(57)【要約】【課題】安全性が高く、ＮＯの活性促進作用を有する医薬品、医薬部外品、飲食品等を提供すること。【解決手段】ピペリン類縁体を含有することを特徴とする一酸化窒素活性促進用組成物。【選択図】図１
2016183149.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピペリン類縁体を含有することを特徴とする一酸化窒素活性促進用組成物。
【請求項２】
一酸化窒素合成酵素の酵素活性増加作用又は酵素量増加作用を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
一酸化窒素合成量増加作用を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
飲食品組成物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピペリン類縁体を含有する一酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ：ＮＯ）活性促進用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＯは、生体内においてＬ−アルギニンと分子状酸素とを基質に、一酸化窒素合成酵素（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ：ＮＯＳ）により生成（合成）される、ガス状の成分であり、ＮＯ合成は種々の因子により調節を受けている。
【０００３】
ＮＯは、主として標的細胞の可溶性グアニル酸シクラーゼを活性化し、サイクリックＧＭＰを介する作用を惹起することにより種々の生理機能に関与すると考えられている（非特許文献１）。例えば、血小板凝集抑制、抗動脈硬化作用や血管拡張、中枢神経系における記憶や学習機能、末梢神経系におけるＮＯ作動性神経系を介する平滑筋弛緩作用などがこれにあたる（非特許文献２）。
【０００４】
このため、ＮＯ合成やＮＯ放出の低下、ＮＯに対する反応性の低下は、これらの機能を低下させる要因となる。従って、ＮＯ合成などを増強することで、ＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能を良好に維持したり、低下した機能を改善したりする効果が期待できる。
【０００５】
このようなことから、ＮＯ合成などを促進する成分や組成物の提案が既になされている。例えば、クロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸（特許文献１）、ハイペロサイドやイソクエルシトリンなどのＮＯ作用増強剤が挙げられる（特許文献２）。しかし、これらのＮＯ作用増強剤の効果は弱く、ＮＯに対する作用特異性も低い。例えば、血管組織の収縮弛緩機能に対するフェルラ酸の効果において、ＮＯが関わる比率はわずか３３％程度である。このため、より安全で、優れたＮＯ活性促進作用を有する成分が求められていた。
【０００６】
ピペリンやピペルロングミニンなどのピペリン類縁体は抗腫瘍作用、抗酸化作用、抗炎症作用、殺菌作用、抗胃潰瘍作用、殺虫作用などの薬理作用（非特許文献３）、機能性胃腸症を治療する作用（特許文献３）、疼痛緩和作用（特許文献４）、ＰＰＡＲγ活性抑制作用（特許文献５）などを有することが認められている。  
【０００７】
他にも、ピペリンやピペルロングミニンは血圧低下作用を有することが知られている。ピペリンの血圧低下作用は、アンジオテンシン変換酵素（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ：ＡＣＥ）阻害作用（非特許文献４）、電位依存性Ｃａチャネルを介した作用（細胞内へのＣａイオンの流入抑制作用）によるものとされていた（非特許文献５）。
【０００８】
従って、ピペリンのＮＯ合成やＮＯ放出に対する促進作用は知られていなかった。ましてや、ＮＯＳに対する活性促進作用については全く知られていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ. ２００５ ;２８９(２)：Ｈ８８６−８９７
【非特許文献２】第４章  ＮＯの生体での種々の作用、Ｐ４６−５６、ＮＯと医学（一酸化窒素の生理作用と薬理作用）、大柳善彦 著、１９９３、共立出版（株）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ Ｒｅｓ.  ２０１３;２７(８):１１２１−１1３０
【非特許文献４】Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ２０１３； １２(３)：４７８−４８２
