(57)【要約】【課題】本発明は、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子（転写因子複合体も含む）の活性を制御する物質および／または分子のスクリーニング方法の提供を目的とする。【解決手段】  本発明は、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法であって、（ａ）該転写因子が発現しており、かつ、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ａを含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ｂを含む核酸が導入されている細胞に、試験分子または試験物質を導入し、（ｂ）レポーター遺伝子Ａの発現とレポーター遺伝子Ｂの発現を検出し、  検出したレポーター遺伝子Ａの発現量の変化とレポーター遺伝子Ｂの発現量の変化が逆である場合に、該試験分子または試験物質を該転写因子の活性を制御する候補分子または候補物質として選択するスクリーニング方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該転写因子が発現しており、かつ、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ａを含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ｂを含む核酸が導入されている細胞に、試験分子または試験物質を導入し、
（ｂ）レポーター遺伝子Ａの発現とレポーター遺伝子Ｂの発現を検出し、
検出したレポーター遺伝子Ａの発現量の変化とレポーター遺伝子Ｂの発現量の変化が逆である場合に、該試験分子または試験物質を該転写因子の活性を制御する候補分子または候補物質として選択するスクリーニング方法。
【請求項２】
前記レポーター遺伝子Ａの発現量が減少し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が増加した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を抑制する候補分子または候補物質として選択する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記レポーター遺伝子Ａの発現量が増加し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が減少した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を活性化する候補分子または候補物質として選択する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記転写因子が、β−カテニン/TCF7L2複合体であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記転写因子が正に制御する応答配列が、TCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、請求項４に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記HAL遺伝子の転写調節領域が、HAL遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-90〜-44の領域を含むことを特徴とする請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記PCK1遺伝子の転写調節領域が、PCK1遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-559〜-183の領域を含むことを特徴とする請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸を包含する、請求項１乃至８のいずれかに記載のスクリーニング方法を実施するためのキット。
【請求項１０】
前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が導入された細胞。
【請求項１３】
前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF結合エレメントであることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、請求項１２に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および転写因子の活性を制御する分子および物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
転写因子は単独で、あるいは、転写因子複合体の一員として、遺伝子の転写制御領域に結合し、その遺伝子の発現を調節しており、生体内における様々な現象を調節する役割を担っている。そのため、複雑な生体内の現象を紐解く上で、転写因子の活性制御機構の解析は極めて重要である。これまでにも、転写因子を制御する因子の同定およびその作用機序に関する研究がさかんに行われており、多くの知見が報告されている。
従来、転写因子（または転写複合体。以下、転写因子と記す）の機能解析、あるいは、転写因子の機能を制御する分子や物質の同定・解析を行う場合、その転写因子の活性の変化をモニターする方法として、転写因子が結合するゲノム上の転写制御領域の野生型配列と、転写因子が結合しない変異型配列を、それぞれレポーター遺伝子の上流にクローニングして、細胞の中でレポーター遺伝子の活性を測定する、いわゆる、レポーターアッセイが用いられてきた（非特許文献１を参照のこと）。
【０００３】
転写制御領域の野生型配列をもつレポータープラスミド上のレポーター遺伝子の発現は、転写因子の転写活性に応じて変化する。これに対し、転写制御領域の変異型配列をもつレポータープラスミド上のレポーター遺伝子の発現は、転写因子が変異型配列である転写制御領域に結合しないため、レポーター遺伝子の発現が低く、しかも変化しないという特徴を有している。従来型のレポーターアッセイでは、これらの２種類のレポータープラスミドを組み合わせて使用しているが、アッセイコントロールとして使用している変異型配列に隣接するレポーター遺伝子の発現がもともと低いために、野生型配列に隣接するレポーター遺伝子の発現が下がったとしても、その発現の低下が、測定対象となる転写因子の活性の抑制によるものなのか、あるいは、それ以外の要因、例えば、基本転写因子複合体に対する影響、細胞内のRNA安定性の変化、翻訳効率低下などによるものなのか判別が困難である。従って、解析対象の転写因子の特異性等を検討するための他の解析方法を併用しなければ、対象としている転写因子の活性制御等の機能解析を正確に行うことは困難であった。
【０００４】
上述のように、転写因子の制御因子の同定、解析は、非常に重要であるにも関わらず、現在までのところ、簡便かつ正確に転写因子の活性変化を検出できるスクリーニング方法は存在していなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Barker NおよびClevers H., Nat Rev Drug Discov. 2006 Dec;5(12):997-1014.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、標的とする転写因子（本明細書においては転写因子複合体も含む）の活性、およびその転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路を特異的に制御する分子や物質のスクリーニング方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、細胞内シグナル、あるいは、遺伝子発現を、転写レベルおよびその上流のシグナルで制御する分子や物質を、効果的に検出するために、目的とする転写因子が結合する野生型配列を用いたレポーターアッセイに、新たなアッセイを併用し、従来の非特異的要素を除外できるシステムを開発した。すなわち、転写因子が結合する野生型配列をもつレポータープラスミドに加えて、その転写因子が逆に転写制御する遺伝子発現調節領域を同定し（例えば、転写因子Ｘが正に制御する遺伝子発現調節領域を野生型配列としてレポータープラスミドＡを調製した場合には、転写因子Ｘが別の転写因子Ｙを介して負に制御される遺伝子調節領域を同定する）、その調節領域を有する別のレポータープラスミドを作製し、従来使用されていた変異型結合配列を有するレポータープラスミドの代わりに用いて、レポーターアッセイを行った。
