(57)【要約】【課題】      本願発明は、従来知られていなかった作用機序に基づく乳癌細胞増殖抑制剤等を提供する。【解決手段】  乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、ＥＲＫ１/２の活性を抑制、又は、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制する細胞増殖抑制剤である。また、乳癌細胞の細胞増殖抑制方法であって、前記乳癌細胞を継続してノビレチン存在下に置くことにより、ＥＲＫ１/２の活性を抑制するステップ、又は、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制するステップを含む、細胞増殖抑制方法である。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、
ノビレチンを有効成分とし、ＥＲＫ１/２の活性を抑制する細胞増殖抑制剤。
【請求項２】
トリプルネガティブ乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、
ノビレチンを有効成分とし、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制する請求項１記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項３】
乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、
ノビレチンを有効成分とし、
ヒト血液中のノビレチン濃度を１０μＭ以上とする、請求項１又は２記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項４】
乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、
ノビレチンを有効成分とし、
ヒト血液中のノビレチン濃度を２０μＭ以上とする、請求項３記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項５】
乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、
ノビレチンを有効成分とし、
ヒト血液中のノビレチン濃度を４０μＭ以上とする、請求項４記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項６】
乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、
ノビレチンを有効成分とし、
ヒト血液中のノビレチン濃度を６０μＭ以上とする、請求項５記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項７】
ヒトの体内に取り込まれることにより、ヒト血液中のノビレチン濃度を７２時間一定濃度以上に保つことに相当するノビレチンを有効成分として含有する、請求項３から６のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
前記乳癌細胞は、トリプルネガティブ乳癌細胞であって、
ヒトの体内に取り込まれることにより、ヒト血液中のノビレチン濃度を１６８時間以上２０μＭ以上に保つことに相当するノビレチンを有効成分として含有する、請求項４から７のいずれかに記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
乳癌細胞の細胞増殖抑制方法であって、
前記乳癌細胞を継続してノビレチン存在下に置くことにより、ＥＲＫ１/２の活性を抑制し、p２１の蛋白合成を誘導するステップを含む、細胞増殖抑制方法。
【請求項１０】
前記誘導するステップにおいて、前記乳癌細胞を継続して６時間以上ノビレチン存在下に置くことにより、ＥＲＫ１/２の活性を抑制する、請求項９記載の細胞増殖抑制方法。
【請求項１１】
前記乳癌細胞は、トリプルネガティブ乳癌細胞であり、
前記誘導するステップにおいて、前記トリプルネガティブ乳癌細胞を継続してノビレチン存在下に置くことにより、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制する、請求項９又は１０記載の細胞増殖抑制方法。
【請求項１２】
