(57)【要約】【課題】  ゴムノキの成木、幼木、又は苗木由来の節、腋芽若しくは頂芽を含む組織から安定的にゴムノキを再生できるゴムノキの再生方法、及び安定的にゴムノキのクローン苗を大量に取得できるゴムノキの増殖方法を提供する。【解決手段】  ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含むことを特徴とするゴムノキの再生方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含むことを特徴とするゴムノキの再生方法。
【請求項２】
更に、誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させる伸長工程を含む請求項１記載のゴムノキの再生方法。
【請求項３】
更に、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含む請求項１又は２記載のゴムノキの再生方法。
【請求項４】
更に、発根工程により発根したシュートを消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる馴化工程を含む請求項３記載のゴムノキの再生方法。
【請求項５】
前記ゴムノキがＨｅｖｅａ属に属する植物である請求項１〜４のいずれかに記載のゴムノキの再生方法。
【請求項６】
前記誘導培地が、活性炭を０．０１〜０．１質量％含む請求項１〜５のいずれかに記載のゴムノキの再生方法。
【請求項７】
前記誘導培地が、硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含む請求項１〜６のいずれかに記載のゴムノキの再生方法。
【請求項８】
前記発根誘導培地が、活性炭を０．０１〜０．１質量％含む請求項３記載のゴムノキの再生方法。
【請求項９】
前記発根誘導培地が、硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含む請求項３又は８記載のゴムノキの再生方法。
【請求項１０】
前記消毒剤が、ヨウ素系消毒剤である請求項４記載のゴムノキの再生方法。
【請求項１１】
前記馴化工程が、消毒剤で処理した発根シュートを栽培用土に移植した後、徐々に自然環境に近づけることで環境に適応させ馴化させる工程である請求項４又は１０記載のゴムノキの再生方法。
【請求項１２】
ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含むことを特徴とするゴムノキの増殖方法。
【請求項１３】
更に、誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させる伸長工程を含む請求項１２記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項１４】
更に、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを採取し、多シュートに分割した後、該分割されたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる増殖工程を含む請求項１２又は１３記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項１５】
更に、増殖工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含む請求項１４記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項１６】
更に、発根工程により発根したシュートを消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる馴化工程を含む請求項１５記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項１７】
前記ゴムノキがＨｅｖｅａ属に属する植物である請求項１２〜１６のいずれかに記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項１８】
前記誘導培地が、活性炭を０．０１〜０．１質量％含む請求項１２〜１７のいずれかに記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項１９】
前記誘導培地が、硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含む請求項１２〜１８のいずれかに記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項２０】
前記発根誘導培地が、活性炭を０．０１〜０．１質量％含む請求項１５記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項２１】
前記発根誘導培地が、硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含む請求項１５又は２０記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項２２】
前記消毒剤が、ヨウ素系消毒剤である請求項１６記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項２３】
前記馴化工程が、消毒剤で処理した発根シュートを栽培用土に移植した後、徐々に自然環境に近づけることで環境に適応させ馴化させる工程である請求項１６又は２２記載のゴムノキの増殖方法。
【請求項２４】
ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させることを特徴とするゴムノキのシュートの誘導方法。
【請求項２５】
ゴムノキのシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させることを特徴とするゴムノキのシュートの伸長方法。
【請求項２６】
ゴムノキのシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させることを特徴とするゴムノキのシュートの発根方法。
【請求項２７】
ゴムノキの幼植物を消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させることを特徴とするゴムノキの幼植物の馴化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゴムノキの再生方法、ゴムノキの増殖方法、シュートの誘導方法、シュートの伸長方法、シュートの発根方法、及び幼植物の馴化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、工業用ゴム製品に用いられている天然ゴム（ポリイソプレノイドの１種）は、トウダイグサ科のパラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）や桑科植物のインドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ ｅｌａｓｔｉｃａ）などのゴム産生植物を栽培し、その植物体が有する乳管細胞で天然ゴムを生合成させ、該天然ゴムを植物から手作業により採取することにより得られる。
【０００３】
現状、工業用天然ゴムは、パラゴムノキをほぼ唯一の採取源としている。またゴム製品の主原料として、様々な用途において幅広くかつ大量に用いられている。しかしながら、パラゴムノキは東南アジアや南米などの限られた地域でのみ生育可能な植物である。更に、パラゴムノキは、植樹からゴムの採取が可能な成木になるまでに７年程度を要し、また、採取出来る季節が限られる場合がある。また、成木から天然ゴムを採取できる期間は２０〜３０年に限られる。
【０００４】
今後、開発途上国を中心に天然ゴムの需要の増大が見込まれており、天然ゴム資源の枯渇が懸念されていることから、安定的な天然ゴムの供給源が望まれている。
【０００５】
このような状況下において、パラゴムノキによる天然ゴムの増産を図る動きが見られる。パラゴムノキは、播種により実生苗を育成させ成長させた後台木とし、クローン苗から得た芽を台木に接ぎ木することで苗を増殖させる。クローン苗から得られる芽には限りがあるため、優良品種を普及させるには、優良品種のクローン苗を大量増殖させる必要がある。
【０００６】
また従来のクローン苗から得たクローン増殖技術である接ぎ芽は、元の木がもつ病気を一緒に継いでしまう可能性があり、罹病した苗を増殖させる可能性がある。しかしながら、組織培養による苗の大量増殖により、無菌的にクローン苗を増殖させると接ぎ木の際に羅病の可能性はなくなる。
【０００７】
パラゴムノキにおいてクローン苗から接ぎ木法でクローン苗を増殖させるには、大量の接ぎ穂を使用することになる。クローン苗木１本から使用できる芽の数は限りがあるといえる。そのため、クローン苗を大量増殖させるための接ぎ穂を安定的に得ることが必要となる。
【０００８】
更に接ぎ穂は、台木の影響を受ける場合があるため、真のクローン苗とはならない。そのため、シュートを増殖させ、またシュートから発根させることで真のクローン苗を作出することができる。
【０００９】
一方、植物におけるイソプレノイドの生産量を増大させるためには、例えば、耐ストレス性の向上や、植物中に蓄積されるイソプレノイド量の増大を目的として、植物を改良する方法が考えられる。植物の改良方法としては、人工交配や突然変異を利用する方法も考えられるが、所望する性質を効率的に付与することが難しく、その実現性は低いものと考えられる。そのため、植物の改良には、植物細胞に標的遺伝子を導入し、所望する性質を付与するという細胞工学的手法が利用されることになると考えられる。
