(57)【要約】【課題】新規クラミドモナス及びその応用を提供する。【解決手段】改良された産油クラミドモナス（ｏｉｌ−ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｍｕｔａｔｅｄ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒ）ＣＰＣ１２１５は、海水により培養でき、含油量が高く、低い粘着性（ｌｏｗ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）、重力沈下（ｅａｓｉｌｙ  ｇｒａｖｉｔｙ）、屋外培養可能等の特性を有する。本発明は油脂合成の方法（ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を提供し、バイオディーゼル（Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）の生産方法を含み、前述のクラミドモナスの食品及び飼料を含む。【選択図】図１０
2016140359.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＰＣ１２１５であって、
前記クラミドモナスＣＰＣ１２１５は、受託番号ＢＣＲＣ９８００３５として中華民国の財団法人新竹食品工業発展研究所に寄託されていることを特徴とする、
微生物の生物培養物。
【請求項２】
前記クラミドモナスＣＰＣ１２１５は、そのｒｂｃ  Ｌの配列及び配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の相似度が９０％以上に達することを特徴とする、請求項１に記載の微生物の生物培養物。
【請求項３】
前記クラミドモナスＣＰＣ１２１５は油脂含有量が３０％以上に達し、産油率が１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ以上に達することを特徴とする、請求項２に記載の微生物の生物培養物。
【請求項４】
請求項１の微生物の生物培養物を使用して油脂を生産することを含むことを特徴とする油脂の合成方法。
【請求項５】
前記生物培養物の窒素飢餓処理を含むことを特徴とする、請求項４に記載の油脂の合成方法。
【請求項６】
温度範囲が２５〜３５℃に指定されて前記生物培養物が培養されることを特徴とする、請求項４に記載の油脂の合成方法。
【請求項７】
前記生物培養物の養殖培養基には淡水或いは塩度１〜３％  の海水が配置されて使用され、バイオマス１．５ｇ／Ｌ以上の生産量を獲得することを特徴とする、請求項４に記載の油脂の合成方法。
【請求項８】
請求項１の微生物の生物培養物を使用してバイオディーゼルを生産することを含むことを特徴とするバイオディーゼルの生産方法。
【請求項９】
請求項１の微生物の生物培養物に基づくものを含むことを特徴とする食品。
【請求項１０】
請求項１の微生物の生物培養物に基づくものを含むことを特徴とする飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、海水を利用して培養でき、高い含油量、低い粘着性、重力沈下、屋外で培養可能等の特性を有し、エネルギー生産に応用される技術に関し、より詳しくは、油脂を生産する新規クラミドモナス（Ｎｏｖｅｌ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
石油価格の高騰、環境汚染及び温室効果等の課題に対して、次世代のバイオ燃料として『微細藻類（ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ）』が世界で注目を集めている。微細藻類は多様で培養しやすいという特性があるため、商業上の利用性が極めて高く、製薬、健康食品、農業用の肥料、漁業の養殖用の飼料、化粧品等に限らず、バイオディーゼル等のバイオ燃料及び生化学製品の生産にも利用されている。
【０００３】
科学者が海洋及び湖沼から微細藻類を分離させた結果、その油脂の構成が一般的な植物性の油脂に相似し、Ｃ１６、Ｃ１８系脂肪酸が主となっている。高等な植物種子の脂肪酸の含有量は乾燥重量の僅か１５％〜２０％前後しかなく、微細藻類では脂肪酸の含有量が窒素の欠乏時には細胞の乾燥重量の７０〜８０％に達する。
微細藻類のバイオディーゼルの単位当たりの生産量は他の産油植物よりも約１０〜２０倍高く、優良なバイオディーゼル原料であり、第三世代のバイオ燃料（ｂｉｏｆｕｅｌｓ）といえる。研究では、微細藻類を直接利用してバイオディーゼルを生産した場合、現在の交通燃料の５０％が代替可能であり、これはアメリカの現在の総農作地の僅か３％程度を使用すれば十分である。微細藻類の生長においては、二酸化炭素を炭素源として光合成を行うため、昨今厳しさを増す温室効果問題も同時に解決できる。微細藻類を利用して生産されたバイオディーゼル（Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ）は無毒であり、環境保護に適い、且つ耕地を占有しない等の長所を有し、また、二酸化炭素及び硫酸化物の排出を減少させることもできる。
