(57)【要約】【課題】  アミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、アミロイド線維を分解する分解剤、神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制のための医薬、ならびに、抑制剤および分解剤の製造方法を提供すること。【解決手段】  本発明のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤／アミロイド線維を分解する分解剤は、上述の式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイを含む。【選択図】  図４
2016145175.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイを含む、アミロイド線維の形成を抑制する抑制剤。
【化１】
2016145175.tif 000020
前記式（１）において、ｎは、２以上の自然数であり、Ｚｎは、同一または別異の、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体である。
【請求項２】
前記Ｚｎは、それぞれ、式（２）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体である、請求項１に記載の抑制剤。
【化２】
2016145175.tif 000021
前記式（２）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【請求項３】
前記Ｚｎは、それぞれ、式（３）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体である、請求項２に記載の抑制剤。
【化３】
2016145175.tif 000022
前記式（３）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【請求項４】
ｎが３である場合、前記Ｚｎは、それぞれ、式（４）で表される金属錯体である、請求項３に記載の抑制剤。
【化４】
2016145175.tif 000023
前記式（４）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【請求項５】
前記（Ｘ）は、同一または別異の、ハロゲン化物イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンである、請求項４に記載の抑制剤。
【請求項６】
前記アミロイド線維は、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））、および／または、アミロイドβからなるペプチドを含むタンパク質からなる、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項７】
式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイを含む、アミロイド線維を分解する分解剤。
【化５】
2016145175.tif 000024
前記式（１）において、ｎは、２以上の自然数であり、Ｚｎは、同一または別異の、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体である。
【請求項８】
前記Ｚｎは、それぞれ、式（２）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体である、請求項７に記載の分解剤。
【化６】
2016145175.tif 000025
前記式（２）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【請求項９】
前記Ｚｎは、それぞれ、式（３）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体である、請求項８に記載の分解剤。
【化７】
2016145175.tif 000026
前記式（３）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【請求項１０】
ｎが３である場合、前記Ｚｎは、それぞれ、式（４）で表される金属錯体である、請求項９に記載の分解剤。
【化８】
2016145175.tif 000027
前記式（４）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【請求項１１】
前記（Ｘ）は、同一または別異の、ハロゲン化物イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンである、請求項１０に記載の分解剤。
【請求項１２】
前記アミロイド線維は、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））、および／または、アミロイドβからなるペプチドを含むタンパク質からなる、請求項７に記載の分解剤。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、または、請求項７〜１２のいずれかに記載のアミロイド線維を分解する分解剤を含む、神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制のための医薬。
【請求項１４】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、家族性アミロイドポリニューロパチー、心筋症、認知症、および、パーキンソン病からなる群から選択される疾患である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
前記神経変性疾患は、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））、および／または、アミロイドβからなるペプチドを含むタンパク質からなるアミロイド線維に基づく、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１６】
ペプチド固相合成法を用いて、請求項１〜６のいずれかに記載のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、または、請求項７〜１２のいずれかに記載のアミロイド線維を分解する分解剤を製造する方法。
【請求項１７】
前記ペプチド固相合成法は、少なくとも
固相担体に、式（５）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体を導入するステップと、
前記導入されたＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体にＮ保護グルタミン酸エステルを導入するステップと、
前記導入されたＮ保護グルタミン酸エステルに、式（６）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体を導入するステップと、
前記導入されたＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体にさらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入するステップと、
前記導入されたさらなるＮ保護グルタミン酸エステルにトリエチレングリコール鎖を導入するステップと、
前記固相担体を切り離すステップと
をさらに包含する、請求項１６に記載の方法。
【化９】
2016145175.tif 000028
前記式（５）および（６）において、Ｚは、同一または別異の、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体であり、Ｐｒｏは同一または別異の保護基である。
【請求項１８】
前記Ｚは、それぞれ、式（２）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体である、請求項１７に記載の方法。
【化１０】
2016145175.tif 000029
前記式（２）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【請求項１９】
前記ペプチド固相合成法は、前記式（６）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体を導入するステップ、および、さらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入するステップを１回以上繰り返すステップをさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、アミロイド線維を分解する分解剤、神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制のための医薬、ならびに、抑制剤および分解剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会に伴い、アルツハイマー病、パーキンソン病等の神経変性疾患の患者数が増加しており、神経変性疾患の症状の進行の抑制、改善、発症の予防等に対するアプローチが積極的に研究されている。
【０００３】
神経変性疾患では、タンパク質やペプチドが繊維状に凝集した難溶性の凝集体（以降では、アミロイド線維と呼ぶ）の形成が認められており、このアミロイド線維の形成が発症に起因しているとされている。
【０００４】
例えば、神経変性疾患の中でも家族性アミロイドポリニューロパチーは、血清タンパク質であるトランスサイレチン（ＴＴＲ）により形成されたアミロイド線維が起因している。アミロイド線維となる変異ＴＴＲの多くが肝臓で生成されることから肝移植治療が行われているが、デンドリマーを用いたアミロイド線維の形成抑制といった治療の有効性が報告されている（例えば、特許文献１を参照。）。
