(57)【要約】【課題】新規な自閉症スペクトラムの検査方法を提供すること。【解決手段】BST-1遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型及び該塩基と連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型が自閉症スペクトル障害と関連性を有することを見出し、本発明を完成した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から取得したサンプル中のBST-1遺伝子上に存在する塩基の一塩基多型又は連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型を検出することを特徴とする自閉症スペクトラムの検査方法。
【請求項２】
前記塩基の一塩基多型は、rs4301112、 rs28532698及びrs10001565からいずれか１以上であり、並びに、前記連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型は、rs11931532、rs12645693、rs4698412、rs4538475、rs11724635、rs12502586及びrs4273468からいずれか１以上であることを特徴とする請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記塩基の一塩基多型及び前記連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型がメジャーかマイナーであるかを判定することを特徴とする請求項１又は２に記載の検査方法
【請求項４】
以下のいずれか１以上のプローブを含むことを特徴とする自閉症スペクトラムの検査キット。
（１）rs4301112のマイナー型認識プローブ
（２）rs28532698のマイナー型認識プローブ
（３）rs10001565のマイナー型認識プローブ
（４）rs11931532のマイナー型認識プローブ
（５）rs12645693のマイナー型認識プローブ
（６）rs4698412のマイナー型認識プローブ
（７）rs4538475のマイナー型認識プローブ
（８）rs11724635のマイナー型認識プローブ
（９）rs12502586のマイナー型認識プローブ
（１０）rs4273468のマイナー型認識プローブ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自閉症スペクトラムの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（自閉症スペクトラム）
自閉症スペクトラムとは、自閉性障害、アスペルガー障害、レット症候群、小児崩壊性障害、特定不能の広汎性発達障害等の各疾患を広汎性発達障害の連続体の1要素として捉えたものである。該スペクトラムの主な特徴（障害）は、対人相互反応の質的な障害、意思伝達の著しい異常又はその発達の障害、活動と興味の範囲の著しい限局性等が挙げられる。
【０００３】
本発明者らは、以前、自閉症スペクトラム障害（ASD）の動物モデルとして、ADPリボシル環状化酵素活性をもつ膜タンパク分子CD38の遺伝子を欠損するマウスについて報告した（参照、非特許文献１）。このCD38欠損マウスでは社会性行動の障害、たとえば社会性記憶の低下、育児放棄様行動が観察される。本発明者らは、このような行動異常の生じる機序として、CD38遺伝子欠損による環状ADPリボース産生低下がカルシウム誘発性カルシウム放出を障害し、社会認識に必要な脳下垂体後葉ホルモンであるオキシトシンの分泌が低下させることを示す実験データを得た（参照、非特許文献１）。これ以降、ヒトCD38遺伝子の一塩基多型（single-nucleotide polymorphism: SNP）とASDの関連性を示す報告がなされた（参照、非特許文献２、非特許文献３）。ヒトCD38遺伝子のSNPであるrs3796863 (C > A)は、自閉症遺伝資源交換（Autism Genetic Resource Exchange: AGRE）に由来する高機能自閉症者のサンプル、イスラエルの低機能自閉症者のサンプルにおいて有意な相関を示したが、日本の高機能自閉症者のサンプルでは相関は認められなかった（参照、非特許文献２）。別のSNP rs1800561 (g.4693C > T; p.R140W)が29名のASD者のうち3名の発端者で見つかり、さらに3家系の10名のASD者、ASD傾向者で認められた（参照、非特許文献２）。このR140W型多型変化をもつASD者では、多数型R140をホモ（同型接合）として持つASD者よりも血漿中のオキシトシン濃度が低かった（参照、非特許文献２）。
【０００４】
（BST-1）
CD157分子は骨髄ストローマ細胞抗原１（bone marrow stromal antigen-1：BST-1）とも呼ばれ、NAD分解酵素/ ADPリボース環化酵素ファミリーに属する（参照、非特許文献４−１２）。この分子ファミリーにはCD38分子も含まれている。CD157とCD38はアミノ酸配列の上で36％の類似性をもっており、ともにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(nicotinamide adenine dinucleotide: NAD)を代謝する細胞外酵素（ectoenzyme）としての働きを持つ。また生体情報のシグナル伝達分子として働き、ヒト顆粒白血球の偏向、遊走および血管外遊出をもたらすことも知られている。CD157/BST-1は当初、プレBリンパ球の成長を促進する細胞膜表面分子としてcDNAが単離されたが（参照、非特許文献７、１３）、液性免疫反応、好中球の組織浸潤、造血幹細胞サポートなどの様々な役割を担っている（参照、非特許文献７、９、１４−１６）。また、CD157/BST-1はリウマチ様関節炎でのBリンパ球の生存、白血病の進展やヒト卵巣がんの転移を含む様々な病態の形成に関与している（参照、非特許文献７、１２、１７−１９）。
