(57)【要約】【課題】細胞膜に発現したα6β4インテグリン複合体（ITGA6B4）を特異的に認識することができる抗体を含む、高精度ながん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キットを提供すること。【解決手段】ヒトα6β4インテグリンを認識する抗体を放射性核種または蛍光物質で標識した抗体を含む、がん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトα6β4インテグリンを認識する抗体を放射性核種または蛍光物質で標識した抗体を含む、がん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
【請求項２】
抗体の重鎖可変領域（VH）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域（VL）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５、６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
【請求項３】
抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む抗体である、請求項２に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
【請求項４】
ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体IgG１クラスの定常領域からなる、請求項３に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
【請求項５】
抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（Diabody）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項１から３のいずれか１項に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
【請求項６】
放射性核種が、89Zr、99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、201Ｔｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、85Ｓｒ、197Ｈｇ、64Ｃｕ、123Ｉ、125Ｉ、124I、131Ｉ、90Y、177Lu、186Re、188Re、211At、225Ac、213Bi、212Pb、166Ho、44Sc、47Sc及び227Thからなる群から選択され、蛍光物質が、Fluorescein、Rhodamine、Cyanine dye、Alexa Fluor、Quantum Dot、Texas Red、Indocyanine green (ICG)からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
【請求項７】
（ａ）ヒトα6β4インテグリンを認識する抗体、及び（ｂ）放射性核種または蛍光物質を含む、がん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
【請求項８】
抗体の重鎖可変領域（VH）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域（VL）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５、６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
【請求項９】
抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む抗体である、請求項８に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
【請求項１０】
ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体IgG１クラスの定常領域からなる、請求項９に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
【請求項１１】
抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（Diabody）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項７から９のいずれか１項に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
【請求項１２】
放射性核種が、89Zr、99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、201Ｔｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、85Ｓｒ、197Ｈｇ、64Ｃｕ、123Ｉ、125Ｉ、124I、131Ｉ、90Y、177Lu、186Re、188Re、211At、225Ac、213Bi、212Pb、166Ho、44Sc、47Sc及び227Thからなる群から選択され、蛍光物質が、Fluorescein、Rhodamine、Cyanine dye、Alexa Fluor、Quantum Dot、Texas Red、Indocyanine green (ICG)からなる群から選択される、請求項７から１１のいずれか１項に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトα6β4インテグリン複合体（ITGA6B4）を認識する抗体を含むがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、死亡原因の上位を占める重要な疾患である。がんに一番有効な治療法として手術切除があり、特に、原発巣が周囲の臓器や組織に浸潤する前に切除すれば治癒する可能性が高い。早期に発見することが大切であるが、殆どのがんは、早期に症状があまりでないため、早期診断は極めて困難であり、診断された時点で既に周囲の臓器や組織に浸潤し、治療困難なケースが少なく無い。たとえば、予後が悪いとして知られている膵臓がんは、予後が悪い原因の一つとしては、早期に殆ど症状が無く、診断されたとき既に膵臓の外に浸潤し、肝臓に転移するケースが多いことである。日本国内の全国調査では、最初に膵臓がんを発見した方法として、ＣＴが４４％と最も多く、超音波が４１％である。従って、現在この２つの検査方法が膵臓がんの診断に重要である。しかし、現在一般的に使用されているＣＴの場合、がん組織と非がん組織の区別がつきにくく、熟練した画像診断医による診断を要する。膵臓がんの腫瘍マーカーには、ＣＡ１９−９、ＤＵＰＡＮ-２、Ｓｐａｎ−１、ＣＥＡなどがある。これらのマーカーは、いずれも進行がんで陽性となるが、早期の診断率は低く、早期診断に有用と言えるマーカーはない。さらに、ＣＡ１９−９は肝炎、肝硬変、膵炎のような非悪性腫瘍でも血中濃度が上昇するため、膵臓がんの診断への使用は、適切ではないことが知られている。膵臓がんは早期診断が非常に重要であるが、現在のところ膵臓がんが周囲臓器に浸潤する前に診断する方法は、存在していない。また、浸潤・転移した膵がんに対する有効な治療法も存在していない。
【０００３】
現在、腫瘍の画像診断において、主にＣＴやＭＲＩを用いて行われている。しかしながら、良性／悪性の鑑別・手術後再発の診断・他病変との鑑別などは、たとえ造影剤を用いてもＣＴやＭＲＩでは難しい場合がある。最近では、ＣＴやＭＲＩを補助する画像診断として、18F-2-fluoro-2-deoxyglucose (18F-FDG)を用いたPositron Emission Tomography （ＰＥＴ）診断が利用されている。しかし、18F-FDGは、診断メカニズム上ブドウ糖代謝の盛んな正常組織(例えば脳など)や活動性の炎症組織・肉芽組織にも集積するため、しばしば診断に窮する場合がある。従って、がん組織のみを特異的に認識し、正常組織を認識しない、特異性の高い高精度診断法の開発が望まれている。
【０００４】
近年、がん細胞に特異的に発現されているタンパク質を標的にしたがんの診断方法や治療法などの開発が盛んである。すなわち、がん細胞に高発現するが、正常組織には発現が少ない、あるいは発現していない細胞表面タンパク質を標的として、この細胞表面タンパク質を特異的に認識する抗体を利用し、がんの診断や治療を行う方法である（特許文献１）。
【０００５】
ヒトインテグリンはα鎖とβ鎖の2つのサブユニットからなるヘテロダイマーであり、異なるα鎖、β鎖が多種類存在することで、多様な組み合わせを生み出している。インテグリンα６β４は、分子量１５０ｋＤのα６鎖と２０５ｋＤのβ４鎖のヘテロダイマーで、β４とヘテロダイマーを形成するα鎖としてはα６のみが報告されている、一方α６とヘテロダイマーを形成するβ鎖はβ１も報告されている。インテグリンα６β４は主に上皮細胞の膜表面でヘテロダイマーを形成しており、細胞接着や細胞表面を介したシグナル伝達に関与している。また膵がんで高発現していることが報告されている(非特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２９０９９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Modern pathology 2007;20:656-667.
