(57)【要約】【課題】直鎖トリペプチドを原料として、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドを製造する方法を提供する。【解決手段】Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドの水溶液を加熱することを特徴とする。コラーゲンを分解すれば種々のＸ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙで示される直鎖トリペプチドを得られるため、効率的に種々の環状ジペプチドを製造することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドを加熱することを特徴とする、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドの製造方法。
【請求項２】
加熱温度は、４０〜１４０℃である、請求項１記載の環状ジペプチドの製造方法。
【請求項３】
加熱時の圧力は０．１〜１ＭＰａで行われる、請求項１または２記載の環状ジペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記直鎖トリペプチドは、ｐＨ２〜１０の水溶液中で加熱されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の環状ジペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記直鎖トリペプチドは、タンパク質の加水分解物の一部であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の環状ジペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドを原料とする、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）で示される環状ジペプチドが健忘症に有効であるとの報告があり（非特許文献１）、シクロ（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）やシクロ（Ｐｈｅ−Ｈｙｐ）に抗カビ作用があること（非特許文献２）、およびシクロ（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）に抗癌作用があること（非特許文献３）等が知られている。これらはいずれもプロリンやヒドロキシプロリンを構成アミノ酸残基として含むものである。
【０００３】
一方、環状ジペプチドの製造方法として、酵素反応によるもの（特許文献１）、遺伝子工学によるもの(特許文献２）、有機溶剤中での加熱によるもの（特許文献３）、高温高圧水中で脱水・環化反応させ環状ジペプチドを生成するもの（特許文献４）、直鎖ジペプチドや直鎖トリペプチドを加熱して環状ジペプチドを生成するもの（特許文献５）などがある。
【０００４】
前記特許文献４記載の方法では、直鎖ジペプチドを１００〜４５０℃かつ圧力１〜４０Ｍｐａの高温高圧水中で反応させると、環状ジペプチドが生成されるという。実施例では、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕを使用し、これらが加水分解されたアミノ酸と共に、環状ジペプチドであるグリシン無水物、シクロ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、シクロ（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ）をそれぞれ検出している。なお、直鎖ペプチドは、アミノ酸２〜１０個のものが好ましく、環化の際には、直鎖ペプチドのＮ末端アミノ酸のアミノ基とＣ末端アミノ酸のカルボキシル基とが脱水・縮合する。したがって、直鎖トリペプチドであるＰｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒを原料とすればシクロ（Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）が生成し、直鎖テトラペプチドであるＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐを原料とすれば、シクロ（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ）が生成するという。
【０００５】
一方、前記特許文献５記載の方法は、Ｘがフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、グリシンのいずれかであり、Ｙがアルギニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、アラニン、グリシン、プロリン、またはヒドロキシプロリンである場合に、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ、Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｙで示される直鎖ジペプチドを０．５ＭＰａ以下で加熱すると、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｙ）で示される環状ジペプチドが生成するというものである。加圧条件が０．５ＭＰａ以下であるため、比較的容易に環状ジペプチドを製造することができるという。なお、特許文献５では、Ｎ末端がグリシンで、プロリンまたはヒドロキシプロリンを含むＧｌｙ−（Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）−（Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）で示される直鎖トリペプチドを原料とする場合も、加熱によりシクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）で示される環状ジペプチドを製造している。上記条件で加熱すると、Ｎ末端アミノ酸のアミノ基と２番目のアミノ酸のカルボキシル基とが環化し、更に３番目のＣ末端アミノ酸が脱離して、シクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）で示される環状ジペプチドが生成するという。この方法は、既存の直鎖トリペプチドを原料に使用でき、温和な反応条件である点で、特許文献１〜特許文献４に示す方法より簡便な方法といえる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００９−５３４０４８号公報