【０００５】
しかしながら、これまでは母体タンパク質であるＴＴＲのアミロイド化の阻害については、ＴＴＲの高次構造を安定化するという方針により抑制剤の設計が行われてきたため、特許文献１に記載の物質を含め、形成されたアミロイド線維を分解する物質はなかった。
【０００６】
別の例では、神経変性疾患の中でもアルツハイマー病は、老人班と呼ばれる特徴的な構造物を示す。老人班は、主に、アミロイドβ（Ａβ）と呼ばれるタンパク質により形成されたアミロイド線維に起因することが分かっている。したがって、アルツハイマー病の発症因子の１つは、Ａβにより形成されたアミロイド線維の脳への蓄積とされている。
【０００７】
アルツハイマー病の進行の抑制、発症を予防するために、Ａβがアミロイド線維を形成するのを抑制する技術、治療薬の開発が盛んである（例えば、非特許文献１、２を参照。）。
【０００８】
非特許文献１によれば、アミノ酸誘導体を含む有機小分子が、Ａβがアミロイド線維を形成すること（以降では単にアミロイド化と称する）を阻害し得、アルツハイマー病の進行の抑制・発症の予防に有効とされている。また、非特許文献２によれば、単核金属錯体が、Ａβのアミロイド化を阻害し得る。
【０００９】
最近では、アルツハイマー病を改善／治療する治療薬として、アミロイド線維となったＡβを分解する、ポリフェノール（−）−エピ−ガロカテキンガラート（ＥＧＣＧ）が開発されている（例えば、非特許文献３を参照。）。
【００１０】
しかしながら、非特許文献１および２に記載のいずれの物質も、形成されたアミロイド線維を分解することは困難であり、神経変性疾患の改善、治療には難しい。また、非特許文献３に記載の物質は、形成されたアミロイド線維を分解することができるが、製造が困難であり、収率が低いといった問題がある。
【００１１】
一方、ペプチド部位に部位特異的に導入された複数の金属錯体からなるペプチド金属錯体アレイが開発された（例えば、非特許文献４を参照。）。非特許文献４によれば、複数の金属錯体が導入されたペプチド金属錯体アレイおよびその製造方法が開示されるが、これらの新しい用途が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００２０２６号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ａ．Ｒａｕｋ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２００９，３８，２６９８−２７１５
【非特許文献２】Ｄ．Ｊ．Ｈａｙｎｅら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１４，４３，６７０１−６７１５
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｅｓｃｈｋｅら，ＰＮＡＳ，２０１０，１０７，７７１０-７７１５
【非特許文献４】Ｐ．Ｖａｉｒａｐｒａｋａｓｈら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１１，１３３，７５９−７６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、アミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、アミロイド線維を分解する分解剤、神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制のための医薬、ならびに、抑制剤および分解剤の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によるアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤／本発明によるアミロイド線維を分解する分解剤は、式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイを含み、これにより上記課題を解決する。
【００１６】
【化１】
2016145175.tif 000003
【００１７】
前記式（１）において、ｎは、２以上の自然数であり、Ｚｎは、同一または別異の、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体である。
前記Ｚｎは、それぞれ、式（２）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体であってもよい。
【００１８】
【化２】
2016145175.tif 000004
【００１９】
前記式（２）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
前記Ｚｎは、それぞれ、式（３）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体であってもよい。
【００２０】
【化３】
2016145175.tif 000005
【００２１】
前記式（３）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
ｎが３である場合、前記Ｚｎは、それぞれ、式（４）で表される金属錯体であってもよい。
【００２２】
【化４】
2016145175.tif 000006
【００２３】
前記式（４）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
前記（Ｘ）は、同一または別異の、ハロゲン化物イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンであってもよい。
前記アミロイド線維は、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））、および／または、アミロイドβからなるペプチドを含むタンパク質からなってもよい。
本発明の神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制のための医薬は、上述のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、または、アミロイド線維を分解する分解剤を含み、これにより上記課題を解決する。
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、家族性アミロイドポリニューロパチー、心筋症、認知症、および、パーキンソン病からなる群から選択される疾患であってもよい。
前記神経変性疾患は、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））、および／または、アミロイドβからなるペプチドを含むタンパク質からなるアミロイド線維に基づいてもよい。
本発明による上述のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、または、アミロイド線維を分解する分解剤を製造する方法は、ペプチド固相合成法を用い、これにより上記課題を解決する。
前記ペプチド固相合成法は、少なくとも、固相担体に、式（５）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体を導入するステップと、前記導入されたＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体にＮ保護グルタミン酸エステルを導入するステップと、前記導入されたＮ保護グルタミン酸エステルに、式（６）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体を導入するステップと、前記導入されたＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体にさらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入するステップと、前記導入されたさらなるＮ保護グルタミン酸エステルにトリエチレングリコール鎖を導入するステップと、前記固相担体を切り離すステップとをさらに包含してもよい。
【００２４】
【化５】
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【００２５】
前記式（５）および（６）において、Ｚは、同一または別異の、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体であり、Ｐｒｏは同一または別異の保護基である。
前記Ｚは、それぞれ、式（２）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体であってもよい。
【００２６】
【化６】
2016145175.tif 000008
【００２７】
前記式（２）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
前記ペプチド固相合成法は、前記式（６）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体を導入するステップ、および、さらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入するステップを１回以上繰り返すステップをさらに包含してもよい。
本発明による神経変性疾患の予防、治療および／または進展の抑制方法は、上述の医薬を投与する。
前記タンパク質に対する前記水溶性ペプチド金属錯体アレイのモル比は、０．１以上１．０以下を満たし得る。
【発明の効果】
【００２８】
本発明による抑制剤／分解剤によれば、上述の特定の化学式（１）を満たし、多座配位子と遷移金属イオンとを含む複数の金属錯体を有する水溶性ペプチド金属錯体アレイを含む。この水溶性ペプチド金属錯体アレイは、タンパク質またはペプチドがアミロイド線維を形成するのを抑制し、さらにはアミロイド線維を分解するように作用する。このような抑制剤／分解剤は、神経性疾患の予防、治療および／または進展抑制のための医薬として有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明のペプチド固相合成法を用いた抑制剤または分解剤の製造工程を示すフローチャート