【００１０】
細胞工学的手法を利用する場合、標的遺伝子を導入した植物細胞や組織から植物体へと再分化、再生させる必要がある。従来から、種々の植物において組織培養の検討が行われており、また、植物のカルスからシュートを誘導する方法が知られている（なお、カルスから植物体を再生させるための培養条件は植物種によって様々である。）。しかしながら、イソプレノイドを生産する多様な植物を安定的に再生、増殖させるための組織培養条件を検討した例はほとんどなく、ゴムノキをはじめイソプレノイドを生産する植物を組織培養により安定的に再生、増殖させることは困難であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
一般的に、組織培養は、シュートの形成、伸長、発根の各段階において、使用する植物成長調整物質の種類や濃度を変えて行われるが、これまでの培養方法は、培地に用いる植物成長調整物質を数多く組み合わせる必要があり、培養方法として工夫の余地があった。
【００１２】
他方、従来のパラゴムノキの増殖方法では、クローン苗から得た芽を台木に接ぎ木することでクローン苗を増殖させているが、クローン苗から利用できる芽には限りがあるため、急速に大量増殖させることが難しく、優良品種のクローン苗を増殖させるための技術の開発が求められている。
【００１３】
本発明は、前記課題を解決し、ゴムノキの成木、幼木、又は苗木（接木苗、実生苗、取り木苗、さし木苗など）由来の節、腋芽若しくは頂芽を含む組織から安定的にゴムノキを再生できるゴムノキの再生方法、及び安定的にゴムノキのクローン苗を大量に取得できるゴムノキの増殖方法を提供することを目的とする。また、安定的にゴムノキのシュートを誘導する方法、ゴムノキのシュートを伸長させる方法、ゴムノキのシュートから発根させる方法、及びゴムノキの幼植物を馴化させる方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、鋭意検討した結果、ゴムノキの成木、幼木、又は苗木由来の節、腋芽若しくは頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することにより、シュートが安定的に形成され、その後、形成されたシュートを安定的に伸長させ、発根、馴化させることができることを見出した。すなわち、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させることにより、安定的にゴムノキを再生でき、ゴムノキのクローン苗を得ることができること、そして更には、安定的にゴムノキのクローン苗を増殖させ、大量に取得することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１５】
すなわち、本発明は、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含むゴムノキの再生方法に関する。
【００１６】
上記再生方法においては、更に、誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させる伸長工程を含むことが好ましい。
【００１７】
上記再生方法においては、更に、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含むことが好ましい。
【００１８】
上記再生方法においては、更に、発根工程により発根したシュートを消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる馴化工程を含むことが好ましい。
【００１９】
上記再生方法において、上記ゴムノキがＨｅｖｅａ属に属する植物であることが好ましい。
【００２０】
上記再生方法において、上記誘導培地が活性炭を０．０１〜０．１質量％含むことが好ましい。
【００２１】
上記再生方法において、上記誘導培地が硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含むことが好ましい。
【００２２】
上記再生方法において、上記発根誘導培地が活性炭を０．０１〜０．１質量％含むことが好ましい。
【００２３】
上記再生方法において、上記発根誘導培地が硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含むことが好ましい。
【００２４】
上記再生方法において、上記消毒剤がヨウ素系消毒剤であることが好ましい。
【００２５】
上記再生方法においては、上記馴化工程が消毒剤で処理した発根シュートを栽培用土に移植した後、徐々に自然環境に近づけることで環境に適応させ馴化させる工程であることが好ましい。
【００２６】
本発明はまた、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含むゴムノキの増殖方法に関する。
【００２７】
上記増殖方法においては、更に、誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させる伸長工程を含むことが好ましい。
【００２８】
上記増殖方法においては、更に、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを採取し、多シュートに分割した後、当該分割されたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる増殖工程を含むことが好ましい。
【００２９】
上記増殖方法においては、更に、増殖工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程を含むことが好ましい。
【００３０】
上記増殖方法においては、更に、発根工程により発根したシュートを消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる馴化工程を含むことが好ましい。
【００３１】
上記増殖方法において、ゴムノキがＨｅｖｅａ属に属する植物であることが好ましい。
【００３２】
上記増殖方法において、上記誘導培地が活性炭を０．０１〜０．１質量％含むことが好ましい。
【００３３】
上記増殖方法において、上記誘導培地が硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含むことが好ましい。
【００３４】
上記増殖方法において、上記発根誘導培地が活性炭を０．０１〜０．１質量％含むことが好ましい。
【００３５】
上記増殖方法において、上記発根誘導培地が硝酸銀を０．１〜５．０ｍｇ／Ｌ含むことが好ましい。
【００３６】
上記増殖方法において、消毒剤がヨウ素系消毒剤であることが好ましい。
【００３７】
上記増殖方法においては、上記馴化工程が消毒剤で処理した発根シュートを栽培用土に移植した後、徐々に自然環境に近づけることで環境に適応させ馴化させる工程であることが好ましい。
【００３８】
本発明はまた、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させることを特徴とするゴムノキのシュートの誘導方法に関する。
【００３９】
本発明はまた、ゴムノキのシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させることを特徴とするゴムノキのシュートの伸長方法に関する。
【００４０】
本発明はまた、ゴムノキのシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させることを特徴とするゴムノキのシュートの発根方法に関する。
【００４１】
本発明はまた、ゴムノキの幼植物を消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させることを特徴とするゴムノキの幼植物の馴化方法に関する。
【発明の効果】
【００４２】
本発明のゴムノキの再生方法は、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含む再生方法であるので、安定的にゴムノキを再生でき、ゴムノキのクローン苗を得ることができる。また、本発明のゴムノキの増殖方法は、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含む増殖方法であるので、安定的にゴムノキのクローン苗を増殖させ、大量に取得することができる。更に、本発明のゴムノキのシュートの誘導方法は、安定的にゴムノキのシュートを誘導でき、本発明のゴムノキのシュートの伸長方法は、安定的にゴムノキのシュートを伸長させることができ、本発明のゴムノキのシュートの発根方法は、安定的にゴムノキのシュートから発根させることができ、また、本発明のゴムノキの幼植物の馴化方法は、安定的にゴムノキの幼植物を馴化させることができるものである。したがって、これらの方法はゴムノキの大量増殖、分子育種に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】パラゴムノキにおける、誘導工程により形成されるシュート（ａ）、増殖工程においてシュートを分割する際に残す腋芽（ｂ）、誘導工程により形成される多芽体（ｃ）、増殖工程により分割したシュートから形成されるシュート（ｄ）、のそれぞれの様子を示す写真である。
【図２】パラゴムノキにおける、発根工程において発根する前のシュート（ａ）、発根した後のシュート（ｂ）、発根後得られる完全な植物体（ｃ）、のそれぞれの様子を示す写真である。
【図３】パラゴムノキにおける、馴化工程において馴化する前の幼植物（ａ）、馴化中の幼植物（ｂ）、馴化を開始してから１週間後の幼植物（ｃ）、のそれぞれの様子を示す写真である。
