(57)【要約】      （修正有）【課題】新規な消化管炎症治療剤、特に炎症性腸疾患（IBD）治療剤の提供。【解決手段】脂肪組織由来間質細胞群が優れた炎症改善能力を有することを確認し、少なくとも、脂肪組織由来間質細胞群、より好ましくは非培養（継代培養をしていない）脂肪組織由来間質細胞群を含む消化管炎症治療剤とした。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来間質細胞群を含む消化管炎症治療剤。
【請求項２】
前記脂肪組織由来間質細胞群は、非培養脂肪組織由来間質細胞群である請求項１に記載の消化管炎症治療剤。
【請求項３】
前記脂肪組織由来間質細胞群は、全細胞に対してＣＤ１０５陽性細胞の割合が0.1％〜40.0％及び／又はＣＤ４５陽性細胞の割合が0.1％〜20.0％である請求項１又は２に記載の消化管炎症治療剤。
【請求項４】
前記消化管は、腸である請求項１〜３のいずれか１に記載の消化管炎症治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織由来間質細胞群を含む消化管炎症治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（IBD）は難治性の疾病であり、未だ明確な原因については解明されていない。炎症性腸疾患として、潰瘍性大腸炎とクローン病の二つが良く知られている。さらに、類似した疾患である腸管ベーチェット病や単純性潰瘍も知られている。これらは、緩解期と活動期を繰り返す難治性の慢性消化管疾患であり、病因の主体は、腸管上皮の防御力の低下、腸管組織に進入する腸内細菌に対する腸管免疫反応の異常によると考えられている。
【０００３】
炎症性腸疾患の一つである潰瘍性大腸炎は、何らかの原因により、大腸の粘膜に炎症が起こり、びらん（ただれ）及び／又は潰瘍ができる病気である。炎症は通常、肛門に近い直腸から始まり、その後、その奥の結腸に向って炎症が拡がっていくと考えられている。 腸に起こる炎症のために、下痢や粘血便（血液、粘膜及び膿の混じった軟便）、発熱や体重減少などの症状が現れる。病状は、おさまったり（緩解期）、悪化したり（活動期）を繰り返すことが多く、長期にわたってこの病気に悩まされる。
なお、潰瘍性大腸炎は、1973年より厚生労働省の特定疾患治療研究対象疾患（難病）の一つとして指定されている。患者は約10万人を超えると言われている（2007年）。
【０００４】
先行特許文献１では、「脂肪組織由来間質細胞群を含む肝炎治療剤」を開示している。しかし、先行特許文献１は、「脂肪組織由来間質細胞群が消化管炎症治療剤になること」を開示又は示唆をしていない。
【０００５】
先行特許文献２では、「NOD2を発現する幹細胞にNOD2のアゴニストを添加して培養した幹細胞またはその培養生成物を含む、免疫疾患または炎症性疾患の予防または治療用の薬学的組成物」を開示している。しかし、先行特許文献２は、「脂肪組織由来間質細胞、特に、非培養脂肪組織由来間質細胞群」を開示又は示唆をしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2012-056913号公報
【特許文献２】特表2013-536222号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
消化管炎症、特に、腸の粘膜に生じる炎症は原因不明な場合が多く、完治が困難である。比較的炎症が軽度な場合には、運動、食事療法及び必要に応じて薬物療法が適用されるが、患者の日々の生活の負担が重い。また炎症が重度な場合には、外科療法（大腸全摘、回腸嚢肛門吻合）や薬物療法（サラゾピロン等の副作用の強い治療薬）が必要になる。
そこで、本発明者らは、新規な消化管炎症治療剤を開発することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために、脂肪組織由来間質細胞群、特に非培養脂肪組織由来間質細胞群に注目した。
そして、本発明者らは、脂肪組織由来間質細胞群が優れた炎症改善能力を有することを確認し、該細胞群を含む消化管炎症治療剤を完成した。
【０００９】
本発明は以下からなる。
「１．脂肪組織由来間質細胞群を含む消化管炎症治療剤。
２．前記脂肪組織由来間質細胞群は、非培養脂肪組織由来間質細胞群である前項１に記載の消化管炎症治療剤。
３．前記脂肪組織由来間質細胞群は、全細胞に対してＣＤ１０５陽性細胞の割合が約0.1％〜約40.0％及び／又はＣＤ４５陽性細胞の割合が約0.1％〜約20.0％である前項１又は２に記載の消化管炎症治療剤。
４．前記消化管は、腸である前項１〜３のいずれか１に記載の消化管炎症治療剤。」
【発明の効果】
【００１０】
