(57)【要約】【課題】上記霊芝の抽出物に由来するチューブリン重合活性調節剤、これを利用した食品、化粧料および医薬品、ならびに該チューブリン重合活性調節剤の製造方法の提供【解決手段】霊芝(Ganoderma lingzhi)から水または有機溶媒を含有する溶媒で抽出することにより得られる成分を有効成分として含み、チューブリン重合を促進または阻害する作用を有するチューブリン重合活性調節剤、該チューブリン重合活性調節剤を含む食品、化粧料および医薬品。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から水を含有する溶媒(水系溶媒)で抽出することにより得られる成分を有効成分として含み、チューブリン重合を阻害する作用を有することを特徴とするチューブリン重合活性調節剤。
【請求項２】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)で抽出することにより得られるトリペノイド類を有効成分として含み、チューブリン重合を促進する作用を有することを特徴とするチューブリン重合活性調節剤。
【請求項３】
前記トリペノイド類が、
ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acidZ)、ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、ガノデロールＡ（Ganoderol A）、ガノデロールＢ（Ganoderol B）、ガノデリオールF（Ganoderiol F）、ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、 ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）、からなる群から選択された１種または２種以上の化合物であることを特徴とする、請求項２に記載のチューブリン重合活性調節剤。
【請求項４】
前記有効成分がβグルカンを含む多糖類であることを特徴とする、請求項１に記載のチューブリン重合活性調節剤。
【請求項５】
前記溶媒が、水系溶媒の場合は水であり、有機系溶媒の場合は、クロロホルム、アルコールまたは含水アルコールであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のチューブリン重合活性調節剤。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする、チューブリン重合に関連する疾患の治療、予防あるいは軽減のための食品、化粧料または医薬品。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする研究試薬。
【請求項８】
前記疾患が、腫瘍性疾患、乾癬または家族性地中熱であることを特徴とする、請求項６の食品、化粧料または医薬品。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする、防カビ剤。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする、苦味料。
【請求項１１】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から、水を含有する溶媒(水系溶媒)を用いて、チューブリン重合阻害作用を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、チューブリン重合を阻害する作用を有するチューブリン重合活性調節剤の製造方法。
【請求項１２】
霊芝(Ganoderma lingzhi)から、有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)を用いて、チューブリン重合促進作用を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、チューブリン重合活性を促進する作用を有するチューブリン重合活性調節剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、霊芝(Ganoderma lingzhi)、特にその子実体の抽出物を含有するチューブリン重合活性調節剤、該チューブリン重合活性調節剤を含む食品および薬剤、並びにチューブリン重合活性調節剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
チューブリンは、真核生物の細胞内にあるタンパク質であり、微小管や中心体を形成している。細胞の有糸分裂の際には、分裂過程の細胞内で細胞内両極の各中心体からチューブリンが中央の１対の染色体に向かって重合して伸長し、各染色体と結合した後、チューブリンが脱重合することにより該染色体が、細胞の両極に移動して、各分裂細胞に分配される。このチューブリンは、αチューブリンおよびβチューブリンからなるヘテロ二量体からなる(非特許文献１)。このうち、チューブリンの重合と脱重合がバランスよく保たれていることが細胞分裂に重要であり、このバランスを損なうと正常細胞、腫瘍細胞いずれの場合も細胞分裂が正しく行われず、増殖できなくなる。
【０００３】
一般に抗腫瘍剤として知られているタキソール（TAXOL、ブリストル・マイヤーズ スクイブ社の登録商標。一般名「パクリタキセル(Paclitaxel)」）は、チューブリンの重合を促進し、かつ微小管が束になって重合した状態を安定化させることで、微小管の脱重合を阻害し、これによって、結果的に腫瘍細胞の増殖を抑制している。一方、ビンブラスチン（Vinblastine）は、おそらくβ-チューブリンに結合し細胞周期を分裂中期で停止させ、チューブリンの重合を阻害することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制していると考えられている（非特許文献２）。
【０００４】
もしも、チューブリンの重合を促進又は阻害等できる物質（チューブリン重合活性調節剤）が新たに見出され、腫瘍等の細胞の分裂を抑制でき、アポトーシスを誘導することができれば、チューブリン重合活性の調節機構の解明や新たな抗腫瘍剤の発見に寄与する観点からも有用である（非特許文献３）。そのため、様々なチューブリン重合活性調節剤が望まれている。
【０００５】
本発明者らは、上述したタキソール（パクリタキセル）やビンブラスチンと同様にチューブリンの重合を調節（すなわち促進又は阻害の何れか）する効能が高い「ガノデリックアシッドＤＭ（ganoderic acid DM）」を発見し、既に報告している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１３−０４３８７４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Downing, K. H., Nogales, E., Tubulin structure: insights into microtubule properties and functions, Current Opinion in Structural Biology, 8(6): 785-791 (1998)
【非特許文献２】Checchi, P. M., nettles, J. H., Zhou, J., Snyder, J. P, Joshi, H. C., Microtubule-interacting drugs for cancer treatment, 24(7)361-365(2003)
【非特許文献３】Jordan A1, Hadfield JA, Lawrence NJ, McGown AT.、“Tubulin as a target for anticancer drugs: agents which interact with the mitotic spindle.”、［online］、平成1998年７月、Medicinal Research Reviews、［平成２６年６月１１日検索］、インターネット〈URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9664292〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、様々な抽出方法で霊芝（特にその子実体）から、異なる方法で抽出した抽出物や抽出物に含まれるトリペノイド類についてチューブリン重合活性などを調べて鋭意研究していたところ、抽出方法の違いにより、抽出物に含まれる主要成分やそれらの組成比などが異なるためか、得られる抽出物によってはチューブリンの重合を促進（またはチューブリンの脱重合を阻害）したり、逆にチューブリンの重合を抑制したりする場合もあることを見出した。さらに、霊芝の抽出物に含まれる従来公知のガノデリックアシッドＤＭ以外の他の霊芝トリペノイド類についても調べたところ、霊芝抽出物中にはガノデリックアシッドＤＭ以上にチューブリンの重合を促進する活性を有するトリペノイド類が多数存在することなどを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
したがって、本発明は、上記霊芝の抽出物に由来し、チューブリン重合活性を高める(重合促進する)、あるいはチューブリン重合活性を低下する（重合抑制、重合阻害する）ことができるチューブリン重合活性調節剤、これを利用した食品、化粧料および医薬品、ならびに該チューブリン重合活性調節剤の製造方法の提供をすることを目的とする。さらには、例えば、チューブリン重合活性の効率的な調節に必要な化学構造の特定に資する研究試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明により、以下のチューブリン重合活性調節剤等が提供される。
［１］  霊芝(Ganoderma lingzhi)から水を含有する溶媒(水系溶媒)で抽出することにより得られる成分を有効成分として含み、チューブリンの重合を阻害する作用を有することを特徴とするチューブリン重合活性調節剤。
