(57)【要約】    【課題】大きさや形状に関わらず人工軟骨を形成することのできる人工軟骨形成用基材の提供。    【解決手段】人工軟骨形成用基材１を中空状とすると共に、小孔１１を形成する。基材内部に軟骨細胞２を収容する。人工軟骨形成用基材１を生体組織材料の存在する環境下におく。小孔１１から基材内部に結合組織４及び血管が侵入する。外部から基材内部への養分や酸素の供給路が確保される。基材内部に軟骨の培養環境が構成される。軟骨細胞２を失うことなく、基材内部に保持して、人工軟骨３を形成することができる。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工軟骨を形成するための基材であって、基材内部に軟骨細胞を収容可能とされると共に、生体組織材料の存在する環境下におくことにより、基材内部に軟骨の培養環境を構成する中空状とされ、前記環境下から基材内部に結合組織及び血管を侵入させる侵入口が形成されたことを特徴とする人工軟骨形成用基材。
【請求項２】
基材内部が人工軟骨を所定の形状に形成する鋳型として兼用されることを特徴とする請求項１に記載の人工軟骨形成用基材。
【請求項３】
基材内部は、その空間の最小寸法が２ｍｍ〜１０ｍｍに設定されたことを特徴とする請求項１又は２に記載の人工軟骨形成用基材。
【請求項４】
前記侵入口は、複数の小孔とされたことを特徴とする請求項１、２又は３に記載の人工軟骨形成用基材。
【請求項５】
前記侵入口は、総開口面積を基材内面の総面積の５％〜２０％に設定されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の人工軟骨形成用基材。
【請求項６】
前記侵入口は、基材の内部空間を挟んで対抗する一対の面にのみ形成されたことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の人工軟骨形成用基材。
【請求項７】
結合組織から形成されたことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の人工軟骨形成用基材。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の基材を用いて形成されたことを特徴とする人工軟骨。
【請求項９】
中空状の基材の内部に軟骨細胞を収容する収容工程と、軟骨細胞を収容した前記基材を生体組織材料の存在する環境下におく設置工程と、前記基材の周囲に結合組織を形成しつつ前記軟骨細胞を基に基材内部に軟骨組織を形成する軟骨組織形成工程と、前記環境下から結合組織で被覆された前記基材を取り出す取り出し工程と、前記基材内部から軟骨組織を基材及び結合組織から剥離して人工軟骨として取り出す分離工程と、を備え、
前記軟骨組織形成工程では、前記基材に形成された侵入口から基材内部に結合組織及び血管を侵入させることにより、基材内部に軟骨の培養環境を構成することを特徴とする人工軟骨の生産方法。
【請求項１０】
前記収容工程において、基材内部に軟骨細胞を分散させつつ含有するゲル体を収容することを特徴とする請求項９に記載の人工軟骨の生産方法。
【請求項１１】
前記収容工程において、基材内部に軟骨細胞の凝集体を収容することを特徴とする請求項９又は１０に記載の人工軟骨の生産方法。
【請求項１２】
生体から軟骨組織を採取し、該軟骨組織から軟骨細胞を分離して前記基材に収容し、前記設置工程において、軟骨組織を採取したのと同一の生体に前記基材を埋設することを特徴とする請求項９、１０又は１１に記載の人工軟骨の生産方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれかに記載の生産方法によって生産されたことを特徴とする人工軟骨。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工軟骨を形成するための人工軟骨形成用基材に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に、軟骨は、人体等の骨格におけるクッション材などとして機能する部位であり、その軟骨組織は、軟骨細胞の周囲をアグリカン（プロテオグリカン）と２型コラーゲンとからなる軟骨基質（細胞外マトリックス）が満たした構造となっている。
