(57)【要約】【課題】    本発明の目的は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子発現を抑制し、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぎ、さらに、創傷、火傷、潰瘍性、日光による皮膚損傷、水疱性、苔癬性、肉芽性等の各種皮膚疾患にも有効であり、皮膚以外にも、関節炎、関節痛の予防や治療にも有効である製剤を得ることにある。【解決手段】  桑枝の抽出物を有効成分として配合すると、上記の目的を達することがわかった。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
桑枝の抽出物を含有するマトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子発現抑制剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子発現を抑制し、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぐ。さらに、創傷、火傷、潰瘍性、日光による皮膚損傷、水疱性、苔癬性、肉芽性等の各種皮膚疾患にも有効であり、皮膚以外にも、関節炎、関節痛の予防や治療にも有効である。
以上の用途に有効な製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）は、皮膚の真皮細胞外マトリックスの主要構成成分であるコラーゲンを分解する酵素として知られている。
その発現は紫外線の照射により大きく増加し、コラーゲンの減少・変性の一因となり、皮膚のシワの形成、弾力性の低下等の大きな要因となると考えられている。したがって、ＭＭＰ−１の活性を阻害することは、皮膚の老化症状を予防・改善する上で重要である。
また、マトリックスメタロプロテアーゼは真皮細胞外基質の代謝をコントロールしているだけでなく、細胞の浸潤やサイトカイン等の生理活性分子の活性化にも深く関与しており、種々の疾患との関連性が報告されている。例えば、皮膚においては、種々のサイトカインや成長因子、細胞の相互作用等により一過的にマトリックスメタロプロテアーゼが過剰に産生されること、創傷、火傷、潰瘍性、日光による皮膚損傷、水疱性、苔癬性、肉芽性等の各種皮膚疾患に関与していることが知られている。
また、関節炎、関節痛の予防や治療にも有効である。
さらにＭＭＰ−１は、がん細胞の浸潤・転移において重要な役割を果たしている。がん細胞の浸潤・転移には、細胞外基質を分解して組織に侵襲していくことが重要な過程となる。がん細胞はＭＭＰを過剰発現し分泌するので、がん細胞の浸潤・転移に深く関与している。特に、基底膜を通り抜けたがん細胞は、ＭＭＰ−１を分泌して、主としてタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩコラーゲンで構成されている細胞外基質を破壊し、血管あるいはリンパ管に到達すると血管の基底膜を破壊して血管内に侵入し、他の臓器などに転移することが知られている。
ＭＭＰはそのほとんどが不活性の前駆体として産生され、他のＭＭＰ等のプロテアーゼによって活性化される。例えば、ＭＭＰ−１はＭＭＰ−２を活性化する働きを有している（非特許文献３）ことから、ＭＭＰ−１の作用を抑制すれば、ＭＭＰ−２の活性化も阻害され、その結果、これらのＭＭＰ２による作用も抑制することができる。（特許文献１、非特許文献１〜３）
【０００３】
また、メイラード反応は、還元糖と蛋白質の非酵素的、非可逆的な反応により、シッフ塩基（Schiff base） の形成、アマドリ転移、様々な中間体形成を経て、蛋白糖化最終生成物（advanced glycation end products: AGEs） の生成に至るまでの過程を意味する。
ＡＧＥｓが細胞にあるレセプター（ＲＡＧＥ）に結合することで、ＮＦ−κＢが活性化し、核内へ移行する。移行したＮＦ−κＢがＭＭＰ−１の遺伝子発現を亢進する。（非特許文献４）
