(57)【要約】【課題】コラーゲンの産生促進に関与する成分を探索し、顕著なコラーゲン産生促進能を有する組成物を提供する。【解決手段】（Ａ）細胞内から細胞外へのコラーゲンの分泌を促進するための、ベルベリン、ベルベリン類縁体、及びそれらの塩、並びにベルベリンを含有する植物抽出物からなる群から選択される１種以上と、（Ｂ）細胞内でのコラーゲンの合成を促進するための、コラーゲン合成促進剤とを含有する、コラーゲン産生促進用組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）細胞内から細胞外へのコラーゲンの分泌を促進するための、ベルベリン、ベルベリン類縁体、及びそれらの塩、並びにベルベリンを含有する植物抽出物からなる群から選択される１種以上と、
（Ｂ）細胞内でのコラーゲンの合成を促進するための、コラーゲン合成促進剤と
を含有する、コラーゲン産生促進用組成物。
【請求項２】
前記成分（Ｂ）が、ＴＧＦ−β及び／又はＴＧＦ−β様作用を有する成分である、請求項１に記載のコラーゲン産生促進用組成物。
【請求項３】
前記成分（Ｂ）が、ＴＧＦ−β、ホエイタンパク質、及びホエイタンパク質の断片からなる群から選択される１種以上である、請求項１に記載のコラーゲン産生促進用組成物。
【請求項４】
前記成分（Ｂ）１００質量部に対して、前記成分（Ａ）０．０５質量部以上を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載のコラーゲン産生促進用組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲン産生促進用組成物を含有する、皮膚外用剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲン産生促進用組成物を含有する、飲食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載のコラーゲン産生促進用組成物を含有する、医薬品。
【請求項８】
ベルベリン、ベルベリン類縁体、及びそれらの塩、並びにベルベリンを含有する植物抽出物からなる群から選択される１種以上を含有する、細胞内から細胞外へのコラーゲンの分泌を促進するための、コラーゲン分泌促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚外用剤、飲食品、医薬品等に好適なコラーゲン産生促進用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
コラーゲンは、真皮、骨、軟骨、腱などを構成する主要なタンパク質であり、ヒトの体の総タンパク質量の約３０％を占める。コラーゲンは、結合組織の主な構造成分であり、実質臓器の間質組織中でみられ、臓器や組織の形態維持に関与している。加えて、コラーゲンは、接する細胞に対して、増殖、分化シグナルを与える、情報伝達の働きも担っていることがわかってきている。コラーゲンはこのような機能を持つことから、老化等によりコラーゲンが減少することで、生体に不調をきたすことがある。例えば、角膜障害、関節障害、炎症性疾患等である。
【０００３】
また、皮膚においては、皮膚乾燥重量の約７０％がコラーゲンであり、真皮中でコラーゲン細線維が集まり束となって、コラーゲン線維束を形成している。これを網目状に張り巡らせることで組織形態を維持している。また、コラーゲンは水分保持機能に優れていることが知られている。これらの機能を持つコラーゲンは、皮膚の弾力性や強度に大きく寄与している。多くの若年者の皮膚に適度なハリがあるのはこのためである。しかし、老年者の皮膚にはハリがなく、シワやタルミが多く見られる。これは自然老化や光老化等により、コラーゲンが減少していくことが一因と考えられている。
【０００４】
上記のようなコラーゲンの減少による生体現象を改善するために、コラーゲン産生促進物質の開発が進められており、これまでに、種々のコラーゲン産生促進物質が見いだされている。例えば、レチノイン酸（非特許文献１）、グリシン及びプロリン及びアラニンからなる３種アミノ酸（特許文献１）、カンゾウ、ソウハクヒ、アロエ、スギナ、キンギンカ、オウバク、ガイヨウ又はゲンチアナ等の植物抽出物（特許文献２）、ＴＧＦ−β、アスコルビン酸類などが知られている。
【０００５】
このように様々なコラーゲン産生促進物質が開発されてきたが、更に、それらと組み合わせることでコラーゲン産生促進能を増強する成分もいくつか見いだされている。例えば、コラーゲン産生促進物質であるＬ−アスコルビン酸２−グルコシドのその機能を増強する、ローヤルゼリー（特許文献３）、コラーゲン産生促進物質であるアスコルビン酸類のその機能を増強する、トリメチルグリシン（特許文献４）などが知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｒ．Ｍａｒｋｓら，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１２２，９１−９８，１９９０
【特許文献１】特開平７−１９４３７５号公報
【特許文献２】特開２００１−２０６８３５号公報
【特許文献３】特許第４４５６７９６号公報
【特許文献４】特許第５２４１０５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、生体においてコラーゲンが果たす役割が重要であることから、コラーゲンの産生促進に関与する更なる成分の探索、そして、顕著なコラーゲン産生促進能を有する組成物の開発が望まれている。
【０００８】
従来のコラーゲン産生促進物質の探索においては、細胞内外のコラーゲンを問わず、細胞内又は細胞外のいずれかのコラーゲン量を増加させるものとして、コラーゲン産生促進能が評価されてきた。しかし、コラーゲンは細胞外において架橋されて線維構造を形成し、前述のような様々な生体機能を持つために、細胞内で合成されたコラーゲンの細胞からの分泌を促して、細胞外コラーゲン量を増加させることが重要である。
【０００９】
本発明は、上記の現状を鑑み、細胞内で合成されたコラーゲンの細胞からの分泌を促進し、細胞外のコラーゲン量を増加させることのできる成分を探索し、当該成分を利用した顕著なコラーゲン産生促進能を有する組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）抽出物が、細胞からのコラーゲンの分泌を促進する作用を有することを見出し、更に、その活性成分がベルベリンであることを明らかにした。コラーゲンは、細胞内で合成された後に、細胞外へと分泌されて、凝集して線維状となり、細胞外マトリクスの形成に関与する。そのため、生体において、細胞内で合成されたコラーゲンを、細胞外へと分泌させる作用は重要である。ベルベリンが、コラーゲンの産生促進に関与することについては従来から報告がなされていたが、上記のように、細胞内で合成されたコラーゲンを細胞外へ積極的に分泌させる作用を有することについては、これまでに知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００１１】
