(57)【要約】【課題】本発明の課題は、日常の食生活において容易に入手および摂取でき、血圧上昇を抑制することができる。副作用が少なく安全性の高い予防・改善用機能性食品又は食品素材や飼料を提供することにある。【解決手段】食経験があるニシン由来のアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド、および当該ペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤、機能性飲食品、飼料、血圧上昇抑制作用を有する医薬を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱変性させたニシン蛋白質にプロテアーゼを作用させて得られるアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
【請求項２】
ニシン蛋白質がカズノコあるいは白子を採取した後の廃棄物由来である請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
プロテアーゼがバチルス属由来の酵素である請求項１記載のペプチド。
【請求項４】
以下の工程を有するアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドの製造方法。
（１）ニシン由来の蛋白質を加熱変性させる工程
（２）加熱変性した蛋白質にプロテアーゼを作用させる工程
【請求項５】
プロテアーゼがバチルス属由来の酵素である請求項４記載の製造法。
【請求項６】
ニシン由来の蛋白質がカズノコあるいは白子を採取した後の廃棄物から得られる蛋白質を用いる請求項４記載の製造法。
【請求項７】
請求項１から請求項３記載のペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項８】
請求項１から請求項３記載のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する機能性食品。
【請求項９】
請求項１から請求項３記載のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する飲料。
【請求項１０】
請求項１から請求項３記載のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペットフード
【請求項１１】
請求項１から請求項３記載のペプチドを含有する血圧上昇抑制作用を有する医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、ニシン蛋白質由来のアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有効成分として含有する血圧上昇抑制作用に関する。本発明は、血圧上昇抑制機能性食品または食品素材、内服剤として、ヒト若しくはヒト以外の動物に与えられる医薬品（動物用治療薬も含む）用、飲食品用、および飼料用またはペットフードの組成物を意味する。
【背景技術】
【０００２】高血圧症は生活習慣病の一つである。高血圧症は原因が分かっている二次性高血圧症と原因不明の本態性高血圧症の二つがあるが、日本における高血圧患者の約９０％が本態性高血圧である。血圧は、心拍出量と末梢血管抵抗その他さまざまな因子によって調節されており、なかでも、レニン・アンジオテンシン系は、血圧の制御に関して大きな役割を担っている。肝臓でアンジオテンシノーゲンが合成され、アンジオテンシノーゲンは腎臓で合成されるレニンによってアンジオテンシンＩに変換さる。さらにアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）によってアンジオテンシンＩＩへと変換される。アンジオテンシンＩＩがアンジオテンシンＩＩ受容体に結合することで、血管平滑筋が収縮し、結果として血圧が上昇する。高血圧は自覚症状がないため、放置してしまうことが多く、動脈硬化、心臓病、脳卒中等の危険因子である。【０００３】  前述の高血圧については、これを解消するための医療品が種々提案され、既に数多く市販されている。