(57)【要約】      （修正有）【課題】ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）由来の新規なポリペプチド等の提供。【解決手段】特定の配列を示すアミノ酸配列における連続する所定のアミノ酸を含むポリペプチド、別の特定の配列を示すアミノ酸配列における連続する所定のアミノ酸を含むポリペプチド、また別の特定の配列を示すアミノ酸配列における連続する所定のアミノ酸を含むポリペプチド。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）の何れかに示すポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（DQQRLITAIN QTHYNLLNVA）を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３８個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸（DWLYIRLGFQ SLCPTINEPC）を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（LAPCLIKCLT SRLLKLLRQA）を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸（PLRLSVFAPD TRGAIRYLST）を含むポリペプチド
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸（LLTLCPATCI LPLGEPFSPN）を含むポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ１）〜（ｅ１）の何れかに示す請求項１に記載のポリペプチド：
（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｂ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｃ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｄ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｅ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドにおいて、１もしくは２個のアミノ酸が置換もしくは付加されてなる、および／または、末端側に位置する１もしくは２個のアミノ酸が欠失されてなり、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドを含んでいるベクター。
【請求項６】
請求項４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項５に記載のベクターが発現可能に導入されている細胞。
【請求項７】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、または請求項６に記載の細胞を含んでいるＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤。
【請求項８】
請求項１〜３の何れか１項に記載のポリペプチド、請求項４に記載のポリヌクレオチド、請求項５に記載のベクター、または請求項６に記載の細胞を含んでいる牛白血病の予防または治療のための薬剤。
【請求項９】
請求項８に記載の薬剤を動物個体に投与する工程を含む牛白血病の予防または治療方法。
【請求項１０】
以下の（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチド、当該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでいるベクター、または当該ポリヌクレオチドもしくは当該ベクターを含んでいる細胞、を含んでいるＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（DQQRLITAIN QTHYNLLNVA）を含むポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸（DWLYIRLGFQ SLCPTINEPC）を含むポリペプチド
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（LAPCLIKCLT SRLLKLLRQA）を含むポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸（PLRLSVFAPD TRGAIRYLST）を含むポリペプチド
（Ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸（LLTLCPATCI LPLGEPFSPN）を含むポリペプチド
（Ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（Ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（Ｈ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド
（Ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KSPRYTLDSV NGYPKIYWPP）を含むポリペプチド
（Ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１０１番目〜１２０番目のアミノ酸（DQGSFYVNHQ ILFLHLKQCH）を含むポリペプチド
（Ｋ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１１番目〜１３０番目のアミノ酸（ILFLHLKQCH GIFTLTWEIW）を含むポリペプチド。
【請求項１１】
以下の（Ａ１）〜（Ｋ１）の何れかに示すポリペプチド、当該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでいるベクター、または当該ポリヌクレオチドもしくは当該ベクターを含んでいる細胞、を含んでいる請求項１０に記載のＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤：
（Ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｂ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｃ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｄ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｅ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｆ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｇ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｈ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｉ１）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｊ１）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１０１番目〜１２０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｋ１）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１１番目〜１３０番目のアミノ酸を含むポリペプチド。
【請求項１２】
活性化の対象となるＣＤ８陽性Ｔ細胞に以下の（Ａ）〜（Ｋ）のうちの少なくとも１つのポリペプチドを接触させる工程を含む、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化方法：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（DQQRLITAIN QTHYNLLNVA）を含むポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸（DWLYIRLGFQ SLCPTINEPC）を含むポリペプチド
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（LAPCLIKCLT SRLLKLLRQA）を含むポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸（PLRLSVFAPD TRGAIRYLST）を含むポリペプチド
（Ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸（LLTLCPATCI LPLGEPFSPN）を含むポリペプチド
（Ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（Ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（Ｈ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド
（Ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KSPRYTLDSV NGYPKIYWPP）を含むポリペプチド
（Ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１０１番目〜１２０番目のアミノ酸（DQGSFYVNHQ ILFLHLKQCH）を含むポリペプチド
（Ｋ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１１番目〜１３０番目のアミノ酸（ILFLHLKQCH GIFTLTWEIW）を含むポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）由来の新規なポリペプチドおよびその利用等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
地方病性牛白血病は、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）というレトロウイルスによって誘発される悪性Ｂリンパ腫である。予防法および根治療法はなく、全世界的に蔓延し、感染率および発症率は増加の一途をたどっている。この病気は潜伏期間が長く、約５〜１０年と言われる。感染しても大部分は無症状で生産上も問題ないとされるが、病態が進むと約３割の感染牛がリンパ球増多症を示し、２〜５％の感染牛が白血病を発症するとされている。特に近年、日本全国でＢＬＶ感染牛が急増しており、それに伴い発症数および発症牛の廃用数も増加している。そのため、感染拡大による経済的損失が懸念されている。現在の対処法は、隔離または淘汰によって、拡大を防ぐことである。したがって、ワクチンによる予防法および治療法の確立が急がれる。
【０００３】
これまでに、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）由来のペプチドにおけるＴ細胞エピトープが調べられており、報告がなされている。例えば、非特許文献１には、Ｅｎｖ領域に由来するｇｐ５１のアミノ酸配列の１３１〜１４０番目がヒツジにおけるＴ細胞エピトープであることが記載されている。また、非特許文献２には、Ｅｎｖ領域に由来するｇｐ５１のアミノ酸配列の９８〜１１７番目がヒツジにおけるＴ細胞エピトープであることが記載されている。
【０００４】
ところで、本発明者らの研究グループは、以前の研究で、ウシの主要組織適合抗原（ＭＨＣ）のクラスＩＩ遺伝子のうち、ＤＲＢ３遺伝子およびその遺伝子産物の構造を明らかにしている（非特許文献３）。さらに、この遺伝子の型によって、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）が引き起こす地方病性牛白血病の発症に対する発症抵抗性および発症感受性が異なることを見出している。
【０００５】
また、ヒツジを用いた感染実験において、白血病に対する発症抵抗性のあるヒツジＭＨＣクラスＩＩを有する個体では、Ｔｈ１型細胞性免疫が優勢となっているが、一方、発症感受性のあるヒツジＭＨＣクラスＩＩを有する個体では、Ｔｈ２型液性免疫が優勢となっていることが報告されている（非特許文献４、非特許文献５）。また、ウシにおいても発症感受性ＭＨＣの型をホモに有する個体は他の個体に比べてプロウイルスロードが高くなっていることが確かめられている（非特許文献６）。そのため、発症感受性ＭＨＣを有する個体では、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対して液性免疫が誘導され、病態進行が起こりやすくなっていると考えられる。また、発症感受性ＭＨＣの型をホモに有する個体は、感染源となる危険性も高い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】M. H. Gatei et al., Journal of Virology, Apr. 1993, p. 1796-1802.
