(57)【要約】      （修正有）【課題】ＵＣＰ１遺伝子の発現増強剤及び発現増強方法の提供。【解決手段】有効成分として、ピセアタンノール、レスベラトロール、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）又はラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）を含有するＵＣＰ１遺伝子の発現増強剤。ＵＣＰ１遺伝子発現増強方法は、ＵＣＰ１遺伝子の発現を増強したい細胞を前記化合物で処理する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＣＰ１遺伝子発現増強剤であって、有効成分として、ピセアタンノール、レスベラトロール、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）を含有する発現増強剤。
【請求項２】
ＵＣＰ１遺伝子転写活性化剤である、請求項１の発現増強剤。
【請求項３】
細胞において、ＵＣＰ１遺伝子の発現を増強させる方法であって、前記細胞をピセアタンノール、レスベラトロール、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）で処理する、方法。
【請求項４】
前記細胞が白色脂肪細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、ヒト以外の生物個体内の細胞である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
ＵＣＰ１遺伝子の転写が活性化する、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＣＰ１遺伝子の発現増強剤及び発現増強方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＵＣＰ１遺伝子は、脱共役タンパク質の一つであるＵＣＰ１（Uncoupling protein1）をコードする。ＵＣＰ１は褐色脂肪細胞で特異的に発現し、ミトコンドリアでの酸化的リン酸化を脱共役させ、基質を酸化するときに生産されるＡＴＰエネルギーを熱として放出する機能を有している。この遺伝子に変異が生じると、熱の産生量が抑えられ、基礎代謝量が増大し、太りやすくなることが知られている。一方、交感神経の興奮により放出されたノルアドレナリンは、褐色脂肪細胞のβ３受容体に結合し、そのシグナル伝達系を活性化することによってＵＣＰ１遺伝子を活性化し、熱産生を増加させる。β３受容体に対する特異的な作動薬を肥満モデル動物に投与すると、エネルギー消費が増加し体脂肪が減少することが明らかになっており（例えば、特許文献１参照）、ＵＣＰ１遺伝子の発現調節による抗肥満薬の開発が期待されている（例えば、非特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】ＷＯ／２００５／０４２５０８国際公開公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】化学と生物  VOl.50, N0.1, 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＵＣＰ１遺伝子の発現増強剤及び発現増強方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
ピセアタンノールは、スチルベン類の化合物であって、例えば、トケイソウ科トケイソウ属（Passiflora）の果物であるパッションフルーツの種子に含まれており、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの生成を抑制する効果があることが報告されている（特開２００９−１０２２９８号公報）。
【０００７】
本発明者らは、１０Ｔ１／２細胞を、ピセアタンノールを含有した培地で培養することによって、ＵＣＰ１遺伝子の発現が亢進することを見いだし、本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明に係る一実施態様は、ＵＣＰ１遺伝子発現増強剤であって、有効成分として、ピセアタンノール、レスベラトロール、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）を含有する発現増強剤である。発現増強剤がＵＣＰ１遺伝子転写活性化剤であってもよい。
【０００９】
本発明に係る他の実施態様は、細胞において、ＵＣＰ１遺伝子の発現を増強させる方法であって、前記細胞をピセアタンノール、レスベラトロール、イソラポンチゲニン（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）で処理する、方法である。前記細胞が白色脂肪細胞であってもよい。前記細胞が、ヒト以外の生物個体内の細胞であってもよい。前記ＵＣＰ１遺伝発現増強方法においては、ＵＣＰ１遺伝子の転写が活性化する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、ＵＣＰ１遺伝子の発現増強剤及び発現増強方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施例において、ＵＣＰ１遺伝子発現増強に対するピセアタンノールの濃度依存性を調べた結果を表すグラフである。
【図２】本発明の一実施例において、ピセアタンノール、レスベラトロール、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニンのＵＣＰ１遺伝子発現増強能を比較した結果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、M. R. Green & J. Sambrook (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (4th edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2012); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１３】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１４】
（１）ＵＣＰ１遺伝子の発現増強剤
本発明のＵＣＰ１遺伝子の発現増強剤あるいは転写活性化剤は、ピセアタンノール（Piceatannol）、レスベラトロール（Resveratrol）、イソラポンチゲニン（Isorhapontigenin）（３，４'，５-トリヒドロキシ-３'-メトキシ-trans-スチルベン）またはラポンチゲニン（Rhapontigenin）（３，３'，５-トリヒドロキシ-４'-メトキシ-trans-スチルベン）などのスチルベンを含有する。各化合物は、以下の構造式で表される。
