(57)【要約】      （修正有）【課題】ヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。【解決手段】化合物Ａ又は化合物Ｂを利用してシキミ酸代謝経路中の３−デヒドロキネートデヒドラターゼのフィードバック阻害し、ヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。化合物Ａは、安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体、トランス-桂皮酸、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸、４−インドフェニルボロン酸又は３，４−ジメトキシアルコールのうちの１つであり、前記化合物Ｂは、脂肪酸のβ‐酸化作用を経て安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体のうちの１つを発生する前駆体化合物である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物Ａを利用してシキミ酸代謝経路中の３−デヒドロキネートデヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のフィードバック阻害し、そのうち、該化合物Ａは、安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体、トランス - 桂皮酸（trans-cinnamic acid）、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸（1,4-cyclohexanedicarboxylic acid）、４−インドフェニルボロン酸（4-indophenylboronic acid）又は３，４−ジメトキシアルコール（3,4-dimethoxybenzyl alcohol）のうちの１つであるヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。
【請求項２】
前記安息香酸誘導体は、４−ニトロ安息香酸（4-nitrobenzoic acid）、４−（ジメチルアミノ）安息香酸（4-(dimethylamino)benzoic acid）、２，４−ジニトロ安息香酸（2,4-dinitrobenzoic acid）、４−エチル安息香酸（4-ethylbenzoic acid）、３−アミノ−４−メチル安息香酸（3-amino-4-methylbenzoic acid）、４−メチルチオ酸（4-methylthiobenzoic acid）、フタル酸（phthalic acid）から組成されるグループから選択される１つである請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。
【請求項３】
前記フェニル酢酸誘導体は、４−アミノフェニル酢酸（4-aminophenylacetic acid）、４−ブロモフェニル酢酸（4-bromophenylacetic acid）、４−クロロフェニル酢酸（4- chlorophenylacetic acid）及び２−メトキシフェニル酢酸（2-methoxyphenylacetic acid）から組成される群から選択される１つである請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。
【請求項４】
前記安息香酸のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度が０．５mg/mlである。請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。
【請求項５】
前記安息香酸のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度が１mg/mlである請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。
【請求項６】
該トランス - 桂皮酸（trans-cinnamic acid）のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度が０．１２５mg/mlである請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。
【請求項７】
前記化合物Ａ中の安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体は、化合物Ｂが脂肪酸のβ‐酸化作用(β-oxidation)を経て発生され、該化合物Ｂは、安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体のうちの１つの前駆体化合物である請求項１に記載のヘリコバクター・ピロリを抑制する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリを抑制する方法に関し、特に、３−デヒドロシキミ酸（3-dehydroshikimate）の化学構造に類似する化合物を利用してシキミ酸代謝経路中の３−デヒドロキネートデヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のフィードバック阻害するヘリコバクター・ピロリを抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori, H.pylori)は、胃部表皮細胞に生息する螺旋状のグラム陰性菌であり、人類の胃粘膜の炎症を誘発する病原菌である。