【非特許文献５】Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.  ２００８； ５２(５):４５２−４５８
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２００３−２６１４４４
【特許文献２】特開２００８−２５５０７５
【特許文献３】特開２００６−３２７９９９
【特許文献４】特開２０１０−２８０６６８
【特許文献５】特開２０１３−２３７６５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、安全性が高く、ＮＯの活性促進作用を有する医薬品、医薬部外品、飲食品等を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、ＮＯ活性を促進させる成分を探索した結果、ピペリンはＮＯ活性促進作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）ピペリン類縁体を含有することを特徴とする一酸化窒素活性促進用組成物、
（２）一酸化窒素合成酵素の酵素活性増加作用又は酵素量増加作用を有する、（１）に記載の組成物、
（３）一酸化窒素合成量増加作用を有する、（１）に記載の組成物、及び
（４）飲食品組成物である、（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物
である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、ピペリンやピペルロングミニンなどのピペリン類縁体を含有する、安全性の高い、ＮＯ活性促進用の組成物を提供することが可能となった。本発明の組成物は、ＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能を良好に維持したり、低下したＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能を改善したりすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ピペリンの血管弛緩作用に対する血管内皮細胞除去による影響を示すグラフである（各群６例、収縮率の平均値±標準誤差を表示。Ｐｒｅの点はピペリン処理前の収縮率を示す。†：ｐ<０．０５、††：ｐ<０．０１ 対 血管内皮細胞保持標本（スチューデントのｔ検定））
【発明を実施するための形態】
【００１６】
「一酸化窒素（ＮＯ）活性促進」とは、正常状態におけるＮＯ合成やＮＯ放出の維持、ＮＯ合成やＮＯ放出の低下の抑制、低下しているＮＯ合成やＮＯ放出の改善（増加）などを意味する。ＮＯ合成量やＮＯ放出量の測定は、ＮＯを指標としても良いし、安定代謝物であるＮＯ２やＮＯ３を指標としても良い。ＮＯ活性を促進する方法としては、例えば、ＮＯＳの酵素活性や酵素量を増加する方法、細胞内ＮＯ合成量を増加する方法などがある。これらの方法によって、ＮＯ合成量やＮＯ放出量は増加する。
【００１７】
ＮＯＳは常時細胞内に一定量存在する構成型ＮＯＳ(ｃＮＯＳ)と炎症やストレスにより誘導される誘導型ＮＯＳ(ｉＮＯＳ、ＮＯＳ２)に分類される。さらにｃＮＯＳは神経型のｎＮＯＳ（ＮＯＳ１)と血管内皮型のｅＮＯＳ（ＮＯＳ３)に分類され、ミトコンドリア型のｍｔＮＯＳもｃＮＯＳに含まれる。本発明におけるＮＯＳは、好ましくはｃＮＯＳであり、より好ましくはｅＮＯＳやｎＮＯＳであり、特に好ましくはｅＮＯＳである。ＮＯＳの酵素活性は細胞内ＮＯ合成量やＮＯＳリン酸化程度などを指標に測定することが可能であり、酵素量はＮＯＳタンパク質やＮＯＳ遺伝子の発現量などを指標に測定することができる。
【００１８】
本発明におけるＮＯ活性促進用組成物は、ＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能に対して、これらの機能を良好に維持したり、低下した機能を改善したり、機能の低下を予防することを目的として使用することが可能である。
【００１９】
ＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能が低下した状態としては、例えば、腎機能障害、タンパク尿の増加、血尿、喘息、長引く咳、胃粘膜の傷害、腸粘膜の傷害、勃起不全、勃起障害、満足な性交がおこなえない状態（硬さや維持が不十分であることも含む）、脱毛、認知機能の低下、集中力の低下、意欲の低下、眼精疲労、眼機能の低下、ピント調節機能の低下、目の下のクマ、難聴、首筋のコリ、肩のコリ、腰のはり、背中のはり、喀血、鼻血、組織損傷修復の遅延、血小板凝集、血栓形成、運動疲労、筋力の低下、インスリン抵抗性を伴う血管障害、コレステロールの増加、中性脂肪の増加、遊離脂肪酸の増加、冷えなどが挙げられ、さらに低下した状態としては心不全、冠動脈痙縮、虚血性疾患の悪化などが挙げられる。
