(57)【要約】【課題】  課題は、滲出型加齢黄斑変性を好適に治療することのできる滲出型加齢黄斑変性治療薬とその製造方法を提供することである。【解決手段】  滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法は、水溶液準備工程と、プラズマ照射工程と、を有する。水溶液準備工程では、リン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムと、塩化ナトリウムと、を含有する第１の水溶液を準備する。プラズマ照射工程では、プラズマ照射装置Ｐ１によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを第１の水溶液に照射する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有する第１の水溶液に大気圧プラズマを照射したものであること
を特徴とする滲出型加齢黄斑変性治療薬。
【請求項２】
請求項１に記載の滲出型加齢黄斑変性治療薬において、
前記第１の水溶液は、
リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有すること
を特徴とする滲出型加齢黄斑変性治療薬。
【請求項３】
請求項１に記載の滲出型加齢黄斑変性治療薬において、
前記第１の水溶液は、
リン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムと、塩化ナトリウムと、を含有すること
を特徴とする滲出型加齢黄斑変性治療薬。
【請求項４】
リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有する第１の水溶液を準備する水溶液準備工程と、
プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを前記第１の水溶液に照射するプラズマ照射工程と、
を有すること
を特徴とする滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法。
【請求項５】
請求項４に記載の滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法において、
前記水溶液準備工程では、
前記第１の水溶液として、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有する水溶液を準備すること
を特徴とする滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法。
【請求項６】
請求項４に記載の滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法において、
前記水溶液準備工程では、
前記第１の水溶液として、リン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムと、塩化ナトリウムと、を含有する水溶液を準備すること
を特徴とする滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書の技術分野は、滲出型加齢黄斑変性治療薬とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラズマ技術は、電気、化学、材料の各分野に応用されている。そして、近年においては、医療への応用が活発に研究されるようになってきた。プラズマの内部では、電子やイオン等の荷電粒子の他に、紫外線やラジカルが発生する。これらには、生体組織の殺菌をはじめとして、生体組織に対する種々の効果があることが分かってきている。
【０００３】
例えば、特許文献１には、プラズマの照射により、血液凝固（特許文献１の実施例４、段落［００６３］−［００６８］参照）と、組織滅菌（特許文献１の実施例５、段落［００６９］−［００７４］参照）と、リーシュマニア症（特許文献１の実施例６、段落［００７５］−［００７７］参照）といった、効果があることが記載されている。そして、メラノーマ細胞（悪性黒色腫細胞）を死滅させる効果があると記載されている（特許文献１の実施例７、段落［００７８］参照）。
【０００４】
また、特許文献２には、ｐＨが４．８以下となるように調整された液体にプラズマを照射することにより、液体中の菌を殺菌する技術が開示されている（特許文献２の段落［００２０］等参照）。また、スーパーオキシドアニオンラジカルやヒドロペルオキシラジカル等が殺菌効果を担っている可能性がある旨が記載されている（特許文献２の段落［００９０］−［００９９］等参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００８−５３９００７号公報
【特許文献２】国際公開第２００９／０４１０４９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、眼科の病気には滲出型加齢黄斑変性というものがある。滲出型加齢黄斑変性とは、網膜の下に位置する脈絡膜から脈絡膜新生血管が網膜に向かって伸び、網膜もしくは黄斑を変形させることにより生じる病気である。また、滲出型加齢黄斑変性は、著しい視力の低下や失明の原因となる。
【０００７】
