４】
請求項１２の方法により生産されたエイコサペンタエン酸を含有する飲食品または飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質生産微生物を用いたエイコサペンタエン酸を高含有する脂質の生産方法に関する。詳細には、脂肪酸不飽和化酵素の遺伝子を導入した変異微生物を用いて、エイコサペンタエン酸を高含有する脂質を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高度不飽和脂肪酸は、不飽和結合を２つ以上持つ脂肪酸であり、ω6系脂肪酸のリノール酸（LA、18：2n−6）、γ−リノレン酸（GLA、18：3n−6）、アラキドン酸（ARA、20：4n−6）、ω3系脂肪酸のα−リノレン酸（ALA、18：3n−3）、エイコサペンタエン酸（EPA、20：5n−3）、ドコサヘキサエン酸（DHA、22：6n−3）等が存在する。高度不飽和脂肪酸は、生体膜の主要構成成分として膜の流動性の調節に関与するほか、生体機能性成分の前駆体としても重要である。ARAやEPAは、高等動物内においてプロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンなどの前駆体であり、DHAは脳内に最も多量に存在する高度不飽和脂肪酸である。EPAは、血小板凝集阻害作用、血中中性脂肪低下作用、抗動脈硬化作用、血液粘度低下作用、血圧降下作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用等の生理作用を有し、医薬品、食品、化粧品、飼料等の様々な分野に利用されている。また、近年では、生活習慣病予防の観点から、ω3系脂肪酸の積極的な摂取が推奨され、需要の拡大が著しい脂質分子種である。
【０００３】
生体のDHAやEPAは、食物から摂取される以外に、一部の生物ではALAから生合成される。一方、ヒトはALAを生合成できないため、DHAやEPAはヒトにとって栄養学的に必須の脂肪酸である。EPAは主にタラ、ニシン、サバ、サケ、イワシ、オキアミ等の魚油、シュワネラ・リビングストネンシス（Shewanella livingstonensis）等の海洋性低温細菌、ラビリンチュラ綱（Labyrinthulomycetes）等の藻類に多く含まれている。これらの生物資源からEPAを抽出または精製する方法が知られている。最も一般的に行われているのは、魚油からのEPA精製である。しかしながら、魚油中のEPA含量は低い上に、魚油由来のEPAは、抽出または精製の方法によっては、魚臭が残ったり、心疾患の原因とされるエルカ酸の含量が多くなったりする等の問題を有している。
【０００４】
近年、エネルギー問題などに関連して、細胞内に脂質を蓄積する脂質生産微生物が注目されており、種々の脂質を微生物学的に生産する方法が開発されている。糸状菌は糸状の菌糸を有する微生物の総称であり、カビやキノコ等を含め、空気中、土壌中、水中のいたるところに存在する菌であるが、その中の１種であるモルティエレラ（Mortierella）属に属する糸状菌は、ω3系やω6系高度不飽和脂肪酸代謝経路を有し、EPAを生産することが知られている（非特許文献１）。モルティエレラ属微生物を利用した高度不飽和脂肪酸の生産方法の研究が進められている。例えば、特許文献１には、EPAを産生するモルティエレラ属微生物を培養してEPAを得る方法が開示されている。特許文献２には、モルティエレラ・アルピナに変異処理を施した変異株を用いてARAやEPAを生産する方法が開示されている。特許文献３には、モルティエレラ・アルピナから単離したω3脂肪酸不飽和化ポリペプチドの遺伝子を酵母に導入した形質転換株を用いて、EPAなどの高度不飽和脂肪酸を生産する方法が開示されている。しかし、モルティエレラ属微生物は、菌が増殖しにくい低温条件下（20℃以下）で培養されなければEPAを効率よく生産することができない。さらにモルティエレラ・アルピナ由来ω3不飽和化酵素は、炭素鎖長18の脂肪酸に優先的に作用するため、炭素鎖長20のEPAは合成されにくい。したがって、上記従来の方法ではEPAを効率よく生産することは難しかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開昭６３−１４６９７号公報
【特許文献２】特開平１１−２４３９８１号公報
【特許文献３】特開２００６−０５５１０４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotecnol., (1989), Vol.32, p.1-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、20℃以上の常温下でEPAを効率よく生産することができる変異微生物、および当該変異微生物を用いてEPAを高濃度で含有する脂質を生産する方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、糸状菌トリコデルマ属（Trichoderma sp. AM076）由来のΔ15不飽和化
酵素遺伝子を、モルティエレラ（Mortierella）属微生物に導入し発現させた。その結果、本発明者らは、導入遺伝子にコードされたΔ15不飽和化酵素が、モルティエレラ属微生物の脂質代謝系路上の炭素鎖長18の高度不飽和脂肪酸に対して、ω3不飽和化活性を発揮すること、そして当該遺伝子を導入された変異微生物が、常温下においても、EPAを高濃度で含有する脂質を効率よく生産することができることを見出した。
【０００９】
さらに、本発明者らは、担子菌コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus、以下、「C. cinereus」ということがある）由来のΔ12不飽和化酵素と、上記トリコデルマ属由
来のΔ15不飽和化酵素または糸状菌サプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina
、以下、「S. diclina」ということがある）由来のΔ17不飽和化酵素とを、共にモルティ
エレラ属微生物に導入し発現させた。その結果、本発明者らは、当該遺伝子を導入された変異微生物が、常温下においても、オレイン酸、アラキドン酸の蓄積を抑え、EPAを高濃度で含有する脂質を効率よく生産することができることを見出した。これらの変異微生物から得られたEPA含有脂質は、オレイン酸やアラキドン酸の蓄積量が低減されており、EPA含有脂質からEPAを効率よく精製することができるため有用である。
【００１０】
すなわち本発明は、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する微生物に外来のΔ15不飽和
化酵素をコードする遺伝子が導入された変異微生物であって、２０℃以上の条件下で１０日間培養後における脂肪酸組成中のエイコサペンタエン酸含量が２０％以上である変異微生物を提供する。
また本発明は、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する微生物に、外来のΔ12不飽和化
酵素遺伝子と、外来のΔ15不飽和化酵素遺伝子および外来のΔ17不飽和化酵素遺伝子のい
ずれか１以上とが導入された変異微生物であって、２０℃以上の条件下で１０日間培養後における脂肪酸組成中のエイコサペンタエン酸含量が２０％以上である変異微生物を提供する。
さらに本発明は、上記変異微生物を２０℃以上の条件下で培養することを含む、エイコサペンタエン酸を含有する脂質の生産方法を提供する。
さらに本発明は、上記方法により生産されたエイコサペンタエン酸を含有する脂質を精製することを含む、エイコサペンタエン酸の生産方法を提供する。
さらに本発明は、上記方法にて生産されたエイコサペンタエン酸を含有する医薬、飲食品または飼料を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の変異微生物は、常温で働く外来のΔ15不飽和化酵素の遺伝子が導入されており
、微生物が増殖しやすい20℃以上の常温条件下においてもEPAを生産することができるばかりか、微生物細胞内でのアラキドン酸の蓄積を抑えて、効率のよいEPA生産を可能にする。さらに、外来Δ12不飽和化酵素と外来Δ15不飽和化酵素または外来Δ17不飽和化酵素
とを共発現させた本発明の変異微生物は、アラキドン酸だけでなくオレイン酸の蓄積も抑えて、効率のよいEPA生産を可能にする。したがって、これら本発明の変異微生物を常温条件下で培養すれば、EPAを高含有する脂質を効率よく生産することができる。EPAは、医薬品・食品・化粧品、飼料等の様々な分野で使用される重要な高度不飽和脂肪酸であり、EPAの工業規模での生産に適用し得る本発明は、極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】M. alpina 1S-4における脂肪酸生合成経路。
【図２】形質転換バイナリーベクターpBIG35SSA2pΔ17mの構造。
【図３】形質転換バイナリーベクターpBIG35PP3pDES2mの構造。
【図４】形質転換バイナリーベクターpBIG35PP3pCopΔ12mの構造。
【図５】形質転換バイナリーベクターpBIG35PP3pCopΔ12mSSA2pΔ17mの構造。
【図６】形質転換バイナリーベクターpBIG35PP3pCopΔ12mSSA2pDES2mの構造。
【図７】S. diclina由来Δ17不飽和化酵素遺伝子を導入したM. alpina形質転換体により生産された脂肪酸の組成および生産量。
【図８】Trichoderma sp. AM076由来Δ15不飽和化酵素遺伝子を導入したM. alpina 形質転換体により生産された脂肪酸の組成および生産量。