従来のレポーターアッセイでは、１つのレポーター遺伝子の発現の変化のみを指標にしていたのに対し、発明者らの開発した方法によると、互いに発現量が逆に変化する２つのレポーター遺伝子を使用しているため、２つの指標に基づき判断をすることが可能となる。しかも、それぞれのレポーターアッセイで非特異的な変化を生じさせる分子や物質は、指標となるレポーター活性が逆に変化するものを選択するために除外される。
その結果、基本転写因子複合体に対する影響、細胞内のRNA安定性の変化、翻訳効率低下など、目的の転写複合体・転写因子以外の要因によって生じていた、いわゆる、偽陽性に基づく検出結果を除外することができ、転写因子の活性を特異的に制御する候補物質を正確、かつ、効率的に同定することができるようになった。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１４）である。
（１）転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該転写因子が発現しており、かつ、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ａを含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ｂを含む核酸が導入されている細胞に、試験分子または試験物質を導入し、
（ｂ）レポーター遺伝子Ａの発現とレポーター遺伝子Ｂの発現を検出し、
検出したレポーター遺伝子Ａの発現量の変化とレポーター遺伝子Ｂの発現量の変化が逆である場合に、該試験分子または試験物質を該転写因子の活性を制御する候補分子または候補物質として選択するスクリーニング方法。
（２）前記レポーター遺伝子Ａの発現量が減少し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が増加した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を抑制する候補分子または候補物質として選択する、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（３）前記レポーター遺伝子Ａの発現量が増加し、前記レポーター遺伝子Ｂの発現量が減少した場合に、前記試験分子または試験物質が転写因子の活性を活性化する候補分子または候補物質として選択する、上記（１）に記載のスクリーニング方法。
（４）前記転写因子が、β−カテニン/TCF7L2複合体であることを特徴とする、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（５）前記転写因子が正に制御する応答配列が、TCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、上記（４）に記載のスクリーニング方法。
（６）前記転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、上記（４）に記載のスクリーニング方法。
（７）前記HAL遺伝子の転写調節領域が、HAL遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-90〜-44の領域を含むことを特徴とする上記（６）に記載のスクリーニング方法。
（８）前記PCK1遺伝子の転写調節領域が、PCK1遺伝子の５’隣接領域の少なくとも、-559〜-183の領域を含むことを特徴とする上記（６）に記載のスクリーニング方法。
（９）転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸を包含する、上記（１）乃至（８）のいずれかに記載のスクリーニング方法を実施するためのキット。
（１０）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、上記（９）に記載のキット。
（１１）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、上記（９）に記載のキット。
（１２）転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が導入された細胞。
（１３）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が正に制御する応答配列がTCF/LEF結合エレメントであることを特徴とする、上記（１２）に記載の細胞。
（１４）前記転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体であり、転写因子が負に制御する応答配列が、HAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域であることを特徴とする、上記（１２）に記載の細胞。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の転写活性を特異的に制御する分子および／または物質の効率的な同定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】大腸がん細胞株、肝がん細胞株におけるβ−カテニン/TCF7L2複合体の活性を比較した結果を示す。TOP-flash とpRL-null、または、FOP-flashとpRL-nullを一過的に導入し、48時間培養した細胞を用いて、デュアルルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性の相対値（TOP-flashまたはFOP-flashのホテルルシフェラーゼ活性の測定値をpRL-nullのウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定値で除した）を解析値として使用した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した（Ａ）。本解析に使用した大腸がん、肝がん細胞株におけるCTNNB1（β−カテニン）およびAPCの遺伝子型を示した（Ｂ）。
【図２】β−カテニンの発現を抑制するsiRNAの検討および評価結果を示す。HepG2細胞に、コントロールまたはβ−カテニンsiRNA（20 nM）を一過的に導入し、48時間後に細胞を回収した。細胞抽出物に対しウェスタンブロッティング解析を行った。Aの”β-アクチン”はサンプル量のコントロールである（Ａ）。HepG2細胞に、TOP-flash、pRL-nullおよび図に表示のsiRNA（20 nM）を導入し、48時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。縦軸の値は、TOP-flashのホテルルシフェラーゼ活性の測定値をpRL-nullのウミシイタケルシフェラーゼ活性の測定値で除した値を、コントロールsiRNA（Ctrl）を導入した場合の値で標準化して、示した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した（Ｂ）。Wt:野生型タンパク質  Mut:変異型タンパク質
