(57)【要約】【課題】  植物に多収性を付与することのできる核酸を提供することが、本発明の課題である。更にそのような核酸を用いて、収量が増大した形質転換植物と、植物の収量を増大させる方法を提供することも本発明の課題である。【解決手段】  オリザ・ロンギスタミナータの疑似レスポンスレギュレーターのプロモーター、および／または、植物の疑似レスポンスレギュレーターの構造遺伝子を機能可能に連結したコンストラクトを、植物に導入することにより該植物に多収性を付与することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列、又は
（２）配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、植物の遺伝子の転写を促進する活性を示す塩基配列、
を含む、核酸。
【請求項２】
（１）請求項１記載の核酸、ならびに、
（２）下記に（ａ）から（ｃ）により規定されるタンパク質をコードする核酸；
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列または配列番号５で示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
（ｂ）植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質の疑似レシーバードメインのアミノ酸配列またはそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質のＣＣＴモチーフのアミノ酸配列またはそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、
（ｃ）LHY（Late Elongated Hypocotyl）遺伝子およびCCA1(Circadian Clock-Associated 1)遺伝子の転写を抑制する活性を有する、
が機能を可能なように結合している核酸であって、
ここで植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質の疑似レシーバードメインと同一性を有するアミノ酸配列は、疑似レシーバードメイン保存アミノ酸を維持し、かつ、上記ドメインのアミノ酸配列において、上記疑似レシーバードメイン保存アミノ酸以外のアミノ酸については改変されてもよく、
ここで植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質のＣＣＴモチーフと同一性を有するアミノ酸配列は、ＣＣＴモチーフ保存アミノ酸を維持し、かつ、上記モチーフのアミノ酸配列において、上記ＣＣＴモチーフ保存アミノ酸以外のアミノ酸配列については改変されてもよい、前記核酸。
【請求項３】
植物の収量の増大を可能とする、請求項２記載の核酸。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか１項記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項２または請求項３に記載の核酸が植物に導入された、形質転換植物。
【請求項６】
前記植物が単子葉植物である、請求項５記載の形質転換植物。
【請求項７】
前記植物がイネまたはトウモロコシである、請求項６記載の形質転換植物。
【請求項８】
請求項２または請求項３記載の核酸または請求項３のベクターを植物に導入する工程を含む、収量が増大した形質転換植物を作製する方法。
【請求項９】
前記植物が単子葉植物である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記植物がイネまたはトウモロコシである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項２または請求項３に記載の核酸を植物に導入することを特徴とする、植物の収量を増大させる方法。
【請求項１２】
配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列および／または配列番号１の３５８２５−４６７２１で示される塩基配列の１５から２０００塩基を含む、収量が増加した植物を選抜するためのＤＮＡマーカー。
【請求項１３】
植物において請求項１２に記載のＤＮＡマーカーの検出を行い、該ＤＮＡマーカーが検出された場合には該植物は多収性であると判定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物に多収性を付与する核酸、特にイネ野生種オリザ・ロンギスタミナータ由来の擬似レスポンスレギュレーターのプロモーターおよび／または擬似レスポンスレギュレーターのコード領域を含む核酸に関する。更に本発明は、上記核酸を用いて収量が増加した形質転換植物を作製する方法、および、植物の収量を増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．植物の量的形質を増加させる遺伝子に関する研究
農業上有益な新品種を育成するため、植物同士を交配させて後代を選抜する交配育種法や、植物に突然変異を誘発させる突然変異育種法などが行われてきた。また、近年では、有用遺伝子を導入し、その機能を発現させる遺伝子組換え植物も育成されている。このような新品種育成のためには優れた性質を付与する遺伝子を集積する方法が有効であるが、作物のさらなる生産性の向上が望まれる状況にあって、利用できる遺伝子がまだまだ少なく、特に多収形質等の量的形質を支配する遺伝子の特定が行われることが望まれている。
【０００３】
近年、分子生物学的手法の発展とともにＤＮＡマーカーを用いて量的形質の遺伝解析を行うことが可能になってきている。さらに遺伝地図を利用し、分子生物学的手法により、農業上有用な遺伝子をクローニングする研究も盛んになっている。遺伝地図が作製されている生物では、特定の表現型を示す形質とマーカーの連鎖分析、およびそれに続く染色体歩行などにより、その形質を支配する遺伝子の物理的位置を明らかにし、遺伝子を単離する試みが行われている（マップベースクローニング法）。しかし、通常、量的形質を支配する遺伝子を含む部位の特定は大まかにしかできず、理論的に多くの遺伝子を含むＤＮＡ断片が明らかになるに過ぎない。そして、クローニング可能な大きさの断片、あるいは、形質転換により植物に導入することが可能な大きさの断片として同定することは容易ではない。また、詳細な遺伝地図を作製して地図情報を基に求める遺伝子を特定し、遺伝子をクローニングする作業には、長い時間と多くの労力が必要となる。実際に、マップベースクローニング法により量的形質を増大させる遺伝子がクローニングされた例は何例かあるものの（非特許文献1：Ashikari et.al. 2005、非特許文献2：Miura et.al. 2010）、未だその数は限られている。
【０００４】
アフリカに自生するイネ野生種オリザ・ロンギスタミナータ（O. longistaminata）は、栽培種であるオリザ・サティバ（O. sativa L.）と同じＡゲノムを有しているものの、栽培種に比べ大きなバイオマスを示すことが知られている。本発明者は、イネ栽培品種「しおかり」にオリザ・ロンギスタミナータの長葯性を導入する過程で、生育旺盛性を示すBC7F6系統「No.645」を育成した。そして、マップベースクローニングを利用して、生育旺盛性を付与する領域を第７染色体最末端部約180 kbに絞り込むことに成功した。そしてこの領域の約82 kbについて塩基配列を決定し、それを基にして作製した形質転換体について調査をしたが、生育旺盛性を示す形質転換体を得ることができなかった（非特許文献３）。
【０００５】
２．植物の時計関連遺伝子
植物の時計関連遺伝子については、シロイヌナズナ（Arabidopsis:アラビドプシス）を用いた研究で、CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1(CCA1)、LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)、TIMING OF CAB EXPRESSION1(TOC1)という３つの遺伝子が発見されている。そして植物の概日時計の基盤をなす機構は、これらの遺伝子発現のフィードバックループであることが判明している。この中でTOC1遺伝子は、擬似レスポンスレギュレーター（Pseudo response regulator: PRR）の1つとして知られている。以下において、擬似レスポンスレギュレーターをPRRと記載する。シロイヌナズナで同定されたPRR遺伝子としては、現在、TOC1（PRR1）を含め、PRR3、PRR5、PRR7、PRR9の５つが知られている。更にPRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1（TOC1）の順に、発現量が上昇・減衰することで日周期的現象を担っていることが見出された（非特許文献４：Matsushikaet.al. 2000）。
【０００６】
その後、単子葉植物のイネにおいて、双子葉植物のシロイヌナズナのPRR遺伝子に対応するオーソログが５種類同定され、それらのオーソログはシロイヌナズナと同様に概日リズムを示すことが明らかとなった。さらに、これらのイネのオーソログ、すなわち、OsPRR1、OsPRR37、OsPRR59、OsPRR73、OsPRR95が、それぞれイネのゲノム上の第1染色体、第7染色体、第11染色体、第3染色体、第9染色体にマッピングされた（非特許文献５: Murakami et.al. 2003）。また、シロイヌナズナのPRR7遺伝子変異株に、イネOsPRR37 cDNAをシロイヌナズナPRR7のプロモーターで発現制御するコンストラクトを導入して、機能の相補を示した報告がある（非特許文献６：Murakamiet.al. 2006）。
【０００７】
また、ジャポニカイネ品種「日本晴」とインディカイネ「kasalath」の間でOsPRR遺伝子の発現プロファイルを比較したところ、非常に似通っており、ジャポニカとインディカの間でかなり保存されていることが明らかとなっている（非特許文献７：Murakami Met.al. 2005）。
【０００８】
ところで、PRR遺伝子に関しては、該遺伝子に構成的プロモーターを連結することにより、植物の収量が増加することが報告されている。具体的には、トマト由来のPRR2構造遺伝子にイネで構成的に発現するプロモーター（GOS2プロモーター）を連結したコンストラクトをイネに導入したところ、イネの収量が増加したという事例（特許文献１）や、シロイヌナズナ由来のPRR5遺伝子に構成的プロモーター（RICE ACTINプロモーター）を連結したコンストラクトをイネに導入したところ、イネの茎数が増加し背丈が伸びた事例（特許文献２）が知られている。しかしPRRのプロモーターに着目した例はこれまでに存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開2011/0145949
【特許文献２】WO2011/049243
【非特許文献１】Ashikari M., Sakakibara H., Lin S., Yamamoto T., Takashi T., Nishimura A., Angeles ER., Qian Q., Kitano H., and Matsuoka M. (2005) Cytokinin oxidase regulates rice grain production Science 309:741-745
【非特許文献２】Miura K., Ikeda M., Matsubara A., Song X.J., Ito M., Asano K., Matsuoka M., Kitano H. and Ashikari M. (2010) OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice  Nature Genetics 42: 545-549
【非特許文献３】前川雅彦、小森俊之「イネ野生種オリザ・ロンギスタミナータ染色体部分導入系統における生育旺盛性に係わる原因遺伝子単離と機能解析（QT2002）40-43」研究成果第473集「ゲノム育種による効率的品種育成技術の開発―QTL遺伝子解析の推進―」平成21年2月20日発行  編集・発行  農林水産省農林水産技術会議事務局
【非特許文献４】Matsushika A., Makino S., Kojima M. and Mizuno T. (2000) Circadian Waves of Expression of the APRR1/TOC1 Family of Pseudo-Response Regulators in Arabidopsis thaliana: Insight into the Plant Circadian Clock  Plant Cell Physiol. 41: 1002-1012
【非特許文献５】Murakami M., Ashikari M., Miura K., Yamashino T. and Mizuno T. (2003) The Evolutionarily Conserved OsPRR Quintet: Rice Pseudo-Response Regulators Implicated in Circadian Rhythm  Plant Cell Physiol. 44: 1229-1236
【非特許文献６】MURAKAMI, M., Y. TAGO, et al. (2007). "Characterization of the Rice Circadian Clock-Associated Pseudo-Response Regulators in Arabidopsis thaliana. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 71(4): 1107-1110.
