(57)【要約】      （修正有）【課題】細胞と培地の相性を評価し、細胞及び培地の最適化条件を選定し細胞の安定的に培養する条件を定量的に求める方法の提供。【解決手段】細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の細胞の発現量に関する数値を求める。第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の細胞の発現量に関する数値を求める。第１の要素と細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフ化する。第１の要素と細胞の発現数に関する数値に関してプロットされたグラフにおける囲まれた領域を用いて，第１の要素に関する細胞の安定条件を求める。【選択図】図１
2016013102.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の安定条件を求める方法であって，
前記細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の前記細胞の発現量に関する数値を求める工程と，
第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の前記細胞の発現量に関する数値を求める工程と，
第１の要素と前記細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフ化する工程と，
前記第１の要素と前記細胞の発現数に関する数値に関してプロットされたグラフにおける囲まれた領域を用いて，第１の要素に関する前記細胞の安定条件を求める方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって，
前記細胞の発現量に関する数値は，トランスクリプトームの情報エントロピーである，
方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって，
前記細胞の安定条件は，前記細胞の遺伝子発現量の変動が小さい条件であり，
前記細胞の環境は，細胞の培地であり，
第１の要素は，前記細胞の培地に含まれる所定の薬剤の濃度である，
方法。
【請求項４】
コンピュータを，
細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の前記細胞の発現量に関する数値を入力する手段と，
第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の前記発現量に関する数値を入力する手段，
入力された第１の要素と前記細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフを得る手段，
前記グラフにおける囲まれた領域を用いて，第１の要素に関する前記細胞の安定条件を求める手段と，
して機能させるためのコンピュータ読み取り可能なプログラム。
【請求項５】
請求項４に記載のプログラムを記憶したコンピュータが読み取り可能な情報記録媒体。
【請求項６】
請求項５に記載のプログラムを実装したコンピュータ。
【請求項７】
コンピュータを用いた細胞の安定条件を求める方法であって，
前記コンピュータに，前記細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の前記細胞の発現量に関する数値を入力する工程と，
前記コンピュータに，第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の前記発現量に関する数値を入力する程と，
前記コンピュータが，入力された第１の要素と前記細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフを得る工程と，
前記コンピュータが，前記グラフにおける囲まれた領域を用いて，第１の要素に関する前記細胞の安定条件を求める工程と，
を含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって，
前記コンピュータが，前記グラフにおける囲まれた領域の面積を求める工程を更に含み，
前記コンピュータが，前記面積を用いて，第１の要素に関する前記細胞の安定条件を求める，方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
