(57)【要約】【課題】難治性がんなどの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる方法を提供すること。異種移植片の調製方法、スクリーニング方法、ｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法及びがん幹細胞増殖抑制剤を提供すること。【解決手段】本発明は、がん幹細胞集団の調製方法である。調製方法は、がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、前記非ヒト動物から前記異種移植片を取り出す工程と、前記異種移植片を、前記がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子を含む無血清３次元培地において培養し、オルガノイドを形成する工程と、を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん幹細胞集団の調製方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、
前記非ヒト動物から前記異種移植片を取り出す工程と、
前記異種移植片を、前記がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子を含む無血清３次元培地において培養し、オルガノイドを形成する工程と、
を有する方法。
【請求項２】
前記がん幹細胞は、胆管がん由来のがん幹細胞である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分裂を促進させる増殖因子は、Ｗｎｔ分泌タンパク質である、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｗｎｔ分泌タンパク質は、Ｒ−スポンジン１である、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記がん幹細胞は、ドライバー遺伝子が変異している幹細胞である、
請求項１乃至４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記分裂を促進させる増殖因子は、Ｎｏｇｇｉｎ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−１０、Ａ８３−０１、Ｗｎｔ３Ａ、及びＹ−２７６３２からなる群から選択される１つ以上を含むものでない、
請求項１乃至５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
がん幹細胞を含む異種移植片の調製方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、を有する方法。
【請求項８】
がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、
被験物質を、前記異種移植片に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、
を有するスクリーニング方法。
【請求項９】
がんの治療剤又は予防剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、
被験物質を、前記異種移植片に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、がんの治療剤又は予防剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、
を有するスクリーニング方法。
【請求項１０】
非ヒト動物において形成される異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、
を有する方法。
【請求項１１】
ｍｉＲ−３４ａからなる、がん幹細胞増殖抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、難病患者などからがん幹細胞集団を調製する方法、異種移植片の調製方法、スクリーニング方法、ｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法及びがん幹細胞増殖抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体における臓器や組織を構成する細胞は、幹細胞を由来として各臓器・組織の機能が維持されている。この幹細胞は、分裂して自分と同じ細胞を作る自己複製能と、別の種類の細胞に分化する多分化能とを有しており、臓器・組織の維持・再生などに重要な役割を果たしている。
【０００３】
このような幹細胞は、腫瘍組織においても重要な役割を果たすことが示唆されている。即ち、自己複製能と多分化能をもつがん幹細胞は、腫瘍組織において様々な性質のがん細胞を供給することで階層性を有した腫瘍組織を構成している。がん幹細胞は、白血病など各種のがん疾患における腫瘍組織で特定されている（非特許文献１）。
現行の化学療法や放射線療法により腫瘍組織を構成するがん細胞の大部分を死滅させたとしても少数のがん幹細胞が残存し、がん幹細胞の自己複製能と多分化能によりがん組織が再生される。また、がんの転移には、その細胞が原発巣から遊離するだけではなく、到達した部位で新しくがんを形成する能力が必要となることから、がん幹細胞は、がんの転移においても重要な役割を果たしている可能性が示唆されている（非特許文献２）。
更に、がん幹細胞は、薬剤耐性を有する細胞が報告されており（非特許文献３）、がん幹細胞のがん治療における重要性が認識されている。
そのため、がん幹細胞は、現行の化学療法や放射線療法に対して治療抵抗性を示す難治性がんにおいて、新たな治療標的として大きな注目を集めている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  Ｖｏｌ．３，  １９９７，  ｐ．ｐ．  ７３０−７３７．
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．１７，  ２００７  ｐ．ｐ．  ３−１４．
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｖｏｌ．５，  ２００５  ｐ．ｐ．  ２７５−２８４．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、がん幹細胞を治療標的として研究をするためには、がん幹細胞を高い純度で分離した上で、分化させずに培養されたがん幹細胞集団が必要である。しかし、がんの組織からがん幹細胞を含む細胞塊を摘出してもがん幹細胞以外の細胞が多く含まれる。また、がん幹細胞を含む細胞塊を培養すると、がん幹細胞が分化することによりがん幹細胞の性質が失われてしまう。
即ち、従来、難治性がんなどの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養する方法はなかった。
【０００６】
本発明は、難治性がんなどの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる方法を提供することを目的とする。また、本発明は、異種移植片の調製方法、スクリーニング方法、ｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法及びがん幹細胞増殖抑制剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（１）  がん幹細胞集団の調製方法であって、がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、前記非ヒト動物から前記異種移植片を取り出す工程と、前記異種移植片を、前記がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子を含む無血清３次元培地において培養し、オルガノイドを形成する工程と、を有する方法。
【０００８】
（２）  前記がん幹細胞は、胆管がん由来のがん幹細胞である、（１）に記載の方法。
【０００９】
（３）  前記分裂促進増殖因子は、Ｗｎｔ分泌タンパク質である、（１）又は（２）に記載の方法。
【００１０】
（４）  前記Ｗｎｔ分泌タンパク質は、Ｒ−スポンジン１である、（３）に記載の方法。
【００１１】
（５）  前記がん幹細胞は、ドライバー遺伝子が変異している幹細胞である、（１）乃至（４）いずれかに記載の方法。
【００１２】
（６）  前記分裂を促進させる増殖因子は、Ｎｏｇｇｉｎ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−１０、Ａ８３−０１、Ｗｎｔ３Ａ、及びＹ−２７６３２からなる群から選択される１つ以上を含むものでない、
（１）乃至（５）いずれかに記載の方法。
【００１３】
（７）  がん幹細胞を含む異種移植片の調製方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、を有する方法。
【００１４】
（８）  がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、
被験物質を、前記異種移植片に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、
を有するスクリーニング方法。
【００１５】
（９）  がんの治療剤又は予防剤の候補物質のスクリーニング方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、
被験物質を、前記異種移植片に投与する工程と、
前記被験物質が投与された前記異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を測定する工程と、
前記測定結果に基づいて、がんの治療剤又は予防剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、
を有するスクリーニング方法。
【００１６】
（１０）  非ヒト動物において形成される異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法であって、
がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、
該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、
を有する方法。
【００１７】
