(57)【要約】【課題】新たな糖尿病の治療又は予防剤、新たな糖尿病モデル非ヒト動物、新たな糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供する。【解決手段】細胞保護タンパク質誘導剤を有効成分とする糖尿病の治療又は予防剤；細胞保護タンパク質をコードする遺伝子が破壊された糖尿病モデル非ヒト動物；被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、細胞における細胞保護タンパク質の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下における前記細胞保護タンパク質の発現量が、被検物質の非存在下における前記細胞保護タンパク質の発現量よりも高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法；糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キット。【選択図】図１５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞保護タンパク質誘導剤を有効成分とする、糖尿病の治療又は予防剤。
【請求項２】
前記細胞保護タンパク質誘導剤が、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０の発現を誘導する化合物である、請求項１に記載の治療又は予防剤。
【請求項３】
前記化合物がテプレノン又はテプレノン誘導体である、請求項２に記載の治療又は予防剤。
【請求項４】
細胞保護タンパク質をコードする遺伝子が破壊されてなる、糖尿病モデル非ヒト動物。
【請求項５】
前記遺伝子がＫＩＦ１２遺伝子又はＨｓｃ７０遺伝子である、請求項４に記載の糖尿病モデル非ヒト動物。
【請求項６】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞における細胞保護タンパク質の発現量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項７】
前記細胞保護タンパク質が、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項９】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１０】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるペルオキシソームの形成量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１１】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１２】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞の酸化ストレスレベルを定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１３】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞における細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１４】
前記細胞保護タンパク質遺伝子がＫＩＦ１２遺伝子であり、前記転写因子がＨＮＦ１α又はＨＮＦ１βである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞保護タンパク質遺伝子がＨｓｃ７０遺伝子であり、前記転写因子がＳｐ１である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１７】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１８】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項１９】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項２０】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるペルオキシソームの形成量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項２１】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項２２】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞の酸化ストレスレベルを定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項２３】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、
被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、
前記細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程と、
被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
【請求項２４】
前記細胞保護タンパク質が、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、ＫＩＦ１２のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キット。
【請求項２６】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗ＫＩＦ１２抗体を含む、キット。
【請求項２７】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗ＨＮＦ１α抗体又は抗ＨＮＦ１β抗体と、ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットとを含む、キット。
【請求項２８】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、ＫＩＦ１２遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キット。
【請求項２９】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｈｓｃ７０のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キット。
【請求項３０】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｈｓｃ７０抗体を含む、キット。
【請求項３１】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｓｐ１抗体と、Ｈｓｃ７０遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットとを含む、キット。
【請求項３２】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キット。
【請求項３３】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｐｅｘ５のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キット。
【請求項３４】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｐｅｘ５抗体を含む、キット。
【請求項３５】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｓｐ１抗体を含む、キット。
【請求項３６】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｓｐ１の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キット。
【請求項３７】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、細胞中のペルオキシソームの形成量を測定する試薬を含む、キット。
【請求項３８】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、細胞の酸化ストレスレベルを測定する試薬を含む、キット。
【請求項３９】
糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、脂肪酸又は細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞、及び抗インスリン抗体を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病の治療又は予防剤、糖尿病モデル非ヒト動物、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、主要な生活習慣病の１つであり、過剰な栄養摂取により代謝恒常性が破壊される病気である。特に、高脂肪食の慢性的な摂取が、次の２段階により２型糖尿病に罹患するリスクを増大させると考えられている。まず、第１段階において、肥満等により、末梢（筋肉、脂肪組織等）での糖質の取込みが低下し、血糖値が下がりにくい状態になる。この状態を、インスリン抵抗性が上昇しているという。この段階は、糖尿病の前段階であり、このインスリン抵抗性の上昇は、膵臓β細胞（以下、略して「β細胞」という場合がある。）によるインスリン産生の増加により補償される。続いて、第２段階において、更に慢性的に過剰な栄養摂取を続けることにより、次第にβ細胞の機能不全が進行し、最終的にグルコース恒常性が破壊され、明確な高血糖状態に至る。
【０００３】
近年、慢性的に過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞が直接損傷されることが報告された（例えば、非特許文献１を参照）。この現象は、β細胞脂肪毒性（糖尿病脂肪毒性）と呼ばれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Oprescu, A.I., et al. (2007) Free fatty acid-induced reduction in glucose-stimulated insulin secretion: evidence for a role of oxidative stress in vitro and in vivo. Diabetes 56, 2927-2937.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
糖尿病を発症させるβ細胞脂肪毒性の分子機構は未解明である。そこで、本発明は、β細胞脂肪毒性の分子機構を解明し、新たな糖尿病の治療又は予防剤を提供することを目的とする。本発明はまた、新たな糖尿病モデル非ヒト動物を提供することを目的とする。本発明はまた、新たな糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の通りである。
（１）細胞保護タンパク質誘導剤を有効成分とする、糖尿病の治療又は予防剤。
（２）前記細胞保護タンパク質誘導剤が、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０の発現を誘導する化合物である、（１）に記載の治療又は予防剤。
（３）前記化合物がテプレノン又はテプレノン誘導体である、（２）に記載の治療又は予防剤。
（４）細胞保護タンパク質をコードする遺伝子が破壊されてなる、糖尿病モデル非ヒト動物。
（５）前記遺伝子がＫＩＦ１２遺伝子又はＨｓｃ７０遺伝子である、（４）に記載の糖尿病モデル非ヒト動物。
（６）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞における細胞保護タンパク質の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（７）前記細胞保護タンパク質が、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０である、（６）に記載の方法。
（８）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（９）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１０）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるペルオキシソームの形成量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１１）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１２）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞の酸化ストレスレベルを定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１３）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞における細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１４）前記細胞保護タンパク質遺伝子がＫＩＦ１２遺伝子であり、前記転写因子がＨＮＦ１α又はＨＮＦ１βである、請求項１３に記載の方法。
（１５）前記細胞保護タンパク質遺伝子がＨｓｃ７０遺伝子であり、前記転写因子がＳｐ１である、請求項１３に記載の方法。
（１６）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１７）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１８）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（１９）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（２０）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるペルオキシソームの形成量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（２１）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（２２）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞の酸化ストレスレベルを定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（２３）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む、方法。
（２４）前記細胞保護タンパク質が、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０である、（２０）〜（２３）のいずれか一項に記載の方法。
（２５）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、ＫＩＦ１２のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キット。
（２６）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗ＫＩＦ１２抗体を含む、キット。
（２７）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗ＨＮＦ１α抗体又は抗ＨＮＦ１β抗体と、ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットとを含む、キット。
（２８）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、ＫＩＦ１２遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キット。
（２９）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｈｓｃ７０のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キット。
（３０）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｈｓｃ７０抗体を含む、キット。
（３１）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｓｐ１抗体と、Ｈｓｃ７０遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットとを含む、キット。
（３２）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キット。
（３３）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｐｅｘ５のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キット。
（３４）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｐｅｘ５抗体を含む、キット。
（３５）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｓｐ１抗体を含む、キット。
（３６）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｓｐ１の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キット。
（３７）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、細胞中のペルオキシソームの形成量を測定する試薬を含む、キット。