【非特許文献７】Murakami M., Matsushika A., Ashikari M., Yamashino T. and Mizuno T. (2005)  Circadian-associated rice pseudo-response regulators(OsPRRs): Insight into the control of flowering time  Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:410-414
【非特許文献８】Harushima, Y., Yano, M., Shomura, A., Sato, M., Shimano, T., Kuboki, Y., Yamamoto, T., Lin, S.Y., Antonio, B.A., Parco, A., Kajiya, H., Huang, N., Yamamoto, K., Nagamura, Y., Kurata, N., Khush, G.S., and Sasaki, T. (1998) A high-density rice genetic linkage map with 2275 markers using a single F2 population. Genetics, 148, 479-494.
【非特許文献９】Hiei et al （1994）Efficient transformation of rice (Oryza Sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of boundaries of the T-DNA Plant J. 6:271-282.
【非特許文献１０】Komari et al （1996）Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant J. 10, 165-174.
【非特許文献１１】Ditta et al （1980）Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proceedings of the National Academyof Sciences of the United   States of America 77:7347-7351.
【非特許文献１２】Ishida et al. (2007) Agrobacterium-mediated transformation of maize. Nature Protocols 2:1614-1621.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
上記で述べたように植物の量的形質を増加させる手段の開発が必要とされている。よって本発明の課題は、植物に多収性を付与することのできる核酸を提供することである。更に本発明の課題はそのような核酸を用いて、収量が増大した形質転換植物、および、植物の収量を増大させる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らによって、オリザ・ロンギスタミナータの第７染色体最末端部に座乗する生育旺盛性を付与する領域についてマップベースクローニングを利用して検討が行われ、第７染色体最末端部約180 kbへの絞り込みが行われていた。この領域の82 kbについて塩基配列を決定したが、５箇所に1 kbp以上の大きな欠失があり、末端側には約3 kbpの挿入も存在していた。よって約180 kbまでは絞り込まれたものの、この差異のためにこれ以上絞り込むことは困難であった。
【００１２】
本発明者らはこの82 kb領域について、「日本晴」の完全長cDNAの位置も考慮にいれつつ７つのコンストラクトを作製して検討を行った。その結果、約82 kb領域に座乗するPRR7遺伝子ホモローグが多収性を付与する原因遺伝子であることが明らかになった。さらに本発明者らは、驚くべきことにオリザ・ロンギスタミナータの多収性には、遺伝子のコード領域よりもプロモーター領域が大きく寄与していることを見出した。
【００１３】
以上の知見に基づき本発明は、オリザ・ロンギスタミナータの擬似レスポンスレギュレーター遺伝子のプロモーターの塩基配列を含む核酸、および、該プロモーターと擬似レスポンスレギュレーターの構造遺伝子とが機能が可能なように結合している核酸を提供する。そのような核酸は植物に多収性を付与することができる。
【００１４】
本発明は、好ましくは以下に記載するような態様により行われるが、これに限定されるものではない。
［態様１］
（１）配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列、又は
（２）配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列と少なくとも８０％の同一性を有し、植物の遺伝子の転写を促進する活性を示す塩基配列、
を含む、核酸。
［態様２］
（１）態様１記載の核酸、ならびに、
（２）下記に（ａ）から（ｃ）により規定されるタンパク質をコードする核酸；
（ａ）配列番号３で示されるアミノ酸配列または配列番号５で示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
（ｂ）植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質の疑似レシーバードメインのアミノ酸配列またはそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および、植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質のＣＣＴモチーフのアミノ酸配列またはそれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、
（ｃ）LHY（Late Elongated Hypocotyl）遺伝子およびCCA1(Circadian Clock-Associated 1)遺伝子の転写を抑制する活性を有する、
が機能を可能なように結合している核酸であって、
ここで植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質の疑似レシーバードメインと同一性を有するアミノ酸配列は、疑似レシーバードメイン保存アミノ酸を維持し、かつ、上記ドメインのアミノ酸配列において、上記疑似レシーバードメイン保存アミノ酸以外のアミノ酸については改変されてもよく、
ここで植物の疑似レスポンスレギュレータータンパク質のＣＣＴモチーフと同一性を有するアミノ酸配列は、ＣＣＴモチーフ保存アミノ酸を維持し、かつ、上記モチーフのアミノ酸配列において、上記ＣＣＴモチーフ保存アミノ酸以外のアミノ酸配列については改変されてもよい、前記核酸。
［態様３］
植物の収量の増大を可能とする、態様２記載の核酸。
［態様４］
態様１から態様３のいずれか１記載の核酸を含む、ベクター。
［態様５］
態様２または態様３に記載の核酸が植物に導入された、形質転換植物。
［態様６］
前記植物が単子葉植物である、態様５記載の形質転換植物。
［態様７］
前記植物がイネまたはトウモロコシである、態様５記載の形質転換植物。
［態様８］
態様２または態様３の核酸または態様４のベクターを植物に導入する工程を含む、収量が増大した形質転換植物を作製する方法。
［態様９］
前記植物が単子葉植物である、態様８記載の方法。
［態様１０］
前記植物がイネまたはトウモロコシである、態様９記載の方法。
［態様１１］
態様２または態様３に記載の核酸を植物に導入することを特徴とする、植物の収量を増大させる方法。
［態様１２］
配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列および／または配列番号1の３５８２５−４６７２１で示される塩基配列の１５から２０００塩基を含む、収量が増加した植物を選抜するためのDNAマーカー。
［態様１３］
植物において態様１２のDNAマーカーの検出を行い、該DNAマーカーが検出された場合には該植物は多収性であると判定する方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のプロモーターとPRR7の構造遺伝子を機能可能に連結したコンストラクトを、植物に導入することにより植物に多収性を付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、イネ野生種オリザ・ロンギスタミナータの染色体部分導入系統「No.645」の遺伝子型を示す図である。図１で塗りつぶされた領域がオリザ・ロンギスタミナータに由来する染色体部分である。
【図２】図２は、第７染色体末端部で組換えを起こし最末端が「No.645」型または「しおかり」型で固定された７個体の遺伝子型を示す図である。
【図３】図３は、生育旺盛性遺伝子周辺の物理地図である。４個のフォスミドクローンと、実施例２で作製した７つのコンストラクト（Fr1からFr7）の関係をこの図に示す。
【図４】図４は、Fr4断片をイネ品種「しおかり」に導入した形質転換体（Fr4-4）の穂を示す写真である。図４の左はFr4断片を有さない遺伝子欠落個体を、右はFr4断片を有する遺伝子保持個体を示す。
【図５】図５は、ユビキチンプロモーターで制御されたオリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子のコード領域を含むコンストラクトを導入した形質転換体の穂（左）と、対照の選抜マーカー遺伝子のみを含むコンストラクトを導入した形質転換体の穂（右）を示す図である。左は稔っていないので籾は緑のままであり、右は稔っているので籾は黄変している。また左では、大きく開穎したまま閉穎しない穎花も見られる（矢印）。
【図６】図６は、単離された日本晴由来、オリザ・ロンギスタミナータ由来、ソルガム由来、及びシロイヌナズナ由来のPRR7遺伝子の翻訳領域によりコードされるアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。Pseudo-receiver ドメイン（赤括弧）とCCTモチーフ（青括弧）は、Takata et al., (2010) BMC Evolutionary Biology 10: 126を参考にした。
【図７】図７は、単離された日本晴由来、オリザ・ロンギスタミナータ由来、ソルガム由来、及びシロイヌナズナ由来のPRR7遺伝子の翻訳領域によりコードされるアミノ酸配列の同一性（identity）％と類似性（similarity）％の値を示す図である。遺伝子解析ソフトウェアGenetyx（登録商標）ネットワーク版ver.11.0.4（株式会社ゼネティックス）を用いて、Protein vs Protein Global Homologyをデフォルト設定で実行する（Unit size to compareを２に設定する）ことにより、同一性（identity）％と類似性（similarity）％を求めた。
【図８】図８は、（１）オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子を含むコンストラクトと、（２）日本晴由来のPRR遺伝子を含むコンストラクトを作製するストラテジーを図解した図である。
【図９】図９Ａは、オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子のPCR産物がHpyCH4Vにより切断されることを示す。図９Ｂは、「日本晴」、オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子を交配で「しおかり」に導入した置換系統「No.240」および「日本晴」と「No.240」とのF1を用いて、PRR遺伝子の発現をPCRにより解析した結果を示す。
【図１０】図１０は、オリザ・ロンギスタミナータ由来のFr4断片を導入したトウモロコシ形質転換体のT１系統No.4の穂の写真である。図１０の上列はFr4断片を有さない遺伝子欠落個体を、図１０の下列はFr4断片を有する遺伝子保持個体を示す。
【発明の実施をするための形態】
【００１７】
以下に、本発明の構成を具体的に説明する。
（１）オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR7遺伝子のプロモーター
本発明者らは下記の実施例に示すように、オリザ・ロンギスタミナータのフォスミド・ライブラリーから、多収性に関与している（オリザ・ロンギスタミナータの）第７染色体末端部に位置する４つのフォスミドクローン（Fos1、Fos2、Fos10、Fos12）を選抜し、当該コンティグの塩基配列をプライマー歩行により解読した。得られた塩基配列を配列番号１に示す。
【００１８】
上記４つのフォスミドクローンを用いて７個の相補性試験用コンストラクトを作製したが、Fos10をSmaIおよびPstIで処理して得られる最も大きな断片と、Fos1をPstIおよびSacIで処理して得られる4番目に大きな断片とを連結したものがフラグメント（Fr）４である。Fr４は多収性に関与しているゲノム断片であり、配列番号１の26779番目の塩基から49155番目の塩基を含む。
【００１９】
イネ野生種であるオリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR7遺伝子のプロモーター（以下、本発明のプロモーターと称する）は、配列番号１の26779−35044で示される塩基配列を含む核酸である。
【００２０】
