(57)【要約】【課題】同時検出するＤＮＡの塩基配列パターンが増えた場合でも、蛍光を検出する光学系が複雑になることなく、小型、安価な構成のＤＮＡ検出装置を提供する。【解決手段】ＤＮＡ検出装置は、センサチップの表面上の流路を流れるサンプル液滴から出力される蛍光を検出して、検出対象となるＤＮＡを検出するＤＮＡ検出装置であって、流路を流れるサンプル液滴から出力される蛍光を検出する蛍光検出部と、検出した前記蛍光の連続時間に基づいて、サンプル液滴それぞれに含まれる蛍光プローブ溶液の種類を判定し、蛍光の光強度のしきい値に対する大小関係に基づいて、サンプル液滴中に、検出対象となる前記ＤＮＡが含まれているか否かを判定するＤＮＡ検出手段ＤＮＡ検出手段と、を備える。【選択図】図１
2016165276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ検出方法であって、
（ａ）ＤＮＡ検出装置にセンサチップを設置し、
前記ＤＮＡ検出装置は、
ＰＣＲ処理部と、蛍光検出部と、ＤＮＡ検出部とを備え、
前記センサチップは、
第１の流路と、第２の流路と、第３の流路と、第４の流路と、第５の流路と、第６の流路と、第７の流路と、第８の流路と、第９の流路とを備え、
前記第１の流路の一端および前記第２の流路の一端が、前記第３の流路の一端と接続され、
前記第３の流路の他端と前記第６の流路の一端とが接続され、
前記第４の流路および前記第５の流路は、前記第３の流路の一端と他端との間に接続され、
前記第６の流路の他端および前記第７の流路の一端が、前記第８の流路の一端と接続され、
前記第８の流路の他端は、前記ＰＣＲ処理部と接続され、
前記ＰＣＲ処理部は、前記第９の流路と接続され、
（ｂ）前記第１の流路および第２の流路に、それぞれ、ＤＮＡ水溶液およびＤＮＡ合成酵素水溶液を導入することにより、前記第３の流路に、前記ＤＮＡ水溶液および前記ＤＮＡ合成酵素水溶液の第１の混合水溶液を通過させ、前記ＤＮＡ水溶液は、対象の１本鎖ＤＮＡを含み、
（ｃ）前記第３の流路を前記第１の混合水溶液が流れているときに、前記第４の流路に、第１の流量で、第１の蛍光プローブ剤と第１のプライマとが混合された第１の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記６の流路に、前記第１の混合水溶液および前記第１の蛍光プローブ水溶液の第２の混合水溶液を通過させ、前記第１の蛍光プローブ剤は、第１の一本鎖ＤＮＡと相補的に結合し、
（ｄ）前記第７の流路に、第２の流量でオイル材料を導入することにより、第８の流路に、複数の第２の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記前記複数の第２の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記８の流路に沿って、交互に並んでおり、
（ｅ）前記第３の流路を前記第１の混合水溶液が流れているときに、前記第５の流路に、第３の流量で、第２の蛍光プローブ剤と第２のプライマとが混合された第２の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記第６の流路に、前記第１の混合水溶液および前記第２の蛍光プローブ水溶液の第３の混合水溶液を流し、前記第２の蛍光プローブ剤は、前記第１の蛍光プローブ剤と異なり、かつ第２の一本鎖ＤＮＡと相補的に結合し、
（ｆ）前記第７の流路に、第４の流量で前記オイル材料を導入することにより、前記８の流路に、複数の第３の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記複数の第３の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記８の流路に沿って、交互に並んでおり、
（ｇ）前記ＰＣＲ処理部により、前記複数の第２の混合水溶液部および前記複数の第３の混合水溶液部をＰＣＲ処理し、前記第９の流路に通過させ、
（ｈ）前記蛍光検出部により、前記第９の流路を流れる前記複数の第２の混合水溶液部および前記複数の第３の混合水溶液部のそれぞれから出力される蛍光の強度を検出し、
（ｉ）前記ＤＮＡ検出部により、前記透過光の強度と、前記第１の流量と、前記第２の流量と、第３の流量と、第４の流量とに基づいて、前記対象の一本鎖ＤＮＡは、前記第１の一本鎖ＤＮＡ及び前記第２の一本鎖ＤＮＡから選択される少なくとも１つを含むか否かを検出する、
ＤＮＡ検出方法。
【請求項２】
前記（ｉ）において、前記ＤＮＡ検出部は、
前記蛍光検出部で第１の閾値以上の光の強度を検出し続けた連続時間を取得し、
前記連続時間の長さに、前記第１の流量及び第２の流量に対応する時間、または前記第３の流量および第４の流量に対応する時間があるか否かにより、前記ＤＮＡ溶液に含まれる前記対象の一本鎖ＤＮＡは、前記第１の一本鎖ＤＮＡ又は前記第２の一本鎖ＤＮＡを含むか否かを検出する、
請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項３】
前記ＤＮＡ検出部は、
前記連続時間が前記第１の流量及び第２の流量に対応する時間であった場合、前記対象の一本鎖ＤＮＡに、前記第１のＤＮＡが含まれていると検出し、
前記連続時間が前記第３の流量及び第４の流量に対応する時間であった場合、前記対象の一本鎖ＤＮＡに、前記第２のＤＮＡが含まれていると検出する、
請求項２に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項４】
前記第１の流量及び第２の流量に対応する時間は、前記第９の流路における前記複数の第２の混合水溶液部の流量に対応し、
前記第３の流量及び第４の流量に対応する時間は、前記第９の流路における前記複数の第３の混合水溶液部の流量に対応し、
請求項３に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項５】
前記第２の流量と前記第４の流量とが同じであり、かつ、前記第１の流量が、前記第３の流量と異なることにより、前記第２の混合水溶液と前記第３の混合水溶液との流量比が、前記第１の蛍光プローブ水溶液と前記第２の蛍光プローブ水溶液との流量比に対応して異なる流量比である、
請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項６】
前記第４の流路の断面積と前記第５の流路の断面積とが異なることにより、前記第１の流量が前記第３の流量と異なる、請求項５に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項７】
前記第２の流量と前記第４の流量とが異なる、請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項８】
前記第１の蛍光プローブ水溶液および前記第２の蛍光プローブ水溶液に含まれる蛍光色素は、同一波長の蛍光を発色する蛍光色素である、請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項９】
前記複数の第２の混合水溶液部の容量の平均値と、前記複数の第３の混合水溶液部の容量の平均値とが、２５％以上異なる、請求項１に記載のＤＮＡ検出方法。
【請求項１０】
センサチップの表面上の流路を流れる複数のＤＮＡ混合水溶液部から出力される蛍光に基づいて、ＤＮＡを検出するＤＮＡ検出装置であって、
前記ＤＮＡ混合水溶液は、ＤＮＡ混合溶液と第１の蛍光プローブ水溶液又は第２の蛍光プローブ水溶液とが混合された水溶液であり、
前記ＤＮＡ混合溶液は、対象の１本鎖ＤＮＡを含むＤＮＡ溶液とＤＮＡ合成酵素とが混合された水溶液であり、
前記第１の蛍光プローブ水溶液は、第１の１本鎖ＤＮＡと相補的に結合する蛍光プローブ剤とプライマとが混合された水溶液であり、
