(57)【要約】      （修正有）【課題】1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法の提供。【解決手段】以下の核酸構築物：a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびにb）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物、またはb2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、およびIVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物を発現させる段階を含み、重鎖の各々は該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法であって、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含む方法であって、重鎖の各々が該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成することができる、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞において、
2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物
を発現させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞において、
−  第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、ならびに
−  IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法であって、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一のIgG4重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一のIgG4重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一のIgG4重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、但し第二の重鎖が野生型IgG4重鎖ではない、核酸構築物
を発現させる段階を含む方法であって、重鎖の各々が該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成することができる、方法。
【請求項５】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
238番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；239番目のAsp（D）がGlu（E）に置換されている；249番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；251番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；251番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；288番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；288番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；290番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；292番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；292番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；302番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および328番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
【請求項６】
292番目のLys（K）がArg（R）に置換されている、請求項5記載の方法。
【請求項７】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、請求項5〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記軽鎖の定常領域が、それがIVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一の定常領域とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸も含有しないように改変されている、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:4に記載されるアミノ酸配列を有するκCL領域をコードする配列を含むが、106番目の末端のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されるかまたは欠失するように該配列が改変されている、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:3に記載されるアミノ酸配列を有するλCL領域をコードする配列を含むが、104番目のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されるかまたは欠失するように該配列が改変されている、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
前記重鎖の定常領域が、前記軽鎖とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができる残基を含有するように改変されている、請求項5〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH1領域をコードする配列を含むが、14番目のSer（S）がシステイン残基に置換されるようにCH1領域が改変されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:6に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法：
234番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；245番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；247番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；247番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；276番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；284番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；284番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；286番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；288番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；288番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；298番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および324番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
【請求項１４】
288番目のLys（K）がArg（R）に置換されている、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:6に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、請求項13〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:7に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法：
285番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；296番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；298番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；298番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；314番目のSer（S）がAsn（N）に置換されている；322番目のAsn（N）がLys（K）に置換されている；327番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；335番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；335番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；337番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；339番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；339番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；349番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；352番目のIle（I）がVal（V）に置換されている；365番目のArg（R）がHis（H）に置換されている；366番目のPhe（F）がTyr（Y）に置換されている；および375番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
【請求項１７】
339番目のLys（K）がArg（R）に置換されている、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:7に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、請求項16〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法：
234番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；236番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；236番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；273番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；273番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；275番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている。
【請求項２０】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
225番目のGlu（E）がAla（A）に置換されている、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
234番目のThr（T）がAla（A）に置換されている、請求項20〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
236番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
236番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
236番目のLeu（L）がGlu（E）に置換されている、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
236番目のLeu（L）がGly（G）に置換されている、請求項20〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
238番目のLys（K）がAla（A）に置換されている、請求項20〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
267番目のAsp（D）がAla（A）に置換されている、請求項20〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
273番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている、請求項20〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
273番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている、請求項20〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
273番目のPhe（F）がAsp（D）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている、請求項20〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
273番目のPhe（F）がThr（T）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている、請求項20〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
275番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている、請求項20〜30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、118番目のThr（T）がGln（Q）に置換され、および／または296番目のMet（M）がLeu（L）に置換されている、請求項20〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、以下の置換の1つ、2つ、または3つ全てがなされている、請求項20〜33のいずれか一項記載の方法：
120番目のMet（M）がTyr（Y）に置換されている；122番目のSer（S）がThr（T）に置換されている；および124番目のThr（T）がGlu（E）に置換されている。
【請求項３６】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAla（A）に置換されている、請求項20〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAlaに置換されており、かつ175番目のThr（T）がAla（A）に置換されており、かつ248番目のGlu（E）がAla（A）に置換されている、請求項20〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、ヒンジ領域における全てのシステイン残基が欠失するかまたは他のアミノ酸残基に置換されるように改変されているCH領域をコードする配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
ヒンジ領域のシステイン残基が非荷電極性側鎖または無極性側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されるように、CH領域が改変されている、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1のCH配列の106番目および109番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が欠失している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の一方がシステインとは異なるアミノ酸残基に置換されており、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の他方が欠失している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1のCH配列の106番目〜109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1の配列の99番目〜110番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、前記請求項のいずれか一項に特定された任意の変異を除き、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むCH領域をコードする配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、ヒンジ領域全体が欠失するように該CH領域が改変されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、N-結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されているCH領域をコードする配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
CH2領域におけるN-結合型グリコシル化のためのNSTアクセプター部位が、GST、MST、CSE、DSE、DSP、ESP、GSP、HSE、NSE、PSPおよびSSEからなる群より選択される配列に改変されている、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
第二の重鎖がIgG1、IgG2、IgG3、または安定化されたIgG4重鎖、またはIgA、好ましくはIgG1重鎖である、請求項1または請求項3〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
