(57)【要約】【課題】安全有効かつ、副作用に限りのある、精神病性障害の、改善された治療を提供すること。【解決手段】本発明は、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害から選択される、炎症性サイトカインレベルの上昇を伴う障害の治療における使用のための、ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株から得ることのできる単離細胞を提供する。【選択図】図１
2016000755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性サイトカインレベルの上昇を伴う障害の治療における使用のための、ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株から得ることのできる単離細胞。
【請求項２】
前記障害が、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害から選択される、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が免疫細胞活性化を阻害する、請求項１または請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記細胞が、直接的な大脳内注入、脳室内注入または全身性注入により投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
ＣＴＸ０Ｅ０３幹細胞株の、精神疾患の治療における療法としての使用への潜在的有効性を決定するための方法であって、
（ｉ）精神疾患を患う患者からの末梢血細胞の試料を、前記細胞株の細胞と接触させる工程、および
（ｉｉ）前記細胞株の前記細胞の、前記末梢血細胞の炎症性サイトカイン応答に対する効果を決定する工程
を含む方法。
【請求項６】
前記精神疾患が、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
炎症性サイトカインレベルの上昇を伴う障害を有する患者を、ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株から得ることのできる細胞を含む組成物を前記患者に投与することによって、治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精神疾患の治療における神経幹細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
うつ病は、世界中で何百万もの人々が冒されており（Lopez AD and Murray C, 1998）、また、社会に対して多大な費用負担を課している（Gumnick and Nemeroff, 2000）、衰弱性の障害である。これは、生涯有病率が１０〜２０％（Wong and Lucinio, 2001）の、一般的な精神疾患である。再発症状が一般的であり、患者の５０％以上が２回以上のうつ病のエピソードを経験する。うつ病は、例えば糖尿病、がんおよび脳卒中などの共存する病気を患う患者において広まっており、心臓発作を経験した後に特に多い。気分変動、食欲不振および疲労などを含む複数のうつ病症状があり、そうした病人の日々の生活は、集中力の欠如、睡眠障害および無価値感により崩壊することが多い。最も深刻な症例においては、患者は、例えば幻覚、妄想、病的思考などの精神病性症状を経験し、さらには例えば自殺思考などの精神病性症状さえ経験する。
【０００３】
ストレスは、うつ病および関連精神疾患の病態生理学において、鍵となる要因として関係しているとされている（Caspi et al.,2003）。視床下部・下垂体・副腎（ＨＰＡ）系ストレス応答における異常（Heuser,1998）と、海馬の、そのＨＰＡ系を阻害する能力の低下とが、うつ病患者において実証されている（Heuser,1998；Young et al.,1991）。海馬の構造変化は、うつ病を患う患者において、および、心的外傷後ストレス障害を患う人々においても、海馬の体積の減少を示す（Sheline et al.,1996；Sapolsky,1996；Bremner et al.,1995）。同様に、慢性的なストレス（例えば、拘束またはグルココルチコイドの全身投与）は、ラットおよび非ヒト霊長類においては、結果として海馬の脆弱なニューロンの萎縮をもたらす(Watanabe et al.,1982；Saplosky et al.,1985；Uno et al.,1989；Sapolsky et al.,1990；Wooley et al.,1990；Stein-Behrens et al.,1994；Mararinos
et al.,1996）。これらの研究および他の研究により、ストレス誘導性の脳萎縮、ニューロンの減少および海馬における神経発生の低下が、うつ病の病態生理学に寄与している可能性がある、ということが確認されている（Watanabe et al.,1982；Sapolsky et al.,1985；Uno et al.,1989；Wooley et al.,1990；Stein-Behrens et al.,1994；Elkis et al.,1995；Magarinos et al.,1996）。
【０００４】
より最近では、うつ病および関連精神疾患の病態生理学における炎症性サイトカインの役割が記述されている。炎症性サイトカインは、うつ病患者において、ＨＰＡ系および自然免疫系を活性化すると示されている（Schiepers et al.,2005）。加えて、免疫障害を患う患者は、より高いうつ病の発病率を呈すると示されている（Dunn et al.,2005）。サイトカインプロファイルの変化も、うつ病患者において実証されている（Kim et al.,2007；Brambilla et al.,2004）。臨床研究においては、強迫性障害（ＯＣＤ）患者から採取された血漿は、健常対照患者と比べて、より高いレベルの、腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦα）およびインターロイキン‐６（ＩＬ‐６）といった炎症性サイトカインを実証した（Konuk et al.,2007）。同様に、うつ病の齧歯類モデルもまた、炎症性サイトカインの上昇を実証する。特に、インターロイキン‐１（ＩＬ‐１）は、これらのモデルにおいて、ストレス誘導性のうつ病の、鍵となるメディエーターとして同定されている（Goshenet al.,2009；Koo and Duman.,2008）。ＩＬ‐Ｉが、これらのモデルにおいて、抗神経性効果を発揮する、という証拠は、精神疾患における炎症反応の役割を裏づけるさらなる証拠をもたらす（Ben Menachem-Zidon et al.,2008）。