2016185922.tif 000002
【００１５】
上記スチルベンは、化学合成品であってもよいが、植物のエキス由来であってもよく、その場合、精製品、エキス、抽出物など、いずれの形態であっても使用することができる。
【００１６】
植物のエキスの具体的な製造方法として、公知の方法を用いることができ、例えば、植物を、乾燥した後に、破砕、粉砕、または、切断などによって種子分解物を得、溶媒を用いて抽出し、残渣を除去することによって抽出液を得ることができる。この抽出液をそのまま用いてもよく、この抽出液から様々な方法でポリフェノールを精製して得られた様々な純度の抽出液を用いてもよいが、さらに、抽出液から溶媒を除去することによって、抽出物を得ることができる。抽出物の形状は、特に限定されず、例えば粉体などの固体状、アモルファス状、または、オイル状であっても良い。このように、植物から抽出物を得る段階のいずれのものも、本発明の植物のエキスとして使用することができる。
【００１７】
抽出に用いる溶媒の種類は、当業者であれば適切に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であっても良く、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であることが好ましく、水、エタノール、または、水およびエタノールの混合溶媒であることがより好ましい。混合溶媒を用いる場合の、各溶媒の混合比は特に限定されないが、例えば水およびエタノールの混合溶媒を用いる場合には、水とエタノールとの体積比は、１：９９〜９９：１であっても良く、３：９７〜８０：２０であることが好ましく、５：９５〜５０：５０であることがより好ましく、１０：９０〜４０：６０であることが特に好ましい。
【００１８】
溶媒として、水、または、水との混合溶媒を用いる場合には、熱水、または、熱水との混合溶媒であること、あるいは、水、または、水と溶媒を混合した後に加熱することが好ましい。水、または、水との混合溶媒は塩を含んでいても良く、塩を含む溶媒の例として、バッファー（緩衝液）であっても良い。バッファーのｐＨは、特に限定されず、酸性、中性、または、アルカリ性のいずれであっても良いが、酸性であることが好ましく、ｐＨ６以下の酸性であることがより好ましく、ｐＨ２．５〜ｐＨ５の酸性であることがさらに好ましい。バッファーに用いる塩の種類は特に限定されず、例として、クエン酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、酢酸塩および炭酸塩などが挙げられる。
【００１９】
抽出液からスチルベンを純化する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、イオン交換樹脂や合成吸着樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーなどがよく知られている。
【００２０】
抽出液から溶媒を除去する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、減圧留去、凍結乾燥、または、スプレードライ（噴霧乾燥）であっても良いが、凍結乾燥、または、スプレードライであることが好ましく、スプレードライであることがより好ましい。
【００２１】
ここで、植物の種類は、スチルベンを含む植物であれば特に限定されず、ピセアタンノールの場合、例えば、パッションフルーツ（例えば、Passiflora edulis、Passiflora alata、Passiflora amethystine、Passiflora antioquiensis、Passiflora biflora、Passiflora buonapartea、Passiflora capsularis、Passiflora cearensis、Passiflora coccinea、Passiflora cochinchinesis、Passiflora filamentosa、Passiflora herbertiana、Passiflora laurifolia、Passiflora ligularis、Passiflora lunata、Passiflora lutea、Passiflora maliformis、Passiflora mixta、Passiflora mucronata、Passiflora mollissima、Passiflora nibiba、Passiflora organensis、Passiflora pallida、Passiflora parahypensis、Passiflora pedeta、Passiflora pinnatistipula、Passiflora popenovii、Passiflora quadrangularis、Passiflora riparia、Passiflora rubra、Passiflora serrate、Passiflora tiliaefolia、Passiflora tripartite、Passiflora villosa、Passiflora warmingiiなど）、テンニンカ（例えば、Rhodomyrtus tomentosaなど）、ブラシノキ（例えば、マキバブラシノキCallistemon speciosus、Callistemon rigidusなど）、カラガナチベチカ（Caragana tibetica）（例えば茎）、イタドリ（Fallopia japonica）（例えば根）、落花生（Arachis hypogaea）、ブドウ（Vitaceae）（例えば果実）、ブルーベリー（Cyanococcus）（例えば果実）、ディアベリー（Vaccinium stamineum）（例えば果実）などが挙げられるが、ピセアタンノールを高濃度で含むことが知られている、パッションフルーツ、テンニンカ、または、ブラシノキであることが好ましい。抽出するのは、植物全体のうち、どの部分であっても良く、例えば、果実、花、種子、葉、枝、樹皮、幹、茎、または、根であっても良いが、パッションフルーツを用いる場合は種子であることが好ましく、テンニンカである場合には果実であることが好ましく、ブラシノキである場合には茎であることが好ましい。
【００２２】
レスベラトロールは、ブドウ（Vitaceae）（例えば果皮）、落花生（Arachis hypogaea）（例えば種皮）、ベリーの果実などに含まれており、これらの植物から単離できる。
【００２３】
イソラポンチゲニンは、インドネシア原産のメリンジョ（Gnetum gnemon）や南米北部に分布するヤシ（オビレハリクジャクヤシ）に多量に含まれており、こうした植物から天然のイソラポンチゲニンを単離してもよい。
【００２４】
ラポンチゲニンは、カラダイオウ(Rheum undulatum）（例えば、根)やマダガスカルに分布する豆科植物の一種である Stuhlmannia moaviに含まれており、これらの植物から単離できる。
