(57)【要約】【課題】スダチ成分として、生体細胞のサーチュイン活性をより強く促進し得る物質を解明し、各種疾患の予防や、アディポネクチンの血中濃度の低下、インスリン抵抗性の亢進等に起因する種々の疾患の予防又は治療用の医薬製剤又はそれを含有する食品、飼料を提供すること。【解決手段】スダチ成分の一つであるリモネン‐１，２‐ジオールとグルカル酸−１，４−ラクトンにＳＩＲＴ１活性が顕著であることを見出した。これにより、上記リモネン‐１，２‐ジオール又はグルカル酸−１，４−ラクトンを用いて、サーチュイン活性化を促進し、メタボリックシンドロームを改善できることを明らかにできた。その結果、糖尿病や脂質異常症等の種々の代謝異常疾患を改善できる医薬組成物又はサプリメント、食品として、本発明の１，２‐ジオール又は１，４−ラクトンを含有する組成物を提供できるようになった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（３）又は一般式（４）
【化９】
2016199545.tif 000010
【化１０】
2016199545.tif 000011
［式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ２は、水素原子、水酸基を表す。Ｒ３は、酸素原子、メチレン基を表す。Ｒ４は、水酸基、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ５とＲ６は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、アセチル基、ベンゾイル基を表す。Ｘは、カルボニル基、メチレン基を表す。Ｙは、酸素原子、２級アミノ基、メチレン基を表す。］
で表される化合物を有効成分とする、ＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。
【請求項２】
上記一般式（３）と一般式（４）の化合物が、以下の一般式（５）と一般式（６）
【化１１】
2016199545.tif 000012
【化１２】
2016199545.tif 000013
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＸおよびＹは、前記と同じことを表す。］
で表される化合物である、請求項１に記載のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。
【請求項３】
一般式（５）の化合物が、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールである、請求項１又は２に記載のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。
【請求項４】
一般式（６）の化合物が、Ｄ−グルカル酸−１，４−ラクトンである、請求項１又は２に記載のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかのＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤を含有することを特徴とする、メタボリック・シンドロームの治療又は予防用の経口用組成物。
【請求項６】
上記メタボリック・シンドロームが、肥満症、糖尿病又は脂質代謝異常症であることを特徴とする、請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項７】
上記経口用組成物が、医薬組成物、健康食品またはサプリメントであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の経口用組成物。
【請求項８】
メタボリック・シンドロームの治療又は予防が、血中又は細胞中のトリグリセリド濃度を減少させることである、請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項９】
メタボリック・シンドロームの治療又は予防が、血中の総コレステロール値を低下させることである、請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項１０】
メタボリック・シンドロームの治療又は予防が、インスリン抵抗性を改善することである、請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項１１】
脂質分解関連酵素のＰＰＡＲα又はＣＰＴ１Ａの産生増強を行うことにより、メタボリック・シンドロームの治療又は予防する、請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項１２】
ＰＧＣ−１ａ又はＡＭＰＫの産生増強を行うと共に活性化させ、メタボリック・シンドロームを治療又は予防する、請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項１３】
メタボリック・シンドロームが、脂肪肝又は肝の線維化である、請求項５に記載の経口用組成物。
【請求項１４】
上記一般式（３）又は（４）の化合物を有効成分として１０ｍｇ／ｋｇ以上を含有することを特徴とする、請求項５〜１３のいずれかに記載の経口用組成物。
【請求項１５】
上記一般式（３）と（４）の化合物が、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールとＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンである、請求項５〜１３に記載の経口用組成物。
【請求項１６】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール又はＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンを１００ｍｇ／ｋｇ以上を含有する、請求項１４に記載の経口用組成物。
【請求項１７】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、トリグリセリド濃度の低下促進剤。
【請求項１８】
上記トリグリセリド濃度が、血中又は肝細胞のトリグリセリド濃度である、請求項１７に記載のトリグリセリド濃度の低下促進剤。
【請求項１９】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分として１０ｍｇ／ｋｇ以上を含有する、請求項１７又は１８に記載のトリグリセリド濃度の低下促進剤。
【請求項２０】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、糖・脂質代謝異常症の予防又は治療剤。
【請求項２１】
上記糖・脂質代謝異常症が脂肪肝である、請求項２０に記載の糖・脂代謝異常症の予防又は治療剤。
【請求項２２】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２−ジオールを有効成分として１０ｍｇ／ｋｇ以上を含有する、請求項２０又は２１に記載の糖・脂質代謝異常症の予防又は治療剤。
【請求項２３】
（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール又はＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンを有効成分とする、ＡＭＰＫ活性化促進剤。