本願明細書において「プロモーター」とは直下に存在する任意の植物の構造遺伝子の転写を活性化する機能を有する核酸を意味する。本願明細書における「プロモーター」は広義の意味で解釈されるものであり、転写因子が結合し、正確な転写開始を導く働きをもつコアプロモーター領域などの狭義の意味に限定されるものではない。本発明のプロモーターはPRR遺伝子のコード領域のみに限らず、種々の植物の任意の構造遺伝子の転写活性を促進する作用を有する。本発明のプロモーターは、配列番号１の26779−35044で示される塩基配列を含む核酸であり、該プロモーターをPRR7遺伝子と機能可能に連結して植物に導入することにより、植物に多収性を付与することができる。本願明細書におけるPRR7タンパク質の定義は下記（２）「本発明のプロモーターとPRRの構造遺伝子とが機能を可能なように結合した核酸」において記載する。
【００２１】
本願明細書において「多収性」とは、植物の、全体重、地上部重、収量、茎径、茎数、稈長、葉面積、葉数、穂数、一穂粒数、穂長、全穂重、又は種子収量等の一部、又は複数が増大していることをいい、好ましくは全穂重及び／又は種子収量が増大していることを、より好ましくは稔実種子収量が増加していることをいう。イネ、トウモロコシなどの穀物において、稔実種子収量は非常に重要な形質である。増大の指標としては、例えば、対照植物（親植物、非形質転換体等）と比較することで評価できる。また、本願明細書において「多収性」と「生育旺盛性」は同じ意味を表す。
【００２２】
配列番号１において、26779−35044に該当する配列はオリザ・ロンギスタミナータのPRR7遺伝子のプロモーター領域であり、35825−46721に該当する配列はオリザ・ロンギスタミナータのPRR7遺伝子のコード領域であり、46722−49157に該当する配列はオリザ・ロンギスタミナータのPRR7遺伝子のターミネーター領域である。
【００２３】
本発明のプロモーターの塩基配列は配列番号１の26779−35044で示されるものに限定されず、その塩基配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、あるいは９９．５％の同一性を有し、植物のコード領域の転写を促進する活性を示す塩基配列を含む核酸も含有する。
【００２４】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マディソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １２：  ３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、及び非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、Ｓｃｈｗａｒｔｚ及びＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １４：  ６７４５，  １９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；又は他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；又はヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：及び（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＵＷ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）により決定される；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，  １９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ｂｉａｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：  ５４４−７１も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフ���ルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，  １９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。
【００２５】
本発明のプロモーターの変異体はまた、配列番号１の26779−35044で示される塩基配列の相補鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含んでなる核酸であって、プロモーター活性を有する核酸であってもよい。
【００２６】
ここで、「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６章，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００１に示され、例えば５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４２℃での、約５０％ホルムアミド、２×ないし６×ＳＳＣ、好ましくは５×ないし６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、及び例えば、約５０℃ないし６８℃、０．１×、ないし、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。
【００２７】
高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、０．５％程度のＳＤＳを含み、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、より好ましくは０．２×ＳＳＣ、あるいは０．１×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）及び／又は洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、及びおよそ６５℃、ないし６８℃、０．２×ないし０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭ  クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間ないし１時間程度行う。
【００２８】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＥＣＬ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＆  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を使用したハイブリダイゼーション等が挙げられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションとしては、例えば、キット中のｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒにＢｌｏｃｋｉｎｇ試薬を５％（ｗ／ｖ）、ＮａＣｌを０．５Ｍになるように加え、４２℃で４時間行い、洗浄は、０．４％  ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ中で、５５℃で２０分を２回、２ｘＳＳＣ中で室温、５分を一回行う、という条件が挙げられる。
【００２９】
（２）本発明のプロモーターとPRR7構造遺伝子とが機能を可能なように結合した核酸
本発明は、本発明のプロモーターと、植物のPRR7タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸（すなわちPRR7構造遺伝子）、とが機能を可能なように結合した核酸である。本発明のプロモーターとPRR7の構造遺伝子とが機能が可能なように結合した上記核酸を植物に導入することにより、植物に多収性を付与することができる。本発明のプロモーターは種々の植物由来のPRR7の構造遺伝子に対してプロモーター活性を発揮してその転写を活性化することができる。よって本発明で用いられるPRR7構造遺伝子の由来は特に限定されるものではない。
【００３０】
本願明細書で「機能を可能なように結合している」とは、本発明のプロモーターの核酸とPRR7の構造遺伝子の核酸が、プロモーターが構造遺伝子の転写活性を促進するというプロモーター活性の機能を作動することができるような様式で結合していることを意味する。
【００３１】
本願明細書で「PRR7タンパク質」とは以下の条件を満たすタンパク質を意味する。
（１）配列番号３で示されるアミノ酸配列または配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質であること
本願明細書におけるPRR7タンパク質は、配列番号３で示されるアミノ酸配列または配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質である。オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR7タンパク質は配列番号３に示す７４０個のアミノ酸からなり、配列番号２で示される塩基配列の核酸によりコードされている。日本晴由来のPRR7タンパク質は配列表の配列番号５に示す７４２個のアミノ酸からなり、配列番号４で示される塩基配列の核酸によりコードされている。
【００３２】
本願明細書におけるPRR7タンパク質は配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むものに限定されるものではなく、配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含有するものである。
【００３３】
また本願明細書におけるPRR7タンパク質は、配列番号３または配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは９９％の類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を含有するものである。本願明細書においてアミノ酸配列の類似性％とは、アミノ酸の違いを考慮したタンパク質間の類似性の程度を意味する。即ち後に述べるアミノ酸の保存的置換などが行われた場合に、類似したアミノ酸とみなして求められた値が類似性％である。
【００３４】
（２）PRドメインとCCTモチーフを含むタンパク質であること
本願明細書におけるPRR7タンパク質は、PRドメインとCCTモチーフを含むタンパク質である。PRRタンパク質は、植物の概日時計と関連し、植物に普遍的に存在することが知られている。PRRタンパク質は、高度に保存された疑似レシーバー（pseudo-receiver:PR）ドメインとCCTモチーフとを含む。PRドメインはPRRタンパク質の共通モチーフであり、タンパク質の相互作用能を有することが知られている。また、CCTモチーフは塩基性に富み、タンパク質間の結合に関与していると考えられている。PRR7タンパク質はPRRタンパク質の一つであり、PRドメインとCCTモチーフを含む。
【００３５】
PRドメインは、配列番号３のアミノ酸配列においてはアミノ酸番号６２から１７６に相当し、配列番号５のアミノ酸配列においてはアミノ酸番号６２から１７６に相当する。さらにCCTモチーフは、配列番号３のアミノ酸配列においてはアミノ酸番号６７６から７２４に相当し、配列番号５のアミノ酸配列においてアミノ酸番号６７８から７２６に相当する。よって本願明細書においてPRドメインとは、配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸番号６２から１７６に相当するアミノ酸配列を意味する。更に本願明細書においてCCTモチーフとは、配列番号３のアミノ酸配列のアミノ酸番号６７６から７２４にするアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を意味する。しかし本願明細書においてPRR7タンパク質のPRドメインとCCTモチーフのアミノ酸配列は上記のものに限定される訳ではなく、それらのアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは９９％の同一性を有するものも含有する。
【００３６】
