(57)【要約】      （修正有）【課題】接着細胞を接着培養するための培養容器において、継代が必ずしも必要とされない培養装置および培養方法の提供。【解決手段】細胞を接着させる底面と、上方が開口する側面とを備え、前記底面は細胞接着性である１または複数の第一の領域１０ａと、細胞剥離時に細胞非接着性である第二の領域１０ｂと有する培養容器１０。第二の領域が光照射により、または温度変化により、細胞接着性の表面から細胞非接着性の表面に変化する表面を有する培養容器。【選択図】図１
2016000008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着細胞を接着培養するための培養容器において、
細胞を接着させる底面と、上方が開口する側面とを備え、
前記底面は、
細胞接着性である１または複数の第一の領域と、
細胞剥離時に細胞非接着性である第二の領域と有することを特徴とする、
培養容器。
【請求項２】
第二の領域が、培養条件下で細胞非接着性である、請求項１に記載の培養容器。
【請求項３】
第二の領域が、培養条件下では細胞接着性であるが、所望により細胞非接着性の表面に変化させることができる表面を有する、請求項１に記載の培養容器。
【請求項４】
第二の領域が、光照射により、または温度変化により、細胞接着性の表面から細胞非接着性の表面に変化させることができる表面を有する、請求項３に記載の培養容器。
【請求項５】
各第一の領域が、それぞれ２０００μｍ２〜４ｍｍ２である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の培養容器。
【請求項６】
各第一の領域が、それぞれ２０００μｍ２〜３００００μｍ２である、請求項３または４に記載の培養容器。
【請求項７】
各第一の領域が、縁から中心部に向かうに従って細胞接着性が高められている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養容器。
【請求項８】
各第一の領域が、同一形状であり、等間隔で整列した、請求項１〜７のいずれか一項に記載の培養容器。
【請求項９】
各第一の領域が、０．５ｍｍ以上の間隔で整列した、請求項８に記載の培養容器。
【請求項１０】
各第一の領域が、整列して複数の直線状に延びる第一の領域列を形成し、各第一の領域列は０．５ｍｍ以上の間隔で平行に並び、第一の領域列内の第一の領域は０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの間隔で配置されている、請求項８に記載の培養容器。
【請求項１１】
培地の供給口と培地の排出口とをさらに備え、閉鎖系培養容器を構成する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の培養容器。
【請求項１２】
請求項１１に記載の培養容器と、
培養容器を保温するためのインキュベーターと、
培養容器の培地の供給口を介して培養容器に培地を供給する培地の供給手段と、
培養容器の培地の排出口を介して培養容器から培地を排出する培地の排出手段と、
培地を排出する際に培地と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と
を備えた、細胞培養装置。
【請求項１３】
請求項１１に記載の培養容器であって、第二の領域が、培養条件下で接着性であり、光照射により細胞非接着性に変化し、かつ、光透過性の容器壁を備えた培養容器と、
培養容器を保温するためのインキュベーターと、
培養容器の培地の供給口を介して培養容器に培地を供給する培地の供給手段と、
培養容器の培地の排出口を介して培養容器から培地を排出する培地の排出手段と、
培地を排出する際に培地と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と、
光透過性の容器壁を介して培養容器の細胞接着面に光を照射する光照射手段と
を備えた、細胞培養装置。
【請求項１４】
請求項１１に記載の培養容器であって、第二の領域が、培養条件下で接着性であり、培養温度よりも低温の条件下で細胞非接着性に変化する、培養容器と、
培養容器を保温するためのインキュベーターと、
培養容器の培地の供給口を介して培養室内に培地を供給する培地の供給手段と、
培養容器の培地の排出口を介して培養室から培地を排出する培地の排出手段と、
培地を排出する際に培地と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と、
培養容器の第二の領域を容器壁を介して冷却する冷却手段と
を備えた、細胞培養装置。
【請求項１５】
細胞培養用の細胞の支持体であって、
支持体の表面は、細胞接着性の１以上の第一の領域と、第一の領域を区画する細胞非接着性の第二の領域とを有する、
細胞の支持体。
【請求項１６】
第一の領域は、それぞれ２０００μｍ２〜４ｍｍ２である、請求項１５に記載の細胞の支持体。
【請求項１７】
支持体が、
筒形状部を備え、
筒形状部は、その内面に第一の領域を有する、
請求項１５または１６に記載の細胞の支持体。
【請求項１８】
支持体が、円筒である、請求項１５または１６に記載の細胞の支持体。
【請求項１９】
細胞を支持体に接着させて培養するための細胞培養装置であって、
細胞を培養するための細胞培養タンクと、
細胞培養タンク内の培養液を撹拌する撹拌手段と、
撹拌手段を駆動する駆動手段と、
細胞培養タンク内に培養液を供給する培地供給手段と、
細胞培養タンクから培養液を排出する培地排出手段と、
細胞が接着する支持体を細胞培養タンク内に保持するための保持手段と、
培養液と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と、
細胞回収後の培養液を廃棄する培養液の廃棄手段と
を備える、細胞培養装置。
【請求項２０】
接着細胞を培養する方法であって、
細胞接着性の第一の領域と、少なくとも細胞剥離時には細胞非接着性である第二の領域とを有する細胞培養面を提供することと、
該細胞培養面に細胞を播種して、少なくとも第一の領域に細胞を接着させることと、
細胞を培養することと、
培養後、第一の領域からはみ出した細胞を回収することと、
を含んでなる、方法。
【請求項２１】
第二の領域が、培養条件下で細胞非接着性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第二の領域が、培養条件下では細胞接着性であるが、光照射により、または培養温度よりも低温にすると細胞非接着性に変化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法であって、
細胞接着性の第一の領域と、少なくとも細胞剥離時には細胞非接着性である第二の領域とを有する細胞培養面が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の培養容器の底面である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、接着細胞の培養装置および培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
接着培養では、細胞は、酵素処理またはセルスクレイパーなどを用いて培養容器の接着面から剥離し、新鮮な培地を含む培養容器に継代される。
【０００３】
再生医療の発展に伴って大量の細胞を培養することが求められるが、酵素処理法には、高価な細胞剥離酵素が大量に必要となる問題と、酵素が細胞に損傷を与える可能性を排除するために酵素による細胞処理時間を制御しなければならないという問題がある。また、セルスクレイパーを用いる方法には、セルスクレイパーを介した雑菌の培養液への混入（コンタミネーション）のリスクがある。