（１１）  ｍｉＲ−３４ａからなる、がん幹細胞増殖抑制剤。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、難治性がんの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができるようになる。また、本発明によれば、異種移植片の調製方法、スクリーニング方法、ｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法及びがん幹細胞増殖抑制剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】胆管がん組織を移植した免疫不全マウス及び免疫不全マウスから摘出した異種移植片を示す図である。
【図２】図２で摘出された異種移植片をＨＥ染色したものを示す図である。
【図３】作製した胆管がんオルガノイドを観察した図である。
【図４】図３で示した胆管がんオルガノイドの切片をＨＥ染色したものを示す図である。
【図５】作製した胆管がんオルガノイドの動物種を判別するためのＰＣＲの結果を示す図である。
【図６】作製した胆管がんオルガノイドを再度培養した際の経過を示す図である。
【図７】図６で示した胆管がんオルガノイドの増殖能を示す図である。
【図８】作製した胆管がんオルガノイドについてＣＫ１９の発現をウエスタンブロット法により示す図である。
【図９】作製した胆管がんオルガノイドについてＣＫ１９の発現をウエスタンブロット法により示す図である。
【図１０】作製した胆管がんオルガノイドの増殖能を示す図である。
【図１１】作製した胆管がんオルガノイドの観察結果を示す図である。
【図１２】作製した胆管がんオルガノイドのＬｇｒ５の発現を免疫蛍光染色により示す図である。
【図１３】作製した胆管がんオルガノイドのＬｇｒ５の発現をフローサイトメトリーにより示す図である。
【図１４】作製した胆管がんオルガノイドを移植した免疫不全マウス及びその免疫不全マウスから摘出した異種移植片を示す図である。
【図１５】図１４で示した異種移植片を培養した後の観察結果を示す図である。
【図１６】作製した胆管がんオルガノイドをエピゲノム解析した結果を示す図である。
【図１７】作製した胆管がんオルガノイドを遺伝子発現の網羅的解析した結果を示す図である。
【図１８】ＣＣＯ１を週１回の間隔で継代し、（ａ）２か月、（ｂ）９か月、（ｃ）１３か月間培養した際の状態についてそれぞれ顕微鏡で観察した画像を示す図である。
【図１９】ＣＣＯ１を１〜１０回、１１〜２０回、２１〜３０回、３１〜４０回、又は４１〜５５回に継代したときの、それぞれのスプリット比の平均値を表したグラフである。
【図２０】ＣＣＯ１が由来する異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量に対する、各継代時（７回、２２回、３２回、３６回、４０回）のＣＣＯ１におけるｍｉＲ−３４ａの発現量についてのグラフである。
【図２１】ＣＣＯ１が由来する異種移植片における、ｍｉＲ−３４ａの標的遺伝子（ＣＤ４４、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＭＥＴ、ＭＹＣ、又はＳＩＲＴ１）の発現量に対する、各継代時（７回、２２回、３２回、３６回、４０回）のＣＣＯ１における各標的遺伝子の発現量についてのグラフを示す図である。
【図２２】ＣＣＯ１が由来する異種移植片における、がん幹細胞マーカー（ＬＧＲ５、ＣＤ１３３、ＡＬＤＨ１Ａ１）の発現量に対する、各継代時（７回、２２回、３２回、３６回、４０回）のＣＣＯ１における各がん幹細胞マーカーの発現量についてのグラフを示す図である。
【図２３】Ｐ１−１及びＰ１−２のプライマーを用いて解析した継代数７、２２、３２、５４のＣＣＯ１におけるｍｉＲ−３４ａプロモーター領域のＤＮＡメチル化についてのグラフを示す図である。
【図２４】１又は３μＭの５ＡＺＡ処理を行った、継代数５４のＣＣＯ１におけるｍｉＲ−３４ａプロモーター領域のＤＮＡメチル化についてのグラフを示す図である。
【図２５】５ＡＺＡ処理を行った継代数５４のＣＣＯ１と、５ＡＺＡ処理を行わなかった継代数５４のＣＣＯ１の、ｍｉＲ−３４ａの発現量についてのグラフを示す図である。
【図２６】５ＡＺＡ処理を行った継代数５４のＣＣＯ１と、５ＡＺＡ処理を行わなかった継代数５４のＣＣＯ１について顕微鏡で観察した画像を示す図である。
【図２７】ＣＣＯ１に対して、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ＧＦＰ、又は、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎを導入したときの、ｍｉＲ−３４ａの相対的な発現量を示すグラフである。
【図２８】ＣＣＯ１に対して、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎを導入したときの、ＣＤ４４、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、及びＬＧＲ５の発現量の相対的な発現量を示すグラフである。
【図２９】ＣＣＯ１に対して、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ＧＦＰ、又は、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎを導入したときの、それぞれのオルガノイドについて顕微鏡で観察したときの画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の実施形態を説明するが、これが本発明を限定するものではない。
【００２１】
＜がん幹細胞集団の調製方法＞
本発明は、がん幹細胞集団の調製方法であって、がん幹細胞を含む細胞塊を、前記がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、前記非ヒト動物から前記異種移植片を取り出す工程と、前記異種移植片を、前記がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子を含む無血清３次元培地において培養し、オルガノイドを形成する工程と、を有する方法を包含する。
【００２２】
後述のとおり、かかる調製方法に係る異種移植片を形成させる工程においては、自己複製能を有するがん幹細胞は増殖して、がん幹細胞ではないがん細胞は増殖しにくい又は実質的に増殖しない。そのため、異種移植片を形成させる工程において、がん幹細胞を多く含む異種移植片が分離される。そして、オルガノイドを形成する工程において、無血清で培養され、がん幹細胞から分化を誘導する因子がほとんど含まれていないため、がん幹細胞からの分化を促進せずに培養することが可能である。これにより、異種移植片を形成させる工程とオルガノイドを形成させる工程とにより、患者から摘出した細胞塊がわずかであっても、がん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる。即ち、難治性がんなどの由来患者の病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる。
また、かかる調製方法により分離・培養したがん幹細胞集団は、現行の化学療法や放射線療法に対して治療抵抗性を示す難治性がんなどにおいて新たな治療標的を探索するために有用である。
【００２３】
（移植工程）
本発明における移植工程は、がん幹細胞を含む細胞塊を、がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程である。
かかる調製方法に包含される移植する工程において、非ヒト動物に移植する部位は、移植するがん幹細胞の由来や種別、移植される非ヒト動物により適宜設定されてよい。好ましくは、皮下組織内である。
【００２４】
かかる調製方法におけるがん幹細胞集団とは、がん幹細胞を含有している細胞の集合体をいい、その集合形態は特に問わない。例えば、細胞が集積した細胞組織体であるオルガノイドであってよく、当該オルガノイドの一部分から得られた細胞集団であってよい。また、がん幹細胞集団は、腫瘍を形成する能力を有するがん幹細胞の他、腫瘍を形成する能力がないがん細胞（幹細胞ではないがん細胞）や非がん細胞（即ち正常細胞）を含んでいてもよい。
【００２５】
かかる調製方法におけるがん幹細胞とは、継続的に増殖可能な腫瘍の再構築に必要ながん細胞であって、自己複製能及び多分化能を有するがん細胞をいう。自己複製能とは、分裂した２つの娘細胞のどちらか１つ、あるいは、両方の細胞が、細胞系譜上、親細胞と同などの能力及び分化程度を保持している細胞を産出できる能力をいう。多分化能とは、腫瘍を構成する複数種のがん細胞へ分化できる能力をいう。
【００２６】
かかる調製方法における細胞塊は、がん幹細胞を含む、細胞塊である。多くの腫瘍は、腫瘍を構成するがん細胞に不均一性を有し、腫瘍を形成する能力を有するがん幹細胞及び腫瘍を形成する能力がないがん細胞（幹細胞ではないがん細胞）から構成される。そのため、細胞塊は、がん幹細胞ではない（即ち上述のがん幹細胞の性質を有していない）細胞を含んでよい。また、細胞塊は、非がん細胞（即ち正常細胞）を含んでよい。
【００２７】
かかる調製方法において、非ヒト動物は、特に限定されないが、ヒトを除く哺乳動物、例えば、齧歯動物（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヒトを除く霊長類（サルなど）、ブタなどが挙げられる。非ヒト動物は、トランスジェニック動物であってもよく、遺伝子改変動物であってもよく、クローンであってもよい。マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウシなどが挙げられる。本発明においては、好ましくは、免疫不全の非ヒト動物が用いられ、より好ましくは、免疫不全のマウスが用いられる。
【００２８】
（異種移植片形成工程、及び、異種移植片を取り出す工程）
本発明における異種移植片形成工程は、上述の移植工程後の非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程である。
かかる調製方法に包含される異種移植片を形成させる工程において、異種移植片を形成させる期間は、がん幹細胞が増殖して移植片として摘出し得るようになる期間であって非がん幹細胞が死滅する期間が設定されることが好ましい。例えば、好ましくは、１か月から５か月、より好ましくは、２か月〜４か月、より好ましくは３か月の期間が設定されてよい。
【００２９】
本発明における異種移植片を取り出す工程は、上述の異種移植片を形成させた後に非ヒト動物から異種移植片を取り出す工程である。
