(57)【要約】【課題】本願発明の目的は、核酸の導入効率が高く、簡便な核酸を細胞に導入する方法を提供することにある。【解決手段】本願発明の核酸を細胞に導入する方法は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布して低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成する準備工程と、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層上に、細胞を２０００個／ｍｍ2以上の密度で播種する播種工程と、播種した上記細胞を培養する培養工程とを含むことを特徴としている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、
前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布して低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成する準備工程と、
前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層上に、細胞を２０００個／ｍｍ2以上の密度で播種する播種工程と、
播種した前記細胞を培養する培養工程と
を含む核酸を細胞に導入する方法。
【請求項２】
前記核酸中のリン酸残基中のリン原子数に対する、前記２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体側鎖のアミン性窒素原子数の割合（Ｎ／Ｐ比）が５以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養面が単位面積あたりに有する、前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に含まれる、前記核酸の量が０．５〜５０ｎｇ／ｍｍ2である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、前記培養工程で培養した細胞を別の細胞培養器に播種する再播種工程を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記播種工程において、細胞を４０００個／ｍｍ2以上の密度で播種する、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記準備工程において、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体が５〜２００ｎｇ／ｍｍ2となるように、前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布する、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞に導入する方法に関する。より詳細には、高い導入効率で、簡便に核酸を細胞に導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に核酸を導入する技術としては、例えば、培地中へ核酸複合体を分散・溶解させて、培地から細胞内へ取り込ませるトランスフェクション、培養皿へ予め核酸複合体などをコーティングしておき、コーティング層から核酸の徐放や細胞による取り込みを利用して、接着基材側から遺伝子を導入するリバーストランスフェクションなどが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０９９９２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
リバーストランスフェクションとしては、例えば、曇点より低い温度では親水性であり、曇点より高い温度では疎水性となる温度感応性を示す温度感応性ポリマーである２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体のポリマーを用いて、上記ポリマーと核酸を混同させた核酸複合体の凝集層を培養皿底面に形成し、上記凝集層上に細胞を播種、培養して核酸を細胞内に導入する方法が知られている（特許文献１）。
【０００５】
核酸を細胞に導入し、遺伝子発現をさせるには、前提として、培地中および細胞質内で核酸が安定化されていることと、細胞分裂期に核酸が核周辺に存在することとがあげられる。一般的に、核酸複合体は、培地中のみならず細胞質内でも安定性が低い。また、導入された核酸は、細胞分裂期に遺伝子発現をし、休止期には遺伝子発現をしないとされている。そのため、細胞の分裂期において核酸複合体と細胞とを接触させ、細胞質内への取り込みと、導入された核酸の遺伝子発現の時間的なタイミングが近くなるように設定されることが多い。
このため、核酸複合体と細胞を接触させる際には、細胞の播種密度を下げ、増殖期にある細胞へ核酸の取り込みと、ｍＲＮＡへの転写とをほぼ同時に行う必要があり、核酸導入の際の細胞の播種密度は５０〜７０％コンフルエントで行なわれることが多い。
しかし、５０〜７０％コンフルエントの細胞のうち、増殖期にある細胞にしか核酸導入ができないため、得られる核酸導入細胞の数は少なくなる。また、核酸自体が細胞毒性を示すため、導入できる核酸の量も制限されていた。
【０００６】
特許文献１の方法は、初代培養細胞や分裂の遅い細胞にも有用で、細胞障害性の低い優れた方法であるが、従来と同様、導入できる核酸の量に制限があり、簡便に核酸の導入効率を一層向上させる方法が求められていた。
【０００７】
従って、本発明の目的は、核酸の導入効率が高く、簡便な、核酸を細胞に導入する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
そこで、本発明者らが鋭意検討した結果、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層上に播種する細胞の密度を所定以上とすることで、核酸の導入効率が高く、簡便な、核酸を細胞に導入する方法が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
すなわち、本発明は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布して低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成する準備工程と、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層上に、細胞を２０００個／ｍｍ2以上の密度で播種する播種工程と、播種した上記細胞を培養する培養工程とを含む核酸を細胞に導入する方法を提供する。
【００１０】
