(57)【要約】【課題】反応容器全体でより均一に核酸を増幅させる技術を提供する。【解決手段】核酸増幅装置は、核酸を含む反応試料を収納する窪みが複数配列される反応容器を保持する保持部１０２と、保持部１０２を加熱及び冷却して、反応試料の温度を調節する温度調節部１０６と、保持部１０２と温度調節部１０６との間に設けられる熱伝導部材１１０と、を備える。熱伝導部材１１０は、保持部１０２と温度調節部１０６とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高い。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む反応試料を収納する窪みが複数配列される反応容器を保持する保持部と、
前記保持部を加熱及び冷却して、前記反応試料の温度を調節する温度調節部と、
前記保持部と前記温度調節部との間に設けられる熱伝導部材と、
を備え、
前記熱伝導部材は、前記保持部と前記温度調節部とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高いことを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項２】
前記熱伝導部材は、グラファイトシートである請求項１に記載の核酸増幅装置。
【請求項３】
前記温度調節部を放熱する放熱部と、
前記温度調節部と前記放熱部との間に設けられる第２の熱伝導部材と、
をさらに備え、
前記第２の熱伝導部材は、前記温度調節部と前記放熱部とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高い請求項１又は２に記載の核酸増幅装置。
【請求項４】
前記温度調節部は、熱電素子を有する請求項１乃至３のいずれか１項に記載の核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、核酸増幅装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid：デオキシリボ核酸）等の核酸にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）を起こさせて、核酸を増幅させる核酸増幅装置が知られている。また、核酸の増幅機構に加えて核酸の検出部を備え、増幅した核酸をリアルタイムに検出することができる核酸増幅装置が知られている（例えば、特許文献１参照）。このような核酸増幅装置は、リアルタイムＰＣＲ装置と呼ばれている。
【０００３】
リアルタイムＰＣＲ装置は、ＤＮＡや蛍光物質等を含む反応試料の温度を制御してＤＮＡを増幅させる。また、リアルタイムＰＣＲ装置は、反応試料を励起させる励起光を照射し、その際に反応試料から発生する蛍光に基づいて増幅されたＤＮＡを測定する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−８１８９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述した核酸増幅装置では、反応試料を収容する窪みが複数設けられている樹脂製の反応容器が用いられていた。また、反応容器は、一般にアルミニウムを材料とする反応ブロックの上に置かれ、反応ブロックの加熱、冷却によって反応試料の温度が制御されていた。
【０００６】
核酸は、所定の温度サイクルを繰り返すことで増幅する。反応容器のすべての窪みで同じように核酸を増幅させるためには、反応容器のいずれの位置においても反応試料が正確に同じ温度とされることが望ましい。しかしながら、従来の核酸増幅装置では、反応容器の窪みの位置、すなわち反応ブロック上の位置によって温度差が生じるおそれがあった。反応ブロック上の位置によって温度差が生じた場合、各窪みで核酸の増幅率にばらつきが生じ得る。
【０００７】
