(57)【要約】【課題】目的物質の製造法を提供する。【解決手段】ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するように改変された微生物を培地で培養し、該培地より目的物質を採取することにより、目的物質を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的物質の製造方法であって、
目的物質の生産能を有する微生物を培地で培養して目的物質を該培地中又は該微生物の菌体内に生成蓄積すること、および該培地又は菌体より目的物質を採取すること、を含み、
前記微生物が、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するように改変されていることを特徴とする、方法。
【請求項２】
ジカルボン酸の排出担体タンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化されることにより、または該遺伝子を欠失することにより、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジカルボン酸の排出担体タンパク質をコードする遺伝子が、ｙｊｊＰ遺伝子、ｙｊｊＢ遺伝子、ｙｅｅＡ遺伝子、ｙｎｆＭ遺伝子からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｙｊｊＰ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項３に記載の方法：
（Ａ）配列番号１５８または１６０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１５８または１６０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１５７または１５９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１５７または１５９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記ｙｊｊＢ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項３または４に記載の方法：
（Ａ）配列番号１６２または１６４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１６２または１６４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１６１または１６３に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１６１または１６３に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項６】
前記ｙｅｅＡ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号１６６、１６８、または１７０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１６６、１６８、または１７０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１６５、１６７、または１６９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１６５、１６７、または１６９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該
塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
前記ｙｎｆＭ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号１７２、１７４、１７６、１７８、または１８０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１７２、１７４、１７６、１７８、または１８０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、または１７９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、または１７９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記目的物質が、アセチルＣｏＡに由来する代謝物である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記アセチルＣｏＡに由来する代謝物が、イソプロピルアルコール、エタノール、アセトン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１−プロパノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アセチルＣｏＡに由来する代謝物が、クエン酸、イタコン酸、酢酸、酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、および６−アミノカプロン酸からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記アセチルＣｏＡに由来する代謝物が、ポリグルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、およびＬ−プロリンからなる群より選択される、請求項８に記載の記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、またはエンテロバクター・アエロゲネスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジカルボン酸が、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、およびα−ケトグルタル酸からなる群より選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、さらに、マリルＣｏＡの生産能が増大するように改変されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記微生物が、さらに、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変されている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いた有用物質の製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
グルタミン酸などのアミノ酸やイソプロピルアルコールなどのアルコールを発酵により生産する場合、コハク酸は副生物の一つとして生成する（特許文献１、２）。その結果、目的物質の収率が低下するため、発酵原料コストの上昇をもたらすだけでなく、生成物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり、経済的ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2013/018734号パンフレット
【特許文献２】WO2008/114721号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、微生物の目的物質生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的な目的物質の製造法を提供することを課題とする。
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するように微生物を改変することにより、微生物の目的物質生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００６】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
目的物質の製造方法であって、
目的物質の生産能を有する微生物を培地で培養して目的物質を該培地中又は該微生物の菌体内に生成蓄積すること、および該培地又は菌体より目的物質を採取すること、を含み、
前記微生物が、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するように改変されていることを特徴とする、方法。
［２］
ジカルボン酸の排出担体タンパク質をコードする遺伝子の発現が弱化されることにより、または該遺伝子を欠失することにより、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下した、前記方法。
［３］
前記ジカルボン酸の排出担体タンパク質をコードする遺伝子が、ｙｊｊＰ遺伝子、ｙｊｊＢ遺伝子、ｙｅｅＡ遺伝子、ｙｎｆＭ遺伝子からなる群より選択される、前記方法。
［４］
前記ｙｊｊＰ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号１５８または１６０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１５８または１６０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１５７または１５９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１５７または１５９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［５］
前記ｙｊｊＢ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号１６２または１６４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１６２または１６４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１６１または１６３に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１６１または１６３に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［６］
前記ｙｅｅＡ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号１６６、１６８、または１７０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１６６、１６８、または１７０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１６５、１６７、または１６９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１６５、１６７、または１６９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［７］
前記ｙｎｆＭ遺伝子が、下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号１７２、１７４、１７６、１７８、または１８０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１７２、１７４、１７６、１７８、または１８０に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、または１７９に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、または１７９に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［８］
前記目的物質が、アセチルＣｏＡに由来する代謝物である、前記方法。
［９］
前記アセチルＣｏＡに由来する代謝物が、イソプロピルアルコール、エタノール、アセトン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１−プロパノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールからなる群より選択される、前記方法。
［１０］
前記アセチルＣｏＡに由来する代謝物が、クエン酸、イタコン酸、酢酸、酪酸、３−ヒ
ドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、および６−アミノカプロン酸からなる群より選択される、前記方法。
［１１］
前記アセチルＣｏＡに由来する代謝物が、ポリグルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、およびＬ−プロリンからなる群より選択される、前記方法。
［１２］
前記微生物が、コリネ型細菌または腸内細菌科に属する細菌である、前記方法。
［１３］
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記方法。
［１４］
前記腸内細菌科に属する細菌が、エシェリヒア・コリ、パントエア・アナナティス、またはエンテロバクター・アエロゲネスである、前記方法。
［１５］
前記ジカルボン酸が、リンゴ酸、コハク酸、フマル酸、およびα−ケトグルタル酸からなる群より選択される、前記方法。
［１６］
前記微生物が、さらに、マリルＣｏＡの生産能が増大するように改変されている、前記方法。
［１７］
前記微生物が、さらに、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大するように改変されている、前記方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、微生物の目的物質生産能を向上させることができ、目的物質を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ジカルボン酸排出担体タンパク質の活性低下がＬ−グルタミン酸生産量に与える影響を示す図。
【図２】ジカルボン酸排出担体タンパク質の活性低下がＬ−グルタミン酸収率に与える影響を示す図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明ついて詳細に説明する。
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、目的物質の生産能を有し、且つジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するように改変された微生物である。
【００１０】
＜１−１＞目的物質の生産能を有する微生物
本発明において、「目的物質」とは、アセチルCoAおよびアセチルCoAに由来する有用な発酵代謝物からなる群より選択される化合物を意味する。アセチルＣｏＡに由来する有用な発酵代謝物として、具体的には、例えば、イソプロピルアルコール、エタノール、アセトン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、１−プロパノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、イソブタノール等の有機物質；クエン酸、イタコン酸、酢酸、酪酸、３−ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−ヒドロキシイソ酪酸、メタクリル酸、６−アミノカプロン酸等の有機酸；ポリグルタミン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、
Ｌ−バリン、Ｌ−プロリン等のＬ−アミノ酸が挙げられる。本発明において、アミノ酸は、特記しない限り、いずれもＬ−アミノ酸であってよい。本発明においては、１種の目的物質が製造されてもよく、２種またはそれ以上の目的物質が製造されてもよい。
【００１１】
「目的物質の生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、目的物質を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成および蓄積する能力をいう。目的物質の生産能を有する微生物は、非改変株よりも多い量の目的物質を培地に蓄積することができる微生物であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、目的物質の生産能を有する微生物は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的物質を培地に蓄積することができる微生物であってもよい。本発明の微生物が生産する目的物質は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。
【００１２】
微生物としては、例えば、細菌や酵母が挙げられる。これらの中では、細菌が好ましい。
【００１３】
細菌としては、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。また、細菌としては、例えば、アリサイクロバチルス（Alicyclobacillus）属細菌やバチルス（Bacillus）属細菌も挙げられる。
【００１４】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００１５】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、プロトタイプの野生株K12由来のエシェリヒア・コリW3110（ATCC 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）が挙げられる。
【００１６】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea aggl
omeransと分類されているものも存在する。
【００１７】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091）、及びSC17(0)株（VKPM B-9246）が挙げられる。なお、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００１８】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エルビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００１９】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属する細菌が挙げられる。
【００２０】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００２１】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060，ATCC 13869，FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００２２】
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテリウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
【００２３】
バチルス属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりバチルス属に分類される細菌が挙げられる。バチルス属細菌としては、例えば、下記のような種が挙げられる。
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）
バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）
バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）
バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）
バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）
バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）
バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）
【００２４】
バチルス・サブチリスとして、具体的には、例えば、バチルス・サブチリス168 Marburg株（ATCC 6051）やバチルス・サブチリスPY79株（Plasmid, 1984, 12, 1-9）が挙げられる。バチルス・アミロリケファシエンスとして、具体的には、例えば、バチルス・アミロリケファシエンスT株（ATCC 23842）やバチルス・アミロリケファシエンスN株（ATCC 23845）が挙げられる。
【００２５】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００２６】
本発明の微生物は、本来的に目的物質の生産能を有するものであってもよく、目的物質の生産能を有するように改変されたものであってもよい。目的物質の生産能を有する微生物は、例えば、上記のような微生物に目的物質の生産能を付与することにより、または、上記のような微生物の目的物質の生産能を増強することにより、取得できる。
【００２７】
目的物質の生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、目的物質のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、目的物質の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。目的物質生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、目的物質生産菌の育種において、活性が増強される目的物質生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
【００２８】
目的物質の生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つ目的物質の生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００２９】
また、目的物質の生産能の付与又は増強は、目的物質の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように微生物を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細書等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する。
【００３０】
また、目的物質の生産能の付与又は増強は、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的物質の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。
【００３１】
以下、目的物質の生産菌、および目的物質の生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。
【００３２】
＜Ｌ−グルタミン酸生産菌＞
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdhA)、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ(prpC)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸キナー
ゼ(pykA, pykF)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼなどが挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、例えば、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。クエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株としては、EP1078989A、EP955368A、及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。また、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素遺伝子の発現が増大するように改変された微生物としては、WO99/07853、及びEP1352966Bに開示されたものも挙げられる。
【００３３】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように微生物を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、イソクエン酸リアーゼ(aceA)、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(sucA)、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhABCD）、酢酸キナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセト乳酸シンターゼ(ilvI等)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl)、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）などが挙げられる。この中では特に、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００３４】
エシェリヒア属細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されている。また、コリネ型細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、パントエア属細菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌、エルビニア属細菌等の腸内細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、米国特許6197559号公報、米国特許6682912号公報、米国特許6331419号公報、米国特許8129151号公報に開示されている。さらに、コリネ型細菌、パントエア属細菌で、α―ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性及びコハク酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる方法は、WO2008/075483号公報に開示されている。
【００３５】
例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を改変すればよい。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；フランス特許公報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869 OAGN、OA2-2、OAGN2-2 （国際公開パンフレット2006/028298号参照）
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム  ΔS株  （国際公開95/34672号パンフレット参照）
パントエア・アナナティス  AJ13601 (FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989)
パントエア・アナナティス  AJ13356 (FERM BP-6615 米国特許6,331,419号)
パントエア・アナナティス  SC17sucA (FERM BP-8646  WO2005/085419)
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410 (FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
【００３６】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、SC17株（FERM BP-11091）、SC17(0)株（VKPM B-9246）が挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。SC17株は、平成２１年２月４日に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に、受託番号FERM P-16644として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。
【００３７】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α-ケトグルタレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損または低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）の欠損株であるAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びSC17株のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)が挙げられる。AJ13356は、1998年2月19日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００３８】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度のＬ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に
、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００３９】
尚、AJ13355は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定されたが、近年、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。よって、AJ13355、AJ13356、およびAJ13601は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書ではPantoea ananatisとして記載する。
【００４０】
さらにコリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492 [gi:19552490]）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。
【００４１】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子（WO2005/085419）やybjL遺伝子（WO2008/133161）を増幅することによっても付与することができる。
【００４２】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、アデニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化させる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
【００４３】
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949 (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355 (FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368 (FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217 (FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218 (FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564 (FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439 (FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684 (FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号公報参照）
【００４４】
また、コリネ型細菌について、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する方法としては、yggB遺伝子の発現を増強する方法やコード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法も挙げられる（WO2006/070944）。yggB遺伝子は、メカノセンシティブチャンネル（mechanosensitive channel）をコードする遺伝子である。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank Accession No. 
NC_003450で登録されているゲノム配列中、1,336,091〜1,337,692の配列の相補配列に相当し、NCgl1221とも呼ばれる。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子にコードされるYggBタンパク質は、GenBank accession No. NP_600492として登録されている。
【００４５】
＜Ｌ−グルタミン生産菌＞
Ｌ−グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、およびグルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌が挙げられる（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ遺伝子（glnE）の破壊やPII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によっても達成できる（EP1229121）。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
【００４６】
また、Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニンスルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法(特開昭56-151495)などが挙げられる。
【００４７】
Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212 (FERM P-8123、特開昭61-202694)
【００４８】
＜Ｌ−プロリン生産菌＞
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌や、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、DandekarとUratsuの文献（J. Bacteriol. 170, 12: 5943-5945 (1988)）に開示されている。また、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056)、エシェリヒア・コリVKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315)、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミドを保持するエシェリヒア・コリ変異株、ならびにBloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミドを保持するエシェリヒア・コリ変異株が挙げられる。
【００４９】
また、Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の具体例としては、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682、b2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したE. coli等も挙げられる（特開2002−300874号公報）。
【００５０】
＜Ｌ−アルギニン生産菌＞
Ｌ−アルギニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を
改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）遺伝子としては、例えば、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いると好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００５１】
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げられる。また、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシア特許出願第2000117677号）も挙げられる。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika ） にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。また、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、237株の誘導体で、酢酸資化能を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）も挙げられる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
【００５２】
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-44096号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等も挙げられる。また、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシン、６−アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株（特開昭52-114092号）、メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシイン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、アルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、及びカナバニン耐性、またはアルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等も挙げられる。
【００５３】
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM BP-6906）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００５４】
また、Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株（米国特許出願公開2002-0045223号）や細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）も挙げられる。
【００５５】
＜Ｌ−シトルリン生産菌およびＬ−オルニチン生産菌＞
Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンは、Ｌ−アルギニンと生合成経路が共通している。よって、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、および／またはアセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、Ｌ−シトルリンおよび／またはＬ−オルニチンの生産能を付与または増強することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。
【００５６】
＜Ｌ−ロイシン生産菌＞
Ｌ−ロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−ロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、leuABCDオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。酵素活性の増強には、例えば、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)が好適に利用できる。
【００５７】
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coil株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE.coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。また、Ｌ−ロイシン生産能を有するコリネ型細菌としては、２−チアゾールアラニン及びβ−ハイドロキシロイシンに耐性で、且つイソロイシン及びメチオニン要求性である、Brevibacterium lactofermentum AJ3718（FERM P-2516）が挙げられる。
【００５８】
＜Ｌ−イソロイシン生産菌＞
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDL-エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。また、Ｌ−イソロイシン生産能を有するコリネ型細菌
としては、分岐鎖アミノ酸排出タンパク質をコードするbrnE遺伝子を増幅したコリネ型細菌（特開2001-169788）、Ｌ−リジン生産菌とのプロトプラスト融合によりＬ−イソロイシン生産能を付与したコリネ型細菌（特開昭62-74293）、ホモセリンデヒドロゲナーゼを強化したコリネ型細菌（特開昭62-91193）、スレオニンハイドロキサメート耐性株（特開昭62-195293）、α-ケトマロン耐性株（特開昭61-15695）、メチルリジン耐性株（特開昭61-15696）、Brevibacterium flavum AJ12149（FERM BP-759）（米国特許第4,656,135号）が挙げられる。
【００５９】
＜Ｌ−バリン生産菌＞
Ｌ−バリン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−バリン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性がが増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ilvGMEDAオペロンの遺伝子にコードされる酵素が挙げられる。なお、ilvGMEDAオペロンは、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、および／またはＬ−ロイシンによる発現抑制（アテニュエーション）を受ける。よって、酵素活性の増強のためには、アテニュエーションに必要な領域を除去または改変し、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するのが好ましい。また、ilvA遺伝子がコードするスレオニンデアミナーゼは、Ｌ−イソロイシン生合成系の律速段階であるＬ−スレオニンから２−ケト酪酸への脱アミノ化反応を触媒する酵素である。よって、Ｌ−バリン生産のためには、ilvA遺伝子が破壊等され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少しているのが好ましい。
【００６０】
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変されたE. coli株(米国特許第5,998,178号) が挙げられる。
【００６１】
また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノアシルt-RNAシンテターゼに変異を有する株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。そのような株としては、例えば、イソロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が挙げられる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、生育にリポ酸を要求する、および／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)も挙げられる。
【００６２】
Ｌ−バリン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変された株を挙げることができる。Ｌ−バリン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、ilvBNCオペロンによりコードされる酵素、すなわちilvBNによりコードされるアセトヒドロキシ酸シンターゼやivlCによりコードされるイソメロリダクターゼ(国際公開00/50624号)が挙げられる。尚、ilvBNCオペロンは、Ｌ−バリン及び/又はＬ−イソロイシン及び/又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい。