【０００５】
最近の遺伝学研究によって、ヒト染色体4p15領域に存在するCD157/BST-1がパーキンソン病の疾患感受性マーカーとして同定された（参照、非特許文献２０−２９）。  
加えて、最近、本発明者らは、CD157/BST-1が欠失したマウスが不安様行動及びうつ様行動をとることを示した（参照：非特許文献３０）。
しかし、これらの文献では、「本発明で特定したCD157/BST-1上の３種類の一塩基多型が、自閉症スペクトル障害と関連性を持つこと」について開示又は示唆をしていない。
【０００６】
さらに、以下の先行特許文献が存在する。
特許文献１では、「オキシトシン受容体遺伝子上のrs35062132をメジャーかマイナーであるかを判定することを特徴とする自閉症スペクトラムの検査方法」を開示している。
特許文献２では、「JARID2核酸分子における遺伝子変異の有無を識別することを含む、対象における自閉症若しくは自閉症スペクトラム障害に対する遺伝的素因、又はそれらの存在を確認する方法」を開示している。
しかし、これらの特許文献では、「本発明で特定したCD157/BST-1上の３種類の一塩基多型が、自閉症スペクトル障害と関連性を持つこと」について開示又は示唆をしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2014-171392号公報
【特許文献１】特表2013-538589号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Nature 2007, 446 (7131), 41-5.
【非特許文献２】Neurosci Res 2010, 67 (2), 181-91.
【非特許文献３】Autism Res 2010, 3 (6), 293-302).
【非特許文献４】FEBS letters 1994, 356 (2-3), 244-8.
【非特許文献５】Biochemical and biophysical research communications 1994, 203 (2), 1309-17.
【非特許文献６】Immunogenetics 1999, 49 (7-8), 597-604.
【非特許文献７】Chemical immunology 2000, 75, 235-55.
【非特許文献８】The FEBS journal 2005, 272 (18), 4590-7.
【非特許文献９】Molecular medicine (Cambridge, Mass.) 2006, 12 (11-12), 334-41.
【非特許文献１０】Physiological reviews 2008, 88 (3), 841-86.
【非特許文献１１】The Journal of biological chemistry 2012, 287 (38), 31633-40.
【非特許文献１２】Cytometry. Part B, Clinical cytometry 2013, 84 (4), 207-17.
【非特許文献１３】Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1994, 91 (12), 5325-9.
【非特許文献１４】Blood 2004, 104 (13), 4269-78.
【非特許文献１５】The Journal of biological chemistry 2005, 280 (7), 5343-9.
【非特許文献１６】Critical reviews in biochemistry and molecular biology 2013, 48 (4), 397-408.
【非特許文献１７】The Journal of clinical investigation 1998, 102 (3), 606-18.
【非特許文献１８】J Natl Cancer Inst 2010, 102 (15), 1160-77.
【非特許文献１９】Frontiers in bioscience 2014, 19, 366-78.
【非特許文献２０】Nature genetics 2009, 41 (12), 1303-7.
【非特許文献２１】Lancet 2011, 377 (9766), 641-9.
【非特許文献２２】BMC Med Genet 2011, 12, 104.
【非特許文献２３】Human molecular genetics 2011, 20 (3), 615-27.
【非特許文献２４】Eur J Hum Genet 2011, 19 (6), 655-61.
【非特許文献２５】Curr Opin Neurol 2011, 24 (4), 318-23.
【非特許文献２６】PLoS genetics 2012, 8 (3), e1002548.
【非特許文献２７】Neurology 2012, 79 (7), 659-67.
【非特許文献２８】Parkinsonism & related disorders 2012, 18 (8), 958-63.
【非特許文献２９】Nature genetics 2014, 46, 989-993.
