(57)【要約】      （修正有）【課題】従来の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体と比較して優れた活性を有する抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体、並びに、該抗体を用いた、ヒトＴＷＥＡＫが病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療手段を提供する。【解決手段】特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列、特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列、又は特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列、特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列、又は特定のアミノ酸配列のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をそれぞれ含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）のいずれかから選択される、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（１）配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体；
（２）配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体；
（３）配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項３】
配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項４】
配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項５】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項６】
前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項７】
前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項８】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項２に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項９】
配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項３に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項１０】
配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項４に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１１及び／又は１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、請求項１４に記載の宿主細胞。
（ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を発現させる工程を包含する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体に関する。詳細には、本発明の新規抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、従来の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体と比較してｓＴＷＥＡＫ及びｍＴＷＥＡＫのいずれに対しても優れた活性を有する抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体である。
【背景技術】
【０００２】
ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦ-ｌｉｋｅ  ｗｅａｋ  ｉｎｄｕｃｅｒ  оｆ  ａｐоｐｔоｓｉｓ）は、マクロファージ、Ｔ細胞などの免疫担当細胞や腎メサンギウム細胞などを含む細胞及び組織に広く発現する一回膜貫通型の蛋白質である（非特許文献１）。ＴＷＥＡＫの受容体はＦｎ１４蛋白質であり、ＴＷＥＡＫがＦｎ１４蛋白質と複合体を形成することで活性化され、細胞内にシグナルを伝達する。ＴＷＥＡＫシグナルの活性化は、例えばＮＦ−κＢ転写因子の活性化を介して、単球走化活性因子（ＭＣＰ−１）などの炎症性のケモカインの発現を誘導し、炎症応答を惹起する（非特許文献２）。
【０００３】
ＴＷＥＡＫは細胞膜上に膜型ＴＷＥＡＫ（ｍＴＷＥＡＫ）として存在し、細胞外領域がｆｕｒｉｎ型セリンプロテアーゼにより切断された場合には、可溶型ＴＷＥＡＫ（ｓＴＷＥＡＫ）となる（非特許文献３）。いずれのＴＷＥＡＫもＦｎ１４蛋白質と複合体を形成し、細胞内にシグナルを伝達するが、伝達シグナルの最大活性はｓＴＷＥＡＫに比べてｍＴＷＥＡＫが強い（非特許文献４）。
【０００４】
ＴＷＥＡＫは、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、強皮症などの自己免疫疾患、脳卒中、動脈硬化症、虚血による急性腎障害、慢性腎不全、癌などの疾患に関与することが知られている（非特許文献５〜１５）。
【０００５】
全身性エリテマトーデスは、ＤＮＡ−抗ＤＮＡ抗体などの免疫複合体の組織沈着により起こる全身性炎症性病変を特徴とする自己免疫疾患である。症状は寛解と憎悪を繰り返して慢性の経過を取ることが多い。また、多くの臓器が侵されるため臨床所見も多彩で、腎障害、中枢神経病変、血管病変、血液異常、関節症状、皮膚病変などがみられる。全身性エリテマトーデス病態においては、種々の細胞がアポトーシスを起こすことで、細胞からＤＮＡやＲＮＡが放出されるが、自己反応性Ｔ細胞に発現するｍＴＷＥＡＫ分子により、単球のアポトーシスが促進されることが報告されている（非特許論文１６）。
【０００６】
ループス腎炎は、全身性エリテマトーデス患者の多くが発症する腎炎であり、命にかかわる危険性が高い疾患である。マウスのループス腎炎病態モデルにおいては、抗ＴＷＥＡＫ抗体の投与により、蛋白尿が改善され、腎臓におけるＭＣＰ−１などのケモカインやサイトカインの産生が抑制されることが報告されている（非特許文献１７）。さらに、Ｆｎ１４の遺伝的欠損動物（ノックアウトマウス）のループス腎炎病態モデルにおいても、蛋白尿などの腎病態改善作用が見られることから、ループス腎炎病態にＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４が関与していることが報告されている（非特許文献１７）。また、ＴＷＥＡＫの刺激により、ヒトメサンギウム細胞株においてＭＣＰ−１などの炎症性メディエーターの発現が誘導されることや、ＴＷＥＡＫ刺激によるサイトカインの産生がＮＦ−κＢの活性化を介しており、抗ＴＷＥＡＫ抗体によりサイトカインの産生が阻害されることも報告されている（非特許文献１８）。さらに、ループス腎炎患者においては、腎臓におけるＴＷＥＡＫ遺伝子発現の増大及び尿中へのＴＷＥＡＫ蛋白質の分泌増大が報告されている（非特許文献１９、２０）。