【００１１】
［２］  霊芝(Ganoderma lingzhi)から有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)で抽出することにより得られるトリペノイド類を有効成分として含み、チューブリンの重合を促進する作用を有することを特徴とするチューブリン重合活性調節剤。
【００１２】
［３］  前記トリペノイド類が、下記の（１）〜（３４）のうちの、(１)〜（６）、（９）〜（３３）からなる群から選択された１種または２種以上の化合物であることを特徴とする、［２］に記載のチューブリン重合活性調節剤（なお、附番（１）〜（３４）は本発明の説明の便宜上付与した。）。
（１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、
（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、
（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、
（４）ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）、
（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、
（６）ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、
（７）ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid DM）、
（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）、
（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）、
（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）、
（１１）ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）、
（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、
（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）、
（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、
（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）、
（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）、
（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）、
（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）、
（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）、
（２０）ガノデリオールF（Ganoderiol F）、
（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）、
（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、
（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）、
（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）、
（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）、
（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）、
（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）、
（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）、
（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）、
（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）、
（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）、
（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）、
（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）、
（３４）ガノデリン酸ＤＭメチルエステル（Ganoderic acid DM methyl ester）
【００１３】
［４］  前記有効成分がβグルカンを含む多糖類であることを特徴とする、［１］に記載のチューブリン重合活性調節剤。
【００１４】
［５］  前記溶媒が、水系溶媒の場合は水であり、有機系溶媒の場合は、クロロホルム、アルコールまたは含水アルコールであることを特徴とする［１］〜［３］のいずれかに記載のチューブリン重合活性調節剤。
【００１５】
［６］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする、チューブリン重合に関連する疾患の予防あるいは軽減のための食品(健康補助食品)、化粧料または医薬品。
【００１６】
［７］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする研究試薬。
【００１７】
［８］  前記疾患が、腫瘍性疾患、乾癬、狭窄症、心筋梗塞、糸球体腎炎などの疾患の予防や症状の改善、移植拒絶であることを特徴とする、[６]の食品、化粧料または医薬品。
【００１８】
［９］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする、防カビ剤、駆虫剤または除草剤。
【００１９】
［１０］  ［１］〜［５］のいずれかに記載のチューブリン重合活性調節剤を有効成分とする、苦味料。
【００２０】
［１１］  霊芝(Ganoderma lingzhi)から、水を含有する溶媒（水系溶媒）を用いて、チューブリン重合阻害作用を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、チューブリンの重合を阻害する作用を有するチューブリン重合活性調節剤の製造方法。
【００２１】
［１２］  霊芝(Ganoderma lingzhi) から有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)を用いて、チューブリン重合促進作用を有する成分を抽出処理する工程を含むことを特徴とする、チューブリンの重合を促進する作用を有するチューブリン重合活性調節剤の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、チューブリンの重合を促進あるいは阻害等することで調節することができる霊芝由来のチューブリン重合活性調節剤、これを含む食品および薬剤、並びにチューブリン重合活性調節剤の効率的な製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、チューブリンの重合を促進する活性が高いガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）とβチューブリン（β‐Tubulin）の結合状態を示す図である。この結合状態は、パクリタキセル（タキソール）とチューブリンの結合構造(PDBコード 1JFF)を利用して、ソフトウェア「Molgro Virtual Docker」（Northern Science Consulting社）により、パクリタキセルに代えてガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）を用い、このガノデリックアシッドＴ−Ｑとβチューブリン（β‐Tubulin）の結合のドッキングシミュレーションを行った結果から求めたものである（以下の図２〜４も同様）。図1では、リガンドとしてのガノデリックアシッドＴ−Ｑのアセトキシ基（−ＯＡｃ）部位に、βチューブリン(分子全体は図示せず)のアミノ酸残基の一部（Thr276(β),Arg284(β)）が結合している。なお、図１では、結合に関わるβチューブリンのアミノ酸残基の一部（Thr276(β),Arg284(β)）が矩形で示されている。この図１によれば、チューブリンの重合を促進する活性の高いチューブリン重合促進剤の化学構造、および該チューブリン重合促進剤とβチューブリンとの結合機構が把握できる。
【図２】図２は、リガンドとしてのガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）とβチューブリンとの結合様式を示す図である。なお、図１の場合と同様に、結合に関わるβチューブリン(分子全体は図示せず)のアミノ酸残基の一部（His229(β),Gly370(β), Thr276(β)）が矩形で示されている。この図２から、ガノデリックアシッドＴＮは、チューブリンの重合促進に寄与する化学構造、および、この場合におけるβチューブリンと該βチューブリンに結合するリガンドとの結合様式の解明に寄与するものといえる。
【図３】図３は、ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）とβチューブリンの結合様式を示す図である。この図３と、図１および図２との対比から、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ，Ｓとは異なる結合様式でチューブリンの重合を促進する活性に影響を与える化合物の化学構造、および、この場合におけるβチューブリンと該βチューブリンに結合するリガンドとの結合様式を把握することができる。