【請求項２４】
骨格筋においてＡＭＰＫ活性化を行う、請求項２３に記載のＡＭＰＫ活性化促進剤。
【請求項２５】
請求項２３又は２４のＡＭＰＫ活性化促進剤を含有する、運動効果と同等の糖脂質代謝改善をもたらす経口用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、リモネン−１，２−ジオール等のスダチ成分のスダチ成分を有効成分とする糖代謝及び脂質代謝の改善剤に関する。本発明のリモネン−１，２−ジオール等は、食品、医薬製剤、飼料等に好適に適用される。
【背景技術】
【０００２】  近年、肥満の進行が先進国を中心として問題化しており、我が国においても、肥満症の患者は年々上昇を続けている。例えば、平成２２年の調査では女性の約２２％、男性では約３０％が肥満状態であると報告されている。
肥満状態にあると脂肪細胞は増加し、肥大化脂肪細胞へ変化する。肥大化脂肪細胞は脂質代謝改善ホルモンのアディポネクチンの分泌を減少し、炎症性サイトカインのＴＮＦ−ａやＭＣＰ−１の分泌を促進させる。また骨格筋や肝臓といったインスリン標的臓器に中性脂肪が蓄積し、細胞内へのグルコース取り込み機能が低下して、その結果、高血糖やインスリン抵抗性が惹起されることになる。
更に、肥満症患者は２型糖尿病、脂質異常症といった代謝関連疾患の発症リスクが高まるという報告があり、肥満の予防および治療は「健康寿命」の延長のためにも有益である。【０００３】  そこで最近になり、上記の糖と脂質の代謝異常を改善する手段になり得るものとして、ＳＩＲＴ１が注目されて来ている。ＳＩＲＴ１は真核生物の核内に存在する「サーチュイン」遺伝子群のひとつでカロリー制限や運動などの条件下で活性化することが知られている。ＳＩＲＴ１は血管拡張や老化抑制、炎症抑制など多くの生体現象に関与し、その中でも、下流遺伝子ＰＧＣ−１ａの活性化や、糖脂質代謝に重要な役割を果たすＡＭＰＫの活性化を通じて、代謝異常を改善する作用のあることが多く報告されている。
このように、ＳＩＲＴ１は代謝関連疾患の抑制や寿命の延長に働くため「長寿遺伝子」とも呼ばれており、新たなＳＩＲＴ１活性化剤の開発は、多くの期待を集めている分野でもある。【０００４】  このようなＳＩＲＴ１活性化試剤としては、植物の感染抵抗性に関与する成分であるレスベラトロールが知られており、動物実験によってコレステロールの減少、心臓病のリスク予防、早期ガンの予防及び進行抑制、血小板凝集予防などの効果が報告されている（非特許文献１，２）。また、近年、ＳＩＲＴ１活性が上昇すると、アディポネクチンの産生が促進されることが明らかとなっている（特許文献１）。
上記の知見に刺激を受け、生体のＳＩＲＴ１活性を促進させる物質の探索が盛んに行われており、前述のレスベラートルより、更に強いサーチュイン活性促進物質が探索されている（特許文献２）。
なお、植物には多くの成分（例えばポリフェノール類等）が存在し、多くの機能を担っている。レスベラトロールも、その一つであり、レスベラトロール以外にも、生体のＳＩＲＴ１活性を促進させる物質が存在することが想像される。そこで、柑橘類の中のすだち果皮の有効利用について研究を進め、その含有成分の中に、糖代謝や脂質代謝、更にはＳＩＲＴ１活性を賦活化できるものを見出そうとする探索研究がなされている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２５５０４０号公報
【特許文献２】特開２０１１−５７５８０号公報
【特許文献３】特開２００９−１２６７９９号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】中畑泰和、「時間生物学」Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．２，６９−７４（２０１１）
【非特許文献２】山盛徹、「北獣会誌」Ｖｏｌ．５５，４５−４９（２０１１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の目的は、スダチ含有成分の中に含有される物質の中で、糖代謝及び脂質代謝を活性化させ、更にはＳＩＲＴ１タンパク質の産生を促進して、生体のサーチュイン活性を促進させる物質を特定することである。更に、その物質を有効成分とするサプリメントや医薬組成物を作製することにより、メタボリックシンドロームに由来する各種疾患の予防を行うことである。特に、アディポネクチンの血中濃度の低下、及びインスリン抵抗性の亢進等に起因する種々の疾患の予防、更にはメタボリックシンドローム、糖尿病やその合併症、動脈硬化、肝臓疾患、消化器疾患等の種々の病態の改善又は予防を行うことを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】  本発明者らは、上記課題を解決するためにスダチ成分から３５種の化合物を単離し、その内、７種にサーチュイン（Ｓｉｒｔ１／Ｓｉｒ２）活性亢進作用を認め、特にその内の２種にはレスベラトロールと同等の活性があることを見出している（特許文献３）。
本発明者らは、更に検討を進め、スダチ果皮由来のリモネン誘導体の中に、新規ＳＩＲＴ１活性化作用を持つ化合物ＡとＢの２つの化合物を見出した。化合物Ａは、以下の化学式（２）のＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンであり、化合物Ｂは、以下の化学式（１）の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ−ｌｉｍｏｎｅｎｅ−ｔｒａｎｓ−１，２−ｄｉｏｌ）である。これらの両化合物は、濃度依存的にＳＩＲＴ１活性を上昇させ、高血糖条件下の肝細胞、骨格筋細胞へのＴＧ蓄積をＳＩＲＴ１依存的に阻害することを見出した。【０００８】
【化１】
2016199545.tif 000002
【０００９】
【化２】
2016199545.tif 000003
【００１０】  また、上記化合物Ａと化合物Ｂを用いて検討したところ、血中のトリグリセリド（中性脂肪）濃度及び細胞中のトリグリセリド濃度の低下を起こすことが明らかとなった。更に、その作用機序の検討を行ったところ、ＳＩＲＴ１の活性化に伴い、ＳＩＲＴ１遺伝子の下流に存在する脂質分解関連遺伝子（ＰＰＡＲαとＣＰＴ１Ａ）の発現量が増加し、また、ＰＧＣ−１αとＡＭＰＫの産生および活性が増大することが明らかとなった。
ＰＰＡＲαとＣＰＴ１Ａ、ＰＧＣ−１αの産生増大により、脂質のβ酸化が促進され、ＡＭＰＫの産生増大により、アディポネクチンの分泌が増加する。従って、化合物ＡとＢのＳＩＲＴ１活性化作用により、これらの作用機序が働き、糖・脂質の代謝改善が行われることを明らかにできた。
また、化合物Ｂには、レスベラトロールと同等の活性があることを見出した。【００１１】  更に、本発明者らは、上記スダチ成分の効果と生合成のプロセスと検討し、以下の一般式（３）と（４）の誘導体に、ＳＩＲＴ１活性亢進作用と、それに伴う一連の効果（ＰＰＡＲαとＣＰＴ１Ａの発現量の増加、ＰＧＣ−１αとＡＭＰＫの産生と活性の増大、その結果、トリグリセリド濃度の低下を起こすこと）のあることが分かった。【００１２】
【化３】
2016199545.tif 000004
