(57)【要約】【課題】ウイルス複製が阻害されるように制御されることができる宿主細胞分子を同定する方法および抗ウイルス化合物を試験する方法、並びに、ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスが一因となるウイルス感染および/または疾患もしくは疾患状態を治療するための組成物、方法および医薬を提供する。【解決手段】本発明は、ウイルス感染、疾患および/または疾患状態を治療するための、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御または模倣することができる複数種抗ウイルス化合物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染、疾患および/または疾患状態を治療するための、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御または模倣することができる複数種抗ウイルス化合物。
【請求項２】
ウイルス感染、疾患および/または疾患状態の治療薬の製造のための、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御または模倣することができる複数種抗ウイルス化合物の使用。
【請求項３】
1以上のウイルス感染、疾患および/または疾患状態を患っている被験者を治療する方法であって、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御または模倣することができる複数種化合物の薬学的に有効な量を投与する段階を含む前記方法。
【請求項４】
複数種抗ウイルス化合物が2以上のウイルス種に対して有効である、請求項1、2または3記載の使用、使用する化合物または方法。
【請求項５】
制御/模倣の標的となる宿主細胞miRNA分子が、ウイルス感染に応答してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされない、請求項1〜4記載の使用、使用する化合物または方法。
【請求項６】
1以上の宿主細胞miRNA分子が、配列番号1;2;3;4;5;6;7;8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18、19;20;21;22;23;24;25および26からなる群から選択される、請求項1〜5記載の使用、使用する化合物または方法。
【請求項７】
複数種抗ウイルス化合物が、配列番号1;2;3;4;5;6;7;8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18、19;20および21からなる群から選択される、請求項1〜6記載の使用、使用する化合物または方法。
【請求項８】
1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御することができる複数種抗ウイルス化合物が、ウイルス感染、疾患および/または疾患状態の治療に有用であると同定された複数種抗ウイルスmiRNA分子のシード配列を含む、請求項1〜5記載の使用、使用する化合物または方法。
【請求項９】
シード配列が、配列番号1;2;3;4;5;6;7;8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18、19;20;21;22;23;24;25および26からなる群から選択されるmiRNA分子のシード配列を含む、請求項8記載の使用、使用する化合物または方法。
【請求項１０】
ウイルス増殖および/または複製を制御する宿主miRNA分子をスクリーニングまたは同定する方法であって、
(a)宿主細胞に宿主細胞miRNA制御化合物を導入し;
(b)宿主細胞と1以上のウイルスとを、前記ウイルス(単数または複数)による細胞の感染を許容する条件下で接触させ;
(c)前記宿主細胞におけるウイルス増殖/複製のいずれかの制御を同定する;
段階を含む前記方法において、制御されるウイルス増殖および/または複製が、宿主細胞miRNAがウイルス増殖/複製を制御することを示す前記方法。
【請求項１１】
段階(b)が、宿主細胞と2以上の異なる種のウイルスとを接触させることを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
複数種抗ウイルス活性のための宿主細胞miRNA制御化合物を試験する方法であって、
(a)宿主細胞または試験動物に宿主細胞miRNA制御化合物を導入し;
(b)宿主細胞または試験動物とウイルスの2以上の異なる種とを、前記ウイルスによる細胞または動物の感染を許容する条件下で接触させ;
(c)前記宿主細胞または試験動物におけるウイルス増殖/複製のいずれかの制御を同定する;
段階を含む前記方法において、制御されるウイルス増殖および/または複製が、宿主細胞miRNA制御化合物が複数種抗ウイルス活性を有しうることを示す前記方法。
【請求項１３】
宿主細胞miRNA制御化合物が、宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を増加させ、かつ/またはそれを減少させる化合物である、請求項10〜12記載の方法。
【請求項１４】
ウイルス増殖/複製の制御が、宿主細胞miRNA制御剤が導入されなかった細胞において生じるウイルス増殖および/または複製のレベルと比較して同定される、請求項10〜13のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１５】
宿主細胞miRNA制御化合物がmiRNA分子である、請求項10〜14のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１６】
同定された宿主細胞miRNAの制御が、複数のウイルス種の増殖および/または複製を阻害する、請求項10、11および13〜15のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞miRNA制御化合物が、トランスフェクションプロトコルおよび/またはベクターを用いて細胞に導入される、請求項10〜16のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項10〜17のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１９】
細胞内での2以上のウイルス種の増殖および/または複製を制御する方法であって、配列番号1;2;3;4;5;6;7;8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18、19;20;21;22;23;24;25および26からなる群から選択される1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御する段階を含む前記方法。
【請求項２０】
配列番号1;2;3;4;5;6;7;8;9;10;11;12;13;14;15;16;17;18、19;20および21からなる群から選択される宿主細胞miRNA配列の阻害が、細胞内でのウイルス増殖および/または複製を増加させる、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
配列番号22;23;24;25および26からなる群から選択される宿主miRNA分子の発現、活性および/または機能の増加が、細胞内でのウイルス増殖および/または複製を減少させる、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
抗ウイルス療法の潜在的標的としての宿主遺伝子、系または経路を同定する方法であって、
(a)請求項10、11および13〜18のいずれかに記載の方法を行って、ウイルス増殖および/または複製が阻害されるように制御されることができる宿主細胞miRNA分子を同定し;
(b)段階(a)で同定される宿主細胞miRNAによって標的とされる宿主遺伝子、細胞系および/または経路を同定する;
段階を含む前記方法において、段階(a)で同定される宿主細胞miRNAによって標的とされる宿主遺伝子、細胞系および/または経路が、潜在的抗ウイルス標的である前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス複製が阻害されるように制御されることができる宿主細胞分子を同定する方法および抗ウイルス化合物を試験する方法を提供する。さらに、本発明は、ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスが一因となるウイルス感染および/または疾患もしくは疾患状態を治療するための組成物、方法および医薬を提供する。
【背景技術】
【０００２】
現在市販されている抗ウイルス剤は、活性医薬成分として小分子を用い、特定の(タイプの)ウイルスに特異的である傾向がある。しかしながら、ランダム変異の導入などによって、ウイルスは、ウイルスタンパク質またはタンパク質の一部を標的とする抗ウイルス剤の効果を容易に逃れることができる。
【０００３】
