(57)【要約】【課題】II型コラーゲン量をより多く含有する軟骨様シートの作成方法を提供する。【解決手段】200μg/ml以上かつ8000μg/ml以下のアスコルビン酸および／または0.02μg/ml以上かつ50μg/ml未満のコラーゲンを添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
200μg/ml以上かつ8000μg/ml以下のアスコルビン酸を添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法。
【請求項２】
0.02μg/ml以上かつ50μg/ml未満のコラーゲンを添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法。
【請求項３】
200μg/ml以上かつ8000μg/ml以下のアスコルビン酸と0.02μg/ml以上かつ50μg/ml未満のコラーゲンの両方を添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法。
【請求項４】
アスコルビン酸がアスコルビン酸リン酸エステルである請求項１または３に記載の軟骨様シートの作成方法。
【請求項５】
コラーゲンがタイプIアテロコラーゲンである請求項２または３に記載の軟骨様シートの作成方法。
【請求項６】
水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養する請求項１から５のいずれかに記載の軟骨様シートの作成方法。
【請求項７】
使用する培養液に分化誘導因子と血清を含み、使用する間葉系幹細胞がヒト骨髄由来である請求項１から５のいずれかに記載の軟骨様シートの作成方法。
【請求項８】
水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器にヒト骨髄由来間葉系幹細胞懸濁液と分化誘導因子と血清を含む培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養する請求項１から５のいずれか記載の軟骨様シートの作成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨様シートの作成に係わる。
【背景技術】
【０００２】
軟骨は骨と共に骨格系を形成する結合組織の一部であり、身体や器官の支持作用にあずかる非常に重要な組織である。関節軟骨は硝子軟骨で構成されており、硝子軟骨の特徴的な物理学的特性は、構成する細胞外マトリックス（ECM：Extracellular matrix）の生化学的特性により規定される。硝子軟骨のECMの主成分はII型コラーゲン、アグリカン（プロテオグリカンの一種）、ヒアルロン酸などである。軟骨の内部ではII型コラーゲン細繊維はIX、XI型コラーゲンと共に網目構造を形成し、その間隙には高度に水和したアグリカンとヒアルロン酸、リンクタンパクからなる巨大会合体が含まれている。このような三次元構造が形成されているため、硝子軟骨は高い含水率と粘弾性（抗圧縮性）を持ち、体重の数倍もの荷重に耐えることができる。また、滑膜や軟骨細胞から分泌される潤滑物質であるヒアルロン酸によって軟骨表面の摩擦係数は低く関節の円滑な運動が可能となり、さらに軟骨そのものの磨耗も抑えられている。しかし、これらの豊富なECMのために周囲の組織からの細胞の浸潤が困難である上に、血管、神経、リンパ管を欠き栄養分の供給も遅いため、軟骨は自己修復能力の非常に乏しい組織である。例えば、損傷が関節軟骨層内に留まる程度の浅いものの場合、欠損周辺部の細胞が増殖してECM産生を促すが、欠損を埋めるだけの反応を励起しない。また、軟骨下骨に達する深い損傷の場合は、骨髄からの出血を生じ、軟骨前駆細胞及び各種サイトカインが供給されるために、軟骨様組織で修復される。しかし、この修復された組織は組織学的、生化学的及び生体力学的にみて、本来の硝子軟骨とは異なるため、長期的には変性を生じて変形性関節症へと進行することが多い。そこで、以上のような軟骨組織の損傷あるいは疾患に対する治療手段として、人工関節による外科的置換術が提案され、実用化されている。しかし、繰り返し応力などによる人工関節の破損のため、耐用年数が限られ、再手術によって人工関節を交換しなければならないが、患者への負担が大きいため、人工関節の適用は高齢者のみとなっているのが現状である。また、感染症の危険性や可動域が限られるなどの欠点もある（非特許文献１−５）。
【０００３】
