(57)【要約】【課題】生体内で安定な低分子量の抗がん作用を有する物質を提供すること。【解決手段】抗６７ＫＤａラミニン・レセプタータンパク質（以下、６７ＬＲと称する）抗体に対する特異的結合性及び抗６７ＬＲ抗体産生能を有することを特徴とする免疫原性ペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチドであって、抗６７ＫＤａラミニン・レセプタータンパク質（以下、６７ＬＲと称する）抗体に対する特異的結合性及び抗６７ＬＲ抗体産生能を有することを特徴とする免疫原性ペプチド：（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチド；（ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅへの結合活性を有するペプチド；又は（ｃ）６７ｋＤａラミニン・レセプター（６７ＬＲ）のアミノ酸配列の一部において、
少なくともアミノ酸番号１６１〜１７０に由来する部分：Ａ１６１−Ａ１６２−Ａ１６３−Ａ１６４−Ａ１６５−Ａ１６６−Ａ１６７−Ａ１６８−Ａ１６９−Ａ１７０（配列中：
Ａ１６１は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６２は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６３は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６４は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６５は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６６は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６７は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６８は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６９は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１７０は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸である）を含み、さらにそれに隣接する１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されていてもよい部分を含んでいてもよいアミノ酸配列からなり；かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅへの結合活性を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチド；又は配列番号：１、配列番号：２、又は６７ＬＲのアミノ酸番号１６１〜１７０に由来するアミノ酸配列：Ａ１６１−Ａ１６２−Ａ１６３−Ａ１６４−Ａ１６５−Ａ１６６−Ａ１６７−Ａ１６８−Ａ１６９−Ａ１７０（配列中、Ａ１６１〜Ａ１７０は、請求項１と同じ）からなり；かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅへの結合活性を有するペプチドである、請求項１に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項３】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７又は配列番号：１８のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項１又は２に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドと、免疫原性を高めるキャリアタンパク質との融合ペプチドであって、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチド。
【請求項５】
キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、請求項４に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドを有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項７】
抗がん活性、抗肥満、抗動脈硬化作用、抗アレルギー、抗炎症又は筋萎縮阻害のいずれかの生理活性を有する、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
腫瘍に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物である、請求項６又は７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
非経口製剤の形態に剤形化されている、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
非経口製剤が注射剤である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
がん患者における抗腫瘍免疫療法用の医薬品を得るための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドの使用。
【請求項１２】
肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症、筋萎縮を治療又は予防するための医薬品を得るための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドの使用。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドを対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドを対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項１６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドのアミノ酸配列をコードし、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを細胞内で発現させることができるＤＮＡ。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫原性ペプチドと、免疫原性を高めるキャリアタンパク質との融合ペプチドのアミノ酸配列をコードし、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを細胞内で発現させることができるＤＮＡ。
【請求項１９】
請求項１７又は１８に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項２０】
抗がん活性、抗肥満、抗動脈硬化作用、抗アレルギー、抗炎症又は筋萎縮阻害のいずれかの生理活性を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
腫瘍に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物である、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
非経口製剤の形態に剤形化されている、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
非経口製剤が注射剤である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
がん患者における抗腫瘍免疫療法用の医薬品を得るための、請求項１７又は１８に記載のＤＮＡの使用。
【請求項２５】
肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症、筋萎縮を治療又は予防するための医薬品を得るための、請求項１７又は１８に記載のＤＮＡの使用。
【請求項２６】
請求項１７又は１８に記載のＤＮＡを対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
【請求項２７】
請求項１７又は１８に記載のＤＮＡを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
【請求項２８】
請求項１７又は１８に記載のＤＮＡを対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項２９】
請求項１７又は１８に記載のＤＮＡを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性ペプチドに関し、特にがんの治療又は予防に有用な免疫原性ペプチド、該免疫原性ペプチド又は該免疫原性ペプチドを細胞内で発現させることができるＤＮＡを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは国民の三分の一を死に至らしめる病であり、適切な治療手段の確立が強く求められている。血液のがんとして知られている白血病において、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）を用いた分化誘導療法やフィラデルフィア染色体を起因とするＢＣＲ／ＡＢＬタンパクに対する分子標的薬の導入により治療業績が改善しつつある。しかしながら、これらの薬剤に対して腫瘍が抵抗性を獲得し、治療が困難となるケースが非常に多く、未だ問題点が多い。従って、従来とは全く異なった作用機作を持つ抗がん剤を開発することは従来の抗がん剤が効奏しなくなった患者に新たな選択肢をもたらす。さらに、その用量規定毒性が異なったものであれば、従来の治療と組み合わせることが可能であり、より有効な治療戦略の立案が可能となる。
【０００３】
緑茶に含まれる主要なカテキンの一種である没食子酸エピガロカテキン（Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ（ＥＧＣＧ））は抗がん作用を持つことが報告されており（非特許文献１）、現在慢性リンパ性白血病患者において臨床試験が行われている（非特許文献２）。我々はこれまでにＥＧＣＧの抗がん作用を担う細胞膜上の標的分子として、６７ｋＤａラミニン・レセプタータンパク質（Ｌａｍｉｎｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，（６７ＬＲ））を同定した（非特許文献３〜６）。この６７ＬＲは当初、基底膜の主要な構成成分であるラミニンと結合する細胞膜タンパク質として発見された（非特許文献７）。近年の研究において、６７ＬＲはがん細胞において発現が異常に亢進しており（非特許文献８）、その発現と増殖、浸潤、転移の間に強い相関が認められている（非特許文献９〜１５）ことがわかった。
【０００４】
リンパ球においても、６７ＬＲは正常リンパ球にはほとんど発現せず、白血病細胞においてのみに高発現しているという報告が数多くなされている（非特許文献１６〜１７）。最近、ＥＧＣＧは６７ＬＲを介して選択的に白血病細胞のみを死滅させることが報告され（非特許文献１６〜１７）、ＥＧＣＧが６７ＬＲ陽性の白血病細胞に対する分子標的剤となりうることが示された。さらにＥＧＣＧはがん細胞に高発現した６７ＬＲを介してｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ｅＮＯＳ）／ｃｙｃｌｉｃ  ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）／ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ  δ（ＰＫＣδ）／ＡＳＭ（酸性スフィンゴミエリナーゼ）経路を活性化させることでがん細胞特異的な細胞致死を誘導することが報告された（非特許文献１８）。つまり、６７ＬＲががん細胞における新規のデスレセプターとして機能するとともに、ＥＧＣＧがそのアゴニストとして働くことによりがん細胞に致死作用を誘導することが明らかになった。しかしながら、ＥＧＣＧの体内吸収性ならびに血中安定性は低く、その応用は困難である。
【０００５】
我々は最近、ＥＧＣＧの６７ＬＲにおける結合部位として１６１−１７０番目のアミノ酸配列（ＥＳＭ：ＥＧＣＧ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆ）を見出している（非特許文献１９）。そこで本領域を含むペプチドを抗原とすることで、ＥＧＣＧと同様な抗がん作用を示す抗体を生体内で誘導するワクチンの作成を試み、発明に至った。
また、本発明者は６７ＬＲを活性化することによって抗がん活性を有する抗体を作製している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−６３２３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋｈａｎ  Ｎ，Ａｆａｑ  Ｆ，Ｓａｌｅｅｍ  Ｍ，Ａｈｍａｄ  Ｎ，Ｍｕｋｈｔａｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｂｙ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ（-）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓ，２００６；６６：２５００−２５０５．
【非特許文献２】Ｓｈａｎａｆｅｌｔ  ＴＤ，Ｃａｌｌ  ＴＧ，ａｎｄ  Ｚｅｎｔ  ＣＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｄａｉｌｙ  ｏｒａｌ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｎ  Ｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  Ｒａｉ  ｓｔａｇｅ  ０  ｔｏ  ＩＩ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ，２００９；２７：３８０８−３８１４．
【非特許文献３】Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｈ，Ｋｏｇａ  Ｋ，Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｙ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ．Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ  ＥＧＣＧ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２００４；１１：３８０−３８１．
【非特許文献４】Ｕｍｅｄａ  Ｄ，Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｈ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ．Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｓｔｒｅｓｓ  ｆｉｂｅｒｓａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｒｉｎｇ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｍｙｏｓｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ６７ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００５；３３３：６２８-６３５．
【非特許文献５】Ｕｍｅｄａ  Ｄ，  Ｙａｎｏ  Ｓ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｈ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ６７−ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｙｏｓｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ  ａｔ  ａ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｃａｃｏ−２  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００８；３７１：１７２-１７６．
