(57)【要約】【課題】簡素化された高精度位置決め機構によりＰＣＲ特性を正確に取得できる核酸増幅検査装置等を提供する。【解決手段】核酸増幅検査装置２００は、反応溶液に含まれる標的核酸がＰＣＲ増幅する核酸反応部１１０を有するＰＣＲプレート３と、光照射部２２１、受光部２２２および光学走査部２２３を有する検出部２２０とを備え、ＰＣＲプレート３は、照射領域上の光学走査領域において、ＰＣＲプレート３におけるＰＣＲ増幅の基準位置の指標となるピッチ変調部３０を有する。【選択図】図１
2016165247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸を含む反応溶液が供給されることにより当該標的核酸がＰＣＲ増幅する核酸反応部を有するＰＣＲプレートと、
前記ＰＣＲプレートに照明光を照射する光照射部、前記照明光が照射された前記ＰＣＲプレートの照射領域からの光を検出する受光部、ならびに、前記ＰＣＲプレート上で前記光照射部および前記受光部に前記照射領域を光学走査させる光学走査部を有する光学検出機構とを備え、
前記ＰＣＲプレートは、
前記照射領域のうち光学走査される領域である光学走査領域において、前記ＰＣＲプレートにおける前記ＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部を有する
核酸増幅検査装置。
【請求項２】
前記ＰＣＲプレートは、前記反応溶液が流れるマイクロ流路を有し、前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、
前記位置指標部は、３箇所以上の前記反応溶液走査領域のピッチと異なるピッチを有する隣り合う反応溶液走査領域の間に配置されたピッチ変調部である
請求項１に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項３】
前記ピッチ変調部が配置された前記隣り合う反応溶液走査領域の前記ピッチの長さは、前記ピッチ変調部以外のピッチの長さの２倍以上であり、且つ、整数倍でない
請求項２に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項４】
前記位置指標部の光学特性は、前記光学走査領域のうち前記位置指標部以外の領域の光学特性と異なる
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項５】
前記位置指標部は、前記反応溶液が流れない部分に形成されている
請求項４に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項６】
前記位置指標部は、前記ＰＣＲプレートの内部、または、表面上に形成されている
請求項４または５に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項７】
前記位置指標部は、反射膜により形成されている
請求項４〜６のいずれか１項に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項８】
前記ＰＣＲプレートは、前記反応溶液が流れるマイクロ流路を有し、前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、
前記位置指標部は、前記３箇所以上の反応溶液走査領域のいずれかを含み、前記位置指標部に含まれる前記反応溶液走査領域における流路断面積は、前記位置指標部に含まれない前記反応溶液走査領域における流路断面積よりも大きい
請求項１に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項９】
前記ＰＣＲプレートは、前記反応溶液が流れるマイクロ流路を有し、
前記マイクロ流路は、複数の折返し点を有する蛇行流路である
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項１０】
前記ＰＣＲプレートは、前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、
隣り合う前記反応溶液走査領域の間の前記マイクロ流路の長さは、前記位置指標部の配置にかかわらず一定である
請求項９に記載の核酸増幅検査装置。  
【請求項１１】
前記ＰＣＲプレートは、複数の前記位置指標部を有する
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項１２】
前記ＰＣＲプレートには、前記標的核酸を検出するための色素物質を含む前記反応溶液が供給される
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項１３】
前記色素物質は、蛍光色素である
請求項１２に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項１４】
前記ＰＣＲプレートは、
前記光学走査領域に、前記反応溶液が前記核酸反応部を経由して流れ込むことで前記反応溶液の送液が完了したことを検出する送液完了検出部を有する
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸増幅検査装置。
【請求項１５】
標的核酸を含む反応溶液を、当該標的核酸がＰＣＲ増幅する核酸反応部を有するＰＣＲプレートに供給する供給ステップと、
前記ＰＣＲプレートに光を照射する光照射部と、前記光が照射された前記ＰＣＲプレートの照射領域からの光を受光する受光部とを、前記ＰＣＲプレート上で光学走査する走査ステップと、
前記ＰＣＲプレートに前記光を前記光照射部から照射し、前記照射領域からの光を前記受光部で検出する光検出ステップと、
前記供給ステップの後、前記照射領域のうち光学走査される領域である光学走査領域に配置された、前記ＰＣＲプレートにおける前記ＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部を前記受光部で検出する位置検出ステップと、を含む
核酸増幅検査方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲプレートは、前記光学走査領域に、前記反応溶液が前記核酸反応部を経由して流れ込むことで前記反応溶液の送液が完了したことを検出する送液完了検出部を有し、
さらに、
前記走査ステップの前に、前記送液完了検出部を前記照射領域に設定した状態で、前記送液完了検出部に前記反応溶液が到達したことにより前記送液完了検出部の前記反応溶液からの光を検出する送液完了検出ステップを含み、
前記送液完了検出ステップの終了タイミングに基づいて、前記走査ステップおよび前記光検出ステップを開始する
請求項１５に記載の核酸増幅検査方法。
【請求項１７】
前記ＰＣＲプレートは、
前記反応溶液が流れるマイクロ流路と、
複数の前記位置指標部とを有し、
前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、
前記走査ステップおよび前記光検出ステップでは、前記複数の位置指標部のそれぞれに隣接する前記反応溶液走査領域からの光のみを前記受光部で仮検出し、
前記仮検出された前記反応溶液走査領域の検出データに基づいて、前記送液完了検出部および複数の前記位置指標部で区切られた前記光学走査領域の区間うち、特定の前記区間において前記光照射部と前記受光部とを前記ＰＣＲプレート上で光学走査する
請求項１５または１６に記載の核酸増幅検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅検査装置およびこれを用いた核酸増幅検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、試料に含まれる標的核酸を短時間で増幅可能なＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が一般的に利用されている。ＰＣＲ増幅中の標的核酸量をリアルタイムに測定しそれを解析して検体中の標的核酸量を定量化する方法としてリアルタイムＰＣＲ法がある。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ法では、例えば、標的核酸を含む反応溶液（反応流体）に所望の温度変化を繰り返し与えることによって標的核酸を増幅させるマイクロ流体デバイス（ＰＣＲプレート）が用いられる。具体的には、マイクロ流体デバイスには、複数の異なる温度領域が設けられ、反応溶液が各温度領域を繰り返して通過するように蛇行した流路（蛇行流路）が設けられている。この温度変化が与えられたマイクロ流体デバイスの流路内を流れる反応溶液を光学測定することにより、標的核酸の増幅特性を高速に取得でき、検体中の標的核酸量を定量化することが可能となる。
【０００４】
特許文献１には、ＰＣＲプレートの上方に光学ヘッドを移動可能に配置し、ＰＣＲプレートのマイクロ流路中を流れる反応溶液からの蛍光を任意のＰＣＲサイクル回数の段階において測定可能なＰＣＲ装置が開示されている。
【０００５】
