(57)【要約】【課題】本発明は、分子アセンブリー中の単一のアクセプター／クエンチャーを蛍光状態に変換することによって活性化され得る、高吸光度のクエンチャー付加「ダイドロン」に対するデザインを提示する。【解決手段】クエンチャーは、独特の相補的な発現可能な蛍光団活性化ペプチド（ＦＡＰ）に非共有結合することによって活性化される。この方法において、クエンチャーは均一なスイッチとして働き、デンドロンのアンテナの各ドナー分子からエネルギーを効率的に受け取り、結合によって活性化された場合にのみそれを蛍光として放出する。アンテナ上の複数の色素の吸光度の合計は、標準の画像化システムにおけるプローブの効率的な輝度における劇的な増強をもたらす。この取組みによりダイドロンの蛍光を活性化する発現タグを特異的に標的とする、例外的な輝度を有する１セットのプローブが提供される。【選択図】図６Ａ
2016014033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の活性化可能なアクセプター部分にリンカーによって結合している、２つ以上の励起可能なドナー部分を含む化合物であって、
前記ドナー部分はその励起エネルギーの少なくとも５０％を前記アクセプター部分に伝達し、前記アクセプター部分は、活性化されると、前記ドナー部分が励起されたときに検出可能な蛍光シグナルを生成することを特徴とする化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所第５Ｕ５４−ＲＲ０２２２４１号および第Ｒ０１−ＮＩＨ １Ｒ０１ＧＭ０８６２３７号の下、政府の支援で行われた。政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光検出の感度は、生物医学的研究、診断、および創薬において、蛍光試薬によって発光されるシグナルから有用な情報を得る上での制限となることが多い。蛍光検出の感度は、（１）検出系における蛍光試薬のコピー数、（２）検出機器の効率、および（３）試料中の内因性生物学的蛍光体から生じるバックグラウンドの蛍光および蛍光試薬の試料との非特異的結合から生じるバックグラウンドの蛍光に対する蛍光試薬の蛍光輝度に依存する。蛍光試薬の輝度は次に、蛍光シグナルを生成する試薬中の色素の量子効率および色素の吸光能力（吸光係数によって定量される）に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０８／０９２０４１号
【特許文献２】米国特許第５，７０２，８９２号明細書
【特許文献３】米国特許第５，７５０，３７３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８２１，０４７号明細書
【特許文献５】米国特許第６，１２７，１３２号明細書
【特許文献６】米国特許第５，９４８，６３５号明細書
【特許文献７】米国特許第６，４０７，２１３号明細書
【特許文献８】米国特許第５，２２３，４０９号明細書
【特許文献９】米国特許第５，１９８，３４６号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，０９６，８１５号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，４７５，０９６号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，２７０，１６３号明細書
【特許文献１３】国際公開第９１／１９８１３号
【特許文献１４】米国特許第５，７０７，７９６号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，５８０，７３７号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，５６７，５８８号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，４９６，９３８号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，６８３，８６７号明細書
【特許文献１９】米国特許第５，６６０，９８５号明細書
【特許文献２０】米国特許第５，６３７，４５９号明細書
【特許文献２１】米国特許第６，１３１，５８０号明細書
【特許文献２２】米国特許第６，２４８，５５８号明細書
【特許文献２３】米国特許第４，２１５，０５号明細書
【特許文献２４】国際公開第９１／０６３０９号
【特許文献２５】日本国特許出願第１０４７３８１号
【特許文献２６】欧州特許出願公開第４３０７５号明細書
【特許文献２７】国際公開第９３／０４７０１号
【特許文献２８】国際公開第９２／２２６３５号
【特許文献２９】国際公開第９２／２０３１６号
【特許文献３０】国際公開第９２／１９７４９号
【特許文献３１】国際公開第９２／０６１８０号
【特許文献３２】米国特許第５，１６６，３２０号明細書
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Szent-Gyorgyi， C; Schmidt， B. F.; Creeger， Y.; Fisher， G. W.; Zakel， K. L.; Adler， S.; Fitzpatrick， J. A. J.; Woolford， C. A.; Yan， Q.; Vasilev， K. V.; Berget， P. B.; Bruchez， M. P.; Jarvik， J. W.; Waggoner， A. Nature Biotechnology 2008， 26， 235-240
【非特許文献２】Babendure， J. R.; Adams， S. R.; Tsien， R. Y. Journal of the American Chemical Society 2003， 125， 14716-14717
【非特許文献３】Thomas Gessner， "Triarylmethane and diarylmethane Dyes"， in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry， Wiley (2005)
【非特許文献４】Klajnert， B. et al.， Dendrimers: Properties and Applications， Acta Biochimica Polonica， (2001) 48(1): 199-208
【非特許文献５】Kuby， Janis， IMMUNOLOGY， Third Edition， pp. 131-139， W.H. Freeman & Co. (1997)
【非特許文献６】Holt， L. J. et al.， "The Use of Recombinant Antibodies in Proteomics，" Current Opinion in Biotechnology 2000， 11 :445- 449
【非特許文献７】Boder， et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci USA 97:10701-5
【非特許文献８】Swers， et al. (2004) Nucl. Acids. Res. 32:e36
【非特許文献９】Yeast Display scFv Antibody Library User's Manual， Pacific Northwest National Laboratory， Richland， WA 99352， Revision Date: MF031112
【非特許文献１０】Hanes J， Pluckthun A (1997) Proc Natl Acad Sci USA 91:4937-4942
【非特許文献１１】He M， Taussig M J (1997) Nucleic Acids Res 25:5132-5134
【非特許文献１２】In Vitro Protein Expression Guide， PROMEGA (2005)， pp-29-33， Chapter 6， Ribosome Display)
【非特許文献１３】Narang， SA (1983) Tetrahedron 39:3
【非特許文献１４】Itakura et al.， (1981) Recombinant DNA. Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules， ed. AG Walton， Amsterdam: Elsevier pp. 273-289
【非特許文献１５】Itakura et al.，(1984) Annu. Rev. Biochem 53:323
【非特許文献１６】Itakura et al.， (1984) Science 198:1056
【非特許文献１７】Ike et al.. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477
【非特許文献１８】Scott et al.， (1990) Science 249:386-390
【非特許文献１９】Roberts et al.， (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2429-2433
【非特許文献２０】Devlin et al.， (1990) Science 249: 404-406
【非特許文献２１】Cwirla et al.， (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378- 6382
【非特許文献２２】Green and Loewenstein， (1989) Cell 55:1179-1188
【非特許文献２３】Derossi et al. (1996) and J Biol Chem 271:18188-18193
【非特許文献２４】Weissbach & Weissbach， 1988， Methods for Plant Molecular Biology.， Academic Press， New York， Section VIII， pp. 421-463
【非特許文献２５】Grierson & Corey， 1988， Plant Molecular Biology， 2d Ed.， Blackie， London， Ch. 7-9
【非特許文献２６】Miller， A.D. (1990) Blood 76:271
【非特許文献２７】Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260
【非特許文献２８】Hermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470
【非特許文献２９】Flotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790
【非特許文献３０】Mizuno et al. (1992) No Shinkei Geka 20:547-551
【非特許文献３１】Viae et al. (1978) J Invest Dermatol 70:263- 266
【非特許文献３２】Mizuno et al. (1992) Neurol. Med. Chir. 32:873-876
【非特許文献３３】Mulligan et al. (1993) Science 260-926
【非特許文献３４】Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. ScL USA 89:7934
【非特許文献３５】Christiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122
【非特許文献３６】Bielinska， A. U.， J. F. KukowskaLatallo， and J. R. Baker. 1997. The interaction of plasmid DNA with polyamidoamine dendrimers: mechanism of complex formation and analysis of alterations induced in nuclease sensitivity and transcriptional activity of the complexed DNA. Bba-Gene Struct Expr 1353:180-190
【非特許文献３７】Hawker， C. J.; Frechet， J. M. J. Journal of the American Chemical Society 1990， 112， 7638-7647
【非特許文献３８】Dick， D. L.; Rao， T. V. S.; Sukumaran， D.; Lawrence， D. S.Journal of the American Chemical Society 1992， 114， 2664-2669
【非特許文献３９】Lagnoux， D.; Delort， E.; Douat-Casassus， C; Esposito， A.; Reymond， L-L. Chemistry- A European Journal2004， 10， 1215 -1226
【非特許文献４０】Patterson， G. H.; Knobel， S. M.; Sharif， W. D.; Kain， S. R.; Piston， D. W. Biophysical Journal 1997， 73， 2782-2790
【非特許文献４１】Mujumdar， R. B.; Ernst， L. A.; Mujumdar， S. R.; Lewis， C. J.; Waggoner， A. S. Bioconjugate Chemistry 1993， 4， 105-111
【非特許文献４２】Berlier， J. E.; Rothe， A.; Buller， G.; Bradford， J.; Gray， D. R.; Filanoski， B. J.; Telford， W. G.; Yue， S.; Liu， J.; Cheung， C. Y. Journal of Histochemistry and Cytochemistry 2003， 51， 1699
【非特許文献４３】Hung， S. -C; Ju， J.; Mathies， R. A.; Glazer， A. N. Analytical Biochemistry 1996， 243， 15-27
【非特許文献４４】Martin， B. R.; Giepmans， B. N. G.; Adams， S. R.; Tsien， R. Y. Nature Biotechnology 2005， 23， 1308-1314
【非特許文献４５】Shaner， N. C; Campbell， R. E.; Steinbach， P. A.; Giepmans， B. N. G.; Palmer， A. E.; Tsien， R. Y. Nature Biotechnology 2004， 22， 1567-1572
【非特許文献４６】Ozhalici-Unal， H.; Pow， C. L.; Marks， S. A.; Jesper， L. D.; Silva， G. L.; Shank， N. L; Jones， E. W.; Burnette Iii， J. M.; Berget， P. B.; Armitage， B. A. Journal of the American Chemical Society 2008， 130， 12620 and Chao， G.; Lau， W. L.; Hackel， B. J.; Sazinsky， S. L.; Lippow， S. M.; Wittrup， K. D. Nature Protocols 2006， 1， 755-768
【非特許文献４７】Szidonya， L.; Cserzo， M.; Hunyady， L. Journal of Endocrinology 2008， 196， 435-53
【非特許文献４８】Rao， B. M.; Lauffenburger， D. A.; Wittrup， K. D. Nature Biotechnology 2005， 23， 191- 194
【非特許文献４９】Shank， N. I.; Zanotti， K. J.; Lanni， F.; Berget， P. B.; Armitage， B. A. Journal of the American Chemical Society 2009， 131， 12960-12969
【非特許文献５０】Fitzpatrick， J. A. J.; Yan， Q.; Sieber， J. J.; Dyba， M.; Schwarz， U.; Szent-Gyorgyi， C; Woolford， C. A.; Berget， P. B.; Waggoner， A. S.; Bruchez， M. P. Bioconjugate Chemistry 2009， 20， 1843-1847
【非特許文献５１】Colby， D. W.; Chu， Y. J.; Cassady， J. P.; Duennwald， M.; Zazulak， H.; Webster， J. M.; Messer， A.; Lindquist， S.; Ingram， V. M.; Wittrup， K. D. Proceedings of the National Academy of Sciences 2004， 101， 17616
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、結果として同時に得られる蛍光検出における２つの重要な進歩と関係している。進歩の１つの構成要素は、試薬の励起波長でより大きな蛍光シグナルをもたらす、大きな有効吸光係数を有する蛍光試薬の作製である。進歩の他の局面は、新しい試薬は、標的化活性化剤によって蛍光状態に選択的に活性化され、そうでなければ、試料中に存在する場合は低い非特異的な蛍光を生成するということである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、分子アセンブリー中の単一のアクセプター／クエンチャーを蛍光状態に変換することによって活性化され得る、高吸光度で消光クエンチャー付加「ダイドロン」をデザインするものである。クエンチャーは、発現可能な蛍光団活性化ペプチド（ＦＡＰ）などの、独特の相補的な蛍光団アクチベーターに非共有的に結合することによって活性化される。この方法において、クエンチャーは均一なスイッチとして働き、デンドロンのアンテナ（dendronic antenna）の各ドナー分子からエネルギーを効率的に受け取り、結合によって活性化された場合にのみこれを蛍光として放出する。
【発明の効果】
【０００７】
アンテナ上の複数の色素の吸光度の合計は、標準の画像化システムにおけるプローブの実効輝度の劇的な増強をもたらす。この方法により、ダイドロンの蛍光を活性化する発現タグを特異的に標的とする、例外的な輝度を有する１セットのプローブが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】クエンチャー（消光）付加ダイドロン（dyedron）の蛍光の活性化の一般的概念を示す図である。クエンチャー（消光）付加ダイドロンは、２種の色素で装飾されているデンドロン（黒）からなり、表面基は蛍光ドナー（明灰色）を有し、頭部基は単一のクエンチャー（暗灰色）にカップリングしている。
【図１Ｂ】クエンチャーが特異的な蛍光団活性化ペプチド（ＦＡＰ）に結合すると、クエンチャーは効率的な蛍光体／アクセプターに変換される。
【図１Ｃ】この活性化により、ドナーアレイの合計の励起とカップリングしたアクセプターからの明るい発光がもたらされ、現存の発現タグよりも輝度が５から１４０倍高い個々の構築体が生成される。
【図２】モル吸光率ε＞１０6を有するドナーアレイ分子を示す模式図である。左：コア中に陽イオン性４級アミン（＋）を示す世代２のＰＡＭＡＭダイドロン；右：無電荷の内部アミドを有するＮｅｗｋｏｍｅのダイドロン（ひし形）。
【図３】ドナーの励起および標的とするアクセプターの発光の性質を示す図である。Ｃｙ−３または同様のスペクトルの変異体がドナーアレイに用いられ、蛍光団のクエンチャーに直接的にまたは中間アクセプターを介してのいずれかで連結している。
【図４Ａ】Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄ ｐＰＮＬ６融合タンパク質（配列番号１）をコードする構築体のＤＮＡ配列を示す図である。
【図４Ｂ】構築体ｐＰＮＬ６ Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄを示す図である。
【図４Ｃ】構築体ｐＰＮＬ６ Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄを示す図である。
【図４Ｄ−１】ｐＰＮＬ６ Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄの関連の部分（配列番号１および２）のヌクレオチド配列上にマッピングされたＬ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄをコードする構築体の領域を示す図である。
【図４Ｄ−２】ｐＰＮＬ６ Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄの関連の部分（配列番号１および２）のヌクレオチド配列上にマッピングされたＬ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄをコードする構築体の領域を示す図である。
【図５Ａ】Ｔ−リンカーおよびトリポッド（Ｔｒｉｐｏｄ）戦略に基づくダイドロンの合成。
【図５Ｂ】トリポッド（Ｔｒｉｐｏｄ）戦略に基づくダイドロンの合成により、ＦＲＥＴの高効率を確実にするための小型の分子内間隙を有する単一の蛍光団のクエンチャーに連結している最高９個のドナーに対する合成経路が提供されることを示す図である。
【図５Ｃ】スペクトルの重複が不十分である蛍光体−ドナー対の場合、媒介する色素を有するカスケードデザインは、ＦＲＥＴ効率を増強することを示す図である。
【図６Ａ】ダイドロンの構造を示す図である。モノアイソトピック質量および確証的な質量分析法のイオンを示す。ＴＣＭ、テトラ−Ｃｙ３．２９マラカイトグリーン。
【図６Ｂ】ダイドロンの構造を示す図である。モノアイソトピック質量および確証的な質量分析法のイオンを示す。ＢＣＭ、Ｂｉｓ−Ｃｙ３．２９マラカイトグリーン。
【図６Ｃ】ダイドロンの構造を示す図である。モノアイソトピック質量および確証的な質量分析法のイオンを示す。ＣＭ、Ｃｙ３．２９マラカイトグリーン。
【図６Ｄ】ダイドロンの構造を示す図である。モノアイソトピック質量および確証的な質量分析法のイオンを示す。Ｍ、マラカイトグリーンジエチレングリコールアミン。
【図７Ａ】ダイドロン合成の概要を示す図である。Ｃｙ３−マラカイトグリーン（ＣＭ）。太字の数字は、実施例１に記載した化合物を参照するものである。
【図７Ｂ−１】ダイドロン合成の概要を示す図である。ビスＣｙ３−マラカイトグリーン（ＢＣＭ）。太字の数字は、実施例１に記載した化合物を参照するものである。
【図７Ｂ−２】ダイドロン合成の概要を示す図である。ビスＣｙ３−マラカイトグリーン（ＢＣＭ）。太字の数字は、実施例１に記載した化合物を参照するものである。
【図７Ｃ】ダイドロン合成の概要を示す図である。テトラＣｙ３−マラカイトグリーン（ＴＣＭ）。太字の数字は、実施例１に記載した化合物を参照するものである。
【図８】ダイドロン対の代表的なスペクトル特性を示す図である。Ｃｙ３−マラカイトグリーン対の励起および発光のスペクトル。太線は、最終的に活性化されたダイドロンから予想される、ドナーの励起および活性化された発光を示す。
【図９】フェルスターの移動モデル(Forster transfer model)に基づくいくつかの消光されたダイドロンの、エネルギー移動効率（上）およびEＧＦＰの輝度に対する倍率（下）を算出したものを示す図である。
【図１０】蛍光発生的なダイドロンの合成および蛍光モジュール開発のためのアクセプターの例を示す図である。
【図１１】ａ）ダイドロン／Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄ複合体の蛍光と励起（発光７１０ｎｍ）を示す図である。蛍光は、６４８ｎｍの励起ピークの蛍光の倍率として標準化して表される。ｂ）ダイドロン／Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄ複合体の蛍光の相対値（励起５１４ｎｍ）を示す図である。スペクトルはＭＧ励起ピークに対して標準化され、蛍光は６８０ｎｍの蛍光の倍率として表される。相対的な発光は励起波長に感受性がある。
【図１２Ａ】本試験において用いたダイドロンが活性化するｓｃＦｖのペプチド配列を提供する図である（配列番号３〜６）。ハイフンはコア配列を示す。
【図１２Ｂ】本試験において用いたダイドロンが活性化するｓｃＦｖに対するペプチド配列をさらに提供する図である（配列番号７〜９）。ハイフンはコア配列を示す。
【図１３】定向進化によるＴＣＭ蛍光モジュールの改善を示す図である。
【図１４】Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄを提示する酵母細胞表面の蛍光画像化を示す図である。酵母生細胞を、Ｚｅｉｓｓ５１０ ＭｅｔａＮＬＯ共焦点顕微鏡上、微分干渉（ＤＩＣ）を用いて、５００ｎＭ ＴＣＭの存在下（ａ）、またはドナー（５６１／６５０−７１０ＢＰ）の蛍光（ｂ）、またはアクセプター（６３３／６５０−７１０ＢＰ）（ｃ）を励起／発光の設定で画像化した。添付の１２ビットスキャンは、黄色線で表される細胞横断面の、定量シグナル／ノイズの特徴を定量化するものである。
