(57)【要約】      （修正有）【課題】風味の良いチーズ様食品の提供。【解決手段】豆乳を新規な乳酸菌Lactobacillus pentosus LS-26（NITE P-01929）により発酵させたチーズ様食品の製造方法。チーズ様食品は、発酵豆乳特有の臭気が無く、レモン様の風味があり、極めて食感がなめらかである。また、Lactobacillus pentosus LS-26は、胃酸及び腸液に耐性を有する乳酸菌である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆乳をLactobacillus pentosus LS-26  （NITE P-01929）により発酵させることを特徴とするチーズ様食品の製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の製造方法により得られるチーズ様食品。
【請求項３】
Lactobacillus pentosus LS-26  （NITE P-01929）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な乳酸菌を用いて豆乳を発酵することで得られるチーズ様食品及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
大豆を原料とする食品は、豆腐、納豆、味噌等の伝統食品の他、豆乳や大豆タンパク等の健康食品を含み、大豆からは多様な製品が開発されている。
【０００３】
この内、豆乳は、蒸煮大豆の圧搾により得られる圧搾大豆液をいう。豆乳は、主に豆腐の製造に用いられているものである。また、牛乳と比べ豆乳は、低カロリー、高タンパクであることに加え、高鉄分である。近年、消費者の健康意識の高まりにより豆乳が注目され、消費量が増加傾向にある。
しかしながら、豆乳は、ｎ−ヘキサナールをはじめとするアルデヒド類等の成分に起因する青臭みやエグ味（収斂味）などの不快な臭いや味を有することが問題となっている。また、豆乳乳酸発酵物は、豆乳以上に青臭さや豆臭さが強くなるだけでなく、独特の不快な発酵臭もあるために、多くの消費者の嗜好に馴染まない状況にあった。従って、豆乳飲料以外の製品を見かけることは少ない。
この臭気を低減するため、希少糖含有シロップを発酵原料中含有させる豆乳乳酸発酵物の製造方法が提案されている（特許文献１）が、希少糖は一般的なものではないため工業的に有利な方法ではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−７９６６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の目的は、上記問題点が無い、豆乳を乳酸発酵することで得られるチーズ様食品及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
斯かる実状に鑑み本発明者らは、広く自然界から種々の菌を採取し、スクリーニングを行った結果、下記乳酸菌を見出し、これを用いて豆乳発酵されて得られるチーズ様食品が上記臭気がなく、極めて食感がなめらかであることを見出し本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
（１）  豆乳をLactobacillus pentosus LS-26  （NITE P-01929）により発酵させることを特徴とするチーズ様食品の製造方法。
【０００８】
（２）  （１）記載の製造方法により得られるチーズ様食品。
【０００９】
（３）  Lactobacillus pentosus LS-26  （NITE P-01929）
【発明の効果】
【００１０】
本発明の製造方法により得られるチーズ様食品は、発酵豆乳特有の臭気が無く、レモン様の風味があり、極めて食感がなめらかである。また、本発明のLactobacillus pentosus LS-26は、胃酸及び腸液に耐性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明方法の原料となる豆乳は、特に制限されない。原料豆としては、大豆、黒大豆、小豆、ひよこ豆、レンズ豆、インゲン豆等が挙げられるが、好ましくは大豆である。豆乳は、公知の方法で製造することができる。また市販品を用いてもよい。豆乳は、豆固形分が、５％以上のものが好ましく、特に１０％以上のものが、食感、風味の点で好ましい。
【００１２】
本発明で用いる乳酸菌Lactobacillus pentosus LS-26 は、平成２６年９月４日に受託番号NITE P-01929として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託したものである。
【００１３】