【図３】β−カテニン/TCF7L2によって負に制御される遺伝子群のプロモーター活性に対する、β−カテニンsiRNAの影響。β−カテニンsiRNAおよびdnTCF7L2（TCF7L2のドミナントネガティブ）によって顕著に発現上昇する５つの遺伝子、PCK1、HAL、OSTα、PLEK2およびSLPIの５’隣接領域を用いてレポータープラスミドを作成した。これらのプラスミド（pPCK1-1911/+63、pHAL-1726/+147、OSTα-1742/+36、pPLEK2-1426/+84またはpSLPI-1845/+31）をHepG2細胞へ導入し、コントロールsiRNA、またはβ−カテニンsiRNA（#09 または #10）で処理した。各レポータープラスミドのルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAで処理した場合のルシフェラーゼ活性の測定値をコントロールsiRNAで処理した場合の測定値で除した値を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図４】β−カテニン/TCF7L2によって負に制御される遺伝子群のプロモーター活性に対する、dnTCF7L2（TCF7L2のドミナントネガティブ）の影響。HepG2細胞に対し、pGL4.14 (empty)、pPCK1-1911/+63、pHAL-1726/+147、pOSTα-1742/+36、pPLEK2-1426/+84またはpSLPI-1845/+31 と pCAGGSベクターもしくは pCAGGS-dnTCF7L2（TCF7L2のドミナントネガティブ発現ベクター）を組み合わせて、一過性に遺伝子導入した。各レポータープラスミドのルシフェラーゼ活性は、遺伝子導入から48時間後に測定した。pCAGGS-dnTCF7L2導入した場合のルシフェラーゼ活性の測定値を、pCAGGS導入した場合の測定値で除した値を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図５】HepG2細胞内におけるAXIN2とHAL遺伝子の発現に対するβ−カテニンsiRNAの影響。β−カテニン/TCF7L2複合体が直接ターゲットにする遺伝子であるAXIN2の発現量（Ａ）と、HALの発現量（Ｂ）を、GADPHを内部コントロールとして定量PCRにより測定した。
【図６】β−カテニンsiRNAによってレポーター活性が促進されるために必要なHAL転写領域の検討。β−カテニンsiRNAによって誘導される転写活性に必要な領域を同定するために、レポータープラスミド（pHAL-1726/+147、pHAL-267/+147、pHAL-90/+147またはpHAL-44/+147）をHepG2細胞へ一過性に導入し、コントロールまたはβ−カテニンsiRNA（#09）で処理した。各レポータープラスミドのルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAで処理した場合のルシフェラーゼ活性の測定値をコントロールsiRNAで処理した場合の測定値で除した値を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図７】大腸がん細胞および肝がん細胞におけるHALプロモーター活性に対するβ−カテニンsiRNAの影響。β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNAの存在下において、pHAL-90/+147レポータープラスミドを大腸がん細胞（RKO、 HCT116およびSW480）および肝がん細胞（Huh-7、Huh-6およびHepG2）に一過性に導入した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるHALプロモーター活性は、β−カテニンsiRNA存在下でのルシフェラーゼ活性をコントロールsiRNA存在下でのルシフェラーゼ活性で除した値で表示した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図８】pHAL-90/+147の応答特異性の検討。HepG2細胞に、pHAL-90/+147ベクター（Ａ）またはpGL4.14 emptyベクター（HALのプロモーター配列を含まないベクター）（Ｂ）を導入し、次いで、コントロールまたはβ−カテニンsiRNA（20 nM）で処理した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図９】pHAL-90/+147の応答特異性の検討。HepG2細胞にpHAL-90/+147ベクターまたはpGL4.14 Emptyベクター（HALのプロモーター配列を含まないベクター）を、pCAGGS-dnTCF7L2またはpCAGGSベクターと共に導入した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミド導入から48時間後に測定した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図１０】β−カテニンの活性化に対するpHAL-90/+147の応答活性の検討。活性型のβ−カテニンを発現するプラスミドであるpcDNAβ-cateninまたはその空ベクターと共に、TOP-flashおよびpRL-null、または、FOP-flashおよびpRL-null を、HeLa細胞およびHuh-7細胞に導入した。Wnt活性は、ウミシイタケルシフェラーゼ活性（pRL-null）で標準化したTOP/FOP活性として示した（左側の図）。また、pcDNAβ-cateninまたはその空ベクターと共に、pHAL-90/+147 およびpRL-null を、HeLa細胞およびHuh-7細胞に導入した（右側の図）。ルシフェラーゼ活性は、プラスミド導入から48時間後に測定した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図１１】異なるコピー数（繰り返し数）のpHAL-90/+147領域をもつレポータープラスミドのルシフェラーゼ活性の検討。HALプロモーターの-90/+147 領域の1つ（x1） またはタンデムリピート（x2、x4およびx8）を、pGL4.14ベクターにクローニングした。β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNAと共に、作製したレポータープラスミドをHepG2細胞に一過性に導入した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミドおよびsiRNA導入から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図１２】pHAL-90/+147領域を組込んだレポーターベクターの評価。HAL-90/+147の8回のタンデムリピートを、pGL4.14、pGL4.22およびpGL4.24のベクターにクローニングした。β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNAと共に、これら３つのレポータープラスミドをHepG2細胞に一過性に導入した。ルシフェラーゼ活性は、プラスミドおよびsiRNA導入から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図１３】pHAL-FlucおよびpTOP-Rlucの両方を安定に発現するHepG2 4-61細胞のルシフェラーゼ活性。HepG2 4-61細胞は、HepG2細胞を、ホタルルシフェラーゼ（Firefly luciferase）遺伝子の上流に8x HAL-90/+147のタンデムリピートを含むpHAL-Flucと、 6xTCF/LEF結合エレメントをウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子の上流に含む pTOP-Rlucを安定的に導入して樹立した。