(57)【要約】      （修正有）【課題】ポリフェノールを安定化するリポソーム製剤およびその製造方法の提供。【解決手段】下記構造式で表される化合物、及びその塩及び配糖体；スキルプシンＡ、スキルプシンＢ、スキルプシンＣ、ラポンチゲニン、イソラポンチゲニン、及びアストリンジン；並びにカテキン、アントシアニジン、及びその塩及び配糖体から選択されるポリフェノールを含有した酸性溶液を酸性リン脂質でリポソームとした製剤。2016183142.tif 000008［Ｒ１〜Ｒ６は、各々独立に、−Ｈ、−ＯＨ又は−ＯＲ（ＲはＣ１〜Ｃ１２のアルキル基）］【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリフェノールを含有する酸性溶液を封入したリポソーム製剤。
【請求項２】
前記ポリフェノールが下記構造式で表される化合物またはその塩または配糖体である、請求項１に記載のリポソーム製剤。
2016183142.tif 000006
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ及び−ＯＲ（ＲはＣ１〜Ｃ１２のアルキル基）から選択される基である。）
【請求項３】
ＲがＣ１〜Ｃ６のアルキル基である、請求項２に記載のリポソーム製剤。
【請求項４】
前記ポリフェノールがスキルプシンＡ、スキルプシンＢ、スキルプシンＣ、ラポンチゲニン、イソラポンチゲニン、アストリンジンから選ばれる、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項５】
前記ポリフェノールがピセアタンノールまたはその塩または配糖体である、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項６】
前記ポリフェノールがピセアタンノールである、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項７】
前記ピセアタンノールが、植物のエキス由来である、請求項６に記載のリポソーム製剤。
【請求項８】
前記エキスが、パッションフルーツ種子、テンニンカ、またはマキバブラシノキのエキスである、請求項７に記載のリポソーム製剤。
【請求項９】
前記ポリフェノールがカテキンまたはアントシアニジンまたはその塩または配糖体である、請求項１に記載のリポソーム製剤。
【請求項１０】
酸性リン脂質を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１１】
ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、および／またはジオレオイルホスファチジルセリンを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１２】
前記酸性溶液がα-シクロデキストリンを含有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のリポソーム製剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のリポソーム製剤である、ポリフェノールの安定化製剤。
【請求項１４】
前記ポリフェノールがピセアタンノールである、請求項１３に記載のポリフェノールの安定化製剤。
【請求項１５】
ポリフェノールを含有する酸性溶液をリポソームに封入する工程を含む、リポソーム製剤の製造方法。
【請求項１６】
前記ポリフェノールがピセアタンノールである、請求項１５に記載のリポソーム製剤の製造方法。
【請求項１７】
前記リポソーム製剤が請求項１〜１２のいずれかに記載のリポソーム製剤である、請求項１５に記載のリポソーム製剤の製造方法。
【請求項１８】
ポリフェノールを含有する酸性溶液をリポソームに封入する工程を含む、ポリフェノールの安定化方法。
【請求項１９】
前記ポリフェノールがピセアタンノールである、請求項１８に記載のポリフェノールの安定化方法。
【請求項２０】
前記ポリフェノールが下記構造式で表される化合物、及びその塩及び配糖体；スキルプシンＡ、スキルプシンＢ、スキルプシンＣ、ラポンチゲニン、イソラポンチゲニン、及びアストリンジン；並びにカテキン、アントシアニジン、及びその塩及び配糖体から選択される、請求項１８に記載のポリフェノールの安定化方法。
2016183142.tif 000007
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ及び−ＯＲ（ＲはＣ１〜Ｃ１２のアルキル基）から選択される基である。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリフェノールのリポソーム製剤およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリフェノールは、天然に豊富に存在し、様々な生理活性を有することが知られている化合物である。ピセアタンノールは、ポリフェノールに属するスチルベン類の化合物であって、例えば、トケイソウ科トケイソウ属（Passiflora）の果物であるパッションフルーツの種子に含まれており、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献１を参照）。
【０００３】