PRドメインのアミノ酸配列において好ましくは、配列番号３のアミノ酸番号６４のバリン（Val）、６６のロイシン（Leu）、６７のバリン（Val）、７０のアスパラギン酸（Asp）、７１のアスパラギン酸（Asp）、７３のトレオニン（Thr）、７４のアルギニン（Arg）、７７のバリン（Val）、７９のアラニン（Ala）、８０のロイシン（Leu）、８１のロイシン（Leu）、８２のアルギニン（Arg）、８４のシステイン（Cys）、８６のチロシン（Tyr）、８７のグルタミン酸（Glu）、８８のバリン（Val）、９１のアラニン（Ala）、９３のアスパラギン（Asn）、９４のグリシン（Gly）、９７のアラニン（Ala）、９８のトリプトファン（Trp）、１０１のロイシン（Leu）、１０２のグルタミン酸（Glu）、１０３のアスパラギン酸（Asp）、１０６のアスパラギン（Asn）、１０８のイソロイシン（Ile）、１０９のアスパラギン酸（Asp）、１１１のバリン（Val）、１１２のロイシン（Leu）、１１３のトレオニン（Thr）、１１４のグルタミン酸（Glu）、１１５のバリン（Val）、１１７のメチオニン（Met）、１１８のプロリン（Pro）、１２１のセリン（Ser）、１２２のグリシン（Gly）、１２３のイソロイシン（Ile）、１２５のロイシン（Leu）、１２６のロイシン（Leu）、１２９のイソロイシン（Ile）、１３２のヒスチジン（His）、１３８のイソロイシン（Ile）、１３９のプロリン（Pro）、１４０のバリン（Val）、１４１のイソロイシン（Ile）、１４２のメチオニン（Met）、１４３のメチオニン（Met）、１４４のセリン（Ser）、１４５のセリン（Ser）、１４７のアスパラギン酸（Asp）、１４９のメチオニン（Met）、１５２のバリン（Val）、１５３のフェニルアラニン（Phe）、１５４のリジン（Lys）、１５５のシステイン（Cys）、１５６のロイシン（Leu）、１５７のセリン（Ser）、１５８のリジン（Lys）、１５９のグリシン（Gly）、１６０のアラニン（Ala）、１６１のバリン（Val）、１６２のアスパラギン酸（Asp）、１６３のフェニルアラニン（Phe）、１６４のロイシン（Leu）、１６５のバリン（Val）、１６６のリジン（Lys）、１６７のプロリン（Pro）、１６９のアルギニン（Arg）、１７０のリジン（Lys）、１７１のアスパラギン（Asn）、１７２のグルタミン酸（Glu）、１７３のロイシン（Leu）、１７４のリジン（Lys）、１７６のロイシン（Leu）のアミノ酸残基は置換されずに保存されている。本願明細書においてはこれらのアミノ酸残基を「疑似レシーバー（PR）ドメイン保存アミノ酸」と称する。
【００３７】
PRドメインのアミノ酸配列において更に好ましくは上記の「疑似レシーバー（PR）ドメイン保存アミノ酸」に加えて、配列番号３のアミノ酸番号６８のグルタミン酸（Glu）、７２のセリン（Ser）、７５のグルタミン（Gln）、７６のバリン（Val）、７８のセリン（Ser）、８９のイソロイシン（Ile）、９０のプロリン（Pro）、９２のグルタミン酸（Glu）、１００のチロシン（Tyr）、１０５のグルタミン（Gln）、１１０のロイシン（Leu）、１２７のセリン（Ser）、１３４のイソロイシン（Ile）、１３５のシステイン（Cys）、１３６のリジン（Lys）、１４６のアスパラギン（Asn）、１７５のアスパラギン（Asn）のアミノ酸残基も置換されずに保存されていてもよい。なおアミノ酸番号６８のグルタミン酸（Glu）については、配列番号５のアミノ酸番号６８のアスパラギン酸（Asp）であってもよい。またPRドメインのアミノ酸配列において更に好ましくは上記の「疑似レシーバー（PR）ドメイン保存アミノ酸」に加えて、配列番号３のアミノ酸番号６２のイソロイシン（Ile）、６５のロイシン（Leu）、９６のグルタミン（Gln）、１３１のアスパラギン（Asn）、１３７のアスパラギン（Asn）、１５０のグリシン（Gly）、１６８のイソロイシン（Ile）のアミノ酸残基も置換されずに保存されていてもよい。
【００３８】
CCTモチーフのアミノ酸配列において好ましくは、配列番号３のアミノ酸番号６７８のグルタミン酸（Glu）、６８２のアラニン（Ala）、６８３のアラニン（Ala）、６８６のリジン（Lys）、６８７のフェニルアラニン（Phe）、６８８のアルギニン（Arg）、６９０のリジン（Lys）、６９１のアルギニン（Arg）、６９２のリジン（Lys）、６９４のアルギニン（Arg）、６９６のフェニルアラニン（Phe）、６９８のリジン（Lys）、６９９のリジン（Lys）、７００のバリン（Val）、７０１のアルギニン（Arg）、７０２のチロシン（Tyr）、７０３のグルタミン（Gln）、７０４のセリン（Ser）、７０５のアルギニン（Arg）、７０６のリジン（Lys）、７０８のロイシン（Leu）、７０９のアラニン（Ala）、７１０のグルタミン酸（Glu）、７１１のグルタミン（Gln）、７１２のアルギニン（Arg）、７１３のプロリン（Pro）、７１４のアルギニン（Arg）、７１５のバリン（Val）、７１６のアルギニン（Arg）、７１７のグリシン（Gly）、７１８のグルタミン（Gln）、７１９のフェニルアラニン（Phe）、７２０のバリン（Val）、７２１のアルギニン（Arg）のアミノ酸残基は置換されずに保存されている。本願明細書においてはこれらのアミノ酸残基を「CCTモチーフ保存アミノ酸」と称する。
【００３９】
CCTモチーフのアミノ酸配列において更に好ましくは上記の「CCTモチーフ保存アミノ酸」に加えて、配列番号３のアミノ酸番号６７７のグルタミン（Gln）、アミノ酸番号６９５のアスパラギン（Asn）、６９７のグリシン（Gly）、７０７のアルギニン（Arg）、７２２のグルタミン（Gln）のアミノ酸残基も置換されずに保存されていてもよい。なおアミノ酸番号６７７のグルタミン（Gln）については、配列番号５のアミノ酸番号６７９のアルギニン（Arg）であってもよい。またCCTモチーフのアミノ酸配列において更に好ましくは上記の「CCTモチーフ保存アミノ酸」に加えて、配列番号３のアミノ酸番号６８９のグルタミン（Gln）、６９３のグルタミン酸（Glu）のアミノ酸残基も置換されずに保存されていてもよい。
【００４０】
本願明細書におけるPRドメインと同一性を有するアミノ酸配列は、PRドメイン保存アミノ酸を維持し、かつ、PRドメインのアミノ酸配列において、PRドメイン保存アミノ酸以外のアミノ酸については改変されてもよい。
【００４１】
本願明細書におけるCCTモチーフと同一性を有するアミノ酸配列は、CCTモチーフ保存アミノ酸を維持し、かつ、CCTモチーフのアミノ酸配列において、CCTモチーフ保存アミノ酸以外のアミノ酸については改変されてもよい。
【００４２】
これらのアミノ酸の改変は、アミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加であってよい。また、アミノ酸の置換は、保存的置換であってもよく、これは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることである。保存的置換の非限定的な例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ相互の置換のような脂肪族基含有アミノ酸残基の間の置換、Ｌｙｓ及びＡｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ相互の置換のような極性残基の間での置換などが含まれる。
【００４３】
（３）LHY（Late Elongated Hypocotyl）遺伝子およびCCA1(Circadian Clock-Associated 1)遺伝子の転写を抑制する活性を有すること
本発明者らは、オリザ・ロンギスタミナータの第７染色体末端に座乗し、配列番号２で示される塩基配列を有するPRR遺伝子、及び「日本晴」の第７染色体末端に座乗し、配列番号４で示される塩基配列を有するPRR遺伝子（OsPRR37）が、多収性に関連する遺伝子であることを見出した。これらのPRRタンパク質はPRR7に分類されるが、PRR7タンパク質はLHY（Late Elongated Hypocotyl）遺伝子およびCCA1(Circadian Clock-Associated 1)遺伝子の転写を抑制する活性を有する。すなわち本願明細書においてPRR7タンパク質は、LHY（Late Elongated Hypocotyl）遺伝子およびCCA1(Circadian Clock-Associated 1)遺伝子の転写を抑制する活性を有するタンパク質である。
【００４４】
下記の実施例で示すようにオリザ・ロンギスタミナータ由来のPRRのプロモーターを日本晴由来のPRR構造遺伝子と機能を可能なように結合させた核酸を植物に導入することによっても、植物の収量を増大すること、即ち該植物に多収性を付与することが可能であった。よって本発明の効果を得るにあたり、オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRRのプロモーターが重要な役割を果たしていると考えられる。
【００４５】
さらに本発明は、配列番号３で示されるアミノ酸配列または配列番号５で示されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、あるいは９９％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有し、オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子のプロモーターと機能可能に連結したときに植物の収量を増大させる活性を有するタンパク質をコードする核酸と、オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子のプロモーターとを機能可能に連結した核酸である。この核酸も植物に導入することによって、植物に多収性を付与することが可能である。本発明の好適な態様においてそのような核酸は、PRドメインとCCTモチーフを含むタンパク質をコードするもの、及び／又は、LHY遺伝子およびCCA1遺伝子の転写を抑制する活性を有するタンパク質をコードするものであってもよい。なお、この核酸は下記（３）〜（６）に記載の本発明のための核酸として用いることができる。
【００４６】
（３）本発明のプロモーター、あるいは本発明のプロモーターとPRR7の構造遺伝子とが機能を可能なように結合した核酸を含むベクター
本発明は、本発明のプロモーターを単独で含むベクター、あるいは、本発明のプロモーターとPRR7タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸（PRR7の構造遺伝子）とが機能を可能なように結合している核酸を含むベクターである。このようなベクターは植物に多収性を付与するのに有用である。
【００４７】
ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクターに所望の遺伝子を常法により連結することによって、調製することができる。本発明の核酸を用いて植物に多収性を付与する場合には、植物形質転換用ベクターが特に有用である。本発明で使用されるベクターは、植物細胞中で本発明の目的とする効果を達成するために使用できるものであれば特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ系のベクター、pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系のベクター等を使用できる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ２２１などが挙げられる。ｐＢＩ系のベクター等のバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的のＤＮＡを導入できるという点で好ましい。また、pBluescript系のベクターとしては、例えば、pBluescript SK(+)、pBluescript SK(-)、pBluescript II KS(+)、pBluescript II KS(-)、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)などが挙げられる。ｐＵＣ系のベクターとしては、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９等を挙げることができる。pBluescript系のベクター、ｐＵＣ系ベクターは、植物にＤＮＡを直接導入することができるという点で好ましい。さらにはpGreenシリーズ（www.pgreen.ac.uk）、pCAMBIAシリーズ（www.cambia.org）などのバイナリーベクターや、pSB11（Komari et al, 1996, Plant J, 10: 165-174）、pSB200（Komori et al, 2004, Plant J, 37: 315-325）などのスーパーバイナリーベクターも好ましく使用することができる。
【００４８】
また、上記ベクターは、転写産物の安定化に必要なポリアデニレーション部位を含む転写ターミネーター配列を含むことが好ましい。当業者は、転写ターミネーター配列を適切に選択することができる。
【００４９】
転写ターミネーター配列は、転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。上記組換え発現ベクターにおいては、転写ターミネーター配列を適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成する現象等の発生を防止することができる。
【００５０】
また、上記組換え発現ベクターには、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、形質転換体選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。
【００５１】
形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる（抗生物質カナマイシン又はゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）。また、除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等も利用可能である。これにより、上記抗生物質や除草剤を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。
【００５２】
翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記融合遺伝子の翻訳効率を高めることができる。