【０００３】
軟骨組織は、内部に血管が存在せず、組織に染み込むわずかな養分や酸素を供給されるだけであり、その分、他の組織よりも増殖しにくく、軟骨が損傷を受けた場合の自己修復能力が乏しい。このような軟骨は、一旦損傷を受けると治り難いため、軟骨の損傷部位に移植可能なよう、培養などによって、本来の軟骨と同じ構造の組織からなる人工軟骨を形成する技術が求められている。
【０００４】
ただ、軟骨細胞については、培養して増殖させる技術が既に得られているものの、その周囲の軟骨基質を含めた軟骨組織は、わずかな養分や酸素が染み込んだ程度の低酸素状態が良好な状態であり、培養環境を適切に整えるが難しく、軟骨細胞を培養によって軟骨組織化させることが困難である。
【０００５】
また、損傷した軟骨の治療方法として、自家骨軟骨片を採取して移植する方法（自家骨軟骨移植法）や、細胞分離した軟骨細胞を増殖させて細胞移植する方法（自家軟骨細胞移植法）などが考えられるが、軟骨の採取量の制限、正常な組織の損傷、感染リスク、高コストなどの問題を生じるおそれがある。
【０００６】
これに対して、非特許文献１には、軟骨を有する人工気管を形成する技術として、動物から採取した軟骨細胞を不織網に付着させてマンドレルの全周に巻き付け、これを動物の体内に埋設することにより、不織網に付着させた軟骨細胞を基に軟骨を生成する方法が開示されている。すなわち、非特許文献１には、動物の体内が軟骨組織の培養環境として好適であることに着目し、軟骨細胞を体内に埋設することにより、軟骨組織を培養する方法が開示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＫＯＪＩ  ＫＯＪＩＭＡ等著、「Ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｒａｃｈｅａ  ｕｓｉｎｇ  ｓｈｅｅｐ  ｎａｓａｌ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」、２００３年５月発行、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．１７，第８２３頁〜第８２８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ところが、非特許文献１の方法は、軟骨細胞を付着させた不織網をマンドレルの全周に巻き付けて体内に埋設し、人工気管の全体を構成する比較的に大形の軟骨を形成するものであり、同様の方法で、軟骨の損傷部位に移植するだけの小形の軟骨を形成しようとすると、軟骨細胞が体内で移動したり、そのまま体内に吸収されたりするおそれがある。
【０００９】
本発明は、大きさや形状に関わらず人工軟骨を形成することのできる人工軟骨形成用基材の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明に係る人工軟骨形成用基材は、人工軟骨を形成するためのものであり、基材内部に軟骨細胞を収容可能とすると共に、生体組織材料の存在する環境下におくことにより、基材内部に軟骨の培養環境を構成する中空状とし、前記環境下から基材内部に結合組織及び血管を侵入させる侵入口を形成したものである。
【００１１】
上記構成によれば、軟骨細胞を収容する中空状の基材に侵入口を形成するので、基材を生体組織材料の存在する環境下におくことにより、基材の周囲に結合組織を形成して、その結合組織及び血管を基材内部にまで侵入させることができる。
【００１２】
つまり、上記「環境下」が例えば人体や動物の体内である場合、その深い位置に異物が侵入すると、その周りに繊維芽細胞が集まってきて、主に繊維芽細胞とコラーゲンからなる結合組織体のカプセルを形成して異物を覆うことにより、体内において隔離しようとする。このような反応を利用して、基材を上記「環境下」におくことにより、基材の周囲に生細胞を用いた結合組織を形成することができ、その結合組織と共に血管を基材内部にまで侵入させることができる。