【０００５】
選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）による慢性的な抗うつ治療は、細胞増
殖、顆粒細胞生存を増加させ、また、海馬神経発生に対するストレスの有害な効果を覆すと報告されている（Malberg et al., 2000；Malberg and Duman, 2003）。
【０００６】
例えばうつ病およびＯＣＤなどの精神疾患の治療の現在の療法は、一部の患者において有効であるものの、治療効果が感じられる前に、長期間の慢性的な治療を要する。すべてのクラスの抗うつ薬に関連する望まれない副作用は忍容できないものである可能性があり、また、一部の患者では、うつ症状が、実際に、治療によってより深刻になる場合がある。数多くの薬理学的物質がうつ病の治療に利用可能であるが、これらは、効能と忍容性の両方において、制限がないわけではない。
【０００７】
一般に、典型的な抗うつ治療には、３つの主要な問題が付随する。第一に、従来の薬物療法に応答しない患者が多く存在すること（Stahl et al., 2001）。第二に、患者が、なんらかの治療効果を得る前に、長い潜伏期を経験すること（Gumnick et al.）。最後に、ほとんどの抗うつ剤が、脳の神経伝達物質およびそれらの特異的受容体サブタイプの調節に関連する広範な望まれない副作用を有すること（Ereshefsky et al., 1997）。
【０００８】
したがって、安全で有効であり、かつ、副作用に限りのある、精神病性障害の、改善された治療、に対する必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００９】
第一の局面によれば、本発明は、炎症性サイトカインレベルの上昇を伴う障害、特に、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害から選択される障害、の治療における使用のための、ＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞株から得ることのできる単離細胞に向けられたものである。
【００１０】
第二の局面によれば、本発明は、前記ＣＴＸ０Ｅ０３幹細胞株の細胞の、精神疾患の治療における療法としての使用への潜在的有効性を決定するための方法であって、精神疾患を患う患者からの末梢血細胞の試料を、前記細胞株の細胞と接触させる工程、および、前記細胞の、前記末梢血細胞の炎症性サイトカイン応答に対する効果を決定する工程を含む方法を提供する。好ましい一実施形態においては、前記精神疾患は、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、賦形剤処理後７日目（１Ａ、１Ｃ、１Ｅ）およびＣＴＸ０Ｅ０３処理後７日目（１Ｂ、１Ｄ、１Ｆ）のマウス脳におけるミクログリアおよびアストロサ    イトの応答の蛍光画像を示す。
【図２Ａ】図２Ａ（ｉ）は、ＣＴＸ０Ｅ０３処理マウス脳をＨＴＳ賦形剤処理マウス脳と比較した、全体のＧＦＡＰ蛍光シグナルの減少を示すグラフである。図２Ａ（ｉ    ｉ）〜２Ａ（ｖ）は、ＨＴＳ、賦形剤処理脳（ｉｉ、ｉｖ）およびＣＴＸ０Ｅ０３処理脳（ｉｉｉ、ｖ）におけるＧＦＡＰ発現を示す、代表的な低い（ｉｉ、ｉｉｉ）および高い（ｉｖ、ｖ）蛍光画像である。
【図２Ｂ】図２Ｂ（ｉ）は、ＣＴＸ０Ｅ０３処理マウス脳をＨＴＳ賦形剤処理マウス脳と比較した、ＴＧＦ‐β蛍光シグナルの有意な減少を示すグラフである。図２Ｂ（ｉｉ）〜２Ｂ（ｉｉｉ）は、ＴＧＦ‐β陽性ミクログリア（ｉｉ）ならびにヘマトキシリンおよびエオシンで染色したミクログリア（ｉｉｉ）を示す、代表的な蛍光画像    である。
【図３Ａ】図３Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γの減少に対する、マイトマイシン処理ＣＴＸ０Ｅ０３の有意な効果を示すグラフである（ｐ＝＜０．０１）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γの減少に対する、マイトマイシン処理ＣＴＸ０Ｅ０３の有意な効果を示すグラフである（ｐ＝＜０．０１）。
【図４Ａ】図４Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γの減少に対する、分化したＣＴＸ０Ｅ０３の用量依存的効果を示すグラフである（ｐ＝＜０．０１）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γの減少に対する、分化したＣＴＸ０Ｅ０３の用量依存的効果を示すグラフである（ｐ＝＜０．０１）。
【図５】図５は、ＣＴＸ０Ｅ０３媒介性のＩＤＯ産生に対する、ＩＦＮ‐γの用量依存的効果を示すグラフである。
【図６】図６は、ＣＴＸ０Ｅ０３誘導性免疫抑制に対する、抗ＣＤ２７４遮断抗体の効果を示すグラフである（ｐ＝＜０．０１）。
【図７】図７は、（ｉ）注入前のＣＴＸ０Ｅ０３製剤によるＩＤＯの高発現、および、（ｉｉ＆ｉｉｉ）注入後２４時間におけるＣＴＸ０Ｅ０３細胞によるＩＤＯ発現のアップレギュレーション、についての画像を示す。
【図８】図８は、（ｉ）注入前のＣＴＸ０Ｅ０３製剤によるＣＤ２７４（ＰＤＬ‐１）の発現は無いこと、ならびに、（ｉｉ＆ｉｉｉ）注入後７日目までのＣＴＸ０Ｅ０３によるＣＤ２７４（ＰＤＬ‐１）のアップレギュレーションおよび持続発現、についての画像を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ‐γのＬＰＳ放出を、濃度依存的に阻害する、ということを示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ‐γのＬＰＳ放出を、濃度依存的に阻害する、ということを示すグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ‐γのＬＰＳ放出を、濃度依存的に阻害する、ということを示すグラフである。
