(57)【要約】【課題】細胞に損傷を与えることなく細胞を捕捉し、細胞捕捉チップの孔における細胞捕捉率を向上させる。【解決手段】単一細胞を基板上に捕捉する細胞捕捉チップにおいて、ガラス基板と、ガラス基板の両面を構成する第１面１１から第２面１２に向けて貫通し、基板面に対して２次元配列された貫通孔２０とを有し、貫通孔は第１面から第２面に向けて径が連続して小さくなる円錐台形状であって、少なくともその貫通孔の内側面はプラズマ照射により、照射前のガラス基板の親水性よりも高い親水性を有する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞を基板上に捕捉する細胞捕捉チップにおいて、
基板と、
前記基板の両面を構成する第１面から第２面に向けて貫通し、基板面に対して２次元配列された貫通孔とを有し、
前記貫通孔は前記第１面から第２面に向けて径が連続して小さくなる円錐台形状であって、少なくともその貫通孔の内側面はプラズマ照射により、照射前の前記基板の親水性よりも高い親水性を有することを特徴とする細胞捕捉チップ。
【請求項２】
前記第２面はプラズマ照射による親水処理が施されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項３】
前記貫通孔の前記内側面の親水性は、前記第２面の側からのプラズマ照射により形成されたことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項４】
前記貫通孔の前記内側面の親水性は、前記第１面及び前記第２面の両側からのプラズマ照射により形成されたことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項５】
前記第１面は、前記貫通孔が配列され、細胞懸濁液を滴下する領域は親水性を有し、他の領域はその領域に比べて疎水性を有することを特徴とする請求項１乃至請求項４の何れか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項６】
前記基板はガラス基板であることを特徴とする請求項１乃至請求項５の何れか１項に記載の細胞捕捉チップ。
【請求項７】
単一細胞を基板上に捕捉する細胞捕捉方法において、
基板の両面を構成する第１面から第２面に向けて貫通し、直径が前記第１面から第２面に向けて小さくなる円錐台形状である、基板面に対して２次元配列された貫通孔を有する基板に対して、少なくとも前記第２面からプラズマを照射して、前記貫通孔の内面に親水処理を施し、
前記基板の前記第１面に細胞懸濁液を滴下して、前記貫通孔に単一細胞を捕捉することを特徴とする細胞捕捉方法。
【請求項８】
前記プラズマ照射は、前記第１面及び前記第２面の両側から照射されることを特徴とする請求項７に記載の細胞捕捉方法。。
【請求項９】
前記第１面におけるプラズマ照射は、前記細胞懸濁液を滴下する領域のみ実行して、その領域の親水性を他の領域よりも高くすることを特徴とする請求項８に記載の細胞捕捉方法。
【請求項１０】
前記基板はガラス基板であることを特徴とする請求項７乃至請求項９の何れか１項に記載の細胞捕捉方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単位細胞毎に細胞の性状や機能などの解析を行うための細胞捕捉チップ及び細胞捕捉方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、下記特許文献１〜４に開示されているように、基板に多数の孔を２次元配列して、各孔に細胞を捕捉することで、孔の座標により細胞を特定してその性状や機能の分析を行うことが知られている。
特許文献１において、Ｓｉ基板に細胞を捕捉する碗状凹部とその底部に連続する吸引孔から成る多数の貫通孔を２次元配列した細胞捕捉チップが知られている。この細胞捕捉チップでは、吸引孔からの吸引により細胞が碗状凹部に捕捉される。また、特許文献２によると、特許文献１に開示された構造と同様に、碗状凹部とその底部に連続する径のより小さな貫通孔とを有した構造において、碗状凹部の内壁面の一部は疎水処理が、貫通孔の内壁面には親水処理が施されている。貫通孔に液体が入り込む毛細管現象を利用して細胞を碗状凹部に捕捉するものである。