【００１３】［式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ２は、水素原子、水酸基を表す。Ｒ３は、酸素原子、メチレン基を表す。Ｒ４は、水酸基、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ５とＲ６は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、アセチル基、ベンゾイル基を表す。Ｘは、カルボニル基、メチレン基を表す。Ｙは、酸素原子、２級アミノ基、メチレン基を表す。］【００１４】
【化４】
2016199545.tif 000005
【００１５】［式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ３は、酸素原子、メチレン基を表す。Ｒ４は、水酸基、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ５とＲ６は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、アセチル基、ベンゾイル基を表す。Ｘは、カルボニル基、メチレン基を表す。Ｙは、酸素原子、２級アミノ基、メチレン基を表す。］
本発明者らは、以上の知見により本発明を完成した。【００１６】  本発明の要旨は以下の通りである。
（１）以下の一般式（３）又は一般式（４）【００１７】
【化５】
2016199545.tif 000006
【００１８】
【化６】
2016199545.tif 000007
【００１９】［式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ２は、水素原子、水酸基を表す。Ｒ３は、酸素原子、メチレン基を表す。Ｒ４は、水酸基、炭素数１〜４の低級アルキル基を表す。Ｒ５とＲ６は、水素原子、炭素数１〜４の低級アルキル基、アセチル基、ベンゾイル基を表す。Ｘは、カルボニル基、メチレン基を表す。Ｙは、酸素原子、２級アミノ基、メチレン基を表す。］
で表される化合物を有効成分とする、ＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。
（２）一般式（３）と一般式（４）の化合物が、一般式（５）と一般式（６）【００２０】
【化７】
2016199545.tif 000008
【００２１】
【化８】
2016199545.tif 000009
【００２２】［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＸおよびＹは、前記と同じことを表す。］
で表される化合物である、上記（１）に記載のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。
（３）一般式（５）の化合物が、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールである、上記（１）又は（２）に記載のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。
（４）一般式（６）の化合物が、Ｄ−グルカル酸−１，４−ラクトンである、上記（１）又は（２）に記載のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤。【００２３】（５）上記（１）〜（４）のいずれかのＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤を含有することを特徴とする、メタボリック・シンドロームの治療又は予防用の経口用組成物。
（６）上記メタボリック・シンドロームが、肥満症、糖尿病又は脂質代謝異常症であることを特徴とする、上記（５）に記載の経口用組成物。
（７）上記経口用組成物が、医薬組成物、健康食品またはサプリメントであることを特徴とする、上記（５）又は（６）に記載の経口用組成物。
（８）メタボリック・シンドロームの治療又は予防が、血中又は細胞中のトリグリセリド濃度を減少させることである、上記（５）に記載の経口用組成物。
（９）メタボリック・シンドロームの治療又は予防が、血中の総コレステロール値を低下させることである、上記（５）に記載の経口用組成物。
（１０）メタボリック・シンドロームの治療又は予防が、インスリン抵抗性を改善することである、上記（５）に記載の経口用組成物。
（１１）脂質分解関連酵素のＰＰＡＲα又はＣＰＴ１Ａの産生増強を行うことにより、メタボリック・シンドロームの治療又は予防する、上記（５）に記載の経口用組成物。
（１２）ＰＧＣ−１ａ又はＡＭＰＫの産生増強を行うと共に活性化させ、メタボリック・シンドロームを治療又は予防する、上記（５）に記載の経口用組成物。
（１３）メタボリック・シンドロームが、脂肪肝又は肝の線維化である、上記（５）に記載の経口用組成物。
（１４）上記一般式（３）又は（４）の化合物を有効成分として１０ｍｇ／ｋｇ以上を含有することを特徴とする、上記（５）〜（１３）のいずれかに記載の経口用組成物。
（１５）上記一般式（３）と（４）の化合物が、（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールとＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンである、上記（５）〜（１３）に記載の経口用組成物。
（１６）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール又はＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンを１００ｍｇ／ｋｇ以上を含有する、上記（１４）に記載の経口用組成物。
（１７）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、トリグリセリド濃度の低下促進剤。
（１８）上記トリグリセリド濃度が、血中又は肝細胞のトリグリセリド濃度である、上記（１７）に記載のトリグリセリド濃度の低下促進剤。
（１９）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分として１０ｍｇ／ｋｇ以上を含有する、上記（１７）又は（１８）に記載のトリグリセリド濃度の低下促進剤。
（２０）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分とする、糖・脂質代謝異常症の予防又は治療剤。
（２１）上記糖・脂質代謝異常症が脂肪肝である、上記（２０）に記載の糖・脂質代謝異常症の予防又は治療剤。
（２２）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオールを有効成分として１０ｍｇ／ｋｇ以上を含有する、上記（２０）又は（２１）に記載の糖・脂質代謝異常症の予防又は治療剤。
（２３）（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール又はＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンを有効成分とする、ＡＭＰＫ活性化促進剤。
（２４）骨格筋においてＡＭＰＫ活性化を行う、上記（２３）に記載のＡＭＰＫ活性化促進剤。
（２５）上記（２３）又は（２４）のＡＭＰＫ活性化促進剤を含有する、運動効果と類似の糖脂質代謝改善をもたらす経口用組成物。
【発明の効果】
