(57)【要約】【課題】ＬＳＤ１の過剰発現を伴う悪性腫瘍に対して有効な医薬を提供すること、および従来よりも高精度に乳癌の予後を予測できるキットを提供すること。【解決手段】ＰＡＲＰ阻害剤を含む医薬は、ＬＳＤ１の過剰発現を伴う悪性腫瘍に対して有効であり、これらの悪性腫瘍を予防または治療するために用いることができる。抗ＬＳＤ１抗体、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーまたはＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブを含む、乳癌の予後予測用キットによれば、乳癌の予後を従来よりも高精度に予測することができる。【選択図】図５
2016056152.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＡＲＰ阻害剤を含む、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍を予防または治療するための医薬。
【請求項２】
前記悪性腫瘍は卵巣癌、非小細胞性肺癌、食道癌、大腸癌、悪性黒色腫、肝癌、リンパ腫、胃癌、膵臓がん、胆管癌、胆嚢癌、脳腫瘍および骨肉種のいずれかである、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記悪性腫瘍は非小細胞性肺癌、食道癌、大腸癌、悪性黒色腫、肝癌、リンパ腫、胃癌、膵臓がん、胆管癌、胆嚢癌、脳腫瘍および骨肉種のいずれかである、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
抗ＬＳＤ１抗体と、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーと、ＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブと、の少なくともいずれかを含む、予後予測用の乳癌組織検査キット。
【請求項５】
前記悪性腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
前記悪性腫瘍はＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌である、請求項４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＳＤ１（Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  １）の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍を予防または治療するための医薬および予後予測用の乳癌組織検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＬＳＤ１は、ヒストンＨ３の４番目と９番目のリジン残基がモノメチル化またはジメチル化されている時に、これらの残基の脱メチル化を行う酵素である。ＬＳＤ１は、この性質により、エピジェネティックな遺伝子発現制御を介し、細胞分化の促進および細胞周期の制御等に関与することが知られている。ＬＳＤ１の過剰発現は様々な悪性腫瘍で見られ、なかでも、食道扁平上皮癌（非特許文献１）、非小細胞性肺癌（非特許文献２）、原発性肝細胞癌（非特許文献３）および大腸癌（非特許文献４）等では、ＬＳＤ１の過剰発現が見られると患者の予後が不良になりやすいことが知られている。
【０００３】
また、悪性腫瘍では、遺伝子（ＤＮＡ）の増幅が見られることがある。遺伝子の増幅による、その転写・翻訳産物の過剰な発現も、細胞の分化または分裂に異常が生じる原因となりうる。そのため、ＬＳＤ１をコードする遺伝子が増幅していると、ＬＳＤ１が過剰発現していることが予測される。
【０００４】
乳癌でも、ＬＳＤ１の過剰発現がみられることがあると報告されているが、乳癌におけるＬＳＤ１の過剰発現と患者の予後との関連は明らかになっていない。乳癌は、遺伝子発現解析の結果によって、Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ、ＨＥＲ２（またはＨＥＲ２−ｅｎｒｉｃｈｅｄ）およびＢａｓａｌ  ｌｉｋｅの４病型に分類される。これらのうち、Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ  ＢおよびＨＥＲ２の３病型は、患者の予後が良好であることが多いか、または近年の治療法の発展により予後が改善されている。しかし、これらの病型の中にも患者が予後不良となるケースは見られる。また、Ｂａｓａｌ  ｌｉｋｅに分類されることはそれ自体が予後因子として用いられているが、Ｂａｓａｌ  ｌｉｋｅに分類される乳癌の中にも、患者が予後不良になるケースとそうではないケースとが見られる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】YanYan Yu, et al., "High expression of lysine-specific demethylase 1 correlates with poor prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma," Biochemical and Biophysical Research Communication, 2013, Vol.437, pp.192-198.
【非特許文献２】Tangfeng Lv., et al., "Over-Expression of LSD1 Promotes Proliferation, Migration and Invasion in Non-Small Cell Lung Cancer," PLoS ONE, Vol.7, Issue 4, 2012, Article No. e35065.
【非特許文献３】Ze-Kun Zhao, et al., "Overexpression of lysine specific demethylase 1 predicts worse prognosis in primary hepatocellular carcinoma patients," World Journal of Gastroenteroloigy, 2012, Vol.18, pp.6651-6656.
【非特許文献４】Ding Jie, et al., "Positive Expression of LSD1 and Negative Expression of E-carherin Correlate with Metastasis and Poor Prognosis of Colon Cancer," Digestive Diseases and Sciences, 2013, Vol.58, pp.1581-1589.
【非特許文献５】Helen E. Bryant, et al., "Specific killing of BRCA2-deficient tomours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase," Nature, 2005, Vol.434, pp.913-917.
【非特許文献６】Hannah Farmer, et al., "Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy," Nature, 2012, Vol.434, pp.917-921.