本発明の消化管炎症治療剤は、優れた炎症改善能力を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原を示す図（実施例１）。図中の「ucADSCs」及び「cADSCs」は、それぞれ、「非培養脂肪組織由来間質細胞群」及び「培養脂肪組織由来間質細胞群」を意味する。
【図２】非培養脂肪組織由来間質細胞群投与群（治療群）の体重変化を示す図（実施例２）。図中の「生存率」は15日目の生存率を意味する。
【図３】非培養脂肪組織由来間質細胞群未投与群（未治療群）の体重変化を示す図（実施例２）。図中の「生存率」は15日目の生存率を意味する。
【図４】マウスの生存率の結果（実施例２）。図中の「Control」及び「Treated」は、それぞれ、「未治療群」及び「治療群」を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（消化管炎症治療剤）
本発明の消化管炎症治療剤は、少なくとも、脂肪組織由来間質細胞群、より好ましくは非培養脂肪組織由来間質細胞群を含む。
なお、本発明の「非培養脂肪組織由来間質細胞群」とは、継代培養をしていない脂肪組織由来間質細胞群を意味する。本発明の「培養脂肪組織由来間質細胞群」とは、１回以上の継代培養をした脂肪組織由来間質細胞群を意味する。本発明の「脂肪組織由来間質細胞群」とは、非培養脂肪組織由来間質細胞群及び培養脂肪組織由来間質細胞群の両方を含む。
【００１３】
（消化管炎症）
本発明の「消化管」とは、口腔、咽頭、食道、胃、小腸、大腸、肛門を含む。また、本発明の「炎症」とは、急性的な炎症と慢性的な炎症を含む。なお、粘膜上皮が物理的または化学的な刺激や細菌やウイルスの感染を受けると炎症が生じ、その程度によりびらんや潰瘍病変を生じる。
【００１４】
（脂肪組織由来間質細胞群）
本発明の「脂肪組織由来間質細胞群」とは、分取した脂肪組織を酵素処理（好ましくは、コラゲナーゼ処理）して得られた細胞群を意味する。
脂肪組織由来間質細胞群は、好ましくは、非培養脂肪組織由来間質細胞群であり、より好ましくは、ＣＤ１０５陽性細胞及び／又はＣＤ４５陽性細胞が存在する。
脂肪組織由来間質細胞群のＣＤ１０５陽性細胞割合は、約0.1％〜約40.0％である。脂肪組織由来間質細胞群のＣＤ４５陽性細胞割合は、約0.1％〜約20％である。
また、脂肪組織由来間質細胞群は、少なくとも、内皮細胞、血球系細胞を含み、より好ましくは、内皮細胞、血球系細胞、線維芽細胞、血管周囲細胞、平滑筋細胞を含む脂肪組織由来間質細胞群を含む。
さらに、脂肪組織由来間質細胞群は、好ましくは、自家性又は同系である。自家性脂肪組織由来間質細胞群とは、投与対象から得られた脂肪組織由来間質細胞群を意味する。また、同系脂肪組織由来間質細胞群とは、投与対象と同じ種から得られた脂肪組織由来間質細胞群を意味する。例えば、投与対象がヒトであるなら、同系脂肪組織由来間質細胞群は投与対象以外のヒトから得られる。
【００１５】
（消化管炎症治療剤の適用対象）
本発明の消化管炎症治療剤の適用対象は、急性的な炎症及び慢性的な炎症の両方を含む。
さらに、本発明の消化管炎症治療剤は、消化管炎症の治療（完治も含む）、改善だけでなく、予防にも利用できる。
【００１６】
（消化管炎症治療剤の治療対象）
本発明の消化管炎症治療剤の治療対象は、哺乳動物を包括的に含む。哺乳動物の例として、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル等であるが、特に限定されない。
【００１７】
（消化管炎症治療剤に含まれる生理活性物質）
本発明の消化管炎症治療剤には、生理活性物質が含まれていても良い。生理活性物質は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖（例えばヘパリン）、オリゴ糖、単糖、二糖、有機化合物、有機金属化合物、又は無機化合物等が挙げられるが特に限定されない。より詳しくは、生物学的に活性な分子、例えば、ホルモン、増殖因子、増殖因子産生ウイルス、増殖因子阻害薬、増殖因子受容体、抗炎症薬、代謝拮抗薬、インテグリン遮断薬、又はセンス遺伝子若しくはアンチセンス遺伝子等が挙げられる。
さらにより詳しくは、増殖因子の例としては、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン、血小板誘発増殖因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン、サイトカイン、又はそれらの組み合わせ等が挙げられる。
【００１８】
（消化管炎症治療剤に含まれる免疫抑制剤）
本発明の消化管炎症治療剤には、免疫抑制剤が含まれていても良い。例えば、自家性ではない脂肪組織由来間質細胞群を含む消化管炎症治療剤の場合には、免疫拒絶反応を抑えるために、好ましくは免疫抑制剤を含める。