【非特許文献２】The Journal of Histochemistry and Cytochemistry 2005;53:799-801.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、細胞膜に発現したα6β4インテグリン複合体（ITGA6B4）を特異的に認識することができる抗体を含む、高精度ながん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ファージディスプレイによりITGA6B4複合体と反応するscFvを取得し、アミノ酸配列を同定した（特願２０１３−１８３７０３）。更にIgG化した抗体を放射性金属核種や蛍光物質で標識し、担がんマウスにおいてITGA6B4陽性発現腫瘍への特異的な集積を確認した。抗体の性能は標的分子への特異性や結合力が求められるが、イメージング用抗体では特異的集積能、バックグランドの低減、標識抗体の安定性等、in vitroの実験で得られるデータからは類推できない特性が必要である。本発明者は当該抗体が上記条件を備え、抗体を利用した画像腫瘍診断剤及びRI治療剤をヒト生体内での使用における有用性を示し、本発明を完成させた。
【００１０】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  ヒトα6β4インテグリンを認識する抗体を放射性核種または蛍光物質で標識した抗体を含む、がん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
（２）  抗体の重鎖可変領域（VH）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域（VL）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５、６で示されるアミノ酸配列を含む、（１）に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
（３）  抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む抗体である、（２）に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
（４） ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体IgG１クラスの定常領域からなる、（３）に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
（５）  抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（Diabody）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（１）から（３）のいずれかに記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
（６）  放射性核種が、89Zr、99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、201Ｔｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、85Ｓｒ、197Ｈｇ、64Ｃｕ、123Ｉ、125Ｉ、124I、131Ｉ、90Y、177Lu、186Re、188Re、211At、225Ac、213Bi、212Pb、166Ho、44Sc、47Sc及び227Thからなる群から選択され、蛍光物質が、Fluorescein、Rhodamine、Cyanine dye、Alexa Fluor、Quantum Dot、Texas Red、Indocyanine green (ICG)からなる群から選択される、（１）から（５）のいずれかに記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤。
（７）  （ａ）ヒトα6β4インテグリンを認識する抗体、及び（ｂ）放射性核種または蛍光物質を含む、がん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
（８）  抗体の重鎖可変領域（VH）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号１、２、３で示されるアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖可変領域（VL）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が、それぞれ配列番号４、５、６で示されるアミノ酸配列を含む、（７）に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
（９）  抗体が、ヒト抗体の定常領域を含む抗体である、（８）に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
（１０） ヒト抗体の定常領域が、ヒト抗体IgG１クラスの定常領域からなる、（９）に記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
（１１）  抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化V領域（Diabody）、ジスルフィド安定化V領域（dsFv）およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、（７）から（９）のいずれかに記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
（１２）  放射性核種が、89Zr、99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、201Ｔｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、85Ｓｒ、197Ｈｇ、64Ｃｕ、123Ｉ、125Ｉ、124I、131Ｉ、90Y、177Lu、186Re、188Re、211At、225Ac、213Bi、212Pb、166Ho、44Sc、47Sc及び227Thからなる群から選択され、蛍光物質が、Fluorescein、Rhodamine、Cyanine dye、Alexa Fluor、Quantum Dot、Texas Red、Indocyanine green (ICG)からなる群から選択される、（７）から（１１）のいずれかに記載のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体キット。
本発明によればさらに、ヒトα6β4インテグリンを認識する抗体を放射性核種または蛍光物質で標識した抗体を対象者に投与することを含む、がん又は腫瘍を診断又は治療する方法が提供される。
本発明によればさらに、がん又は腫瘍の診断又は治療に使用するための、ヒトα6β4インテグリンを認識する抗体を放射性核種または蛍光物質で標識した抗体が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ヒトITGA6B4を認識する抗体を用いたがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キットが提供される。本発明の抗体製剤は、ヒトITGA6B4と特異的に結合し、ITGA6B4が高発現している腫瘍へよく集積する。本発明の抗体製剤及び抗体キットを用いて、腫瘍を体外よりイメージングし、病変部及び浸潤や転移を調べることができる。また、本発明の抗体製剤及び抗体キットを用いて、細胞毒性を有するRIで標識することによりRI治療ができる。本発明の抗体製剤及び抗体キットは、疾患の早期発見や診断、及び治療に有用である。