【０００４】
特許文献１は、幹細胞の大量培養の方法とそのための微粒子状キャリアを開示する。また、特許文献２は、幹細胞の大量培養の方法とそのための微粒子状キャリアを開示する。しかし、特許文献１および２に記載された方法は、大量培養に適した方法として記載されるものの、継代とその後の新たなキャリアへの播種を必要とするものであり、継代時の上記問題を解消するものではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００９／１１６９５１
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１０７３９２
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、接着細胞の培養装置および培養方法であって、継代が必ずしも必要とされない培養装置および培養方法を提供する。
【０００７】
本発明では以下の発明が提供される。
（１）接着細胞を接着培養するための培養容器において、
細胞を接着させる底面と、上方が開口する側面とを備え、
前記底面は、
細胞接着性である１または複数の第一の領域と、
細胞剥離時に細胞非接着性である第二の領域と有することを特徴とする、
培養容器。
（２）第二の領域が、培養条件下で細胞非接着性である、上記（１）に記載の培養容器。
（３）第二の領域が、培養条件下では細胞接着性であるが、所望により細胞非接着性の表面に変化させることができる表面を有する、上記（１）に記載の培養容器。
（４）第二の領域が、光照射により、または温度変化により、細胞接着性の表面から細胞非接着性の表面に変化させることができる表面を有する、上記（３）に記載の培養容器。
（５）各第一の領域が、それぞれ２０００μｍ２〜４ｍｍ２である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の培養容器。
（６）各第一の領域が、それぞれ２０００μｍ２〜３００００μｍ２である、上記（３）または（４）に記載の培養容器。
（７）各第一の領域が、縁から中心部に向かうに従って細胞接着性が高められている、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の培養容器。
（８）各第一の領域が、同一形状であり、等間隔で整列した、上記（１）〜（７）のいずれかに記載の培養容器。
（９）各第一の領域が、０．５ｍｍ以上の間隔で整列した、上記（８）に記載の培養容器。
（１０）各第一の領域が、整列して複数の直線状に延びる第一の領域列を形成し、各第一の領域列は０．５ｍｍ以上の間隔で平行に並び、第一の領域列内の第一の領域は０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの間隔で配置されている、上記（８）に記載の培養容器。
（１１）培地の供給口と培地の排出口とをさらに備え、閉鎖系培養容器を構成する、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の培養容器。
（１２）上記（１１）に記載の培養容器と、
培養容器を保温するためのインキュベーターと、
培養容器の培地の供給口を介して培養容器に培地を供給する培地の供給手段と、
培養容器の培地の排出口を介して培養容器から培地を排出する培地の排出手段と、
培地を排出する際に培地と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と
を備えた、細胞培養装置。
（１３）上記（１１）に記載の培養容器であって、第二の領域が、培養条件下で接着性であり、光照射により細胞非接着性に変化し、かつ、光透過性の容器壁を備えた、培養容器と、
培養容器を保温するためのインキュベーターと、
培養容器の培地の供給口を介して培養容器に培地を供給する培地の供給手段と、
培養容器の培地の排出口を介して培養容器から培地を排出する培地の排出手段と、
培地を排出する際に培地と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と、
光透過性の容器壁を介して培養容器の細胞接着面に光を照射する光照射手段と
を備えた、細胞培養装置。
（１４）上記（１１）に記載の培養容器であって、第二の領域が、培養条件下で接着性であり、培養温度よりも低温の条件下で細胞非接着性に変化する、培養容器と、
培養容器を保温するためのインキュベーターと、
培養容器の培地の供給口を介して培養室内に培地を供給する培地の供給手段と、
培養容器の培地の排出口を介して培養室から培地を排出する培地の排出手段と、
培地を排出する際に培地と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と、
培養容器の第二の領域を容器壁を介して冷却する冷却手段と
を備えた、細胞培養装置。
（１５）細胞培養用の細胞の支持体であって、
支持体の表面は、細胞接着性の１以上の第一の領域と、第一の領域を区画する細胞非接着性の第二の領域とを有する、
細胞の支持体。
（１６）第一の領域は、それぞれ２０００μｍ２〜４ｍｍ２である、上記（１５）に記載の細胞の支持体。
（１７）支持体が、
筒形状部を備え、
筒形状部は、その内面に第一の領域を有する、
上記（１５）または（１６）に記載の細胞の支持体。
（１８）支持体が、円筒である、上記（１５）または（１６）に記載の細胞の支持体。
（１９）細胞を支持体に接着させて培養するための細胞培養装置であって、
細胞を培養するための細胞培養タンクと、
細胞培養タンク内の培養液を撹拌する撹拌手段と、
撹拌手段を駆動する駆動手段と、
細胞培養タンク内に培養液を供給する培地供給手段と、
細胞培養タンクから培養液を排出する培地排出手段と、
細胞が接着する支持体を細胞培養タンク内に保持するための保持手段と、
培養液と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段と、
細胞回収後の培養液を廃棄する培養液の廃棄手段と
を備える、細胞培養装置。
（２０）接着細胞を培養する方法であって、
細胞接着性の第一の領域と、少なくとも細胞剥離時には細胞非接着性である第二の領域とを有する細胞培養面を提供することと、
該細胞培養面に細胞を播種して、少なくとも第一の領域に細胞を接着させることと、
細胞を培養することと、
培養後、第一の領域からはみ出した細胞を回収することと、
を含んでなる、方法。
（２１）第二の領域が、培養条件下で細胞非接着性である、上記（２０）に記載の方法。
（２２）第二の領域が、培養条件下では細胞接着性であるが、光照射により、または培養温度よりも低温にすると細胞非接着性に変化する、上記（２０）に記載の方法。
（２３）上記（２０）〜（２２）のいずれかに記載の方法であって、
細胞接着性の第一の領域と、少なくとも細胞剥離時には細胞非接着性である第二の領域とを有する細胞培養面が、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の培養容器の底面である、方法。
【０００８】
本発明によれば、細胞回収後も第一の領域には接着細胞が接着しつづけることができる。また、第一の領域に接着し続ける細胞を元として細胞をさらに培養して増殖させることが可能である。従って、本発明では、必ずしも細胞の継代は必要ではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、第一の実施形態の細胞培養容器を示す図である。