【非特許文献３０】Frontiers in behavioral neuroscience 2014, 8, 133.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規な自閉症スペクトラムの検査方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、CD157/BST-1上に存在する塩基の一塩基多型及び連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型が自閉症スペクトル障害と関連性を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明は以下からなる。
「１．被験者から取得したサンプル中のCD157/BST-1上に存在する塩基の一塩基多型又は連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型を検出することを特徴とする自閉症スペクトラムの検査方法。
２．前記塩基の一塩基多型は、rs4301112、rs28532698及び rs10001565からいずれか１以上であり、並びに、前記連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型は、rs11931532、rs12645693、rs4698412、 rs4538475、rs11724635及びrs4273468からいずれか１以上であることを特徴とする前項１に記載の検査方法。
３．前記塩基の一塩基多型及び前記連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型がメジャーかマイナーであるかを判定することを特徴とする前項１又は２に記載の検査方法。
４．以下のいずれか１以上のプローブを含むことを特徴とする自閉症スペクトラムの検査キット。
（１）rs4301112のマイナー型認識プローブ
（２）rs28532698のマイナー型認識プローブ
（３）rs10001565のマイナー型認識プローブ
（４）rs11931532のマイナー型認識プローブ
（５）rs12645693のマイナー型認識プローブ
（６）rs4698412のマイナー型認識プローブ
（７）rs4538475のマイナー型認識プローブ
（８）rs11724635のマイナー型認識プローブ
（９）rs12502586のマイナー型認識プローブ
（１０）rs4273468のマイナー型認識プローブ」
【発明の効果】
【００１２】
本発明の検査方法で使用するCD157/BST-1上に存在する塩基の一塩基多型及び連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型は、統計学的に有意に高い頻度で自閉症患者群に存在することを確認しているので、自閉症スペクトラムの検査方法に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１で解析した一塩基多型のリスト。
【図２】ヒトCD157/BST-1の構造とSNPの位置｛ジーンバンク(GenBank) accession numbers NM_004334とNC_000004のデータに基づいてエクソン・イントロン構造が図示してある。黒及び白の四角（ボックス）は、それぞれ、翻訳領域（タンパク・コーディング領域）及び非翻訳領域を意味する。アスタリスクは以前よりパーキンソン病関連マーカーとして報告されているSNPを意味する｝。
【図３】CD157/BST-1の連鎖不平衡プロット｛四角の内部の数値はD′値を意味する。アスタリスクは以前よりパーキンソン病関連マーカーとして報告されているSNPを意味する｝。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、被験者由来のCD157/BST-1上に存在する塩基の一塩基多型（以後、「SNP」と称する場合がある）及び連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型を検出することによる、自閉症スペクトラムの検査方法（以後、「本発明の検査方法」と称する場合がある）を提供する。
【００１５】
（自閉症スペクトラムの検査方法）
本発明の自閉症スペクトラムの検査方法は、CD157/BST-1上の一塩基多型を検出することを特徴とする。より詳しくは、該一塩基多型がメジャーであるかマイナーであるかを判定することを特徴とする。
一塩基多型とは、遺伝子多型（genetic polymorphisms）に含まれるものであり、個体間における一塩基の違いを意味する。遺伝子多型とは、遺伝子を構成しているDNAの配列の個体差である。本明細書において、SNPsを表す番号であるrs番号は、NCBIのSNPデータベースdbSNPに掲載されているヒトの遺伝子情報を参酌したものである。
【００１６】
本発明の自閉症スペクトラムの検査方法において、自閉症スペクトラム患者である又は疑わしい（自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有する）と判定する指標は、対立遺伝子型（以下アレル、単に「遺伝子型」とも称する場合もある）を確認することにより行われる。下記実施例１の結果より、アレルの違いにより、自閉症スペクトラム患者である、自閉症スペクトラム患者であると疑わしい（自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有する）、又は自閉症スペクトラム患者ではないと判定できる。