これらの問題を解決するため、細胞を用いて組織を再生させることが有効であると考えられ、関節軟骨組織、あるいは分離した軟骨細胞の移植が試みられている。例えば、患者本人の重量負荷の少ない複数の部位から少量の軟骨片を採取し、それらを欠損部に移植するモザイク移植法（Mosaicplasty）が臨床的に行われている。しかし、移植できる軟骨には量的な限界があるため大きな欠損には適用できないという問題があり、さらに、移植後の機能は短期的には改善されるものの、長期的には硝子軟骨の性質を失う（繊維化）などの不具合が生じてくる（非特許文献６）。
【０００４】
また、別法として、軟骨小片から酵素処理にて分離した軟骨細胞を単層培養で増殖させてから移植する自家培養軟骨細胞移植法（CarticelTMなど）があるが、細胞は単層培養の過程で繊維芽細胞様に脱分化し、移植後も癒着、繊維化、肥大化が生じるなどの問題がある（非特許文献７、８）。従って、軟骨細胞移植により欠損部の再生を成功させるためには、脱分化していない正常な軟骨細胞を大量に確保できる技術の開発が必要である。
【０００５】
ところで、1999年に骨髄中に、骨、軟骨、脂肪、腱などの間葉系組織への多分化能を示す細胞の存在が報告され、間葉系幹細胞（MSC：Mesenchymal Stem Cell）と名付けられた（非特許文献９）。MSC独自の表面抗原はまだ完全には同定されていないがCD90、CD105、CD166、CD29、CD44などが陽性で、CD14、CD34、CD45などが陰性であるものをMSCと呼ぶことが現在一般的である（非特許文献10）。また、MSCは骨芽細胞への分化能を保ったまま38 PDL（Population Doubling Level）まで増殖でき（非特許文献11）、軟骨細胞への分化能は22 PDLまでは有していることが報告されている（非特許文献12）。すなわち、MSCを増殖させた後で軟骨細胞へ分化させることにより、上述の量的な問題を解決できるとともに、患者本人の細胞を用いるため拒絶反応を回避した治療が可能となる。また、MSCからの軟骨再生の他の利点として、骨髄液採取に関する患者の負担が軽いこと、骨髄液からのMSCの分離が容易なことなども挙げられる。このように、MSCからの軟骨再生は非常に有望視されているが、この再生プロセスには、MSCの分離、増殖、分化、三次元化の一連の工程の開発が必要となる。
【０００６】
ところで、近年ヒト細胞などの動物細胞を用いた組織再生に関する基礎的知見が多々発見されその臨床応用に期待が寄せられている。作成する組織の種類に応じて様々な形状の組織を作成する必要があり、軟骨、皮膚、網膜ではシート状組織の作成が必要となる。これまでシート状組織を作成する方法としては、皮膚細胞のような特殊な例を除けば、温度応答性ポリマーのコーティング面に細胞を接着培養し細胞増殖後に温度を低下させポリマーを分解して細胞シートを回収する方法（WO01/068799）、あるいは、不織布やコラーゲンゲルなどの担体（スキャフォールド）をシート状に成型しその内部で細胞を培養する方法（非特許文献13）などがあった。
【０００７】
様々な担体を用いた培養法が考案されている（非特許文献14−16）。例えば、天然高分子であるコラーゲンや合成高分子であるポリ乳酸（PLA：Poly lactic acid）、ポリグリコール酸（PGA：Poly glycolic acid）、ポリ乳酸-グリコール酸共重合体（PLGA：Poly lactic glycolic acid）などの生体吸収性ポリマーを主成分としたスポンジやメッシュ材料を用いた方法がある。軟骨には抗圧縮性が求められるため、機械的強度の点に関してスポンジやメッシュは優れた足場材料となりうるが、細胞を担体内に均一に播種することが難しく、均質な組織の作成は困難と考えられる。さらにPLAやPGAにおいては移植後に分解生成物（PLAでは乳酸、PGAではグリコール酸）が炎症反応を引き起こすという問題がある。一方、コラーゲンやフィブリン、アガロース、アルギン酸などのゲル材料を用いたゲル包埋培養法がある。この方法は機械的強度は低いものの、担体内に細胞を均一に播種できる利点がある。
【０００８】
しかし、これらの方法では温度応答性ポリマーやコラーゲン、不織布などの薬剤や担体が作成した組織に混入し、組織を人体に移植した後も残留し影響する懸念があった。また、これらの薬剤の使用は組織の製造コストを上げる要因になるばかりでなく、薬剤の操作のために組織作成プロセスが複雑となり、これらの組織を用いた移植治療の実用化の障害となることが懸念されている。
【０００９】