また、ピセアタンノールは、フトモモ科テンニンカ属（Rhodomyrtus）の常緑低木であるテンニンカやフトモモ科ブラシノキ属（Callistemon）の常緑の木本であるマキバブラシノキ（Callistemon rigidus）にも含まれている。それらの抽出物には、それぞれ紫外線ダメージ回復効果やＭＭＰ-２の阻害作用があり、その有効成分は、抽出物に含まれるピセアタンノールであることが報告されている（特許文献２および非特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００９−１０２２９８号公報
【特許文献２】特開２０１２−４６４４８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】佐々木健郎他、東北薬科大学研究誌、５７、６１−６５（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、ポリフェノールのリポソーム製剤、およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者等は、ピセアタンノールやその誘導体、特にパッションフルーツの種子抽出物に含まれるピセアタンノールは、中性付近のｐＨでは不安定であって、時間の経過に伴って、別の化合物へと変換されることを見出した。そして、ピセアタンノールやその誘導体の中性付近での安定化方法を開発すべく、鋭意努力した結果、ピセアタンノールおよび／またはその誘導体を封入したリポソーム製剤とすることによって、ピセアタンノールやその誘導体が別の化合物へと変換されるのを抑制できることを見出し、本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明の一実施態様は、ポリフェノールを含有する酸性溶液を封入したリポソーム製剤である。前記ポリフェノールがピセアタンノール、ピセアタンノール誘導体、カテキン、カテキン誘導体、アントシアニジン、アントシアニジン誘導体、及びそれらの塩からなる群の少なくとも１つであってもよい。また、本リポソーム製剤は、酸性リン脂質を含んでもよく、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、および／またはジオレオイルホスファチジルセリンを含んでもよい。前記ピセアタンノールおよび／またはその誘導体が、植物のエキス由来であってもよく、前記エキスが、パッションフルーツ種子、テンニンカ、またはマキバブラシノキのエキスであってもよい。そして、前記酸性溶液がα-シクロデキストリンを含有してもよい。
【０００９】
本発明の他の実施態様は、ポリフェノールを含有する酸性溶液を封入したリポソーム製剤である、ポリフェノールの安定化製剤である。前記ポリフェノールがピセアタンノール、ピセアタンノール誘導体、カテキン、カテキン誘導体、アントシアニジン、アントシアニジン誘導体、及びそれらの塩からなる群の少なくとも１つであってもよい。前記酸性溶液がα-シクロデキストリンを含有してもよい。
【００１０】
本発明のさらなる実施態様は、ポリフェノールを含有する酸性溶液をリポソームに封入する工程を含む、リポソーム製剤の製造方法である。前記ポリフェノールがピセアタンノール、ピセアタンノール誘導体、カテキン、カテキン誘導体、アントシアニジン、アントシアニジン誘導体、及びそれらの塩からなる群の少なくとも１つであってもよい。前記リポソームが酸性リン脂質を含んでもよく、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、および／またはジオレオイルホスファチジルセリンを含んでもよい。前記ピセアタンノールおよび／またはその誘導体が、植物のエキス由来であってもよく、前記エキスが、パッションフルーツ種子、テンニンカ、またはマキバブラシノキのエキスであってもよい。
【００１１】
本発明のさらなる実施態様は、ポリフェノールを含有する酸性溶液をリポソームに封入する工程を含む、ポリフェノールの安定化方法である。前記ポリフェノールがピセアタンノール、ピセアタンノール誘導体、カテキン、カテキン誘導体、アントシアニジン、アントシアニジン誘導体、及びそれらの塩からなる群の少なくとも１つであってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、ポリフェノールのリポソーム製剤およびその製造方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本発明の一実施例において、ピセアタンノール水溶液を封入するリポソーム製剤中のピセアタンノール（ＰＩＣ）の安定性を調べた結果を表す図である。
【図１Ｂ】本発明の一実施例において、パッションフルーツ種子エキスを封入するリポソーム製剤中のピセアタンノール（ＰＩＣ）の安定性を調べた結果を表す図である。
【図１Ｃ】本発明の一実施例において、テンニンカ実エキスを封入するリポソーム製剤中のピセアタンノール（ＰＩＣ）の安定性を調べた結果を表す図である。
【図１Ｄ】本発明の一実施例において、マキバブラシノキ茎エキスを封入するリポソーム製剤中のピセアタンノール（ＰＩＣ）の安定性を調べた結果を表す図である。
【図２】本発明の一実施例において、パッションフルーツ種子エキスを封入するリポソーム製剤中のスキルプシンＢ（ＳｃｉＢ）の安定性を調べた結果を表す図である。
【図３】本発明の一実施例において、パッションフルーツ種子エキス中のピセアタンノールの安定性に対するリポソームのリン脂質組成の影響を調べた結果を表す図である。