【００２５】
各化合物を発現増強剤あるいは転写活性化剤に剤型化する方法は、賦形剤や緩衝液などを用いた公知の方法を用いればよく、特に限定されない。
【００２６】
（２）ＵＣＰ１遺伝子の発現増強方法
細胞を、上記いずれかの化合物で処理することによって、その細胞内でのＵＣＰ１遺伝子の発現を増強することができる。この発現の増強は、ｍＲＮＡレベルで検出できるため、ＵＣＰ１遺伝子転写を活性化している。
【００２７】
細胞の種類は特に限定されず、動物個体内の細胞であっても、培養細胞であっても構わない。この細胞が動物個体内にあるときの動物の種類は特に限定されず、例えばほ乳類であってもよく、ヒト、マウス、ラット、ブタなどであってもよい。細胞の種類は特に限定されないが、白色脂肪細胞であることが好ましい。培養細胞の種類も特に限定されないが、白色脂肪細胞であることが好ましく、多能性幹細胞、線維芽細胞、白色脂肪前駆細胞、骨髄細胞など（例えば、１０Ｔ１／２細胞や３Ｔ３Ｌ１細胞）を白色脂肪細胞に分化させた細胞、あるいはＨＷ細胞であることが特に好ましい。  
【００２８】
細胞を、上記いずれかの化合物で処理する方法も特に限定されない。in vivoで処理する方法として、細胞が動物個体内にあるときは、その動物に投与すればよいが、投与方法は限定されず、経口投与であっても非経口投与であってもよい。また、in vitroで処理する方法として、細細胞が培養細胞である場合、細胞を培養している培地に上記化合物を添加してもよく、上記化合物を含有した培地を用いて細胞を培養してもよい。
【００２９】
上記化合物で細胞を処理する際の化合物の濃度も特に限定されず、例えば動物個体の場合２０ug/kg-３００mg/kgであればよいが、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇであることが好ましく、２００μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇであることがより好ましい。培養細胞の場合、１００μＭ〜３００μＭであればよいが、３μＭ〜１００μＭであることが好ましい。
【００３０】
上記化合物を動物個体に投与する場合、例えば肥満抑制剤や痩身剤のような医薬として使用できる。その使用方法は、特に限定されず、使用環境、使用条件に従って、適宜決定することができる。
【実施例】
【００３１】
［方法］
マウス胚細胞由来間葉系細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（high glucose、100U/mL penicillin＋100 ug/mL streptomycin含有）で培養した（37℃、5% CO2）。
【００３２】
マウス胚細胞由来間葉系細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１×１０５細胞／ウエルで１２ウエル・プレートに播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（以下、ＤＭＥＭはhigh glucose、100U/mL penicillin＋100 ug/mL streptomycinを含有している）で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。細胞がコンフルエントに達した後、分化誘導試薬(0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 0.25 uM dexamethasone, 10 ug/ml insulin, 1uM troglitazone)を添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで、２日間処理した。その日をday0とし、分化促進培地（5 ug/ml insulinを添加した１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ）で２日おきに培地交換し、８〜１２日間、十分に脂肪滴を溜めるまで白色脂肪細胞に分化させた。その後、各スチルベンを下記の濃度で０．２％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに添加した培地で、細胞を８時間処理した。
【００３３】
その後ＲＮＡを回収し、下記プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法にて、ＵＣＰ１遺伝子及びＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を測定し、ＵＣＰ１遺伝子発現量（Target）／ＧＡＰＤＨ遺伝子発現量（Ref）を算出した。
【００３４】
実験に用いた化合物とその濃度：
実験１  ピセアタンノール(PIC)（３、１０、３０、１００μＭ）
実験２  ピセアタンノール(PIC)（３０μＭ）
レスベラトロール(RES)（３０、１００μＭ）
イソラポンチゲニン(ISO) （３０、１００μＭ）
ラポンチゲニン(RHA) （３０、１００μＭ）
ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマー：
ＵＣＰ１  Ｆｗ：ＧＧＣＣＴＣＴＡＣＧＡＣＴＣＡＧＴＣＣＡ（配列番号１）
ＵＣＰ１  Ｒｖ：ＴＡＡＧＣＣＧＧＣＴＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴ（配列番号２）
ＧＡＰＤＨ  Ｆｗ：ＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣ（配列番号３）
ＧＡＰＤＨ  Ｒｖ：ＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＡＴＧＧ（配列番号４）
【００３５】
［結果］
実験１：本実験では、ＵＣＰ１遺伝子発現増強に対するピセアタンノールの濃度依存性を確認した。図１のグラフでわかるように、培地中のピセアタンノールの濃度が高くなるほど、ＵＣＰ１遺伝子発現増強能も高くなる。そして、ＵＣＰ１遺伝子発現増強能は、転写レベルで検出できるので、ピセアタンノールは、ＵＣＰ１遺伝子転写活性化を増強している。
【００３６】
実験２：本実験では、各化合物のＵＣＰ１遺伝子発現増強能を比較した。図２のグラフでわかるように、ピセアタンノール、レスベラトロール、イソラポンチゲニン、ラポンチゲニンはいずれも、ＵＣＰ１遺伝子発現増強能を有していた。特に、ピセアタンノールは、他の化合物の３分の１の濃度で、ほぼ同じ程度のＵＣＰ１遺伝子発現増強能を有している。
【図１】
2016185922.tif 000003
【図２】
2016185922.tif 000004
【配列表】
2016185922000001.app