本願はこうした状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、反応容器全体でより均一に核酸を増幅させる技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本願のある態様の核酸増幅装置は、核酸を含む反応試料を収納する窪みが複数配列される反応容器を保持する保持部と、保持部を加熱及び冷却して、反応試料の温度を調節する温度調節部と、保持部と温度調節部との間に設けられる熱伝導部材と、を備える。熱伝導部材は、保持部と温度調節部とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高い。
【発明の効果】
【０００９】
本願によれば、反応容器全体でより均一に核酸を増幅させる技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施の形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す側面図である。
【図２】実施の形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す平面図である。
【図３】実施の形態に係る核酸増幅装置の反応ユニットを模式的に示す斜視図である。
【図４】実施の形態に係る核酸増幅装置の反応ユニットの分解斜視図である。
【図５】実施の形態に係る核酸増幅装置の温度調節部を模式的に示す平面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を好適な実施の形態をもとに図面を参照しながら説明する。実施の形態は、発明を限定するものではなく例示であって、実施の形態に記述されるすべての特徴やその組み合わせは、必ずしも発明の本質的なものであるとは限らない。
【００１２】
図１は、実施の形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す側面図である。図２は、実施の形態に係る核酸増幅装置を模式的に示す平面図である。図１及び図２では、核酸増幅装置１の内部を透視した状態が図示されている。また、構造の一部は断面図で描かれている。本実施の形態に係る核酸増幅装置１は、ＤＮＡ等の核酸と蛍光物質等を含む液体状の反応試料の温度を制御して核酸を増幅させ、増幅した核酸の状態を光学的な測定方法により検出することができる装置である。
【００１３】
核酸増幅装置１は、本体１５と、本体１５の前方に取り付けられたカバー１６とを備える。本体１５には、反応容器２０、カバー２２、反応ユニット１００、制御部２４、光源３０、回転部３１、フィルタ部３２，３３、モータ３４、及びカメラ３５が設けられる。
【００１４】
カバー１６は、核酸増幅装置１の使用者が反応容器２０を取替えられるよう、前後に移動可能に本体１５に設置される。カバー１６は、後方に移動した際に本体１５の内部に収納される。図１では、カバー１６が前方に移動された状態が図示されている。本体１５とカバー１６との間には、遮光部材（図示せず）が取付けられる。これにより、核酸増幅装置１の内部空間が遮光される。カバー１６の内側には、反射鏡２５、フレネルレンズ２６が設置される。
【００１５】
反応容器２０には、核酸と蛍光物質等を含む液体状の反応試料を収納する窪みが、複数配列されている。本実施の形態では、縦横等間隔で縦に６個、横に１０個の計６０個の窪みが反応容器２０に形成されている。なお、窪みの数は特に限定されず、例えば縦に８個、横に１２個の計９６個の窪みが形成されていてもよい。反応容器２０は、後述する保持部の熱を効率よく反応試料に伝えるために樹脂製の薄板からなる。反応容器２０の裏面側は、窪みに応じた凸形状になっている。本実施の形態では、反応試料中の核酸は、蛍光物質が励起されると２種類の異なる波長の蛍光Ｌ１，Ｌ２を発生するように、蛍光標識されている。
【００１６】
反応ユニット１００は、反応容器２０を保持し、制御部２４の指示に基づいて反応容器２０の温度を調節する。反応ユニット１００については後に詳細に説明する。
【００１７】
カバー２２は、反応容器２０を覆う部材である。カバー２２により、反応容器２０が加熱された際に反応試料が蒸発することを防ぐことができる。カバー２２には、反応試料を励起させる励起光や、反応試料からの蛍光が透過するよう、光透過性のフィルム等が用いられる。
【００１８】
