(57)【要約】【課題】安全性の高い天然物の中から筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤を提供する。【解決手段】本発明の筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤の有効成分として、ブラックジンジャーからの抽出物を含有することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブラックジンジャーからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする筋肉持久力向上剤。
【請求項２】
ブラックジンジャーからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするミトコンドリア機能向上剤。
【請求項３】
ブラックジンジャーからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤。
【請求項４】
ブラックジンジャーからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とするＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブラックジンジャーからの抽出物を有効成分として含有することを特徴とする筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
運動を行うにあたって、その動きを担っているのは筋肉であり、運動能力の向上のためには筋肉機能を増強することが必要である。これはスポーツ選手に限ったことではなく、一般の人々においても、日々の軽い運動、姿勢の維持など健康的な日常生活を送るために筋肉は非常に重要である。また筋肉は単に体を動かす機能を持つだけでなく、ブドウ糖を利用し血糖値をコントロールしたり、熱産生によって体温を調節したり、脂質の利用により脂肪量の調節をしたり様々な機能を有することからも、健康の維持に重要であることがうかがえる。
【０００３】
筋肉は単核の筋芽細胞がお互い融合して、細長く多核の筋管細胞となる。その後、筋管細胞は集合・整列して筋繊維を作り、筋肉としての大きな力を産み出す。このように筋形成は、筋芽細胞の増殖と分化、筋細胞同士の認識と接着、融合などからなる複雑なプロセスである。この筋肉の働きにおいて、筋力を発揮、維持するためには細胞中に存在するミトコンドリアが重要であるとされる。
【０００４】
生体エネルギー代謝の研究において１９９８年、骨格筋のエネルギー代謝を包括的に制御する新たな因子として核内受容体コアクチベーターであるＰＧＣ−１α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  γ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  １α）が同定された（非特許文献１参照）。ＰＧＣ−１αは、褐色脂肪組織、骨格筋、心臓、腎臓及び脳に発現し、ミトコンドリアの生合成に関与するとされる（非特許文献２参照）。従って、ＰＧＣ−１αはエネルギー代謝や持久力の亢進を担う、ミトコンドリアに対する重要なターゲットとされている。
【０００５】
このように筋肉の持久力においては筋管細胞におけるミトコンドリアが重要であるが、エネルギー源となるＡＴＰを作り出すためには細胞外からグルコースを取り入れる必要がある。このグルコースの細胞内輸送に関わるチャネルがＧＬＵＴ４（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ４）であり、インスリン刺激や筋収縮によってＧＬＵＴ４が細胞表面に移動し、血液中のグルコースを筋肉細胞に送り込む。したがって、ＧＬＵＴ４が多いと細胞内へ取り込まれるグルコース量が増し、ミトコンドリアによってより多くのＡＴＰが作られると考えられる。実際にトレーニングでは、筋細胞表面のＧＬＵＴ４が増えることが確認されており（非特許文献３参照）、運動選手は一般の人よりもＧＬＵＴ４が多いことなども報告されている（非特許文献４参照）。
【０００６】
筋管細胞にＡＭＰＫ活性化剤を投与すると、ＰＧＣ−１α発現量は増大する。この事象は、筋細胞が負荷運動に適応する際に観察される反応と非常に良く似ており、筋管細胞は、運動が筋肉のミトコンドリアで起こす適応反応の機構を研究する良いモデル系となっている（非特許文献５参照）。ＰＧＣ−１αの発現亢進が上記のように有効性が高いことが予測されることからＰＧＣ−１α発現亢進作用に関する先行技術も存在する。例えば、ベンゾイミダゾール誘導体を有効成分とするミトコンドリア機能活性化剤（特許文献１参照）、スフィンゴミエリンを有効成分とするミトコンドリア機能向上剤（特許文献２参照）等が知られている。また筋管ミトコンドリア機能および量を増加させる物質としては、例えばウーロン茶の溶媒抽出物（非特許文献６参照）、ハマナスの溶媒抽出物（特許文献３参照）等が知られている。
【０００７】
しかしながら、現在までのところ、入手が容易で安価であり、安全性の高い天然物系のものであって、味、匂い、使用感等の点で添加対象物の品質に悪影響を及ぼさず、化粧料、飲食品、飲食品添加剤、動物用飼料または動物用飼料添加剤に広く使用可能な筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤は未だ提供されておらず、その速やかな提供が強く求められているのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００４−６７６２９号公報
【特許文献２】特開２０１１−１５７３２８号公報
【特許文献３】特開２０１０−１２５７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ，９２，ｐ８２９−８３８（１９９８）
【非特許文献２】Ｐｕｉｇｓｅｖｅｒ  Ｐ，  Ｗｕ  Ｚ，  Ｐａｒｋ  ＣＷ，  Ｇｒａｖｅｓ  Ｒ，  Ｗｒｉｇｈｔ  Ｍ，  ａｎｄ  Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ.  Ａ  ｃｏｌｄ−ｕｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｃｅｌｌ  ９２：  ８２９−８３９，  １９９８．
【非特許文献３】Ｈｏｌｌｏｓｚｙ  ＪＯ，  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，  ５９（７），  ５−１８  （２００８）．
【非特許文献４】「炭水化物ローディングの最新知見」慶応義塾大学スポーツ医学研究センター紀要  １９９６
