(57)【要約】【課題】ヒト心筋トロポニンＴを精度良く測定することができる、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるヒト心筋トロポニンＴの測定方法及びヒト心筋トロポニンＴの測定キットを提供する。【解決手段】Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔを含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体。
【請求項２】
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２のハイブリドーマより産生される請求項１に記載の抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体。
【請求項３】
独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２であるハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項３に記載のハイブリドーマを培養することを特徴とする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項５】
免疫測定方法であって、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を用いることを特徴とする抗ヒト心筋トロポニンＴの測定方法。
【請求項６】
前記抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である請求項５に記載の抗ヒト心筋トロポニンＴの測定方法。
【請求項７】
Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を含むヒト心筋トロポニンＴ測定キット。
【請求項８】
前記抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２のハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体である請求項７に記載の抗ヒト心筋トロポニンＴ測定キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるヒト心筋トロポニンＴの測定方法及びヒト心筋トロポニンＴの測定キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト心筋トロポニンＴ（Ｈｕｍａｎ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ；以下、「ＴｎＴ」と略する。）は、心筋の筋原繊維を構成するタンパク質の１つであって、心筋梗塞の発症に伴い血液中のＴｎＴ濃度が上昇する。そのため、血液中のＴｎＴ濃度は、心筋梗塞の診断指標として用いられている。
従来、ＴｎＴは、免疫測定法によってその濃度が測定されている。例えば、特許文献１には、免疫測定法に用いられる抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体についての開示がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平０３−７５９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上述した従来の技術では、より精度良くＴｎＴを測定できる技術が求められていた。本願の限定的ではない例示的な実施形態は、ＴｎＴを精度良く測定することができる、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターにおける受託番号がＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２のハイブリドーマより産生される抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体である。
【発明の効果】
【０００６】
本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットによれば、ＴｎＴを精度良く測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のＴｎＴに対する結合能の測定結果の一例を示す図である。
【図２】ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のエピトープの特定に用いられた２９種類のペプチドのアミノ酸配列（配列番号：１〜２９）を示す図である。
【図３】ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のエピトープの特定に用いられた２９種類のペプチドそれぞれに対する結合能の測定結果の一例を示す図である。
【図４】ＴｎＴ（野生型）のアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す図である。
【図５】ＴｎＴ（アイソフォーム３）のアミノ酸配列（配列番号：３１）を示す図である。
【図６】ＴｎＴ−Ｆ２３抗体を用いた免疫測定結果の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＴｎＴには、少なくとも６種類のアイソフォーム（Ｉｓｏｆｏｒｍ）が存在することが知られており、ＴｎＴの多様な変化の一因とされている（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：３５３４１−３５３４９を参照。）。
ＴｎＴ（野生型）は分子量が約３９，０００であって、そのアミノ酸配列は図４（配列番号：３０）に示す通りである。一方、ＴｎＴ（アイソフォーム）は、ＴｎＴ（野生型）のＮ末端側から１−４０番目の領域で特有の変化を示し、成人においてはアイソフォーム３がメジャーとされている。アイソフォーム３は、分子量が約３７，０００であって、そのアミノ酸配列は図５（配列番号：３１）に示す通りである。アイソフォーム３は、ＴｎＴ（野生型）のＮ末端側から２４−３３番目のアミノ酸が欠失している点がＴｎＴ（野生型）とは異なる。
【０００９】
一方、ＴｎＴの構造は、急性心筋梗塞患者の血液中において、心筋梗塞の発症からの時間に依存してその動態が変化することが報告されている（例えば、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００７；４０：８５１−８５５を参照。）。具体的には、血液中のＴｎＴ濃度は、心筋梗塞等による心筋の損傷に伴いその濃度が迅速に上昇するが、心筋梗塞の発症からの経過時間に依存して、血液中のＴｎＴが分解し、細分化される。例えば、心筋梗塞の発症から１２時間経過後の患者における血液中には、分子量が約３７，０００の状態のＴｎＴ（アイソフォーム３）はほとんど存在せず、細分化されて分子量が約２５，０００のフラグメントとその他のフラグメントとで存在する。細分化された分子量約２５，０００のフラグメントは、ＴｎＴ（アイソフォーム３）のアミノ酸配列のＮ末端側から１−２００番目の領域に対応することが確認されている。
【００１０】
本願発明者は、これらのことから血液中のＴｎＴを精度良く測定するためには、ＴｎＴの安定な構造部位のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体を用いる必要があると考えた。具体的には、アイソフォーム３でいうと、Ｎ末端側から４１−２００番目の領域部分内のアミノ酸配列に対して特異的に結合する抗体である。
【００１１】
そこで本願発明者は、安定な構造部位のアミノ酸配列に特異的に結合する抗体について、鋭意検討を行い、抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットに関する発明を完成するに至った。本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、その製法、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットは、以下の通りである。
【００１２】
本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする。
【００１３】
本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、ＴｎＴを精度良く測定することができる。なぜなら、係る抗体は、アイソフォーム３でいうとＮ末端側から１７７−１８１番目のアミノ酸配列、野生型でいうとＮ末端側から１８７−１９１番目を含むアミノ酸配列に対する抗原認識部位を有する抗体であるため、分子量が約２５，０００のフラグメントであっても結合することができ、アイソフォームに依存しないため、ＴｎＴの多様な変化に対応することができるからである。