前記誘導するステップにおいて、前記トリプルネガティブ乳癌細胞を継続して２４時間以上ノビレチン存在下に置くことにより、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制する、請求項１１記載の細胞増殖抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞増殖抑制剤及び細胞増殖抑制方法に関し、特に、乳癌細胞の細胞増殖抑制剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は女性の癌の中でも発症率が高く、また、近年の食生活やライフスタイルの変化等により、その発症率は増加傾向にある。乳癌の治療は比較的確立され、他の癌と比較し予後が良好であるものの、治療による副作用等のリスクは回避できない。そのため、乳癌対策として、効果的な予防法さらには副作用や侵襲性の低い治療法の確立が求められている。
【０００３】
表１に示す通り、乳癌細胞はエストロゲン受容体・プロゲステロン受容体（これらはホルモン受容体）及び上皮細胞増殖因子受容体2（ＨＥＲ−２）状態の違いにより三種類に分けられる。一つ目が、ホルモン受容体陽性・ＨＥＲ−２陰性のＭＣＦ-７細胞（以下、ホルモン受容体陽性乳癌細胞）という。二つ目が、ホルモン受容体陰性・ＨＥＲ−２陽性のＳＫ−ＢＲ−３細胞（以下、「ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞」という。）、そして三つ目が、ホルモン受容体陰性・ＨＥＲ−２陰性のＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（以下、「トリプルネガティブ乳癌細胞」という）である。ホルモン受容体陽性乳癌に対しては、エストロゲン作用を抑えることにより癌細胞の増殖を抑制するホルモン療法が行われ、ＨＥＲ−２陽性乳癌に対しては、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞表面のＨＥＲ−２に結合する抗体を用いて癌細胞の働きを妨げ、増殖を抑制する分子標的治療が行われている。しかし、トリプルネガティブ乳癌に対しては、ホルモン治療も抗体による分子標的治療も効果がなく、強い副作用を有する抗癌剤療法の他には薬物療法は確立されていない。このため、乳癌の中でも、トリプルネガティブ乳癌の予防および治療の確立は特に重要である。なお、トリプルネガティブ乳癌細胞の例としては、他にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞などがある。
【０００４】
【表１】
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【０００５】
乳癌は食生活、ホルモンやライフスタイルの様々なリスクを最小化することにより、大きく予防できることが知られている。果物と野菜の摂取は疫学的に乳癌のリスクを低減し、明らかに乳癌の発生率に影響を及ぼし、特にＥＲ陰性乳癌のリスクを低下させることが示唆されている。具体的には、果物や野菜に含まれているフラボノイドは、果物や野菜の潜在的な抗癌物質として考えられている（非特許文献１及び２）。柑橘果皮に含まれるノビレチンは、ポリメトキシフラボノイドの一種であり、ＨＴ-２９ヒト結腸直腸細胞、ホルモン受容体陽性乳癌細胞、４つの胃腺癌細胞株、およびＳＭＭＣ-７７２１肝細胞癌細胞を含むヒト癌細胞株に対し抗癌活性を発揮することが示されている（非特許文献３〜６）。
【０００６】
さらに、動物研究においてノビレチンは、遺伝子導入ラットの前立腺癌や、げっ歯類における化学的に誘発した大腸癌の発症を減少させることが報告されている（非特許文献７〜１０）。動物実験および細胞実験の双方において、ノビレチンによる抗癌作用の機序は、抗酸化および抗炎症作用によるものと説明されてきた（非特許文献１１及び１２）。一方、細胞周期停止やシグナル伝達の阻害およびアポトーシス誘導などの他の潜在的な抗癌メカニズムも、いくつかの癌細胞において報告されている（非特許文献４〜６）。さらに、ノビレチンが、ＭＥＫ阻害によりヒト線維肉腫ＨＴ−１０８０細胞の転移を阻害し、またＣ６ラット神経膠腫細胞において、Ｒａｓ活性やマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）/ＥＲＫシグナル伝達を阻害することによって細胞増殖を抑制し、ＡＧＳ胃癌細胞においてはホスホイノシトール３-キナーゼ（ＰＩ-３Ｋ）/ＡＫＴの阻害を介して浸潤および遊走を抑制することが報告されている（非特許文献１３〜１５）。
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｍａｇｎｏｌｏ  ＤＦら、Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｇｅｒｉａｔｒ  ３１：２０６-２３８、２０１２
