(57)【要約】【課題】細胞認識性が高く、且つ優れた細胞形質維持効果、細胞接着性を有する新規重合体を提供すること。【解決手段】ペプチド鎖を側鎖に有する構造単位を有する重合体であって、前記ペプチド鎖が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする重合体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド鎖を側鎖に有する構造単位を有する重合体であって、前記ペプチド鎖が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする重合体。
【請求項２】
前記ペプチド鎖を側鎖に有する構造単位が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び該ペプチドを導入可能な基を有するモノマーに由来するものである請求項１に記載の重合体。
【請求項３】
前記ペプチドが３〜２０個のアミノ酸残基からなるものである請求項２に記載の重合体。
【請求項４】
前記ペプチドを導入可能な基が、基−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、カルボキシ基、オキシラニル基、オキセタニル基、エピスルフィド基、イソシアネート基又はチオイソシアネート基である請求項２又は３に記載の重合体。
【請求項５】
前記アミノ酸配列が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列である請求項１〜４のいずれか１項に記載の重合体。
【請求項６】
疎水性モノマーに由来する構造単位を更に有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の重合体。
【請求項７】
前記疎水性モノマーが、スチレン系モノマー、ビニルエーテル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマー及び（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種以上の疎水性モノマーである請求項６に記載の重合体。
【請求項８】
水溶性である請求項１〜７のいずれか１項に記載の重合体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の重合体を含有することを特徴とするコーティング剤。
【請求項１０】
細胞培養基材用コーティング剤である請求項９に記載のコーティング剤。
【請求項１１】
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖が表面に固定化されていることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の重合体で表面の一部又は全部がコーティングされていることを特徴とする細胞培養基材。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の細胞培養基材を用いることを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１４】
ペプチドの認識性を利用して細胞を選別することを特徴とする請求項１３に記載の細胞培養方法。
【請求項１５】
前記ペプチドの認識性を利用して分化細胞と未分化細胞を選別できる請求項１４に記載の細胞培養方法。
【請求項１６】
ペプチド鎖を有する構造単位を有する重合体の合成方法。
【請求項１７】
前記重合体が、水溶性でかつコーティング性能を有する重合体である、請求項１６に記載の合成方法。
【請求項１８】
原料重合体にペプチド鎖を導入する工程を含む、請求項１６又は１７に記載の合成方法。
【請求項１９】
原料重合体に導入するペプチド鎖が細胞認識性を有する、請求項１８に記載の合成方法。
【請求項２０】
原料重合体に導入するペプチド鎖が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項１８又は１９に記載の合成方法。
【請求項２１】
原料重合体に導入するペプチド鎖が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、請求項１８又は１９に記載の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規重合体、コーティング剤、細胞培養基材、細胞培養方法及び重合体の合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の培養には、現在、フィーダー細胞といわれる胎児由来の細胞が主に用いられており、これがｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の培養・増殖には不可欠とされている。ｉＰＳ細胞は、ヒトの組織細胞から比較的簡単に作製することが可能となったが、増殖に必要なフィーダー細胞が他種・他者由来であるため、再生医療への応用の際に、異物タンパク質や遺伝子、病原体などの混入の可能性が問題視されている。
最近では、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶなどの細胞外マトリックスを単独もしくは混合して用いたフィーダーレスのｉＰＳ細胞やＥＳ細胞の培養システムも検討され上市されているが、高価であり、また、ｉＰＳ細胞のソースによっては、細胞が増殖しにくい、継代可能な期間が短いなどの問題点が指摘されていて、完成品とはいいがたい。
また、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を増殖させる際には、未分化のまま細胞を維持することが非常に重要であり、培養液中に様々な未分化維持成分を添加する必要がある。マウスＥＳ細胞の未分化性維持にはＬＩＦおよびＢＭＰ４シグナリングが重要であることが知られているのに対し、ヒトＥＳ細胞の未分化性維持にはｂＦＧＦおよびＡｃｔｉｖｉｎＡシグナリングが重要である。現状では、ＬＩＦやｂＦＧＦの添加は不可欠であり、これがｉＰＳ細胞研究においてシステムを非常に高価にする要因になっている。
【０００３】
ところで、細胞接着性を向上させる種々の技術が開発されており、例えば、細胞培養基材にコーティングし細胞の接着性を向上させるためのペプチドとして、間質性基質や血漿中に存在するフィブロネクチン由来の配列（例えば、ＬＤＶ、ＲＥＤＶ、ＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ）や基底膜を構成する糖タンパク由来のラミニン由来の配列（例えば、ＤＹＡＴＬＱＬＱＥＧＲＬＨＦＭＦＤＬＧ、ＡＡＳＩＫＶＡＶＳＡＤＲ、ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ、ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ、ＫＮＳＦＭＡＬＹＬＳＫＧＲＬＶＦＡＬＧ）を側鎖に有する重合体が提案されている（特許文献１）。
一方、細胞の相互認識には、カドヘリンと呼ばれるタンパク質が重要な役割を果たしており、ＥＳ細胞が分化する過程におけるカドヘリンの認識機構に注目が集まっている。細胞認識が起こる際のＥ−カドヘリンのキーペプチドは、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含む特定のペプチド（例えば、ＬＦＳＨＡＶＳＳＮＧ、ＬＲＡＨＡＶＤＩＮＧ）であるとされており、このペプチドについて研究が進められている。例えば、このペプチドが、Ｅ−カドヘリンの機能を阻害し癌の浸潤を引き起こす可能性があるとの報告や（非特許文献１）、血液脳関門の浸透性を高めるとの報告がある（非特許文献２）。
上記のような細胞接着性ペプチドやカドヘリンの主要ペプチドを効率よくポリマーの側鎖に導入したものはこれまで知られておらず、細胞培養基材等に応用することもこれまで検討されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４５５５７７３号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１２，１２７−１３５（１９９９）
【非特許文献２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １１，９７４−９８１（２０１４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、細胞認識性が高く、且つ優れた細胞形質維持効果、細胞接着性を有する新規重合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討した結果、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖を側鎖に有する構造単位を有する重合体が、細胞認識性が高く、且つ優れた細胞形質維持効果、細胞接着性を有し、細胞培養基材のコーティング剤として有用であること、また、細胞特異的な認識性を有しており、細胞選別用デバイスのコーティング剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の＜１＞〜＜２１＞を提供するものである。
【０００９】
＜１＞  ペプチド鎖を側鎖に有する構造単位を有する重合体であって、前記ペプチド鎖が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする重合体。
＜２＞  前記ペプチド鎖を側鎖に有する構造単位が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド、及び該ペプチドを導入可能な基を有するモノマーに由来するものである＜１＞に記載の重合体。
＜３＞  前記ペプチドが３〜２０個のアミノ酸残基からなるものである＜２＞に記載の重合体。
＜４＞  前記ペプチドを導入可能な基が、基−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−、カルボキシ基、オキシラニル基、オキセタニル基、エピスルフィド基、イソシアネート基又はチオイソシアネート基である＜２＞又は＜３＞に記載の重合体。
＜５＞  前記アミノ酸配列が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列である＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の重合体。
＜６＞  疎水性モノマーに由来する構造単位を更に有する＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の重合体。
＜７＞  前記疎水性モノマーが、スチレン系モノマー、ビニルエーテル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマー及び（メタ）アクリルアミド系モノマーから選ばれる１種以上の疎水性モノマーである＜６＞に記載の重合体。
＜８＞  水溶性である＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の重合体。
【００１０】
＜９＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の重合体を含有することを特徴とするコーティング剤。
