(57)【要約】【課題】タンパク質を基板上に固定化することなくアレイ化可能なプロテインチップの製造方法及びそのプロテインチップを提供する。【解決手段】［１］１つ以上のマイクロホール2が表面に形成された基板1と、タンパク質をコードした核酸と、前記核酸にコードされたタンパク質の合成を行う分子群を含むタンパク質合成系溶液4と、を準備して、前記核酸及び前記タンパク質合成系溶液を前記マイクロホール内に導入し、前記マイクロホールの開口部2aを脂質二分子膜5によりシールして、前記マイクロホール内で前記コードされたタンパク質を発現させる、プロテインチップの製造方法。［２］ハイドロゲル前駆体を前記マイクロホール内に導入した後で前記脂質二分子膜によるシールを行う前記製造方法。［３］前記ハイドロゲル前駆体をゲル化させてなるハイドロゲルを前記マイクロホール内に生成する前記製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のマイクロホールが表面に形成された基板と、
タンパク質をコードした核酸と、前記核酸にコードされたタンパク質の合成を行う分子群を含むタンパク質合成系溶液と、を準備して、
前記核酸及び前記タンパク質合成系溶液を前記マイクロホール内に導入し、
前記マイクロホールの開口部を脂質二分子膜によりシールして、
前記マイクロホール内で前記コードされたタンパク質を発現させる、
プロテインチップの製造方法。
【請求項２】
ハイドロゲル前駆体を前記マイクロホール内に導入した後で前記脂質二分子膜によるシールを行う、請求項１に記載のプロテインチップの製造方法。
【請求項３】
前記ハイドロゲル前駆体をゲル化させてなるハイドロゲルを前記マイクロホール内に生成する、請求項２に記載のプロテインチップの製造方法。
【請求項４】
前記核酸を前記マイクロホールの内壁に固定した後で、前記タンパク質合成系溶液を当該マイクロホール内に導入する、請求項１〜３の何れか一項に記載のプロテインチップの製造方法。
【請求項５】
前記基板の表面に脂質ベシクルを展開することによって、前記脂質二分子膜によるシールを行う、請求項１〜４の何れか一項に記載のプロテインチップの製造方法。
【請求項６】
前記マイクロホールの開口部をシールする前記脂質二分子膜に、予め準備した膜タンパク質を配置する、請求項１〜５の何れか一項に記載のプロテインチップの製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか一項に記載の製造方法によって得られたプロテインチップであって、前記核酸がコードするタンパク質が前記マイクロホール内又は前記脂質二分子膜に備えられたプロテインチップ。
【請求項８】
前記核酸がコードするタンパク質が前記マイクロホール内において拡散可能な状態で備えられた、請求項７に記載のプロテインチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無細胞タンパク質合成系を利用したプロテインチップの製造方法およびプロテインチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノテクノロジー技術の発展によって、その微細加工レベルは10ナノメートルオーダーまで到達している。また、近年、ナノテクノロジーによる微細加工技術を用いて、基板上に生体分子をアレイ化したバイオチップの作製が盛んに行われている。中でも、生体に対する薬剤の影響を確認するための薬剤スクリーニングは、創薬の開発に欠くことのできない技術である。創薬の標的としてタンパク質が注目されており、様々な病気の発生やその治療に関連するタンパク質をアレイ化したバイオチップはハイスループットな薬剤スクリーニング基板として期待できる（非特許文献１）。
【０００３】
生体分子をアレイ化する方法としては、基板上に物理吸着や化学結合を介して固定化させる方法があるが、特にタンパク質を用いた場合、どちらもタンパク質を変性させる可能性があった。中でも、膜タンパク質は脂質二分子膜内でその活性を保持するため、脂質二分子膜が無い基板に対する固定化は、その活性を著しく損なわせてしまうという問題があった（非特許文献２）。そのため、生体分子、特に膜タンパク質の活性を保持した状態でアレイ化する技術が求められていた。
【０００４】
上記の問題を改善するために、我々は以前にマイクロホールアレイ基板を用いたタンパク質アレイを提案している。例えば、マイクロホールの開口部に架橋した脂質膜に膜タンパク質を安定に保持したタンパク質アレイが挙げられる（特許文献１）。さらに、マイクロホールの内部に充填したハイドロゲルを、脂質膜の支持体にすることによって、脂質膜の安定化を向上した方法を開示している（特許文献２）。
【０００５】
ところで、タンパク質を調製する手法として、大腸菌や培養細胞内に遺伝子を導入し、目的のタンパク質を発現させ、抽出及び精製する手法が一般的である。この手法によれば、培養規模をスケールアップすることにより大量のタンパク質を一度に調製することができる。しかし、目的タンパク質以外にも細胞の生命活動に必須な様々なタンパク質が夾雑しているため、目的タンパク質を精製する手法が煩雑であり、精製過程における目的タンパク質の変性が問題になることがある。
【０００６】
