(57)【要約】【課題】灌流液を臓器内に十分に拡散させることができる、臓器灌流方法および装置を提供すること。【解決手段】臓器に灌流液を導入し、臓器から灌流液を導出する際に、臓器に対して振動を与えながら、臓器と灌流液とを接触させることを特徴とする。臓器灌流装置１０は、臓器４１を収容する臓器収容容器１１と、臓器収容容器１１に収容された臓器４１に灌流液を導入する第１流路１２と、臓器収容容器１１に収容された臓器４１から灌流液を導出する第２流路１３と、臓器収容容器１１に収容された臓器４１に対して振動を与える振動発生装置１４と、を備え、灌流液の流速および振動発生装置１４の稼動を制御することにより、臓器と灌流液との接触時に、振動発生装置１４によって、臓器に対して振動を与える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から摘出された臓器に灌流液を導入し、前記臓器から前記灌流液を導出する臓器灌流方法であって、
前記臓器に対して振動を与えながら、前記臓器と前記灌流液とを接触させることを特徴とする、臓器灌流方法。
【請求項２】
前記臓器が保存液に収容されており、
前記保存液を介して前記臓器に対して振動を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記臓器が臓器収容容器中の保存液に収容されており、
前記臓器収容容器を振動させることにより、前記臓器に対して振動を与える、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記臓器が臓器収容容器中の保存液に収容されており、
前記保存液を超音波で振動させることにより、前記臓器に対して振動を与える、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記灌流液が、細胞可溶化剤を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記灌流液が、細胞を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、未分化細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記臓器が、脱細胞化された臓器である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
生体から摘出された臓器を収容する臓器収容容器と、
前記臓器収容容器に収容された臓器に灌流液を導入する第１流路と、
前記臓器収容容器に収容された臓器から灌流液を導出する第２流路と、
前記臓器収容容器に収容された臓器に対して振動を与える振動発生装置と、
を備え、
前記灌流液の流速および前記振動発生装置の稼動を制御することにより、前記臓器と前記灌流液との接触時に、前記振動発生装置によって、前記臓器に対して前記振動を与える、臓器灌流装置。
【請求項１０】
前記振動発生装置が、前記臓器収容容器を振動させる振動器、または前記臓器を振動させる超音波を発生する超音波発生装置である、請求項９に記載の臓器灌流装置。
【請求項１１】
前記第１流路は、前記臓器に導入する灌流液を収容する容器を含む、請求項９または１０に記載の臓器灌流装置。
【請求項１２】
前記第２流路は、前記臓器から導出された灌流液を含む液体を回収する回収部を含む、請求項９〜１１のいずれかに記載の臓器灌流装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器灌流方法および臓器灌流装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
深刻化する臓器移植のドナー不足を解決するために、人工臓器の作製が検討されている。人工臓器としては、機械式人工臓器、脱細胞化した臓器に細胞を播種した人工臓器（以下、「脱細胞型人工臓器」ともいう）などが提案されている。これらの人工臓器の中でも、脱細胞型人工臓器は、生体適合性が高いという利点がある。臓器の脱細胞化、脱細胞化された臓器の再細胞化を行なう方法として、例えば、特許文献１に記載の方法が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３／１０９０８８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
臓器の灌流により、臓器の脱細胞化、脱細胞化された臓器の再細胞化などを実施する場合、効率良く脱細胞化、再細胞化を実施するためには、灌流液を臓器内に十分に拡散させる必要がある。本発明は、灌流液を臓器内に十分に拡散させることができる、臓器灌流方法および装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の１つの側面は、臓器に灌流液を導入し、臓器から灌流液を導出する臓器灌流方法であって、臓器に対して振動を与えながら、臓器と灌流液とを接触させることを特徴とする、臓器灌流方法を含む。
【０００６】
本発明の他の側面は、臓器を収容する臓器収容容器と、臓器収容容器に収容された臓器に灌流液を導入する第１流路と、臓器収容容器に収容された臓器から灌流液を導出する第２流路と、臓器収容容器に収容された臓器に対して振動を与える振動発生装置と、を備え、灌流液の流速および振動発生装置の稼動を制御することにより、臓器と灌流液との接触時に、振動発生装置によって、臓器に対して前記振動を与える、臓器灌流装置を含む。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、灌流液を臓器内に十分に拡散させることができる、臓器灌流方法および装置を提供できる。これにより、臓器の脱細胞化、脱細胞化された臓器の再細胞化などを効率よく実施することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】臓器灌流装置の構成を示す概略説明図である。
【図２】細胞の導入および細胞の回収を行なう際の手順を示す工程図である。
【図３】臓器の洗浄を行なう際の臓器灌流装置の灌流部の動作状態を示す回路図である。
【図４】灌流液による臓器の灌流を行なう際の臓器灌流装置の灌流部の動作状態を示す回路図である。
【図５】第１流路への細胞の導入を行なう際の臓器灌流装置の灌流部の動作状態を示す回路図である。
【図６】臓器への細胞の導入を行なう際の臓器灌流装置の灌流部の動作状態を示す回路図である。
【図７】細胞培養を行なう際の臓器灌流装置の灌流部の動作状態を示す回路図である。
【図８】細胞回収を行なう際の臓器灌流装置の灌流部の動作状態を示す回路図である。
【図９】装置の洗浄を行なう際の臓器灌流装置の灌流部の動作状態を示す回路図である。
【図１０】実施例１、２および４で用いられた臓器灌流装置の構成を示す概略説明図である。
【図１１】比較例１〜３で用いられた臓器灌流装置の構成を示す概略説明図である。
【図１２】（Ａ）は実施例１および比較例１において、白血球数に基づく結果を示すグラフ、（Ｂ）は赤血球数に基づく結果を示すグラフ、（Ｃ）は血小板数に基づく結果を示すグラフである。
【図１３】（Ａ）は実施例２において、脾臓に振動を与えながら灌流を行なったときの脾臓の経時的変化を観察した結果を示す図面代用写真、（Ｂ）は比較例２において、脾臓に振動を与えずに灌流を行なったときの脾臓の経時的変化を観察した結果を示す図面代用写真である。
【図１４】灌流時間と臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合との関係を調べた結果を示すグラフである。
【図１５】実施例３で用いられた臓器灌流装置の構成を示す概略説明図である。
【図１６】（Ａ）は実施例３および比較例３において、白血球数に基づく結果を示すグラフ、（Ｂ）は赤血球数に基づく結果を示すグラフ、（Ｃ）は血小板数に基づく結果を示すグラフである。
