(57)【要約】【課題】培養後の微生物の生存期間を長期化させることができる、あるいは、土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させることができる、簡単かつ低コストな方法等を提供する。【解決手段】本発明は、培養後の微生物の生存期間を長期化させる方法であって、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたことを特徴とする。また、本発明は、土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させる方法であって、土壌に生息する微生物に二酸化ケイ素を供給したことを特徴とする。また、本発明の微生物製剤は、培養後の微生物を付着させた二酸化ケイ素により構成されたことを特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養後の微生物の生存期間を長期化させる方法であって、
培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたことを特徴とする微生物の生存期間を長期化させる方法。
【請求項２】
微生物を培養した菌液と二酸化ケイ素とを混合して、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたことを特徴とする請求項１に記載の微生物の生存期間を長期化させる方法。
【請求項３】
土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させる方法であって、
土壌に生息する微生物に二酸化ケイ素を供給したことを特徴とする微生物の生存期間を長期化させる方法。
【請求項４】
培養後の微生物を付着させた二酸化ケイ素により構成されたことを特徴とする微生物製剤。
【請求項５】
請求項４に記載の微生物製剤の製造方法であって、微生物を培養した菌液に二酸化ケイ素を加えて、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたことを特徴とする微生物製剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の生存期間を長期化させる方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物は、汚染物質を分解させるために用いられたり、土壌改良、医療用等に幅広く利用されている。
例えば、微生物を利用して汚染土壌を浄化する方法として、主として、浄化対象とする汚染土壌中の油等の汚染物質の分解に寄与する石油分解菌等の微生物を汚染土壌に供給して汚染土壌を浄化するバイオオーグメンテーション（例えば特許文献１等参照）と、浄化対象とする汚染土壌中に生息する汚染物質の分解や除去に寄与する微生物を活性化させて汚染土壌を浄化するバイオスティミュレーションと、が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−６２１５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
所定の濃度まで培養された微生物や土中に生存する微生物の活性及び濃度は徐々に減少するため、微生物の生存期間を長期化させ、微生物の活性及び濃度を長期間維持させることが好ましい。
例えば、バイオオーグメンテーションにおいて目的とする所定の浄化性能を達成するためには、培養直後の活性の高い微生物を汚染土壌に供給（添加）することが重要となるが、浄化工事の進捗状況によっては、培養直後の活性の高い微生物を汚染土壌に供給することができないことがあり、この場合、培養後の微生物を低温状態に維持して微生物の活性や濃度の減少を緩やかにするようにしている。即ち、培養後の微生物を低温状態に維持して微生物の生存期間を長期化させるようにしている。
しかしながら、実際の浄化工事においては、対象となる土量に比例して大量の微生物を使用するため、このような大量の微生物を低温状態に維持するためには、業務用の大型の冷蔵庫等の設備が何台も必要となり、このような何台もの大型の設備を準備することは、設置場所の確保やコスト等から考えて採用し難い。
また、バイオスティミュレーションにおいては、浄化対象とする汚染土壌中に生息する汚染物質の分解や除去に寄与する微生物を活性化させるため、汚染土壌の温度・ｐＨ・水分・酸素・栄養塩などの様々な環境要因が整っていなければならず、環境要因が整っていなければ微生物が早期に死滅する可能性もあり、この場合、バイオスティミュレーションによる浄化効果が得られない。
【０００５】