また、特許文献２には、温度が繰り返しパターンで変化する流路に流し、当該流路を流れる標的核酸を含む反応溶液の状態の変化を、当該流路の複数箇所で光学的検出する構成が開示されている。具体的には、上記流路が、回転駆動されるディスク上の試料分析領域に配置され、当該ディスクに対峙して設けられた光情報検出手段によって、流路内の反応溶液の情報が同時連続的かつ継続的に検知される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００７−３００８９６号公報
【特許文献２】特開２００５−２９５８７７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示されたＰＣＲ装置の場合、ＰＣＲプレートは測定ごとに交換されるが、ＰＣＲプレート外形とマイクロ流路との位置精度は成形品ごとにばらつく。このため、マイクロ流路の検出開始点近傍では、蛍光強度が小さいこともあり、検出開始点の位置検出精度の低下が懸念される。従って、ＰＣＲプレートを加熱冷却部に高精度で取り付けるだけではマイクロ流路の位置を高精度に検出することができず、画像処理等を用いた高精度位置決め機構が必要となり、装置が大型化および煩雑化してしまう。
【０００８】
また、特許文献２に開示された光学検出機構では、流路の回転駆動を実現するため、加熱冷却機構部の断熱機構および温度制御機構を回転駆動する構造が大型化および煩雑化してしまう。
【０００９】
本発明は、このような課題を解決するためになされたものであり、簡素化された位置決め機構によりＰＣＲ特性を高精度に取得できる核酸増幅検査装置及び核酸増幅検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様は、標的核酸を含む反応溶液が供給されることにより当該標的核酸がＰＣＲ増幅する核酸反応部を有するＰＣＲプレートと、前記ＰＣＲプレートに照明光を照射する光照射部、前記照明光が照射された前記ＰＣＲプレートの照射領域からの光を検出する受光部、ならびに、前記ＰＣＲプレート上で前記光照射部および前記受光部に前記照射領域を光学走査させる光学走査部を有する光学検出機構とを備え、前記ＰＣＲプレートは、前記照射領域のうち光学走査される領域である光学走査領域において、前記ＰＣＲプレートにおける前記ＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部を有する。
【００１１】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、前記反応溶液が流れるマイクロ流路を有し、前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、前記位置指標部は、３箇所以上の前記反応溶液走査領域のピッチと異なるピッチを有する隣り合う反応溶液走査領域の間に配置されたピッチ変調部である、としてもよい。
【００１２】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ピッチ変調部が配置された前記隣り合う反応溶液走査領域の前記ピッチの長さは、前記ピッチ変調部以外のピッチの長さの２倍以上であり、且つ、整数倍でない、としてもよい。
【００１３】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記位置指標部の光学特性は、前記光学走査領域のうち前記位置指標部以外の領域の光学特性と異なる、としてもよい。
【００１４】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記位置指標部は、前記反応溶液が流れない部分に形成されている、としてもよい。
【００１５】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記位置指標部は、前記ＰＣＲプレートの内部、または、表面上に形成されている、としてもよい。
【００１６】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記位置指標部は、反射膜により形成されている）、としてもよい。
【００１７】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、前記反応溶液が流れるマイクロ流路を有し、前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、前記位置指標部は、前記３箇所以上の反応溶液走査領域のいずれかを含み、前記位置指標部に含まれる前記反応溶液走査領域における流路断面積は、前記位置指標部に含まれない前記反応溶液走査領域における流路断面積よりも大きい、としてもよい。
【００１８】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、前記反応溶液が流れるマイクロ流路を有し、前記マイクロ流路は、複数の折返し点を有する蛇行流路である、としてもよい。
【００１９】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、隣り合う前記反応溶液走査領域の間の前記マイクロ流路の長さは、前記位置指標部の配置にかかわらず一定である、としてもよい。
【００２０】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、複数の前記位置指標部を有する、としてもよい。
【００２１】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ＰＣＲプレートには、前記標的核酸を検出するための色素物質を含む前記反応溶液が供給される、としてもよい。
【００２２】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記色素物質は、蛍光色素である、としてもよい。
【００２３】
また、本発明に係る核酸増幅検査装置の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、前記光学走査領域に、前記反応溶液が前記核酸反応部を経由して流れ込むことで前記反応溶液の送液が完了したことを検出する送液完了検出部を有する、としてもよい。
【００２４】
また、本発明に係る核酸増幅検査方法の一態様は、標的核酸を含む反応溶液を、当該標的核酸がＰＣＲ増幅する核酸反応部を有するＰＣＲプレートに供給する供給ステップと、前記ＰＣＲプレートに光を照射する光照射部と、前記光が照射された前記ＰＣＲプレートの照射領域からの光を受光する受光部とを、前記ＰＣＲプレート上で光学走査する走査ステップと、前記ＰＣＲプレートに前記光を前記光照射部から照射し、前記照射領域からの光を前記受光部で検出する光検出ステップと、前記供給ステップの後、前記照射領域のうち光学走査される領域である光学走査領域に配置された、前記ＰＣＲプレートにおける前記ＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部を前記受光部で検出する位置検出ステップと、を含む。
【００２５】
また、本発明に係る核酸増幅検査方法の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、前記光学走査領域に、前記反応溶液が前記核酸反応部を経由して流れ込むことで前記反応溶液の送液が完了したことを検出する送液完了検出部を有し、さらに、前記走査ステップの前に、前記送液完了検出部を前記照射領域に設定した状態で、前記送液完了検出部に前記反応溶液が到達したことにより前記送液完了検出部の前記反応溶液からの光を検出する送液完了検出ステップを含み、前記送液完了検出ステップの終了タイミングに基づいて、前記走査ステップおよび前記光検出ステップを開始する、としてもよい。
【００２６】
また、本発明に係る核酸増幅検査方法の一態様において、前記ＰＣＲプレートは、前記反応溶液が流れるマイクロ流路と、複数の前記位置指標部とを有し、前記光学走査領域と前記マイクロ流路とが、前記ＰＣＲプレートの平面視において重なる領域である反応溶液走査領域を３箇所以上含み、前記走査ステップおよび前記光検出ステップでは、前記複数の位置指標部のそれぞれに隣接する前記反応溶液走査領域からの光のみを前記受光部で仮検出し、前記仮検出された前記反応溶液走査領域の検出データに基づいて、前記送液完了検出部および複数の前記位置指標部で区切られた前記光学走査領域の区間うち、特定の前記区間において前記光照射部と前記受光部とを前記ＰＣＲプレート上で光学走査する、としてもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明に係る核酸増幅検査装置または核酸増幅検査方法よれば、ＰＣＲプレート中に位置指標部が設けられているので、簡素化された位置決め機構を用いてもＰＣＲ法により増幅された標的核酸の増幅特性を高精度に取得することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】実施の形態１に係る核酸増幅検査装置の構成を示す図である。
【図２】実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの斜視図である。
