(57)【要約】【課題】アスパラギン酸系アミノ酸の製造法を提供する。【解決手段】ｙｅｃＳＣ遺伝子の発現が増大するように改変されたアスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、該培地または菌体よりアスパラギン酸系アミノ酸を採取することにより、アスパラギン酸系アミノ酸を製造する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、アスパラギン酸系アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりアスパラギン酸系アミノ酸を採取すること、を含むアスパラギン酸系アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、ｙｅｃＳＣ遺伝子の発現が増大するように改変されていることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ｙｅｃＳＣ遺伝子の発現が、それぞれ、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｙｅｃＳ遺伝子が下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項１または２に記載の方法：
（Ａ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１７、１９、または２１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１７、１９、または２１に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
前記ｙｅｃＣ遺伝子が下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法：
（Ａ）配列番号２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２３、２５、または２７に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２３、２５、または２７に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記細菌が、さらに、シスタチオニン生合成系酵素の活性が増大するように改変されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記シスタチオニン生合成系酵素が、ホモセリントランスサクシニラーゼである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、エシェリヒア属細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細菌が、エシェリヒア・コリである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アスパラギン酸系アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、およびＬ−イソロイシンからなる群より選択される１またはそれ以上のアミノ酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アスパラギン酸系アミノ酸が、Ｌ−リジンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌が、さらに、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択される性質を有する、請求項１０に記載の方法：
（Ａ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている；
（Ｂ）リジンデカルボキシラーゼの活性が低下するように改変されている；
（Ｃ）上記性質の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたＬ−アミノ酸、具体的にはＬ−リジンやＬ−メチオニン等のアスパラギン酸系アミノ酸、の製造法に関する。Ｌ−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、調味料や飲食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、例えば、Ｌ−アミノ酸生産能を有する各種微生物を用いた発酵法により工業生産されている。発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法としては、例えば、野生型微生物（野生株）を用いる方法、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を有する株を用いる方法が挙げられる。
【０００３】
また、近年は、組換えＤＮＡ技術によりＬ−アミノ酸生産能を向上させた微生物がＬ−アミノ酸の製造に利用されている。微生物のＬ−アミノ酸生産能を向上させる方法としては、例えば、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素をコードする遺伝子の発現を増強すること（特許文献１、特許文献２）やＬ−アミノ酸生合成系への炭素源の流入を増強すること（特許文献３）が挙げられる。
【０００４】
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）のyecSC遺伝子は、予測上のアミノ酸ＡＢＣ
トランスポーターをコードする遺伝子である。具体的には、yecS遺伝子にコードされるYecSタンパク質は、アミノ酸ＡＢＣトランスポーターのパーミアーゼタンパク質（amino-acid ABC transporter permease protein）と推定されている。また、yecC遺伝子にコード
されるYecCタンパク質は、アミノ酸ＡＢＣトランスポーターのＡＴＰ結合タンパク質（amino-acid ABC transporter ATP-binding protein）と推定されている。YecSタンパク質およびYecCタンパク質は、yecSC遺伝子の近傍に存在するfliY遺伝子にコードされるFliYタ
ンパク質と共に、シスチンおよびジアミノピメリン酸のトランスポーターを構成する可能性が示唆されている（非特許文献１）。また、FliYタンパク質の活性が低下するように改変された腸内細菌科の細菌によりＬ−システインを発酵生産する方法が知られている（特許文献４）。しかしながら、in vivoでのYecSタンパク質およびYecCタンパク質の機能は
実験的には明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第5,168,056号明細書
【特許文献２】米国特許第5,776,736号明細書
【特許文献３】米国特許第5,906,925号明細書
【特許文献４】特開2010-207194号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hosie AH, Poole PS., Res Microbiol., 2001, 152(3-4):259-70.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、細菌のアスパラギン酸系アミノ酸生産能を向上させる新規な技術を開発し、効率的なアスパラギン酸系アミノ酸の製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、yecSC遺伝子がシスタ
チオニン取り込み系をコードする遺伝子であると推定されることを見出し、さらに、yecSC遺伝子の発現が増大するように細菌を改変することによって、細菌のアスパラギン酸系
アミノ酸生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、アスパラギン酸系アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりアスパラギン酸系アミノ酸を採取すること、を含むアスパラギン酸系アミノ酸の製造法であって、
前記細菌が、ｙｅｃＳＣ遺伝子の発現が増大するように改変されていることを特徴とする、方法。
［２］
前記ｙｅｃＳＣ遺伝子の発現が、それぞれ、該遺伝子のコピー数を高めること、および／または該遺伝子の発現調節配列を改変することによって増大した、前記方法。
［３］
前記ｙｅｃＳ遺伝子が下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号１７、１９、または２１に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号１７、１９、または２１に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［４］
前記ｙｅｃＣ遺伝子が下記（Ａ）〜（Ｄ）からなる群より選択されるＤＮＡである、前記方法：
（Ａ）配列番号２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２３、２５、または２７に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２３、２５、または２７に示す塩基配列に相補的な塩基配列又は該相補配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、シスタチオニン取り込み活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［５］
前記細菌が、さらに、シスタチオニン生合成系酵素の活性が増大するように改変されている、前記方法。
［６］
前記シスタチオニン生合成系酵素が、ホモセリントランスサクシニラーゼである、前記方法。
［７］
前記細菌が、エシェリヒア属細菌である、前記方法。
［８］
前記細菌が、エシェリヒア・コリである、前記方法。
［９］
前記アスパラギン酸系アミノ酸が、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、およびＬ−イソロイシンからなる群より選択される１またはそれ以上のアミノ酸である、前記方法。
［１０］
前記アスパラギン酸系アミノ酸が、Ｌ−リジンである、前記方法。
［１１］
前記細菌が、さらに、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選択される性質を有する、前記方法：
（Ａ）ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように改変されている；
（Ｂ）リジンデカルボキシラーゼの活性が低下するように改変されている；
（Ｃ）上記性質の組み合わせ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、細菌のアスパラギン酸系アミノ酸生産能を向上させることができ、アスパラギン酸系アミノ酸を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）の構造を示す図。図中の塩基配列を配列番号１３に示す。
【図２】5JS/MG1655株（対照株；●）およびyecSC/MG1655株（yecSC遺伝子発現増強株；△）をシスタチオニン含有M9培地で培養した際の残存シスタチオニン濃度の推移を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の方法は、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌を培地で培養し、アスパラギン酸系アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりアスパラギン酸系アミノ酸を採取すること、を含むアスパラギン酸系アミノ酸の製造法であって、前記細菌が、yecSC遺伝子の発現が増大
するように改変されていることを特徴とする、方法である。同方法に用いられる細菌を、「本発明の細菌」ともいう。
【００１４】
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する腸内細菌科に属する細菌であって、且つ、yecSC遺伝子の発現が増大するように改変された細菌である。
【００１５】
＜１−１＞アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する細菌
本発明において、「アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する細菌」とは、培地で培養したときに、目的とするアスパラギン酸系アミノ酸を生成し、回収できる程度に培地中または菌体内に蓄積する能力を有する細菌をいう。アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する細菌は、非改変株よりも多い量の目的とするアスパラギン酸系アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する細菌は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より
好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的とするアスパラギン酸系アミノ酸を培地に蓄積することができる細菌であってもよい。
【００１６】
「アスパラギン酸系アミノ酸」とは、Ｌ−アスパラギン酸を中間体として生合成される一群のＬ−アミノ酸をいう。アスパラギン酸系アミノ酸としては、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−スレオニン、およびＬ−イソロイシンが挙げられる。これらの中では、例えば、Ｌ−リジンおよび／またはＬ−メチオニンが好ましい。本発明の細菌は、１種のアスパラギン酸系アミノ酸の生産能のみを有していてもよく、２種またはそれ以上のアスパラギン酸系アミノ酸の生産能を有していてもよい。
【００１７】
本発明において、アスパラギン酸系アミノ酸は、特記しない限り、いずれもＬ−アミノ酸である。
【００１８】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セ
ラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属
、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００１９】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.