【図１７】実施例４において、回転速度と、血球細胞数の比との関係を調べた結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．臓器灌流方法
臓器灌流とは、臓器に灌流液を導入し、臓器から灌流液を導出することを意味する。本実施形態の臓器灌流方法は、臓器に対して振動を与えながら、臓器と灌流液とを接触させることを特徴とする。
【００１０】
本実施形態に係る臓器灌流方法は、臓器に対して振動を与えながら、臓器と灌流液とを接触させることにより、灌流液を臓器内に行き渡らせて十分に拡散させることができる。本実施形態に係る臓器灌流方法は、（１）臓器の脱細胞化、（２）脱細胞化された臓器の再細胞化、（３）臓器への細胞導入、（４）臓器からの細胞の回収などの用途に用いることができる。
【００１１】
臓器は、灌流対象の臓器であれば、実質臓器であってもよく、管腔臓器であってもよい。灌流対象の実質臓器としては、例えば、心臓、肝臓、肺、脾臓、すい臓、腎臓、脳、骨などが挙げられるが、特に限定されない。灌流対象の管腔臓器としては、例えば、小腸、子宮、膀胱、などが挙げられるが、特に限定されない。臓器の供給源としては、例えば、ブタ、マウス、ニワトリ、ウサギ、ウシ、ヒツジ、イヌなどの非ヒト動物などが挙げられるが、特に限定されない。臓器は、上述の用途に応じて、脱細胞化されていない臓器および脱細胞化された臓器のいずれかが用いられる。
【００１２】
灌流液としては、例えば、培地、臓器保存液、生理食塩水、リンゲル液、クレブス−リンガー液などが挙げられるが、特に限定されない。培地としては、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉａ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地などが挙げられるが、特に限定されない。臓器保存液としては、セルシオ（Ｃｅｌｓｉｏｒ）液、ＬＰＤ（Ｌｏｗ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｄｅｘｔｒａｎ）液、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液などの細胞外液型、ユーロ−コリンズ（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉｎｓ）液、ＵＷ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）液などの細胞内液型保存液などが挙げられるが、特に限定されない。臓器保存液は、細胞外液型保存液であってもよく、細胞内液型保存液であってもよい。灌流液には、必要に応じ、細胞の維持などに適した添加物、例えば、血漿、血清、アミノ酸などが含まれていてもよい。
【００１３】
臓器の脱細胞化の場合、灌流液は、細胞可溶化剤を含むことができる。細胞可溶化剤としては、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムなどのアニオン性界面活性剤、ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（商品名：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などの非イオン性界面活性剤などの界面活性剤；トリプシンなどのタンパク質分解酵素；ポリエチレングリコールなどの高分子化合物などが挙げられるが、特に限定されない。また、この場合、灌流液は、エンドヌクレアーゼなどの核酸分解酵素をさらに含んでいてもよい。
【００１４】
脱細胞化された臓器の再細胞化または臓器への細胞導入の場合、灌流液は、細胞を含むことができる。また、培地を含む灌流液を用いることができる。
【００１５】
本実施形態に係る臓器灌流方法を臓器への細胞導入に用いる場合、細胞として、例えば、未分化細胞を用いることができる。本明細書において、「未分化細胞」とは、細胞系譜において、最終分化に至っていない細胞をいう。未分化細胞としては、例えば、幹細胞、前駆細胞などが挙げられるが、特に限定されない。幹細胞としては、胚性幹細胞、ＭＵＳＥ細胞（ＭＵｌｔｉｌｉｎｉａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）、ｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、間葉系幹細胞、神経幹細胞、上皮幹細胞、肝幹細胞、生殖幹細胞、造血幹細胞、骨格筋幹細胞などが挙げられるが、特に限定されない。前駆細胞としては、血管内皮前駆細胞、血小板前駆細胞、肝臓前駆細胞、心臓前駆細胞、神経前駆細胞などが挙げられるが、特に限定されない。血小板前駆細胞としては、例えば、巨核球前駆細胞、巨核芽球、前巨核球、成熟巨核球などが挙げられるが、特に限定されない。肝臓前駆細胞としては、肝芽細胞、肝前駆細胞、肝星細胞前駆細胞、肝幹前駆細胞などが挙げられるが、特に限定されない。心臓前駆細胞としては、心筋前駆細胞などが挙げられるが、特に限定されない。神経前駆細胞としては、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞などが挙げられるが、特に限定されない。細胞として未分化細胞を用いた場合、臓器内で未分化細胞を培養することで最終分化細胞への分化を行なうことができる。本明細書において、「最終分化細胞」とは、細胞系譜において、最終分化に至った細胞をいう。最終分化細胞としては、例えば、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、肝中皮細胞、胆管上皮細胞、肝星細胞、肝類洞内皮細胞、クッパー細胞、ピット細胞、血管内皮細胞、膵管上皮細胞、膵導管細胞、腺房中心細胞、腺房細胞、ランゲルハンス島、心筋細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、１型肺胞上皮細胞、２型肺胞上皮細胞、クララ細胞、線毛上皮細胞、基底細胞、杯細胞、神経内分泌細胞、クルチッキー細胞、尿細管上皮細胞、尿路上皮細胞、円柱上皮細胞、糸球体上皮細胞、糸球体内皮細胞、蛸足細胞、メサンギウム細胞、神経細胞、アストロサイト、ミクログリア、オリゴデンドロサイトなどが挙げられるが、特に限定されない。
【００１６】
脱細胞化された臓器の再細胞化の場合、細胞として、未分化細胞および／または最終分化細胞を用いることができる。
【００１７】
臓器への灌流液の導入および導出に際し、臓器は、保存液中に浸漬することが好ましい。保存液としては、臓器保存液、生理食塩水、リンゲル液などが挙げられるが、特に限定されない。臓器保存液としては、例えば、セルシオ液、ＬＰＤ液、ＥＴ−Ｋｙｏｔｏ液などの細胞外液型保存液、ユーロ−コリンズ液、ＵＷ液などの細胞内液型保存液などが挙げられるが、特に限定されない。臓器保存液は、細胞外液型保存液であってもよく、細胞内液型保存液であってもよい。保存液は、灌流液と同じ液であってもよく、灌流液と異なる液であってもよい。
【００１８】
本明細書において、「振動」は、臓器自体に外的な力を直接加えて臓器自体を振動させること、および保存液中に浸漬された臓器の周囲の保存液または臓器が収容された容器を振動させて間接的に臓器を振動させることを含む。臓器の振動には、例えば、振盪器、超音波発生器などを用いることができる。振盪器および超音波発生器として、市販のものを用いることができる。振盪器の例として、アズワン製ラボシェーカーＳＲＲ−２が挙げられる。超音波発生器の例として、アズワン製ＵＳＫシリーズが挙げられる。臓器の振動には、手などで臓器に力を加えることも含まれる。なお、本明細書における「振動」の概念は、通常の灌流によって生じる、意図的ではない臓器の振動を含まない。
【００１９】
