(57)【要約】【課題】本発明は、高い核酸導入効率で、簡便に、核酸が導入された細胞構造体の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を、１００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する第１播種工程と、第１播種工程において播種した細胞を、２００個／ｍｍ2以上の細胞密度になるまで、培養する第１培養工程と、細胞を、３０００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の播種した細胞上に播種する第２播種工程と、第２播種工程において播種した細胞を培養する第２培養工程と、を含むことを特徴とする、核酸が導入された細胞構造体の製造方法。【選択図】図２
2016131537.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、
前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、
細胞を、１００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記培養面上に播種する第１播種工程と、
前記第１播種工程において播種した細胞を、２００個／ｍｍ2以上の細胞密度になるまで、培養する第１培養工程と、
細胞を、３０００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記播種した細胞上に播種する第２播種工程と、
前記第２播種工程において播種した細胞を培養する第２培養工程と、
を含むことを特徴とする、核酸が導入された細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
前記第２播種工程では、前記細胞密度が、４０００個／ｍｍ2以上であることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記準備工程では、前記被覆細胞培養器において、該被覆細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する前記核酸の量が０．５〜５０ｎｇ／ｍｍ2である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記準備工程では、前記被覆細胞培養器において、該被覆細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体の量が、５〜２００ｎｇ／ｍｍ2である、請求項１に記載の移植材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、核酸導入効率が高く、簡便な、核酸が導入された細胞構造体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に遺伝子を導入する技術としては、合成高分子、ミセル（リポソーム）、ウイルス、エレクトロポレーション、金コロイド銃、マイクロインジェクション（微細針による直接注入）等数多くの技術が知られている。
中でも、培養皿へ予め核酸複合体等をコーティングしておき、コーティング層から核酸の徐放や細胞による取り込みを利用して、接着基材側から遺伝子を導入するリバーストランスフェクション等が有力な技術として知られている（特許文献１参照）。
【０００３】
細胞凝集塊（胚葉体ともいう）を作製する技術としては、非接着性コーティングされた丸底面培養容器を用いる技術、遠心・振盪培養技術、マイクロパターン印刷された平底面培養容器で培養する技術等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０９９９２４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ここで、上記従来の核酸を導入する方法を用いて、細胞凝集塊（胚葉体）を調製しようとした場合、下記のような問題があった。
すなわち、胚葉体培養は，三次元的に細胞を培養して凝集塊を構築する関係で（細胞数が多い）で、遺伝子導入で使用されている密度で細胞を播種すると培養容器底面へ接着させてしまい単層培養体（二次元）となってしまう可能性がある。一方、予め遺伝子導入した細胞を定法に従って酵素処理で細胞浮遊液として回収してから改めて凝集塊にしようとすると時間軸の制約を受ける。つまり、導入した遺伝子が発現される時間は一過性であって短く、凝集塊が形成されるまで遺伝子発現が維持できない問題がある。また、細胞凝集塊を作製してから遺伝子導入を行おうとしても，これは，細胞周期の制約を受ける。つまり、凝集塊中の細胞は休止期にあるため、核が核膜で保護されているため遺伝子導入は不可能である。
【０００６】
そこで、本発明は、高い核酸導入効率で、簡便に、核酸が導入された細胞構造体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の要旨は以下の通りである。
本発明の核酸が導入された細胞構造体の製造方法は、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、細胞を、１００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記培養面上に播種する第１播種工程と、前記第１播種工程において播種した細胞を、２００個／ｍｍ2以上の細胞密度になるまで、培養する第１培養工程と、細胞を、３０００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記播種した細胞上に播種する第２播種工程と、前記第２播種工程において播種した細胞を培養する第２培養工程と、を含むことを特徴とする。
【０００８】
本発明においては、前記第２播種工程では、前記細胞密度が、４０００個／ｍｍ2以上であることが好ましい。
【０００９】
本発明においては、前記準備工程では、前記被覆細胞培養器において、該被覆細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する前記核酸の量が０．５〜５０ｎｇ／ｍｍ2であることが好ましい。
【００１０】
本発明においては、前記準備工程では、前記被覆細胞培養器において、該被覆細胞培養器の培養面が、単位面積当たりに有する２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート及び／又はその誘導体の重合体の量が、５〜２００ｎｇ／ｍｍ2であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、高い核酸導入効率で、簡便に、核酸が導入された細胞構造体の製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】（ａ）実施例の（試験Ｃ−１）において播種、培養した細胞を位相差顕微鏡により観察したときの写真である。（ｂ）実施例の（試験Ｃ−１）において播種、培養した細胞を蛍光位相差顕微鏡により観察したときの写真である。