【００２４】  本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール（１）又はＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンは、レスベラトロールと同程度以上のＳＩＲＴ１活性化作用を有し、更に、血中と肝細胞のトリグリセリドの濃度を有意に低下させることができる。従って、これらの化合物を含有する治療剤や健康食品を作製することによって、メタボリック・シンドロームの治療又は予防を行うことができる。その結果として、本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，‐ジオール（１）、Ｄ−グルカル酸−１，４−ラクトン又はこれらの誘導体は、糖尿病やその合併症、脂質代謝異常症、消化器疾患等の種々の病態の治療・予防にも有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＦａＯ細胞を使用し、レスベラトロール（１μＭ）、スダチ果皮粉末（２５０μｇ／ｍＬ）を投与した時の細胞中のトリグリセライド濃度（ＴＧ濃度）を測定した結果を表した図である。スダチ果皮粉末では、２５０μｇ／ｍＬを投与して細胞を刺激することによって、対照群より有意にＴＧ濃度が減少することが見出された。
【図２】スダチ果皮粉末のヘキサン抽出物のカラム分画をＨ１〜Ｈ８とした。このカラム画分（Ｈ１〜Ｈ８）のそれぞれについて、ＦａＯ細胞に投与してＴＧ濃度の減少を評価した結果を表した図である。中でも、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ９の３画分にＴＧ濃度の抑制効果が得られた。
【図３】スダチ果皮粉末のメタノール抽出物のカラム分画をＭ１〜Ｍ５とした。このカラム画分（Ｍ１〜Ｍ５）のそれぞれについて、ＦａＯ細胞に投与してＴＧ濃度の減少を評価した結果を表した図である。中でも、Ｍ３、Ｍ５の２画分にＴＧ濃度の抑制効果が得られた。
【図４】化学式（２）で表される化合物Ａを用いてＣ２Ｃ１２筋管細胞に投与し、ＳＩＲＴ１活性を測定した結果を表したのが図４の上の図である。化合物Ａは、濃度依存的にＳＩＲＴ１活性を上昇させることが示された。ＦａＯ細胞に化合物Ａを投与し、ＴＧ濃度の変化を評価したのが図４の下の図である。化合物Ａは、濃度依存的にＴＧ濃度を減少させることが見出された。このことから、化合物Ａは濃度依存的にＳＩＲＴ１活性を上昇させ、ＴＧ濃度の低下作用を示す化合物であることが示された。
【図５】化学式（１）で表される化合物Ｂを用いて、Ｃ２Ｃ１２筋管細胞に投与しＳＩＲＴ１活性を測定した結果を表した図である。図５の上の図は、０．５〜５００μＭでの投与を行った実験結果であり、濃度依存的なＳＩＲＴ１活性の上昇が見られた。また、刺激濃度を５００μＭに固定し、刺激時間を２時間から２４時間に振り分けた場合でも、時間依存的にＳＩＲＴ１活性が上昇した。このことから、化合物ＢのＴＧ濃度低下作用にはＳＩＲＴ１の活性化が寄与し、またこのＳＩＲＴ１活性化は濃度・時間依存的であることが示された。
【図６】化合物Ｂをラット肝細胞ＦａＯおよびマウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２に投与し、両細胞株の細胞内ＴＧ濃度の変化を評価した図である。両細胞株共に、化合物Ｂを投与することで、有意なＴＧ濃度の減少が見られた。
【図７】化合物ＢのＴＧ濃度上昇抑制作用が、ＳＩＲＴ１活性に依存するものであるのか否かを評価した図である。化合物ＢのＳＩＲＴ１作用を阻害するため、ＳＩＲＴ１阻害剤のニコチンアミドを用いた。ＳＩＲＴ１阻害剤として用いるニコチンアミドの濃度として３段階を設定した。化合物Ｂとして５００μＭを用いて、ニコチンアミドと併用してＦａＯ細胞に投与した。その結果、ニコチンアミドの存在しない化合物Ｂ単独群ではＴＧ濃度が有意に減少していた。一方、ニコチンアミド併用群ではＴＧ濃度が減少せず、化合物Ｂの作用は抑制された。この結果から、化合物ＢのＴＧ濃度低下作用はＳＩＲＴ１活性化と強く関連することが示された。
【００２６】
【図８】化合物ＢのＴＧ濃度低下作用の作用機序を解明するために、化合物Ｂを投与した場合に起きるタンパク質発現の強度変化を表した図である。ウエスタンブロッティング法を用いた検討の結果、化合物Ｂは、０．５〜５００μＭで濃度依存的にＳＩＲＴ１のタンパク発現レベルを上昇させることが見出された。また、化合物Ｂによる細胞刺激の時間を２時間から２４時間に分けて検討した結果、刺激時間の延長に従ってＳＩＲＴ１およびＰＧＣ−１ａの発現レベルが上昇した。
【図９】普通食負荷マウス（ＮＤ）と高脂肪食負荷マウス（ＨＦＤ）を使用し、ＨＦＤに化合物Ｂを経口投与して体重の変化と、摂食量の変化を評価した図である。化合物Ｂを２群に分けて経口投与したところ、毎日１００ｍｇ／ｋｇ（Ｈｉｇｈ）では体重減少が有意差を持って起きたが、毎日１０ｍｇ／ｋｇ（Ｌｏｗ）では有意差が出なかった。一方、摂食量については、いずれの群でも変化はなかった。このことから、化合物Ｂは、ＳＩＲＴ１活性等の代謝を向上させ、体重減少に寄与することが示された。
【図１０】マウスに対する経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行い、化合物Ｂの効果を評価した結果を表した図である。上記図９と同様に化合物Ｂの経口投与をＨＦＤに対して行った。その結果、化合物Ｂの高投与群（１００ｍｇ／ｋｇ・日）では、無投与群と比較し、約１８％のＡＵＣ低下がもたらされた。
【図１１】マウスにインスリン負荷試験（ＩＴＴ）を行った結果を表した図である。化合物Ｂの経口投与により、インスリン抵抗性が改善されていることが示されている。
【図１２】ＨＦＤに対して、化合物Ｂを図９〜１１と同様に経口投与し、インスリン抵抗性の指標（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を測定した結果を表した図である。ＨＦＤ群では、インスリン血中濃度が高いが、化合物Ｂ投与群では血中のインスリン濃度が改善されている。その結果、ＨＯＭＡ−ＩＲの値も改善されている。
【図１３】化合物Ｂが経口投与された高脂肪食負荷マウス（ＨＦＤ）では、肝重量の増大および肝臓へのＴＧ蓄積が抑制されることを表した図である
【図１４】化合物Ｂが経口投与された高脂肪食負荷マウス（ＨＦＤ）では、血中のＴＧ濃度と血中の総コレステロール値の上昇が抑制されることを表した図である。
【図１５】化合物Ｂを経口投与した高脂肪食負荷マウス（ＨＦＤ）では、肝臓および腓腹筋のＳＩＲＴ１活性が上昇することを表した図である。
【図１６】化合物Ｂの肝臓に対する作用機序を解明するため、マウス肝臓における脂質分解酵素（ＰＰＡＲαとＣＰＴ１Ａ）の発現変化を評価した結果を表した図である。ＰＰＡＲαとＣＰＴ１Ａは、脂質β酸化を促進する酵素であり、化合物Ｂの投与によって蛋白遺伝子の発現が増大していることは、肝臓における糖新生阻害や脂肪酸の利用を促進し、ミトコンドリアにおける脂肪酸β酸化を促進したことを表している。これらのことから、肝臓での糖新生抑制効果等により、血糖値上昇抑制につながったと考えられる。
【図１７】Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスの６週齢から１２週齢までの期間、コリン欠乏メチオニン減量４５Ｋｃａｌ％脂肪食を与えて作製した非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ）モデルマウス（４５Ｋ）に対して、化合物Ｂを１００ｍｇ／ｋｇ、１０日間連続して腹腔内投与を行った結果を表した図である。４５Ｋマウスに化合物Ｂを投与した群を４５Ｋ＋Ｌで表す。その対照群として、４５ＫマウスにＰＢＳを投与した群を４５Ｋで表す。化合物Ｂを投与した４５Ｋ＋Ｌ群では、肝機能（ＡＬＴ、ＡＳＴ）が改善されていることが示された。