【特許文献２】特表２００６−５０３５５４号公報
【特許文献３】特表２００３−５３１１９７号公報
【特許文献４】特開２００３-２５２８９６号公報
【特許文献５】特許第５４５６８７６号公報
【特許文献６】国際公開第２０１４／０１７４７４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｕｄａｓｈｅｖａ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｓ．  Ｓ．  Ｂｏｙｋｏ，  Ｖ．  Ａｋｐａｒｏｖ，  Ｒ．  Ｕ．  Ｏｓｔｒｏｖｓｋａｙａ，  Ｓ．  Ｐ．  Ｓｋｏｌｄｉｎｏｖ，  Ｇ．  Ｇ．  Ｒｏｚａｎｔｓｅｖ，  Ｔ．  Ａ．  Ｖｏｒｏｎｉｎａ，  Ｖ．  Ｐ．  Ｚｈｅｒｄｅｖ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｂ．  Ｓｅｒｅｄｅｎｉｎ  （１９９６）．  ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｍｅｍｏｒｙ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｙｃｌｏ−ｐｒｏｌｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ．”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３９１（１−２）：  １４９−１５２．
【非特許文献２】Ｓｔｒｏｍ，  Ｋ．，  Ｊ．  Ｓｊｏｇｒｅｎ，  Ａ．  Ｂｒｏｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｃｈｎｕｒｅｒ  （２００２）．  ”Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＭｉＬＡＢ  ３９３  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｒｏ）  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｐｈｅ−ｔｒａｎｓ−４−ＯＨ−Ｌ−Ｐｒｏ）  ａｎｄ  ３−ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ．”  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６８（９）：  ４３２２−４３２７．
【非特許文献３】Ｂｒａｕｎｓ，  Ｓ．  Ｃ．，  Ｐ．  Ｍｉｌｎｅ，  Ｒ．  Ｎａｕｄｅ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｖｅｎｔｅｒ  （２００４）．  ”Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＨＴ−２９  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．”  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２４（３ａ）：  １７１３−１７１９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前記特許文献５では、直鎖ジペプチドや直鎖トリペプチドを原料として、シクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）で示される環状ジペプチドを生成させている。一方、前記特許文献４は、直鎖トリペプチドから環状トリペプチドが生成すると記載する。後記するように、コラーゲンおよび／またはゼラチンをバクテリアコラゲナーゼやショウガ根茎由来酵素で分解することにより、Ｇｌｙ−Ｘ−ＹやＸ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙといった直鎖トリペプチドを効率的に生成することができる一方、コラーゲンおよび／またはゼラチンから単独の酵素で直鎖ジペプチドを効率的に生成させることは困難である。環状ジペプチドの生成経路は明確ではないが、直鎖トリペプチドから環状ジペプチドを生成することができれば、直鎖ジペプチドを使用せずに環状ジペプチドを製造できる点で有利である。したがって、直鎖トリペプチドを使用して、環状ジペプチドを製造する方法の開発が望まれる。
【０００９】
一方、特許文献５で使用する直鎖トリペプチドは、Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）−（Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）に限定される。このため、前記した抗カビ効果のあるシクロ（Ｐｈｅ−Ｈｙｐ）や抗カビ効果や抗癌作用があるシクロ（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ）を製造することはできない。前記したように、プロリンやヒドロキシプロリンを構成アミノ酸残基として含む環状ジペプチドは、種々の効果を示すものが多い。したがって、直鎖トリペプチドを原料として、シクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）以外の環状ジペプチドを製造する方法の開発が望まれる。
【００１０】
前記特許文献５の実施例では、直鎖トリペプチドとして市販のコラーゲン分解物を使用している。コラーゲンはアミノ酸繰り返し配列−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−）ｎ−（式中、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す。）で構成されるポリペプチドを含み、クロストリジウム・ヒストリチカム等のコラゲナーゼを作用させると、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−）ｎ−（式中、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す。）で示されるアミノ酸繰り返し配列のグリシンとＹとの間のアミド結合を切断するため、得られるトリペプチドの主成分は、Ｎ末端がグリシンのＧｌｙ−Ｘ−Ｙとなる。