上記核酸中のリン酸残基中のリン原子数に対する、上記２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体側鎖のアミン性窒素原子数の割合（Ｎ／Ｐ比）が５以上であることが好ましい。
【００１１】
上記培養面が単位面積あたりに有する、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に含まれる、上記核酸の量が０．５〜５０ｎｇ／ｍｍ2であることが好ましい。
【００１２】
さらに、上記培養工程で培養した細胞を別の細胞培養器に播種する再播種工程を含むことが好ましい。
【００１３】
上記播種工程において、細胞を４０００個／ｍｍ2以上の密度で播種することが好ましい。
【００１４】
上記準備工程において、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体が５〜２００ｎｇ／ｍｍ2となるように、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布することが好ましい。なお、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体が５〜２５０ｎｇ／ｍｍ2となるように、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布してもよい。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、上記構成を有するため、核酸の導入効率が高く、操作が簡便である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例で得られた細胞構造体を、位相差顕微鏡で撮影した写真である。
【図２】図２は、実施例で得られた細胞構造体を、蛍光位相差顕微鏡で撮影した写真である。
【図３】図３は、実施例において、再播種した細胞構造体がブリードする様子を位相差顕微鏡で撮影した写真である。
【図４】図４は、実施例において、再播種した細胞構造体がブリードする様子を蛍光位相差顕微鏡で撮影した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の核酸を細胞に導入する方法は、調製工程、準備工程、播種工程、培養工程を少なくとも含む。上記調製工程の前、各工程の間、上記培養工程後に他の工程が含まれていてもよい（例えば、培養工程後に再播種工程、準備工程と播種工程の間に乾燥工程などが含まれていてもよい）。
【００１８】
（調製工程）
上記調製工程では、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体（ポリマー）と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する。
【００１９】
ＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリロイル基中のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリロイル基中のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。
【００２０】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（本明細書において、「ＤＭＡＥＭＡ」ともいう）の重合体は、温度応答性高分子として公知であり、その下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature、以下、「曇点」ともいう。）は３２℃程度である。
なお、本願明細書中では、組成物の「曇点」とは、必ずしも厳密な意味で、「所定の温度未満では溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、その温度」のみを指すものではなく、「不溶化して沈殿した組成物を所定の温度未満の条件下で溶解する際に、溶解に要する時間が１０分以上である、その温度」をも指す。
先般、発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、室温（２５℃）程度の曇点を有する低曇点型温度応答性ポリマー組成物（以下、単に「温度応答性ポリマー組成物」ともいう）を調製することに成功した。低曇点型温度応答性ポリマー組成物としては、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー組成物、混合型温度応答性ポリマー組成物などがある。
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー組成物は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）の繰り返し単位（後述）、及び該ＤＭＡＥＭＡの加水分解物の繰り返し単位（後述）を含む。発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー組成物を被覆してなる細胞培養器を調製した。
また、混合型温度応答性ポリマー組成物は、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸を含む（（２）トリスは任意選択的に含む。）。発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記混合型温度応答性ポリマー組成物を被覆してなる細胞培養器を調製した。
【００２１】
また、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体、及び核酸を含むことにより、曇点が室温（２５℃）以下であり、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成できる低曇点型温度応答性ポリマー組成物が得られる。
【００２２】
上記核酸としては、例えば、ＤＮＡ（一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）、ＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ）、修飾された核酸（例えば、モリフォリノ環を付加したＤＮＡ又はＲＮＡなど）及びこれらの組み合わせ、が挙げられる。上記核酸は、例えば、目的とする遺伝子の機能を発現できる形態（例えば、導入された細胞内で当該遺伝子が発現されるように配置されたプラスミド、プロモーター領域、開始コドン、目的遺伝子、終止コドン、ターミネーター領域が連続的に配列したプラスミドなど）であってもよい。
【００２３】
