(57)【要約】【課題】高額な設備投資を必要とせず、一般的な細胞観察に用いられる汎用的な顕微鏡を用い、時間的および空間的に高解像で接着細胞の縦断面および斜め断面を観察することができる顕微鏡観察用部材、及び、該顕微鏡観察用部材を用いて簡便に接着細胞の縦断面および斜め断面を観察することができる細胞観察方法を提供する。【解決手段】本発明の顕微鏡観察用部材は、略平坦な第１壁と、前記第１壁に対して４５度〜１３５度の角度で配置された第２壁とを少なくとも備える、細胞の縦断面の観察に用いる顕微鏡観察用部材であって、前記第１壁の厚みが、１０〜２００μｍであり、前記第１壁が、細胞の光学的な観察を許容させる光学的透明度を有し、前記第１壁および前記第２壁によって画定される細胞懸濁液収容区画を有し、前記第２壁の内表面に細胞を接着させて、前記第２壁の内表面に接着した細胞の縦断面の観察に用いる、ことを特徴とする。【選択図】図２
2016131500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
略平坦な第１壁と、前記第１壁に対して４５度〜１３５度の角度で配置された第２壁とを少なくとも備える、細胞の縦断面の観察に用いる顕微鏡観察用部材であって、
前記第１壁の厚みが、１０〜２００μｍであり、
前記第１壁が、細胞の光学的な観察を許容させる光学的透明度を有し、
前記第１壁および前記第２壁によって画定される細胞懸濁液収容区画を有し、
前記第２壁の内表面に細胞を接着させて、前記第２壁の内表面に接着した細胞の縦断面の観察に用いる、
ことを特徴とする、顕微鏡観察用部材。
【請求項２】
該第１壁と略平行に対向する第３壁を更に備える請求項１に記載の顕微鏡観察用部材。
【請求項３】
前記第１壁及び／又は前記第３壁に、前記細胞懸濁液収容区画に連通した開口部を１つ備える、請求項２に記載の顕微鏡観察用部材。
【請求項４】
前記第１壁及び／又は前記第３壁に、前記細胞懸濁液収容区画に連通した開口部を２つ備える、請求項２又は３に記載の顕微鏡観察用部材。
【請求項５】
前記第１壁が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の顕微鏡観察用部材。
【請求項６】
前記第２壁の高さが、１０〜２００μｍである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の顕微鏡観察用部材。
【請求項７】
前記第２壁の内表面に、細胞接着用の足場がコーティングした、請求項１〜６のいずれか１項に記載の顕微鏡観察用部材。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の顕微鏡観察用部材を用いた細胞観察方法であって、
前記顕微鏡観察用部材の前記細胞懸濁液収容区画に、細胞懸濁液を注入する細胞懸濁液注入工程と、
該細胞懸濁液注入工程の後に、前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記第２壁の内表面に接着させる細胞接着工程と、
該細胞接着工程の後に、前記顕微鏡観察用部材を顕微鏡の試料台に配置する顕微鏡観察用部材配置工程と、
該顕微鏡観察用部材配置工程の後に、前記第２壁の内表面に接着した細胞を第１壁に対して垂直な方向から顕微鏡で観察する細胞観察工程と、
を含むことを特徴とする、細胞観察方法。
【請求項９】
前記細胞観察工程で観察する細胞が、蛍光色素若しくは発光色素を取り込ませた細胞、又は蛍光成分若しくは発光成分を発現する細胞である、請求項８に記載の細胞観察方法。
【請求項１０】
前記細胞接着工程の後で前記細胞観察工程の前に、接着していない細胞を洗い流す非接着細胞洗い流し工程を更に含む、請求項８又は９に記載の細胞観察方法。
【請求項１１】
前記顕微鏡が、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の細胞観察方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡観察用部材及び該顕微鏡観察用部材を用いた細胞観察方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラスボトムディッシュ等に付着性細胞を播種すると、付着性細胞はディッシュ底面上に平面的（二次元的）に広がって接着する。接着細胞のイメージング方法としては、倒立型の顕微鏡を用いて二次元的に観察するのが一般的である。しかし、細胞接着面に対して垂直方向の細胞および細胞内構造を観察し解析する場合は、上記方法では難しい。斯かる観察には、主に共焦点顕微鏡が用いられる。共焦点顕微鏡では、細胞接着面に対して水平方向の多数の二次元スライス画像から三次元情報を構築し、計算機上で細胞接着面に対して垂直方向のスライス画像を再構築して得るのが一般的である。したがって、共焦点顕微鏡を用いる場合、細胞接着面の水平方向のスライス画像は高解像度であるが、細胞接着面に対して垂直方向のスライス画像は、空間解像度が劣ってしまう。また、細胞接着面に対して垂直方向のスライス画像を再構築するには、多くの水平画像を取得する時間を要するため、高速で起こる現象をとらえたり、リアルタイムで観察したりすることは困難である。
