(57)【要約】【課題】  病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカス（以下、ビブリオ）と、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカス（以下、病原性ビブリオ）の検出を同時にかつ高い特異性で行うことを可能とする。【解決手段】  病原性ビブリオ及びビブリオ（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオの検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオの有無及びビブリオの有無を同時に検出する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法であって、
試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無及びビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
【請求項２】
前記toxRを含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合するプローブ、前記tdhを含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合するプローブ、及び前記trhを含むＤＮＡ断片を増幅して得られた増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体を用いて、前記それぞれの増幅産物を同時に検出する
ことを特徴とする請求項１記載のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
【請求項３】
前記toxRを含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットと、
前記tdhを含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットと、
前記trhを含むＤＮＡ断片を増幅するための配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーと配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットと、を含むＰＣＲ反応液を用いて、前記マルチプレックスＰＣＲを行い、
前記toxRから選択された配列番号７〜１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
前記tdhから選択された配列番号１１〜１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
前記trhにおける耐熱性溶血毒類似毒素1型遺伝子（trh1）から選択された配列番号１６〜１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
前記trhにおける耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択された配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、を固定化したビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体を用いて、前記それぞれの増幅産物の有無の検出を行う
ことを特徴とする請求項１又は２記載のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
【請求項４】
前記各遺伝子から選択された少なくともいずれかのプローブが、以下の（１）〜（３）のいずれかであることを特徴とする請求項３記載のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法。
（１）配列番号に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２）配列番号に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【請求項５】
病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するためのビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体であって、
ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）から選択された配列番号７〜１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）から選択された配列番号１１〜１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素1型遺伝子（trh1）から選択された配列番号１６〜１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、
ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択された配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、を固定化したことを特徴とするビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体。
【請求項６】
前記各遺伝子から選択された少なくともいずれかのプローブが、以下の（１）〜（３）のいずれかであることを特徴とする請求項５記載のビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体。
（１）配列番号に示す塩基配列において、１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたプローブ。
（２）配列番号に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ。
（３）（１）又は（２）のプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒菌などの微生物を検出するための技術に関し、特にビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、食品や環境などの公衆衛生の分野における衛生水準の向上により、食中毒の発生には減少傾向が見られるものの、現在でもなお日本国内で毎年２万人以上が食中毒に罹患している。この中には、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス（腸炎ビブリオ）を原因とするものも少なからず含まれており、その発生を防止するために、食中毒菌等の検査において、食品や環境中の病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを精度高く検出することが重要になっている。
【０００３】
病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを検出する方法としては、例えば特許文献１に記載のように、所定のプライマーを用いて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法により増幅対象領域（増幅対象遺伝子領域、標的遺伝子領域）のＤＮＡ断片を増幅し、その増幅産物のサイズを電気泳動法で分析することによって行う方法がある。