【図４】本発明の一実施例において、パッションフルーツ種子エキス中のピセアタンノールの安定性に対するリポソームの粒径の影響を調べた結果を表す図である。
【図５】本発明の一実施例において、ピセアタンノール、カテキン、アントシアニンのそれぞれの酸性溶液または中性溶液を封入するリポソーム製剤中で、各ポリフェノールの安定性を調べた結果を表す図である。
【図６】本発明の一実施例において、リポソーム製剤中で、ポリフェノールの安定性に対するα-シクロデキストリンの効果を調べた結果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的、特徴、利点、およびそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態および具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
（１）ポリフェノール
ポリフェノールは特に限定されず、例えば、下記構造式で表される、フラバン骨格、trans-スチルベン骨格、またはcis-スチルベン骨格を有するポリフェノールであってもよい。
【００１６】
【化１】
2016183142.tif 000002
フラバン骨格を有するポリフェノールとして、例えば、フラボノール（ケルセチン、ルチンなど）、フラボン（アピゲニン、ルテオリンなど）、イソフラボン（ダイゼイン、ゲニステインなど）、フラバノン（ナリンゲニン、ナリンジンなど）、カテキン（ＥＣ、ＥＧＣｇなど）、およびアントシアニジン（シアニジンなど）などのフラボノイド、並びに、これらの光学異性体、塩、配糖体などが挙げられる。スチルベン骨格を有するポリフェノールとして、例えば、レスベラトロール、およびピセアタンノールなどのスチルベン、並びに、これらのシス−トランス異性体、塩、配糖体が挙げられる。配糖体としては、グリコシド、ガラクトシド等が例示できる。
【００１７】
中でも、ポリフェノールが、ピセアタンノール、ピセアタンノール誘導体、カテキン、カテキン誘導体、アントシアニジン、アントシアニジン誘導体、またはそれらの塩であることが好ましい。以下、代表的なポリフェノールについて説明する。
【００１８】
［１］ピセアタンノールおよびその誘導体
下記構造式で示されるピセアタンノールはポリフェノールの一種であり、上記スチルベン骨格を基本とした化合物であるスチルベン類の一つである。
【００１９】
【化２】
2016183142.tif 000003
ピセアタンノールまたはその誘導体には、例えば、下記構造式（Ｉ）のトランス体が含まれる。
【００２０】
【化３】
2016183142.tif 000004
（式中、Ｒ１〜Ｒ６は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ及び−ＯＲ（Ｒはアルキル基）から選択される基である。）
なお、置換基Ｒに関して、様々な態様が考えられるが、Ａ）〜Ｃ）が好ましい。
【００２１】
Ａ）ＲはＣ１〜Ｃ１２のいずれかである。
【００２２】
Ｂ）ＲはＣ１〜Ｃ６のいずれかである。
【００２３】
Ｃ）ＲはＣ１のメチル基である。
【００２４】
また、Ｒ１〜Ｒ６に関しても、様々な組み合わせが考えられるが、１）〜６）が好ましい。
【００２５】
１）Ｒ１〜Ｒ３のいずれも−ＯＨまたは−ＯＲである。
【００２６】
２）Ｒ１〜Ｒ３のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＨまたは−ＯＲである。
【００２７】
３）Ｒ１〜Ｒ３のうち、Ｒ３は−Ｈであって、残りの二つは−ＯＨまたは−ＯＲである。
【００２８】
４）Ｒ４〜Ｒ６のいずれも−ＯＨまたは−ＯＲである。
【００２９】
５）Ｒ４〜Ｒ６のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＨまたは−ＯＲである。
【００３０】
６）Ｒ４〜Ｒ６のうち、Ｒ６は−Ｈであって、残りの二つは−ＯＨまたは−ＯＲである。
【００３１】
ここで、本明細書では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６が−ＯＨであって、Ｒ３が−Ｈであって、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである化合物をピセアタンノールと呼ぶ。また、ピセアタンノールのメチル化誘導体として、ＲはＣ１のメチル基であって、Ｒ１〜Ｒ３のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＨまたは−ＯＲであって、Ｒ４〜Ｒ６のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＨまたは−ＯＲである場合（上記選択肢において、Ｃ／２／５の組み合わせ）が好ましい。ここで、Ｒ１、Ｒ２が−ＯＨであって、Ｒ３が−Ｈであって、Ｒ６が−ＯＣＨ３であって、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＨである化合物がラポンチゲニンであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ６が−ＯＨであって、Ｒ３が−Ｈであって、Ｒ４とＲ５のうち、一方が−Ｈで、もう一方が−ＯＣＨ３である化合物がイソラポンチゲニンである。また、ピセアタンノールのアルキル化誘導体として、ＲはＣ１〜Ｃ６のアルキル基であって、Ｒ１〜Ｒ３のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲであって、Ｒ４〜Ｒ６のうち、いずれか一つは−Ｈであって、残りの二つは−ＯＲである場合（上記選択肢において、Ｂ／２／５の組み合わせ）が好ましい。
