(57)【要約】【課題】特異的かつ高感度に標的物質を測定することができる方法を提供すること。【解決手段】以下を含む、標的物質の測定方法：１）標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液を得ること；２）前記放出溶液において、共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定すること；３）前記固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること；ならびに４）前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量に基づき、標的物質の存在または量を評価すること。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、標的物質の測定方法：
１）標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を、溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液を得ること；
２）前記放出溶液において、共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定すること；
３）前記固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること；ならびに
４）前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量に基づき、標的物質の存在または量を評価すること。
【請求項２】
切断性リンカーが、共有結合性リンカー、または親和性リンカーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標的物質が抗原であり、かつ、第１親和性分子および第２親和性分子の各々が抗体である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記第１親和性分子が、抗原の第１エピトープに対する抗体であり、かつ前記第２親和性分子が、抗原の第２エピトープに対する抗体である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
標的物質を含むサンプルを、前記第１親和性分子および前記第２親和性分子と接触させて、前記蛍光分子標識複合体を調製することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光分子標識複合体の調製の間および/または後に、固相を洗浄することをさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記工程１）が以下により行われる、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法：
１−１）前記蛍光分子標識複合体を溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液、および固相を含む二相系を得ること；ならびに
１−２）前記二相系から固相を除去して、蛍光分子標識複合体を含み、かつ固相を含まない放出溶液を得ること。
【請求項８】
前記工程２）が、フォトンカウンティング法により行われる、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記特性が、分子量または蛍光特性である、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記工程３）が、蛍光相関法、または蛍光相互相関法を利用して行われる、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記固相が磁性ビーズである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
以下を含む標的物質の測定方法である、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法：
ａ１）標的物質を含むサンプルを、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子と液相中で接触させて、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および前記第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体と、液相とを含む第１二相系を得ること；
ａ２）第１二相系から液相を除去して、前記蛍光分子標識複合体を得ること；
ａ３）前記蛍光分子標識複合体を溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液、および固相を含む第２二相系を得ること；
ａ４）前記第２二相系から固相を除去して、蛍光分子標識複合体を含み、かつ固相を含まない放出溶液を得ること；
ａ５）前記放出溶液において、共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定すること；
ａ６）前記固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること；ならびに
ａ７）前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量に基づき、標的物質の存在または量を評価すること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的物質の測定方法として、免疫学的方法が従来から行われている。免疫学的方法では、典型的には、標的物質を標識抗体と接触させて標識複合体を形成し、次いで、形成された標識複合体中の標識を利用することにより、標的物質が測定される。このような方法として、固相を用いる測定方法（例、非特許文献１）、および固相を用いることなく、均質な液相系を利用する測定方法（例、特許文献１、非特許文献１）等の先行技術が報告されている。
【０００３】
また、共焦点蛍光検出が、免疫学的方法による標的物質の高感度測定に利用されている（特許文献１、非特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−３４５３１１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｔｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２００７，ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．１１，ｐｐ．１９９０−１９９５
【非特許文献２】Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，ｖｏｌ．３７０，ｐｐ．１３１−１４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、従来の免疫学的方法を利用した共焦点蛍光検出では、必ずしも標的物質を特異的に測定することができていなかった、換言すれば、標的物質の測定精度が十分ではなかったという課題が存在することを見出した。例えば、このような従来の蛍光検出法では、特異シグナルのみならず非特異シグナルもまた計測されるが、これらのシグナルはしばしば識別できないことから、標的物質の測定精度を改善する余地があると考えられた。
【０００７】
具体的には、非特許文献１に記載される方法では、磁性微粒子に固定された、標的物質を含む蛍光分子標識複合体（磁性微粒子−ストレプトアビジン−ビオチン標識捕捉抗体−標的物質−蛍光分子標識検出抗体）を変性剤（尿素）で処理することにより、蛍光分子標識複合体の各構成因子を無差別に解離させ、換言すれば、蛍光分子標識抗体を磁性微粒子（固相）から溶液（液相）中に放出させ、次いで、放出された蛍光分子標識抗体を含む溶液を共焦点検出器で光学解析することにより、蛍光分子標識抗体から発生する蛍光シグナルを検出している。この方法では、検出された蛍光シグナルのイベント数は、標的物質を含む蛍光分子標識複合体数（すなわち、標的物質数）に相当するという前提下で、標的物質が測定される。
【０００８】
しかしながら、この方法では、磁性微粒子に非特異的に結合した蛍光分子標識抗体（非特異物質）もまた、変性剤による磁性微粒子の処理により、磁性微粒子から放出されると考えられる。したがって、この方法では、非特異物質から発生する非特異シグナルが計測されるという課題がある。また、この方法では、計測された蛍光シグナルが、上記複合体由来の蛍光分子標識抗体、または磁性微粒子に非特異的に結合した蛍光分子標識抗体（非特異物質）のいずれに由来するのか識別することができないという課題がある。
【０００９】
また、特許文献１および非特許文献２に記載される方法では、磁性微粒子等の固相を利用することなく、均質な液相系で標的物質（プリオンタンパク質）が測定される。これらの方法は、特異シグナルの差別的な計測を可能にする方法論として開発された、蛍光相関法（ＦＣＳ）／蛍光相互相関法（ＦＣＣＳ）を利用した共焦点蛍光検出において、標的物質を測定することから、一見すると、標的物質および蛍光分子標識抗体を含む蛍光分子標識複合体（特異複合体）から発生する特異シグナルを特異的に計測できそうである。
【００１０】
しかしながら、本発明者らは、これらの方法も特異シグナルの特異的計測に十分であるとはいえず、依然として課題が存在することを見出した。
【００１１】
第１に、これらの方法では、未反応の蛍光分子標識抗体が液相中に多く残存するため、十分な測定精度を得ることができないという課題（課題Ｉ）がある。免疫学的方法により抗原を測定する場合、一般的に、標的物質である抗原の量に比べて、多量の捕捉抗体や標識抗体が使用される。従って、一般的な免疫学的方法では、未反応の蛍光分子標識抗体が液相中に多く残存し、多くの非特異シグナルが検出される。そうすると、検出されるシグナル中の非特異シグナルの比率が高くなり、結果として演算（フィッティング）精度が落ちる。具体的には、ＦＣＳ／ＦＣＣＳを利用した共焦点蛍光検出では、例えば、検出されたシグナルの何％が非特異シグナル（ＮＳＳ）由来で、何％が特異シグナル（ＳＳ）由来か（つまり、ＮＳＳとＳＳの割合）がアウトプットとして得られる。そうすると、多量の遊離蛍光分子を含む均質な液相系において、ＳＳを生じる蛍光分子標識複合体が、ＮＳＳを生じる遊離蛍光分子に比べてごく微量にしか存在しない場合、ＳＳについての値（シグナル）が、ＮＳＳについての値（バックグラウンド）のばらつき内に隠れてしまい、ＳＳの値を特異的に認識することができない。
【００１２】
第２に、これらの方法では、非特異複合体の特性（例、分子量）が特異複合体のものと類似する場合、特異シグナルを十分に識別できないという課題（課題ＩＩ）がある。具体的には、これらの方法では、蛍光分子標識抗体がサンプル中の夾雑物等と非特異的に結合することがあるため、このような非特異結合により標的物質を含まない非特異複合体が形成され、かつ、非特異複合体の特性（例、分子量）が特異複合体のものと類似する場合、特異複合体から発生する特異シグナルを、非特異複合体から発生する非特異シグナルと十分に識別できず、結果として十分な測定精度を得ることができないと考えられる。
【００１３】
これらの課題はまた、サンプル中において標的物質の量が相対的に少なく、かつサンプル中の夾雑物等の量が相対的に多い場合、特に懸念される。
【００１４】
したがって、本発明の第１の目的は、共焦点蛍光検出による標的物質の高感度測定において測定精度を改善することである。
【００１５】
また、従来の免疫学的方法を利用した共焦点蛍光検出では、測定サンプルのマトリクス成分（蛍光を発する成分）由来のノイズ、例えば振動などの測定機器に由来する機械的ノイズ、外部からの電界、熱変動による電子放出、アースからの誘導ノイズといった電気的ノイズ等に起因して、測定サンプル中に蛍光標識が含まれていないゼロ濃度においても非特異シグナルが検出されてしまい、特異シグナルの正確な検出が困難となる場合もある。
【００１６】
実際、非特許文献１のＴａｂｌｅ  １には、測定サンプル中の蛍光標識抗体（標的物質）がゼロ濃度である場合であっても信号強度がゼロではないことが示されている。よって非特許文献１に記載される方法では、特に標的物質の濃度が低い場合には、特異シグナルの検出精度に大きな影響を与え、検出精度が低下してしまうという課題もある。
【００１７】
したがって、本発明の第２の目的は、測定サンプルのマトリクス成分（蛍光を発する成分）由来のノイズを排除して、検出精度をより向上させることができる蛍光標識検出システムおよびかかる蛍光標識検出システムを用いた蛍光標識検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（第１の目的）
共焦点蛍光検出による高感度測定系では、光学的に検出される被解析物が液相中にあることを要するため、標的物質を含む蛍光分子標識複合体を液相中で形成させ、次いで、この複合体中の蛍光分子から発生するシグナルを計測することが必要であると考えられる。また、特許文献１および非特許文献２に記載されるように、ＦＣＳ／ＦＣＣＳを利用した共焦点蛍光検出により、目的の複合体から発生する特異シグナルをより特異的に検出できると考えられる。しかしながら、このような測定系では、上述したように、依然として十分な測定精度を得ることができない事態が想定される。
【００１９】
先ず、本発明者らは、このような状況の下で鋭意検討した結果、標的物質を含む蛍光分子標識複合体を液相中で形成させるのではなく、一旦固相で形成された当該複合体を、その結合状態を維持したまま固相から液相中に特異的に放出させること（特異的放出）により、共焦点蛍光検出による標的物質の高感度測定において測定精度を改善できることを着想した。
【００２０】
具体的には、本方法論により、課題ＩおよびＩＩが以下のとおり解決される。
【００２１】
第１に、標的物質を含む蛍光分子標識複合体を、液相中で形成させるのではなく、一旦固相で形成させることにより、当該固相を、多量の遊離蛍光分子を含む液相系から分離することが可能になる。これにより、非特異シグナルを生じる遊離蛍光分子の割合、ひいてはバックグランド値を低減させることができ、その結果、特異シグナルの認識性を向上させることができる。したがって、このような方法論により、課題Ｉを解決することができる。
【００２２】
第２に、固相で形成された、標的物質を含む蛍光分子標識複合体を、その結合状態を維持したまま固相から液相中に特異的に放出させることにより、特異シグナルの識別性を向上させることができる。標的物質を含む蛍光分子標識複合体（特異複合体）は、一般に、高い分子量を有する。上述したように、蛍光分子標識抗体を含み、かつ標的物質を含まない非特異複合体が形成され、かつ、非特異複合体の分子量が特異複合体のものと類似する場合、非特異複合体もまた、特異複合体に類似する高い分子量を有する。一旦固相で形成された特異複合体を、その結合状態を維持したまま固相から液相中に特異的に放出させ（換言すれば、固相に非特異的に結合した非特異複合体を放出させず）、次いで、液相において、この特異複合体中の蛍光分子から発生する特異シグナルを共焦点蛍光検出器で計測することにより、特異シグナルの認識性を向上させることができる。したがって、このような方法論により、課題ＩＩを解決することができる。