【０００７】
関節リウマチは、関節内に存在する滑膜組織の異常増殖により、関節内に慢性の炎症を生じる疾患で、進行によって関節破壊等の様々な機能障害を引き起こす自己免疫疾患である。ＴＷＥＡＫに対する拮抗剤又はＦｎ１４に対する拮抗剤を用いた試験で、関節炎スコアなどに対して改善効果が認められることから、関節リウマチの病態にはＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４が関与していることが報告されている（非特許文献２１、２２）。
【０００８】
炎症性腸疾患は、腸管内の免疫異常が関連し、腸管を主とする原因不明の難病である。腹痛、下痢、血便、下血、発熱、又は体重減少等の症状があり、代表的なものとしては、クローン病や潰瘍性大腸炎などがこれに含まれる。ＴＷＥＡＫのノックアウトマウス及びＴＷＥＡＫに対する拮抗剤を用いた試験で、炎症の改善効果が認められることから、ＴＷＥＡＫシグナルが関与していることが報告されている（非特許文献２３）。
【０００９】
多発性硬化症は、炎症及び髄鞘消失を特徴とする中枢神経系疾患である。マウスＥＡＥモデル（実験的自己免疫性脳炎モデル）では、ＴＷＥＡＫに対する拮抗剤により、症状の改善効果が認められることから、多発性硬化症病態におけるＴＷＥＡＫの関与が報告されている（非特許文献２４）。
【００１０】
脳卒中は、虚血による酸素欠乏及び二次的事象により、脳において神経細胞の壊死及び損傷を引き起こす疾患である。マウス脳虚血モデルにおいて、ＴＷＥＡＫに対する拮抗剤により、症状の改善が認められることから、脳卒中におけるＴＷＥＡＫの関与が報告されている（非特許文献２５）。
【００１１】
急性腎障害は、外傷性や手術に伴う出血、血圧の急激な低下、脱水症、薬の副作用など様々な因子によって発症し、数日間のうちに腎機能が低下する重篤な病態であり、細胞障害と虚血障害に大別される。Ｆｎ１４は、ヒト虚血腎において発現が増大することが報告されており、また、マウス急性腎障害モデルにおいては、ＴＷＥＡＫに対する拮抗剤又はＦｎ１４に対する拮抗剤を用いた試験で、腎機能や生存率に改善効果が認められることから、急性腎障害にはＴＷＥＡＫ及びＦｎ１４が関与していることが報告されている（非特許文献２６、２７）。
【００１２】
ＴＷＥＡＫやＦｎ１４が種々の癌腫で発現が増大することが知られている（非特許文献２８、２９）。また、ＴＷＥＡＫの過剰発現細胞が形質転換能を持つことも報告されている（非特許文献３０）。さらに、ＴＷＥＡＫに対する拮抗剤が、Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデル（担癌移植モデル）において、癌細胞増殖を抑制することが報告されている（非特許文献３１）。
【００１３】
従って、ＴＷＥＡＫに特異的に結合し、ＴＷＥＡＫの作用を阻害するモノクローナル抗体を開発することができれば、ＴＷＥＡＫが病態形成に関与する各種疾患の治療、予防に有用であることが期待される。
【００１４】
現在までに研究が進められてきたヒトＴＷＥＡＫに対して機能阻害作用を示す抗体としては、マウスモノクローナル抗体であるｍＰ２Ｄ１０とそのヒト化モノクローナル抗体であるｈｕＰ２Ｄ１０−１及びｈｕＰ２Ｄ１０−２（特許文献１）や、マウスモノクローナル抗体であるＭＴＷ−１（非特許文献３２）が報告されている。また、ハムスターモノクローナル抗体であるＴＷ−２１２とそのヒト化モノクローナル抗体（特許文献２）や、ウサギモノクローナル抗体であるＴＷ−３０５とそのヒト化モノクローナル抗体（特許文献３）も報告されている。しかし、従来の抗体はＴＷＥＡＫに対する中和活性が十分とはいえない。
【００１５】
また、抗体医薬の有効投与量を規定する主な要因としては、抗体が有する抗原に対する結合活性や中和活性、体内に存在する抗原の量が挙げられるが、結合活性や中和活性を向上させることは投与量の低減に繋がり、結果として患者の経済的な負担や医療コストの低減にも繋がる極めて有益な改良であるといえる。
【００１６】
こうしたことから、従来の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体と比較して活性において優れた抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を取得することが、ヒトに投与して各種疾患の治療、予防に利用するためには必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＷＯ２００６／１３０３７４
【特許文献２】ＷＯ２０１０／１１５５５５
【特許文献３】ＷＯ２０１２／０４５６７１
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Cytokine Growth Factor Rev. 2003;14(3-4):241-249.
【非特許文献２】Nat Rev Drug Discov. 2008;7(5):411-425.
【非特許文献３】J Biol Chem. 2010;285(23):17432-17441.
【非特許文献４】J Immunol. 2010;185(3):1593-1605.
【非特許文献５】Inflamm Res. 2012;61(4):277-284.
【非特許文献６】Drug News Perspect. 2006;19(10):589-595.
【非特許文献７】J Leukoc Biol. 2012;92(2):265-279.
【非特許文献８】J Neuroimmunol. 2002;133(1-2):116-123.
【非特許文献９】Ann Rheum Dis. 2010;69(1):301-304
【非特許文献１０】J Rheumatol. 2009;36(8):1657-1662.
【非特許文献１１】Am J Pathol. 2005;166(2):511-520.
【非特許文献１２】Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2009;29(12):2061-2068.
【非特許文献１３】Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(3):251-258
【非特許文献１４】Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4(11):1716-1723.
【非特許文献１５】Front Biosci. 2007;12:2761-2771.
【非特許文献１６】J Immunol. 2002;169(10):6020-6029.
【非特許文献１７】J Immunol. 2007;179(11):7949-7958.
【非特許文献１８】Cytokine 2009;46(1):24-35.
【非特許文献１９】Nephrology (Carlton). 2011;16(4):426-432.
【非特許文献２０】J Immunol. 2006 Dec;27(4):242-50.
【非特許文献２１】J Immunol. 2006;177(4):2610-2620.
【非特許文献２２】Rheumatology(Oxford). 2008;47(4):442-450.
【非特許文献２３】Gastroenterology. 2009;136(3):912-923.
