(57)【要約】      （修正有）【課題】凹凸構造への対象物質の吸着状態に関する詳細な情報を得られるバイオセンサチップの評価方法および評価装置を提供する【解決手段】評価方法は、第１画像を生成する工程Ｓ１１０、第２画像を生成する工程Ｓ１２０、および吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０を備える。第１画像を生成する工程Ｓ１１０では、バイオセンサチップに第１のレーザー光および第２のレーザー光を同時に照射し、反射光を共焦点顕微鏡で観察することにより、三次元の第１画像を生成する。第２画像を生成する工程Ｓ１２０では、バイオセンサチップに第１のレーザー光を照射し、共焦点顕微鏡で観察することにより、第１の蛍光の情報を示す三次元の第２画像を生成する。吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０では、第１画像と第２画像とを用いて、吸着基材に対する対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサチップの吸着基材に対する対象物質の吸着状態を評価する評価方法であって、
前記吸着基材は表面に周期的な凹凸構造を有し、
前記対象物質は、第１の蛍光を発生し、
前記バイオセンサチップに第１のレーザー光および第２のレーザー光を同時に照射し、反射光を共焦点顕微鏡で観察することにより、三次元の第１画像を生成する第１ステップと、
前記バイオセンサチップに前記第１のレーザー光を照射し、前記共焦点顕微鏡で観察することにより、前記第１の蛍光の情報を示す三次元の第２画像を生成する第２ステップと、
前記第１画像と前記第２画像とを用いて、前記吸着基材に対する前記対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する第３ステップと、
を備え、
前記第１のレーザー光は前記第１の蛍光を発生させるための光であり、
前記第１のレーザー光と前記第２のレーザー光とはピーク波長が異なる評価方法。
【請求項２】
請求項１に記載の評価方法において、
前記第３ステップにおいて、前記第１画像と前記第２画像とを重ねることにより、前記吸着状態情報として、前記吸着基材に対する前記対象物質の位置を示す三次元の第３画像を生成する評価方法。
【請求項３】
請求項２に記載の評価方法において、
前記第３ステップにおいて、
前記第３画像を用いて二次元の第４画像をさらに生成し、
前記第４画像は、前記バイオセンサチップの断面画像、またはいずれかの方向から前記バイオセンサチップを見た画像である評価方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項に記載の評価方法において、
前記第２ステップと前記第３ステップとの間に、前記第２画像における前記第１の蛍光の位置に基づいて、前記対象物質の存在する位置を示す位置情報を生成する第４ステップをさらに含み、
前記第３ステップにおいて、
前記第１画像から前記吸着基材の表面積を算出し、
前記位置情報を用いて、前記吸着基材への前記対象物質の吸着面積を算出し、
前記表面積および前記吸着面積に基づいて、前記吸着状態情報として、前記吸着基材の前記対象物質による表面被覆率を生成する評価方法。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の評価方法において、
前記第１ステップおよび前記第２ステップのいずれよりも前に、
前記吸着基材に、前記対象物質を含む測定対象液体を接触させ始める第５ステップをさらに含み、
前記第２ステップおよび前記第３ステップを繰り返し行って、前記吸着状態情報の経時情報を生成する評価方法。
【請求項６】
請求項５に記載の評価方法において、
前記第１ステップおよび前記第２ステップの後、前記第３ステップの前に、
前記第１画像および前記第２画像を用いて、前記吸着基材に接していない前記対象物質に関わる情報を前記第２画像から取り除く第６ステップをさらに含む評価方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の評価方法において、
前記第３ステップで生成した前記吸着状態情報と、正常に吸着が生じた場合の前記対象物質の前記吸着基材への吸着状態を示す正常吸着状態情報とを比較し、正常に吸着が生じたか否かを判定する第７ステップをさらに含む評価方法。
【請求項８】
バイオセンサチップの吸着基材に対する対象物質の吸着状態を、共焦点顕微鏡の画像生成部が生成した画像を用いて評価する評価装置であって、
前記対象物質は、第１の蛍光を発生し、
前記共焦点顕微鏡は、前記バイオセンサチップに第１のレーザー光および第２のレーザー光を同時に照射して反射させたときの前記バイオセンサチップの画像である第１画像と、前記対象物質が前記第１の蛍光を発生したときの前記第１の蛍光の情報を示す前記バイオセンサチップの画像である第２画像とを生成し、
前記第１画像と前記第２画像とを用いて、前記吸着基材に対する前記対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する処理部を備え、
前記第１のレーザー光は前記第１の蛍光を発生させるための光であり、
前記第１のレーザー光と前記第２のレーザー光とはピーク波長が異なる、評価装置。
【請求項９】
請求項８に記載の評価装置において、
前記共焦点顕微鏡は、前記第１のレーザー光および前記第２のレーザー光を生成する光源を備え、
前記共焦点顕微鏡を制御する制御部を備え、
前記制御部は、前記光源及び前記画像生成部を制御することにより、前記第１画像及び前記第２画像を生成する評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオセンサチップの評価方法および評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
微細凹凸構造を形成したバイオセンサにおいて、その感度はチップ間でのばらつきが大きかった。特許文献１には、表面に凹部を有するバイオチップに、ＤＮＡが固定化されていることを確認するため蛍光顕微鏡を用いることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−２７４３６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者が鋭意検討したところ、表面に凹凸構造を有するバイオチップにおいて、蛍光顕微鏡を用いた観察により、所望の吸着が得られていない場合があることが分かったが、蛍光顕微鏡では平面視での観察に限られ、その原因の究明が困難であった。