【非特許文献２】Ｎｅｕｈｏｕｓｅｒ  ＭＬ、Ｎｕｔｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ５０：１-７、２００４
【非特許文献３】Ｋａｗａｂａｔａ  Ｋら、Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６９：３０７-３１４、２００５
【非特許文献４】Ｍｏｒｌｅｙ  ＫＬら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ  ２５１：１６８-１７８、２００７
【非特許文献５】Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ  Ｎら、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０（Ｓｕｐｐｌ  １）：９５-１０１、２００４
【非特許文献６】Ｍａ  Ｘら、Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３
【非特許文献７】Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２９：１０５７-１０６３、２００８
【非特許文献８】Ｋｏｈｎｏ  Ｈら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６９：９０１-９１３、２００１
【非特許文献９】Ｓｕｚｕｋｉ  Ｒら、Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ  ２２：１１１-１１４、２００４
【非特許文献１０】Ｔａｎｇ  Ｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ９８：４７１-４７７、２００７
【非特許文献１１】Ｌａｉ  ＣＳら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２９：２４１５-２４２４、２００８
【非特許文献１２】Ｍｕｒａｋａｍｉ  Ａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６０：５０５９-５０６６、２０００
【非特許文献１３】Ｌｅｅ  ＹＣら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３４７：１０３-１１５、２０１１
【非特許文献１４】Ｍｉｙａｔａ  Ｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ３６６：１６８-１７３、２００８
【非特許文献１５】Ａｏｋｉ  Ｋら、Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ３６：５４０-５４７、２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、乳癌細胞におけるノビレチンの増殖阻害およびアポトーシスを誘導する分子メカニズムは明らかにされておらず、さらに、乳癌細胞のサブタイプによる、ノビレチン活性の違いに言及した報告もなされていなかった。
【０００９】
そこで、本願発明は、従来知られていなかった作用機序に基づく乳癌細胞増殖抑制剤等を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明の第１の観点は、乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、ノビレチンを有効成分とし、ＥＲＫ１/２の活性を抑制する。
【００１１】
本願発明の第２の観点は、第１の観点の細胞増殖抑制剤であって、トリプルネガティブ乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、ノビレチンを有効成分とし、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制する。
【００１２】
本願発明の第３の観点は、第１又は第２の観点の細胞増殖抑制剤であって、乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、ノビレチンを有効成分とし、ヒト血液中のノビレチン濃度を１０μＭ以上とする、細胞増殖抑制剤である。
【００１３】
