(57)【要約】      （修正有）【課題】癌性細胞に対する優れた選択的な細胞毒性を示す新規なＮ−置換ノルカンタリミドの誘導体の提供。【解決手段】式（Ｉ）で表されるＮ−置換ノルカンタリミド誘導体。2016098200.tif 000011【効果】上記Ｎ−置換ノルカンタリミド誘導体は、癌、特に白血病を治療するための医薬組成物を製造するためのリード化合物として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
請求項１
式（Ｉ）の化合物。
【化７】
2016098200.tif 000010
Ｒがファルネシル又はファルネシルオキシである。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物の有効量及び薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物であって、前記組成物を必要とする対象において癌を治療するための組成物。
【請求項３】
前記癌が、白血病、肝臓癌、膀胱癌、結腸癌、腎癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記癌が白血病である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記癌が肝臓癌である、請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、Ｎ−置換ノルカンタリミド誘導体の新規な合成化合物、及び癌を治療するための医薬又は医薬組成物を製造するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マダラゲンセイから単離される活性化合物の１つ、カンタリジンは、強力なセリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）及びホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）阻害剤であり、インビトロ及びインビボの双方で抗癌特性を有することが示されている。しかしながら、腎臓及び肝臓に対して毒性があることも発見された。過去の研究は、正常な組織に対する重要な細胞毒性のない抗癌活性を示すカンタリジンの類似体及び／又は誘導体を特定することが試みられ、例えば、ノルカンタリジン及びノルカンタリミドが製造されている。カンタリジンが脱メチル化された、ノルカンタリジンは、腎毒性をほとんど有さないことが発見されるが、脱メチル化反応もまた、低い生理活性となる。ノルカンタリミドに関して、Ｎ位に長いアルキル鎖を有するその類似体は、アルキル鎖の疎水性により、改良された生体吸収が与えられるため、高められた生理活性を有することが提案されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従って、関連技術において、正常細胞ではなく、癌性細胞に対する、優れた選択的な細胞毒性を示すカンタリジンの類似体及び／又は誘導体の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、２つのＮ−置換ノルカンタリミド誘導体が、癌性細胞の成長を阻害し得るとの予想外の発見に少なくとも部分的に基づく。本発明の結果は、特定された２つのＮ−置換ノルカンタリミド誘導体が、癌の治療のための治療薬としての使用に可能性があるリード化合物であるということを示唆する。
【０００５】
従って、本開示の第１の態様は、式（Ｉ）の化合物を対象とする。
【化１】
2016098200.tif 000002
Ｒがファルネシル又はファルネシルオキシである。
【０００６】
１つの例では、式（Ｉ）の化合物はＮ−ファルネシルオキシ−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（ＮＯＣ１５）である。別の例では、式（Ｉ）の化合物は、Ｎ−ファルネシル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（ＮＣ１５）である。
【０００７】
本開示の第２の態様は、それゆえ、癌を治療するための医薬組成物を対象とする。医薬組成物は、上記の式（Ｉ）の化合物の有効量および薬学的に許容できる賦形剤を含む。
【０００８】
本開示の医薬組成物によって治療され得る癌は、白血病、肝臓癌、膀胱癌、結腸癌、腎癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）からなる群から選択される。１つの例では癌が白血病である。別の例では、癌が肝臓癌である。
【０００９】
本発明の化合物（すなわち、式（Ｉ）の化合物）は、医薬組成物の総重量に基づき、約０．１〜９９重量％のレベルで存在する。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも１重量％のレベルで存在する。ある実施形態において、本発明の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも５重量％のレベルで存在する。さらなる他の実施形態において、本発明の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも１０重量％のレベルで存在する。さらにまた他の実施形態において、本発明の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも２５重量％のレベルで存在する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、医薬又は医薬組成物は、癌の治療を改善し又は癌性細胞の成長の抑制を助けるのに知られる別の作用物質をさらに含む。好ましくは、本発明の医薬又は医薬組成物は、さらに化学療法剤を含む。
【００１１】
それゆえ、本開示の第３の態様は、癌を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法を提供する。その方法は、癌の成長を抑え又は妨げるために、対象に本開示の医薬組成物を投与する工程を含む。この方法によって治療しうる癌は、白血病、肝臓癌、膀胱癌、結腸癌、腎癌、卵巣癌，子宮頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、又は扁平上皮癌（ＳＣＣ）の何れかである。１つの例では、癌が白血病である。別の例では、癌が肝臓癌である。対象は、哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。
【００１２】
いくつかの実施形態において、前記方法は、式（Ｉ）の化合物の投与前、その投与と一緒に、及び／又はその投与後、癌の治療を改良することが知られている別の作用物質を、対象に投与することをさらに含む。いくつかの例では、従来の医薬組成物は、化学療法剤と一緒に投与される。
【００１３】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、以下の本明細書において説明される。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明から、及び特許請求の範囲から、明らかとなる。
【００１４】
前述の一般的説明及び以下の詳細な説明の双方は、実例によるものであり、主張された本発明のさらなる説明を提供することを意図することを理解されたい。
【００１５】
本特許又は出願書類は、カラーで製作された図を含む。カラーの図面と、本特許又は特許出願公開のコピーは、請求し、必要な手数料を支払うと、庁によって提供されるだろう。
【００１６】
本発明の説明は、添付の図面を考慮して読まれる以下の詳細な説明から、より理解できるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の１つの実施形態に係る、化合物２、９、及び１８のそれぞれで処置した際の、核の変化を明らかにするためにＨｏｅｃｈｓｔ３３５２８で染色したＨｅｐＧ２細胞の写真である。
【図２】図２は、本発明の１つの実施形態に係る、化合物２、９、及び１８のそれぞれで処置した際の、ＨｅｐＧ２細胞の細胞周期分析を図示する。
【図３】図３は、本発明の１つの実施形態に係る、化合物２、９、及び１８のそれぞれで処置した際の、細胞のアポトーシスの分析を図示する。