【０００５】
本発明は凹凸構造への対象物質の吸着状態に関する詳細な情報を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、
バイオセンサチップの吸着基材に対する対象物質の吸着状態を評価する評価方法であって、
前記吸着基材は表面に周期的な凹凸構造を有し、
前記対象物質は、第１の蛍光を発生し、
前記バイオセンサチップに第１のレーザー光および第２のレーザー光を同時に照射し、反射光を共焦点顕微鏡で観察することにより、三次元の第１画像を生成する第１ステップと、
前記バイオセンサチップに前記第１のレーザー光を照射し、前記共焦点顕微鏡で観察することにより、前記第１の蛍光の情報を示す三次元の第２画像を生成する第２ステップと、
前記第１画像と前記第２画像とを用いて、前記吸着基材に対する前記対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する第３ステップと、
を備え、
前記第１のレーザー光は前記第１の蛍光を発生させるための光であり、
前記第１のレーザー光と前記第２のレーザー光とはピーク波長が異なる評価方法
が提供される。
【０００７】
本発明によれば、
バイオセンサチップの吸着基材に対する対象物質の吸着状態を、共焦点顕微鏡の画像生成部が生成した画像を用いて評価する評価装置であって、
前記対象物質は、第１の蛍光を発生し、
前記共焦点顕微鏡は、前記バイオセンサチップに第１のレーザー光および第２のレーザー光を同時に照射して反射させたときの前記バイオセンサチップの画像である第１画像と、前記対象物質が前記第１の蛍光を発生したときの前記第１の蛍光の情報を示す前記バイオセンサチップの画像である第２画像とを生成し、
前記第１画像と前記第２画像とを用いて、前記吸着基材に対する前記対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する処理部を備え、
前記第１のレーザー光は前記第１の蛍光を発生させるための光であり、
前記第１のレーザー光と前記第２のレーザー光とはピーク波長が異なる、評価装置
が提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、凹凸構造への対象物質の吸着状態に関する詳細な情報を得られるバイオセンサチップの評価方法および評価装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】第１の実施形態に係るバイオセンサチップの評価方法のフローを示す図である。
【図２】第１の実施形態に係る共焦点顕微鏡の構造を示す図である。
【図３】第１の実施形態に係る評価装置、共焦点顕微鏡、およびバイオセンサチップの構成を示すブロック図である。
【図４】第２の実施形態に係るバイオセンサチップの評価方法のフローを示す図である。
【図５】第３の実施形態に係るバイオセンサチップの評価方法のフローを示す図である。
【図６】実施例１に係る三次元の第１画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を平面視する方向から見た画像である。
【図７】（ａ）は、実施例１に係る三次元の第２画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を平面視する方向から見た画像である。（ｂ）は、実施例１に係る三次元の第２画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を斜め上方から見た画像（斜視図）である。（ｃ）は、実施例１に係る三次元の第２画像の１つの表示画像例であり、断面図としての画像である。
【図８】実施例１に係る三次元の第３画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を平面視する方向から見た画像である。
【図９】（ａ）は、実施例２において斜視図として得た第４画像である。（ｂ）は、実施例２において断面図として得た第４画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１１】
なお、以下に示す説明において、評価装置１０の制御部１４０、処理部１２０、および共焦点顕微鏡２０の画像生成部２２０は、ハードウエア単位の構成ではなく、機能単位のブロックを示している。評価装置１０の制御部１４０、処理部１２０、および共焦点顕微鏡２０の画像生成部２２０は、任意のコンピュータのＣＰＵ、メモリ、メモリにロードされた本図の構成要素を実現するプログラム、そのプログラムを格納するハードディスクなどの記憶メディア、ネットワーク接続用インタフェースを中心にハードウエアとソフトウエアの任意の組合せによって実現される。そして、その実現方法、装置には様々な変形例がある。
【００１２】
（第１の実施形態）
図１は、第１の実施形態に係るバイオセンサチップの評価方法のフローを示す図である。
本実施形態に係る評価方法は、バイオセンサチップの吸着基材に対する対象物質の吸着状態を評価する評価方法である。吸着基材は表面に周期的な凹凸構造を有する。対象物質は、第１の蛍光を発生する。本実施形態に係る評価方法は、第１画像を生成する工程Ｓ１１０（第１ステップ）、第２画像を生成する工程Ｓ１２０（第２ステップ）、および吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０（第３ステップ）を備える。第１画像を生成する工程Ｓ１１０では、バイオセンサチップに第１のレーザー光および第２のレーザー光を同時に照射し、反射光を共焦点顕微鏡で観察することにより、三次元の第１画像を生成する。第２画像を生成する工程Ｓ１２０では、バイオセンサチップに第１のレーザー光を照射し、共焦点顕微鏡で観察することにより、第１の蛍光の情報を示す三次元の第２画像を生成する。吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０では、第１画像と第２画像とを用いて、吸着基材に対する対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する。第１のレーザー光は第１の蛍光を発生させるための光であり、第１のレーザー光と第２のレーザー光とはピーク波長が異なる。
【００１３】