【非特許文献６】Ｕｍｅｄａ  Ｄ，  Ｙａｎｏ  Ｓ，  Ｙａｍａｄａ  Ｋ，  Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｈ．  Ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ  ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−  ３−ｇａｌｌａｔｅ  （ＥＧＣＧ）  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ６７−ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２００８；２８３：３０５０−３０５８．
【非特許文献７】Ｎｅｌｓｏｎ  Ｊ，ＭｃＦｅｒｒａｎ  ＮＶ，Ｐｉｖａｔｏ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ６７ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｒｅｐ，２００８；２８：３３−４８．
【非特許文献８】Ｃｉｏｃｅ  Ｖ，Ｃａｓｔｒｏｎｏｖｏ  Ｖ，ａｎｄ  Ｓｈｍｏｏｋｌｅｒ  ＢＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，１９９１；８３：２９−３６．
【非特許文献９】Ｍｅｎａｒｄ  Ｓ，Ｃａｓｔｒｏｎｏｖｏ  Ｖ，Ｔａｇｌｉａｂｕｅ  Ｅ，Ｓｏｂｅｌ  ＭＥ．Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ６７ｋＤ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９７；６７：１５５−１６５．
【非特許文献１０】Ｍｅｎａｒｄ  Ｓ，Ｔａｑｌｉａｂｕｅ  Ｅ，Ｃｏｌｎａｇｈｉ  ＭＩ．Ｔｈｅ  ６７ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ，１９９８；５２：１３７−１４５．
【非特許文献１１】Ｖａｃｃａ  Ａ，Ｒｉｂａｔｔｉ  Ｄ，ａｎｄ  Ｒｏｎｃａｌｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ６７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９３；７２：４５５−４６１．
【非特許文献１２】Ｓａｎｊｕａｎ  Ｘ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＰＬ，ａｎｄ  Ｍｉｑｕｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ６７−ｋＤ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１９９６；１７９：３７６−３８０．
【非特許文献１３】Ｃｈｅｎ  ＦＸ，Ｑｉａｎ  ＹＲ，Ｄｕａｎ  ＹＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ６７ＬＲ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ，２００９；７９：４０２−４０８．
【非特許文献１４】Ｆｏｎｔａｎｉｎｉ  Ｇ，Ｖｉｇｎａｔｉ  Ｓ，ａｎｄ  Ｃｈｉｎｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．６７−Ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｗｏｒｓｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９７；３：２２７−２３１．
【非特許文献１５】Ｂａｓｏｌｏ  Ｆ，Ｐｏｌｌｉｎａ  Ｌ，ａｎｄ  Ｐａｃｉｎｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｒ  ６７，０００  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ａｎ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９６；２：１７７７−１７８０．
【非特許文献１６】Ｂｒｉｔｓｃｈｇｉ  Ａ，Ｓｉｍｏｎ  ＨＵ，Ｔｏｂｌｅｒ  Ａ，Ｆｅｙ  ＭＦ，Ｔｓｃｈａｎ  ＭＰ．Ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｄｅａｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ２．  Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，２０１０；１４９：５５−６４．
【非特許文献１７】Ｓｈａｍｍａｓ  ＭＡ，Ｎｅｒｉ  Ｐ，Ｋｏｌｅｙ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ（−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ  ｅｘｒａｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ：ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｌｏｏｄ，２００６；１０８：２８０４−２８１０．
【非特許文献１８】Ｋｕｍａｚｏｅ  Ｍ，Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ｋ，Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．６７−ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｃＧＭＰ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ．  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１３；１２３：７８９−７９９．
【非特許文献１９】Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｙ，Ｓｕｍｉｄａ  Ｍ，Ｓｕｇｉｈａｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ  ＥＧＣＧ  ｓｅｎｓｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｏｎ  ｔｈｅ  ６７−ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１２；７：ｅ３７９４２．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上のことから、６７ＬＲに特異的に結合し、６７ＬＲの作用を活性化し得る抗体は、がんの診断や治療に有用であることが期待される。しかしながら、抗体を医薬として用いるには、生体内での免疫反応を惹起するリスクが高く、また分子量が大きく、開発コスト及び量産コストが高価であるという問題がある。したがって、本発明は、生体内で安定な低分子量の抗がん作用を有する物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、６７ＬＲのＥＧＣＧとの結合部位である１６１−１７０番目のアミノ酸配列を用いることにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）下記の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチドであって、抗６７ＫＤａラミニン・レセプタータンパク質（以下、６７ＬＲと称する）抗体に対する特異的結合性及び抗６７ＬＲ抗体産生能を有することを特徴とする免疫原性ペプチド：（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチド；（ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＣＧ（エピカテキンガレート（ｅｐｉｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）、ＥＧＣＧ（エピガロカテキンガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）又はＥＧＣＧＭｅ（ＥＧＣＧのメチル化体であるエピガロカテキンメチルガレート（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ）への結合活性を有するペプチド；又は（ｃ）６７ｋＤａラミニン・レセプター（６７ＬＲ）のアミノ酸配列の一部において、
少なくともアミノ酸番号１６１〜１７０に由来する部分：Ａ１６１−Ａ１６２−Ａ１６３−Ａ１６４−Ａ１６５−Ａ１６６−Ａ１６７−Ａ１６８−Ａ１６９−Ａ１７０（配列中：
Ａ１６１は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６２は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６３は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６４は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６５は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６６は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６７は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６８は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１６９は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、リシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸であり；
Ａ１７０は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸である）を含み、さらにそれに隣接する１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されていてもよい部分を含んでいてもよいアミノ酸配列からなり；かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅへの結合活性を有するペプチド。
（２）配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチド；又は配列番号：１、配列番号：２、又は６７ＬＲのアミノ酸番号１６１〜１７０に由来するアミノ酸配列：Ａ１６１−Ａ１６２−Ａ１６３−Ａ１６４−Ａ１６５−Ａ１６６−Ａ１６７−Ａ１６８−Ａ１６９−Ａ１７０（配列中、Ａ１６１〜Ａ１７０は、（１）と同じ）からなり；かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅへの結合活性を有するペプチドである、（１）に記載の免疫原性ペプチド。
（３）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７又は配列番号：１８のアミノ酸配列からなるペプチドである、（１）又は（２）に記載の免疫原性ペプチド。
（４）（１）〜（３）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドと、免疫原性を高めるキャリアタンパク質との融合ペプチドであって、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチド。
（５）キャリアタンパク質がキーホールリンペットヘモシアニンである、（４）に記載の免疫原性ペプチド。
（６）（１）〜（３）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドを有効成分として含有する、医薬組成物。
（７）抗がん活性、抗肥満、抗動脈硬化作用、抗アレルギー、抗炎症又は筋萎縮阻害のいずれかの生理活性を有する、（６）に記載の医薬組成物。
（８）腫瘍に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物である、（６）又は（７）に記載の医薬組成物。
（９）非経口製剤の形態に剤形化されている、（６）〜（８）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（１０）非経口製剤が注射剤である、（９）に記載の医薬組成物。
（１１）がん患者における抗腫瘍免疫療法用の医薬品を得るための、（１）〜（５）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドの使用。
（１２）肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症、筋萎縮を治療又は予防するための医薬品を得るための、（１）〜（５）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドの使用。
（１３）（１）〜（５）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドを対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
（１４）（１）〜（５）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
（１５）（１）〜（５）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドを対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
（１６）（１）〜（５）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
（１７）（１）〜（３）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドのアミノ酸配列をコードし、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを細胞内で発現させることができるＤＮＡ。
（１８）（１）〜（３）のいずれか１に記載の免疫原性ペプチドと、免疫原性を高めるキャリアタンパク質との融合ペプチドのアミノ酸配列をコードし、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを細胞内で発現させることができるＤＮＡ。
（１９）（１７）又は（１８）に記載のＤＮＡを有効成分として含有する、医薬組成物。
（２０）抗がん活性、抗肥満、抗動脈硬化作用、抗アレルギー、抗炎症又は筋萎縮阻害のいずれかの生理活性を有する、（１９）に記載の医薬組成物。
（２１）腫瘍に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物である、（１９）又は（２０）に記載の医薬組成物。
（２２）非経口製剤の形態に剤形化されている、（１９）〜（２１）のいずれか１に記載の医薬組成物。
（２３）非経口製剤が注射剤である、（２２）に記載の医薬組成物。
（２４）がん患者における抗腫瘍免疫療法用の医薬品を得るための、（１７）又は（１８）に記載のＤＮＡの使用。
（２５）肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症、筋萎縮を治療又は予防するための医薬品を得るための、（１７）又は（１８）に記載のＤＮＡの使用。
（２６）（１７）又は（１８）に記載のＤＮＡを対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
（２７）（１７）又は（１８）に記載のＤＮＡを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法。
（２８）（１７）又は（１８）に記載のＤＮＡを対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