前記混合物における抗体の少なくとも1つ、少なくとも2つ、例えば全てがヒト抗体である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５０】
3種以上の異なる抗体の混合物、4種以上の異なる抗体の混合物など、例えば5種以上の異なる抗体の混合物が産生される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
20種未満の異なる抗体の混合物が産生される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞が、軽鎖をコードする複数の核酸構築物を含み、好ましくは前記重鎖の各々が該軽鎖の各々と対を形成して機能的抗体を形成することができる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５３】
前記混合物の全ての抗体が同じ標的に向けられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記混合物の抗体が前記標的との結合に関して競合しない、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
前記混合物における2種以上の抗体が異なる標的に向けられる、請求項1〜52のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも20回細胞分裂させるために前記宿主細胞を培養する段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
前記細胞培養物から前記混合物を回収するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体混合物を精製するさらなる段階を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、CHO細胞などの哺乳動物細胞である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
共通の軽鎖がSEQ ID NO:8に記載される配列を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
共通の軽鎖が、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む共通の軽鎖など、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む、請求項60記載の抗体。
【請求項６２】
前記核酸が前記宿主細胞のゲノムに安定に組み入れられる、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
前記請求項のいずれか一項記載の方法によって得ることが可能な抗体の混合物を含む、組成物。
【請求項６４】
薬剤として用いるための、請求項63記載の組成物。
【請求項６５】
以下を含む、2種以上の異なる抗体を含む混合物の産生において用いるために適した組み換え型宿主細胞：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物。
【請求項６６】
CHO細胞などの哺乳動物細胞である、請求項65記載の宿主細胞。
【請求項６７】
重鎖と、SEQ ID NO:8に記載される配列を含む軽鎖とを含む、組み換え型抗体。
【請求項６８】
前記軽鎖が、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む軽鎖など、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む、請求項67記載の抗体。
【請求項６９】
二重特異性抗体である、請求項67または68記載の抗体。
【請求項７０】
一価抗体である、請求項67または68記載の抗体。
【請求項７１】
ポリクローナル二価抗体またはポリクローナル一価抗体などのポリクローナル抗体である、請求項67または68記載の抗体。
【請求項７２】
癌の処置のための薬剤など、薬剤として用いるための、請求項67〜68のいずれか一項記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗体混合物を産生する方法、本発明の方法によって得ることが可能な混合物、およびそのような混合物の使用、特に癌の処置での使用を提供する。本発明はまた、本発明の方法において特に有用である軽鎖にも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
今日、多数のヒト疾患が、治療的モノクローナル抗体によって、例えばヒト化または完全なヒトモノクローナル抗体によって処置されている。しかし、いくつかの疾患は、モノクローナル抗体では十分有効に処置されず、または例えば標的のダウンレギュレーションもしくは別の病原性経路への切り換えにより、処置はモノクローナル抗体の適用後時間と共に効果を失う。そのため、代替治療はポリクローナル抗体または抗体混合物による処置であろう。そのような抗体混合物は、同じ標的上の異なるエピトープに対する2つもしくはそれより多くの抗体を含むか、または異なる標的に対する抗体混合物を含みうる。
【０００３】
US7262028（特許文献1）は、1つの軽鎖および異なる重鎖を発現させることにより1つの宿主細胞クローンから二価抗体または二価抗体混合物を産生する方法について記載する。US7262028（特許文献1）に開示されるこの発明は、多くの応用における有用性に関してスクリーニングすることができる抗体の組み合わせの産生方法を提供する。
【０００４】
治療抗体の所望の特徴は、処置される特異的状態に応じて異なる可能性がある。いくつかの適応症に関して、例えば抗体の治療効果が、そうでなければ抗原に結合することができる1つまたは複数の特異的分子と抗原との相互作用を遮断することである場合、抗原に結合することのみが必要である。他の適応症では、補体活性化の誘導能、Fc受容体結合能などのような、さらなる抗体による効果もまた必要である可能性がある。そのような使用では、Fc領域など、抗原結合部分以外の抗体分子の部分が重要である可能性がある。いくつかの完全長の抗体は、標的抗原に結合するとアゴニスト作用を示す可能性がある（これは特に癌の治療に関して望ましくないと見なされる可能性がある）。いくつかの例において、この作用は、二価抗体による「クロスリンク」によって起こる可能性があり、その結果標的の二量体化を促進して、それによって特に標的が受容体である場合には活性化が起こる可能性がある。可溶性抗原の場合、二価の標的化は、望ましくない免疫複合体を形成する可能性がある。このように、いくつかの治療応用に関して、一価抗体が好ましい可能性がある。
【０００５】
一価抗体の例には、Fab断片、scFv抗体、およびナノボディが含まれる。1つの重鎖と1つの軽鎖を含む別のタイプの一価抗体（UniBody（登録商標）分子）が、WO2007/059782（特許文献2）、WO/2008/145137（特許文献3）、WO/2008/145138（特許文献4）、WO/2008/145139（特許文献5）、およびWO/2008/145140（特許文献6）に記載されている。これらの分子において、重鎖の配列は、重鎖間結合が形成されないように、従って二価抗体が形成されないように改変されている。Unibody（登録商標）分子は、Fab断片と比較して好ましい薬物動態を特徴とする。
【０００６】
ポリクローナル抗体または抗体混合物を用いる長所を一価の抗原結合の長所と組み合わせた、抗体に基づく改善された治療が必要である。本発明は、一価抗体の混合物または一価抗体と二価抗体の混合物を産生する方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US7262028
【特許文献２】WO2007/059782
【特許文献３】WO/2008/145137
【特許文献４】WO/2008/145138
【特許文献５】WO/2008/145139
【特許文献６】WO/2008/145140
【発明の概要】
【０００８】
第一の主な局面において、本発明は、1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生する方法に関し、本方法は、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下でまたは哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含み、重鎖の各々は該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成することができる。
【０００９】
このように、第一の重鎖の配列は、安定な重鎖間結合が形成されないように改変されており、このように得られた抗体は一価である（例えば、WO2007/059782を参照されたい）。
【００１０】
よって、選択肢b1の場合では、異なる一価抗体の混合物が同じ細胞において産生される。そのような混合物は、例えば疾患の処置において、特に先に説明したように、モノクローナル一価抗体および／またはポリクローナル二価抗体が最適に有効ではない疾患において用いられうる。
【００１１】
選択肢b2の場合では、一価抗体と二価抗体の混合物が同じ細胞において産生される。そのような混合物は、例えば癌などの疾患の処置において用いられうる。特に興味深い態様において、一価抗体は、標的タンパク質に対するアンタゴニスト的結合または標的タンパク質の遮断によって細胞増殖を阻害して、および二価抗体は、例えば同じ標的細胞上の別の標的抗原に結合して、標的細胞を殺すためにエフェクター機能を動員する。
【００１２】
さらに主な局面において、本発明は、本発明の方法によって得られたまたは得ることができる抗体混合物を含む、薬学的組成物などの組成物に関する。
【００１３】
なおさらなる局面において、本発明は、上記の方法に従う抗体混合物を産生するために適した組み換え型宿主細胞を提供する。
【００１４】
本発明はまた、疾患を処置するために上記の本発明に従う組成物の使用も提供する。
【００１５】
本発明はまた、特異性を失うことなく様々な異なる抗原特異的抗体の軽鎖と交換することができることから、本発明で用いるのに特に適している共通の軽鎖を開示する。そのような軽鎖はより一般的に、組み換え型ポリクローナル抗体または二重特異性抗体などの、1つの軽鎖を多数の重鎖と組み合わせる抗体産物を含有する応用のために用いられる可能性がある。
【００１６】
このように、さらなる局面において、本発明は、重鎖と、SEQ ID NO:8に記載される配列を含む軽鎖とを含む組み換え型抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】トランスフェクトしたHEK-293F細胞の細胞培養上清に存在する一価抗体の、可溶型HisタグCD38に対する結合を、ELISAにおいて測定した。「一価のUni-005」は、一価のUni-005（抗CD38）構築物をトランスフェクトしたHEK-293F細胞の上清を示す。「一価の組み合わせ」は、Uni-7D8（抗CD20）およびUni-005の重鎖と、抗CD38抗体005の軽鎖の組み合わせを発現する細胞の上清を示す。
【図２】トランスフェクトしたHEK-293F細胞の細胞培養上清に存在する一価抗体の、Uni-7D8にも結合するHuMab-7D8に対する抗イディオタイプ抗体に対する結合を、ELISAにおいて測定した。「一価のUni-7D8」は、Uni-7D8構築物をトランスフェクトしたHEK-293F細胞の上清を示す。「一価の組み合わせ」は、Uni-7D8およびUni-CD38の重鎖と抗CD38抗体005の軽鎖との組み合わせを発現する細胞の上清を示す。
【図３】共通の軽鎖を同定するための、様々な重鎖との結合に関するヒトκ軽鎖生殖系列ライブラリのスクリーニング。EGFr（A）、c-Met（B）、またはHer2（C）に対して特異的な可変ドメインを有するヒンジ改変（F273T、Y275E）重鎖とライブラリからの1つの生殖系列κ軽鎖とを発現する、一過性にトランスフェクトしたHEK-293F細胞の上清を、コーティングとして組み換え型可溶型抗原を用いるELISAにおいて結合に関してスクリーニングした。各々の点は、独自の重鎖と軽鎖の組み合わせおよび結合（OD405）および発現（μg/mL、1：20倍希釈後）を表す。機能的結合抗体を形成する重鎖と軽鎖の組み合わせに、1、2、および3という印をつける（1'、2'および3'はアッセイにおける1、2および3の複製である）。特定の重鎖を伴うもとのκ軽鎖を陽性対照（四角）として各実験に含めた。
【図４】同時発現および組み換え型標的に対するELISAでの結合による共通の軽鎖の確認。EGFR、c-Met、およびHer2に対して特異的な可変ドメインを有する3つのヒンジ改変（F273T、Y275E）重鎖と、一次スクリーニング（図3における1、2、または3）において同定された1つの共通のκ軽鎖生殖系列配列とを同時発現する、一過性にトランスフェクトしたHEK-293F細胞の上清を、コーティングとして組み換え型可溶型抗原（それぞれ、EGFR（A）、c-Met（B）、またはHer2（C））を用いるELISAにおいて結合に関して試験した。特定の重鎖を伴うもとのκ軽鎖を、陽性対照として各実験に含めた。
【図５】クロスリンクELISAによる抗体の一価性の決定。EGFRおよびc-Metに対してそれぞれ、特異的な可変ドメインを有する3つのヒンジ改変（F273T、Y275E）重鎖と、一次スクリーニングにおいて同定された（図3における1、2、または3）1つの共通のκ軽鎖生殖系列配列とを同時発現する、一過性にトランスフェクトしたHEK-293F細胞の上清を、コーティングとしての組み換え型可溶型抗原（EGFr（A）およびc-Met（B））と、二価の分子を検出するためのビオチンにコンジュゲートした同じ抗原とを用いるクロスリンクELISAにおいて一価性に関して試験した。EGFRおよびc-Metに対するIgG1抗体をアッセイにおいて陽性対照として用いて、EGFRおよびc-Metに対する一価抗体の対照バッチを陰性対照として用いた。
【００１８】
SEQ ID NO:1：ヒトIgG4の重鎖（CH）の野生型定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01861）。斜体の配列はCH1領域を表し、強調した配列はヒンジ領域を表し、通常の配列はCH2領域を表し、および下線の配列はCH3領域を表す。
SEQ ID NO:2：ヒンジ領域が欠失しているヒトIgG4の重鎖（CH）の変異体定常領域のアミノ酸配列
SEQ ID NO:3：ヒトλ軽鎖（CL）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号S25751）
SEQ ID NO:4：ヒトκ軽鎖（CL）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01834）
SEQ ID NO:5：ヒトIgG1の重鎖（CH）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01857）。斜体の配列はCH1領域を表し、強調した配列はヒンジ領域を表し、通常の配列はCH2領域を表し、および下線の配列はCH3領域を表す。
SEQ ID NO:6：ヒトIgG2の重鎖（CH）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01859）。斜体の配列はCH1領域を表し、強調した配列はヒンジ領域を表し、通常の配列はCH2領域を表し、および下線の配列はCH3領域を表す。
SEQ ID NO:7：ヒトIgG3の重鎖（CH）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01860）。斜体の配列はCH1領域を表し、強調した配列はヒンジ領域を表し、通常の配列はCH2領域を表し、および下線の配列はCH3領域を表す。
SEQ ID NO:8：VセグメントVKVI-2-1-(l)-A14（IGKV6D-41*01）のアミノ酸配列。
SEQ ID NO:9：JK-セグメントJK1（IGKJ1*01）のアミノ酸配列
SEQ ID NO:10：JK-セグメントJK2 （IGKJ2*01）のアミノ酸配列
SEQ ID NO:11：JK-セグメントJK3（IGKJ3*01）のアミノ酸配列
SEQ ID NO:12：共通の軽鎖1のアミノ酸配列
SEQ ID NO:13：共通の軽鎖2のアミノ酸配列
SEQ ID NO:14：共通の軽鎖3のアミノ酸配列 
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
定義
特に明記していなければ、本明細書において言及される「抗体」という用語には、全抗体分子、抗原結合断片、一価抗体、およびその一本鎖が含まれる。抗体分子は免疫グロブリンと呼ばれる血漿タンパク質ファミリーに属し、その基本構築ブロック、免疫グロブリンの折り畳みまたはドメインは、免疫系の多くの分子および他の生物学的認識系において様々な形で用いられている。本来の抗体および免疫グロブリンは通常、2つの同一の軽（L）鎖および2つの同一の重（H）鎖で構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各々の重鎖および軽鎖はまた、規則正しい間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有してもよい。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてVLと省略される）および軽鎖定常領域（本明細書においてCLと省略される）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（VH）と3つの相同なドメイン（CH1、CH2、およびCH3）およびヒンジ領域で構成される重鎖定常領域（CH）を含む。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメイン（CH1）と共に整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと共に整列して、抗原結合断片に関して「Fab」として知られる断片を形成する。重鎖のCH1とCH2とは、ヒンジ領域によって互いに離れており、その柔軟性によって、抗体分子のFab「アーム」はFc部分からある程度動くことができる。ヒンジ領域は通常、1つの抗体分子内で他の重鎖のヒンジ領域のシステイン残基とジスルフィド架橋を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を含む。
【００２０】