【図１５】ドナー（青色）またはアクセプター（赤色）を励起することによる、ダイドロンで標識した酵母のフローサイトメトリー解析を示す図である。その表面上にＬ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄを発現する出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞を、本質的に特許文献１および非特許文献１に記載に従い分析した。染色した各集団のアリコート２つおよび非染色の対照（Ｕ）をそれぞれ、５３２ｎｍ（ドナー）または６３５ｎｍ（アクセプター）で励起し、６７５／５０ｎｍ帯域（ＢＰ）フィルターを通して発光を収集して分析した。分析は各々、細胞１００，０００個を含んでいた。染色した試料はｓｃＦｖをコードするプラスミド（そのシグナルは非染色の試料（細線によって印をつけた）のシグナルに相当する）を失っているために、無蛍光の細胞の亜集団を含んでいる。対照は、ＦＡＰ無発現の細胞表面上にダイドロンによる蛍光は実質的に生成されないことを示している（表３）。波長が短いほど細胞の自己蛍光が高いため、５３２ｎｍで励起した非染色の細胞は６３５ｎｍで励起したものより比較的明るい。二重線の染色したピークは非出芽および出芽した酵母細胞に対応し、このような実験には典型的である。陰性の細胞から陽性の細胞を分離すると、６３５ｎｍの励起下では本質的に一定のままであるが、５３２ｎｍの励起下ではＣｙ３ドナーの数に比例して増大する。ダイドロンにおける励起の増強は、フローサイトメーターにおける感度の上昇をもたらす。
【図１６Ａ】改善された蛍光モジュールでの生細胞の表面画像化を示す図である。（Ｅ５２Ｄ １００ｎＭ ＴＣＭ）
【図１６Ｂ】改善された蛍光モジュールでの生細胞の表面画像化を示す図である。（Ｅ５２ＤＬ９１Ｓ １０ｎＭ ＴＣＭ）
【図１６Ｃ】改善された蛍光モジュールでの生細胞の表面画像化を示す図である。（Ｅ５２ＤＬ９１Ｓ 培地中 ５０ｎＭ ＴＣＭ）
【図１６Ｄ】改善された蛍光モジュールでの生細胞の表面画像化を示す図である。（Ｅ５２ＤＬ９１Ｓ ５０ｎＭ ＴＣＭ（ＰＢＳ＋））
【発明を実施するための形態】
【０００９】
図１は本発明における取組みを概略するものである。デンドロンは、規定された一定の数の分子で表面が装飾され得る、化学的に明確に定義されているナノ構造体である。典型的な高分子系とは異なり、デンドロンは分子的に単分散であり、どのデンドロンも、数および配列が同じ官能基を有している。さらに、Ｂａｌｚａｎｉらによる研究は、単一の非共有性にホストされたエオジン分子（アクセプター）は、世代４（ダンシル分子３２個）までの完全にダンシル修飾されたポリプロピレンイミンデンドロンの蛍光を消光することができることを実証している。この知見に基づき、非対称性デンドロンは、強力な吸収性の色素分子で周囲を装飾することによってアンテナ分子として作動するようにデザインすることができ、これらは単一の直接連結されている消光性の分子の量子収量を調整することによってスイッチの切換えができると論じられていた。活性化の方法は、多くの現在の「ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）」センサーの取組みを思わせるものであるが、リンカーの切断に依存するものではない。
【００１０】
これらのモジュールは、消光性部分に連結しているドナーアレイから形成される。ドナーアレイ、連結性ユニット、およびクエンチャーの性質を個々に特徴付け、最適化することができる。これらは、表面に複数のアミノ基および頭部に単一のスルフヒドリルを容易に与え、単一クエンチャー付加ダイドロンの調製を単純にするので、デンドロンを用いて標準の入手可能な色素分子を用いてダイドロンを形成することができる。しかし、ある範囲の極性を有し、ある範囲の電荷を有するアレイ骨格を調製するには、選ばれたモノマーが利用可能である（図２）。これらデンドロン骨格は、ティンカートイ（tinker-toys）（例えば、クリック化学）のように構築されて、最適のドナー色素の密度および配向を達成することができる。高度に蛍光性のドナーアレイが、アクセプターによる効率的な消光には大き過ぎる、またはスペクトル的に離れ過ぎている場合、中間体のアクセプター色素がデンドロンを頭部に含ませて、アレイから励起エネルギーを収集することができ、それをクエンチャー（アクセプター）の蛍光団に中継することができる。これら中間体のアクセプターのスペクトルの性質および空間の配向を操作して、特にマラカイトグリーンよりもさらに赤色にシフトした蛍光団によって、より良好な伝達およびストークスシフトをもたらすことができる（標的化の性質を図３に概略した）。
【００１１】
以下の実施例に例示する通り、非蛍光有機色素分子に特異的であり、溶液中の遊離色素の存在下でタンパク質モジュールに結合している場合にのみこれらの色素を蛍光にする、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）分子が選択された。高親和性（低ナノモル）のクローンを用いると、この結合は多くの洗浄ステップを生き残るが、低親和性（マイクロモル）のクローンでは蛍光シグナルを維持するのに色素の存在が必要とされる。ｓｃＦｖモジュールは酵母ディスプレイライブラリーおよび他のディスプレイライブラリーにおいて入手可能であり、広範囲の分子およびタンパク質に特異的な結合パートナーを生成するのに用いられ得る。この遺伝的にコードされたシステムの１つの主要な利点は、選択された抗体を発現可能なタンパク質タグとして用いることができることである。これにより比較的小型のユニット（典型的には、「全体の」ｓｃＦｖに対して分子量約２５ｋＤａ、または「単一ドメインの」ｓｃＦｖに対して１１ｋＤａほどの小ささ）が、細胞の状況において特異的なパートナーを有する融合タンパク質として発現されるが、ｓｃＦｖは、あらゆる効果的な手段によって細胞のタンパク質、リガンド、受容体、抗体などの特異的なパートナーに付着することができる。
【００１２】
一実施形態において、本発明は単一の色素または蛍光タンパク質よりも５から１４０倍明るいシグナルを生成する、新しい生物学的プローブの戦略である。これらダイドロンは著しく赤色にシフトしているので、バックグラウンドに対するシグナルは少なくとも１０倍さらに増強される。検出できる全体のシグナル対バックグラウンド比において、これらのプローブはこれまでの標識を１００〜１０００倍凌ぐ改善、および入手可能な最良のＱＤを５〜５０倍凌ぐ改善を表す。これらのプローブは、発現されるは配列によって選択的に活性化され、その他の場合は暗いままであるので、これらには元来蛍光分子を悩ませた洗い流し、またはバックグラウンドの問題がなく、独立に選択された「特異的分子」（例えば、抗体）の性質によって制限されない。
【００１３】
高強度のアーク放電ランプまたはレーザーからの照明に細胞を長時間曝露すると、細胞の生理を損傷することがあるため、吸光度の増強は用いられる励起出力を低減する助けとなるはずである。単一分子の研究は、光毒性効果なしにより長い時間尺度の画像を得るための赤色シフトした励起レーザーおよび励起源に依存する。スペクトルの青〜緑領域から離れると生物学的な発色団（自己蛍光）がないため、通則は「赤いほどよい」であるが、５６１ｎｍのレーザーは生細胞に対して全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡における使用を獲得している。このレーザーは生細胞の動的測定に十分適しており、単一分子の実験に高いシグナル対ノイズ比を提供する。さらに、このレーザーはＣｙ３およびＡｌｅｘａ５６８などの色素をかなり十分に励起し、これらのプローブは良好なエネルギー伝達ドナーであることが知られている。この理由から、プローブは５６１ｎｍで励起し、６５０ｎｍから８００ｎｍまでの近赤外波長において発光するようにデザインされている。
【００１４】
本明細書に記載する通り、蛍光団ダイドロン化合物を、ダイドロン活性化複合体、ダイドロンアクチベーター、および関連の方法とともに提供する。ダイドロンは少なくとも２つのドナー（本明細書においてドナー部分とも呼ぶ）、１つまたは複数の活性化可能なアクセプター、および連結基を含んでいる。ダイドロン複合体は、ダイドロン、およびアクセプターのアクチベーターを含んでいる。ドナーの発光スペクトルはアクセプターの吸収スペクトルと重複して蛍光共鳴エネルギー伝達を達成する。ドナースペクトルとアクセプタースペクトルとが重複しない、または重複が不十分である場合、ドナーおよびアクセプターと重複するスペクトルを有するメディエータを用いてドナーとアクセプターとの間のスペクトルのギャップを架橋してもよい。アクチベーターによって非結合である場合、ダイドロンは波長の異なる蛍光を放つか、または、アクセプターにアクチベーターが結合している場合とは強度が異なる（好ましくは蛍光がより低い、取るに足らない、もしくは事実上蛍光がない）。
【００１５】
ドナーは、ドナーとアクセプターとの間のスペクトルおよび／または距離のギャップを架橋するメディエータが適用可能である場合、アクセプターに対するＦＲＥＴアクチベーターとして働くことができるあらゆる分子または基である。ドナーおよびアクセプターは、本明細書において独立の化学的実体（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）としばしば呼ばれるが、これらの部分は化合物に付着しており、「ドナー部分」および「アクセプター部分」とも呼ばれることが理解される。ドナーおよびアクセプターとして有用であると本明細書に記載する化合物は、よく知られている化学的方法にしたがって、あらゆる有用な手段によってダイドロンに付着していてよい。例えば、化合物は、下記の構造において示され、またはあらゆる様々な方法によってリンカーとして加えられ得るペンダントのカルボキシル基またはアミン基によってデンドロンまたは他のリンカーに連結していてよい。
【００１６】
本明細書で用いられるドナーは、ダイドロン化合物の部分を形成する部分または基である。ドナーは、１タイプの分子（例えば、Ｃｙ３）または２つ以上のタイプのドナー（例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５）を含むことができる。２つ以上のドナーを組み合わせて、ダイドロンの発光スペクトルをドナーの吸収スペクトルから離れる方向へさらにシフトすることができる。一例において、カスケードの取組みを利用すると、第１のドナーは、その最大の波長でアクセプターの吸収スペクトルと重複しない、または重複が不十分である吸収スペクトルおよび発光スペクトルを有する。このような場合、第１のドナーの吸収スペクトル内の波長のダイドロンの照明がアクセプターによる発光をもたらすように、メディエータは第１のドナーの発光スペクトルと重複する吸収スペクトル、およびアクセプターの吸収スペクトルと重複する発光スペクトルを有する。
【００１７】
特に、適切なドナーは完全に蛍光性である必要はなく、ドナーが励起されるときにアクチベーターの存在（例えば、アクチベーターによる結合）下、アクセプターが蛍光発光し、最大の程度まで蛍光発光し、または異なる波長で蛍光発光するようにアクセプターにエネルギーを効率的に伝達することができるだけでよい。適切なドナーの非限定的な例には、シアニン色素、フルオレセイン、ウンベリフェロン（クマリン化合物）、ピレン、レゾルフィン、ローダミン、ヒドロキシエステル、芳香族酸、スチリル色素、テトラメチルローダミン色素、オキサジン、チアジン、金属置換されているプタロシアニン（ｐｔｈａｌｏｃｙａｎｉｎｅ）およびポルフィリン、ならびに多環芳香族色素、例えば、ペリレンジイミン（perylenediimide）誘導体が含まれる。代替には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓからのＡｌｅｘａ Ｄｙｅ（スルホン化されたクマリン、ローダミン、キサンテン（例えば、フルオレセイン）およびシアニン色素）、ＡｎａＳｐｅｃからのＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からのＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒｓ、ならびにＡＴＴＯ−ＴＥＣおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能であるＡＴＴＯ Ｄｙｅシリーズが含まれる。ダイドロンにおいて用いるのに適するＦＲＥＴ対または群の非制限的な例には、（ドナーの次にアクセプター、または適用できる場合にはドナー、メディエータ、およびアクセプターの順序で列挙して）Ｃｙ３およびＭＧ；Ｃｙ３および少なくとも１つの炭素−炭素結合が三重結合であるＭＧ；Ｃｙ３、Ｃｙ５、およびＭＧ；Ｃｙ３およびＤＩＲ；Ｃｙ３およびＣｙ５およびＩＣＧが含まれる。
【００１８】
ドナーは蛍光性である必要はない。例えば、近位のアクセプターへの分子内エネルギーの伝達を可能にするのに十分、励起状態の寿命が長いのであれば、ドナーは、アゾ色素、または量子収量が非常に低い、ニトロ修飾された色素であってよく、その多くは市販されている。
【００１９】
アクセプターは、環境の変化に反応して、すなわちアクチベーターが結合することによって、それ自体「活性化可能である」とみなされる、検出可能なシグナルの変化を生成するあらゆる分子であってよい。同様に、アクセプターは活性化可能であるので、ダイドロンは活性化可能であるとみなされる。例えば、シグナルの変化はシグナル強度における増大もしくは低減であってよく、または生成されるシグナルのタイプにおける変化（例えば、ダイドロンの発光の波長におけるシフト）であってよい。例えば、適切なレポーターには、光学的に検出可能なシグナルを生成する分子、例えば、蛍光性の、および化学発光性の分子が含まれる。ある実施形態において、レポーター分子は、組織試料を通したレポーターシグナルの検出、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの応用と結びついたレポーターの非侵襲性の検出を可能にする長波長蛍光分子である。
【００２０】
ある実施形態によると、アクセプターは、モノメチン基などによって架橋されている芳香環および／またはヘテロ芳香環を含む非強化の芳香族系である。
【００２１】
アクセプターは、アクチベーターとの相互作用時にスペクトルまたは蛍光強度の変化を示す、ｐＨ感受性の蛍光色素（ｐＨセンサー色素）であってよい。アクチベーターのアクセプターとの相互作用は、アクチベーター上の酸性残基および塩基性残基の組成により、アクセプター周囲の微小環境のｐＨにおけるシフトをもたらすことがある。次に、ｐＨ微小環境におけるシフトは、アクチベーターに会合しているｐＨ感受性蛍光色素分子のシグナルにおける検出可能なスペクトルまたは蛍光強度の変化をもたらす。例示の実施形態において、ｐＨ感受性の色素は、アクチベーターに結合したときに最適なスペクトルの変化をもたらす好適なｐＫａで選択される。において用いるのに適する様々なｐＨ感受性の色素が市販されている。例示の実施形態において、ｐＨ感受性の色素には、例えば、フルオレセイン、ウンベリフェロン（クマリン化合物）、ピレン、レゾルフィン、ヒドロキシエステル、芳香族酸、スチリル色素、テトラメチルローダミン色素、およびシアニン色素、ならびにこれらのｐＨ感受性の誘導体が含まれる。
【００２２】
アクセプターは、アクチベーターと相互作用したときにスペクトルの変化を示す、極性感受性の蛍光色素（極性センサー色素）であってよい。アクチベーターの標的分子との相互作用は、アクチベーター上の極性残基および／または非極性残基の組成により、アクセプター周囲の微小環境の極性におけるシフトをもたらすことがある。次に、微小環境の極性における変化は、アクチベーターに会合している極性感受性の蛍光色素分子のシグナルにおける検出可能なスペクトルの変化をもたらす。使用に適する様々な極性感受性の色素が市販されている。例示の実施形態において、極性感受性の色素には、例えば、メロシアニン色素、５−（（（（２−インドアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）、およびＣＰＭ、ならびにメロシアニン色素の極性感受性の誘導体である、ＩＡＥＤＡＮＳ、およびＣＰＭが含まれる。
【００２３】
アクセプターは、局所環境の微小粘度における変化に感受性がある蛍光色素であってよい（制限センサー色素）。アクチベーターのアクセプターとの相互作用は、アクセプター周囲の局所環境における微小粘度における変化をもたらすことがある。次に、微小粘度における変化は、アクチベーターに会合している移動性のセンサー色素分子のシグナルにおける検出可能なスペクトルの変化をもたらすことがある。例えば、標的に結合したときの微小粘度の増大は、色素を制限し、発光される蛍光シグナルの量子収量を増大する。使用に適する様々な制限センサー色素が市販されている。例示の実施形態において、制限センサー色素には、例えば、モノメチン（monomethin）およびトリメチンシアニン（trimethine cyanine）色素、ならびにモノメチンおよびトリメチンシアニン色素の微小粘度に感受性がある誘導体が含まれる。
【００２４】
ある実施形態において、アクセプターは、アクチベーターに特異的に結合したときにそのスペクトルの性質における変化を表す色素である。核酸、例えば、アプタマーを、このような色素、例えば、マラカイトグリーンに特異的に結合するようにデザインしてもよい（非特許文献２を参照されたい）。このような色素は、これらに特異的である核酸またはタンパク質との複合体における場合、これらのスペクトルの性質を変える。例えば、マラカイトグリーンおよびその類似体は、通常蛍光性ではないが、それに特異的なｓｃＦｖに結合すると強力に蛍光性になる。多くのジ−およびトリ−アリールメチン類似体が、本明細書に記載するアクセプターおよびＦＡＰバインダーの優れた候補物質である。多くのジ−およびトリ−アリールメチンが調製されており、非特許文献３によって再考されている。他に記載されているが合成されるべきある種のこれらの非架橋のジ−およびトリ−アリールメチン色素、および類似の色素が、本明細書に記載する目標にしたがって適切に修飾されると、ダイドロンにおける優れたアクセプター色素構造を提供すると考えられる。
【００２５】
マラカイトグリーン（Ｉ）およびフェノールフタレイン（ＩＩ）の類似体を、代表として下記に示す。
【００２６】
【化１】
2016014033.tif 000003
【００２７】
（１）光の吸収および蛍光の波長、（２）アクセプター色素の活性化の程度、ダイドロンの水溶性、（３）ダイドロンの細胞成分に対する非特異的な結合、ならびに（４）生体膜を横切るダイドロンの能力または無力を制御するために、マラカイトグリーン類似体のＲ１〜Ｒ４基は、ダイドロンの発達中に修飾されるのが好ましいことがある。Ｒ５基は、マラカイトグリーンおよびフェノールフタレインのクラスのトリアリールメチン色素におけるのと同様、置換されているアリール基であってよい。ジアリールメチン色素のＲ５基は、記載したばかりの目標を遂行する、いくつかの他の化学的置換基であってよく、さらにドナー色素の、ダイドロンのエネルギー受容部位に対する連結のための部位を提供する。色素の光の吸収および発光系を担う共鳴電荷非局在化系を変更しない他の非フェノール基または非アミノ基は、上記の目標を達成するためにアリール環上のジ−およびトリアリールメチン構造に置換していてよい。これらの基は、以下「Ｔ」として列挙する１つまたは複数の原子または基から選択されてよい。上記の目標に有用であり得るＲ１〜Ｒ４基の例は、−Ｈ、−ＣＨ3、（ＣＨ2）n−Ｔ、および置換されているアリールであり、置換基は、以下「Ｔ」として列挙する原子または基から選択され、ｎ＝０〜６である。これらの構造において「Ｔ」は、−Ｈ、−ＯＨ、ＣＯＯ−、ＳＯ3-、−ＰＯ4-、アミド、ハロゲン、置換されている単一もしくは複数のアリール、エーテル、ポリエーテル、ＰＥＧｎ（ｎ＝１〜３０）、Ｎ、Ｓ、もしくはＯ原子を含む複素環、置換されているアセチレン基、シアノ、および炭水化物基から選択されてよい。本発明の一実施形態において、Ｒ１〜Ｒ４の１つは、ドナー色素に付着しているリンカーを含んでいる。
【００２８】
トリアリールメチン色素に対するＲ５基の例を以下に列挙し、置換基は上記「Ｔ」の下に列挙したものから選択することができる。存在する場合、ヘテロ原子、Ｘ、およびＹは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＣ（ＣＨ3）2から選択することができる。本発明の一実施形態において、置換基の１つはドナー色素に付着しているリンカーである。
【００２９】
【化２】
2016014033.tif 000004
【００３０】
ジアリールメチン（diarylmethine）アクセプター色素に対するＲ５基の例は、上記「Ｔ」の下に列挙したものから選択することができる。本発明の好ましい一実施形態において、置換基の１つは、ドナー色素に付着しているリンカーである。
【００３１】
光の吸収および発光系を担う共鳴電荷非局在化系の末端成分である窒素または酸素分子がインタクトのままである限り、ジおよびトリアリールメチン色素はさらなる縮合環を含むこともできる。これらの縮合環化合物は、望ましい方向でアクセプターの吸収および発光の波長を調節するのに有用であり得る。置換基が上記「Ｔ」の列挙から選択される簡単な一例を以下に示す。
【００３２】
【化３】
2016014033.tif 000005
【００３３】
以下は、モノメチンである、またはさらなるメチン基を含んでいる、置換されているシアニン、メロシアニン（merocyanines）、スチリル、およびオキソノール色素を含むシアニン色素ファミリーのメンバーである。一実施形態によると、アクセプターはジアリールメチン（diarylmethine）またはトリアリールメチン（triarylmethine）である。例えば、アクセプターは以下の構造を有し、
【００３４】
【化４】
2016014033.tif 000006
【００３５】
式中、Ｒ１は、芳香族、ヘテロ芳香族、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アルカノイル（ａｌｋａｎｏｙｌ）（アルコール、例えば、Ｎ−ヒドロキシエチル）であり、Ｒ２は、Ｈ、シアノ、芳香族、ヘテロ芳香族、アセチレン、アルキルであり、Ｘは、Ｎ、Ｏ、またはＳであり、Ｒ３およびＲ４は、アルキル、アリール、もしくはヒドロキシエチルである。アクセプターは、典型的に、Ｒ２によってリンカー／デンドロンに付着している。ある実施形態において、Ｒ１はＣ1~3ジ−アルキルアミノ、例えば、−Ｎ−（ＣＨ3）2であり、Ｒ２は、アミノまたは置換されているアミノ基などで置換されている、置換されているフェニルアセチレン、例えば、−Ｎ−（ＣＨ3）2；−Ｎ−（ＣＨ3）（（ＣＨ2）nＯ（ＣＨ2）mＣＯＯＨ）であり、式中、ｎおよびｍは独立に、１、２、３、もしくは４であり、または−Ｎ−（ＣＨ3）（（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）3ＣＯＯＨ）、フェニル、−Ｎ−アルキル置換されているフェニル、−Ｏ−（ＣＨ2）nＲ５で置換されているフェニルであり、式中、ｎは１〜５であり、Ｒ５はカルボキシルまたはアミノであり、Ｒ３およびＲ４は独立に、Ｃ1~3アルキル、アルコキシル、アルカノイル（alkanoyl）、フェニル、Ｃ1~3アルキル置換されているフェニルである。一実施形態において、Ｒ１は−Ｎ−（ＣＨ3）2であり、Ｒ２は、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｒ５で置換されているフェニルおよび
【００３６】
【化５】
2016014033.tif 000007
【００３７】
の１つであり、かつ／またはＲ３およびＲ４はＣＨ3である。アクセプターはダイドロンにＲ１〜Ｒ４のいずれか１つを介して付着している。
【００３８】
他の実施形態において、アクセプターは、
【００３９】
【化６】
2016014033.tif 000008
【００４０】
の１つの、リンカーが修飾する誘導体である。
【００４１】
ある実施形態において、アクセプターは、構造ＩＶ、Ｖ、およびＶＩ：
【００４２】
【化７】
2016014033.tif 000009
【００４３】
によって表され、式中、曲線は、１個の環、２個の縮合環、および３個の縮合環から選択される構造を完成するのに必要な原子を表し、前記環の各々は５個または６個の原子を有し、前記環の各々は、炭素原子、および任意選択的に、酸素、窒素、およびイオウから選択される２個を超えない原子を有し、Ｄは、存在する場合には、
【００４４】
【化８】
2016014033.tif 000010
【００４５】
であり、ｍは１、２、３、または４であり、シアニン、オキソノール、およびチアゾールオレンジに対してｍは０であってよく、ＸおよびＹは独立に、Ｏ、Ｓ3、および−Ｃ（ＣＨ3）2−からなる群から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の少なくとも１つは、水溶性および非特異性の結合を制御する部分、レポーター分子が膜を介して細胞に侵入するのを防ぐ部分、任意選択的にリンカー、ビオチンハプテン、Ｈｉｓ−タグを含む群、または選択の実体を単離するプロセスを促進する他の部分からなる群から選択され、蛍光標識は、場合により、リンカー、光反応性基、または反応性基（例えば、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン（monochlorotriazine）、ジクロロトリアジン（dichlorotriazine）、モノ−もしくはジ−ハロゲン置換されているピリジン、モノ−もしくはジ−ハロゲン置換されているジアジン、ホスホラミダイト、マレイムニド（maleimnide）、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシンイミドエステル（hydroxysuccinimide ester）、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（hydroxysulfosuccinimide ester）、イミドエステル、ヒドラジン、アキシドニトロフェニル（axidonitrophenyl）、アジ化物、３−（２−ピリジルジチオ）−プロプリオナミド（proprionamide）、グリオキサール、ハロアセトアミド（haloacetamido）、またはアルデヒドを含む群）を含み、Ｒ１およびＲ２は、−ＣＨＲ8−ＣＨＲｓ−、または−ＢＦ2−ビラジカルによって連結されていてよいことをさらに提供し、この場合、Ｒ８は、各出現に対して独立に、水素、アミノ、４級アミノ、アルデヒド、アリール、ヒドロキシル、ホスホリル、スルフヒドリル、水溶性基、炭素原子２６個以下のアルキル基、脂溶性基、炭化水素可溶性基、極性溶媒中の可溶性を促進する基、非極性溶媒中の可溶性を促進する基、およびＥ−Ｆからなる群から選択され、またＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７のいずれかは、ハロ（halo）、ニトロ、シアン、−ＣＯ2アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯ2アリール、ＮＯ2、もしくはアルコキシで置換されていてよいことをさらに提供し、この場合、  