マイクロRNA(miRNA)は、特定のメッセンジャーRNA転写産物に結合することによって真核遺伝子の発現を制御し、mRNAを分解させるか、またはその翻訳を抑制する小さなRNA(22nt)である(Bartel(2004))。マイクロRNAは、動物、植物およびウイルスのゲノムにコードされる。これらの遺伝子は、より大きな折り返し転写産物(一次miRNA)の一部としてRNAポリメラーゼIIによって転写され、これらはDroshaファミリーメンバーによって核内でプロセシングされて短いステムループ(pre-miRNA)を生じ、次いで細胞質に輸送され、Dicerファミリーメンバーによるプロセシングを受けて成熟miRNAを生じる。miRNAは、動物の遺伝子の1%を構成し、ヒトの遺伝子の最大30%を標的とすることができると推定されている(Lewis、Burgeら(2005))。所定のマイクロRNAは、数百もの遺伝子を標的にできる可能性があり、遺伝子標的の全ネットワークを制御することによって、種々の細胞過程に劇的な効果を発揮することができる(Giraldez、Mishimaら(2006))。マイクロRNAの機能(一般に宿主タンパク質のダウンレギュレーション)の機構は独特であるが、恐らくは、他の制御分子(例えば転写因子)に対して相補的であると思われる。マイクロRNAは、細胞の増殖、分化、発達およびニューロン機能に重要な役割を果たしていることが示されている。特定のmiRNAはまた、癌の形成、心血管疾患および代謝疾患にも関与していることが示されており、より最近ではウイルス感染にも関与していることが示されている。
【０００４】
マイクロRNAは、ウイルス-宿主相互作用の重要な構成要素であり、ウイルス感染の結果に影響することが示されているが、それについては概説(Ghosh、Mallickら(2008);GottweinおよびCullen(2008);Kumar(2008))がある。最近の研究により、特定の宿主マイクロRNAは、特定のウイルスの感染後にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ、これらの宿主マイクロRNAのあるものは、特定のウイルスに対する標的部位を有することが明らかになった。このことより、マイクロRNAは抗ウイルス防御を媒介することが示唆された。例えば、mir-32は、PFVゲノム領域を標的にすることによって、ヒト細胞における霊長類フォーミーウイルス(PFV)の複製を抑制することが示された(Lecellier、Dunoyerら(2005))。他の研究において、mir-24およびmir-93は、水疱性口内炎ウイルスを標的とし、マウスにおいてこのウイルスの複製を抑制することが示された(Otsuka、Jingら(2007))。しかしながら、ウイルスを標的とする宿主マイクロRNAは、“抗ウイルス性”であるよりはむしろ、実際には、ウイルス持続感染に利用されうる。進化の観点からは、宿主miRNAの標的部位がウイルスに不都合であるとすれば、ウイルスは容易に進化して、(単一変異を必要とするのみで)その部位を除去することができるであろう(Mahajan、Drakeら(2008))。例えば、宿主マイクロRNA(mir-28、mir-125b、mir-150、mir-223およびmir-382)は、HI RNAをダウンレギュレートし、免疫系によって除去されるのを防ぐためにウイルスがそれを活用できることが示された(Huang、Wangら(2007))。さらにまた、宿主マイクロRNAであるmir-122は、実際に、(未知の機構によって)ウイルス遺伝子をアップレギュレートするためにウイルスが活用できることが知られている(Jopling、Normanら(2006))。ヒトまたはマウスマイクロRNAは、ウイルス配列と相互作用することによってプロウイルスまたは抗ウイルス機能を果たすことができることを上記の研究は示している。しかしながら、ウイルスゲノムと特異的に相互作用するマイクロRNAをベースとする抗ウイルス療法は、いくつかの不都合を有する。1)ウイルスは変異/進化してマイクロRNA-標的相互作用を逃れることができること、2)同定されたマイクロRNAは、広い抗ウイルス潜在力を保持するというよりはむしろ、標的部位を有するウイルスに対する機能に限定されると考えられることなどである。
【０００５】
つい最近、ウイルス感染によって誘導されるかまたはダウンレギュレートされる細胞のマイクロRNAはまた、ウイルス感染の補因子である宿主遺伝子を制御することもできることが明らかにされた。例えば、HIV-1感染によってmir-17/92 miRNAクラスターが減少することが示され、ノックダウン実験によって、HIV-1の複製が行われることが示された。このマイクロRNAは、ヒストンアセチラーゼタンパク質PCAFを標的とするが、これはウイルスTatタンパク質の補因子である(Triboulet、Mariら(2007))。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ウイルス感染の治療の手段として、マイクロRNA(miRNA)分子を用いることができるという発見に基づく。より具体的には、本発明者らは、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現を制御することによって、宿主細胞内での1以上のウイルス種の複製および/または増殖を阻害することができることを見出した。
【０００７】
特定の宿主細胞miRNA分子は、過剰発現されるとき、抗ウイルス効果を示すことができることを本発明者らは観察した。これらの同じ宿主細胞miRNA分子が阻害されるとき、宿主細胞におけるウイルス増殖および/または複製は増加することができる。他の例において、特定の宿主細胞miRNA分子は親ウイルス性(pro-viral)であり、従って、これらの宿主細胞miRNAを阻害することによって抗ウイルス効果を得ることも可能である。
【０００８】
本明細書に用いられる種々の用語の定義は、本発明のすべての側面および実施形態に適用されることを理解すべきである。
【０００９】
第1の側面において、本発明は、ウイルス増殖および/または複製を制御する宿主miRNA分子をスクリーニングまたは同定する方法であって、
(a)宿主細胞に宿主細胞miRNA制御化合物を導入し;
(b)宿主細胞と1以上のウイルスとを、前記ウイルス(単数または複数)による細胞の感染を許容する条件下で接触させ;
(c)前記宿主細胞におけるウイルス増殖および/または複製のいずれかの制御を同定する;段階を含む前記方法において、
制御されるウイルス増殖および/または複製が、宿主細胞miRNA制御化合物がウイルス増殖および/または複製を制御できる宿主細胞miRNAを制御することを示す前記方法を提供する。
【００１０】
段階(b)が、宿主細胞と2以上の異なる種のウイルスとを接触させることを含む場合、制御されたとき、複数種または広域スペクトルの抗ウイルス活性をもたらす宿主miRNA分子を同定することを可能にできる。すなわち、本明細書記載の方法を用いて同定された宿主細胞miRNAを制御することによって、単に、1つのウイルス種の増殖および/または複製を阻害するだけでなく、複数の異なる(すなわち2以上の)ウイルス種の増殖および/または複製を阻害することができる。用語“複数種”が2以上の異なるウイルス種を含むことができることを理解すべきである。
【００１１】
理論に拘束されるものではないが、本明細書記載の方法によって同定された宿主miRNA分子は、ウイルス遺伝子よりはむしろ宿主細胞遺伝子を標的とし、そのようなものとして、ウイルスはこれらのmiRNA分子を制御する効果を逃れるために変異または進化することができないことを本発明者らは仮定する。
【００１２】
用語“制御”は、増加および/または減少発現(あるいは過剰または低発現)ばかりでなく、アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション事象を共に含むことを理解すべきである。さらにまた、用語“制御”は、機能および/または活性の任意の増加および/または減少を含む。例えば、“宿主細胞miRNA制御剤”は、特定の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を増加および/または減少させる化合物であることができる。他の実施形態において、宿主細胞miRNA分子の活性および/または機能を制御する化合物は、前記宿主細胞miRNA分子の効果を模倣または阻害する化合物であることができる。句“ウイルス増殖および/または複製の制御”は、ウイルスの増殖および/または複製レベルの任意の増加および/または減少を含む。同様に、“宿主細胞ｍｉＲＮＡ分子の制御”は、宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性の増加または減少を含む。
【００１３】
宿主miRNA分子および/またはウイルス増殖/複製の制御は、宿主細胞miRNA制御剤が導入されなかった細胞において生じる宿主細胞miRNA分子発現あるいはウイルス増殖および/または複製のレベルと比較して検出できる。これに加えて、あるいはこれに代えて、宿主細胞miRNA制御剤の代わりに、細胞に対照分子を導入することができる。対照分子は、宿主細胞miRNA分子を模倣または阻害しない分子という形をとることができる。
【００１４】
本発明の第1の側面によって提供される方法が、宿主細胞miRNA制御剤の導入を含まないか、あるいは対照分子を用いる場合、これらの方法を参照、標準または対照方法と呼ぶことができる。全ての場合において、本発明の第1の側面によって提供される方法から得られる結果を、参照、標準または対照方法から得られる結果と比較することができる。他の対照、参照または標準法は、細胞と1以上のウイルスとを接触させる段階(段階(b))を欠くことができる。
【００１５】