重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを形成する。抗体は、主に6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（CDR）に位置するアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。この理由から、CDR内のアミノ酸配列は、CDR外の配列より個々の抗体間で多様である。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例として、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（C1q）が含まれる宿主の組織または因子との、免疫グロブリンの結合を媒介する可能性がある。
【００２１】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、少なくとも5つの主要なクラスの免疫グロブリンに分類することができる：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM。これらのクラスのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例としてIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4；IgAlおよびIgA2に細分類されることがある。免疫グロブリンの重鎖定常ドメインをコードする遺伝子は、IgAに関してアルファ（α）、IgDに関してデルタ（δ）、IgEに関してイプシロン（ε）、IgGに関してガンマ（γ）、およびIgMに関してミュー（μ）と呼ばれる。IgGサブクラスは異なる遺伝子によってコードされる：IgG1に関してγ1、IgG2に関してγ2、IgG3に関してγ3、およびIgG4に関してγ4。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの明らかに別個のタイプの1つに割付される。異なるクラスの免疫グロブリンの3次元構造は周知であり、サブユニットに分割することができる。IgG重鎖内の比較により、CH1、CH2、およびCH3相同性領域が定義される。これらの領域を、本明細書における配列表において異なるIgGアイソタイプに関して示す。4つのIgGサブクラスの各々の相同性領域を比較すると、＞95％の配列同一性が明らかとなる（Jefferis, R. 1990. F. Shakib, ed. Pergamon Press, Oxford, p. 15）。IgG1重鎖に関してGlm(a)、Glm(x)、Glm(f)およびGlm(z)、ならびにκ軽鎖に関してKm1、Km1,2およびKm3などの、免疫グロブリンの独自のアロタイプがヒト集団に存在する。これらのアロタイプは、その定常領域における独自のアミノ酸が異なる。CH1とCH2ドメインとの間の配列は、それが分子の柔軟性を可能にすることからヒンジ領域と呼ばれる。1つの抗体内の2つの重鎖のCH3ドメインが対を形成し、その非共有相互作用は、軽度の条件下で重鎖間ジスルフィド架橋の還元した後にIgG分子がその構造の完全性を維持するのに十分である。CH3ドメインの対形成はコンパクトで、Fabでの対形成と類似であり、2つのドメイン間でほぼ正確なダイアドを有する（Saphire, et al., 2002. J Mol Biol 319:9）。これは、密接に会合せず、その接触がAsn297残基に付着した2つの炭水化物鎖によって主に媒介されるCH2ドメインとは対照的である（Saphire, et al., 2002. J Mol Biol 319:9）。2つの重鎖軽鎖ヘテロ二量体が連結される特徴的なIgG構造は、このようにヒンジ領域の重鎖間ジスルフィド架橋およびCH3ドメインの非共有相互作用によって維持される。
【００２２】
本発明の文脈において、「共通の軽鎖」は、同一であってもよく、またはアミノ酸配列の差を有してもよい軽鎖を指す。共通の軽鎖は、同じ重鎖と組み合わせた場合に抗体の特異性を変化させない変異を含んでもよく、それらも本発明の範囲に含まれる。例として、例えば保存的アミノ酸変化、または重鎖と対を形成した場合に結合特異性に関与しないもしくは関与してもごく部分的である領域におけるアミノ酸の変化を、導入および試験することによって、同一ではないが、なおも機能的に同等である軽鎖を調製するまたは見い出すことが、本明細書において用いられる共通の軽鎖の定義の範囲内で可能である。例示的な態様において、本発明は、異なる重鎖と組み合わせて機能的な抗原結合ドメインを有する抗体を形成するために、共通の軽鎖、1つの同一の軽鎖を用いることを提供する。1つの共通の軽鎖を用いることにより、軽鎖および重鎖の対形成によって、機能的でない、または言い換えれば1つもしくは複数の標的抗原に結合することができない抗原結合ドメインを生じるヘテロ二量体の形成が回避される。
【００２３】
本発明の文脈において、「異なる重鎖」は、可変領域が異なる重鎖を意味する。異なる重鎖は同一のまたは異なる定常領域を有してもよい。
【００２４】
本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれることが意図される。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例として、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によって、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）が含まれてもよい。しかし、本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語には、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するCDR1もしくはCDR2配列、またはマウスなどのヒト以外の別の種からの抗体に由来するCDR3領域がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体が含まれないことが意図される。
【００２５】
本明細書において用いられる「KD」という用語は、特定の抗体抗原相互作用のモル（M）での解離平衡定数を指す。
【００２６】
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。よって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域とを有する、単一の結合特異性を示す抗体を指す。
【００２７】
本明細書において用いられる「核酸」、「核酸構築物」、または「核酸分子」という用語には、DNA分子およびRNA分子が含まれると意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってもよい。
【００２８】
本明細書において用いられる「特異的結合」は、既定の抗原に対する抗体またはその抗原結合断片の結合を指す。典型的に、抗体は、例としてBIAcoreにおいてスルホンプラズモン共鳴を用いて測定した場合に、またはFACSもしくはELISAにおけるIC50値に基づく見かけの親和性として、約10-7 Mもしくはそれ未満のKD、例えば約10-8 Mもしくはそれ未満、約10-9 Mもしくはそれ未満、約10-10 Mもしくはそれ未満、または約10-11 Mもしくはなおそれ未満のKDに対応する親和性で、既定の抗原に結合して、既定の抗原以外の非特異的抗原（例えば、BSA、カゼイン）または近縁の抗原に対する結合に関するその親和性より、少なくとも10倍低い、少なくとも100倍低いなど、例として少なくとも1,000倍低い、少なくとも10,000倍低いなど、例として少なくとも100,000倍低いKDに対応する親和性で、既定の抗原に結合する。親和性がどの程度低下するかは抗体のKDに依存し、抗体のKDが非常に低い場合（すなわち、抗体が非常に特異的である場合）、既定の抗原に対する親和性が非特異的抗原に対する親和性より低くなるその程度は、少なくとも10,000倍であり得る。
【００２９】
「非ヒトトランスジェニック動物」という用語は、トランスジーンまたはトランス染色体（transchromosome）上で1つまたは複数のヒト重鎖および／または軽鎖座を含むゲノムを有し、ヒト抗体を発現することができる非ヒト動物を指す。例えば、トランスジェニックマウスは、抗原および／または抗原を発現する細胞によって免疫した場合にそのマウスがヒト抗体を産生するように、トランスジーン上にヒト軽鎖座を有し、かつトランスジーン上にヒト重鎖座またはトランス染色体上にヒト重鎖座のいずれかを有することができる。ヒト重鎖トランスジーンを、トランスジェニック、例としてHCo7もしくはHCo12マウスなどのHuMAb（商標）マウスの場合のように、マウスの染色体DNAに組み入れることができ、またはWO 02/43478に記載されるトランス染色体KM-マウス（商標）の場合のように、ヒト重鎖トランスジーンをヒト染色体断片内で染色体外に維持することができる。そのようなトランスジェニックおよびトランス染色体マウスは、V-D-J組み換えおよびアイソタイプスイッチを受けることによって、選択された抗原（例えば、IgG、IgA、および／またはIgE）に結合するヒト抗体の多数のアイソタイプを産生することができる。
【００３０】
「抗体の価数」という用語は、抗体が反応することができる抗原決定基の最大数を意味する。例えば、野生型IgG抗体は2つのFab領域を含有して、2つの抗原分子または同じ粒子上の2つの同一の部位に結合することができ、このように2の価数（「二価」）を有する。「一価抗体」という用語は、本発明の文脈において、抗体分子が多くて1つのFab領域を有し、通常抗原1分子のみに結合することができるが、抗原のクロスリンクを媒介することができないことを意味する。
【００３１】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面官能基からなり、通常、特異的三次元構造特徴のみならず特異的電荷特徴を有する。コンフォメーショナルエピトープと非コンフォメーショナルエピトープは、前者に対する結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点において識別される。
【００３２】
本明細書において用いられる「宿主細胞」（または「組み換え型宿主細胞」）という用語は、組み換え型発現ベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。そのような用語は、特定の被験細胞のみならず、そのような細胞の子孫も指すことが意図されると理解すべきである。変異または環境の影響のいずれかにより、ある程度の改変がその後の世代に起こる可能性があることから、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではない可能性があるが、それでもなお本明細書において用いられる「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。単数形の「宿主細胞」という用語はまた、特定の種類の宿主細胞の培養物も指すことがある。本発明に従う抗体の発現は、大腸菌（E. coli）、エンテロバクター（Enterobactor）、サルモネラ（Salmonella）、バチルス（Bacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）、およびストレプトミセス（Streptomyces）などの細菌、出芽酵母（S. cerevisiae）、K.ラクチス（K. lactis）、P.パストリス（P. pastoris）などの酵母、カンジダ（Candida）、ヤロウィア（Yarrowia）、アカパンカビ（Neurospora）、コメコウジ菌（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・ニジュランス（Aspergillus nidulans）および黒色アスペルギルス（Aspergillus niger）などの糸状菌、シロイヌナズナ（Arabidopsis）などの植物細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）SF-9およびSF-21細胞などの昆虫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）、BHK細胞、SP2/0およびNS-0骨髄腫細胞が含まれるマウス細胞などの哺乳動物細胞、COSおよびVero細胞などの霊長類細胞、MDCK細胞、BRL 3A細胞、ハイブリドーマ、腫瘍細胞、不死化初代培養細胞、W138、HepG2、HeLa、HEK-293、HT1080、またはPER.C6（商標）などの胎児網膜細胞などのヒト細胞等が含まれる、組み換え型DNA分子を発現することができる任意の宿主細胞を用いることを通して行ってもよい。中でも細胞の選択は、得られるグリコシル化パターンに依存する。
【００３３】
「IVIG」という用語は、Sanquin, the Netherlandsによって調製された静脈内免疫グロブリンを指す。簡単に説明すると、IVIGは、Brummelhuis (1983) Acta Pharmac Scand (suppl) 4:91によって記載される改変Cohnエタノール分画技術により、ドナー少なくとも1,000例のヒト血漿プールから調製される。調製物は、Cohn分画IIを微量のペプシンの存在下でpH 4で処置することによって、静脈内投与に適した形となる。材料は、凍結乾燥型で提供される。明記された容量に溶解した後、産物は、タンパク質約60 g/Lを含有する。タンパク質分画は、少なくとも95％IgG、少量のIgA（＜2 g/L）およびIgM、ならびに微量の他の血漿タンパク質を含有する。IgGサブクラスの含有量は、健常なヒト血漿の含有量と同等である：60％IgG1、33％IgG2、3％IgG3、および3％IgG4。調製物は、1リットルあたりグルコース0.24 molおよびナトリウム37 mmolを含有する。
【００３４】
本発明のさらなる局面および態様
先に説明したように、1つの局面において、本発明は、1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するためのインビトロ方法に関し、本方法は、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含み、重鎖の各々は該軽鎖と対を形成して、機能的抗体を形成することができる。
【００３５】
したがって、1つの態様において、本発明の方法は、宿主細胞において以下を発現させる段階を含む：
2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物。
【００３６】
このように得られた組成物は、2種以上の異なる一価抗体を含む。
【００３７】
代替の態様において、本発明の方法は、宿主細胞において以下を発現させる段階を含む：
−  第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
−  IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物。
【００３８】
このようにして得られた組成物は、一価抗体と二価抗体の混合物を含む。
【００３９】
本発明の方法によって産生された抗体混合物内に含まれる一価抗体は、基本的に、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2が含まれるがこれらに限定されるわけではない任意のアイソタイプの抗体であってもよい。
【００４０】
したがって、1つの態様において、一価抗体は、IgG1に由来するが、分子間相互作用をさらに低減させるように改変されている。このように、本発明の方法の1つの態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:5に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域は、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている：238番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；239番目のAsp（D）がGlu（E）に置換されている；249番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；251番目のLeu（L）がAla（A）またはVal（V）に置換されている；288番目のPhe（F）がAla（A）またはLeu（L）に置換されている；290番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；292番目のLys（K）がArg（R）またはAla（A）に置換されている；302番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および328番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。好ましい態様において、292番目のLys（K）はArg（R）に置換されている。
【００４１】
さらに好ましい態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:5に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む。
【００４２】
CH領域がIgG1アイソタイプである場合、IgG1における軽鎖の遊離のシステイン残基は、ヒンジ領域にシステインが存在しない場合であっても、おそらく抗体を二価型で維持できるであろうことから、その定常領域を任意でさらに改変してもよい。
【００４３】
このように、1つの態様において、軽鎖の定常領域は、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与した場合に、同一の定常領域とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸も含有しないように改変されている。例えば、共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:4に記載されるアミノ酸配列を有するκCL領域をコードする配列を含むが、配列は、106番目の末端のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されているか、もしくは欠失しているように改変されており、または共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:3に記載のアミノ酸配列を有するλCL領域をコードする配列を含むが、配列は、104番目のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されているか、もしくは欠失しているように改変されている。
【００４４】
または、重鎖の定常領域は、それが軽鎖とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができる残基を含有するように改変されている。例えば、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:5に記載されるCH1領域をコードする配列を含むが、CH1領域は、14番目のSer（S）がシステイン残基に置換されているように改変されている。
