(57)【要約】【課題】試料の位相分布の可視化に有利な観察装置を提供すること【解決手段】試料の像を形成する結像光学系（１０４）と、前記結像光学系に設けられ、入射する光を変調する第１変調領域を有する変調部（１０５）と、前記結像光学系を介して前記試料を撮像する撮像手段（１０６）と、前記撮像手段により得られる画像情報と、前記試料からの回折光のうち前記第１変調領域によって変調を受ける回折光成分と、に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出する算出手段（１０７）と、を有することを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の像を形成する結像光学系と、
前記結像光学系に設けられ、入射する光を変調する第１変調領域を有する変調部と、
前記結像光学系を介して前記試料を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により得られる画像情報と、前記試料からの回折光のうち前記第１変調領域によって変調を受ける回折光成分と、に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出する算出手段と、を有することを特徴とする観察装置。
【請求項２】
前記算出手段は、前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合を用いて前記回折光成分を算出することを特徴とする請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記算出手段は、物体がないところでの明視野像の強度を１としたときの像の強度分布をＩ（ｘ）、前記試料の複素振幅透過率分布をＵ（ｘ）、前記Ｕ（ｘ）の平均値をＵ0、前記第１変調領域の振幅透過率をα、前記変調部における前記第１変調領域とは異なる第２変調領域の振幅透過率をβ、前記第１変調領域の位相変調量をε、前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合をｎ（０＜ｎ＜１）、虚数単位をｉ、とするとき、
Ｉ（ｘ）＝｜Ｕ（ｘ）-Ｕ0（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-ｎ（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-（1-ｎ）（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-β）｜２    
なる式に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出することを特徴とする請求項１または２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記算出手段は、前記第１変調領域の振幅透過率α、前記第２変調領域の振幅透過率β、前記第１変調領域の位相変調量ε、前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合ｎ（０＜ｎ＜１）、のうち少なくとも１つを変えて撮像して得られた複数の画像情報に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出することを特徴とする請求項３に記載の観察装置。
【請求項５】
光源からの光で前記試料を照明する照明光学系を備え、
前記照明光学系は、開口が設けられた開口絞りを有し、
前記変調部は、前記開口と共役な位置に配置され、前記第１変調領域と異なる第２変調領域を有し、
前記第１変調領域は、前記開口を通過した前記光源からの直接光が入射するように配置され、
前記第２変調領域は、前記直接光が入射しないように配置されることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の観察装置。
【請求項６】
前記試料から前記変調部までの合成焦点距離をｆ、前記結像光学系の前記試料の側の開口数をＮＡ、前記光源の最大波長をλ（μｍ）、Ｒｎ＝０．１２×λ／ＮＡ、とするとき、
Ｒｎ＝Ｒ／（ＮＡ×ｆ）
なる式を満たす直径Ｒの円を前記変調部の任意の位置に配置した場合、前記第１変調領域または前記第２変調領域は該円を内包しない大きさであることを特徴とする請求項５に記載の観察装置。
【請求項７】
前記算出手段は、前記光源の波長を変えて撮像して得られた複数の画像情報に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出することを特徴とする請求項５または６に記載の観察装置。
【請求項８】
前記第１変調領域は、光軸を中心として回転対称な形状を有し、前記光軸を中心とした円の周方向よりも径方向に長い形状を有することを特徴とする請求項１ないし７のいずれか１項に記載の観察装置。