欧州連合（ＥＵ）は２０２０年までに、全ての燃料の１０％をバイオ燃料とすることを目標として定め、航空燃料及びディーゼルも１０％のバイオ燃料を加えることを求められている。故に、近い将来、バイオディーゼルには大きな需要が生まれることが予想され、このため、バイオディーゼル材料の探求と開発が世界各国で危急の議題となっている。２００７年Ｎａｔｕｒｅ誌に『Ａｌｇａｅ  ｂｌｏｏｍ  ａｇａｉｎ』と題されたコラムが掲載され、再生エネルギー分野において藻類によるバイオエネルギーの重要性が掲示され、これは環境保護の角度、エネルギーの角度、及び国家の経済等のどの角度から見ても藻類は国家のエネルギー政策にとって決して欠くことのできない役割を担っていることを間接的に説明している。どのように高い経済効果を実現し、環境保護も両立させ、異なる藻体の炭素分離効率及び付加価値を高めるかが、近年先進各国が研究開発に力を入れている課題である。
【０００４】
また、１キログラム（乾燥重量）の独立栄養微細藻類が約１．８キログラムの二酸化炭素を吸収してバイオマスに変化させるため、微細藻類の成長時には同時に温室効果ガスである二酸化炭素の大気中への排出量が減少する。また、微細藻類の培養に必要な窒素及び燐は生活廃水或いは養殖の廃水から取得でき、養殖時に廃水が浄化されるため、廃水の処理効果も達成できる。
微細藻類によるバイオ燃料の最大のボトルネックは、生産コストが高過ぎ、化石燃料よりもずっと高く、アメリカ合衆国エネルギー省が２０１２年に行った微細藻類による藻オイルの販売価格の分析では、１ガロン約９．２８米ドルであり、同時期の化石燃料のディーゼルの販売価格は１ガロン３．６１米ドルであった。
アメリカ合衆国エネルギー省は２０１３年８月に藻類によるバイオ燃料の開発に２億２千万米ドルを投資すると発表しており、２０１９年には微細藻類によるバイオ燃料のコストが半減し、大規模な商業化を達成させ、微細藻類による藻オイルの販売価格が１ガロン２．２７米ドルまで低下し、コストが削減されると予測している。即ち、遺伝子組み換え方式により藻類の生産効率を高め、生物化学技術の発展により、人工的に突然変異を誘導して藻の改良を行い、微細藻類の生長密度を高め、養殖環境に対する耐性を高め、極めて高い商業的価値を有するスーパー微細藻類を創出することを目指している。
【０００５】
人工的に突然変異を誘導することは種の進化における重要なメカニズムであり、自然環境ではその発生確率が約百万分の一から十万分の一に過ぎず、よって人工的に突然変異を誘発する。その方式は、放射線、紫外線、アルキル化剤（ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ニトロソ（ｎｉｔｒｏｓｏ）化合物等があり、ここでは紫外線による突然変異を例にする。
紫外線を照射してＤＮＡ分子にピリミジン二量体を形成させ、染色体の遺伝子が正確に対になって配置されるのを阻害させ、微細藻類の遺伝子に突然変異を引き起こさせるか死亡させる。通常では、この方式により無数の突然変異株を獲得し、続いて形質スクリーニングを行い、産油能力の優れた微細藻類を獲得し、微細藻類の油脂含有量のスクリーニングを行って、優良な産油能力を有する微細藻類を大規模に選別する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
クラミドモナス属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）は、緑藻植物門（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔａ）／緑藻類（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ）の１つの属（ｇｅｎｕｓ）であり、鞭毛を有する単細胞生物であり、直径約１０マイクロメートルである。クラミドモナス及び藍藻類は微細藻類界の真核藻類及び原核藻類で最も代表的なモデル生物であり、ショウジョウバエが遺伝学の学術研究に貢献しているのと同じく、クラミドモナスも１９４５年から分子生物学及び遺伝子工学の研究材料として長く用いられ、核酸及びタンパク質等の生物の分子の機能、形態構造の特徴、機能性及び規則性の研究に使用されている。
クラミドモナスは学術研究において重要な研究材料であり、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７Ｃが最もよく使用される藻類（ａｌｇａｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ）である。クラミドモナスはバイオ燃料関連の研究において、１９５２年にＦｒｅｎｋｅｌがクラミドモナス及び他の緑藻が特定の状況下で水素を発生させることを発見し、それから研究が始まった。