【００３２】
ピセアタンノールの誘導体は、上記化合物の他、上記化合物の二量体（ホモ二量体及びヘテロ二量体を含む）などの多量体や配糖体であってもよい。誘導体としては、例えば、二量体であるスキルプシンＡ、スキルプシンＢ、スキルプシンＣ、メチル化体であるラポンチゲニン、イソラポンチゲニン、配糖体であるアストリンジンなどが挙げられる。
【００３３】
ピセアタンノールおよびその誘導体の分子量は、特に限定されないが、例えば、２０００以下であっても良く、１０００以下であることが好ましく、６００以下であることがより好ましい。
【００３４】
［２］カテキンおよびその誘導体
カテキンとは、C15H14O6で表されるフラボノイド及びその誘導体を意味し、具体的には、エピカテキン、カテキン、エピガロカテキン、ガロカテキンが例示できる。また、その誘導体は、そのメチル化体やエチル化体を含んだアルキル化体、またはその配糖体であってもよく、具体的には、４”Ｍｅ−ＥＧＣｇ（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート）、４”Ｍｅ−ＧＣｇ（（−）−ガロカテキン−３−Ｏ−（４−Ｏ−メチル）ガレート）、３”Ｍｅ−ＥＧＣｇ（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート）、３”Ｍｅ−ＧＣｇ（（−）−ガロカテキン−３−Ｏ−（３−Ｏ−メチル）ガレート）、ＥＣｇ（（−）−エピカテキン−３−Ｏ−ガレート）、Ｃｇ（（−）−カテキン−３−Ｏ−ガレート）、ＥＧＣｇ（（−）−エピガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）、または、ＧＣｇ（（−）−ガロカテキン−３−Ｏ−ガレート）が例示できる。
【００３５】
［３］アントシアニジンおよびその誘導体
アントシアニジンは、フラボノイドの中で、2-phenylbenzopyrylium (flacvylium)を基本骨格とする化合物群の総称であり、下記の構造式（ＩＩ）で表される。
【００３６】
2016183142.tif 000005
（式中、Ｒ1〜Ｒ７はそれぞれ独立に選ばれた水素原子、水酸基、又は炭素数が１〜４のアルコキシ基を示す。）天然に存在するものとして、ペラルゴニジン、シアニジン、デルフィニジン、ペオニジン、ペチュニジン、マルビジン等が挙げられるが、本発明で用いることのできるアントシアニジンは、これらに限定されない。
【００３７】
アントシアニジンの誘導体は、配糖体や有機酸結合体が例示できる。アントシアニジンの配糖体はアントシアニンと呼ばれ、グルコース、ガラクトース、ラムノースなどが結合しているが、結合糖はこれらに限定されない。
【００３８】
（２）植物エキスの製法
上記ポリフェノールは、化学合成品であってもよいが、植物エキス由来であってもよい。
【００３９】
植物のエキスの具体的な製造方法として、公知の方法を用いることができ、例えば、植物を、乾燥した後に、破砕、粉砕、または、切断などによって種子分解物を得、溶媒を用いて抽出し、残渣を除去することによって抽出液を得ることができる。この抽出液をそのまま用いてもよく、この抽出液から様々な方法でポリフェノールを精製して得られた様々な純度の精製溶液を用いてもよいが、さらに、抽出液から溶媒を除去することによって、抽出物を得ることができる。抽出物の形状は、特に限定されず、例えば粉体などの固体状、アモルファス状、または、オイル状であっても良い。このように、植物から抽出物を得る段階のいずれのもの（抽出液あるいは精製溶液）、抽出物を水溶液に溶解させた抽出物水溶液、あるいは抽出液、精製溶液、抽出物水溶液などを水溶液で希釈したもののいずれも、本発明の植物のエキスとして使用することができる。
【００４０】
抽出に用いる溶媒の種類は、当業者であれば適切に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であっても良く、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であることが好ましく、水、エタノール、または、水およびエタノールの混合溶媒であることがより好ましい。混合溶媒を用いる場合の、各溶媒の混合比は特に限定されないが、例えば水およびエタノールの混合溶媒を用いる場合には、水とエタノールとの体積比は、１：９９〜９９：１であっても良く、３：９７〜８０：２０であることが好ましく、５：９５〜５０：５０であることがより好ましく、１０：９０〜４０：６０であることが特に好ましい。
【００４１】
溶媒として、水、または、水との混合溶媒を用いる場合には、熱水、または、熱水との混合溶媒であることが好ましい。水、または、水との混合溶媒は塩を含んでいても良く、塩を含む溶媒の例として、バッファー（緩衝液）であっても良い。バッファーのｐＨは、特に限定されず、酸性、中性、または、アルカリ性のいずれであっても良いが、酸性であることが好ましく、ｐＨ６以下の酸性であることがより好ましく、ｐＨ１〜ｐＨ５の酸性であることがさらに好ましい。バッファーに用いる塩の種類は特に限定されず、例として、クエン酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、酢酸塩および炭酸塩などが挙げられる。
【００４２】