【００５３】
また、エンハンサーとしては、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。
【００５４】
組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、本発明のプロモーター、PRR7の構造遺伝子、及びターミネーター配列、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。上記遺伝子を母体となるベクターに挿入するには、常法にしたがい、精製された遺伝子のＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる（例えば、Molecular Cloning, 5.61-5.63）。
【００５５】
当業者においては、所望の遺伝子を有するベクターを、一般的な遺伝子工学技術によって、適宜、作製することが可能である。通常、市販の種々のベクターを利用することにより容易に作製できる。
【００５６】
（４）本発明のプロモーターとPRR7の構造遺伝子が導入された形質転換植物
更に本発明は、本発明のプロモーターと、PRR7タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸（PRR7の構造遺伝子）とが機能を可能なように結合している核酸が植物に導入された、形質転換植物である。上記核酸は、通常、適当なベクターへ挿入され、形質転換の対象となる植物細胞へ導入される。すなわち本発明は、上記核酸又は組換え発現ベクターを保持する植物細胞（形質転換植物）を提供するものである。上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、植物体中の細胞が含まれる。また、本発明に係る形質転換体としては、植物細胞のみならず、植物体全体、植物器官（例えば、根、茎、葉、花弁、種子、果実、完熟胚、未熟胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等）、植物組織（例えば、表皮、篩部、柔組織、木部、維管束等）、これらの切片、カルス、苗条原基、多芽体、毛状根及び培養根等のいずれをも包含する。
【００５７】
宿主細胞内で上記遺伝子を発現させる方法としては、上記遺伝子を適当なベクターに組み込み、例えば、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（エレクトロポレーション）（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等の当業者に公知の方法により生体内に導入する方法が挙げられる。本発明においては、アグロバクテリウム法を好ましく使用することができる。植物体内へ本発明の遺伝子を導入する場合、遺伝子は、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法等を用いて、植物細胞に直接導入することもできるが、植物への遺伝子導入用プラスミドに組込み、これをベクターとして、植物感染能のあるウイルスあるいは細菌を介して、間接的に植物細胞に導入することもできる。かかるウイルスとしては、例えば、代表的なウイルスとして、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、ジェミニウイルス等が挙げられ、細菌としては、アグロバクテリウム等が挙げられる。アグロバクテリウム法により、植物への遺伝子導入を行う場合には、市販のプラスミドを用いることができる。
【００５８】
また、本発明には、上記核酸又はベクターを直接導入した植物細胞のみならず、植物細胞を生育させた植物体、当該植物の、後代、子孫またはクローンである植物、並びに繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）が含まれる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。上記技術については既に確立し、本発明の技術分野において広く用いられており、本発明において上記方法を好適に用いることができる。
【００５９】
形質転換された植物細胞を再分化させて植物体を再生させる方法は、植物細胞の種類により異なるが、例えばイネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）の方法が挙げられる。上記手法により再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来遺伝子の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、又は植物体中のＤＮＡの塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡの抽出は、公知のJ.Sambrookらの方法（Molecular Cloning、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）にしたがって実施することができる。
【００６０】
例えば、再生させた植物体中に存在する本発明の遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出したＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う。また、本発明の遺伝子、あるいは改変された遺伝子の塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中において増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明の遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明の遺伝子に対応することを確認することが可能である。
【００６１】
一旦、ゲノム内に本発明の遺伝子が導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖又は無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明の遺伝子又は組換え発現ベクターが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫及びクローン、並びに該植物体、その子孫、及びクローンの繁殖材料が含まれる。つまり、本発明には、形質転換処理を施した再分化当代である「T0世代」やT0世代の植物の自殖種子である「T1世代」などの後代植物や、それらを片親にして交配した雑種植物やその後代植物を含む。
【００６２】
このようにして作出された形質転換植物は、通常の植物に比べて、多収性という有利な特性を有することが期待される。本発明で形質転換をする対象として用いられる植物は特に限定されるものではなく、本発明の方法により、多収性を有する種々の形質転換植物を作製することができる。
【００６３】
（５）本発明のプロモーターとPRR7構造遺伝子を用いて収量が増大した形質転換植物を作製する方法
更に本発明は、本発明のプロモーター配列と、PRR7タンパク質をコードする塩基配列を含む核酸（PRR7の構造遺伝子）とが機能を可能なように結合している核酸を植物に導入する工程を含む、収量が増大した形質転換植物を作製する方法である。より具体的には、本発明のプロモーター配列と、PRR7タンパク質をコードする核酸（PRR7の構造遺伝子）とが機能を可能なように結合している核酸を作製し、前記核酸を植物細胞に導入し、核酸が導入された前記植物細胞から植物体を再生する、ことにより、収量が増大した形質転換植物を作製することができる。核酸を導入するための植物材料として、例えば、根、茎、葉、種子、完熟胚、未熟胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物組織やその切片、細胞、カルス、それを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物細胞を挙げることができ、完熟胚又は未熟胚を好ましく使用することができる。本発明の形質転換植物を作製する方法は特に限定されるものではなく、本技術分野で一般的に用いられている種々の植物の形質転換方法を用いることができる。例えば、上記（４）に記載した形質転換方法を、適宜用いることができる。
【００６４】
本発明の好ましい態様において形質転換される植物は被子植物であり、好ましくは単子葉植物であり、さらに好ましくはイネ、トウモロコシ、ソルガムであり、最も好ましくはイネとトウモロコシである。また、本発明の好ましい態様において形質転換される植物は、短日植物である。下記の実施例では、本発明のプロモーターとオリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR7構造遺伝子をトウモロコシに導入することにより、トウモロコシに多収性を付与できたことが示されている。
【００６５】
（６）本発明のプロモーターとPRR7構造遺伝子を用いて植物の収量を増大させる方法
更に本発明は、本発明のプロモーター配列と、PRR7タンパク質をコードする塩基配列とを含む核酸（PRR7の構造遺伝子）が機能を可能なように結合している核酸を植物に導入することを特徴とする、植物の収量を増大させる方法である。
【００６６】
（７）本発明のプロモーターとオリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR7構造遺伝子の、DNAマーカーとしての使用
本発明のプロモーターおよび／またはオリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR7構造遺伝子の全体又は部分配列は、植物の多収性のＤＮＡマーカーとして有用である。本発明のプロモーターの配列あるいはオリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR7構造遺伝子の配列が植物において検出された場合には、その植物はオリザ・ロンギスタミナータ様の多収性の形質を示すことが期待される。このようなマーカーとしては、本発明のプロモーター由来の塩基配列がより好ましい。
【００６７】
そのような目的で使用される本発明のＤＮＡマーカーは、好ましくは配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列および／または配列番号1の３５８２５−４６７２１で示される塩基配列の１５から２０００塩基を含むものであり、更に好ましくは配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列および／または配列番号1の３５８２５−４６７２１で示される塩基配列で示される塩基配列の２０乃至５００塩基を含むものであり、更に好ましくは配列番号１の２６７９９−３５０４４で示される塩基配列および／または配列番号1の３５８２５−４６７２１で示される塩基配列で示される塩基配列の３０乃至１００塩基を含むものである。しかし本発明の多収性のＤＮＡマーカーは、それらに限定されるものではない。
【００６８】
好適な１態様として、本発明のプロモーターの塩基配列またはオリザ・ロンギスタミナータのPRR構造遺伝子の塩基配列と、日本晴の対応する部分の塩基配列との比較を行い、両者の間で差が見られる領域に相当するオリザ・ロンギスタミナータ部分配列を、上記で述べたＤＮＡマーカーとして選択することができる。
【００６９】
本発明のＤＮＡマーカーを植物において検出し、該ＤＮＡマーカーが存在する場合には該植物は多収性であると判定することができる。例えば、日本晴とオリザ・ロンギスタミナータを交配することにより得られた植物について、多収性のイネ品種を選抜する際には、上記で述べたようなオリザ・ロンギスタミナータと日本晴で差異がある領域に相当するオリザ・ロンギスタミナータ部分配列をＤＮＡマーカーとして使用することができる。
【００７０】
本発明のＤＮＡマーカーの検出手段は特に限定されるものではなく、PCR、RFLP、あるいは塩基配列解読など、本技術分野で知られている種々の方法を用いることができる。更に本発明のＤＮＡマーカーの検出は、交配で得られた植物の成長のいずれの段階においても行うことが可能である。交配で得られた植物について幼植物の段階でＤＮＡマーカーの検出を行うことは本発明において好適であり、それによって交配した植物が成長する前に該植物が多収性かどうか、判定をすることができる。
【実施例】
【００７１】
実施例１：イネ野生種オリザ・ロンギスタミナータの持つ多収性を有する栽培イネ系統の作出と多収性遺伝子領域の同定
アフリカに自生するイネ野生種オリザ・ロンギスタミナータ（O. longistaminata）は、栽培種であるオリザ・サティバ（O. sativa L.）と同じＡゲノムを有しているものの、栽培種に比べ大きなバイオマスを示すことが知られている。本発明者は、オリザ・ロンギスタミナータの有するこのような優良形質を栽培種に導入するべく、イネ栽培品種「しおかり」とオリザ・ロンギスタミナータとの交配・選抜を続けた結果、「しおかり」に比較して多収性を示すBC7F6系統「No.645」を得た。この「No.645」はほとんどの農業形質で「しおかり」を凌駕しており、特に、稈基径が太くなるのが特徴であった（表１）。この多収性系統について全12本の染色体をカバーする80個のDNAマーカーを用いて、遺伝子型を調査したところ、オリザ・ロンギスタミナータの第３染色体末端部と第７染色体末端部だけを有することがわかった（図１）。