無細胞タンパク質合成系は上述の問題を解決する手法として注目されている。無細胞タンパク質合成系とは、適当な細胞から抽出されたタンパク質合成能を有する成分からなるタンパク質翻訳系である。この系には例えば、リボソーム、翻訳開始因子、翻訳伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素等、翻訳に必要な分子群が含まれている（非特許文献３）。公知のタンパク質翻訳系として、大腸菌抽出液、ウサギ網状赤血球抽出液、小麦胚芽抽出液等が挙げられる。さらに、タンパク質翻訳に必要な分子群がそれぞれ独立に精製された後で必要な分子のみが混合されてなる、生体由来の不要な因子を含まない再構成型無細胞タンパク質合成系が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系溶液を利用することにより、煩雑な精製過程を経ずに目的タンパク質を得ることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Drews. Science, 287: 1960-1964 (2000)
【非特許文献２】M. Tanaka and E. Sackmann. Nature, 437: 656-663 (2005)
【非特許文献３】A. S. Spirin and J. R. Swartz, Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH Verglag GmbH & Co.KGaA, (2008)
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−１６０７１８号公報
【特許文献２】特開２０１３−１１８８５２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、調製した目的タンパク質を基板上に固定してアレイ化する段階で、目的タンパク質の変性や分解が起きやすい問題が依然として残っていた。
本発明は、上記背景を鑑みてなされたものであり、タンパク質を基板上に固定化することなくアレイ化可能なプロテインチップの製造方法及びそのプロテインチップの提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［１］１つ以上のマイクロホールが表面に形成された基板と、タンパク質をコードした核酸と、前記核酸にコードされたタンパク質の合成を行う分子群を含むタンパク質合成系溶液と、を準備して、前記核酸及び前記タンパク質合成系溶液を前記マイクロホール内に導入し、前記マイクロホールの開口部を脂質二分子膜によりシールして、前記マイクロホール内で前記コードされたタンパク質を発現させる、プロテインチップの製造方法。
［２］ハイドロゲル前駆体を前記マイクロホール内に導入した後で前記脂質二分子膜によるシールを行う、前記［１］に記載のプロテインチップの製造方法。
［３］前記ハイドロゲル前駆体をゲル化させてなるハイドロゲルを前記マイクロホール内に生成する、前記［２］に記載のプロテインチップの製造方法。
［４］前記核酸を前記マイクロホールの内壁に固定した後で、前記タンパク質合成系溶液を当該マイクロホール内に導入する、前記［１］〜［３］の何れか一項に記載のプロテインチップの製造方法。
［５］前記基板の表面に脂質ベシクルを展開することによって、前記脂質二分子膜によるシールを行う、前記［１］〜［４］の何れか一項に記載のプロテインチップの製造方法。
［６］前記マイクロホールの開口部をシールする前記脂質二分子膜に、予め準備した膜タンパク質を配置する、前記［１］〜［５］の何れか一項に記載のプロテインチップの製造方法。
［７］前記［１］〜［６］の何れか一項に記載の製造方法によって得られたプロテインチップであって、前記核酸がコードするタンパク質が前記マイクロホール内又は前記脂質二分子膜に備えられたプロテインチップ。
［８］前記核酸がコードするタンパク質が前記マイクロホール内において拡散可能な状態で備えられた、前記［７］に記載のプロテインチップ。
［９］前記核酸がコードするタンパク質が膜タンパク質であって、前記マイクロホール内で発現させた前記膜タンパク質を、前記マイクロホールの開口部をシールする前記脂質二分子膜の表面に付着した状態又は内部に挿入された状態で配置する、前記［１］〜［５］の何れか一項に記載のプロテインチップの製造方法。
［１０］前記核酸がコードするタンパク質が膜タンパク質であって、前記膜タンパク質が前記マイクロホールの開口部をシールする前記脂質二分子膜の表面に付着した状態又は内部に挿入された状態で備えられた、前記［７］に記載のプロテインチップ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のプロテインチップの製造方法によれば、マイクロホール内で任意の目的タンパク質を発現させることにより、精製工程を全く経ずに、マイクロホール内に無傷の目的タンパク質を導入することができる。基板上にアレイ化された複数のマイクロホールの各々に対して種々の目的タンパク質を配置することにより、目的タンパク質を基板表面に対して物理的に固定することなく、目的タンパク質をアレイ化したプロテインチップが得られる。
