(57)【要約】      （修正有）【課題】肝炎治療剤、特に、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤及び急性肝炎治療剤の提供。【解決手段】優れた炎症抑制効果、線維化抑制効果、代謝異常改善効果（特に、脂肪酸代謝改善効果）及び肝障害の改善効果を有する、全細胞に対してＣＤ１０５陽性細胞の割合が0.1〜40.0％及び／又はＣＤ４５陽性細胞の割合が0.1〜20.0％である脂肪組織由来間質細胞群、及び該細胞群を有効成分とする非アルコール性脂肪性肝炎治療剤及び急性肝炎治療剤、代謝異常治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織由来間質細胞群を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
【請求項２】
前記脂肪組織由来間質細胞群は、全細胞に対してＣＤ１０５陽性細胞の割合が0.1％〜40.0％及び／又はＣＤ４５陽性細胞の割合が0.1％〜20.0％である請求項１に記載の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
【請求項３】
前記非アルコール性脂肪性肝炎治療剤は、予防用治療剤である請求項１又は２に記載の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
【請求項４】
脂肪組織由来間質細胞群を含む代謝異常治療剤。
【請求項５】
前記代謝異常治療剤が、脂肪酸代謝治療剤である請求項４に記載の治療剤。
【請求項６】
非培養脂肪組織由来間質細胞群を含む肝炎治療剤。
【請求項７】
前記脂肪組織由来間質細胞群は、全細胞に対してＣＤ１０５陽性細胞の割合が0.1％〜40.0％及び／又はＣＤ４５陽性細胞の割合が0.1％〜20.0％である請求項６に記載の肝炎治療剤。
【請求項８】
前記肝炎が、急性肝炎である請求項６又は７に記載の肝炎治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤及び急性肝炎治療剤、並びに代謝異常治療剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
（肝臓及びその疾患）
肝臓は、身体に必要な物質を合成し、老廃物を排泄するなど、生命活動にとって重要な臓器である。
しかし、肝臓は、ウイルス、薬物、アルコール等の原因により、急性及び慢性的に障害を受け、肝炎、肝硬変、肝癌等の肝疾患を起こす。
【０００３】
（非アルコール性脂肪性肝炎：NASH）
非アルコール性脂肪性肝炎は、肝臓に脂肪が蓄積することで起こる肝炎である。NASHの原因としては、食生活の異常、肥満、糖尿病や高脂血症などの生活習慣病が挙げられるが、発症機序は不明である。
【０００４】
NASHの治療剤として、下記が報告されている。
先行特許文献１では、「非アルコール性脂肪性肝炎の予防及び／又は治療に用いる経口摂取用組成物であって,未成熟パパイア果実発酵物からなることを特徴とする経口摂取用組成物」を開示している。
先行特許文献２では、「3,7,11,15-テトラメチル-2,4,6,10,14-ヘキサデカペンタエン酸を有効成分として含む医薬」を開示している。
先行特許文献３では、「３"Ｏ−メチルエピガロカテキンガレートおよび／または３"Ｏ−メチルガロカテキンガレートを含有する、非アルコール性脂肪性肝炎の治療および／または予防用組成物」を開示している。
しかし、これらの先行特許文献では、「脂肪組織由来間質細胞群を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤」を開示又は示唆をしていない。
【０００５】
（急性肝炎）
急性肝炎は、ほとんどがウイルス（特に肝炎ウイルス）の感染により起こる。感染ウイルスの種類により、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、及びその他のウイルスによる肝炎に分類される。
日本における急性肝炎の年間発生は、約35万人といわれており、その内訳はＡ型肝炎10万人、Ｂ型肝炎10万人、Ｃ型肝炎14万人であり、Ｄ型肝炎とＥ型肝炎は僅かである。
また、肝炎ウイルス感染による慢性肝炎をはじめ、肝疾患の多くは炎症を伴う。B型、C型慢性ウイルス肝炎、非アルコール性脂肪肝炎等、慢性肝炎においては、持続する肝内炎症によって、肝細胞の壊死、線維化の進展が生じ、最終的に肝機能低下を伴う肝硬変・肝不全状態に至る。また、劇症肝炎では、肝臓に生じた炎症により、急激に肝細胞の壊死がおこり、肝不全に至る。そのため、肝疾患の再生療法においては、肝機能の再生効果に加えて、炎症に対する制御効果が重要である。
