(57)【要約】【課題】本発明は、生物学的製剤の治療効果を客観的に予測又は評価することができる関節リウマチの診断方法を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、関節リウマチの診断方法に関する。本発明は、また、採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、抗腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα）生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を予測又は評価する方法にも関する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、関節リウマチの診断方法。
【請求項２】
採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、抗腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα）生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を予測する方法。
【請求項３】
採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、抗腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα）生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチの診断方法に関する。本発明は、また、抗腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα）生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を予測又は評価する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（ＲＡ））は、複数の関節滑膜にリンパ球、マクロファージを主体とした慢性炎症が起こり、その結果軟骨骨破壊がおこる疾患である。
【０００３】
関節リウマチの治療には、葉酸拮抗剤であるメソトレキサートや各種生物学的製剤が高い治療効果を発揮すると期待されている。生物学的製剤は、バイオテクノロジーによって作製された医薬品で、関節リウマチの治療に使用される生物学的薬剤としては、抗腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）抗体、抗ＩＬ−６リセプター抗体、Ｔ細胞選択的共刺激調節薬等がある。これらの生物学的製剤は、従来の薬剤に比べて関節破壊効果は強いが、高額であること、進行が進んだ関節リウマチでは多量の生物学的製剤が必要となることや、免疫抑制作用による感染症等の重篤な副作用が生じる可能性がある等の課題がある。また、抗ＴＮＦα生物学的製剤は、滑膜マクロファージの傷害を経て治療効果を発揮することが知られている（非特許文献１）が、抗ＴＮＦα生物学的製剤の効果を予測するマーカーについては、決定づけるものがあるとは言い難いのが現状である（非特許文献２、３）。
【０００４】
関節リウマチの診断基準のひとつとして、ＤＡＳ２８−ＣＲＰがある。ＤＡＳ２８−ＣＲＰは、ＲＡの活動性を絶対的な数値で表現しようというもので、全身２８関節における疼痛関節数、腫脹関節数、患者による総合評価、ＣＲＰにて評価する方法である。しかし、このような臨床症状による判断は、患者と医療従事者の経験則に依存するため、客観性に欠ける。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Davignon JL et al., Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology(Oxford). 2013 Apr;52(4):590-8.
【非特許文献２】Cuchacovich M et al.,Clinical parameters and biomarkers for anti-TNF treatment prognosis in rheumatoid arthritis patients. Clin Rheumatol. 2014 Dec;33(12):1707-14.
【非特許文献３】Choi IY et al., MRP8/14 serum levels as a strong predictor of response to biological treatments in patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2013 Dec 2. doi: 10.1136/annrheumdis-2013-203923.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、従来の関節リウマチの診断方法では、生物学的製剤の治療効果を客観的に予測又は評価することができなかった。それ故、本発明は、生物学的製剤の治療効果を客観的に予測又は評価することができる関節リウマチの診断方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するための手段を種々検討した結果、可溶性の葉酸リセプター（以下ＦＲ）βの血中濃度を測定することにより、関節リウマチに対する生物学的製剤の治療効果を客観的に予測又は評価することができることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）採取した血液に存在する可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とした、関節リウマチの診断方法。
