(57)【要約】【課題】  遺伝子組換え体の培養で得られた増殖因子前駆体のリフォールディングの方法を提供する。【解決の手段】  遺伝子組換え体の培養液から増殖因子前駆体のインクルージョンボディを調製し、アルギニン、ジメチルスルフォキシド及び還元型グルタチオンを含む緩衝液によってリフォールディングを行う。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体を微生物細胞内で不溶性発現させた後、アルギニン、ジメチルスルフォキシド、及び還元型グルタチオンを含む緩衝液によりリフォールディングすることを特徴とする細胞増殖因子前駆体の製造方法。
【請求項２】
ＴＧＦβスーパーファミリーに属する増殖因子の前駆体がＴＧＦβである請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
ＴＧＦβの前駆体がＴＧＦβ３である請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記緩衝液中のアルギニン濃度が０．１〜２Ｍ、ジメチルスルフォキシドが５〜６０％（Ｖ／Ｖ）、還元型グルタチオンが０．００２〜２０ｍＭであり、弱アルカリ性の緩衝液を用いる請求項１〜３に記載の製造方法。
【請求項５】
弱アルカリ性の緩衝液がｐＨ８．５〜１０の緩衝液である請求項２〜４に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞の分化誘導にかかわる細胞増殖因子前駆体のリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦβは多様な機能を持つ増殖因子であり、ＴＧＦβスーパーファミリーと呼ばれる構造が類似した一群の増殖因子の一つである（非特許文献１）。これらの増殖因子は細胞の増殖、分化、細胞外マトリクスの形成などに関与する。ＴＧＦβにはＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３等と呼ばれる複数の類縁体が知られている。これらのアミノ酸配列のホモロジーは６５％以上であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験では類似した生理活性を示すことが報告されている（非特許文献２）。一方で、造血幹細胞への阻害、内皮細胞の増殖、脊椎動物胚における中胚葉の形成などに対する効果には相違があることが知られており（非特許文献１）、生体内ではそれぞれ別の役割をもっているものと考えられている。
【０００３】
ＴＧＦβはいずれもアミノ酸残基数３９０〜４１２の２本ポリペプチド鎖よりなる前駆体として生合成され、限定的タンパク質分解を受けてＣ末端側のアミノ酸残基数１１２のポリペプチド２本よりなる成熟体となる（特許文献１）。前駆体のＮ末端付近にはシグナルペプチドを有しており、生合成の際の細胞外への分泌に関与する。続くプロ領域は分子種毎に長さが異なっており、タンパク質のフォールディングや２量体の形成、因子の活性調整に関与する。プロ領域には細胞結合アミノ酸配列モチーフであるＲＧＤ配列が存在し、またＣ末端側には限定的タンパク質分解のサイトとなる共通アミノ酸配列モチーフＲＸＸＲが存在する。成熟体は７つのシステイン残基を有し、そのうち６つがポリペプチド内でのＳＳ結合を形成し、残りの１つはポリペプチド間でのＳＳ結合を形成して２量体の安定化に関与する。（非特許文献３）。上記の構造はＴＧＦβスーパーファミリーに属するタンパク質全てに共通した構造である。ＴＧＦβ３の構造の概略図を図１に示した。
【０００４】
ＴＧＦβは細胞や組織のタイプ、他の増殖因子の有無に依存して、細胞の有糸分裂や増殖・成長を促進・阻害し、脂質生成、筋発生、軟骨形成、骨形成、免疫細胞機能の調節、走化性の刺激、分化の誘導や阻害の活性を示す。また、炎症の発生後に顆粒組織の形成に関与し、フィブロネクチンやコラーゲン、各種プロテアーゼインヒビター等の細胞外マトリクス遺伝子の発現を促進するなどの多様な生理活性を示す（特許文献１）。そのためＴＧＦβは医薬品や再生医療における細胞調製用試薬として注目されており、安価に提供するための大腸菌による製造法の検討が多数行われている（特許文献１、非特許文献１、非特許文献４）。これらの方法ではいずれも成熟体領域を菌体内にインクルージョンボディとして発現させ、リフォールディングで目的物が得られている。
【０００５】
一方、ＴＧＦβは生体内で通常は、プロ領域と成熟体領域間のペプチド結合切断されているものの、両者が非共有結合的に結合したラテント複合体（Ｌａｔｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）として存在する。この複合体はＮ末端付近のシステイン残基で別のタンパク質であるラテントＴＧＦ結合タンパク（Ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＴＢＰ）のシステイン残基にＳＳ結合で結合し、これを介して細胞外マトリクス内に局在する（非特許文献５）。
【０００６】