【０００３】
また、特許文献３においては、基板をＰＥＴ樹脂として、２次元配列させる孔を、細胞を取り入れる側の開口の径が液体を流出させる側の開口の径よりも小さい反すり鉢状とし、細胞懸濁液を孔に導入する流路内面を非イオン性活性剤で処理することが行われている。これにより孔の吐出口から吸引することによる細胞の破壊の防止と、導入流路に細胞が付着することが防止されている。
【０００４】
さらに、特許文献４においては、細胞を捕捉する孔を２次元配列させたマイクロアレイチップにおいて、基板をポリスチレンなどの疎水性材料で構成した場合には、基板の表面を酸素プラズマ処理などの親水化処理を施すことが望ましく、基板をガラスなどの親水材料で構成した場合には、基板表面を親水化処理することが必要ではないとしている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００７−２２２１３２号公報
【特許文献２】特許第５０８１８５４号公報
【特許文献３】特許第５２７８９１３号公報
【特許文献４】ＷＯ２０１０／０２７００３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記特許文献１、３に開示のマイクロアレイチップは、孔の吐出口から吸引することで、細胞を孔に捕捉するチップであるので、細胞に損傷を与えるという問題があった。また、特許文献２によると細胞を捕捉する径の大きな碗状凹部とその底部に連続する径のより小さな貫通孔とを設けることが必要であり、さらには、碗状凹部には疎水処理、貫通孔には親水処理を必要とするために、加工が複雑になるという問題がある。また、特許文献４に開示のマイクロアレイチップは、樹脂製基板の表面にプラズマを照射して、接触角が所定範囲に制御された親水性を持たせることで、基板表面に細胞懸濁液を滴下して孔に細胞を捕捉するようにしている。しかしながら、基板表面における細胞懸濁液の流動性は向上しても、孔内部での親水性については示唆がなく、細胞の捕捉効率が未だ高くないという問題がある。
【０００７】
そこで、本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであり、細胞に損傷を与えることなく細胞を捕捉し、細胞捕捉チップの孔における細胞捕捉率を向上させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、単一細胞を基板上に捕捉する細胞捕捉チップにおいて、基板と、基板の両面を構成する第１面から第２面に向けて貫通し、基板面に対して２次元配列された貫通孔とを有し、貫通孔は第１面から第２面に向けて径が連続して小さくなる円錐台形状であって、少なくともその貫通孔の内側面はプラズマ照射により、照射前の基板の親水性よりも高い親水性を有することを特徴とする細胞捕捉チップである。
【０００９】
本発明において、プラズマ照射による親水処理は、ラジカル（酸素ラジカルなど）による表面洗浄による表面からの疎水基の離脱、付着した不純物の除去、表面への親水基の付着、表面改質などの概念を含む処理である。また、基板には、ガラス基板の他、ステンレス、シリコン、ＰＥＴなどの樹脂を用いることができる。
本発明において、第２面はプラズマ照射による親水処理が施されていることが望ましい。このときに、貫通孔の内側面の親水性と第２面の親水性との共同作用により、細胞懸濁液の貫通孔への流入と、溶媒の貫通孔からの排出を促進でき、細胞の捕捉率を向上させることができる。また、貫通孔の内側面における親水性は、第２面に近い程、高いことが望ましい。また、貫通孔の内側面は、第２面に近い程、親水基の密度が大きいことが望ましい。これらの親水度又は親水基の分布のときに捕捉率はさらに向上するものと予測される。これらの親水度や親水基の分布は、第２面の側からのプラズマ照射により形成されると考えられる。また、貫通孔の内側面の親水性は、第１面及び第２面の両側からのプラズマ照射により形成されたものでも良い。さらに、第１面は、貫通孔が配列され、細胞懸濁液を滴下する領域は親水性を有し、他の領域はその領域に比べて疎水性を有することが望ましい。両面からプラズマを照射して、且つ、第１面に親水性に差を持たせる場合に、捕捉率は最大となる。
【００１０】