【図９】C. cinereus由来Δ12不飽和化酵素遺伝子を導入したM. alpina形質転換体により生産された脂肪酸の組成および生産量。
【図１０】Δ12不飽和化酵素遺伝子とΔ17不飽和化酵素遺伝子を導入したM. alpina 形質転換体により生産された脂肪酸の組成および生産量。
【図１１】Δ12不飽和化酵素遺伝子とΔ15不飽和化酵素遺伝子を導入したM. alpina 形質転換体により生産された脂肪酸の組成および生産量。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列におけるアミノ酸またはヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入に関して使用される「１個または複数個」とは、例えば、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、なお好ましくは１〜３個、さらになお好ましくは１〜２個であり得る。また本明細書において、アミノ酸またはヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端および両末端への１〜複数個のアミノ酸またはヌクレオチドの付加が含まれる。
【００１４】
本明細書において、アミノ酸配列やヌクレオチド配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 5873）、またはFASTA（Methods Enzymol., 1990, 183, 63）を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている（J. Mol. Biol., 1990, 215, 403）。BLASTに基づいてBLASTNによってヌクレオチド配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（www.ncbi.nlm.nih.gov参照）。
【００１５】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、同一性が高いヌクレオチド配列同士、例えば７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上または９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いヌクレオチド配列同士がハイブリダイズしない条件をいう。具体的には、本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である60℃、1×SSC、0.1％ SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1％ SDS、さらに好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1％ SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件等が挙げられる。
【００１６】
本明細書において、「ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路」とは、リノール酸から、γ−リノレン酸、ジホモ-γ-リノレン酸、アラキドン酸（ARA）等のω6系の高度不飽和脂肪酸を生産する代謝経路をいい、「ω3高度不飽和脂肪酸代謝経路」とは、α−リノレン酸から、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸（EPA）等のω3系の高度不飽和脂肪酸を生産する代謝経路をいう（図１参照）。また本明細書において、「高度不飽和脂肪酸」とは、炭素鎖長が18以上で不飽和結合数が2以上の長鎖脂肪酸をいう。
【００１７】
本明細書において、ある微生物に対して使用する用語「本来」とは、ある機能や形質が天然に存在する当該微生物（野生型）が保有するものであることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該微生物に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や形質を表すために使用される。例えば、ある微生物に外部から導入された遺伝子は、外来遺伝子である。外来遺伝子は、それが導入された微生物と同種の微生物由来の遺伝子であっても、異種の生物由来の遺伝子であってもよい。
【００１８】
本発明の変異微生物の親株となる微生物（以下、「親微生物」ということがある）は、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する微生物であればよく、好ましくは、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有し、かつω6高度不飽和脂肪酸を生産する脂質生産菌（oleaginous microorganisms）である。
【００１９】
本発明の変異微生物の親微生物として使用することができるω6高度不飽和脂肪酸代謝経路を有する微生物としては、例えば、モルティエレラ（Mortierella）属、ムコール（Mucor）属、ウンベロプシス（Umbelopsis）属等の糸状菌が挙げられ、好ましくは、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）、モルティエレラ クラミドスポラ（Mortierella chlamydospora）、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Mortierella hygrophila）、モルティエレラ・エピガマ（Mortierella epigama）、モルティエレラ・アクロトナ（Mortierella acrotona）、モルティエレラ・ミヌティシマ（Mortierella minutissima）、モルティエレラ・リギコラ（Mortierella lignicola）、モルティエレラ・クロノシスティス（Mortierella clonocystis）、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）、モルティエレラ・フミコラ（Mortierella humicola）、モルティエレラ・バイニエリ（Mortierella bainieri）、モルティエレラ・ヒアリン（Mortierella hyaline）、モルティエレラ・グロバルピナ（Mortierella globalpina）、ウンベロプシス・ナナ（Umbelopsis nana）、ウンベロプシス・イサベリナ（Umbelopsis isabellina）等のモルティエレラ属微生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
より好ましくは、本発明の変異微生物の親微生物は、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路およびω3高度不飽和脂肪酸代謝経路を有し、ω6およびω3高度不飽和脂肪酸を生産する脂質生産菌である。より具体的には、ω6高度不飽和脂肪酸代謝経路およびそれに関与する酵素群に加えて、さらにω3不飽和化酵素を有しており、本来的にEPA生産能を有する微生物である。このような微生物としては、上述したモルティエレラ属微生物、例えば、Mortierella alpina（以下、本明細書において「M. alpina」ということがある）、Mortierella clonocystis、Mortierella nana、Mortierella humicola、Mortierella bainieri、Mortierella hyaline、Mortierella globalpinaなどが挙げられる。さらに、本発明の変異微生物の親微生物には、上述したモルティエレラ属微生物の変異株であって、EPA生産能を有するものも含まれる。このような微生物としては、M. alpina 1S-4（Agric. Biol. Chem., 1987, 51(3), p.785-790）が挙げられる。したがって、本発明の変異微生物の親微生物としては、EPA生産能を有するモルティエレラ属微生物の野生株およびその変異株、好ましくはM. alpinaの野生株およびそのEPA生産能を有する変異株、より好ましくはM. alpina 1S-4およびその変異株が挙げられる。
【００２１】
しかしながら、上記モルティエレラ属微生物の有するω3不飽和化酵素は、低温下でなければ活性が低いため、本発明による常温下でのEPA生産には必要ない。したがって、本発明の変異微生物の親微生物には、さらに、上記EPA生産能を有するモルティエレラ属微生物のω3不飽和化酵素欠損株が含まれる。当該ω3不飽和化酵素欠損株としては、M. alpina 1S-4変異株であるM. alpina ST1358が挙げられる（Biosci. Biotechnol. Biochem., 2010, vol.74, p.908-917）。本明細書において、「ω3不飽和化酵素を欠損する」とは、ω3不飽和化酵素が本来有する正常な機能が十分に発揮できない状態をいい、例えば、ω3不飽和化酵素が全く発現していない状態、ω3不飽和化酵素が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下している状態、ω3不飽和化酵素遺伝子産物の機能が完全に喪失した状態、または遺伝子変異等により、ω3不飽和化酵素が本来有する正常な機能が発揮できない程度にω3不飽和化酵素遺伝子産物の機能が低下した状態等をいう。ω3不飽和化酵素を欠損させる方法としては、常法、例えば、メタンスルホン酸エチル（EMS）、メタンスルホン酸メチル（MMS）、N−メチル−N−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（J. Gen. Microbiol., 1992, vol.138, p.997-1002）、5−ブロモデオキシウリジン（BrdU）、シスプラチン、マイトマイシンC等の変異原処理、またはRNAi（Appl. Environ. Microbiol., 2005, vol.71, p.5124-5128）等が挙げられる。あるいは、放射線照射、紫外線照射または高熱処理等により突然変異を誘発させる方法等が挙げられる。しかし、ω3不飽和化酵素を欠損させる方法は、上述の性質を有する変異が生じる限り、これらの方法に限定されない。