更に、本発明者らは、上記のベルベリンと、細胞内でのコラーゲン合成を促進する作用を有する物質とを組み合わせることで、それぞれを単独で用いるよりも、コラーゲン産生促進能を相乗的に増強することができることを見出した。そして、細胞内でのコラーゲン合成を促進する作用を有する様々な物質の中でも、特に、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）及び／又はＴＧＦ−β様作用を有する成分を、上記のベルベリンと組み合わせることで、顕著なコラーゲン産生促進能が見られることを見出した。ベルベリンとＴＧＦ−β等とを組み合わせることで、コラーゲン産生促進能が顕著に増強することはこれまでに知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。これらの知見を基に、本発明の完成に至った。
【００１２】
すなわち、本発明は、（Ａ）細胞内から細胞外へのコラーゲンの分泌を促進するための、ベルベリン、ベルベリン類縁体、及びそれらの塩、並びにベルベリンを含有する植物抽出物からなる群から選択される１種以上と、（Ｂ）細胞内でのコラーゲンの合成を促進するための、コラーゲン合成促進剤とを含有する、コラーゲン産生促進用組成物に関する。
【００１３】
本発明は、別の側面において、前記コラーゲン産生促進用組成物を含有する皮膚外用剤、飲食品、又は医薬品に関する。
【００１４】
本発明は、また別の側面において、ベルベリン、ベルベリン類縁体、及びそれらの塩、並びにベルベリンを含有する植物抽出物からなる群から選択される１種以上を含有する、細胞内から細胞外へのコラーゲンの分泌を促進するための、コラーゲン分泌促進剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、上記の課題を解決することができ、顕著なコラーゲン産生促進能を有するコラーゲン産生促進用組成物、並びにこれを利用した、皮膚外用剤、飲食品、及び医薬品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養液に各種抽出物を添加した場合の、細胞外（培養上清中）コラーゲン量の変化を示したグラフである。
【図２】正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養液に各種抽出物を添加した場合の、細胞内コラーゲン量の変化を示したグラフである。
【図３】正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養液に、ベルベリン及び／又はコラーゲン合成促進剤（ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、又はクルクミン）を単独で又は組み合わせて添加した場合の、細胞外（培養上清中）コラーゲン量の変化を示したグラフである。
【図４】正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養液に、ベルベリン及び／又はコラーゲン合成促進剤（ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、又はクルクミン）を単独で又は組み合わせて添加した場合の、細胞内コラーゲン量の変化を示したグラフである。
【図５】正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養液に、ベルベリン及び／又はコラーゲン合成促進剤（ホエイタンパク又はイラクサ抽出物）を単独で又は組み合わせて添加した場合の、細胞外（培養上清中）コラーゲン量の変化を示したグラフである。
【図６】正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）の培養液に、ベルベリン及び／又はコラーゲン合成促進剤（ホエイタンパク又はイラクサ抽出物）を単独で又は組み合わせて添加した場合の、細胞内コラーゲン量の変化を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
［コラーゲン産生促進用組成物］
本発明に係るコラーゲン産生促進用組成物は、（Ａ）ベルベリン、ベルベリン類縁体、及びそれらの塩、並びにベルベリンを含有する植物抽出物からなる群から選択される１種以上（本明細書中において、「ベルベリン類」と称することがある）と、（Ｂ）コラーゲン合成促進剤とを含有する。
【００１８】
なお、従来の文献中では、コラーゲンについての「合成」と「産生」との語は同義に使用されることも多いが、本明細書中では、文脈にもよるが、原則としてこれらの語を区別して使用する。すなわち、本明細書において、コラーゲンの「合成促進」とは、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞等のコラーゲンを産生する細胞の内部において行われるコラーゲン合成を促進させる作用を指すものとし、これは、例えば、後述する実施例で示すように、コラーゲンを産生する細胞に、対象となる物質を作用させた際の、細胞内コラーゲンの増加量を検出することによって確認することができる。一方、本明細書において、コラーゲンの「産生促進」とは、細胞内におけるコラーゲンの合成のみならず、その後の細胞外へのコラーゲンの分泌をも含めた一連の過程のいずれかに関与することによって、最終的に細胞外に存在するコラーゲン量を増加させる作用を指すものとし、これは、例えば、後述する実施例で示すように、コラーゲンを産生する細胞に、対象となる物質を作用させた際の、細胞外に分泌されたコラーゲン（培養上清中に存在するコラーゲン）の増加量を検出することによって確認することができる。なお、細胞内又は細胞外におけるコラーゲンの増加量は、各々常法により検出することができるが、例えば、対象となる物質を作用させる前と後のそれぞれにおいて、細胞内又は細胞外におけるタンパク質レベルでのコラーゲン量を、抗体を用いて測定し、それらの測定量の差によって検出することができる。最終的には、細胞間で細胞外マトリクスとして機能するコラーゲンの量を増加させることが望ましいことから、本発明においては、細胞内におけるコラーゲンの「合成促進」に加え、細胞外への分泌をも含めたコラーゲンの「産生促進」を、主な目的とする。
