(57)【要約】【課題】高活性であって且つ高選択的にHDAC8の機能を阻害することのできる化合物及びHDAC8阻害剤を提供する。【解決手段】発明のヒドロキサム酸誘導体は、下記一般式(1)又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることを特徴とする特徴とする。2016017040.tif 000014これらのヒドロキサム酸誘導体(1)は、HDAC8の酵素活性を選択的に阻害することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式(1)又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることを特徴とするヒドロキサム酸誘導体。
【化１】
2016017040.tif 000013
【請求項２】
前記φは置換基のないベンゼン環である請求項１に記載のヒドロキサム酸誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のヒドロキサム酸誘導体を有効成分として含有することを特徴とするHDAC8阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HDAC8の機能を選択的に阻害することのできるヒドロキサム酸誘導体及びそれを用いたHDAC8阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンは、真核生物においてＤＮＡを折りたたんでクロマチン構造を形成するタンパク質であり、様々な酵素の働きによって化学修飾され、これによりクロマチン構造が変化し、遺伝子の発現が制御されると考えられている。近年、こうしたエピジェネティックな遺伝子制御に関する様々な知見が発見されている。
【０００３】
最近発見されたHistone Deacetylase（以下「HDAC」という）は、アセチル化されたヒストンのリシン残基を脱アセチル化する反応を触媒し、多くの遺伝子発現を制御している。ヒストンのリシン残基のε−アミノ基がアセチル化されると、ヒストンの正電荷が中和されてヌクレオソーム構造が弛緩する。すなわち、そのプロモータ領域には転写調節因子がアクセスし易くなり、結果的に転写が活性化する。また、逆にヒストンの脱アセチル化が亢進するとヌクレオソーム構造が凝縮し、転写が抑制される。
【０００４】
HDACにはHDAC1〜HDAC11までの１１種類のアイソフォームが知られており、最近の研究によると、HDAC8を阻害することによって血液系がん細胞の増殖抑制や、神経芽細胞腫の分化誘導が可能となることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。
【０００５】
しかし、HDAC8が生体にどのような影響を与えるかなど、生物学的意義に関しては未だ不明な点も多い。このため、HDAC8の触媒作用を阻害する物質（すなわちHDAC8阻害剤）を見つければ、これをHDAC8の機能を調べるためのバイオプローブとして用いたり、新しいタイプの抗がん剤として利用したりすることが期待できる。
【０００６】
これまでに報告されたHDAC8を阻害する化合物として、SAHA（非特許文献３）、PCI-34051（非特許文献１）等が挙げられる。
本発明者らにおいても、Huisgen反応を利用してHDAC8阻害活性を有する化合物の探索を網羅的に行い、HDAC8を選択的に阻害する化合物を見出している（特許文献１）。
【０００７】
以下にこれまで報告されている、HDAC8阻害活性を有する化合物を挙げる。これらの中でも、特許文献１において報告されている化合物7（略称「NCC-149」）は、HDAC8に対して優れた阻害活性と選択性とを有している。
【化１】
2016017040.tif 000002
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2011/089995
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Leukemia 2008, 22, 1026-1034
【非特許文献２】Clin Cancer Res 2009, 15, 91-99
【非特許文献３】Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3003-3007, 1998
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、高活性であって且つ高選択的にHDAC8の機能を阻害することのできる化合物及びHDAC8阻害剤を提供することを解決すべき課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、HDAC8とNCC149の相互作用について、計算化学ソフトウェアGlide-Macromodelを用いて解析した。その結果、NCC149に存在するトリアゾール環のπ電子はHDAC8のPhe152のベンジル位水素との間で相互作用が働いており、このことが阻害活性及び選択性に深く関わっているということが示唆された（図１参照）。このため、NCC149におけるトリアゾール環部分に代えて、π電子共役系を有する他の環状構造とした様々な化合物を合成し、HDAC8に対する阻害特性を調べた。その結果、HDAC8阻害活性を選択的に発揮する新たな化合物を見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
すなわち、本発明のヒドロキサム酸誘導体は、下記一般式(1)又はその薬学上許容される塩、水和物、溶媒和物若しくはプロドラッグからなることを特徴とする特徴とする。
【化２】