本願発明の第４の観点は、第３の観点の細胞増殖抑制剤であって、乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、ノビレチンを有効成分とし、ヒト血液中のノビレチン濃度を２０μＭ以上とする、細胞増殖抑制剤である。
【００１４】
本願発明の第５の観点は、第４の観点の細胞増殖抑制剤であって、乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、ノビレチンを有効成分とし、ヒト血液中のノビレチン濃度を４０μＭ以上とする、細胞増殖抑制剤である。
【００１５】
本願発明の第６の観点は、第５の観点の細胞増殖抑制剤であって、乳癌細胞の細胞増殖抑制剤であって、ノビレチンを有効成分とし、ヒト血液中のノビレチン濃度を６０μＭ以上とする、細胞増殖抑制剤である。
【００１６】
本願発明の第７の観点は、第３から第６のいずれかの観点の細胞増殖抑制剤であって、ヒトの体内に取り込まれることにより、ヒト血液中のノビレチン濃度を７２時間以一定濃度以上に保つことに相当するノビレチンを有効成分として含有する。
【００１７】
本願発明の第８の観点は、第４から７のいずれかの観点の増殖抑制剤であって、前記乳癌細胞は、トリプルネガティブ乳癌細胞であって、ヒトの体内に取り込まれることにより、ヒト血液中のノビレチン濃度を１６８時間以上２０μＭ以上に保つことに相当するノビレチンを有効成分として含有する。
【００１８】
本願発明の第９の観点は、乳癌細胞の細胞増殖抑制方法であって、前記乳癌細胞を継続してノビレチン存在下に置くことにより、ＥＲＫ１/２の活性を抑制し、p２１の蛋白合成を誘導するステップを含む、細胞増殖抑制方法である。
【００１９】
本願発明の第１０の観点は、第９の観点の細胞増殖抑制方法であって、前記誘導するステップにおいて、前記乳癌細胞を継続して６時間以上ノビレチン存在下に置くことにより、ＥＲＫ１/２の活性を抑制する。
【００２０】
本願発明の第１１の観点は、第９又は第１０の観点の細胞増殖抑制方法であって、前記乳癌細胞は、トリプルネガティブ乳癌細胞であり、前記誘導するステップにおいて、前記トリプルネガティブ乳癌細胞を継続してノビレチン存在下に置くことにより、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制する、細胞増殖抑制方法である。
【００２１】
本願発明の第１２の観点は、第１１の観点の細胞増殖抑制方法であって、前記誘導するステップにおいて、前記トリプルネガティブ乳癌細胞を継続して２４時間以上ノビレチン存在下に置くことにより、Ｂｃｌ−ｘＬの発現を抑制する。
【発明の効果】
【００２２】
本願発明の各観点によれば、従来知られていなかった作用機序に基づいて乳癌細胞の増殖を抑制する細胞増殖抑制剤、又は、細胞増殖抑制方法を提供可能となる。
【００２３】
本願発明の第１の観点によれば、本願発明で初めて明らかにされた、ノビレチンの作用により、ＥＲＫ１/２の活性が抑制され、それに付随する、サイクリンＤ１の発現抑制及びｐ２１タンパク質の発現増加によって、Ｇ０/Ｇ１期において細胞周期が停止するという作用機序に基づいた細胞増殖抑制剤を提供可能となる。
【００２４】
本願発明の第２の観点によれば、本願発明で初めて明らかにされた、ノビレチンの作用により、Ｂｃｌ−ｘＬの発現が抑制され、トリプルネガティブ乳癌細胞のアポトーシスが誘導されるという作用機序に基づいたトリプルネガティブ乳癌細胞増殖抑制剤を提供可能となる。
【００２５】
また、本願発明の第３から第８の観点によれば、特に効果の高い条件で乳癌細胞の増殖を抑制する細胞増殖抑制剤を提供可能となる。
【００２６】
発明者らは、ノビレチン濃度を１６８時間以上、一定以上に保つ場合に以下の効果が得られることを確認した。第３の観点によれば、トリプルネガティブ乳癌において、生存細胞数に著しい変化が認められる細胞増殖抑制剤を提供可能となる。さらに、第４の観点によれば、トリプルネガティブ乳癌の生存細胞数を半減させる細胞増殖抑制剤、第５の観点によれば、トリプルネガティブ乳癌の生存細胞数を半数以下まで減少させ、ホルモン受容体陽性乳癌細胞の生存細胞数を半減させる細胞増殖抑制剤、第６の観点によれば、三種類の乳癌細胞において、生存細胞数が半数以下まで減少させる細胞増殖抑制剤を提供可能となる。
【００２７】
また、発明者らはノビレチン濃度が６０μＭ以上である場合に以下の効果が得られることも確認した。第７の観点によれば、ホルモン受容体陽性乳癌細胞及びトリプルネガティブ乳癌細胞の生存細胞数を半減させる細胞増殖抑制剤を提供可能となる。
【００２８】