制御部２４は、ハードウェア構成としてはコンピュータのＣＰＵやメモリをはじめとする素子や回路で実現され、ソフトウェア構成としてはコンピュータプログラム等によって実現される。制御部２４には、各種プログラム及びデータが記憶される。制御部２４は、記憶されているプログラムを実行して、核酸増幅装置１の各部を制御する。例えば、制御部２４は、核酸が増幅するように反応ユニット１００による反応容器２０の温度調節を制御する。また、制御部２４は、光源３０の点消灯やモータ３４の回転を制御する。なお、制御部２４は、本体１５の外部に設けられてもよい。
【００１９】
反射鏡２５は、フィルタ部３２，３３からの励起光をフレネルレンズ２６に向けて反射する。また、反射鏡２５は、反応試料からの蛍光をカメラ３５に向けて反射する。フレネルレンズ２６は、反射鏡２５で反射される励起光を、フレネルレンズ２６の光軸に平行な状態に収束させて透過させる。
【００２０】
光源３０は、本体１５の側面（−Ｙ側の側面）に設置される。光源３０は、例えばハロゲンランプであり、励起光を含む光を照射する。
【００２１】
回転部３１は、いわゆるターレット式の回転装置である。回転部３１には、反応試料からの蛍光を観測する際に用いられるフィルタ部３２，３３が装着される。回転部３１は、回転板６０，６１、及び回転軸６２を有する。回転部３１は、回転板６０と回転板６１との間に、例えば最大６つのフィルタ部を装着することができる。
【００２２】
回転板６０は、カメラ３５側に配置される。回転板６０には、フィルタ部３２，３３が装着される位置に、蛍光を通過させる丸窓が設けられる。回転板６１は、反射鏡２５側に配置される。回転板６１には、フィルタ部３２，３３が装着される位置に、励起光及び蛍光を通過させる角窓が設けられる。回転軸６２は、回転板６０，６１と、回転板６０，６１に装着されたフィルタ部３２，３３とを回転させる。
【００２３】
本実施の形態では、フィルタ部３３は、フィルタ部３２が設置される位置から回転軸６２周りに１８０度ずれた位置に装着される。回転部３１は、フィルタ部３２，３３のいずれかを光源３０と対向する位置に移動させ、光源３０からの光をフィルタ部に入射させる。なお、「光源３０と対向する位置」とは、光源３０の光軸と、フィルタ部が有する光学フィルタとが交わる位置をいう。図２では、フィルタ部３２が光源３０と対向する位置にある状態が図示されている。
【００２４】
フィルタ部３２は、蛍光Ｌ１を観測する際に用いられる。フィルタ部３２は、箱状のフィルタキューブ７０と、光学フィルタ７１，７３と、ダイクロイックミラー７２とを有する。光学フィルタ７１，７３及びダイクロイックミラー７２は、フィルタキューブ７０に取り付けられる。
【００２５】
光学フィルタ７１は、光源３０からの光のうち反応試料を励起させる励起光を透過させるバンドパスフィルタである。ダイクロイックミラー７２は、反応試料に励起光を照射すべく、光学フィルタ７１を透過した励起光を反射鏡２５に向けて反射する。ダイクロイックミラー７２で反射された励起光は、反射鏡２５でさらに反射され、フレネルレンズ２６を透過して反応容器２０に照射される。また、ダイクロイックミラー７２は、励起される反応試料から発生する蛍光Ｌ１，Ｌ２を透過させる。光学フィルタ７３は、ダイクロイックミラー７２を透過した蛍光Ｌ１を選択的に透過させるバンドパスフィルタである。
【００２６】
フィルタ部３３は、蛍光Ｌ２を観測する際に用いられる。フィルタ部３３は、箱状のフィルタキューブ８０と、光学フィルタ８１，８３と、ダイクロイックミラー８２とを有する。光学フィルタ８１，８３及びダイクロイックミラー８２は、フィルタキューブ８０に取り付けられる。
【００２７】
光学フィルタ８１は、光学フィルタ７１と同様に、光源３０からの光のうち反応試料を励起させる励起光を透過させるバンドパスフィルタである。ダイクロイックミラー８２は、光学フィルタ８１を透過した励起光を反射鏡２５に向けて反射するとともに、反応試料からの蛍光Ｌ１，Ｌ２を透過させる。光学フィルタ８３は、ダイクロイックミラー８２を透過した蛍光Ｌ２を選択的に透過させるバンドパスフィルタである。
【００２８】
モータ３４は、制御部２４の指示により回転軸６２を回転させる。モータ３４は、例えばステッピングモータである。カメラ３５は、蛍光Ｌ１，Ｌ２を受光して撮影する。この結果、核酸増幅装置１の使用者は、増幅された核酸の量等を検出することができる。