本発明のプロテインチップによれば、無傷の目的タンパク質がアレイ化されているため、目的タンパク質が本来的に有する機能を発揮させることができる。このようなプロテインチップは、創薬のハイスループットスクリーニングの用途に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の一実施形態のプロテインチップ１０の模式断面図である。
【図２】本発明の一実施形態のプロテインチップ２０の模式断面図である。
【図３】本発明の一実施形態のプロテインチップ３０の模式断面図である。
【図４】本発明の一実施形態のプロテインチップ４０の模式断面図である。
【図５】実施例１で観察した基板表面の蛍光顕微鏡画像である。
【図６】参考例で観察した基板表面の蛍光顕微鏡画像である。
【図７】核酸をマイクロホールの内壁に固定化する手順の一例を示す模式図である。
【図８】核酸をマイクロホールの内壁に固定化する手順の一例を示す模式図である。
【図９】負電荷の壁面を有するマイクロホール内に正電荷を有するハイドロゲルを封入した基板表面の蛍光顕微鏡画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、好適な実施の形態に基づき、図面を参照して本発明を説明するが、本発明はかかる実施形態に限定されない。
【００１４】
《プロテインチップの製造方法》
まず、１つ以上のマイクロホールが表面に形成された基板と、目的のタンパク質をコードした核酸と、前記核酸にコードされたタンパク質の合成を行う分子群を含むタンパク質合成系溶液と、を準備する。
【００１５】
前記基板は公知のマイクロホールアレイ基板が適用可能であり、例えば、特開２０１１−１６０７１８号公報、特開２０１３−１１８８５２号公報等に記載されたマイクロホールを複数有する基板が挙げられる。一例として、図１に示すプロテインチップ１０を構成する基板が挙げられる。基板本体１は、任意の別の支持体（不図示）上に形成されたシリコン層又はシリコン基板からなり、マイクロホール（穴部）２が設けられた基板本体の上面には酸化シリコン層３が形成されている。マイクロホールの開口部２ａには酸化シリコン層３がせり出したオーバーハング部３ａが形成されている。オーバーハング部３ａによってマイクロホールの開口部２ａが狭められている。
【００１６】
基板本体１の材料は特に限定されない。基板表面は親水性であってもよいし、疎水性であってもよい。親水性基板である場合は、ベシクルラプチャ法によってマイクロホールの開口部２ａを脂質二分子膜で容易にシールすることができる。疎水性基板である場合は、マイクロホールの開口部２ａの直上に位置する脂質二分子膜に、膜タンパク質を容易に集合させることができる。
【００１７】
マイクロホールの開口部２ａの形状は特に限定されず、上方から見た形状として例えば、円形、楕円形、三角形、矩形、その他の多角形等の形状が挙げられる。
【００１８】
マイクロホールの開口部２ａの口径（直径）或いは開口部２ａを構成する多角形の対角線のうち最長の長さ又は前記多角形の外接円の直径は、特に制限されないが、０．１μｍ〜１０μｍ程度が好ましい。
上記範囲の下限値０．１μｍ以上とすることにより、マイクロホールの内部に種々の溶液を容易に導入することができる。上記範囲の上限値１０μｍ以下とすることにより、目的タンパク質を含む溶液をマイクロホール内において安定に保持して、マイクロホール内で前記溶液が波立ったり、マイクロホール外へ流出するような勢いが与えられたりすることを確実に防止できる。
【００１９】
マイクロホール２の深さは特に制限されず、開口部２ａのサイズや内部に導入するタンパク質合成系溶液４の体積に応じて適宜設計すればよい。前記深さは例えば０．１μｍ〜１０μｍとすることができる。
【００２０】
基板本体１に設けられるマイクロホール２の数は特に限定されず、アレイ（配列した並び）の規模に応じて適宜設定すればよく、例えば１〜１００００個とすることができる。
【００２１】
図１に示すプロテインチップ１０のマイクロホール２の内部はタンパク質合成系溶液４によって満たされている。
タンパク質合成系溶液４の種類は、前記核酸にコードされた目的タンパク質を発現することができる溶液であれば特に限定されず、例えば、前述した公知のタンパク質翻訳系、非特許文献３等に記載された無細胞タンパク質合成系、これらの系を構成する分子群を含む溶液等を適用することができる。
【００２２】
前記目的タンパク質をコードする核酸の種類は特に限定されず、ＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。ここで、「目的タンパク質をコードする核酸」とは、所望のタンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。ＤＮＡ及びＲＮＡには、分子の安定性を向上するための公知の化学修飾が施されていてもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡは一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡはセンス鎖であってもよいし、アンチセンス鎖であってもよい。これらのＤＮＡ又はＲＮＡに基づいて、最終的に、タンパク質合成系溶液４が含む分子群によって目的タンパク質をコードするｍＲＮＡが生成されることが好ましい。ＲＮＡは目的タンパク質をコードしたｍＲＮＡであることが好ましい。導入したＲＮＡ分子はタンパク質合成系溶液４が含む分子群によって逆転写されることにより目的タンパク質をコードしたＤＮＡに変換されてもよい。通常、前記核酸には目的タンパク質のアミノ酸配列をコードする構造遺伝子領域の他、ＲＮＡポリメラーゼが結合するプロモーター領域、転写発現を調節する調節領域がコードされる。これらの領域がコードされた核酸は、公知の化学合成法によって得られる。
