(57)【要約】      （修正有）【課題】保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整える皮膚改善剤の提供。【解決手段】ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミンのＣ−４位、Ｃ−６位、ならびに、ヒアルロン酸を構成するグルクロン酸のＣ−２位、Ｃ−３位の少なくとも一部の水酸基の水素原子が、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基に置換されている、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分とする、皮膚改善剤。前記カルボキシメチル基含有ヒアルロン酸及び／又はその塩が、分子量４０万以上であり、ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率が５〜２００％である皮膚改善剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分とする、
皮膚改善剤。
【請求項２】
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、
ヒアルロン酸を構成する水酸基のうち少なくとも一部の水酸基の水素原子が、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基に置換されている、
請求項１記載の皮膚改善剤。
【請求項３】
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、
ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率が５％以上２００％以下である、
請求項１又は２に記載の皮膚改善剤。
【請求項４】
前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、
分子量が２５万以上である、
請求項１乃至３のいずれかに記載の皮膚改善剤。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の皮膚改善剤を０．００５質量％以上５質量％以下含有する、
化粧料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有する皮膚改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は生体内の多くの組織（例えば皮下組織、眼球、関節）に多く存在するムコ多糖類であり、その高い保湿機能により、化粧料等の成分として広く利用されており、例えば、特許文献１では、ヒアルロン酸ナトリウムを直径１０〜１５０ｎｍにナノ化することにより、１重量％を越える高濃度で化粧料に含ませ、皮膚の乾燥、しわ、しみ等の皮膚の障害を緩和ないし解消できる皮膚改善化粧料が記載されている。
しかしながら、ヒアルロン酸の保湿機能や皮膚改善効果は十分とは言えず、更なる改善の余地があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−９１２９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整える皮膚改善剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を含有させることによって、保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整える皮膚改善剤となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１）カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分とする、
皮膚改善剤、
（２）前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、
ヒアルロン酸を構成する水酸基のうち少なくとも一部の水酸基の水素原子が、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基に置換されている、
（１）記載の皮膚改善剤、
（３）前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、
ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率が５％以上２００％以下である、
（１）又は（２）に記載の皮膚改善剤、
（４）前記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、
分子量が２５万以上である、
（１）乃至（３）のいずれかに記載の皮膚改善剤、
（５）（１）乃至（４）のいずれかに記載の皮膚改善剤を０．００５質量％以上５質量％以下含有する、
化粧料の製造方法、
である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整える皮膚改善剤を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本発明において、格別に断らない限り、「％」は「質量％」を意味する。
【０００９】
＜本発明の特徴＞
本発明の皮膚改善剤は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を含有することによって、保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整えることを特徴とする。
【００１０】
＜カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩＞
本発明において、「修飾ヒアルロン酸および／またはその塩」とは、少なくとも一部に有機基が導入されているヒアルロン酸および／またはその塩のことをいう。また、本発明において「有機基」とは、炭素原子を有する基のことをいう。
ヒアルロン酸は、鶏冠、さい帯、皮膚、軟骨、硝子体、関節液などの生体組織中に広く分布しているムコ多糖類である。本発明のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、ヒアルロン酸を原料として作られることから、生体適合性が高く肌への刺激性が少ないことが考えられる。