現在既に多くの研究によりヘリコバクター・ピロリ感染が多くの疾患と関連し、慢性胃炎(chronic gastritis)、胃潰瘍 (gastric ulcers)、十二指腸潰瘍(duodenal ulcers)、更には、胃癌(gastric cancer)、胃粘膜関連リンパ腫(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma; MALToma)等の癌症状と極めて大きな関連性を有することが証明されている。従って、世界保健機関(World Health Organization)は、１９９４年にヘリコバクター・ピロリを第一類の発癌性物質(group I carcinogen)に列している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリの取り扱いのコンセンサス会議は、三剤併用療法を提案しており、第一選択薬は、プロトンポンプ阻害剤(omeprazole)及び２種以上の抗生物質（clarithromycin、tetracycline、amoxicillin又はmetronidazole）である。そのうち、アモキシシリン（amoxicillin）及びテトラサイクリン（tetracyclie）は、薬剤耐性の報告があまり見られない。但し、テトラサイクリン及びアモキシシリンは、胃内環境状況、例えば、酸アルカリ値の影響を受け易いので（酸が強すぎる状況に適合しない）、例えば、表１に示すように（Megraud F.& Lamouliatte H. Aliment. Pharmacol. Ther.17:1333-1343(2003)）、最小発育阻止濃度(MIC90)は、ｐＨ値5.5では、ｐＨ値7.0より4倍及び8倍に上昇する。しばしば、インビボ（in vivo）で使用する時に、その効果を予測し難くなる。クラリスロマイシン（Clarithromycin）は、３剤併用治療方式の重要な組成であり、その薬剤耐性も高くないが、同様に胃内環境状況、例えば、酸アルカリ値の影響を受け易く、MIC90がｐＨ値5.5ではｐＨ値7.0に比べて8倍に上昇する。メトロニダゾール（metronidazole）のインビボでの治療効果は、インビトロ（in vitro）試験結果に最も近いものであり、薬物アレルギー試験によりこの薬物を選択するか否かの根拠とすることができる(Megraud and Lamouliatte, 2003)。メトロニダゾールの薬剤耐性の発生は、しばしば治療失敗の主要な原因となる（Debets-Ossenkopp et al., 1999）。最近の報告は、メトロニダゾールが西欧諸国で有病率が10％〜50％である（Ling et al., 1996; Lopez-Brea et al., 1997; Megraud, 1997; Megraud and Doermann, 1998; van der Wouden et al., 1997）。東台湾地区の現在の薬剤耐性割合は、メトロニダゾールが51.9％であり、アモキシシリンが36.1％であり、クラリスロマイシン（clarithromycin）が13.5％である(Hu et al., 2007)。現在の細菌薬剤耐性を解決する方式の多くは、抗生物質を交換することを採用し、例えば、モキシフロキサシン（moxifloxacin）又はレボフロキサシン（levofloxacin）により薬剤耐性が深刻なメトロニダゾールに取って代えるか(Schrauwen et al., 2009; Yoon et al., 2009)、治療中に直接抗生物質を追加し、４剤併用療法としている(quadruple rescue therapy)(Cheng and Hu, 2009)。薬物の副作用の多くは、抗生物質の使用と関連し、吐き気、下痢、便秘、嘔吐、腹部不快感等を含み、これは、主に、腸内細菌叢の変化によるものである(Adamsson et al., 1999)。
【０００４】
表一、ｐＨに応じて影響を受け易いヘリコバクター・ピロリに対する様々な抗生物質の最小発育阻止濃度（Minimal inhibitory concentration=MIC）
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【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明が提示するヘリコバクター・ピロリを抑制する方法は、化合物Ａを利用してシキミ酸代謝経路中の３−デヒドロキネートデヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のフィードバック阻害し、そのうち、該化合物Ａは、安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体、トランス - 桂皮酸（trans-cinnamic acid）、１，４−シクロヘキサンジカルボン酸（1,4-cyclohexanedicarboxylic acid）、４−インドフェニルボロン酸（4-indophenylboronic acid）又は３，４−ジメトキシアルコール（3,4-dimethoxybenzyl alcohol）のうちの１つである。