【００２２】
一実施形態において、本発明の変異微生物は、上記親微生物に、外来のΔ15不飽和化酵
素をコードする遺伝子を導入することによって作製される。導入された遺伝子にコードされたΔ15不飽和化酵素は、本発明の変異微生物内で、炭素鎖長18の高度不飽和脂肪酸に対
してあたかもω3不飽和化酵素のように作用することによって、高度不飽和脂肪酸の生合成経路におけるリノール酸からα−リノレン酸への変換やγ−リノレン酸からステアリドン酸への変換を促進し、その結果、微生物中のEPAの生合成量を高めることができる。
【００２３】
別の実施形態において、本発明の変異微生物は、上記親微生物に、外来のΔ12不飽和化
酵素をコードする遺伝子と、外来のΔ15不飽和化酵素をコードする遺伝子および外来のΔ
17不飽和化酵素をコードする遺伝子のいずれか１以上とを導入することによって作製される。導入された遺伝子にコードされたΔ12不飽和化酵素は、本発明の変異微生物内でオレ
イン酸からリノール酸への変換を促進し、微生物中でのオレイン酸の蓄積を抑制する。またΔ17不飽和化酵素は、炭素鎖長20の高度不飽和脂肪酸に対してあたかもω3不飽和化酵
素のように作用することによって、高度不飽和脂肪酸の生合成経路におけるジホモ−γ−リノレン酸からエイコサテトラエン酸への変換や、アラキドン酸からエイコサペンタエン酸への変換を促進し、微生物中でのアラキドン酸の蓄積を抑制する。
【００２４】
図１にM. alpina 1S-4の脂肪酸の生合成経路を示す。α−リノレン酸やステアリドン酸のようなω3高度不飽和脂肪酸への変換を促進することによって、ω3高度不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸の生合成量を高めることができる。また、オレイン酸の蓄積を抑制することによって、さらにエイコサペンタエン酸の生合成量を高めることができる。
【００２５】
Δ15不飽和化酵素は、Δ15不飽和化酵素活性を示すタンパク質である。Δ15不飽和化酵
素活性とは、脂肪酸分子のカルボキシル末端から数えて15番目と16番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化する活性をいう。当該酵素が炭素数18の高度不飽和脂肪酸に作用すれば、メチル末端から見るとω3位が不飽和化されることになるので、ω3不飽和化酵素の機能を代替し得る。例えば、Δ15不飽和化酵素活性は、リノール酸からα−リノレン酸への変
換活性、γ−リノレン酸からステアリドン酸への変換活性を含み得る。好ましくは、本発明の変異微生物に導入される遺伝子にコードされるΔ15不飽和化酵素は、炭素鎖長18の高
度不飽和脂肪酸に対して優先的にΔ15不飽和化酵素活性を示す酵素である。
【００２６】
Δ12不飽和化酵素は、Δ12不飽和化酵素活性を示すタンパク質である。Δ12不飽和化酵
素活性とは、脂肪酸分子のカルボキシル末端から数えて12番目と13番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化する活性をいう。当該酵素が炭素数18の高度不飽和脂肪酸に作用すれば、メチル末端から見るとω6位が不飽和化されることになるので、ω6不飽和化酵素の機能を代替し得る。例えば、Δ12不飽和化酵素活性は、オレイン酸から、リノール酸への変換
活性を含み得る。好ましくは、本発明の変異微生物に導入される遺伝子にコードされるΔ
12不飽和化酵素は、炭素鎖長18の高度不飽和脂肪酸に対して優先的にΔ12不飽和化酵素活
性を示す酵素である。
【００２７】
Δ17不飽和化酵素は、Δ17不飽和化酵素活性を示すタンパク質である。Δ17不飽和化酵
素活性とは、脂肪酸分子のカルボキシル末端から数えて17番目と18番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化する活性をいう。当該酵素が炭素数20の高度不飽和脂肪酸に作用すれば、メチル末端から見るとω3位が不飽和化されることになるので、ω3不飽和化酵素の機能を代替し得る。例えば、Δ17不飽和化酵素活性は、アラキドン酸からエイコサペンタエン
酸への変換活性、ジホモ−γ−リノレン酸からエイコサテトラエン酸への変換活性を含み得る。好ましくは、本発明の変異微生物に導入される遺伝子にコードされるΔ17不飽和化
酵素は、炭素鎖長20の高度不飽和脂肪酸に対して優先的に作用するΔ17不飽和化酵素活性
を示す酵素である。
【００２８】
好ましくは、本発明で使用される上記Δ15不飽和化酵素、Δ12不飽和化酵素およびΔ17
不飽和化酵素（以下、「本発明で使用される不飽和化酵素」ということがある）は、常温下でそれらの酵素活性を示す。本明細書において、「常温下で酵素活性を示す」とは、酵素活性の至適温度が２０℃以上、好ましくは２０〜４０℃であるか、または２０℃において至適温度での活性の７０％以上、好ましくは８０％以上の活性を有することをいう。
【００２９】
本発明の変異微生物に導入される遺伝子にコードされるΔ15不飽和化酵素としては、例
えば、トリコデルマ（Trichoderma）属由来、ピシウム（Pythium）属由来、線虫（Caenorhabditis elegans）由来（Biochemistry, 2000, 39(39), p.11948-11954）、Pichia pastoris由来（Yeast, 2008 Jan;25(1), p.21-7）のΔ15不飽和化酵素が挙げられる。こ
れらの酵素のアミノ酸配列は公知である（例えば、J. Gen. Microbiol., 1991, vol.137, p.1825-1830、欧州特許公開公報 EP 2500420 A1）。好ましくは、本発明で使用されるΔ15不飽和化酵素は、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるトリコデルマ・エスピ
ー（Trichoderma sp.）AM076由来のΔ15不飽和化酵素である。
【００３０】
したがって、本発明で使用されるΔ15不飽和化酵素の好ましい例としては、以下のもの
が挙げられる。
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列からなり、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号３で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質
（ｄ）配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５に示されるヌクレオチド配列の相補鎖配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質、あるいは、
（ｅ）配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ15不飽和化素活性を有するタンパク質
【００３１】
本発明の変異微生物に導入される遺伝子にコードされるΔ12不飽和化酵素としては、例
えば、Coprinus cinereus由来Δ12不飽和化酵素が挙げられる。この酵素のアミノ酸配列
は公知であり（例えば、FEBS Lett., 2007, 581 p.315-319）、配列番号６で示される。
【００３２】
したがって、本発明で使用されるΔ12不飽和化酵素の好ましい例としては、以下のもの
が挙げられる。
（ａ'）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ'）配列番号６に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列からなり、かつΔ
12不飽和化酵素活性を有するタンパク質
（ｃ'）配列番号６で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつΔ12不飽和化酵素活性を有するタンパク質
（ｄ'）配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７に示されるヌクレオチド配列の相補鎖配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ12不飽和化酵素活性を有するタンパク質、あるいは
、
（ｅ'）配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ12不飽和化素活性を有するタンパク質
【００３３】
本発明の変異微生物に導入される遺伝子にコードされるΔ17不飽和化酵素としては、例
えば、サプロレグニア（Saprolegnia）属由来またはフィトフトラ（Phytophthora）属由来のΔ17不飽和化酵素が挙げられる。これらの酵素のアミノ酸配列は公知である（例えば