【００４５】
さらなる態様において、一価抗体は、IgG2に由来するが、分子間相互作用をさらに低減させるように改変されている。このように、本発明の方法の1つの態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:6に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域は、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている：234番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；245番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；247番目のLeu（L）がAla（A）またはVal（V）に置換されている；276番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；284番目のPhe（F）がAla（A）またはLeu（L）に置換されている；286番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；288番目のLys（K）がArg（R）またはAla（A）に置換されている；298番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および324番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。好ましい態様において、288番目のLys（K）はArg（R）に置換されている。
【００４６】
さらに好ましい態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:6に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む。
【００４７】
さらなる態様において、一価抗体はIgG3に由来するが、分子間相互作用をさらに低減させるように改変されている。このように、本発明の方法の1つの態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:7に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域は、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている：285番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；296番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；298番目のLeu（L）がAla（A）またはVal（V）に置換されている；314番目のSer（S）がAsn（N）に置換されている；322番目のAsn（N）がLys（K）に置換されている；327番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；335番目のPhe（F）がAla（A）またはLeu（L）に置換されている；337番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；339番目のLys（K）がArg（R）またはAla（A）に置換されている；349番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；352番目のIle（I）がVal（V）に置換されている；365番目のArg（R）がHis（H）に置換されている；366番目のPhe（F）がTyr（Y）に置換されている；および375番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。好ましい態様において、339番目のLys（K）はArg（R）に置換されている。
【００４８】
さらに好ましい態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:7に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む。
【００４９】
本発明の特に興味深い局面において、本発明の方法によって産生された混合物内に含まれる一価抗体はIgG4アイソタイプの抗体である。このように、さらなる局面において、本発明は、1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法に関し、本方法は、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一のIgG4重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一のIgG4重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一のIgG4重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、但し、第二の重鎖が野生型IgG4重鎖ではない、核酸構築物
を発現させる段階を含み、重鎖の各々は該軽鎖と対を形成して、機能的抗体を形成することができる。
【００５０】
1つの態様において、一価抗体は、IgG4に由来するが、分子間相互作用をさらに低減させるように改変されている。このように、本発明の方法の1つの態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域は、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている：217番目のTyr（Y）がArg（R）に置換されている；219番目のLeu（L）がAsn（N）またはGln（Q）に置換されている；225番目のGlu（E）がAla（A）、Thr（T）、Val（V）またはIle（I）に置換されている；232番目のSer（S）がArg（R）またはLys（K）に置換されている；234番目のThr（T）がAla（A）、Arg（R）、Lys（K）またはAsn（N）に置換されている；236番目のLeu（L）がAla（A）、Val（V）、Glu（E）、Gly（G）、Ser（S）またはThr（T）に置換されている；238番目のLys（K）がAla（A）、Arg（R）、またはThr（T）に置換されている；267番目のAsp（D）がAla（A）、Thr（T）、またはSer（S）に置換されている；273番目のPhe（F）がAla（A）、Leu（L）、Thr（T）、Asp（D）、Arg（R）、Gln（Q）、Lys（K）、またはTyr（Y）に置換されている；275番目のTyr（Y）がAla（A）、Glu（E）、Gln（Q）、Lys（K）、またはPhe（F）に置換されている；277番目のArg（R）がAla（A）、Lys（K）、またはGlu（E）に置換されている；279番目のThr（T）がAsp（D）、Val（V）、またはAsn（N）に置換されている。好ましい態様において、236番目のLeu（L）はVal（V）に置換されている。
【００５１】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含む。
【００５２】
さらなる態様において、273番目のPhe（F）がAsp（D）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている。
【００５３】
さらなる態様において、 273番目のPhe（F）がThr（T）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている。
【００５４】
さらなる態様において、275番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている。
【００５５】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、118番目のThr（T）がGln（Q）に置換され、および／または296番目のMet（M）がLeu（L）に置換されている。
【００５６】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、以下の置換の1つ、2つ、または3つ全てがなされている：120番目のMet（M）がTyr（Y）に置換され；122番目のSer（S）がThr（T）に置換され；および124番目のThr（T）がGlu（E）に置換されている。
【００５７】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAla（A）に置換されている。
【００５８】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAla（A）に置換されており、175番目のThr（T）がAla（A）に置換されており、および248番目のGlu（E）がAla（A）に置換されている。
【００５９】
ヒンジ領域の改変はいくつかの方法で行われてもよい。
【００６０】
1つの態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、ヒンジ領域における全てのシステイン残基が欠失しているか、または他のアミノ酸残基に置換されるように改変されているCH領域をコードする配列を含む。
【００６１】
さらなる態様において、CH領域は、ヒンジ領域のシステイン残基が非荷電極性側鎖または無極性側鎖を有するアミノ酸残基に置換されるように改変されている。
【００６２】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1のCH配列の106番目および109番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が欠失している。
【００６３】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の一方がシステインとは異なるアミノ酸残基に置換されており、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の他方が欠失している。
【００６４】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1のCH配列の106番目〜109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している。
【００６５】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1の配列の99番目〜110番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している。
【００６６】
さらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、前記請求項のいずれかに明記された任意の変異を除き、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むCH領域をコードする配列を含む。
【００６７】
なおさらなる態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、CH領域は、ヒンジ領域全体が欠失するように改変されている。
【００６８】
一価抗体は、任意でさらなる改変を含んでもよい。1つの態様において、第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物は、N-結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されたCH領域をコードする配列を含む。好ましくは、CH2領域におけるN-結合型グリコシル化のためのNSTアクセプター部位は、GST、MST、CSE、DSE、DSP、ESP、GSP、HSE、NSE、PSP、およびSSEからなる群より選択される配列に改変されている。
【００６９】
本発明の方法のさらなる態様において、混合物における抗体の少なくとも1つ、少なくとも2つ、例えば全てがヒト抗体である。
【００７０】
本発明の方法のさらなる態様において、共通の軽鎖は、SEQ ID NO:8に記載される配列を含む。
【００７１】
そのなおさらなる態様において、共通の軽鎖は、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む共通の軽鎖など、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む。
【００７２】
本発明の方法の別の態様において、3種以上の異なる抗体の混合物、4種以上の抗体の混合物など、例えば5種以上の異なる抗体の混合物が産生される。
【００７３】
さらなる態様において、20種未満の異なる抗体の混合物が産生される。
【００７４】
なおさらなる態様において、宿主細胞は、軽鎖をコードする複数の核酸構築物を含み、好ましくは、重鎖の各々は軽鎖の各々と対を形成して、機能的抗体を形成することができる。
【００７５】
なおさらなる態様において、方法は、少なくとも20回細胞分裂させるために宿主細胞を培養する段階を含む。
【００７６】
なおさらなる態様において、方法は、細胞培養から混合物を回収するさらなる段階を含む。
【００７７】
なおさらなる態様において、方法は、抗体混合物を精製するさらなる段階を含む。
【００７８】
なおさらなる態様において、核酸は、宿主細胞のゲノムに安定に組み入れられる。
【００７９】
さらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって得ることができる抗体の混合物を含む組成物に関する。1つの態様において、組成物は薬剤として用いられる。
【００８０】
なおさらなる態様において、本発明は、2種以上の異なる抗体を含む混合物の産生において用いるのに適した組み換え型宿主細胞に関し、この宿主細胞は以下を含む：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物。
【００８１】
1つの態様において、宿主細胞は、CHO細胞などの哺乳動物細胞である。
【００８２】
一価抗体と二価抗体の混合物
先に説明したように、1つの態様において、本発明は、1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生する方法に関し、本方法は、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含み、重鎖の各々は該軽鎖と対を形成して、機能的抗体を形成することができる。
【００８３】
このように、この態様において、一価抗体と二価抗体の混合物は同じ細胞において産生される。そのような混合物は例えば、癌などの疾患の処置において用いられうる。特に興味深い態様において、一価抗体は、標的タンパク質を遮断することによって細胞増殖を阻害し、二価抗体は、例えば同じ標的細胞上の別の標的抗原に結合して、標的細胞を殺すためにエフェクター機能を動員する。
【００８４】
好ましくは第二の重鎖は、IgG1、IgG2、IgG3、IgA、または安定化IgG4重鎖である。
【００８５】
より好ましくは、第二の重鎖は、ADCCおよびCDCなどのエフェクター機能を活性化することができる二価抗体の形成を可能にするアイソタイプ、例えばIgG1の重鎖である。
【００８６】
別の態様において、第二の重鎖はIgG4に基づくが、IgG4分子を安定化するように改変されている（すなわち、van den Neut Kolfschoten (2007) Science 317: 1507に記載されているように動的なFabのアーム交換を防止する）。そのような安定化されたIgG4は、エフェクター機構を活性化しないが、受容体をクロスリンクする。安定化IgG4抗体は、PCT/DK2008/050129に記載されている。
【００８７】
IgG4の安定化は、CH3領域の改変によってまたはヒンジ領域の改変によって、達成されうる。
【００８８】
このように、1つの態様において、重鎖はSEQ ID NO:1における289番目の位置でLys、Ala、Thr、Met、Leu、およびTrpからなる群より選択される残基、および／またはSEQ ID NO:1の285番目に対応する位置でAla、Val、Gly、Ile、およびLeuからなる群より選択される残基を有するヒトIgG4定常領域を含み、抗体は任意で1つまたは複数のさらなる置換、欠失、および／または挿入を含む。好ましくは、抗体は、289番目に対応する位置でLys、Met、もしくはLeuを含み、または抗体は285番目に対応する位置でAlaもしくはLeu残基を含む。別の態様において、安定化IgG4抗体は、SEQ ID NO:1の229番目に対応する位置でAsp、および／または231番目に対応する位置でLys、および／または237番目に対応する位置でThr、および／または244番目に対応する位置でThrもしくはAsp、および／または250番目に対応する位置でThr、Gln、もしくはGluを含み、および／またはSEQ ID NO:1の291番目に対応する位置でPheもしくはValを含む。抗体は任意で、SEQ ID NO:1に記載される定常領域において1つまたは複数のさらなる置換、欠失、および／または挿入を含む。
【００８９】
別の態様において、IgG4抗体は、ヒンジ領域においてCys-Pro-Pro-Cys配列を含むように改変されている。
【００９０】
標的分子
1つの態様において、本発明の方法によって産生された混合物の全ての抗体は、同じ標的（すなわち、同じ抗原）に向けられる。好ましくは、混合物の抗体は、標的との結合に関して競合しない。
【００９１】
別の態様において、混合物における2種以上の抗体は異なる標的に向けられる。
【００９２】
本発明の1つの態様において、得られた混合物は、一価抗体と二価抗体の混合物であり、二価抗体は、それに対する免疫能が望ましい標的（例えば、エフェクター機構を介した死滅が望ましい腫瘍細胞表面上の標的）に向けられ、一価抗体は、免疫調節分子、例えば免疫阻害分子に向けられ、それによってその受容体への結合を阻害する、または補体防御分子を遮断する。
【００９３】
1つの態様において、本発明の一価抗体の混合物は、受容体の二量体化によって活性化される細胞表面受容体に特異的に結合する。本発明の抗体分子はその一価の性質により、受容体の二量体化を誘導することができず、従ってそのような活性化を誘導できないことから、一価抗体はしばしば、受容体の活性化が望ましくない疾患または障害の処置において有用である可能性がある。特異的受容体に限定されないが、そのような受容体の例は、erb-Bl、erb-B2、erb-B3、erb-B4、ならびにエフリン-AlからA8およびeph-Blからeph-B6などのエフリンおよびエフリン受容体のメンバーであろう。
【００９４】