【非特許文献７】Cancer Genome Atlas N., "Comprehensive molecular portraits of human breast tomours," Nature, 2012, Vol.490, pp.61-70.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍に有効な抗癌剤が開発されれば、様々な悪性腫瘍において、患者の予後の改善が見込まれる。基礎実験レベルでは、食道癌に対してＬＳＤ１阻害剤が有効であることを示唆するデータが報告されているが、ＬＳＤ１阻害剤が他の悪性腫瘍にも有効であるかどうかは不明であり、ＬＳＤ１の過剰発現を伴う悪性腫瘍の全般に対して有効な抗癌剤は、いまだ開発されていない。また、悪性腫瘍は薬剤に対して耐性を獲得することがあると知られており、新しい抗癌剤への需要は常に存在する。
【０００７】
複数種の悪性腫瘍において、ＬＳＤ１の過剰発現が見られると患者の予後が不良になる可能性が高いことが知られているが、これらの悪性腫瘍でＬＳＤ１が予後不良を引き起こす機序には不明な点も多く、また、これら以外の悪性腫瘍の発生、増殖または浸潤とＬＳＤ１の過剰発現との関連は明らかになっていない。乳癌においても、ＬＳＤ１の過剰発現と患者の予後との関係はまだ調べられていない。乳癌においては、ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅに分類されるか等の予後因子によって予後予測がなされているが、より高精度に予後を予測することができれば、より治療計画が立てやすくなり、治療成績の向上が期待される。
【０００８】
本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍に対して有効な医薬を提供すること、および従来よりも高精度に乳癌の予後を予測できるキットを提供することを、その目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題に鑑み、本発明の第１は、以下の医薬に関する。
［１］ＰＡＲＰ阻害剤を含む、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍を予防または治療するための医薬。
［２］前記悪性腫瘍は卵巣癌、非小細胞性肺癌、食道癌、大腸癌、悪性黒色腫、肝癌、リンパ腫、胃癌、膵臓がん、胆管癌、胆嚢癌、脳腫瘍および骨肉腫のいずれかである、［１］に記載の医薬。
［３］前記悪性腫瘍は非小細胞性肺癌、食道癌、大腸癌、悪性黒色腫、肝癌、リンパ腫、胃癌、膵臓がん、胆管癌、胆嚢癌、脳腫瘍および骨肉腫のいずれかである、［１］または［２］に記載の医薬。
【００１０】
また、本発明の第２は、以下の乳癌の予後予測用キットに関する。
［４］抗ＬＳＤ１抗体と、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーと、ＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブと、の少なくともいずれかを含む、予後予測用の乳癌組織検査キット。
［５］前記悪性腫瘍はトリプルネガティブ乳癌である、［４］に記載のキット。
［６］前記悪性腫瘍はＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌である、［４］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍に対して有効な医薬、および従来よりも高精度に乳癌の予後を予測できるキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１（ａ）は、ＬＳＤ１のｍＲＮＡの発現量を乳癌の分類ごとにプロットしたグラフである。図１（ｂ）は、ＢＲＣＡ１のｍＲＮＡの発現量を乳癌の分類ごとに比較したグラフである。
【図２】図２（ａ）〜図２（ｅ）は、それぞれ、すべてのタイプの乳癌患者、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌に分類された乳癌患者、Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ乳癌に分類された乳癌患者、Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ乳癌に分類された乳癌患者およびＨＥＲ２乳癌に分類された乳癌患者についての、ＬＳＤ１の発現量が多い乳癌患者に由来する検体およびＬＳＤ１の発現量が少ない乳癌患者に由来する検体のそれぞれをもとに作成したカプラン−マイヤー生存曲線を表すグラフである。
【図３】図３（ａ）は、ＬＳＤ１の過剰発現が検出された試料の免疫染色イメージであり、図３（ｂ）は、ＬＳＤ１の過剰発現が検出されなかった試料の免疫染色イメージである。図３（ｃ）は、ＬＳＤ１の過剰発現が検出された検体を採取した患者およびＬＳＤ１の過剰発現が検出されなかった検体を採取した患者のカプラン−マイヤー生存曲線を表したグラフである。
【図４】図４（ａ）は、ＬＳＤ１の過剰発現が検出された試料およびＬＳＤ１の過剰発現が検出されなかった試料のそれぞれについて、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現量をプロットしたグラフである。図４（ｂ）は、乳腺細胞における、ＬＳＤ１過剰発現群およびベクターコントロール群のウェスタンブロット結果を示す写真である。図４（ｃ）は、骨肉腫細胞における、ＬＳＤ１過剰発現群およびベクターコントロール群のウェスタンブロット結果を示す写真である。
【図５】図５（ａ）および図５（ｂ）は、それぞれ、乳癌細胞および骨肉腫細胞のＬＳＤ１過剰発現群およびベクターコントロール群にＰＡＲＰ阻害剤を注入したときの細胞の生存率を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．第１の実施形態：ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍を予防または治療するための医薬
本発明の第１の実施形態に係る、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍を予防または治療するための医薬は、有効成分としてＰＡＲＰ（ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）阻害剤を含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の第１の実施形態は、従来はＢＲＣＡ１遺伝子変異またはＢＲＣＡ２遺伝子変異を伴う癌細胞のみを選択的に死滅させる抗癌剤として用いられてきたＰＡＲＰ阻害剤に、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍を死滅させる効果があるという、本発明者らによる新たな知見に基づくものである。ＰＡＲＰ阻害剤はＢＲＣＡ１遺伝子変異もしくはＢＲＣＡ２遺伝子変異を伴う乳癌または卵巣癌の治療にのみ有効であるとされており、その適応の低さが問題となっていたが、本発明者らの新たな知見によれば、多用な種類の悪性腫瘍の治療にＰＡＲＰ阻害剤の適用を拡大することができる。
【００１５】
本発明において、ＬＳＤ１の発現とは、患者または被験者から採取した検体またはそれを加工した試料のタンパク質解析によりＬＳＤ１が検出されること、または患者または被験体から採取した検体またはそれを加工した試料のｍＲＮＡ解析によりＬＳＤ１をコードする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡが検出されることを意味する。
【００１６】
本発明において、ＬＳＤ１が過剰発現しているとは、患者または被験者から採取した検体またはそれを加工した試料から、ＬＳＤ１の発現が通常よりも多く定量されることを意味する。検体または試料中のＬＳＤ１の発現は、任意の方法で定量することができる。たとえば、タンパク質レベルでＬＳＤ１の発現を定量してもよく、ｍＲＮＡレベルで定量してもよい。ＬＳＤ１の発現量は、他の細胞株（例えばＨｅＬａ細胞等）におけるＬＳＤ１の発現量または同じ検体から検出した他の遺伝子（ハウスキーピング遺伝子等）の産物の発現量と比較した相対値を用いてもよいし、ＬＳＤ１発現量の絶対値を用いてもよい。ＬＳＤ１が過剰発現しているか否かは、ある検体から測定したＬＳＤ１の発現量を健常者の検体から測定したＬＳＤ１の発現量と比較することによって判定してもよいし、後述するように、ある検体におけるＬＳＤ１の発現量をスコア化して行ってもよい。
【００１７】