斯かる課題に対し、顕微鏡側の性能を向上させる取り組みがされているが、特殊な顕微鏡は複雑かつ高額となることから、複雑かつ高額な設備投資費用が必要となる（例えば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−２１５５８２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、高額な設備投資を必要とせず、一般的な細胞観察に用いられる汎用的な顕微鏡を用い、時間的および空間的に高解像で接着細胞の縦断面および斜め断面を観察することができる顕微鏡観察用部材、及び、該顕微鏡観察用部材を用いて簡便に接着細胞の縦断面および斜め断面を観察することができる細胞観察方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の顕微鏡観察用部材は、略平坦な第１壁と、前記第１壁に対して４５度〜１３５度の角度で配置された第２壁とを少なくとも備える、細胞の縦断面の観察に用いる顕微鏡観察用部材であって、前記第１壁の厚みが、１０〜２００μｍであり、前記第１壁が、細胞の光学的な観察を許容させる光学的透明度を有し、前記第１壁および前記第２壁によって画定される細胞懸濁液収容区画を有し、前記第２壁の内表面に細胞を接着させて、前記第２壁の内表面に接着した細胞の縦断面の観察に用いることを特徴とする。
本発明の顕微鏡観察用部材によれば、高額な設備投資を必要とせず、一般的な細胞観察に用いられる汎用的な顕微鏡を用い、時間的および空間的に高解像で接着細胞の縦断面および斜め断面を観察することができる。
【０００６】
本明細書において、「細胞の縦断面」は、細胞が壁に接着する接着面に対して垂直面で細胞をスライスしたときに得られる細胞の断面を意味する。
本明細書において、「細胞の斜め断面」は、細胞が壁に接着する接着面に対して斜め方向の面で細胞をスライスしたときに得られる細胞の断面を意味する。
本明細書において、「第２壁の高さ」は、顕微鏡観察用部材の第１壁に対して垂直方向の前記顕微鏡観察用部材の厚みから、前記第１壁の厚み（後述する第３壁を備える場合には、第１壁の厚みと第３壁の厚みとの和）を差し引いた残りの長さを意味する。
本明細書において、「光学的な観察を許容させる光学的透明度」は、第１壁の全光線透過率をＪＩＳＫ７３６１−１法に基づいて測定したときに、例えば８０％以上となることを意味する。
本明細書において、「略垂直」は、完全に垂直な状態の他、±１０度程度の角度範囲で垂直からずれている状態も含む。
本明細書において、「略平行」は、完全に平行な状態の他、±１０度程度の角度範囲で平行からずれている状態も含む。
【０００７】
本発明の顕微鏡観察用部材は、該第１壁と略平行に対向する第３壁を更に備えることが好ましい。
この構成によれば、細胞懸濁液を細胞懸濁液収容区画に注入した後に、顕微鏡用観察用部材を斜め又は垂直に傾けたときに、細胞懸濁液がこぼれるのを防ぐことができ、また、細胞懸濁液収容区画の細胞懸濁液が蒸発するのを防ぐことができる。
【０００８】
本発明の顕微鏡観察用部材は、前記第１壁及び／又は前記第３壁に、前記細胞懸濁液収容区画に連通した開口部を１つ備えることが好ましい。
この構成によれば、ピペット等を用いて開口部から細胞懸濁液を細胞懸濁液収容区画へ注入することができる。
【０００９】
本発明の顕微鏡観察用部材は、前記第１壁及び／又は前記第３壁に、前記細胞懸濁液収容区画に連通した開口部を２つ備えることが好ましい。
この構成によれば、一方の開口部から細胞懸濁液を注入するときに、もう一方の開口部がガス抜き口となり、細胞懸濁液収容区画への細胞懸濁液の注入が容易となる。
【００１０】
本発明の顕微鏡観察用部材は、前記第１壁が、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）からなることが好ましい。
この構成によれば、前記顕微鏡観察用部材をソフトリソグラフィ法によって作製することが可能となる。また、ポリジメチルシロキサンは透明性が高く、他の弾性透明樹脂に比べて毒性が低いことから、細胞を接着させて光学的に観察するための顕微鏡観察用部材の材質として好適である。
【００１１】
本発明の顕微鏡観察用部材は、前記第２壁の高さが、１０〜２００μｍであることが好ましい。
この構成によれば、第２壁の内表面において第１壁に対して垂直方向に数個の細胞を付着させることができ、第１壁に対して垂直方向で接着する細胞数を少なすぎず多すぎず調節することができる。また、細胞が過剰に接着することによる弊害、例えば、顕微鏡観察での光の減弱を防ぐことができる。
【００１２】
本発明の顕微鏡観察用部材は、前記第２壁の内表面に、細胞接着用の足場がコーティングされたことが好ましい。
この構成によれば、足場の種類を適宜変更することによって、多種類の細胞に対応した顕微鏡観察用部材となる。
【００１３】
本発明の細胞観察方法は、本発明の顕微鏡観察用部材を用いた細胞観察方法であって、前記顕微鏡観察用部材の前記細胞懸濁液収容区画に、細胞懸濁液を注入する細胞懸濁液注入工程と、該細胞懸濁液注入工程の後に、前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記第２壁の内表面に接着させる細胞接着工程と、該細胞接着工程の後に、前記顕微鏡観察用部材を顕微鏡の試料台に配置する顕微鏡観察用部材配置工程と、該顕微鏡観察用部材配置工程の後に、前記第２壁の内表面に接着した細胞を第１壁と垂直な方向から顕微鏡で観察する細胞観察工程と、を含むことを特徴とする。
本発明の細胞観察方法によれば、本発明の顕微鏡観察用部材を用いて簡便に接着細胞の縦断面を観察することができる。なお「底側」とは、重力方向下側を意味する。
【００１４】
本発明の細胞観察方法は、前記細胞観察工程で観察する細胞が、蛍光色素若しくは発光色素を取り込ませた細胞又は蛍光成分若しくは発光成分を発現する細胞であることが好ましい。