前記第２の蛍光プローブ水溶液は、第２の１本鎖ＤＮＡと相補的に結合する蛍光プローブ剤とプライマとが混合された水溶液であり、
前記流路を流れる複数のＤＮＡ混合水溶液部から出力される蛍光の強度を検出する蛍光検出部と、
前記蛍光の連続時間に基づいて、複数のＤＮＡ混合水溶液部それぞれに含まれる蛍光プローブ水溶液の種類を判定し、前記蛍光のしきい値に対する大小関係に基づいて、前記対象の一本鎖ＤＮＡは、前記第１の一本鎖ＤＮＡ及び前記第２の一本鎖ＤＮＡから選択される少なくとも１つを含むか否かを検出するＤＮＡ検出部と、
を備える、ＤＮＡ検出装置。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ検出部は、第１の閾値以上の強度を有する蛍光を検出し続けた連続時間を取得し、
前記連続時間の長さに基づいて、前記対象の一本鎖ＤＮＡは、前記第１の一本鎖ＤＮＡ及び前記第２の一本鎖ＤＮＡから選択される少なくとも１つを含むか否かを検出する、
請求項１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【請求項１２】
前記蛍光プローブ水溶液の種類ごとに生成される前記複数のＤＮＡ混合水溶液部による前記蛍光の連続時間の平均値を、短い方からＴ（ｎ）（秒）（ｎ＝１、２、・・・）とすると、
Ｔ（ｎ）  ×  １．２５  ≦  Ｔ（ｎ＋１）
の関係が成り立つ、請求項１０に記載のＤＮＡ検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、遺伝子（ＤＮＡ）を検出する方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）と呼ばれる技術を用いて、遺伝子中の所望のＤＮＡ／ＲＮＡ断片を、検出に必要な量となるまで増幅させ、検出する方法がある。また、その発展型としてｑＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）と呼ばれる定量解析技術が用いられることが多い。これら遺伝子の定量解析技術がマイクロ流路チップ内の小型リアクタなどに導入される。
【０００３】
特許文献１には、遺伝子を定量解析するｑＰＣＲについての基本的な実現方法が開示されている。この特許文献１には、一本鎖のＤＮＡからなるサンプルに対して、ターゲットＤＮＡの配列鎖の第一の領域に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチド（長さの短いＤＮＡ／ＲＮＡの配列）と、同じターゲットＤＮＡの配列鎖の第二の領域に相補的な配列を含む標識オリゴヌクレオチドを接触させる。ハイブリダイゼーションを生じさせる条件で二本鎖複合体の混合物を形成して、５‘→３’ヌクレアーゼ活性によって、アニールした標識オリゴヌクレオチドを切断して標識断片を遊離させる。その遊離した標識断片を検出する方法が開示されている。標識オリゴヌクレオチドの標識として、蛍光色素と消光剤を用いれば、標識断片が遊離した際に初めて蛍光が発光することになり、上記プロセスを繰り返すことで、蛍光強度が強くなっていく。この蛍光強度を光検出器によって検出することで、ターゲットＤＮＡの所望の配列鎖がどの程度含まれていたかを解析する。一検体あたり複数部位のＤＮＡ／ＲＮＡを検出する場合は、それぞれの配列鎖に相補的な標識オリゴヌクレオチドを準備し、標識となる蛍光色素の材料、波長をそれぞれの標識オリゴヌクレオチド毎に異ならしめることで、光検出器において蛍光波長の差で、分離解析することが可能となる。
【０００４】
また、特許文献２には、遺伝子を定量解析する手法についての実現方法の一例が開示されている。特に乳化技術を使ったハイスループットアッセイの改善技術についての開示がなされている。乳化技術を使って、生化学反応用の独立した反応チャンバとして機能する液滴を作り出し、それらを用いて個々のサブコンポーネント（細胞や核酸、タンパク質など）を処理し、検査する手法である。
【０００５】
ＤＮＡ／ＲＮＡなどからなる水滴を油中に懸濁させて、油の中に水が入っている状態の乳剤を作る。この乳剤を界面活性剤によって安定化させて、加熱、冷却や輸送中の、液滴の結合を減らすか、または無くすことができ、それによって、温度サイクリングを実施することができる。このため、ＰＣＲを利用した液滴中の核酸標的分子の単一コピー増幅は、乳剤を使用して実施している。これら液滴の内、ある標的に対して陽性である液滴をポアソン統計に基づいて解析して、試料中の標的の濃度を推定することができる。液滴によるアッセイでは、液滴中の標識として１種または複数種の蛍光体を用いて、増幅などの反応が起こったかどうかがわかる。液滴を生成し、反応させ、ついで各液滴からの放出光を測定することで液滴中に標的が存在するかどうかを判断しうる。区別可能な異なる蛍光体がそれぞれ異なる標的毎に対応させれば、複数の異なる標的が存在するかどうかを液滴毎に測定できる。このように複数の異なる標的を区別する場合、複数種の蛍光体、つまり波長の異なる蛍光を発する色素材料を用いて、その蛍光波長によって区別することが多い。特許文献２においては、２種類の蛍光色素を用いて、それぞれを区別して検出する方法が開示されている。第１の色素、第２の色素の各々に対応する検出構成（光源と検出器からなる）を設けて、液滴が流路の検出領域を通過するときに第１の色素に対応する検出構成と、第２の色素に対応する検出構成で交互に液滴を検出することによって実現している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第２８２５９７６号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２４１６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら従来の構成では、ＤＮＡ／ＲＮＡの塩基配列のうち、目標とする複数の塩基配列パターンを同時検出する場合、それぞれの塩基配列と結合する蛍光プローブの蛍光波長を変えることで、分離検出することが必要となる。この場合、蛍光を検出する検出器は、それぞれの蛍光色素に対応する光源と、それぞれの蛍光色素の蛍光波長に対応する検出器とが必要となる。そのため、同時検出するＤＮＡの塩基配列パターンが増えるにしたがって、蛍光を検出する光学系が複雑となる課題を有している。
【０００８】
本開示は、同時検出するＤＮＡの塩基配列パターンが増えた場合でも、蛍光を検出する光学系が複雑になることなく、小型、安価な構成のセンサチップを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本開示に係るＤＮＡ検出方法は、
（ａ）ＤＮＡ検出装置にセンサチップを設置し、
前記ＤＮＡ検出装置は、
ＰＣＲ処理部と、蛍光検出部と、ＤＮＡ検出部とを備え、
前記センサチップは、
第１の流路と、第２の流路と、第３の流路と、第４の流路と、第５の流路と、第６の流路と、第７の流路と、第８の流路と、第９の流路とを備え、
前記第１の流路の一端および前記第２の流路の一端が、前記第３の流路の一端と接続され、
前記第３の流路の他端と前記第６の流路の一端とが接続され、
前記第４の流路および前記第５の流路は、前記第３の流路の一端と他端との間に接続され、
前記第６の流路の他端および前記第７の流路の一端が、前記第８の流路の一端と接続され、
前記第８の流路の他端は、前記ＰＣＲ処理部と接続され、
前記ＰＣＲ処理部は、前記第９の流路と接続され、
（ｂ）前記第１の流路および第２の流路に、それぞれ、ＤＮＡ水溶液およびＤＮＡ合成酵素水溶液を導入することにより、前記第３の流路に、前記ＤＮＡ水溶液および前記ＤＮＡ合成酵素水溶液の第１の混合水溶液を通過させ、前記ＤＮＡ水溶液は、対象の１本鎖ＤＮＡを含み、