コラーゲンは、Ｘ位やＹ位にプロリンやヒドロキシプロリンが含まれ、Ｇｌｙ−（Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）−（Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）が含有されるため、反応によりシクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）が生成されたと推定される。しかしながら、特許文献５の実施例７では、トリペプチドの１２％を環化・脱離してシクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を得るために６０℃で７２時間の加熱を必要とし、実施例９では、トリペプチドの２８％を環化・脱離してシクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）とするために、８０℃で４８時間の加熱を必要としている。いずれも長時間の加熱を必要とするため、より短時間の反応で、環状ジペプチドを効率的に製造できる方法の開発が望まれる。
【００１１】
一方、コラーゲンのアミノ酸繰り返し配列−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−）ｎ−（式中、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す。）において、グリシンとＹとの間を切断する酵素以外を使用してなるペプチド組成物、例えば、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＰｒｏおよびＨｙｐ以外のアミノ酸残基を示す。）で示すペプチドを含むコラーゲンペプチド組成物は公知である（特許文献６）。しかしながら、直鎖ペプチドから環状ペプチドが生成される工程は明確でなく、特許文献４に示すように、直鎖トリペプチドがＰｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒの場合はシクロ（Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ）で示す環状トリペプチドが生成し、直鎖ジペプチドがＧｌｙ−Ａｌａの場合には、シクロ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）の生成と共にグリシンやアラニンが副生し、更に配列が反転したＡｌａ−Ｇｌｙで示す直鎖ジペプチドが副生している。直鎖トリペプチドを原料とする場合は、更に反応が複雑化する可能性がある。したがって、高収率で環状ジペプチドを製造する方法の開発が望まれる。
【００１２】
上記現状に鑑み、本発明は、直鎖トリペプチドから効率的にシクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドを製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、直鎖トリペプチドとして、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）を加熱すると、Ｃ末端アミノ酸が脱離してグリシンとＸ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐで示す直鎖ジペプチドとが生成され、前記直鎖ジペプチドが瞬時に環化してシクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）で示す環状ジペプチドを形成すること、前記直鎖ジペプチドの環化は、前記直鎖トリペプチドのＣ末端アミノ酸の脱離と密接に関連していること、２番目のアミノ酸がプロリンまたはヒドロキシプロリンでありＣ末端アミノ酸がグリシンである直鎖トリペプチドは、加熱によりＣ末端アミノ酸が効率的に脱離し、および生成した直鎖ジペプチドが速やかに脱水縮合して環化し、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示す環状ジペプチドを生成することを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち本発明は、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドを加熱することを特徴とする、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１５】
また、本発明は、加熱温度が、４０〜１４０℃である、前記環状ジペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１６】
また、本発明は、加熱時の圧力が０．１〜１ＭＰａで行われる、前記環状ジペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１７】
また、本発明は、前記直鎖トリペプチドが、ｐＨ２〜１０の水溶液中で加熱されることを特徴とする、前記環状ジペプチドの製造方法を提供するものである。
【００１８】
また、本発明は、前記直鎖トリペプチドが、タンパク質の加水分解物の一部であることを特徴とする、前記環状ジペプチドの製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドを原料とすることで、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドを効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例１において、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ水溶液を８５℃で加熱した場合の経時的Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ量、および分解物量の変化を示す図である。
【図２】実施例１において、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ水溶液を８５℃で加熱した場合の経時的変化をＬＣ／ＭＳ分析した結果を示す図である。
【図３】実施例２において、８５℃での加熱時、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ水溶液のｐＨを変化させた場合のシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）量の変動をＬＣ／ＭＳ分析した結果を示す図である。