細胞を96-wellプレートに播種し、β−カテニンsiRNA（#09および#10）またはコントロールsiRNAで処理した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【図１４】β−カテニンsiRNAに応答するPCK1レポーターの活性の検討。レポータープラスミド（pPCK1-1911/+63、pPCK1-559/+63または pPCK1-183/+63）を、HepG2細胞に一過性に導入し、β−カテニンsiRNA（#09）またはコントロールsiRNA、20 nMで処理した。ルシフェラーゼ活性は、siRNA処理から48時間後に測定した。β−カテニンsiRNAに応答して誘導されるルシフェラーゼ活性は、コントロールsiRNAのルシフェラーゼ活性で除した値を示した。グラフは、レポーター活性の倍率変化を示す。データは、3回の実験値の平均値±SDで示した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法に関するものである。
本発明の実施形態の１つは、任意の転写因子および／またはその上流のシグナル伝達経路の活性を制御する、分子および／または物質のスクリーニング方法であって、
（ａ）該転写因子が発現し、かつ、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ａを含む核酸および該転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子Ｂを含む核酸が導入されている細胞に、試験分子または試験物質を導入し、
（ｂ）レポーター遺伝子Ａの発現とレポーター遺伝子Ｂの発現を検出し、
検出したレポーター遺伝子Ａの発現量の変化とレポーター遺伝子Ｂの発現量の変化が逆である場合に、該試験分子または試験物質を該転写因子の活性を制御する候補分子または候補物質として選択するスクリーニング方法である。
【００１２】
本発明において、転写因子とは、ある遺伝子の転写を制御（正、負、いずれの制御をも含む）するため、該遺伝子の転写調節領域のDNA配列を認識し、結合する因子のことである。本明細書では、転写調節領域のDNAに直接結合する因子の他、該因子を含む転写複合体についても、転写因子として表現する。また、転写因子は、本発明のスクリーニング方法で使用する細胞に内在するものであっても、あるいは、外来の転写因子を該細胞内で発現させたものであってもよい。
また、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路とは、特定の遺伝子の転写調節を行うために、細胞膜あるいは細胞質内の因子が次々と相互作用をして、転写因子に対して、転写調節の指令を伝達する経路のことである。このシグナル伝達経路が何らかの制御を受けると、その経路で機能する転写因子の活性に影響が及ぼされることになる。従って、本発明のスクリーニング方法は、転写因子を制御する分子や物質を対象とするのみならず、該転写因子調節する上流のシグナル伝達経路を制御する分子や物質のスクリーニング方法としても使用可能である。
【００１３】
本発明のスクリーニング方法においては、「転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸」、および、「転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸」が導入された細胞を使用する。
「転写因子が正に制御する応答配列」または「転写因子が負に制御する応答配列」とは、転写因子が転写調節を行っている遺伝子の発現を正または負に制御するために、該転写因子が直接的または間接的に制御する転写調節領域（転写プロモーターを含む領域）のことである。
【００１４】
例えば、「転写因子が正に制御する応答配列」とは、ある遺伝子Ｍの発現を増加させるため、転写因子が直接結合するDNA領域（直接的に制御する転写領域）、または、該転写因子が他の転写因子を介して、遺伝子Ｍの発現を増加させる場合であって、他の転写因子が結合するDNA領域（間接的に制御する転写領域）のことである。また、「転写因子が負に制御する応答配列」とは、ある遺伝子Ｎの発現を減少させるために、転写因子が直接結合するDNA領域（直接的に制御する転写領域）、または、該転写因子が他の転写因子を介して、遺伝子Ｎの発現を減少させる場合であって、他の転写因子が結合するDNA領域（間接的に制御する転写領域）のことである。「間接的」な転写制御の場合には、対象の転写因子が応答配列を制御するまでに、複数の他の転写因子が機能してもよい。
【００１５】
本発明のスクリーニング方法の対象となる転写因子が、上述の通り、正または負に制御する応答配列は、直接的に制御する配列（該転写因子が直接結合する応答配列）、間接的に制御する配列（該転写因子が他の転写因子の活性を通じて制御する応答配列）、いずれの配列であってもよい。
「転写因子が正に制御する応答配列」は、その転写因子を細胞に導入した場合に、該細胞内において発現が増加する遺伝子の転写調節領域、あるいは、該転写因子の阻害因子を（ドミナントネガティブ、siRNAなど）細胞内に導入した場合に、該細胞内において発現が減少する遺伝子の転写調節領域などを使用してもよく、マイクロアレイやRNAシークエンシングなどを用いて網羅的に同定することができる。あるいは、当業者であれば、公開されている遺伝子発現解析データ（例えば、Gene Expression Omnibus、Expression Atlas、およびcBioPortal for Cancer Genomicsなどのデータベースを利用することができる）などを利用することもできる。さらに、発現変動する遺伝子の５’隣接領域やイントロン領域の転写因子結合モチーフを、公開されているプログラム（JASPAR CORE databaseなど）で検索することにより、どの転写因子がどの配列に結合または作用するか予測することができる。本発明の実施例にも示す通り、例えば、転写因子がβ−カテニン/TCF7L2の場合には、「転写因子が正に制御する応答配列」は、TCF binding element（TBE）などを例示することができる。その他、転写因子ATF、androgen receptor、NRF、C/EBP、CREB、E2F、p53、EGR1、CBF/NF-Y/YY1、estrogen receptor、GATA、glucocorticoid receptor、HSF、HNF、MTF1、GLI、HIF、IRF、STAT、KLF、LXRa、Elk-1、AP-1、MEF2、Myc、Nanog、NFκB、RBP-J、Oct4、Pax6、FOXO、NFAT、PPAR、progesterone receptor、RAR、RXR、Sox2、SP1、SMAD、vitamin D receptor、AhRなどはその特異的な応答配列が同定されている（http://www.sabiosciences.com/reporterassays.phpなどを参照のこと）。