【図４】本発明のゴムノキの再生方法及び増殖方法の一例について、一連の工程の流れを表すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明のゴムノキの再生方法は、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含む再生方法である。上述のように、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織から特定の誘導培地を用いてシュートを誘導することにより、安定的にシュートが形成され（図１（ａ）参照）、接ぎ穂となる組織（シュート、多芽体）を得ることができる（図１（ａ）及び（ｃ）参照）。そして更には、形成されたシュートを伸長、発根（図２参照）、馴化（図３参照）させることで、安定的にゴムノキを再生でき、ゴムノキのクローン苗を得ることができる。
【００４５】
また、本発明のゴムノキの増殖方法は、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含む増殖方法である。本発明のゴムノキの増殖方法は、上述の本発明のゴムノキの再生方法を利用したゴムノキの増殖方法であるので、安定的にゴムノキのクローン苗を増殖させることができる。より具体的には、上記誘導工程により形成されたシュートを、節、腋芽や頂芽の部分は採取しないようにして採取して、多シュートに分割し（図１（ｂ）参照）、得られた組織を更に誘導培地で培養することでシュートを形成することができ（図１（ｄ）参照）、シュートの数を増加させることが可能となり、接ぎ穂となる組織を大量に増殖させることができ、安定的かつ大量にゴムノキのクローン苗を取得することができる。
【００４６】
本発明の方法が適用できる植物は、ゴムを資源として採取できるゴムノキであれば特に限定されず、例えば、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）等のＨｅｖｅａ属；ノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｏｌｅｒａｃｅｕｓ）、オニノゲシ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ａｓｐｅｒ）、ハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ  ｂｒａｃｈｙｏｔｕｓ）、タイワンハチジョウナ（Ｓｏｎｃｈｕｓ ａｒｖｅｎｓｉｓ）等のＳｏｎｃｈｕｓ属；セイタカアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、アキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ａｓｉａｔｉｃａ）、ミヤマアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ）、キリガミネアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｌｅｉｐｃａｒｐａ  ｆ．  ｐａｌｕｄｏｓａ）、オオアキノキリンソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｖｉｒｇａｕｒｅａ  ｓｕｂｓｐ．  ｇｉｇａｎｔｅａ）、オオアワダチソウ（Ｓｏｌｉｄａｇｏ  ｇｉｇａｎｔｅａ  Ａｉｔ．  ｖａｒ．  ｌｅｉｏｐｈｙｌｌａ  Ｆｅｒｎａｌｄ）等のＳｏｌｉｄａｇｏ属；ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、シロタエヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｒｇｏｐｈｙｌｌｕｓ）、ヘリアンサス・アトロルベンス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｔｒｏｒｕｂｅｎｓ）、ヒメヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｂｉｌｉｓ）、コヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｄｅｃａｐｅｔａｌｕｓ）、ジャイアントサンフラワー（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）等のＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ属；タンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ）、エゾタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｖｅｎｕｓｔｕｍ  Ｈ．Ｋｏｉｄｚ）、シナノタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｈｏｎｄｏｅｎｓｅ  Ｎａｋａｉ）、カントウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｐｌａｔｙｃａｒｐｕｍ  Ｄａｈｌｓｔ）、カンサイタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、セイヨウタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ  Ｗｅｂｅｒ）、ロシアンタンポポ（Ｔａｒａｘａｃｕｍ ｋｏｋｓａｇｈｙｚ）等のＴａｒａｘａｃｕｍ属；イチジク（Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ）、インドゴムノキ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｌａｓｔｉｃａ）、オオイタビ（Ｆｉｃｕｓ  ｐｕｍｉｌａ  Ｌ．）、イヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｅｒｅｃｔａ  Ｔｈｕｍｂ．）、ホソバムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ａｍｐｅｌａｓ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、コウトウイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｕｅｔｅｎｓｉｓ  Ｍｅｒｒ．）、ムクイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｉｒｉｓａｎａ  Ｅｌｍ．）、ガジュマル（Ｆｉｃｕｓ  ｍｉｃｒｏｃａｒｐａ  Ｌ．ｆ．）、オオバイヌビワ（Ｆｉｃｕｓ  ｓｅｐｔｉｃａ  Ｂｕｒｍ．ｆ．）、ベンガルボダイジュ（Ｆｉｃｕｓ  ｂｅｎｇｈａｌｅｎｓｉｓ）等のＦｉｃｕｓ属；グアユール（Ｐａｒｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ  ｓｅｒｒｉｏｌａ）等が挙げられる。なかでも、Ｓｏｎｃｈｕｓ属、Ｓｏｌｉｄａｇｏ属、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ属、Ｔａｒａｘａｃｕｍ属に属する植物等のキク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）に属する植物、Ｈｅｖｅａ属に属する植物等のトウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）��属する植物であることが好ましく、Ｈｅｖｅａ属に属する植物であることがより好ましく、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）であることが特に好ましい。
【００４７】
以下において、本発明のゴムノキの増殖方法について具体的に説明する。なお、本発明のゴムノキの増殖方法は、後述する増殖工程を含む以外、基本的に本発明のゴムノキの再生方法を利用したゴムノキの増殖方法であるので、本発明のゴムノキの増殖方法を説明することにより、本発明のゴムノキの再生方法についても説明したこととなる。また、本発明のゴムノキのシュートの誘導方法は、後述の誘導工程に相当し、本発明のゴムノキのシュートの伸長方法は、後述の伸長工程に相当し、本発明のゴムノキのシュートの発根方法は、後述の発根工程に相当し、本発明のゴムノキの幼植物の馴化方法は、後述の馴化工程に相当するため、本発明のゴムノキの増殖方法を説明することにより、これら方法についても説明したこととなる。
【００４８】
本発明のゴムノキの増殖方法は、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程を含む増殖方法である。具体的には、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織からシュートを誘導、増殖させて、ゴムノキのクローン苗の増殖を行えばよい。更に具体的には、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織からシュートを誘導し、該シュートを多シュートに分割した後に培養してシュートを形成させ、形成されたシュートを発根、馴化させることでゴムノキを再生し、ゴムノキのクローン苗の増殖を行えばよい。
【００４９】