）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、W3110株（ATCC 27325）やMG1655株（ATCC 47076）等のエシェリヒア・コリK-12株；エシェリ
ヒア・コリK5株（ATCC 23506）；BL21(DE3)株等のエシェリヒア・コリB株；およびそれらの派生株が挙げられる。
【００２０】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的
には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる
。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細
書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されているものも存在する。
【００２１】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パン
トエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、AJ13355株（FERM BP-6614
）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）、SC17株（FERM BP-11091
）、及びSC17(0)株（VKPM B-9246）が挙げられる。なお、エンテロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２２】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エル
ビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００２３】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００２４】
本発明の細菌は、本来的にアスパラギン酸系アミノ酸生産能を有するものであってもよく、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有するように改変されたものであってもよい。アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にアスパラギン酸系アミノ酸生産能を付与することにより、または、上記のような細菌のアスパラギン酸系アミノ酸生産能を増強することにより、取得できる。
【００２５】
アスパラギン酸系アミノ酸生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参
照）。そのような方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、アスパラギン酸系アミノ酸のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、アスパラギン酸系アミノ酸の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。アスパラギン酸系アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、アスパラギン酸系アミノ酸生産菌の育種において、活性が増強されるアスパラギン酸系アミノ酸生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
【００２６】
アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つアスパラギン酸系アミノ酸生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００２７】
アスパラギン酸系アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のアスパラギン酸系アミノ酸の生合成系酵素の活性を増強することによって行うことができる。酵素活性の増強は、例
えば、同酵素をコードする遺伝子の発現を増強することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755号明細
書等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する。
【００２８】
また、アスパラギン酸系アミノ酸生産能の付与又は増強は、目的のアスパラギン酸系アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のアスパラギン酸系アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的のアスパラギン酸系アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のアスパラギン酸系アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的のアミノ酸の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性の低下は、例えば、同酵素をコードする遺伝子を破壊することにより行うことができる。酵素活性を低下させる詳細な手法については後述する。
【００２９】
以下、アスパラギン酸系アミノ酸生産菌、およびアスパラギン酸系アミノ酸生産能を付与または増強する方法について具体的に例示する。なお、以下に例示するようなアスパラギン酸系アミノ酸生産菌が有する性質およびアスパラギン酸系アミノ酸生産能を付与または増強するための改変は、いずれも、単独で用いてもよく、適宜組み合わせて用いてもよい。
【００３０】
＜Ｌ−リジン生産菌＞
Ｌ−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−リジン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（dihydrodipicolinate synthase）（dapA）、アスパルトキナーゼIII（aspartokinase III）（lysC）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（dihydrodipicolinate reductase）（dapB）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（diaminopimelate decarboxylase）（lysA）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（diaminopimelate dehydrogenase）（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
（phosphoenolpyruvate carboxylase）（ppc）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（aspartate semialdehyde dehydrogenase）（asd）、アスパラギン酸アミノト
ランスフェラーゼ（aspartate aminotransferase）（アスパラギン酸トランスアミナーゼ（aspartate transaminase））（aspC）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（diaminopimelate epimerase）（dapF）、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ（tetrahydrodipicolinate succinylase）（dapD）、スクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼ（succinyl-diaminopimelate deacylase）（dapE）、及びアスパルターゼ（aspartase）（aspA）（EP 1253195 A）が挙げられる。なお、カッコ内は、その酵素をコードする遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、例えば、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラーゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株では、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP 1170376 A）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲ
ナーゼ（nicotinamide nucleotide transhydrogenase）をコードする遺伝子（pntAB）（
米国特許第5,830,716号）、ybjE遺伝子（WO2005/073390）、またはこれらの組み合わせの発現レベルが増大していてもよい。アスパルトキナーゼIII（lysC）はＬ−リジンによる
フィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子を利
用してもよい（米国特許5,932,453号明細書）。また、ジヒドロジピコリン酸合成酵素（d
apA）Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには
、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA遺伝子を利用してもよい。
【００３１】
また、Ｌ−リジン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−リジンの生合成経路から分岐してＬ−リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、リジンデカルボキシラーゼ（lysine
decarboxylase）（米国特許第5,827,698号）やリンゴ酸酵素（malic enzyme）（WO2005/010175）が挙げられる。
【００３２】
また、Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−リジンアナログに耐性を有する変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログは腸内細菌科の細菌やコリネ型細菌等の細菌の生育を阻害するが、この阻害は、Ｌ−リジンが培地に共存するときには完全にまたは部分的に解除される。Ｌ−リジンアナログとしては、特に制限されないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタムが挙げられる。これらのリジンアナ
ログに対して耐性を有する変異株は、細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。
【００３３】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E. coli AJ11442（FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照）及びE. coli VL611が挙げられる。これらの株では、アスパルトキナーゼのＬ−リジンによるフィードバ
ック阻害が解除されている。
【００３４】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、E. coli WC196
株も挙げられる。WC196株は、E. coli K-12に由来するW3110株にAEC耐性を付与すること
により育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され
、1994年12月6日に、工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技
術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-5252が付与されている（米国特許第5,827,698号）。
【００３５】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、E. coli WC196ΔcadAΔldcやE. coli WC196ΔcadAΔldc/pCABD2が挙げられる（WO2010/061890）。WC196ΔcadAΔldcは、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊する
ことにより構築した株である。WC196ΔcadAΔldc/pCABD2は、WC196ΔcadAΔldcに、リジ
ン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することに
より構築した株である。WC196ΔcadAΔldcは、AJ110692と命名され、2008年10月7日に、
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-11027として寄託された。pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコ
リン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる。
【００３６】
Ｌ−リジン生産菌又はそれを誘導するための親株として、E. coli AJIK01株（NITE BP-01520）も挙げられる。AJIK01株は、E. coli AJ111046と命名され、2013年1月29日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に寄託され、2014年5月15日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号NITE BP-01520が付与されている。
【００３７】
＜Ｌ−メチオニン生産菌＞
Ｌ−メチオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−メチオニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、ホモセリントランスサクシニラーゼ（metA）、シスタチオニンγ−シンターゼ（metB）、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII（metL）が挙げられる（特開2000-139471号）。
これらＬ−メチオニン生合成系酵素をコードする遺伝子の発現はメチオニンリプレッサー（metJ）により抑制されるため、これらの酵素活性を増強するには、メチオニンリプレッサー（metJ）を欠損させてもよい（特開2000-139471号）。ホモセリントランスサクシニ
ラーゼ（metA）はＬ−メチオニンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼをコードする変異型metA遺伝子を利用してもよい（特開2000-139471
号、US20090029424）。
【００３８】
また、Ｌ−メチオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ（metK）の活性が低下するように細菌を改変する方法も挙げられる（特開2000-139471号）。Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ（metK）は
欠損させてもよいが、その場合は、通常、培養の際に培地中にＳ−アデノシルメチオニンを補填する必要がある。よって、Ｓ−アデノシルメチオニンシンセターゼ（metK）の活性は、完全に消失しない程度に低下させるのが好ましい（特開2000-139471号）。
【００３９】
また、Ｌ−メチオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−スレオニン要求性またはノルロイシン耐性を付与する方法も挙げられる（特開2000-139471
号）。Ｌ−スレオニン要求性は、例えば、Ｌ−スレオニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素を欠損させることにより、付与できる。そのような酵素としては、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）（thrB）、スレオニンシンターゼ（threonine synthase）（thrC）が挙げられる。E. coliにおいてこれらの酵素をコードする遺伝子はthrABCオペロンとして存
在する。Ｌ−スレオニン要求性は、具体的には、例えば、thrB遺伝子および／またはthrC遺伝子を欠失させることにより、付与できる。なお、thrA遺伝子は、Ｌ−メチオニンとＬ−スレオニンに共通の生合成酵素であるアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼのアイソザイムの１つをコードしているため、欠失させないのが好ましい。
【００４０】
なお、Ｌ−メチオニンはＬ−システインを中間体として生合成されるため、Ｌ−システインの生産能の向上によりＬ−メチオニンの生産能も向上させることができる（特開2000-139471、US20080311632）。
【００４１】
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli AJ11539 (NRRL B-12399)、E. coli AJ11540 (NRRL B-12400)、E. coli AJ11541 (NRRL B-12401)、E. coli AJ11542 (NRRL B-12402) (英国特許第2075055号)、Ｌ−メチオニンのアナログであるノルロイシン耐性を有するE. coli 218株 (VKPM B-8125)(ロシア特許第2209248号)や73株 (VKPM B-8126) (ロシア特許第2215782号)、E. coli AJ13425 (FERM P-16808)（特開2000-139471）が挙げられる。AJ13425株は、pMWPthmetA-W/WΔBCΔJK-24
株ともいい、E. coli WΔBCΔJK-24株にmetA遺伝子の発現プラスミドpMWPthrmetA-Wを導
入することにより得られた株である。WΔBCΔJK-24株は、E. coli K-12 W3110株から、ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子、スレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子、及びメチオニンリプレッサーをコードするmetJ遺伝子を欠損させ、S-アデノシルメチオニンシンターゼ（metK）の活性を弱化することにより得られた株である。AJ13425株は
、平成10年5月14日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政
法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託されており、受託番号FERM P-16808が
付与されている。
【００４２】
＜Ｌ−スレオニン生産菌＞
Ｌ−スレオニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−スレオニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（asd）、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼI（thrA）、ホモセリンキナーゼ（homoserine kinase）（thrB）、スレオニンシンターゼ（threonine synthase）（thrC）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）（aspC）が挙げられる。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒド
デヒドロゲナーゼ、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼI、ホモセリンキ
ナーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、及びスレオニンシンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子は、スレオニン分解が抑制された株に導入してもよい。スレオニン分解が抑制された株としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したE.