従って、本願発明のＮＯ活性促進用組成物は、腎機能障害、タンパク尿の増加、血尿、喘息、長引く咳、胃粘膜の傷害、腸粘膜の傷害、勃起不全、勃起障害、満足な性交がおこなえない状態（硬さや維持が不十分であることも含む）、脱毛、認知機能の低下、集中力の低下、意欲の低下、眼精疲労、眼機能の低下、ピント調節機能の低下、目の下のクマ、難聴、首筋のコリ、肩のコリ、腰のはり、背中のはり、喀血、鼻血、組織損傷修復の遅延などの予防又は改善用組成物として使用することが可能である。
【００２０】
本発明の組成物は、ピペリン類縁体を含有する。
「ピペリン類縁体」とは、ピペリンと化学構造や受容体結合特性などの分子生物学的な性質が類似している化合物のことを意味し、好ましくは、ピペリン、ピペルロングミニン、ピペルノナリン、ジヒドロピペリン、ジヒドロピペルロングミニン、ジヒドロピペルノナリンより選ばれる１成分以上を含有する。より好ましくはピペリン又はピペルロングミニンであり、さらに好ましくはピペリンである。これらのピペリン類縁体は有効成分として含有することが特に好ましい。
【００２１】
これらのピペリン類縁体は、化学合成品として市販のものを入手可能であるが、ピペリジン誘導体などから合成してもよく、また、ピペリン類縁体を含有する天然物からの抽出物でも良い。
【００２２】
ピペリン類縁体を含有する天然物とは、例えば、黒コショウなどのコショウ科コショウ属の天然物である。天然物からの抽出は、室温又は加熱した状態で溶剤に含浸させるか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて行われる溶剤抽出の他に、水蒸気蒸留等の蒸留法を用いて抽出する方法、炭酸ガスを超臨界状態にして行う超臨界抽出法、あるいは圧搾して抽出物を得る圧搾法等を用いることができる。
【００２３】
溶剤抽出に用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、例えば、水、エタノール又はヘキサンなどであり、これらは単独で又は２種以上を組み合わせて使用でき、溶剤を変えて繰り返し行うことも可能である。このうち、水、エタノールを用いるのが好ましく、水を用いるのがより好ましい。また、抽出物の分離精製手段としては、例えば、抽出物を活性炭処理、液液分配、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、精密蒸留等を挙げることができる。
【００２４】
本発明に用いるピペリン類縁体を含む抽出物は、抽出物や分離精製物をそのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、濃縮抽出物や乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。
【００２５】
１日あたりのピペリン類縁体の総摂取量としては、年齢、性別、体重などを考慮して適宜増減できるが、０．０１ｍｇから１００ｍｇが好ましく、０．０２ｍｇから２０ｍｇがより好ましく、０．０４ｍｇから２ｍｇが更に好ましい。
【００２６】
また、１日あたりのピペリンの摂取量としては、０．０１ｍｇから５０ｍｇが好ましく、０．０２ｍｇから１０ｍｇがより好ましく、０．０４ｍｇから１ｍｇが特に好ましい。
【００２７】
１日あたりの摂取量は、１日１回又は数回に分けて投与（摂取）することができる。
【００２８】
本発明の組成物は、ピペリン類縁体の他、本発明の効果を損なわない範囲で、ビタミン、アミノ酸、ミネラル、生薬及びその抽出物等を配合することができる。そして、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、抗酸化剤、コーティング剤、着色剤、矯味矯臭剤などを配合し、さらに必要に応じてｐＨ調整剤、清涼化剤、懸濁化剤、消泡剤、粘稠剤、溶解補助剤、界面活性剤、香料などを配合して、常法により、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、ドライシロップ剤などの経口用固形製剤又はドリンク剤、飲料、濃縮飲料、固形発泡飲料、粉末飲料などの内服液剤として提供することができる。なお、内服液剤中におけるピペリン類縁体の状態としては、溶解状態であっても、分散状態であっても良く、その存在状態は問わない。
【００２９】