＜１０＞  細胞培養基材用コーティング剤である＜９＞に記載のコーティング剤。
【００１１】
＜１１＞  Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖が表面に固定化されていることを特徴とする細胞培養基材。
＜１２＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の重合体で表面の一部又は全部がコーティングされていることを特徴とする細胞培養基材。
【００１２】
＜１３＞  ＜１１＞又は＜１２＞に記載の細胞培養基材を用いることを特徴とする細胞培養方法。
＜１４＞  ペプチドの認識性を利用して細胞を選別することを特徴とする＜１３＞に記載の細胞培養方法。
＜１５＞  前記ペプチドの認識性を利用して分化細胞と未分化細胞を選別できる＜１４＞に記載の細胞培養方法。
【００１３】
＜１６＞  ペプチド鎖を有する構造単位を有する重合体の合成方法。
＜１７＞  前記重合体が、水溶性でかつコーティング性能を有する重合体である、＜１６＞に記載の合成方法。
＜１８＞  原料重合体にペプチド鎖を導入する工程を含む、＜１６＞又は＜１７＞に記載の合成方法。
＜１９＞  原料重合体に導入するペプチド鎖が細胞認識性を有する、＜１８＞に記載の合成方法。
＜２０＞  原料重合体に導入するペプチド鎖が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、＜１８＞又は＜１９＞に記載の合成方法。
＜２１＞  原料重合体に導入するペプチド鎖が、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である、＜１８＞又は＜１９＞に記載の合成方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の重合体は、細胞認識性が高く、且つ優れた細胞形質維持効果を有し、しかも細胞毒性が低い。したがって、本発明によれば、細胞認識性が高く、優れた細胞形質維持効果と細胞接着性を有し、しかも細胞毒性が低い重合体を提供できる。
また、本発明によれば、細胞特異的な細胞認識性が高く、優れた細胞形質維持効果と細胞接着性を有し、しかも細胞毒性の低いコーティング剤を提供できる。
また、本発明の細胞培養基材及び細胞培養方法によれば、簡便に且つ安定的に効率よく細胞の培養を行うことができる。
また、本発明の重合体の合成方法によれば、さまざまな長さのペプチド鎖、所望のアミノ酸シークエンスをもつペプチド鎖を有する重合体を、効率的且つ容易に合成できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜重合体＞
本発明のペプチド鎖を側鎖に有する構造単位（以下、構造単位（Ａ）とも称する）を有する重合体は、斯かるペプチド鎖が、Ｈｉｓ（ヒスチジン）−Ａｌａ（アラニン）−Ｖａｌ（バリン）、Ｉｌｅ（イソロイシン）−Ｌｙｓ（リジン）−Ｖａｌ（バリン）−Ａｌａ（アラニン）−Ｖａｌ（バリン）又はＡｒｇ（アルギニン）−Ｇｌｕ（グルタミン酸）−Ａｓｐ（アスパラギン酸）−Ｖａｌ（バリン）で表されるアミノ酸配列を含むことを特徴とするものである。このペプチド鎖は細胞認識性を有する。
なお、本明細書において、アミノ酸とはα−アミノ酸のことを意味し、各アミノ酸の配列はＮ末からＣ末方向の順に記載する。
【００１６】
（構造単位（Ａ））
構造単位（Ａ）としては、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド（以下、ペプチド化合物とも称する）、及び該ペプチドを導入可能な基を有するモノマーに由来するものが好ましい。
【００１７】
上記モノマーが有するペプチドを導入可能な基としては、無水カルボキシ基（−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−）、カルボキシ基、オキシラニル基、オキセタニル基、エピスルフィド基、イソシアネート基、チオイソシアネート基が挙げられ、細胞形質維持効果、細胞認識性の観点から、無水カルボキシ基、カルボキシ基、オキシラニル基、オキセタニル基、イソシアネート基が好ましく、無水カルボキシ基、カルボキシ基、オキシラニル基がより好ましく、無水カルボキシ基、カルボキシ基が更に好ましく、無水カルボキシ基が特に好ましい。
また、これらモノマーとしては、重合性エチレン性不飽和結合をもつものが好ましい。
【００１８】
上記無水カルボキシ基を有するモノマーとしては、無水マレイン酸、無水イタコン酸、無水シトラコン酸、テトラヒドロ無水フタル酸、テトラヒドロメチル無水フタル酸、メチル−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸無水物等の不飽和ジカルボン酸無水物が好ましい。また、無水カルボキシ基を有するモノマーの炭素数は、好ましくは３〜２０であり、より好ましくは４〜１６である。
【００１９】
また、上記カルボキシ基を有するモノマーとしては、不飽和カルボン酸が好ましい。斯かる不飽和カルボン酸としては、例えば、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、α−クロロアクリル酸、ケイ皮酸等の不飽和モノカルボン酸；マレイン酸、イタコン酸、シトラコン酸、フマル酸、メサコン酸、等の不飽和ジカルボン酸；こはく酸モノ〔２−（メタ）アクリロイルオキシエチル〕、フタル酸モノ〔２−（メタ）アクリロイルオキシエチル〕等の２価以上の多価カルボン酸のモノ〔（メタ）アクリロイルオキシアルキル〕エステルが挙げられ、好ましくは不飽和モノカルボン酸、不飽和ジカルボン酸である。また、カルボキシ基を有するモノマーの炭素数は、好ましくは５〜３０である。
【００２０】
また、オキシラニル基を有するモノマーとしては、例えば、（メタ）アクリル酸グリシジル、フェニルグリシジルエーテル、１−オキシラニル−４−ビニルシクロヘキサン等の不飽和グリシジル基含有モノマーが挙げられる。
また、オキセタニル基を有するモノマーとしては、例えば、（３−チルオキセタン−３−イル）メチル（メタ）アクリレート等の不飽和オキセタニル基含有モノマーが挙げられる。
また、エピスルフィド基を有するモノマーとしては、例えば、４−ビニル安息香酸８−（チイラン−２−イル）オクチル等の不飽和エピスルフィド基含有モノマーが挙げられる。
また、イソシアネート基を有するモノマーとしては、例えば、アリルイソシアネート等の不飽和イソシアネート基含有モノマーが挙げられる。
また、チオイソシアネート基を有するモノマーとしては、例えば、アリルイソチオシアネート等の不飽和チオイソシアネート基含有モノマーが挙げられる。
【００２１】
また、上記ペプチド化合物に含まれるＨｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列の数は特に限定されないが、細胞毒性が低い点で、ペプチド化合物１個あたり、１〜２０個が好ましく、１〜１２個がより好ましく、１〜８個が更に好ましく、１〜５個が更に好ましく、１又は２個が更に好ましく、１個が特に好ましい。
【００２２】
また、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列の中では、細胞毒性が低い点や細胞形質維持効果、細胞認識性の観点から、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列が好ましい。Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列をペプチド鎖が含む場合、特に、細胞形質維持効果が改善される。
【００２３】
また、上記ペプチド化合物は、上記Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むものであれば特に限定されないが、細胞毒性が低い点や細胞形質維持効果、細胞認識性の観点からは、３〜２０個のアミノ酸残基からなるものが好ましく、３〜１６個のアミノ酸残基からなるものがより好ましく、３〜１２個のアミノ酸残基からなるものが更に好ましく、４〜１０個のアミノ酸残基からなるものが特に好ましい。
【００２４】
また、上記ペプチド化合物中の上記アミノ酸配列以外の部分に含まれるアミノ酸残基は特に限定されないが、グリシン、バリン、アラニン、ロイシン、イソロイシン等の脂肪族アミノ酸の残基；フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸の残基；セリン、トレオニン等のオキシアミノ酸の残基；システイン等の含イオウアミノ酸の残基；アスパラギン等の他の中性アミノ酸の残基；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸の残基；ヒスチジン、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸の残基が挙げられる。
【００２５】
また、上記ペプチド化合物の好適な具体例としては、下記式（１）で表されるペプチド化合物、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物、Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列からなるペプチド化合物が挙げられる。中でも、細胞形質維持効果、細胞認識性の観点から、式（１）で表されるペプチド化合物が好ましい。
【００２６】
【化１】
2016190802.tif 000002
【００２７】
〔式（１）中、
Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸残基を示し、
ｎ１及びｎ２は、それぞれ独立して、０以上の整数を示し、
ｎ３は、１〜８の整数を示す。〕
【００２８】
上記Ｘ1及びＸ2で示される任意のアミノ酸残基としては、上記ペプチド化合物中のアミノ酸配列以外の部分に含まれるアミノ酸残基として挙げたものと同様のものが挙げられるが、側鎖の立体障害が小さい残基が好ましい。特に、Ｘ1が立体障害の小さい残基である場合、ポリマーの主鎖にペプチドが導入されやすくなり、ペプチド導入率が向上する。
斯様な立体障害の小さい残基としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン等が挙げられる。
【００２９】
上記ｎ１は０以上の整数を示すが、細胞毒性が低い点や細胞形質維持効果、細胞認識性の観点から、０〜１６の整数が好ましく、０〜１２の整数がより好ましく、０〜８の整数が更に好ましく、０〜４の整数が更に好ましく、０〜３の整数が更に好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。
上記ｎ２は０以上の整数を示すが、細胞毒性が低い点で、０〜１６の整数が好ましく、０〜１２の整数がより好ましく、０〜８の整数が更に好ましく、０〜４の整数が特に好ましい。
上記ｎ３は１〜８の整数を示すが、細胞毒性が低い点で、１〜５の整数が好ましく、１又は２がより好ましく、１が特に好ましい。
なお、ｎ１が２以上の整数である場合、ｎ１個のＸ1は同一であっても異なっていてもよい。ｎ２個のＸ2、ｎ３個のＨｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌについても同様である。
【００３０】