治療剤としては、腎臓でのナトリウムと水の再吸収を抑制し循環血液量を減少させて血圧を下げる利尿薬、交感神経のα受容体の血管収縮作用を遮断し血管を拡張させ血圧を下げるα遮断薬、交感神経のβ受容体の心臓収縮力強化や昇圧ホルモン産生などの作用を遮断して血圧を下げるβ遮断薬、カルシウムイオンの細胞内への取り込みを抑制し血管を拡張することで血圧を下げるカルシウム拮抗薬、強力な昇圧ホルモンであるアンジオテンシンＩＩの生産を減少させ、血圧を下げるアンジオテンシン変換酵素（以下ＡＣＥと略すこともある。）阻害薬、昇圧ホルモンであるアンジオテンシンＩＩが作用する受容体の働きを阻害することで血圧を下げるアンジオテンシンＩＩ受容体阻害薬（ＡＲＢ）が用いられるが、これら医療用合成製剤は、処方箋を必要とするため、簡易には入手できないばかりか、製剤の投与又は服用により種々の副作用を伴うことがある。従って、高血圧の治療に使用される抗高血圧剤として、入手が容易でかつ副作用ができるだけ少ない天然物起源のものが求められている。天然物起源の高血圧の改善剤としては、ＡＣＥ阻害を示すノリ蛋白質由来ペプチド（非特許文献１、特許文献１）、微細藻類蛋白質由来ペプチド（非特許文献２）、ワカメ蛋白質由来ペプチド（非特許文献３）、イワシ蛋白質ペプチド（非特許文献４）、マグロ蛋白質由来ペプチド（非特許文献５）、マサバ蛋白質由来ペプチド（非特許文献６）、ミルクカゼイン由来ペプチド（非特許文献７）、ニンニク由来ペプチド（非特許文献８）、朝鮮人参蛋白質由来ペプチド（特許文献２）、コムギふすま、大麦糠、コメ糠蛋白質由来ペプチド（特許文献３）、ダイズ蛋白質由来ペプチド（特許文献４、特許文献５）などが知られている。これらＡＣＥ阻害活性を示すペプチドの他に副交感神経を刺激し血管平滑筋が弛緩され血圧が降下作用を示す杜中葉抽出物、ノルアドレナリンの分泌を抑制し血圧降下作用を示すγ−アミノ酪酸を配合した特定保健用食品が知られており、これらは特定保健用食品としての承認を得ている。【０００４】
【非特許文献１】マリンバイオテクノロジー、６巻、１６３頁、１９９８年
【非特許文献２】マリンバイオテクノロジー、３巻、３０５頁、２００１年
【非特許文献３】ジャーナル・ニュートリショナル・バイオケミストリー、１１巻、４５０頁、２０００年
【非特許文献４】日食工誌、４１巻、５８９頁、１９９４年
【非特許文献５】Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１８巻、９６頁、２０１０年
【非特許文献６】Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，７０巻、１１２１頁、２００４年
【非特許文献７】Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４６巻、１３９３頁、１９８３年
【非特許文献８】ジャーナル・ニュートリショナル・バイオケミストリー、９巻、４１５頁、１９９８年
【０００５】
【特許文献１】特許第２６７８１８０号
【特許文献２】特許第２９２０８２９号
【特許文献３】特開２０１１−１０２３００
【特許文献４】特開２０１０−２４８０９６号
【特許文献５】特開２０１０−１６３４００号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  本発明の課題は、日常の食生活において容易に入手および摂取でき、血圧上昇を抑制することができる、副作用の少ない予防・改善用機能性食品又は食品素材や、飼料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】本発明者は、上述の目的を達成するために、ニシン蛋白質由来のペプチドの機能性成分に着目し、鋭意研究を行った結果、ニシンに含有される蛋白質由来ペプチドに血圧上昇抑制作用があることを見出した。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものである。すなわち、本発明の血圧上昇抑制作用は、ニシン蛋白質由来のペプチドを有効成分することを特徴とするものである。
ニシン蛋白質由来のペプチドは、そのままあるいは機能性食品、飲料、ペットフードなどの構成成分とすることで高血圧症を予防・改善することができる。
即ち本発明が提供するのは以下の通りである。
［１］加熱変性させたニシン蛋白質にプロテアーゼを作用させて得られるアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチド。