【図４】実施例３において、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ水溶液の加熱温度を変化させた場合のシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）量の変動をＬＣ／ＭＳ分析した結果を示す図である。
【図５】実施例４において、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを加熱した際の経時的環状ジペプチド生成率を測定した結果を示す図である。
【図６】実施例５において、Ａｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａを同条件で加熱した場合の反応液に含まれる元のペプチドの量および環状ジペプチド量をＬＣ／ＭＳで定量した結果を示す図である。
【図７】実施例６において、各種直鎖トリペプチドを同条件で加熱した場合の反応液に含まれる元のペプチドの量をＬＣ／ＭＳで定量した結果を示す図である。
【図８】実施例７において、Ａｌａ−ＨｙｐおよびＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを同条件で加熱した場合の生成したシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）をＬＣ／ＭＳで定量した結果を示す図である。
【図９】実施例８において、分解工程の異なるコラーゲンペプチド組成物に含まれるＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、および環状ジペプチド量をＬＣ／ＭＳで定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドを加熱することを特徴とする、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドの製造方法である。以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
（１）直鎖トリペプチド
本発明で原料として使用する直鎖トリペプチドは、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される。前記直鎖トリペプチドは、ペプチド合成によって製造されたものを使用してもよく、タンパク質を分解してなるペプチドであってもよい。例えば、コラーゲンはアミノ酸繰り返し配列−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ−）ｎ−（式中、Ｘ，Ｙはアミノ酸残基を表し、ｎは正の整数を表す。）で構成されるポリペプチドを含み、Ｘ位にプロリン、Ｙ位にヒドロキシプロリンが多く配列される。コラーゲンに、Ｃ末端から２番目がプロリンまたはヒドロキシプロリンとなるペプチドを産生しうるエンドペプチダーゼを作用させると、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示されるトリペプチドを含むペプチド組成物を得ることができる。このようなエンドペプチダーゼとしてショウガ根茎由来酵素がある。本発明では、ショウガ根茎由来酵素を作用して得られたペプチド組成物から特定のＸ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）を単離して使用してもよく、上記直鎖トリペプチドを含むペプチド組成物をそのまま原料として使用してもよい。なお、コラーゲンの分解は、上記酵素反応に限定されず、他の１以上の酵素を使用してもよい。更に、塩酸、酢酸などの酸や、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリを使用してコラーゲンを部分的に加水分解し、適宜精製して、前記直鎖トリペプチドを得てもよい。更に、コラーゲン由来のペプチド組成物を得るために、加水分解反応と酵素反応とを併用してもよい。
【００２３】
本発明で使用する直鎖トリペプチドは、Ｎ末端から２番目のアミノ酸がプロリンまたはヒドロキシプロリンであり、Ｃ末端がグリシンであることを特徴とする。後記する実施例に示すように、Ｃ末端がアラニンであるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａを８５℃、１時間加熱してもその１７％がシクロ（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）で示される環状ジペプチドに変換されるに過ぎないが、Ｃ末端がグリシンであるＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを使用すると、同１時間の加熱で４８％がシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）で示される環状ジペプチドに変換され、１時間時で３倍量の環状ジペプチドを生産できることが判明した。なお、前記直鎖トリペプチドを使用すると、同３時間の加熱により、６７％が環状ジペプチドに変換され、環状ジペプチドの生成率は極めて高い。
【００２４】
本発明では、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドの中で、Ｘとしてアラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸を好適に使用することができる。
【００２５】
前記式で示される直鎖トリペプチドとしては、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用すると、Ｘで示されるアミノ酸残基に対応する２種以上の環状ジペプチドの組成物を得ることができる。２種以上の直鎖トリペプチドを含むものとして、タンパク質の加水分解物がある。加水分解は、酸やアルカリによる分解でもよく、酵素による分解でもよい。例えば、前記したように、コラーゲンにショウガ根茎由来酵素を作用させて得たペプチド組成物は、前記式で示す直鎖トリペプチドを多量に含み、上記加水分解物として使用することができる。コラーゲンにショウガ根茎由来酵素を作用させて得たペプチド組成物から１種以上の直鎖トリペプチドを単離して使用し、対応する環状ジペプチドを製造することができる。さらに、このような直鎖トリペプチドを含むペプチド組成物を原料として加熱し、種々の環状ジペプチドを含む環状ジペプチド組成物を製造することもできる。このような環状ジペプチド組成物から、所定の環状ジペプチドを単離してもよい。
【００２６】
（２）反応条件