具体的には、本発明のゴムノキの増殖方法は、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程と、該誘導工程により形成させたシュートを採取し、多シュートに分割した後、該分割されたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる増殖工程と、該増殖工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程と、該発根工程により発根したシュートを消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる馴化工程とを含むことが好ましく、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる誘導工程と、該誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させる伸長工程と、該伸長工程により伸長させたシュートを採取し、多シュートに分割した後、該分割されたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養してシュートを形成させる増殖工程と、該増殖工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程と、該発根工程により発根したシュートを消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる馴化工程とを含むことがより好ましい。そして更には、上記増殖工程後、形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させる伸長工程を行った後に、上記発根工程を行ってもよい。すなわち、本発明のゴムノキの増殖方法としては、上記誘導工程と、上記増殖工程と、上記発根工程と、上記馴化工程とを含むことが好ましく、上記誘導工程と、上記伸長工程と、上記増殖工程と、上記発根工程と、上記馴化工程とを含むことがより好ましい。そして更には、上記増殖工程後、上記発根工程の前に、上記伸長工程を行ってもよい。
また、本発明のゴムノキの再生方法としては、上記誘導工程と、該誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程と、上記馴化工程とを含むことが好ましく、上記誘導工程と、上記伸長工程と、該伸長工程により伸長させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させる発根工程と、上記馴化工程とを含むことがより好ましい。
なお、各工程は、１回行ってもよいし、植え継ぐことで複数回行ってもよい。
【００５０】
以下において、上記各工程について説明する。なお、以下の説明においては、ゴムノキの一例としてパラゴムノキを使用する場合について述べるが、パラゴムノキ以外の他のゴムノキにおいてもこれと同様に実施することができる。
【００５１】
（誘導工程）
誘導工程では、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、シュートを誘導、形成させる。
【００５２】
上記シュートを誘導するための材料としては、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織が用いられるが、具体的には、成木や幼木、苗木、クローン苗、又は試験管内で実生苗から生育させた無菌苗（無菌実生苗）由来の節、腋芽若しくは頂芽を含む組織などが挙げられる。成木や幼木、苗木、又はクローン苗由来の節、腋芽若しくは頂芽を含む組織を使用する場合には、適宜必要な大きさに切断した後、表面を殺菌又は滅菌することで使用することができるが、試験管内で実生苗から生育させた無菌苗（無菌実生苗）由来の節、腋芽又は頂芽を含む組織を使用する場合には、適宜必要な大きさに切断した後に使用することが可能である。
【００５３】
成木や幼木、苗木、又はクローン苗由来の節、腋芽若しくは頂芽を含む組織を用いる場合、誘導培地で培養する前にまず、組織の表面を洗浄する。例えば、磨き粉で洗浄したり、柔らかいスポンジで洗浄したりしても良いが、流水で洗浄するのが好ましい。当該洗浄用の水は、界面活性剤を約０．１質量％含むものであってもよい。
【００５４】
次に、組織を殺菌又は滅菌する。殺菌又は滅菌は、周知の殺菌剤、滅菌剤を用いて行うことができるが、エタノール、塩化ベンザルコニウム、次亜塩素酸ナトリウム水溶液が好ましい。なお、殺菌又は滅菌処理の後、更に滅菌水で洗浄してもよい。
【００５５】
上記洗浄、殺菌又は滅菌処理を行う具体例として例えば以下の手順が挙げられる。流水で組織の表面を洗浄した後、エタノールで洗浄。次いで次亜塩素酸ナトリウム水溶液で必要に応じて撹拌しながら滅菌。その後、滅菌水を用いて洗浄。
【００５６】
誘導工程では、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することにより、シュートを誘導、形成させる。なお、誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地に上記組織を差し込んで培養することでシュートを誘導しやすくなるため、固体培養が好ましい。また、誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
また、殺菌又は滅菌処理を行った組織を用いる場合には、殺菌剤、滅菌剤の影響を除くため切り口を切除して培養に用いるのが好ましい。
【００５７】
植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、サイトカイニン系植物ホルモンを用いることが好ましい。
【００５８】
オーキシン系植物ホルモンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸、インドールプロピオン酸、クロロフェノキシ酢酸、ナフトキシ酢酸、フェニル酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、パラクロロフェノキシ酢酸、２−メチル−４−クロロフェノキシ酢酸、４−フルオロフェノキシ酢酸、２−メトキシ−３，６−ジクロロ安息香酸、２−フェニル酸、ピクロラム、ピコリン酸等が挙げられる。なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸がより好ましい。
【００５９】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチン、ベンジルアミノプリン、イソペンテニルアミノプリン、チジアズロン、イソペンテニルアデニン、ゼアチンリボシド、ジヒドロゼアチン等が挙げられる。なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。
【００６０】
炭素源としては、特に限定されず、スクロース、グルコース、トレハロース、フルクトース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、マルトース等の糖類が挙げられる。なかでも、スクロースが好ましい。
【００６１】
誘導培地は、上記組織への成長阻害物質の蓄積を防止するために、更に活性炭を含むことが好ましい。また、シュートの形成を促進するために、更に硝酸銀を含むことが好ましい。更には、シュートの形成を促進するために、ココナッツウォーター（ココナッツミルク）を含んでもよい。
【００６２】
誘導培地としては、Ｗｈｉｔｅの培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｈｅｌｌｅｒの培地（Ｈｅｌｌｅｒ  Ｒ，  Ｂｏｔ．Ｂｉｏｌ．Ｖｅｇ．Ｐａｒｉｓ  １４  １−２２３（１９５３））、ＳＨ培地（ＳｃｈｅｎｋとＨｉｌｄｅｂｒａｎｄｔの培地）、ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＬＳ培地（ＬｉｎｓｍａｉｅｒとＳｋｏｏｇの培地）（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、Ｇａｍｂｏｒｇ培地、Ｂ５培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）、ＭＢ培地、ＷＰ培地（Ｗｏｏｄｙ  Ｐｌａｎｔ：木本類用）等の基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えたものを使用すればよい。なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。
【００６３】
誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【００６４】
好適な誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ゴムノキの場合は）以下の組成である。
【００６５】
誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５．０質量％以下である。なお、本明細書において、炭素源の濃度とは、糖類の濃度を意味する。
【００６６】
誘導培地にオーキシン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【００６７】
誘導培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、誘導培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは７．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下である。