このラテント複合体のＲＧＤモチーフに、細胞が表層のインテグリンを介して結合すると、ラテント複合体に力学的な刺激が加えられて変形し、成熟体が複合体から遊離して活性発現することが知られている（非特許文献５）。従って、ＴＧＦβの生理活性の解析には前駆体またはラテント複合体を使用することが必要であるだけでなく、ＴＧＦβを医薬品や細胞調製用試薬として使用する際にＴＧＦβを細胞に対して効果的に作用する環境に局在させることや徐放させるために前駆体を利用することは有用である。しかしながら、ＴＧＦβの前駆体やラテント複合体は動物細胞の培養で調製することが一般的であり（非特許文献５、６）、培養コストが安価な微生物細胞系で発現した後にリフォールディングして調製する方法は報告されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第４３５４９８０号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈａｎ．ら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．１９９７年１１，１６９−１７８
【非特許文献２】Ｇｒａｙｃａｒら、１９８９年、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．３，１９７７−１９８６
【非特許文献３】Ｂｏｔｔｎｅｒら、Ｊ．Ｎｅｒｒｏｃｈｅｍ．２０００年、７５，２２２７−２２３９
【非特許文献４】Ｈｕａｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｏｎ．Ｐｒｏｇ．２５，２００９年、１３８７−１３９５
【非特許文献５】Ｂｕｓｃｅｍｉら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１，２０１１年、２０４６−２０５４
【非特許文献６】Ｂｏｔｔｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１９９６年、５８７７−５８８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、遺伝子組換え大腸菌で発現させたＴＧＦβスーパーファミリーに属する増殖因子前駆体、特にｐｒｏＴＧＦβのリフォールディング方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、大腸菌で発現したｐｒｏＴＧＦβが、アルギニンとジメチルフルフォキシドの存在下で効率的にリフォールディングできることを解明し、本発明の完成に至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：  
（１）ＴＧＦβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体を微生物細胞内で不溶性発現させた後、アルギニン、ジメチルスルフォキシド、及び還元型グルタチオンを含む緩衝液によりリフォールディングすることを特徴とする細胞増殖因子前駆体の製造方法。
（２）ＴＧＦβスーパーファミリーに属する増殖因子の前駆体がＴＧＦβである（１）に記載の製造方法。
（３）ＴＧＦβの前駆体がＴＧＦβ３である（２）に記載の製造方法。
（４）前記緩衝液中のアルギニン濃度が０．１〜２Ｍ、ジメチルスルフォキシドが５〜６０％（Ｖ／Ｖ）、還元型グルタチオンが０．００２〜２０ｍＭであり、弱アルカリ性の緩衝液を用いる（１）〜（３）に記載の製造方法。
（５）弱アルカリ性の緩衝液がｐＨ８．５〜１０の緩衝液である（２）〜（４）に記載の製造方法。
【００１２】
以下に、本発明を詳細に説明する。
本明細書においてｐｒｏＴＧＦβ３は、ヒトｐｒｏＴＧＦβ３のｐｒｏ領域と成熟体領域を含むものであり、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２４番目のロイシンから４１２番目のセリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２４番目のロイシンから４１２番目のセリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、があげられる。
【００１３】
本発明の形質転換体を作製する際に用いる宿主としては、バチルス属（ブレビバチルス属細菌やパエニバチルス属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）や大腸菌に代表される細菌、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属に代表される酵母、麹菌に代表される糸状菌等が例示できるが、取扱いの簡便な大腸菌を宿主とするのが好ましい。大腸菌で発現する場合には、不溶性の封入体として発現される。
【００１４】