なお、導入された核酸は、遺伝子発現のほか、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイなどのオリゴヌクレオチドにより遺伝子発現抑制を目的としてもよい。遺伝子の種類は、特に限定されず、例えば、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子、ＢＲＣＡ癌抑制遺伝子、サイトカイン遺伝子（例えば、ＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−１２遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子、ＦＧＦ遺伝子など）、癌抗原ペプチド遺伝子（例えば、ｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１など）、ｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイ、ｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、Ｋｌｆ−４、ＮａｎｏＧなどが挙げられる。
【００２４】
上記核酸の長さとしては、特に限定されないが、例えば、２０〜１５，０００ｂｐ程度の当業者に周知の核酸の長さが使用可能であり、この点は、従来の合成高分子系遺伝子導入と同様で、ウイルスベクターのように使用できる核酸の長さに制限はほとんどない。
【００２５】
以下、一例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法について記載する。この例では、低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーと上記核酸とを含む。
【００２６】
この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（混合物調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
【００２７】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。
【００２８】
重合禁止剤の混合物に対する重量割合は、０．０１％〜１．５％であることが好ましく、０．１％〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される分子内イオン複合体型応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の混合物に対する重量割合は、１．０％〜５０％であることが好ましく、９．０％〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の分子内イオン複合体型応答性ポリマーを得ることができる。
【００２９】
次いで、この例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、混合物に紫外線を照射する（紫外線照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００３０】
紫外線の波長としては、２１０ｎｍ〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０ｎｍ〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、初期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００３１】
反応条件に関して、温度条件としては、１５℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７時間〜２４時間であることが好ましく、１７時間〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、分子内イオン複合体型応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
【００３２】
なお、調製工程において混合物が調製され終えてから、照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。
【００３３】
混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。
【００３４】
この例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
2016131536.tif 000002
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
2016131536.tif 000003
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
【００３５】
なお、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマー組成物の製造方法も、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法に含めることができる。
【００３６】
ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
【００３７】
この例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物中の、核酸中のリン酸残基中のリン原子数に対する、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体側鎖のアミン性窒素原子数の割合（Ｎ／Ｐ比）は、特に限定されないが、例えば、核酸を強く凝集させて分解酵素などの作用から核酸を保護し、かつ、陰電荷を持つ細胞膜との静電作用が強くなり、核酸を効率良く細胞内へ送達できるという観点から、例えば、２〜３０が好ましく、より好ましくは５以上（例えば、５〜２０）である。
また、Ｎ／Ｐ比を５以上とすることにより、陽電荷量が増大して、核酸を強く凝集させることができ、低曇点型温度応答性ポリマー組成物が安定化する。従来の方法では、Ｎ／Ｐ比が高いと、細胞に対する毒性を示すが、本願発明の方法によれば、毒性は著しく低減し、毒性はほとんどない。
【００３８】
以下、別の例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法について記載する。この例では、低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、ＤＭＡＥＭＡの重合体である温度応答性ポリマーを含む混合型温度応答性ポリマー組成物である。
【００３９】
すなわち、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸とを混合する（（２）トリスに関しては任意選択的とすることもできる）。