【図９Ｄ】図９Ｄは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ‐γのＬＰＳ放出を、濃度依存的に阻害する、ということを示すグラフである。
【図９Ｅ】図９Ｅは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ‐γのＬＰＳ放出を、濃度依存的に阻害する、ということを示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の発現プロファイリングを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の発現プロファイリングを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、炎症性サイトカインＩＦＮ‐γのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの添加により、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞はＣＤ２７４を発現するよう誘導される、ということを示す画像である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＬＰＳとの共培養の前の、ヒトＣＤ２７４に対して産生される遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ、２時間）とＣＴＸ０Ｅ０３細胞とのプレインキュベーションが、ＰＢＭＣを刺激し、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞により誘導される阻害を回復させる、ということを示すグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、当該細胞の免疫抑制機能を活性化するための炎症環境の要件を説明する、提唱される作用機構を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症性サイトカインを減少させるか、調節するかまたは阻害することができ、したがって、Ｔ細胞および免疫系の他の細胞の活性化を調節するかまたは阻害することができる、という驚くべき発見に基づくものである。そのようなものとして、これらの細胞は、対照と比べると、炎症性サイトカインレベルの上昇を伴う障害の治療において有用であり、また、対照と比べると、１つ以上の炎症マーカーのレベルの上昇を特徴とする障害の治療において有用である。これらの細胞は、産業的に測定可能な、安全かつ強力な同種異系間処理を提供する。
【００１３】
特に、本発明は、単極性および双極性うつ病、ストレス誘導性のうつ病、強迫性障害、
双極性障害、統合失調症ならびに自閉症または自閉性症候群障害を含む精神疾患の治療における、前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株から得た細胞の使用に向けられたものである。
【００１４】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞は以下の特性を有する。
・  多能性細胞。
・  単一の創始細胞に由来する（クローン細胞）。
・  正常な染色体を有する、遺伝的に安定な細胞。
・  大量に増殖させ、保存することができる。
・  安全なものであり、特に、腫瘍形成能を示さないものである。
・  一旦注入されると、移動が組織損傷領域に限られる。
・  認識されている動物モデルにおいては有効である。
・  出所が文書により十分に立証されている。
【００１５】
好ましい一実施形態においては、本発明は、一般的な抗うつ薬に応答しないうつ症状を有するうつ病患者の治療に関する。
【００１６】
本明細書で用いられているように、「炎症性サイトカイン」という語は、当該分野におけるその通常の意味を持ち、全身性の炎症を促進するサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン‐１（ＩＬ‐１）、腫瘍壊死因子‐アルファ（ＴＮＦ‐α）、壊死因子‐ベータ（ＴＮＦ‐β）およびインターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮ‐γ）が挙げられる。
【００１７】
神経幹細胞株ＣＴＸ０Ｅ０３は、英国  ＳＰ４  ０ＪＧ  ウィルトシャー州  ソールズベリー  ポートン・ダウン、公衆衛生臨床検査サービス（Public Health Laboratory Services）、ワクチン研究・製造研究所（Vaccine Research and Production laboratories）、欧州動物培養収集機関（European Collection of Cell Cultures；ＥＣＡＣＣ）に寄託されている。ＥＣＡＣＣ受託番号は、０４０９１６０１である。この細胞株の誘導については、欧州特許第１６４５６２６号に記載されており、この欧州特許第１６４５６２６号の内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１８】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞は、以下の培養条件にて培養してもよい。
・  ヒト血清アルブミン              ０．０３％
・  ヒトトランスフェリン            １００μｇ／ｍｌ
・  プトレシン二塩酸塩              １６．２μｇ／ｍｌ
・  ヒト型インスリン                ５μｇ／ｍｌ
・  プロゲステロン                  ６０ｎｇ／ｍｌ
・  Ｌ‐グルタミン                  ２ｍＭ
・  亜セレン酸ナトリウム（セレン）  ４０ｎｇ／ｍｌ
これに、細胞の増殖のために、塩基性線維芽細胞増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、上皮成長因子（２０ｎｇ／ｍｌ）および４‐ヒドロキシタモキシフェン  １００ｎＭを加えたもの。これら細胞は、この４‐ヒドロキシタモキシフェンの除去により分化することができるが、これは、患者への細胞の投与の際に起こることとなる。