かかる調製方法に包含される異種移植片を形成させる工程及び異種移植片を取り出す工程は、異種移植片に含まれるがん幹細胞の純度を高めるために複数回（例えば、２〜５回）繰りかえされることが好ましい。
【００３０】
かかる調製方法において、異種移植片（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）とは、非ヒト動物の体内において培養された、細胞が集積した細胞組織体であって、移植された非ヒト動物とは異なる動物種を由来とする細胞組織体をいう。例えば、ヒトから摘出した細胞塊をマウスに移植してマウスの体内で培養されたヒト由来の細胞組織体を異種移植片という。
【００３１】
本発明における異種移植片は、がん幹細胞の増殖能に優れる。その理由は、異種移植片が、がん幹細胞を含む細胞塊を該がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植して形成されることで、がんを抑制するｍＲＮＡであるｍｉＲ−３４ａの発現量が減少するためである。また、本発明における異種移植片においてｍｉＲ−３４ａの発現量が減少することで、異種移植片においてＣＤ４４、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＳＩＲＴ１などのｍｉＲ−３４ａ標的遺伝子の発現量が上昇する。特に、がん細胞のマーカーであるＣＤ４４の発現量が上昇することから、がん細胞の性質が増強されているものと推測される。
【００３２】
更に、本発明における異種移植片は、がん幹細胞を含む細胞塊を該がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植して形成されることで、ＬＧＲ５、ＣＤ１３３、ＡＬＤＨ１Ａ１などのがん幹細胞マーカーの発現量を上昇させることができ、これにより、その増殖活性が更に増強される。
【００３３】
（オルガノイド形成工程）
本発明におけるオルガノイド形成工程は、異種移植片を、がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子を含む無血清３次元培地において培養し、オルガノイドを形成する工程である。
かかる調製方法における増殖因子は、幹細胞の増殖を促進する物質であればよく、通常、分子量が２０，０００以下のペプチドで、受容体との結合により低濃度で作用が発揮される因子が挙げられる。例えば、増殖因子には、ＥＧＦ、Ｗｎｔ分泌タンパク質（Ｗｎｔ関連タンパク質）（Ｒ−スポンジン１（Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ１、Ｒｓｐｏ１）、Ｗｎｔ３Ａなど）、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ、ＦＧＦ１０、ＨＧＦ、Ａ８３−０１（ＴＧＦ−β受容体阻害薬）、Ｙ−２７６３２、Ｇａｓｔｒｉｎなどが含まれる。
【００３４】
ただし、本発明における異種移植片は、上述のとおり、がん幹細胞の増殖能に優れるため、オルガノイドを形成する工程における培地は、多数の増殖因子を含まなくてもよい。例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−１０、Ａ８３−０１、Ｗｎｔ３Ａ、及びＹ−２７６３２からなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含まなくてもよい。このように、これらＮｏｇｇｉｎなどの増殖因子を含まないことにより、より幹細胞性を維持できるという利点がある。したがって、オルガノイドを形成する工程における培地は、Ｎｏｇｇｉｎ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−１０、Ａ８３−０１、Ｗｎｔ３Ａ、及びＹ−２７６３２からなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含まないことが好ましい。
【００３５】
かかる調製方法において、無血清３次元培地が用いられる。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まないことをいい、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に含まれる。３次元培地とは、培養用プレートなどの２次元的な培地ではなく、３次元的な培養を可能とする培地をいい、例えば、マトリジェルなどを用いた培地が用いられてよい。
【００３６】
かかる調製方法により形成されたオルガノイドとは、細胞が集積した細胞組織体をいう。
【００３７】
本発明においては、種々のがん由来のがん幹細胞を用いることが可能であり、がんの種類としては、固形がん（例えば、胆管がん、大腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん、膀胱がん、前立腺がんなど）、血液がん（例えば、骨髄腫、リンパ腫など）などを挙げることができるが、特にこれらに限定されない。本発明においては、好ましくは胆管がん由来のがん幹細胞が用いられる。
【００３８】
このような胆管がん由来のがん幹細胞が用いられた調製方法においては、調製方法により形成されたオルガノイドがＣＫ１９などの胆管がんのマーカーを発現し、胆管がん組織の特性を有するものである。そのため、本発明の調製方法は、難治性がんの代表である胆管がんの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる。
【００３９】
本発明においては、がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子は、上述のとおり、Ｗｎｔ分泌タンパク質（Ｗｎｔ関連タンパク質）を包含する。Ｗｎｔ分泌タンパク質は、幹細胞の増殖と分化とを調節するＷｎｔシグナル伝達経路において、Ｗｎｔシグナル伝達経路を増強及び維持する正のフィードバック制御タンパク質をいう。例えば、Ｗｎｔ分泌タンパク質には、Ｗｎｔファミリータンパク質やＲｓｐｏファミリーを含んでよい。
【００４０】
このような調製方法は、オルガノイドを形成する工程において、無血清で培養され、がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子は、Ｗｎｔ分泌タンパク質以外含まれていないことが好ましく、この場合には幹細胞から他の細胞への分化が誘導されず、がん幹細胞のまま培養することが可能である。即ち、難治性がんの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる。なお、がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子は、Ｗｎｔ分泌タンパク質とともに、他の増殖因子を含んでもよい。
【００４１】
本発明においては、オルガノイドを形成する工程におけるＷｎｔ分泌タンパク質は、Ｒ−スポンジン１を包含する。このような調製方法は、オルガノイドを形成する工程において、無血清で培養され、がん幹細胞の分裂を促進させる増殖因子は、Ｒ−スポンジン１以外含まれていないため、幹細胞から他の細胞への分化が誘導されず、がん幹細胞のまま培養することが可能である。即ち、難治性がんの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる。なお、Ｗｎｔ分泌タンパク質は、Ｒ−スポンジン１とともに、他の増殖因子を含んでもよい。
【００４２】
本発明のオルガノイドを形成する工程における培養条件は、用いられる培地及び幹細胞により適宜設定される。本発明はまた、本発明の方法で用いられる培地を提供する。
【００４３】
本発明における培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として用いて調製することができる。基礎培地としては、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、及びＦｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、並びにこれら任意の混合培地などが使用でき、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
【００４４】
オルガノイドを形成する工程に用いる培養器は、幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。
【００４５】
オルガノイドを形成する工程における培養は、継代培養を行ってもよく、行わなくてもよいが、継代培養を行うごとに、スプリット比が増加するため、継代培養は行うことが好ましい。なお、スプリット比とは、細胞を継代する際に１つのｗｅｌｌからいくつのｗｅｌｌに細胞を継代するかの割合を指し、例えば、ある継代において、１つのｗｅｌｌから１０のｗｅｌｌに細胞を継代できた場合は、この継代におけるスプリット比は１０である。継代培養を行う間隔は、特に限定されず、例えば、１〜２０日であってもよい。また、継代を行う回数も特に限定されず、例えば、１〜１００回であってもよいが、がん幹細胞をより大量に得るためには、１０回以上行うことが好ましく、２０回以上行うことがより好ましく、３０回以上行うことが更に好ましく、４０回以上行うことがより一層好ましく、５０回以上行うことが最も好ましい。
【００４６】
オルガノイドを形成する工程における培養は、例えば、スプリット比を指標として、継代の回数を決定してもよく、例えば、スプリット比が１：５〜１：１０になるまで継代を行うことが好ましい。
【００４７】
オルガノイドを形成する工程における、培養期間は、継代培養の回数、継代培養を行う間隔、所望のがん幹細胞の量などに応じて適宜設定することができ、例えば、１日〜２年といった幅広い期間で行うことができる。ただし、培養期間が長い方が、がん幹細胞を増殖できることから、３０日以上であることが好ましい。他方、所望のがん幹細胞の量が少ない場合は、培養期間は、６０日以下であってもよい。
【００４８】
その他の培養条件は、適宜設定できる。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり得る。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、好ましくは約２〜５％であり得る。酸素分圧は、１〜１０％であり得る。
【００４９】