coli TDH6株（特開2001-346578号）が挙げられる。
【００４３】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素の活性は、最終産物のＬ−スレオニンによって阻害される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変するのが好ましい。上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しており、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成している。スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより抑制される。スレオニンオペロンの発現の増強は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいはアテニュエーターを除去することにより達成できる（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987);
WO02/26993; WO2005/049808; WO2003/097839参照）。
【００４４】
スレオニンオペロンの上流には固有のプロモーターが存在するが、同プロモーターを非天然のプロモーターに置換してもよい（WO98/04715号パンフレット参照）。また、スレオニン生合成関与遺伝子がラムダファ−ジのリプレッサーおよびプロモーターの制御下で発現するようにスレオニンオペロンを構築してもよい（欧州特許第0593792号明細書参照）
。また、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変された細菌は、Ｌ−スレオニンアナログであるα-amino-β-hydroxyvaleric acid（AHV）に耐性な菌株を選抜することによっても取得できる。
【００４５】
このようにＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、コピー数の上昇により、あるいは強力なプロモーターに連結されることにより、宿主内での発現量が向上しているのが好ましい。コピー数の上昇は、スレオニンオペロンを含むプラスミドを宿主に導入することにより達成できる。また、コピー数の上昇は、トランスポゾン、Muファ−ジ等を利用して、宿主のゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成できる。
【００４６】
また、Ｌ−スレオニン生産能を付与または増強する方法としては、宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法やＬ−ホモセリン耐性を付与する方法も挙げられる。耐性の付与は、例えば、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することにより達成できる。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子（Res. Microbiol. 154:123−135 (2003)）、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK遺伝子、yeaS遺
伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また、宿主にＬ−スレオニ
ン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や国際公開第90/04636号
パンフレットに記載の方法を参照出来る。
【００４７】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株として、具体的には、例えば、E.
coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)
、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRＬ−21593
(米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)、ならびにE. coli VKPM B-5318 (EP 0593792 B) が挙げられる。
【００４８】
VKPM B-3996株は、TDH-6株に、プラスミドpVIC40を導入した株である。TDH-6株は、ス
クロース資化性であり、thrC遺伝子を欠損し、ilvA遺伝子にリーキー（leaky）変異を有
する。また、VKPM B-3996株は、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたはホモセリンに
対する耐性を付与する変異を有する。プラスミドpVIC40は、RSF1010由来ベクターに、ス
レオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンが挿入されたプラスミドである（米国特許第5,705,371号）。この変異型thrA遺伝子は、スレオ
ニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス（Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia）に、受託番号RIA 1867で寄託されている。この株は、また、1987年4
月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオル
ガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM
B-3996で寄託されている。
【００４９】
VKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオ
ペロンの制御領域を温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換したプラスミドpPRT614を保持する。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ (VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託され
ている。
【００５０】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子
は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子と
の間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにさ
れている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディ
ングフレームとの間に位置する。また、スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異型thrA遺伝子と野生型thrBC遺伝子を含むthrA*BCオペロンは、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在す
る周知のプラスミドpVIC40（米国特許第5,705,371号）から取得できる。
【００５１】
E. coliのrhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: resistant to homoserine and threonine（ホモセ
リン及びスレオニンに耐性）)。また、高濃度のスレオニン又はホモセリンへの耐性を付
与するrhtA23変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No.
457, EP 1013765 A)。
【００５２】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより取得できる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００５３】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、その遺伝子の塩基配列に基づいて
作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる。他の微生物のaspC遺伝子も
同様に得ることができる。
【００５４】
＜Ｌ−イソロイシン生産菌＞
Ｌ−イソロイシン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−イソロイシン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、スレオニンデアミナーゼやアセトヒドロキシ酸シンターゼが挙げられる（特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号）。
【００５５】
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、例えば、６−ジメチルアミノプリンに耐性を有する変異株（特開平5-304969号）、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、イソロイシンアナログに加えてＤＬ−エチオニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株（特開平5-130882号）等のエシェリヒア属細菌が挙げられる。
【００５６】
また、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、細菌の細胞からアスパラギン酸系アミノ酸を排出する活性が増大するように細菌を改変する方法が挙げられる。アスパラギン酸系アミノ酸を排出する活性は、例えば、アスパラギン酸系アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることにより、増大させることができる。各種アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子としては、例えば、b2682遺伝子（ygaZ）、b2683遺伝子（ygaH）、b1242遺伝子（ychE）、b3434遺伝子（yhgN）が挙げられる（特開2002-300874号公報）。
【００５７】
また、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を付与または増強する方法としては、例えば、糖代謝に関与するタンパク質やエネルギー代謝に関与するタンパク質の活性が増大するよ
うに細菌を改変する方法が挙げられる。
【００５８】
糖代謝に関与するタンパク質としては、糖の取り込みに関与するタンパク質や解糖系酵素が挙げられる。糖代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエ
ノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps；欧州出願公開877090号明細書）、ホスホエノ
−ルピルビン酸カルボキシラ−ゼ遺伝子（ppc；国際公開95/06114号パンフレット)、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pyc；国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレッ
ト）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（pfkB, fbp；国際公開03/04664号パン
フレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF；国際公開03/008609号パンフレット）、
トランスアルドラーゼ遺伝子（talB；国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ
遺伝子（fum；国際公開01/02545号パンフレット）、non-PTSスクロース取り込み遺伝子（csc；欧州出願公開149911号パンフレット）、スクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【００５９】
エネルギー代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB；米国特許 5,830,716号明細書）、チトクロムbo型オキシダーゼ（cytochromoe bo type oxidase）遺伝子（cyoB；欧州特許出願公開1070376号明細書）が挙
げられる。
【００６０】
なお、上記のアスパラギン酸系アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、アスパラギン酸系アミノ酸生産菌の育種に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、後述するyecSC遺伝子およびYecSCタンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【００６１】
＜１−２＞yecSC遺伝子の発現の増強
本発明の細菌は、yecSC遺伝子の発現が増大するように改変されている。yecSC遺伝子の発現が増大するように細菌を改変することによって、細菌のアスパラギン酸系アミノ酸生産能を向上させることができる。
【００６２】
本発明の細菌は、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を有する細菌を、yecSC遺伝子の発
現が増大するように改変することにより取得できる。また、本発明の細菌は、yecSC遺伝
子の発現が増大するように細菌を改変した後に、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を付与または増強することによっても得ることができる。なお、本発明の細菌は、yecSC遺伝子
の発現が増大するように改変されたことにより、アスパラギン酸系アミノ酸生産能を獲得したものであってもよい。本発明の細菌を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００６３】
「yecSC遺伝子」とは、yecS遺伝子およびyecC遺伝子の総称である。本発明においては
、yecS遺伝子およびyecC遺伝子の両方の発現を増大させる。yecS遺伝子およびyecC遺伝子がコードするタンパク質を、それぞれ、YecSタンパク質およびYecCタンパク質ともいう。YecSタンパク質およびYecCタンパク質を総称して「YecSCタンパク質」ともいう。
【００６４】
yecSC遺伝子としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）、パントエ
ア・アナナティス（Pantoea ananatis）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enteric
a）等の腸内細菌科に属する細菌のyecSC遺伝子が挙げられる。
【００６５】
Escherichia coli K-12 MG1655株のyecS遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.3 GI:556503834)として登録されているゲノム配列中、1997811〜1998479位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYecSタンパク質は、GenBank accession NP_416428 (version NP_416428.1  GI:16129865)として登録されている。MG1655株のyecS遺伝子の塩基配列およびYecSタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１７および１８に示す。
【００６６】
Pantoea ananatis AJ13355株のyecS遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、1893511〜1894179位の配列の相補配列に相当する。また、AJ13355株のYecSタンパク質は
、GenBank accession YP_005934448 (version YP_005934448.1  GI:386016162)として登
録されている。AJ13355株のyecS遺伝子の塩基配列およびYecSタンパク質のアミノ酸配列
を、それぞれ配列番号１９および２０に示す。
【００６７】
Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のyecS遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_003198 (VERSION NC_003198.1 GI:16762629)として登録されている
ゲノム配列中、2005588〜2006256位の配列の相補配列に相当する。また、CT18株のYecSタンパク質は、GenBank accession NP_456515 (version NP_456515.1  GI:16760898)として登録されている。CT18株のyecS遺伝子の塩基配列およびYecSタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２１および２２に示す。
【００６８】