（ｃ）前記第３の流路を前記第１の混合水溶液が流れているときに、前記第４の流路に、第１の流量で、第１の蛍光プローブ剤と第１のプライマとが混合された第１の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記６の流路に、前記第１の混合水溶液および前記第１の蛍光プローブ水溶液の第２の混合水溶液を通過させ、前記第１の蛍光プローブ剤は、第１の一本鎖ＤＮＡと相補的に結合し、
（ｄ）前記第７の流路に、第２の流量でオイル材料を導入することにより、第８の流路に、複数の第２の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記前記複数の第２の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記８の流路に沿って、交互に並んでおり、
（ｅ）前記第３の流路を前記第１の混合水溶液が流れているときに、前記第５の流路に、第３の流量で、第２の蛍光プローブ剤と第２のプライマとが混合された第２の蛍光プローブ水溶液を導入することにより、前記第６の流路に、前記第１の混合水溶液および前記第２の蛍光プローブ水溶液の第３の混合水溶液を流し、前記第２の蛍光プローブ剤は、前記第１の蛍光プローブ剤と異なり、かつ第２の一本鎖ＤＮＡと相補的に結合し、
（ｆ）前記第７の流路に、第４の流量で前記オイル材料を導入することにより、前記８の流路に、複数の第３の混合水溶液部および複数のオイル材料部を通過させ、前記複数の第３の混合水溶液部と前記複数のオイル材料部とは、前記８の流路に沿って、交互に並んでおり、
（ｇ）前記ＰＣＲ処理部により、前記複数の第２の混合水溶液部および前記複数の第３の混合水溶液部をＰＣＲ処理し、前記第９の流路に通過させ、
（ｈ）前記蛍光検出部により、前記第９の流路を流れる前記複数の第２の混合水溶液部および前記複数の第３の混合水溶液部のそれぞれから出力される蛍光の強度を検出し、
（ｉ）前記ＤＮＡ検出部により、前記透過光の強度と、前記第１の流量と、前記第２の流量と、第３の流量と、第４の流量とに基づいて、前記対象の一本鎖ＤＮＡは、前記第１の一本鎖ＤＮＡ及び前記第２の一本鎖ＤＮＡから選択される少なくとも１つを含むか否かを検出する。
【発明の効果】
【００１０】
本開示に係るセンサチップを用いたＤＮＡ検出方法によれば、同時検出するＤＮＡの塩基配列パターンが増えた場合でも、蛍光プローブに用いる蛍光色素を同一波長のものを使用することが可能となり、蛍光を検出する光学系が複雑になることなく、小型、安価な構成のセンサチップを用いたＤＮＡ検出方法を実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】光導波手段の流路を流れてくる液滴の様子を示す概略図であり、および光導波手段の流路を流れてくる液滴について、ＰＭＴで検出される光信号の様子を示すグラフである。
【図２】実施の形態１に係るセンサチップ及びＤＮＡ検出装置の構成を示すブロック図である。
【図３】混合溶液生成手段の構成の一例を示す概略図である。
【図４】サンプル液滴を生成する一本の流路の構成の一例を示す概略図である。
【図５】ＤＮＡ増幅手段の構成の一例を示す概略図である。
【図６】センサチップの光導波路手段の箇所とＤＮＡ検出装置２１０とを含む検出光学系の構成の一例を示す概略図である。
【図７】実施の形態１におけるオイル流量を変化させた場合の混合溶液とオイル材料の流量比と液滴容量の関係を示すグラフである。
【図８】実施の形態１におけるオイル材料流量／混合溶液流量の流量比を変えた場合に生成するサンプル液滴の容量の分布図である。
【図９】サンプル液滴を生成する一本の流路の構成の変形例を示す概略図である。
【図１０Ａ】ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲの各過程を示す概略図である。
【図１０Ｂ】ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲの各過程を示す概略図である。
【図１０Ｃ】ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲの各過程を示す概略図である。
【図１１】実施の形態１における混合溶液の流量を変化させた場合の混合溶液とオイル材料の流量比と液滴容量の関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
初めに、遺伝子の検査方法に関して説明する。遺伝子とは生物の遺伝情報を担う主要因子であり、あらゆる生物においてＤＮＡ／ＲＮＡ（核酸）を媒体として、その塩基配列に遺伝情報がコードされている。近年、遺伝子を診断する技術の向上により、遺伝子の多様性解析や発現解析の進展が目覚しい。特に、医療分野においては遺伝子情報と疾患の関係が注目されている。例えば、疾患に関連した個々の遺伝子情報（特定部位のＤＮＡ／ＲＮＡの塩基配列）を解析することで、患者個人毎に適切な治療や投薬を行うこと（テーラーメード医療）が可能になってきた。テーラーメード医療では、その場診断が最も望ましく、ＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）性が高く、迅速、簡便な手法が求められる。そのため、血液など、採取した検体から解析対象の遺伝子のＤＮＡ／ＲＮＡを抽出、増幅し、その塩基配列の情報あるいはその量の検出を迅速、簡便に行えるデバイスの実現が強く求められている。
【００１３】
これらの要望に応える手段の一つとして、近年、μＴＡＳ（μ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）またはＬｏＣ（Ｌａｂ  ｏｎ  Ｃｈｉｐ）と呼ばれるデバイスが注目されている。μＴＡＳまたはＬｏＣは、基板内にマイクロメートルオーダーの微細構造で構成されたマイクロ流路やポートを設け、その構造内で物質の混合、抽出、精製、化学反応および分析など各種の操作を行うデバイスで、一部は実用化もされている。このようなデバイスは各種の操作が微細構造内で行われるため、所謂専門の研究所、解析機関等で用いられる常用サイズの同種の装置に比べ、サンプルや試薬の使用量が著しく少なく、分析時間も短く、感度も高いなどの特長を有する。また小型のデバイス構成の実現も可能で、専門の研究所だけではなく、現場に携帯し、その場での解析も実現可能である。このような目的のために作製された、基板内にマイクロ流路およびポート等の微細構造を有し、各種機能が実装された構造物は総称してマイクロ流路チップ（センサチップ）またはマイクロ流体デバイスとも呼ばれる。
【００１４】
マイクロ流路チップを用いて短時間で検体中の遺伝子を解析するためには、チップ内に遺伝子のＤＮＡ／ＲＮＡの抽出、増幅、検出の機能が組み込まれることが望まれる。特に、より多くの情報を短時間で得るために、同一チップ内で一度に複数個の検体を検出することや、一検体あたり複数部位のＤＮＡ／ＲＮＡの塩基配列を増幅、検出すること（マルチプレックス増幅および検出）が求められる。また、用途によっては、所望の遺伝子の量も解析（定量解析）することが求められる。
【００１５】
以下、本開示の実施の形態に係るセンサチップ及びＤＮＡ検出装置について、図面を参照しながら説明する。
【００１６】
（実施の形態１）
実施の形態１に係るセンサチップ２０１及びＤＮＡ検出装置２１０について、図を参照しながら説明する。図２は、実施の形態１に係るセンサチップ２０１及びＤＮＡ検出装置２１０の構成を示すブロック図である。
【００１７】
＜センサチップ＞
センサチップ２０１について説明する。センサチップ２０１は、凹部が形成された表面を有する基板である。基板の材料の例はシリコンなどである。凹部が流路（溝）に相当する。例えば、流路は、数百マイクロメートルオーダーの幅および深さを有する。この流路によって、混合溶液生成手段２０２、サンプル液滴を生成する一本の流路２０３、ＤＮＡ増幅手段２０４、および光導波手段２０５がつながれている。以下に、センサチップ２０１を構成する各構成要素について説明する。
