(57)【要約】      （修正有）【課題】新生児や乳児に感染してリステリア症を引き起こすリステリア菌、望ましくは、リステリア菌と一般生菌の両方、に対する殺菌作用を有する殺菌用薬剤組成物の提供。【解決手段】食品における通常使用範囲内で、フェルラ酸と酢酸等の有機酸との組み合わせから成る、リステリア菌、又はリステリア菌と一般生菌の両方、に対する殺菌作用を有する薬剤組成物。食品の重量を基準として、フェルラ酸の通常使用量が０．５重量％以下であり、有機酸の通常使用量が４重量％以下である、薬剤組成物。更にグリシン酢酸ナトリウムを含有する薬剤組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸及び有機酸から成る、Listeria monocytogenes、又はListeria monocytogenes と一般生菌の両方、に対する殺菌作用を有する薬剤組成物。
【請求項２】
食品を対象とする請求項１に記載の薬剤組成物であって、フェルラ酸及び有機酸の食品に対する使用量が通常使用量の範囲内である薬剤組成物。
【請求項３】
食品の重量を基準として、フェルラ酸の通常使用量が0.5重量％以下であり、有機酸の通常使用量が4重量％以下である請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記食品が、野菜又は野菜を含む食品（野菜を除く）である請求項２又は３に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
更に、グリシン酢酸ナトリウムを含有する請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬剤組成物が添加された食品。
【請求項７】
前記食品が野菜又は野菜を含む食品（野菜を除く）である請求項６に記載の食品。
【請求項８】
食品にフェルラ酸及び有機酸を添加することから成る、Listeria monocytogenes、又はListeria monocytogenes と一般生菌の両方、を殺菌する方法。
【請求項９】
前記食品が野菜又は野菜を含む食品（野菜を除く）である請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、望ましくは、Listeria monocytogenes と一般生菌の両方、に対する殺菌作用を有する薬剤組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リステリア症は、通性嫌気性のグラム陽性桿菌であるListeria monocytogenes による感染症であり、この菌に汚染された食品などを介して経気道、経口、接触感染する。リステリア症は、新生児や乳児に感染して、髄膜炎や敗血症を引き起こし、妊娠している女性や免疫機能が弱まっている人などにも感染する。この食中毒として、生乳、サラダ、ナチュラルチーズ、コールスローなどの、加熱や調理を必要としないready-to-eat (RTE) 食品による事例が数多く報告されている。
Listeria monocytogenes に対する抗菌剤又は増殖抑制剤として、ロスマリン酸などの酸が検討されている（特許文献1等）。
本発明で使用するフェルラ酸は、米ぬかから精製する等して得られるため、食品に使用しても安全上の問題がなく、食品用の酸化防止剤として使用されている（特許文献1等）。但し、多すぎると食品の味に影響するため、食品に添加する量には上限がある。
本発明者らは、フェルラ酸単体及びチーズなどに使用されている殺菌剤であるナイシン(nisin)とフェルラ酸との組み合わせについて、Listeria monocytogenes 及び一般生菌の増殖抑制効果を確認している（非特許文献１、２等）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2010-37282
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Food Control 33 (2013) 244-248
【非特許文献２】Food Control 47 (2015) 560-503
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、通常使用範囲のフェルラ酸単体及びナイシン(nisin)とフェルラ酸との組み合わせ等について、Listeria monocytogenes 及び一般生菌の増殖抑制効果を確認しているが（非特許文献１、２等）、これらはListeria monocytogenes 及び一般生菌の増殖抑制効果を示すに留まり、それらに対する殺菌作用を示すには至っていなかった（後述の参考例１参照）。
Listeria monocytogenesや一般生菌の増殖を抑制しても、再びこれらの菌が増殖する可能性があり、食品業界においては、これらの菌を殺菌することが期待されている。
そこで、本発明は、Listeria monocytogenes、望ましくは、Listeria monocytogenes と一般生菌の両方、に対する殺菌作用を有する殺菌用薬剤組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、フェルラ酸と他の薬剤との組み合わせを検討した結果、フェルラ酸と有機酸とを組み合わせることによって、これらの通常使用範囲内において、Listeria monocytogenes 及び一般生菌の両方に対する殺菌作用を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は、フェルラ酸及び有機酸から成る、Listeria monocytogenes、又はListeria monocytogenes と一般生菌の両方、に対する殺菌作用を有する薬剤組成物である。