【００１２】
また本発明によれば、ヒトインテグリンA6B4ヘテロダイマーを認識する抗体を用いた腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キットが提供される。本発明によれば、インテグリンα鎖、β鎖を個別に認識する場合に予想されるインテグリンA6B4以外の、例えばインテグリンα6β1への非特異的集積を回避することができる。即ち本発明の抗体製剤及び抗体キットによれば、がん部への高集積性と、非がん部でのバックグランドを比較したシグナル/ノイズ比が明確に示されることにより高精度ながん診断系、さらにはがん治療系が構築される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１−１は111In標識した抗体PPMXITG-005を用いてマウス体内のイメージングを解析した結果を示す。図１−２は蛍光標識した抗体PPMXITG-005を用いてマウス体内のイメージングを解析した結果を示す。図１−１、１−２ともにITGA6B4発現腫瘍塊に高集積している事が分かる。図１−３は111In標識抗ITGA6B4抗体（PPMXITG-005）を投与後、1.5〜96時間後に継時的に摘出臓器への集積量を評価した。
【図２】図２は、90Y標識抗ITGA6B4抗体PPMXITG-005(100μCi, 20μg)を投与後の腫瘍増殖を示す。コントロールとして、PBS (Control)、未標識抗体(20μg, Cold ITGA6B4)を投与した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
定義および一般技術
本明細書において別段定義しない限り、本発明に関して使用した科学技術用語は、当業者に通常理解されている意味を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関して使用した命名法およびその技術は、当技術分野で周知のものであり、通常使用されている。
本発明の方法および技術は一般に、別段示さない限り、当技術分野で周知である従来の方法に従って、本明細書全体にわたって引用し論じた種々の一般的参照文献およびより具体的な参照文献に記載されているように実施する。
【００１５】
ITGA6B4
本タンパク質は構造上特別に限定せず、細胞膜上発現型や可溶性型、また遺伝子の変異や欠損などの変異型、リン酸化、翻訳語修飾を受けたものも含めITGA6B4を意味する。またITGA6B4をインテグリンＡ６Ｂ４、インテグリンα6β4複合体、ITGA6/B4、ITGA6B4複合体、A6B4複合体などと記す場合も全て同一のタンパク質を意味する。
【００１６】
抗体
本明細書では必要に応じて、慣習に従い以下の略号（括弧内）を使用する。
重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、第１相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２相補性決定領域（ＣＤＲ２）、第３相補性決定領域（ＣＤＲ３）重鎖の第１相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１）、重鎖の第２相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ２）、重鎖の第３相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ３）軽鎖の第１相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１）、軽鎖の第２相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ２）、軽鎖の第３相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ３）。
【００１７】
本明細書において、「抗体」という用語は、イムノグロブリンと同義であり、当技術分野で通常知られている通りに理解されるべきである。具体的には、抗体という用語は、抗体を作製する任意の特定の方法により限定されるものではない。例えば、抗体という用語には、それだけに限らないが、組換え抗体、モノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体がある。
【００１８】
本発明で用いる抗体は、細胞膜表面上のインテグリンα６β４を特異的に認識する抗体であり、膜表面上のヘテロダイマーを複合体として認識することを特徴としている。また、成体内での動態がイメージング用抗体に適した性能を有することも本発明に重要な特徴として挙げられる。
【００１９】
本発明で用いる抗体としては、ヒト抗体、ヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、ヒト以外の動物抗体などを使用できる。好ましくは、ヒト抗体である。
【００２０】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体Ｈ鎖Ｖ領域（以下、ＶＨとも表記する）および抗体Ｌ鎖Ｖ領域（以下、ＶＬとも表記する）とヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域（以下、ＣＨとも表記する）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも表記する）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット等、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００２１】
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒトITGA6B4に特異的に反応するヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００２２】
ヒト抗体は、いろいろな取得方法で取得する抗体を意味する。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９３／１２２２７,ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２,ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６,ＷＯ９６／３３７３５参照）。好ましく、ファージディスプレイ法による取得したヒト抗体である。
【００２３】
ファージディスプレイによる抗体の取得について詳細に説明する。
１．ファージディスプレイライブラリの構築
患者あるいは健常人から骨髄、リンパ節あるいは末梢血を用いてヒトＢ細胞のcDNAを得られる。それぞれ抗体重鎖及び軽鎖抗体遺伝子の可変領域のプライマーを用いてＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)により抗体遺伝子断片を増幅する。これらの遺伝子断片を人為的に結合させ、線維状バクテリアファージＭ１３の外殻蛋白ｇ３ｐとの融合蛋白として発現させる。
