(57)【要約】【課題】  所定の薬物で処理することによって、植物の環境ストレスに対する耐性を強化する方法を提供する。【解決手段】  アブシジン酸で処理することによって植物の乾燥耐性を誘導し、乾燥ストレス又は凍結ストレスを負荷し、その後オートファジー抑制剤を用いて処理するか、又はオートファジー関連遺伝子を欠損させ、アブシジン酸で処理をした後に環境ストレスを負荷することにより、環境ストレスに対する耐性を強化させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境ストレスに対する植物の耐性を強化させる方法であって、
植物をアブシジン酸で処理する工程と、
前記アブシジン酸で処理した植物に環境ストレスを負荷する工程と、
前記環境ストレスを負荷した植物をオートファジー抑制剤で処理する工程と、を備える方法。
【請求項２】
環境ストレスに対する植物の耐性を強化させる方法であって、
植物のオートファジー関連遺伝子を欠損させる工程と、
前記オートファジー関連遺伝子を欠損させた植物をアブシジン酸で処理する工程と、
前記アブシジン酸で処理した植物に環境ストレスを負荷する工程と、を備える方法。
【請求項３】
前記植物が、非維管束植物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物が、蘚苔類である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記アブシジン酸の処理濃度が1μM〜100μMである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記アブシジン酸の処理濃度が25μM〜75μMである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アブシジン酸の処理濃度が50μMである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記環境ストレスが、乾燥ストレスである、請求項１、３〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記オートファジー抑制剤が、クラスIII PI 3-キナーゼの阻害剤、システインプロテアーゼの阻害剤及び液胞型H＋-ATPaseの阻害剤からなる群より選ばれるいずれかの抑制剤である、請求項１、３〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記オートファジー抑制剤が、3-メチルアデニンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オートファジー抑制剤が、E-64ｃ又はE-64ｄである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記オートファジー抑制剤が、コンカナマイシン又はバフィロマイシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記3-メチルアデニンの処理濃度が、5mM〜10mMである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記E-64ｃ又はE-64ｄの処理濃度が、10μM〜100μMである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記コンカナマイシン又はバフィロマイシンの処理濃度が、0.1〜1μMである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記環境ストレスが、乾燥ストレス又は低温ストレスである、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記低温ストレスを負荷する工程が、0℃以下で処理する第一処理段階を備える、請求項2〜７、１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記低温ストレスを負荷する工程が、0℃以上5℃以下で処理する第二処理段階を更に含む、請求項２〜７、１６、１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記オートファジー関連遺伝子が、ATG1〜ATG10遺伝子、ATG12〜ATG14遺伝子、ATG16〜ATG18遺伝子及びATG29遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子を含む、請求項２〜７又は１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記オートファジー関連遺伝子が、ATG5遺伝子、ATG7遺伝子、ATG8遺伝子及びATG12遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子を含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境ストレスに対する植物の耐性を強化させる方法に関する。より詳細には、オートファジー関連遺伝子を欠損させた形質転換植物をアブシジン酸で処理、又はアブシジン酸で処理した非形質転換植物をオートファジー抑制剤で処理することで、環境ストレスに対する植物の耐性を強化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物にとって、温度変化や乾燥などの環境ストレスは、生育を左右する大きな要因である。例えば、高温ストレス又は乾燥ストレスにより植物体の水分含有量が低下すると、植物は恒常性を維持できなくなり死に至る。また、低温ストレス下では、急冷による細胞内での水分の凍結又は緩速冷却による過度の脱水により、重大な障害を受ける。そのため、環境ストレスに強い植物について、様々な研究開発が進められている。
【０００３】
アブシジン酸（以下、ABAということがある）は、植物学の分野で広く知られている植物ホルモンの一つである。植物における乾燥耐性機構にはABA応答が関与することが知られ、種子成熟や種子休眠、気孔開閉の制御と乾燥耐性の誘導、老化の際の落葉などに関与している。さらに、植物が乾燥などの環境ストレスにさらされた時に、ABAは様々な応答機構を制御するなどの重要な生理機能を担っている。
【０００４】
これまで、シロイヌナズナを用いて環境ストレス負荷におけるABA応答の解析が盛んに行われてきた。ヒメツリガネゴケにおいてもABA応答が知られ、ABAによって高い乾燥耐性を誘導できることが知られている(非特許文献１)。このとき、乾燥によって蓄積される変性タンパク質は除去される必要があるが、その除去機構としてのオートファジーと乾燥耐性機構に関わる知見はこれまでに知られていない。
【０００５】
オートファジーとは、細胞質タンパク質やオルガネラなどの細胞質成分を、液胞やリソソーム内で分解する機構であり、その生理的意義は、主に栄養飢餓条件下でのタンパク質分解によるアミノ酸調達である。そのほか、オートファジーは個体発生やタンパク質代謝回転に関与しているとも考えられている(非特許文献２)。
【０００６】
オートファジーは、形態学的特徴に基づき、マクロオートファジーとミクロオートファジー、シャペロン介在性オートファジーに分類される(非特許文献３)。マクロオートファジーは大規模な細胞内成分の分解に最も大きく貢献しており、他の二つは生理的役割の重要性は未だはっきりしていない。そのため、一般的に、オートファジーはマクロオートファジーを指している。マクロオートファジーは以下の(1)〜(3)の過程に大別される。(1)細胞内成分を隔離膜が取り込み、オートファゴソームを形成する；(2)その後、あるオートファゴソームは直接液胞と融合し、また別のオートファゴソームはリソソーム様オルガネラと融合し、オートリソソームを形成してから液胞と融合する；(3)液胞と融合したオートファゴソームやオートリソソーム及びこれらに取り込まれた細胞質成分は、液胞内の様々な加水分解酵素によって分解される。
【０００７】
例えば、シロイヌナズナ培養細胞では、ショ糖飢餓に応答してタンパク質分解を伴うマクロオートファジーが起こることが知られており、栄養飢餓条件によって、植物におけるオートファジーが誘導されると考えられている。
【０００８】
オートファジーには、オートファジー関連タンパク質が必須である(非特許文献４)。
これまでの酵母を用いた研究により多数のオートファジー関連遺伝子が発見されている。2013年の時点では少なくとも38個発見されており、今後その個数は増えることが予想される(非特許文献５)。これらオートファジー関連遺伝子の産物であるオートファジー関連タンパク質群のうち、オートファゴソーム形成に必須なオートファジー関連タンパク質群として、ATG1〜10、ATG12〜14、ATG16〜18、ATG29の17つの因子が挙げられる。その中で、オートファゴソームの形成にはATG8結合系とATG12-ATG5結合系の2つが特に必要である。
【０００９】
ユビキチン様タンパク質であるATG8は、リン脂質結合体（ATG8-PE）としてオートファゴソーム膜に存在する (非特許文献６)。
ATG12はATG5と共有結合し、オートファゴソームの隔離膜の伸長に関与する(非特許文献７)。この2つの結合系にはATG7が必須な触媒として知られている(非特許文献８)。遺伝子配列の比較によって、オートファジー関連遺伝子は酵母、動物、植物において見られ、その分子機構は真核生物で広く保存されていることが知られている(非特許文献９)。
【００１０】
