(57)【要約】【課題】試料と試薬の混合反応により、試料に含まれる極微量の信号量を測定する場合に、試料に含まれる測定対象物質の存在有無を判定する、または物質量を定量的に解析する。【解決手段】  上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、試料から測定される信号量の測定データ点を測定時間に対してプロットしてグラフを生成し、少なくとも一つのカーブフィティング関数で、測定データ点のプロットから構成される反応曲線を近似してフィッティングし、前記フィッティングにより得られたカーブフィティング関数の変数値に基づいて試料の測定を行う構成とした。【選択図】  図１
2016183860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料と試薬の反応による信号量の時間変化をもとに、試料に含まれる物質量を計測する計測装置であって、
試料から測定される信号量の測定データ点を取得する測定データ取得部と、
前記測定データ点を測定時間に対してプロットしてグラフを生成するグラフ生成部と、
少なくとも一つのカーブフィティング関数で、前記グラフの前記測定データ点のプロットから構成される反応曲線を近似してフィッティングするデータ処理部と、
前記フィッティングにより得られた前記カーブフィティング関数の変数値に基づいて、前記試料の測定を行う計測部と、を備える、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項２】
請求項１に記載の計測装置であって、
前記計測部は、
前記フィッティングにより得られた変数値を、前記フィッティングに用いたカーブフィティング関数について予め設定された変数の閾値と比較して、前記比較結果に基づいて前記物質量の計測を行う、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項３】
請求項１に記載の計測装置であって、
前記計測部は、
前記カーブフィティング関数の変数値に基づいて、
前記試料に含まれる測定対象物の量を計測する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項４】
請求項１に記載の計測装置であって、
前記計測部は、
前記カーブフィティング関数の変数値に基づいて、
前記測定の異常の有無を判定する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項５】
請求項１に記載の計測装置であって、
前記測定データ取得部は、
試薬混合前の試料から測定される信号量及び試薬を混合した後の試料から測定される信号量の測定データ点を取得し、
前記データ処理部は、
前記フィッティングによって、前記試薬を混合した後の反応で生じる信号量の最大値を含む時間からその後の減少する変化曲線を近似する、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項６】
請求項１に記載の計測装置であって、
前記測定データ取得部は、
試薬混合前の試料から測定される信号量及び試薬を混合した後の試料から測定される信号量の測定データ点を取得し、
前記測定データ点は、前記試薬混合前後における化学発光、又は生物発光の光信号量の時間変化である、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項７】
請求項１に記載の計測装置であって、
前記データ処理部は、
前記変数の少なくとも一つに指数関数的減衰項を含むカーブフィティング関数を用いて前記フィッティングを行う、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項８】
請求項７に記載の計測装置であって、
前記測定データ取得部は、
試薬混合前の試料から測定される信号量及び試薬を混合した後の試料から測定される信号量の測定データ点を取得し、
前記データ処理部は、
前記カーブフィティング関数として、ｙ＝ｙ０＋ΣＡi・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔi)（1≦i≦ｎ）を用いて前記フィッティングを行い、
前記カーブフィティング関数において、ｙ０は試料と試薬を混合する前のバックグラウンド信号量の平均値であり、ｘ０は試料と試薬を混合した後の信号量の最大値である、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項９】
請求項８に記載の計測装置であって、
前記データ処理部は、
変数ｔ1からｔｎのうちの少なくとも一つの変数ｔi、または変数Ａ1からＡｎのうちの少なくとも一つの変数Ａi、または変数Ａ1からＡｎのうちの少なくとも２つ以上の変数Ａiを合計した値、の少なくとも何れかについて前記閾値に設定し、
前記フィッティングにより得られた変数値を、前記閾値と比較して、前記比較結果に基づいて前記物質量の計測を行う、
ことを特徴とする計測装置。
【請求項１０】
試料と試薬の反応による信号量の時間変化をもとに、試料に含まれる物質量を計測する方法において、
ブランク試料を用意し、試薬を混合し、反応させ、信号量の時間的変化である第１の測定データ点を測定データ取得部に取得するステップと、
第１の測定データ点を少なくとも一つのカーブフィッティング曲線でフィッティングするステップと、
フィッティングで得られた第１のカーブフィッティング曲線の第１の変数群を、記憶するステップと、
測定試料を用意し、試薬を混合し、反応させ、信号量の時間的変化である第２の測定データ点を測定データ取得部に取得するステップと、
第２の測定データ点を少なくとも一つのカーブフィッティング曲線でフィッティングするステップと、
フィッティングで得られた第２のカーブフィッティング曲線の第２の変数群を、記憶するステップと、