【０００４】
紫外線、特に長波長紫外線（ＵＶＡ）の照射により真皮線維芽細胞において促進されるＩ型マトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤で、スルフヒドリル基を有する化合物及びジスルフィド結合を有する化合物より選択した１種又２種以上を含有してなる、Ｉ型マトリクスメタロプロテアーゼ産生阻害剤が開示されている。（特許文献２）  
トウキ及びその近縁植物、ニオイウド、クチナシ及びその同属植物、ワレモコウの各植物抽出物、リポ酸、その塩及びその誘導体より成る群から選択した１種又は２種以上を含有して成るマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が開示されている。（特許文献３）
【０００５】
歯周病予防あるいは治療に用いることを特徴とする、ブドウ種子エキスを含有してなるマトリックスメタロプロテアーゼ阻害物口腔剤組成物が開示されている。（特許文献４）
細胞のコラーゲン合成促進効果及び細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ阻害作用を有する、ブドウ種子エキス、ビタミンＣ及びビタミンＥを含有する歯周病予防または治療用の喫煙者乃至受動喫煙者向け食品組成物あるいは口腔用組成物が開示されている。（特許文献５）
【０００６】
（Ａ）天然ポリフェノールを含む抽出物から選ばれる１種又は２種以上、並びに、（Ｂ）ビタミンＣ及びその塩、ビタミンＥ、ビタミンＡ並びにベータカロチンからなる群より選ばれる１種又は２種以上を含有する、ニコチン刺激による歯周組織細胞由来マトリックスメタロプロテアーゼ産生の抑制作用を有する、喫煙者に特に有用な歯周病予防又は治療用食品組成物が開示されている。（特許文献６）
柑橘類に由来するフラボノイドを含有するマトリクスメタロプロテアーゼまたはその前駆体の賛成を阻害するための薬剤が開示されている。（特許文献７）
しかしながら、従来のマトリックスメタロプロテアーゼ産生阻害剤は、阻害活性が十分ではないものや不安定なものもあり、色や臭いの点で化粧品の素材として用いるには不向きなものもあった。
【０００７】
桑は学名をモルス ボムビシス（Morus Bombycis）、モルス アルバ（Morus alba）等と称する桑の木の乾燥した葉を言う。モルス ボムビシスは日本各地、および南千島、朝鮮、中国、ベトナムからインド、カシミールの温帯から亜熱帯に分布する。山地にはえ、畑に栽植される落葉高木であり、クワまたはヤマグワと呼ばれる。モルス アルバは中国，朝鮮半島の原産で日本には古くより渡来し、庭園樹、街路樹、養蚕用に各地で栽植される落葉高木で、カラグワ、トウグワと呼ばれている。これは、従来解熱、鎮咳、涼血、明目薬として、感冒、咳嗽、頭痛、目疾、脚気、水腫、腹痛、下痢、撲損お血などに応用し、医薬品としてすでに用いられている。ニキビ治療薬として利用されている。（特許文献８）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１４−２２１７５８号公報
【特許文献２】特開２００２−４７１７８号公報
【特許文献３】特開２０００−３１９１５５号公報
【特許文献４】特開２０００−１９１４８７号公報
【特許文献５】特開２００２−２９９５３号公報
【特許文献６】特開平１１−３０２１４２号公報
【特許文献７】特開２０００−８００３５号公報
【特許文献８】特開平１０−００７５４４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ、ＮＯ．４４１、１３７−１４０、１９９８、Ｓｃｏｔｔ ＫＡ ｅｔ ａｌ
【非特許文献２】がん研究のいま〜(2)がん細胞の生物学、高井義美・秋山徹 編集／東京大学出版会／2006
【非特許文献３】Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｎｏ.６、１９９−２１３、１９９７、Ｋａｈｒｉ Ｖ−Ｍ．ｅｔ ａｌ.