本発明の一酸化窒素活性促進用の組成物は、通常、効能・効果等を標榜できる医薬品、医薬部外品等として提供される。また、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養機能食品等の飲食品として提供することも可能である。その摂取により期待できる効能・効果等の表示をする製品としては、ＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能において、これらの機能の良好な維持、低下した機能の改善を意味する表記を付した製品が挙げられる。例えば、腎機能障害、タンパク尿の増加、血尿、喘息、長引く咳、胃粘膜の傷害、腸粘膜の傷害、勃起不全、勃起障害、満足な性交がおこなえない状態（硬さや維持が不十分であることも含む）、脱毛、認知機能の低下、集中力の低下、意欲の低下、眼精疲労、眼機能の低下、ピント調節機能の低下、目の下のクマ、難聴、首筋のコリ、肩のコリ、腰のはり、背中のはり、喀血、鼻血、組織損傷修復の遅延などを改善する旨の表記を付して提供することも可能である。
【００３０】
本発明の組成物を飲食品として用いる場合、飲食品の具体例としては、ドリンク類、スープ類、乳飲料、清涼飲料水、茶飲料、アルコール飲料、ゼリー状飲料、機能性飲料等の液状食品；食用油、ドレッシング、マヨネーズ、マーガリンなどの油分を含む製品；飯類、麺類、パン類等の炭水化物含有食品；ハム、ソーセージ等の畜産加工食品；かまぼこ、干物、塩辛等の水産加工食品；漬物等の野菜加工食品；ゼリー、ヨーグルト等の半固形状食品；みそ、発酵飲料等の発酵食品；洋菓子類、和菓子類、キャンディー類、ガム類、グミ、冷菓、氷菓等の各種菓子類；カレー、あんかけ、中華スープ等のレトルト製品；インスタントスープ、インスタントみそ汁等のインスタント食品や電子レンジ対応食品等が挙げられる。さらには、粉末、穎粒、錠剤、カプセル剤、液状、ペースト状またはゼリー状に調製された健康飲食品も挙げられる。本発明における飲食品の製造は、当該技術分野に公知の製造技術により実施することができる。
【実施例】
【００３１】
以下に本発明の代表的な試験例と実施例を示し、詳細に説明する。
【００３２】
１．ラット胸部大動脈を用いたＮＯ活性促進作用の評価
（試験方法）
実験には、８週齢〜１２週齢の雄性ＳＤ系ラット（Ｃｒｌ:ＣＤ、日本チャールス・リバー株式会社）を使用した。代表的なピペリン類縁体としてピペリン（和光純薬工業（株）製）を使用した。
【００３３】
ラットを麻酔した後に安楽死させ、胸部大動脈を摘出した。胸部大動脈に付着した結合組織及び脂肪組織を除去した後、約３ｍｍ幅の血管リング標本を作製し、血管内皮細胞保持標本として使用した。血管内皮細胞除去標本は、血管標本の内腔に木綿糸を通し、摩擦によって血管内皮細胞を剥離することにより作製した。
【００３４】
試験に用いるピペリンはＤＭＳＯに、血管収縮剤のフェニレフリン、血管弛緩剤のアセチルコリン、ＮＯＳ阻害剤のＬ−ＮＡＭＥ、ＣＯＸ阻害剤のインドメタシンは注射用水に溶解した。
【００３５】
３７℃に加温したＫｒｅｂｓ液をｏｒｇａｎ ｂａｔｈに満たし、９５ % Ｏ２／ ５ % ＣＯ２を通気した。血管標本は、１ｇの張力を負荷してｏｒｇａｎ ｂａｔｈ内に懸垂させた。
血管標本の張力は、ＦＤピックアップ、センサカプラ及びセンサ用アンプを介して、ポリグラフシステムを用いて測定した。血管内皮細胞保持標本にはフェニレフリン（１μｍｏｌ／Ｌ）惹起血管収縮反応を観察した後にアセチルコリン（１０μｍｏｌ／Ｌ）による弛緩反応が顕著に認められる標本を選定し、血管内皮細胞除去標本には、アセチルコリンによる弛緩反応が著しく減弱している標本を選定した。
【００３６】
（試験１）
血管標本の血管内皮細胞依存性の血管弛緩反応を確認した後に、標本を洗浄し、再度、フェニレフリンによる血管収縮反応を惹起させ、ピペリンの血管弛緩作用を評価した。ピペリンの血管内皮細胞に対する作用の検証は、血管内皮細胞保持標本及び血管内皮細胞除去標本を用いて、ピペリンによる血管弛緩作用を比較して行った。
（試験２）
ピペリンのＮＯＳを介した作用の検証は、血管内皮細胞保持標本を用いて、ピペリンの弛緩作用に及ぼすＬ−ＮＡＭＥ（１００μｍｏｌ／Ｌ）またはインドメタシン（１０μｍｏｌ／Ｌ）前処置の有無による影響を評価して行った。
【００３７】
ピペリンの弛緩作用は次に示す式より算出した収縮率を用いて評価した。
収縮率（％）＝（ピペリン添加後の収縮張力／ピペリン添加前の収縮張力）×１００
【００３８】
（結果１）
ピペリンの血管内皮細胞に対する作用を検証した結果を図１に示す。
ピペリンによる血管弛緩作用に及ぼす血管内皮細胞除去の影響を評価した。その結果、血管内皮細胞保持標本において、１０μｍｏｌ／Ｌ〜１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンはフェニレフリン惹起性血管収縮を濃度の増加に伴い抑制し、１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンの収縮率は１１．８％（平均値）であった。一方、血管内皮細胞除去標本においては、１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンの収縮率は７０．０％であり、ピペリンの弛緩作用は著しく減弱した（ｐ＜０．０５、対  血管内皮細胞保持標本でのピペリン収縮率（スチューデントのｔ検定）、例数各６）。