【請求項９】
前記第１変調領域は、前記光軸を中心として放射状に延びる形状、または、螺旋形状を有することを特徴とする請求項８に記載の観察装置。
【請求項１０】
前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合ｎ（０＜ｎ＜１）が、
０．４  ＜  ｎ  ＜  ０．６
なる式を満たすことを特徴とする請求項１ないし９のいずれか１項に記載の観察装置。
【請求項１１】
結像光学系に設けられる第１変調領域を有する変調部を介した撮像により得られる試料の画像情報と、前記試料からの回折光のうち前記第１変調領域によって変調を受ける回折光成分と、に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出する算出ステップを有することを特徴とする演算方法。
【請求項１２】
前記算出ステップは、前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合を用いて前記回折光成分を算出することを特徴とする請求項１１に記載の演算方法。
【請求項１３】
前記算出ステップは、物体がないところでの明視野像の強度を１としたときの像の強度分布をＩ（ｘ）、前記試料の複素振幅透過率分布をＵ（ｘ）、前記Ｕ（ｘ）の平均値をＵ0、前記第１変調領域の振幅透過率をα、前記変調部における前記第１変調領域とは異なる第２変調領域の振幅透過率をβ、前記第１変調領域の位相変調量をε、前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合をｎ（０＜ｎ＜１）、虚数単位をｉ、とするとき、
Ｉ（ｘ）＝｜Ｕ（ｘ）-Ｕ0（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-ｎ（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-（1-ｎ）（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-β）｜２    
なる式に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出することを特徴とする請求項１１または１２に記載の演算方法。
【請求項１４】
結像光学系に設けられる第１変調領域を有する変調部を介した撮像により得られる試料の画像情報と、前記試料からの回折光のうち前記第１変調領域によって変調を受ける回折光成分と、に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出する算出手段を有することを特徴とする演算装置。
【請求項１５】
前記算出手段は、前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合を用いて前記回折光成分を算出することを特徴とする請求項１４に記載の演算装置。
【請求項１６】
前記算出手段は、物体がないところでの明視野像の強度を１としたときの像の強度分布をＩ（ｘ）、前記試料の複素振幅透過率分布をＵ（ｘ）、前記Ｕ（ｘ）の平均値をＵ0、前記第１変調領域の振幅透過率をα、前記変調部における前記第１変調領域とは異なる第２変調領域の振幅透過率をβ、前記第１変調領域の位相変調量をε、前記結像光学系の瞳に占める前記第１変調領域の割合をｎ（０＜ｎ＜１）、虚数単位をｉ、とするとき、
Ｉ（ｘ）＝｜Ｕ（ｘ）-Ｕ0（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-ｎ（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-（1-ｎ）（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-β）｜２    
なる式に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出することを特徴とする請求項１４または１５に記載の演算装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関し、特に位相物体を観察するための位相差観察装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
無染色の細胞に代表される位相物体（試料）を観察するための方法として位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡が用いられている。一般的な位相差顕微鏡は照明系に輪帯状の開口部を持ち、試料を照明した後の直接光に対して、対物レンズ内に配置された複素振幅変調領域で位相差をπ/２与えることによって、直接光と回折光との干渉によるコントラストの高い像を得られるようにしている。しかし、このような位相差顕微鏡では位相差量の大きい試料を観察すると、直接光だけでなく低次の回折光も複素振幅変調領域を透過することで背景と試料の境界にハロと呼ばれるアーティファクトが生じ、位相分布を定量的に可視化することができなかった。また、一般的な暗視野顕微鏡は照明系による直接光が対物レンズに入射しないように大きな開口数で照明し、位相物体からの回折光のみで像を得ている。しかし、従来の暗視野顕微鏡では高次の回折光のみで結像させるため、位相物体の境界だけが強調されたような像を形成し、定性的な観察しかできなかった。