【０００６】
そのうち、該安息香酸誘導体は、４−ニトロ安息香酸（4-nitrobenzoic acid）、４−（ジメチルアミノ）安息香酸（4-(dimethylamino)benzoic acid）、２，４−ジニトロ安息香酸（2,4-dinitrobenzoic acid）、４−エチル安息香酸（4-ethylbenzoic acid）、３−アミノ−４−メチル安息香酸（3-amino-4-methylbenzoic acid）、４−メチルチオ酸（4-methylthiobenzoic acid）、フタル酸（phthalic acid）から組成されるグループから選択される１つである。
【０００７】
そのうち、該フェニル酢酸誘導体は、４−アミノフェニル酢酸（4-aminophenylacetic acid）、４−ブロモフェニル酢酸（4-bromophenylacetic acid）、４−クロロフェニル酢酸（4- chlorophenylacetic acid）及び２−メトキシフェニル酢酸（2-methoxyphenylacetic acid）から組成される群から選択される１つである。
【０００８】
そのうち、該安息香酸のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度が０．５mg/mlである。
【０００９】
そのうち、該安息香酸のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度が１mg/mlである。
【００１０】
そのうち、該トランス - 桂皮酸（trans-cinnamic acid）のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度が０．１２５mg/mlである。
【００１１】
そのうち、該化合物Ａ中の安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体は、化合物Ｂが脂肪酸のβ‐酸化作用(β-oxidation)を経て発生され、該化合物Ｂは、安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体のうちの１つの前駆体化合物である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の利点は、前記化合物Ａ又は化合物Ｂが胃内環境で酸アルカリ値の影響を受け難く、安定した菌抑制効果を維持することができることを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＰＢＳの二次元タンパク質電気泳動パターンである。
【図２】安息香酸の二次元タンパク質電気泳動パターンである。
【図３】フェニル酢酸の二次元タンパク質電気泳動パターンである。
【図４】トランス - 桂皮酸の二次元タンパク質電気泳動パターンである。
【図５】シキミ酸代謝経路において、３‐デヒドロキネートを３−デヒドロシキミ酸に変換する説明図である。
【図６】３，4‐ジメトキシベンジルアルコール、インドフェニルボロン酸、エタノール及びＨ２Ｏが培養基で形成される抑制圏の大きさの説明図である。
【図７】安息香酸及びフェニル酢酸及びトランス - 桂皮酸のヘリコバクター・ピロリに対する殺菌濃度試験結果の説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上記技術特徴を綜合し、本発明のヘリコバクター・ピロリを抑制する方法の主な効果は、下記の実施例で明確に呈現されることができる。
【００１５】
本発明が提供するヘリコバクター・ピロリを抑制する方法は、３−デヒドロシキミ酸（3-dehydroshikimate）の化学構造に類似する化合物Ａを利用してシキミ酸代謝経路中の３−デヒドロキネートデヒドラターゼ（3-dehydroquinate dehydratase）のフィードバック阻害し、そのうち、該化合物Ａは、安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体、トランス - 桂皮酸（trans-cinnamic acid）、又は１，４−シクロヘキサンジカルボン酸（1,4-cyclohexanedicarboxylic acid）、４−インドフェニルボロン酸（4-indophenylboronic acid）又は３，４−ジメトキシアルコール（3,4-dimethoxybenzyl alcohol）のうちの１つである。
【００１６】
また、前記化合物Ａ中の安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体は、化合物Ｂが脂肪酸のβ‐酸化作用(β-oxidation)を経て発生され、該化合物Ｂは、安息香酸、安息香酸誘導体、フェニル酢酸、フェニル酢酸誘導体のうちの１つの前駆体化合物である。そのうち、該化合物Ｂの剤型は、経口錠剤、経口液剤、注射溶液、カプセル又はリポソーム（Liposome）であることができる。
【００１７】