【００１４】
また、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の抗原認識部位は、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴ（Ｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｔ）も認識しない。なぜなら、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴも、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）に対応するアミノ酸配列を有さないからである。そのため、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、ＴｎＴを精度良く測定することができる。
【００１５】
なお、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体はＩｇＧであるが、当該ＩｇＧそのものだけでなく、その結合特性を保持した機能断片も含まれる（例えば、Ｆ（ａｂ）やＦ（ａｂ’）２）。当該結合特性の典型例としては、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとすることが挙げられる。
【００１６】
さらに、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、上記ＩｇＧ抗体の変異体も含まれる。かかる変異体は、上記ＩｇＧ抗体のアミノ酸配列において、１個〜数個、あるいは１個〜数十個のアミノ酸が置換、欠失、付加されているものであってもよい。かかる変異体は、哺乳動物の抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であってもよい。かかる変異体もまた、上記ＩｇＧ抗体の結合特性を保持している。
【００１７】
本願の一態様に係るハイブリドーマ（１２Ｐ−２  Ｎｏ．２３）は、前述の抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を産生するものであって、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に従って、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託され、２０１４年６月１７日付けで受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２を付与された。
【００１８】
したがって、本願の一形態に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマにより産生される抗体であってもよい。関連する態様において、本発明は、上記ハイブリドーマを培養することを特徴とする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の製造方法を提供する。
【００１９】
本願の一態様に係るＴｎＴの測定方法は、免疫測定方法であって、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を用いることを特徴とする。
【００２０】
本願の一態様に係るＴｎＴの測定方法は、例えば、酵素結合免疫吸着法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ；以下、「ＥＬＩＳＡ法」と略する。）に代表される酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：以下、「ＥＩＡ法」と略する。）、放射免疫アッセイ（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ；以下、「ＲＩＡ法」と略する。）又は蛍光抗体法（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）のいずれを用いてもよい。また、化学発光法（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ）や電気化学発光法（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｓｓａｙ）を用いてもよい。
【００２１】
また、測定形式としては、代表的なものとしては直接吸着法、サンドイッチ法及び競合法が挙げられるが、いずれを用いてもよい。
【００２２】
本願の一態様に係るＴｎＴの測定キットは、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとする抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を含む。通常は、取り扱い説明書をキットに添付する。
【００２３】
なお、本願において、アミノ酸を略号で表示する場合、以下の通りとする。また、アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合には、特に明示しない限りＬ−体を示すものとする。
（１）    Ａ，Ａｌａ  ：  アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）
（２）    Ｒ，Ａｒｇ  ：  アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）
（３）    Ｎ，Ａｓｎ  ：  アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）
（４）    Ｄ，Ａｓｐ  ：  アスパラギン酸（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ａｃｉｄ）
（５）    Ｃ，Ｃｙｓ  ：  システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）
（６）    Ｑ，Ｇｌｎ  ：  グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）
（７）    Ｅ，Ｇｌｕ  ：  グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ）
（８）    Ｇ，Ｇｌｙ  ：  グリシン（Ｇｌｙｃｉｎ）
（９）    Ｈ，Ｈｉｓ  ：  ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）
（１０）  Ｉ，Ｉｌｅ  ：  イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）
（１１）  Ｌ，Ｌｅｕ  ：  ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）
（１２）  Ｋ，Ｌｙｓ  ：  リジン（Ｌｙｓｉｎｅ）
（１３）  Ｍ，Ｍｅｔ  ：  メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）
（１４）  Ｆ，Ｐｈｅ  ：  フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）
（１５）  Ｐ，Ｐｒｏ  ：  プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）
（１６）  Ｓ，Ｓｅｒ  ：  セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）
（１７）  Ｔ，Ｔｈｒ  ：  トレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）
（１８）  Ｗ，Ｔｒｐ  ：  トリプトファン（Ｔｒｉｐｔｏｐｈａｎ）
（１９）  Ｙ，Ｔｙｒ  ：  チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）
（２０）  Ｖ，Ｖａｌ  ：  バリン（Ｖａｌｉｎｅ）
【００２４】
以下に、実施例を示して、本願の実施の形態の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、該抗体を用いるＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットについて、図面とともに詳細に説明する。ただし、実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２５】