他の発明は、方法発明であり、単一細胞を基板上に捕捉する細胞捕捉方法において、基板の両面を構成する第１面から第２面に向けて貫通し、直径が第１面から第２面に向けて小さくなる円錐台形状である、基板面に対して２次元配列された貫通孔を有する基板に対して、少なくとも第２面からプラズマを照射して、貫通孔の内面に親水処理を施し、基板の第１面に細胞懸濁液を滴下して、貫通孔に単一細胞を捕捉することを特徴とする細胞捕捉方法である。
【００１１】
この方法発明においては、細胞懸濁液は、貫通孔の内側面における親水性を利用して貫通孔の第２面側に導くことができる。また、第２面にも親水性処理が施されていることから、貫通孔から溶媒の排出を促進させることができる。また、貫通孔は、第２面に近い程、親水性を高くすることで、捕捉率を向上させ得ると考えられる。また、プラズマ照射は、第１面及び第２面の両側から照射されても良い。両面から照射する場合に細胞の捕捉率を最も大きくすることができる。さらに、第１面におけるプラズマ照射は、細胞懸濁液を滴下する領域のみ実行して、その領域の親水性を他の領域よりも高くすることが望ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、貫通孔は第１面から第２面に向けて径が連続して小さくなる円錐台形状であって、少なくともその貫通孔の内側面はプラズマ照射により、照射前の基板の親水性よりも高い親水性を有している。このため、細胞懸濁液を貫通孔の内部に容易に導き、溶媒を排出して細胞を貫通孔に効果的に捕捉することができ、細胞の捕捉率を向上させることができる。吸引などの外力を用いていないので、細胞に損傷を与えることがない。
【００１３】
また、第２面がプラズマ照射による親水処理が施されていると、貫通孔に流入した細胞懸濁液の溶媒の第２面への排出を促進させることができる。
また、貫通孔の内側面における親水性を第２面に近い程、高くすることが、第２面側の開口から溶媒を排出することを促進し、細胞の捕捉率をより向上させているものと推定される。
【００１４】
方法発明においては、基板の第１面から第２面に向けて径が連続して小さくなる円錐台形状の貫通孔の内側面を、少なくとも第２面からプラズマを照射して、貫通孔の内面に親水処理を施し、基板の第１面に細胞懸濁液を滴下して、貫通孔に単一細胞を捕捉するようにしている。このため、細胞懸濁液が貫通孔の内部を流れ易くなり、細胞の捕捉率が向上するする。また、貫通孔の吐出口から吸引するなどの外力を用いていないので、捕捉する細胞を損傷させることがない。
【００１５】
また、細胞懸濁液は、貫通孔の内側面における親水性が第２面に近い程高いことを利用して貫通孔の第２面側に導くことにより、貫通孔の第２面側の開口からの溶媒の排出が促進されるので、細胞の捕捉率をより向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の具体的な一実施例に係る細胞捕捉チップの平面図。
【図２】同細胞捕捉チップの断面図。
【図３】プラズマ照射による接触角変化率の時間変化特性を測定した特性図。
【図４】プラズマ照射有りと無の場合とで、接触角の変化の時間変化を示した写真。
【図５】ビーズ捕捉率とプラズマ照射面との関係を測定した特性図。
【図６】細胞捕捉率と細胞懸濁液の細胞個数密度との関係を測定した特性図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を具体的な一実施例に基づいて説明する。本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
［細胞捕捉チップの構成］  
本実施例は基板にガラス基板を用いた例である。図１は、細胞捕捉チップ１の平面図であり、図２はその断面図ある。細胞捕捉チップ１は、ガラス基板１０に後述する貫通孔を形成し、プラズマ処理を施すことにより形成される。ガラス基板１０は、細胞懸濁液を滴下して細胞を捕捉する貫通孔２０が２次元配列された捕捉領域Ｓ１と、貫通孔２０の存在しない非捕捉領域Ｓ２とを有している。厚さ１４０μｍのガラス基板１０の捕捉領域Ｓ１において、ｘ軸方向に１０列、ｙ方向に１０行の２次元配列された１００個の貫通孔２０が形成されている。ガラス基板１０は表面である第１面１１と裏面である第２面１２とを有し、貫通孔２０は第１面１１上の第１開口２１と第２面１２上の第２開口２２とを有している。第１面１１は細胞懸濁液を滴下する面、第２面１２は細胞懸濁液を滴下しない面で溶媒を排出する側の面である。貫通孔２０は円錐台形状であり、第１開口２１の直径は２５μｍ、第２開口２２の直径は６μｍ、高さは１４０μｍである。この貫通孔２０の内側面２３と、第１面１１の捕捉領域Ｓ１、又は、第２面１２には後述するプラズマ照射により親水性処理が施されている。