【０００６】
先行特許文献４では、「脂肪組織由来間質細胞群を含む肝炎治療剤」を開示している。しかし、先行特許文献４は、「非培養脂肪組織由来間質細胞群、ＣＤ１０５陽性細胞及びＣＤ４５陽性細胞が、急性肝炎に効果があること」を開示又は示唆をしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開2014-055146号公報
【特許文献２】特開2013-216679号公報
【特許文献３】特開2012-031101号公報
【特許文献４】特開2012-056913号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非アルコール性脂肪性肝炎は、比較的炎症が軽度な場合には、運動及び食事療法並びに必要に応じて薬物療法が適用されるが、患者の日々の生活の負担が重い。また炎症が重度な場合には、外科療法（肝臓一部切除等）や薬物療法（ビオグリタゾン等の副作用の強い治療薬）が必要になる。
また、急性肝炎・劇症肝炎は、治療奏功まで時間を要する場合があり、また、速やかな治療開始にもかかわらず急速な肝機能悪化を防ぐことができない場合がある。重篤な肝機能障害症状の場合には、血漿交換、さらには肝移植が必要である。しかし、肝移植のためのドナーが不足している状況である。
そこで、本発明者らは、新規な肝炎治療剤、特に、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤及び急性肝炎治療剤を開発することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために、脂肪組織由来間質細胞群、特に非培養脂肪組織由来間質細胞群に注目した。
そして、本発明者らは、脂肪組織由来間質細胞群が優れた炎症抑制効果、線維化抑制効果、代謝異常改善効果（特に、脂肪酸代謝改善効果）及び肝障害の改善効果を有することを確認し、該細胞群を含む、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤、急性肝炎治療剤及び代謝異常治療剤を完成した。
【００１０】
本発明は以下からなる。
「１．脂肪組織由来間質細胞群を含む非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
２．前記脂肪組織由来間質細胞群は、全細胞に対してＣＤ１０５陽性細胞の割合が約0.1％〜約40.0％及び／又はＣＤ４５陽性細胞の割合が約0.1％〜約20.0％である前項１に記載の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
３．前記非アルコール性脂肪性肝炎治療剤は、予防用治療剤である前項１又は２に記載の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤。
４．脂肪組織由来間質細胞群を含む代謝異常治療剤。
５．前記代謝異常治療剤が、脂肪酸代謝治療剤である前項４に記載の治療剤。
６．非培養脂肪組織由来間質細胞群を含む肝炎治療剤。
７．前記脂肪組織由来間質細胞群は、全細胞に対してＣＤ１０５陽性細胞の割合が約0.1％〜約40.0％及び／又はＣＤ４５陽性細胞の割合が約0.1％〜約20.0％である前項６に記載の肝炎治療剤。
８．前記肝炎が、急性肝炎である前項６又は７に記載の肝炎治療剤。」
【発明の効果】
【００１１】
本発明の非アルコール性脂肪性肝炎治療剤及び代謝異常治療剤は、優れた線維化抑制効果及び代謝異常改善効果を示す。
さらに、本発明の急性肝炎治療剤は、優れた肝障害の改善効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原を示す図（実施例１）。図中の「ucADSCs」及び「cADSCs」、は、それぞれ、「非培養脂肪組織由来間質細胞群」及び「培養脂肪組織由来間質細胞群」を意味する。
【図２】早期治療群のアルブミン及びTNFの測定結果。
【図３】早期治療群のコラーゲン４型α1及びコラーゲン１型α1の測定結果。
【図４】早期治療群のPPARa及びAdipoR2の測定結果。
【図５】予防治療群のアルブミン及びTNFの測定結果。