【図２】本発明のペプチド固相合成法を用いた抑制剤または分解剤を製造するプロシージャ
【図３】比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料の様子を示す図
【図４】比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料のＴＥＭ観察の結果を示す図
【図５】比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料のＣＤスペクトルを示す図
【図６】比較例６、実施例７、比較例８および比較例９の試料の様子を示す図
【図７】比較例６および実施例７の試料のＴＥＭ観察の結果を示す図
【図８】比較例６、実施例７、比較例８および比較例９の試料のＣＤスペクトルを示す図
【図９】比較例１０および実施例１１の試料のＣＤスペクトルを示す図
【図１０】比較例１０および実施例１１の試料のＴＥＭ観察の結果を示す図
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の実施の形態を説明する。本願発明者らは、非特許文献４に記載のペプチド金属錯体アレイに着目し、これを用いて鋭意工夫し、適切に改変することにより、アミロイド線維の形成の抑制、ならびに、アミロイド線維の分解に有効であることを見出した。
【００３１】
（実施の形態１）
実施の形態１では、本発明のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、アミロイド線維を分解する分解剤、および、その製造方法について説明する。
【００３２】
本発明のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、および、アミロイド線維を分解する分解剤の有効成分である水溶性ペプチド金属錯体アレイは、式（１）で表される。
【００３３】
【化７】
2016145175.tif 000009
【００３４】
式（１）において、ｎは、２以上の自然数であり、Ｚｎは、同一または別異の、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体である。なお、Ｚｎは、式（１）における繰り返し単位における金属錯体Ｚを、繰り返し数（ｎ＝２、３、４・・・）に合わせて、例えば、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４・・・のように区別するために用いられていることに留意されたい。
【００３５】
本願発明者らは、このような特定の式（１）を満たす水溶性ペプチド金属錯体アレイが、タンパク質またはペプチドがアミロイド線維を形成するのを抑制し、さらには形成したアミロイド線維を分解するように作用することを見出した。
【００３６】
好ましくは、Ｚｎは、式（２）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体である。式（２）において、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。Ｚｎが、式（２）に記載の金属錯体であれば、アミロイド線維の形成を抑制し、アミロイド線維を分解できる。
【００３７】
【化８】
2016145175.tif 000010
【００３８】
例えば、Ｒｅ＋を有する金属錯体に配位する（Ｘ）ｍは、１価のカウンターアニオンであり、ｍは１となる。１価のカウンターアニオンは、ハロゲン化物イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンである。ハロゲン化物イオンが塩化物イオンの場合、製造が容易であり得る。
【００３９】
例えば、Ｒｕ２＋またはＰｔ２＋を有する金属錯体に配位する（Ｘ）ｍは、１価または２価のカウンターアニオンである。カウンターアニオンがすべて１価である場合には、カウンターアニオンの数であるｍは２となり、カウンターアニオンが２価である場合には、ｍは１となる。１価のカウンターアニオンは、ハロゲン化物イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンである。２価のカウンターアニオンは、例えば、炭酸イオン（ＣＯ３２−）、硫酸イオン（ＳＯ４２−）等である。
【００４０】
例えば、Ｒｈ３＋またはＩｒ３＋を有する金属錯体に配位する（Ｘ）ｍは、１価、２価、３価またはこれらの組み合わせのカウンターアニオンである。カウンターアニオンが１価である場合には、カウンターアニオンの数であるｍは３となり、カウンターアニオンが１価と２価との組み合わせである場合には、ｍは２となり、カウンターアニオンが３価である場合には、ｍは１となる。１価のカウンターアニオンは、ハロゲン化物イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンである。２価のカウンターアニオンは、例えば、炭酸イオン、硫酸イオン等である。３価のカウンターアニオンは、例えば、リン酸イオン（ＰＯ４３−）等である。
【００４１】
より好ましくは、Ｚｎは、式（２）で表される金属錯体群のうち式（３）で表される金属錯体群から選択される、同一または別異の金属錯体である。ここでも、式（２）と同様に、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【００４２】
【化９】
2016145175.tif 000011
【００４３】
Ｚｎが、式（３）に記載の金属錯体であれば、上述の水溶性ペプチド金属錯体アレイを高収率で製造できるとともに、アミロイド線維の形成を抑制し、アミロイド線維を分解できる。
【００４４】
さらに好ましくは、式（１）において、ｎが３（ｎ＝３）である場合、Ｚ１〜Ｚ３は、それぞれ、式（４）で表される金属錯体である。ここでも、式（２）と同様に、（Ｘ）は、同一または別異の、１価、２価および３価からなる群から選択されるカウンターアニオンであり、ｍは、金属イオンに配位するカウンターアニオンの数であり、１以上の自然数である。
【００４５】
【化１０】
2016145175.tif 000012
【００４６】
Ｚ１〜Ｚ３が、式（４）で表される金属錯体であれば、上述の水溶性ペプチド金属錯体アレイを高収率で製造できるとともに、アミロイド線維の形成の抑制、ならびに、アミロイド線維の分解を促進できる。
【００４７】
式（４）において、（Ｘ）は、好ましくは、同一または別異の、１価のカウンターアニオンであり、ハロゲン化物イオンまたはトリフルオロ酢酸イオンある。ハロゲン化物イオンであれば特に制限はないが、製造の容易さから、好ましくは、塩化物イオンである。
【００４８】
式（１）において、ｎが２以上であれば、同様の効果が得られるが、製造の容易さ、収率、および、アミロイド線維に対する抑制・分解の効果の観点からから、ｎは３が好ましい。
【００４９】
本発明の抑制剤または分解剤は、任意のタンパク質またはペプチドがアミロイド線維を形成するのを抑制し、さらにはそのようなアミロイド線維を分解することができるが、特に、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））、および／または、アミロイドβからなるペプチドを含むタンパク質がアミロイド線維を形成するのを抑制し、このようなタンパク質からなるアミロイド線維を分解することを得意とする。
【００５０】
本発明の抑制剤または分解剤が、式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイを有効成分とする場合、例えば、タンパク質に対する水溶性ペプチド金属錯体アレイのモル比が、０．１以上１．０以下を満たすことが好ましい。この範囲であれば、アミロイド線維の形成を抑制できるとともに、アミロイド線維が分解される。
【００５１】
本発明の抑制剤または分解剤は、有効成分として式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイを含有していれば、固体または液体のいずれの形態であってもよい。例えば、薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体または液体状の医薬組成物として調製してもよい。
【００５２】
ここで、非特許文献４に記載のペプチド金属錯体アレイとの差異について述べておく。上述の式（１）の水溶性ペプチド金属錯体アレイは、非特許文献４に記載のペプチド金属錯体アレイに対して、ペプチド部位が異なっている。さらに、非特許文献４に記載のペプチド金属錯体アレイは水溶性を有さないが、上述の式（１）の水溶性ペプチド金属錯体アレイは水溶性を有する。また、非特許文献４では、ペプチド金属錯体アレイのアミロイド線維の形成の抑制あるいは分解については着目しておらず、ペプチド部位の改変によって及ぼす効果については一切開示されていないことに留意されたい。
【００５３】
次に、このような水溶性ペプチド金属錯体アレイを含むアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、または、このような水溶性ペプチド金属錯体アレイを含むアミロイド線維を分解する分解剤の例示的な製造方法について説明する。例えば、本発明の抑制剤または分解剤は、ペプチド固相合成法により製造される。図１および図２を参照して、ペプチド固相合成法を用いた製造方法を詳述する。なお、図１および図２では、簡単のため、上述の式（１）においてｎ＝２である水溶性ペプチド金属錯体アレイの製造方法を詳述する。
【００５４】
図１は、本発明のペプチド固相合成法を用いた抑制剤または分解剤の製造工程を示すフローチャートである。
図２は、本発明のペプチド固相合成法を用いた抑制剤または分解剤を製造するプロシージャである。