【図４】図４は、本発明の１つの実施形態に係る、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート及びイオノマイシン（ＰＭＡＩ）で活性化させた白血病Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞モデルを用いて、ヒト白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）及びヒトリンパ芽球細胞（ＮＨＬ）のそれぞれの生存率を縦軸として、（Ａ）化合物２、及び（Ｂ）ＮＯＣ１５の効果を図示する折れ線グラフである。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、本発明の１つの実施形態に係る、（Ａ）０時間、（Ｂ）２４時間、及び（Ｃ）４８時間のそれぞれで、ＮＯＣ１５で処置したヒト白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）の細胞周期の分布を図示する。図５Ｄは、図５Ａ〜５Ｃの定量した結果を図示する。
【図６】図６は、本発明の１つの実施形態に係る、（Ａ）２４時間、及び（Ｂ）４８時間のそれぞれで処置されたヒト白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）及びヒトリンパ芽球細胞（ＮＨＬ）の生存率を縦軸として、ＮＣ１５の効果を図示する棒グラフである。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、本発明の１つの実施形態に係る、（Ａ）０時間、（Ｂ）２４時間、及び（Ｃ）４８時間のそれぞれで、ＮＣ１５で処置されたヒト白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）の細胞周期の分布を図示する。図７Ｄは、図７Ａ〜７Ｃの定量した結果を図示する。
【図８】図８Ａは、本発明の１つの実施形態に係る、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５で処置されたＬ１２１０細胞をＳＣ注射された動物の生存期間経過を図示する。図８Ｂは、本発明の１つの実施形態に係る、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５で処置されたＬ１２１０細胞をＩＰ注射された動物の生存期間経過を図示する。
【図９】図９は、本発明の１つの実施形態に係る、ＳＣ注射又はＩＰ注射された白血病細胞を有する動物の（Ａ）腫瘍、（Ｂ）肝臓、及び（Ｃ）脾臓のそれぞれの重量変化を図示する。
【図１０】図１０Ａは、本発明の１つの実施形態に係る、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５で処置されたＬ１２１０細胞をＳＣ注射された動物の白血球数を図示する。図１０Ｂは、本発明の１つの実施形態に係る、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５で処置されたＬ１２１０細胞をＩＰ注射された動物の白血球数を図示する。
【図１１】図１１Ａは、本発明の１つの実施形態に係る、ＮＯＣ１５で処置された動物の体重の変化を図示する。図１１Ｂは、本発明の１つの実施形態に係る、ＮＣ１５で処置された動物の体重の変化を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本発明の説明として意図され、本発明が作成される又は利用され得る唯一の形態であることは意図されない。
【００１９】
便宜のため、詳細な説明、実施例、及び特許請求の範囲において採用される特定の用語は、ここに集められる。本明細書で特段の記載がない限り、本開示において採用される科学的及び技術的専門用語は、当業者によって共通に理解され、使用される意味を有すだろう。また、文脈によって特段の必要がない限り、単数の用語は、同じものの複数形を含み、複数の用語は単数を含むであろうことが理解されるだろう。特に、本願明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が明らかに、そうでないことを意図しない限り、複数の言及を含む。また、本願明細書、及び特許請求の範囲で使用する場合、「少なくとも１つの」及び「１以上の」との用語は、同じ意味を有し、１、２、３、又はそれより大きい数を含む。
【００２０】
本発明の幅広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、具体例において説明する数値は、できるだけ正確に報告される。どんな数値でも、しかしながら、本質的に、それぞれの試験測定において発見される標準偏差から必ず生じる、ある一定の誤差が含まれる。また、本願明細書で使用する場合、「約」との用語は、一般に、与えられた数値又は範囲の１０％、５％、１％、又は０．５％内を意味する。あるいは、「約」との用語は、当業者によって考慮される際、許容できる平均値の標準誤差内を意味する。作用する／実施する例以外において、又は特段の明確な特定がない限り、本願明細書に開示される、数値範囲、量、値、並びに物質の量、継続時間、温度、動作状況、及び量の比などのパーセンテージのようなパーセンテージの全ては、「約」との用語によって、全ての場合において、調整されていることと理解されるだろう。従って、それと反対に示されない限り、本開示及び特許請求の範囲において説明する数値パラメータは、要望通り変更できる近似値である。少なくとも、それぞれの数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字を考慮して、及び通常の丸め技術を適用することによって、解釈されるべきである。
【００２１】
「阻害すること又は阻害」又は「抑制すること又は抑制」との用語は、本願明細書で使用する場合、癌性細胞の、少なくとも４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の成長を止めるために、本発明の化合物を投与することを示し、それらの倍増を防ぎ、それゆえに、癌の大きさの縮小という結果になる；このように、「阻害すること又は阻害」又は「抑制すること又は抑制」との用語は、本願明細書で使用する場合も、癌性細胞を殺傷し、又はアポトーシスを誘導することを示す。
【００２２】
本願明細書で使用する場合、「治療すること」との用語は、腫瘍に伴う症候、二次的障害又は病態を予防すること、改善すること、軽減すること、及び／又は管理することを、部分的に又は完全に、包含する。「治療すること」との用語は、本願明細書で使用する場合、部分的に又は完全に、腫瘍の１以上の症候、二次的障害、又は特徴について、緩和し、改善し、軽減し、発症を遅らせ、進行を抑制し、重症度を低減し、及び／又は発生率を低減する目的で、腫瘍に伴う症候、二次的障害、又は病態を有する対象への、本開示に従った、式（Ｉ）の化合物の適用又は投与を示す。腫瘍に伴う症候、二次的障害、及び／又は病態は、これらに限定されないが、説明ができない体重減少、熱、疲労、疼痛、及び身体機能の変化を含む。治療は、腫瘍に伴う症候、二次的障害、及び／又は病態を発症するリスクの減少を目的として、このような症候、障害、及び／又は病態の早期の兆候のみが存在する対象に投与されてもよい。治療は、一般的に、もし１以上の症候、又は臨床マーカーが減少されれば、本明細書で定義される用語として、「有効なもの」である。あるいは、もし、症候、障害、又は病態の進行が減少され、又は止められれば、治療が「有効なもの」である。
【００２３】
「有効量」との用語は、本願明細書で使用する場合、癌の治療に関して所望の治療的に望ましい結果を達成するために、投薬時、及び必要な期間で有効となる量を示す。
【００２４】
「化合物」、「組成物」、「作用物質」、又は「医薬」との用語は、対象（ヒト又は動物）に投与される際、局部の及び／又は全身性の作用による所望の薬理学的な、及び／又は生理効果を引き起こす化合物又は組成物を示すため、本明細書においてほとんど同義で使用される。
【００２５】
「投与される」、「投与する」、又は「投与」との用語は、本発明の化合物又は組成物を直接に投与すること、又は体内で当量の活性化合物を形成するプロドラッグ、誘導体、又は類似体を投与することの何れかの意味を示すため、本明細書において、ほとんど同義で使用される。
【００２６】
用語「対象」又は「患者」は、本発明の組成物及び／又は方法で治療可能であるヒトの種を含む動物を示す。「対象」又は「患者」は、一方の性別が特に示されていない限り、男性及び女性の双方を示すことを意図する。従って、「対象」又は「患者」との用語は、本開示の化合物による治療から利益を得られる、任意の哺乳動物、好ましくはヒトを含む。
【００２７】