記憶部に保存された第１の変数群と第２の変数群を比較部にて比較するステップと、を含む計測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる物質についての検出に関する。特に、試料に含まれる極微量な物質量を高い感度と高い精度で検出するための計測装置及び計測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品工場や飲料工場では、近年、アセプティックシステムと呼ばれる無菌環境を実現する製造施設が設けられ、医薬品や飲料水、清涼飲料水の製造が行われる。アセプティックシステムの無菌環境性の保証や、製品の無菌性保証の検査には、培養法が用いられる。しかしながら、培地を恒温機中にて２〜３日間、場合によっては１０日間以上培養した後の発生コロニー数を目視で数えるため、結果を得るのに時間がかかり、製品の出荷にはその結果を待つ必要がある。このような背景から、無菌判定を可能とする迅速測定法の開発が望まれている。
【０００３】
迅速かつ簡便な菌体検出法の１つであるＡｄｅｎｏｓｉｎｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＡＴＰ）生物発光法（以下、ＡＴＰ法）は、ホタルの発光反応を利用して、細胞内の物質ＡＴＰを光に変換して測定する。ルシフェラーゼ酵素に基質ルシフェリンとＡＴＰ分子を取り込ませ、ＡＴＰの消費とともに酸化されたルシフェリン（オキシルシフェリン）が励起状態から基底状態に遷移するときの発光量を計測する方法で、このとき、ＡＴＰ1分子の消費が1フォトン（光子）生成に対応するため、光子発生数がＡＴＰの個数に比例する。生菌中1個あたりにはエネルギー源として1アトモル（amol＝10-18 mol）相当のＡＴＰ分子が存在するため、測定試料に含まれていたＡＴＰ発光量から生菌の総数を推定することができる。さらに、生物発光及び化学発光のうちで最も優れた量子効率（ΦBL：≒0.5）であることから、細胞1個を数10万個相当のフォトンとして検出できることになり、発光反応で細胞1個相当の光を検出することは原理的に可能な方法である。
【０００４】
しかしながら、ＡＴＰ法の検出下限は計測装置の性能だけでなく、環境中に存在するＡＴＰの試料への混入やルシフェリン・ルシフェラーゼ試薬、いわゆる発光試薬やその他ＡＴＰ法に必要な試薬自体にＡＴＰが含まれていることが多く、その影響を受けることによるデータの揺らぎにより、一般的に102 amol（amol＝10-18 mol）程度と報告されている。それらのデータの揺らぎを防ぐ方法として、特許文献１、２、及び３に開示されるように、近年、外部汚染を防ぐ洗浄機能を具備した分注システムと、光学フィルターを用いた分光による物質種同定システムと、高感度光検出器を同一装置内の遮光かつ外部からの汚染物質の抑制された空間に配置した生物発光検出システムが報告されており、1 amol相当のＡＴＰ分子量の計測が可能になってきている。
【０００５】
また、計測装置の性能を向上させるには、例えば特許文献４に開示されるように、ランダムノイズ成分や暗電流パルス数の低減を行い、信号成分の揺らぎを抑え、微弱光の信号成分を高い確度で抽出し、検出感度を向上させる手段が採用される。
【０００６】
また、特許文献５には、誤差を表す評価関数を用いてフィッティングを行い、パラメータが目標値より大きく乖離した際に計算を打ち切ることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−２６８０１９号公報
【特許文献２】特開２００８−２４９６２８号公報
【特許文献３】特開２０１２−２１１７８５号公報
【特許文献４】特開平１１−１４２２４２号公報
【特許文献５】特開２０１２−４３０５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
特許文献１、２、及び３に記載のとおり、ＡＴＰ法で高い検出感度と高い検出精度を得るためには、測定試料への環境中に存在するＡＴＰや菌体、さらに他の不純物の混入を防ぐこと、発光試薬の活性が維持されているかなどの試薬類の状態把握、試薬類へのＡＴＰや菌体、その他不純物の混入による汚染、他付随する消耗品の汚染、さらに、計測装置に不具合が生じてないかの状態管理、等を考慮し、測定装置とその周辺が常に安定していることを確認することが重要である。
【０００９】
特に、試薬類に関しては、製造時にＡＴＰが混入してしまう場合が多く、これらは、事前に除去不可能なＡＴＰであり、発光計測時に常にバックグラウンドとして存在する。このバックグラウンドと測定試料の菌体由来のＡＴＰの差分を正確に測定値として示さないと無菌性を示すレベルに近い計測では、偽陽性、偽陰性の判定をしてしまう恐れがある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上述した課題の少なくとも一の課題を解決するための本発明の一態様として、試料から測定される信号量の測定データ点を測定時間に対してプロットしてグラフを生成し、少なくとも一つのカーブフィティング関数で、測定データ点のプロットから構成される反応曲線を近似してフィッティングし、前記フィッティングにより得られたカーブフィティング関数の変数値に基づいて試料の測定を行う構成とした。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、信頼性をもって試料中の物質量を計測することができる試料分析装置が提供される。上記した以外の、課題、構成及び効果は、以下の実施形態の説明により明らかにされる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試料分析装置とその周辺システム構成を示す図である。
【図２】試料分析装置の構成を示す図である。
【図３】試料分析装置の動作フローチャートの一例を示す図である。
【図４Ａ】試料分析装置を用いて得られたＡＴＰ測定結果のデータ波形の典型例を示す図である。
【図４Ｂ】試料分析装置を用いて得られたＡＴＰ測定結果のデータ波形の典型例を示す図である。
【図５Ａ】生菌を含まないブランク試料のＡＴＰ発光の試料分析結果を示す図である。
【図５Ｂ】生菌を含まないブランク試料のＡＴＰ発光の試料分析結果を示す図である。
【図５Ｃ】生菌を含まないブランク試料のＡＴＰ発光の試料分析結果を示す図である。
【図６Ａ】生菌１個程度を含む試料のＡＴＰ発光の試料分析結果を示す図である。