【００５５】
本発明の水溶性ペプチド金属錯体アレイを含有する抑制剤または分解剤は、少なくともステップＳ１１０〜ステップＳ１６０を行うペプチド固相合成法により製造される。各ステップを詳述する。
【００５６】
ステップＳ１１０：レジンなどの前処理した固相担体に、式（５）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体（図２）を導入する。例えば、レジンは、９−Ｆｍｏｃ−アミノキサンテン−３−イロキシＴＧレジン（ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧ  Ｓｉｅｂｅｒレジン）であり得る。
【００５７】
式（５）において、Ｚは、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体であり、式（１）におけるＺ１に相当する。好ましくは、Ｚは、上述の式（２）の金属錯体群から選択される。これにより、アミロイド線維の形成を抑制し、アミロイド線維を分解できる。さらに好ましくは、Ｚは、上述の式（３）の金属錯体群から選択される。これにより、アミロイド線維の形成の抑制ならびにアミロイド線維の分解が促進される。さらに好ましくは、Ｚは、上述の式（３）の金属錯体群のうち、Ｒｕ２＋を有する金属錯体である。これにより、アミロイド線維の形成の抑制ならびにアミロイド線維の分解が確実に促進される。
【００５８】
式（５）において、Ｐｒｏは保護基であるが、所定の条件下で容易に脱保護できることから、好ましくは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）である。
【００５９】
ステップＳ１１０における金属錯体の例示的な導入手順は、前処理したレジン等の固相担体に、式（５）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、ジメチルスルホキシド、塩化メチレン等のハロゲン化メチレン、次いで、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加し、撹拌すればよい。
【００６０】
なお、ステップＳ１１０において、固相担体に未反応のアミノ基がある場合には反応性を失わせるためにキャッピングを行うことが好ましい。キャッピングは既存の手順で行われる。
【００６１】
また、ステップＳ１２０に先立って、導入された式（５）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体から保護基を除去してもよい。保護基の除去は、保護基の種類に応じて、既存の手順で行われる。例えば、保護基がＦｍｏｃであれば、ピペリジンを含有する溶液で撹拌することにより容易に除去される。
【００６２】
ステップＳ１２０：ステップＳ１１０で導入されたＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体（保護基は除去されていてもよい）にＮ保護グルタミン酸エステルを導入する。このように導入されたＮ保護グルタミン酸エステルは、後述するステップＳ１６０において固相担体を切り離すことにより、カルボン酸へと変化し、ペプチド部位に水溶性を付与するので、タンパク質またはペプチド、あるいは、それらがアミロイド化したアミロイド線維に対する親和性が向上し得る。
【００６３】
ステップＳ１２０の例示的な導入手順は、ステップＳ１１０で金属錯体が導入された固相担体に、Ｎ末端をＦｍｏｃ、Ａｌｌｏｃ等の保護基で保護し、カルボン酸をｔ−ブチル基（ｔＢｕ）等の保護基で保護したグルタミン酸、ＨＢＴＵ、塩化メチレン等のハロゲン化メチレン、ジメチルスルホキシド、次いで、ＤＩＰＥＡを添加し、撹拌すればよい。
【００６４】
なお、ステップＳ１２０において、固相担体に未反応のアミノ基がある場合には反応性を失わせるためにキャッピングを行うことが好ましい。キャッピングは既存の手順で行われる。
【００６５】
また、ステップＳ１３０に先立って、導入されたＮ末端を保護基で保護されたグルタミン酸エステルから保護基を除去してもよい。保護基の除去は、上述のとおりである。
【００６６】
ステップＳ１３０：ステップＳ１１０〜Ｓ１２０で得た、金属錯体、グルタミン酸エステルが導入された固相担体に、式（６）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体（図２）を導入する。
【００６７】
式（６）において、Ｚは、多座配位子と遷移金属イオンとを含む金属錯体であり、式（１）におけるＺ２に相当する。好ましくは、Ｚは、上述の式（２）の金属錯体群から選択される。これにより、アミロイド線維の形成を抑制し、アミロイド線維を分解できる。さらに好ましくは、Ｚは、上述の式（３）の金属錯体群から選択される。これにより、アミロイド線維の形成の抑制ならびにアミロイド線維の分解が促進される。さらに好ましくは、Ｚは、上述の式（３）の金属錯体群のうち、Ｐｔ２＋を有する金属錯体である。これにより、アミロイド線維の形成の抑制ならびにアミロイド線維の分解が確実に促進される。
【００６８】
式（６）において、Ｐｒｏは保護基であるが、所定の条件下で容易に脱保護できることから、好ましくは、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）である。
【００６９】
ステップＳ１３０における金属錯体の導入の手順は、ステップＳ１１０のそれと同様である。
【００７０】
なお、ステップＳ１３０において、固相担体に未反応のアミノ基がある場合には反応性を失わせるためにキャッピングを行うことが好ましい。キャッピングは既存の手順で行われる。
【００７１】
また、ステップＳ１４０に先立って、導入された式（６）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体から保護基を除去してもよい。保護基の除去は、上述したとおりである。
【００７２】
ステップＳ１４０：ステップＳ１３０で導入されたＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体（保護基は除去されていてもよい）にさらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入する。このように導入されたＮ保護グルタミン酸エステルは、後述するステップＳ１６０において固相担体を切り離すことにより、カルボン酸へと変化し、ペプチド部位に水溶性を付与するので、タンパク質またはペプチド、あるいは、それらがアミロイド化したアミロイド線維に対する親和性が向上し得る。ステップＳ１４０におけるさらなるＮ保護グルタミン酸エステルの導入手順は、ステップＳ１２０のそれと同様である。
【００７３】
なお、ステップＳ１４０において、固相担体に未反応のアミノ基がある場合には反応性を失わせるためにキャッピングを行うことが好ましい。キャッピングは既存の手順で行われる。
【００７４】
また、ステップＳ１５０に先立って、導入されたＮ末端を保護基で保護されたグルタミン酸エステルから保護基を除去してもよい。保護基の除去は、上述のとおりである。
【００７５】
ステップＳ１５０：ステップＳ１４０で導入されたさらなるＮ保護グルタミン酸エステル（保護基は除去されていてもよい）にトリエチレングリコール鎖を導入する。これにより、ペプチド部位がさらに水溶性となるので、タンパク質またはペプチド、あるいは、それらがアミロイド化したアミロイド線維に対する親和性が向上し得る。
【００７６】
ステップＳ１５０の例示的な導入手順は、ステップＳ１１０〜Ｓ１４０で導入された金属錯体、および、グルタミン酸エステルが導入された固相担体に、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸、ＨＢＴＵ、塩化メチレン等のハロゲン化メチレン、次いで、ＤＩＰＥＡを添加し、撹拌すればよい。
【００７７】
ステップＳ１６０：固相担体を切り離す。すなわち、本発明の水溶性ペプチド金属錯体アレイを切り出す。切り離し剤としてトリフルオロ酢酸等の酸が用いられる。このようにして、上述した式（１）においてｎが２を満たす水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる抑制剤または分解剤が得られる。また、切り離しにより、導入されたＮ保護グルタミン酸エステルは、カルボン酸へと変化するので、ペプチド部位に水溶性が付与されることになる。その結果、タンパク質またはペプチド、あるいは、それらがアミロイド化したアミロイド線維に対する親和性を向上させることができる。
【００７８】
上述した式（１）において、ｎが３以上である水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる抑制剤または分解剤を製造する場合には、ステップＳ１５０に先立って、ステップＳ１３０の式（６）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体を導入するステップ、および、ステップＳ１４０のさらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入するステップを１回以上繰り返せばよい（図示せず）。
【００７９】
上述した式（１）においてｎが３を満たす水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる抑制剤、または、分解剤を得たい場合には、ステップＳ１３０およびステップＳ１４０を１回だけ繰り返せばよい。この場合、好ましくは、Ｚは、上述の式（３）の金属錯体群のうち、Ｒｈ３＋を有する金属錯体である。これにより、アミロイド線維の形成の抑制ならびにアミロイド線維の分解が確実に促進される。
【００８０】
（実施の形態２）
実施の形態２では、本発明のアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、および、アミロイド線維を分解する分解剤を含む医薬、ならびに、それを用いた治療方法について説明する。