Ｆは、ヒドロキシ、保護されているヒドロキシ、アルコキシ、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、および低級アルキル置換されているアミノまたは４級アミノからなる群から選択され、
Ｅは、式−（ＣＨ2）n−のスペーサー基であり、式中、ｎは０〜５の整数（境界を含む）であり、  
あるいは、Ｅは、式−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）n−のスペーサー基であり、式中、ｎは０〜５の整数（境界を含む）である。
【００４６】
他の実施形態において、構造ＩＶ、V、およびＶＩにおいてｍ＝０である場合、以下の一般構造ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸが与えられ、
【００４７】
【化９】
2016014033.tif 000011
【００４８】
式中、曲線は、１個の環、２個の縮合環、および３個の縮合環から選択される構造を完成するのに必要な原子を表し、前記環の各々は５個または６個の原子を有し、前記環の各々は、炭素原子、および任意選択で、酸素、窒素、およびイオウから選択される２個を超えない原子を含み、Ｄは、存在する場合には、
【００４９】
【化１０】
2016014033.tif 000012
【００５０】
であり、ＸおよびＹは独立に、Ｏ、Ｓ、および−Ｃ（ＣＨ3）2−からなる群から選択され、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７の少なくとも１つは、水溶性および非特異性の結合を制御する部分、レポーター分子が膜を介して細胞に侵入するのを防ぐ部分、場合により、リンカー、ビオチン、ハプテン、Ｈｉｓ−タグを含む群、または選択の実体を単離するプロセスを促進する他の部分からなる群から選択され、蛍光標識は、場合により、リンカー、光反応性基、または反応性基（例えば、イソチオシアネート、イソシアネート、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、モノ−もしくはジ−ハロゲン置換されているピリジン、モノ−もしくはジ−ハロゲン置換されているジアジン、ホスホラミダイト、マレイムニド（ｍａｌｅｉｍｎｉｄｅ）、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、酸ハロゲン化物、ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アキシドニトロフェニル、アジ化物、３−（２−ピリジルジチオ）−プロプリオナミド、グリオキサール、ハロアセトアミド、またはアルデヒドを含む群）を含み、Ｒ１およびＲ２は、−ＣＨＲ8−ＣＨＲｓ−、または−ＢＦ2−ビラジカルによって連結されていてよいことをさらに提供し、  
この場合、Ｒ8は、各々の出現に対して独立に、水素、アミノ、４級アミノ、アルデヒド、アリール、ヒドロキシル、ホスホリル、スルフヒドリル、水溶性基、炭素原子２６個以下のアルキル基、脂質可溶性基、炭化水素可溶性基、極性溶媒中の可溶性を促進する基、非極性溶媒中の可溶性を促進する基、およびＥ−Ｆからなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、またはＲ７のいずれかは、ハロ(halo)、ニトロ、シアン、−ＣＯ2アルキル、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＯ2アリール、ＮＯ2、もしくはアルコキシで置換されていてよいことをさらに提供し、  
Ｆは、ヒドロキシ、保護されているヒドロキシ、アルコキシ、スルホネート、スルフェート、カルボキシレート、および低級アルキル置換されているアミノ、または４級アミノからなる群から選択され、  
Ｅは、式−（ＣＨ2）n−のスペーサー基であり、式中、ｎは０〜５の整数（境界を含む）であり、  
あるいは、Ｅは、式−（ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2）n−のスペーサー基であり、式中、ｎは０〜５の整数（境界を含む）である。
【００５１】
以下は、構造ＩＶ、Ｖ、およびＶＩによるレポーター分子のより具体的な例である。
【００５２】
【化１１】
2016014033.tif 000013
【００５３】
これらの構造において、ＸおよびＹは、Ｏ、Ｓ、および−ＣＨ（ＣＨ3）2−からなる群から選択され、Ｚは、ＯおよびＳからなる群から選択され、ｍは、０、１、２、３、および４からなる群から選択される整数であり、好ましくは１〜３の整数である。上記の式において、メチン基の数が励起色を部分的に決定する。
【００５４】
環状アジン構造もまた、励起色を部分的に決定し得る。しばしば、ｍの値が大きければ、ルミネセンス（発光）および吸収の増大に寄与する。ｍの値が４を超えると、化合物は不安定になる。その結果、環状構造を修飾することによってさらなる発光が得られ得る。ｍ＝２のとき、励起波長は約６５０ｎｍであり、化合物は非常に蛍光性である。最大発光波長は、通常、最大励起波長よりも１５〜１００ｎｍ大きい。
【００５５】
本発明のルミネセンス（発光）色素のポリメチン鎖は、ポリメチン鎖の２つ以上の炭素原子の間に架橋を形成する１つまたは複数の環状化学基も含むことができる。これらの架橋は、色素の化学的または光安定性を増大するように働くことがあり、色素の吸収および発光の波長を変更するのに、または吸光係数もしくは量子収率を変えるのに用いられ得る。この修飾によって、溶解性の性質の改善が得られることがある。
【００５６】
様々な実施形態において、アクセプターとアクチベーターとの、場合により標的分子が選択性成分と相互作用するときのアクセプター色素の変化は、例えば、吸収波長のシフト、発光波長のシフト、量子収量率の変化、色素分子の極性の変化、および／または蛍光強度の変化を含むことができる。変化は、２倍、１０倍、１００倍、１０００倍、またはさらに高くてもよい。所与のアクセプターに関連するスペクトルの変化を検出するのに適するあらゆる方法を用いることができ、センサー色素のスペクトルの変化を検出するのに適する機器には、例えば、蛍光分光計、フィルター蛍光光度計、マイクロアレイリーダー、光ファイバーセンサーリーダー、落射蛍光顕微鏡、共焦点レーザースキャニング（走査）顕微鏡、２光子励起顕微鏡、およびフローサイトメーターが含まれる。
【００５７】
アクチベーターは選択性成分と会合していてよい。例えば、アクセプターは、選択性成分に共有結合的に付着していてよい。アクチベーターは、標準の技術を用いて選択性成分に共有結合的に付着していてよい。例えば、アクチベーターは、２個の分子上の１つまたは複数の反応基間に化学結合を形成することによって、選択性成分に直接付着していてよい。例えば、アクチベーター上のチオール反応基が、選択性成分上のシステイン残基（または他のチオール含有分子）に結合している。あるいは、アクチベーターは、選択性成分上のアミノ基を介して選択性成分に結合していてよい。別の実施形態において、アクチベーターおよび選択性成分は、近接する融合タンパク質上に提示される。他の実施形態において、アクチベーターは、リンカー基を介して選択性成分に結合していてよい。適切なリンカーには、例えば、化学基、アミノ酸または２つ以上のアミノ酸の鎖、ヌクレオチドまたは２つ以上のヌクレオチドの鎖、ポリマー鎖、および多糖類が含まれる。一例において、アクチベーターは、マレイミド部分を有するリンカーを用いて選択性成分に付着している。リンカーは、ホモ官能性（同じタイプの反応基を含む）、ヘテロ官能性（異なる反応基を含む）、または光反応性（照射時に反応性になる基を含む）であってよい。ニトレンファミリーにおける基など、様々な光反応性基が知られている。
【００５８】
１つまたは複数のアクチベーターが、選択性成分上の１つまたは複数の位置に付着していてよい。例えば、同じアクチベーターの２つ以上の分子が、単一の選択性成分分子上の異なる位置に付着していてよい。あるいは、２つ以上の異なるアクチベーターが、単一の選択性成分の分子上の異なる位置に結合していてよい。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超えるアクチベーターが、選択性成分上の異なる部位に付着している。１つまたは複数のアクチベーターが、アクチベーターおよび選択性成分の活性を維持するように選択性成分に結合していてよい。
【００５９】
ある実施形態において、アクチベーターは選択性成分に特異的である部分をさらに含んでいる。例えば、アクチベーターは、選択性成分に特異的である、基質、ハプテン、抗体フラグメント、または他の結合試薬などに連結していてよい。アクチベーターは、標準の技術を用いて部分に共有結合的に付着していてよい。ある実施形態において、アクチベーターは、２個の分子上の１つまたは複数の反応性基間に化学結合を形成することによって、部分に直接付着していてよい。他の実施形態において、アクチベーターは、リンカー基を介して部分に付着していてよい。適切なリンカーには、例えば、化学基、アミノ酸または２つ以上のアミノ酸の鎖、ヌクレオチドまたは２つ以上のポリヌクレオチドの鎖、ポリマー鎖、および多糖類が含まれる。リンカーは、ホモ官能性（同じタイプの反応基を含む）、ヘテロ官能性（異なる反応基を含む）、または光反応性（照射時に反応性になる基を含む）であってよい。
【００６０】
ドナーおよびアクセプターは、典型的に、少なくとも３個の分枝、２つ以上のドナーについては少なくとも２個、およびアクセプターについては少なくとも１個を有するリンカーによって接続されている。リンカーは、多分散度の低いもしくは単分散性（ＰＤ＝１）のデンドロンであってよく、または分枝もしくはスターグループ（ｓｔａｒ ｇｒｏｕｐ）もしくはポリマーであってよい。スターポリマー（星型高分子）は、フリーラジカル法、好ましくは、低多分散に対してリビングラジカル重合法、例えば、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を含めた標準の重合法によって調製することができる。アクセプターの効率的な活性化、および生成物の機能における一貫性を含めた多くの理由から、連結基は構造の規定されたデンドロンであるのが多くの場合において好ましい。一実施形態において、連結基はデンドロン、例えば、ＰＡＭＡＭ、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、およびポリプロピレンイミン（ＰＰＩ）デンドロンである。他のデンドロンには、Ｎｅｗｋｏｍｅデンドロン、２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸（ｂｉｓ−ＭＰＡ）、およびポリフェニレンデンドロンが含まれる。多くのデンドロンが市販されており、これらの合成化学は十分に特徴付けられている。デンドロンは、小型ユニットを繰り返し付加することを伴う「クリック化学」によって調製され得る。デンドロンは分岐的に、すなわち、インサイドアウト（ｉｎｓｉｄｅ ｏｕｔ）から、またはアウトサイドイン（ｏｕｔｓｉｄｅ ｉｎ）から構築することができる。
【００６１】
ＰＡＭＡＭデンドロンでは、例えば、コア分子としてアンモニアまたはエチレンジイミンが用いられる。メタノールの存在下、これをアクリル酸メチルと反応させ、次いでエチレンジイミンを加える。
ＮＨ3＋３ＣＨ2ＣＨＣＯＯＣＨ3→Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＣＨ3）3（１）
Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＣＨ3）3＋３ＮＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2→Ｎ（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）3＋３ＣＨ3ＯＨ（２）
各分枝の末端に、２つのアクリル酸メチルモノマーおよび２つのエチレンジアミン分子と反応することができる遊離アミノ基が存在する。各々の完全な反応順序により、新しいデンドロンの生成がもたらされる。半世代のＰＡＭＡＭデンドロン（例えば、０．５、１．５、２．５）は、カルボキシレート基の陰イオン表面を有する。反応性表面部位の数は、世代ごとに２倍になる。例えば、ポリ（プロピレンイミン）デンドロンに対して、ブチレンジアミン（butylenediamine；ＢＤＡ）をコア分子として用いることができる。繰り返しの反応順序は、１級アミノ基へのアクリロニトリルのＭｉｃｈａｅｌ添加、およびその後ニトリル基の１級アミノ基への水素付加を伴う（例えば、非特許文献４を参照されたい）。
【００６２】
ＰＡＭＡＭデンドロンは、下記に示す通りに合成され得る。ＰＡＭＡＭから形成されたデンドロンの材料は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉから市販されている（例えば、１級アミノ基４個を有する世代０、１級アミノ基８個を有する世代１、１級アミノ基１６個を有する世代２、１級アミノ基３２個を有する世代３、および１級アミノ基６４個を有する世代４）。ポリプロピレンイミンから形成されたデンドロンの材料は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌから「ＤＡＢ−ＡＭ」の商標名の下で市販されている。例えば、ＤＡＢ−Ａｍ−４は１級アミノ基４個を有する世代１のポリプロピレンイミンテトラアミン（polypropylenimine）デンドロンであり、ＤＡＢ−Ａｍ−８は１級アミノ基８個を有する世代２のポリプロピレンイミンオクタアミン（polypropylenimine octaamine）デンドロンであり、ＤＡＢ−Ａｍ−１６は１級アミノ基１６個を有する世代３のポリプロピレンイミンヘキサデカアミン（polypropylenimine hexadecaamine）デンドロンであり、ＤＡＢ−Ａｍ−３２は１級アミノ基３２個を有する世代４のポリプロピレンイミンドトリアコンタアミン（polypropylenimine dotriacontaamine）デンドロンであり、ＤＡＢ−Ａｍ−６４は１級アミノ基６４個を有する世代５のポリプロピレンイミンテトラヘキサコンタアミン（polypropylenimine tetrahexacontaamine）デンドロンである。２，２−ビス（ヒドロキシル−メチル）プロピオン酸（ＭＰＡ）から形成されるデンドロンの材料も、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能である。他の市販の供給源には、数ある中で、Ｍｏｕｎｔ Ｐｌｅａｓａｎｔ、ＭｉｃｈｉｇａｎのＤｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭｉｃｈｉｇａｎのＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．、およびＮａｃｋａ、ＳｗｅｄｅｎのＰｏｌｙｍｅｒ Ｆａｃｔｏｒｙが含まれる。
【００６３】
一例において、ダイドロン合成において有用なデンドロンは、デンドロンが別々の部分（例えば、半分）に分割することができるように、分割可能なコアを含んでいる。このようなデンドロンの一例は、システアミンコアＰＡＭＡＭデンドリマーである。一例において、得られたデンドロンの末端は、それに対してドナーが付着することができる２つ以上の活性基を含んでおり、「頭部」は、それに対してアクセプターが付着することができる異なる活性基を含んでいる。これにより、単一のアクセプターに連結している２つ以上のドナーを含むダイドロンの別々の官能性および容易な調製が可能となる。
【００６４】
本明細書に記載するダイドロン系のアクチベーター成分は、アクセプターとあらゆる方法で相互作用して（例えば、アクセプターを結合することによって）アクセプターを蛍光性にし、ますます蛍光性にし、かつ／またはダイドロンの吸収スペクトル（典型的に、ドナーの吸収スペクトル）内の照明に反応してその発光スペクトルをシフトする、結合試薬、結合パートナー、リガンド、ＦＡＰなどである。好適には、アクチベーターのアクセプターへの結合の非存在、アクセプターは蛍光発光せず、または非現実的には検出波長で蛍光発光する。アクセプターは別の波長では蛍光発光することがあるが、検出波長で蛍光の検出を妨害する方法で、または検出波長で蛍光の検出を本質的に妨害する方法で蛍光発光してはならない。アクチベーターによるアクセプターの結合の非存在下では低レベルの蛍光が存在することがあるが、アクチベーターがアクセプターに結合している場合はバックグラウンドの蛍光は得られた蛍光のレベルよりはるかに低くなければならないことを認識しなければならない。アクチベーターが結合したダイドロンの、アクチベーターが非結合のダイドリマー（ｄｙｄｒｉｍｅｒ）に対する蛍光における「増幅率」は、少なくとも１００倍、１０００倍、１０，０００倍、またはさらに大きいのが好ましい。最適の一実施形態において、アクセプターは、アクチベーターが結合していない場合は蛍光発光せず、または実世界においてより可能性がある通り、アクチベーターが結合していなければ実質的に蛍光発光しない。実際の使用において、あるレベルのバックグラウンドの蛍光が存在するが、実質的でないのが好ましい。
【００６５】
本明細書の実施例に記載する通り、アクチベーターの非限定的な一実施形態は、所与の刺激波長および強度でアクセプターの蛍光を増大するように、蛍光団および／またはダイドロン化合物に結合するあらゆる有用な手段によって生成されるペプチドである、ＦＡＰ（蛍光団が活性化するペプチド）である。実施例に記載する通り、ＦＡＰの一実施形態は、酵母細胞表面ディスプレイライブラリーから得られ、蛍光発光するようにアクセプターを活性化するｓｃＦｖフラグメントである。酵母ディスプレイライブラリーの使用、およびＦＡＰを発現する特異的なクローンの同定は、特異的なクローンが所与のダイドロン系におけるより望ましい活性を有する誘導体を生成する定向進化を許す。その一例を、親のｓｃＦｖ Ｌ５−ＭＧ、ならびに進化した誘導体であるＦＡＰ Ｌ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄ、Ｌ５−ＭＧ Ｌ９１Ｓ、およびＬ５−ＭＧ Ｅ５２Ｄ Ｌ９１Ｓに関して以下に記載する。
【００６６】
当業者には容易に明らかである通り、適切なアクチベーターを生成するための方法は多数存在する。考えを証明するものとして本明細書に示す通り、酵母ディスプレイライブラリーを用いた選択および進化は、有用なＦＡＰを生成するための効果的な機序である。アクチベーターはペプチドであり得ることは明らかでなければならないが、核酸およびその誘導体、例えばアプタマーなどの他の分子であってもよい。小分子、天然分子、合成分子などのライブラリーなどの分子ライブラリーも、ダイドロンを単に化合物に曝露し、本明細書に記載する通り化合物がダイドロンを効率的に活性化できるか否かを決定することによって、アクセプターの活性化に対して容易にスクリーニングすることもできる。ダイドロンを、ランダムポリペプチドのライブラリーに対して、またはｓｃＦｖフラグメントもしくは他の抗体フラグメントなどの結合性の物質のライブラリーに対してスクリーニングしてもよい。細菌、酵母、ファージなどによって発現される、タンパク質／ペプチドのフラグメントまたはアプタマーの発現ライブラリーを、コロニーの蛍光、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、または表面結合性ダイドロンの親和性およびその後の保持されているファージ、細胞などの増幅によってスクリーニングすることができる。ディスプレイ／発現ライブラリーの増殖、増幅、選別、変異はよく知られている。多くの市販のディスプレイ／発現ライブラリーが入手可能であり、その使用は当業者の範囲内に十分ある。
【００６７】
その全文が参照によって本明細書に組み込まれる特許文献１は、Ｌ５−ＭＧ ＦＡＰの調製だけではなく、それによってアクチベーター（特許文献１において記載されている選択性化合物）が選択され、評価され、用いられる多数の他の方法を詳しく記載している。その参照において、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た、組換えヒトｓｃＦｖの酵母細胞表面ディスプレイライブラリーが得られ、ＦＡＣＳの１つまたは複数のラウンドによって初めにクローンが選別され、所望の蛍光団を活性化する細胞を単離した。後に、ＦＡＣＳでスクリーニングされた細胞を、親和性選択またはさらなる細胞選別によってさらに濃縮した。
【００６８】
アクチベーターは、アクセプターと選択的に相互作用してアクセプター／ダイドロンに蛍光を発生させ、または蛍光を増大させることができるあらゆる分子であってよい。アクチベーターの非制限的な例には、ポリペプチド、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子もしくはゲノムのＤＮＡフラグメント）、炭水化物、または他の適切な有機分子もしくは無機分子が含まれる。
【００６９】
アクチベーターは、細胞または生物体の１つまたは複数の成分に結合し、それらと相互作用し、またはそれらを複製する選択性成分を含んでいてもよく、または結合していてもよい。選択性成分の非制限的な例には、タンパク質もしくはポリペプチド、抗体もしくは他の結合性物質、ならびにアプタマー、リガンド、アゴニストもしくはアンタゴニスト、代謝産物もしくは化学的部分、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、細胞、微生物（例えば、細菌、真菌、およびウイルス）、ホルモン、受容体、サイトカイン、薬物分子、炭水化物、駆除剤、色素、アミノ酸、有機小分子もしくは無機小分子、または脂質が含まれる。選択性成分のための好適例示の標的分子には、例えば、成長因子、サイトカイン、形態形成因子、神経伝達物質などの調節性分子を含めた、組織の分化および／または成長、細胞間コミュニケーション、細胞分裂、細胞の運動性、および細胞内もしくは細胞間で起こる他の細胞の機能に関与する分子が含まれる。ある実施形態において、標的分子は、骨形成タンパク質、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ならびに／またはhedgehogおよびＷｎｔポリペプチドファミリーのメンバーであってよい。選択性成分の他の例には、パスウェイおよびネットワークタンパク質（例えば、キナーゼもしくはホスファターゼなどの酵素）、抗体フラグメント、抗体以外の受容体分子、アプタマー、テンプレートインプリンテッド材料（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌ）、ならびに有機または無機の結合性エレメントが含まれる。限られた交差反応性を有する選択性成分が一般的に好ましい。
【００７０】
アクチベーターおよび選択性成分は、融合（キメラ）タンパク質、または単官能性成分の組合せなど、二官能性化合物、例えば、アクチベーターが連結基によって選択性成分に連結している架橋結合成物の部分であってよい。アクチベーターおよび選択性成分は、二官能性のキメラタンパク質、連結されている２つのｓｃＦｖフラグメント、またはタンパク質、抗体、もしくは他のポリペプチドに連結しているｓｃＦｖアクチベーターの場合におけるように、類似の化学的実体であってよい。これらはまた、アクチベーターがｓｃＦｖフラグメントなどのポリペプチドであり、選択性成分が、アプタマー、テンプレートインプリンテッド材料、代謝産物、脂質、多糖、ビリオンなどの核酸である場合におけるように、異なる化学的実体であってもよい。
【００７１】
ある実施形態において、アクチベーターおよび／または選択性成分は、抗体または抗体フラグメントである。例えば、アクチベーターは、モノクローナル抗体、またはその誘導体もしくは類似体であってよく、制限なく、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、単一ドメイン抗体、ｃａｍｅｌｉｚｅｄ抗体および抗体フラグメント、ヒト化抗体および抗体フラグメント、ならびに前述の多価バージョンを含み、多価アクチベーターは、制限なく、単一特異性または二特異性抗体、例えば、ジスルフィド安定化したＦｖフラグメント、ｓｃＦｖタンデム（（ｓｃＦｖ））2フラグメント）；典型的に共有結合的に連結している、または別の方法で安定化されている（すなわち、ロイシンジッパー、もしくはヘリックス安定化されている）ｓｃＦｖフラグメントである、ダイアボディ、トリボディ、またはテトラボディ；所望の標的分子と天然に相互作用する受容体分子を含む。
【００７２】