また、「転写因子が負に制御する応答配列」は、その転写因子を細胞に導入した場合に、該細胞内において発現が減少する遺伝子の転写調節領域、あるいは、該転写因子の阻害因子（ドミナントネガティブ、siRNAなど）を細胞内に導入した場合に、該細胞内において発現が増加する遺伝子の転写調節領域などを使用してもよく、マイクロアレイやRNAシークエンシングなどを用いて網羅的に同定することができる。あるいは、当業者であれば、公開されている遺伝子発現解析データ（例えば、Gene Expression Omnibus、Expression Atlas、およびcBioPortal for Cancer Genomicsなどのデータベースを利用することができる）などを利用することもできる。さらに、発現変動する遺伝子の５’隣接領域やイントロン領域の転写因子結合モチーフを、公開されているプログラム（JASPAR CORE databaseなど）で検索することにより、どの転写因子がどの配列に結合または作用するか予測することができる。本発明の実施例にも示す通り、例えば、転写因子がβ−カテニン/TCF7L2の場合、「転写因子が負に制御する応答配列」としては、β−カテニン/TCF7L2が他の転写因子を介して間接的に制御する応答配列（つまり、当該他の転写因子が直接制御する応答配列）であるHAL遺伝子など、表４に示される遺伝子の転写調節領域の中でβ−カテニン/TCF7L2によって間接的にその転写が負に制御するDNA配列を例示することができる（なお、表４に示される遺伝子の転写調節領域の配列は、米国NCBIの遺伝子情報を統合したデータベース(Entrez Gene: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)などから容易に入手可能である）。
【００１６】
本発明のスクリーニング方法においては、対象となる転写因子が正または負に制御する応答配列が「作用可能」に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が、スクリーニングに使用する細胞内に導入されている。ここで、「作用可能」とは、転写因子が制御する応答配列に、該転写因子または該転写因子が活性制御する他の転写因子が結合した場合に、該応答配列に隣接して結合されているレポーター遺伝子が発現し得るように、応答配列とレポーター遺伝子を連結することを意味する。
【００１７】
レポーター遺伝子は、本発明のスクリーニング方法に使用される「応答配列」が機能していることを示す遺伝子、すなわち、応答配列によって転写が制御される遺伝子であれば、いかなる遺伝子であっても使用可能であり、例えば、緑色蛍光蛋白質（GFP）遺伝子およびその変異体、ルシフェラーゼ遺伝子などが利用可能であり、当業者であれば、容易に選択し、使用することが可能である。そして、レポーター遺伝子を含む「核酸」は、本発明のスクリーニング方法を実施する細胞内において、応答配列の制御を介して、レポーター遺伝子を発現させるものであれば、いかなるものであってもよく、プラスミドベクターのように、宿主細胞から独立して、自立的に発現制御されるものであってもよく、あるいは、宿主細胞の染色体に組み込まれレポーター遺伝子が転写制御されるように構築されたベクターであってもよい。
【００１８】
本発明の転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および／または転写因子の活性を制御する分子および／または物質のスクリーニング方法は、該転写因子が発現し、機能する細胞であって、該転写因子が正に制御する応答配列によって発現調節されるレポーター遺伝子（レポーター遺伝子Ａとする）を含む核酸（レポーター遺伝子の発現ベクターなど）、および、該転写因子が負に制御する応答配列によって発現調節されるレポーター遺伝子（レポーター遺伝子Ｂとする）を含む核酸（レポーター遺伝子の発現ベクターなど）が導入された細胞に、試験物質を導入して、レポーター遺伝子（ＡおよびＢ）の活性の変化を指標として、試験物質または試験分子が転写因子に及ぼす影響を評価することに基づいている。すなわち、レポーター遺伝子Ａとレポーター遺伝子Ｂの発現を確認し、Ａの発現とＢの発現が逆に制御される場合に、該試験物質または試験分子が、転写因子の活性を制御する候補物質または候補分子であると判断する。
例えば、試験物質が転写因子の活性を抑制する物質であった場合、転写因子によって正に制御されるレポーター遺伝子Ａの発現は減少し、転写因子によって負に制御されるレポーター遺伝子Ｂの発現は増加することになる。これとは逆に、試験物質が転写因子の活性を増強する物質であった場合、転写因子に正に制御されるレポーター遺伝子Ａの発現は増加し、転写因子に負に制御されるレポーター遺伝子Ｂの発現は減少することになる。
従って、本発明のスクリーニング方法においては、レポーター遺伝子Ａとレポーター遺伝子Ｂの発現が逆方向に変化する場合に、試験物質または試験分子は、転写因子の活性を抑制または増強するように作用する物質または分子であると判断することができる。このように、本発明のスクリーニング方法は、対象となる転写因子の活性の変化を２種類のレポーター遺伝子で評価し、しかも、それらのレポーター活性が逆に変化することを指標にしているため、偽陽性の結果を排除することができ、確度の高い、転写因子の制御物質または分子の検索を可能にするものである。
【００１９】
レポーター遺伝子の発現の変化は、当業者であれば、容易に検出することが可能である。例えば、GFPやルシフェラーゼのように発光性の蛋白質の遺伝子をレポーター遺伝子として使用する場合には、細胞を培養後、細胞を溶解し、発光を測定するのに適したプレートに溶解物を移して、発光を測定してもよく、あるいは、培養した細胞からの発光を直接測定してもよい。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法において使用される細胞は、対象となる転写因子が機能し、転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が導入されている細胞であって、２つのレポーター遺伝子が発現可能な（機能し得る）細胞であれば、いかなる細胞であってもよく、いかなる種由来であってもよい。つまり、上記要件を満たす細胞であれば、例えば、哺乳類細胞（マウス、ラット、ヒトなど）や、目的によっては、鳥類の細胞などを使用してもよい。また、正常細胞であっても癌細胞であってもよく、限定はされない。
そして、本発明のスクリーニング方法の対象となる転写因子が内在的に存在し、発現し、機能している細胞であっても、あるいは、対象となる転写因子が元々は存在しないが、外来性の転写因子を導入することで、その転写因子が発現し、機能し得る細胞であっても、使用可能である。
【００２１】
本発明の他の実施形態は、本発明のスクリーニング方法を実施するためのシステムあるいはキットである。本発明のシステムあるいはキットには、転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸が含まれていてもよい。また、本発明のシステムあるいはキットには、スクリーニングの対象となる転写因子がすでに発現しているか、あるいは、発現し得る細胞であって、該転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含む核酸に挿入されているレポーター遺伝子が発現し、機能し得る細胞が含まれていてもよい。
さらに、本発明のシステムあるいはキットには、核酸、細胞以外にも、本発明のスクリーニングを実施するために必要な試薬類、細胞株、アッセイプレートなどが含まれていてもよい。
【００２２】
転写因子がβ−カテニン/TCF7L2複合体である場合には、例えば、限定はしないが、β−カテニン/TCF7L2複合体が正に制御する応答配列としTCF/LEF結合エレメントが作用可能に連結されたレポーター遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子など）を含む核酸（レポ−ター遺伝子を発現する発現ベクターなど）、および、限定はしないが、β−カテニン/TCF7L2複合体が負に制御する応答配列としHAL遺伝子、PCK1遺伝子、PLEK2遺伝子、SLPI遺伝子、OSTα遺伝子、ITGB3遺伝子、CAPN5遺伝子、MUC20遺伝子、CREB3L3遺伝子、MFSD2B遺伝子、CYP2C18遺伝子、TMEM229B遺伝子、APOA4遺伝子、TIMD4遺伝子、FXYD3遺伝子、FAM65B遺伝子、HAVCR1遺伝子、PDZD3遺伝子、SORCS2遺伝子またはLGALS2遺伝子の転写調節領域が作用可能に連結されたレポ−ター遺伝子（例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子など）を含む核酸（レポ−ター遺伝子を発現する発現ベクターなど）などが本発明のシステムあるいはキットに含まれていてもよい。