この構成によれば、蛍光色素を利用して細胞の内外に存在する様々な生体分子（細胞内器官、細胞内タンパク質等）の局在を光学的に観察することができる。
【００１５】
本発明の細胞観察方法は、前記細胞接着工程の後で前記細胞観察工程の前に、接着していない細胞を洗い流す非接着細胞洗い流し工程を更に含むことが好ましい。
この構成によれば、細胞観察工程において、接着していない細胞による影響を低減して観察することができる。
【００１６】
本発明の細胞観察方法は、前記顕微鏡が、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡であるのが好ましい。
この構成によれば、蛍光成分を利用して細胞内器官、細胞内タンパク質等の局在を光学的に観察することができる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、高額な設備投資を必要とせず、一般的な細胞観察に用いられる汎用的な顕微鏡を用い、時間的および空間的に高解像で接着細胞の縦断面および斜め断面を観察することができる顕微鏡観察用部材、及び、該顕微鏡観察用部材を用いて簡便に接着細胞の縦断面および斜め断面を観察することができる細胞観察方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の顕微鏡観察用部材の一実施形態を示す、図２のＡ−Ａ線に沿う断面図である。
【図２】図２は、本発明の顕微鏡観察用部材の一実施形態を示す斜視図である。
【図３】図３は、本発明の顕微鏡観察用部材を用いた細胞観察方法の一実施形態を説明するための図であり、図３（ａ）は細胞注入工程、図３（ｂ）は細胞接着工程、図３（ｃ）は顕微鏡観察用部材配置工程及び細胞観察工程を示す。
【図４】図４は、本発明の顕微鏡観察用部材を用いて倒立型顕微鏡で撮影した細胞の縦断面の明視野画像である。
【図５】図５は、本発明の顕微鏡観察用部材を用いて共焦点顕微鏡で撮影した細胞の縦断面画像である。図５（ａ）は、明視野像（微分干渉像）による接着細胞の縦断面画像であり、図５（ｂ）は、ＤｉＩにより細胞膜を染色した際の蛍光像である。
【図６】図６は、本発明の顕微鏡観察用部材とは異なる比較例の部材を用いて得られた倒立顕微鏡で撮影した細胞集団の水平面画像である。
【図７】図７は、本発明の顕微鏡観察用部材とは異なる比較例の部材を用いて得られた、共焦点顕微鏡で撮影した細胞の画像である。図７（ａ）は、共焦点顕微鏡でＺ方向に３μｍ間隔で１７枚のスライス画像を取得し、ＺＥＮ２０１２ソフトウェアを用いて三次元の断面を再構築した画像であり、図７（ｂ）は、Ｚ方向に撮影した細胞のスライス画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明を実施するための形態を例示する。
【００２０】
（顕微鏡観察用部材の構造）
以下に、図面を参照しながら本発明の一実施形態に係る顕微鏡観察用部材について説明する。
図１は、本発明の顕微鏡観察用部材の一実施形態を示す、図２のＡ−Ａ線に沿う断面図であり、図２は、本発明の顕微鏡観察用部材の一実施形態を示す斜視図である。
図示例の顕微鏡観察用部材１は、第１壁２と、該第１壁２と略垂直に配置された第２壁３と、第１壁２と略平行に対向する第３壁４と、を備えている。より具体的には、本例では図１に示すように、第１壁２の外面、第１壁２の内面、第３壁４の外面及び第３壁４の内面が、互いに平行であり、第１壁２の外面、第１壁２の内面、第３壁４の外面及び第３壁４の内面と垂直な、第２壁３の外面、第２壁３の内面を有する。図示例の顕微鏡観察用部材１は、第１壁２および第２壁３によって画定される細胞懸濁液収容区画５を有し、第３壁４は、細胞懸濁液収容区画５に連通した開口部６を２つ備えている。
図１には、第１壁２の厚みＬ1、第３壁４の厚みＬ2、第２壁３の高さＷを示す。図示例では、第２壁３の高さＷは、第１壁２に対して垂直方向の顕微鏡観察用部材の厚みから、第１壁２の厚みＬ1と第３壁４の厚みＬ2との和を差し引いた残りの長さとなる。
【００２１】
図示例の顕微鏡観察用部材１は、第３壁４を備えているが、本発明の顕微鏡観察用部材は、第３壁を備えなくともよい。
図示例の顕微鏡観察用部材１は、細胞懸濁用収容区画５が直方体に画定されているが、本発明の顕微鏡観察用部材の細胞懸濁用収容区画は、円柱でも直方体以外の角柱であってもよい。
図示例の顕微鏡観察用部材１は、第３壁４に２つの開口部６を備えているが、本発明の顕微鏡観察用部材は、１つ又は３つ以上の開口部を備えていてもよい。また、開口部は第１壁に備えていてもよい。開口部を複数備える場合は、それぞれの開口部が共通の細胞懸濁液収容区画に連通するのがよい。
なお、図示をしていないが、例えば、図１及び２に示す顕微鏡観察用部材１を１つの単位として、複数単位を１枚のプレートに配置させることもできる。
【００２２】
＜第１壁＞
上記第１壁は、細胞の光学的な観察を許容させる光学的透明度を有する。
【００２３】
＜＜第１壁の材質＞＞