滲出型加齢黄斑変性を治療するための方法として、光線力学治療や薬物治療がある。光線力学治療では、ビスダイン（登録商標）という光感受性物質を脈絡膜新生血管に点滴し、その後にレーザーを病変に照射する。薬物治療では、血管内皮増殖因子を阻害する薬物を硝子体内に注入する。血管内皮増殖因子とは、脈絡膜新生血管を発生させると考えられる因子である。この薬物として、例えば、マクジェン（登録商標）、ルセンティス（登録商標）、アイリーア（登録商標）といったものが挙げられる。
【０００８】
上記のような治療方法を用いることにより、患者の視力を維持すること、もしくは視力をある程度改善することはできる。しかし、患者の正常な視力を回復することは非常に困難である。したがって、新たな治療方法が期待されている。
【０００９】
本明細書の技術は、前述した従来の技術が有する問題点を解決するためになされたものである。すなわちその課題とするところは、滲出型加齢黄斑変性を好適に治療することのできる滲出型加齢黄斑変性治療薬とその製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様における滲出型加齢黄斑変性治療薬は、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有する第１の水溶液に大気圧プラズマを照射したものである。
【００１１】
この滲出型加齢黄斑変性治療薬は、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導することにより脈絡膜新生血管を抑制する。この滲出型加齢黄斑変性治療薬は、既存の網膜血管に影響を与えない。また、この滲出型加齢黄斑変性治療薬には網膜毒性もない。
【００１２】
第２の態様における滲出型加齢黄斑変性治療薬においては、第１の水溶液は、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有する。
【００１３】
第３の態様における滲出型加齢黄斑変性治療薬においては、第１の水溶液は、リン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムと、塩化ナトリウムと、を含有する。
【００１４】
第４の態様における滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法は、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二カリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有する第１の水溶液を準備する水溶液準備工程と、プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを第１の水溶液に照射するプラズマ照射工程と、を有する。
【００１５】
第５の態様における滲出型加齢黄斑変性治療薬においては、水溶液準備工程では、第１の水溶液として、リン酸水素二ナトリウムとリン酸二水素カリウムとの少なくとも一つを含有する水溶液を準備する。
【００１６】
第６の態様における滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法においては、水溶液準備工程では、第１の水溶液として、リン酸水素二ナトリウムと、リン酸二水素カリウムと、塩化ナトリウムと、を含有する水溶液を準備する。
【発明の効果】
【００１７】
本明細書では、滲出型加齢黄斑変性を好適に治療することのできる滲出型加齢黄斑変性治療薬とその製造方法が提供されている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】プラズマ照射装置のガス噴出口を走査するロボットアームの構成を説明するための概念図である。
【図２】図２．Ａは第１のプラズマ照射装置の構成を示す断面図であり、図２．Ｂは電極の形状を示す図である。
【図３】図３．Ａは第２のプラズマ照射装置の構成を示す断面図であり、図３．Ｂはプラズマ領域の長手方向に垂直な断面における部分断面図である。
【図４】図４．Ａは実施形態の滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度と新生血管細胞の分岐点数との関係を示すグラフであり、図４．Ｂから図４．Ｅは顕微鏡写真である。
【図５】実施形態の滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度と新生血管細胞の増殖能力との関係を示すグラフである。
【図６】図６．Ａは滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度と脈絡膜新生血管の体積との関係を示すグラフであり、図６．Ｂはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をマウスの眼に注入した場合の脈絡膜新生血管を示す顕微鏡写真であり、図６．Ｃは滲出型加齢黄斑変性治療薬をマウスの眼に１μＬ注入した場合の脈絡膜新生血管を示す顕微鏡写真である。
【図７】図７．Ａから図７．Ｄまではマウスの眼にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合を示しており、図７．Ｅから図７．Ｈまではマウスの眼に滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合を示す。