Escherichia coli K-12 MG1655株のyecC遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_000913 (VERSION NC_000913.3 GI:556503834)として登録されているゲノム配列中、1997062〜1997814位の配列の相補配列に相当する。また、MG1655株のYecCタンパク質は、GenBank accession NP_416427 (version NP_416427.1  GI:16129864)として登録されている。MG1655株のyecC遺伝子の塩基配列およびYecCタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２３および２４に示す。
【００６９】
Pantoea ananatis AJ13355株のyecC遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_017531 (VERSION NC_017531.1 GI:386014600)として登録されているゲノム配列中、1892762〜1893514位の配列の相補配列に相当する。また、AJ13355株のYecCタンパク質は
、GenBank accession YP_005934447 (version YP_005934447.1  GI:386016161)として登
録されている。AJ13355株のyecC遺伝子の塩基配列およびYecCタンパク質のアミノ酸配列
を、それぞれ配列番号２５および２６に示す。
【００７０】
Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のyecC遺伝子は、NCBIデータベースに、GenBank accession NC_003198 (VERSION NC_003198.1 GI:16762629)として登録されている
ゲノム配列中、2004839〜2005591位の配列の相補配列に相当する。また、CT18株のYecCタンパク質は、GenBank accession NP_456514 (version NP_456514.1  GI:16760897)として登録されている。CT18株のyecC遺伝子の塩基配列およびYecCタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２７および２８に示す。
【００７１】
yecS遺伝子およびyecC遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記例示したyecS遺伝子およびyecC遺伝子のバリアントであってもよい。同様に、YecSタンパク質およびYecCタンパク質は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記例示したYecSタンパク質およびYecCタンパク質のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。すなわち、「yecS遺伝子」および「yecC遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したyecS遺伝子および
yecC遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「YecSタンパク質」および「YecCタンパク質」という用語は、それぞれ、上記例示したYecSタンパク質およびYecCタンパク質に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したyecSC遺伝子およびYecSCタンパク質のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【００７２】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることであってよい。実施例より、yecSC遺
伝子は、シスタチオニンの取り込み系をコードする遺伝子であると推定される。すなわち、yecSC遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがシ
スタチオニンの取り込み活性を有するタンパク質をコードすることであってよい。また、YecSCタンパク質についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアン
トがシスタチオニンの取り込み活性を有することであってよい。なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合は、各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体が対応する機能（活性や性質）を有することであってよい。すなわち、例えば、YecSタンパク質およびYecCタンパク質が所定の複合体（例えばYecSタンパク質およびYecCタンパク質を含む複合体）を形成して機能する場合は、YecSCタンパク質についての「
元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが所定の複合体を形成してシスタチオニンの取り込み活性を示すことであってもよい。本発明において、YecSCタンパ
ク質についての「シスタチオニンの取り込み活性を有する」とは、YecSタンパク質およびYecCタンパク質がそれぞれ単独でシスタチオニンの取り込み活性を有する場合に限られず、YecSタンパク質およびYecCタンパク質が所定の複合体を形成してシスタチオニンの取り込み活性を示す場合も包含する。
【００７３】
YecSCタンパク質のバリアントがシスタチオニンの取り込み活性を有するか否かは、例
えば、同バリアントをコードする遺伝子を細菌に導入し、シスタチオニン取り込み能が向上するか否かを確認することにより、確認できる。その際には、yecS遺伝子およびyecC遺伝子の両方の発現が増大するように、遺伝子を導入するのが好ましい。すなわち、例えば、YecSタンパク質のバリアントがシスタチオニンの取り込み活性を有するか否かは、同バリアントをコードする遺伝子と適当なyecC遺伝子（例えば上記例示したyecC遺伝子）を細菌に導入し、シスタチオニン取り込み能が向上するか否かを確認することにより、確認できる。また、例えば、YecCタンパク質のバリアントがシスタチオニンの取り込み活性を有するか否かは、同バリアントをコードする遺伝子と適当なyecS遺伝子（例えば上記例示したyecS遺伝子）を細菌に導入し、シスタチオニン取り込み能が向上するか否かを確認することにより、確認できる。
【００７４】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００７５】
yecSC遺伝子のホモログは、例えば、上記例示したyecSC遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、yecSC遺伝子のホモログは、例えば、微生物の染色体を鋳型にして、
これら公知のyecSC遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして用いたPCRにより取得することができる。
【００７６】
yecS遺伝子およびyecC遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記アミノ酸配列（例えば、YecSタンパク質について配列番号１８、２０、または２２に示すアミノ酸配列、YecCタンパク質について配列番号２４、２６、または２８に示すアミノ酸配列
）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００７７】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００７８】
また、yecS遺伝子およびyecC遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、
さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００７９】
また、yecS遺伝子およびyecC遺伝子は、元の機能が維持されている限り、それぞれ、上記塩基配列（例えば、yecS遺伝子について配列番号１７、１９、または２１に示す塩基配列、yecC遺伝子について配列番号２３、２５、または２７に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」と
は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上
、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性
を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００８０】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、yecSC遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作
製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いる
ことができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリ
ダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００８１】
また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、yecSC遺伝子は、任意のコドンをそ
れと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、yecSC遺伝子は、使用する宿
主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。
【００８２】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers 及び Miller (1988) CABIOS 4:11 17のアルゴリ
ズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman及びWunsch (1970) J. Ｍol. Biol. 48:443 453のホモロジーアラインメントアル
ゴリズム、Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 2448の類似性を検索する方法、Karlin 及びAltschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873 5877に記載されているような、改良された、Karlin及びAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264のアルゴリズムが挙げられる。
【００８３】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアラインメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237 244 (1988)、Higgins
et al. (1989) CABIOS 5:151 153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881 90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155 65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307 331によく記載されている。
【００８４】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア
＝１００、ワード長＝１２にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラ
ム、スコア＝５０、ワード長＝３にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較
を目的としてギャップを加えたアラインメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0
）を利用できる。また、PSI-BLAST (BLAST 2.0)を、配列間の離間した関係を検出する反
復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アラインメントは、手動にて行われてもよい。
【００８５】
なお、上記のyecSC遺伝子およびYecSCタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、アスパラギン酸系アミノ酸生合成系酵素やシスタチオニン生合成系酵素等の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００８６】
＜１−３＞シスタチオニン生合成能の増強
本発明の細菌は、さらに、シスタチオニン生合成能が増強されるよう、改変されていてもよい。シスタチオニン生合成能は、シスタチオニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増大させることにより、増強できる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｌ−メチオニン生合成系酵素として既に例示したホモセリントランスサクシニラーゼ（metA）、シスタチオニンγ−シンターゼ（metB）、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII（metL）が挙げられる。これらＬ−メチオニン生合成系酵素をコードする遺伝子の発現はメチオニンリプレッサー（metJ）により抑制されるため、これらの酵素活性を増強するには、メチオニンリプレッサー（metJ）を欠損させてもよい（特開2000-139471号）。また、これらの中では、例えば、ホモセリントランスサ
クシニラーゼ（metA）の活性を増強するのが好ましい。E. coli K-12 W3110株のmetA遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするMetAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および１６に示す。ホモセリントランスサクシニラーゼ（metA）はＬ−メチオニンによるフィードバック阻害を受けるので、同酵素の活性を増強するには、Ｌ−メチオニンによるフィードバック阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼをコードする変異型metA遺伝子を利用してもよい（特開2000-139471号、US20090029424）。活性を増大させる酵素は、目的のアスパラギン酸系アミノ酸の種類等に応じて適宜選択できる。例えば、Ｌ−リジンを製造する場合には、通常、ホモセリンデヒドロゲナーゼ活性は増強しないのが好ましい。
【００８７】
なお、上記のシスタチオニン生合成能の増強に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示した遺伝子や公知の塩基配列を有する遺伝子に限られず、そのバリアントであってもよい。例えば、シスタチオニン生合成能の増強に使用される遺伝子は、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。遺伝子やタンパク質のバリアントについては、上述したyecSC遺伝子およびYecSCタンパク質の保存的バリアントに関する記載を準用できる。
【００８８】
＜１−４＞遺伝子の発現を増大（上昇）させる手法
以下に、yecSC遺伝子等の遺伝子の発現を増大（上昇）させる手法について説明する。
【００８９】
「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現の上昇の程度は、遺伝子の発現が非改変株と比較して上昇していれば特に制限されない。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。また、結果として遺伝子の発現が上昇する限り、宿主が本来有する標的の遺伝子の発現を弱化させる、または宿主が本来有する標的の遺伝子を破壊する、等の改変を行った上で、好適な標的の遺伝子を導入してもよい。
【００９０】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００９１】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Mill
erI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。相同組み換えを利用する遺伝子導入法としては、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性
複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、ファージを用いたtransduction法が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、ト
ランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入する
こともできる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【００９２】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００９３】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pACYC184、pMW219（ニッポンジーン社）