、Biochem. J., 2004, 378, 665-671 doi:10.1042/BJ20031319、EP2010648B1）。好ましくは、本発明で使用されるΔ17不飽和化酵素は、配列番号９で示されるアミノ酸配列か
らなるサプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina）由来のΔ17不飽和化酵素で
ある。
【００３４】
したがって、本発明で使用されるΔ17不飽和化酵素の好ましい例としては、以下のもの
が挙げられる。
（ａ''）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ''）配列番号９に示されるアミノ酸配列において、１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたアミノ酸配列からなり、かつΔ
17不飽和化酵素活性を有するタンパク質
（ｃ''）配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつΔ17不飽和化酵素活性を有するタンパク質
（ｄ''）配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６に示されるヌクレオチド配列の相補鎖配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ17不飽和化酵素活性を有するタンパク質、あるい
は、
（ｅ''）配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにコードされ、かつΔ17不飽和化素活性を有するタンパク質
【００３５】
上述、（ｂ）、（ｂ'）、（ｂ''）に関し、「１個または複数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および付加から選択される変異」としては、以下が挙げられる。
（b1）配列番号３、６もしくは９に示されるアミノ酸配列における、１個または複数個のアミノ酸の欠失、
（b2）配列番号３、６もしくは９に示されるアミノ酸配列における、１個または複数個のアミノ酸の他のアミノ酸への置換、
（b3）配列番号３、６もしくは９に示されるアミノ酸配列における、１個または複数個のアミノ酸の挿入、
（b4）配列番号３、６もしくは９に示されるアミノ酸配列の一末端または両末端への、合計で、１個または複数個のアミノ酸の付加、または
（b5）上記（b1）〜（b4）の組み合わせであって、欠失、置換、挿入および付加されたアミノ酸の数が、合計で、１個または複数個である変異
アミノ酸配列に対するアミノ酸の欠失、置換、挿入の位置は、変異後のタンパク質に上述の不飽和化酵素活性が保持される限り、特に限定されない。
【００３６】
さらに、本発明で使用される不飽和化酵素は、上述した（ａ）〜（ｅ）、（ａ'）〜（ｅ'）、または（ａ''）〜（ｅ''）で示されるタンパク質において、性質の類似するアミノ酸（例えば、グリシンとアラニン、バリンとロイシンとイソロイシン、セリンとトレオニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、アスパラギンとグルタミン、リシンとアルギニン、システインとメチオニン、フェニルアラニンとチロシン等）同士の置換がさらになされたタンパク質であり得る。類似するアミノ酸による置換の位置および数は、置換後のタンパク質に所望の不飽和化酵素活性が保持される限り、特に限定されない。
【００３７】
上記本発明で使用される不飽和化酵素をコードする遺伝子は、上述した各酵素についての公知のアミノ酸配列や、上述した（ａ）〜（ｅ）、（ａ'）〜（ｅ'）、または（ａ''）〜（ｅ''）で示されるタンパク質のアミノ酸配列に基づいて取得することができる。例えば、当該遺伝子は、上述した本発明で使用される不飽和化酵素を有する微生物から常法により単離することができる。または上述した本発明で使用される不飽和化酵素のアミノ酸配列をもとに化学的に合成することができる。
【００３８】
さらに、得られた本発明で使用される不飽和化酵素をコードする遺伝子の中から、一般的なスクリーニング方法により、所望の基質特異性を有する酵素をコードする遺伝子をさらに選択し、本発明に使用することができる。例えば、炭素鎖長18の高度不飽和脂肪酸に対して基質特異性が高いΔ15不飽和化酵素もしくはΔ12不飽和化酵素をコードする遺伝子
、または炭素鎖長20の高度不飽和脂肪酸に対して基質特異性が高いΔ17不飽和化酵素をコ
ードする遺伝子を選択し、本発明に使用することができる。
【００３９】
本発明の変異微生物に導入されるΔ15不飽和化酵素をコードする遺伝子としては、上述
したトリコデルマ種（Trichoderma sp. AM076）属由来、ピシウム（Pythium）属由来、線虫（Caenorhabditis elegans）由来、Pichia pastoris由来のΔ15不飽和化酵素をコー
ドする遺伝子が挙げられるが、好ましくは、配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるTrichoderma sp. AM076由来のΔ15不飽和化酵素をコードする遺伝子である。
【００４０】
本発明の変異微生物に導入されるΔ12不飽和化酵素をコードする遺伝子としては、配列
番号４で示されるヌクレオチド配列からなる上述したCoprinus cinereus由来のΔ12不飽
和化酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
【００４１】
本発明の変異微生物に導入されるΔ17不飽和化酵素をコードする遺伝子としては、上述
したサプロレグニア（Saprolegnia）属由来またはフィトフトラ（Phytophthora）属由来のΔ17不飽和化酵素をコードする遺伝子が挙げられるが、好ましくは、配列番号７で示さ
れるヌクレオチド配列からなるサプロレグニア・ディクリナ（Saprolegnia diclina）由来のΔ17不飽和化酵素をコードする遺伝子である。
【００４２】
さらに、上記で挙げたΔ15不飽和化酵素、Δ12不飽和化酵素またはΔ17不飽和化酵素を
コードする遺伝子は、当該遺伝子が導入される微生物種におけるコドン使用頻度にあわせて、コドンを至適化されていることが好ましい。各種微生物種が使用するコドンの情報は、Codon Usage Database（www.kazusa.or.jp/codon/）から入手可能である。例えば、モルティエレラ属微生物に不飽和化酵素遺伝子を導入する際には、モルティエレラ属微生物のコドン使用頻度（www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=64518）を参考に当該遺伝子のヌクレオチド配列を改変し、コドンの至適化を行うことができる。具体的には、配列番号１で示されるΔ15不飽和化酵素遺伝子をM. alpinaのコドン使用頻度にあわせて改変すると、配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５で示される配列のポリヌクレオチドを得ることができる。配列番号４で示されるΔ12不飽和化酵素遺伝子をM. alpinaのコドン使用頻度にあわせて改変すると、配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７で示される配列のポリヌクレオチドを得ることができる。配列番号７で示されるΔ17不飽和化酵素遺伝子をM. alpinaのコドン使用頻度にあわせて改変すると、配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６で示される配列のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００４３】
したがって、本発明で使用されるΔ15不飽和化酵素をコードする遺伝子の好ましい例と
しては、以下が挙げられる。
（i）  配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ii） 配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５で示されるヌクレオチド配列において、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたヌクレオチド配列からなり、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質
をコードするポリヌクレオチド
（iii）配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（iv） 配列番号２のヌクレオチド番号５３〜１２２５に示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ15不飽和化酵素活性を有するタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド
【００４４】
本発明で使用されるΔ12不飽和化酵素をコードする遺伝子の好ましい例としては、以下
が挙げられる。
（i'）  配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ii'） 配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７で示されるヌクレオチド配列において、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたヌクレオチド配列からなり、かつΔ12不飽和化酵素活性を有するタンパク