【図６Ｂ】生菌１個程度を含む試料のＡＴＰ発光の試料分析結果を示す図である。
【図６Ｃ】生菌１個程度を含む試料のＡＴＰ発光の試料分析結果を示す図である。
【図７Ａ】ブランク試料とＡＴＰ抽出試料のフィッティング処理結果の変数値を比較する図である。
【図７Ｂ】ブランク試料とＡＴＰ抽出試料のフィッティング処理結果の変数値を比較する図である。
【図７Ｃ】ブランク試料とＡＴＰ抽出試料のフィッティング処理結果の変数値を比較する図である。
【図７Ｄ】ブランク試料とＡＴＰ抽出試料のフィッティング処理結果の変数値を比較する図である。
【図８】実施例２における試料分析装置の結果から測定対象物量の真の信号か、装置異常かを判定するフローを示す図である。
【図９】試料分析装置の表示画面を示す図である。
【図１０】ＡＴＰの検量線データから、生菌の総数を推定する方法を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、添付図面を参照して本発明の実施形態について説明する。ただし、本実施形態は本発明を実現するための一例に過ぎず、本発明を限定するものではないことに注意すべきである。また、各図において共通の構成については同一の参照番号が付されている。
【００１４】
＜実施例１＞
図１Ａは、試料分析装置とその周辺システム構成を示す１例であり、測定装置１、制御装置２、試料分析装置３で構成される。勿論、試料分析装置３は、制御装置２の機能も含む形態でも良く、さらに、測定装置１と制御装置２と試料分析装置３の全機能を一つの装置として集約した一体化システムの形態でも良い。
【００１５】
本実施例では、本発明の試料分析装置３における測定装置１の測定結果の処理機能について詳細に説明する。よって、本実施例の形態の一例として、制御装置２が制御信号６によって測定装置１の駆動機構の運転制御を行い、試料分析装置３は、測定装置１内の計測器からの信号出力４を処理する構成を用いて説明を行う。なお、本実施例では、制御装置２は、制御装置２と試料分析装置３との間の試料分析装置３の信号取得開始/終了についてのトリガ信号５に基づいて連動して、測定装置１の運転を制御信号６によって制御するものである。
【００１６】
図２は試料分析装置３の構成を示す図である。試料分析装置３は、本体８と、ディスプレイ９で主に構成され、その他、場合によっては、マウス、キーボードなどの手動入力手段１０が接続できるようになっている。
【００１７】
図２は、試料分析装置８の処理プログラムをハードウェアの観点から表わしており、本体８は、計測器からの化学発光または生物発光の光信号量を示す信号出力４を取得する測定データ取得部１１と、測定データ取得部１１で取得した測定データ点を測定時間に対して経時的にプロットして、光信号量の時間変化としてグラフ化するグラフ波形生成部１３と、グラフ化されたグラフ波形を近似するための複数のカーブフィティング関数と、複数のカーブフィッティング関数の複数の変数とを蓄積するカーブフィッティング関数記憶部１５と、カーブフィッティング関数記憶部１５に蓄積された複数のカーブフィッティング関数と複数の変数を順次変更して、測定データ点から構成されるデータ波形フィッティング処理するデータ処理部１６と、データ処理部１６の処理結果を記憶するデータ記憶部１９と、データ記憶部１９で記憶された変数値と、任意に設定可能な変数参照値と比較するデータ比較部１７と、測定データ点１２のフィッティング処理で得られた変数値と予め設定しておいた変数参照値とのズレを判定するデータ判定部２０で構成される。
【００１８】
ここで、変数参照値とは、いわゆる閾値であり、ズレの大きさはデータ記憶部１９で記憶された変数値と変数参照値との差分で表わされる。例えば、ブランク試料、即ち、測定対象物を含まない溶液に、化学発光または生物発光の専用試薬を反応させた時の光信号量の平均値を変数参照値として設定することで、変数値と変数参照値との差分から対象とする物質量を定量化することも可能である。その際には、図１０に示すような対象物質数、または対象物質濃度を横軸に、濃度に応じた光の量を縦軸にして作成する検量線を予め作成しておく。
【００１９】
なお、図２で上述した本体８の制御機能を構成する各機能ブロックは、ソフトウェアモジュールとして実装しても良いしハードウェアで実現してもよい。つまり、各機能ブロックは、本体８内において、それぞれの機能を実現するメモリに格納されたプログラムをプロセッサが解釈して実行することによりソフトウェアで実現することができる。また、各機能ブロックは、それらの一部又は全部を、例えば集積回路で設計する等によりハードウェアで実現してもよい。各機能を実現するプログラム、ファイル、データベース、関数データ、変数データ、等の情報は、例えば、メモリや、ハードディスク、ＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｄｒｉｖｅ）等の記録装置、または、ＩＣカード、ＳＤカード、ＤＶＤ等の記録媒体に置くこともできる。
【００２０】
以下、図２の試料分析装置３の構成と図３の動作フローチャートを用いて試料分析装置３の動作を説明する。測定装置１の計測器からの信号出力４は、測定データ点として測定データ取得部１１で記憶される（Ｓ３０１）。次に、グラフ波形生成部１３にて、測定データ取得部１１で記憶された測定データ点１２からグラフ波形を作成する（Ｓ３０２）。なお、作成されたグラフ波形はデータ記憶部に１９にテキストファイル等の方法で記憶されるため、図９のディスプレイ９の表示画面のブランク試料のグラフ表示部３５，または測定試料のグラフ表示部３６に図４Ａ，図４Ｂ等で例示するような表示ができる。表示したい測定データは、第１のグラフ呼び出しのプロダウンメニュー４２、第２のグラフ呼び出しのプルダウンメニュー４３で選択する。
【００２１】