【００２３】
前記核酸にコードされた目的タンパク質の種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択すればよく、水溶性タンパク質であってもよいし、膜タンパク質であってもよい。膜タンパク質は、表在性膜タンパク質であってもよいし、内在性膜タンパク質であってもよい。
【００２４】
基板本体１に設けられた単一のマイクロホール内に導入される前記核酸は１種類であってもよいし、複数種類であってもよい。
基板本体１に設けられた複数のマイクロホールの各々に導入される前記核酸は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００２５】
《第一実施形態》
本発明の第一実施形態は、前記核酸及び前記タンパク質合成系溶液を前記マイクロホール内に導入する＜導入工程＞と、前記マイクロホールの開口部を脂質二分子膜によりシールする＜封止工程＞と、前記マイクロホール内で前記コードされたタンパク質を発現させる＜合成工程＞と、を有するプロテインチップの製造方法である。その他の処理を行う他の工程を有していてもよい。
【００２６】
＜導入工程＞
前記核酸及びタンパク質合成系溶液をマイクロホール内に導入する方法は特に限定されず、例えば、前記核酸を添加したタンパク質合成系溶液を公知のインクジェット技術によって基板上の任意のマイクロホール内に撃ち込む方法が挙げられる。この方法によれば、溶液の導入量を例えば、マイクロリットル（μL）〜フェムトリットル（ｆL）単位で正確に制御することができる。導入量はマイクロホールが満たされる最大量であってもよいし、最大量よりも少ない任意の量であってもよい。
【００２７】
前記核酸と前記タンパク質合成系溶液とは、マイクロホール内に同時に導入されてもよいし、各々が独立に導入されてもよい。別々に導入する場合の順序は特に限定されず、前記核酸を先に導入してもよいし、前記無細胞タンパク質合成系溶液を先に導入してもよい。前記核酸を独立に導入する場合は、所定の溶媒、例えばRNaseフリー滅菌水に溶解した核酸溶液として導入することができる。
【００２８】
＜封止工程＞
導入工程の後に、マイクロホールの開口部２ａを脂質二分子膜５によりシールする方法は特に限定されず、例えば、特開２０１１−１６０７１８号公報、特開２０１３−１１８８５２号公報等に記載された、脂質ベシクルをマイクロホールの開口部上に展開する方法が好適である。
【００２９】
脂質二分子膜を構成する脂質分子の種類は、脂質二分子膜（脂質二重膜）を形成できるものであれば特に限定されず、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、及びスフィンゴ脂質からなる群から選ばれる１種以上が挙げられる。
【００３０】
これらの脂質分子を材料として、静置水和法やエレクトロスウェリング法（電界形成法）等の公知方法によりベシクルを調製することができる。例えば、１０μｍ〜１００μｍ程度の大きさのベシクルを０．１ｍＭ〜１０ｍＭ程度の濃度で含有するベシクル分散液を基板上に滴下して、ベシクルをマイクロホールの開口部２ａ上で展開することによって、脂質二分子膜５が基板表面を覆い、マイクロホールの開口部２ａをシールする。
【００３１】
マイクロホールをシールする脂質二分子膜５が空気と接触することにより、脂質分子が酸化したりマイクロホール内の溶液が乾燥したりすることを防ぐために、脂質二分子膜５を覆う外液Ｌを基板表面に張ることが好ましい。
【００３２】
＜合成工程＞
マイクロホール内に導入した前記核酸及びタンパク質合成系溶液において、前記核酸にコードされた目的タンパク質を発現させる方法は特に限定されない。合成中、タンパク質合成系溶液に含まれるリボソーム等の酵素活性が安定に発揮される温度にマイクロホールを静置することが好ましい。通常、タンパク質翻訳を阻害する因子が無い限り、前記核酸が前記タンパク質合成系溶液に混合された時点で翻訳が自然に開始される。
【００３３】
封止工程と合成工程の順序は特に限定されず、封止工程が先で合成工程が後であってもよいし、合成工程が先で封止工程が後であってもよいし、封止工程と合成工程とが同時に行われてもよい。
【００３４】
以上の工程により、脂質二分子膜５によって開口部２ａがシールされたマイクロホール２内に目的のタンパク質４ｚが含まれた溶液を備えたプロテインチップ１０を製造することができる。
【００３５】
《第二実施形態》
本発明の第二実施形態においては、第一実施形態で製造したプロテインチップ１０の脂質二分子膜５に予め準備した膜タンパク質６を配置することにより、プロテインチップ２０を得る（図２参照）。
【００３６】
脂質二分子膜５に膜タンパク質６を配置する方法は特に限定されず、例えば、ベシクルフュージョン法等の公知方法が適用される。具体的には、プロテオリポソームと呼ばれる膜タンパク質６を含有するベシクルを、脂質二分子膜５上に添加することにより、プロテオリポソームと脂質二分子膜５が融合し、膜タンパク質６が脂質二分子膜５中に再構成される。
