(57)【要約】【課題】  従来、ＲＮＡを抽出するための原料として着目されてこなかった少量の試料から、効率よくＲＮＡを抽出する方法を提供する。【解決手段】  骨表面からＲＮＡ精製体を得るＲＮＡ抽出方法であって、  削開されて細粒となった骨表面の骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液をフィルタを介して吸引することで、骨細粒含有懸濁液から骨表面の骨細粒を得る工程（１）と、  前記工程（１）で得られた骨表面の骨細粒を脱脂することでＲＮＡ含有脱脂成分を得る工程（２）と、  前記工程（２）により脱脂したＲＮＡ含有脱脂成分を精製することでＲＮＡ精製体を得る工程（３）とを有することを特徴とするＲＮＡ抽出方法。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨表面からＲＮＡ精製体を得るＲＮＡ抽出方法であって、
削開されて細粒となった骨表面の骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液をフィルタを介して吸引することで、骨細粒含有懸濁液から骨表面の骨細粒を得る工程（１）と、
前記工程（１）で得られた骨表面の骨細粒を脱脂することでＲＮＡ含有脱脂成分を得る工程（２）と、
前記工程（２）により脱脂したＲＮＡ含有脱脂成分を精製することでＲＮＡ精製体を得る工程（３）とを有することを特徴とするＲＮＡ抽出方法。
【請求項２】
前記工程（２）が、ＲＮＡ含有骨細粒を、タンパク質変性剤によりＲＮａｓｅを変性させることでＲＮＡを安定させ、さらに酸性条件下で有機溶媒を加え遠心分離することで水層と有機溶媒層とを分離し、前記有機溶媒層を除去することで脱脂し、水層に残留した成分からＲＮＡ含有脱脂成分を得る工程である請求項１記載のＲＮＡ抽出方法。
【請求項３】
前記工程（３）が、イソプロパノールおよび／またはマイクロビーズを用いた精製である請求項１または２記載のＲＮＡ抽出方法。
【請求項４】
前記骨表面の骨細粒が、乳様突起骨由来の骨細粒であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のＲＮＡ抽出方法。
【請求項５】
吸引装置に接続され、骨細粒を骨細粒含有懸濁液から分離して採取するための骨細粒採取装置であって、
削開されて細粒となった骨表面の骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液を吸引するための吸引部と、
前記吸引部から吸引された骨細粒含有懸濁液中の骨細粒を分離して捕集するためのフィルタを有する回収部とを有する骨細粒採取装置。
【請求項６】
前記吸引部に、形状記憶部材製の吸引補助部を設けたことを特徴とする請求項５記載の骨細粒採取装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨表面に含まれるＲＮＡを効率よく得ることができるＲＮＡの抽出方法に関する。また、このＲＮＡの抽出方法に適したＲＮＡを含有する骨表面の骨細粒を採取する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子の発現は各組織や臓器等によって大きく異なり、その発現の違いを把握するにはＲＮＡの発現を調べることが一般的である。その遺伝子発現を確認する対象として、骨は、肉や血液等の他の人体を構成する組織よりもリン酸カルシウム等の無機質が多く、人体の遺伝子発現等に関連する物質を得ることが難しく、どのような遺伝子発現が生じている組織か解明することが困難な組織であった。このような骨から、ＲＮＡ精製体を得ようとする場合、比較的大きい骨から０．５〜１ｃｍ角程度の大きいブロックを採取し、ここからＲＮＡを抽出し分析することが行われてきた。例えば、骨からＲＮＡを抽出する方法として、非特許文献１が開示されているが、ここでは、ブロックとして採取した骨組織を保存性や粉砕しやすさを考慮して液体窒素で瞬間凍結してから粉砕してＲＮＡの抽出を行っている。
【０００３】