本願発明の第８の観点によれば、トリプルネガティブ乳癌細胞の生存細胞を半減させる細胞増殖抑制剤が提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】表１の３種類の乳癌細胞に対する、ノビレチンの細胞増殖抑制作用を示す図である。
【図２】ノビレチン存在下で培養した乳癌細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で解析した結果である。
【図３】ノビレチン存在下で培養した乳癌細胞をＦＡＣＳで解析した結果である。
【図４】ノビレチン存在下で培養した乳癌細胞をウエスタンブロットで解析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３０】
乳癌細胞の培養
本願発明中で使用した乳癌細胞はすべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｌｕｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。また、乳癌細胞の培養は、１０％ウシ胎児血清及びペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて、任意の濃度のノビレチン溶液を添加し、二酸化炭素５％、気温３７℃の加湿条件下で行った。
【００３１】
ノビレチン溶液の調整
ノビレチン（純度９８％以上）は東京化成株式会社から購入し、‐２０℃で保存した。実験で使用する直前にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、調製した。なお、本願発明における全ての実験にて、ＤＭＳＯの最終濃度は０．０５％以下に維持されており、ＤＭＳＯによる乳癌細胞への影響はないことも証明済みである。
【００３２】
培地中の生存細胞数の測定
培地中の生存細胞数はＷＳＴ試験にて測定した。乳癌細胞の浮遊液をウェルあたり２，０００細胞の密度で９６のウェルプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に播種した。未処理細胞は7日間では100％培養密度に到達しないことを確認し、生細胞数の測定はこの細胞密度での増殖曲線により決定した。一晩インキュベートした後、異なる濃度のノビレチン溶液１００μＬを添加し、細胞をさらに168時間培養した。処理後の様々な時点で、Ｐｒｅｍｉｘ  ＣＣＫ-８細胞増殖アッセイシステム（同仁化学、熊本、日本）によって細胞生存率を測定した。生存細胞の相対数は、溶媒のみを加えた細胞の吸光度を１００％とし、それとノビレチン処理された細胞の吸光度を比較することによって決定した。実験は、各ノビレチン濃度において、３回以上実施した。ＩＣ５０値は、生細胞率５０％減少に必要な濃度として定義した。
【００３３】
細胞周期分析及びアポトーシス測定
乳癌細胞にノビレチンを添加し、任意の処理時間経過後に、浮遊細胞とトリプシン処理した接着細胞を合わせて、７０％エタノールで固定し、細胞解析実験まで４℃で保存した。遠心分離によるエタノールの除去後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＲＮａｓｅ  Ａ試薬及びヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む溶液で染色した。細胞周期分析は、Ｋａｌｕｚａバージョン１.２ソフトウェアパッケージ（ベックマンコールター社、ブレア、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてベックマンコールターＧａｌｌｉｏｕｓフローサイトメーター上で実施し、アポトーシスの程度は、サブＧ０/Ｇ１集団を測定することにより決定した。
【００３４】
シグナル伝達タンパク質のウエスタンブロット
等量のタンパク質を４〜１５％ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（バイオラッド社、ヘラクレス、ＣＡ、ＵＳＡ）で展開し、ポリビニリデンジフルオリド膜（ＧＥヘルスケア社、ピスカタウェイ、ＮＪ、ＵＳＡ）上に転写した。室温条件下で３０分間、ブロッキング緩衝液（ナカライテスク社、京都、日本）中において膜をインキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックした。次いで、リン酸化ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）（Ａｂｃａｍ社、ケンブリッジ、ＵＫ）、リン酸化ｐ４４/４２  ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１/２）（Ｔｈｒ２０２/Ｔｙｒ２０４）、リン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、サイクリンＤ１（２９２２）、ｐ２１（Ｃ１９）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ダラス、テキサス、ＵＳＡ）、Ｂｃｌ−ｘＬ（２７６２）、Ｂａｘ（２７７２）のいずれかに対する一次抗体と共に膜をインキュベートした。膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（７０７４）とハイブリダイズさせた。イムノブロットは増強化学発光システム（ＧＥヘルスケア社）で展開し、その後、ＬＡＳ−３０００発光画像アナライザー（富士フイルム株式会社、東京、日本）を用いて定量した。ブロットはストリッピングし、ｍＴＯＲ（９９６４）、ＭＡＰＫ（９１０２）、ＡＫＴ（９２７２）、β-ａｃｔｉｎ（４９６７）に対する一次抗体で再プローブした。ｐ２１及びリン酸化ｍＴＯＲに対する抗体を除く全ての一次及び二次抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ダンヴァーズ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。再ブロットのため、洗浄、ブロッキング、抗体とのインキュベート前に、室温で３０分間ストリッピング緩衝液(Ｔｈｅｒｍｏ社、ロックフォード、ＩＬ、ＵＳＡ)中で膜をインキュベートした。３回の測定は独立に実施された。
【００３５】
統計解析
観察された差異の有意性を決定するために、観測データを統計ソフトウェア（Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）のバージョン１２．０．１、ＳＰＳＳ社、ＵＳＡ）を用いて解析し、分散分析を行った。平均値はダネットのt-検定を用いて比較し、Ｐ-値＜０．０５を有意とみなした。
【００３６】
図１は、表１に示した３種類の乳癌細胞に対する、ノビレチンの細胞増殖抑制作用を示す図である。縦軸は乳癌細胞をノビレチン存在下で１６８時間培養した後の生存細胞数であり、横軸はノビレチン濃度である。また、ホルモン受容体陽性乳癌細胞を丸（○）、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞を四角（□）、トリプルネガティブ乳癌細胞を三角（△）のプロットで示している。３種類の乳癌細胞の全てにおいて、ノビレチンの濃度増加に伴い、乳癌細胞の生存細胞数の減少が観測された。特にトリプルネガティブ乳癌細胞において、最大の増殖抑制作用が観測された。
【００３７】
表２は、各乳癌細胞をノビレチン存在下で７２時間、１２０時間、１６８時間培養した場合のＩＣ５０値である。３種類の乳癌細胞の全てにおいて、インキュベーション時間が長くなるに従い、ＩＣ５０値は減少し、ノビレチンによる乳癌細胞増殖抑制作用が強くなることが示された。ノビレチンで１６８時間処理したトリプルネガティブ乳癌細胞のＩＣ５０値は２０．３μＭであり、ホルモン受容体陽性乳癌細胞（３９．６μＭ）、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞（５９．３μＭ）と比較して、有意に低く、ノビレチンに対する感受性はそれぞれ約２倍及び約３倍であることが明らかになった。また、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞はノビレチンによる７２時間処理を経ても、ホルモン受容体陽性乳癌細胞及びトリプルネガティブ乳癌細胞より顕著な耐性を示した。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