遺伝子発現を制御する、一本鎖RNA分子を含む用語“miRNA”は、当業者には明らかであろう。miRNA分子は、10〜50ヌクレオチド長、好ましくは15〜40ヌクレオチド長、より好ましくは16〜30ヌクレオチド長、よりさらに好ましくは17〜25ヌクレオチド長であることができる。一般的には、miRNA分子は19〜26ヌクレオチド長であることができる。miRNA分子に関するさらなる情報は、Lagos-Quintana, M., R. Rauhut, W. Lendeckel, and T. Tuschl. "The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14". Cell 75 (5): 84354 において見いだすことができる。
【００１６】
本発明の文脈において、用語“ウイルス(単数)”、“ウイルス(複数)”または“ウイルス性”は、例えば、DNAおよび/またはRNAウイルスを含むすべてのタイプのウイルスを含むものとする。そのようなものとして、本発明によって提供される方法は、制御されたとき、種々の異なる種の異なるウイルスの増殖および/または複製を阻害する宿主miRNA分子を同定することができる。すなわち、本発明の第1の側面によって提供される方法によって同定された宿主細胞miRNAの制御は、複数種または広域スペクトルの抗ウイルス活性、すなわち1つのウイルス種のみに特異的ではなく、多くの(すなわち2以上の)ウイルス種に特異的な抗ウイルス活性をもたらすことができる。
【００１７】
細胞は、マウスサイトメガロウイルス(MCMV)、マウスガンマヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型、セムリキ森林ウイルスおよびヒトサイトメガロウイルス(HCMV)からなる群から選択される1以上のウイルスと接触させることができる。使用できるウイルス(DNAおよび/またはRNA)の数は多く、的確な選択は、使用される細胞の特定のタイプによって決めることができることは、当業者にはには明らかであろう。
【００１８】
細胞への宿主細胞miRNA制御化合物の導入に含まれる段階は公知であり、例えば、トランスフェクションプロトコルまたはベクター(例えば真核遺伝子発現ベクター)、例えば転写カセット、プラスミドまたはウイルスベクターの使用を含むことができる。
【００１９】
一般的には、トランスフェクションプロトコル(リバーストランスフェクションプロトコルを含む)は、核酸などの化合物に対して細胞膜を透過性にする条件を用いる。例として、エレクトロポレーション、熱ショックおよび/またはリン酸カルシウムもしくは脂質ベース試薬などの化合物を用いて、細胞を宿主miRNAミミックおよび/または阻害分子でトランスフェクトする(またはリバーストランスフェクトする)ことを可能にすることができる。
【００２０】
さらに、またはその代わりに、遺伝子銃によって、細胞内に宿主miRNA制御化合物を導入することができる。この場合には、導入される核酸は、細胞に直接に送達されることができる粒子と結合しているか、または別の方法で結合していることができる。
【００２１】
一実施形態において、宿主miRNA制御化合物は、ベクターの形態で宿主細胞に導入されることができる。このことは、宿主細胞制御化合物が核酸(RNAまたはDNA)分子の形態を有する場合に特に有用である。この場合は、用語“ベクター”は、プラスミド、ウイルスゲノムまたは、細胞への核酸配列の導入に適した発現カセットの他の形態を含むことができる。適切なベクターに関するさらなる情報は、Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T., Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Harbor Spring Laboratory Press, second edition, 1989 において見いだすことができる。
【００２２】
用語“宿主細胞”は、ウイルス複製を維持することができる細胞を含み、そのようなものとして、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類(マウス、ラット、ウサギ、モルモットなど)細胞またはヒト細胞などを含む。植物細胞および/または昆虫細胞もまた、“宿主細胞”と見なされる。この点から、これらの方法に使用するのに、どのようなタイプの哺乳動物、植物または昆虫細胞も使用するのに適していることができることが理解されるべきである。特に、線維芽細胞などのヒト細胞、例えばMRC-5線維芽細胞は有用であることができる。他の実施形態において、マウス細胞、例えばNIH-3T3細胞を使用することができる。さらに、細胞の特定の選択は、その細胞と接触されるウイルス(単数または複数)の選択に影響しうることを理解すべきである。例えば、細胞がヒト細胞である場合、段階(b)では、ヒト細胞に感染し、その内部で増殖/複製することができるウイルス種を用いることが考えられる。同様に、細胞が植物または昆虫細胞である場合、ウイルス種の選択は、植物または昆虫細胞に感染し、その内部で増殖/複製することができる種を含むことが考えられる。
【００２３】
宿主細胞miRNA制御剤は、宿主細胞miRNA分子の配列を複製または模倣することができる。以下、このような化合物を“ミミック”miRNA分子と呼ぶ。ミミックmiRNA分子は、特定の宿主細胞miRNAの発現、活性および/または機能を増加またはアップレギュレートする手段として用いることができる。例として、細胞を、宿主細胞miRNAを模倣するmiRNA分子で接触または(リバース)トランスフェクトさせて、アップレギュレートまたは過剰発現させることができる。この方法において、宿主細胞の通常のmiRNA発現プロフィールが、ミミックmiRNA分子によって補充される。一実施形態において、ミミックmiRNA分子は核酸(DNAまたはRNA)を含み、それ自体がmiRNA分子であることができる。
【００２４】
他の実施形態において、宿主細胞miRNA制御剤は、特定の宿主細胞miRNAの発現を阻害またはダウンレギュレートすることができる。このような化合物は、核酸、例えば1以上の宿主細胞miRNA配列の発現を阻害するように特に設計されたオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。このタイプの化合物を、以下、“阻害化合物”と呼ぶ。適切な阻害化合物は、例えば、DNAまたはRNAオリゴヌクレオチド、好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むことができる。このようなsiRNAオリゴヌクレオチドは、何らかの方法で(例えば化学修飾によって)ヌクレアーゼ抵抗性であるように修飾された一本鎖または二本鎖RNA分子という形をとることができる。特定の宿主細胞miRNAの発現を減少またはダウンレギュレートするために、あるいはその宿主細胞マイクロRNAの活性を遮断するために、上記の阻害化合物のいずれかと宿主細胞とを接触させるか、またはそれで宿主細胞をトランスフェクトすることができる。天然型または野生型宿主細胞miRNA配列、例えば配列番号22〜26として本明細書に記載した配列を分析し、BIOPREDsiなどのアルゴリズムを活用すれば、当業者は、これらの遺伝子に対して最適のノックダウン効果を有する核酸配列を容易に決定またはコンピュータで予測することができる(例えば:http://www.biopredsi.org/start.htmlを参照のこと)。従って、当業者は、特定の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御することができるかどうかを決定するために、種々のオリゴヌクレオチドのアレイまたはライブラリーを作成し、試験することができる。
【００２５】
ウイルス複製および/または増殖のいずれかの制御を同定するために、ある種のレポーターエレメントを含むようにウイルスを改変することが可能である。例えば、ウイルスは、蛍光またはルシフェラーゼレポーター部分を含むように改変することができる。2以上のウイルスが細胞に加えられる場合、異なるレポーター部分を含むように各ウイルスを改変することができる。このような部分の発現は、例えば、光学プレートリーダーなどを用いて容易に検出できる。他の実施形態において、宿主細胞におけるウイルス増殖および/または複製の制御を検出するために、プラーク、補体、抗体、溶血および/または血球凝集アッセイを用いることができる。全ての場合において、検出される蛍光もしくはルシフェラーゼ部分、プラーク、溶血、細胞溶解および/または血球凝集の量もしくは数は、制御されるウイルス増殖および/または複製と関連している。
【００２６】
上記のように、制御されるウイルス増殖および/または複製は、本発明の第1の側面によって提供される方法から得られる結果と、宿主細胞miRNA制御化合物が導入されていない対照、標準または参照方法から得られる結果とを比較することによって容易に検出できる。一実施形態において、対照、標準または参照方法において観察されるウイルス増殖および/または複製のレベルと比較しての、増殖および/または複製のレベルの0.1〜3倍の増加または減少を、制御されるウイルス増殖および/または複製を示すために採用することができる。一般的には、対照、標準または参照方法において観察されるウイルス増殖および/または複製のレベルと比較しての、増殖および/または複製のレベルにおける1.5倍の増加または減少を、制御されるウイルス増殖および/または複製を示すために採用することができる。
【００２７】