実施例１  抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体及びハイブリドーマの調製
本願発明者は、本願の実施の形態の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体及びハイブリドーマを以下の通りにして得た。
【００２６】
１．哺乳動物への免疫
哺乳動物をＴｎＴで免疫し、免疫した哺乳動物の体内で抗体産生細胞を産生させた。
免疫の対象となる哺乳動物としては、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ等を用いることができるが、本願発明者はマウスを用いた。また、免疫するマウスの系等には、例えば、Ａ／Ｊ系統、ＢＡＬＢ／Ｃ系統、ＤＢＡ／２系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、Ｃ３Ｈ／Ｈｅ系統、ＳＪＬ系統、ＮＺＢ系統、ＣＢＡ／ＪＮＣｒｊ系統が挙げられる。ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスは、免疫後の血清に高い抗体力価（Ｔｉｔｅｒ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）を示すことが知られており、ＴｎＴとの親和性が高いモノクローナル抗体が得られることが期待されることと、細胞株（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ）の確立後に腹水による抗体大量作製において一般的に用いられていることから、本願発明者はこの系統のマウスを用いることとした。
【００２７】
免疫するマウスの齢は、特に限定されるものではないが、一般的には生後４〜１２週齢のものが用いられるが、好ましくは生後６〜１０週齢であり、より好ましくは生後７週齢である。なお、本願発明者は、生後７週齢の雌のＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスを用いた。
【００２８】
免疫に用いられる抗原は、ＴｎＴそのもの又はそのフラグメントを用いることができる。また、ＴｎＴは、天然のものを用いることが好ましく、ヒト血清から精製したものを用いてもよいし、市販されているものを用いてもよい。免疫に用いられるＴｎＴは、総タンパク質に対する純度が通常８０％以上のものが用いられるが、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、更に好ましくは９８％以上のものである。
【００２９】
免疫に用いられるＴｎＴは、アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合したものを用いることが好ましい。なぜなら、ＴｎＴとアジュバントとを混合させたものを用いることで、哺乳動物の抗原に対する免疫応答の増強を期待できるからである。
【００３０】
アジュバントの例としては、油中水型乳剤（例えば、不完全フロイントアジュバント）、水中油中水型乳剤、水中油型乳剤、リポソーム、水酸化アルミニウムゲル、シリカアジュバント、粉末ベントナイト及びタピオカアジュバントが挙げられる。また、ＢＣＧ、Ｐｒｏｐｉｏｎｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ等の菌体、細胞壁及びトレハロースダイコレート（ＴＤＭ）等の菌体成分、グラム陰性菌の内毒素であるリポ多糖体（ＬＰＳ）、リピドＡ画分、β―グルカン（多糖体）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、ベスタチン、レバミゾール等の合成化合物、胸腺ホルモン、胸腺ホルモン液性因子及びタフトシン等の生体成分由来のタンパク質又はペプチド性物質をアジュバントとして用いることもできる。更に、これらの混合物（例えば、完全フロイントアジュバント）をアジュバントして用いてもよい。
【００３１】
これらアジュバントは、哺乳動物に対する投与経路、投与量、投与時期等に依存して免疫応答の増強又は抑制を図ることができる。更にアジュバントの種類によっては、抗原に対する抗体産生、細胞性免疫の誘導及び免疫グロブリンのクラスに差が認められる。それ故、目的とする免疫応答に応じて、適切なアジュバントを選択する必要がある。本願発明者は、完全フロイントアジュバントを用いた。
【００３２】
哺乳動物への免疫は、例えば、哺乳動物の皮下、皮内、静脈又は腹腔内にＴｎＴを注射することで行われる。免疫応答は、対象となる哺乳動物の種類及び系統によって異なるので、免疫スケジュールは使用する哺乳動物に応じて適宜設定する必要がある。また、哺乳動物への最初の免疫後には、複数回にわたって追加の免疫が行われる。
【００３３】
≪試薬≫
以下（ａ）及び（ｂ）の試薬を調製した。
（ａ）生理食塩水リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ；以下、「ＰＢＳ」と略する。）
ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４を最終濃度がそれぞれ１３７ｍＭ、２．７ｍＭ、８．１ｍＭ、１．４７ｍＭとなるように水に溶解させ、ＰＢＳを調製した。
【００３４】
（ｂ）第１の抗原溶液
ＰＢＳに最終濃度が１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴｎＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、３０Ｃ−ＣＰ３０３７）を溶解させ、第１の抗原溶液を調製した。
【００３５】
≪手順≫
以下の（１）〜（４）の手順により、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスに免疫を行った。
（１）第１の抗原溶液に、アジュバントとして同体積量のヒト結核死菌含有完全フロイントアジュバント（和光純薬製、Ｈ３７Ｒｖ）を加え、ホモジナイザにより十分に乳化させ（ホモジナイザの回転数は１０００ｒｐｍ）、アジュバントエマルジョン（Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｅｍｕｌｕｓｉｏｎｓ）を調製した。
（２）生後７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウス５匹それぞれに対し、調製したアジュバントエマルジョン５０μｌを腹腔内に注射した。
（３）アジュバントエマルジョンを最初に注射してから２週間後に、これら５匹のマウスそれぞれにアジュバントエマルジョン５０μｌを腹腔内に注射した。
（４）その後、同様に最初の注射から４週間後、６週間後及び８週間後に、これら５匹のマウスそれぞれに対してアジュバントエマルジョン５０μｌを腹腔内に注射した。
【００３６】
２．マウス生体内における抗体産生の確認
哺乳動物への免疫後、生体内に抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体が産生されていることを確認した。具体的には、免疫した哺乳動物から血液を採取し、得られた血液を用いてＴｎＴの結合活性（Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定することで、哺乳動物の体内に抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体が産生されていることを確認した。また、免疫末期には、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃｌａｓｓ  Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）が起こっていることを確認した。本願発明者は、これら評価をＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスへの２回目の注射から１週間後と、４回目の注射から１週間後とで行った。
【００３７】
結合活性の測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法又は蛍光抗体法により確認することができる。本願発明者は、ＴｎＴの結合活性の測定にＥＬＩＳＡ法を採用した。
【００３８】
≪試薬≫
以下（ｃ）〜（ｈ）の試薬を新たに調製した。
（ｃ）ＰＢＳ−Ａｚ溶液
ＰＢＳに最終濃度が０．０４重量％となるようにアジ化ナトリウムを加え、ＰＢＳ−Ａｚ溶液を調製した。
（ｄ）ＴｎＴ溶液