【図８】脈絡膜新生血管におけるアポトーシスを誘導された細胞の割合を示すグラフである。
【図９】ＴＵＮＥＬ染色した細胞およびＤＡＰＩ染色した細胞を示す顕微鏡写真である。
【図１０】マウスの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を測定した結果を示すグラフである。
【図１１】図１１．ＡはＮ−アセチルシステインを用いて活性酸素種の寄与度を測定した結果を示すグラフであり、図１１．Ｂから図１１．Ｄまではレーザーで発生させた脈絡膜新生血管の体積を示す顕微鏡写真である。
【図１２】図１２．Ａは滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いた場合の網膜血管を示す顕微鏡写真であり、図１２．Ｂは図１２．Ａの領域を部分的に拡大した図であり、図１２．Ｃはある区画された領域内に占める既存の網膜血管の割合を示すグラフである。
【図１３】図１３．Ａは眼底画像であり、図１３．Ｂは滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入したマウスの眼をＨ＆Ｅ染色した画像であり、図１３．Ｃは滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合における網膜電図写真（ＥＲＧ）の違いを示すグラフであり、図１３．Ｄは網膜電図写真（ＥＲＧ）のａ波を比較するグラフであり、図１３．Ｅは網膜電図写真（ＥＲＧ）のｂ波を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、具体的な実施形態について、滲出型加齢黄斑変性治療薬とその製造方法を例に挙げて図を参照しつつ説明する。
【００２０】
１．治療薬製造装置
１−１．治療薬製造装置の構成
本実施形態の治療薬製造装置ＰＭは、図１に示すように、プラズマ照射装置Ｐ１と、アームロボットＭ１と、を有している。プラズマ照射装置Ｐ１は、プラズマを発生させるとともに、そのプラズマを溶液に向けて照射するためのものである。プラズマ照射装置Ｐ１には、後述するように、２種類の方式（第１のプラズマ照射装置１００および第２のプラズマ照射装置１１０）がある。そして、いずれの方式を用いてもよい。
【００２１】
アームロボットＭ１は、図１に示すように、プラズマ照射装置Ｐ１の位置をｘ軸、ｙ軸、ｚ軸方向のそれぞれの方向に移動させることができるようになっている。なお、説明の便宜上、プラズマを照射する向きを−ｚ軸方向としている。このアームロボットＭ１は、溶液の液面と、プラズマ照射装置Ｐ１との間の距離を調整することができる。また、この治療薬製造装置ＰＭは、予めプラズマ照射時間を設定することにより、その時間だけプラズマを照射することができるものである。
【００２２】
１−２．第１のプラズマ照射装置
図２．Ａはプラズマ照射装置１００の概略構成を示す断面図である。ここで、プラズマ照射装置１００は、プラズマを点状の噴出口から噴出する第１のプラズマ照射装置である。図２．Ｂは、図２．Ａのプラズマ照射装置１００の電極２ａ、２ｂの形状の詳細を示す図である。
【００２３】
プラズマ照射装置１００は、筐体部１０と、電極２ａ、２ｂと、電圧印加部３と、を有している。筐体部１０は、アルミナ（Ａｌ2 Ｏ3 ）を原料とする焼結体から成るものである。そして、筐体部１０の形状は、筒形状である。筐体部１０の内径は２ｍｍ以上３ｍｍ以下である。筐体部１０の厚みは０．２ｍｍ以上０．３ｍｍ以下である。筐体部１０の長さは、例えば、１０ｃｍ以上３０ｃｍ以下である。筐体部１０の両端には、ガス導入口１０ｉと、ガス噴出口１０ｏとが形成されている。ガス導入口１０ｉは、プラズマを発生させるためのガスを導入するためのものである。ガス噴出口１０ｏは、プラズマを筐体部１０の外部に照射するための照射部である。なお、ガスの移動する向きは、図中の矢印の向きである。
【００２４】
電極２ａ、２ｂは、対向して配置されている対向電極対である。電極２ａ、２ｂの対向面方向の長さは、筐体部１０の内径より小さい。例えば１ｍｍ程度である。電極２ａ、２ｂには、図２．Ｂに示すように、対向面のそれぞれに凹部（ホロー）Ｈが多数形成されている。そのため、電極２ａ、２ｂの対向面は、微細な凹凸形状となっている。なお、この凹部Ｈの深さは、０．５ｍｍ程度である。
【００２５】
電極２ａは、筐体部１０の内部であってガス導入口１０ｉの近傍に配置されている。電極２ｂは、筐体部１０の内部であってガス噴出口１０ｏの近傍に配置されている。そのため、プラズマ照射装置１００では、電極２ａの対向面の反対側からガスを導入するとともに、電極２ｂの対向面の反対側にガスを噴出するようになっている。そして、電極２ａ、２ｂ間の距離は、例えば、８ｃｍ以上２８ｃｍ以下である。
【００２６】
電圧印加部３は、電極２ａ、２ｂ間に交流電圧を印加するためのものである。電圧印加部３は、商用交流電圧である、６０Ｈｚ、１００Ｖを用いて９ｋＶに昇圧するとともに、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加する。
【００２７】
ガス導入口１０ｉからアルゴンを導入するとともに、電圧印加部３が電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加すると、筐体部１０の内部にプラズマが発生する。図２．Ａの斜線で示すように、プラズマが発生する領域をプラズマ発生領域Ｐとする。プラズマ発生領域Ｐは、筐体部１０に覆われている。