2016017040.tif 000003
【００１３】
本発明のヒドロキサム酸誘導体(1)は、HDAC8の酵素活性を選択的に阻害することができる。このため、HDAC8の機能を調べるための生物学的ツールとして好適に用いることができる。また、癌細胞増殖抑制作用も有しており、抗がん剤として利用することも期待される。なお、プロドラッグとは、生体内で加水分解されてヒドロキサム酸誘導体(1)を再生する化合物をいう。
【００１４】
φは置換基のないベンゼン環であってもよい。発明者らはφが置換基のないベンゼン環である場合、HDAC8阻害剤として確実に高活性及び高選択性となることを確認している。特に、トリアゾール環がNCC149とは逆向きで炭素に結合しており、その他の構造部分はNCC149と同じである化合物は、HDAC8阻害剤としてNCC149よりも高活性及び高選択性であった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】計算化学ソフトウェアGlide-Macromodelを用いて解析したNCC149とHDACとのπ電子間の相互作用を示す図である。
【図２】Western blot analysisにおける電気泳動の結果を示す写真である。
【図３】MTSアッセイの原理を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜分子設計＞
前述したように、NCC149のトリアゾール環はHDAC8のPhe152のベンジル位水素との間で相互作用が働いていると考えられる（図１参照）。そこで、NCC149のトリアゾール環を6員環であるベンゼン環に変換した化合物8や、トリアゾール環と同じ5員環で電子密度の異なるヘテロ環に変換した化合物9、10、12や、トリアゾール環がNCC149とは逆向きで炭素に結合しており、その他の構造部分はNCC149と同じである化合物11を合成した（下記構造式参照）。以下にその合成方法を詳細に述べる。
【化３】
2016017040.tif 000004
【００１７】
測定方法
融点はヤナギモト・ミクロ融点測定装置またはBuehi 545融点測定装置を用いて測定した。1H-NMR及び13C NMRはJEOL JNM-LA500またはJEOL JNM-A500を用いた。 化学シフト（δ）は、内部標準としてTMSを用いて測定した。元素分析は、Yanaco CHN CORDER NT-5 analyzer,を用いて測定した。 ElMS分析は、JEOL JMS-SX102A質量分析計を用いた。FTIRは島津FTIR84005を用いて測定した。試薬及び溶媒は、アルドリッチ、東京化成工業、和光純薬工業、関東化学から購入しやものを、精製することなくそのまま用いた。フラッシュ・カラムクロマトグラフィーはMerk社製のシリカゲル60を使って行った（粒径：0.046-0.063 mm）。
【００１８】
（実施例１）
実施例１では化合物8を以下の合成経路によって調製した。以下、詳細に説明する。
【化４】
2016017040.tif 000005
【００１９】
・化合物15の合成
3-ヨードベンジルアルコール13 (2.72g, 11.6mmol)と3-(メトキシカルボニル)フェニルボロン酸(14) (2.009, 11.1 mmol)とPd(OAc)2 (56.2ng, 0.250 mmol)のDMF (7 mL)溶液に1MのNa2CO3 (34 mL)水溶液を加えて55℃で1.5時間加熱した。反応溶液をクロロホルムで希釈し、ろ過した。そしてクロロホルム層を分離し、水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。さらに、真空濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は0-80% 酢酸エチル／n−ヘキサン)淡褐色オイルとして化合物15を3.85 g得た。
lH NMR (500 MHz,CDCl3) :δ=8.27 (t, J=1.7 Hz, 1H), 8.00 (dt, J=1.5, 7.5 Hz, 1H), 7.78(dt, J= 1.6, 7.8 Hz, 1H), 7.63 (5, 1H). 7.57-7.48 (m, 2H). 7.43 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.37 (d, J=7.0 Hz, 1H), 4.76 (d, J=6.0 Hz, 2H).3.94 ppm (s, 3H)
ElMS: m/z 242 [M+].
【００２０】
・化合物16の合成
窒素気流下0℃において、PBr3(0.6 mL, 6.38 mmol)をアルコール15 (3.85 g, 15.9mmol)の10ml無水ジオキサン溶液に滴下する。反応溶液を0℃で1.5時間撹拌した後、氷と飽和炭酸水素ナトリウム溶液の混合物中に注ぐ。そして、反応液をエチルエーテルで抽出し、水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、真空濃縮し、黄色オイルとして化合物16を4.01 g (収率83%)得た。
lH NMR (500 MHz, CDCl3) : δ=8.26 (s, 1H), 8.02 (d, )=7.5 Hz, 1H), 7.76 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.63 (5,1H), 7.56-7.47 (111,2 H), 7.44-7.38 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 3.94ppm (5,3H); ElMS: m/z 304, 306 [M+].