【００１９】
また、本明細書において、「コラーゲン」とは、その生合成過程におけるいずれの段階のものであってもよい。すなわち、コラーゲンは、コラーゲンを産生する細胞内で１本鎖のプロα鎖として合成され、それらが３本寄り集まって３本鎖のプロコラーゲンとして細胞外へ分泌される。その後、酵素分解により末端の一部のアミノ酸が切断されてトロポコラーゲンとなり、凝集して線維状となって、更に架橋が行われて成熟コラーゲン線維となる。本明細書においては、これらのいずれの段階のものも「コラーゲン」に含まれる。
【００２０】
（Ａ）ベルベリン類
ベルベリン類は、コラーゲンを産生する細胞に作用させて、当該細胞内で合成されたコラーゲンの、細胞外への分泌を促進させる目的でコラーゲン産生促進用組成物に配合される。ベルベリン類は、細胞内のコラーゲン量を減少させる一方で、細胞外のコラーゲン量を増加させる。そのため、ベルベリン類をコラーゲン産生促進用組成物中に配合することで、細胞内で合成されたコラーゲンを細胞外に効率よく分泌させ、細胞間で実際に機能するコラーゲン線維を増やすことが可能となると考えられる。
【００２１】
ベルベリン類としては、ベルベリン、ベルベリン類縁体、ベルベリン又はベルベリン類縁体の塩、ベルベリンを含有する植物抽出物が挙げられ、これらは医薬品、医薬部外品、化粧品、又は食品の分野において使用され得るものであれば、特に制限なく使用することができる。ベルベリン類縁体としては、塩化ベルベリン、硫酸ベルベリン、タンニン酸ベルベリン、パルマチン、コプチシン、ウォレニン、ジャトロリジン、サンギナリンなどが挙げられる。ベルベリン又はベルベリン類縁体の塩としては、ナトリウムやカリウム等のアルカリ金属塩、カルシウムやマグネシウム等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、トリエタノールアミンやトリエチルアミン等の有機アミン塩、リジンやアルギニン等の塩基性アミノ酸塩などが挙げられる。ベルベリンを含有する植物抽出物としては、オウレン（Ｃｏｐｔｉｓ  ｊａｐｏｎｉｃａ）抽出物、オウバク（キハダ（Ｐｈｅｌｌｏｄｅｎｄｒｏｎ  ａｍｕｒｅｎｓｅ）の樹皮）抽出物などが挙げられる。オウレン抽出物については、特に根茎からの抽出物が好ましい。これらは１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００２２】
ベルベリンを含有する植物抽出物は、例えば、上記の植物から常法に応じて抽出することにより得ることができる。例えば、上記の植物から、水、グリセリン、プロピレングリコール、エタノール、ブチレングリコール等の水溶性溶剤、又はそれらの混合液などで、常温または加温処理により、抽出、精製することにより得ることができる。得られた抽出液はそのまま使用してもよいし、不活性な夾雑物を除去し使用してもよい。或いは、濃縮・乾固物を、水や極性溶媒に再度溶解して使用してもよい。更には、所望の程度の分泌促進作用を損なわない範囲で、抽出液に対し、脱色、脱臭、脱塩の精製処理を行ったり、カラムクログラフィーによる分画抽出を行ったりした後で使用することもできる。また、ベルベリンを含有する植物抽出物としては、市販品を使用することもでき、例えば、オウレン抽出液−Ｊ（丸善製薬社製）等が挙げられる。
【００２３】
コラーゲン産生促進用組成物中のベルベリン類の含有量は、特に制限なく、目的に応じて適宜選択することができるが、有効成分であるベルベリン（類縁体、塩を含む）の量として、通常、０．０００１〜５０質量％であり、０．０１〜５質量％が好ましく、０．０２５〜０．５質量％がより好ましい。ベルベリン類の含有量が好ましい範囲内であると、コラーゲン分泌促進作用の観点や、多量のベルベリン類による組成物の着色等に起因する問題を防ぐ観点から、有利である。
【００２４】
（Ｂ）コラーゲン合成促進剤
コラーゲン合成促進剤は、上記のベルベリン類と組み合わせることで、全体として相乗的なコラーゲン産生促進効果を奏する目的で、コラーゲン産生促進用組成物に配合される。ベルベリン類とコラーゲン合成促進剤との組み合わせが、顕著なコラーゲン産生促進効果を奏する理由としては、特にそのメカニズムに限定されるものではないが、コラーゲン合成促進剤の作用によって増加した細胞内のコラーゲンを、上記のベルベリン類の作用により細胞外に積極的に分泌することで、全体として、細胞外に存在するコラーゲン量を効率的に増やすことが可能となるためと考えられる。
【００２５】
コラーゲン合成促進剤としては、少なくとも細胞内でのコラーゲンの合成を促進させる作用を有し、医薬品、医薬部外品、化粧品、又は食品の分野において使用され得るものであれば、特に制限なく使用することができ、例えば、ウマスギゴケ、オオスギゴケ、サウスレア・インボルクラタ、クスノハガシワ、ハイビスカス、破布樹、竜利葉、霧水葛、アントセファラス・インディカス、アナファリス  ブスア、鋪地草、キヨスミイトゴケ、ジンギバーカッサムナー、回心草、蓮子草、オオタマゴケ、黄皮の葉、オニイチゴ、セイロンマツリ、クロレラ、サキシマフヨウ、ホソバオキナゴケ、オオシラガゴケ、五斂子、ツルゲンゲ、ハス胚芽、センネンケン、月桃、水ナス、五指毛桃、アメリカハリブキ、チャングバット、土貝母、アモールセコ、コエロスポンディアス・アクシラリス、ネムノキ、ノゲイトウ、ローマンカモミール、バショウ、オオズキンカブリタケ、ヒトリシズカ、パッションフルーツ、大花紅景天、茎地紅景天、カンゾウ、ソウハクヒ、アロエ、スギナ、キンギンカ、オウバク、ガイヨウ又はゲンチアナ等の植物抽出物、レチノイン酸、グリシン及びプロリン及びアラニンからなる３種アミノ酸、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、アスコルビン酸類、ブラシノライド、エピブラシノライド、メナキノン−７、ホスファチジン酸などが挙げられる。これらは１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００２６】
中でも、コラーゲン合成促進剤としては、ＴＧＦ−β（トランスフォーミング増殖因子−β）を使用することが好ましい。ＴＧＦ−βは、自然に存在する多くの機能を持つ増殖因子であり、細胞外マトリックスタンパク質の産生、沈着や、上皮系細胞の増殖抑制、免疫細胞の機能抑制等、細胞の増殖や分化において重要な役割を果たすことが知られている。ＴＧＦ−βは、線維芽細胞等の標的細胞の表面に存在するＴＧＦ−β受容体に結合し、情報伝達を担うタンパク質であるＳｍａｄ２、Ｓｍａｄ３をリン酸化させることによって、標的遺伝子の転写発現を誘導し、細胞外マトリックスタンパク質であるコラーゲンの合成を導く。このように、ＴＧＦ−βによりコラーゲンの合成が促進されることは一般に知られているが、上記のベルベリン類と組み合わせて使用した際に、特に顕著なコラーゲン産生促進効果を奏することは、これまでに知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