【００１９】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の開発により、臨床上使用するための一貫した製品のスケールアップが可能となっている。保存された材料からの細胞の製造は、商業的応用のための量での細胞の生成を可能にする。
【００２０】
本明細書で用いられているように、「精神疾患」という語は、典型的には全身性のおよび脳の炎症に関与する、慢性的行動障害を指す。障害としては、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害が挙げられる。
【００２１】
本明細書で用いられているように、「患者」という語は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、サルおよびヒト）を含む、哺乳類を指し、より好ましくはヒトを指す。
【００２２】
患者への送達のための製剤の調製のための方法は、当業者にとって明らかであろう。適切な賦形剤、希釈剤等もまた、神経幹細胞をベースとする療法を準備する際の現在の実務に基づいて明らかであろうし、また、文献に記載されているであろう。送達に必要な細胞の量は、治療の形態、疾患の重症度、および、治療期間内において複数回投与を適用する必要性に応じて異なることとなる。しかしながら、当業者であれば、既存の細胞移植療法に基づいて、容易に、適切な治療を決定することができる。
【００２３】
本発明にかかる細胞の適切な投与経路としては、直接的な静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射または大脳内注射が挙げられる。これら細胞は、好ましくは未分化の状態で投与されることとなる。
【００２４】
好ましい一実施形態においては、移植用の細胞は、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｎａ+、Ｋ+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｃｌ-、Ｈ2ＰＯ4-、ＨＥＰＥＳ、ラクトビオン酸塩、スクロース、マンニトール、グルコース、デキストラン‐４０、アデノシンおよびグルタチオンを含む組成物中に懸濁する。好ましくは、前記組成物は、例えばＤＭＳＯなどの双極性非プロトン性溶媒を含まない。例えばＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）‐ＦＲＳなど、適切な組成物が市販されている。こうした組成物によって、細胞を４℃〜２５℃にて長期間（数時間から数日）にわたり保存することや、冷凍温度、すなわち−２０℃よりも低い温度にて保存することが可能となるため、こうした組成物が好ましい。これら細胞は、その後、解凍後に、この組成物に入った状態で、投与されてもよい。
【００２５】
さらなる一実施形態においては、本発明は、前記ＣＴＸ０Ｅ０３細胞株の細胞の、精神疾患の治療における療法としての使用への潜在的有効性を決定するための方法に向けられたものであり、前記方法は、精神疾患を患う患者からの末梢血細胞の試料を、前記細胞株の細胞と接触させる工程、および、前記細胞株の前記細胞の、前記末梢血細胞の炎症性サイトカイン応答に対する効果を決定する工程を含む。好ましい一実施形態においては、前記精神疾患は、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害から選択される。前記細胞により炎症性サイトカインが減少するかまたは調節される場合には、これは、前記障害の治療における使用の可能性を指し示している。
【００２６】
ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、炎症性サイトカインを阻害するかまたは調節し、それによりミクログリアおよびＴ細胞の活性化を含む炎症を阻害するかまたは減少させる機構は、プログラム細胞死リガンドＣＤ２７４の細胞表面発現に関与している、とのことが提唱される。ＣＤ２７４のアップレギュレーションにはＩＦＮ‐γが必要であり、このことは、上記で記載したデータにおいて示されているように、結果としてＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γ産生の抑止をもたらす。したがって、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の免疫抑制活性は炎症性サイトカイン（例えばＩＦＮ‐γなど）の存在によって駆動されており、また、ｉｎ  ｖｉｖｏでの注入後の、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の免疫調節活性は、当該細胞を取り囲む炎症微小環境によって引き起こされるＣＤ２７４のアップレギュレーションにより部分的に媒介されているようである。
【実施例】
【００２７】
以下の非限定的な例を参照して、以下、本発明を説明する。
【００２８】
実施例１―ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、マウス脳において、宿主アストロサイトおよびミクロ
グリア応答を減少させる
成体オスＢａｌｂＣマウスに、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞または対照賦形剤を、脳の線条体領域に、注入した。グラフティング後７日目にて、脳を回収し、組織学的解析に供した。アストロサイトを検出するための特異的マーカー（グリア線維性酸性タンパク質、ＧＦＡＰ）およびミクログリアを検出するための特異的マーカー（ＣＤ１１ｂ、ＴＧＦ‐β）を用いた蛍光免疫組織化学を行なった。
その結果を図１Ａ〜Ｆに提示する。見て分かるように、賦形剤対照処理脳と比べて、ＣＴＸ０Ｅ０３処理では、注入部位にて、線条体におけるＧＦＡＰ、ＣＤ１１ｂおよびＴＧＦ‐βの発現の減少がもたらされた。
【００２９】
実施例２―ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、マウス脳において、宿主アストロサイトおよびミクログリア応答を減少させる