（３８）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、細胞の酸化ストレスレベルを測定する試薬を含む、キット。
（３９）糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、脂肪酸又は細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞、及び抗インスリン抗体を含む、キット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、新たに解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構に基づいた、新たな糖尿病の治療又は予防剤を提供することができる。また、新たな糖尿病モデル非ヒト動物を提供することができる。さらに、新たな糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＫＩＦ１２の発現を示すイムノブロッティングの写真である。
【図２】（Ａ）は、野生型のＫＩＦ１２遺伝子座、ターゲッティングベクター及びターゲッティングベクターで置き換えられたＫＩＦ１２遺伝子座の構造を示す図である。（Ｂ）及び（Ｃ）はサザンブロッティングの結果を示す写真である。（Ｄ）は、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス、野生型及びヘテロ接合体を判定するＰＣＲ増幅の結果を示す写真である。（Ｅ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）の膵臓ランゲルハンス島におけるＫＩＦ１２タンパク質を検出するイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】（Ａ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）における血糖値の変化を示すグラフである。（Ｂ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のグルコース刺激インスリン分泌量の結果を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は、ＫＩＦ１２をノックダウンしたＭＩＮ６細胞（ＫＤ）及びネガティブコントロール（ＳＣ）の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真並びにＥＣＦＰ−ＰＴＳ１の蛍光強度を示すグラフである。（Ｂ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真並びに抗ＡＣＡＡ１抗体の蛍光強度を示すグラフである。（Ｃ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のランゲルハンス島におけるカタラーゼ活性を示すグラフである。（Ｄ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のランゲルハンス島におけるＧＰｘ活性を示すグラフである。（Ｅ）は、蛍光顕微鏡で観察した結果をもとに、過酸化水素濃度を疑似カラーで示した写真及びグラフである。
【図５】抗Ｈｓｃ７０抗体で染色した、（Ａ）野生型マウス（ＷＴ）及び（Ｂ）ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞の蛍光顕微鏡写真並びに（Ｃ）抗Ｈｓｃ７０抗体の蛍光強度を示すグラフである。
【図６】（Ａ）は、Ｈｓｃ７０の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトの構造を示す図である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、Ｈｓｃ７０プロモーターレポーターアッセイにおいて、レポーターであるＴａｇＲＦＰとＥＧＦＰの蛍光強度比を蛍光顕微鏡で検出した結果を示す写真である。（Ｄ）は、顕微鏡観察の結果を数値化したグラフである。
【図７】（Ａ）は、各転写因子のイムノブロッティングの結果を示す写真であり、（Ｂ）は、検出された各転写因子のタンパク質量を数値化したグラフである。
【図８】（Ａ）はイムノブロッティングによりＳｐ１タンパク質の存在量を測定した写真である。（Ｂ）及び（Ｃ）は、（Ａ）に基づいてＳｐ１（１０５ｋＤ）の存在量（Ｂ）及びＳｐ１（９５ｋＤ）の存在量（Ｃ）を数値化したグラフである。
【図９】ＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ顕微鏡による蛍光顕微鏡写真（Ａ〜Ｏ）及びグラフ（Ｐ）である。
【図１０】（Ａ）及び（Ｂ）は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより、ＫＩＦ１２及びＨｓｃ７０のｍＲＮＡを定量したグラフである。（Ｃ）は、イムノブロッティングの結果を示す写真である。
【図１１】ＨＮＦ１αとＫＩＦ１２遺伝子プロモーター領域との結合をクロマチン免疫沈降法により検討した結果を示すグラフである。
【図１２】（Ａ）は、過酸化水素濃度を疑似カラーで示した写真及びグラフである。（Ｂ）は、脂肪酸処理していないＭＩＮ６細胞（ｍｏｃｋ）、脂肪酸処理したＭＩＮ６細胞（ＦＡ）及びＫＩＦ１２を高発現させたＭＩＮ６細胞を脂肪酸処理したもの（ＦＡ＋ＫＩＦ１２）の蛍光顕微鏡写真及びその結果を数値化したグラフである。（Ｃ）は、ネガティブコントロールのβ細胞（ｍｏｃｋ）及びＨｓｃ７０を高発現させたＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞の蛍光顕微鏡写真及びその結果を数値化したグラフである。
【図１３】（Ａ）及び（Ｂ）は、過酸化水素濃度を疑似カラーで示した写真及びグラフである。
【図１４】（Ａ）は、グルコース刺激インスリン分泌量の測定結果を示すグラフである。（Ｂ）は、腹腔内グルコース寛容性試験の結果を示すグラフである。
【図１５】発明者らが明らかにしたβ細胞脂肪毒性の分子機構を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
〔糖尿病の治療又は予防剤〕
１実施形態において、本発明は、細胞保護タンパク質誘導剤を有効成分とする、糖尿病の治療又は予防剤を提供する。
【００１０】
細胞保護タンパク質とは、他のタンパク質等に結合する事により、それらのタンパク質の細胞内局在や、シグナル伝達の効率を変化させ、細胞を保護するタンパク質を指す。また、シャペロンとは、他のタンパク質分子が正しい折りたたみ（フォールディング）を行って機能を獲得するのを助けるタンパク質の総称である。多くのシャペロンは、温度が上昇したときに発現される熱ショックタンパク質であり、熱ショック等の種々のストレスから生体を守る役割を担っている。シャペロンは、細胞保護タンパク質の一種であると捉えることもできる。
【００１１】
後述するように、発明者らは、β細胞脂肪毒性の分子機構を明らかにした。その概要は次の通りである。まず、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等の細胞保護タンパク質の発現が低下する。その結果、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされる。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇する。この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷される（機能障害を示す）。β細胞脂肪毒性の分子機構の詳細については後述する。
【００１２】
ＫＩＦ１２は、キネシンスーパーファミリータンパク質の１種である。キネシンスーパーファミリータンパク質は、微小管細胞骨格に関連した機能を有する分子モーターのスーパーファミリーで構成される。キネシンスーパーファミリータンパク質は、微小管上を移動する共通のモータードメインを有しており、細胞内小器官や、発生におけるシグナル伝達に重要な巨大分子複合体等の輸送に役立っている。
【００１３】
微小管のシステムが、細胞質内の必須のタンパク質の安定化に寄与していることが、長年示唆されてきた。しかしながら、キネシンスーパーファミリータンパク質が、どのようにして、タンパク質の安定化に直接影響を与えるのかの詳細な機構は未解明であった。
【００１４】
ＫＩＦ１２は、ＨＮＦ１α／β転写因子により膵臓及び腎臓で発現し、多発性嚢胞腎の表現型を修飾することが報告されている。しかしながら、β細胞におけるＫＩＦ１２の機能は未解明であった。これに対し、本発明において、発明者らは、ＫＩＦ１２が細胞保護タンパク質であることを明らかにした。
【００１５】
細胞保護タンパク質誘導剤とは、細胞内における細胞保護タンパク質の発現を増大させる物質である。細胞保護タンパク質誘導剤を投与して、β細胞内の細胞保護タンパク質の発現を上昇させることにより、ペルオキシソームの形成異常を正常な状態に近づけることができる。この結果、β細胞の酸化ストレスレベルを低減させて、β細胞の損傷を抑制することができる。これにより、糖尿病の治療又は予防を行うことができる。したがって、細胞保護タンパク質誘導剤は、糖尿病、より好ましくは、２型糖尿病の治療又は予防剤である。また、本実施形態の糖尿病の治療又は予防剤は、β細胞の抗酸化ストレス剤であるともいえる。
【００１６】
細胞保護タンパク質誘導剤は、それ自身単独で細胞保護タンパク質の発現を誘導することができる化合物でもよいし、それ自身単独では細胞保護タンパク質の発現を誘導することはできなくても、その他の軽度のストレスと併用した場合に細胞保護タンパク質の発現を誘導することができる化合物でもよい。細胞保護タンパク質誘導剤としては、サリチル酸ナトリウム、インドメタシン、アスピリン等の非ステロイド性抗炎症薬；ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ（１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン）、ラディシコール、ハービマイシンＡ等のＨｓｐ９０阻害剤；アラキドン酸；プロスタグランジンＡ１、プロスタグランジンＪ２等のプロスタグランジン；２−シクロペンテン−１−オン；ＭＧ−１３２、ラクタシスチン等のプロテアソーム阻害剤；ＤＣＩＣ、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ等のセリンプロテアーゼ阻害剤；テプレノン、レバミピド、カルベノキソロン、ポラプレジンク等の抗潰瘍薬；ペオニフロリン、グリチルリチン、セラストロール、ジヒドロセラストロール、ジヒドロセラストロール・ジアセテート、バイオクロモール、クルクミン等の生薬；及びこれらの誘導体が挙げられる。
【００１７】
上記の細胞保護タンパク質誘導剤は、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０の発現を誘導する化合物であることが好ましい。後述するように、発明者らは、β細胞内でＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０を高発現させると、脂肪酸添加培地による培養で誘導されるβ細胞の酸化ストレスレベルの上昇が、抑制されることを明らかにした。
【００１８】
ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０の発現を誘導する化合物としては、テプレノン又はテプレノン誘導体が挙げられる。テプレノンは、下記構造式（１）で示される化合物であり、消化性潰瘍や胃炎の治療・予防剤として広く臨床的に使用されている。
【００１９】
【化１】
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【００２０】
テプレノンの化学名は、６，１０，１４，１８−テトラメチル−５，９，１３，１７−ノナデカテトラエン−２−オン又はゲラニルゲラニルアセトンである。テプレノンには複数の異性体が存在するが、消化性潰瘍や胃炎の治療・予防剤として実用に供されているのは、５Ｅ，９Ｅ，１３Ｅゲラニルゲラニルアセトンと５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅゲラニルゲラニルアセトンとを、重量比３：２で含む混合物である。
【００２１】
本実施形態に係るテプレノンは、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０の発現を誘導する（発現量を高める）限り、いずれの異性体であってもよく、複数の異性体を任意の混合比で混合した混合物であってもよい。テプレノン誘導体としては、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０の発現を誘導する限り特に制限はなく、例えば、イソプレン骨格の長さを変更したもの、アセトン部分をカルボン酸、アルコール等に変更したもの等が挙げられる。
【００２２】
上記の細胞保護タンパク質誘導剤は、糖尿病の治療又は予防剤として、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の製剤として経口的に、又は、注射剤、坐剤等の製剤として非経口的に投与してもよい。
【００２３】
これらの製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を用いて、周知の方法で製造することができる。
【００２４】
賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
【００２５】
結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００２６】
崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００２７】
滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
【００２８】
乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００２９】
安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。
【００３０】
希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００３１】
注射剤用溶剤としては、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００３２】
〔糖尿病モデル非ヒト動物〕
１実施形態において、本発明は、細胞保護タンパク質をコードする遺伝子が破壊されてなる、糖尿病モデル非ヒト動物を提供する。
【００３３】
発明者らが明らかにしたβ細胞脂肪毒性の分子機構によれば、β細胞における細胞保護タンパク質の発現が低下する結果、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされる。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇する。この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷される。
【００３４】
このことから、細胞保護タンパク質をコードする遺伝子が破壊された非ヒト動物は、ペルオキシソームの形成異常を引き起こすことが理解される。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇して、この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷されることが理解される。
【００３５】
糖尿病モデル非ヒト動物において、遺伝子を破壊する対象の細胞保護タンパク質としては、Ｈｓｃ７０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０等の熱ショックタンパク質、ＫＩＦ１２等のキネシンスーパーファミリータンパク質が挙げられる。
【００３６】
後述するように、発明者らは、細胞保護タンパク質であるＫＩＦ１２をコードする遺伝子を破壊したマウスが、有意なグルコース不寛容性を示すことを明らかにした。この結果は、細胞保護タンパク質をコードする遺伝子が破壊された非ヒト動物が、新たな糖尿病モデル動物であることを示す。本実施形態の糖尿病モデル非ヒト動物は、２型糖尿病モデルであるともいえるし、β細胞脂肪毒性モデルであるともいえる。
【００３７】
上記の糖尿病モデル非ヒト動物において、破壊された遺伝子は、ＫＩＦ１２遺伝子であることが好ましい。
【００３８】
非ヒト動物としては、特に限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル等が挙げられる。
【００３９】
〔糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法〕
［細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地でβ細胞を培養する工程と、前記細胞における細胞保護タンパク質の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。上記の細胞保護タンパク質は、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０であることが好ましい。
【００４０】
上述したように、発明者らが解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構の概要は次の通りである。まず、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等の細胞保護タンパク質の発現が低下する。その結果、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされる。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇する。この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷される。
【００４１】