一方、ＲＮＡの抽出方法として、ＡＧＰＣ（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔａｒａｃｔｉｏｎ）法と呼ばれる抽出方法が知られている。これは、ＲＮＡが、ＤＮＡやタンパク質等と異なり、酸性条件で比較的親水性が高いことを利用した抽出方法である。具体的には、組織や細胞の破砕液に酸を加えて、さらにフェノールやクロロホルム等の無極性の有機溶媒を混合し分離させると、ＤＮＡやタンパク質等は有機溶媒層側に移行し、ＲＮＡは水層側に溶解することを利用した抽出方法である。このＡＧＰＣ法を行うにあたっては、ＲＮａｓｅ等のタンパク質を予め変性させておくなどの工程の変更が適宜行われる。さらにＡＧＰＣ法を改良する手法として、カオトロピック剤を用いるもの（特許文献１）など、種々のＲＮＡ抽出方法が提案されている。また、効率的な核酸抽出方法として両イオン性緩衝液を用いたり（特許文献２）、ガラスファイバーやホウケイ酸ファイバーの層が充填されている予備濾過カラムを用いてＤＮＡとＲＮＡとを分離する技術等が検討されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−１３７２９５号公報
【特許文献２】特開２０１３−０４２７５０号公報
【特許文献３】特開２００５−５２１４２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】LE Carter, G Kilroy, JM Gimble & ZE Floyd, “An improved method for isolation of RNA from bone”, BMC biotechnology, 12(1),5, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前述したＡＧＰＣ法は、ＲＮＡ等を水層−有機溶媒層とに十分に分離するために、ＲＮＡ等が含有される破砕液を調製することが求められる。これを、骨に採用しようとする場合、大きいブロック状に採取された骨片を液体窒素で凍結し、粉砕することが行われてきた。しかしながら、骨を大きいブロックで採取することは生体（患者等）への負担が大きく困難な場合や、そもそも大きいブロックが存在しない組織もあり採取できない場合が多い。よって、従来の大きいブロックを必要とする手法は採用しにくかった。一方で、骨は、常に破壊、再生を繰り返しているダイナミックな組織であり、その遺伝子発現が特に注目される組織である。この骨から効率よくＲＮＡを抽出する方法が提示されることで遺伝子解析等の人体の機構を解明することに貢献できると考えられ、さらにはその発現状況等からより詳しい人体の状態の評価ができるようになると考えられる。また、骨周辺でのＲＮＡ発現を調べることで、新たな治療法等のアプローチを見出すためにも有効と考えられる。かかる状況下、本発明は、骨から効率よくＲＮＡを抽出する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、骨の表層部に存在し、破骨細胞が存在するハウシップ窩（Howship’s lacuna）ともよばれる骨と肉との境界になる部分で遺伝子発現が多く生じていると考えられる部分に着目した。このハウシップ窩に含まれていた成分は、骨の表層部（骨表面）を削開したものに含まれる。この骨表面を削開したものは、手術時に多く発生しているものの、手術対象の組織そのものではないため直ちに洗浄除去される対象だった。これは、そもそも骨はＲＮＡ等の核酸やタンパク質等の含有量が極めて少なく、リン酸カルシウム等の無機質が多く、遺伝子発現を調べにくい対象ととらえられていたため、一般的に少量しか得られない骨細粒の収集や評価を想定していなかったためである。
【０００８】
本発明は、この削開された骨表面の細骨粒を利用し、かつ、従来使用されてこなかった試料を有効活用することでＲＮＡ精製体を得ることができることを見出したことに基づくものである。この知見に基づき、本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明にかかるものである。
＜１＞  骨表面からＲＮＡ精製体を得るＲＮＡ抽出方法であって、削開されて細粒となった骨表面の骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液をフィルタを介して吸引することで、骨細粒含有懸濁液から骨表面の骨細粒を得る工程（１）と、前記工程（１）で得られた骨表面の骨細粒を脱脂することでＲＮＡ含有脱脂成分を得る工程（２）と、前記工程（２）により脱脂したＲＮＡ含有脱脂成分を精製することでＲＮＡ精製体を得る工程（３）とを有することを特徴とするＲＮＡ抽出方法。
＜２＞  前記工程（２）が、ＲＮＡ含有骨細粒を、タンパク質変性剤によりＲＮａｓｅを変性させることでＲＮＡを安定させ、さらに酸性条件下で有機溶媒を加え遠心分離することで水層と有機溶媒層とを分離し、前記有機溶媒層を除去することで脱脂し、水層に残留した成分からＲＮＡ含有脱脂成分を得る工程である前記＜１＞記載のＲＮＡ抽出方法。