特開２０１４−７５９９５号公報には，トランスクリプトームを用いた実験区の選定方法が開示されている。この方法は，トランスクリプトームを用いることで，培地の各種条件を含めた実験のための最適化条件を効果的に予測することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】特開２０１４−７５９９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記の方法は，有益な方法である。しかし，たとえば，培養に用いる培地の選択などによって，遺伝子の発現量にばらつきが生ずる場合がある。そのような場合，上記の方法では，非常に高い確度をもって最適条件を選定することが難しい事態も生ずる。さらに，上記の方法では，所定の条件を定量的に評価することが難しい。
【０００４】
そこで，本発明は，最適化条件を選定するための上記とは別の方法を提供することを目的とする。特に本発明は，細胞と培地との相性を評価することで，遺伝子発現のばらつきを抑え，細胞及び培地の最適化条件を選定する方法を提供することを目的とする。また本発明は，安定性を定量的に評価する方法を提供することを目的とする。さらに本発明は，そのような最適化を行うことができるプログラムや，そのようなプログラムを記録した情報記録媒体，そのようなプログラムを実装したコンピュータを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は，基本的には，ある条件を増加させた場合における細胞の発現量に関連する数値（たとえば，トランスクリプトームの情報エントロピー，遺伝子の発現量）をプロットしたものと，ある条件を減少させた場合の上記数値をプロットしたものによって囲まれる領域の面積を用いることで，細胞の安定条件を求めることができるという実施例による知見に基づくものである。
【０００６】
本発明の第１の側面は，細胞の安定条件を求める方法である。この方法は，ある要素を増加させた際と減少させた際の細胞の発現量に関する数値を求めて，それぞれをプロットする。そして，プロットされた２つのグラフに囲まれた領域を用いて，細胞の安定条件を求める。この際にこの領域の形状や面積を用いることで，細胞の安定条件を定量的に評価できる。
【０００７】
この方法は，細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の細胞の発現量に関する数値を求める工程を含む。
また，この方法は，第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の細胞の発現量に関する数値を求める工程を含む。
さらに，この方法は，第１の要素と細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフ化する工程を含む。
そして，この方法は，第１の要素と細胞の発現数に関する数値に関してプロットされたグラフにおける囲まれた領域を用いて，第１の要素に関する細胞の安定条件を求める工程を含む。具体的には，囲まれた領域の面積（又は形状）を他の測定例において求めた面積（又は形状）と比較することで，グラフを求めた条件の安定性を評価する。
【０００８】
細胞の安定条件の例は，細胞の遺伝子発現量の変動が小さい条件である。細胞の環境の例は，細胞の培地である。そして，第１の要素の例は，細胞の培地に含まれる所定の薬剤の濃度である。
【０００９】
金属のヒステリシスに相当するようなグラフを用いて，そのグラフで囲まれた領域を分析することで，容易に，所定の条件が系に与える変動の少ない条件であるか否かを判定できる。
【００１０】
本発明の第２の側面は，プログラムに関する。このプログラムは，コンピュータを，数値入力手段，グラフ取得手段，及び安定条件判断手段として機能させるためのものである。すなわち，数値入力手段は，細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の細胞の発現量に関する数値を入力するとともに，
第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の発現量に関する数値を入力するための手段である。
次に，グラフ取得手段は，入力された第１の要素と細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフを得るための手段である。