【図４】図４は、パクリタキセル（タキソール）とβチューブリンとの結合様式を示す図である。
【図５】図５は、霊芝(Ganoderma lingzhi)由来の化合物（１）〜（３４）について調べたチューブリン重合活性（ΔＲＦＵ平均）と、上記ドッキングシミュレーションにより調べた、各化合物とβチューブリンとの相互作用エネルギー(E1)と各化合物の内部エネルギー(E2)との和であるＥ-Total値との相関関係を示したものである。図５中、符号（１），（３）〜（８），（１０），（１２）〜（１４），（１６）〜（２４），（２８），（３４）は、それぞれ上記化合物（１），（３）〜（８），（１０），（１２）〜（１４），（１６）〜（２４），（２８），（３４）を示す。また、Ｒ2は相関係数を示し、ｙは線形近似式を示す。ΔＲＦＵ平均は、チューブリン重合活性を示す。この図５によれば、チューブリン重合活性（ΔＲＦＵ平均）とＥ-Total値と相関が示されている。
【図６】図６は、霊芝(Ganoderma lingzhi)のクロロホルム抽出物(クロロホルムを用いて室温３０分、振とう抽出：試験例４)、および熱水抽出物(１２１℃、２０分オートクレーブ抽出：試験例４)について、所定濃度で「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて評価した場合のチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。比較のため、パクリタキセル(Paclitaxel)2.73μM(2.33μg/mL)、ビンブラスチン（Vinblastine）2.73μM(2.48μg/mL)およびコントロール(無添加)を用いた場合も併せて示す。この図６によれば、チューブリン重合体の量(ＲＦＵ)は、何らの処理をしない場合（コントロール(無添加)：図６の上から３つ目の実線）でも経時的(0〜60分の間)に次第に増加していくことが分かる。それに対して、本発明に係るクロロホルム抽出物(273μg/mL：点線)で処理した場合、比較対照のパクリタキセル（2.33μg/mL：図６の上から１つ目の実線）で処理した場合より、チューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時的な増加の程度（チューブリン重合活性：ΔＲＦＵ平均）は低いがコントロール（無添加）よりも増加傾向を示している。また、この図６によれば、本発明に係る熱水抽出物(1820μg/mL：２点鎖線)では、チューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時的な増加の程度は比較対照のビンブラスチン（2.48μg/mL：図６の下から１つ目の破線）より僅かに高いが、ビンブラスチンと同様、チューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時的な増加は実質上見られず、コントロール（無添加）に比べるとチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）は増加しないといえる。これらのことから、図６によれば、クロロホルム等の有機系溶媒により霊芝から抽出した抽出物（霊芝有機系溶媒抽出物）は、チューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の変化の仕方からパクリタキセルに近似したメカニズムによる抗腫瘍効果等を期待することができる。また、霊芝の熱水抽出物は、ビンブラスチンに近似したメカニズムによる抗腫瘍効果等を期待することができる。
【図７Ａ】図７Ａは、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（１８．２μＭ）を「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて評価した場合のチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。（Ａ）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ、（Ｂ）ガノデリックアシッドＳＺ、（Ｃ）ガノデリックアシッドＳ、（Ｄ）ガノデリックアシッドＴＮ、（Ｅ）ガノデルマノントリオール、（Ｆ）ガノデリックアシッドＡＭ１、（Ｇ）ガノデルマノントリオール、（Ｈ）ガノデリックアシッドＤ。なお、比較のため、パクリタキセル(Paclitaxel)3μM(2.6μg/mL)、ビンブラスチン（Vinblastine）3μM(2.7μg/mL)、コントロール(無添加)を用いた場合も併せて示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（１８．２μＭ）を「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて評価した場合のチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。（Ａ）ガノデリオールＦ、（Ｂ）ガノデリックアシッドＴＲ、（Ｃ）ガノデルマノントリオール、（Ｄ）ルシアルデヒドＡ、（Ｅ）ガノデリン酸Ａ、（Ｆ）ガノデリン酸Ｄ、（Ｇ）ガノデリン酸Ｆ、（Ｈ）ガノデリックアシッドＣ２。なお、比較のため、パクリタキセル(Paclitaxel)3μM(2.6μg/mL)、ビンブラスチン（Vinblastine）3μM(2.7μg/mL)、コントロール(無添加)を用いた場合も併せて示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（１８．２μＭ）を「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて評価した場合のチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。（Ａ）ガノデリックアシッドＣ６、（Ｂ）ガノデリックアシッドＹ、（Ｃ）ガノデリックアシッドＤ、（Ｄ）ガノデリックアシッドＫ、（Ｅ）ガノデリックアシッドＦ、（Ｆ）ガノデリックアシッドＨ、（Ｇ）ガノデリン酸Ｃ、（Ｈ）ガノデリックアシッドＣ１。なお、比較のため、パクリタキセル(Paclitaxel)3μM(2.6μg/mL)、ビンブラスチン（Vinblastine）3μM(2.7μg/mL)、コントロール(無添加)を用いた場合も併せて示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（１８．２μＭ）を「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて評価した場合のチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。（Ａ）ガノデリックアシッドＺ、（Ｂ）ガノデリックアシッドＬＭ２、（Ｃ）ガノルシディックアシッドＡ、（Ｄ）ガノデリックアシッドＤＭ、（Ｅ）ガノデリックアシッドＡ、（Ｆ）ガノデロールＢ、（Ｇ）ガノデロールＡ、（Ｈ）ルシアルデヒドＢ。なお、比較のため、パクリタキセル(Paclitaxel)3μM(2.6μg/mL)、ビンブラスチン（Vinblastine）3μM(2.7μg/mL)、コントロール(無添加)を用いた場合も併せて示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、霊芝(Ganoderma lingzhi)から得られるトリペノイド化合物（１８．２μＭ）を「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて評価した場合のチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時変化を示したグラフである。（Ａ）ガノデリックアシッドＢ、（Ｂ）ガノデリックアシッドＮ。なお、比較のため、パクリタキセル(Paclitaxel)3μM(2.6μg/mL)、ビンブラスチン（Vinblastine）3μM(2.7μg/mL)、コントロール(無添加)を用いた場合も併せて示す。図７Ａ〜図７Ｅによれば、コントロール(無添加)、パクリタキセルあるいはビンブラスチンと、各トリペノイド化合物との対比から、霊芝から得られる各トリテルペノイドは、パクリタキセルを作用させた場合より後の時点からチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）が上昇し、各トリテルペノイドはパクリタキセルと異なる機構でチューブリン重合を促進していると考えられ、パクリタキセルと併用できる可能性があることが分かる。その結果、このような併用の相乗効果が期待できる。また、図８〜図９と図7とを対比すると、霊芝由来のトリペノイド類はクロロホルム抽出物よりも少量でありながら、クロロホルム抽出物よりもチューブリン重合活性（ΔＲＦＵ平均）が高いことから、霊芝由来のトリテルペノイド類は、チューブリン重合促進剤としてクロロホルム抽出物より有効であることが分かる。
【図８】図８は、ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A；保持時間１９．６６分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。測定条件：(ＳＨＩＳＥＩＤＯ社製「CAPCELL PACK  Ｃ１８ (カラム内径：１ｍｍ、カラム長さ：１５０ｍｍ、充填剤の各粒子の平均粒径：５μｍ)、注入量：５μＬ、流速：０．１ｍＬ／ｍｉｎ、ＬＣ検出波長：２５２ｎｍ、カラム温度：３０℃)。なお、特に言及しない限り、以下のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルも同様である。