これらの担体の問題を解決するために、担体を使用しない培養方法が有用であることが考えられる。この代表例として軟骨細胞のペレット培養法（非特許文献17、18）や旋回凝集培養法（非特許文献19）がある。ペレット培養法は細胞懸濁液を遠心分離することによって球状細胞凝集体を作成し、培養するというものである。MSCもペレット培養により軟骨細胞へ分化できることが確認されており（非特許文献20）、ペレット中では細胞密度が高く、パラクリン、ジャクスタクリンを含めた細胞間相互作用が強いため、効率良くMSCから軟骨細胞への分化させることができると考えられている。よって、MSCから担体を使用しないで三次元軟骨組織を作成できることが考えられたが、この方法では1本の遠心管で1つのペレットしか作成できず、直径も約0.03 mmと臨床研究に用いるには小さすぎるという欠点がある（非特許文献21）。このように、ペレット培養法や旋回凝集培養法で作成できる細胞凝集塊はシート状ではなく球状でその大きさや形状を正確にコントロールできない。
【００１０】
これに対して本発明者らは、スキャフォールドフリーで、形状や大きさを制御できるシート状組織の作成方法を検討し、遠心回転半径方向に垂直な平坦な内面を含む容器に動物細胞懸濁液を入れて遠心分離し、シート状動物細胞塊を形成させたまま該当容器内で培養開始して得られることを特徴とするシート状動物細胞塊培養組成物を発明した（特許文献１）。また、水平方向に平坦な内面の底面を含む容器に動物細胞懸濁液を入れ、自然沈降した細胞を培養しても、シートの形状に偏りが生じるもののシート状動物細胞塊作成できることも見出し、再生医療学会（2010年3月18、19日：広島国際会議場）にて発表している。しかし、これらのシート状動物細胞塊は作成途中に収縮して球場に近い凝集塊になってしまうことが多かった。これに対して本発明者らは、水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と、血清を含む培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養することを特徴とする、シート状動物細胞塊の収縮の無い軟骨様シートの作成方法を見出した（非特許文献22）。この軟骨様シートは、直径約5 mm、厚さ約1 mmであり、臨床研究に用いるにも十分な大きさである。
【００１１】
ところで、軟骨組織に特徴的な物理学的特性は、構成する細胞外マトリックス（ECM：Extracellular matrix）の生化学的特性により規定される。したがって、ECMの主成分であるアグリカン（プロテオグリカンの一種）とII型コラーゲンの、軟骨様シートにおける十分な量の蓄積が軟骨様シートの良好な移植成績に重要となる。一般にヒトの正常な関節軟骨において、アグリカン含有量、II型コラーゲン含有量はそれぞれ約80 mg/ml、約150 mg/ml（非特許文献23）であるのに対して、上記の収縮なく作成した軟骨様シート中の各含有量は、それぞれ約7 mg/ml、約0.01 mg/mlと明らかに少ない（非特許文献22）。シート中の蓄積量は絶対量が少ないことの他に、正常軟骨に比べてアグリカンは約9%の蓄積量があるが、II型コラーゲンは約0.01%しかない。
【００１２】
ところで、培養液は溶質濃度に応じた浸透圧を有する。浸透圧の単位は[mOsm/L]であるが、グルコースの様に水溶液中でほとんど解離しない溶質の場合は、1 mmol/Lがほぼ1 mOsm/Lに等しいが、NaClのようにほぼ完全に解離する溶質の場合は、1 mmol/Lがほぼ2 mOsm/Lとなる。生理的浸透圧は約280 mOsm/Lといわれているが（非特許文献24）、培養液の浸透圧がそれより高くなると、細胞増殖速度が低下するだけでなく、アミノ酸やRNAなどの細胞内含量が増大することが知られている（非特許文献25）。また、細胞1個当たりのグルコース消費速度、エネルギー獲得速度やタンパク質生産速度は、ある浸透圧までは浸透圧上昇に応じて増大することも報告されている（非特許文献26）。したがって、培養液単位体積当たりのタンパク質生産速度は、生理的浸透圧より高い浸透圧で最大になることが多い（非特許文献27、28）。さらに、これらの知見を応用し、培養中に、培養液の浸透圧を段階的に増大させたり（非特許文献29）、周期的に増減させる（非特許文献30）ことによってタンパク質の生産性を改善した例も報告されている。本発明らはこれらの知見に基づき、上記の軟骨様シート培養における培養液浸透圧の影響を調べた結果、培養液の浸透圧を300 mOsm/L付近に調節することによって、アグリカン、II型コラーゲンの両方の蓄積量を最大にすることができることを見出し、特許出願している（特願2014-79737）が、II型コラーゲン蓄積量の大幅な増加は得られなかった。したがって、II型コラーゲンの蓄積量を増大させることが今後の課題である。
【００１３】
一般に細胞によるコラーゲン分子中のハイドロキシプロリンやハイドロキシリジンの合成を促進するアスコルビン酸（アスコルビン酸およびアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩などのアスコルビン酸エステル）はコラーゲン生合成に重要である（非特許文献31、32）。そのため、軟骨細胞の再分化培養や間葉系幹細胞の軟骨分化培養において、アスコルビン酸は通常50 μg/mlの濃度で添加されている（非特許文献33−35）。しかし、より高濃度でのアスコルビン酸の添加効果はこれまで調べられていない。