植物において、一連のオートファジーの各過程を阻害し、オートファジー経路全体を抑制するのがオートファジー抑制剤である。こうしたオートファジーの抑制剤としては、上記(1)〜(3)の過程を阻害する抑制剤が知られている。
一つ目は、オートファジー初期の過程で、細胞質成分を取り囲んで包み込むオートファゴソーム形成に関与するクラスIII PI 3-キナーゼの阻害剤であり、3-メチルアデニン（以下、3-MAということがある）がこれに含まれる。
二つ目は、オートファゴソームが液胞と融合し、オートファゴソーム内部の細胞質成分が、液胞内部にある加水分解酵素によって分解される過程において、該加水分解酵素の一つであるシステインプロテアーゼの阻害剤であり、E-64cやE-64dがこれに含まれる。
三つ目は、液胞内の加水分解酵素の至適pHを維持する液胞型H＋-ATPaseの阻害剤であり、コンカナマイシンAやバフィロマイシンがこれに含まれる。
【００１１】
これらのオートファジー抑制剤を用いて、オートファジーを抑制する有効濃度で植物を処理した場合、光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察すると、核の周囲に凝集物の蓄積や、細胞質に球状の未分解物が確認できる。
【００１２】
現存する陸上植物は、４億８千万年前に初めて海から陸上に進出した共通の祖先陸上植物に行き着く。この植物から、様々な植物が分化と絶滅を繰り返し、現代に至っている。  植物の系統樹をみると、この祖先陸上植物から最初に分岐したのがコケ植物であり、コケ植物は、その後に分化した被子植物と、祖先陸上植物が有していた形質を共有している。そのため、コケ植物が有する形質を理解することは、祖先陸上植物が有していた形質を理解することに繋がり、ひいてはその後に分化した植物の形質を理解することになる。
【００１３】
ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)は、1950年代から遺伝学の材料として用いられている植物である。その後、特定の遺伝子を計画的に操作する遺伝子ターゲティングが、他の多細胞生物の中で最も容易であることがわかり、被子植物のシロイヌナズナ、イネ、ポプラやブドウに次いでゲノム解読が行われ、現在約１万５千の遺伝子をカタログ化することに成功している植物である。
【００１４】
ヒメツリガネゴケは、モデル植物のひとつであるシロイヌナズナなどの高等植物と比べて、構造が簡単であるため形態学的観察が容易であり、成長が早く、アブシジン酸による乾燥耐性を誘導できるなどの特徴も有する。そのため、ヒメツリガネゴケは、効率良く相同組換えを行うことが可能な数少ない多細胞生物の一つとして、植物の進化や発生、生理学、バイオテクノロジー分野等でモデル生物として利用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２０１４−５０９６５０
【特許文献２】特表２０００−５１１０５９
【特許文献３】特開２０１１−２２９５１１
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Nature Communications 4 (2013)
【非特許文献２】Science 290(5497) 1717-1721 (2000)
【非特許文献３】Autophagy 3(4) 295 (2007)
【非特許文献４】Developmental cell 6(4) 463-477（2004）
【非特許文献５】The Journal of cell biology 203(2) 299-313 (2013)
【非特許文献６】Cell 130(1) 165-178 (2007)
【非特許文献７】Cell death and differentiation 14(7) 1247-1249 (2007)
【非特許文献８】Journal of Biological Chemistry 276(3) 1701-1706 (2001)
【非特許文献９】Plant Physiology 129(3) 1181-1193 (2002)
【非特許文献１０】The plant cell 10(8) 1391-1406 (1998)
【非特許文献１１】Plant Science 6(9) 431-438 (2001)
【非特許文献１２】Journal of Experimental Botany 59(14) 4029-4043 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
特表２０１４−５０９６５０（以下、「従来技術１」という。）には、高温ストレス下でも植物の生産性を改善する方法が開示されている。従来技術１は、サイトカイニンなどの植物ホルモンをイネやとうもろこしに処理することで、種子の収量を増加させる点では優れた発明である。一方で、植物ホルモンであるゼアチンを含む培地で育てたシロイヌナズナでは、発育障害が見られる例も報告されている（非特許文献１０)。
【００１８】
特表２０００−５１１０５９（以下、「従来技術２」という。）には、ガラス化法による貯蔵方法が開示されている。従来技術２は酵素やペプチドなどを高温条件で脱水することで、安定したガラス化法を提供している点において優れた発明である。一方で、ガラス化法においては、吸水過程での細胞へのダメージが原因で、乾燥状態からの水戻し後の生存率が十分でないという例も報告されている（非特許文献１１）。
【００１９】
また、特開２０１１−２２９５１１（以下、「従来技術３」という。）には、乾燥ストレス耐性を与えるための特定の転写因子を過剰発現させるDNAの発明が開示されている。従来技術３は、タンパク質の生産性が向上させ、乾燥ストレスを向上させる点で優れている。一方、特定の遺伝子を過剰発現させることで、植物体が矮性化し、成長が遅延するなどの報告例もある（非特許文献１２）。
【００２０】
そのため、遺伝子の過剰発現やオートファジー阻害剤としての植物ホルモンに頼らず、環境ストレス後の生存率が高くなるような、環境ストレスに対して植物の耐性を強化させる新たな方法の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本願の発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、植物の乾燥耐性を誘導して、環境ストレス負荷後の再培養や吸水再開時に、オートファジーを抑制することで、環境ストレスに対する植物の耐性を強化しうる方法を見出し、本発明を完成した。
【００２２】
すなわち、本発明の第一の実施態様は、環境ストレスに対する植物の耐性を強化させる方法であって、(A1)植物をアブシジン酸で処理する工程と、(B1)前記アブシジン酸で処理した植物に環境ストレスを負荷する工程と、(C)前記環境ストレスを負荷した植物をオートファジー抑制剤で処理する工程と、を備える方法である。前記植物は、非維管束植物であることが好ましく、蘚苔類であることがより好ましい。前記アブシジン酸の処理濃度は、1μM〜100μMであることが好ましく、25μM〜75μMであることがより好ましく、50μMであることが特に好ましい。前記環境ストレスは、乾燥ストレスであることが好ましい。
【００２３】
前記オートファジー抑制剤は、クラスIII PI 3-キナーゼの阻害剤、システインプロテアーゼの阻害剤及び液胞型H＋-ATPaseの阻害剤からなる群より選ばれるいずれかの抑制剤であることが好ましく、3-メチルアデニン、E-64c又はE-64d、コンカナマイシン又はバフィロマイシンであることがより好ましい。前記3-メチルアデニンの処理濃度は、5mM〜10mMであることが好ましい。前記E-64c又はE-64dの処理濃度は、10μM〜100μMであることが好ましい。前記コンカナマイシン又はバフィロマイシンの処理濃度は、0.1μM〜1μMであることが好ましい。
【００２４】
本発明の第二の実施態様は、環境ストレスに対する植物の耐性を強化させる方法であって、(X)植物のオートファジー関連遺伝子を欠損させる工程と、(A2)前記オートファジー関連遺伝子を欠損させた植物をアブシジン酸で処理する工程と、(B2)前記アブシジン酸で処理した植物に環境ストレスを負荷する工程と、を備える方法である。
【００２５】
前記植物は、非維管束植物であることが好ましく、蘚苔類であることが特に好ましい。前記アブシジン酸の処理濃度は、1μM〜100μMであることが好ましく、25μM〜75μMであることがより好ましく、50μMであることが特に好ましい。前記環境ストレスは、乾燥ストレス又は低温ストレスであることが好ましい。前記低温ストレスを負荷する工程が、0℃以下で処理する第一処理段階を備えることが好ましく、0℃以上5℃以下で処理する第二処理段階を更に含むことが好ましい。
【００２６】
前記オートファジー関連遺伝子は、ATG1〜ATG10遺伝子、ATG12〜ATG14遺伝子、ATG16〜ATG18遺伝子及びATG29遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子を含むことが好ましく、ATG5遺伝子、ATG7遺伝子、ATG8遺伝子及びATG12遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子を含むことがより好ましい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、オートファジー阻害剤として植物ホルモンを使用せず、また特定の遺伝子を過剰発現させない方法で、環境ストレスに対する植物の耐性を強化する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１はヒメツリガネゴケの野生株を、アブシジン酸（ABA）処理後に乾燥ストレス負荷を与え、その後の吸水再開時に3-メチルアデニン（3-MA）を含む寒天培地で3日間培養ときの結果を示す。