【００６３】
Ｌ−バリン生産能を有するコリネ型細菌としては、例えば、Ｌ−バリン産生を減少させる物質代謝経路に関与する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように改変された株も挙げられる。そのような酵素としては、例えば、Ｌ−ロイシン合成に関与するスレオニンデヒドラターゼやＤ−パントテン酸合成に関与する酵素が挙げられる（国際公開00/50624号）。
【００６４】
また、Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アミノ酸アナログな
どへの耐性を有する株も挙げられる。そのような株としては、例えば、Ｌ−イソロイシンおよびＬ−メチオニン要求性、ならびにＤ−リボース、プリンリボヌクレオシド、またはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し、且つＬ−バリン生産能を有するコリネ型細菌株（FERM P-1841、FERM P-29、特公昭53-025034）、ポリケトイド類に耐性を有するコリネ型細菌株（FERM P-1763、FERM P-1764、特公平06-065314）、酢酸を唯一の炭素源とする培地でＬ−バリン耐性を示し、且つグルコースを唯一の炭素源とする培地でピルビン酸アナログ（フルオロピルビン酸等）に感受性を有するコリネ型細菌株（FERM BP-3006、FERM BP-3007、特許3006929号）が挙げられる。
【００６５】
＜イソプロピルアルコール生産菌＞
イソプロピルアルコール生産能を有する微生物については、WO2013/018734A1に詳細に記載されている。
【００６６】
イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、イソプロピルアルコール生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アセ卜酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ、及びチオラーゼが挙げられる（WO2009/008377A1）。特に、これら４種酵素全ての活性を増強するのが好ましい。
【００６７】
また、イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、GntR（gntR）の活性が低下するように微生物を改変する方法が挙げられる。GntRとは、グルコン酸の代謝系をコードするオペロンの発現を負に制御する転写因子を指す。同オペロンは、具体的には、グルコン酸の取り込み系とグルコン酸のリン酸化酵素をコードする。例えば、エシェリヒア・コリには、２つのグルコン酸の代謝系、GntI系とGntII系、が存在するが、GntRはそれら両方の発現を抑制する。
【００６８】
また、GntRの活性低下に加えて、さらに、GntRの活性低下時にイソプロピルアルコール生産能に影響し得る他の酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大または低下するように微生物を改変してもよい。そのような酵素を「補助酵素」ともいう。補助酵素としては、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ(pgi)、グルコース−6−リン酸−1−デヒドロゲナーゼ(Zwf)、及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)が挙げられる。これらの酵素活性の改変パターンは、GntRの活性低下により向上したイソプロピルアルコール生産量が維持されるか、あるいはさらに向上する限り、特に制限されない。
【００６９】
補助酵素の酵素活性の改変パターンとしては、好ましくは、以下のパターンを挙げることができる:
(1)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(pgi)活性、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性及びホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の野生型の維持、
(2)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(pgi)活性の低下と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の増強、
(3)グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(pgi)活性の低下と、グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)活性の増強と、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)活性の低下。
なかでも、上記(3)の補助酵素群の酵素活性パターンがイソプロピルアルコール生産能の観点からより好ましい。
【００７０】
グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(pgi)とは、国際生化学連合(1.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号5.3.1.9に分類され、D-グルコース-6-リン酸からD-フルク卜ース-6-リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００７１】
グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ(Zwf)とは、国際生化学連合(1.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.1.49に分類され、D-グルコース-6-リン酸からD-グルコノーし5-ラクトン-6-リン酸を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００７２】
ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(Gnd)とは、国際生化学連合(1.U.B.)酵素委員会報告に準拠した酵素番号1.1.1.44に分類され、6-ホスホ-D-グルコン酸からD-リブロース-5-リン酸とCO2を生成する反応を触媒する酵素の総称を指す。
【００７３】
グルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ遺伝子（Zwf）としては、ディノコッカス・ラジオフィラス（Deinococcus radiophilus）等のディノコッカス属細菌、アセトバクター・ハンセニー（Acetobacter hansenii）等のアセトバクター属細菌、サーモトガ・マリチナ（Thermotoga maritima）等のサーモトガ属細菌、シュードモナス・フルオセセンス（Pseudomonas fluorescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginos）等のシュードモナス属細、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）等のバチルス属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・アキュリタス（Aspergillus aculeatus）等のアスペルギルス属真菌、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）等のクリプトコッカス属真菌、ディクチオステリウム・ディスコイデウム（Dictyostelium discoideum）等のディクチオステリウム属真菌、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）等のサッカロミセス属酵母由来のZwf遺伝子が挙げられる。好適なグルコース-6-リン酸-1-デヒドロゲナーゼ遺伝子（Zwf）としては、ディノコッカス属細菌、アセトバクター属細菌、サーモトガ属細菌、シュードモナス属細菌、バチルス属細菌、エシェリヒア属細菌、アスペルギルス属真菌に由来するZwf遺伝子が挙げられ、エシェリヒア・コリ由来のZwf遺伝子が特に好ましい。
【００７４】
イソプロピルアルコール生産能を有する微生物は、乳酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されていてよい。このような改変により、酸素供給が制限された培養条件下においても、乳酸の生産が抑制され、イソプロピルアルコールを効率よく生産することができる。酸素供給が制限された培養条件とは、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）、回転数２００〜６００ｒｐｍのことをいう。
【００７５】
イソプロピルアルコール生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2009/008377号パンフレッ卜に記載されているアセ卜酢酸デカルボキシラーゼ活性、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性、CoAトランスフェラーゼ活性、及びチオラーゼ活性が増強され、植物由来原料からイソプロピルアルコールを生成しうるエシェリヒア・コリpIPA/B株およびplaaa/B株などを挙げることができる。また、イソプロピルアルコール生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2009/008377号パンフレッ卜に記載されている、CoAトランスフェラーゼ活性およびチオラーゼ活性を、ゲノム上の対応する遺伝子の発現を上昇させることにより増強し、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ活性およびアセ卜酢酸デカルボキシラーゼ活性を、対応する遺伝子を搭載するプラスミドを導入することにより増強した、エシェリヒア・コリpla/B::atoDAB株も挙げられる。その他、イソプロピルアルコール生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2009/094485号パンフレッ卜、国際公開第2009/094485号パンフレッ卜、国際公開第2009/046929号パンフレッ卜、国際公開第2009/046929号パンフレッ卜に記載のエシェリヒア・コリも挙げられる。
【００７６】
＜アセトン生産菌＞
アセトンは、イソプロピルアルコール生産におけるイソプロピルアルコールの前駆体である。よって、アセトン生産能は、イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するた
めの方法を一部利用することにより、付与又は増強することができる。例えば、アセトン生産能は、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ以外の上記例示したイソプロピルアルコール生合成系酵素、すなわちアセ卜酢酸デカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、及びチオラーゼ、から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変することにより、付与又は増強することができる。
【００７７】
＜エタノール生産菌＞
エタノール生産能を有する微生物としては、例えば、サッカロミセス属酵母、ならびにアシネトバクター属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、エシェリヒア属、ジオバクター属、シュワネラ属、サルモネラ属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、オエノコッカス属、ストレプトコッカス属、及びユーバクテリウム属に属する細菌が挙げられる。また、エタノール生産能を有する組換え微生物を製造する方法は、分子生物学の技術分野において公知である（米国特許第7,026,152号明細書、同第6,849,434号明細書、同第6,333,181号明細書、同第5,821,093号明細書、同第5,482,846号明細書、同第5,424,202号明細書、同第5,028,539号明細書、同第5,000,000号明細書、同第5,487,989号明細書、同第5,554,520号明細書、同第5,162,516号明細書、国際公開第WO2003/025117号）。また、エタノール生産能を有する微生物としては、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）を欠損し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhB）が導入されたCorynebacterium glutamicumの変異株や、同株のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）をさらに欠損させた変異株が挙げられる（J Mol Microbiol Biotechnol 2004, 8, 243-254）。また、エタノール生産能を有する微生物としては、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ遺伝子（pfl）およびフマル酸レダクターゼ遺伝子（frd）を欠損し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhB）が導入されたE.coli KO11株も挙げられる（Ann N Y Acad Sci. 2008, 1125, 363-372）。
【００７８】
＜１，３−プロパンジオール生産菌＞
１，３プロパンジオールを生産する能力を有する微生物としては、例えば、エシェリヒア属、クレブシエラ属、クロストリジウム属、ラクトバチルス属に属する細菌が挙げられる。１，３プロパンジオールを生産する能力を有する微生物は、例えば、（a）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子、（b）グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子をコードする少なくとも１つの遺伝子、及び（c）３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールに転換する非特異的触媒活性をコードする少なくとも１つの遺伝子、を有しているのが好ましい。また、クロストリジウム属の１，３プロパンジオール生産株は、Ｂ−１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの異種遺伝子が導入されているのが好ましい。そのような遺伝子としては、dhaB1、dhaB2、およびdhaT遺伝子が挙げられる。１，３プロパンジオールを生産する能力を有する微生物としては、例えば、特表2010-508013に示されている微生物が利用できる。
【００７９】
＜有機酸生産菌＞
酢酸、３−ヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ酪酸、イタコン酸、クエン酸、酪酸それぞれの生産能を有する微生物としては、例えば、発酵ハンドブック（共立出版）に記載されている微生物が挙げられる。３−ヒドロキシイソ酪酸の生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2009/135074号パンフレットや国際公開第2008/145737号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。２−ヒドロキシイソ酪酸の生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2009/135074号パンフレットや国際公開第2009/156214号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。３−アミノイソ酪酸およびメ
タクリル酸それぞれの生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2009/135074号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。６−アミノカプロン酸の生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2012/177721号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。
【００８０】
＜その他の目的物質生産菌＞
プロピレンの生産能を有する微生物としては、例えば、US2012-0329119号明細書記載の経路を導入した微生物が挙げられる。１，３−ブタンジオールの生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2012/177619号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。１，４ブタンジオール生産能を有する微生物としては、例えば、特開昭62-285779記載の方法が挙げられる。１−プロパノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオールそれぞれの生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2012/177599号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。エチレングリコールの生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2012/177983号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。イソブタノールの生産能を有する微生物としては、例えば、国際公開第2012/177601号パンフレット記載の経路を導入した微生物が挙げられる。プロピレンの生産能を有する微生物としては、例えば、US2012-0329119号明細書記載の経路を導入した微生物が挙げられる。
【００８１】
また、目的物質生産能を有する微生物は、糖代謝やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するよう改変されていてもよい。これらのタンパク質の活性は、例えば、これらのタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。
【００８２】
糖代謝に関与するタンパク質としては、糖の取り込みに関与するタンパク質や解糖系酵素が挙げられる。糖代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;  欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkBfbp;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００８３】
エネルギー代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【００８４】
また、炭素源としてグリセロールを使用する場合、グリセロールの資化性を高めるために、目的物質生産能を有する微生物は、glpR遺伝子（EP1715056）の発現が弱化されているか、glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa及びtalC遺伝子等のグリセロール代謝遺伝子（EP1715055A）の発現が増強されるよう、改変されていてもよい。
【００８５】
また、目的物質生産能を有する微生物は、微生物の細胞から目的物質を排出する活性が増大するよう改変されていてもよい。目的物質を排出する活性は、例えば、目的物質を排
出するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。例えば、各種アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【００８６】
なお、上記の目的物質生産能を有する微生物の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、目的物質生産能を有する微生物の育種に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、後述するジカルボン酸の排出担体タンパク質、およびそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。
【００８７】
＜１−２＞ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性の低下
本発明の微生物は、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するよう、改変されている。本発明の微生物は、上述したような目的物質の生産能を有する微生物を、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するように改変することにより取得できる。また、本発明の微生物は、ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下するように微生物を改変した後に、目的物質の生産能を付与または増強することによっても得ることができる。本発明において、本発明の微生物を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００８８】
「ジカルボン酸の排出担体タンパク質」とは、炭素数が４つまたは５つのジカルボン酸（Ｃ4−Ｃ5ジカルボン酸）を排出する活性を有するタンパク質をいう。Ｃ4−Ｃ5ジカルボン酸としては、例えば、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、α−ケトグルタル酸が挙げられる。
【００８９】
ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性は、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊等することにより、低下させることができる。タンパク質の活性を低下させる詳細な手法は後述する。ジカルボン酸の排出担体タンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、yjjP、yjjB、yeeA、およびynfM遺伝子が挙げられる。
【００９０】
＜yjjP遺伝子＞
yjjP遺伝子とは、predicted inner membrane structural proteinと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjP遺伝子は、b4364またはECK4354とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjP遺伝子の塩基配列を配列番号１５７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Acession No NP_418784.4）を配列番号１５８に示す。また、Enterobacter aerogenesのyjjP遺伝子の塩基配列を配列番号１５９に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６０に示す。
【００９１】
＜yjjB遺伝子＞
yjjB遺伝子とは、conserved inner membrane proteinと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjB遺伝子は、b3463またはECK4353とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のyjjB遺伝子の塩基配列を配列番号１６１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_418783.2）を配列番号１６２に示す。また、Enterobacter aerogenesのyjjB遺伝子の塩基配列を配列番号１６３、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６４に示す。
【００９２】
＜yeeA遺伝子＞
yeeA遺伝子とは、conserved inner membrane proteinと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のyeeA遺伝子は、b2008またはECK2002とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のyeeA遺伝子の塩基配列を配列番号１６５に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_416512.1）を配列番号１６６に示す。また、Pantoea ananatis AJ13355株のyeeA遺伝子の塩基配列を配列番号１６７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１６８に示す。また、Enterobacter aerogenesのyeeA遺伝子の塩基配列を配列番号１６９、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７０に示す。
【００９３】
＜ynfM遺伝子＞
ynfM遺伝子とは、predicted transport protein YnfMと推定されるタンパク質をコードする遺伝子である。エシェリヒア・コリMG1655株のynfM遺伝子はb1596またはECK1591とも呼ばれる。エシェリヒア・コリMG1655株のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１７１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_416113.1） を配列番号１７２に示す。また、Pantoea ananatis AJ13355株のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１７３に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７４に示す。また、Enterobacter aerogenesのynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１７５に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１７６に示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１７７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No NP_602116.1）を配列番号１７８に示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869のynfM遺伝子の塩基配列を配列番号１７９に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１８０に示す。
【００９４】
また、スクリーニングにより新たに見出されるジカルボン酸排出担体タンパク質の活性を低下させてもよい。ジカルボン酸排出担体タンパク質のスクリーニングは、例えば、以下の方法で行うことが出来る。スクリーニングの宿主には、P. ananatis SC17(0)ΔsdhA/RSFPP株を用いることができる。本株は、コハク酸デヒドロゲナーゼを欠損しており、更にRSFPPプラスミドを導入することによりppc遺伝子及びprpC遺伝子の発現が増強された株である。RSFPPプラスミドは、RSFPPGプラスミド（WO2010/027022A1）よりgdhA遺伝子を含む領域を除去して得られたプラスミドである（下記実施例参照）。本株は、好気条件下にてコハク酸を生成し、また低pHにてコハク酸が培地に存在すると生育が阻害される。本性質を利用して、1〜20 mMのコハク酸を含むpH4.7の最少培地をスクリーニング培地として用い、本株にE.coli、P.anantis、E.aerogenesなどのゲノムライブラリーを導入し、耐性株を取得することにより、ジカルボン酸排出担体タンパク質をスクリーニングすることができる。また、スクリーニングの宿主には、yeeAおよび／またはynfMを欠損した、P. ananatis SC17(0)ΔsdhAΔyeeA/RSFPP株、P. ananatis SC17(0)ΔsdhAΔynfM/RSFPP株、またはP. ananatis SC17(0)ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP株を用いることもできる。
【００９５】
本発明においては、１種のジカルボン酸排出担体タンパク質の活性を低下させてもよく、２種またはそれ以上のジカルボン酸排出担体タンパク質の活性を低下させてもよい。
【００９６】
ジカルボン酸の排出担体タンパク質の活性が低下したことは、例えば、コハク酸生産能の減少を確認することにより、確認できる。具体的には、例えば、或る改変型の遺伝子が野生型（非改変型）のジカルボン酸排出担体タンパク質よりも活性の低いジカルボン酸排出担体タンパク質をコードしていることは、コハク酸排出能が著しく低下した株に当該改変型遺伝子を導入し、非改変型の遺伝子を導入した場合と比較して、コハク酸の生産能が低いことを確認することにより、確認できる。コハク酸排出能が著しく低下した株としては、例えば、P.ananatis SC17(0)ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPPやC.glutamicum ΔldhΔsucE1（Fukui et al., J. biotechnol, 154(2011)25-34）が挙げられる。また、ジカルボン酸
の排出担体タンパク質の活性が低下したことは、例えば、対応するｍＲＮＡの量が低下したことを確認することや、タンパク質の量が低下したことを確認することによっても、確認できる。
【００９７】
ジカルボン酸排出担体タンパク質は、ジカルボン酸を排出する活性を有する限り、上記ジカルボン酸排出担体タンパク質、例えば各種yjjP、yjjB、yeeA、およびynfM遺伝子にコードされるタンパク質、のバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記ジカルボン酸排出担体タンパク質、例えば各種yjjP、yjjB、yeeA、およびynfM遺伝子にコードされるタンパク質、のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００９８】
上記ジカルボン酸排出担体タンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記ジカルボン酸排出担体タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記ジカルボン酸排出担体タンパク質のホモログをコードする遺伝子は、例えば、細菌や酵母の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【００９９】
ジカルボン酸排出担体タンパク質の保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、以下のような遺伝子であってよい。すなわち、ジカルボン酸排出担体タンパク質をコードする遺伝子は、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。この場合、対応する活性は、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加される前のタンパク質に対して、通常70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上が維持され得る。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【０１００】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【０１０１】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記アミノ酸配列全体に対して、
80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【０１０２】
また、ジカルボン酸排出担体タンパク質をコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【０１０３】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０１０４】
また、ジカルボン酸排出担体タンパク質をコードする遺伝子は、ジカルボン酸を排出する活性を有するタンパク質をコードする限り、任意のコドンがそれと等価のコドンに置換されたものであってもよい。例えば、ジカルボン酸排出担体タンパク質をコードする遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されたものであってもよい。
【０１０５】
なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、α−ケトグルタル酸シンターゼ等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【０１０６】
＜１−３＞その他の改変
本発明の微生物は、さらに、他の改変を有していてもよい。他の改変は、目的物質の種類や微生物の種類等に応じて適宜選択することができる。
【０１０７】
例えば、本発明の微生物は、NADHを酸化する反応が弱化するよう、改変されていてよい。例えば、本発明の微生物は、NADHの酸化を伴う、エネルギー代謝に関連する反応が弱化されるよう、且つ／または、NADHの酸化を伴う、ピルビン酸またはアセチルCoAに由来する物質の生合成系が弱化されるよう、改変されることにより、NADHを酸化する反応が弱化されていてよい。
【０１０８】
NADHの酸化を伴う、エネルギー代謝に関連する反応を弱化させることは、同反応に関与する１種またはそれ以上の酵素の活性を低下させることにより達成できる。同反応に関与する酵素は、直接NADHを酸化する酵素であってもよく、他の酵素等と共役して間接的にNADHを酸化する酵素であってもよい。同反応に関与する酵素としては、例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（NADH dehydrogenase）やマレートキノンオキシドレダクターゼ（malate
:quinone oxidoreductase；ＭＱＯ）が挙げられる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、直接NADHを酸化する酵素である。ＭＱＯは、間接的にNADHを酸化する酵素である。本発明においては、例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよびＭＱＯの片方の活性を低下させてもよく、両方の活性を低下させてもよい。
【０１０９】
NADHの酸化を伴う、ピルビン酸またはアセチルCoAに由来する物質の生合成系を弱化させることは、同生合成系の１種またはそれ以上の酵素の活性を低下させることにより達成できる。同生合成系の酵素としては、例えば、以下に示す酵素が挙げられる（WO2009/072562）。
・乳酸デヒドロゲナーゼ（乳酸生合成系）
・アルコールデヒドロゲナーゼ（エタノール生合成系）。
・アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アセトインレダクターゼ（2,3-ブタンジオール生合成系）。
【０１１０】
すなわち、本発明の微生物は、具体的には、例えば、（ａ）ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼおよびマレートキノンオキシドレダクターゼからなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性、並びに／または、（ｂ）乳酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセト乳酸シンターゼ、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、およびアセトインレダクターゼからなる群より選択される１種またはそれ以上の酵素の活性、が低下するように改変されていてよい。酵素の活性は、同酵素をコードする遺伝子を破壊等することにより、低下させることができる。酵素の活性を低下させる詳細な手法は後述する。
【０１１１】
「ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ」とは、キノンを電子受容体としてNADHを酸化する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性」ともいう。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼは、タイプＩとタイプＩＩに分類される。本発明においては、タイプＩおよびタイプＩＩの片方の活性を低下させてもよく、両方の活性を低下させてもよい。
【０１１２】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩは、プロトン排出能を有するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼであり、NDH-1またはNADH:ubiquinone reductaseとも呼ばれる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩは、具体的には、以下の反応を触媒する。
NADH + quinone + 5H+in → NAD+ + quinol + 4H+out（EC 1.6.5.3）
【０１１３】
NDH-1をコードする遺伝子としては、nuoABCEFGHIJKLMNオペロン（「nuoオペロン」ともいう）が挙げられる。nuoオペロンは以下のサブユニットをコードしており、これらのサブユニットは複合体を形成してNDH-1として機能する。
・Membrane subunit A, H, J, K, L, M, N
membrane subunit A = NuoA (nuoA)
membrane subunit H = NuoH (nuoH)
membrane subunit J = NuoJ (nuoJ)
membrane subunit K = NuoK (nuoK)
membrane subunit L = NuoL (nuoL)
membrane subunit M = NuoM (nuoM)
membrane subunit N = NuoN (nuoN)
・soluble NADH dehydrogenase fragment, chain E, F, G
NADH:ubiquinone oxidoreductase, chain E = NuoE (nuoE)
NADH:ubiquinone oxidoreductase, chain F = NuoF (nuoF)
NADH:ubiquinone oxidoreductase, chain G = NuoG (nuoG)
・connecting fragment of NADH dehydrogenase I, chain B, CD, I
NADH:ubiquinone oxidoreductase, chain B = NuoB (nuoB)
NADH:ubiquinone oxidoreductase, chain CD = NuoC (nuoC)
NADH:ubiquinone oxidoreductase, chain I = NuoI (nuoI)
【０１１４】
E. coli MG1655のnuoABCEFGHIJKLMNオペロンは、NCBIデータベースにGenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2388070〜2403094位の配列の相補配列に相当する。E. coli MG1655のnuoABCEFGHIJKLMNオペロンの塩基配列を配列番号１に示す。また、各遺伝子のコード領域（終止コドンを除く）の配列番号１における位置、および各遺伝子がコードするサブユニットのアミノ酸配列の配列番号は以下の通りである。
nuoA; 1-441        （NuoA; 配列番号２）
nuoB; 460-1119     （NuoB; 配列番号３）
nuoC; 1228-3015    （NuoC; 配列番号４）
nuoE; 3021-3518    （NuoE; 配列番号５）
nuoF; 3518-4852    （NuoF; 配列番号６）
nuoG; 4908-7631    （NuoG; 配列番号７）
nuoH; 7631-8605    （NuoH; 配列番号８）
nuoI; 8623-9162    （NuoI; 配列番号９）
nuoJ; 9177-9728    （NuoJ; 配列番号１０）
nuoK; 9728-10027   （NuoK; 配列番号１１）
nuoL; 10027-11865  （NuoL; 配列番号１２）
nuoM; 12032-13558  （NuoM; 配列番号１３）
nuoN; 13568-15022  （NuoN; 配列番号１４）
【０１１５】
Pantoea ananatis LMG20103のnuoABCEFGHIJKLMNオペロンは、NCBIデータベースにGenBank accession NC_013956 (VERSION NC_013956.2 GI:332139403)として登録されているゲノム配列中、2956133〜2971292位の配列の相補配列に相当する。また、Pantoea ananatis
AJ13355のnuoABCEFGHIJKLMNオペロンは、NCBIデータベースにGenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、2333027〜2348186位の配列の相補配列に相当する。Pantoea ananatis AJ13355のnuoABCEFGHIJKLMNオペロンの塩基配列を配列番号１５に示す。また、各nuo遺伝子のコード領域（終止コドンを除く）の配列番号１５における位置、および各nuo遺伝子がコードするサブユニットのアミノ酸配列の配列番号は以下の通りである。
nuoA; 1-441        （NuoA; 配列番号１６）
nuoB; 460-1134     （NuoB; 配列番号１７）
nuoC; 1255-3051    （NuoC; 配列番号１８）
nuoE; 3057-3569    （NuoE; 配列番号１９）
nuoF; 3569-4912    （NuoF; 配列番号２０）
nuoG; 5027-7747    （NuoG; 配列番号２１）
nuoH; 7747-8721    （NuoH; 配列番号２２）
nuoI; 8736-9275    （NuoI; 配列番号２３）
nuoJ; 9238-9837    （NuoJ; 配列番号２４）
nuoK; 9837-10136   （NuoK; 配列番号２５）
nuoL; 10136-11968  （NuoL; 配列番号２６）
nuoM; 12281-13693  （NuoM; 配列番号２７）
nuoN; 13703-15157  （NuoN; 配列番号２８）
【０１１６】
なお、例えば、コリネ型細菌はNDH-1を有していない。
【０１１７】
NDH-1の活性は、nuoオペロンから選択される１またはそれ以上の遺伝子を改変することにより、低下させることができる。また、nuoオペロンの転写に影響する領域（プロモー
ター配列やSD配列）を改変することにより、nuoオペロンの転写をまとめて低下させ、よって、NDH-1の活性を低下させることもできる。
【０１１８】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩＩは、プロトン排出能を有さないＮＡＤＨデヒドロゲナーゼであり、NDH-2、NADH dhII、またはNADH dehydrogenase IIとも呼ばれる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩＩは、具体的には、以下の反応を触媒する。
NADH + H+ + quinone → NAD+ + quinol（EC 1.6.99.3またはEC 1.6.99.5）
【０１１９】
NDH-2をコードする遺伝子としては、ndh遺伝子が挙げられる。
【０１２０】
E. coli MG1655のndh遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、1165308〜1166612位の配列に相当する。E. coli MG1655のndh遺伝子は、ECK1095、JW1095と同義である。また、E. coli MG1655のNdhタンパク質は、GenBank accession NP_415627 (version NP_415627.1 GI:16129072, locus_tag="b1109")として登録されている。E. coli MG1655のndh遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするNdhタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２９および３０に示す。
【０１２１】