【非特許文献２４】Clin Immunol. 2005;117(1):15-23.
【非特許文献２５】J Cereb Blood Flow Metab. 2007;27(3):534-544.
【非特許文献２６】Kidney Int. 2011;79(2):179-188.
【非特許文献２７】J Am Soc Nephrol. 2008;19(4):695-703.
【非特許文献２８】Results Probl Cell Differ. 2009;49:145-160.
【非特許文献２９】Oncogene. 2005;24(16):2613-2624.
【非特許文献３０】Cancer Res. 2004;64(24):8968-8972.
【非特許文献３１】Clin Cancer Res. 2010;16(2):497-508.
【非特許文献３２】Biochem Biophys Res Commun. 2003;306(4):819-825.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明の課題は、従来の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体と比較して優れた活性を有する抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質及び方法として以下の発明を含むものである。
（１）以下の１）〜３）のいずれかから選択される、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
１）配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体；
２）配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体；
３）配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（２）配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（３）配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（４）配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、上記（１）に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（５）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（６）前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（７）前記抗体の重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、前記抗体の軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（８）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（２）に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（９）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（３）に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（１０）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、上記（４）に記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（１２）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含む、ポリヌクレオチド。
（１３）上記（１１）及び／又は（１２）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１４）上記（１３）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（１５）以下の（ａ）及び（ｂ）からなる群より選択される、上記（１４）に記載の宿主細胞。
（ａ）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｂ）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（１６）上記（１４）又は（１５）に記載の宿主細胞を培養し、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を発現させる工程を包含する、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を生産する方法。
（１７）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を含む、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎治療薬。
（１８）上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の治療有効量を投与する工程を包含する、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎を予防又は処置するための方法。
（１９）全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の予防又は処置に使用するための、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によって、従来の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体と比較してｓＴＷＥＡＫ及びｍＴＷＥＡＫのいずれに対しても優れた活性を有する抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体が提供される。本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、ｓＴＷＥＡＫとｍＴＷＥＡＫの両者の機能を阻害することにより、免疫担当細胞、腎糸球体上皮細胞、メサンギウム細胞などの細胞に対する抑制作用を有するものであり、ヒトＴＷＥＡＫが病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。そして、このような本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、投与量の低減、投与間隔の拡大、投与方法の改善（例えば、皮下注射剤）等の臨床適用における優れた改善をもたらし、治療有効性及び患者コンプライアンスの改善に大きく寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒトｍＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性に対する阻害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下に、本発明について詳述する。
本発明者らは、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、従来の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体と比較してｓＴＷＥＡＫ及びｍＴＷＥＡＫのいずれに対しても優れた活性を有する抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を作製することに成功した。
【００２４】
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２５】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶH）及び軽鎖可変領域（ＶL）とよばれている。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣH１、ＣH２、ＣH３あるいはＣLと表される）。
【００２６】
抗体の抗原決定部位はＶH及びＶLによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）と呼んでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２７】
本発明者らが作製に成功した本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、以下のいずれかの特徴を有する抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体である。
１）配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
２）配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
３）配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【００２８】
具体的には、本発明者らは、ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗体を作製し、各種生物学的活性試験及び物性試験を用いた抗体のスクリーニングによって、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を同定することに成功した。ベロシミューン技術では、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒト可変領域で置換されたトランスジェニックマウスを目的の抗原（例えば、ヒトｍＴＷＥＡＫ（配列番号１６）、ヒトｓＴＷＥＡＫ(配列番号１５)及び／又はそれらの変異体（例えば、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるヒトｍＴＷＥＡＫ変異体）で免疫した後、抗体を発現するマウスのリンパ系細胞を取得し、マウスミエローマ細胞と細胞融合することによってハイブリドーマを作製する。次いで、このハイブリドーマ細胞を、目的の抗原に特異的に結合する抗体を産生するか否かについてスクリーニングする。ここで産生される抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（キメラ抗体とも称する）である。次いで、目的の抗原に特異的に結合する抗体が同定された場合、そのハイブリドーマ細胞から抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを所望のクラスのヒト抗体重鎖及び軽鎖の定常領域をコードするＤＮＡにそれぞれ連結する。このようにして得られた重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を細胞内（例えば、ＣＨＯ細胞）で発現させて、抗体分子を産生する。当該方法により作製された抗体の重鎖及び軽鎖は、ヒト免疫グロブリン遺伝子に由来する「完全ヒト型」抗体の重鎖及び軽鎖である。