（２９）（１７）又は（１８）に記載のＤＮＡを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、生体内で安定な低分子量の抗がん作用を有する免疫原性ペプチドを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、各種抗原でマウスに免疫した結果を示す。図１のＡは、６７ＬＲ１６１−１７０ペプチドに対する反応性を見たものであり、図１のＢは、リコンビナント６７ＬＲに対する反応性を見たものである。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清では６７ＬＲ１６１−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇が確認されたが、ＫＬＨやｒ６７ＬＲを免疫したマウスの血清では６７ＬＲ１６１−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇は確認されなかった。
【図２】図２は、マウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１の腫瘍成長に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を示すグラフである。ＫＬＨ及びｒ６７ＬＲを免疫したマウスと比較して、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスでは腫瘍成長が顕著に阻害されることがわかった。
【図３】図３は、マウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１移植マウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を調べた結果を示す。ＫＬＨ及びｒ６７ＬＲを免疫したマウスと比較して、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスでは生存期間が顕著に延長したことがわかった。
【図４】図４は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（Ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）の活性化を調べた結果を示す。ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの腫瘍ではｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスではｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化が顕著に観察された。
【図５】図５は６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ｅＮＯＳｓｅｒ１１７７リン酸化）の活性化を調べた結果を示す。ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの腫瘍ではｅＮＯＳ  のＳｅｒ１１７７リン酸化は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０  ペプチド抗原を免疫したマウスではｅＮＯＳの  Ｓｅｒ１１７７リン酸化が顕著に観察された。
【図６】図６は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ＰＫＣδｓｅｒ６６２リン酸化）の活性化を調べた結果を示す。ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの腫瘍ではＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスではＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化が顕著に観察された。
【図７】図７は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（酸性スフィンゴミエリナーゼ活性化）の活性化を調べた結果を示す。ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスと比較して、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスでは腫瘍における酸性スフィンゴミエリナーゼの活性上昇が顕著であった。
【図８】図８は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫マウス血清の抗がん作用を調べた結果を示す。ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの血清には抗がん活性は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清には顕著な抗がん作用が観察された。
【図９】図９は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫マウス血清による６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路の活性化を調べた結果を示す。図９のＡはカスパーゼ断片化誘導作用の評価を行ったものであり、図９のＢはｅＮＯＳ  のＳｅｒ１１７７リン酸化誘導作用の評価を行ったものであり、図９のＣはＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化誘導作用の評価を行ったものであり、図９のＤは酸性スフィンゴミエリナーゼ活性誘導作用の評価を行ったものである。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清は、マウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に対しｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化を顕著に誘導し、ｅＮＯＳ  Ｓｅｒ１１７７リン酸化を顕著に誘導し、ＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化を顕著に誘導し、更に、酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を顕著に誘導することが明らかとなった。
【図１０】図１０は、マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２の移植腫瘍に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫により、乳がん細胞株の腫瘍成長阻害が認められた。
【図１１】図１１は、マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２を移植したマウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群ではマウスの生存期間が顕著に延長されたことが観察された。
【図１２】図１２は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍（ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２）における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（Ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）の活性化を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２の腫瘍において細胞致死作用を誘導することが示された。
【図１３】図１３は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍（ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２）における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ｅＮＯＳｓｅｒ１１７７リン酸化）の活性化を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞の腫瘍において６７ＬＲ依存的ながん細胞致死経路を活性化することが明らかになった。
【図１４】図１４は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍（ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２）における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ＰＫＣδｓｅｒ６６２リン酸化）の活性化を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞の腫瘍において６７ＬＲ依存的ながん細胞致死経路を活性化することが示された。
【図１５】図１５は、マウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５の移植腫瘍に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群では、多発性骨髄腫の腫瘍成長が顕著に阻害されることが示された。
【図１６】図１６は、マウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５を移植したマウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群ではマウスの生存期間が顕著に延長されたことが観察された。
【図１７】図１７は、マウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５の移植腫瘍におけるがん幹細胞のマーカーであるとともにがん幹細胞の機能維持に重要な役割を果たすタンパク質であるＣＤ４４の発現に対する効果を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群の腫瘍組織におけるＣＤ４４の発現量の低下が観察された。
【図１８】図１８は、マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２の移植腫瘍に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫により、乳がん細胞株の腫瘍成長阻害が認められた。黒三角はＫＬＨ免疫群、黒丸は６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫群を表している。
【図１９】図１９は、マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２を移植したマウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群ではマウスの生存期間が顕著に延長されたことが観察された。
【図２０】図２０は、各種抗原でマウスに免疫した結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清では６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇が確認されたが、ＫＬＨを免疫したマウスの血清では６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇は確認されなかった。
【図２１】図２１は、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫マウス血清による６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路の活性化を調べた結果を示す。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清は、多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対しＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２のリン酸化を顕著に誘導することが明らかとなった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者は、既にＥＧＣＧの６７ＬＲにおける結合部位が１６１−１７０番目のアミノ酸配列（ＥＳＭ：ＥＧＣＧ  Ｓｅｎｓｉｎｇ  Ｍｏｔｉｆ）であることを見出している。そこで、本発明者は、この領域を含む抗原を用いてＥＧＣＧと同様な抗がん作用を示す抗体を生体内で誘導するワクチンの作成を試み、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のペプチドであって、抗６７ＬＲ抗体に対する特異的結合性及び抗６７ＬＲ抗体産生能を有することを特徴とする免疫原性ペプチドである。本明細書において、抗６７ＬＲ抗体は、当該技術分野において通常の用語として使用され、６７ＬＲを認識する（６７ＬＲと結合する）特異抗体として定義される。抗６７ＬＲ抗体としてはモノクローナル抗体であってもよい。
【００１３】
抗６７ＬＲ抗体に対する特異的結合性を有するとは、抗６７ＬＲ抗体が６７ＬＲの１６１−１７０番目のアミノ酸配列と結合するが、６７ＬＲの他の部位とは結合しないか、その結合の強度が弱いことが好ましい。また抗６７ＬＲ抗体産生能を有するとは、該ペプチドもしくはそのペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、必要に応じて他のタンパク質等と組み合わせて哺乳動物に投与したときに、該ペプチドに対する抗体産生を誘導する能力を有することを意味する。
【００１４】
本発明の免疫原性ペプチドは、以下の態様を包含する。（ａ）配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチド；（ｂ）配列番号：３（ＩＰＣＮＮＫＧＡＨＳ）のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅ（好ましくはＥＧＣＧ）への結合活性を有するペプチド；又は
（ｃ）６７ｋＤａラミニン・レセプター（６７ＬＲ）のアミノ酸配列の一部において、
少なくともアミノ酸番号１６１〜１７０に由来する部分：Ａ１６１−Ａ１６２−Ａ１６３−Ａ１６４−Ａ１６５−Ａ１６６−Ａ１６７−Ａ１６８−Ａ１６９−Ａ１７０（配列中：
Ａ１６１は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはイソロイシンであり；
Ａ１６２は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはプロリンであり；
Ａ１６３は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはシステインであり；
Ａ１６４は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはアスパラギンであり；
Ａ１６５は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはアスパラギンであり；
Ａ１６６は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはリシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはリシンであり；
Ａ１６７は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはグリシンであり；
Ａ１６８は、非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはアラニンであり；
Ａ１６９は、正電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはリシン、アルギニン、及びヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはヒスチジンであり；
Ａ１７０は、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸であり、好ましくはセリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選択されるアミノ酸であり、より好ましくはセリンである）を含み、さらにそれに隣接する１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されていてもよい部分を含んでいてもよいアミノ酸配列からなり；かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅ（好ましくはＥＧＣＧ）への結合活性を有するペプチド。
【００１５】