【００２４】
ヒトｓｃＦｖ断片である重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片又は軽鎖断片−リンカー配列−重鎖断片を、ファージミドベクターまたはファージベクターにインテグレイトすることにより、ヒト一本鎖抗体遺伝子ライブラリーを作製することができる。
【００２５】
このヒト一本鎖抗体断片が組み込まれたファージミドベクターの大腸菌への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。
【００２６】
２．バイオパニング
バイオパニングとは、抗体ファージライブラリから目的の標的タンパクに対するファージを選別する操作である。様々なパニング法が知られている。標的タンパクを固定化し、抗体ファージライブラリと反応させ、結合しなかったファージを洗浄により除去する。その後、結合したファージを溶出し大腸菌に感染させて増殖させるという操作を数回行うことで標的タンパクに特異的なファージを濃縮することがある。標的タンパク質の固定化法はイムノチューブなどのプラスチック表面に標的タンパクを直接吸着させる方法や、標的タンパクをビオチン化し、固定化されたストレプトアビジンを介して固定化することなどができる。また、ストレプトアビジンがコートされたビーズに標的タンパクを固定化することもできる。その以外、細胞表面上の分子に対するパニングを行う場合には細胞に抗体ファージライブラリを直接反応させる細胞パニングがある。このようにバイオパニングを行い、標的タンパクと反応するファージを選ぶ。
【００２７】
３．ファージ抗体の解析
選択された標的タンパクと反応するファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列から適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、ＷＯ９２／０１０４７,ＷＯ９２／２０７９１, ＷＯ９３／０６２１３,ＷＯ９３／１１２３６,ＷＯ９３／１９１７２,ＷＯ９５／０１４３８,ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
【００２８】
本発明で用いる抗体は、抗体遺伝子を適当な宿主細胞系に導入して、タンパク質を発現させることにより取得することができる。タンパク質発現に使用する宿主細胞系は、抗体生産系では哺乳動物起源のものが多い。該生産者は発現したい遺伝子産物に最も適する特定の宿主細胞系を優先的に決定できる。一般的な宿主細胞系としては、ＣＨＯ由来細胞株（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）、ＣＶ１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原をするＣＶ１の誘導体）、ＳＰ２／０（マウスミエローマ）、Ｐ３ｘ６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、および２９３（ヒト腎臓）、２９３Ｔ（ＳＶ４０Ｔ抗原をする２９３の誘導体）が挙げられるがそれらに限定されない。宿主細胞系は商業施設やｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から、または発表された文献の発表機関から入手することができる。
【００２９】
好ましくは、宿主細胞系はｄｇｆｒ遺伝子の発現欠損であるＣＨＯ由来細胞株かＳＰ２／０のいずれかである。Ｕｒｌａｎｄ，  Ｇ．  ら、Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇａｍｍａ  ｒａｙｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｌｏｃｕｓ：  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎｓ，  Ｓｏｍａｔ．  Ｃｅｌｌ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｖｏｌ．  １２，  １９８６，  ｐ５５５５-５６６、および、Ｓｃｈｕｌｍａｎ，  Ｍ．  ら、Ａ  ｂｅｔｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｖｏｌ．  ２７６，  １９７８，  ｐ２６９-２７０  をそれぞれ参照のこと。最も好ましくは、宿主細胞系はＤＨＦＲ欠失ＣＨＯである。宿主細胞中へのプラスミドのトランスフェクションは、任意の技術を使って達成できる。具体的な方法としては、トランスフェクション（リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ法、リポフェクション、およびエレクトロポレーションを含む）、センダイウイルス等のエンベロープを利用してＤＮＡを導入する方法、マイクロインジェクション、およびレトロウイルスウイルスやアデノウイルス等のウイルスベクターを用いた感染が挙げられるがそれらに限定されない。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ９  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．を参照のこと。最も好ましいのは、エレクトロポレーションによる宿主中へのプラスミド導入である。
【００３０】
（抗体の断片）
本発明で用いる抗体は、抗体断片でもよい。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）2、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、およびＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００３１】
本発明のＦａｂは、ITGA6B4に特異的に反応する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
【００３２】
Ｆ（ａｂ'）2は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００３３】
Ｆａｂ'は、上記Ｆ（ａｂ'）2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
Ｆａｂ'は、ITGA6B4に特異的に反応するＦ（ａｂ'）2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ'断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＦａｂ'を発現させ、製造することができる。
【００３４】
ｓｃＦｖは、一本のＶＨと一本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと表記する）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す。本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のITGA6B4に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００３５】
ｓｃＦｖは、ITGA6B4に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