＜３＞  前記工程（３）が、イソプロパノールおよび／またはマイクロビーズを用いた精製である前記＜１＞または＜２＞記載のＲＮＡ抽出方法。
＜４＞  前記骨表面の骨細粒が、乳様突起骨由来の骨細粒であることを特徴とする前記＜１＞〜＜３＞のいずれか１項に記載のＲＮＡ抽出方法。
＜５＞  吸引装置に接続され、骨細粒を骨細粒含有懸濁液から分離して採取するための骨細粒採取装置であって、削開されて細粒となった骨表面の骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液を吸引するための吸引部と、前記吸引部から吸引された骨細粒含有懸濁液中の骨細粒を分離して捕集するためのフィルタを有する回収部とを有する骨細粒採取装置。
＜６＞  前記吸引部に、形状記憶部材製の吸引補助部を設けたことを特徴とする前記＜５＞に記載の骨細粒採取装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＲＮＡ抽出方法によれば、少量の骨由来のサンプルからＲＮＡを抽出することができる。また、この方法は、従来、ＲＮＡを得る対象として着目されず、一般的に除去廃棄されてきた組織を用いるものであり、生体への影響も少ない方法である。また、本発明の骨細粒採取装置は、ＲＮＡを抽出する等のために骨細粒を採取するにあたって、効率よく骨細粒を採取することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の骨細粒採取装置の一態様を示す図である。
【図２】本発明の骨細粒採取装置の吸引部に、吸引補助部を取り付けた構造の拡大図である。
【図３】本発明の骨細粒採取装置の吸引部に取り付けられる吸引補助部の変形を示す図であり、（ａ）は吸引補助部が記憶した形状とした状態を示す図であり、（ｂ）は吸引補助部を直管状に変形させた状態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。
【００１３】
本発明は、骨表面からＲＮＡ精製体を得るＲＮＡ抽出方法であって、削開されて細粒となった骨表面の骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液をフィルタを介して吸引することで、骨細粒含有懸濁液から骨表面の骨細粒を得る工程（１）と、前記工程（１）で得られた骨表面の骨細粒を脱脂することでＲＮＡ含有脱脂成分を得る工程（２）と、前記工程（２）により脱脂したＲＮＡ含有脱脂成分を精製することでＲＮＡ精製体を得る工程（３）とを有することを特徴とするＲＮＡ抽出方法に関する。この方法により、少量の骨から、効率よくＲＮＡを抽出することができる。
【００１４】
本発明のＲＮＡ抽出方法は、骨表面からＲＮＡ精製体を得るＲＮＡ抽出方法に関し、これについて以下に説明する。まず、骨（骨組織）は、その中心付近に髄腔や海綿質を有し、その表層付近には、緻密骨（緻密質）を有している。また、一部前述したように、骨の表層部の筋肉と接する部分にはハウシップ窩と呼ばれる小さなくぼみがみられ、ここで骨は破壊、再生を繰り返している。このハウシップ窩周辺では破壊、再生に関する重要なＲＮＡ発現が生じているものと考えられている。本発明のＲＮＡ抽出方法においては、これらの、骨の緻密骨やハウシップ窩を含む骨表面を細粒化した骨細粒から、精製されたＲＮＡ（ＲＮＡ精製体）を得ることを特徴とする。以下、この骨表面を細粒化した骨細粒（骨表面の骨細粒）を、単に「骨細粒」と記載する場合がある。
【００１５】
本発明のＲＮＡ抽出方法は、削開されて細粒となった骨表面の骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液をフィルタを介して吸引することで、骨細粒含有懸濁液から骨表面の骨細粒を得る工程（１）を有する。本発明においては、前述した骨の表層部付近である骨表面を削開することで細粒となった、骨表面の骨細粒を利用する。この削開は、ドリルで行われることが一般的である。また、骨を削開するにあたっては、熱等による影響を抑えるために生理食塩水等を削開部に供給しながら削開する。このため、削開直後の骨細粒は、生理食塩水等との混合物の状態であり、生理食塩水等の液量を多く含有し、流動性が高い骨細粒を含有する骨細粒懸濁液の状態となっている。よって、この骨細粒含有懸濁液は、主に骨細粒や生理食塩水を含み、これらの他に一部、血や骨周辺の筋肉等が含まれ得る。本発明は、これらの骨細粒懸濁液に含まれる成分のうち、ＲＮＡ精製体を得る原料として、骨表面の骨細粒に着目したものであるが、この骨細粒は、骨細粒懸濁液の生理食塩水等が液体であることに対し、固体であるため分離しやすい。このため、骨細粒を生理食塩水等の液体と分離するために、フィルタを介して、骨細粒を採取する。この採取した骨細粒を、ＲＮＡを含有する骨表面の骨細粒として用いる。