また、本出願人による特許文献２に記載の発明では、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスが有する耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を増幅可能なプライマーを用いて、ＰＣＲ法により当該遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し、その増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いて、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００８−５３８０７５号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１４２１１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、公衆衛生の分野においては、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無の検査のみならず、衛生学的指標として、病原性に拘わらず、ビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検査できることが望ましい。
しかしながら、上述した従来の技術では、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスを、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスと同時に検出することはできなかった。
また、ビブリオ・パラヘモリティカスの検査を行う実際の現場においては、検査試料に食物の遺伝子など様々なＤＮＡが混入することから、特異性に優れた検出精度が求められていた。
さらに、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの毒素遺伝子には種々のものが存在しているところ、これらを識別して検出可能にすることが好ましい。
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスと、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能なビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明のビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無及びビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検出する方法としてある。
【０００７】
また、本発明のビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するためのビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体であって、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）から選択された配列番号７〜１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）から選択された配列番号１１〜１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素1型遺伝子（trh1）から選択された配列番号１６〜１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択された配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブと、を固定化した構成としてある。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスと、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体の試験１〜３で用いた菌株の毒素遺伝子保有状況を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において用いられる３種類のプライマーセットの塩基配列（プライマー配列）を示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法におけるマルチプレックスＰＣＲによる増幅産物の電気泳動の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法における耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）領域を増幅するためのプライマーセット（trhプライマーセット）と、本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体における耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子（trh1）から選択されたプローブ（trh1プローブ）及び耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）から選択されたプローブ（trh2プローブ）を用いたビブリオ・パラヘモリティカスの検出結果（蛍光強度）を示す図である。
【図５】本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体におけるプローブの塩基配列（プローブ配列）を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体における各プローブによるビブリオ・パラヘモリティカスの検出結果（蛍光強度）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体について、詳細に説明する。
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性のものを含む）を同時に検出するビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法であって、試料から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）を含むＤＮＡ断片と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を含むＤＮＡ断片と、をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅させ、それぞれの増幅産物の有無を検出することによって、試料中における病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無及びビブリオ・パラヘモリティカスの有無を同時に検出することを特徴とする。
【００１１】
ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio  parahaemolyticus）は、グラム陰性で好塩性の桿菌である。主として海水中に生息し、ヒトに感染すると、食中毒を発症させる病原性ビブリオ・パラヘモリティカス（腸炎ビブリオ）が存在する。一方、非病原性ビブリオ・パラヘモリティカスも存在している。しかしながら、公衆衛生の分野においては、衛生学的指標として、このような病原性の有無に拘わらず、ビブリオ・パラヘモリティカスを幅広く検出可能にすることが好ましい。
そこで、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法では、ビブリオ・パラヘモリティカスのゲノムＤＮＡに共通して保有される病原性発現調節遺伝子（toxR）を増幅対象領域としてＰＣＲ法により増幅し、その増幅産物を検出することによって、試料中における、病原性のあるものとないものとを含むビブリオ・パラヘモリティカスの有無を検出可能にしている。
【００１２】
また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスには、毒素を産生する遺伝子として、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）及び／又は耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を有するものが存在する。