【図２】図２はヒメツリガネゴケの野生株を、ABA処理後に乾燥ストレス負荷を与え、その後の吸水再開時に3-MAを含む液体培地で3時間培養ときの結果を示す。
【図３】図３は、図１と図２と同条件で処理したヒメツリガネゴケ野生株の、タンパク質を分析した実験結果を示す。(A)はLowry法でタンパク質含有量を、(B)は電気泳動で調べた結果を示す。R24（a）は3-MA未処理群、R24（b）は寒天培地で24時間3-MA処理した群、R24（ｃ）は液体培地で3時間3-MA処理した群を示す。
【００２９】
【図４】図４は、GFP-AtATG8を発現するよう形質転換させたヒメツリガネゴケに対し、乾燥ストレス負荷後の吸水再開時に3-MA処理したときの、ウェスタンブロッティング解析の結果を示す。
【図５】図５は、乾燥ストレス負荷後のヒメツリガネゴケの野生株を、3-MAを含む液体培地で培養した後、totalRNAを抽出して電気泳動した結果を示す。26Sと18Sはそれぞれリボソームを構成するrRNAのサブユニットを示す。
【図６】図６は、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の、欠損領域と導入領域のcDNAとPpATG5ゲノム〜Pcmv領域を電気泳動で調べた結果を示す。（A）は導入領域の構造、（B）は欠損領域のcDNA、及び（C）はPpATG5ゲノム〜Pcmv領域の電気泳動の結果を示す。
【００３０】
【図７】図７は、ヒメツリガネゴケの野生株とATG7遺伝子欠損株の、欠損領域と導入領域のcDNAとPpATG7ゲノム領域を電気泳動で調べた結果を示す写真である。（A）は導入領域の構造、（B）はPpATG7ゲノム領域と導入領域の電気泳動の結果を示す。
【図８】図８は、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の、ABA処理による培養結果を示した写真である。（A）はABA未処理群、（B）と（C）はそれぞれATG5遺伝子欠損株とATG7遺伝子欠損株のABA処理群であり、それぞれの群の乾燥ストレス負荷後の吸水再開（R0d）から7日（R7d）までの結果を示す。
【図９】図９は、ABAで処理したヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の、低温ストレス負荷後の、再培養時の結果を示す。
【００３１】
【図１０】図１０は、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株を、乾燥ストレス負荷後の吸水再開時に、エバンスブルーで染色したときの写真を示す。
【図１１】図１１は、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の、乾燥ストレス負荷後の水分含有量の測定結果を示す。(A)は野生株、（B）はATG5遺伝子欠損株の結果を示す。
【図１２】図１２は、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の、ABA処理前後の水分含有量と総タンパク質含有量の測定結果を示す。(A)と(C)はABA処理前の水分含有量と総タンパク質含有量、(B)と(D)はABA処理後の水分含有量と総タンパク質量をそれぞれ示す。
【００３２】
【図１３Ａ】図１３Ａは、吸水再開（R0d）から24時間（R24h）までの、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の、ABA処理と乾燥ストレス負荷後の、吸水再開以降の総タンパク質の経時変化を電気泳動で分析した結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは吸水再開から3日後（R3d）までの、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の、ABA処理と乾燥ストレス負荷後の、吸水再開以降の総タンパク質の経時変化を電気泳動で分析した結果を示す。
【図１４】図１４は、ヒメツリガネゴケの野生株の、ABA処理及び乾燥ストレス負荷後のオートファジー関連遺伝子の発現量の経時変化のグラフ（A）と、GFP-AtATG8タンパク質分解の経時変化の結果（B）を示す。
【図１５】図１５は、ヒメツリガネゴケの野性株とATG5遺伝子欠損株を、100μMのE-64d又は0.1μMのコンカナマイシンAで処理したときの、顕微鏡写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００３４】
１．オートファジー抑制剤を用いた環境ストレス耐性強化方法について
本発明の第一の実施態様は、環境ストレスに対する植物の耐性を強化させる方法であって、(A1)植物をABAで処理する工程と、(B1)前記ABAで処理した植物に環境ストレスを負荷する工程と、(C)前記環境ストレスを負荷した植物をオートファジー抑制剤で処理する工程と、を備える方法である。
【００３５】
本発明において、上記(A1)工程で対象とする「植物」とは、オートファジーを起こす植物をいい、具体的には、種子植物とシダ植物からなる維管束植物や、蘚苔類や藻類からなる非維管束植物がこれに含まれる。ここで、「維管束植物」とは、植物の茎や葉、根等にある柱状の組織の集まりである維管束を有する植物をいい、この維管束を通して根から水分を吸い上げ、光合成産物などを組織に運搬して生体を維持する植物をいう。また、「非維管束植物」とは、上記の維管束を有さない植物をいう。
【００３６】
まず、「種子植物」は、被子植物と裸子植物とに大別される。前記被子植物のうち、オートファジーを起こす双子葉植物の例としてはシロイヌナズナ等を挙げることができ、単子葉植物としてはイネ等を挙げることができる。裸子植物でオートファジーを起こす植物として、スギ、サワラ、コノテガシワ、アカマツなどを挙げることができる。シダ植物としては、イワヒバやコンテリクラマゴケ等を挙げることができる。「蘚苔類」としては、スギゴケやマゴケなどを含む蘚類や、ゼニゴケなどを含む苔類及びツノゴケ類を例示することができる。「藻類」は、光合成を行う植物のうち、種子植物、シダ植物、及びコケ植物を除いた植物であり、紅藻や緑藻などの海藻やシアノバクテリア等を例示することができる。
【００３７】
上記(A1)工程で対象とする植物は、非維管束植物であることが好ましく、具体的には、蘚苔類、藻類等を挙げることができる。こうした非維管束植物の中でも、蘚苔類を対象とすることが、個体表面から水分や栄養等を吸収できる理由からさらに好ましい。
前記(A1)工程の「植物をABAで処理する」とは、植物に環境ストレスを負荷する前に、乾燥耐性誘導する濃度のABAを植物が吸収できる状態におくことをいう。具体的には、植物が生育している土壌や培地等に所定の濃度のABAを加えることや、所定の濃度のABAを含んだ土壌や培地に、他の場所で生育している植物を植え替えることをいう。ここでいう所定の濃度は、25μM〜75μMであることが環境ストレス耐性を強化することができることから好ましく、50μMであることが環境ストレス耐性をより高めることができる点でさらに好ましい。
【００３８】
ABAで植物を処理する期間は、ABAによる乾燥耐性誘導が生じるのに必要な期間であり、具体的には環境ストレスを負荷する前数日間に処理することができ、または環境ストレスを負荷する前1日間に処理してもよい。
【００３９】
上記(C)工程におけるオートファジー抑制剤は、クラスIII PI 3-キナーゼの阻害剤、システインプロテアーゼの阻害剤及び液胞型H＋-ATPaseの阻害剤からなる群より選ばれるいずれかの抑制剤であることが、オートファジーの主要な過程を阻害できることから好ましい。クラスIII PI 3-キナーゼの阻害剤は、真核生物の細胞膜に存在する、イノシトールリン脂質をリン酸化する酵素の阻害剤であり、例えば、3−メチルアデニン等を挙げることができる。システインプロテアーゼの阻害剤は、触媒部位における求核基であるチオール基と結合することで、タンパク質分解を阻害するような作用をする薬剤であり、例えば、E-64c、E-64d等を挙げることができる。
【００４０】
液胞型H＋-ATPaseの阻害剤は、液胞やリソソームなどの細胞膜に存在し、ATPの分解エネルギーを利用してプロトンを能動輸送する酵素を阻害するような作用をする薬剤であり、例えば、バフィロマイシンやコンカナマイシン等を挙げることができる。こうした阻害剤の中でも、3-メチルアデニン、E-64c、E-64d、コンカナマイシン又はバフィロマイシンを使用することが、オートファジーを効果的に阻害できることから好ましい。
【００４１】
(C)工程の「植物をオートファジー抑制剤で処理する」とは、環境ストレスを負荷する工程後の遅くとも24時間以内に、オートファジーを阻害することのできる有効濃度で、植物がオートファジー抑制剤を吸収できる環境におくことをいう。「オートファジーを阻害することのできる有効濃度」とは、オートファジー抑制剤で処理された植物細胞を、光学顕微鏡や電子顕微鏡などで観察した際に、オートファジーが阻害されたことに起因する核の周囲に凝集物の蓄積や、細胞質に球状の未分解物が確認できる濃度をいう。また「植物がオートファジー抑制剤を吸収できる環境におく」とは、環境ストレスの負荷後、上記オートファジー抑制剤を含んだ土壌や培地などに、植物を植え替えることをいう。
【００４２】
以下にヒメツリガネゴケを用いた、第一の実施態様による環境ストレスに対する強化の方法を説明する。
【００４３】