しかしながら、水素を発生させるメカニズムが解明されておらず、効率を制御するのが難しく、さらなる研究でこのボトルネックを突破することが期待されている。
【０００７】
クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７Ｃは油脂の生産に関する研究のモデル藻類であり、クラミドモナスは遺伝物質を有する細胞核、葉緑体、ミトコンドリアの３つの染色体遺伝子の解読がすでに完了しており、オープンなデータベースが構築されて研究者に提供されている。前述の３つの系統の形質転換工具が更に発展し、油脂生産の研究では、遺伝子組み換え技術を利用してモデルクラミドモナスに対して改造を加えるものに集中しており、クラミドモナスＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  １３７Ｃに対して突然変異或いは産油に関わる遺伝子の改造を人工的に誘導し、産油形質の改変の研究が進んでいる。
以前の研究では、発見されたクラミドモナスの大部分が淡水環境で生長しており、且つその油脂含有量は低く（１０〜１５％）、他の油脂を生産する微細藻類（  ＞３０％）と比べると、大規模な養殖には適していない。商業生産で最もよく油脂生産に使用される藻類はクロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｖｕｌｇａｌｉｓ）であり、産油率は約５０〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄであり、淡水環境で生長するが、クロレラの淡水での培養には大量の飲用水が必要であり、水資源の奪い合いの問題があるため、多くの科学者は、海水或いは塩水で培養できる藻類の探求を始めている。このため、海水で養殖でき、且つ高い脂肪含有量及び高いバイオマスの生産量を有する微細藻類が、バイオ燃料を生産するための有望な藻類となっている。
本発明の油脂を生産する新規クラミドモナスも同様に、海水で培養でき、高い含油量、低い粘着性、重力沈下、屋外で培養可能等の特性を有し、エネルギー生産技術に応用され、且つ飲用水を消費しないという長所を有する。
【０００８】
参考資料：Ｃｈｉｓｔｉ  Ｙ  （２００７）  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ  ２５：  ２９４−３０６；Ｃｈｉｓｔｉ  Ｙ  （２００８）  Ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  ｂｅａｔｓ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：  １２６−１３１；Ｆｕ  Ｚ，  Ｙａｎｇ  Ｆ，  Ａｎ  Ｙ，  Ｘｕｅ  Ｙ  （２００９）  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｔｅ  ａｎｄ  ｎｉｔｒａｔｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌａｎｄｆｉｌｌ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  １００：  ３０１５−３０２１；Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ＡＲ  （２０００）  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：  １３２−１３７；Ｈａａｇ  ＡＬ  （２００７）  Ａｌｇａｅ  ｂｌｏｏｍ  ａｇａｉｎ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４４７：  ５２０−５２１；Ｒｏｄｏｌｆｉ  Ｌ，  Ｃｈｉｎｉ  Ｚｉｔｔｅｌｌｉ  Ｇ，  Ｂａｓｓｉ  Ｎ，  Ｐａｄｏｖａｎｉ  Ｇ，  Ｂｉｏｎｄｉ  Ｎ，  Ｂｏｎｉｎｉ  Ｇ，  Ｔｒｅｄｉｃｉ  ＭＲ  （２００９）  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ  ｆｏｒ  ｏｉｌ：  ｓｔｒａｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｕｔｄｏｏｒ  ｍａｓｓ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｌｏｗ−ｃｏｓｔ  ｐｈｏｔｏｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０２：  １００−１１２；Ｓｉａｕｔ  Ｍ，  Ｃｕｉｎｅ  Ｓ，  Ｃａｇｎｏｎ  Ｃ，  Ｆｅｓｓｌｅｒ  Ｂ，  Ｎｇｕｙｅｎ  Ｍ，  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｐ，  Ｂｅｙｌｙ  Ａ，  Ｂｅｉｓｓｏｎ  Ｆ，  Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｉｄｅｓ  Ｃ，  Ｌｉ−Ｂｅｉｓｓｏｎ  Ｙ，  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｇ  （２０１１）  Ｏｉｌ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｄｅｌ  ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａ  Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ：  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃｏｍｍｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒａｉｎｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｒｃｈ  ｒｅｓｅｒｖｅｓ．  ＢＭＣ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：  ７；Ｓｐｏｌａｏｒｅ  Ｐ，  Ｊｏａｎｎｉｓ−Ｃａｓｓａｎ  Ｃ，  Ｄｕｒａｎ  Ｅ，  Ｉｓａｍｂｅｒｔ  Ａ  （２００６）  Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０１：  ８７−９６；Ｗａｎｇ  Ｂ，  Ｌｉ  Ｙ，  Ｗｕ  Ｎ，  Ｌａｎ  ＣＱ  （２００８）  ＣＯ（２）  ｂｉｏ−ｍｉｔｉｇａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７９：  ７０７−７１８。
【０００９】
本発明は、このような従来の問題に鑑みてなされたものである。上記課題解決のため、本発明は、改良した微細藻類を提供することを主目的とする。
【００１０】
窒素が欠乏する条件の下、高い脂質含有量、海水及び淡水で培養可能、重力沈下、低い粘着性等の特性を有し、バイオディーゼルの生産、二酸化炭素の捕捉、食品及び飼料の生産に広く応用される。
【００１１】
本発明は大量の油脂が累積される原生藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＰＣ１は、台湾中部の河川の河口から選別された藻類であり、実験室の環境で培養した場合、油脂の含有量が乾燥重量の４３％に達し、屋外で５０リットルの光バイオリアクタで培養した場合、平均油脂含有量は２０‐３０％になる。
屋外で培養する場合、制御不能な要因、例えば、光量が一定ではない、温度が高過ぎる、汚染等の問題のために、油脂の累積量が減少し、生長速度が遅くなり、油脂生産量が減少した。このため、紫外線により突然変異を誘発する方法により藻類の改良が行われた。
本発明は主に紫外線を放射することでＣＰＣ１藻類に対して突然変異を発生させ、大量の選別方式により、油脂生産量を増加させる突然変異藻類を探し出す。紫外線の放射により生物体のＤＮＡに突然変異を起こさせ、ＤＮＡの断裂或いはチミン二量体（ｔｈｙｍｉｎｅ  ｄｉｍｅｒ）を形成させ、ＤＮＡが正常な機能を維持できなくすることで、遺伝子を改変させ、生物体の代謝経路及び生理的特性に影響を与える。突然変異を起こした藻類の数量が膨大であり、高速且つ精確に藻体の油脂を分析するため、本発明ではＮｉｌｅ  ｒｅｄ蛍光技術により油脂の分析を行う。Ｎｉｌｅ  ｒｅｄは脂質を検知させる蛍光染色試薬であり、中性脂質（ｎｅｕｔｒａｌ  ｌｉｐｉｄ）に結合された後、５３０ｎｍの光を励起させ、５８０ｎｍの蛍光を放射させる。
Ｎｉｌｅ  ｒｅｄは、ガスクロマトグラフィー（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を使用して藻体の油脂の分析を行うのに比べ精確性が低いが、その長所として、迅速に操作でき、低コストで、事前処理時間が短く、必要なサンプルの体積も小さくてよいため、大規模な選別及び分析に適合する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上述した課題を解決し、目的を達成するための、本発明に係る微生物の生物培養物はクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＰＣ１２１５であり、中華民国の財団法人新竹食品工業発展研究所に寄託され、受託番号はＢＣＲＣ  ９８００３５である。
【００１３】
前述のクラミドモナスＣＰＣ１２１５は、そのｒｂｃ  Ｌの配列及び本発明で提供する配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の相似度が９０％以上に達し、油脂含有量が３０％以上に達し、産油率が１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ以上に達するものを指す。