【００２７】
上記のようなＴＧＦ−βの作用機序を考慮すると、ＴＧＦ−βと同様に、ＴＧＦ−β様の作用を有する成分（例えば、ＴＧＦ−βの産生を促進する物質や、ＴＧＦ−β以外の、ＴＧＦ−β情報伝達経路を活性化させる物質等が含まれる）にも、コラーゲン合成を促進する作用が期待できる。すなわち、このようなＴＧＦ−β様作用を有する成分も、本発明におけるコラーゲン合成促進剤として好ましく使用できる。ＴＧＦ−β様作用を有する成分としては、例えば、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質の断片、イラクサ抽出物、シカクマメ抽出物、ダイフウシ抽出物、アロエベラ抽出物、クルクミン、フコキサンチン、フコキサンチノール、キチン、β−１，４−マンノビオースなどが挙げられる。中でも、ＴＧＦ−β様作用を有する成分としては、ホエイタンパク質及び／又はホエイタンパク質の断片が好ましい。
【００２８】
ホエイタンパク質は、ウシ、ヒツジ、ヒト等の生乳から、カゼインと乳脂肪を取り除いた乳清（ホエイ）に含まれるタンパク質の総称である。主なホエイタンパク質としては、例えば、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、免疫グロブリン、グリコマクロペプチド、ラクトフェリンなどが挙げられる。ホエイタンパク質としては、好ましくはウシのβ−ラクトグロブリン（配列番号６）が使用される。また、ホエイタンパク質としては、βラクトグロブリンを高濃度に含有するように調製されたホエイタンパク質を使用することも好ましい。また、ホエイタンパク質の低分子画分（１〜３０ｋＤａ）を濃縮させたＣＢＰ（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  Ｂｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ  ｗｈｅｙ  ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；濃縮乳清活性タンパク質）を使用することもできる。
【００２９】
ホエイタンパク質の断片としては、好ましくはβ−ラクトグロブリンの断片が使用され、特に好ましくは、β−ラクトグロブリンの１０２〜１０５番目のアミノ酸配列であるＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（配列番号１）、β−ラクトグロブリンの１４２〜１４５番目のアミノ酸配列であるＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ（配列番号２）、β−ラクトグロブリンの１４６〜１４９番目のアミノ酸配列であるＨｉｓ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ（配列番号３）、β−ラクトグロブリンの１１〜１９番目のアミノ酸配列であるＡｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ（配列番号４）、及び、β−ラクトグロブリンの１５０〜１６２番目のアミノ酸配列であるＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ（配列番号５）からなる群から選択される１以上のペプチド断片を使用することができる。
【００３０】
ホエイタンパク質は、例えば、ウシの生乳からの抽出、限外濾過、電気透析、エバポレーション、逆浸透などによって得ることができる。或いは、微生物を用いて生合成したものや、有機合成化学的に人工合成したものを使用してもよい。また、ホエイタンパク質の断片は、ホエイタンパク質を加水分解することにより得ることができる。或いは、微生物を用いて生合成したものや、有機合成化学的に人工合成したものを使用してもよい。また、ホエイタンパク質及びホエイタンパク質の断片は、Ｎ末端及び／又はＣ末端が修飾されることにより誘導体化されていてもよい。
【００３１】
コラーゲン産生促進用組成物中のコラーゲン合成促進剤の含有量は、特に制限なく、目的に応じて適宜選択することができるが、通常、０．００００００１〜５０質量％であり、０．０００００１〜１０質量％が好ましく、０．０００００１〜１．２質量％がより好ましい。コラーゲン合成促進剤の含有量が好ましい範囲内であると、コラーゲン合成促進作用の観点や、多量のコラーゲン合成促進剤による色や性状等の品質への望ましくない影響を防ぐ観点から、有利である。
【００３２】
コラーゲン産生促進用組成物中の、ベルベリン類とコラーゲン合成促進剤との含有量比は、通常、コラーゲン合成促進剤１００質量部に対して、ベルベリン類が（有効成分であるベルベリン（類縁体、塩を含む）の量として）０．０５質量部以上であり、０．０５〜２０００００００質量部となることが好ましく、０．１２５〜５００００質量部となることがより好ましい。含有量比が好ましい範囲内であると、コラーゲン産生促進作用の点で有利である。
【００３３】
コラーゲン産生促進用組成物は、上記の二成分（ベルベリン類、及び、コラーゲン合成促進剤）のみからなるものであってもよいが、必要に応じて、通常の医薬品、医薬部外品、化粧品又は食品に使用され得る各種の任意成分、例えば、油剤、粉体、界面活性剤、粘剤、樹脂、アミノ酸類、糖類、有機系紫外線吸収剤、天然系の植物抽出成分、溶媒、防腐剤、金属イオン封鎖剤、抗炎症成分、薬効成分等を適宜含有することができる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。また、組成物中のこれらの任意成分の含有量は、本発明の効果を損なわない範囲内で適宜選択することができる。
【００３４】
本発明に係るコラーゲン産生促進用組成物は、優れたコラーゲン産生促進能を有することから、例えば、コラーゲンの減少や変性等に起因する美容上の問題や各種障害を予防又は治療するための組成物、具体的には、シワ又はタルミ、ハリの低下の予防及び／又は改善のための組成物や、角膜障害、関節障害、炎症性疾患等の予防及び／又は治療用の組成物などとして、有益に使用することができる。なお、コラーゲン産生促進用組成物の適用対象となる生体は、主にヒトであるが、ヒト以外の動物にも適用が可能である。また、コラーゲン産生促進用組成物は、培養線維芽細胞等の生体外のコラーゲン産生細胞において、コラーゲンの産生を促進させるために使用することも可能である。