【００４０】
（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）の核酸は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。
【００４１】
この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
【００４２】
ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。
【００４３】
また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリル基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリル基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。
【００４４】
上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加などにより、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。
【００４５】
上記（３）核酸は、前述のとおりである。
【００４６】
また、上記（３）核酸は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、核酸は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
【００４７】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、さらに、核酸以外のアニオン性物質を含んでいてもよい。上記核酸以外のアニオン性物質としては、例えば、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、ポリビニル安息香酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩などが挙げられる。また、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸などのジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。
【００４８】
なお、上記核酸以外のアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。
【００４９】
ここで、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。
【００５０】
上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
【００５１】
また、上記割合は、０．１以上あることが好ましい。上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００５２】
上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。
【００５３】
上記の別の例の温度応答性ポリマー組成物中の、核酸中のリン酸残基中のリン原子数に対する、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体側鎖のアミン性窒素原子数の割合（Ｎ／Ｐ比）は、特に限定されないが、例えば、核酸を強く凝集させて分解酵素などの作用から核酸を保護し、かつ、陰電荷を持つ細胞膜との静電作用が強くなり、核酸を効率良く細胞内へ送達できるという観点から、例えば、２〜３０が好ましく、より好ましくは５以上（例えば、５〜２０）である。
また、Ｎ／Ｐ比を５以上とすることにより、陽電荷量が増大して、核酸を強く凝集させることができ、低曇点型温度応答性ポリマー組成物が安定化する。従来の方法では、Ｎ／Ｐ比が高いと、細胞に対する毒性を示すが、本願発明の方法によれば、毒性は著しく低減し、毒性はほとんどない。
【００５４】
なお、上記の別の例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）を必ずしも用いなくてもよく、この例による低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、（２）トリスを含まなくてもよい。
【００５５】
（準備工程）
上記準備工程では、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布して低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成する。すなわち、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面に被覆して、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成し、被覆細胞培養器を準備する。なお、本明細書において、培養面上に上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成した細胞培養器を、「被覆細胞培養器」と称する場合がある。
【００５６】
上記被覆細胞培養器において、培養面が単位面積当たりに有する、低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に含まれるＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の量は、特に限定されないが、低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器に均一に塗布でき、細胞構造体を形成しやすくなるという観点から、例えば、５〜２５０ｎｇ／ｍｍ2が好ましく、より好ましくは５〜２００ｎｇ／ｍｍ2である。すなわち、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体が５〜２００ｎｇ／ｍｍ2となるように、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布することが好ましい。上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、カチオン性のＤＭＡＥＭＡを有することにより、十分量の核酸を安定に担時することができる。
【００５７】
上記被覆細胞培養器において、培養面が単位面積当たりに有する、低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に含まれる上記核酸の量は、特に限定されないが、例えば、０．５〜２００ｎｇ／ｍｍ2（中でも、５〜２００ｎｇ／ｍｍ2）が好ましく、より好ましくは０．５〜５０ｎｇ／ｍｍ2（中でも、５〜５０ｎｇ／ｍｍ2）である。核酸の割合が上記範囲であることにより、高い密度で播種された多数の細胞へ核酸を送達する確率を上げることが可能であり、結果、核酸の細胞への導入効率を向上させることができる。