具体的には、例えば図１に示すように、これらの毒素遺伝子の保有状況が分っている菌株が存在している。さらに、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）は、耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子（trh1）と耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子（trh2）に区別される。後述する実施例では、これらの菌株を使用して、toxR、tdh、及びtrhの３つの遺伝子を同時に検出すると共に、さらにtrh1とtrh2とを識別可能にしている。
【００１３】
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法では、上記の病原性発現調節遺伝子（toxR）と、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）と、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）とを増幅対象領域としてＰＣＲ法により同時に増幅し、その増幅産物を検出することによって、試料中における、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを含むビブリオ・パラヘモリティカスの有無と、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無とを同時に検出可能にしている。
これによって、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法によれば、ビブリオ・パラヘモリティカスについて、従来の方法ではなし得なかった衛生指標菌及び食中毒危害菌の２種類の指標を同時に識別することが可能となっている。
【００１４】
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において、図２に示すように、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（toxRプライマーセット）として、配列番号１に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号２に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（tdhプライマーセット）として、配列番号３に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号４に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）領域をＰＣＲ法により増幅するためのプライマーセット（trhプライマーセット）として、配列番号５に示す塩基配列からなるプライマー（Ｆ：フォワードプライマー）と、配列番号６に示す塩基配列からなるプライマー（Ｒ：リバースプライマー）とからなるものを用いることが好ましい。
【００１５】
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において、ＰＣＲ反応液は、上記のtoxRプライマーセット、tdhプライマーセット、及びtrhプライマーセットを含有し、それ以外の成分には、一般的なものを用いることができる。具体的には、緩衝液、核酸合成基質、Ex  Taq等の核酸合成酵素、Cy5等の標識成分、試料のＤＮＡ、及び水を含むものなどを用いることができる。
そして、このようなＰＣＲ反応液を用いてサーマルサイクラーなどの核酸増幅装置により、試料中のゲノムＤＮＡの一部が増幅される。すなわち、上記プライマーセットによる増幅対象領域を有するゲノムＤＮＡが試料中に存在している場合、その対象領域が増幅される。
【００１６】
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において用いるプライマーは、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。
【００１７】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１〜６で表される配列からなるＤＮＡに対し高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１〜６で表される配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【００１８】
次に、ＰＣＲ法により得られた増幅産物（ＰＣＲ増幅産物）を用いて、例えば電気泳動を行うことにより、本実施形態における上記各プライマーセットによる増幅産物が得られているか否かを確認して、試料中におけるビブリオ・パラヘモリティカス及び病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無を検出することが好ましい。電気泳動は、アガロースゲル電気泳動やポリアクリルアミドゲル電気泳動、マイクロチップ電気泳動など一般的な方法により行うことができる。
【００１９】
また、ＰＣＲ増幅産物を本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体上（ＤＮＡチップ）に滴下して、当該担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することにより、試料中におけるビブリオ・パラヘモリティカス及び病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの有無を検出することも好ましい。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（Ｒ）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。なお、標識は、蛍光に限定されず、その他のものを用いてもよい。
【００２０】
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、ビブリオ・パラヘモリティカスの病原性発現調節遺伝子（toxR）領域から選択されたプローブ（toxRプローブ）として、配列番号７〜１０に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
また、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）領域から選択されたプローブ（tdhプローブ）として、配列番号１１〜１５に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
さらに、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）領域における耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子から選択されたプローブ（trh1プローブ）として、配列番号１６〜１９に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましく、同遺伝子（trh）領域における耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子から選択されたプローブ（trh2プローブ）として、配列番号２０又は２１に示す塩基配列からなる少なくともいずれかのプローブを固定化したものとすることが好ましい。
【００２１】
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体をこのような構成にすることによって、ビブリオ・パラヘモリティカス（病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを含む）と共に、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを同時に特異的に検出することが可能になる。また、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスとして、耐熱性溶血毒遺伝子（tdh）と耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）を有するか否かを識別して検出することも可能となる。さらに、耐熱性溶血毒類似毒素遺伝子（trh）として、耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子と耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子を識別して検出することも可能となる。