本発明において、ＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅とは、患者または被験者から採取した検体またはそれを加工した試料において、乳癌に罹患していない被験者から採取した検体またはそれを加工した試料と比べて、ＬＳＤ１をコードする遺伝子（ＤＮＡ等の核酸配列）が多く検出されることを意味する。ＬＳＤ１をコードする遺伝子が増幅しているか否かは、ある検体から測定したＬＳＤ１をコードする遺伝子の量を健常者の検体から測定したＬＳＤ１をコードする遺伝子の量と比較することによって判定することができる。
【００１８】
このとき、後述する、本発明の第２の実施形態に係るキットを用いてＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を検出してもよい。
【００１９】
タンパク質レベルでのＬＳＤ１の発現は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法等）、電気泳動法（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法等）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロット法等によって定量することができる。ｍＲＮＡレベルでのＬＳＤ１の発現は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、分岐ＤＮＡプローブ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ）等によって定量することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであることが好ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）であることが好ましい。
【００２０】
遺伝子の増幅は、サザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ）等によって検出することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）であることが好ましい。
【００２１】
免疫染色法は、例えば、以下の手順により行うことができる。乳癌患者から採取した検体を常法によりホルマリン等で固定した後、パラフィンに包埋する。包埋した検体を組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付け、試料として使用する。必要であれば、２次抗体の種類に応じて、細胞内の酵素を失活させる。試料に抗ＬＳＤ１抗体（抗ヒトＬＳＤ１抗体を含む）を滴下し、１次反応を行う。試料に２次抗体を滴下し、２次反応を行う。必要に応じて、試料の細胞核等を染色する。
【００２２】
免疫染色法を行った場合、ＬＳＤ１の過剰発現は、例えば、以下の方法（Ｒｅｍｍｅｌｅ法）によって判定することができる。細胞が明瞭に区別できる領域を５カ所選択し、表１に記載の基準にしたがって領域内の染色強度（ＳＩ：Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）および領域内から任意に選定した５００個の細胞のうちの染色された細胞の割合（ＰＰ：Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ）を求め、ＳＩとＰＰとを乗算した数を免疫染色スコアとする。免疫染色スコアが５以上の場合、ＬＳＤ１の過剰発現が検出されたと判定する。なお、ＳＩおよびＰＰの基準は表１に限定されず、目的等に応じて判断基準を適宜変更してもよい。ない。また、ＬＳＤ１の過剰発現が認められる基準値となるスコアも、この値に限定されない。例えば、健常者から採取した検体について同様の測定を行って健常者の免疫染色スコアを算出し、健常者の免疫染色スコアとは明瞭に差がでるようなスコアをＬＳＤ１の過剰発現が検出されたと判定するための基準値に設定してもよい。
【００２３】
【表１】
2016056152.tif 000003
【００２４】
ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、以下の手順により行うことができる。乳癌患者から採取した検体に、ＲＮＡ抽出試薬を添加し、検体中に含まれるＲＮＡを抽出する。逆転写酵素を用いて逆転写を行い、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの任意のサイクルごとにＰＣＲ産物を定量する。ＰＣＲ産物は、決められたサイクルごとに反応液をサンプリングして電気泳動によって定量してもよいし、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合（インターカレーション）して蛍光を発するインターカレーターまたは蛍光標識プローブによってリアルタイムに定量してもよい。サイクルごとのＰＣＲ産物の量から回帰分析を行うことで、鋳型となったＬＳＤ１のｍＲＮＡの量を求めることができる。
【００２５】
ＩＳＨは、例えば、以下の手順により行うことができる。乳癌患者から採取した検体を常法によりホルマリン等で固定した後、パラフィンに包埋する。包埋した検体を組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付け、試料として使用する。プローブが酵素で標識されている場合等には、必要であれば、ラベルとして用いる酵素の種類に応じて、細胞内の酵素を失活させる。ｍＲＮＡレベルでＬＳＤ１の発現を定量する場合、ＲＮａｓｅによってｍＲＮＡを分離したり、プロテアーゼによってｍＲＮＡを取り囲むタンパク質を消化したりしてもよい。遺伝子（ＤＮＡ）の増幅を検出する場合、エタノール沈殿等によってＤＮＡを分離したり、プロテアーゼによってＤＮＡを取り囲むタンパク質を消化したりしてもよい。ＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブの溶液を試料に滴下し、プローブとｍＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズさせる。用いたプローブの種類に応じた方法で、ｍＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズしたプローブを検出する。たとえば、プローブが蛍光物質で標識されている場合、蛍光顕微鏡でプローブからの蛍光を検出することができる。検出されたプローブのシグナルの強度をもとに、ハイブリダイズしたＬＳＤ１のｍＲＮＡの定量またはＬＳＤ１をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の増幅の検出をすることができる。プローブは、放射性同位元素、蛍光物質または酵素等で標識することができる。
【００２６】
ＬＳＤ１の過剰発現は、乳癌、卵巣癌、非小細胞性肺癌、食道癌、大腸癌、悪性黒色腫、肝癌、リンパ腫、胃癌、膵臓がん、胆管癌、胆嚢癌、脳腫瘍および骨肉腫等にみられる。ＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅も、これらの悪性腫瘍でみられると考えられる。本願発明者らが今回得た知見によると、ＬＳＤ１の過剰発現を伴う悪性腫瘍においては、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現量が抑制されている。そのため、ＢＲＣＡ１遺伝子変異を伴う癌細胞を死滅させる抗癌剤であるＰＡＲＰ阻害剤は、これらの悪性腫瘍の治療に有効であると考えられる。また、ＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍においては、ＬＳＤ１が過剰に発現することにより、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現量が抑制されていると予測される。そのため、ＰＡＲＰ阻害剤は、ＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍の治療にも有効であると考えられる。これらの悪性腫瘍のうち、本発明の第１の実施形態に係る医薬は、好ましくは卵巣癌、非小細胞性肺癌、食道癌、大腸癌、悪性黒色腫、肝癌、リンパ腫、胃癌、膵臓がん、胆管癌、胆嚢癌、脳腫瘍および骨肉腫に有効であり、さらに好ましくは非小細胞性肺癌、食道癌、大腸癌、悪性黒色腫、肝癌、リンパ腫、胃癌、膵臓がん、胆管癌、胆嚢癌、脳腫瘍および骨肉腫に有効である。
【００２７】