【図２】図２は、第一の実施形態の細胞培養容器のＡ−Ａ断面図である。
【図３】図３は、第一の実施形態の細胞培養容器の平面図である。
【図４】図４は、第一の実施形態の細胞培養容器の変形例の平面図である。
【図５】図５は、第一の実施形態の閉鎖系培養容器を示す図である。
【図６】図６は、第一の実施形態の細胞培養装置の模式図である。
【図７】図７は、第二の実施形態の細胞培養装置の模式図である。
【図８】図８は、第三の実施形態の細胞培養装置の模式図である。
【図９】図９は、第四の実施形態の支持体を示す図である。
【図１０】図１０は、第四の実施形態の支持体の変形例を示す図である。
【図１１】図１１は、第四の実施形態の細胞培養装置を示す模式図である。
【図１２】図１２は、第一の実施形態の細胞培養容器を用いた細胞培養の一連の工程を示す模式図である。
【図１３】図１３は、第一の実施形態の細胞培養容器を用いた細胞培養工程のフローチャートである。
【図１４】図１４は、第二の実施形態または第三の実施形態の細胞培養容器を用いた細胞培養の一連の工程を示す模式図である。
【図１５】図１５は、第二の実施形態または第三の実施形態の細胞培養容器を用いた細胞培養の一連の工程を示す模式図である。
【図１６】図１６は、第二の実施形態または第三の実施形態の細胞培養容器を用いた細胞培養工程のフローチャートである。
【図１７】図１７は、第一の実施形態の培養容器において第一の領域１０ａから細胞がシート状に突出するようすを示す顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明者らは、細胞接着性である第一の領域と、細胞非接着性である第二の領域を有する細胞培養面に細胞を播種すると、第一の領域にのみ細胞が接着し増殖を開始すること、および、増殖した細胞は第一の領域からはみ出してシートを形成することを見出した。本発明者らはまた、第一の領域からはみ出したシート部分の細胞は、水流や振動により容易に第一の領域から解離させて回収することができることを見出した。本発明者らはさらに、細胞回収後、第一の領域に接着し続ける細胞をさらに培養することができ、その後、上記のように細胞をさらに回収することができることを見出した。
【００１１】
本明細書では、「接着細胞」とは、支持体に接着して増殖する細胞を意味する。接着精細胞としては、特に限定されないが例えば、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、上皮細胞、内皮細胞および繊維芽細胞などの細胞が挙げられ、多能性幹細胞が好ましく用いられ得る。細胞が由来する種（species）は特に限定されないが、哺乳類（例えばヒト）の細胞を用いることができる。本発明では、接着細胞として多能性幹細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞を用いることができる。
【００１２】
以下の実施形態においては、矛盾のない範囲ですべてのあらゆる組み合わせが可能である。
【００１３】
第一の実施形態
以下、図１、図２および図６に基づいて、第一の実施形態について説明する。
【００１４】
（細胞培養容器）
まず、図１および図２により第一の実施形態における細胞培養容器を説明する。本実施形態における細胞培養容器１０は、図１に示されるように、細胞を接着させる底面と、上方が開口する側面とを備えている。
【００１５】
細胞培養容器１０の底面は、細胞接着性である１または複数の第一の領域１０ａと、細胞剥離時に細胞非接着性である第二の領域１０ｂとを有する。第一の領域１０ａは第二の領域１０ｂにより区画されている。
【００１６】
第一の領域１０ａは、細胞接着性であり、１０ａ上では細胞の増殖が可能である。
【００１７】
細胞接着性を付与する方法は、当業者に周知であり、例えば、細胞接着性コーティングを施す様々な方法が知られている。細胞は、適度な疎水性表面または正電荷を有する表面に付着し易いことが知られており、第一の領域１０ａは、正電荷ポリマーでコーティングした表面とすることができる。本実施形態で用いられる正電荷ポリマーとしては、ポリＬ−リジンやポリＬ−オルニチンが挙げられる。また、多能性幹細胞の培養では、特に限定されないが例えば、細胞外基質を接着面に塗布することにより良質な細胞接着性の表面を得ることができる。従って、第一の領域１０ａは、細胞外基質を塗布した表面とすることができる。本実施形態で用いられ得る多能性幹細胞を培養するための細胞外基質は、当業者に周知であり、特に限定されないが例えば、マトリゲル（商標）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンなどの細胞外基質が挙げられる。
【００１８】
各第一の領域１０ａは、ある態様では、約２０００μｍ２〜約４ｍｍ２の面積を有し、好ましくは、約２０００μｍ２〜約３００００μｍ２の面積を有する。ある態様では、各第一の領域１０ａは、直径約２５μｍ〜約２ｍｍ、例えば、直径約５０μｍ〜約１ｍｍ、例えば、直径１００μｍ〜５００μｍの円の概形を有する。第一の領域１０ａと、隣接する他の第一の領域１０ａとの間隔は、ある態様では、０．５ｍｍ以上であるが、別の態様では、１ｍｍ以上、１．５ｍｍ以上または２ｍｍ以上である。各第一の領域１０ａは、別の態様では、２５μｍ〜２ｍｍ、例えば、５０μｍ〜１ｍｍ、例えば、１００μｍ〜５００μｍの幅を有する。
【００１９】
ある態様では、各第一の領域１０ａは、縁から中心部に向かうに従って細胞接着性が高められている。
【００２０】
第一の実施形態では、第二の領域１０ｂは、培養条件下でも細胞剥離時にも細胞非接着性である。すなわち、第二の領域１０ｂは、細胞の継代培養の全工程において細胞非接着性である。細胞の継代培養の全工程において細胞非接着性であることを、単に「細胞非接着性」ということができる。
【００２１】
従って、第二の領域１０ｂは、特に限定されないが、例えば、細胞接着性の表面処理をしない表面としてもよいし、周知の細胞非接着性コーティングを施すことにより形成してもよい。細胞非接着性コーティングとしては、アルブミンコーティングおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングが挙げられる。
【００２２】
第一の実施形態の細胞培養容器１０は、開放系培養容器であってもよいし、閉鎖系培養容器であってもよい。図５に示されるように、閉鎖系培養容器である細胞培養容器２０は、培地の供給口と培地の排出口とをさらに備え、閉鎖系培養容器を構成すること以外は、図１に示される第一の実施形態の細胞培養容器１０と同一である。
【００２３】
ある態様では、細胞培養容器１０の第一の領域１０ａには、多能性幹細胞が接着している。ある態様では、第一の領域１０ａに接着した多能性幹細胞は、第一の領域１０ａから突出するシート構造を有する。  
【００２４】
（細胞培養装置）
次に、図６により第一の実施形態における細胞培養装置１００を説明する。
【００２５】
図６に示されるように、本実施形態における細胞培養装置１００は、培養容器を保温するためのインキュベーター３０と、培養容器２０の培地の供給口１１を介して培養容器２０に培地を供給する培地の供給手段４０と、培養容器１０の培地の排出口１２を介して培養容器１０から培地を排出する培地の排出手段５０とを備える。
【００２６】
インキュベーター３０は、その内部を細胞の培養に必要な温度、湿度およびガス環境に保つことができる。
【００２７】
培地供給手段４０は、培地を培養容器１０内に流し込むことができる。培地供給手段４０は、好ましくは、ポンプなどの培地の送液手段である。