【０００３】
このような影響を低減し、位相分布を定量的に可視化する方法が特許文献１、２に開示されている。特許文献１では、点光源を使用し、対物レンズ内に微小な複素振幅変調領域を配置することで直接光のみ複素振幅変調領域を透過するように構成し、得られた画像を所定の式で演算することで位相分布を定量的に可視化している。また、特許文献２では、対物レンズ内に配置した複素振幅変調領域の位相差量を可変とし、複数の画像を取得することで縞走査手法により位相分布を定量的に可視化している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第２０３２５７０号
【特許文献２】特許第３７９０９０５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、特許文献１に開示されている方法では点光源しか想定されていないため、解像度の低下やスペックルを生じるという問題があった。また、特許文献２に開示されている方法では複素振幅変調領域を一般的な位相差顕微鏡と同じような輪帯状としているためハロが生じ、この影響を除去するのにデコンボリューション処理を行っていた。そのため、計算コストが大きくなる問題や３回以上撮像することを前提としているため、高速に撮像することが難しいという問題があった。
【０００６】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、試料の位相分布の可視化に有利な観察装置、演算方法、および演算装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一側面としての観察装置は、試料の像を形成する結像光学系と、前記結像光学系に設けられ、入射する光を変調する第１変調領域を有する変調部と、前記結像光学系を介して前記試料を撮像する撮像手段と、前記撮像手段により得られる画像情報と、前記試料からの回折光のうち前記第１変調領域によって変調を受ける回折光成分と、に基づいて、前記試料の位相差量分布を算出する算出手段と、を有することを特徴とする。
【０００８】
本発明の他の目的及び特徴は、以下の実施例において説明される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、試料の位相分布の可視化に有利な観察装置、演算方法、および演算装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の実施例における位相差観察装置の概略図である。
【図２】本発明の実施例における複素振幅変調領域ＣＡＭ、開口ＩＡを示した図である。
【図３】本発明の実施例における複素振幅変調領域ＣＡＭの大きさの説明図である。
【図４】瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合を変えた時の像強度を示したグラフである。
【図５】シミュレーション用位相物体の説明図である。
【図６】従来の位相差顕微鏡のシミュレーション結果である。
【図７】実施例１の位相差観察装置のシミュレーション結果である。
【図８】実施例２の位相差観察装置のシミュレーション結果である。
【図９】実施例３の位相差観察装置のシミュレーション結果である。
【図１０】実施例４の位相差観察装置のシミュレーション結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、図１を参照して、本発明の位相差観察装置１０（位相差顕微鏡、暗視野顕微鏡等）について説明する。ここで、図１は本実施例の位相差観察装置１０の概略図である。１００は、光源である。１０１は、光源１００からの光を被照射面（被照射面に配置された試料）１０３に導く照明光学系である。１０２は、照明光学系１０１の内部に設けられ、開口ＩＡが形成された開口絞りである。開口絞り１０２は、照明光学系１０１の内部の例えば瞳位置（近傍）に配置される。開口絞り１０２に形成された開口ＩＡは、光源１００から出射した光を制限する。これにより、光源１００から出た光は、開口ＩＡにより制限されて試料１０３を照明する。本実施形態において、好ましくは、開口絞り１０２として可変開口絞りが用いられる。可変開口絞りを用いることにより、コントラストや分解能を変更することができる。