バイオセンサチップは、たとえば、ＤＮＡセンサ、糖鎖センサ、酵素センサ、免疫センサ、微生物センサ、またはタンパク質センサ等が設けられたチップである。バイオセンサチップには周期的な凹凸構造を有する吸着基材が設けられており、検出しようとする対象物質は、バイオセンサチップにおいて、吸着基材に吸着することで検出される。なお、バイオセンサチップの検出原理は特に限定されず、たとえば光学的、電気的、化学的、あるいは機械的な検出原理によるものとすることができる。また、内部にマイクロ流路が設けられたようなバイオセンサチップであっても良い。なお、吸着基材への対象物質の吸着状態を詳細に評価するために、バイオセンサチップにおける吸着基材以外の構造は、あらかじめ取り外すなどしても良い。
【００１４】
いずれのバイオセンサチップにおいても、その開発過程において、吸着基材の吸着機能を評価し、向上させることが重要である。そのために、バイオセンサチップの本来の検出対象に限らず、たとえば擬似的に、蛍光を発生する対象物質を用いて、本実施形態に係る評価方法を適用することができる。
【００１５】
吸着基材の材質は特に限定されないが、たとえば、樹脂、半導体結晶、金属などでありうる。また、樹脂の表面に金属コートがされたものなど、多層構造であってもよい。また、吸着基材の表面には化学的な修飾や表面処理がされていても良いし、生体分子による修飾がされていても良い。吸着基材は蛍光を発する材料を含んでも良いが、その場合、吸着基材から発せられる蛍光のピーク波長は、第１の蛍光のピーク波長と異なることが好ましく、吸着基材から発せられる蛍光のピーク波長と、第１の蛍光のピーク波長とは、５０ｎｍ以上の差があることがより好ましく、１００ｎｍ以上の差があることがさらに好ましくい。そのことにより、後述する第２画像に吸着基材から発せられる蛍光の情報が混入することなく、対象物質の吸着状態に関するより詳細な情報を取得することができる。なお、同様の観点から、吸着基材から発せられる蛍光の発光波長帯と、第１の蛍光の発光波長帯とは、互いに重なり無く離れていることがより好ましい。
【００１６】
吸着基材の表面には、周期的な凹凸構造が設けられている。吸着基材の表面に凹凸構造が設けられていることにより、表面積が増大し、対象物質の吸着量を増やすことができる。凹凸構造としては、たとえば周期的なトレンチ構造、柱状構造、壁状構造、ホール構造などがあり得る。凹凸構造はたとえば半導体プロセスやナノインプリンティングなどにより形成された微細構造であり得る。
【００１７】
凹凸構造の表面には、対象物質が吸着している。吸着は、たとえば、バイオセンサチップの吸着基材の表面に、対象物質を含んだ液体を接触させることにより行うことができる。吸着は、物理吸着でも、静電気的な吸着でも、化学結合を伴う吸着であってもよい。溶液の調整、溶液を接触させる方式や条件、凹凸構造の形状、吸着基材の表面状態等により、吸着状態は異なる。吸着状態にはたとえば、吸着の量、吸着位置の分布、均一さ等が含まれる。
【００１８】
対象物質は、蛍光能を有するものであれば特に限定されず、たとえばＤＮＡ、タンパク質、糖鎖、ナノ粒子などが挙げられる。なお、対象物質が発する蛍光を以下では第１の蛍光と呼ぶ。なお、対象物質は必ずしもバイオセンサチップの本来の検出対象に限らず、擬似的な対象として準備した蛍光を発する物質であっても良い。ただし、バイオセンサチップにおける吸着基材の、より実効的な性能を評価するためには、バイオセンサの検出対象を対象物質として用いて評価を行うことが好ましい。また、対象物質は、吸着基材に特異的に吸着する部位と、蛍光を発生する部位とを有するような物質であっても良い。
【００１９】
次に、共焦点顕微鏡の構造について説明する。
図２は、本実施形態に係る共焦点顕微鏡２０の構造を示す図である。実線で示した矢印の光路は、第１の光源２４２および第２の光源２４４から吸着基材３１０に至るまでの光路であり、点線で示した矢印の光路は、吸着基材３１０から検出器２１６に至るまでの光路である。共焦点顕微鏡２０は第１の光源２４２および第２の光源２４４を備えている。第１の光源２４２は第１のレーザー光を出射する光源であり、第２の光源２４４は第２のレーザー光を出射する光源である。第１の光源２４２および第２の光源２４４から出射したレーザー光はそれぞれコリメーターレンズ２１４，２１５およびダイクロイックミラー２１８を経た後、ダイクロイックミラー２１９により反射されて吸着基材３１０へ導かれる。ダイクロイックミラー２１９と吸着基材３１０との間には対物レンズ２１０が設けられており、光は焦点面Ｓ上に集光される。
【００２０】
焦点面Ｓで反射された光、もしくは焦点面Ｓで発せられた蛍光は、本図中点線の様にフィルター２０８、コンフォーカルレンズ２０２等を経てピンホール２１２へ導かれ、ピンホール２１２を通過する。その後接眼レンズ２０４を経て検出器２１６に至り、検出される。
【００２１】
一方、焦点面Ｓとは高さの異なる面から反射した光、もしくは発せられた蛍光は、ピンホール２１２を通過できず、検出器２１６では検出されない。よって、不鮮明な像の原因となる光を遮断した、鮮明な観察が可能である。
【００２２】
さらにダイクロイックミラー２１９と対物レンズ２１０との間には、スキャナー２０６が設けられており、吸着基材３１０上の集光点を焦点面Ｓに平行な面内（ＸＹ平面内）で走査できる。一方、吸着基材３１０は図示しないアクチュエータにより、焦点面Ｓに垂直な方向（Ｚ方向）に走査される。これらスキャナー２０６およびアクチュエータにより、吸着基材３１０における観察点（集光点）は三次元に走査され、各点において検出器２１６で検出された光に基づいて三次元画像が構成される。なお、三次元画像の画素数、すなわち、観察点の数は特に限定されず、取得したい吸着状態情報の種類や精度、画像の生成に要する時間、観察範囲の広さ、対象物質へのダメージ等のバランスを考慮して適宜設定することができる。
【００２３】
共焦点顕微鏡２０としては、上記の構造のものに限られず、市販の共焦点顕微鏡装置を用いることができる。
【００２４】
共焦点顕微鏡２０を用いて第１画像および第２画像を生成する方法についてそれぞれ以下に説明する。
第１画像を生成する工程Ｓ１１０では、三次元の反射像を第１画像として生成する。第１画像を生成する際には、第１の光源２４２から第１のレーザー光を出射させ、第２の光源２４４から第２のレーザー光を出射させて、同時に吸着基材３１０に入射させる。複数のレーザー光を用いることにより、反射光の強度を上げることができ、より明瞭な反射像を得ることができる。第１のレーザー光および第２のレーザー光はいずれも第１の蛍光とは異なるピーク波長を有するものとする。また、第１のレーザー光と第２のレーザー光のピーク波長は互いに異なるものとすることができる。第１のレーザー光、第２のレーザー光、および第１の蛍光は、その発光波長帯が互いに重ならないことが好ましい。なお、第１画像は３つ以上のレーザー光を吸着基材に照射して生成しても良い。