したがって、β細胞の脂肪酸への暴露により生じる細胞保護タンパク質の発現量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【００４２】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本工程では、被検物質の存在下又は非存在下において、β細胞を脂肪酸添加培地中で培養する。
【００４３】
被検物質としては特に制限はなく、例えば、植物抽出液、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。
【００４４】
β細胞は、例えば野生型のβ細胞であってよい。β細胞は、株化された培養細胞であってもよく、非ヒト動物から採取された初代培養細胞であってもよく、ＥＳ細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）やｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等の幹細胞から誘導された細胞であってもよい。又は、β細胞は、単離した膵臓ランゲルハンス島であってもよい。
【００４５】
脂肪酸添加培地としては、β細胞脂肪毒性を誘導できる培地であれば特に制限はない。脂肪酸としては、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸等が挙げられる。培地への脂肪酸の添加濃度は、例えば０．１〜１ｍＭである。培養時間は、β細胞脂肪毒性が誘導される時間であればよく、例えば２４〜７２時間が挙げられる。β細胞脂肪毒性が誘導されるとは、脂肪酸非添加培地で培養した同様の細胞と比較した場合に、検出可能な差異が生じることを意味する。ここで、検出可能な差異とは、例えば、ＫＩＦ１２又はＨｓｃ７０の発現量、ペルオキシソームの形成量、Ｓｐ１のタンパク質レベル等における差異であり、詳細については後述する。
【００４６】
非ヒト動物としては、特に限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル等が挙げられる。
【００４７】
（細胞保護タンパク質の発現量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内の細胞保護タンパク質の発現量、及び被検物質の非存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内の細胞保護タンパク質の発現量を定量する。細胞保護タンパク質としては、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等が挙げられる。細胞保護タンパク質の発現量の定量はｍＲＮＡレベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。
【００４８】
細胞保護タンパク質の発現量の定量をｍＲＮＡレベルで行う方法としては、例えば、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等の細胞保護タンパク質のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを使用した、ＳＹＢＲグリーン法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法等によるリアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。
【００４９】
また、細胞保護タンパク質の発現量の定量を、細胞保護タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を定量することにより行ってもよい。細胞保護タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を定量する方法としては、例えば、細胞保護タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを使用したレポーターアッセイ等が挙げられる。レポーターコンストラクトとしては、細胞保護タンパク質のプロモーターの下流に、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子等の酵素をコードする遺伝子や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ＴａｇＲＦＰ遺伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子等を有するものが利用できる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用した場合には、ルシフェラーゼ活性を定量することにより、細胞保護タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を定量することができる。例えば、レポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用した場合には、ＧＦＰの蛍光強度を定量することにより、細胞保護タンパク質をコードする遺伝子の転写活性を定量することができる。細胞保護タンパク質としては、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等が挙げられる。
【００５０】
細胞保護タンパク質の発現量の定量をタンパク質レベルで行う方法としては、例えば、抗ＫＩＦ１２抗体、抗Ｈｓｃ７０抗体を使用したＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。
【００５１】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞における上記の細胞保護タンパク質の発現量が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞における上記の細胞保護タンパク質の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【００５２】
［Ｓｐ１タンパク質の存在量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地でβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【００５３】
発明者らが解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構の概要を上述した。それによれば、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等の細胞保護タンパク質の発現が低下する。この過程のより詳細な分子機構は次の通りである。まず、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２の発現が低下する。ＫＩＦ１２の発現が低下することにより、転写因子であるＳｐ１のタンパク質レベルでの存在量が減少する。Ｓｐ１は、Ｈｓｃ７０の発現に必要であるため、Ｓｐ１タンパク質の減少によりＨｓｃ７０の発現が低下する。この後の過程は上述した通りである。
【００５４】
したがって、β細胞の脂肪酸への暴露により生じるＳｐ１タンパク質の存在量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【００５５】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述した細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【００５６】
（Ｓｐ１タンパク質の存在量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内のＳｐ１タンパク質の存在量、及び被検物質の非存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内のＳｐ１タンパク質の存在量を定量する。
【００５７】
Ｓｐ１タンパク質の存在量を定量する方法としては、抗Ｓｐ１抗体を使用したＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。より顕著な結果が得られる観点から、Ｓｐ１タンパク質の存在量の定量は、シクロヘキシミド処理等により、タンパク質合成の阻害を一定時間行った細胞を試料として行うことが好ましい。
【００５８】
なお、後述するように、発明者らは、過剰な脂肪酸に暴露されたβ細胞において、Ｓｐ１のタンパク質レベルでの存在量が減少することを明らかにした。したがって、本実施形態のスクリーニング方法においては、Ｓｐ１のｍＲＮＡレベルでの発現量を定量するよりも、Ｓｐ１タンパク質の存在量を定量することが好ましい。
【００５９】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞における上記のＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞における上記のＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【００６０】
［Ｓｐ１タンパク質の活性に基づくスクリーニング］
Ｓｐ１タンパク質の存在量に基づくスクリーニングの代わりに、Ｓｐ１タンパク質の活性に基づくスクリーニングを行うこともできる。
【００６１】
したがって、１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地でβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【００６２】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述した細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【００６３】
（Ｓｐ１タンパク質の活性を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内のＳｐ１タンパク質の活性、及び被検物質の非存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内のＳｐ１タンパク質の活性を定量する。
【００６４】
Ｓｐ１タンパク質の活性を定量する方法としては、Ｓｐ１の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを使用したレポーターアッセイ等が挙げられる。レポーターコンストラクトとしては、Ｓｐ１結合配列の下流に、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子等の酵素をコードする遺伝子や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子等を有するものが利用できる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用した場合には、ルシフェラーゼ活性を定量することにより、Ｓｐ１タンパク質の活性を定量することができる。例えば、レポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用した場合には、ＧＦＰの蛍光強度を定量することにより、Ｓｐ１タンパク質の活性を定量することができる。
【００６５】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞における上記のＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞における上記のＳｐ１タンパク質の活性と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【００６６】
［ペルオキシソームの形成量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地でβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるペルオキシソームの形成量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【００６７】
上述したように、発明者らが解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構の概要は次の通りである。まず、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等の細胞保護タンパク質の発現が低下する。その結果、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常（ペルオキシソームの形成量の低下）が引き起こされる。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇する。この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷される。
【００６８】
したがって、β細胞の脂肪酸への暴露により生じるペルオキシソームの形成量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【００６９】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述した細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【００７０】
（ペルオキシソームの形成量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内のペルオキシソームの形成量、及び被検物質の非存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞内のペルオキシソームの形成量を定量する。
【００７１】
ペルオキシソームとは、ほぼ全ての真核細胞が持つ細胞内小器官であり、その内部であるマトリクス領域において、多様な物質の酸化反応を行っている。ペルオキシソームは、一重の生体膜に包まれた直径０．１〜２μｍの器官であり、多くは球形である。哺乳類の細胞では数百から数千個が一細胞内に存在する。ペルオキシソームは、タンパク質を細胞質からマトリクス領域に直接取り込み成長する。
【００７２】
ペルオキシソームのマトリクス領域にタンパク質を移行させるシグナル配列として、ＰＴＳ１、ＰＴＳ２等が知られている。
【００７３】
ＰＴＳ１は、セリン／アラニン−リジン／アルギニン−ロイシン／メチオニンのコンセンサス配列を有するトリペプチドからなるシグナル配列であり、ペルオキシソームに取り込まれるタンパク質のＣ末端に存在する。
【００７４】
ＰＴＳ２は、アルギニン−ロイシン／イソロイシン−Ｘ（５）−ヒスチジン−ロイシン（ここで、Ｘは任意のアミノ酸を示し、かっこ内の数字は、連続する当該アミノ酸残基の数を示す。）のコンセンサス配列を有するシグナル配列であり、ペルオキシソームに取り込まれるタンパク質のＮ末端に存在する。アセチル−ＣｏＡ  アシルトランスフェラーゼ１（ＡＣＡＡ１）、フィタノイル−ＣｏＡ  ヒドロキシラーゼ（ＰＨＹＨ）、アルキルグリセロン−リン酸シンターゼ（ＡＧＰＳ）等は、ＰＴＳ２シグナルを有するタンパク質であることが知られている。
【００７５】
β細胞のペルオキシソームの形成が正常に行われている場合、ペルオキシソームへの移行シグナルを有するタンパク質は、ペルオキシソームに取り込まれて集積する。そこで、β細胞を、ペルオキシソームへの移行シグナルを有するタンパク質に対する抗体で蛍光染色して蛍光顕微鏡で観察すると、ペルオキシソームがドット状に蛍光染色される。
【００７６】
これに対し、β細胞のペルオキシソームの形成が少ない場合、ペルオキシソームへの移行シグナルを有するタンパク質の、ペルオキシソームへの集積量が減少する。このため、β細胞を、ペルオキシソームへの移行シグナルを有するタンパク質に対する抗体で蛍光染色して蛍光顕微鏡で観察した場合に、蛍光染色されるペルオキシソームが減少する。
【００７７】
そこで、ペルオキシソームの形成量の定量は、例えば、β細胞を、ペルオキシソームへの移行シグナルを有するタンパク質に対する抗体で蛍光染色して蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を定量することにより行うことができる。
【００７８】
ペルオキシソームへの移行シグナルを有するタンパク質としては、上記のＡＣＡＡ１、ＰＨＹＨ、ＡＧＰＳ等が挙げられる。
【００７９】
ペルオキシソームの形成量を定量する別の方法として、β細胞に、ペルオキシソームへの移行シグナルを有する蛍光タンパク質を発現させて蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を定量することが挙げられる。この場合、ペルオキシソームへの移行シグナルを有する蛍光タンパク質を安定に発現する、β細胞株を樹立し、これをスクリーニング系として使用してもよい。
【００８０】
ペルオキシソームへの移行シグナルを有する蛍光タンパク質としては、上記のＰＴＳ１、ＰＴＳ２等のシグナル配列を組み込んだ、ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＴａｇＲＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）、ＴａｇＧＦＰ２（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）等の蛍光タンパク質等が挙げられる。
【００８１】
ペルオキシソームの形成量を定量する別の方法として、ペルオキシソームに取り込まれる抗酸化酵素の活性を測定することが挙げられる。抗酸化酵素としては、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）等が挙げられる。カタラーゼ及びＧＰｘは、ペルオキシソームに取り込まれる主要な抗酸化酵素である。このため、β細胞のカタラーゼ活性又はＧＰｘ活性を定量することにより、ペルオキシソームの形成量を定量することができる。カタラーゼ及びＧＰｘは、過酸化水素を分解する活性等を有する。そこで、例えば、この活性を指標として、市販のキット等でカタラーゼ活性又はＧＰｘ活性を測定することができる。