【図９】図９は、ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）（保持時間１４．９４分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１０】図１０は、ガノルシディックアシッドＡ（Ganolucidic acid A）（保持時間８．１２分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１１】図１１は、ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid DM）（保持時間６７．４７分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１２】図１２は、ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）（保持時間６２．２３分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１３】図１３は、ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）（保持時間２０．９８分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１４】図１４は、ガノデリックアシッドＴＱ（Ganoderic acid TQ）（保持時間８１．１４分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１５】図１５は、ガノデロールＡ（Ganoderol A）（保持時間９８．６９分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１６】図１６は、ガノデリオールF（Ganoderiol F）（保持時間74．00分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１７】図１７は、霊芝(Ganoderma lingzhi)のクロロホルム抽出物のクロマトグラフを示した図である。測定条件：(gradient); Line A: 0.1%AcOH-Water, Line B: 0,1%AcOH-AcCN, 25-35% B in 0-35 min, 35-45% B in 35-45 min, 45-100% in 45-145 min, 100% B in 145-160 min  流速は0.1 mm/min。
【図１８】図１８は、図１７のクロマトグラフのピーク１（保持時間１５．００分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図１９】図１９は、図１７のクロマトグラフのピーク２（保持時間１５．００分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【図２０】図２０は、図１７のクロマトグラフのピーク３（保持時間６６．２２分）のＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明に係るチューブリン重合活性調節剤は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から、水を含有する溶媒(水系溶媒)または有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)で抽出することにより得られる成分を有効成分として含む。このうち、水系溶媒抽出物は、チューブリン重合を阻害する作用を有する。また、有機系溶媒抽出物は、チューブリンの重合を促進する作用を有する。なお、「チューブリン重合活性調節剤」には、チューブリン重合促進剤とチューブリン重合阻害剤が含まれる。
【００２５】
以下、チューブリン重合促進剤とその製法、該チューブリン重合促進剤に含まれる霊芝トリペノイド化合物とその物性、効果および用途等について説明する。その次に、チューブリン重合阻害剤について同様に説明する。
【００２６】
《チューブリン重合促進剤》
本発明に係るチューブリン重合促進剤は、霊芝から有機溶媒を含有する溶媒(有機系溶媒)により抽出した成分を含む。
【００２７】
（抽出）
抽出素材としての霊芝(Ganoderma lingzhi)は、採取した霊芝をそのまま原料として用いてもよいが、抽出効率等の点からは、採取した天然物(霊芝)を乾燥、破砕等の加工処理に供して調製したものが好ましい。前記抽出素材を粉砕する場合、ロール式粉砕機、フードプロセッサー、ボールミル粉砕機、またはハンマー式粉砕機等による粉砕を例示することができる。
【００２８】
抽出用の有機系溶媒は、チューブリンの重合を促進する作用を有する霊芝のトリペノイド類等の成分を効率よく抽出する観点から、該溶媒として有機溶媒を１０％以上含有する溶媒が好ましく、有機溶媒を５０％以上含有する溶媒（有機系溶媒）がさらに好ましい。なお、有機系溶媒中に含まれる有機溶媒の量は、溶媒全量に対して、通常10％以上、さらには30〜70)％程度であることが望ましい。
【００２９】
該有機系溶媒の例としては、ハロゲン化アルキル（例：クロロホルム等）、アルコール類（例：メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等、Ｃ１〜１０程度の1価の脂肪族アルコール、あるいはエチレングリコールやグリセリンなどの多価アルコール）、炭化水素（例：ｎ−ヘキサンなど、Ｃ１〜１０程度の脂肪族炭化水素）、エーテル（例：ジメチルエーテル、エチルメチルエーテル、ジエチルエーテル等の式「Ｒ1−Ｏ−Ｒ2(Ｒ1,Ｒ2はＣ１〜５程度のアルキル基）」で示される鎖状エーテル；フラン、ジベンゾフラン、テトラヒドロフラン等の脂肪族又は芳香族系の環状エーテル；エステル（例：酢酸エチル等、1価〜多価カルボン酸のＣ１〜５程度のアルキルエステル）の有機溶媒；又は水とこれらの有機溶媒との混合物を挙げることができる。
【００３０】
特に、アルコール類としてメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールが好ましいが、抽出成分中に残存しても人体に悪影響が少ない観点からエタノールまたは含水エタノールが特に好ましい。含水エタノールとしては、例えば、エタノール濃度が５〜９９.5％の含水エタノールを用いることができる。
【００３１】
抽出処理は、特に制限されないが、例えば、山野より採取した天然物や人工栽培の霊芝を、必要に応じて乾燥または粉砕した後、抽出溶媒に浸漬し放置することにより所望の成分を抽出する浸漬法（冷浸法、温浸法）、及びソックスレー抽出器を用いた加熱還流によるソックスレー抽出法等の公知の抽出法を適用することができる。このように抽出された抽出液は、必要に応じて、溶媒を蒸発させて濃縮または乾固してもよく、固体又はその粉末の形態として調製することができる。
【００３２】
抽出温度は、用いられる抽出溶媒が凍結・固化しない限り、特に制限はなく、有機系溶媒による抽出では、例えば０℃〜１００℃である。また、抽出時間は、所望の成分（前記トリペノイド類）を抽出できれば特に制限はなく例えば１時間〜３日間である。抽出処理の圧力も、特に制限はなく、例えば常圧〜４気圧である。
【００３３】
また、抽出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などの各種クロマトグラフィーに供して分画操作を繰り返し、抽出成分の含有量及び純度を高めてもよい。
【００３４】
（抽出成分）
霊芝(Ganoderma lingzhi)から、上記有機系溶媒で抽出することにより得られる成分(霊芝有機系溶媒抽出物)として下記トリペノイド類（１）〜（３４）が含まれる。これらのトリテルペノイド類が抽出物に含まれていることは、例えばＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（島津製作所「ＬＣＭＳ−２０２０」）等を用いたＬＣＭＳ分析(液体クロマトグラフ質量分析)により確認することができる。
【００３５】
本発明者らは、これらのトリペノイド類（１）〜（３４）（特に（１）〜（６）、（９）〜（３３））が、チューブリンの重合を促進する作用を有することを見出している。したがって、本発明に係るチューブリン重合促進剤には、下記に列挙するトリペノイド類の化合物（１）〜（３４）（このうち、（７）、（８）及び（３４）を除く。以下同様。）からなる群から選択された１種または２種以上を含むものが含まれる。これらの化合物（１）〜（３４）は、霊芝由来の化合物として各メーカー(Quality Phytochemicals LLC，American Custom Chemicals Corporation，AK scientific，BOC Sciences，Cheminstock，Chromadex，ChemFaces、BioBioPha 等)により市販されているため、これを購入して用いてもよい。さらに、例えば（７）ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid ＤＭ）は、ChromaDex Inc.(Santa Ana, CA)等から商業的に入手することができる。
【００３６】
【化１】
2016013981.tif 000002
（１）ガノデリックアシッドＺ(Ganoderic acid Z)、
【００３７】
【化２】
2016013981.tif 000003
（２）ガノデリックアシッドＮ(Ganoderic acid N)、
【００３８】
【化３】
2016013981.tif 000004
（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）
【００３９】
【化４】
2016013981.tif 000005
（４）ガノデリックアシッドＦ（Ganoderic acid F）
【００４０】
【化５】
2016013981.tif 000006
（５）ガノデリックアシッドＳＺ（Ganoderic acid SZ）、
【００４１】
【化６】
2016013981.tif 000007
（６）ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）