豆乳の発酵は、あらかじめ食品原料で培養した乳酸菌培養液を、豆乳に対して適量、例えば１〜５容量％で植菌し、好ましくは  ３０〜４５℃、特に好ましくは  ３７〜４０℃で、好ましくは１５〜４８時間、特に好ましくは２０〜２４時間静置培養行う。発酵により豆乳は凝固しカードとなる。豆乳の発酵の際には、乳酸菌または乳酸菌培養液以外の添加物、例えば一般的に炭素源として用いるグルコース、スクロース等の糖を添加することが好ましい。
【００１４】
得られたカードは濾過して固形分を回収する。カードの濾過は、常法によって行うことが出来る。例えば、蒸気滅菌あるいは煮沸消毒した目の細かい布、例えば木綿の布、酒袋などを用いて、濾過を行う方法がある。濾過後の、カード固形分の水分は ８０〜５０重量％、好ましくは、７０〜６０重量％とすることが好ましい。
【実施例】
【００１５】
実施例１
乳酸菌の分離・同定
（１）分離
1）三角フラスコに下記に示す組成のおから液体培地を加え、オートクレーブ滅菌を行なった。滅菌したおから液体培地を10 ℃恒温下、6000 rpm（4830×g）にて15 分間遠心分離後、上清8 mL を内容積9 mL ねじ口試験管に加えた。試験管に生理食塩水5 mL と細かく破砕した分離原試料（植物等）1 g とを加え、ボルテックスミキサーにて撹拌懸濁後、静置した。得られた試料液の上清100 μL をおから液体培地に加え37 ℃恒温、嫌気条件下、2 日間静置培養を行なった。
【００１６】
おから液体培地組成
成分 濃度 / (g / L)
おから 30
りん酸二水素ナトリウム二水和物 30
グルコース 10
（pH 4.2）
【００１７】
2）濁りが観察されたおから液体培地を生理食塩水にて10 倍希釈した。得られた希釈菌液50 μL を下記 に示す組成のBCP 加プレートカウント寒天培地に植菌し、37 ℃恒温、好気条件下、2 日間静置培養を行なった。
【００１８】
BCP 加プレートカウント寒天培地組成
成分     濃度 / (g / L)
酵母エキス 2.5
ペプトン 5.0
ブドウ糖 1.0
ポリソルベート80   1.0
L-システイン塩酸塩   0.1
ブロムクレゾールパープル 0.04
寒天 15
（pH 6.9 ± 0.2）
【００１９】
3）内容積9 mL のねじ口試験管におから液体培地上清8 mL を加えた。 2）の培養でpH 低下を示す黄色ハローが形成されたコロニーを釣菌し、おから液体培地へ植菌を行なった。この培地について37 ℃恒温、嫌気条件下、2 日間静置培養を行なった。得られた培養液を白金耳にて釣菌し、BCP 加プレートカウント寒天培地に画線植菌後、37 ℃恒温、好気条件下、2 日間静置培養を行なった。培養後のシングルコロニーを滅菌爪楊枝にて釣菌し、BCP 加プレートカウント寒天培地に画線植菌後、 37 ℃恒温、好気条件下、2 日間培養を行なった。
【００２０】
4）内容積9 mL ねじ口試験管に次に示す組成の改変MRS液体培地8 mLを加えた。 3 ）にて形成されたコロニーを釣菌し、改変MRS 液体培地に植菌した。
植菌後の培地について37 ℃恒温、好気条件下、2 日間静置培養を行なった。得られた培養液についてpH 測定を行なった。
【００２１】
改変MRS 液体培地組成
成分     濃度 / (g / L)
ポリペプトン 10
肉エキス 10
酵母エキス 5.0
りん酸水素二カリウム 2.0
グルコース 20
ツイーン80   1.0
酢酸ナトリウム 5.0
硫酸マグネシウム七水和物 0.58
硫酸マンガン五水和物 0.12
（pH 6.2〜6.6）
【００２２】
自然界から採取した154 試料から上記スクリーニングで、31 株が単離された。コロニーの形状は、白色、円形、艶があり、輪郭が明確である菌株が多くみられた。
このうち、改変MRS 液体培地での培養でpH 4.0 を下回った菌株として LS-26 株を得た。
【００２３】
（２）Lactobacillus pentosus LS-26の性質
１．培養条件
培地：  ＭＲＳ寒天(Oxoid Hampshire, UK)
培養温度：  ３７℃
培養時間：  ２４時間
【００２４】
２．細菌第一段階試験
光学顕微鏡による形態観察及びバロー(BARROW, (G.I.) and FELTHAM, (R.K.A.): Cowan and Steel’s  Manual for the Identification of Medical Bacteria. 3rd edition 1993, Cambridge University Press.)らの方法に基づき、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）について試験を行った。
グラム染色  フェイバーＧ「ニッスイ」（日水製薬）
顕微鏡      光学顕微鏡  ＢＸ５０Ｆ４（オリンパス）
【００２５】