上記第１壁の材質としては、細胞の光学的な観察を許容させる光学的透明度を有する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シリコーン樹脂、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）、ＡＢＳ樹脂（アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン共重合合成樹脂）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ガラス、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、シリコーン樹脂のポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、ソフトリソグラフィ法による作製が可能となる点、短時間低価格で作製が可能であり、多様な表面改質が可能であり、可視光領域での透明性が高く、自家蛍光も持たず、他の弾性透明樹脂に比べ毒性が低い点で有利である。また、ポリジメチルシロキサンの屈折率（１．４１）は、通常の細胞観察に用いられるスライドガラスやカバーガラスの屈折率（一般的に１．５２）と近い点で有利である。
【００２４】
−ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）−
上記ポリジメチルシロキサンとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、下記式（１）で表されるポリジメチルシロキサン、ポリジメチルシロキサンの両末端、片末端または側鎖のメチル基を他の官能基で置換した変性ポリジメチルシロキサン、分子内に電離放射線硬化性基が導入された変性ポリジメチルシロキサン、ポリエステル変性ポリジメチルシロキサン、ポリエーテル変性ポリジメチルシロキサン、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【化１】
2016131500.tif 000003
（式（１）中、ｎは０〜２０００の整数である。）
【００２５】
＜＜第１壁の厚み＞＞
上記第１壁の厚みとしては、１０〜２００μｍである限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０〜１００μｍが好ましく、１０〜８０μｍがより好ましい。
前記第１壁の厚みが１０μｍ以上であると、顕微鏡観察用部材としての強度を確保でき、２００μｍ以下であると、開口数の大きい対物レンズを備える顕微鏡で観察が可能となる。一般的にレンズの開口数が大きいと、レンズの作動距離は短くなる。第１壁の厚みは、レンズの作動距離よりも短い必要である。したがって、第１壁の厚みが２００μｍ以下であると、作動距離が短く開口数の大きいレンズでの観察に用いることが可能となる。第１壁の厚みが２００μｍを超えると、使用できる対物レンズが制限されることがある。
一般的に光学顕微鏡の性能は、使用する光の波長と対物レンズの分解能に大きく影響され、微細なパターン等を観察するには分解能の高い対物レンズを用いて観察する必要がある。分解能は、対物レンズの開口数に大きく依存する。ところが、開口数が大きい対物レンズは、作動距離が短くなるため、対物レンズと細胞との距離を短くすることが必要となる。したがって、第１壁の厚みが薄いほど、細胞と対物レンズとの距離を短くすることができ、分解能を高くして観察することが可能となる。
例えば、前記第１壁の厚みが５００μｍ以上であると、開口数の大きい対物レンズを用いた観察ができなくなり、開口数が小さく低分解能の対物レンズでしか観察することができないため、高解像度の細胞縦断面を観察できなくなることがある。
【００２６】
＜＜光学的透明度＞＞
上記光学的透明度としては、細胞の光学的な観察を許容させる光学的透明度である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ＪＩＳＫ７３６１−１法に基づいて第１壁の全光線透過率を測定したときに８０％以上であることが好ましく、８４％以上がより好ましく、９０％以上が特に好ましい。
前記全光線透過率が８０％以上であると、光量を確保でき、高解像度で細胞観察をすることができる。前記全光線透過率が、前記より好ましい範囲内または特に好ましい範囲内であると、より高解像度で細胞観察をできる点で有利である。
【００２７】
＜＜屈折率＞＞
本発明の顕微鏡観察用部材は、第１壁の屈折率が、ＪＩＳＫ７１４２：２００８法に基づいて測定したときに、例えば、１．３〜１．８であることが好ましい。この構成によれば、オイル液浸して観察するのに好適となる。
上記屈折率は、１．３〜１．５であることがより好ましい。
【００２８】
＜第２壁＞
上記第２壁の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シリコーン樹脂、ポリスチレン、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）、ＡＢＳ樹脂、ポリカーボネート、ガラス、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ポリジメチルシロキサン、ガラスは、透明性が高く、細胞に対する毒性が低い点で有利であり、ポリジメチルシロキサンは、ソフトリソグラフィ法による作製が可能となる点で有利であり、ポリスチレン、ポリメチルメタアクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、およびＡＢＳ樹脂は、射出成形で量産しやすい点で有利である。
【００２９】
＜＜第２壁の高さ＞＞
上記第２壁の高さとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１０〜２００μｍが好ましい。
前記第２壁の高さが１０μｍ以上であると、細胞のサイズの観点で、第２壁へ細胞を接着させることが可能となり、２００μｍ以下であると、第２壁の内表面において第１壁に対して垂直方向に過剰な数の細胞が接着することによる弊害、例えば顕微鏡観察での光の減弱等、を回避することができる。