【図１８】図１７と同様に、コリン欠乏メチオニン減量６０Ｋｃａｌ％脂肪食を与えて作製した非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ）モデルマウス（６０Ｋ）を用いて、化合物Ｂの効果を確認した。化合物Ｂを投与した６０Ｋ＋Ｌ群では、対照群（６０Ｋ）と比較して肝機能（ＡＬＴ、ＡＳＴ）が改善されていることが示された。
【発明を実施するための形態】
【００２７】  本発明の一般式（３）と（４）の化合物において、Ｒ１とＲ４、Ｒ５とＲ６の炭素数１〜４の低級アルキル基とは、置換基で置換されていても良い低級アルキル基のことであり、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基を挙げることができる。好ましいものとしては、メチル基を挙げることができる。置換基としては、水酸基、カルボニル基、カルボキシル基を挙げることができ、好ましい置換基としては水酸基を挙げることができる。
Ｙの２級アミノ基とは、水素原子又は炭素数１〜４の低級アルキル基を持った２級アミノ基のことを言い、炭素数１〜４の低級アルキル基は、Ｒ１とＲ４の低級アルキル基と同じ意味を表す。
本発明の「メタボリック・シンドローム」とは、生活習慣によって引き起こされる内臓脂肪型肥満を共通の要因とする高血糖、脂質代謝異常、高血圧が引き起こされる状態のことを言う。生活習慣病と呼ばれることもあり、肥満症、糖尿病又は脂質代謝異常症を総称するものである。脂質代謝異常症としては、血中のトリグリセリドやコレステロール値の上昇と、それに基づく内臓への脂肪沈着や動脈硬化等を挙げることができる。また、内臓への脂肪沈着としては、脂肪肝とそれが進行悪化した肝の線維化を挙げることができる。
【００２８】  本発明の「経口用組成物」とは、メタボリック・シンドロームを軽減させ、治療又は予防を行うために経口投与される組成物のことを言い、医薬品、健康食品、サプリメントなどの総称である。
本発明の（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール」とは、上記構造式（１）の化合物であり、Ｒ（＋）−リモネン（ｌｉｍｏｎｅｎｅ）の酸化代謝体であり、スダチやオレンジをはじめとする柑橘類の果皮に多く含まれ、香気成分としても用いられるサイクリックモノテルペン類である。
本発明のＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンとは、上記構造式（２）の化合物であり、スダチ果皮に特異的に含有されるポリフェノール類である。
本発明の「ＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤」とは、ＳＩＲＴ１遺伝子の発現増強を通じて、ＳＩＲＴ１タンパク質の産生促進効果を示す化合物のことであり、更には、ＳＩＲＴ１タンパク質の阻害物質を排除する効果を示す化合物のことを言う。
本発明のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤は、メタボリックシンドロームの予防や治療用の医薬品やサプリメントの有効成分としてヒトおよび動物に投与することができる。更には、各種飲食品、飼料（ペットフード等）に配合しても摂取させることができる。本発明のＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤を医薬品として使用する場合には、経口的にあるいは非経口的（静脈投与、腹腔内投与、等）に適宜に使用される。剤型も任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤、または、注射剤などの非経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの製剤や各種飲食品には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やｐＨ調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。
【００２９】  本発明の「糖・脂質代謝異常症」とは、上記糖脂質代謝異常症のことをいう。
本発明の「糖脂質代謝改善」とは、上記糖脂質代謝異常症の症状を軽減し、改善することをいう。
本発明の飲食品やサプリメントの中に含まれる有効成分である（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２‐ジオール又はＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンの含有量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができ、例えば、１〜１０質量％程度とすることができる。特に、保健用飲食品やサプリメント等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。例えば、本発明の医薬品の有効成分として（＋）‐リモネン‐トランス‐１，２−ジオール又はＤ−グルカル酸−１，４−ラクトンを投与する場合、その使用量は、疾患の種類、患者の年令、体重、状況などによって異なるが、例えば経口的に服用される場合には、成人１日１回〜数回投与され、１日あたりの有効投与量としては、ＳＩＲＴ１を活性化するに充分な量であれば特に問題はない。例えば、１０ｍｇ／ｋｇ以上を毎日経口投与できれば、有効である。好ましい投与量として、１００ｍｇ／ｋｇ以上を毎日投与することが挙げられる。更に好ましくは、１００ｍｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ程度を毎日経口投与することが挙げられる。
【００３０】  本発明の「トリグリセリド（ＴＧ）」とは中性脂肪のことであり、砂糖などの糖質、炭水化物、動物性脂肪などを主な原料として、肝臓で作製される。糖質、炭水化物、動物性脂肪を多く取りすぎると、皮下脂肪の主成分として蓄積される。中性脂肪が血液中に増加してくると、動脈硬化を進める一因になる。そのため、中性脂肪の血中濃度の測定は、動脈硬化性疾患（狭心症、心筋梗塞、脳卒中など）を予防するために重要な数値となっている。
本発明の「総コレステロール値」とは、体内には、脂肪酸と結合したエステル型のコレステロールと遊離型のコレステロールの２つがあり、これら２つを合わせて総コレステロール（Ｔ−Ｃｈｏ）と言い、この総コレステロールの血中の値を総コレステロール値と言う。
本発明の「ＰＰＡＲα」とは、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプター）のことであり、肝臓や褐色脂肪組織，心臓，腎臓で強く発現している。そして、このＰＰＡＲαは遊離脂肪酸などをリガンドとして活性化し、血中トリグリセリド濃度の低下を促進することが知られている。
本発明の「ＣＰＴ１Ａ」とは、Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ  Ｐａｌｍｉｔｏｙｌｔ  ｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  １Ａ（カルニチンパルミトイル基転移酵素１Ａ）のことであり、パルミチン酸のような長鎖脂肪酸をカルニチンにアシル化する酵素である。このアシル化されたカルニチンがミトコンドリアに取り込まれて、長鎖脂肪酸のβ酸化を受ける。即ち、ＣＰＴ１Ａの蛋白発現が増大すれば、ＴＧの消化が進み、血中のＴＧ濃度の低下が生じる。