【図６】（Ａ）脂肪組織由来間質細胞を投与された急性肝炎マウスから摘出した肝臓の肉眼的所見及び組織学的所見（HE染色 ×100倍、Bar: 200μm）。（Ｂ）脂肪組織由来間質細胞を投与された急性肝炎マウスの血清AST、ALT、LDH活性値の測定結果（* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.005）。
【図７】（Ａ）非培養脂肪組織由来間質細胞群投与細胞数による血清AST、ALT、LDH活性比較（1×104個投与はn=3、1×105個投与及び1×106個投与はn=2）。（Ｂ）非培養脂肪組織由来間質細胞群投与細胞数による肝組織のCD4、CD8、CD11b、Gr-1及びF4/80の免疫染色比較（倍率: ×100倍、Bar: 200μm）。
【図８】セルソーターによる細胞分画の分離｛分離前と分離後の非培養脂肪組織由来間質細胞群に含まれる陽性細胞分画率(P1領域)の比較｝。
【図９】IFNγ、TNFα、CCL3における発現変化｛縦軸に18SrRNAと比較した発現量、横軸にConA刺激脾細胞(ConA SPC)と共培養を行った非培養脂肪組織由来間質細胞分画を示す。コントロールとしてナイーブ脾細胞(SPC)を使用した｝。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（肝炎治療剤及び代謝異常治療剤）
本発明の肝炎治療剤（非アルコール性脂肪性肝炎治療剤及び急性肝炎治療剤も含む）及び代謝異常治療剤（特に、脂肪酸代謝治療剤）は、少なくとも、脂肪組織由来間質細胞群、及び／又は非培養脂肪組織由来間質細胞群を含む。急性肝炎治療剤は、好ましくは、非培養脂肪組織由来間質細胞群を含む。
なお、本発明の「非培養脂肪組織由来間質細胞群」とは、継代培養をしていない脂肪組織由来間質細胞群を意味する。本発明の「培養脂肪組織由来間質細胞群」とは、１回以上の継代培養をした脂肪組織由来間質細胞群を意味する。本発明の「脂肪組織由来間質細胞群」とは、非培養脂肪組織由来間質細胞群及び培養脂肪組織由来間質細胞群の両方を含む。
【００１４】
（炎症）
本発明の「炎症」とは、急性的な炎症と慢性的な炎症を含む。なお、粘膜上皮が物理的又は化学的な刺激や細菌やウイルスの感染を受けると炎症が生じ、その程度によりびらんや潰瘍病変といった臓器構成細胞の傷害を生じる。
【００１５】
（脂肪組織由来間質細胞群）
本発明の「脂肪組織由来間質細胞群」とは、分取した脂肪組織を酵素処理（好ましくは、コラゲナーゼ処理）して得られた細胞群を意味する。
脂肪組織由来間質細胞群は、好ましくは、非培養脂肪組織由来間質細胞群であり、より好ましくは、ＣＤ１０５陽性細胞及び／又はＣＤ４５陽性細胞が存在する。
脂肪組織由来間質細胞群のＣＤ１０５陽性細胞割合は、約0.1％〜約40.0％である。脂肪組織由来間質細胞群のＣＤ４５陽性細胞割合は、約0.1％〜約20.0％である。
また、脂肪組織由来間質細胞群は、少なくとも、内皮細胞、血球系細胞を含み、より好ましくは、内皮細胞、血球系細胞、線維芽細胞、血管周囲細胞、平滑筋細胞を含む脂肪組織由来間質細胞群を含む。
さらに、脂肪組織由来間質細胞群は、好ましくは、自家性又は同系である。自家性脂肪組織由来間質細胞群とは、投与対象から得られた脂肪組織由来間質細胞群を意味する。また、同系脂肪組織由来間質細胞群とは、投与対象と同じ種から得られた脂肪組織由来間質細胞群を意味する。例えば、投与対象がヒトであるなら、同系脂肪組織由来間質細胞群は投与対象以外のヒトから得られる。
【００１６】
（肝炎治療剤の適用対象）
本発明の肝炎治療剤の適用対象は、急性的な炎症及び慢性的な炎症の両方であり、非アルコール性脂肪性肝炎、急性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎、劇症肝不全、又は急性肝不全等であるが、特に好ましいのは、非アルコール性脂肪性肝炎及び急性肝炎である。
さらに、本発明の肝炎治療剤は、肝炎の治療（完治も含む）、改善だけでなく、予防にも利用できる。
【００１７】
（代謝異常治療剤の適用対象）
本発明の代謝異常治療剤の適用対象は、脂質代謝機能が低下し、該機能を改善、向上、活性化の必要な疾患を対象とする。例えば、生活習慣病、脂肪性肝炎（非アルコール性、アルコール性を含む）、糖尿病、脂質異常症、高血圧に適用可能である。
さらに、本発明の脂質代謝治療剤は、脂質代謝機能改善だけでなく、脂質代謝機能低下予防にも利用できる。
【００１８】
（肝炎治療剤及び代謝異常治療剤の治療対象）