【非特許文献２】H. Kabeya et al., J. Vet. Med. Sci., 1999, 61(5):475-480.
【非特許文献３】Y. Aida et al., Biochem Biophys Res Commun 1995, 209(3):981-988.
【非特許文献４】Y. Nagaoka et al., Cancer Res., 1999, 59(4):975-981.
【非特許文献５】S. Konnai et al., Microbiol Immunol 2003, 47(3):223-232.
【非特許文献６】T. Miyasaka et al., Tissue Antigens 2013, 81(2), 71-82.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するワクチンによる予防法および治療法を確立するためには、さらなるＴ細胞エピトープの探索が必要となる。
【０００８】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）由来の新規なポリペプチド等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った。より詳細には、発症感受性のＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲＢ３＊１６０１型）をホモに有するウシの免疫細胞、および発症感受性・抵抗性の何れも有さないウシの免疫細胞を用いて、ＢＬＶのＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープマッピングを行った。その結果、ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチドを同定した。
【００１０】
本発明はすなわち、以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）  以下の（ａ）〜（ｅ）の何れかに示すポリペプチド：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（DQQRLITAIN QTHYNLLNVA）を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３８個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸（DWLYIRLGFQ SLCPTINEPC）を含むポリペプチド
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（LAPCLIKCLT SRLLKLLRQA）を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸（PLRLSVFAPD TRGAIRYLST）を含むポリペプチド
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸（LLTLCPATCI LPLGEPFSPN）を含むポリペプチド。
【００１２】
（２）  以下の（ａ１）〜（ｅ１）の何れかに示す上記（１）に記載のポリペプチド：
（ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｂ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｃ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｄ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｅ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸を含むポリペプチド。
【００１３】
（３）  上記（１）または（２）に記載のポリペプチドにおいて、１もしくは２個のアミノ酸が置換もしくは付加されてなる、および／または、末端側に位置する１もしくは２個のアミノ酸が欠失されてなり、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチド。
【００１４】
（４）  上記（１）から（３）の何れかに記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【００１５】
（５）  上記（４）に記載のポリヌクレオチドを含んでいるベクター。
【００１６】
（６）  上記（４）に記載のポリヌクレオチドまたは上記（５）に記載のベクターが発現可能に導入されている細胞。
【００１７】
（７）  上記（１）から（３）の何れかに記載のポリペプチド、上記（４）に記載のポリヌクレオチド、上記（５）に記載のベクター、または上記（６）に記載の細胞を含んでいるＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤。
【００１８】
（８）  上記（１）から（３）の何れかに記載のポリペプチド、上記（４）に記載のポリヌクレオチド、上記（５）に記載のベクター、または上記（６）に記載の細胞を含んでいる牛白血病の予防または治療のための薬剤。
【００１９】
（９）  上記（８）に記載の薬剤を動物個体に投与する工程を含む牛白血病の予防または治療方法。
【００２０】
（１０）  以下の（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチド、当該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでいるベクター、または当該ポリヌクレオチドもしくは当該ベクターを含んでいる細胞、を含んでいるＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤：
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（DQQRLITAIN QTHYNLLNVA）を含むポリペプチド
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸（DWLYIRLGFQ SLCPTINEPC）を含むポリペプチド
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（LAPCLIKCLT SRLLKLLRQA）を含むポリペプチド
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸（PLRLSVFAPD TRGAIRYLST）を含むポリペプチド
（Ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸（LLTLCPATCI LPLGEPFSPN）を含むポリペプチド
（Ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド
（Ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド
（Ｈ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド
（Ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KSPRYTLDSV NGYPKIYWPP）を含むポリペプチド
（Ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１０１番目〜１２０番目のアミノ酸（DQGSFYVNHQ ILFLHLKQCH）を含むポリペプチド
（Ｋ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１１番目〜１３０番目のアミノ酸（ILFLHLKQCH GIFTLTWEIW）を含むポリペプチド。
【００２１】
（１１）  以下の（Ａ１）〜（Ｋ１）の何れかに示すポリペプチド、当該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含んでいるベクター、または当該ポリヌクレオチドもしくは当該ベクターを含んでいる細胞、を含んでいる上記（１０）に記載のＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤：
（Ａ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｂ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｃ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｄ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｅ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｆ１）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｇ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｈ１）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｉ１）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｊ１）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１０１番目〜１２０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（Ｋ１）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１１番目〜１３０番目のアミノ酸を含むポリペプチド。