【００８１】
実施の形態１で説明した本発明の式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイを含む、アミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、および、アミロイド線維を分解する分解剤は、アミロイド線維に起因するとされる神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制のための医薬に含有されてもよい。
【００８２】
ここで、本発明の医薬の適用対象となる神経変性疾患は、アルツハイマー病、家族性アミロイドポリニューロパチー、心筋症、認知症、および、パーキンソン病からなる群から選択される疾患である。これらは、主として、アミロイド線維に起因するとされる。
【００８３】
中でも、本発明の医薬は、含有される抑制剤または分解剤が、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））、および／または、アミロイドβ（Ａβ）からなるペプチドを含むタンパク質がアミロイド線維となるのを抑制し、分解するので、ＴＴＲ（１０５−１１５）、および／または、Ａβからなるペプチドを含むタンパク質に基づく神経変性疾患に対して、有効である。ＴＴＲ（１０５−１１５）、および／または、Ａβからなるペプチドを含むタンパク質に基づく神経変性疾患としては、代表的には、アルツハイマー病、家族性アミロイドポリニューロパチーが知られており、本発明の医薬はこれらの神経変性疾患に有効である。
【００８４】
本発明の医薬は、実施の形態１で説明した本発明の抑制剤または分解剤に加えて、１以上の調剤用添加物を含む。経口投与に適した医薬として、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤等がある。非経口投与に適した医薬として、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、軟膏剤、クリーム、貼付剤等がある。これらの調剤用添加物としては、乳糖、オリゴ糖等の賦形剤、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、色素、気借財、ｐＨ調整剤、安定化剤、粘着剤等がある。
【００８５】
本発明の医薬を、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物等に適用させてもよい。例えば、機能性食品、栄養補助剤、飲食物として使用する場合、本発明の医薬を、甘味料、香辛料、調味料等とともに用いてもよい。この場合、固形状、液体状、ゼリー状等形態を問わない。
【００８６】
本発明の医薬を用いた治療方法としては、本発明の医薬を人に投与すれば、神経変性疾患の予防、治療および／または進展の抑制に有効である。その投与量は、神経変性疾患に寄与するタンパク質に対する医薬中の式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイのモル比が０．１以上１．０以下を満たすことが好ましい。これにより、予防、治療および／または進展の抑制を促進できる。例えば、有効成分量として、成人一日あたり１０ｍｇ〜１０ｇ、より好ましくは、１５ｍｇ〜５ｍｇである。
【００８７】
次に具体的な実施例を用いて本発明を詳述するが、本発明がこれら実施例に限定されないことに留意されたい。
【実施例】
【００８８】
［実施例１］
実施例１では、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物を、図１および図２を参照して詳述した固相ペプチド合成法を用いて製造した。式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイは、式（１）において、ｎが３であり、Ｚｎが式（４）を満たす場合に相当する。図１および図２を参照し、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイの製造方法を説明する。
【００８９】
【化１１】
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【００９０】
固相担体として、９−Ｆｍｏｃ−アミノキサンテン−３−イロキシＴＧレジン（ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧ  Ｓｉｅｂｅｒレジン）用いた。レジンを次の手順で前処理した。レジン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製、０．２１ｍｍｏｌ／ｇ、２７．６μｍ、１３０ｍｇ）を含有する塩化メチレン懸濁液（１．０ｍＬ）にピペリジンの２５％ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、２５℃で５時間撹拌後、溶液を除去した。次いで、レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×４回）。
【００９１】
前処理したレジンに式（８）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体（Ｒｕ錯体と呼ぶ）を導入した（図１および図２のステップＳ１１０）。
【００９２】
【化１２】
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【００９３】
前処理したレジンにＲｕ錯体（５５．４μｍｏｌ、７０．２ｍｇ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（８３．１μｍｏｌ、３１．６ｍｇ）、ジメチルスルホキシド（４．５ｍＬ）、塩化メチレン（０．５ｍＬ）、および、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（５０μＬ）を順番に加え、２５℃で１２時間撹拌し、溶液をデカンテーションで除去した。レジンをジメチルスルホキシドで洗浄（３ｍＬ×３回）後、さらにメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）し、最後に塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【００９４】
次に、レジンに導入されたＲｕ錯体（以降では、レジンに導入されたものを、簡単のため単にレジンと呼ぶ）上の未反応アミノ基を次の手順でキャッピングした。洗浄後のレジンに安息香酸無水物（１．５ｍｍｏｌ、３３９ｍｇ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１．５ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）および塩化メチレン（３．０ｍＬ）を加え、２５℃で２時間撹拌後、溶液を除去した。次いで、レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【００９５】
次に、保護基であるＦｍｏｃ基を次の手順で除去した。洗浄後のレジンにピペリジンの２５％ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、２５℃で５時間撹拌後、溶液を除去した。次いで、レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×４回）。洗浄液中の脱離Ｆｍｏｃ基を吸収スペクトル測定（３００ｎｍ）により定量した結果、Ｒｕ錯体の導入量は２０．２μｍｏｌ（７４％）であった。
【００９６】
式（８）で表されるＲｕ錯体にＮ保護グルタミン酸エステルを導入した（図１および図２のステップＳ１２０）。
【００９７】
レジン（詳細には、ステップＳ１１０で得られた、保護基Ｆｍｏｃ基が除去されたＲｕ錯体が導入されたレジン）に、Ｎ末端をＦｍｏｃ基、側鎖カルボン酸をｔＢｕ基で保護されたグルタミン酸（１００．９μｍｏｌ、４４．７ｍｇ）、ＨＢＴＵ（１５１．４μｍｏｌ、５７．６ｍｇ）、塩化メチレン（４．５ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（０．５ｍＬ）、および、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ）を順番に加え、２５℃で１２時間撹拌し、溶液をデカンテーションで除去した。これをジメチルスルホキシドで洗浄（３ｍＬ×３回）後、さらにメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【００９８】
次に、レジン上の未反応アミノ基を次の手順でキャッピングした。洗浄後のレジンに安息香酸無水物（１．５ｍｍｏｌ、３３９ｍｇ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１．５ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）、塩化メチレン（３．０ｍＬ）を加え、２５℃で２時間撹拌後、溶液を除去した。レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【００９９】
次に、保護基であるＦｍｏｃ基を次の手順で除去した。洗浄後のレジンにピペリジンの２５％ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、２５℃で５時間撹拌後、溶液を除去した。レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×４回）。洗浄液中の脱離Ｆｍｏｃ基を吸収スペクトル測定（３００ｎｍ）により定量した結果、グルタミン酸エステルの導入量は１９．３μｍｏｌ（９６％）であった。
【０１００】