【００１１】
本発明において、「カルボキシメチル基」とは、「−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ」または「−ＣＨ２−ＣＯ２−」で表される基のことをいう。
【００１２】
したがって、本発明において、「カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩」とは、少なくとも有機基の一部にカルボキシメチル基が導入されているヒアルロン酸および／またはその塩のことをいう。
【００１３】
より具体的には、本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩では、例えば、ヒアルロン酸（下記式（１）参照）を構成する水酸基（下記式（１）において、ヒアルロン酸を構成するＮ−アセチルグルコサミンのＣ−４位、Ｃ−６位、ならびに、ヒアルロン酸を構成するグルクロン酸のＣ−２位、Ｃ−３位）の少なくとも一部の水酸基の水素原子が、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基)に置換されていることができる。すなわち、本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩では、これらの位置にある水酸基のうち１つまたは２つ以上の位置にある水酸基の水素原子が、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基に置換されていてもよい。
【００１４】
本発明において、「ヒアルロン酸を構成する２糖単位」とは、ヒアルロン酸を構成する、隣り合って結合する２糖（グルクロン酸およびＮ−アセチルグルコサミン）で構成される１単位をいい、「ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率」とは、該１単位に含まれるカルボキシメチル基の数であり、より具体的には、該１単位を１００％とした場合、該１単位に含まれるカルボキシメチル基の数の割合（％）をいう。
【００１５】
【化１】
2016199518.tif 000002
（式中、ｎは１以上の整数を示す。）
【００１６】
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は例えば、下記式（２）で表される化合物であることができる。
【００１７】
【化２】
2016199518.tif 000003
（式中、Ｒ１〜Ｒ５は独立して、水素原子、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈで表される基、または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基を表し、ｎは１以上の整数を示す。ただし、当該カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩全体のＲ１〜Ｒ５がいずれも水素原子を表す場合を除く。
【００１８】
＜分子量＞
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整える皮膚改善剤とする観点から、分子量を２５万以上とすることができる。
また、５０万以上２００万以下、８０万以上２００万以下、９０万以上１５０万以下、１００万以上１５０万以下とすることができる。本発明において、カルボキシルメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量は、以下の方法にて測定することができる。
【００１９】
ゲル濾過カラムを用いて、分子量が既知である複数の精製ヒアルロン酸（基準物質）を液体クロマトグラフィー分析することで、それらの保持時間より検量線を作成する。
同様に、測定対象であるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を液体クロマトグラフィー分析し、前記検量線を用いて分子量を求めることで、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量を求めることができる。
【００２０】
前記液体クロマトグラフィー分析に使用することができる液体クロマトグラフィー分析装置としては、例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９０  ＨＰＬＣ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２６９５  ＨＰＬＣ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ社製）、１２００  Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）が挙げられる。また、液体クロマトグラフィー分析に使用することができるカラムとしては、例えば、ｓｈｏｄｅｘ社製  配位子交換クロマトグラフィー用カラム（配位子交換モード＋サイズ排除モード)、型名「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０１」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０２」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０３」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０４」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０５」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０６」、「ＳＵＧＡＲ  ＫＳ−８０７」や、ＴＯＳＯＨ製  サイズ排除クロマトグラフィーカラム、型名「ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷ」が挙げられる。
【００２１】
＜カルボキシメチル化率＞