【００２２】
（１２）  活性化の対象となるＣＤ８陽性Ｔ細胞に上述の（Ａ）〜（Ｋ）のうちの少なくとも１つのポリペプチドを接触させる工程を含む、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化方法。
【発明の効果】
【００２３】
本発明におけるポリペプチドは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなり、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例において設計した各ペプチドの具体的な配列およびペプチドプールを示す図である。
【図２】実施例における細胞増殖試験（１回目）の結果を示す図である。
【図３】実施例における細胞増殖試験（２回目）の結果を示す図である。
【図４】実施例における非放射性細胞毒性アッセイの結果を示す図である。
【図５】実施例における非放射性細胞毒性アッセイの結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
〔１．本発明におけるポリペプチド〕
本発明におけるポリペプチドは、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）を構成する主要なタンパク質であるＥｎｖ領域由来のｇｐ３０およびｇｐ５１、ならびにｐＸ領域由来のｔａｘのペプチドの配列に基づき設計された、ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチドである。特にウシ（Bos taurus）、コブウシ（Bos indicus）、および／またはスイギュウ（Bubalus bubalis）のＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる。好ましくは、ウシおよび／またはスイギュウのＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる。より好ましくは、ウシのＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる。ウシとしては、乳用種、肉用種、乳肉兼用種、役用種、および役肉兼用種等が挙げられる。具体的には、例えば、黒毛和種、日本短角種等の和牛、ホルスタイン、ジャージー、および各国の在来種等の品種が挙げられるが、これらに限定されない。なお、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウ以外の動物のＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープにもなり得る。そのような動物としては、例えば、マウス、ヒツジ、ヤギ、ブタ、霊長類、およびヒト等が挙げられる。
【００２６】
「ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる」とは、ＭＨＣクラスＩに結合することができ、かつ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させることを指す。「ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させる」とは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へ分化させること、分化した細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させること、分化した細胞傷害性Ｔ細胞に感染細胞を攻撃させること、および分化した細胞傷害性Ｔ細胞を記憶Ｔ細胞に分化させる等のうちの少なくとも１つを指す。
【００２７】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩに結合した抗原ペプチドを提示されたナイーブＣＤ８陽性Ｔ細胞から分化する。細胞傷害性Ｔ細胞は、インビボにおいて、病原体に感染した細胞に対して、パーフォリン、グランザイム、および／またはＴＮＦ（tumor necrosis factor）等を放出したり、ターゲット細胞のＦａｓを刺激したりして、アポトーシスを誘導する。
【００２８】
本発明におけるポリペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩの型（ハプロタイプ）は特に限定されない。本発明におけるポリペプチドが結合するＭＨＣクラスＩＩの型は、例えば、牛白血病発症に対して感受性を有する個体のＭＨＣクラスＩＩの型であることが好ましく、ＤＲＢ３＊１６０１型であることがより好ましい場合がある。あるいは、多くの型のＭＨＣクラスＩＩに結合するものであってもよい。例えば、牛白血病発症に対して感受性を有する型だけでなく、牛白血病発症に対して抵抗性を有する型（例えば、ＤＲＢ３＊０７０１型、ＤＲＢ３＊１４０１１型、およびＤＲＢ３＊１１０１型等）、および／または抵抗性・感受性の何れも有さない型（例えば、ＤＲＢ３＊１５０１型、ＤＲＢ３＊２７０３型、およびＤＲＢ３＊０５０３型等）のＭＨＣクラスＩＩに結合するものであってもよい。なお、上述のＭＨＣクラスＩＩの型の具体的なアミノ酸配列は、http://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/bola/align.htmlから入手することができる。
【００２９】
本発明におけるポリペプチドの一例は、以下の（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すものである。
（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（DQQRLITAIN QTHYNLLNVA）を含むポリペプチド；
（Ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸（DWLYIRLGFQ SLCPTINEPC）を含むポリペプチド；
（Ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（LAPCLIKCLT SRLLKLLRQA）を含むポリペプチド；
（Ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸（PLRLSVFAPD TRGAIRYLST）を含むポリペプチド；
（Ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸（LLTLCPATCI LPLGEPFSPN）を含むポリペプチド；
（Ｆ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、５２番目〜７１番目のアミノ酸（THYNLLNVA SVVAQNRRGL D）を含むポリペプチド；
（Ｇ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（ILNQMANFSL LPSFDTLLVD）を含むポリペプチド；
（Ｈ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１８１番目〜２００番目のアミノ酸（TRGAIRYLST LLTLCPATCI）を含むポリペプチド；
（Ｉ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（KSPRYTLDSV NGYPKIYWPP）を含むポリペプチド；
（Ｊ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１０１番目〜１２０番目のアミノ酸（DQGSFYVNHQ ILFLHLKQCH）を含むポリペプチド；
（Ｋ）配列番号３に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で５０個以下のアミノ酸からなり、かつ、１１１番目〜１３０番目のアミノ酸（ILFLHLKQCH GIFTLTWEIW）を含むポリペプチド。
【００３０】
ＣＤ８陽性Ｔ細胞をより活性化させるという観点では、上記（Ａ）〜（Ｋ）に示すポリペプチドは、それぞれ、４０個以下のアミノ酸からなることが好ましく、３０個以下のアミノ酸からなることがより好ましく、２５個以下のアミノ酸からなることがさらに好ましい。
【００３１】