本発明では、前記直鎖トリペプチドを加熱する。直鎖トリペプチドは、固体であっても溶媒に溶解または懸濁された液状であってもよい。前記直鎖トリペプチドを粉末、顆粒その他の固体で得た場合には、直接加熱することができる。固体を均一に加熱するため、撹拌機能付きの加熱装置を使用してもよい。一方、直鎖トリペプチドを溶媒に溶解、分散、または懸濁すると、簡便に均一な加熱を行うことができる。溶媒を使用する場合は、不要な副反応を回避するため、水を使用することが好ましい。溶媒中の直鎖トリペプチド濃度は、０．００１〜１０ｇ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０１〜１ｇ／Ｌである。
【００２７】
反応温度は、前記直鎖トリペプチドが固体であるか液状であるか、固体である場合の密度や液状である場合の濃度その他によって適宜選択することができる。反応圧力によっても変動するが、一般には、温度４０〜１４０℃であり、好ましくは温度６０〜１２０℃、より好ましくは７０〜１００℃、特に好ましくは８０〜１００℃である。温度が高い方が環状ジペプチドの生成率が高い傾向がある。脱水・縮合反応が速やかに進行するためと考えられる。なお、１４０℃以下、より好ましくは１００℃以下であれば、環化時の脱離以外の加水分解は無視しうる。
【００２８】
反応時間は、加熱温度や前記直鎖トリペプチドの種類、その他によって適宜選択することができる。一般には、５分から５時間であり、好ましくは１〜４時間であり、特に好ましくは１〜３時間である。
【００２９】
加熱時の圧力は、０．１〜１ＭＰａ、より好ましくは０．１〜０．５ＭＰａである。本発明では、大気圧下でも十分に反応が進行する。上記範囲であれば、直鎖トリペプチドから環状トリペプチドの副生や、加水分解によって生じるアミノ酸や直鎖ジペプチドの副生を低減して、効率的に環状ジペプチドを製造することができる。
【００３０】
前記直鎖トリペプチド水溶液を反応に使用する場合、ｐＨを調整してもよい。至適ｐＨは、使用する直鎖トリペプチドによって適宜選択することができる。好ましくは、ｐＨ２〜１０、より好ましくはｐＨ３．０〜８．６、特に好ましくはｐＨ４．０〜８．０、さらに好ましくは、ｐＨ４．０〜６．０である。直鎖トリペプチドは、酸やアルカリ条件での加熱により加水分解されるが、前記ｐＨ範囲であれば、強酸条件や中性条件、強アルカリ条件よりも、前記環状ジペプチドの生成率に優れる。本発明では、前記直鎖トリペプチドを溶解または懸濁する溶媒として、上記ｐＨ範囲の緩衝液を使用してもよい。
【００３１】
例えば、直鎖トリペプチド水溶液を温度６０〜１２０℃、反応時間５分〜３時間、ｐＨ４．０〜６．０、０．１〜１ＭＰａ、より好ましくは、温度８０〜１００℃、反応時間１〜３時間、ｐＨ４．０〜６．０、０．１〜０．５ＭＰａで加熱して、対応する環状ジペプチドを製造することができる。
【００３２】
本発明において、前記直鎖トリペプチドから前記環状ジペプチドが生成する反応経路の詳細は明確ではない。しかしながら、後記する実施例に示すように、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドを加熱した反応液をＬＣ／ＭＳ分析すると、グリシンと直鎖トリペプチドのピークとシクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）で示される環状ジペプチドのピークとが検出され、一方、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐで示される直鎖ジペプチドのピークは検出されなかった。直鎖トリペプチドのＣ末端アミノ酸が脱離し、Ｎ末端アミノ酸と２番目のアミノ酸との直鎖ジペプチドが形成され、これが瞬時にＮ末端アミノ酸と２番目のアミノ酸とを脱水縮合し、環化し、環状ジペプチドが生成されたと推察される。なお、前記直鎖トリペプチドのＣ末端アミノ酸を除去した直鎖ジペプチドを用いて前記直鎖トリペプチドと同様の反応を行ったが、環状ジペプチドの生成率は極めて低く、直鎖トリペプチドを原料とする場合の７０分の１の生成量に過ぎなかった。このことから、Ｃ末端の脱離と直鎖ジペプチドの環化工程とが密接に関連し、環状ジペプチドが生成されると推察される。本発明で使用する直鎖トリペプチドは、Ｃ末端アミノ酸がグリシンに限定され、かつ２番目のアミノ酸がプロリンまたはヒドロキシプロリンである。反応の際に、Ｃ末端アミノ酸であるグリシンの脱離が容易であり、２番目のアミノ酸がプロリンまたはヒドロキシプロリンであることなどが相乗的に作用し、環状ジペプチドの生成に優れると考えられる。環状ジペプチドの生成率は、直鎖トリペプチドのＣ末端アミノ酸によって相違すること、およびＣ末端アミノ酸がグリシンである場合に、環状ジペプチドの生成率に優れることは、従来全く知られていなかった。
【００３３】
（３）生成物
上記反応により、シクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドが製造される。Ｘは、原料に用いた直鎖トリペプチドを構成するアミノ酸に対応し、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、バリン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシン、グルタミン酸、アスパラギン酸などとなる。本発明によれば、Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される直鎖トリペプチドを原料とし、かつ反応工程でＣ末端アミノ酸が脱離した後に残存するジペプチドが環化してなる環状ジペプチドが生成されるため、シクロ（Ａｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｐｈｅ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｌｅｕ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｔｈｒ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｓｅｒ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｇｌｎ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ａｓｎ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ａｒｇ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｌｙｓ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）、シクロ（Ａｓｐ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）などの種々の環状ジペプチドを製造することができる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。  