次に、カーブフィッティング関数記憶部１５から、測定対象および測定内容から予め推定されるデータ波形に対応可能と判定されるカーブフィッティング関数群１８を呼び出し（Ｓ３０３）、呼び出したカーブフィッティング関数群１８の各々の関数を用いて、順番に、フィッティング処理をデータ処理部１６で行う（Ｓ３０３）。なお、カーブフィティング関数群１８は、関数群設定手段２５にて、ユーザーが事前に設定しておく。場合によっては、フィッティング処理時間を短縮するために、フィッティング関数の固定変数を変数固定値設定手段２６により決めておいても良い。フィッティング処理は、得られた測定データ点１２のグラフ波形に対して、波形の変数であるピーク位置、ピーク高さ、などを逐次反復変化させながら最小自乗規範で一致させていく。例えば、非線形カーブフィットに関しては、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法で非線形最小二乗問題を解いてフィッティングする。呼び出したカーブフィッティング関数群１８全てのカーブフィッティング関数の複数の変数値の結果は、各々のカーブフィッティング関数と関連づけて、データ記憶部１９で記憶される（Ｓ３０４）。
【００２２】
なお、各々のカーブフィッティング関数の収束の有無は考慮せず、カーブフィッティング関数群１８の何れにおいても、それらの変数値は、データ記憶部１９に全て記憶される（Ｓ３０４）。また、収束の有無判定は、フィッティング処理の試行回数を限定することで、処理時間を短縮できる。これらは、フィッティング処理設定手段２７にユーザーが事前に決定しておくことができる。また、主に用いられるカーブフィッティング関数群は、指数減衰関数、ローレンツ関数、ガウス関数をベースにしたものである。
【００２３】
データ記憶部１９で記憶された変数値群は、次に、データ比較部１７にて、変数閾値設定手段２８で予め設定しておいた少なくとも一つの比較用変数値群４４と比較される（Ｓ３０５）。比較用変数値群２４の変数参照値には、少なくとも一つの閾値が設定されているため、閾値の範囲内か、閾値の範囲外かをデータ判定部２０にて判定する（Ｓ３０６）。データ判定部での判定結果は、ディスプレイ９の判定結果表示部３４に表示される（Ｓ３０７）。
【００２４】
作成されたカーブフィッティング曲線は、データ記憶部に１９にテキストファイル等の方法で記憶されているため、図９に示されるように、ディスプレイ９の表示画面のブランク試料のグラフ表示部３５，または測定試料のグラフ表示部３６に表示できる。表示したい測定データは、第１のグラフ呼び出しのプルダウンメニュー４２、第２のグラフ呼び出しのプルダウンメニュー４３で選択する。また、測定データ点１２のグラフ波形とカーブフィッティング曲線は、後述する図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃに示されるように、１つのグラフ上で重ねて表示することも可能である。
【００２５】
本実施例では、試料分析装置３を用いて測定対象物質の存在有無を判定および存在量を定量分析する１例として、ＡＴＰ発光測定による無菌検査を例にあげて試料分析装置３の行う処理について詳細に説明する。ただし、試料分析装置３の分析内容については当該検査例に限定されない事はいうまでもない。以下に、ＡＴＰ発光法を用いた検査方法を簡単に述べる。
【００２６】
ＡＴＰ法はホタルの発光反応を利用して、細胞、細菌内のＡＴＰの数を光の量に変換して測定する。その原理は、ルシフェラーゼ酵素に基質ルシフェリンとＡＴＰ分子を取り込ませ、ＡＴＰの消費とともに酸化されたルシフェリン（オキシルシフェリン）が励起状態から基底状態に遷移するときの発光量を計測する。
【００２７】
【化１】
2016183860.tif 000003
【００２８】
このとき、ＡＴＰ1分子の消費が1フォトン（光子）生成に対応するため、光子発生数がＡＴＰの個数に比例する、生きている細菌（生菌）は平均で1アトモルのＡＴＰを内胞していることが知られているため、ＡＴＰの個数と光子発生数（光信号量）の関係を、予め把握しておくことで、測定試料に含まれていた生菌の総数を推定することができる。生菌数を推定するためのデータベースの作成方法を図１０を用いて説明する。まず、ＡＴＰ数を制御したＡＴＰスタンダード溶液を専用の希釈液を用いて作成する。次に、各々の個数で制御されたＡＴＰスタンダード溶液を用いて、図１の計測システム４５を用いて測定し、光信号量をＡＴＰ数ごとに整理する。具体的には、ＡＴＰ数を横軸に、光の量を縦軸にしてＡＴＰの検量線３９を作成する。検量線から傾きｙが求められ、光信号量から、ｘ１＝ｙ/aでＡＴＰ数が算出できる。
【００２９】
次に、生菌数を制御した生菌スタンダード溶液を専用の希釈液を用いて作成する。次に、各々の個数で制御された生菌スタンダード溶液を用いて、図１の計測システム４５を用いて測定し、光信号量を生菌数ごとに整理する。具体的には、生菌数を横軸に、光の量を縦軸にして生菌の検量線４０を作成する。検量線から傾きｙが求められ、光信号量から、ｘ２＝ｙ/ｂでＡ生菌数が算出できる。以上から、生菌数ｘ２＝（a/ｂ）×ｘ１の関係で求められる。
【００３０】
これにより、光信号量から、生菌数が求められる。先に生菌には平均１amolと述べたが、細菌の種類によって異なるため、目的とする対象物がある程度想定できる場合には、図１０の方法を用いて、ＡＴＰ数と生菌数の関係を明瞭にしておいた方が良い。これらの関係式は、図２のデータ比較部１７、データ判定部２０にて処理され、ディスプレイ９上の判定結果表示部３４に表示される。
【００３１】
次に、標準的な生菌内ＡＴＰ発光測定の測定手順を説明する：
(Ｘ)ＡＴＰ分解酵素による生菌以外の外来ＡＴＰ分子の除去
(Ｙ)界面活性剤による生菌内ＡＴＰ分子の抽出
(Ｚ)生菌から抽出されたＡＴＰ分子と発光試薬との生物発光反応、
の３ステップからなる。
【００３２】
図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃは、ステップ（Ｙ）の工程を終了したＡＴＰ抽出試料を一定量用意し、測定装置１の計測部所定の位置にセットし、ステップ(Ｚ)で、ルシフェリン−ルシフェラーゼ系発光試薬を試料に分注し、ＡＴＰ抽出試料と混合反応させ、そのＡＴＰ溶出試料中の生物発光反応量を光検出器で計測した結果と、本実施例の試料分析装置３を用いて分析、即ちカーブフィッティングの結果を示したグラフ波形の典型例である。
【００３３】