他の側面において、本発明は、潜在的抗ウイルス化合物または薬物を試験する手段を提供する。例えば、抗ウイルス剤として使用できるかどうかを決定するために、miRNA制御剤を試験することができる。このような実験は、例えばげっ歯動物などの動物における、例えばin vitroまたはin vivoでの細胞系を用いて行うことができる。例として、宿主細胞miRNA制御化合物(例えばmiRNAミミックまたは阻害化合物)を、細胞内または動物内に導入することができる。その後、前述のように、宿主細胞または動物と1以上のウイルスとを接触させることができ、ウイルス増殖および/または複製のいずれかの制御を検出することができる。ウイルス増殖および/または複製を阻害するとして同定されたmiRNA制御剤は、ウイルス感染および/または疾患および/または疾患状態を治療する方法において、それを治療する化合物として、あるいはそれを治療する医薬の製造において使用することができる。宿主miRNA配列は、多くの場合保存されており、例えば、マウス系(生きたマウスなどを含む)においてウイルス増殖および/または複製を制御するmiRNA化合物は、ヒト系(例えばヒト細胞株)において、ヒトウイルスを用いてさらに試験することができる。特定の実施形態において、コレステロール修飾または結合miRNA化合物をこの方法を用いて試験することができる。さらにまた、制御されるウイルス増殖および/または複製の徴候に関して、肝臓、脾臓、心臓、肺および腎臓などの臓器を試験することができる。注射、吸入(例えば鼻吸入)または局所を含む任意の適切な経路で、試験抗ウイルス化合物を動物に投与することができる。
【００２８】
ウイルス増殖および/または複製を制御(例えば阻害)する手段として制御されることができる宿主細胞miRNA分子を同定する方法を提供することに加えて、本発明は、宿主細胞におけるウイルス増殖および/または複製を阻害するための制御の標的となることができる特定の宿主細胞miRNA分子を提供する。これらの宿主細胞miRNA分子は、本発明の第1の側面において記載された方法によって同定されることができる。宿主細胞miRNAは、複数の異なる種にわたって高度に保存された配列を有することができることを理解すべきである。他の動物、例えばげっ歯動物などで同定されるmiRNA分子のヒトホモログまたはオーソログはそのようなものとして存在できる。特定の動物種の細胞で同定されるmiRNA分子の配列を用いて、例えばヒト細胞における同一または相同配列を試験することが可能である。相同配列は、保存されたシード部位を有することができる。
【００２９】
複数の典型的な宿主miRNA分子を以下に列挙する。それぞれ、配列番号1〜26と呼んだ。
配列番号1〜26によって示されたmiRNA分子のそれぞれは、マウス細胞とヒト細胞との間で保存されていることに留意すべきである。
Mir-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG(配列番号1)
Mir-30a-3 UUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC(配列番号2)
Mir-28 AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG(配列番号3)
Mir-128 CACAGUGAACCGGUCUCUUU(配列番号4)
Mir-129-5 UUUUUGCGGUCUGGGCUUGC(配列番号5)
Mir-345 GCUGACCCCUAGUCCAGUGCUU(配列番号6)
Mir-222 AGCUACAUCUGGCUACUGGGU(配列番号7)
Mir-223 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA(配列番号8)
Mir-155 UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU(配列番号9)
Mir-27 UCACAGUGGCUAAGUUCUGC(配列番号10)
Mir-103 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA(配列番号11)
Mir-346 UGUCUGCCCGAGUGCCUGCCUCU(配列番号12)
Mir-542-5p(C) UCGGGGAUCAUCAUGUCA(配列番号13)
Mir-199a* UACAGUAGUCUGCACAUUGG(配列番号14)
Mir-24 GGCUCAGUUCAGCAGGAAC(配列番号15)
Mir-124 AAGGCACGCGGUGAAUGC(配列番号16)
Mir-34 AGGCAGUGUAAUUAGCUGAU(配列番号17)
Mir-452 UGUUUGCAGAGGAAACUGAG(配列番号18)
Mir-214 ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU(配列番号19)
Mir-107 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA(配列番号20)
Mir-744 UGCGGGGCUAGGGCUAACAGCA(配列番号21)
Mir-30a-5 GUAAACAUCCUCGACUGGA(配列番号22)
Mir-30 GUAAACAUCCUACACUCAG(配列番号23)
Mir-30 GUAAACAUCCUACACUCUCA(配列番号24)
Mir-30 GUAAACAUCCCCGACUGGA(配列番号25)
Mir-30 GUAAACAUCCUUGACUGG(配列番号26)
【００３０】
配列番号1〜21で示されるmiRNA分子を過剰発現、アップレギュレートまたは模倣することによって、あるいは、配列番号22〜26で示されるmiRNA分子を阻害することによって、宿主細胞におけるウイルス増殖および/または複製を阻害することが可能である。
【００３１】
1つのウイルス種のみの増殖および/または複製サイクルを特異的に標的化するmiRNA分子とは異なって、配列番号1〜26として列挙されるmiRNA分子は、宿主遺伝子、細胞系および/または経路を標的とし、それらの発現が制御されるとき、複数種(または広域スペクトル)抗ウイルス活性を示すことを理解すべきである。すなわち、本明細書記載のmiRNA分子のそれぞれは、宿主細胞における種々のウイルス種(すなわち2以上の種)の増殖および/または複製を阻害するのに有効である。
【００３２】
一実施形態において、宿主細胞におけるウイルス増殖および/または複製を阻害するための制御の標的となることができる特定の宿主細胞miRNA分子は、ウイルスによって制御される宿主細胞miRNA分子ではなく、かつ/またはウイルスの生活環におけるすべての段階で、すべての細胞型/組織において制御されない。言いかえれば、本発明によって提供される化合物は、ウイルス感染に応答してアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる宿主細胞miRNA分子を標的にすることはできない。例えば、Mir-17/92、Mir-28、Mir-93、Mir-100、Mir-101、Mir-122、Mir-125b、Mir-130b、Mir-146、Mir-150、Mir-155、Mir-203、Mir-218、Mir-223およびMir-382として知られるmiRNA分子は、本発明の範囲から除外することができる。
【００３３】
従って、本発明の第2の側面は、ウイルス感染、疾患および/または疾患状態の治療のための、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御することができる複数種抗ウイルス化合物を提供する。
【００３４】
本発明の第3の側面は、ウイルス感染、疾患および/または疾患状態の治療薬の製造のための、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現、機能および/または活性を制御することができる複数種抗ウイルス化合物を提供する。
【００３５】
本発明の第4の側面は、ウイルス感染、疾患および/または疾患状態を患っている被験者を治療する方法であって、1以上の宿主細胞miRNA分子の発現を制御することができる複数種抗ウイルス化合物の薬学的に有効な量を投与する段階を含む前記方法を提供する。
【００３６】
一実施形態において、1以上の宿主細胞miRNA分子は、上記の配列番号1〜26によって示される分子である。
【００３７】
本発明の第2、第3および第4の側面で述べた、宿主細胞miRNA分子を制御することができる化合物が、前述のmiRNAミミックまたは阻害化合物という形をとることができることは、当業者には明らかであろう。
【００３８】
配列番号1〜21として同定されたmiRNA分子に関して言えば、これらの配列を含む化合物は、宿主細胞において対応するmiRNA分子を模倣または過剰発現するために使用することができる。従って、本発明のさらなる側面は、(a)ウイルス感染の治療に使用するための、配列番号1〜21からなる群から選択される複数種抗ウイルス化合物;(b)ウイルス感染のの治療薬の製造のための、配列番号1〜21からなる群から選択される複数種抗ウイルス化合物の使用;および、(c)ウイルス感染を治療する方法であって、配列番号1〜21からなる群から選択される複数種抗ウイルス化合物を含む組成物の薬学的に有効な量を投与する段階を含む前記方法を提供する。
【００３９】