【００１３】
このように結合組織及び血管を基材内部に侵入させることにより、基材内部に軟骨細胞を保持したまま、外部から基材内部への養分や酸素の供給路を確保し、基材内部を結合組織の存在する生体内と類似した環境にして、軟骨の培養環境を構成することができる。これにより、基材内部において、軟骨細胞の周囲に適切な量の養分や酸素を染み込ませて、軟骨細胞に軟骨基質を産生させ、軟骨細胞の周囲に軟骨基質が満たされた人工軟骨を形成することができる。
【００１４】
ここで、「結合組織」とは、通常は、コラーゲンを主成分とする組織であって、生体内に形成される組織のことをいうが、本明細書及び特許請求の範囲の記載においては、生体内に形成される結合組織に相当する組織が生体外の環境下で形成される場合のその組織をも含む概念である。
【００１５】
また、「生体組織材料」とは、所望の生体由来組織を形成するうえで必要な物質のことであり、例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の動物細胞、各種たんぱく質類（コラーゲン、エラスチン）、ヒアルロン酸等の糖類、その他、細胞成長因子、サイトカイン等の生体内に存在する各種の生理活性物質が挙げられる。この「生体組織材料」には、ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類動物、鳥類、魚類、その他の動物に由来するもの、又はこれと同等の人工材料が含まれる。
【００１６】
また、「生体組織材料の存在する環境下」とは、動物（ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類動物、鳥類、魚類、その他の動物）の生体内（例えば、四肢部、肩部、背部又は腹部などの皮下、もしくは腹腔内への埋入）、又は、動物の生体外において、生体組織材料を含有する人工環境内を表す。
【００１７】
さらに、基材内部を、人工軟骨を所定の形状に形成する鋳型として兼用するようにしてもよい。この構成によれば、基材内部を所定の形状に設定することにより、例えば患者の軟骨の欠損部に対応する形状の人工軟骨を形成することができるので、人工軟骨を形成した後で、所定の形状に整える作業を省略することができ、基材を極力小形化して、例えば体内に基材を埋設する患者の負担を小さくすることができる。
【００１８】
また、基材内部の空間の最小寸法を２ｍｍ〜１０ｍｍに設定するようにしてもよい。この構成によれば、人工軟骨を形成するのに要する十分な大きさを確保すると共に、軟骨細胞の周囲に適切な量の養分や酸素を染み込ませて供給することができる。
【００１９】
ここで、基材内部の空間の最小寸法とは、基材の内部空間の任意の一点について、この点を通るあらゆる方向に測った寸法のうちの最小の寸法をいい、例えば、基材の内部空間が薄形の円柱形である場合、その全領域において、円柱形状の高さ方向に測った寸法が最小寸法である。この最小寸法は、基材の内部空間の各点について定まり、したがって、例えば、内部空間が先細形状である場合、その先端部分においては、最小寸法が１ｍｍ以下であり人工軟骨を形成することができないが、基端部分においては、最小寸法が２ｍｍ以上であり人工軟骨を形成することができるということがあり得る。
【００２０】
なお、基材の内部空間は、人工軟骨を形成できる環境であれば、上記の最小寸法の範囲に限定されるものではないが、最小寸法が１ｍｍ以下であると、結合組織が侵入することによって、人工軟骨を形成するスペースがなくなる場合があり、最小寸法が１１ｍｍ以上であると、人工軟骨を形成する空間の全体に適切な量の養分や酸素を染み込ませて供給することができない場合がある。
【００２１】
また、侵入口を複数の小孔とするようにしてもよい。この構成によれば、小孔を外部から基材内部に結合組織及び血管が侵入可能な程度の大きさに設定し、基材内面に分散させて配置することができ、基材内部に極力均一に結合組織及び血管を侵入させると共に、基材内部に均一に養分や酸素を供給することができる。なお、侵入口は、小孔の代わりに、スリットなどの他の形状であってもよい。