まず、ヒメツリガネゴケを0.1〜1.5mM 塩化カルシウム、2.5〜7.5mM 酒石酸アンモニウム、20〜36mM グルコース及び0.15〜0.25M リン酸カリウムを含むヒメツリガネゴケ培養用BCDATG培地等の培地で5〜7日間、室温下で培養する。次いで、培養したヒメツリガネゴケのコロニーを、1〜100μM（終濃度）のABAを含む培地の上に載せ、室温下で24時間〜3日間ABAをヒメツリガネゴケに吸収させる、ABA処理工程を行う。
【００４４】
次いで、デシケーター内のシリカゲル上にろ紙をしき、その上にヒメツリガネゴケコロニーを置いて室温下で24時間〜3日間乾燥処理する。この乾燥ストレス負荷の工程は、例えば、電気乾燥庫を使用する場合、温度を20℃〜25℃に設定する。機器の説明書に従い、植物の大きさに応じてタイマーをセットして、庫内で植物に乾燥ストレスを負荷することもできる。
ヒメツリガネゴケやシロイヌナズナのような、培地で培養できる植物の場合、シリカゲルのような乾燥剤を入れた、ガラス製やプラスチック製等のデシケーターや密閉可能な容器の中に入れて、室温下で1時間〜数日間おくことで乾燥ストレスを負荷するようにしてもよい。
【００４５】
次いで5〜10mM（終濃度）の3-MAを含んだグルコース欠乏BCDATG寒天培地等の培地に、上記乾燥ストレス負荷を与えたヒメツリガネゴケのコロニーを移し、室温下で24時間〜3日間培養してオートファジー抑制剤を吸収させて、オートファジーを阻害する。
このとき、コンカナマイシンやバフィロマイシン終濃度が、0.1〜1μMとなるように調製した培地に、乾燥ストレス負荷を与えたヒメツリガネゴケのコロニーを移し、室温下で培養して、オートファジーを阻害することもできる。さらに、E-64cやE-64dの終濃度が10〜100μMとなるように調製した培地に、乾燥ストレス負荷を与えたヒメツリガネゴケのコロニーを移し、室温下で培養して、オートファジーを阻害することもできる。
【００４６】
このオートファジー抑制剤で処理する工程を行うことで、細胞内の核の周囲に凝集物の蓄積や、細胞質に球状の未分解物を確認することができる。
これら(A1)、(B1)及び(C)工程によりにより、乾燥ストレスに対するヒメツリガネゴケの耐性を強化することができる。
【００４７】
２．オートファジー関連遺伝子を欠損させる環境ストレス耐性強化方法
本発明の第二の実施態様は、環境ストレスに対する植物の耐性を強化させる方法であって、(X)植物のオートファジー関連遺伝子を欠損させる工程と、(A2)前記オートファジー関連遺伝子を欠損させた植物をアブシジン酸で処理する工程と、(B2)前記アブシジン酸で処理した植物に環境ストレスを負荷する工程と、を備える方法である。
前記(X)工程の「オートファジー関連遺伝子」とは、オートファジーの制御機構に関連するタンパク質群をコードする遺伝子をいい、オートファジー関連遺伝子は現在38個が知られているが、これらに限られない。
【００４８】
これらオートファジー関連遺伝子が産生するオートファジー関連タンパク質群のうち、オートファゴソーム形成に関与するタンパク質には、ATG1〜10、ATG12〜14、ATG16〜18、ATG29までの17のタンパク質があり、このうちATG5、ATG7、ATG8及びATG12のタンパク質がオートファゴソーム形成初期の膜形成に関与するタンパク質である。
(X)工程のオートファジー関連遺伝子は、ATG1〜10、ATG12〜14、ATG16〜18、ATG29の各タンパク質をコードする、ATG1〜ATG10遺伝子、ATG12〜ATG14遺伝子、ATG16〜ATG18遺伝子及びATG29遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子を含むことが、オートファゴソーム形成に関与する遺伝子という理由から好ましい。
【００４９】
また、ATG5タンパク質をコードするATG5遺伝子、ATG7タンパク質をコードするATG7遺伝子、ATG8タンパク質をコードするATG8遺伝子及びATG12タンパク質をコードするATG12遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも一つの遺伝子を含むことが、オートファゴソーム形成に強く関与する遺伝子であるという理由からより好ましい。
【００５０】
前記(X)工程に用いる植物は、第一の実施態様の(A1)工程の対象植物と同じである。
前記(B2)工程の「植物に環境ストレスを負荷する工程」とは、植物を生育困難な条件下におくことをいう。一般的な環境ストレスとしては、温度ストレス、紫外線ストレス、乾燥ストレス等を挙げることができるが、上記(B2)工程で付加する前記環境ストレスは、乾燥ストレス又は低温ストレスであることが、環境ストレス後の耐性強化の点から好適である。ここで、前記低温ストレスを負荷する工程が、0℃以下で処理する第一処理段階を備えることが好ましく、0℃以上5℃以下で処理する第二処理段階を更に含むことが、環境ストレス後の生存率を高めることから好ましい。
【００５１】
以下にヒメツリガネゴケを用いた、第二の実施態様による環境ストレスに対する強化の方法を説明する。
本発明において、（X）工程は、公知の遺伝子操作の手法により行うことができる。例えば、DNAの相同組換えを利用して、遺伝子のノックアウト（遺伝子破壊）する方法で行うことができる。すなわち、目的の遺伝子をプラスミドにクローニングし、蛋白質をコードする領域の中に抗生物質耐性遺伝子を挿入した遺伝子破壊用プラスミドを、植物の細胞中に導入することで、プラスミドとゲノム間の相同な領域の間で組換えを起こすことで、遺伝子を欠損させることができる。
【００５２】
欠損させる遺伝子は、例えば、NCBIのBLASTリサーチから、遺伝子解析が終了しているシロイヌナズナ（Arabidopsis. thaliana ）のオートファジー関連遺伝子（AtATG）と相同性の高い遺伝子として選択することができる。ヒメツリガネゴケのオートファジー関連遺伝子（PpATG）の場合、例えば、これによりAtATG7タンパク質と相同性の高いタンパク質（スコア：688、e-value：0.0）をコードするPpATG7遺伝子やPpATG5遺伝子等を選択することができる。このようにして選択したオートファジー関連遺伝子のノックアウト用コンストラクト作製のために、オートファジー関連遺伝子に任意のプライマーを使用して、常法によりPCRで増幅させる。
この増幅産物を適当なベクターに挿入してライゲーションしたのち、増幅産物のオートファジー関連遺伝子領域内を適当な制限酵素で処理して取り除く。この領域に、同じ制限酵素によって別のベクターから切り出した薬剤耐性マーカー遺伝子を含む領域を挿入することができる。
【００５３】
薬剤耐性マーカー遺伝子には、nptII、hpt(aphIV)やzeocin registant gene(ble)などの周知の遺伝子を使用することができる。このとき、オートファジー関連遺伝子は、薬剤耐性マーカー遺伝子の上流と下流に、それぞれターゲット領域のゲノムDNA配列を連結するようにデザインしてもよく、ターゲット遺伝子をそっくり欠損させ、薬剤耐性マーカー遺伝子と置換したコンストラクトを構築してもよい。
その後、常法によりプラスミドを増殖させたのち、プラスミドを抽出しヒメツリガネゴケに導入することができる。
【００５４】
遺伝子を導入するには、ポリエチレングリコール（PEG）法、マイクロインジェクション法、エレクトロンポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法、ウィスカー法などを用いることができる。マイクロインジェクション法は、顕微鏡下でガラス針に細胞に孔をあけてDNAを挿入する方法である。エレクトロポレーション法は、高電圧の印加によって一過的に細胞膜に修復可能な孔を生じさせ、そこからDNAを取り込ませる方法である。パーティクルガン法は、金属粒子にDNAをまぶして、ガスや火薬などの力により細胞に打ちこむ方法である。ウィスカー法は、鋭く尖った針状のウィスカーと細胞を、DNAを含む溶液中で撹拌することで、細胞に微細な穴が開き、そこからDNAを細胞に取り込む方法である。
【００５５】
アグロバクテリウム法は、土壌細菌であるアグロバクテリウム（Agrobacterium tumegfaciens）が植物に感染し、体内の遺伝子領域を宿主に導入して自分が生きてくために必要な養分を作らせる性質を利用する方法である。アグロバクテリウムのプラスミドに目的とする遺伝子を結合させ、アグロバクテリウムを植物に感染させる事で、植物に目的とする遺伝子を導入することができる。
【００５６】
PEG法を用いる場合は、所定の条件で増殖させたプラスミドベクターから、任意の制限酵素を用いてターゲット領域を切り出して線状化させる。
次いで、ヒメツリガネゴケをセルラーゼ等の酵素で細胞壁を除去し、浸透圧を調整した溶液中でプロトプラストを調製する。これをろ過して回収し、プロトプラスト用液体培地の中に、上記線状化させたプラスミドベクターと入れて軽く撹拌し、室温で数日間培養することで、相同組換えにより目的とする遺伝子を導入し、遺伝子欠損株を作製する。
細胞壁分解酵素としては、例えば、セルラーゼ・プロテアーゼ・ペクチナーゼ複合酵素であるドリセラーゼを用いてもよい。
【００５７】
この方法により遺伝子を導入した形質転換体を選択するときは、１次スクリーニングと２次スクリーニングを行う。具体的には、１次スクリーニングは選択薬剤を含む選択培地に形質転換体を移し、所定の条件で培養する。選択薬剤としては、例えばマーカー遺伝子にnptIIを使用した場合はジェネティシンを、hpt(aphIV)を使用した場合はハイグロマイシンBを、bleを使用した場合はゼオシンを選択することができる。
【００５８】