上記（Ａ）に示すポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｂ）に示すポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１番目〜９０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｃ）に示すポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｄ）に示すポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列における１７１番目〜１９０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｅ）に示すポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列における１９１番目〜２１０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｆ）に示すポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列における５２番目〜７１番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｇ）に示すポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｈ）に示すポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列における１８１番目〜２００番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｉ）に示すポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｊ）に示すポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列における１０１番目〜１２０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（Ｋ）に示すポリペプチドは、配列番号３に示すアミノ酸配列における１１１番目〜１３０番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００３２】
（Ａ）、（Ｃ）〜（Ｇ）および（Ｉ）〜（Ｋ）は、牛白血病発症に対して感受性を有するＭＨＣクラスＩＩ（ＤＲＢ３＊１６０１型）をホモにもつ個体の免疫細胞を用いて同定されたエピトープである。したがって、本発明のポリペプチドのうち（Ａ）、（Ｃ）〜（Ｇ）および（Ｉ）〜（Ｋ）は、発症率が高く、感染源となりやすい個体に対する効果が特に期待できる。なお、牛白血病発症に対して感受性を有さない（抵抗性を有する、あるいは何れも有さない）ＭＨＣクラスＩＩをもつ個体に対する効果も期待できる。また、本発明のポリペプチドのうち（Ｃ）、（Ｆ）および（Ｊ）は、牛白血病発症に対して感受性を有さないＭＨＣクラスＩＩをもつ個体の免疫細胞においてもエピトープとして同定されている。したがって、（Ｃ）、（Ｆ）および（Ｊ）は、より幅広いＭＨＣクラスＩＩに対して効果が期待できる。特に（Ｊ）は実施例で用いた全てのウシにおいて効果が示されているため、かなり幅広いＭＨＣクラスＩＩに対して効果が期待できる。また、本発明のポリペプチドのうち、後述する（Ｂ）および（Ｈ）は、牛白血病発症に対して感受性を有さないＭＨＣクラスＩＩをもつ個体の免疫細胞を用いて同定されたエピトープである。
【００３３】
また、（Ｆ）〜（Ｈ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとしての効果も有している。したがって、本発明のポリペプチドのうち（Ｆ）〜（Ｈ）は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞との両方を活性化させることができ、相乗効果が期待できる。なお、「ＣＤ４陽性Ｔ細胞エピトープとなる」とは、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩに結合することができ、かつ、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させることを指す。「ＣＤ４陽性Ｔ細胞を活性化させる」とは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／または制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）へ分化させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞に種々のサイトカインを産生させること、ならびに分化したＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および／またはＴｒｅｇ細胞が免疫応答を制御すること等のうちの少なくとも１つを指し、より好ましくは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞をＴｈ１細胞へ分化させること、分化したＴｈ１細胞を増殖させること、分化したＴｈ１細胞に種々のサイトカインを産生させること、およびその結果として細胞性免疫を活性化すること等のうちの少なくとも１つを指す。
【００３４】
なお、本発明におけるポリペプチドの製造方法は特に限定されず、固相合成法等のペプチド化学合成法によって製造してもよいし、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入し当該細胞に大量に産生させてもよいし、または細胞抽出液を用いた無細胞ペプチド合成系によって産生させてもよい。本発明におけるポリペプチドは、比較的短鎖であり、かつ特別な修飾等を行わずともＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなるため、ペプチド化学合成法による製造も容易である。
【００３５】
また、本発明におけるポリペプチドは、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなる限りにおいて、アミノ酸の置換、付加、および／または欠失が生じていてもよい。ここで許容されるアミノ酸の置換、付加、または欠失とは、具体的には以下に示すものである。
【００３６】
アミノ酸の置換とは、１または２個のアミノ酸の置換であり、好ましくは１個のアミノ酸の置換である。具体的には、例えば、上記（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチドを構成する塩基性アミノ酸を他の塩基性アミノ酸に置換すること、酸性アミノ酸を他の酸性アミノ酸に置換すること、中性アミノ酸を性質の類似する他の中性アミノ酸に置換すること、等が挙げられる。さらに具体的には、例えば、上記（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチドにおいて、以下の（１）〜（６）の何れかの置換が生じていること等が挙げられる。
（１）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（２）リジン、アルギニン、およびヒスチジンからなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（３）アスパラギン、およびグルタミンからなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（４）アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（５）アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびプロリンからなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
（６）セリン、およびスレオニンからなる群から選択される１アミノ酸から、当該群中の他のアミノ酸への置換。
【００３７】
アミノ酸の欠失とは、１または２個のアミノ酸の欠失であり、好ましくは１個のアミノ酸の欠失である。より具体的には、例えば、上記（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチドを構成する末端側に位置するアミノ酸を欠失させることを意図する。すなわち、アミノ末端側に位置する１または２個のアミノ酸を欠失させる、カルボキシ末端側に位置する１または２個のアミノ酸を欠失させる、あるいは、アミノ末端側に位置する１個のアミノ酸とカルボキシ末端側に位置する１個のアミノ酸とを欠失させる、ことを意図する。
【００３８】
アミノ酸の付加とは、１または２個のアミノ酸の付加であり、好ましくは１個のアミノ酸の付加である。より具体的には、例えば、上記（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチドを構成する末端側に１または２個のアミノ酸を付加することを意図する。すなわち、アミノ末端側に１または２個のアミノ酸を付加する、カルボキシ末端側に１または２個のアミノ酸を付加する、あるいは、アミノ末端側とカルボキシ末端側とにそれぞれ１個のアミノ酸を付加する、ことを意図する。
【００３９】
上記したアミノ酸の置換、欠失、および／または付加は、公知の方法で行うことができる。公知の方法とは、例えば、Kunkel法等の部位特異的な変異導入法を利用して上記ポリペプチドに所望の変異を導入する方法が挙げられる。あるいは、上記したアミノ酸の置換、欠失、および／または付加をした配列を、ペプチド合成法によって合成することが挙げられる。
【００４０】