【００２３】
以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳細な説明を行うが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。以下の実施例では、転写因子複合体であるβ−カテニン/TCF7L2の活性を負に制御する物質をスクリーニングする方法の構築過程を一例として示した。
本実施例では、転写因子が正に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含むプラスミド、および、転写因子が負に制御する応答配列が作用可能に連結されたレポーター遺伝子を含むプラスミドの作製方法について、具体的な遺伝子を示して説明を行った。
【実施例】
【００２４】
１．材料と方法
１−１．細胞株
ヒト大腸がん細胞株HCT116、SW480、RKOは、American Tissue Culture Collection(ATCC)より購入した。ヒト肝細胞がんHuh-6、Huh-7は医薬基盤研究所・JCRB細胞バンク、肝芽腫HepG2細胞およびヒト子宮頸がん由来HeLa細胞はATCCより購入した。これらの細胞株は10 %ウシ胎児血清(FBS)と抗生物質を含む培地を用いて37℃、5%CO2条件下で継代培養した。HCT116細胞にはMcCoy’s 5A培地RKO、Huh-6およびHuh-7細胞にはDulbecco’s modified Eagle’s培地、HepG2およびHeLa細胞にはEagle’s Minimum Essential培地を用いた。SW480細胞に関しては10 %FBSと抗生物質を含むLeibovitz’s L-15培地を用いて37 ℃、CO2 free 条件下で継代培養を行った。
【００２５】
１−２．レポータープラスミドおよび発現プラスミドの作製
TOP-flashおよびFOP-flash はMillipore、pRL-nullはPromegaより購入した。
Histidine ammonia-lyase(HAL)、phosphoenolpyruvate carboxykinase 1(PCK1)、organic solute transporter alpha(OSTα)、pleckstrin 2(PLEK2)、およびsecretory leukocyte peptidase inhibitor (SLPI)の5’-flanking領域をPCRによって増幅し、それぞれに対応する制限酵素で消化し、pGL4.14ベクター(Promega)にクローニングした。
pHAL-Flucレポータープラスミドは、HAL遺伝子-90/+147領域をPCRで増幅した産物を精製し、制限酵素で消化した後、pGL4.24ベクター(Promega)にクローニングした。最終的に8個のHAL遺伝子-90/+147領域がタンデムに連結するクローン(pHAL-Fluc)を構築した。pTOP-Rlucレポータープラスミドは、pGL4.71ベクター(Promega)由来のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をPCRにより増幅して得られた産物を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を制限酵素で切断し除去しておいたTOP-flashに挿入した。これらのプラスミド作製に使用したプライマー配列を表１に示した。
発現プラスミドはpCAGGS-dnTCF7L2(TCF7L2のドミナントネガティブ変異型)およびpcDNA-mutβ-catenin(HCT116細胞株より得られたβ−カテニンの活性型変異体、p.S45del)を使用した（Cancer Res. 2002 Oct 15;62(20):5651-6. Isolation of a novel human gene, APCDD1, as a direct target of the beta-Catenin/T-cell factor 4 complex with probable involvement in colorectal carcinogenesis.Takahashi M, Fujita M, Furukawa Y, Hamamoto R, Shimokawa T, Miwa N, Ogawa M, Nakamura Y.および Cancer Res. 2001 Nov 1;61(21):7722-6. Up-regulation of the ectodermal-neural cortex 1 (ENC1) gene, a downstream target of the beta-catenin/T-cell factor complex, in colorectal carcinomas. Fujita M, Furukawa Y, Tsunoda T, Tanaka T, Ogawa M, Nakamura Y.を参照のこと）。作製したプラスミドの配列はシークエンシング（ABI PRISM3730、Thermo Fisher Scientific）によって確認した。
【００２６】
【表１】
2016149942.tif 000002
【００２７】
１−３．遺伝子サイレンシングおよび定量RT-PCR
異なる配列を標的とする3種類のβ-catenin siRNA（#09、#10、#12）あるいはコントロールsiRNA（siCtrl）をThermo Fisher Scientific およびSigmaより購入した。これらのsiRNAの標的配列を表２に示した。細胞にsiRNAをLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて導入し、48時間後に細胞を回収した。回収した細胞からRNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてtotal RNAを抽出し、1μgのtotal RNAよりTranscriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche Diagnostics）を用いてcDNA合成を行った。リアルタイムPCRはStepOnePlus（Thermo Fisher Scientific）を用いてSYBR Green法により検出した。使用したプライマー配列を表３に示した。転写産物量はglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)を内部コントロールとしてrelative standard curve法を用いて決定した。
【００２８】
【表２】
2016149942.tif 000003
【００２９】
【表３】
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【００３０】
１−４．レポーターアッセイ
細胞を12ウェルに播種し、FuGENE6（Promega）を用いて、解析を目的とするホタルルシフェラーゼレポータープラスミド(0.2〜0.3μg)をpRL-null(0.05μg)プラスミドと共に、一過性に細胞に導入した。RNAiによるβ−カテニンノックダウンの影響についての検討では、レポータープラスミドおよびsiRNAをLipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)を用いて導入した。48時間インキュベートした後、細胞を溶解し、ピッカジーンデュアル (TOYO B-Net)を用いて発光測定を行った(Lumat LB9507、Berthold Technologies)。一部のデータについては、ウミシイタケルシフェラーゼ(pRL-null)の値で標準化したホタルルシフェラーゼの活性データを用いた。