（２）採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、抗腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα）生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を予測する方法。
（３）採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、抗腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα）生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を評価する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、生物学的製剤の治療効果を客観的に予測又は評価することができる関節リウマチの診断方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１（Ａ）は、抗ヒトＦＲラットモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．５）のＦＲα及びＦＲβに対する反応性を示すフローサイトメトリーの図である。図１（Ｂ）は、抗ヒトＦＲβラットモノクローナル抗体（抗体Ｎｏ．２）のＦＲα及びＦＲβに対する反応性を示すフローサイトメトリーの図である。図１（Ｃ）は、ビオチン化Ｎｏ．２抗体のＦＲβに対する反応性を示すフローサイトメトリーの図である。抗体Ｎｏ．５はヒトＦＲα及びＦＲβに反応するのに対し（図１（Ａ））、抗体Ｎｏ．２はヒトＦＲβに特異的である（図１（Ｂ））。さらに図１（Ｃ）の結果より、ビオチン化Ｎｏ．２抗体が示すＦＲβに対する反応性は、Ｆ（ａｂ’）２断片化Ｎｏ．５抗体存在下によっても影響を受けない。
【図２】図２は、リコンビナント可溶性ＦＲβ蛋白を用いた標準曲線を示す図である。
【図３】図３は、関節リウマチ患者（１０名）で抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与前及び投与後３ヶ月における関節炎の活動性指標（ＤＡＳ２８−ＣＲＰ）と血中の可溶性ＦＲβ値（高値及び低値）を、抗ＴＮＦα生物学的製剤の反応患者と無反応患者で比較した図である。患者１０名の可溶性ＦＲβ値の平均値に対して高値群の患者（４名）のすべてが抗ＴＮＦα生物学的製剤に反応し、低値群の患者（６名）では３名が抗ＴＮＦα生物学的製剤に反応した。
【図４】図４は、関節リウマチ患者で抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与前及び投与後３ヶ月における血中の可溶性ＦＲβ濃度を、抗ＴＮＦα生物学的製剤の反応患者と無反応患者で比較した図である。抗ＴＮＦα生物学的製剤が反応した患者７例のうち６例が投与後３ヶ月で可溶性ＦＲβの血中濃度が低下した。一方、無反応患者では可溶性ＦＲβの血中濃度が増加した。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
１．関節リウマチの診断方法
本発明は、関節リウマチの診断方法に関する。本発明の方法では、関節リウマチに罹患している被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することにより、関節リウマチを診断する。本発明の診断方法では、生物学的製剤の治療効果を客観的に判断することができ、特に、抗腫瘍壊死因子α（抗ＴＮＦα）生物学的製剤の治療効果を客観的に予測又は評価することができる。また、本発明の診断方法は血液を評価するため、滑液を評価する方法に比べて検体の取得容易性及び患者への負担等の点で有利である。
【００１３】
本明細書で使用される「可溶性ＦＲβ」という用語は、滑膜マクロファージから遊離し、血液や滑液等の体液中に溶解したＦＲβを意味する。ＦＲβはＧＰＩアンカー型の膜蛋白質で通常は細胞膜に露出している。膜型ＦＲβが可溶性ＦＲβに変化するメカニズムは不明であるものの、関節リウマチ病態においてＴＮＦαやＩＬ−６などの炎症性サイトカインの供給源である滑膜マクロファージで高い発現が認められる。
【００１４】
本明細書で使用される「被験者」という用語には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物等の哺乳動物が含まれる。好ましい被験者はヒトである。
【００１５】
検査用検体としての血液としては、被験者から採取した血液が挙げられ、好ましくは該血液から分離取得した血清を検体とする。血清は、特に限定されずに、例えば、血液から臨床検査用検体として取得する通常の血清の分離方法により取得することができる。具体的には、血液検体を静置した後の上清や、遠心分離したときの上清などから取得することができる。
【００１６】
本発明の診断方法では、可溶性ＦＲβの血中濃度は、好ましくは、免疫学的測定法により測定され、例えば、抗ＦＲβ抗体を用いて、可溶性ＦＲβとの抗原抗体反応を利用して測定する方法が挙げられる。具体的には、固相担体に抗ＦＲβ抗体を固相化し、検査用検体を固相担体と接触させて検体中の可溶性ＦＲβを抗ＦＲβ抗体で捕捉し、捕捉した可溶性ＦＲβを、標識物質を用いて測定する方法が挙げられる。本発明に用いられる抗ＦＲβ抗体は、ＦＲβ蛋白質を認識してこの蛋白質に結合することができる抗体又はそのフラグメントであり、抗体の種類や形態は問わないものとする。
【００１７】