ＰＡＲＰ阻害剤は、ＢＲＣＡ１遺伝子変異またはＢＲＣＡ２遺伝子変異を伴う癌細胞を特異的に死滅させる抗癌剤として知られている。ＢＲＣＡ１遺伝子の発現により産出されるＢＲＣＡ１タンパク質またはＢＲＣＡ２遺伝子の発現により産出されるＢＲＣＡ２タンパク質は、相同組換えによる遺伝子修復において重要な役割を有する。一方でＰＡＲＰ遺伝子の発現により産出されるＰＡＲＰタンパク質は、塩基除去修復によるＤＮＡの一本鎖切断の修復に関与する。ＢＲＣＡ１タンパク質またはＢＲＣＡ２タンパク質が欠損している細胞において、ＰＡＲＰタンパク質も阻害されると、切断部位の修復が行われないため、ＤＮＡ合成期に奇形ＤＮＡが生じることになる。このような奇形ＤＮＡが生じた細胞は、細胞周期のチェックポイントを通過できず、アポトーシスにより自死する（非特許文献５、非特許文献６等参照）。ＰＡＲＰ阻害剤によるこのような作用機序を合成致死性ともいう。
【００２８】
ＰＡＲＰタンパク質にはＰＡＲＰ１タンパク質およびＰＡＲＰ２タンパク質が存在するが、これらのいずれが阻害されても、上記合成致死が導かれる。そのため、本発明の第１の実施態様において用いるＰＡＲＰ阻害剤は、ＰＡＲＰ１タンパク質の発現または働きを阻害するものでも、ＰＡＲＰ２タンパク質の発現または働きを阻害するものでもよい。本発明の第１の実施態様において用いるＰＡＲＰ阻害剤は、これらの双方を阻害するものであることが好ましいが、ＰＡＲＰ１タンパク質またはＰＡＲＰ２タンパク質のいずれか一方の発現または働きのみを阻害するものである場合は、ＰＡＲＰ１タンパク質の発現または働きを阻害するものであることが好ましい。
【００２９】
本発明の第１の実施形態に係る医薬に含まれるＰＡＲＰ阻害剤は、当業者に知られる方法を用いて製造したものでもよいが、市販の製剤でもよい。このような市販の製剤の例には、アストラゼネカ株式会社の「オラパリブ」（４−［［３−［［４−（シクロプロピルカルボニル）−１−ピペラジニル］カルボニル］−４−フルオロフェニル］メチル］−１（２Ｈ）−フタラジノン）、和光純薬工業株式会社の「ＢＹＫ  ２０４１６５」（４−（１−メチル−１Ｈ−ピロール−２−イルメチレン）−４Ｈ−イソキノリン−１，３−ジオン）、「ＤＲ２３１３」（２−メチル−３，５，７，８−テトラヒドロチオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン） 、「ＮＵ１０２５」（８−ヒドロキシ−２−メチルキナゾリン−４−オン）および「ＵＰＦ１０６９」（５−（２−オキソ−２−フェニルエトキシ）−３，４−ジヒドロイソキノリン−１（２Ｈ）−オン）、バイオマリン・ファーマシューティカル社の［ＢＭＮ６７３］（（８Ｓ，９Ｒ）−５−フルオロ−８−（４−フルオロフェニル）−９−（１−メチル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾル−５−イル）−８，９−ジヒドロ−２Ｈ−ピリド［４，３，２−ｄｅ］フタラジン−３（７Ｈ）−オン）、テサロ社の［ニラパリブ］（（Ｓ）−２−（４−（ピペリジン−３−イル）フェニル）−２Ｈ−インダゾール−７−カルボキシアミド）、クロヴィス・オンコロジー社の［ルカパリブ］（８−フルオロ−５−（４−（（メチルアミノ）メチル）フェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−アゼピノ［５，４，３−ｃｄ］インドール−１（６Ｈ）−オン  フォスフェート）等が含まれる。
【００３０】
本発明の第１の実施形態に係る医薬は、任意の様式で投与することができる、当該医薬を投与する際に採用できる様式の例には、経口投与および非経口投与（皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内への注射、および経皮または経粘膜投与等）が含まれる。これらのうち、患者の負担を軽減する観点からは、経口投与が好ましい。
【００３１】
本発明の第１の実施形態に係る医薬の剤形は、特に限定されず、投与様式に従って任意に決定することができる。たとえば、経口投与の場合は、錠剤、顆粒剤、細粒剤、丸剤、散剤およびカプセル剤などの固形剤形、ならびにエリキシル、シロップおよび懸濁液などの液体剤形とすることができる。錠剤の場合には、患者が嚥下しやすい大きさの錠剤になるようにＰＡＲＰ阻害剤の１錠当たりの含量を設定し、常法通り打錠すればよい。
【００３２】
本発明の第１の実施形態に係る医薬の１日当たりの投与量は、患者の年齢、体重、病状および臨床経過ならびに投与様式等によって適宜定めることが好ましいが、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍の増殖および浸潤を抑制する量であって副作用の少ない量のＰＡＲＰ阻害剤を投与しうる量であれば特に限定されない。たとえば、ＰＡＲＰ阻害剤としてオラパリブを用いるときは、患者に１日当たり４００ｍｇを投与すればよい。当該医薬全量に対するＰＡＲＰ阻害剤の配合量（割合）は特に限定されず、剤形に応じて適宜設定すればよい。
【００３３】
本発明の第１の実施形態に係る医薬は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。薬学的に許容される担体として、任意の標準的な担体、緩衝剤および賦形剤（例えばリン酸緩衝食塩水、５％デキストロース水溶液等）を用いることができる。
【００３４】
本発明の第１の実施形態に係る医薬の用法は、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍の増殖および浸潤を抑制することができれば特に限定されない。たとえば、ＰＡＲＰ阻害剤としてオラパリブを用いるときは、前記１日当たりの投与量を２回に分けて食前、食間または食後に経口投与すればよい。
【００３５】
本発明の第１の実施形態に係る医薬は、患者への安全性を考慮したうえで、他の抗癌剤、抗腫瘍剤その他医薬と併用してもよい。
【００３６】
本発明の第１の実施形態に係る医薬は、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍に罹患している患者に投与することで、これらの悪性腫瘍の治療に用いることができる。また、当該医薬は、ＬＳＤ１が過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子が増幅しているが増殖または浸潤はしていない悪性腫瘍の細胞を死滅させることもできるため、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍に罹患していると臨床的には診断されない患者に投与することで、これらの悪性腫瘍の予防に用いることができる。
【００３７】
２．第２の実施形態：乳癌の予後予測用キット
本発明の第２の実施形態に係る、乳癌の予後予測用キットは、抗ＬＳＤ１抗体と、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーと、ＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブと、の少なくともいずれかを含むことを特徴とする。
【００３８】
本発明の第２の実施形態は、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う乳癌患者は予後不良になる可能性が高いという、本発明者らによる新たな知見に基づくものである。特には、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌の患者がＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う場合は予後不良になる可能性がより高いという、本発明者らによる新たな知見に基づき、本発明の第２の実施形態に係るキットは、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌の予後予測用キットとして用いることができる。さらには、トリプルネガティブ乳癌（エストロゲン受容体（ＥＲ：Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ：Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）およびＨＥＲ２のいずれのマーカーも陰性である乳癌）の患者について、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う場合は予後不良になる可能性がより高いという、本発明者らによる新たな知見に基づき、本発明の第２の実施形態に係るキットは、トリプルネガティブ乳癌の予後予測用キットとして用いることができる。
【００３９】