【００１９】
［貫通孔の製法］
貫通孔２０の形成は次のようにレーザを用いて行った。レーザには、第３高調波Ｎｄ：ＹＶＯ４レーザ装置から出射される高繰り返しパルスレーザ（波長３５５ｎｍ、繰り返し周波数１１０ｋＨｚ、２８Ｗ）を用いた。レーザ装置から出射されたレーザパルス（パルス幅２０ｎｓ、パワー７Ｗ、ビーム径３．５ｍｍ）を、対物レンズでガラス基板１０の第１面１１に集光させた。１つの貫通孔２０当たりの照射時間は約３．５ｍｓであり、ガラス基板１０をＸＹステージに固定して、貫通孔２０を加工する毎にＸＹステージを任意に動かすことによってピッチ２００μｍで１０×１０に２次元配列された貫通孔群を作成した。
【００２０】
第１面１１上のレーザビームのスポット径を調整することで、貫通孔２０の第１開口２１の直径を制御することができる。第１開口２１の直径は、２０〜２５μｍφ、第２開口２２の直径は５〜１０μｍφとすることができた。このようにガラス基板１０の第１面１１側からレーザを照射するだけで、第１面１１上に第１開口２１の直径が、第２面１２側の第２開口２２の直径よりも大きくなる円錐台形状の貫通孔２０を形成できた。
【００２１】
なお、貫通孔２０の第１面１１での第１開口２１の半径と第２面１２での第２開口２２の半径との差の基板の厚さに対する比は、実験で用いたガラス基板では、０．０６８であるが、０．０１７以上、０．１２３以下の範囲の任意の値とすることが望ましい。この比の範囲は、貫通孔２０の内側面２３と第１面１１との成す角で表現すると、実験で用いたガラス基板では、３．８８°であり、１°以上、７°以下の範囲である。これらの範囲にある時に細胞の捕捉率を高くすることができる。内側面２３の傾斜が大きくなり過ぎると細胞を内側面２３に捕捉し難く、内側面２３の傾斜が緩やかになり過ぎると、単一細胞の捕捉が困難になると思われる。さらに、ガラス基板１０の厚さの貫通孔２０の第１面１１における第１開口２１の直径に対する比は、実験で用いたガラス基板では、５．６であり、２以上、１０以下とすることが望ましい。この比はアスペクト比であるが、第１開口２１の直径や基板の厚さ（貫通孔の長さ）が捕捉率に関与するものと想定される。この範囲にある時に細胞の捕捉率を高くすることができる。また、貫通孔２０の第１面１１での第１開口２１の直径は捕捉する細胞の最大長の１倍以上、２倍以下とすることが望ましく、第２開口２２の直径は捕捉する細胞の最小長の０．５倍以上、１倍以下とすることが望ましい。これは、血球系細胞・がん細胞の直径が概ね１０μｍ〜２０μｍの範囲に分布することに由来し、細胞懸濁液を第１面１１側から第２面１２側に効率よく導き、細胞を貫通孔２０により効果的に捕捉するためである。したがって、第１開口２１の直径は、１０μｍ以上、４０μｍ以下、より望ましくは１５μｍ以上、３０μｍ以下が望ましく、第２開口２２の直径は、５μｍ以上、２０μｍ以下、より望ましくは５μｍ以上、１７μｍ以下が望ましい。
【００２２】
［親水性処理とその評価］
次に、ガラス基板１０の貫通孔２０の開口の径が小さい側の第２面１２にプラズマを照射した後、貫通孔２０の開口の径が大きい側の第１面における貫通孔２０の配列上に水を１μＬ滴下して、水滴の接触角を測定した。プラズマの照射条件は、大気圧、Ａｒ流量２．１３ＳＬＭ、Ｎ2 流量５．０ＳＬＭ、電圧９０Ｖであり、処理時間を０〜５ｍｉｍまで変化させた。比較のために貫通孔の形成されていないガラス基板（No. １）、貫通孔を有するがプラズマを照射しないガラス基板（No. ２）、貫通孔を有するガラス基板であって、プラズマ照射時間が、それぞれ、１、２、３、４、５ｍｉｎのガラス基板（No. ３、No. ４、No. ５、No. ６、No. ７）を準備した。なお、水滴の下には、１０×１０個の貫通孔が存在する。なお、微量に酸素を含ませると、酸素ラジカルの作用により親水性が向上するので望ましい。