本開示は、２つの親油性のＮ−置換ノルカンタリミド誘導体が、正常な細胞に影響を及ぼさずに、癌性細胞、特に白血病の癌細胞の成長を阻害し得ることの予期しない発見に、少なくとも部分的に基づく。それゆえ、これらの２つのＮ−置換ノルカンタリミド誘導体は、白血病を含む、癌を治療するための治療薬として使用する、可能性のあるリード化合物である。
【００２８】
本開示の１つの態様は、それゆえ、式（Ｉ）の化合物を対象とする。
【化２】
2016098200.tif 000003
Ｒがファルネシル又はファルネシルオキシである。
【００２９】
１つの好ましい例は、式（Ｉ）の化合物が、Ｎ−ファルネシルオキシ−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物９又はＮＯＣ１５）である。別の好ましい例は、式（Ｉ）の化合物が、Ｎ−ファルネシル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物１８又はＮＣ１５）である。
【００３０】
ＮＯＣ１５及びＮＣ１５は、本開示の実施例１において説明する、それぞれの合成スキーム定義されている、以下の工程によって、それぞれ製造され得る。
【００３１】
１つの実施形態によれば、スキーム１は、ＮＯＣ１５を含むＮＯ−置換ノルカンタリミド誘導体の製造が採用される。特に、５，６−デヒドロノルカンタリジン（５）は、出発物質として、フラン（３）及び無水マレイン酸（４）を用いた、以下のＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ反応によって、はじめに製造される。次いで、化合物５は、水素化されてノルカンタリジン（２）を与え、次いで、室温で、ドライメタノール中、ナトリウムメトキシドの存在下でヒドロキシルアミン塩酸塩と反応され、Ｎ−ヒドロキシノルカンタリミド（６）を製造する。Ｎ−ヒドロキシノルカンタリミド（６）は、次いで、Ｋ２ＣＯ３の存在下で、ファルネシル臭化物と反応され、Ｎ−ファルネシルオキシ−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物９又はＮＯＣ１５）を製造する。
【００３２】
スキーム１。ＮＯＣ１５の合成。
【化３】
2016098200.tif 000004
【００３３】
スキーム１における試薬及び条件は、以下のとおりである：（ａ）エーテル、室温、４８時間；（ｂ）３ａｔｍ  Ｈ２、１０％  Ｐｄ／Ｃ、ＴＨＦ、室温、８時間；（ｃ）ＮａＯＣＨ３、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ、ＭｅＯＨ、室温、２０時間；（ｄ）Ｋ２ＣＯ３、ファルネシル臭化物、アセトン、還流、８〜１０時間。
【００３４】
別の実施形態によれば、スキーム２は、ＮＣ１５を含むＮ−置換ノルカンタリミド誘導体の製造に採用される。スキーム２は、フラン（３）及びマレイミド（１３）がトルエン中で反応することで開始され、ジヒドロキシノルカンタリミド（１４）を与える。次いで、ジヒドロキシノルカンタリミド（１４）は、水素化され、ノルカンタリミド（１５）を生成する。次いで、ノルカンタリミド（１５）は、Ｋ２ＣＯ３の存在下でファルネシル臭化物と反応され、Ｎ−ファルネシル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物１８又はＮＣ１５）を製造する。
【００３５】
スキーム２。ＮＣ１５の合成。
【化４】
2016098200.tif 000005
【００３６】
スキーム２における試薬及び条件は、以下のとおりである：（ａ）トルエン、８０℃、６時間；（ｂ）３ａｔｍ  Ｈ２、１０％  Ｐｄ／Ｃ、ＴＨＦ、室温、８〜４８時間；（ｃ）Ｋ２ＣＯ３、ファルネシル臭化物、アセトン、還流、８〜１０時間。
【００３７】
白血病、肝臓癌、膀胱癌、結腸癌、腎癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）のような癌性細胞の成長は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０μＭのような約１〜２０μＭの濃度で、式（Ｉ）の化合物によって阻害され、又は抑制され得る。１つの例では、肝臓癌性細胞のエキソビボ成長は、約８．２μＭのＮＯＣ１５（化合物９）で、約５０％阻害されるのに対して、正常な肝臓細胞は影響を受けない。さらに別の例では、肝臓癌性細胞のエキソビボ成長は、ＮＯＣ１５（化合物９）によって、約１０．７μＭの濃度で、約５０％阻害される。さらなる例では、白血病細胞のエキソビボ成長は、約８．３μＭで、約５０％抑制される。さらに別の例では、白血病細胞（Ｌ１２１０）のエキソビボ成長は、約１．６μＭのＮＣ１５（化合物１８）によって、約５０％抑制される。他の例では、Ｌ１２１０細胞のエキソビボ成長は、約２．６μＭのＮＣ１５（化合物１８）によって、約５０％抑制される。
【００３８】
従って、本開示は、それらに限定されないが、白血病、肝臓癌、膀胱癌、結腸癌、腎癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含む、癌を治療するのに好適な医薬組成物を提供する。１つの好ましい例において、癌は白血病である。別の好ましい例において、癌は肝臓癌である。
【００３９】
医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物の有効量及び薬学的に許容できる賦形剤を含む。一般的に、式（Ｉ）の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき約０．１〜９９重量％のレベルで存在する。いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも１重量％のレベルで存在する。ある実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも５重量％のレベルで存在する。さらなる他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも１０重量％のレベルで存在する。さらに他の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、医薬組成物の総重量に基づき、少なくとも２５重量％のレベルで存在する。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａｌｆｏｎｏｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５）において説明されるような、許容できる製薬の手順に従って調製されてもよい。薬学的に許容できる賦形剤は、製剤において他の成分と親和性があり、生物学的に許容できるものである。
【００４１】
医薬組成物は、これらに限定されないが、錠剤、カプセル、及びサシェ剤を含む固形の剤形に製剤されてもよい。それぞれの錠剤は、微結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、及びグリシンのような種々の賦形剤を；デンプン、アルギン酸、及び特定のケイ酸塩のような種々の崩壊剤と一緒に；ポリビニルピロリドン、スクロース、ゼラチン、及びアラビアゴムのような造粒結合剤と一緒に含んでもよい。加えて、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルクのような平滑剤が加えられてもよい。原料は、これに関しても、高分子量のポリエチレングリコールと同様に、ラクトース、又は乳糖を含む。前述の固形の剤形は、任意の成分の放散速度を調整するために、任意に、腸用コーティング、及びコーティングのようなコーティング、及びシェルを含有してもよい。そのようなコーティングの例は、当該技術分野で周知である。１つの例では、本開示の医薬組成物は、錠剤として製剤される。別の例において、本開示の医薬組成物は、軟質及び硬質ゼラチンカプセルに封入された、又は生分解性の医薬的サシェ剤に詰められた粉末である。水性懸濁液及び／又はエリキシル剤が、経口投与のために所望される際、有効成分は、種々の甘味料、又は着香剤、着色剤、又は染料と、もし所望するならの乳化及び／又は懸濁剤も、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン、及びこれらの組合せのような希釈剤と一緒に組み合わせてもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、経口投与のための液体の剤形である。液体製剤は、所望のｐＨを維持するために、さらに、緩衝剤を含んでもよい。