【図３】実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの分解斜視図である。
【図４】実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの平面図である。
【図５Ａ】実施の形態１に係る核酸増幅検査装置により測定された標的核酸の光検出データを示すグラフである。
【図５Ｂ】実施の形態１に係る主流路毎の蛍光発光ピークをプロットしたＰＣＲカーブを表すグラフである。
【図６】比較例に係る核酸増幅デバイスの平面図である。
【図７Ａ】比較例に係る核酸増幅デバイスを用いて測定された標的核酸の光検出データを示すグラフである。
【図７Ｂ】比較例に係る核酸増幅デバイスを用いて検出された蛍光発光ピークをプロットしたＰＣＲカーブを表すグラフである。
【図８Ａ】反応溶液走査領域の流路内が泡噛みした場合のＰＣＲプレートの平面外略図である。
【図８Ｂ】実施の形態１に係るピッチ変調部近傍におけるＰＣＲプレートの平面外略図である。
【図９】実施の形態２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。
【図１０Ａ】実施の形態２に係る核酸増幅検査装置により測定された標的核酸の光検出データを示すグラフである。
【図１０Ｂ】実施の形態２に係る主流路毎の蛍光発光ピークをプロットしたＰＣＲカーブを表すグラフである。
【図１１Ａ】実施の形態２に係る光学反射部の第１の形成位置を表すＰＣＲプレートの断面概略図である。
【図１１Ｂ】実施の形態２に係る光学反射部の第２の形成位置を表すＰＣＲプレートの断面概略図である。
【図１１Ｃ】実施の形態２に係る光学反射部の第３の形成位置を表すＰＣＲプレートの断面概略図である。
【図１２】実施の形態２の変形例に係る光学反射部を含む流路の平面図および断面図である。
【図１３】実施の形態２に係る核酸増幅検査方法を説明する動作フローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、いずれも本発明の好ましい一具体例を示すものである。したがって、以下の実施の形態で示される、数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、並びに、ステップ及びステップの順序などは、一例であって本発明を限定する主旨ではない。よって、以下の実施の形態における構成要素のうち、本発明の最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００３０】
なお、各図は、模式図であり、必ずしも厳密に図示されたものではない。また、各図において、実質的に同一の構成に対しては同一の符号を付しており、重複する説明は省略または簡略化する。
【００３１】
（実施の形態１）
［１．核酸増幅検査装置の構成］
実施の形態１に係る核酸増幅検査装置２００について、図１〜図４を用いて説明する。
【００３２】
図１は、実施の形態１に係る核酸増幅検査装置の構成を示す図である。本実施の形態における核酸増幅検査装置２００は、核酸増幅デバイス１と、核酸増幅デバイス１における核酸反応部１１０の温度を制御するための温度制御部２１０と、標的核酸の核酸増幅度を検出するための検出部２２０とを備える。この構成により、高速かつ高精度に標的核酸のＰＣＲ特性を検出することが可能となる。以下、核酸増幅デバイス１、温度制御部２１０および検出部２２０について詳細に説明する。
【００３３】
［１−１．核酸増幅デバイスの構成］
図２は、実施の形態１に係る核酸増幅デバイスの斜視図であり、図３は、同核酸増幅デバイスの分解斜視図であり、図４は、同核酸増幅デバイスの平面図である。
【００３４】
本実施の形態に係る核酸増幅デバイス１は、試料となる標的核酸を増幅させるためのデバイス（デバイスチップ）であって、ＰＣＲプレート３と、ヒータ部１４０とを備える。ＰＣＲプレート３は、少なくとも標的核酸を含む反応溶液が導入される導入部（インレット）１２０と、導入部１２０に導入された反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させるための核酸反応部１１０と、核酸反応部１１０で増幅された標的核酸を含む反応溶液を排出するための排出部（ドレイン）１３０とを備える。ヒータ部１４０は、標的核酸を含む反応溶液を加熱する。
【００３５】
核酸反応部１１０は、さらに、導入された反応溶液を毛管力により送液するための毛管力運搬機構を有する流路１００を有する。流路１００は、反応溶液が一方通行的に流れる反応流路であって、少なくとも核酸反応部１１０を通るように設けられている。
【００３６】
核酸反応部１１０では、反応溶液が流路１００内を毛管力（キャピラリ力）により送液されながら反応溶液に含まれる標的核酸が増幅する。反応溶液は、少なくとも試料となる標的核酸を含む溶液であり、本実施の形態では、標的核酸と標的核酸を増幅させるための反応試薬とを含む水溶液である。なお、反応溶液には、ある種のアルコールや界面活性剤等が含まれていてもよい。
【００３７】
本実施の形態では、核酸増幅デバイス１を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を実施し、当該ＰＣＲ法により増幅された標的核酸の増幅特性を検出する場合について説明する。ＰＣＲ法は、標的核酸（ターゲットＤＮＡ）を温度サイクルにより増幅させる技術である。反応溶液（反応流体）には、ターゲットＤＮＡの他に、ＰＣＲプライマやポリメラーゼ酵素、バッファー等が含まれている。このような反応溶液に温度サイクルを付与することで、ターゲットＤＮＡを増幅することができる。増幅したＤＮＡの増幅量は、反応検出機構によって検出することができる。
【００３８】
なお、反応溶液には、標的核酸を検出するための色素物質を含むことが好ましい。特に、本実施の形態では、後述する検出部２２０により反応溶液からの蛍光を検出するため、反応溶液に含まれる色素物質は、蛍光色素であることが好ましい。
【００３９】
これにより、ＰＣＲ増幅された標的核酸の増幅量を、光学測定系により高精度に測定することが可能となる。なお、本実施の形態では、反応溶液のレーザ励起光を照射し、当該反応溶液からの蛍光を検出しているが、これに限らず、蛍光以外の反射光、または、透過光などを検出してもよい。
【００４０】
核酸増幅デバイス１は、具体的には、図２〜図４に示すように、第１基板１０と、第２基板２０と、ヒータ部１４０とによって構成されている。また、ヒータ部１４０は、設定温度が異なる第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを備える。
【００４１】
本実施の形態における核酸増幅デバイス１は、マイクロ流路（流路１００）を有するマイクロ流体デバイスである。核酸増幅デバイス１の外形は、例えば縦の長さが４０ｍｍで横の長さが２０ｍｍの略矩形状である。
【００４２】
以下、核酸増幅デバイス１の各構成部材の詳細構成について、図２〜図４を用いて詳述する。
【００４３】
［１−１−１．第１基板］
図３に示すように、第１基板１０は、導入部１２０の一部を構成する第１凹部１１と、排出部１３０の一部を構成する第２凹部１２と、流路１００を構成する溝部１３とを備える。第１基板１０としては、例えばシリコン基板を用いることができる。
【００４４】
溝部１３（流路１００）は、第１凹部１１と第２凹部１２とをつなぐように形成されている。溝部１３（流路１００）には反応溶液が流れる。具体的には、第１凹部１１（導入部１２０）に反応溶液が導入されると、当該反応溶液は、第２凹部１２（排出部１３０）に向かって溝部１３（流路１００）内を進行する。
【００４５】
図４に示すように、流路１００は、複数の折返し点を有する蛇行流路であり、第１ヒータブロック１４１（第１温度領域）と第２ヒータブロック１４２（第２温度領域）とを交互に繰り返して通過するように構成されている。
【００４６】
具体的に、核酸反応部１１０における流路１００は、ライン状の流路を所定間隔毎に折り曲げながら連続的に折り返すように（往復するように）形成されている。核酸反応部１１０における流路１００の折り返し回数は、例えば２０〜７０サイクル程度である。
【００４７】
本実施の形態における流路１００は、ライン状の複数の主流路１００ａと、対向する各行の主流路１００ａの端部同士を接続する副流路１００ｂとを有する。主流路１００ａおよび副流路１００ｂは、核酸反応部１１０に設けられる。
【００４８】
ここで、流路１００が蛇行形成された核酸反応部１１０には、ピッチ変調部３０が複数箇所、形成されている。ピッチ変調部３０とは、光学走査領域に設けられた、ＰＣＲプレート３におけるＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部である。なお、光学走査領域とは、後述する検出部２２０の光照射部２２１が光を照射するＰＣＲプレート３上の照射領域のうち光学走査される領域であり、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２との境界上の領域である。
【００４９】