より具体的には、本発明の診断方法に用いられる免疫学的測定法として、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法等が挙げられるが、エンザイムイムノアッセイが好ましく、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法が、可溶性ＦＲβを高感度で検出でき、かつ多数の検体を自動的に測定できるので、より好ましい。ＥＬＩＳＡ法の中でも、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。
【００１８】
本発明において、可溶性ＦＲβの血中濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定する場合、例えば、合成樹脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン等）、多糖類、ガラス、金属等の固相担体に固相化した抗ＦＲβ抗体（キャプチャー抗体）と、標識化した抗ＦＲβ抗体（検出抗体）を用いて、公知のサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定する。
【００１９】
キャプチャー抗体としては、好ましくは、抗ＦＲβ抗体が用いられる。抗ＦＲβ抗体は、ＦＲβ蛋白質を認識してこの蛋白質に結合することができる抗体又はそのフラグメントであり、抗体の種類や形態は問わないものとする。抗ＦＲβ抗体は、ＦＲβと免疫学的反応により結合するが、ＦＲβ又はそれと９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を持つそれらの変異蛋白質と結合するものであってもよい。
【００２０】
抗ＦＲβ抗体は、いずれの免疫グロブリン（Ｉｇ）クラス（ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＹ等）及びサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２等）のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ鎖又はλ鎖のいずれであってもよい。
【００２１】
具体的には、抗ＦＲβ抗体は、例えば、上記クラス又はサブクラスの完全構造を有する抗体又はそれらのフラグメント、組換え抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、ＳｃＤｂ（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｄｉａｂｏｄｙ）、ｄｓＦｖ-ｄｓＦｖ等）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体等の抗体或いはそれらのフラグメント、ならびにこれらフラグメントを高分子架橋させたポリマー抗体である。
【００２２】
本発明で使用可能な抗体のフラグメントは、７以上、より好ましくは８〜１２又はそれ以上の連続アミノ酸を有するＦＲβ蛋白質抗原エピトープと結合可能である。
【００２３】
抗体フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂｃ等を含む。このようなフラグメントの作製方法は当技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。本発明では、関節リウマチ患者の血中に存在するリウマチ因子が結合する抗体のＦｃ領域を除いた、Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントを用いることが好ましい。
【００２４】
キャプチャー抗体としては、後述する検出抗体とリガンドであるＦＲと競合阻害を起こさない抗体であれば、特に限定されずに、例えば以下のものが挙げられる。
【００２５】
下記の実施例における抗ヒトＦＲラットモノクローナル抗体（クローン名：Ｎｏ．５）由来の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号２４、対応する塩基配列：配列番号２３）、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号３２、対応する塩基配列：配列番号３１）を含む抗体又はそのフラグメント：
抗ヒトＦＲラットモノクローナル抗体（クローン名：Ｎｏ．５）由来の重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２）、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０）を含む抗体又はそのフラグメント：
抗ヒトＦＲラットモノクローナル抗体（クローン名：Ｎｏ．５）由来の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列（配列番号２４、対応する塩基配列：配列番号２３）において４４番目のアミノ酸グリシンをシステインに変異させたアミノ酸配列（配列番号３４、その対応する塩基配列：配列番号３３）、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列（配列番号３２、対応する塩基配列：配列番号３１）において１００番目のアミノ酸グリシンをシステインに変異させたアミノ酸配列（配列番号３６、その対応する塩基配列：配列番号３５）を含む抗体又はそのフラグメント：
重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２）、並びに軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０）を含むヒト化抗体又はそのフラグメント。
【００２６】