【００３６】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは本発明のITGA6B4に特異的に反応する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００３７】
ｄｓＦｖは、ITGA6B4に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
【００３８】
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００３９】
ＣＤＲを含むペプチドは、インテグリンα６β４に特異的に反応する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
【００４０】
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００４１】
（ITGA6B4発現細胞に対する反応性）
ITGA6B4発現細胞に対する反応性を検討するためには、細胞表面に発現されているITGA6B4をフローサイトメーターよる検定などがあげられる。
フローサイトメーターに用いる抗体としては、ＦＩＴＣなどの蛍光物質、ビオチンなどにより標識された抗体であっても、標識をされていない抗体であってもよい。用いた抗体の標識の有無、その種類により、蛍光標識アビジン、蛍光標識抗ヒト免疫グロブリン抗体などを使用する。反応性は、十分量の抗ITGA6B4抗体（通常最終濃度が０．１〜１０μｇ／ｍｌ）を検体に加えて行い、陰性対照抗体、陽性対照抗体の反応性との比較を行うことにより評価することができる。
【００４２】
（がん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キット）
本発明のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キットは、細胞表面上のITGA6B4に特異的に認識する抗体と放射性核種または蛍光物質から構成される。本発明のがん又は腫瘍の診断又は治療のための抗体製剤及び抗体キットは、画像用腫瘍診断剤又はRI治療剤として使用することができる。
【００４３】
放射性核種としては、89Zr、99mＴｃ、111Ｉｎ、113mＩｎ、67Ｇａ、68Ｇａ、201Ｔｌ、51Ｃｒ、57Ｃｏ、58Ｃｏ、60Ｃｏ、85Ｓｒ、197Ｈｇ、64Ｃｕ、123Ｉ、125Ｉ、124I、131Ｉ、90Y、177Lu、186Re、188Re、211At、225Ac、213Bi、212Pb、166Ho、44Sc、47Sc及び227Thが好適に用いられるが、これに限定されるものではない。蛍光物質としては、Fluorescein、Rhodamine、Cyanine dye、Alexa Fluor、Quantum Dot、Texas Red、Indocyanine green (ICG)が好適に用いられるが、これに限定されるものではない。
【００４４】
本発明の一つの形態としては、本発明の抗体製剤及び抗体キットは、ITGA6B4に特異的に認識する抗体、放射性核種または蛍光物質、及びリンカー(金属キレート試薬)から構成される。また、本発明の別の形態としては、金属キレート試薬を介さずに、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ等の放射性核種または蛍光物質が、ITGA6B4に特異的に認識する抗体に結合していてもよい。
【００４５】
上記した放射性金属核種を抗ITGA6B4抗体に結合させるには、該抗体に金属キレート試薬を反応させ、これに放射性金属元素を反応させて錯体とするのが好ましい。このようにして得られた修飾抗体は、放射性金属核種が金属キレート試薬を介して抗ITGA6B4抗体に結合している。
【００４６】
このような錯体形成に用いられる金属キレート試薬の例としては、例えば（１）８−ヒドロキシキノリン、８−アセトキシキノリン、８−ヒドロキシキナルジン、硫酸オキシキノリン、Ｏ−アセチルオキシン、Ｏ−ベンゾイルオキシン、Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイルオキシン、キノリン骨格を有するキノロン系化合物であるノルフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、ロメフロキサシン、トスフロキサシン、フレロキサシン、スパルフロキサシン等のキノリン誘導体；（２）クロラニル酸、アルミノン、チオ尿素、ピロガロール、クペロン、ビスムチオール（ＩＩ）、ガロイル没食子酸、チオリド、２−メルカプトベンゾチアゾール、テトラフェニルアルソニウムクロライド等の化合物；（３）エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）およびこれらに類似した骨格を有するジヒドロキシエチルグリシン、ジアミノプロパノール四酢酸、エチレンジアミン二酢酸、エチレンジアミン二プロピオン酸塩酸塩、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホン酸）、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヘキサメチレンジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、イミノ二酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ニトリロ三プロピオン酸、ニトリロトリス（メチレンスルホン酸）三ナトリウム塩、トリエチレンテトラミン六酢酸、メチルＤＴＰＡ、シクロヘキシルＤＴＰＡ、アミノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＥＤＴＡ、イソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、マレイミドプロピルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドペンチルアミドベンジルＤＴＰＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＥＤＴＡ、マレイミドデシルアミドベンジルＤＴＰＡ；（４）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、イソチオシアノベンジルＮＯＴＡ、及び  デフェロキサミン系化合物である  イソチオシアノベンジルデフェロキサミン等が挙げられる。
【００４７】
これらの金属キレート試薬のうち、イソチオシアノベンジルＤＯＴＡ、メチルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、シクロヘキシルイソチオシアノベンジルＤＴＰＡ、イソチオシアノベンジルデフェロキサミンが金属キレートの容易な抗体への導入反応、標識率、錯体の安定性等の点で好ましい。(標識する核種により適正なキレートは異なります）
【００４８】
抗ITGA6B4抗体への放射性金属核種の結合は、常法に従って行うことができる。例えば抗ITGA6B4抗体に金属キレート試薬を反応させ、予め標識前駆体を調製しておき、次いで放射性金属核種を反応させることにより行うことができる。
【００４９】