【００２３】
次いで、本発明者らは、かかる着想を実現するため、鋭意検討した。その結果、本発明者らは、特異的放出のためには、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を固相系として利用すればよいこと、などを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明者らが把握する限り、固相および共焦点蛍光検出を併用することにより、標的物質の高感度測定を実現する方法は知られていない。
【００２４】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、標的物質の測定方法：
１）標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を、溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液を得ること；
２）前記放出溶液において、共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定すること；
３）前記固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること；ならびに
４）前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量に基づき、標的物質の存在または量を評価すること。
〔２〕切断性リンカーが、共有結合性リンカー、または親和性リンカーである、〔１〕の方法。
〔３〕標的物質が抗原であり、かつ、第１親和性分子および第２親和性分子の各々が抗体である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記第１親和性分子が、抗原の第１エピトープに対する抗体であり、かつ前記第２親和性分子が、抗原の第２エピトープに対する抗体である、〔３〕の方法。
〔５〕標的物質を含むサンプルを、前記第１親和性分子および前記第２親和性分子と接触させて、前記蛍光分子標識複合体を調製することをさらに含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕前記蛍光分子標識複合体の調製の間および/または後に、固相を洗浄することをさらに含む、〔５〕の方法。
〔７〕前記工程１）が以下により行われる、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法：
１−１）前記蛍光分子標識複合体を溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液、および固相を含む二相系を得ること；ならびに
１−２）前記二相系から固相を除去して、蛍光分子標識複合体を含み、かつ固相を含まない放出溶液を得ること。
〔８〕前記工程２）が、フォトンカウンティング法により行われる、〔１〕〜〔７〕のいずれかの方法。
〔９〕前記特性が、分子量または蛍光特性である、〔１〕〜〔８〕のいずれかの方法。
〔１０〕前記工程３）が、蛍光相関法、または蛍光相互相関法を利用して行われる、〔１〕〜〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕前記固相が磁性ビーズである、〔１〕〜〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕以下を含む標的物質の測定方法である、〔１〕〜〔１１〕のいずれかの方法：
ａ１）標的物質を含むサンプルを、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子と液相中で接触させて、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および前記第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体と、液相とを含む第１二相系を得ること；
ａ２）第１二相系から液相を除去して、前記蛍光分子標識複合体を得ること；
ａ３）前記蛍光分子標識複合体を溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液、および固相を含む第２二相系を得ること；
ａ４）前記第２二相系から固相を除去して、蛍光分子標識複合体を含み、かつ固相を含まない放出溶液を得ること；
ａ５）前記放出溶液において、共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定すること；
ａ６）前記固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること；ならびに
ａ７）前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量に基づき、標的物質の存在または量を評価すること。
【００２５】
（第２の目的）
本発明者らはまた、測定サンプルのマトリクス成分（蛍光を発する成分）由来のノイズの排除について鋭意検討した結果、パルスカウンティング法と、ＦＣＳ、ＦＣＣＳなどの解析方法とを組み合わせることにより、上記の課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２６】
すなわち、本発明は、下記［１’］〜［８’］を提供する。
［１’］測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出する共焦点検出部と、
前記共焦点検出部に接続されており、該共焦点検出部が生成したパルス信号データに基づいて一次測定データを生成し、蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の存在比率を算出し、前記一次測定データおよび前記存在比率に基づいて蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の数を決定して二次測定データを形成する演算部と
を含む、蛍光標識検出システム。
［２’］前記共焦点検出部が、レーザー光を発生して出力するレーザー光発生部と、該レーザー光発生部に接続されており、レーザー光を前記測定サンプルに照射し、該測定サンプル中で生じた蛍光光子を出射する光学的処理部と、該光学的処理部に接続されており、前記蛍光光子を検出する検出部とを含む、［１’］に記載の蛍光標識検出システム。
［３’］前記検出部が、前記光学的処理部に接続されており、該光学的処理部が出射した前記蛍光光子が入射され、入射された該蛍光光子を光量に基づいて電気信号に変換して出力するセンサー部と、該センサー部に接続されており、該センサー部が出力した電気信号を増幅して電気パルス信号に変換して出力する電気信号処理部とを含む、［２’］に記載の蛍光標識検出システム。
［４’］前記検出部が、前記電気信号処理部に接続されており、該電気信号処理部が出力した電気パルス信号が入力され、入力された電気パルス信号に基づいて計数データを形成し、これを出力する計数部をさらに含む、［３’］に記載の蛍光標識検出システム。
［５’］前記演算部が、前記検出部が出力したパルス信号データを収録し、該パルス信号データを再計数して再計数データを算出し、該再計数データと閾値とを対照して該閾値を超える有効イベント数を計数して一次測定データを生成し、前記パルス信号データに基づいて自己相関関数データを生成し、該自己相関関数データを統計的に処理して蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の存在比率を算出し、前記一次測定データおよび前記存在比率に基づいて蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の数を決定して二次測定データを生成する演算部である、［２’］〜［４’］のいずれか１つに記載の蛍光標識検出システム。
［６’］共焦点検出部が、測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出し、検出された前記蛍光光子の数に基づいてパルス信号データを生成する工程と、
演算部が、前記パルス信号データに基づいて、一次測定値を算出し、一次測定データを生成する工程と、
前記演算部が、前記パルス信号データに基づいて蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の存在比率を算出する工程と、
前記演算部が、前記一次測定データおよび前記存在比率に基づいて蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の数を決定して二次測定データを生成する工程と
を含む、蛍光標識検出方法。
［７’］前記一次測定データを生成する工程が、演算部がパルス信号データを所定のビニング幅で再計数して再計数データを生成し、再計数データの各イベントの信号強度値と閾値とを対照し、該閾値を超えるイベントのみを再計数して一次測定値を算出し、一次測定データを生成する工程を含む、［６’］に記載の蛍光標識検出方法。
［８’］前記存在比率を算出する工程が、前記演算部が前記パルス信号データに基づいて自己相関関数を算出し、自己相関関数データを生成する工程と、前記演算部が前記自己相関関数データを統計的に処理して、蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の存在比率を算出する工程とを含む、［６’］または［７’］に記載の蛍光標識検出方法。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の方法は、標的物質を特異的に測定することができるため、標的物質の定性的および定量的測定に有用である。本発明の方法はまた、サンプルが超微量の標的物質しか含まない場合であっても、標的物質を超高感度に検出することができる。
また、本発明によれば、極めて低濃度であってもより精度よく特異的に蛍光標識を検出し、定量することができる蛍光標識検出システムおよびかかる蛍光標識検出システムを用いた蛍光標識検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、標的物質、切断性リンカーを有する第１親和性分子が固定された固相（即ち、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子）、および蛍光分子で標識された第２親和性分子の接触による、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体の調製の一例（サンドイッチ法）を示す模式図である。固相の洗浄は任意の工程であるが、好ましくは固相は洗浄される。
【図２】図２は、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を切断性リンカーの部位で特異的に切断することによる、蛍光分子標識複合体の固相からの放出を示す模式図である。
【図３】図３は、固相から放出された蛍光分子標識複合体中の蛍光分子から発生した蛍光シグナルを、共焦点蛍光検出器で測定する概要を示す図である。
【図４】図４は、放出溶液において、固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な特性に基づき、蛍光分子標識複合体中の蛍光分子から発生する特異シグナルを、非特異シグナルとは識別して、共焦点蛍光検出器で計測することの一例〔１分子パルスカウンティングと蛍光相互相関法（ＦＣＳ）との組合せ〕を示す図である。ＦＣＳは、共焦点エリア中の分子のゆらぎ（拡散係数）を計測することで、分子量を判別し、蛍光シグナルに対する、特異シグナルの存在率と非特異シグナルの存在率を識別できる。
【図５】図５は、蛍光検出システムの構成例を示す概略的な機能ブロック図である。
【図６】図６は、検出部の構成例を示す概略的な機能ブロック図である。
【図７】図７は、蛍光検出方法を説明するためのフローチャートである。
【図８】図８は、再計数データの一例を示すグラフである。
【図９】図９は、自己相関関数データの一例を示すグラフである。
【図１０】図１０は、共焦点蛍光検出器で測定された、糖リンカーを介して切断した蛍光分子標識複合体の蛍光シグナルデータを再計数した再計数データの一例を示す図である。
【図１１】図１１は、従来法（比較例１）におけるＡＦＰ濃度（ｎｇ／ｍＬ）と蛍光標識複合体の存在比率（％）との関係を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の方法におけるＡＦＰ濃度（ｎｇ／ｍＬ）と二次測定データとの関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、標的物質の測定方法を提供する。
本発明の方法は、以下を含む：
１）標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を、溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液を得ること（切断反応）；
２）前記放出溶液において、共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定すること（カウンティング）；
３）前記固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること（検出）；ならびに
４）前記放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量に基づき、標的物質の存在または量を評価すること（評価）。
【００３０】
１）切断反応
本工程では、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体が、溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断される。これにより、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液を得ることができる。
【００３１】
本発明では、切断性リンカーとは、その種類に応じた特異的な処理により特異的に切断され得る分子または分子複合体をいう。切断性リンカーを特異的に切断することにより、固相に非特異的に結合した物質（例、後述するような非特異物質）の放出を抑制しつつ、固相に固定された蛍光分子標識複合体を溶液中に放出させることができる。得られた放出溶液を測定に用いることにより、バックグランドノイズの低減、およびＳ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比の向上が可能になる。切断性リンカーとしては、例えば、共有結合性リンカー、および親和性リンカーが挙げられる。
【００３２】
共有結合性リンカーは、その種類に応じた特異的な処理により、共有結合の切断を介して特異的に切断され得る分子であり、共有結合を介して蛍光分子標識複合体を固相に固定するために用いられる。共有結合性リンカーを特異的に切断するための処理としては、例えば、酵素等の切断剤（物質）、および刺激（非物質）による処理が挙げられる。