【００３５】
コラーゲン産生促進用組成物の使用方法としても、特に制限はなく、生体内又は生体外におけるコラーゲンを産生する細胞に対して、有効成分（ベルベリン類、及び、コラーゲン合成促進剤）を作用させることができればよい。例えば、対象となる生体に、組成物を経口的又は非経口的（例えば、経皮的）に摂取させることができる。また、対象が生体外の細胞である場合には、組成物を細胞の培養液に対して添加することができる。生体における組成物の摂取量、又は生体外の細胞に対する組成物の添加量にも、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で適宜選択することができる。
【００３６】
［皮膚外用剤、飲食品、医薬品］
本発明は、上記のコラーゲン産生促進用組成物を含む、皮膚外用剤、飲食品、及び医薬品にも関する。これらは、ベルベリン類とコラーゲン合成促進剤との組合せに基づく優れたコラーゲン産生促進能を有することから、例えば、コラーゲンの減少や変性等に起因する、シワやタルミの予防又は改善、角膜障害、関節障害、炎症性疾患等の疾患の予防又は治療などのために好適に利用可能である。
【００３７】
皮膚外用剤としては、医薬部外品や化粧品であってよく、例えば、ローション、乳剤、クリーム、軟膏等の形態の医薬部外品、化粧水、乳液、クリーム、化粧油等のスキンケア化粧品、ファンデーション、パウダー、口紅、頬紅、アイシャドウ、ネイルエナメル等のメークアップ化粧品、エアゾール式、ポンプ式、押出し式等の機構で噴射する化粧品、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤等の形態の入浴剤などが挙げられる。皮膚外用剤は、少なくともベルベリン類、及びコラーゲン合成促進剤を含有し、更に任意の、医薬部外品や化粧品に配合され得る成分を含有し、常法に応じて任意の剤型に製造することができる。
【００３８】
飲食品としては、例えば、パン類、菓子類、麺類、乳製品、粉類、飲料類、各種加工品等の一般加工食品や、ビタミン剤等の栄養補助食品、栄養補助飲料、動物用健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品、保健機能食品などが挙げられる。飲食品は、少なくともベルベリン類、及びコラーゲン合成促進剤を含有し、更に任意の、飲食品に配合され得る成分を含有し、常法に応じて任意の剤型に製造することができる。
【００３９】
医薬品としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形組成物からなる経口用医薬品、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液体組成物からなる経口用医薬品、注射剤、経皮吸収剤、外用剤等の非経口用医薬品などが挙げられる。医薬品は、少なくともベルベリン類、及びコラーゲン合成促進剤を含有し、更に任意の、医薬品に配合され得る成分を含有し、常法に応じて任意の剤型に製造することができる。
【００４０】
皮膚外用剤、飲食品、及び医薬品中の、有効成分（ベルベリン類及びコラーゲン合成促進剤）の含有量としては、特に制限はなく、所望のコラーゲン産生促進作用の程度や、使用する有効成分の種類、皮膚外用剤、飲食品、及び医薬品の剤型等、目的に応じてそれぞれ適宜選択することができる。例えば、ベルベリン類としてベルベリンを含有する植物抽出物を使用する場合、その植物抽出物中のベルベリン類の含有量にもよるが、皮膚外用剤、飲食品、及び医薬品中に０．００１〜３０質量％の範囲内で含有させることができる。また、例えば、コラーゲン合成促進剤としてホエイタンパク質を使用する場合、皮膚外用剤、飲食品、及び医薬品中に０．００２５〜３０質量％の範囲内で含有させることができる。また、皮膚外用剤、飲食品、及び医薬品中の上記二成分の含有量比としては、例えば、質量比で、ベルベリンを含有する植物抽出物：ホエイタンパク質＝２０：１〜１：２００とすることができる。
【００４１】
［コラーゲン分泌促進剤］
また、本発明は、ベルベリン、ベルベリン類縁体、及びそれらの塩、並びにベルベリンを含有する植物抽出物からなる群から選択される１種以上を含有する、コラーゲン分泌促進剤にも関する。コラーゲン分泌促進剤としては、上記のベルベリン類を、単独で使用してもよいし、他の任意成分と共に使用してもよい。また、コラーゲン分泌促進剤中のベルベリン類の含有量や剤型に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。本発明に係るコラーゲン分泌促進剤は、細胞内で合成されたコラーゲンを細胞外に効率的に分泌させる作用を有することから、例えば、生体外において培養線維芽細胞等のコラーゲンを産生する細胞に対してコラーゲンの分泌を促進させる目的で、また、生体内において細胞間のコラーゲン減少に起因する美容上や健康上の問題を予防又は改善する目的で、有益に使用することができる。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例及び製剤例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例及び製剤例に何ら限定されるものではない。
【００４３】
［試験例１：皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン分泌促進能を有する成分のスクリーニング］
皮膚線維芽細胞を用いて、コラーゲンを細胞内から培養上清中へと分泌促進する成分のスクリーニングを行った。具体的には、植物抽出物をはじめとした各種成分を培養液に添加した場合の、細胞内及び細胞外（培養上清中）のコラーゲン量の変化をそれぞれ測定し、細胞内におけるコラーゲンの合成、及び、細胞外へのコラーゲンの分泌に対する各種成分の作用を以下のように試験した。なお、各種成分として、ホエイタンパクとしては、βラクトグロブリン高含有ホエイタンパク質（Ｓｅｐｅｒｅｘ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ社製）を使用した。βラクトグロブリン高含有ホエイタンパク質は、Ｓｅｐｅｒｅｘ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ社の所有する専売工程により調製されたものであり、工程の概略は以下の通りである。ウシ由来の生乳を脱脂処理、低温殺菌、限外濾過、噴霧乾燥を行った。得られた濃縮物を希釈し、ディアフィルトレーション（３０ｋＤａ膜）によって主要な非ホエイタンパク質を除去した。さらに、得られた浸透液について限外濾過／ディアフィルトレーション（１ｋＤａ膜）を行い、低分子を除去した。得られたホエイタンパクは１〜３０ｋＤａのタンパク質を含有し、特にβラクトグロブリンを高濃度で含有する。植物抽出物としては、アセンヤク抽出液（アセンヤク抽出液、丸善製薬社製）、ダイズ抽出液（ファイトポリアミン−Ｓ、東洋紡社製）、オウレン抽出液（オウレン抽出液−Ｊ、丸善製薬社製）、アルファルファ抽出液（ビタノール、シラブ社製）を使用した。