質をコードするポリヌクレオチド
（iii'）配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつΔ12不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（iv'） 配列番号５のヌクレオチド番号５２〜１３７７に示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ12不飽和化酵素活性を有するタン
パク質をコードするポリヌクレオチド
【００４５】
本発明で使用されるΔ17不飽和化酵素をコードする遺伝子の好ましい例としては、以下
が挙げられる。
（i''）  配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
（ii''） 配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６で示されるヌクレオチド配列において、１個または複数個のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および付加から選択される変異を施されたヌクレオチド配列からなり、かつΔ17不飽和化酵素活性を有するタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド
（iii''）配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６で示されるヌクレオチド配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつΔ17不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
（iv''） 配列番号８のヌクレオチド番号１００〜１１７６に示されるヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつΔ17不飽和化酵素活性を有するタ
ンパク質をコードするポリヌクレオチド
【００４６】
上記（ii）〜（iv）、（ii'）〜（iv'）および（ii''）〜（iv''）のポリヌクレオチドは、モルティエレラ属微生物において使用頻度の高いコドンで構成されていることが望ましい。本発明において、上記（i）〜（iv）、（i'）〜（iv'）および（i''）〜（iv''）のポリヌクレオチドは、好ましくは、モルティエレラ属微生物、より好ましくはM. alpinaに導入される。
【００４７】
上述の本発明で使用される不飽和化酵素をコードする遺伝子は、ベクターを用いて親微生物へ導入することができる。導入に使用されるベクターの種類は、特に限定されず、親微生物、クローニングの方法、遺伝子発現の目的等に応じて適宜選択して使用することができる。例えば、ベクターとしては、親微生物がモルティエレラ属微生物の場合、pD4ベクター（Appl. Environ. Microbiol., November 2000, 66(11), p.4655-4661）、pDZeoベクター（J. Biosci. Bioeng., December 2005, 100(6), p.617-622）、pDura5ベクター（Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 65(4), p.419-425）、pDXベクター（Curr. Genet., 2009, 55(3), p.349-356）、pBIG3ura5（Appl. Environ. Microbiol., 2009, 75, p.5529-5535）等が挙げられるが、親微生物内で導入した遺伝子を発現させることができるベクターであれば、これらに限定されない。
【００４８】
さらに上記ベクターには、組み込んだ不飽和化酵素遺伝子を発現させるためのプロモーター配列もしくは転写終結シグナル配列、または不飽和化酵素遺伝子が導入された形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子が含まれていることが好ましい。プロモーターとしては、親微生物がモルティエレラ属微生物の場合、高発現プロモーターを利用することができる。モルティエレラ属微生物用の好ましい高発現プロモーターとしては、M. alpina由来のPP3プロモーターおよびSSA2プロモーター、ならびにこれらのプロモーターの配列に置換、欠失、付加等を加えて改変したプロモーターが挙げられるが、導入した遺伝子を高発現させることができれば、これらに限定されない。選択マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求変異を相補する遺伝子等、ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性変異を相補する遺伝子等を挙げることができる。好ましい選択マーカー遺伝子の例としては、ウラシル要求性変異を相補する遺伝子が挙げられる。例えば、M. alpinaのウラシル要求性変異株（Biosci Biotechnol Biochem., 2004, 68, p.277-285）が開発されている。このようなウラシル要求株に対しては、選択マーカー遺伝子としてオロチジン−5'−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ura3遺伝子）、またはオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子（ura5遺伝子）を使用することができる。ベクターを構築するための手順や使用する試薬類、例えば制限酵素またはライゲーション酵素等の種類については、特に限定されるものではない。当業者は、通常の知識に従って、または市販品を適宜用いてベクターを構築することができる。
【００４９】
上記ベクターには、Δ15不飽和化酵素をコードする遺伝子、Δ12不飽和化酵素をコード
する遺伝子、またはΔ17不飽和化酵素をコードする遺伝子のいずれか１つが含まれていれ
ばよいが、それらの遺伝子の複数、例えばΔ12不飽和化酵素の遺伝子とΔ15不飽和化酵素
の遺伝子、Δ12不飽和化酵素の遺伝子とΔ17不飽和化酵素の遺伝子、またはΔ12不飽和化
酵素の遺伝子とΔ15不飽和化酵素の遺伝子とΔ17不飽和化酵素の遺伝子が含まれていても
よい。したがって、本発明の変異株には、上記不飽和化酵素遺伝子のいずれか１つを含むベクターが導入されていてもよく、複数の上記不飽和化酵素を含むベクターが導入されていてもよく、または異なる不飽和化酵素を含む２種類以上のベクターが導入されていてもよい。
【００５０】
本発明の変異株の作製用に構築された形質転換バイナリーベクターの一例の構造を、図２〜６に示す。当該ベクターにおいては、恒常的高発現プロモーターであるPP3プロモーターまたはSSA2プロモーターの下流に、Δ17不飽和化酵素、Δ15不飽和化酵素またはΔ12
不飽和化酵素をコードするポリヌクレオチドが連結されており、さらにターミネーターとしてsdhBターミネーター、形質転換体の選択マーカーとしてura5遺伝子が組み込まれている。
【００５１】
上記ベクターを本発明の微生物に導入するには、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）法、コンピテント細胞法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、等の公知の方法を使用することができる。さらに、親微生物としてモルティエレラ属微生物を用いた場合の遺伝子導入法としては、後述の実施例に記載のアグロバクテリウムを介したATMT法（Appl. Environ. Microbiol., 2009, vol.75, p.5529-5535）を好適に例示することができ、あるいはATMT法の改変法等を挙げることができる。しかし、目的の形質を安定して保持する形質転換体を得ることができれば、遺伝子導入法はこれらの方法に限定されない。
【００５２】
あるいは、上述の不飽和化酵素をコードする遺伝子は、親微生物のゲノムに直接導入されてもよい。不飽和化酵素の遺伝子とともに、上述したプロモーター配列、転写終結シグナル配列または選択マーカー遺伝子をともに導入してもよい。さらに、異なる不飽和化酵素をコードする複数の遺伝子を一緒に導入してもよい。遺伝子をゲノムに直接導入する方法としては、相同組換え法が挙げられる。
【００５３】
以上の手順により親微生物に、外来のΔ15不飽和化酵素をコードする遺伝子、または外
来のΔ12不飽和化酵素をコードする遺伝子と、外来のΔ15不飽和化酵素をコードする遺伝
子および外来のΔ17不飽和化酵素をコードする遺伝子のいずれか１以上とを導入すること
によって、本発明の変異微生物を作製することができる。本発明の変異微生物は、導入された遺伝子にコードされる不飽和化酵素の働きによって、常温下でも、高度不飽和脂肪酸に対するω3不飽和化酵素活性を示し、高いEPA生合成能を発揮することができる。したがって、本発明の変異微生物を培養することによって、当該微生物の細胞内にEPAを高含有する脂質が生産される。さらに、本発明の変異微生物が産生するEPAを高含有する脂質は、オレイン酸やアラキドン酸の蓄積量が低減されているため、生産された脂質を精製することにより、純度の高いEPAを効率よく生産することが可能になる。