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩のカルボキシメチル化率は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて、ヒアルロン酸骨格中のＣ−２位に結合するＮ−アセチル基のメチル基（−ＣＨ３）のプロトンを示すピーク（２ｐｐｍ付近に発現）の積算値に対する、−ＣＨ２−ＣＯ２Ｈおよび／または−ＣＨ２−ＣＯ２−で表される基中のメチレン基（−ＣＨ２−）のプロトンを示すピーク（３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に発現）の積算値の割合（％）で表される。
【００２２】
また、保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整える皮膚改善剤とする観点から、本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、ヒアルロン酸を構成する２糖単位に対するカルボキシメチル化率（以下、単に「カルボキシメチル化率」ともいう。）が、５％以上２００％以下であることができ、さらに１０％以上２００％以下、５０％以上２００％以下とすることができる。また、６０％以上、７０％以上、８０％以上、１５０％以下、１００％以下とすることができる。
【００２３】
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩によれば、カルボキシメチル基−ＣＨ２−ＣＯ２−の負電荷によって分子同士の反発する力が生じ、分子同士の構造の隙間に水が取り込まれることによって、
保湿機能を有すると考えられる。
また上記のように分子同士の構造の隙間に水が取り込まれることによって、本発明の皮膚改善剤を肌に塗布した際に、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸が肌水分の潤いを保ち、また皮脂と肌水分が適切な割合で接触することで肌の油っぽさを改善すると推察される。
さらにカルボキシメチル基−ＣＨ２−ＣＯ２−の負電荷によって分子同士の反発する力が生じ、皮膚改善剤中の分子の立体構造に柔軟性を与えることで、肌に塗布した際に肌のもちもち感を改善すると推察される。
上記のような保湿機能や肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感改善により、肌の調子が整うと考えられる。
【００２４】
＜動粘度＞
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の動粘度は、動粘度が１ｍｍ２／ｓ以上２００ｍｍ２／ｓ以下とすることができる。本実施形態に係る修飾ヒアルロン酸類の動粘度は、ウベローデ粘度計（柴田科学器械工業株式会社製）を用いて測定することができる。この際、流下秒数が２００秒以上１，０００秒になるような係数のウベローデ粘度計を選択する。また、測定は３０℃の恒温水槽中で行ない、温度変化のないようにする。ウベローデ粘度計により測定された前記水溶液の流下秒数と、ウベローデ粘度計の係数との積により、動粘度（単位：ｍｍ２／ｓ）を求めることができる。
【００２５】
＜色相＞
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を皮膚改善剤に使用する場合、白色の皮膚改善剤の色に影響を及ぼさないという点から、本発明に用いる修飾ヒアルロン酸類は色の明度が高く、かつ、黄味が弱いほうが好ましい。
【００２６】
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、色の色相を表すｂ値（以下、単に「ｂ値」ともいう）が５以下であることができ、４以下であることが好ましく、３以下であることがより好ましく、また、０以上であることが好ましい。
【００２７】
ｂ値は、物質が有する色の色相（ｈｕｅ）を規定する値であり、ｂ値が大きいほど黄味が強いことを示し、一方、ｂ値が小さいほど青味が強いことを示す。
【００２８】
また、本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩は、色の明度を表すＬ値（以下、単に「Ｌ値」ともいう）が９０以上（９０以上１００以下）であることができ、Ｌ値が９２以上であることが好ましく、Ｌ値が９３以上であることがより好ましい。
【００２９】
Ｌ値は、物質が有する色の明度（ｌｉｇｈｔｎｅｓｓ）を規定する値であり、０〜１００の間の数値で表される。Ｌ値が１００である場合最も明るい状態（完全な白色）を示し、一方、Ｌ値が０である場合最も暗い状態（完全な黒色）を示す。
【００３０】
ｂ値およびＬ値は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７３０によって規定される色差表示方法によって、Ｌａｂ系色度座標で表示されることができる。
また、ｂ値およびＬ値は、市販の色差計により測定することができる。
なお、本発明においては、固体のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩について、ｂ値およびＬ値を測定するものとする。
【００３１】
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩のｂ値およびＬ値は、例えば、色差計（商品名「ＣＯＬＯＲ  ＡＮＤ  ＣＯＬＯＲ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＣＥ  ＭＥＴＥＲＭＯＤＥＬ  １００１  ＤＰ」，日本電色工業株式会社製）に１０Φレンズを装着し、ガラスセルに測定試料１ｇ以上を敷き詰めて測定することができる。
【００３２】
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩によれば、色差計により測定されたｂ値が５以下（さらには、Ｌ値が９０以上）であることにより、さらなる精製工程を必要とせずに、皮膚改善剤の原料として使用することができる。
【００３３】
＜カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法＞
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法は、温度が３０℃以下、さらには１０℃以下、０℃以上１０℃以下の含水溶媒中で、溶解した原料ヒアルロン酸および／またはその塩をハロ酢酸および／またはその塩と反応させる工程を含むことができる。