これらの知見に基づけば、乳癌患者から採取した検体中のＬＳＤ１の発現を定量するかまたはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を検出することで、乳癌患者、特にはＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌患者、さらにはトリプルネガティブ乳癌患者の予後予測を行うことができる。また、従来はＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌そのものが予後因子とされていたが、本発明の第２の実施形態によれば、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌以外の乳癌患者についても予後予測を行うことができる。また、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌に分類された患者においても予後不良となる患者と寛解する患者とが従来は見られたが、本発明の第２の実施形態によれば、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌の患者についてより高精度に予後予測を行うことが可能となる。
【００４０】
本発明の第２の実施形態によって予後予測を行った結果をもとに、その後の患者の治療計画を立てることで、患者の治療成績が上がることが可能となり、また、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ）を向上させることも可能になる。たとえば、本発明の第２の実施形態によって予後不良の可能性が高いとされた患者には、早期から悪性乳癌治療剤の投与を開始することで、乳癌、特にはＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌、さらにはトリプルネガティブ乳癌の患者の治療成績が向上することが見込まれる。
【００４１】
なお、本発明の第２の実施形態において、予後不良とは、診断後５年経過後の無再発生存率が７５％以下であることを意味する。
【００４２】
本発明の第２の実施形態は、上記知見に基づいて提供される、乳癌患者の予後を予測するためのキットに係るものである。当該キットによれば、乳癌患者から採取した検体または試料中のＬＳＤ１の発現を定量またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を検出することができる。
【００４３】
本発明において、ＬＳＤ１の発現とは、患者または被験者から採取した検体またはそれを加工した試料のタンパク質解析によりＬＳＤ１が検出されること、または患者または被験体から採取した検体またはそれを加工した試料のｍＲＮＡ解析によりＬＳＤ１をコードする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡが検出されることを意味する。
【００４４】
本発明において、ＬＳＤ１が過剰発現しているとは、患者または被験者から採取した検体またはそれを加工した試料から、ＬＳＤ１の発現が通常よりも多く定量されることを意味する。検体または試料中のＬＳＤ１の発現は、任意の方法で定量することができる。たとえば、タンパク質レベルでＬＳＤ１の発現を定量してもよく、ｍＲＮＡレベルで定量してもよい。ＬＳＤ１の発現量は、他の細胞株（例えばＨｅＬａ細胞等）におけるＬＳＤ１の発現量または同じ検体から検出した他の遺伝子（ハウスキーピング遺伝子等）の産物の発現量と比較した相対値を用いてもよいし、ＬＳＤ１発現量の絶対値を用いてもよい。ＬＳＤ１が過剰発現しているか否かは、ある検体から測定したＬＳＤ１の発現量を健常者の検体から測定したＬＳＤ１の発現量と比較することによって判定してもよいし、後述するように、ある検体におけるＬＳＤ１の発現量をスコア化して行ってもよい。
【００４５】
本発明において、ＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅とは、患者または被験者から採取した検体またはそれを加工した試料において、乳癌に罹患していない被験者から採取した検体またはそれを加工した試料と比べて、ＬＳＤ１をコードする遺伝子（ＤＮＡ等の核酸配列）が多く検出されることを意味する。ＬＳＤ１をコードする遺伝子が増幅しているか否かは、ある検体から測定したＬＳＤ１をコードする遺伝子の量を健常者の検体から測定したＬＳＤ１をコードする遺伝子の量と比較することによって判定することができる。
【００４６】
タンパク質レベルでのＬＳＤ１の発現は、例えば、免疫染色法（蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法等）、電気泳動法（ウェスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法等）、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロット法等によって定量することができる。ｍＲＮＡレベルでのＬＳＤ１の発現は、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、分岐ＤＮＡプローブ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ）等によって定量することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであることが好ましい。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法は、蛍光  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）であることが好ましい。
【００４７】
遺伝子の増幅は、サザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＩＳＨ）等によって検出することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法は、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）であることが好ましい。
【００４８】
免疫染色法は、例えば、以下の手順により行うことができる。乳癌患者から採取した検体を常法によりホルマリン等で固定した後、パラフィンに包埋する。包埋した検体を組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付け、試料として使用する。必要であれば、２次抗体の種類に応じて、細胞内の酵素を失活させる。試料に抗ＬＳＤ１抗体（抗ヒトＬＳＤ１抗体を含む）を滴下し、１次反応を行う。試料に２次抗体を滴下し、２次反応を行う。必要に応じて、試料の細胞核等を染色する。
【００４９】
免疫染色法を行った場合、ＬＳＤ１の過剰発現は、例えば、以下の方法（Ｒｅｍｍｅｌｅ法）によって判定することができる。細胞が明瞭に区別できる領域を５カ所選択し、前述の表１に記載の基準にしたがって領域内の染色強度（ＳＩ：Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）および領域内から任意に選定した５００個の細胞のうちの染色された細胞の割合（ＰＰ：Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ）を求め、ＳＩとＰＰとを乗算した数を免疫染色スコアとする。免疫染色スコアが５以上の場合、ＬＳＤ１の過剰発現が検出されたと判定する。なお、ＬＳＤ１の過剰発現が認められる基準値となるスコアは、この値に限定されない。たとえば、健常者から採取した検体について同様の測定を行って健常者の免疫染色スコアを算出し、健常者の免疫染色スコアとは明瞭に差がでるようなスコアをＬＳＤ１の過剰発現が検出されたと判定するための基準値に設定してもよい。
【００５０】
免疫染色法を採用する場合、本発明の第２の実施形態に係るキットは、抗ＬＳＤ１抗体（モノクローナルおよびポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびにこれらの結合活性断片を含む）を含む。抗ＬＳＤ１抗体には、セル・シグナリング・テクノロジー（ＣＳＴ）社のＡｎｔｉ−ＬＳＤ１  （２１３９）  ａｎｔｉｂｏｄｙ等が含まれる。
【００５１】