本発明によって提供される組成物、医薬および方法は、上記で配列番号1〜21として提供される配列の1以上を含むことができるか、または使用できることを理解すべきである。例えば、ウイルス感染を治療するための組成物または医薬は、本明細書記載のmiRNA配列の2以上を含むことができる。配列番号1〜21からなる化合物から選択される化合物をプールするかまたは併用する組成物、医薬および方法は、2以上の異なる種のウイルスに感染した患者を治療する場合に特に有用であることができる。さらにまた、本明細書記載の組成物、医薬および/または方法は、任意の数の既存の抗ウイルス化合物または治療薬と併用することができる。
【００４０】
一実施形態において、本発明によって提供されるmiRNA分子は、1以上のウイルス種によって引き起こされるかまたはそれが一因となるウイルス感染および/または疾患および/または疾患状態を治療するのに特に有用であると同定されたmiRNA分子のシード配列(see equence)を含むことができる。例えば、シード配列は、配列番号1〜26として上記したものを含むmiRNA分子の5’末端の最初の1〜8または2〜7ヌクレオチドを含むことができる。シード配列は、一般にmiRNA分子の機能部分であるため、miRNA配列の残りは高度に可変であることができることは当業者には明らかであろう。特に、本発明の一実施形態は、上記で配列番号10、11および20と呼んだmiRNA配列のシード配列を含むmiRNA分子に関する。
【００４１】
第6の側面において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤と組み合わせた、前述の化合物(例えば、配列番号1〜26を含む宿主細胞miRNA制御(ミミックおよび/または阻害)化合物)のいずれかを含む医薬組成物を提供する。このような組成物は、例えば、ウイルスによって引き起こされるか、またはウイルスが一因となるウイルス感染および/または疾患および/または疾患状態の治療に応用されることができる。
【００４２】
好ましくは、本発明によって提供される医薬組成物は、滅菌医薬組成物として製剤化される。適切な賦形剤、担体または希釈剤は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば血清アルブミン、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水塩もしくは電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコン(polyethylen lycon)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラートワックス、ポリエチレン-ポリプロピレン-ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００４３】
前記医薬製剤は、例えば、経口、非経口または局所投与に適した形態で製剤化できる。局所投与のために製剤化した医薬組成物は、水性もしくは非水性液体の軟膏、溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルションとして提供できる。
【００４４】
本発明によって提供される宿主細胞miRNA制御剤は、種々の異なる方法で投与のために製剤化できることは当業者には明らかであろう。例えば、本発明によって提供される宿主細胞miRNA制御剤(例えば配列番号1〜21として列挙したもの)は、細胞における導入および発現のためのベクターの形態で提供できる。
【００４５】
上記に加えて、本発明は、抗ウイルス療法の標的となることができる宿主遺伝子、細胞系または経路(例えばTol受容体、Tol様受容体などを含む自然免疫経路)を同定する手段を提供する。例えば、ウイルス増殖および/または複製を阻害されるように制御されることができる宿主細胞miRNA分子を同定するための本発明の第1の側面に記載の方法を用いることによって、宿主細胞miRNAによって標的とされる特定の遺伝子、細胞系および/または経路を同定することを可能にすることができる。本発明の第1の側面に記載の方法によって同定された宿主細胞miRNA分子によって結合または制御される遺伝子、細胞系および/または経路の同定は、抗ウイルス療法のさらなる標的を提供することができる。例として、本発明者らは、以下に列挙した遺伝子を含む遺伝子がmir-30によって制御されることを測定した:
(1)アンキリンリピート、ファミリーA(RFXANK様)、2
(2)イソクエン酸脱水素酵素1(NADP+)、可溶性
(3)kelch様20(ショウジョウバエ)
(4)LIMホメオボックスタンパク質8
(5)転写因子Dp1
(6)コラーゲン三重らせんリピート含有1
(7)グルコサミン-6-ホスファートデアミナーゼ1
(8)dpy-19様1(C.エレガンス)
(9)ニューロン特異的遺伝子ファミリーメンバー1
(10)EGF様ドメインおよび2つのフォリスタチン様ドメイン含有膜貫通タンパク質1
(11)twinfilin、アクチン結合タンパク質、ホモログ1(ショウジョウバエ)
(12)PRKC、アポトーシス、WT1、調節因子
(13)SETドメイン含有(リジンメチルトランスフェラーゼ)7
(14)cDNA配列BC031353
(15)グリコシルトランスフェラーゼ様
(16)LIMおよびカルポニン相同性ドメイン1
(17)スカベンジャー受容体クラスA、メンバー5(推定上)
(18)unc-5ホモログC(C.エレガンス)
(19)ジンクフィンガー、DHHCドメイン含有17
(20)c-abl癌遺伝子1、受容体チロシンキナーゼ
(21)ホスファチジルイノシトール輸送タンパク質、膜結合型2
(22)レチノイン酸受容体、γ
(23)LIMホメオボックスタンパク質9
(24)N-アセチルグルコサミン-1-ホスホジエステルα-N-アセチルグルコサミニダーゼ
(25)プロコラーゲン-プロリン、2-オキソグルタラート4-ジオキシゲナーゼ(プロリン4-ヒドロキシラーゼ)、αIIポリペプチド
(26)サルコグリカン、β(ジストロフィン結合糖タンパク質)
(27)SNAP結合タンパク質
(28)UDP-Gal:βGlcNAcβ1,4-ガラクトシルトランスフェラーゼ、ポリペプチド6
(29)dapperホモログ1、βカテニンアンタゴニスト(ゼノパス)
(30)ホスファチジルイノシトール-5-ホスファート4-キナーゼ、II型、α
(31)タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体13型
(32)ringフィンガータンパク質122
(33)ナトリウムチャネル、電位依存性、II型、α1
(34)WDリピートドメイン7
さらに、miR-199aによって制御される遺伝子/経路を図16で詳述する。
【００４６】
上記を考慮すれば、エフリン受容体シグナル伝達、トロンビンシグナル伝達、リン酸イノシトール代謝および細胞骨格組織化は、広範な親ウイルスまたは抗ウイルス細胞過程を制御する重要な経路であることは明らかである。
【００４７】
ウイルス感染、疾患および/または疾患状態を参照して本発明を説明してきたが、本明細書記載の方法、医薬および組成物は、他の病原体によって引き起こされるか、またはそれが一因となる感染、疾患および/または疾患状態にも応用できることは、当業者には明らかであろう。例えば、本発明の範囲は、細菌感染(特に細胞内細菌感染)および/または寄生虫感染(寄生原虫(例えばトリパノソーマなど)によって引き起こされるか、またはそれが一因となるものを含む)の治療にまで拡大することができる。さらに、本発明は、病原性細菌および/または病原性原虫などの他の病原体の複製、増殖および/または細胞内侵入を阻害するように制御されることができる宿主miRNA分子のスクリーニング方法または同定法を提供することができる。
【００４８】
発明の詳細な説明
ここで、以下の図面を参照して、本発明をさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】アゴニスト-アンタゴニストmiRNAスクリーニングを示す図である。(A)はスクリーニングプロトコルのあらましである。miRNAミミックまたは阻害剤でNIH-3T3細胞をリバーストランスフェクトし(6回の技術的反復試験)、60時間インキュベートし、次いで細胞生存率分析(n=3)またはGFPウイルスによる感染(n=3)を行った
【図１Ｂ】(B)NIH-3T3細胞におけるGFPレポーターウイルスの蛍光増殖曲線である。Y1軸はMCMVおよびMHV-68についての値を示し、Y2はHSV-1についての値を示し、エラーバーは3回の技術的反復試験の標準偏差値を示す。白線は、その後の分析に用いた時点を示す。
【図１Ｃ】(C)正規化された蛍光データ(MCMVについては感染後70時間(70hpi)での、MHV-68およびHSV-2については57hpiでの)である。陰性対照(RISCフリーsiRNA、C.エレガンスmiRミミックまたはC.エレガンスmiR阻害剤)は、GFPを標的にするsiRNAを用いた>50%ノックダウンと比較して、GFPシグナルに対し<10%の効果を示す(n=3、エラーバーは標準偏差値を示す)。
【図２】NIH-3T3細胞におけるMCMVのウイルス増殖曲線である(本ウイルスは、pola tarプレートリーダーで検出するためにGFPタンパク質をコードするように操作されている)。GFPシグナルは、これらの細胞における経時的なウイルス蓄積と相関する。本アッセイ開発の目的は、ウイルス複製に対するマイクロRNAの過剰発現または阻害の効果をセミハイスループットで試験することができることであった。このモデルは、“抗ウイルス”miRNAは、過剰発現されるとき(中性対照と比較して)、複製を阻害し、逆に、通常は複製を阻害するmiRNAは、阻害されるとき、複製の増加を引き起こすというものである。用いる中性対照は、マウスによってはコードされず、マウス遺伝子を標的にすることはないと考えられ、複製に対する効果を有さないと予想されるC.エレガンスマイクロRNAである。この図は2つの“ヒット”(1つは複製を減少させるもの、1つは複製を増加させるもの)を示す。我々は〜6日間の測定を行うが、標準偏差値はより長期での方が高く、従って、我々はウイルスが増殖の直線相にある、およそ〜70時間でのデータを分析する。