また、構造単位（Ａ）としては、上記ペプチド鎖が重合体の主鎖に直接またはスペーサーを介して結合したものが好ましい。スペーサーとしては、２価の有機基が挙げられる。２価の有機基としては、例えば、アルキレン基、ポリオキシアルキレン基（具体的にはポリオキシエチレン基等）等が挙げられる。
中でも、構造単位（Ａ）としては、上記ペプチド鎖がマレイミド環に連結した構造をもつものが好ましく、以下の式（２−１）〜（２−６）で表されるものがより好適な具体例として挙げられ、式（２−１）〜（２−３）で表されるものが特に好適な具体例である。
【００３１】
【化２】
2016190802.tif 000003
【００３２】
〔式（２−１）中、
Ｒ1はアミノ酸の側鎖を示し、
Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子又はメチル基を示し、
ｎ４は、０以上の整数（好ましくは０〜１５の整数、より好ましくは０〜１１の整数、更に好ましくは０〜７の整数、更に好ましくは０〜３の整数、特に好ましくは０〜２の整数である。）を示し、
その他の記号は前記と同義である。〕
【００３３】
【化３】
2016190802.tif 000004
【００３４】
〔式（２−２）中、
Ｒ4は水素原子又はメチル基を示し、
その他の記号は前記と同義である。〕
【００３５】
【化４】
2016190802.tif 000005
【００３６】
〔式（２−３）中、
Ｒ5は水素原子又はメチル基を示し、
その他の記号は前記と同義である。〕
【００３７】
【化５】
2016190802.tif 000006
【００３８】
〔式（２−４）〜（２−６）中、各記号は前記と同義である。〕
【００３９】
また、構造単位（Ａ）の合計含有量としては、細胞認識性、細胞形質維持効果及び細胞接着性の観点から、全構造単位中、１０〜１００質量％が好ましく、２０〜８０質量％がより好ましく、３０〜７０質量％が更に好ましく、４０〜６０質量％が特に好ましい。
なお、構造単位（Ａ）の含有量は13Ｃ−ＮＭＲ、元素分析等により測定可能である。
【００４０】
（構造単位（Ｂ））
また、本発明の重合体としては、細胞培養基材に対する吸着性の観点から、疎水性モノマーに由来する構造単位（以下、構造単位（Ｂ）とも称する）を更に有するものが好ましい。
【００４１】
上記疎水性モノマーとしては、例えば、スチレン系モノマー、ビニルエーテル系モノマー、（メタ）アクリレート系モノマー、（メタ）アクリルアミド系モノマーが挙げられ、これら１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用されていてもよい。
また、疎水性モノマーとしては、ノニオン性のものが好ましく、また、親水性基がないものが好ましい。
【００４２】
上記スチレン系モノマーとしては、下記式（３）で表されるものが好ましい。
【００４３】
【化６】
2016190802.tif 000007
【００４４】
〔式（３）中、Ｒ6は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ7は、炭素数１〜１０の有機基を示し、ｐは０〜５の整数を示す。〕
【００４５】
式（３）中、Ｒ7で示される有機基としては、炭化水素基が挙げられ、斯かる炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基および芳香族炭化水素基に大別される。また、上記有機基の炭素数は、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３である。なお、斯かる有機基は、炭素数１〜３のアルコキシ基等が置換していてもよい。また、ｐが２〜５の整数の場合、ｐ個のＲ7は同一であっても異なっていてもよい。
【００４６】
上記脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等のアルキル基が挙げられる。
また、上記脂環式炭化水素基は、単環の脂環式炭化水素基と橋かけ環炭化水素基に大別される。上記単環の脂環式炭化水素基としては、シクロプロピル基、シクロヘキシル基等のシクロアルキル基が挙げられる。また、橋かけ環炭化水素基としては、イソボルニル基等が挙げられる。
また、上記芳香族炭化水素基としては、フェニル基等のアリール基が挙げられる。
【００４７】
また、ｐは０〜５の整数を示すが、０〜３が好ましく、０がより好ましい。
【００４８】
上記スチレン系モノマーの具体例としては、スチレン、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２，４，６−トリメチルスチレン、４−エチルスチレン、４−イソプロピルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン、α−メチルスチレン等が挙げられる。
【００４９】
また、上記ビニルエーテル系モノマーとしては、下記式（４）で表されるものが好ましい。
【００５０】
【化７】
2016190802.tif 000008
【００５１】
〔式（４）中、Ｒ8は、炭素数１〜２０の有機基を示す。〕
【００５２】
式（４）中、Ｒ8で示される有機基としては、Ｒ7で示される有機基と同様のものが挙げられるが、その炭素数は好ましくは１〜１８であり、より好ましくは２〜１４であり、更に好ましくは３〜１０である。
【００５３】
上記ビニルエーテル系モノマーの具体例としては、メチルビニルエーテル、エチルビニルエーテル、ｎ−プロピルビニルエーテル、イソプロピルビニルエーテル、ｎ−ブチルビニルエーテル、イソブチルビニルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルビニルエーテル、ペンチルビニルエーテル、ヘキシルビニルエーテル、ドデシルビニルエーテル、ステアリルビニルエーテル等が挙げられる。
【００５４】
また、上記（メタ）アクリレート系モノマーとしては、下記式（５）で表されるものが好ましい。
【００５５】
【化８】
2016190802.tif 000009
【００５６】
〔式（５）中、Ｒ9は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ10は、炭素数１〜２０の有機基を示す。〕
【００５７】
式（５）中、Ｒ9で示される有機基としては、Ｒ7で示される有機基と同様のものが挙げられるが、その炭素数は、好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜６であり、更に好ましくは１〜４であり、特に好ましくは１〜３である。また、斯かる有機基は、炭素数１〜１０のアルコキシ基、炭素数２〜１０のアルカノイル基、炭素数６〜１２のアリールオキシ基等が置換していてもよい。斯かるアルコキシ基の炭素数は好ましくは１〜８、より好ましくは１〜４、更に好ましくは１〜３、特に好ましくは１又は２であり、上記アルカノイル基の炭素数は好ましくは２〜８、より好ましくは２〜４、更に好ましくは２又は３であり、上記アリールオキシ基の炭素数は好ましくは６である。
【００５８】
また、上記（メタ）アクリレート系モノマーの具体例としては、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸イソブチル、（メタ）アクリル酸２−エチルヘキシル等の（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルキル；（メタ）アクリル酸シクロヘキシル等の（メタ）アクリル酸Ｃ6-10シクロアルキル；（メタ）アクリル酸１−メトキシエチル、（メタ）アクリル酸２−メトキシエチル等の（メタ）アクリル酸Ｃ1-10アルコキシＣ1-10アルキル；（メタ）アクリル酸フェノキシエチル等の（メタ）アクリル酸Ｃ6-12アリールオキシＣ1-10アルキル；（メタ）アクリル酸１−アダマンチル、（メタ）アクリル酸１−メチル−（１−アダマンチルエチル）、（メタ）アクリル酸トリシクロ[５．２．１．０2,6]デカン−８−イル等の炭素数８〜１６の橋かけ環炭化水素基を有する（メタ）アクリル酸エステル等が挙げられる。
【００５９】
また、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーとしては、下記式（６）で表されるものが好ましい。
【００６０】
【化９】
2016190802.tif 000010
【００６１】
〔式（６）中、Ｒ11は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ12およびＲ13は、それぞれ独立して、水素原子または炭素数１〜１０の有機基を示す。〕
【００６２】
式（６）中、Ｒ12およびＲ13で示される有機基としては、Ｒ7で示されるものと同様のものが挙げられるが、その炭素数は、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜４である。また、斯かる有機基は、炭素数１〜１０のアルコキシ基や炭素数２〜１０のアルカノイル基等が置換していてもよい。斯かるアルコキシ基やアルカノイル基の好ましい炭素数はＲ9で示される有機基に置換していてもよいものと同様である。
【００６３】
また、上記（メタ）アクリルアミド系モノマーの具体例としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジＣ1-10アルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド等のＮ−Ｃ1-10アルキル（メタ）アクリルアミド；Ｎ−（１，１−ジメチル−２−アセチルエチル）（メタ）アクリルアミド（別名：ダイアセトンアクリルアミド）等のＮ−Ｃ2-10アルカノイルＣ1-10アルキル（メタ）アクリルアミドの他、（メタ）アクリロイルピペリジン等が挙げられる。
【００６４】
また、本発明の重合体が構造単位（Ｂ）を有する場合、斯かる構造単位（Ｂ）の合計含有量としては、細胞培養基材に対する吸着性の観点から、全構造単位中、１０〜９０質量％が好ましく、２０〜８０質量％がより好ましく、３０〜７０質量％が更に好ましく、４０〜６０質量％が特に好ましい。
なお、構造単位（Ｂ）の含有量は、構造単位（Ａ）の含有量と同様にして測定すればよい。
【００６５】
また、本発明の重合体が構造単位（Ｂ）を有する場合、重合体に含まれる構造単位（Ａ）と構造単位（Ｂ）との質量比〔（Ａ）：（Ｂ）〕は、特に限定されないが、細胞培養基材に対する吸着性、細胞接着性、細胞形質維持効果及び細胞認識性の観点から、２０：８０〜８０：２０が好ましく、４０：６０〜８０：２０がより好ましく、６０：４０〜８０：２０が更に好ましい。
また、本発明で用いる重合体が構造単位（Ｂ）を有する場合、重合体に含まれる構造単位（Ａ）と構造単位（Ｂ）とのモル比＜（Ａ）：（Ｂ）＞は、特に限定されないが、細胞培養基材に対する吸着性、細胞接着性、細胞形質維持効果及び細胞認識性の観点から、１０：９０〜９０：１０が好ましく、２０：８０〜８０：２０がより好ましく、３０：７０〜７０：３０が更に好ましい。
【００６６】
なお、本発明の重合体は、上記構造単位（Ａ）及び（Ｂ）以外の構造単位（以下、構造単位（Ｃ）とも称する）を有していてもよい。構造単位（Ｃ）としては、例えば、上記ペプチドを導入可能な基を有するモノマーに由来するが上記ペプチドが導入されていない構造単位等が挙げられる。