【００８２】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞におけるペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞におけるペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【００８３】
［Ｐｅｘ５の発現量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地でβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【００８４】
後述するように、発明者らは、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞では、ペルオキシソーム形成因子であるＰｅｘ５の発現量が有意に低下していることを明らかにした。この結果から、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０と共にＰｅｘ５の発現量も低下し、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされると考えられる。
【００８５】
したがって、β細胞の脂肪酸への暴露により生じるＰｅｘ５の発現量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【００８６】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述した細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【００８７】
（Ｐｅｘ５の発現量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞におけるＰｅｘ５の発現量、及び被検物質の非存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞におけるＰｅｘ５の発現量を定量する。Ｐｅｘ５の発現量の定量はｍＲＮＡレベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。
【００８８】
Ｐｅｘ５の発現量の定量をｍＲＮＡレベルで行う方法としては、例えば、Ｐｅｘ５のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを使用した、ＳＹＢＲグリーン法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法等によるリアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。
【００８９】
Ｐｅｘ５の発現量の定量をタンパク質レベルで行う方法としては、例えば、抗Ｐｅｘ５抗体を使用したＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。
【００９０】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞におけるＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞におけるＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【００９１】
［酸化ストレスレベルに基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地でβ細胞を培養する工程と、前記細胞の酸化ストレスレベルを定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【００９２】
上述したように、発明者らが解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構の概要は次の通りである。まず、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等の細胞保護タンパク質の発現が低下する。その結果、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされる。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇する。この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷される。
【００９３】
したがって、β細胞の脂肪酸への暴露により生じる酸化ストレスレベルの上昇を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【００９４】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述した細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【００９５】
（酸化ストレスレベルを定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞の酸化ストレスレベル、及び被検物質の非存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞の酸化ストレスレベルを定量する。
【００９６】
活性酸素には、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、過酸化水素、一重項酸素等が存在する。酸化ストレスレベルは、細胞中に含まれる活性酸素の量を定量することにより定量することができる。
【００９７】
活性酸素として、例えば過酸化水素を定量してもよい。過酸化水素を定量する方法としては、例えば過酸化水素を特異的に検出する蛍光タンパク質センサーを利用することが挙げられる。このような蛍光タンパク質センサーとしては、例えばＨｙＰｅｒ（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）が挙げられる。ＨｙＰｅｒは、波長４２０ｎｍ及び５００ｎｍに２つの吸収極大を有し、波長５１６ｎｍの１つの蛍光波長のピークを有する蛍光タンパク質である。Ｈｙｐｅｒは、Ｈ２Ｏ２の濃度の上昇に比例して、励起波長４２０ｎｍのピークが減少し、励起波長５００ｎｍのピークが増大するという性質を有する。この性質を利用して、Ｈｙｐｅｒを４２０ｎｍの励起波長で励起した場合と５００ｎｍの励起波長で励起した場合のそれぞれにおける波長５１６ｎｍの蛍光の比を測定することにより、Ｈ２Ｏ２の濃度を定量することができる。ＨｙＰｅｒの４２０ｎｍの吸収極大に対応する励起波長としては、例えば４０５ｎｍを使用することができ、ＨｙＰｅｒの５００ｎｍの吸収極大に対応する励起波長としては、例えば４８８ｎｍを使用することができる。
【００９８】
より具体的には、ＨｙＰｅｒの発現ベクターであるｐＨｙＰｅｒ−Ｃｙｔｏ（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）をあらかじめβ細胞に導入してＨｙＰｅｒを発現させておき、励起波長４０５ｎｍで励起した場合の波長５１６ｎｍの蛍光強度と、励起波長４８８ｎｍで励起した場合の波長５１６ｎｍの蛍光強度の比を測定することにより、β細胞内の過酸化水素濃度を定量することができる。
【００９９】
活性酸素の量は、例えば、２’，７’−ジクロロフルオレシンジアセテート等の細胞浸透性蛍光プローブを使用する方法により定量してもよい。この蛍光プローブを細胞の培地に添加すると、細胞内に散在され、細胞内エラスターゼにより脱アセチル化され、非蛍光型の２’，７’−ジクロロフルオレシンに変化する。この２’，７’−ジクロロフルオレシンは、更に活性酸素により素早く酸化され、強い蛍光を有する２’，７’−ジクロロフルオレセインに変化する。２’，７’−ジクロロフルオレセインの蛍光強度は、細胞内の活性酸素量に比例する。
【０１００】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１０１】
［細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞における細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。前記細胞保護タンパク質遺伝子としては、ＫＩＦ１２遺伝子、Ｈｓｃ７０遺伝子等が挙げられる。前記細胞保護タンパク質遺伝子がＫＩＦ１２遺伝子である場合には、前記転写因子としては、ＨＮＦ１α、ＨＮＦ１β等が挙げられる。前記細胞保護タンパク質遺伝子がＨｓｃ７０遺伝子である場合には、前記転写因子としては、Ｓｐ１等が挙げられる。
【０１０２】
後述するように、発明者らは、β細胞株であるＭＩＮ６細胞を、脂肪酸添加培地で培養すると、転写因子であるＨＮＦ１αのＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域への結合量が有意に低下することを明らかにした。
【０１０３】
したがって、β細胞の脂肪酸への暴露により生じる、細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１０４】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述した細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【０１０５】
（細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞における、細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量、及び被検物質の非存在下において脂肪酸添加培地で培養したβ細胞における、細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量を定量する。
【０１０６】
細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量を定量する方法としては、例えば、クロマチン免疫沈降法が挙げられる。被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞中のタンパク質及びＤＮＡを、ホルムアミド等の架橋剤を用いて架橋する。続いて、細胞からＤＮＡを抽出し、制限酵素、超音波等により切断する。続いて、転写因子に対する抗体を用いて免疫沈降を行い、ＤＮＡ−転写因子−転写因子に対する抗体の複合体を回収する。続いて、回収された複合体からＤＮＡを分離し、当該ＤＮＡ中に存在する細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域断片の量を定量する。細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域の定量には、例えば、細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのＰＣＲプライマーセットを用いた定量ＰＣＲ等を利用することができる。以上の操作により、細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量を定量することができる。
【０１０７】
ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのＰＣＲプライマーセットとしては、例えば、プライマー「ＣｈＩＰ１２ｆ」（配列番号１４）及びプライマー「ＣｈＩＰ１２ｒ」（配列番号１５）の組み合わせ等が挙げられる。また、ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのＰＣＲ条件としては、例えば、９５℃１分の後、９５℃１０秒、５６℃１５秒、７２℃３０秒のサイクルを４５回繰り返す条件等が挙げられる。
【０１０８】
Ｈｓｃ７０遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのＰＣＲプライマーセットとしては、例えば、プライマー「ＣｈＩＰ７０ｆ」（配列番号１６）及びプライマー「ＣｈＩＰ７０ｒ」（配列番号１７）の組み合わせ等が挙げられる。また、Ｈｓｃ７０遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのＰＣＲ条件としては、例えば、９５℃３０秒の後、９５℃１０秒、５６℃１５秒、７２℃２０秒のサイクルを３５回繰り返す条件等が挙げられる。
【０１０９】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞における、細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞における、細胞保護タンパク質遺伝子のプロモーター領域への転写因子の結合量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１１０】
［グルコース刺激インスリン分泌量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、脂肪酸添加培地で膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量と比較して少なかった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１１１】
上述したように、発明者らが解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構の概要は次の通りである。まず、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０等の細胞保護タンパク質の発現が低下する。その結果、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされる。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇する。この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷される。
【０１１２】
また、後述するように、発明者らは、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）の膵臓ランゲルハンス島では、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）量が有意に低下することを明らかにした。
【０１１３】
したがって、膵臓β細胞を脂肪酸添加培地で培養することにより生じる、グルコース刺激インスリン分泌量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１１４】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述した細胞保護タンパク質の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。β細胞は、単離した膵臓ランゲルハンス島であってもよい。特に、グルコース刺激インスリン分泌量の測定には、膵臓ランゲルハンス島を用いることが効果的である。
【０１１５】
（グルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程）
本工程では、上記の細胞又は単離した膵臓ランゲルハンス島のグルコース刺激インスリン分泌量を定量する。より具体的には、上記の細胞又は単離した膵臓ランゲルハンス島の培地に、例えば２０ｍＭのグルコースを添加し、例えば３０分間放置する。続いて、培養上清中のインスリン含有量（分泌されたインスリン量）を、抗インスリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等により定量する。ここで、細胞又は単離した膵臓ランゲルハンス島を、例えば酸−エタノール等で処理してインスリンを抽出し、抗インスリン抗体を用いたＥＬＩＳＡ法等により定量して細胞又は単離した膵臓ランゲルハンス島中の全インスリン量を測定し、分泌されたインスリン量と比較してもよい。
【０１１６】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞又は単離した膵臓ランゲルハンス島における、グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞又は単離した膵臓ランゲルハンス島におけるグルコース刺激インスリン分泌量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１１７】
［ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｈｓｃ７０の発現量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＨｓｃ７０の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１１８】
上述したように、発明者らが解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構の概要は次の通りである。まず、過剰な脂肪酸に暴露されることにより、β細胞において、ＨＮＦ１遺伝子群の活性が低下する。その結果、ＨＮＦ１タンパク群とＫＩＦ１２遺伝子のプロモーターの結合が低下する。その結果、転写レベルでＫＩＦ１２の発現が低下する。ＫＩＦ１２の発現が低下することにより、転写因子であるＳｐ１のタンパク質レベルでの存在量が減少する。Ｓｐ１は、Ｈｓｃ７０の発現に必要であるため、Ｓｐ１タンパク質の減少によりＨｓｃ７０の発現が低下する。その結果、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされる。その結果、β細胞の酸化ストレスレベルが上昇する。この酸化ストレスレベルの上昇によりβ細胞が損傷される。
【０１１９】
後述するように、発明者らはＫＩＦ１２ノックアウトマウスを作製した。ＫＩＦ１２ノックアウトマウスのβ細胞では、Ｓｐ１のタンパク質レベルでの存在量が減少しており、Ｈｓｃ７０の発現が低下しており、ペルオキシソームの形成異常と酸化ストレスの上昇が観察された。また、ＫＩＦ１２ノックアウトマウスは、個体レベルでも糖代謝異常を示し、糖尿病のモデルとしての有用性が示された。