【００４４】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、１２ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、８．０×１０４細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガス及び９５％空気の環境下で２４時間培養した。培養液には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を２質量％の濃度で含有した培地を各ウェル１ｍＬずつ使用した。次いで、ホエイタンパクは２００μｇ／ｍＬ、その他の抽出液は０．２５質量％になるように添加し、培養終了後、培養上清中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ；株式会社エーセル製）にて測定した。結果を図１に示す。なお、ホエイタンパク質又はその他の抽出液をいずれも添加しない場合の培養上清中のコラーゲン量を１００としてコラーゲン量を比較した。
【００４５】
図１の結果から、オウレン抽出液を添加した培養液で培養した細胞では、その他の培養液で培養した細胞と比べて、培養上清中のコラーゲン量が最も増加した。
【００４６】
続いて、細胞内のコラーゲン量の変化を確認するために、細胞内のコラーゲン量を検出した。まず培養上清回収後の細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＩＰＡバッファーを添加した。その後、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて加熱還元処理した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ウェスタンブロッティングにて細胞内のコラーゲンを抗体（Ａｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ；メルクミリポア社製）を用いて検出した。結果を図２に示す。なお、ホエイタンパク質又はその他の抽出液をいずれも添加しない場合の細胞内のコラーゲン量を１００としてコラーゲン量を比較した。
【００４７】
図２の結果から、オウレン抽出液を添加した培養液で培養した細胞では、その他の培養液の場合と比較して、細胞内のコラーゲン量が大きく減少した。
【００４８】
図１及び図２の結果から、オウレン抽出液は細胞内のコラーゲン量を減少させ、培養上清中のコラーゲン量を増加させることがわかった。このことから、オウレン抽出液は細胞内から培養上清中へのコラーゲンの分泌を促進していることが示唆された。オウレン抽出液の主要成分はベルベリンであることが知られており、ベルベリンが、コラーゲンの細胞内から細胞外への分泌を促進する作用を有しているものと考えられる。
【００４９】
［実施例１：皮膚線維芽細胞におけるベルベリン及びコラーゲン合成促進剤（化合物）の共刺激時のコラーゲン産生］
上記の試験例１において、コラーゲン分泌促進作用が示されたオウレン抽出液の主要成分であるベルベリンと、コラーゲン合成促進作用を有する化合物（ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、又はクルクミン）とを組み合わせて添加した場合の、細胞内におけるコラーゲンの合成、及び、細胞外へのコラーゲンの分泌に対する促進作用について以下のように試験した。なお、ベルベリンとしては塩化ベルベリン（和光純薬社製）を使用し、ＴＧＦ−βとしてはＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−β１  ｈｕｍａｎ（シグマ  アルドリッチ社製）、ＩＧＦ−１としてはＩｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｉ  ｈｕｍａｎ（シグマ  アルドリッチ社製）、クルクミンとしてはクルクミン（和光純薬社製）を使用した。
【００５０】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、１２ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、８．０×１０４細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガス及び９５％空気の環境下で２４時間培養した。培養液には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を２質量％の濃度で含有した培地を各ウェル１ｍＬずつ使用した。次いで、ベルベリンを１μｇ／ｍＬ、コラーゲン合成促進剤（ＴＧＦ−β、ＩＧＦ−１、又はクルクミン）を１０ｎｇ／ｍＬになるように、単独で又は双方を添加し、培養終了後、培養上清中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ；株式会社エーセル製）にて測定した。測定結果はベルベリン又はコラーゲン合成促進剤をいずれも添加しない場合（図中、「−」）のコラーゲン量を１００とし、図３に相対値で示す。
【００５１】
培養上清中のコラーゲン量を調べた図３の結果から、ベルベリン及びコラーゲン合成促進剤の双方を添加した培養液で培養した細胞では、それぞれを単独の培養液で培養するよりも、コラーゲン量が増加した。このことからベルベリンとコラーゲン合成促進剤とを組み合わせることで、細胞外へのコラーゲン分泌が顕著に増強されることが認められた。また、一定質量のコラーゲン合成促進剤とベルベリンとを組み合わせた際に、ＴＧＦ−βとベルベリンとの組み合わせが最も細胞外へのコラーゲン分泌を促進した。ＴＧＦ−βは試験した３種のコラーゲン合成促進剤の中で最も分子量が大きく、添加した分子数は少なかったことから、一定の物質量にて比較した場合でも、ＴＧＦ−βは他の化合物よりも、ベルベリンと組み合わせた際の培養上清中へのコラーゲン分泌が最も顕著であったと言える。
【００５２】