図１、図２及び図３、図４を参照し、それは、それぞれPBS、安息香酸及びフェニル酢酸及びトランス - 桂皮酸の二次元タンパク質電気泳動パターンであり、Ｘ軸がｐＨ値を表し、Ｙ軸が分子量（単位がkDaである）を表し、PBS、安息香酸及びフェニル酢酸のこの四つの二次元タンパク質電気泳動パターンにより表現され、 パフォーマンスに明らかな変化を有するタンパク質スポットを検出する。これら明らかな差異を有するタンパク質スポットは、更に、質量分析計で分析し、タンパク質データベース(NCBI database)で対比し、タンパク質の同一性を確認し、表２を併せて参照し、それは、３−デヒドロキネートデヒドラターゼ(HP-aroQ)のデータ列であり、質量分析の結果の退避により、タンパク質データベース中の３−デヒドロキネートデヒドラターゼのpI値及び分子量が何れも図１、図２、図３、図４中のタンパク質１で表される位置に適合し、対応して適合するタンパク質１の配列及び関連データ（検出された配列カバレッジ及び検出された配列数）が表３に列記される。従って、図１、図２、図３、図４中のタンパク質１が１つのパフォーマンスが増加したヘリコバクター・ピロリタンパク３−デヒドロキネートデヒドラターゼ(HP-aroQ)である。
【００１８】
表２、PBsで処置されたH. pylori J99により表される差次的に発現される代表的なたんぱく質
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【００１９】
表３、マッチタンパク質及びカバーペプチドのカバー配列
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【００２０】
図５に示すように、３−デヒドロキネートデヒドラターゼの酵素は、シキミ酸経路（shikimate pathway）の３番目の酵素であり、主な機能は、３−デヒドロキネートを３−デヒドロシキメートに転換することである。この代謝経度は、細菌、植物及び某寄生虫内にのみ存在し、細菌、植物及び寄生虫の生存が不可欠であり、主な機能は、芳香族アミノ酸の生成及び芳香族化合物の生成であり、L-フェニルアラニン（L-phenylalanine）、L-チロシン（L-tyrosine）、L-トリプトファン（L-tryptophan）、葉酸補因子（folate cofactors）、ユビキノン（ubiquinone）、ビタミンE、ビタミンKを含む。但し、哺乳動物内では、この種の経路がなく、即ち、この経路が必要とする酵素が欠乏しており、従って、本発明は、主に、３−デヒドロシキメートの化学構造に類似した前記化合物Ａ又は化合物Ｂを利用してシキミ酸代謝経路中の３−デヒドロキネートデヒドラターゼ(3-dehydroquinate dehydratase)をフィードバック阻害し、ヘリコバクター・ピロリに対する抑制の効果を発生する。特に説明すべき点として、前記化合物Ａ又は化合物Ｂは、主にそのベンゼン環、六環又は複素環の官能基によって３−デヒドロキネートデヒドラターゼの活性領域に作用する。
【００２１】
本発明は、具体的実施例において、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori J99, HP J99)を選択し、その供給元は、生物資源保存研究センター(BCRC，Bioresource Collection and Research Center)から購入する標準菌株である。培養条件は、ヘリコバクター・ピロリをCDC(CDC 嫌気性菌 5% 血液寒天, BD)培養基に接種し、３７℃で４８〜７２時間培養後である。ヘリコバクター・ピロリは、微好気性条件（5%O2, 10%CO2, 85%N2）中で培養する。前記化合物Ａ又は化合物Ｂが溶液に配置される時、何れもエタノールを溶解液として適当な濃度に配置される。
【００２２】
本発明の化合物Ａ又は化合物Ｂのヘリコバクター・ピロリを抑制する効果の試験は、先ず、ヘリコバクター・ピロリを含羊血液培養基CDCで４８〜７２時間培養した後、綿棒又は接種リングで菌体を削ぎ取って生理食塩水（0.9% NaCl)中に置き、吸光濃度を２膜ファーランド(1-4×108 /ml バクテリア)に調整し、ヘリコバクター・ピロリの菌体溶液を得る。続いて前記化合物Ａ又は化合物Ｂを濃度１０mg/ml〜１００mg/mlの試験液４０μlに配置し、白紙(blank paper discs, BBL)上に加え、乾燥させた後、培養基上の適当な位置に貼合する。３７℃の微好気下で４８時間培養した後、阻止帯が出現しているかを観察する。
【００２３】
本発明の具体的試験の化合物は、フェノキシ酸（Phenoxyacetic acid）、3,4 - ジヒドロ安息香酸（3,4-dihydrobenzoic acid）、3,5 - ジアミノ安息香酸（3,5-diaminobenzoic acid）、4 - アミノフェニル酢酸（4-aminophenylacetic acid）、4 - ニトロ安息香酸（4-nitrobenzoic acid）、2,4 - ジニトロ安息香酸（2,4-dinitrobenzoic acid）、4 - （ジメチルアミノ）安息香酸（4-(dimethylamino)benzoic acid）、2-メトキシフェニル酢酸（2-methoxyphenylacetic acid）、3-アミノ-4-メチル安息香酸（3-amino-4-methylbenzoic acid）、4 - メチル安息香酸（4-methylthiobenzoic acid）、1,4 - シクロヘキサンジカルボン酸（1,4-cyclohexanedicarboxylic acid）、フタル酸（phthalic acid）、トランス- 桂皮酸（Trans-cinnamic acid）、4 - エチル安息香酸（4-ethylbenzoic acid）、フェニル酢酸（Phenylacetic acid）、安息香酸（Benzoic acid）、3 - フェニルプロピオン酸（3-phenylpropionic acid）、4 - フェニル酪酸（4-phenylbutyric acid）、3,4 - ジメトキシベンジルアルコール（3,4-dimethoxybenzyl alcohol）（１）、インドフェニルボロニック酸（２）、エタノール対照群（３）及び水（４）を有する。