【図２】実施例の（試験Ｃ−２）において細胞を播種、培養した結果得られた細胞構造体を蛍光位相差顕微鏡により観察したときの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、図面を参照して、本発明の核酸が導入された細胞構造体の製造方法の実施形態について詳細に例示説明する。
【００１４】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（本明細書において、「ＤＭＡＥＭＡ」ともいう）の重合体は、温度応答性高分子として公知であり、その下限臨界溶解温度（Lower Critical Solution Temperature、以下、「曇点」ともいう。）は３２℃程度である。
なお、本願明細書中では、組成物の「曇点」とは、必ずしも厳密な意味で、「所定の温度未満では溶解するが、所定の温度以上では不溶化して沈殿する、その温度」のみを指すものではなく、「不溶化して沈殿した組成物を所定の温度未満の条件下で溶解する際に、溶解に要する時間が１０分以上である、その温度」をも指す。
先般、発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、室温（２５℃）程度の曇点を有する低曇点型温度応答性ポリマー組成物（以下、単に「温度応答性ポリマー組成物」ともいう）を調製することに成功した。低曇点型温度応答性ポリマー組成物としては、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー組成物、混合型温度応答性ポリマー組成物等がある。
分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー組成物は、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）の繰り返し単位（後述）、及び該ＤＭＡＥＭＡの加水分解物の繰り返し単位（後述）を含む。発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記分子内イオン複合体型温度応答性ポリマー組成物を被覆してなる細胞培養器を調製した。
また、混合型温度応答性ポリマー組成物は、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸を含む（（２）トリスは任意選択的に含む。）。発明者らは、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる、上記混合型温度応答性ポリマー組成物を被覆してなる細胞培養器を調製した。
【００１５】
また、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体、及び核酸を含むことにより、曇点が室温（２５℃）以下であり、室温のクリーンベンチ内で操作しても、培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができ、培養した細胞構造体をそのままの状態で回収することができる低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成できる低曇点型温度応答性ポリマー組成物が得られる。
【００１６】
（核酸が導入された細胞構造体の製造方法）
本発明の実施形態の核酸が導入された細胞構造体の製造方法は、
２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート及び／又はその誘導体の重合体と核酸とを含む低曇点型温度応答性ポリマー組成物を調製する調製工程と、
前記低曇点型温度応答性ポリマー組成物で細胞培養器の培養面を被覆して、被覆細胞培養器を準備する準備工程と、
細胞を、１００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記培養面上に播種する第１播種工程と、
前記第１播種工程において播種した細胞を、２００個／ｍｍ2以上の細胞密度になるまで、培養する第１培養工程と、
細胞を、３０００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記播種した細胞上に播種する第２播種工程と、
前記第２播種工程において播種した細胞を培養する第２培養工程と、
を含む。
【００１７】
本発明の実施形態の核酸が導入された細胞構造体の製造方法に用いられる細胞としては、軟骨細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、心筋細胞等の間葉系細胞が好ましい。初代細胞の場合は、コロニーを形成する接着性細胞を選択すれば良く、当業者によって適宜選択可能である。
【００１８】
上記核酸としては、例えば、ＤＮＡ（一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）、ＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ）、修飾された核酸（例えば、モリフォリノ環を付加したＤＮＡ又はＲＮＡ等）及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。上記核酸は、例えば、目的とする遺伝子の機能を発現できる形態（例えば、導入された細胞内で当該遺伝子が発現されるように配置されたプラスミド、プロモーター領域、開始コドン、目的遺伝子、終止コドン、ターミネーター領域が連続的に配列したプラスミド等）であってもよい。
【００１９】
なお、導入された核酸は、その遺伝子を発現する目的のものの他、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、デコイ等、特定の遺伝子の発現を抑制する目的のものとしてもよい。遺伝子の種類は、特に限定されず、例えば、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子、ＢＲＣＡ癌抑制遺伝子、サイトカイン遺伝子（例えば、ＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−１２遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＨＧＦ遺伝子、ＦＧＦ遺伝子等）、癌抗原ペプチド遺伝子（例えば、ｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１、ＭＡＧＥ−１等）、ｃ−ｍｙｃアンチセンス、ｃ−ｍｙｂアンチセンス、ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス、ＰＣＮＡアンチセンス、Ｅ２Ｆデコイ、ｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、Ｋｌｆ−４、ＮａｎｏＧ等が挙げられる。