【００４２】
【化７】
2016013981.tif 000008
（７）ガノデリックアシッドＤＭ（Ganoderic acid ＤＭ）
【００４３】
【化８】
2016013981.tif 000009
（８）ガノデリックアシッドＡ（Ganoderic acid A）
【００４４】
【化９】
2016013981.tif 000010
（９）ガノデリックアシッドＡＭ１（Ganoderic acid AM1）
【００４５】
【化１０】
2016013981.tif 000011
（１０）ガノデリックアシッドＢ（Ganoderic acid B）
【００４６】
【化１１】
2016013981.tif 000012
（１１）ガノデリックアシッドＤ（Ganoderic acid D）
【００４７】
【化１２】
2016013981.tif 000013
（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）
【００４８】
【化１３】
2016013981.tif 000014
（１３）ガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid TN）
【００４９】
【化１４】
2016013981.tif 000015
（１４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）
【００５０】
【化１５】
2016013981.tif 000016
（１５）ガノルシド酸Ａ（Ganolucidic acid A）
【００５１】
【化１６】
2016013981.tif 000017
（１６）ガノデルマノントリオール（Ganodermanontriol）
【００５２】
【化１７】
2016013981.tif 000018
（１７）ガノデルマノンジオール（Ganodermanondiol）
【００５３】
【化１８】
2016013981.tif 000019
（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）
【００５４】
【化１９】
2016013981.tif 000020
（１９）ガノデロールＢ（Ganoderol B）
【００５５】
【化２０】
2016013981.tif 000021
（２０）ガノデリオールＦ（Ganoderiol F）
【００５６】
【化２１】
2016013981.tif 000022
（２１）ルシアルデヒドＡ（Lucialdehyde A）
【００５７】
【化２２】
2016013981.tif 000023
（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）
【００５８】
【化２３】
2016013981.tif 000024
（２３）ガノデリックアシッドＣ１（Ganoderic acid C1）
【００５９】
【化２４】
2016013981.tif 000025
（２４）ガノデリックアシッドＣ２（Ganoderic acid C2）
【００６０】
【化２５】
2016013981.tif 000026
（２５）ガノデリックアシッドＣ６（Ganoderic acid C6）
【００６１】
【化２６】
2016013981.tif 000027
（２６）ガノデリックアシッドＨ（Ganoderic acid H）
【００６２】
【化２７】
2016013981.tif 000028
（２７）ガノデリックアシッドＫ（Ganoderic acid K）
【００６３】
【化２８】
2016013981.tif 000029
（２８）ガノデリックアシッドＴＲ（Ganoderic acid TR）
【００６４】
【化２９】
2016013981.tif 000030
（２９）ガノデリン酸Ａ（Ganoderenic acid A）
【００６５】
【化３０】
2016013981.tif 000031
（３０）ガノデリン酸Ｃ（Ganoderenic acid C）
【００６６】
【化３１】
2016013981.tif 000032
（３１）ガノデリン酸Ｄ（Ganoderenic acid D）
【００６７】
【化３２】
2016013981.tif 000033
（３２）ガノデリン酸Ｆ（Ganoderenic acid F）
【００６８】
【化３３】
2016013981.tif 000034
（３３）ガノデリン酸Ｈ（Ganoderenic acid H）
【００６９】
【化３４】
2016013981.tif 000035
（３４）ガノデリン酸ＤＭメチルエステル（Ganoderic acid DM methyl ester）
【００７０】
（塩、エステル）
抽出した化合物（１）〜（３４）をアルコールと反応させてエステル化したり、または塩基と反応させて塩を形成しても良い。これら化合物（１）〜（３４）のエステルとして、メチルエステル等、炭素数１〜１１を有する直鎖または分岐状のアルキルエステルを挙げることができる。これら化合物（１）〜（３４）の塩としては、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。
【００７１】
（成分濃度）
当該チューブリン重合促進剤に含まれる有効成分（化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上の合計）の濃度は、チューブリンに対して結合し、チューブリンの重合を促進する作用を発揮することを限度として特に制限されず、血中濃度０．１〜１００μＭとなるように、チューブリン重合促進剤１００重量％中、剤型、用法、用量に合わせて０．１〜１００重量％の範囲から適宜設定することができる。
【００７２】
（チューブリン重合促進剤の評価）
従来、タキソール（パクリタキセル）等のチューブリン重合促進剤が存在するが、タキソールは下記化学構造（Ａ１）を有し、上記化合物（１）〜（３４）より巨大な分子であり、細胞内へ取り込まれにくいと考えられる。これに対して、上記化合物（１）〜（３４）は、ステロイド骨格を基本骨格とする分子であるため、分子サイズがタキソールに比べて小さく比較的細胞に取り込まれやすいと考えられる。その結果、タキソールに比べて、本発明に係る霊芝トリペノイド類の化合物（１）〜（３４）は、より強いチューブリン重合促進活性を示して細胞分裂を抑制することから、防カビ、駆虫、除草の各効果、および、特定の疾患（腫瘍性疾患、乾癬、狭窄症、心筋梗塞、糸球体腎炎などの疾患の予防や症状の改善、移植拒絶の軽減）の治療等の効果が、より一層得られることが推測される。
【００７３】
なお、チューブリン重合活性（ΔＲＦＵ平均）とは、「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて、チューブリンの重合反応の開始から、１分毎に開始時点の０分を含む合計６１回、チューブリン重合体の量を示す相対蛍光（ＲＦＵ）を定量した場合における該平均値を示す。チューブリン重合活性（ΔＲＦＵ６０）とは、上記６１回目の定量時点のＲＦＵ値を示す。
【００７４】
【化３５】
2016013981.tif 000036
また、化合物（１）〜（３４）は、同じステロイド基本骨格を有するものであるが、個々に化学構造が異なるため、チューブリン重合促進活性が相違するだけでなく、各化合物による細胞致死率（％）も相違する。したがって、本発明に係るチューブリン重合促進剤は、少なくとも、（ｉ）チューブリン重合活性（ＩＣ50）、（ｉｉ）細胞致死率（％）の双方でもって総合的に評価することが望ましい。
【００７５】
このうち、細胞致死率（％）は、上記化合物が細胞に実際に取り込まれてチューブリンの重合を促進又は阻害し、あるいは脱重合を阻害し該細胞にアポトーシスを引き起こす等の結果を示すものであり、「細胞に対する作用のしやすさ」が影響すると推測される。
【００７６】
任意の2つの化合物（チューブリン重合促進剤）において、チューブリン重合促進活性が同等である場合、より細胞致死率(：１００−細胞生存率％)が高いチューブリン重合促進剤の方が細胞に作用しやすいといえるため、チューブリン重合促進剤としての有用性は高い。
【００７７】
この観点から、チューブリン重合促進剤として特に好ましいものは、下記表１に示すように、順に、（1４）ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）、（３）ガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid S）、（６）ガノデリックアシッドＬＭ２（Ganoderic acid LM2）、（２２）ルシアルデヒドＢ（Lucialdehyde B）、（１２）ガノデリックアシッドＹ（Ganoderic acid Y）、（１８）ガノデロールＡ（Ganoderol A）である（下記表１参照）。
【００７８】
【表１】
2016013981.tif 000037
【００７９】
（ドッキングシミュレーション）
本発明者らは、βチューブリンと２２種類の化合物（１），（３）〜（８），（１０），（１２）〜（１４），（１６）〜（２４），（２８），（３４）とのドッキングシミュレーションを「Molegro Virtual Docker」（Northern Science Consulting社製）により行った。
【００８０】
この結果、各化合物とβチューブリンとの相互作用エネルギー(E1) と、リガンドの内部エネルギー(E2)との和(E1+E2)であるE-total値が、ガノデリックアシッドＴ−Ｑにおいて最小値となることを見出した（表２参照）。なお、E-totalの値が小さい（値が負(-)で、絶対値が大きい）ほど、リガンドとレセプタとしてのタンパク質とが結合状態において安定となり、相互作用しやすいことを意味する。ここでは、リガンドが２２種類の化合物のそれぞれであり、タンパク質が、真核生物の細胞内タンパク質であるβチューブリンに該当する。
【００８１】
