(57)【要約】      （修正有）【課題】生体脳において生じるシナプスの増大及び新生を可視化するための核酸プローブ、該核酸プローブを組み込んだ発現ベクター等、及びシナプス増強を可視化するための方法の提供。【解決手段】（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする特定の塩基配列からなる核酸から、１９３〜９３６ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする特定の塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）との間に挿入されるリポータータンパク質をコードする核酸を含む、シナプス増強を可視化するための核酸プローブ。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９２ｎｔ〜９３５ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
を含む、シナプス増強を可視化するための遺伝子カセット。
【請求項２】
（ａ）において特定される核酸が、配列番号１の１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの全部が欠失されている塩基配列（配列番号４）を有する核酸である、請求項１に記載の遺伝子カセット。
【請求項３】
（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）との間に挿入されるリポータータンパク質をコードする核酸
を含む、シナプス増強を可視化するための核酸プローブ。
【請求項４】
前記リポータータンパク質をコードする核酸が、ヴィーナス、緑色蛍光タンパク質、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、グルタミン酸脱炭酸酵素、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びβ-グルクロニダーゼからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸である、請求項３に記載の核酸プローブ。
【請求項５】
さらにＲｈｏファミリーＧタンパク質、ＦＡＫ（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ＰＡＫ（ｐ２１  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）、及びパルブアルブミンからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項４に記載の核酸プローブ。
【請求項６】
（ａ）において特定される核酸が、配列番号１の１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの全部が欠失されている塩基配列（配列番号４）を有する核酸である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の核酸プローブ。
【請求項７】
（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）との間に挿入されたマルチクローニングサイト
を含む、シナプス増強を可視化するための発現ベクター。
【請求項８】
前記マルチクローニングサイトに、リポータータンパク質をコードする核酸が挿入されている、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記リポータータンパク質をコードする核酸が、ヴィーナス、緑色蛍光タンパク質、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、グルタミン酸脱炭酸酵素、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びβ-グルクロニダーゼからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸である、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
ＲｈｏファミリーＧタンパク質、ＦＡＫ、ＰＡＫ、及びパルブアルブミンからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項９に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
（ａ）において特定される核酸が、配列番号１の１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの全部が欠失されている塩基配列（配列番号４）を有する核酸である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の発現ベクターを神経細胞に組み込み、リポータータンパク質の発現によりシナプス増強を可視化する方法。
【請求項１３】
神経細胞に請求項３〜６のいずれか１項に記載の核酸プローブが導入されているトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体脳において生じるシナプスの増大及び新生を可視化するための遺伝子カセット、核酸プローブ、タンパク質プローブ、該核酸プローブを組み込んだ発現ベクター、核酸プローブを組み込んだトランスジェニック非ヒト動物、及びシナプス増強を可視化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊椎動物の神経系は、神経細胞及びグリア細胞から構成されている。このうち、神経細胞は、細胞体と、樹状突起及び軸策の２種の突起とからなる細胞であり、その機能として、他の神経細胞や刺激受容細胞からの刺激を受け、この刺激を統合した後に軸策に伝達し、軸策末端の神経終末にあるシナプスを介して他の神経細胞や筋あるいは腺細胞などのシナプス後細胞に伝達することが挙げられる。神経細胞が伝達する刺激は、シナプス後細胞を興奮させるものと、興奮を抑制するものに大別される。シナプス後細胞が有する細胞膜（シナプス後膜）は、ある一定以上の刺激を受けると脱分極性のシナプス反応（興奮性シナプス電位を起こし、シナプス後細胞に興奮が伝達される。このような刺激をシナプス後細胞に伝達する神経細胞を興奮性神経細胞という。また、逆にシナプス後細胞の興奮を抑制する働きを有するものを抑制性神経細胞といい、抑制性神経細胞がシナプス後膜に作用して誘導する電位を抑制性シナプス電位という。代表的な興奮性神経細胞としては、大脳皮質運動野の錐体細胞や脊髄の運動ニューロンなどが知られており、抑制性神経細胞としては海馬のバスケット細胞、小脳皮質のプルキンエ細胞や脊髄のレンショウ細胞などが知られている。
【０００３】
上記した機能の異なる中枢神経系の神経細胞は、様々な情報を伝達するために複雑に連関して相互作用しており、その相互作用や動態などを解析することは様々な脳機能（例えば、記憶や学習）のメカニズムを明らかにするために必須である。このような目的を達成するため、これまで中枢神経系における興奮性及び抑制性神経細胞の分別、同定方法が試みられてきた。具体的な分別方法としては、例えば、神経細胞に特異的なマーカーで染色する方法などが挙げられる。しかし、この方法は抗体などのマーカーによる染色を行うために組織を固定する必要があり、生体の神経細胞の活動をリアルタイムで解析することはできなかった。一方、生体内タンパク質をリアルタイムで観察する方法としては、目的のタンパク質を蛍光タンパク質との融合タンパク質として生体内で発現させる方法などが開発されている。例えば、シナプス増強を可視化するプローブとしてＳＥＰ−ＧｌｕＡ１が知られているが、半減期が長く、一度増強したシナプスで１カ月以上も蛍光を発現するため、新規学習で生じるシナプス増大だけを特異的に標識することは不可能であると言われている。また、このプローブは、シナプス増強を可視化することはできるものの、そのシナプスを人為操作することはできなかった。
【０００４】