検出抗体としては、先述したキャプチャー抗体とリガンドであるＦＲと競合阻害を起こさない抗体であれば、特に限定されずに、抗ＦＲβ抗体に、例えば酵素（例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、発蛍光団（例えばＦＩＴＣ、テトラメチルローダミン、テキサスレッド等）、色素、放射性同位元素等のラベル（標識）を結合したものを用いることができる。検出抗体としては、ＦＲβ蛋白質を認識してこの蛋白質に特異的に結合する抗ＦＲβ抗体を用いることが好ましい。ラベルの結合には、化学的結合法、ビオチン-（ストレプト）アビジン系を利用する結合法等が含まれる。
【００２７】
２．抗ＴＮＦα生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を予測する方法
本発明は、関節リウマチに罹患している被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、抗ＴＮＦα生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を予測する方法にも関する。
【００２８】
被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度は、上記の通りにして測定することができる。
【００２９】
本発明の予測方法によってその治療効果を予測可能な抗ＴＮＦα生物学的製剤は、ＴＮＦαを抗原として認識し、ＴＮＦαと結合する可変領域を有する抗体、あるいはＴＮＦα特異的なリセプターであればよい。市販の抗ＴＮＦα生物学的製剤としては、例えば、ゴリムマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト等が挙げられる。
【００３０】
本発明の予測方法では、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与開始前に被験者から血液を採取し、採取した血液（好ましくは、血清）の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定する。被験者から血液を採取するタイミングは、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与開始前であれば特に限定されないが、通常、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与開始直前（投与開始時）である。
【００３１】
本発明の予測方法では、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与開始前に被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度が高ければ、被験者における抗ＴＮＦα生物学的製剤の反応性が高く、抗ＴＮＦα生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果が高いと予測することができる。具体的には、本発明の予測方法では、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与開始前に被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度が高ければ、抗ＴＮＦα生物学的製剤投与後の被験者のＤＡＳ２８−ＣＲＰが低下する。
【００３２】
本発明の予測方法において、被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度が高い場合とは、例えば、複数の被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度の平均値よりも高い可溶性ＦＲβの血中濃度を有する場合をいう。下記の実施例においては、平均値よりも高い可溶性ＦＲβの血中濃度を有する被験者は、１９．０ｎｇ／ｍｌ以上の可溶性ＦＲβの血中濃度を有する。
【００３３】
３．抗ＴＮＦα生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を評価する方法
本発明は、関節リウマチに罹患している被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定することを特徴とする、抗ＴＮＦα生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果を評価する方法にも関する。
【００３４】
本発明の評価方法では、関節リウマチに罹患している被験者に抗ＴＮＦα生物学的製剤を投与した後に被験者の血液を採取し、該血液（好ましくは、血清）の可溶性ＦＲβの血中濃度を測定する。被験者から血液を採取するタイミングは、抗ＴＮＦα生物学的製剤を投与した後であれば特に限定されないが、例えば、抗ＴＮＦα生物学的製剤投与後３ヶ月である。
【００３５】
被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度は、上記の通りにして測定することができる。
【００３６】
本発明の評価方法によってその治療効果を評価可能な抗ＴＮＦα生物学的製剤は、ＴＮＦαを抗原として認識し、ＴＮＦαと結合する可変領域を有する抗体、もしくはＴＮＦα特異的なリセプターであればよい。市販の抗ＴＮＦα生物学的製剤としては、例えば、ゴリムマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト等が挙げられる。
【００３７】