このように、耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子と耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子とを、それぞれ専用のプライマーを用いて増幅産物のサイズで識別するのではなく、同一のプライマーを用いて増幅産物を得た後に、それぞれ専用の特異性の高いプローブを用いて識別可能にすることによって、マルチプレックスＰＣＲにおけるプライマー数を減らすことができ、精度の向上とコストの低減を実現することが可能になっている。
【００２２】
本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体において用いるプローブも、上記の塩基配列に限定されるものではなく、それぞれの塩基配列において１又は数個の塩基が欠損、置換又は付加されたものを用いることができる。また、それぞれの塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸断片からなるものを用いることもできる。さらに、これらのようなプローブに対して相補的な塩基配列を有するプローブを用いることもできる。
【００２３】
このようなビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体を用いて、具体的には、ＰＣＲ増幅産物に所定の緩衝液を混合し、当該担体に滴下する。次に、当該担体を４５℃で１時間静置し、その後、所定の緩衝液によりハイブリダイズしなかったＰＣＲ増幅産物等を当該担体から洗い流す。そして、当該担体を標識検出装置にかけて標識の検出を行うことにより、試料中に病原性ビブリオ・パラヘモリティカス及びビブリオ・パラヘモリティカス（病原性ビブリオ・パラヘモリティカスを含む）が存在するか否かを同時に検出することができる。
【００２４】
以上説明したように、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法、及びビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によれば、病原性を持たないものを含むビブリオ・パラヘモリティカスと、食中毒の原因となる病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時にかつ高い特異性で行うことが可能である。
【実施例】
【００２５】
＜試験１：３種類のプライマーセットを用いた同時増幅の検証＞
図１に示す毒素遺伝子の保有状況が既知の７種類のビブリオ・パラヘモリティカスの菌株を用いて、これらのビブリオ・パラヘモリティカスから常法によりＤＮＡを抽出した。これらは、いずれも大阪大学微生物病研究所からの分譲由来のものである。
次いで、図２に示すtoxRプライマーセット、tdhプライマーセット、及びtrhプライマーセットを用いて、菌株毎に、それぞれの増幅対象領域をマルチプレックスＰＣＲにより同時に増幅し、得られた増幅産物を検出できるか否かを検証した。具体的には、以下のように行った。
【００２６】
上記７種類のビブリオ・パラヘモリティカスの菌株を、それぞれ１％塩化ナトリウム添加トリプティックソイブロス（日本ＢＤ製）に接種して、３７℃で一晩培養を行ったのち、培養液をそれぞれ１ｍＬずつ回収し、５０００×ｇで、１０分間の遠心分離を行った。
次に、上清を廃棄し、得られた沈殿に、２０ｍｇ／ｍＬ濃度のリゾチーム溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０／２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を加えて、３７℃で３０分間溶菌処理を行った。さらに、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて、カラム精製を行うことにより、ＤＮＡ抽出液を得た。このＤＮＡ抽出液を１０ｐｇ／μＬ濃度に調製したものをＰＣＲにおいて使用する試料とした。
【００２７】
次に、ＰＣＲ反応液を以下の組成で調製した。プライマーはシグマアルドリッチジャパン合同会社に合成委託し、それ以外の試薬はタカラバイオ株式会社製のものを使用した。以下の組成において、ビブリオ・パラヘモリティカスをビブリオと略称している。
・緩衝液（10×Ex  Taq  buffer）                          (2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP  Mixture）                         （1.6μl）
・ビブリオtoxR増幅用Ｆプライマー                        (0.2μl）
・ビブリオtoxR増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）    （0.2μl）
・ビブリオtdh増幅用Ｆプライマー                         (0.2μl）
・ビブリオtdh増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）      (0.2μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｆプライマー                         (0.2μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）      (0.2μl）
・TaKaRa  Ex  Taq  Hot  Start  Version                  （0.2μl）
・試料のＤＮＡ                                          （1.0μl）
・滅菌水                                                （14.0μl）
（全量  20μl）
【００２８】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅には、サーマルサイクラーｅｐグラジエント（エッペンドルフ株式会社）を使用した。反応条件は、以下の通りである。
（１）９５℃  ２分
（２）９５℃  １０秒（ＤＮＡ鎖の乖離工程）
（３）６８℃  ３０秒（アニーリング工程）
（４）７２℃  ３０秒（ＤＮＡ合成工程）
（５）７２℃  ２分
（２）〜（４）を４０サイクル
【００２９】
次に、このようにして得られたＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液をマイクロチップ電気泳動装置ＭｕｌｔｉＮＡ（株式会社島津製作所）に供し、ＰＣＲ増幅産物のサイズ分析を行った。その結果を図３に示す。
同図に示すように、電気泳動の結果、toxRプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ３１９ｂｐ）は、７種類の菌株の全てについて検出された。
一方、tdhプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ１９５ｂｐ）は、tdh遺伝子を有する菌株(4)、(5)、(6)についてのみ検出され、trhプライマーセットによる増幅産物（推定サイズ２７４ｂｐ）は、trh遺伝子を有する菌株(1)、(2)、(3)、(6)についてのみ検出された。
【００３０】