pHAL-Fluc、pTOP-Rlucを含む安定細胞株を樹立するために用いたアッセイでは、細胞を96ウェルプレートに播種し、20 nMのβ−カテニンあるいはコントロール siRNAをLipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific)を用いて導入した。導入後48時間に細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼの活性を、ルシフェラーゼ発光試薬（PromegaおよびTOYO B-Net）と発光プレートリーダー(FLUOstar OPTIMA、BMG Labtech）を用いて測定した。
【００３１】
１−５．ウェスタンブロッティング
細胞をPBSで洗浄後、プロテアーゼ阻害剤(Protease inhibitor cocktail set III、Calbiochem)を加えたRadio Immunoprecipitation Assayバッファー(50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、1% NP40、0.1% SDS、0.5% sodium deoxycholate)で可溶化した。この細胞溶解液をBCAプロテインアッセイ（Thermo Fisher Scientific）を用いてタンパク質濃度を測定した。細胞タンパク質溶液はSDS-PAGEで分離後ニトロセルロースメンブレン(GE Healthcare)に転写し、一次抗体には抗β-catenin抗体(#9582, Cell Signaling Technology)および抗β-actin抗体(Sigma)を用いてハイブリダイゼーションを行った。それぞれに対応するHRP標識二次抗体を反応させた後、ECLウェスタンブロッティングシステム（GE Healthcare）を用いてシグナルの検出を行った。
【００３２】
１−６．網羅的な遺伝子発現解析
HepG2細胞に20 nMのβ−カテニンsiRNA（siβ-catenin #09、siβ-catenin #10）あるいは20 nMのコントロールsiRNA（siCtrl）をLipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific）を用いて導入した。各siRNA処理はduplicateで行った。siRNA導入から48時間後に細胞を回収し、RNeasy Mini Kitを用いてtotal RNAを抽出し、RNA 6000 Nano Lab-On-chipを用いてAgilent 2100バイオアナライザ（Agilent Technologies）により、RNAの品質確認を行った。200 ngのRNAはLow Input Quick Amp Labeling Kit, One-Color（Agilent Technologies）を用いてCy3ラベル化を行い、マイクロアレイ（SurePrint G3 Human GE マイクロアレイ 8x60K v1、Agilent Technologies）に65℃で17時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズ後にはバッファー洗浄を行い、直ちにスキャンした。シグナルの検出にはAgilent DNA マイクロアレイスキャナ（G2505、Agilent Technologies）を用いた。その後、得られた画像ファイルはAgilent Future Extraction Software9.5.3.1を用いて数値化を行った。
【００３３】
１−７．マイクロアレイデータ解析
マイクロアレイ解析により得られた数値データに加えて、米国NCBIの遺伝子発現情報データベース(Gene Expression Omnibus; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)に公開されているデータ(GSE46465)（Mol Cell. 2013 Jul 25;51(2):211-25. TRIB2 acts downstream of Wnt/TCF in liver cancer cells to regulate YAP and C/EBPα function. Wang J, Park JS, Wei Y, Rajurkar M, Cotton JL, Fan Q, Lewis BC, Ji H, Mao J.）を用いた。GeneSping GX11.5 software package（Agilent Technologies）にインポートし、siβ-catenin(#09)群、siβ-catenin(#10)群およびdnTCF7L2群(GSE46465)において、それぞれの対照群と比較して2倍以上発現上昇する遺伝子群を抽出した。その後、3つの群間に共通して存在する遺伝子群を抽出し、遺伝子リストを作成した。
【００３４】
１−８．安定細胞株の樹立
HepG2細胞にpTOP-Rlucを導入し、抗生物質(G418、Roche Diagnostics)を培地に添加して安定にプラスミドが導入された細胞の選択を行った。さらに、この細胞にpHAL-Flucを導入し、抗生物質Puromycin(Sigma)による選択を行った。このようにして得られた約280種類のクローンの中から、レポーターアッセイにより、β−カテニンsiRNA処置によってホタルルシフェラーゼ活性が顕著に増加し、しかもウミシイタケルシフェラーゼ活性が顕著に減少するクローンを選択し、HepG2 4-61細胞を得た。
【００３５】
２．結果
２−１．β−カテニン（β-catenin）/TCF7L2複合体によって発現抑制される遺伝子の同定
HepG2は、β−カテニン/TCF7L2複合体の活性が高い肝がん(hepatoblastoma)由来の細胞株である。この細胞に2種類のβ−カテニン特異的siRNA (#09、#10)を導入し、発現が増加する遺伝子を、DNAマイクロアレイを用いて解析した。その結果、発現が有意に誘導されるDNAマイクロアレイ上にスポットされたオリゴヌクレオタイドプローブ（entity）を、それぞれ2660（#09）、2465（#10）種類同定した。また、β−カテニン/TCF7L2複合体の活性を抑制するドミナントネガティブ（dominant negative）TCF7L2（dnTCF7L2）をHepG2細胞に導入した細胞の遺伝子発現解析のデータが公開されている。そのデータから、dnTCF7L2発現が誘導される810 種類のentityを同定した。これらの結果から、β−カテニン siRNA (#09、#10)、dnTCF7L2全てにより発現増加する遺伝子群を探索し、86のentityを同定した。これら86 種類のentityの中で、もっとも発現が上昇したトップ20 entityに相当する遺伝子を表４に示す。
【００３６】
【表４】
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【００３７】
２−２．大腸がん、肝がん細胞株におけるβ−カテニン/TCF7L2複合体の活性比較
β−カテニン/TCF7L2複合体の機能を制御する分子や物質の探索のために、がん細胞株でその複合体の活性を調べた（図１）。大腸がんや肝がんではAPC遺伝子やβ−カテニン(CTNNB1)遺伝子の異常のために、高頻度にβ−カテニン/TCF7L2の活性が上昇していることが知られている。そこで大腸がん細胞株(RKO、HCT116、SW480)、肝がん細胞株(Huh-7、Huh-6、HepG2)計6種類の細胞で、TOP-flash（TCF/LEFのレポータープラスミド）、FOP-flashレポータープラスミド（TCF/LEF結合配列に変異をもつレポータープラスミド；ネガティブコントロール）を用いて、β−カテニン/TCF7L2の活性を測定した。その結果、HepG2細胞で最も高い活性が認められた（図１Ａ）。各細胞株のAPC、 CTNNB1の遺伝子型は図１Ｂの通りである。
【００３８】