【００３０】
＜＜第２壁の内表面の形状＞＞
上記第２壁の内表面の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、略平面の形状、複数の凹部を有する形状、複数の凸部を有する形状、湾曲形状、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
前記凹部の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円柱形、直方体、逆円錐形、逆角錐形、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３１】
＜＜第２壁の第１壁に対する角度＞＞
前記第２壁の第１壁に対する角度としては、４５度〜１３５度である限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記第２壁の第１壁に対する角度が８０度〜１００度であると、細胞の縦断面の観察が容易となる。
【００３２】
＜＜細胞接着用の足場＞＞
上記第２壁の内表面には、細胞接着用の足場がコーティングされていることが好ましい。
前記細胞接着用の足場としては、特に制限はなく、播種する細胞の種類に応じて適宜選択することができ、例えば、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、ポリリジン、ビトロネクチンテイネシン、エラスチン、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００３３】
＜細胞懸濁液収容区画＞
上記細胞懸濁液収容区画は、前記第１壁および複数の前記第２壁によって画定される。
前記細胞懸濁液収容区画は、細胞懸濁液を収容することができる画定された区画であり、前記細胞懸濁液収容区画に細胞懸濁液が収容されることで、細胞懸濁液が第２壁の内表面に接触した状態を保つことが可能となる。
図１及び２に示す顕微鏡観察用部材１のように、細胞懸濁液収容区画５を、第３壁４によってさらに閉じることによって、例えば、図３（ａ）のように、細胞懸濁液を細胞懸濁液収容区画５に注入した後に、図３（ｂ）のように顕微鏡観察用部材１を９０度回転させたときに、細胞懸濁液が細胞懸濁収容区画５から流れ出るのを防ぐことができる。さらに、細胞懸濁液が密閉されることで蒸発を防ぐことができるため、細胞懸濁液を顕微鏡観察用部材中で長時間保存することも可能となる。
【００３４】
＜第３壁＞
上記第３壁は、上記第１壁と略平行に対向して配置して備えられることが好ましい。
図１及び２に示す顕微鏡観察用部材１のように、第３壁４は、第１壁２と平行に対向して細胞懸濁液収容区画５を覆うように配置される。
【００３５】
＜開口部＞
上記開口部は、上記第１壁及び／又は上記第３壁に、上記細胞懸濁液収容区画に連通して設けられる。
前記細胞懸濁液収容区画に連通して設けられる前記開口部の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１つが好ましく、２つが特に好ましい。
前記開口部の数が１つであると、ピペット等で、細胞懸濁液を開口部を介して容易に注入ができ、細胞懸濁液を注入する際の操作性が向上する点で好ましい。
一方、前記開口部の数が２つであると、ピペット等を用いて、一方の開口部から細胞懸濁液を注入すると、もう一方の開口部からはガスが抜けるため、細胞懸濁液収容区画内の内圧を保ちながら細胞懸濁液を注入することができる。また、細胞懸濁液収容区画の容積を超えて細胞懸濁液が注入されると、細胞懸濁液の注入口と別の開口部から、過剰に注入された細胞懸濁液が排出されるため、細胞懸濁液収容区画内を細胞懸濁液で充填するのが容易となる。
また、細胞懸濁液収容区画内に接着した細胞に薬剤処理をする際に、２つの開口部を備えることで、細胞懸濁液収容区画内の溶液交換を容易に行うことができる。
さらに、前記第２壁に細胞を接着させた後に、細胞懸濁液収容区画において接着していない細胞を除去しようとするとき、一方の開口部から細胞を含まない液体を注入して、もう一方の開口部から接着していない細胞を排出させることにより、細胞懸濁液収容区画内に接着細胞を残して、接着していない細胞を分離することができる。
【００３６】
開口部の配置としては、第１壁及び／又は第３壁に設けられ、前記細胞懸濁液収容区画に連通する限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
【００３７】
開口部は、細胞懸濁液収容区画と顕微鏡観察用部材の外部とを連通しているが、必要な時に蓋等で開口部の穴を塞いで用いることも可能である。
【００３８】
＜顕微鏡観察用部材の作製方法＞
本発明の顕微鏡観察用部材は、公知のソフトリソグラフィ法により作製することができる。ソフトリソグラフィは、微細構造を有した鋳型にシリコーン樹脂などの柔軟性のある素材を流し込み、硬化させ、該硬化物を鋳型から取り出すことで、微細な立体構造を転写する技術である。
鋳型の作製方法としては、厚膜のフォトレジストをフォトリソグラフィ（光露光）によってパターニングして得る方法が挙げられる。斯かる方法は、短時間で鋳型を製作することができる点で有利である。また、前述の方法で得られる型を用いて、さらに電析（電解めっき）を行うことで、フォトレジストの鋳型の反転パターンを得る方法が挙げられる。斯かる方法では、強度、耐久性に優れる鋳型を得ることができる。
【００３９】
（細胞観察方法）