そして，安定条件判断手段は，グラフにおける囲まれた領域を用いて，第１の要素に関する細胞の安定条件を求めるための手段である。この手段は，たとえば，グラフにおける囲まれた領域の面積や形状を用いて安定条件を評価する。
【００１１】
この側面の例は，上記したプログラムを記憶したコンピュータが読み取り可能な情報記録媒体や，上記したプログラムを実装したコンピュータに関する。
【００１２】
この側面は，上記したコンピュータを用いた細胞の安定条件を求める方法をも提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は，特開２０１４−７５９９５号公報に開示された方法とは別の，最適化条件を選定するための方法を提供できる。特に本発明は，細胞と培地との相性を評価することで，遺伝子発現のばらつきを抑え，細胞及び培地の最適化条件を選定する方法を提供するこができる。本発明は，安定化条件を面積を用いて評価する場合，面積を比較することで，たとえば遺伝子発現の安定性を定量的に評価できる。さらに本発明は，そのような最適化を行うことができるプログラムや，そのようなプログラムを記録した情報記録媒体，そのようなプログラムを実装したコンピュータを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は，本発明の方法を実現するコンピュータのブロック図である。
【図２】図２は，第１の要素と細胞の発現数に関する数値をプロットしたグラフの例である。
【図３】図３は，実施例におけるランスクリプトームの情報エントロピー量と薬剤濃度をプロットした位相図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
【００１６】
本発明の第１の側面は，細胞の安定条件を求める方法である。この方法は，ある要素を増加させた際と減少させた際の細胞の発現量に関する数値を求めて，それぞれをプロットする。そして，プロットされた２つのグラフに囲まれた部分の面積を求めて，細胞の安定条件を求める。
【００１７】
細胞の安定条件における細胞の例は，生体由来の細胞，臓器，体液及び微生物である。
【００１８】
細胞の安定条件における安定条件は，たとえば，遺伝子発現が安定的な条件（ぶれが小さい条件），細胞を好ましく培養又は保存することができる条件である。
【００１９】
この方法は，細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の細胞の発現量に関する数値を求める工程を含む。この工程は，たとえば，ウェット系において，適宜試薬の濃度を変えて細胞を培養した上で，細胞の発現量に関する数値を測定すればよい。
【００２０】
第１の要素の例は，培地におけるある試薬である。たとえば，細胞培養に用いられる培地に添加する試薬の量をいくつか離散的に（又は等差数列的に）増加させる。そして，それぞれの数値における細胞の発現量に関する数値を求めればよい。細胞の発現量に関する数値を求める方法は，公知である。
【００２１】
細胞の発現量に関する数値の例は，トランスクリプトーム量，トランスクリプトームの情報エントロピー，遺伝子の発現量を示すバンドの強度，遺伝子の発現量，生存細胞数，である。これらの数値は絶対的な数値である必要はなく，ある条件で求めた値を参照値とした相対値であってもよい。細胞の発現量に関する数値を測定するために，細胞の発現量（たとえば，培地の単位体積当たりの細胞の量）を測定してもよい。細胞の発現量自体は，たとえば，特許５２７３６５９号公報に開示されているように，プロテオーム解析，ウエスタンブロット及び免疫組織化学染色法等を用いて測定すればよい。細胞の発現量に関する数値の例は，トランスクリプトームの情報エントロピーである。トランスクリプトームの情報エントロピーを求める方法はすでに知られており，たとえば，特開２０１４−７５９９５号公報に開示された方法を用いることで，情報エントロピーを求めることができる。
【００２２】
この方法は，第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の細胞の発現量に関する数値を求める工程を含む。
【００２３】
この工程は，先に説明した工程と逆の工程である。つまり，ある要素を次第に減少させつつ，細胞の発現量に関する数値を求める。または，ある要素の値を一度高めたのちに，その要素の濃度を低い値とした複数のものにおける細胞の発現量に関する数値を求めてもよい。
【００２４】