その後の２次スクリーニングで、生育した形質転換体を選択薬剤が含まれない培地に移し、所定の条件で培養する。その中で生育したコロニーを形質転換体として選抜する。
選抜した形質転換体の成否は、形質転換体の選択後に生育した形質転換体と、形質転換していない非形質転換体のゲノムDNAとcDNAの発現を調べることで確認することができる。例えば、オートファジー関連遺伝子を欠損するべき領域（欠損領域）と、相同組換えにより導入された領域（導入領域）の長さが同じである場合、同じプライマーを使用しても、ゲノムDNAの発現量を電気泳動で調べることで判別することができる。欠損領域と導入領域が同じ長さである場合は、片方を同じプライマーを使用し、もう片方を別のプライマーを使用し、かつゲノムDNAの他に、cDNAの発現量を調べることで判別することができる。
【００５９】
こうして、(X)工程を行ったあと、ヒメツリガネゴケを(A1)工程の植物をABAで処理するのと同じ方法で(A2)工程を行う。
上記(A2)工程を行った後、（B2)工程の処理を行う。例えば、約0℃未満に設定された冷凍庫の中にヒメツリガネゴケを入れて凍結させる。約30分後、凍結したヒメツリガネゴケを冷凍庫から取り出し、約0〜約5℃に設定された冷蔵庫内で約30分間ゆるやかに解凍させることで、低温ストレスを負荷することができる。また上記(A2)工程を行った後、上述した(B1)工程と同じ乾燥ストレスを負荷することもできる。これらの(X)、(B2)及び(C)工程により、乾燥ストレスや低温ストレスに対するヒメツリガネゴケの耐性を強化することができる。
【００６０】
３．環境ストレス耐性の評価方法
環境ストレスに対する植物の耐性の強化の評価は、例えば環境ストレス負荷後の吸水再開以降や再培養以降の生育状態の形態観察や、エバンスブルー染色による死細胞の有無の程度、植物中の水分含有量やタンパク質含有量などに基づいて行うことができる。
エバンスブルーは、細胞膜の機能を失った細胞、すなわち死細胞を青く染色する試薬であり、生細胞確認試薬として広く使用されている。環境ストレス負荷後の植物に使用した場合、死細胞が多いほど植物全体が青くなるため、植物が環境ストレスに対して強化されているか否かを形態観察で判別することができる。
【００６１】
水は生命機能の維持に不可欠の物質の１つである。一般に生体内の水分含量は80％ほどであるが、水分含量が低下すると、生物は恒常性を維持できなくなり死に至る。そのため、水分含有量を多く保持できる能力は環境ストレスに対する耐性を反映する。こうした水分含有量は、例えば、常圧加熱乾燥法や近赤外分析計や電気水分計など用いて測定することができる。
【００６２】
タンパク質は、組織や酵素等を構成し生命活動を維持するために不可欠な成分であり、またリボソームはタンパク質合成の場であるため、リボソームを構成するリボソームRNAの減少は、直接生命活動に影響する。そのため、これらを分析することで、生命活動の適否が分かり、植物が環境ストレスに対して強化されているか否かを判別する指標になる。
タンパク質含有量は、例えばLowry法やビューレッド法などの周知の方法を用いて測定することが出来る。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）3-MA処理ヒメツリガネゴケの形態観察による乾燥誘導及び乾燥耐性評価
（１）培地の調製
ヒメツリガネゴケ培養用の寒天培地及び液体培地を以下のように調製した。表1に示す配合で、純水を用いて各ストック液を調製した。その後、各10mlのストックＢ液、ストックＣ液及びストックＤ液、1mlのAlternative TES液、10mlのAmmonium Tartrate液、20mlのCaCl2液及び5ｇのグルコースと8ｇの寒天に、純水を加え1Lとなるように調製し、オートクレーブした（121℃、20分間、以下、全ての実施例で条件同じとした）。溶けた寒天培地を60mmφのプラスチックシャーレに分注し、BCDATG寒天培地とした。
【００６４】
【表１】
2016199519.tif 000002
【００６５】
表１の各10mlのストックＢ液、ストックＣ液及びストックＤ液、1mlのAlternative TES液、10mlのAmmonium Tartrate液、20mlのCaCl2液及び5ｇのグルコースに、純水を加え1LとなるようにBCDATG液体培地を調製し、オートクレーブした。
【００６６】
（２）ヒメツリガネゴケの培養、ABA処理及びストレス負荷
ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）原糸体は埼玉大学  竹澤研究所から入手した。これを、1mM 塩化カルシウム、5mM 酒石酸アンモニウム、28mM グルコース及び0.184M リン酸カリウムを含む0.8％ BCDATG寒天培地で7日間、25℃、明条件下で培養した。
上記ヒメツリガネゴケのコロニーを、50μM（終濃度）ABA（SIGMA-ALDRICH製）を含むBCDATG寒天培地上のセロハンに移し、25℃で24時間培養した。その後、上記ABA処理したヒメツリガネゴケのコロニーを、シリカゲル入りの容器に入れて25℃で24時間、暗所で乾燥ストレスを負荷した。
【００６７】
（３）3-MA処理
蒸留水で3-MA粉末（SIGMA-ALDRICH製）を溶解し、100mM 3-MA溶液を作製し、マイナス20℃で保存した。3-MA溶液は、使用直前に100℃で数分間温め、完全に溶解させた。溶解させた3-MAを、終濃度が5mMになるよう上記BCDATG寒天培地とBCDATG液体培地に加えた。上述したABA処理及び乾燥ストレスを負荷したヒメツリガネゴケコロニーを、培地に戻して吸水させる吸水再開以降に、表２の３つの条件(a)〜(c)で、上記3-MA含有培地で25℃、明条件下で培養した。
【００６８】
【表２】
2016199519.tif 000003
【００６９】
吸水再開直後から、3-MA含有のBCDATG培地で培養したヒメツリガネゴケは、寒天培地（図１；＋3‐MA）及び液体培地（図２；＋3-MA）のいずれの場合においても、吸水開始（R0d）後の7日目（R7d）まで茶色の枯死の様相を呈していた。しかし、吸水開始後14日目（R14ｄ）には緑色の度合いが強まりつつ増殖し、乾燥耐性誘導及びオートファジー阻害効果による強い乾燥耐性による回復傾向を示した。一方、3-MAを含まないBCDATG培地で培養したヒメツリガネゴケは、寒天培地（図１；−3-MA）及び液体培地（図２；−3-MA）のいずれにおいても、ほとんど回復傾向は認められなかった。
【００７０】
（実施例２）3-MAで処理したヒメツリガネゴケのタンパク質含有量による乾燥耐性評価
（１）ヒメツリガネゴケの培養
実施例１と同様の方法で、ABA処理後に乾燥ストレスを負荷したヒメツリガネゴケの吸水再開0日目のコロニーを、表３の３つの条件(a)〜(c)で培養した。
【００７１】
【表３】
2016199519.tif 000004
【００７２】
（２）タンパク質の抽出、定量及び分解抑制の検討
上記(a)〜(c)で培養した各ヒメツリガネゴケを、0.1M Hepes-Na（pH7.5）、1M EDTA、10μM ロイペプチン、0.1M PMSF、0.1％(v/v) 2-メルカプトエタノールを含んだHomogenization buffer 900 μlと乳鉢に入れ、乳棒を用いて4℃で破砕した。破砕液全量をエッペンドルフチューブ（氷上）に入れ、15,000rpm(機器名:HITACHI/CF15D2、ローター:1.5mlチューブ用)で30分間遠心分離し、上清を新しいエッペンチューブに移して総タンパク質溶液を作製した。上記抽出した総タンパク質をLowry法によって測定した。
上記(a)〜(c)の条件で培養した各試料から得られた総タンパク質を2x Tris-SDS-ME（コスモ・バイオ（株）製）と混合し、100℃で2分間煮沸した。その後、各サンプルを10％(w/v) SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、クマシーブリリアントブルー (CBB)溶液で染色した。タンパク質用電気泳動用ゲルは表４及び表５の配合で作製した。
【００７３】
【表４】
2016199519.tif 000005
【００７４】
【表５】
2016199519.tif 000006
【００７５】
図３（Ａ）に示したように、吸水再開直後（R0h）と比較して、3-MA未処理群（R24h(a)）では、総タンパク質量が60％以上減少していた。これに対し、3-MA処理群では、総タンパク質量の減少を有意に抑える結果となった（R24h（b）及び(c）)。また、SDS-PAGEの結果（図３（Ｂ））からも、3-MAで処理した群においては（R24h（b）及び(c）)、未処理群（R24h(a)）に比べて、タンパク質のバンドがはっきりと認められ、3-MAにより、タンパク質の分解が抑制されたことが確認された。
【００７６】
（実施例３）3-MAのオートファジー抑制有効期間
GFPと結合したAtATG8タンパク質が、液胞内に取り込まれると、GFPとAtATG8に分断される。このうち、AtATG8タンパク質はプロテアーゼにより分解されるが、プロテアーゼ感受性が比較的低いGFPは液胞内に蓄積して蛍光を発する。
これを利用して、オートファジーによるタンパク質分解を3-MAが抑制することを確かめるために、GFP-AtATG8発現株を吸水再開過程において3-MAで処理したときの、GFP発現を解析した。
【００７７】
（１）GFP-AtATG8株のコンストラクトと作製
シロイヌナズナから抽出したRNAからcDNAを合成した。AtATG8 cDNA全長を次のプライマーを用いて表６の条件でPCRにより増幅させた。
【００７８】
フォワードプライマー： 5’-TTTGTACATGGCGATTAGCTCCTTCAA-3’  （配列番号１）