【００１６】
この骨細粒の採取にあたっては、骨細粒を骨細粒含有懸濁液から分離して採取するための骨細粒採取装置を用いることができる。この骨細粒採取装置として、図１に本発明の骨細粒採取装置の一実施形態を示す。この骨細粒採取装置１０は、吸引部１と、第一の配管２を介して吸引部１と接続されフィルタ３１を備える回収部３とを有する。この骨細粒採取装置１０は、第二の配管４を介して回収部３と吸引装置５とを接続させ使用される。この、第一の配管２や、第二の配管４等には、適宜逆流防止弁等を設けてもよい。この骨細粒採取装置１０は、骨細粒を効率よく採取することに適している。
【００１７】
この吸引部１は、削開され骨細粒となった骨細粒を含有する骨細粒含有懸濁液が発生する場所から効率よく懸濁液を吸引するために、削開部付近に近接させるための部分であり、懸濁液を吸引するための開放部を有する。なお、この吸引部１における吸引作用は、吸引部１が第一の配管２、回収部３、第二の配管４を介して接続されている吸引装置５の吸引によって生じる。
【００１８】
さらに、図２は、吸引補助部１ａを取り付けた吸引部１を、中耳腔内で、耳小骨上部付近に近接させる概要を示す部分拡大図である。このように、吸引部１が骨表面を採取しようとする部分に到達しやすいように、その採取部分の形状に併せて成形された形状記憶部材製の吸引補助部１ａを設けることが好ましい。このように吸引補助部１ａを設けることで、複雑な形状の部分から骨表面を削開し骨細粒を得ようとする場合であっても、その削開部分に近接した場所に吸引部１を到達させやすくなる。すなわち、この吸引補助部１ａが、吸引部１と第一の配管２との間にあることで吸引部１の開放部を任意の方向に調整しやすくなる。
【００１９】
図３（ａ）、図３（ｂ）は、形状記憶部材製の吸引補助部１ａの形状についてより詳しく説明するための図である。吸引部１の第一の配管２側の部分は、形状記憶部材により形成された吸引補助部１ａとなっている。これらの図において、第一の配管２の先端に吸引補助部１ａを設けてあり、その先端が吸引部１となる。この形状記憶部材製の吸引補助部１ａは、この図３（ａ）に示すような形状を予め記憶させておくことができるものである。これを使用する際、図２における外耳道等を通過させやすいように、図３（ｂ）に示すような直管状等の状態に変形させ、図２の耳小骨上部付近のような、骨表面を採取しようとする部分に到達したときに、図３（ａ）の形状に戻すことで、吸引部１の開放部が採取部分方向に向き、目的とする採取を効率よく行うものである。このような形状記憶部材としては、例えば、熱や電気で記憶した形状に戻すことができる形状記憶合金や、形状記憶プラスチックなどを利用したものが挙げられる。また、吸引部と吸引補助部とは同一の部材で形成してもよい。
【００２０】
次に、骨細粒採取装置１０の回収部３は、第一の配管２を介して吸引部１と接続されており、吸引部１から吸引された骨細粒含有懸濁液の骨細粒を分離するためのフィルタ３１を有する。このフィルタ３１は、回収部３の内部の先端（吸引部１側）に、収納されている。これは、一部前述したように、吸引部１から吸引された骨細粒含有懸濁液には、大量の生理食塩水等の流体が含まれているが、ＲＮＡ精製体を得るための原料として使用する部分は、骨細粒の固体部分である。この固体部分にあたる骨細粒を効率よく分離し回収するために骨細粒採取装置１０には回収部３が設けられるものである。この回収部３は、第一の配管２を介して吸引部１と接続されている。第一の配管２より流通してきた懸濁液は、フィルタ３１を通るとき、その懸濁液に含まれる固体部分（骨細粒）がフィルタ３１に捕集される。そして骨細粒が分離された生理食塩水等の液体部分は、回収部３に接続された第二の配管４に流出する。
【００２１】
本発明の骨細粒採取装置１０は、第二の配管４を介して回収部３と吸引装置５とを接続して使用される。この吸引装置５は、骨細粒採取装置１０全体の吸引作用を奏するために、吸引ポンプ等の吸引手段を有している。吸引装置は、より具体的には、小型の吸引器を用いても良いし、医療設備等に導入されている吸引供給装置等による吸引ユニット等を使用しても良い。
【００２２】