振盪器によって臓器の振動を行なう場合、振盪器の回転速度は、灌流液を臓器全体に行き渡らせて十分に拡散させる観点から、好ましくは５０ｒｐｍ以上、より好ましくは１００ｒｐｍ以上である。また、振盪器の回転速度は、保存液の臓器収容容器外への漏出抑制、臓器の損傷防止などの観点から、好ましくは５００ｒｐｍ以下、より好ましくは４００ｒｐｍ以下である。また、振盪器の振幅は、灌流液を臓器全体に行き渡らせて十分に拡散させる観点から、好ましくは１０ｍｍ以上、より好ましくは２５ｍｍ以上である。振盪器の振幅は、臓器の機能を良好な状態に維持する観点から、好ましくは１００ｍｍ以下、より好ましくは７５ｍｍ以下である。振盪器の加振方向は、振盪器の底面を基準として前後方向、左右方向および回転方向のいずれであってもよい。超音波発生器によって臓器の振動を行なう場合、超音波の周波数は、灌流液を臓器全体に行き渡らせて十分に拡散させる観点から、好ましくは２０ｋＨｚ以上である。また、超音波の周波数は、臓器の機能を良好な状態に維持する観点から、好ましくは５０ｋＨｚ以下である。振盪器による振盪、超音波による振盪の他に、臓器を保存する容器内を保存液で満たし、スターラーなどを用いて保存液を攪拌することにより、臓器を振動させてもよい。
【００２０】
本明細書において、「臓器と灌流液との接触」には、灌流をしている間の臓器と灌流液との状態、および灌流液を臓器に導入した後に一時的に灌流を停止している時の臓器と灌流液との状態が含まれる。
【００２１】
本実施形態に係る臓器灌流方法の用途などに応じて、臓器と灌流液との接触に先立って、臓器を洗浄液によって洗浄できる。洗浄液としては、上述の臓器保存液、生理食塩水、リンゲル液、クレブス−リンガー液などが挙げられるが、特に限定されない。臓器の洗浄とは、血管を通して臓器内に洗浄液を導入し、血管を通して臓器から洗浄液を導出する工程をいう。臓器の洗浄により、例えば、臓器内に存在する血球細胞などを臓器内から除去することができる。
【００２２】
洗浄液の流速は、例えば、臓器の洗浄を十分に行なう観点から、好ましくは０．０１ｍＬ／ｍｉｎ以上、より好ましくは０．１ｍＬ／ｍｉｎ以上である。また、洗浄液の流速は、臓器の損傷防止などの観点から、好ましくは１００ｍＬ／ｍｉｎ以下、より好ましくは２０ｍＬ／ｍｉｎ以下である。臓器の洗浄時間は、例えば１〜３０００分間、好ましくは１５〜１５００分間、より好ましくは６０〜１０００分間、さらに好ましくは１００〜８００分間、特に好ましくは２００〜６００分間であるが、特に限定されない。
【００２３】
灌流液の流速は、臓器の灌流において一般的に用いられる流速であればよい。灌流液の流速は、例えば、チューブおよび血管を通して臓器内に安定的に灌流液を導入する観点から、好ましくは０．０１ｍＬ／ｍｉｎ以上、より好ましくは０．１ｍＬ／ｍｉｎ以上である。また、灌流液の流速は、臓器の機能を良好な状態に維持する観点から、好ましくは１００ｍＬ／ｍｉｎ以下、より好ましくは２０ｍＬ／ｍｉｎ以下である。
【００２４】
臓器と灌流液との接触時の灌流液の温度は、例えば、臓器の脱細胞化の場合は、４〜４０℃、好ましくは４〜２５℃であるが、特に限定されない。また、臓器に細胞を導入する場合は、４〜４０℃、好ましくは２０〜３８℃であるが、特に限定されない。臓器と灌流液との接触時の臓器の温度は、例えば、臓器の脱細胞化の場合は、４〜４０℃、好ましくは４〜２５℃であるが、特に限定されない。また、臓器に細胞を導入する場合は、４〜４０℃、好ましくは２０〜３８℃であるが、特に限定されない。
【００２５】
灌流液と臓器との接触時間は、例えば、本実施形態に係る臓器灌流方法の用途などに応じて、適宜決定できる。
【００２６】
以下、本実施形態に係る臓器灌流方法の手順の概略を用途ごとに説明する。
【００２７】
（１）脱細胞化
「脱細胞化」とは、臓器灌流によって、臓器の一部または全部の細胞を臓器から脱離させることをいう。臓器の脱細胞化は、例えば、細胞可溶化剤を含む灌流液を臓器内に導入して灌流液と臓器とを接触させることによって行なうことができる。
【００２８】
灌流液と臓器との接触時間は、灌流液を臓器全体に行き渡らせて十分に拡散させる観点から、好ましくは６０分間以上、より好ましくは１２０分間以上である。灌流液と臓器との接触時間の上限は、例えば、臓器の種類、大きさ、脱細胞化の度合いなどに応じて適宜決定できる。なお、本明細書において、脱細胞化の際の灌流液と臓器との接触時間は、脱細胞化に用いられる灌流液を臓器に灌流させる時間の総和をいう。
【００２９】
脱細胞化された臓器の確認は、例えば、下記（Ａ１）、（Ｂ１）、（Ｃ１）などによって行なうことができる。
（Ａ１）得られた臓器の組織切片を組織学的に染色し、検出可能な細胞の存在と、細胞外マトリックスから構成される構造の維持とを調べること。
（Ｂ１）得られた臓器の色の変化を調べること。
（Ｃ１）得られた臓器における遺伝子の発現量を調べること。
【００３０】
（２）再細胞化
「再細胞化」とは、脱細胞化された臓器に細胞を導入し、脱細胞化された臓器の一部または全体で導入された細胞を生着させることをいう。脱細胞化された臓器の再細胞化は、例えば、以下のステップなどによって行なうことができる。まず、細胞を脱細胞化された臓器に導入する。その後、培養を行なう。これにより、脱細胞化された臓器の再細胞化を行なうことができる。臓器への細胞の導入は、例えば、下記方法（２−１）、（２−２）、（２−３）などによって行なわれる。
（２−１）細胞を含んだ還流液を臓器に灌流させること。
（２−２）細胞を含まない灌流液の灌流後、細胞を含む灌流液を臓器に灌流させること。
（２−３）細胞を含まない灌流液の灌流後、灌流を停止させて細胞を灌流系内に導入し、培地を含む灌流液とともに臓器に灌流させること。
【００３１】
灌流液と臓器との接触時間は、灌流液を臓器全体に行き渡らせて十分に拡散させる観点から、好ましくは５分間以上、より好ましくは２０分間以上である。灌流液と臓器との接触時間の上限は、例えば、臓器の種類、再細胞化の度合いなどに応じて適宜決定できる。本明細書において、再細胞化の際の灌流液と臓器との接触時間は、下記（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）をいう。
（Ｉ）細胞を含んだ灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ｂ１と、培地を含む灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ｃ１と、培養を行う培養時間Ｄ１との総和（灌流時間Ｂ１＋灌流時間Ｃ１＋培養時間Ｄ１）。
（ＩＩ）細胞を含まない灌流液を臓器に還流させる灌流時間Ａ２と、細胞を含む灌流液を臓器に灌流させる時間Ｂ２と、培地を含む灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ｃ２と、灌流培養を行なう培養時間Ｄ２との総和（灌流時間Ａ２＋灌流時間Ｂ２＋灌流時間Ｃ２＋培養時間Ｄ２）。
（ＩＩＩ）細胞を含まない灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ａ３と、灌流を停止して細胞を灌流系内に導入する停止時間Ｂ３と、培地を含む灌流液を臓器に還流させる灌流時間Ｃ３と、培養を行なう培養時間Ｄ３との総和（灌流時間Ａ３＋停止時間Ｂ３＋灌流時間Ｃ３＋培養時間Ｄ３）。
【００３２】
