(57)【要約】【課題】生体から採取された組織について癌の有無を、簡便且つ迅速に判定することが可能な検出方法を提供すること。【解決手段】生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーを、塗布する塗布工程；マーカーを塗布した組織検体から、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去する洗浄工程；癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去した後の、組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出工程を有する、癌の検出方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーを、塗布する塗布工程；
マーカーを塗布した組織検体から、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去する洗浄工程；
癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去した後の、組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出工程；
を有する、癌の検出方法。
【請求項２】
癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位が、糖鎖抗原への結合性を有する部位である請求項１に記載の癌の検出方法。
【請求項３】
光学的な手法により検出可能な部位が、励起光を吸収し蛍光を発し、光学的に検出可能になる部位である請求項１又は２に記載の癌の検出方法。
【請求項４】
検出工程における光学的な手法による検出が、蛍光検出器を用いた蛍光の測定である、請求項３に記載の癌の検出方法。
【請求項５】
光学的な手法により検出する検出工程が、光学的な手法により得られたデータを画像化し画像処理して、組織検体に残存するマーカーを検出する工程である請求項１〜４の何れか１項に記載の癌の検出方法。
【請求項６】
生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーを塗布し、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去して得られる組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出手段を有する、癌の検出装置。
【請求項７】
生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーを、塗布する塗布手段；
マーカーを塗布した組織検体から、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去する洗浄手段；
癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去した後の、組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出手段を有する、癌の検出装置。
【請求項８】
癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位が、糖鎖抗原への結合性を有する部位である請求項６又は７に記載の癌の検出装置。
【請求項９】
光学的な手法により検出可能な部位が、励起光を吸収し蛍光を発し、光学的に検出可能になる部位である請求項６〜８の何れか１項に記載の癌の検出装置。
【請求項１０】
検出手段における光学的な手法による検出が、蛍光検出器を用いた蛍光の測定である、請求項６〜９の何れか１項に記載の癌の検出装置。
【請求項１１】
光学的な手法により検出する検出手段が、光学的な手法により得られたデータを画像化し画像処理して、組織検体に残存するマーカーを検出する手段である請求項６〜１０のいずれか１項に記載の癌の検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、迅速で簡便な癌の検出方法及び、検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
喉頭癌、食道癌、胃癌、大腸癌等の消化器癌の診断では、癌の疑いのある部位を内視鏡検査などにより鉗子を用いて採取し、病理診断（例えば、特許文献１参照）や免疫染色による診断（例えば、特許文献２参照）等により癌の有無や進行度の判定が行われる。しかしながら、従来の判定方法では、顕微鏡用試料の作成や染色等の煩雑な処理が必要であり診断まで長時間を要し、判定にも熟練を要するという問題があり、より迅速で簡便な癌の判定方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１０−１６００１８号公報
【特許文献２】国際公開第２０１０／０９８４３５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、生体から採取した組織検体について、癌細胞の有無を、簡便な手法により、迅速に判定が容易な検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記に鑑み鋭意研究の結果、本発明に到達した。即ち本発明は、生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーを、塗布する塗布工程；
マーカーを塗布した組織検体から、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去する洗浄工程；
癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去した後の、組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出工程を有する、癌の検出方法である。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の目的は、癌細胞の有無を、簡便な手法により、迅速に判定が容易な検出方法を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の癌の検出方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明のマーカーとして、蛍光又はリン光を発するマーカーを使用した場合の本発明の癌の検出方法の概略図である。なお、組織検体１は組織検体の断面図である。
【図３】本発明の装置の検出手段を示す概念図である。
【図４】癌組織片１の蛍光顕微鏡写真である。
【図５】正常組織片１の蛍光顕微鏡写真である。
【図６】癌組織片１の画像処理により階調０〜Ｖに分割した画像である。
【図７】正常組織片１の画像処理により階調０〜Ｖに分割した画像である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
以下、本発明を説明するが、必要に応じて、図１のフローチャート及び図２の概略図を用いて説明する。
【０００９】
〔塗布工程〕
まず、生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカー（以下、「本発明のマーカー」という場合がある）を、塗布する塗布工程について説明する。塗布工程は、図２（ａ）の組織検体１に本発明のマーカー４を塗布し、図２（ｂ）に示すように正常細胞部分２及び癌細胞部分３にマーカー４を付着させる。塗布工程の目的は、採取された組織検体に、本発明のマーカーを塗布することにより、本発明のマーカーを癌細胞に結合、吸着又は配位させることである。
【００１０】
本発明の癌の検出方法が適用できる組織検体としては、癌の発生する生体組織由来であれば特に限定されない。このような生体組織としては、例えば、口腔、食道、胃、小腸、大腸、肛門等の消化管；肝臓、胆嚢、膵臓等の消化腺；鼻腔、咽頭、喉頭、気管、気管支、肺等の呼吸器；腎臓、尿管、膀胱、尿道等の泌尿器；心臓、脾臓、骨髄等の循環器；皮膚、筋肉、皮下、軟骨、骨(骨盤・脊椎)、リンパ節、乳腺、甲状腺、前立腺、精巣(精巣上体)、末梢神経、子宮膣部、子宮内膜等が挙げられる。これらの中で、癌の検出が容易であることから、消化管の組織が好ましく、胃、大腸の組織が更に好ましく、大腸の組織が最も好ましい。
【００１１】
本発明のマーカーは、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーである。本発明のマーカーの、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位としては、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位するタンパク質を結合させた残基を有する部位が好ましく、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位するタンパク質としては、レクチン又はモノクローナル抗体が好ましく、入手が容易であることからレクチンが更に好ましい。癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位するレクチンは、種々のものが知られているが、癌細胞Thomsen-Friedenreich抗原との結合性に優れたレクチンが好ましく、ピーナッツレクチンが更に好ましい。
【００１２】
本発明のマーカーの、光学的な手法により検出可能な部位とは、光学的な手法により検出可能な化合物が、結合、吸着又は配位する部位である。光学的な手法により検出可能な化合物としては、可視光を反射又は吸収して呈色する化合物（例えば、色素、染料、顔料等）、紫外線等の励起光を吸収し蛍光又はリン光を発する化合物等が挙げられ、マーカーが存在する部分とマーカーが存在しない部分とのコントラスト比が大きくできることから、励起光を吸収し蛍光を発する化合物が好ましい。励起光を吸収し蛍光を発する化合物としては、フルオレセイン化合物、ローダミン化合物、クマリン化合物、ＢＯＤＩＰＹ化合物、ｂｉｍａｎｅ化合物、５−ジメチルアミノナフタレンスルホニル化合物、ダポキシル化合物、ＭＡＮＴ化合物、トルイジニルナフタレンスルホニル化合物、ｂｉｍａｎｅ化合物、ピレン化合物、シアニン化合物、ＮＢＤ化合物等が挙げられる。
【００１３】
本発明のマーカーは、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する化合物と、光学的な手法により検出可能な化合物とが、直接に、又はスペーサーを介して間接的に結合してもよいし、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する化合物、若しくは癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する化合物が結合、吸着又は配位された化合物に、光学的な手法により検出可能な化合物が、吸着又は配位してもよい。
【００１４】
癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する化合物と、光学的な手法により検出可能な化合物とが、直接に、又はスペーサーを介して間接的に結合したマーカーとしては、例えば、ＦＩＴＣ等の蛍光標識試薬で蛍光標識したレクチン等が挙げられ、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する化合物が結合、吸着又は配位された化合物に、光学的な手法により検出可能な化合物が吸着したマーカーとしては、例えば、国際公開第２００７／０９７３１８号で開示されたマーカー等が挙げられる。
【００１５】