抽出液からポリフェノールを精製する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、イオン交換樹脂や合成吸着樹脂等を用いたカラムクロマトグラフィーなどがよく知られている。
【００４３】
抽出液から溶媒を除去する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、減圧留去、凍結乾燥、または、スプレードライ（噴霧乾燥）であっても良いが、凍結乾燥、または、スプレードライであることが好ましく、スプレードライであることがより好ましい。
【００４４】
ここで、植物の種類は、ポリフェノールを含む植物であれば特に限定されず、パッションフルーツ（例えば、Passiflora edulis、Passiflora alata、Passiflora amethystine、Passiflora antioquiensis、Passiflora biflora、Passiflora buonapartea、Passiflora capsularis、Passiflora cearensis、Passiflora coccinea、Passiflora cochinchinesis、Passiflora filamentosa、Passiflora herbertiana、Passiflora laurifolia、Passiflora ligularis、Passiflora lunata、Passiflora lutea、Passiflora maliformis、Passiflora mixta、Passiflora mucronata、Passiflora mollissima、Passiflora nibiba、Passiflora organensis、Passiflora pallida、Passiflora parahypensis、Passiflora pedeta、Passiflora pinnatistipula、Passiflora popenovii、Passiflora quadrangularis、Passiflora riparia、Passiflora rubra、Passiflora serrate、Passiflora tiliaefolia、Passiflora tripartite、Passiflora villosa、Passiflora warmingiiなど）、テンニンカ（例えば、Rhodomyrtus tomentosaなど）、ブラシノキ（例えば、マキバブラシノキCallistemon speciosus、Callistemon rigidusなど）、カラガナチベチカ（Caragana tibetica）（例えば茎）、イタドリ（Fallopia japonica）（例えば根）、落花生（Arachis hypogaea）、ブドウ（Vitaceae）（例えば果実）、ブルーベリー（Cyanococcus）（例えば果実）、ディアベリー（Vaccinium stamineum）（例えば果実）、ブラックベリー（Rubus fruticosusなど）（例えば果実）、カシス（Ribes nigrum）（例えば果実）、茶（Camellia sinensis）（例えば葉や茎）、カカオ（Theobroma cacao）（例えば種子）、などが挙げられる。ピセアタンノールを高濃度で含むことが知られている、パッションフルーツ、テンニンカ、またはブラシノキ、カテキンを高濃度で含むことが知られている茶、カカオ、アントシアニジン配糖体であるアントシアニンを高濃度で含むことが知られているブルーベリーやブラックベリーであることが好ましい。抽出するのは、植物全体のうち、どの部分であっても良く、例えば、果実、花、種子、葉、枝、樹皮、幹、茎、または、根であっても良いが、パッションフルーツを用いる場合は種子であることが好ましく、テンニンカである場合には果実であることが好ましく、ブラシノキである場合には茎であることが好ましい。
【００４５】
（３）リポソーム製剤
本発明のリポソーム製剤の製法は特に限定されず、リポソームへ薬剤を封入するための手段として様々な方法が知られているが、例えば、水和法（Bangham法）、Ｎａ+／Ｋ+濃度勾配を用いたリモートローディング法（特公平０７−１１２９６８号公報）などのイオン勾配法、ｐＨ勾配法（Remote loading法、特許公報第２６５９１３６号、米国特許５１９２５４９号）などが例示できる。なお、リポソーム製剤に用いる脂質組成、脂質の修飾など、特に限定されるものではない。
【００４６】
本発明に用いるリポソーム製剤は特に限定されないが、脂質二重層が多重に構成された、多重層リポソーム（multilamellar vesicle; MLV）または多重層巨大リポソーム（giant multilamellar vesicle; GMV）を用いることが好ましい。ＭＬＶは、例えば、クロロホルムまたはクロロホルム／メタノールの混合溶媒中にリン脂質を溶解した後、エバポレーターを用いて溶媒を留去することによって作製した脂質薄膜に封入溶液を加え、加温した上でボルテックスミキサーを用いて水和、浸透させて調製することができる。また、ＧＭＶは、例えば、クロロホルムまたはクロロホルム／メタノールにヘキソースを添加した混合溶媒中にリン脂質を溶解した後、エバポレーターを用いて溶媒を留去することによって作製した脂質薄膜に封入溶液を加え、加温した上で穏やかにボルテックスすることで水和、浸透、膨潤させて調製することができる。さらに、得られたＭＬＶまたはＧＭＶに超音波照射することにより調製された、単層リポソーム（unilamellar vesicle）を用いてもよい。リポソーム製剤の粒子径は特に限定されないが、数ｎｍ〜数十μｍであってもよい。