光検出器で計測する機構を有する図１で説明した測定装置１および制御装置２の実施形態は、特開２００８−２６８０１９号公報（特許文献１）に記載されているものが一つの例であり、本発明の明細書にて詳細内容は記載しないが、測定装置１の計測器は、微弱発光を測定するためのフォトンカウンティング方式であり、計測器からの信号出力４は、カウンター基板を用いて処理された1秒間毎のカウント値の合計数が出力され、試料分析装置３に測定データ点として入力される。
【００３４】
図４Ａ、図４Ｂは、測定装置１からの信号出力４を測定データ取得部１１が記憶し（図３のＳ３０１）、グラフ波形生成部１３が、測定データ取得部１１で記憶された測定データ点１２から波形（ＡＴＰ発光データ波形）２１を作成する（図３のＳ３０２）結果の典型例を示している。これらは、図９のディスプレイ上のブランク試料のグラフ表示部３５と測定試料のグラフ表示部３６にて表示される。生菌1個に相当するＡＴＰ量が含まれたＡＴＰ抽出試料の結果が図４Ａであり、試料中にＡＴＰが含まれていないブランク試料、つまり、界面活性剤抽出試薬を混合、反応させた結果が図４Ｂである。
【００３５】
ここで、波形（ＡＴＰ発光データ波形２１）は、図４Ａ、図４Ｂで、試料と試薬を混合する前の試料バックグラウンド信号２２、試料と発光試薬を混合した後の反応により生じたＡＴＰ発光信号２３の２つの領域に区別される。図４Ｂからわかるように、ブランク試料においても、発光試薬を混合することで、信号量が増加しており、ＡＴＰ発光と同様な波形が現れている。これは、発光試薬中やその他試薬や消耗品にＡＴＰが含まれていることを示していると考察できる。
【００３６】
次に、データ処理部１６が、カーブフィッティング関数記憶部１５から、測定対象および測定内容から予め推定される波形２１に対応可能なカーブフィッティング関数群１８を呼び出し、呼び出したカーブフィッティング関数群１８の各々を用いて、順番に、フィッティング処理を行う。ここでは、図３のＳ３０３で示したフィッティング処理の一例として、関数群として、1つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数２６、２つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数２７、３つの指数関数減衰項を含むを含むカーブフィッティング関数２８、の３種類を選択する場合について説明する。
（1つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数）
ｙ＝ｙ０＋Ａ1・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ1)            …  式（１）
（２つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数）
ｙ＝ｙ０＋Ａ1・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ1)＋Ａ２・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ２)
…  式（２）
（３つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数）
ｙ＝ｙ０＋Ａ1・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ1)＋Ａ２・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ２)＋Ａ３ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ３)                          …  式（３）
ここで、ｙ０は、試料バックグラウンド２２の測定データ点の平均値である。平均値ｙ０は３０点以上の測定データ点１２、言い換えれば、３０秒以上の測定データから算出するのが好適である。ｘ０は、ＡＴＰ発光信号２３の最大値を示した時間である。ＡＴＰ発光信号２３の最大値は、発光開始から、５秒間以内で得られるのが一般的であるため、最大値の検出領域は予め狭めておくこともできる。また、ｙ０は、試料バックグラウンド２２の測定データ点１２のみを抽出し、フィッティングして算出しても良い。これらの処理は、フィッティング処理設定手段２７でユーザーが任意に設定し、データ処理部１６で行うことができる。
【００３７】
次に、図３のＳ３０４で述べた変数値の記憶について例示して説明する。指数関数減衰項のＡ１、Ａ２、Ａ３は、試料バックグラウンド２２の測定データ点の平均値を差し引いたｘ０秒の時の信号強度に関係する変数である。式（１）では、Ａ１がｘ０秒の時のＡＴＰ発光信号値を示し、式（２）では、Ａ１＋Ａ２がｘ０秒の時のＡＴＰ発光信号値を示し、式（３）では、Ａ１＋Ａ２＋Ａ３がｘ０秒の時のＡＴＰ発光信号値を示している。ｔ１、ｔ２、ｔ３は、ＡＴＰ発光信号２３の減衰率を示す変数である。式（１）のｔ１は、ｘ０秒からＡＴＰ―ルシフェラーゼ発光反応の反応過程、いわゆるＡＴＰがルシフェラーゼで消費される過程を示している。式（２）のｔ２も、ｘ０秒からＡＴＰがルシフェラーゼで消費される過程を示すものであるが、ｔ１とは異なる反応経路を有すると仮定した場合のもう一つの減衰率を示している。さらに、式（３）のｔ３は、ｔ１、ｔ２の他に、もう一つの反応経路が存在する仮定した場合のさらに、さらに一つの減衰率を示している。以下にて、データ処理部１６による式（１）、（２）、（３）を用いたフィッティング処理を詳細に説明する。
【００３８】
まず、図４Ａ、４Ｂの試料バックグラウンド２２の測定データ点１２から、ｙ０を決定する。具体的には、図２のフィッティング処理設定手段２７により、８０秒から１１０秒の３０秒間の測定データ点１２の平均値をデータ処理部１６にて計算し、フィッティング処理設定手段２７に固定パラメータとしてｙ０値をデータ記憶部１９に記憶させる。
【００３９】