【００５８】
上記被覆細胞培養器によれば、例えば、室温のクリーンベンチ内で操作する際においても、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層はある程度の時間、具体的には５分〜４０分間、固化したままであるため、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層、ひいては培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができる。
【００５９】
特に、低曇点型温度応答性ポリマー組成物として、（２）トリスを含む混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、下記の作用効果を奏する。
上記被覆細胞培養器では、培養工程で、上記組成物に含まれるＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の疎水性側鎖と、トリスのアミノ基とが、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えるものと推定される。
また、上記組成物に含まれる（３）核酸は、培養工程で、上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にするものと推定される。
なお、上記被覆細胞培養器は、培養面に上記（１）及び上記（２）のみからなる組成物を被覆してなる被覆細胞培養器と比較して、細胞毒性、細胞傷害性が抑制され、細胞培養に適した表面状態を有していると推定される。
【００６０】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層の形成方法としては、特に限定されないが、例えば、曇点以下の温度まで冷却した低曇点型温度応答性ポリマー組成物の水溶液を、細胞培養器のウェルの底面に流延させて、その後、３７℃のインキュベーター中で静置して、低曇点型温度応答性ポリマー組成物を培養皿の底面へ沈降させれば使用可能である。
なお、上記組成物を被覆するために使用した水（上澄液）を除去して使用することも可能であり、さらに水を除去した後、上記組成物を乾燥させて使用することも可能であるが、必須の操作ではない。
【００６１】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層は、さらに乾燥をさせてもよい。乾燥の方法としては、特に限定されないが、例えば、加湿を一時的に停止させた細胞インキュベーター内に一定時間（例えば、２４時間程度）静置する方法などが挙げられる（乾燥工程）。
【００６２】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体、核酸、及びトリスが含まれる場合、上記被覆細胞培養器では、培養工程で、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の疎水性側鎖と、トリスのアミノ基とが、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えるものと推定される。また、核酸は、培養工程で、上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にするものと推定される。
【００６３】
（播種工程）
上記播種工程では、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層上に、細胞を２０００個／ｍｍ2以上の密度で播種する。
【００６４】
上記細胞としては、例えば、動物細胞が好ましく、より好ましくは動物の接着細胞である。具体的には、例えば、間葉系細胞（例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞など）、初代培養細胞（接着性を有し、コロニーを形成する初代培養細胞）、細胞株などが挙げられる。
【００６５】
播種する細胞の密度は、２０００個／ｍｍ2以上（例えば、２０００〜８０００個／ｍｍ2）であり、好ましくは４０００個／ｍｍ2以上（例えば、４０００〜６０００個／ｍｍ2）である。詳細なメカニズムは不明であるが、細胞の密度を上記範囲とすることにより、低曇点型温度応答性ポリマー組成物のＮ／Ｐ比が高い場合であっても、陽電荷による細胞の毒性が著しく低減する。そのため、Ｎ／Ｐ比を高い組成物を用いることができ、核酸の導入効率が向上する。
【００６６】
また、播種後の細胞の、細胞培養器の培養面の全表面積（低曇点型温度応答性ポリマー組成物層の一方の面の全表面積）（１００％）に対する、細胞の投影面積（細胞が占める表面積）の割合は、特に限定されないが、例えば、９０〜１００％（９０〜１００％コンフルエント）が好ましく、より好ましくは９５〜１００％（９５〜１００％コンフルエント）、特に好ましくは１００％である。割合が上記範囲であることにより、Ｎ／Ｐ比が高い組成物を用いることに起因する毒性を著しく低減させることができる。
なお、細胞が重層した状態（オーバーコンフルエント）も、１００％コンフルエントに含まれるものとする。
【００６７】
上記細胞密度に関して、例えば、２００ｍｍ2の培養面の面積及び１ｍＬの培地容量を有する２４ウェルプレートに、播種する場合に、２０００個／ｍｍ2以上の細胞密度で播種を行うためには、４０×１０4個／ｍＬ以上の細胞密度を有する細胞浮遊液を用いる必要がある。
【００６８】
上記播種工程における細胞の播種は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた上記被覆細胞培養器を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
【００６９】
（培養工程）
上記培養工程は、上記播種工程で播種した細胞を培養する工程である。
【００７０】
播種した細胞は、静置することが好ましい。播種した細胞を静置する温度は、特に限定されないが、例えば、３０℃以上が好ましく、より好ましくは３５〜３８℃、さらに好ましくは３７℃である。また、静置時間としては、特に限定されないが、例えば、１５分以上（例えば１５分〜２４時間）が好ましい。中でも、核酸の導入効率が一層向上するという観点から、１５分以上、３０℃以上の環境で静置することが好ましい。
なお、培地などの培養条件は、細胞の種類に基づいて、適宜選択することができる。
【００７１】