免疫染色法を採用する場合、本発明の第２の実施形態に係るキットは、ペルオキシダーゼ等の酵素、２次反応用の抗体、染色液、緩衝液（ＥＤＴＡ溶液、クエン酸緩衝液またはＰＢＳ等）および洗浄液の少なくともいずれかを含んでいてもよい。２次反応用の抗体は、当該キットに用いる抗ＬＳＤ１抗体と親和性のあるものであれば特に限定されない。２次反応用の抗体は、蛍光プローブとして機能するものであってもよい。染色液は、核を染色することができるものを含むことが好ましく、例えばヘマトキシリン、メチル緑またはケルンエヒトロートを含むことが好ましい。染色液には、エオジン等の核以外の部位を染色できるものを組みあわせてもよい。
【００５２】
ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、以下の手順により行うことができる。乳癌患者から採取した検体に、ＲＮＡ抽出試薬を添加し、検体中に含まれるＲＮＡを抽出する。逆転写酵素を用いて逆転写を行い、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの任意のサイクルごとにＰＣＲ産物を定量する。ＰＣＲ産物は、決められたサイクルごとに反応液をサンプリングして電気泳動によって定量してもよいし、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合（インターカレーション）して蛍光を発するインターカレーターまたは蛍光標識プローブによってリアルタイムに定量してもよい。サイクルごとのＰＣＲ産物の量から回帰分析を行うことで、鋳型となったＬＳＤ１のｍＲＮＡの量を求めることができる。
【００５３】
ＲＴ−ＰＣＲを採用する場合、本発明の第２の実施形態に係るキットは、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーを含む。ＬＳＤ１をコードする遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーは、ＬＳＤ１の配列またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の配列をもとに設計してもよいし、市販のものを用いてもよい。
【００５４】
ＲＴ−ＰＣＲを採用する場合、本発明の第２の実施形態に係るキットは、逆転写酵素、ＰＣＲ用のリバースプライマー、核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用試薬、検出用のインターカレーターまたは蛍光標識プローブ、緩衝液（ＥＤＴＡ溶液、クエン酸緩衝液またはＰＢＳ等）および洗浄液の少なくともいずれかを含んでいてもよい。蛍光標識プローブには、ＴａｑＭａｎプローブ等が含まれる。
【００５５】
ＩＳＨは、例えば、以下の手順により行うことができる。乳癌患者から採取した検体を常法によりホルマリン等で固定した後、パラフィンに包埋する。包埋した検体を組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付け、試料として使用する。プローブが酵素で標識されている場合等に、必要であれば、ラベルとして用いる酵素の種類に応じて、細胞内の酵素を失活させる。ｍＲＮＡレベルでＬＳＤ１の発現を定量する場合、ＲＮａｓｅによってｍＲＮＡを分離したり、プロテアーゼによってｍＲＮＡを取り囲むタンパク質を消化したりしてもよい。遺伝子（ＤＮＡ）の増幅を検出する場合、エタノール沈殿等によってＤＮＡを分離したり、プロテアーゼによってＤＮＡを取り囲むタンパク質を消化したりしてもよい。ＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブの溶液を試料に滴下し、プローブとｍＲＮＡまたはＤＮＡとをハイブリダイズさせる。用いたプローブの種類に応じた方法で、ｍＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズしたプローブからのシグナルを検出する。たとえば、プローブが蛍光物質で標識されている場合、蛍光顕微鏡でプローブからの蛍光を検出することができる。検出されたプローブのシグナルの強度をもとに、ハイブリダイズしたＬＳＤ１のｍＲＮＡの定量またはＬＳＤ１をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の増幅の検出をすることができる。
【００５６】
ＩＳＨを採用する場合、本発明の第２の実施形態に係るキットは、ＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブを含む。ＬＳＤ１をコードする遺伝子に特異的な配列と相補的な配列を有するプローブは、ＬＳＤ１の配列またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の配列をもとに設計してもよいし、市販のものを用いてもよい。プローブは、放射性同位元素、蛍光物質または酵素等で標識することができるが、これらのうち、蛍光物質で標識されていることが好ましい。プローブの長さは特に限定されないが、１０〜５００ｂｐ、１０〜２５０ｂｐ、１０〜１００ｂｐ、または２０〜５０ｂｐとすることができる。
【００５７】
ＩＳＨを採用する場合、本発明の第２の実施形態に係るキットは、ペルオキシダーゼ等の酵素、ＲＮａｓｅ、プロテアーゼ、溶媒、緩衝液（ＥＤＴＡ溶液、クエン酸緩衝液またはＰＢＳ等）および洗浄液の少なくともいずれかを含んでいてもよい。
【００５８】
本発明の第２の実施形態に係るキットは、必要に応じて、その他の試薬、試験に必要な器具およびコントロール等をさらに含むことができる。
【００５９】
ＬＳＤ１の発現を定量またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を検出する検体は、乳癌患者の罹患組織または血液に由来することが好ましい。検体は、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌の患者から採取したものであることが好ましく、トリプルネガティブ乳癌の患者から採取したものであることも好ましい。試験に供する試料は、患者から採取された検体自体であってもよく、また試験に応じて検体を処理して試料としてもよい。たとえば、試料を免疫染色法で定量する場合、患者から得られた検体から調製したパラフィン切片を試料として用いることができる。また、試料をウェスタンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲで定量する場合、患者から得られた検体から調製したタンパク質抽出液またはｍＲＮＡ抽出液を試料として用いることができる。
【００６０】
以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００６１】
１．Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌におけるＬＳＤ１の過剰発現（ｍＲＮＡレベル）
１−１．バイオインフォマティクスによる解析
非特許文献７に添付の浸潤性乳癌のｍＲＮＡ発現量データを癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）からダウンロードし、４つの乳癌の分類（Ｌｕｍｉｎａｌ  Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ  Ｂ、ＨＥＲ２およびＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ）のそれぞれにおけるＬＳＤ１をコードする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの量（以下、単にＬＳＤ１のｍＲＮＡの発現量ともいう。）およびＢＲＣＡ１遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの量（以下、単にＢＲＣＡ１のｍＲＮＡの発現量ともいう。）を比較した。
【００６２】
図１（ａ）は、ＬＳＤ１のｍＲＮＡの発現量を乳癌の分類ごとにプロットしたグラフである。乳癌のタイプによって、ＬＳＤ１のｍＲＮＡの発現量には有意な差が見られた（ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによる検定：ｐ＜０．０００１）。Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌では、他の種類の乳癌よりもＬＳＤ１のｍＲＮＡの発現量が増加していた（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法によるｐｏｓｔ  ｈｏｃ多重比較：Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌と他の乳癌との間のすべての組みあわせについて、ｐ＜０．０００１）。
【００６３】