【００２３】
水滴滴下直後の水滴の初期接触角θ1 と滴下後２ｍｉｍ経過後の水滴の接触角θ2 を測定し、接触角の変化率Δθ（％）を求めた。ただし、変化率Δθは、（１）式で表される。
【数１】
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【００２４】
その結果を図３に示す。No. １とNo. ２のガラス基板を比較すると、接触角の変化率に差異はない。すなわち、プラズマを照射していない場合には、貫通孔２０の存在は接触角の変化に影響を与えないということが分かる。プラズマを照射した場合には、接触角の変化率は、No. １とNo. ２のガラス基板に比べて大きくなっている。すなわち、水滴滴下２ｍｉｎ後の接触角θ2 が初期接触角θ1 に比べて約７０％程低下していることが分かる。そして、接触角の変化率は、プラズマの照射時間が１ｍｉｎ以上の場合に、それ以上長くなっても、ほとんど変化していないことが理解される。したがって、プラズマ照射時間は少なくとも１ｍｉｎあれば良い。
【００２５】
この実験から、プラズマを照射していない場合には、貫通孔が存在しても、接触角の変化率が小さいことから、水滴はその貫通孔に浸水し難いことが分かる。また、プラズマを照射した場合には、接触角の変化率が大きく、接触角が水滴滴下後の経過時間に対して減衰することから、時間の経過に伴い水が貫通孔に浸入し易いことが分かる。プラズマは第２面から照射しているので、第１面の親水性は、プラズマを照射していないガラス基板（No. ２）と、第２面からプラズマを照射したガラス基板（No. ３〜No. ７）とで差異はない。それであるにもかかわらず、接触角の変化率は、ガラス基板（No. ３〜No. ７）の方が、ガラス基板（No. ２）に比べて圧倒的に大きい。このことから、第２面からのプラズマ照射により、貫通孔の内側面の親水性が向上するために、貫通孔への水の浸入が促進されたと理解することができる。また、第２面からのプラズマ照射により、第１面上の水滴の貫通孔へ浸入容易性が向上していることは、図４に示す水滴の画像からも理解される。図４からは、減衰して安定した接触角は１３．６°である。なお、この接触角は、貫通孔への浸水を促進するには、１０°以下となることがなお望ましい。
【００２６】
［捕捉実験］
次に、細胞の貫通孔への捕捉率を推定するために、直径１０μｍの蛍光ビーズを水に溶解して一定濃度のビーズ懸濁液を製造した。ビーズの個数密度は１０００／５．５μＬである。準備したガラス基板は、表１に示すように、No. １１〜No. １８の８個であり、何れも図１に示す貫通孔２０の２次元配列を有している。
【表１】
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【００２７】
１. プラズマ照射の差異によるガラス基板の種類
No. １１〜No. １３のガラス基板は、ビーズ懸濁液を滴下する第１面において、貫通孔の存在しない非捕捉領域Ｓ２（図１）にはテープを貼付してプラズマが第１面に照射されないようにした基板である。ただし、プラズマ照射後にビーズ懸濁液を第１面に滴下する時には、そのテープを剥がしている。したがって、第１面からプラズマを照射したNo. １１とNo. １３のガラス基板においては、第１面の捕捉領域Ｓ１の親水度はプラズマ照射前のガラス基板の親水度より高く、非捕捉領域Ｓ２の親水度はテープの糊が付着するためプラズマ照射前のガラス基板の親水度よりも低い。また、No. １２のガラス基板においては、第１面にはプラズマを照射していないので、第１面の捕捉領域Ｓ１の親水度はプラズマ照射前の親水度に等しく、非捕捉領域Ｓ２の親水度はテープの糊の付着によりプラズマ照射前のガラス基板の親水度よりも低い。いずれにしても、No. １１〜No. １３のガラス基板の第１面においては、捕捉領域Ｓ１の親水度は非捕捉領域Ｓ２の親水度よりも高い。また、No. １２のガラス基板は第２面にプラズマを照射しているが、第２面には照射領域を制限するためのテープの貼付は行っていない。No. １１のガラス基板は第１面側からのみプラズマを照射し、No. １２のガラス基板は第２面側からのみプラズマを照射し、No. １３のガラス基板は、第１面側からプラズマを照射し、その後第２面側からもプラズマを照射した基板である。以下、これらのNo. １１〜No. １３のガラス基板を、以下の説明を簡略にするために、便宜上、有親水度差ガラス基板という。