ヒト大脳皮質では、膨大な数の神経細胞が約６０兆個のシナプスを介して連絡した神経回路網を構築するが、そのうち興奮性シナプスの約８０％は、スパインという小突起構造を形成し、学習又は経験（記憶）に応じて、スパインは、その形態及びサイズを劇的に変化させ、それに伴い電気的伝達効率を変化させている。そのため、スパインは脳機能の記憶素子と考えられている。これまでに、脳機能と関連したシナプスの動的挙動を追跡することを目的して、活動した特定のスパインを視覚化するための技術は開発されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、ある一定以上の刺激を受けて興奮したシナプス後細胞に配置及び集積する性質を有するイオンチャネル型受容体のアンカリングタンパク質（例えば、ＰＳＤ−９５）とシナプスの可塑性に関与し、シナプスの末端で翻訳される樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）の２つのタンパク質に着目し、これらとリポータータンパク質との融合タンパク質が、シナプス増大を可視化できることに成功し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９２ｎｔ〜９３５ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
を含む、シナプス増強を可視化するための遺伝子カセット。
［２］（ａ）において特定される核酸が、配列番号１の１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの全部が欠失されている塩基配列（配列番号４）を有する核酸である、上記［１］に記載の遺伝子カセット。
［３］（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）との間に挿入されるリポータータンパク質をコードする核酸
を含む、シナプス増強を可視化するための核酸プローブ。
［４］前記リポータータンパク質をコードする核酸が、ヴィーナス、緑色蛍光タンパク質、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、グルタミン酸脱炭酸酵素、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びβ-グルクロニダーゼからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸である、上記［３］に記載の核酸プローブ。
［５］ＲｈｏファミリーＧタンパク質、ＦＡＫ（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ＰＡＫ（ｐ２１  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）、及びパルブアルブミンからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸をさらに含む、上記［４］に記載の核酸プローブ。
［６］（ａ）において特定される核酸が、配列番号１の１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの全部が欠失されている塩基配列（配列番号４）を有する核酸である、上記［３］〜［５］のいずれか１つに記載の核酸プローブ。
［７］（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）との間に挿入されたマルチクローニングサイト
を含む、シナプス増強を可視化するための発現ベクター。
［８］前記マルチクローニングサイトに、リポータータンパク質をコードする核酸が挿入されている、上記［７］に記載の発現ベクター。
［９］前記リポータータンパク質をコードする核酸が、ヴィーナス、緑色蛍光タンパク質、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、グルタミン酸脱炭酸酵素、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びβ-グルクロニダーゼからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸である、上記［８］に記載の発現ベクター。
［１０］ＲｈｏファミリーＧタンパク質、ＦＡＫ、ＰＡＫ、及びパルブアルブミンからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸をさらに含む、上記［９］に記載の発現ベクター。
［１１］（ａ）において特定される核酸が、配列番号１の１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの全部が欠失されている塩基配列（配列番号４）を有する核酸である、上記［８］〜［１０］のいずれか１つに記載の発現ベクター。
［１２］上記［８］〜［１１］のいずれか１つに記載の発現ベクターを神経細胞に組み込み、リポータータンパク質の発現によりシナプス増強を可視化する方法。
［１３］神経細胞に上記［３］〜［６］のいずれか１つに記載の核酸プローブが導入されているトランスジェニック非ヒト動物。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のプローブは、増大したシナプスに特異的に集積することができるため、シナプス形態を観察する必要がなく、全ての神経細胞に遺伝子導入し、広範囲及び短時間にシナプス増大を可視化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】海馬スライス培養物における本発明のプローブのシナプス増強に依存した蓄積を示す。
【図２】インビボにおける運動学習時の本発明のプローブの蓄積特性を示す。
【図３】インビボにおける運動学習時の本発明のプローブの時空的動力学を示す。
【図４】光活性化による本発明のプローブを含むスパインの縮小を示す。
【図５】光活性化による、獲得した学習の抹消を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。
発明は、イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質であるＰＳＤ−９５の一部又は全部を欠失させたＰＳＤ９５変異体をコードする塩基配列を有する核酸、及び樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする塩基配列を有する核酸を含む遺伝子カセット、該遺伝子カセットにリポータータンパク質をコードする核酸を挿入した核酸プローブ、該核酸からタンパク質発現をさせたタンパク質プローブ、神経細胞内で上記プローブを発現させることができる発現ベクター、シナプス増強を可視化する方法、並びに該核酸プローブが導入されている、シナプス増強をモニターすることができるトランスジェニック非ヒト動物に関する。
【００１０】
１．本発明のプローブを用いて可視化する対象
本発明は、核酸プローブ又はタンパク質プローブを用いて、記憶及び学習と関連付けられるシナプス（特に、スパイン）を可視化するツールを提供する。シナプス形成及び可塑性の分子メカニズムの解明は、記憶及び学習などの高次脳機能を明らかにするだけでなく、痴呆疾患、精神神経疾患、癲癇などの病態解明、さらには有効な治療法の開発を促すと考えられる。シナプスは、前シナプスと後シナプスという２つの特殊化した構造からなり、一方向にシグナルを伝達する。この特殊構造の形成及び維持には前シナプスと後シナプスにそれぞれ固有のタンパク質の集積が不可欠であることが知られている。例えば、後シナプスには、神経伝達物質の放出に関わるＳＮＡＰ−２５が選択的に配置され、一方、前シナプスには、イオンチャネル型受容体のアンカリングタンパク質であるＰＳＤ−９５（Ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ９５ｋＤ）が選択的に配置されることが知られている。これらのＳＮＡＰ−２５及びＰＳＤ−９５はパルミトイル化という翻訳後脂質修飾を受け、この脂質修飾がＳＮＡＰ−２５及びＰＳＤ−９５の特異的な局在及び機能を制御していることが知られている。また、脳内興奮性シナプスの主要な神経伝達物質であるグルタミン酸の受容体であるＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロ−５−メチル−４−イソキサゾールプロピオン酸）受容体のシナプスへの輸送やリサイクリングは神経活動依存的に制御され、シナプス可塑性の本体であることが示唆されている。上記のＰＳＤ−９５はＡＭＰＡ受容体の主要結合タンパク質であるスタルガジン（ｓｔａｒｇａｚｉｎ）を介してＡＭＰＡ受容体を後シナプスにアンカリングするため、ＰＳＤ−９５の動的制御はシナプス可塑性において重要な役割を果たしていると言われている。なお、ＰＳＤ−９５は、その分子中にＮ末端部分、３つのＰＤＺドメイン、ＳＨ（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン、及びＧＫ（グアニル酸キナーゼ）ドメインを含む。