液体の剤形は、軟質ゼラチンカプセルに満たされてもよい。例えば、液体は、式（Ｉ）の化合物、それらの薬学的に許容できる誘導体、立体異性体、代謝産物、塩、又は溶媒和物、又はこれらの組合せを保有する、溶液、懸濁液、エマルション、マイクロエマルション、沈殿物、又は任意の所望の液体媒体を含んでもよい。液体は、放出時に薬品を含有するエマルション又は分散相を形成するために、式（Ｉ）の化合物の溶解性を改良するように設計されてもよい。そのような形態において、有効成分は、それらに限定されないが、上記のとおりのものを含む、少なくとも１つの薬学的に許容できる賦形剤と混合される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、非経口投与のための、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、又は腹腔内注射によって投与できる無菌液、又は懸濁液である液体の剤形である。無菌の注射剤又は懸濁液を製造するための、好適な希釈剤又は溶媒は、これらに限定されないが、１，３−ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、及び等張性の塩化ナトリウム溶液を含む。オレイン酸、及びそのグリセリド誘導体のような脂肪酸も、オリーブ油又はヒマシ油のような天然の薬剤的に許容できる油として、注射剤を調製するために有用である。これらの油剤又は懸濁液は、アルコール希釈剤若しくはカルボキシメチルセルロース、又は同様の分散剤も含有してもよい。他の一般的に使用されるＴｗｅｅｎ若しくはＳｐａｎのような界面活性剤、若しくは他の同様の乳化剤、又は薬学的に許容できる剤形を製剤する際に一般的に使用される生物学的利用能促進剤も、製剤の目的で使用され得る。
【００４４】
いくつかの他の実施形態において、本開示の医薬組成物は、経粘膜投与のための液体の剤形であり、本発明の前記医薬又は前記医薬組成物も、口腔粘膜経由の薬物送達のための投薬単位の口腔内及び／又は舌下薬品のような、粘膜適用のために、様々な剤形に製剤されてもよい。実に様々な生分解性の重合体の賦形剤は、薬学的に許容できる、好適な付着度、及び所望の薬品拡散プロファイルの双方を提供し、投与される活性薬剤、及び口腔内及び／又は舌下薬品の投薬単位において存在し得る、任意の他の構成成分と親和性があるものが使用されてもよい。一般的に、重合体の賦形剤は、口腔の粘膜の湿潤面に付着する親水性のポリマーを含む。重合体の賦形剤の例は、これらに限定されないが、アクリル酸ポリマー、及びコポリマー；加水分解ポリビニルアルコール；ポリエチレンオキシド；ポリアクリレート；ビニルポリマー及びコポリマー；ポリビニルピロリドン；デキストラン；グアーガム；ペクチン；デンプン；並びにセルロース誘導体ポリマーを含有する。
【００４５】
加えて、本発明の医薬組成物も、局所の適用に対して様々な剤形に製剤されてもよく、当該技術分野においてよく知られている実に様々な皮膚科学的に許容できる不活性な賦形剤が、本発明の医薬組成物を調製するために採用されてもよい。局所の組成物は、液体、クリーム、ローション剤、軟膏剤、ゲル、噴霧剤、エアロゾル、皮膚パッチなどを含んでもよい。典型的な不活性な賦形剤は、例えば、水、エチルアルコール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、鉱油、ステアリルアルコール、及びゲル生成物質であってもよい。前述の剤形及び賦形剤の全ては、製薬の分野にとっては周知である。剤形の選択は、本願明細書に記載される組成物の有効性にとって重要ではない。
【００４６】
従って、本開示は、癌を有する又は有すると疑われる対象を治療する方法も提供する。その方法は、癌の成長及び／又は転移を抑制及び／又は阻害するために、式（Ｉ）の化合物の有効量を含む本開示の医薬組成物を患者に投与することを含む。本発明の方法によって治療できる癌の例は、これらに限定されないが、白血病、肝臓癌、膀胱癌、結腸癌、腎癌、卵巣癌、子宮頚部癌、子宮内膜癌、前立腺癌、すい臓癌、肺癌、乳癌、黒色腫、及び扁平上皮癌（ＳＣＣ）を含む。１つの好ましい例において、対象は白血病を有する。別の好ましい例において、対象は、肝臓癌を有する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）の化合物の有効量を含む、本発明の医薬組成物は、経口摂取、静脈内又は筋注射によって、対象の体重１Ｋｇ当たり約１〜１００ｍｇ、対象に投与される。好ましくは、本発明の組成物は、経口的に投与される。量は、１日当たり、対象の体重１Ｋｇ当たり約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００ｍｇで、好ましくは、１日当たり、対象の体重１Ｋｇ当たり３０、４０、５０、６０、又は７０ｍｇのような、対象の体重１Ｋｇ当たり約３０〜７０ｍｇで；及び、より好ましくは、１日当たり、対象の体重１Ｋｇ当たり約５０ｍｇで対象に投与される。用量は、単一の投薬量で、又は代わりに複数の投薬量で投与され得る。
【００４８】
いくつかの実施形態において、方法は、本発明の医薬組成物（又は、本発明の式（Ｉ）の化合物）を投与する工程の前に、一緒に、及び／又はその後に、癌の治療を改良することが知られる別の作用物質を投与する工程をさらに含む。本発明の組成物又は式（Ｉ）の化合物と共に投与されてもよい作用物質は、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性薬物、抗微小管薬及びその他のような化学療法剤である。
【００４９】
一般に、本発明の組成物（又は式（Ｉ）の化合物）は、任意の好適な経路、例えば、カプセル、サシェ剤、懸濁液又は錠剤で経口によって；又は非経口的に投与されてもよい。非経口的に投与とは、例えば、口腔、筋肉内、静脈内、皮下、又は腹腔内注射のような全身投与を含み得る。組成物は、局所的に、又は吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、口腔吸入、又は鼻腔内滴剤）による何れか、又は直腸に、単独、又は従来の薬学的に許容できる賦形剤と組み合わせて、経皮的に投与されてもよい。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、対象に対して、経口的に（例えば飲食で）投与される。
【００５０】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物を受けた対象は、任意の対照対象（すなわち、本発明の組成物によって治療されていない対象）と比較したとき、寿命において少なくとも１０〜４０％の増加、腫瘍の大きさ、及び白血球数の減少を示す。
【００５１】
本発明の化合物の投薬量は、選択される特定の化合物又は組成物、投与経路、及び患者において所望の反応を誘導する化合物（単独又は１つ以上の薬物と組み合わせて）の能力だけでなく、軽減される病態の病状若しくは重症度、患者の年齢、性別、体重、患者の状態及び治療される病態の重症度、患者によって続けられている併用医薬又は特別食などの要因並びに当業者が認識している他の要因によって患者ごとに変わることは理解され、最終的に適切な投薬量は主治医の判断による。投薬計画は、改良された治療反応を提供するために調整されてもよい。治療上有効量は、化合物又は組成物のあらゆる有毒な又は有害な効果を、治療的に有益な効果が上回る場合である。好ましくは、本発明の化合物又は組成物は、症候の数及び／又は重症度が低減されるような投薬量及び期間で投与される。
【００５２】
本開示の幅広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータが、近似値であるにもかかわらず、具体例で説明する数値はできるだけ正確に報告される。あらゆる数値は、しかしながら、本質的に、それぞれの試験測定において発見される標準偏差から必ず生じる、ある一定の誤差が含まれる。
【００５３】
本発明は、限定よりはむしろ、説明の目的のために提供される以下の具体例を参照して、より具体的に説明されるだろう。
【実施例】
【００５４】
材料及び方法
細胞培養及び動物
本開示において使用される細胞株は、ヒト肝臓癌細胞株ＨｅｐＧ２、ヒト膀胱癌細胞株ＢＦＴＣ９０５、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９及びＳＷ４８０、及びヒト白血病細胞株ＨＬ６０及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ、及びマウスリンパ性白血病細胞株Ｌ１２１０を含む。それぞれの細胞株を培養し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、又はＲＰＭＩ１６４０培地において、１０％熱失活したウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充し、５％のＣＯ２／９５％の空気中、３７℃で維持した。