Pantoea ananatis LMG20103のndh遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_013956 (VERSION NC_013956.2 GI:332139403)として登録されているゲノム配列中、1685397〜1686704位の配列に相当する。また、Pantoea ananatis LMG20103のNdhタンパク質は、GenBank accession YP_003519794 (version YP_003519794.1 GI:291617052, locus_tag="PANA_1499")として登録されている。また、Pantoea ananatis AJ13355のndh遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、1000123〜1001370位の配列に相当する。また、Pantoea ananatis AJ13355のNdhタンパク質は、GenBank accession YP_005933721 (version YP_005933721.1 GI:386015440)として登録されている。Pantoea ananatis AJ13355のndh遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするNdhタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３１および３２に示す。
【０１２２】
Corynebacterium glutamicum ATCC13032のndh遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、1543151〜1544554位の配列の相補配列に相当する。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のndh遺伝子は、Cgl1465と同義である。また、Corynebacterium glutamicum ATCC13032のNdhタンパク質は、GenBank accession NP_600682 (version NP_600682.1 GI:19552680, locus_tag="NCgl1409")として登録されている。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のndh遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするNdhタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８５および８６に示す。
【０１２３】
ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性が低下したことは、例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性を測定することにより、確認することができる。ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩの活性およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩＩの活性は、いずれも、公知の方法（Journal of Biotechnology 158 (2012) p215-223）により測定することができる。なお、同方法において、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩＩの活性は、可溶化された膜画分溶液を用いてNADH濃度の減少を340nmの吸光度で測定することによりＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの総活性（ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩの活性とＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩＩの活性の合計）を算出し、その総活性の値からＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ  タイプＩの活性の値を差し引くことにより、間接的に算出できる。
【０１２４】
「マレートキノンオキシドレダクターゼ」とは、キノンを電子受容体としてリンゴ酸を
酸化する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。また、同活性を、「マレートキノンオキシドレダクターゼ活性」ともいう。マレートキノンオキシドレダクターゼは、具体的には、以下の反応を触媒する。
(S)-malate + quinone → oxaloacetate + quinol（EC 1.1.99.16）
【０１２５】
マレートキノンオキシドレダクターゼは、ＮＡＤ型マレートデヒドロゲナーゼ（malate
dehydrogenase）と共役してリンゴ酸とオキサロ酢酸間でのサイクルを形成し、ＮＡＤＨの正味の酸化をもたらす。
【０１２６】
マレートキノンオキシドレダクターゼをコードする遺伝子としては、mqo遺伝子が挙げられる。
【０１２７】
E. coli MG1655のmqo遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.2 GI:49175990)として登録されているゲノム配列中、2303130〜2304776位の配列の相補配列に相当する。E. coli MG1655のmqo遺伝子は、ECK2202、JW2198、yojHと同義である。また、E. coli MG1655のMqoタンパク質は、GenBank accession NP_416714
(version NP_416714.1 GI:16130147, locus_tag="b2210")として登録されている。E. coli MG1655のmqo遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするMqoタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３３および３４に示す。
【０１２８】
また、例えばPantoea属細菌には、２コピーのマレートキノンオキシドレダクターゼ遺伝子（以下、「mqo1遺伝子」および「mqo2遺伝子」ともいう）を有するものがある。Pantoea ananatis LMG20103のmqo1遺伝子およびmqo2遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_013956 (VERSION NC_013956.2 GI:332139403)として登録されているゲノム配列中、4213429〜4215042位の配列と、4560249〜4561898位の配列の相補配列に、それぞれ相当する。また、Pantoea ananatis LMG20103のmqo1遺伝子およびmqo2遺伝子がコードするタンパク質は、GenBank accession YP_003522102 (version YP_003522102.1 GI:291619360, locus_tag="PANA_3807")およびGenBank accession YP_003522407 (version YP_003522407.1 GI:291619665, locus_tag="PANA_4112")として、それぞれ登録されている。また、Pantoea ananatis AJ13355のmqo1およびmqo2遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、197167〜198816位の配列と、3620570〜3622183位の配列に、それぞれ相当する。また、Pantoea ananatis AJ13355のmqo1遺伝子およびmqo2遺伝子がコードするタンパク質は、GenBank accession YP_005941143 (version YP_005941143.1 GI:386018537) およびGenBank accession YP_005935901 (version YP_005935901.1 GI:386017603)として、それぞれ登録されている。Pantoea ananatis AJ13355のmqo1遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３５および３６に示す。Pantoea ananatis AJ13355のmqo2遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９７および９８に示す。
【０１２９】
Corynebacterium glutamicum ATCC13032のmqo遺伝子は、NCBIデータベースにGenBank accession NC_003450 (VERSION NC_003450.3 GI:58036263)として登録されているゲノム配列中、2113861〜2115363位の配列の相補配列に相当する。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のmqo遺伝子は、Cgl2001と同義である。また、Corynebacterium glutamicum ATCC13032のMqoタンパク質は、GenBank accession NP_601207 (version NP_601207.1 GI:19553205, locus_tag="NCgl1926")として登録されている。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のmqo遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするMqoタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８７および８８に示す。
【０１３０】
マレートキノンオキシドレダクターゼの活性は、公知の方法（Eur. J. Biochem. 254 (
1998) 395-403）により測定できる。
【０１３１】
「乳酸デヒドロゲナーゼ」とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電子供与体として、ピルビン酸から乳酸を生成する反応を触媒する酵素をいう。また、同反応を触媒する活性を、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性」ともいう。乳酸デヒドロゲナーゼは、Ｌ−乳酸を生成するＬ型乳酸脱水素酵素（L-LDH； EC 1.1.1.27）と、Ｄ−乳酸を生成するＤ型乳酸脱水酵素（D-LDH； EC1.1.1.28）に大別されるが、そのいずれの活性を低下させてもよい。乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）活性は、例えば、後述するように、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（LDH遺伝子）を破壊等することにより低下させることができる。エシェリヒア・コリのLDH遺伝子として、D-LDH遺伝子(ldhA)の塩基配列を配列番号３７に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号３８に示す。パントエア・アナナティスのLDH遺伝子として、D-LDH遺伝子(ldhA)の塩基配列を配列番号３９に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４０に示す。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のL-LDH遺伝子(ldh)の塩基配列を配列番号２２９に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２３０に示す。コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC 13869）のL-LDH遺伝子(ldh)の塩基配列を配列番号２３１に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２３２に示す。乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（L.
Kanarek and R.L. Hill, J. Biol. Chem. 239, 4202 (1964)）により乳酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した腸内細菌の変異株の具体的な製造方法としては、Alam, K. Y., Clark, D. P. 1989. J. Bacteriol. 171: 6213-6217に記載されている方法等が挙げられる。
【０１３２】
「アルコールデヒドロゲナーゼ」とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電子供与体として、アルデヒドからアルコールを生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 1.1.1.1、EC 1.1.1.2、またはEC 1.1.1.71）。また、同反応を触媒する活性を、「アルコールデヒドロゲナーゼ活性」ともいう。アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）活性は、例えば、後述するように、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ADH遺伝子）を破壊等することにより低下させることができる。エシェリヒア・コリのADH遺伝子として、adhE遺伝子の塩基配列を配列番号４１に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４２に示す。パントエア・アナナティスのADH遺伝子として、adhE遺伝子の塩基配列を配列番号４３に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４４に示す。コリネバクテリウム・グルタミカムのADH遺伝子として、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のadhE遺伝子の塩基配列を配列番号２３３に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号２３４に示す。アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（Lutstorf, U.M., Schurch, P.M. & von Wartburg, J.P., Eur. J. Biochem. 17, 497-508(1970)）によりアルコールデヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。アルコールデヒドロゲナーゼ活性が低下した腸内細菌の変異株の具体的な製造方法としては、Sanchez, A. M., Bennett, G. N., San, K.-Y., Biotechnol. Prog. 21, 358-365(2005)に記載されている方法等が挙げられる。
【０１３３】
「アセト乳酸シンターゼ」とは、２分子のピルビン酸からアセト乳酸およびＣＯ2を生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 2.2.1.6）。また、同反応を触媒する活性を、「アセト乳酸シンターゼ活性」ともいう。アセト乳酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）には、ＡＨＡＳ
Ｉ〜ＩＩＩのアイソザイムが知られているが、いずれのアイソザイムの活性を低下させてもよい。アセト乳酸シンターゼ活性は、例えば、後述するように、アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子を破壊等することにより低下させることができる。アセト乳酸シンターゼをコードする遺伝子としては、ＡＨＡＳ  Ｉの活性サブユニットをコードするilvB遺伝子、ＡＨＡＳ  ＩＩの活性サブユニットをコードするilvG遺伝子、ＡＨＡＳ  ＩＩＩの活性サブユニットをコードするilvI遺伝子が挙げられる。E. coli MG1655のilvB、ilvI遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号２３５、２３７に、同遺伝子がコードするタンパク
質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２３６、２３８に示す。Pantoea ananatis AJ13355のilvG、ilvI遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号２３９、２４１に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２４０、２４２に示す。Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のilvB遺伝子の塩基配列を配列番号２４３に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４４に示す。アセト乳酸シンターゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（F.C. Stormer and H.E. Umbarger, Biochem. Biophys. Res. Commun., 17, 5, 587-592(1964)）によりアセト乳酸シンターゼ活性を測定することによって確認することができる。
【０１３４】
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」とは、アセト乳酸を脱炭酸してアセトインを生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 4.1.1.5）。また、同反応を触媒する活性を、「アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性」ともいう。アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性は、例えば、後述するように、アセト乳酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を破壊等することにより低下させることができる。Pantoea ananatis AJ13355のアセト乳酸デカルボキシラーゼ遺伝子（budA）の塩基配列を配列番号２４５に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４６に示す。なお、例えば、E. coliやCorynebacterium glutamicumは、アセト乳酸デカルボキシラーゼを有していない。アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（Juni E., J. Biol. Chem., 195(2): 715-726(1952)）によりアセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【０１３５】
「アセトインレダクターゼ」とは、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電子供与体として、アセトインから2,3-ブタンジオールを生成する反応を触媒する酵素をいう（EC 1.1.1.4）。また、同反応を触媒する活性を、「アセトインレダクターゼ活性」ともいう。アセトインレダクターゼ活性は、例えば、後述するように、アセトインレダクターゼをコードする遺伝子を破壊等することにより低下させることができる。Pantoea ananatis AJ13355のアセトインレダクターゼ遺伝子（budC）の塩基配列を配列番号２４７に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２４８に示す。Corynebacterium glutamicum ATCC 13032のアセトインレダクターゼ遺伝子（butA）の塩基配列を配列番号２４９に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２５０に示す。なお、例えば、E.
coliは、アセトインレダクターゼを有していない。アセトインレダクターゼ活性が低下したことは、例えば、公知の方法（K. Blomqvist et al., J Bacteriol., 175, 5, 1392-1404(1993)）によりアセトインレダクターゼ活性を測定することによって確認することができる。
【０１３６】
また、本発明の微生物は、酢酸生合成系が弱化されるよう、改変されていてよい。本発明の微生物は、具体的には、例えば、以下の酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するよう、改変されていてよい（US2007-0054387、WO2005/052135、WO99/53035、WO2006/031424、WO2005/113745、WO2005/113744）。
・ホスホトランスアセチラーゼ
・アセテートキナーゼ
・ピルビン酸オキシダーゼ
・アセチルCoAハイドロラーゼ
【０１３７】
ホスホトランスアセチラーゼ（PTA）活性は、例えば、後述するように、ホスホトランスアセチラーゼをコードする遺伝子（PTA遺伝子）を破壊等することにより低下させることができる。エシェリヒア・コリのPTA遺伝子として、pta遺伝子の塩基配列を配列番号４５に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４６に示す。パントエア・アナナティスのPTA遺伝子として、pta遺伝子の塩基配列を配列番号４７に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号４８に示す。ホスホトランスアセチラーゼ活性が低下したことは、公知の方法（Klotzsch, H.R., Meth. Enzymol. 12, 381-386(1969)）によりホスホトランスアセチラーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【０１３８】
また、本発明の微生物は、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ（PFL）活性が低下するように改変されていてよい。ピルビン酸・ギ酸リアーゼ活性は、例えば、後述するように、ピルビン酸・ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（PFL遺伝子）を破壊等することにより低下させることができる。エシェリヒア・コリのPFL遺伝子として、pflB, pflD, tdcE遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号８９、９１、および９３に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９０、９２、および９４に示す。パントエア・アナナティスのPFL遺伝子として、pflB遺伝子の塩基配列を配列番号９５に、同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号９６に示す。ピルビン酸・ギ酸リアーゼ活性が低下したことは、公知の方法（Knappe, J. & Blaschkowski, H.P., Meth. Enzymol. 41, 508-518(1975)）によりピルビン酸・ギ酸リアーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【０１３９】
また、本発明の微生物は、コハク酸デヒドロゲナーゼ（SDH）の活性が低下するように改変されていてよい。コハク酸デヒドロゲナーゼ活性は、例えば、後述するように、コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（SDH遺伝子）を破壊等することにより低下させることができる。コハク酸デヒドロゲナーゼ活性が低下したことは、公知の方法（Tatsuki Kurokawa and Junshi Sakamoto, Arch. Microbiol. 183: 317-324(2005)）によりコハク酸デヒドロゲナーゼ活性を測定することによって確認することができる。
【０１４０】
また、本発明の微生物は、還元型キノンを電子供与体とするフマレートレダクターゼ（キノン型フマレートレダクターゼ）（EC 1.3.5.1またはEC 1.3.5.4）の活性が低下し、且つ、NADHを電子供与体とするフマレートレダクターゼ（NADH型フマレートレダクターゼ）（EC 1.3.1.6）の活性が増大するよう、改変されていてよい。具体的には、例えば、キノン型フマレートレダクターゼをコードする遺伝子を、NADH型フマレートレダクターゼをコードする遺伝子に置換するのが好ましい。遺伝子の置換は、例えば、後述する手法により行うことができる。NADH型フマレートレダクターゼとしては、例えば、Saccharomyces cerevisiaeのFRDS1やFRDS2が挙げられる。Saccharomyces cerevisiaeにおいて、FRDS1はFRDS遺伝子に、FRDS2はOSM1遺伝子に、それぞれコードされている。
【０１４１】
また、本発明の微生物は、TCAサイクルの補充経路が増強されるよう、改変されていてよい。本発明の微生物は、具体的には、例えば、以下の酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するよう、改変されていてよい（特開平11-196888号、特開2006-320208号、WO99/53035、WO2005/021770、Hong SH, Lee SY. Biotechnol Bioeng. 74(2): 89-95(2001)、Millard, C. S., Chao, Y. P., Liao, J. C., Donnelly, M. I. Appl. Environ. Microbiol. 62: 1808-1810(1996)、Pil Kim, Maris Laivenieks, Claire Vieille,
and J.Gregory Zeikus. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1238-1241(2004)）。
・ピルビン酸カルボキシラーゼ
・ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
・ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ
【０１４２】
酵素活性は、例えば、後述するように、酵素をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。ピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムやブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）やシゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等の酵母のPC遺伝子が挙げられる（WO2009/072562）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
キナーゼをコードする遺伝子としては、例えば、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_001343536.1）、ハエモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_248516.1）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. NP_246481.1）、マンヘイミア・サクシニシプロデューセンス（Mannheimia succiniciproducens）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_089485.1）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. YP_072243）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. ZP_01981004.1）、セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）のpckA遺伝子（GenBank Accession No. AB016600）が挙げられる（WO2009/072562）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムやブレビバクテリウム・フラバム等のコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）のppc遺伝子が挙げられる。また、酵素活性は、例えば、フィードバック阻害の低減または解除によっても、増大させることができる。例えば、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEPC）の活性は、コハク酸生合成経路の中間産物であるＬ−リンゴ酸により阻害される（Masato Yano and Katsura Izui, Eur. Biochem. FEBS, 247, 74-81, 1997）。Ｌ−リンゴ酸による阻害は、例えば、PEPCに1アミノ酸置換による脱感作変異を導入することにより低減することができる。1アミノ酸置換による脱感作変異としては、具体的には、例えば、エシェリヒア・コリ由来のPEPCタンパク質の６２０番目のアミノ酸をリジンからセリンへ置換する変異が挙げられる（同文献）。
【０１４３】
また、本発明の微生物は、α−ケトグルタル酸シンターゼ（α−ＫＧＳ）の活性が増大するように改変されていてよい。「α−ケトグルタル酸シンターゼ」とは、還元型フェレドキシンまたは還元型フラボドキシンを電子供与体として、スクシニル-CoAとCO2からα−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）を生成する反応を触媒する酵素（EC 1.2.7.3）をいう。また、同反応を触媒する活性を、「α−ケトグルタル酸シンターゼ活性」ともいう。α−ケトグルタル酸シンターゼは、α−ケトグルタル酸オキシドレダクターゼ、α−ケトグルタル酸フェレドキシンオキシドレダクターゼ、２−オキソグルタル酸シンターゼ、２−オキソグルタル酸オキシドレダクターゼ、または２−オキソグルタル酸フェレドキシンオキシドレダクターゼともいう。α−ケトグルタル酸シンターゼは、複数のサブユニットからなる複合体、通常はαサブユニットとβサブユニットからなるヘテロダイマー、として機能することが知られている。α−ケトグルタル酸シンターゼ活性は、例えば、後述するように、α−ケトグルタル酸シンターゼをコードする遺伝子（α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子）の発現を上昇させることにより、増大させることができる。
【０１４４】
α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子としては、例えば、還元的ＴＣＡサイクルを有する細菌である、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、およびパイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌のα−ケトグルタル酸酸シンターゼ遺伝子、具体的には、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）やハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子が挙げられる。また、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子としては、例えば、海洋性細菌であるプランクトマイセテス（Planctomycetes）目に属するブラストピレルラ・マリーナ（Blastopirellula marina）（Schlesner, H. et al. 2004. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1567-1580）、ε−プロテオバクテリアに属する硫黄酸化細菌であるスルフォリモナス・デニトリフィカンス（Sulfurimonas denitrificans）（Brinkhoff, T. et al. 1999. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:875-879）、古細菌に属するメタン生産菌であるメタノコッカス・マリパルディス（Methan
ococcus maripaludis）（Jones, W. J. et al. Arch. Microbiol. 1983. 135: 91-97）のα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子も挙げられる。
【０１４５】
クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）は決定されている（Eisen, J. A. et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9509-9514）。クロロビウム・テピダムのゲノム配列の塩基番号170164〜172047（相補鎖）に位置するα−ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号４９に、クロロビウム・テピダムのゲノム配列の塩基番号169132〜170160（相補鎖）に位置するβサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号５１に示す。また、同遺伝子コードされるα−ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列（GenBank Accession No. NP_661069）を配列番号５０に、βサブユニットのアミノ酸配列（GenBank Accession No. NP_661068）を配列番号５２に示す。ブラストピレルラ・マリーナ(Blastopirellula marina)のゲノム配列（GenBank Accession No. AANZ00000000）は決定されている（Fuchsman, C. A., and Rocap, G. Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72: 6841-6844）。ブラストピレルラ・マリーナのゲノム配列の塩基番号3180〜5045（相補鎖）に位置するα-ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号５３に、ブラストピレルラ・マリーナのゲノム配列の塩基番号2089〜3108（相補鎖）に位置するβサブユニット遺伝子の塩基配列を配列番号５５に示す。また、同遺伝子コードされるα-ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニットのアミノ酸配列を配列番号５４に、βサブユニットのアミノ酸配列を配列番号５６に示す。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子（GenBank Accession No. AB046568）はクローニングされており（Yun, N. R. et al. 2001. Biochem. Biophy. Res. Commum. 282: 589-594）、αサブユニット（GenBank Accession No. BAB21494）及びβサブユニット（GenBank Accession No. BAB21495）が同定されている。また、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子としては、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC_00091）の塩基番号620219〜623070番に位置するHP0588、HP0589、HP0590、HP0591の４つの遺伝子や、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002754）の塩基番号2575303〜2578105番に位置するSSO2815、SSO2816の2つの遺伝子も挙げられる。
【０１４６】
α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子としては、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属、スルフォリモナス（Sulfurimonas）属、メタノコッカス（Methanococcus）属細菌等からクローニングされるものを利用してもよい。
【０１４７】
α−ケトグルタル酸シンターゼのαサブユニット遺伝子とβサブユニット遺伝子は、同じ生物由来のものを用いることが好ましいが、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有するタンパク質を構成し得る限り、各々の遺伝子は異なる生物に由来するものであってもよい。好ましい組合わせは、配列番号５０のアミノ酸配列からなるαサブユニット又はその保存的バリアントと、配列番号５２のアミノ酸配列からなるβサブユニット又はその保存的バリアント、及び、配列番号５４のアミノ酸配列からなるαサブユニット又はその保存的バリアントと、配列番号５６のアミノ酸配列からなるβサブユニット又はその保存的バリアントであるが、これらに制限されない。
【０１４８】
α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と改変後の微生物よりそれぞれ粗酵素液を調製し、そのα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を比較することにより、確認できる。α−ケトグルタル酸シンターゼの活性は、例えば、Yunらの方法（Yun, N. R. et al. 2001. Biochem. Biophy. Res. Commum. 282: 589-594）
に従って測定できる。具体的には、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含有する反応液にα−ケトグルタル酸を添加し、α−ケトグルタル酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、α−ケトグルタル酸シンターゼ活性を測定できる。１ユニット（U）のα−ケトグルタル酸シンターゼ活性は、１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンを還元する活性として表される。α−ケトグルタル酸シンターゼの活性は、非改変株と比較して増大していればよいが、非改変株がα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有している場合は、非改変株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上に上昇してよい。また、非改変株がα−ケトグルタル酸シンターゼ活性を有していない場合には、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子を導入することによりα−ケトグルタル酸シンターゼが生成されていればよいが、α−ケトグルタル酸シンターゼはその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよく、菌体中の総タンパク質に対して、好ましくは0.001 U/mg以上、より好ましくは0.005 U/mg以上、さらに好ましくは0.01 U/mg以上の量で生産されていてよい。
【０１４９】
また、本発明の微生物は、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性に必要な電子供与体を酸化型から還元型にリサイクルする活性が増大するように改変されていてよい。そのような改変により、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大し得る。電子供与体の酸化型を還元型にリサイクルする活性としては、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性やピルビン酸シンターゼ活性を挙げることができる。電子供与体を酸化型から還元型にリサイクルする活性は、例えば、そのような活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。電子供与体を酸化型から還元型にリサイクルする活性の増大は、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子の発現の増強等の他の改変と組み合わせてもよく、組み合わせなくてもよい。
【０１５０】
「フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ」とは、以下の反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.18.1.2）をいう。
還元型フェレドキシン + NADP+ → 酸化型フェレドキシン + NADPH + H+
【０１５１】
本反応において、フェレドキシンはフラボドキシンと代替可能である。すなわち、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼは、フラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼと同義である。また、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼは）、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+オキシドレダクターゼ、またはＮＡＤＰＨ−フェレドキシンオキシドレダクターゼともいう。上記反応は可逆反応であり、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼは、ＮＡＤＰＨの存在下で、酸化型フェレドキシンおよび／または酸化型フラボドキシンを還元型に再生することができる。すなわち、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼをα−ケトグルタル酸シンターゼと組み合わせることにより、α−ケトグルタル酸シンターゼにより消費された還元型フェレドキシンおよび／または還元型フラボドキシンをフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの逆反応により再生することが可能となる。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性は、例えば、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼをコードする遺伝子（フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子）のコピー数または発現量を上昇させることにより、増大させることができる。
【０１５２】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼは微生物から高等生物まで幅広く存在が確認されている（Carrillo, N. and Ceccarelli, E. A., Eur. J. Biochem. 270: 1900-1915(2003), Ceccarelli, E. A., et al., Biochim. Biophys. Acta. 1698: 155-165(2004)）。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子としては、例えば、エシェリヒア・コリのfpr遺伝子（Bianchi, V. et al. 1993. J. Bacteriol. 175:1590-1595）、コリネバクテリウム・グルタミカムのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子、シュードモナス・プチダ（Psuedomonas putida）のＮＡＤＰＨ−プチダレドキシンレダクターゼ（
Putidaredoxin reductase）遺伝子（Koga, H. et al. 1989. J. Biochem. (Tokyo) 106: 831-836）が挙げられる。
【０１５３】
エシェリヒア・コリのフラボドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子として、具体的には、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号4111749〜4112495（相補鎖）に位置する、配列番号５７に示す塩基配列を有するfpr遺伝子を例示することができる。配列番号５８には、同遺伝子にコードされるFprタンパク質のアミノ酸配列（GenBank Accession No. AAC76906）を示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカムのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）の塩基番号2526234〜2527211に見出されている（GenBank Accession No. BAB99777）。
【０１５４】
フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と改変後の微生物よりそれぞれ粗酵素液を調製し、そのフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を比較することにより、確認できる。フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼの活性は、例えば、Blaschkowskiらの方法（Blaschkowski, H. P. et al. 1982.