本発明は、培養後の微生物の生存期間を長期化させることができる、あるいは、土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させることができる、簡単かつ低コストな方法等を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明に係る微生物の生存期間を長期化させる方法は、培養後の微生物の生存期間を長期化させる方法であって、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたので、二酸化ケイ素に付着した微生物の生存期間が長くなり、培養後の微生物の生存期間を簡単かつ低コストな方法で長期化させることができる。
また、微生物を培養した菌液と二酸化ケイ素とを混合して、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたので、二酸化ケイ素に付着した微生物の生存期間が長くなり、培養後の微生物の生存期間を長期化させることができる。
また、本発明に係る微生物の生存期間を長期化させる方法は、土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させる方法であって、土壌に生息する微生物に二酸化ケイ素を供給したので、土壌に生息する微生物が二酸化ケイ素に付着し、二酸化ケイ素に付着した微生物の生存期間が長くなり、土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させることができる。
また、本発明に係る微生物製剤は、培養後の微生物を付着させた二酸化ケイ素により構成されたので、微生物の生存期間が長い微生物製剤を得ることができる。また、軽量な二酸化ケイ素に培養後の微生物を付着した構成であるので、重量あたりの菌体数の多い、軽量でかつ取扱い容易であるとともに、環境適合性が高い微生物製剤を得ることができる。
さらに、本発明に係る微生物製剤の製造方法は、微生物を培養した菌液に二酸化ケイ素を加えて、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させるので、簡単に製造できる。また、菌液濃度や二酸化ケイ素の量を調整することで、目的に適した微生物濃度の微生物製剤を容易に製造できる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】二酸化ケイ素に付着させたRhodococcus  erythropolis  NDKK6の生存率を示す図。
【図２】Rhodococcus  erythropolis  NDKK6の培養液中での生存率を示す図。
【図３】二酸化ケイ素に付着させたGordonia  terrae  NDKY76Aの生存率を示す図。
【図４】Gordonia  terrae  NDKY76Aの培養液中での生存率を示す図。
【図５】二酸化ケイ素に付着させたBacillus  subtilis（natto）Takahashiの生存率示す図。
【図６】二酸化ケイ素の四面体構造を示す図。
【図７】二酸化ケイ素のシート状構造を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
実施形態１
培養後の微生物を二酸化ケイ素（シリカ）に付着させたことによって、二酸化ケイ素に付着した培養後の微生物の生存期間を長期化できることを、以下の実験により確認した。
・実験対象とした菌種
以下の３種類の菌について、それぞれ以下の実験を行って培養後の菌の生存率を求めた。
（１）Rhodococcus  erythropolis  NDKK6（→Rhdococcus sp.RN1（受託番号：FERM  P-20708））。
（２）Gordonia  terrae  NDKY76A（→Gordonia sp.RN2（受託番号：FERM  P-20709))。
（３）Bacillus  subtilis（natto）Takahashi(入手元「有限会社  ▲高▼橋祐蔵研究所」）。
【０００９】
・実験手順
（１）100mlのLB（Luria-Bertani）液体培地（以下、LB培地という）にて上述した各菌を30℃で振盪培養を行った（菌体数が飽和に達したと判断（約108cells/ml〜109cells/ml）されるまで培養した）後、LB培地を遠心分離（4℃において5000rpmの遠心分離を5分間行った。）し、菌体を洗浄した後、蒸留水で懸濁したものを供試用の菌液とし、当該菌液中の生菌数（二酸化ケイ素を添加前の最大生菌数）を計数した。
当該菌液をシャーレ上に敷き詰められた二酸化ケイ素5gの上に滴下し、撹拌しながら約1時間〜3時間自然乾燥させた。菌体を付着させた二酸化ケイ素5gは、コニカルチューブに移し替え、30℃で静置した。次に、菌体を付着後の二酸化ケイ素を滅菌水にて希釈混合し、平板培地に塗抹後、所定時間経過後に生菌数（二酸化ケイ素を添加して所定時間経過後の生菌数）を計数した。
（２）そして、（二酸化ケイ素を添加して所定時間経過後の生菌数）／（二酸化ケイ素を添加前の最大生菌数）＝生存率と定義した。
【００１０】
・二酸化ケイ素に付着させたRhodococcus  erythropolis  NDKK6の生存率