図１（ｂ）は、ＢＲＣＡ１のｍＲＮＡの発現量を乳癌の分類ごとに比較したグラフである。Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌では、他の種類の乳癌よりもＢＲＣＡ１のｍＲＮＡの発現量が減少する傾向が見られた。
【００６４】
１−２．考察
図１（ａ）の結果は、Ｂａｓａｌ-ｌｉｋｅ乳癌においてＬＳＤ１のｍＲＮＡの発現量が増加していることを示しており、図１（ｂ）の結果は、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌においてＢＲＣＡ１のｍＲＮＡの発現量が減少していることを示している。これらの結果から、ＬＳＤ１のｍＲＮＡの発現量の増加とＢＲＣＡ１のｍＲＮＡの発現量の減少が相関することが示唆された。
【００６５】
２．ＬＳＤ１の過剰発現（ｍＲＮＡレベル）と予後不良との関係
２−１．バイオインフォマティクスによる解析
ｋｍｐｌｏｔ（ｗｗｗ．ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ）を用いて、ＬＳＤ１の発現量（ｍＲＮＡレベル）が多いと判定された乳癌患者由来の検体およびＬＳＤ１の発現量（ｍＲＮＡレベル）が少ないと判定された乳癌患者由来の検体のそれぞれをもとにしたカプラン−マイヤー生存曲線を、２０１４年６月１９日の時点でｋｍｐｌｏｔに内在するデータを用いて作成した。「Ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ」に［ＫＤＭ１］を入力し、「Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｓｕｂｔｙｐｅ」を［ａｌｌ］、［ｂａｓａｌ］、［ｌｕｍｉｎａｌ Ａ］、［ｌｕｍｉｎａｌ ｂ］、［ＨＥＲ２＋］として図２（ａ）〜図２（ｅ）に示すカプラン−マイヤー生存曲線を作成した。
【００６６】
図２（ａ）は、すべてのタイプの乳癌患者についての、ＬＳＤ１の発現量が多い乳癌患者に由来する検体およびＬＳＤ１の発現量が少ない乳癌患者に由来する検体のそれぞれをもとに作成したカプラン−マイヤー生存曲線を表すグラフである。ＬＳＤ１の発現量が多い患者の無再発生存期間（ＲＦＳ：Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  Ｆｒｅｅ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ）は、ＬＳＤ１の発現が少ない患者の無再発生存期間よりも短かった（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：１．１４）。
【００６７】
図２（ｂ）は、Ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌に分類された患者についての、ＬＳＤ１の発現量が多い乳癌患者に由来する検体およびＬＳＤ１の発現量が少ない乳癌患者に由来する検体のそれぞれをもとに作成したカプラン−マイヤー生存曲線を表すグラフである。ＬＳＤ１の発現量が多い患者の無再発生存期間は、ＬＳＤ１の発現量が少ない患者の無再発生存期間よりも短かった（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：１．３９）。
【００６８】
図２（ｃ）、図２（ｄ）および図２（ｅ）はそれぞれ、Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ、Ｌｕｍｉｎａｌ ＢおよびＨＥＲ２乳癌に分類された患者についての、ＬＳＤ１の発現量が多い乳癌患者に由来する検体およびＬＳＤ１の発現量が少ない乳癌患者に由来する検体のそれぞれをもとに作成したカプラン−マイヤー生存曲線を表すグラフである。これらの乳癌については、ＬＳＤ１の発現量が多くても無再発生存期間は短くならなかった（Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ乳癌のｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：０．８８、Ｌｕｍｉｎａｌ Ａ乳癌のｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：１．０１、ＨＥＲ２乳癌のｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：１．０３）。
【００６９】
２−２．考察
これらの結果により、乳癌、特にＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌において、ＬＳＤ１の発現量が多くなるとその後の再発または死亡の可能性が高くなることがわかる。これらの結果により、ＬＳＤ１の過剰発現は乳癌、特にＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌における予後因子として用いることができることが示された。また、ＬＳＤ１をコードする遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの量をもとに、乳癌、特にＢａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌において患者の予後判定ができることが示された。
【００７０】
３．ＬＳＤ１の過剰発現（タンパク質レベル）と予後不良との関係
３−１．臨床試料による解析
２００７年から２００９年にかけて聖マリアンナ医科大学病院を受診した乳癌患者のうち、トリプルネガティブ乳癌と診断された患者（ｎ＝２０）から乳癌組織切片を採取した。
【００７１】
採取した組織切片中のＬＳＤ１の発現は、以下の手順で定量した。
【００７２】
採取した乳癌のパラフィン組織切片を厚さ４μｍのスライド状に薄切し、常法にしたがってパラフィンを除去した。その後、薄切した切片を３％過酸化水素溶液中に５分間浸漬して、切片に含まれる内在性ペルオキシダーゼを失活させた。ウサギ抗ヒトＬＳＤ１抗体（セル・シグナリング・テクノロジー社、２１３９、１：１００に希釈）を切片に乗せて６０分静置することで、１次反応を行った。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ダコ・ジャパン株式会社、ヒストファイン  シンプルステイン  ＭＵＬＴＩ）によって、メーカー推奨の方法により２次反応を行い、その後、ヘマトキシリンで核を染色した。各工程の間に、必要に応じて適宜ＰＢＳまたは水で試料を洗浄した。
【００７３】
ＬＳＤ１発現の程度（免疫染色スコア）は、Ｒｅｍｍｅｌｅ法により求めた。具体的には、細胞が明瞭に区別できる領域を５カ所選択し、表１に記載の基準にしたがって染色強度（ＳＩ）および５００個の細胞のうちの染色された細胞の割合（ＰＰ）を求め、ＳＩとＰＰとを乗算した数を免疫染色スコアとして、免疫染色スコアが５以上の場合、ＬＳＤ１の過剰発現が検出されたとした。図３（ａ）はＬＳＤ１の過剰発現が検出された試料の免疫染色イメージであり、図３（ｂ）はＬＳＤ１の過剰発現が検出されなかった試料の免疫染色イメージである。図３（ａ）および図３（ｂ）中、濃い色になっている部分は、染色が見られた部分である。
【００７４】
３−２．カプラン−マイヤー生存曲線
図３（ｃ）は、上記方法でＬＳＤ１の過剰発現が検出された検体を採取した患者（図中点線、ｎ＝５）およびＬＳＤ１の過剰発現が検出されなかった検体を採取した患者（図中実線、ｎ＝１５）のカプラン−マイヤー生存曲線を表したグラフである。それぞれの患者の無再発生存期間（ＲＦＳ）は、聖マリアンナ医科大学病院の診療記録をもとに求めた、検体を採取した後に乳癌の再発がなく生存した期間を用いた。
【００７５】
３−３．考察
図３（ａ）および図３（ｂ）により示されるように、免疫染色法によって、乳癌患者から採取した試料から、その患者が罹患している乳癌がＬＳＤ１の過剰発現を伴う悪性腫瘍であるか否かを判断することができた。また、ＬＳＤ１の発現により産出されたタンパク質の量をもとに、乳癌、特にトリプルネガティブ乳癌において患者の予後判定ができることが示された。
【００７６】
図３（ｃ）に示されているように、トリプルネガティブ乳癌の患者でも、ＬＳＤ１過剰発現が検出された患者の無再発生存期間は、ＬＳＤ１過剰発現が検出されなかった患者の無再発生存期間よりも短かった（ｈａｚａｒｄ  ｒａｔｉｏ：８．２１８）。これらの結果により、ＬＳＤ１の過剰発現はトリプルネガティブ乳癌における予後因子として用いることができることが示された。
【００７７】
４．ＬＳＤ１の発現とＢＲＣＡ１タンパク質の発現との関係
４−１．免疫染色法による検証