【００３５】
（製造例）
凍結ショウガ根茎に対して５倍量（容量／重量）の冷エタノールを添加し、カッティングミルで十分粉砕してスラリーとし、このスラリーをろ過してエタノールを除去し、残渣を風乾してショウガ根茎粉砕物を得た。ウシ由来ゼラチン５質量％溶液（ｐＨ４．８）に対し、１／１０倍量の前記ショウガ根茎粉砕物を添加し、およびグルタチオン含有酵母エキス（株式会社興人社製、ハイチオンエキスＹＨ−１５（グルタチオン含有率１５％以上））を０．０２w/v％となるように添加し、５０℃で振盪、攪拌しながら１６ｈ反応させた。反応終了後静置し、上清を回収してペプチド溶液を得た。
【００３６】
（１）ＬＣ／ＭＳ測定条件
高速液体クロマトグラフ：1200Series(Agilent Technologies)、
質量分析装置：3200QTRAP(AB Sciex)、
分析カラム： Ascentis Express F5 HPLC column 5μm, 4.6mmi.d.×250mm(Supelco)、
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル、
グラジエント条件：
０〜７．５分：Ａ液１００％、
７．５〜２０分：Ａ液１００〜１％；Ｂ液０〜９９％、
２０．１〜２５分：Ａ液１％；Ｂ液９９％、
２５．１〜３０分：Ａ液１００％、
流速：０．６ｍＬ／ｍｉｎ、
（２）質量分析条件：
イオン化：ＥＳＩ、ポジティブ、
分析モード：Multiple Reaction Monitoring(MRM)モード、
イオンスプレー電圧：３ｋＶ、
イオンソース温度：６００℃
【００３７】
（実施例１）
Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを用いて以下の実験を行った。
２００μｇ／ｍｌのＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを蒸留水中で８５℃、１時間または３時間加熱し、反応前、反応１時間時、反応３時間時の反応液に含まれるＨｙｐ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ量を前記ＬＣ／ＭＳ条件にて分析した。結果を図１に示す。反応時間の経過に伴ってＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ量が減少し、およびＧｌｙ量が増加することが観察された。Ｈｙｐ、Ａｌａ、Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｈｙｐは、ほとんど検出されなかった。更に、ＭＳ分析で生成物のスキャン（ｍ／ｚ  １００〜３００）を行った。結果を図２に示す。図２に示すように、加熱反応によりｍ／ｚ  １８５．１の化合物が生成した。
Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙの加熱により、グリシンのピークが検出され、Ａｌａ−Ｈｙｐが検出されないことから（図１）、Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（ｍ／ｚ  ２６０．１）を加熱すると、Ｃ末端アミノ酸であるグリシンが脱離すると瞬時にＡｌａ−Ｈｙｐが脱水縮合し、シクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）（ｍ／ｚ  １８５．１）で示される環状ジペプチドが生成すると考えられた。
【００３８】
（実施例２）
Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを１００μｇ／ｍｌとなるように０．１％ギ酸（ｐＨ２．８）、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０、ｐＨ４．４、ｐＨ４．８、ｐＨ５．２、およびｐＨ５．６）、５０ｍＭ  ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．０）、または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０、ｐＨ７．８、およびｐＨ８．６）に溶解し、それぞれ８５℃で１時間加熱した。各反応液に含まれるシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）量を前記ＬＣ／ＭＳ条件で定量した。結果を図３に示す。なお、コントロールは、加熱前の値を示す。
【００３９】
（実施例３）
Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを１００μｇ／ｍｌとなるように、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）に溶解し、反応温度４０℃、５５℃、７０℃、８５℃、および１００℃でそれぞれ１時間加熱し、各反応液に含まれるシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）量を前記ＬＣ／ＭＳ条件で定量した。結果を図４に示す。なお、コントロールは、加熱前の値を示す。
【００４０】
（実施例４）
Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを１００μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）に溶解し、８５℃で加熱した。経時的に反応液を採取し、生成した環状ジペプチド量を前記ＬＣ／ＭＳ条件で定量し、元のＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙモル量に対する生成したモル量を生成率（％）として評価した。結果を図５に示す。加熱５分でも反応が進行し加熱１２０分で略平衡に達した。
【００４１】
（実施例５）