本発明の肝炎治療剤及び代謝異常治療剤の治療対象は、哺乳動物を包括的に含む。哺乳動物の例として、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル等であるが、特に限定されない。
【００１９】
（肝炎治療剤及び代謝異常治療剤に含まれる生理活性物質）
本発明の肝炎治療剤及び代謝異常治療剤には、生理活性物質が含まれていても良い。生理活性物質は、例えば、タンパク質、ポリペプチド、多糖（例えばヘパリン）、オリゴ糖、単糖、二糖、有機化合物、有機金属化合物、又は無機化合物等が挙げられるが特に限定されない。より詳しくは、生物学的に活性な分子、例えば、ホルモン、増殖因子、増殖因子産生ウイルス、増殖因子阻害薬、増殖因子受容体、抗炎症薬、代謝拮抗薬、インテグリン遮断薬、又はセンス遺伝子若しくはアンチセンス遺伝子等が挙げられる。
さらにより詳しくは、増殖因子の例としては、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒト成長ホルモン、血小板誘発増殖因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン、サイトカイン、又はそれらの組み合わせ等が挙げられる。
【００２０】
（肝炎治療剤及び代謝異常治療剤に含まれる免疫抑制剤）
本発明の肝炎治療剤及び代謝異常治療剤には、免疫抑制剤が含まれていても良い。例えば、自家性ではない脂肪組織由来間質細胞群を含む肝炎治療剤及び代謝異常治療剤の場合には、免疫拒絶反応を抑えるために、好ましくは免疫抑制剤を含める。
【００２１】
（肝炎治療剤及び代謝異常治療剤に含まれる担体）
本発明の肝炎治療剤及び代謝異常治療剤には、担体が含まれていても良い。担体の例としては、生理食塩水、溶媒、分散培地、細胞培養液、水溶性緩衝、抗酸化剤等が挙げられるが特に限定されない。
【００２２】
（肝炎治療剤及び代謝異常治療剤の投与形態）
本発明の肝炎治療剤及び代謝異常治療剤の投与経路は特に限定されない。例えば、静脈内注射、動脈内注射、門脈内注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、又は腹腔内注射等を利用することができる。
また、本発明の肝炎治療剤及び代謝異常治療剤の投与量は、例えば、１回の１治療部位当たり約1×102〜2.5×1011個の脂肪由来幹細胞を該治療部位に投与できるが、特に限定されない。
【００２３】
（脂肪組織由来間質細胞群の調製方法）
脂肪組織由来間質細胞群の調製方法を以下に記載するが、特に限定されない。
脂肪組織（皮下脂肪、内臓脂肪、筋肉内脂肪、筋肉間脂肪）を動物から切除、吸引などの手段で採取する。免疫拒絶を回避するため、治療対象と同一の個体から脂肪組織を採取することが好ましい。
採取した脂肪組織は、必要に応じて、付着した血液成分の除去及び細片化を経た後、酵素処理に供される。酵素処理は、脂肪組織をコラゲナーゼ、トリプシン、ディスパーゼ等の酵素によって消化する。
なお、脂肪組織を適当な緩衝液や培養液中で洗浄することによって血液成分等を除去することができる。
【００２４】
（脂肪組織由来間質細胞群の調製方法の例）
脂肪組織由来間質細胞群の調製方法の具体例を以下に示すが、特に限定されない。
ヒトから採取した脂肪を、緩衝液を含有する培養皿に置き、洗浄し、さらに別の緩衝液を含有する培養皿に移す。該脂肪を微細な小片に刻み、2mg/mLコラゲナーゼＩを用いて数時間、約30℃〜39℃で消化する。消化済みの脂肪の懸濁液をＤＭＥＭ−１０（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン/アンピリシン）中で洗浄する。そして、消化されなかった脂肪組織を除去し、細胞ペレットを５ｍＬのＤＭＥＭ−１０中に懸濁させる。さらに、脂肪細胞懸濁液を、フィルターメッシュに通し、大きな粒子及び凝集塊を除去して、脂肪組織由来間質細胞群を得る。
【００２５】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
なお、本実施例は、金沢大学動物実験規程に従って行った。
【実施例１】
【００２６】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の調製並びに発現表面抗原の確認）