【００２１】
・化合物17の合成
ナトリウムチオフェノール(2.07 g, 15.7 mmol) の水溶液 (15 mL) とトリエチルアミン(5 mL)とを化合物16 (3.70g, 12.1 mmol)のアセトン(35mL)溶液中に加えた。この混合物を室温下で19.5時間撹拌した。溶媒を留去させた後、残留物を水中に注ぎ、クロロホルムで抽出した。有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、真空濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は0-30%酢酸エチル／n−ヘキサン) 無色オイルとして化合物172.02g(収率50%)を3.85 g得た。
lH NMR (500 MHz, CDCl3:δ=8.20 (t,J= 1.7 Hz, 1H), 7.99 (dt, J= 1.4, 7.7 Hz, 1H), 7.68 (dt, J= 1.2, 7.2 Hz,1H), 7.47-7.44 trn, 3H), 7.35-7.18 (rn, 7H), 4.14 (s, 2H), 3.92ppm (s,3H); ElMS: m/z 334[M+].
【００２２】
・化合物18の合成
メチルエステル17(2.02 g, 6.04 mmol)をメタノール (20mL),THF(10mL)及びCHCl3(10 mL)の混合溶媒中に溶解し、水酸化ナトリウム水溶液(2N.12mL,24.0 mmol)を注いだ。反応溶液を室温で5時間撹拌した。溶媒を除去後、残渣を2Nの水酸化ナトリウム水溶液に注ぎ、クロロホルムで抽出し、有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、真空濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離は0-40%酢酸エチル／n−ヘキサンの後0-40% メタノール/CHCl3で溶出)白色固体として化合物18を957mg (収率50%)得た。
IH NMR(500 MHz,CDCl3) : δ=8.26 (5,1 H), 8.07 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.77 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.53-7.21(m, 10H), 4.18 ppm (s, 2H); ElMS: m/z 320 [M+]..
【００２３】
・化合物19の合成
化合物18 (0.957 g, 2.99 mmol), EDCl・HCl (1.70 g, 8.85 mmol)及びHOBt・H2O(1.39 g, 9.08 mmol)のDMF(25 mL)溶液にNH2OTHP (1.00 g, 8.55 mmol)を加える。そして、混合物を室温で30時間撹拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、エチルエーテルで抽出する。有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、真空濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は10-50%酢酸エチル／n−ヘキサン)淡黄色非結晶固体として化合物19を1.06 g (収率84%)得た。
lH NMR (500 MHz, CDCl3) : δ = 8.90 (s, 1H),7.88 (s, 1H), 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.66 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.497.45(m, 3H), 7.37-7.27 (m, 6H), 7.21 (m, 1H), 5.11 (s, 1H), 4.16 (s,2H), 4.02 (t, J=10.2 Hz, 1 H), 3.68-3.66 (m, 1 H), 1.91-1.86 (m, 3H)1.87-1.59 ppm (m, 3H); ElMS: m/z 419 [M+].
【００２４】
・化合物8の合成
化合物19(264 mg, 0.630 mmol)のメタノール (30 mL)溶液にTsOH・H20 (12.0 mg, 63μmol)を加え混合物を室温で5.5時間撹拌する。溶媒を除去して得られた固体を酢酸エチル中に懸濁させ、ろ過することにより、白色固体として化合物8を85.1 mg (収率40%)で得た。さらにこれをTHF中で再結晶させ、無色結晶の化合物8を51 mg得た。
mp: 167-168℃;lH NMR (500 MHz, [D6]DMSO): δ= 11.33 (s, 1H), 9.12 (s,1 H), 7.98 (s, 1H), 7.76-7.73 (m, 2 H), 7.69 (s, 1H), 7.59-7.53 (m, 2 H),7.44-7.37 (m, 4H), 7.31 (t, J=7.7 Hz, 2H), 7.19 (t, J=7.2 Hz, 1H),4.33 ppm (s, 2H); 13C NMR (125 MHz, [D6]DMSO): δ= 164.1, 140.0,139.5, 138.4, 136.0, 133.5, 129.3, 129.2, 129.1, 129.0, 128.5, 128.3,127.4, 126.1, 126.0, 125.6, 125.1, 36.7 ppm; ElMS: m/z 335 [M+];元素分析C20H17NO2S・0.5H2Oとしての計算値: C 69.74, H 5.27, N 4.07, 実測値: C69.72, H 5.12, N 4.17.
【００２５】
（実施例２）
実施例２では化合物9を以下の合成経路によって調製した。以下、詳細に説明する。
【化５】
2016017040.tif 000006
【００２６】
・化合物21の合成
3-アセチル安息香酸20(2.02 g,12.3 mmol) のメタノール(60mL)溶液に濃硫酸(4 mL) を加え、26.5時間撹拌しながら還流した。溶媒を除去後、残渣を水に投入し、エチルエーテルで抽出し、有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、ろ過物を真空濃縮し、白色個体として化合物21を2.12 g (収率97%)得た。
1H NMR(500 MHz, CDCl3) : δ=8.60 (s, 1H), 8.24 (t, J=7.5 Hz, 1H), 8.17 (d,J = 7.5 Hz, 1H), 7.57 (t, J = 7.7 Hz, 1 H), 3.96 (s, 3 H), 2.66 ppm (s,3H);ElMS: m/z 178 [M+].