これより、ピペリンは、これまでの知見と異なり、血管内皮細胞に作用することが明らかとなった。
【００３９】
（結果２）
ピペリンのＮＯＳを介した作用を検証した結果を示す。
ピペリンによる血管弛緩作用に及ぼすＬ−ＮＡＭＥの影響を血管内皮細胞保持標本を用いて評価した。その結果、Ｌ−ＮＡＭＥ未処理における１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンの収縮率は３７．２％を示したが、Ｌ−ＮＡＭＥ前処理における１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンの収縮率は７６．９％であった（ｐ＜０．０５、対  Ｌ−ＮＡＭＥ未処理時のピペリン収縮率（スチューデントのｔ検定）、例数各６）。
一方、インドメタシン前処理における１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンの収縮率は３２．２％であり、同時に評価したインドメタシン未処理における１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンの収縮率は４０．８％であった。
これより、ピペリンの作用においてＮＯによる作用が占める比率は約６３％（ピペリンによる弛緩率６２．８％＜１００％−３７．２％＞に占めるＬ−ＮＡＭＥ前処理により減弱した弛緩率３９．７％＜７６．９％−３７．２％＞）であることが確認できた。
【００４０】
以上の試験例より、ピペリンは、ｅＮＯＳによるＮＯの合成を介して効果を発揮することが明らかになった。
【００４１】
２．ヒト由来血管内皮細胞を用いた細胞内ＮＯ合成量増加作用の評価
（試験方法）
実験には、ヒト由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ：倉敷紡績（株）製）を使用した。ヒト由来血管内皮細胞は、継代用試薬セットを用いてサブコンフルエントまで培養した後に、試験に使用した。
【００４２】
代表的なピペリン類縁体としては、ピペリン（和光純薬工業（株）製）を使用した。ピペリンはＤＭＳＯに溶解し、試験に使用した。
【００４３】
ＮＯ活性促進作用は細胞内ＮＯ量の増加を指標に評価し、細胞内ＮＯ量は蛍光色素ＤＡＦ-ＦＭ  ＤＡを用いて測定した。
【００４４】
（試験３）
細胞内にＤＡＦ-ＦＭ  ＤＡを取り込ませるため、ＤＡＦ-ＦＭ  ＤＡを含有する培地を用いて細胞を６０分間処置した。その後、ピペリン（１００μｍｏｌ／Ｌ）を含有する培地に交換し、６０分間処置した。
Ｔｒｙｐｓｉｎ溶液を用いて培養容器から細胞を剥離し、ＰＢＳ溶液に懸濁し、生細胞あたりのＤＡＦ-ＦＭ  ＤＡの蛍光強度をフローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ ＸＬ、ベックマンコールター（株）製）を用いて測定した。
【００４５】
（結果３）
ピペリンによるヒト由来血管内皮細胞内のＮＯ合成量に及ぼす作用を評価した。その結果、１００μｍｏｌ／Ｌのピペリンの添加はピペリン非添加時と比較して細胞内ＮＯ合成量を２３．８％（平均値）有意に増加させた（ｐ＜０．０５、対  ピペリン非添加細胞内でのＮＯ合成量（ウィルコクソン検定）、例数各７）。
これより、ピペリンは、ヒト血管内皮細胞内のＮＯ合成量を増加させ、ＮＯ活性促進作用を有することが明らかとなった。
【００４６】
従って、ピペリンやピペルロングミニンなどのピペリン類縁体は、一酸化窒素活性促進のための組成物として用いることができ、ＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能に対して、これらの機能を良好に維持したり、低下した機能を改善したり、機能の低下を予防する効果を有していることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のピペリンやピペルロングミニンなどのピペリン類縁体を含有する組成物は、一酸化窒素活性促進用の医薬品、医薬部外品、機能性を有する旨を表示する食品等として有用である。また、ＮＯが関わる身体の生理機能や組織機能に対して、これらの機能を良好に維持したり、低下した機能を改善したり、機能の低下を予防することに役立つ組成物として、日常的に摂取することが可能となった。
【図１】
2016183149.tif 000003