特に、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてベンジルアデニンを使用する場合の、該ベンジルアデニンの濃度は、４．０〜６．０ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、５．０ｍｇ／Ｌである。他方、上記サイトカイニン系植物ホルモンとしてカイネチンを使用する場合の、該カイネチンの濃度は、０．８〜１．２ｍｇ／Ｌであることが好ましく、最も好ましくは、１．０ｍｇ／Ｌである。
【００６８】
誘導培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
【００６９】
誘導培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００７０】
誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．５〜６．０が更に好ましい。
なお、本明細書において、固体培地のｐＨは、固形化剤を除く全成分を添加した培地のｐＨを意味する。
【００７１】
誘導工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、３〜５週間がより好ましい。
【００７２】
固体培地の場合、誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【００７３】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン、又はカイネチン）で、その濃度が０．８〜６．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【００７４】
以上のように、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織を上記誘導培地で培養することにより、シュートを誘導、形成することが可能である。
【００７５】
上記誘導工程により形成されたシュートを後述する増殖工程に供することにより、シュートの数を増加させることができ、接ぎ穂となる組織を大量に増殖させることが可能となる。ここで、誘導工程により形成されたシュートは、シュートが安定して成長したことが確認できれば増殖工程に供することが可能であるが、例えば誘導培地で４週間培養すると、シュートが誘導されるだけでなく、伸長することとなり、誘導されたシュートだけでなく、このような誘導、伸長されたシュートを増殖工程に供してもよい。この際のシュートの伸長度合いは、誘導培地での培養期間等の培養条件により適宜調整することができる。そして更には、誘導工程により誘導されたシュートを後述する伸長工程に供して伸長させた後に、増殖工程に供してもよい。
【００７６】
（伸長工程）
伸長工程では、誘導工程により形成させたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養することにより、シュートを伸長させる。具体的には、誘導工程により形成させたシュート（例えば、２ｃｍ程度）を伸長培地に差し込み移植し、４週間程度培養することで、シュートが伸長し、また新たな芽を取得することも可能となる。
なお、伸長培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地にシュートを差し込んで培養することでシュートが伸長しやすくなるため、固体培養が好ましい。また、伸長培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【００７７】
伸長培地は、植物生長ホルモン及び炭素源を含むものであるが、該植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、オーキシン系植物ホルモンとサイトカイニン系植物ホルモンとを併用することが好ましい。
【００７８】
オーキシン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるオーキシン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸が好ましく、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸がより好ましく、１−ナフタレン酢酸が特に好ましい。
【００７９】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるサイトカイニン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましく、ベンジルアデニンが更に好ましい。
【００８０】
伸長培地に用いられる炭素源としては、特に限定されず、上記誘導培地に用いられる炭素源と同様のものを用いることができるが、なかでも、スクロースが好ましい。
【００８１】
伸長培地は、上記誘導培地同様、更に、活性炭、硝酸銀を含むことが好ましい。
【００８２】
伸長培地としては、上記誘導培地として用いられる基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えた同様のものを用いることができるが、なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。
【００８３】
伸長培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【００８４】
好適な伸長培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ゴムノキの場合は）以下の組成である。
【００８５】
伸長培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５．０質量％以下である。
【００８６】
伸長培地にオーキシン系植物ホルモンを加える場合の、伸長培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．０３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは２．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０８ｍｇ／Ｌ以下である。
【００８７】
伸長培地にサイトカイニン系植物ホルモンを加える場合の、伸長培地中のサイトカイニン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上、特に好ましくは０．８ｍｇ／Ｌ以上である。該サイトカイニン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは２．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００８８】
伸長培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
【００８９】
伸長培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【００９０】
伸長培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．５〜６．０が更に好ましい。
【００９１】
伸長工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、３〜５週間がより好ましい。
【００９２】
固体培地の場合、伸長培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【００９３】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがオーキシン系植物ホルモン（特に、１−ナフタレン酢酸）及びサイトカイニン系植物ホルモン（特に、ベンジルアデニン）で、その濃度がそれぞれ０．０５〜０．０８ｍｇ／Ｌ、０．８〜２．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【００９４】
伸長培地としては、少なくとも１層が固体培地の層、少なくとも１層が液体培地の層であって、複数の層に分離された層構造を有する培地であることも好ましい。伸長培地をこのような構造のものとすることにより、シュートの伸長をより促進することができる。
【００９５】
伸長培地が上記層構造を有する場合には、伸長培地の配合は全体として上述の好ましい範囲を満たすものである。
上記層構造を有する伸長培地としては、上層が液体層、下層が固体層である形態がより好ましく、上層の液体層１層と、下層の固体層１層の２層からなる形態が更に好ましく、具体的には例えば以下のような形態が挙げられる。
上層が、１／２ＭＳ培地に、オーキシン系植物ホルモン及びサイトカイニン系植物ホルモンを加えた液体層であり、下層が、ＭＳ培地に、サイトカイニン系植物ホルモン、硝酸銀、炭素源、活性炭、及び固形化剤を加えた固体層である形態。
なお、上記２層構造を有する伸長培地において、サイトカイニン系植物ホルモンの添加量は、液体層に０．０１〜０．０５ｍｇ／Ｌ、固体層に０．８〜２．０ｍｇ／Ｌであることが好ましい。他方、オーキシン系植物ホルモンの添加量は、液体層に０．０３〜０．１ｍｇ／Ｌ、固体層に０．０１ｍｇ／Ｌ以下（実質的に含まれない）であることが好ましく、硝酸銀の添加量は、液体層に０．０１ｍｇ／Ｌ以下（実質的に含まれない）、固体層に０．５〜２．５ｍｇ／Ｌであることが好ましく、また、活性炭の添加量は、液体層に０．００１質量％以下（実質的に含まれない）、固体層に０．０３〜０．１質量％であることが好ましい。
【００９６】