次に，第１の要素と細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフ化する。この方法は，第１の要素と細胞の発現数に関する数値に関してプロットされたグラフにおける囲まれた領域を用いて，第１の要素に関する細胞の安定条件を求める工程を含む。具体的には，囲まれた領域の面積を他の測定例において求めた面積と比較することで，グラフを求めた条件が安定か否かを評価する。
【００２５】
細胞の安定条件の例は，細胞の遺伝子発現量の変動が小さい条件である。細胞の環境の例は，細胞の培地である。そして，第１の要素の例は，細胞の培地に含まれる所定の薬剤の濃度である。
【００２６】
細胞の安定条件の上記とは別の例は，細胞を保存する際の細胞の劣化が少ない条件である。この場合，細胞の環境の例は，細胞の保存液である。そして，第１の要素の例は，細胞の保存液に含まれる所定の薬剤の濃度である。
【００２７】
細胞の安定条件の上記とは別の例は，細胞を培養する際の細胞の増殖速度が一定である条件である。この場合，細胞の環境の例は，培地添加剤を加えた細胞の培地である。そして，第１の要素の例は，培地添加剤を加えた細胞の培地に含まれる所定の薬剤の濃度である。
【００２８】
金属のヒステリシスに相当するようなグラフを用いて，そのグラフで囲まれた領域を分析することで，容易に，所定の条件が系に与える変動の少ない条件であるか否かを判定できる。
【００２９】
本発明は，コンピュータによって実現することができるので，以下コンピュータを用いて本発明を実現する方法について説明する。この例では，細胞を培養する際に，培地に添加される薬剤の濃度を変動させ，その薬剤がその細胞の培養に安定であるか否か評価する。
【００３０】
本発明の方法は，プログラムによって実現できる。このプログラムは，コンピュータを，数値入力手段，グラフ取得手段，及び安定条件判断手段として機能させるためのものである。
【００３１】
図１は，本発明の方法を実現するコンピュータのブロック図である。図１に示されるように，このプログラムが実装されたコンピュータは，数値入力手段１１，グラフ取得手段１３，及び安定条件判断手段１５を有する。これらの要素は，上方の授受を行うことができるように接続されるほか，コンピュータ外部と情報の授受を行うことができるように入出力手段を有している。特に図示しないが，コンピュータは，入出力装置，記憶装置，演算装置，及び制御装置を具備する。そして，各要素はバスなどで接続され，情報の授受を行うことができるようにされている。本発明のプログラムは，たとえば，制御プログラムとして記憶装置に格納される。本発明のコンピュータは，たとえば，以下のように動作する。入力装置から何らかの指示が入力される。すると，制御装置は，記憶装置に格納されたプログラムを読み出す。そして，入力情報を用いるとともに，適宜記憶装置に記憶された情報を読み出し，演算装置で所定の演算を行う。そして，演算装置で行った演算結果を記憶装置に記憶する。そして，制御装置は，記憶装置に記憶された演算結果を入出力装置から出力する。このようにしてコンピュータは，所望の演算を行うことができる。
【００３２】
まず，ウェット系にて，同一条件の複数の培地を用意する。そして，その培地に，細胞をまき，培養を行う。また，その培養にある試薬の濃度を漸増させ，細胞培養を行う。ある試薬の濃度を漸増させつつ，細胞の発現量に関する数値を測定する。この際に，遺伝子発現量を測定してもよいし，トランスクリプトームの量を測定してもよい。トランスクリプトームの量を測定するためには，培地におけるリボ核酸を抽出し，リボ核酸を解読することで，細胞由来のトランスクリプトームの発現定量データを得てもよい。このトランスクリプトームの発現定量データを用いれば，トランスクリプトームの情報エントロピーを求めることができる。
【００３３】
数値入力手段は，細胞の環境に関連する第１の要素を増加させた際の細胞の発現量に関する数値を入力する。具体的に説明すると，たとえば，上記で説明したように，ある培地に添加するある試薬の濃度を初期値（たとえば０）から所定量ずつ増加させ，その都度，細胞の発現量又はそれに関する数値を測定する。先に説明したとおり，これらの数値を求める方法自体は公知である。なお，本発明のコンピュータは，これらの数値を求める装置と情報の授受を行うことができるように接続されており，求めた数値を，本発明のコンピュータに直接入力できるようにされていてもよい。そして，数値入力手段１１としての入力手段から，その数値がコンピュータに入力される。
【００３４】