【００２５】
吸着基材３１０の表面で反射された各レーザー光は、上述したように検出器２１６に入射して検出される。このとき、フィルター２０８およびダイクロイックミラー２１９としては、吸着基材３１０に照射した第１のレーザー光および第２のレーザー光のいずれの波長帯も透過させるものを用いる。また、フィルター２０８およびダイクロイックミラー２１９の少なくともいずれかとして、第１の蛍光を透過させないものを用いる。特に、波長選択が可能なダイクロイックミラー２１９として、第１の蛍光を透過させないものを用いることが好ましい。そうすることで、第１のレーザー光の照射により対象物質（不図示）から発せられた第１の蛍光を除いた、反射光のみを検出器２１６で検出できる。このように反射光を検出しながら、観察点を三次元に走査する。走査した三次元空間の各点で検出された反射光の情報に基づき、共焦点顕微鏡２０では、三次元の反射像である第１画像が生成される。
【００２６】
なお、吸着基材が蛍光を発しうる場合には、上記の様に反射像を得る際、入射したレーザー光と同じ波長を有する反射光に加えて、吸着基材からの蛍光を検出する場合がある。以下では、特に言及しない限り、反射光にはこのような蛍光を含み得ることとし、反射像にはこのような蛍光の影響を含み得ることとする。
【００２７】
第２画像を生成する工程Ｓ１２０では、三次元の蛍光像を第２画像として生成する。第２画像を生成する際には、第１の光源２４２からの第１のレーザー光のみを吸着基材３１０に照射する。その際、第２の光源２４４は停止させても良いし、第２のレーザー光のみをシャッターなどで遮って、ダイクロイックミラー２１８に至らないようにしても良い。蛍光像を取得する際には、フィルター２０８およびダイクロイックミラー２１９としては、所望の蛍光を透過させるものを用いる。また、フィルター２０８およびダイクロイックミラー２１９の少なくともいずれかとして、第１のレーザー光を透過させないものを用いる。そうすることにより、所望の波長の蛍光に基づく蛍光像を得ることができる。第２画像としては、第１の蛍光に基づく三次元の蛍光像を生成する。
【００２８】
第１画像は、主に吸着基材３１０の形状を示す。吸着基材３１０の表面が反射面である場合、第１画像において反射光の検出された点を吸着基材の表面に位置する点として理解することができる。もしくは、たとえば吸着基材が半透明である場合など、吸着基材の内部からも反射光が検出される場合には、反射光の検出された点を吸着基材の構造が存在する点として理解することができる。また、吸着基材が蛍光を発しうる場合には、当該蛍光が反射像において検出されるため、同様に反射光の検出された点を吸着基材の構造が存在する点として理解することができる。吸着基材３１０の形状を直接的に観察した第１画像を用いることで、吸着基材３１０の形状が設計からずれている場合や、構造の不均一性が生じている場合にも、形状と吸着状態の関係を詳細に評価できる。なお、第１画像には、対象物質からの反射光の情報も含まれうるが、吸着基材３１０からの反射光に比べてわずかであり、第１画像は主に吸着基材３１０の形状を示すといえる。
【００２９】
吸着基材の凹凸構造が樹脂もしくは有機無機複合材料から成る場合、好適に観察され得る。樹脂としてはたとえば、熱可塑性樹脂、熱硬化性樹脂、光硬化性樹脂、シリコーン樹脂等が挙げられる。熱可塑性樹脂としてはたとえば、ポリスチレン、シクロオレフィンポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリ乳酸、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ＡＢＳ樹脂、ＡＳ樹脂、ポリアミド、ポリアセタール、ポリブチレンテレフタレート、ガラス強化ポリエチレンテレフタレート、変成ポリフェニレンエーテル、ポリ塩化ビニル、ポリフェニレンスルフィド、ポリエーテルエーテルケトン、液晶性ポリマー、フッ素樹脂、ポリアレート、ポリスルフォン、ポリエーテルスルフォン、ポリアミドイミド、ポリエーテルイミド、熱可塑性ポリイミド等が挙げられる。熱硬化性樹脂としてはたとえば、フェノール樹脂、メラミン樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、シリコーン樹脂、ジアリルフタレート樹脂、ポリアミドビスマレイミド、ポリビスアミドトリアゾール等が挙げられる。シリコーン樹脂としてはたとえば、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等が挙げられる。樹脂は、１種類の樹脂から成るものでも、２種類以上の樹脂から成るものでもよい。また、適宜、酸化防止剤や難燃剤等を添加したものでも良い。有機無機複合材料としてはたとえばシルセスキオキサンが挙げられる。
【００３０】
一方、第２画像は、主に対象物質に関する情報を示す。具体的には、第２画像における第１の蛍光の位置が対象物質の存在位置を示し、当該第１の蛍光の強度が対象物質の存在量を示す。第１画像を生成する工程Ｓ１１０と第２画像を生成する工程Ｓ１２０はどちらを先に行っても良い。
【００３１】
第１画像を示す情報は、たとえば、測定した各点の三次元の座標値と、その点で検出器２１６により検出された反射光の強度とを対応づけたテーブルから成る。第２画像を示す情報は、たとえば、測定した各点の三次元の座標値と、その点で検出器２１６により検出された第１の蛍光の強度とを対応づけたテーブルから成る。
【００３２】
次いで、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０を行う。本工程では、第１画像と第２画像とを用いて、吸着基材に対する対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する。吸着状態情報は二次元、または三次元の画像であっても良いし、表面被覆率、吸着密度等の値であっても良い。本実施形態では、吸着状態情報として三次元の第３画像を生成する場合について以下に説明する。
【００３３】
本実施形態に係る吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０においては、第１画像と第２画像とを重ねることにより、吸着状態情報として三次元の第３画像を生成することができる。第３画像は吸着基材に対する対象物質の位置を示す。第３画像により、吸着基材に対する対象物質の吸着状態が視覚的、直感的に三次元で理解できる。