本発明の細胞観察方法は、本発明の顕微鏡観察用部材を用いた細胞観察方法であって、前記顕微鏡観察用部材の前記細胞懸濁液収容区画に、細胞懸濁液を注入する細胞懸濁液注入工程と、該細胞懸濁液注入工程の後に、前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記第２壁の内表面に接着させる細胞接着工程と、該細胞接着工程の後に、前記顕微鏡観察用部材を顕微鏡の試料台に配置する顕微鏡観察用部材配置工程と、該顕微鏡観察用部材配置工程の後に、前記第２壁の内表面に接着した細胞を第１壁に対して垂直な方向から顕微鏡で観察する細胞観察工程、とを少なくとも含む。
本発明の細胞観察方法によれば、本発明の顕微鏡観察用部材を用いて簡便に接着細胞の縦断面を観察することができる。
【００４０】
＜細胞注入工程＞
上記細胞注入工程は、前記顕微鏡観察用部材の前記細胞懸濁液収容区画に、細胞懸濁液を注入する工程である。
図３（ａ）は、顕微鏡観察用部材１の第１壁２を底側にした状態で、ピペット７を用いて、開口部６から細胞懸濁液を細胞懸濁液収容区画５に注入する様子の例を示す。
図３（ａ）では、第３壁４を備えた顕微鏡観察用部材１の例を示しているが、本発明の顕微鏡観察用部材は、第３壁を備えない場合は、第１壁２を底側にした状態で、ピペット等を用いて、細胞懸濁液収容区画内に細胞懸濁液を滴下するなどして注ぎ込むことができる。また、このように細胞懸濁収容区画に細胞懸濁液を注ぎ込んだ後に、第３壁としての蓋を、第１壁と対向するように設置して、次工程の細胞接着工程にすすむことができる。
また、図３（ａ）では、第１壁２を底側にした状態で細胞懸濁液を注入しているが、本発明の細胞観察方法は、図３（ｂ）のように顕微鏡観察用部材の第２壁を底部にした状態にして、開口部を介して細胞懸濁液を注入してもよい。
なお、顕微鏡観察用部材に細胞接着用の足場コーティングをするときは、細胞注入工程の前に、細胞接着用の足場を顕微鏡観察用部材の第２壁にコーティングしておくのがよい。付着性細胞は、第２壁の内表面に直接接着させることもできるが、細胞の種類によっては、細胞接着用の足場を介して接着するため、使用する細胞の種類に応じて、細胞接着用の足場の種類やコーティング条件を適宜選択するのがよい。
【００４１】
＜細胞接着工程＞
上記細胞接着工程は、上記細胞懸濁液注入工程の後に、上記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記第２壁の内表面に接着させる工程である。
前記細胞接着工程は、前記細胞懸濁液注入工程の後に、前記顕微鏡観察用部材の前記第２壁を底側にして、前記細胞懸濁液に含まれる細胞を前記第２壁の内表面に接着させるのが好ましい。前記第２壁を底側にすると、細胞懸濁液に含まれる細胞が重力を介して沈降するため、第２壁の内表面への細胞接着を効率よく行うことができる。
図３（ｂ）は、細胞懸濁液を注入した後に、顕微鏡観察用部材１を９０度回転させて第２壁３を底側にして、細胞を接着させる様子の例を示す。細胞懸濁液に含まれる細胞１０は、重力により第２壁３の内表面で堆積して、第２壁３の内表面に接する細胞の一部又は全てが第２壁３の内表面に接着する。細胞を接着させるために細胞懸濁液が注入された顕微鏡観察用部材１を放置するする時間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
図３（ｂ）では、開口部６が開いた状態の例を示しているが、本発明の細胞観察方法は、細胞懸濁液が開口部６から漏れるときは、開口部６に蓋をして、第２壁３を底側にした状態にすることができる。
【００４２】
＜＜細胞＞＞
上記細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、骨膜細胞、間葉系幹細胞、神経細胞、肝細胞、腎細胞、上皮細胞、繊維芽細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、ＥＳ細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
これらの中でも、極性を持つ細胞、例えば、腸管、血管、腎臓などの上皮細胞は、頂端面と基底面でタンパク質等の組成が大きく異なること、物質輸送に関しても方向性を有することから、本発明の顕微鏡観察用部材により観察すれば、方向性のある物質輸送現象を同一の観察平面内でことができる点で好ましい。
細胞観察工程で観察する細胞は、蛍光色素若しくは発光色素を取り込ませた細胞又は蛍光成分若しくは発光成分を発現する細胞であることが好ましい。
具体的には、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質を発現させるための遺伝子を導入した細胞を用いることで、細胞内タンパク、細胞器官の局在を光学的に観察することが可能である。
また、細胞注入工程の前工程、細胞注入工程および細胞接着工程の少なくともいずれかの工程において、蛍光色素で細胞を染色することにより、細胞に蛍光色素が取り込まれ、細胞内タンパク、細胞器官の局在を光学的に観察することができる。
【００４３】
＜顕微鏡観察用部材配置工程＞
上記顕微鏡観察用部材配置工程は、上記細胞接着工程の後に、前記顕微鏡観察用部材を顕微鏡の試料台に配置する工程である。
前記顕微鏡観察用部材配置工程は、前記細胞接着工程の後に、前記顕微鏡観察用部材の上記第１壁を顕微鏡の対物レンズ側にして、前記顕微鏡観察用部材を顕微鏡の試料台に配置することができる。一般的な倒立型顕微鏡に、本発明の顕微鏡観察用部材の第１壁を顕微鏡の対物レンズ側にした状態で顕微鏡の試料台に配置すると、第１壁を介して、第２壁に接着した細胞の縦断面を観察できる。