【００３３】
【表１】
2016183966.tif 000002
【００３４】
親和性リンカーは、その種類に応じた特異的な処理により、親和性物質の解離を介して特異的に切断（解離）され得る分子複合体であり、親和性物質を介して蛍光分子標識複合体を固相に固定するために用いられる。親和性リンカーを特異的に切断するための処理としては、例えば、競合剤（例、一対の親和性物質のうちの一方、およびその類似物質）による処理が挙げられる。
【００３５】
【表２】
2016183966.tif 000003
【００３６】
蛍光分子標識複合体は、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む。
【００３７】
本発明の方法で測定されるべき標的物質としては、本発明の方法により測定できる物質である限り特に限定されないが、例えば、アミノ酸重合体（例、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質）、糖（例、オリゴ糖、多糖）、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、および低分子物質、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。標的物質はまた、免疫学的複合体の構成因子（例、抗原、または抗体）であってもよい。標的物質の好ましい一例は、抗原である。本発明の方法は、サンプル中の抗原を測定することができる。このような抗原としては、例えば、アレルギー原因物質である抗原、病原性微生物由来の抗原、ならびに疾患マーカー（腫瘍マーカー、心疾患マーカーおよび腎疾患マーカー）等のバイオマーカーである抗原が挙げられる。標的物質の好ましい別の例は、抗体である。本発明の方法は、サンプル中の抗体（例、血液中の自己抗体）を測定することができる。
【００３８】
標的物質はまた、分子量の観点から、低分子物質、および高い分子量を有する物質に分類することもできる。
用語「低分子物質（ｓｍａｌｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」とは、１，５００未満の分子量を有する化合物をいう。低分子物質は、天然物質または合成物質である。低分子物質の分子量は、１，２００未満、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満または３００未満であってもよい。低分子物質の分子量はまた、５０以上、１００以上、１５０以上または２００以上であってもよい。低分子物質としては、例えば、ビタミン（例、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３等のビタミンＤ）、ホルモン（例、卵胞ホルモン等のステロイドホルモン、甲状腺ホルモン）、アミノ酸化合物、リガンド、脂質、脂肪酸、オピオイド、神経伝達物質（例、カテコールアミン）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、およびオリゴペプチド、あるいは医薬、毒物、および代謝産物が挙げられる。
用語「高い分子量を有する物質」とは、１，５００以上の分子量を有する化合物をいう。高い分子量を有する物質は、例えば、２，０００以上、３，０００以上、５，０００以上、１０，０００以上、１５，０００以上、２０，０００以上、３０，０００以上、または５０，０００以上の分子量を有していてもよい。高い分子量を有する物質はまた、例えば、１０００，０００未満、５００，０００未満、または３００，０００未満の分子量を有していてもよい。
【００３９】
第１親和性分子および第２親和性分子は、標的物質、固相に固定された第１親和性分子および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、固相に固定された蛍光分子標識複合体を親和的結合（例、免疫学的反応）により形成できるものである限り特に限定されない。このような親和性分子としては、例えば、免疫学的複合体の構成因子（例、抗体、および抗原）が挙げられる。例えば、標的物質が抗原である場合、第１親和性分子および第２親和性分子として抗体が好適に使用される。一方、標的物質が抗体である場合、第１親和性分子として、抗原が好適に使用され、かつ第２親和性分子として所望の分子を適宜選択することができる。
【００４０】
好ましくは、第１親和性分子および第２親和性分子の各々は抗体である。このような場合、第１親和性分子および第２親和性分子としては任意の抗体を使用できるが、これらの親和性分子は、好ましくはモノクローナル抗体である。第１抗体および第２親和性分子はそれぞれ、免疫グロブリン（例、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）のいずれのアイソタイプであってもよい。第１抗体および第２抗体はまた、全長抗体であってもよい。全長抗体とは、可変領域および定常領域を各々含む重鎖および軽鎖を含む抗体（例、２つのＦａｂ部分およびＦｃ部分を含む抗体）をいう。第１抗体および第２抗体はまた、このような全長抗体に由来する抗体断片であってもよい。抗体断片は、全長抗体の一部であり、例えば、定常領域欠失抗体（例、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）が挙げられる。第１抗体および第２抗体はまた、単鎖抗体等の改変抗体であってもよい。
【００４１】
固相としては、例えば、液相を収容または搭載可能な固相（例、プレート、メンブレン、試験管等の支持体、およびウェルプレート、マイクロ流路、ガラスキャピラリー、ナノピラー、モノリスカラム等の容器）、ならびに液相中に懸濁または分散可能な固相（例、ビーズ等の固相担体）が挙げられる。固相の材料としては、例えば、ガラス、プラスチック、金属、カーボンが挙げられる。固相の材料としてはまた、非磁性材料または磁性材料を用いることができるが、操作の簡便性等の観点から、磁性材料が好ましい。固相は、好ましくは固相担体であり、より好ましくは磁性固相担体であり、さらにより好ましくは磁性ビーズである。
【００４２】
固相に切断性リンカーを介して固定された第１親和性分子の調製は、公知の方法により行うことができる。
切断性リンカーが共有結合性リンカーの場合、固相に切断性リンカーを固定した後に、切断性リンカーに第１親和性分子を固定化してもよいし、第１親和性分子に切断性リンカーを結合した後に、該切断性リンカーを介して固相に第１親和性分子を固定してもよい。切断性リンカーが親和性リンカーの場合、一対の親和性物質の一方を固相に固定し、他方を第１親和性分子に結合した後に、親和性物質間の親和性により、第１親和性分子を固相に固定することができる。固相への切断性リンカーの固定、及び第１親和性分子と切断性リンカーの結合は、切断性リンカーの特異的切断反応を適宜行うことができれば、どのような結合様式であってもよく、例えば、物理的吸着、共有結合、イオン結合、親和性を利用した結合、およびこれらの組み合わせなどにより行うことができる。例えば、共有結合は、架橋剤を用いて達成することができる。このような架橋剤としては、例えば、マレイミド試薬、カルボジイミド試薬、グルタルアルデヒド、および塩化シアヌリルが挙げられる（ペプチド合成法，丸善株式会社，（昭和５０年）；酵素免疫測定法，共立出版（１９８７年）；蛋白質核酸酵素  別冊第３１号（１９８７年）参照）。マレイミド試薬としては、例えば、Ｎ−サクシニミジルマレイミド酢酸、Ｎ−サクシニミジル  ４−マレイミド酪酸（ＧＭＢＳ）、Ｎ−サクシニミジルマレイミドヘキサン酸、Ｎ−サクシニミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｎ−スルホサクシニミジル  ４−マレイミドメチル−シクロヘキサン−１−カルボン酸が挙げられる。カルボジイミド試薬としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）が挙げられる。カルボジイミド試薬は、反応性基（例、アミド基、エステル基）の導入により、固相への切断性リンカーの固定、及び第１親和性分子と切断性リンカーの結合を達成することができる。
【００４３】
蛍光分子としては、本技術分野で蛍光標識試薬として一般的に用いられている蛍光分子を用いることができる。例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）化合物（例、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７）、ＡＴＴＯ化合物（ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ５５０、ＡＴＴＯＲｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ６４７Ｎ）、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）、ＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン）、ＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、ＲＯＸ（カルボキシ−６−ローダミン）、およびＴＡＭＲＡ（（６−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド）ヘキサノエート）等の低分子物質、並びにＲ−フィコエリスリン（赤色蛍光タンパク質）、およびＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）等の蛍光タンパク質が挙げられる。
【００４４】
蛍光分子で標識された第２親和性分子の調製は、蛍光分子による抗体の標識を可能にする公知の方法により行うことができる。第２親和性分子と蛍光分子の結合は、切断性リンカーの特異的切断反応を適宜行うことができれば、どのような結合様式であってもよく、例えば、物理的吸着、共有結合、イオン結合、親和性を利用した結合、およびこれらの組み合わせなどにより行うことができる。例えば、上述したような架橋剤を用いて行うことができる。
【００４５】
具体的には、固相に固定された第１親和性分子の調製、および蛍光分子で標識された第２親和性分子の調製は、特開平３−１１５８６２号公報、特開平１０−１９７５３５号公報等の既報に開示された方法により行われてもよい。
【００４６】
切断反応で用いられる溶液は、切断性リンカーの部位での切断を阻害せず、かつ、蛍光分子標識複合体の保持（例、標的物質、固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子の親和的結合の維持）を可能にするものであれば特に制限されず、適切な水溶液を用いることができる。このような水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、純水）、および緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液等のＴｒｉｓベースの緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、中性付近のｐＨが適切である。このようなｐＨは、例えばｐＨ５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０、さらにより好ましくは６．５〜７．５である。切断反応で用いられる溶液は、少量の有機溶媒（例、アルコール）、他の成分を含んでいてもよい。
【００４７】
切断反応で用いられる溶液の容量は、一般的には、例えば１〜１０００μＬであり、好ましくは３〜５００μＬであり、より好ましくは５〜２００μＬであり、さらにより好ましくは１０〜１００μＬである。
【００４８】
特異的な切断反応は、蛍光分子標識複合体中の切断性リンカーの種類に応じた適切な処理により行うことができる（例、表１、２を参照）。例えば、蛍光分子標識複合体を物質（例、切断剤および競合剤）で処理する場合、切断反応は、通常４〜４５℃（例えば１０〜４２℃、好ましくは１５〜４０℃）で、１秒〜６時間（例えば３秒〜１時間、好ましくは５秒〜１０分間）程度で行われる。
【００４９】
一実施形態では、第１親和性分子は、標的物質の第１標的部位に対する親和性分子であり、かつ第２親和性分子は、標的物質の第２標的部位に対する親和性分子である。本発明の方法では、第１親和性分子および第２親和性分子のこのような組合せを用いることにより、蛍光分子標識複合体中の蛍光分子から発生する特異シグナルを計測することができる。好ましくは、第１親和性分子は、抗原の第１エピトープに対する抗体であり、かつ第２親和性分子は、抗原の第２エピトープに対する抗体である。
【００５０】
別の実施形態では、第１親和性分子は、標的物質の標的部位に対する親和性分子であり、かつ第２親和性分子は、標的物質および第１親和性分子を含む複合体に対する親和性分子である。本発明の方法では、第１親和性分子および第２親和性分子のこのような組合せを用いることにより、蛍光分子標識複合体中の蛍光分子から発生する特異シグナルを計測することができる。好ましくは、第１親和性分子は、抗原のエピトープに対する抗体であり、かつ第２親和性分子は、抗原および第１親和性分子を含む複合体に対する抗体である。このような第２親和性分子の調製は、例えば、ＷＯ２０１３／０４２４２６に記載される方法を用いて行うことができる。
【００５１】
本発明の方法は、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を提供することをさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の方法は、標的物質を含むサンプルを、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子と接触させて、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を調製することをさらに含んでいてもよい。このような調製は、例えば、１ステップ法、ディレイ１ステップ法、および２ステップ法等のサンドイッチ法等の公知の方法により行うことができる。接触は、標的物質、第１親和性分子および第２親和性分子を、同時または時間差によりインキュベートすることにより行われる。インキュベートは、通常４〜４５℃（例えば１０〜４２℃、好ましくは１５〜４０℃）で、１秒〜６時間（例えば３秒〜１時間、好ましくは１０秒〜１０分間）程度で行われる。
【００５２】
本発明の方法で用いられるサンプルは、上述したような標的物質を含有するサンプルである。サンプルの由来は特に限定されず、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられるが、好ましくは哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。生物学的サンプルとしてはまた、例えば、血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織および細胞抽出液、ならびにこれらの混合物が挙げられる。環境サンプルとしては、例えば、土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。