【非特許文献５】Ｏｊｕｋａ  ＥＯ，  Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ  ６３（２），  ２７５−２７８  （２００４）．
【非特許文献６】Ｂｕｌｌ．  Ｉｎｓｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｐｏｒｔ  Ｓｃｉ．，  Ｕｎｉｖ．  ｏｆ  Ｔｓｕｋｕｂａ  ３０  ：  １５３−１５５，２００７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、天然物由来の化合物の中から筋肉持久力向上、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤を有するものを見出し、それを有効成分とする筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するために、本発明のブラックジンジャーからの抽出物を配合したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本実施形態の筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤は、ブラックジンジャーからの抽出物を有効成分として含有するものである。
【００１４】
ブラックジンジャーは、ショウガ科バンウコン属の植物であり、別名を黒ショウガといい、学名はＫａｅｍｐｆｅｒｉａ ｐａｒｖｉｆｌｏｒａである。前記ブラックジンジャーは、東南アジアのタイ等に分布しており、この地域から容易に入手可能である。
【００１５】
前記ブラックジンジャーの抽出物は、植物の抽出に一般に用いられている方法により容易に得ることができる。なお、前記ブラックジンジャーの抽出物には、ブラックジンジャーの抽出液、該抽出液の希釈液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。
【００１６】
前記ブラックジンジャーの抽出原料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ブラックジンジャーの根茎部などを用いることができる。
【００１７】
前記抽出原料であるブラックジンジャーの根茎部は、乾燥した後、そのまま又は粗砕機を用い粉砕して溶媒抽出に供することにより得ることができる。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用されている乾燥機を用いて行ってもよい。前記ブラックジンジャーは、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。なお、脱脂等の前処理を行うことにより、ブラックジンジャーの極性溶媒による抽出処理を効率よく行うことができる。
【００１８】
前記抽出に用いる溶媒としては、水、親水性有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を室温乃至溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、濾過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。なお、前記抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。
【００１９】
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、これら親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。
なお、前記水と親水性有機溶媒との混合溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１質量部〜４０質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１質量部〜９０質量部添加することが好ましい。
【００２０】
本発明において、抽出原料であるブラックジンジャーから、筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤の少なくともいずれかを有する物質を抽出するにあたって特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の抽出装置を用いて抽出することができる。
【００２１】
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽内に、抽出原料としてのブラックジンジャーの根茎部を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分間〜２時間静置して可溶性成分を溶出した後、濾過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０℃〜９５℃にて１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０℃〜８０℃にて３０分間〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであれば、そのまま本発明の筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤として用いることができる。
【００２２】
得られるブラックジンジャーの抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るため、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。
【００２３】
なお、得られるブラックジンジャーの抽出液は、そのままでも筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。抽出液の乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。また、前記ブラックジンジャーの抽出物は、特有の匂いを有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、美容用飲食品に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。なお、精製としては、例えば、活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。
【００２４】