【００３７】
脂質二分子膜５に配置する膜タンパク質６の種類は特に限定されず、例えば、マイクロホール２の内部又は外液Ｌのイオン濃度を変化させるイオンチャネル型受容体が挙げられる。また、膜タンパク質６とマイクロホール２内で発現されたタンパク質４ｚとが物理的又は化学的に或いは直接的又は間接的に相互作用してもよい。
第二実施形態におけるプロテインチップ２０の外液Ｌに医薬候補物質等を添加することにより、膜タンパク質６、脂質二分子膜５、タンパク質合成系溶液４及びタンパク質４ｚを含む細胞を模した系に対する当該医薬候補物質の作用を解析することができる。
【００３８】
また、プロテインチップ１０，２０の製造方法の変形例として、マイクロホール内で発現させるタンパク質が膜タンパク質である場合、発現させた当該膜タンパク質が、マイクロホールの開口部をシールする脂質二分子膜に移動することによって、当該膜タンパク質がその脂質二分子膜に挿入された状態又はその脂質二分子膜の表面に付着した状態、を備えたプロテインチップを製造することもできる。
【００３９】
《第三実施形態》
本発明の第三実施形態においては、第二実施形態に加えて、ハイドロゲル前駆体をマイクロホール２内に導入した後で開口部２ａを脂質二分子膜５によってシールし、さらに前記ハイドロゲル前駆体をゲル化させてなるハイドロゲル７をマイクロホール２内に生成する方法、或いは、ハイドロゲル前駆体をマイクロホール２内に導入し、さらにゲル化させてなるハイドロゲル７が内部に備えられたマイクロホールの開口部２ａを脂質二分子膜５によってシールする方法によって、プロテインチップ３０を得る（図３参照）。後者の方法によれば、比較的小さいベシクル、例えば開口部２ａよりも小さいベシクル、を用いて開口部２ａを脂質二分子膜５でシールすることができる。
【００４０】
前記ハイドロゲル前駆体をマイクロホール２内に導入する方法は特に限定されず、前記核酸及びタンパク質合成系溶液と共に導入してもよいし、ハイドロゲル前駆体を溶解した溶液を独立して導入してもよい。ハイドロゲル前駆体をゲル化させる方法は特に限定されず、例えば光重合開始剤を予め添加したハイドロゲル前駆体溶液を準備し、この溶液をマイクロホール２内に導入して、マイクロホール内でタンパク質合成系溶液と均一に混ざった後で光照射することによりゲル化させる方法が挙げられる。
【００４１】
ゲル化させる時期は、目的タンパク質の合成が完了した後でもよいし、目的タンパク質の合成が完了する以前であってもよい。
【００４２】
前記ハイドロゲル前駆体の種類は特に限定されず、前記タンパク質合成系溶液におけるタンパク質翻訳を阻害し難い親水性ポリマーを構成する公知のモノマーを使用することが好ましい。このような好適なモノマーとしては、例えば、特開２０１３−１１８８５２号公報に記載されたモノマーが挙げられる。
【００４３】
ハイドロゲル７の含水量は特に限定されず、例えばハイドロゲル７の全質量に対して１〜９９質量％の範囲で調整することができる。前記含水量は５０〜９９重量％が好ましく、７０〜９５重量％がより好ましく、８５〜９５重量％がさらに好ましい。これらの好適な含水量であると、ハイドロゲル７が細胞の細胞質に近い物性を有するとともに、当該ハイドロゲル中でタンパク質翻訳が円滑に進む。
【００４４】
マイクロホール２内を細胞質に近い環境にする観点から、ハイドロゲル７は親水性ポリマーであることが好ましい。親水性ポリマーであると、マイクロホール２内でタンパク質が安定に合成されるとともに、開口部２ａにおいて脂質二分子膜５を安定に支持することができる。前記親水性ポリマーとしては、例えば（メタ）アクリル樹脂、中性のポリエチレングリコールジメタクリラート、このメタクリラートに任意の割合で、負電荷を有するアクリル酸又は正電荷を有するジメチルアミノプロピルメタクリルアミド（ＤＭＡＰＭＡ）を混合及び重合した、負電荷又は正電荷を有するアクリル樹脂等が挙げられる。さらに、アガロース、デキストラン等の多糖類、アクチン、チューブリン等の細胞骨格を構成するタンパク質同士が会合してなる繊維構造を有するゲルもハイドロゲル７として適用可能である。これらの細胞骨格を構成するタンパク質からなるハイドロゲルを利用することにより、マイクロホール内の環境を細胞内環境により一層近づけることができる。
【００４５】
ハイドロゲルに電荷をもたせる効果として、マイクロホールの壁面が電荷を有する場合、それと反対の電荷を有するハイドロゲルを用いることで、ハイドロゲルをマイクロホール内に高効率かつ安定に保持することができる。例えば、酸化シリコンが壁面を構成するマイクロホールを利用した場合、酸化シリコン表面は負電荷を有するため、それと反対の電荷を有するポリエチレングリコールジメタクリレートとＤＭＡＰＭＡの混合溶液から作製された正電荷のハイドロゲルは、当該マイクロホールに高効率に封入することが可能である（図９参照）。
【００４６】
マイクロホール２の全容積に対するハイドロゲル７の体積は特に限定されず、例えば５０〜１００％の範囲で調整することができる。ハイドロゲル７によって開口部２ａをシールする脂質二分子５を支持する場合、ハイドロゲル７はマイクロホール２の底部から開口部２ａまで充填されることが好ましい。