本発明の「ＰＧＣ１α」とは、ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ共同因子１）のことであり、ミトコンドリア合成やエネルギー産生を促進している。即ち、ＰＧＣ−１は筋機能とインスリン感受性に影響を与えている。従って、ＰＧＣ１αの発現増加により、インスリン感受性が改善される。
【００３１】  本発明の「ＡＭＰＫ」とは、ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ（ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ）のことであり、ＡＭＰＫの発現量が増加するか、ＡＭＰＫが活性化すると、糖や脂肪や蛋白質の合成は抑制され、一方、糖や脂肪や蛋白質の分解（異化）が亢進してＡＴＰが産生される。この効果は運動と同じ効果であり、肥満や２型糖尿病の治療にも有効である。本発明では、ＡＭＰＫの活性化の指標である、ＡＭＰＫリン酸化（ｐ−ＡＭＰＫ）の亢進が認められている。即ち、ＡＭＰＫの活性化が引き起こされることが明らかとなった。
骨格筋におけるＡＭＰＫの活性化は、糖取込みの促進だけでなく、脂肪酸β酸化の亢進など、身体運動による派生効果と類似した種々の糖脂質代謝改善効果を引き起こすことが明らかとなっている。即ち、ＡＭＰＫの活性化に寄与する化合物は、糖尿病を含む多くの代謝疾患に対する運動療法と同様の糖脂質代謝改善効果をもたらすものとなっている。従って、本発明の化合物の経口投与により、骨格筋におけるＡＭＰＫの活性化が引き起こされ、身体運動と類似の糖脂質代謝改善効果が得られる。
【実施例】
【００３２】  以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３３】（実施例１）スダチ成分による細胞内の中性脂肪（トリグリセリド）の抑制作用
（１）試剤
１）使用細胞：マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２（未分化）、ラット肝癌細胞ＦａＯ
２）使用培地：５％グルコース濃度の液体培地（１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭ）
３）サンプル：スダチ果皮粉末、また粉末をメタノールあるいはヘキサンで抽出した化合物全１３種類、更に細分化抽出物全３１種類を使用。また、ポジティブコントロールとして、ＳＩＲＴ１活性化剤のレスベラトロールを使用した。
（２）方法
１）細胞培養：
細胞培養用の３５ｍｍディッシュあるいは６穴プレートにＦａｏ細胞を播種し、１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭでコンフルエントになるまで培養した。
２）細胞刺激：
上記培地を吸引し、コントロールのグループは通常培地と、サンプルのグループは任意の濃度でサンプルを溶解した培地と交換した。本実験ではサンプルの最終濃度は５０ｕＭとした。Ｎ数は１グループにつき最低でも３，５〜６を用意するとより望ましい。３７℃インキュベーターで２４時間刺激を行った。
３）細胞収穫（Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）：
以下の手順で細胞刺激を終了し、サイトゾルを回収する。サイトゾルの回収は以下の通りである。まず、培地を吸引し、氷冷したＰＢＳで２回洗った。次に、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて（コンフルの場合は２５０〜３００μｌ程度に増やしても良く、一見して細胞密度が低い場合は５０〜１００μｌ程度に減量しても良い。）、氷上で１５分放置する。顕微鏡で、細胞質が溶解していることを確認し、セルスクレーパーで掻きとり、エッペンチューブに移した。その後、５秒×３回超音波破砕を行った。次に、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清を他のエッペンチューブに移し、使用するまで−８０℃で保存した。【００３４】（３）評価結果
上記細胞内の中性脂肪の測定には、刺激後の細胞を氷冷ＰＢＳにて洗浄したのち、１０％メタノール、９０％クロロホルム中にて超音波破砕を行うことにより脂質を抽出した。抽出した脂質は減圧遠心により乾固し、少量の２−プロパノールにて再懸濁した。その２−プロパノール中に溶解している中性脂肪をＴＧワコー（和光純薬）試薬を用いて定量した。
その結果を、以下に示す。
ａ）すだち果皮粉末使用群では、ＦａＯ細胞を２５０μｇ／ｍｌで刺激することによって、対照群より有意に細胞内のＴＧ濃度が減少した。その結果を図１に示す。
ｂ）すだち果皮粉末をメタノールあるいはヘキサンで抽出した化合物の全１３種類の分画を使用して、ＦａＯ細胞を２５０μｇ／ｍｌで刺激した。同じく、対照群より有意に細胞内のＴＧ濃度が減少した。その結果を図２（ヘキサン抽出物８分画）と図３（メタノール抽出物５分画）に示す。
ｃ）更に細分化抽出物全３１種類の化合物を使用して、ＦａＯ細胞を２５０μｇ／ｍｌで刺激した。その結果、３種類の化合物で有意なＴＧ濃度の減少が見られた。その中でも２種類の化合物（化合物Ａと化合物Ｂ）では、レスベラトロールと同程度のＴＧ濃度の減少が認められた。
なお、化合物Ａでは、図４の下図に示されるように、濃度依存的に（１〜１０００μＭの範囲において）細胞内ＴＧ濃度の減少が見られた。
化合物Ｂでは、図６に示すように、Ｃ２Ｃ１２（未分化）細胞、ＦａＯ細胞において、細胞内ＴＧ濃度は有意に減少した。【００３５】（実施例２）スダチ成分（化合物Ａと化合物Ｂ）のＳＩＲＴ１活性の評価
（１）試剤
１）使用細胞：マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２（未分化）
２）使用培地：１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭ
３）サンプル：Ｄ−グルカル酸−１，４−ラクトン（２）（化合物Ａ）、リモネン‐トランス‐１，２−ジオール（１）（化合物Ｂ）
４）キット：Ｃｙｃｌｅｘ社製品「Ｃｙｃｌｅｘ  ＳＩＲＴ１／Ｓｉｒ２  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」
５）サイトゾル回収用緩衝液（Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５％  ＮＰ−４０、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ
（２）方法
１）細胞培養：
細胞培養用の３５ｍｍディッシュあるいは６穴プレートに細胞を播種し、１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭでコンフルエントになるまで培養する。
２）細胞刺激：
上記培地を吸引し、コントロールのグループは通常培地と、サンプルのグループは任意の濃度でサンプルを溶解した培地と交換する。本実験ではサンプルの最終濃度は５０μＭとした。Ｎ数は１グループにつき最低でも３，５〜６用意するとより望ましい。３７℃インキュベーターで２４時間刺激を行う。