Eur. J. Biochem. 123: 563-569）に従って測定できる。具体的には、基質としてフェレドキシンを用い、減少するNADPH量を分光学的に測定することによって、フェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性を測定できる。１ユニット（U）のフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼ活性は、１分間あたり１μmolのNADPHを酸化する活性として表される。
【０１５５】
「ピルビン酸シンターゼ」とは、還元型フェレドキシンまたは還元型フラボドキシンを電子供与体として、アセチル-CoAとCO2からピルビン酸を生成する下記反応を可逆的に触媒する酵素（EC 1.2.7.1）をいう。
還元型フェレドキシン + アセチル-CoA + CO2 → 酸化型フェレドキシン + ピルビン酸
【０１５６】
ピルビン酸シンターゼは、ピルビン酸オキシドレダクターゼ、ピルビン酸フェレドキシンレダクターゼ、ピルビン酸フラボドキシンレダクターゼ、またはピルビン酸フェレドキシンオキシドレダクターゼともいう。上記反応は可逆反応であり、ピルビン酸シンターゼは、ピルビン酸の存在下で、酸化型フェレドキシンおよび／または酸化型フラボドキシンを還元型に再生することができる。すなわち、ピルビン酸シンターゼをα−ケトグルタル酸シンターゼと組み合わせることにより、α−ケトグルタル酸シンターゼにより消費された還元型フェレドキシンおよび／または還元型フラボドキシンをピルビン酸シンターゼの逆反応により再生することが可能となる。ピルビン酸シンターゼ活性は、例えば、ピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子（ピルビン酸シンターゼ遺伝子）のコピー数または発現量を上昇させることにより、増大させることができる。
【０１５７】
ピルビン酸シンターゼ遺伝子としては、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、ハイドロジェノバクター・サーモフィラス（Hydrogenobacter thermophilus）等の還元的ＴＣＡサイクルを有する細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子、エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科に属する細菌のピルビン酸シンターゼ遺伝子、メタノコッカス・マリパルディス（Methanococcus maripaludis）、メタノカルドコッカス・ジャナスチ（Methanocaldococcus jannaschii）、メタノサーモバクター・サーモオートトロフィカス（Methanothermobacter thermautotrophicus）等の独立栄養性メタン生成古細菌（autotrophic methanogens）のピルビン酸シンターゼ遺伝子が挙げられる。
【０１５８】
クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）のピルビン酸シンターゼ遺伝子として、具体的には、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1534432〜1537989に位置する、配列番号５９に示す塩基配列を有する遺伝子を例示することができる。配列番号６０には、同遺伝子がコードするピルビン酸シンタ
ーゼのアミノ酸配列（GenBank Accession No. AAC76906）を示す。また、ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのピルビン酸シンターゼは、δサブユニット（GenBank Accession No. BAA95604）、αサブユニット（GenBank Accession No. BAA95605）、βサブユニット（GenBank Accession No. BAA95606）、γサブユニット（GenBank Accession No. BAA95607）の４つのサブユニットからなる複合体を形成していることが知られている（Ikeda, T. et al. 2006. Biochem. Biophys. Res. Commun. 340: 76-82）。また、ピルビン酸シンターゼ遺伝子としては、例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 000915）の塩基番号1170138〜1173296番に位置するHP1108、HP1109、HP1110、HP1111の4つの遺伝子や、スルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列（GenBank Accession No. NC 002754）の塩基番号1047593〜1044711番で示されるSSO1208、SSO7412、SSO1207、SSO1206の4つの遺伝子が挙げられる。
【０１５９】
ピルビン酸シンターゼ遺伝子としては、上記で例示された遺伝子との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものを利用してもよい。
【０１６０】
ピルビン酸シンターゼの活性が増大したことは、増強前の微生物と増強後の微生物よりそれぞれ粗酵素液を調製し、そのピルビン酸シンターゼ活性を比較することにより、確認できる。ピルビン酸シンターゼの活性は、例えば、Yoonらの方法（Yoon, K. S. et al. 1997. Arch. Microbiol. 167: 275-279）に従って測定できる。測定原理は上述のα−ケトグルタル酸シンターゼの活性測定と同じであり、具体的には、電子受容体としての酸化型メチルビオロゲンとCoAと粗酵素液を含有する反応液にピルビン酸を添加し、ピルビン酸の脱炭酸反応によって増大する還元型メチルビオロゲンの量を分光学的に測定することによって、ピルビン酸シンターゼ活性を測定できる。１ユニット（U）のピルビン酸シンターゼ活性は、１分間あたり１μmolのメチルビオロゲンを還元する活性として表される。ピルビン酸シンターゼの活性は、非改変株と比較して増大していればよいが、非改変株がピルビン酸シンターゼ活性を有している場合は、非改変株と比較して、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上、さらに好ましくは3倍以上に上昇してよい。また、非改変株がピルビン酸シンターゼ活性を有していない場合には、ピルビン酸シンターゼ遺伝子を導入することによりピルビン酸シンターゼが生成されていればよいが、ピルビン酸シンターゼはその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよく、菌体中の総タンパク質に対して、好ましくは0.001 U/mg以上、より好ましくは0.005 U/mg以上、さらに好ましくは0.01 U/mg以上の量で生産されていてよい。
【０１６１】
また、本発明の微生物は、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性に必要な電子供与体、すなわちフェレドキシンおよび／またはフラボドキシン、の生産能が増大するように改変されていてよい。そのような改変により、α−ケトグルタル酸シンターゼの活性が増大し得る。フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンの生産能は、例えば、フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンをコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンの生産能の増大は、α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子の発現の増強等の他の改変と組み合わせてもよく、組み合わせなくてもよい。
【０１６２】
「フェレドキシン」とは、鉄−硫黄クラスターを含む、１電子の伝達体として機能するタンパク質をいう。「鉄−硫黄クラスター」とは、非ヘム鉄原子（Fe）と硫黄原子を含むクラスターであり、その構成に応じて、4Fe-4S、3Fe-4S、または2Fe-2Sクラスターと呼ばれる。「フラボドキシン」とは、FMN（Flavin-mononucleotide）を補欠分子属として含む
、１あるいは２電子の伝達体として機能するタンパク質をいう。フェレドキシンとフラボドキシンについては、McLeanらの文献に記載されている（McLean, K. J. et al. 2005. Biochem. Soc. Trans. 33: 796-801）。
【０１６３】
フェレドキシンをコードする遺伝子（フェレドキシン遺伝子）およびフラボドキシンをコードする遺伝子（フラボドキシン遺伝子）は、自然界に広く分布している。フェレドキシン遺伝子またはフラボドキシン遺伝子としては、α−ケトグルタル酸シンターゼと電子供与体再生系が利用可能なフェレドキシンまたはフラボドキシンをコードするものであれば、どのようなものでも用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリには、2Fe-2Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてfdx遺伝子が存在し（Ta, D. T. and Vickery, L. E. 1992. J. Biol. Chem. 267:11120-11125）、4Fe-4Sクラスターを有するフェレドキシンをコードする遺伝子としてyfhL遺伝子が予想されている。また、フラボドキシン遺伝子としては、fldA遺伝子（Osborne, C. et al. 1991. J. Bacteriol.
173: 1729-1737）とfldB遺伝子（Gaudu, P. and Weiss, B. 2000. J. Bacteriol. 182:1788-1793）の存在が知られている。コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノム配列（GenBank Accession No. BA00036）においては、塩基番号562643〜562963番にフェレドキシン遺伝子fdx（GenBank Accession No. BAB97942）及び塩基番号1148953〜1149270番にfer（GenBank Accession No. BAB98495）が見出されている。また、クロロビウム・テピダムにおいては、多くのフェレドキシン遺伝子が存在するが、ピルビン酸シンターゼの電子受容体となる4Fe-4S型のフェレドキシン遺伝子としてフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIが同定されている（Yoon, K. S. et al. 2001. J. Biol. Chem. 276: 44027-44036）。ハイドロジェノバクター・サーモファイラスのフェレドキシン遺伝子等、還元的ＴＣＡサイクルを持つ細菌由来のフェレドキシン遺伝子あるいはフラボドキシン遺伝子を用いることもできる。
【０１６４】
エシェリヒア・コリのフェレドキシン遺伝子として、具体的には、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号2654770〜2655105番（相補鎖）に位置する配列番号６１に示すfdx遺伝子、及び塩基番号2697685〜2697945番に位置する配列番号６３に示すyfhL遺伝子を例示することができる。配列番号６２及び配列番号６４には、同遺伝子にコードされるFdxタンパク質及びYfhLタンパク質のアミノ酸配列（それぞれ、GenBank Accession No. AAC75578及びAAC75615）を示す。エシェリヒア・コリのフラボドキシン遺伝子として、具体的には、エシェリヒア・コリK-12株のゲノム配列（GenBank Accession No. U00096）の塩基番号710688〜710158番（相補鎖）に位置する配列番号６５に示すfldA遺伝子、及び塩基番号3037877〜3038398 番に位置する配列番号６７に示すfldB遺伝子を例示することができる。配列番号６６及び配列番号６８には、同遺伝子にコードされるfldAタンパク質及びfldBタンパク質のアミノ酸配列を示した（それぞれ、GenBank Accession No. AAC73778及びAAC75933）。クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)のフェレドキシン遺伝子として、具体的には、クロロビウム・テピダムのゲノム配列（GenBank Accession No. NC_002932）の塩基番号1184078〜1184266番に位置する配列番号６９に示すフェレドキシンＩ遺伝子、及び塩基番号1184476〜1184664番に位置する配列番号７１に示すフェレドキシンII遺伝子を例示することができる。配列番号７０及び配列番号７２には、同遺伝子にコードされるフェレドキシンＩ及びフェレドキシンIIのアミノ酸配列（それぞれ、GenBank Accession No. AAM72491及びAAM72490）を示す。また、フェレドキシン遺伝子としては、ハイドロジェノバクター・サーモファイラス（Hydrogenobacter thermophilus）のフェレドキシン遺伝子（GenBank Accession No. BAE02673）やスルフォロバス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus）のゲノム配列中の塩基番号2345414〜2345728番で示されるフェレドキシン遺伝子を例示することができる。
【０１６５】
フェレドキシン遺伝子またはフラボドキシン遺伝子としては、上記で例示された遺伝子
との相同性に基づいて、クロロビウム（Chlorobium）属、デスルホバクター（Desulfobacter）属、アクイフェクス（Aquifex）属、ハイドロジェノバクター（Hydrogenobacter）属、サーモプロテウス（Thermoproteus）属、パイロバキュラム（Pyrobaculum）属細菌等からクローニングされるものを利用してもよく、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、エルビニア属、エルシニア属等のγ−プロテオバクテリア、コリネバクテリウム・グルタミカム、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌、シュードモナス・アエルジノーサ等のシュードモナス属細菌、マイコバクテリウム・ツベルクロシス等のマイコバクテリウム属細菌等からクローニングされるものを利用してもよい。
【０１６６】
フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンの生産能が増大したことは、例えば、フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンの発現量（ｍＲＮＡ量やタンパク質量）を測定することや、フェレドキシンおよび／またはフラボドキシンの活性を測定することにより、確認することができる。フェレドキシン及びフラボドキシンの活性は、適切な酸化還元反応系を利用して測定できる。例えば、フェレドキシンをフェレドキシン−ＮＡＤＰ+レダクターゼにより還元し、生じた還元型フェレドキシンによるチトクロームCの還元を定量することにより、フェレドキシンの活性を測定できる（Boyer, M. E. et al. 2006. Biotechnol. Bioeng. 94: 128-138）。また、フラボドキシンの活性も同様に測定できる。
【０１６７】
また、本発明の微生物は、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（「α-KGDH」ともいう）の活性が低下するよう改変されていてよい。「α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ」とは、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）を酸化的に脱炭酸し、サクシニル−CoA(succinyl-CoA)を生成する反応を触媒する酵素をいう。また、同反応を触媒する活性を、「α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性」ともいう。α-KGDHは、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（oxoglutarate dehydrogenase）、または２-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（2-oxoglutarate dehydrogenase）ともいう。
【０１６８】
上記反応は、α-KGDH（E1o；EC 1.2.4.2）、ジヒドロリポアミドＳ−サクシニルトランスフェラーゼ（dihydrolipoamide-S-succinyltransferase）（E2o；EC 2.3.1.61）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（dihydrolipoamide dehydrogenase）（E3；EC 1.8.1.4）の３種の酵素によって触媒される。すなわち、これらの３種類の酵素はそれぞれ以下の反応を触媒し、α-KGDH活性とは、具体的には、これら３つの反応を合わせた反応を触媒する活性をいう。
E1o: 2-oxoglutarate + [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] lipoyllysine → [dihydrolipoyllysine-residue succinyltransferase] S-succinyldihydrolipoyllysine + CO2
E2o：CoA + enzyme N6-(S-succinyldihydrolipoyl)lysine → succinyl-CoA + enzyme N6-(dihydrolipoyl)lysine
E3: protein N6-(dihydrolipoyl)lysine + NAD+ → protein N6-(lipoyl)lysine + NADH + H+
【０１６９】
腸内細菌科、例えばパントエア・アナナティスでは、この３種それぞれの酵素活性を有するサブユニットタンパク質、E1o、E2o、およびE3、が複合体を形成している。そして、各サブユニットは各々sucA、sucB、及びlpdA遺伝子によってコードされ、sucA、sucB遺伝子は、サクシネートデヒドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子（sdhB）の下流に存在している（米国特許第6,331,419号）。尚、同特許には、これらの遺伝子はエンテロバクター・アグロメランスAJ13355の遺伝子として記載されているが、同菌株は、後にパントエア・アナナティスに再分類されている。腸内細菌のα-KGDHをコードする遺伝子として、パントエア・アナナティスAJ13355のsucA、sucB、およびlpdA遺伝子の塩基
配列を、それぞれ配列番号７３、７５、および７７に示す。また、同遺伝子にコードされるSucA、SucB、およびLpdAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７４、７６、および７８に示す。また、エシェリヒア・コリのα-KGDH遺伝子であるsucA、sucB、およびlpdA遺伝子にコードされるSucA、SucB、およびLpdAタンパク質は、それぞれGenBank NP_415254、NP_415255、およびNP_414658として開示されている。
【０１７０】
また、コリネ型細菌では、E1oサブユニットはodhA遺伝子（sucA遺伝子とも呼ばれる；GenBank Accession No. NC_003450のNCgl1084として登録されている）によってコードされ、E3サブユニットはlpd遺伝子（GenBank Accession No. Y16642）によってコードされている。一方、E2oサブユニットは、E1oサブユニットとともに２機能性タンパク質としてodhA遺伝子にコードされているか（Usuda, Y. et al., Microbiology 1996. 142: 3347-3354参照）、あるいはodhA遺伝子とは別のGenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126として登録されている遺伝子によってコードされていると推測されている。従って、本発明においては、odhA遺伝子は、E1oサブユニットをコードする遺伝子であるが、併せてE2oをコードしていてもよい。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC 13032のodhA遺伝子の塩基配列及び同遺伝子にコードされるE1oサブユニットのアミノ酸配列（WO2006/028298）を、それぞれ配列番号７９および８０に示す。また、lpd遺伝子の塩基配列及び同遺伝子にコードされるE3サブユニットのアミノ酸配列（WO2006/028298）を、それぞれ配列番号８１および８２に示す。また、上記GenBank Accession No. NC_003450のNCgl2126の塩基配列及び同配列によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号８３および８４に示す。
【０１７１】
α-KGDH活性が低下したことは、公知の方法（Shiio, I. and Ujigawa-Takeda, K. 1980. Agric. Biol. Chem. 44: 1897-1904）によりα-KGDH活性を測定することによって確認することができる。
【０１７２】
また、本発明の微生物は、マリルＣｏＡの生産能が増大するように改変されていてよい。なお、ここでいう「マリルＣｏＡの生産能」とは、マリルＣｏＡを生合成する能力をいい、生成したマリルＣｏＡが産物として菌体内外に蓄積することを要しない。すなわち、例えば、生成したマリルＣｏＡは速やかに消費されてよい。
【０１７３】
マリルＣｏＡの生産能は、例えば、下記（Ｉ）または（ＩＩ）により、増大させることができる：
（Ｉ）Ｌ−リンゴ酸からマリルＣｏＡを合成する酵素の活性、マリルCoAリアーゼ活性、及びイソクエン酸リアーゼ活性が増大するように微生物を改変すること；または
（ＩＩ）Ｌ−リンゴ酸からマリルＣｏＡを合成する酵素の活性、マリルCoAリアーゼ活性、グリオキシル酸カルボリガーゼ活性、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピンオン酸レダクターゼ活性、及びヒドロキシピルビン酸レダクターゼ活性が増大するように微生物を改変すること（WO2013/018734）。
【０１７４】
「Ｌ−リンゴ酸からマリルCoAを合成する酵素」とは、Ｌ−リンゴ酸とCoAを結合させ、マリルCoAへと変換する反応を触媒する活性を有するタンパク質をいう。Ｌ−リンゴ酸からマリルCoAを合成する酵素としては、マレートチオキナーゼ、スクシニルCoAシンターゼ、およびスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼが挙げられる。本発明においては、Ｌ−リンゴ酸からマリルCoAを合成する酵素から選択される１種またはそれ以上の酵素の活性を増大させることができる。すなわち、例えば、マレートチオキナーゼ、スクシニルCoAシンターゼ、およびスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼのいずれかの活性を増大させてもよく、それら全ての活性を増大させてもよい。タンパク質の活性は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。タンパク質の活性を増大させる詳細な手法は後述する。
【０１７５】
「マレートチオキナーゼ」とは、Ｌ−リンゴ酸とCoAからマリルCoAを生成する反応を可逆的に触媒する酵素（EC 6.2.1.9）をいう。また、同反応を触媒する活性を、「マレートチオキナーゼ活性」ともいう。なお、上記反応は、生体内および生体外において可逆であることが知られており、すなわち、マレートチオキナーゼは、上記反応の逆反応も触媒できることが知られている。マレートチオキナーゼは、マリルCoAシンターゼ、マレート−CoAリガーゼ、またはマリルコエンザイムAシンターゼとも呼ばれる。
【０１７６】
マレートチオキナーゼは、複数のサブユニットからなる複合体、通常はαサブユニットとβサブユニットからなる複合体、として機能することが知られている。αサブユニットはmtkB遺伝子によってコードされ、βサブユニットはmtkA遺伝子によってコードされている。mtkA遺伝子とmtkB遺伝子は、通常はゲノム上において連続して存在している。
【０１７７】
マレートチオキナーゼをコードする遺伝子は、メタンなどのＣ１炭素源の資化経路（J.