【００２８】
培地の排出手段５０は、培地供給手段４０により培地が培養容器１０内に流し込まれると、培養容器１０から同量の培地を排出することができる。培養容器１０から排出される培地に含まれる細胞を回収するために、培地の排出手段５０は、培地を排出する際に培地と共に排出される細胞を回収する細胞回収手段５１をさらに備える。細胞回収手段５１としては、細胞を回収するためのフィルターや細胞を沈降させるための遠心分離器が挙げられる。培地の排出手段５０は、培養容器１０の培地の排出口１２を介して培養容器１０から排出される培地を回収する培地回収手段５２をさらに備えていてもよい。培地回収手段５２は、例えば、廃液回収タンクである。
【００２９】
本実施形態における細胞培養装置１００は、第一の領域１０ａに対して容器壁を介して振動を与える振動発生手段２５を備えていてもよい。
【００３０】
（第一の実施形態における作用）
次に、図１２および図１３により、第一の実施形態における細胞培養装置１００の作動方法を説明する。
【００３１】
図１２には、細胞培養容器２０のみを図示し、細胞培養装置１００の他の構成要素は省略する。図１３は、細胞培養工程のフローチャートである。
【００３２】
まず、図１２（Ａ）に示されるように、細胞培養容器２０は、細胞接着性の第一の領域１０ａと、細胞非接着性の第二の領域１０ｂとを有する底面を有する。
【００３３】
ステップＳ１において細胞培養容器２０に細胞懸濁液を流し込み、ステップＳ２においてしばらくインキュベートすると、図１２（Ｂ）に示されるように細胞は細胞接着性である第一の領域１０ａにのみ接着する。なお、第一の実施形態の細胞培養容器では、第二の領域１０ｂは細胞非接着性である。その後、ステップＳ３において、第一の領域に接着しなかった細胞を培地交換により除去する。
【００３４】
その後、ステップＳ４において細胞を培養すると細胞は第一の領域１０ａ上で増殖する。さらにその後、ステップＳ５においてさらに培養を継続すると、図１２（Ｃ）に示されるように、細胞は、第一の領域１０ａ上でシート状の構造体を形成し、かつ、細胞シートの辺縁部は第一の領域１０ａの外に向かって延びる、または第一の領域１０ａの外に突出する。
【００３５】
その後、ステップＳ６において細胞を回収する。具体的には、細胞シートの辺縁部は、第一の領域１０ａにも第二の領域１０ｂにも接着しておらず、培養液中に浮遊しているため、振動や水流により容易に第一の領域１０ａから解離させることができる。水流は、例えば、培地供給手段４０により培養容器に培地を流し込むことにより発生させることができる。また、振動は、第一の領域１０ａに対して容器壁を介して振動を与える振動発生手段２５により発生させることができる。振動発生手段２５としては、高周波発生装置および超音波発生装置が挙げられる。
【００３６】
図１２（Ｄ）に示されるように、第一の領域１０ａの外に突出した細胞２は、第一の領域１０ａに水流または振動などを加えることで、第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂに接着した細胞２から解離させることができる。その後、第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂに接着した細胞２から解離させた細胞を回収することができる。細胞の回収は、例えば、培地交換により行なうことができる。第一の領域１０ａが縁から中心部に向かうに従って細胞接着性が高められている場合には、第一の領域１０ａの縁の領域からも細胞２が剥離することがあるため、より多くの細胞を回収し得る。
【００３７】
図１２（Ｅ）に示されるように、細胞回収後、細胞２は、細胞接着性である第一の領域１０ａ上にのみ残存する。  
【００３８】
図１３に示されるように、その後、ステップＳ４、Ｓ５およびＳ６を繰り返し実施することができる。残存した細胞をさらに培養すると、図１２（Ｃ）に示されるように、細胞は、再び、第一の領域１０ａ上でシート状の構造体を形成し、かつ、細胞シートの辺縁部は第一の領域１０ａの外に向かって延びる。その後、上述のように、第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂからの細胞の解離とその後の細胞の回収の行程を繰り返すことができる。細胞は、例えば、１日〜３日に１回の頻度で回収することができる。
【００３９】
通常の細胞は、細胞は、細胞剥離液により生理学的に細胞接着面から剥離され、その後、新しい培養容器に得られた細胞を播種することにより継代される。しかしながら、本実施形態では、回収される細胞は、細胞接着面には付着していない。回収される細胞は、第一の領域１０ａから外に向かって延びるシート部分であり、第一の領域１０ａ上に接着する細胞を剥離させずに、水流や振動により培養液中に遊離させることができる。そのため、本実施形態では、細胞回収後も培地を交換してそのまま培養を継続することができる。そして、これにより、細胞の培養と回収を繰り返すことが可能となる。また、本実施形態の方法により回収される細胞は、接着面に接着していないため、接着面からの剥離の際に通常であれば加わっていたはずの損傷をほとんど受けない。従って、本実施形態の方法により回収された細胞は、様々なアプリケーションに好適に利用できる。また、細胞を容器壁から回収する際には、高価な酵素液を必須としない。
【００４０】
第一の実施形態の変形例
以下、図４に基づき、第一の実施形態の変形例を説明する。第一の実施形態の細胞培養容器の変形例１０Ａは、第一の領域１０ａの配置が異なるのみであり、その他の構成は、図１〜３に示される第一の実施形態の細胞培養容器１０と同一である。従って、図４において、図１〜３に示される第一の実施形態の細胞培養容器１０と同一の部分には同一符号を付して説明は省略する。
【００４１】
第一の実施形態の細胞培養容器の変形例１０Ａでは、各第一の領域１０ａが整列して複数の直線状に延びる第一の領域列を形成し、各第一の領域列は０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上、１．５ｍｍ以上または２ｍｍ以上の間隔で平行に並び、第一の領域列内の第一の領域１０ａは０．１ｍｍ〜０．５ｍｍの間隔で配置されている。
【００４２】
第一の実施形態の細胞培養容器の変形例１０Ａは、開放系培養容器であってもよいし、培地の供給口と培地の排出口とをさらに備え、閉鎖系培養容器２０Ａを構成してもよい（図５参照）。
【００４３】
第一の実施形態の変形例における細胞培養装置は、細胞培養容器が閉鎖系培養容器２０Ａまたは２０Ｂである点で異なるのみであり、その他の部分の構成は、図６に示される第一の実施形態の細胞培養装置１００と同一である。また、その作用も図１２に示される第一の実施形態の細胞培養装置１００の作用と同一である。従って、第一の実施形態の変形例における細胞培養装置およびその作用の説明は省略する。
【００４４】
第二の実施形態
（細胞培養容器）
以下、図１〜３に基づいて、第二の実施形態について説明する。第二の実施形態の細胞培養容器１０は、第二の領域１０ｂの表面コーティングの種類が異なるのみであり、それ以外の構成は、図１〜３に示される第一の実施形態の細胞培養容器１０と同一である。従って、第二の領域１０ｂ以外の構成についての説明は省略する。
【００４５】
第二の実施形態の細胞培養容器１０の第二の領域１０ｂは、培養条件下では細胞接着性であるが、細胞剥離時には細胞非接着性である表面である。すなわち、細胞培養容器１０の第二の領域１０ｂは細胞接着性から細胞非接着性に変化する表面であり、このような表面は特に限定されないが、温度応答性高分子でコーティングされた表面である。