ＰＢＳ−Ａｚ溶液に最終濃度が０．１μｇ／ｍｌとなるようにＴｎＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、３０Ｃ−ＣＰ３０３７）を溶解させ、ＴｎＴ溶液を調製した。
（ｅ）ブロッキング溶液
ＰＢＳ−Ａｚ溶液にスキムミルクを５重量％となるように加え、ブロッキング溶液を調製した。
（ｆ）ＰＢＳＴ溶液
ＰＢＳに最終濃度が０．０５体積％となるようにＴｗｅｅｎ２０（和光純薬製、１６７−１１５１５）を加え、ＰＢＳＴ溶液を調製した。
（ｇ）ＢＳＡ溶液
ＰＢＳ−Ａｚ溶液に最終濃度が１重量％となるようにウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ；以下、「ＢＳＡ」と略する。）（シグマ製、Ａ７８８８）を加え、ＢＳＡ溶液を調製した。
（ｈ）標識抗体溶液
ＢＳＡ溶液に最終濃度が０．２μｇ／ｍｌとなるようにペルオキシダーゼ標識ヤギ由来抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、１０３４−０５）を溶解させ、標識抗体溶液を調製した。
【００３９】
≪手順≫
＜マウスの血液を用いたＴｎＴの結合活性の測定＞
以下の（１）〜（１１）の手順により、免疫したマウスの血液を用いてＴｎＴの結合活性を測定した。
（１）マウスへの２回目の注射から１週間後と、４回目の注射から１週間後のマウス（５匹分）それぞれから血液を採取し、当該血液から血清を得た。
（２）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）にＴｎＴ溶液を１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（３）一晩保存したマイクロプレート中のＴｎＴ溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（４）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（５）各ウェルについて１ウェルに対して取得した血清を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（６）マイクロプレート中の血清を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（７）各ウェルについて１ウェルに対して標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（８）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（９）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ  Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１０）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１１）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。
【００４０】
＜ＩｇＧへのクラススイッチの確認＞
ＩｇＧへのクラススイッチは、前述により得たマウスへの４回目の注射から１週間後のマウスから得た血清に対し、抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、１０３４−０５）への結合反応性により確認した。
【００４１】
≪結果≫
＜マウスの血液を用いたＴｎＴの結合活性の測定＞
得られた血液のＴｎＴの結合活性は、ウェル中の溶液の吸光度（４５０ｎｍの波長）が、明確な発色が認められるか否かで評価した。すなわち、明確な発色が認められれば、得られた血液に対応するＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウスの生体内で抗体産生が行われているということである。
【００４２】
結果、免疫を行った５匹全てのマウスについて、抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体の産生が認められた。特に３匹のマウスについては、力価が高かったため、後述の実験においてはこの３匹を用いることとした。
【００４３】
＜ＩｇＧへのクラススイッチの確認＞
前述により得たマウスへの４回目の注射から１週間後のマウスから得た血清に対し、抗マウスＩｇＧ抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製、１０３４−０５）への結合反応性を確認した結果、いずれのマウスの血液においてもＩｇＧへのクラススイッチが起こっていることを確認した。
【００４４】
３．免疫原の追加注射
前述のＴｎＴの結合活性の測定により、生体内に抗ヒト心筋トロポニンＴ抗体が産生されていることを確認した後、当該マウスに対して免疫原を追加注射（以下、「ブースト」と称する。）を行うことで、マウスの脾臓を肥大させた。
【００４５】
ブーストには、通常、ＴｎＴとアジュバントとが乳化したエマルジョンが用いられるが、最終免疫（後述のハイブリドーマ作成による細胞融合数日前に行う追加注射）においてはアジュバントを用いず、ＴｎＴのみを用いることが好ましい。また、マウスへのＴｎＴの投与経路としては、皮下、皮内、静脈、又は腹腔内それぞれによって、ＴｎＴに対して異なった部位を認識する抗体が得られる可能性がある。
【００４６】
≪試薬≫
以下（ｉ）の試薬を新たに調製した。
（ｉ）第２の抗原溶液
ＰＢＳに最終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＴｎＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、３０Ｃ−ＣＰ３０３７）を溶解させ、第２の抗原溶液を調製した。
【００４７】
≪手順≫
３匹のマウスそれぞれについて、最初の免疫から３ヶ月後に第２の抗原溶液１００μｌをマウスの腹腔内に注射することで、免疫原の追加注射を行った。
【００４８】
４．ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）の作製
マウスへの最終免疫を行った後、マウスから脾臓細胞を摘出し、摘出した脾臓細胞と骨髄腫由来の細胞株とを細胞融合させ、ハイブリドーマを得た。
ハイブリドーマの増殖能力は、細胞融合時に用いられる骨髄腫由来の細胞株の種類に依存するので、増殖能力が優れた骨髄腫由来の細胞株を選択する必要がある。また、骨髄腫由来の細胞株は、融合する脾臓細胞の由来との適合性を勘案する必要がある。マウスの骨髄腫由来の細胞株としては、例えば、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＦＯ・１、Ｓ１９４／５．ＸＸ０ ＢＵ．l、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１が挙げられる。本願発明者は、骨髄腫由来の細胞株として、ハイブリドーマの増殖能力が優れていることが知られているＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３を選択した。
【００４９】
脾臓細胞と骨髄腫由来の細胞株とを細胞融合する手法としては、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いた方法、電流を利用する方法が挙げられる。本願発明者は、細胞毒性も少なく、融合操作も容易であり、再現性の高いポリエチレングリコール法を採用した。
【００５０】
≪手順≫
以下の（１）〜（４）の手順により、ハイブリドーマを作製した。
（１）最終免疫を行ってから３日後に対象となるマウスの脾臓細胞を摘出した。
（２）ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）（ＭＥＲＣＫ社製、８０７４８９、平均分子量１，５００）を用いて脾臓細胞とＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３とを融合させ、ハイブリドーマを作成した。
（３）ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ：以下、「ＦＣＳ」と略する。）が１５重量％含有するイシコフ培地で調製したヒポキサンチン（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ）／アミノプテリン（Ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）／チミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）培地（以下、「ＨＡＴ培地」と称する。）にハイブリドーマを浮遊させた。