【００２７】
・化合物22の合成
化合物21 (1.11 g, 6.24 mmol)のクロロホルム(5 mL)溶液を０℃とし、Br2 (0.3 mL,5.82 mmol)と触媒量の25%HBr-AcOHを加える。反応溶液を室温にて２時間撹拌し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、クロロホルムで抽出する。有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、ろ過し、真空濃縮し、白色個体として化合物22を1.48 g得た。
ElMS: m/z 256, 258[M+].
【００２８】
・化合物24の合成
フェニルチオ酢酸23 (3.01 g,17.9 mmol)と塩化オキサリル(4 mL, 46.6 mmol)の乾燥THF(20 mL)溶液を０℃とし、触媒量のDMFを加える。混合物を０℃で 0.5時間撹拌した後、溶媒を減圧下で留去させ、対応する酸塩化物を黄色固体として得た。この酸塩化物のTHF（40ml）溶液を０℃とし、25％アンモニア水溶液(20 mL)を加え、1.5時間経過後、反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出する。有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、ろ過し、真空濃縮し、白色個体としてアミド24を2.46g(収率83%) 得た。
lH NMR (500 MHz, CDCl3) : δ=7.34-7.30(m,3H), 7.25-7.21 (m,2H), 6.69 (broad s,1H), 5.45 (broad s,1H), 3.63 ppm (s,2H); ElMS: m/z 167 [M+].
【００２９】
・化合物25の合成
アミド24 (2.46 g,14.7 mmol) の乾燥トルエン (100 mL)溶液へ窒素気流下、ローソン試薬（(2.84 g,7.02 mmol) を加え、80℃で3.5時間撹拌する。そして、溶媒を留去後、残渣をシリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は15-50%酢酸エチル／n−ヘキサン)粗白色固体として化合物25を554 mg(収率21%)得た。ElMS: m/z 183 [M+]
【００３０】
・化合物26の合成
チオアミド25 (555mg, 2.16 mmol)のエタノール(10mL)溶液を化合物22 (1.52 g, 8.31 mmol)と3オングストロームの活性化モレキュラシーブが混合されたエタノール (10 mL)及びクロロホルム(10mL)の溶液中に窒素気流下で加える。混合物を70℃で3時間撹拌し、ろ過した後、溶媒を留去させ、残渣飽和炭酸水素ナトリウム水溶液に注ぎ、酢酸エチルで抽出する。有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、残渣をシリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は0-30%酢酸エチル／n−ヘキサン)白色固体として化合物26を636 mg(収率78%)得た。
'H NMR (500MHz,CDCl3) : δ=8.45 (s, 2H), 8.11 (d, J=7.5 Hz, 1H), 7.63-7.61 (m,2H),7.48 (d, J= 7.5 Hz, 2 H), 7.34 (t, J= 7.0 Hz, 2 H), 7.29-7.28 (m, 1H),6.92 (s, 1H), 4.9" (s, 2H), 3.97 ppm (s, 3H); ElMS: m/z 341 [M+].
【００３１】
・化合物9の合成
化合物8の合成方法と同様の方法により、化合物26を原料として化合物29を合成した。
mp:56-60℃;lH NMR(500 MHz, CD3OD):δ=8.25 (s, 1H), 8.02 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.711 (s, 1H), 7.69 (d, J= 7.5 Hz, 1H), 7.50 (t, J= 7.7 Hz,lH), 7.41 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.28 (t, J=7.5Hz, 2H), 7.21 (t, J=8.0 Hz, 1H), 4.53 ppm (s, 2 H); 
13C NMR (125 MHz, CD3OD):δ=171.1, 168.0, 1~.5.2, 136.1, 135.9, 134.2, 131.3, 130.4, 130.2, 130.1,128.2, 127.6, l:~6.0, 116.3, 36.5 ppm;
ElMS: m/z 343 [M+];
元素分析C7H14N2O2S2・H2Oとして計算値C56.65,H4.47,N7.77, 実測値 C56.65,H4.42,N7.76.