【００１８】
＜混合溶液生成手段＞
図３は、混合溶液生成手段２０２の構成の一例を示す概略図である。図３に示す混合溶液生成手段２０２は、複数の流路で構成される。混合溶液生成手段２０２の流路と流路との結合部には、バルブ３０６、３０７が設けられている。
図３に示す混合溶液生成手段２０２は、第１の流路３１１と、第２の流路３１２と、第３の流路３１３と、第４の流路３１４と、第５の流路３１５と、第６の流路３１６とを有する。第１の流路３１１は、ＤＮＡ合成酵素３０１が流れる。第２の流路３１２は、ＤＮＡが含まれたサンプル３０２が流れる。第３の流路３１３は、ＤＮＡ合成酵素３０１とＤＮＡが含まれたサンプル３０２とが混合されたＤＮＡ混合液が流れる。第４の流路３１４は、第１の蛍光プローブ３０３および第１のプライマ３０３が流れる。第５の流路３１５は、第２の蛍光プローブ３０４および第２のプライマ３０４が流れる。第６の流路３１６は、ＤＮＡ混合液と第１の蛍光プローブ３０３および第１のプライマ３０３とが混合された混合液、または、ＤＮＡ混合液と第２の蛍光プローブ３０４および第２のプライマ３０４とが混合された混合液が流れる。  第１の流路３１１、第２の流路３１２、第４の流路３１４、および第５の流路３１５は、それぞれ、ＤＮＡ合成酵素３０１、ＤＮＡが含まれたサンプル３０２、第１の蛍光プローブ３０３および第１のプライマ３０３、第２の蛍光プローブ３０４および第２のプライマ３０４を導入するためのポンプを有していても良い。
図３に示すように２種類の材料を含む場合は、それぞれの液が混合しないように順次流路に供給される。図３において、第１の蛍光プローブ第１の蛍光プローブ３０３および第１のプライマ第１のプライマ３０３第１のプライマ３０３が流路に供給されているときは、第２の蛍光プローブ第２の蛍光プローブ第２の蛍光プローブ３０４および第２のプライマ第２のプライマが供給される流路のバルブ３０７を閉じることにより、第２の蛍光プローブ第２の蛍光プローブ３０４および第２のプライマ第２のプライマ３０４が混合させない。
また、第２の蛍光プローブ第２の蛍光プローブ３０４第２の蛍光プローブ３０４および第２のプライマ第２のプライマ３０４を流路に供給する場合は、バルブ３０６を閉じ、バルブ３０７を開くことで、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマが流路内に供給されない。このようにして、複数の種類の蛍光プローブとプライマとが用いられる場合は、その組み合わせの種類毎に流路が形成され、各流路と第３の流路とがバルブを介して接続される。各流路と第３の流路との間の各バルブのうち、いずれか１つのバルブのみが開けられるように制御することで、異なる種類の複数の種類の蛍光プローブとプライマとが混ざらないようにする。なお、図３のような構成を示したが、各液体を蛍光プローブやプライマの組み合わせの種類毎に別に混合させることができれば、その他の流路構成でも本開示の効果には何ら影響は与えない。例えば、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマ第１のプライマ３０３を供給する流路と、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマ第２のプライマ３０４を供給する流路とをＤＮＡが含まれたサンプル３０２を流す流路について互いに対向して設けてもよい。
【００１９】
＜サンプル液滴を生成する一本の流路＞
図４は、サンプル液滴を生成する一本の流路の構成の一例を示す概略図である。一例として図４に示すように、混合溶液生成手段２０２によって生成された混合溶液４０３を流すための第６の流路４０１と、オイル材料４０４が流れるための第７の流路４０２がＴ型に結合して一本の第８の流路に合流する。混合溶液４０３とオイル材料４０４とはＴ型部分で合流し、それぞれが混じりあうことがないために、オイル材料４０４で小さくちぎられた混合溶液の小さな液滴４０５が一本の流路（第８の流路）内に形成される。混合溶液の単位時間当たりの流量と、オイル材料の単位時間当たりの流量が安定していれば、ほぼ同じ大きさの液滴が連続して形成される。第７の流路４０２には、オイル材料を導入するポンプが配置され得る。
例えば、第１の流路３１１、第２の流路３１２、第４の流路３１４、第５の流路３１５、および第７の流路４０２に位置されるポンプにより、各流路に単位時間当たりの所定流量が導入されることにより、所定の大きさの液滴が形成される。
ここでは、図４のようにＴ型に結合した流路を説明したが、形はこれに限らず、混合溶液の供給用流路の両側からオイル材料が合流する構成などは別の構成であってもよい。つまり、混合溶液とオイル材料とがぶつかることで混合溶液の液滴が形成されるものであれば、別の流路構成であっても、効果には影響しない。
【００２０】
＜ＤＮＡ増幅手段＞
図５は、ＤＮＡ増幅手段２０４の構成の一例を示す概略図である。ＤＮＡ増幅手段２０４は、液滴が収められるチャンバ５０１を含む。チャンバ５０１の入口５０３はバルブ５０４で開閉され、チャンバ５０１の出口５０６はバルブ５０５で開閉される。液滴を導入される時は、入口５０３、および出口５０６とも開けられており、チャンバ５０１の内部が液滴で満たされた後、バルブ５０４及びバルブ５０５により入口５０３及び出口５０６を閉じる。チャンバ５０１内では、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）というＤＮＡ増幅処理が行われる。この処理をＰＣＲ処理とも表記する。ＤＮＡ増幅手段２０４の一例は、チャンバ及びヒーターである。チャンバ５０１は第８の流路および第９の流路の間に位置する。ＤＮＡ増幅手段２０４はＰＣＲ処理部とも表記される。
【００２１】
図１０Ａ〜Ｃは、ＴａｑＭａｎプローブという蛍光プローブを用いたＰＣＲの各過程を示す概略図である。
図１０Ａに示すように、ＤＮＡは、相補的に並んだ塩基配列の二本鎖の構造（１００１、１００２が結合した状態）を持つ。このＤＮＡは、ある温度まで加熱すると、この二本鎖が外れ、一本鎖のＤＮＡ（１００１、１００２）となる。この一本鎖のＤＮＡを含むサンプルに対して、例えば一本鎖ＤＮＡ１００１がターゲットとなるＤＮＡであった場合、ターゲットＤＮＡ１００１の配列鎖の第一の領域に相補的な配列をもつプライマ（１００３）と、同じターゲットＤＮＡの配列鎖の第二の領域に相補的な配列を含む蛍光プローブ（蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチド、１００５）を接触させて、ハイブリダイゼーションを生じさせる条件にすると、プライマ１００３、蛍光プローブ１００５がターゲットＤＮＡ１００１と二本鎖複合体を形成する。また、ターゲットＤＮＡではない一本鎖ＤＮＡ１００２にも対応するプライマ１００４が結合する。しかしターゲットＤＮＡではないため、蛍光プローブは結合しない。
図１０Ｂに示すように、その後、５‘→３’ヌクレアーゼ活性となる条件にすると、ＤＮＡ合成酵素が働き始め、一本鎖ＤＮＡ１００１および１００２に結合したプライマ１００３および１００４を基準として、ＤＮＡ伸長が始まる。
図１０Ｃに示すように、ＤＮＡ伸長が進むと、ターゲットＤＮＡ１００１に結合した蛍光プローブ１００５が遊離する。蛍光プローブ１００５に含まれる蛍光色素１００６と消光剤１００７は、遊離前は近接した領域に存在するため蛍光色素が光ることは無いが、ＤＮＡ伸長によって蛍光プローブが遊離して、蛍光色素１００６と消光剤１００７が離れるので、蛍光が発色する。
この一連のサイクルによってターゲットＤＮＡ一本に対して、一つの蛍光色素が発光する。また、ＤＮＡ伸長によって一本鎖ＤＮＡはそれぞれ二本鎖ＤＮＡとなるため、ＤＮＡは２倍に増幅される。つまり、この過程を繰り返すことで、繰り返し回数に応じて、ＤＮＡの鎖の数は２の累乗倍だけ増幅され、また同様に蛍光色素の遊離も２の累乗倍生じる。この過程を繰り返すことで蛍光強度が強くなっていく。