ステップＳ１２０で導入されたＮ保護グルタミン酸エステルに、式（９）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体（Ｐｔ錯体と呼ぶ）を導入した（図１および図２のステップＳ１３０）。
【０１０１】
【化１３】
2016145175.tif 000015
【０１０２】
レジン（ステップＳ１１０〜Ｓ１２０で得られた、保護基Ｆｍｏｃ基が除去された、Ｒｕ錯体およびグルタミン酸エステルが導入されたレジン）に、Ｐｔ錯体（３８．６μｍｏｌ、３６．７ｍｇ）、ＨＢＴＵ（５７．９μｍｏｌ、２２．０ｍｇ）、ジメチルスルホキシド（４．５ｍＬ）、塩化メチレン（０．５ｍＬ）、および、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ）を順番に加え、２５℃で１２時間撹拌し、溶液をデカンテーションで除去した。レジンをジメチルスルホキシドで洗浄（３ｍＬ×３回）後、さらにメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）し、最後に塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１０３】
次に、レジン上の未反応アミノ基を次の手順でキャッピングした。洗浄後のレシンに安息香酸無水物（１．５ｍｍｏｌ、３３９ｍｇ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１．５ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）、塩化メチレン（３．０ｍＬ）を加え、２５℃で２時間撹拌後、溶液を除去した。次いで、レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）で交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１０４】
次に、保護基であるＦｍｏｃ基を次の手順で除去した。洗浄後のレジンにピペリジンの２５％ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、２５℃で５時間撹拌後、溶液を除去した。次いで、レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０  ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×４回）。洗浄液中の脱離Ｆｍｏｃ基を吸収スペクトル測定（３００ｎｍ）により定量した結果、Ｐｔ錯体の導入量は１５．６μｍｏｌ（８１％）であった。
【０１０５】
式（９）で表されるＰｔ錯体にさらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入した（図１およびお図２のステップＳ１４０）。
【０１０６】
レジン（詳細には、ステップＳ１１０〜Ｓ１３０で得られた、保護基Ｆｍｏｃ基が除去された、Ｒｕ錯体、グルタミン酸エステルおよびＰｔ錯体が導入されたレジン）に、Ｎ末端をＦｍｏｃ基、側鎖カルボン酸をｔＢｕ基で保護されたグルタミン酸（７８．１μｍｏｌ、３４．６ｍｇ）、ＨＢＴＵ（１１７．２μｍｏｌ、４４．６ｍｇ）、塩化メチレン（４．５ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（０．５ｍＬ）、および、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ）を順番に加え、２５℃で１２時間撹拌し、溶液をデカンテーションで除去した。これをジメチルスルホキシドで洗浄（３ｍＬ×３回）後、さらにメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１０７】
次に、レジン上の未反応アミノ基を次の手順でキャッピングした。洗浄後のレシンに安息香酸無水物（１．５ｍｍｏｌ、３３９ｍｇ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１．５ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）、塩化メチレン（３．０ｍＬ）を加え、２５℃で２時間撹拌後、溶液を除去した。レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１０８】
次に、保護基であるＦｍｏｃ基を次の手順で除去した。洗浄後のレジンにピペリジンの２５％ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、２５℃で５時間撹拌後、溶液を除去した。レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×４回）。洗浄液中の脱離Ｆｍｏｃ基を吸収スペクトル測定（３００ｎｍ）により定量した結果、グルタミン酸エステルの導入量は１２．９μｍｏｌ（８３％）であった。
【０１０９】
上述のステップＳ１３０およびＳ１４０を１回繰り返した。ただし、ステップＳ１３０のＰｔ錯体に代えて、式（１０）で表されるＮ保護アミノ酸に結合した金属錯体（Ｒｈ錯体と呼ぶ）を導入した。すなわち、ステップＳ１４０で導入されたＮ保護グルタミン酸エステルに、式（１０）で表されるＲｈ錯体、次いで、さらなるＮ保護グルタミン酸エステルを導入した。
【０１１０】
【化１４】
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【０１１１】
レジン（ステップＳ１１０〜Ｓ１４０で得られた、保護基Ｆｍｏｃ基が除去された、Ｒｕ錯体、Ｐｔ錯体およびグルタミン酸エステルが導入されたレジン）に、Ｒｈ錯体（２５．８μｍｏｌ、２４．０ｍｇ）、ＨＢＴＵ（３８．７μｍｏｌ、１４．７ｍｇ）、ジメチルスルホキシド（５．０ｍＬ）、および、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ）を順番に加え、２５℃で１２時間撹拌し、溶液をデカンテーションで除去した。レジンをジメチルスルホキシドで洗浄（３ｍＬ×３回）後、さらにメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）し、最後に塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１１２】
次に、レジン上の未反応アミノ基を次の手順でキャッピングした。洗浄後のレシンに安息香酸無水物（１．５ｍｍｏｌ、３３９ｍｇ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１．５ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）、塩化メチレン（３．０ｍＬ）を加え、２５℃で２時間撹拌後、溶液を除去した。次いで、レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１１３】
次に、保護基であるＦｍｏｃ基を次の手順で除去した。洗浄後のレジンにピペリジンの２５％ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、２５℃で５時間撹拌後、溶液を除去した。次いで、レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×４回）。洗浄液中の脱離Ｆｍｏｃ基を吸収スペクトル測定（３００ｎｍ）により定量した結果、Ｒｈ錯体の導入量は１１．４μｍｏｌ（８８％）であった。
【０１１４】
次いで、さらなるＮ保護グルタミン酸エステルを次の手順で導入した。レジンに、Ｎ末端をＦｍｏｃ基、側鎖カルボン酸をｔＢｕ基で保護されたグルタミン酸（５６．９μｍｏｌ、２５．２ｍｇ）、ＨＢＴＵ（８５．４μｍｏｌ、３２．５ｍｇ）、塩化メチレン（４．５ｍＬ）、ジメチルスルホキシド（０．５ｍＬ）、および、ＤＩＰＥＡ  （５０  μＬ）を順番に加え、２５℃で１２時間撹拌し、溶液をデカンテーションで除去した。これをジメチルスルホキシドで洗浄（３ｍＬ×３回）後、さらにメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、最後に塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１１５】
次に、レジン上の未反応アミノ基を次の手順でキャッピングした。洗浄後のレジンに安息香酸無水物（１．５ｍｍｏｌ、３３９ｍｇ）、Ｎ−メチルイミダゾール（１．５ｍｍｏｌ、０．１２ｍＬ）、塩化メチレン（３．０ｍＬ）を加え、２５℃で２時間撹拌後、溶液を除去した。レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１１６】
次に、保護基であるＦｍｏｃ基を次の手順で除去した。洗浄後のレジンにピペリジンの２５％ジメチルホルムアミド溶液（４．０ｍＬ）を加え、２５℃で５時間撹拌後、溶液を除去した。レジンをメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、さらに塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×４回）。洗浄液中の脱離Ｆｍｏｃ基を吸収スペクトル測定（３００ｎｍ）により定量した結果、グルタミン酸エステルの導入量は９．７μｍｏｌ（８５％）であった。
【０１１７】
導入されたさらなるＮ保護グルタミン酸エステルにトリエチレングリコール鎖を導入した（図１およびお図２のステップＳ１５０）。
【０１１８】
レジン（ステップＳ１１０〜Ｓ１４０（繰り返しのステップＳ１３０およびＳ１４０を含む）で得られた、保護基Ｆｍｏｃ基が除去された、Ｒｕ錯体、Ｐｔ錯体、Ｒｈ錯体およびグルタミン酸エステルが導入されたレジン）に、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸（９６．８μｍｏｌ、１７．２ｍｇ）、ＨＢＴＵ（１４５．２μｍｏｌ、５５．３ｍｇ）、塩化メチレン（５．０ｍＬ）、および、ＤＩＰＥＡ（５０μＬ）を順番に加え、２５℃で１２時間撹拌し、溶液をデカンテーションで除去した。これをジメチルスルホキシドで洗浄（３ｍＬ×３回）後、さらにメタノール（３．０ｍＬ）と塩化メチレン（３．０ｍＬ）とで交互に洗浄（３サイクル）後、最後に塩化メチレンで洗浄した（３ｍＬ×３回）。