一実施形態において、アクチベーターおよび／または選択性成分は抗体である。抗体の調製は、モノクローナル抗体を産生するためのあらゆる数のよく知られている方法によって遂行されてよい。これらの方法は、動物、典型的にはマウスを、所望の免疫原（例えば、所望の標的分子、またはそのフラグメント）で免疫化するステップを典型的に含む。マウスを免疫化したら、所望の（１つもしくは複数の）免疫原で１回または複数回追加免疫するのが好ましく、モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを調製し、よく知られている方法にしたがってスクリーニングしてもよい（モノクローナル抗体生成の一般的な概要には、例えば、非特許文献５を参照されたい）。
【００７３】
抗体および他の結合試薬の生成はとりわけ強固となっている。抗体認識とファージディスプレイ技術とを組み合わせたｉｎ ｖｉｔｒｏの方法により、非常に特異的な結合能力で、抗体または他の結合試薬の増幅および選択が可能となる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、非特許文献６を参照されたい。これらの方法は、典型的に、伝統的なモノクローナル抗体調製方法によるハイブリドーマの調製よりも煩雑さが相当低い。結合性のエピトープは、ブロモウリジンおよびリン酸化チロシンなどの小型有機化合物から、長さ約７〜９個のアミノ酸のオリゴペプチドまでのサイズの範囲であってよい。
【００７４】
別の実施形態において、アクチベーターおよび／または選択性成分は、抗体フラグメントであってよい。抗体フラグメントの選択および調製は、あらゆる数々のよく知られている方法によって遂行することができる。ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびリボソームディスプレイの方法を利用して同定してもよく、クローム（ｃｌｏｍｅ）が望まれる技術を用いて、所望の標的分子に特異的である抗体フラグメントアクチベーターを生成してもよい（例えば、Ｆａｂフラグメント、ＶH−ＶＬ対を安定化するための構築された分子間ジスルフィド結合を有するＦvs、ｓｃＦｖ、またはディアボディフラグメントを含む）。
【００７５】
ある実施形態において、アクチベーターは、配列番号３〜９のポリペプチド配列のいずれかに、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含んでいる（図１２Ａおよび１２Ｂ）。アクチベーターを生成するためのベクターを、下記、および特許文献１に記載する通りに、配列番号３または他のアクチベーター配列（配列番号４〜９）のポリペプチドをコードする核酸を、ｐＰＮＬ６プラスミドの隣接するＨＡとｃ−ｍｙｃエピトープおよびそのホモログ（例えば、図４における配列番号４）との間のフレーム中に挿入し、本明細書および特許文献１に記載する通り、宿主細胞にトランスフェクトするために用いて調製してもよい。
【００７６】
ファージ、細菌、酵母、リボソーム、およびｍＲＮＡのディスプレイ方法を含めたディスプレイ方法を用いたｓｃＦｖ抗体フラグメントの生成を用いて、本明細書に記載する、アクチベーターおよび／または選択性成分を生成することができる。下記の通り、酵母ディスプレイ方法を用いて、下記のアクチベーターを生成した。酵母ディスプレイ方法は、例えば、非特許文献７、非特許文献８、および非特許文献９に記載されている。
【００７７】
リボソームディスプレイも、アクチベーターおよび／または選択性成分を生成するのに有用な方法である。リボソームディスプレイは、所望のリガンドに結合することができるタンパク質を作製するためのｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質の進化を行うのに用いられる技術である。このプロセスにより、選択ステップにおいて固定化リガンドに結合し、複合体として、これらのｍＲＮＡ前駆体に関連する翻訳タンパク質がもたらされる。このｍＲＮＡはランダムポリペプチドをコードしており、その多様性はファージディスプレイおよび酵母ディスプレイ系をはるかに凌ぐことがある。リガンドに良好に結合するｍＲＮＡ−タンパク質ハイブリッドを、次いで、ｃＤＮＡに逆転写し、その配列をＰＣＲによって増幅する。最終結果は、緊密に結合するタンパク質を作製するのに用いることができるヌクレオチド配列である（例えば、非特許文献１０、非特許文献１１、および非特許文献１２を参照されたい）。
【００７８】
リボソームディスプレイは、ＤＮＡ配列、または特定のタンパク質をコードする配列のナイーブライブラリーのいずれかで開始する。配列は転写され、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳される。しかし、結合性タンパク質の特定のライブラリーをコードするＤＮＡライブラリーは、遺伝学的には終止コドンを欠くスペーサー配列に融合している。このスペーサー配列は、翻訳されるとき、ペプチジルｔＲＮＡに依然として結合しており、リボソームトンネルを占め、このように対象のタンパク質をリボソームから突出し、折り畳む。得られるのは、表面結合性リガンドに結合することができる、ｍＲＮＡ、リボソーム、およびタンパク質の複合体である。この複合体を温度の低下およびＭｇ2+などの陽イオンの添加で安定化する。
【００７９】
その後の結合またはパニングの段階の間、リボソーム複合体が、表面結合性リガンドに導入される。これはいくつかの方法で、例えば、リガンドを含むレジンベッドを有するアフィニティクロマトグラフィーカラム、固定化した表面結合性リガンドを有する９６ウェルプレート、またはリガンドでコーティングしてある磁気ビーズを用いて遂行することができる。良好に結合する複合体を固定化する。引き続き、高い塩濃度、キレート化剤、またはタンパク質の結合モチーフと複合する非固定化リガンドによって結合剤を溶出することで、ｍＲＮＡを解離させる。次いで、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写して戻し、変異誘発を起こさせ、より大きな選択的な圧力を有するプロセスに繰り返し送り込んでさらによく結合剤を単離することができる。
【００８０】
これは全てｉｎ ｖｉｔｒｏで行うので、他の選択技術を凌ぐリボソームディスプレイ方法の主な利点が２つある。第一に、ライブラリーの多様性は細菌細胞の形質転換の効率によって制限されるのではなく、試験管中に存在するリボソームおよび異なるｍＲＮＡ分子の数によってのみ制限される。第二に、いかなる多様化のステップの後にもライブラリーは形質転換されてはならないので、各選択ラウンドの後、ランダム変異が容易に導入され得る。これにより、いくつかの世代にわたる結合性タンパク質の定向進化が容易になる。
【００８１】
ファージディスプレイおよび酵母ディスプレイなどのあるディスプレイ方法において、ＶH鎖およびＶL鎖のライブラリーが、ナイーブの、または免疫化した動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、および他の動物）いずれかのＢ細胞のｍＲＮＡから、またはポリクローナルもしくはモノクローナルのハイブリドーマからも調製される。ポリＡプライマーまたは典型的に所望のＶH鎖およびＶL鎖に隣接する配列に特異的である、マウスの免疫グロブリンに特異的なプライマー（１つもしくは複数）のいずれかを用いて、知られている方法によってｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを得る。所望のＶH鎖およびＶL鎖を、典型的にＶHおよびＶLに特異的なプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、共ににリンカーに連結し、分離する。ＶHおよびＶLに特異的なプライマーセットは、例えば、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣａｌｉｆｏｒｎｉａのＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から市販されている。構築されたＶH−リンカー−ＶL生成物（ｓｃＦｖフラグメントをコードする）を選択し、ＰＣＲによって増幅する。制限部位を、制限部位を含むプライマーを用いて、ＶH−リンカー−ＶLＰＣＲ生成物の末端にＰＣＲによって導入し、ｓｃＦｖフラグメントをファージディスプレイに適する発現ベクター（典型的にはプラスミド）中に挿入する。Ｆａｂ’フラグメントなどの他のフラグメントを、ファージ粒子上の表面発現用のファージディスプレイベクター中にクローニングしてもよい。ファージは、ラムダなど、あらゆるファージであってよいが、典型的には、ｆｄおよびＭ１３などの繊維状ファージ、典型的にはＭ１３である。
【００８２】
ディスプレイベクターにおいて、ＶH−リンカー−ＶL配列を表面タンパク質（例えば、Ｍ１３に対して表面タンパク質ｇ３ｐ（ｐＨＩ）またはｇ８ｐ、最も典型的にはｇ３ｐ）中にクローニングする。ディスプレイシステムはファージミドシステムも含み、ファージミドシステムは、ファージ表面タンパク質遺伝子（例えば、Ｍ１３のｇ３ｐおよびｇ８ｐ）、ならびにファージの複製開始点を含むファージミドプラスミドベクターをベースにしている。ファージ粒子を生成するために、ファージミドを含む細胞を、ファージの生成に必要とされる残りのタンパク質を提供するヘルパーファージでレスキューする。ファージミドの複製はヘルパーファージＤＮＡの複製を著しく凌ぐので、ファージミドベクターだけが、得られたファージ粒子中にパッケージングされる。抗体を生成するためのファージミドパッケージング系は市販されている。細菌細胞中で可溶性ＳｃＦｖフラグメントの生成も可能にする市販のファージミドパッケージング系の一例は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから市販されているＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＰＡＳ）、およびＭｏＢｉＴｅｃ（Ｂｏｃａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）から市販されているｐＳＫＡＮ Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｓｙｓｔｅｍである。ファージディスプレイ系、これらの構築およびスクリーニング方法は、数ある中で、各々がその全文において参照によって本明細書に組み込まれる、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５に詳しく記載されている。
【００８３】
典型的に、抗体フラグメントなどの所望のポリペプチドをディスプレイする、ファージ、酵母、細菌、リボソームなどのクローンの集団を生成した後は、所望の免疫原に対するこれらの親和性によってエピトープに特異的なクローンを選択し、場合により、これらの親和性の欠如を、免疫原に結合しているクローンを非結合性のクローンから物理的に分離するのに用いる。典型的に、免疫原は表面に固定され、クローンは表面と接触する。非結合性のクローンは洗い流されるが、結合性のクローンは結合したままである。結合しているクローンを溶出し、増殖させて選択されたクローンを増幅する。親和性の増大する免疫原に結合しているクローンを増幅するために、しばしば厳密性がますます高い洗浄で、数々の反復性のラウンドの親和性選択を典型的に用いる。所望の標的に対する結合の欠如に対して選択するためにネガティブ選択技術を用いてもよい。この場合、結合していない（洗浄された）クローンが増幅される。本発明の状況において、結合しているダイドロンの蛍光を、クローンを同定するための選択可能なマーカーとして用いることができる。ＦＡＣＳなどのハイスループットの方法を、クローンを選択するのに最初に用い、その後、場合により、蛍光画像化技術によって塗抹したコロニーにおける蛍光を検出してもよい。
【００８４】
ＲＴ−ＰＣＲによってＶHおよびＶL鎖の配列が増幅されているｃＤＮＡの供給源として、所望の免疫原で予め免疫化した動物からの脾臓の細胞および／またはＢリンパ球を用いるのが好ましいが、親和性によって、典型的には上記のファージディスプレイ（ファージミド）方法によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで選択されたＶＨおよびＶL鎖のポリクローナルのセットを生成するためのｃＤＮＡの供給源として、ナイーブの（標的の免疫原で免疫化していない）脾細胞および／またはＢ細胞を用いてもよい。ナイーブのＢ細胞を用いる場合、親和性選択の間、第１の選択ステップの洗浄は、ポリクローナルファージライブラリー中に非常に少ないコピー数存在することがあるあらゆる単一のクローンの喪失を避けるために、典型的に厳密性が非常に高い。このナイーブの方法によって、Ｂ細胞をあらゆるポリクローナルの供給源から得てもよく、Ｂ細胞または脾細胞のｃＤＮＡライブラリーも、そこからＶＨおよびＶL鎖が増幅され得るｃＤＮＡの供給源である。例えば、適切なマウスおよびヒトのＢ細胞、リンパ球、および脾細胞のｃＤＮＡライブラリーはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。ファージミド抗体ライブラリーおよび関連のスクリーニングサービスは、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ、Ｎｏｒｔｈ ＣａｒｏｌｉｎａのＭｏｒｐｈｏＳｙｓＵＳＡ，Ｉｎｃ．から商業的に提供されている（ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ）。
【００８５】
アクチベーターおよび／または選択性成分は、生物学的供給源に、例えば、動物またはヒトのナイーブまたは免疫化した細胞から生じている必要はない。アクチベーターおよび／または選択性成分を、合成ペプチドのコンビナトリアルライブラリーからスクリーニングしてもよい。このような一方法は、Ｍ１３のピル遺伝子（ｐｉｌｌ ｇｅｎｅ）におけるランダムアミノ酸の挿入を有するファージミドライブラリーの生成を記載している、参照によって本明細書に組み込まれる、特許文献６に記載されている。これらのファージは、上記の親和性選択によってクローン的に増幅されてよい。
【００８６】
培養ディッシュまたはフラスコにおけるパニングは、結合性クローンを非結合性クローニングから物理的に分離する一方法である。パニングは、所望の免疫原構造が固定化されている９６ウェルプレートにおいて行うことができる。官能基化されている９６ウェルプレートは、典型的にＥＬＩＳＡプレートとして用いられ、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、ＩｌｌｉｎｏｉｓのＰｉｅｒｃｅから購入することができる。ダイドロンは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＮＨ2またはＣＯＯＨで官能基化されたプレート上で直接合成されてよい。所望の特異性を有するクローンを単離するための他の親和性の方法は、ダイドロンをビーズに固定することを含む。標準の手順にしたがって、ビーズをカラム中に配置してもよく、クローンはカラムに結合しており、洗浄され、溶出されてよい。あるいは、結合性の粒子を非結合性の粒子からの磁性分離を可能にするために、ビーズは磁性であってよい。免疫原はまた、多孔性の膜またはマトリックスに固定されていてもよく、結合性クローンの容易な洗浄および溶出が可能になる。
【００８７】
ある実施形態において、親和性選択プロセスにおけるネガティブ選択のステップを用いて、所与の標的分子またはレポーター分子に対するアクチベーターの特異性を増大するのが望ましいことがある。例えば、アクチベーターをディスプレイするクローンを、標的分子またはレポーター分子と別のダイドロンまたは蛍光団で官能基化した表面と接触させてもよい。クローンを表面から洗浄し、非結合性のクローンを増殖させて非結合性のクローンの集団をクローン的に拡大し、それによって所望の標的分子に特異的ではないクローンを選択解除する。ある実施形態において、ネガティブ選択ステップにおいて、ランダム合成ペプチドを用いることができる。他の実施形態において、アクセプターまたはドナーに構造的に類似性を有する１つまたは複数の免疫原をネガティブ選択ステップにおいて用いることができる。
【００８８】
アクチベーターのスクリーニングは、Ｈｏｌｔらにおいて記載されている通り、ハイスループットのパラレル選択によって遂行されるのが最良である。あるいは、ハイスループットのパラレル選択は、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ ＵＳＡ，Ｉｎｃなどの企業によって行われてもよい。
【００８９】
ある実施形態において、アクチベーターおよび／または選択性成分の結合性領域を変異し、未変異のアクチベーターに比べて優れた結合の性質を有するアクチベーターおよび／または選択性成分を選択するのが望ましいことがある。これは、エラーを引き起こす条件下、ＴａｑポリメラーゼでのＰＣＲなど、あらゆる標準の変異誘発技術によって遂行することができる。このような場合、ＰＣＲ：プライマーは、変異を引き起こす条件下、（例えば）ファージミドプラスミドの、ｓｃＦｖをコードするまたは結合試薬をコードする配列を増幅するのに用いられ得る。ＰＣＲ生成物を、次いで、上記の通り、（例えば）ファージミドベクター中にクローニングし、所望の特異性に対してスクリーニングしてもよい。
【００９０】
他の実施形態において、アクチベーターおよび／または選択性成分を修飾して、それらをプロテアーゼによる切断により耐性にしてもよい。例えば、ポリペプチドを含む本発明のアクチベーターの安定性は、（Ｌ）体における天然に存在するアミノ酸の１つまたは複数をＤ−アミノ酸で置換することによって増大することができる。様々な実施形態において、アクチベーターのアミノ酸残基の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、５０％、８０％、９０％、または１００％が、Ｄ体のものであってよい。Ｌアミノ酸からＤアミノ酸への切り替えは、消化管において見出される偏在性のペプチダーゼの多くの消化能力を中和する。あるいは、本発明のアクチベーターの増強された安定性は、伝統的なペプチド結合の修飾の導入によって実現されてよい。例えば、ポリペプチドのバックボーン内に環状環が導入されると、胃または他の消化器官中で、および血清中でポリペプチドを消化することが知られている多くのタンパク質分解酵素の影響を回避するために、安定性の増強が付与され得る。さらに他の実施形態において、アクチベーターの安定性の増強は、１つまたは複数の右旋性アミノ酸（例えば、右旋性のフェニルアラニンもしくは右旋性のトリプトファン）をアクチベーターのアミノ酸間に挿入することによって実現され得、好適の実施形態において、このような修飾は、所望の標的分子またはレポーター分子との相互作用の活性または特異性に影響を及ぼさずに、アクチベーターのプロテアーゼ耐性を増大する。
【００９１】
ある実施形態において、抗体またはその変異体は、対象に投与する場合、または投与するとき、免疫原性を少なくするように修飾されてよい。例えば、対象がヒトである場合、抗体は「ヒト化」されていてよく、この場合、例えば特許文献７に記載されているように、ハイブリドーマに由来する抗体の相補性決定領域（１つまたは複数）がヒトモノクローナル抗体中に移植されている。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を用いてヒト化抗体を発現させてもよい。このようなヒト化は、部分的でも、または完全でもよい。
【００９２】
別の実施形態において、アクチベーターはＦａｂフラグメントである。Ｆａｂ抗体フラグメントは、プロテアーゼであるパパインを用いて免疫グロブリン分子をタンパク質分解することによって得ることができる。パパイン消化により、各々が単一の抗原結合性部位を有する「Ｆａｂフラグメント」２つの別個の抗原結合性フラグメントおよび残りの「Ｆｃフラグメント」が得られる。さらに別の実施形態において、アクチベーターはＦ（ａｂ’）２フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）2抗体フラグメントは、酵素ペプシンによる限定されたタンパク質分解を用いてＩｇＧ分子から調製することができる。他の実施形態において、選択性成分は、酵素などのネットワークタンパク質またはパスウェイタンパク質、例えば、ホスファターゼまたはキナーゼであってよい。このようなタンパク質を変異させて、レポーターおよび／または標的分子に対する結合部位を作製してもよい。例えば、細胞および組織におけるネットワークタンパク質およびパスウェイタンパク質から選択性成分のバイオセンサーを作製する方法は、選択されたタンパク質上の特異的な領域を変異させて、レポーターまたは標的分子に対する活性化に結合する部位に対するアクチベーター部分を作り出すことを含む。変異用に選択された領域は、アクチベーターに変換されるべきタンパク質をコードする遺伝子の選択された領域において変異を作り出すことによって、ランダムに、または部分的にランダムに変異され得る。変異された領域（１つまたは複数）を有する遺伝子は、アッセイすべき活性（レポーター分子の場合）に対するレポーター分子（または標的分子）の結合および蛍光感受性を可能にする方法で、タンパク質を発現することができる系中にトランスフェクトすることによって、組み入れられ得る。例えば、変異された領域を有するＤＮＡは、ダイドロンのアクセプターにトラニング（ｔｒａｎｉｎｇ）であってよい（例えば、非特許文献７および非特許文献８を参照されたい）。選択方法によって単離および同定することによって、アクチベーターおよび選択性成分として最適に機能する、変異された集団内の特定のタンパク質の遺伝子の配列。他の実施形態において、変異体のライブラリーは、変性されたオリゴヌクレオチド配列から生成される。変性されたオリゴヌクレオチド配列からライブラリーを生成し得る方法は多く存在する。変性された遺伝子配列の化学合成は、ＤＮＡ自動合成機において行うことができ、次いで、合成の遺伝子を発現に好適なベクター中にライゲーションすることができる。変性されたセットの遺伝子の一目的は、一混合物において、可能なタンパク質配列の所望のセットをコードする全ての配列を提供することである。変性されたオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野ではよく知られている（例えば、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７を参照されたい）。このような技術は、他のタンパク質の定向進化において用いられている（例えば、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１、ならびに、特許文献８、特許文献９、および特許文献１０を参照されたい）。
【００９３】
あるいは、他の形態の変異誘発を利用してコンビナトリアルライブラリーを生成してもよい。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発などを用いたスクリーニングによって、リンカースキャニング突然変異誘発によって、飽和突然変異誘発によって、ＰＣＲ突然変異誘発によって、またはランダム突然変異誘発によって、例えば、変異体を生成し、ライブラリーから単離してもよい。とりわけコンビナトリアルの設定におけるリンカースキャニング突然変異誘発は、アクチベーターを同定するための魅力的な方法である。
【００９４】
さらに他の実施形態において、アクチベーターは、核酸リガンドとしても知られるアプタマーであってよい。アプタマーは、所望の分子構造に特異的に結合するように選択されたオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、典型的に、ファージディスプレイの親和性選択に類似の親和性選択プロセスの生成物である（ｉｎ ｖｉｔｒｏの分子進化としても知られる）。このプロセスは、親和性分離のいくつかの直列の反復を行い（例えば、所望の免疫原が結合している固体支持体を用いて）、その後ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って免疫原に結合している核酸を増幅することを伴う。このように親和性分離の各ラウンドにより、所望の免疫原に上首尾に結合する分子に対する核酸の集団が濃縮される。このやり方では、核酸のランダムプールは、標的分子に特異的に結合するアプタマーを生成するように「教育され（ｅｄｕｃａｔｅｄ）」得る。アプタマーは、典型的にはＲＮＡであるが、ＤＮＡまたはその類似体もしくは誘導体、例えば、制限なく、ペプチド核酸およびホスホロチオエート核酸であってよい。アプタマーは、これらの選択された核酸の増幅と組み合わされた望ましいやり方で標的と相互作用する核酸リガンドの選択を伴う、「ＳＥＬＥＸ」法を用いて調製してもよい。ＳＥＬＥＸプロセスは、特許文献１１および特許文献１２、ならびに特許文献１３に記載されている。これらの参考文献は、各々が参照によって本明細書に特に組み込まれ、総称的にＳＥＬＥＸ特許と呼ばれる。
【００９５】
ＳＥＬＥＸプロセスは、各々が独特の配列を有し、その各々が所望の標的化合物または標的分子に特異的に結合する性質を有する核酸分子である１クラスの生成物を提供する。様々な実施形態において、標的分子は、例えば、タンパク質類、炭水化物類、ペプチドグリカン類、または小分子種であってよい。ＳＥＬＥＸ法は、その生物学的構造の不可欠の部分である分子との特異的な相互作用によって、細胞表面またはウイルスなどの生物学的構造を標的にするのに用いることもできる。
【００９６】