【００１４】
また、本発明の油脂の合成方法は、前述の培養物の油脂を含み、生物培養物の窒素飢餓処理を施し、且つ温度範囲が２５〜３５℃に指定されて生物培養物が培養されることを含む。
【００１５】
前述の生物培養物の養殖培養基には淡水或いは塩度１〜３％の海水が配置されて使用され、バイオマス１．５ｇ／Ｌ以上の生産量を獲得する。例えば、使用１Ｌの光リアクタで養殖を行い、Ｂｏｌｄ’ｓ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＢＭ）  の培養液が採用されると共に人工の海塩が添加されて培養を行い、２％のＣＯ２に曝気され、光源はＴＬ５蛍光灯で光強度は１５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓであり、その油脂含有量は最高で５１．８％に達し、油脂の生産率は９日で１２１．８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙに達する。３５℃の高温で誘導した場合、油脂の生産量は１４０．８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙに達する。また、ＣＰＣ１２１５は新鮮な海水或いは人工海水を使用して養殖でき、沈下速度が速く、粘着性が低いという特性を有し、大量に養殖でき、藻類を養殖することで二酸化炭素を削減させ、エネルギー生産等に応用される。
【００１６】
さらに、本発明は、前述の培養物のバイオディーゼルを含むバイオディーゼルの合成方法を提供する。
【００１７】
なお、本発明は、前述の培養物を含む食品である。
【００１８】
また、本発明は、前述の培養物を含む飼料である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のクラミドモナスＣＰＣ１２１５は野生のＣＰＣ１が大量に養殖可能であり、容易に収集できて自然沈下され、産油率が高いという特徴を有するため、商業化が有望である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の分離株（ｉｓｏｌａｔｅｓ）を示す濾過工程図である。
【図２】ＣＰＣ１人工水産養殖がＣＰＣ１のバイオマスに対する影響図である。
【図３】藻類の濃度（ＯＤ６８０）及びＮｉｌｅ  ｒｅｄ蛍光強度を示すリニア関係図である。
【図４】ＣＰＣ１及び変異藻類種のＮｉｌｅ  ｒｅｄ蛍光強度を示す比較図（２５０ｍｌフォトバイオリアクタ培養）である。
【図５】ＣＰＣ１２１５変異藻類種及び野生のＣＰＣ１の成長率を示す比較図である。
【図６】ＣＰＣ１２１５変異藻類種及び野生のＣＰＣ１の油脂蓄積能力を示す比較図である。
【図７】ＣＰＣ１２１５変異藻類種が高温培養での成長率を示す比較図である。
【図８】ＣＰＣ１２１５変異藻類種が高温培養での油脂蓄積能力を示す比較図である。
【図９】ＣＰＣ１２１５変異藻類種外表形及びＮｉｌｅ  ｒｅｄの染色顕微鏡での観察結果である。
【図１０】ＣＰＣ１２１５変異藻類種の接着力が低い観察結果である。
【図１１】ＣＰＣ１２１５変異藻類種野生のＣＰＣ１の沈下速度が速い観察結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明における好適な実施の形態について、添付図面を参照して説明する。尚、以下に説明する実施の形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を限定するものではない。また、以下に説明される構成の全てが、本発明の必須要件であるとは限らない。
【実施例】
【００２２】
（第１実施形態）
本発明は微生物の生物培養物であり、生物培養物はクラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＰＣ１２１５であり、中華民国の財団法人食品工業発展研究所に保管され、受託番号はＢＣＲＣ  ９８００３５である。好ましくは、クラミドモナスＣＰＣ１２１５は、そのｒｂｃ  Ｌの配列及び本発明で提供する配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の相似度が９０％以上に達するものを指す。前述のクラミドモナスＣＰＣ１２１５は油脂含有量が３０％以上に達し、産油率が１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ以上に達する。
本発明は油脂の合成方法を提供し、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＰＣ１２１５を使用して油脂を生産することを含む。好ましくは、前述の方法は、クラミドモナスに窒素飢餓処理を施し、温度範囲が２５〜３５℃に指定されて培養され、且つ養殖培養基には淡水或いは塩度１〜３％の海水が配置されて使用され、バイオマス１．５ｇ／Ｌ以上の生産量を獲得することを含む。
【００２３】