本発明のマーカーを組織検体に塗布する場合の塗布方法としては、浸漬、滴下、吹付け、噴霧、ハケ塗り等の方法が挙げられる。本発明のマーカーが塗布された組織検体は、本発明のマーカーが癌細胞に結合、吸着又は配位するのに十分な時間経過後に、次の洗浄工程を行う。
【００１６】
本発明のマーカーは組織検体に、そのまま塗布してもよいが、塗布が容易であり、次の洗浄工程での癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去が容易となることから、水性媒体に溶解又は分散して塗布することが好ましい。なお、本発明では、本発明のマーカーの水性溶媒溶液又は分散液を「本発明のマーカー液」という場合がある。本発明において、水性媒体とは、少なくとも、水を５０％以上含有し、２５℃で液状である液体をいう。水性媒体としては、水、生理食塩水、緩衝液、ポリオール化合物水溶液等が挙げられる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。ポリオール化合物水溶液のポリオール化合物としては、プロピレングリコール、１，３−ブタンジオール、グリセリン、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、エリトロース、ソルビトール等が挙げられる。
【００１７】
〔洗浄工程〕
次に、マーカーを塗布した組織検体から、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去する洗浄工程について説明する。塗布工程では、癌細胞だけでなく正常細胞にも本発明のマーカーが塗布されるが、癌細胞を検出するためには、癌細胞部分のみに本発明のマーカーが存在する必要がある。このため、洗浄工程では、次の検出工程での癌細胞の検出を容易にするために、図２の（ｃ）に示すように、癌細胞部分３に結合、吸着又は配位した本発明のマーカー４だけを残し、それ以外のマーカーは除去される。
【００１８】
塗布されたマーカーの除去は、組織検体への悪影響が少ないことから、水性媒体を使用することが好ましく、本発明のマーカーに使用した水性媒体と同一の水性媒体であることがさらに好ましい。洗浄する方法としては、（１）組織検体を水性媒体に浸漬する方法、（２）組織検体に水性媒体をスプレー又は滴下する方法等が挙げられる。浸漬する方法で洗浄する場合は、水性媒体中に組織検体を静置するだけでもよいが、洗浄の効率を上げるために、組織検体又は水性媒体に振動を与えたり、水性媒体を撹拌して水性媒体に流れを起こしてもよい。また、浸漬して洗浄する場合は、水性媒体を取り替えて、浸漬を複数回おこなってもよい。
【００１９】
〔検出工程〕
次に、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去した後の、組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出工程について説明する。光学的な手法により、組織検体に残存するマーカーを検出することにより、組織検体に癌細胞が存在することが確認できる。本発明のマーカーの光学的な手法による検出は、検出可能な部位に、結合、吸着又は配位した、光学的な手法により検出可能な化合物が、可視光を反射又は吸収して呈色する化合物の場合には可視光を、励起光を吸収し蛍光又はリン光を発する化合物の場合にはその励起光を照射し、本発明のマーカー由来の呈色若しくは蛍光又はリン光を検出することによって行われる。
【００２０】
本発明のマーカーが蛍光又はリン光を発するマーカーの場合には、図２の（ｄ）に示すように、組織検体１に照射された励起光５は、正常細胞部分２ではそのまま吸収されるが、癌細胞部分３では本発明のマーカー４が存在することにより、蛍光又はリン光６を発し、この蛍光又はリン光６を検出することにより、癌細胞部分３が存在することが確認できる。
【００２１】
本発明のマーカー由来の呈色若しくは蛍光又はリン光が検出は、目視で行ってもよいが、検出者による誤差を減らし、また多数の試料を取り扱うことができることから、検出機器を使用することが好ましい。本発明のマーカーが、蛍光により検出が可能なマーカーの場合には、蛍光検出器を使用する。蛍光検出器から得られたデータは画像化してもよいし、数値化してもよい。蛍光検出器から得られたデータを数値化する場合には、バックグラウンド（正常細胞由来の蛍光又はリン光）を考慮して閾値を設定し、測定値が閾値を超えた場合に、癌細胞があるものとする。
【００２２】
〔検出装置〕
本発明は上述の癌の検出方法を実現する検出装置の発明であり、詳しくは、
生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーを、塗布する塗布手段；
マーカーを塗布した組織検体から、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去する洗浄手段；
癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去した後の、組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出手段を有する、癌の検出装置である。
【００２３】
〔塗布手段〕
生体から採取された組織検体に、癌細胞に特異的に結合、吸着又は配位する部位と光学的な手法により検出可能な部位を有するマーカーを、塗布する塗布手段について説明する。本発明の塗布手段は、上述の塗布工程が行える手段である。生体から採取された組織検体を本発明のマーカーに塗布する方法としては、簡便で、均一な塗布が可能であることから、組織検体を本発明のマーカー液に浸漬する方法、組織検体に本発明のマーカー液を滴下又は噴霧する方法が好ましく、自動化が容易であることから、組織検体に本発明のマーカー液を滴下又は噴霧する方法が好ましい。浸漬する方法の場合は、例えば、シャーレや試験管に本発明のマーカー液を入れ、さらに組織検体を入れて浸漬すればよい。また、滴下又は噴霧する方法の場合には、例えば、ベルトコンベア状の移送手段の上に組織検体を載せ、本発明のマーカー液を上部から滴下又は噴霧すればよい。