別の態様において、本発明の方法によって産生される一価抗体の混合物は、標的分子に結合すると、標的分子の多量体化（二量体化などの）を阻害する。この場合も、本発明の抗体分子はその一価の性質により、そのような多量体化を誘導できないことから、そのような一価抗体は、標的抗原の多量体化が望ましくない疾患または障害の処置において有用である可能性がある。可溶型抗原の場合、多量体化は望ましくない免疫複合体を形成する可能性がある。特異的標的に限定されないが、そのような標的の例は、TLR-3およびTLR-9などのToll様受容体のリガンド、またはアンジオポエチン-1もしくはアンジオポエチン-2、またはCD30、CD40、およびCD95などのTNF受容体ファミリーメンバーでありうる。
【００９５】
先に記載したように、一定の病理状態では、一価抗体を利用することが必要であるおよび／またはそれが望ましい。本発明の方法によって生成された混合物中の一価抗体は、ADCCおよびCDCなどのエフェクター機能を活性化できない。
【００９６】
本発明の1つの態様において、一価抗体と二価抗体の混合物が本発明の方法によって産生される。このように、得られた混合物は典型的に（例えば二価抗体がIgG4アイソタイプの抗体でなければ）、ADCCおよびCDCなどのエフェクター機能を活性化することができる二価抗体と、これらの機能を活性化することができない一価抗体の双方を含有する。
【００９７】
特定の目的に関する本発明の抗体混合物の特異的選択および有用性は、抗体の特異的標的に依存する。本発明の抗体混合物が治療および予防にとって有用である標的の選択は、標的に対して特異的なまたは標的上の所定のエピトープに対して特異的な抗体を投与する治療価値に基づいてもよい。そのような検討は当業者の範囲内である。
【００９８】
本発明の1つの態様は、乳腺、消化管、肺、卵巣、前立腺腫瘍等などの固形腫瘍の処置にとって有用な抗体混合物を伴う。以下に言及する癌標的は、例えば同じ標的上の異なるエピトープに対する（抗体の混合物が標的との結合に関して競合しない）もしくは異なる標的に対する一価抗体の混合物によって、または異なる標的に結合する一価抗体と二価抗体の混合物によって標的化されうる。本発明の態様において、癌標的は、cMet、EGFr、Her2、またはHERVエンベロープタンパク質から選択される。1つの態様において、ペリオスチン、Bigh3、およびSPARCに対する一価抗体の混合物を固形腫瘍の処置において用いることができる。
【００９９】
本発明の態様は、リンパ腫の処置にとって有用な抗体混合物を伴う。1つの態様において、標的は、CD20、CD38、BCR、CD19、CD79、CD37である。1つの態様において、リンパ腫はB-CLLである。上記の態様において、本発明によって産生される抗体混合物は、CD38およびRANKLの組み合わせに対して作製される。
【０１００】
本発明の別の態様は、多発性骨髄腫の処置にとって有用な抗体混合物を伴う。この適応症は、CD38およびCXCR4に対する一価抗体または一価と二価抗体の混合物によって標的化されうる。
【０１０１】
本発明の別の態様は、CLLの処置にとって有用な抗体混合物を伴う。この適応症は、CD20およびCXCR4に対する一価抗体、または一価抗体と二価抗体の混合物によって標的化されうる。または、一価抗体の混合物または一価抗体と二価抗体の混合物は、CD20およびCXCR4および／またはCCR7および／またはCXCR5に対して標的化されうる。
【０１０２】
本発明のさらなる態様は、神経膠腫の処置にとって有用な抗体混合物を伴う。そのような処置は、EGFrwt、EGFrvIII、およびMRP3に対する本発明に従う抗体混合物によって標的化されうる。
【０１０３】
本発明のなおさらなる態様は、血管新生の処置にとって有用な抗体混合物を伴う。以下に言及される血管新生標的は、一価抗体の混合物によって標的化されうる。混合物の抗体が標的との結合に関して競合しない同じ標的上の異なるエピトープに対して、または異なる標的に対して、抗体を作製することができる。1つの態様において、これらの標的は、線維芽細胞増殖因子（FGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、肝細胞増殖因子（HGF）、インターロイキン8、血小板由来内皮細胞増殖因子（PD-ECGF）、血小板由来増殖因子-BB（PDGF-BB）、プレイオトロフィン（PTN）、プログラヌリン、プロリフェリン、トランスフォーミング増殖因子-α（TGF-α）、トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、血管内皮増殖因子（VEGF）、VEGF-C  VEGF-D等である。
【０１０４】
別の態様において、標的には、アンジオスタチン（プラスミノーゲン断片）、抗血管新生アンチトロンビンIII、エンドスタチン（コラーゲンXVIII断片）、フィブロネクチン断片、Gro-β、へパリナーゼ、インターフェロン-α/β/γ、インターフェロン誘導タンパク質（IP-10）、インターロイキン-12、メタロプロテナーゼ阻害剤（TIMP）、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、およびトロンボスポンジン-1（TSP-1）が含まれるがこれらに限定されない血管新生阻害剤が含まれる。
【０１０５】
本発明のさらなる態様において、ラクトアドへリンと併用したVEGFまたはβ2GP1の併用に対する抗体の混合物を、望ましくない血管新生の処置において用いることができるであろう。
【０１０６】
1つの態様において、本発明によって産生された抗体混合物の投与による癌の上記の処置を、上記と同じ様式で抗血管新生標的と併用することができる。
【０１０７】
1つの態様において、上記の抗血管新生標的を、上記と同じ様式で抗プロテアーゼ標的と併用することができる。
【０１０８】
1つの態様において、本発明によって産生された抗体混合物の投与による上記の癌の処置を、上記と同じ様式でCD55、CD59、およびCD46などの補体防御分子に対する抗体と併用することができる。
【０１０９】
1つの態様において、本発明によって産生された抗体混合物の投与による上記の癌の処置は、一価抗体の混合物と併用することができ、この一価抗体の混合物は、例えば限定されないがCD80、CD86、CD200、またはCD200R経路、FcyRI（CD64）、FcyRIIa（CD32a)、FcyRIIc（CD32c）およびFcyRIII（CD16）といった免疫系を調整および活性化し、および／またはKIR、FcyRIIb（CD32b）が含まれるがこれらに限定されないダウンモジュレート受容体を阻害し、それによって免疫刺激効果を生じる。
【０１１０】
1つの態様において、CD20およびRANKLを標的とすることによって、本発明に従って産生される抗体混合物を関節炎などの炎症疾患の処置に用いることができる。本発明によって産生された、標的CH3L1およびキチン結合タンパク質に対する抗体混合物を提供することによって、IBDのような別の炎症疾患を標的とすることができる。
【０１１１】
1つの態様において、本発明に従って産生される抗体混合物を、タウタンパク質、オリゴマー構造および原線維構造と組み合わせたアミロイドβ様の単量体構造のAPP識別構造を標的とすることによって、アルツハイマー病の処置において用いることができる。
【０１１２】
別の態様において、本発明に従う抗体混合物によって、感染疾患が処置される。感染疾患は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、または寄生虫起源の疾患であってもよく、本発明によって産生される抗体混合物を、疾患の処置に適した標的に対して作製してもよい。抗体を、同じ標的上の異なるエピトープに対して作製することができ（混合物の抗体は標的との結合に関して競合しない）または異なる標的に対して作製することができる。
【０１１３】
感染疾患は、炭疽菌（Bacillus antracis）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ジフテリア（Diptheria）、大腸菌、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumofila）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Mycobacterium africanum）、らい菌（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・リケッチア（Mycobacterium rikettsia）、マイコプラズマ・ナイセリア（Mycoplasma neisseria）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、百日咳菌（Pertussis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、連鎖球菌（Streptococcus）およびペスト菌（Yersinia pestis）のような、しかしこれらに限定されない細菌によって引き起こされ得る。
【０１１４】
本発明の1つの態様において、抗体が毒素上の特異的抗原を標的とする、本発明に従って産生される抗体混合物を提供することによって、クロストリジウム毒素により生じる破傷風および大腸炎を処置することができる。
【０１１５】
感染疾患はまた、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎、F型肝炎、G型肝炎、I型単純ヘルペス、II型単純ヘルペス、ヒト免疫不全ウイルス（HIVまたはHIV-1）、ヒトT-細胞リンパ球向性ウイルスIII、ヒト乳頭腫ウイルス（HPV）、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、髄膜炎（ウイルス性）、麻疹ウイルス、パポバウイルス、ポリオウイルス、RSウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、SARSウイルス、および天然痘ウイルスのような、しかしこれらに限定されないウイルスによって引き起こされ得る。
【０１１６】
感染疾患はまた、アスペルギルス（Aspergillus）、カンジダ（Candida）、球菌およびヒストプラスマのような、しかしこれらに限定されない真菌によって引き起こされ得る。
【０１１７】
感染疾患はまた、クラミジア（Chlamydia）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、リーシュマニア（leishmania）、マラリア原虫（熱帯熱マラリア（Plasmodia falciparum）、三日熱マラリア（P. vivax）、および四日熱マラリア（P. malariae））、リケッチア、およびトリパノソーマのような、しかしこれらに限定されない原虫および寄生虫によって引き起こされ得る。
【０１１８】
1つの態様において、AMA-1、MSP、およびGLURPの組み合わせを標的とすることにより、本発明に従って産生される抗体混合物によって、マラリアを標的とすることができる。
【０１１９】
別の態様において、感染疾患の上記の処置を、一価抗体の混合物と併用することができ、この一価抗体の混合物は、例えばCD200またはCD200R経路、FcyRI（CD64）、FcyRIIa（CD32a）、FcyRIIc（CD32c）、FcyRIII（CD16）、およびOX40（CD134）に限定されない免疫系を調整および活性化し、および／またはKIR、FcγRIIb（CD32b）が含まれるがこれらに限定されるわけではないダウンモジュレート受容体を阻害して、それによって免疫刺激効果を生じる。
【０１２０】
1つの態様において、HIVは、CD4、CCR5、CXCR4、およびLFA-1の2つ以上に対する一価抗体の組み合わせによって処置される。
【０１２１】
本発明のさらなる態様において、処置される疾患は、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、関節炎（例えば、急性敗血症性関節炎、乾癬性関節炎、ならびに活動性リウマチ性関節炎および若年性リウマチ性関節炎が含まれるリウマチ性関節炎）、喘息、クローン病、COPD、脳炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、類天疱瘡、敗血症ショック、シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、I型真性糖尿病、潰瘍性大腸炎、移植の拒絶のような、しかしこれらに限定されるわけではない炎症疾患である。
【０１２２】
本発明の抗体混合物はまた、抗炎症剤、DMARD（疾患修飾性抗リウマチ薬）、免疫抑制剤、化学療法剤、および抗乾癬剤などの1つまたは複数の追加の治療物質と併用してもよい。
【０１２３】
本発明の混合物中で発現された抗体はまた、一価抗体の「誘導体」を包含し、この誘導体においては、アミノ酸残基の1つまたは複数が例えばアシル化またはグリコシル化によって誘導体化されているが、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特徴には、有意に影響を及ぼさないかまたはそれを変化させない。本発明の文脈において、一価抗体の誘導体は、例としてその中で一価抗体のアミノ酸残基の1つまたは複数が化学的に改変されている（例としてアルキル化、アシル化、エステル形成、またはアミド形成によって）か、または1つもしくは複数の非アミノ酸の有機および／または無機の原子または分子置換基（例としてポリエチレングリコール（PEG）基、親油性置換基（任意でスペーサー残基またはβ-アラニン、γ-アミノ酪酸（GABA）、L/D-グルタミン酸、コハク酸等などの基によってペプチドのアミノ酸配列に連結してもよい）、蛍光体、ビオチン、放射性核種等）に会合している一価抗体であってもよく、かつ本文にそれ以外であると明記されている場合または矛盾する場合を除き、同様にまたは代替として、非必須アミノ酸残基、天然に存在しないアミノ酸残基、および／または非L-アミノ酸残基を含んでもよい。そのようなアミノ酸残基の非制限的な例には、例えば2-アミノアジピン酸、3-アミノアジピン酸、β-アラニン、β-アミノプロピオン酸、2-アミノ酪酸、4-アミノ酪酸、6-アミノカプロン酸、2-アミノヘプタン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノイソ酪酸、2-アミノピメリン酸、2,4-ジアミノ酪酸、デスモシン、2,2'-ジアミノピメリン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、N-エチルグリシン、N-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、N-メチルグリシン、N-メチルイソロイシン、6-N-メチルリジン、N-メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、およびスタチンハロゲン化アミノ酸が含まれる。
【０１２４】
本発明において発現される抗体はまた、他のペプチド、タンパク質、または治療活性化合物に融合されていてもよい。
【０１２５】
分子がインタクトCH2ドメインまたはインタクトIg Fc領域を含まないように、例えばIg定常ドメインまたはIg様定常ドメインのサルベージ受容体エピトープを改変することによって、抗体のインビボ半減期が改善される可能性がある。US 6121022およびUS 6194551を参照されたい。Fc領域に変異を作製することにより、例えばインタクト抗体分子の252番目の位置のロイシンをトレオニンに、インタクト抗体分子の254番目の位置のセリンをトレオニンに、またはインタクト抗体分子の256番目の位置のフェニルアラニンをトレオニンに置換することにより、インビボ半減期がさらに増加する可能性がある。US 6277375を参照されたい。
【０１２６】
1つの態様において、抗原はヒトタンパク質分子であり、対象はヒト被験者である。1つの態様において、対象は、それに対して本発明の抗体が結合する抗原を発現する非ヒト哺乳動物であってもよい。その上、本発明の一価抗体混合物を、獣医学目的のためにまたはヒト疾患の動物モデルとして、免疫グロブリンが交叉反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物（例として、霊長類、ブタ、またはマウス）に投与してもよい。後者の場合、そのような動物モデルは、本発明の抗体の治療効能を評価するために有用である可能性がある（例として、用量および投与後の推移を試験するために）。
【０１２７】
本発明の抗体混合物は、単独でまたは治療における他の組成物と併用して用いられてもよい。例として、処置される疾患または状態に応じて、本発明の抗体混合物を、本発明に従って産生される抗体など1種もしくは複数種の他の抗体、1種もしくは複数種の化学療法剤（化学療法剤のカクテルが含まれる）、1種もしくは複数種の他の細胞障害剤、1種もしくは複数種の抗血管新生剤、1種もしくは複数種のサイトカイン、1種もしくは複数種の増殖阻害物質、1種もしくは複数種の抗炎症剤、1種もしくは複数種の疾患修飾性抗リウマチ薬（DMARD）、または1種もしくは複数種の免疫抑制剤と同時投与してもよい。本発明の抗体混合物が腫瘍の増殖を阻害する場合、同様に腫瘍の増殖を阻害する1つまたは複数の他の治療物質と本発明の抗体混合物を併用することが特に望ましい可能性がある。代替としてまたは追加で、患者に、併用放射線療法（例として体外照射療法または抗体などの放射活性標識物質による治療）を行ってもよい。先に注目したそのような併用治療には、併用投与（2種以上の物質が同じまたは異なる製剤に含まれる）と、本発明の抗体の投与が、1つまたは複数の補助治療を行う前および／または後に行われてもよい個別の投与とが含まれる。
【０１２８】
本発明の抗体混合物は、良質の医療のための原則（good medical practice）に一致するように製剤化、調薬、および投与されるであろう。この文脈において考慮すべき要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、物質の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医療の実践に公知の他の要因が含まれる。1つの態様において、一価抗体の混合物を、当該障害を予防または処置するために現在用いられている1つまたは複数の物質と共に製剤化してもよい。そのような他の物質の有効量は、製剤に存在する本発明の抗体の量、障害または処置のタイプ、および先に考察した他の要因に依存する。
【０１２９】
本発明の抗体（および補助治療物質）の混合物は、静脈内または皮下投与などの非経口投与が含まれる任意の適した手段によって投与されてもよい。そのほかに、特に抗体混合物の用量を減らしていくパルス注入によって、抗体の混合物を適宜投与してもよい。
【０１３０】
疾患の予防または処置に関して、本発明の抗体混合物の適切な用量（単独でまたは化学療法剤などの他の物質と併用する場合）は、処置される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体混合物が予防的、治療的、または診断目的で投与されるか否か、過去の治療、患者の臨床既往および抗体に対する応答、ならびに主治医の判断に依存するであろう。抗体混合物はふさわしくは、1回または一連の処置にわたって患者に投与されてもよい。