また、このとき使用する光は可視光または近赤外光（例えば、波長４００ｎｍ〜１１００ｎｍ）が用いられ、試料１０３からの光は対物レンズ１０４内に配置された変調部１０５を通り撮像素子１０６に結像する。対物レンズ１０４は、被照射面に配置された試料１０３の像を撮像素子１０６の撮像面に形成（結像）する結像光学系として機能する。変調部１０５は、対物レンズ１０４の内部に設けられ（例えば対物レンズ１０４の瞳位置（近傍）に配置され）、入射する光を変調する複素振幅変調領域（第１変調領域）ＣＡＭを有する。撮像素子１０６は、試料１０３の像を受像する（すなわち、対物レンズ１０４を介して試料１０３を撮像する）撮像手段として機能する。撮像素子１０６は、対物レンズ１０４（結像光学系）の結像面に配置されている。また、撮像素子１０６によって得られたデータにより画像情報を生成し、試料１０３の位相差量分布を算出する画像処理系１０７を有する。画像処理系１０７は、対物レンズ１０４内の変調部１０５を介した撮像により得られる試料の画像情報に基づいて、試料１０３の位相差量分布を算出する算出手段として機能する。このように、画像処理系１０７は、撮像素子１０６により得られたデータから画像情報を生成する生成手段（画像処理装置）と、試料１０３の位相差量分布を算出する算出手段（演算装置）を構成している。
【００１２】
続いて、図２を参照して、位相差観察装置１０に用いられる開口絞り１０２および変調部１０５の構成について説明する。変調部１０５は、開口絞り１０２に形成される開口ＩＡと共役な位置に配置される。変調部１０５は、複素振幅変調領域ＣＡＭ（第１変調領域）と、複素振幅変調領域ＣＡＭとは異なる振幅変調領域ＡＭ（第１変調領域とは異なる第２変調領域）と、を有する。複素振幅変調領域ＣＡＭは、開口ＩＡを通過した光源１００からの直接光が入射するように配置される。また、振幅変調領域ＡＭは、開口ＩＡを通過した光源１００からの直接光が入射しないように配置される。図２は、開口絞り１０２および変調部１０５の構成図である。図２（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの左図は、対物レンズ１０４内に配置された変調部１０５の複素振幅変調領域ＣＡＭおよび振幅変調領域ＡＭを光軸ＡＸの方向から見た図である。また、図２（ａ）〜（ｄ）のそれぞれの右図は、照明光学系１０１内に設けられた開口絞り１０２の開口ＩＡを光軸ＡＸの方向から見た図である。
【００１３】
図２（ａ）は放射状、図２（ｂ）は螺旋状、図２（ｃ）は多重輪帯、図２（ｄ）はランダムドットの複素振幅変調領域ＣＡＭとそれを囲む振幅変調領域ＡＭおよび開口ＩＡをそれぞれ本実施形態の一例として示している。複素振幅変調領域ＣＡＭは、開口ＩＡと同じまたは同様（相似）な形状を有するか、開口ＩＡの形状に該形状と類似した形状を加えたような形状を有する。すなわち、複素振幅変調領域ＣＡＭの数は、開口ＩＡの数と同じか、開口ＩＡの数よりも多く形成される。ただし本実施例は、これらに限定されるものではない。例えば、図２（ａ）〜（ｄ）に示される４つの例を組み合わせることもできる。
【００１４】
本実施例の位相差観察装置１０は、開口ＩＡからの直接光が複素振幅変調領域ＣＡＭに入射するように構成される必要がある。このため、図２に示されるように、瞳（瞳領域）に占める開口の割合は、開口ＩＡよりも複素振幅変調領域ＣＡＭのほうが大きいか、または、同じ（同等の）大きさになるように構成されている。また、複素振幅変調領域ＣＡＭは、開口ＩＡからの直接光の位相や強度を変調するように、振幅変調領域ＡＭは回折光の強度を変調するように構成されている。このとき、複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量は、振幅変調領域ＡＭを基準として決定される。例えば、複素振幅変調領域ＣＡＭは、平行平板上に成膜または切削するなどにより位相差を与えるか、または、減光、遮光するなど（または、これらの組み合わせ）を行うように構成されている。
【００１５】
好ましくは、アーティファクト、製造誤差、および、調整誤差の観点から、図２（ａ）図２（ｂ）に示されるように複素振幅変調領域ＣＡＭは、光軸ＡＸを中心として放射状に延びた形状もしくは螺旋形状を有する回転対称な形状であることが望ましい。また、光軸ＡＸを中心とした円の周方向よりも径方向において長い形状を有することが望ましい。例えば図２（ｃ）のような多重輪帯の複素振幅変調領域ＣＡＭでは、複数の輪帯のそれぞれの輪帯（複素振幅変調領域ＣＡＭ）が等しい間隔で配置しやすい。このため、特定の周波数成分を強調するようなアーティファクトが生じやすい。また、図２（ｄ）のようなランダムドットの複素振幅変調領域ＣＡＭでは、周期性が低いため、開口ＩＡからの直接光が複素振幅変調領域ＣＡＭを通過するように製造および調整するのが困難である。一方、図２（ａ）図２（ｂ）のような回転対称の複素振幅変調領域ＣＡＭでは、上記のようなデメリットを低減することができる。ただし、観察する物体など様々な条件に応じて、複素振幅変調領域ＣＡＭの望ましい形状は変わる。このため、目的や装置の構成に応じて最適な複素振幅変調領域ＣＡＭを選択することが好ましい。