【０１２０】
したがって、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を使用して、上述の、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞を使用するスクリーニング方法と同様のスクリーニング方法により、糖尿病の治療又は予防剤をスクリーニングすることができる。
【０１２１】
例えば、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞における、Ｈｓｃ７０の発現量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１２２】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本工程では、被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を培養する。
【０１２３】
被検物質としては、上述した、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞を使用するスクリーニング方法と同様のものを使用できる。
【０１２４】
β細胞は、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されていれば特に制限はなく、ＫＩＦ１２遺伝子破壊非ヒト動物から採取された初代培養細胞であってもよく、当該初代培養細胞から樹立した株化細胞であってもよい。また、ＫＩＦ１２遺伝子破壊非ヒト動物に由来するｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）等の幹細胞から誘導された細胞であってもよい。また、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）等によりＫＩＦ１２遺伝子の発現をノックダウンした細胞であってもよい。また、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞として、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された膵臓ランゲルハンス島を使用してもよい。また、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞の代わりに、通常ＫＩＦ１２を発現している細胞において、該ＫＩＦ１２遺伝子が破壊された細胞を使用してもよい。通常ＫＩＦ１２を発現している細胞としては、例えば腎細胞が挙げられる。
【０１２５】
非ヒト動物としては、特に限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル等が挙げられる。
【０１２６】
（Ｈｓｃ７０の発現量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＨｓｃ７０の発現量、及び被検物質の非存在下において培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＨｓｃ７０の発現量を定量する。Ｈｓｃ７０の発現量の定量はｍＲＮＡレベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。つまり、Ｈｓｃ７０の発現量の定量は、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性を定量すること、又はＨｓｃ７０タンパク質の発現量を定量することにより行うことができる。
【０１２７】
Ｈｓｃ７０の発現量の定量をｍＲＮＡレベルで行う方法としては、例えば、Ｈｓｃ７０のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを使用した、ＳＹＢＲグリーン法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法等によるリアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。
【０１２８】
また、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性を定量する方法としては、例えば、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを使用したレポーターアッセイ等が挙げられる。レポーターコンストラクトとしては、Ｈｓｃ７０プロモーターの下流に、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子等の酵素をコードする遺伝子や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ＴａｇＲＦＰ遺伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子等を有するものが利用できる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用した場合には、ルシフェラーゼ活性を定量することにより、Ｈｓｃ７０の転写活性を定量することができる。例えば、レポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用した場合には、ＧＦＰの蛍光強度を定量することにより、Ｈｓｃ７０の転写活性を定量することができる。
【０１２９】
Ｈｓｃ７０の発現量の定量をタンパク質レベルで行う方法としては、例えば、抗Ｈｓｃ７０抗体を使用したＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。
【０１３０】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＨｓｃ７０の発現量が、被検物質の非存在下で培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＨｓｃ７０の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１３１】
［ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｓｐ１タンパク質の存在量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１３２】
上述したＫＩＦ１２ノックアウトマウスの性状から理解されるように、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞における、Ｓｐ１タンパク質の存在量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１３３】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述の、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｈｓｃ７０の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【０１３４】
（Ｓｐ１タンパク質の存在量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の存在量、及び被検物質の非存在下において培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の存在量を定量する。Ｓｐ１タンパク質の存在量を定量することは、Ｓｐ１タンパク質の安定性を定量することでもある。
【０１３５】
本実施形態における、Ｓｐ１タンパク質の存在量を定量する方法としては、上述した、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞を使用した、Ｓｐ１タンパク質の存在量に基づくスクリーニング方法におけるものと同様のものを使用できる。
【０１３６】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の存在量が、被検物質の非存在下で培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の存在量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１３７】
［ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｓｐ１タンパク質の活性に基づくスクリーニング］
Ｓｐ１タンパク質の存在量に基づくスクリーニングの代わりに、Ｓｐ１タンパク質の活性に基づくスクリーニングを行うこともできる。
【０１３８】
したがって、１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＳｐ１タンパク質の活性と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１３９】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述の、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｈｓｃ７０の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【０１４０】
（Ｓｐ１タンパク質の存在量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の活性、及び被検物質の非存在下において培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の活性を定量する。
【０１４１】
本実施形態における、Ｓｐ１タンパク質の活性を定量する方法としては、上述した、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞を使用した、Ｓｐ１タンパク質の活性に基づくスクリーニング方法におけるものと同様のものを使用できる。
【０１４２】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の活性が、被検物質の非存在下で培養した、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞内のＳｐ１タンパク質の活性と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１４３】
［細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、ペルオキシソームの形成量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞を培養する工程と、前記細胞におけるペルオキシソームの形成量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１４４】
上述したＫＩＦ１２ノックアウトマウスの性状から理解されるように、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞における、ペルオキシソームの形成量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。細胞保護タンパク質遺伝子としては、ＫＩＦ１２遺伝子、Ｈｓｃ７０遺伝子等が挙げられる。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１４５】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述の、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｈｓｃ７０の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【０１４６】
（ペルオキシソームの形成量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のペルオキシソームの形成量、及び被検物質の非存在下において培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のペルオキシソームの形成量を定量する。
【０１４７】
本実施形態における、ペルオキシソームの形成量を定量する方法としては、上述した、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞を使用した、ペルオキシソームの形成量に基づくスクリーニング方法と同様のものを使用できる。
【０１４８】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のペルオキシソームの形成量が、被検物質の非存在下で培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のペルオキシソームの形成量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１４９】
［細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｐｅｘ５の発現量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞におけるＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１５０】
後述するように、発明者らは、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞では、ペルオキシソーム形成因子であるＰｅｘ５の発現量が有意に低下していることを明らかにした。この結果から、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞では、Ｐｅｘ５の発現量が低下し、β細胞におけるペルオキシソームの形成異常が引き起こされると考えられる。
【０１５１】
したがって、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞におけるＰｅｘ５の発現量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。細胞保護タンパク質遺伝子としては、ＫＩＦ１２遺伝子、Ｈｓｃ７０遺伝子等が挙げられる。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１５２】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述の、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｈｓｃ７０の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【０１５３】
（Ｐｅｘ５の発現量を定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のＰｅｘ５の発現量、及び被検物質の非存在下において培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のＰｅｘ５の発現量を定量する。Ｐｅｘ５の発現量の定量はｍＲＮＡレベルで行ってもよいし、タンパク質レベルで行ってもよい。
【０１５４】
Ｐｅｘ５の発現量の定量をｍＲＮＡレベルで行う方法としては、例えば、Ｐｅｘ５のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを使用した、ＳＹＢＲグリーン法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法等によるリアルタイムＰＣＲ法が挙げられる。
【０１５５】
Ｐｅｘ５の発現量の定量をタンパク質レベルで行う方法としては、例えば、抗Ｐｅｘ５抗体を使用したＥＬＩＳＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。
【０１５６】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のＰｅｘ５の発現量が、被検物質の非存在下で培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞内のＰｅｘ５の発現量と比較して高かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１５７】
［細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、酸化ストレスレベルに基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞を培養する工程と、前記細胞の酸化ストレスレベルを定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した前記細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１５８】
上述したＫＩＦ１２ノックアウトマウスの性状から理解されるように、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞における、酸化ストレスレベルの上昇を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。細胞保護タンパク質遺伝子としては、ＫＩＦ１２遺伝子、Ｈｓｃ７０遺伝子等が挙げられる。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１５９】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述の、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｈｓｃ７０の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【０１６０】
（酸化ストレスレベルを定量する工程）
本工程では、被検物質の存在下において培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞の酸化ストレスレベル、及び被検物質の非存在下において培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞の酸化ストレスレベルを定量する。