【００５３】
本発明の方法では、サンプルは、蛍光分子標識複合体の調製前に、予備処理に付されてもよい。このような予備処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、および攪拌が挙げられる。
【００５４】
（洗浄による液相中の非特異物質の除去）
蛍光分子標識複合体が調製される場合、本発明の方法は、蛍光分子標識複合体の調製の間および/または後に、固相を洗浄することをさらに含むことが好ましい。洗浄は、調製中および/または調製後の異なる段階、好ましくは調製中の１以上（例、１〜３）の異なる段階と調製後の段階において行われてもよい。各段階での洗浄回数は、例えば１〜１０回、好ましくは２〜８回、より好ましくは３〜６回である。このような洗浄により、固相に付着した微量溶液中の非特異物質などを排除することができる。洗浄液は、固相に固定された蛍光分子標識複合体の保持（例、標的物質、固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子の親和的結合の維持）を可能にするものであれば特に制限されず、適切な水溶液を用いることができる。このような水溶液としては、例えば、水（例、蒸留水、滅菌水、滅菌蒸留水、純水）、および緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）緩衝液等のＴｒｉｓベースの緩衝液、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液が挙げられる。緩衝液のｐＨは、中性付近のｐＨが適切である。このようなｐＨは、例えばｐＨ５．０〜９．０、好ましくは５．５〜８．５、より好ましくは６．０〜８．０、さらにより好ましくは６．５〜７．５である。洗浄液は、少量の有機溶媒（例、アルコール）、他の成分を含んでいてもよい。
【００５５】
具体的には、蛍光分子標識複合体の調製は、以下のとおり行われてもよい：
ａ１）標的物質を含むサンプルを、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子と液相中で接触させて、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体（固相）と、液相とを含む二相系を得ること；ならびにａ２）上記二相系から液相を除去して、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体（固相）を得ること。
【００５６】
ａ１）は、以下の工程により行われてもよい：
ａ１−１）標的物質を含むサンプルを、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子と液相中で接触させて、標的物質、および切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された中間複合体（固相）と、液相とを含む第１二相系を得ること；
ａ１−２）第１二相系から液相を除去して、切断性リンカーを介して固相に固定された中間複合体（固相）を得ること；ならびに
ａ１−３）切断性リンカーを介して固相に固定された中間複合体（固相）を、蛍光分子で標識された第２親和性分子と液相中で接触させて、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体（固相）と、液相とを含む第２二相系を得ること。
【００５７】
ａ１）では、接触は、標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子をインキュベートすることにより行われる。接触の条件（例、インキュベート条件）は、上述したものと同様である。
【００５８】
ａ１−１）では、接触は、標的物質、および切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子をインキュベートすることにより行われる。接触の条件（例、インキュベート条件）は、上述したものと同様である。
【００５９】
ａ１−２）では、液相を除去することにより、サンプル由来の非特異物質、および切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子の含有液由来の非特異物質を排除することができる。また、ａ１−２）の後、切断性リンカーを介して固相に固定された中間複合体（固相）を洗浄することが好ましい。このような洗浄により、固相に付着した微量溶液中の非特異物質を排除することができる。洗浄液および洗浄回数等の洗浄条件は、上述したものと同様である。
【００６０】
ａ１−３）では、接触は、切断性リンカーを介して固相に固定された中間複合体、および蛍光分子で標識された第２親和性分子をインキュベートすることにより行われる。接触の条件（例、インキュベート条件）は、上述したものと同様である。
【００６１】
ａ２）では、液相を除去することにより、サンプル由来の非特異物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子の含有液由来の非特異物質（又は切断性リンカーを介して固相に固定された中間複合体の含有液由来の非特異物質）、および蛍光分子で標識された第２親和性分子の含有液由来の非特異物質を排除することができる。また、ａ２）の後、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体（固相）を洗浄することが好ましい。このような洗浄により、固相に付着した微量溶液中の非特異物質を排除することができる。洗浄液および洗浄回数等の洗浄条件は、上述したものと同様である。
【００６２】
（固相に非特異的に結合した物質の除去）
１）では、切断反応により、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液が得られる。固相に非特異的に結合した物質は、切断反応後も固相に結合した状態を維持し得るため、切断反応後の系から放出溶液を採取することで（換言すれば、切断反応後の系から固相を除くことで）、固相に非特異的に結合した物質（例、標識分子、標識分子で標識された第２親和性分子）を排除することができる。固相に非特異的に結合した物質の一部は、処理の過程において固相から液相に放出されることがあるので、切断反応後の系から固相を除くことで、固相に非特異的に結合した物質の放出溶液中への混入を回避することができる。
【００６３】
したがって、処理の過程における固相に非特異的に結合した物質の放出溶液への混入を回避するためには、上記１）の工程は、以下により行われることが好ましい：
１−１）標的物質、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、切断性リンカーを介して固相に固定された蛍光分子標識複合体を溶液中において切断性リンカーの部位で特異的に切断して、固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液、および固相を含む二相系を得ること；ならびに
１−２）固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液、および固相を含む二相系から固相を除去して、蛍光分子標識複合体を含み、かつ固相を含まない放出溶液を得ること。
【００６４】
ところで、蛍光分子標識複合体が調製される場合、上記ａ１−２）およびａ２）の工程で上述したとおり、サンプル等由来の非特異物質を含有し得る液相の除去、および/または非特異物質を含有し得る微量溶液が付着した固相の洗浄により、液相および微量溶液中の非特異物質を排除することができる。したがって、放出溶液は、上述の工程により、液相中に分配され易い非特異物質を含まないように既に処理されている。
一方、上記放出溶液を得る工程〔特に、上記１−１）および１−２）の工程〕では、固相に非特異的に結合した物質の放出溶液中の混入を回避することができる。したがって、放出溶液は、上述の工程により、固相に吸着され易い非特異物質を含まないように既に処理されている。
したがって、本発明の方法によれば、液相中に分配され易い非特異物質、および固相に吸着され易い非特異物質の双方を排除できることから、非特異物質の混入に起因するバックグラウンドノイズを効率的に低減させることができ、また、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を向上させることができる。すなわち、本発明の方法は、液相中に分配され易い非特異物質、および固相に吸着され易い非特異物質の双方を物理的に除去することにより、目的標的物質の高感度測定を実現することができる。
【００６５】
２）共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定する工程（カウンティング）
本工程では、放出溶液において、共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルが測定される。これにより、放出溶液中で生じる光子の数に基づいた蛍光シグナルの測定データ（パルス信号データ）が得られる。
【００６６】
共焦点蛍光検出器による蛍光シグナルを測定する工程は、信号を２値化した電気パルス信号に基づいて光子の数を計数するフォトンカウンティング法により行うことができる。これにより、放出溶液中で生じた光子の数に基づいたパルス信号データが得られる。
【００６７】
フォトンカウンティング法で得られるパルス信号データは、時系列の電気パルス信号に関するデータであり、時系列の電気パルス信号データでもよいし、時系列の電気パルス信号を任意時間あたりの信号数（カウント数／秒、Ｈｚ）として計数した計数データでもよい。この計数データは、例えば所定の単位時間（測光ビニング時間）あたりの信号数にかかるデータであり、その単位としては「計数された蛍光光子の数／秒」または「Ｈｚ」が用いられる。
【００６８】
３）放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量の決定
本工程では、蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量が決定される。
【００６９】
上述の放出溶液は、目的の特異シグナル（ＳＳ）を発生する、固相から放出された蛍光分子標識複合体のみならず、目的外の非特異シグナル（ＮＳＳ）を発生する微量の非特異物質を含む可能性がある。このような非特異物質としては、１）遊離蛍光分子、２）蛍光分子で標識された第２親和性分子、３）蛍光分子で標識された第２親和性分子および標的物質を含むが、第１親和性分子を含まない不完全複合体、ならびに４）蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、標的物質を含まない複合体が挙げられる。蛍光分子で標識された第２親和性分子を含む、標的物質を含まない複合体としては、例えば、４ａ）蛍光分子で標識された第２親和性分子、および第１親和性分子を含むが、標的物質を含まない非特異的複合体、ならびに４ｂ）蛍光分子で標識された第２親和性分子、および夾雑物（例、標的物質を含むサンプル中の夾雑物）を含む非特異的複合体が挙げられる。ＮＳＳを発生する非特異物質の完全な排除を目的として上述の方法〔例、上記１）の方法〕が行われ放出溶液が得られたとしても、ＮＳＳを発生する非特異物質のごく一部については、放出溶液中に混入する可能性がある。したがって、このような場合にカウンティングを単に行うと、ＳＳのみならずＮＳＳも計測され得るため、標的物質の正確な測定に支障をきたすおそれがある。一方、ＳＳを発生する、固相から放出された蛍光分子標識複合体と、ＮＳＳを発生する微量の非特異物質とは分子量等の特性が異なり得る。したがって、固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な蛍光シグナルの特性に基づき、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定することで標的物質のより正確な測定が可能である。
【００７０】
蛍光分子標識複合体の存在または量の決定は、固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な特性を利用して行うことができる。固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な特性は、固相から放出された蛍光分子標識複合体を、非特異シグナルを発生する非特異物質から識別できる特性である。固相から放出された蛍光分子標識複合体は、標的物質、切断性リンカーが切断された第１親和性分子、および蛍光分子で標識された第２親和性分子が親和的に結合した複合体であることから、このような結合状態を評価できる特性を指標として利用することができる。したがって、本発明で利用することができる、固相から放出された蛍光分子標識複合体に特異的な特性としては、例えば、分子量（分子サイズ）、蛍光特性（例、２以上の蛍光分子により標識された複合体の標識様式の相違に起因するもの、相互作用による蛍光強度の変化に起因するもの）が挙げられる。
【００７１】
具体的には、蛍光分子標識複合体の存在または量の決定は、例えば、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を利用して行うことができる（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，ｖｏｌ．３７０，ｐｐ．１３１−１４１；Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，４，３９０−４０１，１９７４；Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，１３，１−２７，１９７４；Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ａ，１０：１９３８−１９４５，１９７４；ｉｎ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｙｏｓｃｏｐｙ，１，ｐｐ．３３７−３７８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ａｎｄ  Ｌｏｎｄｏｎ，１９９１；Ｒ．Ｒｉｇｌｅｒ，Ｅ．Ｓ．Ｅｌｓｏｎ（Ｅｄｓ．），Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｔｙｏｓｃｏｐｙ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，２００１）。ＦＣＳによれば、分子量の差異に基づき、計測された蛍光シグナルを解析してＳＳを得ることができる。ＦＣＳは、蛍光で標識した標的分子の媒質中におけるブラウン運動をレーザー共焦点顕微鏡系により微小領域で捉えることによって、自己相関関数を用いて蛍光強度のゆらぎから拡散時間を解析し、標的分子の物理量（分子量、分子数）を測定することにより実行されるもので、このような微小な領域で分子ゆらぎを捕えるＦＣＳによる解析は、高感度で特異的に分子間相互作用を検出する上で有効な手段である。