３）細胞収穫（Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）：
以下の手順で細胞刺激を終了し、サイトゾルを回収する。
サイトゾルの回収は以下の通りである。
ます、培地を吸引Ｉ、氷冷したＰＢＳで２回洗った。次に、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて（コンフルの場合は２５０〜３００μｌ程度に増やしても良く、一見して細胞密度が低い場合は５０〜１００μｌ程度に減量しても良い。）、氷上で１５分放置する。顕微鏡で、細胞質が溶解していることを確認し、セルスクレーパーで掻きとり、エッペンチューブに移した。その後、５秒×３回超音波破砕を行った。次に、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清を他のエッペンチューブに移し、使用するまで−８０℃で保存した。【００３６】４）Ｓｉｒｔ１活性評価は、Ｃｙｃｌｅｘ社製品「Ｃｙｃｌｅｘ  ＳＩＲＴ１／Ｓｉｒ２  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」の説明書に準じて用い、マイクロプレートリーダーで蛍光強度測定する。【００３７】（４）評価結果
ａ）化合物ＡのＳＩＲＴ１活性：
図４の上図に示されるように、化合物Ａには、濃度依存的なＳＩＲＴ１活性の上昇が見られた。またＴＧ濃度測定においても、図４の下図に見られるように濃度依存的なＴＧ濃度の減少が見られている。このことから、化合物Ａは濃度依存的なＳＩＲＴ１活性上昇に伴いＴＧ低下作用を示す化合物であることが明らかとなった。
ｂ）化合物ＢのＳＩＲＴ１活性：
図５の上図に示されるように、化合物Ｂにおいても、０．５μＭ〜５００μＭでの実験から濃度依存的なＳＩＲＴ１活性の上昇が見られた。また、刺激濃度を５００μＭに固定し、刺激時間を２時間から２４時間に振り分けた場合でも、時間依存的にＳＩＲＴ１活性が上昇した。
このことから、化合物ＢのＴＧ低下作用にはＳＩＲＴ１の活性化が寄与しており、濃度依存的かつ時間依存的であることが明らかとなった。【００３８】（実施例３）ＴＧ低下作用とＳＩＲＴ１活性化の相関性評価
ＴＧ上昇抑制作用がＳＩＲＴ１活性化に由来するものであるのか否かを検証することを行った。まず、化合物Ｂを用いてＳＩＲＴ１活性化を行った時に、ＳＩＲＴ１阻害剤のニコチンアミドを用いて抑制を掛け、化合物Ｂの効果を打ち消すことを行った。
（１）方法
実施例１と２の方法に準じて実験を行った。ＳＩＲＴ１阻害剤としてニコチンアミド（ＮＡＭ）を使用し、用いる濃度として３段階（０．２５ｍＭ、２．５ｍＭ、２５ｍＭ）を設定した。化合物Ｂの５００μＭと併用してＦａＯ細胞に刺激を行った。
（２）評価結果
図７に示されるように、化合物Ｂの単独投与群ではＴＧ値が有意に減少していたが、ＮＡＭ併用群ではＴＧ濃度の減少は抑制され、化合物ＢのＳＩＲＴ１活性化の効果は打ち消されていた。この結果から、化合物ＢのＴＧ低下作用はＳＩＲＴ１活性化の作用と強く関連することが明らかにされた。【００３９】（実施例４）ＴＧ低下作用の作用機序の検討
スダチ成分（化合物Ｂ）のＴＧ低下作用がどのような作用機序で起きるのかを明らかにするため、ＳＩＲＴ１活性化に伴うタンパク質（ＰＧＣ−１ａ、ＡＭＰＫ等）の発現レベルの変動を以下のように評価した。
（１）試剤
１）使用細胞：Ｃ２Ｃ１２細胞
２）使用培地：１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭ
（２）方法
１）細胞培養：
細胞培養用の３５ｍｍディッシュあるいは６穴プレートに上記細胞を播種し、１０％ＦＢＳ  Ｄ−ＭＥＭでコンフルエントになるまで培養する。
２）細胞刺激：
上記培地を吸引し、コントロールのグループは通常培地と、サンプルのグループは任意の濃度でサンプルを溶解した培地と交換する。本実験ではサンプルの最終濃度は５００μＭとした。Ｎ数は１グループにつき最低でも３を用意する。３７℃インキュベーターで２４時間刺激を行う。
３）細胞収穫（Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｉｎｇ）：
以下の手順で細胞の刺激を終了し、サイトゾルを回収する。サイトゾルの回収は以下の通りである。まず、培地を吸引Ｉ、氷冷したＰＢＳで２回洗った。次に、Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを１５０μｌ／ｗｅｌｌを加えて（コンフルの場合は２５０〜３００μｌ程度に増やしても良く、一見して細胞密度が低い場合は５０〜１００μｌ程度に減量しても良い。）、氷上で１５分放置する。顕微鏡で、細胞質が溶解していることを確認し、セルスクレーパーで掻きとり、エッペンチューブに移した。その後、５秒×３回超音波破砕を行った。次に、１２０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、上清を他のエッペンチューブに移し、使用するまで−８０℃で保存した。【００４０】  ４）評価：
サイトゾルを融解し、レムリのサンプルバッファーを添加して９８℃で５分間加熱処理後、常法に従いＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動による展開を行った。展開したゲルは常法に従い、ウエスタンブロットによるＰＶＤＦ膜へ転写し、市販の抗ＳＩＲＴ１抗体、抗ＰＧＣ１α抗体、抗ＡＭＰＫ抗体、抗リン酸化ＡＭＰＫ（ｐ−ＡＭＰＫ）抗体による検出を行った。
（３）評価結果
図８に示されるように、本発明の化合物Ｂ（リモネン‐１，２‐ジオール）は、ウエスタンブロッティング法を用いた検討の結果、０．５μＭ〜５００μＭで濃度依存的にＳＩＲＴ１のタンパク発現レベルの上昇が見られた。
また刺激時間を２時間から２４時間に区分して検討した結果、刺激時間の延長に従ってＳＩＲＴ１およびＰＧＣ−１ａの発現レベルも上昇した。
同様に、ＡＭＰＫの活性化の指標である、ＡＭＰＫリン酸化（ｐ−ＡＭＰＫ）の亢進が認められている。即ち、ＡＭＰＫの活性化が引き起こされることが明らかとなった
以上の結果から、化合物Ｂは、濃度依存的及び時間依存的にＳＩＲＴ１遺伝子とそれに関連する遺伝子の蛋白発現レベルを上昇させることが分かった。このことから、化合物ＢのＴＧ低下作用は、ＳＩＲＴ１活性化に伴うＰＧＣ−１ａやＡＭＰＫの蛋白発現レベルの上昇、ＡＭＰＫの活性化などに基づくものであることが明らかとなった。【００４１】（実施例５）本発明化合物Ｂ（リモネン‐１，２‐ジオール）の薬効評価試験
実施例１〜４の結果、本発明化合物ＡとＢには、Ｓｉｒｔ１の活性化を促進し、その結果、ＴＧ低下作用を有することが明らかになった。そこで、化合物Ｂを用いて、糖・脂質代謝改善効果を評価することを行った。
（１）方法
１）実験動物：  ＤＤＹマウス（雄性、４週令）
２）評価化合物：化合物Ｂ（リモネン‐１，２‐ジオール）
３）評価試験方法：
４週令のＤＤＹマウスを２週間、高脂肪添加飼料で順化・育成する。その後次の４群に分けて飼料を与え、その影響を評価した。
ａ）ＮＤ群：普通飼料（Ｎｏｒｍａｌ  Ｄｉｅｔ）
ｂ）ＨＦＤ群：高脂肪添加飼料（Ｈｉｇｈ  Ｆａｔ  Ｄｉｅｔ）
ｃ）ＬＯＷ群：高脂肪添加飼料＋化合物Ｂ添加（１０ｍｇ／ｋｇ）
ｄ）Ｈｉｇｈ群：高脂肪添加飼料＋化合物Ｂ添加（１００ｍｇ／ｋｇ）
上記ａ）〜ｄ）の４群の飼料を投与して７日後に、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）を行った。９日後にインスリン負荷試験（ＩＴＴ）を行った後、１１日目にＴＧ濃度を評価し、殺処分を行った。