【００２９】
本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、本願明細書に開示される、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。好ましくは、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、その重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をヒト抗体の重鎖定常領域及び軽鎖定常領域にそれぞれ連結して、完全ヒト型抗体として作製することができる。具体的には、本発明の抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含む重鎖可変領域遺伝子断片、及び本発明の抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列）をコードする塩基配列を含む軽鎖可変領域遺伝子断片を作製する。そして、この可変領域遺伝子をヒト抗体の適当なクラスの定常領域遺伝子と連結させて完全ヒト型抗体遺伝子を作製する。次いで、この抗体遺伝子を適当な発現ベクターに連結し、培養細胞中に導入する。最後にこの培養細胞を培養して培養上清からモノクローナル抗体を得ることができる。
【００３０】
本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片は、例えば、該重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。また、本発明の抗体の可変領域遺伝子断片を一旦取得すれば、この遺伝子断片の所定の部位に変異を導入することによって、本発明の他の抗体を取得することも可能である。このような変異導入方法としては、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ８．１−８．５）等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００３１】
次いで、上記の可変領域遺伝子断片とヒト抗体の定常領域遺伝子とを連結させて完全ヒト型抗体遺伝子を作製する。使用されるヒト抗体の定常領域は、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてγ１、γ２、γ３又はγ４、軽鎖としてλ又はκ鎖の定常領域）も選択可能であり得るが、好ましくは重鎖定常領域としてはヒトＩｇγ１が、また、軽鎖定常領域としてはヒトＩｇκを用いることができる。
【００３２】
この完全ヒト型抗体遺伝子の作製につづく、抗体遺伝子の発現ベクターへの導入、発現ベクターの培養細胞への導入、培養細胞の培養、抗体の精製等については、当該分野で公知の種々の方法を使用して行うことができる。
【００３３】
上記のようにして得られた抗体遺伝子と連結される発現ベクターとしては、例えば、ＧＳベクターｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）が挙げられるが、抗体遺伝子を発現することができるものであれば特に制限されない。また、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する発現ベクターに可変領域遺伝子断片を導入して抗体遺伝子を発現することもできる。
【００３４】
上記の発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等により、培養細胞中に導入される。
【００３５】
発現ベクターを導入する培養細胞としては、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞が使用でき、これを常法により培養すればよい。
【００３６】
上記培養後、培養上清中に蓄積された抗体は、各種カラムクロマトグラフィー、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムを用いた各種クロマトグラフィーにより精製することができる。
【００３７】
本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、ヒトｍＴＷＥＡＫ及びヒトｓＴＷＥＡＫに結合する抗体である。得られた抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体のヒトｍＴＷＥＡＫ又はヒトｓＴＷＥＡＫに対する結合活性を測定する方法としては、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂａｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）やＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）等の方法がある。ヒトｍＴＷＥＡＫに対する結合活性を測定する場合は、例えば、ＦＡＣＳを用いることができ、ヒトｍＴＷＥＡＫ（配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる）又はヒトｍＴＷＥＡＫ変異体（配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる）を発現させた細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）を分注したチューブに抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を添加して反応させた後、洗浄し、フィコエリスリン（ＰＥ）等の蛍光蛋白質で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、ＦＡＣＳ  ａｒｒａｙ等を用いた蛍光値の測定により、二次抗体の結合を同定する。ヒトｓＴＷＥＡＫに対する結合活性を測定する場合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いることができ、ヒトｓＴＷＥＡＫ（配列番号１５）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対して抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を添加して反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＢＭ−Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＰＯＤ）（ロシュダイアグノスティック社））等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定する。また、本発明の抗体には、他の動物由来のＴＷＥＡＫ（例えば、サルＴＷＥＡＫ）にも結合する抗体も含まれ、同様の方法を用いてこれらの蛋白質に対する結合活性を測定することができる。
【００３８】
また、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、ヒトｍＴＷＥＡＫ及びヒトｓＴＷＥＡＫに対する中和活性を有している。本明細書中で使用される場合、抗体の「中和活性」とは、ｍＴＷＥＡＫ及び／又はｓＴＷＥＡＫへの結合によりＴＷＥＡＫを介してもたらされる任意の生物活性を阻害する活性を意味し、ＴＷＥＡＫの１つ又は複数の生物活性を指標に評価することができる。このような中和活性としては、例えば、ＴＷＥＡＫ刺激によるＮＦ−κＢの活性化阻害が挙げられ、後記実施例に記載されるような方法を用いることによって評価することができる。
【００３９】
抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の各種安定性（例えば、熱安定性、長期保存安定性、高濃度安定性）を評価する方法としては、例えば、示差走査熱量測定や、抗体保存中の凝集体形成の測定を利用する方法が挙げられる。
【００４０】
好ましくは、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、当該分野で公知の方法を用いて、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及び配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列に示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡを合成し、これらを適当なクラスのヒト抗体定常領域遺伝子、好ましくは、重鎖についてはヒトＩｇγ１定常領域遺伝子、軽鎖についてはヒトＩｇκ定常領域遺伝子と連結して完全ヒト型抗体遺伝子を構築し、当該分野で公知の種々の方法を用いて、該抗体遺伝子を発現ベクターへ導入し、該発現ベクターを培養細胞に導入して該培養細胞を培養し、得られる培養物から抗体を精製することによって、容易に取得することができる。
【００４１】
好ましくは、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号２の塩基番号１から３５４までの塩基配列を含む。配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号６の塩基番号１から３７５までの塩基配列を含む。配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１０の塩基番号１から３６３までの塩基配列を含む。
【００４２】
好ましくは、配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列に示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号４の塩基番号１から３２４までの塩基配列を含む。配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列に示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号８の塩基番号１から３２４までの塩基配列を含む。配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列に示される軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１２の塩基番号１から３２４までの塩基配列を含む。
【００４３】