【００１１】
ある特定のシナプス後部が増大すると、その増大群が構成する神経回路が効率的に使用されるようになるが、本発明者らは、上記の通り、シナプス増大時にシナプス後部タンパク質であるＰＳＤ−９５が、増大したシナプスに集積し、さらに、記憶や学習に伴いＡｒｃ遺伝子のｍＲＮＡが神経入力を受けた樹状突起に集積することに着眼し、ＰＳＤ−９５変異体（例えば、ＰＤＺドメイン１と２を欠損させた「ＰＳＤ−９５Δ１−２」）、蛍光タンパク質、及び樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）（Ａｒｃ  ｍＲＮＡからの翻訳産物の一部）を融合させたタンパク質をプローブとして使用することにより、学習及び記憶と関連付けられたシナプスの増大及び新生の可視化に成功した。したがって、本発明は、一定以上の刺激を受けて増大したシナプス（特に、スパイン）を可視化することができる。以下に、シナプスの増大及び新生を可視化のためのプローブ及び可視化方法を詳述する。
【００１２】
２．遺伝子カセット
本発明は、シナプス増強を可視化する核酸プローブ（後述）に使用するための遺伝子カセットを提供する。本発明によれば、シナプス増大及び新生と脳機能とを関連付ける複数のタンパク質をコードする、各核酸を組み合わせた遺伝子カセットであればよい。典型的には、本発明の遺伝子カセットは、限定されないが、
（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９２ｎｔ〜９３５ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
を含む、シナプス増強を可視化するための遺伝子カセットである。
【００１３】
本発明の遺伝子カセットで使用されるＰＳＤ９５（及びその改変体）及びＤＴＥをコードする核酸には、一本鎖又は二本鎖型ＤＮＡ、及びそのＲＮＡ相補体も含む。ＤＮＡには、例えば、天然由来のＤＮＡ、組換えＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用される核酸としてはＤＮＡが好ましい。なお、周知の通り、コドンには縮重があり、１つのアミノ酸をコードする塩基配列が複数存在するアミノ酸もあるが、上記タンパク質をコードするそれぞれの核酸の塩基配列であれば、いずれの塩基配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００１４】
本明細書で使用するとき、「ＰＳＤ−９５」とは、イオンチャネル型受容体に可逆的に結合するタンパク質であって、スパインが密に存在するシナプス後に存在するＭＡＧＵＫ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）タンパク質の１つであり、シナプスを構造的に維持させる働きを有する。このＰＳＤ−９５をコードする核酸は、配列番号１で表される２１７２塩基の塩基配列を含み、特徴的なドメインとして、（ｉ）Ｎ末端部分（１〜１９２ｎｔ）、（ｉｉ）３つのＰＤＫドメイン（ＰＤＺ１：１９３〜４５３ｎｔ、ＰＤＺ２：４７８〜７３８ｎｔ、ＰＤＺ３：９３６〜１１７９ｎｔ）、（ｉｖ）ＳＨ（Ｓｒｃ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）ドメイン（１３０３〜１４８５ｎｔ）、及び（ｖ）ＧＫ（グアニル酸キナーゼ）ドメイン（１６００〜２１３６ｎｔ）を有する。なお、ＰＳＤ−９５の塩基配列（１〜２１７２ｎｔ）は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０１９６２１中の５８〜２２２９ｎｔに対応する。
【００１５】
本発明によれば、遺伝子カセットの一部としてＰＳＤ−９５をコードする核酸を用いる場合、ＰＳＤ−９５をコードする核酸の全長を用いてもよいが、該遺伝子カセットの一部としてＤＴＥをコードする核酸を使用する場合、ＰＳＤ−９５の塩基配列のうち、配列番号１において１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの一部又は全部が欠失していることが好ましい。本明細書において使用するとき、欠失させる部分が一部である場合、この「一部」とは、上記１９３〜９３６ｎｔのうち、１個の塩基、連結して又は不連続してなる２〜７４３個の塩基、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００個の塩基を意味する。本発明によれば、１９３ｎｔ〜９３６ｎｔ（７４４個の塩基）全部を欠失させた塩基配列（配列番号４）を有する核酸（この場合、該核酸よってコードされるタンパク質を「ＰＳＤ−９５Δ１−２」と称することがある）を用いることができる。本発明の一態様において、遺伝子カセットして使用することができるＰＳＤ−９５をコードする核酸には、配列番号１において１９２ｎｔ〜９３５ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。
【００１６】
本明細書で使用するとき、「樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）」とは、記憶や学習に伴い神経入力を受けた樹状突起に集積するＡｒｃ遺伝子産物の一部を構成するタンパク質である。ＤＴＥは、神経細胞内でｍＲＮＡからタンパク質に翻訳されるタンパク質であるが、学習や記憶を形成するための基本的神経機能であるシナプス可塑性と関連付けられ、可塑的シナプスの真下にＤＴＥをコードするｍＲＮＡが運ばれ、タンパク質発現することが知られている。したがって、シナプス増強を視覚化するという本発明の目的を達成するために、遺伝子カセットの一部として使用する核酸として好ましい。なお、ＤＴＥの塩基配列（配列番号３：１〜６４４ｎｔ）は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ ０１９３６１中の２０３６〜２６９９ｎｔに対応する。本発明の一態様において、遺伝子カセットして使用することができるＤＴＥをコードする核酸には、配列番号３で表される塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸も含まれる。
【００１７】
ＰＳＤ９５（又はその改変体）及びＤＴＥをコードする核酸は、例えば、後述する実施例１に記載するように、それぞれ配列番号１（又は４）及び３の塩基配列に基づいてプライマーとして合成ヌクレオチドを設計し、染色体ＤＮＡを含むプラスミドなどを鋳型として増幅することによって調製できる。核酸を増幅するための手法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉ  Ｒ．Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０−１３５４（１９８５））、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ  Ｄ．Ｙ．ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４，５６０−５６９（１９８９））、及び転写に基づく増幅（Ｋｗｏｈ  Ｄ．Ｙ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，１１７３−１１７７（１９８９））等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，３９２−３９６（１９９２）；Ｗａｌｋｅｒ  Ｇ．Ｔ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，１６９１−１６９６（１９９２））、自己保持配列複製（３ＳＲ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  Ｊ．Ｃ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４−１８７８（１９９０））、及びＱβレプリカーゼシステム（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，１１９７−１２０２（１９８８））等の恒温反応を利用することができるが、これらに限定されない。本発明においては、ＰＣＲ法を使用することが好ましい。なお、遺伝子に変異を導入する方法は、一般的に知られ、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｉｔ  ８．１−８．５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ）が挙げられる。本発明においては、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することができる。