本発明の評価方法では、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与後に被験者から採取した血液の可溶性ＦＲβの血中濃度が投与前と比較して低ければ、被験者における抗ＴＮＦα生物学的製剤の反応性が高く、抗ＴＮＦα生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果が高いと評価することができる。本発明の評価方法では、また、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与後に被験者から採取した血液のＦＲβの血中濃度が投与前と比較して低いほど、抗ＴＮＦα生物学的製剤の関節リウマチに対する治療効果が高いと評価することができる。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）抗ＦＲ抗体の作成
ヒトＦＲβ遺伝子を含むベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ）は、Ｎａｇａｙｏｓｈｉらの方法(Nagayoshi Rら、Arthritis Rheum. 2005 Sep;52(9):2666-75)に従って作製した。次に、ラットＲＢＬ２Ｈ３細胞及びマウスＢ３００−１９細胞に遺伝子導入した。すなわち、予め１×１０５個に調整した各細胞に、２０μＬのリポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と混和したＦＲβ遺伝子含有ベクター１μｇを加え、細胞に添加した。遺伝子導入されたＢ３００−１９マウス細胞は抗生物質Ｇ４１８耐性を獲得するため、１ｍｇ／ｍＬの濃度のＧ４１８を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。
【００３９】
１×１０７に調整した抗ＦＲβ発現細胞を１００μｌの完全フロイントアジュバントに懸濁し、Ｗｉｓｔｅｒラットの足底に免疫した。モノクローナル抗体の作製はＫｏｈｌｅｒの方法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６）に従って行った。すなわち、１６日後に腹腔内リンパ節から得られた抗体産生細胞と骨髄腫由来のＮＳ１細胞を４対１の比で混ぜ、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）にて融合させ、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマは、１０％ＦＢＳ，１％ＨＡＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＩＭＤＭメディウム（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）細胞培養液にて培養した。培養上清中に分泌された抗体の中で、先のＦＲβ発現細胞やＦＲα発現ＫＢ細胞株（Ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）に反応するものを選別した。抗体産生が認められたハイブリドーマのクローン化は、９６穴プレートの各穴当たり１細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。
【００４０】
クローン化したハイブリドーマを用いた抗体の採取は、１０％ＦＣＳ、１０％ＮＣＴＣ−１０９メディウム（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＨＴ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ）及び１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ  Ｍｉｘｅｄ（Ｎａｋａｒａｉ）を含むＩＭＤＭメディウム（Ｇｉｂｃｏ）で培養し、ヤギ抗ラット免疫グロブリンアガロース（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）で精製した。
【００４１】
このようにして、ＦＲβに特異的なクローン（クローン名：Ｎｏ．２）の精製抗体（抗ヒトＦＲβラットモノクローナル抗体：以下、「抗体Ｎｏ．２」と称する）と、ＦＲαとＦＲβの双方に反応するクローン（クローン名：Ｎｏ．５）の精製抗体（抗ヒトＦＲラットモノクローナル抗体：以下、「抗体Ｎｏ．５」と称する）が得られた。
【００４２】
［抗体Ｎｏ．２と抗体Ｎｏ．５の抗体遺伝子の決定］
抗体Ｎｏ．２と抗体Ｎｏ．５を産生するラットハイブリドーマクローンを１×１０７個にそれぞれ調整し、ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃＤＮＡを合成した。次に、Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅ  Ｋｉｔ及びラット抗体重鎖領域のクローニング用にデザインしたプライマー：caccatggagttacttttgag（配列番号３７）を用い、重鎖（以後「ＶＨ」）及び軽鎖（以後「ＶＬ」）の遺伝子をＰＣＲにて増幅させた。
【００４３】
増幅したＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のＰＣＲ産物をプラスミドＰＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、大腸菌（ＴＯＰ１０Ｆ’）に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子の塩基配列を決定した。塩基配列の決定はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（ＡＢＩ）を用いてＰＣＲを行い、ＡＢＩ  ３１０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにて解析した。
【００４４】