本発明の形質転換体の培養液から発現したタンパク質を回収するには、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞破砕（物理的破砕、薬剤による破砕など）後、遠心分離により破砕残渣を回収することで、発現したタンパク質を含む不溶性画分を得ればよい。なお薬剤により宿主細胞を破砕する際は、例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと６ｍＭ  ＭｇＳＯ４と２５０Ｕ／Ｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（商品名）と０．３ｇ／Ｌ  Ｌｙｓｏｚｙｍｅと０．４％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と０．５％  ＣＴＡＢ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）と５０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（特願２０１２−１２９７３２号）や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等の市販の抽出試薬を用いて破砕するとよい。
【００１５】
回収したタンパク質を含む不溶性画分は、そのまま本発明のリフォールディングを行うこともできるが、不溶性画分からＴＧＦβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体のうち、例えばｐｒｏＴＧＦβの封入体を精製した後にリフォールディング処理することもできる。ｐｒｏＴＧＦβの封入体の精製は、尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤で可溶化した後に、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過法、アフィニティクロマトグラフィー等により精製単離することができる。イオン交換クロマトグラフィー用担体は、カルボキシメチル基、スルホプロピル基、ジエチルアミノ基といったイオン交換基を担体に結合したものであり、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＣＭ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＳＰ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０（以上、東ソー社製）、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）が例示できる。
【００１６】
疎水クロマトグラフィー用担体は、エーテル基、フェニル基、ブチル基といった疎水性官能基を担体に結合させたものであり、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｅｔｈｅｒ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｐｈｅｎｙｌ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０（以上、東ソー社製）が例示できる。ゲルろ過にはＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷやＴＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ５５（以上、東ソー社製）があげられる。
【００１７】
アフィニティークロマトグラフィーで精製を行う場合は、抗ＴＧＦβ３抗体を固定化したカラムや、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ−Ｒｅｇｉｎ（ノバジェン社製）、ハロタグ精製キット（プロメガ社製）などを使用することができる。なお、Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ−Ｒｅｇｉｎやハロタグ精製キットで精製する場合には、目的のｐｒｏＴＧＦβ３遺伝子のＮ末端又はＣ末端、あるいは分子内の適切なサイトに、Ｈｉｓオリゴマー（通常は４〜６）又はハロタグをコードする塩基配列を付加・挿入して発現させる必要がある。
【００１８】
各種クロマトグラフィー用担体を用いて精製を行なう際は、アプライ液の導入量や前記担体のタンパク吸着性能などによって決定した量の担体を、適切なオープンカラム等に充填して行なえばよい。また、クロマトグラフィー用担体は、アプライ液を導入する前に、あらかじめ適切な緩衝液（トリス／トリス塩酸塩緩衝液、グリシン／水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸塩緩衝液等）により平衡化しておく。前述の方法で回収したタンパク質を含む溶液を、平衡化したクロマトグラフィー用担体に導入することで前記タンパク質を担体に吸着させ、平衡化に用いた緩衝液と同じ緩衝液で洗浄する。その後、溶出用緩衝液を用いて吸着した前記タンパク質を溶出させることにより精製された前記タンパク質を含む溶液を得ることができる。
【００１９】
上記の様にして得られたｐｒｏＴＧＦβを本発明の緩衝液に添加して、４℃にて整置することでリフォールディングが行われ、可溶性のｐｒｏＴＧＦβを得ることができる。緩衝液への添加は、変性剤で可溶化した菌体不溶性画分又はクロマトグラフィーで得られた封入体の溶液をそのまま使用することもできるが、限外ろ過膜処理による濃縮や残存する菌体由来成分の除去を行って使用することもできる。
【００２０】