【００１８】
本明細書において使用するとき、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度又は高程度なストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，７．４２−７．４５（２００１）に示されるが、ニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０〜５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（又は約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般的に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及び約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。当業者は、温度及び洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さ等の要因に従って、必要に応じて調整可能であることを認識することができる。
【００１９】
上記のような核酸増幅反応又はハイブリダイゼーション等を使用してクローニングされる相同な核酸は、配列番号１（又は４）及び３に記載の塩基配列に対して、それぞれ、少なくとも３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらにより好ましくは９０％以上、さらになお好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。なお、同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列の同一性パーセントは、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，３８７（１９８４）に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３）を用いて、配列情報を比較することによって決定することができる。
【００２０】
本発明の別の実施形態として、本発明において使用されるＰＳＤ９５Δ１−２をコードする核酸は、配列番号４で表される塩基配列において示されるように全長１４２８塩基からなる。本発明の一態様として、ＰＳＤ９５Δ１−２と同等の活性を有し、かつ、上記該塩基配列において１〜１５０個の塩基が置換されてなる塩基配列からなる核酸を用いてもよい。置換される塩基の数は、好ましくは最大１００個、より好ましくは最大７５個、さらに好ましくは最大５０個、さらにより好ましくは最大３０個、なお好ましくは最大２０個、なおより好ましくは最大１０個、最も好ましくは最大５個である。
【００２１】
本発明の他の実施形態として、本発明において使用されるＤＴＥをコードする核酸は、配列番号３で表される塩基配列において示されるように全長６６３塩基からなる。本発明の一態様として、ＤＴＥと同等の活性を有し、かつ、上記核酸配列において１〜７０個の塩基が置換されてなる塩基配列からなる核酸を用いてもよい。置換される塩基の数は、好ましくは最大６０個、より好ましくは最大５０個、さらに好ましくは最大３０個、さらにより好ましくは最大２０個、なお好ましくは最大１０個、なおより好ましくは最大５個、最も好ましくは１最大３個である。
【００２２】
本発明において、ＰＳＤ９５（及びその改変体）及びＤＴＥをコードする核酸を遺伝子カセットとして使用する場合、それらを配置する順番に制限はないが、ＰＳＤ９５（及びその改変体）をコードする核酸は、ＤＴＥをコードする核酸の上流に配置されることが好ましい。
【００２３】
３．核酸プローブ
本発明によれば、シナプス増強を可視化するために、上記遺伝子カセットにリポータータンパク質をコードする核酸を組み込んだ核酸プローブが提供される。本発明の一態様において、リポータータンパク質をコードする核酸の挿入位置は、核酸プローブに組み込まれ、リポータータンパク質として機能し得る位置であれば限定されない。例えば、遺伝子カセットを構成するＰＳＤ９５Δ１−２をコードする核酸とＤＴＥをコードする核酸の間に、リポータータンパク質をコードする核酸を挿入したものであってよい。したがって、本発明のシナプス増強を可視化するための核酸プローブは、典型的には、
（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）との間に挿入されるリポータータンパク質をコードする核酸
を含むものであることが好ましい。なお、上記（ａ）及び（ｂ）における核酸の定義は、遺伝子カセットに使用されるそれぞれ対応する核酸の定義に等しい。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「リポータータンパク質」とは、本発明の核酸プローブが神経細胞に導入され、脳機能（学習や記憶）の発現に依存して、核酸プローブに含まれる遺伝子カセットを構成する核酸ともに翻訳され、脳機能の発現を視覚化するために使用されるタンパク質を意味する。したがって、リポータータンパク質は、上記目的で使用可能なタンパク質であれば限定されず、例えば、ヴィーナス、緑色蛍光タンパク質、チャネルロドプシン、ハロロドプシン、グルタミン酸脱炭酸酵素、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、及びβ-グルクロニダーゼが含まれる。なお、遺伝子カセットに挿入されるリポータータンパク質をコードする核酸の数及び種類は、限定されず、使用目的に応じて２種以上を挿入してもよい。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、核酸プローブに導入される核酸として、上記のリポータータンパク質をコードする核酸の他に、研究目的に応じて、リポータータンパク質をコードする核酸とともに様々な核酸を遺伝子カセットに導入した核酸プローブを提供することができる。例えば、光刺激に応答して活性化するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。このような刺激に応答して活性化するタンパク質として、ＰａＲａｃ１（Ｗｕ，Ｙ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４６１，１０４−１０８（２００９））、ＰａＲｈｏＡ、ＲａＣｄｃ４２等を用いてもよい。Ｒａｃ１、ＲｈｏＡ、及びＣｄｃ４２は、いずれもＲｈｏファミリーＧタンパク質であって、細胞形態や運動を司る細胞骨格（例えば、アクチンやミオシンなど）の形成を制御するタンパク質である。ここで、例えば、ＰａＲａｃ１は、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａのフォトトロピンタンパク質内の光吸収によって構造が変化するＬＯＶドメイン（ｌｉｇｈｔ，ｏｘｙｇｅｎ，ｖｏｌｔａｇｅ  ｄｏｍａｉｎ）をＲａｃ１タンパク質に融合させた融合タンパク質である（Ｗｕら、上述）。