また、本発明で用いる重合体が構造単位（Ｃ）を有する場合、重合体に含まれる構造単位（Ａ）と構造単位（Ｃ）とのモル比＜（Ａ）：（Ｃ）＞は、特に限定されないが、１０：９０〜９９：１が好ましく、２０：８０〜９９：１がより好ましく、２５：７５〜９５：５が更に好ましい。
【００６７】
また、本発明の重合体が共重合体である場合、その構造単位の配列の態様は特に限定されず、共重合体は、ブロック共重合体、グラフト共重合体、ランダム共重合体、交互共重合体のいずれであってもよいが、交互共重合体が好ましい。
【００６８】
また、本発明の重合体の数平均分子量（Ｍn）としては、４，０００〜２００，０００が好ましく、３０，０００〜１８０，０００がより好ましい。また、本発明の重合体の重量平均分子量（Ｍw）としては、４，０００〜２００，０００が好ましく、３０，０００〜１８０，０００がより好ましい。また、本発明の重合体の分子量分布（Ｍw／Ｍn）としては、１．０〜２．５が好ましく、１．０〜１．８がより好ましい。
また、本発明の重合体は、上記ペプチド鎖を除いた部分の数平均分子量（Ｍn）が、好ましくは３，０００〜１５０，０００であり、より好ましくは３０，０００〜１５０，０００である。また、上記ペプチド鎖を除いた部分の重量平均分子量（Ｍw）が、好ましくは３，０００〜１５０，０００であり、より好ましくは３０，０００〜１５０，０００である。また、上記ペプチド鎖を除いた部分の分子量分布（Ｍw／Ｍn）は、好ましくは１．０〜２．５である。
なお、上記数平均分子量、重量平均分子量及び分子量分布は、ＧＰＣ等により測定すればよい。
【００６９】
また、本発明の重合体としては、無機材料で構成される表面に対する非特異吸着防止効果の観点から、水溶性のものが好ましい。ここで、本明細書において、水溶性とは、１００μｇ／ｍＬのポリマー固形分となるように重合体を水（２５℃）に添加・混合したときに、目視で透明となることをいう。
【００７０】
次に、ペプチド鎖を有する構造単位を有する重合体の合成方法について説明する。この合成方法により、水溶性でかつコーティング性能を有する重合体が効率的且つ容易に合成できる。
【００７１】
上記合成方法は、原料重合体にペプチド鎖を導入する工程を含むものが好ましい。ペプチド鎖は、好ましくは細胞認識性を有するペプチド鎖であり、より好ましくはＨｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖であり、更に好ましくはＨｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖である。
【００７２】
本発明の重合体を得る場合には、例えば、＜１＞公知の方法に準じて得たＨｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチドと、該ペプチドを導入可能な基を側鎖に有する公知の（共）重合体とを反応させること、或いは＜２＞重合させたときに側鎖となる部分にペプチドを導入可能な基を有するモノマーに上記ペプチド化合物を導入し、得られたモノマーを、重合または他のモノマーと共重合させること等により製造できる。なお、これら製法においては必要に応じて適宜保護反応を行ってよい。
以下、上記＜１＞の製造方法について、不飽和ジカルボン酸無水物−スチレン系モノマー共重合体とＨｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチドとの反応を例に挙げて具体的に説明する。
【００７３】
上記不飽和ジカルボン酸無水物−スチレン系モノマー共重合体としては、無水マレイン酸−スチレン共重合体、無水イタコン酸−スチレン共重合体、無水シトラコン酸−スチレン共重合体、テトラヒドロ無水フタル酸−スチレン共重合体、テトラヒドロメチル無水フタル酸−スチレン共重合体、メチル−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸無水物−スチレン共重合体等が挙げられる。
【００７４】
一方、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチドとしては、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ等が挙げられる。
上記ペプチド化合物の合計使用量は、不飽和ジカルボン酸無水物に由来する構造単位に対し、通常０．１〜２モル当量であり、好ましくは０．３〜１．２モル当量である。
【００７５】
また、上記反応は、縮合剤存在下で行うのが好ましい。縮合剤はペプチド合成に一般的に使用される縮合剤であればよいが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド誘導体等が挙げられ、これらは１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
上記縮合剤の合計使用量は、上記ペプチド化合物１モルに対し、通常、１〜３モル当量であり、好ましくは１〜２モル当量である。
【００７６】
また、上記反応は塩基存在下で行うのがより好ましい。斯かる塩基としては、トリエチルアミン、テトラメチルエチレンジアミン等の３級アミン；ピリジン、ジメチルアミノピリジン、ピコリン、キノリン等の芳香族アミン等が挙げられる。
上記塩基の合計使用量は、上記ペプチド化合物１モルに対し、通常、１〜３モル当量であり、好ましくは１〜２モル当量である。
【００７７】
また、上記反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。該溶媒としては、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、１，４−ジクロロブタン、クロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン等のケトン類；ヘキサン、ヘプタン、ベンゼン、トルエン、キシレン等の炭化水素類が挙げられ、１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。上記溶媒の合計使用量は、上記ペプチド化合物に対し、通常５〜１０質量倍である。
【００７８】
上記反応の反応時間は、通常１〜１２０時間であり、好ましくは２４〜９６時間である。また、反応温度は特に限定されないが、好ましくは２０℃〜溶媒の沸点又はペプチドの変性温度であり、より好ましくは２０〜４０℃である。
【００７９】
なお、上記反応において、各反応生成物の単離は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、再沈殿、透析、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。
【００８０】
そして、後記実施例に示すように、本発明の重合体は、細胞認識性が高いため優れた細胞接着性を示し、細胞培養基材に対する吸着性や優れた細胞形質維持効果を有し、しかも細胞毒性が低い。また、コーティング剤として使用した場合に所望の細胞種が特異的に接着するコーティング表面を形成できる。
【００８１】
また、上記細胞としては、足場依存性細胞が挙げられる。足場依存性細胞としては、ＨｅＬａ細胞、Ｆ９細胞等のガン細胞；３Ｔ３細胞等の線維芽細胞；ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞；ＨＥＫ２９３細胞等の腎細胞；ＮＴ２細胞等の神経細胞；ＵＶ♀２細胞、ＨＭＥＣ−１細胞等の内皮細胞；Ｈ９ｃ２細胞等の心筋細胞；Ｃａｃｏ−２細胞等の上皮細胞等が挙げられる。なお、本発明の重合体で細胞培養基材をコーティングすることにより、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞等のような一般には細胞塊で培養されていた有用細胞を単層培養することができ、これによって、上記のような細胞塊で培養されていた有用細胞も簡便に且つ安定的に効率よく培養することができる。
【００８２】
＜コーティング剤＞
本発明のコーティング剤は、上記本発明の重合体を含有することを特徴とするものである。本発明の重合体の含有量としては、コーティング剤中、０．０００１〜１５質量％が好ましく、０．００１〜１０質量％がより好ましい。
【００８３】
また、本発明のコーティング剤は、上記本発明の重合体の他に、溶剤等を含んでいてもよい。
また、上記溶剤としては、水；メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール系溶剤等が挙げられる。これら溶剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて含まれていてもよい。
【００８４】
そして、本発明のコーティング剤は、細胞認識性が高いため優れた細胞接着性を示し、優れた細胞形質維持効果を有し、しかも細胞毒性が低い。したがって、本発明のコーティング剤は細胞培養基材をコーティングするのに特に適し、本発明のコーティング剤でコーティングされた細胞培養基材は、上記各性能が培地交換により損なわれる可能性が極めて低いものである。
【００８５】
＜細胞培養基材＞
本発明の細胞培養基材は、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖が表面に固定化されていることを特徴とするものである。本発明の細胞培養基材は、ペプチド鎖が表面に固定化されたものであるため、培地交換により性能が損なわれる可能性が極めて低いものであり、このような基材はこれまでに例がない。
【００８６】
上記細胞培養基材は、上記ペプチド鎖が表面に固定化されているものであれば特に限定されないが、例えば、上記重合体で表面の一部又は全部がコーティングされているもの、上記ペプチド鎖が表面の一部又は全部に直接グラフトされているものが挙げられ、製造コストの観点から、上記重合体で表面の一部又は全部がコーティングされているものが好ましい。
斯かるコーティングは公知の方法で行えばよく、具体的には、スピンコーティング法、スプレーコーティング法、ディップコーティング法、フローコーティング法、刷毛塗り、スポンジ塗り等の方法が挙げられる。具体的には、（１）上記コーティング剤の溶液を基材に接触させ、溶媒を残したまま溶液中でコーティング剤を基材表面に物理吸着させる方法、（２）上記コーティング剤の溶液を基材に接触させ、乾燥により溶媒を揮発させ、コーティング剤の乾燥膜を基材表面に形成させる方法が挙げられる。上記方法（１）においては、溶液中でコーティング剤を基材表面に物理吸着させたのち、通常、溶液が流れ出るように基材を傾ける、基材を溶液から引き上げる、基材上の溶液を吹き飛ばす、溶媒を多量に注ぎ込むなどの方法により、溶液を取り除く工程を経て、コーティング剤が吸着した細胞培養基材を得る。
【００８７】
また、細胞培養基材表面の材質は、無機材料、有機材料が挙げられる。
上記無機材料としては、ホウケイ酸ガラス等のガラス；チタン、ステンレス等の金属やコバルトクロム合金等の合金；熱分解カーボン、アルミナ、ジルコニア、リン酸カルシウム等のセラミックスの他、酸化チタン等が挙げられ、これらが１種または２種以上含まれていてよい。
【００８８】