【００１４】
一方、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞外マトリックスとインテグリン受容体の結合によりERKが活性化することが知られている（非特許文献36、37）。またアスコルビン酸も細胞内におけるERK活性化を誘導することが知られている（非特許文献38）。一方で、ERKの阻害によりコラーゲンの発現が抑制されることが報告されており、ERKはコラーゲン遺伝子発現の制御に関わっていると示唆される（非特許文献39、40)。しかし、コラーゲンの添加によるコラーゲン合成への影響はこれまでに調べられていない。さらに、アスコルビン酸とコラーゲンの同時添加のコラーゲン合成への影響もこれまでに調べられていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特開2010-46053
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】骨と軟骨のバイオロジー  基礎から臨床への展開、金原出版株式会社、87-112 （2002）
【非特許文献２】再生医学  ティッシュエンジニアリングの基礎から最先端技術まで、NTS、225-283、691-701 （2002）
【非特許文献３】関節マーカー  病態診断の分子生物学的アプローチ、メディカルレビュー社、96 （1997）
【非特許文献４】Arthritis Rhem. 43（9）:1916-1926（2000）
【非特許文献５】Biomaterials 21:431-440（2002）
【非特許文献６】Clin Orthop Relat Res. 401:170-184 （2002）
【非特許文献７】J Bone Joint Surg Am. 88:503-507 （2006）
【非特許文献８】J Bone Joint Surg Am. 86:286-295 （2004）
【非特許文献９】Science 4（276）:71-74 （1997）
【非特許文献１０】Biochemical and Biophysical Research Communication 265:134-139 （1999））
【非特許文献１１】Journal of Cellular Biochemistry 64:278-294 （1997）
【非特許文献１２】Experimental Hematology 28:707-715 （2002）
【非特許文献１３】Journal of Bioscience and Bioengineering 98(6):477-481 (2004)
【非特許文献１４】Tissue Eng 13（7）:1583-1592 （2007）
【非特許文献１５】J Biomed Master Res. 50:138-143 （2000）
【非特許文献１６】J Biomed Mater Res. A （2005）
【非特許文献１７】細胞培養技術、東京化学同人p.189、1990
【非特許文献１８】セルプロセッシング工学−抗体医薬から再生医療まで− コロナ社、111-112 （2007）
【非特許文献１９】再生医療(日本再生医療学会雑誌) Vol.7 Suppl. p.124-125 (2008)
【非特許文献２０】Tissue Engineering 44）:415-428 （1998）
【非特許文献２１】Tissue Engineering 14（12）:2041-2049 （2008）
【非特許文献２２】J. Biosci. Bioeng. 116(6)：734-739 (2013)
【非特許文献２３】細胞外マトリックス、羊土社、p.67-74 (1995)
【非特許文献２４】Tissue Culture: Methods and Applications, Academic Press New York, p.703-709 (1973)
【非特許文献２５】Biotech. Bioeng. 43:77-89 (1994)
【非特許文献２６】J Biosci. Bioeng. 87(2):255-257 (1999)
【非特許文献２７】Biotech. Bioeng. 37:292-295 (1991)
【非特許文献２８】Cytotechnology 32(3):171-179 (2000)
【非特許文献２９】Cytotechnology 29(1):27-33 (1999)
【非特許文献３０】J. Biosci. Bioeng. 91(5): 509-514 (2001)