成体オスＢａｌｂＣマウスに、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞または対照賦形剤を、脳の線条体領域に、注入した。注入後４時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日目において、脳を回収し、組織学的解析に供した。アストロサイトを検出するための特異的マーカー（ＧＦＡＰ）およびミクログリアを検出するための特異的マーカー（ＴＧＦ‐β）を用いた蛍光免疫組織化学を行なった。画像解析によってＧＦＡＰおよびＴＧＦ‐βの蛍光シグナルを測定することにより、宿主アストロサイトおよびミクログリア応答を定量化した。
ＧＦＡＰ宿主応答を図２Ａに示す。賦形剤処理脳と比べると、ＣＴＸ０Ｅ０３処理により、注入後７２時間におけるＧＦＡＰ宿主応答が減少した。この時点において賦形剤処理脳により実証された反応性形態は、ＣＴＸ０Ｅ０３処理脳では観察されなかった。  ミクログリアの宿主応答を図２Ｂに示す。賦形剤処理脳と比べると、ＣＴＸ０Ｅ０３処理により、注入後７２時間におけるＴＧＦ‐β宿主応答が有意に減少した。
【００３０】
実施例３―ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）刺激した混合ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共に培養した場合に、対照ＰＢＭＣと比べて、ＩＦＮ‐γの産生を有意に減少させる
マイトマイシン処理した（増殖を止めた）かまたは分化した（増殖因子を除去した）ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を、９６ウェルプレート中で、ＬＰＳ刺激したヒトＰＢＭＣと共に、３７℃にて２４時間培養した。２４時間後に、培養プレートを、１５００ｒｐｍで遠心分離し、細胞上清を、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮガンマ）について、ＥＬＩＳＡにより解析した。
マイトマイシン処理したＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、ＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γ産生を有意に減少させたが、用量依存的効果は無かった。これらの結果を図３に示す。
分化したＣＴＸ０Ｅ０３は、２５Ｋおよび５０ＫにおけるＣＴＸ０Ｅ０３で実証されているような当該応答の完全な抑止と共に、ＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γ産生の、有意かつ用量依存的な減少を実証した（図４参照）。
【００３１】
実施例４―マイクロアレイおよび定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）は、ＩＦＮ‐γに対する応答におけるインドールアミン２，３‐ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）およびプログラム死リガンド‐１（ＰＤＬ‐１）の有意なアップレギュレーションを実証する
ＩＦＮ‐γで刺激したＣＴＸ０Ｅ０３細胞に対し、ＯｐｅｎＡｒｒａｙ（商標）システムを用いて、炎症に関連する遺伝子のマイクロアレイ解析を行なった。ＣＤ２７４（プログラム死リガンド‐１（ＰＤＬ‐１））のアップレギュレーションを含む、３５９個の遺伝子の発現が検出された。
表１は、ＩＦＮ‐γ処理により有意にアップまたはダウンレギュレートされたＣＴＸ０Ｅ０３炎症遺伝子を示す。
ＩＦＮγでの処理の後に、ＣＴＸ０Ｅ０３媒介性のインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）産生のリアルタイムＰＣＲ解析も行なった。ＣＴＸ０Ｅ０３媒介性のＩＤＯ産生に対する、ＩＦＮ‐γの用量応答効果が実証された（図５参照）。
【００３２】
【表１】
2016000755.tif 000003
【００３３】
実施例５―遮断研究により、ＣＴＸ０Ｅ０３によるＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γの抑止がＰＤＬ
‐１媒介性であることが実証される
分化した（増殖因子を除去した）ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を、９６ウェルプレート中で、ＬＰＳ刺激したヒトＰＢＭＣと共に、抗ＣＤ２７４（ＰＤＬ‐１）機能遮断抗体を添加して、３７℃にて２４時間培養した。２４時間後に、培養プレートを、１５００ｒｐｍで遠心分離し、細胞上清を、インターフェロン‐ガンマ（ＩＦＮガンマ）について、ＥＬＩＳＡにより解析した。
図６に示されているように、抗ＣＤ２７４（ＰＤＬ‐１）機能遮断抗体での処理は、ＣＴＸ０Ｅ０３の、ＰＢＭＣ  ＩＦＮ‐γ産生の抑止を有意に覆した。
【００３４】
実施例６―ＣＴＸ０Ｅ０３細胞は、大脳内注入後に、ＩＤＯおよびＰＤＬ‐１を発現する
ＣＴＸ０Ｅ０３製剤の細胞塗抹標本を、顕微鏡用スライドガラス上に作成し、ＩＤＯおよびＣＤ２７４（ＰＤＬ‐１）を検出するための特異的マーカーを用いた蛍光免疫組織化学に供した。
成体オスＢａｌｂＣマウスに、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞を、脳の線条体領域に、注入した。グラフティング後４時間、２４時間、４８時間、７２時間および７日目にて、脳を回収し、ＩＤＯおよびＣＤ２７４（ＰＤＬ‐１）を検出するための特異的マーカーを用いた蛍光免疫組織化学に供した。
ｉｎ  ｖｉｖｏ注入前のＣＴＸ０Ｅ０３細胞のうちのおよそ９５％でＩＤＯの細胞質内発現が実証された。大脳内注入後２４時間までに、生存ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の１００％が、ＩＤＯを発現した。ＩＤＯのこの発現は、注入後のより遅い時点における生存細胞では消失した。図７を参照のこと。
ＣＴＸ０Ｅ０３は、注入前にＣＤ２７４（ＰＤＬ‐１）発現を示さなかった。大脳内注入後のＣＴＸ０Ｅ０３細胞においては、このタンパク質の有意なアップレギュレーションが観察された。このタンパク質の細胞質内発現は、注入後７日目までのＣＴＸ０Ｅ０３細胞において見られ、より遅い時点では、成熟ニューロン様形態を有するＣＴＸ０Ｅ０３において、より顕著であるようであった。図８を参照のこと。