【００１７】
（CD157/BST-1上の一塩基多型）
rs4301112における遺伝子型が、下記実施例１の結果より、Ａ/Ａ（アデニンとアデニンのホモ接合型）である場合をメジャーとし、Ａ/Ｇ（アデニンとグアニンのヘテロ接合型）及びＧ/Ｇ（グアニンとグアニンのホモ接合型）である場合をマイナーと定義する。rs4301112遺伝子型がマイナー（特に、アデニンとグアニンのヘテロ接合型）である場合は、自閉症スペクトラム患者である、自閉症スペクトラム患者である可能性が高い又は自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有すると判定する。
rs28532698における遺伝子型が、下記実施例１の結果より、Ａ/Ａ（アデニンとアデニンのホモ接合型）である場合をメジャーとし、Ａ/Ｇ（アデニンとグアニンのヘテロ接合型）及びＧ/Ｇ（グアニンとグアニンのホモ接合型）である場合をマイナーと定義するrs28532698遺伝子型がマイナー（特に、アデニンとグアニンのヘテロ接合型）である場合は、自閉症スペクトラム患者である、自閉症スペクトラム患者である可能性が高い又は自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有すると判定する。
rs10001565における遺伝子型が、下記実施例１の結果より、Ｃ/Ｃ（シトシンとシトシンのホモ接合型）である場合をメジャーとし、Ｃ/Ｔ（シトシンとチミンのヘテロ接合型）及びＴ/Ｔ（チミンとチミンのホモ接合型）である場合をマイナーと定義する。rs10001565遺伝子型がマイナー（特に、シトシンとチミンのヘテロ接合型）である場合は、自閉症スペクトラム患者である、自閉症スペクトラム患者である可能性が高い又は自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有すると判定する。
【００１８】
（連鎖不平衡にある一塩基多型）
生物集団において２つの密に連鎖した遺伝子座における特定のアレルの組み合わせ出現頻度が、それぞれのアレル頻度から推定される期待値と異なる場合を連鎖不平衡という。
下記実施例１の結果より、上記で記載した３つの一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型は、以下を例示することができる（参照：図３）。下記の連鎖不平衡にある一塩基多型のいずれか１以上を有する場合には、自閉症スペクトラム患者である、自閉症スペクトラム患者である可能性が高い又は自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有すると判定する。
rs11931532：マイナー型の場合には、自閉症スペクトラム患者のリスクアレルと判断する。
rs12645693：マイナー型の場合には、自閉症スペクトラム患者のリスクアレルと判断する。
rs4698412：マイナー型の場合には、自閉症スペクトラム患者のリスクアレルと判断する。
rs4538475：マイナー型の場合には、自閉症スペクトラム患者のリスクアレルと判断する。
rs11724635：マイナー型の場合には、自閉症スペクトラム患者のリスクアレルと判断する。
rs12502586：マイナー型の場合には、自閉症スペクトラム患者のリスクアレルと判断する。
rs4273468：マイナー型の場合には、自閉症スペクトラム患者のリスクアレルと判断する。
【００１９】
（本発明の検査工程）
本発明の自閉症スペクトラムの検査方法の検査工程の例は、以下の通りである。
（１）被検者から取得したサンプルにおいて、CD157/BST-1上に存在する塩基の一塩基多型及び連鎖不均衡にある塩基の一塩基多型について遺伝子型を決定する工程
（２）該遺伝子型がマイナーである場合には、自閉症スペクトラム患者である、自閉症スペクトラム患者である可能性が高い又は自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有すると判定する工程
【００２０】
（検査対象）
本発明の検査方法は、黄色人種、好適には東アジア人種、特に好適には日本人に有効であることが期待される。
【００２１】
（被験者）
本発明の検査方法の被験者とは、自閉症スペクトラムの症状を有する、自閉症スペクトラムの症状を有すると疑われる、又は自閉症スペクトルに対する遺伝子的素因を有する可能性が高い個体をいい、ヒト以外にもチンパンジー等を含むものであるが、ヒトが最も好ましい。上記において、被検者から取得したサンプルとは、被検者由来であれば特に限定されないが、例えば血液、リンパ液、精液、尿、唾液（含：口内粘膜細胞）、その他の体液、及び生体組織等が挙げられ、特に血液（リンパ球）等が採取などの取り扱いが容易で、侵襲性が低いという点で最も好ましい。被検者からサンプルを取得する方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。
【００２２】
（サンプルの処理方法）
上記被検者から取得したサンプルは、各一塩基多型を検出するために、予め処理することができる。サンプルからのDNA又はmRNAの抽出方法は、特に限定されず、自体公知の方法によることができる。例えばDNAを抽出する場合は、塩析、PCI（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出）法、市販のDNA抽出キット等を用いる方法、その他公知の方法によることができる。例えばmRNAを抽出する場合は、PCI法において溶液を酸性にして水層から抽出する方法、オリゴdTカラム等を利用する方法、市販のRNA抽出キットを用いる方法、その他の公知の方法によることができる。