【００７２】
そこで、本発明者は、「No.645」の有する多収性に関与する遺伝子領域を明らかにするため、「No.645」を反復親の「しおかり」と交雑したF2、133個体を用いて収量関連形質に関するQTL解析を行った。その結果、第７染色体末端部に、出穂まで日数、稈長、穂長、1穂穎花数、稈基径に関するQTLが検出された（表２）。引き続き、交雑後代F３個体のうち、第７染色体末端部がヘテロで、その他の第7染色体領域が「しおかり」型の個体と「No.645」型の個体を選抜し、その後代4313個体と4944個体を用いて、末端部の組換え個体を選抜した。その結果、最末端が「No.645」型に固定した個体３個体（F4-No.1, No.2, No.3）と、最末端が「しおかり」型に固定した４個体（F4-No.4, No.5, No.6, No.7）を選抜できた（図２）。最末端が「No.645」型に固定した個体の形質は、「No.645」とほとんど同じであった。また最末端が「しおかり」型に固定した個体の形質は「しおかり」とほとんど同じであった（表３）。マーカーCH15377-1はパッククローンP0627E10の図２の右末端から約180 kb離れていることから、オリザ・ロンギスタミナータの持つ多収性の遺伝子領域は第７染色体末端部約180 kbに絞り込むことができると推定された。
【００７３】
【表１】
2016013057.tif 000002
【００７４】
【表２】
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【００７５】
【表３】
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【００７６】
実施例２：オリザ・ロンギスタミナータの第７染色体末端部領域の形質転換試験による相補性検定（１）
実施例１の遺伝学的解析により、オリザ・ロンギスタミナータの持つ多収性の遺伝子領域を第７染色体末端部の約180 kbに絞り込むことができた。そのうちの約82kbの領域を網羅する7つのコンストラクトを作製し、それぞれを「しおかり」へ形質転換して得られた形質転換体の形質評価を行った。
【００７７】
フォスミドベクターpCC1FOS（EPICENTRE社）を用いて、「No.645」のゲノミックライブラリーを作製した。実施例1の遺伝学的解析により、多収性に関与する遺伝子は第７染色体の長腕末端部に座乗することが示されていたので、当該領域のDNAマーカーであるC213およびC728（Harushima et al, 1998）を用いてライブラリーをスクリーニングし、４個のクローン（Fos1、2、10、12）を選抜した。各クローンの末端塩基配列を解読し、日本晴ゲノム配列と比較することにより、相互の位置関係を明らかにした。さらに、プライマー歩行を行い、当該コンティグの塩基配列を解読した。解読された塩基配列を配列番号１に示す。
【００７８】
上記４個のフォスミドクローンを用いて、下記で述べる７個の相補性試験用コンストラクトを作製した（図３）。
【００７９】
（１）Fr3の作製
Fos12をNotI処理して得られる最も大きな断片（配列番号１の15961番目の塩基から37129番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてアガロースゲルから精製した。
【００８０】
プラスミドベクターpSB200（ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）をNotIで完全消化後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。回収したDNAをTE溶液に溶解後、CIAP（TAKARA-BIO社）により脱リン酸化した。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけた後、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてゲルからベクター断片を精製した。
【００８１】
上記により準備した２つの断片を供試して、DNA Ligation Kit “Mighty Mix”（TAKARA-BIO社）を用いてライゲーション反応を行った。反応後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。回収したDNAを純水（Millipore社製装置により作製）に溶解後、大腸菌DH5αと混合し、エレクトロポレーションに供試した。エレクトロポレーション後の溶液を、LB培地で振とう培養（３７℃、１時間）した後、スペクチノマイシン（50 μg/ml）を含むLBプレートに広げ、保温（３７℃、１６時間）した。生じたコロニーのなかの２４個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。
（２）Fr1の作製
Fos12をNotI処理して得られる2番目に大きな断片（配列番号１の３番目の塩基から9746番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてアガロースゲルから精製した。
【００８２】
この断片を、（１）で用いたNotI-CIAP処理済みのpSB200断片とともに供試して、DNA Ligation Kit “Mighty Mix”を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
（３）Fr7の作製
Fos1をNotI処理して得られる最も大きな断片（配列番号１の58805番目の塩基から82355番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてアガロースゲルから精製した。
【００８３】
この断片を、（１）で用いたNotI-CIAP処理済みのpSB200断片とともに供試して、DNA Ligation Kit “Mighty Mix”を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
（４）Fr5の作製
Fos1をNotI処理して得られる2番目に大きな断片（配列番号１の42409番目の塩基から58808番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてアガロースゲルから精製した。
【００８４】
この断片を、（１）で用いたNotI-CIAP処理済みのpSB200断片とともに供試して、DNA Ligation Kit “Mighty Mix”を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
（５）Fr2の作製
Fos12をPspOMI処理して得られる2番目に大きな断片（配列番号１の6929番目の塩基から19723番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてアガロースゲルから精製した。
【００８５】
この断片を、（１）で用いたNotI-CIAP処理済みのpSB200断片とともに供試して、DNA Ligation Kit “Mighty Mix”を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【００８６】
（６）Fr6の作製
Fos1をPspOMI処理して得られる2番目に大きな断片（配列番号１の51665番目の塩基から62366番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてアガロースゲルから精製した。
【００８７】
この断片を、（１）で用いたNotI-CIAP処理済みのpSB200断片とともに供試して、DNA Ligation Kit “Mighty Mix”を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
【００８８】
（７）Fr4の作製
Fos10をSmaIおよびPstIで処理して得られる最も大きな断片（配列番号１の26779番目の塩基から46059番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてアガロースゲルから精製した。
【００８９】
Fos1をPstIおよびSacIで処理して得られる４番目に大きな断片（配列番号１の46056番目の塩基から49155番目の塩基までを含む）を、QIAEXII Gel Extraction Kitを用いてアガロースゲルから精製した。
【００９０】
プラスミドベクターpSB200をEcoRVおよびSacIで完全消化後、エタノール沈殿によりDNAを回収した。回収したDNAを、（１）に記載した方法でCIAP処理し、ベクター断片を精製した。
【００９１】
これら３断片を供試して、DNA Ligation Kit “Mighty Mix”を用いてライゲーション反応を行った。以後、（１）に記載の方法に準拠して、所望の大腸菌を選抜した。
（１）から（７）により選抜した７種類の大腸菌を、Agrobacterium tumefaciens菌株LB4404/pSB1（Komari et al, 1996）およびヘルパー大腸菌HB101/ pRK2013（Ditta et al, 1980）とともに供試して、Ditta et al（1980）の方法に従いtriparential matingを行った。スペクチノマイシン（50 μg/ml）、テトラサイクリン（15 μg/ml）およびハイグロマイシン（35 μg/ml）を含むABプレート上で選抜したアグロバクテリウムを用いて、Hiei et al （1994）の方法に準拠し、「しおかり」の形質転換を行った。形質転換イネは、馴化後、温室で栽培した。各コンストラクトにつき独立した形質転換体を約２０個体養成し、T１種子を採種した。
【００９２】
T１世代は、１コンストラクトにつき２系統、計１８個体（１系統あたり９個体）を供試した。播種は２００７年６月２５日に行い、７月９日に水田土壌を入れた３.５リットルのバケツに３個体ずつ（１系統あたり３バケツ、計９個体）移植した。対照の「しおかり」に加え、参考品種としてオリザ・ロンギスタミナータの第３染色体末端領域および第７染色体末端領域を「しおかり」に導入した系統「No.645」を栽植した。栽培は日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体評価専用の閉鎖系温室（１４時間３０分日長の長日条件）で、無施肥条件下で行った。収穫は９月２１日に行った。調査形質は、出穂日、稈長、穂数、稈基径、最大穂を対象に穂長、１穂粒数、種子稔性、１穂稔実重（以下、１穂重）につき行った。
【００９３】
各コンストラクト２系統の農業形質データの平均値を表４に示した。供試した全７コンストラクトの１穂粒数や１穂重は対照の「しおかり」とほぼ同等またはそれ以下であり、「しおかり」を凌駕するコンストラクトは見出せなかった。
【００９４】
【表４】
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【００９５】
実施例３：オリザ・ロンギスタミナータの第７染色体末端部領域の形質転換試験による相補性検定（２）
２００７年に供試したものの、生育旺盛性を示す結果を得られなかった７つのコンストラクトについて、コンストラクトあたりの系統数（いずれも独立したT0個体に由来）を５系統（１系統あたり１２個体。２００７年に供試した系統とは異なる。）に増やして、再度試験を行った。播種は、２００８年５月３０日に行い、６月１６日に水田土壌を入れた３.５リットルのバケツに４個体ずつ（１系統あたり３バケツ、計１２個体）移植した。栽培は日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体評価専用の閉鎖系温室（１４時間３０分日長の長日条件）で、無施肥条件下で行った。収穫は９月８日に行った。調査形質は、出穂日、稈長、穂数、稈基径、最大穂を対象に穂長、１穂粒数、種子稔性、１穂稔実重（以下、１穂重）につき行った。２００８年は対照の「しおかり」に加え、オリザ・ロンギスタミナータの第7染色体末端領域のみを「しおかり」に導入した系統「No.240」を参考品種として栽植した。
【００９６】
各コンストラクト５系統の農業形質データの平均値を表５に示した。Fr4コンストラクトは対照の「しおかり」に比較して、出穂まで日数、稈長、穂長、１穂粒数、種子稔性、１穂重、稈基径の７形質で大きく上回っているに対して、残りの６つのコンストラクトはすべての形質において「しおかり」と同等またはそれ以下であった。
【００９７】
【表５】
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【００９８】
次に、Fr4系統のうち最もその特性が顕著に表れたFr4-4について、個体別にPCRを行い、導入遺伝子の有無と形質測定値の大小との関係を調べた。その結果を表６と図４に示す。遺伝子保有個体は、欠落個体より、長日条件下（１４時間３０分）で出穂まで日数、稈長、穂長、1穂粒数、1穂重、稈基経において、上回っていることが明らかとなった。また、遺伝子保有個体は、欠落個体に比較して粒着密度（穂１cmあたりの粒数）が高いことも明らかとなった。
【００９９】
以上の結果から、「しおかり」に多収を付与するゲノム断片はFr4断片であることが強く示唆された。
【０１００】
【表６】
2016013057.tif 000007
【０１０１】