本発明においては、調製方法におけるがん幹細胞は、ドライバー遺伝子が変異しているものを包含する。ここで、ドライバー遺伝子とは、がんにおける遺伝子変異のうち、がんの発生・進展に強く関わっており、がん細胞の生存が依存しているものをいい、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＳＭＡＤ４などを含む遺伝子である。また、変異とは、特定の遺伝子又は当該遺伝子を含む染色体ＤＮＡの特定のヌクレオチドが一定の頻度で修飾される（例えば、置換、欠失、付加、反復、逆位、転座など）ことをいう。
【００５０】
以上で述べた本発明の調製方法は、オルガノイドを形成する工程において、多くの増殖因子を必要としないため、無血清で培養することが可能であり、幹細胞から他の細胞への分化が誘導されず、がん幹細胞のまま培養することが可能である。これにより、本発明の調製方法は、難治性がんの病態を反映したがん幹細胞集団を効率的に分離・培養することができる。
【００５１】
＜異種移植片の調製方法＞
本発明は、がん幹細胞を含む異種移植片の調製方法であって、がん幹細胞を含む細胞塊を、がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、を有する方法を包含する。
【００５２】
本発明の異種移植片の調製方法における、上記移植工程と、異種移植片形成工程とは、それぞれ、上記がん幹細胞集団の調製方法における移植工程、及び異種移植片形成工程と同様の方法を用いることができる。
【００５３】
＜がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質のスクリーニング方法＞
本発明は、がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質のスクリーニング方法であって、がん幹細胞を含む細胞塊を、がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、被験物質を、異種移植片に投与する工程と、被験物質が投与された異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を測定する工程と、測定結果に基づいて、がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有するスクリーニング方法を包含する。
【００５４】
上述のとおり、該非ヒト動物において異種移植片を形成させることで、異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量が減り、結果としてがん幹細胞が増殖する。そのため、異種移植片に投与されることでｍｉＲ−３４ａの発現量を更に減少させることが確認された被験物質は、がん幹細胞の増殖の正の調節が可能な候補物質として特定できる。他方、異種移植片に投与されることでｍｉＲ−３４ａの発現量の減少を抑制させることが確認された被験物質は、がん幹細胞の増殖の負の調節が可能な候補物質として特定できる。即ち、本発明のスクリーニング方法により、がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として、被験物質を特定できる。以下に本発明におけるスクリーニング方法の各工程について説明する。なお、「増殖調節」とは、がん幹細胞の増殖に関して、正又は負の調節のいずれかを指す。
【００５５】
（移植工程）
本発明のスクリーニング方法における移植工程は、上述のがん幹細胞集団の調製方法における移植工程と同様の方法を用いることができる。
【００５６】
（異種移植片形成工程）
本発明のスクリーニング方法における異種移植片形成工程は、上述のがん幹細胞集団の調製方法における異種移植片形成工程と同様の方法を用いることができる。
【００５７】
（投与工程）
本発明のスクリーニング方法における投与工程は、被験物質を、異種移植片に投与する工程である。なお、本発明において、「被験物質を異種移植片に投与する」とは、直接的又は間接的に異種移植片に被験物質を投与することを指す。
【００５８】
「直接的に投与」とは、例えば、異種移植片に注射などを用いることで、直接被験物質を異種移植片内に導入することや、あるいは、形成された異種移植片を取り出して培養してオルガノイドを形成する場合（つまり、本発明のスクリーニング方法が、上述のがん幹細胞集団の調製方法におけるオルガノイド形成工程を有する場合）において、培地中に被験物質を添加し、異種移植片を培養させながら直接異種移植片に被験物質を取り込ませることなどを指す。
【００５９】
「間接的に投与」とは、異種移植片に対する被験物質によるｍｉＲ−３４ａの発現量の調整効果が現れる態様で、被験物質を非直接的に投与することを指す。具体的には、「間接的に投与」とは、非ヒト動物における異種移植片以外の組織に注射などにより導入すること、あるいは、非ヒト動物に被験物質を経口投与することなどを指す。
【００６０】
被験物質の異種移植片への投与は、どの時点で行ってもよい。例えば、移植工程において、移植後の異種移植片に直接的又は間接的に投与を行ってもよく、あるいは、移植前の非ヒト動物にあらかじめ投与を行った状態で移植工程を行い、間接的に異種移植片に投与を行ってもよい。また、非ヒト動物に形成された異種移植片を取り出し、オルガノイド形成を行う場合には、該オルガノイド形成工程において直接的に異種移植片に被験物質を取り込ませてもよい。
【００６１】
投与方法は、特に限定されず、異種移植片への投与の際の状態に応じて適宜選択することができるが、例えば、オルガノイド形成工程において被験物質の存在下で異種移植片を培養して投与してもよい。あるいは、投与方法は、非経口投与であってもよい。非経口投与は、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などであってもよい。また、投与方法は、経口投与であってもよい。
【００６２】
被験物質は、特に限定されず、天然又は合成の有機又は無機の低分子又は高分子物質などの任意の物質であってよい。
【００６３】
（測定工程）
測定工程は、被験物質が投与された異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を測定する工程である。
【００６４】
測定方法は、特に限定されず、従来の公知の方法を使用することができ、例えば、被験物質の投与後の異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を従来の公知の方法で測定することができる。なお、測定対象の「異種移植片」とは、異種移植片形成後の異種移植片自体であってもよく、あるいは、オルガノイド形成工程により形成されたオルガノイドであってもよい。この測定結果に基づいて、後述の選択工程において、候補物質を選択することができる。
【００６５】
また、測定工程において、ｍｉＲ−３４ａ標的遺伝子（ＣＤ４４、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＳＩＲＴ１など）の発現量も併せて測定し、後述の選択工程における被験物質を選択する指標の１つとしてもよい。
【００６６】
（選択工程）
選択工程は、上記測定結果に基づいて、がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として被験物質を選択する工程である。
【００６７】
選択方法は、特に限定されず、従来公知の選択方法により候補物質を選択すればよい。例えば、異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を比較対象となる他の異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量と比較することで、選択することができる。比較対象の異種移植片の具体例としては、被験物質が投与されていないネガティブコントロールの異種移植片や、あらかじめ、ネガティブコントロールの異種移植片よりｍｉＲ−３４ａの発現量が上昇又は減少していることが確認されている他の異種移植片であってもよい。また、選択は、ネガティブコントロールにおけるｍｉＲ−３４ａの発現量と比較して、被験物質が投与された異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量が上昇又は減少していることを確認することで、被験物質をがん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として行うことができる。また、ネガティブコントロールの異種移植片よりｍｉＲ−３４ａの発現量が上昇又は減少していることが確認されている他の異種移植片と比較する場合、該異種移植片と同程度のｍｉＲ−３４ａの発現量であることか、あるいは、他の異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量より更に上昇又は減少していることを確認することで、被験物質をがん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として選択を行うことができる。
【００６８】
（その他）
本発明のスクリーニング方法は、上記で述べた以外の工程を更に有してもよく、有さなくてもよい。上記で述べた以外の工程を更に有してもよい工程としては、例えば、がん幹細胞の増殖調節剤の候補物質として選択された被験物質を、単離されたがん幹細胞又はがん幹細胞を有するがんモデル非ヒト動物に投与して、がん幹細胞の増殖調節作用を確認する工程が挙げられる。
【００６９】
＜がんの治療剤又は予防剤の候補物質のスクリーニング方法＞
本発明は、がんの治療剤又は予防剤の候補物質のスクリーニング方法であって、がん幹細胞を含む細胞塊を、がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、被験物質を、異種移植片に投与する工程と、被験物質が投与された異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を測定する工程と、測定結果に基づいて、がんの治療剤又は予防剤の候補物質として被験物質を選択する工程と、を有するスクリーニング方法を包含する。
【００７０】
上述のとおり、本発明のスクリーニング方法によると、異種移植片を形成させることで、異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を減らし、結果としてがん幹細胞が増殖させることができる。ここで、ｍｉＲ−３４ａは、がん抑制のマーカーである。よって、異種移植片において低下したｍｉＲ−３４ａの発現量を回復させる被験物質は、がんの治療剤又は予防剤の候補物質として、被験物質を特定できる。このように、本発明のスクリーニング方法によると、ｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させた状態を基準として被験物質の選択ができるため、がんの治療剤又は予防剤の候補物質の探索に適している。