以上のように、誘導工程により形成させたシュートを上記伸長培地で培養することにより、シュートを伸長させることができる。また、この伸長工程では、シュートが伸長するだけではなく、新たなシュートも形成される。この伸長工程により伸長させたシュートは後述の増殖工程に使用される。
【００９７】
（増殖工程）
増殖工程では、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを採取し、多シュートに分割した後、該分割されたシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む誘導培地で培養することで、シュートを形成させる。この工程を行うことにより、シュートの数を増加させることができ、接ぎ穂となる組織を大量に増殖させることが可能である。そして更には、この工程を繰り返し行ったり、植え継ぎ培養したりすることによって更に大量に増殖させることができる。
【００９８】
増殖工程において、誘導工程により形成させたシュート、又は、伸長工程により伸長させたシュートを採取する際には、節、腋芽や頂芽の部分は採取しないようにしてシュートを採取すると、増殖工程において安定的にシュートの数を増加させることが可能となり好ましい。
なお、採取したシュートの分割は従来公知の方法により行うことができ、分割する大きさは適宜設定することができる。
【００９９】
増殖工程において用いる誘導培地としては、上記誘導工程において用いられる誘導培地と同様のものを用いることができる。
【０１００】
以上のように、増殖工程では、シュートを採取し、多シュートに分割した後、該分割されたシュートを上記誘導培地で培養することにより、シュートを形成させ、シュートを大量に増殖させることが可能である。この増殖工程により形成させたシュートは後述の発根工程に使用される。シュートが安定して成長したことが確認できれば発根工程に供することが可能であるが、形成させたシュートを上記誘導培地に植え継いで成長させてから発根工程に供してもよいし、上述の伸長工程を経てから発根工程に供してもよい。
【０１０１】
（発根工程）
発根工程では、シュートを発根誘導培地で培養することにより発根させる。ここで、シュートとしては、増殖工程により形成させたシュートを使用するが、伸長工程により伸長させたシュートを使用したり、また、誘導工程により誘導、形成させたシュートを直接使用したりすることも可能である。
【０１０２】
発根工程では、例えば、増殖工程により形成させたシュートを発根誘導培地で培養して発根させる。なお、発根誘導培地は、液体であっても固体であってもよいが、培地にシュートを差し込んで培養することで発根させやすくなるため、固体培養が好ましい。また、発根誘導培地が液体培地である場合には、静置培養を行ってもよく、振とう培養を行ってもよい。
【０１０３】
発根誘導培地は、植物生長ホルモン及び炭素源を含むものであるが、該植物生長ホルモンとしては、例えば、オーキシン系植物ホルモン及び／又はサイトカイニン系植物ホルモンが挙げられる。中でも、オーキシン系植物ホルモンを用いることが好ましい。
【０１０４】
オーキシン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるオーキシン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１−ナフタレン酢酸、インドール−３−酪酸、インドール−３−酢酸が好ましく、インドール−３−酪酸がより好ましい。
【０１０５】
サイトカイニン系植物ホルモンとしては、上記誘導培地に用いられるサイトカイニン系植物ホルモンと同様のものを用いることができるが、なかでも、ベンジルアデニン、カイネチン、ゼアチンが好ましく、ベンジルアデニン、カイネチンがより好ましい。
【０１０６】
発根誘導培地に用いられる炭素源としては、特に限定されず、上記誘導培地に用いられる炭素源と同様のものを用いることができるが、なかでもスクロースが好ましい。
【０１０７】
発根誘導培地は、上記誘導培地同様、更に、活性炭、硝酸銀を含むことが好ましい。
【０１０８】
発根誘導培地としては、上記誘導培地として用いられる基本培地や、該基本培地の組成に変更を加えた改変基本培地等のベースとなる培地に植物生長ホルモンを加えた同様のものを用いることができるが、なかでも、ＭＳ培地、Ｂ５培地、ＷＰ培地に植物生長ホルモンを加えたものが好ましく、ＭＳ培地又はその組成に変更を加えたＭＳ改変培地に植物生長ホルモンを加えたものがより好ましい。
【０１０９】
発根誘導培地を固体培地とする場合、固形化剤を使用して培地を固体にすればよい。固形化剤としては、特に限定されず、寒天、ゲランガム、アガロース、ゲルライト、アガー、フィタゲル等が挙げられる。
【０１１０】
好適な発根誘導培地の組成及び培養条件は、植物種により異なり、また培地が液体培地であるか固体培地であるかによっても異なるが、通常は（特に、ゴムノキの場合は）以下の組成である。
【０１１１】
発根誘導培地中の炭素源の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは１．０質量％以上である。該炭素源の濃度は、好ましくは１０質量％以下、より好ましくは５．０質量％以下である。
【０１１２】
発根誘導培地にオーキシン系植物ホルモンを加える場合の、発根誘導培地中のオーキシン系植物ホルモンの濃度としては、好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以上である。該オーキシン系植物ホルモンの濃度は、好ましくは１０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは６．０ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１１３】
発根誘導培地にサイトカイニン系植物ホルモンを実質的に加えないことが好ましく、具体的には、好ましくは１．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以下、更に好ましくは０．０５ｍｇ／Ｌ以下、特に好ましくは０．０１ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１１４】
発根誘導培地中の活性炭の濃度は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．０３質量％以上である。該活性炭の濃度は、好ましくは１．０質量％以下、より好ましくは０．１質量％以下である。
【０１１５】
発根誘導培地中の硝酸銀の濃度は、好ましくは０．１ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは０．３ｍｇ／Ｌ以上、更に好ましくは０．５ｍｇ／Ｌ以上である。該硝酸銀の濃度は、好ましくは５．０ｍｇ／Ｌ以下、より好ましくは３．０ｍｇ／Ｌ以下である。
【０１１６】
発根誘導培地のｐＨは、４．０〜１０．０が好ましく、５．０〜６．５がより好ましく、５．５〜６．０が更に好ましい。
【０１１７】
発根工程は、通常、温度、照明時間等の培養条件の管理された制御環境下で行われる。培養条件は適宜設定することができるが、例えば、培養温度は、０〜４０℃が好ましく、２０〜４０℃がより好ましく、２５〜３５℃が更に好ましい。培養は、暗所で行っても明所で行ってもよいが、光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。培養時間は、特に限定されないが、１〜１０週間培養することが好ましく、４〜８週間がより好ましい。
【０１１８】
固体培地の場合、発根誘導培地中の固形化剤の濃度は、好ましくは０．１質量％以上、より好ましくは０．２質量％以上、更に好ましくは０．５質量％以上である。該固形化剤の濃度は、好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．１質量％以下、更に好ましくは０．８質量％以下である。
【０１１９】
上述の条件のなかでも、植物生長ホルモンがオーキシン系植物ホルモン（特に、インドール−３−酪酸）で、その濃度が３．０〜６．０ｍｇ／Ｌであり、培養温度が２５〜３５℃であることが特に好ましい。
【０１２０】
以上のように、シュートを上記発根誘導培地で培養することにより、発根させることが可能であり、発根させたシュート（本明細書において、発根したシュートを「幼植物」とも称する。）が得られ、完全な植物体であるクローン苗が形成される。この幼植物は、直接土壌に移植してもよいが、後述する馴化工程に供した後に、土壌に移植することが好ましい。
なお、上記形成されたクローン苗を用いて、本発明の再生方法、増殖方法を繰り返し実施することにより、優良品種のクローン苗を大量に生産することも可能である。
【０１２１】
（馴化工程）
馴化工程では、発根工程により発根したシュートを消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる。
【０１２２】
植物の組織片又は培養細胞を組織培養することによって得られた無菌培養苗及び幼植物や種子から無菌的に培養して得た幼植物は、無菌状態で照明、温度が制御された環境下で生育され、植物は十分に保護された環境下に置かれている。こうした植物を利用するには、制御された環境下から解放し、自然環境下で育成させるために、馴化工程に供することが好ましい。
【０１２３】
馴化に際しては環境の変化や移植など人為的な操作を伴うために、植物体を損傷させることがある。また、組織培養等で得られた幼植物は、寒天培地で生育しているため根数が少ない場合があり、地下茎の生育が悪い場合がある。
このため、直接通常の土壌に移植すると活着が十分にできない場合があるために、組織培養による種苗の大量増殖を効率的に実施する上では問題となる場合もある。