【００２０】
上記核酸の長さとしては、特に限定されないが、例えば、２０〜１５，０００ｂｐ程度の、当業者に周知の長さとしてよい。この点、本発明においては、従来の合成高分子系の遺伝子導入剤の場合と同様に、核酸の長さは特に制限されず、ウイルスベクターの場合と比較してメリットを有する。
【００２１】
以下、各工程の詳細を記載する。
【００２２】
本発明の実施形態の核酸が導入された細胞構造体の製造方法では、まず、低曇点型温度応答性ポリマー組成物（以下、「温度応答性ポリマー組成物」ともいう）を調製する（調製工程）。
−温度応答性ポリマー組成物の製造方法−
温度応答性ポリマー組成物は、例えば、下記の通り、一例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法、及び別の例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法により製造することができる。
【００２３】
以下、一例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法について記載する。この例では、低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、分子内イオン複合体型温度応答性ポリマーと上記核酸とを含む。
【００２４】
この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、まず、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を含む混合物を調製する（混合物調製工程）。ここで、混合物は、重合禁止剤及び水を更に含む。
【００２５】
２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）としては、市販品を用いることができる。重合禁止剤としては、メチルヒドロキノン（ＭＥＨＱ）、ヒドロキノン、ｐ−ベンゾキノリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルヒドロキシルアミン、Ｎ−ｎｉｔｒｏｓｏ−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ（Ｃｕｐｆｅｒｒｏｎ）、ｔ−ブチルハイドロキノン、等が挙げられる。また、市販のＤＭＡＥＭＡに含まれるＭＥＨＱ等をそのまま用いてもよい。水としては、超純水が挙げられる。
【００２６】
重合禁止剤の混合物に対する重量割合は、０．０１％〜１．５％であることが好ましく、０．１％〜０．５％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、ラジカル重合反応の暴走を抑制して、制御できない架橋を低減することができ、製造される分子内イオン複合体型応答性ポリマーの溶媒に対する溶解性を確保することができる。
水の混合物に対する重量割合は、１．０％〜５０％であることが好ましく、９．０％〜３３％であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、側鎖の加水分解反応の反応速度と、重合するポリマー鎖の成長反応の反応速度とを、バランスよく調和させることができる。これにより、側鎖が加水分解されたＤＭＡＥＭＡに対する、側鎖が加水分解されていないＤＭＡＥＭＡの割合（共重合割合）が１．０〜２０程度の分子内イオン複合体型応答性ポリマーを得ることができる。
【００２７】
次いで、この例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、混合物に紫外線を照射する（紫外線照射工程）。ここで、紫外線は、不活性雰囲気下において、照射される。ＤＭＡＥＭＡは、紫外線の照射により、ラジカル重合して、ポリマーとなる。
この工程では、例えば、透明な密封バイアルに、上記混合物を加え、不活性ガスをバブリングすることによってバイアル内を不活性雰囲気とした後に、バイアルの外部から紫外線照射装置を用いて紫外線を照射する。
【００２８】
紫外線の波長としては、２１０ｎｍ〜６００ｎｍであることが好ましく、３６０ｎｍ〜３８０ｎｍであることが更に好ましい。上記範囲とすれば、効率よく重合反応を進行させることができ、初期の共重合割合を有する高分子材料を安定的に得ることができる。また、製造したポリマー材料が着色することを防ぐこともできる。
不活性ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウム、ネオン等が挙げられる。
【００２９】
反応条件に関して、温度条件としては、１５℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜３０℃であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、熱による開始反応を抑制し、光照射による開始反応を優先的に進行させることができる。また、加水分解反応の反応速度をポリマー鎖の成長反応の反応速度に対してバランスのよいものにすることができる。
反応時間としては、７時間〜２４時間であることが好ましく、１７時間〜２１時間であることが更に好ましい。上記範囲とすれば、分子内イオン複合体型応答性ポリマーを高収率で得ることができ、また、光分解反応や不要な架橋反応を抑制しながらラジカル重合を行うことができる。
【００３０】
なお、混合物調製工程において混合物が調製され終えてから、紫外線照射工程において紫外線の照射が開始されるまでの時間は、１０分〜１時間であることが好ましい。
【００３１】
混合物を加えたバイアルの内部の気体を置換して、バイアル内を不活性雰囲気とする際には、１０分程度の時間を要する。そのため、上記時間を１０分未満とすると、ラジカル重合に必要となる不活性雰囲気が得られない虞がある。また、混合物中では、ＤＭＡＥＭＡの加水分解反応が、紫外線の照射が開始される前に開始される。そのため、上記時間を１時間超とすると、ラジカル重合反応に不活性なメタクリル酸が混合物中に多数生じてしまう。
【００３２】