本発明の好ましい抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体重鎖は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であり、アミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域とを含む。本発明の好ましい抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体軽鎖は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖であり、アミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを含む。好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体重鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号２に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体軽鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号４に示される塩基配列を含む。配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体としては、後記実施例に記載される完全ヒト型ＴＢＡ３−２５抗体が挙げられる。
【００４４】
本発明の好ましい抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体重鎖は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であり、アミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域とを含む。本発明の好ましい抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体軽鎖は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖であり、アミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを含む。好ましくは、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体重鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号６に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体軽鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号８に示される塩基配列を含む。配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体としては、後記実施例に記載される完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１抗体が挙げられる。
【００４５】
本発明の好ましい抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体重鎖は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であり、アミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とヒトＩｇγ１定常領域とを含む。本発明の好ましい抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体軽鎖は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖であり、アミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とヒトＩｇκ定常領域とを含む。好ましくは、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体重鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１０に示される塩基配列を含む。好ましくは、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体軽鎖をコードする塩基配列を含むＤＮＡは、配列番号１２に示される塩基配列を含む。配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる重鎖と、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体としては、後記実施例に記載される完全ヒト型ＴＢＡ４−１抗体が挙げられる。
【００４６】
本発明は、以下のいずれかの特徴を有する抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体をも包含する。
１）配列番号１のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号３のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号３のアミノ酸番号８９から９７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
２）配列番号５のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号５のアミノ酸番号９９から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号７のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号７のアミノ酸番号８９から９７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
３）配列番号９のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号９のアミノ酸番号９９から１１０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号１１のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号１１のアミノ酸番号８９から９７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体。
【００４７】
本発明は、本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域とを含み、中和活性を保持した、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2等の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体フラグメントをも包含する。また当業者であれば、本発明に基づいて、当該抗体フラグメントと他のペプチドや蛋白質との融合体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾体を作製することも可能である。融合に用いられる他のペプチドや蛋白質は、抗体フラグメントの結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種ｔａｇペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、抗体フラグメントの結合活性を低下させないものである限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
【００４８】
このようにして得られた本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体又は抗体フラグメントは、必要によりさらに精製された後、常法に従って製剤化され、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、強皮症などの自己免疫疾患、脳卒中、動脈硬化症、虚血による急性腎障害、慢性腎不全又は癌等のＴＷＥＡＫが病態形成に関連する疾患の治療に用いることができる。
【００４９】
本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体又は抗体フラグメントは、好ましくは、全身性エリテマトーデス又はループス腎炎の治療剤として用いることができる。これら治療剤等の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤とすることができ、静脈内投与、皮下投与等により投与することが好ましい。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。
【００５０】
上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体又は抗体フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
【００５１】
本発明はまた、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチド及びそれを含む発現ベクターを提供する。本発明はまた、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、及び本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチド、並びにそれらのいずれか又は両方を含む発現ベクターを提供する。前記の本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。本発明の発現ベクターは、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明の抗体あるいはその重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現し、これらポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げることができる。好ましくは、本発明の発現ベクターは、前述の本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むか、あるいは本発明の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む。
【００５２】
本発明の発現ベクターは、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体をコードする遺伝子あるいは本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子及び／又は本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。細菌中で本発明の抗体をコードする遺伝子あるいはその重鎖可変領域をコードする遺伝子及び／又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、宿主がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００５３】