灌流時間Ｂ１は、細胞を含む灌流液を臓器全体に行き渡らせて灌流液に含まれる細胞を拡散させるに十分な時間であればよい。灌流時間Ｂ１は、例えば、好ましくは１分間以上、より好ましくは５分間以上である。灌流時間Ｃ１は、培地を含む灌流液を臓器全体に行き渡らせて灌流液に含まれる培地を拡散させるに十分な時間であればよい。灌流時間Ｃ１は、例えば、好ましくは１分間以上、より好ましくは１０分間以上である。培養時間Ｄ１は、脱細胞化された臓器内に細胞を接着させるのに十分な時間であればよい。培養時間Ｄ１は、例えば、好ましくは３０分間以上、より好ましくは１時間以上、さらに好ましくは３時間以上である。灌流時間Ａ２は、例えば、好ましくは１分間以上、より好ましくは１０分間以上である。灌流時間Ｂ２は、灌流時間Ｂ１と同様である。灌流時間Ｃ２は灌流時間Ｃ１と同様である。培養時間Ｄ２は、培養時間Ｄ１同様である。灌流時間Ａ３は、灌流時間Ａ２と同様である。停止時間Ｂ３は、灌流系内に細胞を導入するのに十分な時間であればよい。停止時間Ｂ３は、例えば、好ましくは１０分間以下、より好ましくは５分間以下、さらに好ましくは１分間以下である。灌流液の停止のタイミングは、灌流系への細胞の導入開始と同時であってもよく、灌流系内への細胞の導入開始時から所定時間経過後であってもよい。かかる所定時間は、例えば、好ましくは０．０１〜１０００秒間、より好ましくは０．１〜１００秒間である。灌流時間Ｃ３は、細胞を臓器全体に行き渡らせて細胞を拡散させるに十分な時間であればよい。灌流時間Ｃ３は、例えば、好ましくは１分間以上、より好ましくは１０分間以上である。培養時間Ｄ３は、培養時間Ｄ２と同様である。
【００３３】
再細胞化された臓器の確認は、例えば、下記（Ａ２）、（Ｂ２）、（Ｃ２）、（Ｄ２）などによって行なうことができる。
（Ａ２）得られた臓器の組織切片を組織学的に染色し、検出可能な細胞の存在を調べること。
（Ｂ２）得られた臓器の色の変化を調べること。
（Ｃ２）得られた臓器における遺伝子の発現量を調べること。
（Ｄ２）得られた臓器におけるタンパク質の発現量を調べること。
【００３４】
（３）臓器への細胞導入
本明細書において、「臓器への細胞導入」とは、脱細胞化されていない臓器に所定の細胞を導入することをいう。ここで、「脱細胞化されていない臓器」とは、インタクトな臓器または臓器の一部もしくは全体が再細胞化された臓器をいう。ここで、インタクトな臓器とは、生体から摘出された後、実質的に何らかの処理を受けていない臓器のことをいう。例えば、摘出後の臓器に付着した血液などを洗い流した臓器は、ここでいう「インタクトな臓器」に含まれる。導入対象の細胞としては、例えば、未分化細胞、最終分化細胞が挙げられるが、特に限定されない。
【００３５】
導入対象の細胞が未分化細胞である場合、臓器内に導入された未分化細胞が分化する。したがって、分化後の細胞、分化した細胞の産生物およびこれらの両方が得られる。未分化細胞が巨核球系前駆細胞である場合、巨核球系前駆細胞を、例えば、脾臓などの臓器へ導入する。この場合、巨核球系前駆細胞は、巨核球に分化する。また、巨核球は、血小板を産生する。したがって、血小板が得られる。
【００３６】
臓器への細胞導入は、例えば、細胞を臓器に導入して培養することによって行なうことができる。臓器への細胞の導入は、例えば、下記方法（３−１）、（３−２）、（３−３）などによって行なわれる。
（３−１）細胞を含む灌流液を臓器に灌流させること。
（３−２）細胞を含まない灌流液の灌流後、細胞を含む灌流液を臓器に灌流させること。
（３−３）細胞を含まない灌流液の灌流後、灌流を停止させて細胞を灌流系内に導入し、培地を含む灌流液とともに臓器に灌流させること。
【００３７】
灌流液と臓器との接触時間は、灌流液を臓器全体に行き渡らせて十分に拡散させる観点から、好ましくは６０分間以上、より好ましくは１２０分間以上、さらに好ましくは１８０分間以上である。灌流液と臓器との接触時間の上限は、例えば、目的の細胞の種類、臓器の大きさなどに応じて適宜決定できる。本明細書において、細胞を含む灌流液と臓器との接触時間は、下記（ＩＶ）、（Ｖ）または（ＶＩ）をいう。
（ＩＶ）細胞を含む灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ｂ４と、培地を含む灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ｃ４と、培養を行なう培養時間Ｄ４との総和（灌流時間Ｂ４＋灌流時間Ｃ４＋培養時間Ｄ４）
（Ｖ）細胞を含まない灌流液を臓器に還流させる灌流時間Ａ５と、細胞を含む灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ｂ５と、培地を含む灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ｃ５と、培養を行なう培養時間Ｄ５との総和（灌流時間Ａ５＋灌流時間Ｂ５＋灌流時間Ｃ５＋培養時間Ｄ５）、または
（ＶＩ）細胞を含まない灌流液を臓器に灌流させる灌流時間Ａ４と、灌流を停止して細胞を灌流系内に導入する停止時間Ｂ４と、培地を含む灌流液を臓器に還流させる灌流時間Ｃ４と、培養を行なう培養時間Ｄ４との総和（灌流時間Ａ４＋停止時間Ｂ４＋灌流時間Ｃ４＋培養時間Ｄ４）。
【００３８】
灌流時間Ｂ４は、細胞を含む灌流液を臓器全体に行き渡らせて灌流液に含まれる細胞を拡散させるに十分な時間であればよい。灌流時間Ｃ４は、培地を含む灌流液を臓器全体に行き渡らせて灌流液に含まれる培地を拡散させるに十分な時間であればよい。灌流時間Ｃ４は、例えば、好ましくは５分間以上、より好ましくは１５分間以上である。培養時間Ｄ４は、臓器の種類、細胞の種類に応じて決めればよい。培養時間Ｄ４は、例えば、好ましくは１時間以上、より好ましくは２時間以上、さらに好ましくは３時間以上である。また、灌流時間Ａ５は、例えば、好ましくは１０分間以上、より好ましくは３０分間以上である。灌流時間Ｂ５は、灌流時間Ｂ４と同様である。灌流時間Ｃ５は、灌流時間Ｃ４と同様である。培養時間Ｄ５は、培養時間Ｄ４と同様である。一方、灌流時間Ａ６は、灌流時間Ａ５と同様である。停止時間Ｂ６は、灌流系内に細胞を導入するのに十分な時間であればよい。停止時間Ｂ６は、例えば、好ましくは１０分間以下、より好ましくは５分間以下である。灌流液の停止のタイミングは、灌流系内への細胞の導入開始と同時であってもよく、灌流系内への細胞の導入開始時から所定時間経過後であってもよい。かかる所定時間は、例えば、好ましくは０．０１〜１０００秒間、より好ましくは０．１〜１００秒間である。灌流時間Ｃ６は、灌流時間Ｃ５と同様である。培養時間Ｄ６は、培養時間Ｄ５と同様である。
【００３９】
（４）臓器からの細胞の回収
臓器からの細胞の回収は、例えば、以下のステップなどによって行なうことができる。灌流液を臓器内に導入し、臓器から導出される特定の細胞を含んだ灌流液を回収する。
【００４０】
灌流液と臓器との接触時間は、より多くの細胞を回収する観点から、好ましくは１分間以上、より好ましくは１０分間以上である。灌流液と臓器との接触時間の上限は、例えば、臓器の種類、臓器の大きさ、回収する細胞の種類などに応じて適宜決定できる。なお、本明細書において、臓器から細胞を回収する際の灌流液と臓器との接触時間は、臓器からの細胞の回収に用いられる灌流液を臓器に灌流させる時間の総和をいう。
【００４１】
細胞の回収は、例えば、以下のステップを行なうことができる。臓器から導出された灌流液から細胞を分離する。灌流液からの細胞の分離は、例えば、遠心分離などによって行なうことができる。つぎに、分離された細胞から特定の細胞を取得する。分離された細胞からの特定の細胞の取得は、当該特定の細胞に特異的に結合する物質、例えば、抗体などを用いたアフィニティークロマトグラフィー、蛍光染色によるセルソーティングなどによって行なうことができる。
【００４２】
回収された細胞の種類の確認は、例えば、回収された細胞のマーカーの発現を調べること、回収された細胞の形状を調べること、回収された細胞の機能を調べることなどによって行なうことができる。
【００４３】
２．臓器灌流装置
［臓器灌流装置の構成］
以下、添付図面を参照しつつ、本実施形態に係る臓器灌流装置を詳細に説明する。本実施形態に係る臓器灌流装置は、前述した臓器灌流方法に用いることができる。図１に示される臓器灌流装置１０は、灌流部１０ａと、制御部１９とを備える。灌流部１０ａは、臓器収容容器１１と、臓器４１に灌流液を導入する第１流路１２と、臓器４１から灌流液を導出する第２流路１３と、臓器４１に対して振動を与える振動発生装置１４とを備える。また、本実施形態において、灌流部１０ａは、漏液センサ１５と、撮影部１６と、細胞導入口１７と、細胞回収口１８とを備える。