【非特許文献４】Jorunal of Periodontology  2012 Vol.83 No１ 119-126
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は  本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子発現を抑制し、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぐ。さらに、創傷、火傷、潰瘍性、日光による皮膚損傷、水疱性、苔癬性、肉芽性等の各種皮膚疾患にも有効であり、皮膚以外にも、関節炎、関節痛の予防や治療にも有効である製剤を得ることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らが鋭意検討した結果、桑枝の抽出物にマトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子の発現を抑制する作用があることがわかった。
なお、メイラード反応を起こしたコラーゲン（以下ＡＧＥｓコラーゲンと称する。）を添加し、マトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子の発現を促進させた線維芽細胞を用いて、マトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子発現抑制効果を確認した。
以下に詳細を記す。
桑枝は抽出効率を考え、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を用いる。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜１５質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜２０質量部添加することが好ましい。
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる植物（海藻）に対して望ましくは５〜１００倍量程度、さらに望ましくは１０〜５０倍量程度が良い。さらに抽出効率を上げるため、抽出溶媒中で撹拌やホモジナイズしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
尚、抽出操作は１回のみの操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。
必要ならば、その効果に影響のない範囲で更に脱臭、脱色等の精製処理を加えても良く、エバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
また、この抽出物を合成吸着剤（ダイアイオンＨＰ２０やセファビースＳＰ８２５、アンバーライトＸＡＤ４、ＭＣＩｇｅｌＣＨＰ２０Ｐ等）やデキストラン樹脂（セファデックスＬＨ−２０など）、限外濾過等を用いてさらに精製することも可能である。
【００１２】
これらの抽出物の他に、医薬品、食品、化粧品に利用できる原料とともに、製剤を作成するか、既存の医薬品、食品、化粧品にこれらを加えて利用することもできる。
利用できる原料を例示すれば、
アボガド油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、ゴマ油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂、スクワレン、スクワラン、プリスタン又はこれら油脂類の水素添加物（硬化油等）等の各種油脂類。
ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等のロウ類。
流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油。
【００１３】
ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の脂肪酸類。
エタノール、イソピロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等のアルコール類。
エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ペンチルグリコール、グリセリン、ペンタエリトリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、ガラクチトール、ソルビトール、ラクチトール、マルチトール等の多価アルコール類。
【００１４】
ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル、ラウリン酸ヘキシル、ミリスチン酸ミリスチル、オレイン酸オレイル、オレイン酸デシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジメチルオクタン酸ヘキシルデシル、乳酸セチル、乳酸ミリスチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジブチル、酢酸ラノリン、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロピレングリコール、ジオレイン酸プロピレングリコール等のエステル類。
ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸カルシウム、パルミチン酸亜鉛等の金属セッケン類。