続いて、細胞内コラーゲン量の変化を検出した。培養上清回収後の細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＩＰＡバッファーを添加した。その後、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて加熱還元処理した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ウェスタンブロッティングにて細胞内のコラーゲンを抗体（Ａｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ；メルクミリポア社製）を用いて検出した。測定結果はベルベリン又はコラーゲン合成促進剤をいずれも添加しない場合のコラーゲン量を１００とし、図４に相対値で示す。
【００５３】
細胞内のコラーゲン量を調べた図４の結果から、コラーゲン合成促進剤を単独で添加した培養液で培養した細胞の細胞内のコラーゲン量は増加し、有効なコラーゲン合成促進能を示した。その一方で、ベルベリンと組み合わせたときには、コラーゲン合成促進剤を単独で使用したときよりもコラーゲン量は減少し、ベルベリンが細胞外へコラーゲンを分泌促進していることが示唆された。
【００５４】
図３及び図４の結果から、ベルベリンとコラーゲン合成促進剤との共刺激時では、単独刺激時よりも細胞内コラーゲン量は減少し、培養上清中のコラーゲン量は顕著に増加した。これらのことから、ベルベリンと、ＴＧＦ−β等のコラーゲン合成促進剤とを組み合わせることにより、細胞外に分泌されるコラーゲン量を顕著に増加させて、全体としてのコラーゲン産生を促進できることが示された。
【００５５】
［実施例２：皮膚線維芽細胞におけるベルベリン及びコラーゲン合成促進剤（抽出物）の共刺激時のコラーゲン産生］
ベルベリンと、コラーゲン合成促進作用を有する抽出物（ホエイタンパク又はイラクサ抽出物）とを組み合わせて添加した場合の、細胞内におけるコラーゲンの合成、及び、細胞外へのコラーゲンの分泌に対する促進作用について以下のように試験した。なお、ベルベリンとしては塩化ベルベリン（和光純薬社製）を使用し、ホエイタンパクとしては上記の試験例１で使用したものと同様のβラクトグロブリン高含有ホエイタンパク質（Ｓｅｐｅｒｅｘ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ社製）を使用した。イラクサ抽出物としてはイラクサ抽出液ＢＧ（丸善製薬社製）を使用した。
【００５６】
正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、１２ウェルカルチャープレート中で培養した。より詳細には、８．０×１０４細胞／ウェルの密度でプレートに播種し、３７℃で、５％炭酸ガス及び９５％空気の環境下で２４時間培養した。培養液には、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）に牛胎児血清（ＦＢＳ）を２質量％の濃度で含有した培地を各ウェル１ｍＬずつ使用した。次いで、ベルベリンを１μｇ／ｍＬ、コラーゲン合成促進剤（ホエイタンパク又はイラクサ抽出物）を固形分換算で２５μｇ／ｍＬになるように、単独で又は双方を添加し、培養終了後、培養上清中のコラーゲン量をＥＬＩＳＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ；株式会社エーセル製）にて測定した。測定結果はベルベリン又はコラーゲン合成促進剤をいずれも添加しない場合（図中、「−」）のコラーゲン量を１００とし、図５に相対値で示す。
【００５７】
図５の結果から、ベルベリン及びコラーゲン合成促進剤の双方を添加した培養液で培養した細胞では、それぞれ単独の培養液で培養した細胞よりも、培養上清中のコラーゲン量が増加した。このことから、ベルベリンとコラーゲン合成促進剤とを組み合わせることで、細胞外へのコラーゲン分泌が顕著に増強されることが認められた。また、一定量のコラーゲン合成促進剤とベルベリンとを組み合わせたときは、ホエイタンパクとの組み合わせが、最も細胞外へのコラーゲン分泌を増強した。
【００５８】
続いて、細胞内のコラーゲン量の変化を確認するために、細胞内のコラーゲン量を検出した。培養上清回収後の細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、ＲＩＰＡバッファーを添加した。その後、ＳＤＳサンプルバッファーを加えて加熱還元処理した。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥし、ウェスタンブロッティングにて細胞内のコラーゲンを抗体（Ａｎｔｉ−Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ；メルクミリポア社製）を用いて検出した。測定結果はベルベリン又はコラーゲン合成促進剤をいずれも添加しない場合のコラーゲン量を１００とし、図６に相対値で示す。
【００５９】
図６の結果から、コラーゲン合成促進剤を単独で添加した培養液で培養した細胞の細胞内のコラーゲン量は増加した。その一方で、ベルベリンと組み合わせたときには、コラーゲン合成促進剤単独のときよりもコラーゲン量は減少した。これらの結果は、細胞外へのコラーゲンの分泌をベルベリンが促進していることを示唆している。
【００６０】
上記の実施例１及び実施例２の結果から、ベルベリンと、様々なコラーゲン合成促進剤とを組み合わせることで、細胞外に分泌されるコラーゲン量を顕著に増加させ、結果としてコラーゲン産生を効果的に促進できることを見出した。また、コラーゲン合成促進剤の中でも、特にＴＧＦ−βやホエイタンパクと、ベルベリン類とを組み合わせることで、より高いコラーゲン産生促進効果が奏されるという知見を得た。
【００６１】
［製剤例１：化粧水］
以下に示す組成の化粧水を次のように調製した。成分（１）〜（７）を成分（８）に加え、混合した。
（成分）                                              （質量％）
（１）オウレン根エキス                                ０．０１
（２）ホエイタンパク                                  ０．１０
（３）ＰＥＧ−５０水添ヒマシ油                        ０．２０
（４）グリセリン                                      ５．００
（５）ＢＧ                                            ５．００