【００７１】
疾患の対象となるがんの種類は、特に限定されないが、例えば、固形がん（例えば、胆管がん、大腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん、膀胱がん、前立腺がんなど）、血液がん（例えば、骨髄腫、リンパ腫など）などを挙げることができる。本発明においては、疾患の対象となるがんは、好ましくは胆管がんである。
【００７２】
本発明における移植工程、異種移植片形成工程、投与工程、測定工程は、上述のがん幹細胞の増殖調節剤の候補物質のスクリーニング方法のものと同様の方法を用いることができる。
【００７３】
本発明における選択工程は、測定結果に基づいて、がんの治療剤又は予防剤の候補物質として被験物質を選択する工程である。
【００７４】
選択方法は特に限定されず、従来公知の選択方法により候補物質を選択すればよい。例えば、異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を比較対象となる他の異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量と比較することで、選択することができる。比較対象の異種移植片の具体例としては、被験物質が投与されていないネガティブコントロールの異種移植片や、あらかじめ、ネガティブコントロールの異種移植片よりｍｉＲ−３４ａの発現量が上昇していることが確認されている他の異種移植片であってもよい。また、選択は、ネガティブコントロールにおけるｍｉＲ−３４ａの発現量と比較して、被験物質が投与された異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量が上昇していることを確認することで、被験物質をがんの治療剤又は予防剤の候補物質として選択することができる。また、ネガティブコントロールの異種移植片よりｍｉＲ−３４ａの発現量が上昇していることが確認されている他の異種移植片と比較する場合、該異種移植片と同程度のｍｉＲ−３４ａの発現量であることか、あるいは、他の異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量より更に上昇していることを確認することで、被験物質をがんの治療剤又は予防剤の候補物質として選択することができる。
【００７５】
本発明のスクリーニング方法は、上記で述べた以外の工程を更に有してもよく、有さなくてもよい。上記で述べた以外の工程を更に有してもよい工程としては、例えば、がんの治療剤又は予防剤の候補物質として選択された被験物質を、単離されたがん幹細胞又はがん幹細胞を有するがんモデル非ヒト動物に投与して、がんの治療又は予防効果を確認する工程が挙げられる。
【００７６】
＜異種移植片におけるｍｉＲ−３４ａの発現量を低下させる方法＞
本発明は、非ヒト動物において形成される異種移植片におけるｍｉＲ−３４の発現量を低下させる方法であって、がん幹細胞を含む細胞塊を、がん幹細胞の由来種とは異なる非ヒト動物に移植する工程と、該非ヒト動物において異種移植片を形成させる工程と、を有する方法を包含する。
【００７７】
本発明における移植工程、及び異種移植片形成工程は、上述のがん幹細胞集団の調製方法における移植工程、異種移植片形成工程と同様の方法を用いることができる。
【００７８】
＜がん幹細胞増殖促進剤＞
本発明は、ｍｉＲ−３４ａからなる、がん幹細胞増殖抑制剤を包含する。本発明者らは、ｍｉＲ−３４ａが、がん幹細胞の増殖を抑制可能なことを見出した。
【００７９】
ｍｉＲ−３４ａは、従来の公知のもののいずれも用いることができ、例えば、ヒト、齧歯動物（マウス、ラットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヒトを除く霊長類（サルなど）、ブタなどの由来のｍｉＲ−３４ａを用いることができる。これらは、導入する対象に応じて、適切なものを選択して用いることができるが、ヒトに投与する場合、ヒト由来のｍｉＲ−３４ａを用いることが好ましい。
【００８０】
増殖を抑制するがん幹細胞は、特に限定されないが、固形がん（例えば、胆管がん、大腸がん、肺がん、胃がん、食道がん、乳がん、膀胱がん、前立腺がんなど）、血液がん（例えば、骨髄腫、リンパ腫など）などの幹細胞を挙げることができる。本発明においては、対象となるがん幹細胞は、好ましくは胆管がんのがん幹細胞である。
【実施例】
【００８１】
以下の実施例などによって本発明を更に詳しく説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００８２】
＜実施例１＞
（がん幹細胞を含むオルガノイドの調製方法）
肝内胆管がんの診断を受けた患者（７０歳、女性）から外科切除により胆管がん組織を採取した。採取した胆管がん組織を免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ（ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ））の皮下組織内に移植した。胆管がん組織を移植後、約６０日経過後、異種移植片の生成を確認して異種移植片を摘出した。
なお、採取した胆管がん組織は、国立がん研究センター中央病院より供与を受けた。
【００８３】
摘出した異種移植片を免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ（ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ））の皮下組織内に再度移植した。異種移植片を移植してから３か月経過後、異種移植片の大きさが２ｃｍを超えた時点で免疫不全マウスを解剖して異種移植片を摘出した。
異種移植片を移植した免疫不全マウス及び免疫不全マウスから摘出した移植片を図１に示す。
摘出した異種移植片の組織をＨＥ染色にて観察した。観察結果を図２（スケールバーは１００μｍ）に示す。図２に示すように、摘出した異種移植片は、元の胆管がん組織と類似する組織像であると認められた。
【００８４】
異種移植片に含まれるがん幹細胞を必要な増殖因子のみを含む無血清培地を用いてマトリジェル（Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ，  Ｐｈｅｎｏｌ−Ｒｅｄ  Ｆｒｅｅ  １０ｍｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ  ３５６２３１））中で３次元培養（オルガノイド培養）を行い、胆管がんオルガノイドを作製した。培養に用いた無血清培地の組成を表１に示す。また、無血清培地に含まれる基本培地の組成を表２に示す。
【００８５】
【表１】
2016028569.tif 000003
【００８６】
【表２】
2016028569.tif 000004
【００８７】
３次元培養により、作製した胆管がんオルガノイドの観察結果を図３に示す。
【００８８】
作製した胆管がんオルガノイドからパラフィン包埋切片を作成し、ＨＥ染色にて組織像を観察した。観察結果を図４に示す（スケールバーは１００μｍ）。図４に示されるように、観察した組織像は、単層の細胞が嚢胞状に増殖し、中心部は空洞になっていることが確認された。
【００８９】
ミトコンドリアＤＮＡに対するヒト特異的プライマー及びマウス特異的プライマーを用いてＰＣＲにより動物種を判別した。判別する方法は、Ｏｎｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ．  ４３：  １６８−１７５，  ２００７に開示される方法に従い行った。動物種の判別は、ＡＧＳヒト胃がん細胞株（ＡＧＳ）、マウス腸管腺腫（Ｍｏｕｓｅ  Ａｄｅｎｏｍａ）、マウス肝臓（Ｍｏｕｓｅ  Ｌｉｖｅｒ）をコントロールとして、胆管がん幹細胞オルガノイドの動物種を確認した。それぞれの細胞からＤＮＡを抽出し、動物種を確認した結果を図５に示す。
図５に示されるように、作製した胆管がんオルガノイドには、マウス特異的なプライマー（ｍｏｕｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）においてＤＮＡの増殖が確認されず、マウス由来の細胞が混入していないことが確認された。
【００９０】
作製された胆管がんオルガノイドは、２０回以上継代しても培養・維持することができた。そのため、本培養条件により、胆管がん由来の幹細胞を含むオルガノイド（組織構造体）を永続的に培養することが可能になった。即ち、難治性がんの代表である肝内胆管がんからがん幹細胞を永続的に培養・維持することに成功した。
【００９１】
＜評価１＞
（胆管がんオルガノイドの増殖能に関する検討）
作製した胆管がんオルガノイドが増殖していく過程を観察した。観察は、１日ごとに１日〜１０日まで観察した。観察した結果を図６に示す。
胆管がんオルガノイドは、日を追うごとに嚢胞状に増殖し、１０日目には約１０００μｍの大きさになっていることが確認された。
【００９２】
作製した胆管がんオルガノイドの増殖能をＷＳＴアッセイにより評価した。胆管がんオルガノイドに、試薬を添加後、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定した結果を図７に示す。
図７に示すように、作製した胆管がんオルガノイドが指数関数的に増加していることが確認された。
【００９３】
＜評価２＞
（胆管がんオルガノイドにおけるＣＫ１９発現に関する検討）
作製した胆管がんオルガノイドについて、ＣＫ１９の発現をウエスタンブロット法により検討した。ＣＫ１９は、胆管がんのマーカーとして病理診断などに用いられているマーカーである。
ウエスタンブロット法は、ＣＫ１９の発現について、ＡＧＳヒト胃がん細胞株（ＡＧＳ）、ＨｅｐＧ２ヒト肝がん細胞株（ＨｅｐＧ２）、ＨＥＫ２９３ヒト腎細胞株（ＨＥＫ２９３）をコントロールとして、胆管がんオルガノイド（ＣＣ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｏ１、ＣＣ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｏ２）と比較した。ウエスタンブロット法の結果を、図８に示す。
図８に示すように、作製した胆管がんオルガノイド（ＣＣ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｏ１、ＣＣ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｏ２）は、ＣＫ１９を強発現していることが確認された。そのため、作製した胆管がんオルガノイドは、胆管がん組織の特性を有するものであるといえる。