、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロ
ンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社）、pACYC系ベクター、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。
【００９４】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００９５】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、T7ターミネーター、T4ターミネーター、fdファージターミネーター、tetターミネーター、
およびtrpAターミネーターが挙げられる。
【００９６】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００９７】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、それらの遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、それらの遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、yecS遺伝子およびyecC遺伝子を導入する場合、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９８】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、それらの遺伝子は、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、yecS遺伝子およびyecC遺伝子を導入する場合、yecS遺伝子とyecC遺伝子の両方が同一の生物に由来するものであってもよく、yecS遺伝子とyecC遺伝子のそれぞれが異なる生物に由来するものであってもよい。また、yecS遺伝子を導入する場合、１種のyecS遺伝子が導入されてもよく、２種またはそれ以上のyecS遺伝子が導入されてもよい。また、yecC遺伝子を導入する場合、１種のyecC遺伝子が導入されてもよく、２種またはそれ以上のyecC遺伝子が導入されてもよい。
【００９９】
導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として
、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩
基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子
は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。
【０１００】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、tetプロモーター、araBADプロモーター、rpoHプロモーター、PRプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinら
の論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０１０１】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5'-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【０１０２】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことが
できる。
【０１０３】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じ
うる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【０１０４】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０１０５】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０１０６】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53,
159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞か
らコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組
換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。あるいは、コリネ型細菌について報告されているような、電気パ
ルス法（特開平2-207791）を利用することもできる。
【０１０７】
遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。また、遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子から発現するタンパク質の活性が増大したことを確認することにより確認できる。
【０１０８】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して
、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１０９】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１１０】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１１１】
上記した遺伝子の発現を増大させる手法は、yecSC遺伝子の発現増強に加えて、任意の
遺伝子、例えばアスパラギン酸系アミノ酸生合成系酵素やシスタチオニン生合成系酵素をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０１１２】
＜１−５＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【０１１３】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタン
パク質の活性を付与してもよい。
【０１１４】
タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【０１１５】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成される。遺伝子の発現を上昇させる手法については上述した通りである。
【０１１６】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の解除も含まれる。すなわち、タンパク質が代謝物によるフィードバック阻害を受ける場合は、フィードバック阻害が解除された変異型タンパク質をコードする遺伝子を細菌に保持させることにより、タンパク質の活性を増大させることができる。なお、本発明において、「フィードバック阻害の解除」には、特記しない限り、フィードバック阻害が完全に解除される場合、および、フィードバック阻害が低減される場合が包含される。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。
比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【０１１７】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【０１１８】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。
【０１１９】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質、例えばアスパラギン酸系アミノ酸生合成系酵素やシスタチオニン生合成系酵素、の活性増強や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現増強に利用できる。
【０１２０】
＜１−６＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、タンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【０１２１】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の細胞当たりの活性が野性株や親株等の非改変株と比較して減少していることを意味し、活性が完全に消失している場合を含む。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合が含まれる。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合が含まれる。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１２２】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成される。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の細胞当たりの発現量が野生株や親株等の非改変株に対して低下していることを意味する。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合が含まれる。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現の低下の程度は、遺伝子の発現が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１２３】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のプロモーター、シャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の発現調節配列を改変することにより達成できる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。また、発現調節配列の一部または全部を欠失させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、
遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【０１２４】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域の一部又は全部を欠損させることにより達成できる。さらには、染色体上の遺伝子の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域、内部領域、Ｃ末端領域等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが
好ましい。
【０１２５】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、あるいは１〜２塩基を付加または欠失するフレームシフト変異を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【０１２６】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。他の配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【０１２７】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、欠失型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を欠失型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。欠失型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切
り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組み合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用
いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法などがある（米国特許第6303383号、特開平05-007491号）。
【０１２８】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【０１２９】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。また、タンパク質に複数のアイソザイムが存在する場合、結果としてタンパク質の活性が低下する限り、複数のアイソザイムの全ての活性を低下させてもよく、一部のみの活性を低下させてもよい。すなわち、例えば、それらのアイソザイムをコードする複数の遺伝子の全てを破壊等してもよく、一部のみを破壊等してもよい。
【０１３０】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１３１】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【０１３２】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことが出来る。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR等が挙げられる（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量は、非改変株
と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１３３】
タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことが出来る（Molecular cloning（Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【０１３４】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【０１３５】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質、例えば目的のアスパラギン酸系アミノ酸の生合成経路から分岐して目的のアスパラギン酸系アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素、の活性低下や、任意の遺伝子、例えばそれら任意のタンパク質をコードする遺伝子、の発現低下に利用できる。
【０１３６】
＜２＞本発明のアスパラギン酸系アミノ酸の製造法
本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養し、アスパラギン酸系アミノ酸を該培地中または該細菌の菌体内に生成蓄積させること、および該培地または菌体よりアスパラギン酸系アミノ酸を採取すること、を含むアスパラギン酸系アミノ酸の製造法である。本発明においては、１種のアスパラギン酸系アミノ酸が製造されてもよく、２種またはそれ以上のアスパラギン酸系アミノ酸が製造されてもよい。
【０１３７】
使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、アスパラギン酸系アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌等の微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地成分の種類や濃度は、使用する細菌の種類や製造するアスパラギン酸系アミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１３８】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１３９】
培地中での炭素源の濃度は、本発明の細菌が増殖でき、アスパラギン酸系アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培地中での炭素源の濃度は、アスパラギン酸系アミノ酸の生産が阻害されない範囲で可能な限り高くするのが好ましい。培地中での炭素源の初発濃度は、例えば、通常1〜30 %(w/v)、好ましくは3〜10 %(w/v)であってよい。また、発
酵の進行に伴う炭素源の消費に応じて、炭素源を追加で添加してもよい。
【０１４０】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１４１】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０１４２】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０１４３】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビ
タミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１４４】