Bacteriol., 176(23), 7398-7404 (1994)）や３−ヒドロキシプロピオン酸経路（Arch. Microbiol., 151, 252-256 (1989)）を保有する生物において確認されている。なお、一般的に、ゲノム上のマレートチオキナーゼをコードするmtkAB遺伝子の近傍には、後述するマリルCoAリアーゼをコードするmclA遺伝子が存在する。mkAB遺伝子とmclA遺伝子がゲノム上で近接して存在している生物種は、例えば、NCBI BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）により特定することができる。
【０１７８】
マレートチオキナーゼをコードする遺伝子として、具体的には、例えば、メチロバクテリウム・エクストロクエンス（Methylobacterium extorquens）等のメチロバクテリウム属細菌、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）等のメソリゾビウム属細菌、グラニュリバクター・ベセスデンシス（Granulibacter bethesdensis）等のグラニュリバクター属細菌、ロゼオバクター・デニトリフィカンス（Roseobacter denitrificans）等のロゼオバクター属細菌、モーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）等のモーレラ属細菌、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Hyphomicrobium methylovorum）等のハイホマイクロビウム属細菌、クロロフレクサス・アウランチアクス（Chloroflexus aurantiacus）等のクロロフレクサス属細菌、ニトロソモナス・ユーロピア（Nitrosomonas
europaea）等のニトロソモナス属細菌のmtkAB遺伝子が挙げられる。
【０１７９】
メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number NC_012808.1）、メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のマレートチオキナーゼをコードするmtkAB遺伝子の塩基配列も報告されている。すなわち、メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmtkA遺伝子はGenBank accession number NC_012808.1に記載のメチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のゲノム配列の塩基番号1803549〜1804721に相当する。また、メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmtkB遺伝子はGenBank accession number NC_012808.1に記載のメチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のゲノム配列の塩基番号1804744〜1805634に相当する。メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmtkA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９９および１００に示す。メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmtkB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０１および１０２に示す。
【０１８０】
メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり（GenBank
accession number NC_002678.2）、メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のマレートチオキナーゼをコードするmtkAB遺伝子の塩基配列も報告されている。すなわち、メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のmtkA遺伝子及びmtkB遺伝子は、それぞれ、メソリゾビウム
・ロティMAFF303099株のゲノム配列（GenBank accession number NC_002678.2）の塩基番号1110720〜1111904 及び塩基番号1111919〜1112818に相当する。メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のmtkA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０３および１０４に示す。メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のmtkB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０５および１０６に示す。
【０１８１】
グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number NC_002678.2）、グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のマレートチオキナーゼをコードするmtkAB遺伝子の塩基配列も報告されている。すなわち、グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のmtkA遺伝子及びmtkB遺伝子のは、それぞれ、グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のゲノム配列（GenBank accession number NC_008343.1）の塩基番号55236〜56405及び塩基番号56421〜57317に相当する。グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のmtkA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０７および１０８に示す。グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のmtkB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１０９および１１０に示す。
【０１８２】
マレートチオキナーゼ遺伝子としては、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されず用いることができる。例えば、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Hyphomicrobium methylovolum）、ハイホマイクロビウム・デニトリフィカンス（Hyphomicrobium denitrificans）、リゾビウム属の一種（Rhizobium sp.）NGR234株、グラニュリバクター・ベセスデンシス（Granulibacter bethesdensis）、ニトロソモナス・ユーロピア（Nitrosomonas europaea）、およびメチロコッカス・キャプスラタス（Methylococcus capsulatus）のマレートチオキナーゼをコードする遺伝子が、E. coli、Pantoea ananatis、およびCorynebacterium glutamicumにおいて発現し機能することが報告されている（WO2013/018734）。
【０１８３】
マレートチオキナーゼのαサブユニットとβサブユニットは、後述するスクシニルCoAシンターゼのαサブユニットとβサブユニットと、それぞれ高い相同性を有している。後述する実施例に示すように、本発明者により、スクシニルCoAシンターゼがマレートチオキナーゼ活性を有することが発見された。すなわち、マレートチオキナーゼ活性は、スクシニルCoAシンターゼ活性を増大させることによっても、増大させることができる。
【０１８４】
マレートチオキナーゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのマレートチオキナーゼ活性を比較することにより、確認できる。マレートチオキナーゼの活性は、例えば、Louisの方法（Louis B. Hersh J Biol Chem. 1973 Nov 10;248(21):7295-303.）に従って測定できる。具体的には、グリオキシル酸と速やかに反応し呈色するフェニルヒドラジンとCoAとATPとマリルCoAリアーゼと粗酵素液を含有する反応液にＬ−リンゴ酸を添加し、生成されるグリオキシレートフェニルヒドラジンの量を分光学的に測定することによって、マレートチオキナーゼ活性を測定できる。なお、本方法はマレートチオキナーゼにより生成されたマリルCoAが、マリルCoAリアーゼによりアセチルCoAとグリオキシル酸に分解されることを利用する。
【０１８５】
「スクシニルCoAシンターゼ」とは、ATPまたはGTPなどのヌクレオチド3リン酸がヌクレオチド2リン酸と無機リン酸へ加水分解される反応を伴いながら、コハク酸とコエンザイムA（以下、CoA）からスクシニルCoAを生成する反応を触媒する酵素（EC 6.2.1.5またはEC 6.2.1.4）をいう。また、同反応を触媒する活性を、「スクシニルCoAシンターゼ活性」ともいう。なお、上記反応は、生体内および生体外において可逆であることが知られてお
り、すなわち、スクシニルCoAシンターゼは、上記反応の逆反応も触媒できることが知られている。スクシニルCoAシンターゼは、スクシニルCoAリガーゼ、スクシニルコエンザイムAシンターゼ、スクシネートチオキナーゼ、スクシニックチオキナーゼ、スクシネートホスホリレーティングエンザイム、またはP−エンザイムとも呼ばれる。
【０１８６】
スクシニルCoAシンターゼは、複数のサブユニットからなる複合体、通常はαサブユニットとβサブユニットからなる複合体、として機能することが知られている。αサブユニットはsucD遺伝子によってコードされ、βサブユニットはsucC遺伝子によってコードされている。sucC遺伝子とsucD遺伝子は、通常はゲノム上において連続して存在している。
【０１８７】
スクシニルCoAシンターゼをコードする遺伝子は、様々な生物においてその存在が認められている。スクシニルCoAシンターゼをコードする遺伝子は、例えば、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; http://www.genome.jp/kegg/）、NCBI（National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）、およびBRENDA（BRaunschweig ENzyme DAtabase; http://www.brenda-enzymes.info/）等の各種データベースに登録されている。スクシニルCoAシンターゼ遺伝子としては、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されず用いることができるが、例えばスクシニルCoA生成効率の観点から、宿主微生物に内在するスクシニルCoAシンターゼ遺伝子を用いてもよい。
【０１８８】
スクシニルCoAシンターゼをコードする遺伝子として、具体的には、例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エッフィシエンス、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等のコリネバクテリウム属細菌のsucCD遺伝子が挙げられる。
【０１８９】
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number NC_000913.3）、エシェリヒア・コリMG1655株のスクシニルCoAシンターゼをコードするsucCD遺伝子の塩基配列も報告されている。すなわちsucC遺伝子はGenBank accession number NC_000913.3に記載のエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列の塩基番号762237〜763403に相当する。また、sucD遺伝子はGenBank accession number NC_000913.3に記載のエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列の塩基番号763403〜764272に相当する。エシェリヒア・コリMG1655株のsucC遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１１および１１２に示す。エシェリヒア・コリMG1655株のsucD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１３および１１４に示す。
【０１９０】
パントエア・アナナティスAJ13355株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number NC_017531.1）、パントエア・アナナティスAJ13355株のスクシニルCoAシンターゼをコードするsucCD遺伝子の塩基配列も報告されている。すなわちsucC遺伝子はGenBank accession number NC_017531.1に記載のパントエア・アナナティスAJ13355株のゲノム配列の塩基番号610188〜611354に相当する。また、sucD遺伝子はGenBank accession number NC_017531.1に記載のパントエア・アナナティスAJ13355株のゲノム配列の塩基番号611354〜612229に相当する。パントエア・アナナティスAJ13355株のsucC遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１５および１１６に示す。パントエア・アナナティスAJ13355株のsucD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１７および１１８に示す。
【０１９１】
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり
（GenBank accession number NC_003450.3）、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のスクシニルCoAシンターゼをコードするsucCD遺伝子の塩基配列も報告されている。すなわちsucC遺伝子はGenBank accession number NC_003450.3に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のゲノム配列の塩基番号2725382〜2726578に相当する。また、sucD遺伝子はGenBank accession number NC_003450.3に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のゲノム配列の塩基番号2724476〜2725360に相当する。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のsucC遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１９および１２０に示す。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のsucD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２１および１２２に示す。コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC 13869）のsucC遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２３および１２４に示す。コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC 13869）のsucD遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２５および１２６に示す。
【０１９２】
なお、スクシニルCoAシンターゼに変異を導入することにより、スクシニルCoAシンターゼ活性および／またはマレートチオキナーゼ活性を増大させてもよい。少なくともマレートチオキナーゼ活性が増大する変異としては、例えば、以下のような変異が挙げられる。・エシェリヒア・コリのsucD遺伝子がコードするαサブユニットの124位のプロリンがアラニンに置換される変異
・エシェリヒア・コリのsucD遺伝子がコードするαサブユニットの157位のチロシンがグリシンに置換される変異
・エシェリヒア・コリのsucD遺伝子がコードするαサブユニットの161位のバリンがアラニンに置換される変異
・エシェリヒア・コリのsucD遺伝子がコードするαサブユニットの97位のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換される変異
・エシェリヒア・コリのsucC遺伝子がコードするβサブユニットの271位のグリシンがアラニンに置換される変異
【０１９３】
これらの変異は、１つのみ導入されてもよく、２つまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、エシェリヒア・コリのsucD遺伝子がコードするαサブユニットの161位のバリンがアラニンに置換され、sucC遺伝子がコードするβサブユニットの271位のグリシンがアラニンに置換された変異型スクシニルCoAシンターゼ遺伝子を構築してもよい。
【０１９４】
上記変異を有さないスクシニルCoAシンターゼを「野生型スクシニルCoAシンターゼ」、それをコードする遺伝子を「野生型スクシニルCoAシンターゼ遺伝子」ともいう。また、上記変異を有するスクシニルCoAシンターゼを「変異型スクシニルCoAシンターゼ」、それをコードする遺伝子を「変異型スクシニルCoAシンターゼ遺伝子」ともいう。
【０１９５】
野生型スクシニルCoAシンターゼは、上記例示したようなエシェリヒア・コリの野生型スクシニルCoAシンターゼに限られず、その保存的バリアントであってもよい。なお、上記変異の表記における変異の位置は相対的なものであって、アミノ酸の欠失、挿入、または付加などによってその位置は前後することがある。例えば、「αサブユニットの161位のバリン」とは、配列番号１１４における161位のバリン残基に相当するアミノ酸残基を意味し、161位よりもN末端側の１アミノ酸残基が欠失している場合は、N末端から160番目のアミノ酸残基が「αサブユニットの161位のバリン」であるものとする。また、161位よりもN末端側に１アミノ酸残基挿入されている場合は、N末端から162番目のアミノ酸残基が「αサブユニットの161位のバリン」であるものとする。
【０１９６】
任意のアミノ酸配列における上記変異対象のアミノ酸残基は、当該任意のアミノ酸配列と配列番号１１４のアミノ酸配列とでアライメントを行うことにより決定できる。アライメントは、例えば、公知の遺伝子解析ソフトウェアを利用して行うことができる。具体的なソフトウェアとしては、日立ソリューションズ製のDNASISや、ゼネティックス製のGENETYXなどが挙げられる（Elizabeth C. Tyler et al., Computers and Biomedical Research, 24(1), 72-96, 1991；Barton GJ et al., Journal of molecular biology, 198(2), 327-37. 1987）。
【０１９７】
スクシニルCoAシンターゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのスクシニルCoAシンターゼ活性を比較することにより、確認できる。スクシニルCoAシンターゼの活性は、例えば、Williamsonの方法（John R. Williamson, Barbara E. Corkey Methods in Enzymology, edited by Colowich JM.
New York: Academic, 1969, p. 434-514.）に従って測定できる。具体的には、CoA、ATP、ホスホエノールピルビン酸、ピルベートキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、NADH、および粗酵素液を含有する反応液にコハク酸を添加し、消費されるNADHの量を分光学的に測定することによって、スクシニルCoAシンターゼ活性を測定できる。
【０１９８】
「スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ」とは、スクシニルCoAとＬ−リンゴ酸から、コハク酸とマリルCoAを生成する反応を触媒する酵素（EC 2.8.3.-）をいう。また、同反応を触媒する活性を、「スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ活性」ともいう。スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼは、スクシニルCoA（S）−マレートCoAトランスフェラーゼ、またはＬ−カルニチンデヒドロターゼ/バイルアシッド−インデューシブルプロテインfamilyとも呼ばれる。
【０１９９】
スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼとしては、複数のサブユニットからなる複合体として機能するものが知られている。そのようなスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼは、通常は、smtA遺伝子によってコードされたサブユニットとsmtB遺伝子によってコードされたサブユニットにより構成されている。smtA遺伝子とsmtB遺伝子は、通常はゲノム上において連続して存在している。
【０２００】
そのようなスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子として、具体的には、例えば、クロロフレクサス・アウランチアクス（Chloroflexus aurantiacus）等のクロロフレクサス属細菌、およびアキュミュリバクター・ホスファチス（Accumulibacter phosphatis）等のアキュミュリバクター属細菌のsmtAB遺伝子やそのホモログが挙げられる。smtA遺伝子によってコードされたタンパク質とsmtB遺伝子によってコードされたタンパク質は互いに相同性が高く、例えば、クロロフレクサス・アウランチアクスのsmtA遺伝子によってコードされたタンパク質とsmtB遺伝子によってコードされたタンパク質のアミノ酸相同性は59%である。なお、クロロフレクサス・アウランチアクスのsmtAB遺伝子はE. coliにおいて発現し機能することが報告されている（Friedmann S et al. (2006)J Bacteriol. 188(7):2646-55.）。
【０２０１】
また、スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼとしては、単一の遺伝子によりコードされるものも挙げられる。そのようなスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼは、CoA-transferase family III (CaiB/BaiF)に分類される酵素であって、スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ活性を有するものであれば、特に限定されない。
【０２０２】
そのようなスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼをコードする遺伝子として、具体的には、例えば、マグネトスピリルム・マグネティカム（Magnetospirillum magneticum）等のマグネトスピリルム属細菌、およびロドスピリルム・ルブラム（Rhodospirillum rubrum）等のロドスピリルム属細菌のsmtB遺伝子ホモログが挙げられる。
【０２０３】
クロロフレクサス・アウランチアクスJ-10-fl株のゲノムDNAの全塩基配列は公知であり（GenBank accession number NC_010175.1）、クロロフレクサス・アウランチアクスJ-10-fl株のスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼをコードするsmtAB遺伝子（以下、「Ca_smtAB遺伝子」ともいう）の塩基配列も報告されている。すなわち、Ca_smtA遺伝子及びCa_smtB遺伝子は、それぞれ、クロロフレクサス・アウランチアクスJ-10-fl株のゲノム配列（GenBank accession number NC_010175.1）の塩基番号224515〜225882及び223035 〜224252に相当する。Ca_smtA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（YP_001633822）を、それぞれ配列番号１２７および１２８に示す。Ca_smtB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（YP_001633821）を、それぞれ配列番号１２９および１３０に示す。
【０２０４】
アキュミュリバクター・ホスファチス（候補株）clade IIAstr.. UW-1株（Candidatus Accumulibacter phosphatis clade IIA str. UW-1）のゲノムDNAの全塩基配列は公知である（GenBank accession number NC_013194.1）。アキュミュリバクター・ホスファチス（候補株）clade IIAstr.. UW-1株のスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ遺伝子としては、Ca_smtA遺伝子およびCa_smtB遺伝子のホモログ（以下、それぞれ「Ap_smtA遺伝子」および「Ap_smtB遺伝子」ともいい、２つをまとめて「Ap_smtAB遺伝子」ともいう）が挙げられる。Ap_smtA遺伝子及びAp_smtB遺伝子は、それぞれ、アキュミュリバクター・ホスファチス（候補株）clade IIAstr.. UW-1株のゲノム配列（GenBank accession number NC_013194.1）の塩基番号2888316〜2889563及び2889587〜2890813に相当する。Ap_smtA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３１および１３２に示す。Ap_smtB遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３３および１３４に示す。
【０２０５】
ロドスピリルム・ルブラムATCC 11170株のゲノムDNAの全塩基配列は公知である（GenBank accession number NC_007643.1）。ロドスピリルム・ルブラムATCC 11170株のスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ遺伝子としては、Ca_smtB遺伝子に相同な遺伝子（以下、「Rr_smt遺伝子」ともいう）が挙げられる。Rr_smt遺伝子は、ロドスピリルム・ルブラムATCC 11170株のゲノム配列（GenBank accession number NC_007643.1）の塩基番号2965790〜2967016に相当する。Rr_smt遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（YP_427637）を、それぞれ配列番号１３５および１３６に示す。
【０２０６】
マグネトスピリルム・マグネティカムAMB-1株のゲノムDNAの全塩基配列は公知である（GenBank accession number NC_007626.1）。マグネトスピリルム・マグネティカムAMB-1株のスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ遺伝子としては、Ca_smtB遺伝子に相同な遺伝子（以下、「Mm_smt遺伝子」ともいう）が挙げられる。Mm_smt遺伝子は、マグネトスピリルム・マグネティカムAMB-1株のゲノム配列（GenBank accession number NC_007626.1）の塩基番号2307230〜2308438に相当する。Mm_smt遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（YP_421496）を、それぞれ配列番号１３７および１３８に示す。
【０２０７】
スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのスクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ活性を比較することにより、確認できる。スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼの活性は、例えば、Friedmannの方法（Friedmann S et al. (2006)J Bacteriol. 188(7):2646-55.）に従って測定できる。具体的には、グリオキシル酸と速やかに反応し呈色するフェニルヒドラジンとスクシニルCoAとマリルCoAリアーゼと粗酵素液を含有する反応液にＬ−リンゴ酸を添加し、生成されるグリオキシレートフェニルヒド
ラジンの量を分光学的に測定することによって、スクシニルCoA:マレートCoAトランスフェラーゼ活性を測定できる。
【０２０８】
「マリルCoAリアーゼ」とは、マリルCoAから、アセチルCoAとグリオキシル酸を可逆的に生成する反応を触媒する酵素（EC 4.1.3.24）をいう。また、同反応を触媒する活性を、「マリルCoAリアーゼ活性」ともいう。マリルCoAリアーゼは、マリルコエンザイムAリアーゼ、または(3S)−3−カルボキシ−3−ヒドロキシプロパノイルCoAグリオキシレイトリアーゼとも呼ばれる。
【０２０９】
マリルCoAリアーゼをコードする遺伝子として、具体的には、例えば、メチロバクテリウム・エクストロクエンス（Methylobacterium extorquens）等のメチロバクテリウム属細菌、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）等のメソリゾビウム属細菌、グラニュリバクター・ベセスデンシス（Granulibacter bethesdensis）等のグラニュリバクター属細菌、ロゼオバクター・デニトリフィカンス（Roseobacter denitrificans）等のロゼオバクター属細菌、モーレラ・サーモアセチカ（Moorella thermoacetica）等のモーレラ属細菌、ハイホマイクロビウム・メチロボラム（Hyphomicrobium methylovorum）等のハイホマイクロビウム属細菌、クロロフレクサス・アウランチアクス（Chloroflexus aurantiacus）等のクロロフレクサス属細菌、ニトロソモナス・ユーロピア（Nitrosomonas europaea）等のニトロソモナス属細菌のmclA遺伝子が挙げられる。
【０２１０】
メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のマリルCoAリアーゼをコードするmclA遺伝子はGenBank accession number NC_012808.1に記載のメチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のゲノム配列の塩基番号1808790〜1809764に相当する。メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmclA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３９および１４０に示す。
【０２１１】
メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のマリルCoAリアーゼをコードするmclA遺伝子は、メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のゲノム配列（GenBank accession number NC_002678.2）の塩基番号1109744〜1110700に相当する。メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のmclA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４１および１４２に示す。
【０２１２】
グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のマリルCoAリアーゼをコードするmclA遺伝子のDNA配列は、グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のゲノム配列（GenBank accession number NC_008343.1）の塩基番号60117〜61112に相当する。グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のmclA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４３および１４４に示す。
【０２１３】
マリルCoAリアーゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのマリルCoAリアーゼ活性を比較することにより、確認できる。マリルCoAリアーゼの活性は、例えば、Louisの方法（Louis B. Hersh J Biol Chem. 1973 Nov 10;248(21):7295-303.）に従って測定できる。具体的には、グリオキシル酸と速やかに反応し呈色するフェニルヒドラジンとCoAとATPとマレートチオキナーゼと粗酵素液を含有する反応液にＬ−リンゴ酸を添加し、生成されるグリオキシレートフェニルヒドラジンの量を分光学的に測定することによって、マリルCoAリアーゼ活性を測定できる。なお、本方法はマレートチオキナーゼにより生成されたマリルCoAが、マリルCoAリアーゼによりアセチルCoAとグリオキシル酸に分解されることを利用する。あるいは、CoAとATPとマレートチオキナーゼとＬ−リンゴ酸に代えて、マリルCoAを用いても同様にマリルCoAリアーゼ活性を測定できる。
【０２１４】
「イソクエン酸リアーゼ」とは、イソクエン酸から、グリオキシル酸とコハク酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素（EC 4.1.3.1）をいう。また、同反応を触媒する活性を、「イソクエン酸リアーゼ活性」ともいう。イソクエン酸リアーゼは、イソサイトレイトリアーゼ、イソサイトラーゼ、イソシトリターゼ、イソシトラターゼ、スレオ−Ds−イサイトレイトグリオキシレイトリアーゼ、またはイソサイトレイトグリオキシレイトリアーゼとも呼ばれる。
【０２１５】
イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子は、様々な生物においてその存在が認められている。イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子は、例えば、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; http://www.genome.jp/kegg/）、NCBI（National Center for
Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）、およびBRENDA（BRaunschweig ENzyme DAtabase; http://www.brenda-enzymes.info/）等の各種データベースに登録されている。イソクエン酸リアーゼ遺伝子としては、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されず用いることができるが、例えばイソクエン酸リアーゼ生成効率の観点から、宿主微生物に内在するイソクエン酸リアーゼ遺伝子を用いてもよい。
【０２１６】
イソクエン酸リアーゼをコードする遺伝子として、具体的には、例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、パントエア・アナナティス等のパントエア属細菌、およびコリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌のaceA遺伝子が挙げられる。
【０２１７】
エシェリヒア・コリMG1655株のイソクエン酸リアーゼをコードするaceA遺伝子はGenBank accession number NC_000913.3に記載のエシェリヒア・コリMG1655株のゲノム配列の塩基番号4215132〜4216436に相当する。エシェリヒア・コリMG1655株のaceA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４５および１４６に示す。
【０２１８】
パントエア・アナナティスAJ13355株のイソクエン酸リアーゼをコードするaceA遺伝子はGenBank accession number NC_017531.1に記載のパントエア・アナナティスAJ13355株のゲノム配列の塩基番号4068278〜4069579に相当する。パントエア・アナナティスAJ13355株のaceA遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４７および１４８に示す。
【０２１９】
また、例えばコリネバクテリウム属細菌には、２コピーのイソクエン酸リアーゼ遺伝子（以下、「ICL1遺伝子」および「ICL2遺伝子」ともいう）を有するものがある。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のICL1遺伝子（Cgl2331）およびICL2遺伝子（Cgl0097）は、それぞれ、GenBank accession number NC_003450.3に記載のコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のゲノム配列の塩基番号2470741〜2472039および106392〜105838に相当する。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のICL1遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４９および１５０に示す。コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のICL2遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５１および５１２に示す。また、コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC 13869）のICL1遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５３および１５４に示す。コリネバクテリウム・グルタミカム2256株（ATCC
13869）のICL2遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５５および１５６に示す。
【０２２０】
aceA遺伝子は、通常、aceBAK遺伝子からなるオペロンを形成している。後述するように
aceBがコードするマレートシンターゼの活性は弱化していることが好ましい。従って、イソクエン酸リアーゼの活性を増強する際には、例えば、実施例に記載したように、aceBAKオペロンのうちaceB遺伝子を欠失すると同時に強力なプロモーターを導入することにより、aceA遺伝子の発現を増強してもよい。
【０２２１】
イソクエン酸リアーゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのイソクエン酸リアーゼ活性を比較することにより、確認できる。イソクエン酸リアーゼの活性は、例えば、Hoytらの方法（Hoyt JC et al. (1988) Biochim Biophys Acta. 14;966(1):30-5.）に従って測定できる。具体的には、グリオキシル酸と速やかに反応し呈色するフェニルヒドラジンと粗酵素液を含有する反応液にイソクエン酸を添加し、生成されるグリオキシレートフェニルヒドラジンの量を分光学的に測定することによって、イソクエン酸リアーゼ活性を測定できる。また、イソクエン酸リアーゼの活性は、例えば、Mackintoshらの方法（Mackintosh, C et al. (1988) Biochem. J. 250, 25-31）に従って測定できる。具体的には、NADPとイソクエン酸デヒドロゲナーゼと粗酵素液を含有する反応液にグリオキシル酸とコハク酸を添加し、生成されるNADPHの量を分光学的に測定することによって、イソクエン酸リアーゼ活性を測定できる。
【０２２２】
「グリオキシル酸カルボリガーゼ」とは、２分子のグリオキシル酸を１分子の２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸へと変換する反応を触媒する酵素（EC 4.1.1.47）をいう。同反応は、１分子の二酸化炭素の脱炭酸を伴う。グリオキシル酸カルボリガーゼをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、ロドコッカス・ジョスティ等のロドコッカス属細菌のgcl遺伝子が挙げられる。
【０２２３】
「２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼ」とは、NADHを電子供与体として、２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸をグリセリン酸へと変換する酵素（EC 1.1.1.60）をいう。２−ヒドロキシ−３−オキソプロピオン酸レダクターゼをコードする遺伝子としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム等のコリネバクテリウム属細菌、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌のglxR遺伝子が挙げられる。
【０２２４】
「ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ」とは、NADHまたはNADPHを電子供与体として、ヒドロキシピルビン酸をグリセリン酸へと変換する酵素（EC 1.1.1.81）をいう。ヒドロキシピルビン酸レダクターゼをコードする遺伝子としては、例えば、エシェリヒア・コリ等のエシェリヒア属細菌、およびパントエア・アナナティス等のパントエア属細菌のycdW遺伝子が挙げられる。
【０２２５】
なお、これら他の改変に使用される遺伝子も、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、先述したNADHを酸化する酵素およびそれらをコードする遺伝子の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【０２２６】
「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、元のタンパク質の活性に対応する活性を有することをいう。すなわち、例えば、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質がＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有することをいい、マレートキノンオキシドレダクターゼについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質がマレートキノンオキシドレダクターゼ活性を有することをいう。なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合は、各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体が対応する活性を有することであってよい
。すなわち、例えば、NDH-1の各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体がNDH-1活性を有することであってよい。
【０２２７】
＜１−４＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【０２２８】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）またはタンパク質の量を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、微生物が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【０２２９】
タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【０２３０】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【０２３１】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【０２３２】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主微生物の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko,
K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の
直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたtransduction法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【０２３３】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【０２３４】
また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主微生物に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主微生物を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pMW219（ニッポンジーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載のpCG4およびpCG11が挙げられる。
【０２３５】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の微生物に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の微生物で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【０２３６】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の微生物に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構
成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０２３７】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい。
【０２３８】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【０２３９】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌を用いる場合には、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモーターであるcspB、SOD、tufプロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）等のプロモーターを用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０２４０】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるい
は欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【０２４１】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことができる。
【０２４２】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じうる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【０２４３】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０２４４】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０２４５】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【０２４６】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53,
159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。
【０２４７】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０２４８】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０２４９】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０２５０】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０２５１】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばα−ケトグルタル酸シンターゼ、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０２５２】
＜１−５＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【０２５３】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）またはタンパク質の量を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の
分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して低下していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２５４】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２５５】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーターやシャインダルガノ（ＳＤ）配列等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。
【０２５６】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。
【０２５７】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０２５８】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０２５９】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで微生物を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構
造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０２６０】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０２６１】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【０２６２】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０２６３】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０２６４】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２６５】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０２６６】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０２６７】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えばジカルボン酸排出担体タンパク質、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【０２６８】
＜２＞本発明の目的物質の製造法
本発明の方法は、本発明の微生物を培地で培養して目的物質を該培地中又は該微生物の菌体内に生成蓄積すること、および該培地又は菌体より目的物質を採取することを含む、目的物質の製造法である。本発明においては、１種の目的物質が製造されてもよく、２種またはそれ以上の目的物質が製造されてもよい。
【０２６９】
使用する培地は、本発明の微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、使用する微生物の種類や製造する目的物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０２７０】
炭素源は、本発明の微生物が資化して目的物質を生成し得るものであれば、特に限定されない。炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。なお、炭素源としては、植物由来原料を好適に用いることができる。植物としては、例えば、トウモロコシ、米、小麦、大豆、サトウキビ、ビート、綿が挙げられる。植物由来原料としては、例えば、根、茎、幹、枝、葉、花、種子等の器官、それらを含む植物体、それら植物器官の分解産物が挙げられる。植物由来原料の利用形態は特に制限されず、例えば、未加工品、絞り汁、粉砕物、生成物等のいずれの形態でも利用できる。また、キシロース等の５炭糖、グルコース等の６炭糖、またはそれらの混合物は、例えば、植物バイオマスから取得して利用できる。具体的には、これらの糖類は、植物バイオマスを、水蒸気処理、濃酸加水分解、希酸加水分解、セルラーゼ等の酵素による加水分解、アルカリ処理等の処理に供することにより取得できる。なお、ヘミセルロースは一般的にセルロースよりも加水分解されやすいため、植物バイオマス中のヘミセルロースを予め加水分解して５炭糖を遊離させ、次いで、セルロースを加水分解して６炭糖を生成させてもよい。また、キシロースは、例えば、本発明の微生物にグルコース等の６炭糖からキシロースへの変換経路を保有させて、６炭糖からの変換により供給してもよい。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０２７１】
培地中での炭素源の濃度は、本発明の微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培地中での炭素源の濃度は、目的物質の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くするのが好ましい。培地中での炭素源の初発濃度は、例えば、通常5〜30 %(W/V)、好ましくは10〜20 %(W/V)であってよい。また、発酵の進行に伴う炭素源の消費に応じて、炭素源を追加で添加してもよい。
【０２７２】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０２７３】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０２７４】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０２７５】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０２７６】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。また、例えば、コリネ型細菌によりＬ−グルタミン酸を製造する場合は、培地中のビオチン量を制限することや、培地に界面活性剤またはペニシリンを添加することが好ましい。また、培養時の発泡を抑えるために、培地には市販の消泡剤を適量添加しておくことが好ましい。
【０２７７】
培養条件は、本発明の微生物が増殖でき、目的物質が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する微生物の種類や製造する目的物質の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０２７８】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の微生物を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の微生物を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の微生物の量は特に制限されない。例えば、ＯＤ６６０＝４〜８の種培養液を、培養開始時に、本培養用の培地に対して０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％、添加してよい。
【０２７９】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０２８０】
培養は、好気条件で行ってもよく、微好気条件で行ってもよく、嫌気条件で行ってもよい。培養は、微好気条件または嫌気条件で行うのが好ましい。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33ppm以上であることをいい、好ましくは1.5ppm以上であることであってよい。微好気条件とは、培養系に酸素が供給されているが、液体培地中の溶存酸素濃度が0.33ppm未満であることをいう。嫌気条件とは、培養系に酸素が供給されない条件をいう。培養は、その全期間において上記で選択された条件で行われてもよく、一部の期間のみ上記で選択された条件で行われてもよい。すなわち、「好気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において好気条件で培養が行われることをいう。また、「微好気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において微好気条件で培養が行われることをいう。また、「嫌気条件で培養する」とは、培養の全期間の内の、少なくとも一部の期間において
嫌気条件で培養が行われることをいう。「一部の期間」とは、例えば、培養の全期間の５０％以上、７０以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９９％以上の期間であってよい。なお、「培養の全期間」とは、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合には、本培養の全期間を意味してよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養または振盪培養で行うことができる。また、通気量や攪拌速度を低下させる、容器を密閉して無通気で培養する、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の手段により、液体培地中の溶存酸素濃度を低下させ、微好気条件または嫌気条件を達成できる。
【０２８１】
培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH4.0〜9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。
【０２８２】
培地には、炭酸イオン、重炭酸イオン、炭酸ガス、またはそれらの組み合わせが含有されていてよい。これらの成分は、例えば、本発明の微生物の代謝により、またはpH調整に用いられる炭酸塩および／または重炭酸塩から、供給することができる。また、これらの成分は、必要に応じて、炭酸、重炭酸、それらの塩、または炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウムが挙げられる。炭酸イオンおよび／または重炭酸イオンは、例えば、0.001〜5M、好ましくは0.1〜3M、さらに好ましくは1〜2Mの濃度で添加してよい。炭酸ガスを含有させる場合は、例えば、溶液1L当たり50mg〜25g、好ましくは100mg〜15g、さらに好ましくは150mg〜10gの炭酸ガスを含有させてよい。
【０２８３】
培養温度は、例えば、２０〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃であってよい。培養期間は、例えば、１時間以上、４時間以上、１０時間以上、または１５時間以上であってよく、１６８時間以下、１２０時間以下、９０時間、または７２時間以下であってよい。培養期間は、具体的には、例えば、１０時間〜１２０時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の微生物の活性がなくなるまで、継続してもよい。
【０２８４】
このような条件下で本発明の微生物を培養することにより、菌体内および／または培地中に目的物質が蓄積する。
【０２８５】
また、Ｌ−グルタミン酸を製造する場合、Ｌ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地を用いて、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら培養を行うことも出来る。Ｌ−グルタミン酸が析出する条件としては、例えば、ｐＨ５．０〜３．０、好ましくはｐＨ４．９〜３．５、さらに好ましくはｐＨ４．９〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．７付近の条件が挙げられる（欧州特許出願公開第1078989号明細書）。尚、培養は、その全期間において上記ｐＨで行われてもよく、一部の期間のみ上記ｐＨで行われてもよい。「一部の期間」とは、上記例示したような期間であってよい。
【０２８６】
目的物質が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＬＣ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０２８７】
生成した目的物質の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。なお、
菌体内に目的物質が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによって目的物質を回収することができる。回収される目的物質は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【０２８８】
また、目的物質が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出した目的物質は、培地中に溶解している目的物質を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０２８９】
また、目的物質が揮発性である場合は、目的物質を揮発させて回収してもよい。例えば、通気培養により、効率的に目的物質を揮発させて培養液と分離することができる。揮発した目的物質を回収する方法は特に制限されない。例えば、揮発した目的物質は、一般に用いられる密閉容器等の収集部材へ収容してもよく、適当な液体にトラップしてもよい。具体的には、例えば、国際公開2009/008377号パンフレッ卜には、イソプロピルアルコール又はアセトンを液体ににトラップして回収する方法が開示されている。また、そのような方法に好適に用いることができる装置としては、例えば、国際公開2009/008377号パンフレッ卜の図１に記載の培養装置が挙げられる。
【０２９０】
尚、回収される目的物質は、目的物質以外に、例えば、微生物菌体、培地成分、水分、及び微生物の代謝副産物を含んでいてもよい。回収された目的物質の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【実施例】
【０２９１】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれにより制限されるものではない。
【０２９２】
＜実施例１：E. coliによるグルタミン酸生産におけるジカルボン酸排出担体タンパク質の欠損効果＞
＜１−１＞MG1655ΔsucAΔgadAΔgadB株の作製
E.coli MG1655ΔsucA株（WO2007/125954）のgadA及びgadB遺伝子を欠損させ、MG1655ΔsucAΔgadAΔgadB株を構築した。遺伝子の欠損は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）とλファージ由来の切り出しシステム（J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.）を組み合わせた方法（以下、「λ−Ｒｅｄ法」ともいう;WO2005/010175）により行った。手順を以下に示す。
【０２９３】
H70（配列番号１８１）及びH71（配列番号１８２）（gadB遺伝子の一部配列及びattL配列又はattR配列を含む）をプライマーとし、pMW118-attL-Cm-attR（WO2005/010175）を鋳型に用いて、PCR反応を行った。得られたDNA断片をDpnI制限酵素で切断し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）を含むMG1655 ΔsucA株にエレクトロポレーションにより導入した。30℃でAmp(アンピシリン)(50mg/L)及びCｍ（クロラムフェニコール）(20mg/L)を含むLB寒天培地上で培養し、Cm耐性組換え体を選択した。H72（配列番号１８３）およびH73（配列番号１８４）をプライマーとしてコロニーPCRを行い、gadB::Cmに組み変わった株を選択した。選択した株をMG1655ΔsucA gadB::Cmとした。
【０２９４】
次に、H66（配列番号１８５）及びH67（配列番号１８６）（ gadA遺伝子の一部配列及
びattL配列又はattR配列を含む）をプライマーとし、pMW118-attL-Km-attRを鋳型に用いて、PCR反応を行った。得られたDNA断片をDpnI制限酵素で切断し、pKD46を含むMG1655ΔsucA gadB::Cm株にエレクトロポレーションにより導入した。37℃でLB寒天培地(Km(カナマイシン)50 mg/L, Cm25 mg/Lを含む)で培養し、Km耐性組換え体を選択した。H68（配列番号１８７）およびH69（配列番号１８８）をプライマーとしてコロニーPCRを行い、gadA::Kmに組み変わった株を選択した。選択した株をMG1655ΔsucA gadA::Km gadB::Cmとした。37℃でシングルコロニーアイソレーションしAmpsになった株に、pMW-int-xisプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し（30℃Amp耐性株を選択）、得られた株を42℃でSIし、薬剤カセット及びプラスミドを脱落した目的株MG1655ΔsucAΔgadAΔgadB株を得た。
【０２９５】
＜１−２＞MG1655ΔsucAΔgadAΔgadBΔiscRΔldhΔpflDΔpflB株の作製
上記で得たMG1655ΔsucAΔgadAΔgadB株のiscR、ldh、pflD、及びpflB遺伝子をさらに欠損させた株は、各遺伝子を欠損したKeioコレクション（Baba, T., Ara, T., Hasegawa,
M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, K.A., Tomita, M., Wanner, B.L.,
and Mori, H. (2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene
knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol 2: 2006 0008.）からP1ファージを調整し、目的株へP1形質転換を行った後、選択マーカーとして利用した薬剤耐性遺伝子を欠損させるということを繰り返すことで作製した。
【０２９６】
具体的には、まず、keioコレクションの株E.coli BW25113 iscR::Kmr [rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1 iscR::Kmr]をドナー、MG1655ΔsucAΔgadAΔgadBをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、MG1655ΔsucAΔgadAΔgadB ΔiscR::Kmrを得た。次に、この株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミド、pMAN-FLPを導入し、Datsenko（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）に記載の方法でKmr遺伝子を除去し、MG1655ΔsucAΔgadAΔgadB ΔiscRを得た。
【０２９７】
なお、上記で用いたpMAN-FLPは、以下の手順で作成したものである。すなわち、pCP20 (PNAS 97: 6640-6645 (2000))をSmaI及びBamHI制限酵素で処理し、FRT-specific Flpレコンビナーゼ遺伝子を含む3.3kbの断片を得た。得られたDNA断片をpMAN997ベクター(J. Bacteriol. 2001, 183(22):6538)のマルチクローニングサイトSmaI及びBamHIサイトにクローニングすることで、pMAN-FLPを構築した。
【０２９８】
ldh、pflD、 pflBも同様の操作を繰り返すことで順次欠損させ、最終的にMG1655ΔsucAΔgadAΔgadBΔiscRΔldhΔpflDΔpflB株を得た。
【０２９９】
＜１−３＞MG1655ΔsucAΔgadAΔgadBΔiscRΔldhΔpflDΔpflBΔicd株の作製
MG1655 Δicd::Cmをλ−Ｒｅｄ法により作成する。S1及びS2（icd遺伝子の一部配列及びattL配列又はattR配列を含む）をプライマーとし、pMW118-attL-Cm-attRを鋳型に用いてPCR反応を行う。得られたDNA断片をDpnI制限酵素で切断し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むMG1655株にエレクトロポレーションにより導入する。30℃でAmp(アンピシリン)(50mg/L)及びCｍ（クロラムフェニコール）(20mg/L)を含むLB寒天培地上で培養し、Cm耐性組換え体を選択する。S3およびS4プライマーを用い、コロニーPCRを行いicd::Cmに組み変わった株を選択する。選択した株をMG1655Δicd::Cmとする。