本明細書において、ペプチドに関して「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、そのアミノ酸配列からなるペプチドが所望の機能を有する限り特に限定されないが、例えば１〜９個、又は１〜４個程度である。性質（電荷及び／又は極性）の似たアミノ酸への置換等であれば、多数のアミノ酸が置換されていても、所望の機能を消失しないであろう。
【００１６】
アミノ酸の置換等は、抗６７ＬＲ抗体に対する特異的結合性及び抗６７ＬＲ抗体産生能に変化をもたらさないような置換等、例えば、電荷及び／又は極性の似たアミノ酸への置換であってもよい。このような置換には、例えば、生理的ｐＨ（７．０）付近で側鎖（Ｒ基と表現されることもある。）が非極性の脂肪族側鎖を有するアミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びプロリン等）どうしの置換、極性の非電荷型側鎖を有するアミノ酸（セリン、トレオニン、システイン、メチオニン、アスパラギン及びグルタミン等）どうしの置換、生理的ｐＨ付近で側鎖が正電荷を有するアミノ酸（リシン、アルギニン、及びヒスチジン等）どうしの置換、極性アミノ酸どうしの置換、非極性アミノ酸どうしの置換がある。
このような観点から、上述の免疫原性ペプチドに１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加を導入することにより、さらなる改変体を設計することができ、このような改変体も、本発明の範囲に含まれる。
【００１７】
本発明者の検討では、６７ｋＤａラミニン・レセプターのアミノ酸番号１６１〜１７０の部分の配列を有するペプチド又はその一部（配列番号：３及び４〜１７）について、ＭＳ分析においてＥＧＣＧとの結合を示すピークが観察された。このような結果から、アミノ酸番号１６６のＫが結合に重要であると考えられる。また、アミノ酸番号１６１〜１７０の部分の配列を有するペプチドにおいて、１６６番目のＫを、同じ塩基性アミノ酸であるＲ又はＨに置換したペプチド（配列番号：１６及び１７）については、同様に、ＥＧＣＧとの結合ピークが観察された。さらに、タンパク質を構成する主要な２０種のアミノ酸それぞれに対してＥＧＣＧとの結合性を検討すると、やはり塩基性アミノ酸であるＫ，Ｈ，Ｒにのみ結合ピークが観察された。一方で、ＭＳ分析で結合ピークが観察されることは、必ずしも高い結合活性を有することを意味するものではない。したがって、ＥＧＣＧにペプチドが結合するためには、ペプチド中の塩基性アミノ酸の存在がまず重要であり、またそれ以外のアミノ酸の存在は、ペプチドに高い結合活性又は特異性等をもたらすために重要であると考えられる。
【００１８】
本発明の免疫原性ペプチドとしては、例えば、配列番号：３、配列番号：４（ＩＰＣＮＮＫＧＡＨ）、配列番号：５（ＰＣＮＮＫＧＡＨＳ）、配列番号：６（ＩＰＣＮＮＫＧＡ）、配列番号：７（ＩＰＣＮＮＫＧ）、配列番号：８（ＩＰＣＮＮＫ）、配列番号：９（ＰＣＮＮＫ）、配列番号：１０（ＣＮＮＫ）、配列番号：１１（ＧＡＨＳ）、配列番号：１２（ＫＧＡＨＳ）、配列番号：１３（ＮＫＧＡＨＳ）、配列番号：１４（ＮＮＫＧＡＨＳ）、配列番号：１５（ＣＮＮＫＧＡＨＳ）、配列番号：１６（ＩＰＣＮＮＲＧＡＨＳ）、配列番号：１７（ＩＰＣＮＮＨＧＡＨＳ）若しくは配列番号：１８（ＤＩＡＩＰＣＮＮＫＧＡＨＳ）のアミノ酸配列からなるペプチド、又はアミノ酸配列：Ａ１６４−Ａ１６５−Ａ１６６（配列中、Ａ１６４は、アスパラギンであり；Ａ１６５は、アスパラギンであり；Ａ１６６は、リシンである）。
【００１９】
本発明の免疫原性ペプチドは、６７ＬＲタンパク質と比較して、極めて短いペプチド鎖から構成される。６７ＬＲタンパク質の調製は、量的にも質的にも非常に困難であるのに対し、本発明の免疫原性ペプチドは、化学合成することができ、大量にかつ純度の高いものを容易に調製できるという利点を有する。
【００２０】
本発明の免疫原性ペプチドの好ましい例としては、配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチド；又は配列番号：１、配列番号：２、又は６７ＬＲのアミノ酸番号１６１〜１７０に由来するアミノ酸配列：Ａ１６１−Ａ１６２−Ａ１６３−Ａ１６４−Ａ１６５−Ａ１６６−Ａ１６７−Ａ１６８−Ａ１６９−Ａ１７０（配列中、Ａ１６１〜Ａ１７０は、上記のとおりである）からなり；かつＥＣＧ、ＥＧＣＧ又はＥＧＣＧＭｅ（好ましくはＥＧＣＧ）への結合活性を有するペプチドが挙げられる。
【００２１】
また、本発明の免疫原性ペプチドの好ましい例としては、配列番号：１（ＤＳＰＬＲＹＶＤＩＡＩＰＣＮＮＫＧＡＨＳ）、配列番号：２（ＩＰＣＮＮＫＧＡＨＳＶＧＬＭＷＷＬＡＲ）、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７又は配列番号：１８のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
このようなペプチドは、当業者であれば、従来より公知の方法を用いて、容易に製造することができる。このような方法としては、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が挙げられる。
【００２２】
本発明の免疫原性ペプチドは、抗６７ＬＲ抗体産生能を有するものであり、これは、免疫原性を高めた形態、例えば、免疫原性を高めるキャリアタンパク質との融合ペプチド形態であってもよい。キャリアタンパク質としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）等が使用される。キャリア蛋白質との融合ペプチドの製造には、例えば、カルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、ＭＢＳ（マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド）法を使用することができる。
【００２３】
本発明の免疫原性ペプチドは、後述する医薬組成物を製造するために用いることができる。特に、本発明の免疫原性ペプチドは、抗腫瘍免疫療法用の医薬品を得るために用いることができる。
【００２４】
次に、本発明のＤＮＡについて説明する。
本発明のＤＮＡは、上述した本発明の免疫原性ペプチドのアミノ酸配列をコードし、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを細胞内で発現させることができるものである。また、本発明のＤＮＡは、上述した本発明の免疫原性ペプチドと、免疫原性を高めるキャリアタンパク質との融合ペプチドのアミノ酸配列をコードし、抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを細胞内で発現させることができるものである。当業者であれば、ペプチドのアミノ酸配列から、このようなＤＮＡを容易に導き出すことができる。
本発明のＤＮＡとしては、上記ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、上記免疫原性ペプチド、又は上記免疫原性ペプチドと免疫原性を高めるキャリアタンパク質との融合ペプチドを細胞内で発現し得るものも含まれる。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が６０％以上、好ましくは８０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃での条件をいう。
【００２５】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。
本発明の医薬組成物は、本発明の免疫原性ペプチドを有効成分として含有する。
また、本発明の医薬組成物は、本発明のＤＮＡを有効成分として含有する。
本発明の医薬組成物は、６７ＬＲが関与する各種疾患を治療することができる。
６７ＬＲが関与する疾患としては、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症および筋萎縮が挙げられる。特に、本発明の免疫原性ペプチドはがん細胞へのアポトーシスを誘導する作用を有するので、がんの治療又は予防に用いられる。がんとしては、乳がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、胆管がん、結腸がん、子宮頸がんやこれらがんと同様に６７ＬＲを高発現している中皮腫が挙げられる。
【００２６】
本発明の免疫原性ペプチドは、特に、ＥＧＣＧが６７ＬＲを介して抗がん作用を発揮するメラノーマ細胞株Ｂ１６細胞、急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ６０、膵臓がん細胞株ＰＡＮＣ−１、中皮腫細胞株ＭＲＳＯ−４に対して抗がん作用を発揮する。また、ＥＧＣＧは、がん細胞に対して酸性スフィンゴミエリナーゼを活性化させ抗がん活性を示すが、本発明の免疫原性ペプチドはＥＧＣＧ同様にがん細胞に対して酸性スフィンゴミエリナーゼを活性化する。また、後述する実施例により、本発明の免疫原性ペプチドは、がん細胞に対して６７ＬＲ依存的ながん細胞致死経路の活性化マーカーであるプロテインキナーゼＣδ（ＰＫＣδ）のＳｅｒ６６２リン酸化、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）のＳｅｒ１１７７リン酸化活性を誘導することがわかった。このことより、本発明の免疫原性ペプチド、又は免疫原性ペプチドを含有する医薬組成物が、ＥＧＣＧと同様に腫瘍に対して６７ＬＲ依存的ながん細胞致死を誘導することが明らかになった。
【００２７】
本発明の医薬組成物は、ＥＧＣＧが６７ＬＲを介して抗がん作用を発揮するがん種である乳がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、胆管がん、結腸がん、子宮頸がんやこれらがんと同様に６７ＬＲを高発現している中皮腫の治療及び予防に有効である。このように、本発明の医薬組成物は抗腫瘍ワクチンとして用いることができる。
また、本発明の免疫原性ペプチドは、上述したような、６７ＬＲを高発現しているがんの免疫応答を誘導するのに適している。
また、本発明のＤＮＡを含有する医薬組成物は、対象に投与された場合、対象の体内で抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを発現するので、上述の免疫原性ペプチドを含む医薬組成物と同様の作用を有する。
【００２８】
本発明の医薬組成物に含まれる免疫原性ペプチドは、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。薬学的に許容される塩の例としては、アルカリ金属（リチウム、カリウム、ナトリウムなど）との塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウムなど）との塩、有機塩基（メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミンなど）との塩、有機酸（ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩、及び無機酸（塩酸、リン酸、酢酸、硫酸、臭化水素酸など）との塩が挙げられる。好ましい例としては、例えば、酢酸との塩及び塩酸との塩が挙げられる。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、上述のように本発明の免疫原性ペプチド、又は本発明のＤＮＡを含有するが、その他、ＰＤＥ３阻害剤、ＰＤＥ５阻害剤、スフィンゴシンキナーゼ阻害剤、またはゲムシタビンを更に含んでもよい。ＰＤＥ３阻害剤としては、例えば、トレキンシン、シロスタゾール（６‐［４‐（１‐シクロヘキシル‐１Ｈ‐テトラゾール‐５‐イル）ブトキシ］‐３，４‐ジヒドロ‐２（１Ｈ）‐キノロン、または、６‐［４‐（１‐シクロヘキシル‐１Ｈ‐テトラゾール‐５‐イル）ブトキシ］‐３，４‐ジヒドロ‐２（１Ｈ）‐キノリノン）等が挙げられる。を用いてもよい。ＰＤＥ５阻害剤としては、例えば、シルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ウデナフィル等が挙げられる。スフィンゴシンキナーゼ阻害剤としては、例えば、サフィンゴール（Ｌ−スレオ−ジヒドロスフィンゴシン）、Ｎ，Ｎ−ジメチルスフィンゴシン、トリメチルスフィンゴシンおよびスフィンゴシンのアナログおよび誘導体、例えば、ジヒドロスフィンゴシン、およびミリオシンが挙げられる。
【００３０】
本発明の医薬は、通常は薬理学的に許容される１種以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野において周知の任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、又は口腔内、鼻腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内、腹腔内及び静脈内等の非経口投与をあげることができ、抗体又はペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
【００３１】
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等があげられる。乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【００３２】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等に剤形化したものがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、または両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。また、噴霧剤は該抗体又はペプチドそのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【００３３】
本発明の医薬組成物の投与量又は投与回数等は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常１回につき体重１ｋｇあたり有効成分が０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲で選択することが可能である。または、例えば、ヒト患者に投与する場合、患者あたり活性成分が０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ・ｂｏｄｙ・ｗｅｉｇｈｔの範囲を選択することができ、１回当たり投与量としては、例えば、本発明の免疫原性ペプチドが０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ・ｂｏｄｙ・ｗｅｉｇｈｔ程度の量が含まれることが好ましい。しかしながら、本発明の医薬組成物の投与量は上記範囲に制限されるものではない。また、本発明の医薬組成物中の免疫原性ペプチドの含有量については特に制限はないが、投与量が上記範囲となるように調整すればよい。
【００３４】
ＥＧＣＧをドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の担体とすることで、６７ＬＲを標的としてがん特異的に薬剤を集積させることが可能であることが報告されている（Ｓｈｕｋｌａ  Ｒ．，Ｃｈａｎｄａ  Ｎ．，Ｚａｍｂｒｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｇｏｌｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ（１９８ＡｕＮＰ−ＥＧＣｇ）ｓｈｏｗ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，２０１２；１０９：１２４２６−１２４３１）。本発明の免疫原性ペプチドは、免疫応答を誘導して抗６７ＬＲ抗体を産生する能力を有し、産生された抗６７ＬＲ抗体が６７ＬＲに特異的に結合することから、本発明の医薬組成物は、乳がん、胃がん、膵臓がん、前立腺がん、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、胆管がん、結腸癌、子宮頸がん、中皮腫といった６７ＬＲを高発現するがんの治療及び予防に用いることができる。
【００３５】
ＥＧＣＧはがん細胞に直接働きかけて抗がん作用を発揮するだけでなく、６７ＬＲを介して腫瘍免疫を賦活させて抗がん作用を発現することが知られている（Ｓａｎｔｉｌｌｉ