本実施例では、培養脂肪組織由来間質細胞群及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の調製を行い、さらに、それらの細胞群の発現表面抗原を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００２７】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の調製）
マウスの脂肪より脂肪組織由来間質細胞群を調製した。詳細は、以下の通りである。
C57Bl/6マウスを安楽死させ、鼡径部皮下脂肪組織を鈍的に剥離採取し、緩衝液を含有する培養皿に浸し洗浄し、さらに別の緩衝液を含有する培養皿に移した。該脂肪組織を細切し、コラゲナーゼIにて最大30分、37℃にて酵素処理し、抗真菌及び抗生物質を含む10% FBS 添加DMEM/F12(1:1) 溶液へ懸濁し、フィルターメッシュ(100μm)に通した後、遠心分離にて沈降させ、初代間質細胞群（非培養脂肪組織由来間質細胞群）を得た。
また、該初代間質細胞群の一部を、10% FBS (Gibco by Life TechnologiesTM)、  L-glutamine (Gibco by Life TechnologiesTM)、 Antibiotic-Antimycotic (Gibco by Life TechnologiesTM) を加えたDMEM/F12 (Gibco by Life TechnologiesTM) 培地で、37℃ 5% CO2の条件下で培養し、培養脂肪組織由来間質細胞群を得た。
【００２８】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原の確認）
培養脂肪組織由来間質細胞群及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原を確認した。詳細は、以下の通りである。
上記の非培養脂肪組織由来間質細胞群及び５回継代培養を行った培養脂肪組織由来間質細胞群を、蛍光標識anti-CD105抗体、anti-CD44抗体、anti-CD45抗体、anti-CD29抗体、anti-CD90抗体、anti-CD34抗体、anti-CD31抗体、anti-CD73抗体含有2% BSA-PBSにてインキュベーション後、FACSCaliburTM (Becton Dickinson) にて蛍光強度を測定した。
【００２９】
（培養及び非培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原の確認結果）
非培養脂肪組織由来間質細胞群及び５回継代培養を行った培養脂肪組織由来間質細胞群の発現表面抗原の確認結果を図１に示す。
図１の結果より、非培養脂肪組織由来間質細胞群について、間葉系幹細胞、血管内皮細胞、白血球細胞関連の表面抗原の発現を検討したところ、CD105: 15.45%、CD44: 6.56%、CD45: 14.35%、CD29: 35.93%、CD90: 40.35%、CD34: 11.45%、CD31: 21.65%、CD73: 16.15%であった。
一方、5回継代した培養脂肪組織由来間質細胞群ではCD105: 32.0%、CD44: 49.7%、CD45: 1.74%、CD29: 95.3%、CD90: 95.8%、CD34: 7.97%、CD31: 2.25%、CD73: 27.8%であった。
これにより、培養にて、CD105、CD44、CD29、CD90、CD73の陽性細胞分画が増加し、CD45、CD34、CD31の陽性細胞分画が減少したことを確認した。
【実施例２】
【００３０】
（非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物の作成及び脂肪組織由来間質細胞群投与による非アルコール性脂肪性肝炎改善の確認）
本実施例では、非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物を作成し、さらに、培養脂肪組織由来間質細胞群を該動物に投与することによる非アルコール性脂肪性肝炎の改善を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３１】
（非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物の作成）
非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物の一例として、動脈硬化高脂肪食(At-HF食)を摂食させたNASHモデルマウスを使用した。詳細は、以下の通りである。