【０３００】
MG1655Δicd::Cmをドナー、MG1655ΔsucAΔgadAΔgadBΔiscRΔldhΔpflDΔpflBをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、MG1655ΔsucAΔgadAΔgadBΔiscRΔldhΔpflDΔpflBΔicd::Cmを得る。次に、これらの株にpMW-int-xisプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し（30℃Amp耐性株を選択）、得られた株を42℃でSIし、薬剤カセ
ット及びプラスミドを脱落した目的株MG1655ΔsucAΔgadAΔgadBΔiscRΔldhΔpflDΔpflBΔicd株を得る。この株をE7-39株と命名する。
【０３０１】
＜１−４＞ΔyeeA株、ΔynfM株、ΔyjjP株、およびΔyjjB株の作製
MG1655 ΔyeeA::Cmをλ−Ｒｅｄ法により作成した。プライマーDEco yeeA-Fw（GGCCGACAGATGAGTTATGAGCGCTTTTAATCTCATTACGGAGTTTCTGCTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA；配列番号２２１）、及びプライマーDEco yeeA-Rv（TTATCCTTGCTGAATCGAAGCAGCAGCAAGATGATTCTGAAGTTCAGGAACGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA；配列番号２２２）（yeeA遺伝子の一部配列及びattL配列又はattR配列を含む）を用い、pMW118-attL-Cat-attRを鋳型に用いPCR反応を行った。得られたDNA断片をDpnI制限酵素で切断し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むMG1655株にエレクトロポレーションにより導入した。30℃でAmp(アンピシリン)(50mg/L)及びCｍ（クロラムフェニコール）(20mg/L)を含むLB寒天培地上で培養し、Cm耐性組換え体を選択した。プライマーDEco yeeA-CF（ATTACACTGTTCCCGGTTTGTCCGTCGGAT；配列番号２２３）およびプライマーDEco yeeA-CR（ATAGCTGCCGCAGATGACAATGCTTTTATC；配列番号２２４）を用い、コロニーPCRを行いyeeA::Cmに組み変わった株を選択した。選択した株をMG1655ΔyeeA::Cmとした。
【０３０２】
MG1655 ΔynfM::Cmをλ−Ｒｅｄ法により作成した。プライマーDEco ynfM-Fw（CTACCCTATGTATAAGCCTGATCTACAGGCATATTTAGCAAGGATTTCAATGAAGCCTGCTTTTTTATACTAAGTTGGCA；配列番号２２５）、及びプライマーDEco ynfM-Rv（GAGCTGGCAATAAGTCCGGACGGGTATTTACCGCAGTCCGGACTTATTTTCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCTGAACGA；配列番号２２６）（ynfM遺伝子の一部配列及びattL配列又はattR配列を含む）を用い、pMW118-attL-Cat-attRを鋳型に用いPCR反応を行った。得られたDNA断片をDpnI制限酵素で切断し、温度感受性の複製能を有するプラスミドpKD46を含むMG1655株にエレクトロポレーションにより導入した。30℃でAmp(アンピシリン)(50mg/L)及びCｍ（クロラムフェニコール）(20mg/L)を含むLB寒天培地上で培養し、Cm耐性組換え体を選択した。プライマーDEco ynfM-CF（AACATCTTATTTGAGATTATTAATATATTA；配列番号２２７）およびプライマーDEco ynfM-CR（GGAATTGGCTGGCGCTTCGTCTATTTTAGG；配列番号２２８）を用い、コロニーPCRを行いynfM::Cmに組み変わった株を選択した。選択した株をMG1655ΔynfM::Cmとした。
【０３０３】
MG1655ΔyeeA::Cmをドナー、E7-39株をレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、E7-39ΔyeeA::Cmを得た。次に、この株にpMW-int-xisプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し（30℃Amp耐性株を選択）、得られた株を42℃でSIし、薬剤カセット及びプラスミドを脱落した目的株E-39ΔyeeA株を得た。
【０３０４】
MG1655ΔynfM::Cmをドナー、E7-39株をレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、E7-39ΔynfM::Cmを得た。次に、この株にpMW-int-xisプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し（30℃Amp耐性株を選択）、得られた株を42℃でSIし、薬剤カセット及びプラスミドを脱落した目的株E-39ΔynfM株を得た。
【０３０５】
MG1655ΔynfM::Cmをドナー、E7-39ΔyeeA株をレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、E7-39ΔyeeAΔynfM::Cmを得た。次に、この株にpMW-int-xisプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し（30℃Amp耐性株を選択）、得られた株を42℃でSIし、薬剤カセット及びプラスミドを脱落した目的株E-39ΔyeeAΔynfM株を得た。
【０３０６】
keioコレクションの株BW25113 yjjP::Kmr [rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1 iscR::Kmr]をドナー、E7-39をレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、E7-39ΔyjjP::Kmrを得た。次に、この株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミド、pMAN-FLPを導入し、Datsenko（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）に記載の方法で、Kmr遺伝子を除去し、E7-39ΔyjjPを得た
。
【０３０７】
keioコレクションの株BW25113 yjjB::Kmr [rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1 iscR::Kmr]をドナー、E7-39をレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、E7-39ΔyjjB::Kmrを得た。次に、これらの株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミド、pMAN-FLPを導入し、Datsenko（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）に記載の方法で、Kmr遺伝子を除去し、E7-39ΔyjjBを得た。
【０３０８】
keioコレクションの株BW25113 yjjP::Kmr [rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1 iscR::Kmr]をドナー、E7-39ΔyeeAΔynfMをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、E7-39ΔyeeAΔynfMΔyjjP::Kmrを得た。次に、これらの株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミド、pMAN-FLPを導入し、Datsenko（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）に記載の方法で、Kmr遺伝子を除去し、E7-39ΔyeeAΔynfMΔyjjPを得た。
【０３０９】
keioコレクションの株BW25113 yjjB::Kmr [rrnB3 ΔlacZ4787 hsdR514 Δ(araBAD)567 Δ(rhaBAD)568 rph-1 iscR::Kmr]をドナー、E7-39ΔyeeAΔynfMをレシピエントとしてP1トランスダクションを行い、E7-39ΔyeeAΔynfMΔyjjB::Kmrを得た。次に、これらの株にFLPリコンビナーゼ遺伝子を搭載したプラスミド、pMAN-FLPを導入し、Datsenko（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645）に記載の方法で、Kmr遺伝子を除去し、E7-39ΔyeeAΔynfMΔyjjBを得た。
【０３１０】
＜１−５＞RSF-PPGプラスミドの作製
RSF-PPGは、RSFCPG（欧州特許出願公開第0952221号明細書参照）上のgltA遺伝子をprpC遺伝子に置換したプラスミドである。RSF-PPGは、以下の手順で構築した。
【０３１１】
RSFCPGのgltA遺伝子のORF以外の部分を増幅するプライマーRSFBgl-2： ggaagatctatttgccttcgcacatcaacctgg（配列番号２０９）とRSFKpn： cggggtaccttgtaaatattttaacccgcc（配列番号２１０）を設計した。このプライマーを用いて、RSFCPGを鋳型にPCRを行い、約14.9kbの断片を取得した。一方、prpCに関してはプライマーcoliprpCBgl-1：ggaagatctaaggagaccttaaatgagcgacacaacgatcctgcaaaacagtaccc（配列番号２１１）と6:coliprpCKpn：cggggtacctcgtagaggtttactggcgcttatccagcg（配列番号２１２）を用い、E. coli W3110株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行い、約1.2kbの断片を取得した。両PCR産物をそれぞれBglIIおよびKpnIで処理し、ライゲーション後E. coli JM109株を形質転換した。出現したコロニーを全て集菌し、Mixtureとしてプラスミドを抽出した。このプラスミドMixtureでクエン酸シンターゼをコードするgltA遺伝子の欠損株であるME8330株を形質転換し、50mg/L
uracil、5mg/L Thiamine-HClを含有するM9最少培地に塗布した。出現したコロニーを全て集菌し、Mixtureとしてプラスミドを抽出し、このプラスミドMixtureでP. ananatis Glu生産菌宿主株であるNP106株を形質転換した。P. ananatis G106株と同等の収率を示す株をNA1とした。また本菌株よりプラスミドを抽出しこれをprpC、gdh、ppc強化用プラスミドRSFPPGとした。
【０３１２】
＜１−６＞α−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子、ピルビン酸シンターゼ遺伝子、フェレドキシン遺伝子のクローニング
Chlorobaculum tepidum由来のα−ケトグルタル酸シンターゼ遺伝子（KGS遺伝子）、ピルビン酸シンターゼ遺伝子（PS遺伝子）、フェレドキシン遺伝子（Fd）をE. coliで発現させるためのプラスミドを構築した。手順を以下に示す。
【０３１３】
まず、Chlorobaculum tepidumゲノムを鋳型として、配列番号１８９及び配列番号１９
０をプライマーとして常法に従ってPCRを行いFd遺伝子を増幅した。また、同様に配列番号１９１及び配列番号１９２をプライマーとして、KGS遺伝子を増幅した。得られたFd遺伝子産物及びKGS遺伝子産物を混合したものを鋳型として、配列番号１８９及び配列番号１９２をプライマーとして、PCRを行い両断片が連結したFd-KGS遺伝子断片を得た。精製されたFd-KGS遺伝子断片と、pMW219-Ptac-Ttrp（WO2013/069634）をSmaI制限酵素にて処理後精製した断片を、In-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて連結した。得られたFd-KGS遺伝子発現用プラスミドをpMW219-Fd-KGSと命名した。
【０３１４】
次に、Chlorobaculum tepidumゲノムを鋳型として、配列番号１９３及び配列番号１９４をプライマーとして常法に従ってPCRを行いPS遺伝子を増幅した。また、pMW219-Fd-KGSプラスミドを鋳型として、配列番号１９５及び配列番号１９６をプライマーとして常法に従ってPCRを行いpMW219-Fd-KGS断片を増幅した。得られた2つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて連結した。得られたFd、KGS、およびPS遺伝子発現用プラスミドをpMW219-Fd-KGS-PSと命名した。
【０３１５】
＜１−７＞嫌気培養でのグルタミン酸生成の確認
E3-39、E3-39ΔyjjP、E3-39ΔyjjB、E3-39ΔyeeA、E3-39ΔynfM、E3-39ΔyeeAΔynfMA、E3-39ΔyeeAΔynfMΔyjjP、E3-39ΔyeeAΔynfMΔyjjB株のそれぞれに、RSF-PPGプラスミド及びpMW219-FdKGSPSプラスミドを同時に導入した株を作製する。
【０３１６】
次に、作製した菌株についてＬ−グルタミン酸生産培養を行い、Ｌ−グルタミン酸の生産能について検討する。菌株を適切な抗生物質を含む(カナマイシン50 μg/ml、テトラサイクリンの場合は15 μg/ml)LBM9Glcプレート(LB培地800 mlに、5x M9 salts 200 ml、50% グルコース 10 mlを添加して作製)に均一に塗布し、37℃にて16-20時間培養する。その後、該プレートをアネロパック（三菱ガス化学株式会社製  嫌気性菌簡易培養用  品番A-04）に入れ、嫌気条件下、37℃で6時間培養を行う。得られたプレートの菌体を、700ulの0.8%の食塩水に51倍希釈でOD=0.5から1.5（600nm）になる様に懸濁する。この菌体懸濁液200μlと予め炭酸ガスを十分に吹き込んだ(1vvm、 30分以上)生産培地1mlを1.5ml容のねじキャップ式マイクロチューブに分注し蓋を締め、嫌気条件下マイクロチューブシェイカーを用いて37℃において24時間又は48時間培養する。以下に生産培地の組成を示す。
【０３１７】
〔生産培地組成〕
〔Ａ区〕
グルコース                       10  g/L（最終濃度）
〔Ｂ区〕
硫酸マグネシウム・七水和物        1  g/L
硫酸アンモニウム                 15  g/L
リン酸二水素カリウム              1  g/L
ビオチン                          1 mg/L
ビタミンＢ１                      1 mg/L
微量金属溶液                     10 ml/L
(KOHにてpH=7に調製)
〔Ｃ区〕
炭酸カルシウム（日本薬局方）   50  g/L
Ａ区、Ｂ区をそれぞれ115℃、10分オートクレーブ滅菌、Ｃ区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、放冷し、混合する。
微量金属溶液は、1LあたりFeCl2・6H2O 1.35 g、ZnCl2 680 mg、CuSO4・5H2O 249 mg、MnSO4・5H2O 120 mg、CoCl2・6H2O 118 mg、(NH4)6Mo7O24・4H2O 123 mgを含む溶液である。
【０３１８】
培養後、培地中に蓄積したグルタミン酸及び糖の濃度をバイオテックアナライザー AS-310 (サクラエスアイ(株))により分析する。また、その他の有機酸量を液体クロマトグラフィーHPLCシステム（L-7100、L-7200、L-7300、L-7400、(株)日立ハイテクノロジーズ）、
カラムはURUTRON PS-80H（信和化工(株)））により分析する。菌体のODは0.1Nの塩酸でサンプルを希釈し、培地中の炭酸カルシウムを溶解した後、spectrophotometer DU800 (Beckman Coulter)を用いて測定する。
【０３１９】
＜実施例２：E. aerogenesによるグルタミン酸生産におけるジカルボン酸排出担体タンパク質の欠損効果＞
＜２−１＞ES06株の構築
エンテロバクター・アエロゲネスAJ110637（FERM BP-10955）株から構築したES04株（US2010-0297716A1）の染色体上のpoxB遺伝子を、アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株由来のpckA遺伝子で置換することにより、エンテロバクター・アエロゲネスES06株を構築した。手順を以下に示す。
【０３２０】
λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子断片の構築
アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株（ATCC 55618）のゲノムの全塩基配列（GenBank Accession No. CP000746）は既に公開されており、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼをコードする遺伝子（遺伝子名pckA：登録番号 Asuc_0221）も明らかになっている。アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株由来pckA遺伝子の塩基配列を配列番号２１３に、同遺伝子がコードするホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのアミノ酸配列を配列番号２１４に示す。アクチノバチルス・サクシノゲネス130Z株のゲノムDNAを鋳型に、上記塩基配列を基に設計した配列番号２１５と配列番号２１６に記載したプライマーを用いてPCR反応（TaKaRa Prime star（登録商標）  94℃・10sec.、54℃・20sec.、72℃・90sec.、30cycle）を実施し、pckAのORF領域を含むDNA断片を取得した。また、λattL-Kmr-λattR-Ptac (WO2008090770A1)を含むDNA断片を鋳型に、配列番号２１７と配列番号２１８に記載したプライマーを用いてPCR反応（TaKaRa Prime star（登録商標）  94℃・10sec.、54℃・20sec.、72℃・90sec.、30cycle）を実施し、λattL-Kmr-λattR-Ptacを含むDNA断片を取得した。次に、pckAのORF領域を含むDNA断片とλattL-Kmr-λattR-Ptacを含むDNA断片を鋳型にして、配列番号２１６と配列番号２１７に記載したプライマーを用いてPCR反応（TaKaRa Prime star（登録商標）  94℃・10sec.、54℃・20sec.、72℃・180sec.、35cycle）を行い、両端にピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（遺伝子名poxB）の組み換え配列を有したλattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子断片を得た。
【０３２１】
ES04/RSFRedTER株の構築
ES04株(US20100297716A1)をLB液体培地にて終夜培養した。その後、培養液100μLを新たなLB液体培地4ｍLに植菌し、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとし、エレクトロポレーション法により、RSFRedTERを導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。SOC培地(バクトトリプトン20 g/L、イーストエキストラクト5 g/L、NaCl 0.5 g/L、グルコース10 g/L)で2時間培養後、40 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB培地に塗布し、16時間培養を行った。その結果、クロラムフェニコール耐性を示す形質転換体を取得し、ES04/RSFRedTER株と命名した。
【０３２２】
ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株の構築
ES04/RSFRedTER株をLB液体培地にて終夜培養した。その後、培養液1mLを、終濃度1 mMのIPTGと40 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに植菌して、34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピ
テントセルとした。増幅したλattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子断片をWizard PCR Prep
DNA Purification System（Promega社製）を用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。SOC培地で2時間培養後、カナマイシン50mg/Lを含むLB培地に塗布し、16時間培養を行った。出現したコロニーを同培地で純化した後、配列番号２１９と配列番号２２０に記載したプライマーを用いてコロニーPCR（TaKaRa Speed star（登録商標）  92℃・10sec.、56℃・10sec.、72℃・30sec.、40cycle）を行い、染色体上のpoxB遺伝子がλattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA遺伝子に置換している事を確認した。得られた株を、10％シュークロース、1 mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させ、ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株を得た。
【０３２３】
ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株からのカナマイシン耐性遺伝子除去
ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株からカナマイシン耐性遺伝子を除去する為に、RSF-int-xis（US20100297716A1）プラスミドを用いた。ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA株にRSF-int-xisをエレクトロポレーション法で導入し、40 mg/Lクロラムフェニコールを含有するLB培地に塗布後30℃で培養し、ES04ΔpoxB::λattL-Kmr-λattR-Ptac-pckA/RSF-int-xis株を得た。得られたプラスミド保持株を、40 mg/Lクロラムフェニコール及び1 mM IPTGを含有するLB培地で純化し、シングルコロニーを複数得た。その後、50 mg/Lのカナマイシンを加えた培地に塗布し、37℃で一晩培養し、生育出来ない事を確認する事で、カナマイシン耐性遺伝子が除去された株である事を確認した。次に、得られた株からRSF-int-xisプラスミドを脱落させるため、10%シュークロース及び1 mM IPTGを添加したLB培地に塗布し、37℃で一晩培養した。出現したコロニーの中から、クロラムフェニコール感受性を示した株をES06株と命名した。
【０３２４】
＜２−２＞RSFPPプラスミドの構築
RSFPPプラスミドはRSFPPG（WO 2010027022 A1）よりgdhA遺伝子を含む領域を除去することにより取得した。具体的には、RSFPPプラスミドを制限酵素NspVで処理し、75℃10分間加熱処理をして酵素を失活させたのちに、タカラバイオ社製DNA ligation kitを用いて、セルフライゲーションした。このDNA溶液でE.coli DH5α株を形質転換し、12.5mg/Lのテトラサイクリンを含むLB寒天培地で選択することにより、DH5α/RSFPP株を取得した。
【０３２５】
＜２−３＞ES06ΔyeeA株の構築
ES06ΔyeeA株は、λ-red法により作成した。具体的には、配列番号１９７と１９８に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にEnterobacter aerogenesのyeeA遺伝子内部配列と相補的な50bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にカナマイシン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。RSFRedTER（BMC Mol. Biol. 10, 34 (2009)）を保持するES06株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1mMのIPTGと25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに1mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地上で選択することにより、ES06ΔyeeA::Km株を得た。得られた株をM9成分（17.1g/L Na2HPO4・12H2O、3g/L
KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。この株に対してpMW-intxis-sacBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地で選択することにより、ES06ΔyeeA::Km/pMW-intxis-sacB株を得た。この株をLB寒天培地上で純化したのち、40mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にレプリカし、カナマイシンに対して感受性となったものをES06ΔyeeA株とした。
【０３２６】
＜２−４＞ES06ΔyeeAΔynfM株の構築
ES06ΔyeeAΔynfM株は、ES06ΔyeeA株より上述のλ-red法により作成した。具体的には、配列番号１９９と２００に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にEnterobacter aerogenesのynfM遺伝子内部配列と相補的な50bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にカナマイシン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。ES06ΔyeeA株に対してエレクトロポレーションによりRSFRedTERを導入したES06ΔyeeA/RSFRedTER株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1mMのIPTGと25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに1mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地上で選択することにより、ES06ΔyeeAΔynfM::Km株を得た。得られた株をM9成分（17.1g/L Na2HPO4・12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。この株に対してpMW-intxis-sacBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地で選択することにより、ES06ΔyeeAΔynfM::Km/pMW-intxis-sacB株を得た。この株をLB寒天培地上で純化したのち、40mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地にレプリカし、カナマイシンに対して感受性となったものをES06ΔyeeAΔynfM株とした。
【０３２７】
＜２−５＞sdhA破壊株の構築
コハク酸デヒドロゲナーゼのサブユニットをコードするsdhA遺伝子を欠損したES06ΔsdhA株は、ES06株より上述のλ-red法により作成した。具体的には、配列番号２０１と２０２に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にEnterobacter aeronegenesのsdhA遺伝子内部配列と相補的な50bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にカナマイシン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。RSFRedTERを保持するES06株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1mMのIPTGと25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに1mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40mg/Lのカナマイシンと20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地上で選択することにより、ES06ΔsdhA::Km株を得た。得られた株をM9成分（17.1g/L Na2HPO4・12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。この株に対してpMW-intxis-sacBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25mg/Lのクロラムフェニコールと20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地で選択することにより、ES06ΔsdhA::Km/pMW-intxis-sacB株を得た。この株を20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地上で純化したのち、40mg/Lのカナマイシンと20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地にレプリカし、カナマイシンに対して感受性となったものをES06ΔsdhA株とした。また、ES06ΔyeeA株、ES06ΔyeeAΔynfM株からも同様にしてsdhA遺伝子を欠損した株を誘導し、それぞれES06ΔsdhAΔyeeA株、ES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM株とした。これらの株にエレクトロポレーションによりRSFPPプラスミドを導入し、12.5mg/Lのテトラサイクリンと20mM  リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地で選択することにより、それぞれES06ΔsdhA/RSFPP株、ES06ΔsdhAΔyeeA/RSFPP株、ES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP株とした。
【０３２８】
＜２−６＞グルタミン酸生産
次にこれらの株のグルタミン酸生産能の評価を行った。以下に生産培地の組成を示す。
【０３２９】
〔生産培地組成〕
〔Ａ区〕
シュークロース                   30    g/L
MgSO4・7H20                        0.5  g/L
〔Ｂ区〕
(NH4)2SO4                         2.0  g/L
KH2PO4                            2.0  g/L
酵母エキス                        2.0  g/L
FeSO4・7H20                        0.02 g/L
MnSO4・5H20                        0.02 g/L
Ｌ−リジン塩酸塩                  0.2  g/L
ＤＬ−メチオニン                  0.2  g/L
ジアミノピメリン酸                0.2  g/L
(KOHにてpH7.0に調整)
〔Ｃ区〕
CaCO3                            20    g/L
A区、B区をそれぞれ115℃ 10分オートクレーブ滅菌、C区を180℃ 3時間乾熱滅菌した後、混合し、テトラサイクリン塩酸塩を12.5mg/Lとなるように添加した。
【０３３０】
ES06ΔsdhA/RSFPP株、ES06ΔsdhAΔyeeA/RSFPP株、ES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP株を12.5mg/Lのテトラサイクリン及び寒天15 g/Lを添加したLBGM9培地プレートにて34℃終夜培養を行った菌体を、前述の培地5mLを張り込んだ試験管に適量植菌し、120rpm、34℃にて振盪培養を行った。
【０３３１】
結果を表１に示す。対照のES06ΔsdhA/RSFPP株と比べ、yeeA遺伝子を欠損したES06ΔsdhAΔyeeA/RSFPP株、および更にynfM遺伝子を欠損したES06ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFPP株では、Ｌ−グルタミン酸生産能が向上することが明らかとなった。
【０３３２】
【表１】
2016165225.tif 000002
【０３３３】
＜実施例３：P. ananatisによるグルタミン酸生産におけるジカルボン酸排出担体タンパク質の欠損効果＞
＜３−１＞P.ananatis yeeA遺伝子欠損株の構築
配列番号２０３と２０４に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にPantoea ananatisのyeeA遺伝子内部配列と相補的な50bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にカナマイシン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。RSFRedTERを保持するSC17(0)株(BMC Molecular Biology 2009, 10:34)をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1mMのIPTGと25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに1mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV
/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地上で選択することにより、SC17(0)ΔyeeA::Km株を得た。
【０３３４】
＜３−２＞P.ananatis ynfM遺伝子欠損株の構築
配列番号２０５と２０６に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Tetr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にPantoea ananatisのynfM遺伝子内部配列と相補的な50bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にテトラサイクリン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。RSFRedTERを保持するSC17(0)株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1mMのIPTGと25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに1mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天培地上で選択することにより、SC17(0)ΔynfM::Tet株を得た。