（４）マイクロプレートにハイブリドーマを分注後、ＣＯ２インキュベータ（三洋電機製、ＭＣＯ−４０ＡＩＣ）内で、１週間培養を行った。この際、ハイブリドーマの培養開始時の成長因子であるフィーダー細胞として、同じマウス固体の脾臓細胞を用いた。なお、ハイブリドーマの培養条件は、ＣＯ２濃度が５体積％、温度３７℃、湿度９５％である。以下の実験において、ハイブリドーマの培養は特に明示しない限り、この条件で培養を行っている。
【００５１】
５．細胞選別及びクローニング
作成したハイブリドーマから産生された抗体のＴｎＴに対する結合能を評価することで、目的の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、選別したハイブリドーマのクローニングを行った。
【００５２】
結合能の評価は、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法により確認することができるが、本願発明者は、ＥＬＩＳＡ法を採用した。
ＴｎＴの測定に用いられる抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、ＴｎＴに対して高い結合能を有する必要がある。一方、ＴｎＴの測定に用いられる抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、骨格筋トロポニンＴに対して結合能を有さないか、若しくは低い結合能を有する必要がある。したがって、本願発明者は、得られたそれぞれのハイブリドーマから産生された抗体について、ＴｎＴに対する結合能及び骨格筋トロポニンに対する結合能のそれぞれを評価し、目的の特異性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選別した。
【００５３】
なお、本願でいう「ＴｎＴに対して高い結合能を有する抗体」とは、後述の実験手順で示すＥＬＩＳＡ法（詳細には「インヒビションＥＬＩＳＡ法」。）において、ＴｎＴとの抗原抗体反応においてインヒビションがかかり、算出されたインヒビションの半値が１．０×１０−９Ｍ以下であることを意味する。
また、本願でいう「インヒビションがかかる」とは、固相に固定されたＴｎＴに結合する抗体の量が、競合物質（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の存在下で、競合物質の不存在下と比較して減少することをいう。一方、「インヒビションがかからない」とは、固相に固定されたＴｎＴに結合する抗体の量が、競合物質の存在下及び不存在下で同等（実質的に同等である場合も含む。）であることをいう。
本願でいう「インヒビションの半値」とは、競合物質の不存在下における吸光度（抗体結合量を反映する）の半分の吸光度が測定されるインヒビターの濃度をいう。
【００５４】
ハイブリドーマの選別は、例えば、限界希釈法や軟寒天法により行うことができる。本願発明者は、操作が容易で再現性の高い限界希釈法により、ハイブリドーマのクローニングを行った。なお、細胞融合により得られた多くのハイブリドーマの中から、効率よく有用な細胞を選択するために、クローニングの初期の段階から細胞選別を行うことが好ましい。最終的に選別されたハイブリドーマは、液体窒素中で半永久的に保存することができる。
【００５５】
≪試薬≫
以下（ｊ）の試薬を新たに調製した。
（ｊ）細胞保存液
ＦＣＳ１０体積部とジメチルスルフォキシド９０体積部とを混合させ、細胞保存液を調製した。
【００５６】
≪手順≫
以下の手順により、細胞選別及びクローニングを行った。
＜第１段階の選別＞
（１）ハイブリドーマの培養から１週間後、マイクプレートの各ウェル中における培養上清を１００μｌ採取した。一方、各ウェルに残存する培養液を２４ウェルプレートに継代し、各ウェルにＦＣＳが１５重量％含有するヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を１ｍｌずつ加えた。
（２）２４ウェルプレートにハイブリドーマを継代して４日後、その培養上清を１ウェルに対し１５０μｌずつ採取した。ハイブリドーマの培養から１週間後と継代して４日後の培養上清は、以下の（３）〜（１２）に示すＥＬＩＳＡ法によりＴｎＴに対する結合能の測定に用いられた。
（３）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）にＴｎＴ溶液を１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（４）一晩保存したマイクロプレート中のＴｎＴ溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（５）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（６）各ウェルについて１ウェルに対して取得した血清を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（７）マイクロプレート中の血清を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（８）各ウェルについて１ウェルに対して標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（９）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（１０）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ  Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１１）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１２）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。
（１３）吸光度の測定結果に基づき、ＴｎＴに対して高い結合能を有し、増殖状態の良いウェルを選別した。
（１４）選別したウェル中のハイブリドーマを６ウェルプレートに継代し、各ウェルにＦＣＳが１５重量％含有するヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）培地を４ｍｌずつ加え、２日間培養した。
【００５７】
＜第２段階の選別＞
（１）６ウェルプレートにハイブリドーマを継代して２日後、その培養上清を１ウェルに対し１５０μｌずつ採取した。この培養上清は、以下の（２）〜（１２）に示すインヒビションＥＬＩＳＡ法によるＴｎＴに対する結合能の測定に用いられた。
（２）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）にＴｎＴ溶液を１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（３）一晩保存したマイクロプレート中のＴｎＴ溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（４）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（５）各ウェルについて１ウェルに対して取得した血清を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（６）マイクロプレート中の血清を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（７）各ウェルについて１ウェルに対してインヒビターとしてＴｎＴ溶液を２５μｌずつ注入し、更に標識抗体溶液を２５μｌずつ注入し、常温にて１時間放置した。
（８）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（９）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ  Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１０）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１１）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。
（１２）吸光度の測定結果に基づき、インヒビションのかかったウェルを選別した。
（１３）選別された各ウェルの細胞について、それぞれ中フラスコ（５０ｍｌ）に継代した。培地は、ＦＣＳが１５重量％含有するＨＴ培地を４５ｍｌずつ加え、３日間培養した。