【００１６】
続いて、図３を参照して、複素振幅変調領域ＣＡＭの望ましい大きさについて説明する。図３は、複素振幅変調領域ＣＡＭの望ましい大きさの説明図であり、図３（ａ）は複素振幅変調領域ＣＡＭが比較的小さい場合、図３（ｂ）は複素振幅変調領域ＣＡＭが比較的大きい場合をそれぞれ示している。
【００１７】
ここで、変調部１０５の上に配置される直径Ｒの円を考える。被照射面（試料１０３）から変調部１０５までのレンズ１０４ａの合成焦点距離をｆ、光源１００の最大波長をλ（μｍ）、対物レンズ１０４の被照射面側（試料１０３側）の開口数をＮＡとする。また、Ｒｎ＝０．１２×λ／ＮＡと定義する。このとき、以下の式（１）で表される直径Ｒの円を複素振幅変調領域ＣＡＭの任意の位置に配置した場合、複素振幅変調領域ＣＡＭはこの円を内包しない大きさであることが好ましい。より好ましくは、振幅変調領域ＡＭもこの円を内包しない大きさであるとよい。
【００１８】
Ｒｎ＝Ｒ／（ＮＡ×ｆ）  …  （１）
図３（ａ）は、直径Ｒの円Ｃを複素振幅変調領域ＣＡＭの任意の位置に配置しても、円Ｃは複素振幅変調領域ＣＡＭに内包されない場合を示している。一方、図３（ｂ）は、直径Ｒの円Ｃを複素振幅変調領域ＣＡＭのある位置に配置すると、複素振幅変調領域ＣＡＭに内包される場合を示している。
【００１９】
ここで、式（１）のＲｎは、対物レンズ１０４の瞳径（ＮＡ×ｆ）で規格化されたＲである。Ｒｎはエアリーディスクの第一暗環により決定される。本実施形態において、想定している試料１０３の物体直径ｄは２０μｍである。このため、照明光による物体の回折角θは、以下の式（２）ように表すことができる。
【００２０】
２ｓｉｎθ＝２．４４×λ／ｄ≒０．１２×λ  …  （２）
このとき、対物レンズ１０４の瞳面上での回折光の広がりは、２ｓｉｎθ×ｆとして表される。このため、対物レンズ１０４の瞳径ＮＡ×ｆで規格化した回折光の広がりＤは、以下の式（３）ように表される。式（３）で表されるＤは、前述のＲｎに等しい。
【００２１】
Ｄ＝（２ｓｉｎθ×ｆ）／（ＮＡ×ｆ）
＝０．１２×λ／ＮＡ  …  （３）
式（１）を満たす直径Ｒの円が複素振幅変調領域ＣＡＭに内包されないということは、物体の直径が２０μｍ程度の大きな物体から生じる低次の回折光でも複素振幅変調領域ＣＡＭへ入射しないことを意味する。このため、式（１）を満たすことにより、様々な周波数成分の回折光が結像に寄与し、位相差観察装置１０は定量的に像を再現することができる。
【００２２】
更に好ましくはＲｎ＝０．０６×λ／ＮＡと定義するのが良い。
【００２３】
上記のような構成で得られた像は、試料からの低次から高次までの回折光をまんべんなく含むため、定量的な強度分布Ｉ（ｘ）を持ち、以下の式（４）で表すことができる。
【００２４】
Ｉ（ｘ）＝｜Ｕ（ｘ）-Ｕ0（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-ｎ（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-α・ｅｘｐ{ｉε}）-（1-ｎ）（Ｕ（ｘ）-Ｕ0）（1-β）｜２    …  （４）
ここでＩ（ｘ）は物体がないところでの明視野像の強度を１としたときの像の強度分布、Ｕ（ｘ）は試料の複素振幅透過率分布、Ｕ0はＵ（ｘ）の平均値である。αは複素振幅変調領域ＣＡＭの振幅透過率、βは振幅変調領域ＡＭの振幅透過率、εは複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量、ｎは結像光学系の瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合（０＜ｎ＜１）、ｉは虚数単位である。式（４）の第１、２項は特許文献１に開示されているものと同じで、直接光だけが複素振幅変調領域ＣＡＭによって複素振幅変調を与えられた場合の光の成分を表している。第３項は複素振幅変調領域ＣＡＭによって複素振幅変調を与えられた回折光の成分を表している。このように、本発明によれば、結像光学系の瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎを用いて、試料からの回折光のうち複素振幅変調領域ＣＡＭによって位相変調を受ける回折光成分を算出している。第４項は振幅変調領域ＡＭによって振幅変調を与えられた回折光の成分を表している。Ｉ（ｘ）は物体がないところでの明視野像の強度を１としたときの像の強度分布であるため、物体がないところでの明視野像の強度を測定もしくは推定する必要があり、推定する場合は複素振幅変調領域ＣＡＭの振幅透過率αを考慮して推定することができる。
【００２５】