この例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、混合物に水が含まれるため、ＤＭＡＥＭＡのラジカル重合反応と、ポリ２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＰＤＭＡＥＭＡ）の側鎖のエステル結合の加水分解反応とを、拮抗させることができる。
この拮抗により、得られる生成物は、式（Ｉ）で表される繰り返し単位（Ａ）
【化１】
2016131537.tif 000003
、及び式（ＩＩ）で表される繰り返し単位（Ｂ）
【化２】
2016131537.tif 000004
を含むポリマーとなる。
そのため、ポリマーが有するカチオン性官能基、すなわち、ジメチルアミノ基と、ポリマーが有するアニオン性官能基、すなわち、側鎖のエステル結合が加水分解されてできたカルボキシル基の両方を、バランスよく備えることができる。そして、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法によれば、カチオン性官能基及びアニオン性官能基を有する、ポリ（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）由来のポリマーを、少ない工程で簡便に製造することができる。
【００３３】
なお、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法と同一の製造方法ではなくとも、ＤＭＡＥＭＡ、重合禁止剤、及び水が、紫外線照射時に反応系中に共存していれば、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法の上記効果と同様の効果を得ることができる。
例えば、ＤＭＡＥＭＡ及び重合禁止剤を含む混合物と、水とを別々に準備し、次いで、混合物と水とに不活性ガスをバブリングし、その後、混合物と水とを不活性雰囲気下で混合すると同時に紫外線を照射するという、温度応答性ポリマー組成物の製造方法も、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法に含めることができる。
【００３４】
ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜１０．０である分子が好ましい。
【００３５】
この例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物中の、核酸中のリン酸残基中のリン原子数に対する、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体側鎖のアミン性窒素原子数の割合（Ｎ／Ｐ比）は、特に限定されないが、例えば、核酸を強く凝集させることによって、分解酵素等の作用から核酸を保護しつつ、組成物を安定化させる観点、及び、負電荷を持つ細胞膜との静電作用を強めて、核酸を効率的に細胞内に送達する観点から、例えば、２以上であることが好ましく、５以上であることが更に好ましく、また、組成物の細胞に対する毒性を抑制する観点から、２０以下であることが好ましく、３０以下であることが更に好ましい。
【００３６】
以下、別の例の低曇点型温度応答性ポリマー組成物の製造方法について記載する。この例では、低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、ＤＭＡＥＭＡの重合体である温度応答性ポリマーを含む混合型温度応答性ポリマー組成物である。
【００３７】
すなわち、この例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、まず、混合型温度応答性ポリマー組成物を調製する（混合物調製工程）。具体的には、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体と、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）と、（３）核酸とを混合する（（２）トリスに関しては任意選択的とすることもできる）。
【００３８】
（１）のＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体は、温度応答性ポリマーであり、その曇点は３２℃である。（２）のトリスは、曇点の若干の低下、及び／又は曇点よりも高温で形成されたポリマーが、曇点以下に冷却された際に再溶解する速度を低減させる役割を果たし、また、疎水化されたポリマー層中でも親水性を維持しながら、アミノ基に由来する陽電荷により細胞に刺激を与える役割を果たすと推定される。（３）核酸は、培養する細胞の遊走や配向を可能にする役割や細胞傷害性を抑制する役割を果たすと推定される。
【００３９】
この混合型温度応答性ポリマー組成物によれば、曇点を室温（２５℃）以下に低減させることができる。
上記組成物では、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の側鎖とトリスとが、互いに相互作用（例えば、架橋する作用）して、上記重合体が凝集しやすくなっていると推定される。
【００４０】
ここで、上記（１）について、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体としては、数平均分子量（Ｍｎ）が、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａである分子が好ましい。また、重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量（Ｍｎ）との比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜６．０である分子が好ましい。
【００４１】
また、（１）のＤＭＡＥＭＡの誘導体としては、例えば、メタクリル基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、メタクリル基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基の水素原子をハロゲン置換した誘導体、ジメチルアミノ基のメチル基を低級アルキル基で置換した誘導体が挙げられる。
【００４２】
上記（２）について、トリスは、純度９９．９％以上の純物質であるか、又は、トリス水溶液を、アルカリ性物質の添加等により、使用時に中性又は塩基性とすることが好ましい。トリスは、塩酸塩の状態で市販されているところ、これを用いた場合には、トリス水溶液のｐＨが下がるため、組成物の曇点が７０℃程度にまで上昇してしまう。そのため、トリス塩酸塩は好ましくない。
【００４３】
上記（３）核酸は、前述の通りである。
【００４４】
また、上記（３）核酸は、ある程度の大きさ、例えば１ｋＤａ〜５，０００ｋＤａの分子量（Ｍ）を有していることが好ましい。