【００３２】
（実施例３）
実施例３では化合物10を以下の合成経路によって調製した。以下、詳細に説明する。
【化６】
2016017040.tif 000007
【００３３】
・化合物28の合成
NH2OH・HO (3.70 g, 53.3 mmol) とKOH (3.00 g, 53.5 mmol)の混合物をメタノール(10 mL)中で30分、室温下で撹拌する。フェニルチオアセトニトリル27(2.00 g, 13.4 mmol) のメタノール(14 mL)溶液を加え、さらに20時間、室温下で撹拌を行う。混合物をろ過した後、溶媒を減圧下で留去させ、残渣をシリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は30-50%酢酸エチル／n−ヘキサン)茶色オイルとして化合物28を1.04mg(収率43%)得た。
'H NMR (500MHz, [D6DMSO]: d = 9.18 (5, 1H), 7.39 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.2g (t, J=7.7 Hz, 2H), 7.17 (t, J=6.7 Hz, 1H), 5.50 (s,2H), 3.56 ppm (s, 2H); ElMS: m/z 182 [M+].
【００３４】
・化合物29の合成
カルボニルジイミダゾール（CDI）(0.871 g, 5.37 mmol) のDMF(3 mL)溶液をイソフタル酸モノメチル (0.937 g,5.26 mmol) のDMF(4mL)溶液に加える。混合物を室温下で30分撹拌した後、化合物28 (0.979 g, 5.37 mmol)のDMF (7mL)溶液を加え、室温下で一昼夜撹拌する。混合物を電子レンジ（140℃, 2分間450 W)で加熱する。混合物を水中に投入し、エチルエーテルで抽出する。有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、ろ過し、減圧下で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は5-50%酢酸エチル／n−ヘキサン)黄色固体として化合物29を557 mg(収率33%)得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3) : δ=8.79 (s,1H), 8.30 (d, J'=7.5Hz, 1H), 8.26 (d, J=7.0Hz, 1H), 7.62 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.41.5 (d, J=7.5 Hz, 2H), 7.31 (t, J=7.7 Hz, 2H), 7.267.24(m, 1H), 4.22 (s, 2H), 3.97 ppm (s, 3H); ElMS: m/z 326 [M+].
【００３５】
・化合物10の合成
化合物10は化合物29を原料として化合物8の合成法と同様の方法により得た（収率17％）
mp: 157-158°C:1HNMR (500 MHz, CDCl3) :δ=8.48 (t,J = 1.5 Hz, 1H), 8.26 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 8.01 (dt, J= 1.5, 8.0 Hz, 1H),7.69 (t, J=8.0 Hz. 1H), 7.44 (d, J=7.0 Hz, 2H), 7.30 (t, 1=7.5 Hz,2H), 7.23 (t, J= 7.5 Hz, 1H), 4.26 ppm (s, 2 H);
13C NMR (125 MHz,CD3OD):δ= 176.6, 170.3, 166.6, 135.8, 135.0, 132.5, 131.9, 131.8,130.9, 130.2, 128.3, 127.7, 125.7, 29.8 ppm; ElMS: m/z 327 [M+];
元素分析C16H13N3O3Sとして計算値: C 58.70, H 4.00, N 12.84, 実測値 C58.31, H 4.14, N 12.53.
【００３６】
（実施例４）
実施例４では以下の合成経路にしたがって化合物11を調製した。以下、詳細に説明する。
【化７】
2016017040.tif 000008
【００３７】
・化合物31の合成
NaNO2(3.69 g, 53.4 mmol)の水溶液(30 mL)を、0℃下、3-アミノ安息香酸エチル30 (2.02 g, 12.2 mmol)のTFA(17 mL)溶液中に加える。そして、ナトリウムアジド(4.05 g, 62.3 mmol)水溶液を加え、室温で2.5時間撹拌する。反応溶液を2Nの塩酸中に注ぎ、エチルエーテルにて抽出する。有機層を水及び食塩水で洗ってから、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。そして、ろ過し、減圧下で濃縮し、シリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は2-20%酢酸エチル／n−ヘキサン)黄色オイルとして化合物31を2.20 g (収率94%)得た。
1H NMR(500 MHz, CDCl3) : δ= 7.82 (dt, J= 1.0, 8.5 Hz. 1H), 7.70 (t, 1= 1.7 Hz,1H), 7.68 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.42 (t, J=8.0 Hz, 1H), 7.19 (ddd, J=0.9, 2.4, 6.4 Hz, 1H), 4.39 (q, J = 7.3 Hz, 2 H), 1.40ppm (t, 1= 7.0 Hz,3H); FTIR (neat): ν=2102 cm-1
【００３８】
・化合物32の合成
硫酸銅(83.7 mg,523 μmol)とアスコルビン酸ナトリウム(0.585 g, 2.95 mmol)の水溶液 (10mL) をフェニルプロパギルスルフィド(0.775g,5.23 mmol) とアジド31(0.980g,5.12mmol)のメタノール(10mL)溶液に加える。反応混合物を室温下で21時間撹拌し、混合物をセライトろ過した後、溶媒を留去させ、残渣をシリカゲルフラッシュカラムで精製することにより(溶離液は5-40%酢酸エチル／n−ヘキサン)白色個体として化合物32を1.17g(収率67%)得た。
1H NMR (500 MHz, CDCl3): δ = 8.27 (t, 1= 1.7 Hz, 1H),8.10 (dt, 1= 1.2, 8.0 Hz, 1H), 7.95 (ddd, 1= 1.0, 2.2, 6.2 Hz, 1H), 7.84(s, 1H), 7.60 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.38 (d, J = 7.5 Hz, 2 H),7.30 (t. 1=7.7 Hz, 2 H), 7.22 (t, J= 7.5 Hz, 1H), 4.43 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 4.33 (s,2H), 1.43ppm (t, 1=7.2 Hz, 3H); ElMS: m/z 339 [M+].