【００５４】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、上記本発明の変異微生物を培養することを含む、EPAを含有する脂質の生産方法である。また本発明の別のさらなる実施形態は、上記本発明の変異微生物により生産されたEPAを含有する脂質を精製することを含む、EPAの生産方法である。
【００５５】
本発明のEPAを含有する脂質の生産方法において、本発明の変異微生物は、液体培地または固体培地に接種し培養することができる。例えば、当該変異微生物が菌類の場合、菌株の胞子、菌糸、または予め培養して得られた前培養液を、上記培地に接種して培養することができる。培地の炭素源としてはグルコース、フルクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、コーンスターチ、グリセロール、マンニトール、脂質、アルカン、アルケン等が挙げられるが、これらに限定されない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂ダイズ、綿実カス、小麦フスマ等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、並びに、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、大豆油、ココナッツ、コーン油等の脂質を添加してもよい。また、微量栄養源として、リン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩、またはビタミン等も適宜添加することができる。これらの培地成分は、本発明の変異微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限されない。例えば、炭素源は培地中０．１〜４０質量％、好ましくは１〜２５質量％、窒素源は０．０１〜１０質量％、好ましくは０．１〜１０質量％の濃度とすることができる。M. alpinaまたはその変異株を培養する場合、後述のCzapek培地、Czapek-dox培地、グルコース・酵母エキス（以下、「GY」ともいう）培地、SC培地等を使用することができる。あるいは、モルティエレラ属微生物用の培地については、公知の文献（例えば国際公開番号第９８／２９５５８号）を参考にすることもできる。培地のpHは4〜10、好ましくは6〜9であり得る。培養は、通気撹拌培養、振盪培養または静置培養であり得る。
【００５６】
本発明の変異微生物の培養は、至適生育温度で行われる。例えば、本発明の変異微生物は、約５〜６０℃、好ましくは約１０〜５０℃、より好ましくは約１０〜４０℃、さらに好ましくは約２０〜４０℃、なお好ましくは約２０〜３０℃で培養することができる。例えば、M. alpinaまたはその変異株は、約１０〜４０℃、好ましくは約２０〜４０℃、より好ましくは約２０〜３０℃で培養することができる。本発明の変異微生物にEPAを効率よく生産させるためには、培養温度は２０℃以上、好ましくは約２０〜４０℃、なお好ましくは約２０〜３０℃にするのがよい。
【００５７】
培養期間は、２〜２０日間、好ましくは２〜１４日間である。モルティエレラ属微生物の培養法については、公知の文献（例えば、特開平６−１５３９７０号公報）を参考にすることもできる。
【００５８】
上記条件で本発明の変異微生物を培養することによって、当該微生物の細胞内にEPAを高含有する脂質が生産される。本発明の変異微生物を２０℃以上の条件下で１０日間培養した場合、当該微生物に含まれる脂質の脂肪酸組成中のＥＰＡ含量は、２０質量％以上である。微生物細胞中の脂肪酸組成は、ガスクロマトグラフィー分析により測定することができる。
【００５９】
培養終了後、培養液を遠心分離、ろ過等の常用の手段にかけ、微生物細胞を分離する。例えば、培養液を遠心分離またはろ過して液体分を除き、分離された細胞を洗浄後、凍結乾燥、風乾等により乾燥させ、乾燥細胞を得る。当該乾燥細胞から、有機溶媒抽出等の公知の手法により、目的とする脂質を抽出することができる。有機溶媒としてはヘキサン、エーテル、酢酸エチル、酢酸ブチル、クロロホルム、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の、高度不飽和脂肪酸の溶解性が高く、かつ水と分離可能な溶媒が挙げられる。または、これらの有機溶媒を組み合わせて使用することもできる。抽出物から減圧等で有機溶媒を留去することにより、目的の脂質を抽出することができる。あるいは、細胞を乾燥させずに、湿細胞から脂質の抽出を行うこともできる。得られた脂質は、脱ガム、脱酸、脱臭、脱色、カラム処理、蒸留等一般的な方法を適宜用いてさらに精製されてもよい。
【００６０】
上記抽出した脂質の中には、目的物であるEPA以外に、共雑物となる各種脂肪酸が含まれている。したがって、上記脂質をさらに精製してより純度の高いEPAを取得することができる。EPAは、脂質から直接分離することもできるが、一旦脂質中の脂肪酸を低級アルコールとのエステル誘導体に変換した後に、目的とするEPAのエステル誘導体を分離することが好ましい。エステル誘導体は、炭素数、二重結合の数、位置の違い等に応じて、各種分離精製操作を用いることによって分離することができるため、容易に目的の脂肪酸のエステル誘導体を得ることができる。しかしながら、EPAと炭素数が同一で二重結合数が一つ異なるアラキドン酸は、EPAとの分離が難しいため、EPAを含有する脂質中にアラキドン酸は少ないことが好ましい。エステル誘導体は、エチルエステル誘導体が好ましい。エステル化には、塩酸、硫酸、BF3等の酸触媒、またはナトリウムメトキシド、水酸化カリウム等の塩基触媒を含む低級アルコールを使用することができる。得られたエステル誘導体から、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素付加分別法等を単独または組み合わせて、目的とするEPAのエステル誘導体を分離することができる。分離したEPAのエステル誘導体を、アルカリで加水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出することにより、EPAを精製することができる。EPAは塩の形態で精製されてもよい。
【００６１】
本発明によるEPAを高含有する脂質の生産を工業的な規模で行う場合、例えば、本発明の変異微生物をタンク中等で大規模培養し、フィルタープレス等でろ過し、細胞を回収して乾燥後、ボールミル等で細胞を破砕し、有機溶媒で脂質を抽出することができる。また、工業規模で微生物中の成分を抽出して利用する方法や、脂質からEPAを精製する方法は、数多く知られており、これらを適宜改変して本発明の方法に利用することもできる。
【００６２】
本発明で得られたEPAは、ヒトまたは非ヒト動物用の医薬品、化粧料、食品、飼料等の製造に使用することができる。当該医薬品の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、ドライシロップ剤、液剤、懸濁剤等の経口剤；吸入剤、坐剤等の経腸製剤；点滴剤；注射剤；外用剤；経皮、経粘膜、経鼻剤；吸入薬；貼布剤等が挙げられる。また当該化粧料の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧品が通常とり得る任意の形態が挙げられる。
【００６３】
上記医薬品または化粧料は、EPAまたはその塩を有効成分として含有する。上記医薬品または化粧料はまた、医薬として許容される担体または化粧料として許容される担体、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、アルコール、水、水溶性高分子、香料、甘味料、矯味剤、酸味料等を含有していてもよく、さらに必要に応じて他の有効成分、例えば薬効成分、化粧成分等を含有していてもよい。上記医薬または化粧料は、EPAまたはその塩に、上記担体や他の有効成分を剤型に応じて配合し、常法に従って調製することにより、製造することができる。上記医薬または化粧料におけるＥＰＡの含有量は、その剤型により異なるが、通常は、０．１〜９９質量％、好ましくは１〜８０質量％の範囲である。
【００６４】
上記飲食品または飼料は、EPAまたはその塩を有効成分として含有する。これらの飲食品または飼料は、血小板凝集阻害作用、血中中性脂肪低下作用、抗動脈硬化作用、血液粘度低下作用、血圧降下作用、抗炎症作用、抗腫瘍作用等の効果を企図して、その旨を表示した健康食品、機能性飲食品、特定保健用飲食品、病者用飲食品、家畜、競走馬、鑑賞動物等のための飼料、ペットフード等であり得る。
【００６５】
上記飲食品または飼料の形態は特に制限されず、EPAまたはその塩を配合できる全ての形態が含まれる。例えば、当該飲食品の形態としては、固形、半固形または液状であり得、あるいは、錠剤、チュアブル錠、粉剤、カプセル、顆粒、ドリンク、ゲル、シロップ、経管経腸栄養用流動食等の各種形態が挙げられる。具体的な飲食品の形態の例としては、緑茶、ウーロン茶や紅茶等の茶飲料、コーヒー飲料、清涼飲料、ゼリー飲料、スポーツ飲料、乳飲料、炭酸飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料、発酵乳飲料、粉末飲料、ココア飲料、アルコール飲料、精製水等の飲料、バター、ジャム、ふりかけ、マーガリン等のスプレッド類、マヨネーズ、ショートニング、カスタードクリーム、ドレッシング類、パン類、米飯類、麺類、パスタ、味噌汁、豆腐、牛乳、ヨーグルト、スープまたはソース類、菓子（例えばビスケットやクッキー類、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）等が挙げられる。上記飼料は、飲食品とほぼ同様の組成や形態で利用できることから、本明細書における飲食品に関する記載は、飼料についても同様に当てはめることが出来る。