【００９４】
作製した胆管がんオルガノイドについて、ＣＫ１９の発現及び局在を免疫蛍光染色法により検討した。免疫蛍光染色法の結果を図９（スケールバーは１００μｍ）に示す。赤色がＣＫ１９の発現を示し、青色がＤＡＰＩによる核の染色である。
図９に示すように、作製した胆管がんオルガノイドは、胆管がんオルガノイドを構成する細胞の細胞質にＣＫ１９を強発現していることが確認された。
【００９５】
＜実施例２＞
（胆管がんオルガノイドに必須な増殖因子に関する検討）
実施例１のオルガノイド培養において、培地は、基本培地に加え、上皮細胞全般の増殖因子であるＥＧＦ及びＷＮＴシグナルの活性化因子であるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １  （Ｒｓｐｏ１）を含む因子を添加している。
本実施例では、どの因子が胆管がん幹細胞の増殖に必須であるかを検討した。
胆管がんオルガノイドの培養について、基本培地にＥＧＦを加えた培地、基本培地にＲｓｐｏ１を加えた培地それぞれを用いてマトリジェル（Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ，  Ｐｈｅｎｏｌ−Ｒｅｄ  Ｆｒｅｅ  １０ｍｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ  ３５６２３１））中で３次元培養（オルガノイド培養）を行い、胆管がんオルガノイドの増殖能をＷＳＴアッセイにより検討した。ＷＳＴアッセイの結果を図１０に示す。また、胆管がんオルガノイドの観察結果を図１１に示す。
【００９６】
図１０に示すように、基本培地にＲｓｐｏ１を加えた条件において、オルガノイドは活発な増殖能を示した。他方、基本培地にＥＧＦを加え、Ｒｓｐｏ１を加えない条件において、オルガノイドはほぼ増殖能を示さなかった。基本培地にＲｓｐｏ１を加えた条件においては、ＥＧＦを加えた条件の方がＥＧＦを加えない条件に比べて、高いオルガノイドの増殖傾向を示したが、有意差は認められなかった。
【００９７】
図１１に示すように、Ｒｓｐｏ１を加えた条件では胆管がんオルガノイドは活発な増殖能を示した。他方、Ｒｓｐｏ１を加えない条件では胆管がんオルガノイドは、増殖能を示さなかった。
そのため、本方法により樹立した胆管がんオルガノイドの増殖には、Ｒｓｐｏ１が必須であるが、その他の増殖因子は必須ではないことが確認された。
【００９８】
＜評価３＞
（胆管がんオルガノイドにおけるＬｇｒ５陽性幹細胞の存在に関する検討）
実施例１において作製した胆管がんオルガノイドについて、Ｌｇｒ５の発現を免疫蛍光染色により検討した。Ｌｇｒ５は、細胞表面分子であって、幹細胞のマーカーとされている（Ｓａｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：  ２６２−２６５，  ２００９）。
作製した胆管がんオルガノイドのＬｇｒ５の発現の免疫蛍光染色による検討結果を図１２に示す（スケールバーは５０μｍ）。図１２に示すように、作製した胆管がんオルガノイドの細胞表面にＬｇｒ５（図中の白色部分）が発現していることを確認した。なお、ＤＡＰＩによる核の染色も確認された（図中の細胞内の灰色部分）である。
【００９９】
実施例１において作製した胆管がんオルガノイドについて、Ｌｇｒ５の発現をフローサイトメトリーにより検討した。
作製した胆管がんオルガノイドのＬｇｒ５の発現のフローサイトメトリーによる検討結果を図１３に示す。
図１３に示すように、作製した胆管がんオルガノイドにおいて、Ｌｇｒ５の発現は上昇していることが確認された。
図１３に示される結果は、図４に示したようにＬｇｒ５のリガンドであるＲ−ｓｐｏｎｄｉｎが胆管がん幹細胞オルガノイドの増殖に必須であるという結果を裏付けるものである。即ち、Ｒｓｐｏ１が胆管がん幹細胞オルガノイドの細胞表面に発現しているＬｇｒ５と結合し、Ｗｎｔシグナル経路を活性化することで幹細胞の維持に決定的な役割を果たしていると考えられる。
【０１００】
作製した胆管がんオルガノイドに幹細胞が存在していることを確認するため、胆管がんオルガノイドを免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス（Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ（ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）））の皮下組織内に移植した。胆管がんオルガノイドは、免疫不全マウスの背部右側に８ｘ１０５個、免疫不全マウスの背部左側に３ｘ１０５個を移植した。
胆管がんオルガノイドを移植した免疫不全マウスは、移植後約２か月経過後に移植した部位に腫瘍を形成した。形成された腫瘍を図１４に示す。図１４に示すように、形成された腫瘍は、移植した細胞数に比例した大きさの腫瘍であった。
【０１０１】
作製した胆管がんオルガノイドを、免疫不全マウスに移植して形成された腫瘍を摘出して、実施例１の培養条件下でオルガノイド培養を行った。
培養の結果を図１５に示す（スケールバーは１０００μｍ）。図１５に示すように、これまでと同じ条件で胆管がん幹細胞オルガノイドが活発に増殖することを確認した。
【０１０２】
Ｌｇｒ５の発現を検討した、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリーの結果からＬｇｒ５陽性幹細胞が増殖していることが示された。また、作製した胆管がんオルガノイドを免疫不全マウスに移植した結果から、作製した胆管がんオルガノイドには、幹細胞が含まれることが示された。
【０１０３】
＜評価４＞
（胆管がんオルガノイドにおけるエピゲノム解析）
胆管がん幹細胞オルガノイドにおけるエピゲノムの解析を行うために、ビーズアレイ法によりＤＮＡメチル化の状態を比較解析した。エピゲノムの解析は、実施例２において作製した胆管がんオルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）を、免疫不全マウスから摘出した異種移植片（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）と、２次元培養により樹立された細胞株（ｓｅｒｕｍ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）と比較して行った。
エピゲノム解析の結果を、図１６に示す。図１６はそれぞれの細胞の遺伝子についてｐｒｏｍｏｔｅｒ領域、ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ、ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｓｈｏｒｅ  （ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄの前後２  ｋｂ）、ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｓｈｅｌｆ  （ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｓｈｏｒｅの前後２  ｋｂ）におけるＤＮＡメチル化の状態をクラスター解析により比較したものである。
実施例１において作製した胆管がんオルガノイドと免疫不全マウスから摘出した異種移植片とは、遺伝子のｐｒｏｍｏｔｅｒ領域、ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ、ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｓｈｏｒｅのＤＮＡメチル化の状態において、相関係数０．９以上の高い相関を認められた。他方、作製した胆管がんオルガノイドと２次元培養により樹立された細胞株とは、遺伝子のｐｒｏｍｏｔｅｒ領域、ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ、ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｓｈｏｒｅのＤＮＡメチル化の状態において、相関が認められなかった。
【０１０４】
（胆管がんオルガノイドにおける遺伝子発現の網羅的解析）
遺伝子発現の網羅的解析を行うため、マイクロアレイ法により遺伝子の発現プロファイルを比較解析した。遺伝子発現の網羅的解析は、実施例１において作製した胆管がんオルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ）を、免疫不全マウスから摘出した異種移植片（Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）と、２次元培養により樹立された細胞株（ｓｅｒｕｍ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）と比較して行った。
遺伝子発現の網羅的解析の結果を図１７に示す。
実施例１において作製した胆管がんオルガノイドと免疫不全マウスから摘出した異種移植片とは、網羅的な遺伝子発現解析において、胆管がん幹細胞オルガノイドと元になった異種移植片において相関係数０．９以上の高い相関を認められた。他方、作製した胆管がんオルガノイドと２次元培養により樹立された細胞株とは、網羅的な遺伝子発現解析において、相関が認められなかった。
【０１０５】
エピゲノム解析の結果と遺伝子発現の網羅的解析の結果から、必要な増殖因子のみを含む無血清培地を用いた３次元培養により維持されている胆管がんオルガノイドは従来の血清を含む培地を用いた２次元培養により維持されている細胞株よりも元の組織（異種移植片）のＤＮＡメチル化及び遺伝子発現の特性を反映していることが示された。
【０１０６】
＜評価５＞
（胆管がんオルガノイドにおけるドライバー遺伝子変異に関する検討）
胆管がんオルガノイドにおけるドライバー遺伝子変異を同定するため、次世代シーケンサーによる遺伝子変異解析を行った。ドライバー遺伝子変異とは、がんにおける遺伝子変異のうち、がんの発生・進展に強く関わっており、がん細胞の生存が依存しているものをいう。
遺伝子変異解析は、実施例１において免疫不全マウスから摘出した異種移植片（ＣＣ１）と、実施例１において作製した胆管がんオルガノイド（Ｏｒｇａｎｏｉｄ  （ＣＣ１））と、実施例１において作製した胆管がんオルガノイドとは異なる症例を由来とする異種移植片（ＣＣ２、ＣＣ３）と、を対象として行った。実施例１において作製した胆管がんオルガノイドとは異なる症例を由来とする異種移植片（ＣＣ２、ＣＣ３）は、実施例２においてＲｓｐｏ１のみを増殖因子として加えた条件下のオルガノイド培養で長期間培養できなかった系である。