Ｇ，Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋａ  Ｉ，Ｃａｎｔｉｌｅｎａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ  Ｅ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｂｙ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１３；１９：１１１６−１１２５．）。したがって、本発明の免疫原性ペプチドは、抗６７ＬＲ抗体産生能を有することから、ＥＧＣＧと同様に腫瘍免疫を活性化することで幅広いがんに抗がん作用を示す腫瘍免疫活性化剤としての応用が期待できる。すなわち、本発明の医薬組成物は、腫瘍に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物、腫瘍免疫活性化剤としての応用が期待できる。
本発明の免疫原性ペプチドはＥＧＣＧのアポトーシス誘導に直接関与する酸性スフィンゴミエリナーゼを活性化することから、アポトーシス誘導活性を有すると考えられる。従って、本発明の医薬組成物はがん細胞にアポトーシスを誘導し得る。
【００３６】
ＥＧＣＧ  は抗がん作用のみならず６７ＬＲを介して炎症反応阻害（抗炎症）作用（Ｂｙｕｎ  Ｈ，Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｙ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．ＴＬＲ４  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ  ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−ｇａｌｌａｔｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ６７−ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１０；１８５：３３−４５．）、抗アレルギー作用（Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｙ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｈ，Ａ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ６７ｋＤａ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ  ｏｎ  ＦｃｅｐｓｉｌｏｎＲＩ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，２００５；３３６：６７４−６８１）、動脈硬化・血栓予防作用（Ｈｏｌｙ  ＥＷ，Ｓｔaｍｐｆｌｉ  ＳＦ，Ａｋｈｍｅｄｏｖ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１０；４８：１１３８−４５）、筋萎縮抑制（阻害）作用（Ｄｏｒｃｈｉｅｓ  ＯＭ，Ｗａｇｎｅｒ  Ｓ，Ｂｕｅｔｌｅｒ  ＴＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｂａｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ６７ＬＲ，ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  （−）−ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ，Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ．２００９；３５：２７９−９４．）等の生理活性を示すことが知られていることから、６７ＬＲ分子上のＥＧＣＧ結合部位に結合することでＥＧＣＧと同様の活性を示す本発明の医薬組成物は、抗アレルギー剤、抗動脈硬化・血栓予防剤、筋萎縮抑制剤としての利用が期待できる。また、脂肪細胞においてＥＧＣＧは６７ＬＲを介してインスリンによって引き起こされるグルコースの取り込みを阻害すること（Ｈｓｉｅｈ  ＣＦ，Ｔｓｕｅｉ  ＹＷ，Ｌｉｕ  ＣＷ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ６７−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｌａｍｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．２０１０；７６：１６９４−８．）、脂肪細胞の肥大化誘導因子であるヒスタミンの遊離を、６７ＬＲを介して阻害すること（Ｆｕｊｉｍｕｒａ  Ｙ，  Ｕｍｅｄａ  Ｄ，Ｋｉｙｏｈａｒａ  Ｙ，Ｓｕｎａｄａ  Ｙ，Ｙａｍａｄａ  Ｋ，Ｔａｃｈｉｂａｎａ  Ｈ．Ｔｈｅ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ６７ｋＤａ  ｌａｍｉ���ｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ−３−Ｏ−ｇａｌｌａｔｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００６；３４８：５２４−３１．）が知られていることから、本発明の医薬組成物は、抗肥満薬としての利用が期待できる。
【００３７】
上述したように、本発明の免疫原性ペプチドは、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮の治療に有用である。したがって、本発明は、本発明の免疫原性ペプチド、又は該免疫原性ペプチドを含む医薬組成物を対象（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物及び非哺乳動物）に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法を提供する。
また、本発明のＤＮＡは、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮の治療に有用である。したがって、本発明は、本発明のＤＮＡ、又は該ＤＮＡを含有する医薬組成物を対象（例えば、ヒト、非ヒト哺乳動物及び非哺乳動物）に投与することを含む、がん、肥満、動脈硬化、アレルギー、炎症又は筋萎縮を治療する方法を提供する。
また、本明のＤＮＡ、又はＤＮＡを含有する医薬組成物は、対象に投与された場合、対象の体内で抗６７ＬＲ抗体産生能を有する免疫原性ペプチドを発現するので、上述のペプチド、及び免疫原性ペプチドを含有する医薬組成物と同様の作用を有する。
したがって、本発明は、本発明のＤＮＡ、又は該ＤＮＡを含有するＤＮＡを含有する医薬組成物を対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
［製造例１］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の作製
ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ  は和光純薬工業株式会社より購入した。ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ；ＭＢＳ）はＰＩＥＲＣＥ社より、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は  Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した。ＮａＨ２ＰＯ４  及び  Ｎａ２ＨＰＯ４  は和光純薬工業株式会社より購入した。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド（配列ＤＩＡＩＰＣＮＮＫＧＡＨＳ、配列番号：１８）の合成はＧｒｅｉｎｅｒ（独国）に委託した。
【００３９】
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドをＫＬＨに結合させたもの（６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を免疫原とした。即ち、２０ｍｇのＫＬＨを１ｍＬの１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）に溶解し、この溶液に１１μＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した３．３  ｍｇのＭＢＳを加え、室温で３０分間反応させた。透析を行い、ＫＬＨ−ＭＢと遊離のＭＢＳを分離した。６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド１ｍｇを滅菌超純水５００μＬに溶解しＫＬＨ−ＭＢ  １００μＬを混合し、滅菌した０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４溶液にてｐＨを７．３〜７．５に調製した。この混合液に窒素ガスを吹きかけ、室温で３時間振とうして反応させた。その後、反応液を４℃で約１６時間、透析し、−２０℃で凍結保存した。
【００４０】
［製造例２］
リコンビナント６７ＬＲ（ｒ６７ＬＲ）の作製
カナマイシンは和光純薬工業株式会社より、ＩＰＴＧはフナコシ株式会社より、イミダゾールはナカライテスク株式会社より、ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ  カラムは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（英国）より購入した。ＬＢ液体培地は、Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＢＤ，ＵＳＡ）１０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＤ，ＵＳＡ）５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌを超純水に溶解して作製した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）は、ＮａＣｌ  ８．０ｇ／Ｌ、ＫＣｌ  ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．１５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２ｇ／Ｌを超純水に溶解して作製した。ＫＬＨ−ＭＢ−６７ＬＲ１５８−１７０の比較対照として、以下の手順でリコンビナント６７ＬＲ（ｒ−ｈＬＲ１−２９５）を作製した。大腸菌（ｐＥＴ３０ａ−ｈＬＲ１−２９５導入ＢＬ２１）をカナマイシン（終濃度：５０μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ液体培地１８ｍＬに１本播種し、３７℃で一晩振とう培養した。培養後、菌体培養液を２５０ｍＬ  ＬＢ液体培地２本に添加し、３７℃にて振とう培養した。その後、ＩＰＴＧ（終濃度：１ｍＭ）を添加し、３７℃、２２時間振とう培養してＴ７プロモーターを誘導し、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＬＲ１−２９５を発現させた。大腸菌を５０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によってペレットとし、ＰＢＳで洗浄後、得られたペレットを−２０℃にて凍結保存した。凍結保存していたペレットを破砕バッファー（ｐＨ８．０  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ／ＮａＣｌ）に懸濁後、超音波破砕した。その後、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上清を回収し、サンプルとした。ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰカラム（５ｍＬ）に供した。
【００４１】
［実施例１］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドならびにｒ６７ＬＲを免疫したマウス血清の免疫抗原に対する反応性
ＥＬＩＳＡプレートの洗浄には、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ナカライテスク株式会社）を添加したＰＢＳ（ＴＰＢＳ）を用いた。固相抗原希釈溶液は、ＮａＨＣＯ３（ナカライテスク株式会社）を超純水で４．２ｇ／Ｌに調製した５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３に、Ｎａ２ＣＯ３（ナカライテスク株式会社）を超純水で２．６５ｇ／５００ｍＬに調製した５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３を、ｐＨ９．６になるまで混合した５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いた。発色基質は使用直前に０．００６％  Ｈ２Ｏ２添加０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）：超純水：６ｍｇ／ｍＬ  ２，２−アニゾ−ビス（３’エチルベンゾニン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）溶液＝１０：９：１で混合して用いた。ＥＬＩＳＡ  用プレートには、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｐｌａｔｅ  を  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）より購入、使用した。また、吸光度の測定には東ソー株式会社のＩｍｍｕｎｏ  Ｍｉｎｉ  ＮＪ−２３００を使用した。
【００４２】
６７ＬＲ１６１−１７０ペプチド（配列番号：３）（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１０μｇ／ｍＬになるように５０ｍＭ炭酸緩衝液で希釈し、Ｉｍｍｕｎｏ  ｐｌａｔｅの各穴に１００μＬずつ添加した後、３７℃で２時間インキュベートを行った。その後、ＴＰＢＳで洗浄し、ブロッキング剤として１％  ＢＳＡ−ＴＰＢＳを各穴に３００μＬずつ添加した後、４℃で一晩放置した。ＴＰＢＳで洗浄後、追加免疫後に回収したマウス血清（１％  ＢＳＡ−ＴＰＢＳで５００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＴＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ
ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）（１００００倍希釈）を１００μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＴＰＢＳで洗浄後、発色基質溶液を１００μＬずつ添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４３】
６７ＬＲ1５８−１７０ペプチド抗原免疫後のマウス血清における６７ＬＲ１６１−１７０ペプチドに対する抗体価について評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに初回免疫を行い、その２週間後に追加免疫を行った。２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。抗体価の評価をＥＬＩＳＡ法により行った。図１に示すように、６７ＬＲ1５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清では６７ＬＲ１６１−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇が確認されたが、ＫＬＨやｒ６７ＬＲを免疫したマウスの血清では６７ＬＲ１６１−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇は確認されなかった（図１）。
【００４４】
［実施例２］
マウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１の腫瘍成長に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスに初回免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。初回免疫は、各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧ（ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ、配列番号１９）を５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射した。ＣｐＧの合成は  Ｇｅｎｅｎｅｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ（Ｆｕｋｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）に委託した。２回目以降の免疫はフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を用い、同様の方法で免疫を行った。