【００４７】
プロテインチップ３０に備えられた図示略の複数のマイクロホール２には、同じ種類のハイドロゲル７が充填されていてもよいし、異なる種類のハイドロゲル７が充填されていてもよい。例えば、第一の領域に設けられたマイクロホール２にはカチオン性ハイドロゲルが充填され、第二の領域に設けられたマイクロホール２にはアニオン性ハイドロゲルが充填された構成を例示できる。
【００４８】
同一基板上において電荷が互いに異なるハイドロゲルが各領域に配置されていると、異なる種類の脂質二分子膜を各領域に配置することが容易になる。具体的には、カチオン性ハイドロゲルが充填された第一のマイクロホールは負電荷を有する脂質二分子膜によってシールされて、アニオン性ハイドロゲルが充填された第二のマイクロホールは正電荷を有する脂質二分子膜によってシールされた構成が例示できる。
【００４９】
《第四実施形態》
本発明の第四実施形態においては、前記導入工程において、先に前記核酸をマイクロホール２の内壁２ｂに固定した後で、前記タンパク質合成系溶液を当該マイクロホール２内に導入する。その他の工程は、第一、第二又は第三実施形態と同様に行い、プロテインチップ１０，２０，３０を製造することができる。本実施形態によれば、タンパク質合成系溶液をマイクロホール内に導入する以前に目的タンパク質の合成が開始されることを防止できる。
【００５０】
前記核酸をマイクロホールの内壁２ｂ、即ちマイクロホール２の側面及び底面の少なくとも何れか一方、に固定する方法は特に限定されず、例えば、前記核酸を含む溶液をマイクロホール２内に導入した後、当該溶液を乾燥して、前記核酸を内壁２ｂに物理的に吸着させる方法が挙げられる。
【００５１】
また、公知の化学結合を介して内壁２ｂに前記核酸を結合させてもよい。例えば、内壁２ｂをアミノ基、カルボキシ基、エポキシ基等の官能基によって化学的に修飾し、当該官能基と化学結合を形成可能な反応基を前記核酸の５'末端に修飾し、前記化学結合によって内壁２ｂに前記核酸を化学的に固定する方法が挙げられる。
【００５２】
また、公知のリンカー分子を介して内壁２ｂに前記核酸を結合させてもよい。例えば、内壁２ｂをアミノ基、カルボキシ基等の官能基によって化学的に修飾し、当該官能基と化学結合を形成可能な反応基を有するビオチン又はアビジンを前記化学結合によって内壁２ｂに結合させて、前記核酸の５'末端にビオチン又はアビジンを修飾し、ビオチン−アビジン結合を介して内壁２ｂに前記核酸を固定する方法が挙げられる。この固定形態としては、例えば「内壁−ビオチン−アビジン−ビオチン−核酸」、「内壁−アビジン−ビオチン−核酸」、「内壁−ビオチン−アビジン−核酸」等が挙げられる。
【００５３】
《第五実施形態》
本発明の第五実施形態においては、第一、第二、第三又は第四実施形態に加えて、マイクロホール２内に露出する電極を設置することにより、プロテインチップを得る。ここでは一例として、マイクロホール内にハイドロゲルを備えたプロテインチップ４０を図４に示す。
【００５４】
マイクロホール２の底面に電極Ｅ１を設置する方法は特に限定されず、例えば、特開２０１３−１１８８５２号公報に記載されたように、スパッタリング等の成膜法によってマイクロホール２の底部に金属層を形成し、エッチングで所定の形状にパターニングする方法が挙げられる。
【００５５】
プロテインチップ４０の外液Ｌにマイクロホール２内の電極Ｅ１と対をなす電極Ｅ２を設置すると、電気生理学的手法によって膜タンパク質６の機能を測定することができる。例えば、膜タンパク質６の機能によって生じるマイクロホール２内外の電位差又は電流値の変化を検出することができる。
【実施例】
【００５６】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
【００５７】
［実施例１］
＜マイクロホールアレイ基板の作製＞
シリコン製の基板本体１の上に、２００ｎｍの厚さのシリコン酸化膜層（薄膜層）３を、電子サイクロトロン共鳴プラズマ（ＥＣＲプラズマ）堆積法により形成した。次に、フォトリソグラフィ法とドライエッチング法を用いて、四角形状の開口部２ａ（２μｍ×２μｍ）を有する、深さ１μｍの穴部２をアレイ状に複数形成した。さらに、１０質量％の水酸化カリウム水溶液を使用して、シリコン酸化膜層３の下の基板本体１を選択的にエッチングすることにより、各穴部２の開口部２ａの四隅にオーバーハング部３ａを形成した。形成した穴部２の模式的な断面を図１に示す。
【００５８】
＜鋳型ＤＮＡの調製＞
５’末端側からＴ７プロモーター配列、オメガ配列、Ｋｏｚａｋ配列を順に有するＴｕｒｂｏＧＦＰ遺伝子を鋳型として、この鋳型の末端に相補的な配列を有するプライマーを用いてＰＣＲにより二本鎖ＤＮＡを調製した。ＰＣＲによる目的産物の増幅はアガロースゲル電気泳動によって確認した。得られたＰＣＲ産物の精製にはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用した。
【００５９】
＜人口細胞アレイ基板の作製＞