一方，第１の要素を増加させた状態から，第１の要素を減少させ，第１の要素を減少させた際の細胞の発現量に関する数値も数値入力手段１１としての入力手段から，コンピュータに入力される。
【００３５】
数値入力手段１１により入力された，それぞれの第１の要素に関する数値，及びそれぞれの数値に関する細胞の発現量又はそれに関する数値は，適宜記憶部に記憶される。たとえば，第１の要素を増加させた際の第１の要素の濃度をａｘ１，ａｘ２，ａｘ３，．．．ａｘｎとし，それぞれに対応する細胞の発現量又はそれに関する数値をａｙ１，ａｙ２，ａｙ３，．．．ａｙｎとする。この際に，数列ａｘｎが等差数列をなさないものがよい。すなわち，濃度の値の差が一定でない方が，本発明において効率的にデータを取得できるため好ましい。一方，第１の要素を減少させた際の第１の要素の濃度をｂｘｎ，ｂｘ（ｎ−１），．．．ｂｘ１とし，それぞれに対応する細胞の発現量又はそれに関する数値をｂｙ１，ｂｙ２，ｂｙ３，．．．ｂｙ１とする。この場合，ａｘｎとｂｘｎが同じ値であることが好ましい。なお，本発明においては，上記の囲まれた部分を求めればよいため，第１の要素を減少させた際の第１の要素の濃度は，たとえば，ｂｙ１（すなわちａｘ１）まで減少させる必要はない。その場合，上記の囲まれた部分が生じた時点で第１の要素を減少させたデータを取る必要がない旨を出力するようにしてもよい。この演算は，演算部が，グラフが閉じたと判断した場合に，制御部が，記憶部に記憶した表示（これ以上データを必要としない旨の表示）を読み出して，入出力装置から出力すればよい。入出力装置にモニタが含まれている場合，その表示はモニタに表示されることとなる。
【００３６】
グラフ取得手段は，入力された第１の要素と細胞の発現数に関する数値をプロットしてグラフを得る。制御部は，記憶部に格納されたプログラムの指令を受けて，記憶部に記憶された上記の数値を読み出す。そのうえで，制御部は，演算部に対して，グラフを求める演算を行うよう指示を行う。この演算を実現する，図２は，第１の要素と細胞の発現数に関する数値をプロットしたグラフの例である。横軸は，第１の要素としての試薬の濃度を示し，縦軸は細胞の発現数に関する数値としてのトランスクリプトームの情報エントロピーである。このプロット自体は，コンピュータであれば容易に実現できる。たとえば，第１の要素の濃度をｘ軸（横軸）とし，細胞の発現量又はそれに関する数値をｙ軸（縦軸）として，各入力値をグラフ上に求め，隣接する各点を結ぶ演算を行えばよい。このようにすることで，入力された数値から，グラフを求めることができる。なお，視覚化する必要がない場合は，各点を結ぶ必要がない。
【００３７】
次に，制御部は，上記の入力値を用いて，安定化条件を判断する演算を演算部に行わせる。たとえば，上記と同じ培地において第１の要素以外の条件を異ならせた際の面積を記憶部に参照面積値として記憶しておく。そして，制御部は，演算部に対して，グラフを作成した場合における面積に相当する値を求めさせる。その上で制御部は，記憶部から参照面積値を読み出すとともに，読み出した参照面積を演算部に送る。演算部は，制御部からの制御指令に基づいて，参照面積と，求めた面積の数値を比較する。そして，求めた面積が参照面積より大きい場合は，安定ではないと判断する。また，求めた面積値は，第１の要素（及び第１の要素以外の要素）の条件とともに記憶部に記憶する。この記憶した面積地は，第１の要素以外の要素を変動させた際の安定性と比較するための定量データとして用いることができる。
【００３８】
次に，安定条件判断手段が面積を求める例を説明する。ここでいう面積とは，コンピュータにおける処理のための面積に相当する数値である。よって，たとえば，ａｘｎとｂｘｎが同じ値である場合であって，ａｙｎがｂｙｎより大きな値をとる場合は，それらの差をａｘｎにおける面積を示す値として，上記囲まれた部分におけるａｙｎとｂｙｎの差の集合を面積として求めてもよい。このようにすれば，容易に囲まれた部分における面積を求めることができる。
【００３９】
具体的に説明すると，図２のグラフは，ａｘ５，及びａｘ１３付近で２つのグラフが交わっている。そして，閉領域［ａｘ６，ａｘ１２］においては，ｂｙｎがａｙｎより上に位置している。よって，たとえば，ｎ−６〜１２について，ｂｙｎ−ａｙｎを求め，それらの合計を求めることで，囲まれた領域の面積を求めることができる。
【００４０】