【００５５】
ＤＢＡ／２マウス（約７週齢、１８〜２２ｇ）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏ．，Ｌｔｄから得た。全てのマウスを、水及び飼料への接近を自由にして、特定病原体不在の状態で安置した。同系腫瘍を樹立するため、Ｌ１２１０細胞の溶液を、皮下組織中に注射した。あるいは、Ｌ１２１０細胞を、腹膜に注射した。全ての動物実験を、Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｔａｉｐｅｉ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  （Ｔａｉｗａｎ，  Ｒ．Ｏ．Ｃ．）のガイドラインに従って行った。
【００５６】
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイは、生細胞中で、（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）、黄色のテトラゾールを還元し、紫色のホルマザンにする酵素（すなわち、レダクターゼ）の活性を測定する比色分析である。この還元は、細胞が生きた状態のときだけ起こる；それゆえに、ＭＴＴアッセイは、一般的に、細胞の生存率及び増殖を測定するために使用される。簡単に、細胞を、４８時間、テストされた化合物（例えば、式（Ｉ）の化合物）の種々の用量で検証した。次いで、ＭＴＴ染料（５ｍｇ／ｍｌ、１０μＬ）を加え、イソプロパノール５００μｌの追加によって終わる前に、反応を１時間進めた。分光光度計によって、５４０ｎｍでの溶液の吸光度を測定した。ＩＣ５０値を、未治療の細胞の生存率を１００％と定めることにより、５０％の細胞増殖を阻害した薬品濃度として定義した。値を、少なくとも３つの独立した実験から、平均値±ＳＤとして表す。
【００５７】
白血病Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞モデルを活性化させるホルボール  １２−ミリスタート  １３−アセタート及びイオノマイシン（ＰＭＡＩ）
細胞生存率アッセイを、９６−ウェルプレートにおいて行った。１００μＬの細胞懸濁液（ＮＨＬ又はＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞、５×１０３細胞／ウェル、無血清培地）を、ウェルにおいて接種し、プレートを、培養器において、２４時間プレインキュベーションした（２２時間プレインキュベーションし、ＰＭＡＩ治療群において、ＰＭＡ５ｎｇ／ｍｌ及びイオノマイシン２５０ｎｇ／ｍｌで、２時間刺激した）。次いで、種々の濃度のノルカンタリジン（０、２、４、１５、３０、及び６０μＭ）又はＮＯＣ１５（０、０．２５、０．５、１、２及び４μＭ）を、ウェルの培地に加えた。インキュベーションの２４時間後、細胞計数キット−８（ＣＣＫ−８、Ｓｉｇｍａ）によって、ＮＨＬ及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞の細胞生存率を測定した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞及びＮＨＬ細胞上のノルカンタリジン及びＮＯＣ１５の５０％阻害濃度を算出した。
【００５８】
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３５２８染色
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３５２８を用いる染色を、これまでに記載された方法（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００９、５９、２０１−２０８）に従って実行した。簡単に、細胞を、４８時間、４０μＭノルカンタリジン、ＮＯＣ１５、又はＮＣ１５を用いて処理し、次いでＰＢＳ生理食塩水で洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３５２８（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州、アメリカ）を用いて、最終濃度１０μｇ／ｍＬで染色した。スライドを、蛍光顕微鏡の下で調べた。小さい核を備える細胞、高い蛍光強度（クロマチン凝縮による）、又は核断片化は、アポトーシスとみられる。
【００５９】
細胞周期分析
本発明の化合物（すなわち、ノルカンタリジン、ＮＯＣ１５、又はＮＣ１５、１０〜６０μＭ、４８時間）の前処理がされ、又はされなかった培養細胞を、培養された培地から回収し、７５％の氷冷したエタノールを用いてインキュベートすることにより固定し、分析まで−２０℃で保存した。次いで、固定した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、約１．５時間、３７℃で、ＤＮＡアーゼ（２００μｇ／ｍＬ、５００μＬ）を用いて処理した。沈殿した細胞を、遠心分離によって回収し、及びプロピジウムヨウ素（ＰＩ）（４０μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液溶液に再懸濁し、フローサイトメトリ分析に供する前に、暗所で、２０分間、２０〜２５℃でインキュベートし、フローサイトメトリ分析では、それぞれの細胞周期で細胞数を測定した。
【００６０】
アポトーシス細胞のパーセンテージを、アネキシン−Ｖ／ＦＩＴＣキット／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）フローサイトメーターを使用することによる製造業者の手順に従って測定した。アポトーシスの検出を容易にするため、処置した細胞を、５分間、１，０００×ｇの速度で、室温において、遠心分離し、次いで再懸濁し、アネキシン−Ｖ／ＰＩ（アポトーシス検出キット、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、タイペイ、台湾）を用いて染色する前に、５ｍＬのＰＢＳを用いて１度洗浄した。
【００６１】
同系腫瘍の発生、及びインビボ治療
腫瘍を接種するために、Ｌ１２１０細胞（１回の注射に対して１×１０６細胞）を、実験動物に対して皮下又は腹腔内の何れかに注射し、１日で腫瘍が発生した。７日後、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５（生理食塩水に希釈した）を、１８ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日７日間、腹腔内に投与した。動物の平均体重（ＢＷ）を、毎日測定した。
【００６２】
処置後、マウスを屠殺し、それらの腫瘍、肝臓及び脾臓を回収し、それぞれ、重量を測った；白血球（ＷＢＣ）数も測定した。
【００６３】
実施例１  本発明の化合物の合成
１．１  Ｎ−ファルネシルオキシ−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物９又はＮＯＣ１５）の製造
以下のスキームＩに従って、ＮＯＣ１５を合成した。
【化５】
2016098200.tif 000006
【００６４】
スキーム１における試薬及び条件は、以下のとおりである：（ａ）エーテル、室温、４８時間；（ｂ）３ａｔｍ  Ｈ２、１０％Ｐｄ／Ｃ、ＴＨＦ、室温、８時間；（ｃ）ＮａＯＣＨ３、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ、ＭｅＯＨ、室温、２０時間；（ｄ）Ｋ２ＣＯ３、ファルネシル臭化物、アセトン、還流、８〜１０時間。
【００６５】