以上のようにして得られるブラックジンジャーの抽出物は、筋肉持久力向上作用、ミトコンドリア機能向上作用、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進作用およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進作用の少なくともいずれかを有しており、これらの作用に基づいて、本発明の筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤として使用することができる。
【００２５】
（美容用飲食品）
本発明の美容用飲食品は、本発明の前記筋肉持久力向上剤、前記ミトコンドリア機能向上剤、前記ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤および前記ＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。
【００２６】
ここで、前記美容用飲食品とは、人の健康に危害を加えるおそれが少なく、通常の社会生活において、経口又は消化管投与により摂取されるものをいい、行政区分上の食品、医薬品、医薬部外品、などの区分に制限されるものではなく、例えば、経口的に摂取される一般食品、健康食品、保健機能食品、医薬部外品、医薬品などを幅広く含むものを意味する。
【００２７】
本発明の前記美容用飲食品は、ブラックジンジャーの抽出物を、その活性を妨げないように任意の飲食物に配合したものであってもよいし、ブラックジンジャーの抽出物を主成分とする栄養補助食品であってもよい。
【００２８】
前記美容用飲食品としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料等の飲料；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；そば、うどん、はるさめ、ぎょうざの皮、しゅうまいの皮、中華麺、即席麺等の麺類；飴、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、焼き菓子、パン等の菓子類；カニ、サケ、アサリ、マグロ、イワシ、エビ、カツオ、サバ、クジラ、カキ、サンマ、イカ、アカガイ、ホタテ、アワビ、ウニ、イクラ、トコブシ等の水産物；かまぼこ、ハム、ソーセージ等の水産・畜産加工食品；加工乳、発酵乳等の乳製品；サラダ油、てんぷら油、マーガリン、マヨネーズ、ショートニング、ホイップクリーム、ドレッシング等の油脂及び油脂加工食品；ソース、たれ等の調味料；カレー、シチュー、親子丼、お粥、雑炊、中華丼、かつ丼、天丼、うな丼、ハヤシライス、おでん、マーボドーフ、牛丼、ミートソース、玉子スープ、オムライス、餃子、シューマイ、ハンバーグ、ミートボール等のレトルトパウチ食品；種々の形態の健康食品や栄養補助食品；錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、トローチ等の医薬品、医薬部外品などが挙げられる。
【００２９】
前記その他の成分としては、前記美容用飲食品を製造するに当たって通常用いられる補助的原料又は添加物、などが挙げられる。
前記原料又は添加物としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、ブドウ糖、果糖、ショ糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、ルブソサイド、コーンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラチン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム塩類、色素、香料、保存剤、などが挙げられる。
【００３０】
前記美容用飲食品における本発明の前記筋肉持久力向上剤、前記ミトコンドリア機能向上剤、前記ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤および前記ＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤の添加量は、対象となる美容用飲食品の種類に応じて異なり一概には規定することができないが、美容用飲食品本来の味を損なわない範囲で添加すればよく、各種対象美容用飲食品に対し、０．００１質量％〜５０質量％が好ましく、０．０１質量％〜２０質量％がより好ましい。また、顆粒、錠剤又はカプセル形態の美容用飲食品の場合には、０．０１質量％〜１００質量％が好ましく、５質量％〜１００質量％がより好ましい。
【００３１】
本発明の美容用飲食品は、日常的に経口摂取することが可能であり、有効成分であるブラックジンジャーの抽出物の働きによって、筋肉持久力向上作用、ミトコンドリア機能向上作用、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進作用およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進作用の少なくともいずれかを極めて効果的に発揮させることができる。
【００３２】
なお、本発明の筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤は、ヒトに対して好適に適用されるものであるが、それぞれの作用効果が奏される限り、ヒト以外の動物に対して適用することもできる。
【実施例】
【００３３】
以下、製造例及び試験例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の各例に何ら制限されるものではない。
【００３４】
〔製造例１〕
−ブラックジンジャーの水抽出物の製造−
抽出原料としてブラックジンジャーの根茎部の粉砕物１００ｇを、水１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３５】
〔製造例２〕
−ブラックジンジャーの５０質量％エタノール抽出物の製造−
抽出原料としてブラックジンジャーの根茎部の粉砕物１００ｇを、５０質量％エタノール（水とエタノールとの質量比１：１）１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３６】
〔製造例３〕
−ブラックジンジャーのエタノール抽出物の製造−
抽出原料としてブラックジンジャーの根茎部の粉砕物１００ｇを、エタノール１，０００ｍＬに投入し、穏やかに攪拌しながら２時間、８０℃に保った後、濾過した。濾液を４０℃で減圧下に濃縮し、更に減圧乾燥機で乾燥して、抽出物（粉末状）を得た。得られた抽出物の収率を表１に示す。
【００３７】
〔表１〕
抽出溶媒              収率（％）
製造例１            水                ９．６
製造例２    ５０質量％エタノール    １２．４
製造例３        エタノール            ３．１
【００３８】
〔試験例１〕
−筋管細胞におけるミトコンドリア機能増強作用試験−