【００２２】
プライマや蛍光プローブの種類によって条件は異なるが、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離するには、９０度前後の温度、プライマや蛍光プローブをハイブリダイゼーションさせるには、６０度前後の温度、ヌクレアーゼ活性となりＤＮＡ合成酵素が働き、ＤＮＡ伸長させるには７０度前後の温度にそれぞれ設定されることが多い。つまり、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅処理は、このように加熱と冷却を繰り返す温度サイクルによって行われる。ＤＮＡ増幅手段２０４としては、高速にこの温度サイクルを繰り返す必要があるため、Ｓｉ基板のように熱伝導率の良好な材料を基板として使用する場合では、例えばチャンバ領域を周囲のＳｉ部材から切り離すなどの放熱抑制が必要である。実施の形態１においても、図５のＳｉ基板に形成されたＤＮＡ増幅手段２０４のチャンバ５０１の周囲には、エッチング等の方法で隙間（ギャップ）５０７を設けてある。この構成によって、チャンバを加熱した熱が周囲に拡散することなく、非常に高速な温度サイクルが実現される。
【００２３】
＜ＤＮＡ検出装置＞
次に、ＤＮＡ検出装置２１０について説明する。ＤＮＡ検出装置２１０は、サンプル液滴からの蛍光を検出する蛍光検出手段２０７と、検出した蛍光の連続時間に基づいてサンプル液滴に含まれる蛍光プローブ溶液の種類を判定し、蛍光のしきい値に対する大小関係に基づいて、検出対象となるＤＮＡの有無を判定するＤＮＡ検出手段２０８と、を備える。なお、蛍光検出のための励起用光源２０６をさらに備えてもよい。図６は、センサチップの光導波路手段の箇所とＤＮＡ検出装置２１０とを含む検出光学系の構成の一例を示す概略図である。以下に、センサチップの光導波路手段の箇所とＤＮＡ検出装置２１０とを含む検出光学系の各構成要素について説明する。
【００２４】
＜センサチップの光導波路手段＞
センサチップは、Ｓｉ基板６０１上に数百μｍの長さの溝を形成し、その上からガラス板６０２を陽極接合などの方法で貼りあわせることで構成されている。溝はガラス板６０２を貼りあわせることで、液滴が流れる流路６０３となる。流路６０３内を、ＤＮＡ増幅処理後の液滴６０４が一列になって連続的に、かつ決められた一定の速度で流れてくる。液滴６０４に対して蛍光色素を励起する光を照射し、また、それによって発光する蛍光を蛍光検出手段に取り出す必要があるが、この構成のチップにおいてはガラス面を通して、光の入出力を行う。この構成では、このガラス面から液滴が流れている流路までの光学的な経路が光導波手段に相当する。
【００２５】
＜光源＞
光源は、蛍光色素を効率的に励起するために色素の吸収スペクトルの最大吸収波長付近の波長のレーザ、もしくはＬＥＤなどを用いる。特に光学系としてはできるだけ小型で高出力あることが好ましく、光源としては半導体レーザなどが好ましい。実施の形態１においては、波長４９０ｎｍの半導体レーザ６０５を用いた。半導体レーザ６０５から出射するレーザ光はコリメータレンズ６０６によって平行光となり、ダイクロイックミラー６０７で反射される。
【００２６】
＜蛍光検出手段＞
ダイクロイックミラーは、波長によって反射、透過を選択することが可能なミラーで、実施の形態１では、例えば、カットオフ５０５ｎｍのダイクロイックミラーを用いる。５０５ｎｍより短い波長の光を反射し、波長５０５ｎｍより長い波長の光は透過される。反射したレーザ光は対物レンズ６０８によって流路６０３中の液滴通過位置に集光される。ターゲットＤＮＡが含まれた液滴は、液滴中に大量の蛍光色素が遊離した状態となっているため、このレーザ照射によって蛍光色素が励起され、蛍光を発光する。液滴６０４から発した蛍光のうち一部を対物レンズ６０８を通して蛍光検出器側に取り出す。
対物レンズ６０８は、蛍光を出来るだけ効率よく取り込む必要があるため、開口数（ＮＡ）の大きいレンズが好ましい。実施の形態１では、例えば、ＮＡ０．８５の対物レンズを用いる。対物レンズ６０８と透過してきた蛍光はダイクロイックミラー６０７を透過する。その後、蛍光波長の光を透過する光学フィルタ６０９を通して、蛍光以外の光（例えば励起光の漏れこみ、その他の材料から発する蛍光など）を除去した後、レンズ６１０によって蛍光検出器に集光される。レンズ６１０によって集光するポイントに、ちょうど絞り込んだ光が透過するサイズのピンホール６１１を設置することによって、センサチップに絞り込んだレーザ光のうち、焦点以外の領域から反射してきた迷光成分をカットすることが可能となる。そしてピンホールを透過した蛍光のみが蛍光検出器６１２に入力される。
蛍光検出器６１２は、励起光の１万分の１〜１０万分の１くらいの大きさとなる蛍光を高感度に、そして高速に検出する必要があるため、フォトマルチプライア（ＰＭＴ）やアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、フォトダイオード（ＰＤ）などの高感度検出器が用いられる。特に感度も良く応答速度の速いＰＭＴが好ましい。実施の形態１においては、例えば、電流出力型ＰＭＴを用いる。
【００２７】
＜ＤＮＡ検出手段＞
ＤＮＡ検出手段２０８は、検出した蛍光の連続時間が所定値である場合にサンプル液滴に含まれる蛍光プローブ溶液の種類を判定する。蛍光の連続時間とは、閾値以上の強度を有する蛍光を検出し続けた時間である。
より具体的には、ＤＮＡ検出手段２０８は、透過光と、オイルの流量と、混合溶液の流量とに基づいて、ＤＮＡ混合液に、検出対象のＤＮＡが含まれているか否かを検出する。オイルの流量及び混合溶液の流量は、サンプル液滴が第９の流路を流れる時間に対応する。よって、ＤＮＡ検出手段２０８は、混合溶液の流量と連続時間とが対応付けられた基準を参照して、検出した連続時間に対応する混合溶液の流量を特定する。特定された混合溶液に含まれる蛍光プローブ剤の検出対象のＤＮＡが、サンプル液滴に含まれているか否かを検出する。ＤＮＡ検出手段２０８は、例えば、ＣＰＵ、メモリ、記憶装置、入出力部、表示部、インタフェース等を備えたコンピュータによって実現してもよい。
【００２８】
以上の各コンポーネントを含むセンサチップ及びＤＮＡ検出装置でＤＮＡ検出を行うことができる。実施の形態１では、２種類のターゲットＤＮＡを検査するセンサチップを元に具体的な説明を行う。
２種類のターゲットＤＮＡを検査するということは、ターゲットとなる塩基配列が２箇所あるということである。そのため、それぞれの塩基配列に対して相補的に結合する蛍光プローブを別々に準備する。蛍光プローブは、人工的に所望の塩基配列を構成することが可能である。それぞれの蛍光プローブには、その末端に蛍光色素と消光剤を修飾しておく。実施の形態１においては、２種類のターゲットＤＮＡに対応する２種類の蛍光プローブを人工的に構成するが、修飾する蛍光色素は両者とも同じ蛍光色素を用いた。つまり蛍光プローブの塩基配列はそれぞれ異なるものの修飾されている蛍光色素はすべて同じである。実施の形態１では、蛍光色素として、励起波長４９５ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍのフルオレセインと呼ばれる色素を用いた。ターゲットＤＮＡのうちの一つに対応する蛍光プローブとプライマを第１の蛍光プローブと第１のプライマ、もう一つのターゲットＤＮＡに対応する蛍光プローブとプライマを第２の蛍光プローブと第２のプライマと呼ぶことにする。
【００２９】