本発明におけるポリペプチドは、後述のようにＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとして種々の利用法がある。また、新規なポリペプチドの一例として、以下の（ａ）〜（ｅ）の何れかに示すポリペプチドが挙げられる。なお、これらのポリペプチドは、上述の（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチドに包含されるものである。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３０個以下のアミノ酸からなり、かつ、４１番目〜６０番目のアミノ酸（DQQRLITAIN QTHYNLLNVA）を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３８個以下のアミノ酸からなり、かつ、７１番目〜９０番目のアミノ酸（DWLYIRLGFQ SLCPTINEPC）を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で３９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１５１番目〜１７０番目のアミノ酸（LAPCLIKCLT SRLLKLLRQA）を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１７１番目〜１９０番目のアミノ酸（PLRLSVFAPD TRGAIRYLST）を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列における連続する２０個以上で２９個以下のアミノ酸からなり、かつ、１９１番目〜２１０番目のアミノ酸（LLTLCPATCI LPLGEPFSPN）を含むポリペプチド。
【００４１】
ＣＤ８陽性Ｔ細胞をより活性化させるという観点では、上記（ａ）、（ｄ）および（ｅ）に示すポリペプチドは、それぞれ、２５個以下のアミノ酸からなることが好ましい。上記（ｂ）および（ｃ）に示すポリペプチドは、３０個以下のアミノ酸からなることが好ましく、２５個以下のアミノ酸からなることがより好ましい。
【００４２】
上記（ａ）に示すポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（ｂ）に示すポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列における７１番目〜９０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（ｃ）に示すポリペプチドは、配列番号１に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（ｄ）に示すポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列における１７１番目〜１９０番目のアミノ酸からなることが好ましい。上記（ｅ）に示すポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列における１９１番目〜２１０番目のアミノ酸からなることが好ましい。
【００４３】
また、本発明におけるポリペプチドは、任意の２種類以上の組み合わせ物として提供され得る。組み合わせ物の一例として、（Ａ）、（Ｃ）〜（Ｇ）および（Ｉ）〜（Ｋ）に示すポリペプチドのうちの少なくとも１種類と、（Ｃ）、（Ｆ）および（Ｊ）に示すポリペプチドのうちの少なくとも１種類との組み合わせ物が挙げられる。この組み合わせ物の一例では、感染源となりやすい個体に対する効果が高い上、より幅広いＭＨＣクラスＩＩに対しても効果を有する。
【００４４】
〔２．本発明におけるポリヌクレオチド、ベクター〕
（ポリヌクレオチド）
本発明におけるポリヌクレオチドは、上述の本発明におけるポリペプチドをコードしている。当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、一本鎖または二本鎖である。当該ポリヌクレオチドを構成する塩基の配列は、コードすべきポリペプチドのアミノ酸配列に応じて適宜決定すればよい。
【００４５】
配列番号７は、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。配列番号８は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。配列番号９は、配列番号３に示すアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列を示す。本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列は、例えば、配列番号７に示す塩基配列、配列番号８に示す塩基配列、または配列番号９に示す塩基配列を参照して適宜決定すればよい。
【００４６】
例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号７に示す塩基配列における１２１番目〜１８０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１に示すアミノ酸配列における７１番目〜９０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号７に示す塩基配列における２１１番目〜２７０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号７に示す塩基配列における４５１番目〜５１０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号２に示すアミノ酸配列における１７１番目〜１９０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号８に示す塩基配列における５１１番目〜５７０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号２に示すアミノ酸配列における１９１番目〜２１０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号８に示す塩基配列における５７１番目〜６３０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号１に示すアミノ酸配列における５２番目〜７１番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号７に示す塩基配列における１５４番目〜２１３番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号２に示すアミノ酸配列における１５１番目〜１７０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号８に示す塩基配列における４５１番目〜５１０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号２に示すアミノ酸配列における１８１番目〜２００番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号８に示す塩基配列における５４１番目〜６００番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号３に示すアミノ酸配列における４１番目〜６０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号９に示す塩基配列における１２１番目〜１８０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号３に示すアミノ酸配列における１０１番目〜１２０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号９に示す塩基配列における３０１番目〜３６０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。配列番号３に示すアミノ酸配列における１１１番目〜１３０番目のアミノ酸からなるポリペプチドは、配列番号９に示す塩基配列における３３１番目〜３９０番目の塩基を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４７】
配列番号７〜９に示される塩基配列に限らず、当業者であれば、コドン表を参照することによって、ポリペプチドのアミノ酸配列を容易に決定できる。
【００４８】
上記ポリヌクレオチドは、細胞中または無細胞合成系での転写および／または翻訳を容易とするため、プロモータ、エンハンサ等の調節領域；開始コドンおよび終止コドン；その他の転写および／または翻訳関連配列；が機能可能に付加されていることが好ましい。さらに、必要に応じて、上記ポリヌクレオチドには、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ等の精製用ペプチド配列をコードする配列等が付加されていてもよい。これらの配列が付加された本発明におけるポリヌクレオチドの一例は、後述するベクターに組み込まれた形態のものである。
【００４９】
（ベクター）
本発明におけるベクターは、上述の本発明におけるポリヌクレオチドを含んでいる。１つのベクターに含まれるポリヌクレオチドは、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。また、１つのベクターに同じ種類のポリヌクレオチドが２つ以上含まれていてもよい。本発明におけるベクターは、本発明におけるポリペプチドを産生するために使用される。本発明におけるベクターは、組換え発現に用いる発現ベクターであってもよいし、細胞抽出液等を用いた無細胞ペプチド合成系に用いるベクターであってもよい。
【００５０】