また、本発明はバイオディーゼルの生産方法を提供し、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＰＣ１２１５を使用してバイオディーゼルを生産する。
【００２４】
さらに、本発明は、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＰＣ１２１５を含む食品或いは飼料を提供する。
【００２５】
このほか、下述の具体的な実施形態により、本発明の実際の応用範囲を証明するが、但し、本発明の範囲はいかなる形式にも制限されない。
【００２６】
高い油脂含有量を有する本土の微細藻類Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＰＣ１を選別する。
本発明の海水環境から獲得された藻類に対する純化分離工程は、図１に示すように、サンプルの採集工程（Ｓ１１）と、事前培養工程（Ｓ１２）と、単一の藻菌類（ａｌｇａｌ  ｓｔｒａｉｎ）の選別工程（Ｓ１３）と、液体による培養工程（Ｓ１４）と、培養基の種類及び培養条件の最適化工程（Ｓ１５）と、及び藻株（ａｌｇａｌ  ｓｔｒａｉｎ）の生理条件の分析工程（Ｓ１６）とを含む。分離純化方法には階段希釈  （ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）  方式が採用され、藻株の純化後に１８Ｓ  ｒＲＮＡ及びｒｂｃ  Ｌ遺伝子配列を利用して藻類の鑑定を行う。
１８Ｓ  ＤＮＡのＰＣＲ増幅プライマーの正方向はＣＣＡ  ＴＧＣ  ＡＴＧ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＡＡＡ  ＣＴＧ  ＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）であり、反対方向はＴＡＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）であり、取得された配列のＧｅｎＢａｎｋ中での配列アラインメントの比較結果はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示し、登録番号ＫＦ３８３２６９である。
ｒｂｃ  ＬのＰＣＲ増幅プライマーの正方向はＧＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）であり、反対方向はＣＡＴ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＡＴＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＧＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）であり、取得された配列のＧｅｎＢａｎｋ中での配列アラインメントの比較結果はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６に示し、２種類の遺伝子をＧｅｎＢａｎｋのデータベースの配列アラインメントと総合した結果、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ  ＳＡＧ  １１‐１９に最も相似し、且つ外形はＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓに符合し、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＰＣ１と命名される。
【００２７】
ＣＰＣ１は淡水及び海水を使用して培養される。
本研究では、先ず淡水及び海水  （塩度３〜３．５％）  を利用してＢＢＭ  培養基に配置すると共に２％のＣＯ２をＣＰＣ１に曝気させて培養を行い、塩度のバイオマス及び油脂の累積に対する影響を調べる。
図２に示すように、海水環境で培養されるＣＰＣ１の生長日数は１１日であり、バイオマスは最高１．４２ｇ／Ｌに達し、淡水環境で培養された後の生長日数は１４日前後であり、バイオマスは海水に比べて良好であり、２．３２ｇ／Ｌに達する。表１に示す油脂累積に関しては、海水によりＣＰＣ１に対して培養を行って得られた含油率及び産油率が、どちらも淡水での養殖よりも高く、最高４３．３９％及び６４ｍｇ／Ｌ／ｄに達する。また、人工海水、天然海水、及び新鮮な海水（貯蔵時間が１週間より短い）で共にＣＰＣ１の培養に成功し、養殖量は５０Ｌである。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
ＣＰＣ１の紫外線による突然変異技術。
ＣＰＣ１がＢＧ‐１１固体培養基を経て、藻を選別してＢＢＭ培養液に入れ換えて事前培養を行い、対数期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ）の後、５ｍＬの藻液を無菌の培養容器に移し、紫外線による突然変異を行う。