【００６６】
上記飲食品または飼料は、EPAまたはその塩、ならびに飲食品や飼料の製造に用いられる他の飲食品素材、各種栄養素、各種ビタミン、ミネラル、アミノ酸、各種油脂、種々の添加剤（たとえば呈味成分、甘味料、有機酸等の酸味料、界面活性剤、pH調整剤、安定剤、酸化防止剤、色素、フレーバー）等を配合して、常法に従って調製することにより製造することができる。あるいは、通常食されている飲食品または飼料にEPAまたはその塩を配合することにより、本発明に係る飲食品または飼料を製造することができる。上記飲食品または飼料におけるEPAまたはその塩の含有量は、食品の形態により異なるが、通常は、０．０１〜８０質量％、好ましくは０．１〜５０質量％、より好ましくは１〜３０質量％の範囲である。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
（試薬および培地）
50μg/mLアンピシリンまたはカナマイシン含有LB寒天培地、Czapek-Dox寒天培地（3%スクロース、0.2% NaNO3、0.1% KH2PO4、0.05% KC1、0.05% MgSO4・7H2O、0.001% FeSO4・7H2O、2%寒天、pH6.0）、GY培地（2%（w/v）グルコース、1% 酵母エキス）、LB-Mg寒天培地（1%トリプトン、0.5%酵母エキス、85mM NaCl、0.5mM MgSO4・7H2O、0.5mM NaOH、1.5%寒天、pH7.0）、最少培地（MM）（10mM K2HPO4、10mM KH2PO4、2.5mM NaCl、2mM MgSO4・7H2O、0.7mM CaCl2、9μM FeSO4・7H2O、4mM (NH4)2SO4、10mM グルコース、pH7.0）、誘導培地（IM）（MMに0.5%（w/v）グリセロール、200μM アセトシリンゴン、40mM 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸（MES）を加えて、pH5.3に調製）、SC培地（5.0g Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）、1.7g (NH4)2SO4、20gグルコース、20g寒天、20mgアデニン、30mgチロシン、1.0mgメチオニン、2.0mgアルギニン、2.0mgヒスチジン、4.0mgリジン、4.0mgトリプトファン、5.0mgスレオニン、6.0mgイソロイシン、6.0mgロイシン、6.Omg/Lフェニルアラニン）、セフォタキシム、スペクチノマイシン、Nile blue A（Sigma）を使用した。制限酵素、ライゲーション用酵素等は、タカラバイオまたはNew England BioLabs製を使用した。
【００６９】
（参考例１）Δ15不飽和化酵素遺伝子（DES2m；Trichoderma sp. AM076由来）のコドン
至適化
糸状菌トリコデルマ種（Trichoderma sp. AM076）由来のΔ15不飽和化酵素遺伝子（DE
S2m；配列番号１）のコドンを、M. alpinaのコドン使用頻度（www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=64518）を参考に至適化した。得られた遺伝子配列のCDS前後にSpeIおよびBamHIサイトを構築し、全合成を行った（Life Technologies社）。当該遺伝子の至適化および制限酵素切断部位構築後のヌクレオチド配列を配列番号２に示す。当該遺伝子は、SpMA-RQ（ampR）プラスミドにクローニングした。
【００７０】
（参考例２）Δ12不飽和化酵素遺伝子（CopΔ12m； Coprinus cinereus由来）のコドン
至適化
参考例１と同様に、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）由来のΔ12不飽和
化酵素遺伝子(CopΔ12m；配列番号４）のコドンを、M. alpinaのコドン使用頻度に基づ
いて至適化し、得られた遺伝子配列のCDS前後にSpeIおよびBamHIサイトを構築し、全合成を行った（Life Technologies社）。当該遺伝子の至適化および制限酵素切断部位構築後のヌクレオチド配列を配列番号５に示す。当該遺伝子は、SpMA-RQ（ampR）プラスミドにクローニングした。
【００７１】
（参考例３）Δ17不飽和化酵素遺伝子（Saprolegnia diclina由来）のコドン至適化
参考例１と同様に、糸状菌サプロレグニア（Saprolegnia diclina）由来のΔ17不飽和
化酵素遺伝子（Δ17m；配列番号７）のコドンを、M. alpinaのコドン使用頻度に基づい
て至適化し、得られた遺伝子配列のCDS前後にSpeIおよびBamHIサイトを構築し、全合成を行った（Life Technologies社）。当該遺伝子の至適化および制限酵素切断部位構築後のヌクレオチド配列を配列番号８に示す。当該遺伝子は、SpMA-RQ（ampR）プラスミドにクローニングした。
【００７２】
（参考例４〜８）遺伝子導入用バイナリーベクターの構築
参考例１〜３で調製した各プラスミドを、SpeIおよびBamHI制限酵素で処理し、得られたΔ17不飽和化酵素遺伝子、Δ15不飽和化酵素遺伝子、およびΔ12不飽和化酵素遺伝子の
断片を、恒常的高発現プロモーターであるPP3プロモーターまたはSSA2プロモーターを含むプラスミドpBIG35（京都府立大学から提供されたpBIG2RHPH2を改変、Appl. Environ. Microbiol., 2009, vol.75, p.5529-5535に記載）に連結し、発現カセットを構築した。当該発現カセットを、さらに、ウラシル要求性のマーカー遺伝子（ura5）とタンデムに連結させ、形質転換用バイナリーベクター、pBIG35SSA2pΔ17m（Δ17不飽和化酵素遺伝子：
参考例４）、pBIG35PP3pDES2m（Δ15不飽和化酵素遺伝子：参考例５）、pBIG35PP3pCop
Δ12m（Δ12不飽和化酵素遺伝子：参考例６）、pBIG35PP3pCopΔ12mSSA2pΔ17m（Δ12
不飽和化酵素遺伝子およびΔ17不飽和化酵素遺伝子：参考例７）、およびpBIG35PP3pCop
Δ12mSSA2pDES2m（Δ12不飽和化酵素遺伝子およびΔ15不飽和化酵素遺伝子：参考例８）
を構築した。図２〜６に参考例４〜８の各ベクターの構造をそれぞれ示す。
【００７３】
（製造例１）Δ17不飽和化酵素遺伝子導入株の作製
安藤らの報告に基づき（Appl. Environ. Microbiol., 2009, vol.75, p.5529-5535）、参考例４のΔ17不飽和化酵素遺伝子導入用バイナリーベクターpBIG35SSA2pΔ17mを、ア
グロバクテリウムを介したATMT法でホスト株であるM. alpina 1S-4（ウラシル要求性株）に以下の手順で導入した。
M. alpina 1S-4株（ウラシル要求性株）を0.05mg/mLウラシル含有Czapek-Dox寒天培地で培養して得た培養物を集菌し、Miracloth（Calbiochem）でろ過することで、M. alpinaの胞子懸濁液を新たに調製した。
アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens C58C1、京都府立大学から提供）に、参考例４で作製したΔ17不飽和化酵素遺伝子導入用バイナリーベクターをエレクトロポ
レーションで形質転換し、LB-Mg寒天培地上で２８℃、４８時間培養した。PCR法で当該ベクターを含むアグロバクテリウムを確認した。当該ベクターを有するアグロバクテリウムを最小培地（MM）で2日間培養し、5,800×gで遠心分離し、新鮮なIMを加えて懸濁液を調製した。当該懸濁液を、８〜１２時間、２８℃でＯＤ660が０．４から３．７になるまでロータリーシェーカーで誘導培養した。
上記アグロバクテリウムの菌懸濁液100μLを、等量の上記M. alpina懸濁液（108mL-1）と混合し、ニトロセルロース膜（直径70mm；hardened low-ash grade 50、Whatman）を載せた共培養培地（IMと同様の組成、ただし、10mMグルコースの代わりに5mMグルコースおよび1.5%寒天を含む）上に塗布し、２３℃で２〜５日間培養した。共培養後、当該膜をウラシルフリー、50g/mLセフォタキシムおよび50g/mLスペクチノマイシン、0.03％ Nile blue A（Sigma）を含むSC寒天培地に移し、２８℃で５日間培養した。可視可能な真菌コロニーからの菌糸を、新鮮なウラシルフリーSC培地に移した。ウラシルフリーSC寒天培地で増殖することができるが、5-フルオロオロチン酸（5-FOA）を含むGY寒天培地では増殖できない菌体を、形質を安定して保持するΔ17不飽和化酵素遺伝子導入株と判断した
。形質を安定して保持する形質転換体を選抜するために当該作業を３回行った。
【００７４】
（製造例２）Δ15不飽和化酵素遺伝子導入株の作製
参考例５のΔ15不飽和化酵素遺伝子導入用バイナリーベクターpBIG35PP3pDES2mを用い
た以外は、製造例１と同様の手順で、Δ15不飽和化酵素遺伝子導入株を調製した。
【００７５】
（製造例３）Δ12不飽和化酵素遺伝子導入株の作製
参考例６のΔ12不飽和化酵素遺伝子導入用バイナリーベクターpBIG35PP3pCopΔ12mを
用いた以外は、製造例１と同様の手順で、Δ12不飽和化酵素遺伝子導入株を調製した。
【００７６】
（製造例４）Δ12,Δ17不飽和化酵素遺伝子導入株の作製