また、本実施の形態では、ＰＣＲプレート３は、光学走査領域と主流路１００ａとが、ＰＣＲプレート３の平面視において重なる領域である反応溶液走査領域４０を３箇所以上含んでいる。図４に示すように、反応溶液走査領域ＢからＣおよび反応溶液走査領域ＤからＥの反応溶液走査領域は等間隔に配置されている。これに対して、ピッチ変調部３０は、反応溶液走査領域ＢからＣおよび反応溶液走査領域ＤからＥのピッチである主流路１００ａの通常の蛇行ピッチと異なるピッチを有している。具体的には、ピッチ変調部３０は、反応溶液走査領域ＡとＢとの間、ＣとＤとの間、およびＥとＦとの間に配置されている。つまり、ピッチ変調部３０は、３箇所以上の反応溶液走査領域４０のピッチと異なるピッチを有する隣り合う反応溶液走査領域４０の間に配置されており、反応溶液が流れない部分に形成されている。
【００５０】
また、隣り合う反応溶液走査領域４０の間の流路１００の長さは、ピッチ変調部３０の配置にかかわらず一定である。これにより、隣り合う反応溶液走査領域４０間での標的核酸の増幅環境を均一とすることができ、反応溶液走査領域４０上を光学走査することにより取得されるＰＣＲカーブを高精度に評価することが可能となる。
【００５１】
主流路１００ａは、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを跨ぐように、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の長手方向に略直交させて設けられている。副流路１００ｂは、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の長手方向に略平行するように設けられている。
【００５２】
なお、流路１００は、さらに、反応溶液を導入部１２０から核酸反応部１１０に導くための流路である導入流路１００ｃと、反応溶液を核酸反応部１１０から排出部１３０までに導くための排出流路１００ｄとを有する。
【００５３】
このように構成される流路１００はマイクロ流路であり、例えば断面形状は矩形状である。この場合、流路１００を構成する溝部１３の流路幅（溝幅）は、例えば２０〜３００μｍ程度であり、溝部１３の深さは５０〜１５０μｍ程度である。流路１００が蛇行形状を有するマイクロ流路であることにより、簡易的な温度制御機構を用いて、小型でありながら標的核酸の増幅密度が高いＰＣＲプレートを形成することが可能となる。
【００５４】
なお、溝部１３の断面形状は、矩形に限らず、半円形又は逆三角形とすることができる。また、第１凹部１１及び第２凹部１２は、例えば円形開口の凹部とすることができる。また、第１基板１０の材料はシリコンに限らず、樹脂又はガラスであってもよい。
【００５５】
［１−１−２．第２基板］
図３に示すように、第２基板２０は、第１基板１０を覆う蓋部であり、第１基板１０上に配置される。第２基板２０としては、例えばガラス基板を用いることができる。第２基板２０には、導入部１２０の一部として、第２基板２０を貫通する第１貫通孔２１が設けられている。また、第２基板２０には、排出部１３０の一部として、第２基板２０を貫通する第２貫通孔２２が設けられている。第１貫通孔２１および第２貫通孔２２は、例えば円形開口を有する貫通孔である。
【００５６】
図２に示すように、第１基板１０上に第２基板２０を載置することによって、溝部１３の開口部分が塞がれて全方位が密閉された流路１００が構成される。これにより、流路１００は、反応溶液の送液方向（進行方向）に垂直な断面における壁面全周が閉じられた構成となり、かつ、導入部１２０及び排出部１３０においてのみ外部空間と繋がる構成となる。このように、流路１００の全方位を封止することによって、流路１００における毛管力を増強させることができるとともに、送液中に反応溶液が揮発することを抑制できる。
【００５７】
なお、第２基板２０の材料はガラスに限らず、樹脂又はシリコンであってもよい。
【００５８】
［１−１−３．ヒータ部および温度制御部］
図２〜図４に示すように、ヒータ部１４０は、少なくとも核酸反応部１１０に配置されており、核酸反応部１１０の流路１００に送液される反応溶液は、ヒータ部１４０によって所定の温度が付与される。
【００５９】
本実施の形態において、核酸反応部１１０には、ヒータ部１４０として、所定の異なる温度に設定された第１ヒータブロック１４１および第２ヒータブロック１４２が配置される。つまり、核酸反応部１１０には、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の２つのヒータブロックによって所定の異なる温度に設定された２つの温度領域が存在する。
【００６０】
なお、第１ヒータブロック１４１および第２ヒータブロック１４２は、例えば直方体のアルミニウムやステンレス等の金属からなる金属ブロックを用いたヒータである。ヒータ部１４０としては、ヒータブロック以外に、ガラス基板上に金属薄膜を印刷等により形成した金属薄膜ヒータ等を用いることもできる。
【００６１】
本実施の形態では、第１ヒータブロック１４１の温度が第２ヒータブロック１４２の温度よりも高くなるように設定されている。つまり、第１ヒータブロック１４１が配置された領域は高温領域であり、第２ヒータブロック１４２が配置された領域は低温領域である。
【００６２】
高温領域である第１ヒータブロック１４１の温度は、例えば９３℃〜９８℃であり、本実施の形態では、核酸増幅反応の変性反応温度である約９５℃としている。一方、低温領域である第２ヒータブロック１４２の温度は、例えば５０℃〜７５℃であり、本実施の形態では、アニール・伸長反応温度である約６０℃としている。
【００６３】
図４に示すように、ヒータ部１４０は温度制御部２１０に接続されている。これにより、第１ヒータブロック１４１及び第２ヒータブロック１４２の各温度は、温度制御部２１０によって制御することができる。
【００６４】
第１ヒータブロック１４１および第２ヒータブロック１４２は所定の隙間をあけて並べられている。第１ヒータブロック１４１および第２ヒータブロック１４２の上には第１基板１０が配置される。具体的には、流路１００における主流路１００ａが第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを跨ぐようにして第１基板１０がヒータ部１４０に載置される。これにより、流路１００は、２つの温度領域を複数サイクルで往復するように構成される。
【００６５】
この構成により、導入部１２０から反応溶液を導入したときに、反応溶液は核酸反応部１１０における２つの温度領域（第１ヒータブロック１４１および第２ヒータブロック１４２）を交互に繰り返して通過して排出部１３０に送液される。つまり、流路１００を流れる反応溶液に対してヒートサイクルを付与することができる。
【００６６】
以上、本実施の形態に係る核酸増幅検査装置２００の構成により、核酸増幅デバイス１は、標的核酸の二本鎖を解離させる変性反応温度と、変性された一本鎖がアニーリングを開始すると共に伸長するアニール・伸長反応温度との間で加熱冷却を繰り返すＰＣＲサイクルを繰り返しながら、反応溶液に含まれる標的核酸を増幅させる。そして検出部２２０は、流路１００における標的核酸を含む反応溶液の蛍光強度を測定する。
【００６７】
また、流路１００の毛管力運搬機構による毛管力によって反応溶液を送液することができるので、シリンジポンプ等の外部ポンプを用いることなく反応溶液を流路内に進行させることができる。
【００６８】
［１−１−４．検出部］
検出部２２０は、光学検出機構であり、図１に示すように、核酸増幅デバイス１の照射領域に光を照射する光照射部２２１と、核酸増幅デバイス１に照射された光の反射光を受光する受光部２２２と、核酸増幅デバイス１の光学走査領域に上記光を走査させるための光学走査部２２３とを備える。
【００６９】
光照射部２２１は、青色光を発するレーザ素子を備えており、例えば中心波長が４８８ｎｍのレーザ光を出力する。受光部２２２は、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ）である。なお、検出部２２０は、その他に、励起カットフィルタ２２４およびダイクロイックミラー２２５等の光学素子を備える。
【００７０】
本実施の形態では、青色光のレーザ光を反応溶液に照射することによって、青色光を励起光として蛍光発光した緑色光が反射光として戻ってくるように構成されている。この緑色光（反射光）の蛍光量は、核酸の増幅量に応じて変化する。したがって、緑色光の蛍光量を測定することで核酸の増幅量を算出することができる。
【００７１】
本実施の形態に係る核酸増幅検査装置２００は、加熱・冷却系（ヒータ部１４０）と光学検出系（検出部２２０）とが一体化された評価装置である。このように加熱・冷却系と検出系とを一体化することで、簡便な検出装置を実現できる。また、検出系を光学検出方式とすることにより非接触で核酸の増幅量を検出することができる。
【００７２】
なお、本実施の形態では、検出部２２０は、光照射部２２１から出射されたレーザ光がＰＣＲプレート３で反射された光または、反応溶液から発せられた蛍光を受光部２２２にて観測する。このため、検出部２２０の光照射部２２１および受光部２２２を、ＰＣＲプレート３の片側に設置することが可能となる。これにより、光学測定系の配置構成を簡素化でき、省スペース化を実現できる。