【００３９】
・化合物11の合成
化合物11は化合物32を原料として化合物8の合成法と同様の方法により得た（収率48％）
mp: 179-180°C: 1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO): δ=11.40(s, 1H), 9.22 (s, 1H), 8.74 (5, 1H), 8.22 (s, 1H), 8.01 (d, 1= 8.0 Hz.1H), 7.84 (d, J=7.5Hz, lH), 7.67 (d, J=8.0Hz, 1H), 7.41 (d, J=8.0 Hz, 2H), 7.33 (t, 1= 7.7 Hz, 2 H), 7.20 (t, 1= 7.2 Hz, 1H), 4.39 ppm(s, 2H);
13CNMR (125 MHz, [D6]DMSO):δ=162.8, 144.9, 136.4,135.5, 134.3, 130.1, 129.0, 128.2, 126.8, 126.0, 122.4, 121.5, 118.3, 27.1 ppm; ElMS: m/z 326 [M+]; 元素分析C16H14N4O2Sとして計算値: C58.88, H 4.32, N 17.17, 実測値: C 58.69, H 4.54, N 17.00.
【００４０】
（実施例５）
実施例５では化合物12を以下の合成経路によって調製した。以下、詳細に説明する。
【化８】
2016017040.tif 000009
【００４１】
・化合物34の合成
化合物34は3-(メトキシカルボニル)フェニルボロン酸14と、2-ヨード-3-メチルチオフェン33を原料とし、化合物15の合成法と同様の方法により合成した。
1H NMR(500 MHz, CDCl3): δ= 8.22 (s, 1H), 7.90 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d,1=7.5 Hz, 1H), 7.42 (t, 1=7.7 Hz, 1H), 7.18 (d, J=3.5 Hz, 1H), 6.756.74(m, 1H), 3.94 (s, 3H), 2.52 ppm (s, 3H); ElMS: m/z 232 [M+]).
【００４２】
・化合物35の合成
化合物34 (0.601 g, 2.61 mmol)のクロロホルム溶液(20 mL)中にNBS (0.554 g, 3.11 mmol) とAIBN (19.2 mg, 0.116 mmol) を加え、この混合物を還流しながら1時間撹拌した。そして四塩化炭素で希釈し、ろ過した。ろ液をエバポレートし、水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層を採取し、水と食塩水とで洗い、無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。そして、ろ過し、真空濃縮し、化合物35を茶色オイルとして811 mg 得た。
1H NMR (500 MHz, CDCL3) : δ= 8.24 (s, 1H), 7.96 (dt, J= 1.4, 7.7 Hz,1H), 7.74 (ddd,.f= 1.2,2.0,6.1 Hz, 1H), 7.21 (d, 1=4.0 Hz, 1H), 7.10(d, 1=3.5 Hz, 1 ;),4.75 (s, 2H), 3.95 ppm (s, 3H); ElMS: m/z 310,312 [M+].
【００４３】
・化合物12の合成
化合物12は化合物35を原料とし、化合物8を合成した方法と同様の方法で合成した（収率36％）。
mp154-155°C: 1H NMR (500 MHz, [D6]DMSO): δ= 11.32 (s, 1H), 7.92 (s,1H), 7.72 (d, J =7.5 Hz, 1H), 7.65 (d, 1= 8.5 Hz, 1H), 7.47 (t, J =7.5 Hz, l H), 7.40-7.36 (rn, 3H), 7.32 o. J=7.7Hz, 2H), 7.21 (t,1=7.2 Hz, 1H), 7.(11 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.51 ppm (s, 2H); 13C NMR(125 MHz, CDCl3) δ= 163.6, 141.5, 141.5, 135.2, 133.7, 133.4, 129.2,128.9, 128.6, 1~7.9, 127.5, 126.2, 125.8, 123.7, 123.2, 31.6 ppm;
ElMS: m/z 341 [M+];元素分析C18H15NO2S2・0.5H20:として計算値 C 61.19, H
4.60, N 4.00, 実測値: C 61.77, H 4.76, N 4.10.