本発明においてＴＧＦβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体をリフォールディングする際の緩衝液として、アルギニン、ジメチルスルフォキシド及び還元型グルタチオンを使用するが、アルギニンはＴＧＦβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体に変性状態からの巻き戻しという作用をもたらすために使用し、その作用を発揮させるための好ましい濃度範囲は０．１〜２Ｍであり、更に好ましくは０．２〜１Ｍである。ジメチルスルフォキシドは変性状態からの巻き戻しという作用をもたらすために使用し、その作用を発揮させるための好ましい濃度範囲は５〜６０％（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）であり、更に好ましくは３０〜５０％（Ｖｏｌ／Ｖｏｌ）である。還元型グルタチオンにおいてはシステインの酸化状態を制御するという作用をもたらすために使用し、その作用を発揮させるための好ましい濃度範囲は０．００２〜２０ｍＭであり、更に好ましくは２〜１０ｍＭである。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の組成により、微生物で封入体として発現したＴＧＦβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体のうち、例えばｐｒｏＴＧＦβ３を効率よくリフォールディングでき、容易に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｐｒｏＴＧＦβ３構造を示す図。
【図２】リフォールデンィグ前後でのｐｒｏＴＧＦβ３の電気泳動パターンを示す図。図中、ＩＢはインクルージョンボディを、Ｒｅｆｏｌｄｉｇはリフォールディング後のｐｒｏＴＧＦβ３を示し、矢印は二量体の位置を示す。
【実施例】
【００２３】
以下、ヒトｐｒｏＴＧＦβ３を例として、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
Ｃ末端Ｈｉｓ×６タグ付きｐｒｏＴＧＦβ３発現菌株の作成
（１）配列番号１のアミノ酸配列のうち、２４番目のロイシンがメチオニンに置換され、２５番目のセリンから４１２番目のセリンまでの領域をコードし、かつ５’末端付近に６塩基の余分配列とＭｓｃＩサイトが付加され、３’末端にＸｈｏＩサイトと６塩基の余分配列が付加された配列番号２の塩基配列のＤＮＡを化学合成した。
（２）（１）のＤＮＡを制限酵素ＭｓｃＩ（東洋紡）及びＸｈｏＩ（タカラバイオ）で切断した後、キアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ溶液を５０μｌを得た。
（３）市販大腸菌用発現ベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を制限酵素ＭｓｃＩ及びＸｈｏＩで切断した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い（タカラバイオ）、キアゲン社製ＰＣＲ精製キットを用いて、約５．５ｋｂｐのＤＮＡ溶液を５０μｌを得た。
（４）（２）と（３）で得たオリゴヌクレオチドを混合し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（５）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシン（和光純薬社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴｐｒｏＴＧＦｂ３を抽出した。
（６）（５）で作製した発現ベクターｐＥＴｐｒｏＴＧＦｂ３の（２）のＤＮＡ挿入領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  ｒｅａｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ライフテクノロジー社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジー社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号３（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ−３’）または配列番号４（５’−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。解析の結果設計通りであることを確認した。
（７）（５）で得られた発現ベクターｐＥＴｐｒｏＴＧＦｂ３で大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）のコンピテントセル（メルク社製）を形質転換し、発現菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）／ｐＥＴｐｒｏＴＧＦｂ３を得た。
【実施例２】
【００２５】
Ｃ末端Ｈｉｓ×６タグ付きｐｒｏＴＧＦβ３インクルージョンボディの調製