【００４６】
本実施形態で用いられる温度応答性高分子は、特定条件下で細胞接着性から細胞非接着性に変化する表面であれば特に限定されないが、例えば、細胞培養温度では適度な疎水性を有するが、培養温度よりも低温になると可逆的に疎水性から親水性に変化して細胞接着性を低下させる温度応答性高分子が挙げられる。そのような温度応答性高分子としては、例えば、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが挙げられる。温度応答性高分子を用いると、温度を変化させることにより第二の領域１０ｂから細胞を解離させることができる。なお、第二の実施形態の細胞培養容器１０の第一の領域１０ａは、上記温度変化によらず、常に細胞接着性であるので、第二の領域１０ｂから細胞を解離させた後でも、第一の領域１０ａには細胞が付着し続ける。
【００４７】
第二の実施形態の細胞培養容器１０において、ある態様では、各第一の領域１０ａは、約２０００μｍ２〜約３００００μｍ２の面積を有し、特定の態様では、約２０００μｍ２〜約１００００μｍ２の面積を有する。
【００４８】
第二の実施形態の細胞培養容器２０は、第二の実施形態の細胞培養容器１０に、培地の供給口と培地の排出口とをさらに備え、閉鎖系培養容器２０を構成してもよい（図５参照）。
【００４９】
（細胞培養装置）
以下、図７に基づいて、第二の実施形態の細胞培養装置１００Ａを説明する。第二の実施形態の細胞培養装置１００Ａは、細胞培養容器が第二の実施形態の細胞培養容器２０である点と閉鎖系培養容器の第二の領域を容器壁を介して冷却する冷却手段６０をさらに備える点で異なるのみであり、その他の構成は、図６に示される第一の実施形態の細胞培養装置１００と同一である。従って、図７において第一の実施形態の細胞培養装置１００と同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
【００５０】
第二の実施形態の細胞培養装置１００Ａにおいては、細胞培養容器が第二の実施形態の細胞培養容器２０である。従って、上述のように、細胞培養容器２０の第二の領域１０ｂは、培養温度よりも低温になると親水性に変化して細胞接着性を低下させる表面を有する。そして、第二の実施形態の細胞培養装置１００Ａでは、細胞培養容器２０の第二の領域１０ｂを容器壁を介して冷却する冷却手段６０を有し、第二の領域１０ｂを冷却することにより、第二の領域１０ｂから細胞を剥離することができる。
【００５１】
（第二の実施形態における作用）
次に図１４〜１６により、第二の実施形態の細胞培養装置１００Ａの作用を説明する。
【００５２】
図１４および１５には、細胞培養容器２０のみを図示し、細胞培養装置１００Ａの他の構成要素は省略する。図１６は、第二の実施形態における培養工程を示すフローチャートである。
【００５３】
まず、図１４（Ａ）に示されるように、細胞培養容器２０は、例えば、細胞接着性の第一の領域１０ａと、細胞培養温度では適度な疎水性を有するが、培養温度よりも低温になると親水性に変化して細胞接着性を低下させる第二の領域１０ｂとを有する底面を有する。
【００５４】
ステップＳ１１において細胞培養容器２０に細胞懸濁液を流し込み、その後、ステップＳ１２においてしばらくインキュベートすると、図１４（Ｂ）に示されるように、細胞は細胞接着性である第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂの両方に接着する。なお、第二の実施形態の細胞培養容器２０では、第二の領域１０ｂは細胞培養温度で細胞接着性である。その後、第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂに接着しなかった細胞は必要に応じて培地交換により除去することができる。細胞接着後、ステップＳ１３において、冷却手段６０により第二の領域１０ｂを細胞培養容器の容器壁を介して冷却すると、第二の領域１０ｂが細胞非接着性に変わり、第二の領域１０ｂから細胞が剥離して、図１４（Ｃ）に示されるように、第一の領域１０ａに接着した細胞のみが残る。
【００５５】
その後、ステップＳ１４において細胞を培養すると、細胞は第一の領域１０ａ上および第二の領域１０ｂ上で増殖する。さらにその後、ステップＳ１５において、培養を継続すると、図１４（Ｄ）に示されるように、細胞は、第一の領域１０ａ上でシート状の構造体を形成し、かつ、細胞シートの辺縁部は第二の領域１０ｂに向かってに突出する。細胞シートの辺縁部は、培養温度で細胞接着性である第二の領域１０ｂに接着している。
【００５６】
その後、ステップＳ１５において細胞を回収する。具体的には、図１４（Ｄ）の状態で、冷却手段６０により第二の領域１０ｂを細胞培養容器の容器壁を介して冷却すると、第二の領域１０ｂが細胞非接着性に変わり、図１５（Ａ）に示されるように第二の領域１０ｂから細胞が剥離する。剥離した細胞は、図１５（Ｂ）に示されるように、振動や水流により容易に第一の領域１０ａから解離させることができる。その後、解離させた細胞を回収することができる（ステップＳ１６）。細胞の回収は、例えば、培地交換により行なうことができる。
【００５７】
図１５（Ｃ）に示されるように、細胞回収後、細胞２は、細胞接着性である第一の領域１０ａ上にのみ残存する。その後、第二の領域１０ｂの温度を培養温度に戻してその表面を細胞非接着性から細胞接着性に変化させることができる。
【００５８】
図１６に示されるように、ステップＳ１４、ステップＳ１５およびステップＳ１６は繰り返し実施することができる。すなわち、残存した細胞をさらに培養すると、図１４（Ｄ）に示されるように、細胞は、第一の領域１０ａ上でシート状の構造体を形成し、かつ、細胞シートの辺縁部は第二の領域１０ｂに向かってに突出する。その後、上述のように、第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂからの細胞の解離とその後の細胞の回収の行程を繰り返すことができる。細胞は、例えば、１日〜３日に１回の頻度で回収することができる。
【００５９】
第三の実施形態
（細胞培養容器）
以下、図１〜３に基づいて、第三の実施形態について説明する。第三の実施形態の細胞培養容器１０は、第二の領域１０ｂの表面コーティングの種類と光透過性の容器壁を有する点が異なるのみであり、それ以外の構成は、図１〜３に示される第二の実施形態の細胞培養容器１０と同一である。従って、第二の領域１０ｂ以外の構成についての説明は省略する。
【００６０】
第三の実施形態の細胞培養容器１０の第二の領域１０ｂは、培養条件下では細胞接着性であるが、細胞剥離時には細胞非接着性である表面である。すなわち、細胞培養容器１０の第二の領域１０ｂは細胞接着性から細胞非接着性に変化する表面であり、このような表面は特に限定されないが、光応答性高分子でコーティングされた表面である。
【００６１】
本実施形態で用いられる光応答性高分子は、特定条件下で細胞接着性から細胞非接着性に変化する表面であれば特に限定されないが、例えば、光照射により可逆的に疎水性から親水性に変化することにより細胞接着性を低下させる光応答性高分子が挙げられる。このような光応答性高分子としては、例えば、光照射により疎水性から親水性に変化するフォトクロミック基を有する高分子が挙げられる（特開２００６−８９７５号公報）。光応答性高分子を用いると、光照射により第二の領域１０ｂから細胞を解離させることができる。ある態様では、第二の領域１０ｂに対応する容器壁が光透過性である。なお、第二の実施形態の細胞培養容器１０の第一の領域１０ａは、上記光照射によらず、常に細胞接着性であるので、第二の領域１０ｂから細胞を解離させた後でも、第一の領域１０ａには細胞が付着し続ける。