上記３．で用いた試料について、１次反応をＥＤＴＡ溶液（ｐＨ  ９．０）によって４０分間９６℃にスチームすることで抗原賦活化を行った後、抗ＢＲＣＡ１抗体（メルクミリポア社、０７−４３４、１：１０００に希釈）を乗せて６０分静置することにより行った以外は上記３．と同様の方法により、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現を定量した。
【００７８】
図４（ａ）は、上記３．の方法でＬＳＤ１の過剰発現が検出された試料およびＬＳＤ１の過剰発現が検出されなかった試料のそれぞれについて、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現量（免疫染色スコア）をプロットしたグラフである。ＬＳＤ１の過剰発現が検出された試料は、ＬＳＤ１の過剰発現が検出されなかった試料よりも有意にＢＲＣＡ１タンパク質の発現量が低下していた。
【００７９】
４−２．ウェスタンブロット法による検証
Ｘ−ｔｒｅａｍ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬を用いて、ヒト乳腺癌（ｂａｓａｌ−ｌｉｋｅ乳癌）由来の細胞系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１株に、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクションしてＬＳＤ１を過剰発現させた。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を０．５％濃度のＮＰ−４０溶解バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）：５０ｍＭ、ＮａＣｌ：１５０ｍＭ、ＮＰ−４０：０．５％、ＮａＦ：５０ｍＭ、ＤＴＴ：１ｍＭ、Ｎａ３ＶＯ４；１ｍＭ、コンプリート  プロテアーゼ  インヒビター  カクテル（ロシェ社）、ＰＭＳＦ：１ｍＭ）によって溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで展開し、ウェスタンブロット測定を行った。ＬＳＤ１を過剰発現させなかったこと以外は同様にして、何もコードしない遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクションしたベクターコントロール群（ＶＣ）についてもウェスタンブロット測定を行った。
【００８０】
ヒト骨肉腫由来の細胞系列であるＵ２ＯＳ株を使用した以外は上記と同様にして、ウェスタンブロット測定を行った。
【００８１】
図４（ｂ）に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１株におけるＬＳＤ１過剰発現群およびベクターコントロール群のウェスタンブロット結果を示す。図４（ｃ）に、Ｕ２ＯＳ株におけるＬＳＤ１過剰発現群およびベクターコントロール群のウェスタンブロット結果を示す。いずれの株種においても、ＬＳＤ１過剰発現群では、ベクターコントロール群と比較して、ＬＳＤ１の発現量は多かったが、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現量は少なかった。
【００８２】
４−３．考察
図４（ａ）および図４（ｂ）に示されるように、ＬＳＤ１の過剰発現が見られる試料では、ＢＲＣＡ１タンパク質の発現量は低くなっていた。これらの結果は、ＬＳＤ１の過剰発現が見られる組織では、ＰＡＲＰ阻害剤による悪性腫瘍細胞の死滅効果が見込まれることを示唆する。
【００８３】
５．ＬＳＤ１過剰発現細胞に対するＰＡＲＰ阻害剤投与の効果
５−１．乳癌細胞株によるコロニー形成アッセイ
Ｘ−ｔｒｅａｍ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬を用いて、ヒト乳腺癌由来の細胞系列であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１株に、ＬＳＤ１をコードする遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクションしてＬＳＤ１を過剰発現させた。トランスフェクションの２４時間後に、６ウェルプレートに、１ウェルあたり４０００個のセルを導入し、ＬＳＤ１過剰発現群を作成した。何もコードしない遺伝子を有するプラスミドをトランスフェクションしてＬＳＤ１を過剰発現させなかったこと以外は同様にして、ベクターコントロール群（ＶＣ）を作成した。異なる濃度のオラパリブ（ＰＡＲＰ阻害剤、アストラゼネカ株式会社）を、ＬＳＤ１過剰発現群およびベクターコントロール群のそれぞれのウェルに注入し、プレートを３７℃で１週間インキュベートした。オラパリブの量は、ウェル中の濃度が０．２ｎＭ、２ｎＭ、２０ｎＭ、２００ｎＭ、２０００ｎＭ、２００００ｎＭとなるよう調整した。その後、７５％メタノール−２５％酢酸溶液で細胞を固定し、プレートを乾燥させた。コロニーはＬｉｌｌｉｅ’ｓ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ：２ｇ、シュウ酸アンモニウム：０．８ｇ、８０％エタノール：１００ｍｌ）で５分間染色した。染色後、プレートを水で洗浄し、乾燥させ、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００（ＧＥヘルスケア）で撮像した画像をもとに、細胞の生存率（％）を測定した。
【００８４】
図５（ａ）に測定結果を示す。ＬＳＤ１が過剰発現している細胞株（図中点線）にオラパリブを注入すると、ベクターコントロール群（図中実線）と比較して、細胞の生存率は低くなった。オラパリブの濃度が高くなるほどＬＳＤ１が過剰発現している細胞株の生存率は低くなり、特にオラパリブの濃度が２ｎＭ以上２００００ｎＭ以下の場合、さらにはオラパリブの濃度が２０ｎＭ以上２００００ｎＭ以下の場合に、ＬＳＤ１が過剰発現している細胞株の生存率は低くなり、オラパリブの濃度が２００ｎＭ以上４０００ｎＭ以下の場合に、ＬＳＤ１が過剰発現している細胞株の生存率は低くなった。
【００８５】
５−２．骨肉種細胞株によるコロニー形成アッセイ
ヒト骨肉腫由来の細胞系列であるＵ２ＯＳ株を使用した以外は上記と同様にして、コロニー形成アッセイを行った。
【００８６】
図５（ｂ）に測定結果を示す。ＬＳＤ１が過剰発現している細胞株（図中点線）にオラパリブを注入すると、ベクターコントロール群（図中実線）と比較して、細胞の生存率は低くなった。オラパリブの濃度が高くなるほどＬＳＤ１が過剰発現している細胞株の生存率は低くなり、特にオラパリブの濃度が２ｎＭ以上２００００ｎＭ以下の場合、さらにはオラパリブの濃度が２０ｎＭ以上２００００ｎＭ以下の場合に、ＬＳＤ１が過剰発現している細胞株の生存率は低くなり、オラパリブの濃度が２００ｎＭ以上４０００ｎＭ以下の場合に、ＬＳＤ１が過剰発現している細胞株の生存率は低くなった。
【００８７】
５−３．考察
図５（ａ）より、ＰＡＲＰ阻害剤であるオラパリブが、ＬＳＤ１が過剰発現している乳癌細胞を特異的に死滅させるため、ＬＳＤ１が過剰発現している乳癌の治療にＰＡＲＰ阻害剤が有効であることがわかる。また、特にＰＡＲＰ阻害剤の濃度が高いと、癌細胞の死滅効果も高くなることがわかる。
【００８８】
図５（ｂ）より、ＰＡＲＰ阻害剤であるオラパリブが、ＬＳＤ１が過剰発現している骨肉種細胞を特異的に死滅させるため、ＬＳＤ１が過剰発現している骨肉種の治療にもＰＡＲＰ阻害剤が有効であることがわかる。また、特にＰＡＲＰ阻害剤の濃度が高いと、腫瘍細胞の死滅効果も高くなることがわかる。
【００８９】
発生部位も発生機序も異なる２種類の悪性腫瘍細胞株において、ＬＳＤ１が過剰発現しているときにＰＡＲＰ阻害剤によって悪性腫瘍細胞が特異的に死滅させられることから、悪性腫瘍の種類にかかわらず、ＬＳＤ１の過剰発現を伴う悪性腫瘍をＰＡＲＰ阻害剤が特異的に死滅させることがわかる。また、悪性腫瘍の種類にかかわらず、ＰＡＲＰ阻害剤の濃度が高くなるほどＬＳＤ１の過剰発現を伴う悪性腫瘍の死滅効果は高くなることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の第１の実施形態に係る医薬は、ＬＳＤ１の過剰発現またはＬＳＤ１をコードする遺伝子の増幅を伴う悪性腫瘍の治療に用いることができる。本発明の第２の実施形態に係るキットは、乳癌の予後予測に用いることができる。
【図１】
2016056152.tif 000004
【図５】
2016056152.tif 000005
【図２】
2016056152.tif 000006
【図３】
2016056152.tif 000007
【図４】
2016056152.tif 000008