７−オキサビシクロ［２．２．１］−５−ヘプテン−２，３−ジカルボン酸無水物（化合物５）。フラン（４０ｍＬ、５５０ｍｍｏｌ）及び無水マレイン酸（１０ｇ、１０２ｍｍｏｌ）溶液を、エーテル（１００ｍＬ）中で混合し、室温で、４８時間反応し、白色沈殿物を回収した後、乾燥して、無色の固体、収率９３．３％、ｍｐ１２１〜１２２℃として化合物５を製造した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  ６．５８（ｓ、２Ｈ、Ｈ−５，６）、５．４７（ｓ、２Ｈ、Ｈ−１，４）、３．１９（ｓ、２Ｈ、Ｈ−２，３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ  １７０．１（Ｃ＝Ｏ）、１３７．２（Ｃ−５、Ｃ−６）、８２．４（Ｃ−１、Ｃ−４）、４８．９（Ｃ−２、Ｃ−３）；；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−、ｍ／ｚ）Ｃ８Ｈ６Ｏ４についての計算値：１６６．０３、実測値１６４．９０［Ｍ−Ｈ］−。
【００６６】
７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボン酸無水物（化合物２）。化合物５（４．７ｇ、２８．３ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（２００ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（４７０ｍｇ）を加え、及び混合物を、水素雰囲気（３ａｔｍ）下、室温で、８〜１２時間撹拌した。反応混合物を、セライト５４５を通してろ過し、真空条件下で濃縮し、無色の結晶、収率９１．４％、ｍｐ１１６〜１１８℃として、化合物２（すなわち、ノルカンタリジン）を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ５．０５（ｔ、Ｊ＝２．３Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−１、４）、３．１８（ｓ、２Ｈ、Ｈ−２，３）、１．９１−１．８９（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）、１．６５−１．６３（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７１．７、８０．２、５０．６、２８．１；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−、ｍ／ｚ）Ｃ８Ｈ８Ｏ４についての計算値：１６８．０４、実測値１６６．８６［Ｍ−Ｈ］−。
【００６７】
Ｎ−ヒドロキシ−７−オキサビシクロ［２．２．１］−５−ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物６）。化合物２（５．０４ｇ、３０ｍｍｏｌ）のドライメタノール（２００ｍＬ）溶液に、ナトリウムメトキシド（１．６２ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びヒドロキシルアミン塩酸塩（２．０８ｇ、３０ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を、室温で２０時間撹拌した。次いで、反応混合物をろ過し、真空条件下で濃縮し、ＣＨＣｌ３を用いて再結晶化し、無色の結晶、収率６３％、ｍｐ１６８〜１６９℃として、化合物６を得た。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ  ４．９３（ｓ、２Ｈ、Ｈ−１、４）、３．２１（ｓ、２Ｈ、Ｈ−２，３）、１．８９−１．８６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）、１．７８−１．７４（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）；１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：δ  １７７．０、７８．８、４６．９、２８．０；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ＋、ｍ／ｚ）Ｃ８Ｈ９ＮＯ４についての計算値：１８３．０５、実測値２０６．００［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【００６８】
Ｎ−ファルネシルオキシ−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物９又はＮＯＣ１５）。撹拌された化合物６（１ｍｍｏｌ）のドライアセトン溶液に、ファルネシル臭化物（１ｍｍｏｌ）、及びＫ２ＣＯ３（３ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を、８〜１０時間還流した。次いで、その混合物をろ過し、真空条件下で濃縮し、溶離液として酢酸エチル／ｎ−ヘキサンを有するシリカゲルを用いてカラムクロマトグラフィにより残渣を精製し、ＮＯＣ１５を製造した。無色の液体、収率２８％であった。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ５．４２（ｔｄ、Ｊ＝０．９、７．７Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ−２’）、５．１１−５．０７（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６’、１０’）、４．８５（ｑ、Ｊ＝２．４Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−１，４）、４．６２（ｄ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−１’）、２．８３（ｓ、２Ｈ、Ｈ−２，３）、２．０９−２．０４（ｍ、６Ｈ、Ｈ−５，６、Ｈ−４’，８’）、１．９９−１．９６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５’）、１．８９−１．８６（ｍ、２Ｈ、Ｈ−６’）、１．７２（ｄ、Ｊ−０．７Ｈｚ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．６８（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．６３−１．６２（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）、１．６０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．５９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７１．６、１４７．３、１３５．３、１３１．３、１２４．３、１２３．５、１１６．１、７８．５，７３．０、４７．４、３９．６５、３９．６３、２８．７、２６．７、２６．１、２５．７、１７．７、１６．６、１６．０；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ＋、ｍ／ｚ）Ｃ２３Ｈ３３ＮＯ４についての計算値：３８７．２４、実測値４１０．２１［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【００６９】
１．２  Ｎ−ファルネシル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物１８又はＮＣ１５）の製造
ＮＣ１５を、以下のスキームＩＩに従って合成した。
【化６】
2016098200.tif 000007
【００７０】
スキーム２における試薬及び条件は、以下のとおりである：（ａ）トルエン、８０℃、６時間；（ｂ）３ａｔｍ  Ｈ２、１０％Ｐｄ／Ｃ、ＴＨＦ、室温、８〜４８時間；（ｃ）Ｋ２ＣＯ３、ファルネシル臭化物、アセトン、還流、８〜１０時間。
【００７１】
７−オキサビシクロ［２．２．１］−５−ヘプテン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物１４）。マレイミド（化合物１３）（１．５ｇ、１５ｍｍｏｌ）のドライトルエン（３０ｍＬ）溶液を８０℃で加熱し、次いで、フラン（５．４ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で、６時間撹拌し、室温まで冷却し、白色沈殿物を回収し、溶離液として酢酸エチル／ｎ−ヘキサンを有するシリカゲルを用いてカラムクロマトグラフィによって精製し、無色の結晶、ｍｐ１６２〜１６３℃として、化合物１４（２．１ｇ、収率８７％）を製造した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ８．１３  （ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、６．５０（ｓ、２Ｈ、Ｈ−５，６）、５．２９（ｓ、２Ｈ、Ｈ−１．４）、２．８７（ｓ、２Ｈ、Ｈ−２，３）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７６．２、１３６．８、８１．２、４８．９；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−、ｍ／ｚ）Ｃ８Ｈ７ＮＯ３についての計算値：１６５．０４、実測値１６４．０２［Ｍ−Ｈ］−。