組換え発現に用いる発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、コスミド、またはウイルス等を用いる方法が挙げられるが、特に限定されない。本発明におけるポリヌクレオチドは比較的短いものであるため、プラスミドを用いる方法が好ましい。
【００５１】
組換え発現に用いる発現ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、本発明におけるポリヌクレオチドを発現させるために適当なプロモータ配列等を選択し、これと本発明におけるポリヌクレオチドとを各種プラスミド等に組み込んで発現ベクターを構築すればよい。
【００５２】
発現ベクターは、使用される宿主細胞の種類に応じて、少なくとも１つの選択マーカーを含んでいてもよい。このようなマーカーとしては、宿主細胞が原核細胞の場合は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、および蛍光／発光タンパク質をコードする遺伝子等、が挙げられる。
【００５３】
〔３．本発明における細胞〕
本発明における細胞には、上述の本発明におけるポリヌクレオチドまたは本発明におけるベクターが発現可能に導入されている。１つの細胞に導入されているポリヌクレオチドまたはベクターは、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００５４】
上記の細胞の調製に用いる宿主細胞は、特に限定されないが、例えば、原核細胞（例えば、大腸菌）、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞から選択される何れかが挙げられる。これら宿主細胞のための適切な培養培地および培養条件は当分野で周知である。
【００５５】
本発明における上記ポリヌクレオチド、または上記発現ベクターを宿主細胞等に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、ＰＥＧ法、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、パーティクルガン法、およびアグロバクテリウム法（植物細胞に限る）等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明におけるポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【００５６】
〔４．本発明におけるポリペプチドの用途の例示〕
（ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤、およびその具体的用途）
本発明におけるポリペプチドは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとして同定されたものであり、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させる働きがある。そのため、本発明におけるペプチドの用途の一態様は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤である。ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤の一態様では、本発明における少なくとも１種類のポリペプチドを有効成分（ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化成分）として含んでいる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤の別の態様では、本発明におけるポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を有効成分として含んでいる。ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を有効成分として含んでいる場合、これらから産生されたポリペプチドが、上述の効果を発揮する。
【００５７】
本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、必要に応じて、薬学的に許容可能な担体、当該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を安定化させる安定化剤、酸化防止剤、および／またはアジュバンド等を含む組成物であってもよい。上記担体としては、炭酸アパタイト粒子を用いることが好ましい。本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化を増強する目的で、本発明におけるポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞以外の他のＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化成分をさらに含む組成物であってもよい。
【００５８】
本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、特にウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させる。好ましくは、ウシおよび／またはスイギュウのＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させる。より好ましくは、ウシのＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させる。なお、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウ以外の動物のＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させ得る。そのような動物としては、例えば、マウス、ヒツジ、ヤギ、ブタ、霊長類、およびヒト等が挙げられる。
【００５９】
本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、有効成分であるポリペプチド、またはポリヌクレオチド、ベクターもしくは細胞から産生されたポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩに結合して細胞表面に提示され、ポリペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体がＣＤ８陽性Ｔ細胞により認識された後、ＭＨＣクラスＩに結合し、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化することが好ましい。
【００６０】
本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、例えば、牛白血病発症に対して感受性を有する個体において特異的に効果を示すものであることが好ましく、ＤＲＢ３＊１６０１型のＭＨＣクラスＩＩを有する個体において特異的に効果を示すものであることがより好ましい場合がある。あるいは、牛白血病発症に対して感受性を有する個体だけでなく、牛白血病発症に対して抵抗性を有する個体（例えば、ＤＲＢ３＊０７０１型、ＤＲＢ３＊１４０１１型、およびＤＲＢ３＊１１０１型等のＭＨＣクラスＩＩを有する個体）、および／または抵抗性・感受性の何れも有さない個体（例えば、ＤＲＢ３＊１５０１型、ＤＲＢ３＊２７０３型、およびＤＲＢ３＊０５０３型等のＭＨＣクラスＩＩを有する個体）においても幅広く効果を示すものであることが好ましい場合がある。
【００６１】
本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤のより具体的な用途は特に限定されないが、例えば、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）への感染を予防するため、牛白血病の発症を抑制するため、牛白血病の進行を遅らせるため、または牛白血病の症状を低減するために用いられ、その形態は例えばワクチンまたは治療薬等の材料であり得る。適用しうる動物個体としては、ウシ、コブウシ、スイギュウ、ヒツジ、およびヤギ等が挙げられる。また、本発明に係るＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、研究用試薬として利用することもできる。
【００６２】
本発明におけるポリペプチド（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤）をインビボで用いる場合、動物個体に対して、経口投与、静脈内もしくは動脈内への血管内投与、または腸内投与等の手法によって全身投与してもよいし、経皮投与、または舌下投与等の手法によって局所投与してもよい。経口投与の場合、ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤を含んでいる飼料として投与することができる。動物個体は牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染しているものであってもよいし、感染していないものであってもよい。
【００６３】
本発明におけるポリペプチドあるいはＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤の別の態様では、ＤＮＡワクチンまたはベクターワクチンの形態とすることもできる。ＤＮＡワクチンの形態であるＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、本発明におけるポリヌクレオチドを含んでいる。また、ベクターワクチンの形態であるＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤は、本発明におけるベクターを含んでいる。これらのＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤では、当該ＣＤ８陽性Ｔ細胞活性化剤が適用された細胞または動物個体において本発明におけるポリペプチドが産生され、上述の効果を発揮する。
【００６４】
（ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化方法）
本発明はまたＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化方法を提供する。当該活性化方法は、活性化の対象となるＣＤ８陽性Ｔ細胞に、本発明におけるポリペプチドを接触させることによって、好ましくは本発明におけるポリペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体を接触させることによって、当該ＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化させる。すなわち、当該活性化方法の一態様は、活性化の対象となるＣＤ８陽性Ｔ細胞に、本発明における少なくとも１種類のポリペプチドを接触させる、好ましくは本発明におけるポリペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体を接触させる工程を含んでいる。「接触」は、インビボで行ってもよいし、インビトロで行ってもよい。対象となる動物としては、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウの他、マウス、ヒツジ、ヤギ、ブタ、霊長類、およびヒト等が挙げられる。２種類以上のポリペプチド（組み合わせ物）を接触させる場合、当該２種類以上のポリペプチドは同時に接触させてもよいし、逐次的に接触させてもよい。
【００６５】
なお、「ポリペプチドを接触させる」とは、ポリペプチドを直接ＣＤ８陽性Ｔ細胞に接触させること、および、ポリペプチドを抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ／単球、またはＢ細胞等）またはほとんどの有核細胞に発現するＭＨＣクラスＩと結合させた状態で（すなわち、ポリペプチドとＭＨＣクラスＩ分子との複合体を）ＣＤ８陽性Ｔ細胞に接触させることを包含する。「接触」は、ポリペプチドの少なくとも一部におけるものであってもよい。また、「活性化」とは、ＣＤ８陽性Ｔ細胞を細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）へ分化させること、分化した細胞傷害性Ｔ細胞を増殖させること、分化した細胞傷害性Ｔ細胞に感染細胞を攻撃させること、および分化した細胞傷害性Ｔ細胞を記憶Ｔ細胞に分化させる等のうちの少なくとも１つを指す。ＣＤ８陽性Ｔ細胞が活性化したか否かは、例えば、増殖速度、インターフェロンγ等のサイトカインの産生、または細胞表面に発現している分子の種類等を指標にして判断することができる。また、接触させるポリペプチドは、ポリヌクレオチドまたはベクターから産生されたものであってもよい。
【００６６】
また、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化方法の別の態様は、本発明における少なくとも１種類のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を動物個体に投与する工程を含む、動物個体におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞を活性化する方法である。適用しうる動物個体および投与方法は、上述のとおりである。２種類以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を投与する場合、２種類以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞は同時に投与してもよいし、逐次的に投与してもよい。すなわち、組み合わせ物は、同時に投与される形態であっても、逐次的に投与される形態であってもよい。
【００６７】
（牛白血病の予防または治療のための薬剤およびその利用）
本発明はまた牛白血病の予防または治療のための薬剤を提供する。本発明に係る薬剤は、本発明における少なくとも１種類のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含んでいる。当該ポリペプチド、または当該ポリヌクレオチド、当該ベクターもしくは当該細胞から発現されるポリペプチドが有効成分として働く。ポリペプチドとしては、例えば、（ａ）〜（ｅ）の何れかに示すポリペプチド、ならびに、これらポリペプチドにおいて、１もしくは２個のアミノ酸が置換もしくは付加されてなる、および／または、末端側に位置する１もしくは２個のアミノ酸が欠失されてなり、ウシ、コブウシ、および／またはスイギュウのＣＤ８陽性Ｔ細胞エピトープとなるポリペプチドが挙げられる。あるいは、（Ａ）〜（Ｋ）の何れかに示すポリペプチドであり得る。
【００６８】
本発明に係る薬剤は、一実施形態において、治療を目的として、牛白血病に罹患した個体に対して投与される。適用しうる動物個体および投与方法は、上述のとおりである。「治療」の一側面には、牛白血病に関連する少なくとも１つの症状について軽減もしくは緩和すること、進行を遅延すること、および治癒すること等が包含される。また、本発明に係る薬剤は、別の実施形態において、予防を目的として牛白血病に罹患していない個体に対して投与される。「予防」の一側面には、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）への感染を防止すること、および牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に感染した際の発症を防止すること等が包含される。
【００６９】
本発明に係る薬剤では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化によって、牛白血病の予防または治療が達成される。
【００７０】
本発明はまた、上記薬剤を動物個体に投与する工程を含む牛白血病の予防または治療方法を提供する。適用しうる動物個体および投与方法は、上述のとおりである。
【００７１】
（その他の応用）
本発明におけるポリペプチドによるワクチンの開発は、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）と類似性の高い成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）に対するワクチンの開発に、有用な情報を与えうる。
【００７２】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【００７３】
〔材料と方法〕
＜実験動物＞
ウシ白血球抗原（ＢｏＬＡ）−ＤＲＢ３＊１６０１アレルは、黒毛和種において、高ＢＬＶプロウイルスロードに関係していることが知られている（文献：Miyasaka et al. 2013）。また、ＤＲＢ３＊１５０１アレルは、黒毛和種において感受性に関係することが見出されており、ＤＲＢ３＊２７０３はホルスタイン種において、抵抗性に関係することが見出されている（文献：Tatsuyuki Yoshida et al. 2012）。本実験では、ＢＬＶに感染した４頭の黒毛和種（全て約６〜７ヶ月齢）を用いた。用いた黒毛和種のＢｏＬ−ＤＲＢ３のアリルは、感受性ウシ２頭（「Ｓ２」および「Ｓ４」と称する）が共にＤＲＢ３＊１６０１／１６０１、中立牛（感受性でも抵抗性でのない）１頭（「Ｎ１」と称する）がＤＲＢ３＊１５０１／２７０３、中立牛１頭（「Ｎ２」と称する）がＤＲＢ３＊１５０１／０５０３であった。
【００７４】
＜ＰＢＭＣ（末梢血単核球）およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の調製＞
凝固因子として適切なヘパリンを用いた頸静脈注射によって静脈血を回収した。この静脈血をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）で２倍希釈し、LymphoprepTM（１．０７７±０．００１ｇ／ｍＬ）に３：１で重層し、室温、２２００ｒｐｍで３０分間遠心した。軟膜リンパ球単核細胞層を境界面から回収し、ＰＢＳで３〜４回洗浄した（１６００ｒｐｍ、５分間）。１０％ＲＰＭＩ １６４０培地を含む熱失活させたウシ胎児血清（ＦＣＳ）に細胞を懸濁した。ＰＢＭＣを２０μＬの抗ウシＣＤ８αモノクローナル抗体（クローン７Ｃ２Ｂ）と共に４℃で６０分間回転させながらインキュベートした。インキュベート後、磁石抗体細胞ソーキング（ＭＡＣＳ）バッファーで２回洗浄し、２０μＬの抗マウスＩｇＧマイクロビーズを添加して、４℃で１５分間回転させながらインキュベートした。ＣＤ８陽性Ｔ細胞をＭＡＣＳ ＬＳカラムを用いて分離した。ＣＤ８陽性Ｔ細胞を取り除いたＰＢＭＣをＣＤ８陰性Ｔ細胞として次の実験に用いた。
【００７５】
＜合成ペプチド＞