【００２８】
１−３．第２のプラズマ照射装置
図３．Ａはプラズマ照射装置１１０の概略構成を示す断面図である。ここで、プラズマ照射装置１１０は、線状に発生させたプラズマを噴出する第２のプラズマ照射装置である。図３．Ｂは、図３．Ａのプラズマ照射装置１１０のプラズマ領域Ｐの長手方向に垂直な断面における部分断面図である。
【００２９】
プラズマ照射装置１１０は、筐体部１１と、電極２ａ、２ｂと、電圧印加部３と、を有している。筐体部１１は、アルミナ（Ａｌ2 Ｏ3 ）を原料とする焼結体から成るものである。筐体部１１の両端には、ガス導入口１１ｉと、多数のガス噴出口１１ｏとが形成されている。ガス導入口１１ｉは、図３．Ａの左右方向を長手方向とするスリット形状をしている。ガス導入口１１ｉからプラズマ領域Ｐの直上までのスリット幅（図３．Ｂの左右方向の幅）は、例えば、１ｍｍである。
【００３０】
ガス噴出口１１ｏは、プラズマを筐体部１１の外部に照射するための照射部である。ガス噴出口１１ｏは、円筒形状もしくはスリット形状である。円筒形状の場合のガス噴出口１１ｏは、プラズマ領域の長手方向に沿って一直線状に配置されている。ガス噴出口１１ｏの内径は１ｍｍ以上２ｍｍ以下の範囲内である。また、スリット形状の場合には、ガス噴出口１１ｏのスリット幅を１ｍｍ以下とすることが好ましい。これにより、安定したプラズマが形成される。ガス導入口１１ｉは、電極２ａと電極２ｂとを結ぶ線と交差する向きにガスを導入するようになっている。
【００３１】
電極２ａ、２ｂおよび電圧印加部３については、図２に示したプラズマ照射装置１００と同じものである。そして、同様に、商用交流電圧を用いて、電極２ａ、２ｂ間に電圧を印加する。これにより、プラズマを一直線状に噴出することができる。
【００３２】
また、この一直線状にプラズマを噴出するプラズマ照射装置１１０を図３．Ｂの左右方向に列状に並べて配置すれば、プラズマをある長方形の領域にわたって平面的に噴出することができる。
【００３３】
２．プラズマ照射装置により発生されるプラズマ
プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマは、非平衡大気圧プラズマである。ここで、大気圧プラズマとは、０．５気圧以上２．０気圧以下の範囲内の圧力であるプラズマをいう。
【００３４】
本実施の形態では、プラズマ発生ガスとして、主にＡｒガスを用いる。プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマの内部では、もちろん、電子と、Ａｒイオンとが生成されている。そして、Ａｒイオンは、紫外線を発生させる。また、このプラズマは大気中に放出されている。そのため、このプラズマが大気中の分子等と反応して、酸素ラジカルや窒素ラジカル等が発生する。
【００３５】
このプラズマのプラズマ密度は、１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内である。なお、誘電体バリア放電により発生されるプラズマにおけるプラズマ密度は、１×１０11ｃｍ-3以上１×１０13ｃｍ-3以下の程度である。したがって、プラズマ照射装置１００、１１０により発生されるプラズマのプラズマ密度は、誘電体バリア放電により発生されるプラズマのプラズマ密度に比べて、３桁程度大きい。したがって、このプラズマの内部では、より多くのＡｒイオンが生成する。そのため、ラジカルや、紫外線の発生量も多い。なお、このプラズマ密度は、プラズマ内部の電子密度にほぼ等しい。
【００３６】
そして、このプラズマ発生時におけるプラズマ温度は、およそ１０００Ｋ以上２５００Ｋ以下の範囲内である。また、このプラズマにおける電子温度は、ガスの温度に比べて大きい。しかも、電子の密度が１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内の程度であるにもかかわらず、ガスの温度はおよそ１０００Ｋ以上２５００Ｋ以下である。このプラズマの温度は、プラズマの発生しているプラズマ領域Ｐでの温度である。したがって、プラズマの条件や、ガス噴出口から水溶液までの距離を異なる条件とすることにより、水溶液の位置でのプラズマ温度を室温程度とすることができる。
【００３７】
また、酸素ラジカル密度は、２×１０14ｃｍ-3以上１．６×１０15ｃｍ-3以下の範囲内である。アルゴンガスに対して混入する酸素ガスの量を調整することにより、この酸素ラジカル密度を調整することができる。
【００３８】
３．滲出型加齢黄斑変性治療薬