【０１６１】
本実施形態における、酸化ストレスレベルを定量する方法としては、上述した、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞を使用した、酸化ストレスレベルに基づくスクリーニング方法と同様のものを使用できる。
【０１６２】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞の酸化ストレスレベルが、被検物質の非存在下で培養した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞の酸化ストレスレベルと比較して低かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１６３】
［細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、グルコース刺激インスリン分泌量に基づくスクリーニング］
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法であって、被検物質の存在下又は非存在下において、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞を培養する工程と、前記細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程と、被検物質の存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した前記細胞における前記グルコース刺激インスリン分泌量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する工程と、を含む方法を提供する。
【０１６４】
上述したＫＩＦ１２ノックアウトマウスの性状から理解されるように、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞における、グルコース刺激インスリン分泌量の低下を抑制する化合物は、糖尿病の治療又は予防剤となり得る。細胞保護タンパク質遺伝子としては、ＫＩＦ１２遺伝子、Ｈｓｃ７０遺伝子等が挙げられる。以下、本スクリーニング方法の各工程について説明する。
【０１６５】
（被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程）
本実施形態における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程は、上述の、ＫＩＦ１２遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、Ｈｓｃ７０の発現量に基づくスクリーニング方法における、被検物質の存在下又は非存在下で細胞を培養する工程と同様である。
【０１６６】
（グルコース刺激インスリン分泌量を定量する工程）
本工程では、上記の細胞のグルコース刺激インスリン分泌量を定量する。本実施形態における、グルコース刺激インスリン分泌量を定量する方法としては、上述した、脂肪酸添加培地で培養したβ細胞を使用した、グルコース刺激インスリン分泌量に基づくスクリーニング方法と同様のものを使用できる。
【０１６７】
（被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する工程）
本工程では、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であるか否かを判定する。より具体的には、被検物質の存在下で培養した上記の細胞における、グルコース刺激インスリン分泌量が、被検物質の非存在下で培養した上記の細胞におけるグルコース刺激インスリン分泌量と比較して多かった場合に、被検物質が糖尿病の治療又は予防剤であると判定する。
【０１６８】
〔糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キット〕
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、ＫＩＦ１２のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キットを提供する。ＫＩＦ１２のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットとしては、例えば、プライマー「ＲＴ−１２Ｆ」（配列番号１０）及びプライマー「ＲＴ−１２Ｒ」（配列番号１１）の組み合わせ等が挙げられる。
【０１６９】
本実施形態に係るキットは、上述した、ＫＩＦ１２のｍＲＮＡレベルでの発現量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１７０】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗ＫＩＦ１２抗体を含む、キットを提供する。抗体は、ＫＩＦ１２の定量に使用できるものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体であってもよい。
【０１７１】
本実施形態に係るキットは、上述した、ＫＩＦ１２のタンパク質レベルでの発現量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１７２】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗ＨＮＦ１α抗体又は抗ＨＮＦ１β抗体と、ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットとを含む、キットを提供する。
【０１７３】
抗体としては、転写因子であるＨＮＦ１α又はＨＮＦ１βの免疫沈降に使用できるものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体であってもよい。
【０１７４】
ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットとしては、例えば、プライマー「ＣｈＩＰ１２ｆ」（配列番号１４）及びプライマー「ＣｈＩＰ１２ｒ」（配列番号１５）の組み合わせ等が挙げられる。
【０１７５】
本実施形態に係るキットは、上述した、ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域へのＨＮＦ１α又はＨＮＦ１βの結合に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１７６】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、ＫＩＦ１２遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キットを提供する。レポーターコンストラクトとしては、ＫＩＦ１２プロモーターの下流に、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子等の酵素をコードする遺伝子や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ＴａｇＲＦＰ遺伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子等を有するものが利用できる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用した場合には、ルシフェラーゼ活性を定量することにより、ＫＩＦ１２の転写活性を定量することができる。例えば、レポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用した場合には、ＧＦＰの蛍光強度を定量することにより、ＫＩＦ１２の転写活性を定量することができる。
【０１７７】
本実施形態に係るキットは、上述した、ＫＩＦ１２遺伝子の転写活性に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１７８】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｈｓｃ７０のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キットを提供する。Ｈｓｃ７０のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットとしては、例えば、プライマー「ＲＴ−７０Ｆ」（配列番号１２）及びプライマー「ＲＴ−７０Ｒ」（配列番号１３）の組み合わせ等が挙げられる。
【０１７９】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｈｓｃ７０のｍＲＮＡレベルでの発現量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１８０】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｈｓｃ７０抗体を含む、キットを提供する。
【０１８１】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｈｓｃ７０のタンパク質レベルでの発現量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１８２】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｓｐ１抗体と、Ｈｓｃ７０遺伝子のプロモーター領域を増幅するためのプライマーセットとを含む、キットを提供する。
【０１８３】
抗体としては、転写因子であるＳｐ１の免疫沈降に使用できるものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。また、ファージ抗体であってもよい。
【０１８４】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｈｓｃ７０遺伝子のプロモーター領域へのＳｐ１の結合に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１８５】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キットを提供する。レポーターコンストラクトとしては、Ｈｓｃ７０プロモーターの下流に、レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子等の酵素をコードする遺伝子や、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ＴａｇＲＦＰ遺伝子等の蛍光タンパク質をコードする遺伝子等を有するものが利用できる。例えば、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用した場合には、ルシフェラーゼ活性を定量することにより、Ｈｓｃ７０の転写活性を定量することができる。例えば、レポーター遺伝子としてＧＦＰ遺伝子を使用した場合には、ＧＦＰの蛍光強度を定量することにより、Ｈｓｃ７０の転写活性を定量することができる。
【０１８６】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１８７】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｐｅｘ５のｍＲＮＡを増幅するためのプライマーセットを含む、キットを提供する。
【０１８８】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｐｅｘ５のｍＲＮＡレベルでの発現量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１８９】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｐｅｘ５抗体を含む、キットを提供する。
【０１９０】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｐｅｘ５のタンパク質レベルでの発現量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１９１】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、抗Ｓｐ１抗体を含む、キットを提供する。
【０１９２】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｓｐ１タンパク質の存在量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１９３】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、Ｓｐ１の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを含む、キットを提供する。レポーターコンストラクトとしては、上述したものを好適に使用できる。
【０１９４】
本実施形態に係るキットは、上述した、Ｓｐ１タンパク質の活性に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１９５】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、細胞中のペルオキシソームの形成量を測定する試薬を含む、キットを提供する。
【０１９６】
本実施形態に係るキットは、上述した、ペルオキシソームの形成量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０１９７】
細胞中のペルオキシソームの形成量を測定する試薬としては、抗ＡＣＡＡ１抗体、抗ＰＨＹＨ抗体、抗ＡＧＰＳ抗体等の、ペルオキシソームへの移行シグナルを有するタンパク質を認識する抗体；ペルオキシソームへの移行シグナル配列を有する、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰ等の蛍光タンパク質；カタラーゼ活性測定試薬、グルタチオンペルオキシダーゼ等の、ペルオキシソームに存在する酵素の活性を測定する試薬等が挙げられる。
【０１９８】
カタラーゼ活性測定試薬としては、例えば、過酸化水素、メタノール及び適切な色原体の組み合わせが挙げられる。色原体としては、例えば、４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾールが挙げられる。これは、過酸化水素の存在下でカタラーゼとメタノールを反応させることにより生じたホルムアルデヒドが、４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−１，２，４−トリアゾールと反応し、５４０ｎｍの吸収を示す化合物を生成する現象を利用するものである。
【０１９９】
カタラーゼ活性測定試薬の別の例としては、例えば、過酸化水素が挙げられる。これは、カタラーゼの基質である過酸化水素が２４０ｎｍの吸収を示し、カタラーゼによる過酸化水素の分解により生じる水及び酸素が２４０ｎｍの吸収を示さないことを利用するものである。
【０２００】
グルタチオンペルオキシダーゼ活性測定試薬としては、例えば、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）が、酸化型（ＮＡＤＰ＋）に酸化されるときに、３４０ｎｍの吸光が減少する現象を利用するものが使用できる。より具体的には、例えば、グルタチオンペルオキシダーゼが触媒する下記式（Ｇ１）の反応と、グルタチオンレダクターゼが触媒する下記式（Ｇ２）の反応とを、（Ｇ１）の反応が律速になる条件下で同時に行わせた場合、３４０ｎｍの吸光の減少速度が、グルタチオンペルオキシダーゼの活性と比例することを利用することができる。
２ＧＳＨ  ＋  Ｈ２Ｏ２  →  ＧＳ−ＳＧ  +２Ｈ２Ｏ  …（Ｇ１）
ＧＳ−ＳＧ  ＋  ＮＡＤＰＨ  ＋  Ｈ＋  →  ２ＧＳＨ  ＋  ＮＡＤＰ＋  …（Ｇ２）
式（Ｇ１）及び（Ｇ２）中、ＧＳＨはグルタチオンの単量体を示し、ＧＳ−ＳＧは酸化されたグルタチオン（グルタチオンジスルフィド）を示す。
【０２０１】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、細胞の酸化ストレスレベルを測定する試薬を含む、キットを提供する。
【０２０２】
本実施形態に係るキットは、上述した、酸化ストレスレベルに基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０２０３】
細胞の酸化ストレスレベルを測定する試薬としては、例えば、上述した、過酸化水素を特異的に検出する蛍光タンパク質センサーであるＨｙＰｅｒ（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）が挙げられる。ＨｙＰｅｒは、発現ベクターの形態で提供されてもよいし、ＨｙＰｅｒ遺伝子が導入された培養細胞の形態で提供されてもよい。
【０２０４】
細胞の酸化ストレスレベルを測定する試薬の別の例としては、例えば、活性酸素の細胞浸透性指示薬として知られる、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、アミノフェニルフルオレセイン、ヒドロキシフェニルフルオレセイン、カルセイン（いずれもインビトロジェン社）等が挙げられる。
【０２０５】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、脂肪酸及び抗インスリン抗体を含む、キットを提供する。脂肪酸としては、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸等が挙げられる。抗インスリン抗体は、例えばＥＬＩＳＡ法によるインスリンの定量に用いることができる。
【０２０６】
本実施形態に係るキットは、上述した、グルコース刺激インスリン分泌量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【０２０７】