【００４５】
尾採血２日後に、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１をイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に０．７５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬを皮下注射し、移植した。腫瘍の形成を確認後、２日おきに腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍体積は次の式にて算出した。
腫瘍体積（ｍｍ３）＝（短径）２×長径×０．５
結果を図２に示す。図２から明らかなように、ＫＬＨ及びｒ６７ＬＲを免疫したマウスと比較して、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスでは腫瘍成長が顕著に阻害されていた。
【００４６】
［実施例３］
マウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１移植マウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスに初回免疫を行い、その２週間後に追加免疫を行った。２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。初回免疫は、各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射した。２回目以降の免疫はフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を用い、同様の方法で免疫を行った。
【００４７】
尾採血２日後に、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１をイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に０．７５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬを皮下注射し、移植した。その後、各種抗原投与群について、生存期間を調べた。結果を図３に示す。図３から明らかなように、ＫＬＨ及びｒ６７ＬＲを免疫したマウスと比較して、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスでは生存期間が顕著に延長した。
なお、倫理的観点より、腫瘍体積が４０００ｍｍ３を超えたものからイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で心臓採血により屠殺した。
【００４８】
［実施例４］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（Ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）の活性化
がん細胞致死の指標となるｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫による作用を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２日後に、ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１を１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるようマウスの右背面部に皮下注射し、移植を行った。腫瘍生着後、腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、２．５％  ＢＳＡ  ＴＴＢＳを添加し３０分間ブロッキングした後、４００倍希釈したａｎｔｉ−Ｃｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ社）を添加し３時間静置した。その後３００倍希釈した
ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｇｏａｔ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ
Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加後室温で１時間静置した。５００００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に１０分間浸漬させ、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）ｘ４０にて画像の取得を行い、ｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化の評価を行った。
図４に結果を示す。図４から明らかなように、ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの腫瘍ではｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスではｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化が顕著に観察された。図４の結果から、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は腫瘍において細胞致死作用を誘導することが示された。
【００４９】
［実施例５］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ｅＮＯＳｓｅｒ１１７７リン酸化）の活性化
ＥＧＣＧの６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導活性の指標となるｅＮＯＳ  Ｓｅｒ１１７７リン酸化に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫による作用を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２日後にマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１を１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるようにＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したものを右背部に皮下注射することで移植した。腫瘍生着後、腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、２．５％  ＢＳＡ  ＴＴＢＳを添加し３０分間ブロッキングした後、２００倍希釈したＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ１１７７）ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ社）を添加し６時間静置した。その後、４００倍希釈した  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ｇｏａｔ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加後室温で１時間静置した。５００００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に１０分間浸漬させ、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）ｘ４０にて画像の取得を行い、ｅＮＯＳ  Ｓｅｒ１１７７リン酸化レベルを測定した。
【００５０】
結果を図５に示す。図５に示すように、ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの腫瘍ではｅＮＯＳのＳｅｒ１１７７リン酸化は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０  ペプチド抗原を免疫したマウスではｅＮＯＳのＳｅｒ１１７７リン酸化が顕著に観察された。この結果より、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は腫瘍において６７ＬＲ依存的ながん細胞致死経路を活性化することが示された。
【００５１】
［実施例６］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ＰＫＣδｓｅｒ６６２リン酸化）の活性化
ＥＧＣＧの６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導機構活性の指標となるＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫による作用を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２日後にマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１を１．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるようにＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したものを２００μＬ右背部に皮下注射することで移植した。腫瘍生着後、腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、２．５％  ＢＳＡ  ＴＴＢＳを添加し３０分間ブロッキングした後、４００倍希釈したＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＰＫＣδ（Ｓｅｒ６６２）ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ社）を添加し３時間静置した。その後３００倍希釈したａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｇｏａｔ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加後室温で１時間静置した。５００００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に１０分間浸漬させ、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）ｘ４０にて画像の取得を行い、ＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化レベルを測定した。
【００５２】
結果を図６に示す。図６から明らかなように、ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの腫瘍ではＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスではＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２  リン酸化が顕著に観察された。このことより、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は腫瘍において６７ＬＲ依存的ながん細胞致死経路を活性化することが示された。
【００５３】
［実施例７］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（酸性スフィンゴミエリナーゼ活性化）の活性化
ＥＧＣＧの６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導活性を担う酸性スフィンゴミエリナーゼの活性化に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の作用を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，ｒ６７ＬＲ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２日後にマウス形質細胞腫細胞株  ＭＰＣ−１１を１．０ｘ１０６  ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるようにＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁したものを２００μＬ右背部に、皮下注射移植した。腫瘍生着後、腫瘍を摘出し、ライゼートにした後、遠心し、上清をチューブに２０μＬ分注した。基質混合液（ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２−ＳＭ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）２μＬ、１０％Ｔｒｉｔｏｎ  １０μＬ、１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｐＨ４．５、２０μＬ、ｄＨ２Ｏ  ７８μＬ）を８μＬ添加し、８時間、３７℃にてインキュベートした。さらに、停止液（クロロホルム  ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝２：１）を６０μＬ添加し、あらかじめ乾燥器にて活性化させたＴＬＣプレートに１０μＬずつスポットし、展開溶媒（ｄＨ２Ｏ：ＭｅＯＨ：クロロホルム  ＣＨＣｌ３＝８：３５：６０）にて展開した。ＴＬＣ法にて酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を測定した。
【００５４】
結果を図７に示す。図７から明らかなように、ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスと比較して、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウスでは腫瘍における酸性スフィンゴミエリナーゼの活性上昇が顕著であった。以上のことから、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫はＥＧＣＧと同様に、腫瘍に対して６７ＬＲ依存的ながん細胞致死を誘導することが明らかとなった。
【００５５】
［実施例８］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫マウス血清の抗がん作用
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清の抗がん作用の評価を行った。
屠殺後に回収した血清を１％牛胎児血清（ＦＣＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で２５倍希釈した溶液で５．０ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるよう懸濁したマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１を９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに播種し、９６時間培養した。その後、ＡＴＰｌｉｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ，ＭＡ，ＵＳＡ）により生細胞を検出した。
結果を図８に示す。図８から明らかなように、ＫＬＨ又はｒ６７ＬＲを免疫したマウスの血清には抗がん活性は観察されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清には顕著な抗がん作用が観察された。
【００５６】
［実施例９］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫マウス血清による６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路の活性化