【００２２】
また、侵入口の総開口面積を基材内面の総面積の５％〜２０％に設定するようにしてもよい。この構成によれば、基材内部に適度な結合組織及び血管を侵入させて、基材内部に、好適な軟骨の培養環境を構成することができる。
【００２３】
なお、侵入口の開口率（基材内面の総面積に対する総開口面積の比率）は、人工軟骨を形成できる環境であれば、上記の開口率の範囲に限定されるものではないが、開口率が４％以下であると、結合組織及び血管を十分に侵入させることができず、基材内部に適切な量の養分や酸素を供給できない場合があり、開口率が２１％以上であると、結合組織が過度に侵入して、人工軟骨を形成するスペースがなくなる場合がある。
【００２４】
また、侵入口を基材の内部空間を挟んで対抗する一対の面にのみ形成するようにしてもよい。この構成によれば、例えば薄形円柱形の基材の上下面のみに侵入口を形成するので、基材の製造を容易にすることができ、特に、３次元プリンターを用いて基材を製造する場合には、基材形成に要する時間を短くすることができ、好適である。
【００２５】
また、上記の基材を結合組織から形成するようにしてもよい。この構成によれば、例えば体内で結合組織からなるバイオチューブを形成して、これに侵入口を形成して人工軟骨形成用基材として用いるので、基材内部をより体内環境に類似する好適な軟骨組織の培養環境とすることができる。
【００２６】
また、本発明は、上記の基材を用いて形成した人工軟骨を提供する。この構成によれば、上記の基材の構成を採用することによる効果と同じ効果を奏することができる。
【００２７】
また、本発明は、中空状の基材の内部に軟骨細胞を収容する収容工程と、軟骨細胞を収容した基材を生体組織材料の存在する環境下におく設置工程と、基材の周囲に結合組織を形成しつつ軟骨細胞を基に基材内部に軟骨組織を形成する軟骨組織形成工程と、前記環境下から結合組織で被覆された基材を取り出す取り出し工程と、基材内部から軟骨組織を基材及び結合組織から剥離して人工軟骨として取り出す分離工程と、を備え、その軟骨組織形成工程では、基材に形成された侵入口から基材内部に結合組織及び血管を侵入させることにより、基材内部に軟骨の培養環境を構成するようにした人工軟骨の生産方法を提供する。
【００２８】
すなわち、本発明に係る生産方法は、生体内が軟骨組織の培養環境として好適であることに着目したものであり、基材内部に軟骨細胞を保持すると共に、結合組織及び血管を侵入口から基材内部に侵入させて、基材内部を軟骨組織の培養に好適な生体内と類似した環境に設定し、この基材内部で軟骨細胞を基に軟骨組織を培養して人工軟骨を得ようとするものである。
【００２９】
この構成によれば、中空状の基材内部に軟骨細胞を収容して、生体組織材料の存在する環境下におくことにより、基材内部に培養環境を構成して軟骨組織を形成するので、生体内などの前記環境下で軟骨細胞が移動したり、そのまま生体内などに吸収されたりするのを防止することができる。これにより、例えば、軟骨の損傷部位に移植するだけの小形の人工軟骨を形成することができ、目的とする大きさや形状に関わらず人工軟骨を形成することができる。
【００３０】
また、収容工程において、基材内部に、軟骨細胞を分散させつつ含有するゲル体を収容するようにしてもよい。この構成によれば、軟骨細胞をゲル体に分散させて基材内部に収容するので、軟骨細胞を基材内部に均一に分散させることができ、均一な軟骨組織を得ることができる。なお、軟骨細胞は、ゲル体に含有させて基材に収容するだけでなく、基材内面に直接接着するなど、種々の方法によって基材内部に収容することができ、ゲル体を用いた上記の方法と同様の効果を奏することができる。
【００３１】