各２２種類の化合物とβチューブリンとが相互作用しやすいということは、２２種類の化合物を含む各化合物（１）〜（３４）が、細胞増殖が激しい細胞（腫瘍細胞等）のチューブリンに効率的に結合・作用してその増殖を阻害することができることを意味する。このことは、各化合物（１）〜（３４）がチューブリン重合促進剤として優れていることを意味するだけでなく、チューブリンの重合を促進する機構の解明や、チューブリンの重合の促進する化合物やその化学構造のスクリーニングのための研究試薬としての非常に意義が高いことを意味する。
【００８２】
図５に示すように、各２２種類の化合物とβチューブリンとのドッキングシミュレーションで得られたＥ−total値は、ΔＲＦＵ平均と相関がある（図５参照）。ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）等の各化合物のＥ−total値は、−１００〜−１３７の範囲にあり、パクリタキセルのＥ−total値（−１５９．３）より高いが、これらの化合物にはパクリタキセルよりも細胞致死率が高いものが多く含まれており、また分子が小さいため、その分、細胞に作用しやすく、チューブリン重合促進剤の性能としてパクリタキセルよりも優れている（上記表１参照）。
【００８３】
ガノデリックアシッドＴ−Ｑ、ガノデリックアシッドＳおよびガノデリックアシッドＴＮは、互いに似た化学構造を有しながら、チューブリン重合促進活性が個々に異なる。
上記ドッキングシミュレーションにより、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q（１４））の１５位のアセトキシ基の酸素原子がβ-チューブリンの第２７６番目のトレオニン（Thr 276）、第２８４番目のアルギニン（Arg284）と水素結合していることが判明した（図１参照）。
【００８４】
一方、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）の３位の官能基のカルボニル基の酸素原子が還元された化学構造を有するガノデリックアシッドＴＮ（Ganoderic acid ＴＮ（１３））は、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）の場合と異なり、１５位アセトキシ基とβ−チューブリンの第３７０番目のグリシン（Gly370）、３位の水酸基とβ-チューブリンの第２７６番目のトレオニン（Thr276）、２６位のカルボキシル基とβ-チューブリンの第２２９番目のヒスチジン（His229）のそれぞれの間で水素結合がなされていることが判明した（図２参照）。しかし、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）は、チューブリン重合促進活性がガノデリックアシッドＴ−Ｑの半分程度であり（図７Ａ参照）、チューブリンの重合を促進はするが細胞毒性を有しない。
【００８５】
さらに、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（Ganoderic acid T-Q）の１５位のアセトキシ基を水素に変えたガノデリックアシッドＳ（Ganoderic acid Ｓ）については、３位のカルボニル基とβ-チューブリンの第２７６番目のトレオニン（Thr276）、２６位のカルボキシル基とβ-チューブリンの第２７番目のグルタミン酸（Glu27）のそれぞれの間で水素結合がなされていることが判明した（図３参照）。しかし、ガノデリックアシッドＳは、チューブリン重合促進活性がガノデリックアシッドＴ−Ｑの半分程度であり（図７Ａ参照）、細胞毒性はガノデリックアシッドＴ−Ｑと同程度である。
【００８６】
このように、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ等を初めとする各化合物（１）〜（３４）は似た化学構造を有しながら、チューブリン重合促進活性および細胞毒性が個々に異なる。そのため、化合物（１）〜（３４）は、チューブリン重合の促進機構を解明するための研究ツール（研究試薬）として特に有用であるといえる。
【００８７】
【表２】
2016013981.tif 000038
【００８８】
（細胞への送達）
上記化合物（１）〜（３４）の少なくともいずれか１種に対する抗体Ａを作製し、標的細胞（腫瘍細胞等）に特異的に発現する抗原（ＬＡＴ１、上皮成長因子受容体等の膜タンパク質やＣＤ３０等の糖鎖）の抗体Ｂを作製し、各化合物（１）〜（３４）と上記抗体との複合体（以下「抗体薬物複合体」という）を形成し、これを本発明に係るチューブリン重合促進剤を含むＤＤＳ製剤（ドラッグデリバリーシステムを利用して特定の細胞にのみ所定の薬剤を送達するように構成した薬剤）として用いることが考えられる。
【００８９】
ここで、抗体Ａは、各化合物（１）〜（３４）を特異的に保持する機能、抗体Ｂは、特定の細胞（腫瘍細胞等）のみに発現している特定のタンパク質に特異的に結合する機能を有し、抗体Ａ，Ｂの複合体は、これら双方の機能を有するため、抗体Ａ，Ｂの複合体の抗体Ａの部分に各化合物（１）〜（３４）を結合させた抗体薬物複合体を用いれば、化合物（１）〜（３４）を特定の細胞（腫瘍細胞等）に特異的に送達させることができる。
【００９０】
上記例の場合、各化合物（１）〜（３４）と上記抗体Ａとの間は、選択的に切断可能なリンカー（例えば、特定のプロテアーゼで選択的に切断可能なタンパク質配列を含むシアトルジェネティクス社等のリンカー等）で連結される。この抗体薬物複合体は、血中では安定であることから、特定の抗原（ＣＤ３０抗原等）を発現した特定の細胞（腫瘍細胞等）へ選択的に送達されて該細胞に取り込まれる。その後、該細胞由来のタンパク質分解酵素により前記リンカーが切断されることで、各化合物（１）〜（３４）を放出させることができる。その結果、各化合物（１）〜（３４）が特定の細胞に送達されて、該細胞（腫瘍細胞等）のみに特異的にアポトーシスを起こすことができる。
【００９１】
（細胞毒性試験）
チューブリン重合促進剤の細胞毒性は、一般に知られている細胞毒性試験（ＭＴＴ法）で評価することができる。ＭＴＴは、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド、別名３−（４，５−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２,５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ, ｙｅｌｌｏｗ ｔｅｔｒａｚｏｌｅである。
【００９２】
例えば、上述した化合物（１）〜（３４）（１００μＭ）の細胞毒性を評価する場合、乳がん細胞（例えばＭＣＦ７；１×１０5ｃｅｌｌｓ/ｍＬ）を９６穴プレートの各ウェルに１００μＬずつ分注し、乳がん細胞が分注されている該９６穴プレートを５％のＣＯ2を含む恒温槽内で、３７℃で２４時間培養する(溶液（Ａ）)。
【００９３】
また、ＥＭＥＭ培地（Eagle's minimal essential medium；９９μＬ）に、トリペノイド化合物（１）〜（３４）のいずれか１種以上の合計モル濃度を１０ｍＭとしたサンプル溶液を１μＬ加え、トリペノイド入り培地を準備する。得られたトリペノイド入り培地を、上記溶液（Ａ）が入っている各ウェルに加える。さらに同条件（５％のＣＯ2を含む恒温槽内）で７２時間培養する(溶液（Ｂ）)。
【００９４】
次いで、この溶液（Ｂ）にＭＴＴ溶液を各ウェル内の溶液（Ｂ）に２０μLずつ加え、同条件で４時間静置する(溶液（Ｃ）)。
次いで、この溶液（Ｃ）を捨てた後、塩酸イソプロパノール（無水イソプロパノールにＨＣｌを０．０４〜０．１Ｎ添加したもの）を１００μＬ添加することで、生細胞により変換された不溶性の青色のホルマザン色素を可溶化させ、装置(マイクロリーダ、(BioTech社製、型番：ELx800TM)にて５７０ｎｍの波長(吸光度)を調べ、これを定量して細胞生存率を算出できる。さらにこの細胞生存率から細胞致死率（：100-細胞生存率％）を算出することができる。
【００９５】
上述したように、チューブリン重合促進剤の細胞毒性の評価から、細胞へのチューブリン重合促進剤の作用のしやすさを表す指標となる。
なお、ＭＴＴは黄色物質であるが、細胞内のミトコンドリア還元酵素により還元され不溶性の青色ホルマザンが生成する。生細胞が青色に発色することを利用して細胞生存率（＝１００−細胞致死率％）を求める。大抵、ジメチルスルホキシドや、酸性エタノール溶液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の希塩酸溶液を、不溶性のホルマザン色素を可溶化させるために添加する。得られた着色溶液の任意の波長（通常５００〜６００ｎｍの間）の吸光度を分光光度計で測定することで定量化を行う。吸収極大波長は使用する溶媒に依存している。
【００９６】
（チューブリン重合促進活性の測定）
チューブリン重合促進活性は、チューブリンの重合に影響を与える物質を含まないコントロール物質のΔＲＦＵ（ΔＲＦＵ平均またはΔＲＦＵ６０）に対して、各化合物のΔＲＦＵがどの程度高いかによって表すことができるが、チューブリン重合活性に影響を与える他の薬剤が存在しない場合において、生じる細胞増殖の５０％を阻害するチューブリン重合促進剤の量(すなわち、ＩＣ50)としても評価することができる。例えば、上述した細胞毒性試験において、同一のチューブリン重合促進剤について終濃度の異なるサンプルを複数用意（例えば１００μＭ，７５μＭ，５０μＭ，２５μＭ，１２．５μＭのサンプルを用意）してそれぞれ細胞毒性を測定し、これらのサンプルの濃度と細胞毒性との関係から近似曲線を得ることで５０％細胞増殖阻害濃度(ＩＣ50)を算出することができる。
【００９７】
また、チューブリン重合活性（ΔＲＦＵ平均、ΔＲＦＵ６０）の測定は、チューブリン重合アッセイキット（Cytoskeleton Inc., Denver, CO, USA）を用いてチューブリンの重合を調べることができる。ΔＲＦＵ平均は、上記キットで測定した単位時間（１分）当たりのＲＦＵ値の平均を意味し、ΔＲＦＵ６０は、上記キットで測定した場合のチューブリンの重合開始後６０分の時点のＲＦＵ値を示す。