【０１２４】
従来行われている馴化方法としては、無菌状態の培養容器を開封して、無菌培養されていた幼植物を取り出し、根についた寒天などの培地を洗い流したのち、馴化のための環境下に移す、そして、培養土に幼植物を植え付け、外気になれるよう雑菌汚染の少ない環境などにおいて管理する、といった方法が採用されている。
【０１２５】
これに対して、本発明における馴化工程は、発根工程により発根したシュート（幼植物）を消毒剤で処理した後、栽培用土に移植するものであり、無菌的な操作が必要であったり、生育工程に応じた管理が必要であったりといった煩雑な管理をすることなく、効率的にかつ安定的に馴化を行うことができ、移植後の枯死や生育停止も低減できて、効率的に幼植物の馴化を行うことができるものである。
【０１２６】
馴化工程では、まず、幼植物から発根工程時に使用した発根誘導培地を注意深く取り除き、流水で穏やかに洗い流すなどにより幼植物に付着している培地を取り除く。その後、消毒剤で処理する。消毒剤での処理の方法としては、例えば、消毒剤を含む溶液に幼植物の根を浸す方法などが挙げられる。
【０１２７】
上記消毒剤としては、特に限定されないが、例えば、アルデヒド系消毒剤、塩素系消毒剤、酸化剤、ヨウ素剤、アルコール系消毒剤、ビグアナイド系消毒剤、第４級アンモニウム塩、両性界面活性剤、色素系消毒剤などが挙げられる。なかでも、ポビドンヨード、ヨードチンキなどのヨウ素系消毒剤が好ましく、ポビドンヨードが特に好ましい。
【０１２８】
使用される消毒剤の濃度は適宜設定でき、植物種により効果が発現する濃度以上であればよいが、ゴムノキの場合には、０．００１質量％以上が好ましく、０．００５質量％以上がより好ましい。また、該濃度としては、０．１質量％以下が好ましく、０．０５質量％以下がより好ましい。
また、消毒剤を含む溶液に幼植物を浸す時間についても消毒が充分できるように適宜設定すればよい。
【０１２９】
消毒剤で処理した後、栽培用土に幼植物を移植する。該栽培用土としては、有機質及び無機質のいずれのものでも使用でき、有機質及び無機質の両方を含んでいてもよい。具体的には、アタパルジャイト、モンモリロナイト、ゼオライト、赤玉土、鹿沼土、黒ボク土、焼成赤玉土、バーミキュライト、パーライト、化石貝等の無機物や、ピートモス、木炭、パルク、藁、バガス、油かす、魚かす、骨粉、血粉、カニがら等の有機物、又はそれらの混合物が挙げられる。
【０１３０】
栽培用土に移植した幼植物は、湿度を保つためにプラスチック容器、プラスチックバック等で上部をカバーし、例えば１０時間以上の照明下で培養する。そして、栽培用土環境下に幼植物が馴染んだ後、上部のカバーを徐々に除去するなどして徐々に自然環境に近づけていき、例えばカバーが完全に除去されたときなど幼植物が自然環境下に置かれたときに馴化が完了する。
【０１３１】
上記カバーの素材としては、プラスチックに限らず、光を透過することができ、内部の湿度を保つことのできる素材であれば適宜選択することができ特に制限されない。
また上記培養の光条件としては、例えば、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１４〜１６時間の明時間という条件などが挙げられる。
上記幼植物が栽培用土環境下に馴染むまでの培養時間としては、特に限定されないが、例えば、１〜１０週間培養することが好ましく、１〜４週間がより好ましい。
【０１３２】
このように、馴化工程が、消毒剤で処理した発根シュート（幼植物）を栽培用土に移植した後、徐々に自然環境に近づけることで環境に適応させ馴化させる工程であることもまた、本発明の好適な実施形態の１つである。上記徐々に自然環境に近づける方法としては、例えば、栽培用土環境下に幼植物が馴染んだ後に、幼植物の状態を見ながら、幼植物の上部を覆っているカバーを徐々に除去していく方法や、栽培用土環境下に幼植物が馴染んだ後に、幼植物の上部を覆っているカバーの一部を開放して幼植物の環境を外部の自然環境と連続した環境とし、幼植物の状態を見ながら、カバー内での幼植物の位置を移動させていき、徐々にカバーの開放部に幼植物を近づけていく方法などが挙げられる。
【０１３３】
以上の説明の通り、本発明では、ゴムノキの節、腋芽又は頂芽を含む組織からシュートを誘導し、安定的にシュートを形成させ、形成させたシュートを伸長させ、発根、馴化させることができ、安定的にゴムノキを再生できる。また、制御された環境下で組織培養し、増殖させることにより、安定的にゴムノキのクローン苗を増殖できる。
【０１３４】
まとめとして、本発明のゴムノキの再生方法及び増殖方法の一例について、一連の工程の流れを表すフロー図を図４に示す。まず、本発明のゴムノキの再生方法の一例としては、パラゴムノキの成木（ａ）から腋芽を含む組織を採取し、誘導培地で培養して（ｂ）、シュートを形成させ（ｃ）（誘導工程）、形成させたシュートを伸長培地で培養し（ｄ）（伸長工程）、伸長させたシュートを発根誘導培地で培養して発根、成長させ（ｅ、ｆ）（発根工程）、馴化させる（ｇ）（馴化工程）。また、本発明のゴムノキの増殖方法の一例としては、パラゴムノキの成木（ａ）から腋芽を含む組織を採取し、誘導培地で培養して（ｂ）、シュートを形成させ（ｃ）（誘導工程）、形成させたシュートを採取し、多シュートに分割した後、該分割されたシュートを誘導培地で培養してシュートを形成させ（ｈ）（増殖工程）、形成させたシュートを発根誘導培地で培養して発根、成長させ（ｅ、ｆ）（発根工程）、馴化させる（ｇ）（馴化工程）。
【０１３５】
ここで、上記伸長工程は、上記誘導工程により形成させたシュートに対して適用するものであるが、上記伸長工程による伸長方法は、上記誘導工程により形成させたシュートに限らず、ゴムノキのシュートであれば上記誘導工程以外の方法により形成させたシュートに対しても適用し伸長させることが可能である。このように、ゴムノキのシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む伸長培地で培養してシュートを伸長させるゴムノキのシュートの伸長方法もまた、本発明の１つである。
【０１３６】
更に、上記発根工程は、上記誘導工程により形成させたシュートや、上記伸長工程により伸長させたシュート、上記増殖工程により形成させたシュートに対して適用するものであるが、上記発根工程による発根方法は、上記誘導工程により形成させたシュートや、上記伸長工程により伸長させたシュート、上記増殖工程により形成させたシュートに限らず、ゴムノキのシュートであれば上記誘導工程、伸長工程、増殖工程以外の方法により形成させたシュートに対しても適用し発根させることが可能である。このように、ゴムノキのシュートを、植物生長ホルモン及び炭素源を含む発根誘導培地で培養して発根させるゴムノキのシュートの発根方法もまた、本発明の１つである。
【０１３７】
上記伸長方法、上記発根方法において用いることができるゴムノキのシュートとしては特に限定されず、どのような方法により形成されたシュートであっても用いることができる。
【０１３８】
また、上記馴化工程は、上記発根工程により発根したシュートに対して適用するものであるが、上記馴化工程による馴化方法は、上記発根工程により発根したシュートに限らず、ゴムノキの幼植物の材料となる他の根茎を含む幼苗に対しても適用し馴化を行うことが可能である。このように、ゴムノキの幼植物を消毒剤で処理した後、栽培用土に移植して馴化させる馴化方法もまた、本発明の１つである。
【０１３９】
上記幼植物の材料となる根茎を含む幼苗としては、例えば、通常の組織培養により継代、維持されたものを用いることができる。その他、未分化な組織から再分化することにより作製された植物を用いてもよい、また、種子を用いた胚培養を行うことで得た無菌苗も用いることができる。
【０１４０】
上記無菌幼植物又は幼苗の製造方法は、特に限定されず、従来知られた方法を用いればよい。例えば、無菌下で親植物から切り出した茎頂や葉、花、根、茎、種子等から切り出した組織片等を植物生長用の栄養素を含む培養培地の上に置床し、得られたカルス、苗条原基、早生分枝等を増殖培地に移植して細胞組織の増殖を行い、不定芽等を得、得られた組織から発根培地に移植して発根及び新芽の伸長を行い、培養植物体（幼植物）を得る方法が例示される。また、親植物から生長点を切り出し、培地に置床して発根及び新芽の伸長を行い、培養植物体（幼植物）を製造する方法も採用できる。
【実施例】
【０１４１】
実施例に基づいて、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。
【０１４２】
以下、実施例で使用した各種薬品について、まとめて説明する。
ＢＡ：ベンジルアデニン
ＫＩ：カイネチン
ＮＡＡ：１−ナフタレン酢酸
ＩＢＡ：インドール−３−酪酸
硝酸銀：メルク社製の硝酸銀
ココナッツウォーター：市販のココヤシ果実を用いた。
ゲル化剤：フルカ（ＦＬＵＫＡ）社製のアガー（Ａｇａｒ）（パウダー）
消毒剤：ユナイテッド  ドラッグ（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｄｒｕｇ）社製、ピラッド−ポビドン（Ｐｙｒａｄ−Ｐｏｖｉｄｏｎｅ）（商品名）（ポビドンヨード溶液）
パラゴムノキ：プリンス・オブ・ソンクラ大学内に自生しているパラゴムノキ
【０１４３】
（実施例１〜１８、比較例１〜６）
＜誘導工程＞
パラゴムノキの成木又は苗木から節、腋芽若しくは頂芽を含む組織を採取した。また、パラゴムノキの種子を試験管内で無菌的に発芽させて培養した実生苗（無菌実生苗）から節、腋芽又は頂芽を含む組織を採取した。
次に、成木又は苗木から採取した節、腋芽若しくは頂芽を含む組織を流水で洗浄し、更に７０質量％エタノールで洗浄した後、約５〜１０体積％に希釈した次亜塩素酸ナトリウム水溶液で滅菌し、滅菌水で洗浄した。