【００２８】
No. １４〜No. １６のガラス基板は、プラズマ照射時に、第１面及び第２面にテープの貼付を行っていない基板である。したがって、No. １４〜No. １６のガラス基板の第１面において捕捉領域Ｓ１と非捕捉領域Ｓ２とで親水度の差は存在しない。No. １４のガラス基板は第１面側からのみプラズマを照射し、No. １５のガラス基板は第２面側からのみプラズマを照射し、No. １６のガラス基板は、第１面側からプラズマを照射し、その後第２面側からもプラズマを照射した基板である。以下、これらのNo. １４〜No. １６のガラス基板を、便宜上、均一親水度ガラス基板という。No. １７、No. １８のガラス基板は、プラズマを照射しない基板である。
【００２９】
２．ビーズ懸濁液の滴下による捕捉実験
貫通孔を有したこれらのガラス基板上の第１面の捕捉領域Ｓ１にビーズ懸濁液を滴下し、１時間経過後に、貫通孔に捕捉されたビーズの個数を蛍光顕微鏡により計数し、ビーズの捕捉率を求めた。ただし、捕捉率βは、（２）式で定義される。ビーズは、細胞とほぼ同じ大きさとするため、直径１０μｍの蛍光ビーズとした。ビーズ懸濁液における個数密度は、１０００／５．５μＬである。
【数２】
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その結果を図５に示す。測定は、各ガラス基板の処理種類毎に３回行い、グラフはその平均値を表している。いずれのガラス基板も、ビース懸濁液の滴下面は、貫通孔の径の大きな側の第１面である。
【００３０】
３．第１面における親水度が捕捉率に与える影響
No. １４、No. １６の均一親水度ガラス基板のビーズ捕捉率は、それぞれ、No. １１、No. １３の有親水度差ガラス基板のビーズ捕捉率に比べて小さい。特に、第１面にのみプラズマを照射したガラス基板（No. １１、No. １４）では、No. １１の有親水度差ガラス基板の捕捉率は、No. １２の均一親水度ガラス基板の捕捉率に対して、２．５倍大きい。また、両面にプラズマを照射したガラス基板（No. １３、No. １６）においては、No. １３の有親水度差ガラス基板の捕捉率は、No. １６の均一親水度ガラス基板の捕捉率に対して、１．７倍大きい。
【００３１】
このことから、ビーズ懸濁液を滴下する第１面にのみプラズマを照射した場合には、捕捉率に与える効果は、貫通孔の内側面での親水性の向上によるよりも、第１面上の捕捉領域Ｓ１のみ親水性を向上させたことによる方が大きいことを意味している。すなわち、有親水度差ガラス基板は、第１面の平坦な面における捕捉領域Ｓ１の親水性が非捕捉領域Ｓ２の親水性に比べて高いために、液滴が広がらずに貫通孔に効果的に浸入するためであると考えられる。また、均一親水度ガラス基板は、捕捉領域Ｓ１と非捕捉領域Ｓ２との親水度に差がないために、液滴が広がり貫通孔に流れ込む効率が低下するものと考えられる。
【００３２】
これに対して、第２面側からのみプラズマを照射した場合には、有親水度差ガラス基板と均一親水度ガラス基板とで、捕捉率の差異が小さく、均一親水度ガラス基板の方がやや大きい。上記の第１面における液滴の広がりによる捕捉率低下の考察からすれば、有親水度差ガラス基板No. １２の方が、均一親水度ガラス基板No. １５よりも捕捉率は高いはずである。第１面側からプラズマを照射する場合に比べて第２面側からプラズマを照射した方が、捕捉率の向上に大きく寄与しており、その効果が、均一親水度ガラス基板No. １５の第１面における液滴の広がりによる捕捉率の低下を補償しているものと思われる。
【００３３】
４．プラズマ照射面と捕捉率との関係
有親水度差ガラス基板No. １２の親水度は、有親水度差ガラス基板No. １１の親水度の１．１倍である。均一親水度ガラス基板No. １５の親水度は均一親水度ガラス基板No. １４の親水度の３．０倍である。プラズマの照射による効果は、何れか一方の面に照射するのであれば、第１面に照射するよりは第２面に照射した方が高いことを意味している。この原因には、次のことが考えられる。第１面側からプラズマを照射した場合には、第１面及び貫通孔の内側面に親水性処理が施される。第２面側からプラズマを照射した場合には、第２面及び貫通孔の内側面に親水性処理が施される。