また、収容工程において、基材内部に軟骨細胞の凝集体を収容するようにしてもよい。この構成によれば、軟骨細胞をその多数を集めて固めた凝集体（スフェロイド）にするので、軟骨細胞をある程度の大きさとして取り扱うことができ、例えば、基材内面に直接接着する場合など、その取り扱いを容易にすることができる。しかも、軟骨細胞の凝集体は、細胞単体のものよりも軟骨に分化しやすいので、ゲル体に含有させて基材内部に収容する形態や、基材内面に直接接着するなどして基材内部に収容する形態のいずれの形態においても好適である。
【００３２】
また、生体から軟骨組織を採取し、この軟骨組織から軟骨細胞を分離して基材に収容し、設置工程において、軟骨組織を採取したのと同一の生体に基材を埋設するようにしてもよい。
【００３３】
この構成によれば、基材に収容する軟骨細胞を分離する元の生体と、軟骨細胞を軟骨組織に培養する環境を構成するための生体と、を同一の生体とするので、免疫システムによる拒絶反応が生じにくい軟骨についてであるが、その拒絶反応の可能性をなくすことができる。さらに、軟骨は、他の組織と比較して他家移植が容易な組織であるが、同一の生体に人工軟骨を移植すること（自家移植）により、移植による拒絶反応の可能性をなくすこともできる。なお、生体から軟骨細胞を分離するだけでなく、ｉＰＳ細胞や幹細胞から分化誘導した軟骨細胞、あるいは、軟骨細胞に分化する前の幹細胞を用いるようにしてもよい。
【００３４】
また、本発明は、上記の生産方法によって生産した人工軟骨を提供する。この構成によれば、上記の人工軟骨の生産方法の構成を採用することによる効果と同じ効果を奏することができる。
【発明の効果】
【００３５】
上記のとおり、本発明によると、生体内が軟骨組織の培養環境として好適であることに着目し、中空状の基材を生体組織材料の存在する環境下に設置して、結合組織及び血管を侵入口から基材内部に侵入させることにより、基材内部を軟骨組織の培養に好適な生体内と類似した環境に設定するようにしている。
【００３６】
この中空状の基材内部に軟骨細胞を収容することにより、生体内などの前記環境下で軟骨細胞が移動したり、そのまま生体内などに吸収されたりするのを防止しつつ、基材内部で軟骨細胞を基に軟骨組織を培養して人工軟骨を得ることができる。これにより、例えば、軟骨の損傷部位に対応する大きさの小形の人工軟骨を形成することができるなど、目的とする大きさや形状に関わらず人工軟骨を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明に係る人工軟骨形成用基材の斜視図で、（ａ）は蓋を閉じた状態を示し、（ｂ）は蓋を開いた状態を示す
【図２】人工軟骨の生産方法を説明する図
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明に係る人工軟骨形成用基材を実施するための形態について、図面を用いて説明する。
【００３９】
図１に示すように、人工軟骨形成用基材１は、基材内部に軟骨細胞２を収容して人工軟骨３を培養形成するためのものであり、生体内などの生体組織材料の存在する環境下におくことにより、基材内部に血管を含む結合組織４を侵入させて、基材内部に軟骨の培養環境を構成する中空状とされる。
【００４０】
この人工軟骨形成用基材１は、円筒部５及び底部６を有する基材本体７と円盤状の蓋部８とからなり、基材本体７に蓋部８を装着することにより、基材内部に円柱形の内部空間９を構成し、その内部空間９に、例えば軟骨細胞２を分散させたアテロコラーゲンやゼラチンなどのゲル体１０が充填される。
【００４１】
人工軟骨形成用基材１の材質としては、アクリルやシリコーンなどの医療分野に用いられる汎用性プラスチックを採用することができ、さらに、それ以外にも、ガラスやセラミックス、金属などを採用することができる。なお、人工軟骨形成用基材１を合成樹脂製とすることにより、３次元プリンターを用いて人工軟骨形成用基材１を形成することができ、好適である。
【００４２】
内部空間９は、例えば、その内径（Ｄ）を１０ｍｍ（断面積：０．７８５ｃｍ２）に設定し、高さ（Ｈ）を２ｍｍ〜１０ｍｍに設定することにより、内部空間９の最小寸法が２ｍｍ〜１０ｍｍに設定される。最小寸法をこの範囲に設定された内部空間９は、結合組織４を侵入させつつ人工軟骨３を形成するのに十分なスペースを確保すると共に、軟骨細胞２の周囲に適切な量の養分や酸素を染み込ませて供給することができる。