【００９８】
具体的には、チューブリン重合活性の測定は、チューブリン重合促進剤とブランクの溶液（ブランクは溶媒のみ）をそれぞれ３７℃に静置し、これにチューブリンを含む５０μLのReaction mixture (1 × Buffer 1（80 mM Piperazine-N,N'-bis[2-ethanesulfonic acid] sequisodium salt; 2.0 mM Magnesium chloride; 0.5 mM Ethylene glycol-bis(b-amino-ethyl ether) N,N,N',N'-tetra-acetic acid, pH 6.9, 10 μM fluorescent reporter. ）, 10% Glycerol, 1mM GTP, 2 mg/mL Tublin)を加え、変化する反応溶液の蛍光強度（４２０ｎｍにおける値）を経時的にプロットする方法である。このときのチューブリン重合体の量を示す蛍光（４２０ｎｍ）が相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表され、該ＲＦＵからΔＲＦＵ平均とΔＲＦＵ６０とを算出することができる。
【００９９】
このチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）の経時変化を調べることで、チューブリン重合促進剤について、チューブリンの脱重合の阻害効果（チューブリン重合促進効果）が十分に得られるまでの時間を把握することができ、他の薬剤（パクリタキセル等）と比較してどの程度、即効性（または徐効性）を有するかを把握することができる。
【０１００】
《チューブリン重合促進剤の用途》
本発明に係るチューブリン重合促進剤は、食品（サプリメント、食品添加物等）、化粧料、医薬品、研究試薬等として用いることができる。これら食品等は、上記トリペノイド化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種または２種以上を含有しているものである。さらに、食品等は、任意に、化合物（７）、（８）、（３４）を含有してもよい。
【０１０１】
〔食品〕
本発明に係る食品は、上述したように、霊芝有機系溶媒抽出物に高濃度で含まれる、チューブリン重合促進剤としての化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）をいずれか１種または２種以上含有するものであり、任意に化合物（７）、（８）、（３４）を含有するものである。
【０１０２】
たとえば、ガノデロールＢ（１９）については５α-リダクターゼ阻害活性や男性ホルモン受容体結合活性を有していることから、前立腺肥大症への有効性が期待される。また、ガノデロールＢは、α−グルコシダーゼ阻害活性を有することから、糖尿病に有効である。したがって、ガノデロールＢを含有する食品であれば、チューブリンの重合促進効果による前述した疾患（腫瘍性疾患等）の予防、軽減または治療の効果に加えて、前立腺肥大症および糖尿病を予防、軽減または治療する効果が得られる食品として有用である。
【０１０３】
また、ガノデリックアシッドＤＭ（７）、ガノデリックアシッドＦ（４）およびガノデルマノンジオール(１７)は、破骨細胞の分化抑制効果を示し、骨粗鬆症への有効性が期待できる。したがって、これらの化合物（７），（４）および（１７）を含有する食品であれば、チューブリンの重合促進効果による前述した疾患（腫瘍性疾患等）の予防、軽減または治療の効果に加えて、骨粗鬆症を予防、軽減または治療する効果が得られる食品として有用であるといえる。
【０１０４】
ガノデリン酸Ａ（２９）は、アルドースレダクターゼ阻害活性を有し、糖尿病合併症に有効である。したがって、これらの化合物（２９）を有効成分とする食品であれば、チューブリンの重合促進効果による前述した疾患（腫瘍性疾患等）の予防、軽減または治療の効果に加えて、糖尿病を予防、軽減または治療する効果が得られる食品として有用であるといえる。
【０１０５】
本発明に係る食品の剤型として、霊芝有機系溶媒抽出物または化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のうちのいずれか１種または２種以上を、そのまま食品として調製したものを挙げることができる。本発明に係る食品の形態として、霊芝有機系溶媒抽出物または化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のうちのいずれか１種または２種以上を、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品の形態としたもの等、通常用いられる任意の形態を例示することができる。
【０１０６】
また、本発明に係るチューブリン重合促進剤を食品に配合して、ヒトやその他動物が摂取する場合、該食品中に、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料等をチューブリン重合促進剤と共に適宜添加することができる。その場合、本発明に係るチューブリン重合促進剤を食品およびこれら任意成分と混合し、用途に応じて、その剤型を粉末、顆粒、錠剤等の形に成形することができる。さらには、チューブリン重合促進剤を食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することができる。
【０１０７】
前記食品を摂取したヒト等における血中濃度で、上記化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上の合計の濃度が０．０１〜１００μＭとなる分量で、上記化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）を食品に含有させて製造することが好ましい。例えば、成人（体重６０ｋｇ）に対して、化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上または上記抽出物を１ｍｇ〜１０００ｍg／日の態様で摂取する例が挙げられる。
【０１０８】
（サプリメント）
本発明に係るチューブリン重合促進剤は、サプリメントとして用いることができる。サプリメントとする場合は、例えば、化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上、または霊芝有機系溶媒抽出物を原料とし、公知の賦形剤を用いて常法により顆粒状・粉末状・ゲル状・カプセル状・ペースト状または錠剤にして用いることができる。このうち、ペースト状にする場合、チューブリン重合促進剤をサイクロデキストリンの空孔に内包させても良い。また、上記原料に化合物（７）、（８）または（３４）を任意に含有させてもよい。
【０１０９】
サプリメント中の霊芝トリペノイド化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上の合計の含有量は、特に制限はないが、霊芝１００ｇ中には２００ｍｇ程度ガノデリン酸が含まれ、通常１回の摂取で霊芝２５〜３０ｇを用いることから、これと同様に、例えば、サプリメント１粒（１ｇ）中に、化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上が合計として５ｍｇ〜６０ｍｇ程度含有されていることが好ましい。
【０１１０】
（食品添加物）
化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）は、強い苦味を呈し、また、細胞の増殖を抑制することから、食品添加物（苦味料、防カビ剤）として苦味が許容される清涼飲料水、酒精飲料等に用いることができる。化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）は、基本的にセスキテルペン等の公知の苦味料と同様に取り扱うことが可能である。
【０１１１】
逆に、化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）の苦味を抑えた防カビ剤として用いることも可能であり、その場合は、苦味マスキング剤（花王「ベネコート  ＢＭＩ−４０」等）により苦味をマスキング等した上で、上記効能（チューブリン重合活促進に基づくガン予防効果、乾癬、狭窄症、心筋梗塞、糸球体腎炎などの疾患の予防や症状の改善、移植拒絶の軽減）を期待し、かかる機能を有する食品添加物として用いてもよい。
【０１１２】
化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）を上記食品添加物として用いる場合、安全性の点で許可されている以下の別の食品添加物を併用して水溶性または油溶性にして用いてもよい。この別の食品添加物としては、一価アルコール(エタノールなど)、多価アルコール（例：エチレングリコール、グリセリンなど）、動植物油(例：グリセリンのモノ、ジ、トリ-脂肪酸エステルに代表される多価アルコールの脂肪酸エステル等)などの公知の溶媒、公知の界面活性剤または公知の乳化剤｛例：シュガーエステル、ソルビタン脂肪酸エステル（ソルビタンエステル),プロピレングリコール脂肪酸エステル(PGエステル)、レシチン）｝などを挙げることができる。
【０１１３】
また、化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）を、水・天然ガム質および多糖類などの高分子物質とともに常用の溶剤または乳化剤を用いて乳化し、油性食品（マヨネーズ等）、水性食品（清涼飲料等）に含めてもよい。
【０１１４】
食品添加物中の化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上の合計の含有量は、特に制限はないが、霊芝１００ｇ中には２００ｍｇ程度ガノデリン酸が含まれ、霊芝そのものでも十分に苦いこと、さらに通常１回の摂取で霊芝２５〜３０ｇを用いる（ガノデリン酸に換算して５０ｍｇ〜６０ｍｇ摂取する）ことから、食品添加物の一人分の１回の用量としてのパッケージ中に、化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上が合計量として１０ｍｇ以上〜６０ｍｇ以下含有されていることが好ましい。