【００４４】
臓器収容容器１１は、灌流対象の臓器４１および臓器４１の保存液４２を収容する容器である。臓器収容容器１１は、開口部を有する開放系の容器であってもよく、密閉可能な容器であってもよい。臓器収容容器１１の容量は、臓器４１および保存液４２を収容するのに十分な容量であればよい。臓器４１に振動を与える際に臓器収容容器１１からの漏液を抑制する観点から、臓器収容容器１１の容量は、臓器４１および保存液４２の合計体積よりも多いことが好ましい。通常、臓器収容容器１１の容量は、臓器４１および保存液４２の合計体積の１．２倍以上であることが好ましく、５倍以上であることがより好ましい。臓器収容容器１１の容量の上限は、臓器灌流装置１０に求められる大きさ、臓器の大きさなどに応じて適宜設定できる。臓器収容容器１１に収容された臓器４１および保存液４２は、所定温度に保たれる。したがって、臓器収容容器１１は、所定の温度に保持可能なインキュベータ内に配置されていてもよく、所定の温度に保持可能な保温部よって外周が覆われていてもよい。また、臓器収容容器１１に収容された臓器４１および保存液４２は、所定の二酸化炭素濃度に保たれる。したがって、臓器収容容器１１は、所定の二酸化炭素濃度に保持可能なインキュベータ内に配置されてもよい。
【００４５】
第１流路１２は、臓器洗浄液、灌流液または装置洗浄液を搬送する流路である。臓器収容容器１１内に臓器４１が収容されている場合、第１流路１２は、臓器収容容器１１内の臓器４１と接続される。この場合、第１流路１２は、臓器洗浄液または灌流液を臓器４１に導入する流路として機能する。また、臓器収容容器１１内に臓器４１が収容されていない場合、第１流路１２は、臓器収容容器１１と接続される。この場合、第１流路１２は、装置洗浄液を臓器収容容器１１に導入する流路として機能する。第１流路１２は、臓器洗浄液タンク２１、灌流液タンク２２、センサ２３、装置洗浄液タンク２４、送液ポンプ２６、流量計２７、圧力計２８および切替弁２５，２９を備える。臓器洗浄液タンク２１、灌流液タンク２２および装置洗浄液タンク２４は、それぞれ流路１２ａ，１２ｂ，１２ｃを介して切替弁２５と接続されている。切替弁２５，２９としては、電磁弁などが挙げられるが、特に限定されない。
【００４６】
臓器洗浄液タンク２１は、臓器を洗浄するための洗浄液を収容している。灌流液タンク２２は、灌流液を収容している。灌流液タンク２２には、センサ２３が設けられている。センサ２３は、灌流液タンク２２内の灌流液の状態、例えば、灌流液のｐＨ、温度、溶存酸素量などを測定する。装置洗浄液タンク２４は、装置内の流路１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ，１２ｆ，１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ，１３ｆ、センサ２３、切替弁２５，２９，３１，３３などを洗浄するための洗浄液を収容している。
【００４７】
切替弁２５の下流側の流路１２ｄの中途には、送液ポンプ２６、流量計２７および圧力計２８が設けられている。送液ポンプ２６は、臓器洗浄液タンク２１内の臓器洗浄液、灌流液タンク２２内の灌流液または装置洗浄液タンク２４内の装置洗浄液の送液を行なう。流量計２７は、流路１２ｄ内における臓器洗浄液、灌流液または装置洗浄液の流量を測定する。圧力計２８は、流路１２ｄ内におけるチューブ内および臓器にかかる圧力を測定する。流路１２ｄの下流には、切替弁２９が接続されている。切替弁２９は、流路１２ｅおよび流路１２ｆが接続されている。流路１２ｅは、細胞導入口１７と接続されている。流路１２ｆは、臓器収容容器１１を貫通している。臓器収容容器１１内に臓器４１が収容されている場合、流路１２ｆは、臓器４１と接続される。
【００４８】
第２流路１３は、臓器洗浄液、灌流液または装置洗浄液を搬送する流路である。臓器収容容器１１内に臓器４１が収容されている場合、第２流路１３は、臓器収容容器１１内の臓器４１と接続される。この場合、第２流路１３は、臓器４１から臓器洗浄液または灌流液を導出する流路として機能する。また、臓器収容容器１１内に臓器４１が収容されていない場合、第２流路１３は、臓器収容容器１１と接続される。この場合、第２流路１３は、臓器収容容器１１から装置洗浄液を導出する流路として機能する。第２流路１３は、切替弁３１，３３および導出液タンク３２を含む。切替弁３１，３３としては、電磁弁などが挙げられるが、特に限定されない。切替弁３１は、流路１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｅに接続されている。導出液タンク３２は、流路１３ｂの下流側に接続されている。流路１３ｃの下流側には切替弁３３が接続されている。切替弁３３は、流路１３ｆを介して導出液タンク３２と、流路１３ｄを介して灌流液タンク２２と接続されている。流路１３ｅは、細胞回収口１８と接続されている。
【００４９】
振動発生装置１４は、臓器収容容器１１内の臓器４１に振動を与えるべく振動を発生させる。振動発生装置１４としては、例えば、臓器収容容器１１を振盪させる振盪器、臓器収容容器１１内に収容された保存液に超音波を印加する超音波発生装置などが挙げられるが、特に限定されない。振動発生装置１４は、臓器収容容器１１と一体的に形成されていてもよく、互いに分離して配置されていてもよい。
【００５０】
漏液センサ１５は、臓器収容容器１１からの保存液の漏れの有無をモニターする。漏液センサ１５は、臓器収容容器１１の外周に設けられていてもよく、保存液の漏れの有無をモニターできる範囲内で臓器収容容器１１と離隔して設けられていてもよい。
【００５１】
撮影部１６は、臓器４１の状態の変化をモニターする。撮影部１６は、臓器収容容器１１内の臓器４１をモニターできる位置に設置できる。
【００５２】
制御部１９は、灌流部１０ａと接続されている。制御部１９は、漏液センサ１５で得られた漏液の有無の情報、撮影部１６で得られた臓器の状態の情報、流量計２７で得られた流量の情報、圧力計２８で得られた流路内の圧力の情報などに基づき、送液ポンプ２６の稼動を制御できる。また、制御部１９は、臓器灌流方法の手順に従って、切替弁２５，２９，３１，３３を制御できる。
【００５３】
［臓器灌流装置の動作］
つぎに、添付図面を参照しつつ、本実施形態に係る臓器灌流装置の動作を詳細に説明する。以下において、本実施形態に係る臓器灌流装置を臓器への細胞導入、および細胞回収に用いる場合の動作を例として挙げて説明するが、特に限定されない。
【００５４】
図２のステップＳ１０１において、臓器の洗浄を行なう。ステップＳ１０１では、図３に示されるように、臓器洗浄液タンク２１と接続された流路１２ａが、切替弁２５を介して流路１２ｄと接続されている。また、切替弁２９を介して、流路１２ｄと、流路１２ｆとが接続されている。流路１２ｆは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の動脈に接続されている。また、流路１３ａは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の静脈に接続されている。さらに、切替弁３１を介して、流路１３ａと、流路１３ｂとが接続されている。これにより、送液ポンプ２６により、臓器洗浄液タンク２１内の臓器洗浄液が第１流路１２を介して臓器４１に導入され、第２流路１３を介して臓器から導出される。このとき、流量計２７および圧力計２８によって臓器洗浄液の流量および流路内の圧力がモニターされる。ステップＳ１０１では、振動発生装置１４が、臓器収容容器１１内の臓器４１に振動を与える。これにより、臓器４１内の全体に洗浄液を行き渡らせて、臓器内の血球細胞を十分に取り除くことができる。
【００５５】