【００４３】
内部空間９を挟んで対抗する底部６及び蓋部８には、前記環境下から基材内部に血管を含む結合組織４を侵入させる侵入口としての複数の小孔１１が形成され、基材内部を軟骨の培養環境として好適な生体内と類似した環境に設定するようになっている。
【００４４】
小孔１１は、例えば、その孔径（ｄ）が０．５ｍｍ（孔面積：０．００１９６ｃｍ２）程度で、血管を含む結合組織４が侵入可能な大きさに設定され、底部６及び蓋部８に形成した小孔１１の総数が、例えば６０〜２００に設定される。この場合の小孔１１の開口率（基材内面の総面積に対する小孔１１の総開口面積の比率）は、５％〜２０％であり、基材内部に結合組織４を過度に侵入させることなく、必要十分な養分や酸素を供給することができる。
【００４５】
次に、上記の人工軟骨形成用基材１を用いて人工軟骨を生産する方法について説明する。本実施形態の生産方法は、軟骨細胞２を含有すると共にゲル化可能な軟骨細胞分散溶液を調製する「溶液調製工程」と、軟骨細胞分散溶液をモールドに注入してゲル体１０を形成する「ゲル体形成工程」と、人工軟骨形成用基材１の内部にゲル体１０を充填して軟骨細胞２を収容する「収容工程」と、軟骨細胞２を収容した人工軟骨形成用基材１を生体組織材料の存在する環境下におく「設置工程」と、軟骨細胞２を基に基材内部に軟骨組織を形成する「軟骨組織形成工程」と、環境下から結合組織４で被覆された人工軟骨形成用基材１を取り出す「取り出し工程」と、基材内部から軟骨組織を人工軟骨形成用基材１及び結合組織４から剥離して人工軟骨３として取り出す「分離工程」とからなる。
【００４６】
＜溶液調製工程＞
まず、ウサギなどの動物の耳介軟骨組織をハサミで切り取り採取し、その軟骨組織をメスで米粒程度の大きさに細切した後、コラーゲンを分解する酵素に所定時間浸漬（例えば、０．３％  ＣＯＬＬＡＧＥＮＡＳＥ ｔｙｐｅ２溶液に３７℃で１．５時間浸漬）する。これにより、コラーゲンやコンドロイチン硫酸を主成分とする軟骨組織内のコラーゲンが分解されて軟骨組織がほぐれ、軟骨組織内に点在する軟骨細胞２が分離する。
【００４７】
なお、軟骨組織を採取した後、その軟骨組織を細切して酵素に浸漬するまで短期間保存するには、合成された基礎的な培地であるＦ−１２培地（血清含まない）などに浸漬して、軟骨組織の乾燥を防ぐのがよい。
【００４８】
次いで、コラーゲンを分解した軟骨組織を含む溶液を例えば１００μｍ孔のフィルター（セルストレーナーなど）を用いて濾過し、軟骨細胞２を含む溶液を得ると共に、残りの軟骨組織を取り除く。遠心分離器を１０００ｒｐｍの回転数で５分間運転し、先に得た軟骨細胞２を含む溶液を常温で処理して軟骨細胞２を回収する。さらに、回収した軟骨細胞２を周知の方法で培養して増加させる。なお、軟骨細胞２を増殖培養する際に、軟骨細胞２のうちの幾分かは脱分化するが、脱分化した細胞も、再度、軟骨細胞２に変化するので、特に大きな問題にはならない。
【００４９】
軟骨細胞を培養した後、その軟骨細胞の数を調整しつつＦ−１２培地溶液に投入し、これにアテロコラーゲン水溶液を混合して、軟骨細胞を含有すると共にゲル化可能な軟骨細胞分散溶液を調製する。
【００５０】
なお、軟骨細胞を投入した培地溶液に混合する溶液は、軟骨細胞を分散させた状態でゲル化するものであればよく、アテロコラーゲンの代わりに、ゼラチンなどを用いることもできる。また、動物から軟骨細胞を取り出す代わりに、ｉＰＳ細胞や幹細胞から分化誘導した軟骨細胞を用いることもでき、あるいは、軟骨細胞に分化する前の幹細胞を用いることもできる。
【００５１】
＜ゲル体形成工程＞
例えば、内径１０ｍｍ、深さ２ｍｍのモールドに、約１６０μＬの軟骨細胞分散溶液を注入し、軟骨細胞２の数を１〜１０×１０６個とする。なお、モールドの形状や大きさは、移植対象の軟骨損傷部に対応する人工軟骨形成用基材１の内部空間９の形状に応じて適宜設定される。また、軟骨細胞２の数が少ないと、固まった軟骨組織が形成されにくいので、軟骨細胞２の数は多めに設定しておくのがよい。