再構成型無細胞タンパク質合成用の溶液Ｐｕｒｅｆｒｅｘ（ジーンフロンティア社製）に前記鋳型ＤＮＡを添加して得られた溶液をマイクロホールアレイ基板上に滴下することにより、マイクロホール内に前記溶液を流入させた。その直後に、予め調製した脂質膜ベシクルの分散液を同様に基板上に滴下して、静置した。脂質膜ベシクルが基板上に展開してマイクロホールの開口部を覆った後で、マイクロホール外に溢れていた前記分散液を含む前記溶液を洗い流した。この洗浄には、マイクロホール内の無細胞タンパク質合成用溶液と浸透圧が等しい等張液（以下、外液Ｌと呼ぶ。）を使用した。
【００６０】
洗浄後の基板表面を蛍光顕微鏡で観察した結果を図５に示す。脂質二分子膜を構成する脂質分子に予め標識しておいた赤色蛍光色素（ローダミン）からの蛍光が観察されている。これにより、脂質二分子膜がマイクロホール上をシールしており、マイクロホール内に無細胞タンパク質合成系溶液が封入されたことが確認された。このように準備を整えた基板を室温〜３７℃でインキュベーションすることによって、基板に形成された複数のマイクロホール内部においてＴｕｒｂｏＧＦＰを発現させた。この結果、脂質二分子膜でシールされた複数のマイクロホール内部にタンパク質溶液が封入された、図１に示すプロテインチップ１０が得られた。
【００６１】
＜脂質膜ベシクルの調製＞
前記脂質膜ベシクルの分散液は、特開２０１１−１６０７１８号公報、特開２０１３−１１８８５２号公報に記載の方法で調製した。
【００６２】
［実施例２］
実施例１と同様に、マイクロホールアレイ基板と、脂質膜ベシクルの分散液と、鋳型ＤＮＡを含む無細胞タンパク質合成用溶液と、を準備した。
【００６３】
＜ハイドロゲル前駆体の合成＞
２−ヒドロキシエチルメタクリラート（ＨＥＭＡ：2-hydroxyethyl methacrylate）とＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールをＴＨＦに溶解して、室温で撹拌した。続いて、ＴＨＦをロータリーエバポレータで取り除き、酢酸エチルに再溶解し、水による洗浄を行った後、硫酸ナトリウムで脱水して溶媒を取り除いた。得られた粗生成物とデキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）とジメチルアミノピリジンをＤＭＳＯに溶解した後、室温で撹拌した。この溶液からジエチルエーテルを使用して再沈殿させることにより、目的生成物であるデキストラン−ＨＥＭＡを得た。 
【００６４】
＜ハイドロゲル内での無細胞タンパク質発現＞
合成したハイドロゲル前駆体及び水溶性の光重合開始剤であるＬＡＰを無細胞タンパク質合成用溶液に対して所定の割合で混合した混合溶液を基板上に滴下し、続けて脂質膜ベシクルの分散液を滴下することによって、実施例１と同様に、脂質二分子膜によって複数のマイクロホール内に混合溶液を封入した。
【００６５】
上記マイクロホールアレイ基板に対して、キセノン光源から３６０ｎｍの光を照射することにより、マイクロホール内の混合溶液をゲル化させた。その後、ハイドロゲル内で発現されたＴｕｒｂｏＧＦＰの発現量を、マイクロプレートリーダーによってＴｕｒｂｏＧＦＰの蛍光強度を測定することによって求めた。その結果、ハイドロゲルによる発現量の低下及び蛍光強度の低下は少ないことが分かった。
【００６６】
［参考例］
ハイドロゲル前駆体としてカチオン性の高分子モノマーであるＤＭＡＰＭＡを１質量％添加したこと、及び無細胞タンパク質合成用溶液に代えて緑色蛍光色素カルセインを含む溶液を使用して前記混合液を調製したこと以外は、実施例２と同様にして、脂質二分子膜によって前記溶液がマイクロホール内に封入されたマイクロホールアレイ基板を得た。
【００６７】
得られたマイクロホールアレイ基板の表面を蛍光顕微鏡で観察した結果を図６に示す。カルセイン由来の蛍光が各マイクロホールから観察されている。高密度且つ均一に混合溶液を封入できた理由として、特開２０１３−１１８８５２号公報においても述べられているように、アニオン性の脂質膜ベシクルとカチオン性のハイドロゲルが静電相互作用により引き合い、ハイドロゲル上における脂質二分子膜の形成が促進されたことが挙げられる。
【００６８】
以上の結果から、カルセイン溶液に代えて無細胞タンパク質合成用溶液を使用した場合にも同様に、目的タンパク質を含む溶液又はハイドロゲルが基板全体に渡って高密度且つ均一に封入されたプロテインチップを作製できることが明らかである。
【００６９】
［実施例３］
＜ＤＮＡマイクロアレイ基板の作製（１）＞
実施例１と同様に、マイクロホールアレイ基板と、脂質膜ベシクルの分散液と、５’末端をアミノ基で修飾した鋳型ＤＮＡを準備した。鋳型ＤＮＡの調製は５’末端をアミノ基で修飾したプライマーを使用する公知方法で行った。
マイクロホールアレイ基板の上面をパリレン３ｚによってコートした後、アミノ基を有するシランカップリング剤を含む溶液中に浸漬し、マイクロホールの内壁２ｂに多数のアミノ基８が露出した反応面を形成した（図７参照）。基板を洗浄して、未反応の余分なカップリング剤等を除去した後、５’末端をアミノ基で修飾した鋳型ＤＮＡを含むＤＭＳＯ溶液をマイクロホール内に導入し、前記反応面に鋳型ＤＮＡを固定化した。ここで、上記ＤＭＳＯ溶液の導入方法としてスーパーインクジェット技術を適用したので、マイクロホールアレイ中の任意のマイクロホールに所定量の鋳型ＤＮＡを導入することができた。以上の方法により、ＤＮＡマイクロアレイ基板を得た。
また、パリレンコーティングに代えてアルミ薄膜コーティングを行った場合、及びアミノ基に代えてエポキシ基を有するシランカップリング剤を使用した場合にも、同様にＤＮＡマイクロアレイ基板を作製することができた。