［２］ニシン蛋白質がカズノコあるいは白子を採取した後の廃棄物由来である前記［１］記載のペプチド。
［３］プロテアーゼがバチルス属由来の酵素である前記［１］記載のペプチド。
［４］以下の工程を有するアンジオテンシン変換酵素阻害活性を有するペプチドの製造方法。
（１）ニシン由来の蛋白質を加熱変性させる工程
（２）加熱変性した蛋白質にプロテアーゼを作用させる工程
［５］プロテアーゼがバチルス属由来の酵素である前項［４］記載の製造法。
［６］ニシン由来の蛋白質がカズノコあるいは白子を採取した後の廃棄物から得られる蛋白質を用いる前項［４］記載の製造法。
［７］前項［１］から［３］記載のペプチドを有効成分とするアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
［８］前項［１］から［３］記載のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する機能性食品。
［９］前項［１］から［３］記載のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する飲料。
［１０］前項［１］から［３］記載のペプチドを含有するアンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペットフード
［１１］前項［１］から［３］記載のペプチドを含有する血圧上昇抑制作用を有する医薬。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ニシン由来ペプチドのラットにおける血圧低下作用を示した。
【図２】カツオ由来ペプチドのラットにおける血圧低下作用を示した。
【発明の効果】
【０００９】本発明の血圧上昇抑制剤、またはこれを含有する組成物は、体内でアンジオテンシンＩを、昇圧作用を持つアンジオテンシンＩＩに変換するＡＣＥの活性を抑制することから、血圧上昇抑制作用が期待できる。従って、血圧上昇抑制に有用である。さらに、食経験のある材料から本発明の剤または組成物を製造することが可能であるので、摂取しても安全である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】  本発明でニシン由来のＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの原料となる蛋白質は、水に可溶性のものであっても水に不溶性のものであっても良い。ニシンは生のものを使用しても良く、カズノコや白子などを採取した廃棄物を使用してもよいが、ＡＣＥ活性阻害作用を有するペプチドを安価に製造するためには廃棄物を使用する方が好ましい。廃棄物中から魚肉のみを選別したものも蛋白質原料として用いることもできるが魚の頭部、骨、皮などを含んだものを原料にしてＡＣＥ阻害活性ペプチドを得ても良い。ニシン蛋白質にプロテアーゼを作用させペプチドに加水分解することができる。この際未変性蛋白質に直接プロテアーゼを作用することもできるが、加熱あるいは酸性処理することによって変性させた蛋白質にプロテアーゼを作用させる方が効率的にペプチド化できる。使用するプロテアーゼの起源としては動植物由来の酵素の他に微生物由来の酵素も使用することができるが、品質の安定性の面で微生物由来の酵素が好ましい。微生物由来酵素のなかでもバチルス属由来酵素が特に好ましい。プロテアーゼ反応の際のｐＨは中性からアルカリ性が好ましい。反応温度は酵素が失活しない範囲で行うことができるが３０℃から６０℃が好ましく特に４０から５０℃が好ましい。使用する酵素の量は、０．０１％から０．５％程度が好ましく、特に０．１〜０．２％程度が好ましい。反応時間としては、用いる酵素の量にもよるが６〜２０時間である。製造工程の作業効率を考慮すると１５から１８時間が好ましい。以上の条件は酵素反応によって遊離されるＡＣＥ阻害活性を測定することによって決定すれば良い。酵素反応は固形分をホモゲナイズしたものに直接酵素を添加して反応を行ってもよい。酵素反応によって遊離したＡＣＥ阻害活性を有するペプチドの調製法としては酵素反応後に添加した酵素を加熱処理あるいは酸、アルカリ性にして失活させた後、濾過あるいは遠心分離によりＡＣＥ阻害活性ペプチドを含有する水溶液を得ることができる。この液を直接ＡＣＥ活性阻害物として用いることもできるが凍結乾燥、減圧乾燥あるいはスプレードライ化して粉末を得ることもできる。長期保存のためには粉末化する方が好ましい。前記のＡＣＥ阻害活性ペプチドを含有する水溶液にエタノール等の有機溶媒を添加してＡＣＥ阻害ペプチド以外の成分を沈殿分離して上清を得、減圧濃縮して精製したＡＣＥ阻害活性を示すペプチドを得ることもできる。更にイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどによって精製した高純度ペプチドを得ることもできる。