Ａｌａ−Ｈｙｐ−ＧｌｙおよびＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａをそれぞれ１００μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）に溶解し、これを８５℃で１時間または３時間加熱し、元のペプチド量と生成した環状ジペプチド量とを前記ＬＣ／ＭＳ条件で定量した。結果を図６に示す。Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを原料とした場合は、１時間時に４８．２μｇ／ｍｌ、３時間時に６７．４μｇ／ｍｌの環状ジペプチドを生成した。一方、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａを原料とする場合の環状ジペプチドの生成量は、１時間時に１６．７μｇ／ｍｌ、３時間時に３６．１μｇ／ｍｌであった。Ｃ末端がグリシンである直鎖トリペプチドは、Ｃ末端がアラニンである直鎖トリペプチドよりも加熱１時間時に約３倍量の環状ジペプチドを生成し、加熱３時間で２／３量を環状ジペプチドに変換していた。
【００４２】
（実施例６）
Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙを、それぞれ１００μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）に溶解した。また、比較のため、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＳｅｒおよびＰｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙについて同様に１００μｇ／ｍｌ（ｐＨ４．８）の溶液を調製した。これらをそれぞれ８５℃で１時間加熱した。各反応液に含まれる元のペプチドの量を前記ＬＣ／ＭＳ条件で定量した。結果を図７に示す。Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｐｈｅ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｔｈｒ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｐｒｏ−ＧｌｙおよびＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙの全てで、元の直鎖トリペプチドが反応により２１．８％〜６７．３％まで減少し、図１〜６で示されたＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを原料とした結果から、その他のペプチドでも同様にそれぞれ対応する環状ジペプチドが生成したと考えられる。これに対し、その他の直鎖トリペプチドでは元の原料が多く残存し（８０．１％〜１３６．０％）、反応率が低かった。Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙは、Ｃ末端アミノ酸がグリシンであるが、プロリンやヒドロキシプロリンが連続すると、立体障害により環化率が低下すると考えられる。
【００４３】
（実施例７）
直鎖トリペプチドと直鎖ジペプチドを原料として、環状ジペプチドの生成率を観察した。
Ａｌａ−ＨｙｐおよびＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを１００μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）に溶解した。これを８５℃で１時間加熱し、生成したシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）を前記ＬＣ／ＭＳ条件で定量した。結果を図８に示す。Ａｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙを原料とすると、Ａｌａ−Ｈｙｐを原料とする場合よりも約７０倍の高率でシクロ（Ａｌａ−Ｈｙｐ）を生成した。
【００４４】
（実施例８）
コラーゲンペプチド組成物（Ｉ）（株式会社ニッピ製、コラーゲン加水分解物、平均分子量３０１０Ｄａ）、コラーゲンペプチド組成物（ＩＩ）（株式会社ニッピ製、コラゲナーゼ分解物、平均分子量１５８６Ｄａ）、コラーゲンペプチド組成物（ＩＩＩ）（製造例１で得られたショウガ根茎由来酵素分解物、平均分子量８６８Ｄａ）という分解工程の異なるコラーゲン由来ペプチド組成物をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．８）に溶解し、それぞれ８５℃で１時間または３時間加熱した。各反応液に含まれるＡｌａ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、Ｌｅｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ、および環状ジペプチド量を前記ＬＣ／ＭＳ条件で定量した。結果を図９に示す。
図９（ａ）に示すように、加熱前ではＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘはアラニン、ロイシンを示す。）で示される直鎖トリペプチドは、コラーゲン組成物（ＩＩＩ）に多く含有されており、それに対応するシクロ（Ｘ−Ｈｙｐ）（式中、Ｘはアラニン、ロイシンを示す。）は、コラーゲン組成物（Ｉ）、（ＩＩ）にはごく微量、コラーゲン組成物（ＩＩＩ）には少量含有されていた。これを８５℃で加熱すると、Ｘ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘはアラニン、ロイシンを示す。）で示される直鎖トリペプチドは経時的に減少し、これに対応して図９（ｂ）に示すように、コラーゲン組成物（ＩＩＩ）でシクロ（Ｘ−Ｈｙｐ）（式中、Ｘはアラニン、ロイシンを示す。）の増加が確認された。コラーゲン組成物（ＩＩＩ）に多量に含有されるＸ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ（式中、Ｘはアラニン、ロイシンを示す。）が加熱によって脱水縮合して環化しシクロ（Ｘ−Ｈｙｐ）（式中、Ｘはアラニン、ロイシンを示す。）に変換したと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明によれば、種々のシクロ（Ｘ−Ｐｒｏ／Ｈｙｐ）（式中、ＸはＧｌｙ、ＨｙｐおよびＰｒｏ以外のアミノ酸残基を示し、Ｐｒｏ／ＨｙｐはＰｒｏまたはＨｙｐを示す。）で示される環状ジペプチドを簡便、短時間、高収率で製造できるため、有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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