【００２３】
サンプルから得られたDNA又はmRNA等のポリヌクレオチドの量が少ない場合には、必要に応じて、公知の方法によってこれらを増幅することができる。ポリヌクレオチドの増幅方法は、特に限定されず自体公知の方法を採用することができ、増幅の対象がDNAの場合は、例えばPCR（polymerase chain reaction）法やLAMP（loop-mediated isothermal amplification）法を利用することができ、増幅の標的となる対象がmRNAの場合には、RT (reverse transcription)-PCR法やRT-LAMP法等を利用することができる。
【００２４】
上記サンプルから得られたDNA又はmRNAから、一塩基多型を含む領域を増幅することができる。増幅されたヌクレオチド断片は、後述するアレル型を決定する方法に応じて、測定可能なサイズのものであればよい。測定可能なサイズのヌクレオチド断片は、例えば約100 bp以上、好ましくは約200 bp以上、より好ましくは約400 bp以上の長さを有し得る。
【００２５】
（本発明の検査方法に使用するプライマー）
上記各一塩基多型を含む領域を増幅するためのプライマーは、上記各一塩基多型を含む領域のポリヌクレオチドの、アンチセンス鎖及びセンス鎖の3'末端と、それぞれ特異的にハイブリダイズする、フォワード（センス）プライマーとリバース（アンチセンス）プライマーが含まれる。これらのプライマーは、上記各一塩基多型を含む領域の塩基配列に合わせて、適宜デザインすることができる。
【００２６】
プライマーのサイズは、一塩基多型を含む領域を増幅可能な限り特に限定されないが、好ましくは約15〜100 bp、より好ましくは約18〜50 bpであり得る。また、該プライマーは、標識物質により標識されたものであっても良い。標識物質としては、蛍光分子、放射性物質、ビオチン、ジゴキシゲニン、酵素標識等が挙げられる。ポリヌクレオチドへの標識物の結合は、自体公知の方法に従って行うことができる。
【００２７】
本発明における具体的なプライマー及びプローブとしては、以下に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００２８】
（rs4301112）
rs4301112を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-GAATTCACTGAAGTTCTCCTAAACACTTTCAATGGGACC-3'（配列番号１）
rs4301112を含む領域増幅用リバースプライマー: 
5'-TCAGAGCCATGTCTATAGAGTTAAACCATTAACAGCTGAT-3'（配列番号２）
G型マイナー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTTCTTAAAAAAAAATAAAGAGCTTTTTGAG-3'（配列番号１９）
A型メジャー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATTCTTAAAAAAAAATAAAGAGCTTTTTGAA-3'（配列番号２０）
共通プローブ:
5'-GTTTTTCTTCTTTAGCTTTTATTTTTAGGTTACTTTTTACCGTCGCTAATAATCGGATATGG-3'（配列番号２１）
【００２９】
（rs28532698）
rs28532698を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-TATGGGCAATAAAGAAATGGGAGCTTCCTCATTTCTTTAC-3'（配列番号３）
rs28532698を含む領域増幅用リバースプライマー: 
5'-TACCACTTGGTGAGCAGCTATGGGCCAGACACTTTAT-3'（配列番号４）
G型マイナー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTCATGGTTTGTATATTTTTCTGAACG-3'（配列番号２２）
A型メジャー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATCATGGTTTGTATATTTTTCTGAACA-3'（配列番号２３）
共通プローブ:
5'-TAGATTATATTTCCAGAAAAGGACATTTGCCTTGTTTCTAGCAATCTTTAACCCAGACGG-3'（配列番号２４）
【００３０】
（rs10001565）
rs10001565を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-TATGGGCAATAAAGAAATGGGAGCTTCCTCATTTCTTTAC-3'（配列番号５）
rs10001565を含む領域増幅用リバースプライマー：
5'-TACCACTTGGTGAGCAGCTATGGGCCAGACACTTTAT-3'（配列番号６）
T型マイナー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATTGGGCTGAGTTATAATTGCT-3'（配列番号２５）
C型メジャー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTGGGCTGAGTTATAATTGCC-3'（配列番号２６）
共通プローブ:
5'-GGGCCAGAGCCCAGGTCTCCGCAGAGTGAGTTTCATTTAGGCG-3'（配列番号２７）
【００３１】
（rs11931532）
rs11931532を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-TGGAGTTTCACACTTGTTGACTGGGCTGGAGTGCA-3'（配列番号７）
rs11931532を含む領域増幅用リバースプライマー：
5'-GTGTGTATTTTAAATTTTGATATGTTCTGAGAAATTTTGATATGT-3'（配列番号８）
A型マイナー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATTGGGCTGAGTTATAATTGCT-3'（配列番号２８）
G型メジャー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTGGGCTGAGTTATAATTGCC-3'（配列番号２９）
共通プローブ:
5'-CTGTCATCAGGTTGTGTACAAAGTCCTTGGGCCTCAACTTATTGTCATTGGCG-3'（配列番号３０）
【００３２】
（rs12645693）
rs12645693を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-ACAGCTGTTCTTATATGCTACATTCTCTAAAATATTGCCAATA-3'（配列番号９）
rs12645693を含む領域増幅用リバースプライマー：
5'-TCTGGAGTCATCATCTCATTTTACTCCAACCACATTCC-3'（配列番号１０）
G型マイナー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATGGGTACACTTACTGGTGGG-3'（配列番号３１）
A型メジャー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTGGGTACACTTACTGGTGGA-3'（配列番号３２）
共通プローブ:
5'-AGTAGAATATAGCCCTTAAAGACAATGGTAGGTGCGTTATAATCTATTCCCGGGC-3'（配列番号３３）
【００３３】
（rs11724635）
rs11724635を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-CTTTTCTCTTTCTCTAAGTACCCAAAAGTCTTATGCTGCT-3'（配列番号１１）
rs11724635を含む領域増幅用リバースプライマー：
5'-CAAAAAACAGTAGACATCACTTCTCTGGGACAGCTG-3'（配列番号１２）
T型マイナー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTAYGSCACACCTTGTTATAAAT-3'（配列番号３４）
G型メジャー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATAYGSCACACCTTGTTATAAAG-3'（配列番号３５）
共通プローブ:
5'-CTTCCCTTGTACCCTCCCTGGCCGTCCGTAAGAAGCTTTTGGGAC-3'（配列番号３６）
【００３４】
（rs4698412）
rs4698412を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-ACTTCTCTGGGACAGCTGGGCTGGTTTCAGTCGGA-3'（配列番号１３）
rs4698412を含む領域増幅用リバースプライマー：
5'-ATTCGGGAAAAAAGTGAAGTTATGTTTAGTTTTTAAAAA-3'（配列番号１４）
A型マイナー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTCCAGCCAAGGCGCA-3'（配列番号３７）
G型メジャー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATCAGCCAAGGCGCG-3'（配列番号３８）
共通プローブ:
5'-TCTCTTAGACCAAGCTTGGAAAACACAGTGTCTGCAGTGATGTCGTTGGTAGAATA-3'（配列番号３９）
【００３５】
（rs4273468）
rs4273468を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-ATAAAAACAAATGGATCTGGAACTAAGTAAGGCTTCGAGG-3'（配列番号１５）
rs4273468を含む領域増幅用リバースプライマー：
5'-TATCATTGCCTCCTGACTGATCTCTCTGCTTCTGCTT-3'（配列番号１６）
C型マイナー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATCACTCAGGACCCAAGC-3'（配列番号４０）
T型メジャー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTCACTCAGGACCCAAGT-3'（配列番号４１）
共通プローブ:
5'-GTAGGACATTGCTCTGGCAGCATTGTCCGTCGCTAATAATCGGATATGG-3'（配列番号４２）
【００３６】
（rs4538475）
rs4538475を含む領域増幅用フォワードプライマー：