２００９年は２００８年に栽培したFr4-4の遺伝子保有個体および遺伝子欠落個体の後代（T2世代）を対照の「しおかり」、「No.240」とともに栽培し（1系統あたり１２個体）、収量形質を評価することとした。播種は、２００９年５月１日に行い、５月１１日に水田土壌を入れた３.５リットルのバケツに４個体ずつ移植した。栽培は日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体評価専用の閉鎖系温室（１４時間３０分日長の長日条件）で、無施肥条件下で行った。収穫は８月１９日に行った。調査形質は、出穂日、稈長、穂数、稈基径、最大穂を対象に穂長、1穂粒数、種子稔性、1穂稔実重（以下、1穂重）につき行った。
【０１０２】
結果を表7に示した。遺伝子保有個体の後代Fr4-4-1とFr4-4-2は、遺伝子欠落個体の後代Fr4-4-3に比較して、出穂まで日数、稈長、穂長、1穂粒数、1穂重、稈基経において、上回っていることが明らかとなった。また、遺伝子保有系統は、欠落系統に比較して粒着密度（穂1 cmあたりの粒数）が高いことも明らかとなった。一方、Fr4-4-3の全形質測定値は「しおかり」とほぼ同等であることがわかった。
【０１０３】
以上の結果から、「しおかり」に多収を付与するゲノム断片はFr4断片であると結論した。日本晴配列（AP005199）のアノテーション情報を参照すると、Fr4断片には日本晴完全長cDNA AK066112の対立遺伝子が包含されており、当該遺伝子が多収性を付与するものと推察された。なお、AK066112座は、Murakami et al. (2005)では、OsPRR37と記載されている。従って、オリザ・ロンギスタミナータの持つPRR遺伝子が「しおかり」に多収を付与する原因遺伝子であると推定された。そしてこのFr4断片には、PRR遺伝子のコード領域及びこれを発現させるための領域がすべて含まれると考えられた。
【０１０４】
【表７】
2016013057.tif 000008
【０１０５】
実施例４：オリザ・ロンギスタミナータPRR遺伝子のコード領域の効果の確認
実施例３の結果から、オリザ・ロンギスタミナータの持つPRR遺伝子が多収性を付与する遺伝子であると考えられた。このことを確認するため、オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子のコード領域が収量関連形質に及ぼす影響を調査した。
【０１０６】
具体的には、オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子のコード領域に、プロモーターとしてユビキチンプロモーターを、ターミネーターとしてオリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子のターミネーター領域を連結させたコンストラクトを以下のようにして作製した。ユビキチンプロモーターは、単子葉植物用に通常用いられる構成的プロモーターであり、PRR遺伝子の効果を見るために適切であると考えられた。これらのコンストラクトを栽培イネ「ゆきひかり」に導入して収量関連形質の評価を実施することとした。
【０１０７】
オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子のコード領域（配列番号２）をユビキチンプロモーターの制御下で発現させるためのコンストラクトを、overlap extension PCR等の常法を用いて構築した。具体的には、pSB200のユビキチンプロモーターおよびユビキチンイントロンを含む領域をPCR増幅し、その直下にオリザ・ロンギスタミナータの翻訳開始点上流領域（配列番号１の35045番目塩基から35824番目塩基まで）、配列番号２、および、オリザ・ロンギスタミナータの翻訳終了点下流領域（配列番号１の46722番目塩基から49157番目塩基まで）を接続したキメラ遺伝子が、pSB200のマルチプルクローニングサイトに挿入されているコンストラクトを作成した。なお、選抜マーカー遺伝子（ハイグロマイシン抵抗性遺伝子）のみを保持するプラスミドを対照として用いた。
【０１０８】
上記２種のコンストラクトを保有する大腸菌を用いて、実施例２で記載した方法でtriparental matingおよび栽培イネ「ゆきひかり」への形質転換を行った。形質転換イネは、馴化後、閉鎖系温室で栽培した。PRR遺伝子および対照のコンストラクトは、独立した形質転換体をそれぞれ６０個体、２０個体養成した。供試６０個体のうち、（１）草丈が高い、（２）茎が太い、（３）出穂まで日数が長いといった多収性に関連する特性を示す個体が１８個体観察された。その１８個体について、成熟期に穂の形質を観察したところ、全個体において、（１）種子稔性が低い（２０％未満）、（２）穂が止葉から十分に抽出していない、（３）穎花が開穎したまま閉穎しないなどのいずれかの状況が観察された。そして最終的な種子収量は対照と比較して大幅に低下した（図５）。一方、残りの４２個体は対照の２０個体とほぼ同様の特性を示し、上記の劣悪形質はほとんど観察されなかった。
【０１０９】
以上の結果から、オリザ・ロンギスタミナータの持つPRR遺伝子のコード領域が多収性を付与する遺伝子であると確認することはできなかった。
【０１１０】
実施例５：オリザ・ロンギスタミナータ由来プロモーターと各種PRR遺伝子コード領域を連結したコンストラクトの効果
実施例４の結果からは、オリザ・ロンギスタミナータの持つPRR遺伝子のコード領域が多収性を付与する遺伝子であると結論することはできなかった。そこで発明者らは鋭意検討の末、オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子のプロモーター領域が、オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子の発現に必要なのではないかと考え、オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子のコード領域に、プロモーターとしてオリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子のプロモーター領域を、ターミネーターとしてオリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子のターミネーター領域を、連結させたコンストラクトを作製し、栽培イネに導入して収量関連形質の評価を実施することとした。なお、オリザ・ロンギスタミナータPRR遺伝子の効果を評価するための対照として、通常の栽培イネ「日本晴」のPRR遺伝子のコード領域を、上記プロモーターおよびターミネーターと連結したコンストラクトも作製して実験を行った。
【０１１１】
オリザ・ロンギスタミナータPRR遺伝子及び栽培イネ「日本晴」PRR遺伝子の単離
オリザ・ロンギスタミナータ染色体断片導入系統「No.645」および「日本晴」の幼苗から、RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)を用いて、全RNAを抽出した。キットのマニュアル通りに操作したが、RLTバッファーに添加するメルカプトエタノールは使用せず、替わりにDTTを最終濃度40mMになるように添加した。付属のRNase free water（40〜50μl）で全RNAを溶出後、DNase処理（TURBO DNA-free Kit, Ambion）を行った。処理後のRNA溶液をアガロースゲル電気泳動で濃度および純度をチェックした後、QuantiTect Rev. Transcription kit (QIAGEN)によりcDNA合成を行った。得られたcDNA溶液を鋳型に、PRR遺伝子のコード領域を単離するために、以下の２種類のプライマーを用いて、RT-PCRを行った。下記のlongi-PRR 2Fは配列番号１の35847−35869で示される塩基配列に、longi-PRR 2Rは配列番号１の46712−46735で示される塩基配列に、それぞれ該当する。
longi-PRR 2F: ACCAAACCGCCGGCTCTGCCCTC（配列番号６）
longi-PRR 2R: GGTAGGTAGGTAGGTCATCTGTC（配列番号７）
その結果得られた塩基配列を用いて、「No.645」が保有するオリザ・ロンギスタミナータ由来PRR構造遺伝子の塩基配列（配列番号２）を決定した。その塩基配列は、７４０個のアミノ酸から成るタンパク質（配列番号３）をコードするものと推定された。配列番号３においてアミノ酸番号６２から１７６に相当する領域がPRドメインであり、アミノ酸番号６７６から７２４に相当する領域がCCTモチーフである。また、日本晴のPRR構造遺伝子の塩基配列（配列番号４）も同様の手法を使って決定し、その塩基配列は、７４２個のアミノ酸から成るタンパク質（配列番号５）をコードするものと推定された。配列番号５においてアミノ酸番号６２から１７６に相当する領域がPRドメインであり、アミノ酸番号６７８から７２６に相当する領域がCCTモチーフである。
【０１１２】
単離された日本晴由来、オリザ・ロンギスタミナータ由来、及びシロイヌナズナ由来のPRR遺伝子の翻訳領域によりコードされるアミノ酸配列のアラインメントを図６に示す。更に、単離された日本晴由来、オリザ・ロンギスタミナータ由来、及びシロイヌナズナ由来のPRR遺伝子の翻訳領域によりコードされるアミノ酸配列の同一性（identity）％と類似性（similarity）％の値を図７に示す。
【０１１３】
各PRR遺伝子を含むコンストラクトの作製
単離したcDNAを、オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域との間に挿入させたコンストラクトを、以下の手順で作製した。PCRにはPrimeSTAR MAX DNA Polymerase（TAKARA-BIO社）を、ライゲーションにはDNA Ligation Kit “Mighty Mix”（TAKARA-BIO社）を用いた。なお下記に述べるコンストラクト作製のストラテジーを図解したものを図８に示す。
【０１１４】
（１）オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRR遺伝子のコード領域を含むコンストラクト（以下、ロンギコンストラクト）
実施例２のFr4コンストラクトのプラスミドを鋳型に、以下の２種類のプライマーを用いて、PCRを行った。下記のlongi-PRR 1Fは配列番号１の34020−34044で示される塩基配列に、longi-PRR 1Rは配列番号１の35838−35861で示される塩基配列に、それぞれ該当する。
【０１１５】
longi-PRR 1F: CGCTTCGAAGATATCATCATCATTCATGTATGAG（配列番号８）
longi-PRR 1R: AGCCGGCGGTTTGGTTGTGATGAG（配列番号９）
次に、得られたPCR産物と上記「No.645」由来RT-PCR産物を供試して、longi-PRR 1Fおよびlongi-PRR 2Rを用いてoverlap extension PCRを行った。得られたPCR産物にEx-Taq（TAKARA-BIO社）を用いてA-Tailを付加後、pCR-XL-TOPO（Invitrogen社）にクローニングした後、pCR-XL-TOPOに元々存在するPstI部位を破壊するために、EcoRV処理後、セルフライゲーションを行った。セルフライゲーション後、SacIおよびPstIによる消化ならびにCIAP（TAKARA-BIO社）による脱リン酸化を行った。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、ベクター断片（図８の断片１を含む）を回収した。
【０１１６】
また、実施例２のFr4コンストラクトのプラスミドを鋳型に、以下の２種類のプライマーを用いて、PCRを行った。下記のlongi-PRR 3Fは配列番号１の46721−46744で示される塩基配列を認識し、longi-PRR 3Rは配列番号１の49137−49157で示される塩基配列に、それぞれ該当する。
【０１１７】
longi-PRR 3F: ACCTACCTACCTACCTACGCAATG（配列番号１０）
longi-PRR 3R: GCTAGAATTCGAGCTCTCCAGGGAGCAGGGA（配列番号１１）
得られたPCR産物と上記「No.645」由来RT-PCR産物を供試して、longi-PRR 2Fおよびlongi-PRR 3Rを用いてoverlap extension PCRを行った。得られたPCR産物をSacIおよびPstIにより消化した後、反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、2.6kb断片（図８の断片２）をインサート用として回収した。この2.6kb断片は配列番号１の4605649156で示される塩基配列に対応する（ただし、46108-46595がイントロンのため、スプライシングを受けて46056-46107と46596-49156をタンデムに結合した配列となる）。
【０１１８】
上記２種類の回収断片を用いてライゲーションを行った。得られたプラスミドをSacIおよびNotIで消化し、反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、6.5kb断片（図８の断片３）を回収した。回収した断片３は、pSB200（SacIおよびNotIによる消化後、CIAP処理）にクローニングした。得られたプラスミドを供試して、NotIおよびEcoRVによる消化ならびにCIAPによる脱リン酸化を行った。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、ベクター断片（断片３を含む）を回収した。一方、実施例２のFr4コンストラクトのプラスミドをNotIおよびEcoRVで消化し、反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、7.3kb断片（断片４）を回収した。この7.3kb断片は配列番号１の26779-34022で示される塩基配列に対応する。両断片を用いてライゲーションを行い、目的のプラスミドを得た。