基本的なＳＥＬＥＸ法は、数々の特異的な目的を達成するために修正されている。例えば、特許文献１４は、ベントＤＮＡなど、特異的な構造の特徴を有する核酸分子を選択するためにゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸプロセスの使用を記載している。特許文献１５は、カウンターＳＥＬＥＸと呼ばれる、緊密に関連する分子間を識別することができる高度に特異的な核酸リガンドを同定するための方法を記載している。特許文献１６は、標的分子に対して高親和性を有するオリゴヌクレオチドと低親和性を有するオリゴヌクレオチドとの間の高度に効率的な分割を実現するＳＥＬＥＸベースの方法を記載している。特許文献１７および特許文献１８は、ＳＥＬＥＸを行った後、改善された核酸リガンドを得るための方法を記載している。
【００９７】
ある実施形態において、本明細書に記載する核酸リガンドは、これらの安定性を増大する修飾、例えば、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの酵素による分解に対する耐性の増大を提供する修飾、ならびに／または核酸リガンドの送達を増強もしくは媒介する修飾を含むことができる（例えば、特許文献１９および特許文献２０を参照されたい）。このような修飾の例には、リボース、および／またはホスフェート、および／または塩基の位置の化学的置換が含まれる。様々な実施形態において、核酸リガンドの修飾には、それだけには限定されないが、核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に対してさらなる電荷、分極率、疎水性、水素結合、静電相互作用、および流動性を組み入れる他の化学基を提供するものが含まれてよい。このような修飾には、それだけには限定されないが、糖の２’位修飾、ピリミジンの５位修飾、プリンの８位修飾、アミンの環外修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−インド−ウラシルの置換、バックボーン（主鎖）の修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルホスフェートの修飾、メチル化、普通ではない塩基対の組合せ、例えば、イソ塩基（ｉｓｏｂａｓｅ）、イソシチジン（isocytidine）、およびイソグアニジン（isoguanidine）などが含まれる。修飾には、キャッピングなどの３’および５’修飾も含まれてよい。例示の実施形態において、核酸リガンドは、ピリミジン残基の糖部分上を２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾されているＲＮＡ分子である。
【００９８】
アクチベーターおよび／または選択性成分は、テンプレートがインプリントされた材料であってよい。テンプレートがインプリントされた材料は、外側に糖の層、およびその下のプラズマが堆積した層を有する構造である。テンプレートがインプリントされた構造と、それに対して相補的である標的分子との間の特異的な相互作用を可能にするように、外側の糖の層は所望の標的分子またはテンプレートに対して形状が相補的である押込みまたはインプリントを含んでいる。テンプレートのインプリントは、例えば、医療用装具（例えば、人工心臓弁、人工肢関節、コンタクトレンズ、およびステント）、マイクロチップ（好ましくはシリコンベースのマイクロチップ）、ならびにウイルスまたは細菌などの特定の微生物を検出するようにデザインされている診断用装置の構成要素を含めた、様々な構造の表面上で利用することができる。テンプレートがインプリントされた材料は、その全文が参照によって本明細書に組み込まれる、特許文献２１において論じられている。
【００９９】
ある実施形態において、アクチベーターは、その単離、固定化、同定、もしくは検出を促進し、かつ／またはその可溶性を増大するタグまたはハンドルを含むことができる。様々な実施形態において、タグはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、または化学的部分、およびこれらの組合せもしくは変形であってよい。ある実施形態において、例示の化学的ハンドルには、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、カルモジュリン結合蛋白質、チオレドキシン、マルトース結合蛋白質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリアルギニン、ポリＨｉｓ、ポリＨｉｓ−Ａｓｐ、またはＦＬＡＧタグ等が含まれる。さらなる例示のタグ類には、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質の局在性を変更するポリペプチド、例えば、シグナルペプチド類、ＩＩＩ型分泌系を標的にするペプチド類、トランスサイトーシスドメイン類、核移行シグナル類などが含まれる。
【０１００】
別の実施形態において、アクチベーターおよび／または選択性成分は、細胞膜を横断する速度が増大するように修飾されてよい。例えば、アクチベーターは、「トランスサイトーシス」（例えば、細胞によるポリペプチドの取込み）を促進するペプチドに結合していてよい。ペプチドはＨＩＶトランスアクチベーター（ＴＡＴ）タンパク質、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞によって速やかに取り込まれることが観察されている部分である、ＴＡＴの残基３７〜６２または４８〜６０に対応するフラグメントの一部分であってよい（非特許文献２２）。あるいは、内部移行するペプチドは、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉａ）のアンテナペディアタンパク質、またはそのホモログに由来していてよい。ホメオタンパク質アンテナペディアの６０アミノ酸長のホメオドメインは、生体膜を介して移行することが実証されており、それに対して結合している異種性のポリペプチドの移行を促進することができる。このように、アクチベーターは、ショウジョウバエのアンテナペディアのアミノ酸およそ４２〜５８、またはトランスサイトーシスのためのより短いフラグメントからなるペプチドに融合していてよい（非特許文献２３）。トランスサイトーシスのポリペプチドはまた、特許文献２２に開示されているペプチド配列などの、天然に存在する膜転位配列（ＭＴＳ）であってよい。
【０１０１】
さらに他の実施形態において、アクチベーター／選択性成分は、２価であり、アクチベーターおよび選択性成分の両方を、１つの近接するポリペプチド配列中に、あらゆる適切なポリペプチドのアクチベーターおよび選択性成分を含む融合（キメラ）タンパク質の形態において含んでいる。上記の通り、融合タンパク質は、その溶解性を増大し、かつ／またはその精製、同定、検出、標的化、および／もしくは送達を促進する少なくとも１つのドメインを含んでいてよい。好適例のドメイン類には、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、カルモジュリンに結合するペプチド、チオレドキシン、マルトースに結合するタンパク質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリアルギニン、ポリＨｉｓ、ポリＨｉｓ−Ａｓｐ、またはＦＬＡＧ融合タンパク質類、およびタグ類が含まれる。さらなる例示のドメインには、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質の局在化を変更するドメイン、例えば、シグナルペプチド類、ＩＩＩ型分泌系を標的にするペプチド類、トランスサイトーシスドメイン類、核移行シグナル類、標的化部分類、すなわち標的分子に特異的なタンパク質等などが含まれる。様々な実施形態において、本発明のポリペプチドは、１つまたは複数の異種性の融合物類を含むことができる。ポリペプチドは、同じ融合ドメインの複数のコピーを含んでいてよく、または２つ以上の異なるドメイン類に対する融合物を含んでいてよい。融合物は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の両方に生じてよい。融合タンパク質の構築を促進するために、またはタンパク質の発現もしくは融合タンパク質の構造的な拘束を最適化するために、アクチベーターおよび／または選択性成分ポリペプチドの間のリンカー配列が含まれていてよい。好適例の融合タンパク質の概念の証明を、以下に記載する。
【０１０２】
他の実施形態において、アクチベーターおよび選択性成分は、細胞もしくは生物体、または分析されるべき対象内で、融合タンパク質として発現される（下記の実施例を参照されたい）。下記の発現方法を用いて、宿主細胞中でアクチベーターおよび選択性成分を発現させ、次いで、宿主細胞を、本明細書に記載し、当業者には知られている通りに単離および精製してもよい。
【０１０３】
一般的に、アクチベーターおよび選択性成分をコードする核酸は、トランスフェクトまたは感染などによって宿主細胞中に導入することができ、宿主細胞を、アクチベーターを発現させる条件下で培養する。核酸を原核細胞および真核細胞中に導入する方法は、当技術分野ではよく知られている。哺乳動物および原核生物の宿主細胞の培養に適する培地は、当技術分野ではよく知られている。ある場合には、対象のポリペプチドをコードする核酸は誘導性のプロモーターの制御下にあり、これは一旦誘導されると核酸を含む宿主細胞はある回数分割する。例えば、核酸がベータ−ガラクトースのオペレーターおよびリプレッサーの制御下にある場合、細菌の宿主細胞が約０．４５〜０．６０の密度のＯＤ600を達成したらイソプロピルベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培地に加える。次いで、培地をさらに数回増殖させて、宿主細胞にポリペプチドを合成する時間を与える。次いで、典型的に、培地を凍結し、しばらくの間凍結して貯蔵し、その後ポリペプチドを単離および精製してもよい。
【０１０４】
このように、アクチベーターおよび選択性成分を全てまたは一部分コードするヌクレオチド配列を用いて、微生物または真核細胞のプロセスによって、アクチベーターおよび選択性成分の形態の組換え体を生成してもよい。発現ベクターなどのポリヌクレオチド構築体中に配列を連結し、真核生物（酵母、トリ、昆虫、もしくは哺乳動物）または原核生物（細菌細胞）いずれかの宿主細胞中にトランスフォームし、感染させ、またはトランスフェクトするのが標準的な手順である。同様の手順、またはそれを修正したものを用いて、本発明による微生物的手段または組織培養技術によって組換えのポリペプチドを調製してもよい。
【０１０５】
「発現」は、遺伝子（制限なく、遺伝子生成物を生成するための機能的な遺伝学的ユニットであって、典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡ上にコードされ、いくつかのウイルスでは、転写プロモーターや他の応答エレメント、および／もしくはエンハンサー等のようなｃｉｓ−作用性エレメントを含め、ならびに典型的にはタンパク質（オープンリーディングフレームすなわちＯＲＦである）をコードする発現された配列、または機能上／構造上のＲＮＡならびにポリアデニル化配列から遺伝子産物（典型的には蛋白質、任意選択的に転写後修飾又は機能上／構造上のＲＮＡ）からの情報の全体の流れを意味する。
【０１０６】
デザインされた配列「の転写制御下の遺伝子の発現」、または代替的に、デザインされた配列「による制御を受けさせる」は、遺伝子に操作可能に連結している（典型的にはｃｉｓにおいて、機能的に結合している）示された配列を含む遺伝子からの遺伝子発現を意味する。示された配列は、転写のエレメント（制限なく、プロモーター、エンハンサー、および応答エレメント）の全てまたは部分であってよく、遺伝子の転写を完全に、または部分的に、制御し、および／または影響を及ぼすことができる。
記載した遺伝子生成物「の発現のための遺伝子」は、適切な環境中に配置した場合に、例えば、細胞中にトランスフォームされ、トランスフェクトされ、または形質導入され、発現に適した条件に曝された場合に、記載された遺伝子生成物を発現することができる遺伝子である。
【０１０７】
構成的プロモーターの場合、「適切な条件」は、遺伝子が、典型的に宿主細胞中に導入されることだけを必要とすることを意味する。誘導性のプロモーターの場合、「適切な条件」は、ある量のそれぞれの誘導因子が、遺伝子の発現を引き起こすのに効果的な発現系（例えば、細胞）に与えられたことを意味する。本明細書に記載するヌクレオチド配列は全て、５’から３’の方向において提供され、本明細書に記載するアミノ酸配列は全て、Ｎ末端からＣ末端の方向において提供される。
【０１０８】
アクチベーターおよび選択性成分をコードする核酸、ならびにベクター、宿主細胞、それらの培養物の他の実施形態、ならびに融合タンパク質を作製する方法は、下記、または特許文献１に記載されている。アクチベーターおよび／または選択性成分をコードする核酸は、細菌のプロモーター、例えば、嫌気性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＮｉｒＢプロモーターまたは大腸菌のリポタンパク質ｌｉｐ、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ｐａｇＣプロモーター、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ｅｎｔプロモーター、ＴｎＩＯ上のｔｅｔプロモーター、またはビブリオコレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ）のｃｔｘプロモーターに操作可能に連結していてよい。あらゆる他のプロモーターを使用することができる。細菌のプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性のプロモーターであってよい。アクチベーターが細胞から分泌されるように、シグナルペプチド配列を構築体に加えてもよい。このようなシグナルペプチドは当技術分野ではよく知られている。一実施形態において、大腸菌のＲＮＡポリメラーゼによって認識される強力なファージＴ５プロモーターを、ｌａｃオペレーター抑制モジュールと一緒に用いて、厳重に制御された、大腸菌における高レベルの発現または組換えタンパク質を提供する。この系において、高レベルのｌａｃリプレッサーの存在下、タンパク質の発現は阻止される。組換えタンパク質およびポリペプチドを生成するための非常に様々な方法および遺伝子構築体が市販されており、当業者には別の方法で知られており、または入手可能である。例えば、真核生物の可溶化物（例えば、ウサギ網状赤血球可溶化物、ウサギ卵母細胞可溶化物、ヒト細胞可溶化物、昆虫細胞可溶化物、およびコムギ胚芽抽出物、または合成方法も用いたｉｎ ｖｉｔｒｏのタンパク質合成を、広く知られている通り、用いて本明細書に記載するポリペプチドを生成することができる。
【０１０９】
植物の発現ベクターを用いることができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ ＲＮＡおよび１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモーターなどのウイルスのプロモーターを用いてもよく、あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小型サブユニットなどの植物のプロモーター、またはダイズｈｓｐ１７．５−Ｅもしくはｈｓｐ１７．３−Ｂなどの熱ショックプロモーターを用いてもよい。これらの構築体を、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡトランスフォーメーション、マイクロインジェクション、電気穿孔などを用いて植物細胞中に導入することができる。このような技術の再考には、例えば、非特許文献２４および非特許文献２５を参照されたい。あるいは、昆虫系を用いて本明細書に記載するポリペプチドを生成することができる。このような１つの系において、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いられる。このウイルスはヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で増殖する（例えば、Ｓｍｉｔｈ、米特許文献２３を参照されたい）。昆虫系の別の実施形態において、対象のポリペプチドをコードするＤＮＡを、ポリヘドリンプロモーターの下流のｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ組換えトランスファーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）中にクローニングし、Ｓｆ９昆虫細胞（ヨトウガの卵巣細胞に由来する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．から入手可能）中にトランスフェクトして組換えのウイルスを生成する。別の実施形態において、対象のポリペプチドを、ある実施形態においてポリペプチドがメス動物のミルクなどの中に分泌されるように、トランスジェニック動物において調製する。
【０１１０】
ウイルスベクターは関連技術において広く知られており、その多くは市販されており、核酸を細胞中に効率的にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入するのにも用いられ得る。細胞をウイルスベクターに感染させることには、多数の標的にされる細胞が核酸を受け取ることができるという利点がある。さらに、ウイルスベクター中の遺伝物質によって、例えば、ウイルスベクター中に含まれる核酸によってコードされたポリペプチドは、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現される。有用なウイルスベクター系の例には、レトロウイルス、アデノウイルスが含まれ、アデノ随伴ウイルスベクターは、とりわけ哺乳動物中に、ｉｎ ｖｉｖｏで外来の遺伝子を輸送するのに有用であると、一般的に理解されている。これらのベクターは、細胞中への遺伝子の効率的な送達をもたらし、輸送された核酸は、典型的には、宿主の染色体ＤＮＡ中に安定に組み込まれる（非特許文献２６を参照されたい）。
【０１１１】
別のウイルスの遺伝子送達系は、アデノウイルスに由来するベクターを利用する。アデノウイルスＡｄ ５ｄｌ３２４型系統、またはアデノウイルスの他の系統（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する適切なアデノウイルスベクターが当業者にはよく知られている。ある状況において、組換えのアデノウイルスは、非分裂性の細胞に感染することができ、気道の上皮、内皮細胞、肝細胞、および筋肉細胞を含めた、広範囲の細胞型に感染させるのに用いることができる点で有利であり得る。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製および濃縮が容易であり、上記の通り、感染性スペクトルに影響を及ぼすように修飾することができる。さらに、導入されたアデノウイルスのＤＮＡ（およびそれに含まれる外来のＤＮＡ）は宿主細胞のゲノム中に組み込まれないがエピソームのままであり、それによって、導入されたＤＮＡが宿主のゲノム（例えば、レトロウイルスのＤＮＡ）中に組み込まれる状態において、挿入変異の結果として生じることがある潜在的な問題を回避する。さらに、外来ＤＮＡに対するアデノウイルスのゲノムの収容力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（最大８キロベース）。現在使用中であり、したがって本発明が好ましいほとんどの複製欠損アデノウイルスベクターは、ウイルスのＥ１およびＥ３遺伝子の全てまたは部分を欠失しているが、アデノウイルスの遺伝物質の８０％ほどを保持している。挿入された遺伝物質の発現は、例えば、ＥＩＡプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）および付随するリーダー配列、Ｅ３プロモーター、または外因的に加えたプロモーター配列の制御下であり得る。
【０１１２】
対象のポリペプチドをコードする遺伝物質の送達に有用なさらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖性の生活環のためのヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである。これは、そのＤＮＡを非分裂細胞中に組み込むことがあり、高頻度の安定な組込みを表すことがある少数のウイルスの１つでもある。ＡＡＶをわずか３００塩基対程度含むベクターが、パッケージングされてよく、組み込まれてよい。外来性のＤＮＡに対する空間は約４．５ｋｂに限られている。非特許文献２７に記載されているものなどのＡＡＶベクターを用いて、ＤＮＡを細胞中に導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて様々な核酸が異なる細胞型中に導入されている（例えば、非特許文献２８および非特許文献２９を参照されたい）。他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびいくつかのＲＮＡウイルスに由来していてよい。
【０１１３】
ウイルス伝達法の他に、上記に説明したものなど、非ウイルスの方法をやはり用いて、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞中で、または動物の組織において、対象のポリペプチドをコードする核酸の発現を引き起こすことができる。遺伝子導入の最も非ウイルス的方法は、巨大分子の取込みおよび細胞内輸送のために哺乳動物細胞によって用いられる通常の機序に頼るものである。好ましい実施形態において、本発明の非ウイルスの遺伝子導入方法は、標的細胞によって遺伝材料を取り込むためのエンドサイトーシス経路に頼っている。このタイプの例示の遺伝子送達系には、リポソーム由来の系、ポリリジンコンジュゲート、および人工のウイルスエンベロープが含まれる。例えば、遺伝材料は、その表面上に正の電荷を帯びているリポソーム（例えば、リポフェクチン）中に捕捉され、場合により、これは標的組織の細胞表面抗原に対して抗体でタグ付けされる（非特許文献３０、特許文献２４、特許文献２５、および、特許文献２６）。例えば、パピローマに感染した細胞のリポフェクションは、ＰＶに関連抗原に対するモノクローナル抗体でタグ付けされたリポソームを用いて行い得る（非特許文献３１を参照されたい、非特許文献３２も参照されたい）。
【０１１４】
遺伝子送達系は、抗体、またはポリリジンなどの遺伝子を結合する物質と架橋結合している細胞表面リガンドを含んでいる（例えば、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０、および特許文献３１を参照されたい）。例えば、対象のキメラのポリペプチドをコードする遺伝物質を、ポリカチオンにコンジュゲートしているアシアロ糖タンパク質を含む可溶性のポリヌクレオチド担体を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで肝細胞にトランスフェクトするのに用いることができる（特許文献３２を参照されたい）。媒介されたエンドサイトーシスによる核酸構築体の効率的な送達は、エンドソームの構造から遺伝子の逸脱を増強する物質を用いて改善することができることも理解される。例えば、アデノウイルス全体またはインフルエンザＨＡの遺伝子生成物の融合性のペプチドを送達系の部分として用いて、ＤＮＡを含有するエンドソームの効率的な破壊を引き起こすことができる（非特許文献３３、非特許文献３４、および非特許文献３５）。
【０１１５】
本明細書に記載するダイドロンのある実施形態によると、ある機能的な目標が望ましい。
【０１１６】
一例において、目標は、以下の特徴を有するドナーアレイ調製物を生成することである。＞１０6モル吸光度（５６１ｎｍ）およびφアレイ／φ遊離＝０．７。標準の単一反応性の（ｍｏｎｏｒｅａｃｔｉｖｅ）ＮＨＳエステルドナー色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｔｔｏ−５６５）を、市販の２官能基性デンドリマー（例えば、ＰＡＭＡＭ、シスタミンコア）の複数の変異体とカップリングし、これらの定常状態の吸収および蛍光の性質を測定する。ＦＣＳ、電気泳動、および質量分析法による分子キャラクタリゼーションにより、標識化および分子分散度の程度が確認され、最高の吸光度および量子収量を有するドナーアレイの選択が可能になる。量子収量が劇的に消光したら、別々の電荷、極性、および空間の性質を有する、色素または代替のデンドロンの骨格の立体的な修飾（例えば、ＰＥＧ修飾）を調製して、色素間相互作用を低減することができる。
【０１１７】
別の例において、デザインの目標は＞９０％の伝達効率である。ブライトドナーアレイは、ダーククエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬ、４−（（４−ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）およびＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動、または蛍光共鳴エネルギー移動）アクセプター（例えば、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ７００、Ｃｙ７）に連結して、リンカー長さの変動によって消光の性質を最適化し、中間のアクセプター（すなわち、第１のドナーおよびアクセプターの両方とスペクトルが重複する第２のドナーが提供され、この場合第１のドナーの発光スペクトルはアクセプターの吸収スペクトルと重複しない（または必ずしも重複しない））がより赤色にシフトした蛍光団に必要とされるか否かを決定する。必要であれば、ヘテロ２官能基性（heterobifunctional）の中間体のアクセプター色素（すなわち、ＮＨＳエステルおよびヨード酢酸の官能性）を調製して中間のアクセプターの試験を促進することができる（非特許文献３６）。
【０１１８】