【００７３】
上記構成によれば、検出部２２０は、核酸増幅デバイス１に導入した反応溶液における標的核酸の増幅量を検出する場合、図１に示すように、主流路１００ａと交差する方向にレーザ光を走査するとともに反射光を受光する。つまり、蛇行形成された流路１００を横切るようにレーザ光を走査することにより、各主流路１００ａにおける蛍光強度をＰＣＲサイクルの回数に対応させて測定することができる。これにより、ＰＣＲサイクルを、ある特定の回数付与したときの蛍光強度のみではなく、０回からＰＣＲサイクル終了に至るまでの蛍光強度に基づいて標的核酸の増幅特性であるＰＣＲカーブを描かせることができる。つまり、第１ヒータブロック１４１と第２ヒータブロック１４２とを往復する流路１００のサイクルに応じた標的核酸の増幅曲線を取得することができる。
【００７４】
なお、標的核酸を検出する色素物質として特定の波長の光を吸収するが蛍光は発しない色素物質を用いた場合、光検出機構としては、光照射部２２１と受光部２２２はＰＣＲプレート３を間に挟んだ状態で対向して設置することが好ましい。このような構成にすることにより、光照射部２２１で照射された光のうち反応溶液中の色素物質で吸収されなかった光を受光部２２２で検出することができる。
【００７５】
［２．実施例に係る核酸増幅検査］
上記構成を有する核酸増幅検査装置２００を用いて、標的核酸の増幅量を検出する手順を説明する。
【００７６】
まず、反応溶液をＰＣＲプレート３の導入部１２０に流し込む。反応溶液は、流路１００内をキャピラリ力で自走しながら、ヒータ部１４０により変性温度とアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返し、標的核酸を増幅させる。
【００７７】
次に、反応溶液が排出部１３０に到達した後に、流路１００を横切るように長手方向に沿って、受光部２２２、励起カットフィルタ２２４及びダイクロイックミラー２２５で構成された光学検出機構を、核酸反応部１１０上に走査させる。このとき、核酸反応部１１０における反応溶液走査領域４０の光検出強度（蛍光強度）を流路１００のサイクルに対応させて測定する。
【００７８】
図５Ａは、実施の形態１に係る核酸増幅検査装置により測定された標的核酸の光検出データを示すグラフである。同図において、横軸は、光学検出機構が核酸反応部１１０上を走査した場合のＰＣＲサイクル数を表す。言い換えると、横軸は、上記光学検出機構の核酸反応部１１０上における走査変位を表す。また、縦軸は、光照射部２２１から出射されるレーザ励起光を核酸反応部１１０に照射することにより核酸反応部１１０から出射された蛍光を受光部２２２で検出した場合の光検出強度を表す。光照射部２２１から出射されるレーザ励起光と受光部２２２で検出される蛍光の波長とを異ならせることで、励起光の反射光である背景蛍光とＰＣＲ反応による蛍光との強度差を強調することができる。具体的には、流路１００以外の核酸反応部１１０上を測定した場合には、背景蛍光による低い光検出強度が測定される。一方、流路１００上では、標的核酸の増加量に応じて、背景蛍光より高い蛍光発光強度が測定される。また、標的核酸が増加するほど、標的核酸からの蛍光発光と背景蛍光との強度差は大きくなる。
【００７９】
図５Ａに示すように、光学検出機構の走査により光検出強度の増減が繰り返される。この光検出強度の繰り返しピッチは、走査レーザ光が主流路１００ａを横切るピッチを表している。ここで、ピッチ変調部３０に隣接していない主流路１００ａ（図４中のＢ−Ｃ間およびＥ−Ｆ間）のピッチは等間隔となっており、図５Ａのグラフにおける光検出強度の繰り返しピッチに対応している。一方、光検出強度の繰り返しピッチが変化している箇所（図５Ａ中のＡ−Ｂ間、Ｃ−Ｄ間およびＥ−Ｆ間）は、ピッチ変調部３０での光検出強度に対応している。ピッチ変調部３０は、主流路１００ａの間であって反応溶液が流れない部分に形成されているため、ピッチ変調部３０での蛍光強度は、ピッチ変調部３０以外の反応溶液走査領域４０での蛍光強度と異なる。このピッチ変調部３０での蛍光強度の変化を図５Ａのグラフから読み取ることにより、核酸反応部１１０の基準位置を特定することが可能となる。これにより、加熱・冷却系（ヒータ部１４０）および光学系（検出部２２０）に対してＰＣＲプレート３の取付け位置がずれている場合、または、ＰＣＲプレート３上における核酸反応部１１０の形成位置がずれている場合であっても、流路１００における基準位置を特定できる。よって、この基準位置に基づいて、ＰＣＲサイクル数を正確に測定することが可能となる。つまり、ＰＣＲプレート３中に位置指標部が設けられているので、簡素化された位置決め機構によりＰＣＲ特性を高精度に取得することが可能となる。
【００８０】
なお、ピッチ変調部３０を、標的核酸の増加が進行し蛍光強度が高くなっている反応溶液走査領域４０の近傍（図５ＡのＥ−Ｆ間）に設けることで、蛍光検出による光検出強度のＳ／Ｎ比（標的核酸からの蛍光発光と背景蛍光との強度比）を、より大きく確保できる。
【００８１】
図５Ｂは、主流路毎の蛍光発光ピークをプロットしたＰＣＲカーブを表すグラフである。図５Ｂに示すように、ＰＣＲサイクル数の増加に従って標的核酸の増幅量が増加することがわかる。このＰＣＲカーブから、標的核酸の評価指標の一つである閾サイクル数を求めることができる。ここで、閾サイクル数とは、光検出強度が蛍光閾強度に到達するＰＣＲサイクル数である。例えば、閾サイクル数を、光検出強度の最大値（飽和値）の１０％程度となるサイクル数として求めることにより、標的核酸の初期濃度を定量することが可能となる。
【００８２】
［３．比較例に係る核酸増幅検査］
ここで、比較例に係る核酸増幅検査装置を用いた核酸増幅検査について説明する。
【００８３】
図６は、比較例に係る核酸増幅デバイスの平面図である。本比較例に係る核酸増幅デバイス５０１は、ＰＣＲプレート５０３と、ヒータ部５４０とを備える。ＰＣＲプレート５０３は、導入部５２０と、核酸反応部５１０と、排出部５３０とを備える。ヒータ部５４０は、標的核酸を含む反応溶液を加熱する。
【００８４】
核酸反応部５１０は、さらに、流路５００を有する。流路５００は、反応溶液が一方通行的に流れる反応流路であって、核酸反応部５１０を通るように設けられている。
【００８５】
図６示すように、流路５００は、蛇行するように形成された蛇行流路であり、第１ヒータブロック５４１（第１温度領域）と第２ヒータブロック５４２（第２温度領域）とを交互に繰り返して通過するように構成されている。核酸反応部１１０における流路５００は、ライン状の流路を所定間隔毎に折り曲げながら連続的に折り返すように（往復するように）形成されている。核酸反応部５１０における流路５００の折り返し回数は、例えば２０〜７０サイクル程度である。流路５００は、ライン状の複数の主流路５００ａと、対向する各行の主流路５００ａの端部同士を接続する副流路５００ｂとを有する。主流路５００ａ及び副流路５００ｂは、核酸反応部５１０に設けられる。ここで、本比較例に係る核酸増幅デバイス５０１では、全ての主流路５００ａのピッチは等間隔となっている。
【００８６】
主流路５００ａは、第１ヒータブロック５４１と第２ヒータブロック５４２とを跨ぐように、第１ヒータブロック５４１及び第２ヒータブロック５４２の長手方向に略直交させて設けられている。副流路５００ｂは、第１ヒータブロック５４１及び第２ヒータブロック５４２の長手方向に略平行するように設けられている。流路５００は、さらに、反応溶液を導入部５２０から核酸反応部５１０に導くための流路である導入流路５００ｃと、反応溶液を核酸反応部５１０から排出部５３０までに導くための排出流路５００ｄとを有する。
【００８７】
図７Ａは、比較例に係る核酸増幅デバイスを用いて測定された標的核酸の光検出データを示すグラフである。同図において、横軸は、上記光学検出機構が核酸反応部５１０上を走査した場合のＰＣＲサイクル数を表す。また、縦軸は、レーザ励起光を核酸反応部５１０に照射することにより核酸反応部５１０から出射された蛍光を検出した場合の光検出強度を表す。図７Ａに示すように、光検出強度の繰り返しピッチは、走査レーザ光が主流路５００ａを横切るピッチを表している。ここで、核酸増幅デバイス５０１の全ての主流路５００ａのピッチは等間隔となっており、図７Ａのグラフにおける光検出強度の繰り返しピッチに対応している。
【００８８】
図７Ｂは、比較例に係る核酸増幅デバイスを用いて検出された蛍光発光ピークをプロットしたＰＣＲカーブを表すグラフである。図７Ｂに示すように、ＰＣＲサイクルの増加に従って標的核酸の増幅量が増加することがわかる。このＰＣＲカーブから、標的核酸の評価指標の一つである閾サイクル数を求めることができる。
【００８９】
しかしながら、ＰＣＲプレート５０３は測定ごとに交換されるが、ＰＣＲプレート５０３の外形と流路５００との位置精度は成形品ごとにばらつく。このため、流路５００の検出開始点近傍では、蛍光強度が小さいこともあり、光学系により検出される核酸増幅開始点の位置精度の低下が懸念される。従って、ＰＣＲプレート５０３を加熱冷却部に高精度に取り付けたとしても、流路５００の検出基準位置を高精度に検出することができない。