【００５８】
＜ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定＞
ＴｎＴに対する結合能の測定については、前述の第２段階の選別で行ったインヒビションＥＬＩＳＡ法と同様であるので、説明を省略する。また、骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定については、マイクロプレート中に固定化する抗原及びインヒビターを、ＴｎＴから骨格筋トロポニンＴに変えただけであるので、説明を省略する。
【００５９】
＜限界希釈法によるハイブリドーマの単離及び選定＞
（１）選別した各ウェルに含まれるハイブリドーマについて、ＦＣＳが１５重量％含有のＨＴ培地を用いて、１ウェルあたり２ケの細胞が含まれる濃度に限界希釈し、各希釈液を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに分注した。
（２）フィーダー細胞として、生後４週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウスの胸線細胞を用いて、ハイブリドーマの初期増殖を促進させた。
（３）各ウェル中のハイブリドーマについて、適宜、継代培養を繰り返すことで、培養スケールを上げ、継代の都度、前述の「第１段階の選別」で行ったＴｎＴに対する結合能の測定（ＥＬＩＳＡ法）を行うことでスクリーニングを繰り返した。
（４）継代培養を繰り返すことでスクリーニングを行い、最終的に２００ｍｌの培地中におけるハイブリドーマが約５．０×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌとなるまで増殖させた。
（５）スクリーニングを繰り返すことで、目的の機能を有するハイブリドーマを選定した。
【００６０】
＜ハイブリドーマの保存＞
（１）選定したハイブリドーマは、遠心分離（１６００ｒｐｍ、５分）し、その培養上清を取り除いた。
（２）遠心分離により培養上清が取り除かれたハイブリドーマに対し、ハイブリドーマが約１．０×１０７ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように細胞保存液に浮遊させた。なお、ハイブリドーマの１ｍｌあたりのｃｅｌｌ数の調整は、血球計算盤により単位面積当たりの細胞数をカウントすることにより行われた。
（３）細胞保存液に浮遊されたハイブリドーマは、−８０℃で予備凍結し、その後、液体窒素中に保存した。
【００６１】
≪結果≫
＜第１段階の選別＞
２回採取した培養上清のうち、定性的な判断でＴｎＴに対して高い結合能を有し、増殖状態の良かった５３ウェル中のハイブリドーマを第２段階の選別に用いることとした。
【００６２】
＜第２段階の選別＞
培養上清中にＴｎＴに結合する抗体が存在するウェルには、インヒビターとして添加されたＴｎＴと結合し、マイクロプレートに固定化されたＴｎＴへの結合が阻害されるため、ＥＬＩＳＡ法の発色反応による発色が抑制される。従って、インヒビションＥＬＩＳＡ法によりインヒビションがかかった１５ウェルを選別し、ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定に用いることとした。
【００６３】
＜ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定＞
第２段階の選別により選別された１５ウェル中のハイブリドーマについて、ＴｎＴ及び骨格筋トロポニンＴに対する結合能の測定を行い、ＴｎＴでのみインヒビションがかかり、骨格筋トロポニンＴでインヒビションがかからなかった１１ウェルを選別し、限界希釈法によるハイブリドーマの単離に用いることとした。
【００６４】
＜限界希釈法によるハイブリドーマの単離及び選定＞
最終的にＴｎＴに対して高い結合能を有し、かつ、骨格筋トロポニンＴに対して結合能を有さないモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを１株選定した。
この選定したハイブリドーマを、１２Ｐ−２  Ｎｏ．２３と命名し、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８の独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託され、平成２６年（２０１４年）６月１７日に受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２を付与された。なお、以後の説明においては、１２Ｐ−２  Ｎｏ．２３が産生するモノクローナル抗体のことをＴｎＴ−Ｆ２３抗体と称することとする。
【００６５】
６．抗体の精製
前述の細胞選別及びクローニングにより得られたハイブリドーマを大量培養し、大量培養されたハイブリドーマから産生される抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を精製した。
【００６６】
ハイブリドーマの大量培養法としては、インビボ（Ｉｎ  ｖｉｖｏ）及びインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）により行う方法がある。インビボでの大量培養法の例としては、マウスの腹腔内にハイブリドーマを注射して、マウス腹水中にハイブリドーマを増殖させる方法が挙げられる。これにより、マウス腹水中に抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を大量に産生させることができる。一方、インビトロの培養では、ハイブリドーマを無血清培地（味の素社製、ＡＳＦ培地）中で培養する方法が挙げられる。これにより、培養液中に抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を大量に産生させることができる。本願発明者は、インビボにより大量培養を行った。
【００６７】
得られた腹水を用いて抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体を精製した。抗体の精製法としては、ＤＥＡＥ（「Ｄｉｅｔｙｌａｍｉｎｏ  Ｅｔｙｌ」の略である。）陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、硫安分画法（Ａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ；以下「ＰＥＧ」と略する。）分画法（ＰＥＧ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、エタノール分画法（Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｆｒａｇｔｉｏｎａｔｉｏｎ）等が挙げられる。また、これら精製法を適宜組み合わせて用いることもできる。本願発明者は、アフィニティークロマトグラフィーにより抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の精製を行った。
【００６８】
抗体の精製においては、総タンパク質に対する抗心筋トロポニンＴモノクローナル抗体の純度が、９０％以上であることが好ましく、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上の純度であることが好ましい。
【００６９】
≪試薬≫
以下（ｋ）及び（ｌ）の試薬を新たに調製した。
（ｋ）結合緩衝液
グリシン、ＮａＣｌの最終濃度がそれぞれ１．５Ｍ、３Ｍとなるように水に溶解させ、ｐＨ８．９に調整することで、結合緩衝液を調製した。
（ｌ）溶出緩衝液
クエン酸を最終濃度が１００ｍＭとなるように水に溶解させ、ｐＨ４．０に調整することで、溶出緩衝液を調製した。
【００７０】
≪手順≫
以下の（１）〜（８）の手順により、抗体の精製を行った。
（１）ハイブリドーマ１２Ｐ−２  Ｎｏ．２３を７週齢のＢＡＬＢ／Ｃ系統の雌マウスの腹腔内に注射した。
（２）腹腔内への注射後、腹水の貯留状態を確認しながら、生存しているマウスから順次、蓄積した腹水を採取した。
（３）プロテインＡ結合ゲル（ＧＥヘルスケア製、プロテインＡセファロース４ＦＦ）を充填したカラムを、結合緩衝液で平衡化した。
（４）採取した腹水を結合緩衝液で３倍に希釈し、平衡化したカラムにアプライした。
（５）カラムからの溶出液を２８０ｎｍの波長における吸光度でモニターし、不純物の溶出が終了するまでカラムを結合緩衝液で洗浄した。
（６）カラムの洗浄後、溶出緩衝液をカラムにアプライ（線流速が２０ｃｍ／ｈｏｕｒ）し、ＩｇＧ含有溶出液を回収した。