本特許では６Ｗの短波長（２５４  ｎｍ）の紫外線ランプが使用され、光源と藻液との距離は１２．５センチメートルであり、照射時間は２分間である。紫外線光の照射が完了した後、藻液（ａｌｇａｅ  ｌｉｑｕｉｄ）への光を２４時間遮り、その後に藻液を１０００倍に希釈させてＢＧ‐１１の固体培養基に塗布する。
【００３０】
Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ（ナイルレッド）蛍光染色技術による藻体の油脂を検知する。
ＣＰＣ１藻液を７日間から１２日間培養し、油脂が累積されるのを待った後、２０％のエタノールで希釈してＯＤ６８０の濃度で固定させ、総体積が１ｍＬとなってから１μＬのＮｉｌｅ  ｒｅｄ染色試薬を加え（０．１ｍｇ／ｍＬがアセトンに配合される）、室温で１００ｒｐｍで１０分間均等に混合させる。染色過程では、全行程アルミ箔によりサンプルを被覆させて、光線が照射されて染色試薬が活性を失わないようにする。染色の完成後、サンプルを蛍光分光計専用の石英管に移動させ、蛍光分光計により励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：５３０ｎｍ；ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：５８０ｎｍ）の検知を行う。
図３ではＣＰＣ１藻液を異なる濃度に希釈させた後、Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ染色試薬により検知された蛍光結果、藻体の濃度及び蛍光強度が線形関係を呈し、そのＲ平方値（Ｒ  ｓｑｕａｒｅ）は０．９９９８であり、高い線形関係を有することを示す。Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ蛍光は高感度の検知技術であり、本発明では、ＯＤ６８０が０．２より高い場合、細胞の濃度が高過ぎ、蛍光数値が不安定になり、精確に計測できないことが分かり、評価実験では全てＯＤ６８０＝０．０６〜０．１の範囲でＮｉｌｅ  ｒｅｄ蛍光測定を行う。
【００３１】
微細藻類の脂肪酸の組成成分、含油率及び産油率の分析方法。
微細藻類の脂肪酸の組成の分析は、先ず乾燥藻粉（ｄｒｉｅｄ  ａｌｇａｅ  ｐｏｗｄｅｒ）を取得し、０．５Ｎの水酸化カリウム（ＫＯＨ）のメタノール（ｍｅｔｈａｎｏｌ）溶液を加え、超音波破砕機により藻細胞を破砕し、完全に破砕された藻液に対して鹸化反応（ｓａｐｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を行った後、メタノールを添加させてエステル化反応を行い、完全に反応した産物（ＦＡＭＥ）に対してガスクロマトグラフにより油脂の総量及び組成の分析を行い、藻体の油脂含有量を推計し、重量のパーセンテージで含油率を表示する。
含油率（％）及びバイオマス生産量（ｇ／Ｌ／ｄａｙ）の相乗により、算出された産油率は毎日１リットル当たりの培養液で生産される油脂の重量となる。検量線の設定は脂肪酸メチル標準品（Ｃ１４：０、Ｃ１６：０、Ｃ１６：１、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ２０：５及びＣ２２：６等を含む）にｎ‐ｈｅｘａｎｅを混合させ、ガスクロマトグラフにより各脂肪酸メチルの滞留時間の分析を行うことで、藻オイルの組成の鑑定を行う。
【００３２】
ＣＰＣ１２１５突然変異藻類の選別フローチャート及び産油率の測定。
紫外線により突然変異を起こした藻類を先ず５ｍＬのＢＢＭでガラス試験管の中で培養を行い、室温で６０ｒｐｍで回転させ、１０‐１４日培養を行った後、Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ蛍光技術により油脂含有量の検知を行い、蛍光強度が原生種より高い突然変異藻類を１６株選別し、第二階段の測定に進む。
２５０ｍＬの光バイオリアクタで培養を行い、ＢＢＭに２％の人工海塩を加えて培養液とし、７日間培養を行った後、ガスクロマトグラフにより油脂含有量の分析を行い、含油量が野生のＣＰＣ１より高いと確認された後、１Ｌの光バイオリアクタに拡大させて測定を行い、培養液は同様にＢＢＭに２％の海塩を加えたものである。
【００３３】
２５０ｍＬの光バイオリアクタで培養を行い、Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ染色試薬により含油量が高い突然変異株（ｍｕｔａｎｔ）を５株選別させた後（図４参照）、ＧＣによりＦＡＭＥの含有量の検知を行い、油脂含有量が最も高い３株の藻類  （ＣＰＣ１２１５／１２１８／１２６６）を選別させ、１Ｌの光バイオリアクタで生長培養を行い、油脂の蓄積試験結果は下述のようになる。