また、本発明は、この薬剤組成物が添加された食品、特に、野菜又は野菜を含む食品（野菜を除く）である。
また、本発明は、食品にフェルラ酸及び有機酸を添加することから成る、Listeria monocytogenes、又はListeria monocytogenes と一般生菌の両方、を殺菌する方法である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の薬剤組成物が殺菌作用を有することを示す図である。（a)はListeria monocytogenesに対する殺菌作用、(b)は一般生菌に対する殺菌作用を示す。
【図２】コールスローに本発明の薬剤組成物を添加したときの、PMA-qPCR分析の結果を示す図である。
【図３】TSB培地における酢酸とフェルラ酸の単独又は混合液添加後のL. monocytogenesの増殖挙動を示す図である。
【図４】非特許文献１（Food Control 33 (2013) 244-248）のFig. 1の引用である。ａはチーズにおけるL. monocytogenesの増殖の変化を示し、ｂはチーズにおける一般生菌の増殖の変化を示す。◆と■は"フェルラ酸あり"、◇と□は"フェルラ酸なし"を示す。エラーバーはn=3の標準偏差を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の薬剤組成物は、フェルラ酸及び有機酸から成る。
フェルラ酸(ferulic acid)は、フィトケミカルとして植物の細胞壁などに存在する有機化合物であり、下式で表される。
【化１】
2016190836.tif 000002
フェルラ酸は、米ぬかを精製する等して得ることができる。また、バニリンと無水酢酸を反応させたり（パーキン反応）、コーヒー酸にo-メチルトランスフェラーゼを作用させることにより、得ることができる。
【０００９】
フェルラ酸の通常使用量は、野菜等の食品に対し0.5重量％以下、好ましくは0.05〜0.3重量％、より好ましくは0.05〜0.15重量％である。多すぎると、食品の味へ影響する。
【００１０】
本発明で使用する有機酸は、Ｒ（−ＣＯＯＨ）ｎで表される。
式中、ｎは１〜３の整数を表す。
Ｒは、炭素数が1〜6のｎ価の炭化水素基を表し、この炭化水素基は脂肪族でも芳香族でもよく、また水酸基を含んでもよい。
この有機酸として、具体的には、食品添加物として一般的に使用される酢酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、プロピオン酸、ソルビン酸、安息香酸、酪酸、コハク酸などが好ましい。
有機酸の通常使用量は、野菜等の食品に対し4重量％以下、好ましくは0.02〜4重量％、より好ましくは0.05〜3重量％であり、多すぎると酸味が強く食用には適さない。
【００１１】
また本発明の薬剤組成物は、その他の抗菌剤、殺菌剤、増殖抑制剤と併用してもよく、これらの例として、ポリリジン、プロタミン、ナイシン、ショ糖脂肪酸エステル、グリシン、酢酸ナトリウム、などが挙げられる。
【００１２】
本発明の薬剤組成物が対象とする食品としては、野菜、野菜サラダ、コールスロー、卵、イクラ、ハム、ソーセージ、チーズ、乳製品、弁当、総菜などが挙げられ、この中で特に野菜、その他野菜を含む食品が本発明の薬剤組成物の対象として適している。
添加方法に特に限定はないが、例えば、本発明の薬剤組成物を水溶液に調整して添加してもよいし、また粉末のまま食品等に練りこんでもよい。
本発明の薬剤組成物は、Listeria monocytogenes、又はListeria monocytogenes と一般生菌の両方、に対する殺菌作用を有する。
一般生菌とは、食品中に存在し、好気的条件で一般的な培地に増殖する中温性の細菌群の総称であり、大腸菌などもこの中に含まれる。
また、殺菌作用は、使用直後に発現する。
【実施例】
【００１３】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
なお、以下の実験において、リステリア菌として、発明者らがスジコから分離したL. monocytogenes 2-9株を用いた。
また、菌数の測定は、リステリア菌の鑑別培地であるPALCAM培地を用いて行った。各試験区において、25 g採取した試料を3つ用意して試験を行い、その結果を平均値±標準偏差で示した。
【００１４】
実施例１
小売店で購入したキャベツの外葉を三枚と芯を除去して適度な大きさに切断し、55℃の湯で洗浄した後、フードプロセッサーで約5 mm角に破砕した。その後、2%食塩水に1分間浸漬し、水切りをした。キャベツの重量に対して、マヨネーズ（キューピー株式会社社製キューピーマヨネーズ、酢酸酢（酢酸3wt%含有）12wt%含有）を20重量％及びフェルラ酸(三栄源エフ・エフ・アイ株式会社)を1000ppm又は1500 ppm添加して、混和した。
また、フェルラ酸を添加しない試料をコントロール試験区(即ち、マヨネーズは含む)とした。