【０１３１】
同様に、本発明の1つまたは複数の抗体を含む本発明の薬学的組成物と使用説明書とを含むキットも、本発明の範囲に含まれる。キットはさらに、処置される疾患もしくは障害、または本発明の1種もしくは複数種の追加の抗体（例として、補足的活性を有する抗体混合物）に応じて、免疫抑制試薬、細胞障害剤、または放射性毒物など、1つまたは複数の追加の物質を含んでもよい。
【０１３２】
1つの態様において、本発明は、本発明の抗体の混合物を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体もしくは希釈剤のみならず、Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示される技術などの慣用の技術に従う他の任意の公知のアジュバントおよび賦形剤と共に処方されてもよい。
【０１３３】
選択される投与経路によらず、薬学的に許容される塩の形または適した水和型で用いられてもよい本発明の抗体、および／または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の慣用の方法により薬学的に許容される投与剤形に製剤化される。
【０１３４】
先に記載したように、さらなる局面において、本発明は、重鎖と、SEQ ID NO:8に記載される配列を含む軽鎖とを含む、組み換え型抗体に関する。
【０１３５】
1つの態様において、軽鎖は、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む軽鎖などの、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む。
【０１３６】
1つの態様において、抗体は二重特異性抗体である。さらなる態様において、抗体は一価抗体である。なおさらなる態様において、抗体は、ポリクローナル二価抗体またはポリクローナル一価抗体などのポリクローナル抗体である。
【０１３７】
1つの態様において、抗体は、例えば癌の処置のための薬剤として用いるためである。
【実施例】
【０１３８】
実施例1：1つの細胞における共通の軽鎖を有する2つの一価ヒト抗体の発現
2つの抗体、すなわち抗CD20抗体7D8（WO2004035607）および抗CD38抗体005（WO2006099875）の重鎖（HC）の発現ベクターを、アイソタイプをIgG4に変化させて、ヒンジ領域をコードする配列を欠失するように改変した（ESKYGPPCPSCPをコードする配列を欠失させた）（WO2007/059782もまた参照されたい）。得られた構築物を、HEK-293F細胞（Invitrogen、製造元の推奨に従う）における一過性の同時発現によって005の軽鎖（LC）と共に同時発現させた。発現レベルを比濁法によって測定したところ、この系における発現に関して正常範囲であった。上清中の2種の異なる一価抗体に関して可能性がある組み合わせをELISAによって試験して、WO2006099875において記載されるようにELISAによる可溶型CD38上での結合および7D8に対する抗イディオタイプ抗体との結合（WO2004035607の実施例16に記載される）を検出した。図1および2において、一価の7D8および一価の抗CD38の双方に関して、細胞培養上清中に結合が検出できることが示される。このように、2つの機能的な一価抗体を、共通の軽鎖を用いることによって1つの細胞に発現させることができる。
【０１３９】
実施例2：1つの細胞株における共通の軽鎖を有する多数の一価抗体の産生および評価
最初に、抗体パネルのVH領域をコードする配列（それぞれ、EGFr（クローンLC1006-018、WO2009030239に記載される）、c-MetおよびHer2に対して特異的）を、ヒンジ改変された一価の（WO2008145140に記載されるように、ヒンジ領域E99-P110を欠失して、CH3領域（SEQ ID NO:2）に置換F273TおよびY275Eを含有する）ヒトIgG4抗体の定常領域を含有する哺乳動物発現ベクター（pcDNA3.3, Invitrogen）においてクローニングした。共通の軽鎖を同定するために、HCベクターの各々を、1つのヒトLCκ生殖系列配列をコードする発現ベクターのライブラリと共に、HEK-293F細胞に一過性に同時トランスフェクトした。ライブラリは、一般に入手可能なデータベースVBASE（Tomlinson, I. M., Williams, S. C, Corbett, SJ., Cox, J. B. L., Winter, G., 1996. VBASE Sequence Directory. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)）から得られた200個の生殖系列κ配列の組（5個の機能的J-κヒト生殖系列配列の各々と組み合わせた各40個の公知の機能的V-κセグメント）を含んだ。共通の軽鎖を同定するために、一過性にトランスフェクトした全ての細胞培養の上清を、トランスフェクションの5日後に収集して、20倍希釈し、以下に記載するようにプレートにコーティングした組み換え型精製可溶型抗原標的を用いてELISAでの結合を行うことによって、機能的抗体の存在に関してスクリーニングした。上清中のIgGの濃度を、チップ表面上にコーティングした抗ヒトIgG Fcバイオセンサーを用いてOctet Dip and Read（商標）アッセイ（ForteBio）によって決定した。
【０１４０】
図3において、ELISAでの結合によるスクリーニング結果を示す。各々が異なる抗原特異性を有する異なるヒンジ改変（F273T、Y275E）重鎖3つ全てとの組み合わせにおいて、LCκ生殖系列配列200個中3個（共通の軽鎖1、2、および3）が、機能的抗体を形成すると同定された。同定された共通の軽鎖は、JK-セグメントJK1 (IGKJ1*01)
2016165285.tif 000002
（共通の軽鎖1）、JK2 (IGKJ2*01)
2016165285.tif 000003
（共通の軽鎖2）、またはJK3 (IGKJ3*01)
2016165285.tif 000004
（共通の軽鎖3）と組み合わせたV-セグメントVKVI- 2-l-(l)-A14（IGKV6D-41*01）
2016165285.tif 000005
で構成された。
【０１４１】
このように、同定された共通の軽鎖配列は以下のとおりであった：
共通の軽鎖1の配列：
2016165285.tif 000006
共通の軽鎖2の配列：
2016165285.tif 000007
共通の軽鎖3の配列：
2016165285.tif 000008
【０１４２】
同定された共通の軽鎖の各々と共に3つの重鎖を1つの細胞に同時発現させることによって、これらの結果を確認した。以下に記載されるように3つの個々のELISAにおいて上清が3つ全ての組み換え型抗原に結合するか否かを試験することによって、1つの細胞において異なる3つの機能的抗体が発現されたか否かを決定した。図4に、3つの個々のELISAの結果を示す。コーティングとして用いた組み換え型抗原の各々に対する結合が、1つの細胞において発現された異なる3つの機能的な一価抗体の混合物を含有する上清について観察される。抗体が一価であることを確認するために、クロスリンクELISAを行った。このアッセイにおいて、2つのバージョンの標的抗原を用いた。組み換え型可溶型抗原をELISAのためのコーティングとして用いた。次に、ビオチニル化した抗原を加えてその後ストレプトアビジン-HRPによって検出することによって、標的（EGFr、c-Met、またはHer2）に対する二価抗体を検出する。図5は、このELISAにおいて、混合物由来の抗体に関してシグナルが観察されなかったことを示しており、少なくとも抗EGFrおよび抗c-Met材料が一価であることを確認している（抗Her-2材料が一価であるか否かは試験しなかった）。
【０１４３】
ELISAにおける組み換え型EGFr、c-Met、およびHer2に対する結合
組み換え型可溶型c-Met-Fcキメラ（R&D systems）、EGFrECDHis（His-タグ付加した細胞外EGFrドメイン）、およびHer2ECDHis（His-タグ付加した細胞外Her2ドメイン）を産生して、4℃で終夜インキュベートすることにより96-ウェル平底Microlon ELISAプレート（Greiner, Frickenhausen, Germany; product# 655092）にコーティングした。ウェルを空にしてPBSC（2％トリ血清を添加したPBS）によって室温で60分間ブロックした。EL404 Microplate Autowasher（Bio-Tek Instruments）を用いてプレートをPBSTで3回洗浄した。PBSTC（2％トリ血清および0.05％Tween-20を添加したPBS）中で上清を1：20倍希釈した。ウェルを300 rpmで振とうさせながら室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTCによって3回洗浄して、ウェルをHRPコンジュゲートマウス抗ヒトIgG Fc特異的（CLB, The Netherlands；PBSTC中で1：10,000倍希釈、100μl/ウェル）と共に室温で1時間インキュベートした。プレートをPBSTによって3回洗浄した。ウェルを新しく調製したABTS溶液（ABTS：2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸：ABTS緩衝液[Roche Diagnostics]中で錠剤を1 mg/mLにする）と共に室温の暗所で30分間インキュベートした。KC4（商標）ソフトウェアを備えたEL808 Ultra Microplate Reader（Bio-Tek Instruments）を用いて405 nmでの吸光度を測定した。
【０１４４】
配列表
SEQ ID NO:1：ヒトIgG4の重鎖（CH）の野生型定常ドメインのアミノ酸配列。
2016165285.tif 000009
SEQ ID NO:2：ヒンジ領域が欠失しているヒトIgG4の重鎖（CH）の変異体定常ドメインのアミノ酸配列
2016165285.tif 000010
SEQ ID NO:3：ヒトλ軽鎖（CL）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号S25751）
2016165285.tif 000011
SEQ ID NO:4：ヒトκ軽鎖（CL）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01834）
2016165285.tif 000012
SEQ ID NO:5：ヒトIgG1の重鎖（CH）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01857）
2016165285.tif 000013
SEQ ID NO:6：ヒトIgG2の重鎖（CH）の定常ドメインのアミノ酸配列（アクセッション番号P01859）
2016165285.tif 000014
SEQ ID NO:7：ヒトIgG3の重鎖（CH）の定常ドメインのアミノ酸配列
2016165285.tif 000015
SEQ ID NO:8：V-セグメントVKVI-2-l-(l)-A14 (IGKV6D- 41*01)のアミノ酸配列
2016165285.tif 000016
SEQ ID NO:9：JKセグメントJK1 (IGKJ1*01)のアミノ酸配列
2016165285.tif 000017
SEQ ID NO: 10：JKセグメントJK2 (IGKJ2*01)のアミノ酸配列
2016165285.tif 000018
SEQ ID NO:11：JKセグメントJK3 (IGKJ3*01)のアミノ酸配列
2016165285.tif 000019
SEQ ID NO:12：共通の軽鎖1のアミノ酸配列
2016165285.tif 000020
SEQ ID NO:13：共通の軽鎖2のアミノ酸配列
2016165285.tif 000021
SEQ ID NO:14：共通の軽鎖3のアミノ酸配列
2016165285.tif 000022
【図１】
2016165285.tif 000023
【図２】
2016165285.tif 000024
【図３】
2016165285.tif 000025
【図４】
2016165285.tif 000026
【図５】
2016165285.tif 000027
【配列表】
2016165285000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成28年4月14日(2016.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法であって、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含む方法であって、重鎖の各々が該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成することができる、方法。
【請求項２】
前記宿主細胞において、
2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物
を発現させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記宿主細胞において、
−  第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、ならびに
−  IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法であって、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一のIgG4重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一のIgG4重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一のIgG4重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、但し第二の重鎖が野生型IgG4重鎖ではない、核酸構築物
を発現させる段階を含む方法であって、重鎖の各々が該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成することができる、方法。
【請求項５】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
238番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；239番目のAsp（D）がGlu（E）に置換されている；249番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；251番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；251番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；288番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；288番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；290番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；292番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；292番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；302番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および328番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
【請求項６】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
ａ）前記軽鎖の定常領域が、それがIVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一の定常領域とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸も含有しないように改変されているか、または
ｂ）前記重鎖の定常領域が、前記軽鎖とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができる残基を含有するように改変されている、
請求項5〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
ａ）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:4に記載されるアミノ酸配列を有するκCL領域をコードする配列を含むが、106番目の末端のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されるかまたは欠失するように該配列が改変されているか、または
ｂ）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:3に記載されるアミノ酸配列を有するλCL領域をコードする配列を含むが、104番目のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されるかまたは欠失するように該配列が改変されている、
請求項7記載の方法。
【請求項９】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH1領域をコードする配列を含むが、14番目のSer（S）がシステイン残基に置換されるようにCH1領域が改変されている、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:6に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法：