図５は生長速度の比較結果を図示する。ＣＰＣ１２１５の生長速度が最も速く、対数期に入った後、バイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）が野生（ＣＰＣ１）及び他の突然変異の藻類よりも明らかに高くなる。静止期も同様の状況になり、１４日目には２．４４ｇ／Ｌに達し、ＣＰＣ１が２．２４ｇ／Ｌで８．９％に増加する。また、ＣＰＣ１２１８及びＣＰＣ１２６６は静止期のバイオマスも野生（ＣＰＣ１）より高くなり、１４日目にはそれぞれ２．４１及び２．３８ｇ／Ｌになる。ＣＰＣ１２１５の好ましい油脂蓄積能力の部分は、油脂蓄積の速度及び総量が共に野生のＣＰＣ１より高い点である（図６参照）。９日目での差異が最も顕著であり、ＣＰＣ１２１５の含油率は４６．５％に達し、野生のＣＰＣ１の含油率３８．５％に比べて２０．８％高くなる。１４日目の含油率は５０％を突破して、５１．８％に達する。以上の結果から分かるように、ＣＰＣ１２１５の生長速度及び油脂含有量は、共に野生のＣＰＣ１よりも向上する。
【００３４】
表２はＣＰＣ１２１５の産油率（ｌｉｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）  の計算結果であり、ＣＰＣ１２１５の産油率は野生（ＣＰＣ１）  及び他の突然変異株（ＣＰＣ１２１８／１２６６）よりも明らかに高く、培養７日目の産油率は１１８．８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙにもなり、野生のＣＰＣ１よりも３５．３％高くなる。９日目には最高の産油率を達成させ、１２１．８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙとなり、野生のＣＰＣ１の９３．２ｍｇ／Ｌ／ｄａｙよりも３０．８％高くなる。
ＣＰＣ１２１５は財団法人食品工業発展研究所に保管され、受託番号はＢＣＲＣ９８００３５である。本発明で使用されるＣＰＣ１２１５は共に前述の保管されている藻類と同じである。
【００３５】
【表２】
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【００３６】
ＣＰＣ１２１５を高温で培養し油脂の累積を増加させる。
培養温度を本来の２５℃から３５℃まで上昇させ、Ｂｏｌｄ’ｓ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＢＭ）  培養基を使用する。培養体積は１Ｌであり、１．０％の海水塩度で、炭素源には２％の二酸化炭素が使用され、開始時の藻の量は０．３０５ｇ／Ｌである。結果は図７に示すように、ＣＰＣ１２１５突然変異藻類の生長速度は高温により抑制されず、１１日間の操作期間に、室温及び高温で培養すると、藻体の濃度はそれぞれ２．４６ｇ／Ｌ及び２．５１ｇ／Ｌに達する。
油脂の蓄積能力については、図８によると、３５℃で培養されるＣＰＣ１２１５は油脂の蓄積速度及び油脂含有量がどちらも高く、７日目での差異が最も顕著になり、高温で培養されたＮｏ．２１５の含油量は４２．５％になり、室温で培養されたもの（３８．４％）と比べて１０．７％高くなり、原生種の３５．２％に比べて２０．７％高くなる。１１日目の含油量は５１．０％に達し。産油率の結果は表３に示すように、高温で培養された油脂の生産速度が明確に高く、７日間培養すると産油率が１４０．８ｍｇ／Ｌ／ｄａｙになる。
【００３７】
【表３】
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【００３８】
ＣＰＣ１２１５の低い粘着性及び速い沈下特性。
ＣＰＣ１２１５の培養過程では低い粘着性を示し、例えば、外形を顕微鏡で観察すると（図９参照）、突然変異株ＣＰＣ１２１５の細胞形状が野生のＣＰＣ１と比較して円く、且つＮｉｌｅ  ｒｅｄで染色した場合、突然変異株ＣＰＣ１２１５の染色された油滴が明瞭で数量も多い。藻体を取った際には、突然変異株ＣＰＣ１２１５の培養容器上の藻体の残留が少なく（図１０参照）、３回以上の実験の結果、突然変異株ＣＰＣ１２１５の容器への粘着性が低いことが分かった。
ＣＰＣ１２１５は図１１に示すように、野生に比べて沈下しやすく、室温で５分間静置した後、ＣＰＣ１２１５は野生に比べて沈下速度が速かった。以上の観察及び試験を総合すると、ＣＰＣ１２１５は野生のＣＰＣ１に比べて大量に養殖でき、容易に収集可能で、自然に沈下し、産油率も高いという特徴を有し、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｉｓ  ＣＰＣ１２１５は商業化が有望である。
【００３９】
本明細書に開示された実施形態は、本発明を限定するものではなく、説明するためのものであり、このような実施形態によって本発明の思想と範囲が限定されるものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲により解釈すべきであり、それと同等の範囲内にある全ての技術は、本発明の権利範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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