このようにして、抗体Ｎｏ．２の抗体遺伝子として、ＶＨ遺伝子（塩基配列：配列番号７及びその対応アミノ酸配列：配列番号８）、ＣＤＲＨ１遺伝子（塩基配列：配列番号１及びその対応アミノ酸配列：配列番号２）、ＣＤＲＨ２遺伝子（塩基配列：配列番号３及びその対応アミノ酸配列：配列番号４）及びＣＤＲＨ３遺伝子（塩基配列：配列番号５及びその対応アミノ酸配列：配列番号６）、並びにＶＬ遺伝子（塩基配列：配列番号１５及びその対応アミノ酸配列：配列番号１６）、ＣＤＲＬ１遺伝子（塩基配列：配列番号９及びその対応アミノ酸配列：配列番号１０）、ＣＤＲＬ２遺伝子（塩基配列：配列番号１１及びその対応アミノ酸配列：配列番号１２）及びＣＤＲＬ３遺伝子（塩基配列：配列番号１３及びその対応アミノ酸配列：配列番号１４）を決定した。また、抗体Ｎｏ．５の抗体遺伝子として、ＶＨ遺伝子（塩基配列：配列番号２３及びその対応アミノ酸配列：配列番号２４）、ＣＤＲＨ１遺伝子（塩基配列：配列番号１７及びその対応アミノ酸配列：配列番号１８）、ＣＤＲＨ２遺伝子（塩基配列：配列番号１９及びその対応アミノ酸配列：配列番号２０）及びＣＤＲＨ３遺伝子（塩基配列：配列番号２１及びその対応アミノ酸配列：配列番号２２）、並びにＶＬ遺伝子（塩基配列：配列番号３１及びその対応アミノ酸配列：配列番号３２）、ＣＤＲＬ１遺伝子（塩基配列：配列番号２５及びその対応アミノ酸配列：配列番号２６）、ＣＤＲＬ２遺伝子（塩基配列：配列番号２７及びその対応アミノ酸配列：配列番号２８）及びＣＤＲＬ３遺伝子（塩基配列：配列番号２９及びその対応アミノ酸配列：配列番号３０）を決定した。
【００４５】
［抗体Ｎｏ．２とＮｏ．５のフローサイトメーター（ＦＡＣＳ）によるＦＲα及びＦＲβに対する反応の実験］
１×１０５に調整したＦＲα発現ＫＢ細胞とＦＲβ発現Ｂ３００−１９細胞に、終濃度１μｇ／ｍｌとなるように調整した抗体Ｎｏ．２、抗体Ｎｏ．５、陰性対照抗体（ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＲａｔＩｇＧ２ａ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を反応させた。更にＡＰＣでラベルした抗ラット抗体で更に反応させた。反応終了後の染色性をフローサイトメーターで測定した。図１に示すように、抗体Ｎｏ．５はＦＲβ発現Ｂ３００−１９細胞とＦＲα発現ＫＢ細胞のいずれにも反応するのに対し（図１（Ａ））、抗体Ｎｏ．２はＦＲβ発現Ｂ３００−１９細胞のみに反応した（図１（Ｂ））。
【００４６】
（実施例２）ヒト関節リウマチ血清中の可溶性ＦＲβの測定
［Ｆ（ａｂ’）２断片化Ｎｏ．５抗体の作製］
関節リウマチ患者の血中に存在するリウマチ因子は、抗体のＦｃ領域に結合する性質をもつ理由から、サンドイッチＥＬＩＳＡ法で可溶性ＦＲβをプレート上で捕捉する抗体Ｎｏ．５のＦ（ａｂ’）２断片化を行った。まず、得られたハイブリドーマ培養液１Ｌを２ｍｌのヤギ抗ラットＩｇＧ−ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）にｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐを用いて一晩反応させた後、グリシンバッファー（０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ２．４）３ｍｌにて抗体Ｎｏ．５を溶出し０．５ｍｇの抗体を得た。この操作を１０回行い、合計で５ｍｇの抗体を得た。
【００４７】
精製した抗体Ｎｏ．５は酢酸緩衝液（０．０７Ｍ  Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％ＮａＮ３）を用いて５ｍｇ／ｍｌの終濃度で調整後、１５ｍｇのｐｅｐｓｉｎ−ａｇａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）（ペプシンとして０．６ｍｇ）を加え、３７℃で１８時間反応させ、抗体Ｎｏ．５のＦ（ａｂ’）２断片化を行った。反応終了後、ゲル濾過クロマトグラフィーＴＳＫ−ＳＷ３０００（Ｔｏｓｏｈ）にてＦ（ａｂ’）２を精製した（以後、Ｆ（ａｂ’）２断片化Ｎｏ．５抗体を「キャプチャー抗体」と称する）。
【００４８】
［ビオチン化抗ＦＲβ抗体の作成］
Ｎｏ．２ハイブリドーマの得られた培養液１Ｌを、２ｍｌのヤギ抗ラットＩｇＧ−ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｎｃ．，Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）にｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐを用いて一晩反応させた後、グリシンバッファー（０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ、０．１５Ｍ  Ｎａｃｌ、ｐＨ２．４）３ｍｌにて抗体Ｎｏ．２を溶出し、０．３ｍｇの抗体を得た。この操作を５回行い、合計で１．５ｍｇの抗体Ｎｏ．２を得た。
【００４９】
精製した抗体Ｎｏ．２はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて５ｍｇ／ｍｌの終濃度で調整後、１ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、４℃で１８時間反応させた。遊離したビオチンは脱塩カラム（ＰＤ−１０，ＧＥ社）にて除去した（以後、ビオチン化Ｎｏ．２抗体を「検出抗体」と称する）。
【００５０】
［検出抗体のＦＲβ発現細胞に対する反応性］