【００５２】
軟骨細胞分散溶液を注入したモールドを３７℃で２時間放置する。これにより、軟骨細胞分散溶液が含有するアテロコラーゲンがゼリー状に固まって軟骨細胞分散溶液がゲル化し、軟骨細胞２を分散させつつ含有するゲル体１０が得られる。なお、アテロコラーゲンに代えてゼラチンを混合して調製した軟骨細胞分散溶液を用いる場合、モールドを４℃に冷やした状態で放置して軟骨細胞分散溶液をゲル化すればよい。
【００５３】
＜収容工程＞
図２（ａ）に示すように、軟骨細胞２を分散させつつ含有するゲル体１０を基材本体７に充填して蓋部８を装着することにより、人工軟骨形成用基材１の内部に軟骨細胞２を収容する。
【００５４】
＜設置工程＞
収容工程で軟骨細胞２を収容した人工軟骨形成用基材１を、軟骨組織を採取した例えばウサギの皮下や腹腔内に埋設する。
【００５５】
なお、人工軟骨形成用基材１は、軟骨組織を採取したのと同一の生体に埋設するのがよいが、生体組織材料の存在する環境下であれば、他の環境に人工軟骨形成用基材１を設置するようにしてもよい。
【００５６】
生体組織材料の存在する環境下とは、動物の生体内（例えば、四肢部や肩部、背部、腹部などの皮下、あるいは、人工軟骨形成用基材１を受け入れる容積を有する腹腔内）、又は、動物の生体外において生体組織材料が浮遊する溶液中等の人工環境内が挙げられる。生体組織材料としては、ヒト、イヌ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、その他の哺乳類動物由来のものや、鳥類、魚類、その他の動物由来のもの、又は人工材料を用いることもできる。
【００５７】
＜軟骨組織形成工程＞
図２（ｂ）に示すように、設置工程の後、人工軟骨形成用基材１の周囲に結合組織４が形成されると共に、小孔１１から基材内部に結合組織４及び血管が侵入して、基材内部に軟骨の培養環境が構成される。ここで、結合組織４は、繊維芽細胞とコラーゲンなどの細胞外マトリックスで構成される。
【００５８】
図２（ｃ）に示すように、結合組織４及び血管によって基材内部に供給された養分や酸素がゲル体１０に染み込んで、その適切な分量が軟骨細胞２の周囲に供給され、軟骨細胞２が、その周囲に、アグリカン（プロテオグリカン）と２型コラーゲンとからなる軟骨基質１２を産生する。
【００５９】
図２（ｄ）に示すように、軟骨基質１２が徐々に増加して、例えば４週間程度が経過することにより、人工軟骨形成用基材１の内部に、軟骨細胞２の周囲に軟骨基質１２が満たされた構造の人工軟骨３が形成される。
【００６０】
このように、人工軟骨形成用基材１を用いることにより、目的とする人工軟骨３が小形であっても、軟骨細胞２が生体組織材料の存在する環境下で移動したり、そのまま前記環境下に吸収されたりすることなく、人工軟骨３を形成することができる。なお、軟骨基質１２を構成するコラーゲンは、収容工程において基材内部に充填したゲル体１０を構成するコラーゲンとは別のものであり、ゲル体１０を構成するアテロコラーゲンは分解されて消滅している。
【００６１】
＜取り出し工程＞
所定時間の軟骨組織形成工程を経て、人工軟骨３が十分に形成された後、人工軟骨形成用基材１を生体組織材料の存在する環境下から取り出す取り出し工程を行う。生体組織材料の存在する環境下から取り出された人工軟骨形成用基材１は、その表面の全体を結合組織４による膜で覆われている。
【００６２】
＜分離工程＞
人工軟骨形成用基材１の表面の結合組織４を除去して、基材本体７から蓋部８を取り外し、人工軟骨３を人工軟骨形成用基材１及び結合組織４から剥離するようにして基材内部から取り出す。
【００６３】
次に、上記の方法によって人工軟骨３を形成する際の、人工軟骨形成用基材１の内部空間９の最小寸法、及び小孔１１の開口率の影響を説明する。
【００６４】