図３（ｃ）は、細胞１０を第２壁３の内表面に接着させた後に、顕微鏡観察用部材１を９０度回転させて、第１壁２が顕微鏡の対物レンズ９側となるように、顕微鏡観察用部材１を顕微鏡の顕微鏡試料台８に配置する様子の例を示す。
図３（ｃ）では、対物レンズ９が顕微鏡の試料台８の下部に設置された例を示すが、対物レンズが顕微鏡の試料台の上部に設置された顕微鏡を用いるときは、第１壁２を上側にして第１壁２が対物レンズ側になるように顕微鏡観察用部材を配置すればよい。
【００４４】
＜＜顕微鏡＞＞
上記顕微鏡としては、光学的に観察する顕微鏡である限り、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、実体顕微鏡、などが挙げられる。
【００４５】
−共焦点顕微鏡−
上記共焦点顕微鏡としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、照明方式が反射型の反射型共焦点顕微鏡、照明方式が透過型の透過型共焦点顕微鏡、などが挙げられ、特に光源がレーザーである反射型または透過型の共焦点レーザー顕微鏡、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
本発明の顕微鏡観察用部材が第３壁を備える場合、第３壁の透明度を高くすることで、透過型の共焦点顕微鏡での観察にも適用可能となる。
【００４６】
−蛍光顕微鏡−
上記蛍光顕微鏡としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、透過型蛍光顕微鏡、落射型蛍光顕微鏡、などが挙げられる。これらは１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００４７】
＜細胞観察工程＞
上記細胞観察工程は、上記顕微鏡観察用部材配置工程の後に、前記第２壁の内表面に接着した細胞を第１壁に対して垂直な方向から顕微鏡で観察する細胞観察工程である。
上記細胞観察工程により、細胞接着面の水平方向のスライス画像、細胞接着面に対して垂直方向及び斜め方向のスライス画像を得ることができる。本発明の方法によれば、細胞接着面に対して垂直方向又は斜め方向のスライス画像、すなわち細胞の縦断面又は細胞の斜め断面の画像を高解像度で得ることができる。
第３壁の構成が顕微鏡観察に適当であれば、第３壁側から観察してもよいし、第１壁側から観察してもよい。
【００４８】
＜非接着細胞洗い流し工程＞
本発明の細胞観察方法は、上記細胞接着工程の後で上記細胞観察工程の前に、非接着細胞洗い流し工程を更に含むのが好ましい。
上記非接着細胞洗い流し工程は、接着していない細胞を洗い流す工程である。
前記非接着細胞洗い流し工程をさらに行うことで、細胞観察工程において接着していない細胞の存在による影響を低減することができる。
前記非接着細胞洗い流し工程は、例えば、図２で示す顕微鏡観察用部材１を用いる場合、細胞接着工程の後に、一方の開口部６から、細胞を含まない溶液を注入することにより、細胞懸濁液収容区画５内の接着していない細胞を、もう一方の開口部６から排出させることで、洗い流すことができる。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明の顕微鏡観察用部材及び細胞観察方法をさらに詳しく説明するが、本発明は下記の実施例になんら限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲において適宜変更可能である。
【００５０】
（実施例１）
＜顕微鏡観察用部材の作製＞
顕微鏡観察用部材の材質として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）（信越化学社製、商品名：ＫＥ１０６）を用いて、ソフトリソグラフィ法により顕微鏡観察用部材を作製した。まず、鋳型は、マイクロケム社ＳＵ−８により作製した。得られた鋳型を用いて、ＰＤＭＳを成形し、さらに別途準備したＰＤＭＳ部材と接合させて顕微鏡観察用部材を得た。
上記顕微鏡観察用部材は、さらに細胞接着用足場のフィブロネクチンでコーティングした。５０μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液を細胞懸濁液収容区画に導入し、室温で３０分程度放置することで第２壁にフィブロネクチンをコーティングした。
上記方法により得られた顕微鏡観察用部材は、第１壁の厚みが１９０μｍ、第３壁の厚みが５ｍｍ、第２壁の高さが１００μｍ、第１壁の全光線透過率が約１００％、第１壁の屈折率が１．４１であった。なお、図１〜３の第２壁の内表面は平坦であるが、実施例で用いた顕微鏡観察用部材は、細胞が接着する第２壁の内表面に複数の凹構造を備え、該凹構造は、直径１０μｍで深さが３０μｍの円柱形状である。
【００５１】
＜細胞の調製＞
観察する細胞として、付着性細胞のＨｅＬａ細胞を用いた。細胞は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて５％ＣＯ2の存在下で培養した。ディッシュ中の細胞を０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液で培養皿からはがし、細胞濃度が３．０×１０7個／ｍＬとなるようにｂａｓａｌ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  （ＢＳＳ）に懸濁させて、細胞懸濁液とした。細胞の蛍光色素による染色は、細胞膜を５μｇ／ｍＬのＤｉＩ（Ｄ２８２，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）溶液を用いて染色した。