３．細菌第二段階試験
細菌第二段階試験には次のキットを用いた。
ＡＰ１５０ＣＨＬ(bioMerieux, Lyon, France)
また、英国ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ.(http://www.ncimb.co.uk/)との技術提携事項及び分類・同定の関連文献に従い、追加試験を実施した。
【００２６】
細菌第一段階試験結果（＋：陽性、−：陰性）
細胞形態：桿菌（0.8-0.9×1.5-2.0  μｍ）
グラム染色性  ＋
胞子の有無  −
運動性  −
【００２７】
コロニー形態
直径：1.0-2.0ｍｍ
色調：乳白色
形：円形
隆起状態：レンズ状
周縁：全縁
表面の形状など：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：バター様
【００２８】
生育温度試験
３０℃  ＋
４５℃  −
カタラーゼ反応  −
オキシダーゼ反応  −
グルコースからの酸産生  ＋
グルコースからのガス産生  −
Ｏ／Ｆテスト（酸化／発酵）ＮＴ
【００２９】
細菌第二段階試験結果（＋：陽性、−：陰性）
コントロール  −
グリセロール  ＋
エリスリトール  −
Ｄ−アラビノース  −
Ｌ−アラビノース  ＋
リボース  ＋
Ｄ−キシロース  ＋
Ｌ−キシロース  −
アドニトール  −
β−メチル−Ｄ−キシロキシド  −
ガラクトース  ＋
【００３０】
グルコース  ＋
フラクトース  ＋
マンノース  ＋
ソルボース  −
ラムノース  −
ズルシトール  −
イノシトール  −
マンニトール  ＋
ソルビトール  ＋
α−メチル−Ｄ−マンノシド  −
【００３１】
α−メチル−Ｄ−グルコシド  ＋
Ｎ−アセチルグルコサミン  ＋
アミグダリン  ＋
アルブチン  ＋
エスクリン  ＋
サリシン  ＋
セロビオース  ＋
マルトース  ＋
ラクトース  ＋
メリビオース  ＋
【００３２】
スクロース  ＋
トレハロース  ＋
イヌリン  −
メレチトース  ＋
ラフィノース  ＋
でんぷん  −
グリコーゲン  −
キシリトール  −
ゲンチオビオース  ＋
Ｄ−ツラノース  ＋
【００３３】
Ｄ−リキソース  −
Ｄ−タガトース  −
Ｄ−フコース  −
Ｌ−フコース  −
Ｄ−アラビトール  −
Ｌ−アラビトール  −
グルコネート −
２−ケトグルコネート  −
５−ケトグルコネート  −
【００３４】
追加試験結果
【００３５】
１５℃での生育  ＋ｗ（陽性、生育弱い）
アルギニンジヒドロラーゼ  −
（−：陰性）
【００３６】
16SrDNAの塩基配列に基づく相同性
LS-26株の16SrDNAの塩基配列を決定し、DNAデータベース（アポロンDB-BA9.0（テクノスルガ・ラボ））にて相同性検索を行った結果、Lactobacillus pentosusJCM1558株に対し99.8％の相同性を示した。
【００３７】
・分類／同定
LS-26株の16SrDNAの塩基配列解析の結果から、LS-26株はLactobacillus pentosusに帰属すると示唆された。
また、上記細菌第一段階試験の結果、LS-26株は運動性を有さないグラム陽性桿菌で、グルコースを酸化し、カタラーゼ反応及びオキシダーゼ反応は共に陰性を示した。これらの性状は、Lactobacillus属の一般性状と一致する。
更に、上記細菌第二段階試験の結果、LS-26株はグリセロール、Ｌ−アラビノース及びリボースなどを発酵し、Ｌ−キシロースやアドニトールなどを発酵しなかった。また、追加試験の結果、LS-26株は、１５℃で弱いながら生育し、アルギニンジヒドロラーゼ活性を示さなかった。これらの性状はLactobacillus pentosusの性状とほぼ一致した［ZANORI(P.), FARROW(J.A.E.), PHILLIPS(B.A.) and COLLINS (M.D.): Lactobacillus pentosus(Fred, Peterson, and Anderson) sp. Nov., nom. Rev. Int.J.Syst.Bacteriol., 1987,37,339-341 ］。
以上の結果から、LS-26株はLactobacillus pentosusであることが示された。
【００３８】
胃酸耐性試験