図３に示すように、混合溶液生成手段では、希釈したＤＮＡサンプル３０２とＤＮＡ合成酵素３０１を流路中で混合させた後、バルブ３０６を開き、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを流路中で混ぜ合わせる。この間、バルブ３０７は閉めたままにしておき、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマが、ＤＮＡサンプルと混ざらないようにしておく。この状態で、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを含んだ混合溶液３０５は、次のサンプル液滴を生成する一本の流路に送られ、液滴が生成される。この際、各液体を送り出すポンプの流量を一定にして、送り出される混合溶液３０５の流量を一定にしておけば、サンプル液滴を生成する一本の流路で生成される液滴のサイズもほぼ同じ大きさで形成される。この状態で第１の蛍光プローブと第１のプライマを含む液滴を一定の大きさ（一定の容量）で生成した後、バルブ３０６を閉じ、次にバルブ３０７を開くことで、希釈したＤＮＡサンプル、ＤＮＡ合成酵素と、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを流路中で混合させ、第２の蛍光プローブと第２のプライマを含んだ混合溶液３０５を次のサンプル液滴を生成する一本の流路に送り出す。第１の蛍光プローブと第１のプライマを送り出す流量と、第２の蛍光プローブと第２のプライマを送り出す流量を変えておくことによって、この混合溶液生成手段から出力される混合溶液３０５の流量は、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマと、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマとで異なる。第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを送り出す流量と、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを送り出す流量とを異ならしめることは、例えば、それぞれを送り出すためのポンプの圧力を変化させることによって行ってもよいし、あるいは図３に示すように第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを送り出す流路の幅、深さ、断面積と、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを送り出す流路の幅、深さ、断面積を変えて、ポンプの圧力は同じであっても、送り出される流量が異なるようにしてもよい。
【００３０】
図７は、オイル流量を変化させた場合の混合溶液の流量とオイル材料の流量の比に対する液滴サイズの関係を示すグラフである。このグラフは、実験的に、オイル材料の流量を、５０、７５，１００ｎＬ／ｍｉｎのそれぞれの流量に固定し、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマの供給ラインのみを有効にして、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを送液するポンプの流量を段階的に変化させていくことによって取得したものである。横軸は、オイル材料流量／混合溶液流量の流量比を表し、縦軸は、生成された液滴、各々おおよそ１０００個の液滴の平均容量の平均値を表している。オイル材料と混合溶液との流量比が大きくなるにつれ、生成される液滴の容量は小さくなっていく。本結果から、実施の形態１におけるセンサチップでは、オイル流量５０〜１００ｎＬ／ｍｉｎの範囲において、容量０．１〜２．２ｎＬまでの液滴生成を確認した。また、オイル流量、混合溶液流量と、その流量比を変化させることによって、範囲内の任意の容量の液滴が生成できることを確認した。
【００３１】
図８は、オイル材料流量／混合溶液流量の流量比を変えた場合に生成するサンプル液滴の容量の分布図である。図８では、上記と同様の方法で、オイル材料の流量を１００ｎＬ／ｍｉｎに固定し、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマの供給ラインのみを有効にして、混合溶液の流量を７５、１００、１２５ｎＬ／ｍｉｎと変化させた場合の液滴の容量の分布を示した液滴容量と液滴個数との関係を示す分布図である。上記各条件で各々約５０００個の液滴を順次生成した。混合溶液の流量７５ｎＬ／ｍｉｎ（流量比１．３）の条件では、液滴容量平均値０．３ｎＬ、最大容量０．３３ｎＬ、最小０．２６ｎＬ、バラツキ（標準偏差σとして、±３σを計算）は±０．０３ｎＬという結果であった。また、混合溶液の流量１００ｎＬ／ｍｉｎ（流量比１．０）の条件では、液滴容量平均値０．３８ｎＬ、最大容量０．４２ｎＬ、最小容量０．３４ｎＬ、バラツキは±０．０４ｎＬという結果であった。また、混合溶液の流量１２５ｎＬ（流量比０．８）の条件では、液滴容量平均値０．４８ｎＬ、最大容量０．５２ｎＬ、最小容量０．４２ｎＬ、バラツキは±０．０５ｎＬという結果であった。今回の結果では、もっとも小さい液滴群の容量平均値０．３ｎＬと２番目に小さい液滴群の容量平均値０．３８ｎＬの容量比は１．２６、２番目に小さい液滴群の容量平均値０．３８ｎＬと３番目に小さい液滴群の容量平均値０．４８ｎＬの容量比は１．２６であった。このようにオイル材料と混合溶液の流量比を変化させて、各条件での液滴容量の平均値が、小さいものから順に２５％以上ずつ大きく形成されれば、図８に示すようにそれぞれの液滴群の大きさ分布は明確に分離して分布することになり、その液滴群の大きさの違いによって、それぞれの条件毎で液滴群を識別できる。
【００３２】
＜ＤＮＡ検出方法＞
次に、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマ、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを使用して、２種類のターゲットＤＮＡを検出する方法について説明する。
【００３３】
＜混合溶液生成工程＞
混合溶液生成手段は、図３に示すとおり、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを供給する流路と、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを供給する流路が別々に設けられており、それぞれの流路の出口にはバルブが設けられ、それぞれを別々に供給できるようになっている。また、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを供給する流路と、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを供給する流路は、深さは両者とも３０μｍと同じ深さだが、幅は第１の蛍光プローブの流路は１００μｍ、第２の蛍光プローブの流路は１２０μｍと異なった設計としている。各蛍光プローブを送液するためのポンプの圧力は、同じ圧力のポンプを使用しており、混合溶液生成手段の出力における流量は、この蛍光プローブを供給する流路の幅の違いに応じて変化する。また、ここでは流路の幅を変えたが、深さを変えることによっても同じ効果が得られる。流路の断面積を変えられれば、実施の形態１における効果には影響を及ぼさない。
【００３４】
＜サンプル液滴生成工程＞
第一に、図３のバルブ３０６を開き、ＤＮＡ合成酵素３０１とＤＮＡサンプル３０２と第１の蛍光プローブおよび第１のプライマ第１のプライマ３０３を流路中で混合させ、生成した混合溶液３０５を次のサンプル液滴を生成する一本の流路へと送液する。このとき、混合溶液生成手段の出口での流量は、例えば、約１００ｎＬ／ｍｉｎである。この混合溶液３０５は、図４に示すサンプル液滴を生成する一本の流路の入力流路４０１に送液される。図４のオイル材料４０２の供給流路でのオイル材料の流量は約１００ｎＬ／ｍｉｎに設定した。このとき、サンプル液滴を生成する一本の流路のＴ型に結合した流路部分で、混合溶液とオイル材料が合流し、図４に示すようにオイル材料によって分離された混合溶液の液滴が順次生成される。混合溶液に含まれるＤＮＡサンプルは大きく希釈されており、このとき生成される液滴中には、ＤＮＡが一分子以下の数だけ入るように調整されている。この条件では、生成される液滴の容量は、平均すると０．３８ｎＬであった。その後、この液滴は、次のＤＮＡ増幅手段へと送られる。