分子量を上記範囲とすれば、核酸は、カチオン性物質とイオン結合して、カチオン性物質を、長時間捕捉する役割を果たすことができ、安定したイオン複合体微粒子を形成させることがでる。また、一般的にカチオン性物質が有する、細胞の細胞膜表面に対する静電的相互作用に起因する細胞傷害性を緩和することもできる。
【００４５】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、更に、核酸以外のアニオン性物質を含んでいてもよい。上記核酸以外のアニオン性物質としては、例えば、ヘパリン、ヒアルロン酸、デキストラン硫酸、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリリン酸、ポリビニル安息香酸、硫酸化多糖類、カードラン及びポリアルギン酸並びにこれらのアルカリ金属塩等が挙げられる。また、カチオン性ポリマーであるポリ（４−アミノスチレン）の４−位のアミノ基に対してシュウ酸等のジカルボン酸を脱水縮合させることによって、アニオン性官能基を導入した、実質的にアニオン性物質として機能するポリマー誘導体も、用いることができる。
【００４６】
なお、上記核酸以外のアニオン性物質は、二種以上含まれていてもよい。
【００４７】
ここで、（１）２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び／又はその誘導体の重合体に対する、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）の割合（（２）／（１））が、１．０以下とした混合型温度応答性ポリマー組成物を用いることが好ましい。
なお、割合（（２）／（１））は、重量割合であるものとする。
【００４８】
上記割合の混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、後述の培養工程で、細胞構造体を形成しやすくすることができる。この組成物によれば、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを更に好適にすることができる。そして、この好適なバランスが、培養面への細胞の接着性を好適に調整し、細胞の遊走や配向を活性化していると推定される。
【００４９】
また、上記割合は、０．１以上あることが好ましい。上記割合を０．１以上とすることにより、曇点を低減させるという上記効果が得られやすい。また、細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００５０】
上記と同様の理由により、上記割合（（２）／（１））は、０．１〜０．５であることが更に好ましい。
【００５１】
上記の別の例の温度応答性ポリマー組成物中の、核酸中のリン酸残基中のリン原子数に対する、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体側鎖のアミン性窒素原子数の割合（Ｎ／Ｐ比）は、特に限定されないが、例えば、核酸を強く凝集させることによって、分解酵素等の作用から核酸を保護しつつ、組成物を安定化させる観点、及び、負電荷を持つ細胞膜との静電作用を強めて、核酸を効率的に細胞内に送達する観点から、例えば、２以上であることが好ましく、５以上であることが更に好ましく、また、組成物の細胞に対する毒性を抑制する観点から、２０以下であることが好ましく、３０以下であることが更に好ましい。
【００５２】
なお、上記の別の例の温度応答性ポリマー組成物の製造方法では、（２）２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（トリス）を必ずしも用いなくてもよく、この例による低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、（２）トリスを含まなくてもよい。
【００５３】
（準備工程）
次いで、調製した低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面に被覆して、被覆細胞培養器を準備する（準備工程）。
すなわち、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面に被覆して、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成し、被覆細胞培養器を準備する。なお、本明細書において、培養面上に上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層を形成した細胞培養器を、「被覆細胞培養器」と称する場合がある。
【００５４】
上記被覆細胞培養器において、培養面が単位面積当たりに有する、低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に含まれるＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の量は、特に限定されないが、低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器に均一に塗布でき、細胞構造体を形成しやすくなるという観点から、例えば、５〜２００ｎｇ／ｍｍ2が好ましい。すなわち、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体が５〜２００ｎｇ／ｍｍ2となるように、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物を細胞培養器の培養面上に塗布することが好ましい。上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物は、カチオン性のＤＭＡＥＭＡを有することにより、十分量の核酸を安定に担時することができる。
【００５５】
上記被覆細胞培養器において、培養面が単位面積当たりに有する、低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に含まれる上記核酸の量は、特に限定されないが、例えば、０．５〜５０ｎｇ／ｍｍ2が好ましく、２．５〜７．５ｎｇ／ｍｍ2であることが更に好ましい。核酸の割合が上記範囲であることにより、高い密度で播種された多数の細胞に核酸を導入する（送達する）確率を高めることが可能となり、結果として、細胞への核酸の導入効率を向上させることができる。
【００５６】
上記被覆細胞培養器によれば、例えば、室温のクリーンベンチ内で操作する際においても、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層はある程度の時間、具体的には５分〜４０分間、固化したままであるため、上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層、ひいては培養中の細胞を細胞培養器に接着させ続けることができる。