（２）評価結果
１）体重と飼料摂取量
図９の下図に示されるように、高脂肪添加飼料を摂食させた３つの投与群では、飼料摂取量に変化はなく、同量の飼料を摂取していた。しかし、図９の上図に見られるように、体重増加は、化合物Ｂの添加量が高い投与群ほど、体重増加が抑制されることが分かった。
２）経口ブドウ糖負荷試験
糖代謝機能への効果を評価するため、経口ブドウ糖負荷試験を行い、インスリン分泌能を評価した。その結果、図１０に示されるように、化合物Ｂは、Ｈｉｇｈ群において、ＨＦＤ群に対して約１８％のＡＵＣ低下が認められた。このように化合物Ｂは、有意に高脂肪食マウスの血糖値上昇を抑制することが示された。
３）インスリン負荷試験
糖代謝機能への効果として、インスリン抵抗性に関する効果を評価した。図１１に示されるように、化合物Ｂの投与により、インスリン抵抗性が有意に改善されていることが明らかとなった。【００４２】４）血中のインスリン濃度
試験終了時（剖検時）の高脂肪食マウスの空腹時のインスリン血中濃度と血糖値を測定し、インスリン抵抗性の指標であるＨＯＭＡ−ＩＲの数値を求めた。
図１２の左図で示されるように、高脂肪食マウスのＨＦＤ群では、ＮＤ群と比較して顕著にインスリン血中濃度が高くなっている。しかし、化合物Ｂを投与した群では、血中のインスリン濃度が改善される傾向が見られ、ＨＯＭＡ−ＩＲの値も改善される傾向が見られた。
５）肝臓重量の変化
高脂肪食の摂取により、肝臓に脂肪が蓄積し脂肪肝になる。そこで、本評価系において、高脂肪食を摂取したマウスの肝臓重量を計測し、脂肪蓄積の程度を評価した。
図１３の上図に示されるように、化合物Ｂの経口投与により、Ｈｉｇｈ群において有意に肝臓重量が軽減されており、また、図１３の下図に示されるように、Ｈｉｇｈ群において有意に肝臓における脂肪蓄積が軽減されていることが見出された。
以上のことから、化合物Ｂは、高脂肪食マウスにおいて、肝重量の増大を抑制すると共に、肝臓へのＴＧ蓄積を抑制することが明らかとなった。
６）血中のＴＧ濃度と総コレステロール値
図１４に示されるように、高脂肪食マウスの血中濃度を評価すると、化合物Ｂを経口投与したＨｉｇｈ群において、有意に血中のＴＧ濃度の上昇が抑制され、総コレステロール値の上昇も抑制されることが明らかとなった。
７）肝臓と筋肉（腓腹筋）におけるＳＩＲＴ１活性の変化
図１５に示されるように、殺処分された高脂肪食マウスの肝臓と筋肉（腓腹筋）を採取し、実施例２と同様の方法にて各組織におけるＳＩＲＴ１活性を評価すると、化合物Ｂを経口投与したＨｉｇｈ群において、有意なＳＩＲＴ１活性の上昇が確認できた。
このように、化合物Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、有意にＳＩＲＴ１活性を上昇させ、その結果として、糖・脂質代謝が改善できることが示された。
８）脂質分解関連遺伝子の発現促進
血中のＴＧ濃度が低下することから、その要因として肝臓における脂質分解酵素の蛋白産生が向上していることを確認した。即ち、殺処分された高脂肪食マウスの肝臓を採取し、脂質分解関連酵素（ＰＰＡＲα、ＣＰＴ１Ａ）の発現変化を確認した。
図１６に示されるように、化合物Ｂを経口投与すると、肝臓における脂質分解関連酵素（ＰＰＡＲα、ＣＰＴ１Ａ）の遺伝子産生が向上し、Ｈｉｇｈ群においては有意に蛋白産生が増大していた。このことは、化合物Ｂが、ＳＩＲＴ１活性を促進し、その結果として、肝臓等での脂質のβ酸化を促進して、ＴＧの消費が進んだと考えられる。また、肝臓での糖新生が抑制され、血糖値上昇の抑制につながったと考えられる。【００４３】  以上のように、スダチ果皮由来化合物より、ＳＩＲＴ１活性化剤として新たに化合物ＡとＢの２種類の化合物が見出された。化合物ＡとＢは濃度依存的にＳＩＲＴ１活性を上昇させることが見出され、高グルコース条件下で培養された肝細胞と骨格筋細胞に対して、これら細胞へのＴＧ蓄積をＳＩＲＴ１依存的に阻害することが見出された。
更に、化合物Ｂの投与により、ＳＩＲＴ１及びその下流遺伝子ＰＧＣ−１ａの蛋白発現が促進されると共に、ＡＭＰＫの蛋白発現が促進され、ＡＭＰＫ活性化が生じることが見出された。その結果、脂肪酸のβ酸化や細胞内グルコース取り込み作用が促進され、メタボリックシンドロームの改善が図られていることが明らかとなった。【００４４】（実施例６）本発明化合物Ｂ（リモネン‐１，２‐ジオール）の肝機能の改善効果評価試験
（１）方法
１）実験動物：  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性、６週令）
２）評価化合物：化合物Ｂ（リモネン‐１，２‐ジオール）
３）評価試験方法：
６週令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの一群（３〜７匹）に６週間（１２週齢まで）、コリン欠乏メチオニン減量４５％脂肪食、コリン欠乏メチオニン減量４５％脂肪食とコリン欠乏メチオニン減量６０％脂肪食を給餌して作製した非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ）モデルマウス（４５Ｋ、６０Ｋ）（日薬理誌１４４，６９−７４（２０１４））を使用した。
上記２種のＮＡＳＨモデルマウスに対して、本発明化合物Ｂを１００ｍｇ／ｋｇ、１０日間腹腔内に連続投与した。対照群として上記モデルマウス（４５Ｋ、６０Ｋ）にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を投与した群を作製した。化合物Ｂの投与終了後、血液を採取し、血中のＡＬＴ、ＡＳＴの値をＲｅｉｔｍａｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ法により測定した。【００４５】（２）評価結果
化合物Ｂの投与により、ＮＡＳＨモデルマウスの肝機能（ＡＬＴ、ＡＳＴ）は、図１７と図１８に示されるように、１０日間の投与で改善される傾向が見出された。
このことは、化合物Ｂの投与を継続すれば、ＮＡＳＨモデルマウスの肝機能が改善されることを示しており、更には、肝機能の悪化を予防できることが示されている。
【産業上の利用可能性】
【００４６】  本発明のスダチ成分であるリモネン−１，２−ジオール又はグルカン酸−１，４−ラクトンは、新たなＳＩＲＴ１タンパクの産生促進剤又はＳＩＲＴ１活性化促進剤であることが見出された。そして、更にＳＩＲＴ１の下流遺伝子であるＰＧＣ−１ａやＡＭＰＫの蛋白発現が促進され、脂肪酸酸化が増大して、血中のＴＧ濃度が抑制されることを見出した。
このように、本発明のリモネン−１，２−ジオールとグルカン酸−１，４−ラクトンの新たな用途から、これらの化合物を単独で使用し、更にはスダチ果皮粉末などと共に用いて、メタボリックメタボリックシンドロームに関連する疾患の予防と治療、例えば糖尿病や脂質異常症の改善や治療、又は予防を行うことができる。また、本発明のリモネン−１，２−ジオールとグルカン酸−１，４−ラクトンを使用することにより、ＳＩＲＴ１活性を制御して大腸癌などの腫瘍性疾患にも効果が期待でき、これらの病態の改善や治療、又は予防を行うことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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