本実施形態の滲出型加齢黄斑変性治療薬は、原材料である第１の水溶液に大気圧プラズマを照射して第２の水溶液としたものである。この第２の水溶液が、滲出型加齢黄斑変性治療薬である。第１の水溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。第１の水溶液は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）とリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）とリン酸水素二カリウム（Ｋ2 ＨＰＯ4 ）とリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）との少なくとも一つを含有する。または、第１の水溶液は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）とリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）との少なくとも一つを含有する。例えば、第１の水溶液は、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）と、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、を含有する。また、これらの溶質の水和物を用いてもよい。
【００３９】
４．滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法
本実施形態の滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造方法は、水溶液準備工程と、プラズマ照射工程と、を有する。水溶液準備工程では、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）とリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ2 ＰＯ4 ）とリン酸水素二カリウム（Ｋ2 ＨＰＯ4 ）とリン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）との少なくとも一つを含有する第１の水溶液を準備する。プラズマ照射工程では、プラズマ発生装置によりプラズマ発生領域に発生させた大気圧プラズマを第１の水溶液に照射して第２の水溶液とする。
【００４０】
４−１．水溶液準備工程
まず、第１の水溶液を準備する。第１の水溶液とは、プラズマを照射する前の水溶液のことをいう。この第１の方法では、第１の水溶液として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を準備する。第１の水溶液は、例えば、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）と、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、を含有する。
【００４１】
４−２．プラズマ照射工程
次に、治療薬製造装置ＰＭにより大気圧プラズマを第１の水溶液に照射する。プラズマを照射する際における液面とプラズマ噴出口との間の距離は、例えば、１ｃｍである。また、この距離は、例えば、０．５ｃｍ以上３ｃｍ以下の範囲内で変えてもよい。このプラズマのプラズマ密度は、１×１０14ｃｍ-3以上１×１０17ｃｍ-3以下の範囲内である。そして、このプラズマにおけるプラズマ温度は、およそ１０００Ｋ以上２５００Ｋ以下の範囲内である。ただし、このプラズマ温度は、液面では、室温程度（３００Ｋ程度）まで下げることもできる。また、酸素ラジカル密度は、２×１０14ｃｍ-3以上５．０×１０15ｃｍ-3以下の範囲内である。これらのプラズマ条件を表１に示す。これらの条件は、あくまで一例である。
【００４２】
［表１］
条件                          数値範囲
液面−噴出口距離            ０．５ｃｍ以上                ３ｃｍ以下
プラズマ密度          １×１０14ｃｍ-3以上      １×１０17ｃｍ-3以下
プラズマ温度                １０００Ｋ以上            ２５００Ｋ以下
酸素ラジカル密度      ２×１０14ｃｍ-3以上  ５．０×１０15ｃｍ-3以下
【００４３】
このように、第１の水溶液にプラズマを照射することにより、第１の水溶液を第２の水溶液にする。この第２の水溶液は、滲出型加齢黄斑変性治療薬である。プラズマ照射前の第１の水溶液のｐＨは、７に近い。例えば、５．５以上８．５以下の範囲内である。
【００４４】
５．滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いた治療
治療に際して、この滲出型加齢黄斑変性治療薬を患者の硝子体内に一定量注入する。この滲出型加齢黄斑変性治療薬は、血管内皮細胞のアポトーシスを誘導することにより脈絡膜新生血管を抑制する。後述するように、この滲出型加齢黄斑変性治療薬は、既存の網膜血管に影響を与えない。また、この滲出型加齢黄斑変性治療薬には網膜毒性もない。
【００４５】
６．変形例
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有してもよい。また、ＭｇまたはＣａを含有してもよい。
【００４６】
７．本実施形態のまとめ
以上詳細に説明したように、本実施形態における滲出型加齢黄斑変性治療薬は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に大気圧プラズマを照射したものである。この滲出型加齢黄斑変性治療薬は、血管内皮細胞にアポトーシスを誘導することにより脈絡膜新生血管を抑制することができる。この滲出型加齢黄斑変性治療薬は、既存の網膜血管に影響を与えない。また、この滲出型加齢黄斑変性治療薬には網膜毒性もない。
【実施例】