【００５７】
特に、低曇点型温度応答性ポリマー組成物として、（２）トリスを含む混合型温度応答性ポリマー組成物を用いた場合、下記の作用効果を奏する。
上記被覆細胞培養器では、培養工程で、上記組成物に含まれるＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の疎水性側鎖と、トリスのアミノ基とが、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えるものと推定される。
また、上記組成物に含まれる（３）核酸は、培養工程で、上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にするものと推定される。
なお、上記被覆細胞培養器は、培養面に上記（１）及び上記（２）のみからなる組成物を被覆してなる被覆細胞培養器と比較して、細胞毒性、細胞傷害性が抑制され、細胞培養に適した表面状態を有していると推定される。
【００５８】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層の形成方法としては、特に限定されないが、例えば、曇点以下の温度まで冷却した低曇点型温度応答性ポリマー組成物の水溶液を、細胞培養器のウェルの底面に流延させて、その後、３７℃のインキュベーター中で静置し、低曇点型温度応答性ポリマー組成物を培養皿の底面へ沈降させる方法が挙げられる。
なお、上記被覆細胞培養器は、上記組成物を被覆するために使用した水（上澄液）を除去した後に使用することも可能であり、また、水を除去した後に上記組成物を乾燥させてから使用することも可能である。
【００５９】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物層は、更に乾燥をさせてもよい。乾燥の方法としては、特に限定されないが、例えば、加湿を一時的に停止させた細胞インキュベーター内に一定時間（例えば、２４時間程度）静置する方法等が挙げられる（乾燥工程）。
【００６０】
上記低曇点型温度応答性ポリマー組成物中に、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体、核酸、及びトリスが含まれる場合、上記被覆細胞培養器では、培養工程で、ＤＭＡＥＭＡ及び／又はその誘導体の重合体の疎水性側鎖と、トリスのアミノ基とが、何らかの相互作用をしながら、細胞に刺激を与えるものと推定される。また、核酸は、培養工程で、上記組成物中の正電荷と負電荷とのバランスを好適にして、細胞傷害性を抑制し（哺乳類細胞の細胞膜の表面は負電荷を帯びているため、カチオン性物質は細胞傷害性を有することが多い）、且つ、上記組成物の親水性と疎水性とのバランスを好適にして、細胞の遊走や配向を可能にするものと推定される。
【００６１】
（第１播種工程）
そして、準備した被覆細胞培養器に、細胞を、１００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、被覆細胞培養器の培養面上に播種する（第１播種工程）。
この工程は、例えば、３７℃のインキュベーター中に静置しておいた被覆細胞培養器を、室温のクリーンベンチに取り出して、行うことができる。
【００６２】
上記細胞密度に関して、例えば、２００ｍｍ2の培養面の面積及び１ｍＬの培地容量を有する２４ウェルプレートに、播種する場合に、１００個／ｍｍ2以上の細胞密度で播種を行うためには、２×１０4個／ｍＬ以上の細胞密度を有する細胞浮遊液を用いる必要がある。
【００６３】
また、上記細胞密度は、培養中の細胞同士の接触による増殖停止等の、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、３００個／ｍｍ2以下とすることが好ましい。
【００６４】
そして、上記細胞密度は、１００個／ｍｍ2〜２００個／ｍｍ2とすることが更に好ましい。上記細胞密度を上記範囲とすれば、細胞が培養皿に接着・伸展しながら増殖する細胞に対して、十分な量の核酸を送達することが可能となり、その結果、これに引き続く下記の第２培養工程で、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００６５】
この第１播種工程において播種された細胞は、低曇点型温度応答性ポリマー組成物層に付着し、エンドサイトーシスにより前述のポリマー組成物又は前述の核酸を取り込むと考えられる。そして、このとき、取り込む確率や機会は、細胞を培養する比較的長い期間（長いものでは１０日間）の間、継続的に供給されているので、より多くの核酸が取り込まれると考えられる。この点、核酸を細胞に接触させる時間が数秒〜３時間程度という比較的短い期間となる従来技術とは大きく異なっている。
【００６６】
（第１培養工程）
次いで、第１播種工程において播種した細胞を、２００個／ｍｍ2以上の細胞密度になるまで、培養する（第１培養工程）。
なお、２００個／ｍｍ2以上という細胞密度の数値範囲は、当業者により判断される概ねコンフルエントの状態に相当する範囲を指すことを意味しており、この数値範囲は細胞種や培養条件により変動を生じ得る。
【００６７】
播種した細胞は、静置することによって培養することが好ましい。
培養温度としては、特に限定されないが、例えば、３０℃以上であることが好ましく、３５℃以上であることが更に好ましく、また、３８℃以下であることが好ましく、３７℃であることが特に好ましい。
培養時間としては、細胞種により増殖速度が異なり、同種の細胞でもその状態や継代回数により増殖速度は変動するため、特に限定されないが、細胞群が当業者により判断されるコンフルエントの状態を超えない程度の時間であることが好ましく、例えば、皮下脂肪由来の間葉系幹細胞の場合には、通常１〜１０日間程度である。
【００６８】
なお、培地等の培養条件は、細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができる。
【００６９】
この工程では、播種された細胞は、生育しながら、低曇点型温度応答性ポリマー組成物に含まれる核酸の導入を受ける。
【００７０】
なお、第１培養工程後の細胞の、細胞培養器の培養面の全表面積（低曇点型温度応答性ポリマー組成物層の一方の面の全表面積）（１００％）に対する、細胞の投影面積（細胞が占める表面積）の割合は、特に限定されないが、例えば、９０〜１００％（９０〜１００％コンフルエント）が好ましく、より好ましくは９５〜１００％（９５〜１００％コンフルエント）、特に好ましくは１００％である。
【００７１】
（第２播種工程）