以上のことから、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法におけるtoxRプライマーセット、tdhプライマーセット、及びtrhプライマーセットによって、これらの領域をそれぞれ特異的に同時に検出できたことがわかる。このように、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法によれば、ビブリオ・パラヘモリティカスと病原性ビブリオ・パラヘモリティカスの検出を同時に行えることが確認された。
【００３１】
＜試験２：耐熱性溶血毒類似毒素１型及び２型遺伝子（trh1,trh2）の識別の検証＞
試験１で調製した菌株(1)、(2)、(3)の各ＤＮＡ抽出液１０ｎｇ／μｌとtrhプライマーセットを用いて、菌株毎に、ＰＣＲによりtrh遺伝子領域の増幅を行った。ＰＣＲ反応液は以下の組成で調製し、その他の点については試験１と同様にして、ＰＣＲ増幅産物を含むＰＣＲ反応液を得た。
【００３２】
・緩衝液（10×Ex  Taq  buffer）                        (2.0μl）
・核酸合成基質（dNTP  Mixture）                       （1.6μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｆプライマー                       (0.2μl）
・ビブリオtrh増幅用Ｒプライマー（5’末端Cy5修飾）   （0.2μl）
・TaKaRa  Ex  Taq  Hot  Start  Version                （0.2μl）
・試料のＤＮＡ                                        （1.0μl）
・滅菌水                                              （14.8μl）
（全量  20μl）
【００３３】
また、予め、図５に示す配列番号１６〜１９の塩基配列からなる耐熱性溶血毒類似毒素１型遺伝子検出用のプローブ（trh1プローブ）と、配列番号２０〜２１の塩基配列からなる耐熱性溶血毒類似毒素２型遺伝子検出用のプローブ（trh2プローブ）を固定化したＤＮＡチップを作製した。そして、菌株毎に、ＰＣＲ反応液４μＬとハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS  クエン酸−生理食塩水−ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、上記ＤＮＡチップに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
反応後、ＤＮＡチップを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。
【００３４】
具体的には、プローブにハイブリダイズした増幅産物の標識成分（Cy5）をレーザー光により励起して発光させ、その光量を検出器内に取り付けたＣＣＤカメラにより検出した。また、光量を電気信号に置換して数値化し、蛍光強度を得た。この蛍光強度は、当該装置での強度指標であり、単位はなく、バックグラウンドの数値が０になるように補正して算出した。その結果を図４に示す。
【００３５】
同図に示すように、菌株(1)、菌株(2)については、trh1検出用プローブでは高い蛍光強度が得られ、trh2検出用プローブでは低い蛍光強度しか得られなかった。このことから、菌株(1)、菌株(2)は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスのtrh遺伝子保有菌のうち、trh1遺伝子保有菌であることがわかる。
一方、菌株(3)については、trh2検出用プローブでは高い蛍光強度が得られ、trh1検出用プローブでは比較的低い蛍光強度しか得られなかった。このことから、菌株(3)は、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスのtrh遺伝子保有菌のうち、trh2遺伝子保有菌であることがわかる。
【００３６】
以上のことから、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によれば、trh1検出用プローブとtrh2検出用プローブを併用することで、病原性ビブリオ・パラヘモリティカスのtrh遺伝子保有菌が検出対象の試料に含まれている場合に、trh1遺伝子保有菌とtrh2遺伝子保有菌を識別できると共に、trh遺伝子についての偽陰性の判定を回避できることがわかった。
【００３７】
＜試験３：ＤＮＡチップによる同時検出の検証＞
toxR、tdh、tr1、及びtrh2遺伝子を含むＤＮＡ断片と結合可能なプローブを固定化した本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によって、ビブリオ・パラヘモリティカスにおけるtoxR、tdh、trhの３種類の遺伝子を、同時に特異的に検出できるか否かを検証した。
具体的には、図５に示す配列番号７〜２１の塩基配列からなる各プローブを固定化したＤＮＡチップを作製した。
そして、図１に示す７種類のビブリオ・パラヘモリティカスの菌株を用いて、菌株毎に、試験１と同様にして得られたＰＣＲ反応液４μＬと、ハイブリダイゼーション用の緩衝液２μＬ（3×SSC／0.3%SDS  クエン酸−生理食塩水−ドデシル硫酸ナトリウム）を混合したものを、このＤＮＡチップに滴下して、４５℃で１時間反応させた。
反応後、試験２と同様に、ＤＮＡチップを室温下で洗浄液（2×SSC／0.2%SDS溶液、2×SSC溶液の順に）に浸して洗浄を行い、カバーガラスを載せて蛍光検出器Ｂｉｏｓｈｏｔ(東洋鋼鈑株式会社製)により各プローブのスポット領域の蛍光を検出した。その結果を図６に示す。
【００３８】
同図に示すように、配列番号７〜１０のtoxR検出用プローブでは、７種類全てのビブリオ・パラヘモリティカスの菌株について、高い蛍光強度を示した。
これに対して、配列番号１１〜１５のtdh検出用プローブでは、tdh遺伝子を保有する菌株(4)、(5)、(6)のみについて高い蛍光強度を示し、tdh遺伝子を保有しない菌株(1)、(2)、(3)、(7)については、高い蛍光強度を示さなかった。
また、配列番号１６〜１９のtrh1検出用プローブでは、trh1を保有する菌株(1)、(2)、(6)のみについて高い蛍光強度を示し、trh1を保有しない菌株(3)、(4)、(5)、(7)については、高い蛍光強度を示さず、さらに配列番号２０〜２１のtrh2検出用プローブでは、trh2を保有する菌株(3)のみについて高い蛍光強度を示し、trh2を保有しない菌株(1)、(2)、(4)、(5)、(6)、(7)については、高い蛍光強度を示さなかった。
【００３９】
以上のことから、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体によれば、ビブリオ・パラヘモリティカスにおけるtoxR、tdh、trhの３種類の遺伝子領域を、同時に特異的に検出できることがわかった。特に、trhについては、trh1とtrh2のいずれか一方のタイプのもののみが試料中に存在している場合には、そのいずれであるかを識別できると共に、偽陰性の判定を防止できることが明らかとなった。
【００４０】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能である。例えば、本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカスの検出方法において、ＰＣＲ反応液にその他の成分を含有させたり、あるいは本実施形態に係るビブリオ・パラヘモリティカス検出用担体に、上記以外のプローブをさらに追加して固定化したりするなど適宜変更することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
本発明は、食品検査、疫学的環境検査、環境検査、臨床試験、及び家畜衛生等において、ビブリオ・パラヘモリティカスを検出する場合に好適に利用することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図３】
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【配列表】
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