【００７２】
蛍光分子標識複合体の存在または量の決定はまた、蛍光相互相関法（ＦＣＣＳ）を利用して行うことができる（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，ｖｏｌ．３７０，ｐｐ．１３１−１４１；生化学  第８２巻  第１２号，ｐｐ．１１０３〜１１１６，２０１０；生物物理４８（５），２９０〜２９３，２００８）。ＦＣＣＳが行われる場合、固相に固定された第１親和性分子として、固相に固定された、蛍光分子で標識された第１親和性分子を用いること、および、第１親和性分子の標識に用いられる蛍光分子の波長が、第２親和性分子の標識に用いられる蛍光分子の波長と異なることが必要である。ＦＣＣＳでは、この２種類の蛍光強度のゆらぎを、相互相関関数を用いて解析し、２種類の蛍光分子の相互作用を検出することができる。２種の蛍光分子を利用するＦＣＣＳによれば、ＳＳを発生する蛍光分子標識複合体とＮＳＳを発生する非特異物質との間に分子量（分子サイズ）の差異がない場合であっても、蛍光特性により、計測された蛍光シグナルを解析してＳＳを得ることができる。
【００７３】
本工程では、具体的には、パルス信号データに基づき、相関値（自己相関値または相互相関値）の算出後、相関関数データ（自己相関関数データまたは相互相関関数データ）を生成し、次いで相関関数データを統計的に処理（フィッティング）する。これにより、放出溶液中に含まれる、蛍光分子標識複合体に相当する分子量を有する分子の数、および／または放出溶液中に含まれる、全蛍光分子に対する蛍光分子標識複合体を構成する蛍光分子の存在比率が算出される。次いで、算出された分子数または存在比率に基づいて、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定する。
【００７４】
好ましい実施形態では、本発明の方法における上記工程２）は、フォトンカウンティング法とパルスカウンティング法との組合せにより行われてもよい。
【００７５】
パルスカウンティング法では、パルス信号データから有効イベント数が生成される。具体的には、まず、パルス信号データを、所定のビニング幅で再計数して再計数データを算出する。これにより、各ビニング幅（イベント）に含まれる蛍光信号強度値が得られる。
次いで、所定のビニング幅で再計数された各イベントの信号強度値を予め設定されていた閾値と対照し、信号強度値が予め設定されていた閾値を超えるイベントのみを、有効イベント数としてカウントする。
【００７６】
所定のビニング幅は、好ましくは約１０μ秒〜約１０ｍ秒、より好ましくは約１００μ秒〜約１ｍ秒である。
【００７７】
閾値は、任意の信号/雑音比が保たれるように設定されれば、特に限定されない。例えば、蛍光標識を含まない溶液を測定した場合の平均信号強度値の所定のＳＤ値を閾値として設定することができる。好ましくは１ＳＤ〜１０ＳＤ、より好ましくは３ＳＤ〜８ＳＤを閾値とすることができる。
【００７８】
パルスカウンティング法によれば、低レベルのシグナルを排除することができる。また、シグナル高さのバラツキの影響を受けないため、低信号域では、高Ｓ／Ｎ比での信号計測が実現可能となる。特に、共焦点蛍光検出法により極低濃度の蛍光標識タンパク質を測定する場合などは、数ｆＬレベルの測定体積に蛍光標識分子が通過する時間によりシグナルの高低差が生じる。つまり同じ１分子が測定体積を通過した場合でも、その分子が測定体積を通過する時間（経路）によりシグナル量に差が生じるため、極低濃度域などでの検出法においては、シグナルの高さを計数する方式は、原理的に定量性に欠けてしまう。こういった場合には、シグナルの高さに関係なく、閾値を超える有効イベント数を計数するパルスカウンティング法が非常に有効である。
【００７９】
好ましい別の実施形態では、本発明の方法における上記工程２）および３）は、フォトンカウンティング法と相関法（例、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ）との組合せにより行うことができる。この場合、工程２）および３）はそれぞれ、以下のとおり行われてもよい；
２’）フォトンカウンティング法により共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定して、パルス信号データを得ること；
３ａ’）パルス信号データに基づき相関関数データ（例、自己相関関数データ、相互相関関数データ）を生成すること；および
３ｂ’）相関関数データに基づき、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること。
【００８０】
好ましいさらに別の実施形態では、本発明の方法における上記工程２）および３）は、フォトンカウンティング法と相関法（例、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ）との組合せに基づく分子数の算出により、行うことができる。この場合、工程２）および３）はそれぞれ、以下のとおり行われてもよい；
２−１）フォトンカウンティング法により共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定して、パルス信号データを得ること；
３−１ａ）パルス信号データに基づき相関関数データ（例、自己相関関数データ、相互相関関数データ）を生成すること；
３−１ｂ）相関関数データに基づき、固相から放出された蛍光分子標識複合体に相当する分子量を有する分子の数を算出すること；および
３−１ｃ）算出された分子数から、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること。
【００８１】
好ましいさらに別の実施形態では、本発明の方法における上記工程２）および３）は、フォトンカウンティング法と相関法（例、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ）との組合せに基づく存在比率の算出により行うことができる。この場合、工程２）および３）はそれぞれ、以下のとおり行われてもよい。
２−２）フォトンカウンティング法により共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定して、パルス信号データを得ること；
３−２ａ）パルス信号データに基づき相関関数データ（例、自己相関関数データ、相互相関関数データ）を生成すること；
３−２ｂ）相関関数データに基づき、蛍光シグナルを発する全蛍光分子に対する、固相から放出された蛍光分子標識複合体の存在比率を算出すること；
３−２ｃ）固相から放出された蛍光分子標識複合体の存在比率に基づき、パルス信号データを補正して、固相から放出された蛍光分子標識複合体数に対応するパルス信号数（光子数）を得ること；
３−２ｄ）パルス信号数（光子数）から、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること。
【００８２】
さらに別の実施形態では、本発明の方法における上記工程２）および３）は、フォトンカウンティング法とパルスカウンティング法と相関法（例、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ）との組合せにより行うことができる。
【００８３】
フォトンカウンティング法とパルスカウンティング法と相関法（例、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ）との組合せが利用される場合、工程２）および３）は、以下のとおり行われてもよい；
２−３）フォトンカウンティング法により共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定して、パルス信号データを得ること；
３−３ａ）パルス信号データに基づき相関関数データ（例、自己相関関数データ、相互相関関数データ）を生成すること；
３−３ｂ）相関関数データに基づき、蛍光シグナルを発する全蛍光分子に対する、固相から放出された蛍光分子標識複合体の存在比率を算出すること；
３−３ｃ）パルスカウンティング法によりパルス信号データから有効イベント数（一次測定データ）を生成すること；
３−３ｄ）前記比率に基づき、有効イベント数（一次測定データ）を補正して、固相から放出された蛍光分子標識複合体数に対応するイベント数（二次測定データ）を得ること；ならびに
３−３ｅ）固相から放出された蛍光分子標識複合体数に対応するイベント数（二次測定データ）から、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量を決定すること。
【００８４】
上記工程２）および３）、ならびに上記具体工程２−１）〜２−３）、３−１ａ）〜３−１ｃ）、３−２ａ）〜３−２ｄ）、３−３ａ）〜３−３ｅ）については、例えば、実施例２の方法を参照することができる。また、これらの工程の少なくとも一部は既知であるので、既報の方法（例、特開２００５−３４５３１１号公報；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，ｖｏｌ．３７０，ｐｐ．１３１−１４１；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６０，１１７−１２４，２００２；生化学  第８２巻  第１２号，ｐｐ．１１０３〜１１１６，２０１０；生物物理４８（５），２９０〜２９３，２００８）を参照してもよい。なお、補正は、例えば、パルス信号データ、または有効イベント数（一次測定データ）を、固相から放出された蛍光分子標識複合体の存在比率で乗算することにより行われてもよい。
【００８５】
本発明は、上記工程２）および３）に示されるような光学解析により、ＮＳＳを除去できるので、ＮＳＳを発生する非特異物質に起因するバックグランドノイズを低減させることができ、また、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を向上させることができる。すなわち、本発明では、光学解析において、ＮＳＳを光学的に除去することにより、標的物質の高感度測定を実現することができる。
【００８６】
４）評価
本工程では、標的物質の存在または量が、放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体の存在または量に基づき、評価される。例えば、放出溶液の全部または一部において蛍光分子標識複合体の存在が確認された場合、標的物質が存在すると評価することができる。また、標的物質の量は、放出溶液の全部または一部における蛍光分子標識複合体の量に基づき、評価することができる。例えば、３−２ｃ）または３−３ｄ）において得られる値がパルス信号数（光子数）またはイベント数である場合、別途作成した検量線を用いて標的物質の濃度および分子数を評価することができる。また、例えば、３−１ｂ）においてフィッティングにより標的物質の分子数を算出する場合、検量線を作成することなく、求めた複合体数から標的物質の分子数を評価してもよい。
【００８７】
上記工程２）〜４）は、例えば、ＦＣＳユニット（Ｃ９４１３、浜松ホトニクス株式会社製）、ＦＣＣＳユニット（Ｃ１０８７４−０１、浜松ホトニクス株式会社製）、共焦点スペクトルイメージャー（ＬＳＭ８８０、カールツァイスマイクロスコピー株式会社）、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８  ＳＭＤ  ＦＣＳ、ライカマイクロシステムズ）、ＭＦ２０（オリンパス株式会社製）を用いて行うことができる。
【００８８】
本発明者らが知る限り、非特異物質の除去（物理的除去）と非特異シグナルの除去（光学的除去）とを組み合わせることによる標的物質の測定方法は報告されていない。本発明の方法は、物理的除去（例、固相の洗浄および／または除去による非特異物質の除去）ならびに光学的除去（例、共焦点蛍光検出器による特異シグナルの差別的な計測、および／またはパルスカウンティングによる非特異シグナルの除去）の双方の実現というコンセプトの下、非特異物質および非特異シグナルの双方に起因するバックグランドノイズを低減させることができ、また、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比を向上させることができる。蛍光相関法を用いた従来の方法では、未反応の蛍光分子標識抗体が液相中に多く残存するために、演算（フィッティング）精度が落ち、十分な測定精度を得ることができなかった。特に、サンプル中に標的物質が超微量しか存在しない場合、その標的物質の検出は極めて難しく、事実上不可能であった。また、共焦点蛍光検出法のみを用いた従来の方法では、蛍光シグナルから非特異シグナルを除去できないため、十分な測定感度を得ることができなかった。それに対し、本発明の方法では、光学的除去を行う前に物理的除去を行うことで、非特異シグナルを十分に低減することが可能となり、光学的除去における演算（フィッティング）精度を大幅に改善することができる。したがって、本発明の方法は、サンプルが超微量の標的物質しか含まない場合であっても、標的物質を超高感度に検出することができる点で有用である。
【００８９】
上述したとおり、工程１）〜４）を必須なものとして本発明の方法の主要な実施形態を説明したが、特定の実施形態では、本発明の方法は、工程１）を省略することもできる。この場合、本発明の方法は、工程２）〜４）（およびその具体的形態）により行うことができ、工程２）〜４）で用いられる「固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液」、「固相から放出された蛍光分子標識複合体」、および「放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体」等の蛍光分子標識複合体に関する用語は、単に「蛍光分子標識複合体」と読み替えることができる。また、このような本発明の方法は、蛍光分子標識複合体に限らず、蛍光分子自体にも適用できる。したがって、工程２）〜４）で用いられる「固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液」、「固相から放出された蛍光分子標識複合体」、および「放出溶液中に含まれる蛍光分子標識複合体」等の蛍光分子標識複合体に関する用語は、単に「蛍光分子」と読み替えられてもよい。以下においても同様である。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明の方法における上記工程２）および３）がフォトンカウンティング法とパルスカウンティング法と相関法との組合せにより行われる場合、上記工程（２）および（３）は、特定の蛍光検出システム、またはそれを用いた蛍光検出方法により行われてもよい。
【００９１】
このようなシステムおよび方法としては、例えば、以下が挙げられる。
＜１＞測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出する共焦点検出部と、前記共焦点検出部に接続されており、該共焦点検出部が生成したパルス信号データに基づいて一次測定データを生成し、蛍光分子標識複合体の存在比率を算出し、前記一次測定データおよび前記存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを形成する演算部とを含む、蛍光検出システム。