【００２４】
〔洗浄手段〕
マーカーを塗布した組織検体から、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去する洗浄手段について説明する。洗浄手段は、上述の洗浄工程が行える手段である。洗浄の方法としては、簡便であることから、組織検体を水性媒体に浸漬する方法、組織検体に水性媒体を滴下又は噴霧する方法が好ましく、自動化が容易であることから、組織検体に水性媒体を滴下又は噴霧する方法が好ましい。浸漬する方法の場合は、例えば、シャーレや試験管に組織検体を入れ、水性媒体を入れて軽く振盪すればよく、小さな組織検体の場合には、マイクロチューブを使用してもよい。また、滴下又は噴霧する方法の場合には、例えば、ベルトコンベア状の移送手段の上に組織検体を載せ、水性媒体を上部から滴下又は噴霧すればよい。
【００２５】
〔検出手段〕
次に、癌細胞に結合、吸着又は配位していないマーカーを除去した後の、組織検体に残存するマーカーを、光学的な手法により検出する検出手段について説明する。本発明の検出手段は、上述の検出工程が行える手段である。本発明の検出手段では、洗浄された組織検体に可視光又は励起光を照射する照射器と、本発明のマーカー由来の呈色若しくは蛍光又はリン光を検出する検出器が必要となる。すなわち、図３に示すように、洗浄処理後の組織検体７に、照射器８から、可視光又は励起光１０を照射し、これにより発生する本発明のマーカー由来の呈色若しくは蛍光又はリン光１１を、検出器９により検出する。検出器により得られたデータにより癌の有無を判断することになるが、癌細胞は組織検体の全面に存在するとは限らず、組織検体の癌細胞が存在する部分と、存在しない部分では、検出器により得られたデータは大きく異なることになる。このため、癌の検出の精度を高めるには、癌細胞が存在する部分、即ち、検出器により得られたデータがより高い測定値となる部分について測定する必要があり、検出器により得られたデータをコンピューター１２に送って画像化し画像処理して、検出器の測定値が高い部分の測定値とその大きさにより癌の有無を判断することが好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下本発明を実施例により、具体的に説明する。
【００２７】
〔マーカー液〕
フルオレセイン化コレステロールの代わりに、クマリン６を使用した以外は、国際公開第２００７／０９７３１８号の実施例２と同様の方法によりマーカーＡを合成し、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンを含有するダベルコリン酸緩衝液（シグマアルドリッチジャパン社製、商品名：以下ＤＰＢＳ（＋）と略記する）に、マーカーＡが１質量％となるように分散させてマーカー液を調製した。マーカーＡは、蛍光を発する化合物としてクマリン６、癌に結合、吸着又は配位する部位としてピーナツレクチンを有する微粒子であり、動的光散乱法により測定した平均粒子径は４００ｎｍであった。
【００２８】
〔評価に使用する生体組織〕
ヒト大腸癌細胞株（ＨＴ−２９）をヌードマウスの直腸の漿膜下に移植し、２８日間飼育して癌細胞を定着、成長させた大腸癌組織と、ヌードマウスの大腸の正常組織を試験に用いた。
【００２９】
〔試験方法〕
小片状に切断された組織片（癌組織片３点、正常組織片２点）を、マーカー液に２分間浸漬した後、ＤＰＢＳ（＋）を用いて、過剰の検出液を除去した。検出液処理した組織片を蛍光顕微鏡（オリンパス社製、型式：ＢＸ６３）を用いて撮影（観察倍率４０倍、露光時間１／６０、ＦＩＴＣフィルター使用）し、撮影した画像を画像ソフト（三谷商事製、製品名ＷｉｎＲＯＯＦ）を用いて以下の方法により画像処理し、下記の方法により、蛍光強度により階調ＩＩＩ〜Ｖの面積％比を求めた。結果を表１に示す。また、図４、図５に癌組織片又は正常組織片の蛍光顕微鏡写真、図６、図７に、癌組織片又は正常組織片の画像処理により階調０〜Ｖに分割した画像を示す。
（１）蛍光顕微鏡の画像（カラー画像）を白黒画像にする。
（２）癌組織片の白黒画像を濃淡により２５６階調に分ける。
（３）組織片の存在しない階調を階調０、残りの階調を表１に示す階調幅で５つの階調に分割し、発光強度が低い順に階調Ｉ〜Ｖとする。
（４）階調Ｉ〜Ｖのそれぞれの面積％比を求める。
（５）正常組織片の画像についても、癌組織片の画像と同様の尺度の階調区分を適用し階調Ｉ〜Ｖのそれぞれの面積％比を求める（従って、階調ＩＶ又はＶが０％もありうる）。
【００３０】
【表１】
2016048232.tif 000003
【００３１】
最も蛍光強度が高い階調ＩＶ又はＶの値だけでは、癌組織片と正常組織を判別することは困難であるが、階調ＩＩＩからＶの合計の値では、癌組織片が何れも５％を超えているのに対し、正常組織片では１％未満であり、癌組織片と正常組織を容易に判別できる。図４と図５は、癌組織片１と正常組織片１の蛍光顕微鏡写真、図６と図７は、画像処理して階調Ｉ〜Ｖに分割した画像である。蛍光顕微鏡写真だけで、癌組織片と正常組織を判別することは困難であるが、画像処理することにより判別が容易となるが、上述のように数値化することによりさらに判別が容易となる。従って、本発明の方法は、生体から採取した組織検体について、癌細胞の有無を、簡便な手法により、迅速に判定が容易な検出方法であるといえる。
【符号の説明】
【００３２】
１    組織検体
２    正常細胞部分
３    癌細胞部分
４    マーカー
５    励起光
６    蛍光又はリン光
７    洗浄処理後の組織検体
８    照射器
９    検出器
１０  可視光又は励起光
１１  本発明のマーカー由来の呈色若しくは蛍光又はリン光
１２  コンピューター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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