【００３５】
次に、図３のバルブ３０６を閉じ、バルブ３０７を開き、ＤＮＡ合成酵素とＤＮＡサンプルと第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを流路中で混合させ、生成した混合溶液を次のサンプル液滴を生成する一本の流路へと送液する。このとき、混合溶液生成手段の出口での流量は約１２５ｎＬ／ｍｉｎであった。これは、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを供給する流路の幅が、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを供給する流路の幅に対して、広く形成され、流路の断面積が大きくなっていることに起因する。この混合溶液は図４に示すサンプル液滴を生成する一本の流路の入力経路４０１に送液される。図４のオイル材料４０２の入力流路でのオイル材料の流量は、先ほどと同じ約１００ｎＬ／ｍｉｎに設定した。このとき、サンプル液滴を生成する一本の流路にＴ型に結合した流路部分で、混合溶液とオイル材料が合流し、図４に示すようにオイル材料によって分離された混合溶液の液滴が順次生成される。混合溶液に含まれるＤＮＡサンプルは大きく希釈されており、このとき生成される液滴中には、ＤＮＡが一分子以下の数だけ入るように調整されている。この条件では、生成される液滴の容量は、平均すると０．４８ｎＬであった。その後、この液滴は次のＤＮＡ増幅手段へと送られる。
【００３６】
＜ＤＮＡ増幅工程＞
それぞれ順次生成された第１の蛍光プローブを含む液滴と、第２の蛍光プローブを含む液滴は図５に示すようなＤＮＡ増幅手段に送られ、ＤＮＡ増幅チャンバ内に密集した形で満たされる。図５においては、ＤＮＡチャンバ内の液滴の数は少なく書かれているが、本実施の形態１においては、第１の蛍光プローブを含む液滴を約５０００個、第２の蛍光プロープを含む液滴を約５０００個ずつそれぞれ生成して、計約１００００個の液滴がＤＮＡ増幅チャンバ内を満たしている。また、混合溶液内、あるいはオイル材料内には、界面活性剤が含まれており、このように液滴がチャンバ内で密集した状態においても、また、ＤＮＡ増幅処理中の温度サイクルを実施しても、液滴同士が結合してしまうことは無い。所定の数の液滴が生成され、ＤＮＡ増幅チャンバ内が液滴で満たされると、ＤＮＡ増幅手段の入口、出口のバルブを両者とも閉じ、ＤＮＡ増幅処理を行う。
【００３７】
ＤＮＡ増幅処理は、図１０で説明した蛍光プローブとプライマを用いた処理を行った。実施の形態１では蛍光プローブとプライマは各ターゲットＤＮＡに対応する２種類の材料を使用している。しかし、各蛍光プローブに用いた蛍光色素は同じ材料を用いて作製されている。ここでは、先に説明したとおりフルオレセインという蛍光色素を用いた。ＤＮＡ増幅処理は、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに分離する工程、蛍光プローブおよびプライマをハイブリダイゼーションする工程、そしてプライマを起点にしたＤＮＡ伸長を行う工程を、温度サイクルを繰り返すことによってなされる。本実施の形態１においては、ＤＮＡ増幅手段に液滴が満たされた後、９５℃の温度で約５分間チャンバ全体を加熱した後、９５℃で１０秒、６５℃で１０秒、７５℃で１０秒の温度変化を１サイクルとして、このサイクルを４０回繰り返した。このＤＮＡ増幅処理工程によって、ターゲットＤＮＡが含まれる液滴の中では、対応する蛍光プローブとプライマがターゲットＤＮＡと反応して、ＤＮＡが増幅され、その増幅回数に応じて、液滴中に蛍光色素が遊離する。温度サイクルを４０回繰り返すと、液滴中の１つのＤＮＡ分子が２の４０乗個に増幅され、その増幅個数の分だけ蛍光色素も遊離する。ターゲットＤＮＡが含まれていない液滴中では、ターゲットＤＮＡが含まれないために、蛍光プローブが結合することもなく、当然、蛍光色素が遊離することもない。なお、ここで示した温度サイクル条件等は、蛍光プローブの種類や、プライマの種類によって最適な条件が異なるため、その材料に適した温度条件に設定することが好ましい。本実施の形態１においては、上記条件でのＤＮＡ増幅処理を行ったが、これと異なる温度条件であっても、ターゲットＤＮＡが含まれる液滴中で、正常にＤＮＡ増幅が行われ、ＤＮＡ増幅に応じて蛍光を発光する材料の機能が有効になりさえすれば、その他の方法であってもその効果には影響を及ぼさない。また、温度サイクルは４０回と設定したが、後の蛍光検出時に十分な蛍光強度が得られる条件にさえなれば、必ずしも４０回が必要ではない。蛍光プローブやプライマの材料によって最適な値は異なるため、充分な蛍光強度が得られるまでＤＮＡが増幅されれば、他のサイクル回数であっても特に問題はない。
【００３８】
＜光照射工程及び蛍光検出工程＞
ＤＮＡ増幅処理後の液滴は、次の光導波手段へと導かれる。本実施の形態１においては、Ｓｉ基板に掘られた幅５０μｍ、深さ３０μｍの溝の上から厚み５００μｍのガラス板を貼りあわせた構造の光導波手段を構成した。この流路中にＤＮＡ増幅手段でＤＮＡ増幅処理を受けた液滴が、一個ずつ一列になって送液される。このときの送液レートは、蛍光検出手段で流れてくる液滴の数をカウントする間、常に一定に保たれる。図６に示す光学系を用いて、液滴の数をカウントした。
レーザは、今回用いた蛍光色素フルオレセインを励起するために４９０ｎｍの半導体レーザを用い、蛍光検出器として高感度で高速応答性を有する電流出力型のＰＭＴ（フォトマルチプライア）を用いた。また対物レンズはより多くの蛍光を効率よく取り込むため、ＮＡ（開口数）０．８５の石英の対物レンズを用いた。
【００３９】
＜ＤＮＡ検出工程＞
図１の（ａ）は、光導波手段の流路１０１を流れてくる液滴１０２、１０３の様子を示す概略図である。図１の（ｂ）は、図１の（ａ）の光導波手段の流路１０１を流れてくる液滴１０２、１０３について、ＰＭＴで検出される光信号の様子を示すグラフである。図１の（ａ）に示すように、光導波手段の流路１０１の中を液滴１０２、１０３が一個ずつ順番に流れてくる。実施の形態１では、２種類の蛍光プローブを用いて、それぞれ異なる容量の液滴を生成するので、４つのパターンの液滴が流路中を流れてくる。それは、第１の蛍光プローブを含む平均容量０．３８ｎＬの小さな液滴で、蛍光色素が遊離した液滴と、蛍光色素が遊離していない液滴、そして、第２の蛍光プローブを含む平均容量０．４８ｎＬの大きな液滴で、蛍光色素が遊離した液滴と蛍光色素が遊離していない液滴の４種類である。
【００４０】
図６に示す光学系を使い、対物レンズ６０８でレーザ光をガラス板６０２を通して流路中の一点に絞り込む。本実施の形態１の光学系の構成では、焦点位置でのビーム直径は約０．７μｍとなる。液滴は流路中を一定速度で流れてくるため、レーザ光は、流れてくる液滴一個一個に個別に照射され、その都度、ＰＭＴで信号を検出する。図１の（ａ）のように流路中を液滴が流れてきた場合には、図１の（ｂ）のような信号がＰＭＴで検出される。ターゲットＤＮＡを含む液滴は、レーザ照射によって蛍光を発色するため、ＰＭＴで検出する信号の強度も強くなる。また、ターゲットＤＮＡを含まない液滴は、蛍光を発することはないため、非常に弱い信号がＰＭＴで検出される。蛍光を発しない液滴の検出信号を検出可能なレベルに信号検出しきい値１０５を設定し、そのしきい値を超えた部分の信号強度最大値と、しきい値を超えている時間（これを横断時間と呼ぶ）を取得する。
【００４１】