234番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；245番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；247番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；247番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；276番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；284番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；284番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；286番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；288番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；288番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；298番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および324番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
【請求項１１】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:6に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:7に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法：
285番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；296番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；298番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；298番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；314番目のSer（S）がAsn（N）に置換されている；322番目のAsn（N）がLys（K）に置換されている；327番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；335番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；335番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；337番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；339番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；339番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；349番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；352番目のIle（I）がVal（V）に置換されている；365番目のArg（R）がHis（H）に置換されている；366番目のPhe（F）がTyr（Y）に置換されている；および375番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
【請求項１３】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:7に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法：
234番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；236番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；236番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；273番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；273番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；275番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている。
【請求項１５】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされている、請求項15記載の方法：
ａ）225番目のGlu（E）がAla（A）に置換されている、および／または
ｂ）234番目のThr（T）がAla（A）に置換されている、および／または
ｃ）236番目のLeu（L）がAla（A）、Val（V）、Glu（E）、またはGly（G）に置換されている、および／または
ｄ）238番目のLys（K）がAla（A）に置換されている、および／または
ｅ）267番目のAsp（D）がAla（A）に置換されている、および／または
ｆ）273番目のPhe（F）がAla（A）、またはLeu（L）に置換されている、および／または
ｇ）273番目のPhe（F）がAsp（D）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている、および／または
ｈ）273番目のPhe（F）がThr（T）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている、および／または
ｉ）275番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている。
【請求項１７】
ａ）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、118番目のThr（T）がGln（Q）に置換され、および／または296番目のMet（M）がLeu（L）に置換されている、または
ｂ）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、以下の置換の1つ、2つ、または3つ全てがなされている：120番目のMet（M）がTyr（Y）に置換されている；122番目のSer（S）がThr（T）に置換されている；および124番目のThr（T）がGlu（E）に置換されている、または
ｃ）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAla（A）に置換されている、または
ｄ）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAlaに置換されており、かつ175番目のThr（T）がAla（A）に置換されており、かつ248番目のGlu（E）がAla（A）に置換されている、
請求項15〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、ヒンジ領域における全てのシステイン残基が欠失するかまたは他のアミノ酸残基に置換されるように改変されているCH領域をコードする配列を含む、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
ヒンジ領域のシステイン残基が非荷電極性側鎖または無極性側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されるように、CH領域が改変されている、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、
ａ）IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1のCH配列の106番目および109番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が欠失している、および／または
ｂ）IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の一方がシステインとは異なるアミノ酸残基に置換されており、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の他方が欠失している、および／または
ｃ）IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1のCH配列の106番目〜109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している、および／または
ｄ）IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1の配列の99番目〜110番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している、および／または
ｅ）先の請求項のいずれか一項に特定されたいずれかの変異を除き、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むCH領域をコードする配列を含む、および／または
ｆ）IgG4 CH領域をコードする配列を含み、ヒンジ領域全体が欠失するように該CH領域が改変されている、
先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、N-結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されているCH領域をコードする配列を含む、たとえば、CH2領域におけるN-結合型グリコシル化のためのNSTアクセプター部位が、GST、MST、CSE、DSE、DSP、ESP、GSP、HSE、NSE、PSPおよびSSEからなる群より選択される配列に改変されている、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
第二の重鎖がIgG1、IgG2、IgG3、または安定化されたIgG4重鎖、またはIgA、好ましくはIgG1重鎖である、請求項1または請求項3〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
ａ）前記混合物における抗体の少なくとも1つ、少なくとも2つ、例えば全てがヒト抗体である、および／または
ｂ）3種以上の異なる抗体の混合物、4種以上の異なる抗体の混合物など、例えば5種以上の異なる抗体の混合物が産生される、および／または
ｃ）20種未満の異なる抗体の混合物が産生される、
先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、軽鎖をコードする複数の核酸構築物を含み、好ましくは前記重鎖の各々が該軽鎖の各々と対を形成して機能的抗体を形成することができる、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物の全ての抗体が同じ標的に向けられる、たとえば前記混合物の抗体が前記標的との結合に関して競合しない、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記混合物における2種以上の抗体が異なる標的に向けられる、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
ａ）少なくとも20回細胞分裂させるために前記宿主細胞を培養する段階、および／または
ｂ）前記細胞培養物から前記混合物を回収するさらなる段階、および／または
ｃ）前記抗体混合物を精製するさらなる段階
を含む、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、CHO細胞などの哺乳動物細胞である、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
共通の軽鎖がSEQ ID NO:8に記載される配列を含む、たとえば、共通の軽鎖が、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む共通の軽鎖など、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸が前記宿主細胞のゲノムに安定に組み入れられる、先の請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
先の請求項のいずれか一項記載の方法によって得ることが可能な抗体の混合物を含む、組成物。
【請求項３２】
薬剤として用いるための、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
以下を含む、2種以上の異なる抗体を含む混合物の産生において用いるために適した組み換え型宿主細胞：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物。
【請求項３４】
CHO細胞などの哺乳動物細胞である、請求項33記載の宿主細胞。
【請求項３５】
重鎖と、SEQ ID NO:8に記載される配列を含む軽鎖とを含む、たとえば、前記軽鎖が、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む軽鎖など、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む、組み換え型抗体。
【請求項３６】
二重特異性抗体、一価抗体、またはポリクローナル二価抗体もしくはポリクローナル一価抗体などのポリクローナル抗体である、請求項35記載の抗体。
【請求項３７】
癌の処置のための薬剤など、薬剤として用いるための、請求項35記載の抗体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
このように、さらなる局面において、本発明は、重鎖と、SEQ ID NO:8に記載される配列を含む軽鎖とを含む組み換え型抗体に関する。
[本発明1001]
1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法であって、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含む方法であって、重鎖の各々が該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成することができる、方法。
[本発明1002]
前記宿主細胞において、
2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物
を発現させる段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記宿主細胞において、
−  第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、ならびに
−  IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物
を発現させる段階を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
1つの組み換え型宿主細胞において2種以上の異なる抗体を含む混合物を産生するための方法であって、該宿主細胞において以下の核酸構築物：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一のIgG4重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一のIgG4重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一のIgG4重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、但し第二の重鎖が野生型IgG4重鎖ではない、核酸構築物
を発現させる段階を含む方法であって、重鎖の各々が該軽鎖と対を形成して機能的抗体を形成することができる、方法。
[本発明1005]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、前記本発明のいずれかの方法：
238番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；239番目のAsp（D）がGlu（E）に置換されている；249番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；251番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；251番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；288番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；288番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；290番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；292番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；292番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；302番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および328番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
[本発明1006]
292番目のLys（K）がArg（R）に置換されている、本発明1005の方法。
[本発明1007]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、本発明1005〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記軽鎖の定常領域が、それがIVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一の定常領域とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸も含有しないように改変されている、本発明1005〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:4に記載されるアミノ酸配列を有するκCL領域をコードする配列を含むが、106番目の末端のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されるかまたは欠失するように該配列が改変されている、本発明1008の方法。
[本発明1010]
共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:3に記載されるアミノ酸配列を有するλCL領域をコードする配列を含むが、104番目のシステイン残基が別のアミノ酸残基に置換されるかまたは欠失するように該配列が改変されている、本発明1008の方法。
[本発明1011]