本発明の血圧上昇抑制剤は、ニシン由来蛋白質のペプチドを有効成分として含有するＡＣＥ阻害作用を有する剤および組成物である。上記の化合物の含有量は限定されないが、血圧上昇抑制作用を発揮できる範囲で含まれていれば良い。【００１１】  本発明の飲食用組成物は、上記の血圧上昇抑制剤を含有する組成物であり、これらを一般的な食品に混合したものである。また、公知の食品として適当な担体や助剤などを使用してカプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態にしたものでもよい。ここに言う飲食用とは、例えば、一般食品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品、ペットフードなどである。ここにいう一般食品とは、飲料、乳製品、発酵乳、乳酸菌飲料、加工乳、コーヒー飲料、ジュース、アイスクリーム、飴、ビスケット、ウェハース、ゼリー、スープ、麺類、を含むがそれに限定されるものではない。好ましくは飲料、乳製品、加工乳、発酵乳、乳酸菌飲料、ウェハース、ゼリーを含む。【００１２】  本発明の医薬用組成物は、上記の血圧上昇抑制剤を含有する組成物であり、上記剤そのものであってもよいし、所望により医薬的に許容される担体を含有する組成物であってもよい。その用途は限定されず、例えば一般用医薬品（ＯＴＣ）など容易に入手可能な医薬品又は医薬部外品などが挙げられる。医薬用組成物の形態は限定されず、例えば、丸薬剤、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル錠剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤などである。好ましくはカプセル剤、液剤、エリクシル、錠剤、カシェ、座薬などとするほうが良い。また医薬的に許容される担体とは、経口、経腸、経皮、および皮下投与のために好適である任意の材料であり、例えば水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド性二酸化ケイ素などが挙げられる。【００１３】  ニシン蛋白質由来ペプチド該組成物は、血圧上昇抑制剤の有効成分として配合されるが、血圧上昇抑制剤として製剤化する場合、剤形としては、粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形を採用することができる。その際、保存や取り扱いを容易にするために、デキストリン、シクロデキストリン等のキャリヤ、保存料、その他任意の助剤を必要に応じて配合することができる。またその形態は限定されず、飲食用組成物、医薬用組成物を含む。これらの含有量は限定されないが、血圧上昇抑制作用に対して効果が発揮できる範囲で含まれていれば良い。前記血圧上昇抑制剤は、ＡＣＥの活性を阻害してアンジオテンシンＩＩが生成されないようにする。【００１４】  ニシン蛋白質由来該組成物は、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有するペプチドを有効成分として含有する本発明の血圧上昇の予防・改善用機能性食品又は食品素材は、前記本発明の血圧上昇の予防・改善剤を飲食品原料の一部として用いたり、あるいは製造工程又は製造後に添加・配合することにより得ることができる。かかる機能性食品としては特に制限されるものではなく、調味類、ふりかけ類、菓子類、スナック類、麺類、魚肉練り製品、乳製品、飲料などを具体的に例示することができ���。
以下に実施例を挙げより詳細に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。【００１５】［実施例１、各種プロテアーゼ処理によるＡＣＥ阻害活性ペプチドの調製］