【０３３５】
＜３−３＞P.ananatis sdhA欠損株の構築
配列番号２０７と２０８に示すプライマーを用い、pMW118-attL-Kmr-attRを鋳型としてPCR反応を行い、両端にPantoea ananatisのsdhA遺伝子内部配列と相補的な50bpの配列を有し、λファージのattLとattR配列にテトラサイクリン耐性遺伝子が挟まれた断片を増幅した。RSFRedTERを保持するSC17(0)株をLB液体培地にて終夜培養し、終濃度1mMのIPTGと25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB液体培地100mLに1mL植菌して34℃で3時間振盪培養を行った。菌体を回収した後、10％グリセロールで3回洗浄したものをコンピテントセルとした。増幅したPCR断片をPromega社製Wizard PCR Prepを用いて精製したものをエレクトロポレーション法によりコンピテントセルに導入した。尚、エレクトロポレーションはGENE PULSER II（BioRad社製）を用い、電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で行った。40mg/Lのカナマイシンと20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地上で選択することにより、SC17(0)ΔsdhA::Km株を得た。得られた株をM9成分（17.1g/L Na2HPO4・12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl）、10％シュークロース、1mM IPTGを含むLB寒天培地に塗布し、RSFRedTERプラスミドを脱落させた株を得た。この株に対してpMW-intxis-sacBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25mg/Lのクロラムフェニコールと20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地で選択することにより、SC17(0)ΔsdhA::Km/pMW-intxis-sacB株を得た。この株を20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地上で純化したのち、40mg/Lのカナマイシンと20mM リンゴ酸二ナトリウムを含むLB寒天培地にレプリカし、カナマイシンに対して感受性となったものをSC17(0)ΔsdhA株とした。
【０３３６】
＜３−４＞SC17(0)ΔsdhA株からのyeeA遺伝子、ynfM遺伝子欠損株の構築
SC17(0)ΔyeeA::Km株、SC17(0)ΔynfM::Tet株より、Edge Biosystems社製 Bacterial Genomic DNA Purification Kitを用いて染色体を抽出した。一方、SC17(0)ΔsdhA株を、LBGM9寒天培地（17.1g/L Na2HPO4・12H2O、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、5g/L グルコース、15g/L 寒天を含有するLB培地）にて終夜培養した。菌体をエーゼで掻き取り、氷冷しておいた10%グリセロールで3回洗菌し、菌体に10%グリセロールを最終500μLとなるように加えて懸濁したものをコンピテントセルとした。このコンピセントセルに、SC17(0)ΔyeeA::Km株の染色体DNA 600ngを、GENE PULSER II（BioRad社製）を用いて電場強度20kV/cm、コンデンサー容量25μF、抵抗値200Ωの条件で導入した。細胞懸濁液に、氷冷しておいたSOC培地を添加し、34℃で2時間振盪培養を行った後に、それぞれ40mg/LのカナマイシンLBGM9寒天培地上で34℃にて選択した。得られた株をそれぞれSC17(0)ΔsdhAΔyeeA::Km株とした。同様にSC17(0)ΔsdhAΔyeeA::Km株を宿主として、SC17(0)ΔynfM::Tet株の染色体DNAを導入し、12.5mg/Lテトラサイクリンと40mg/Lカナマイシンを含むLBGM9
寒天培地で選択することにより、SC17(0)ΔsdhAΔyeeA::KmΔynfM::Tet株を取得した。これらの株に、pMW-intxis-sacBプラスミドをエレクトロポレーションにより導入し、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLBGM9寒天培地上で選択することにより、SC17(0)ΔsdhAΔyeeA::Km/pMW-intxis-sacB株およびSC17(0)ΔsdhAΔyeeA::KmΔynfM::Tet/pMW-intxis-sacB株を得た。取得した株をLBGM9寒天培地上で純化したのち、40mg/Lのカナマイシンまたは12.5mg/Lテトラサイクリンを含むLBGM9寒天培地にレプリカし、カナマイシン・テトラサイクリンに対して感受性となったものをそれぞれSC17(0)ΔsdhAΔyeeA株およびSC17(0)ΔsdhAΔyeeAΔynfM株とした。SC17(0)ΔsdhA株及びこれらの株よりコンピテントセルを調製し、エレクトロポレーションによりRSFCPGプラスミドを導入し、12.5mg/Lテトラサイクリンを含むLBGM9寒天培地で選択することにより、SC17(0)ΔsdhA/RSFCPG株、SC17(0)ΔsdhAΔyeeA/RSFCPG株、およびSC17(0)ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFCPG株を得た。
【０３３７】
＜３−５＞グルタミン酸生産
次にこれらの株のグルタミン酸生産能の評価を行った。以下に生産培地の組成を示す。
【０３３８】
〔生産培地組成〕
〔Ａ区〕
シュークロース                  100    g/L
MgSO4・7H20                        0.5  g/L
〔Ｂ区〕
(NH4)2SO4                         5.0  g/L
KH2PO4                            6.0  g/L
酵母エキス                        6.0  g/L
FeSO4・7H20                        0.02 g/L
MnSO4・5H20                        0.02 g/L
GD113                             0.1 mL/L
(KOHにてpH7.0に調整)
A区、B区をそれぞれ120℃ 20分オートクレーブ滅菌した後、混合し、テトラサイクリン塩酸塩を12.5mg/Lとなるように添加した。
【０３３９】
SC17(0)ΔsdhA/RSFCPG株、SC17(0)ΔsdhAΔyeeA/RSFCPG株、およびSC17(0)ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFCPG株を12.5mg/Lのテトラサイクリンを含むLBGM9寒天培地にて34℃終夜培養を行った。プレート一枚分の菌体を、前述の培地250mLを張り込んだジャーファーメンターに植菌し、900rpm、34℃、アンモニアにてpH6.0に制御して培養を行った。
【０３４０】
結果を図１および図２に示す。対照のSC17(0)ΔsdhA/RSFCPG株と比べ、yeeA遺伝子を欠損したSC17(0)ΔsdhAΔyeeA/RSFCPG株においてＬ−グルタミン酸の生産能の向上が認められ（図１）、更にynfM遺伝子を欠損したSC17(0)ΔsdhAΔyeeAΔynfM/RSFCPG株では、Ｌ−グルタミン酸の収率が大幅に向上することが明らかとなった（図２）。
【０３４１】
＜配列表の説明＞
配列番号１：E. coli MG1655のnuoオペロンの塩基配列
配列番号２〜１４：E. coli MG1655のnuoオペロンがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５：Pantoea ananatis AJ13355のnuoオペロンの塩基配列
配列番号１６〜２８：Pantoea ananatis AJ13355のnuoオペロンがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２９：E. coli MG1655のndh遺伝子の塩基配列
配列番号３０：E. coli MG1655のNdhタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３１：Pantoea ananatis AJ13355のndh遺伝子の塩基配列
配列番号３２：Pantoea ananatis AJ13355のNdhタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３３：E. coli MG1655のmqo遺伝子の塩基配列
配列番号３４：E. coli MG1655のMqoタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３５：Pantoea ananatis AJ13355のmqo1遺伝子の塩基配列
配列番号３６：Pantoea ananatis AJ13355のmqo1がコードするタンパク質のアミノ酸配列配列番号３７：E. coli MG1655のldhA遺伝子の塩基配列
配列番号３８：E. coli MG1655のLdhAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号３９：Pantoea ananatis AJ13355のldhA遺伝子の塩基配列
配列番号４０：Pantoea ananatis AJ13355のLdhAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４１：E. coli MG1655のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号４２：E. coli MG1655のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４３：Pantoea ananatis AJ13355のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号４４：Pantoea ananatis AJ13355のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４５：E. coli MG1655のpta遺伝子の塩基配列
配列番号４６：E. coli MG1655のPtaタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４７：Pantoea ananatis AJ13355のpta遺伝子の塩基配列
配列番号４８：Pantoea ananatis AJ13355のPtaタンパク質のアミノ酸配列
配列番号４９：Chlorobium tepidumのα-KGSのαサブユニット遺伝子の塩基配列
配列番号５０：Chlorobium tepidumのα-KGSのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号５１：Chlorobium tepidumのα-KGSのβサブユニット遺伝子の塩基配列
配列番号５２：Chlorobium tepidumのα-KGSのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号５３：Blastopirellula marinaのα-KGSのαサブユニット遺伝子の塩基配列
配列番号５４：Blastopirellula marinaのα-KGSのαサブユニットのアミノ酸配列
配列番号５５：Blastopirellula marinaのα-KGSのβサブユニット遺伝子の塩基配列
配列番号５６：Blastopirellula marinaのα-KGSのβサブユニットのアミノ酸配列
配列番号５７：E. coli K-12のfpr遺伝子の塩基配列
配列番号５８：E. coli K-12のFprタンパク質のアミノ酸配列
配列番号５９：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼ遺伝子の塩基配列
配列番号６０：Chlorobium tepidumのピルビン酸シンターゼのアミノ酸配列
配列番号６１：E. coli K-12のfdx遺伝子の塩基配列
配列番号６２：E. coli K-12のFdxタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６３：E. coli K-12のyfhL遺伝子の塩基配列
配列番号６４：E. coli K-12のYfhLタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６５：E. coli K-12のfldA遺伝子の塩基配列
配列番号６６：E. coli K-12のFldAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６７：E. coli K-12のfldB遺伝子の塩基配列
配列番号６８：E. coli K-12のFldBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号６９：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩ遺伝子の塩基配列
配列番号７０：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩのアミノ酸配列
配列番号７１：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩI遺伝子の塩基配列
配列番号７２：Chlorobium tepidumのフェレドキシンＩIのアミノ酸配列
配列番号７３：Pantoea ananatis AJ13355のsucA遺伝子の塩基配列
配列番号７４：Pantoea ananatis AJ13355のSucAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７５：Pantoea ananatis AJ13355のsucB遺伝子の塩基配列
配列番号７６：Pantoea ananatis AJ13355のSucBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７７：Pantoea ananatis AJ13355のlpdA遺伝子の塩基配列
配列番号７８：Pantoea ananatis AJ13355のLpdAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７９：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のodhA遺伝子の塩基配列
配列番号８０：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のE1oサブユニットのアミノ酸配列
配列番号８１：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のlpd遺伝子の塩基配列
配列番号８２：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のE3サブユニットのアミノ酸配列配列番号８３：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のNCgl2126の塩基配列
配列番号８４：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のNCgl2126がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８５：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のndh遺伝子の塩基配列
配列番号８６：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のNdhタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８７：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のmqo遺伝子の塩基配列
配列番号８８：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のMqoタンパク質のアミノ酸配列
配列番号８９：E. coli MG1655のpflB遺伝子の塩基配列
配列番号９０：E. coli MG1655のPflBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９１：E. coli MG1655のpflD遺伝子の塩基配列
配列番号９２：E. coli MG1655のPflDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９３：E. coli MG1655のtdcE遺伝子の塩基配列
配列番号９４：E. coli MG1655のTdcEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９５：Pantoea ananatis AJ13355のpflB遺伝子の塩基配列
配列番号９６：Pantoea ananatis AJ13355のPflBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号９７：Pantoea ananatis AJ13355のmqo2遺伝子の塩基配列
配列番号９８：Pantoea ananatis AJ13355のmqo2がコードするタンパク質のアミノ酸配列配列番号９９：メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmtkA遺伝子の塩基配列
配列番号１００：メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のMtkAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０１：メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmtkB遺伝子の塩基配列
配列番号１０２：メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のMtkBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０３：メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のmtkA遺伝子の塩基配列
配列番号１０４：メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のMtkAタンパク質のアミノ酸配列配列番号１０５：メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のmtkB遺伝子の塩基配列
配列番号１０６：メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のMtkBタンパク質のアミノ酸配列配列番号１０７：グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のmtkA遺伝子の塩基配列
配列番号１０８：グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のMtkAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１０９：グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のmtkB遺伝子の塩基配列
配列番号１１０：グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のMtkBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１１：E. coli MG1655のsucC遺伝子の塩基配列
配列番号１１２：E. coli MG1655のSucCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１３：E. coli MG1655のsucD遺伝子の塩基配列
配列番号１１４：E. coli MG1655のSucDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１５：Pantoea ananatis AJ13355のsucC遺伝子の塩基配列
配列番号１１６：Pantoea ananatis AJ13355のSucCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１７：Pantoea ananatis AJ13355のsucD遺伝子の塩基配列
配列番号１１８：Pantoea ananatis AJ13355のSucDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１１９：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のsucC遺伝子の塩基配列
配列番号１２０：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のSucCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２１：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のsucD遺伝子の塩基配列
配列番号１２２：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のSucDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２３：Corynebacterium glutamicum 2256 (ATCC13869)のsucC遺伝子の塩基配列
配列番号１２４：Corynebacterium glutamicum 2256のSucCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２５：Corynebacterium glutamicum 2256のsucD遺伝子の塩基配列
配列番号１２６：Corynebacterium glutamicum 2256のSucDタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２７：クロロフレクサス・アウランチアクスJ-10-fl株のCa_smtA遺伝子の塩基配列
配列番号１２８：クロロフレクサス・アウランチアクスJ-10-fl株のCa_SmtAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２９：クロロフレクサス・アウランチアクスJ-10-fl株のCa_smtB遺伝子の塩基配列
配列番号１３０：クロロフレクサス・アウランチアクスJ-10-fl株のCa_SmtBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３１：アキュミュリバクター・ホスファチス（候補株）clade IIAstr.. UW-1株のAp_smtA遺伝子の塩基配列
配列番号１３２：アキュミュリバクター・ホスファチス（候補株）clade IIAstr.. UW-1株のAp_SmtAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３３：アキュミュリバクター・ホスファチス（候補株）clade IIAstr.. UW-1株のAp_smtB遺伝子の塩基配列
配列番号１３４：アキュミュリバクター・ホスファチス（候補株）clade IIAstr.. UW-1株のAp_SmtBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３５：ロドスピリルム・ランバムATCC 11170株のMm_smt遺伝子の塩基配列
配列番号１３６：ロドスピリルム・ランバムATCC 11170株のMm_Smtタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３７：マグネトスピリルム・マグネティカムAMB-1株のRr_smt遺伝子の塩基配列
配列番号１３８：マグネトスピリルム・マグネティカムAMB-1株のRr_Smtタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１３９：メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のmclA遺伝子の塩基配列
配列番号１４０：メチロバクテリウム・エクストルクエンスAM1株のMclAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４１：メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のmclA遺伝子の塩基配列
配列番号１４２：メソリゾビウム・ロティMAFF303099株のMclAタンパク質のアミノ酸配列配列番号１４３：グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のmclA遺伝子の塩基配列
配列番号１４４：グラニュリバクター・ベセスデンシスCGDNIH1株のMclAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４５：E. coli MG1655のaceA遺伝子の塩基配列
配列番号１４６：E. coli MG1655のAceAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４７：Pantoea ananatis AJ13355のaceA遺伝子の塩基配列
配列番号１４８：Pantoea ananatis AJ13355のAceAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１４９：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のICL1遺伝子の塩基配列
配列番号１５０：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のICL1がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５１：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のICL2遺伝子の塩基配列
配列番号１５２：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のICL2がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５３：Corynebacterium glutamicum 2256のICL1遺伝子の塩基配列
配列番号１５４：Corynebacterium glutamicum 2256のICL1がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５５：Corynebacterium glutamicum 2256のICL2遺伝子の塩基配列
配列番号１５６：Corynebacterium glutamicum 2256のICL2がコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５７：E. coli MG1655のyjjP遺伝子の塩基配列
配列番号１５８：E. coli MG1655のYjjPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１５９：Enterobacter aerogenesのyjjP遺伝子の塩基配列
配列番号１６０：Enterobacter aerogenesのYjjPタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６１：E. coli MG1655のyjjB遺伝子の塩基配列
配列番号１６２：E. coli MG1655のYjjBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６３：Enterobacter aerogenesのyjjB遺伝子の塩基配列
配列番号１６４：Enterobacter aerogenesのYjjBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６５：E. coli MG1655のyeeA遺伝子の塩基配列
配列番号１６６：E. coli MG1655のYeeAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６７：Pantoea ananatis AJ13355のyeeA遺伝子の塩基配列
配列番号１６８：Pantoea ananatis AJ13355のYeeAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１６９：Enterobacter aerogenesのyeeA遺伝子の塩基配列
配列番号１７０：Enterobacter aerogenesのYeeAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７１：E. coli MG1655のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１７２：E. coli MG1655のYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７３：Pantoea ananatis AJ13355のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１７４：Pantoea ananatis AJ13355のYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７５：Enterobacter aerogenesのynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１７６：Enterobacter aerogenesのYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７７：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１７８：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７９：Corynebacterium glutamicum ATCC13869のynfM遺伝子の塩基配列
配列番号１８０：Corynebacterium glutamicum ATCC13869のYnfMタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１８１〜２１２：プライマー
配列番号２１３：Actinobacillus succinogenes 130ZのpckA遺伝子の塩基配列
配列番号２１４：Actinobacillus succinogenes 130ZのPckAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１５〜２２８：プライマー
配列番号２２９：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のldh遺伝子の塩基配列
配列番号２３０：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のLdhタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３１：Corynebacterium glutamicum 2256のldh遺伝子の塩基配列
配列番号２３２：Corynebacterium glutamicum 2256のLdhタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３３：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のadhE遺伝子の塩基配列
配列番号２３４：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のAdhEタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３５：E. coli MG1655のilvB遺伝子の塩基配列
配列番号２３６：E. coli MG1655のIlvBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３７：E. coli MG1655のilvI遺伝子の塩基配列
配列番号２３８：E. coli MG1655のIlvIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３９：Pantoea ananatis AJ13355のilvG遺伝子の塩基配列
配列番号２４０：Pantoea ananatis AJ13355のIlvGタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４１：Pantoea ananatis AJ13355のilvI遺伝子の塩基配列
配列番号２４２：Pantoea ananatis AJ13355のIlvIタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４３：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のilvB遺伝子の塩基配列
配列番号２４４：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のIlvBタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４５：Pantoea ananatis AJ13355のbudA遺伝子の塩基配列
配列番号２４６：Pantoea ananatis AJ13355のBudAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４７：Pantoea ananatis AJ13355のbudC遺伝子の塩基配列
配列番号２４８：Pantoea ananatis AJ13355のBudCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２４９：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のbutA遺伝子の塩基配列
配列番号２５０：Corynebacterium glutamicum ATCC13032のButAタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
2016165225.tif 000003
【図２】
2016165225.tif 000004
【配列表】
2016165225000001.app