【００３４】
したがって、第１には、第２面の親水度が向上したために、貫通孔の第２開口から溶媒が第２面に回り込み、溶媒の流出を促進しているためであると考えられる。第２には、貫通孔の内側面における親水度の分布が、プラズマを第１面側から照射した場合と第２面側から照射した場合とで異なっており、第２面側からプラズマを照射した時の親水度の分布の方が貫通孔への懸濁液の引き込みと排出が促進されるためであると考えられる。貫通孔の内側面での親水度の分布が異なるとすれば、プラズマの照射側に近い方が親水度は高いと考えられる。よって、第２面側からプラズマを照射した時には、貫通孔の内側面では第１開口から第２開口に向かうに連れて親水度が高くなっている、又は、親水基密度が高くなっているものと考えられる。これにより、貫通孔に流入した懸濁液のうち溶媒を第２開口から外部に排出する作用が強くなり、捕集率が向上したものと思われる。
【００３５】
５．両面からプラズマを照射した場合の捕捉率への影響
有親水度差ガラス基板No. １３の親水度は、均一親水度ガラス基板No. １６の親水度の１．７倍である。これは、第１面において捕捉領域Ｓ１の親水度が非捕捉領域Ｓ２の親水度よりも可なり大きいために、液滴の広がりが抑制されるので第１開口から懸濁液の流入が促進されるためであると考えられる。また、有親水度差ガラス基板No. １３の親水度は、有親水度差ガラス基板No. １２の親水度の１．３倍である。これは第１面の捕捉領域Ｓ１の親水度が向上したために、第１開口から懸濁液の流入が促進されるためであると考えられる。
【００３６】
一方、均一親水度ガラス基板No. １６の親水度は均一親水度ガラス基板No. １５の親水度より低い。これは、第１面にプラズマを照射したために、逆に、捕捉率が低下したことを意味する。第１面の親水度の分布に差がないために、液滴が大きくひろがり、貫通孔の第１開口からの懸濁液の流入が低下するためと思われる。
【００３７】
６．細胞の捕捉率
以上のことから、直径１０μｍのビーズの捕捉率の実験から、同様な大きさの細胞において同様な捕捉率の特性が得られると考えられる。
次に、細胞の捕捉率を測定した。用いた細胞は、H1299(ヒト非小細胞肺癌細胞である。染色方法はCalcein-AM(495/515nm) を用いた。観察方法は共焦点顕微鏡による観察で貫通孔に捕捉された蛍光細胞の数を計測した。共焦点顕微鏡による平面画像と断面画像により単一細胞が貫通孔に捕捉されていることを確認した。貫通孔における捕捉位置は第２開口（吐出口）から貫通孔の全長の約１／３位置であった。
【００３８】
細胞懸濁液の個数濃度を変化させて、捕捉率を測定した。個数濃度は、２５０／３μＬ、５００／３μＬ、１０００／３μＬである。用いたガラス基板は、両面にプラズマを照射した有親水度差ガラス基板No. １３である。なお、１液滴は３μＬであるので、１液滴中の細胞の個数と上記の個数密度は等しい。捕捉率を図６に示す。細胞懸濁液の細胞の個数密度が１０００／３μＬの場合の捕捉率は８５％と、高い捕捉率を示している。
【００３９】
以上、説明したように、本発明によると、基板の第１面の捕捉領域に細胞懸濁液を滴下するだけで、貫通孔の第２開口（吐出口）から吸引することなく、親水性だけで単位細胞毎に貫通孔に捕捉することができる。この結果、細胞に損傷を与えることがない。特に、細胞懸濁液を滴下する面とは反対側の第２面の親水度を向上させることで、細胞の捕捉率が向上されたものと想定される。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
細胞毎の性状、機能の分析に用いることができる。
【符号の説明】
【００４１】
１０…ガラス基板
１１…第１面
１２…第２面
２０…貫通孔
２１…第１開口
２２…第２開口
２３…内側面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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