【００３５】
実施例７―Ｔ細胞活性化のＣＴＸ０Ｅ０３媒介性抑制におけるＣＤ２７４の関与
７日間増殖を止めたＣＴＸ０Ｅ０３細胞を、９６ウェルプレートの１ウェルあたり１００，０００個のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と混合して、２４時間、リンパ球反応を行なった。記載されている場合には、ＬＰＳは、５０ｎｇ／ｍｌで添加した。遮断抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いた機能実験が、ＰＢＭＣ（１０μｇ／ｍｌ）の２時間前に、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞に対して追加された。
図９（Ａ〜Ｅ）は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、種々のドナーから単離されたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮ‐γのＬＰＳ放出を阻害する、ということを示している。無刺激（ＬＰＳなし）のヒトＰＢＭＣとＣＴＸ０Ｅ０３細胞との共培養物内のＩＦＮ‐γレベルを図９Ａに示す。図９Ｂ〜Ｅは、異なるドナーからのＣＴＸ０Ｅ０３細胞とＬＰＳ刺激したヒトＰＢＭＣとの共培養物内のＩＦＮ‐γレベルを示す（ｐ＜０．０１）。これらのデータは、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞が、ＩＦＮ‐γ放出を、濃度依存的に阻害する、ということを示している。
図１０（ＡおよびＢ）は、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞の発現プロファイリングを示している。リアルタイムＰＣＲは、ＩＦＮ‐γの存在下または（of）非存在下（対照）における、公知の免疫モジュレータの相対的発現レベルを示している。図１０Ａに示されているように、各遺伝子の発現レベルは、ＩＦＮ‐γの濃度に依存していた。表２のように、５０ｎｇ／ｍｌにおいてさえ、ＩＦＮ‐γには、特定の遺伝子発現レベルに対する効果は無かった。４倍よりも大きい増加を有意であるとした。
【００３６】
【表２】
2016000755.tif 000004
【００３７】
図１１Ａは、炎症性サイトカインＩＦＮ‐γのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの添加により、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞はＣＤ２７４を発現するよう誘導された、ということを示している。ＬＰＳとの共培養の前の、ヒトＣＤ２７４に対して産生される遮断抗体（１０μｇ／ｍｌ、２時間）とＣＴＸ０Ｅ０３細胞とのプレインキュベーションは、ＰＢＭＣを刺激し（ｎ＝３）、ＣＴＸ０Ｅ０３細胞により誘導される阻害の平均８．３％を回復させた。このことは図１１Ｂに示されている。図１１Ｃは、当該細胞の免疫抑制機能を活性化するための炎症環境の要件を説明する、提唱される作用機構を示している。
【００３８】
参考文献1. Lopez AD, Murray CC (1998) The Global Burden of disease, 1990-2020. Nat Med 4(11): 1241-3.
2. Gumnick JF, Nemeroff CB (2000) Problems with currently available antidepressants. J Clin Psychiatry 61(10):5-15.
3. Wong ML, Licinio J (2001) Research and treatment approaches to depression. Nature Reviews Neuroscience 2: 343-351.
4. Caspi A, Sugden K, Moffitt TE, Taylor A, Craig IW, Harrington H, McClay J, Mill J, Martin J, Braithwaite A, Poulton R (2003) Influence of life stress on depression: Moderation by a polymorphism in the 5-HTT gene. Science 301:386-389.
5. Heuser I (1998) The hypothalamic-pituitary-adrenal system in depression. Pharmacopsychiatry 31:10-13.
6. Young EA, Haskett RF, Murphy-Weinburg V, Watson SJ, Akil H (1991) Loss of glucocorticoid fast feedback in depression. Arch Gen Psychiatry 48: 693-699.
7. Sheline YI, Wany P, Gado MH, Csernansky JG, Vannier MW (1996) Hippocampal atrophy in recurrent major depression. Proc Natl Acad Sci USA 93:3908-3913.
8. Sapolsky RM (1996) Glucocorticoids and atrophy of the human hippocampus. Science 273:749-775.
9. Bremner JD, Randall P, Scott TM, Bronen RA, Seibyl JP, Southwick SM, Delaney RC, McCarthy G, Charney DS, Innis RB (1995) MRI- based measurement of hippocampal volume in patients with combat related posttraumatic stress disorder.