8〜10週齢のC57BL/6マウスに、At-HF食を摂食させて、非アルコール性脂肪性肝炎マウスを作成した。下記表１に記載の通りに、予防治療群及び早期治療群に、1×105個GFP-培養脂肪組織由来間質細胞群（ADSC）を投与し、12週目に解剖を行い、各マーカーの数値測定を行った。なお、投与経路は、脾被膜下注射で行った。より詳しくは、10%ソムノペンチルにて全身麻酔下に、左側腹部の小切開創より脾臓を同定し、被膜下に投与を行った。
用意した群は、予防治療群（At-HF食を摂食させて、0週目及び4週目にGFP-培養脂肪組織由来間質細胞群を投与した群）、早期治療群（At-HF食を摂食させて、4週目及び8週目にGFP-培養脂肪組織由来間質細胞群を投与した群）、未治療群（At-HF食を摂食させて、GFP-培養脂肪組織由来間質細胞群を投与しない群）及びコントロール群｛通常食を摂食させて、GFP-培養脂肪組織由来間質細胞群を投与しない（PBS投与）群｝である。
また、肝臓が持つタンパク質産出能の指標であるアルブミン、腫瘍マーカーであるTNF（腫瘍壊死因子）、線維化マーカーであるColl4a1（コラーゲン４型α1）及びColl1a1（コラーゲン１型α1）並びに脂肪酸代謝マーカーであるPPARa（α型ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体）及びAdipoR2（アディポネクチン受容体R2）は、市販のキットを使用して測定した。
【００３２】
【表１】
2016017067.tif 000002
【００３３】
（非アルコール性脂肪性肝炎改善・予防の確認結果）
早期治療群に関し、アルブミン及びTNFの測定結果を図２、コラーゲン４型α1及びコラーゲン１型α1の測定結果を図３、並びにPPARa及びAdipoR2の測定結果を図４に示した。
アルブミンに関し、培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、低下するアルブミン値を上昇させることができた。すなわち、肝炎に伴う肝細胞機能の低下を防ぐことができた。
TNFに関し、培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、肝炎において上昇するTNF値を低下させることができた。TNFは、炎症開始に関連するサイトカインであるので、炎症を抑えることができた。
線維化マーカーであるColl4a1及びColl1a1に関し、培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、上昇した線維化マーカーを低下させることができた。
脂肪酸代謝マーカーであるPPARa及びAdipoR2に関し、培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、低下した脂肪酸代謝マーカーを上昇させることができた。
すなわち、脂肪組織由来間質細胞群投与により、脂肪性肝炎を改善することができた。
【００３４】
予防治療群に関し、アルブミン及びTNFの測定結果を図５に示した。
アルブミンに関し、培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、低下するアルブミン値を抑えることができた。
TNFに関し、培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、上昇するTNF値を抑えることができた。
すなわち、脂肪組織由来間質細胞群投与により、脂肪性肝炎を予防することができた。
【００３５】
以上により、非アルコール性脂肪性肝炎の症状を示す各マーカー値を改善することができた。特に、脂肪組織由来間質細胞群投与は、線維化マーカーの上昇及び脂肪酸代謝マーカーの低下を抑えることができたので、非アルコール性脂肪性肝炎の治療効果及び予防効果に優れている。
さらに、脂肪組織由来間質細胞群投与は、肪酸代謝マーカーの低下を抑えることができたので、代謝異常改善効果、特に、脂肪酸代謝改善効果も有する。
【実施例３】
【００３６】
（急性肝炎モデル動物の作成及び非培養脂肪組織由来間質細胞群投与による急性肝炎改善の確認）
本実施例では、急性肝炎モデル動物を作成し、さらに、培養脂肪組織由来間質細胞群又は非培養脂肪組織由来間質細胞群を該動物に投与することによる急性肝炎の改善を確認した。詳細は、以下の通りである。
【００３７】
（急性肝炎モデル動物の作成及び該モデル動物への脂肪組織由来間質細胞群投与）