まず、内部空間９の最小寸法としての高さ（Ｈ）が１ｍｍ、２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍである５種類の人工軟骨形成用基材１について、上記の方法によって人工軟骨３が形成されるかを調べた。ここで、人工軟骨形成用基材１の他の構成としては、内部空間９を円柱形状として、その内径（Ｄ）を１０ｍｍとし、孔径（ｄ）が０．５ｍｍの小孔１１を底部６及び蓋部８に総数１００だけ形成した。また、人工軟骨３が形成されているかどうかは、目視により判断した上で、一部の組織の基質を染色して、顕微鏡観察により確認した。
【００６５】
内部空間９の高さ（Ｈ）が１ｍｍの場合、基材内部に十分な量の結合組織４を侵入させつつ軟骨組織を形成するスペースを確保することができず、人工軟骨３は形成されなかった。一方、内部空間９の高さ（Ｈ）が２ｍｍ、４ｍｍ、８ｍｍ、１０ｍｍの場合、いずれも基材内部に人工軟骨３が形成されていた。
【００６６】
また、底部６及び蓋部８に形成した小孔１１の総数が０、２０、６０、１００、１５０、２００である６種類の人工軟骨形成用基材１について、上記の方法によって人工軟骨３が形成されるかを調べた。ここで、小孔１１は、その孔径（ｄ）を０．５ｍｍとし、内部空間９は、内径（Ｄ）が１０ｍｍで、高さ（Ｈ）が２ｍｍの円柱形状とした。なお、人工軟骨３が形成されているかどうかの判断は、上記の方法と同じである。
【００６７】
小孔１１の総数が０の場合と２０の場合は、血管侵入はほとんど見られず、基材内部の組織は白濁して多くは死滅していた。一方、小孔１１の総数が６０、１００、１５０、２００の場合、いずれも基材内部の全体が軟骨組織で満たされており、多数の新生血管が侵入していた。小孔１１の総数が２０以下であると、基材内部への養分や酸素の供給が不十分であるが、小孔１１の総数を６０以上にすることで、養分や酸素の供給ルートが確保され、基材内部で軟骨組織が生存できる培養環境が整備されていることがわかる。
【００６８】
また、小孔１１が多すぎると、基材内部に結合組織４が過度に侵入して、軟骨組織を形成するスペースが奪われる可能性があると考えられる。すなわち、小孔１１の開口率（基材内面の総面積に対する小孔１１の総開口面積の比率）が、５％〜２０％であれば、基材内部に結合組織４を過度に侵入させることなく、必要十分な養分や酸素を供給することができるといえる。
【００６９】
なお、本発明は、上記の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、適宜変更を加えることができる。例えば、人工軟骨形成用基材１は、汎用性プラスチックなどによって形成するだけでなく、バイオチューブ（体内で作った結合組織管）を用いるなど、結合組織から形成することもでき、これにより、基材内部をより生体内に近い環境として、軟骨組織の形成に好適な環境に設定することができる。
【００７０】
また、人工軟骨形成用基材１は、その基材内部を、人工軟骨を所定の形状に形成する鋳型として兼用することもでき、例えば、内部空間９を円柱形に設定する代わりに、内部空間９を患者の軟骨の欠損部の形状に対応させた形状に設定するようにしてもよい。また、小孔１１は、底部６及び蓋部８のみに形成するだけでなく、円筒部５にも形成することができ、基材内部に結合組織４及び血管をより均一に侵入させることができる。また、小孔１１に代えて、スリットなどの他の構成の侵入口を形成するようにしてもよい。
【００７１】
また、収容工程において、基材内部にゲル体１０を充填する代わりに、内部空間９の内面に接着するなどして、基材内部に軟骨細胞２の凝集体（スフェロイド）を収容するようにしてもよく、ゲル体１０に軟骨細胞２の凝集体（スフェロイド）を含有させて基材内部に充填するようにしてもよい。
【符号の説明】
【００７２】
１    人工軟骨形成用基材
２    軟骨細胞
３    人工軟骨
４    結合組織
５    円筒部
６    底部
７    基材本体
８    蓋部
９    内部空間
１０  ゲル体
１１  小孔
１２  軟骨基質
【図１】
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【図２】
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