また，囲まれた部分における幅を求めてそれが比較的狭い場合に安定であるといった囲まれた部分の形状に基づいて安定条件を評価することもできる。この場合，たとえば，囲まれた部分の両端に位置する細胞の発現量又はそれに関する数値を求め，それらの値の中間の値を示す横軸に平行な直線と，先に求めたグラフとの２つの交点を求め，２つの交点の幅（すなわちｘ座標の差）を形状に関する数値としてもよい。このようにすることで，囲まれた部分が広い形状を有しているか，狭い形状を有しているかを評価することができる。このようにして求めた情報を用いても上記の安定性を評価することができる。具体的に説明すれば，上記の囲まれた部分の面積が相対的に広いことは，細胞の安定の度合いが高いといえる。つまり，そのような広い面積を与える培養条件は，細胞の遺伝子を安定的に発現しやすい条件であるといえる。
【００４１】
本発明は，上記したプログラムを記憶したコンピュータが読み取り可能な情報記録媒体をも提供する。情報記録媒体の例は，ＣＤ−ＲＯＭ，ＤＶＤ，ＵＳＢメモリ，及びブルーレイディスクである。
【実施例１】
【００４２】
以下にA培地（MGM-450培地）を用いて行った実施例を示す。
１．組織培養
ｐ５０系統のカイコBombyx moriに新鮮なクワMorus bombycis の葉を与えて蚕室で飼育した。実験には終齢脱皮３日後の幼虫を用いた。カイコ幼虫は70%エタノールに10分間浸漬させることで表面殺菌を行い,無菌的に解剖して脂肪体を摘出した。４０頭のカイコ幼虫から摘出した２mm 四方のおよそ100片程度の脂肪体を２４つに分け,それぞれ 2ml のMGM−450培地 (Mitsuhashi and Inoue, 1988)中に静置した。培養器には35mmのプラスティックディッシュ (BD Biosciences, NJ, USA) を用いた。ディッシュの縁はパラフィルム (Pechiney Plastic Packaging Company, IL, USA)を巻いた。組織片は25℃下で80時間培養した。培養環境下の脂肪体の形態は実体顕微鏡(Leica EZ4D)と位相差顕微鏡 (Leica DM IRB) で観察した。
【００４３】
２.  化学物質
全ての薬剤は分析に適した等級のものを用いた。フェノバルビタールソディウム（Wako Pure Chemical, Osaka, Japan）は脱イオン水に溶かしたストック溶液を作成した。最終濃度に合わせてストック溶液の濃度は変更し,25mM,100mM,250mM,1mMのストックを作成した。最終濃度として,0.25mM,1mM,2.5mM,12.5mMとなるようにMGM-450培地に処理した。
【００４４】
３.  薬剤処理試験
薬剤処理試験は薬剤の添加されていない培地から,各濃度フェノバルビタールの添加された培地に取り替えることで行った。組織培養環境下のカイコ脂肪体を培養開始より80時間後にフェノバルビタールの添加された培地に移し,その後10時間培養した。コントロールとして,フェノバルビタールの添加していない培地を用いた。また最終フェノバルビタール濃度が 1mM である培地で10時間培養した脂肪体の一部を最終フェノバルビタール濃度が0mM, 0.25mM である培地に移し10時間培養した。薬剤処理試験は,25-30mgの脂肪体を1.5mlのプラスティックチューブ (Eppendorf, Le Pecq, France)に入れた300μlのTRIzol LS (Invitrogen, CA, USA)に浸漬させることによって終了させ,その後,実験に用いるまで-80℃下で保存した。
【００４５】
4.  RNA抽出
Total RNAはTRIzol LS のマニュアルに従って抽出した。TRIzol LS に浸漬したカイコ脂肪体をホモジナイズした後,25℃下で5分間静置した。その後0.2ml のクロロホルムを処理し,15秒間力強く振った。その後25℃下で15分間静置した後に12,000 x g ,4℃下で15分間遠心分離した。RNAを含む水層を新しいチューブに移し,水層と等量のイソプロピルアルコールを加え良く混和した後に12,000 x g ,4℃下で１５分間遠心分離した。RNAのペレットは75%エタノールで洗浄した後に40μlの水に溶かした。最終的に,各サンプル6.9μg以上のtotal RNA が得られた。ナノドロップを用いて測定したA260/280 比は1.98から2.03であった。また,アガロース電気泳動を行ってtotal RNAの品質を確認した (Jing et al., 2006)。解析に十分な量のtotal RNAが得られた。
【００４６】
5.  サンプル調整とシーケンシング(RNA-seq)