【００２９】
続いて、反応ユニット１００の構造について詳細に説明する。図３は、反応ユニット１００を模式的に示す斜視図である。図４は、反応ユニット１００の分解斜視図である。図５は、温度調節部１０６を模式的に示す平面図である。反応ユニット１００は、保持部１０２、保持部ベース１０４、温度調節部１０６、放熱部１０８及び熱伝導部材１１０，１１２を主な構成として有する。
【００３０】
保持部１０２は、温調ブロックあるいは反応ブロックとも称され、反応容器２０を保持する平板状の部材である。保持部１０２の一方の主表面には、反応容器２０の裏面側の凸部が収納される穴が設けられる。反応容器２０は、保持部１０２の一方の主表面上に裁置される。保持部１０２は、熱伝導性を有する。保持部１０２の材料としては、アルミニウム等の熱伝導性の高い金属を用いることができる。
【００３１】
保持部ベース１０４は、保持部１０２からの放熱を抑制するための断熱部材である。保持部ベース１０４は、上側パッキン１１４を介して保持部１０２上に設置される。保持部ベース１０４は、枠形状を有し、保持部１０２の周囲を覆う。保持部ベース１０４の中央の開口において、保持部１０２が露出する。
【００３２】
温度調節部１０６は、保持部１０２を加熱及び冷却し、これにより反応容器２０中の反応試料の温度を調節する。温度調節部１０６は、保持部１０２の鉛直方向下方に配置される。温度調節部１０６は、熱電素子プレート１１６と、基板１１８とを有する。図５に示すように、熱電素子プレート１１６は、保持部１０２を６等分した領域のそれぞれを加熱及び冷却するための熱電素子１２０〜１２５と、温度センサ１３０〜１３２とを有する。熱電素子１２０〜１２５は、例えばペルチェ素子である。温度センサ１３０〜１３２は、例えばサーミスタである。
【００３３】
温度センサ１３０は、熱電素子１２０と熱電素子１２１との間に配置される。温度センサ１３０は、保持部１０２のうち、主に熱電素子１２０及び熱電素子１２１によって加熱及び冷却される領域の温度を検知することができる。温度センサ１３１は、熱電素子１２２と熱電素子１２３との間に配置される。温度センサ１３１は、保持部１０２のうち、主に熱電素子１２２及び熱電素子１２３によって加熱及び冷却される領域の温度を検知することができる。温度センサ１３２は、熱電素子１２４と熱電素子１２５との間に配置される。温度センサ１３２は、保持部１０２のうち、主に熱電素子１２４及び熱電素子１２５によって加熱及び冷却される領域の温度を検知することができる。
【００３４】
基板１１８には、熱電素子プレート１１６が搭載される。基板１１８は、コネクタ形状の外部接続端子１１８ａを有する。外部接続端子１１８ａに制御部２４及び電源（図示せず）が接続される。基板１１８を介して、制御部２４からの制御信号が熱電素子プレート１１６に送信され、また温度センサ１３０〜１３２の出力信号が制御部２４に送信される。熱電素子プレート１１６の熱電素子１２０〜１２５は、制御部２４からの指示に基づいて保持部１０２を加熱及び冷却する。また、制御部２４は、温度センサ１３０〜１３２のうちの少なくとも１つの温度センサの出力値に基づいて、熱電素子１２０〜１２５による加熱及び冷却を制御する。
【００３５】
放熱部１０８は、温度調節部１０６を放熱する部材である。具体的には、放熱部１０８は、温度調節部１０６の熱電素子１２０〜１２５を放熱する。放熱部１０８は、例えば複数の放熱フィンを有するヒートシンクである。放熱部１０８は、温度調節部１０６の鉛直方向下方に配置され、下側パッキン１３４を介して温度調節部１０６に接続される。すなわち、放熱部１０８は、温度調節部１０６の保持部１０２とは反対側に配置される。
【００３６】
熱伝導部材１１０は、保持部１０２と温度調節部１０６との間に設けられる。熱伝導部材１１０は、保持部１０２と温度調節部１０６との間の熱伝達を仲介する。熱伝導部材１１０は、保持部１０２と温度調節部１０６とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高い。本実施の形態において、熱伝導部材１１０は、グラファイトシートであり、一方の主表面が保持部１０２に当接し、他方の主表面が温度調節部１０６に当接するように配置される。したがって、熱伝導部材１１０は、シートの面方向、すなわちシートの主表面に対して平行な方向（図４中の矢印Ｘ１及びＹ１で示す方向を含む、矢印Ｚ１に対して直交する方向）における熱伝導率が、シートの主表面の法線方向（図４中の矢印Ｚ１で示す方向）における熱伝導率よりも高い。