凍結保存されたグリセロールストック菌液0.5 mL を改変MRS 液体培地4.5 mL に植菌した。植菌後の培地について37 ℃恒温、好気条件下、24 時間静置培養を行なった。胃酸耐性試験液組成を下記 に示す。内容積50 mL 遠心管に該試験液を加え、6 N 塩酸を添加することによりpH 2 に調製した。pH 調製後、37 ℃恒温下、3時間放置することにより胃酸耐性試験を行なった。放置後の試料について15 ℃恒温下、 2290×g の条件にて20 分間遠心分離を行なうことにより、菌体を集菌した。上清を捨て、遠心管に改変MRS 液体培地10 mL を加え、菌体を再浮遊させた。得られた菌液を集菌と同条件にて遠心分離を行なうことにより菌体の洗浄を行なった。洗浄後の菌液50 μL10をBCP 加プレートカウント寒天培地に植菌後、37 ℃恒温下、2 日間静置培養を行なった。培養後、コロニーを形成した菌株について、pH 1 の条件でも同様にして耐性試験を行なった。
【００３９】
胃酸耐性試験液組成
前培養液   5 mL
改変MRS 液体培地  4 mL
0.4 %ペプシン（終濃度0.04 %） 1 mL
全容  10 mL
【００４０】
腸液耐性試験
pH 1 条件での胃酸耐性試験後の培養にてコロニーを形成した菌株について腸液耐性試験を行なった。腸液耐性試験液組成を下記に示す。この試験液に37 ℃恒温下、24 時間放置することにより、腸液耐性試験を行なった。放置後の試料について15 ℃恒温下、2290×g の条件にて20 分間遠心分離を行なうことにより、菌体を集菌した。上清を捨て、遠心管に改変MRS 液体培地10 mL を加え、菌体を再浮遊させた。得られた菌液を集菌と同条件にて遠心分離を行なうことにより菌体の洗浄を行なった。
洗浄後の菌液50 μL をBCP 加プレートカウント寒天培地に植菌後、37 ℃恒温下、2 日間静置培養を行なった。
【００４１】
腸液耐性試験液組成
胃酸耐性試験液（pH 1）0.3 mL
改変MRS液体培地  8.1 mL
2.5 %パンクレアチン  1 mL（終濃度0.25 %）
5 %胆汁末水溶液   0.6 mL(終濃度0.3 %)
全容10 mL
【００４２】
LS-26の胃酸、腸液耐性試験の結果
胃酸耐性試験 ｐＨ２  コロニー数1
胃酸耐性試験  ｐＨ１コロニー数多数でシャーレ全体でのコロニー形成（100 cfu/mL 以上）、
腸液耐性試験  コロニー数多数でシャーレ全体でのコロニー形成（100 cfu/mL 以上）
以上の結果から、LS-26 株は胃液通過後も腸内での生育が可能であることがわかる。
【００４３】
実施例２
チーズ様食品の製造
LS-26株を豆乳中で培養しチーズ様食品を製造した。
【００４４】
試薬および器具
グルコースはシグマアルドリッチジャパン株式会社製 試薬特級を用いた。りん酸二水素ナトリウム二水和物、硫酸マグネシウム七水和物、硫酸マンガン(II)五水和物、酢酸ナトリウムは和光純薬株式会社製 試薬特級を用いた。ポリペプトン、粉末酵母エキスD-3 は日本製薬株式会社製のものを用いた。BBLTM Extract Powder はベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー（Becton・Dickinsonand Company） 製のものを用いた。Tween 80 は東京化成工業株式会社製のものを用いた。
BCP 加プレートカウント寒天培地‘栄研’は栄研化学株式会社製のものを用いた。恒温培養器は三洋電機株式会社製M1R260 を用いた。乾熱滅菌機はヤマト科学株式会社製DS64 を用いた。クリーンベンチは島津製作所株式会社製SHV-750P を用いた。コンパクトpH メータは株式会社堀場製作所製B-712 を用いた。
【００４５】
培養に使用した豆乳は無調整豆乳（販売者；株式会社シジシージャパン）を用いた。 
【００４６】
方法
豆乳中のpH と生菌数の経時変化
凍結保存されたグリセロールストック菌液0.5 mL を改変MRS 液体培地4.5 mL に植菌を行なった。植菌後の培地について37 ℃恒温下、24 時間静置培養を行なった（前培養）。三角フラスコに豆乳39.5 mL、50 %グルコース溶液10 mL から成る培養基に前培養液0.5 mL を植菌後、混和を行なった。この試料について40 ℃恒温下、15 時間静置培養を行なった。培養後、4 ℃恒温条件にて２４時間放置した。
LS-26 株は40 ℃恒温下、15 時間の培養期間で初期生菌数2.2×107cfu / mL から1.0×109cfu / mL に増加後、4 ℃恒温下、24 時間の培養期間では6.8×108 cfu / mL まで低下した。その後、チーズ様食品豆乳発酵物を4 ℃恒温下、一夜自然濾過することにより、豆乳発酵物からホエーを排出させた。ろ紙上の発酵物を豆乳チーズとした。得られた豆乳チーズについて食味評価を行なった。比較対象として市販のフレッシュチーズ（森永乳業株式会社製 クラフト フィラデルフィアクリームチーズ）を用いた。
食味評価の結果、LS-26 株を用いて調製した豆乳チーズは、市販のフレッシュチーズと比較し、さっぱりとしており、脂っこさが感じられなかった。食感はとてもやわらかで硬さは豆乳チーズの方がやや柔らかだった。また、豆乳特有の不快臭はなく、レモン様の風味を有していた。