＜２＞前記共焦点検出部が、レーザー光を発生して出力するレーザー光発生部と、該レーザー光発生部に接続されており、レーザー光を前記測定サンプルに照射し、該測定サンプル中で生じた蛍光光子を出射する光学的処理部と、該光学的処理部に接続されており、前記蛍光光子を検出する検出部とを含む、＜１＞の蛍光検出システム。
＜３＞前記検出部が、前記光学的処理部に接続されており、該光学的処理部が出射した前記蛍光光子が入射され、入射された該蛍光光子を光量に基づいて電気信号に変換して出力するセンサー部と、該センサー部に接続されており、該センサー部が出力した電気信号を増幅して電気パルス信号に変換して出力する電気信号処理部とを含む、＜２＞の蛍光検出システム。
＜４＞前記検出部が、前記電気信号処理部に接続されており、該電気信号処理部が出力した電気パルス信号が入力され、入力された電気パルス信号に基づいて計数データを形成し、これを出力する計数部をさらに含む、＜３＞の蛍光検出システム。
＜５＞前記演算部が、前記検出部が出力したパルス信号データを収録し、該パルス信号データを再計数して再計数データを算出し、該再計数データと閾値とを対照して該閾値を超える有効イベント数を計数して一次測定データを生成し、前記パルス信号データに基づいて相関関数データを生成し、該相関関数データを統計的に処理して蛍光分子標識複合体の存在比率を算出し、前記一次測定データおよび前記存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを生成する演算部である、＜１＞〜＜４＞のいずれかの蛍光検出システム。
＜６＞共焦点検出部が、測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出し、検出された前記蛍光光子の数に基づいてパルス信号データを生成する工程と、演算部が、前記パルス信号データに基づいて、一次測定値を算出し、一次測定データを生成する工程と、前記演算部が、前記パルス信号データに基づいて蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する工程と、前記演算部が、前記一次測定データおよび前記存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを生成する工程とを含む、蛍光検出方法。
＜７＞前記一次測定データを生成する工程が、演算部がパルス信号データを所定のビニング幅で再計数して再計数データを生成し、再計数データの各イベントの信号強度値と閾値とを対照し、該閾値を超えるイベントのみを再計数して一次測定値を算出し、一次測定データを生成する工程を含む、＜６＞の蛍光検出方法。
＜８＞前記存在比率を算出する工程が、前記演算部が前記パルス信号データに基づいて相関関数を算出し、相関関数データを生成する工程と、前記演算部が前記相関関数データを統計的に処理して、蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する工程とを含む、＜６＞または＜７＞の蛍光検出方法。
以下、このようなシステムおよび方法を具体的に説明する。
【００９２】
＜蛍光検出システム＞
蛍光検出システムは、測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出する共焦点検出部と、共焦点検出部に接続されており、該共焦点検出部が生成したパルス信号データに基づいて一次測定データを生成し、蛍光分子標識複合体の存在比率を算出し、一次測定データおよび存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを得る演算部と含む。
【００９３】
以下、図面を参照して、実施形態について説明する。なお、各図面は、発明が理解でき
る程度に、構成要素の形状、大きさおよび配置が概略的に示されているに過ぎない。本発
明は以下の記述によって限定されるものではなく、各構成要素は本発明の要旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。以下の説明において、同様の構成要素については同一の符号を付して示し、重複する説明については省略する場合がある。
【００９４】
図５を参照して、蛍光検出システムの構成例について説明する。図５は、蛍光検出システム１０の構成例を示す概略的な機能ブロック図である。
【００９５】
図５に示されるように、蛍光検出システム１０は、共焦点検出部１２と、共焦点検出部１２に接続されている演算部１４とを備えている。以下、各部について具体的に説明する。
【００９６】
（共焦点検出部）
共焦点検出部１２は、測定サンプルにレーザー光を照射して、測定サンプル中の蛍光標識から生じる蛍光光子（蛍光シグナル）を検出し、検出した蛍光シグナルを電気パルス信号として出力することができる機能部である。
【００９７】
この構成例では共焦点検出部１２は、演算部１４に電気通信回線により接続されているレーザー光発生部２０と、レーザー光発生部２０に光学的に接続されている光学的処理部３０と、光学的処理部３０に光学的に接続されており、かつ演算部１４に電気通信回線により接続されている検出部４０とを備えている。なお、レーザー光発生部２０は、演算部１４に接続されず、演算部１４による制御を受けない構成としてもよい。
【００９８】
ここで「光学的に接続されている」とは、直接的に、あるいは光ファイバなどの光導波路により、光データ、光信号等をやりとりできるように接続されていることを意味している。また「電気通信回線により接続されている」とは、電気、光等の媒体による有線または無線による情報回線により、データ、制御信号等をやりとりすることができるように接続されていることを意味している。
【００９９】
レーザー光発生部２０は、レーザー光を発生して出力することができる機能部である。レーザー光発生部２０が出力するレーザー光は、演算部１４による制御、または他の構成による制御あるいは自律的な制御によりその強度等を最適化することができる。
【０１００】
上述のとおり、レーザー光発生部２０が演算部１４による制御を受けない場合には、レーザー光発生部２０自体が備える電源スイッチのオンオフ、またはメカニカルシャッタ等の開閉によりレーザー光を制御することができ、また光学フィルタ等によってもレーザー光を制御することができる。
【０１０１】
レーザー光発生部２０としては、用いられる蛍光標識に適切な波長のレーザー光を発生することができる従来公知の任意好適なレーザー発振器を用いることができる。
【０１０２】
光学的処理部３０は、レーザー光発生部２０が出力したレーザー光を測定サンプルに照射し、測定サンプル中の蛍光標識により生じる蛍光光子を検出部４０に入射することができる機能部である。光学的処理部３０は、従来公知の任意好適な光学要素を含み、共焦点系を構築できる構成とされる。具体的には光学的処理部３０は、例えば、測定サンプルと対向するように配置されている対物レンズを含む１または２以上のレンズ、光路上に配置される１または２以上のミラー（ダイクロイックミラーを含む。）、ピンホールなどの任意好適な光学要素を所望の設計に対応した任意好適な配置で備え得る。また、光学的処理
部３０は、メカニカルシャッタ、光学フィルタ等を備えていてもよく、メカニカルシャッタの開閉によりレーザー光発生部が出力したレーザー光の特性を制御することができ、また光学フィルタによってもレーザー光の特性を制御することができる。
【０１０３】
検出部４０は、レーザー光が照射されることによって生じる、測定サンプル中の蛍光標識により生じる蛍光光子を検出し、時系列の電気パルス信号に変更することができる機能部であって、光学的処理部３０から蛍光光子が入射され、入射された蛍光光子を検出し、時系列の電気パルス信号に変更して、パルス信号データを演算部１４に出力することができる機能部である。
検出部４０から出力されるパルス信号データは、時系列の電気パルス信号データでもよいし、時系列の電気パルス信号を任意時間あたりの信号数（カウント数／秒、Ｈｚ）とし
て計数された計数データであってもよい。
【０１０４】
図６を参照して、検出部４０の構成例について説明する。図６は、検出部４０の構成例
を示す概略的な機能ブロック図である。
【０１０５】
図６に示されるように、検出部４０は、光学的処理部３０に光学的に接続されているセンサー部４２と、センサー部４２に電気通信回線により接続されている電気信号処理部４４と、電気信号処理部４４に電気通信回線により接続されており、かつ演算部１４に電気通信回線により接続されている計数部４６とを備えている。
後述の工程において、パルス信号データとして電気パルス信号データを用いる場合は、計数部４６を省略することができる。
【０１０６】
なお、センサー部４２と電気信号処理部４４と計数部４６とは、一体的に構成されていてもよい。
【０１０７】
センサー部４２は、光学的処理部３０から、蛍光標識により生じた蛍光光子が入射され、入射された蛍光光子を光量に基づいて電気信号に（光電）変換して出力することができる機能部である。センサー部４２としては、従来公知の任意好適な光電子増倍管（ＰＭＴ）、フォトンカウンティングヘッド、アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、超電導単一光子検出器（ＳＳＰＤ）などを用いることができる。
【０１０８】
電気信号処理部４４は、センサー部４２が出力した電気信号を増幅し、所定の信号処理
を行うことにより、電気パルス信号を生成して出力することができる機能部である。電気信号処理部４４は従来公知の任意好適な増幅回路（増幅回路を含む装置）、および従来公知の任意好適な波高弁別回路（波高弁別回路を含む装置）等の信号処理回路を備えている。
【０１０９】
計数部４６は、計数データを生成し、該計数データを出力することができる機能部である。より具体的には、計数部４６は、共焦点検出部１２、すなわち電気信号処理部４４が出力した電気パルス信号が入力され、入力された電気パルス信号に基づいて任意時間あたりの信号数（カウント数／秒、Ｈｚ）を計数して計数データを形成し、これを出力することができる機能部である。計数部４６は従来公知の任意好適な周波数カウンタ回路（周波数カウンタ回路を含む装置）を用いることができる。計数部４６の動作方式は特に限定されない。動作方式としては、例えばゲート方式、レシプロカル方式が挙げられる。動作方式としては、例えば免疫学的測定を想定した場合の光量、分解能等を勘案すると、レシプロカル方式を採用することが好ましい。
【０１１０】
（演算部）
演算部１４は、検出部４０（電気信号処理部４４、計数部４６）などの外部に直接的または間接的に接続された機能部の動作を統括して制御することができる機能部である。演算部１４は、具体的には検出部４０が出力したパルス信号データを収録し、このパルス信号データを読み出して、取得したパルス信号データを所定のビニング幅で再計数して再計数データを算出し、再計数データと閾値とを対照し、閾値を超える再計数データのイベントの数（有効イベント数）を計数して一次測定値を算出し、一次測定データを生成したり、パルス信号データに基づいて相関関数（例、自己相関関数、相互相関関数）を算出し、相関関数データを生成したり、相関関数データを統計的に処理して、蛍光分子標識複合体の存在比率を算出したり、一次測定データおよび存在比率等に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを生成したりするなどの機能を有する（詳細は後述する。）。
【０１１１】
演算部１４は、例えばマイクロプロセッサ（ＣＰＵ）、グラフィックプロセッサ（ＧＰＵ）、外部の機能部、機器とデータをやりとりするための例えばシリアル接続、パラレル接続等のインターフェース、入力されたデータ、形成したデータを収録する記憶装置、キーボードなどの入力インターフェース、データを視覚的に表示できる表示機器、紙媒体などに収録されたデータを出力することができるプリンターなどを備えるコンピュータハードウェア資源、あるいは上記各機能部に対応する機能を発揮できる専用のハードウェア資源により実現することができる。
【０１１２】
蛍光検出システム１０は、例えばＦＣＳユニット（浜松ホトニクス株式会社製Ｃ９４１３）、共焦点スペクトルイメージャー（カールツァイスマイクロスコピー株式会社製ＬＳＭ８８０）、共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ製Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８  ＳＭＤ  ＦＣＳ）、一分子蛍光分析システム（オリンパス株式会社製ＭＦ２０）を用いて構成することができる。
また、既に説明した上記の各機能部は、適宜組み合わされて一体的に構成されていてもよい。
【０１１３】
＜蛍光検出方法＞
蛍光検出方法は、上記の蛍光検出システムを用いる蛍光検出方法であって、共焦点検出部が、測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出する工程と、共焦点検出部が、検出された蛍光光子に基づいてパルス信号データを生成し、該パルス信号データに基づいて、演算部が一次測定値（有効イベント数）を算出し、一次測定データを生成する工程と、演算部が、パルス信号データに基づいて蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する工程と、演算部が、一次測定データおよび存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを生成する工程とを含む。
【０１１４】
図７を参照して、蛍光検出方法について説明する。図７は、蛍光検出方法を説明するためのフローチャートである。
【０１１５】
蛍光検出方法を実施するにあたっては、例えば、既報の方法（例、特開２００５−３４５３１１号公報；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，ｖｏｌ．３７０，ｐｐ．１３１−１４１；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６０，１１７−１２４，２００２；生化学  第８２巻  第１２号，ｐｐ．１１０３〜１１１６，２０１０；生物物理４８（５），２９０〜２９３，２００８）を参照し、必要であれば適宜改変して実施することができる。
【０１１６】
図７に示されるように、蛍光検出方法は、測定サンプルが調製される工程（測定サンプル調製工程）（Ｓ１）を含むことが好ましい。
【０１１７】
蛍光検出方法では、液相の測定サンプルが用いられる。測定サンプルは、好ましくは、上記放出溶液である。
【０１１８】
蛍光検出方法は、測定ノイズの影響をより効果的に排除することができる。このようなノイズとしては、測定サンプルに由来するノイズ（例、緩衝液、成分、ｐＨ、温度）、測定機器に由来する機械的ノイズ（例、振動、測定サンプル注入容器の材料）、電気的ノイズ（例、外部からの電界、熱変動による電子放出、アースからの誘導ノイズ、検出器自体からのアフターパルス）等が挙げられる。ノイズ源となり得る緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液（例、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ）、リン酸緩衝液、塩酸−塩化カリウム緩衝液、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸−