式（４）を見てわかるように、試料と関係するＵ（ｘ）とＵ0以外は既知のものである。よって、Ｕ0は試料が透明であれば１と近似することができるため、強度分布Ｉ（ｘ）からＵ（ｘ）、つまり試料の位相分布を推定することができる。つまり、撮像素子１０６により得られる試料の画像情報と式（４）とに基づいて、試料の位相差量分布を算出することができる。式（４）では、上述したように特許文献１に開示の第１、２項に加え、第３項（直接光と同じ位相変調を受ける回折光成分）、第４項（直接光と異なる振幅変調を受ける回折光成分）に基づき試料の位相差量分布を算出することを特徴とする。また、試料に吸収がある場合はあらかじめ明視野像を撮影し像強度の平方根を計算することでＵ（ｘ）の振幅透過率分布やＵ0を求めることができるため、その値を利用してＵ（ｘ）の位相分布を推定することができる。
【００２６】
また、実際に得られる像の強度分布Ｉ（ｘ）＿ｒは誤差などの影響により、強度変調量Ａやオフセット量Ｂによって式（５）のように変化することが予想される。
【００２７】
Ｉ（ｘ）＿ｒ＝Ａ・Ｉ（ｘ）＋Ｂ …  （５）
そのため精度よく試料の位相分布を推定する場合は、複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量を変える、もしくは照明する際の波長を変えるなど異なる条件で得られた複数の画像を使用して推定することが望ましい。具体的には、上述の振幅透過率α、振幅透過率β、位相変調量ε、割合ｎ、のうち少なくとも１つを変えて撮像することで得られる複数の画像情報から、試料１０３の位相差量分布を算出することが望ましい。また、光源の波長を変えて撮像することで得られる複数の画像情報から、試料１０３の位相差量分布を算出してもよい。
【００２８】
また、白色の光源を用いて試料の位相分布を推定する際に誤差を小さくするため、結像光学系の瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎ（０＜ｎ＜１）は、以下の式（６）を満たすことが好ましい。
【００２９】
０．４  ＜  ｎ  ＜  ０．６  …  （６）
このことについて図４を用いて説明する。図４は式（４）を用いて横軸に試料の位相分布、縦軸に像の強度を算出したものである。図４では、６００ｎｍの波長で複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量εにπ/２の位相差量を与えた場合に４００ｎｍ、８００ｎｍで像の強度がどのようになるかを示している。また、図４（ａ）、（ｂ）は瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎを０．１、０．５とした場合で、複素振幅変調領域ＣＡＭの振幅透過率αなどは変調せずに透明な位相物体を想定している。図４（ａ）を見てわかるように瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎが０．１であると、波長によって像の最大強度や試料の位相分布に対する像強度のピーク位置が大きく変わっている。それに対し図４（ｂ）のように瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎを０．５とすると、波長によって像の最大強度や試料の位相分布に対する像強度のピーク位置が大きく変わらない。そのため、白色の光源を用いて試料の位相分布を想定する際は瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎは式（６）を満たすような値とし、ｎを０．５に近い値とすることが好ましい。
【実施例１】
【００３０】
従来の一般的な位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡と本発明の位相差観察装置１０の構成で主に異なっている部分は対物レンズ内に配置された複素振幅変調領域ＣＡＭ、振幅変調領域ＡＭと照明光学系内に配置された開口ＩＡである。そのため、これらが変わった際の効果をシミュレーションによって示す。シミュレーションの条件は波長λを５５０ｎｍとしている。また、試料は、像強度が位相分布を定量的に可視化していることを確認するため、図５に示すように位相が０〜４πまで線形的に増加する矩形の物体とした。また、本実施例では物体を完全な透明物体としている。
【００３１】
以下の図６、図７に示したＮＡ０．２の時のシミュレーション結果を用いて実施例１の位相差観察装置１０について詳細に説明する。図６では複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量εをπ/２、振幅透過率αを０．７、振幅変調領域ＡＭの振幅透過率βを１、複素振幅変調領域ＣＡＭと開口ＩＡは相似な形状としている。図６は従来の一般的な位相差顕微鏡を想定しており、図６（ａ）の上段と下段は複素振幅変調領域ＣＡＭと開口ＩＡを表している。また、図６（ｂ）はシミュレーションの二次元画像、図６（ｃ）は図６（ｂ）の物体像を縦方向に切り物体のある部分のみを抜き出した断面図であり、縦軸は像の強度である。図６（ｂ）を見てわかるように物体の横方向には位相分布がないにもかかわらず像強度の変化がみられる。また、図６（ｃ）を見てわかるように物体の位相差量が０と４πで不連続となって像強度に周期性がないことが分かる。これらの結果からも一般的な位相差顕微鏡では像強度に定量性がないことが分かる。