ＰａＲａｃ１を神経細胞で発現させ、外部から青い光をあてると、局所的なＲａｃ１の活性化により、リン酸化酵素ＰＡＫの活性化を介したアクチン重合が促進され、細胞の形態や動きの時空間的な操作を行うことができる。このように、Ｒａｃ１が青い光によって活性化され得るため、シナプス可塑性を光刺激といった人為的に操作によって誘起することができる。また、他の態様において、リポータータンパク質をコードする核酸とともにＦＡＫ（ｆｏｃａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ＰＡＫ（ｐ２１  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）、及びパルブアルブミンからなる群から１つ以上選択されるタンパク質をコードする核酸をさらに核酸プローブに導入することができる。ここで、ＦＡＫは、インテグリン結合タンパク質の一種であり、細胞接着班に局在し、細胞の形態や運動に関与するキナーゼである。ＰＡＫは、細胞骨格構築に関連するリン酸化酵素である。また、パルブアルブミンは、カルシウム結合性の低分子量アルブミンであって、神経系のＧＡＢＡ駆動性介在ニューロンに存在し、統合失調症患者においてはパルブアルブミンの発現量が減少することも見出されている。
【００２６】
４．発現ベクター
本発明によれば、本発明の遺伝子カセットは、これらを構成する核酸を組み込んだベクターの形態で使用されることが好ましい。より典型的には、本発明のシナプス増強を可視化するためのベクターは、
（ａ）イオンチャネル型受容体アンカリングタンパク質ＰＳＤ−９５をコードする配列番号１で示される塩基配列からなる核酸から、１９３ｎｔ〜９３６ｎｔの一部又は全部を欠失させた塩基配列を有する核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；
（ｂ）樹状突起標的エレメント（ＤＴＥ）をコードする配列番号３で示される塩基配列からなる核酸、又は該核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸；及び
（ｃ）上記（ａ）と（ｂ）との間に挿入されたマルチクローニングサイト
を含む発現ベクターであってもよい。ここで、「マルチクローニングサイト」とは、種々の制限酵素に認識される配列が存在する部位を意味し、これを適切な制限酵素で切断し、外来の核酸を挿入することができる。当業者であれば、マルチクローニングサイトとして使用可能な制限部位の配列を設計することができる。本発明によれば、シナプス増大を可視化するという目的のために、このマルチクローニングサイトに挿入される外来の核酸には、限定されないが、リポータータンパク質（上述）をコードする核酸が好ましい。他の実施形態において、本発明は、発現ベクターに導入される核酸として、上記のリポータータンパク質をコードする核酸の他に、研究目的に応じて、リポータータンパク質をコードする核酸とともに様々な核酸を導入した発現ベクターを提供することができる。例えば、光刺激に応答して活性化するタンパク質をコードする核酸を導入した発現ベクターであってもよく、このようなタンパク質の例はＰａＲａｃ１等を挙げることができる（「３．核酸プローブ」の項を参照されたい）。さらに、発現ベクターには、組み込まれたリポータータンパク質をコードする核酸を適切に発現させるために、限定されないが、プロモーター（例えば、ＣＡＧ）、エンハンサー、開始コドン、終始コドン、及びターミネーターを含んでいてもよい。
【００２７】
本発明において、ＰＳＤ９５（及びその改変体）及びＤＴＥをコードする核酸を遺伝子カセットとして発現ベクターに導入して使用する場合、それらを配置する順番に制限はないが、ＰＳＤ９５（及びその改変体）をコードする核酸は、ＤＴＥをコードする核酸の上流に配置されることが好ましい。さらに、本発明の発現ベクターは、ＰＳＤ９５（及びその改変体）をコードする核酸とＤＴＥをコードする核酸との間にマルチクローニングサイトを有することが好ましい。本発明によれば、このマルチクローニングサイトに、リポータータンパク質（例えば、ヴィーナス）をコードする核酸、ＰａＲａｃ１をコードする核酸を制限酵素で処理することによって組み込むことができる。なお、ＰａＲａｃ１などの光刺激に応答して活性化するタンパク質をコードする核酸を本発明の発現ベクターに組み込む場合、該タンパク質の性質上、ＤＴＥをコードする核酸の上流に終始コドンを設け、その直前に該タンパク質の核酸を組み込むことが好ましい。
【００２８】
ベクターに目的とする核酸を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１．１（２００１）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、トーヨーボー社製等）を用いることもできる。ベクターは、簡単には当該技術分野において入手可能な組換え用ベクター（例えば、プラスミドＤＮＡ等）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本発明のシナプス増大を可視化するための核酸プローブを導入するために使用されるベクターとしては、限定されないが、ウイルスベクターが好ましい。使用可能なウイルスベクターとしては、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／２、ＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８血清型ベクター）；アデノウイルス（ＡＶ）に由来するベクター；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス；水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）などが挙げられる。
【００２９】
当業者であれば、組換えベクターに適合するように制限末端を適宜選択することができ、さらに、所望のタンパク質を発現させるために、宿主細胞に適した組換えベクターを適宜選択することができる。このようなベクターは、本発明で使用する遺伝子が目的の宿主細胞の遺伝子と相同性組換えが起るように機能する領域（必要に応じて、自立複製起点、接合伝達領域、選択マーカー（例えば、カナマイシン耐性遺伝子）等）が適切に配列されており又は導入することにより、該核酸が適切に組換えられるように構築されている又は構築することが好ましい。
【００３０】
一般的に、形質転換体は、組換えベクターを宿主細胞に組み込むことによって作製することができる。この場合、宿主細胞として原核細胞（例えば、大腸菌（Ｓ１７−１株等）、枯草菌）であっても真核細胞（哺乳類細胞、酵母、昆虫細胞等）であっても使用することができる。組換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）は公知の方法を用いて行うことができる。例えば、細菌（大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等）の場合は、例えばＣｏｈｅｎらの方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９））やコンピテント法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６，２０９（１９７１））、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００３１】
本発明によれば、上記で作製した発現ベクターを脳に所定部位（例えば、皮質）に直接導入してもよい。このような手段によりベクターを導入し、後述する測定方法によって、生体の脳機能と関連付けられたシナプス増大をリアルタイムで可視化するのに役立つ。発現ベクターを脳に導入する方法としては、限定されないが、発現ベクターを含む生理食塩水等をピペットを用いて直接注入してもよい。
【００３２】
５．シナプス増強を可視化する方法及び検出