本発明のＲＮＡ抽出方法は、前記工程（１）で得られた骨表面の骨細粒を脱脂することでＲＮＡ含有脱脂成分を得る工程（２）とを有する。ＲＮＡは、ＤＮＡやタンパク質等と異なり、酸性条件で比較的親水性が高い。すなわち、これを利用して、ＲＮＡ含有骨細粒から、ＤＮＡやタンパク質等の脂質成分との親和性が高い成分を脱脂して取り除くことで、ＲＮＡ含有量が高いＲＮＡ含有脱脂成分を得ることができる。より具体的には、骨細粒に酸を加えて、さらにフェノールやクロロホルム等の無極性の有機溶媒を混合し分離することで、ＤＮＡやタンパク質等は有機溶媒層側に移行し、ＲＮＡは水層側に溶解する。よって、この有機溶媒層を除去することで、ＲＮＡ含有量が高いＲＮＡ含有脱脂成分を得ることができる。
【００２３】
さらに、この脱脂を行うにあたっては、ＲＮＡが分解されたりしないように、タンパク質を変性させることが好ましい。この目的で、例えば、タンパク変性剤であるチオシアン酸グアニジンを含む溶液を用いたり、さらには、ジスルフィド結合を破壊するβメルカプトエタノール、各種界面活性剤などが用いられている。また、これらを混合したものとしてＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社）や、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポン・ジーン社）等が市販されており、本発明においては適宜、これらの市販品を用いることができる。
【００２４】
本発明はこれらのＲＮＡ成分を残すための脱脂を効果的に行う手法とすることが好ましい。すなわち、本発明のＲＮＡ抽出方法における工程（２）は、ＲＮＡ含有骨細粒（骨表面の骨細粒）を、タンパク質変性剤によりＲＮａｓｅを変性させることでＲＮＡを安定させ、さらに酸性条件下で有機溶媒を加え遠心分離することで水層と有機溶媒層とを分離し、前記有機溶媒層を除去することで脱脂するものであることが好ましい。
【００２５】
本発明のＲＮＡ抽出方法は、前記工程（２）により脱脂したＲＮＡ含有脱脂成分を精製することでＲＮＡ精製体を得る工程（３）とを有することを特徴とするＲＮＡ抽出方法を有する。
前述の工程（２）によりＲＮＡを高濃度で含有するように調製されたＲＮＡ含有脱脂成分は、さらに精製することで、ＲＮＡ精製体とすることができる。このＲＮＡ精製方法としては、例えば、ＲＮＡ含有脱脂成分にイソプロパノールを混合し、ＲＮＡを沈殿させ、その沈殿物をエタノール等で洗浄することで、ＲＮＡを精製する方法が挙げられる。また、マイクロビーズを用いて、クロマトグラフィーの原理を利用して、ＲＮＡ含有の画分を精製する方法により精製を行っても良い。また、これらの精製方法を組み合わせて行っても良い。
【００２６】
また、本発明のＲＮＡ抽出方法により得られたＲＮＡ精製体を用いて、さらにＰＣＲ法等の核酸増幅方法を利用して、ＲＮＡ含有量を増加させることができる。また、適宜、このＰＣＲと組み合わせて、ＲＮＡ精製体のＲＮＡ発現性を調べることで、骨細粒の由来となった骨組織における遺伝子発現性を調べることができる。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
［装置］
［採取装置（Ａ）］
図１に示す吸引装置５に接続され、骨細粒を骨細粒含有懸濁液から分離して採取するための骨細粒採取装置１０は、ＲＮＡ含有骨細粒を得る工程（１）に用いられる。この骨細粒採取装置１０を、以下の構成として用いて、骨表面の骨細粒を抽出した。この吸引部１としてヤンカーサクションチューブ（ＣＯＶＩＤＩＥＮ社）を、第一の配管２としてセイラムサンプチューブ（ＣＯＶＩＤＩＥＮ社）を、回収部３として輸血セットに用いられるメッシュフィルタ（フィルタ３１）を有するテルフュージョン輸血セット（テルモ社製）を用いて骨細粒採取装置１０とした。さらに、この骨細粒採取装置を使用するにあたり、吸引装置５として病院に配管設備として設置されている吸引供給設備の吸引ユニットを用いて、また、骨細粒採取装置１０の回収部３と吸引装置５とは、第二の配管４としてコネクティングチューブ（ＣＯＶＩＤＩＥＮ社）により接続させて、採取装置（Ａ）とした。
【００２９】
［ＲＮＡ含有骨細粒の脱脂法］
［試薬］
・ＴＲＩｚｏｌ：Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ社製の、ＲＮａｓｅ失活剤を使用した。
【００３０】
［実施例１］
・ＲＮＡ含有骨細粒を得る工程（１）