リン酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、炭酸−重炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液が挙げられる。ノイズ源となり得る成分としては、ＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイに用いられる成分、生体由来成分等の測定サンプルに混入し得る成分が挙げられる。したがって、本発明で用いられる放出溶液〔例、上記工程１）で用いられる放出溶液〕は、このような条件下にあってもよく、例えば、このような緩衝液または成分を含んでいてもよい。
【０１１９】
［共焦点検出部が測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出し、蛍光光子の数に基づいたパルス信号データを生成する工程］
この工程は、共焦点検出部１２が、測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出し、検出された蛍光光子の数に基づいたパルス信号データを生成し、さらには得られたパルス信号データを演算部に入力する（Ｓ２）工程である。
【０１２０】
この工程は信号を２値化してパルス数によって蛍光光子の数を計数するフォトンカウンティング法により行われる。
【０１２１】
具体的には、まず演算部１４からの制御信号が入力された共焦点検出部１２のレーザー光発生部２０がレーザー光を発生させ、発生したレーザー光が光学的処理部３０に入射される。次いで光学的処理部３０は、導入されたレーザー光を測定サンプルに照射する。測定サンプルに照射されたレーザー光は測定サンプル中の蛍光標識により蛍光光子を放出させる。次に光学的処理部３０は、放出された蛍光光子とレーザー光とを分離し、分離された蛍光光子のみを出射して検出部４０に入射する。このようにして入射された蛍光光子は検出部４０により検出される。
【０１２２】
次いで、共焦点検出部１２の検出部４０は検出された蛍光光子に基づいてデジタル信号であるパルス信号データを生成し、パルス信号データを演算部１４に入力する。演算部１４は取得したパルス信号データを一旦収録する。
【０１２３】
ここでパルス信号データは、時系列の電気パルス信号に関するデータであり、時系列の電気パルス信号データでもよいし、時系列の電気パルス信号を任意時間あたりの信号数（カウント数／秒、Ｈｚ）として計数した計数データでもよい。
【０１２４】
パルス信号データとして、計数データを用いる場合には、例えば、計数部４６は、電気信号処理部４４から入力された電気パルス信号に基づいて蛍光光子の数を計数して計数データを生成する。
【０１２５】
この計数データは、例えば所定の単位時間（測光ビニング時間）あたりの信号数にかかるデータであり、その単位としては「計数された蛍光光子の数／秒」、「Ｈｚ」が用いられる。
【０１２６】
次いで、計数部４６は計数データを演算部１４に入力する。
【０１２７】
フォトンカウンティング法における計測周波数は、後に行われるＦＣＳ、ＦＣＣＳ等による処理を勘案して、一定の時間分解能以上とすることが好ましく、例えば、５ｋＨｚ以上、好ましくは８０ｋＨｚよりも高い周波数とすることが好ましい。
【０１２８】
このようにしてフォトンカウンティング法によるパルス信号データが取得される。
【０１２９】
［演算部が、パルス信号データに基づいて、一次測定値を算出し、一次測定データを生成する工程］
この工程は、パルス信号データに基づいて、演算部１４が一次測定値を算出し、一次測定データを生成する工程である。この工程は、具体的には例えばパルスカウンティング法により行われる。以下、具体的に説明する。
【０１３０】
まず、演算部１４が、パルス信号データを所定のビニング幅で再計数して再計数データを生成する（Ｓ３）。
【０１３１】
具体的には、演算部１４は、収録されたパルス信号データを読み出して、パルス信号データを所定のビニング幅で再計数して再計数データを算出する。これにより、各ビニング幅（イベント）に含まれる蛍光信号強度値が得られる。「所定のビニング幅」は、好ましくは約１０μ秒〜約１０ｍ秒であり、より好ましくは約１００μ秒〜約１ｍ秒である。
【０１３２】
次に、演算部１４は、再計数データの各イベントの信号強度値と閾値とを対照する（Ｓ４）。
【０１３３】
具体的には、演算部１４は、所定のビニング幅で再計数された各イベントの信号強度値をゼロ濃度試料の測定データから算出した閾値、または予め設定されていた閾値等と対照する。
【０１３４】
次いで、演算部１４は、閾値を超えるイベントのみをカウントして一次測定値（有効イベント数）を算出し、一次測定データを生成する（Ｓ５〜Ｓ９）。以下、これらのステップについて具体的に説明する。
【０１３５】
まず、演算部１４は、再計数データの各イベントの信号強度値が予め設定されていた閾値を超えるか、または否かを判定する（Ｓ５）。演算部１４は、各イベントの信号強度値が閾値を超えていた場合（Ｓ５においてＹｅｓ）のみ該当イベントを有効イベント数としてカウントするパルスカウンティング法による再計数を行う（Ｓ６）。演算部１４は、イベントの信号強度値が閾値以下であった場合（Ｓ５においてＮｏ）、該当イベントをカウントしない（非カウントとする。）（Ｓ７）。演算部１４は全イベントについてＳ６またはＳ７の処理が終了したか否かを判定する（Ｓ８）。全イベントについてＳ６またはＳ７
の処理が終了した場合（Ｓ８においてＹｅｓ）、演算部１４はカウントされたイベントの数（有効イベント数）に基づいて一次測定値を算出し、一次測定データを生成し（Ｓ９）、さらに一次測定データを収録する。全イベントについてＳ６またはＳ７の処理が終了していない場合（Ｓ８においてＮｏ）、終了するまでＳ５に戻って処理を繰り返す。
【０１３６】
ここで再計数データの一例を図８に示す。図８は、蛍光標識Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２を含む溶液に、励起波長５３２ｎｍ、励起光強度１ｍＷの励起レーザーを照射し、生じた蛍光光子を３秒間、８０ｋＨｚで電気パルス信号として取得し、ビニング幅１ｍ秒で再計数した再計数データを示す。図８では、約２０００個のイベントそれぞれに含まれる蛍光信号強度値が得られる。例えば、図８において閾値を、蛍光標識を含まない溶液を測定した場合の平均信号強度値の６ＳＤに設定した場合、有効シグナル数は１１８である。
ここで閾値は、任意の信号／雑音比が保たれるように設定されれば、特に限定されない。閾値としては、例えば、蛍光標識を含まない溶液を測定した場合の平均信号強度値（ＳＤ）の値の所定の倍数値を用いることができる。閾値は、好ましくは１ＳＤ〜１０ＳＤとすることができ、より好ましくは３ＳＤ〜８ＳＤとすることができる。
【０１３７】
［演算部がパルス信号データに基づいて蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する工程］
この工程は、演算部１４がパルス信号データに基づいて蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する工程である。ここで存在比率とは、蛍光分子標識複合体の数にかかる二次測定データを得るためのパラメータである。
【０１３８】
二次測定データを得るために用いられる存在比率を算出するためのデータの例としては、ＦＣＳにより算出される自己相関値、およびＦＣＣＳにより算出される相互相関値にかかるデータが挙げられる。
【０１３９】
演算部１４が存在比率を算出する工程の好適な例として、演算部１４がパルス信号データに基づいて相関関数を算出し、相関関数データを生成し、演算部１４が、相関関数データを統計的に処理して、蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する工程を例にとって具体的に説明する。
【０１４０】
まず、演算部１４が、パルス信号データに基づいて相関関数を算出し、相関関数データを生成する（Ｓ１０）。
具体的には、この工程はＦＣＳにより行うことが好ましい。以下、ＦＣＳによりこの工程を実施する例について説明する。ＦＣＳによる自己相関関数の算出は、公知の方法であれば特に限定されない。例えば、マルチプルタウ方式により行うことができる。
以下、マルチプルタウ方式による自己相関関数の算出工程について具体的に説明する。
【０１４１】
まず、演算部１４は、収録されたパルス信号データを読み出し、このパルス信号データと下記式（１）とに基づいて、自己相関関数を算出して自己相関関数データを生成し、さらには自己相関関数データを収録する。
【０１４２】
【数１】
2016183966.tif 000004
【０１４３】
式（１）中、符号「＜＞」は調和平均を表し、Ｉは蛍光強度信号を表し、δＩ（ｔ）は、蛍光強度信号の揺らぎ成分を表し、δ（ｔ＋τ）はτ（時間）後の蛍光強度信号の揺らぎ成分を表す。
【０１４４】
ここでマルチプルタウ方式により算出された自己相関関数データ（自己相関値Ｇ（ｔ）と時間との関係とを示すデータ）の一例を図９に示す。
具体的には、図９は、タンパク質をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２で蛍光標識した分子を試料とし、８０ｋＨｚでフォトンカウンティングしたパルス信号データから、最小タウ２００μ秒で自己相関関数を算出した結果を示している。
【０１４５】
次に、演算部１４が、自己相関関数データを統計的に処理して、蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する（Ｓ１１）。
【０１４６】
具体的には、演算部１４は、収録された自己相関関数データを読み出し、例えば、下記式（２）を用いて統計的に処理（フィッティング）する。
【０１４７】
【数２】
2016183966.tif 000005
【０１４８】
式（２）中、Ｔは３重項状態の比率を表し、τｔｒｉｐは３重項状態の並進拡散時間を表し、τｉはｉ成分（Ｉｎｄｅｘ）の並進拡散時間を表し、ｆｉはｉ成分の比率を表し、Ｎは分子の数を表し、Ｍは分子種の数を表し、ｓは観測領域の長軸半径と短軸半径との比を表す。
【０１４９】
このようにして、Ｔ、τｔｒｉｐ、τｉ、ｆｉ、Ｎ、Ｍ、ｓ（算出パラメータという。）が算出され、さらに計数された蛍光光子の総数（イベント数）のうちの蛍光分子標識複合体の存在比率を算出することができる。そして演算部１４は、算出された数値（存在比率）を収録する。
【０１５０】
この工程におけるフィッティングは、例えば、レベンバーグマルカドール法により行うことができる。
【０１５１】
［演算部が、一次測定データおよび存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを得る工程］
この工程は、演算部１４が、一次測定データおよび存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定して二次測定データを得る工程である（Ｓ１２）。
【０１５２】
具体的には、演算部１４が一次測定データ（一次測定値）、および上記の統計的な処理により算出された存在比率を用いて蛍光分子標識複合体の数（濃度）を決定する。このときに用いられる存在比率は、上記のいずれの方法により得られたものであってよく、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【０１５３】
演算部１４は、一次測定データと存在比率とから目的の蛍光分子標識複合体の数（濃度）を決定し、得られた決定値（二次測定データ）を収録する。二次測定データは、例えば下記の計算式に基づいて得ることができる。
計算式：一次測定データ（一次測定値）×存在比率＝二次測定データ（決定値）
【０１５４】
以上の工程により、測定対象である蛍光分子標識複合体の数（濃度）を精度よく決定することができる。
【０１５５】
なお、上述した蛍光検出方法においてはパルス測定データを得る工程（Ｓ２）の次に、一次測定データを得る工程（Ｓ３〜Ｓ９）を行う例を説明したが、パルス測定データを得る工程（Ｓ２）の次に、パルス測定データに基づいて存在比率を得る工程（Ｓ１０及びＳ１１）を行い、次いで一次測定データを得る工程（Ｓ３〜Ｓ９）を行ってもよい。
【０１５６】
このような蛍光検出方法によれば、フォトンカウンティング法およびパルスカウンティング法を組み合わせることにより、パルス信号の高さのばらつきの影響を受けないため、低レベルのパルス信号域でも、高いＳ／Ｎ比での信号計測を行うことができ、低レベルかつ非特異的なパルス信号のみを精度よく除外することができ、さらには相関法を組み合わせるので、測定サンプルのマトリクス成分由来のノイズ、機械的ノイズ、電気的ノイズ等に起因するバックグラウンドノイズを抑制することができる結果として、極めて低濃度であってもより精度よく特異的に蛍光標識（蛍光標識を含む標的物質）を検出し、定量することができる。
【０１５７】
本発明はまた、コンピュータに既に説明した蛍光検出システムに上記蛍光検出方法を実行させるためのプログラムにも関する。
かかるプログラムは具体的には、コンピュータハードウェア資源（コンピュータ）である演算部１４に例えば下記の工程を実行させるためのプログラムである。
（１）コンピュータが、共焦点検出部１２に、測定サンプル中で生じた蛍光光子を検出させる工程
（２）コンピュータが、共焦点検出部１２に、検出された蛍光光子に基づいてパルス信号データを生成させ、取得する工程
（３）コンピュータが、取得したパルス信号データを所定のビニング幅で再計数し、再計数データを生成させ、取得する工程
（４）コンピュータが、取得した再計数データの各イベントの信号強度値と閾値とを対照し、該閾値を超えるイベントのみを再計数して一次測定値（有効イベント数）を算出し、一次測定データを生成する工程
（５）コンピュータが、パルス信号データに基づいて自己相関関数を算出し、自己相関関数データを生成する工程
（６）コンピュータが、自己相関関数データを統計的に処理して、蛍光分子標識複合体の存在比率を算出する工程
（７）コンピュータが、一次測定データおよび存在比率に基づいて蛍光分子標識複合体の数を決定する工程
【０１５８】
（実施例）
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【０１５９】
（材料）
１）デキストラン架橋抗αーフェトプロテイン（ＡＦＰ）モノクローナル抗体固定磁性ビーズの作製