遺伝子変異解析の結果を表３に示す。表３において、第１列は、遺伝子名（Ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ）を示し、第２列〜第４列は、各系の遺伝子変異の有無及び遺伝子変異の種類を示している。第２列〜第４列に示す「ＷＴ」は、野生型（遺伝子変異なし）であることを示す。
【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
表３に示すように、表１に今回検討した胆管がん症例におけるアミノ酸変異をまとめた。作製した胆管がんオルガノイドは、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＴＧＦＢＲ２及びＥＧＦなどの主要なドライバー遺伝子変異が認められる。他方、実施例２において作製した胆管がんオルガノイドとは異なる症例を由来とする異種移植片（ＣＣ２）は、作製した胆管がんオルガノイドに認められたＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＴＧＦＢＲ２及びＥＧＦの変異のうち、ＫＲＡＳ及びＴＧＦＲ２の変異が認められなかった。また、実施例２において作製した胆管がんオルガノイドとは異なる症例を由来とする異種移植片（ＣＣ３）は、作製した胆管がんオルガノイドに認められたＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＴＧＦＢＲ２及びＥＧＦの変異のうち、ＴＰ５３、ＴＧＦＢＲ２及びＥＧＦの変異が認められなかった。
【０１０９】
幹細胞の維持にはニッシェと呼ばれる微小環境が必要であると考えられているが、胆管がん幹細胞オルガノイドにおいては、これらのドライバー遺伝子変異があるためにニッシェに依存しない増殖が可能になったと考えられる。
今回の実験で分離に成功した胆管がん症例では、ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＡＰＣ、ＴＧＦＢＲ２、ＥＧＦなどの主要なドライバー遺伝子変異を同時に認めていたため、基本培地にＲｓｐｏ１のみを加えた条件のみで長期間培養することが可能になったと考えられる。
【０１１０】
＜実施例３＞
以下の方法により、オルガノイドの形成における異種移植片を形成させる工程の意義に関する検討を行った。具体的には、２症例の肝内胆管がん患者から外科切除により胆管がん組織を採取した。採取した胆管がん組織を免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ（ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ））の皮下組織内に移植した。胆管がん組織を移植後、ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）飼育施設における自由飲水、通常食の自由摂取により飼育を行い、約６０日経過後、異種移植片の生成を確認して異種移植片を摘出した。
なお、採取した胆管がん組織は、国立がん研究センター中央病院より供与を受けた。
【０１１１】
摘出した異種移植片を免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス、Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ−ｓｃｉｄ（ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ））の皮下組織内に再度移植した。異種移植片を移植してから３か月経過後、異種移植片の大きさが２ｃｍを超えた時点で免疫不全マウスを解剖して異種移植片を摘出した。異種移植片の移植を行い、摘出するまでの工程が異種移植片を形成させる工程に相当する。
【０１１２】
異種移植片に含まれるがん幹細胞を必要な増殖因子のみを含む無血清培地を用いてマトリジェル（Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ，  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ，  Ｐｈｅｎｏｌ−Ｒｅｄ  Ｆｒｅｅ  １０ｍｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ  ３５６２３１））中で３次元培養（オルガノイド培養）を行い、胆管がんオルガノイドを作製した。得られたオルガノイドを以下、「ＣＣＯ１」という。
【０１１３】
また、異種移植片を移植しなかった点と、オルガノイドの調製に使用した培地を変更した点以外はＣＣＯ１と同様にしてオルガノイドを調製した。以下、該オルガノイドを「ＣＣＯ２」という。
【０１１４】
ＣＣＯ１及びＣＣＯ２の由来を表４に示す。ＣＣＯ１及びＣＣＯ２のオルガノイド培養に用いた培地の組成を表５に示す。表５中、「○」は、その項目の成分を含有することを示し、「−」は、その項目の成分を含有しないことを示す。
【０１１５】
１つの胆管がん由来の幹細胞が、オルガノイドを形成し、増大していく様子をＣＣＯ１及びＣＣＯ２のそれぞれについて観察したところ、ＣＣＯ１が非常に強い増殖活性を示しながらオルガノイドが増大していくのに対し、ＣＣＯ２は培養開始後１２日をピークにオルガノイドが縮小していった。また、ＣＣＯ２の増殖のためには、培養条件としてＥＧＦ、Ｒ−Ｓｐｏｎｄｉｎ１の他、Ｎｏｇｇｉｎ、ＨＧＦ、ＦＧＦ−１０、Ａ８３−０１（ＴＧＦ−β受容体阻害薬）など、ＣＣＯ１よりも多くの増殖因子を必要とした。
【０１１６】
以上の結果より、ＣＣＯ１はＣＣＯ２に比べ、増殖活性が高く、またより少ない増殖因子で継代及び維持することが可能であることから、異種移植片を形成させる工程を含む本発明の調製方法によれば、より少ない増殖因子で強い増殖能を有するオルガノイドが得られることが示唆された。即ち、異種移植片とオルガノイド培養によるがん幹細胞に対する２重のセレクションを行うことで、より効率良くがん幹細胞を分離及び培養できる可能性が考えられた。
【０１１７】
【表４】
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【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
＜実施例４＞
実施例３で得られたＣＣＯ１を用いて、長期間（１年以上）培養を行った後のオルガノイドの変化を検討した。図１８はＣＣＯ１を週１回継代（パッセージ）し、２か月、９か月、１３か月間培養した際の状態を観察したものである。長期間継代培養してもオルガノイドの形態には大きな変化を認めなかったが、オルガノイドの数が増加する傾向が認められた。そこで、各継代回数（１〜１０回、１１〜２０回、２１〜３０回、３１〜４０回、４１〜５５回）における細胞継代時のスプリット比の平均値を比較した。スプリット比とは、細胞を継代する際に、１つのｗｅｌｌからいくつのｗｅｌｌに細胞を継代するかを示したものである。その結果を図１９に示す。図１９のグラフに示したとおり、継代回数１〜１０の培養初期ではスプリット比の平均値は５前後であったが、培養開始後約１年が経過した継代回数４１〜５５の時点ではスプリット比の平均値は１０前後であり、約２倍に増強していることが明らかになった。
【０１２０】
以上の結果より、長期間にわたってオルガノイド培養を行うと、その増殖活性が増強することから、オルガノイド培養ががん幹細胞の培養及び維持に適しており、長期間培養を行うことで、がん幹細胞が濃縮され、オルガノイドにおけるがん幹細胞の比率が上昇する可能性が考えられた。
【０１２１】
＜実施例５＞
実施例３で得られたＣＣＯ１におけるマイクロＲＮＡの発現変化を解析することで、長期間にわたってオルガノイド培養を行うと増殖活性が増強する理由を検討した。マイクロＲＮＡは長さ２０塩基程度の小さな１本鎖ＲＮＡであるが、複数の標的遺伝子の発現を制御し、発がんや幹細胞性の維持において重要な役割を果たす。ＣＣＯ１におけるマイクロＲＮＡの発現変化の網羅的な解析の結果を表６及び図２０に示す。図２０は、ＣＣＯ１が由来する異種移植片（図２０中の「Ｘｅｎｏ」）におけるｍｉＲ−３４ａの発現量に対する、各継代時（７回、２２回、３２回、３６回、４０回）におけるＣＣＯ１のｍｉＲ−３４ａの発現量を示す。図２０に示すとおり、がん抑制マイクロＲＮＡとして報告されているｍｉＲ−３４ａの発現が、ＣＣＯ１が由来する異種移植片に比べて、オルガノイドであるＣＣＯ１において顕著に低下していた。
【０１２２】
【表６】
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【０１２３】
ｍｉＲ−３４ａの標的遺伝子としては、ＣＤ４４、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＳＩＲＴ１などが知られている。これらの標的遺伝子についてのＣＣＯ１における発現量を、各継代時（７回、２２回、３２回、３６回、４０回）において測定した。その結果を、図２１に示す。図２１に示すとおり、オルガノイドの長期培養に伴い、これらの標的遺伝子の発現は増加していた。このことから、ｍｉＲ−３４ａの発現の低下（増加）は、これらの標的遺伝子の発現を増加（低下）させていることが考えられた。また、ＣＤ４４はｍｉＲ−３４ａの標的遺伝子であると同時に、がん幹細胞のマーカーでもあり、オルガノイドの長期培養によってＣＤ４４の発現が上昇することで、がん幹細胞としての性質が増強されている可能性が考えられた。
【０１２４】
更に、ＣＣＯ１についてのオルガノイドの長期培養に伴い、各継代時（７回、２２回、３２回、３６回、４０回）において、がん幹細胞マーカーであるＬＧＲ５、ＣＤ１３３、ＡＬＤＨ１Ａ１などのがん幹細胞マーカーについての発現量を測定した。その結果を、図２２に示す。図２２に示すとおり、ＬＧＲ５、ＣＤ１３３、ＡＬＤＨ１Ａ１などのがん幹細胞マーカーの発現が上昇しており、オルガノイドを長期間培養することで、その増殖活性が増強することを裏付ける結果となった。
【０１２５】
以上の結果より、ｍｉＲ−３４ａの発現が、がん幹細胞の維持及び増殖に極めて重要な役割を果たしており、有望な治療標的となることが考えられた。ｍｉＲ−３４ａの発現を上昇させる低分子化合物や核酸医薬ががん幹細胞に対する新たな治療薬となる可能性がある。
【０１２６】
＜実施例６＞
（胆管がんオルガノイドの長期培養の間のｍｉＲ−３４ａプロモーター領域におけるＤＮＡのメチル化の解析）
ｍｉＲ−３４ａ遺伝子は、染色体座位１ｐ３６に位置しており、ＣｐＧアイランドのプロモーター領域におけるＤＮＡの高度メチル化は、ｍｉＲ−３４ａのサイレンシングに関わる原因の１つであることが知られている。そこで、実施例３で得られたＣＣＯ１の継代数７、２２、３２、及び５４のものにおけるｍｉＲ−３４ａプロモーター領域のＤＮＡメチル化状態を、バイサルファイトピロシーケンスによって解析した。