別の例において、デザインの目標は、ＦＡＰまたはドナーに結合していないときデンドロンに連結しているアクセプターの低い蛍光である。アクセプターの蛍光団は、ダイドロンの合成に好適な化学を用いてデンドロン骨格に結合しており、構築体の蛍光を細胞抽出物中および精製した核酸材料中で、複数のドナーの存在下でダイドロンを検出するのに用いられる条件下でバックグラウンドの蛍光に対して試験する。蛍光の活性化が高い場合、アクセプターの電荷、サイズ、および疎水性の修飾を、細胞の状況における非特異的な相互作用を低減するのに利用することができる。
【０１１９】
別の例において、ダイドロン／ＦＡＰ調製物および確証のためのデザインの目標は、細胞可溶化物中φon／φoff＞１０００を有する、空間的に間隙が約６０ｎｍである３個のダイドロン／ＦＡＰモジュールである。本発明者らはバッファー中で＞１５，０００倍の切換え比（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ ｒａｔｉｏ）でこれを活性化するモジュールをすでに選択していたので、マラカイトグリーンが最初の蛍光団として働くことができる。さらなる蛍光団をデザインし、合成することができる。近赤外（ｆａｒ−ｒｅｄ）および近赤外線（ｎｅａｒ ＩＲ）発光を有する、極性を感知する色素（例えば、メロシアニンおよびスチリル色素）の多くができるように、非対称性のポリメチン色素、およびインドシアニングリーンの類似体を蛍光団として用いることができる。蛍光団は、ドナーアレイを修飾する前に、細胞可溶化物中の非特異的な活性化に対してスクリーニングされる。選択されたＦＡＰモジュールによる消光および活性化をバッファー中および細胞可溶化物中で特徴付けて、活性化率を決定する。許容できる切換え比を有するＦＡＰ／ダイドロン対は、ＦＣＳおよびＴＩＲＦ単一分子顕微鏡によって特徴付けされる。
【０１２０】
ある実施形態によると、酵母表面ディスプレイライブラリーからの最初の蛍光団活性化ペプチドの選択に確立された方法を用いて、新規な蛍光団活性化ペプチドを単離する。簡潔に述べると、合成的に調製された各蛍光団のビオチン化されたバージョンを、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの酵母表面にディスプレイされたｓｃＦｖライブラリー（約１０9個の別々のクローン、選択用の細胞１０11個）の拡大され、誘発されたアリコートを使用してインキュベートする。ビオチン化された色素に結合する酵母を、最初にストレプトアビジンがコンジュゲートした磁性ビーズで、その後、拡大、および抗ビオチンコンジュゲートした磁性ビーズでの第２ラウンドの濃縮で、２つのステップにおいて磁気的に濃縮する。これらの酵母をビーズから溶出し、次いで、遊離の色素を使用してインキュベートし（フローサイトメーター上の直接検出ができる場合。できない場合は、ビオチン化した色素の後に洗浄およびストレプトアビジンＡｌｅｘａ４８８標識化が続く）、流動性選別（flow sorted）して蛍光発生的な細胞の集団または蛍光団に結合している細胞の集団を選択する。サイトメーター上で検出できない蛍光団のクローンは、誘導されたコロニーの単離されたものを含む寒天平板上で色素を洗浄し、その後の分析用に広視野の蛍光画像化システムを用いて最も明るいコロニーを選択することによって検出することができる。ライブラリーから回収されたクローンは、ある範囲の親和性およびスペクトルの性質を有し、引き続き（エラープローン（error-prone）ＰＣＲによって）親和性成熟により、親和性、量子収量、および選択性における変化がもたらされ得ることが見出された。クローンは、確立されたプロトコールを用いて、表面ディスプレイ系から酵母分泌系に容易に移行される。有望なクローンは配列決定され得、独特のクローンはｐＰＮＬ９分泌ベクターに伝達されて、集合の分子および単一分子の蛍光、ならびに蛍光団との結合性の性質を引き続き特徴付けるためにタンパク質を生成する。
【０１２１】
ダイドロンの合成。所与の蛍光団が、生存可能な蛍光団活性化ペプチドをライブラリーから生成した後、この蛍光団をダイドロン中に組み込む（図５Ａを参照されたい）。合成の戦略により、連続的なラウンドの蛍光団頭部へのリンカー付加によってダイドロンが構築される（分岐的合成戦略）。得られた中間体は、増大数の分岐部位および特定の数の機能性アミンを周囲に有する、一連の蛍光発生的なプレダイドロン（ｐｒｅ−ｄｙｅｄｒｏｎ）である。これらのアミンは、市販のドナー色素の活性エステルと容易に反応することができる。この戦略の利点の１つは、どの蛍光団が最も効率的なエネルギー伝達を有し、色素の凝集または非特異的な結合に及びがちな最小の傾向を示すかを決定するために、各プレダイドロンで、数々の個々のドナーの蛍光団を試験することができることである。この合成の取組みは、単一のＭＧ分子に対して最高４個のＣｙ３分子に連結するためのＴリンカーを用いて実証された。ドナー色素の密度および充填における増大は、Ｔリンカーよりむしろトリポッド（tripod）リンカーを用いて実現することができる。この形状により、ドナー６個または９個を有する、小型サイズのダイドロンの合成が可能になる（図５Ｂを参照されたい）。少なくとも１つの炭素−炭素結合が三重結合であるマラカイトグリーン、ＤＩＲ（ジメチルインドールレッド）、およびＭＧ蛍光団に対してフェルスター半径が比較可能であり、直接的な分子間ＦＲＥＴの取組みが、Ｃｙ３nＭＧダイドロンに対して示される結果にとって同様に成功する可能性がある。しかし、インドシアニングリーンの場合、フェルスター半径は相当短く、全体的なＦＲＥＴの効率が低減される可能性がある。このような場合には、媒介色素でのカスケードの取組みを利用して、ドナーからの効率的なＦＲＥＴ、およびアクセプターに対する効率的なＦＲＥＴを確実にしてもよい（図５Ｃ）。この場合、Ｃｙ５−ＩＣＧの直列が、上記のリンカー拡大合成戦略のための「開始の蛍光団」として働くことができる。
【０１２２】
蛍光モジュールの最適化および成熟。蛍光団単独に対して選択される、蛍光団活性化ペプチドの性質は、蛍光発生的なダイドロンの結合および活性化に対して最適化されているとは限らない。累加的な数のドナー色素を、予め選択された蛍光団に添加したときのクローンの親和性の低減が注目された。特に結合性の、および活性化する蛍光発生的なダイドロンに対する、これらＦＡＰの性質を洗練するために、高量子収量および結合の緊密な、蛍光団に結合するクローンの親和性成熟をエラープローンＰＣＲ法によって行うことができ、得られた変異体のライブラリーは、親の蛍光団ではなく、むしろダイドロンの結合性および活性化に対して選択される。フローサイトメトリー（蛍光団の輝度を測定するためのＨＡエピトープタグで測定した発現の比率により、クローンの量子収量に相関する値がもたらされる）によって決定した、低濃度で、かつ高量子収量で蛍光発生的なダイドロンと結合し、活性化することができるクローンを収集し、配列決定する。
【０１２３】
本明細書に記載するダイドロンおよびダイドロン系は、実質的にあらゆるアッセイ、蛍光団が有用である画像化システムに有用である。本明細書に詳しく記載する通り、ダイドロンは、細胞または生物体におけるリアルタイムの画像化において有用である。一例として、アクチベーター／選択性成分を含むポリペプチドを、遺伝学的なものを含むあらゆる手段によって、ポリペプチドを発現するための遺伝子を含む核酸との、細胞または生物体の、一過性または永続的な、トランスフェクション、形質導入、または形質転換によって、細胞中に導入することができる。あるいは、ポリペプチドを細胞または生物体中に導入することができる。アクチベーターおよび選択性成分を含む融合タンパク質または複合体、例えば抗体を、例えば固定した細胞または組織のインサイチューのアッセイに用いることができる。このような一実施形態において、所望の細胞または組織成分が細胞または組織中に局在することができるように、選択性成分は、細胞または組織の構成成分、例えば、細胞または組織のタンパク質に結合しており、アクチベーターはダイドロンに結合している。複合体中に、または融合タンパク質として選択性成分に結合しているアクチベーターを、ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡに類似の蛍光アッセイ、例えば、サンドイッチ型のアッセイにおいて用いることもできる。同様に、アクチベーター、および抗体または核酸などの選択性成分を含むプローブを、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、もしくはサザンブロット、またはＥＭＳＡ（電気泳動移動度シフト解析）、または他の電気泳動法における、タンパク質または核酸の検出に用いることができる。
【実施例】
【０１２４】
（実施例１）
ダイドロンの合成
ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００ＭＨｚ機器上で得た。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）実験を、Ｘｃａｌｉｂｕｒバージョン１．２を用いてＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ四重極イオントラップ質量分析計上で行った。最終生成物である「ＴＣＭ」１３の質量分析をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＣＱクラシック、およびＸｃａｌｉｂｕｒバージョン１．３ソフトウエアで行った。試料を脱塩し、自家製３ｃｍ Ｃ−１８キャピラリー液体クロマトグラフィーカラムで濃縮し、質量分析計中に直接エレクトロスプレーした。色素溶液を１μＬの体積において高圧容器充填し、水１００％からメタノール２０％の「勾配」ステップを用いて、試料をカラムから約１μ／分で溶出した。
【０１２５】
図６Ａ〜Ｄにおける小型のマルチ発色団のダイドロンを、Ｆｒｅｃｈｅｔ（非特許文献３７）の収束合成に類似の戦略によって調製し、逆相液体クロマトグラフィーによって精製し、Ｃｙ３ドナー分子１、２、および４個が分子の周囲を共有結合性および化学量論的に装飾し、単一のＭＧ消光性の基がダイドロンのベースにある分枝されている構造を得た。
【０１２６】
図７Ａ〜７Ｃは、化合物ＣＭ、ＢＣＭ、およびＴＣＭに対する以下の合成模式図を表す。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００ＭＨｚ機器上で得た。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）実験を、Ｘｃａｌｉｂｕｒバージョン１．２を用いてＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＣＱ四重極イオントラップ質量分析計上で行った。最終生成物である「ＴＣＭ」１３の質量分析をＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＣＱクラシック、およびＸｃａｌｉｂｕｒバージョン１．３ソフトウエアで行った。試料を脱塩し、自家製３ｃｍ Ｃ−１８キャピラリー液体クロマトグラフィーカラムで濃縮し、質量分析計中に直接エレクトロスプレーした。色素溶液を１μＬの体積において高圧容器充填し、水１００％からメタノール２０％の「勾配」ステップを用いて、試料をカラムから約１μ／分で溶出した。
【０１２７】
化合物３ 「Ｃｙ３．２９−マラカイトグリーン」（ＣＭ）
１−｛６−［（２−｛［４−（４−｛［４−（ジメチルアミノ）フェニル］［４−（ジメチルイミノ）シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン］メチル｝フェノキシ）ブタノイル］アミノ｝エチル）アミノ］−６−オキソヘキシル｝−２−［（１Ｅ，３Ｚ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホネート−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−インドール−２−イリデン）プロパ（prop）−１−エン−１−イル］−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート
Ｃｙ３．２９ １（７ｍｇ、０．００１ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ０．２ｍＬ中に溶解した。ＴＳＴＵ（６ｍｇ， ０．００２ｍｍｏｌ）を加え、その後ジイソプロピルエチルアミン「ＤＩＰＥＡ」（３．５μＬ；０．００２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。Ｎ−［４−［［４−（ジメチルアミノ）フェニル］（４−（−９−ミノ（ｍｉｎｏ）−６−アザ−１−オキサ−５−オキソ−ノニル）フェニル）メチレン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリジン（ylidene）］−Ｎ−メチル−メタナミウム（methanaminium）クロリド ２（５ｍｇ；０．００１ｍｍｏｌ）（非特許文献３８）を加え、その後（３．５μＬ；０．００２ｎｍｏｌ）ＤＩＥＡを加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌した。エチルエーテルを加えて（１０ｍＬ）生成物を沈澱させた。有機相をデカントした。残渣をアセトニトリル／水／１％ＴＦＡ中に溶解した。反応混合物を、μ−Ｂｏｎｄａｐａｋ １０μｍ ７．８×３００ｍｍ ＲＰ−１８カラム；直線勾配溶出液２０〜４０％アセトニトリル／水／０．１ＴＦＡ、２０分／流速３ｍＬによって分離した。収量：８ｍｇ（７４％）。
Ｃ60Ｈ72Ｎ6Ｏ9Ｓ2、ＥＳＩ／ＭＳ：［Ｈ+］ｍ／ｚ（モノアイソトピックイオン）：１０８５．４．ＵＶ／ＶＩＳ：エタノールλmax＝４６２；５５８；６０２；水λmax＝４６２；５３４；６２０；1H-NMR(Me（Ｍｃ）OD):8.53 (1H， t， J=13.5Hz， Cy3); 7.93 (1H， d， J=1.5Hz， Cy3);7.92 (1H， d， J=1.5Hz， Cy3); 7.90 (2H， m， Cy3); 7.39 (2H， 不明瞭， Cy3); 7.38 (4H， d， J=9.3Hz， MG); 7.33 (2H， d， J=8.7， MG); 7.16 (2H， d， J=8.7Hz); 7.02 (4H， d， J=9.3Hz， MG); 6.53 (1H， d， J=13.5Hz， Cy3); 6.50 (1H， d， J=13.5Hz， Cy3); 4.21 (2H， m， Cy3); 4.16 (2H， m， MG); 4.15 (2H， m， Cy3); 3.31 (12H， s， MG); 2.80(4U（Ｈ）， s， リンカー); 2.40 (2H， t， J=7.4Hz， MG); 2.19 (2H， t， J=7.2Hz， Cy3)， 2.11 (2H， m， MG); 1.84 (2H， m， Cy3); 1.74(12Hs， Cy3); 1.68 (2H， m， Cy3)， 1.44 (2H， m， Cy3); 1.41 (3H， t， J=7.2Hz， Cy3).
【０１２８】
化合物５
４，４’−［（４−［３−（１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）プロポキシフェニル（propoxyphenyl）］メチレン］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンゼンアミン
４−（３−フタルイミドプロポキシ（Phthalimidopropoxy））ベンズアルデヒド（非特許文献３８）４（６．１８ｇ、２０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン（４．８７ｇ、４０ｍｍｏｌ）および塩化亜鉛（２．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を無水エタノール（２５０ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を２日間還流した。１日後、生成物が反応混合物から沈澱し始めた。熱性反応混合物をろ過して、融点１８４〜１８８℃の明黄緑色固体５．７８ｇを得た（５０％）。
Ｃ34Ｈ35Ｎ3Ｏ3ＭＷ：５３３．６７ｇ／ｍｏｌ；1H-NMR: (CDCl3) 7.85 (2H， m); 7.72 (2H， m); 6.99 (6H， m); 6.70(6H， m); 5.32 (1H， s); 4.02 (2H， t， J=6.0Hz); 3.92 (2H， t， J-6.8Hz); 2.93 (12H， s); 2.18 (2H， m).
【０１２９】
化合物６ 「ＭＧフタルイミド」
［４−［［４−（［３−（１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソインドール−２−イル））プロポキシフェニル（propoxyphenyl）］［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチレン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン］−Ｎ−メチル−メタンアミニウムクロリド（methanaminium）］
４，４’−［（４−［３−（１，３−ジヒドロ−１，３−ジオキソ−２Ｈ−イソインドール（isoindol）−２−イル）プロポキシフェニル（propoxyphenyl）］メチレン］ビス［Ｎ，Ｎ−ジメチル−ベンゼンアミン５（５３３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）中に溶解した。テトラクロロベンゾキノン（Tetrachlorobenzoquinone）（３６８ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を少しずつ加えた。反応混合物を２時間還流した。室温に冷却後、緑色固体をろ過して取り出し酢酸エチルで洗浄した。Ｍｐ１６７〜１７２℃。定量的収率Ｃ34Ｈ34ＣｌＮ3Ｏ3、ＭＷ：５６８．１２ｇ／ｍｏｌ。
1H-NMR: (CDCl3) 7.87 (2H， m); 7.76 (2H， m); 7.37 (4H， d); 7.28 (2H， d); 6.97 (6H， m); 4.21 (2H， t); 3.97 (2H， t); 3.37 (12H， s); 2.28 (2H， 五重線).
【０１３０】
化合物７「ＭＧ−アミン」
［４−［［４−［（３−アミノプロポキシ（Aminopropoxy））フェニル］［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチレン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン］−Ｎ−メチル−メタンアミニウム（methanaminium）クロライド
ＭＧ−フタルイミド  ６（５６８．１２、１ｍｍｏｌ）を、無水エタノール１５０ｍｌ中に溶解した。無水ヒドラジン（０．１ｍＬ、３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を５５℃で３時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、ろ過した。ろ液を１Ｍ  ＨＣｌ／エタノールで酸性化した。固体をろ過除去し、ろ液を濃縮した。残渣をＲＰ−１８上カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶出液：水／アセトニトリル／０．１％ＴＦＡ  １０〜４０％アセトニトリルの勾配。
1H-NMR: (MeOH) 7.45 (4H， d， J=9.1Hz); 7.41 (2H， d， J=8.7Hz); 7.24 (2H， d， J=8.6Hz); 7.06 (4H， d， J=9.3Hz); 4.32 (2H， t， J=7.2Hz); 3.33 (12H， s); 3.25 (2H， t， J=7.2Hz); 2.25 (2H， m).
【０１３１】
化合物９「ＭＧ−Ｔ−ビスアミン（bisamine）」
Ｎ−［４−（｛４−［３−（｛［（１，３−ジアミノプロパン−２−イル）オキシ］アセチル｝アミノ）プロポキシ］フェニル｝［４（ジメチルアミノ）フェニル］メチレン］−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン］−Ｎ−メチル−メタンアミニウム（methanaminium）クロライド  ２−［２−［［（１，１−ジメチルエトキシ（Dimethylethoxy））カルボニル］アミノ］−１−［［［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］メチル］エトキシ］−酢酸８（非特許文献３９）（１７．４ｍｇ；０．０５ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ０．１ｍＬ中に溶解した。ＴＳＴＵ（１６ｍｇ；０．０５２ｍｍｏｌ）を加え、ＤＩＰＥＡ（１７μＬ；０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌した。ＭＧ−アミン  ７（４３．８ｍｇ；０．１ｍｍｏｌ）を加え、その後ＤＩＰＥＡ（１７μＬ；０．０１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を一夜撹拌した。エーテル（３ｍＬ）を加えることによって生成物を沈澱させた。沈殿物をエーテルで洗浄した。残渣をアセトニトリル（０．５ｍＬ）中に溶解した。トリフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌した。真空下で溶媒を除去し、残渣をＨＰＬＣ；ＲＰ−１８アセトニトリル／水／０．１％ＴＦＡ；直線勾配アセトニトリル３０％〜１００％；２５分によって精製した。
Ｃ31Ｈ42Ｎ5Ｏ3Ｃｌ×２ＴＦＡ；1H-NMR: (CD3CN) 7.56 (1H， s， NHC(O)); 7.36 (4H， d， J=8.3Hz); 7.30(2H， d， J=7.8Hz); 7.12 (2H， d， J=8.3Hz); 6.95(4H， d， J=8.6Hz); 4.23 (2H， s); 4.14 (2H， t， J=6.8Hz); 4， 11 (1H， m); 3.40 (2H， m); 2.3-3.17 (4H， m); 3.25 (12H. s); 2.02 (2H， m).
【０１３２】
化合物１０「ビス−Ｃｙ３−マラカイトグリーン」（ＢＣＭ）
２，２’−｛［２−（２−｛［３−（４−｛［４−（ジメチルアミノ）オヘニル（ohenyl）（ｏｈｅｎｙｌ）］［４−ジメチルイミノ（dimethyliiminio））シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン］メチル｝フェノキシ）プロピル］アミノ｝−２−オキソエトキシ）プロパン−１，３−ジイル］ビス［イミノ（６−オキソヘキサン−６，１−ジイル）（３，３−ジメチル−５−スルホネート−１Ｈ−インドール−１−イル−２−イリデン）（１Ｅ，３Ｅ）プロパ（prop）−１−エン−１−イル−３−イリデン］｝ビス（１−エチル−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム（indolium）−５−スルホネート）  
乾燥ＤＭＦ０．１ｍＬ中に溶解したＭＧ−Ｔ  ９（６ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）を、Ｃｙ３．２９−ＯＳｕ（２８ｍｇ、０．０４ｍｏｌ）のＤＭＦ０．１ｍＬ溶液に加えた。ＤＩＰＥＡ（１７μＬ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌した。エチルエーテル（２ｍＬ）を加えることによって、反応生成物を沈澱させた。有機相をデカントし、残渣をエチルエーテルの別の部分で洗浄した。残渣に水（２ｍＬ）を加えた。水不溶性の残渣を水で数回洗浄して過剰のＣｙ３．２９を除去し、アセトニトリル／水＝４０／６０混液中に溶解し、ＨＰＬＣ；ＲＰ−１８（３０％アセトニトリル〜１００％アセトニトリル；２５分にわたる直線勾配）によって精製した。  
Ｃ93Ｈ112Ｎ9Ｏ17Ｓ4 ＥＳＩＭＳ（ネガティブ）［Ｍ-1］ｍ／ｚ  １７５４．７３モノアイソトープ（monoisotope）。1H-NMR: (MeOD) 8.53 (2H， dd， J= 13.5Hz， Cy3); 7.94 (2H， d， J=1.5Hz， Cy3); 7.92 (2H， d， J=1.5Hz， Cy3); 7.91 (2H， dd， J=8.3Hz， 1.5Hz， Cy3);7.88 (2H， dd， J=8.3Hz， 1.5Hz， Cy3); 7.38 (2H， d， J=8.3Hz， Cy3); 7.37 (2H， d， J=8.3Hz， Cy3);7.34 (4H， d， J=9.3Hz， MG); 7.30 (2H， d， J=8.8Hz， MG); 7.14 (2H， d， J=8.8Hz， MG); 7.00 (4H， d， J=9.3Hz MG); 6.54(2H， d， J=13.5Hz， Cy3); 6.52 (2H， d， J=13.5Hz， Cy3); 4.22 (4H， m， Cy3); 4.18 (2H， m， MG); 4.16 (4H， m， Cy3);4.03 (2U， s， リンカー); 3.44 (2H， 不明瞭， MG); 3.29 (12H， s， MG); 3.43 (1H， m， リンカー); 3.25 (2H， m， リンカー); 3.16(2H， m， リンカー); 2.23 (4H， t， J=7.4Hz， Cy3); 2.05 (2H， m， MG); 1.84 (4H， m， Cy3); 1.74 (24H， s， Cy3); 1.67(4H， m， Cy3); 1.43 (4H. m， Cy3); 1.42 (6H， t， J=7.2Hz， Cy3).