検出抗体のＦＲβ発現細胞に対する反応性を、キャプチャー抗体存在下にてフローサイトメータで測定した。すなわち、１×１０５に調整したＦＲβ発現Ｂ３００−１９細胞に、ビオチン化Ｎｏ．２抗体に加えてＦ（ａｂ’）２断片化Ｎｏ．５抗体を反応させた。反応後、ＡＰＣラベル化ストレプトアビジン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を加え、ビオチン−ストレプトアビジンの反応を行った。反応終了後の染色性をフローサイトメーターで測定した。図１（Ｃ）より、検出抗体はキャプチャー抗体の存在下においても図１（Ｂ）と同等の結果が得られた。これより、抗体Ｎｏ．２と抗体Ｎｏ．５が認識するＦＲβのエピトープ領域はそれぞれ異なっていることが示唆された。
【００５１】
［可溶性ＦＲβ蛋白の作製］
関節リウマチ滑膜マクロファージから得られたｃＤＮＡ（Ｎａｇａｙｏｓｈｉ  Ｒら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．  ２００５  Ｓｅｐ；５２（９）：２６６６−７５）は、以下のプライマー：5’-agaaagacatggtctggaaatggatg-3’(upstream)（配列番号３８）、5’-tcaattcacatgcatggctgcagcatagaacc-3’(downstream)（配列番号３９）（ＦＲβのアミノ酸残基１−２３０を含む）にて増幅し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に組み込んだ。そのＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｉｎｓｅｒｔをさらにｐＢａｃＰＡＫ９  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）に組み込んだ。Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ液に溶かしたｐＢａｃＰＡＫ９−ＦＲβ（１００ｎｇ／μｌ）５μｌとＢａｃＰＡＫ６  ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）５μｌ、滅菌水８６μｌを混ぜ、さらにＢａｃｆｅｃｔｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃ）４μｌを加え混ぜ１５分静置の後、３５ｍｍ組織培養ディッシュに予めＢａｃＰＡＫ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ１．５ｍｌで単層培養しておいたｓｆ２１細胞（約１×１０６細胞数）をＢａｃＰＡＫ  Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）２ｍｌに置き換え加えたディッシュに加え、２７℃で５時間培養した。その後、１．５ｍｌのＢａｃＰＡＫ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍを加え、２７℃で５日間培養後に培地を回収した。ｓｆ２１細胞の継代培養には液体窒素から凍結した細胞バイアルを取出し、２５ｍｌのフラスコに５ｍｌのＢａｃＰＡＫ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍにて２７℃の条件で８０から９０％コンフルエンシー（約４日間）になるまで培養した。組み換えウイルスの単離は次のように行った。１×１０６のｓｆ２１細胞を単層培養した３５ｍｍのディッシュの培地を除き、１ｍｌのウイルス希釈液（ＢａｃＰＡＫ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍにて１０、１０２、１０３倍に希釈）を加え、１時間室温で培養し、３７℃に冷ました２％ＳｅａＰｌａｑｕｅアガロースを含む蒸留水液に、等量のＢａｃＰａｃｋ  Ｃｏｍｐｌｅｔ  Ｍｅｄｉｕｍを混合し、その１．５ｍｌをウイルス接種液を除去した単層細胞に重層した。重層後さらに、１．５ｍｌのＢａｃＰＡＫ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍを加え、２７℃で７日間培養した。培養終了後、１ｍｌの０．０３％ニュートラルレッドを含むＰＢＳを加え、２７℃で３時間培養した。培養終了後、ニュートラルレッド液を除去し、ディッシュを倒置し、室温、暗所にて一晩放置した。次に、パスツールピペットを用いてプラークを採取し、０．５ｍｌのＢａｃＰＡＫ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍを含むミニセントリフージチューブに移した。プラークは合計１０個採取し、各チューブはボルテックスで縣濁し、室温、暗所にて一晩放置した。翌日、プラークピックを５×１０５のｓｆ２１細胞を付着させたディッシュに感染させ、２７℃で４日間培養した。この培養液を１回継代ウイルスストックとした。１００μｌの１回継代ウイルスストックを各ディッシュのｓｆ２１細胞に感染させ、上記のようにプラーク形成を行った。ウイルスの力価の測定の計算は、各��ィッシュのプラーク数の１０希釈倍数で行った。１回継代ウイルスストックの力価は３×１０７Ｐｌａｑｕｅ  Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｕｎｉｔ／ｍｌであった。
【００５２】
この１回継代ウイルスストックを用いて、リコンビナントＦＲβ蛋白の産生を行った。Ｍ．Ｏ．Ｉ．（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）１０の力価のウイルスストック１．１ｍｌを７５ｃｍ２培養ディッシュに４×１０６に調整したｓｆ２１細胞に感染させ、１０ｍｌのＢａｃＰａＫ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍを加え、２７℃で２日間培養することにより、培養上清にＦＲβ蛋白を産生させた。１００ｍｌの培養上清をＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ）に抗体Ｎｏ．５を固相化させた抗ＦＲβ抗体アフィニティ―カラムにて精製し、１ｍｇのリコンビナントＦＲβ蛋白を得た。精製蛋白の純度は７．５−１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し９０％以上であった。