そして、細胞を、３０００個／ｍｍ2以上の細胞密度で、前記被覆細胞培養器の前記播種した細胞上に、播種する（第２播種工程）。
この工程は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。
【００７２】
上記細胞密度で細胞を播種すれば、詳細なメカニズムは不明であるが、下記の培養工程で、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成させることができる。この細胞構造体は、そのペレット状の構造内に生存している細胞を有する。
【００７３】
また、上記細胞密度は、培養中の細胞同士の接触による増殖停止等の、細胞周期に関する問題を生じにくくするため、６０００個／ｍｍ2以下とすることが好ましい。
【００７４】
そして、上記細胞密度は、３０００個／ｍｍ2〜５０００個／ｍｍ2とすることが更に好ましい。上記細胞密度を上記範囲とすれば、細胞が培養皿に接着・伸展しながら増殖する細胞に対して、十分な量の核酸を送達することが可能となり、その結果、引き続く下記の第２培養工程で、ペレット状の構造を有する細胞構造体を形成しやすくするという上記効果が得られやすい。
【００７５】
（第２培養工程）
次いで、第２播種工程において播種した細胞を培養する（第２培養工程）。
この工程は、例えば、一般的な３７℃の細胞インキュベーターを用いて行うことができる。
【００７６】
播種した細胞は静置培養することが好ましい。
培養温度としては、特に限定されないが、例えば、３０℃以上であることが好ましく、３５℃以上であることが更に好ましく、また、３８℃以下であることが好ましく、３７℃であることが特に好ましい。
培養時間としては、培養時間としては、細胞種により増殖速度が異なり、同種の細胞でもその状態や継代回数により増殖速度は変動するため、特に限定されないが、細胞群が当業者により判断されるコンフェルトの状態を超えない程度の時間であることが好ましく、例えば、皮下脂肪由来の間葉系幹細胞の場合には、通常１〜１０日間程度である。
【００７７】
なお、培地等の培養条件は、細胞種や実験目的に基づいて、当業者は適切に定めることができる。
【００７８】
第２播種工程において播種された細胞は、第１播種工程において播種され、低曇点型温度応答性ポリマー組成物に含まれる核酸の導入を受けた細胞と共に、１つの細胞塊を形成する。
そして、この細胞塊は、培養皿の端部から全ての細胞が一度に剥離して、まるでシートが丸まりながら収縮して行くような動作で、細胞が互いに一箇所に凝集する現象を生じる。互いに集まった細胞は、あたかも何らかの組織を形成するかのように自発的に集合し、立体的なペレット状の構造を形成する。
【００７９】
ここで、驚くべきことに、上記細胞塊では、第１播種工程において播種された細胞のみならず、低曇点型温度応答性ポリマー組成物と直接的に接触していない、第２播種工程において播種された細胞も、核酸の導入を受けていることがわかった。
これは、第１播種工程で核酸導入された細胞から低曇点型温度応答性ポリマー組成物の微粒子、導入された核酸分子、又はｍＲＮＡが、その分子自体かエクソソーム等を介して送達された可能性が推測されるが、今後の研究により解明されると考えられる。
【００８０】
（核酸が導入された細胞構造体）
本発明の実施形態の核酸が導入された細胞構造体は、上記本発明の実施形態の核酸が導入された細胞構造体の製造方法により製造することができる。
【００８１】
本発明の実施形態の核酸が導入された細胞構造体の製造方法は、単層構造を形成する培養（単層培養）と異なり、三次元的構造を形成する培養（三次元培養）である。これにより、細胞凝集塊を得ること（胚葉体培養）ができ、生体内に存在する細胞に近い状態にあり、同様の機能を備える細胞を、試験管内に調製することが可能となる。
従来、単層培養した細胞に遺伝子を導入することによって行なっていた、遺伝子、タンパク質、細胞機能等に関する研究は、今後、三次元培養した細胞を用いて行う方向に向かうと考えられる。また、従来、生体内に存在する細胞に遺伝子を導入することによって行なっていた研究（すなわち、動物実験による研究）は、今後、試験管内で行う方向に向かうと考えられる。この点は、動物愛護の観点、実験の難易度を低減し再現性を高める観点等から、社会的ニーズに応える点でもある。
【００８２】
発明者らは、ペレット状の核酸が導入された細胞構造体に関する前述の知見に加えて、この細胞構造体は、生体内の所定の部位におく、又は生体内の所定の部位の環境に似た環境中におくことによって、その部位の組織に適合した細胞（その部位におけるあるべき型の細胞）に分化する機能を有することを見出した。
【００８３】
そして、調製した細胞構造体は、コラーゲンやフィブロネクチンに対して頑強に接着する性質がある。
特に、核酸が導入された細胞構造体の製造方法において、低曇点型温度応答性ポリマー組成物に含まれる核酸が、抗凝固性タンパク質をコードする遺伝子であり、血管の吻合術において核酸が導入された細胞構造体を吻合部位に貼り付けた場合、細胞構造体が、物理的に針孔を塞いで、血液の漏れを防ぎつつ、細胞構造体で発現された抗凝固性タンパク質が、吻合部を通過する血液の凝固を抑制する、という効果が得られる。この場合、細胞構造体は、血栓溶解剤として用いることができる。
抗凝固性タンパク質としては、納豆キナーゼ、トロンボプラスチン、ＶＥＧＦ等が挙げられる。
【００８４】
また、調製した細胞構造体は、癌病巣に対して頑強に接着する性質がある。
特に、移植材料において、低曇点型温度応答性ポリマー組成物が、混合型温度応答性ポリマー組成物であり、該混合型温度応答性ポリマー組成物に含まれる核酸が、抗腫瘍性タンパク質をコードする遺伝子であり、癌病巣の治癒において移植材料を癌病巣に注入した場合、細胞構造体内で発現された抗腫瘍性タンパク質を、所定期間、癌病巣に分泌し続ける、という効果が得られる。この場合、細胞構造体は、プロドラッグ徐放剤として用いることができる。
抗腫瘍性タンパク質としては、ＴＮＦ−α、マイタケフラクションＩＶ等が挙げられる。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は下記の実施例に何ら限定されるものではない。
【００８６】
下記の試験において、市販の試薬は、特に断りのない限り更に精製することなく用いた。
【００８７】
（試験Ａ）低曇点型温度応答性ポリマー組成物（混合型温度応答性ポリマー組成物）の調製
（試験Ａ１）温度応答性ポリマーの調製
容量５０ｍＬの軟質ガラス製の透明なバイアル瓶に、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル）メタクリレート７．０ｇを加えて、磁気撹拌器を用いて撹拌した。そして、この混合物（液体）に対してＧ１グレードの高純度（純度：９９．９９９９５％）の窒素ガスを１０分間パージ（流速：２．０Ｌ／分）することにより、この混合物を脱酸素した。