本発明の抗体製剤においては、抗ITGA6B4抗体と金属キレート試薬とのモル比ががん細胞集積性に重要であり、そのモル比（抗体：キレート試薬）は１：０．１〜１：４．５が好ましく、１：０．５〜１：３がさらに好ましい。このようなモル比にするには、抗体とキレート試薬を１：０．１〜１：５未満、特に１：１〜１：３のモル比で仕込んで反応させるのが好ましい。抗体のキレート修飾数は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法等を用いて分子量を測定し、未修飾抗体と修飾抗体の分子量を比較することにより算出することができる（米国特許公報第７５１４０７８号、Ｌｕら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．９４（４），２００５，ｐ７８８−７９７、Ｔｅｄｅｓｃｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏ．２３（１６Ｓ），２００５，４７６５）。また、抗体のキレート修飾数はキレート滴定法により測定することもできる。アルカリ土類金属比色試薬（アルセナゾIII）を用いた方法が知られている（Ｂｒａｄｙｒら、Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．３１，７９５−８０２，２００４、Ｄａｄａｃｈｏｖａら、Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２６，９７７−９８２，１９９９）。
【００５０】
本発明の抗体製剤及び抗体キットは、既標識抗体製剤として提供する方法と、標識前駆体を含有するキット製剤として提供する方法があるが、本発明ではいずれの方法でもよい。既標識製剤として提供する場合には、標識済みの抗ITGA6B4抗体を含有する抗体製剤をそのまま投与に用いることができる。キット製剤として提供する場合には、所望の放射性核種または蛍光物質で抗体の標識を行ってから投与に用いることができる。
【００５１】
放射性核種または蛍光物質で標識された抗体は、薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、乳化などすることによって抗体製剤として用いてもよい。例えば、放射性核種または蛍光物質で標識された抗体は、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、放射性金属核種または蛍光物質で標識された本発明の抗体は、水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。
【００５２】
本発明の抗体製剤の投与経路は特に限定されないが、通常は非経口投与であり、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜などで投与することができる。
【００５３】
投与量および投与回数は、患者の年齢、体重、診断の目的などによって異なるが、一般
に、本発明のモノクローナル抗体は、１回あたり体重１ｋｇあたり、約０．１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．１ｍｇから１００ｍｇの範囲となるように
投与することができる。
【００５４】
腫瘍はITGA6B4が高発現している悪性腫瘍である。大腸がん、乳がん、肺がん、肝がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、前立腺がん、白血病などがあげられる。
【００５５】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００５６】
実施例１：がん細胞株を使用したファージ抗体スクリーニング
（１）がん細胞に結合するファージ抗体のスクリーニング（AML 株USCD-AML1）
USCD-AML1 細胞（Oval et al., Blood 76: 1369-1374 (1990)；Taetle et al.,Cancer Res. 53: 3386-3393 (1993)；Hu et al., Leukemia 10: 1025-1040 (1996)）を任意の方法で培養した。細胞を回収し、冷却したＰＢＳで洗浄した後、１×１０１３ｃｆｕのヒト抗体ファージライブラリー（特開２００５−１８５２８１号公報、ＷＯ２００８／００７６４８号公報、ＷＯ２００６／０９０７５０号公報を参照）を混ぜ、最終容積１．６ｍＬになるように反応液（１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３、ＭＥＭ）を添加し、４℃にて４時間ゆっくり回転させて反応させた。反応終了後、反応液を二つに分け、それぞれ事前に用意した０．６ｍＬの有機溶液(ｄｉｂｕｔｙｌ ｐｈｔａｌａｔｅ ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ９：１)に重層し、マイクロ遠心機により２分間遠心（３０００ｒｐｍ）した。上清を捨て、チューブの底に沈降した細胞を０．７ｍＬの１％ＢＳＡ/ＭＥＭで懸濁し、更に０．７ｍＬの有機溶媒に重層した。同じように遠心により上清を捨て、細胞を０．３ｍＬのＰＢＳで懸濁し、液体窒素で凍結した。
【００５７】
凍結した細胞を３７℃で融解し、これをOD0.5の大腸菌DH12S 20mlに１時間感染させ、その一部をアンピシリンプレートに蒔いて回収されたファージのtiterを算出した。ファージ感染大腸菌は600mlの2xYTGA培地（2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate, 1% glucose）にて30℃で通夜培養した。この通夜培養10mlを2xYTA培地（2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate）200mlと混ぜ、37℃にて1.5時間培養後ヘルパーファージKO7を1x1011入れ、３７℃にて１時間培養したのち、800mlの2xYTGAK(2xYT, 200μg/ml ampicillin sulfate, 0.05% glucose, 50μg/ml kanamycin)を入れて３０℃にて通夜培養した。これを8000rpmにて10分間遠心して上清1lを調製、それに200mlのPEG液（20% polyetyleneglycol 6000, 2.5M NaCl）を混ぜてよくかきまぜたのち、8000rpm 10分間の遠心を行いファージを沈殿させた。これを10mlのPBSに懸濁し、その一部を使用して大腸菌感染数を調べた。これが1stスクリーニングのファージである。
【００５８】
2ndスクリーニングには培養細胞2x107と1stファージ1x1010を使用し、反応液の容積を0.8mlとした。反応液は1%BSA-0.1%NaN3/MEMで、全体のスケールを1stスクリーニングの半分で行った。
【００５９】
3rdスクリーニングは2ndファージ1x109を使用する以外は2ndスクリーニングと同じ条件で行った。
【００６０】
ファージ抗体の解析
３ｒｄスクリーニングしたファージを回収し、既存法によりＤＮＡ配列を解析し、欠損領域を保持する不完全な抗体や配列が重複する抗体を排除し、独立した抗体配列を持つファージ抗体を取得した（特許第４８７０３４８を参照）。
【００６１】
実施例２：ＥＬＩＳＡによる陽性ファージのスクリーニング
精製可溶性ヒトITGA6B4 抗原（Recombinant Human Integrin alpha 6 (X1) beta 4 R