【００５２】
＜細胞注入工程＞
得られた顕微鏡観察用部材は、第１壁が底側となるように配置した。上記細胞懸濁液５０μＬをピペットで採取して、顕微鏡観察用部材の開口部の一方にピペットのチップの先端を差しこみ吐出した。５０μＬは、顕微鏡観察用部材の細胞懸濁液収容区画の容積より大きいため、細胞懸濁液を吐出した開口部とは別の開口部から、余剰量の細胞懸濁液が排出され、細胞懸濁液収容区画に細胞懸濁液が充填された。
【００５３】
＜細胞接着工程＞
細胞懸濁液を注入した上記顕微鏡観察用部材は、９０度回転させて、第２壁が底側となるようにした。第２壁の外壁を底部とすると顕微鏡観察用部材は倒れ易いため、第２壁を底側にした状態で維持できるように、２枚のガラス板を補助器具として用いた。細胞懸濁液中の細胞を第２壁の内表面に沈降させ、接着させるために、顕微鏡観察用部材を３７℃で９０分間静置した。
【００５４】
＜非接着細胞洗い流し工程＞
細胞は上記細胞接着工程により第２壁の内表面に接着させることができるが、細胞懸濁液収容区画内には、接着していない細胞が残存するため、接着していない細胞を取り除くために、細胞懸濁液収容区画内を洗い流した。具体的には、第１壁が底側となるように顕微鏡観察用部材を回転させ、ピペットを用いて、１００μＬのｂａｓａｌ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＳ）を一方の開口部に吐出し、もう一方の開口部から接着していない細胞を含む液を排出させた。
【００５５】
＜顕微鏡観察用部材配置工程＞
第２壁の内表面に細胞が付着した顕微鏡観察用部材を第１壁が底側となるように回転させて、倒立型顕微鏡（オリンパス社製、商品名：ＩＸ−５１）の試料台に第１壁が対物レンズ側になるように配置した。使用した倒立型顕微鏡は、試料台の底側に対物レンズが配置され、対物レンズが、開口数０．４５、倍率２０倍であった。
【００５６】
＜細胞観察工程＞
上記の工程の後に、透過照明を用いて明視野画像を取得した。図４に示すように、第２壁に接着したＨｅＬａ細胞を、接着面に対して垂直方向から観察できている様子がわかる。
【００５７】
（実施例２）
実施例１において、倒立型顕微鏡を用い、染色していないＨｅＬａ細胞を観察するかわりに、共焦点レーザー顕微鏡を用い、ＤｉＩ蛍光マーカーで染色したＨｅＬａ細胞を観察したこと以外は実施例１と同様にして細胞の縦断面を観察した。
ＤｉＩ蛍光マーカーは細胞膜に局在するため、細胞膜の形態をイメージングすることができる。共焦点レーザー顕微鏡（カールツァイス社製ＬＳＭ−７００）を使用し、倍率１０倍、開口数０．４５の対物レンズを用いて取得した、明視野像（微分干渉像）およびＤｉＩの蛍光像を図５（ａ）および（ｂ）にそれぞれ示す。一回の画像取得により、細胞膜を染色した細胞の縦断面形状が取得できていることがわかる。
【００５８】
（比較例１）
縦１８ｍｍ×横１８ｍｍ、厚さ約０．５ｍｍの部材を、ＰＤＭＳを用いて作製した。該部材は、縦１８ｍｍ×横１８ｍｍからなる面の表面に、複数の凹構造を備え、該凹構造は、直径１０μｍで深さが３０μｍの円柱形状である。該部材の表面は、実施例１と同様のコーティング条件で、フィブロネクチンでコーティングした。上記部材は１８ｍｍ×１８ｍｍからなる面を底側にして水平な台に置き、未染色のＨｅＬａ細胞を、部材の上面に播種して、そのままの状態で９０分のインキュベーションを行い、細胞を部材の上面に接着させた。前記部材を、縦１８ｍｍ×横１８ｍｍからなる面のうち細胞を播種した面を上側にして倒立顕微鏡ＩＸ−５１の試料台に配置し、細胞を明視野（位相差）で観察した。明視野観察の結果を図６に示す。ＨｅＬａ細胞がコンフルエントに広がって接着する様子がわかる。
次に、カールツァイス製ＬＳＭ７００レーザー共焦点顕微鏡を用い、細胞膜に局在したＤｉＩ蛍光試薬の可視化を行った。Ｚ方向に３μｍ間隔で合計して１７枚のスライス画像を取得し、ＺＥＮ２０１２ソフトウェアを用いて三次元の断面を再構築した画像を図７（ａ）に示す。なお、この画像は、図７（ｂ）に示した、再構築に利用した平面画像（１７枚のうちの一例）において、点線で示した直線部分の再構築断面画像である。画像全体がぼやけており、Ｚ方向のノイズが大きく、構造を認識することが困難であることがわかる。
【００５９】
本発明の顕微鏡観察用部材を用いて撮影した細胞縦断面画像（実施例１、実施例２）と、本発明の顕微鏡観察用部材とは異なるＰＤＭＳ部材を用いて３次元情報から再構築した細胞の縦断面画像（比較例１）との比較から、画像の解像度が、比較例１の画像より、実施例１及び実施例２の画像が優れることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の顕微鏡観察用部材は、顕微鏡による細胞観察に利用でき、特に付着性細胞の接着縦断面を観察するのに有用である。本発明の顕微鏡観察用部材により、細胞研究の発展に寄与することができ、パーソナル医療等の医療技術の発展に貢献できる。
【符号の説明】
【００６１】
１  顕微鏡観察用部材
２  第１壁
３  第２壁
４  第３壁
５  細胞懸濁液収容区画
６  開口部
７  ピペット
８  試料台
９  対物レンズ
１０  細胞
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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