参考例７のΔ12不飽和化酵素遺伝子およびΔ17不飽和化酵素遺伝子導入用バイナリーベ
クターpBIG35PP3pCopΔ12mSSA2pΔ17mを用いた以外は、製造例１と同様の手順で、Δ12
不飽和化酵素遺伝子およびΔ17不飽和化酵素遺伝子導入株を調製した。
【００７７】
（製造例５）Δ12,Δ15不飽和化酵素遺伝子導入株の作製
参考例８のΔ12不飽和化酵素遺伝子およびΔ15不飽和化酵素遺伝子導入用バイナリーベ
クターpBIG35PP3pCopΔ12mSSA2pDES2mを用いた以外は、製造例１と同様の手順で、Δ12
不飽和化酵素遺伝子およびΔ15不飽和化酵素遺伝子導入株を調製した。
【００７８】
製造例１〜５で作製した変異株を以下にまとめる。
【００７９】
【表１】
2016165226.tif 000002
【００８０】
（試験例１）遺伝子導入株における脂肪酸組成および生産量
製造例１〜５で得られた変異株を、それぞれ10mL GY培地中（2%グルコース、1%酵母エキス）、２８℃で１週間、３００ｒｐｍで好気的に培養した。それぞれの培養液から、吸引ろ過にて遺伝子導入M. alpina菌体を回収し、１２０℃で３時間乾燥した。乾燥菌体に、0.5mg/mlの濃度にて内部標準（M. alpinaが生合成できない炭素数23の飽和脂肪酸）を含むジクロロメタン溶液1 ml、塩酸メタノール2 mlを加え、５５oＣ、２時間の温浴にて脂肪酸のメチルエステル化処理を行った。その後、蒸留水1 mlとヘキサン4 mlを加え、ヘキサン層を抽出し、減圧遠心して脂肪酸メチルエステルを回収した。それぞれのサンプルをクロロホルムに溶解し、ガス液体クロマトグラフィー（ＧＬＣ）にてサンプル中の脂肪酸組成を測定した。ＧＬＣは、島津社製GC-2010を用い、ＧＬサイエンス社製キャピラリーカラムTC70（0.25mm×60m）を用い、カラム温度１８０℃、気化室温度２５０℃、検出器温度２５０℃、キャリアガスＨｅ、メイクアップガスＮ2、Ｈ2流量40 mL/min、Ａｉｒ流量400 mL/min、スプリット比５０、分析時間３０ｍｉｎの条件にて行った。抽出された脂肪酸量を、ＧＬＣのチャートのピーク面積値から、内部標準の脂肪酸量を基準として定量した。
【００８１】
その結果、製造例１のΔ17不飽和化酵素遺伝子導入株では、アラキドン酸蓄積の低減と
、総脂肪酸あたり４７％のエイコサペンタエン酸（EPA）の蓄積がみられた。製造例２のΔ15不飽和化酵素遺伝子導入株でも、アラキドン酸蓄積の低減と、総脂肪酸あたり４８％
のEPAの蓄積がみられた。一方、製造例３のΔ12不飽和化酵素遺伝子導入株は、オレイン
酸の低減、アラキドン酸の蓄積向上がみられたものの、EPAの蓄積は向上しなかった。製造例４のΔ12不飽和化酵素とΔ17不飽和化酵素の遺伝子の導入株では、アラキドン酸の低
減に加え、オレイン酸の低減がみられ、かつEPA総脂肪酸あたり５０％以上のEPAの蓄積がみられた。また、製造例５のΔ12不飽和化酵素とΔ15不飽和化酵素の遺伝子の導入株に
おいても、オレイン酸の低減とアラキドン酸の低減、かつEPA総脂肪酸あたり４０％以上のEPAの蓄積がみられた。
【００８２】
（試験例２）不飽和化酵素遺伝子導入株における脂肪酸組成および生産量の経時変化
（Δ17不飽和化酵素遺伝子導入株）
製造例１で得られたΔ17不飽和化酵素遺伝子導入M. alpina変異株（＃1、＃2、＃4
、＃6、＃9、＃19、＃21および＃24）について、4mL GY培地中（2%グルコース、1%酵母エキス）、２８℃で３、７、１０、１４日間、１２０ｒｐｍで好気的に培養し、試験例１と同様の手順で菌体中の脂肪酸の組成および生成量を経時的に分析した。結果を図７に示す。野生株（M. alpina 1S-4）やコントロール株（ウラシル要求株にマーカー遺伝子のみを含むベクターを挿入した株）、ホスト株（ウラシル要求株）は、この培養条件ではEPAを全く生産しなかったが、Δ17不飽和化酵素遺伝子導入株は、いずれもEPA生産量が向上
し、アラキドン酸が低減していた。総脂肪酸中のEPAの割合は培養１０日目でほぼ最大に達しており、培養１４日目では、最大で総脂肪酸あたり４７％（0.9mg/mL）のEPAが生産され、一方アラキドン酸の蓄積は２％に低減した（株＃9）。また、脂肪酸生産量は培養１０日目には、多くの遺伝子導入株において、コントロール株よりも多くの脂肪酸を生産していた。このことから、Δ17不飽和化酵素遺伝子導入株では、EPAが効率よく生産され
ていると考えられた。
【００８３】
（Δ15不飽和化酵素遺伝子導入株）
製造例２で得られたΔ15不飽和化酵素遺伝子導入M. alpina変異株（＃2、＃3、＃9
、＃13、＃14、および＃20）について、4mL GY培地中（2%グルコース、1%酵母エキス）、２８℃で３、７、１０、１４日間、１２０ｒｐｍで好気的に培養し、試験例１と同様の手順で菌体中の脂肪酸の組成および生成量を経時的に分析した。結果を図８に示す。Δ15不
飽和化酵素遺伝子導入株は、いずれもコントロール株（ウラシル要求株にマーカー遺伝子のみを含むベクターを挿入した株）に比べてEPA生産量が向上し、アラキドン酸が低減していた。総脂肪酸中のEPAの割合は培養１４日目でほぼ最大であり、培養１４日間では、最大で総脂肪酸あたり４８％（0.6mg/mL）のEPAが生産され、一方アラキドン酸の蓄積は６％に低減した（株＃20）。また、脂肪酸生産量は培養７日目には、多くの遺伝子導入株において、コントロール株よりも多くの脂肪酸を生産していた。このことから、Δ15不飽
和化酵素遺伝子導入株では、EPAが効率よく生産されていると考えられた。
【００８４】
（Δ12不飽和化酵素遺伝子導入株）
製造例３で得られたΔ12不飽和化酵素遺伝子導入M. alpina変異株（＃1、＃2、＃7
、＃22、＃23、および＃24）について、4mL GY培地中（2%グルコース、1%酵母エキス）、２８℃で３、７、１０、１４日間、１２０ｒｐｍで好気的に培養し、試験例１と同様の手順で菌体中の脂肪酸の組成および生成量を経時的に分析した。結果を図９に示す。Δ12不
飽和化酵素遺伝子導入株では、コントロール株（ウラシル要求株にマーカー遺伝子のみを含むベクターを挿入した株）やホスト株（ウラシル要求株）に比べてEPA生産量はほとんど向上しなかったが、脂質生産量や脂肪酸組成中のアラキドン酸の割合が増加し、一方で、コントロール株では蓄積していたオレイン酸の量が低減した。例えば、株＃7では、ホスト株に比べ脂質生産量が１０％以上向上し、さらに脂肪酸組成中のアラキドン酸の割合が、コントロール株に比べ培養７日目には１５％、培養１０日目には２０％以上（総脂肪酸中５３％）に向上した。一方で、オレイン酸量は、培養７日目で野生株が３０％、コントロール株が１２％であったのに対し、Δ12不飽和化酵素遺伝子導入株では培養７日目で６％以下、さらに培養１０、１４日目には２％に低減した。
【００８５】
（Δ17,Δ12不飽和化酵素遺伝子導入株）
製造例４で得られたΔ12,Δ17不飽和化酵素遺伝子導入M. alpina変異株（＃6、＃11
、＃16、＃17、＃21、＃23、＃25、＃27、＃33、＃37、＃40、＃45、＃46、および＃48）について、4mL GY培地中（2%グルコース、1%酵母エキス）、２８℃で４、１０、１４日間、１２０ｒｐｍで好気的に培養し、試験例１と同様の手順で菌体中の脂肪酸の組成および生成量を経時的に分析した。結果を図１０に示す。Δ12不飽和化酵素遺伝子とΔ17不飽和化酵素遺伝子を導入した株では、いずれもコントロール株（ウラシル要求株にマーカー遺伝子のみを含むベクターを挿入した株）に比べてEPA生産量が向上するとともに、アラキドン酸とオレイン酸のいずれもが低減しており、EPAが効率よく生産されていると考えられた。培養１４日では、最大で総脂肪酸あたり５１％（0.3 mg/mL）のEPAを生産し、アラキドン酸の蓄積が２．５％、オレイン酸の蓄積が４％に低減した（株＃17）。
【００８６】
（Δ15,Δ12不飽和化酵素遺伝子導入株）
製造例５で得られたΔ12,Δ15不飽和化酵素遺伝子導入M. alpina変異株（＃4、＃7
、＃8、＃11、および＃16）について、4mL GY培地中（2%グルコース、1%酵母エキス）、２８℃で４、１０、１４日間、１２０ｒｐｍで好気的に培養し、試験例１と同様の手順で菌体中の脂肪酸の組成および生成量を経時的に分析した。結果を図１１に示す。Δ12不飽
和化酵素遺伝子とΔ15不飽和化酵素遺伝子を導入した株では、いずれもコントロール株（
ウラシル要求株にマーカー遺伝子のみを含むベクターを挿入した株）に比べEPA生産量が向上するとともに、アラキドン酸とオレイン酸のいずれもが低減しており、EPAが効率よく生産されていると考えられた。培養１４日では、最大で総脂肪酸あたり４３％（0.13 mg/mL）のEPAを生産し、アラキドン酸の蓄積が１２％、オレイン酸の蓄積が５％に低減した（株＃7）。
【図１】
2016165226.tif 000003
【図２】
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【図３】
2016165226.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016165226.tif 000009
【図８】
2016165226.tif 000010
【図９】
2016165226.tif 000011
【図１０】
2016165226.tif 000012
【図１１】
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【配列表】
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