骨表面の骨細粒を、乳突削開鼓室形成術中（tympanomastoidectomy）に発生した、真珠腫の有無のある慢性中耳炎の患者１４人から採取した。より具体的には、乳様突起の皮質骨（正常骨細粒）、真珠腫性中耳炎患者の真珠腫に隣接した骨（真珠腫骨細粒）、真珠腫が確認されない慢性中耳炎患者の乳突蜂巣に隣接した骨（非真珠腫骨細粒）から採取した。
乳突削開鼓室形成術中に生理食塩水を供給しながらドリルで削開することで発生する骨細粒を含有する懸濁液（骨細粒含有懸濁液）から、前述の採取装置（Ａ）を用いて、ＲＮＡを含有する骨表面の骨細粒（１）として採取した。この採取にあたっては、採取装置（Ａ）の吸引部が、骨細粒含有懸濁液に接触するようにして、吸引装置を作動させ吸引することで、骨細粒含有懸濁液が吸引部、第一の配管を通り、回収部に流入し、回収部のメッシュフィルタに骨細粒（骨表面の骨細粒（１））はトラップされ、その他の生理食塩水や血等はフィルタを通過し、第二の配管を通り吸引装置に流れた。
【００３１】
・ＲＮＡ含有骨細粒の脱脂、精製
採取した骨表面の骨細粒（１）１５０〜７９０ｍｇ（中央値４２０ｍｇ）を、１ｍＬのＴＲＩｚｏｌ試薬中に浸漬し、超音波ホモジナイザー（タイテック社）で超音波処理してホモジナイズ化して懸濁液にした。この懸濁液に、酸性条件として、２００μＬのクロロホルムを添加し、十分に振盪して、４℃で１５分間２１８８０ｘｇで遠心分離した。遠心分離により分離された水層を、別のチューブに移し、全ＲＮＡを、酸グアニジニウム−チオシアネート−フェノール−クロロホルム法により抽出し、完全に自動化可能ＥＺ１バイオロボットシステム（ＱＩＡＧＥＮ社、ヒルデン、ドイツ）を使用してクリーンアップ抽出および磁気ビーズ技術による核酸の精製を行い、ＲＮＡ精製体を得た。ＲＮＡ精製体のＲＮＡの純度は、２８０ｎｍ（Ａ２８０）と２６０ｎｍ（Ａ２６０）での光吸収の比率を決定することによって評価した。ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍの吸光度から決定した。
【００３２】
・定量ＲＴ―ＰＣＲとＲＮＡ発現（ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ１、ＴＲＡＰ、カテプシンＫ）
サンプルは、タックマン高速ユニバーサルＰＣＲマスターミックス（Applied Biosystems社）を用いて、アプライドバイオシステムステップワンプラスリアルタイムＰＣＲシステムによるリアルタイムＰＣＲにて、核因子κＢ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫのリガンド（ＲＡＮＫ１）、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、およびカテプシンＫのｍＲＮＡの定量をおこなった。
【００３３】
・結果
骨表面の骨細粒の質重量１５０〜７２０ｍｇ（中央値４２０ｍｇ）から、ＲＮＡ総量として０．８０〜１０．３２μｇ（中央値３．８９μｇ）を抽出した。また、ＲＮＡ精製体のＡ２６０／Ａ２８０の比は、１．７７〜１．８１であり、ＲＮＡ精製体の純度と品質は十分なものであった。
ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ１、ＴＲＡＰ、カテプシンＫを比較した結果、正常骨細粒および真珠腫骨細粒、非真珠腫骨細粒のＲＮＡ精製体は、ＴＲＡＰとカテプシンＫの発現において有意な差はなかった。一方、非真珠腫骨細粒に対して、真珠腫骨細粒のＲＮＡＫおよびＲＡＮＫ１の発現は有意に低かった。これらの結果は、中耳真珠腫において破骨細胞活性が低下することを示す。
このように中耳真珠腫におけるＲＮＡ発現を調べることが可能であることから、本発明によれば骨表面の骨細粒からＲＮＡを十分に抽出することができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明のＲＮＡ抽出方法によれば、ＲＮＡを効率よく抽出することができ、生体から採取したものを処理、分析するなどして、各種データを収集する方法として有用である。また、本発明の骨細粒採取装置は、このＲＮＡ抽出方法に適した装置として有用である。
【符号の説明】
【００３５】
１０  骨粒採取装置
１  吸引部
１ａ  吸引補助部
２  第一の配管
３  回収部
３１  フィルタ
４  第二の配管
５  吸引装置
【図１】
2016131499.tif 000003
【図２】
2016131499.tif 000004
【図３】
2016131499.tif 000005