図２のステップＳ１０２において、灌流液による臓器の灌流を行なう。ステップＳ１０２では、図４に示されるように、灌流液タンク２２に接続された流路１２ｂが、切替弁２５を介して流路１２ｄと接続されている。また、切替弁２９を介して、流路１２ｄと、流路１２ｆとが接続されている。流路１２ｆは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の動脈に接続されている。また、流路１３ａは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の静脈に接続されている。さらに、切替弁３１を介して、流路１３ａと、流路１３ｃとが接続されている。切替弁３３を介して、流路ｃと、灌流液タンク２２に接続された流路１３ｄとが接続されている。流量計２７および圧力計２８によって臓器洗浄液の流量および流路内の圧力がモニターされる。また、センサ２３によって灌流液タンク２２内の灌流液の状態、例えば、ｐＨ、温度、溶存酸素量などがモニターされる。これにより、送液ポンプ２６により、灌流液タンク２２内の灌流液が第１流路１２を介して臓器４１に導入され、第２流路１３を介して臓器から導出される。さらに、臓器から導出された灌流液は、灌流液タンク２２に戻される。ステップＳ１０２では、振動発生装置１４が、臓器収容容器１１内の臓器４１に振動を与える。これにより、臓器４１内の全体に灌流液を行き渡らせて十分に拡散させることができる。
【００５６】
図２のステップＳ１０３において、第１流路１２への細胞の導入を行なう。ステップＳ１０３では、図５に示されるように、切替弁２９を介して流路１２ｅと流路１２ｆとが接続されている。このとき、切替弁２９における流路１２ｅ側の開口部および流路１２ｆ側の開口部以外の開口部は閉じられている。流路１２ｆは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の動脈に接続されている。また、流路１３ａは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の静脈に接続されている。切替弁３１における流路１３ａ側の開口部以外の開口部は、閉じられている。これにより、灌流系内に細胞を導入できる。
【００５７】
図２のステップＳ１０４において、臓器への細胞の導入を行なう。ステップＳ１０４では、図６に示されるように、灌流液タンク２２に接続された流路１２ｂが、切替弁２５を介して流路１２ｄと接続されている。また、切替弁２９を介して、流路１２ｄと、流路１２ｆとが接続されている。流路１２ｆは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の動脈に接続されている。また、流路１３ａは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の静脈に接続されている。切替弁３１における流路１３ａ側の開口部以外の開口部は、閉じられている。これにより、灌流液とともに細胞を臓器４１に導入できる。流量計２７および圧力計２８によって灌流液の流量および流路内の圧力がモニターされる。また、センサ２３によって灌流液タンク２２内の灌流液の状態、例えば、ｐＨ、温度、溶存酸素量などがモニターされる。ステップＳ１０４では、振動発生装置１４が、臓器収容容器１１内の臓器４１に振動を与える。これにより、臓器４１内の全体に灌流液とともに細胞を行き渡らせて十分に拡散させることができる。
【００５８】
図２のステップＳ１０５において、細胞培養を行なう。ステップＳ１０５では、図７に示されるように、切替弁２９における流路１２ｆ側の開口部以外の開口部は閉じられている。また、切替弁３１における流路１３ａ側の開口部以外の開口部は、閉じられている。
【００５９】
図２のステップＳ１０６において、細胞回収を行なう。ステップＳ１０６では、図８に示されるように、灌流液タンク２２に接続された流路１２ｂが、切替弁２５を介して流路１２ｄと接続されている。また、切替弁２９を介して、流路１２ｄと、流路１２ｆとが接続されている。流路１２ｆは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の動脈に接続されている。また、流路１３ａは、臓器収容容器１１内に収容された臓器４１の静脈に接続されている。さらに、切替弁３１を介して、流路１３ａと、流路１３ｅとが接続されている。これにより、灌流液とともに細胞を臓器４１から導出し、細胞回収口１８で回収できる。流量計２７および圧力計２８によって灌流液の流量および流路内の圧力がモニターされる。また、センサ２３によって灌流液タンク２２内の灌流液の状態、例えば、ｐＨ、温度、溶存酸素量などがモニターされる。ステップＳ１０６では、振動発生装置１４が、臓器収容容器１１内の臓器４１に振動を与える。これにより、臓器４１内の全体に行き渡っていた細胞を十分に回収することができる。
【００６０】
図２のステップＳ１０７において、装置の洗浄を行なう。このとき、臓器４１は、臓器収容容器１１内から取り出されている。ステップＳ１０７では、図９に示されるように、装置洗浄液タンク２４と接続された流路１２ｃが、切替弁２５を介して流路１２ｄと接続されている。また、切替弁２９を介して、流路１２ｄと、流路１２ｆとが接続されている。流路１２ｆ，１３ａは、臓器収容容器１１に接続されている。また、切替弁３１を介して、流路１３ａと、流路１３ｃとが接続されている。さらに、切替弁３３を介して、流路１３ｃと、流路１３ｆとが接続されている。これにより、送液ポンプ２６により、装置洗浄液タンク２４内の装置洗浄液が第１流路１２を介して臓器収容容器１１に導入される。ついで、装置洗浄液は、第２流路１３を介して臓器収容容器１１から導出液タンク３２に導出される。
【００６１】
本実施形態に係る臓器灌流装置は、臓器の脱細胞化、脱細胞化された臓器の再細胞化などの用途にも用いることができる。
【実施例】
【００６２】
（実施例１）
（１）脾臓のカニュレーション
ケタラールで麻酔したブタ（ＬＷＤ系、体重：３０ｋｇ程度）から脾臓を摘出した。脾臓の短胃動静脈を結紮した後、チューブ（図１０中、２２１）〔アトムメディカル（株）製、商品名：アトム多用途チューブ、外径２．０ｍｍ〕を用いて脾臓の動脈をカニュレーションした。また、チューブ（図１０中、２３１）〔テルモ（株）製、商品名：サフィード延長チューブ〕を用いて脾臓の静脈をカニュレーションした。つぎに、カニュレーションされた脾臓に、５０ｍＬ容量シリンジ（テルモ（株）製）を用いて、動脈側から流速：２０ｍＬ／ｍｉｎ程度で、ヘパリン含有生理食塩水〔生理食塩水５００ｍＬに対してヘパリン１ｍＬを添加した溶液〕１００ｍＬを導入した。静脈側からヘパリン含有生理食塩水が導出されることを確認した。確認後、脾臓を４℃にて保冷保管した。
【００６３】
（２）脾臓の灌流
以下において、図１０に示される臓器灌流装置２０１を用いて脾臓２４１の灌流を行なった。図１０に示される臓器灌流装置２０１は、臓器収容容器２１１と、灌流液を臓器に導入する第１流路２１２と、臓器から灌流液を導出する第２流路２１３と、振動器２１４（アズワン製ラボシェーカーＳＲＲ−２）とを備える。第１流路２１２は、チューブ２２１，２２３，２２５と、切替弁としての三方活栓２２２〔テルモ（株）製、商品名：ＴＳ−ＴＲ２Ｋ、タイプＲ型、コック仕様３６０°〕と、送液ポンプ２２４〔ヤマト科学社製、商品名：マスターフレックス送液ポンプ、０７５２８−１０〕と、灌流液タンク２２６〔容量５Ｌ、アズワン（株）製、型番：２００２−５０００ＳＤ〕とを備えていた。臓器の動脈と三方活栓２２２とは、チューブ２２１を介して接続した。三方活栓２２２と送液ポンプ２２４とは、チューブ２２３〔ヤマト科学（株）製、Ｃ−フレックス  ポンプチューブ  ６４２４−２５〕を介して接続した。送液ポンプ２２４と灌流液タンク２２６とは、チューブ２２５〔ヤマト科学（株）製、商品名：Ｃ−フレックス  ポンプチューブ  ６４２４−２５〕を介して接続した。第２流路２１３は、チューブ２３１，２３３，２３４と、切替弁としての三方活栓２３２と、導出液タンク２３５とを備えていた。三方活栓２３２〔テルモ（株）製、商品名：ＴＳ−ＴＲ２Ｋ、タイプＲ型、コック仕様３６０°〕の１つの開口部に細胞回収口としてのチューブ２３３〔ヤマト科学（株）製、Ｃ−フレックス  ポンプチューブ、６４２４−２５〕を接続した。三方活栓２２２と導出液タンク２３５〔サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製、型番：２２５０−００２０〕とを、チューブ２２３〔ヤマト科学（株）製、Ｃ−フレックス  ポンプチューブ、６４２４−２５〕を介して接続した。灌流液タンク内に灌流液として生理食塩水を入れた。