【００９０】
一例として、比較例に係るＰＣＲプレート５０３の流路幅は、０．１ｍｍ〜０．５ｍｍ程度であり、主流路５００ａのピッチは、０．２ｍｍから１ｍｍ程度である。また、ＰＣＲプレート５０３の外形と流路５００との位置精度は、成形品の収縮や張り合わせ公差により±０．２ｍｍ程度である。ＰＣＲプレート５０３は、測定ごとに交換されるため、結局、±０．２ｍｍ程度の取り付け公差を必要とする。このため、流路５００の検出開始点近傍では、位置測定精度の低下が懸念される。
【００９１】
図７Ｂには、２つのＰＣＲカーブが示されており、各ＰＣＲカーブを基にして閾サイクル数が求められている。この閾サイクル数の大小により、標的核酸の解析が可能であるが、本比較例に係る核酸増幅デバイス５０１を用いた場合、例えば、核酸増幅開始点の位置精度が低下する。閾サイクル数は、核酸増幅開始点から蛍光閾強度に到達したＰＣＲサイクルまでのサイクル数であるが、核酸増幅開始点の位置精度の低下のため、閾サイクル数の算出精度も低下する。これにより、異なるＰＣＲプレートを用いて測定された２つの閾サイクル数を高精度に比較することが困難となる。この閾サイクル数の算出精度を向上させるため、比較例に係る核酸増幅デバイス５０１を用いて測定する場合には、例えば、画像処理等を用いた高精度位置決め機構が必要となり、装置が大型化および煩雑化してしまう。
【００９２】
上述した比較例に係る核酸増幅デバイスを用いた核酸増幅検査と比較して、本実施の形態に係る核酸増幅検査装置２００によれば、加熱・冷却系（ヒータ部１４０）および光学系（検出部２２０）に対してＰＣＲプレート３の取付け位置がずれている場合、または、ＰＣＲプレート３上における核酸反応部１１０の形成位置がずれている場合であっても、検出部２２０がピッチ変調部３０からの反射光（蛍光）を高精度に検出できる。これにより、流路１００における基準位置を特定できる。よって、ＰＣＲサイクル数を正確に測定することが可能となる。つまり、ＰＣＲプレート３中に位置指標部が設けられているので、簡素化された位置決め機構によりＰＣＲ特性を高精度に取得することが可能となる。
【００９３】
また、光学測定系および加熱・冷却系と核酸増幅デバイスとの位置関係に依存せず、流路１００における基準位置を特定できるので、ＰＣＲプレート３を容易に交換できる。よって、短時間で高密度なＰＣＲ測定を実現できる。
【００９４】
［４．実施例に係る核酸増幅検査装置のその他の構成］
図８Ａは、反応溶液走査領域の流路内が泡噛みした場合のＰＣＲプレートの平面外略図である。同図に示すように、導入部１２０に反応溶液を注入する際に、流路１００内へ微小気泡が流れ込む場合がある。この状態で、上記微小気泡が加熱されると、突沸等で気泡が大きく成長する。この成長した気泡が、反応溶液走査領域４０に滞留した状態で、検出部２２０が当該反応溶液走査領域４０を光学検出する場合が想定される。この場合、検出部２２０は、背景蛍光と同等の蛍光強度を測定してしまうため、当該反応溶液走査領域４０をピッチ変調部３０であるものと誤認識してしまう可能性がある。
【００９５】
これに対して、本実施の形態に係る核酸増幅デバイス１では、ピッチ変調部３０に隣接する２つの反応溶液走査領域４０のピッチを、ピッチ変調部３０に隣接しない反応溶液走査領域４０のピッチの長さの２倍以上であり、且つ、整数倍でないこととしてもよい。
【００９６】
図８Ｂは、ピッチ変調部近傍におけるＰＣＲプレートの平面外略図である。本実施の形態では、同図に示すように、ピッチ変調部３０に隣接する２つの反応溶液走査領域４０のピッチＮ２と、ピッチ変調部３０に隣接しない反応溶液走査領域４０のピッチＮ１との関係が、２Ｎ１＜Ｎ２＜３Ｎ１となるように、Ｎ２が設定されている。
【００９７】
これにより、反応溶液走査領域４０の流路内が泡噛みするなどにより検出された蛍光強度と、ピッチ変調部３０での蛍光強度とを、隣接する反応溶液走査領域４０から検出される蛍光強度ピークの間隔を確認することにより識別することが可能となる。よって、基準位置であるピッチ変調部３０を、正確に特定できる。よって、ＰＣＲサイクル数を正確に測定することが可能となる。
【００９８】
また、本実施の形態に係るＰＣＲプレート３は、複数のピッチ変調部３０を有している。これにより、一つのピッチ変調部３０からの蛍光検出、または、当該ピッチ変調部３０に隣接する反応溶液走査領域４０からの蛍光検出のノイズレベルが高いなどにより、当該ピッチ変調部３０を識別できない場合であっても、他のピッチ変調部３０によりＰＣＲサイクル数を正確に測定することが可能となる。
【００９９】
［５．核酸増幅検査方法］
なお、本発明は、上述した特徴的な構成を備える核酸増幅検査装置２００として実現することができるだけでなく、核酸増幅検査方法として実現することができる。以下、本実施の形態に係る核酸増幅検査方法について説明する。
【０１００】
まず、標的核酸を含む反応溶液を、導入部１２０からＰＣＲプレート３に供給する（供給ステップ）。
【０１０１】
次に、ＰＣＲプレート３に光を照射する光照射部２２１と、ＰＣＲプレート３の照射領域からの光を受光する受光部２２２とを、ＰＣＲプレート３上で光学走査する（走査ステップ）。
【０１０２】
次に、上記走査ステップを実行しながら、ＰＣＲプレート３にレーザ光を光照射部２２１から照射し、照射領域からの光を受光部２２２で検出する（光検出ステップ）。
【０１０３】
次に、上記光検出ステップにおいて、照射領域のうち光学走査される領域である光学走査領域に配置された、ＰＣＲプレート３におけるＰＣＲ増幅の基準位置の指標となるピッチ変調部３０を受光部２２２で検出する（位置検出ステップ）。なお、ピッチ変調部３０は、ＰＣＲプレート３におけるＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部であって、主流路１００ａの通常の蛇行ピッチと異なるピッチを有している。
【０１０４】
これにより、加熱・冷却系（ヒータ部１４０）および光学系（検出部２２０）に対してＰＣＲプレート３の取付け位置がずれている場合、または、ＰＣＲプレート３上における核酸反応部１１０の形成位置がずれている場合であっても、流路１００における基準位置を特定できる。よって、ＰＣＲサイクル数を正確に測定することが可能となる。つまり、ＰＣＲプレート３中に位置指標部が設けられているので、簡素化された位置決め機構によりＰＣＲ特性を高精度に取得することが可能となる。
【０１０５】
また、ＰＣＲプレート３は、図１〜４に示すように、排出部１３０を有している。ここで、排出部１３０は、反応溶液が核酸反応部１１０を経由して流れ込むことで当該反応溶液の送液が完了したことを検出する送液完了検出部である。
【０１０６】
なお、検出部２２０が核酸反応部１１０を光学走査する前に、排出部１３０を照射領域に設定した状態で、排出部１３０に上記反応溶液が到達したことにより排出部１３０の反応溶液からの光を検出し（送液完了検出ステップ）、当該検出タイミングに基づいて上記走査ステップおよび上記光検出ステップを開始してもよい。
【０１０７】
反応溶液の粘性、およびＰＣＲプレート３の流路寸法のばらつきなどにより、反応溶液が排出部１３０に到達するまでの送液時間はばらつくことが想定される。このため、導入部１２０に反応溶液を注入後、送液時間のばらつきを考慮した安定時間の経過後、検出部２２０により光学走査を開始する必要があり、測定時間が長くなってしまう。また、この安定時間の経過中に、流路１００内で反応溶液の拡散が生じ、蛍光強度が変化する可能性がある。
【０１０８】
これに対して、排出部１３０の配置により、および、上記送液完了検出ステップを実行することにより、測定時間の短縮および安定化を図ることができる。
【０１０９】
（実施の形態２）
本実施の形態に係る核酸増幅デバイス２は、ＰＣＲプレート４におけるＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部を有する。本実施の形態に係る核酸増幅デバイス２は、実施の形態１に係る核酸増幅デバイス１と比較して、上記位置指標部の構成が異なる。以下、本実施の形態に係る核酸増幅検査装置について、実施の形態１に係る核酸増幅検査装置２００と同じ構成は説明を省略し、異なる点を中心に説明する。
【０１１０】
［６．核酸増幅デバイスの構成］
図９は、実施の形態２に係る核酸増幅デバイスの平面図である。本実施の形態に係る核酸増幅デバイス２は、標的核酸を増幅させるためのデバイスであって、ＰＣＲプレート４と、ヒータ部１４０とを備える。ＰＣＲプレート４は、反応溶液が導入される導入部１２０と、核酸反応部３１０と、排出部１３０とを備える。
【０１１１】
核酸反応部３１０は、流路１００を有する。核酸反応部３１０では、反応溶液が流路１００内を毛管力により送液されながら反応溶液に含まれる標的核酸が増幅する。
【０１１２】
本実施の形態では、核酸増幅デバイス２を用いてＰＣＲ法を実施し、当該ＰＣＲ法により増幅された標的核酸の増幅特性を検出する場合について説明する。
【０１１３】