【００３４】
第１画像を生成する工程Ｓ１１０で得られた第１画像を示す情報と、第２画像を生成する工程Ｓ１２０で得られた第２画像を示す情報とを用いて、たとえばコンピュータにより合成処理することで生成できる。第３画像を示す情報は、たとえば、三次元の座標値と、その点での反射光の強度と、その点での第１の蛍光の強度とを対応づけたテーブルから成る。第３画像はたとえばモニター上に立体モデルとして表示させることができ、任意の視点から吸着状態を確認することができる。このとき、第３画像においては、三次元空間における各点において、第１画像の対応する点の反射光の情報と、第２画像の対応する点の第１の蛍光の情報とが合わせて表示されている。各点において、第１画像に基づく情報と、第２画像に基づく情報とはたとえば異なる色で示され、反射光もしくは第１の蛍光の強度は、各色の輝度に対応させて表示させることができる。
【００３５】
また、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０において、第３画像を用いて二次元の第４画像をさらに生成することもできる。第４画像は、バイオセンサチップの断面画像、またはいずれかの方向からバイオセンサチップを見た画像である。いずれかの方向からバイオセンサチップを見た画像とは、たとえは、斜視図、平面図、側面図などである。第４画像により、吸着基材に対する対象物質の吸着状態を視覚的、直感的に理解できる。また、第４画像は二次元画像であるため、情報の取り扱いが容易で汎用的である。
【００３６】
本実施形態に係る評価方法を行う評価装置の一例について以下に説明する。
図３は、本実施形態に係る評価装置１０、共焦点顕微鏡２０、およびバイオセンサチップ３０の構成を示すブロック図である。本図において、破線の矢印は、光の光路を示し、実線の矢印は情報の流れを示している。
本実施形態に係る評価装置１０は、バイオセンサチップ３０の吸着基材に対する対象物質の吸着状態を、共焦点顕微鏡２０の画像生成部２２０が生成した画像を用いて評価する評価装置である。対象物質は、第１の蛍光を発生する。共焦点顕微鏡２０は、第１画像および第２画像を生成する。第１画像はバイオセンサチップ３０に第１のレーザー光および第２のレーザー光を同時に照射して反射させたときのバイオセンサチップ３０の画像である。第２画像は、対象物質が第１の蛍光を発生したときの第１の蛍光の情報を示すバイオセンサチップ３０の画像である。評価装置１０は、処理部１２０を備える。処理部１２０は、第１画像と第２画像とを用いて、吸着基材に対する対象物質の吸着状態を示す吸着状態情報を生成する。第１のレーザー光は第１の蛍光を発生させるための光であり、第１のレーザー光と第２のレーザー光とはピーク波長が異なる。以下で詳細に説明する。
【００３７】
本実施形態において、共焦点顕微鏡２０は、第１のレーザー光および第２のレーザー光を生成する光源２４０をさらに備える。評価装置１０は、共焦点顕微鏡２０を制御する制御部１４０をさらに備える。制御部１４０は、光源２４０及び画像生成部２２０を制御することにより、第１画像及び第２画像を生成する。
【００３８】
光源２４０は図２の第１の光源２４２および第２の光源２４４を含んでいる。画像生成部２２０は図２における検出器２１６を含んでいる。
【００３９】
制御部１４０は、第１画像を生成する工程Ｓ１１０および第２画像を生成する工程Ｓ１２０を順に行うよう、光源２４０および画像生成部２２０を制御する。当該制御に基づき、共焦点顕微鏡２０では、上述したようにバイオセンサチップ３０にレーザー光が照射され、バイオセンサチップ３０が走査され、検出器２１６で検出された光の情報に基づいて三次元の第１画像および第２画像が順に生成される。なお、第１画像を生成する工程Ｓ１１０と第２画像を生成する工程Ｓ１２０の先後は問わない。
【００４０】
画像生成部２２０で生成された第１画像を示す情報および第２画像を示す情報は、評価装置１０の処理部１２０に入力される。処理部１２０では第１画像および第２画像を用いて、吸着状態情報を生成する。
【００４１】
なお、評価装置１０はこのような制御部１４０を有する構成に限られず、使用者の操作に基づいて共焦点顕微鏡２０の画像生成部２２０で生成させた第１画像および第２画像を、処理部１２０に入力するようにしてもよい。
【００４２】
次に、本実施形態の作用および効果について説明する。本実施形態に係る評価方法および評価装置では、バイオセンサチップの三次元画像に基づいて吸着状態情報を得るため、凹凸構造への対象物質の吸着状態に関する詳細な情報を得ることができる。
【００４３】
（第２の実施形態）
図４は、第２の実施形態に係るバイオセンサチップの評価方法のフローを示す図である。本実施形態に係る評価方法は、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０の代わりに吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２を備える点、および第２画像を生成する工程Ｓ１２０と吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２の間に位置情報を生成する工程Ｓ１２２を備える点を除いて、第１の実施形態に係る評価方法と同様の構成である。吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２では吸着情報として表面被覆率を生成する。
【００４４】
本実施形態に係る評価方法は、第２画像を生成する工程Ｓ１２０（第２ステップ）と吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２（第３ステップ）との間に、位置情報を生成する工程Ｓ１２２（第４ステップ）をさらに含む。位置情報を生成する工程Ｓ１２２では、第２画像における第１の蛍光の位置に基づいて、対象物質の存在する位置を示す位置情報を生成する。吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２では、吸着基材の表面積と、吸着基材への対象物質の吸着面積とを算出し、算出した表面積および吸着面積に基づいて、吸着状態情報として、吸着基材の対象物質による表面被覆率を生成する。吸着基材の表面積は第１画像から算出する。吸着基材への対象物質の吸着面積は、位置情報を用いて算出する。以下に詳細に説明する。
【００４５】