【００４７】
ここで、実施形態における滲出型加齢黄斑変性治療薬について行った実験について説明する。
【００４８】
１．滲出型加齢黄斑変性治療薬の製造
実施形態で述べた治療薬製造装置ＰＭを用いて第２の水溶液、すなわち、滲出型加齢黄斑変性治療薬を製造した。そのために、第１の水溶液として、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ2 ＨＰＯ4 ）と、リン酸二水素カリウム（ＫＨ2 ＰＯ4 ）と、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）と、を含有するものを用いた。表２に示すように、第１の水溶液は、超純水１Ｌに塩化ナトリウム９ｇ、リン酸水素二ナトリウム０．７９５ｇ、リン酸二水素カリウム０．１４４ｇを混合したものである。
【００４９】
［表２］
塩化ナトリウム                ９．０ｇ
リン酸水素二ナトリウム        ０．７９５ｇ
リン酸二水素カリウム          ０．１４４ｇ
超純水                        １Ｌ
【００５０】
プラズマの条件を、表３に示す。プラズマを発生させるためのガスとしてアルゴンガスのみを用いた。ガスの流量は、２．０ｓｌｍであった。また、プラズマ噴出口と液面との間の距離は、１３ｍｍであった。電極間距離は８ｍｍであった。そして、プラズマ照射時間は、１０分であった。また、プラズマ発生領域におけるプラズマ密度は、２×１０16ｃｍ-3であった。
【００５１】
［表３］
ガスの流量                            ２．０ｓｌｍ
プラズマ噴出口と液面との間の距離      １３ｍｍ
プラズマ照射時間                      １０分
プラズマ密度（発生時）                ２×１０16ｃｍ-3
【００５２】
また、実験によっては、比較のために、プラズマを照射していない単なるリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。また、図中、「ＰＡＭ」とあるのは、プラズマを照射したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を注入した場合であることを示している。なお、ＰＡＭとは、プラズマにより活性化された溶媒（Ｐｌａｓｍａ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ）であることを意味する。「Ｃｔｒｌ」とあるのは、プラズマを照射していない通常のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等を注入した場合であることを示している。
【００５３】
２．細胞
細胞を用いた実験をするに際して、ヒト網膜血管内皮細胞を用いた。細胞の培養にＥＧＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社製ＣＣ−３１６２）を用いた。ＰＡＭとして、ＥＢＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ社製ＣＣ−３１５６）にプラズマを照射したものを用いた。このように、培養した細胞に対しては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にプラズマを照射したＰＡＭではなく、培地にプラズマを照射したＰＡＭを用いた。
【００５４】
３．マウス
生物実験として、生後６週間から８週間の雄のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）を用いた。マウスの眼底にレーザーを照射することにより、マウスの眼底に脈絡膜新生血管を発生させた。
【００５５】
４．実験１（生体外）
図４は、血管形成を調べた図である。図４では、それぞれの濃度の水溶液中でヒト網膜血管内皮細胞を４時間培養した後の結果が示されている。図４．Ａは、滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度と網膜血管内皮細胞の分岐点数との関係を示すグラフである。図４．Ｂは、滲出型加齢黄斑変性治療薬を含まない場合、すなわち滲出型加齢黄斑変性治療薬が０％のときの網膜血管内皮細胞の顕微鏡写真である。図４．Ｃは、滲出型加齢黄斑変性治療薬が４％のとき（２５倍に希釈）の網膜血管内皮細胞の顕微鏡写真である。図４．Ｄは、滲出型加齢黄斑変性治療薬が１０％のとき（１０倍に希釈）の網膜血管内皮細胞の顕微鏡写真である。図４．Ｅは、滲出型加齢黄斑変性治療薬が２５％のとき（４倍に希釈）の網膜血管内皮細胞の顕微鏡写真である。
【００５６】
このように、滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度が高いほど、ヒト網膜血管内皮細胞の分岐点数は少ない。つまり、滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度が高いほど、新たな血管の形成が抑制されていることを示している。
【００５７】
また、図５に示すように、滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度が高いほど、ヒト網膜血管内皮細胞の増殖は抑制される。