10. Watanabe Y, Gould E, McEwen BS (1982) Stress induces atrophy of apical dendrites of hippocampal CA3 pyramidal neurones. Brain Res 588:341-345.
11. Sapolsky RM, Krey LC, McEwen BS (1985) Prolonged glucocorticoid exposure reduces hippocampal neurone number: implications for aging. J Neurosci :1222-1227.
12. Uno H, Tarara R, Else JG, Suleman MA, Sapolsky RM (1989) Hippocampal damage associated with prolonged and fatal death in primates. J Neurosci 9:1705-1711.
13. Sapolsky RM (1990) Glucocorticoids, hippocampus, and the glutamatergic synapse. Prog Brain Res 86:13-23.
14. Wooley CS, Gould E, McEwen BS (1990) Exposure to excess glucocorticoids alters dendritic morphology of adult hippocampal pyramidal neurones. Brain Res 531:225-231.
15. Stein-Beherens B, Mattson MP, Chang I, Yen M, Sapolsky R (1994) Stress exacerbates neurone loss and cytoskeletal pathology in the hippocampus. J Neurosci 14:5373-5380.
16. Margarinos AM, McEwen BS, Flugge G, Fuchs E (1996) Chronic psychosocial stress causes apical dendritic atrophy of hippocampal CA3 pyramidal neurones in subordinate tree shrews. J Neurosci 16:3534-3540.
17. Elkis H, Friedman L, Wise A, Meltzer HY (1995) Meta-analysis of studies of ventricular enlargement and cortical sulcal prominence in mood disorders. Arch Gen Psychiatry 52:735-746.
18. Schiepers OJ, Wichers MC, Maes M (2005) Cytokines and major depression. ProgNeuropsycopharmacol Biol Psychiatry 29(2):201-217.
19. Dunn AJ, Swiergiel AH, de Beaurepaire R (2005) Cytokines as mediators of depression:what can we learn from animal studies Neurosci Biobeh Rev 29:891-909.
20. Kim YK, Na KS, Shin KH, Jung HY, Choi SH, Kim JB (2007) Cytokine imbalance in the pathophysiology of major depressive disorder. Prog Neuropsycopharmacol Biol Psychiatry 31(5):1044-1053.
21. Brambilla F, Monteleone P, Maj M (2004) Interleukin-1beta and tumor necrosis
factor alpha in children with major depressive disorder or dysthymia. J Affect Disord 78:273-277.
22. Konuk N, Tekin IO, Ozturk U, Atik L, Atasoy N, Bektas S, Erdogan A (2007) Plasma levels of tumor necrosis factor-alpha and Interleukin-6 in obsessive compulsive disorder. Mediators Inflamm 2007:65704.
23. Goshen I, Yirmiya R (2009) Interleukin-1 (IL-1): A central regulator of stress responses. Front Neuroendocrinol 30:30-45.
24. Koo JW, Duman RS (2008) IL-1beta is an essential mediator of the antineurogenic and anhedonic effects of stress. Proc Natl Acad Sci USA 105(2):751-6.
25. Ben Menachem-Zidon O, Goshen I, Kriesle T, Ben Menachem Y, Reinhartz E, Ben Hur T, Yirmiya R (2008) Intrahippocampal transplantation of transgenic Neural precursor cells overexpressing Interleukin 1 receptor antagonist blocks chronic isolation induced impairment in memory and neurogenesis. Neuropsychopharmacol 33:2251-2262.
26. Sluzewska A, Rybakowski J, Bosmans E, Sobieska M, Berghmans R, Maes M, Wiktorowicz K (1996) Indicators of immune activation in major depressive illness. Psychiatry Res 64:161-167.
27. Basterzi AD, Aydemir C, Kisa C, Aksaray S, Tuzer V, Yazici K, Goka E (2005) IL-6 levels decrease with SSRI treatment in patients with major depression. Hum 
Psycopharmacol 20:473-476.
28. Malberg JE, Eisch AJ, Nestler EJ, Duman RS (2000) Chronic antidepressant treatment increases neurogenesis in the adult rat hippocampus. J Neurosci 20(24):9104-9110.
29. Malberg JE, Duman RS (2003) Cell proliferation in the adult hippocampus is decreased by inescapable stress: Reversal by Fluoxetine treatment. Neuropsychopharmacology 28:1562-1571.
30. Sahay A, Hen R (2007) Adult hippocampal neurogenesis in depression. Nat Neurosci 10(9):1110-1115.
31. Santarelli L, Saxe M, Gross C, SurgeT A, Battaglia F, Dulawa S, Weisstaub N,
Lee J, Duman R, Arancio O, Belzung C, Hen R (2003) Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioural effects of antidepressants. Science 3012:805-809.
32. O'Brien S, Scully P, Fitzgerald P, Scott LV, Dinan TG (2007) Plasma cytokine
profiles in depressed patients who fail to respond to selective serotonin reuptake inhibitor therapy. J Psychiatr Res 2007; 41:326-331.