（１）実施例１で得た発現菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）／ｐＥＴｐｒｏＴＧＦｂ３をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（２０μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）を含む２ＹＴ培地（酵母エキス１０ｇ／Ｌ、バクトペプトン１６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）３ｍｌに植菌して、３７℃で一晩培養した。
（２）（１）の培養液１ｍｌを同じ培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容のフラスコ３本に植菌し、３７℃で３時間培養した。ついで、培養温度を２５℃に変更して、０．５Ｍ  ＩＰＴＧ水溶液を０．２ｍｌ（終濃度１ｍＭ）加えて一晩培養した。
（３）培養液より、７，５００ｒｐｍ、３０分の遠心分離によって菌体を回収し、８Ｍ塩酸グアニジンを含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁して、室温で１．５時間、マグネチックスターラーで攪拌して、インクルージョンボディを抽出した。次いで７，５００ｒｐｍ、３０分の遠心分離によって上清を回収した。
（４）Ｈｉｓ−Ｔｒａｐ−Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のカラム（ベッド容量３０ｍｌ）を予め６Ｍ尿素、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ＮＰ−４０を含む−２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化し、（５）の上清を通液して、インクルージョンボディを吸着させた。このカラムをｐＨ６．８に調整した同じ緩衝液で洗浄し、次いでｐＨ４．２に調整した同じ緩衝液で溶出することにより精製されたインクルージョンボディの溶液（濃度１．５ｍｇ／ｍｌ）、２０ｍｌを得た。
【実施例３】
【００２６】
リフォールディング
実施例２のインクルージョンボディ１８．５ｍｌを、２６０ｍｌの４０％（Ｖ／Ｖ）ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、１Ｍ  ＮａＣｌ  、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン  を含む０．１Ｍ  トリス塩酸バッファー（ｐＨ９．５）で希釈し、還元型グルタチオンを５ｍＭになるように添加して４℃で３日間静置した。次いで、５Ｌの２０ｍＭイミダゾールと１．５Ｍ尿素を含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して２回透析を行った。さらに予め２０ｍＭイミダゾールと２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉｓ−Ｔｒａｐ−Ｒｅｓｉｎのカラム（ベッド容量３０ｍｌ）に通液して、リフォールディングされたｐｒｏＴＧＦβ３を吸着させ、同じ緩衝液でカラムを洗浄した後に、２５０ｍＭイミダゾールと２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出し、可溶化された０．２５ｍｇ／ｍｌのｐｒｏＴＧＦβ３の溶液５ｍｌを得た。
【００２７】
溶出物をＳＤＳ電気泳動法で分析したところ、インクルージョンボディでは非還元条件においても分子量４５Ｋの単一バンドが観察されるのみであったのに対し、リフォールディング後は２量体の約９０Ｋのバンドが観察され、正しい立体構造を有する２量体ｐｒｏＴＧＦβ３が生成していることが確認された。電気泳動の結果を図２に示した。
【実施例４】
【００２８】
シグナルペプチドの下流にシステインタグ及びＨｉｓ×６タグを挿入したｐｒｏＴＧＦβ３のリフォールディング
（１）  配列番号５に示す合成ＤＮＡを用いた他、実施例１（１）〜（６）と同様にして発現ベクターｐＥＴＣｙｔ３ｐｒｏＴＧＦβ３を調製し、配列を確認した。
（２）このベクターを実施例１（７）と同様に形質転換して発現菌株Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）／ｐＥＴＣｙｔ３ｐｒｏＴＧＦｂ３を得た。
（３）実施例２と同様に精製インクルージョンボディを調製した。
（４）実施例３と同様にリフォールディング操作を行った。この溶液をＨｉｓ−Ｔｒａｐ−Ｒｅｓｉｎ（ベッド容量３ｍｌ）に吸着させ、２０ｍＭイミダゾールと２５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液  （ｐＨ８．０）で洗浄した後に、２５０ｍＭイミダゾールと２５０ｍＭＮａＣｌを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液  （ｐＨ４．３）で溶出しｐｒｏＴＧＦβ３濃度０．１ｍｇ／ｍｌの溶液６ｍｌを得た。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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