次に、ＡＴＰ発光信号２３から、最大値を抽出し、そのときの時間ｘ０を抽出し、フィッティング処理設定手段２７に固定パラメータｘ０として、データ記憶部１９に記憶させる。データ記憶部１９に記憶された固定値であるｙ０、ｘ０は、フィッティング処理設定手段２７が呼び出し、呼び出したｙ０、ｘ０をデータ処理部１６に送り、フィッティング処理設定手段２７を用いて、式（１）、（２）、（３）の三種類のカーブフィッティング関数を選択し、各々について、データ処理部１６にてフィッティングする。波形の変数であるＡ1、Ａ２、Ａ３、ｔ１、ｔ２、ｔ３を逐次反復変化させながら最小自乗規範で一致させていく。例えば、Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ−Ｍａｒｑｕａｒｄｔ法で非線形最小二乗問題を解いてフィッティングする。呼び出したカーブフィッティング関数群１８全てのカーブフィッティング関数のＡ1、Ａ２、Ａ３、ｔ１、ｔ２、ｔ３の変数値の結果は、各々のカーブフィッティング関数と関連づけて、データ記憶部１９に記憶される。
【００４０】
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃに、ブランク試料において、データ処理部１６が式（１）、式（２）、式（３）でそれぞれフィッティングした結果のグラフを示す。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃは、生菌1個程度のＡＴＰ含む試料のＡＴＰ発光の結果を、データ処理部１６が式（１）、式（２）、式（３）でそれぞれのフィッティング結果を示している。  
式（１）を用いた場合では、フィッティング処理は収束しているが（図５Ａ）、式（２）、式（３）を用いた場合は、どちらもフィッティング処理は収束せず（図５Ｂ、図５Ｃ）、式（２）のｔ２、式（３）のｔ３が無限大に近い値となっている（図５Ｂ、図５Ｃ）。つまり、ブランク試料の測定データにおいては、１つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数（式（１））は、フィッティング関数の選択として適しているが、その他、２つの指数関数減衰項を含むを含むカーブフィッティング関数（式（２））や３つの指数関数減衰項を含むを含むカーブフィッティング関数（式（３））は、フィッティング関数の選択として、不適であることを本結果は示している。不適であることを示す変数値は、図５Ｂのｔ２、図５Ｃのｔ３であり、それぞれ、９．８８１１×１０の８３乗、４．７９１×１０の８５乗であり、ほぼ無限大に発散している。このフィッティング結果は、ｔ２、ｔ３を含む項はほぼ０であることが好ましく、ｔ２、ｔ３を含む項がカーブフィッティングに不要であることを示している。
【００４１】
また、無限大ではなくとも、選択されたカーブフィッティング関数の不適さ、ｔ２、ｔ３の不要さの判断について、ｘ０から１００秒後に１ＣＰＳ未満の減衰しか与えない項は不要だと判断しても良い。図５Ｂを例に挙げると、Ａ２＝５３．６５０７６をそのまま引用した場合、ｔ２＝５４００（５．４×１０の４乗）で、１００秒後に、０．９８ＣＰＳの変化量しか与えないため、５．４×１０の４乗以上を判定閾値として設定しても良い。同様に、図５ＣでＡ３＝２７．５６３５４をそのまま引用した場合、ｔ２＝２８００（２．８×１０の４乗）の場合、１００秒後に、０．９６ＣＰＳの変化量しか与えないため、２．８×１０の４乗以上を閾値として設定すれば良い。つまり、Ａｎ・ＥＸＰ(-（（ｘ０+１００）-ｘ０）/ｔｎ)＜1の関係から、カーブフィッティング関数の不適さ、ｔ２、ｔ３の不要さの判断に用いるｔｎの閾値を決めることができ、本実施例のケースでは、より尤度を持って、１×１０の５乗以上の場合は、カーブフィッティング関数が不適、ｔ２、またはｔ３は不要と判断するようにすれば良い。これらの判定閾値を決める処理は、変数閾値設定手段２８が担う。
【００４２】
一方、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃに、生菌１個程度のＡＴＰを含む試料において、式（１）、（２）、（３）の何れのカーブフィッティング関数を用いてもフィッティング処理が収束した結果の一例を示す。本結果から、カーブフィティング関数の信号強度に相当する変数値群Ａ1、Ａ１＋Ａ２、さらにＡ１+Ａ２+Ａ３が、図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃで上述したブランク試料よりも生菌１個程度のＡＴＰを含む試料の方が大きいことが分かる。また、ｔ1、ｔ２、ｔ３の値に差があり、ｔ２、ｔ３に関しては、フィッティングの収束有無により、これらの変数値がブランク試料と生菌１個程度のＡＴＰを含む試料で大きく異なることがわかる。
【００４３】
この結果に基づき、データ判定部２０は、以下のような判定基準で、生菌が試料内に１個以上存在するか否かの判定を行う。なお、この場合は、図３のＳ３０５の比較処理を行わずに例えば以下の（a）（b）のとおりＳ３０６の判定を行う。
【００４４】
（a）ｙ＝ｙ０＋Ａ1・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ1)＋Ａ２・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ２)のカーブフィッティング曲線で収束しない場合は、無菌である。
【００４５】
（b）ｙ＝ｙ０＋Ａ1・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ1)＋Ａ２・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ２)＋Ａ３ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ３)のカーブフィッティング曲線で収束しない場合は無菌である。
【００４６】
また、判定処理（Ｓ３０６）の前に変数値と比較変数値との比較（Ｓ３０５）を行って判定を行うことも可能である。つまり、比較用変数値群のｔ２、ｔ３に閾値を設けて、下記（ｃ）（ｄ）のように判定する構成である。ただし、ｔ２、ｔ３の値の判定基準はこれに限定されず、任意に設定可能である。
【００４７】
（c）ｙ＝ｙ０＋Ａ1・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ1)＋Ａ２・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ２)のカーブフィッティング曲線でフィッティングした結果で、ｔ２の値が１×１０の５乗以上であれば、無菌である。