流路１００が蛇行形成された核酸反応部３１０には、光学反射部３５が複数箇所、形成されている。光学反射部３５は、光学走査領域に設けられた、ＰＣＲプレート４におけるＰＣＲ増幅の基準位置の指標となる位置指標部である。光学反射部３５の光学特性は、光学走査領域のうち光学反射部３５以外の領域の光学特性と異なる。より具体的には、光学反射部３５の光反射強度は、光学走査領域のうち光学反射部３５以外の反応溶液走査領域４０の蛍光強度よりも高い。この光学特性を実現するため、光学反射部３５は、例えば、金属からなる反射膜で形成されている。これにより、流路１００を加工することなく、主流路１００ａの間に簡易的な形成方法で光学反射部３５を形成でき、高い反射光強度を確保することが可能となる。なお、光学反射部３５は、金属反射膜で形成されていなくてもよく、蛍光発光部材などで形成されていてもよい。
【０１１４】
また、本実施の形態では、ＰＣＲプレート４は、光学走査領域と主流路１００ａとが、ＰＣＲプレート４の平面視において重なる領域である反応溶液走査領域４０を３箇所以上含んでいる。
【０１１５】
本実施の形態では、図９に示すように、光学反射部３５は、主流路１００ａの通常の蛇行ピッチと異なるピッチを有している。つまり、光学反射部３５は、３箇所以上の反応溶液走査領域４０のピッチと異なるピッチを有する隣り合う反応溶液走査領域４０の間に配置されている。
【０１１６】
なお、光学反射部３５が形成された領域は、本実施の形態のように、主流路１００ａの通常の蛇行ピッチと異なるピッチを有していなくてもよい。つまり、光学反射部３５が形成された領域に隣接する反応溶液走査領域４０のピッチは、主流路１００ａの通常の蛇行ピッチと同じであってもよい。実施の形態１では、ピッチ変調部３０の位置は、光検出強度のピーク間隔に基づいて特定される。これに対して、実施の形態２では、光学反射部３５の位置は光検出強度の大きさに基づいて特定されるが、さらに、これを補足すべく光検出強度のピーク間隔が利用される。よって、光学反射部３５の光検出強度が、他の反応溶液走査領域４０の蛍光強度と比較して十分大きく設定されている場合には、光学反射部３５が形成された近傍のピッチを、主流路１００ａの通常の蛇行ピッチと異ならせる必要はない。
【０１１７】
また、隣り合う反応溶液走査領域４０の間の流路１００の長さは、光学反射部３５の配置にかかわらず一定である。
【０１１８】
なお、ヒータ部１４０、温度制御部２１０および検出部２２０の構成は、実施の形態１に係るそれらと同じであるため、本実施の形態ではそれらの説明を省略する。
【０１１９】
［７．実施例に係る核酸増幅検査］
上記構成を有する核酸増幅検査を用いて、標的核酸の増幅量を検出する手順を説明する。
【０１２０】
まず、反応溶液をＰＣＲプレート４の導入部１２０に流し込む。反応溶液は、流路１００内をキャピラリ力で自走しながら、ヒータ部１４０により変性温度とアニーリング温度との間で加熱冷却を繰り返し、標的核酸を増幅させる。
【０１２１】
次に、反応溶液が排出部１３０に達した後に、流路１００を横切るように長手方向に沿って光学検出機構を、核酸反応部３１０上に走査させる。このとき、核酸反応部３１０における反応溶液走査領域４０の光検出強度（蛍光強度）を流路１００のサイクルに対応させて測定する。
【０１２２】
図１０Ａは、実施の形態２に係る核酸増幅検査装置により測定された標的核酸の光検出データを示すグラフである。同図において、横軸は、上記光学検出機構が核酸反応部３１０上を走査した場合のＰＣＲサイクル数を表す。また、縦軸は、光照射部２２１から出射されるレーザ励起光を核酸反応部３１０に照射することにより核酸反応部３１０から出射された蛍光を受光部２２２で検出した場合の光検出強度を表す。なお、本実施の形態では、光学反射部３５からの反射光は、蛍光ではなく、光照射部２２１から出射されるレーザ励起光と同波長の反射光を検出している。
【０１２３】
図１０Ａに示すように、光学検出機構の走査により光検出強度の増減が繰り返される。この光検出強度の繰り返しピッチは、実施の形態１の図７Ａと同様に、走査レーザ光が主流路１００ａを横切るピッチを表している。
【０１２４】
なお、本実施の形態における光学走査の方向は、実施の形態１における光学走査の方向と逆方向であり、図９における排出部１３０→光学反射部３５（Ｇ）→光学反射部３５（Ｈ）→光学反射部３５（Ｊ）の方向である。よって、図１０Ａのグラフにおいて、ＰＣＲサイクル数の増加方向に対して、光検出強度が減少する方向となっている。
【０１２５】
ここで、光学反射部３５に隣接していない主流路１００ａのピッチは等間隔となっており、図１０Ａのグラフにおける光検出強度の繰り返しピッチに対応している。一方、光検出強度が反応溶液走査領域４０からの蛍光強度よりも大きい箇所は、光学反射部３５での光検出強度を示している。つまり、光学反射部３５での光反射強度は、光学反射部３５以外の反応溶液走査領域４０での蛍光強度と異なる。この光学反射部３５での蛍光強度の変化を図１０Ａのグラフから読み取ることにより、核酸反応部３１０の基準位置を特定することが可能となる。これにより、加熱・冷却系（ヒータ部１４０）および光学系（検出部２２０）に対してＰＣＲプレート４の取付け位置がずれている場合、または、ＰＣＲプレート４上における核酸反応部３１０の形成位置がずれている場合であっても、流路１００における基準位置を特定できる。よって、ＰＣＲサイクル数を正確に測定することが可能となる。つまり、ＰＣＲプレート４中に位置指標部が設けられているので、簡素化された位置決め機構によりＰＣＲ特性を高精度に取得することが可能となる。
【０１２６】
なお、光学反射部３５を、標的核酸の増加が進行していない（蛍光強度が低い）反応溶液走査領域４０の近傍（図１０ＡのＨまたはＪ）に設けることで、光検出強度のＳ／Ｎ比（光学反射部３５からの反射強度と反応溶液走査領域４０からの蛍光強度との強度比）を、より大きく確保できる。
【０１２７】
図１０Ｂは、主流路毎の蛍光発光ピークをプロットしたＰＣＲカーブを表すグラフである。図１０Ｂに示すように、ＰＣＲサイクルの増加に従って光検出強度が減少することがわかる。このＰＣＲカーブから、標的核酸の評価指標の一つである閾サイクル数を求めることができる。
【０１２８】
［８．光学反射部の形成］
次に、光学反射部３５の形成位置について説明する。光学反射部３５は、ＰＣＲプレート４の貼り合わせ面、表面、および裏面のいずれに設けてもよい。
【０１２９】
図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１１Ｃは、それぞれ、実施の形態２に係る光学反射部の第１の形成位置、第２の形成位置および第３の形成位置を表すＰＣＲプレートの断面概略図である。図１１Ａ〜１１Ｃには、ＰＣＲプレート４の主流路１００ａと交差する面で切断した断面図が表され、流路１００が形成された第１基板が上方に表され、第１基板を覆う蓋部である第２基板が下方に表されている。つまり、ＰＣＲプレート４の表面側が下方に、また、裏面側が上方に表されている。
【０１３０】
図１１Ａでは、光学反射部３５は、第１基板と第２基板とが貼りあわされる境界部に形成されている。このように、光学反射部３５は、ＰＣＲプレート４の内部に形成されていることが好ましい。
【０１３１】
なお、光学反射部３５を、流路１００が形成されていない第２基板に形成する場合は、基板の貼り合せの精度のばらつきにより、流路１００に対する光学反射部３５の位置精度が低くなる。よって、図１１Ａに示すように、光学反射部３５は、ＰＣＲプレート４の内部であって流路１００が形成される第１基板に形成されることが好ましい。
【０１３２】
なお、図１１Ｃに示すように、光学反射部３５は、ＰＣＲプレート４の表面側（第１基板上）に形成されてもよい。
【０１３３】
また、図１１Ｂに示すように、光学反射部３５がＰＣＲプレート４の裏面に形成された場合、ＰＣＲプレート４の裏面がヒータ部１４０と密着するため、光学反射部３５の反射膜が剥がれる可能性がある。
【０１３４】
以上より、光学反射部３５は、ＰＣＲプレート４の内部、または、表面上に形成されていることが好ましい。
【０１３５】
これにより、光学反射部３５を、高精度かつ安定に配置することが可能となる。
【０１３６】
なお、光学反射部は、上述した光学反射部３５のように主流路１００ａの間に配置されなくてもよく、主流路１００ａ内に形成されてもよい。
【０１３７】
図１２は、実施の形態２の変形例に係る光学反射部を含む流路の平面図および断面図である。同図には、主流路１００ａと光学走査領域とが重複する領域が拡大表示されている。図１２の上方には、並行する３本の主流路１００ａが表されているが、中央に位置する主流路１００ａには光学反射部３６が形成されている。具体的には、光学反射部３６の流路断面積は、光学反射部３６に含まれない反応溶液走査領域４０における流路断面積よりも大きい。これにより、光学反射部３６において、流路の体積が大きくなる。流路の体積が大きくなると、レーザ励起光が照射される体積が増加し、蛍光発光強度が大きくなる。具体的には、例えば、図１２に示すように、主流路１００ａの深さを、反応溶液走査領域４０における主流路１００ａの深さよりも大きくした箇所を光学反射部３６とする。これにより、流路１００における基準位置を特定できる。よって、ＰＣＲサイクル数を正確に測定することが可能となる。