【０１４４】
次に、滅菌した組織又は無菌実生苗由来の組織を誘導培地（固体培地）に差し込み、培養を行った（誘導工程）。誘導培地は、ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、下記表１に記載の所定濃度の植物ホルモン、硝酸銀、スクロース、活性炭、ココナッツウォーターを添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、ゲル化剤を０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１４５】
パラゴムノキの上記組織を誘導培地（固体培地）に差し込み、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で４週間培養し、シュートを誘導した。どの程度シュートを誘導することができたか、について下記評価基準により評価した。
〔シュート誘導率の評価〕
シュート誘導率を下記式により算出し、算出されたシュート誘導率から下記評価基準により評価した。
（シュート誘導率（％））＝｛（シュートの形成が確認された組織の個数）／（誘導培地に移植した組織の個数）｝×１００
評価基準：
○・・・シュート誘導率が７５％以上
△・・・シュート誘導率が５０％以上７５％未満
×・・・シュート誘導率が２５％未満
【０１４６】
実施例１〜１８、比較例１〜６における、用いた組織、培地の配合、培養温度、及びシュート誘導率の評価を表１に示す。
【０１４７】
【表１】
2016140318.tif 000002
【０１４８】
実施例１〜１８の培養ではいずれも良好にシュートが誘導され、シュートや多芽体の形成が見られた。形成されたシュート、多芽体については４週間ごとに同じ組成の誘導培地に移植する植え継ぎを行った。一方、サイトカイニン系植物ホルモン、硝酸銀、及び活性炭を添加しない誘導培地で培養した比較例１〜６ではいずれもシュートの誘導が見られず、培養を続けることで組織が枯渇した。
【０１４９】
＜増殖工程＞
実施例１〜１８の培養により誘導され、植え継ぎをして３ｃｍ程度に成長したシュートを、節、腋芽や頂芽の部分を残して分割し、更に同じ組成の誘導培地に移植し、培養した。これにより、分割したシュートから更に新たなシュート、多芽体が発生し、増殖させることができた。この増殖工程を繰り返すことで、良好にシュートを大量増殖させることができた。
【０１５０】
（実施例１９〜２７、比較例７〜１５）
＜伸長工程＞
実施例１〜９の培養により誘導され、植え継ぎをして成長したシュートを伸長培地で培養した（伸長工程）。伸長培地は、２層構造であり、２層ともＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）を基にした。下層培地としては、ＭＳ培地に下記表２に記載の所定濃度の植物ホルモン、硝酸銀、スクロース、活性炭を添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、ゲル化剤を０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。上層培地は、１／２ＭＳ培地に下記表２に記載の所定濃度の植物ホルモンを添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。固体層である下層培地の上に液体層である上層培地を載せて伸長培地を作製した。
【０１５１】
実施例１〜９の培養により誘導され、植え継ぎをして成長したシュートを伸長培地の下層培地（固体層）に差し込み、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で４週間培養した。どの程度シュートを伸長させることができたのか、について下記評価基準により評価した。
〔シュート伸長率の評価〕
シュート伸長率を下記式により算出し、算出されたシュート伸長率から下記評価基準により評価した。
（シュート伸長率（％））＝｛（新しい新芽が確認できたシュート数）／（伸長工程に移植したシュート数）｝×１００
評価基準：
○・・・シュート伸長率が７０％以上
×・・・シュート伸長率が７０％未満
【０１５２】
実施例１９〜２７、比較例７〜１５における、用いたシュート、培地の配合、培養温度、及びシュート伸長率の評価を表２に示す。
【０１５３】
【表２】
2016140318.tif 000003
【０１５４】
実施例１９〜２７の培養ではいずれも良好にシュートの伸長が見られた。一方、植物ホルモン、硝酸銀、及び活性炭を添加しない伸長培地で培養した比較例７〜１５ではいずれもシュートの伸長、多芽体の形成がほとんど見られず、また培養を続けることで組織が枯渇した。
【０１５５】
＜増殖工程＞
実施例１９〜２７の培養により伸長成長したシュートを、節、腋芽や頂芽の部分を残して分割し、更に同じ組成の伸長培地に移植し、培養した。これにより、分割したシュートから更に新たなシュートが伸長し、多芽体が発生して、増殖させることができた。この増殖工程を繰り返すことで、良好にシュートを大量増殖させることができた。
【０１５６】
（実施例２８〜３６、比較例１６〜２４）
＜発根工程＞
実施例１〜９の培養により誘導され、植え継ぎをして成長したシュートを発根誘導培地（固体培地）に差し込み、培養を行った（発根工程）。発根誘導培地は、１／２ＭＳ培地（植物細胞工学入門（学会出版センター）ｐ２０〜ｐ３６に記載）に、下記表３に記載の所定濃度の植物ホルモン、硝酸銀、スクロース、活性炭を添加し、培地のｐＨを５．７に調整した後、ゲル化剤を０．７５質量％となるように添加して、オートクレーブ（１２１℃、２０分）で滅菌し、クリーンベンチ内で冷却することにより調製した。
【０１５７】
実施例１〜９の培養により誘導され、植え継ぎをして成長したシュートを発根誘導培地（固体培地）に差し込み、培養温度２８℃、１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で４週間培養した。４週間の培養後、発根の有無を目視により確認した。有無の基準は下記の通りである。また、シュートの生育率を下記式により算出した。
〔発根の有無〕
有：５０％以上のシュートから発根が見られる
無：５０％未満のシュートから発根が見られる
〔シュート生育率〕
（シュート生育率（％））＝｛（新芽又は伸長等の生育が確認できたシュート数）／（発根誘導培地に移植したシュート数）｝×１００
【０１５８】
実施例２８〜３６、比較例１６〜２４における、用いたシュート、培地の配合、培養温度、シュート生育率、及び発根の有無を表３に示す。
【０１５９】
【表３】
2016140318.tif 000004
【０１６０】
実施例２８〜３６の培養ではいずれも良好に発根が見られた。発根したシュートについては４週間ごとに同じ組成の発根誘導培地に移植する植え継ぎを行った。このように発根したシュートを培養することで完全な植物体へ再生させることができ、これらの工程を行うことで、良好にクローン苗を大量増殖させることが可能であった。一方、植物ホルモン、硝酸銀、及び活性炭を添加しない発根誘導培地で培養した比較例１６〜２４ではいずれもシュートからの発根は見られず、また培養を続けることでシュートが枯渇した。
【０１６１】
（実施例３７〜４５）
＜馴化工程＞
実施例２８〜３６の培養により発根したシュート（幼植物）を培養管から注意深く取り出した。流水を用いて、幼植物に付着している固形培養培地を取り除いた。消毒剤（０．０１質量％のポビドンヨード溶液）に幼植物を２〜３分程度浸した。栽培用土を詰めたポットに幼植物を移植した。光が透過するプラスチックバックを幼植物の上部にカバーした。１２．５μｍｏｌ／ｍ２／ｓの照明の下、１６時間の明時間という条件で栽培した。１週間カバーをかけて栽培した後、植物の生育を確認し、状態を見ながら徐々にカバーを外した。安定した生育が見られたところで、カバーを完全に外した。
〔生存率の評価〕
生存率を下記式により算出し、算出された生存率から下記評価基準により評価した。
（生存率（％））＝｛（栽培用土への移植から２ヶ月後の幼植物の生存数）／（栽培用土へ移植した幼植物の数）｝×１００
評価基準：
○・・・生存率が７５％以上
△・・・生存率が２５％以上５０％以下
×・・・生存率が２５％未満
【０１６２】
（比較例２５〜３３）
＜馴化工程＞
消毒剤に幼植物を浸さず、かつ、光が透過するプラスチックバックを幼植物の上部にカバーしなかった以外、実施例３７〜４５と同様にして馴化工程を行った。
【０１６３】
（比較例３４）
＜馴化工程＞
消毒剤に幼植物を浸さなかった以外、実施例３７〜４５と同様にして馴化工程を行った。
【０１６４】
実施例３７〜４５、比較例２５〜３４における、用いた幼植物、消毒剤濃度、カバーの有無、及び生存率の評価を表４に示す。
【０１６５】
【表４】
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【０１６６】
実施例３７〜４５の馴化ではいずれも良好に馴化が起こり、自然環境下で良好に幼植物が成長することが確認された。一方、消毒剤を用いず、上部カバーをしなかった比較例２５〜３３では自然環境下で幼植物はほとんど成長しなかった。また、消毒剤は用いずに、上部にカバーをしただけの場合（比較例３４）には、自然環境下で幼植物は実施例３７〜４５に比べてあまり成長しなかった。
【図１】
2016140318.tif 000006
【図２】
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【図３】
2016140318.tif 000008
【図４】
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