全てのサンプル調整をmRNA-seq Sample Preparation Kit (Illlumina, San Diego, CA, USA) を用い,マニュアルに従って行った。poly-T磁気ビーズを用いて,10μg のtotal RNA からmRNAを精製した。精製したmRNAを断片化し,cDNAに逆転写した。最終的にアダプターがcDNA断片にライゲーションされる前に,終末を修正し,アデニン塩基を付加した。ゲル切り出し法によって約200bp のフラグメントを抽出し,15サイクルのPCRを行って増幅させた。増幅させたサンプルはAgilent 2100 Bioanalyzer とDNA Nano Chip Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)を用いて品質確認を行った。それぞれのサンプルは10nM に調製し,その後の実験まで-40℃下で保存した。クラスター生成のために,8pMのサンプルをcBot に入れ,cBot Single Read Cluster Generation Kit (Illumina) を用いた。シーケンス反応はGenome Analyzer IIx (Illumina)を用いて行い,36サイクルのシーケンスを 36 Cycle Sequencing Kit v4 (Illumina) を用いて行った。
【００４７】
6.  データ解析とプログラム
シーケンス反応で得られた配列（リード）の品質確認はFast QC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) を用いて行った。リードはKAIKOBASE (Shimomura et al., 2009) (http://sgp.dna.affrc.go.jp/KAIKObase/)から取得したカイコゲノムデータ,アノテーションデータをリファレンスにし,CASAVA 1.7.0 (Hosseini et al., 2010) (Illumina) を用いてマッピングした。アライメントあたり最大２つのマッピングエラーを許容した。マルチヒットしたリードは除外した。一方で,最大で2つのNをもつリードを許容した。mRNA Sequencing Sample Preparation KIt (Illumina) のアダプターの配列,カイコリボソーム配列 (39 配列),カイコトランスファーRNA配列 (56 配列) についてはコンタミネーションとして扱った。全ての統計解析はR 3. 0. 1 を用いて行った。各トランスクリプトームデータについて情報エントロピーを算出させるためのR コマンドを下に示す。
【００４８】
entroshannon<-function(ｘ){
x2<-x/sum(x)
x3<-x2*log2(x2)
x4<-x3[!is.na(x3)]
−sum(x4)
}
【００４９】
7.  トランスクリプトームの情報エントロピー量と薬剤濃度をプロットした位相図上に現れるヒステリシス的閉曲線に囲まれる面積の測定
【００５０】
トランスクリプトームの情報エントロピーとトランスクリプトームデータの由来細胞の培養に用いられていた培地のフェノバルビタール最終濃度をプロットし, トランスクリプトームの情報エントロピー量と薬剤濃度をプロットした位相図上に現れるヒステリシス的閉曲線に囲まれる面積を測定した。0.227 であった。
【００５１】
同様にして、B培地においても トランスクリプトームの情報エントロピー量と薬剤濃度をプロットした位相図上に現れるヒステリシス的閉曲線に囲まれる面積の測定を行った結果、0.133 であった。
【００５２】
得られたグラフを図３に示す。A 培地を用いた試験では、情報エントロピーが同一であるフェノバルビタール最終濃度0 mMのトランスクリプトームデータと、0.25mMのトランスクリプトームデータの比較から、29個の発現変動遺伝子が検出された。一方、B培地を用いた試験では、同等の比較から、20個の発現変動遺伝子が検出された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は，細胞培養を行うバイオ・医薬の分野において利用されうる。  
【符号の説明】
【００５４】
１１  数値入力手段，  １３  グラフ取得手段，  １５  安定条件判断手段
【図１】
2016013102.tif 000003
【図２】
2016013102.tif 000004
【図３】
2016013102.tif 000005