【０１２７】
まず、それぞれの継代時におけるゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて抽出し、ＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いてバイサルファイト変換を行った。その後、ＤＮＡメチル化レベルを、ＰｙｒｏＭａｒｋ  Ｑ２４（株式会社キアゲン製）を用いて、ピロシーケンスによって解析した。使用したプライマーの配列は、ｍｉＲ−３４ａプロモーター領域であるＰ１−１及びＰ１−２の２つを用いた。また、ヒトメチル化ＤＮＡ及び非メチル化ＤＮＡについての対照として、ＥｐｉＴｅｃｔメチル化対照ＤＮＡ及び非メチル化対照ＤＮＡ（株式会社キアゲン製）を使用した。また、ＤＮＡ脱メチル化アッセイのために、継代数５４のＣＣＯ１を、１μＭ又は３μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−Ａｚａ−ＣｄＲ、シグマアルドリッチ社製）で処理（以下、「５ＡＺＡ処理」という場合がある。）した。次いで、２４時間後、５−Ａｚａ−ＣｄＲを含む培地を通常の培地に交換して、上記と同様の方法で、ｍｉＲ−３４ａプロモーター領域のＤＮＡメチル化状態を解析した。
【０１２８】
図２３に、Ｐ１−１及びＰ１−２のプライマーを用いて解析した各ＣＣＯ１における継代時のｍｉＲ−３４ａプロモーター領域のＤＮＡメチル化を示す。図２４に、５ＡＺＡ処理を行ったＣＣＯ１に対する、Ｐ１−１及びＰ１−２のプライマーを用いて解析したｍｉＲ−３４ａプロモーター領域のＤＮＡメチル化を示す。図２３中、ＰＣは陽性対照を示し、ＮＣは陰性対照を示す。図２４中の「５ＡＺＡ  ０」は、５ＡＺＡ処理を行わなかったコントロールのＣＣＯ１を示し、「５ＡＺＡ  １」は、１μＭの５ＡＺＡ処理を行ったＣＣＯ１を示し、「５ＡＺＡ  ３」は、３μＭの５ＡＺＡ処理を行ったＣＣＯ１を示す。図２４中、ＰＣは陽性対照を示し、ＮＣは陰性対照を示す。
【０１２９】
図２３に示すとおり、Ｐ１−１領域及びＰ１−２領域におけるＤＮＡメチル化レベルは、継代前の異種移植片（図２３中の「Ｘｅｎｏ」）においては低いレベル（約２０〜４０％）であったのに対し、ＣＣＯ１においては、継代回数が増えるにつれて高まった。また、Ｐ１−１領域及びＰ１−２領域は、継代数５４のＣＣＯ１では、特に高度にメチル化されていた（約８０％）。
【０１３０】
また、図２４に示すとおり、継代数５４のＣＣＯ１のＰ１−１領域及びＰ１−２領域におけるＤＮＡメチル化レベルは、１μＭ又は３μＭの５ＡＺＡ処理後に低下したことが示された。
【０１３１】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
継代数５４のＣＣＯ１において、３μＭの５ＡＺＡ処理を行ったときのｍｉＲ−３４ａの発現レベルを、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって解析した。定量的ＲＴ−ＰＣＲには、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｉＲ−３４ａ（ライフテクノロジーズ社製）を用いた。発現レベルは、Ｕ６  ＲＮＡの発現量に基づき標準化した。発現レベルは、１８Ｓ  ｒＲＮＡの発現量に基づき標準化した。定量分析は、ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて行った。その結果を、図２５に示す。図２５に示すように、５ＡＺＡ処理を行ったＣＣＯ１（５ＡＺＡ（＋））は、５ＡＺＡ処理を行わなかったＣＣＯ１（５ＡＺＡ（−））より、ｍｉＲ−３４ａの発現レベルが相対的に高かったことが確認された。
【０１３２】
また、５ＡＺＡ処理を行った継代数５４のＣＣＯ１と、５ＡＺＡ処理を行わなかった継代数５４のＣＣＯ１について、顕微鏡で観察した。その明視野像を図２６に示す（スケールバー：１０００μｍ）。図２６に示すように、５ＡＺＡ処理を行うことにより、胆管がん幹細胞は大きいＣＣＯ１を形成することができなかった。
【０１３３】
以上の結果から、ｍｉＲ−３４ａにより、がん幹細胞の増殖が抑制する可能性があることが示唆された。
【０１３４】
＜実施例７＞
（レンチウイルスを媒介したｍｉＲ−３４ａの過剰発現）
実施例３で得られたＣＣＯ１において、レンチウイルスを媒介してｍｉＲ−３４ａを過剰発現させた。
【０１３５】
マーカーとしてのＧＦＰと、ヒトｍｉＲ−３４ａ前駆体領域をコードするレンチウイルスベクター（以下、「Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ＧＦＰ」という場合がある。）（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を準備した。また、同じくマーカーとしてピューロマイシン耐性レンチウイルスベクター（ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ  Ｐｕｒ）（タカラバイオ株式会社製）にヒトｍｉＲ−３４ａ前駆体領域を組み込んだベクター（以下、「Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎ」という場合がある。）を作製した。このマーカーにおいて、ヒトｍｉＲ−３４ａ前駆体領域は、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ  Ｐｕｒベクター内のＥｃｏＲＩ部位とＮｏｔＩ部位との間に挿入した。レンチウイルス感染は、Ｋｏｏら（２０１２）の方法と同様にして行った。具体的には、以下の手順でレンチウイルス感染を行った。
【０１３６】
まず、それぞれのｍｉＲ−３４ａ前駆体領域をコードするレンチウイルスベクター、及び、それぞれのコントロールとしてヒトｍｉＲ−３４ａ前駆体領域が組み込まれてないベクターを、２９３ＦＴ細胞に、ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｍｉｘ（ライフテクノロジーズ社製）とともにトランスフェクトし、ウイルス濃縮液を得た。ＣＣＯ１は、６２の継代数のものを用い、該ＣＣＯ１に対してトリプシン処理を行い、細胞を分離した。その後、上述のウイルス濃縮液に１００ｘ  ポリブレンを混ぜ合わせた。次いで、このウイルス濃縮液を用いてトリプシン処理したＣＣＯ１を懸濁し、３７℃で、ＣＯ２インキュベーターにおいて２．５時間静置し、ウイルス感染を行った。静置後、５０００  ｒｐｍ、５分の条件で遠心を行い、遠心後の上清を除去した。得られたウイルス感染細胞をマトリゲル（５００μＬ）に懸濁４８ｗｅｌｌプレートに２５μＬずつドームを作るメディウムを７５０μＬ入れて培養した。
【０１３７】
Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎを導入したＣＣＯ１については、トランスフェクションから２４時間後に、感染したオルガノイドを、ピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）を用いて選別した。それらのｍｉＲ−３４ａの相対的な発現量を、実施例６の定量的ＲＴ−ＰＣＲと同様の手順により解析した。Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ＧＦＰについては、２日後の発現量を、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎについては、感染から３日後と５日後の発現量を解析した。その結果を、図２７に示す。図２７中、「Ｃ」は、コントロールのベクターを示す。図２７に示すように、レンチウイルス感染後のｍｉＲ−３４ａがコントロールと比較して顕著に発現していることが確認された。
【０１３８】
上記と同様のＬｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎを感染させたＣＣＯ１について、感染から３日又は５日後に、ＣＤ４４、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、及びＬＧＲ５の発現量を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ（ライフテクノロジーズ社製）を用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって解析した。その他の定量的ＲＴ−ＰＣＲは、実施例６と同様の手順で行った。その相対発現量を結果を図２８に示す。図２８中、白抜きのバーがコントロールを示し、黒で塗りつぶされた色バーが、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎを示す。図２８に示すように、ＬＧＲ５及びｍｉＲ−３４ａの標的遺伝子（ＣＤ４４、ＣＤＫ４及びＣＤＫ６）の発現量は、コントロールよりも、ｍｉＲ−３４ａを過剰発現させたオルガノイドにおいて顕著に低かった。この結果から、レンチウイルスを媒介したｍｉＲ−３４ａの過剰発現が、その標的がん遺伝子の阻害を介して、胆管がん幹細胞の生育を抑制することを示唆された。
【０１３９】
上記と同様のＬｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ＧＦＰ又はＬｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎを感染させたＣＣＯ１について、その導入をＧＦＰ及びピューロマイシン耐性によって確認した後、顕微鏡により観察した。その結果を図２９（スケールバー：１０００μｍ）に示す。図２９に示すように、オルガノイドの増殖は、コントロールと比較して、Ｌｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ＧＦＰ又はＬｅｎｔｉ−ｍｉＲ−３４ａ  ｐｕｒｏｍｉｙｃｉｎの感染後において顕著に抑制されたことが確認された。
【０１４０】
以上の結果から、ｍｉＲ−３４ａにより、胆管がん幹細胞の増殖を抑制できることがわかった。
【図１０】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２６】
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【図２９】
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