また、上記有機材料としては、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂等のスチレン系ポリマー；ポリエチレン、ポリプロピレン等のオレフィン系ポリマー（環状オレフィン樹脂を含む）；ポリビニルアセテート、ポリ塩化ビニル、ポリビニルカルバゾール、ポリビニルピロリドン、ポリブタジエン等のビニル系ポリマー；ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン等のハロゲン化ビニリデン系ポリマー；ポリアミド、ポリアクリルアミド、ナイロン等のアミド系ポリマー；ポリイミド、ポリエチレンイミド等のイミド系ポリマー；ポリシロキサン、ポリジメチルシロキサン等のシリコーン系ポリマー；ポリアセトニトリル、ポリアクリロニトリル等のニトリル系ポリマー；ポリビニルフェノール等のビニルフェノール系ポリマー；ポリビニルアルコール等のビニルアルコール系ポリマー；ポリウレタン等のウレタン系ポリマー；ポリカーボネート等のカーボネート系ポリマー；ポリベンゾイミダゾール等のベンゾイミダゾール系ポリマー；ポリエーテルエーテルケトン等のポリエーテルエーテルケトン系ポリマー；ポリアニリン等のアニリン系ポリマー；ポリアクリレート等のポリ（メタ）アクリレート類；ポリカプロラクトン等のポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等の芳香族ポリエステル；ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ乳酸・グリコール酸等のヒドロキシカルボン酸系ポリエステルを含む）；エポキシ樹脂（ＳＵ−８等を含む）；フェノール樹脂；メラミン樹脂；テフロン（登録商標）等のフッ素樹脂の他、糖鎖高分子、タンパク質等が挙げられ、これらが１種または２種以上含まれていてよい。
また、上記糖鎖高分子としては、アガロースまたはその誘導体、セルロースまたはその誘導体（酢酸セルロース等）、キチン、酸化セルロース、コンドロイチン、ヘパリン、ヒアルロン酸等の等の多糖類が挙げられる。また、上記タンパク質としては、コラーゲンまたはその誘導体、フィブロイン、フィブロネクチン、ゼラチン等が挙げられる。また、ペプチドやポリアミノ酸であってもよい。
これら有機材料の中でも、スチレン系ポリマーが好ましい。
【００８９】
また、細胞培養基材の具体例としては、シャーレ、フラスコ、プレート、キュベット、フィルム、ファイバー、ビーズ等が挙げられる。
【００９０】
また、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖が表面に固定化されている基材の一態様として、細胞増殖デバイス、パンニング型細胞分離デバイス、永続的又は半永続的未分化維持デバイス、分化増殖デバイス、大量細胞培養システムが挙げられる。これら基材を用いることにより、所望の細胞の分化、増殖、分離、維持を簡便に行うことができる。
【００９１】
これら基材の具体例としては、以下の１）〜６）の基材が挙げられる。
１）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖が表面に固定化されている未分化維持を指向したデバイス。
この永続的又は半永続的未分化維持デバイスを用いることにより、ペプチドの未分化能を利用して、細胞の未分化を維持させることができる。また、ＬＩＦなどの高価な添加物を使用しなくても、細胞の未分化を維持させることができる。
２）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖が表面に固定化されている細胞増殖デバイス。
この細胞増殖デバイスを用いることにより、ペプチドの認識を利用して細胞を増殖させることができる。
３）上記２）の細胞増殖デバイスを三次元培養に応用した大量細胞培養システム。
４）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖に加えて、他の細胞認識性を有するペプチド鎖が表面に固定化されている分化増殖デバイス。
この分化増殖デバイスを用いることにより、２種以上のペプチドの細胞認識を利用して、所望の細胞を特異的に分化増殖させることができる。
５）上記４）の分化増殖デバイスを三次元培養に応用した大量細胞培養システム。
６）Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌで表されるアミノ酸配列を含むペプチド鎖に加えて、他の細胞認識性を有するペプチド鎖が表面に固定化されている細胞分離デバイス（例えば、パンニング型、カラム型、シート型、流路型等）。
例えば、パンニング型細胞分離デバイスを用いることにより、ペプチドの認識を利用して未分化細胞と分化細胞を分離することができる。また、未分化維持から逸脱した細胞を簡単なパンニングなどによって系外に除くことが可能である。
【００９２】
＜細胞培養方法＞
本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養基材を用いることを特徴とするものである。斯かる方法によれば、細胞の形態変化、増殖性、機能を制御することができる。
本発明の細胞培養方法は、上記細胞培養基材を用いる以外は公知の細胞培養方法と同様にして行えばよい。具体的には、上記細胞培養基材と液体培地を用いて、細胞を増殖させ、その後回収すればよい。
本発明の細胞培養方法としては、ペプチドの認識性を利用して細胞を選別する方法が好ましく、上記認識性を利用して分化細胞と未分化細胞を選別できることがより好ましい。
【実施例】
【００９３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００９４】
実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。
＜1Ｈ−ＮＭＲスペクトル＞
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、内部標準物質としてトリメチルシランを、溶媒として重ジメチルスルホキシドをそれぞれ用い、ＪＥＯＬ製ＪＮＭ−ＥＣＳ−４００により測定した。
＜吸光度測定＞
ＴＨＥＲＭＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製Ｎｉｃｏｌｅｔ  ｉＳ１０  ＦＴ−ＩＲを用いてＡＴＲ法により測定した。
【００９５】
＜実施例１  重合体（ＭＡＳＴ（ＨＡＶ））の合成＞
下記式で示されるＭＡＳＴ（ＨＡＶ）を、以下の手順で合成した。
【００９６】
【化１０】
2016190802.tif 000011
【００９７】
（１）Ｌ−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【００９８】
【化１１】
2016190802.tif 000012
【００９９】
Ｌ−バリン（３０．０ｇ）と酢酸ｔ−ブチル（５００ｍＬ）を氷上で懸濁させ、これに７０％過塩素酸水溶液（５０ｍＬ）を添加した。次いで、これを室温で２３時間撹拌し、１Ｎ  ＨＣｌ（５００ｍＬ）を加え、塩化メチレンで洗浄した。
その後、水酸化ナトリウム水溶液で水層をｐＨ８．０に中和し、塩化メチレンを加えて有機層を抽出し、更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、目的物であるＬ−バリン−ｔ−ブチルエステル（２２．７ｇ）を得た。構造は1Ｈ−ＮＭＲで確認した。
【０１００】
（２）アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１０１】
【化１２】
2016190802.tif 000013
【０１０２】
上記（１）で得たＬ−バリン−ｔ−ブチルエステル（２．００ｇ）とＦｍｏｃ−アラニン（３．８０ｇ）を塩化メチレン（２０ｍＬ）に溶解させ、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（以後、ＤＣＣと称す）（２．４０ｇ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（以後、ＨＯＢｔと称す）（１．８０ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（５．３０ｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（５．３０ｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（１．５５ｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、１．５ｐｐｍ付近にｔ−ブチル基由来のピークが確認され、得られた化合物がアラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１０３】
（３）ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１０４】
【化１３】
2016190802.tif 000014
【０１０５】
上記（２）で得たアラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（１．５５ｇ）とＦｍｏｃ−ヒスチジン（Ｔｒｔ）（３．９４ｇ）を塩化メチレン１０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（１．３０ｇ）及びＨＯＢｔ（１．１０ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（５．８０ｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（５．８０ｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（４．３０ｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、１．５ｐｐｍ付近にｔ−ブチル基由来のピーク、７．０〜７．５ｐｐｍにヒスチジン側鎖のイミダゾール環由来のピーク、７．０〜８．０ｐｐｍ付近にヒスチジン側鎖の保護基（トリチル基）由来のピークが確認され、得られた化合物がヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１０６】
（４）重合体（ＭＡＳＴ（ＨＡＶ））の合成
【０１０７】
【化１４】
2016190802.tif 000015
【０１０８】
無水マレイン酸−スチレン共重合体（Ｍｗ：１０６，０００、Ｍｎ：５７，０００（以後、この共重合体をＭＡＳＴと称す））（５８ｍｇ）と上記（３）で得たヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（１８６ｍｇ）とを、塩化メチレン１０ｍＬに溶解させ、これにＤＣＣ（５６ｍｇ）及び４−ジメチルアミノピリジン（以後、ＤＭＡＰと称す）（３３ｍｇ）を添加し、室温（２５℃）で７２時間撹拌した。
次いで、溶媒を除去し、反応物をトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）に溶解させた後、室温（２５℃）で１時間撹拌することで、トリチル基とｔ−ブチル基を脱保護した。その後、４Ｍ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に中和し、透析にて分子量１４，０００以下を除去し、透析後の水溶液を凍結乾燥し、ＭＡＳＴ（ＨＡＶ）（１５７ｍｇ）を得た。