対象物質を吸着させた吸着基材に対し、第１画像を生成する工程Ｓ１１０および第２画像を生成する工程Ｓ１２０を第１の実施形態と同様に行う。第２画像を生成する工程Ｓ１２０と吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２との間には、位置情報を生成する工程Ｓ１２２を行う。位置情報は、対象物質の吸着位置を示す情報である。位置情報はたとえば、三次元の座標と、各点における対象物質の有無を示す情報とを対応づけたテーブル、もしくは、対象物質が存在する座標のリストなどであり得る。位置情報を生成する工程Ｓ１２２では、三次元の座標空間の各点における、対象物質の有無を判定し、位置情報を生成する。当該判定の方法としては、たとえば、あらかじめ第１の蛍光の強度の基準値を定めておき、第２画像の各点について、基準値を超える強度が検出された場合を「対象物質有り」、当該強度が検出されなかった場合を「対象物質無し」とする方法を用いることができる。
【００４６】
次いで、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２では、第１画像を生成する工程Ｓ１１０で生成された第１画像、および位置情報を生成する工程Ｓ１２２で生成された位置情報を用いて吸着状態情報として表面被覆率を生成する。
【００４７】
具体的にはまず、第１画像から吸着基材の表面積を算出する。表面積を算出する方法としては、たとえば、第１画像において反射光の検出された点を吸着基材の表面に位置する点として、吸着基材の表面を構成する座標を抽出し、抽出された座標の数に基づいて、表面積を算出する方法を用いることができる。もしくは、たとえば吸着基材が半透明である場合など、吸着基材の内部からも反射光が検出される場合には、反射光の検出された点を吸着基材の構造が存在する点として認識することができる。この場合、当該構造の存在する領域と存在しない領域の界面部分を表面とし、吸着基材の表面を構成する座標を抽出して表面積を算出することができる。
【００４８】
一方、位置情報を生成する工程Ｓ１２２で生成された位置情報を用いて、吸着基材への対象物質の吸着面積を算出する。具体的には、たとえば位置情報における対象物質の存在する点の数を面積に換算して、吸着面積を算出することができる。当該換算においては、たとえば、対象物質の存在する点の数と、吸着面積とが比例関係にあるものとしても良い。
【００４９】
次いで、算出された表面積と吸着面積とに基づいて、表面被覆率を吸着状態情報として生成する。表面被覆率は、表面積に対する吸着面積の比として生成される。ただし、適宜、表面積や吸着面積に補正のための重み付け等を行った上で、表面被覆率を求めても良い。
【００５０】
なお、上記の方法で表面被覆率として得られる値は、真の表面被覆率とは異なる値である場合があるが、相対的な値として用いても有益である。一定の方法に基づいて行う評価により得た複数の値を比較することにより、吸着状態を定量的に比較することができる。
【００５１】
また、本実施形態に係る方法とは異なる評価手法を用いて測定した、より真の値に近い表面被覆率と、本実施形態に係る評価方法で生成した表面被覆率との対応を示すテーブルや数式等をあらかじめ用意しておき、本実施形態に係る評価方法で生成した表面被覆率から、より正確な値を得ることもできる。当該テーブルや数式は、たとえば事前の実験に基づき、経験的に求めることができる。
【００５２】
なお、本実施形態に係る評価方法を行う評価装置は、第１の実施形態に係る評価装置と同様に実現できる。このとき、処理部１２０において、上記の処理が行われ、吸着情報として表面被覆率が生成される。
【００５３】
次に、本実施形態の作用および効果について説明する。本実施形態においては第１の実施形態と同様の作用および効果が得られる。加えて、吸着状態情報として、表面被覆率を生成することにより、吸着状態の定量的な評価を行うことができるという作用および効果が得られる。
【００５４】
（第２の実施形態の変形例）
本変形例に係る評価方法は、位置情報を生成する工程Ｓ１２２の代わりに積算強度を算出する工程を備える点、および吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２において吸着情報として吸着密度を生成する点を除いて、第２の実施形態に係る上記の評価方法と同様の構成である。
【００５５】
本実施形態に係る評価方法では、第２画像を生成する工程Ｓ１２０（第２ステップ）と吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２（第３ステップ）との間に、積算強度を算出する工程をさらに含む。積算強度を算出する工程では、第２画像における第１の蛍光の積算強度を算出する。吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２では、吸着基材の表面積と、吸着基材への対象物質の吸着量とを算出し、算出した表面積と吸着量とを用いて、吸着状態情報として、対象物質の吸着基材への吸着密度を生成する。表面積は第１画像を用いて算出する。吸着量は積算強度を用いて算出する。以下で詳細に説明する。
【００５６】
積算強度を算出する工程では、第２画像における各点の第１の蛍光の検出強度を、全ての点について積算した値を積算強度として算出する。
吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２では、吸着密度が、表面積に対する積算強度の比に基づいて算出される。
【００５７】
本変形例においても、第１の実施形態と同様の作用および効果が得られる。加えて、吸着状態情報として、吸着密度を生成することにより、吸着状態の定量的な評価を行うことができるという作用および効果が得られる。
【００５８】
（第３の実施形態）
図５は、第３の実施形態に係るバイオセンサチップの評価方法のフローを示す図である。本実施形態に係る評価方法は、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０の代わりに吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６を備える点、第１画像を生成する工程Ｓ１１０および第２画像を生成する工程Ｓ１２０の後、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６の前に未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８を備える点、および、第２画像を生成する工程Ｓ１２０と吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６とを繰り返し行う点を除いて、第１の実施形態に係る評価方法と同様の構成である。吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６では吸着情報の径時情報を生成する。