【非特許文献３１】PROLYL HYDROXYLASE, Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology 41:245-300 (1974)
【非特許文献３２】REGULATION OF COLLAGEN-SYNTHESIS BY ASCORBIC-ACID, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences 78: 2879-2882 (1981)
【非特許文献３３】Tissue Engineering 4:415-428 (1998)
【非特許文献３４】Journal of Bioscience and Bioengineering 111:489-492 (2011)
【非特許文献３５】Tissue Engineering Part A, 14:1225-1235 (2008)
【非特許文献３６】Circ Res. 91:769-775 (2002)
【非特許文献３７】Nature Reviews Molecular Cell Biology 5:816-826 (2004)
【非特許文献３８】American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism Published Vol.299 no.2:E325-E334 (2010)
【非特許文献３９】American Journal of Physiology - Endocrinology and MetabolismPublished Vol. 299 no. 2:E325-E334 (2010)
【非特許文献４０】BBRC 382:259-263 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、II型コラーゲン量をより多く含有する軟骨様シートの作成方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上述の課題を解決すべく鋭意検討した結果、以下の発明を完成させた。
（1）200μg/ml以上かつ8000μg/ml以下のアスコルビン酸を添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法。
（2）0.02μg/ml以上かつ50μg/ml未満のコラーゲンを添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法。
（3）200μg/ml以上かつ8000μg/ml以下のアスコルビン酸と0.02μg/ml以上かつ50μg/ml未満のコラーゲンの両方を添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法。
（4）アスコルビン酸がアスコルビン酸リン酸エステルである前記（1）または（3）に記載の軟骨様シートの作成方法。
（5）コラーゲンがタイプIアテロコラーゲンである前記（2）または（3）に記載の軟骨様シートの作成方法。
（6）水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養する前記（1）から（5）のいずれかに記載の軟骨様シートの作成方法。
（7）使用する培養液に分化誘導因子と血清を含み、使用する間葉系幹細胞がヒト骨髄由来である前記（1）から（5）のいずれかに記載の軟骨様シートの作成方法。
（8）水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器にヒト骨髄由来間葉系幹細胞懸濁液と分化誘導因子と血清を含む培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養する前記（1）から（5）のいずれか記載の軟骨様シートの作成方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、少なくとも、水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器に間葉系幹細胞懸濁液と培養液を入れた後、自然沈降により形成したシート状細胞塊を該当容器内で培養する軟骨様シートにおいて、アスコルビン酸やコラーゲンを培養液に添加することによって、II型コラーゲンの蓄積量を増大させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】アスコルビン酸リン酸エステルを添加した培養液で培養した場合の軟骨様シートの性状。
【図２】I型アテロコラーゲンを添加した培養液で培養した場合の軟骨様シートの性状。