２−３．β−カテニンの発現を抑制するsiRNAの検討と評価
β−カテニンを特異的にノックダウンするために、3種類のβ−カテニンsiRNA (#09、#10、#12)の影響を、ウエスタンブロット法で調べた（図２Ａ）。その結果、HepG2細胞の野生型β−カテニン（Wt）の発現は、この3種類のsiRNAにより抑制されるが、変異型β−カテニン（Mut）の発現は、β−カテニン siRNA #09、およびsiRNA #10でのみ抑制された。この結果に一致して、TOP-flashの活性は、β−カテニンsiRNA (#09、#10)で抑制されるが、β−カテニン siRNA (#12)では抑制されなかった（図２Ｂ）。そこで以後の解析には、siRNA (#09、#10)を用いた。
【００３９】
２−４．β−カテニン/TCF7L2により負に発現制御される遺伝子群のプロモーター解析
β−カテニン/TCF7L2により負に発現制御されるトップ20遺伝子の中で、5種類の遺伝子(PCK1、HAL、OSTα、PLEK2、SLPI)の５’隣接領域を用いたレポータープラスミドを作製した。これらのレポータープラスミドを用いて、β−カテニン/TCF7L2の活性抑制により、レポーター活性が増加するかどうか解析を行った（図３）。β−カテニンsiRNA処理の結果、PCK1、HAL、OSTαの３種類の遺伝子領域が有意に転写活性化されることが明らかとなった。これに対し、dnTCF7L2の共発現では、PCK1、HAL、PLEK2、SLPI の4種類の領域が転写活性化された（図４）。共通して活性化された領域の中で、最も活性化の高いHAL遺伝子に関して、細胞内での発現がβ−カテニン/TCF7L2により負に調節されるか定量RT-PCRにより解析した（図５）。その結果、β−カテニン/TCF7L2で制御される既知の下流遺伝子AXIN2の発現は、β−カテニンsiRNA (#09、#10)で低下するのに対して（図５Ａ）、HAL遺伝子の発現は増加した（図５Ｂ）。
これらの結果は、HAL遺伝子はβ−カテニン/TCF7L2により発現抑制されているとともに、HAL遺伝子の５’隣接領域にその調節領域があることを示唆している。そこでレポータープラスミドにクローニングした-1726から+147ついて、詳細な調節領域の解析を進めることにした。
【００４０】
２−５．HAL遺伝子の調節領域解析
HAL遺伝子の様々な５’隣接領域の欠失レポータープラスミドを作製し、そのレポーター活性がβ−カテニンsiRNAにより誘導されるかどうか調べたところ、-90から-44に重要な領域があることが示された（図６）。そこで、この領域（-90〜-44の領域）をもつレポータープラスミドの活性が、大腸がんや肝がん細胞でβ−カテニンsiRNA処置により誘導されるかどうか調べたところ、肝がん細胞ではCTNNB1に遺伝子変異のある細胞株で顕著に増加した。大腸がん細胞株でもAPCまたは CTNNB1に遺伝子変異のある細胞株で有意に増加したが、その増加は肝がんと比較すると限られていた（図７）。APCまたは CTNNB1に変異のない細胞株では増加しなかった（RKO、Huh-7）。
次に、その活性上昇がβ−カテニン/TCF7L2活性に特異的かどうかを、3種類のβ−カテニンsiRNA (#09、#10、#12)でHepG2細胞を処理して検討したところ、β−カテニン/TCF7L2の活性を抑制する#09、#10のみで上昇し、#12では変化がなかった（図８）。また、dnTCF7L2によっても顕著に増加した（図９）。さらに、本来β−カテニン/TCF7L2活性の低いHeLa細胞やHuh-7細胞に、活性型のβ−カテニンを発現させたところ、HALのレポーター活性は減少した（図１０）。
これらの結果から、HALの５’隣接領域の-90から-44に、β−カテニン/TCF7L2活性特異的に、HAL遺伝子の発現が負に制御を受ける領域が存在することが明らかとなった。
従って、HALの５’隣接領域の-90から-44を基本転写因子の結合部分とつなげてプロモーターとして使用すること、あるいは、他のプロモーターとつなげてエンハンサーとして使用することが可能である。
【００４１】
２−６．β−カテニン/TCF7L2により負に制御されるレポータープラスミドの作製
HALの５’隣接領域の-90から-44に、β−カテニン/TCF7L2により、その発現が調節される領域があることから、基本転写因子の結合部位も含む-90から+147を1個、またはタンデムに複数（2個、4個、8個）もつレポータープラスミドを、pGL4.14ベクターを用いて作製した。これらのレポータープラスミド活性を、HepG2細胞で調べたところ、-90から+147の領域を8個もつプラスミドが最も高い活性を示した（図１１）。このプラスミドのインサートである8回繰り返しの調節領域を、他のレポーターベクター（pGL4.22、pGL4.24）のレポーター遺伝子の上流に組み込み、解析を行ったところ、pGL4.24ベクターに組み込んだレポータープラスミドが、最も高くβ−カテニンsiRNAにより活性誘導された（図１２）。そこで、このレポータープラスミドを「pHAL-Fluc」として、レポーターアッセイのための細胞株の樹立を行った。
【００４２】
２−７．β−カテニン/TCF7L2により、正と負の両方向に制御されるレポータープラスミドを発現する細胞株の樹立
β−カテニン/TCF7L2活性によって、負に調節される領域をホタルルシフェラーゼ（Firefly luciferase）遺伝子の上流に含むレポータープラスミド「pHAL-Fluc」を作製した。次に、TOP-flashのホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を異なるレポーター遺伝子、ウミシイタケルシフェラーゼ（Renilla luciferase）遺伝子に交換し、β−カテニン/TCF7L2活性によって、正に制御されるレポータープラスミド「pTOP-Rluc」を作製した。これら2種類のレポータープラスミドを、HepG2細胞に薬剤耐性遺伝子と共に導入し、約280種類のクローンの中から、β−カテニン/TCF7L2活性の低下によりホタルルシフェラーゼの活性が上昇するとともに、ウミシイタケルシフェラーゼの活性が低下するクローン、HepG2 4-61細胞株を樹立した。この細胞株では、β−カテニンsiRNAによりホタルルシフェラーゼ活性が約20倍誘導され、ウミシイタケルシフェラーゼ活性が約4分の1に低下した（図１３）。
この細胞は、HALのβ−カテニン/TCF7L2活性に調節される領域を複数個もっているが、他の発現抑制される遺伝子、例えば、PCK1の５’隣接領域-559から-183を含む領域を用いても、同様な細胞株の樹立が可能である（図１４）。図１４からは、PCK1の５’隣接領域-559から-183に、β−カテニン/TCF7L2活性特異的に、PCK1遺伝子の発現が負に制御を受ける領域が存在することがわかる。つまり、PCK1の５’隣接領域の-559から-183を基本転写因子の結合部分とつなげてプロモーターとして使用すること、あるいは、他のプロモーターとつなげてエンハンサーとして使用することが可能である。
また、他の発現抑制遺伝子の中から、β−カテニン/TCF7L2活性により負に制御される領域を同定すれば、同様に、β−カテニン/TCF7L2活性を効率良く検出することが可能であり、当業者において容易に行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明のスクリーニング方法を使用することで、転写因子を調節する上流のシグナル伝達経路および、転写因子または転写因子複合体、の活性を特異的に制御する分子や物質を簡便、かつ、効率的に検出することが可能となる。従って、本発明は、生命現象の解明を目的とするあらゆる分野において、利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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