アラビアゴム、グアヤク脂、カラヤゴム、トラガントゴム、クインシード、寒天、カゼイン、乳糖、果糖、ショ糖又はそのエステル、トレハロース又はその誘導体、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、カラギーナン、カルボキシメチルキチン又はキトサン、エチレンオキサイド等のアルキレン(Ｃ２〜Ｃ４)オキサイドが付加されたヒドロキシアルキル(Ｃ２〜Ｃ４)キチン又はキトサン、低分子キチン又はキトサン、キトサン塩、硫酸化キチン又はキトサン、リン酸化キチン又はキトサン、アルギン酸又はその塩、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、ヘパリン、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等のガム質、糖類又は水溶性高分子化合物。
アルキルカルボン酸塩、アルキルスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、アルキルアミン塩、アルキル四級アンモニウム塩、カルボン酸型両性界面活性剤、硫酸エステル型両性界面活性剤、スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル型両性界面活性剤、エーテル型非イオン界面活性剤、エーテルエステル型非イオン界面活性剤、エステル型非イオン界面活性剤、ブロックポリマー型非イオン界面活性剤、含窒素型非イオン界面活性剤等のアニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤。
【００１５】
レチノール、レチナール、デヒドロレチナール、カロチン、リコピン、チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ又はその誘導体、エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、ビタミンＥ又はその誘導体、ユビキノン類等の各種ビタミン類又はその誘導体。
バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、リジン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、システイン、シスチン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒドロキシリジン、オルニチン、ヒスチジン等や、それらの硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、クエン酸塩、或いはピロリドンカルボン酸のごときアミノ酸誘導体等の各種アミノ酸類。
【００１６】
赤芽柏、地黄、木通、地胆頭、一薬草、イチョウ、ウーロン茶、ウイキョウ、ウコン、夏枯草、陳皮、エゾウコギ、決明子、オウレン、白朮、オオバナサルスベリ、オクラ、オタネニンジン又はトチバニンジン (人参)、オリーブ、オレガノ、オレンジ、カミツレ又はローマカミツレ、カムカム、ガラナ、厚朴、ギョリュウ、グースベリー、クララ、クランベリー、グレープフルーツ、クローブ、コブシ、モクレン、威霊仙、サクラ、升麻、サンシチニンジン、山茱萸、山椒、サンズコン、シクンシ、シソ紫蘇、紫蘇、シャクヤク、スイカズラ、セイヨウトチノキ、セロリ、センキュウ、センブリ、ダイオウ、タチジャコウソウ、チクセツニンジン、テングサ、甜茶、テンダイウヤク、トクサ、ドクダミ、トチュウ、トネリコ、ナツメ、桂皮、五倍子、ノイバラ、ノバラ、ハトムギ、バラ、菱実、ビワ、ブラックベリー、プルーン、ホウノキ、ボウフウ(防風)、ホオノキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マオウ、マカ、マカデミアナッツ、桑白皮、苦参、マンネンタケ、枳実、ミロバラン、ムクロジ、ムラサキ、益母草、メマツヨイグサ、メリッサ、メリロート、モッコウ、ヤーコン、 ユーカリ、ユキノシタ、ユッカ、ユズ、ユリ、ヨロイグサ、ヨモギ、ラベンダー、レモン、レモングラス、ローズマリー、地楡、クロレラ、クロレラ、コンブ、ワカメ、ジャイアントケルプ、ヒジキ、ヒバマタ、キリンサイ、アサクサノリ、スサビノリ、スピルリナ、イシゲ、イロロ、フクロノリ等の植物、海藻、藻類の各種抽出物。
【００１７】
馬又は豚の胎盤抽出物、シルク蛋白及びその分解物又はそれらの誘導体、牛乳、カゼイン及びその分解物又はそれらの誘導体、脱脂粉乳及びその分解物又はそれらの誘導体、ラクトフェリン又はその分解物、鶏卵成分、魚肉分解物、核酸関連物質（リボ核酸、デオキシリボ核酸）等の動物系原料由来物質。
海洋成分深層水、海水塩、海水乾燥物、死海又は大西洋又は太平洋の海より得た無機塩、海泥等の海洋産物。
酵母菌抽出エキス、細菌代謝物、細菌抽出エキス、カビ又は放線菌代謝物、カビ又は放線菌抽出エキス、納豆菌代謝物、納豆抽出エキス、米発酵エキス、米糠（赤糠、白糠）発酵エキス、生乳又は脱脂粉乳の乳酸発酵物、マメ科植物の乳酸菌発酵物、ココヤシ属植物の乳酸菌発酵物等の菌類由来物質。
グリコール酸、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸等のα-ヒドロキシ酸類。
無水ケイ酸、ケイ酸マグネシウム、タルク、カオリン、ベントナイト、マイカ、雲母チタン、オキシ塩化ビスマス、酸化ジルコニウム、酸化マグネシウム、酸化亜鉛、酸化チタン、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、黄酸化鉄、ベンガラ、黒酸化鉄、グンジョウ、酸化クロム、水酸化クロム、カーボンブラック、カラミン等の無機顔料。