【００６４】
臓器灌流装置２０１の振動器２１４上の臓器収容容器２１１内に、保存液として生理食塩水２４２を入れた。つぎに、生理食塩水２４２が入った臓器収容容器２１１内に、弾性保持体を固定した。その後、実施例１（１）でカニュレーションされた脾臓２４１を臓器収容容器２１１内の弾性保持体上に配置した。つぎに、脾臓２４１の動脈側のチューブ２２１に三方活栓２２２を接続した。また、脾臓２４１の静脈側のチューブ２３１に三方活栓２３２を接続した。
【００６５】
静脈側の三方活栓２３２における細胞回収口側の開口部を閉じ、導出液タンク側の開口部を開いた。振動器２１４によって臓器収容容器２１１を振幅４５ｍｍ、回転速度１６０ｒｐｍで振盪することによって脾臓２４１に振動を与えながら、送液ポンプ２２４を用いて灌流液タンク２２６中の灌流液を脾臓２４１内に流速：１０ｍＬ／ｍｉｎで６０分間灌流させた。灌流開始から６０分間経過後に静脈側の三方活栓２３２を切替え、脾臓２４１から導出された灌流液を１０ｍＬずつ回収した。回収された灌流液中に含まれる白血球、赤血球および血小板それぞれの数を自動血球分析装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＸＴ−２０００ｉｖ〕を用いて計測した。灌流開始時の白血球数、赤血球数および血小板数に対する灌流開始から６０分間経過時の白血球数、赤血球数および血小板数の比（灌流開始から６０分間経過時の血球数／灌流開始前の血球数）を求めた。
【００６６】
（比較例１）
（１）脾臓のカニュレーション
実施例１と同様の操作を行ない、カニュレーションされた脾臓を得た。
【００６７】
（２）脾臓の灌流
以下において、図１１に示される臓器灌流装置２５０を用いて脾臓２４１の灌流を行なった。図１１に示される臓器灌流装置２５０は、振動器２１４を有していない点を除き、図１０に示される臓器灌流装置２０１と同様の構成を備えていた。
【００６８】
臓器灌流装置２０１の振動器２１４上の臓器収容容器２１１内に、保存液として生理食塩水２４２を入れた。つぎに、生理食塩水２４２が入った臓器収容容器２１１内に、弾性保持体を固定した。その後、比較例１（１）でカニュレーションされた脾臓２４１を臓器収容容器２１１内の弾性保持体上に配置した。つぎに、脾臓２４１の動脈側のチューブ２２１に三方活栓２２２を接続した。また、脾臓２４１の静脈側のチューブ２３１に三方活栓２３２を接続した。
【００６９】
静脈側の三方活栓２３２における細胞回収口側の開口部を閉じ、導出液タンク側の開口部を開いた。送液ポンプ２２４を用いて灌流液タンク２２６中の灌流液を脾臓２４１内に流速：１０ｍＬ／ｍｉｎで６０分間灌流させた。導入開始から６０分間経過後に静脈側の三方活栓２３２を切替え、脾臓２４１から導出された灌流液を１０ｍＬずつ回収した。回収された灌流液中に含まれる白血球、赤血球および血小板それぞれの数を自動血球分析装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＸＴ−２０００ｉｖ〕を用いて計測した。灌流開始時の白血球数、赤血球数および血小板数に対する灌流開始から６０分間経過時の白血球数、赤血球数および血小板数の比（灌流開始から６０分間経過時の血球数／灌流開始前の血球数）を求めた。
【００７０】
（結果）
実施例１および比較例１の結果を図１２に示す。図１２（Ａ）は白血球数に基づく結果（白血球数の比）、図１２（Ｂ）は赤血球数に基づく結果（赤血球数の比）、図１２（Ｃ）は血小板数に基づく結果（血小板数の比）を示す。
【００７１】
図１２（Ａ）〜（Ｃ）に示された結果から、実施例１における白血球数、赤血球数および血小板数は、比較例１における白血球数、赤血球数および血小板数よりも高かった。したがって、脾臓に振動を与えながら、脾臓と灌流液とを接触させた実施例１では、振動を与えずに、脾臓と灌流液とを接触させた比較例１に比べて、より多くの細胞を回収または臓器から除去できることが確認された。
【００７２】
（実施例２）
灌流時間を６０分間に設定する代わりに、灌流時間を１２０分間に設定したことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、灌流を行なった。灌流開始時、灌流開始から６０分間経過時、９０分間経過時および１２０分間経過時に脾臓２４１を観察した。また、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所開発ＩｍａｇｅＪ〕を用い、臓器全体の面積と、灌流によって色が変化した部分の面積（灌流された面積）とを、画像の二値化処理により求めた。つぎに、臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合（灌流された面積／臓器全体の面積）を求めた。
【００７３】
（比較例２）
灌流時間を６０分間に設定する代わりに、灌流時間を１２０分間に設定したことを除き、比較例１と同様の操作を行ない、灌流を行なった。灌流開始時、灌流開始から６０分間経過時、９０分間経過時および１２０分間経過時に脾臓２４１を観察した。また、画像処理ソフトウェア〔アメリカ国立衛生研究所開発ＩｍａｇｅＪ〕を用い、臓器全体の面積と、灌流によって色が変化した部分の面積（灌流された面積）とを、画像の二値化処理により求めた。つぎに、臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合（灌流された面積／臓器全体の面積）を求めた。
【００７４】
（結果）
実施例２および比較例２の結果を図１３および図１４に示す。図１３（Ａ）は、脾臓に振動を与えながら灌流を行なったときの脾臓の経時的変化を観察した結果（実施例２）を示す。図１３（Ｂ）は脾臓に振動を与えずに灌流を行なったときの脾臓の経時的変化を観察した結果（比較例２）を示す。図中、（Ａ−１）および（Ｂ−１）は灌流開始時（０分）の脾臓を観察した結果、（Ａ−２）および（Ｂ−２）は灌流開始から６０分間経過時の脾臓を観察した結果、（Ａ−３）および（Ｂ−３）は灌流開始から９０分間経過時の脾臓を観察した結果、（Ａ−４）および（Ｂ−４）は灌流開始から１２０分間経過時の脾臓を観察した結果を示す。
【００７５】
また、図１４は、灌流時間と臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合との関係を調べた結果を示す。図中、黒四角は実施例２において、灌流時間と臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合との関係を調べた結果、黒丸は比較例２において、灌流時間と臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合との関係を調べた結果を示す。
【００７６】