【図３】用いた他の2つのウイルス、MHVおよびHSV-1で得られた増殖曲線の例である。MCMVとは増殖動態が異なるため、我々は、ウイルスが増殖の直線相にあり、シグナル対バックグラウンド比が高い58時間でのデータを分析する。これらの曲線は、中性対照および陽性対照(GFPに対するsiRNA)を示す。
【図４】複製に対して>1.5または<1.5効果を有するヒットをオパール中に示した図である。左下象限にあるマイクロRNAは、治療戦略として合成試薬で模倣されることができる“抗ウイルス”マイクロRNAの候補と見なされる。miRNAファミリーの１つ、mir-30(mir-30a-5p、mir-30b、mir-30c、mir-30d、mir-30e)は、ウイルスの3つすべてにおける対照と比較して、複製において>1.5X増加をもたらした(上記のMCMVに関して示したデータ、これらは右上象限にある)。
【図５】ミミックライブラリーを用いて、3つすべてのウイルスに対して得られたGFPシグナルを示す図である(x軸は異なるmiRNAミミックであり、y軸は複製の程度を反映するGFPシグナルである)。示されているように、過剰発現されるとき、3つすべてのウイルスにおいて複製の減少をもたらすいくつかのマイクロRNAが存在する。過剰発現されるとき、複製の増加をもたらす他のマイクロRNA(mir-30ファミリー)が存在する。我々は、図5に記載されているようにカットオフを行った。
【図６】MCMVにおける“ヒット”の一部を示す図である。左のカラムにおいて、正規化された対照の蛍光値を示す。これらは、C.エレガンスマイクロRNAミミック(黒い棒)または阻害剤(灰色の棒)でトランスフェクトされた細胞におけるウイルス複製の量を反映する。陰影ボックスは、対照の2標準偏差値を示す。従って、これらのボックスの上または下の値は“ヒット”とみなされる。図のように、一部のmiRNAは、過剰発現されるとき、複製に顕著に影響を与える（“ミミックヒット”)。あるものは複製を減少させ、あるものは複製を増加させる。他のmiRNAは、阻害されるとき、複製に顕著に影響を与える(“阻害剤ヒット”)。過剰発現されるとき複製を減少させ、阻害されるとき複製を増加させるmiRNAは“ダブルヒット”である。これら2つの補完する結果を得ることによって、REALヒットのためのデータを検証/スクリーニングするのに役立つ。これらのダブルヒットは抗ウイルス薬として使用できるmiRNAと考えられる(in vivoでmiRNAを過剰発現させて感染を制御/治療する)。しかしながら、この細胞型においてすべてのmiRNAが発現されるわけではない。従って、阻害剤スクリーニングにおいては、偽陰性が生じ得る(miRNAが発現されない場合、それを阻害しても効果が現れないだろう)。従って、我々は、抗ウイルスマイクロRNA候補の同定のために主としてミミックデータを当てにする。さらに、ミミックの存在下で複製が増加し、かつ/または阻害剤の存在下で複製が減少する点で“親ウイルス性”であると考えられるmiRNAが一部存在する。これらは他のタイプの薬剤標的(このようなマイクロRNAの阻害が感染を制御する方法となる)と考えられる。
【図７】広域スペクトル抗ウイルスmiRNAの表示である。3つの異なるウイルスMCMV、MHV-68およびHSVに対して、図5で記載したのと同じ方法およびカットオフを用いた。これらの基準を用いて、ウイルス3つすべてに対して同じ効果(ダウンレギュレーション)を示す21のミミックのリストを得た。マイクロRNAの1ファミリーであるmir-30は、ウイルス3つすべてにおいて複製の>1.5倍アップレギュレーションをもたらした。
【図８】C127細胞およびMCMVでの最初のデータである。前述のようにウイルス増殖を測定したが、これらの条件下では速すぎる増殖動態に基づいて、51時間でデータを分析した(MOI=0.5で必要なシグナル/ノイズ比)。
【図９】MOI=0.5でHCMVに感染させたMRC-5ヒト線維芽細胞における予備的な結果である。感染58時間後に蛍光を測定した。
【図１０】MOI=0.5でルシフェラーゼレポーターを有するSFVに感染させたNIH-3T3細胞における予備的な結果である。感染10時間後にルシフェラーゼを測定した。
【図１１Ａ】25nm mir-30阻害剤またはmir-30ミミックで48時間、NIH-3T3細胞をリバーストランスフェクトし、次いでMCMV(GFPレポーターを有する)で感染させた。A)感染24時間後に視覚化した感染細胞である。
【図１１Ｂ】25nm mir-30阻害剤またはmir-30ミミックで48時間、NIH-3T3細胞をリバーストランスフェクトし、次いでMCMV(GFPレポーターを有する)で感染させた。B)48時間で、ミミックまたは阻害剤でトランスフェクトされた細胞からRNAを採取し、rt-pcrを行って、これらの条件下でmir-30dばかりでなく、mir-30ファミリーメンバー(mir-30)または、トランスフェクションによっては効果を生じないと考えられる対照宿主マイクロRNA(mir-16)の(相対)発現量を測定した。これにより、阻害剤による模倣および阻害(〜85%)によるmir-30dの過剰発現(〜40倍)が示される。
【図１２Ａ】(A)ヒトMRC-5細胞における、HCMVを用いる、miRNAの抗ウイルスおよび親ウイルス効果の検証である。
【図１２Ｂ】(B)レプリコン発現レニラを用いる、セムリキ森林ウイルスに対するmiRNAの抗ウイルスまたは親ウイルス効果の試験である。すべての実験において、n=4であり、エラーバーは標準偏差値を示す。
【図１３Ａ】MCMVまたはHCMVに応答したmiRNA発現の変化である。(A):MOI=3でMCMVに感染したマウス線維芽細胞NIH-3T3細胞(感染24時間後に採取した)またはMOI=3でHCMVに感染したヒト線維芽細胞MRC-5細胞(感染48時間後に採取した)から単離された全RNAのノーザンブロット分析である。
【図１３Ｂ】MCMVまたはHCMVに応答したmiRNA発現の変化である。(B):MOI=3でMCMVに感染したマウス線維芽細胞NIH-3T3細胞(感染24時間後に採取した)またはMOI=3でHCMVに感染したヒト線維芽細胞MRC-5細胞(感染48時間後に採取した)から単離された全RNAのノーザンブロット分析である。
【図１４−１】マウスおよびヒト細胞の両方における、miRNA(個々のおよびプールされた)の抗ウイルスおよび親ウイルス性の検証である。C:COX-2は、マウスおよびヒト細胞の両方において、miR-199a-3p過剰発現によってダウンレギュレートされ、miR-199a-3p阻害によってアップレギュレートされる。
【図１４−２】マウスおよびヒト細胞の両方における、miRNA(個々のおよびプールされた)の抗ウイルスおよび親ウイルス性の検証である。C:COX-2は、マウスおよびヒト細胞の両方において、miR-199a-3p過剰発現によってダウンレギュレートされ、miR-199a-3p阻害によってアップレギュレートされる。
【図１４−３】マウスおよびヒト細胞の両方における、miRNA(個々のおよびプールされた)の抗ウイルスおよび親ウイルス性の検証である。C:COX-2は、マウスおよびヒト細胞の両方において、miR-199a-3p過剰発現によってダウンレギュレートされ、miR-199a-3p阻害によってアップレギュレートされる。
【図１４−４】マウスおよびヒト細胞の両方における、miRNA(個々のおよびプールされた)の抗ウイルスおよび親ウイルス性の検証である。C:COX-2は、マウスおよびヒト細胞の両方において、miR-199a-3p過剰発現によってダウンレギュレートされ、miR-199a-3p阻害によってアップレギュレートされる。
【図１４−５】マウスおよびヒト細胞の両方における、miRNA(個々のおよびプールされた)の抗ウイルスおよび親ウイルス性の検証である。C:COX-2は、マウスおよびヒト細胞の両方において、miR-199a-3p過剰発現によってダウンレギュレートされ、miR-199a-3p阻害によってアップレギュレートされる。
【図１５】miR-199aによって制御される遺伝子である。従って、miRNAは、ウイルス生活環に重要な/必要な複数のネットワークを同時に制御する抗ウイルス剤として機能することができる。
【００５０】
材料および方法
細胞およびウイルス
本研究に用いたウイルスについては、他に記載がある。簡潔に言えば、mcmv-gfpは、mcmv ie2遺伝子[1](前初期制御下の遺伝子であり、組織培養における増殖には必須ではない[2])の前にあるgfp発現カセットをコードする。野生型およびmcmv-gfpウイルスは、NIH-3T3で増殖させ、他で記載されているようにp53 MEFで力価を測定した[3]。MHV-gfpウイルスは、正式には“LHΔgfp”と呼ばれ、ヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターによって駆動されるgfpをコードするゲノムの5’末端に挿入された挿入カセットを含む。このカセットで、ウイルス因子m1およびvtRNAをコードするnt 1-3223と交換する(この欠失によって、in vitroでのウイルス増殖動態は顕著には変化しない、B.Dutia、未公表データ)[4]。他で記載されているように、BHK-21細胞でLHΔgfpウイルスストックを作製した[5]。HSV-gfp27ウイルスは、ICP27遺伝子と置換し、天然ICP27プロモーターの調節下にあるgfpカセットをコードする[6]。