【００１９】
（消化管炎症治療剤に含まれる担体）
本発明の消化管炎症治療剤には、担体が含まれていても良い。担体の例としては、生理食塩水、溶媒、分散培地、細胞培養液、水溶性緩衝、抗酸化剤等が挙げられるが特に限定されない。
【００２０】
（消化管炎症治療剤の投与形態）
本発明の消化管炎症治療剤の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射等を利用することができる。
また、本発明の消化管炎症治療剤の投与量は、例えば、１回の１治療部位当たり約1×102〜2.5×1011個の脂肪由来幹細胞を該治療部位に投与できるが、特に限定されない。
【００２１】
（脂肪組織由来間質細胞群の調製方法）
脂肪組織由来間質細胞群の調製方法を以下に記載するが、特に限定されない。
脂肪組織（皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪、筋肉間脂肪）を動物から切除、吸引などの手段で採取する。免疫拒絶を回避するため、治療対象と同一の個体から脂肪組織を採取することが好ましい。
採取した脂肪組織は、必要に応じて、付着した血液成分の除去及び細片化を経た後、酵素処理に供される。酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素によって消化する。
なお、脂肪組織を適当な緩衝液や培養液中で洗浄することによって血液成分等を除去することができる。
【００２２】
（脂肪組織由来間質細胞群の調製方法の例）
脂肪組織由来間質細胞群の調製方法の具体例を以下に示すが、特に限定されない。
ヒトから採取した脂肪を、緩衝液を含有する培養皿に置き、洗浄し、さらに別の緩衝液を含有する培養皿に移す。該脂肪を微細な小片に刻み、2mg/mLコラゲナーゼＩを用いて数時間、約30℃〜約39℃で消化する。消化済みの脂肪の懸濁液をＤＭＥＭ−１０（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン/アンピリシン）中で洗浄する。そして、消化されなかった脂肪組織を除去し、細胞ペレットを５ｍＬのＤＭＥＭ−１０中に懸濁させる。さらに、脂肪細胞懸濁液を、フィルターメッシュに通し、大きな粒子及び凝集塊を除去して、脂肪組織由来間質細胞群を得る。
【００２３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、本実施例は、金沢大学動物実験規程に従って行った。
【実施例１】
【００２４】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の調製並びに発現表面抗原の確認）
本実施例では、培養脂肪組織由来間質細胞群及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の調製を行い、さらに、それらの細胞群の発現表面抗原を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００２５】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の調製）
マウスの脂肪より脂肪組織由来間質細胞群を調製した。詳細は、以下の通りである。
C57Bl/6マウスを安楽死させ、鼡径部皮下脂肪組織を鈍的に剥離採取し、緩衝液を含有する培養皿に浸し洗浄し、さらに別の緩衝液を含有する培養皿に移した。該脂肪組織を細切し、コラゲナーゼIにて最大30分、37℃にて酵素処理し、抗真菌及び抗生物質を含む10% FBS 添加DMEM/F12(1:1) 溶液へ懸濁し、フィルターメッシュ(100μm)に通した後、遠心分離にて沈降させ、初代間質細胞群（非培養脂肪組織由来間質細胞群）を得た。
また、該初代間質細胞群の一部を、10% FBS (Gibco by Life TechnologiesTM)、  L-glutamine (Gibco by Life TechnologiesTM)、 Antibiotic-Antimycotic (Gibco by Life TechnologiesTM) を加えたDMEM/F12 (Gibco by Life TechnologiesTM) 培地で、37℃ 5% CO2の条件下で培養し、培養脂肪組織由来間質細胞群を得た。
【００２６】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原の確認）
培養脂肪組織由来間質細胞群及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原を確認した。詳細は、以下の通りである。