【００５９】
本実施形態に係る評価方法は、第１画像を生成する工程Ｓ１１０（第１ステップ）および第２画像を生成する工程Ｓ１２０（第２ステップ）のいずれよりも前に、液体の接触を開始する工程Ｓ１００（第５ステップ）をさらに含む。液体の接触を開始する工程Ｓ１００では、吸着基材に、対象物質を含む測定対象液体を接触させ始める。第２画像を生成する工程Ｓ１２０および吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６（第３ステップ）を繰り返し行って、前記吸着状態情報の経時情報を生成する。
【００６０】
また、本実施形態に係る評価方法は、第１画像を生成する工程Ｓ１１０および第２画像を生成する工程Ｓ１２０の後、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６の前に、未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８（第６ステップ）をさらに含む。未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８では、第１画像および第２画像を用いて、吸着基材に接していない対象物質に関わる情報を第２画像から取り除く。以下で詳細に説明する。
【００６１】
液体の接触を開始する工程Ｓ１００では、吸着基材に、対象物質を含む測定対象液体を接触させ始める。接触の開始時点が、生成する径時情報における基準時点となる。測定対象液体は、たとえばバッファー液にタンパク質等を添加したものでありうる。吸着基材に測定対象液体を接触させる方法としては、測定対象液体に吸着基材を浸漬させる方法や、吸着基材に測定対象液体を滴下する方法等が挙げられる。もしくは、バイオセンサチップが流路を有する場合、当該流路に測定対象液体を流すことによって吸着基材に接触させる方法もある。いずれの場合も、吸着基材の観察領域に、測定対象液体が接触し始めた時点を、基準時点とする。たとえば、測定対象液体中に分散された対象物質の個々の分子は、吸着基材に接触して吸着し、また再離脱しうる。吸着基材への吸着量は基準時点から時間を経るに従い変化し、基本的には増加しながら定常状態に到達しうる。本実施形態に係る評価方法では、このような変化の過程を評価し得る。
【００６２】
液体の接触を開始する工程Ｓ１００の後、第１の実施形態と同様に第１画像を生成する工程Ｓ１１０および第２画像を生成する工程Ｓ１２０を行う。これら２つの工程の順序は問わない。
【００６３】
少なくとも第１画像を生成する工程Ｓ１１０および第２画像を生成する工程Ｓ１２０を一度ずつ行った後、未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８を行う。未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８では、取得した第１画像および第２画像を生成する工程Ｓ１２０を用いて吸着基材に接していない対象物質に関わる情報を第２画像から取り除く。具体的には、まず、第２の実施形態に係る吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２と同様の方法で、第１画像から吸着基材の表面を構成する座標を抽出する。そして、当該座標からあらかじめ定めた距離範囲内にある領域を表面領域とする。次いで、第２画像において、表面領域に相当する領域以外で検出された第１の蛍光の情報を除去し、未吸着物質（未吸着対象物質）の情報を除去した第２画像を得る。このことにより、表面に吸着した対象物質に基づく第１の蛍光の情報のみを利用することができる。次いで、第１画像と、未吸着物質の情報を除去した第２画像とを用いて、吸着状態情報を生成する。
【００６４】
このように１つの吸着状態情報を得た後、第２画像を生成する工程Ｓ１２０、未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６を順に繰り返し行うことにより、複数の吸着状態情報からなる、吸着基材の径時情報が得られる。生成した複数の第２画像のそれぞれには、液体の接触を開始する工程Ｓ１００における基準時間を基準として、第２画像を生成した時点を示す情報を関連づけておく。第２画像を生成する工程Ｓ１２０は、一定の時間間隔で行うことができる。このことにより、測定対象液体中の対象物質が、吸着基材に吸着する過程を示す詳細な情報を得ることができる。なお、第２画像を生成する工程Ｓ１２０を繰り返し取得する際、第１画像を生成する工程Ｓ１１０は、第２画像を生成する工程Ｓ１２０と同様に、もしくは異なる時間間隔で、繰り返し行っても良いし、初めに１度のみ行っても良い。初めに１度のみ行う場合、その際に得た第１画像を繰り返し用いて、未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８および吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３６を行うことができる。
【００６５】
本実施形態では、未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８を備える評価方法について説明した。このような構成では、吸着状態情報の測定精度を向上させることができる。ただし、径時情報を得るために未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８は必ずしも必要ではない。たとえば、吸着基材に吸着することによって初めて蛍光を発するような対象物質を用いる場合、未吸着物質の情報を除去する工程Ｓ１２８を備えることなく、精度の高い吸着状態情報を生成することができる。
【００６６】
なお、本実施形態に係る評価方法を行う評価装置は、第１の実施形態に係る評価装置と同様に実現できる。このとき、繰り返し第２画像を生成するよう、制御部１４０により画像生成部２２０が制御され、処理部１２０において、上記の処理が行われ、吸着状態情報の径時情報が生成される。
【００６７】
次に、本実施形態の作用および効果について説明する。本実施形態においては第１の実施形態と同様の作用および効果が得られる。加えて、吸着基材への対象物質の吸着が進行する過程を示す詳細な情報を得ることができるという作用および効果が得られる。
【００６８】