詳細なメカニズムは不明であるが、上記細胞密度で細胞を播種することにより、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成させることもできる。細胞構造体の形状は、細胞培養器に播種される細胞の密度に依存すると考えられる。また、細胞構造体内の細胞は、生存している。
【００７２】
上記培養工程で得られる細胞構造体とは、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層に対する接着力よりも細胞間の結合力が勝ることで、細胞群を塊として回収できる構造を有していれば特に限定されず、例えば、ペレット状の構造を有する細胞構造体（立体的な構造を有する細胞構造体）の他に、細胞同士が平面状に接着している構造体（平面構造の細胞構造体、シート状の細胞構造体）も含む。
【００７３】
本発明の方法によれば、播種工程において播種された細胞は、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層に付着し、細胞のレセプターが低曇点型温度応答性ポリマー組成物層側に集まり、培養工程において、該レセプターを介して核酸が効率よく取り込まれると考えられる。
【００７４】
（再播種工程）
上記再播種工程は、上記細胞構造体を回収し、回収した上記細胞構造体を分散させる工程である。
【００７５】
上記細胞構造体を回収する方法は、特に限定されないが、例えば、上記被覆細胞培養器を低曇点型温度応答性ポリマー組成物の曇点未満に置き、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層から細胞構造体を剥離させる方法などが挙げられる。
【００７６】
被覆細胞培養器から細胞構造体を剥離するには、播種した細胞の培養を継続するだけで達成できる。培養する細胞が細胞間マトリックスを生成して成熟することで細胞間の結合力が強まり、この結合力が低曇点型温度応答性ポリマー組成物層に対する細胞の接着力よりも勝るようになった時点で自然に細胞群を塊として回収することができる。
【００７７】
回収した上記細胞構造体は別の細胞培養器（上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成した細胞培養器と異なる細胞培養器）に播種することが好ましい。
回収した上記細胞構造体の内部の細胞は、構造体が形成される直前まではシート状に培養されていたため（凝集開始から構造体の形成までの時間は短い）、壊死しておらずほとんどの細胞が生存している。回収した上記細胞構造体を、他の細胞培養器に播種すると、培養面に接着した細胞の塊が崩壊してばらばらとなり、細胞がブリードして細胞培養器へ接着して伸展し、増殖を開始する。
【００７８】
回収した細胞構造体を播種する細胞培養器は、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成した細胞培養器よりも、培養面の面積が大きいことが好ましい。これにより、播種された細胞構造体は、細胞密度が低くなり、細胞を容易に分裂期へ移行させることができる。分裂期に移行した細胞は、導入された核酸の機能を発現（例えば、導入された核酸にコードされたタンパク質を発現）することができる。
【００７９】
回収した細胞構造体を培養する条件は、特に限定されず、適宜選択することができる。
【００８０】
通常の核酸導入法では、細胞の増殖期に核酸複合体を細胞と接触させるため、細胞密度を５０〜７０％コンフルエント程度で播種し、核酸の導入のタイミング（核酸複合体を添加するタイミング）を調整する必要があった。しかしながら、本願発明の方法によれば、細胞密度を高い状態で播種すればよく、操作が簡便である。
【００８１】
また、通常の核酸導入法は、核酸の導入効率が低く、得られる核酸が導入された細胞が少ない。しかしながら、本願発明の方法によれば、核酸の導入効率が高く、核酸が導入された細胞を大量得ることができる。
さらに、核酸の導入量が増えることにより、核酸が機能を発現している期間を長くすることができる。
【００８２】
さらに、核酸導入の際に、抗生物質や血清を除いた培地に交換する必要がなく、操作が簡便である。また、無血清培地を用いることなどによる細胞へのストレスが少ないため、培養皿への接着性が低い細胞（例えば、初代培養細胞など）でも、本発明の方法を適用することが可能である。さらに、抗生物質や生理活性物質の使用に制限がないため、各種細胞に適した条件で培養し、核酸を導入できる。
【００８３】
また、本願発明の方法によれば、高い細胞密度で、Ｎ／Ｐ比の高い低曇点型温度応答性ポリマー組成物を用いる、細胞にストレスの多い条件とした場合でも、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層から効率よく核酸を導入させることができ、休止期の細胞構造体を回収できる。すなわち、核酸は導入されているが、発現していない状態の細胞を調製することができる。このような細胞構造体は、所定の条件により保存をすることも可能と考えられる。
また、細胞構造体となった状態でも内部の細胞はすぐには壊死しないため、再播種が可能となる。さらに、再播種後に、細胞が一つ一つに分離してブリードするため、核酸が導入された細胞が、速やかに分裂期に入り、核酸の機能を発現する。そのため、容易に、高効率で核酸が導入された細胞群を得ることができる。
【００８４】
核酸を細胞に導入する方法において、低曇点型温度応答性ポリマー組成物のＮ／Ｐ比が高い場合、低曇点型温度応答性ポリマー組成物の安定性に優れるものの、陽電荷が高く細胞に対する毒性が強い。そのため、Ｎ／Ｐ比が高い組成物を添加すると細胞はネクローシスするため、核酸を細胞に導入する際、通常は、高いＮ／Ｐ比を有する組成物を用いることはできない。
しかしながら、本発明者らは、詳細な原理は不明であるが、驚くべきことに、細胞の播種密度が高くする（細胞密度を高くする）という容易な手法により、Ｎ／Ｐ比が高い（例えば、５以上）組成物の細胞毒性が著しく低減することも見出した。
【実施例】
【００８５】
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００８６】
下記の実施例において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。
【００８７】
（実施例１）
（１）低曇点型温度応答性ポリマー組成物（混合型温度応答性ポリマー組成物）の調製
（１−１）温度応答性ポリマーの調製
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート７．０ｇを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２１時間紫外線照射することにより、上記反応物を、溶媒を用いることなく（すなわち、ニート条件下で）、重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び、１５時間後に固化して、重合体が、反応生成物として得られた。この反応生成物を、クロロホルムに溶解させ、その後、ｎ−ヘキサンを用いて再沈殿させた。クロロホルム／ｎ−ヘキサンを用いた上記再沈殿を、計６回繰り返すことにより、反応生成物を精製した。