本発明によれば、本発明の核酸プローブを組み込んだ発現ベクターを用いて、シナプス増強を可視化することができる。神経細胞を生きたままリアルタイムで観察するために、リポータータンパク質が蛍光性タンパク質である場合、限定されないが、２光子レーザー顕微鏡、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー顕微鏡を用いることができる。ここで、「２光子レーザー顕微鏡」とは、物質励起に２光子吸収過程を利用した顕微鏡であり、通常の１光子励起で必要な波長の２倍以上の長波長レーザー光で励起する。光の散乱は波長の４乗に反比例するので、例えば、１光子励起レーザー５００ｎｍに対して、２光子励起に用いる１０００ｎｍのレーザー光では組織の散乱は原理的に１／１６倍へ減少するため、通常の蛍光顕微鏡では組織表面からせいぜい数十μｍであった深部到達度が、１ｍｍ程度までの深部の画像を取得でき、また長波長であるがゆえに光毒性も大きく軽減するという利点を備えた顕微鏡である。このような生体観察には圧倒的に有利な特性のため、生きたままの脳を内部まで比較的低い侵襲度でライブ撮影が可能となる。さらには同一の個体の行動を同時に解析することにより、脳の内部で見られた現象と行動レベルでの現象を同時に観察し、両者の関係を模索できる。
【００３３】
６．トランスジェニック非ヒト動物
本発明によれば、シナプス増強を可視化してリアルタイムで観察するために使用されるヒト以外のトランスジェニック動物を提供することができる。本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、上記目的を達成するものであればよく、その製造方法やその他の特性は限定されない。より典型的には、本発明の発現ベクターを用いて形質転換又は染色体に相同組換えされたヒト以外のトランスジェニック動物である。ヒト以外の動物（非ヒト動物）は、例えば、脊椎動物であり、哺乳動物であることが好ましい。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコが挙げられる。好ましくはマウス、ラットである。また、本発明のヒト以外のトランスジェニック動物は、非ヒト動物個体だけでなく、非ヒト動物の一部、例えば、非ヒト動物の細胞、組織、器官などを含む広い概念で捉えられるべきものである。
【００３４】
本発明の発現ベクターを用いて、本発明の核酸プローブをヒト以外の動物生殖細胞にトランスジーン法により導入し、トランスジェニック動物細胞を作製する。次に、これを発生させることによりヒト以外のトランスジェニック動物を作製することができる。上記「トランスジーン法」とは、導入遺伝子を宿主が有するゲノムＤＮＡの不特定の位置に複数コピー挿入する方法である。本発明によれば、導入遺伝子として、例えば、ＣＡＧプロモーター＋ＰＳＤ−９５Δ１−２をコードする核酸＋ヴィーナスをコードする核酸（＋ＰａＲａｃ１をコードする核酸）＋ＤＴＥをコードする核酸を用いるトランスジーン法を用いることが好ましい。
【００３５】
本発明において、宿主として用いる細胞は非ヒト細胞であればよく、特に限定されるものではない。例えば、ヒト以外の受精卵を用いることができる。以下に、ヒト以外の受精卵に導入遺伝子を導入する方法をより詳細に説明する。本発明で用いるヒト以外の受精卵は、これらに導入遺伝子を導入して発生・成育させ、プロモーター領域の活性により、ＰＳＤ−９５Δ１−２をコードする核酸＋ヴィーナスをコードする核酸（＋ＰａＲａｃ１をコードする核酸）＋ＤＴＥをコードする核酸を発現するヒト以外のトランスジェニック動物を作製できるものであればよく、特に限定されるものではない。このような受精卵は、ヒト以外の動物の雄と雌を交配させることによって得られる。得られた受精卵は、導入遺伝子をマイクロインジェクション法等により注入して、動物の雌の輸卵管に人工的に移植、着床させて出産させることにより、トランスジェニック動物を得ることができる。上記マウスの受精卵としては、例えば、Ｂ６Ｃ３Ｆ１、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９／ｓｖ、ＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ３Ｈ、ＳＪＬ／Ｗｔ等に由来するマウスの交配により得られるものを用いることができる。
【００３６】
導入遺伝子の量は１００〜３，０００コピーが適当である。導入遺伝子の導入方法としては、マイクロインジェクション法やエレクトロポレーション法等の通常用いられる方法を挙げることができる。ここで、上記導入遺伝子が導入された仔マウスの選択は、マウスの尾の先を切り取って、高分子ＤＮＡ抽出法（発生工学実験マニュアル、野村達次監修・勝木元也編、講談社（１９８７））又はＤＮＡｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販のキットを用いることによりゲノムＤＮＡを抽出し、サザンブロット法やＰＣＲ法等の通常用いられる方法に導入遺伝子の存在を確認することによって行うことができる。さらに、実際にその個体内で導入された導入遺伝子が発現され、該遺伝子から翻訳されたタンパク質が産生されていることは、ノーザンブロット法やウェスタンブロット法等の通常用いられる方法により確認することができる。また、本発明において、蛍光を発するリポータータンパク質をコードされた遺伝子が導入されている場合、上記の例では、ＰＳＤ−９５Δ１−２＋ヴィーナス（＋ＰａＲａｃ１）＋ＤＴＥの融合タンパク質を発現するように遺伝子導入することによって、ＰＳＤ−９５Δ１−２及びＤＴＥの発現を生体において可視化することができる。なお、可視化を観察する方法は、上記したものであってもよく、好ましくは２光子レーザー顕微鏡を用いることができる。
【実施例】
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、本実施例におけるマウスを用いた実験プロトコールは、東京大学の動物実験に関する倫理委員会によって承認されたものであり、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって刊行された「実験動物の管理と使用に関する指針」（１９９６年改定版）に沿って実施された。
【００３８】
実施例１：発現ベクターの作製
ＰＳＤ−９５及びＰａＲａｃ１の欠失は、以前の報告（Ｈａｙａｓｈｉ−Ｔａｋａｇｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３，３２７−３３２（２０１０））に記載される方法に従って行った。要約すると、ＰＳＤ−９５Δ１−２は、ＮＭ ０１９６２１を参照して、配列番号１から１９２ｎｔ〜９３５ｎｔを欠失させて作製した。ＤＴＥは、以下のプライマー（配列１と２）：
配列１：５’−ａｔｇａｔａａｇｃｔｔｔｃｇｇｃｔｃｃａｔｇａｃｔｃａｇｃｃａｔｇｃｃ−３’（配列番号５）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位である）；及び
配列：５’−ａｔｇａｔａａｇｃｔｔａｇａｃａｃｇａｇｃａｇｔｔａｃｃａａｃａｃｇ−３’（配列番号６）（下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限部位である）
を用いて、ＳＤラットの前頭皮質から生じさせたｃＤＮＡからクローニングした。次に、ＮＭ ０１９３６１に示される配列の２０３６ｎｔ〜２６９９ｎｔに対応する塩基配列（配列番号３）を有するアンプリコンをＰａＲａｃ１の終始コドンの直後の下流にサブクローニングした。上記ＰＳＤ−９５Δ１−２及びＤＴＥは、ＣＡＧプロモーターを有するｐＣＡＧベクターの制限部位（ＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩ）に挿入した。
【００３９】
実施例２：シナプス増強の可視化
１．方法
（１）ＡＡＶ２／５ベクターの作製