【００５１】
トランスフェクションおよびスクリーニングプロトコル
マイクロRNAミミックまたは阻害剤で、0.4%Dharmafect 1(トランスフェクション試薬)中、最終濃度25nMで、96ウェル当たり1.5X104細胞で、NIH-3T3細胞をリバーストランスフェクトした。脂質が4%になるように無血清培地(optimem)10uLに5分間希釈し、次いでmiRNAミミックと混合した。次いで、無血清培地(optimem)中で20分間ミミック+脂質(10uL+10uL)をインキュベートし、次いで10%仔牛血清を加えたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM;Invitrogen社)に細胞(1.875X10^4/mlで80uL)を添加した。次いでトランスフェクトされた細胞を37C、5%CO2で60時間インキュベートし、その後培地を除去して、MOI=0.2で細胞をウイルスに感染させた。使用したウイルスは、2%仔牛血清、DMEM培地+1%ペニシリン-ストレプトマイシンで、マウスサイトメガロウイルス(前初期制御下に挿入されたGFPを持つBAC由来株)、マウスガンマヘルペスウイルス(GFPレポーターを持つBAC由来株)または単純ヘルペスウイルス-1(GFPレポーターを持つBAC由来株)またはセムリキ森林ウイルス(ルシフェラーゼレポーター)であった。37C、5%CO2で1時間、細胞にウイルスを接種し、その後プレートをフリックしてウイルスを除去し、次いでフェノールレッド不含DMEM培地+1%ペニシリン-ストレプトマイシン(100uL)を添加した。プレートにガス透過膜を貼り付けて蒸発を防ぎ、プレートを37C、5%CO2で140時間までインキュベートした。蛍光プレートリーダーを用い、MCMV、MGHVおよびHSV-1感染細胞に関して、それぞれ線形増殖時間範囲(50〜80時間)において蛍光シグナルを測定した。セムリキ森林ウイルスでの感染に関しては、感染後2〜10時間においてルシフェラーゼを測定した。検証試験のために、マイクロRNAミミックまたは阻害剤で、0.3%リポフェクタミン2000(トランスフェクション試薬)中、最終濃度25nMで、96ウェル当たり1.5X104細胞で、C127細胞をリバーストランスフェクトし、10%仔牛血清、DMEM培地+1%ペニシリン-ストレプトマイシン中で維持し、次いでMCMVを感染させた(上記のように)。マイクロRNAミミックまたは阻害剤で、0.3%Dharmafect 1(トランスフェクション試薬)中、最終濃度25nMで、96ウェル当たり1.5X10^4細胞で、MRC-5細胞をリバーストランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞を37C、5%CO2で60時間インキュベートし、次いで培地を除去し、細胞をMOI=0.5でヒトサイトメガロウイルス(GFPレポーター)に感染させた。これらの条件下で、線形増殖範囲(感染後40〜70時間)において蛍光シグナルを測定した。
【００５２】
細胞生存率アッセイ
逆転写およびモック感染の後、細胞生存率に対するマウスmiRNAの効果を、カットオフとして80%を用い、cel itr lueアッセイ(Promega社)で評価した。miRNAミミックの一部は、リバーストランスフェクション中にNIH-3t3細胞が適切に接着する能力に影響を与えたが、このことはcel itr lue(このプロトコルにおいて、細胞は洗い流されるので)によっても同定することができ、視覚的検査によって確認された。毒性を有するかまたはプレートへの接着を妨げるmiRNA(試験された301の内26)は、さらなる分析から除外した。ウイルスアッセイにおいて“ヒット”として同定されたmiRNAミミックおよび阻害剤を、生存率への影響に関して上記のように再試験した。
【００５３】
データの正規化およびスクリーニングの分析
各ウイルスに関して、2つの独立した実験で、それぞれ最低限3回の技術的反復試験をおこなって、miRNAミミックおよび阻害剤ライブラリーをスクリーニングした。
【００５４】
正規化のために、各ウェルに関して、非感染細胞からのバックグラウンドシグナルを、対応するフォアグラウンドシグナルから差し引いた。次いで、データをlog2スケールに変換した。所定のスクリーニング内の各プレート間の蛍光強度の変化を、各プレート(トランスフェクトされていない細胞、RISCフリーsiRNA、C.エレガンス(C.elegans)miR-67ミミックおよびC.エレガンスmiR-67阻害剤でトランスフェクトされた細胞)上に含まれる対照ウェルの中央値に対して正規化した。各スクリーニングに、>50%のノックダウンを要求する、トランスフェクション効率の陽性対照(gf iRNA)を含めた。
【００５５】
インフルエンザウイルスプラークアッセイ
0.3%(脂質)のDharmaFECT 3を用い、6ウェルプレートにおいて、1x106細胞/ウェルで、25n iRNAを用いてMDCK細胞をリバーストランスフェクトした。トランスフェクション後48時間で、マウスに適応したインフルエンザウイルス(A/WSN/33)で細胞を感染させ、1時間インキュベートした。感染後、アガロース2%およびN-アセチルトリプシン0.1mg/mlを含む培地2mlを加えた。次いで、37c、5%Co2で感染細胞を3日間インキュベートした。次いで、10%中性緩衝化ホルマリンで細胞を24時間固定した。0.1%トルイジンブルーでの短時間の染色後にプラークを数えた。
【００５６】
Hep2細胞/HSV実験
0.3%(脂質)のDharmaFECT 3を用い、96ウェルプレート、1.5x104細胞/ウェル、25n iRNAを用いてHep2細胞をリバーストランスフェクトした。トランスフェクション後48時間で、moi=0.5で細胞をHSV-1(GFPウイルス)で感染させた。経時的に蛍光シグナルを測定した。
【００５７】
プーリング実験
miRNAプールの最終濃度が25nmになるように、プールにおけるmiRNAの数に基づいて各miRNAの濃度を調整した。他の個別のmiRNAと同様に、miRNAプールでトランスフェクトした。miR-23、24、27を試験するように選択した理由は、それらがすべて同じクラスターに由来するからである。
【００５８】
結果
アゴニスト-アンタゴニストmiRNAスクリーニング
【００５９】
ここで報告するアゴニスト-アンタゴニストスクリーニングプロトコルは、合成ミミックまたは阻害剤のトランスフェクションによってmiRNAを過剰発現または阻害させ、次いでウイルス増殖に対する影響を分析することを含む(GFPレポーターをコードするウイルスを用いて;図1A)。ヘルペスウイルスファミリーの3つすべて:マウスサイトメガロウイルス(MCMV)、マウスガンマヘルペスウイルス(MHV-68)および単純ヘルペスウイルス-1(HSV-1)の代表の複製を支持するマウス線維芽細胞株(NIH-3T3)でスクリーニングを行った(図1B)。これらのウイルスの進化距離(〜2億年[19])が大きいにもかかわらず、ウイルスの3つすべては、共通の宿主細胞プロセス(細胞周期、アポトーシス、インターフェロン応答)を必要とし、操作し、逃れるが、これらはmiRNAによって制御されることが予想され、in vitroで検査することができる。〜60〜70時間で検出される蛍光シグナルが、複数ラウンドの複製に基づき、それによって複製サイクルの任意の段階に対するmiRNAの影響が検出可能であるように、低い感染多重度(0.2〜0.5)で細胞を感染した。本スクリーニングアプローチにおける仮定の1つは、トランスフェクション単独ではウイルス複製に影響を与えないということである。このことは、C.エレガンスmiRNAミミックもしくは阻害剤または“RISCフリー”siRNA(これは細胞には取り込まれるが、RISCには組み込まれない)を用いるトランスフェクションによって確認される。図1Cに示すように、これらの試薬は、GFPに対するsiRNAでの>50%ノックダウンと比較して、GFPシグナルに対する10%未満の効果を示す。各プレートに対照を含め、蛍光強度におけるプレート間の変化を正規化した。細胞に対して一般に毒性をもたらすmiRNAミミックまたは阻害剤を考慮にいれるために、並行して生存率アッセイを行った。細胞への毒性および/または変化した接着性によって、26のmiRNAミミック(ライブラリーの8%に相当する)を分析から除外した。毒性とスコアされる阻害剤はなかった。
【００６０】
マウス線維芽細胞(NIH-3T3)における、マウスサイトメガロウイルス、マウスガンマヘルペスウイルスおよび単純ヘルペスウイルス-1の増殖に対するマウスマイクロRNAの効果
3つの異なるウイルス(マウスサイトメガロウイルス、マウスガンマヘルペスウイルスおよび単純ヘルペスウイルス-1)の増殖特性に対するマウスマイクロRNAの効果を、ゲノム全域にわたるmiRNAミミックライブラリーを用いてマウス線維芽細胞(NIH-3T3)で試験した。図2は、中性対照および代表的“ヒット”と比較したMCMVの増殖曲線を示し、図3は、中性対照および陽性対照(レポーターGFPに対するsiRNA)に対するMHVおよびHSV-1の増殖曲線を示す。
【００６１】