【００４４】
−評  価−
＜蛍光酵素アッセイによる評価＞
以上のようにして合成した実施例１〜５の化合物8〜12について、各種HDAC（HDACS、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC4、HDAC6及びHDAC8）に対する阻害作用を蛍光酵素アッセイ法によって調べ、各HDACアイソザイムのIC50を求めた。また、比較例１として化合物7（NCC149）についても同様の測定を行った。さらには、比較例２として、FADにおいて皮膚T細胞リンパ腫に対して効果が認められ承認されているvorinostat（商品名：ZOLINZA、旧名：SAHA）についても同様の測定を行った。
蛍光酵素アッセイ法では、HDACの基質として蛍光物質標識されたアセチル化リシンアナログを用いた。そして、HDACがその蛍光標識された基質を脱アセチル化すると、リシンエンドペプチダーゼ(LEP)が脱アセチル化されたリシンを認識し、リシン後方のアミド結合を加水分解することによって蛍光物質AMCが遊離する。こうして遊離したAMCの蛍光強度を測定し、controlの蛍光強度に対する割合を計算することにより、酵素活性を評価するものである。
HDAC活性の測定は、HDACs/HDAC8脱アセチル化酵素蛍光分析キット（CY-1150/CY-1158、Cyclex Compary社）、（HDAC1/HDAC6蛍光活性drug discoverly kit（AK-511 I AK-516、BIOMOl Research Laboratories）、Fluorescent SIRT1 Activity Assay/Drug Discovery（AK-555,BIOMOL研究所））、又はFluorogenic HDAC Class2α Assay Klt（BPS Bioscience社）、総HDACs（CY-1150、Cyde社）、HDAC1（SE456、BIOMOL Research Laboratories）、HDAC2（SE-500、BIOMOL Research Laboratories）,HDAC3/NCOR1 complwx（SE-515、BIOMOL Research Laboratories）,HDAC4（BPS Bioscience社）、HDAC6（SE508,BIOMOL研究所）及びHDAC8（CY-1158、Cydex CompanyLimited）を使用し、メーカーの指示書に従って測定した。蛍光測定は励起波長を160nmとし、検出波長は460nmとした。50%阻害活性（IC50）における濃度は、各濃度のlog対阻害活性％のグラフから求めた。Cohesinや a-tubulinやH3K9のアセチル化活性度は常法に従って測定した。各測定は少なくとも２回行った。結果を表１に示す。
【００４５】
【表１】
2016017040.tif 000010
【００４６】
表１に示すように、比較例２の化合物7（NCC149）は、HDAC8阻害剤として汎用されている比較例１のvorinostatよりも、優れた阻害活性及び優れた阻害選択性を示した（HDAC8ではIC50=0.070μMであるのに対して、HDACsではIC50=54μM、HDAC1ではIC50=38μM、HDAC2ではIC50＞100μM、HDAC3では68μM、HDAC4ではIC50=44μM、HDAC6ではIC50=2.4μM）。
また、比較例２の化合物7（NCC149）におけるトリアゾール環をベンゼン環に代えた実施例１の化合物8では、比較例1の１/20のHDAC8阻害活性ではあるが、選択的にHDAC8活性を阻害することが分かった。
一方、実施例２〜５の化合物９〜１２は優れたHDAC8阻害活性を示した。これらの結果から、実施例２〜５の化合物９〜１２が有している５員環は、HDAC8のCap部位への結合に有利に働き、それが優れた阻害活性及び優れた選択性に貢献していることが示唆された。
特に、実施例４に化合物11では、NCC149(7)よりも大きなHDAC8阻害活性を示すことが分かった（化合物11ではIC50=0.053μMであるのに対し化合物7ではIC50=0.070）。
さらに、実施例２〜５の化合物９〜１２はHDAC8活性を選択的に阻害することが分かった。特に、実施例４の化合物11は、NCC149(7)よりもHDAC8阻害活性に対する選択性が優れていた（11： HDAC1 ICsolHDAC8 ICso 1900; HDAC4 IC50 HDAC8 IC50 1900; HDAC6 ICsolHDAC8 IC50=42。 7： HDAC1 ICsolHDAC8 ICso=540; HDAC4 ICso/HDAC8 ICso=630; HDAC6 ICsolHDAC8 IC50= 34）。以上の結果は、5員環を有するヘテロアリール環の小さな幾何学的な違いがHDAC8阻害活性だけでなくHDAC8選択性にも影響を及ぼすことを示唆した。