図２及び図３は、ＦＡＣＳ解析の結果である。Ａ、Ｂ、Ｃは、ぞれぞれ、ホルモン受容体陽性乳癌細胞、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞、トリプルネガティブ乳癌細胞における結果のグラフである。ノビレチン処理した場合、ホルモン受容体陽性乳癌細胞では、処理開始時に６４．９％だったＧ０/Ｇ１期の細胞の割合が、２４時間処理後には７９．５％にまで増加し、その後は、各細胞周期の細胞の割合に有意な変化はみられなかった。アポトーシス細胞を示すＳｕｂ−Ｇ０/Ｇ１細胞の割合は、顕著ではないものの、２４時間暴露で１．７％、４８時間暴露で２．５％、７２時間暴露で３．７％に増加した。ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞では、ノビレチン処理しても、細胞周期各期の細胞の割合が有意に変化せずＳｕｂ−Ｇ０/Ｇ１細胞集団の割合も全く変化しなかった。対照的にトリプルネガティブ乳癌細胞では、ノビレチン処理するとＳｕｂ−Ｇ０/Ｇ１細胞の割合は、２４時間暴露後に１．４％から５．４％に増加し、７２時間暴露では１４．７％まで増加した。一方、Ｇ０/Ｇ１期の細胞の割合は、６２．１％（０時間）から８６．１％（２４時間）に増加した。したがって、ノビレチンによる増殖抑制効果は、トリプルネガティブ乳癌細胞に対して、細胞周期Ｇ０/Ｇ１の停止およびアポトーシスの誘導により起こることが明らかとなった。
【００４０】
図４はウエスタンブロットの結果である。１００μＭのノビレチンで処理すると、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞でＥＲＫ１/２の抑制はわずかであったが、３つの細胞株において、ＥＲＫ１/２の恒常的活性は処置開始後２〜６時間で減少し、２４時間にわたって抑制された。トリプルネガティブ乳癌細胞においては、ＡＫＴのリン酸化及び下流のｍＴＯＲは明らかにノビレチンによって阻害された。一方、ホルモン受容体陽性乳癌細胞及びＨＥＲ−２陽性乳癌細胞についてはアポトーシス誘導が検出されないか又は極端に低かった。Ｇ０/Ｇ１細胞周期チェックポイントの重要な調節因子として機能するサイクリンＤ１は、全ての細胞株においてｐ２１タンパク質の増加に伴って阻害された。ノビレチンは乳癌のサブタイプにかかわらずサイクリンＤ１発現を減少させ、付随するｐ２１の発現増加によりＧ０/Ｇ１での細胞周期を停止させることを示しているといえる。
【００４１】
ノビレチンにより誘導されるアポトーシスのメカニズムを明らかにすべく、本願発明の発明者らはＢｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−２の抗アポトーシス同体、及びアポトーシス誘導性のＢａｘタンパク質の発現を調べた。その結果が図４のＢである。１００μＭのノビレチンで処理すると、トリプルネガティブ乳癌細胞において、Ｂｃｌ−ｘＬの発現は抑制された。一方で、ホルモン受容体陽性乳癌細胞及びＨＥＲ−２陽性乳癌細胞においては、アポトーシスは明らかではなかった。Ｂａｘタンパク質の発現は、すべての細胞株においてインキュベーション時間と共に変化しなかった。したがって、トリプルネガティブ乳癌細胞おいて、Ｂｃｌ−ｘＬ発現の減少がノビレチンによるアポトーシス誘導の原因といえる。また、トリプルネガティブ乳癌細胞と比較してアポトーシス誘導が極めて少ないことからも、ホルモン受容体陽性乳癌細胞及びＨＥＲ−２陽性乳癌細胞においては、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢａｘは、ノビレチンによる乳癌細胞のアポトーシスに関与していないと考えられる。
【００４２】
上述した図２〜４に示される結果は、トリプルネガティブ乳癌細胞に対するノビレチンの抗癌活性は、Ｇ０/Ｇ１期における細胞周期の停止、及び、Ｂｃｌ−ｘＬ発現の抑制によるアポトーシス誘導によるものであることを示唆している。一方、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞は、有意のアポトーシス効果を示さなかった。ノビレチンは、ＲＡＳ/ＭＡＰＫ経路及びＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ経路の両方を阻害することが報告されている。本研究においてノビレチンは、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞ではＥＲＫ１/２の活性化を抑制したが、ＡＫＴ/ｍＴＯＲ活性を抑制しなかった。ＨＥＲ−２過剰活性化細胞に対するノビレチンの感受性の低下は、ノビレチンがＡＫＴ及び下流のｍＴＯＲの活性を抑制することができないことが原因である可能性がある。ＲＡＳ/ＭＡＰＫ経路及びＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ経路を含むＨＥＲ−２の下流のシグナル伝達カスケードは、ＨＥＲ−２過剰発現細胞において活性化されるため、ノビレチンはＨＥＲ−２陽性乳癌細胞におけるＨＥＲ−２主導のＡＫＴ活性化を抑えることができなかったと考えられる。逆に、ノビレチン感受性の高いトリプルネガティブ乳癌細胞においては、ＡＫＴ及び下流のｍＴＯＲは明らかに抑制された。したがって、ＥＲＫ１/２及びＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ経路の両方の同時阻害は、上皮成長因子受容体阻害剤によるゲフィチニブ非小細胞肺癌の治療において報告されているように、ノビレチンが細胞増殖抑制作用を発揮し、アポトーシス誘導するための重要なプロセスであると考えられる。