（６）ｐＨ調整剤                                          適量
（７）防腐剤                                              適量
（８）精製水                                              残余
計                                                    １００
【００６２】
［製剤例２：乳液］
以下に示す組成の乳液を次のように調製した。成分（３）〜（７）を約８０℃に加熱混合した。これに、約８０℃に加熱混合した成分（８）、（９）、（１２）、（１３）を加え、室温まで冷却した。成分（１０）、（１１）を順次添加し、成分（１）、（２）を最後に添加した。
（成分）                                              （質量％）
（１）オウレン根エキス                                ０．１０
（２）ホエイタンパク                                  １．００
（３）スクワラン                                      ０．５０
（４）ジメチコン                                      ０．５０
（５）ポリソルベート８０                              ０．５０
（６）ステアリン酸グリセリル                          １．００
（７）ベヘニルアルコール                              １．００
（８）グリセリン                                      ５．００
（９）ＢＧ                                            ８．００
（１０）カルボマー                                    ０．２０
（１１）水酸化Ｎａ                                    ０．０６
（１２）防腐剤                                            適量
（１３）精製水                                            残余
計                                                    １００
【００６３】
［製剤例３：クリーム］
以下に示す組成のクリームを次のように調製した。成分（３）〜（９）を約８０℃に加熱混合した。これに、約８０℃に加熱混合した成分（１０）、（１１）、（１４）、（１５）を加え、室温まで冷却した。成分（１２）、（１３）を順次添加し、成分（１）、（２）を最後に添加した。
（成分）                                              （質量％）
（１）オウレン根エキス                                ０．１０
（２）ホエイタンパク                                  １．００
（３）スクワラン                                      ０．７０
（４）ジメチコン                                      １．００
（５）ステアリン酸                                    ５．５０
（６）ステアリン酸ＰＥＧ−４０                        １．２０
（７）ステアリン酸ＰＥＧ−２５                        ０．４０
（８）ベヘニルアルコール                              ３．５０
（９）エチルヘキサン酸セチル                          ４．６０
（１０）グリセリン                                    ２．００
（１１）ＢＧ                                          ３．００
（１２）カルボマー                                    ０．２５
（１３）水酸化Ｎａ                                    ０．０８
（１４）防腐剤                                            適量
（１５）精製水                                            残余
計                                                    １００
【００６４】
［製剤例４：ハードカプセル］
以下に示す組成のハードカプセルを次のように調製した。成分（１）〜（６）を混合してカプセルに充填し、ハードカプセルとした。
（成分）                                              （質量％）
（１）オウレン根エキス                              １０．００
（２）ホエイタンパク                                １０．００
（３）アスコルビン酸ナトリウム                      １８．００
（４）デキストリン                                  ２４．００
（５）グリセリン脂肪酸エステル                        ０．５０
（６）粉糖                                                残余
計                                                    １００
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明に係るコラーゲン産生促進用組成物は、優れたコラーゲン産生促進能を有するため、例えば、抗シワ用組成物、抗タルミ用組成物、角膜障害、関節障害、炎症性疾患等の予防又は治療用組成物などとして好適に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2016056116.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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