【００７２】
７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物１５）。化合物１４（０．５ｇ、２．８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液へ１０％Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を加え、その混合物を、室温で、水素環境下、４時間撹拌した。反応混合物を、セライトを通してろ過し、真空条件下で濃縮し、無色の結晶、ｍｐ１８８〜１９０℃として、ＮＣ１５（４２４ｍｇ、収率８４％）を製造した。１Ｈ−ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ  ８．６０（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、４．９１（ｄｄ、Ｊ＝２．４、３．３Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−１，４）、２．９２（ｓ、２Ｈ、Ｈ−２，３）、１．８９−１．８５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）、１．６１−１．５７  （ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７７．２、７９．１、５１．３、２８．５；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−、ｍ／ｚ）Ｃ８Ｈ９ＮＯ３についての計算値：１６７．０６、実測値１６６．０３［Ｍ−Ｈ］−。
【００７３】
Ｎ−ファルネシル−７−オキサビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２，３−ジカルボキシイミド（化合物１８又はＮＣ１５）。化合物１５（１．０ｍｍｏｌ）のドライアセトン（２５ｍＬ）中の混合物において、ファルネシル臭化物（１ｍｍｏｌ）及びＫ２ＣＯ３（３ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を、８〜１０時間還流した。次いで、混合物をろ過し、真空条件下で濃縮し、溶離液として酢酸エチル／ｎ−ヘキサンを有するシリカゲルを用いるカラムクロマトグラフィによって、残渣を精製し、無色の液体、収率２０％として、ＮＣ１５を製造した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  ５．１０−５．０２（ｍ、３Ｈ、Ｈ−２’、６’、１０’）、４．８４（ｄｄ、Ｊ＝２．２、２．３Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−１，４）、４．０３（ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、２Ｈ、Ｈ−１’）、２．８２（ｓ、２Ｈ、Ｈ−２，３）、２．０６−２．０１（ｍ、４Ｈ、Ｈ−４’，８’）、１．９７−１．９２（ｍ、４Ｈ、Ｈ−５’、９’）、１．８４−１．８１（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）、１．７５（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．６７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．６０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．５９（ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）、１．５８−１．５５（ｍ、２Ｈ、Ｈ−５，６）；１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ  １７６．８、１４０．９、１３５．３、１３１．２、１２４．３、１２３．７、１１７．２、７８．９、５０．０、３９．７、３９．５、３７．０、２８．６、２６．８、２６．３、２５．７、１７．７、１６．４、１６．０；ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ＋、ｍ／ｚ）Ｃ２３Ｈ３３ＮＯ３についての計算値：３７１．２５、実測値３９４．２［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【００７４】
実施例２  本発明の化合物の抗増殖性活性
ＨｅｐＧ２細胞（肝臓癌）、ＢＦＴＣ９０５（膀胱癌）、ＨＴ２９（結腸癌）、ＳＷ４８０（結腸癌）、及びＨＬ６０（白血病）に対する、本開示の式（Ｉ）の化合物、特に、ＮＯＣ１５及びＮＣ１５の効果を、化合物２、並びに５−ＦＵ、シスプラチン、及びドキソルビシンを含む、他の知られている抗癌剤をそれぞれ、陽性対照として使用して、上記の手順に従った細胞生存率分析によって分析した。結果を表１にまとめる。
【００７５】
種々の癌細胞株上の増殖阻害
【表１】
2016098200.tif 000008
ａ：試験を行わなかった。
ＮＤは、１００μＭでの最大濃度の処置の際、検知できる阻害値（ＩＣ５０）を観察することができなかったことを示す。
【００７６】
表１に示されたデータから分かるように、ＮＯＣ１５及びＮＣ１５の双方は肝臓、膀胱、結腸、及び白血病癌細胞を含む５つの異なる型の癌細胞株に対して細胞毒性があり；それぞれ化合物は、少なくとも、５−ＦＵ、シスプラチン、及びドキソルビシンのような、他の知られている抗癌剤に対して、同じ効力があり、又はより優れた効力がある。白血病細胞株ＨＬ６０は、５−ＦＵ又はシスプラチンの処置によく反応しなかったがＮＯＣ１５又はＮＣ１５の処置には反応したことは、さらに留意されたい。
【００７７】
実施例３  ヒト肝臓癌上のＮＯＣ１５及びＮＣ１５の抗増殖活性
３．１  細胞生存率分析
この実施例において、化合物２を陽性対照として使用して、上記の手順に従って細胞生存率分析により、ＨｅｐＧ２細胞に対するＮＯＣ１５又はＮＣ１５の効果を分析した。結果を表２にまとめる。
【００７８】
肝臓癌細胞における増殖阻害
【表２】
2016098200.tif 000009
＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１  化合物２に対して。
【００７９】
ＮＯＣ１５及びＮＣ１５は、それぞれ、化合物２より少なくとも３〜４倍効力があり、細胞数の減少に関して同じ阻害のレベルが、化合物２の用量の１／３〜１／４で達成できることが、表２から分かる。
【００８０】
３．２  核の形態学的な変化
ＮＯＣ１５及びＮＣ１５の細胞毒性における、アポトーシスの役割をさらに調べるために、ＨｅｐＧ２細胞を、化合物  ２、ＮＯＣ１５及びＮＣ１５、それぞれで、４８時間インキュベートした；次いで、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３５２８を用いて染色し、任意の局所の形態学的な変化について、蛍光顕微鏡により調べた。
【００８１】
図１の写真は、それぞれ、化合物２、ＮＯＣ１５、及びＮＣ１５、で処置した細胞の核を示す。細胞収縮、クロマチン凝縮、及びＤＮＡ断片化を含む、アポトーシスのかなりの形態学的な特徴を、処置された細胞（化合物２、ＮＯＣ１５、及びＮＣ１５を含む）において、それらの対照細胞と比較したとき、発見した。
【００８２】
３．３  細胞周期分布及びアポトーシスの分析
ＨｅｐＧ２細胞を、１０〜６０μＭの試験化合物で、４８時間処置し、次いで、細胞周期分布及びアポトーシス分析を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色したｓｕｂＧ１相を有するフローサイトメトリにより分析した。結果を図２及び３に図示する。
【００８３】