（７）回収したＩｇＧ含有溶出液の精製分画それぞれについて、２８０ｎｍの波長における吸光度を測定し、測定された吸光度を吸光係数で換算することにより、抗体濃度を算出した。
（８）回収したＩｇＧ含有溶出液の精製分画それぞれについて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、標準タンパク質（タンパク質マーカー）との比較を行った。
【００７１】
≪結果≫
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体の各精製分画はいずれも分子量が約５０，０００のＨ鎖と約２５，０００のＬ鎖からなるＩｇＧであることを確認した。
【実施例２】
【００７２】
実施例２  抗体の評価
精製により得られたＴｎＴ−Ｆ２３抗体のＴｎＴに対する結合能を測定した。
≪手順≫
前述の「細胞選別及びクローニング」のおける「第２段階の選別」で行ったインヒビションＥＬＩＳＡ法と同様であるため、説明を省略する。
【００７３】
≪結果≫
図１は、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のＴｎＴに対する結合能の測定結果を示すグラフである。図１に示すグラフは、縦軸が４５０ｎｍの波長における吸光度（図１中には「ＯＤ４５０」と記載している。）であり、横軸はＴｎＴ濃度（Ｍ）の対数値を示している。
【００７４】
図１の結果に基づきＴｎＴ−Ｆ２３抗体のインヒビションの半値を算出した結果、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のインヒビションの半値は１．０×１０−９であった。前述で説明した通り、インヒビションの半値が１．０×１０−９以下の抗体は、ＴｎＴに対する結合能が高い抗体であるので、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体は、ＴｎＴに対して高い結合能を有することが分かる。
【００７５】
８．エピトープの特定
ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のエピトープの特定を行った。まず、ＴｎＴのアミノ酸配列に含まれる１０〜２０程度のアミノ酸からなるペプチドを複数準備し、これらペプチドを用いてＥＬＩＳＡ法によりエピトープの特定を行った。エピトープの特定には、図２に示す２９種類のペプチドが用いられた。
【００７６】
≪試薬≫
以下（ｍ）及び（ｎ）の試薬を新たに調製した。
（ｍ）ペプチド溶液
２９種類のペプチドについて、ＰＢＳ−Ａｚ溶液に図２に示した２９種類のペプチドそれぞれについて、最終濃度が０．１μＭとなるように加え、ペプチド溶液（２９種類）を調製した。
（ｎ）ＴｎＴ−Ｆ２３抗体溶液
ＰＢＳ溶液に、最終濃度が０．１μＭとなるようにＴｎＴ−Ｆ２３抗体を加え、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体溶液を調製した。
【００７７】
≪手順≫
以下の（１）〜（１０）の手順により、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のエピトープの特定を行った。
（１）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）に２９種類のペプチド溶液それぞれを１ウェルに対して１００μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（２）一晩保存したマイクロプレート中のペプチド溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（３）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（４）各ウェルについて１ウェルに対してＴｎＴ−Ｆ２３抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて９０分間放置した。
（５）マイクロプレート中の抗体溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（６）各ウェルについて１ウェルに対して標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（７）マイクロプレート中の標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（８）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ  Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（９）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１０）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。
【００７８】
≪結果≫
図３は、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体の２９種類のペプチドそれぞれに対する結合能の測定結果を示すグラフである。図３に示すグラフは、縦軸が４５０ｎｍの波長における吸光度であり、横軸は２９種類のペプチドのペプチドナンバーである。図３の横軸のペプチドナンバーは、図２のペプチドナンバーに対応している。また、横軸のＴｎＴはコントロールである。
【００７９】
図３の結果から明らかなように、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体は、ペプチドナンバー１９のペプチドに対して結合能を有する一方、それ以外のペプチドについては結合能を有さなかった。
ペプチドナンバー１９のペプチドは、アイソフォーム３でいうとＮ末端側から１７２―１８６番目のアミノ酸配列に対応する。一方、ペプチドナンバー１８及び２０のペプチドは、アイソフォーム３でいうとそれぞれＮ末端側から１６２−１７６番目、１８２−１９６番目のアミノ酸配列に対応する。
【００８０】
ペプチドナンバー１８とペプチドナンバー１９とのペプチドでは、アイソフォーム３でいうとＮ末端側から１７２−１７６番目のアミノ酸配列で重複し、ペプチドナンバー２０とペプチドナンバー１９のペプチドでは、アイソフォーム３でいうとＮ末端側から１８２−１８６番目のアミノ酸配列で重複する。図３の結果より、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体が、ペプチドナンバー１８及びペプチドナンバー２０のペプチドに対する結合能を有さなかったことから、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体は、ＴｎＴ中のＡｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ（配列番号：３２）を含むアミノ酸配列をエピトープとするものと考えられる。すなわち、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体のエピトープは、アイソフォーム３でいうとＮ末端側から１７７−１８１番目のアミノ酸配列、野生型でいうとＮ末端側から１８７−１９１番目を含むアミノ酸配列に対応する。
【００８１】
これらのことから、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体は、ＴｎＴの経時変化に伴い細分化された分子量が約２５，０００のフラグメントであっても結合することができ、アイソフォームに依存しないため、ＴｎＴの多様な変化に対応することができ、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体を用いることで、ＴｎＴを精度良く測定することができるといえる。
【００８２】
また、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体は、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴにも特異的に結合しない。なぜなら、遅筋型及び速筋型のいずれの骨格筋トロポニンＴにも、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔに対応するアミノ酸配列を有さず、前述の「細胞選別及びクローニング」において骨格筋トロポニンＴに対する結合能を有さなかったことからも示されているからである。
【００８３】