筋肉において持続したエネルギー産生のためにはミトコンドリア機能の向上作用が必要であると考えられるため、ブラックジンジャー抽出物について、マウス筋管細胞におけるミトコンドリア機能増強作用に関する試験を行った。
具体的には、まず、マウス骨格筋由来筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を１０質量％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ；ＦＢＳ）含有ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。なお、培養装置としては、三洋電機株式会社製ＣＯ２インキュベーターを用い、培養条件としては、ＣＯ２濃度５％、インキュベーション温度３７℃とした。その後、トリプシン処理により細胞を回収した。次いで、回収した細胞をコラーゲンコートした９６ｗｅｌｌプレートへ０．１ｍＬずつ播種し増殖させた。
その後、コンフルエントに達した時点で２質量％馬血清含有ＤＭＥＭに切り替え、筋管への分化誘導を行った。７日後の分化した筋管に対して、培地を抜き、２質量％馬血清含有ＤＭＥＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに０．１ｍＬ添加し、３日間培養した。
なお、前記ブラックジンジャー抽出物としては、製造例２で得られたブラックジンジャーの５０質量％エタノール抽出物を用いた。ブラックジンジャー抽出物の濃度としては、培地中の最終濃度が６．２５μｇ／ｍＬ及び１２．５μｇ／ｍＬの２種類について試験を行った。
次いで、培養後、アラマーブルー法を用いて、ミトコンドリア機能を評価した。アラマーブルー法として具体的には、アラマーブルー溶液を各ｗｅｌｌに１０μＬずつ添加し３０分後に波長５７０ｎｍおよび波長６００ｎｍにおける吸光度を測定し、両者の値を用いて既知の計算法によりミトコンドリア機能としてのアラマーブルー還元率を算出した。結果を表２に示す。
ミトコンドリア機能増強率の計算方法は以下のとおりである。
ミトコンドリア機能増強率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただしＡはブラックジンジャー抽出物を添加した場合のアラマーブルー還元率を、Ｂはブラックジンジャー抽出物を添加しなかった場合のアラマーブルー還元率を、それぞれ表す。
【００３９】
〔表２〕
被験試料                濃度（μｇ／ｍＬ）  ミトコンドリア機能増強率（％）
無し                      ０                      １００
ブラックジンジャー抽出物      ６．２５                １０１．８
（製造例２）                １２．５                  １０８．２
表２より、筋管への分化した細胞にブラックジンジャー抽出物を３日間作用させることで優れたミトコンドリア機能増強作用を有することが確認された。
【００４０】
〔試験例２〕
−筋管細胞におけるＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進作用試験−
ミトコンドリア機能の調節は、核内転写因子による代謝酵素遺伝子の発現制御に強く依存しており、その中でも転写調節因子であるＰＧＣ−１αが統合的な役割を果たしている。試験例１においてブラックジンジャー抽出物にミトコンドリア機能増強作用が認められたため、次に、ブラックジンジャー抽出物について、マウス筋管細胞におけるＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進作用に関する試験を行った。
具体的には、まず、Ｃ２Ｃ１２を１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞をコラーゲンコートした６ｗｅｌｌプレートへ２ｍＬずつ播種し増殖させた。その後、コンフルエントに達した時点で２質量％馬血清含有ＤＭＥＭに切り替え、筋管への分化誘導を行った。７日後の分化した筋管に対して、培地を抜き、２質量％馬血清含有ＤＭＥＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２ｍＬ添加し、３日間培養した。
なお、前記ブラックジンジャー抽出物としては、製造例２で得られたブラックジンジャーの５０質量％エタノール抽出物を用いた。ブラックジンジャー抽出物の濃度としては、培地中の最終濃度が６．２５μｇ／ｍＬ及び１２．５μｇ／ｍＬの２種類について試験を行った。
次いで、培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；  Ｃａｔ．ｎｏ．  ３１１−０７３６１）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ／μＬになるようにｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、ＰＧＣ−１αと内部標準であるβ−ＡｃｔのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＰＧＣ−１α遺伝子の発現量は、被験試料無添加、被験試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、β−Ａｃｔの値で補正値を求め、さらに被験試料無添加の補正値を１００とした時の被験試料添加の補正値を算出した。結果を表３に示す。
ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進率の計算方法は以下の通りである。
ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただしＡはブラックジンジャー抽出物を添加した場合のＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現量の補正値を、Ｂはブラックジンジャー抽出物を添加しなかった場合のＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現量の補正値を、それぞれ表す。
【００４１】
〔表３〕
ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ
被験試料                濃度（μｇ／ｍＬ）        発現促進率（％）
無し                      ０                      １００
ブラックジンジャー抽出物      ６．２５                １１８．２
（製造例２）                １２．５                  １５６．１