【０１１９】
固相担体を切り離した（図１および図２のステップＳ１６０）。
【０１２０】
レジンをジエチルエーテルで洗浄（４ｍＬ×３回）し、乾燥した。塩化メチレン（０．５ｍＬ）を加えて、５分間静置後、ＣＦ３ＣＯ２Ｈ（０．１ｍＬ）およびＥｔ３ＳｉＨ（２０μＬ）を含む１，２−ジクロロエタン（１．９ｍＬ）を加え、２５℃で１時間静置し、溶液をデカンテーションで分離した。この操作を溶液が無色になるまで繰り返し、得られた溶液を全てまとめた後、乾固した。残渣をジメチルスルホキシドに溶解させ、酢酸エチルを加えた。生じた沈殿をろ別し、メタノールで洗浄した後、減圧乾燥し、赤色固体（７．３ｍｇ）が得られた。
【０１２１】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化法および飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ジスラノール）により、この赤色固体が、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイであることを確認した。結果を示す。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：Ｃ１４０Ｈ１３０Ｃｌ２Ｎ２０Ｏ２０ＰｔＲｈＲｕ（［Ｍ-２Ｃｌ−３ＣＦ３ＣＯ２］＋）のｍ／ｚ理論値２８８１．６９、実測値２８８２．０７．
【０１２２】
次に、比較例２、実施例３、比較例４および比較例５において、タンパク質またはペプチドのアミロイド線維の形成に対する抑制効果について調べた。
【０１２３】
［比較例２］
比較例２では、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））からなるペプチドを含有するタンパク質（以降では単にＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドと称する）を用い、これのアミロイド線維を得た。
【０１２４】
ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドをアセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリル：水＝１：９（体積比））に溶かし、ＨＣｌを添加し、ｐＨを２．０に調整した。この溶液中のペプチドの濃度は８００μＭであった。この溶液を３７℃で１４日間保持し、目視観察した。結果を図３（Ａ）に示す。次いで、この溶液の濃度を半分に希釈し、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）により観察した。結果を図４（Ａ）に示す。この溶液の円偏光２色性（ＣＤ）スペクトルを測定し、二次構造を評価した。結果を図５に示す。
【０１２５】
［実施例３］
実施例３では、ＴＴＲ（１０５−１１５）を用い、実施例１で得た式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイペプチドからなる組成物（単にＲｕＰｔＲｈ錯体アレイと呼ぶ）のアミロイド線維の形成に対する抑制効果を調べた。
【０１２６】
ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドおよびＲｕＰｔＲｈ錯体アレイを、アセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリル：水＝１：９（体積比））に溶かし、ＨＣｌを添加し、ｐＨを２．０に調整した。ここで、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドとＲｕＰｔＲｈ錯体アレイとのモル比（ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチド：ＲｕＰｔＲｈ錯体アレイ）は、８：１であった。すなわち、ペプチド（タンパク質）に対するＲｕＰｔＲｈ錯体アレイのモル比は、０．１２５であった。この溶液中のペプチドの濃度は８００μＭであった。この溶液を３７℃で１４日間保持し、目視観察した。結果を図３（Ｂ）に示す。次いで、この溶液の濃度を半分に希釈し、ＴＥＭ観察し、ＣＤスペクトルを測定した。結果を図４（Ｂ）および図５に示す。
【０１２７】
［比較例４］
比較例４では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドを用い、式（８）で表されるＲｕ錯体（実施例１で用いたＲｕ錯体と同じ）のアミロイド線維の形成に対する抑制効果を調べた。
【０１２８】
比較例４は、実施例３のＲｕＰｔＲｈ錯体アレイに代えて、Ｒｕ錯体を用いた以外は、同様の手順であった。目視観察、ＴＥＭ観察およびＣＤスペクトル測定の結果を、図３（Ｃ）、図４（Ｃ）および図５に示す。
【０１２９】
［比較例５］
比較例５では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドを用い、式（１１）で表されるＰｔ錯体のアミロイド線維の形成に対する抑制効果を調べた。
【０１３０】
【化１５】
2016145175.tif 000017
【０１３１】
比較例５は、実施例３のＲｕＰｔＲｈ錯体アレイに代えて、式（１１）で表されるＰｔ錯体を用いた以外は、同様の手順であった。目視観察、ＴＥＭ観察およびＣＤスペクトル測定の結果を、図３（Ｄ）、図４（Ｄ）および図５に示す。
【０１３２】
以上の比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の実験条件について表１にまとめ、以上の結果を説明する。
【０１３３】
【表１】
2016145175.tif 000018
【０１３４】
図３は、比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料の様子を示す図である。
【０１３５】
図３（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料の様子である。図３ではグレースケールで示すため、明瞭ではないが、図３（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、繊維状会合体を示したが、図３（Ｂ）は、繊維状会合体を示すことなく、透明であった。
【０１３６】
図４は、比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料のＴＥＭ観察の結果を示す図である。
【０１３７】
図４（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料のＴＥＭ観察の結果である。図４（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、ナノスケールの太さを有する繊維構造を示したが、図４（Ｂ）は、繊維構造を示さなかった。
【０１３８】
図５は、比較例２、実施例３、比較例４および比較例５の試料のＣＤスペクトルを示す図である。
【０１３９】
比較例２、比較例４および比較例５の試料のＣＤスペクトルは、いずれも、βシート構造特有のパターンを示した。このことは、比較例２、比較例４および比較例５の試料では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドのアミロイド化が、βシート構造の形成を介して進んでいることを示唆している。一方、実施例３の試料のＣＤスペクトルは、ランダムコイル構造特有のパターンを示した。このことは、実施例３の試料では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドのアミロイド化が二次構造レベルで抑制されていることを示す。
【０１４０】
以上の結果から、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物は、タンパク質またはペプチドがアミロイド線維を形成するのを抑制する抑制剤として機能するこを確認した。
【０１４１】
また、実施例３と比較例４および５とを比較すれば、任意の金属錯体にはタンパク質またはペプチドがアミロイド線維を形成するのを抑制する効果はないが、複数の任意の金属錯体が特定の水溶性ペプチド部位に結合することによって、抑制効果を発揮し得ることが示唆される。このことは、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイの一般式である式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物においても同様に抑制剤として機能することを示す。
【０１４２】
次に、比較例６、実施例７、比較例８および比較例９において、タンパク質またはペプチドからなるアミロイド線維に対する分解効果について調べた。
【０１４３】
［比較例６］
比較例６では、トランスサイレチンの１０５−１１５残基（ＴＴＲ（１０５−１１５））からなるペプチドを含有するタンパク質を用い、これのアミロイド線維を得た。
【０１４４】
ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドをアセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリル：水＝１：９（体積比））に溶かし、ＨＣｌを添加し、ｐＨを２．０に調整した。この溶液中のペプチドの濃度は１６００μＭであった。この溶液を３７℃で２６日間保持し、アミロイド線維を形成した。
【０１４５】