5'-ATAAAAACAAATGGATCTGGAACTAAGTAAGGCTTCGAGG-3'（配列番号１７）
rs4538475を含む領域増幅用リバースプライマー：
5'-TGATCTCTCTGCTTCTGCTTGGTTTCTCCTTCAGC-3'（配列番号１８）
T型マイナー型認識プローブ: 
5'-CCGTGTCCACTCTAGAAAAACCTTCTTGAAGAGCAGATTTTAATATT-3'（配列番号４３）
C型メジャー型認識プローブ: 
5'-ACCACCGCTTGAATACAAAACATCTTGAAGAGCAGATTTTAATATC-3'（配列番号４４）
共通プローブ:
5'-TGAAATTTGTCTTGCCAAGGGTAGGAAACCACGCGGATTTACATTTAACCAGCC-3'（配列番号４５）
【００３７】
（自閉症スペクトラムの検査キット）
本発明の自閉症スペクトラムの検査キットは、以下のいずれか１以上の一塩基多型のマイナー型認識プローブを含む。具体的な配列は、上記に記載された配列であるが、特に限定されない。さらに、必要に応じて、メジャー型認識プローブ、共通プローブ、一塩基多型を含む領域増幅用フォワードプライマー、及び／又は、一塩基多型を含む領域増幅用リバースプライマーを含んでも良い。
（１）rs4301112のマイナー型認識プローブ
（２）rs28532698のマイナー型認識プローブ
（３）rs10001565のマイナー型認識プローブ
（４）rs11931532のマイナー型認識プローブ
（５）rs12645693のマイナー型認識プローブ
（６）rs4698412のマイナー型認識プローブ
（７）rs4538475のマイナー型認識プローブ
（８）rs11724635のマイナー型認識プローブ
（９）rs12502586のマイナー型認識プローブ
（１０）rs4273468のマイナー型認識プローブ
【００３８】
本発明の検査方法は、サンプルから得られたDNA又はmRNA等のポリヌクレオチド、又は上記増幅により得られたポリヌクレオチド断片により、一塩基多型のタイプを決定する工程を含む。一塩基多型のタイプを決定する方法は、自体公知の方法を用いることができ、例えば、シークエンサー等を用いて直接塩基配列を決定するdirect sequence法（ジデオキシ法）の他、RELP（制限酵素断片長多型性）を利用するPCR-RELP法、TaqMan法、DigiTag2法、シングルヌクレオチドプライマー伸長法、SnaPshot法（ABI）、ASP-PCR法、PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）法、PCR-SSP（sequence specific primer）法、PCR-SSCP（single-stranded conformational polymorphism analysis）法、電気泳動等による核酸の長さの確認、及びDNAチップ等の遺伝子多型検査用器具等を用いる方法等が挙げられる。
【００３９】
以下に示す実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。すべての本実施例は、金沢大学医学部の倫理委員会によって承認されており、ヘルシンキ宣言に従っており、かつ参加者に対するインフォームドコンセントの後に行われた。
【実施例１】
【００４０】
本実施例では、CD157/BST-1上のタンパク質コード領域の塩基置換が自閉症リスクに関与しているかを確認した。詳細は以下の通りである。
【００４１】
（参加者）
金沢大学病院の外来精神科で147名(男性113名、女性 34 名、年齢15.6±0.6歳)の自閉症スペクトラム障害の被験者を募集した。すべての自閉症スペクラム障害の被験者は、広汎性発達障害のDSM-IV基準を満たしていた。診断は、インタビュー及びカルテレビューを基にして２人の経験豊富な児童精神科医によって行った。被験者には明らかな身体的奇形は見られなかった。２人の経験豊富な児童精神科医は、独立して、被験者とその両親との半構造的行動観察及び面接によって大多数の患者を自閉症スペクトラム障害であると診断した。該両親とのインタビューは、自閉症特有行動及び症状の評価に利用した。該児童精神科医は、アスペルガー症候群診断インタビュー（Asperger Syndrome Diagnostic Interview：Autism 2001, 5:57-66.）、改定自閉症診断インタビュー（Autism Diagnostic Interview-Revised：J Autism Dev Disord 1994, 24:659-685.）、広汎性発達障害日本自閉症協会評定尺度（Pervasive Developmental Disorders Autism Society Japan Rating Scale：Autism Society Japan; 2006.）及び社会及びコミュニュケーション障害の診断インタビュー（Diagnostic Interview for Social and Communication Disorders：J Child Psychol Psychiat 2002, 43:307-325.）及び東京自閉行動尺度（Tokyo Autistic Behavior Scale）の中からいずれか一つの方法を使用した。150名(男性115 名, 女性35名、年齢23.8±0.3歳)からなる対照群は、互いに親族ではない健常者のボランティアである。すべての患者と対照は、非日本人の両親や祖父母のいない日本人である。
【００４２】
｛ゲノタイピング（遺伝子型の決定）｝