また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−リジン生合成経路が強化され、Ｌ−リジン分解能が弱化されている場合が多い。そのようなＬ−リジン生産菌を培養する場合には、例えば、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンから選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸を培地に補添するのが好ましい。また、培地にシスタチオニンを補填してもよい。
【０１４５】
培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、アスパラギン酸系アミノ酸が生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、エシェリヒア・コリ等の細菌の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。培養条件は、使用する細菌の種類や製造するアスパラギン酸系アミノ酸の種類等の諸条件に応じて適宜設定してよい。
【０１４６】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の細菌を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の細菌を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の細菌の量は特に制限されない。例えば、ＯＤ６６０＝４〜８の種培養液を、培養開始時に、本培養用の培地に対して０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％、添加してよい。
【０１４７】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養
において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０１４８】
本発明において、各培地成分は、初発培地、流加培地、またはその両方に含有されていてよい。初発培地に含有される成分の種類は、流加培地に含有される成分の種類と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、初発培地に含有される各成分の濃度は、流加培地に含有される各成分の濃度と、同一であってもよく、そうでなくてもよい。また、含有する成分の種類および／または濃度の異なる２種またはそれ以上の流加培地を用いてもよい。例えば、複数回の流加が間欠的に行われる場合、各流加培地に含有される成分の種類および／または濃度は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。
【０１４９】
培養は、例えば、好気的に行うことができる。例えば、培養は、通気培養または振盪培養で行うことができる。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％
程度に制御されてよい。培地のpHは、例えば、pH 3〜10、好ましくはpH 4.0〜9.5であっ
てよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20〜45℃、好ましくは25℃〜37℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間〜120時間
であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の細菌の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の細菌を培養することにより、菌体内および／または培地中にアスパラギン酸系アミノ酸が蓄積する。
【０１５０】
流加培養または連続培養においては、流加は、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、流加培養または連続培養においては、複数回の流加が間欠的に行われてもよい。
【０１５１】
複数回の流加が間欠的に行われる場合、１回当たりの流加の継続時間が、複数回の流加の合計時間の、例えば30％以下、好ましくは20％以下、より好ましくは10％以下となるように、流加の開始と停止を繰り返してもよい。
【０１５２】
また、複数回の流加が間欠的に行われる場合、２回目以降の流加を、その直前の流加停止期において発酵培地中の炭素源が枯渇したときに開始されるように制御することにより、発酵培地中の炭素源濃度を自動的に低レベルに維持することもできる（米国特許5,912,113号明細書）。炭素源の枯渇は、例えば、pHの上昇または溶存酸素濃度の上昇により検
出できる。
【０１５３】
連続培養においては、培養液の引き抜きは、培養の全期間を通じて継続されてもよく、培養の一部の期間においてのみ継続されてもよい。また、連続培養においては、複数回の培養液の引き抜きが間欠的に行われてもよい。培養液の引き抜きと流加は、同時に行われてもよく、そうでなくてもよい。例えば、培養液の引き抜きを行った後で流加を行ってもよく、流加を行った後で培養液の引き抜きを行ってもよい。引き抜く培養液量は、流加させる培地量と同量であるのが好ましい。ここで、「同量」とは、例えば、流加させる培地量に対して９３〜１０７％の量であってよい。
【０１５４】
培養液を連続的に引き抜く場合には、流加と同時に、または流加の開始後に、引き抜きを開始するのが好ましい。例えば、流加の開始後５時間以内、好ましくは３時間以内、より好ましくは１時間以内に、引き抜きを開始してよい。
【０１５５】
培養液を間欠的に引き抜く場合には、予定したアスパラギン酸系アミノ酸濃度に到達したときに、培養液を一部引き抜いてアスパラギン酸系アミノ酸を回収し、新たに培地を流加して培養を継続するのが好ましい。
【０１５６】
また、引き抜かれた培養液から、アスパラギン酸系アミノ酸を回収し、菌体を含むろ過残留物を発酵槽中に再循環させることにより、菌体を再利用することもできる（フランス特許2669935号明細書）。
【０１５７】
また、Ｌ−リジン等の塩基性アミノ酸を製造する場合、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用して塩基性アミノ酸を発酵生産する方法を利用してもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）。これらの
方法によれば、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして従来利用されていた硫酸イオン及び／又は塩化物イオンの使用量を削減しつつ、塩基性アミノ酸を製造することができる。
【０１５８】
同方法においては、培養中の培地のｐＨを６．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．０、培養終了時の培地のｐＨを７．２〜９．０となるように制御し、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが培地中に２０ｍＭ以上、好ましくは３０ｍＭ以上、より好ましくは４０ｍＭ以上存在する培養期があるようにする。塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるためには、発酵中の発酵槽内圧力を正となるように制御すること、炭酸ガスを培養液に供給すること、またはその両方を行うのが好ましい。
【０１５９】
発酵中の発酵槽内圧力を正となるように制御するには、例えば、給気圧を排気圧より高くすればよい。発酵槽内圧力を正にすることによって、発酵により生成する炭酸ガスが培養液に溶解して重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを生じ、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが塩基性アミノ酸のカウンタイオンとなり得る。発酵槽内圧力として、具体的には、ゲージ圧（大気圧に対する差圧）で、０．０３〜０．２ＭＰａ、好ましくは０．０５〜０．１５ＭＰａ、より好ましくは０．１〜０．３ＭＰａが挙げられる。また、炭酸ガスを培養液に供給する場合は、例えば、純炭酸ガス又は炭酸ガスを５体積％以上含む混合ガスを培養液に吹き込めばよい。発酵槽内圧力、炭酸ガスの供給量、および制限された給気量は、例えば、培地のｐＨ、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン濃度、または培地中のアンモニア濃度を測定することにより決定できる。
【０１６０】
従来の塩基性アミノ酸の製造方法においては、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンを塩基牲アミノ酸のカウンタイオンとして利用するため、十分量の硫酸アンモニウム及び／又は塩化アンモニウム、あるいは、栄養成分として蛋白等の硫酸分解物及び／又は塩酸分解物が培地に添加されていた。そのため、培地中には、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンが多量に存在し、弱酸性である炭酸イオン濃度はppmオーダーと極めて低かった。
【０１６１】
一方、上記方法（特開2002-65287、US2002-0025564A、EP1813677A）は、これら硫酸イ
オンおよび塩化物イオンの使用量を減じ、微生物が発酵時に放出する炭酸ガスを培地中に溶解せしめ、カウンタイオンとして利用することに特徴がある。
【０１６２】
すなわち、同方法においては、硫酸イオン及び／又は塩化物イオンの使用量を削減することが目的の一つであるため、培地に含まれる硫酸イオンおよび塩化物イオンのモル濃度の合計は、通常、７００ｍＭ以下、好ましくは５００ｍＭ以下、より好ましくは３００ｍＭ以下、さらに好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは１００ｍＭ以下である。硫酸イオン及び／又は塩化物イオン濃度を低減することで、重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンをより容易に培地中に存在させることができる。すなわち、同方法においては、従来法
に比べて、塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させるための培地のpHを低く抑えることが可能となる。
【０１６３】
また、同方法においては、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオン以外のアニオン（他のアニオンともいう）の濃度は、塩基性アミノ酸生産菌の生育に必要な量が含まれてさえいれば、低いことが好ましい。他のアニオンとしては、塩化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、イオン化した有機酸、水酸化物イオンが挙げられる。培地に含まれる他のアニオンのモル濃度の合計は、通常９００ｍＭ以下、好ましくは７００ｍＭ以下、より好ましくは５００ｍＭ以下、さらに好ましくは３００ｍＭ以下、特に好ましくは２００ｍＭ以下である。
【０１６４】
同方法においては、硫酸イオンや塩化物イオンを塩基性アミノ酸生産菌の生育に必要な量以上に培地に添加する必要はない。好ましくは、培養当初は硫酸アンモニウム等を培地に適当量フィードし、培養途中でフィードを止める。あるいは、培地中の炭酸イオン及び／又は重炭酸イオンの溶存量とのバランスを保ちつつ、硫酸アンモニウム等をフィードしてもよい。また、塩基性アミノ酸の窒素源として、アンモニアを培地にフィードしてもよい。例えば、アンモニアでｐＨを制御する場合、ｐＨを高めるために供給されたアンモニアが、塩基性アミノ酸の窒素源として利用され得る。アンモニアは、単独で、又は他の気体とともに培地に供給することができる。
【０１６５】
また、同方法においては、培地中の総アンモニア濃度を、塩基性アミノ酸の生産を阻害しない濃度に制御するのが好ましい。「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度としては、例えば、最適な条件において塩基性アミノ酸を生産する場合の収率及び／又は生産性に比べて、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上の収率及び／又は生産性が得られる総アンモニア濃度が挙げられる。培地中の総アンモニア濃度として、具体的には、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは２５０ｍＭ、特に好ましくは２００ｍＭ以下の濃度が挙げられる。アンモニアの解離度はｐＨが高くなると低下する。解離していないアンモニアは、アンモニウムイオンよりも菌に対して毒性が強い。そのため、総アンモニア濃度の上限は、培養液のｐＨにも依存する。すなわち、培養液のｐＨが高いほど、許容される総アンモニア濃度は低くなる。したがって、「塩基性アミノ酸の生産を阻害しない」総アンモニア濃度は、ｐＨ毎に設定することが好ましい。しかし、培養中の最も高いｐＨにおいて許容される総アンモニア濃度範囲を、培養期間を通じての総アンモニア濃度範囲として用いてもよい。
【０１６６】
一方、塩基性アミノ酸生産菌の生育及び塩基性アミノ酸の生産に必要な窒素源としての総アンモニア濃度は、培養中にアンモニアが枯渇した状態が継続せず、且つ、窒素源が不足することによる微生物による目的物質の生産性の低下が起こらない限り、特に制限されず、適宜設定することができる。例えば、培養中にアンモニア濃度を経時的に測定し、培地中のアンモニアが枯渇したら少量のアンモニアを培地に添加してもよい。アンモニアを添加したときのアンモニア濃度としては、特に制限されないが、例えば、総アンモニア濃度として好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは１０ｍＭ以上、特に好ましくは２０ｍＭ以上の濃度が挙げられる。
【０１６７】
また、同方法において、培地には、塩基性アミノ酸以外のカチオンが含まれ得る。塩基性アミノ酸以外のカチオンとしては、培地成分由来のＫイオン、Ｎａイオン、Ｍｇイオン、Ｃａイオンが挙げられる。塩基性アミノ酸以外のカチオンのモル濃度の合計は、好ましくは、総カチオンのモル濃度の５０％以下である。
【０１６８】
アスパラギン酸系アミノ酸が生成したことは、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により確認することができる。そのような手法としては、例えば、ＨＰＬＣ、Ｌ
Ｃ／ＭＳ、ＧＣ／ＭＳ、ＮＭＲが挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。
【０１６９】
生成したアスパラギン酸系アミノ酸の回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法、膜処理法、沈殿法、および晶析法が挙げられる。これらの手法は適宜組み合わせて用いることができる。なお、菌体内にアスパラギン酸系アミノ酸が蓄積する場合には、例えば、菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清から、イオン交換樹脂法などによってアスパラギン酸系アミノ酸を回収することができる。回収されるアスパラギン酸系アミノ酸は、フリー体、その塩、またはそれらの混合物であってよい。すなわち、本発明における「アスパラギン酸系アミノ酸」という用語は、フリー体のアミノ酸、その塩、またはそれらの混合物を意味してよい。塩としては、例えば、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩が挙げられる。
【０１７０】
また、アスパラギン酸系アミノ酸が培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したアスパラギン酸系アミノ酸は、培地中に溶解しているアスパラギン酸系アミノ酸を晶析した後に、併せて単離してもよい。
【０１７１】
尚、回収されるアスパラギン酸系アミノ酸は、アスパラギン酸系アミノ酸以外に、例えば、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。回収されたアスパラギン酸系アミノ酸の純度は、例えば、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、80％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【実施例】
【０１７２】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１７３】
以下の実施例において、試薬は、特記しない限り、和光純薬工業製またはナカライテスク社製のものを用いた。実施例で用いた培地の組成および手法は以下に示すとおりである。
【０１７４】
〔L培地〕
バクトトリプトン（ディフコ社製）10 g/L、酵母エキス（ディフコ社製）5 g/L、NaCl 5 g/L。120℃、20分間のオートクレーブを行った。
【０１７５】
〔L寒天培地〕
L培地、バクトアガー（ディフコ社製）15 g/L。120℃、20分間のオートクレーブを行った。
【０１７６】
〔PCR反応〕
PCR反応は、Prime Star DNA polymerase（タカラバイオ（株）製）を使用し、同酵素に添付のプロトコールに従って行った。得られたPCR産物をWizard PCR Preps DNA purification system（Promega（株））を用いて精製した。
【０１７７】
〔ライゲーション反応〕
ライゲーション反応は、Ligation kit ver.2（タカラバイオ（株））を用い、同キットに添付のプロトコールに従って行った。
【０１７８】
〔E. coliの形質転換〕
ライゲーション反応液あるいはプラスミドDNAを用いてHanahanらの方法（Hanahan, D. 