ＡＡＶウイルスの作製は、ＡＡＶヘルパーフリーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）に基づいて行なった。各ｐＡＡＶベクター、ｐＲｅｐ−Ｃａｐ（ＡＡＶ５；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｖｉｒｏｍｉｃｓ，ＣＡ）、及びｐＨｅｌｐｅｒプラスミドをポリエチレンイミン「マックス」（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰＡ）によってＡＡＶ−２９３細胞にコトランスフェクトした。７２時間のインキュベーション後、細胞を回収し、５回の凍結融解サイクルを用いて溶解した。得られた上清を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０．０１％ＢＳＡ（ｖ／ｖ）を含む４０％ショ糖溶液上に重層し、４℃にて１６時間、１００，０００ｇで遠心分離した。ペレット（粗製ウイルス粒子）を３７℃にて１時間、１０００ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ，ＷＩ）で処理した。５μｍのフィルターを通過させる濾過により破片を除去後、濾過された材料を４８時間、１５℃にて２５７，３００ｇでＣｓＣｌ勾配（１．２５ｇ／ｍｌと１．５０ｇ／ｍｌ）に供した。ウイルスに富んだ画分を回復し、次に、溶媒をＡＳＣＦ（１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ＣａＣｌ2不含）に交換した。ウイルス力価を定量的リアルタイムＰＣＲ分析（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ，Ｊａｐａｎ）によって決定した。
【００４０】
（２）ウイルス注入及び頭蓋開放頭蓋窓外科手術
上記で作製したＡＡＶ２／５ベクターをマウスの皮質に以下の通り注入した。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、脳腫脹を予防するためにマンニトール（４μｇ／ｇ体重）及びデキサメタゾンの腹腔内注射とともにイソフルランによって麻酔した。ケトプロフェン（４０μｇ／ｇ体重）及びペニシリン／ストレプトマイシン（４Ｕ／ｇ体重）を手術前の４日間連続して皮下注射し、炎症を予防した。頭蓋骨を定位座標に従ってＭ１皮質に対応する領域全体で露出させた。１μｌのＡＡＶ調製物（０．５〜４．０×１０12のゲノムコピー／ｍｌ）を、シリンジポンプ（Ｌｅｇａｔｏ１３０；Ｍｕｒｏｍａｃｈｉ  Ｋｉｋａｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて１５０ｎｌ／分）の流速で、ガラスピペット（先端径３０μｍ、４５°の角度で傾斜している）によって注入した。頭蓋開放窓を作製するために、ステンレス製トレフィン（φ１．８ｍｍ，Ｆｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ，ＣＡ）を、円形の開放頭蓋窓を作製するために用いた。脳損傷を避けるために、１０，０００回転／分で断続的な掘削を行い、その間、酸素化されたＡＣＳＦで連続して穏やかに灌流を行った。頭蓋骨に対する掘削誘起弾圧を最大限に回避した。出血が認められないことを確認後、ドリルホールは円形カバースリップ（φ１．８ｍｍ、０．１ｍｍ未満厚）（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ，Ｊａｐａｎ）で覆い、歯科用セメント（Ｆｕｊｉ  Ｌｕｔｅ  ＢＣ；ＧＣ，Ｊａｐａｎ）で密封した。次に、インビボ画像化のためにヘッドギアを装着した。
【００４１】
（３）２光子画像化、グルタミン酸アンケージング、及び光活性化
２光子画像化は、水浸対物レンズ（ＬＵＭＰｌａｎＦＬ  Ｎ，×６０，１．０Ｎ．Ａ．）を有するＦＶ１０００レーザースキャニング顕微鏡システム（ＦＶ１０００，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を備えた正立顕微鏡（ＢＸ６１ＷＩ；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。２モードロックされたフェムト秒パルスのＴｉ：サファイアレーザー（ＭａｉＴａｉ  ＤｅｅｐＳｅｅ  ａｎｄ  ＨＰ；Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，ＣＡ）は、デュアルカラーイメージング（ヴィーナスとｍＲＦＰ）について１０００ｎｍ、及びグルタミン酸アンケージングについて７２０ｎｍで使用された。ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ／ＳＥＰ−ＧｌｕＡ１／ｍＲＦＰ用の３色画像化について、７８０ｎｍ（ｍＴｕｒｑｕｉｓｅ及びｍＭＲＦＰと）と９７０ｎｍの（ＳＥＰ−ＧｌｕＡ１及びｍＲＦＰ）での２つの独立して撮影した画像を、ｍＲＦＰによって示される共通の蛍光シグナルに基づいて重ね合わせた。インビトロでの画像化のために、１０−４０ｘｙ画像（デジタルズーム×５、５１２×５１２ピクセル）をｚ軸上の０．５μｍステップサイズで捕捉した。インビボでの画像化のために、マウスをイソフルランで麻酔し、画像（デジタルズーム×２、１０２４×１０２４ピクセル）を硬膜から３００μｍについて１．０μｍのステップサイズで補足した。グルタミン酸アンケージングについて、１μＭテトロドトキシン（ＴＴＸ；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｊａｐａｎ）を含むＭｇ2+不含ＡＣＳＦ中の８ｍｍ  ＭＮＩ−グルタミン酸（Ｔｏｃｒｉｓ，ＵＫ）を、１０μＭフォルスコリン（Ｗａｋｏ）及び５μＭアニソマイシン（Ｓｉｇｍａ）の存在下又は不存在下で樹状突起上にガラスピペットから局所的に適用した。スパインヘッドへのＭＮＩ−グルタミン酸の反復（５Ｈｚ、×８０）光分解を７２０ｎｍで行い、パルス時間は０．６ｍｓであった。アンケージングレーザ強度は対物レンズ下で６ｍＷであった。１０ｍＷのレーザーパワーで７２０ｎｍでのＰｃＧＦＰ（光変換可能である）の２光子光活性化は、全スパインヘッドを含む１０ｍｓ間、循環光活性化のために誘導された。
【００４２】
（４）自由に動き回る動物におけるインビボでの光活性化
ＡＡＶ注入又は子宮内遺伝子導入によって形質導入されたマウスは、両側性のガラス窓を確立するために、通常の頭蓋開放頭蓋窓外科手術に供された。傾斜のない１８Ｇ針（長さ１５ｍｍ、内径＝０．９ｍｍ）を付した外側シリンダは、後の光活性化のために、ガラス窓に移植された。光活性化前に外側シリンダに光学ファイバーを挿入し、それにより、ファイバー先端がカバーガラスに直接配置され、ファイバーと外側シリンダ間の連結をＢｌｕ−Ｔａｃｋでしっかりロックした。それにもかかわらず、光活性化後には容易に脱着した。ＣＯＭＥ−２シリーズ（Ｌｕｃｉｒ，Ｊａｐａｎ）を用いて光刺激を行った。これは、４５７ｎｍのレーザーダイオード、Ｏｐｔｉｃａｌｓｗｉｖｅｌｓ、及び両側性の光学（ＣＯＭＥ２−α  ＤＦ１；コア径＝５００μｍ、０．５Ｎ．Ａ．）からなっている。レーザーダイオードを各ファイバーの先端に２０ｍＷの出力を有するように調整した。光パルスは、１時間、１Ｈｚで１５０ミリ秒送達され、これは、カスタマイズされたＬａｂＶｉｅｗプログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＴＸ）によって調節された。
【００４３】
（５）行動分析
マウスは、標準的な実験室条件（１２時間の明／暗サイクルで食餌と水を自由に摂取可能）下で収容した。すべての行動分析は明期に実施した。運動学習として、ＲｏｔａＲｏｄトレーニング（Ｒｏｔａ−Ｒｏｄ  Ｔｒｅａｄｍｉｌｌｓ  ＥＮＶ−５７６；Ｍｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，ＶＴ）を利用した。トレーニングセッション前に、マウスを２分間静止したロッドに馴らして留まらせた。トレーニング期間は、固定速度のプロトコールを低速（８ｒｐｍ）で適用し、それにより、マウスはほとんどロッドから落ちなかった。マウスが確実にロッド上に維持できるようになった後、速度を段階的に増加させ、最終的には４０ｒｐｍとした。マウスがより容易にかつ早く学習するように、嫌悪刺激として後肢に空気を吹きかけた。その結果、マウスの姿勢は、ロッド上で、後傾ではなく、前傾となるように改善され、マススはより高速でこのタスクを容易に行った。落下した場合、マウスをすぐにロッドに戻した。落下するまでの時間を自動的に記録した。３つのトレーニングセッションを１〜２日間行った（１セッションあたり２時間であり、全体で６時間のトレーニングとなる）。学習到達度の評価について、加速プロトコール（４〜４０ｒｐｍ）のロタロッド「テスト」は、５分間のインターバルをおいて３回試行された。３回試行の平均をタスク性能として用いた。改善の程度が前回のトレーニング性能と比較して２０％未満である対象を失敗とみなし、以降の分析から除いた。マウスの走行速度をビデオ追跡システム（Ｌｉｍｅｌｉｇｈｔ３；Ａｃｔｉｍｅｔｒｉｃｓ，ＩＬ）によって測定した。