【００６２】
第三の実施形態の培養容器１０において、ある態様では、各第一の領域１０ａは、約２０００μｍ２〜約３００００μｍ２の面積を有し、特定の態様では、約２０００μｍ２〜約１００００μｍ２の面積を有する。
【００６３】
第三の実施形態の細胞培養容器２０は、第三の実施形態の細胞培養容器１０に、培地の供給口と培地の排出口とをさらに備え、閉鎖系培養容器２０を構成するものとしてもよい（図５参照）。
【００６４】
（細胞培養装置）
以下、図８に基づいて、第三の実施形態の細胞培養装置１００Ｂを説明する。第三の実施形態の細胞培養装置１００Ｂは、細胞培養容器が第三の実施形態の細胞培養容器２０である点と光透過性の容器壁を介して閉鎖系培養容器の第二の領域１０ｂを光照射する光照射手段７０をさらに備える点で異なるのみであり、その他の構成は、図６に示される第一の実施形態の細胞培養装置１００と同一である。従って、図８において第一の実施形態の細胞培養装置１００と同一部分には同一符号を付して説明は省略する。
【００６５】
第三の実施形態の細胞培養装置１００Ｂにおいては、細胞培養容器が第三の実施形態の細胞培養容器２０である。従って、上述のように、細胞培養容器２０の第二の領域１０ｂは、光照射により可逆的に疎水性から親水性に変化して細胞接着性を低下させる光応答性の高分子によりコーティングされた表面を有する。そして、第三の実施形態の細胞培養装置１００Ｂでは、細胞培養容器２０の第二の領域１０ｂを光透過性の容器壁を介して光照射する光照射手段７０を有し、第二の領域１０ｂに光を照射することにより、第二の領域１０ｂから細胞を剥離させることができる。
【００６６】
（第三の実施形態における作用）
次に、図１４〜１６により、第三の実施形態の細胞培養装置１００Ｂの作用を説明する。第三の実施形態の細胞培養装置１００Ｂの作用は、第二の領域１０ｂを冷却する代わりに光照射して細胞を第二の領域１０ｂから解離させる点が異なるのみであり、それ以外の作用は第二の実施形態の細胞培養装置１００Ａと同一である。従って、第三の実施形態の細胞培養装置１００Ｂの作用は、図１４および１６を参照しながら説明する（図１４中の１００Ａを１００Ｂと読み替える）。
【００６７】
すなわち、まず、図１４（Ａ）に示されるように、細胞培養容器２０は、細胞接着性の第一の領域１０ａと、光照射により可逆的に疎水性から親水性に変化して細胞接着性を低下させる第二の領域１０ｂとを有する底面を有する。
【００６８】
ステップＳ１１において細胞培養容器２０に細胞懸濁液を流し込み、その後、ステップＳ１２においてしばらくインキュベートすると、図１４（Ｂ）に示されるように、細胞は細胞接着性である第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂの両方に接着する。なお、第二の実施形態の細胞培養容器２０では、第二の領域１０ｂは細胞培養温度で細胞接着性である。その後、第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂに接着しなかった細胞は必要に応じて培地交換により除去することができる。細胞接着後、ステップＳ１３において、光照射手段７０により第二の領域１０ｂを光透過性の容器壁を介して光照射すると、第二の領域１０ｂが細胞非接着性に変わり、第二の領域１０ｂから細胞が剥離して、図１４（Ｃ）に示されるように、第一の領域１０ａに接着した細胞のみが残る（ステップＳ１３）。
【００６９】
その後、ステップＳ１４において細胞を培養すると、細胞は第一の領域１０ａ上および第二の領域１０ｂ上で増殖する。さらにその後、ステップＳ１５において、培養を継続すると、図１４（Ｄ）に示されるように、細胞は、第一の領域１０ａ上でシート状の構造体を形成し、かつ、細胞シートの辺縁部は第二の領域１０ｂに向かってに突出する。細胞シートの辺縁部は、培養温度で細胞接着性である第二の領域１０ｂに接着している。
【００７０】
その後、ステップＳ１５において細胞を回収する。具体的には、図１４（Ｄ）の状態で、光照射手段７０により第二の領域１０ｂを細胞培養容器の光透過性の容器壁を介して光照射すると、第二の領域１０ｂが細胞非接着性に変わり、図１５（Ａ）に示されるように第二の領域１０ｂから細胞が剥離する。剥離した細胞は、図１５（Ｂ）に示されるように、振動や水流により容易に第一の領域１０ａから解離させることができる。その後、解離させた細胞を回収することができる。細胞の回収は、例えば、培地交換により行なうことができる。
【００７１】
図１５（Ｃ）に示されるように、細胞回収後、細胞２は、細胞接着性である第一の領域１０ａ上にのみ残存する。その後、第二の領域１０ｂには、別の波長の光を照射してその表面を細胞非接着性から細胞接着性に変化させることができる。
【００７２】
図１６に示されるように、その後、さらにステップＳ１４、ステップＳ１５およびステップＳ１６を繰り返し実施することができる。すなわち、残存した細胞をさらに培養すると、図１４（Ｄ）に示されるように、細胞は、第一の領域１０ａ上でシート状の構造体を形成し、かつ、細胞シートの辺縁部は第二の領域１０ｂに向かってに突出する。その後、上述のように、第一の領域１０ａおよび第二の領域１０ｂからの細胞の解離とその後の細胞の回収の行程を繰り返すことができる。細胞は、例えば、１日〜３日に１回の頻度で回収することができる。
【００７３】
第四の実施形態
次に、図９〜１１により、第四の実施形態について説明する。
【００７４】
図９に示されるように、第四の実施形態の支持体１５Ａは、細胞培養用の細胞の支持体であって、支持体の表面は、細胞接着性の１以上の第一の領域１０ａと、第一の領域を区画する細胞非接着性の第二の領域１０ｂとを有する。第一の領域１０ａは第二の領域１０ｂにより区画されている。
【００７５】
第四の実施形態の支持体１５Ａは、図１１に示されるように培養中は撹拌手段１２０により培養液中で浮遊させることができるものである。第四の実施形態の支持体１５Ａは、特に限定されないが、例えば、約８ｍｍ３以下の体積を有する。第四の実施形態の支持体１５Ａは、特に限定されないが、例えば、１ｇ／ｍｍ３〜２ｇ／ｍｍ３の比重を有し、撹拌手段１２０により培養液中で浮遊させることができるものから選択される。
【００７６】
第一の領域１０ａは、細胞接着性であり、１０ａ上では細胞の増殖が可能である。細胞接着性を付与する方法は、当業者に周知であり、例えば、プラズマ処理などの細胞接着性の表面処理を施す方法や細胞接着性コーティングを施す方法などの様々な方法が知られている。細胞は、適度な親水性を有する表面および正電荷を有する表面に付着し易いことが知られており、プラズマ処理や、ポリＬ−リジンやポリＬ−オルニチンなどの正電荷ポリマーで表面をコーティングすることにより、細胞接着性の表面を得ることができる。従って、第一の領域１０ａは、正電荷ポリマーでコーティングした表面とすることができる。また、細胞培養では、特に限定されないが、細胞外基質を接着面に塗布することにより良質な細胞接着性の表面を得ることができる。従って、第一の領域１０ａは、細胞外基質を塗布した表面とすることができる。本実施形態で用いられ得る多能性幹細胞を培養するための細胞外基質は、当業者に周知であり、特に限定されないが例えば、マトリゲル（商標）、ヒアルロン酸、ラミニン−５１１などのラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ゼラチンおよびコラーゲンなどの細胞外基質が挙げられる。
【００７７】