1983. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol., 166, 557-580）にてE. coliを形質転換した。
【０１７９】
［実施例１］yecSC遺伝子の発現増強によるシスタチオニン取り込み能の強化
＜１＞yecSC遺伝子の発現プラスミドの構築
E. coli K-12 MG1655株（ATCC 47076）よりyecSC遺伝子をpMIV-Pnlp23をベースとした
発現ベクターにクローニングし、yecSC遺伝子の発現プラスミドを構築した。この発現ベ
クターには強力なnlp23プロモーター（Pnlp23）とrrnBターミネーターが組み込まれてお
り、プロモーターとターミネーターの間に目的の遺伝子を挿入することで発現ユニットとして機能させることができる。「Pnlp23」は、E. coli K-12 MG1655株由来のnlpD遺伝子
のプロモーター（野生型nlpDプロモーター；Pnlp0ともいう）を改変して得られた改変型
プロモーターである。
【０１８０】
＜１−１＞発現ベクターの構築
E. coli K-12 MG1655の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP1（配列番号２）及びプライマーP2（配列番号３）を用いたPCRによって、野生型nlpDプロモーター領域約300 bpを含むDNA断片を増幅した。これらプライマーの5'末端には制限酵素SalI及びPaeIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。増幅したDNA断片をSalI及びPaeIで処理し、pMIV-5JS（特開2008-99668）のSalI−PaeIサイトに挿入し、プラスミドpMIV-Pnlp0を取得した。このpMIV-Pnlp0プラスミドに挿入されたPnlp0を含むDNA断片の塩基配列は配列番号１に示したとおり
である。
【０１８１】
次に、MG1655の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP3（配列番号４）及びプ
ライマーP4（配列番号５）を用いたPCRによって、rrnB遺伝子のターミネーター領域約300
bpを含むDNA断片を増幅した。これらプライマーの5'末端には制限酵素XbaI及びBamHIの
サイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、59℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。増幅したDNA断片をXbaI及びBamHIで処理し、pMIV-Pnlp0のXbaI−BamHIサイトに挿入しプラスミドpMIV-Pnlp0-terを取得した。
【０１８２】
続いて、MG1655の染色体DNAをテンプレートとして、プライマーP5（配列番号６）及び
プライマーP6（配列番号７）を用いたPCRによって、yeaS遺伝子を含む約700 bpのDNA断片を増幅した。これらプライマーの5'末端には制限酵素SalI及びXbaIのサイトがそれぞれデザインされている。PCRサイクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30
秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72
℃ 5分。増幅したDNA断片をSalI及びXbaIで処理し、pMIV-Pnlp0-terのSalI−XbaIサイト
に挿入しプラスミドpMIV-Pnlp0-YeaS3を取得した。こうして、pMIV-5JSベクター上に、野生型nlpDプロモーター、yeaS遺伝子、及びrrnBターミネーターが、この順に繋がったyeaS遺伝子の発現ユニットが構築された。
【０１８３】
野生型nlpDプロモーターの-10領域を改変することでより強力なプロモーターとするた
め、以下の手法で-10領域のランダム化を行った。野生型nlpDプロモーター領域にはプロ
モーターとして機能すると推定される領域が２箇所存在し、それぞれpnlp1およびpnlp2とする（図１）。プラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして、プライマーP1及びプライマーP7（配列番号８）を用いたPCRによって、野生型nlpDプロモーターの3'末端側に含まれ
る-10領域（-10(Pnlp1)）をランダム化したDNA断片を増幅した。PCRサイクルは次の通り
である。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60
℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。
【０１８４】
一方、同様にプラスミドpMIV-Pnlp0をテンプレートとして、プライマーP2及びプライマーP8（配列番号９）を用いたPCRによって、野生型nlpDプロモーターの5'末端側に含まれ
る-10領域（-10(Pnlp2)）をランダム化したDNA断片を増幅した。PCRサイクルは次の通り
である。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60
℃ 20秒、72℃ 15秒を25サイクル、最後に72℃ 5分。
【０１８５】
増幅した3'末端側と5'末端側のDNA断片をプライマーP7とP8にデザインされたBglIIサイトによってつなぎ合わせ、２箇所の-10領域がランダム化された改変型nlpDプロモーター
全長のDNA断片を構築した。このDNA断片をテンプレートとして、プライマーP1及びプライマーP2を用いたPCRによって、改変型nlpDプロモーター全長のDNA断片を増幅した。PCRサ
イクルは次の通りである。95℃ 3分の後、95℃ 60秒、50℃ 30秒、72℃ 40秒を2サイクル、94℃ 20秒、60℃ 20秒、72℃ 15秒を12サイクル、最後に72℃ 5分。
【０１８６】
増幅したDNA断片を、プライマーの5'末端にデザインされた制限酵素SalI及びPaeIで処
理し、同じくSalI及びPaeIで処理したプラスミドpMIV-Pnlp0-YeaS3に挿入することで、プラスミド上の野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）を改変型nlpDプロモーターと置き換えた
。こうして得られたプラスミドの内、nlp23プロモーター（Pnlp23）を有するものを選び
、pMIV-Pnlp23-YeaS7とした。このプラスミドに挿入されたPnlp23を含むDNA断片の塩基配列は配列番号１０に示したとおりである。
【０１８７】
pMIV-Pnlp23-YeaS7には、yeaS遺伝子がSalIとXbaI部位を介してnlp0プロモーターとrrnBターミネーターの間にクローニングされている。よって、SalIとXbaIをデザインしたプ
ライマーを用いてyecSC遺伝子を増幅し、当該プラスミド上のyeaS遺伝子をyecSC遺伝子に置換することで、yecSC遺伝子の発現プラスミドを構築することができる。
【０１８８】
＜１−２＞yecSC遺伝子の発現プラスミドの構築
E. coli K-12 MG1655株の染色体DNAを鋳型として、プライマーSalI-yecS Fw（配列番号１１）及びプライマーXbaI-yecC Rv（配列番号１２）を用いたPCRによって、yecSC遺伝子を含むDNA断片を増幅した。PCRサイクルは次の通りである。94℃ 5分の後、98℃ 5秒、55℃ 10秒、72℃ 2分を30サイクル、最後に4℃保温。これらプライマーの両端にはSalIとXbaIのサイトがそれぞれデザインされている。増幅したDNA断片を制限酵素SalI及びXbaIで
処理し、同じくSalI及びXbaIで処理したプラスミドpMIV-Pnlp23-YeaS7に挿入することで
、プラスミド上のyeaS遺伝子をyecSC遺伝子と置き換え、yecSC遺伝子の発現プラスミドを得た。得られたプラスミドをpMIV-Pnlp23-yecSCと命名した。
【０１８９】
＜２＞yecSC遺伝子発現増強株のシスタチオニン取り込み能評価
E. coli K-12 MG1655株にpMIV-Pnlp23-yecSCを導入し、yecSC遺伝子発現増強株を構築
した。この菌株をyecSC/MG1655株と命名した。一方、E. coli K-12 MG1655株にpMIV-5JS
を導入し、対照株を構築した。この菌株を5JS/MG1655株と命名した。
【０１９０】
対照株及yecSC遺伝子発現増強株を、M9最少培地にシスタチオニンを終濃度50μMとなるよう添加した以下に示す培地（M9培地）で培養し、残存シスタチオニン濃度を追跡した。結果を図２に示す。対照株（5JS/MG1655株）ではシスタチオニンの取り込みがほとんど認められなかったのに対し、yecSC遺伝子発現増強株（yecSC/MG1655株）では良好なシスタ
チオニンの取り込みが観察された。すなわち、yecSC遺伝子の発現を増強することによっ
て、シスタチオニン取り込み能を付与又は増強出来ることが分かった。よって、yecSC遺
伝子はシスタチオニン取り込み系をコードする遺伝子であると推定された。
【０１９１】
［M9培地］
（各成分の濃度は最終濃度）
成分１：
グルコース                   2 g/L
成分２：
Na2HPO4・7H2O               12.8 g/L
KH2PO4                       3 g/L
NaCl                         0.5 g/L
NH4SO4                       0.1 g/L
成分３：