＆D 社）を用いてＥＬＩＳＡによる抗原抗体の反応性を検討した。すなわち、可溶性ITGA6B4抗原をＰＢＳで１0μg/ｍＬになるように調整し、Ｉｍｍｕｎｏ Ｍｏｄｕｌｅ／Ｓｔｒｉｐ Ｐｌａｔｅｓ（ＮＵＮＫ）に50μＬ/ｗｅｌｌに添加し、３７℃で２時間静置した。その後、可溶性ITGA6B4 抗原を捨て、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ液（５％ スキムミルク / ０．０５％ ＮａＮ３/ ＰＢＳ)２００μＬ/ｗｅｌｌで添加し、３７℃で２時間ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除き、ＰＢＳにより洗浄し、上記２ｎｄスクリーニングのファージの培養上清を１00μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した１μｇ/ｍＬＲａｂｂｉｔ ａｎｔｉ−ｃｐ３を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、更にＰＢＳ/０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で２０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰを１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、ＯＰＤ ｉｎ ０．１Ｍクエン酸リン酸バーファー（ｐＨ５．１）＋０．０１％Ｈ２Ｏ２ を１００μＬ/ｗｅｌｌ添加し室温で５分間反応させた。２ＮＨ２ＳＯ２を１００μＬ/ｗｅｌｌ加え、発色反応を停止した。その後、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ３４０ＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）にて４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、可溶性ITGA6B4 抗原と顕著な陽性反応を示すファージクローンのＤＮＡ配列を解析し、それぞれのＣＤＲ配列を確認し、独立配列を有するものを分類した。その結果、特に反応性の強い抗体を選別し、抗体PPMXITG-005とした。
【００６２】
抗体PPMXITG-005
VH：
CDR１：Asp Tyr Ala Met His（配列番号１）
CDR2：Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly（配列番号２）
CDR3：Ala Leu Pro Ser Gly Gly Trp Ala Asp Ala Phe Asp Ile （配列番号３）
VL：
CDR1：Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn Tyr Val Gln （配列番号４）
CDR2：Glu Asp Asp Gln Arg Pro Ser （配列番５）
CDR3：Gln Ser Phe His Asp Thr Lys Gln Met （配列番号６）
【００６３】
実施例３：ITGA6B4高発現細胞株結合性の評価（ＦＡＣＳ）
単離した各種抗体クローンの各種細胞株に対する反応性を以下の通りFCMで確認した。実験操作は次の通りとした。まず、付着性細胞株については6穴プレート（Falcon 3516）において、ATL由来細胞株などの浮遊細胞株は浮遊培養フラスコ（70ml(スラントネック)）において、培地（RPMI-1640：Sigma-Aldrich 社製、10%ウシ胎児血清、1%ペニシリンーストレプトマイシン溶液）を用い、CO2インキュベーター内、37℃で培養したものを使用した。
【００６４】
付着性細胞株は2mg/ml collagenase I(Gibco BRL)/cell dissociation buffer(Gibco BRL)で培養皿から解離させたのち、10%FBS/D MEMにて回収した。一方、浮遊系細胞の場合は一度培地を除くためにそのままの状態で遠心分離（400xg, 4℃, 2分）した。このような操作の後、各細胞を2.5%BSA, 0.05%NaN3/PBS(BSA液)にて洗浄し、2.5% normal goat serum/BSA液100μlに懸濁して氷上に30分静置した後、106個/wellになるように分注し、遠心分離（400xg, 4℃, 2分）し上清を除いた。
【００６５】
抗体を、5μg/mlになるように加えて、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、抗cp3マウスモノクローナル抗体（株式会社医学生物学研究所）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて一度洗浄したのち、Alexa488結合抗マウスIgGヤギ抗体（Molecularprobe社製）5μg/ml BSA液100μlにて懸濁し、氷上に1時間静置した。これをBSA液にて二度洗浄したのち、BSA液500μlにて懸濁し、固定液（ホルムアル デヒド）50μlを添加し、10分静置した。その後PBS 150μl添加し、セルストレイナー（Becton Dickinson社製）にて処理したのち、Becton Dickinson社製FACScaliver（FCM）にて 細胞集団の蛍光強度を解析した。その結果、３種類の抗体は結合性評価を行ったITGA6B4高発現をしている癌細胞株（A431、PANC1、KATOIII、MIAPaCa2）全てにおいて有意なピークシフトを示した。
【００６６】
実施例４：IgG型抗体への変換
（IgG型抗体遺伝子の構築）
抗体医薬としての有効性を探るため、抗体PPMXITG-005をIgG型へ変換した。
まず、scFVcp3型抗体のVH、VL遺伝子を用い、それをIgG1のFc領域と遺伝子の塩基配列内にクローニングする際必要な制限酵素サイトが無いことを確認した。抗体遺伝子を鋳型とし、H鎖とL鎖増幅用プライマーを用い、PCRを行った。増幅産物をIgG1 construction vectorのCMVプロモーター下流へライゲーションし、IgG型抗体遺伝子を含むプラスミドDNAを得た。
【００６７】
（IgG型抗体の発現）
プラスミドDNAのCHO-K1細胞へのトランスフェクションにはGenePORTER Reagent（ Gene Therapy Systems社：T201007）を使用した。まず、60mm培養皿にCHO-K1細胞が2×104cells/mlになるように、トランスフェクションの前日から準備しておいた（培地はα-MEM(Invitrogen:12561-056)に10%FCS(エキテック社:268-1)添加したものを使用）。
プラスミドDNA 8μgを250μLの血清非含有培地（Serum Free Medium、以下SFMと略す-(Invtrogen:12052-098 CHO-S-SFMII)に溶かし、0.22μmのフィルターにかけた。GenePORTER Reagent 40μLを250μLのSFMに加えた。
【００６８】
SFMに溶かしたプラスミドDNAとGenePORTER Reagentをすばやく混ぜ、室温30min静置した。
細胞をSFM 2mlで2回洗い、プラスミドDNA-GenePORTER mixture (Transfection Medium)を細胞の入ったプレートにゆっくり加え、インキュベーター内、37℃、5時間培養した。
トランスフェクション用培地を吸引し、αMEM 10％FCSで2回洗った後、αMEM 10％FCSを5ml加え、インキュベーター内、37℃、48時間培養した。
【００６９】