各第一の領域１０ａは、約２０００μｍ２〜約４ｍｍ２の面積を有し、ある態様では、約２０００μｍ２〜約２ｍｍ２の面積を有し、更なる態様では、約２０００μｍ２〜約１ｍｍ２の面積を有する。
【００７８】
ある態様では、各第一の領域１０ａは、縁から中心部に向かうに従って細胞接着性が高められている。
【００７９】
第二の領域１０ｂは、培養条件下でも細胞剥離時にも細胞非接着性である。すなわち、第二の領域１０ｂは、細胞の継代培養の全工程において、常に細胞非接着性である。
【００８０】
第二の領域１０ｂは、特に限定されないが、親水性表面または負電荷を有する表面とすることができ、例えば、周知の細胞非接着コーティングを施すことにより形成することができる。
【００８１】
（細胞培養装置）
次に、図１１により第四の実施形態の細胞培養装置２００を説明する。
【００８２】
第四の実施形態の細胞培養装置２００は、細胞を培養するための細胞培養タンク１１０と、細胞培養タンク１１０内の培地１を撹拌する撹拌手段１２０と、撹拌手段を駆動する駆動手段１２０Ａと、細胞培養タンク１１０内に培地１を供給する培地供給手段１３０と、細胞培養タンクから培地１を排出する培地排出手段１４０と、細胞が接着する支持体１５Ａを細胞培養タンク１１０内に保持するための保持手段１８０と、培地１と共に排出される細胞２を回収する細胞回収手段１５０と、細胞回収後の培地１を廃棄する培地の廃棄手段１６０とを備える。
【００８３】
第四の実施形態の細胞培養装置２００は、細胞培養タンク内の培養液の温度を培養温度に調節する温度調節手段１７０をさらに備える。
【００８４】
細胞培養タンク１１０は、その内部が無菌的に保たれるタンクである。撹拌手段１２０は、例えば、回転により撹拌する撹拌装置である。駆動手段１２０Ａは、例えば、回転式のモーターである。培地供給手段１３０は、培地１を細胞培養タンク１１０内に流し込むことができる。培地供給手段１３０は、好ましくは、ポンプなどの培地の送液手段である。培地の排出手段１４０は、培地供給手段１３０により培地１が細胞培養タンク１１０内に流し込まれると、細胞培養タンク１１０から同量の培地を排出することができる。
【００８５】
保持手段１８０は、細胞２を通過させることができるが、支持体１５Ａを通過させない。保持手段１８０は、例えば、支持体１５Ａよりも小さなポアを有するフィルターとすることができる。細胞２は、支持体１５Ａよりも培地１中を浮遊しやすく、保持手段１８０は、細胞培養タンクの中央から上部にかけて設置することができる。
【００８６】
細胞回収手段１５０としては、細胞を回収するためのフィルターや細胞を沈降させるための遠心分離器が挙げられる。
【００８７】
培地の廃棄手段１６０は、例えば、廃液回収タンクである。
【００８８】
第四の実施形態における細胞培養装置２００は、支持体１５Ａをさらに備えていてもよい。
【００８９】
（第四の実施形態における作用）
次に、図１１により第四の実施形態における細胞培養装置２００の作動方法を説明する。
【００９０】
まず、細胞培養タンク１１０に培地供給手段１３０により培地１を供給する。次に、撹拌手段１２０を駆動手段１２０Ａにより駆動させて培地を撹拌しながら、第一の領域１０ａに細胞を付着させた支持体１５Ａを細胞培養タンク１１０内に導入する。これにより、支持体１５Ａは、細胞培養タンク１１０内で培地１中を浮遊する。必要に応じて細胞培養タンク１１０内の培地１を温度調節手段１７０により培養に適した温度に調節する。
【００９１】
細胞２は支持体１５Ａの第一の領域１０ａに接着し増殖するが、第二の領域１０ｂには接着できない。結果として、細胞２は、支持体１５Ａの第一の領域１０ａからはみ出るように突出したシート部分を形成する。突出したシート部分は、撹拌手段１２０により生じる水流によって支持体１５Ａから解離し、その後、培地１を浮遊する。一方で、支持体１５Ａの第一の領域１０ａに接着していた細胞は、支持体１５Ａから解離しない。このようにして、支持体１５Ａの第一の領域１０ａ上に細胞が残存する一方で、第一の領域１０ａからはみ出た細胞を回収することが可能となる。
【００９２】
支持体１５Ａから解離した細胞２は、撹拌される培地１中を浮遊するが、培地排出手段１４０により、培地１と共に保持手段１８０を通過して細胞回収手段１５０へ到達する。これにより、支持体１５Ａから細胞が回収される。保持手段１８０は、支持体１５Ａを細胞培養タンク１１０内に保持する。細胞培養タンク１１０からの培地の排出は、培地供給手段１３０により細胞培養タンク１１０に培地１を供給してタンク１１０内の培地１を押し出すことにより受動的に行なってもよく、培地排出手段１４０による培地１の能動的な排出により行なってもよい。また、細胞を回収する際には、細胞培養タンク１１０内の培地１の量は、かならずしも一定に保つ必要は無い。例えば、細胞培養タンク１１０内の培地１の量を一定に保つように培地供給手段１３０と培地排出手段１４０を協働させて、培地１を細胞培養タンク１１０内に供給しながら、同量を培地排出手段１４０により排出してもよい。代わりに、培地排出手段１４０による細胞培養タンク１１０からの培地１の排出を優性にして、場合によっては培地供給手段１３０による細胞培養タンク１１０への培地１の供給を停止させて、培地と共に排出される細胞を回収してもよく、この場合は、細胞回収後に、培地供給手段１３０により細胞培養タンク１１０に培地１を供給することができる。細胞培養タンク１１０から排出され、細胞回収後の培地は、培地の廃棄手段１６０により廃棄される。
【００９３】
このようにして、細胞は、支持体１５Ａの第一の領域１０ａ上で増殖し続ける一方で、第一の領域１０ａをはみ出してシート状の突出を形成した細胞は、水流により支持体１５Ａから解離し、培地と共に回収され、その後のアプリケーションに利用される。
【００９４】
第四の実施形態の変形例
次に、図１０により第四の実施形態の支持体の変形例を説明する。第四の実施形態の支持体の変形例は、図１０に示されるように、第四の実施形態の変形例における支持体１５Ｂは、筒状部を備える。
【００９５】
図１０に示されるように、支持体１５Ｂは、筒状部の内面に第一の領域１０ａを有し、これにより、物理的な損傷から第一の領域１０ａを保護することができる。また、ある態様では、支持体１５Ｂの筒上部の外面は第二の領域１０ｂを有する。支持体１５Ｂは、その内面が第一の領域１０ａからなり、外面が第二の領域１０ｂからなるものとしてもよい。
【００９６】
ある態様では、筒状部は円筒である。
【００９７】
第一の領域１０ａは、細胞接着性であり、１０ａ上では細胞の増殖が可能である。細胞接着性を付与する方法は、当業者に周知であり、例えば、細胞接着性コーティングを施す様々な方法が知られている。細胞は、適度な疎水性表面または正電荷を有する表面に付着し易いことが知られており、ポリＬ−リジンやポリＬ−オルニチンなどの正電荷ポリマーで表面をコーティングすることにより、細胞接着性の表面を得ることができる。従って、第一の領域１０ａは、正電荷ポリマーでコーティングした表面とすることができる。また、多能性幹細胞の培養では、特に限定されないが、細胞外基質を接着面に塗布することにより良質な細胞接着性の表面を得ることができる。従って、第一の領域１０ａは、細胞外基質を塗布した表面とすることができる。本実施形態で多能性幹細胞の培養に用いられ得る細胞外基質は、当業者に周知であり、特に限定されないが例えば、マトリゲル（商標）、ヒアルロン酸、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびコラーゲンなどの細胞外基質が挙げられる。
【００９８】