33. Eller T, Vasar V, Shlik J, Maron E (2008) Proinflammatory cytokines and treatment response to escitalopram in major depressive disorder. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2008; 32:445-450.
34. Hong ZF, Huang XJ, Yin ZY, Zhao WX, Wang XM (2009) Immunosuppressive function of bone marrow mesenchymal stem cells on acute rejection of liver allografts in rats. Transplantation Proceedings 41:403-409.
35. Li Y, Tredget EE, Ghaffari A, Lin X, Kilani RT, Ghahary A (2006) Local expression of indoleamine 2,3-dioxygenase protects engraftment of xenogeneic substitute. Journal Invest Dermatol 126:128-136.
36. Stroemer P, Patel S, Hope A, Oliveira C, Pollock K, Sinden J (2009) The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioural recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose dependent fashion. Neurorehabil Neural Repair 23(9):895-909.
37. Park DH, Eve DJ, Sanberg PR, Musso J 3rd, Bachstetter AD, Wolfson A, Schlunk
A, Baradez MO, Sinden JD, Gemma C (2010) Increased neuronal proliferation in the dentate gyrus of aged rats following neural stem cell implantation. Stem Cells
Dev 19(2):175-180.
38. Couillard-Depres S, Wuertinger C, Kandasamy M, Caioni M, Stadler K, Aigner R, Bogdahn U, Aigner L (2009) Ageing abolishes the effects of fluoxetine on neurogenesis. Mol Psychiatry 14(9):856-864.
39. Tfilin M, Sudai E, Merenlender A, Gispan I, Yadid G, Turgeman (2009) Mesenchymal stem cells increase hippocampal neurogenesis and counteract depressive-like
behaviour. Molecular Psychiatry 1-12.
40. Stahl SM, Nierenburg AA, Gorman JM (2001) Evidence of early onset of antidepressant effect in randomized controlled trials. J Clin Psychiatry 62(4):17-23.
41. Ereshefsky L, Alfaro CL, Lam YWF (1997) Treating depression: potential drug interactions. Psych Ann 27:244-258.
42. Fink F (2001) Convulsive therapy: a review of the first 55 years. J Affect Disord 63 (1-3):1-15.
43. Zetterstrom TSC, Pei Q, Grahame-Smith DG (1998) Repeated electric convulsive
shock extends the duration of enhanced expression of BDNF in rat brain compared
with a single administration. Mol Brain Res 57:106-110.
44. Skolnick P, Legutko B, Li X, Bymaster FP (2001) Current perspectives on the development of non-biogenic amine-based antidepressants. Pharmacological Researc
h 43 (5):411-422. (14) JP 2013-533887 A 2013.8.29
45. Himmelhoch JM (1995) Monoamine oxidase inhibitors. Kaplan HI, Sadock BJ, eds. Comprehensive Textbook of Psychiatry. 6th ed. Baltimore, Md: Williams and Wilkins 2038-2054.
46. Janicak PG, Davis JM, Preskorn SH (1997) Principles and practice of clinical
psycopharmacotherapy 2nd ed. Baltimore, Md:Williams and Wilkins.
【図３Ａ】
2016000755.tif 000005
【図３Ｂ】
2016000755.tif 000006
【図４Ａ】
2016000755.tif 000007
【図４Ｂ】
2016000755.tif 000008
【図５】
2016000755.tif 000009
【図６】
2016000755.tif 000010
【図９Ａ】
2016000755.tif 000011
【図９Ｂ】
2016000755.tif 000012
【図９Ｃ】
2016000755.tif 000013
【図９Ｄ】
2016000755.tif 000014
【図９Ｅ】
2016000755.tif 000015
【図１０Ａ】
2016000755.tif 000016
【図１０Ｂ】
2016000755.tif 000017
【図１１Ｂ】
2016000755.tif 000018
【図１１Ｃ】
2016000755.tif 000019
【図１】
2016000755.tif 000020
【図２Ａ】
2016000755.tif 000021
【図２Ｂ】
2016000755.tif 000022
【図７】
2016000755.tif 000023
【図８】
2016000755.tif 000024
【図１１Ａ】
2016000755.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月9日(2015.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたＣＴＸ０Ｅ０３神経幹細胞を含む、炎症性サイトカインレベル低下剤。
【請求項２】
前記細胞が免疫細胞活性化を阻害する、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
前記細胞が、直接的な大脳内注入、脳室内注入または全身性注入により投与される、請求項１または２に記載の剤。
【請求項４】
ＣＴＸ０Ｅ０３幹細胞株の、炎症性サイトカインレベル低下の潜在的有効性を決定するための方法であって、
（ｉ）精神疾患を患う患者からの末梢血細胞の試料を、前記細胞株の細胞と接触させる工程、および
（ｉｉ）前記細胞株の前記細胞の、前記末梢血細胞の炎症性サイトカイン応答に対する効果を決定する工程
を含む方法。
【請求項５】
前記精神疾患が、単極性および双極性うつ病、統合失調症、強迫性障害、自閉症および自閉性症候群障害から選択される、請求項４に記載の方法。