図６を参照し、それは、3,4 - ジメトキシベンジルアルコール（3,4-dimethoxybenzyl alcohol）（1）、4 - インドフェニルボロニック酸 （4-indophenylboronic acid）（２）、エタノール（３）及び水（４）が培養基上で発生する抑制圏の大きさであり、そのうち、白紙（Ｂ）（blank paper discs, BBL）の直径（ｄ）が８ｍｍであり、エタノール（３）及び水（４）は、抑制効果を有さないので、エタノール（３）及び水（４）をドロップした白紙（Ｂ）（blank paper discs, BBL）周囲は、抑制圏が形成されず、3,4 - ジメトキシベンジルアルコール（１）及び4 - インドフェニルボロニック酸（２）をドロップした白紙（Ｂ）（blank paper discs, BBL）周囲は、それぞれ直径（d1）が２０ｍｍ及び直径（d2）が３５ｍｍの抑制圏が形成される。表４は、前記試験化合物の培養基上の抑制圏の大きさを示し、抑制圏の直径に基づき、反端し、4 - インドフェニルボロニック酸がヘリコバクター・ピロリに対し、最も強い抑制能力を有することが分かり、白紙上に１ｍｇの4 - インドフェニルボロニック酸をドロップした場合、７０ｍｍの抑制圏を形成することができる。その他の前記試験化合物は、何れも大きさが一定しない抑制圏を形成することができる。
【００２４】
表４、ヘリコバクター・ピロリを阻害する異なる濃度の脂肪酸を用いて拡散法によって得られる抑制圏直径（ｍｍ）
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【００２５】
最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentrations, MBC）に関する特定は、異なる薬剤濃度で、一定時間試験細菌と作用させた後、溶液を段階的に希釈した後、塗布方式で細菌を培養基上で生長させる必要がある。この時、薬剤濃度は、既に段階希釈及び塗布方式の２種の処理後に希釈して抑制能力を有さず、細菌は、成長することができる。この時、培養液をクリアな菌液中で、細菌が既に死亡しているか否かを区分することができる。ただ該濃度の薬剤の抑制を受けて生長できないだけであれば、前記処理を経た後に生長することができ、コロニー方式で発現させることができる。本発明の具体的実施例において、ヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)を２日間予め培養した後、生理食塩水でヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)の菌体を溶解し、菌体濃度を２膜ファーランドに調整し、適当な濃度の安息香酸又はフェニル酢酸を加えて３７℃で１〜２時間培養した後、段階希釈を経て、１００μlを取り出し、ＣＤＣ上に塗布し、３７℃且つ微好気性条件で２日間培養し、コロニー数値を記録し、対照群９９.９％に低減を最小殺菌濃度とする。図７を参照し、それは、安息香酸及びフェニル酢酸のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度の試験結果であり、そのうち、安息香酸及びフェニル酢酸及びトランス - 桂皮酸のヘリコバクター・ピロリ(H. pylori J99)に対する最小殺菌濃度がそれぞれ０．５mg/ml及び１ mg/ml及び０．１２５mg/mlである。
【００２６】
本発明が使用する前記化合物Ａ又は化合物Ｂは、胃内環境で酸アルカリ値の影響を受け難く、安定した菌抑制効果を維持することができ、表５に示すように安息香酸及びフェニル酢酸及びトランス - 桂皮酸の酸アルカリ値が６．０〜７．０での試験であり、試験結果は、安息香酸及びフェニル酢酸の酸アルカリ値６．０〜７．０の間でＭＩＣ値が何れも０．０６及び０．１２５及び０．０１５であり、変化を発生していないので、酸環境で安定効果を有する抗菌物質である。
【００２７】
表５、ヘリコバクター・ピロリ（H. pylori J99）に対する異なるｐＨで安息香酸及びフェニル酢酸の最小殺菌濃度の決定
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【符号の説明】
【００２８】
１  ３，４−ジメトキシベンジルアルコール
２  ４−インドフェニルボロン酸
３  エタノール
４  水
Ｂ  白紙
ｄ  直径
ｄ１  直径
ｄ２  直径
【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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