C57BL/6Jマウス (10-12 週齢、雌) にConA (Sigma-Aldrich) 300μg を尾静脈より投与し、急性肝炎を誘導させた。ConA投与 3時間後に1×105個の非培養脂肪組織由来間質細胞群又は培養脂肪組織由来間質細胞群を尾静脈より投与し、ConA投与から24時間後に血液を採取、肝臓を摘出した。
また、非培養脂肪組織由来間質細胞群の投与細胞数と抗炎症効果の相関検討として、GFP-Tgマウス（CMVプロモーター改良後のCAGプロモーターであるCAGプロモーター下にGFPを発現するトランスジェニックマウス）より得た1×104個、1×105個又は1×106個の細胞を投与し、ConA投与から16時間後に血液を採取、肝臓を摘出した。
【００３８】
（血清AST、ALT、LDH活性測定）
麻酔下にて、マウスの後眼窩静脈叢より血液を採取し、遠心分離した血清にて、市販の測定キットを用いてAST、ALT、LDH活性を測定した。統計解析は、JMP統計解析ソフトウェア(SAS)を用いて、wilcoxon検定、Student's T testを行った。
【００３９】
｛組織学的解析 (HE染色及び免疫染色)｝
摘出した肝臓を10% ホルマリン緩衝液に固定後、パラフィンに包埋し、2 μm薄切切片を作製し、HE染色を行った。また、OCT compound (Sakura Finetek) にて凍結した肝組織は、4 μmの薄切切片を作製し、アセトンにて固定後、内因性ペルオキシダーゼブロッキング、非特異的タンパクブロッキング後、1% BSA含有PBSで希釈したanti-CD4抗体、anti-CD8抗体、anti-CD11b抗体、anti-Gr-1抗体、anti-F4/80抗体を4℃で一晩反応させた後、二次抗体シンプルステインマウスMAX-PO(R) (ニチレイバイオサイエンス) を室温で30分反応させ、Diaminobenzidine(DAB)+Liquid・基質キット (Dako) を用いて発色後、ヘマトキシリンにて対比染色した。
【００４０】
（脂肪組織由来間質細胞投与による急性肝炎マウスに対する治療効果の確認）
ConA (300μg) を尾静脈投与し、3時間後に非培養脂肪組織由来間質細胞又は培養脂肪組織由来間質細胞を投与し、24時間後において、肝表面の肉眼的所見、組織学的所見及び血清AST、ALT、 LDH活性を評価した。
図６（Ａ）から明らかなように、培養脂肪組織由来間質細胞群投与及び非培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、肉眼的、組織学的に肝壊死が抑制された。
図６（Ｂ）から明らかなように、培養脂肪組織由来間質細胞群投与及び非培養脂肪組織由来間質細胞群投与により、急性肝炎に伴う血清AST、ALT、LDH活性値上昇が抑制された。
AST、ALT及びLDHは、肝細胞が破壊されたときに流出するので、肝細胞障害を抑制することができた。
以上により、培養脂肪組織由来間質細胞群投与及び非培養脂肪組織由来間質細胞群投与は、肝炎抑制効果を示した。
【００４１】
（非培養脂肪組織由来間質細胞群の投与細胞数と急性肝炎マウスに対する治療効果の確認）
非培養脂肪組織由来間質細胞群の急性肝炎に対する治療効果と投与細胞数の関連について確認した。
図７（Ａ）から明らかなように、GFP-Tgマウスより得た非培養脂肪組織由来間質細胞群を1×104個、1×105個又は1×106個投与した場合、投与細胞数依存的に、血清AST、ALT、LDH活性値が抑制された。
図７（Ｂ）から明らかなように、肝組織における炎症細胞集簇は、投与細胞数依存的にCD4、CD11b及びGr-1陽性細胞集簇の減少が見られた。
以上により、非培養脂肪組織由来間質細胞群投与は、投与細胞数依存的に肝炎抑制効果を示した。
【実施例４】
【００４２】
（脂肪組織由来間質細胞群中の肝炎に効果のある細胞の特定）
脂肪組織由来間質細胞群中に含まれる細胞を分離し、さらにどの細胞が肝炎に効果があるかを特定した。詳細は、以下の通りである。
【００４３】
（脂肪組織由来間質細胞群中に含まれる細胞の分離方法）
C57BL/6J雄性マウス4匹から4×107個の非培養脂肪組織由来間質細胞群を採取し、2% BSA含有PBSで希釈したPE標識のanti-Notch-1抗体、anti-CD206抗体、anti-CD137抗体、anti-CD11b抗体、anti-SiglecF抗体、anti-CD90抗体、amti-CD105抗体、anti-CD45抗体にてインキュベーション後、FACSAriaTMIIセルソーターにて、陽性細胞を分離し、各細胞分画を獲得した。分離後の陽性細胞の純度を、Flow cytometoryにて評価した。