【図３】アスコルビン酸リン酸エステルおよびI型アテロコラーゲンを添加した培養液で培養した場合の軟骨様シートの性状。無添加（−）、I型アテロコラーゲン（COL）、アスコルビン酸リン酸エステル（VCP）、これらの両方（C+V）。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は少なくとも、200μg/ml以上かつ8000μg/ml以下のアスコルビン酸や0.02 μg/ml以上かつ50μg/ml未満のコラーゲンを添加した培養液を用いて間葉系幹細胞を培養することを特徴とする軟骨様シートの作成方法である。
【００２２】
本発明で用いるアスコルビン酸としては、フリーのアスコルビン酸でもアスコルビン酸エステルでもよい。アスコルビン酸エステルとしては、アスコルビン酸のエステル化合物であればどのようなものであってもよく、アスコルビン酸２リン酸（アスコルビン酸リン酸エステル）、アスコルビン酸６パルミチン酸、アスコルビン酸２硫酸などが挙げられる。
【００２３】
本発明で用いるコラーゲンとしては、ヒト組織由来でもウシ等の動物組織由来でも良い。コラーゲンのタイプとしては、例としてタイプI、タイプIIなどを挙げることができる。テロペプチドを除去したアテロコラーゲンでも良い。
【００２４】
本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の多孔性膜の材質としては、ポリエチレンテレフタレートやポリカーボネートを例として挙げることができる。
【００２５】
本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の多孔性膜の細孔径としては、0.1μm〜12μmを例として挙げることができるが、0.4μm〜3μmが望ましい。
【００２６】
本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の多孔性膜の細孔密度は細孔径にもよるが、2×105個/cm2〜1×108個/cm2を例として挙げることができる。
【００２７】
本発明で用いる本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の底面の形状としては、円形、楕円形、三角形、正方形、長方形、正五角形、ドーナツ型などを例として挙げることができる。
【００２８】
本発明で用いる本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の底面の面積としては、0.15〜1000 cm2のいずれでもよいが、0.3〜10 cm2が好ましい。
【００２９】
本発明で用いる本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の深さとしては、3〜100 mmのいずれでもよいが、5〜50 mmが好ましい。
【００３０】
本発明で用いる本発明で用いる「水平方向に平坦な多孔性膜の底面を含む容器」の材質は、その成分が培養液に溶出し細胞に悪影響を与えるものでなくてはならないが、例としてポリスチレン、ポリプロピレン、ステンレス、ガラスなどを挙げることができる。
【００３１】
本発明で用いる間葉系幹細胞の由来としては、ヒト骨髄由来、ヒト羊膜由来、ヒト関節滑膜由来、ヒト臍帯血由来を例として挙げることができる。
【００３２】
本発明で用いる間葉系幹細胞懸濁液に含まれる間葉系幹細胞の数としては、多孔性膜の底面積1 cm2あたり1×105個〜1×108個を例として挙げることができるが0.2×107個〜1×107個が望ましい。
【００３３】
本発明で用いる培養液用の培地としては、細胞の増殖及び維持を支援すべく使用される成長因子及び栄養素を含む標準培地や標準培地に種々の添加物を加えた培地を例として挙げることができる。用いる標準培地は通常動物細胞の培養で用いられるダルベッコＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、イスコフ培地、ＲＰＭＩ培地などを用いうる。細胞の増殖及び維持に有効であることが知られている因子、たとえば血清アルブミン、トランスフェリン、脂質及び脂肪酸源、コレステロール、ピルビン酸塩、増殖因子、並びに細胞外マトリックス細胞（例えばコラーゲン、フィブロネクチン及びラミニン）等を添加してもよい。
【００３４】
本発明で用いる培養液用の分化誘導因子としては、ＴＧＦベータ、ＩＧＦ、デキサメタゾンなどを例として挙げることができる。
【００３５】
本発明で用いる培養液用の血清としては、ウシ胎児血清、ヒト血清などを例として挙げることができる。ヒト血清としては、間葉系幹細胞の由来するドナーの血清、プール血清などを例として挙げることができる。ここで分化誘導因子や血清は培養開始時に加えてもよいし、培養開始後の培養中に加えてもよい。