上述した実験において、Rhodococcus  erythropolis  NDKK6を二酸化ケイ素に付着させた場合における、Rhodococcus  erythropolis  NDKK6の生存率の変化を、図１（ａ）の表、図１（ｂ）のグラフに示す。
・Rhodococcus  erythropolis  NDKK6の培養液中での生存率
LB培地で72時間培養したRhodococcus  erythropolis  NDKK6の培養液(5.5×109cells/ml）を作製した。その菌液を室温（25℃）で保存し、LB寒天培地を用い、生存率を測定した。この場合の生存率の変化を、図２（ａ）の表、図２（ｂ）のグラフに示す。
実験結果から、培養液中でのRhodococcus  erythropolis  NDKK6の生存率は、時間が経過する毎に徐々に小さくなり（生菌数が徐々に少なくなっていき）、5週目で10％以下になったのに対して、二酸化ケイ素に付着させたRhodococcus  erythropolis  NDKK6の生存率は５週目まで80％以上を維持した。
また、Rhodococcus  erythropolis  NDKK6の場合、同じ経過時期において、二酸化ケイ素への付着によって、培養液中での生存率よりも顕著に高い生存率が確認され、培養後のRhodococcus  erythropolis  NDKK6を二酸化ケイ素に付着させた場合、Rhodococcus  erythropolis  NDKK6の生存期間を長期化させる効果が高いことがわかった。
【００１１】
・二酸化ケイ素に付着させたGordonia  terrae  NDKY76Aの生存率
上述した実験において、Gordonia  terrae  NDKY76Aを二酸化ケイ素に付着させた場合における、Gordonia  terrae  NDKY76Aの生存率の変化を、図３（ａ）の表、図３（ｂ）のグラフに示す。
・Gordonia  terrae  NDKY76Aの培養液中での生存率
LB培地で72時間培養したGordonia  terrae  NDKY76Aの培養液（5.9×109cells/ml）を作製した。その菌液を室温（25℃）で保存し、LB寒天培地を用い、生存率を測定した。この場合の生存率の変化を、図４（ａ）の表、図４（ｂ）のグラフに示す。
実験結果から、培養液中でのGordonia  terrae  NDKY76Aの生存率は、時間が経過する毎に小さくなり（生菌数が少なくなっていき）、2週目で40％以下4週目で２0％以下、5週目で10％以下になったのに対して、二酸化ケイ素に付着させたGordonia  terrae  NDKY76Aの生存率は、時間が経過する毎に小さくなったが、4周目まで40％以上を維持し、5週目でも20％以上を維持した。
また、Gordonia  terrae  NDKY76Aの場合、同じ経過時期において、二酸化ケイ素への付着によって、培養液中での生存率よりも高い生存率が確認され、培養後のGordonia  terrae  NDKY76Aを二酸化ケイ素に付着させた場合、Gordonia  terrae  NDKY76Aの生存期間を長期化させることができることがわかった。
【００１２】
・二酸化ケイ素に付着させたBacillus  subtilis（natto）Takahashiの生存率
上述した実験において、Bacillus  subtilis（natto）Takahashiを二酸化ケイ素に付着させた場合における、Bacillus  subtilis（natto）Takahashiの生存率の変化を、図５（ａ）の表、図５（ｂ）のグラフに示す。
実験結果から、二酸化ケイ素に付着させたBacillus  subtilis（natto）Takahashiの生存率は、4周目まで95％以上を維持し、5週目でも94.5％を維持した。
このように、Bacillus  subtilis（natto）Takahashiにおいては、二酸化ケイ素への付着によって、Bacillus  subtilis（natto）Takahashiの生存期間を長期化させることができる著しい効果が確認された。
【００１３】
二酸化ケイ素（単体）への微生物の付着は、イオン交換的な吸着、疎水結合、静電結合等による結合、及び、微生物が入り込み易い二酸化ケイ素の物理的空間（間隙）の構造に基づく物理的な保持等により実現されていると考えられる。
【００１４】
土壌中の鉱物は、火成岩や堆積岩が年月によって風化し、粒状になった状態のものである。その中でも、二酸化ケイ素はケイ酸イオンとなってイネ科などの植物に取り込まれるため、環境中を循環している。そのことから、微生物と二酸化ケイ素は密接な関係があると考えられる。
土壌中の二酸化ケイ素量を見ると30％以上を占めている。また、二酸化ケイ素は、シリカゲルでも知られるように吸水性が高い。吸水性が高い理由として、二酸化ケイ素は四面体構造をとり、さらに四面体構造がシート状に連なり結晶構造をとる。シート状構造には、多数の間隙があり、その結果、間隙に水が入り込むため、吸水性が高い。さらに、間隙も非常に小さく水の流出が少ないため、保水性も高い。二酸化ケイ素の四面体構造を図６に示し、二酸化ケイ素のシート状構造は図７に示す。