ここで、前記含水溶媒は、水、または水溶性有機溶媒と水との混合液であり、前記混合液の場合には、６０ｖ／ｖ％以下の水溶性有機溶媒を含むことができる。水溶性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどのアルコール系溶媒、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン系溶媒、テトラヒドロフラン、アセトニトリル等を挙げることができ、これらを単独でまたは組み合わせて使用することができる。また、ハロ酢酸は、クロロ酢酸および／またはその塩、または、ブロモ酢酸またはその塩であることができる。また、反応は塩基性条件下、例えば反応液（含水溶媒）のｐＨが９以上、９以上１４以下とすることができる。
【００３４】
本発明に用いるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の製造方法は、前記ハロ酢酸および／またはその塩と反応させる工程で上述の３０℃以下の低い反応温度で行うこととにより高分子量４０万以上のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を簡便に得ることができる。
また、色を表すｂ値５以下Ｌ値９０以上の明度が高くかつ黄味が弱いカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を簡便に得ることができる。
【００３５】
＜皮膚改善剤＞
本実施形態に係る皮膚改善剤は、上記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を有効成分として含有することから、上記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩をそのまま皮膚改善剤として用いるのが好ましいが、清水等の溶媒、デキストリン等の賦形剤あるいはその他皮膚化粧料原料を添加してもよい。
さらに上記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を肌の油っぽさ改善剤や肌のもちもち感改善剤として用いても良い。
【００３６】
＜皮膚改善剤の用途＞
本実施形態に係る皮膚改善剤は各種皮膚用化粧料に使用することができる。
皮膚用化粧料の態様としては、例えば、洗顔料、洗浄料、化粧水（例えば、美白化粧水）、クリーム（例えば、バニシングクリーム、コールドクリーム）、乳液、ゲル、美容液、パック（例えば、ゼリー状ピールオフタイプ、ペースト状拭き取りタイプ、粉末状洗い流しタイプ）、フェイスマスク、クレンジング、ファンデーション、口紅、リップクリーム、リップグロス、リップライナー、頬紅、化粧下地、シェービングローション、サンスクリーン、アフターサンローション、デオドラントローション、ボディローション（ハンドケアローション、フットケアローションを含む）、ボディオイル、石鹸、入浴剤が挙げられる。
【００３７】
＜皮膚化粧料への皮膚改善剤の含量＞
皮膚化粧料への皮膚改善剤の含量は、保湿機能に優れ、かつ、肌に塗布した際に肌の油っぽさともちもち感を改善し、肌の調子を整える皮膚改善剤とする観点から、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を皮膚改善剤として０．００５％以上５％以下含有させることができる。さらに０．０１％以上、また２％以下、１％以下とすることができる。含有量を前記範囲にすることによって、肌の油っぽさともちもち感改善効果を発揮することができ、かつ保湿機能を変えてしまうことがない。前記範囲よりも含有量を多くすると皮膚化粧料自体の粘度が高くなりすぎ、皮膚全体に伸ばしにくくなる恐れがある。
【００３８】
＜他のヒアルロン酸類＞
本発明の皮膚改善剤は、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩に加えて他のヒアルロン酸類を含有することができる。ここで、他のヒアルロン酸類とは、ヒアルロン酸および／またはその塩（ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸亜鉛、加水分解ヒアルロン酸等）、カチオン化ヒアルロン酸、アセチル化ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ジメチルシラノール、加水分解ヒアルロン酸アルキル（Ｃ１２−１３）グリセリル等が挙げられる。
【実施例】
【００３９】
［実施例１］＜皮膚改善剤の調製＞
３０ｍＬのサンプル瓶に水酸化ナトリウム１．０４ｇを秤り取った後、水８ｍＬを添加して溶解させた。次に、ヒアルロン酸２．０ｇを添加し溶解させた後、モノブロモ酢酸ナトリウム１．５２ｇを添加して溶解させて、１０℃で１６時間静置した。ここで、前記反応液のｐＨは１３であった。その後、２００ｍＬビーカーにエタノール８０ｍＬを入れ、該反応液を撹拌しながら添加し、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を沈殿させた。その後、４００メッシュのろ布で沈殿を２００ｍＬビーカーに回収した後、１０％塩化ナトリウム水溶液４０ｍＬを添加して沈殿を溶解させた。さらに、８％塩酸水溶液でｐＨを調製した後、溶解液に撹拌しながらエタノール８０ｍＬを入れ、再度カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を沈殿させた。８０％含水エタノール１００ｍＬで３回洗浄した後、減圧濾過し、５５℃で３時間減圧乾燥することにより、分子量１００万カルボキシメチル化率８０％であるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を得、これを実施例１の皮膚改善剤（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）とした。
実施例１のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の色差計（商品名「ＣＯＬＯＲ  ＡＮＤ  ＣＯＬＯＲ  ＤＩＦＦＥＲＥＮＣＥ  ＭＥＴＥＲＭＯＤＥＬ  １００１  ＤＰ」，日本電色工業株式会社製）での測定値はｂ値５以下、Ｌ値９０以上であった。また、動粘度は１ｍｍ２／ｓ以上２００ｍｍ２／ｓ以下の範囲内であった。
【００４０】
［実施例２］＜皮膚改善剤の調製＞
実施例1においてモノブロモ酢酸ナトリウムとの反応温度と時間を６０℃３時間に変更した以外は実施例１と同様の方法で実施例２のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を調製した。