【００４４】
（非培養脂肪組織由来間質細胞分画を脾細胞に投与することによる肝炎に効果がある細胞の特定方法）
脾細胞は、C57BL/6Jマウスのナイーブ脾臓を鈍的破砕し、ACK Lysis Buffer (Lonza) にて赤血球を破砕後、獲得した。24-well plate (Becton Dickinson) に非培養脂肪組織由来間質細胞群の各細胞分画を1×104個播種した後、カルチャーインサート (Becton Dickinson) を挿入し、カルチャーインサート内へ1×105個の脾細胞を播種し、ConA (5μg/mL)、10% FBS添加RPMI (Gibco by Life TechnologiesTM) 培地にて、 37℃ 5% CO2 の条件下で2時間共培養を行った後、脾細胞を回収し、MicroRNA isolation kit (Stratagene) にてRNAを抽出した。抽出したRNA 100ngをHigh Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ABI) にて、cDNAを作製し、IFNγ、TNFα及びCCL3の発現をqPCR Mastermix Plus (EUROGENTEC) にて、定量した。プローブは TaqMan  Gene Expression Assays (Applied Biosytems)、リファレンスは18SrRNA (Applied Biosytems) を用いた。
統計解析は、JMP統計解析ソフトウェア(SAS)を用いて、wilcoxon検定、Student's T testを行った。
【００４５】
（脂肪組織由来間質細胞群中に含まれる細胞の特定）
FACSAriaTMIIセルソーターにて、表面抗原によって細胞分画を分離、回収した。回収した表面抗原発現陽性細胞の純度は、図８に記載のように、Notch-1: 81.2%、CD206: 70.4%、CD137: 63.1%、CD11b: 84.1%、SiglecF: 84.8%、CD90: 86.4%、CD105: 86.1%及びCD45: 84.8%であった。
【００４６】
（非培養脂肪組織由来間質細胞分画を脾細胞に投与することによる肝炎に効果がある細胞の特定）
非培養脂肪組織由来間質細胞群から分離した細胞分画を播種し、カルチャーインサートを挿入後、カルチャーインサート内に脾細胞を播種し、ConA刺激下に2時間共培養した後、脾細胞を回収、RNA抽出後、IFNγ、TNFα、CCL3の遺伝子発現を検討した。
図９に記載のように、CD105陽性細胞分画とCD45陽性細胞分画がIFNγ、TNFα、CCL3全ての発現を抑制した。また、CCL3の発現抑制については、Notch-1陽性細胞分画、CD206陽性細胞分画、CD11b陽性細胞分画、SiglecF陽性細胞分画及びCD90陽性細胞分画によっても抑制された。
すなわち、IFNγとTNFαの発現を抑制したので、炎症を抑制することができた。また、CCL3は、単球系細胞より産生され炎症細胞浸潤に関与するので、炎症惹起及び炎症細胞浸潤を抑制することができた。
【００４７】
（総論）
非培養脂肪組織由来間質細胞投与により、急性肝炎に対する抗炎症効果及び治療効果を確認した。治療効果は、投与細胞数依存的に増強した。急性肝炎における肝内CD4、CD11b及びGr-1陽性炎症細胞集簇は、投与細胞数を増やすに従い、著明に減少した。抗炎症効果を有する細胞分画を確認するため、非培養脂肪組織由来間質細胞分画を分離し、脾細胞とConA刺激下に共培養を行ったところ、CD105及びCD45陽性細胞分画との共投与により、IFN、TNFα及びCCL3の遺伝子発現が抑制できた。これにより、非培養脂肪組織由来間質細胞における間葉系幹細胞及び白血球細胞分画が抗炎症効果を有することが考えられる。
【００４８】
本実施例の結果より、脂肪組織由来間質細胞群は、優れた炎症抑制効果、線維化抑制効果、脂肪酸代謝改善効果及び肝障害の改善効果を有する。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明では、新規な肝炎治療剤、特に、非アルコール性脂肪性肝炎治療剤、並びに脂肪酸代謝治療剤を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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