【００４８】
（d）ｙ＝ｙ０＋Ａ1・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ1)＋Ａ２・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ２)＋Ａ３ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔ３)のカーブフィッティング曲線でフィッティングした結果で、ｔ３の値が１×１０の５乗以上であれば、無菌である。
【００４９】
反対に、上記（a）〜（d）に相当しない場合、即ち、カーブフィッティング曲線が何れも収束した場合や、さらに、ｔ２やｔ３が１×１０の５乗未満であれば、生菌が1個以上存在したという判定が可能となる。
【００５０】
また、さらに、Ａ１とＡ２の合計、または、Ａ１とＡ２とＡ３の合計値から、信号強度を算出し、ＡＴＰ量を算出することも可能である。
【００５１】
さらに、（a）から（d）に加えて、Ａ１、Ａ２、Ａ３にも閾値を設けても良く、複数の変数の閾値比較により、試料中に生菌が存在するか否かの判定精度を向上させられる。
【００５２】
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄは、ブランク試料と生菌１個相当量のＡＴＰ抽出試料の各々を３回ずつ測定し、試料分析装置３にて、式（２）にてフィッティング処理した結果から、Ａ１とＡ２、Ａ＝Ａ１＋Ａ２、ｔ２の変数値についてグラフ表示したものである。図７Ａに示されるＡ１の変数値からは、ブランク試料とＡＴＰ抽出試料の差を区別することができないのに対して、図７Ｂに示されるＡ２、図７Ｃに示されるＡ２Ａ＝Ａ１＋Ａ２、さらに、図７Ｄに示されるｔ２の変数比較で、ブランク試料と生菌からのＡＴＰ抽出試料の信号量の差と、有菌か無菌かを明瞭に判定することが可能であることが確認された。
【００５３】
このように、データ判定部２０による生菌の有無判定はｔ１、ｔ２、ｔ３を用いずにＡ２またはＡ＝Ａ１+Ａ２でも判定することも可能である。しかし、ブランク試料のＡ２またはＡ＝Ａ１+Ａ２を用いて判定する場合、偽陽性に注意が必要なため、検出限界や定量限界は踏まえて生菌の有無判定の閾値を決定する必要がある。様々な思想のもとに決められているが、現在最も受け入れられているＩＵＰＡＣとＩＳＯ（国際標準化機構）で定められた検出下限、定量下限を採用するのが好適である。具体的には、プランク試料の信号量＋ブランク試料の信号量の標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＳＤ）の３．３倍の値を検出下限とし、また、標準偏差の１０倍以上を定量下限とする。例えば、複数のブランク試料の測定データから、Ａ２の標準偏差（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ：ＳＤ）を算出し、データ比較用変数値群２４の変数参照値にＡ２+３．３ＳＤ（Ａ２）の値を格納しておく。
【００５４】
同様に、Ａ＝Ａ1+Ａ２のＳＤを計算し、データ比較用変数群２４の変数参照値にＡ+３．３ＳＤ（Ａ）の値を格納しておく。格納したこれらの変数参照値と比較し、閾値以上か否かでＡＴＰ抽出試料内に生菌が存在したか否かを判定できる。また、さらに１つの変数参照値をブランク試料の平均値として設定し、測定試料で得られた信号値との差分量から、図１０を用いて説明した検量線からの生菌数の算出方法で算出し、検出下限か否かによる生菌有無判定に加えて、生菌数を判定結果として表示しても良い。これらは、何れも判定結果表示部３４に表示される。
【００５５】
以上、本実施例では、試料分析装置３のデータ比較部１７の変数閾値設定手段２８が、ｔ２、Ａ２、Ａを変数として選択し、各変数参照値、例えばｔ２＝1×１０の５乗、Ａ２＝７０、Ａ＝１４０と設定して、高い確度で生菌の有無を判定できる。また、Ａの閾値として、さらに、プランク試料の平均値を加えることで、生菌数の定量が可能となる。
【００５６】
なお、本実施例で例示した数値はあくまでも実験結果の典型例から見出した値であり、試薬の状況や、測定装置１の性能により変化することは言うまでもない。
【００５７】
＜実施例２＞
本実施例では、試料分析装置３は、菌の存在有無の判定に加え、測定装置１の不具合による誤計測や消耗品関係の汚染や試薬の活性不具合による誤計測を検知する、いわゆる、測定異常検知も行う実施形態について説明する。
【００５８】
図８は、試料分析装置３の結果から無菌検査の有菌か無菌か、さらに、測定異常による誤計測かを判定するステップを示している。ここでは、式（２）の２つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数で判定される例を示している。測定対象は、ＡＴＰであり、ＡＴＰ生物発光の時系列信号値が測定データ点であり、測定データ点を２００秒測定し、試料と試薬を混合する前の試料バックグラウンド信号、試料と発光試薬を混合した後の反応により生じたＡＴＰ発光信号の２つの領域をまとめて測定する。
【００５９】
ここで、本実施例における試料分析装置の表示画面を示す図９を用いて説明する。まず、無菌試料、すなわちブランク試料の測定を測定装置１で行う。測定終了後、試料分析装置３において、指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数群を、図９のディスプレイ上の関数群選択プルダウンメニュー２９から選択する（式（４））。
【００６０】
ｙ＝ｙ０＋ΣＡi・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔi)（1≦i≦ｎ）            …（４）