ベンゾフェノン誘導体、パラアミノ安息香酸誘導体、メトキシ桂皮酸誘導体、サリチル酸誘導体、ウロカニン酸誘導等の紫外線吸収または遮断剤。
【００１８】
パラアミノ安息香酸誘導体、サルチル酸誘導体、アントラニル酸誘導体、クマリン誘導体、アミノ酸系化合物、ベンゾトリアゾール誘導体、ハイドロキノン又はその誘導体、ニコチン酸誘導体、コウジ酸又はその誘導体、オキシベンゾン、ベンゾフェノン、アルブチン、グアイアズレン、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン、胎盤エキス、エラグ酸、ルシノール等の美白剤。
イクタモール、インドメタシン、カオリン、サリチル酸、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸メチル、アセチルサリチル酸、塩酸ジフェンヒドラミン、d-カンフル、dl-カンフル、ヒドロコルチゾン、グアイアズレン、カマズレン、マレイン酸クロルフェニラミン、グリチルリチン酸又はその塩、グリチルレチン酸又はその塩の抗炎症剤。
アクリノール、イオウ、グルコン酸カルシウム、グルコン酸クロルヘキシジン、トリクロサン等の抗菌・殺菌・消毒薬。
ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カルダモン精油、シンナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、シダーウッド精油、ジャスミン精油、バラ精油、ベルガモット精油、ラベンダー精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油等の動植物性香料、その他合成香料等。
感光素１０１号、感光素２０１号、感光素４０１号、感光素３０１号、ヒノキチオール、パントテン酸又はその誘導体、アラントイン、ペンタデカン酸グリセリド、尿素、グアニジン等の各種薬剤。
その他ホルモン類、金属イオン封鎖剤、ｐＨ調整剤等が挙げられる。
【００１９】
これらより、種々選択し、任意の形態にして利用に供する。形態の例としては、カプセル、粉末、顆粒、固形、液体、ゲル、気泡、乳液、クリーム、軟膏、シート等が挙げられる。
桑枝の抽出物の製剤への配合量は、固形分として好ましくは０．００００１〜１０重量％、さらに好ましくは０．０００１〜１．０重量％である。
【００２０】
実施例
桑の枝（乾燥品）１０ｇに５０％エタノール３００ｍｌを加えて、時々撹拌しつつ５日間放置した。これを濾過後、エバポレートした後、凍結乾燥した。
【００２１】
実施例について以下の実験を行った。
6ウェルプレートへヒト正常線維芽細胞（クラボウ）を播種し、予備培養として10%ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で４日間培養した。培養後、ＡＧＥｓコラーゲンと0.1%のFBSを含むDMEM培地と実施例を加え、２４時間培養した。なお、対照として実施例を添加しない系でも試験を実施した。
なお、ＡＧＥｓコラーゲンの作成方法は以下のようにおこなった。
５０mgのコラーゲンを１mM ＨＣｌで溶解し、sodium cyanoborohydrideを1.42gとglyoxylic acidを0.715gを溶解したＰＢＳ（25ml）へ加えた。
３７℃２４時間反応させた後、限外濾過（分子量３００００）し、凍結乾燥したものを用いた。
【００２２】
ＲＮＡの抽出
細胞からのＴｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用い、添付マニュアルに従い調整した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて算出した。
【００２３】
ＲＴ反応およびリアルタイムＰＣＲ
抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを使い、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、添付マニュアルに従いＲＴ反応を行った。
リアルタイムＰＣＲは、７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて実施した。
詳細には、前述のＲＴ産物と、MMP−１および内在性コントロールとしてＧＡＰＤＨのＴａｑＭａｎ（登録商標）  プライマー（ライフテクノロジーズ・ジャパン）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ・ジャパン）を用いて、ΔΔＣＴ法により遺伝子発現量の比較を行った。
【００２４】
結果を図１に示す。
【００２５】
また、実施例を配合した外用剤を作成し、実際に使用してみた結果、皮膚のシワを抑制し、弾力性の低下を防ぎ皮膚のタルミを防ぐ製剤が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】マトリックスメタロプロテアーゼ−１遺伝子発現抑制試験の結果であり、ＡＧＥｓコラーゲンによって発現が増加したマトリックスメタロプロテアーゼ−１を実施例が濃度に依存して抑制することを示す図である。  なお、結果は、ＡＧＥｓコラーゲンを添加し、実施例を添加していない実験のマトリックスメタロプロテアーゼ−１の発現量を１として表した。
【図１】
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