カズノコ採取後のニシン廃棄物６０グラムに１２０ｍｌの精製水を加え家庭用ミキサーで５分間ホモゲナイズした後、１００℃で３分間処理し蛋白質を加熱変性させた。室温まで戻した後表１に記載した各種プロテアーゼ１６０ｍｇを添加し、４０℃で１８時間反応した。酵素反応液を１００℃で５分間処理し酵素を失活させた後、濾布で固形分を除去し濾液１７０ｍｌを得た。濾液を減圧濃縮し２０ｍｌの濃縮液を得た。濃縮液に６０ｍｌのエチルアルコールを添加し、生じた沈殿物を濾布で濾過した後更に濾紙で濾過し濾液を得た。
濾液を凍結乾燥した後ＡＣＥ阻害活性を測定した。結果を表１に示した。
【表１】
2016000711.tif 000002
【００１６】［実施例２、カズノコ採取後のニシン廃棄物からのＡＣＥ阻害を示すペプチドの調製］
カズノコ採取後のニシン廃棄物６０グラムに１２０ｍｌの精製水を加え家庭用ミキサーで５分間ホモゲナイズした後、１００℃で３分間処理し蛋白質を加熱変性させた。室温まで戻した後プロテアーゼ（アマノエンザイム社製、ＳＤ−ＮＹ１０）１６０ｍｇを添加し、４０℃で１８時間反応した。酵素反応液を１００℃で５分間処理し酵素を失活させた後、濾布で固形分を除去し濾液１７０ｍｌを得た。濾液を減圧濃縮し２０ｍｌの濃縮液を得た。濃縮液に６０ｍｌのエチルアルコールを添加し、生じた沈殿物を濾布で濾過した後更に濾紙で濾過し濾液を得た。濾液を凍結乾燥して４．４ｇの粉末を得た。この標品のＡＣＥ阻害活性は６６単位／ｍｇであった。【００１７】［実施例４、ＡＣＥ阻害活性の測定法］
ＡＣＥ酵素活性キット（富士レビオ社）の基質溶液１５０マイクロリットルに適宜希釈したＡＣＥ阻害活性を示す溶液５マイクロリットルを添加し、３７℃で３分間予備加温した後、ＡＣＥ（シグマ社のウサギ肺由来の酵素）１０マイクロリットルを添加し、３７℃で６０分間反応を行い、発色剤を含む反応停止液３００マイクロリットルを添加した後、５００マイクロリットルの精製水を添加し、５００ｎｍにおける吸光度を測定した。ＡＣＥ阻害活性１単位は上記条件下、ＡＣＥ活性を５０％阻害する活性として定義した。【００１８】［実施例５、ニシン蛋白質由来ペプチドの血圧低下作用活性］
６週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ、雄性）を用い、１群５匹で８５００単位のＡＣＥ阻害活性を示すニシン蛋白質由来ペプチド溶液（０．５ｍｌ）を経口投与した。投与前、投与後１時間、２時間、４時間目の血圧を測定した。血圧測定には、マウス・ラット用無加温型非観血式血圧計（ＢＬＯＯＤ  ＰＲＥＳＳＵＲＥ  ＭＯＮＩＴＯＲ  ＦＯＲ  ＭＩＣＥ＆ＲＡＴ  Ｍｏｄｅｌ  ＭＫ−２０００）を使用し、ラットの尾動脈収縮期血圧（ＳＢＰ）を測定した。ラットの尾部をカフで締め付け、Ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法によりＳＢＰを６回測定し、その平均値を求めた。
図１にニシン蛋白質由来ペプチドのラットでの血圧低下作用を示した。４時間まで経時的に血圧低下が見られた。【００１９】［比較例、カツオ蛋白質由来ペプチドの血圧低下作用活性］
６週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ、雄性）を用い、１群５匹で８５００単位のＡＣＥ阻害活性を示すカツオ蛋白質由来ペプチド溶液（０．５ｍｌ）を経口投与した。投与前、投与後１時間、２時間、４時間目の血圧を測定した。血圧測定には、マウス・ラット用無加温型非観血式血圧計（ＢＬＯＯＤ  ＰＲＥＳＳＵＲＥ  ＭＯＮＩＴＯＲ  ＦＯＲ  ＭＩＣＥ＆ＲＡＴ  Ｍｏｄｅｌ  ＭＫ−２０００）を使用し、ラットの尾動脈収縮期血圧（ＳＢＰ）を測定した。
ラットの尾部をカフで締め付け、Ｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法によりＳＢＰを６回測定し、その平均値を求めた。
図２にカツオ蛋白質由来ペプチドのラットでの血圧低下作用を示した。４時間まで経時的に血圧低下が見られた。２時間目まで経時的に血圧低下が見られたが４時間で血圧上昇が見られた。
【図１】
2016000711.tif 000003
【図２】
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