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞又は昆虫細胞を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の抗体あるいはその重鎖可変領域又は軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００５４】
本発明はまた、本発明の抗体をコードする遺伝子あるいは本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子及び／又は本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子で形質転換された宿主細胞（形質転換体）を提供する。このような形質転換体は、例えば、本発明の発現ベクターで宿主細胞を形質転換することにより作製できる。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞（例えば、ＣＨＯ）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）が例示される。形質転換は自体公知の方法により行われ得る。
【００５５】
好ましくは、本発明の形質転換体は、本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。より好ましくは、本発明の形質転換体は、前述の本発明の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞であるか、又は、前述の本発明の抗体の重鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと本発明の抗体の軽鎖をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
【００５６】
本発明はまた、本発明の抗体をコードする遺伝子あるいは本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子及び／又は本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を宿主細胞に発現させること、即ち、このような形質転換体を用いることを含む、本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の生産方法を提供する。好ましくは、該方法で使用される宿主細胞は、前述の本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞であり、該発現ベクターは、本発明の抗体の重鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドと本発明の抗体の軽鎖可変領域をコードする配列を含むポリヌクレオチドを、別々に又は同時に含んでもよい。
【００５７】
本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の生産において、形質転換体は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【００５８】
形質転換体の培養は自体公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１２２，ｐ．５０１，１９５２）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．８，ｐ．３９６，１９５９）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１９９，ｐ．５１９，１９６７）、１９９培地（ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．７３，ｐ．１，１９５０）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８２，ｐ．８４０４，１９８５）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４３１，１９７２）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７７，ｐ．４５０５，１９８０）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００５９】
本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、上述のような形質転換体を培養し、該形質転換体から回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００６０】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００６１】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
【００６２】
（実施例１：ヒトｍＴＷＥＡＫ発現ＨＥＫ２９３細胞の取得）
本発明者らは、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体の結合性試験、中和活性試験及び抗体取得のための細胞抗原として使用するために、ヒトｍＴＷＥＡＫ発現細胞を取得した。ヒトｍＴＷＥＡＫ変異体遺伝子（配列番号１４（配列番号１３に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列））を哺乳細胞発現用ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み換えた。このベクターをトランスフェクション試薬であるＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてヒト樹立培養細胞であるＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）へ遺伝子導入した。配列番号１３に示されるヒトｍＴＷＥＡＫ変異体は、配列番号１６に示される野生型のヒトｍＴＷＥＡＫのアミノ酸番号９０から９３までのアミノ酸配列（プロテアーゼによる切断部位）を欠失させたヒトｍＴＷＥＡＫであり、これらのアミノ酸を欠失させても、ＴＷＥＡＫシグナルを活性化することは確認されている。この細胞をＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ含有ＤＭＥＭ培地にて選択培養した後、限界希釈法にてモノクローン化した。その後、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体（ｈｕＰ２Ｄ１０−２；特許文献１）を用いたフローサイトメトリー測定により高い蛋白発現を示すクローンを選別した（以下、ヒトｍＴＷＥＡＫ発現ＨＥＫ２９３細胞と称する）。
【００６３】
（実施例２：抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体産生ハイブリドーマの作製）
本発明者らは、抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体を取得するため、ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、ヒトｓＴＷＥＡＫ蛋白質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３１０−０６）及びヒトｍＴＷＥＡＫ発現ＨＥＫ２９３細胞を免疫した。マウスを数回免疫し、血中抗体価の上昇を確認し、最終免疫を行った。定法に従い、免疫したマウスの脾臓やリンパ節を摘出しリンパ球を収集し、これをマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの限界希釈サンプルを作製し、モノクローン化を行った。各クローンについて、拡大培養を行った後に無血清培地であるＣＤハイブリドーマメディウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に培地変更し、５日間培養した。得られた培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｕｓ社）を用いて抗体を精製した。
【００６４】
（実施例３：細胞ＥＬＩＳＡ結合阻害アッセイ）
本発明者らは、抗体の抗原特異的結合阻害活性を測定するために、抗体によるヒト大腸癌細胞株ＨＴ２９細胞（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３８）（ヒトＴＷＥＡＫ受容体を内在的に発現している）に対するｓＴＷＥＡＫ蛋白質の結合阻害を評価した。ＨＴ２９細胞を３８４ウェルプレート（Ｇｌｅｉｎｅｒ社）に１ウェルあたり１万個を播種した。培地を除去後、ビオチン標識ヒトｓＴＷＥＡＫ蛋白質（ビオチン化したＰｅｐｒｏｔｅｃｈ社のヒトｓＴＷＥＡＫ蛋白質）とハイブリドーマの培養上清を３０μｌ添加した。３７℃に設定したＣＯ2インキュベータにて１時間インキュベートした後、洗浄液（０．１％ウシ血清入りＨＥＰＥＳ緩衝液）にて洗浄し、希釈液（１％ウシ血清入りＨＥＰＥＳ緩衝液）で２０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＨＲＰ−Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３０μｌ添加した。３７℃に設定したＣＯ2インキュベータにて１時間インキュベートした後、洗浄液で洗浄した。化学発光検出試薬であるＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社）を加えて、その化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
【００６５】
（実施例４：抗原ＥＬＩＳＡ結合アッセイ）