なお、得られた重合体について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、７．０〜７．５ｐｐｍにヒスチジン側鎖のイミダゾール環由来のピーク、７．５ｐｐｍ付近にスチレン由来のピークが確認された。また、ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＨＡＶ）であることを同定した。
また、このポリマーの元素分析（元素分析にはＪ−ＳＣＩＥＮＣＥ製ＭＩＣＲＯ  ＣＯＲＤＥＲ  ＪＭ１０を用いた。以下同じ。）からペプチド鎖導入率を算出した結果、９１．０％であった。
【０１０９】
＜実施例２  重合体（ＭＡＳＴ（ＶＨＡＶ））の合成＞
下記式で示されるＭＡＳＴ（ＶＨＡＶ）を、以下の手順で合成した。
【０１１０】
【化１５】
2016190802.tif 000016
【０１１１】
（１）バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１１２】
【化１６】
2016190802.tif 000017
【０１１３】
実施例１の（３）で得たヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（１．５０ｇ）とＦｍｏｃ−バリン（１．００ｇ）を塩化メチレン１０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（０．５０ｇ）及びＨＯＢｔ（０．４０ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（２．３０ｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（２．３０ｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（１．６０ｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍに２つのＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、１．５ｐｐｍ付近にｔ−ブチル基由来のピーク、７．０〜７．５ｐｐｍにヒスチジン側鎖のイミダゾール環由来のピーク、７．０〜８．０ｐｐｍ付近にヒスチジン側鎖の保護基（トリチル基）由来のピークが確認され、得られた化合物がバリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１１４】
（２）重合体（ＭＡＳＴ（ＶＨＡＶ））の合成
【０１１５】
【化１７】
2016190802.tif 000018
【０１１６】
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをバリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例１の（４）と同様にして、ＭＡＳＴ（ＶＨＡＶ）を得た。
なお、得られた重合体について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍに２つのＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、７．０〜７．５ｐｐｍにヒスチジン側鎖のイミダゾール環由来のピーク、７．５ｐｐｍ付近にスチレン由来のピークが確認された。また、ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＶＨＡＶ）であることを同定した。
また、このポリマーの元素分析からペプチド鎖導入率を算出した結果、６０．２％であった。
【０１１７】
＜実施例３  重合体（ＭＡＳＴ（ＧＨＡＶ））の合成＞
下記式で示されるＭＡＳＴ（ＧＨＡＶ）を、以下の手順で合成した。
【０１１８】
【化１８】
2016190802.tif 000019
【０１１９】
（１）グリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１２０】
【化１９】
2016190802.tif 000020
【０１２１】
実施例１の（３）で得たヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（３００ｍｇ）とＦｍｏｃ−グリシン（１４２ｍｇ）を塩化メチレン２０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（９９ｍｇ）及びＨＯＢｔ（７４ｍｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−グリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（４３６ｍｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−グリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（４７４ｍｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、グリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（３２６ｍｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、４．０付近のペプチド主鎖メチレン由来のピークとプロトン比の増加、７．０〜７．５ｐｐｍにヒスチジン側鎖のイミダゾール環由来のピークが確認され、得られた化合物がグリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１２２】
（２）重合体（ＭＡＳＴ（ＧＨＡＶ））の合成
【０１２３】
【化２０】
2016190802.tif 000021
【０１２４】
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをグリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例１の（４）と同様にして、ＭＡＳＴ（ＧＨＡＶ）を得た。
なお、得られた重合体について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、４．０付近のペプチド主鎖メチレン由来のピークとプロトン比の増加、７．０〜７．５ｐｐｍにヒスチジン側鎖のイミダゾール環由来のピーク、７．５ｐｐｍ付近にスチレン由来のピークが確認された。また、ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＧＨＡＶ）であることを同定した。
また、このポリマーの元素分析からペプチド鎖導入率を算出した結果、６８．８％であった。
【０１２５】
＜実施例４  重合体（ＭＡＳＴ（ＧＨＡＶＨＡＶ））の合成＞
下記式で示される（ＭＡＳＴ（ＧＨＡＶＨＡＶ））を、以下の手順で合成した。
【０１２６】
【化２１】
2016190802.tif 000022
【０１２７】
（１）バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
実施例１の（３）で得たヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルにＦｍｏｃ−バリンを反応させ、実施例２の（１）と同様にして、バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルを得た。
【０１２８】
（２）アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
Ｌ−バリン−ｔ−ブチルエステルをバリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例１の（２）と同様にして、アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルを得た。
【０１２９】
（３）ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをアラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例１の（３）と同様にして、ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルを得た。
【０１３０】
（４）グリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルを、ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例３の（１）と同様にして、グリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルを得た。
【０１３１】
（５）重合体（ＭＡＳＴ（ＧＨＡＶＨＡＶ））の合成
【０１３２】
【化２２】
2016190802.tif 000023
【０１３３】
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをグリシル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリニル−ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例１の（４）と同様にして、ＭＡＳＴ（ＧＨＡＶＨＡＶ）を得た。
なお、得られた重合体について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、４．０付近のペプチド主鎖メチレン由来のピークとプロトン比の増加、７．０〜７．５ｐｐｍにヒスチジン側鎖のイミダゾール環由来のピーク、７．５ｐｐｍ付近にスチレン由来のピークが確認された。また、ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＧＨＡＶＨＡＶ）であることを同定した。
また、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルのスチレン由来のピークと側鎖のジメチル基由来ピークとのプロトン比からペプチド鎖導入率を算出した結果、６０．０％であった。
【０１３４】
＜実施例５  重合体（ＭＡＳＴ（ＬＦＳＨＡＶＳＳＮＧ））の合成＞
下記式で示される（ＭＡＳＴ（ＬＦＳＨＡＶＳＳＮＧ））を、以下の手順で合成した。
【０１３５】
【化２３】
2016190802.tif 000024
【０１３６】
（１）ロイシニル−フェニルアラニル−セリニル（ｔＢｕ）−ヒスチジル（Ｂｏｃ）−アラニル−バリニル−セリニル（ｔＢｕ）−セリニル（ｔＢｕ）−アスパラギニル（Ｔｍｏｂ）−グリシンの合成
ロイシニル−フェニルアラニル−セリニル（ｔＢｕ）−ヒスチジル（Ｂｏｃ）−アラニル−バリニル−セリニル（ｔＢｕ）−セリニル（ｔＢｕ）−アスパラギニル（Ｔｍｏｂ）−グリシンの合成は、島津製作所社製のペプチド固相合成機ＰＳＳＭ−８を使用し、Ｆｍｏｃペプチド合成法により合成した。
【０１３７】
（２）重合体（ＭＡＳＴ（ＬＦＳＨＡＶＳＳＮＧ））の合成
【０１３８】
【化２４】
2016190802.tif 000025
【０１３９】
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをロイシニル−フェニルアラニル−セリニル（ｔＢｕ）−ヒスチジル（Ｂｏｃ）−アラニル−バリニル−セリニル（ｔＢｕ）−セリニル（ｔＢｕ）−アスパラギニル（Ｔｍｏｂ）−グリシンに変更する以外は、実施例１の（４）と同様にして、ＭＡＳＴ（ＬＦＳＨＡＶＳＳＮＧ）を得た。
ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＬＦＳＨＡＶＳＳＮＧ）であることを同定した。
また、このポリマーの元素分析からペプチド鎖導入率を算出した結果、３０．０％であった。
【０１４０】
＜実施例６  重合体（ＭＡＳＴ（ＲＥＤＶ））の合成＞
下記式で示される（ＭＡＳＴ（ＲＥＤＶ））を、以下の手順で合成した。
【０１４１】
【化２５】
2016190802.tif 000026
【０１４２】
（１）アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１４３】
【化２６】
2016190802.tif 000027
【０１４４】
実施例１の（１）で得たＬ−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．７ｇ）とＦｍｏｃ−アスパラギン酸−ｔ−ブチルエステル（１．６０ｇ）を塩化メチレン２０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（０．８２ｇ）及びＨＯＢｔ（０．６１ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（２．２６ｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（４３０ｍｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（１６０ｍｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、得られた化合物がアスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１４５】
（２）グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１４６】
【化２７】
2016190802.tif 000028
【０１４７】
上記（１）で得たアスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（１６０ｍｇ）とＦｍｏｃ−グルタミン酸−ｔ−ブチルエステル・一水和物（２０６ｍｇ）を塩化メチレン１０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（９６ｍｇ）及びＨＯＢｔ（７１ｍｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（３４８ｍｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（３４８ｍｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（１９５ｍｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、得られた化合物がグルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１４８】
（３）アルギニル（Ｐｂｆ）−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１４９】
【化２８】
2016190802.tif 000029
【０１５０】
上記（２）で得たグルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（１９５ｍｇ）とＦｍｏｃ−アルギニン（Ｐｂｆ）（２３９ｍｇ）を塩化メチレン１０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（７６ｍｇ）及びＨＯＢｔ（５６ｍｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−アルギニル（Ｐｂｆ）−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（４２０ｍｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−アルギニル（Ｐｂｆ）−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（４２０ｍｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、アルギニル（Ｐｂｆ）−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステル（３１６ｍｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、得られた化合物がアルギニル（Ｐｂｆ）−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１５１】
（４）重合体（ＭＡＳＴ（ＲＥＤＶ））の合成
【０１５２】
【化２９】
2016190802.tif 000030
【０１５３】
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをアルギニル（Ｐｂｆ）−グルタミル（ｔＢｕ）−アスパルチル（ｔＢｕ）−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例１の（４）と同様にして、ＭＡＳＴ（ＲＥＤＶ）を得た。
なお、得られた重合体について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、７．５ｐｐｍ付近にスチレン由来のピークが確認された。また、ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＲＥＤＶ）であることを同定した。
また、このポリマーの元素分析からペプチド鎖導入率を算出した結果、４４．０％であった。
【０１５４】
＜実施例７  重合体（ＭＡＳＴ（ＩＫＶＡＶ））の合成＞
下記式で示される（ＭＡＳＴ（ＩＫＶＡＶ））を、以下の手順で合成した。
【０１５５】
【化３０】
2016190802.tif 000031
【０１５６】
（１）バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１５７】
【化３１】
2016190802.tif 000032
【０１５８】
実施例１の（２）で得たアラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（２．６ｇ）とＦｍｏｃ−バリン（３．６０ｇ）を塩化メチレン２０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（２．２０ｇ）及びＨＯＢｔ（１．６０ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（６．００ｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（６．００ｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（３０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（２．２０ｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行い、得られた化合物がバリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１５９】
（２）リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１６０】
【化３２】
2016190802.tif 000033
【０１６１】
上記（１）で得たバリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．９２ｇ）とＦｍｏｃ−リジン（Ｂｏｃ）（１．２６ｇ）を塩化メチレン２０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（０．５５ｇ）及びＨＯＢｔ（０．４１ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．９８ｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．９８ｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（２０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．４５ｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、１．５〜２．０ｐｐｍ付近にリジンのメチレン由来のピークが確認され、得られた化合物がリジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１６２】
（３）イソロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルの合成
【０１６３】
【化３３】
2016190802.tif 000034
【０１６４】
上記（２）で得たリジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．３７ｇ）とＦｍｏｃ−イソロイシン（０．２３ｇ）を塩化メチレン１０ｍＬに溶解させ、ＤＣＣ（０．１４ｇ）及びＨＯＢｔ（０．１０ｇ）を加え、室温で２４時間撹拌した。その後、溶媒を除去し、酢酸エチルに溶解させた後、０．１Ｍクエン酸、炭酸水素ナトリウム飽和水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。更に硫酸ナトリウムで脱水した後、溶媒を除去し、Ｆｍｏｃ−イソロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．４５ｇ）を得た。
次いで、得られたＦｍｏｃ−イソロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．４５ｇ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（１０ｍＬ）に溶解させ、室温で１４時間撹拌した。溶媒を除去後、酢酸エチルに溶解させ、カラムクロマトグラフィーにて精製を行い、イソロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステル（０．０５ｇ）を得た。
なお、得られた化合物について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、およびイソロイシン側鎖のメチル基由来のピークの増加、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、１．５〜２．０ｐｐｍ付近にリジンのメチレン由来のピークが確認され、得られた化合物がイソロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルであることを同定した。