精製した重合体をエバポレーションすることにより、その中に残留する溶媒を除去した。その後、重合体を１５０ｍＬのベンゼンに溶解させ、ＰＴＦＥ製の０．４５μｍフィルター（ポール社製、型番：Ｅｋｉｃｒｏｄｉｓｋ  ２５ＣＲ）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、カチオン性の温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量４．３ｇ、転化率：６１．４％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝９７，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝４．１）と決定した。
また、このポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ2Ｏ）中で測定した。結果は下記の通りである。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, 3H, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, 2H, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, 6H, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, 2H, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, 2H, -O-CH2-)
【００８８】
（１−２）ポリマー／核酸の調製
以下、ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーのＰＢＳを用いた。
核酸として、ＲＦＰをコードするＤＮＡ（ｐＴｕｒｂｏ ６０４−Ｎ１）を用い、ＰＢＳに溶解させ、ＤＮＡ溶液を調製した（最終濃度：３３μｇ／ｍＬ）。
（１−１）で合成した温度応答性ポリマーを、ＰＢＳに溶解させ、ポリマー水溶液を調製し、この水溶液を４℃まで冷却することにより、この溶液を液体状態とした（最終濃度は、ポリマー：１００μｇ／ｍＬ）。
上記ＤＮＡ溶液３００μＬに、上記ポリマー溶液４００μＬを少しずつ滴下して混合した。この混合物をＰＢＳで希釈して全量を２ｍＬとし、混合型温度応答性ポリマー組成物（最終濃度、ポリマー：２０μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ：５μｇ／ｍＬ）を得た。
なお、上記混合型温度応答性ポリマー組成物におけるＮ／Ｐ比は、８であった。
【００８９】
（２）被覆細胞培養器の調製
（１−２）で調整した混合型温度応答性ポリマー組成物（低曇点型温度応答性ポリマー組成物）の水溶液を４℃まで冷却することにより、この溶液を液体状態とし、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、マイクロプレート、型番：３８１５−０２４、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ2）の各ウェルに、この溶液を２００μＬずつ（ポリマー２０ｎｇ／ｍｍ2、ＤＮＡ５ｎｇ／ｍｍ2）、室温下で加えて、素早く穴の底面の全面に流延させた。そして、この細胞培養皿を、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で６時間インキュベートした。
こうして、培養面であるウェルに低曇点型温度応答性ポリマー組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（被覆細胞培養器）が得られた。
【００９０】
（３）細胞の播種
続いて上記被覆細胞培養器の各ウェルに、ビーグル皮下脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＤＳＣ）を完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液、ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９６５、ＦＣＳ：インビトロジェン社製、ロット番号：８５２５４６）中に浮遊させ、細胞密度を４０×１０4個／ｍＬに調整し、この細胞液を１ｍＬずつ加えた。そして、この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で培養した。
なお、細胞は、播種した直後でおおむね１００％コンフルエントの状態であった。
【００９１】
培養開始とともに細胞は培養皿の底面へ一度接着して伸展した。培養６時間後に、細胞が互いに一箇所に凝集する現象が生じた。上記現象は、肉眼で十分に視認可能であった。互いに集まった細胞構造体は、立体的なペレット状の構造を形成することを、位相差顕微鏡で観察した（図１）。蛍光位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、ＩＸ−７０、波長６９９ｎｍ）により観察するとＲＦＰ由来の蛍光は確認されなかった（図２）。
【００９２】
２４時間培養後に形成されたペレット状の細胞構造体をピンセットで回収すると弾力性と粘着性に富み、引き伸ばしても千切れることなく１個の塊であることが確認された。細胞間マトリックスが豊富であると思料できた。このペレット状細胞構造体１個を完全培地１ｍＬで満たした別の２４Ｗｅｌｌ培養皿（ＦＡＬＣＯＮ社、細胞培養用マルチウエルプレート平底ポリスチレン）の１個のＷｅｌｌへ入れて静置すると、底まで沈降すると同時に培養皿の底面へ接着し、ピンセットでは剥がせなくなった。細胞構造体からは１個１個バラバラとなった細胞がブリードを開始し、培養皿へ伸展して増殖を開始した。２４時間後に顕微鏡観察を行なうと、位相差像からはペレット状細胞構造体からの継続的な細胞のブリードが確認され（図３）、蛍光像にＲＦＰ由来の蛍光が確認された（図４）。
【００９３】
核酸が発現されていなかったペレット状細胞構造体（図１、図２）から市販のポリスチレン製培養皿上へブリード、伸展して増殖を開始した細胞中でＲＦＰをコードする核酸が発現され、蛍光を発するのが確認された（図３、図４）。
【図１】
2016131536.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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