【００５８】
５．実験２（生体内）
図６は、滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度と脈絡膜新生血管量との関係を示す図である。図６．Ａは、滲出型加齢黄斑変性治療薬の濃度と脈絡膜新生血管の体積との関係を示すグラフである。図６．Ｂは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をマウスの眼に注入した場合の脈絡膜新生血管を示す顕微鏡写真である。図６．Ｃは、滲出型加齢黄斑変性治療薬をマウスの眼に１μＬ注入した場合の脈絡膜新生血管を示す顕微鏡写真である。
【００５９】
図６．Ａに示すように、滲出型加齢黄斑変性治療薬をマウスの眼に注入する量が多いほど、脈絡膜新生血管量は少ない。また、図６．Ｂおよび図６．Ｃについても、同様の傾向を示している。このように、生体内であっても、滲出型加齢黄斑変性治療薬は、脈絡膜新生血管の成長を抑制する。
【００６０】
６．実験３（アポトーシス）
図７は、マウスの眼を横方向から視た断面写真である。図７．Ａから図７．Ｄまでは、マウスの眼にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合を示している。図７．Ｅから図７．Ｈまでは、マウスの眼に滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合を示している。
【００６１】
図７．Ｄに示すように、マウスの眼にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合には、脈絡膜新生血管が網膜色素上皮細胞を貫いている。図７．Ｈに示すように、マウスの眼に滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合には、脈絡膜新生血管が網膜色素上皮細胞を貫いていない。
【００６２】
一方、図７．Ｆおよび図７．Ｇに示すように、マウスの眼に滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合には、緑色に染色された帯状の領域が生じている（図中中央付近）。すなわち、脈絡膜新生血管でアポトーシスが強く生じている。なお、図７．Ｂおよび図７．Ｃに示すように、マウスの眼にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合には、脈絡膜新生血管でアポトーシスがわずかに生じている。
【００６３】
また、図８に示すように、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いた場合には、アポトーシスを誘導された細胞の割合は、１５．２％程度であった。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた場合には、アポトーシスを誘導された細胞の割合は、１１．５％程度であった。
【００６４】
図９に示すように、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いた場合には、ヒト網膜血管内皮細胞のアポトーシスが生じている（ＰＡＭ、ＴＵＮＥＬの写真）。
【００６５】
このように、滲出型加齢黄斑変性治療薬は、ヒト網膜血管内皮細胞のアポトーシスを誘導している。
【００６６】
７．実験４（血管内皮増殖因子との関係）
滲出型加齢黄斑変性において血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が、脈絡膜新生血管を悪化させる主要な因子であると考えられている。そこで、血管内皮増殖因子の発現の状態について調べた。
【００６７】
図１０に示すように、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いなかった場合の血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を１００％とした。滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いた場合には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、８４％であった。このように、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いることにより、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、抑制された。
【００６８】
８．実験５（活性酸素種）
水にプラズマを照射した場合には水中に活性酸素種が発生することが知られている。そこで、活性酸素種の寄与度を調べた。活性酸素種は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）により中和される。
【００６９】