【００４７】
ポリフェノール（特に、ピセアタンノール、ピセアタンノール誘導体、カテキン、カテキン誘導体、アントシアニジン、アントシアニジン誘導体、およびそれらの配糖体からなる群の少なくとも１つ）を含有する封入液は、例えば、植物から抽出されたポリフェノールを含有する植物エキス、あるいは化学合成したポリフェノールを水溶液に溶解させたポリフェノール水溶液など、上述したポリフェノールを含む水性溶液であれば限定されない。ポリフェノールを含有する封入液のｐＨは酸性であって、ｐＨ６以下であってもよく、あるいはｐＨ５以下であってもよい。また、ｐＨ１以上であってもよく、ｐＨ３．５以上であってもよい。なお、水性溶液とは、水そのものまたは水が主たる成分または溶媒であって油と相分離する任意の溶液をいう。
【００４８】
この封入液は、α-シクロデキストリンを含有することが好ましい。α-シクロデキストリンの濃度は特に限定されないが、０．１〜２０重量％であることが好ましく、１〜１０重量％であることがより好ましく、３〜７重量％であることがさらに好ましい。
【００４９】
リポソーム製剤に使用するリン脂質は特に限定されないが、酸性リン脂質を含むことが好ましく、具体的には、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール等が例示できる。特に、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールと、中性リン脂質であるホスファチジルコリンを組み合わせて使用することが好ましい。
【００５０】
リポソーム製剤に使用するリン脂質の濃度は特に限定されないが、リポソーム製剤中に通常１〜１０００ｍＭ、好ましくは２〜５００ｍＭ、より好ましくは１０〜２００ｍＭの濃度で含まれる。
【００５１】
このようにして得られたリポソーム製剤は、外液を中性（例えば、ｐＨ５〜９、好ましくは、ｐＨ６〜８、より好ましくはｐＨ６．５〜７．５）に調整することが可能である。ポリフェノール（特に、ピセアタンノール、ピセアタンノール誘導体、カテキン、カテキン誘導体、アントシアニジン、アントシアニジン誘導体、およびそれらの配糖体からなる群の少なくとも１つ）は、通常、中性溶液中で不安定であるが、このようにリポソーム製剤とすることにより、中性溶液中での安定化製剤とすることができ、それによって溶液のｐＨに関わらず、ポリフェノールを安定化することができる。このようにして、本発明のリポソーム製剤は、薬品（医薬および試薬を含む）、化粧品、食品など、様々な用途に用いることができる。
【実施例】
【００５２】
[実施例１]
（１）サンプル調製
まず、ｐＨ４．５のピセアタンノール純品水溶液、パッションフルーツ種子エキス、テンニンカ実エキス、マキバブラシノキ茎エキスを準備した。ピセアタンノール純品はパッションフルーツ種子エキスからの純度９０％以上の精製物を使用し、これをｐＨ４．５の２０ｍＭ酢酸バッファーで０．５ｍｇ／ｍＬになるよう室温で溶解した。一方、パッションフルーツ種子エキス、テンニンカ実エキス、マキバブラシノキ茎エキスは、パッションフルーツの種子またはテンニンカの実またはマキバブラシノキの茎を破砕し、含水エタノール（水：エタノール＝２０：８０（ｖ／ｖ））で抽出し、適量に濃縮し、さらにｐＨ４．５の１００ｍＭ酢酸バッファーにて希釈することによって調製した。なお、得られたパッションフルーツ種子エキスは１．２５ｍｇ／ｍＬ、テンニンカ実エキスおよびマキバブラシノキ茎エキスは０．０５ｍｇ／ｍＬのピセアタンノールを含有していた。
【００５３】
（２）リポソーム製剤作製
リポソームは、次のようにして調製した。クロロホルムに溶かしたリン脂質およびメタノールに溶かしたフルクトースの混合溶液（ジオレオイルホスファチジルコリン（ＰＣ）/ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＧ）/フルクトース = １/９/１０、クロロホルムとメタノールの量比２:１）を、減圧ボルテックス処理により溶媒を除去して脂質薄膜を形成させた後、さらに1時間減圧を行い、薄膜状になったリン脂質に（１）の純品水溶液および各エキスを加え、穏やかにボルテックス処理を行い、リポソームを作製した。次に、作製したリポソームを１０μｍのポリカルボネートメンブレンフィルターで加圧濾過した。また、リポソームに封入されなかった成分を除去するために、分画分子量（ＭＷＣО）３００ｋＤの透析チューブにリポソーム溶液を入れ、フルクトースを添加してリポソーム溶液と等張にした１０ｍＭ酢酸-酢酸ナトリウム/フルクトース溶液（ｐＨ４．５）５００倍量に対して９６時間、２４時間毎に透析液を交換して透析した。透析後のリポソームは、アルゴンガスを充填し遮光して４℃で保存した。この作製方法により、リポソーム製剤の粒子径が数μｍ〜数十μｍとなった。
【００５４】
（３）安定性測定