【００５３】
［可溶性ＦＲβの測定］
（１）キャプチャー抗体の固相化とブロッキング：キャプチャー抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度に、リン酸バッファー、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）にて調整し、ＥＬＩＳＡ用９６穴マイクロプレート（マキシソープ，Ｔｈｅｒｍｏ）の各ウェルに１００μｌ加え、室温にてオーバーナイトでインキュベートしてキャプチャー抗体をウェルに固相化させた。その後、各ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。洗浄後、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むＰＢＳを加え、室温にて３０分間反応させて各ウェルのブロッキングを行った。ブロッキング終了後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。
【００５４】
（２）サンプル（標準可溶性ＦＲβ蛋白、関節リウマチ患者血清）の反応：標準可溶性ＦＲβ蛋白は、９００、３００、１００、３３、１１μｇ／ｍｌの濃度となるように１０％のＦＢＳを含むＰＢＳで調整し、関節リウマチ患者血清サンプルは同溶液で２倍に希釈して調整した。調整後、各サンプル１００μｌを各ウェルに加え、室温にて３時間反応させた。反応終了後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。
【００５５】
（３）検出抗体の添加と発色：検出抗体を１μｇ／ｍｌの濃度となるように１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで調整後、１００μｌを各ウェルに添加し、室温にて２時間反応させた。反応終了後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。洗浄後、ＰＢＳで１０００倍に希釈したストレプトアビジンペルオキシダーゼ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｈ，ＭＤ）を各ウェルに１００μｌを添加し、室温にて１時間反応させた。反応終了後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで４回洗浄し、さらにＰＢＳで１回洗浄した。洗浄後、１００μｌのＡＢＴＳ溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を加えて発色を行った。各ウェルの発色は４０５ｎｍの吸光度をｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて測定した。発色時間は標準ＦＲβ蛋白９００μｇ／ｍｌ溶液の吸光度が２．０から３．０になる範囲にした。可溶性ＦＲβ値は標準蛋白の吸光度を片対数グラフにブロットし、この曲線から血清の可溶性ＦＲβ値を推定した（図２）。
【００５６】
［抗ＴＮＦα生物学的製剤治療における関節リウマチ患者血清の可溶性ＦＲβの測定］
関節リウマチ患者（１０名）で抗ＴＮＦα生物学的製剤（インフリキシマブ、エタネルセプト）の投与開始時及び投与後３ヶ月に採取した血清の可溶性ＦＲβ値を測定した。抗ＴＮＦα生物学的製剤投与開始時における可溶性ＦＲβ濃度の最大値は２２ｎｇ／ｍｌで最小値は１６ｎｇ／ｍｌ、平均値は１８．９ｎｇ／ｍｌであった。
【００５７】
最初に血中の可溶性ＦＲβ濃度における抗ＴＮＦα生物学的製剤の治療効果の予測を検討した。まず、平均値よりも高値を示した４名の患者を高値群とし、残りの６名を低値群としてグループ化を行った後、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与開始時及び投与後３ヶ月における関節炎の臨床症状スコア（ＤＡＳ２８−ＣＲＰ）と抗ＴＮＦα生物学的製剤の反応性を比較した（図３）。図３より、可溶性ＦＲβが高値を示した高値群の４名の患者のすべてが抗ＴＮＦα生物学的製剤に反応し、低値群の６名の患者のうち、３名が抗ＴＮＦα生物学的製剤に反応した。
【００５８】
次に、抗ＴＮＦα生物学的製剤の治療効果を評価する目的で、抗ＴＮＦα生物学的製剤の投与開始時及び投与後３ヶ月における血中の可溶性ＦＲβ濃度を、抗ＴＮＦα生物学的製剤の反応患者と無反応患者で比較した（図４）。図４において、投与後３ヶ月で、３例の患者がＦＲβ濃度２１ｎｇ／ｍｌで重なっており（「３例」と表示）、２例の患者がＦＲβ濃度１４ｎｇ／ｍｌで重なっている（「２例」と表示）。また、図４において、２例の反応患者が、投与開始時のＦＲβ濃度１８ｎｇ／ｍｌ及び投与３ヶ月後のＦＲβ濃度１４ｎｇ／ｍｌで重なっており、２例の無反応患者が、投与開始時のＦＲβ濃度１８ｎｇ／ｍｌ及び投与３ヶ月後のＦＲβ濃度２１ｎｇ／ｍｌで重なっている。図４より、抗ＴＮＦα生物学的製剤が反応した患者７例のうち６例が投与後３ヶ月で可溶性ＦＲβ濃度が低下した。一方、無反応患者では可溶性ＦＲβ濃度が増加した。
【００５９】
以上の結果から、血中の可溶性ＦＲβ濃度の測定は、抗ＴＮＦα生物学的製剤の治療効果の予測及び評価において有用なことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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