得られたサラダに対し終濃度が約105 CFU/gとなるようにL. monocytogenes 培養液2.5 mLを接種し、ストマッカー (シーワード社製、230 rpm、30 sec)により試料と菌液をよく混合した後、10℃で5日間保存した。
保存0、1、2、3、4、5日目に各試験区を回収し、生理的食塩水を用いて段階希釈を行い、希釈液をPALCAM寒天培地に塗沫してL. monocytogenes 数を測定した。
【００１５】
結果を、図１(a)に示す。
フェルラ酸1000 ppm及び1500 ppmを添加した試験区においては、サラダ中のL. monocytogenesの殺菌効果が確認された。
コントロール試験区においては、5日間の保存期間中にL. monocytogenes 数の増加は認められず、接種菌数5.38 log CFU/gに対し、保存5日目のL. monocytogenes 数は5.25 log CFU / gであった。
フェルラ酸添加区においては、保存１日目以降にL. monocytogenes 数の減少が確認され、保存5日目のL. monocytogenes 数は1000 ppm添加で3.98 log CFU/g、1500 ppm添加で3.74 log CFU/gであった。
【００１６】
実施例２
一般生菌数への効果を観察するため、実施例１で作成したサラダに菌を接種せずに、実施例１と同様に保存したサンプルを用意した。保存後、各日に回収されたサンプルを生理的食塩水で段階希釈し、TSA培地を用いた混釈法で一般生菌数の測定を行なった。
結果を、図１(b)に示す。
コントロール試験区においては、4日目以降に菌数の増加が確認され、保存5日目の菌数は4.31 log CFU/gであった。
フェルラ酸添加区の保存5日目の菌数は、1000 ppm添加で2.32 log CFU/g、1500 ppm添加で2.70 log CFU/g であり、コントロール試験区と比較して菌数の減少が確認された。
【００１７】
実施例１と２（図１(a)と(b)）ではL. monocytogenes及び一般生菌の菌数は経時により減少しており、本発明の薬剤組成物が殺菌作用を有することを示している。
対照的に、フェルラ酸のみの添加（参考例１）では、L. monocytogenesと一般生菌の菌数は経時により減少しておらず、これらに対し増殖抑制効果はあるが、殺菌効果はない。
【００１８】
実施例３
コールスロー(酢酸0.07wt％含有)にフェルラ酸1000ppmを添加して、PMA(R)(Propidium Monoazide、コスモ・バイオ株式会社)を用いた定量リアルタイムPCT(qPCR)により、L. monocytogenesの菌数の変化を調べた。
結果を図２に示す。
PMAは核酸に結合するとPCR反応を阻害するため、図２の"PMAなし"と"PMAあり"の差は、細胞膜が破壊された死細胞に相当する。つまり、図２は、本発明の薬剤組成物によりL. monocytogenesが殺菌されたことを示している。
【００１９】
実施例４
以下の４種の培地を用意し、これらにListeria monocytogenesを接種した（接種時：5.6 logCFU/mL）。
(1) TSB培地にフェルラ酸2000 ppmを添加した。
(2) TSB培地に酢酸3000 ppmを添加した。
(3) TSB培地に酢酸3000 ppm とフェルラ酸2000 ppmを添加した。
(4) 対照としてTSB培地のみ
これらを10℃で5日間保存し、0, 1, 3, 5 日目に回収した。回収したサンプルを段階希釈し、その溶液をTSA培地に塗沫して、30℃で48 時間培養した後、菌数を測定した。結果を図３に示す。
酢酸又はフェルラ酸を単独で添加した場合、L. monocytogenesに対して、増殖抑制効果は認められたが、殺菌効果は認められなかった（酢酸のみ、0日目：5.4 log CFU/mL、5日目：5.3 log CFU/mL；フェルラ酸のみ、0日目：5.5 log CFU/mL、5日目：6.3 log CFU/mL）。
一方、酢酸とフェルラ酸を組み合わせて添加した場合、L. monocytogenesに対して殺菌的効果を示し、5日目にはL. monocytogenesの菌数が1.78 log CFU/mL減少した（0日目：5.3 log CFU/mL、5日目：3.9 log CFU/mL）。
【００２０】
参考例１
本発明者らは、既にL. monocytogenes を接種したチーズ等にフェルラ酸のみを添加して（チーズに対してフェルラ酸2000ppm）、L. monocytogenesの菌数の変化を報告しているが（非特許文献１：Food Control 33 (2013) 244-248）、そのFigure 1を引用する（図４）。
図４のL. monocytogenes及び一般生菌の増殖の変化をみると、"フェルラ酸あり（◆と■）"の菌数は"フェルラ酸なし（◇と□）"よりも少ないが、"フェルラ酸あり（◆と■）"のデータは経時により減少していない。これは、フェルラ酸のみの添加では、増殖抑制効果はあるが、殺菌効果はないことを示している。
【図１】
2016190836.tif 000003
【図２】
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【図３】
2016190836.tif 000005
【図４】
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