１実施形態において、本発明は、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング用キットであって、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞及び抗インスリン抗体を含む、キットを提供する。細胞保護タンパク質遺伝子としては、ＫＩＦ１２遺伝子、Ｈｓｃ７０遺伝子等が挙げられる。細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓β細胞は、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊された膵臓ランゲルハンス島であってもよい。膵臓β細胞又は膵臓ランゲルハンス島は、凍結保存されていてもよい。
【０２０８】
本実施形態に係るキットは、上述した、細胞保護タンパク質遺伝子が破壊されたβ細胞を利用した、グルコース刺激インスリン分泌量に基づく、糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニングに好適である。
【実施例】
【０２０９】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【０２１０】
［ＫＩＦ１２のｃＤＮＡのクローニング及び塩基配列解析］
発明者らは、４週齢のＩＣＲマウスの腎臓からＫＩＦ１２のｃＤＮＡの全長をクローニングし、塩基配列を解析した。ＫＩＦ１２のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示し、ＫＩＦ１２のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＫＩＦ１２は、６４８アミノ酸からなるタンパク質であり、Ｎ末端領域に高度に保存されたキネシンモータードメインを有し、中央部分にコイルドコイル構造を有し、Ｃ末端領域にプロリンリッチドメインを有していた。
【０２１１】
［抗ＫＩＦ１２抗体の作製及びＫＩＦ１２の発現解析］
発明者らは、ＫＩＦ１２のアミノ酸配列に基づいて、抗ＫＩＦ１２ポリクローナル抗体を作製した。具体的には、まず、合成ペプチド「１２ＰＲ」（配列番号３）及び「１２Ｔ」（配列番号４）を合成した。続いて、これらの合成ペプチドでウサギを免疫した。続いて、上記合成ペプチドを用いたアフィニティー精製により、ウサギ血清から抗体を精製した。
【０２１２】
β細胞株ＭＩＮ６及び成体マウス組織（膵臓ランゲルハンス島（膵島）、脳、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓、脂肪、筋）におけるＫＩＦ１２の発現（組織分布）を、イムノブロッティングにより検討した。図１に結果を示す。その結果、膵臓ランゲルハンス島、腎臓及びＭＩＮ６細胞株においてＫＩＦ１２の発現が認められた。
【０２１３】
［ＫＩＦ１２ノックアウトマウスの作製］
続いて、発明者らは、ＫＩＦ１２遺伝子座の第２〜１１エクソンをポジティブ選択カセットに置き換えることにより、ＫＩＦ１２遺伝子を破壊したノックアウトマウスを作製した。図２（Ａ）は、野生型のＫＩＦ１２遺伝子座、ターゲッティングベクター及びターゲッティングベクターで置き換えられたＫＩＦ１２遺伝子座の構造を示す図である。
【０２１４】
ターゲッティングベクターは、ＥＳ細胞株である１２９ＳｖＥｖＢｒｄ（Ｔｅｘａｓ  Ａ＆Ｍ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）に導入した。図２（Ａ）に示す「Ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｂｅ」及び「Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｂｅ」を使用したサザンブロッティングにより、相同組換えを起こしたＥＳ細胞クローンを選択した。図２（Ｂ）及び（Ｃ）はサザンブロッティングの結果を示す写真である。選択したＥＳ細胞をマウス胚の胚盤胞に移植し、生殖系列細胞に導入し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスへの戻し交配により維持した。
【０２１５】
マウスの遺伝子型は尾のＤＮＡのＰＣＲ増幅により決定した。より具体的には、プライマー「１２ｆ」（配列番号５、図２（Ａ））及び「１２ｒ」（配列番号６、図２（Ａ））を用いたＰＣＲ増幅、並びにプライマー「ｎｅｏＦ」（配列番号７、図２（Ａ））及び「ｎｅｏＲ」（配列番号８、図２（Ａ））を用いたＰＣＲ増幅により、マウスの遺伝子型を決定した。図２（Ｄ）は、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス、野生型及びヘテロ接合体について、上記のＰＣＲ増幅を行った結果を示す写真である。
【０２１６】
図２（Ｅ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）の膵臓ランゲルハンス島におけるＫＩＦ１２タンパク質を検出するイムノブロッティングの結果を示す写真である。
【０２１７】
ＫＩＦ１２ノックアウトマウスは、生存可能であり、繁殖可能であった。
【０２１８】
［ＫＩＦ１２ノックアウトマウスにおける糖代謝異常］
３月齢の野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）を用いて、腹腔内グルコース寛容性試験（ＩＰＧＴＴ、Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔｅｓｔ）を行った。具体的には、マウスを一晩（１５時間）絶食させた後、マウスの腹腔内にグルコースを２ｇ／ｋｇ体重投与し、メディセーフ血糖測定器（商品名、テルモ社）を使用して２時間にわたり血糖を測定した。図３（Ａ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）における血糖値の変化を示すグラフである（ｎ＝５）。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。ＫＩＦ１２ノックアウトマウスは、有意なグルコース不寛容性を示した。
【０２１９】
野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）を用いて、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ、Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）量を測定した。膵臓ランゲルハンス島を、２ｍＭグルコースを添加したクレブス・リンガー重炭酸液１ｍＬ中において、３７℃で３０分間プレインキュベートした。続いて、３つの同等の大きさの膵臓ランゲルハンス島を、２ｍＭ又は２０ｍＭのグルコースを添加した１ｍＬのクレブス・リンガー重炭酸液に３７℃で３０分間暴露した。続いて、培養上清中のインスリン含有量、及び、酸−エタノールによる膵臓ランゲルハンス島抽出物中のインスリン含有量を、それぞれ、マウス  インスリンＥＬＩＳＡキット（シバヤギ社）で定量し、分泌されたインスリンの割合を計算した。図３（Ｂ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のグルコース刺激インスリン分泌量の結果を示すグラフである（ｎ＝６）。「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）には、インスリン分泌の障害があると考えられた。
【０２２０】
図１の結果から、肝臓、脂肪、及び筋におけるＫＩＦ１２の発現は検出限界以下であったため、上記のグルコース不寛容性は、グルコース刺激による膵臓ランゲルハンス島からのインスリン分泌の障害によるものと考えられた。
【０２２１】
［ＫＩＦ１２ノックアウトマウスのβ細胞におけるペルオキシソームの形成異常］
発明者らは、ＫＩＦ１２ノックアウトマウスのβ細胞において、ペルオキシソームの形成異常が認められることを見出した。
【０２２２】
まず、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ｍｉＲ  ＲＮＡｉ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｋｉｔ（商品名、インビトロジェン社）を使用して、ＫＩＦ１２の塩基配列の一部（ＡＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴ）（配列番号９）を標的としたＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）ベクター「ｍｉＲ１２」を作製した。また、ネガティブコントロールとして、上記のキットに含まれていたスクランブル配列を使用してベクター「ｍｉＲｓｃ」を作製した。
【０２２３】
また、ペルオキシソームへの移行シグナルの１種であるＰＴＳ１のアミノ酸配列（セリン−リジン−ロイシン）をＣ末端に有する蛍光タンパク質である、ＥＣＦＰ−ＰＴＳ１の発現ベクターを、β細胞株ＭＩＮ６に導入した。
【０２２４】
続いて、ＥＣＦＰ−ＰＴＳ１を導入したＭＩＮ６細胞株に、上記のｍｉＲ１２ベクター（ＫＤ）（ｎ＝１２）及びｍｉＲｓｃベクター（ＳＣ）（ｎ＝９）を導入し、蛍光顕微鏡でＥＣＦＰの蛍光を観察した。ｍｉＲ１２ベクター及びｍｉＲｓｃベクターの細胞への導入には、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、インビトロジェン社）を使用した。より具体的には、上記キットを使用して、ｍｉＲ１２ベクター及びｍｉＲｓｃベクターをもとに、複製能を欠失したアデノウイルスベクターをそれぞれ作製し、これらのアデノウイルスベクターを細胞に感染させた。図４（Ａ）は、ＫＩＦ１２をノックダウンしたＭＩＮ６細胞（ＫＤ）及びネガティブコントロール（ＳＣ）の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真並びにＥＣＦＰ−ＰＴＳ１の蛍光強度を示すグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、ＫＩＦ１２をノックダウンしたＭＩＮ６細胞では、ＥＣＦＰ−ＰＴＳ１を取り込んだペルオキシソームが有意に減少したことが示された。
【０２２５】
次に、ペルオキシソームへの移行シグナルの１種であるＰＴＳ２を有するタンパク質として知られるＡＣＡＡ１を対象として、同様の検討を行った。具体的には、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞を、蛍光標識した抗ＡＣＡＡ１抗体（東洋紡社）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した（ｎ＝５〜７）。図４（Ｂ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真並びに抗ＡＣＡＡ１抗体の蛍光強度を示すグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）では、ＡＣＡＡ１を取り込んだペルオキシソームが有意に減少したことが示された。
【０２２６】
以上の結果から、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）では、ＰＴＳ１シグナルを有するタンパク質、ＰＴＳ２シグナルを有するタンパク質のいずれについても、ペルオキシソームへの取り込みが減少していることが示された。
【０２２７】
続いて、ペルオキシソームに存在する主要な酵素であるカタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を検討した。カタラーゼ活性は次のようにして行った。まず、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）の膵臓ランゲルハンス島５０個ずつを３０μＬの氷冷した緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中で溶解させ、４℃、１００００×ｇで１５分間遠心した。続いて、上清１０μＬ中のカタラーゼ活性を、カタラーゼアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ社）を使用して測定した。酵素活性は、遠心上清５μＬを用いてＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて測定したタンパク質濃度により規準化した。
【０２２８】
図４（Ｃ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のランゲルハンス島におけるカタラーゼ活性を示すグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。この結果から、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のペルオキシソームでは、カタラーゼを含む主要な抗酸化酵素が顕著に障害を受けていることが示された。
【０２２９】
次に、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の活性を検討した。野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）の膵臓ランゲルハンス島５０個ずつを３０μＬの氷冷した緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）中で溶解させ、４℃、１００００×ｇで１５分間遠心した。上清１０μＬ中のグルタチオンペルオキシダーゼ活性を、グルタチオンペルオキシダーゼキット（Ｃａｙｍａｎ社）を使用して測定した。酵素活性は、遠心上清５μＬを用いてＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて測定したタンパク質濃度により規準化した。
【０２３０】
図４（Ｄ）は、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のランゲルハンス島におけるＧＰｘ活性を示すグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のペルオキシソームでは、ＧＰｘの活性も低下していることが明らかとなった。ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のランゲルハンス島における酵素活性の障害の程度は、カタラーゼのほうが、ＧＰｘよりも顕著であった。
【０２３１】
［ＫＩＦ１２ノックアウトマウスのβ細胞における酸化ストレス上昇］
続いて、発明者らは、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞における酸化ストレスを測定した。具体的には、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞に、過酸化水素濃度に応じた強度で蛍光を発する蛍光タンパク質センサーである、ＨｙＰｅｒをコードする、ｐＨｙＰｅｒ−Ｃｙｔｏベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）を導入した。遺伝子導入から２４時間後に各β細胞を蛍光顕微鏡で観察し、過酸化水素濃度を測定した。
【０２３２】
図４（Ｅ）は、蛍光顕微鏡で観察した結果をもとに、過酸化水素濃度を疑似カラーで示した写真及びグラフである。「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。この結果から、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞では、酸化ストレスが上昇していることが示された。
【０２３３】
［ＫＩＦ１２ノックアウトマウスのβ細胞におけるＨｓｃ７０の減少］
発明者らは、上述のペルオキシソームの形成異常がＨｓｃ７０の発現量の減少に起因している可能性を考え、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞におけるＨｓｃ７０のタンパクレベルでの発現量を検討した。
【０２３４】
具体的には、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞を、抗Ｈｓｃ７０抗体（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で染色して蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を測定した。図５は、抗Ｈｓｃ７０抗体で染色した、野生型マウス（ＷＴ、図５（Ａ））及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ、図５（Ｂ））のβ細胞の蛍光顕微鏡写真並びに抗Ｈｓｃ７０抗体の蛍光強度を示すグラフ（図５（Ｃ））である。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）では、Ｈｓｃ７０タンパクの発現量が有意に減少したことが示された。
【０２３５】
［ＫＩＦ１２ノックアウトマウスのβ細胞におけるＨｓｃ７０の減少（２）］
続いて、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞におけるＨｓｃ７０の転写レベルでの発現量（転写活性）を、Ｈｓｃ７０プロモーターレポーターアッセイより検討した。
【０２３６】
具体的には、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞に、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性を定量するためのレポーターコンストラクトを遺伝子導入した。図６（Ａ）は、レポーターコンストラクトの構造を示す図である。レポーターコンストラクトは、Ｈｓｃ７０プロモーターの下流に蛍光タンパク質であるＴａｇＲＦＰをコードする遺伝子が連結された構造を有していた。このレポーターコンストラクトからは、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性に対応した量のＴａｇＲＦＰタンパク質と、コンストラクトの発現量に応じたＥＧＦＰタンパク質が発現される。Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性は、ＴａｇＲＦＰの蛍光強度をＥＧＦＰの蛍光強度で正規化して定量することにより定量することができる。