各第一の領域１０ａは、約２０００μｍ２〜約４ｍｍ２の面積を有し、ある態様では、約２０００μｍ２〜約２ｍｍ２の面積を有し、更なる態様では、約２０００μｍ２〜約１ｍｍ２の面積を有する。
【００９９】
ある態様では、各第一の領域１０ａは、縁から中心部に向かうに従って細胞接着性が高められている。
【０１００】
第二の領域１０ｂは、特に限定されないが、親水性表面または負電荷を有する表面とすることができる。第二の領域１０ｂは、例えば、周知の細胞非接着コーティングを施すことにより形成することができる。
【０１０１】
（細胞培養装置）
第四の実施形態の細胞培養装置の変形例（図１１参照）は、支持体として支持体１５Ｂを用いる点で異なるのみであり、その他の部分は、第四の実施形態の細胞培養装置２００と同一である。従って、細胞培養装置の説明は省略する。
【０１０２】
（作用）
第四の実施形態細胞培養装置の変形例の動作方法（図１１参照）は、第四の実施形態の細胞培養装置の動作方法と同一である。従って、動作方法の説明は省略する。
【０１０３】
さらに上記の第四の実施形態および第四の実施形態の変形例では、第二の領域１０ｂは、第二の実施形態または第三の実施形態の培養容器の第二の領域１０ｂとすることもできる。これにより、温度や光に応答して細胞を第二の領域１０ｂから剥離させ、回収することができる。
【０１０４】
本発明の方法
次に、本発明による細胞の培養方法について説明する。
【０１０５】
第一の実施形態、第二の実施形態、第三の実施形態および第四の実施形態並びにそれぞれの変形例において説明したように、本発明によれば、細胞接着性の第一の領域１０ａからはみ出した細胞を回収する一方で、第一の領域１０ａに接着している細胞は回収されず、更なる培養に供することができる。
【０１０６】
従って、本発明によれば、
細胞を培養する方法であって、
細胞接着性の第一の領域と、少なくとも細胞剥離時には細胞非接着性である第二の領域とを有する細胞培養面を提供することと、
該細胞培養面に細胞を播種して、少なくとも第一の領域に細胞を接着させることと、
細胞を培養することと、
培養後、第一の領域からはみ出した細胞を回収することと、
を含んでなる、方法が提供される。
【０１０７】
本発明の方法のある態様では、第二の領域は、培養条件下および細胞剥離時に細胞非接着性である。従って、細胞は、第一の領域のみに接着して増殖し、その後、第一の領域からはみ出した細胞が回収される。第一の領域からはみ出した細胞の回収は、例えば、水流や振動を第一の領域または第一の領域からはみ出した細胞に加えることにより可能となる。一方で、第一の領域に接着した細胞は、細胞回収後も第一の領域上に残存し、更なる培養に供することができる。従って、本発明の方法は、第一の領域からはみ出した細胞を回収した後に、第一の領域に接着した細胞を培養することをさらに含んでいてもよい。
【０１０８】
本発明の方法のある態様では、第二の領域は、培養条件下では細胞接着性であるが、光照射により、または温度を培養温度よりも低下させると細胞非接着性に変化する。この態様では、細胞培養時には、細胞は第一の領域と第二の領域の両方に接着することができるが、少なくとも第二の領域に光照射をするか、その温度を培養温度よりも低下させることにより、細胞を第二の領域から剥離させることが可能となる。第二の領域からの細胞剥離後も、第一の領域に接着する細胞は第一の領域上に残存する。第一の領域に接着した細胞は更なる培養に供することが可能であり、細胞は第一の領域から第二の領域にはみ出すように増殖するので、さらに、細胞を第二の領域から剥離させ、剥離した細胞を回収することができる。
【０１０９】
従って、ある態様では、
細胞を培養する方法であって、
細胞接着性の第一の領域と、少なくとも細胞剥離時には細胞非接着性である第二の領域とを有する細胞培養面を提供することと、
該細胞培養面に細胞を播種して、少なくとも第一の領域に細胞を接着させることと、
細胞を培養することと、
培養後、第一の領域からはみ出した細胞を回収することと、
を含んでなり、
第二の領域は、光照射により細胞接着性から細胞非接着性に変化する高分子によりコーティングされている、方法が提供される。本発明の方法は、第一の領域からはみ出した細胞を回収した後に、第二の領域に光を照射してその表面を細胞非接着性から細胞接着性に変化させることと、第一の領域に接着した細胞を培養することとをさらに含んでいてもよい。
【０１１０】
また、別の態様では、
細胞を培養する方法であって、
細胞接着性の第一の領域と、少なくとも細胞剥離時には細胞非接着性である第二の領域とを有する細胞培養面を提供することと、
該細胞培養面に細胞を播種して、少なくとも第一の領域に細胞を接着させることと、
細胞を培養することと、
培養後、第一の領域からはみ出した細胞を回収することと、
を含んでなり、
第二の領域は、培養温度よりも低温で細胞非接着性に変化する高分子によりコーティングされている、方法が提供される。本発明の方法は、第一の領域からはみ出した細胞を回収した後に、第二の領域の温度を培養温度に戻してその表面を細胞非接着性から細胞接着性に変化させることと、第一の領域に接着した細胞を培養することとをさらに含んでいてもよい。
【０１１１】
本発明の方法によれば、細胞回収後、第一の領域上に接着し続ける細胞をさらに培養することにより、第一の領域からはみ出した細胞をさらに回収することができる。しかも、この細胞の培養と回収のサイクルは繰り返すことが可能である。
【０１１２】
細胞の回収は、特に限定されないが例えば、１〜３日に１回の頻度で行なうことができる。
【０１１３】
第二の領域のコーティングは、第一の実施形態の培養容器、第二の実施形態の培養容器または第三の実施形態の培養容器の第二の領域のコーティングとすることができる。
【０１１４】
本発明の方法のある実施態様では、本発明の方法は、第一の実施形態の培養容器、第二の実施形態の培養容器若しくは第三の実施形態の培養容器またはこれらの変形例を用いて実施することができる。
【０１１５】
細胞は、Ｙ−２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤存在下で培養してもよい。
【実施例】
【０１１６】
実施例１：接着細胞の培養
第一の実施形態の培養容器を試作し、細胞を培養した。
【０１１７】
細胞は、ヒトｉＰＳ細胞（公益財団法人  先端医療振興財団  細胞評価グループ  川真田研究室による樹立株）を用いた。培地としては、ＲｅｐｒｏＦＦ２培地（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ社製、製品番号：ＲＣＨＥＭＤ００６）にｂＦＧＦ（和光純薬工業社製、製品番号：０６４−０４５４１）最終濃度５ｎｇ／ｍＬを添加した培地を用いた。
【０１１８】
培養ディッシュの前面をブロックマスター試薬（ＪＳＲ社製）で処理し、細胞非接着面を形成し、その後、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）試薬（ＪＳＲ社製）をスポッターで半径１ｍｍの円形に滴下し、さらにビトロネクチンＸＦ溶液でコートしてスポットに細胞接着面を形成し、ディッシュ表面をパターニングした。
【０１１９】
得られた培養ディッシュにｉＰＳ細胞を播種してインキュベートしたところ、図１７に示されるように、円形の細胞接着面から細胞がシート状に突出することが確認できた（図１７の矢印）。
【０１２０】
この突出部は、水流により容易に培養液中に回収することが可能であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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