【００３２】
図７では複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量εをπ/２、振幅透過率αを０．７、振幅変調領域ＡＭの振幅透過率βを１、結像光学系の瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎを０．５としている。図７（ａ）の上段と下段は複素振幅変調領域ＣＡＭと開口ＩＡ、図７（ｂ）はシミュレーションの二次元画像、図７（ｃ）は図７（ｂ）の物体像を縦方向に切り物体のある部分のみを抜き出した断面図であり、縦軸は像の強度である。図７（ｃ）にはシミュレーションによる像強度を実線、式（４）の理論式によって推定した強度を点線で示している。
【００３３】
図７（ａ）に示すように複素振幅変調領域ＣＡＭは光軸ＡＸを中心として５．６２５°の角度で放射状に延びるように、また角度ピッチが１１．２５°となるように設定した。放射状に延びた複素振幅変調領域ＣＡＭの円弧の長さは０．０８７であり、式（１）の右辺は０．３３である。このため、直径Ｒの円は、複素振幅変調領域ＣＡＭの任意の位置に配置しても複素振幅変調領域ＣＡＭに内包されない。図７（ｂ）を見てわかるように、図６（ｂ）と違って像の横方向には像強度の変化がない。また、図７（ｃ）を見てわかるようにシミュレーションの結果である実線と式（４）の理論式によって推定した点線の強度誤差は、最大強度の１０％以下に抑えられている。これらの結果から本実施例では物体の位相分布を定量的に可視化し、物体の位相分布を正しく推定できていることが分かる。
【実施例２】
【００３４】
以下の図８に示したＮＡ０．２の時のシミュレーション結果を用いて実施例２の位相差観察装置１０について詳細に説明する。特に述べない部分については実施例１と同様である。
【００３５】
図８では複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量εを０、振幅透過率αを０．２５、振幅変調領域ＡＭの振幅透過率βを１、結像光学系の瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎを０．３としている。図８（ａ）の上段と下段は複素振幅変調領域ＣＡＭと開口ＩＡ、図８（ｂ）はシミュレーションの二次元画像、図８（ｃ）は図８（ｂ）の物体像を縦方向に切り物体のある部分のみを抜き出した断面図であり、縦軸は像の強度である。図８（ｃ）にはシミュレーションによる像強度を実線、式（４）の理論式によって推定した強度を点線で示している。
【００３６】
ランダムドットである複素振幅変調領域ＣＡＭのそれぞれのドットの径は０．０５であり、式（１）の右辺は０．３３である。このため、直径Ｒの円は、複素振幅変調領域ＣＡＭの任意の位置に配置しても複素振幅変調領域ＣＡＭに内包されない。図８（ｂ）を見てわかるように、図６（ｂ）と違って像の横方向には像強度の変化がない。また、図８（ｃ）を見てわかるようにシミュレーションの結果である実線と式（４）の理論式によって推定した点線の強度誤差は、最大強度の１０％以下に抑えられている。これらの結果から本実施例では物体の位相分布を定量的に可視化し、物体の位相分布を正しく推定できていることが分かる。
【実施例３】
【００３７】
以下の図９に示したＮＡ０．２の時のシミュレーション結果を用いて実施例３の位相差観察装置１０について詳細に説明する。特に述べない部分については実施例１と同様である。
【００３８】
図９では複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量εを０、振幅透過率αを１、振幅変調領域ＡＭの振幅透過率βを０、結像光学系の瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎを０．５としている。図９（ａ）の上段と下段は複素振幅変調領域ＣＡＭと開口ＩＡ、図９（ｂ）はシミュレーションの二次元画像、図９（ｃ）は図９（ｂ）の物体像を縦方向に切り物体のある部分のみを抜き出した断面図であり、縦軸は像の強度である。図９（ｃ）にはシミュレーションによる像強度を実線、式（４）の理論式によって推定した強度を点線で示している。
【００３９】