リバースプライマー： 5’-CCGCGGCCGCTTAGAAGAAGATCCCGAACG-3’   （配列番号２）
【００７９】
【表６】
2016199519.tif 000007
【００８０】
フォワードプライマーには、開始コドン(ATG)を含むAtATG8 cDNA領域 (20 bp)にBsrG Iサイトを付加したプライマーを使用した。リバースプライマーには、AtATG8 cDNAの終止コドンから20bpの領域に、Not Iサイトを付加したプライマーを使用した。PCRで増幅させたAtATG8 cDNAをBsrG IとNot Iとで消化し、BsrG IとNot Iとで消化したPCaMV35Somega-sGFP(S65T)-nos3’ベクター (Plant Biotechnology vol.20 1-11 No.1 2003)と連結して、GFP-ATG8d発現ベクターを作製した。ライゲーション反応にはDNA Ligation kit, ver. 2 (TAKARA BIO製)を用いた。
【００８１】
GFP-AtATG8 knock-inコンストラクト作製のために、GFP-AtATG8ベクターを鋳型として GFP-AtATG8 cDNA領域 (1,077bp)を次のプライマーを用いて増幅させた。反応条件は表７に示した。
【００８２】
フォワードプライマー： 5’-TTGTAGGTAGAAGATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’（配列番号３）
リバースプライマー： 5’-CGGACGAAAGCTGATTTAGAAGAAGATCCCGAACG-3’ （配列番号４）
【００８３】
【表７】
2016199519.tif 000008
KOD plus Neo (TOYOBO製)を使用
【００８４】
フォワードプライマーとリバースプライマーの5’末端に、In-Fusion HD Cloning kit (Clontech Laboratories, TaKaRa Bio製)用に15bpの塩基配列(pTN90領域)を付加した。pTN90はnptII領域を含むイネアクチンプロモーターのコンストラクトである。pTN90との相同領域 (15bp+15bp)を含むPCR産物 (1,107bp)をEcoR Vで消化したpTN90に挿入した。GFP-AtATG8 knock-inコンストラクトを線状化のためにNot Iで消化した。
【００８５】
（２）PEG法による形質転換
（２−１）試薬の調製及び培地の調製
ドリセラーゼ（Sigma製）0.6gに8％のマンニトール溶液30mlを加え、30分以上撹拌して、ドリセラーゼ溶液を調製した。8％マンニトール9ml、1M Ca(NO3)2 1ml、1M Tris-HCl (pH 8.0)100μlを混合してフィルター滅菌(0.22μm：ADVANTEC製)した。この溶液5ml、2gのポリエチレングリコール及びスターラーバーを滅菌処理した50ml遠沈管に入れ、湯浴上で撹拌し、PEG/T溶液を調製した。マンニトール910mg、滅菌水8.85ml、1M MgCl2150μl及び1％ MES1mlを転倒混和し、フィルターで滅菌(0.22μm)してMMM溶液を調製した。
プロトプラスト用液体培地として、表８に示す試薬をよく混合した後、オートクレーブした。また、PRM/B培地として、表９に示す試薬をよく混合した後、オートクレーブした。その後、クリーンベンチ内で60mmφのシャーレに分注した。培地が固まったら、シャーレの蓋を開けて、30分間乾燥させた。
【００８６】
【表８】
2016199519.tif 000009
【００８７】
【表９】
2016199519.tif 000010
【００８８】
選択培地として、表１０にある試薬をよく混合した後、オートクレーブした。オートクレーブ後、約50℃まで冷まし、クリーンベンチ内で20 mg/mlのG418（ジェネテシン）を0.2ml加え、よく撹拌した。60mmφのシャーレに分注後、培地が固まったら、シャーレの蓋を開けて、30分間乾燥させた。また、PRM/T培地として、表１１に示す試薬をよく混合した後、オートクレーブした。
【００８９】
【表１０】
2016199519.tif 000011
【００９０】
【表１１】
2016199519.tif 000012
【００９１】
（２−２）プロトプラストの調製
ドリセラーゼ溶液50mlを4000rpm(機器名TOMY/LC-121、ローター:7050-02)で10分間遠心した後、上清部分10ml程度をフィルター滅菌(0.45μm：ADVANTEC製)して60mmφの滅菌シャーレに入れた。ここに3〜5日培養したヒメツリガネゴケを加え、滅菌した上清をヒメツリガネゴケがほぐれるよう加えた。クリーンベンチの中でシャーレを空箱で覆い、室温で30分間静置した。途中5分ごとにシャーレを優しく揺らして混ぜた。
【００９２】
こうして調製したプロトプラスト溶液を100μmメッシュ（TOKYO SCREEN 製）で濾過後、50μmメッシュ（TOKYO SCREEN 製）で再度濾過した。
その後(1)800rpm(機器名TOMY/LC-121、ローター:7015-06)で2.5分間遠心し、静置後、上清をゆっくり吸って取り除いた。(2)これに8％マンニトールを40ml、ゆっくり入れて懸濁した。この(1)と(2)の作業をもう一度繰り返した。
これに、プロトプラスト溶液/4mlとなるようにMMM溶液を加え懸濁した。
【００９３】
（２−３）プロトプラストへのプラスミドベクターの導入と薬剤耐性形質転換体の選択（１次スクリーニング）
丸底チュープに5〜20μlのプラスミドベクター溶液をチューブの底の、中央部分に入れた。ここにプロトプラスト溶液を400μl加え、ゆっくりピペッティングした後、1分間静置した。静置後、PEG/T溶液を300μl加えてピペッティングし、45℃のウォーターバス中で5分間、手で振り混ぜた後、20℃のウォーターバス中に10分間置いた。
【００９４】
その後、プロトプラスト液体培地を300μl加えては3分間静置する作業を5回繰り返した。次に液体培地を1ml加えては3分間静置する作業を5回繰り返した。この全量を60mmφのシャーレにいれて遮光し、25℃、24時間静置した。24時間静置したプロトプラストを丸底チューブへ移し、800rpmで2分間遠心し、その後30秒静置した。ディスペンサーで上清をできる限り捨てた後、丸底チューブにPRM/T培地を8ml加えた。これを2mlずつPRM/B培地へ分注し、25℃で2日間培養した。その後、クリーンベンチ内でピンセットを用いて、再生しているヒメツリガネゴケをセロハンごと選択培地に移した。移したシャーレをパラフィルム又はサージカルテープでシールし、25℃で2日間培養した。
【００９５】
（２−４）3-MA処理及びタンパク質分解の解析
上記ヒメツリガネゴケの培養後、生き残った形質転換体を乾燥ストレスの負荷後に3-MAで処理した。その後実施例2で記載した方法でタンパク質を抽出し、100Vで電気泳動しタンパク質を分離した。タンパク質用電気泳動用ゲルは表４及び表５の配合で作製した。
次いで、電気泳動でタンパク質を分離した後、総タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ウエスタンブロッティングにより解析した。GFP-ATG8を一次抗体(1:2,000)としてウサギ抗GFP抗体(Bio Academia製)を使って検出した。そして、二次抗体(1:7,500)としてヤギ抗ウサギ抗体であるGoat Anti-Rabbit IgG (Fc), AP Conjugate(Promega製) を用いた。メンブレンはBCIP/NBT (Promega製)を含んだアルカリホスファターゼ緩衝液で発色させた。
【００９６】
図４で示したように、吸水再開後12時間（R12h）から、3-MA処理群（+）と未処理群（-）でオートファジーによるタンパク質分解で生じたGFPのバンドが認められた。しかし、未処理群に比べ、処理群のほうが、濃い未分解のGFP-AtATG8のバンドが認められた。この傾向は、吸水再開後24時間で顕著になり、未処理群ではGFP−AtATG8が僅かに認められる程度なのに対して、処理群では未分解のGFP-AtATG8がはっきりと確認された。
これにより、オートファジーは吸水再開後から生じること、そのタイミングで3-MA処理をすることによりオートファジーによるタンパク質分解を抑制し、ヒメツリガネゴケの乾燥耐性に寄与していることが示された。
【００９７】
（実施例４）3-MAで処理したヒメツリガネゴケのrRNA量による乾燥耐性評価
（１）total RNAの抽出
吸水再開後24時間まで野生株を、3-MAを含むBCDATG液体培地又は3-MAを含まないBCDATG培地で培養した。そして、吸水0時間後、吸水3時間後、吸水12時間後、吸水24時間後の時点において、野生株から、RNAiso Plus (Takarabio製)を用いてtotalRNAを抽出した。RNAiso Plusで破砕した野生株コロニーを室温で5分間放置し、15,000rpm、4℃で5分間遠心した。上清を新しい遠心チューブに移し、沈殿物は90℃で24時間乾熱器中にて乾燥させ、乾燥重量を測定した。
【００９８】
上清の溶液にクロロホルムをRNAiso Plus溶液の0.2倍量加え、ボルテックスによって混和した。その後、室温で5分間放置し、15,000rpm、4℃で15分間遠心した。その上層の水層を新しい遠心チューブに移した。ここに水層容量と等量のイソプロパノールを加えて転倒混和した。室温で10分間放置後、15,000rpm、4℃で10分間遠心した。ここに75％エタノールを500μl加えて、転倒混和し、15,000rpm、4℃で5分間遠心した。沈殿を残し、上清を捨てた。その後、風乾し、沈殿をRNase free水に溶解した。