表３より、筋管への分化した細胞にブラックジンジャー抽出物を３日間作用させると優れたＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【００４２】
〔試験例３〕
−マウスにおける筋肉持久力向上作用試験−
ブラックジンジャー抽出物に筋肉におけるミトコンドリア機能向上作用およびＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進作用が認められたことから、筋肉持久力の向上に繋がると考えられたため、マウスにおいて筋肉持久力向上作用を検討した。
具体的には、５週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウス（清水実験材料株式会社、京都市）を購入し、十分検疫馴化した後に一般状態の観察および体重測定を行い、健康状態が良好な動物を選んで６週齢で使用した。１群６匹使用し、対照群には０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ・Ｎａ）水溶液、試験物質群には製造例２で得られたブラックジンジャーの５０質量％エタノール抽出物を５０ｍｇ／ｋｇおよび１５０ｍｇ／ｋｇ投与量となるようになるように０．５％ＣＭＣ・Ｎａで調製したものを無麻酔下に胃ゾンデを用いて経口投与した。これらの投与を平日に行い８週間継続させた。最終日に、ワイヤーぶら下がり試験により筋肉持久力を測定した。ワイヤーぶら下がり試験は地上３７ｃｍの高さに張った直径１．２ｍｍのワイヤーにマウスを前肢だけで捕まらせ、３００秒間で落下するまでの時間を計測した。結果を表４に示す。
【００４３】
〔表４〕
投与群                          ワイヤーぶら下がり時間（ｓｅｃ．）
対照群                                    ９９．０
ブラックジンジャー抽出物（製造例２）
５０ｍｇ／ｋｇ投与群                        １１３．７
ブラックジンジャー抽出物（製造例２）
１５０ｍｇ／ｋｇ投与群                        １３０．０
表４より、ブラックジンジャー抽出物５０ｍｇ／ｋｇ投与群およびブラックジンジャー抽出物１５０ｍｇ／ｋｇ投与群は対照群と比較して、優れたマウスのワイヤーへのぶら下がり時間増加作用を有することが確認された。
【００４４】
〔試験例４〕
−筋管細胞におけるＧＬＵＴ４遺伝子発現促進作用試験−
筋肉が持続的にエネルギー源であるＡＴＰを作り出すためには、原料となるグルコースが必要である。この細胞内への取り込みはＧＬＵＴ４によって行われるため、ＧＬＵＴ４の発現促進が持久力の向上に繋がると考えられる。そこで次に、ブラックジンジャー抽出物について、マウス筋芽細胞の分化時におけるＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進作用に関する試験を行った。
具体的には、まず、Ｃ２Ｃ１２を１０質量％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用いて培養した後、トリプシン処理により細胞を回収した。回収した細胞をコラーゲンコートした６ｗｅｌｌプレートへ２ｍＬずつ播種し増殖させた。その後、コンフルエントに達した時点で培地を抜き、２％馬血清含有ＤＭＥＭで溶解した被験試料を各ｗｅｌｌに２ｍＬ添加し、７日間培養することで、筋管への分化誘導を行った。
なお、前記ブラックジンジャー抽出物としては、ブラックジンジャー抽出物（丸善製薬株式会社製）を用いた。ブラックジンジャー抽出物の濃度としては、培地中の最終濃度が３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ及び１２．５μｇ／ｍＬの３種類について試験を行った。
次いで、培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ  ＩＩ（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ；  Ｃａｔ．ｎｏ．  ３１１−０７３６１）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００ｎｇ/μＬになるようにｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。
このｔｏｔａｌ  ＲＮＡを鋳型とし、ＧＬＵＴ４と内部標準であるβ−ＡｃｔのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  （Ｃｅｐｈｅｉｄ社）を用いて、ＴａＫａＲａ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。ＧＬＵＴ４遺伝子の発現量は、被験試料無添加、被験試料添加でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、β−Ａｃｔの値で補正値を求め、さらに被験試料無添加の補正値を１００とした時の被験試料添加の補正値を算出した。結果を表５に示す。
ＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進率の計算方法は以下の通りである。
ＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
ただしＡはブラックジンジャー抽出物を添加した場合のＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現量の補正値を、Ｂはブラックジンジャー抽出物を添加しなかった場合のＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現量の補正値を、それぞれ表す。
【００４５】
〔表５〕
ＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ
被験試料            農度（μｇ/ｍＬ）     発現促進率（％）
無し                    ０                   １００．０
ブラックジンジャー抽出物    ３．１２５           １６１．９
（製造例２）            ６．２５             １５４．２
１２．５               １２４．２
表５より、筋管への分化途中の細胞にブラックジンジャー抽出物を７日間作用させることで優れたＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のブラックジンジャー抽出物を用いた筋肉持久力向上剤、ミトコンドリア機能向上剤、ＰＧＣ−１α  ｍＲＮＡ発現促進剤およびＧＬＵＴ４  ｍＲＮＡ発現促進剤は、筋肉の持久力の低下の抑制、向上並びに改善に大きく貢献できる。