ゲノムDNAを、Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega、マジソン、ウィスコンシン州、米国)を用いて静脈血から、又は、ISOHAIR DNA Extraction kit (ニッポンジーン、東京、日本)を用いて爪から、抽出した。収量の応じて、得られたゲノムDNAを全ゲノム増幅法にて増やした。SNPの検出は、配列特異的プライマー（sequence-specific primer: SSP)-PCR法と蛍光相関分光法との組み合わせによるDigiTag2法 (Nishida et al., Analyt. Biochem. 364: 78-85, 2007)によった。まず、検出対象SNPの周辺領域をPCRによって増幅し、次にアレル特異的プローブ（query probe）2種と、その対象SNPを挟んで反対側の配列に基づく共通プローブ（common probe）をPCR産物上でアニールした後、ライゲーション反応で結合し、さらにAlexa555とAlexa647で2種それぞれを蛍光標識して検出した。研究対象としたSNPは、国際HapMapプロジェクト（International HapMap Project; http://www.hapmap.org)とNational Center for Biotechnology Information (NCBI dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)の情報を利用して選んだ。少数型アレルの頻度(minor allele frequency: MAF)が0.1より大きいSNPを対象に選んだ。
さらに、HaploView 4.2を用いて連鎖不均衡 (Linkage disequilibrium: LD) ブロックを解析した。
【００４３】
（統計分析）
本実施例1の遺伝子型及びアレルの頻度のデータは、分割表及びフィッシャーの直接確率検定（GraphPad Prism 6; GraphPad Software Inc. 、サンジエゴ、カリフォルニア州、米国）を用いて分析し、P値が0.05より小さい場合、統計学的有意差があるとみなした。又、Nyholtの方法 (http://genepi.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD)も用い、独立したSNPの有効数（effective number）を23と見積り、個々のSNP解析のP値が0.002より小さい場合、統計学的有意差があると判断した。
【００４４】
（遺伝子分析結果）
今回調べた121のSNP (参照：図１)のうち、成功率が95%よりも高かった93のSNPをさらに統計学的に解析した。これらのうち、3種類のSNPで対照群に比してASD群で有意に高いアレル頻度が検出された (rs4301112, オッズ比＝6.4, 95%信頼区間=1.9 − 22, P = 0.0007; rs28532698, オッズ比＝6.2, 95%信頼区間=1.8−21, P = 0.0012 及び rs10001565, オッズ比＝5.5, 95%信頼区間=1.6−19, P = 0.0038; フィッシャーの直接確率検定; 参照：下記表１)。rs4301112、rs28532698及びrs10001565 は、それぞれ in 第4、6、7イントロンに位置する (参照：図２)。有効総SNP数を用いて多数検定の較正をすると、有意に高いアレル頻度はrs4301112及びrs28532698で認められた(参照：表１)。rs10001565では、 遺伝子型C/T のみが対照群に比してASD群で有意に高かった(オッズ比＝15, 95%信頼区間= 2.0−117, P = 0.0007; フィッシャーの直接確率検定; 表１)。
解析したSNPにはパーキンソン病との関連性が報告されているものも含まれていた。これらは、rs11931532、rs12645693、 rs4698412、rs4538475、 rs11724635、 rs12502586及びrs4273468 (図２)である。
これらのSNPについて連鎖不均衡 (Linkage disequilibrium: LD) 解析をすると、2つのハプロタイプ・ブロックの存在が明らかになった。一つは5キロベース(kb)に渡るもので、ASDに関連するrs4301112、 rs28532698及びrs10001565を含むものであり (ブロック1; 図３)、もう一つは12 kbに渡るパーキンソン病に関連するSNP群を含むものである(ブロック2; 図３)。
以上により、rs4301112、 rs28532698及びrs10001565の塩基置換は、自閉症リスクに有意に関与していることが結論づけられた。さらに、連鎖不平衡にある一塩基多型であるrs11931532、rs12645693、 rs4698412、rs4538475、 rs11724635、 rs12502586及びrs4273468は、自閉症リスクに関与していると考えられる。
【００４５】
【表１】
2016149988.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００４６】
新規な自閉症スペクトラムの検査方法を提供する。
【図１】
2016149988.tif 000003
【図２】
2016149988.tif 000004
【図３】
2016149988.tif 000005
【配列表】
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