この試料を４分割し、そのうち１つを、同量のアセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリル：水＝１：９（体積比））で希釈した。この溶液中のペプチドの濃度は８００μＭであった。この溶液をさらに３７℃で１４日間保持し、目視観察した。結果を図６（Ａ）に示す。次いで、この溶液の濃度を半分に希釈し、ＴＥＭ観察およびＣＤスペクトル測定をした。結果を図７（Ａ）および図８に示す。
【０１４６】
［実施例７］
実施例７では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドを用い、実施例１で得た式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物（単にＲｕＰｔＲｈ錯体アレイと呼ぶ）のアミロイド線維に対する分解効果を調べた。
【０１４７】
比較例６において４分割したうちの１つに、ＲｕＰｔＲｈ錯体アレイ、および、アセトニトリルと水との混合溶媒（アセトニトリル：水＝１：９（体積比）、ｐＨ＝２．０）を添加した。この溶液中のペプチドの濃度およびＲｕＰｔＲｈ錯体アレイの濃度は、それぞれ、８００μＭおよび２００μＭであった。すなわち、ペプチド（タンパク質）に対するＲｕＰｔＲｈ錯体アレイのモル比は、０．２５であった。この溶液を３７℃で１４日間保持し、目視観察した。結果を図６（Ｂ）に示す。次いで、この溶液の濃度を半分に希釈し、ＴＥＭ観察し、ＣＤスペクトルを測定した。結果を図７（Ｂ）および図８に示す。
【０１４８】
［比較例８］
比較例８では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドを用い、式（８）で表されるＲｕ錯体のアミロイド線維に対する分解効果を調べた。
【０１４９】
比較例８は、実施例７のＲｕＰｔＲｈ錯体アレイに代えて、Ｒｕ錯体を用いた以外は、同様の手順であった。目視観察およびＣＤスペクトル測定の結果を、図６（Ｃ）および図８に示す。
【０１５０】
［比較例９］
比較例９では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドを用い、式（１１）で表されるＰｔ錯体のアミロイド線維に対する分解効果を調べた。
【０１５１】
比較例９は、実施例７のＲｕＰｔＲｈ錯体アレイに代えて、式（１１）で表されるＰｔ錯体を用いた以外は、同様の手順であった。目視観察およびＣＤスペクトル測定の結果を、図６（Ｄ）および図８に示す。
【０１５２】
以上の比較例６、実施例７、比較例８および比較例９の実験条件について表２にまとめ、以上の結果を説明する。
【０１５３】
【表２】
2016145175.tif 000019
【０１５４】
図６は、比較例６、実施例７、比較例８および比較例９の試料の様子を示す図である。
【０１５５】
図６（Ａ）〜（Ｄ）は、それぞれ、比較例６、実施例７、比較例８および比較例９の試料の様子である。図６ではグレースケールで示すため、明瞭ではないが、図６（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、形成された繊維状会合体に変化はなかったが、図６（Ｂ）は、形成された繊維状会合体が減少し、より透明であった。
【０１５６】
図７は、比較例６および実施例７の試料のＴＥＭ観察の結果を示す図である。
【０１５７】
図７（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、比較例６および実施例７の試料のＴＥＭ観察の結果である。図７（Ａ）は、ナノスケールの太さを有する繊維構造を示したが、図７（Ｂ）は、繊維構造を示さなかった。
【０１５８】
図８は、比較例６、実施例７、比較例８および比較例９の試料のＣＤスペクトルを示す図である。
【０１５９】
比較例６、比較例８および比較例９の試料のＣＤスペクトルは、いずれも、βシート構造特有のパターンを示した。このことは、比較例６、比較例８および比較例９の試料では、βシート構造の形成を介してＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドのアミロイド線維が形成されていることを示唆している。一方、実施例７の試料のＣＤスペクトルは、ランダムコイル構造特有のパターンを示した。このことは、実施例７の試料では、ＴＴＲ（１０５−１１５）ペプチドからなるアミロイド線維の分解が二次構造レベルで生じていることを示す。
【０１６０】
、
上述したように、これまでは母体タンパク質であるＴＴＲのアミロイド化阻害については、ＴＴＲの高次構造を安定化するという方針で抑制剤の設計が行われてきたため、形成されたアミロイド線維は分解されなかった。これに対し、注目すべきは、本発明の水溶性ペプチド金属錯体アレイはβシート構造をランダムコイル構造に変化させる能力を有しており、アミロイド線維を分解することができる点にある。
【０１６１】
以上の結果から、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物は、タンパク質またはペプチドからなるアミロイド線維を分解する分解剤として機能するこを確認した。
【０１６２】
また、実施例７と比較例８および９とを比較すれば、任意の金属錯体にはタンパク質またはペプチドからなるアミロイド線維を分解する効果はないが、複数の任意の金属錯体が特定の水溶性ペプチド部位に結合することによって、分解効果を発揮し得ることが示唆される。このことは、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイの一般式である式（１）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物においても同様に分解剤として機能することを示す。
【０１６３】
次に、比較例１０および実施例１１において、別のタンパク質またはペプチドのアミロイド線維の形成に対する抑制効果について調べた。
【０１６４】
［比較例１０］
比較例１０では、アミロイドβ（Ａβ）ペプチド（１−４２）を含有するタンパク質（以降では単にＡβ（１−４２）ペプチドと称する）を用い、これのアミロイド線維を得た。
【０１６５】
Ａβ（１−４２）ペプチドを０．１％アンモニア水に溶解し、０．５ｍＭの溶液を調整した。この溶液をアセトニトリルとリン酸バッファーとの混合溶媒（アセトニトリル：リン酸バッファー＝１：１９（体積比））で希釈し、２０μＭの溶液（ｐＨ＝７．４）とした。この溶液を２５℃で２４時間保持し、ＣＤスペクトルを測定した。結果を図９に示す。さらにこの溶液を２５℃で９日間保持し、ＴＥＭ観察をした。結果を図１０（Ａ）に示す。
【０１６６】
［実施例１１］
実施例１１では、Ａβ（１−４２）ペプチドを用い、実施例１で得た式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物（単にＲｕＰｔＲｈ錯体アレイと呼ぶ）のアミロイド線維の形成に対する抑制効果を調べた。
【０１６７】
Ａβ（１−４２）ペプチドとＲｕＰｔＲｈ錯体アレイとを０．１％アンモニア水に溶解し、０．５ｍＭの溶液を調整した。ここで、Ａβ（１−４２）とＲｕＰｔＲｈ錯体アレイとのモル比（Ａβ（１−４２）：ＲｕＰｔＲｈ錯体アレイ）は、２：１であった。すなわち、ペプチド（タンパク質）に対するＲｕＰｔＲｈ錯体アレイのモル比は、０．５であった。この溶液をアセトニトリルとリン酸バッファーとの混合溶媒（アセトニトリル：リン酸バッファー＝１：１９（体積比））で希釈し、２０μＭの溶液（ｐＨ＝７．４）とした。この溶液を２５℃で２４時間保持し、ＣＤスペクトルを測定した。結果を図９に示す。さらにこの溶液を２５℃で９日間保持し、ＴＥＭ観察をした。結果を図１０（Ｂ）に示す。
【０１６８】
図９は、比較例１０および実施例１１の試料のＣＤスペクトルを示す図である。
【０１６９】
比較例１０の試料のＣＤスペクトルは、βシート構造特有のパターンを示しており、Ａβ（１−４２）ペプチドのアミロイド化が、βシート構造の形成を介して進んでいることを示唆している。一方、実施例１１の試料のＣＤスペクトルは、ランダムコイル構造特有のパターンを示した。このことは、実施例１１の試料では、Ａβ（１−４２）ペプチドのアミロイド化が二次構造レベルで抑制されていることを示す。
【０１７０】
図１０は、比較例１０および実施例１１の試料のＴＥＭ観察の結果を示す図である。
【０１７１】
図１０（Ａ）および（Ｂ）は、それぞれ、比較例１０および実施例１１の試料のＴＥＭ観察の結果である。図１０（Ａ）は、ナノスケールの太さを有する繊維構造を示したが、図１０（Ｂ）は、繊維構造を示さなかった。
【０１７２】
以上の結果から、式（７）で表される水溶性ペプチド金属錯体アレイからなる組成物は、タンパク質またはペプチドがアミロイド線維を形成するのを抑制する抑制剤として機能するこを確認した。
【０１７３】
実施例３、実施例７および実施例１１の結果から、本発明の組成物によるアミロイド線維の形成の抑制／分解の効果は、特定のタンパク質またはペプチドに限るものではなく、任意のタンパク質またはペプチドに対して同様に効果を発揮することが示唆される。
【０１７４】
また、本発明の組成物は、タンパク質またはペプチドのアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤、ならびに、アミロイド線維を分解する分解剤として機能することから、本発明の組成物を含有する医薬は、アミロイド線維に起因する神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制し得ることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明の抑制剤／分解剤は、タンパク質またはペプチドがアミロイド線維を形成するのを抑制し、さらにはアミロイド線維を分解するよう作用するので、神経変性疾患の予防、治療および／または進展抑制に有効であり、このような抑制剤／分解剤を用いた医薬、化粧品、機能性食品、栄養補助剤、飲食物にも有利である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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