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清のｃａｓｐａｓｅ  ３断片化誘導作用の評価を行った。５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に２５倍希釈となるよう血清を添加し７２時間インキュベート後、細胞溶解液を調製した。１次抗体として３０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ−３  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＣＳＴ社）およびａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いてカスパーゼ３の断片化をウエスタンブロットにて評価を行った。
結果を図９Ａ）に示す。図９Ａ）から明らかなように、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清はマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に対しｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化を顕著に誘導することが観察された。
【００５７】
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清の６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路活性化作用の評価を行った。１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に２５倍希釈となるよう血清を添加し１時間インキュベート後、細胞溶解液を調製した。１次抗体として３０００倍希釈したＡｎｔｉ−ｅＮＯＳ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）およびＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ１１７７）ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ社）を用いてｅＮＯＳｓｅｒ１１７７のリン酸化レベルをウエスタンブロットにて評価を行った。
結果を図９Ｂ）に示す。図９Ｂ）から明らかなように、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清はマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に対しｅＮＯＳ  Ｓｅｒ１１７７リン酸化を顕著に誘導することが観察された。
【００５８】
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清の６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路活性化作用の評価を行った。１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に２５倍希釈となるよう血清を添加し３時間インキュベート後、細胞溶解液を調製した。１次抗体として３０００倍希釈したＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＰＫＣδ（Ｓｅｒ６６２）ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ社）およびＡｎｔｉ−ＰＫＣδ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてＰＫＣδｓｅｒ６６２のリン酸化レベルをウエスタンブロットにて評価を行った。
結果を図９Ｃ）に示す。図９Ｃ）から明らかなように、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清はマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に対しＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化を顕著に誘導することが観察された。
【００５９】
抗６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド血清による６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路活性化作用の評価を行った。１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に２５倍希釈となるよう血清を添加し３時間培養した。その後ｐＨ４．５の細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＦ，３０ｍＭ
Ｎａ４Ｐ２Ｏ７，１ｍＭ  Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｉｃ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ，２μｇ／ｍＬ  Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ；ｐＨ  ４．５）で回収し、溶解液にＢＯＤＹＰＹ−Ｃ−１２−Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎを添加し１８時間インキュベートした後、ＴＬＣ解析により酸性スフィンゴミエリナーゼの活性を測定した。
結果を図９Ｄ）に示す。図９Ｄ）から明らかなように、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清はマウス形質細胞腫細胞株ＭＰＣ−１１に対し酸性スフィンゴミエリナーゼ活性を顕著に誘導することが明らかとなった。
【００６０】
［実施例１０］
マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２の移植腫瘍に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
乳がん移植マウスモデルにおける６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の抗腫瘍効果の評価を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２１日後に、ＤＭＥＭ培地に懸濁したＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞をイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ皮下注射し、移植を行った。腫瘍の形成を確認後、２日おきに腫瘍体積をノギスで測定した。
【００６１】
結果を図１０に示す。図１０から明らかなように、ＫＬＨ免疫群では腫瘍成長が認められたのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫により、乳がん細胞株の腫瘍成長阻害が認められた。
【００６２】
［実施例１１］
マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２を移植したマウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
乳がん移植マウスモデルにおける６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の延命効果の評価を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。
【００６３】
尾採血２１日後に、ＤＭＥＭ培地に懸濁したＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞をイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ皮下注射し、移植を行った。腫瘍の形成を確認後、２日おきに腫瘍体積をノギスで測定した。なお、倫理的観点より、顕著な衰弱が認められたマウスからイソフルラン麻酔下で、心臓採血により屠殺を行った。
結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、ＫＬＨ免疫群と比べ、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群ではマウスの生存期間が顕著に延長されたことが観察された。
【００６４】
［実施例１２］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍（ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２）における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（Ｃｌｅａｖｅｄ  ｃａｓｐａｓｅ  ３）の活性化
がん細胞致死の指標となるｃａｓｐａｓｅ  ３断片化に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の作用メカニズムを検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。
【００６５】
さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２１日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞を４．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるようにＤＭＥＭ培地に懸濁したものを２００μＬ右背部に、皮下注射移植した。腫瘍生着後、腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、２．５％  ＢＳＡ  ＴＴＢＳを添加し３０分間ブロッキングした後、４００倍希釈したＣｌｅａｖｅｄ  Ｃａｓｐａｓｅ−３  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｂ（Ｄ１７５）を添加し３時間静置した。その後３００倍希釈した  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｇｏａｔ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加後室温で１時間静置した。５００００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に１０分間浸漬させ、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）ｘ４０にて画像の取得を行い、ｃａｓｐａｓｅ  ３断片化レベルを測定した。
結果を図１２に示す。図１２から明らかなように、ＫＬＨ免疫群はｃａｓｐａｓｅ  ３の断片化を誘導しないのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫はｃａｓｐａｓｅ
３の断片化を顕著に誘導した。このことより、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２の腫瘍において細胞致死作用を誘導することが示された。
【００６６】
［実施例１３］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍（ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２）における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ｅＮＯＳｓｅｒ１１７７リン酸化）の活性化
６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導活性の指標となるｅＮＯＳのＳｅｒ１１７７リン酸化に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫による作用を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。
【００６７】
さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２１日後に、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞を４．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるようにＤＭＥＭ培地に懸濁したものを２００μＬ右背部に、皮下注射移植した。腫瘍生着後、腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、２．５％  ＢＳＡ  ＴＴＢＳを添加し３０分間ブロッキングした後、２００倍希釈したＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ｅＮＯＳ（Ｓｅｒ１１７７）ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ社）を添加し６時間静置した。その後４００倍希釈したａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ｇｏａｔ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加後室温で１時間静置した。５００００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に１０分間浸漬させ、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）ｘ４０にて画像の取得を行い、ｅＮＯＳ  Ｓｅｒ１１７７リン酸化レベルを測定した。
結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、ＫＬＨ免疫群ではｅＮＯＳのＳｅｒ１１７７リン酸化は惹起されなかったのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群ではｅＮＯＳのＳｅｒ１１７７リン酸化を惹起することが観察された。このことより、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞の腫瘍において６７ＬＲ依存的ながん細胞致死経路を活性化することが明らかになった。
【００６８】
［実施例１４］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス腫瘍（ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２）における６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路（ＰＫＣδｓｅｒ６６２リン酸化）の活性化
６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導活性の指標となるＰＫＣδのＳｅｒ６６２  リン酸化に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の作用を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。
【００６９】
さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２１日後にＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞を４．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるようにＤＭＥＭ培地に懸濁したものを２００μＬ右背部に、皮下注射移植した。腫瘍生着後、腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、２．５％  ＢＳＡ  ＴＴＢＳを添加し３０分間ブロッキングした後、３００倍希釈したＡｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＰＫＣδ（Ｓｅｒ６６２）ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ社）を添加後室温で１時間静置した。５００００倍希釈したＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に１０分間浸漬させ、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）ｘ４０にて画像の取得を行い、ＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化レベルを測定した。