その結果、分子量１０万、カルボキシメチル化率６０％、ｂ値８．９、Ｌ値９１、動粘度は１ｍｍ２／ｓ以上２００ｍｍ２／ｓ以下の範囲内のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を得、これを実施例２の皮膚改善剤とした。
実施例２の皮膚改善剤（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）は、実施例１に比べて目視で色がやや褐変していた。
【００４１】
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸のカルボキシル化率の測定方法は以下の方法にて１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの積算値より求めた。
【００４２】
（試料調製）
試料７ｍｇと内部標準物質４，４−ジメチル−４−シラペンタンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）１ｍｇを重水０．７ｍＬに溶かし、ＮＭＲ試料管に移し入れ、キャップした。
【００４３】
（測定条件）
装置：Ｖａｒｉａｎ  ＮＭＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ４００ＮＢ型(バリアンテクノロジーズジャパンリミテッド)
観測周波数：４００ＭＨｚ
温度：３０℃
基準：ＤＳＳ（０ｐｐｍ）
積算回数：６４回
【００４４】
（解析方法）
１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの２．０ｐｐｍ付近に現れるヒアルロン酸のＮ−アセチル基（ＣＨ３）のピークと、３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に現れるカルボキシメチル基のメチレン基（−ＣＨ２―）のピークを積分した。積分値から下記の式より、修飾ヒアルロン酸を構成するヒアルロン酸の２糖繰り返し単位毎に結合しているカルボキシメチル基の数を、カルボキシメチル化率（ＣＭ化率）を求めた。
ＣＭ化率＝(３．８ｐｐｍ以上４．２ｐｐｍ以下の範囲に現れるピーク積分値／２)／(２．０ｐｐｍのピーク積分値／３)
【００４５】
カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸の分子量は、ゲル濾過カラムを用いて、分子量が既知である複数の精製ヒアルロン酸（基準物質）を液体クロマトグラフィー分析することで、それらの保持時間より検量線を作成する。同様に、測定対象であるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を液体クロマトグラフィー分析し、前記検量線を用いて分子量を求めることで、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩の分子量を求めた。
【００４６】
［処方例１］＜化粧料の調製＞
配合１の化粧水を調製した。具体的には、実施例１で得たカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を含む下記配合１に示した原料を少しずつ混合、均一にし、カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を１％含有する化粧料を得た。
【００４７】
＜配合１＞化粧料
実施例１の皮膚改善剤
（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）                  １      ％
エタノール                                                ４．５  ％
グリセリン                                                ３      ％
ポリエチレングリコール１５００                            ２      ％
１、３−ブチレングリコール                                ２      ％
フェノキシエタノール                                      ０．２  ％
メチルパラベン                                            ０．１  ％
EDTA-２Na                                                 ０．１  ％
クエン酸ナトリウム                                        ０．０９％
クエン酸                                                  ０．０１％
イオン交換水                                              残余
【００４８】
［比較例１］＜化粧料の調製＞
処方例１の化粧料において、実施例１のカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を分子量１００万のヒアルロン酸ナトリウムに等量置き換えた以外は同様にして比較例１の化粧料を得た。
【００４９】
［試験例１］
処方例１及び比較例１の化粧料について、以下の評価方法及び評価基準にしたがって肌に塗布した際の肌の調子の評価を行った。結果を表１に示す。
【００５０】
＜評価方法＞
パネラー１０名の顔に５日間毎日、処方例１及び比較例１の化粧料を塗布し、塗布開始５日目の肌の調子について肌の評価を行った。以下の評価基準に基づいて評価結果を点数化し平均点を算出した。
【００５１】
＜使用感の評価基準＞
１点：肌の調子が非常に悪い
２点：肌の調子がやや悪い
３点：比較例１と同等
４点：肌の調子が良い
５点：肌の調子が非常に良い
【００５２】
【表１】
2016199518.tif 000004
【００５３】
表１の結果より、実施例１の皮膚改善剤（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）を配合した処方例１の化粧料は、塗布開始５日目で平均点数が３．４点であり、比較例１に比べ、肌の調子が良くなった。