第１の蛍光プローブを含む液滴は、平均容量が０．３８ｎＬと小さいため、横断時間は短く、図１（ｂ）におけるＡ（秒）となる。また、第２の蛍光プローブを含む液滴は、平均容量が０．４８ｎＬと大きいため、横断時間は、Ａより長くなり、Ｂ（秒）となる。よって、２種類のターゲットＤＮＡの区別を、同じ蛍光色素を用いながらも、横断時間の差によって判定することが可能となる。今回の流路構成と液滴の容量の場合では、液滴の容量差が横断時間の差にほぼ等しくなるため、横断時間Ｂの平均値は、横断時間Ａの平均値より約２５％長くなる。このように横断時間によって、第１の蛍光プローブが含まれる液滴か、第２の蛍光プローブが含まれる液滴かを区別した上で、それぞれの液滴の個数をカウントする。
【００４２】
また、第１の蛍光プローブが含まれる液滴の内、横断時間中の信号強度最大値が、しきい値１０５としきい値１０６の間にあるか、あるいはしきい値１０６より大きな値となるかで、液滴中にターゲットＤＮＡが含まれているかどうかが判定される。また、第２の蛍光プローブが含まれる液滴についても同様の判定を行う。
【００４３】
その後、第１の蛍光プローブが含まれる液滴全数に対して、しきい値１０６より大きな値となる液滴の数の割合を調べることで、もともとのＤＮＡサンプル中でのターゲットＤＮＡの量が定量的に検出できる。第２の蛍光プローブが含まれる液滴に対しても同様の処理を行い、第２の蛍光プローブが含まれる液滴全数に対して、しきい値１０６より大きな値となる液滴の数の割合を調べることで、もともとのＤＮＡサンプル中でのターゲットＤＮＡの量が定量的に検出できる。なお、液滴中には必ずしもＤＮＡが含まれているわけではなく、ＤＮＡ１個もしくは０個といういずれかの条件のため、定量値を求めるためには、単純な割り算では求めることができない。よって、定量値は、ポワソン分布の考え方に従い統計的に解析してもよい。
【００４４】
このように実施の形態１においては、ターゲットＤＮＡが２種類と複数となっても、同じ蛍光色素を用いて検出することが可能であり、液滴をカウントするための光学系は蛍光波長一波長にのみ対応すればよく、光学系の構成が非常に簡単となる。ターゲットＤＮＡの数が、３個以上となった場合においても、それぞれに対応する液滴群の容量平均値を２５％以上ずつ変えて設定しておけば、同様の効果が得られ、非常に簡易な光学系で複数ターゲットの定量検出が可能となる。
【００４５】
また、ここまでは、サンプル液滴を生成する一本の流路によって、オイル材料の流量を一定に、混合溶液の流量を変化させて蛍光プローブの種類ごとに液滴の大きさを変化させたが、逆に混合溶液の流量を一定にして、オイル材料の流量を変化させても液滴の大きさを変えることは可能である。
【００４６】
第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを含む混合溶液を供給する場合も、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを含む混合溶液を供給する場合も、混合溶液の流量は一定となるように流量を設定する。その上で、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを含む混合溶液が供給されているときのオイル材料の流量と、第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを含む混合溶液が供給されているときのオイル材料の流量とを異ならせる。これによって、蛍光プローブの種類毎に混合溶液とオイル材料との流量比を異ならせ、サンプル液滴を生成する一本の流路で生成される液滴の容量を異ならせる。図１１は、混合溶液の流量を変化させた場合の混合溶液とオイル材料の流量比と液滴容量の関係を示すグラフである。図１１に混合溶液の流量を５０、７５、１００ｎＬ／ｍｉｎと固定した場合にオイル材料の流量を変化させたときの混合溶液とオイル材料の流量比と、生成される液滴の容量の関係を示す。テストした条件で液滴群の容量平均値で０．１９ｎＬから１．７５ｎＬまでの範囲で任意に液滴の容量を調整できることを確認した。オイル材料の流量を変化させることでも、蛍光プローブ毎の液滴群の容量平均値を２５％以上ずつ変えて設定しておけば、異なる複数の蛍光プローブで同じ蛍光色素を使用した場合でも横断時間の差で液滴群を区別することが可能となる。
【００４７】
図９は、サンプル液滴を生成する一本の流路の構成の変形例を示す概略図である。サンプル液滴を生成する一本の流路において、オイル材料の供給流路を複数設け、それぞれの出口にバルブを設けて、個別に開閉できるようにしておく。例えば、第１の蛍光プローブおよび第１のプライマを含む混合溶液が流れている場合は、バルブ９０３、９０５、９０７をすべて開いて、混合溶液とオイル材料が合流する部分におけるオイル材料の流量を高く設定する。第２の蛍光プローブおよび第２のプライマを含む混合溶液が流れている場合は、バルブ９０７だけ閉じて、オイル材料の流量を小さくすれば、混合溶液とオイル材料の流量比を異ならしめることができ、生成される液滴の容量も変化させることができる。このようにしてオイル材料の流量を調整して流量比を変化させ、生成される液滴の容量を蛍光プローブの種類ごとに２５％以上変化させれば効果が得られる。また、ここでは図９のような流路構成を用いたが、オイル材料の流量を所定の量だけ変化させることができれば、上記構成に限ることはない。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本開示に係るＤＮＡ検出装置は、血液など採取した検体から解析対象のＤＮＡの量を定量的に解析するマイクロ流路デバイスであり、特に、複数の解析対象のＤＮＡの量を同時に解析する場合に有用である。本開示によって、複数のＤＮＡを同時に解析する場合でも、蛍光検出を行う光学系を非常に簡単な構成で実現することができるため、テーラーメード医療の現場で利用できる、迅速、簡便な装置として特に有用である。
【符号の説明】
【００４９】
１０１  流路
１０２  ターゲットＤＮＡを含まないサンプル液滴
１０３  ターゲットＤＮＡを含むサンプル液滴
１０４  蛍光検出信号
１０５  信号検出しきい値
１０６  第二のしきい値
２０１  センサチップ
２０２  混合溶液生成手段
２０３  一本の流路
２０４  ＤＮＡ増幅手段
２０５  光導波手段
２０６  光源
２０７  蛍光検出手段
３０１  ＤＮＡ合成酵素
３０２  ＤＮＡサンプル
３０３  第１の蛍光プローブと第１のプライマを含む溶液
３０４  第２の蛍光プローブと第２のプライマを含む溶液
３０５  混合溶液
３０６  バルブ
３０７  バルブ
４０１  混合溶液入力流路
４０２  オイル材料入力流路
４０３  混合溶液
４０４  オイル材料
４０５  サンプル液滴
５０１  ＤＮＡ増幅チャンバ
５０２  サンプル液滴
５０３  入力流路
５０４  バルブ
５０５  バルブ
５０６  出力流路
５０７  ＤＮＡ増幅チャンバと周辺部材を分けるギャップ
６０１  Ｓｉ基板
６０２  ガラス板
６０３  流路
６０４  液滴
６０５  レーザ
６０６  コリメートレンズ
６０７  ダイクロイックミラー
６０８  対物レンズ
６０９  光学フィルタ
６１０  レンズ
６１１  ピンホール
６１２  ＰＭＴ（フォトマルチプライア）
９０１  混合溶液
９０２  オイル材料
９０３  バルブ
９０４  オイル材料
９０５  バルブ
９０６  オイル材料
９０７  バルブ
９０８  サンプル液滴
１００１  一本鎖ＤＮＡ
１００２  一本鎖ＤＮＡ
１００３  フォワードプライマ
１００４  リバースプライマ
１００５  プローブ
１００６  蛍光色素
１００７  消光剤
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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