その後、試料分析開始ボタン３０をクリックし、分析を開始する。測定装置１の計測器からの信号出力４を受け取り、測定データ点を記憶し（Ｓ８０１）、グラフ波形の作成を行う（Ｓ８０２）。次に、式（４）のiを1から順番に増加させていきグラフ波形のフィッティング処理を行う（Ｓ８０３）。次に、複数のカーブフィッティング処理結果の変数値を記憶する（Ｓ８０４）。記憶された変数値は、画面上の測定試料変数値表示部３２に表示される。測定試料変数値表示部に表示された変数の値は、保存され、任意に呼び出せる。ここでは、実施例１で説明したように、ブランク試料結果をもとに、Ａ、ｔ２の変数値に閾値を設定する。例えば、ＡＡを１４０、ｔ２を１Ｅ５と設定する。これを比較変数群として保存する比較用変数群設定ボタン３８をクリックすると、試料分析装置３に記憶される。
【００６１】
記憶された比較用変数群を試料測定の際に呼び出すと、図９の比較用変数群表示部３２に表示される。比較用変数群表示部３２は、１列目に変数値の記号が表示され、２列目には、それらの変数値が表示される。それらの変数値をもとに、閾値表示部３７に変数参照値として入力する。これらの変数参照値は閾値として、設定される。もちろん、記憶済みの閾値を呼び出して表示することも可能であり、ブランク試料の結果の変数値は、あくまでも参照値であり、閾値の設定値は自由に選択すれば良い。
【００６２】
この状態にした後に、実測定試料の測定を開始する。測定装置１の計測器からの信号出力４を受け取り、測定データ点を記憶し（Ｓ８０１）、グラフ波形の作成を行い（Ｓ８０２）、次に、式（４）のiを1から順番に増加させていきグラフ波形のフィッティング処理を行う（Ｓ８０３）。次に、複数のカーブフィッティング処理結果の変数値を記憶する（Ｓ８０４）。記憶された変数値群は、画面上の測定試料変数値表示部３３に表示される。この表示された測定試料変数値と、比較用変数値との比較が次に実施される。まず、Ａ２が閾値以上か閾値未満かの比較１が実施を実施する（Ｓ８０５）。次に、ｔ２が閾値以上か閾値未満かの比較２が実施する（Ｓ８０６、Ｓ８０７）。以上のステップにより、菌の存在の有無、即ち、有菌か無菌か、もしくは測定異常の判定が下る。
【００６３】
具体的な例として、比較１（Ｓ８０５）で閾値以上、つまり、ブランク試料の光信号値の平均値よりも測定試料の光の信号値が大きい場合、または、ブランク試料測定のＡの標準偏差ＳＤの３．３倍以上の場合、有菌である可能性が高いと判断し、次に、比較２（Ｓ８０６）に移る。比較２（８０６）で、閾値未満であった場合、有菌と判定される。有菌と判定された場合、微生物量をカウントすることも可能であり、ＡＴＰ数、生菌数、各々の光信号量の関係から、測定試料に含まれていた生菌の総数の推定量を算出することができる。
【００６４】
一方、比較１（Ｓ８０５）で閾値以上であったにも関わらず、比較２（８０６）で、閾値以上であった場合、ＡＴＰ発光の濃度に応じた減衰曲線が得られていないことを示すため、測定異常と判定される。このような結果が出てしまう測定異常の原因としては、測定装置の遮光性能が損なわれた、または、コンタミによるＡＴＰ発光以外の定常的な光物質が混入した、等が考えられ、測定中止のメッセージ３８が表示され、測定が中止される。
【００６５】
また、比較１（Ｓ８０５）で閾値未満の場合、つまり、ブランク試料の光信号値の平均値よりも測定試料の光の信号値が同等か低い場合、または、ブランク試料測定のＡの標準偏差ＳＤの３．３倍未満の場合、無菌である可能性が高いと判断し、次に、比較３（Ｓ８０７）に移る。比較３（８０６）で、閾値以上であった場合、無菌と判定される。一方、比較３（８０７）で閾値未満と判定された場合、通常のＡＴＰ発光の減衰曲線が得られていないことから、測定異常と判定される。測定異常の原因としては、試薬の分注量が設定値よりも少なかった、もしくは試薬が分注されなかった、等が考えられ、測定中止のメッセージ３８が表示され、測定が中止される。
【００６６】
図９の画面上では、判定結果表示部３４に有菌、無菌の結果、有菌の場合は生菌数、またはＡＴＰ数が表示され、測定異常の際には、測定異常と表示される。さらに、測定データ点から構成されるグラフ、グラフのフィッティング曲線も表示され、視覚的に解析が順調に進んでいるかを確かめられるようになっている（３５、３６）。
【符号の説明】
【００６７】
１…測定装置、２…制御装置、３…試料分析装置、４…計測器からの信号出力、５…トリガ信号、８…本体、９…ディスプレイ、１０…手動入力手段１１…測定データ取得部、１３…グラフ波形生成部、１５…カーブフィッティング関数記憶部、１６…データ処理部、１７…データ比較部、１８…カーブフィッティング関数群、１９…データ記憶部、２０…データ判定部、２１…波形（ＡＴＰ発光データ波形）、２２…試料バックグラウンド、２３…ＡＴＰ発光信号、２４…比較用変数値群、２５…関数群設定手段、２６…1つの指数関数減衰項を含むカーブフィッティング関数、２７…２つの指数関数減衰項を含むを含むカーブフィッティング関数、２８…３つの指数関数減衰項を含むを含むカーブフィッティング関数、２９…関数群選択プルダウンメニュー、３０…試料分析開始ボタン、３１…比較用変数群呼び出しプルダウンメニュー、３２…比較用変数群表示部、３３…測定試料変数値表示部、３４…判定結果表示部、３５…ブランク試料のグラフ表示部、３６…測定試料のグラフ表示部、３７…閾値表示部、３８…比較用変数群設定ボタン、３８…測定中止のメッセージ、３９…ＡＴＰの検量線、４０…生菌の検量線、４１…ＡＴＰ個数と生菌数の関係、４２…第１のグラフ呼び出しのプロダウンメニュー、４３…第２のグラフ呼び出しのプロダウンメニュー、４４…比較変数値群、４５…計測システム、４６…カーブフィッティング曲線ｙ＝ｙ０＋ΣＡi・ＥＸＰ(-（ｘ-ｘ０）／ｔi)のiの設定ボタン
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2016183860.tif 000013
【図６Ｃ】
2016183860.tif 000014
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2016183860.tif 000016
【図７Ｃ】
2016183860.tif 000017
【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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