【０２３７】
図６（Ｂ）及び（Ｃ）は、Ｈｓｃ７０プロモーターレポーターアッセイにおいて、ＴａｇＲＦＰとＥＧＦＰの蛍光強度比を蛍光顕微鏡で検出した結果を示す写真である。図６（Ｄ）は、顕微鏡観察の結果を数値化したグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞では、野生型マウス（ＷＴ）のβ細胞と比較して、Ｈｓｃ７０遺伝子の転写活性が低下していることが示された。
【０２３８】
［ＫＩＦ１２ノックアウトマウスのβ細胞におけるＰｅｘ５の減少］
発明者らは、上述のペルオキシソームの形成異常がＰｅｘ５の発現量の減少に起因している可能性を考え、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞におけるＰｅｘ５の発現量を検討した。
【０２３９】
具体的には、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞を、抗Ｐｅｘ５抗体で染色して蛍光顕微鏡で観察し、蛍光強度を測定した。その結果、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）では、Ｐｅｘ５タンパクの発現量が有意に減少したことが示された。
【０２４０】
［ＫＩＦ１２遺伝子をノックダウンしたβ細胞におけるＳｐ１タンパク質の存在量の減少］
続いて、発明者らは、Ｈｓｃ７０遺伝子の発現を増強することが知られている転写因子であるＳｐ１、ＮＦ−ＹＡ及びＫＬＦ４の発現量を測定した。
【０２４１】
具体的には、上述したｍｉＲ１２ベクター（ＫＤ）を導入して、ＫＩＦ１２をノックダウンしたＭＩＮ６細胞（ＫＤ）において、イムノブロッティングによりＳｐ１、ＮＦ−ＹＡ及びＫＬＦ４の発現量を測定した。ネガティブコントロールには、上述したｍｉＲｓｃベクター（ＳＣ）を導入したＭＩＮ６細胞株を使用した。図７（Ａ）は、イムノブロッティングの結果を示す写真であり、図７（Ｂ）は、測定された各転写因子のタンパク量を示すグラフである。タンパク量は、ネガティブコントロールにおいて測定された各転写因子のタンパク量を１００％とした割合（％）で示した。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。「ＮＳ」は５％超の安全率で有意差がないことを示す。
【０２４２】
その結果、ＫＩＦ１２をノックダウンしたＭＩＮ６細胞（ＫＤ）において、ネガティブコントロール（ＳＣ）と比較して、Ｓｐ１タンパク質の存在量の減少が認められた。ＮＦ−ＹＡ及びＫＬＦ４のタンパク質の存在量には変化が認められなかった。
【０２４３】
［ＫＩＦ１２はＳｐ１に結合する細胞保護タンパク質である］
（Ｓｐ１タンパク質の分解速度の検討）
ＫＩＦ１２をノックダウンしたＭＩＮ６細胞（ＫＤ）をタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）で処理し、Ｓｐ１タンパク質の分解速度を検討した。ネガティブコントロールには、上述したｍｉＲｓｃベクター（ＳＣ）を導入したＭＩＮ６細胞株を使用した。
【０２４４】
図８（Ａ）はイムノブロッティングによりＳｐ１タンパク質の存在量を測定した写真である。図８（Ｂ）及び（Ｃ）は、図８（Ａ）に基づいてＳｐ１（１０５ｋＤ）の存在量（図８（Ｂ））及びＳｐ１（９５ｋＤ）の存在量（図８（Ｃ））を数値化したグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。
【０２４５】
その結果、ＫＩＦ１２をノックダウンしたＭＩＮ６細胞では、Ｓｐ１タンパク質の分解速度が有意に速いことが示された。この結果は、ＫＩＦ１２がＳｐ１タンパク質の安定化に関わっていることを示唆する。
【０２４６】
（ＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ顕微鏡による検討）
続いて、超解像度顕微鏡の１種であるＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ顕微鏡を使用して、Ｓｐ１、ＫＩＦ１２、α−チューブリンの局在を検討した。結果を図９（Ａ）〜（Ｅ）に示す。その結果、微小管が繊維状の構造として可視化された（図９（Ｅ））。また、Ｓｐ１（図９（Ｃ））及びＫＩＦ１２（図９（Ｄ））が、共局在している様子も観察された（図９（Ａ）及び（Ｂ））。この結果は、新生の（新たに発現した）Ｓｐ１が微小管上でＫＩＦ１２と結合し安定化されることを示唆した。更に、ＫＩＦ１２−Ｓｐ１−Ｈｓｃ７０が共局在している様子も観察された（図９（Ｆ）〜（Ｊ））。このＳｐ１−Ｈｓｃ７０の共局在について、野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）由来のβ細胞を用いて検討して比較した（図９（Ｋ）〜（Ｏ））。野生型マウス（ＷＴ）及びＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）それぞれについて、Ｓｐ１全体に対する、Ｈｓｃ７０と共局在したＳｐ１の割合を計測してグラフ化した（図９（Ｐ））。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）では、Ｈｓｃ７０と共局在したＳｐ１の割合が野生型マウス（ＷＴ）の約半分に減少していることが示された。この結果は、ＫＩＦ１２が、Ｓｐ１およびＨｓｃ７０に結合する細胞保護タンパク質として機能することにより、Ｓｐ１−Ｈｓｃ７０の相互作用を増強し、Ｓｐ１の発現ならびにその活性を安定化させていることを示唆した。
【０２４７】
以上の結果は、ＫＩＦ１２がＳｐ１によるＨｓｃ７０の転写を促進し、β細胞を保護するＨｓｃ７０の抗酸化作用を増強することを示す。
【０２４８】
次に、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）由来のβ細胞にモータードメインを欠失したＫＩＦ１２を発現させた細胞、及び、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）由来のβ細胞にモータードメインを含む全長のＫＩＦ１２を発現させた細胞を作製した。続いて、ＰＡＬＭ／ＳＴＯＲＭ顕微鏡を使用し、上述した方法と同様にして、これらの細胞におけるＳｐ１、ＫＩＦ１２、α−チューブリンの局在を検討した。
【０２４９】
その結果、全長のＫＩＦ１２を発現させた細胞では、Ｓｐ１全体に対する、Ｈｓｃ７０と共局在したＳｐ１の割合が野生型マウスと同等レベルに回復したのに対し、モータードメインを欠失したＫＩＦ１２を発現させた細胞では、Ｈｓｃ７０と共局在したＳｐ１の割合の回復は認められなかった。
【０２５０】
この結果は、Ｓｐ１−Ｈｓｃ７０の共局在には、ＫＩＦ１２のモータードメインの存在が必要であることを示す。
【０２５１】
［β細胞の脂肪酸処理はＫＩＦ１２の転写を抑制する］
脂肪酸処理がＫＩＦ１２及びＨｓｃ７０の転写に及ぼす影響をインビボ及びインビトロで検討した。
【０２５２】
（インビボでの検討）
野生型マウスに高脂肪食を与えた。具体的には、同腹仔のマウスを２群に分け、一方に通常食（ＣＥ−２、日本クレア社）を、他方に高脂肪食（ＨＦＤ３２、日本クレア社）を与え、２週間後に実験に用いた。
【０２５３】
上記マウスの膵臓ランゲルハンス島におけるＫＩＦ１２及びＨｓｃ７０のｍＲＮＡの存在量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＫＩＦ１２遺伝子を増幅するＰＣＲプライマーとして、ＲＴ−１２Ｆ（配列番号１０）及びＲＴ−１２Ｒ（配列番号１１）を使用した。また、Ｈｓｃ７０遺伝子を増幅するＰＣＲプライマーとして、ＲＴ−７０Ｆ（配列番号１２）及びＲＴ−７０Ｒ（配列番号１３）を使用した。
【０２５４】
結果を図１０（Ａ）に示す（ｎ＝３）。「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、高脂肪食を与えたマウスのβ細胞ではＫＩＦ１２及びＨｓｃ７０のｍＲＮＡの転写が減少していることが示された。
【０２５５】
（インビトロでの検討）
脂肪酸処理を行ったＭＩＮ６細胞（ＦＡ）及び脂肪酸処理を行っていないＭＩＮ６細胞（Ｍｏｃｋ）を使用して、ＫＩＦ１２及びＨｓｃ７０のｍＲＮＡの存在量を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定した。また、ＫＩＦ１２、Ｓｐ１、Ｈｓｃ７０及びα−チューブリンのタンパク質レベルでの存在量をイムノブロッティングにより測定した。
【０２５６】
脂肪酸処理は、培地に０．５ｍＭパルミチン酸を添加して４８時間培養することにより行った。ＰＣＲのプライマーは、上記のインビボでの検討と同様である。
【０２５７】
定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を図１０（Ｂ）に示す（ＫＩＦ：ｎ＝３、Ｈｓｃ７０：ｎ＝６）。その結果、脂肪酸処理したＭＩＮ６細胞では、ＫＩＦ１２及びＨｓｃ７０のｍＲＮＡの転写が減少していることが示された。
【０２５８】
図１０（Ｃ）は、イムノブロッティングの結果を示す写真であり、図１０（Ｄ）は図１０（Ｃ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝３）。その結果、脂肪酸処理したＭＩＮ６細胞では、ＫＩＦ１２、Ｓｐ１及びＨｓｃ７０のタンパク質レベルでの存在量が減少していることが示された。
【０２５９】
続いて、ＫＩＦ１２遺伝子の発現を制御している可能性が考えられる転写因子である、ＨＮＦ１αと、ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域との結合を、クロマチン免疫沈降法により検討した。具体的には、脂肪酸処理を行ったＭＩＮ６細胞及び脂肪酸処理を行っていないＭＩＮ６細胞について、抗ＨＮＦ１α抗体を用いたクロマチン免疫沈降により、ＨＮＦ１αが結合したＤＮＡ断片を回収した。回収されたＤＮＡ断片中のＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域のＤＮＡ断片を定量的ＰＣＲにより定量した。
【０２６０】
図１１は、ＨＮＦ１αとＫＩＦ１２遺伝子プロモーター領域との結合をクロマチン免疫沈降法により検討した結果を示すグラフである。グラフの縦軸は、反応系内の全ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域断片を基準とした、クロマチン免疫沈降により回収されたＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域断片の割合（％）を示す。「ＮＧＧ」は陰性対照として正常ヤギＩｇＧを使用して免疫沈降を行ったことを示す。「ＨＮＦ１α」は、抗ＨＮＦ１α抗体を用いて免疫沈降を行ったことを示す。「ＦＡ」は脂肪酸処理を行ったＭＩＮ６細胞の結果を示し、「Ｍｏｃｋ」は脂肪酸処理を行っていないＭＩＮ６細胞の結果を示す。その結果、ＨＮＦ１αと、ＫＩＦ１２遺伝子のプロモーター領域との結合が、ＭＩＮ６細胞の脂肪酸処理により有意に減少することが明らかとなった。
【０２６１】
［脂肪酸による酸化ストレスはＫＩＦ１２、Ｈｓｃ７０高発現で拮抗される］
脂肪酸処理を行ったＭＩＮ６細胞及び脂肪酸処理を行っていないＭＩＮ６細胞の酸化ストレスレベルを測定した。具体的には、上述したｐＨｙＰｅｒ−Ｃｙｔｏベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）を導入したＭＩＮ６細胞を２群に分け、一方を脂肪酸処理（ＦＡ）し、他方を通常の培地で培養（Ｃａｒｒｉｅｒ）した。これらの細胞を蛍光顕微鏡で観察し、過酸化水素濃度を測定した。図１２（Ａ）は、測定結果をもとに、過酸化水素濃度を疑似カラーで示した写真及びグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。この結果から、脂肪酸処理を行うとβ細胞における酸化ストレスが上昇することが示された。
【０２６２】
続いて、ＭＩＮ６細胞と、ＫＩＦ１２を高発現させたＭＩＮ６細胞を脂肪酸処理し、ペルオキシソームの形成量を測定した。具体的には、上記のＭＩＮ６細胞を、蛍光標識した抗ＡＣＡＡ１抗体（東洋紡社）で染色し、蛍光顕微鏡で観察した（ｎ＝１０）。
【０２６３】
図１２（Ｂ）は、脂肪酸処理していないＭＩＮ６細胞（Ｍｏｃｋ）、脂肪酸処理したＭＩＮ６細胞（ＦＡ）及びＫＩＦ１２を高発現させたＭＩＮ６細胞を脂肪酸処理したもの（ＦＡ＋ＫＩＦ１２）の蛍光顕微鏡写真及びその結果を数値化したグラフである。「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。ＡＣＡＡ１抗体の蛍光強度が高いことは、ペルオキシソームの形成量が多いことを示す。この結果から、脂肪酸処理による酸化ストレスの上昇はＫＩＦ１２の高発現により拮抗されることが示された。
【０２６４】
続いて、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞にＨｓｃ７０を高発現させ、ペルオキシソームの形成を観察した。ネガティブコントロールには、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞にコントロールベクターを導入した細胞を使用した。ペルオキシソームの形成量は、上記のＭＩＮ６細胞を、蛍光標識した抗ＡＣＡＡ１抗体（東洋紡社）で染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより測定した（ｎ＝１０）。
【０２６５】
図１２（Ｃ）は、ネガティブコントロールのβ細胞（ｍｏｃｋ）及びＨｓｃ７０を高発現させたＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞の蛍光顕微鏡写真及びその結果を数値化したグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。ＡＣＡＡ１抗体の蛍光強度が高いことは、ペルオキシソームの形成量が多いことを示す。この結果から、ＫＩＦ１２の欠失は、Ｈｓｃ７０の高発現により拮抗されることが示された。
【０２６６】
［脂肪酸処理又はＫＩＦ１２欠失細胞の酸化ストレスはシャペロン誘導薬テプレノンにより抑制される］
ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞の酸化ストレスレベルに対するテプレノンの影響を検討した。テプレノンとしては、消化性潰瘍や胃炎の治療・予防剤として市販されているもの（５Ｅ，９Ｅ，１３Ｅゲラニルゲラニルアセトンと５Ｚ，９Ｅ，１３Ｅゲラニルゲラニルアセトンとを、重量比３：２で含む混合物）を使用した。具体的には、上述したｐＨｙＰｅｒ−Ｃｙｔｏベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）を導入したＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞を２０μＭのテプレノンで２４時間処理後（Ｔｅｐ）、蛍光顕微鏡で観察し、過酸化水素濃度を測定した。ネガティブコントロールにはテプレノンで処理していない（Ｃａｒｒｉｅｒ）β細胞を使用した。
【０２６７】
図１３（Ａ）は、測定結果をもとに、過酸化水素濃度を疑似カラーで示した写真及びグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。この結果から、テプレノンを投与することにより、ＫＩＦ１２ノックアウトマウス（ＫＯ）のβ細胞における酸化ストレスの上昇を低減できることが示された。
【０２６８】
続いて、脂肪酸処理を行ったＭＩＮ６細胞の酸化ストレスレベルに対するテプレノンの影響を検討した。具体的には、上述したｐＨｙＰｅｒ−Ｃｙｔｏベクター（Ｅｖｒｏｇｅｎ社）を導入したＭＩＮ６細胞を２群に分けた。一方については、培地に０．５ｍＭパルミチン酸を添加して２４時間培養後、２０μＭのテプレノンを培地に添加し、更に２４時間培養した（ＦＡ＋Ｔｅｐ）。他方については、培地にテプレノンを添加しない点以外は上記と同様の操作を行った（ＦＡ）。続いて、蛍光顕微鏡で観察し、過酸化水素濃度を測定した。
【０２６９】
図１３（Ｂ）は、測定結果をもとに、過酸化水素濃度を疑似カラーで示した写真及びグラフである。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。この結果から、テプレノンを投与することにより、脂肪酸処理によるβ細胞の酸化ストレスの上昇を低減できることが示された。
【０２７０】
［テプレノンの投与は、個体レベルでもＫＩＦ１２ノックアウトマウスの糖代謝異常を正常化する］
ＫＩＦ１２ノックアウトマウスに、２００ｍｇ／ｋｇのテプレノンを、１日１回、２週間、腹腔内投与した（ＫＯ＋Ｔｅｐ）。ネガティブコントロールには、テプレノンを投与していないＫＩＦ１２ノックアウトマウスを使用した（ＫＯ）。
【０２７１】
その結果、β細胞の過酸化水素濃度は、テプレノン非投与群の約６０％に減少した。また、上述した方法と同様にして、グルコース刺激インスリン分泌量を測定した。図１４（Ａ）に結果を示す。「＊」は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、テプレノン投与群のグルコース刺激インスリン分泌量はテプレノン非投与群の約２倍に改善した。
【０２７２】
また、上述した方法と同様にして、腹腔内グルコース寛容性試験を行った。図１４（Ｂ）に結果を示す。「＊＊」は、１％未満の危険率で有意差があることを示す。その結果、テプレノン投与群（ＫＯ＋Ｔｅｐ）は、テプレノン非投与群（ＫＯ）と比較して、グルコース寛容性の顕著な改善を示した。
【０２７３】
以上の結果は、ＫＩＦ１２遺伝子破壊動物へのテプレノンの投与は、インビボ及びインビトロレベルで糖尿病様症状を大きく改善することを示す。
【０２７４】
図１５に、発明者らが明らかにしたβ細胞脂肪毒性の分子機構を示す。
【産業上の利用可能性】
【０２７５】
本発明によれば、新たに解明したβ細胞脂肪毒性の分子機構に基づいた、新たな糖尿病の治療又は予防剤を提供することができる。また、新たな糖尿病モデル非ヒト動物を提供することができる。さらに、新たな糖尿病の治療又は予防剤のスクリーニング方法及びスクリーニング用キットを提供することができる。
【図３】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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