【０１３３】
化合物１１「ＭＧ−ＴＴ−Ｂｏｃ」
Ｎ−（４−｛（４−｛［７−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝−１３−（６−｛［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］メチル｝−１１，１１−ジメチル−３，９−ジオキソ−５，１０−ジオキサ−２，８−ジアザドデク（diazadodec）−１−イル）−２，２−ジメチル−４，１０，１６−トリオキソ−３，８，１４−トリオキサ−５，１１，１７−トリアザイコサン（triazaicosan）−２０−イル］オキシ｝フェニル）［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチリデン（methylidene）｝シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）−Ｎ−メチルメタナミウム（methylmethanaminium）クロライド  
２−［２−［［（１，１−ジメチルメトキシ）カルボニル］アミノ］−１−［［［（１，１ジメチルエトキシ）カルボニル］アミノ］メチル］エトキシ］−酢酸  ８（非特許文献３８）（３５ｍｇ；０．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ溶液０．１ｍＬに、ＴＳＴＵ（３２ｍｇ；０．１２ｍｍｏｌ）を加え、ＤＩＰＥＡ（３４μＬ；０．２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間撹拌した。反応が完了した後、「ＭＧ−Ｔ」９（２４ｍｇ；０．０４ｍｍｏｌ）を加え、その後ＤＩＰＥＡ（３４μＬ；０．１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一夜撹拌した。エーテル（３ｍＬ）を加えることによって生成物を沈澱させた。沈殿物をクロロホルム中に溶解し、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム／５〜３０％メタノール／０．１％アンモニア）によって精製した。生成物の分画を濃縮して、暗緑色樹脂４０ｍｇを得た（８１％）。  
Ｃ41Ｈ62Ｎ9Ｏ17+Ｃｌ-ＥＳＩ：ＭＳ+７９２．４７モノアイソトープ（monoisotope）。1H-NMR: (CDCl3， 500MHz) δ 8.55 (2H， m， アミド); 8.43 (1H， m， アミド); 7.39 (4H， d， J=9.1Hz); 7.30 (2H， d， J=8.4Hz); 7.14 (2H， d， J=8.4Hz); 6.90 (4H， d， J=8.9Hz); 5.90 (4H， m， Boc-アミド); 4.27 (2H， t， J=6.4Hz); 4.13 (2H， s); 4.05 (4H， s); 3.53 (6H， m); 3.47 (2H， m); 3.35 (5H， m); 3.32 (12H， s， MG-N-メチル); 3.15 (4H， m); 2.15 (2H， m); 1.43 (36H， s， Boc).
【０１３４】
化合物１２「ＭＧ−ＴＴ」
Ｎ−（４−｛［４−（｛１５−アミノ−１４−（アミノメチル）−８−［（｛［（１，３−ジアミノプロパン−２−イル）オキシ］アセチル｝アミノ）メチル］−５，１１−ジオキソ−７，１３−ジオキサ−４，１０−ジアザペンタデク（-diazapentadec）−１−イル｝オキシ）フェニル］［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチリデン（methylidene）｝シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン）−Ｎ−メチルメタンアミニウム（methyl methanaminium）クロライド
ＭＧ−ＴＴ−ＢＯＣ  １１  ４０ｍｇのクロロホルム（１ｍｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸（１００μＬ）を加えた。反応混合物を一夜撹拌した。反応混合物から生成物が沈澱する。上清を捨て、残渣をクロロホルムで洗浄した（２×１ｍＬ）。生成物をそのまま次の反応ステップにおいて用いた。
【０１３５】
ＥＳＩＭＳ（ネガティブ）［Ｍ+1］ｍ／ｚ７９２．５モノアイソトープ。1H-NMR: (MeOD， 500MHz) δ 7.42 (4H， d， J=9.1Hz); 7.37 (2H， d， J=8.8Hz); 7.18 (2H， d， J=8.8Hz); 7.04 (4H， d， J=9.4Hz); 4.30 (4H， s); 4.21 (2H， t， J=6.1Hz); 4.14 (2H， s); 4.06 (2H， m); 3.64 (1H， m); 3.47 (2H， t， J=7.2Hz); 3.46 (2H， dd; J=14.4Hz， 4.9Hz); 3.38 (2H， dd， J=14.1Hz， 5.8Hz); 3.33 (12H， s); 3.30 (4H， dd， J=14.4Hz， 3.8Hz); 3.17 (4H， dd， J=13.8Hz， 7.1Hz); 2.09 (2H， 五重線).
【０１３６】
化合物１３「テトラＣｙ３−マラカイトグリーン」（ＴＣＭ）
三ナトリウム２−｛（１Ｅ，３Ｅ）−３−［１−（１５−［２−（｛３−［４−（｛４−［クロロ（ジメチル）−ｌ5−アザイリデン（azanylidene）］シクロヘキサ−２，５−ジエン−１−イリデン｝［４−（ジメチルアミノ）フェニル］メチル）フェノキシ］プロピル｝アミノ）−２−オキソエトキシ（oxoethoxy）］−２９−｛（２Ｅ）−２−［（２Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホネート−３Ｈ−インドリウム（indolium）−２−イル）プロパ（prop）−２−エン−１−イリデン］−３，３−ジメチル−５−スルホネート−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール（indolium）−１−イル｝−２１−｛［（６−｛（２Ｅ）−２−［（２Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホネート−３Ｈ−インドリウム−２−イル）プロパ（prop）−２−エン−１−イリデン］−３，３−ジメチル−５−スルホネート−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール（indolium）−１−イル｝ヘキサノイル）アミノ］メチル｝−９−｛［（６−｛（２Ｚ）−２−［（２Ｅ）−３−（１−エチル−３，３−ジメチル−５−スルホネート−３Ｈ−インドリウム−２−イル）プロパ（prop）−２−エン−１−イリデン］−３，３−ジメチル−５−スルホネート−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドール−１−イル｝ヘキサノイル）アミノ］メチル｝−６，１２，１８，２４−テトラオキソ−１０，２０−ジオキサ−７，１３，１７，２３−テトラアザノナコス（ｔｅｔｒａａｚａｎｏｎａｃｏｓ）−１−イル）−３，３−ジメチル−５−スルホネート−１Ｈ−インドール（indolium）−２（３Ｈ）−イリデン］プロパ（prop）−１−エン−１−イル｝−１−エチル−３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリウム−５−スルホネート
【０１３７】
「ＭＧ−ＴＴ」１２（１６．５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の０．５Ｍ炭酸水素ナトリウム／２０％アセトニトリル（０．５ｍＬ）溶液に、固体Ｃｙ３．２９−ＯＳｕ（１００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を少しずつ、撹拌しながら６時間かけて加えた。標識化反応の進行を、ＨＰＬＣ  ＲＰ１８−水／アセトニトリル；１０〜１００％直線勾配３０分（５５０ｎｍおよび６３０ｎｍで検出）によってモニタリングした。最後の添加の後、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応混合物をＢｉｏ−ｇｅｌ  Ｐ２カラム（１９ｍｍ×５００ｍｍ）を通過させて未反応のＣｙ３．２９を反応生成物から分離した。移動の速い分画を収集し、濃縮し、ｕ−Ｂｏｎｄａｐａｋ  ＲＰ−１８  ｐｒｅｐ  ＨＰＬＣカラム（１９ｍｍ×３００ｍｍ）流速ｆｌｏｗ：１０ｍＬ／分  水／アセトニトリル（１０〜２５％  ３０分；３０％〜１００％  ３０分）上で分離した。収量：１５ｍｇ（２２％）。Ｃ165Ｈ202Ｎ17Ｏ15Ｓ8Ｎａ3  ＬＣ−ＥＳＩＭＳ（ネガティブ）［Ｍ-3］ｍ／ｚ１０７９．１、モノアイソトープ；Ｃ165Ｈ202Ｎ17Ｏ15Ｓ8-3に対する計算値ｍ／ｚ１０７９．０７。1H-NMR.
【０１３８】
（実施例２）
最初のプローブデザインは、十分に特徴付けられた有機蛍光色素および活性化可能な蛍光団（fluorogen）に基づくものである（図８）。マラカイトグリーンは、選択されたｓｃＦｖによって高度に蛍光状態に（＞１５，０００倍）活性化される、６５６ｎｍで発光極大の、非蛍光性のトリフェニルメタン色素である。本発明者らのプローブの効率は、ドナー（Ｃｙ３）分子と蛍光団分子との間の著しいエネルギー移動に依存する。全てのモデルに対するフェルスター半径（radii）は、Ｓｔｒｙｅｒによって提唱された式から算出された。これらの数値およびＰＡＭＡＭデンドロンの実験上の性質の平均から、本発明者らは、本発明者らの各々の潜在的な色素対に対するデンドロン世代の関数として、エネルギー伝達効率（Ｅ）を形作ることができた。図９（上）は、各対に対する世代の関数としてのＥの値を示す。これらの色素対の各々の最高世代４までの選択に対して、効率は９９％を超え、高吸光度で劇的な切替えの可能性がある試薬が提供される。
【０１３９】
これらのプローブの性質が溶液色素の性質にしたがうことを想定して、本発明者らは、ＥＧＦＰと比較し、アクセプター色素の励起の増強、および単一分子分析における輝度の増強（図９下）に対する可能性を分析した。この分析において、ドナー色素の吸光係数に、所与のデンドロンの世代における官能基の数を乗じた。アクセプターの効率的な吸光度をもたらすために、この数は上記で計算されたＦＲＥＴ効率（Ｅ）によって決定された。これらの値は、活性化条件下、アクセプター分子の報告されている量子収量によって決定された（ＭＧ−ｓｃＦｖ  ＱＹ＝０．２４）。これは、ＥＧＦＰと比べた活性化された分子の輝度の尺度をもたらし（５３，０００Ｍ-1ｃｍ-1およびＱＹ＝０．６０）、単一の可視の蛍光タンパク質よりも潜在的に５〜１４０倍明るいプローブを開発することができ、標準的な蛍光顕微鏡における単一分子検出の範囲に容易に移行することを実証した。さらに、青色から黄色への励起のシフトにより、自己蛍光は劇的に低減し、長いストークスのシフトおよび近赤外の発光により検出効率および効率的なシグナル対ノイズが改善される。
【０１４０】
ドナーアレイの蛍光に対する高充填の影響を試験するために、２つのシスタミンコアＰＡＭＡＭデンドリマー（世代２〜１６ＮＨ2および世代３〜３２ＮＨ2）を過剰の単反応性Ｃｙ３−ＮＨＳエステルで標識した。ゲルろ過によって過剰の色素を除去した後、得られた巨大分子を電気泳動によって分析し、正味の移動度が低いことを見出した。各Ｃｙ３分子は１つの負の正味荷電を保有するので、完全に修飾されているデンドロンは−２の正味荷電を有さなければならない。これらのコンジュゲートにおいて観察される移動度の欠如は、これらが実質的に修飾されていることを示唆するが、質量分析ではこれはまだ確認されていない。しかし、これらのコンジュゲートにより、ドナー消光の潜在的な危険性の評価が可能である。驚くべきことに、本発明者らは、色素は著しく込み合っているのにかかわらず、色素ごとの量子効率はわずかにしか低減されないことを見出した（表１）。さらに、著しいシフトまたは空間の変化は見出されず、これらのドナーアレイは溶液中では凝集物を形成しないことを示していた。
【０１４１】
【表１】
2016014033.tif 000014
【０１４２】
蛍光発生的なダイドロンは、Ｃｙ３と現存する（および予想される）蛍光団との間のエネルギー移動対としてデザインされている。マラカイトグリーンは、選択されたｓｃＦｖによって高度に蛍光状態に（＞１５，０００倍）活性化され、６５６ｎｍで発光極大の、本質的に非蛍光性のトリフェニルメタン色素である。プローブは、ドナー（Ｃｙ３）分子と蛍光団分子との間の効果的なエネルギー移動に依存している。このプロジェクトにおける蛍光発生的なダイドロンを有する蛍光モジュールに発展するためのより赤色の蛍光団を図１０に示すが、これには、これらのカルボキシル基によって連結するデンドロンに結合することができる、マラカイトグリーンのアセチレン性誘導体（発光７３０ｎｍ）、ＤＩＲ、およびインドシアニングリーンの誘導体（発光約８００ｎｍ）が含まれる。マラカイトグリーンのアセチレン性誘導体、およびインドシアニングリーンの誘導体が選択されているが、これはこれらが水中で非常に低い量子収量（≦０．００３）、および環境的に感受性がある蛍光の性質を有するからであり、これは潜在的な蛍光発生性の最強の指標の１つである。
【０１４３】
（実施例３）
方法
バッファー系。記載がない場合は、全実験において、修飾されたリン酸緩衝食塩水系（ＰＢＳ＋）を用いた（３７ｍＭ  ＮａＣｌ１、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、Ｋ２ｍＭ  Ｈ2ＰＯ4、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％（重量／容量）  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ａｎａｔｒａｃｅ）、ｐＨ７．４）。
【０１４４】
吸収スペクトル。ＨＰ  Ｌａｍｂｄａ４５分光光度計でスペクトルを取った。ＭＧ−２ｐの吸光係数は、エタノール／５％ＨＡｃ中同じ溶媒中マラカイトグリーンシュウ酸塩（ＡＣＲＯＳ）の半塩に対してキャリブレーションすることによって、９１，５００Ｍ-1ｃｍ-1であると決定された。ＭＧ−２ｐの酸性化したエタノール／ＰＢＳ＋の吸光度比により、ＰＢＳ＋中の吸光係数５０，７００Ｍ-1ｃｍ-1がもたらされた。次いで、この値に、ＭＧ−２ｐならびにＣＭ、ＢＣＭ、およびＴＣＭダイドロンのＭＧバンドがＬ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄに結合した場合に観察されるファクターの増大（それぞれ１．５６、１．７８、１．９３、１．８０）を乗じて、各蛍光団に対する効果的なＭＧの吸光係数を得た。５５２ｎＭのダイドロン吸効率を、効果的なＭＧ係数に割り当てることで、表２に報告するダイドロンの吸光係数がもたらされた。
【０１４５】
蛍光スペクトル。Ｑｕａｎｔａｍａｓｔｅｒモノクロメーター蛍光計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）でスペクトルを取った。蛍光モジュール（図１１）を評価するために、約３００ｎＭのＭＧ−２ｐまたはダイドロンを、３μＭのＬ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ  ＦＡＰと室温で２時間平衡にした後、スペクトルを取った。蛍光モジュールおよび遊離の蛍光団のスペクトルを、ＰＢＳのバックグラウンドおよび波長依存性の光電子増倍管の感度に対して補正した。
【０１４６】
量子収量。蛍光モジュールを上記の通り構築し、アクセプターのＭＧ励起バンドに基づく量子収量を、キャリブレーション色素としてＣｙ５．１８を用いて記載されている通りに決定した（非特許文献１）。６２０ｎｍの励起で決定された量子収量（表２）は、５９０ｎｍの励起で決定された未報告の量子収量と本質的に同じであった（＜５％差）。
【０１４７】
マイクロプレート蛍光定量法。マイクロプレート蛍光定量法を、酵母細胞５×１０6個／ウェルを有する９６ウェルマイクロプレートを用いてＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ２マイクロプレートリーダー上で行った。蛍光の読みを、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａフローサイトメーターを用いて免疫標識したｓｃＦｖ  ｃ−ｍｙｃエピトープの分析によって、酵母表面にディスプレイされたＦＡＰの数に対して標準化した（非特許文献１）。
【０１４８】
顕微鏡。画像は全て、Ｚｅｉｓｓ  ５１０  ＭｅｔａＮＬＯ共焦点顕微鏡で取った（設定に対して、補足情報の表３を参照されたい）。顕微鏡の本来の１２ビットのダイナミックレンジを用いた画像分析をＺｅｉｓｓ  ＺＥＮ  ２００７ソフトウエアを用いて行った。新たに収集し、洗浄した生酵母細胞（ＰＢＳ  ｗ／ｏ  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７またはＥＤＴＡ中、約３×１０7細胞／ｍｌの懸濁液２０μｌ）を、コンカナバリン−Ａ  １ｍｇ／ｍｌで予めコーティングした、可視光域ウィンドウ１４ｍｍを有する３５ｍｍ培養皿（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）上に固定化した。１０分間、細胞を結合させ、次いで、好適な濃度のダイドロンを含むＰＢＳ＋またはｓｃＦｖ誘導培地１ｍｌで重層し（非特許文献１）、ロータリーシェーカー上で３０分間穏やかに混和して色素と細胞とを確実に平衡にした。非コーティングの３５ｍｍ培養皿上、ＤＭＥＭ中ＨｅＬａ細胞を増殖させた（上記を参照されたい）。下記の通り、マイクロインジェクションおよび共焦点顕微鏡を、ＤＭＥＭ中で行った。図６における小型マルチ発色団のダイドロンを、実施例１に記載する通りに調製した。
【０１４９】
ダイドロンの性質を詳しく研究するために、本発明者らは、定向進化によってＭＧに結合したときに親和性および輝度を増大するオリジナルのＬ５−ＭＧクローン（特許文献１を参照されたい）由来のアミノ酸１１０個のｓｃＦｖ（Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ）を使用し、定向進化が、色素タンパク質および蛍光タンパク質よりも大幅に大きい輝度を有するダイドロン／ＦＡＰ蛍光モジュールを生成することができることを実証するために、本発明者らは引き続き、さらなるＬ５−ＭＧ誘導体であるＬ９１ＳおよびＥ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓを特徴付けした（図１２）。さらなるＦＡＰを図１２Ｂに示す。
【０１５０】
分泌されたＬ５−ＭＧアクチベーターおよび進化した誘導体のｓｃＦｖのペプチド配列を、図１２Ａに示す。ダイドロンに結合するユニットを含む、アミノ酸１１０個の抗体軽鎖可変領域に下線をつけてある。発現の表現型（下線付）を供与する親のＬ５−ＭＧの定向進化（非特許文献１）によって獲得されるアミノ酸；灰色で強調したアミノ酸は、発現の変化に相関しない変異である。Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄは、Ｌ５−ＭＧに比べて明るく、細胞表面上にディスプレイされる場合、ダイドロンにより緊密に結合するので、ダイドロンシリーズの系統的研究に選択された、最初に特徴付けられた誘導体であった（図１３）。Ｌ９１Ｓ誘導体はＥ５２D変異体よりも相当明るいが、ダイドロンシリーズにかなり不十分に結合し、定量比較にあまり適さない（図１３）。引き続き特徴付けられた二重変異体のＥ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓは、Ｅ５２Ｄの高い結合親和性を保持し、Ｌ９１Ｓの輝度を改善することが見出され（図１３）、したがってダイドロンを用いた画像化およびアッセイの応用に対する現在の選りぬきのＦＡＰである。
【０１５１】
図１３は、定向進化によるＴＣＭ蛍光モジュールの改善を示す。Ｌ５−ＭＧ  ＦＡＰを変異誘発に曝し、酵母細胞表面にディスプレイされたＦＡＰを、ＭＧ−２ｐを用いて、輝度および結合親和性の増大に対してスクリーニングした。示した点突然変異を有する、Ｌ５−ＭＧをディスプレイする酵母細胞および変異体（図１４）を、９６ウェルマイクロプレートのフォーマットにおいて、ＴＣＭ蛍光（励起５５４ｎｍ／発光６６０ｎｍ）に対してＰＢＳ＋中アッセイした。データを、免疫染色したｃ−ｍｙｃエピトープのＦＡＣＳ分析によって決定された、発現されたＦＡＰの数に対して標準化する。
【０１５２】
Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄに結合しているダイドロンのスペクトルの特徴付け
ダイドロンは全て溶液中で遊離であり、活性化するポリペプチドの非存在下でＭＧの量子収量が非常に低いことと一致して、ＭＧによるＣｙ３蛍光の＞９９％の消光（表２）、およびＭＧに関連するスペクトル範囲において本質的に検出できない蛍光を示した（非特許文献２）。結合していないＴＣＭダイドロンの蛍光の量子収量は＜０．０００５であり、ドナーの非常に直接的な発光は効率的に消光され、ＦＡＰが活性化するダイドロンの検出を妨害しない。
【０１５３】
【表２】
2016014033.tif 000015
【０１５４】
a可溶性ダイドロン／Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ複合体の決定。b励起６２０ｎｍで決定されたＭＧ励起ピークに対する量子収量。c非特許文献４０を参照されたい。d細胞表面にディスプレイされたＴＣＭ３０ｎＭのＬ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓ対Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ蛍光の比率として図１３におけるデータから。e（染色された集団の中央値−非染色の対照の中央値）としてデータから算出された分子および約数。fＬ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄをディスプレイする酵母細胞表面結合性ダイドロンに対して決定。g合計の吸収で標準化したダイドロンの蛍光（５３０〜８００ｎｍ）を、合計の吸収で標準化したＣｙ３．２９の蛍光によって除して算出。ＭＧの吸収のピークをダイドロンの標準化に用いた。
【０１５５】
ＴＣＭダイドロンを哺乳動物の生存細胞の細胞質中に注射すると、同様の画像化条件下のポジティブのシグナルに比べて本質的に検出できない、低レベルの蛍光を生成した。
【０１５６】
ダイドロンの、酵母細胞表面がディスプレイするｓｃＦｖに対する結合親和性を、以下の通り決定した。Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄを発現するＪＡＲ２００酵母細胞を、指摘されたダイドロン濃度の存在下、修飾されたＰＢＳ＋バッファー中細胞１０7個／ｍｌに懸濁した。Ｓａｆｉｒｅ２プレート蛍光光度計で蛍光強度を読み取った。表２に報告したＫD値を、ここに示す１サイト（ｓｉｔｅ）の双曲線結合曲線に対するＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４ソフトウエアの適合を用いて決定した。これらの条件下で１ｎＭ未満のＫD値を正確に決定することはできない。蛍光レベルがプラトーであることは、ＭＧバンドの６３５ｎｍのレーザー励起を用いたフローサイトメトリー分析において見られた相対的な蛍光シグナルに緊密に対応した（表３）。
【０１５７】
【表３】
2016014033.tif 000016
【０１５８】
ＰＢＳ＋バッファー中ダイドロン１００ｎＭのスペクトルを記載した通りに取り、ＰＢＳ＋バックグラウンドおよび波長依存性の光電子増倍管の感度に対して補正した。遊離のダイドロンの蛍光は、Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ  ＦＡＰが活性化するダイドロンに比べて大幅に低減される。比較として、遊離ＴＣＭの最大蛍光は５７２ｎｍで１６，４３０であるが、同じ実験においてＦＡＰ結合したＴＣＭの蛍光は６７６ｎｍで１，６７５，０００である。
【０１５９】