【００９９】
（２）電気泳動による評価
表１２の組成の5×TBEバッファーを蒸留水で10倍希釈して、0.5×TBEバッファーを作製した。50mL 0.5×TBEバッファーに0.4g Agarose S (ニッポン・ジーン製)を加え、電子レンジで加熱して十分に溶かした。これに1μlのエチジウムブロマイドを加え、十分にかき混ぜた後、型に流し、固まったゲルを0.5×TBEバッファーの入っている泳動層にセットした。上記のようにして抽出したtotal RNAを65℃、15分間で熱変性させ、その後4℃、5分間放置してからローディングし、100Vで30分間電気泳動した。
【０１００】
【表１２】
2016199519.tif 000013
【０１０１】
図５に示したように、3-MAで処理した場合、吸水再開24時間後（R24h）には、リボソームを構成するrRNAの26Sと18Sの双方を示すバンドが確認され、リボソームの分解が抑制されていることが示された。
【０１０２】
（実施例５）オートファジー関連遺伝子欠損株の形態観察による乾燥耐性及び低温耐性評価
（１）遺伝子破壊用プラスミドの調整
ヒメツリガネゴケのPpATG5及びPpATG7ノックアウト株のコンストラクトを作製するために、PpATG5 genomic region (4,279 bp)、PpATG7 genomic region (5,562 bp)を、PCRにより増幅した。プライマーは以下の配列のものをそれぞれ使用した。また、TAクローニング用にTaKaRaEX Taq（登録商標）を用いた。反応条件はそれぞれ表１３及び表１４に示した。
【０１０３】
PpATG5ノックアウト株用プライマー
フォワードプライマー: 5’-GCGTTTGAGTTCATTCTTACATTTAGA-3’  （配列番号５）
リバースプライマー: 5’-AAGACAGCAGAATACACATGAAAGC-3‘  （配列番号６）
【０１０４】
PpATG7ノックアウト株用プライマー
フォワードプライマー: 5’-AATCCAGACGCATGTGGTATCAACG-3’  （配列番号７）
リバースプライマー: 5’-CTGTCGCAGAAGTACCAGTGC-3’  （配列番号８）
【０１０５】
【表１３】
2016199519.tif 000014
Ex taq (Takarabio製)を使用
【０１０６】
【表１４】
2016199519.tif 000015
Ex taq (Takarabio製)を使用
【０１０７】
この増幅領域を、それぞれTAクローニングにより製品説明書に従ってpGEM-T Easy Vector (Promega製)に挿入し、PpATG5用プラスミドベクターとPpATG7用プラスミドベクターとした。上記PpATG5プラスミドベクターをBamHI域に、BamHI/HindIIIで処理したpTN82由来のnptII領域をライゲーションした。
またPpATG7用ベクターをEcoRV/ EcoRVで処理し、pATG7の増幅領域のEcoRV/ EcoRVの制限酵素サイトにはさまれた領域に、EcoRV/ EcoRVで処理したpTN86由来のaph4領域をライゲーションした。
【０１０８】
（２）プラスミドベクターの作製と形質転換
インサートDNA溶液 (50〜250ng) 5 μlとプラスミドDNA溶液 (50ng) 5μlを混合し、そこにLigation Mix (Takarabio製, 製品コード6023)を10μl加え、16℃で30分間インキュベートしライゲーション反応液とした。大腸菌DH5αコンピテントセル 100μlを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液にライゲーション反応液20μlを加え、氷上で30分間放置した。その後、42℃で30秒間インキュベート後、氷上で2分間冷却した。ここに、表１５のSOC培地を200μl加え、37℃で1時間静置した。LB選択培地にまき、37℃で一晩静置した。
【０１０９】
【表１５】
2016199519.tif 000016
【０１１０】
その後、キットに付属している説明書に従い、増殖させた各プラスミドベクターを抽出した。抽出して得た、PpATG5ノックアウト株用プラスミドをEcoRI/NotIで消化し、PpATG7ノックアウト株用プラスミドをSacI/KspIで消化し、エタノール沈殿後、滅菌水に溶解させ、PEG法用の線状化プラスミドベクタターを作製した。その後、実施例３の方法で形質転換を行った。
【０１１１】
（３）薬剤耐性形質転換体の選択（２次スクリーニング）と欠損株の作製
実施例３で行った方法で１次スクリーニングした後、選択薬剤を含まないBCDATG寒天培地で1週間培養し、再度選択培地で培養した。培養後、生き残った形質転換体を次の相同組換え確認用に選抜した。次いで、PEG法により得られた株がATG5遺伝子株であることを確認するために、生き残った形質転換体のうち、3株のcDNA発現とゲノムDNAを調べた。
ヒメツリガネゴケ野生株と3つの候補株から常法によりcDNAを合成し、増幅させるATG5 cDNA領域(1,016bp)を、次のプライマーを用いてRT-PCRにより表１６の条件で増幅させた。
【０１１２】
フォワードプライマー：5’-AGGTGGATTTCGGTGTGATCAC-3’（配列番号９）
リバースプライマー：5’-AGATCGTACAATACACCCGTCGG-3’（配列番号１０）
【０１１３】
【表１６】
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【０１１４】
その結果、3つの候補株ではバンドが見られなかったが、野生株ではバンドが確認された(図６Ｂ)。また、野生株と3つの候補株から常法によりゲノムDNAを抽出し、PpATG5ゲノム領域から薬剤耐性マーカー挿入領域にあるPcmv部位までを選択して、プライマーを設計した。ここで、Pcmvとは、カリフラワーモザイクウィルスに存在するCaMV 35S プロモーターである。PpATG5ゲノム〜Pcmv領域(977 bp)を次のプライマーにより表17の条件で増幅させた。
【０１１５】
フォワードプライマー：5’- AGGTGGATTTCGGTGTGATCAC -3’  （配列番号１１）
リバースプライマー：5’- GAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGT -3’  （配列番号１２）
【０１１６】
【表１７】
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【０１１７】
その結果、野生株ではバンドが見られなかったが、3つの候補株では、約1kbp付近にバンドが見られた (図６C)。これら3株をATG5遺伝子欠損株とし、各々atg5-1、atg5-2、atg5-3と名付けた。
【０１１８】
PEG法により得られた株がATG7遺伝子欠損株であることを確認するために、同様に生き残った形質転換体のうち、3株のゲノムDNAを調べた。ヒメツリガネゴケ野生株と3つの候補株から常法によりcDNAを合成した。次のプライマーを用いてPCRによりPpATG7ゲノム領域(2572 bp)を増幅させた。反応条件は表18に示した。
【０１１９】
フォワードプライマー：5’-GGAGAGGAACTGTTTATCCTCTCC-3’  （配列番号１３）
リバースプライマー：5’-CGGAAGATTTGAAGGATCATAAA-3’  （配列番号１４）
【０１２０】
【表１８】
2016199519.tif 000019
【０１２１】
3つの候補株ではバンドが見られなかったが、野生株ではバンドが確認された（図７（Ｂ））。
また、次のプライマーを用いて、PpATG7ゲノム領域と挿入領域（3689bp）をPCRにより増幅させた。反応条件は表19に示した。
【０１２２】
フォワードプライマー：5’- GGAGAGGAACTGTTTATCCTCTCC-3’  （配列番号１５）
リバースプライマー：5’- CGGAAGATTTGAAGGATCATAAA-3’  （配列番号１６）
【０１２３】
【表１９】
2016199519.tif 000020
【０１２４】
野生株ではバンドが見られなかったが、3つの候補株では、約4,000kbp付近にバンドが見られた(図７（Ｂ）)。これら3株をATG7遺伝子欠損株とし、各々atg7-1、atg7-2、atg7-3と名付けた。
【０１２５】
（４）ABA処理とストレス負荷
上記ヒメツリガネゴケの野生株及び遺伝子欠損株を、50μM（終濃度）ABA（SIGMA-ALDRICH製）を含むBCDATG寒天培地上に移し、25℃で24時間培養した。次いで、上記のようにABA処理したヒメツリガネゴケの野生株及び遺伝子欠損株を、シリカゲル入りの容器に入れて25℃で24時間、暗所で培養した。その後、新鮮なBCDATG寒天培地上に移し7日間培養した。又は、上記ABA処理したヒメツリガネゴケの野生株及び遺伝子欠損株を、マイナス80℃で30分間低温処理した。そして、4℃で30分間融解処理を行った後、新鮮なBCDATG寒天培地上に移して14日間培養した。
【０１２６】
ABA未処理の群では、乾燥ストレスを負荷した後、野生株とATG5遺伝子欠損株いずれにおいても、吸水再開後7目目（R7d）でヒメツリガネゴケは茶色に変色して死に至っていた（図８Ａ）。一方、ABAで処理した野生株が茶色く変色して死滅する中、ATG5遺伝子欠損株及びATG7遺伝子欠損株では、緑色を維持し、乾燥ストレスに対して強い耐性を示した。