以上の結果から、実施例４の化合物11は、HDAC8阻害剤として比較例１の化合物7（NCC149）より強力であり選択性を優れていることが分かった。
【００４７】
＜細胞内におけるHDAC8阻害の評価＞
細胞内におけるHDAC8阻害の選択性を調べるために、実施例２〜４の化合物9〜11及び比較例１の化合物7について、Western blot analysis による評価を行った。HDAC8はコヒーシンの脱アセチル化酵素であり、HDAC8に対する阻害作用はヒーラー細胞でアセチル化されたコヒーシンの量を測定することによって評価した。
図２に示すように、実施例２〜４の化合物9〜11及び比較例１の化合物7は、全てアセチル化されたコヒーシンの増加を誘発し、細胞内で強いHDAC8阻害作用を示した。代表的な汎HDAC阻害剤であるtrichostatin A はヒーラー細胞でアセチル化H3K9をかなり増やすと報告されているが、実施例２〜４の化合物9〜11及び比較例１の化合物7はH3K9（すなわち、核HDACs（例えばHDAC1とHDAC2）の主要なサブストレート）のアセチル化を促進しなかった。アセチル化α-tubullnやHDAC6については、比較例１の化合物7及び実施例３、４の化合物10,11が10μM以上の濃度でα-tubullnの誘発を促したが、実施例２の化合物9では、α-tubullnが誘発されなかった。これらの結果から、実施例２の化合物9では、細胞内に含まれる他のHDACsよりもHDAC8を選択的に妨げることが分かった。
【００４８】
＜T細胞性腫瘍細胞系に対する増殖抑制試験＞
HDAC8選択的阻害薬として知られるPCI-34051はT細胞性腫瘍に対し、細胞増殖阻害活性を示すことが報告されている。そこで、実施例２〜４の化合物9〜11及び比較例１の化合物7について、T細胞性腫瘍細胞系に対する増殖抑制試験(MTSアッセイ)を行った。
【００４９】
（MTSアッセイの手順）
([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)- 2H-tetrazolium, inner salt])は、細胞内ミトコンドリアの中にある脱水素酵素(NADH)と電子キャリアーであるPMS(フェナジンメトサルフェート)共存化で酸化還元反応を起こし、還元されFormazanとなる（図３参照）。NADHは呼吸鎖に関係する酵素であるため、この反応によるFormazan量は生存細胞数に対応する。このFormazan量を比色定量することで細胞数を定量化し、GI50を算出した。
【００５０】
（結  果）
MTSアッセイの結果を表２に示す。実施例２及び実施例３の化合物9及び化合物10はJurkat, HH, MT4,及びHeLa細胞に対し比較例１の化合物7（NCC149）よりも強い細胞増殖抑制作用を示した。また、実施例２の化合物9はK562, HUT78細胞においても比較例１の化合物7（NCC149）と同等の細胞増殖抑制作用を示した。一方、HDAC8へのアイソザイム選択性が向上し実施例３の化合物10は比較例１の化合物7（NCC149）よりも細胞増殖抑制作用が低下した。また、実施例２及び実施例３の化合物9及び化合物10は、現在まで最も優れたHDAC8選択的阻害剤として知られているPCI-34051よりも強い細胞増殖抑制作用を示した。
【００５１】
【表２】
2016017040.tif 000011
【００５２】
＜DAOY,Daudi及びA549に対するMTTアッセイによる評価＞
DAOY(ヒト髄芽細胞腫細胞株), Daudi(悪性リンパ腫細胞株)及び A549(ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株)についても、前述したMTSアッセイと同様の手法により、MTTアッセイを行った。アッセイは各化合物について少なくとも３回行った。
【００５３】
（結  果）
MTTアッセイの結果を表３に示す。実施例３の化合物9はDAOY,Daudi及びA549全ての細胞に対して比較例１の化合物7（NCC149）よりも強い細胞増殖抑制作用を示した。また、実施例４の化合物10はDaudi及びA549について比較例１の化合物7（NCC149）よりも強い細胞増殖抑制作用を示した。さらに、実施例５の化合物11は、DAOY,Daudi及びA549全ての細胞に対して比較例１の化合物7（NCC149）と同程度の細胞増殖抑制作用を示した。
【００５４】
【表３】
2016017040.tif 000012
【産業上の利用可能性】
【００５５】
HDAC8の機能を調べるための生物学的ツールとして好適に用いることができる。
【図１】
2016017040.tif 000015
【図３】
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【図２】
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