過剰のＬ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄの存在下の色素分子の単一濃度で、ＭＧプローブで正規化した励起スペクトル（７１０ｎｍ検出）は、Ｃｙ３励起がＣｙ３数に正比例して増大する寄与を明らかにしており、これらの簡単な修飾が、ＭＧ単独に比べて構築体の全体の励起の標本（cross-section）を実質的に増強することを示している（図１１Ａおよび表２）。標本（cross-section）の増強の大きさは、Ｃｙ３の吸光度（ε＝１５０，０００Ｍ-1ｃｍ-1）と良好に相関する（非特許文献４１）。ＭＧ励起ピークにおける全てのダイドロンの量子収量は本質的に一定であった。対応する蛍光発光スペクトルは、結合しているＭＧ色素から近赤外発光へのＣｙ３の励起のほとんど完全な移動（＞９９％）を示し、増大する世代のダイドロンと一緒に用いる場合の、プローブ構築体の輝度における本質的な増大を示している（図１１Ｂ）。Ｃｙ３励起およびＭＧ励起の相対的な量子収量は、ドナーの励起は競合する放射性および非放射性のプロセスにはほとんど失われないことを指摘している（表４）。これらの知見は、ダイドロンにおける本質的に非蛍光性または自己消光性のドナーであっても、明るい蛍光に対して高度に効率的な増感性の構造を生成し得る概念を支持するものである（非特許文献４２および非特許文献４３）。
【０１６０】
【表４】
2016014033.tif 000017
【０１６１】
Ｅ５２Ｄ  ＦＡＰに結合している場合、ＭＧ−２ｐおよび全てのダイドロンＭＧアクセプターの吸収はほぼ２倍増大し、これらの吸収最大は赤色シフトし、約６４２ｎｍで合体し、アクセプターの光物理的性質はＦＡＰの結合ポケットによって特異的に調整され、ドナーとは大きく無関係であることを示唆している。これとは対照的にＦＡＰに結合しているダイドロンおよび遊離のＣｙ３のドナー波長での吸収スペクトルには同様の特徴があり、Ｃｙ３の光物理学は大幅に変更されないことを示唆している。
【０１６２】
生存細胞表面上に発現されるダイドロン／Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ蛍光モジュール
Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ蛍光モジュールのｉｎ  ｖｉｔｒｏの分光学的性質は、細胞壁上に融合タンパク質として蛍光団を活性化するｓｃＦｖを発現する生酵母細胞の懸濁液にダイドロン（３００ｎＭ）を直接加えた場合に再現される。フローサイトメトリーは５３２ｎｍで励起した場合の輝度における段階的上昇、および６３５ｎｍで励起した場合のほとんど一定の輝度（図１５）を明らかにしており、励起スペクトル、および６２０ｎｍの励起で測定される一定の量子収量に見られる違いに十分対応している。６３５ｎｍ対５３２ｎｍで励起した酵母細胞の間の染色比を分析することで、（Ｃｙ３）nＭＧ構築体における約２（ｎ＝１）、３（ｎ＝２）、および７（ｎ＝４）倍（a factor of）の特異的な輝度における増大が明らかにされる（表２および表３）。したがって、この取組みは、ドナーアレイによってもたらされる増強された吸光度との直接的な相関において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの分子の輝度を増大する。
【０１６３】
ダイドロンが媒介するシグナル増幅は、生存細胞の蛍光顕微鏡にも応用することができる。その表面上にＬ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ融合タンパク質を発現する酵母細胞（非特許文献１、配列番号１および２の配列については図４Ａを参照されたく、また、ｓｃＦｖアクチベーターと選択性成分との間の有用な融合タンパク質のさらなる例については特許文献１も参照されたい）を、レーザー走査共焦点顕微鏡下で画像化した（図１４）。酵母細胞はその表面上を特異的に標識し、５６１ｎｍの励起で画像化した場合１２ビット画像のフルダイナミックレンジを消費する。ＦＡＰを発現しない細胞から、または細胞間領域から、蛍光は実質的に検出されない。ダイドロンのいくつかの選択的な退色が、このレーザー照射下で観察され、ダイドロンの増強を約３倍まで低減した。
【０１６４】
定向進化によるダイドロン蛍光モジュールのさらなる改善
ＭＧ−２ｐ／Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ蛍光モジュールは中程度の量子収量を有するが、ＴＣＭダイドロンはそのシグナルを増幅してＥＧＦＰおよびほとんどの小型分子タンパク質タグほどの計算された分子輝度をもたらすことができる（表２）。親和性成熟した本発明者らのＬ５−ＭＧ  ＦＡＰの中で、本発明者らは、ＭＧ−２ｐ／Ｌ５−ＭＧ蛍光モジュールの量子収量を数倍増大する単一点突然変異を含むが、ＭＧ−２ｐおよびダイドロンをかなりゆるく結合するＬ５−ＭＧ  Ｌ９１Ｓを特徴付けた。しかし、Ｅ２５Ｄ  ＦＡＰに比べて、Ｌ９１ＳおよびＥ５２Ｄ変異を組み合わせると、同様の親和性でＴＣＭに結合し、マイクロプレートのフォーマットにおいて生酵母を用いてアッセイした場合におよそ６倍大きい蛍光を生成するＦＡＰを作り出すように相加的に振舞う（図１３）。Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓの改善された蛍光の性質は、非常に低濃度のダイドロンを用いて（図１６Ａおよび１６Ｂ）、増殖メディウム（培地）中でさえ（図１６Ｃおよび１６Ｄ）、生酵母の表面を画像化した場合に明らかである。
【０１６５】
図１６Ａ〜１６Ｄは、改善された蛍光モジュールでの生存細胞の表面画像化を示す。Ｅ５２Ｄ（１６Ａ）またはＥ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓ（１６Ｂ）の変異を有する、Ｌ５−ＭＧを発現する酵母細胞を、示されたＴＣＭ濃度を用いて同一のＣｙ３励起／発光で、Ｚｅｉｓｓ５１０  ＭｅｔａＮＬＯ共焦点顕微鏡上、ＰＢＳ＋中、画像化した。スキャンのプロファイルは、１０ｎＭ  ＴＣＭでのＥ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓ二重変異体の蛍光は、１０倍高いＴＣＭでのＥ５２Ｄ蛍光より約５倍高いことを示している。図１４に比べてＥ５２Ｄ蛍光モジュールの弱い見かけの蛍光は、異なる顕微鏡の設定によるものであり、ＴＣＭの結合の低減のためではない（図１３）。ＦＡＰを発現しない酵母細胞の亜集団は蛍光を表さず、特異性に対する内部標準を構成する。
【０１６６】
増殖メディウム（培地）中の酵母のダイドロンベースの画像化。Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓ  ｓｃＦｖの発現を誘発するためにＳＧＲ＋ＣＡＡ培地中で増殖させた酵母を、コンカナバリンＡでコーティングしたＭａｔＴｅｋディッシュに直接加え、ＴＣＭ５０ｎＭを含む同培地１ｍｌで重層した。５６１／６５０〜７１０ＢＰ（バンドパス）の励起／発光の設定による取得共焦点画像のシグナルプロファイルプロットは、表面に限定された蛍光を表しており、細胞間バックグラウンドシグナルは非常に低い（図１６Ｃ）。同一の画像化条件下において、ＰＢＳ＋を増殖メディウム（培地）に置き換えると、本質的に同じ結果が得られ（図１６Ｄ）、メディウム（培地）において同じことを示す。
【０１６７】
考察
これらのダイドロンは、特異的な、遺伝的に標的化可能で切換え可能なアクセプター発色団が、共有結合的に結合したドナー分子からのエネルギー移動による効率的な励起に対して増強される、新しいクラスの蛍光検出試薬を代表するものである。これら合成の巨大分子の全体の分子量は、特に遺伝的に標的にされる蛍光プローブの輝度を改善するための代替の取組みに比べると、依然として小さい。さらに、これらダイドロンを活性化するのに必要とされる遺伝的な融合タンパク質は、ＧＦＰの半分未満のサイズであり得る（ここでは＜１３ｋＤａ）。本明細書に記載するフローサイトメトリー、マイクロプレートアッセイ、および顕微鏡によって示す通り、これらダイドロンは蛍光団／ＦＡＰ複合体のｉｎ  ｖｉｖｏの蛍光を大幅に増強する。ＴＣＭ／Ｌ５−ＭＧ  Ｅ５２Ｄ  Ｌ９１Ｓ蛍光モジュールは、ＥＧＦＰ、および赤色蛍光の二ヒ素（ｂｉａｒｓｅｎｉｃａｌ）複合体（ＲｅＡｓＨ＝３４）よりほぼ５倍高く（表２）（非特許文献４４）、入手可能な最良の単量体の赤色蛍光タンパク質より約１０倍明るい（ｍＣｈｅｒｒｙ＝１６）（非特許文献４５）推定された輝度値（１６０）を有する。ダイドロン蛍光モジュールは、長いストークスシフトおよび近赤外の発光を有し（ｍＣｈｅｒｒｙおよびＲｃＡｓＨに対して６６０ｎｍ対６１０ｎｍ）、これにより確実にこれらプローブは感度における実質的な改善をもたらす（非特許文献４６）。ダイドロンでは、蛍光団の標的ペプチドに対する結合は、ドナーアレイをまたは結合部位近傍中へ運び、ペプチド−蛍光団全体の親和性を低減するが（表２）、これら複合体の安定性は依然として高い（Ｅ５２Ｄ変異体に対して＜２０ｎＭ）。このような機能的な変形は、ｓｃＦｖまたは他の認識骨格の定向進化によって、補正され、または活用される。
【０１６８】
ドナー化学における変形を、このように、蛍光団／ペプチドの相互作用における変形と組み合わせてダイドロンの性質を改善することができる。所与のドナーアレイの検討において、改善された蛍光団の結合親和性および量子収量を選択することができる。ドナーアレイを、吸光係数を増強するようにデザインすることができるが、特定の蛍光団の多光子の標本（cross-section）を増強するなど、他の光学的性質を改善するようにデザインしてもよい。
【０１６９】
これらダイドロンの膜透過性の性質により、遺伝子融合に利用可能な細胞外ドメインを露出している原形質膜タンパク質に関与する広範囲の生物学的機能を研究するのに理想的となっている。これらの中には、細胞間シグナル伝達、イオンおよび代謝産物の伝達チャンネル、ならびに細胞認識および接着のタンパク質を媒介する受容体がある。細胞外ドメインの排他的な標識化により、これらタンパク質の検出は、これらの生物学的機能の部位に限定される。これとは対照的に、蛍光タンパク質がこれら同じ細胞外ドメインに融合すると、生合成および細胞内輸送の間の検出に曝され、細胞表面の機能に無関連のバックグラウンドシグナルが生成される（非特許文献１および非特許文献４７）。本明細書に記載するダイドロンは、その対応物であるＭＧ−２ｐ同様、洗浄または他の処理なしに細胞メディウム（培地）に直接加えることができ、これら蛍光団を、膜タンパク質に応用されている他の低分子標識化方法と区別している。発現可能なプローブの感度の増強により、細胞生物学の研究における高レベルの過剰発現の必要性が低減され（非特許文献４７）、発現レベルに関する人工産物を低減し得る代替の標識化の取組みが提供される。これらダイドロンは組織における細胞間間隙に効率的に浸透するのに十分小型であるので、トランスジェニック動物への注射は潜在的に可能である（非特許文献４８）。
【０１７０】
本明細書に記載するダイドロンは、現在、フローサイトメトリーおよびマイクロプレートアッセイなどの応用に光学的なシグナルの増強をもたらし、個々の蛍光モジュールは合計の励起光束を中程度にするようにされている。さらなる努力により、おそらく、電子求引基をＣｙ３ドナーに加えることによって（非特許文献４９）、またはダイドロンの結合のオン／オフ比を増大するためのＦＡＰの定向進化によって連続的に機能的な蛍光モジュールを再生することによって（非特許文献１）、共焦点蛍光顕微鏡では典型的である強力な照射下でのダイドロンの光安定性の改善が対処される。
【０１７１】
蛍光団を活性化するｓｃＦｖは、細胞質および他の細胞間を還元する環境において機能し得る内部ジスルフィド結合を含んでおり、定向進化を用いてこのようなジスルフィドを除去し、ｓｃＦｖを細胞内機能に適合させてもよい（非特許文献５０および非特許文献５１）。次いで、ダイドロンを、有用性が最大になるように細胞中に導入するのが望ましい。マイクロインジェクション、孔形成、ダイドロンの物理化学的性質の修飾、ダイドロンへの輸送シグナルの付加、または原形質膜と融合することができるダイドロン−担体小胞もしくはエマルションの作製を含めた、膜貫通の送達のためのいくつかの取組みが利用可能である。本明細書に示すダイドロンのマイクロインジェクションに際する低活性化は、細胞内の使用は、特異性の問題ではなく、大きく送達の問題に依然としてあることを指摘している。
【０１７２】
参照によって本明細書に組み込まれる全ての参照に対して、あらゆる対立する用語、概念、または定義に関して、本文書が規制するものとする。
【図１Ａ】
2016014033.tif 000018
【図１Ｂ】
2016014033.tif 000019
【図１Ｃ】
2016014033.tif 000020
【図２】
2016014033.tif 000021
【図３】
2016014033.tif 000022
【図４Ａ】
2016014033.tif 000023
【図４Ｂ】
2016014033.tif 000024
【図４Ｃ】
2016014033.tif 000025
【図４Ｄ−１】
2016014033.tif 000026
【図４Ｄ−２】
2016014033.tif 000027
【図５Ａ】
2016014033.tif 000028
【図５Ｂ】
2016014033.tif 000029
【図５Ｃ】
2016014033.tif 000030
【図６Ａ】
2016014033.tif 000031
【図６Ｂ】
2016014033.tif 000032
【図６Ｃ】
2016014033.tif 000033
【図６Ｄ】
2016014033.tif 000034
【図７Ａ】
2016014033.tif 000035
【図７Ｂ−１】
2016014033.tif 000036
【図７Ｂ−２】
2016014033.tif 000037
【図７Ｃ】
2016014033.tif 000038
【図８】
2016014033.tif 000039
【図９】
2016014033.tif 000040
【図１０】
2016014033.tif 000041
【図１１】
2016014033.tif 000042
【図１２Ａ】
2016014033.tif 000043
【図１２Ｂ】
2016014033.tif 000044
【図１３】
2016014033.tif 000045
【図１４】
2016014033.tif 000046
【図１５】
2016014033.tif 000047
【図１６Ａ】
2016014033.tif 000048
【図１６Ｂ】
2016014033.tif 000049
【図１６Ｃ】
2016014033.tif 000050
【図１６Ｄ】
2016014033.tif 000051
【配列表】
2016014033000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年9月7日(2015.9.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デンドロンに共有結合により結合した活性化可能なアクセプター部分および前記デンドロンに共有結合的により結合した複数のドナー部分を含む化合物であって、
（ａ）前記アクセプター部分はトリアリールメチン色素であり、および、
（ｂ）前記ドナー部分はＣｙ３色素であり、ならびに、
前記ドナー部分は少なくとも５０％の励起エネルギーを前記アクセプター部分に伝達し、
前記アクセプター部分は、活性化されると、前記ドナー部分が励起されて、前記アクセプター部分が活性化されないときに生成されるシグナルとは異なる検出可能な蛍光シグナルを生成する、
ことを特徴とする化合物。
【請求項２】
前記デンドロンは、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドロン、ポリ（エチレン  イミン）（ＰＥＩ）デンドロン、ポリ（プロピレン  イミン）（ＰＰＩ）デンドロン、Ｎｅｗｋｏｍｅデンドロン、２，２−ビス（メチロール）プロピオン酸（ｂｉｓ−ＭＰＡ）デンドロン、ポリフェニレンデンドロン、トリス（オキシメチル）メチルアミノ（ＴＲＩＳ）トリポッドリンカー、（１，３−ジアミノプロパン−２−イル）オキシＴ−リンカー、または、任意選択的にひとつまたは複数の（１，３−ジアミノプロパン−２−イル）オキシＴリンカーに結合したトリス（オキシメチル）メチルアミノ（ＴＲＩＳ）トリポッドリンカーを含むことを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記デンドロンは、６個以下のドナー部分を前記アクセプター部分に接続するトリス（オキシメチル）メチルアミノ（ＴＲＩＳ）トリポッドリンカーを含むことを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記デンドロンは、１６個以下のドナー部分を前記アクセプター部分に接続するＰＡＭＡＭデンドロンを含むことを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
前記アクセプター部分がマラカイトグリーンおよび少なくとも１つの炭素−炭素結合が三重結合であるマラカイトグリーンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記アクセプター部分は、マラカイトグリーンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物は、５０ｋＤａ（キロダルトン）未満の平均分子量を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記化合物は、１０ｋＤａ（キロダルトン）未満の平均分子量を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記ドナー部分は、ひとつまたは複数のドナー部分、および、ひとつまたは複数のメディエータであり、
前記ドナーのスペクトルは、前記メディエータのスペクトルと重複し、および、
前記メディエータのスペクトルは、ドナー部分とアクセプター部分の両方のスペクトルと重複する、
ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物であって、前記アクセプター部分は、
【化１】
2016014033.tif 000052
［式中、
Ｒ１〜Ｒ４は、−Ｈ、−ＣＨ3、（ＣＨ2）n−Ｔ、または、置換されているアリールであり、
Ｒ５は、
【化２】
2016014033.tif 000053
［式中、
ｎ＝０〜６であり、
Ｔは、−Ｈ、−ＯＨ、−ＣＯＯ-、ＳＯ3-、−ＰＯ4-、アミド、ハロゲン、置換された単一もしくは複数個のアリール、エーテル、ポリエーテル、ＰＥＧ１〜３０、Ｎ、Ｓ、もしくはＯ原子を含む複素環、置換されたアセチレン基、シアノ、または、炭水化物基から選択される］であることを特徴とする化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物であって、前記アクセプター部分は、
【化３】
2016014033.tif 000054
［式中、
Ｒ１は、芳香族基、ヘテロ芳香族基、ヒドロキシル、アミノ、Ｎ−アルキル、Ｎ−アルカイリルであり、
Ｒ２は、Ｈ、シアノ、芳香族基、ヘテロ芳香族基、少なくとも１つの炭素−炭素三十結合を有する基、アルキル、−Ｎ（ＣＨ3）2、または、−Ｎ（ＣＨ3）（（ＣＨ2）nＯ（ＣＨ2）mＣＯＯＨ）であり、
Ｘは、Ｎ、Ｏ、またはＳであり、
Ｒ３およびＲ４は存在しないか、またはアルキル、アリール、もしくはヒドロキシエチル
である］
であることを特徴とする化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の化合物であって、
Ｒ１は、ジ−Ｃ1-3アルキルアミノであり、
Ｒ２は、置換されたフェニルアセチレン、フェニル、−Ｎ−アルキル置換フェニル、または、−（ＣＨ2）nＲ５により置換されたフェニルであり、
ｎは、１〜５であり、
Ｒ５は、カルボキシルまたはアミノであり、
Ｘは、Ｎであり、
Ｒ３およびＲ４は、独立に、Ｃ1-3アルキル、アルコキシル、アルカノイル、フェニル、Ｃ1-3アルキル置換フェニルである、
ことを特徴とする化合物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の化合物であって、
Ｒ２は、−Ｎ−（ＣＨ3）2、または、−Ｎ−（ＣＨ3）（（ＣＨ2）nＯ（ＣＨ2）mＣＯＯＨ）［式中、ｎおよびｍは、独立に、１、２、３、または４である］である、
ことを特徴とする化合物。
【請求項１４】
請求項１２に記載の化合物であって、
Ｒ１は、−Ｎ−（ＣＨ3）2であり、
Ｒ２は、−Ｏ（ＣＨ2）3Ｒ５で置換されているフェニル、および、
【化４】
2016014033.tif 000055
のいずれか１つであり、または、
Ｒ３およびＲ４は、ＣＨ3である、
ことを特徴とする化合物。
【請求項１５】
前記アクセプター部分は、
【化５】
2016014033.tif 000056
の１つまたは複数であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物は、
【化６】
2016014033.tif 000057
（ＢＣＭ）または、
【化７】
2016014033.tif 000058
（ＴＣＭ）
から選択される構造を有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記アクチベーターが前記化合物に結合し、前記ドナー部分が励起されたときに、前記化合物の蛍光の増大を引き起こすアクチベーターに結合した請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を含むことを特徴とする複合体。
【請求項１８】
前記蛍光の増大が少なくとも１００倍であることを特徴とする請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
前記蛍光の増大が少なくとも１０００倍であることを特徴とする請求項１７に記載の複合体。
【請求項２０】
前記アクチベーターは、選択性成分に結合していることを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項２１】
前記選択性成分は、前記アクチベーターおよび前記選択性成分を含む融合タンパク質であることを特徴とする請求項２０に記載の複合体。
【請求項２２】
前記選択性成分は、前記アクチベーターに架橋結合していることを特徴とする請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
前記アクチベーターは、ｓｃＦｖフラグメントであることを特徴とする請求項１７に記載の複合体。
【請求項２４】
前記アクチベーターは、配列番号３〜１１の１つであることを特徴とする請求項１７に記載の複合体。
【請求項２５】
前記デンドロンは、ＰＡＭＡＭデンドロンであり、前記アクセプターは、マラカイトグリーンであることを特徴とする請求項２４に記載の複合体。
【請求項２６】
前記化合物は、ＢＣＭまたはＴＣＭであることを特徴とする請求項２４に記載の複合体。
【請求項２７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を、前記化合物のアクチベーターに結合している選択性成分を含む融合タンパク質と接触させてダイドロン複合体を生成するステップと、
細胞中の前記ダイドロン複合体を検出するステップと、
を含むことを特徴とする細胞中の細胞成分を同定する方法。
【請求項２８】
前記選択性成分および前記アクチベーターは、近接するポリペプチド上にあることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記アクチベーターは、ｓｃＦｖフラグメントであることを特徴とする請求項２７または２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記近接するポリペプチドは、前記細胞中に導入された遺伝子によって生成されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記アクセプターは、マラカイトグリーンであることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記アクチベーターは、配列番号３〜９の１つまたは複数を含むポリペプチドであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物は、ＴＣＭまたはＢＣＭであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物は、ＴＣＭおよびＢＣＭの一方であることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記ダイドロン複合体は、蛍光画像化によって検出されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物を、前記化合物のアクチベーターと接触させるステップと、
前記ドナー部分を励起するステップとを含むこと、
を特徴とする蛍光シグナルを生成する方法。