GenBankデータベースから取得した、ｐ１５（配列番号４）、ｐ２４（配列番号５）、ｐ１２（配列番号６）、ｇｐ３０（配列番号１）、ｇｐ５１（配列番号３）、およびｔａｘ（配列番号２）のアミノ酸配列に基づいて候補ペプチドを設計し、シグマ社の受託ペプチド合成により合成した。なお、ｐ１５、ｐ２４およびｐ１２は、ＢＬＶのＧａｐ領域にある。純度は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって決定した。候補ペプチドを８０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に再懸濁し、ストック溶液（２ｎＭ）として分けて、−２０℃で保存した。１１５個の候補ペプチドは、長さが１５、１８、１９および２０アミノ酸であり、１０アミノ酸ずつオーバーラップさせた。５個の候補ペプチドを含んでいるペプチドプール（各ペプチドの最終濃度は４００μＭ）を２３個作製した。各候補ペプチドの具体的な配列およびペプチドプールは、図１に示すとおりである。なお、ｇｐ３０Ｎ２１は、配列番号１に示すアミノ酸配列における１９５〜２１０番目のアミノ酸の後ろに配列「RPCP」を付加したものである。ｇｐ５１Ｎ２７は、配列番号３に示すアミノ酸配列における２６２〜２６８番目のアミノ酸の後ろに配列「SDAPPTRVRRSDS」を付加したものである。
【００７６】
＜ＷＳＴアッセイによるＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖試験＞
５０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（シグマ社製）および熱失活させたＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ １６４０培地でＣＤ８陰性Ｔ細胞を３７℃で６０分間処理することによって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を調製した。ＰＢＳで５回洗浄した後、細胞をＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。ＡＰＣ（２×１０６個）およびＣＤ８陽性Ｔ細胞（２×１０６個）を、５．５μＬのペプチドプールまたは同量の８０％ＤＭＳＯ（ネガティブコントロール）と共に、９６ウェル平底マイクロプレート（シグマ社製）中でインキュベートした（全量１１０μＬのＲＰＭＩ １６４０培地）。プレートは５％ＣＯ２、加湿雰囲気下、３７℃でインキュベートした。１１９時間インキュベートした後、各ウェルに１０μＬのcell count kit-8溶液を添加した。cell count kit-8溶液は、組織培養培地に可溶であり、細胞内のデヒドロゲナーゼ活性によって還元されて、黄色ホルマザン染色を与える。細胞内のデヒドロゲナーゼ活性によって生成したホルマザン染色の量は、生細胞数に正比例する。細胞を同じ条件において４時間インキュベートした。合わせて１１３時間インキュベートした後、マイクロプレートについて４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を測定した。上記のように、ＡＰＣ（２×１０６個）およびＣＤ８陽性Ｔ細胞（２×１０６個）を陽性ペプチドプールの各候補ペプチド（４０μｇ／ｍＬ）１．１μＬを用いて刺激した。全ての試験は３回行った。
【００７７】
＜非放射性細胞毒性アッセイ＞
非放射性細胞毒性アッセイは、５１Ｃｒ放出細胞毒性アッセイの比色定量代替アッセイである。非放射性細胞毒性アッセイでは、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を定量的に測定する。ＬＤＨは、細胞溶解に伴って放出される安定なサイトゾルの酵素である。培養上清中に放出されたＬＤＨを酵素学的アッセイ（テトラゾリウム塩（ＩＮＴ）が赤色ホルマザン生成物へと転換する）に３０分間供して測定した。形成された色量は溶解した細胞数に比例する。
【００７８】
５０μＬのエフェクター細胞（ＣＤ８陽性Ｔ細胞，各エフェクター細胞濃度において）を、１．１μＬの候補ペプチドを含む実験ウェルに添加した。また、エフェクター細胞自発的放出ＬＤＨコントロールとして候補ペプチドを含まないものを用意した。５０μＬのターゲット細胞（ＰＢＭＣ，５０μＬに１×１０６個）をターゲット細胞自発的放出ＬＤＨコントロールと、実験ウェルに添加した。１００μＬの培養培地を体積較正コントロールおよび培養培地バックグラウンドコントロールとして添加し、１０μＬの溶解溶液（１０×）を体積較正コントロールとして添加した。９６ウェル丸底プレートを１０００ｒｐｍ（２５０×ｇ）で４分間遠心し、３７℃で４８時間インキュベートした。遠心の４５分前に、１０μＬの溶解溶液（１０×）をターゲット細胞最大放出ＬＤＨコントロールに添加した。インキュベート後、全てのウェルから５０μＬを取り出し、新しい９６ウェル（酵素学的アッセイ）プレートに移し、プレートの各ウェルに５０μＬの再構成した基質混合物を添加した。プレートをホイルで覆って遮光し、室温で３０分間インキュベートした後、各ウェルに５０μＬのストップ溶液を添加した。ストップ溶液の添加から４５分後に、４９２ｎｍの吸光度を記録した。
【００７９】
結果は、細胞毒性＝［（実験−培養培地バックグラウンド）−（エフェクター自発的−培養培地バックグラウンド）−（ターゲット自発的−培養培地バックグラウンド）］／［（ターゲット最大−体積較正コントロール）−（ターゲット自発的−培養培地バックグラウンド）］×１００（％）として表した。各アッセイにおけるエフェクター細胞：ターゲット細胞（ＥＣ：ＴＣ）比は、０．３１：１、０．６２５：１、１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１および２０：１とした。細胞毒性の最大パーセンテージは、Ｎ１では１０：１の場合にみられ、他の３頭では２０：１の場合にみられた。したがって、全てのデータは、種々の濃度のペプチド（０、１、１０、４０μｇ／ｍＬ）で、ＥＣ：ＴＣ比を１０：１または２０：１として、非放射性細胞毒性アッセイを行った。
【００８０】
＜ＰＣＲ−ＳＢＴによるＢｏＬＡ−ＤＱＡ１タイピング＞
ＢｏＬＡ−ＤＱＡ１アレルを、文献：Takeshima et al., 2007. T. Miyasaka et al., 2011の記載に従ってタイピングした。簡単に述べると、プライマー対DQA1 intL2およびDQA1-667R（増幅の第１段階用）、ならびに、DQA1 intL3およびQA1ex2REV2.1（増幅の第２段階用）をｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲによって行った。第２のＰＣＲ産物をExoSAP-IT PCR product purification kit（USB Crop.製）を用いて精製した。配列データをAssign 400ATF ver. 1.0.2.41 software（Conexio Genomics製）を用いて解析した。
【００８１】
＜統計学的解析＞
Wu-Kabat変動指数を、（所定の位置における異なるアミノ酸の数）／（当該所定の位置における最も一般的なアミノ酸の頻度）として算出した（文献：Tai Te Wu, PhD, and Elvin A. Kabat, Ph.D. 1970）。
【００８２】
＜その他の手順＞
４頭（Ｎ１、Ｎ２、Ｓ２およびＳ４）のＢＬＶプロウイルスロードを、BLV-CoCoMo-qPCR法（文献：Jimba M. et al. 2010）を用いて、１つの時点で測定した。抗ＢＬＶ抗体酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（JNC Inc.製）を用いて、使用説明書に従って抗ＢＬＶ抗体を検出した。ＢｏＬＡ−ＤＲＢ３アレルを、文献：T. Miyasaka et al., 2011に記載のようにタイピングした。
【００８３】
〔結果〕
ペプチドプールを用いた増殖試験の結果を図２に示す。（ａ）は感受性牛Ｓ２、（ｂ）は感受性牛Ｓ４、（ｃ）は中立牛Ｎ１、（ｄ）は中立牛Ｎ２の細胞を用いたものである。グラフ中の「conA」はコンカナバリンＡ（最終濃度５μｇ／ｍＬ）を用いたポジティブコントロールである。
【００８４】
次いで、ペプチドプールの中で細胞増殖の大きかったペプチドプールを中心に、候補ペプチド毎に再度スクリーニングを行った。その結果を図３に示す。
【００８５】
種々のＥＣ：ＴＣ比で行った非放射性細胞毒性アッセイ（予備実験的）の結果を図４に示す。この結果を用いて、各候補ペプチドの非放射性細胞毒性アッセイでの細胞比を決定した。
【００８６】
細胞増殖誘導能がみられた候補ペプチドについて、種々のペプチド濃度で非放射性細胞毒性アッセイを行った結果を図５に示す。感受性牛Ｓ２では、ｔａｘ１６、ｔａｘ１８、ｔａｘ２０、ｇｐ３０Ｎ６、ｇｐ５１Ｎ５、ｇｐ５１Ｎ１１およびｇｐ５１Ｎ１２がＣＤ８エピトープとして同定された。感受性牛Ｓ４では、ｇｐ３０Ｎ５、ｇｐ３０Ｎ６、ｇｐ５１Ｎ１１およびｇｐ３０Ｎ１６がＣＤ８エピトープとして同定された。中性牛Ｎ１では、ｇｐ３０Ｎ１６およびｇｐ５１Ｎ１１がＣＤ８エピトープとして同定された。中性牛Ｎ２では、ｇｐ３０Ｎ６、ｇｐ３０Ｎ８、ｇｐ５１Ｎ１１、ｇｐ５１Ｎ１２およびｔａｘ１９がＣＤ８エピトープとして同定された。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明におけるポリペプチド等は、牛白血病ウイルス（ＢＬＶ）に対するワクチン製造の材料として利用し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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