また、ABA処理した後に、低温ストレスを与えた群においては、野生株が吸水再開後に7日目（図９の7d）では茶色く変色して死に至っていたのに対して、ATG5遺伝子欠損株は14日目（図９の14d）には茶色から緑色に回復し、低温ストレスにも強い耐性を示した。
【０１２７】
（実施例６）オートファジー関連遺伝子欠損株のエバンスブルーによる乾燥耐性評価
乾燥ストレス負荷後のオートファジー現象を抑制するタイミングを確認するため、ヒメツリガネゴケ野生株及びATG5遺伝子欠損株を、5mlの遠沈管に3mlの0.5％エバンスブルー（和光純薬工業(株)製）とヒメツリガネゴケのコロニーを入れ、15分間シェーカーの上で回転震盪させて染色を行った。その後、細胞の周りに付着したエバンスブルーを蒸留水により洗浄し、実体顕微鏡で観察を行った。
【０１２８】
乾燥ストレス負荷後の吸水再開3時間後以降から、野生株は全体的に青く染色されたのに対し、ATG5遺伝子欠損株では染色されなかった（図１０）。これは、オートファジーが少なくとも3時間後には始まっていて、その影響により24時間後にはコロニー全体が死に至らしめることを示している。このことは、吸水再開後3時間から24時間の間にオートファジーを阻害することで、乾燥耐性を強めることができることを示した。
【０１２９】
（実施例７）オートファジー関連遺伝子欠損株の水分含有量による乾燥ストレス耐性評価
ヒメツリガネゴケの野生株及びATG5遺伝子欠損株に対し、上述した乾燥ストレスを負荷した後、乾燥中のコロニー生重量 (FW)を測定した。乾燥ストレス負荷24時間後、コロニーを乾燥器に入れ、24時間、90℃で加熱してコロニー細胞内の水分を完全に除去し、乾燥重量 (DW)を測定した。水分含有量は、(gH2O/gDW) = (gFW-gDW) /gDWの式により算出した。
【０１３０】
野生株及びATG5遺伝子欠損株のいずれにおいても、1時間以内に0.1(gH20/gDW)未満に低下した(図１１（Ａ）及び１１（Ｂ）)。しかし、野生株ではその後も水分含有量が低下し、乾燥24時間後の水分含有量は、野生株が0.000(gH20/gDW)になった。これに対して、ATG5遺伝子欠損株は0.015(gH20/gDW)と有意に (p<0.05  ANOVA)高かった(図１１（Ｂ）)。この結果は、ATG5遺伝子欠損株は野生株よりも保水力が高いことを示し、野生株よりもATG5遺伝子欠損株の方が乾燥耐性能力が高いことを示した。
【０１３１】
（実施例８）オートファジー関連遺伝子欠損株の水分含有量とタンパク質含有量による乾燥ストレス耐性評価
（１）乾燥ストレス負荷前のタンパク質含有量の差異
乾燥ストレス負荷前における、ABA処理前後の、ヒメツリガネゴケの野生株とATG5遺伝子欠損株の水分含有量と総タンパク質量を、実施例2及び7の方法により測定した。
ABA処理によって野生株とATG5遺伝子欠損株の両方でタンパク質含量が増加した。また野生株とATG5遺伝子欠損株間で水分含有量と総タンパク質量を比較すると、ABA処理群及び未処理群のいずれにおいても、ATG5遺伝子欠損株のほうが高かった（図１２）。
【０１３２】
（２）乾燥ストレス負荷後のタンパク質含有量の差異
ABA処理後、上述した乾燥ストレス負荷後のヒメツリガネゴケのタンパク質含有量を、実施例2の方法によりSDS-PAGEで電気泳動し、総タンパク質量の変化を調べた。
野生株においては、吸水開始直後から総タンパク質の殆どが分解されてプロペプチドバンドが見られなくなった（図１３Ａ及びＢ）。これに対し、ATG5遺伝子欠損株のほうは分解が抑制されていることが示された。
以上から、ABA処理やオートファジー関連遺伝子の欠損によって、細胞が生命活動に必要な水分やタンパク質を多く含むことができる構造をとることを示唆され、環境ストレスに対する耐性を強化していることが示された。
【０１３３】
（実施例９）吸水再開後のオートファジー抑制の有効期間について
（１）オートファジー関連遺伝子発現の測定
ABA処理及び乾燥ストレス負荷を行ったあと、吸水再開後の一定時間のヒメツリガネゴケ野生株から、RNAiso Plus (Takarabio製)、the NucleoSpin RNAII (MACHEREY-NAGEL製)を用いてトータルRNAを抽出した。その後、Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche製)を使ってPpATG5、PpATG7及びPpATG8のcDNAを合成した。
SYBR（登録商標） Green Realtime PCR Master Mix (TOYOBO製)のキットとStepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems製)を使ってリアルタイムPCRを行った。データノーマライゼーションと定量とのために、PpRPL22 (NP_904231.1)を内部標準とした。反応条件は表２0に示した。
【０１３４】
【表２０】
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【０１３５】
PpATG5、PpATG7、PpATG8遺伝子の発現はABAで処理しても変化せず、吸水再開直後も変化しなかった。しかし、吸水再開1日後には増加し、その増加は吸水再開3日後くらいまで持続した (図１４（Ａ）)。
【０１３６】
（２）GFP-AtATG8によるオートファジーのタイミング
上述した方法でGFP-AtATG8株のコンストラクトを作製し、ヒメツリガネゴケのABA処理後のGFP-AtATG8株のGFP-AtATG8タンパク質の量を抗GFP抗体を用いたウエスタンブロット解析を行った。吸水再開12時間後には、GFP-AtATG8のバンド(40.9 kDa)に加えてGFP (27.0 kDa)のバンドも見られるようになり、吸水再開24時間後には、GFP-AtATG8が減少するのに合わせてGFPバンドが増加した (図１４（Ｂ）, R12h, R24h)。このことは、吸水再開後3時間〜3日間にオートファジーが活性化していること示し、この間のオートファジーを抑制することで、環境ストレス耐性を強化できることを示していた。
【０１３７】
（実施例１０）オートファジー抑制剤とオートファジー関連遺伝子欠損株について
栄養飢餓や暗条件下でオートファジーが誘導されるのを利用して、ヒメツリガネゴケ野生株とATG5遺伝子欠損株を100μm E-64d（ペプチド研究所製）又は0.1μm コンカナマイシンA(和光純薬工業(株)製) を含む、グルコース欠乏BCDAT培地で、暗条件下23℃で1日培養し、顕微鏡で観察した。
【０１３８】
野生株の細胞をE-64dで処理すると、細胞内にタンパク質等の未分解産物と思われる凝集体の蓄積が認められた。これに対し、ATG5遺伝子欠損株では、こうした凝集体の蓄積は認められなかった（図１５）。また、野生株の細胞をコンカナマイシンAで処理すると、細胞内に多数のタンパク質等を取り込んだオートファジックボディー様構造が液胞内に認められた。これに対し、ATG5遺伝子欠損株では認められなかった。
以上から、オートファジー関連遺伝子のうち、ATG5遺伝子を欠損させることで、E-64dやコンカナマイシンAよりオートファジー経路のより上流でタンパク質分解を阻害し、環境ストレス耐性を強めることが示された。
【０１３９】
以上のように、本発明の環境ストレスに対する耐性を強化する方法によれば、例えば、乾燥や寒冷の厳しい環境条件下においても、これらに強い耐性を有する植物の保存や育成に利用することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１４０】
本発明は、育種学や農業の分野において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４１】
配列番号１：AtATG8d cDNA領域増幅用フォワードプライマー
配列番号２：AtATG8d cDNA領域増幅用リバースプライマー
配列番号３：GFP-AtATG8 cDNA領域増幅用フォワードプライマー
配列番号４：GFP-AtATG8 cDNA領域増幅用リバースプライマー
配列番号５：PpATG5ノックアウト株用フォワードプライマー
配列番号６：PpATG5ノックアウト株用リバースプライマー
配列番号７：PpATG7ノックアウト株用フォワードプライマー
配列番号８：PpATG7ノックアウト株用リバースプライマー
配列番号９：ATG5 cDNA領域増幅用フォワードプライマー
配列番号１０：ATG5 cDNA領域増幅用リバースプライマー
配列番号１１：PpATG5ゲノム〜Pcmv領域増幅用フォワードプライマー
配列番号１２：PpATG5ゲノム〜Pcmv領域増幅用リバースプライマー
配列番号１３：PpATG7ゲノム領域と挿入領域フォワードプライマー
配列番号１４：PpATG7ゲノム領域と挿入領域リバースプライマー
配列番号１５：PpATG7ゲノム領域と挿入領域フォワードプライマー
配列番号１６：PpATG7ゲノム領域と挿入領域リバースプライマー
【図１】
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【図２】
2016199519.tif 000023
【図３】
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【図４】
2016199519.tif 000025
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016199519.tif 000029
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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