一方、ヒアルロン酸ナトリウムを配合した比較例１の化粧料は、処方例１に比べ、肌の調子が改善しにくいことが示された。
【００５４】
［試験例２］
処方例１及び比較例１の化粧料について、以下の評価方法及び評価基準にしたがって肌に塗布した際の肌の油っぽさの評価を行った。結果を表２に示す。
【００５５】
＜評価方法＞
パネラー１０名の顔に５日間毎日、処方例１及び比較例１の化粧料を塗布し、塗布開始５日目の肌の油っぽさについて肌の評価を行った。以下の評価基準に基づいて評価結果を点数化し平均点を算出した。
【００５６】
＜使用感の評価基準＞
１点：肌が油っぽくなっている
２点：肌がやや油っぽくなっている
３点：比較例１と同等
４点：肌の油っぽさがやや改善している
５点：肌の油っぽさが改善している
【００５７】
【表２】
2016199518.tif 000005
【００５８】
表２の結果より、実施例１の皮膚改善剤（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）を配合した処方例１の化粧料は、塗布開始５日目で平均点数が３．５点であり、比較例１に比べ、肌の油っぽさが改善された。
一方、ヒアルロン酸ナトリウムを配合した比較例１の化粧料は、処方例１に比べ、肌の油っぽさが改善しにくいことが示された。
【００５９】
［試験例３］
処方例１及び比較例１の化粧料について、以下の評価方法及び評価基準にしたがって肌に塗布した際の肌のもちもち感の評価を行った。結果を表３に示す。
【００６０】
＜評価方法＞
パネラー１０名の顔に５日間毎日、処方例１及び比較例１の化粧料を塗布し、塗布開始５日目の肌のもちもち感について肌の評価を行った。以下の評価基準に基づいて評価結果を点数化し平均点を算出した。
【００６１】
＜使用感の評価基準＞
１点：肌のもちもち感が低下している
２点：肌のもちもち感がやや低下している
３点：比較例１と同等
４点：肌のもちもち感がやや改善している
５点：肌のもちもち感が改善している
【００６２】
【表３】
2016199518.tif 000006
【００６３】
表３の結果より、実施例１の皮膚改善剤（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）を配合した処方例１の化粧料は、塗布開始５日目で平均点数が３．４点であり、比較例１に比べ、肌のもちもち感が改善された。
一方、ヒアルロン酸ナトリウムを配合した比較例１の化粧料は、処方例１に比べ、肌のもちもち感が改善しにくいことが示された。
【００６４】
［実施例３乃至７］＜皮膚改善剤の調製＞
分子量およびカルボキシメチル化率の異なるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸を用いた以外は実施例１に準じて各種カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を調製し、実施例３乃至７の皮膚改善剤とした。
なお、実施例３乃至７に用いた分子量およびカルボキシメチル化率の異なるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸は、実施例１のモノブロモ酢酸ナトリウム、反応の静置温度および時間を変更することによって得た。
実施例３に用いたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸はモノブロモ酢酸ナトリウムを用いて４℃で４８時間反応させた。  
実施例４に用いたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸はモノブロモ酢酸ナトリウムを用いて２５℃で３時間反応させた。
実施例５に用いたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸はモノブロモ酢酸を用いて４℃で２４時間反応させた。
実施例６に用いたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸はモノブロモ酢酸ナトリウムを用いて４℃で３時間反応させた。
実施例７に用いたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸はモノクロロ酢酸を用いて２５℃で４８時間反応させた。
実施例３乃至７に用いたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸のｂ値およびＬ値は、全てｂ値５以下かつＬ値９０以上であった。動粘度は１ｍｍ２／ｓ以上２００ｍｍ２／ｓ以下の範囲内であった。
【００６５】
［試験例２：保水力試験］
秤量瓶を酸化リン(Ｖ)１０ｇと一緒に真空乾燥機に入れ、減圧下、６０℃で３０分間乾燥させた。乾燥させた秤量瓶をデシケーター中で冷ました後、空の秤量瓶の重量を測定し、実施例３乃至７の皮膚改善剤（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）の１．０％液を１．０ｇ秤量した。また、実施例３で得られたカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸と同じ分子量（１２０万）を有するヒアルロン酸（キユーピー株式会社製）も同様の処理にて、秤量瓶に秤量し、比較例２とした。次に、これらの秤量瓶を、シリカゲルを同封したデシケーターに入れて、３５℃の恒温機に入れて１９．５時間保持した後に質量を測定した。以下の式に基づいて、保水率（％）を算出した。
保水率（％）＝｛（恒温機に入れる前のサンプルの質量）−（１９．５時間後のサンプルの質量）｝／（恒温機に入れる前のサンプルの質量）×１００（％）
【００６６】
上記カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および上記ヒアルロン酸の保水率の測定結果を表４に示す。
【００６７】
【表４】
2016199518.tif 000007
【００６８】
表４の結果より、本発明の皮膚改善剤（カルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸）は、同程度の分子量のヒアルロン酸と比較して保水率が高いことが理解できる。
また、表４の結果より、分子量２５万以上またはカルボキシメチル化率が５％以上２００％以下であるカルボキシメチル基含有修飾ヒアルロン酸および／またはその塩を含有する実施例３乃至７の皮膚改善剤は、比較例２のヒアルロン酸と比較して保水率が高いことが理解できる。