多重輪帯である複素振幅変調領域ＣＡＭのそれぞれの輪帯幅は０．０５であり、式（１）の右辺は０．３３である。このため、直径Ｒの円は、複素振幅変調領域ＣＡＭの任意の位置に配置しても複素振幅変調領域ＣＡＭに内包されない。図９（ｂ）を見てわかるように、図６（ｂ）と違って像の横方向には像強度の変化がない。また、図９（ｃ）を見てわかるようにシミュレーションの結果である実線と式（４）の理論式によって推定した点線の強度誤差は、最大強度の１０％以下に抑えられている。これらの結果から本実施例では物体の位相分布を定量的に可視化し、物体の位相分布を正しく推定できていることが分かる。
【実施例４】
【００４０】
以下の図１０に示したＮＡ０．７の時のシミュレーション結果を用いて実施例４の位相差観察装置１０について詳細に説明する。特に述べない部分については実施例１と同様である。
【００４１】
図１０では複素振幅変調領域ＣＡＭの位相変調量εを３π/２、振幅透過率αを１、振幅変調領域ＡＭの振幅透過率βを１、結像光学系の瞳に占める複素振幅変調領域ＣＡＭの割合ｎを０．５としている。図１０（ａ）の上段と下段は複素振幅変調領域ＣＡＭと開口ＩＡ、図１０（ｂ）はシミュレーションの二次元画像、図１０（ｃ）は図１０（ｂ）の物体像を縦方向に切り物体のある部分のみを抜き出した断面図であり、縦軸は像の強度である。図１０（ｃ）にはシミュレーションによる像強度を実線、式（４）の理論式によって推定した強度を点線で示している。
【００４２】
図１０（ａ）に示すように複素振幅変調領域ＣＡＭは光軸ＡＸを中心として２．８１２５°の角度で放射状に延びるように、また角度ピッチが５．６２５°となるように設定した。放射状に延びた複素振幅変調領域ＣＡＭの円弧の長さは０．０４４であり、式（１）の右辺は０．０９４である。このため、直径Ｒの円は、複素振幅変調領域ＣＡＭの任意の位置に配置しても複素振幅変調領域ＣＡＭに内包されない。図１０（ｂ）を見てわかるように、図６（ｂ）と違って像の横方向には像強度の変化がない。また、図１０（ｃ）を見てわかるようにシミュレーションの結果である実線と式（４）の理論式によって推定した点線の強度誤差は、最大強度の１０％以下に抑えられている。これらの結果から本実施例では物体の位相分布を定量的に可視化し、物体の位相分布を正しく推定できていることが分かる。
【００４３】
本発明によれば、従来の位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡の構成を大きく変えることなく、取得した画像から位相分布を低い計算コストで定量的に可視化する位相差観察装置を提供することができる。つまり、本発明によれば、試料の位相分布の可視化に有利な位相差観察装置を提供することができる。
【００４４】
以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限定されないことはいうまでもなく、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。例えば本実施例では透過照明としたが落射照明として構成してもよい。
【００４５】
例えば、上述の実施形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムを、記録媒体から直接、或いは有線／無線通信を用いてプログラムを実行可能なコンピュータを有するシステム又は装置に供給し、そのプログラムを実行する場合も本発明に含む。
【００４６】
従って、本発明の機能処理をコンピュータで実現するために、該コンピュータに供給、インストールされるプログラムコード自体も本発明を実現するものである。つまり、本発明の機能処理を実現するための手順が記述されたコンピュータプログラム自体も本発明に含まれる。
【００４７】
その場合、プログラムの機能を有していれば、オブジェクトコード、インタプリタにより実行されるプログラム、ＯＳに供給するスクリプトデータ等、プログラムの形態を問わない。プログラムを供給するための記録媒体としては、例えば、ハードディスク、磁気テープ等の磁気記録媒体、光／光磁気記憶媒体、不揮発性の半導体メモリでもよい。
【００４８】
また、プログラムの供給方法としては、コンピュータネットワーク上のサーバに本発明を形成するコンピュータプログラムを記憶し、接続のあったクライアントコンピュータはがコンピュータプログラムをダウンロードしてプログラムするような方法も考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、生物試料や生体組織などを観察する位相差顕微鏡や暗視野顕微鏡に好適に利用できる。
【符号の説明】
【００５０】
１０                位相差観察装置
１０４              対物レンズ
１０５              変調部
１０６              撮像素子
１０７              画像処理系
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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