前記重鎖の定常領域が、前記軽鎖とジスルフィド結合または他の共有結合を形成することができる残基を含有するように改変されている、本発明1005〜1007のいずれかの方法。
[本発明1012]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:5に記載されるCH1領域をコードする配列を含むが、14番目のSer（S）がシステイン残基に置換されるようにCH1領域が改変されている、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:6に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、本発明1001〜1006のいずれかの方法：
234番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；245番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；247番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；247番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；276番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；284番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；284番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；286番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；288番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；288番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；298番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；および324番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
[本発明1014]
288番目のLys（K）がArg（R）に置換されている、本発明1013の方法。
[本発明1015]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:6に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、本発明1013〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:7に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、本発明1001〜1006のいずれかの方法：
285番目のArg（R）がGln（Q）に置換されている；296番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；298番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；298番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；314番目のSer（S）がAsn（N）に置換されている；322番目のAsn（N）がLys（K）に置換されている；327番目のMet（M）がVal（V）に置換されている；335番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；335番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；337番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている；339番目のLys（K）がArg（R）に置換されている；339番目のLys（K）がAla（A）に置換されている；349番目のGln（Q）がGlu（E）に置換されている；352番目のIle（I）がVal（V）に置換されている；365番目のArg（R）がHis（H）に置換されている；366番目のPhe（F）がTyr（Y）に置換されている；および375番目のPro（P）がLeu（L）に置換されている。
[本発明1017]
339番目のLys（K）がArg（R）に置換されている、本発明1016の方法。
[本発明1018]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:7に記載されるCH1および／またはCH2領域をコードする配列をさらに含む、本発明1016〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含むが、CH3領域が、以下のアミノ酸置換の1つまたは複数がなされるように改変されている、本発明1001〜1006のいずれかの方法：
234番目のThr（T）がAla（A）に置換されている；236番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている；236番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている；273番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている；273番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている；275番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている。
[本発明1020]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH3領域をコードする配列を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1021]
225番目のGlu（E）がAla（A）に置換されている、本発明1020の方法。
[本発明1022]
234番目のThr（T）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
236番目のLeu（L）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
236番目のLeu（L）がVal（V）に置換されている、本発明1020〜1022のいずれかの方法。
[本発明1025]
236番目のLeu（L）がGlu（E）に置換されている、本発明1020〜1022のいずれかの方法。
[本発明1026]
236番目のLeu（L）がGly（G）に置換されている、本発明1020〜1022のいずれかの方法。
[本発明1027]
238番目のLys（K）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
267番目のAsp（D）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
273番目のPhe（F）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
273番目のPhe（F）がLeu（L）に置換されている、本発明1020〜1028のいずれかの方法。
[本発明1031]
273番目のPhe（F）がAsp（D）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている、本発明1020〜1028のいずれかの方法。
[本発明1032]
273番目のPhe（F）がThr（T）に置換され、および／または275番目のTyr（Y）がGlu（E）に置換されている、本発明1020〜1028のいずれかの方法。
[本発明1033]
275番目のTyr（Y）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1030のいずれかの方法。
[本発明1034]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、118番目のThr（T）がGln（Q）に置換され、および／または296番目のMet（M）がLeu（L）に置換されている、本発明1020〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、以下の置換の1つ、2つ、または3つ全てがなされている、本発明1020〜1033のいずれかの方法：
120番目のMet（M）がTyr（Y）に置換されている；122番目のSer（S）がThr（T）に置換されている；および124番目のThr（T）がGlu（E）に置換されている。
[本発明1036]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1033のいずれかの方法。
[本発明1037]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、SEQ ID NO:2に記載されるCH2領域をコードする配列をさらに含むが、302番目のAsn（N）がAlaに置換されており、かつ175番目のThr（T）がAla（A）に置換されており、かつ248番目のGlu（E）がAla（A）に置換されている、本発明1020〜1033のいずれかの方法。
[本発明1038]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、ヒンジ領域における全てのシステイン残基が欠失するかまたは他のアミノ酸残基に置換されるように改変されているCH領域をコードする配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1039]
ヒンジ領域のシステイン残基が非荷電極性側鎖または無極性側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されるように、CH領域が改変されている、本発明1038の方法。
[本発明1040]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1のCH配列の106番目および109番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が欠失している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1041]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の一方がシステインとは異なるアミノ酸残基に置換されており、SEQ ID NO:1の配列の106番目および109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基の他方が欠失している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1042]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1のCH配列の106番目〜109番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1043]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、少なくともSEQ ID NO:1の配列の99番目〜110番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基が欠失している、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1044]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、前記本発明のいずれか一項に特定された任意の変異を除き、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むCH領域をコードする配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1045]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、IgG4 CH領域をコードする配列を含み、ヒンジ領域全体が欠失するように該CH領域が改変されている、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1046]
第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物が、N-結合型グリコシル化のためのいかなるアクセプター部位も含まないように改変されているCH領域をコードする配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1047]
CH2領域におけるN-結合型グリコシル化のためのNSTアクセプター部位が、GST、MST、CSE、DSE、DSP、ESP、GSP、HSE、NSE、PSPおよびSSEからなる群より選択される配列に改変されている、本発明1046の方法。
[本発明1048]
第二の重鎖がIgG1、IgG2、IgG3、または安定化されたIgG4重鎖、またはIgA、好ましくはIgG1重鎖である、本発明1001または本発明1003〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記混合物における抗体の少なくとも1つ、少なくとも2つ、例えば全てがヒト抗体である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1050]
3種以上の異なる抗体の混合物、4種以上の異なる抗体の混合物など、例えば5種以上の異なる抗体の混合物が産生される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1051]
20種未満の異なる抗体の混合物が産生される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記宿主細胞が、軽鎖をコードする複数の核酸構築物を含み、好ましくは前記重鎖の各々が該軽鎖の各々と対を形成して機能的抗体を形成することができる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記混合物の全ての抗体が同じ標的に向けられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記混合物の抗体が前記標的との結合に関して競合しない、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記混合物における2種以上の抗体が異なる標的に向けられる、本発明1001〜1052のいずれかの方法。
[本発明1056]
少なくとも20回細胞分裂させるために前記宿主細胞を培養する段階を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記細胞培養物から前記混合物を回収するさらなる段階を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記抗体混合物を精製するさらなる段階を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記宿主細胞が、CHO細胞などの哺乳動物細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1060]
共通の軽鎖がSEQ ID NO:8に記載される配列を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1061]
共通の軽鎖が、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む共通の軽鎖など、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む、本発明1060の抗体。
[本発明1062]
前記核酸が前記宿主細胞のゲノムに安定に組み入れられる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記本発明のいずれかの方法によって得ることが可能な抗体の混合物を含む、組成物。
[本発明1064]
薬剤として用いるための、本発明1063の組成物。
[本発明1065]
以下を含む、2種以上の異なる抗体を含む混合物の産生において用いるために適した組み換え型宿主細胞：
a）共通の軽鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物、ならびに
b）以下を含む、重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物：
b1）2つ以上の異なる第一の重鎖をコードする2つ以上の核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、第一の重鎖の定常領域の各々のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、または
b2）第一の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物であって、ヒンジ領域、および免疫グロブリンサブタイプにより必要であればCH3領域などのCH領域の他の領域が、IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができるいかなるアミノ酸残基も含有しないように、定常領域のアミノ酸配列が改変されている、核酸構築物、および
IVIGの存在下または哺乳動物もしくはヒトに投与された場合に、同一のCH領域とジスルフィド結合または重鎖間共有結合もしくは安定な重鎖間非共有結合を形成することができる第二の重鎖をコードする少なくとも1つの核酸構築物。
[本発明1066]
CHO細胞などの哺乳動物細胞である、本発明1065の宿主細胞。
[本発明1067]
重鎖と、SEQ ID NO:8に記載される配列を含む軽鎖とを含む、組み換え型抗体。
[本発明1068]
前記軽鎖が、SEQ ID NO:12、13、および14からなる群より選択される配列を含む軽鎖など、SEQ ID NO:9、10、および11からなる群より選択される配列をさらに含む、本発明1067の抗体。
[本発明1069]
二重特異性抗体である、本発明1067または1068の抗体。
[本発明1070]
一価抗体である、本発明1067または1068の抗体。
[本発明1071]
ポリクローナル二価抗体またはポリクローナル一価抗体などのポリクローナル抗体である、本発明1067または1068の抗体。
[本発明1072]
癌の処置のための薬剤など、薬剤として用いるための、本発明1067〜1068のいずれかの抗体。