【００４３】
細胞周期チェックポイントは、細胞周期事象の適切な実行を確保するための重要な制御機構である。三つのサブタイプのヒト乳腺癌細胞を５０μＭのノビレチンで処理すると、全ての乳癌細胞において、Ｇ０/Ｇ１期での細胞周期の停止が誘導されたが、ＨＥＲ−２陽性乳癌細胞ではＧ０/Ｇ１期における細胞周期の停止は有意ではなかった。これはＨＥＲ−２陽性乳癌細胞が、ノビレチンに対し耐性があり、５０μＭより高いＩＣ５０値を有するためである。１００μＭのノビレチンで処理すると、細胞周期の進行は全ての細胞株において、Ｇ０/Ｇ１期で完全に停止し、ほぼ完全にＳ期及びＧ２/Ｍ期の細胞数が減少した。ホルモン受容体陽性乳癌細胞においても、同様にノビレチンによって、Ｇ０/Ｇ１期における細胞周期の停止が誘導されることが報告されている。ノビレチンがＧ０/Ｇ１期にある細胞を停止させる分子機構は、依然として不明である。しかし、ＥＲＫ１/２の恒常的活性の抑制は、ノビレチンがＧ０/Ｇ１期で細胞周期を停止させることに起因する可能性がある。ＥＲＫ１/２は、広範囲の細胞の活動や生理学的プロセスを制御するＭＡＰＫの重要なサブファミリーである。本研究では、ノビレチンによる連続処理により、２〜６時間経過後からＥＲＫ１/２の恒常的活性が抑制され、２４時間以上経過後においても低レベルに維持され、それに付随して、サイクリンＤ１の発現が抑制され、また、ｐ２１タンパク質の発現が増加した。したがってノビレチンが誘導するＥＲＫ１/２経路の強力かつ持続的な阻害は、ホルモン受容体およびＨＥＲ−２の状態に関係なく乳癌細胞におけるＧ０/Ｇ１細胞周期の遮断を引き起こすことがあり、ノビレチンによる処理がＧ０/Ｇ１での細胞周期の停止を引き起こす普遍的な事象である可能性を示唆している。
【００４４】
トリプルネガティブ乳癌細胞において、ノビレチンはＢａｘの発現に影響を与えることなく、アポトーシスを抑制するＢｃｌ−ｘＬの発現を減少させることによって、アポトーシスを誘導している。アポトーシスがほとんど観測されなかったホルモン受容体陽性乳癌細胞及びＨＥＲ−２陽性乳癌細胞では、Ｂｃｌ−ｘＬの発現の抑制も観測されなかった。ヒト膵臓癌細胞及びヒト皮膚ケラチノサイトにおいて、ＥＲＫ１/２の活性抑制を通じ、Ｂｃｌ−ｘＬの発現が抑制され、アポトーシスが誘導され得ることが示されている。ホルモン受容体陽性乳癌細胞及びＨＥＲ−２陽性乳癌細胞では、ＥＲＫ１/２の活性が抑制されたにも関わらず、Ｂｃｌ−ｘＬの発現は抑制されず、アポトーシスが誘導されなかった。これは、これらの細胞において、ＡＫＴをノビレチンによって不活性化させることができないためだと考えられる。ＡＫＴは、抗アポトーシス経路につながるシグナルを誘導し、ｍＴＯＲをリン酸化することによって、生存とアポトーシスの制御において重要な役割を果たしている。実際に、発明者らはトリプルネガティブ乳癌細胞においてＡＫＴおよびｍＴＯＲの下流のリン酸化が明らかにノビレチンによって阻害されたことを見出した。これらのデータは、ノビレチンが主にトリプルネガティブ乳癌細胞においてＡＫＴ/ｍＴＯＲ阻害により媒介されるシグナル伝達経路を遮断することを通じてアポトーシスを誘導していることを示唆し、ＲＡＳ/ＥＲＫ経路自体の阻害は、アポトーシスの誘導には不十分であることを示唆する。以上をまとめると、ノビレチンの細胞増殖抑制作用は、乳癌細胞のサブタイプに応じて、アポトーシス誘導とＧ０/Ｇ１期での細胞周期の停止の両方の程度によって決定される。
【００４５】
結論として、トリプルネガティブ乳癌細胞は、ホルモン受容体陽性及びＨＥＲ−２陽性乳癌細胞に比べ、ノビレチンに対して顕著に感受性が高いことが認められた。トリプルネガティブ乳癌細胞におけるノビレチンの抗癌作用は、Ｂｃｌ−ｘＬの発現抑制によるアポトーシスを誘導だけでなく、Ｇ０/Ｇ１期での細胞周期の停止によってももたらされる可能性があり、ノビレチンがトリプルネガティブ乳癌の予防に効果的であることが示唆される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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