このように、二酸化ケイ素の高い吸水性と保水性が、保持している微生物に適度な湿度を与えることで、生存率が向上したと考えられる。
また、微生物が好気性の菌である場合、液体環境であると、菌が沈んで分解してしまうが、二酸化ケイ素に付着した場合、液体が少なく菌が空気に触れ易くなるので、菌が、生き伸び易くなると考えられる。
【００１５】
実施形態１によれば、微生物を培養した菌液と二酸化ケイ素とを混合して、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたことにより、二酸化ケイ素に付着した微生物の生存期間が長くなり、簡単かつ低コストに、培養後の微生物の生存期間を長期化させることができるようになった。
【００１６】
例えば機械工場のような建屋の下の地中においてＡ重油や機械油等の油で汚染された油汚染土壌をバイオオーグメンテーションによって浄化する場合において、培養直後の石油分解菌に二酸化ケイ素を供給することによって、石油分解菌（例えば上述したRhodococcus  erythropolis  NDKK6）の生存期間を長期化させることができるようになる。
例えば浄化工事において汚染土壌への微生物の供給工事日の日程に合うようにRhodococcus  erythropolis  NDKK6を培養していたが、何等かの事情で日程通りに浄化工事を行えず、汚染土壌への微生物の供給工事日を延期しなければならない場合において、培養直後のRhodococcus  erythropolis  NDKK6に二酸化ケイ素を供給して、培養直後のRhodococcus  erythropolis  NDKK6を二酸化ケイ素に付着させることで、培養直後のRhodococcus  erythropolis  NDKK6の長期保存が可能となり、油汚染土壌へのRhodococcus  erythropolis  NDKK6の供給工事が遅れた場合でも、培養直後と同等の活性の高いRhodococcus  erythropolis  NDKK6を油汚染土壌に供給することできるようになり、バイオオーグメンテーションによる浄化工事において所定の浄化性能を達成できるようになる。
従って、バイオオーグメンテーションによる浄化工事の遅延によってRhodococcus  erythropolis  NDKK6等の石油分解菌を保管する必要が生じた場合、浄化工事に必要な大量の石油分解菌を低温状態に維持するための冷蔵庫等を用意する必要が無くなって、培養直後の石油分解菌を二酸化ケイ素に付着させるだけという、簡単かつ低コストな方法によって、石油分解菌の生存期間を長期化させることができるようになり、培養直後の石油分解菌を濃度及び活性を維持させた状態で保存することができるようになる。
【００１７】
尚、上記では、培養直後の微生物に二酸化ケイ素単体を供給して培養直後の微生物を二酸化ケイ素に付着させる例を説明したが、二酸化ケイ素を含む物質、例えば、ゼオライト、珪藻土、珪砂等の二酸化ケイ素含有物質を培養直後の微生物に供給して、培養直後の微生物を二酸化ケイ素含有物質中の二酸化ケイ素に付着させるようにしても、微生物の生存期間を長期化させることができると考えられる。
【００１８】
実施形態２
実施形態１で説明した培養後の微生物の生存期間を長期化させる方法を利用し、培養後の微生物を付着した二酸化ケイ素によって粉末／顆粒状に構成された微生物製剤を製造できる。
例えば、培養後の菌液に二酸化ケイ素を加えて、充分に撹拌した後に、自然乾燥によって二酸化ケイ素の外表面を乾燥状態にして、培養後の微生物を二酸化ケイ素に付着させたことによって、培養後の微生物を付着した二酸化ケイ素により構成された微生物製剤を簡単に製造できる。
また、当該微生物製剤の微生物濃度を増減させたい場合、言い換えれば、二酸化ケイ素の単位グラム当たりの菌数を増減させたい場合には、菌液の濃度、あるいは、二酸化ケイ素の量を変更することで、調整できる。
例えば、菌液を希釈または濃縮して、１（菌液）：１（二酸化ケイ素）の割合で混合して乾燥させることで、微生物濃度の異なる微生物製剤を容易に製造できる。例えば、10mlの菌液に10gの二酸化ケイ素を加え、充分に撹拌した後、自然乾燥させたことによって、培養後の微生物を付着した二酸化ケイ素により構成された粉末／顆粒状の微生物製剤を製造できる。
また、菌液に供給される二酸化ケイ素の量を少なくすれば、単位グラム当たりの二酸化ケイ素への微生物の付着量が増えるため、単位グラム当たりの菌数が多い微生物製剤を製造でき、逆に、菌液に供給される二酸化ケイ素の量を多くすれば、単位グラム当たりの二酸化ケイ素への微生物の付着量が減るため、単位グラム当たりの菌数が少ない微生物製剤を製造できる。
即ち、菌液濃度や二酸化ケイ素の量を調整することで、目的に適した微生物濃度の微生物製剤を容易に製造できる。
【００１９】
実施形態２で説明した微生物製剤によれば、液状から粉末／顆粒化されたことによる体積の低減（重量あたりの菌体数増加）が顕著となり、軽くなって輸送量が軽減し、また、取扱いの容易な微生物製剤となる。