（２）で作製した各リポソーム製剤を、フルクトース含有リン酸バッファーで希釈した。具体的には、ピセアタンノール純品水溶液封入リポソーム製剤は、ｐＨ７．２の７０ｍＭフルクトース含有２０ｍＭリン酸バッファーで８．９倍希釈、パッションフルーツ種子エキス封入リポソーム製剤は、ｐＨ７．２の２４ｍＭフルクトース含有１００ｍＭリン酸バッファーで５倍希釈、テンニンカ実エキス封入リポソーム製剤は、ｐＨ７．２の５８６ｍＭフルクトース含有１００ｍＭリン酸バッファーで２．５倍希釈、マキバブラシノキ茎エキス封入リポソーム製剤は、ｐＨ７．２の３４５ｍＭフルクトース含有１００ｍＭリン酸バッファーで２．５倍希釈した。いずれのバッファーも、フルクトースを添加することによって、希釈するリポソーム製剤と等張にした。この希釈操作により、ピセアタンノール純品水溶液封入リポソーム製剤はｐＨ６．９に、パッションフルーツ種子エキス封入リポソーム製剤はｐＨ７．２に、テンニンカ実エキス、マキバブラシノキ茎エキス封入リポソーム製剤はｐＨ６．３に調製された。また、コントロールとしては、リポソーム製剤とせず、（１）で調製したピセアタンノール純品水溶液および各エキスを、単にそれぞれ同じフルクトース含有リン酸バッファーにて希釈した溶液を用いた。各リポソーム製剤溶液と、それに対応する各コントロール溶液のｐＨは同じである。これら希釈した溶液を、それぞれスクリュー管バイアル（株式会社島津ＧＬＣ製, スクリューガラスバイアル２ｍＬ（褐色）, 型番９５１９４）に１．５ｍＬずつ分注し、アルミホイルで遮光して、４℃、２００rpmで撹拌しながら保管した。それぞれ２日後、７日後または１４日後に各サンプルにおけるピセアタンノールの濃度をＨＰＬＣで測定した。測定条件は以下の通りである。
【００５５】
［ＨＰＬＣ条件］
カラム：Mightysil RP-18 GP250-10  径10 mm、長さ250 mm（関東化学株式会社製）
カラム温度：40℃
溶出条件：流速3mL/min、0％メタノール−100％純水  →  30％メタノール−70％純水（グラジエント、10min）
ＵＶ検出：280nm
得られた結果を図１Ａ〜Ｄに示す。
【００５６】
（４）結果
図１Ａ〜Ｄに示すように、いずれのサンプルにおいても、サンプル溶液をそのまま保存するより、リポソーム製剤で保存する方が、ピセアタンノールの残存率が高かった。このように、中性付近で不安定なピセアタンノールであっても、リポソーム製剤にすることによって、安定化することが可能になり、長期保存ができるようになる。
【００５７】
[実施例２]
（１）サンプル調製
実施例１と同様に、パッションフルーツ種子エキスを準備した。
【００５８】
（２）リポソーム製剤作製
実施例１と同様に、リポソーム製剤を調製した。
【００５９】
（３）安定性測定
パッションフルーツ種子エキス中に含まれるピセアタンノール以外のピセアタンノール誘導体であるスキルプシンＢの濃度を測定した以外は、実施例１と同様にして安定性測定を行った。それぞれ６日後または１２日後に、各サンプルにおけるスキルプシンＢの濃度をＨＰＬＣで測定した。測定条件は実施例１と同様である。
【００６０】
（４）結果
図２に示すように、パッションフルーツ種子エキスにおける、ピセアタンノール以外のピセアタンノール誘導体であるスキルプシンＢについても同様に、リポソーム製剤で保存する方が、パッションフルーツ種子エキス中でのスキルプシンＢの残存率が高かった。このように、中性付近で不安定なピセアタンノール誘導体であっても、リポソーム製剤にすることによって、安定化することが可能になり、長期保存ができるようになる。
【００６１】
[実施例３]
（１）サンプル調製
実施例１と同様に、パッションフルーツ種子エキスを準備した。得られたパッションフルーツ種子エキスは４．６ｍｇ／ｍＬのピセアタンノールを含有していた。
【００６２】
（２）リポソーム製剤作製
リン脂質として、ジオレオイルホスファチジルグリセロールの代わりにジオレオイルホスファチジン酸（ＰＡ）またはジオレオイルホスファチジルセリン（ＰＳ）を用いた以外は、実施例１と同様に、リポソーム製剤を調製した（それぞれ、ＰＡ／ＰＣリポソームまたはＰＳ／ＰＣリポソーム）。
【００６３】
（３）安定性測定
実施例１と同様にして安定性測定を行った。それぞれ７日後または１６日後に、各サンプルにおけるピセアタンノールの濃度をＨＰＬＣで測定した。
【００６４】
（４）結果
図３に示すように、いずれのリン脂質を用いても、リポソーム製剤で保存した場合のパッションフルーツ種子エキス中でのピセアタンノールの残存率が高かった。このように、リポソーム製剤作製に用いるリン脂質がジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジン酸またはジオレオイルホスファチジルセリンのいずれかと、ジオレオイルホスファチジルコリンとのどの組合せであっても、中性付近で不安定なピセアタンノールの安定性が高まった。
【００６５】
[実施例４]
（１）サンプル調製
実施例１と同様に、パッションフルーツ種子エキスを準備した。得られたパッションフルーツ種子エキスは４．６ｍｇ／ｍＬのピセアタンノールを含有していた。
【００６６】
（２）リポソーム製剤作製
リポソームは、次のようにして調製した。クロロホルムに溶かしたリン脂質溶液（ジオレオイルホスファチジルコリン（ＰＣ）/ジオレオイルホスファチジン酸（ＰＡ） = １/９）を、減圧ボルテックス処理により溶媒を除去して脂質薄膜を形成させた後、さらに1時間減圧を行い、薄膜状になったリン脂質に（１）で調製したエキスを加え、ボルテックス処理を行い、リポソームを作製した。次に、作製したリポソームを１０μｍのポリカルボネートメンブレンフィルターで加圧濾過した。また、リポソームに封入されなかった成分を除去するために、分画分子量（ＭＷＣО）３００ｋＤの透析チューブにリポソーム溶液を入れ、１０ｍＭ酢酸-酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）５００倍量に対して９６時間、２４時間毎に透析液を交換して透析した。透析後のリポソームは、アルゴンガスを充填し遮光して４℃で保存した。この作製方法により、リポソーム製剤の粒子径が数百ｎｍ〜数μｍとなった（ＰＡ／ＰＣリポソーム）。