MgSO4・7H2O                  0.494 g/L
成分４：
CaCl2・2H2O                  0.0147 g/L
成分５：
シスタチオニン              11.1 mg/L
成分１〜３は別々に120℃、20分間オートクレーブ。成分４〜５はそれぞれ濾過滅菌。
培養前にクロラムフェニコールを25 mg/Lの濃度で加えた。
【０１９２】
〔実施例２〕E. coliのyecSC遺伝子発現増強株によるＬ−リジン生産
＜１＞metA遺伝子およびyecSC遺伝子の発現増強
Ｌ−リジン生産菌として、E. coli AJIK01株（NITE BP-01520）を用いた。AJIK01株にpMWPthmetA-W（JP 4110641）及びpMIV-Pnlp23-yecSCを導入し、yecSC遺伝子発現増強株を
構築した。この菌株をyecSC/PthmetA/AJIK01と命名した。一方、AJIK01株にpMWPthmetA-W及びpMIV-5JSを導入し、対照株を構築した。この菌株を5JS/PthmetA/AJIK01と命名した。pMWPthmetA-Wは、ホモセリントランスサクシニラーゼをコードするmetA遺伝子の発現プラスミドであり、スレオニンオペロンのプロモーターとその制御下で発現するE. coli K-12
W3110株（ATCC 27325）のmetA遺伝子を有する。すなわち、ここで得られた対照株及びyecSC遺伝子発現増強株は、いずれも、metA遺伝子の発現が増強されている。スレオニンオ
ペロンのプロモーターの塩基配列を配列番号１４に示す。E. coli K-12 W3110株のmetA遺伝子の塩基配列および同遺伝子がコードするMetAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１５および１６に示す。
【０１９３】
対照株及びyecSC遺伝子発現増強株を、100 mg/Lのアンピシリンを含むL培地にてOD600
が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等量の30%グリセロール溶液を加えて攪拌した。その後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。
【０１９４】
＜２＞Ｌ−リジン生産培養
対照株及びyecSC遺伝子発現増強株のグリセロールストックを融解し、500μLを、100 mg/Lのアンピシリン及び25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLプレートに均一に塗布し
、37℃にて24時間培養した。プレートのおよそ1/8量の菌体を、100 mg/Lのアンピシリン
及び25 mg/Lのクロラムフェニコールを含む20 mLの以下に示すＬ−リジン生産培地（MS-Glc培地）を張り込んだ500 mL容坂口フラスコに植菌し、往復振とう培養装置で37℃において培養した。培養終了後に、培地中に蓄積したＬ−リジンの量を定量した。結果を表１に示す。対照株（5JS/PthmetA/AJIK01）と比較して、yecSC遺伝子発現増強株（yecSC/PthmetA/AJIK01）では、Ｌ−リジン蓄積量が増大した。すなわち、yecSC遺伝子の発現を増強することによって、Ｌ−リジン生産が向上することが明らかとなった。
【０１９５】
［Ｌ−リジン生産培地（MS-Glc培地）］
グルコース                      20 g/L
(NH4)2SO4                       24 g/L 
KH2PO4                           1.0 g/L
MgSO4・7H2O                      1.0 g/L
FeSO4・7H2O                      0.01 g/L
MnSO4・7H2O                      0.08 g/L
Yeast Extract                    2.0 g/L
L-isoleucine                     0.1 g/L
CaCO3（日本薬局方）             30 g/L
KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブを行なった。但し、グルコースとMgSO4・7H2Oは混合し、他の成分とは別にオートクレーブを実施した。CaCO3は乾熱滅菌後に
添加した。
【０１９６】
【表１】
2016149983.tif 000002
【０１９７】
〔実施例３〕E. coliのyecSC遺伝子発現増強株によるＬ−メチオニン生産
Ｌ−メチオニン生産菌として、E. coli pMWPthmetA-W/WΔBCΔJK-24株（FERM P-16808
）（JP 4110641）を用いた。pMWPthmetA-W/WΔBCΔJK-24株にpMIV-Pnlp23-yecSCを導入し、yecSC遺伝子発現増強株を構築した。この株をyecSC/PthmetA/WΔBCΔJK-24と命名した
。一方、pMWPthmetA-W/WΔBCΔJK-24株にpMIV-5JSを導入し、対照株を構築した。この株
を5JS/PthmetA/WΔBCΔJK-24と命名した。
【０１９８】
対照株及びyecSC遺伝子発現増強株を、100 mg/Lのアンピシリン及び25 mg/Lのクロラムフェニコールを含むL培地にてOD600が約0.6となるまで37℃にて培養した後、培養液と等
量の30%グリセロール溶液を加えて攪拌した。その後、適当量ずつ分注、-80℃に保存し、グリセロールストックとした。
【０１９９】
対照株及びyecSC遺伝子発現増強株を、100mg/Lのアンピシリンを含むLBプレート上で、37℃で一晩培養した。菌体を、グルコース20 g/L、硫酸マグネシウム1 g/L、硫安16 g/L
、リン酸二水素カリウム１ g/L、酵母抽出物（Bacto Yeast-Extract (Difco)）2 g/L、硫酸マンガン0.01 g/L、硫酸鉄0.01 g/L、炭酸カルシウム30 g/L、アンピシリン50 mg/L、
Ｌ−スレオニン0.5 g/Lを含むpH7の培地20 mLに植菌し、37℃で48時間培養した。培養物
から菌体を除き、アミノ酸分析計（日立社製）にてＬ−メチオニン量を測定した。結果を表２に示す。対照株（5JS/PthmetA/WΔBCΔJK-24）と比較して、yecSC遺伝子発現増強株
（yecSC/PthmetA/WΔBCΔJK-24）では、Ｌ−メチオニン蓄積量が増大した。すなわち、yecSC遺伝子の発現を増強することによって、Ｌ−メチオニン生産が向上することが明らか
となった。
【０２００】
【表２】
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【０２０１】
＜配列表の説明＞
配列番号１：野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）を含むDNA断片の塩基配列
配列番号２〜９：プライマー
配列番号１０：nlp23プロモーター（Pnlp23）を含むDNA断片の塩基配列
配列番号１１、１２：プライマー
配列番号１３：下流の遺伝子との連結部位を含む野生型nlpDプロモーター（Pnlp0）の塩
基配列
配列番号１４：スレオニンプロモーターの塩基配列
配列番号１５：Escherichia coli K-12 W3110株のmetA遺伝子の塩基配列
配列番号１６：Escherichia coli K-12 W3110株のMetAタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１７：Escherichia coli K-12 MG1655株のyecS遺伝子の塩基配列
配列番号１８：Escherichia coli K-12 MG1655株のYecSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号１９：Pantoea ananatis AJ13355株のyecS遺伝子の塩基配列
配列番号２０：Pantoea ananatis AJ13355株のYecSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２１：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のyecS遺伝子の塩基配列
配列番号２２：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のYecSタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２３：Escherichia coli K-12 MG1655株のyecC遺伝子の塩基配列
配列番号２４：Escherichia coli K-12 MG1655株のYecCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：Pantoea ananatis AJ13355株のyecC遺伝子の塩基配列
配列番号２６：Pantoea ananatis AJ13355株のYecCタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のyecC遺伝子の塩基配列
配列番号２８：Salmonella enterica serovar Typhi CT18株のYecCタンパク質のアミノ酸配列
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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