【０１３８】
なお、光学反射部３６の流路容積が、光学反射部３６に含まれない反応溶液走査領域４０における流路容積よりも大きくなるように構成されていてもよい。
【０１３９】
［９．核酸増幅検査方法］
反応溶液の粘性、およびＰＣＲプレート４の流路寸法のばらつきなどにより、反応溶液が排出部１３０に到達するまでの送液時間はばらつくことが想定される。このため、導入部１２０に反応溶液を注入後、送液時間のばらつきを考慮した安定時間の経過後、検出部２２０により光学走査を開始する必要があり、測定時間が長くなってしまう。また、この安定時間の経過中に、流路１００内で反応溶液の拡散が生じ、蛍光強度が変化する可能性がある。
【０１４０】
また、受光部２２２は送液が完了するまでは排出部１３０における背景蛍光を検出するが、当該背景蛍光の強度は低いため、検出部２２０により排出部１３０の位置検出をすることが困難な場合がある。さらに、排出部１３０が小面積である場合、ＰＣＲプレート４の位置ずれによって、送液完了を検出できない場合も想定される。
【０１４１】
また、検出部２２０により蛍光強度を計測する場合には、光学検出機構の計測安定時間および光学検出機構の振動抑制期間を考慮する必要があるため、光学検出機構の移動を低速にする必要があり、流路全体のＰＣＲ測定に時間がかかってしまう。
【０１４２】
これに対して、本実施の形態に係る核酸増幅検査方法を実行することにより、ＰＣＲ測定時間を大幅に短縮することが可能となる。以下、本実施の形態に係る核酸増幅検査方法について説明する。
【０１４３】
図１３は、実施の形態２に係る核酸増幅検査方法を説明する動作フローチャートである。
【０１４４】
まず、標的核酸を含む反応溶液を、当該標的核酸がＰＣＲ増幅する核酸反応部３１０を有するＰＣＲプレート４に供給する（供給ステップ）。
【０１４５】
一方、受光部２２２により、排出部１３０に隣接する光学反射部３５Ｚの反射光を検出することにより、排出部１３０の位置を特定する（Ｓ１０）。これにより、光学検出機構を排出部１３０に精度よく合わせることが可能となる。また、光学検出機構を排出部１３０上に待機させ、反応溶液が排出部１３０に到達して蛍光強度が変化したことを検出したことをきっかけとしてＰＣＲ測定を開始することで、測定時間の短縮と測定の安定化を図ることができる。
【０１４６】
次に、光学検出機構を排出部１３０に合わせた状態で、排出部１３０に反応溶液が到達したことにより排出部１３０の反応溶液からの光を検出する（Ｓ２０）。
【０１４７】
次に、複数の光学反射部３５Ｇ、３５Ｈおよび３５Ｊのそれぞれに隣接する反応溶液走査領域４０からの蛍光を受光部２２２で仮測定する（Ｓ３０）。つまり、排出部１３０に反応溶液が到着した後、光学反射部３５Ｇへ計測なしで光学検出機構を高速移動させ、光学反射部３５Ｇを検出後、光学反射部３５Ｇに隣接する仮測定点である反応溶液走査領域４０で仮測定を行う。次に、光学反射部３５Ｈへ計測なしで光学検出機構を高速移動させ、光学反射部３５Ｈを検出後、光学反射部３５Ｈに隣接する仮測定点である反応溶液走査領域４０で仮測定を行う。次に、光学反射部３５Ｊへ計測なしで光学検出機構を高速移動させ、光学反射部３５Ｊを検出後、光学反射部３５Ｊに隣接する仮測定点である反応溶液走査領域４０で仮測定を行う。
【０１４８】
次に、仮測定された複数の上記反応溶液走査領域４０の蛍光強度と蛍光閾強度とを比較する（Ｓ４０）。具体的には、排出部１３０および複数の光学反射部（３５Ｇ、３５Ｈ、３５Ｊ）で区切られた光学走査領域の区間うち、蛍光閾強度を跨る区間を特定する。図１３の例では、光学反射部３５Ｈと３５Ｇとの間の区間において、蛍光閾強度を跨っている。
【０１４９】
次に、仮検出された反応溶液走査領域４０の検出データより、蛍光閾強度を跨る区間が存在した場合には（Ｓ４０のＹ）、蛍光閾強度を跨る区間を本測定区間と決定し、また、光学走査方向を決定する（Ｓ５０）。
【０１５０】
最後に、ステップＳ５０で決定された本測定区間および光学走査方向に従い、光照射部２２１と受光部２２２とをＰＣＲプレート４上で光学走査して、ＰＣＲ本測定を実行する（Ｓ６０）。
【０１５１】
上記核酸増幅検査方法によれば、排出部１３０に隣接する光学反射部３５Ｚにより、排出部１３０での光検出強度が低くても、また、排出部１３０が小面積であっても、排出部１３０の位置を、正確に特定することが可能となる。
【０１５２】
また、複数の光学反射部３５の光検出強度およびこれらに隣接する反応溶液走査領域４０の蛍光強度を仮測定し、当該仮測定された蛍光強度と蛍光閾強度とを比較することにより、詳細にＰＣＲ測定すべき区間を限定することができる。これにより、光学検出機構によるＰＣＲ計測時間を大幅に短縮することが可能となる。
【０１５３】
（その他）
以上、本発明に係る核酸増幅検査装置及び核酸増幅検査方法について、実施の形態及び変形例に基づいて説明したが、本発明は、上記実施の形態及び変形例に限定されるものではない。
【０１５４】
例えば、実施の形態２で説明した核酸増幅検査方法は、光学反射部３５を有する核酸増幅デバイス２に対して適用されるだけでなく、実施の形態１に係るピッチ変調部３０を有する核酸増幅デバイス１に対しても適用可能である。具体的には、上記ステップＳ３０において、複数のピッチ変調部３０のそれぞれに隣接する反応溶液走査領域４０からの蛍光のみを受光部２２２で仮測定し、当該仮測定された蛍光強度と蛍光閾強度とを比較することにより、詳細にＰＣＲ測定すべき区間を限定することができる。これにより、光学検出機構によるＰＣＲ計測時間を大幅に短縮することが可能となる。
【０１５５】
例えば、上記実施の形態及び変形例では、核酸反応部１１０における流路１００を蛇行流路として標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるフローＰＣＲとしたが、フローＰＣＲとせずに標的核酸を含む反応溶液に温度変化を繰り返し与えるようなＰＣＲとしてもよい。但し、上記実施の形態のようにフローとした方が効率良くＰＣＲを実施することができる。
【０１５６】
また、上記実施の形態及び変形例では、流路１００を蛇行流路としたが、これに限らない。例えば、平面上に形成された渦巻き状の流路であって、当該流路が高温領域（９５℃）と低温領域（６０℃）とを交互に通過するように構成してもよい。
【０１５７】
また、上記実施の形態及び変形例では、ヒータ部１４０は２つの温度領域としたが、３つ以上の温度領域としてもよい。この場合、流路は、反応溶液が異なる複数の温度領域を周期的に通過するように構成されていればよい。
【０１５８】
また、上記実施の形態及び変形例では、複数の温度領域の各温度の設定は、ヒータブロックで行ったが、ペルチェ素子等の他の温度制御部材を用いて温度設定してもよい。
【０１５９】
また、上記実施の形態１および２では、毛管力によって反応溶液を送液したが、これに限るものではない。例えば、流路にシリンジポンプをつないで反応溶液を送液してもよいし、毛管力以外の方法で反応溶液を自送液させてもよい。
【０１６０】
その他、各実施の形態及び変形例に対して当業者が思いつく各種変形を施して得られる形態や、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で実施の形態における構成要素及び機能を任意に組み合わせることで実現される形態も本発明に含まれる。
【符号の説明】
【０１６１】
３、４    ＰＣＲプレート
３０    ピッチ変調部
３５、３５Ｇ、３５Ｈ、３５Ｊ、３５Ｚ、３６    光学反射部
４０    反応溶液走査領域
１００、５００    流路（マイクロ流路）
１１０、３１０    核酸反応部
１３０    排出部（送液完了検出部）
２００    核酸増幅検査装置
２２０    検出部（光学検出機構）
２２１    光照射部
２２２    受光部
２２３    光学走査部
【図１】
2016165247.tif 000003
【図２】
2016165247.tif 000004
【図３】
2016165247.tif 000005
【図４】
2016165247.tif 000006
【図５Ａ】
2016165247.tif 000007
【図５Ｂ】
2016165247.tif 000008
【図６】
2016165247.tif 000009
【図７Ａ】
2016165247.tif 000010
【図７Ｂ】
2016165247.tif 000011
【図８Ａ】
2016165247.tif 000012
【図８Ｂ】
2016165247.tif 000013
【図９】
2016165247.tif 000014
【図１０Ａ】
2016165247.tif 000015
【図１０Ｂ】
2016165247.tif 000016
【図１１Ａ】
2016165247.tif 000017
【図１１Ｂ】
2016165247.tif 000018
【図１１Ｃ】
2016165247.tif 000019
【図１２】
2016165247.tif 000020
【図１３】
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