【００３６】
以下に実施形態例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
アスコルビン酸リン酸エステル（25、50、250、2500、25,000 μg/ml）を添加したウシ胎児血清（5％）含有軟骨分化培地（TGFβ3、IGF-1、デキサメタゾン含有）を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（MSC、6.2×105 cells）を、24穴マルチウェル中にセットした隔膜培養器（セルカルチャーインサート、CCI）に入れ、37℃、5％ CO2雰囲気下で2日ごとに培地を全量交換し、3週間静置培養した。培養終了後、シート湿重量、アグリカン蓄積密度(DMMB法)、II型コラーゲン（COL(II)）蓄積密度(ELISA法)を各々定量した。その結果を、図１に示した。なお、アスコルビン酸リン酸エステル25,000 μg/ml添加条件ではシートが形成されず、培地中の細胞は死滅していたため、アグリカン、COL(II)は定量できなかった。シート湿重量は250 μg/mlの添加条件でのみ増加が見られた。アグリカン（sGAG）の蓄積量および単位湿重量当たりの蓄積密度はいずれの条件でも変化しなかった。一方、COL(II)の蓄積量および単位湿重量当たりの蓄積密度は、アスコルビン酸リン酸エステルの添加濃度の増大に応じて増加し、通常の添加濃度である50 μg/mlに比べて250および2500 μg/mlの高濃度添加では、それぞれ、2.3〜2.4倍、2〜2.6倍と顕著に高くなった。
【実施例２】
【００３８】
I型アテロコラーゲン（0、0.05、0.5、5、50μg/ml）を添加したウシ胎児血清（5％）含有軟骨分化培地（TGFβ3、IGF-1、デキサメタゾン含有）を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（MSC、6.2×105 cells）を、24穴マルチウェル中にセットした隔膜培養器（セルカルチャーインサート、CCI）に入れ、37℃、5％ CO2雰囲気下で2日ごとに培地を全量交換し、3週間静置培養した。培養終了後、シート湿重量、アグリカン蓄積密度(DMMB法)、II型コラーゲン（COL(II)）蓄積密度(ELISA法)を各々定量した。その結果を、図２に示した。シート湿重量はいずれの条件でも変化しなかった。アグリカン（sGAG）の蓄積量および単位湿重量当たりの蓄積密度は添加濃度に応じて増加し、0.5 μg/mlの添加では0 μg/mlに比べて約1.2倍に増加した。一方、COL(II)の蓄積量および単位湿重量当たりの蓄積密度は、I型アテロコラーゲンの添加濃度の増大に応じて増加し、通常の添加濃度である0 μg/mlに比べて5 μg/mlの添加では、それぞれ、約3.4倍、約3.6倍と顕著に高くなった。
【実施例３】
【００３９】
I型アテロコラーゲン（COL; 5 μg/ml）とアスコルビン酸リン酸エステル（VCP; 250 μg/ml）の一方、または両方（C+V）を添加したウシ胎児血清（5％）含有軟骨分化培地（TGFβ3、IGF-1、デキサメタゾン含有）を用いてヒト骨髄由来間葉系幹細胞（MSC、6.2×105 cells）を、24穴マルチウェル中にセットした隔膜培養器（セルカルチャーインサート、CCI）に入れ、37℃、5％ CO2雰囲気下で2日ごとに培地を全量交換し、3週間静置培養した。培養終了後、シート湿重量、アグリカン蓄積密度(DMMB法)、II型コラーゲン（COL(ii)）蓄積密度(ELISA法)を各々定量した。その結果を、図３に示した
。シート湿重量はアスコルビン酸リン酸エステルの添加により約1.2倍に、I型アテロコラーゲンとアスコルビン酸リン酸エステルの両方を添加した場合には約1.3倍に増加した。アグリカン（sGAG）の蓄積量および単位湿重量当たりの蓄積密度はI型アテロコラーゲンの添加によりそれぞれ約1.2倍、約1.5倍に増加した。アスコルビン酸リン酸エステルを添加した場合には、蓄積量は約1.3倍に増加したが、蓄積密度はほぼ変化しなかった。一方、COL(II)の蓄積量および単位湿重量当たりの蓄積密度は、I型アテロコラーゲンの添加によりそれぞれ約1.6倍、約2倍となり、アスコルビン酸リン酸エステルの添加でもそれぞれ約4.8倍、約4倍となった。さらに、I型アテロコラーゲンとアスコルビン酸リン酸エステルの両方を添加した場合には、それぞれ、約7.6倍、約6倍となり、どちらか一方だけの添加に比べて顕著に高くなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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