図２に示すように、アポトーシスを起こした細胞のごく一部だけを、低濃度（すなわち、１０μＭ）の化合物２で処置した細胞と同様に、対照細胞（すなわち、処置していない）中に検出した。化合物２の濃度が２０μＭから６０μＭまで増加した場合、アポトーシスを起こした細胞の割合が、用量依存的な様式において１．６％から１６．７％に増加した。同様に、細胞を１０μＭから６０μＭ（３．７％から１９．８％）に増加した化合物１８の濃度で処置したとき、かなりの割合のアポトーシスを起こした細胞を発見した。さらに、化合物９及び１８（すなわち、ＮＯＣ１５及びＮＣ１５）の双方は、Ｇ２／Ｍ相において細胞の蓄積を誘導することができる。
【００８４】
図３に示すデータから分かるように、細胞死は、用量依存的であるように見えるＮＯＣ１５又はＮＣ１５の処置の結果であり、アポトーシスを起こした細胞のパーセンテージは、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５の濃度の増加と共に増加した。化合物２について、高濃度の化合物２を使用したとき（すなわち、６０μＭ）、細胞毒性効果を唯一観察した。
【００８５】
実施例４  白血病におけるＮＯＣ１５の抗増殖活性
４．１  細胞生存率分析
この実施例において、白血病Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞モデルを活性化する、ホルボール  １２−ミリスタート  １３−アセタート及びイオノマイシン（ＰＭＡＩ）のモデルを、ヒト白血病細胞（Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞）及びヒトリンパ芽球細胞（ＮＨＬ）に対するＮＯＣ１５の効果を調査するために採用した。
【００８６】
図４Ａに示すように、化合物２のみ、正常なリンパ細胞に対して重大な細胞毒性を有していないが、白血病癌Ｊｕｋａｔ  Ｔ細胞に対して有毒である。さらに、生細胞のパーセンテージは、細胞を、アポトーシスから細胞を保護することが知られている作用物質、ホルボール  １２−ミリスタート  １３−アセタート（ＰＭＡ）で前処理すれば、わずかに増加した。同様の結果を、ＮＯＣ１５処置した細胞でも観察した（図４Ｂ）。その知見は、化合物２及びＮＯＣ１５の双方が、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路を妨げることにより、細胞増殖を抑制することを確証した。
【００８７】
４．２  細胞周期分布の分析
細胞周期分布を、「材料及び方法」の節において説明したようにフローサイトメトリにより測定した。結果を図５に示す。
【００８８】
対照細胞のごく一部だけがｓｕｂＧ１相（図５Ａ）にあることが見出されたが、ｓｕｂＧ１相における細胞のパーセンテージは、それらをＮＯＣ１５で、２４時間（図５Ｂ）及び４８時間（図５Ｃ）それぞれ前処理すれば増加した。Ｇ２／Ｍ相における白血病細胞のパーセンテージは、ＮＯＣ１５で４８時間（図５Ｃ）処理したとき増加したことも留意されたい。図５Ｄは、図５Ａ〜５Ｃにおける知見の定量分析を与える。
【００８９】
実施例５  白血病におけるＮＣ１５の抗増殖活性
５．１  細胞生存率分析
図６における棒グラフは、正常なヒトリンパ芽球細胞（ＮＨＬ）及びヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対するＮＣ１５の細胞傷害効果を図示する。化合物２及びＮＯＣ１５の効果と同様に、ＮＣ１５のみ、正常なリンパ芽球細胞に対する重大な細胞毒性を有していないが、ヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞に対して有毒であり、その効果は、用量依存的であるように見えた。細胞をＮＣ１５で２４時間処理したとき、生細胞の数は、ＮＣ１５の濃度の増加につれて減少した（図６Ａ）；細胞を４８時間処理したとき、同様の結果を観察した（図６Ｂ）。
【００９０】
５．２  細胞周期分析
この実施例において、細胞周期分析に供する前に、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をＮＣ１５（２．５１３μＭ）で、２４時間又は４８時間処置し、又は処置しなかった。結果を図７に示す。
【００９１】
対照細胞のほとんどがＧ０／Ｇ１相にあり、ＮＣ１５で２４時間処置した後、ｓｕｂＧ１相における細胞のパーセンテージは、増加し始め（図７Ｂ）；４８時間の処置によって、ｓｕｂＧ１相における細胞集団は、かなりのレベルに達した（図７Ｃ）、一方で、Ｇ０／Ｇ１相における細胞数は、対照のものと比較して減少した（図７Ｄ）。
【００９２】
５．３  ヒト白血病癌細胞株（Ｌ１２１０）が移植された動物においてＮＯＣ１５及び／又はＮＣ１５は腫瘍の大きさを縮小する
マウスにて、「材料及び方法」の節において説明した手順に従って、Ｌ１２１０腫瘍細胞を接種した。インビボ治療のため、動物に、腹腔内の経路により、少なくとも７日間、１８ｍｇ／ＫｇのＮＯＣ１５又はＮＣ１５を与えた。次いで、それぞれの動物の、腫瘍の大きさ、動物の体重、肝臓及び脾臓のそれぞれの重量、白血球数を同様に、指示された時間で、それぞれ測定した。結果を、それぞれ図８〜１１に示す。
【００９３】
腫瘍を（Ａ）ＳＣ−又は（Ｂ）ＩＰ−接種した動物の生存率を縦軸に、ＮＯＣ１５及びＮＣ１５の効果を、図８に図示した。ＮＯＣ１５及びＮＣ１５の双方は、腫瘍をＳＣ−接種した動物の寿命において約４０％の増加、及び腫瘍をＩＰ−接種した動物において約１４〜１８％の増加で、うまく動物の寿命を延ばすことができた。ＮＯＣ１５又はＮＣ１５で処置した動物において、皮下注射腫瘍の重量における有意な減少を観察し（図９Ａ）、一方、腫瘍をＩＰ−接種した動物における肝臓及び脾臓のそれぞれの重量が、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５で処置したとき、有意に改善した（図９Ｂ及び９Ｃ）。白血球（ＷＢＣ）数における有意な減少も、ＮＯＣ１５及びＮＣ１５処置した動物において、１４日目に観察した（図１０）。
【００９４】
従来の化学療法における１つ主要な欠点は、もし、受容者が健康な体重を維持するのに失敗したなら、治療の効果を損なう体重減少に、受容者がしばしば苦しむことである。ここで図１１Ａを参照すると、ＮＯＣ１５又はＮＣ１５を摂取していない健康な正常な動物である対照のものと比較したとき、１８ｍｇ／Ｋｇの用量で与えられたＮＯＣ１５では、治療過程に従って、徐々に総体重を改善した；ところが、同じ用量で与えられたＮＣ１５では、最終的に動物の体重が対照と同様のレベルになった（図１１Ｂ）。そのデータは、ＮＣ１５では腫瘍成長を抑制することができ、さらに、一般に化学療法剤の使用に伴う従来の「体重減少」問題がない；このように、ＮＣ１５は優れた抗癌剤の候補になる。
【００９５】
先に示したデータをまとめると、２つの新規に合成されたＮ−置換ノルカンタリミド誘導体が、それぞれ種々の癌細胞株に対する、細胞毒性の、抗増殖性の、及びアポトーシスの効果を有する；さらに、それらは正常なリンパ細胞に対して効果がほとんど又は全くなく、このようにそれらを次世代の抗癌剤に可能性のある候補にしていることを確証した。
【００９６】
本開示の種々の実施形態の前述の説明は、例証及び説明の目的で示されている。それは、網羅的であること、又は本開示を開示されたまさにその実施形態に限定することを示すものではない。前述の技術を考慮して、多くの変更又は変化は可能である。開示された実施形態は、本開示の原理の最良な例証、及びこれにより、種々の実施形態、及び企図する特定の用途に適するように種々の変更をした実施形態において、当業者が本開示を利用することを可能することの現実的応用を提供するために選ばれ、説明された。公平に、適法に、及び公正に権利が与えられた広さに従って解釈される際、全てのそのような変更及び変化は、特許請求の範囲によって決められる本開示の範囲内である。
【図４】
2016098200.tif 000012
【図５】
2016098200.tif 000013
【図６】
2016098200.tif 000014
【図７】
2016098200.tif 000015
【図８】
2016098200.tif 000016
【図９】
2016098200.tif 000017
【図１０】
2016098200.tif 000018
【図１１】
2016098200.tif 000019
【図１】
2016098200.tif 000020
【図２】
2016098200.tif 000021
【図３】
2016098200.tif 000022
【外国語明細書】
2016098200000001.pdf
2016098200000002.pdf
2016098200000003.pdf
2016098200000004.pdf