なお、上記の各実施形態で示した吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３０，Ｓ１３２，Ｓ１３６は互いに排他的なものではなく、２つ以上を合わせて行い、吸着状態情報として、複数の情報を得るようにしてもよい。
【００６９】
（変形例）
次に、実施形態の変形例について説明する。本変形例は、上述した第１の実施形態から第３の実施形態まで、いずれの実施形態にも適用できる。ここでは、第２の実施形態を例に挙げて説明する。
【００７０】
本変形例に係る評価方法は、判定する工程（第７ステップ）をさらに含む。判定する工程では、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２で生成した吸着状態情報と、正常に吸着が生じた場合の対象物質の吸着基材への吸着状態を示す正常吸着状態情報とを比較し、正常に吸着が生じたか否かを判定する。
【００７１】
正常吸着状態情報は、たとえば、理論的に生成された情報や、事前実験において良好な吸着状態であった場合の吸着状態情報に基づく情報とすることができる。判定においては、たとえば、吸着状態情報を生成する工程Ｓ１３２で生成した吸着状態情報と、正常吸着状態情報との差分が、あらかじめ定めた基準範囲内である場合に正常に吸着が生じたと判定し、それ以外の場合に、正常に吸着が生じなかったと判定することができる。
【００７２】
なお、本変形例に係る評価方法を行う評価装置は、第１の実施形態に係る評価装置と同様に実現できる。このとき、処理部１２０において、上記の処理が行われ、判定が行われる。
【００７３】
本変形例においては第１の実施形態と同様の作用および効果が得られる。加えて、吸着の成否についての判定情報が得られる。
【００７４】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
【実施例】
【００７５】
次に、本発明の実施例について説明する。
（実施例１）
バイオセンサチップを準備し、第１の実施形態と同様の評価方法で評価した。以下に詳細に説明する。
本実施例において、バイオセンサチップの吸着基材は、ポリスチレンに周期的なトレンチ構造（ラインアンドスペース）をナノインプリンティングにより形成して準備した。対象物質を含む測定対象液体として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にストレプトアビジンを溶かした溶液（１００μｇ／ｍＬ）を用意した。ストレプトアビジンは蛍光基Ｃｙ３が付加されており、本実施例における対象物質である。そして、測定対象液体に吸着基材を浸漬し、静置することにより、対象物質を吸着基材に吸着させた。吸着基材を測定対象液体から取り出し、リンスした後、第１の実施形態と同様の評価方法で評価した。
【００７６】
共焦点顕微鏡として、共焦点レーザ走査型顕微鏡（オリンパス製、ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ１０００）を用い、吸着基材を観察した三次元画像の反射像を第１画像として生成した。また、吸着基材においてＣｙ３が発する蛍光（第１の蛍光）を観察した蛍光像を第２画像として生成した。このとき、第２画像を生成する際にはＣｙ３の蛍光を発生させるためのレーザー光（第１のレーザー光）を吸着基材に照射し、第１画像を生成する際には、当該レーザー光に加えて、当該レーザー光とはピーク波長が異なるレーザー光（第２のレーザー光）を吸着基材に照射した。
【００７７】
図６は、三次元の第１画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を平面視する方向から見た画像である。図７（ａ）は、三次元の第２画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を平面視する方向から見た画像である。図７（ｂ）は、三次元の第２画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を斜め上方から見た画像（斜視図）である。図７（ｃ）は、三次元の第２画像の１つの表示画像例であり、断面図としての画像である。
【００７８】
第１画像と第２画像とを重ね合わせて、三次元画像である第３画像を得た。図８は、三次元の第３画像の１つの表示画像例であり、吸着基材を平面視する方向から見た画像である。第３画像では、第１画像に基づく情報は緑色で、第２画像に基づく情報は赤色で表示させた。第３画像からは、対象物質が、トレンチ構造の溝部に主に吸着していることが分かった。第３画像から、凹凸構造への対象物質の吸着状態に関する詳細な情報を得ることができた。
【００７９】
（実施例２）
実施例１と同一のバイオセンサチップについて、共焦点顕微鏡として共焦点レーザー顕微鏡システム（ニコン製、Ｃ２＋）を用いた以外は実施例１と同様にして第３画像を得た。そしてさらに、三次元の第３画像から次の各第４画像を得た。第４画像は二次元の画像である。図９（ａ）は斜視図として得た第４画像、図９（ｂ）は断面図として得た第４画像である。第３画像および第４画像では、第１画像に基づく情報は緑色で、第２画像に基づく情報は赤色で表示させた。第３画像および第４画像からは、対象物質が、吸着基材のトレンチ構造の側壁に吸着している様子が確かめられた。第３画像および第４画像から、凹凸構造への対象物質の吸着状態に関する詳細な情報を得ることができた。
【符号の説明】
【００８０】
２０ 共焦点顕微鏡
２０２ コンフォーカルレンズ
２０４ 接眼レンズ
２０６ スキャナー
２０８ フィルター
２１０ 対物レンズ
２１２ ピンホール
２１４ コリメーターレンズ
２１５ コリメーターレンズ
２１６ 検出器
２１８ ダイクロイックミラー
２１９ ダイクロイックミラー
２２０ 画像生成部
２４０ 光源
２４２ 第１の光源
２４４ 第２の光源
【図１】
2016017933.tif 000003
【図２】
2016017933.tif 000004
【図３】
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【図４】
2016017933.tif 000006
【図５】
2016017933.tif 000007
【図６】
2016017933.tif 000008
【図７】
2016017933.tif 000009
【図８】
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【図９】
2016017933.tif 000011