αMEM 10％FCS＋700μg/ml G418（Sigma:G7034）の培地10mLに置き換え、セレクションを開始した(以後のmediumはαMEM 10％FCS＋700μg/mL G418を使用)。37℃、48時間培養後、細胞をPBS 10mLにて洗浄し、0.25%Trypsin-EDTA（Sigma T4049）750μLにて処理後、αMEM 5mL加えプレートより剥離、回収し細胞数を測定した。その結果を元に限界希釈を10cells/200μL/well 96well 2platesの条件で行った。14日間培養後、各wellの培養上清を用いてELISAを行い、IgG型抗体の発現を確認した。
【００７０】
（培養上清からの発現タンパク(IgG)の精製）
Protein G Sepharose 4 Fast Flow(amersham pharmacia biotech:17-0618-01) 1mLをカラムにつめ、5mLのPBSで平衡化した。培養上清をアプライ、流速1滴/2秒で送液し、発現タンパク(IgG)をカラムに結合させた。10mLのPBSを流速1滴/2秒で送液し、非吸着成分を洗浄後、6mLの溶出バッファー（0.2M グリシン-HCl,pH3）を流速1滴/秒で送液、溶出液を1mLずつ1.5mlチューブに回収した。回収チューブにはあらかじめ中和バッファー（3M Tris-HCl）400μLを添加、回収と同時に中和した。溶出液をまとめ750μLまで濃縮、溶液置換（PBS、complete、0.01%NaN3）を行い、SDS−PAGEによって抗体タンパクの濃度を算出した。
【００７１】
実施例５：放射性標識抗体の作製
（１）抗体へのCHX-A''-DTPAの結合
抗体を緩衝液（0.05M borate buffer pH8.5）に溶解し、抗体濃度を5ｍｇ／ｍＬに調整した。CHX-A''-DTPA（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ社製  Ｂ−355）を、緩衝液（0.05M borate buffer pH8.5）に0.62ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解した。抗体とDFのモル比が1：2.5となるように混合、撹拌し、37℃で一晩静置した。反応終了後、Sephadex G50（ＧＥヘルスケア社製）カラムで0.1M acetate buffer pH6.0を用いて精製した。使用した抗体は、抗体PPMXITG-005である。
【００７２】
（２）キレート導入率の確認
5uL 1M acetate buffer pH6.0と5uL 111InCl3を混合し、室温で5分静置した。その後、（１）で精製する前のキレート-抗体反応液(5μL)を加え、室温で30分静置した。等電点電気泳動により、抗体画分とキレート画分を分け、イメージングプレート(富士フィルム)に5秒間露光し、イメージスキャナー(富士フィルム)で画像を取得した。付属ソフトウエアで抗体とキレートのintensityを測定し、キレート導入率を算出した。
【００７３】
（３）111In標識抗体の調製
（ｉ）111In標識
1M acetate buffer pH6.0と111InCl3を1:1で混合し、室温で5分静置した。その後、精製した抗体PPMXITG-005(4ｍｇ／ｍＬ)を加えて室温で30分静置した。反応終了後、Sephadex G50（ＧＥヘルスケア社製）カラムで0.1M acetate buffer pH6.0を用いて精製した。
（ｉｉ）標識率の確認
（i）で精製する前の標識反応液(0.5μL)を電気泳動により、抗体画分とキレートと錯体形成していない画分に分け、イメージングプレート(富士フィルム)に5秒間露光し、イメージスキャナー(富士フィルム)で画像を取得した。付属ソフトウエアで抗体とDPTAのintensityを測定し、標識率を算出した。
【００７４】
実施例６：蛍光標識抗体の作製
ICG Labeling Kit-NH2及びFluorescein Labeling Kit-NH2（Dojindo Molecular Technologies社製)を用いて蛍光標識を行った。100μgの抗体とICG-NH2またはfluorescein-NH2をfiltration tubeのメンブレン上で混合し、37度で10分間反応させた。その後付属のバッファーを加え、遠心した。メンブレン上の蛍光標識抗体をPBSをピペッティングして回収した。Infinite 200 PROマルチモードマイクロプレートリーダー(Tecan社製)を用いて、ICG標識抗体は800nm、fluorescein標識抗体は490nmの吸光度を測定し、抗体に結合した蛍光物質の数を求めた。使用した抗体は、抗体PPMXITG-005である。
【００７５】
実施例７：腫瘍のイメージング
実施例５及び実施例６で作成した、111In標識抗ITGA6B4抗体またはICG標識抗ITGA6B4抗体を、ヒトITGA6B4を高発現している腫瘍（ヒトBxPC3細胞株）と、ヒトITGA6B4を発現していない腫瘍（マウスA4細胞株）を皮下移植したヌードマウスに投与し、投与後経時的にイメージングを行った。投与1日後から111In標識抗ITGA6B4抗体(抗体PPMXITG-005)のヒトITGA6B4高発現移植腫瘍への明瞭な集積を認め、その集積は投与4日後まで上昇した。（図１−１）一方、ヒトITGA6B4を発現していない移植腫瘍への集積は低く、時間経過とともに上昇することはなかった。蛍光標識抗ITGA6B4抗体でも同様の結果が得られたことから、111In標識抗ITGA6B4抗体及び蛍光標識抗ITGA6B4抗体(抗体PPMXITG-005)は、ITGA6B4を発現している腫瘍の画像診断に適していることが示された。（図１−２）同様に111In標識抗ITGA6B4抗体をBxPC3細胞株およびA4細胞株を移植したヌードマウスへ投与し、1.5〜96時間後の体内分布を評価した結果からも、腫瘍への高い集積性と他臓器へ非特異な集積がない事が確認された（図１−３）。
またこの結果を元に腫瘍への集積量から、90Y標識抗ITGA6B4抗体のITGA6B4腫瘍のBxPC-3細胞株への吸収線量は約8Gy/MBq、さらに別にAsPC-1細胞株への吸収線量は約10Gy/MBq、と推測できたことから、RI治療にも適していることが示された。
【００７６】
実施例８：90Y標識抗体の作製
1M acetate buffer pH6.0と90YCl3を1:1で混合し、室温で5分静置した。その後、精製した抗体PPMXITG-005(4ｍg /ｍL)を加えて室温で30分静置した。反応終了後、Sephadex G50（ＧＥヘルスケア社製）カラムで0.1M acetate buffer pH6.0を用いて精製した。
【００７７】
実施例９：in vivo抗腫瘍効果の解析
実施例8で作製した90Y標識抗ITGA6B4 (PPMXITG-005) 抗体を、ヒトITGA6B4を高発現している腫瘍（BxPC3細胞株）を皮下移植したヌードマウスに投与し薬効を確認した。ヒトBxPC3細胞株を移植後、腫瘍がおよそ300mm3を超えた時点でマウスを3群に分け、それぞれ1) 90Y標識-ITGA6B4抗体(3.7MBq)  2) 未標識ITGA6B4抗体  3)  未処置  とし、1) 群は100μCi, 20μg、2)群は20μgを単回投与した。（各群n=7で用意）腫瘍の経過観察は投与後、隔週２回腫瘍径を測定すると共に、FDG-PETによるモニターを継続した。この結果、90Y標識-ITGA6B4抗体投与群では未標識抗体投与および、PBS投与群に比べ腫瘍の増殖を完全に抑制する効果が観察された。（図２）
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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