【００３７】
このため、熱電素子１２０〜１２５で発生する熱は、熱伝導部材１１０に達すると、熱伝導部材１１０の厚さ方向に比べて面方向により伝達される。したがって、熱電素子１２０〜１２５から熱伝導部材１１０に伝達される熱の大部分は、熱伝導部材１１０内で面方向に拡散された後に保持部１０２に伝達される。これにより、反応試料の温度を上げる場合に、反応容器２０全体で均一に温度を上げることができる。また、保持部１０２が冷却される際、保持部１０２から熱電素子１２０〜１２５に伝達される熱の大部分は、熱伝導部材１１０内で面方向に拡散された後に熱電素子１２０〜１２５に伝達される。これにより、反応容器２０全体で均一に温度を下げることができる。
【００３８】
熱伝導部材１１２（第２の熱伝導部材）は、温度調節部１０６と放熱部１０８との間に設けられる。熱伝導部材１１２は、温度調節部１０６と放熱部１０８との間の熱伝達を仲介する。熱伝導部材１１２は、温度調節部１０６と放熱部１０８とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高い。本実施の形態において、熱伝導部材１１２は、グラファイトシートであり、一方の主表面が温度調節部１０６に当接し、他方の主表面が放熱部１０８に当接するように配置される。したがって、熱伝導部材１１２は、シートの面方向、すなわちシートの主表面に対して平行な方向（図４中の矢印Ｘ２及びＹ２で示す方向を含む、矢印Ｚ２に対して直交する方向）における熱伝導率が、シートの主表面の法線方向（図４中の矢印Ｚ２で示す方向）における熱伝導率よりも高い。
【００３９】
このため、保持部１０２からの伝熱によって加熱された熱電素子１２０〜１２５の熱は、熱伝導部材１１２に達すると、熱伝導部材１１２の厚さ方向に比べて面方向により伝達される。したがって、熱電素子１２０〜１２５から放熱部１０８に伝達される熱の大部分は、熱伝導部材１１２内で面方向に拡散された後に放熱部１０８に伝達される。これにより、反応試料の温度を下げる場合に、反応容器２０全体で均一に温度を下げることができる。
【００４０】
熱伝導部材１１０及び熱伝導部材１１２として用いるグラファイトシートの厚さは、好ましくは５０μｍ以上１００μｍ以下である。本実施の形態では、厚さ７０μｍのグラファイトシートを用いている。グラファイトシートの厚さを５０μｍ以上１００μｍ以下とすることで、シートの熱伝導量、シートの貼り付け対象に対する密着性、及びシートを貼り付ける際の作業性をより良好なものとすることができる。グラファイトシートの厚さを厚くすると、シートの主表面に対して平行な方向における熱伝導量が多くなる。このため、反応容器２０全体の温度をより均一に調節することができる。一方で、グラファイトシートの厚さを厚くすると、シートの主表面の法線方向における熱伝導量が少なくなる。また、グラファイトシートの厚さを薄くすると、シートの貼り付け対象である保持部１０２、温度調節部１０６、及び放熱部１０８の表面形状に合わせてシートが変形しやすくなる。このため、グラファイトシートと、保持部１０２、温度調節部１０６及び放熱部１０８との密着性を高めることができ、反応容器２０全体の温度をより均一に調節することができる。一方で、グラファイトシートの厚さを薄くすると、シートの取り扱いに注意を要するため、シートを貼り付ける際の作業性が低下しうる。以上の理由から、グラファイトシートの厚さを５０μｍ以上１００μｍ以下とすることが好ましい。
【００４１】
保持部ベース１０４、保持部１０２、熱伝導部材１１０、温度調節部１０６、熱伝導部材１１２及び放熱部１０８は、固定部材１３６ａ，１３６ｂによって固定される。
【００４２】