上記の非培養脂肪組織由来間質細胞群及び５回継代培養を行った培養脂肪組織由来間質細胞群を、蛍光標識anti-CD105抗体、anti-CD44抗体、anti-CD45抗体、anti-CD29抗体、anti-CD90抗体、anti-CD34抗体、anti-CD31抗体、anti-CD73抗体含有2% BSA-PBSにてインキュベーション後、FACSCaliburTM (Becton Dickinson) にて蛍光強度を測定した。
【００２７】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原の確認結果）
非培養脂肪組織由来間質細胞群及び５回継代培養を行った培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原の確認結果を図１に示す。
図１の結果より、非培養脂肪組織由来間質細胞群について、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、白血球細胞関連の表面抗原の発現を検討したところ、CD105: 15.45%、CD44: 6.56%、CD45: 14.35%、CD29: 35.93%、CD90: 40.35%、CD34: 11.45%、CD31: 21.65%、CD73: 16.15%であった。
一方、5回継代した培養脂肪組織由来間質細胞群ではCD105: 32.0%、CD44: 49.7%、CD45: 1.74%、CD29: 95.3%、CD90: 95.8%、CD34: 7.97%、CD31: 2.25%、CD73: 27.8%であった。
これにより、培養にて、CD105、CD44、CD29、CD90、CD73の陽性細胞分画が増加し、CD45、CD34、CD31の陽性細胞分画が減少したことを確認した。
【実施例２】
【００２８】
（消化管炎症モデル動物の作成及び非培養脂肪組織由来間質細胞群投与による炎症改善の確認）
本実施例では、消化管炎症モデル動物を作成し、さらに、非培養脂肪組織由来間質細胞群を該動物に投与することによる炎症の改善及び生存率の上昇を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００２９】
（消化管炎症モデル動物の作成）
消化管炎症モデル動物の一例として、腸炎症マウスを使用した。詳細は、以下の通りである（参照文献：NATURE PROOCOLS VOL.2 NO.3 2007）。
C57Bl/6マウス（体重が20g前後）に、3%デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）を試験開始の初日から毎日投与して、腸炎症マウスを作成した。なお、給餌は、CRF-1とした。
非培養脂肪組織由来間質細胞群投与群（９匹：治療群）に関し、連日の3%デキストラン硫酸ナトリウム投与に加え、試験開始から３日目に、約1×106／300μlの非培養脂肪組織由来間質細胞群を、腸炎症マウスに尾静脈投与した。
コントロールの非培養脂肪組織由来間質細胞群未投与群（９匹：未治療群）に関し、3%デキストラン硫酸ナトリウムのみを試験開始から毎日投与した。
【００３０】
（非培養脂肪組織由来間質細胞群投与による炎症改善及び生存率の確認）
治療群の体重変化及び未治療群の体重変化を、それぞれ、図２及び図３に示す。
図２の結果から明らかなように、非培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、２匹の腸炎症マウス（図２中の治療Ｃ、治療Ｄ）は１２日目頃から体重が増加した。
一方、図３の結果から明らかなように、非培養脂肪組織由来間質細胞群を投与しないと、すべての炎症マウスでは体重増加が見られなかった。
治療群の生存率及び未治療群の生存率を、図４に示す。
図４の結果から明らかなように、非培養脂肪組織由来間質細胞群投与群は、非培養脂肪組織由来間質細胞群未投与群と比較して、生存日数が上昇した。
以上により、非培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、腸炎症が改善して、体重が増加すること、さらには生存日数が伸びることを確認した。すなわち、非培養脂肪組織由来間質細胞群は、腸炎症改善効果及び生存日数増加効果を有する。
【００３１】
（総論）
本実施例の結果より、本発明の消化管炎症治療剤は炎症改善効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明では、新規な消化管炎症治療剤を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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