図１１は、Ｎ−アセチルシステインにより活性酸素種の効果を調べた図である。図１１．Ａの縦軸は、マウスの脈絡膜新生血管の体積である。図１１．Ａの左側では、滲出型加齢黄斑変性治療薬もＮ−アセチルシステインも用いなかった。この場合のマウスの脈絡膜新生血管の体積を１００％とした。図１１．Ａの真ん中では、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用い、Ｎ−アセチルシステインを用いた。この場合のマウスの脈絡膜新生血管の体積は、８３％であった。図１１．Ａの右側では、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いたが、Ｎ−アセチルシステインについては用いなかった。この場合のマウスの脈絡膜新生血管の体積は、６４％であった。
【００７０】
図１１．Ａに示すように、Ｎ−アセチルシステインにより活性酸素種の効果を打ち消した場合には、マウスの脈絡膜新生血管を減少させる効果は約半分に減少した。つまり、脈絡膜新生血管の成長を抑制する要因の一つは、活性酸素種である。また、活性酸素種以外にも要因となる原因物質がある。活性酸素種以外の要因は、活性酸素種と同程度に脈絡膜新生血管の成長を抑制する。
【００７１】
なお、図１１．Ｂは、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いず、Ｎ−アセチルシステインを用いなかった場合の脈絡膜新生血管の顕微鏡写真である。図１１．Ｃは、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用い、Ｎ−アセチルシステインを用いた場合の脈絡膜新生血管の顕微鏡写真である。図１１．Ｄは、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用い、Ｎ−アセチルシステインを用いなかった場合の脈絡膜新生血管の顕微鏡写真である。
【００７２】
９．実験６（既存の網膜血管への影響）
図１２は、滲出型加齢黄斑変性治療薬について、既存の網膜血管への影響を調べた図である。マウスの硝子体内に滲出型加齢黄斑変性治療薬もしくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を硝子体内に注入して３日後にテトラメチルローダミンイソチオシアネートで染色した。図１２．Ａは、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いた場合の網膜血管を示す顕微鏡写真である。図１２．Ｂは、図１２．Ａの領域を部分的に拡大した図である。
【００７３】
図１２．Ｃに示すように、ある区画された領域内に占める既存の網膜血管の割合は、滲出型加齢黄斑変性治療薬を用いた場合とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた場合とで同程度であった。
【００７４】
このように、滲出型加齢黄斑変性治療薬は、正常な既存の網膜血管を退化させるおそれはほとんどない。そして、滲出型加齢黄斑変性治療薬は、病気の原因である脈絡膜新生血管のみを選択的に攻撃すると考えられる。
【００７５】
１０．実験７（網膜毒性の有無）
図１３．Ａは、眼底画像である。図１３．Ｂは、滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入したマウスの眼をＨ＆Ｅ染色した画像である。図１３．Ｃは、滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合における網膜電図写真（ＥＲＧ）の違いを示すグラフである。図１３．Ｄは、網膜電図写真（ＥＲＧ）のａ波を比較するグラフである。図１３．Ｅは、網膜電図写真（ＥＲＧ）のｂ波を比較するグラフである。
【００７６】
図１３．Ｃから図１３．Ｅまでに示すように、網膜電図写真（ＥＲＧ）のａ波およびｂ波について、滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合とでほとんど差異は見られなかった。つまり、フラッシュに対する電気的応答は、滲出型加齢黄斑変性治療薬を注入した場合とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入した場合とでほとんど差異はない。したがって、滲出型加齢黄斑変性治療薬では、網膜に対する毒性はほとんどない。
【００７７】
１１．実験のまとめ
以上の実験で説明したように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にプラズマを照射した滲出型加齢黄斑変性治療薬は、脈絡膜新生血管を抑制した。この滲出型加齢黄斑変性治療薬は、血管内皮細胞にアポトーシスを誘導した。また、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を抑制した。滲出型加齢黄斑変性治療薬は、既存の網膜血管を退化させることはなかった。また、網膜に対する毒性もなかった。つまり、滲出型加齢黄斑変性の病原である新生血管のみを標的とすることができる。したがって、滲出型加齢黄斑変性治療薬は、滲出型加齢黄斑変性の治療に有効であると推測される。
【符号の説明】
【００７８】
１００、１１０…プラズマ照射装置
１０、１１…筐体部
１０ｉ、１１ｉ…ガス導入口
１０ｏ、１１ｏ…ガス噴出口
２ａ、２ｂ…電極
Ｐ…プラズマ領域
Ｈ…凹部（ホロー）
Ｐ１…プラズマ照射装置
Ｍ１…ロボットアーム
ＰＭ…治療薬製造装置
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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