本発明者らは、抗体の抗原特異的結合活性を測定するために、抗原ＥＬＩＳＡを使用した。ヒトｓＴＷＥＡＫ蛋白質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）０．５μｇ／ｍｌを、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に固相化した。ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ；ナカライテスク社）を添加し室温にて１時間静置した後、洗浄液（ＴＢＳ−Ｔ：０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリスバッファー生理食塩水（ＴＢＳ）（ｐＨ７．４））で洗浄し、ハイブリドーマの培養上清を３０μｌ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、洗浄液にて洗浄し、希釈液（Ｂｌｏcｋｉｎｇ  Ｏｎｅをリン酸緩衝液で２倍に希釈したもの）で２０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＨＲＰ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３０μｌ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、洗浄液で洗浄した。化学発光検出試薬であるＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社）を加えて、その化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
【００６６】
（実施例５：ヒトｓＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性化阻害アッセイ）
ＴＷＥＡＫの刺激により、ＮＦ−κＢが活性化されて、ＭＣＰ−１などのケモカインの発現が誘導され炎症応答が惹起されること（非特許文献２）から、本発明者らは、ＮＦ−κＢの活性化阻害を指標として、ヒトｓＴＷＥＡＫに対する抗体の中和活性を評価した。ヒト樹立培養細胞であるＨＥＫ２９３細胞（ヒトＴＷＥＡＫ受容体を内在的に発現している）を、実験の３日前に４×１０6細胞／１０ｃｍディッシュとなるように、１０ｃｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）に１７ｍｌ／ディッシュにて播種した。１時間後、ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ−κＢ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて細胞に導入した。これにより、ＮＦ−κＢの活性化をルシフェラーゼの活性を指標に評価することができる。翌々日、細胞を回収し、１×１０4細胞／ウェルで３８４ウェルプレート（Ｇｌｅｉｎｅｒ社）に３０μｌで播種した。１５μｌのハイブリドーマ由来抗体溶液（ハイブリドーマの培養上清をプロテインＧカラム（Ｐｒｏ−Ｃｈｅｍ社）で精製し、ＤＭＥＭ培地で希釈した溶液）を加え、３７℃に設定したＣＯ2インキュベータにて５分間静置した。さらに、１５μｌのヒトｓＴＷＥＡＫ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）溶液を添加し（終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）、３７℃に設定したＣＯ2インキュベータにて５時間培養した。培養上清を３０μｌ除去した後、３０μｌのＯｎｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し、室温で１０分間撹拌した。その後、化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
【００６７】
（実施例６：ヒトｍＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性化阻害アッセイ）
ＴＷＥＡＫの刺激により、ＮＦ−κＢが活性化されて、ＭＣＰ−１などのケモカインの発現が誘導され炎症応答が惹起されること（非特許文献２）、また、伝達シグナルの最大活性はｓＴＷＥＡＫに比べてｍＴＷＥＡＫのほうが強いこと（非特許文献４）から、本発明者らは、ＮＦ−κＢの活性化阻害を指標として、ヒトｍＴＷＥＡＫに対する抗体の中和活性を評価した。ヒト樹立培養細胞であるＨＥＫ２９３細胞（ヒトＴＷＥＡＫ受容体を内在的に発現している）を、実験の３日前に４×１０6細胞／１０ｃｍディッシュとなるように、１０ｃｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社）に１７ｍｌ／ディッシュにて播種した。１時間後、ｐＧＬ４．３２［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦ−κＢ−ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて細胞に導入した。これにより、ＮＦ−κＢの活性化をルシフェラーゼの活性を指標に評価することができる。翌々日、細胞を回収し、１×１０4細胞／ウェルで３８４ウェルプレート（Ｇｌｅｉｎｅｒ社）に３０μｌで播種した。１５μｌのハイブリドーマ由来抗体溶液（ハイブリドーマの培養上清をプロテインＧカラム（Ｐｒｏ−Ｃｈｅｍ社）で精製し、ＤＭＥＭ培地で希釈した溶液）を加え、３７℃に設定したＣＯ2インキュベータにて５分間静置した。さらに、ヒトｍＴＷＥＡＫ発現ＨＥＫ２９３細胞溶液を５×１０4細胞／ウェルとなるように１５μｌ添加し、５時間培養した。培養上清を３０μｌ除去した後、３０μｌのＯｎｅ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を添加し、室温で１０分間撹拌した。その後、化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。
【００６８】
実施例３、４、５及び６での抗体の評価の結果、ＴＢＡ３−２５、ＴＢＡ３−３５、及びＴＢＡ４−１と命名した抗体（キメラ抗体）が、ヒトｓＴＷＥＡＫ及びヒトｍＴＷＥＡＫに対する高い結合活性及び中和活性を有していることが明らかとなった。
【００６９】
（実施例７：抗体の配列決定）
前述のアッセイによって同定された抗体について、本発明者らはハイブリドーマから抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングした。各ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ増幅キット（ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。次いで、ＰＣＲを用いて、重鎖及び軽鎖の可変領域を伸長及び増幅した。このＰＣＲ産物を直接シークエンサー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１００；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で配列解析を行った。また、ＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等のＰＣＲ産物サブクローニング用ベクターへ組み換えた後、遺伝子配列を解析して配列決定を行った。
【００７０】
抗体の配列決定後、抗体の物性及び安定性向上のために、前述の抗体ＴＢＡ３−３５については、その重鎖及び軽鎖の可変領域にアミノ酸変異を導入して、抗体の改変体（ＴＢＡ３−３５．１）を作製した。
【００７１】
（実施例８：完全ヒト型抗体の作製）
前述の抗体は、可変領域がヒト由来であり、定常領域がマウス由来の抗体である。そこで、本発明者らは、ＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社）を用いて、重鎖及び軽鎖の両遺伝子を含む発現ベクターを構築し、完全ヒト型抗体を作製した。具体的には、ＴＢＡ３−２５、ＴＢＡ３−３５．１及びＴＢＡ４−１の各抗体の重鎖可変領域遺伝子の５'側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ  Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １９８７；１（６）：４９９−５０５．）を、そして３'側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４７３５．１の塩基番号４６５から１４５７までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。また、抗体の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ  Ｗｈｉｔｔｌｅら、前出）を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４７３６．１の塩基番号４０５から７２５までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。
【００７２】
作製したＴＢＡ３−２５の完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＴＢＡ３−２５）の重鎖の塩基配列を配列番号２に、アミノ酸配列を配列番号１に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号４に、アミノ酸配列を配列番号３にそれぞれ示す。完全ヒト型ＴＢＡ３−２５の重鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１０７までのアミノ酸配列からなる。完全ヒト型ＴＢＡ３−２５の軽鎖可変領域は、配列番号３のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１のアミノ酸番号２４から３４、５０から５６、８９から９７までのアミノ酸配列からなる。
【００７３】
作製したＴＢＡ３−３５．１の完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１）の重鎖の塩基配列を配列番号６に、アミノ酸配列を配列番号５に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号８に、アミノ酸配列を配列番号７にそれぞれ示す。完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１の重鎖可変領域は、配列番号５のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号５のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１１４までのアミノ酸配列からなる。完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１の軽鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号７のアミノ酸番号２４から３４、５０から５６、８９から９７までのアミノ酸配列からなる。
【００７４】
作製したＴＢＡ４−１の完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＴＢＡ４−１）の重鎖の塩基配列を配列番号１０に、アミノ酸配列を配列番号９に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号１２に、アミノ酸配列を配列番号１１にそれぞれ示す。完全ヒト型ＴＢＡ４−１の重鎖可変領域は、配列番号９のアミノ酸番号１から１２１までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号９のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１１０までのアミノ酸配列からなる。完全ヒト型ＴＢＡ４−１の軽鎖可変領域は、配列番号１１のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１１のアミノ酸番号２４から３４、５０から５６、８９から９７までのアミノ酸配列からなる。