【０１６５】
（４）重合体（ＭＡＳＴ（ＩＫＶＡＶ））の合成
【０１６６】
【化３４】
2016190802.tif 000035
【０１６７】
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをイソロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−バリニル−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルに変更する以外は、実施例１の（４）と同様にして、ＭＡＳＴ（ＩＫＶＡＶ）を得た。
なお、得られた重合体について1Ｈ−ＮＭＲ測定を行った結果、０〜１．０ｐｐｍにＬ−バリン側鎖のジメチル基由来のピーク、１．０ｐｐｍ付近にアラニン側鎖のメチル基由来のピーク、７．５ｐｐｍ付近にスチレン由来のピークが確認された。また、ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＩＫＶＡＶ）であることを同定した。
また、このポリマーの元素分析からペプチド鎖導入率を算出した結果、３９．０％であった。
【０１６８】
＜比較例１  重合体（ＭＡＳＴ（ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ））の合成＞
下記式で示される（ＭＡＳＴ（ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ））を、以下の手順で合成した。
【０１６９】
【化３５】
2016190802.tif 000036
【０１７０】
（１）リジニル（Ｂｏｃ）−アラニル−フェニルアラニル−アスパラギニル（ｔＢｕ）−イソロイシニル−スレオニル（ｔＢｕ）−チロシニル（ｔＢｕ）−バリニル−アルギニル（Ｐｂｆ）−ロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−フェニルアラニンの合成
【０１７１】
リジニル（Ｂｏｃ）−アラニル−フェニルアラニル−アスパラギニル（ｔＢｕ）−イソロイシニル−スレオニル（ｔＢｕ）−チロシニル（ｔＢｕ）−バリニル−アルギニル（Ｐｂｆ）−ロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−フェニルアラニンの合成は、島津製作所社製のペプチド固相合成機ＰＳＳＭ−８を使用し、Ｆｍｏｃペプチド合成法により合成した。
【０１７２】
（２）重合体（ＭＡＳＴ（ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ））の合成
【０１７３】
【化３６】
2016190802.tif 000037
【０１７４】
ヒスチジル（Ｔｒｔ）−アラニル−バリン−ｔ−ブチルエステルをリジニル（Ｂｏｃ）−アラニル−フェニルアラニル−アスパラギニル（ｔＢｕ）−イソロイシニル−スレオニル（ｔＢｕ）−チロシニル（ｔＢｕ）−バリニル−アルギニル（Ｐｂｆ）−ロイシニル−リジニル（Ｂｏｃ）−フェニルアラニンに変更する以外は、実施例１の（４）と同様にして、ＭＡＳＴ（ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ）を得た。
ＩＲ測定を行った結果、１７００ｃｍ-1付近にイミド由来のピークが出ていることから、マレイミドの形成が確認され、得られた重合体が、上記式で示されるＭＡＳＴ（ＫＡＦＤＩＴＹＶＲＬＫＦ）であることを同定した。
また、このポリマーの元素分析からペプチド鎖導入率を算出した結果、３２．０％であった。
【０１７５】
＜比較例２  マレイン酸−スチレン共重合体の合成＞
【０１７６】
【化３７】
2016190802.tif 000038
【０１７７】
実施例１の（４）のＭＡＳＴを水に分散させ、１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を少量ずつ添加し、完全に溶解させた後、透析にて分子量１４，０００以下を除去し、透析後の水溶液を凍結乾燥することで、マレイン酸−スチレン共重合体（以下、ＭＡＳＴ−ＯＨと略す）を合成した。
【０１７８】
＜比較例３  ＭＡＳＴ−ＯＨ（ＲＫＲＬＱＶＱＬＳＩＲＴ）＞
【０１７９】
【化３８】
2016190802.tif 000039
【０１８０】
上記の比較例２で得られたＭＡＳＴ−ＯＨ（２００ｍｇ）に、ＷＳＣ（５０ｍｇ）を加えて２時間反応させた後、アルギニル−リジニル−アルギニル−ロイシニル−グルタミニル−バリニル−グルタミニル−ロイシニル−セリニル−イソロイシニル−アルギニル−スレオニンで構成されるペプチド（２０ｍｇ）を加えて、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、透析にて分子量１４，０００以下を除去し、透析後の水溶液を凍結乾燥してこれを得た。
このポリマーの元素分析結果よりペプチド鎖導入率を算出した結果、２．４％であった。
【０１８１】
＜比較例４  ＭＡＳＴ−ＯＨ（ＹＡＶＴＧＲＧＤＳＰＡＳ）＞
【０１８２】
【化３９】
2016190802.tif 000040
【０１８３】
上記の比較例２で得られたＭＡＳＴ−ＯＨ（２００ｍｇ）に、ＷＳＣ（５０ｍｇ）を加えて２時間反応させた後、チロシニル−アラニル−バリニル−スレオニル−グリシル−アルギニル−アスパラギン酸残基（Ａｓｐ）−セリニル−プロリニル−アラニル−セリンで構成されるペプチド（２０ｍｇ）を加えて、室温で２時間攪拌反応させた。反応終了後、透析にて分子量１４，０００以下を除去し、透析後の水溶液を凍結乾燥してこれを得た。
このポリマーの元素分析からペプチド鎖導入率を算出した結果、３．６％であった。
【０１８４】
各実施例及び比較例で得た重合体とそのペプチド鎖導入率を以下の表１に示す。
【０１８５】
【表１】
2016190802.tif 000041
【０１８６】
＜実施例８〜１４  コーティング剤＞
１００μｇ／ｍＬとなるように実施例１〜７で得た各重合体を遠沈管内でそれぞれ超純水に溶解させ、コーティング剤を得た。
【０１８７】
＜比較例５〜８  コーティング剤＞
１００μｇ／ｍＬとなるように比較例１〜４で得た各重合体を遠沈管内でそれぞれ超純水に溶解させ、コーティング剤を得た。
【０１８８】
＜試験例１  細胞接着性試験＞
細胞接着性試験は、Ｆ９細胞（マウス卵巣腫）を使用し、滅菌済み１６ｍｍφ細胞培養用２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製１８２０−０２４）にコーティング剤をコーティングして行った。なお、以下全ての操作は無菌操作を前提とする。
（１）細胞培養基材へのコーティング
始めに、表２に示す実施例及び比較例の各コーティング剤を、０．２２μｍの滅菌フィルターに通した後に、上記の２４ウェルプレートの各ウェルに０．５ｍＬずつ分注し、２４時間静置した。その後、超純水１ｍＬで各ウェル内を２回洗浄し、室温で乾燥させ、細胞を播種するまで保管した。
（２）細胞播種
１０％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す）を含むダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭと称す）でＦ９細胞（マウス卵巣腫）を２５×１０4細胞／ｍＬに希釈し、この希釈液を、細胞が１ウェル当たり１０×１０4個となるように上記（１）で調製した各ウェルに播種し、３７℃５％ＣＯ2条件でインキュベーションした。
（３）細胞接着性
細胞播種４時間後に、上清を取り除き、新たにＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）培地を０．５ｍＬ加え、７２時間後に細胞を観察し、比較例６のＭＡＳＴ−ＯＨをコントロールとして細胞接着性を評価した。評価結果を以下の表２に示す。
【０１８９】
【表２】
2016190802.tif 000042
【０１９０】
試験の結果、ペプチドを結合していない重合体を用いた比較例６のコーティング剤と比較して、実施例８〜１４並びに比較例５、７及び８のコーティング剤でコーティング処理したウェルには、細胞が多く接着していることが認められた。
実施例１〜７の重合体は、細胞認識性が高く、これによって優れた細胞接着性を示すものと認められる。
【０１９１】
＜試験例２  細胞毒性試験＞
細胞培養用に親水化処理された市販の９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製）の各ウェルに、２５×１０4ｃｅｌｌ／ｍＬに調製したＦ９細胞を含む液体培地（１０％ＦＢＳ）を１００μＬずつ添加し３７℃、５％ＣＯ2条件で１２時間前培養した。
一方、表３に示す実施例及び比較例の各重合体をそれぞれ０．１０質量％含み、かつ重合体水溶液が１０質量％となるよう培地を調製した。
次いで、前培養したＦ９の培地を上記重合体含有培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件で２４時間培養した。
重合体水溶液を超純水に変更した以外は上記と同様にして培養したものをコントロールとして、ＣＣＫ−８アッセイにて重合体の細胞毒性を確認した。ＣＣＫ−８アッセイにはＣＣＫ−８アッセイキット（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８  ＣＫ０４：同仁化学研究所製）を使用し、使用説明書に従って試験した。試験結果を表３に示す。
【０１９２】
【表３】
2016190802.tif 000043
【０１９３】
試験の結果、実施例１〜３、５〜７の重合体は細胞毒性が低いことがわかった。
【０１９４】
＜試験例３  細胞形質維持試験＞
（１）細胞培養基材へのコーティング
滅菌済み１６ｍｍφ細胞培養用２４ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製１８２０−０２４）の各ウェルに、表４に示す実施例及び比較例の各コーティング剤０．５ｍＬをそれぞれ分注し、２４時間静置した。その後、純水１ｍＬで各ウェル内を２回洗浄し、室温で乾燥させた。
（２）ＥＳ細胞モデル細胞（Ｆ９細胞）の培養
１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭと称す）でＦ９細胞（マウス卵巣腫）を２５×１０4細胞／ｍＬに希釈し、この希釈液を、細胞が１ウェル当たり１０×１０4個となるように上記各ウェルに播種し、３７℃５％ＣＯ2条件で２４時間インキュベーションした。
（３）アルカリフォスファターゼ活性評価
アスピレーターで培地と未認識細胞を上記各ウェルから除去し、レチノイン酸などの分化誘導剤の１ｍＭ（０．１％（ｖ／ｖ））ＤＭＳＯ溶液を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで１００倍希釈した溶液０．５ｍＬずつを添加し、４８時間インキュベートした。
【０１９５】
次いで、アスピレーターで培地を除去し、ＳＴＥＭＧＥＮＴ製Ａｌｋａｌｉｎ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｋｉｔII  ＳＴＥＭＧＥＮＴ製ＳＴＧ００−００５５）を用いてアルカリフォスファターゼ活性を評価した。
評価結果を以下の表４に示す。
【０１９６】
【表４】
2016190802.tif 000044
【配列表】
2016190802000001.app