【００４４】
２．結果
（１）インビトロでのシナプス増強の可視化
実施例１で作製した発現ベクター（核酸プローブ）を用いて、海馬スライス培養物においてシナプス増強の可視化を試みた。海馬スライス（３５０μｍ厚）をビブラトーム（ＶＴ１２００Ｓ；Ｌｅｉｃａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＳＤラットから摘出した。これを０．４μｍのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（商標）培養インサート（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）上にマウントした。１．６μｍの金マイクロキャリアをＰＤＳ１０００／Ｈｅ  Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ遺伝子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，ＣＡ）を用いて、上記海馬スライスにトランスフェクトした。トランスフェクションの２〜４日後、海馬スライス培養物をレコーディングチャンバーに移し、これに２９〜３０℃にて、酸素化した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ，９５％Ｏ2及び５％ＣＯ2）を用いて一定の灌流を行った。人工脳脊髄液は、１２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１．２５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、２０ｍＭグルコース、及び２００μＭ  Ｔｒｏｌｏｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）を含む。
【００４５】
結果を図１に示す。図１ａは、ＰＳＤ−９５Δ１−２（図中、「ＰＳＤΔ１．２」と表記）とＤＴＥ配列を含む核酸プローブ（ＣとＥ）がプローブの不均衡な分布に必要十分であることを示す（中央の矢頭）。図１ｂは、本発明の核酸プローブ（３段目に「ＡＳ−ＰａＲａｃ１−ｍＲＦＰ」と表記）が、従来技術の「ＳＥＰ−ＧｌｕＡ１」（２段目）と同程度にスパインの一部に蓄積することが分かる。ｍＴａｑ（ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ）、ＳＥＰ−ＧｌｕＡ１、及びＡＳ−ＰａＲａｃ１−ｍＲＦＰをコトランスフェクトされたニューロンを３６時間、遺伝子発現させた。３６時間中、増強されたスパインがＳＥＰ−ＧｌｕＡ１によって視覚化された（矢頭）。図１ｃは、フォルスコリン（ＦＳＫ）及びアニソマイシンの有無によるグルタミン酸アンケージングによる単一のスパイン増強を画像化したものである。フォルスコリンの存在下でグルタミン酸アンケージングによってスパインは増加したが（図１ｃの中央）、これはアニソマイシンの存在下で消失したことから、核酸プローブは、該プローブからのタンパク質発現（蓄積）がシナプス増大と相関し、増大したシナプスを特異的に視覚化できることが示唆された。
【００４６】
（２）インビボでのシナプス増強の可視化
マウスの運動学習に基づく、核酸プローブのスパインへの蓄積について検討した。核酸プローブからの遺伝子発現は、シナプス活動応答エレメント（ＳＡＲＥ）とＡｒｃプロモーターの調節下で転写されるようにした。Ａｒｃプロモーターは、一次運動野（Ｍ１）の皮質層ＩＩ／ＩＩＩにおける錯体ニューロンにおいて活性に依存した転写を促すプロモーターである。ニューロンの長期増強は、運動学習により誘導される。マウスの皮質に、上記核酸プローブを含む発現ベクターを注入し、ロタロッドを用いた学習によって誘発されたニューロンの活性化を学習の前後において定量的に比較した。リポータータンパク質からの蛍光の検出には、２光子レーザー顕微鏡を用いて行った。結果を図２にします。図中、「Ｅｎｌａｒｇｅｄ」はスパインの増大を示し、スパインヘッド体積増加分が５０％以上のものを意味する。「Ｎｅｗ」は学習によって新たに出現したスパインを意味する。「Ｓｈｒｕｎｋ」はスパインの縮小を示し、スパインヘッド体積減少分が５０％以上のものを意味する。「Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ」はスパインの消滅を意味する。また、「Ｎｏ  ｃｈａｎｇｅｄ」はスパインの増大及び縮小等が観察されずに維持され、スパインヘッド体積の増加分及び減少分が５０％未満のものを意味する。この図からも分かるように、核酸プローブは、新たに出現したスパインと増大したスパインに特異的に標識し、それぞれの感度は、８３±７．９％及び６９±３．０％であった。このことから、本発明の核酸プローブは、学習によって増強されたシナプスに特異的に蓄積され、非常に高い感度で視覚化することができることを示唆した。
【００４７】
次に、インビボにおいて、マウスにおいて学習に応じた核酸プローブ蓄積の時空間的動力学を検討した。核酸プローブを子宮内エレクトロポレーションによって、ＩＩ／ＩＩＩ相の錯体ニューロンに疎らに形質導入した。頭蓋窓をＭ１皮質を覆うように作製した。頭蓋窓を作製してから１カ月後、ロタロッドトレーニング前後で画像化を試みた。図３のパネルにおいて、「Ｂｅｆｏｒｅ」学習の列は、学習の１日前に存在していた核酸プローブによって特定された、増強されたスパインを示し、順に、学習直後（「学習」期間）、学習の１日後（「Ａｆｔｅｒ−１」）、及び学習の２日後（「Ａｆｔｅｒ−２」）の増強されたスパインを示す。特に注目すべきは、ロタロッドトレーニングによる学習直後において、シナプス増強が盛んであり（０日目）、学習後にはスパインが大きくなっていることが分かる（２日後）。
【００４８】
続いて、学習に対してシナプスの必要性を実証するために、Ｒａｃ１の長期活性化がスパイン収縮を顕著に誘導するという減少を利用した。図４は、頭部を固定した新皮質の光活性化による実験手段の概略図（図４ａ）と典型的な画像（図４ｂ）を示す。また、自由に動き回る動物の光活性化の実験手段の概略図（図４ｃ）とｚスタック画像（図４ｄ）を示す。ＰａＲａｃ１を組み込んだ核酸プローブ子宮内エレクトロポレーションによってマウスのＩＩ／ＩＩＩ相ニューロンに導入し、ロタロッドトレーニングを行った。各脳半球において少なくとも０．２ｍｍ2領域を光（４６５ｎｍ）で照射した。その結果、核酸プローブが導入されたスパインでは、光照射によって縮小していることが分かる。一方、該プローブが導入されていないスパインでは、光照射による影響はなかった。
【００４９】
さらに、ロタロッドトレーニングを行った後のマウスに光照射した場合の、学習によって増大したスパインの縮小とマウスの運動学習能力の相関について検討した。図５ａに実験設計を示す。マウスのＭ１にＡＡＶベクターを注入後、ロタロッドトレーニングを行った。異なる光照射時期により３つのグループ（プロトコール１〜３）に分けた。ロタロッドトレーニング後のタスク性能の改善について、トレーニング前、トレーニング直後、及び光照射後において、マウスが落下するまでの時間を測定した。図５ｂは、プロトコール１において施行されるマウスに導入されるベクターの相違によって、３つのグループに分けた（左：ｍＲＦＰ単独（対照）、中央：ＤＴＥを含まない核酸ベクター、右：ＤＴＥを含む核酸ベクター）。図５ｃ及びｄは、それぞれプロコール２及び３に対応するが、導入されるベクターは、いずれもＤＴＥを含む核酸ベクターを使用した。図５ｃでは、マウスの落下時間が、トレーニング前と比較してトレーニング後には顕著に改善されたが、トレーニングの１日後の光照射により落下時間がトレーニング前と同程度までに短くなることから、１日では学習が定着していないことが分かる。これに対して、図５ｄでは、トレーニングの２日後に光照射した場合であっても落下時間が短くなることなく、学習が定着した様子が分かる。
【００５０】
本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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