ヘルペスウイルスサブファミリーの3つすべてにおいて、4つのmiRNA(mir-199a、miR-214、miR-24およびmiR-103)が、最も高い信頼度の抗ウイルスマイクロRNAを代表する(miRNAが過剰発現される場合の増殖欠損およびmiRNAが阻害される場合のウイルスの増加量に基づく)。2つのmiRNA、miR-30bおよびmiR-30dは、反対の特性(過剰発現される場合の増殖増加および阻害される場合の増殖減少)を示す。この研究と発現分析とを組み合わせて、mir-199aおよびmiR-214(共通のクラスター由来である)は、マウスおよびヒト両方のサイトメガロウイルスにおいて、感染後ダウンレギュレートされることを我々は明らかにする。発現およびネットワーク分析により、mir-199a-3pは、免疫応答、細胞運動および免疫細胞トラフィッキングに関与する一連の遺伝子を制御することが示唆される。プーリング実験によって、クラスターを形成するmiRNA(miR-199a-5p、mir-199a-3pおよびmiR-214)は、ウイルス増殖能の阻害に相加効果を示すことができることがさらに明らかにされる。宿主miRNAは、ウイルス感染の制御可能な、かつ結果として起こる特徴であり、これらの分子が複数のウイルスに対して広範な抗ウイルス潜在能を保持する最初の根拠を示す。
【００６２】
マイクロRNAヒットを明らかにするために、図4に示すように、スクリーニングに関して所定のウイルスを用いて得られた正規化された蛍光値をプロットした。y軸は、1つのスクリーニングにおいて得られた値(n=3に基づく中央値)を示し、x軸は、もう1つの独立したスクリーニングにおいて得られた値を示す(図3は2つの独立したMCMVスクリーニングを示す)。2つのスクリーニングに関する2標準偏差値(点線)から外れたミミックは、外れ値であると予想されるため除外する。cell titre blueアッセイおよびウェルの視覚的検査に基づいて、毒性または接着効果を示したmiRNAもまた、この分析から除外する(全部で301の特異的マウスmiRNAの内、26を除外)。感染の前に細胞をトランスフェクトした場合、ウイルス3つすべてを用いた2つの独立したスクリーニングにおける複製に対して、全部で21のmiRNAが>1.5Xの減少を示し(以下の表1に記載)(図8参照)、3つすべてのウイルスにおける複製に対して、マイクロRNAのファミリーの1つ、mir-30が>1.5Xの増加を示した。
【００６３】
in vitroスクリーニング結果-阻害剤ライブラリー
マイクロRNA阻害剤のスクリーニングからの結果は、結果を確証するために用いることができる。しかしながら、これらの結果を、ヒットのいずれかを“除外する”ために用いないことが重要である。これには2つの理由がある。1)用いている細胞型において、すべてのマイクロRNAが発現されているわけではなく、従って阻害剤結果に複数の偽陰性が存在することが考えられること。2)マイクロRNAの抗ウイルス効果には、それらが内因性レベル以上に発現されることを必要としうること。
【００６４】
他の細胞型における検証
同じ親ウイルスまたは抗ウイルス機能を発揮するかどうかを測定するために、マイクロRNAを他の細胞型で試験する。NIH-3t3(線維芽細胞)細胞およびC127(上皮)細胞でスクリーニング(前述のように)を行った(図7参照)。配列番号1〜22で示したマイクロRNAの多くは、異なる細胞型において、同じ抗ウイルスまたは親ウイルス機能を示すことをこれらのスクリーニング結果は示している。これは、異なる細胞型においてmiRNA宿主標的が発現される有力な根拠である。
【００６５】
ヒトDNAウイルスにおける検証
我々のスクリーニングで同定されたマイクロRNAヒットのすべては、ヒトと完全に同じ配列か、または最小限、保存されたシード部位(nt2〜7)を有する(これらのマイクロRNAの標的および機能が、マウスとヒトとで保存されていることを意味する)。
【００６６】
我々は、表1および2に示した多くのマイクロRNAをスクリーニングし、それらは、ヒト細胞およびHCMVにおいて同じ抗ウイルスまたは親ウイルス機能を有するとして同定された(図9参照)。
【００６７】
RNAウイルスにおける検証
我々は、配列番号1〜22として示した多数のマイクロRNAをスクリーニングしたが、それらは、NIH-3t3細胞においてセムリキ森林ウイルスに対して抗ウイルスマイクロRNA機能を示す。
【００６８】
ヘルペスウイルスサブファミリー3つすべてにおいて保存された抗ウイルスまたは親ウイルス特性を有するmiRNA
本アッセイにおいて、ウイルス増殖に負に影響を与えるマウスmiRNAは、ミミックライブラリーにおいて蛍光減少をもたらし、阻害剤ライブラリーにおいて蛍光増加をもたらすものと定義される。このような“ヒット”を適格とする共通の測定基準は、陰性対照の平均を1または2標準偏差値外れるものである([20]で概説されている)。しかしながら、ミミ
ックおよび阻害剤データの分析により、効果の分布および大きさに明確な差異が示唆される。従って、我々は、統計ベースのヒット選択法である“ランクプロダクト法(ran roduct)”を選択した。これは基礎をなすデータ分布について仮定を設けず、異常値に対してロバストである[21]。“ヒット”は、一貫して高いかまたは低い蛍光シグナル(他のミミックまたは阻害剤のすべてと比較して)をもたらすミミックまたは阻害剤と定義され、統計的重みは実験間の反復に基づく[21]。ランクプロダクト法のP値とミミックまたは阻害剤によって誘導される蛍光の変化(陰性対照と比較して)の間には明確な相関が存在する。ウイルス3つすべてに関する合わせたデータセット(n=19;FDR<0.01)を用いて、ランクプロダクト法分析により、4つの高信頼度抗ウイルスmiRNA(ミミックライブラリーにおける蛍光減少、阻害剤ライブラリーにおける蛍光増加)(miR-199a-3p、miR-214、miR-103およびmiR-24)ならびに3つの高信頼度親ウイルスmiRNA(ミミックライブラリーにおける蛍光増加、阻害剤ライブラリーにおける蛍光減少)(mir-30b、mir-30dおよびmir-93)が同定された。mir-93を除いては、これらのmiRNAのすべてをその後の分析において検証した(図15)。個々のデータセットの分析によりウイルス間の差異が明らかになった(例えばmir-29bは、HSV-1においては強い抗ウイルス性であるが、MCMVまたはMHV-68においてはそうでなく、miR-378はMCMVにおいては親ウイルス性であるが、MHV-68またはHSV-1においてはそうではない)。これらのmiRNAミミックおよび阻害剤の蛍光シグナルの変化と感染性ウイルスの量の変化とを同一視するために、野生型MCMVウイルスを用いて標準プラークアッセイを行った。感染後70時間において、ミミックは、感染性ウイルスの量に対して〜log倍効果をもたらすが、阻害剤は〜2倍変化をもたらす。増殖曲線の分析により、さらに、miR-199a-3pおよびmiR-214ミミックに基づく感染性ウイルスの1〜2log倍減少およびmiR-30ミミックによるウイルス量の〜5倍増加が明らかとなる。注目すべきは、ヒト細胞においてヒトCMVウイルスを試験する場合、マウスおよびヒトにおいてこれらの高信頼度のヒットが好ましく保存され、同じ抗ウイルス性および親ウイルス性が観察されることである(図15)。これらの抗ウイルスおよび親ウイルス効果の幅に対するパースペクティブを得るために、NIH-3T3細胞において複製されるレプリコンシステムを用いて、進化的に類縁性がないセムリキ森林ウイルスおよびアルファウイルスもまた試験した。図13Dに示すように、ヘルペスウイルスと同様に、mir-199a-3pおよびmiR-214はSFVに対して抗ウイルス性を示し、miR-30は親ウイルス性を示す。
【００６９】
mir-199a-3pによる宿主シグナル伝達ネットワークの制御
任意の所定のmiRNAの多数の潜在的標的(最も最近の推定値では〜300)を考慮すれば、1つの特定の標的(あるいは一握りの標的であっても)ではmiRNAベース表現型を十分に説明できない。例えば、miR-199a-3pの以前報告された標的の1つはプロスタグランジン合成COX-2である。この遺伝子の阻害は、複数のヘルペスウイルスにおける抗ウイルス戦略としてすでに示されており、miR-199a-3pの抗ウイルス性を説明できる可能性がある。このことと一致して、COX-2は、マウスおよびヒト細胞の両方において、miR-199a-3p過剰発現によってダウンレギュレートされ、miR-199a-3p阻害によってアップレギュレートされる(図14C)。しかしながら、COX-2は、同じ抗ウイルス性を示さないいくつかの他のmiRNA(例えばmiR-16、xx)によって標的とされることが報告されている。miR-199a-3p機能に寄与しうる遺伝子ネットワークのバイアスのない(かつより全体論的な)概観を得るために、過剰発現および阻害の両方に関して包括的転写分析を行った。図15は、mir-199a-3pによって制御される最も顕著な遺伝子およびネットワークのリストを示す。これらのいくつかは複数のウイルスにとって重要であり、それぞれ、薬剤標的になることが示されている。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１４−５】
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【図１５】
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【配列表】
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