続いて、核酸増幅装置１の動作について説明する。ここでは、一例として核酸増幅装置１を用いて核酸を増幅させ、蛍光Ｌ１を検出する場合を説明する。まず制御部２４は、光源３０からの光がフィルタ部３２に入力されるよう、回転部３１を回転させる。次に、制御部２４は、反応試料中の核酸を増幅させるべく熱電素子１２０〜１２５の温度を制御する。これにより、熱電素子１２０〜１２５は、所定の温度サイクルで保持部１０２の加熱と冷却とを繰り返す。この結果、反応試料の加熱と冷却が繰り返され、核酸は増幅される。
【００４３】
光源３０から出射される光に含まれる励起光は、光学フィルタ７１を透過してダイクロイックミラー７２で反射される。反射された励起光は反射鏡２５でさらに反射され、フレネルレンズ２６、カバー２２を透過して反応容器２０の反応試料に照射される。この結果、反応試料は励起され、蛍光Ｌ１，Ｌ２が発生する。蛍光Ｌ１，Ｌ２は、反射鏡２５で反射されてダイクロイックミラー７２を透過する。ダイクロイックミラー７２を透過した蛍光Ｌ１，Ｌ２は光学フィルタ７３に入射し、蛍光Ｌ１のみが選択的に光学フィルタ７３を透過してカメラ３５に入射する。この結果、カメラ３５は、リアルタイムで蛍光Ｌ１を検出することができる。なお、蛍光Ｌ２を検出する場合には、フィルタ部３３が用いられる。
【００４４】
以上説明したように、本実施の形態に係る核酸増幅装置１は、反応容器２０を保持する保持部１０２と、保持部１０２を加熱及び冷却して、反応試料の温度を調節する温度調節部１０６と、保持部１０２と温度調節部１０６との間に設けられる熱伝導部材１１０とを備える。熱伝導部材１１０は、保持部１０２と温度調節部１０６とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高い。したがって、温度調節部１０６の熱電素子１２０〜１２５で発生する熱は、その大部分が熱伝導部材１１０において面方向に拡散した後に保持部１０２に伝達される。また、保持部１０２の熱は、その大部分が熱伝導部材１１０において面方向に拡散した後に熱電素子１２０〜１２５に伝達される。これにより、保持部１０２の全体をより均一に加熱、冷却することができるため、反応容器２０の各窪みにおける温度差を小さくすることができる。その結果、反応容器２０全体でより均一に核酸を増幅させることができる。
【００４５】
また、核酸増幅装置１は、温度調節部１０６を放熱する放熱部１０８と、温度調節部１０６と放熱部１０８との間に設けられる熱伝導部材１１２とを備える。熱伝導部材１１２は、温度調節部１０６と放熱部１０８とが並ぶ方向における熱伝導率よりも、当該方向と交わる方向における熱伝導率が高い。したがって、熱電素子１２０〜１２５の冷却によって保持部１０２から温度調節部１０６に伝達された熱は、その大部分が熱伝導部材１１２において面方向に拡散した後に放熱部１０８に伝達される。これにより、保持部１０２の全体をより均一に冷却することができるため、反応容器２０の各窪みにおける温度差を小さくすることができる。その結果、反応容器２０全体でより均一に核酸を増幅させることができる。
【００４６】
本発明は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、当業者の知識に基づいて各種の設計変更などのさらなる変形を加えることも可能であり、そのような変形が加えられた実施の形態も本発明の範囲に含まれる。上述した実施の形態への変形の追加によって生じる新たな実施の形態は、組み合わされる実施の形態、及び変形それぞれの効果をあわせもつ。
【００４７】
上述した実施の形態では、核酸増幅装置１は、核酸の増幅機構と検出機構とを備えるが、核酸増幅装置１は核酸の増幅機構のみを備えてもよい。
【符号の説明】
【００４８】
１  核酸増幅装置、  ２０  反応容器、  １０２  保持部、  １０６  温度調節部、  １０８  放熱部、  １１０，１１２  熱伝導部材、  １２０，１２１，１２２，１２３，１２４，１２５  熱電素子。
【図１】
2016185103.tif 000003
【図２】
2016185103.tif 000004
【図３】
2016185103.tif 000005
【図５】
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【図４】
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