例えば、バイオオーグメンテーションによって油汚染土壌を浄化する場合において、液体で輸送量の多い菌液を用いる場合に比べて、当該微生物製剤を油汚染土壌に供給する場合、微生物製剤を油汚染土壌に輸送するための輸送コストを減らすことができるとともに、固体であるため取り扱いが容易となり、かつ、二酸化ケイ素は、もともと土中の成分であるため、環境適合性が高いという効果もある。
【００２０】
実施形態３
土壌に二酸化ケイ素を供給することによって、土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させるようにしてもよい。
例えば、浄化対象とする油汚染土壌中に生息する汚染物質の分解や除去に寄与する微生物を活性化させて汚染土壌を浄化するバイオスティミュレーションにおいて、油汚染土壌中の微生物に二酸化ケイ素単体や、二酸化ケイ素を主成分とするゼオライト、珪藻土、珪砂等の二酸化ケイ素含有物質を供給することで、油汚染土壌中の微生物が供給された二酸化ケイ素に付着して、油汚染土壌中の微生物の生存期間を長期化させることができ、油汚染土壌中の微生物の活性及び濃度を維持させることができるため、バイオスティミュレーションによる浄化作業を効果的に行うことが可能となる。
【００２１】
即ち、実施形態３の方法によれば、土壌に二酸化ケイ素単体や二酸化ケイ素含有物質を供給して、土壌に生息する微生物を当該二酸化ケイ素に付着させるという、簡単かつ低コストな方法によって、土壌に生息する微生物の生存期間を長期化させて微生物の活性及び濃度を維持させることができるようになる。
【００２２】
実施形態２で説明した微生物製剤を土壌に供給するようにしてもよい。
例えば、上述したように、バイオオーグメンテーションによって油汚染土壌を浄化する場合において当該微生物製剤を油汚染土壌に供給しても良いし、あるいは、浄化対象とする油汚染土壌中に生息する汚染物質の分解や除去に寄与する微生物を活性化させて油汚染土壌を浄化するバイオスティミュレーションにおいて当該微生物製剤を油汚染土壌に供給しても良く、バイオオーグメンテーションやバイオスティミュレーションによる浄化作業をより効果的に行うことが可能となる。
【００２３】
また、本発明による微生物の生存期間を長期化させる方法は、農地の土壌改良に利用される微生物、石油以外の汚染物質（例えばPCBやダイオキシン類）により汚染された土壌・河川・湖沼などの汚染土の浄化に利用される微生物、畜産用に利用される微生物の生存期間を長期化させる場合にも適用可能である。
（１）河川・湖沼への応用
水圏環境において底土中の微生物は物質循環や水質浄化に重要な役割を果たしている。従って、二酸化ケイ素単体や二酸化ケイ素含有物質、あるいは、上述した微生物製剤を、水圏環境に供給することにより、底土中の微生物数が増大し、また微生物叢が豊かになる。その結果、物質循環が活発になることから水質浄化が効率的に行える。
（２）農地への応用
上記と同様に、二酸化ケイ素単体や二酸化ケイ素含有物質、あるいは、上述した微生物製剤を、農地に供給することにより、土壌中の微生物数が増大し微生物叢が豊かになる。その結果、土壌中の有機物が効率よく分解され、無機化が促進される。最終的に無機物は植物の肥料成分になることから、効率の良い有機農業に寄与できる。また、農地において、微生物が二酸化ケイ素の間隙内に入り込んで安定化（生存が長期化）し、微生物叢が固定化するため、他の菌（病原菌等）の増殖を抑制できるようになる。
（３）畜産への応用
稲わら等の家畜の餌に、二酸化ケイ素に乳酸菌などの土壌細菌を付着させた微生物製剤を混ぜ込んで、二酸化ケイ素に固定化させた乳酸菌などの土壌細菌を家畜に食べさせる。
【００２４】
尚、本発明に用いられる微生物に特に制限はないが、土壌中で生育可能な微生物であることが好ましく、例えば、カビ、酵母、真正細菌、古細菌などが挙げられ、より好ましくは真正細菌が用いられる。
農業用の土壌改良には、例えばバシラス（Bacillus）属微生物、ストレプトマイセス（Streptomyces）属微生物、シュードモナス（Pseudomonas）属微生物、アゾモナス（Azomonas）属微生物、汚染土壌浄化には、例えばロドコッカス（Rhodococcus）属微生物、ゴルドニア（Gordonia）属微生物、畜産土壌への散布には例えばラクトバシラス（Lactobacillus）属微生物、ラクトコッカス（Lactococcus）属微生物などを用いることができるが、より具体的には、例えば、Bacillus  subtilis（natto）Takahashi、Gordonia  terrae  NDKY76A、Rhodococcus  erythropolis  NDKK6などを用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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