その後、この反応物に対して、丸型ブラック蛍光灯（ＮＥＣ社製、型番ＦＣＬ２０ＢＬ、１８Ｗ）を用いて、２１時間紫外線照射することにより、上記反応物を、溶媒を用いることなく（すなわち、ニート条件下で）、重合させた。反応物は、５時間後に粘性を帯び、１５時間後に固化して、重合体が、反応生成物として得られた。この反応生成物を、クロロホルムに溶解させ、その後、ｎ−ヘキサンを用いて再沈殿させた。クロロホルム／ｎ−ヘキサンを用いた上記再沈殿を、計６回繰り返すことにより、反応生成物を精製した。
精製した重合体をエバポレーションすることにより、その中に残留する溶媒を除去した。その後、重合体を１５０ｍＬのベンゼンに溶解させ、ＰＴＦＥ製の０．４５μｍフィルター（ポール社製、型番：Ｅｋｉｃｒｏｄｉｓｋ  ２５ＣＲ）で濾過し、得られた濾液を凍結乾燥させることにより、カチオン性の温度応答性（ホモ）ポリマーが得られた（収量４．３ｇ、転化率：６１．４％）。このポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）を、ＧＰＣ（島津社製、型番：ＬＣ−１０ｖｐシリーズ）を用いて、ポリエチレングリコール（Ｓｈｏｄｅｘ社製、ＴＳＫシリーズ）を標準物質として測定し、Ｍｎ＝９７，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝４．１）と決定した。
また、このポリマーの核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）を、核磁気共鳴装置（Ｖａｒｉａｎ社製、型番：Ｇｅｍｉｎｉ３００）を用いて、重水（Ｄ2Ｏ）中で測定した。結果は下記の通りである。
1H-NMR (in D2O) δ 0.8-1.2 (br, 3H, -CH2-C(CH3)-), 1.6-2.0 (br, 2H, -CH2-C(CH3)-), 2.2-2.4 (br, 6H, -N(CH3)2), 2.5-2.7 (br, 2H, -CH2-N(CH3)2), 4.0-4.2 (br, 2H, -O-CH2-)
【００８８】
（試験Ａ２）ポリマー／核酸の調製
以下、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製、ＤＰＢＳ（１×））を用いた。
核酸として、ＲＦＰをコードするＤＮＡ（ｐＴｕｒｂｏ６０４−Ｎ１）を用いて、このＤＮＡをＰＢＳに溶解させ、ＤＮＡ溶液を調製した（最終濃度：５００μｇ／ｍＬ）。
（試験Ａ１）で合成した温度応答性ポリマーをＰＢＳに溶解させることによってポリマー溶液を調製し、この溶液を４℃まで冷却することにより、グロビュール相転移による疎水凝集性のクラスターを形成させない均質な溶液とした（最終濃度は、ポリマー：４００μｇ／ｍＬ）。
このＤＮＡ溶液８μＬに、上記ポリマー溶液４０μＬを少しずつ滴下して混合した。この混合物に８３２μＬのＰＢＳを加えて希釈して、混合型温度応答性ポリマー組成物（最終濃度、ポリマー：１６μｇ／ｍＬ、ＤＮＡ：４μｇ／ｍＬ）を得た。
なお、上記混合型温度応答性ポリマー組成物におけるＮ／Ｐ比は、８であった。
【００８９】
（試験Ｂ）細胞培養器に対する細胞培養用組成物の被覆
（試験Ａ）で調整した、４℃に冷却された低曇点型温度応答性ポリマー組成物のＰＢＳ溶液を、ポリスチレン製の２４ウェル細胞培養プレート（イワキ社製、マイクロプレート、型番：３８１５−０２４、１ウェル当たりの底面積：２００ｍｍ2）の各ウェルに、この溶液を２００μＬずつ、室温下で加えて、素早く穴の底面の全面に流延させた。そして、この細胞培養皿を、細胞培養インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ2）中で３時間インキュベートした。
こうして、培養面であるウェルに低曇点型温度応答性ポリマー組成物を被覆してなる２４ウェル細胞培養プレート（細胞培養器）が得られた。
【００９０】
（試験Ｃ−１）細胞の播種、培養
室温条件下において、（試験Ｂ）で準備した２４ウェル細胞培養プレートの各ウェルに、ビーグル犬皮下脂肪由来の間葉系幹細胞（初代培養細胞、ＡＤＳＣ）を、完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）溶液）（ＤＭＥＭ：ギブコ社製、型番：１１９６５）、（ＦＣＳ：インビトロジェン社製、ロット番号：８５２５４６）中に浮遊させ、細胞密度を２００個／ｍｍ2（４×１０4個／ｍＬ）に調整した培養液を１ｍＬずつ加えた。図１（ａ）に、細胞を位相差顕微鏡により観察したときの写真を示す。
そして、この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で１０日間培養した。細胞を、蛍光位相差顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社、型番：ＩＸ−７０）（波長：６９９ｎｍ）を用いて観察したところ、ＡＤＳＣ内にＲＦＰの発現が確認された（図１（ｂ））。
【００９１】
（試験Ｃ−２）細胞の播種、培養
次いで、室温条件下において、上記の培養した細胞上に、初代ＡＤＳＣを、細胞密度を３５００個／ｍｍ2として、加えた。
そして、この細胞を３７℃の細胞培養インキュベーター中で２４時間培養した。
培養６時間後から、培養皿上で単層培養されて円形シート状の構造となっている細胞が、培養皿の外縁部から全ての細胞が一度に剥離して、まるでシートが丸まりながら収縮して行くような動作で、細胞が互いに一箇所に凝集する現象が生じた。上記現象は、肉眼で十分に視認可能であった。互いに集まった細胞は、１個の立体的なペレット状の構造を形成した。細胞構造体を、蛍光位相差顕微鏡を用いて観察したところ、細胞塊のほぼ全体にＲＦＰ由来の赤色の蛍光を確認することができた（図２）。
【００９２】
こうして得られたペレット状の構造を有する細胞構造体をトリプシン処理により培養皿から剥離し、該細胞構造体をなす細胞を用いて細胞浮遊液とした。この細胞浮遊液について、ＦＡＣＳ解析を行なったところ、５０％〜９０％の細胞でＲＦＰ由来の蛍光が確認された。（試験Ｃ−１）及び（試験Ｃ−２）において播種された細胞数を考慮すると、（試験Ｃ−１）において培養面上に播種した細胞のみならず、（試験Ｃ−２）において播種された細胞上に更に播種した細胞にも、核酸が導入されていることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、高い核酸導入効率で、簡便に、核酸が導入された細胞構造体の製造方法を提供することができる。
【図１】
2016131537.tif 000005
【図２】
2016131537.tif 000006