図１３（Ａ）に示された結果から、脾臓に振動を与えながら、灌流を行なった場合、時間の経過に伴い、脾臓の色が濃い色から全体的に薄い色に変化したことがわかった。また、図１３（Ｂ）に示された結果から、脾臓に振動を与えずに灌流を行なった場合、時間の経過に伴い、脾臓内で灌流している箇所（脾臓の中央部）のみ色が変化していることがわかった。この結果から、脾臓に振動を与えずに灌流を行なった場合、脾臓の一部のみから血液細胞が除去されていることが確認された。さらに、図１４に示された結果から、実施例２では、灌流開始から９０分間経過するまでは、灌流時間の経過とともに、臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合が増加する傾向にあることがわかった。これに対し、比較例２では、灌流開始から６０分間経過するまでは、灌流時間の経過とともに、臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合が増加する傾向にあることがわかった。また、実施例２における臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合は、比較例２における臓器全体の面積に対する灌流された面積の割合よりも大きいことがわかった。これらの結果から、脾臓に振動を与えながら、灌流を行なった場合、脾臓全体から血液細胞が除去されていることが確認された。したがって、臓器に振動を与えながら灌流を行なうことにより、臓器内の広範囲の細胞を短時間で除去できることがわかった。
【００７７】
（実施例３）
（１）脾臓のカニュレーション
実施例１と同様の操作を行ない、カニュレーションされた脾臓を得た。
【００７８】
（２）脾臓の灌流
図１５に示される臓器灌流装置２０２を用いて脾臓２４１の灌流を行なった。図１５に示される臓器灌流装置２０２は、振動器２１４の代わりに超音波発生装置２１５（アズワン製ＵＳＫ）を有している点を除き、図１０に示される臓器灌流装置２０１と同様の構成を備えていた。
【００７９】
臓器灌流装置２０２の臓器収容容器２１１内に、保存液として生理食塩水２４２を入れた。つぎに、生理食塩水２４２が入った臓器収容容器２１１内に、弾性保持体を固定した。その後、実施例３（１）でカニュレーションされた脾臓２４１を臓器収容容器２１１内の弾性保持体上に配置した。つぎに、脾臓２４１の動脈側のチューブ２２１に三方活栓２２２を接続した。また、脾臓２４１の静脈側のチューブ２３１に三方活栓２３２を接続した。
【００８０】
静脈側の三方活栓２３２における細胞回収口側の開口部を閉じ、導出液タンク側の開口部を開いた。超音波発生装置２１５によって臓器収容容器２１１内の生理食塩水に超音波を印加することによって脾臓２４１に振動を与えながら、送液ポンプ２２４によって灌流液タンク２２６中の灌流液を脾臓２４１内に流速：１０ｍＬ／ｍｉｎで３０分間導入することによって灌流を行なった。灌流開始から３０分間経過後に静脈側の三方活栓２３２を切替え、脾臓２４１から導出された灌流液を１０ｍＬずつ回収した。回収された灌流液中に含まれる白血球、赤血球および血小板それぞれの数を自動血球分析装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＸＴ−２０００ｉｖ〕を用いて計測した。灌流開始時の白血球数、赤血球数および血小板数に対する灌流開始から３０分間経過時の白血球数、赤血球数および血小板数の比（灌流開始から３０分間経過時の血球数／灌流開始前の血球数）を求めた。
【００８１】
（比較例３）
灌流時間を６０分間に設定する代わりに、灌流時間を３０分間に設定したことを除き、比較例１と同様の操作を行ない、回収された灌流液中に含まれる白血球、赤血球および血小板それぞれの数を計測した。灌流開始時の白血球数、赤血球数および血小板数に対する灌流開始から３０分間経過時の白血球数、赤血球数および血小板数の比（灌流開始から３０分間経過時の血球数／灌流開始前の血球数）を求めた。
【００８２】
（結果）
実施例３および比較例３の結果を図１６に示す。図１６（Ａ）は白血球数に基づく結果（白血球数の比）、図１６（Ｂ）は赤血球数に基づく結果（赤血球数の比）、図１６（Ｃ）は血小板数に基づく結果（血小板数の比）を示す。
【００８３】
図１６（Ａ）〜（Ｃ）に示された結果から、実施例３における白血球数、赤血球数および血小板数は、比較例３における白血球数、赤血球数および血小板数よりも高いことがわかった。これらの結果から、超音波発生装置を用いて脾臓に振動を与えながら、脾臓と灌流液とを接触させることにより、より多くの細胞が回収または臓器から除去できることが確認された。
【００８４】
（実施例４）
（１）脾臓のカニュレーション
実施例１と同様の操作を行ない、カニュレーションされた脾臓を得た。
【００８５】
（２）脾臓の灌流
図１１に示される臓器灌流装置２０２の臓器収容容器２１１内に、保存液として生理食塩水２４２を入れた。つぎに、生理食塩水２４２が入った臓器収容容器２１１内に、弾性保持体を固定した。その後、実施例４（１）でカニュレーションされた脾臓２４１を臓器収容容器２１１内の弾性保持体上に配置した。つぎに、脾臓２４１の動脈側のチューブ２２１に三方活栓２２２を接続した。また、脾臓２４１の静脈側のチューブ２３１に三方活栓２３２を接続した。
【００８６】
静脈側の三方活栓２３２における細胞回収口側の開口部を閉じ、導出液タンク側の開口部を開いた。振動器２１４によって臓器収容容器２１１を振幅４５ｍｍ、回転速度１６０ｒｐｍまたは２４０ｒｐｍで振盪することによって脾臓２４１に振動を与えながら、送液ポンプ２２４によって灌流液タンク２２６中の灌流液を脾臓２４１内に流速：１０ｍＬ／ｍｉｎで６０分間導入することによって灌流を行なった。灌流開始時および灌流開始から６０分間経過時に静脈側の三方活栓２３２を切替え、脾臓２４１から導出された灌流液を１０ｍＬずつ回収した。回収された灌流液中に含まれる白血球、赤血球および血小板それぞれの数を自動血球分析装置〔シスメックス（株）製、商品名：ＸＴ−２０００ｉｖ〕を用いて計測した。また、前記において、臓器収容容器２１１を振盪させなかったことを除き、前記と同様の操作を行ない、回収された灌流液中に含まれる白血球、赤血球および血小板それぞれの数を計測した。つぎに、灌流開始時の白血球数、赤血球数および血小板数それぞれに対する灌流開始から６０分間経過時の白血球数、赤血球数および血小板数それぞれの比（灌流開始から６０分間経過時の血液細胞数／灌流開始時の血液細胞数）を求めた。
【００８７】
回転速度と血液細胞数の比との関係を調べた結果を図１７に示す。図中、黒丸は回転速度と白血球数の比との関係を調べた結果、黒三角は回転速度と赤血球数の比との関係を調べた結果、黒四角は回転速度と血小板数の比との関係を調べた結果を示す。
【００８８】
図１７に示された結果から、回転速度を大きくすること、すなわち、振動数を大きくすることにより、白血球数の比、赤血球数の比および血小板数の比がそれぞれ高くなる傾向があることがわかった。したがって、これらの結果から、脾臓に振動を与えながら、脾臓と灌流液とを接触させることにより、より多くの細胞が回収または臓器から除去できることが確認された。
【符号の説明】
【００８９】
１０  臓器灌流装置
１０ａ  灌流部
１１  臓器収容容器
１２  第１流路
１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ，１２ｅ，１２ｆ  流路
１３  第２流路
１３ａ，１３ｂ，１３ｃ，１３ｄ，１３ｅ，１３ｆ  流路
１４  振動発生装置
１５  漏液センサ
１６  撮影部
１７  細胞導入口
１８  細胞回収口
１９  制御部
２１  臓器洗浄液タンク
２２  灌流液タンク
２３  センサ
２４  装置洗浄液タンク
２５，２９，３１，３３  切替弁
２６  送液ポンプ
２７  流量計
２８  圧力計
３２  導出液タンク
４１  臓器
４２  保存液
２０１，２０２，２５０  臓器灌流装置
２１１  臓器収容容器
２１２  第１流路
２１３  第２流路
２１４  振動器
２１５  超音波発生装置
２２１，２２３，２２５，２３１，２３３，２３４  チューブ
２２２，２３２  三方活栓
２２４  送液ポンプ
２２６  灌流液タンク
２３５  導出液タンク
２４１  脾臓
２４２  生理食塩水
【図１】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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