【００７０】
得られたＤＮＡマイクロアレイ基板を使用して、実施例１と同様の方法により、無細胞タンパク質合成用溶液をマイクロホール内に導入し、脂質二分子膜によって封止したプロテインチップ１０を得た。所定のマイクロホール内において、鋳型ＤＮＡにコードされたＴｕｒｂｏＧＦＰが発現していることが確認された。
さらに、無細胞タンパク質合成用溶液に前記ハイドロゲル前駆体及び重合開始剤を混合してマイクロホール内に導入し、光照射によってゲル化した後においても同様にＴｕｒｂｏＧＦＰが発現することが確認された。
【００７１】
実施例３の方法によれば、鋳型ＤＮＡにコードされた目的タンパク質の合成は、マイクロホール内に無細胞タンパク質合成系溶液を導入した後に開始されるので、溶液をマイクロホール内に導入することに伴う目的タンパク質の変性をより一層確実に防ぐことができる。
【００７２】
［実施例４］
＜ＤＮＡマイクロアレイ基板の作製（２）＞
実施例３と同様の方法により、マイクロホールアレイ基板のマイクロホールの内壁２ｂに多数のアミノ基が露出した反応面を形成した（図８参照）。基板を洗浄して、未反応の余分なカップリング剤等を除去した後、末端にＮ−ヒドロキシスクシンイミド基を有するビオチン誘導体を含む溶液中に浸漬し、前記反応面にアミド結合を介して多数のビオチン誘導体を結合させた。基板を水で洗浄して、未反応の余分なビオチン誘導体を除去した後、１分子中に複数のビオチン結合サイトを有する公知のアビジンをリンカー分子８ｚとして導入し、ビオチン-アビジン反応によって前記反応面に多数のアビジンを結合させた。続いて、未結合のアビジンを除去した後、５’末端をビオチンで修飾した鋳型ＤＮＡを含むＤＭＳＯ溶液をマイクロホール内に導入し、前記リンカー分子を介して、マイクロホールの内壁に鋳型ＤＮＡを固定化した。ここで、上記ＤＭＳＯ溶液の導入方法としてスーパーインクジェット技術を適用したため、マイクロホールアレイ中の任意のマイクロホールに所定量の鋳型ＤＮＡを導入することができた。以上の方法により、ＤＮＡマイクロアレイ基板を得た。
【００７３】
得られたＤＮＡマイクロアレイ基板を使用して、実施例１と同様の方法により、無細胞タンパク質合成用溶液をマイクロホール内に導入し、脂質二分子膜によって封止した人工細胞アレイ基板を得た。所定のマイクロホール内において、鋳型ＤＮＡにコードされたＴｕｒｂｏＧＦＰが発現していることが確認された。
さらに、無細胞タンパク質合成用溶液に前記ハイドロゲル前駆体及び重合開始剤を混合してマイクロホール内に導入し、光照射によってゲル化した後においても同様にＴｕｒｂｏＧＦＰが発現することが確認された。
【００７４】
実施例４の方法によれば、鋳型ＤＮＡにコードされた目的タンパク質の合成は、マイクロホール内に無細胞タンパク質合成系溶液を導入した後に開始されるので、溶液をマイクロホール内に導入することに伴う目的タンパク質の変性をより一層確実に防ぐことができる。
【００７５】
［実施例５］
＜電気生理測定用プロテインチップの作製＞
マイクロホール内に電極を備えた図４に示すマイクロホールアレイ基板を特開２０１１−１６０７１８号公報に記載された方法で作製した。実施例１と同様に所定の細胞内タンパク質をコードした鋳型ＤＮＡを含む無細胞タンパク質合成用溶液を、電極を備えたマイクロホール内に流入させて、脂質二分子膜によってシールした。続いて、脂質二分子膜を覆う外液にイオンチャネルである膜タンパク質を含むベシクルを添加して、公知のベシクルフュージョン法によって、マイクロホールの開口部をシールする前記脂質二分子膜に当該イオンチャネルを設置した。得られた電気生理測定用プロテインチップの外液のイオン濃度を変化させたところ、当該イオンチャネルを介してイオンが脂質二分子膜を透過して、マイクロホール内のイオン濃度が変化したことを前記電極で測定することができた。このイオン濃度変化に応じて、マイクロホール内で発現させたタンパク質の挙動を変化させることも可能である。また、マイクロホール内をハイドロゲルで満たした場合にも同様に、脂質二分子膜にイオンチャネルを設置し、マイクロホール内にイオンを透過させることが可能であった。
【００７６】
以上の様に膜タンパク質を備えた脂質二分子膜にシールされたマイクロホール内において、細胞内環境を模したハイドロゲル及び細胞内タンパク質を備えたプロテインチップは、生体が有する細胞の重要な機能を再構成した系であると言え、人工細胞アレイ基板と呼ぶに相応しい。
【００７７】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明にかかる基板は、生体分子の機能測定の分野に広く適用可能である。
【符号の説明】
【００７９】
１…基板本体、２…マイクロホール（穴部）、３…酸化シリコン層、３ａ…オーバーハング部、４…タンパク質合成系溶液、４ｚ…目的タンパク質、５…脂質二分子膜、６…膜タンパク質、７…ハイドロゲル、８…官能基、８ｚ…リンカー分子、９…目的タンパク質をコードした核酸
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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