結果を図１４に示す。図１４から明らかなように、ＫＬＨ免疫群ではＰＫＣδのＳｅｒ６６２リン酸化は増強しなかったが、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫により、ＰＫＣδのＳｅｒ６６２のリン酸化は顕著に増強された。このことより、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫は乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞の腫瘍において６７ＬＲ依存的ながん細胞致死経路を活性化することが示された。
【００７０】
［実施例１５］
マウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５の移植腫瘍に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
多発性骨髄腫移植マウスモデルにおける６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の抗腫瘍作用の評価を行った。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。
【００７１】
さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２日後に、ＤＭＥＭ培地に懸濁したマウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５細胞を２．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ、イソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に皮下注射し、移植を行った。腫瘍の形成を確認後、２日おきに腫瘍体積をノギスで測定した。
結果を図１５に示す。図１５から明らかなように、ＫＬＨ免疫群では、多発性骨髄腫の腫瘍成長が観察されたのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群では、多発性骨髄腫の腫瘍成長が顕著に阻害されることが示された。
【００７２】
［実施例１６］
マウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５を移植したマウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
多発性骨髄腫移植マウスモデルにおける６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の延命効果の評価を行った。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。
【００７３】
さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２日後に、ＤＭＥＭ培地に懸濁したマウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５細胞を２．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ、イソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に皮下注射し、移植を行った。腫瘍の形成を確認後、２日おきに腫瘍体積をノギスで測定した。倫理的観点より、顕著な衰弱が認められたマウスからイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で、心臓採血により屠殺を行った。
結果を図１６に示す。図１６から明らかなように、ＫＬＨ免疫群と比較して、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群では生存期間が顕著に延長することが示された。
【００７４】
［実施例１７］
がん幹細胞のマーカーであるとともにがん幹細胞の機能維持に重要な役割を果たすタンパク質であるＣＤ４４の発現に対する効果
ＢＡＬＢ／ｃマウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その２週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその一週間後に同様の方法で追加免疫を行い、２回目の追加免疫を行ってから５日後にマウスより尾採血を行い、血清を回収した。尾採血２日後に、ＤＭＥＭ培地に懸濁したマウス多発性骨髄腫細胞株ＭＯＰＣ３１５細胞を、２．０ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬをマウスの右背面部に皮下注射し、移植を行った。腫瘍を摘出し、組織切片を作成し、２．５％  ＢＳＡ  ＴＴＢＳを添加し３０分間ブロッキングした後、１００倍希釈した抗ＣＤ４４抗体  （Ａｂｃａｍ社）を添加し室温で７時間静置した。その後３００倍希釈したａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｇｏａｔ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加後室温で１時間静置した。５００００倍希釈したｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２に１０分間浸漬させ、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）ｘ４０にて画像の取得を行い、ＣＤ４４の発現量を評価した。
結果を図１７に示す。図１７から明らかなように、ＫＬＨ免疫群の腫瘍組織と比較し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群の腫瘍組織ではＣＤ４４の発現量の低下が観察された。
【００７５】
［実施例１８］
マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２の移植腫瘍に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
乳がん移植マウスモデルにおける６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の治療効果の評価を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＭＥＭ  培地に懸濁したＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞をイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に４．８ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ皮下注射し、移植を行った。３日後、マウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その１週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０  ペプチド抗原）を５０μｇ含む溶液にＣｐＧを２５μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその１週間後に同様の方法で追加免疫を行った。腫瘍体積は移植後９日目から、４日毎にノギスで測定した。
【００７６】
結果を図１８に示す。図１８から明らかなように、ＫＬＨ免疫群では腫瘍成長が認められたのに対し、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原の免疫により、乳がん細胞株の腫瘍成長阻害が認められた。
【００７７】
［実施例１９］
マウス乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２を移植したマウスの生存期間に対する６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫の効果
乳がん移植マウスモデルにおける６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫の治療効果の評価を行った。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＭＥＭ  培地に懸濁したＢＡＬＢ／ｃマウス由来乳がん細胞株ＢＡＬＢ−ＭＣ．Ｅ１２細胞をイソフルラン（マイラン製薬株式会社）麻酔下で各マウスの右背面部に４．８ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬ皮下注射し、移植を行った。３日後、マウスに各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原）を１００μｇ含む溶液にＣｐＧを５０μｇ加え、これにフロイント完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで初回免疫を行った。その１週間後に各免疫原（ＫＬＨ，６７ＬＲ１５８−１７０  ペプチド抗原）を５０μｇ含む溶液にＣｐＧを２５μｇ加え、これにフロイント不完全アジュバント（シグマ社）を等量混合し、乳化させたものをマウスの腹腔内に注射することで追加免疫を行った。さらにその１週間後に同様の方法で追加免疫を行った。
【００７８】
なお、倫理的観点より、顕著な衰弱が認められたマウスからイソフルラン麻酔下で、心臓採血により屠殺を行った。
結果を図１９に示す。図１９から明らかなように、ＫＬＨ免疫群と比べ、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫群ではマウスの生存期間が顕著に延長されたことが観察された。
【００７９】
［実施例２０］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドを免疫したマウス血清の免疫抗原に対する反応性
ＥＬＩＳＡプレートの洗浄には、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ナカライテスク株式会社）を添加したＰＢＳ（ＴＰＢＳ）を用いた。固相抗原希釈溶液は、ＮａＨＣＯ３（ナカライテスク株式会社）を超純水で４．２ｇ／Ｌに調製した５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３に、Ｎａ２ＣＯ３（ナカライテスク株式会社）を超純水で２．６５ｇ／５００ｍＬに調製した５０  ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３を、ｐＨ９．６になるまで混合した５０ｍＭ炭酸緩衝液を用いた。発色基質は使用直前に０．００６％  Ｈ２Ｏ２添加０．２Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）：超純水：６ｍｇ／ｍＬ  ２，２−アニゾ−ビス（３’エチルベンゾニン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）溶液＝１０：９：１で混合して用いた。ＥＬＩＳＡ  用プレートには、Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｐｌａｔｅ  を  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｎｕｎｃ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）より購入、使用した。また、吸光度の測定には東ソー株式会社のＩｍｍｕｎｏ  Ｍｉｎｉ  ＮＪ−２３００を使用した。
【００８０】
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド（配列番号：１８）（Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１０μg／ｍＬになるように５０ｍＭ炭酸緩衝液で希釈し、Ｉｍｍｕｎｏ  ｐｌａｔｅの各穴に５０μＬずつ添加した後、３７℃で２時間インキュベートを行った。その後、ＴＰＢＳで洗浄し、ブロッキング剤として１％  ＢＳＡ−ＴＴＢＳを各穴に１００μＬずつ添加した後、４℃で一晩放置した。ＴＰＢＳで洗浄後、と殺後に回収したマウス血清（１％  ＢＳＡ−ＴＰＢＳで１００倍希釈）を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＴＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ標識ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）（１０００倍希釈）を５０μＬずつ添加し、３７℃で１時間反応させた。ＴＰＢＳで洗浄後、発色基質溶液を１００μＬずつ添加し、３７℃で１５分間反応させた後、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８１】
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原免疫後のマウス血清における６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドに対する抗体価について評価するために、と殺時に回収した血清を用いて抗体価の評価をＥＬＩＳＡ法により行った。図２０に示すように、６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清では６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇が確認されたが、ＫＬＨを免疫したマウスの血清では６７ＬＲ１５８−１７０ペプチドに対する抗体価の上昇は確認されなかった（図２０）。
【００８２】
［実施例２１］
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド免疫マウス血清による６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路の活性化
６７ＬＲ１５８−１７０ペプチド抗原を免疫したマウス血清の６７ＬＲ依存的がん細胞致死誘導経路活性化作用の評価を行った。５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウス多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に２５倍希釈となるよう血清を添加し３時間インキュベート後、細胞溶解液を調製した。１次抗体として３０００倍希釈した  Ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  ＰＫＣδ（Ｓｅｒ６６２）ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ａｂｃａｍ社）およびＡｎｔｉ−  ＰＫＣδ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いてＰＫＣδｓｅｒ６６２のリン酸化レベルをウエスタンブロットにて評価を行った。
結果を図２１に示す。図２１から明らかなように、６７ＬＲ１５８−１７０  ペプチド抗原を免疫したマウス血清はマウス多発性骨髄腫細胞株Ｕ２６６に対しＰＫＣδ  Ｓｅｒ６６２リン酸化を顕著に誘導することが観察された。
【図１】
2016145200.tif 000002
【図２】
2016145200.tif 000003
【図３】
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【図７】
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【図８】
2016145200.tif 000006
【図９】
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【図１０】
2016145200.tif 000008
【図１１】
2016145200.tif 000009
【図１５】
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【図１６】
2016145200.tif 000011
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2016145200.tif 000014
【図２１】
2016145200.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１７】
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【配列表】
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