【０１１９】
（２）日本晴由来のPRR遺伝子のコード領域を含むコンストラクト（以下、日本晴コンストラクト）
実施例２のFr4コンストラクトのプラスミドを鋳型に、longi-PRR 1Fおよびlongi-PRR 1Rを用いて、PCRを行った。得られたPCR産物と上記日本晴由来RT-PCR産物を供試して、longi-PRR 1Fおよびlongi-PRR 2Rを用いてoverlap extension PCRを行った。得られたPCR産物にEx-Taqを用いてA-Tailを付加後、pCR-XL-TOPOにクローニングした。得られたプラスミドをPstIおよびNotIで消化し、反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、3.9kb断片（日本晴cDNA由来-図８の断片１）を回収し、インサート１とした。
【０１２０】
また、実施例２のFr4コンストラクトのプラスミドを鋳型に、longi-PRR 3Fおよびlongi-PRR 3Rを用いて、PCRを行った。得られたPCR産物と上記日本晴由来RT-PCR産物を供試して、longi-PRR 2Fおよびlongi-PRR 3Rを用いてoverlap extension PCRを行った。得られたPCR産物にEx-Taqを用いてA-Tailを付加後、pCR-XL-TOPOにクローニングした。得られたプラスミドをSacIおよびPstIで消化し、反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、2.6kb断片（日本晴cDNA由来-図８の断片2）を回収し、インサート２とした。この2.6kb断片は配列番号１の4605649156をで示される塩基配列に対応する。ただし、46108-46595がイントロンのため、スプライシングを受けて46056-46107と46596-49156をタンデムに結合した配列となる）。
【０１２１】
上記２種類のインサート断片を、pSB200（SacIおよびNotIによる消化後、CIAP処理）とともに供試して、ライゲーションを行った。得られたプラスミドを供試して、NotIおよびEcoRVによる消化ならびにCIAPによる脱リン酸化を行った。反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、ベクター断片（日本晴cDNA由来-図８の断片3を含む）を回収した。
一方、実施例２のFr4コンストラクトのプラスミドをNotIおよびEcoRVで消化し、反応液をアガロースゲルによる電気泳動にかけ、7.3kb断片（図８の断片4）を回収した。両断片を用いてライゲーションを行い、目的のプラスミドを得た。この7.3kb断片は配列番号１の26779-34022で示される塩基配列に対応する。
【０１２２】
（１）および（２）で得た目的のプラスミドを保有する大腸菌を用いて、実施例２に記載した方法でtriparential matingおよび「しおかり」の形質転換を行った。形質転換イネは、馴化後、閉鎖系温室で栽培した。各コンストラクトにつき独立した形質転換体を６０個体養成し、T１種子を採種した。各コンストラクトから採種量の多い順に１８個体を選んで、T１の評価試験に供試した。
【０１２３】
T１世代では、1コンストラクトにつき18系統（１系統あたり１２個体）を供試した。播種は、６月２５日に行った。移植前に個体別に葉を切り取り、ハイグロマイシン溶液に浸漬し、ハイグロマイシンに抵抗性を示した個体（遺伝子を保持していると推定される個体）を移植の対象とした。７月１２日に水稲用育苗土を入れた容量570 mlのポリエチレン製ポットに1個体ずつ（１系統あたり１２ポット、計１２個体）移植した。施肥はポットあたりN、P、Kを各0.21 g、0.33 g、0.05 gとした。対照として、「しおかり」に加え、野生イネの第7染色体末端領域のみを「しおかり」に導入した系統「No.240」を参考品種として栽植した。栽培は日本たばこ産業株式会社植物イノベーションセンターの組換え体評価専用の閉鎖系温室（１４時間３０分日長の長日条件）で行った。調査形質は、出穂日、稈長、穂数、稈基径、最大穂を対象に穂長、１穂粒数、種子稔性、1穂稔実籾重（以下、1穂重）につき行った。
【０１２４】
結果を表８に示した。まず、ロンギコンストラクトと日本晴コンストラクトについて、それぞれ全１８系統の平均値をみると、対照「しおかり」に比較して、両コンストラクトを導入した植物は共に、出穂まで日数、稈長、穂長、１穂粒数、１穂重、稈基径において明らかに上回っていた。また、いずれのコンストラクトを導入した植物も、出穂まで日数、稈長、穂長、１穂粒数、１穂重、稈基径において、複数の系統で、対照「しおかり」より有意に上回っていた。さらに、ロンギコンストラクトを導入した全18系統、および日本晴コンストラクトを導入した全18系統の粒着密度（穂1 cmあたりの粒数）の平均値は、それぞれ5.15 粒/cm、4.80粒/cmであり、「しおかり」の粒着密度の平均値4.40粒/cmより高いことが明らかとなった。
【０１２５】
以上のことから、PRR遺伝子が多収性を付与する原因遺伝子であることが確認された。さらに、それぞれのコンストラクトの評価試験の結果に差がなかったことと、実施例３の結果を考え併せると、驚くべきことにオリザ・ロンギスタミナータの多収性は、PRR遺伝子のコード領域よりも、プロモーター領域が寄与している可能性が高いという結果が得られた。
【０１２６】
【表８】
2016013057.tif 000009
【０１２７】
実施例６：オリザ・ロンギスタミナータと「日本晴」のPRR遺伝子の発現解析
実施例５の結果からPRR遺伝子のプロモーター領域が多収に影響すると推定されたため、オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子プロモーターと栽培イネ「日本晴」のPRR遺伝子プロモーターの発現の違いを調べるべく、「日本晴」と「No.240」（オリザ・ロンギスタミナータのPRR遺伝子を交配によって「しおかり」に導入した置換系統）のF1を用いて、PRR遺伝子の発現解析を行った。
【０１２８】
「日本晴」（２個体）、「No.240」（２個体）および「日本晴」と「No.240」のF1（４個体）を供試して、播種３週間後に最も若い完全展開葉をサンプリングし、実施例３に記載した方法で全RNAを抽出およびcDNA合成を行った。なお、逆転写酵素を添加せずに調整したサンプルも準備し、ネガティブコントロールとして用いた。また、RNA抽出時に得たDNase処理前の核酸溶液の一部を用いて、全DNA溶液を準備した。得られた全DNA 溶液およびcDNA溶液を鋳型にし、２種類のプライマー（CGAGGTACCATACACCTGTGGCTT（配列番号１２）とGCATCTGAGTTTGACTTCATGTTG（配列番号１３））を用いて、以下の反応条件でPCRを行った。    
全DNA     cDNA 
Template DNA              1.0μl    1.0μl
10×PCR buffer            2.0μl    2.5μl
2.5mM dNTP                1.0μl    1.25μl
rTaq                      0.1μl    0.125μl
Forward primer (10μM)    0.5μl    0.5μl
Reverse primer (10μM)    0.5μl    0.5μl
H20                      14.9μl   19.125μl
Total                    20.0μl   25.0μl
94℃            2 min
94℃            30sec
60℃            30sec
（94℃、30secと60℃、30secを３５サイクル行った）
PCR産物（130 bp）を制限酵素HpyCH4V (New England Biolabs社)で37℃一晩処理した後、3% Metaphor Agarose（TAKARA-BIO社）を用いて電気泳動にかけた。
【０１２９】
日本晴の全DNA 溶液およびcDNA溶液を鋳型に用いた場合には、PCR産物がHpyCH4Vにより切断されたのに対し、No.240の全DNA 溶液およびcDNA溶液を鋳型に用いた場合には、PCR産物がHpyCH4Vにより切断されなかった（図９Ａ）。このことから、本手法により、日本晴対立遺伝子からのPCR産物とオリザ・ロンギスタミナータ対立遺伝子からのPCR産物を、識別できることが確認できた。
【０１３０】
そこで、F1のサンプルを用いてHpyCH4V処理後のバンドパターンを比較した結果、cDNA溶液を鋳型に用いた場合には全DNA 溶液を鋳型に用いた場合と比較して、HpyCH4Vで切断されないPCR産物の比率が高いことが示された。本結果から、日本晴にオリザ・ロンギスタミナータ遺伝子を導入した置換系統のF1においては、日本晴由来のPRRの対立遺伝子発現量と比較して、オリザ・ロンギスタミナータ由来のPRRの対立遺伝子の発現量の方が多いことが示された（図９Ｂ）
【０１３１】
実施例７：オリザ・ロンギスタミナータのPRRプロモーター及びPRR遺伝子のトウモロコシにおける効果
実施例２で作製したFr4断片（オリザ・ロンギスタミナータのPRRプロモーター及びPRR構造遺伝子を含む）をトウモロコシ品種に形質転換し、T１世代で収量関連形質の評価を行った。
【０１３２】
大きさ約1.2 mmのトウモロコシ未熟胚（品種：A188）を温室栽培した植物から無菌的に取り出し、アグロバクテリウム懸濁用液体培地（LS-inf、Ishida et al. 2007）に浸漬した。46 ℃、3分間の熱処理後、同液体培地で未熟胚を１回洗浄した。次に15,000 rpm、4 ℃ 、10分間の遠心処理を行った。実施例２で作製したFr4コンストラクトを保有するアグロバクテリウム菌LBA4404を約1 x 109 cfu/mlで懸濁したLS-inf-AS培地（Ishida et al. 2007）に遠心処理後の未熟胚を浸漬した。30秒間撹拌し、５分間室温で静置した後、共存培地（LS-AS、Ishida et al. 2007）に置床し、25 ℃、暗黒下で７日間培養した。
【０１３３】
共存培養後の未熟胚をハイグロマイシンを含む選抜培地（LSD1.5AおよびLSD1.5B、Ishida et al. 2007）に置床し、25 ℃、暗黒下で培養した。増殖したカルスを小片に切り取り、ハイグロマイシン再分化培地（LSZ、Ishida et al. 2007）に置床し、25 ℃、照明下で2週間培養した。再分化した植物を発根培地（LSF、Ishida et al. 2007）に置床し、25 ℃、照明下で２週間培養した。発根した植物を温室内のポットに移植し栽培した。
【０１３４】
抽出した雄穂は、開花前に引き抜き除雄した。雌穂から十分に抽出した絹糸に形質転換してないトウモロコシ（品種：A188）から採取した花粉を交配した。包被の枯れた雌穂を収穫し、30 ℃で２週間乾燥後、種子を脱粒した。１５イベント・４４個体から採種することができた。
【０１３５】
T0個体に稔った穂の中で大きいものから順に１０イベント・１１個体を選抜し、T１世代で収量関連形質の評価を行った。試験は３回（１回目：５系統、２回目：３系統、３回目：３系統の計１１系統）に分けて行った。容量360 mlのポリエチレン製ポットに1イベント・1系統あたり1粒ずつ（１回目試験は１６粒、計１６ポット、２回目および３回目試験は２５粒、計２５ポット）播種した。播種して約2週間後に葉の一部を切り取り、ハイグロマイシン溶液に浸漬し、ハイグロマイシンの抵抗性・感受性を調査した。ハイグロマイシン抵抗性と感受性の個体を対にして収量形質の評価ができるように個体数を調整して、容量5100 ccのポリエチレン製ポットへ移植し、栽培を継続した。草丈は播種して14日後から56日後まで毎週測定した。抽出した雄穂は、開花前に引き抜き除雄した。雌穂からの絹糸抽出日を記録するとともに十分に抽出した絹糸に非形質転換トウモロコシ（品種：A188）から採取した花粉を交配した。穂を収穫後、雌穂長、1列粒数、穂重を測定した。各系統について、ハイグロマイシン抵抗性個体（遺伝子保有個体）とハイグロマイシン感受性個体（遺伝子欠落個体）の収量関連形質の比較を行った。その結果、全１０イベント・１１系統のうち、２イベント・２系統（T1-No.4、T1-No.6）において、抵抗性個体が感受性個体に比較して、雌穂長、1列粒数、穂重の３形質が大きくなることがわかった（表９、図１０）。さらに、系統T1-No.4は播種して３５日目以降、一貫して、抵抗性個体が感受性個体より草丈が高くなっており、栄養成長期より生育を旺盛にすることが示唆された。
【０１３６】
以上のことから、オリザ・ロンギスタミナータのPRRプロモーターと機能可能に連結したPRR遺伝子はイネだけでなく、トウモロコシの収量も増大させることが明らかとなった。また、栄養生長期の生育も旺盛にすることが示唆された。
【０１３７】
【表９】
2016013057.tif 000010
【図１】
2016013057.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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