【００６７】
（３）安定性測定
実施例１と同様にして安定性測定を行った。それぞれ６日後または１２日後に、各サンプルにおけるピセアタンノールの濃度をＨＰＬＣで測定した。
【００６８】
（４）結果
図４に示すように、粒子径が数百ｎｍ〜数μｍのリポソーム製剤であっても、リポソーム製剤で保存した場合のパッションフルーツ種子エキス中でのピセアタンノールの残存率が高かった。このように、リポソーム製剤の粒子径が数百ｎｍ〜数μｍであっても、数μｍ〜数十μｍであっても、中性付近で不安定なピセアタンノールを安定化することが可能になり、長期保存ができるようになる。
【００６９】
[実施例５]
（１）サンプル調製
まず、ｐＨ４．７あるいはｐＨ７．０のピセアタンノール純品水溶液、カテキン混合物水溶液、アントシアニン純品水溶液を準備した。それぞれ２０ｍＭ酢酸-酢酸ナトリウム／４０ｍＭフルクトース（ｐＨ４．７）あるいは１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）に対し、ピセアタンノールは最終濃度が４ｍＭになるよう、カテキン混合物（和光純薬工業(株)製カテキン混合物、緑茶由来）は最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるよう、アントシアニン（フジッコ(株)製塩化シアニジン-３-О-グルコシド、黒大豆由来）は最終濃度が４ｍＭになるよう、室温で溶解してサンプルを調製した。
【００７０】
（２）リポソーム製剤作製
透析液を、ｐＨ４．７のサンプルについては２０ｍＭ酢酸-酢酸ナトリウム／９０ｍＭフルクトース（ｐＨ４．７）に、ｐＨ７．０のサンプルについては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２０ｍＭ塩化ナトリウム／５０ｍＭフルクトース（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例１と同様に、リポソーム製剤を調製した。
【００７１】
（３）安定性測定
ポリフェノールは抗酸化活性をもち、その濃度が高いほど抗酸化活性も強くなることから、各サンプルの抗酸化活性を指標として、各物質の安定性を評価した。（２）で作製した各リポソーム製剤を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２０ｍＭ塩化ナトリウム／５０ｍＭフルクトース（ｐＨ７．０）で１０倍希釈した。これら希釈した溶液を、遮光して３７℃で静置して保管した。それぞれ２４時間後、４８時間後または７２時間後に、各サンプルの抗酸化活性をＯＲＡＣ法により測定し、０時間時点の測定値と比較することで、各ポリフェノールの安定性を評価した。
【００７２】
（４）結果
図５に示すように、いずれのポリフェノールについても、ｐＨ７．０で封入するよりもｐＨ４．７で封入した方が、その抗酸化活性が高く保持された。このように、中性付近で不安定なポリフェノールであっても、酸性溶液としてリポソーム製剤に封入することによって安定化することが可能になり、長期保存ができるようになる。
【００７３】
[実施例６]
（１）サンプル調製
各サンプルに５％のα-シクロデキストリンを添加した以外は、実施例５と同様に、ｐＨ４．７あるいはｐＨ７．０のピセアタンノール純品水溶液、カテキン混合物水溶液、アントシアニン純品水溶液を準備した。
【００７４】
（２）リポソーム製剤作製
透析液を、ｐＨ４．７、ｐＨ７．０のどちらのサンプルについても１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２０ｍＭ塩化ナトリウム／８０ｍＭフルクトース（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例１と同様に、リポソーム製剤を調製した。
【００７５】
（３）安定性測定
希釈溶液を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／２０ｍＭ塩化ナトリウム／８０ｍＭフルクトース（ｐＨ７．０）に変更した以外は、実施例５と同様に、安定性を評価した。
【００７６】
（４）結果
図６に示すように、いずれのポリフェノールについても、ｐＨ７．０で封入するよりもｐＨ４．７で封入した方が、その抗酸化活性が高く保持された。さらに実施例５と比較すると、いずれのポリフェノールについても、α-シクロデキストリン存在下で封入した方が、抗酸化活性がより高く保持されていた。このように、中性付近で不安定なポリフェノールであっても、α-シクロデキストリンを含有した酸性溶液としてリポソーム製剤にすることによって、安定化することが可能になり、長期保存ができるようになる。
【図１Ａ】
2016183142.tif 000009
【図１Ｂ】
2016183142.tif 000010
【図１Ｃ】
2016183142.tif 000011
【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2016183142.tif 000016
【図６】
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