【００７５】
各抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗体発現を行った。一過性発現については、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で約１００万個／ｍＬに培養されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対し、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターをトランスフェクション試薬である２９３フェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。もしくは、約１０００万個のＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞に対して、前述の重鎖及び軽鎖の両発現ベクターをエレクトロポレーション法を用いてトランスフェクトし、ＣＤ−ＣＨＯ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で１４日間培養した。培養上清をプロテインＡ又はプロテインＧ（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いて精製し、各完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。恒常的発現については、各抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ＮＩＰＰＯＮＧＥＮＥ社）又はＬｉｇａｔｉｏｎ−ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。この発現ベクターは、完全長の重鎖及び軽鎖とグルタミン合成酵素（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）をコードしており、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞にトランスフェクションにより抗体を発現させた。培養上清をプロテインＡ又はプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケアジャパン社）で精製し、各完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。
【００７６】
（実施例９：完全ヒト型抗体のヒトｓＴＷＥＡＫに対する結合活性評価）
本発明者らは、各完全ヒト型抗体について、ヒトｓＴＷＥＡＫに対する結合活性を評価した。本実施例は、比較抗体としてｈｕＰ２Ｄ１０−２を用いた。ヒトｓＴＷＥＡＫ蛋白質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）０．５μｇ／ｍｌを、３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ社）に固相化した。ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ；ナカライテスク社）を添加し室温にて１時間静置した後、洗浄液（ＴＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．４））で洗浄し、完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＴＢＡ３−２５、完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１又は完全ヒト型ＴＢＡ４−１）を３０μｌ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、洗浄液にて洗浄し、希釈液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅをリン酸緩衝液で２倍に希釈したもの）で２０００倍に希釈したホースラディッシュぺルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（ＨＲＰ−ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  Ｉｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を３０μｌ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、洗浄液で洗浄した。化学発光検出試薬であるＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社）を３０μｌ加えて、その化学発光量をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定し、ＫＤ値を算出した（表１）。
表１：完全ヒト型抗体のヒトｓＴＷＥＡＫに対する結合活性
【表１】
2016000003.tif 000002
【００７７】
その結果、本発明の完全ヒト型抗体はいずれも、比較抗体ｈｕＰ２Ｄ１０−２よりも高いヒトｓＴＷＥＡＫに対する結合活性を有することが明らかとなった。
【００７８】
（実施例１０：完全ヒト型抗体のヒトｍＴＷＥＡＫに対する結合活性評価）
本発明者らは、各完全ヒト型抗体について、ヒトｍＴＷＥＡＫに対する結合活性を評価した。本実施例は、比較抗体としてｈｕＰ２Ｄ１０−２を用いた。具体的には、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いた結合アッセイにてＫＤ値を算出した。ヒトｍＴＷＥＡＫ発現ＨＥＫ２９３細胞を１×１０5細胞／チューブで分注し、完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＴＢＡ３−２５、完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１又は完全ヒト型ＴＢＡ４−１）を３０μｌ添加した。４℃で６時間インキュベーション後、ＦＡＣＳ緩衝液（０．１％アジ化ナトリウム及び１０％ウシ血清入りリン酸緩衝液）で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液で１００倍希釈したＰＥ標識ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を３０μｌ加え、４℃で１時間インキュベーションした。ＦＡＣＳ  ａｒｒａｙを用いてＭＦＩ（ｍｅｄｉａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）値を測定し、ＫＤ値を算出した（表２）。
表２：完全ヒト型抗体のヒトｍＴＷＥＡＫに対する結合活性
【表２】
2016000003.tif 000003
【００７９】
その結果、本発明の完全ヒト型抗体はいずれも、比較抗体ｈｕＰ２Ｄ１０−２よりも高いヒトｍＴＷＥＡＫに対する結合活性を有することが明らかとなった。
【００８０】
（実施例１１：ヒトｓＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性化阻害アッセイ）
実施例５の方法に従い、本発明者らは、各完全ヒト型抗体について、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、ヒトｓＴＷＥＡＫに対する抗体の中和活性を評価した。ただし、ハイブリドーマ由来抗体溶液の代わりに、各完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＴＢＡ３−２５、完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１又は完全ヒト型ＴＢＡ４−１）を添加した。本実施例は、比較抗体としてｈｕＰ２Ｄ１０−２を用いた。
化学発光量を測定後、各抗体のヒトｓＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性に対するＩＣ５０値を算出した（表３）。
表３：ヒトｓＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性化阻害活性
【表３】
2016000003.tif 000004
【００８１】
その結果、本発明の完全ヒト型抗体のいずれもが、ヒトｓＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性に対して、比較抗体ｈｕＰ２Ｄ１０−２よりも高い抑制作用を有していることが明らかとなった。
【００８２】
（実施例１２：ヒトｍＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性化阻害アッセイ）
実施例６の方法に従い、本発明者らは、各完全ヒト型抗体について、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、ヒトｍＴＷＥＡＫに対する抗体の中和活性を評価した。ただし、ハイブリドーマ由来抗体溶液の代わりに、各完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＴＢＡ３−２５、完全ヒト型ＴＢＡ３−３５．１又は完全ヒト型ＴＢＡ４−１）を添加した。本実施例は、比較抗体としてｈｕＰ２Ｄ１０−２を用いた。
化学発光量を測定後、各抗体のヒトｍＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性に対するＩＣ５０値を算出した（表４）。
表４：ヒトｍＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性化阻害活性
【表４】
2016000003.tif 000005
【００８３】
その結果、表４及び図１に示すように、比較抗体ｈｕＰ２Ｄ１０−２が、ヒトｍＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性を部分的にしか抑制しなかったのに対し、本発明の完全ヒト型抗体のいずれもが、ヒトｍＴＷＥＡＫ刺激ＮＦ−κＢ活性を完全に抑制することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明の抗ヒトＴＷＥＡＫ抗体は、ヒトＴＷＥＡＫが病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。
【図１】
2016000003.tif 000006
【配列表】
2016000003000001.app