なお、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体はＩｇＧであるが、ＩｇＧそのものだけでなく、その結合特性を保持した機能断片も含まれる（例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）２）。また、本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体は、その結合特性を保持した変異抗体も包含する。
【実施例３】
【００８４】
実施例３  ＴｎＴ−Ｆ２３抗体によるＴｎＴの測定
本願発明者は、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体を用い、ＥＩＡ法によりＴｎＴの測定を行った。本発実施例で行ったＥＩＡ法とは、具体的には、ＥＬＩＳＡ法（比色測定、サンドイッチ法）である。
【００８５】
≪試薬≫
以下の試薬を新たに調製した。
（ｍ）固相抗体溶液
サンドイッチ反応用の固相抗体として、ＰＢＳに最終濃度が０．１μＭとなるようにトロポニンＴ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、品番  １０−Ｔ８５Ａ）を加え、固相抗体溶液を調製した。
（ｎ）液相抗体溶液
サンドイッチ反応用の液相抗体として、本発明のＴｎＴ−Ｆ２３抗体を次の手順にてビオチン化を行った。まず、ＰＢＳにて２μＭに調製したＴｎＴ−Ｆ２３抗体溶液１ｍｌに対して、最終濃度２０ｍＭになるようＰＢＳ溶液にて調製したＮＨＳ-Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ製、２１４２５）を２μＬ添加し、３０分間室温にて転倒混和した後、ブロッキングＢｕｆｆｅｒ（０．５Ｍグリシン／０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．３）を１ｍｌを加え、３０分間室温にて転倒混和したものをビオチン化抗体とした。（グリシン：和光純薬製、０７７−００７３５、ＮａＣｌ：和光純薬製、品番１９１−０１６６５）
このビオチン化抗体をＰＢＳに加え、最終濃度が０．１μＭとなるよう調製したものを、液相抗体溶液として用いた。
（ｏ）反応用抗原溶液
抗原溶液として、ＢＳＡ溶液に最終濃度が、０．０００１、０．０００３、０．００１、０．００３、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０ｎＭとなるようにＴｎＴ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、品番  ３０Ｃ−ＣＰ３０３７）を溶解させ、１２種類の濃度のＴｎＴ溶液を調製した。
【００８６】
≪手順≫
以下の（１）〜（１２）の手順により、ＴｎＴの測定を行った。
（１）マイクロプレート（Ｎｕｎｃ製、イムノプレートマキシソープ丸底Ｕ９６、４４９８２４）に固相抗体溶液を１ウェルに対して５０μｌずつ注入し、室温にて飽和水蒸気中で一晩保存した。
（２）一晩保存したマイクロプレート中の抗体溶液をアスピレータで除去し、各ウェルについて１ウェルに対してブロッキング溶液を２００μｌずつ注入し、室温にて６０分間放置した。
（３）マイクロプレート中のブロッキング溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（４）各ウェルについて１ウェルに対して１２種類の反応用抗原溶液をそれぞれ５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（５）マイクロプレート中の抗原溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（６）各ウェルについて、１ウェルに対して液相抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（７）マイクロプレート中の抗体溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、その後、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（８）各ウェルについて１ウェルに対してストレプトアビジン標識抗体溶液を５０μｌずつ注入し、常温にて３０分間放置した。
（９）マイクロプレート中のストレプトアビジン標識抗体溶液を捨て、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄し、アスピレータで各ウェルに残存するＰＢＳＴ溶液を除去した。
（１０）各ウェルについて１ウェルに対して発色反応試薬（Ｔｈｅｒｍｏ製  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ、１ＳＴＥＰ  Ｕｌｔｒａ）を５０μｌずつ注入し、室温にて５分間反応させた。
（１１）５分間反応後、各ウェルについて１ウェルに対して４Ｎ硫酸を５０μｌずつ注入し、発色反応を停止させた。
（１２）発色反応を停止させた後、各ウェルの溶液についてマイクロプレートリーダ（ＴＥＣＡＮ製、品番  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００）を用いて吸光度（４５０ｎｍの波長）の測定を行った。
【００８７】
≪結果≫
図６は、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体を用いたサンドイッチ反応の測定結果を示すグラフである。図６に示すグラフは、縦軸が４５０ｎｍの波長における吸光度（図６中には「ＯＤ４５０」と記載している。）であり、横軸はＴｎＴ濃度（ｎＭ）の対数値を示している。
【００８８】
図６の結果から、本発明のＴｎＴ−Ｆ２３抗体と今回用いた市販トロポニンＴ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ製、品番  １０−Ｔ８５Ａ）とのサンドイッチ反応によって、０．００１ｎＭからのトロポニンＴの検出が可能であること、図６により得られた検量線を用いれば、未知の濃度のトロポニンＴを含む溶液中のトロポニンＴ濃度の定量が可能であることがわかる。
【００８９】
以上のように、本発明の抗体を用いる事で、トロポニンＴの検出及び定量が可能であることが理解される。
【００９０】
なお、本実施例では、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体を用いたＴｎＴの測定として、ＥＬＩＳＡ法（比色測定、サンドイッチ法）により行ったが、本願はこれに限定されるものではない。
シグナル検出手法としては、本実施例で示した酵素による比色反応を用いた系だけでなく、その他、例えば、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、化学発光法及び電気化学発光法が挙げられる。
また、測定形式としては、本実施例ではサンドイッチ法によるものを示したが、本願はこれに限定されるものではなく、例えば、測定検体を固相に吸着させて測定する直接吸着法や競合法を用いてもよい。
【００９１】
さらに、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体は、本実施例で示したように固相に固定化された抗体に結合したＴｎＴに対する抗原抗体反応に用いたが、本願はこれに限定されるものではなく、例えば、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体を固相に固定した状態で用いてもよい。
さらにまた、ＴｎＴ−Ｆ２３抗体は、本実施例でビオチン標識したものを用いているが、他の方法にてＴｎＴ−Ｆ２３抗体を標識化してもよい。ＴｎＴ−Ｆ２３抗体に標識されるものとしては、例えば、ペルオキシダーゼ等の酵素、化学発光物質や電気化学発光物質等のシグナル物質が挙げられる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本願の一態様に係る抗ヒト心筋トロポニンＴモノクローナル抗体、ハイブリドーマ、ＴｎＴの測定方法及びＴｎＴの測定キットによれば、ＴｎＴを精度良く測定することができる。
【受託番号】
【００９３】
ＮＩＴＥ  Ｐ−０１８６２
【配列表フリーテキスト】
【００９４】
配列番号：１〜２９はＴｎＴ−Ｆ２３抗体のエピトープの特定に用いられたペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号：３０はＴｎＴ（野生型）のアミノ酸配列である。
配列番号：３１はＴｎＴ（アイソフォーム３）のアミノ酸配列である。
配列番号：３２はＴｎＴ−Ｆ２３抗体のエピトープに含まれるアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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