５ｍｇのカルボキシル化磁気ビーズ（ライフテクノロジーズ）に、１６７μＬの０．１Ｍ  水溶性カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、室温にて３０分間攪拌した。精製水で洗浄後、１６７μＬのアミノ化デキストランの５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５溶液を加え、室温にて３０分間インキュベートを行った後、精製水で洗浄し、アミノ化デキストラン磁性ビーズを得た。４ｍｇのアミノ化デキストラン磁性ビーズに３２０μＬの１ｍｇ／ｍＬ  ＧＭＢＳ（Ｎ−スクシンイミジル−４−マレイミド酪酸）エタノール溶液を加え一時間反応後、ビーズをリン酸緩衝液で洗浄し、２００μＬの０．４ｍｇ／ｍＬ  抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’溶液を加え、２時間反応を行った後、ビーズを洗浄し、デキストラン架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体固定磁性ビーズを得た。
【０１６０】
２）抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’の作製
ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）を使用して、抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液をクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）に置換し、ペプシンを抗体の１／１００（ｗ／ｗ）量加え、３７℃にて１時間放置した。この溶液を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥヘルケアバイオサイエンス）を使用して精製し、Ｆ（ａｂ’）２を得た。このＦ（ａｂ’）２に０．２Ｍの２−メルカプトエチルアミンを１／２０（ｖ／ｖ）加え、３７℃にて３時間放置した後、ＰＤ−１０カラムで２−メルカプトエチルアミンを除去してＦａｂ’断片を得た。
抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’に１０等量のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２  Ｃ５−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ライフテクノロジーズ）を加え、４℃にて一晩放置した後、ＰＤ−１０カラムで未反応の色素を除去し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’を得た。なお、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２を標識する際に用いた抗ＡＦＰモノクローナル抗体は、磁性ビーズに固定された抗ＡＦＰモノクローナル抗体とは異なる抗体を用いた。
【０１６１】
３）ビオチン−抗ビオチン抗体架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体固定磁性ビーズの作製
３ａ）抗ビオチン抗体固定磁性ビーズの作製
磁性ビーズに、抗ビオチン抗体を加え、撹拌しながら室温で１時間反応させる。磁力吸引により磁性ビーズを３回洗浄し、抗ビオチン抗体固定磁性ビーズを得る。
【０１６２】
３ｂ）ビオチン標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体の作製
抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液に、ＮＨＳ−ビオチン溶液を加え、得られた溶液を室温で６０分間静置する。ＰＤ−１０カラムによる脱塩精製（未反応ビオチンの除去）により、ビオチン標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体を得る。
【０１６３】
３ｃ）抗ビオチン抗体固定磁性ビーズとビオチン標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体との親和性反応
抗ビオチン抗体固定磁性ビーズ溶液  ２５０μＬに、ビオチン標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体溶液  ２５０μＬを加えて撹拌し、得られた溶液を３７℃で３０分間静置する。
これにより、ビオチン−抗ビオチン抗体架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体固定磁性ビーズが親和性反応により得られる。
磁力吸引により磁性ビーズを３回洗浄し、ビオチン−抗ビオチン抗体架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体固定磁性ビーズ溶液を得る。
【０１６４】
比較例１：均質な液相系を利用する測定方法（従来法）
１２５μＬの８７６ｎＭ  抗ＡＦＰモノクローナル抗体に１２５μＬの０．６８６ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’を加え攪拌した。さらに、２０μＬの濃度既知ＡＦＰ溶液を添加して攪拌し、室温にて１時間インキュベートを行った後、下記の実施例２と同様の方法にて共焦点蛍光検出器で蛍光シグナルを測定し、自己相関関数を用いて、抗ＡＦＰモノクローナル抗体とＡＦＰとＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’とを含む蛍光標識複合体の存在比率を求めた。
【０１６５】
実施例１：固相から放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液の調製
１−１）磁性ビーズから放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液の調製（１）
Ｉ）切断性リンカー（デキストラン）を介して磁性ビーズに固定された蛍光分子標識複合体の調製
２５０μＬのデキストラン架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体固定磁性ビーズに、２０μＬの濃度既知ＡＦＰ溶液を加え、３７℃にて１０分間インキュベートを行った。磁気ビーズを３回洗浄し、２５０μＬの５ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’を加え、３７℃にて１０分間インキュベートを行った。これにより、蛍光分子標識複合体、つまり、抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’（第１親和性分子）−ＡＦＰ（標的物質）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体Ｆａｂ’（第２親和性分子）がデキストランを介して磁性ビーズに固定された。
【０１６６】
ＩＩ）切断性リンカー（デキストラン）の部位での蛍光分子標識複合体の特異的切断
蛍光分子標識複合体を結合した磁性ビーズを５回洗浄し、２００μＬの５Ｕ／ｍＬデキストラナーゼを加え、３７℃にて１０分間インキュベートを行った後、磁力吸引により放出された複合体を磁性ビーズから分離し、得られた蛍光分子標識複合体溶液の蛍光シグナルを共焦点蛍光検出器で測定した。
【０１６７】
１−２）磁性ビーズから放出された蛍光分子標識複合体を含む放出溶液の調製（２）
Ｉ）切断性リンカー（親和性リンカー）を介して磁性ビーズに固定された蛍光分子標識複合体の調製
ビオチン−抗ビオチン抗体架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体固定磁性ビーズ上のビオチンおよび抗ビオチン抗体架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体を、切断性リンカーを介して固相に固定された第１親和性分子として、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体を、蛍光分子で標識された第２親和性分子として用いる。第１親和性分子および第２親和性分子のエピトープは互いに異なり、第１親和性分子および第２親和性分子の双方が１分子のＡＦＰに同時に結合できる。
ビオチン−抗ビオチン抗体架橋抗ＡＦＰモノクローナル抗体（第１親和性分子）固定磁性ビーズ溶液  ２５０μＬに、標的物質としてのＡＦＰの標準液  １０μＬを加えて撹拌し、得られた溶液を３７℃で１０分間静置する。免疫学的反応により、ビオチンおよび抗ビオチン抗体を介して磁性ビーズに固定された複合体（磁性ビーズ−抗ビオチン抗体−ビオチン−第１親和性分子−ＡＦＰ）が得られる。
磁力吸引により磁性ビーズ（複合体が固定）を３回洗浄した後、洗浄液を全て除去する。
洗浄した磁性ビーズ（複合体が固定）に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２標識抗ＡＦＰモノクローナル抗体（第２親和性分子）溶液  ２５０μＬを加えて撹拌し、得られた溶液を３７℃で１０分間静置する。免疫学的反応により、ビオチンおよび抗ビオチン抗体を介して磁性ビーズに固定された蛍光分子標識複合体（磁性ビーズ−抗ビオチン抗体−ビオチン−第１親和性分子−ＡＦＰ−第２親和性分子−蛍光分子）が得られる。
磁力吸引により磁性ビーズ（蛍光分子標識複合体）を６回洗浄した後、洗浄液を全て除去する。
【０１６８】
ＩＩ）切断性リンカー（親和性リンカー）の部位での蛍光分子標識複合体の特異的切断
得られた磁性ビーズ（蛍光分子標識複合体）に、ビオチン溶液２５０μＬを加えて撹拌し、得られた溶液を室温で３０分間静置する。ビオチン溶液中のビオチンは、蛍光分子標識複合体中のビオチンと競合する。ビオチンおよび抗ビオチン抗体を介して磁性ビーズに固定された蛍光分子標識複合体を、ビオチン溶液中のビオチンにより抗ビオチン抗体−ビオチンの部位で特異的に切断して、磁性ビーズから放出された蛍光分子標識複合体（ビオチン−第１親和性分子−ＡＦＰ−第２親和性分子−蛍光分子）を含む放出溶液２５０μＬを得る。
【０１６９】
実施例２：共焦点蛍光検出器での蛍光シグナルの計測およびその解析
２−１）共焦点蛍光検出器での蛍光シグナルの測定
比較例１と実施例１でそれぞれ得られた測定サンプルの全量もしくはその一部を、ブロッキング剤（日本油脂株式会社製Ｎ１０１）でブロッキング処理した容器（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｎｕｎｃ  カバーグラスチェンバー１５５４１１）に分注し、次いで、共焦点蛍光検出器で測定サンプルの蛍光シグナルを測定した。
【０１７０】
測定条件は、以下のとおりであった。
励起レーザー：コヒレントジャパン株式会社Ｓａｐｐｈｉｒｅ５３２ＦＰ、励起波長５３２ｎｍ、励起光強度１ｍＷ（試料位置）
対物レンズ：オリンパス株式会社ＵＡＰＯＮ  ４０ＸＷ３４０
センサー：浜松ホトニクス株式会社Ｈ７４２１−４０、測光ビニング時間：５０ｎ秒
測定時間：３．２秒間×１０ループを１回の測定として、各サンプルにつき１０回の測定を行った。
【０１７１】
得られた測光ビニング時間５０ｎ秒のパルス信号データを、２×１０４個ごとに積算することにより、ビニング幅１ｍ秒の再計数データを算出した。再計数データの１つのパルスを１つのイベントとし、各イベントに含まれる蛍光信号強度が閾値を超えるイベント数が計数（パルスカウンティング）されることにより一次測定データを得た。閾値は、緩衝液を測定したときの各イベントに含まれる蛍光信号強度の平均値＋標準偏差×６として設定した。
図１０に８０ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを測定したときの再計数データの一つを示す。このときの閾値は４であった。
【０１７２】
２−２）パルス信号データの解析
計測されたパルス信号データの解析を蛍光相関法により行った。
先ず、式（１）を用いて、得られたパルス信号データからマルチプルタウ演算方式の自己相関値を算出し、自己相関関数データを生成した。図９に２００ｎｇ／ｍＬのＡＦＰを測定したときの自己相関関数データを示す。
【０１７３】
【数３】
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【０１７４】
次いで、式（２）を用いて、得られた自己相関関数データからレベンバーグマルカドール法フィッティングを施し、蛍光シグナルを発する全蛍光分子に対する、目的の蛍光分子標識複合体の存在比率を算出した。
【０１７５】
【数４】
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【０１７６】
最後に、一次測定値（一次測定データ）および存在比率を用いて、蛍光標識、または蛍光標識を含む標的物質の数（濃度）を二次測定値（二次測定データ）として下記の計算式に基づいて決定した。
計算式：一次測定値×存在比率＝二次測定値
【０１７７】
（本発明の第１の目的に関連する実験結果）
比較例１（従来法）の結果を表３および図１１に示す。測定感度を、「ゼロ濃度のサンプルを測定したときの測定データの平均値＋２倍の標準偏差（２ＳＤ）と、既知濃度のサンプルを測定したときの測定値データの平均値−２ＳＤが重ならない濃度」と定めると、比較例１の測定感度は、ＡＦＰ濃度２００から２，０００ｎｇ／ｍＬの間である。
本発明の実施例１−１および実施例２の結果を表４および図１２に示す。比較例１と同様に測定感度を求めると、測定感度はＡＦＰ濃度１０から８０ｎｇ／ｍＬの間にあり、本発明は従来法に比べて高感度であった。
従来法では、未反応の蛍光分子標識体が液相中に多く残存するため、蛍光分子複合体の存在量が未反応の蛍光分子標識体と比較して少量の場合には、両者のシグナルが十分に識別できないが、本発明においては、未反応の蛍光分子標識体を洗浄除去した後、放出された蛍光分子標識複合体を測定しているため、複合体量がより少ない場合であっても、両シグナルの識別が可能になっていることを示している。
【０１７８】
（本発明の第２の目的に関連する実験結果）
標的物質がゼロ濃度の場合であっても、測定サンプルの緩衝液などマトリックスに由来するノイズや、機械的ノイズ、環境由来のノイズ等の影響によって、非特異シグナルが検出されてしまうことが一般的に知られている。本発明の実施例においても、ＡＦＰゼロ濃度の一次測定データとして、平均８２．６の有効イベント数が測定されている（表４）。
しかし、本発明では、同時に算出された蛍光分子複合体の存在比率を加味することでノイズ等の影響を低減することが可能である。実施例において、ＡＦＰゼロ濃度における蛍光分子複合体の存在比率はゼロと算出されたため、二次測定データもゼロとなり、より特異性の高い測定が実現された（表４）。
【０１７９】
【表３】
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【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明の方法は、標的物質の測定（即ち、イムノアッセイ）に有用であり、診断等での応用が期待される。
【符号の説明】
【０１８１】
１０  蛍光検出システム
１２  共焦点検出部
１４  演算部
２０  レーザー光発生部
３０  光学的処理部
４０  検出部
４２  センサー部
４４  電気信号処理部
４６  計数部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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