【０１１５】
〔化粧料〕
本発明に係る化粧料は、霊芝トリペノイド化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上を含有するものである。この化粧料には、任意に化合物（７）、（８）または（３４）を含んでもよい。霊芝トリペノイドの化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）は、ステロイドの基本骨格を有するため、細胞の脂質と化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）との間の脂質間相互作用により皮膚から細胞に取り込まれやすく、(皮膚)化粧料としても用いることが好ましい。この化粧料は、皮膚の腫瘍（イボなど）や毛細胞の増殖の抑制、予防に有用であり、抗腫瘍剤や抑毛剤の用途がある。
【０１１６】
本発明に係る化粧料中の上記霊芝トリペノイド化合物や霊芝の溶剤（または熱湯（熱水））抽出物の終濃度は、特に制限はないが、例えば、上記有効成分を例えば０．１μＭから１００μＭとなるように化粧料に含めることが好ましく、より好ましくは１５〜２５μＭである。この場合、肌に塗られた抽出成分を細胞内へと効率よく浸透させるために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、イオン活性剤、エタノール，プロピレングリコール、脂肪酸，脂肪酸エステル等の浸透促進剤（経皮吸収促進剤）を化粧料の成分として含有させてもよい。このうち、ＤＭＳＯを用いる場合、化粧料全体に対して１０重量％以下含有させることが好ましい。エタノールを使用して上述した抽出を行う場合には、再度エタノールを化粧料の成分として含有させることとなるため、抽出に用いたエタノールを溶媒除去しなくともよい点で有利である。
【０１１７】
上記化粧料の剤型として、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティックなどの他、不織布などのシートに含浸ないし塗布したものなどを挙げることができる。
【０１１８】
本発明では、化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上に、植物油などの油脂類、ラノリンやミツロウなどのロウ類、炭化水素類、脂肪酸、高級アルコール類、エステル類、各種界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物や動物の抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防腐剤、殺菌剤などを適宜配合して化粧料を製造してもよい。
【０１１９】
〔除カビ剤（草用）〕
本発明に係る防カビ剤（草用）は、上記化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）のいずれか１種以上を除カビ剤の有効成分として含有し、一般的な防カビ剤(例：イソチアゾリン系の防カビ剤)と同様に観賞用植物や作物等の幼苗の葉表面に少量散布して、植物の表面に付着する微生物の繁殖を防止するものである。ここで、上記防カビ剤（草用）は、上記化合物（７），（８），（３４）を含有してよい。一般に、除カビ剤を散布した作物を人間が食した場合には、除カビ剤の有効成分の人体への悪影響が問題となるが、上述したように、本発明に係る防カビ剤の有効成分である上記霊芝由来のトリペノイドである化合物（１）〜（６）、（９）〜（３３）や霊芝からの有機系溶媒抽出物は、いずれも食品となりうる安全な成分であることから人体への悪影響は無いに等しい。本発明に係る防カビ剤（草用）は、終濃度として、上記有効成分を例えば１μＭから１００μＭで含有していることが望ましく、この防カビ剤には、上述したようにＤＭＳＯ等の溶剤が含まれていてもよい。
【０１２０】
〔研究試薬〕
霊芝トリペノイド化合物（１）〜（３４）は、その化学構造の相違によりチューブリン重合促進活性が相違するため、各化合物（１）〜（３４）はそれぞれβチューブリンとの結合の態様及びチューブリンの重合促進活性の発現機構（シグナル伝達系に与える影響等）が異なると考えられるが、その詳細は現在不明である。したがって、チューブリン重合促進活性の程度が異なる化合物（１）〜（３４）を、チューブリン重合の促進機構やそれにまつわるシグナル伝達への影響を解明するための研究試薬として用いることができる。
【０１２１】
また、各化合物（１）〜（３４）は、後述するように、化学構造が相違するため、βチューブリンとの結合様式やチューブリン重合促進活性が相違する。したがって、これら化合物（１）〜（３４）に基づいて、さらに高活性のチューブリン重合促進活性剤を開発することも可能であり、このための研究試薬としても用いることができる。
【０１２２】
前者の例としては、各化合物（１）〜（３４）を使用した場合としない場合における遺伝子の発現やシグナル伝達をＤＮＡマイクロアレイ等により網羅的に解析する例を挙げることができる。
【０１２３】
具体的には、各化合物（１）〜（３４）のうちで、チューブリンの重合促進活性が最も強いガノデリックアシッドＴ−Ｑ（化合物（１４））と、最も弱いガノデリックアシッドＮ（化合物（２））とを同じモル濃度（０．０１μＭ〜１００μＭの範囲、例えば３０μＭ）含む培地で、それぞれ標的細胞を培養し、培養細胞からｍＲＮＡ抽出等して、多数の遺伝子を搭載したＤＮＡマイクロアレイにより各細胞伝子発現を網羅的に解析する例を挙げることができる。また、後者の例としては、チューブリン重合促進活性の程度およびβチューブリンとの結合様式が化合物（１）〜（３４）で相違する上に、タキソールとも相違することから、所定の化学構造及びチューブリン重合促進活性を有する基準試薬として用いることができる。これにより、抗腫瘍活性の抗がん剤の発見にも寄与する。
【０１２４】
《チューブリン重合阻害剤》
霊芝(Ganoderma lingzhi)等の薬用キノコは、古くから民間伝承的に生体防御反応（免疫機能）を増強する働きがあるとされ、腫瘍やアレルギー患者、高齢者といった生体の免疫機能が崩れた人々に有用とされてきた。霊芝には、その有用成分としてβ−グルカンが含まれている。β−グルカンとは、キノコ等に含まれるブドウ糖（グルコース）が連なって形成された高分子の多糖体であり、キノコの種類によってグルコースの結合様式が若干異なる。
【０１２５】
本発明者らは、霊芝(Ganoderma lingzhi)の熱水抽出物にチューブリンの重合阻害活性があることを見出し、チューブリン重合阻害剤を完成させた。したがって、本発明に係るチューブリン重合阻害剤は、霊芝(Ganoderma lingzhi)から水を含有する溶媒（水系溶媒）で抽出することにより得られる成分、特にβ-グルカンを有効成分として含み、チューブリン重合活性を阻害する作用を有することを特徴とする。
【０１２６】
（水系溶媒抽出）
水系溶媒抽出に供される素材としての霊芝(Ganoderma lingzhi)は、山野で採取した天然物や人工栽培物をそのまま抽出処理に供してもよいが、抽出効率等を考慮すると、霊芝を一旦(凍結)乾燥、破砕等の加工処理に供して調製したものを好ましく挙げることができる。
【０１２７】
抽出溶媒としては、水を含む溶媒（水系溶媒）であればよく、水分を５０〜１００％含有する抽出溶媒であれば、チューブリンの重合を好適に阻害することができる抽出物が得られる観点から好ましい。このような溶媒として、例えば、水、緩衝液（例えばＰＢＳ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、３０％〜１００％エタノール水溶液等を挙げることができる。
【０１２８】
上記有効成分は、代表的には、水系溶媒の存在下に、霊芝を以下に示す所定の抽出条件で加熱抽出し、得られた抽出混合物を濾過し、濾液から溶媒を留去し、所望の抽出物を得ることによって調製される。上記抽出の条件は適宜変更することが可能である。
【０１２９】
抽出温度は、霊芝から多糖類（β-グルカン、ペプチドグリカン、アラビノキシルグリカンなど、その他マンニトール等）を主として含む成分を抽出できれば特に制限はなく、３０℃〜１２５℃、好ましくは８０℃〜１２５℃、最も好ましくは１２１℃前後（１１５℃〜１２５℃）を使用することができる。
【０１３０】
抽出時の圧力は、霊芝から多糖類（βグルカン等）を主として含む成分を抽出できれば特に限定されず、常圧でもよいが、加圧する場合は、例えば１０６０ｈＰａ〜４９００ｈＰａ（約１〜５気圧）で行うことができ、特に好ましくは２気圧である。
【０１３１】
抽出時間についても、多糖類（β-グルカン等）を主として含む成分を抽出できれば特に制限はなく、例えば数分〜３日間であり、最も好ましくは２０分程度である。
さらに、上記抽出物にエタノール等の低級アルコールやアセトンを加えて、沈殿物を中和して膜ろ過して、βグルカンを主とする多糖類以外のタンパク質等を沈殿させて分画してもよい。上記抽出物は、さらに、限外濾過処理や超音波処理などを行ってもよく、そのような限外濾過物（濾液および濾物）や超音波処理物などもまた、霊芝の水系溶媒の抽出物であり、本発明に包含される。
【０１３２】
また、上記抽出物について、さらにシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相分取液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーによって、分画操作（分離・精製）を繰り返し、凍結乾燥する等して、抽出物中の有効成分の含有量及び純度を高めてもよい。
【０１３３】
（チューブリン重合阻害活性の測定）
チューブリン重合阻害活性は、チューブリンの重合活性に影響を与える他の薬剤が存在しない場合に生じる細胞増殖の５０％を阻害するチューブリン重合阻害剤の量(すなわち、ＩＣ50)として評価することができる。例えば、上述した細胞毒性試験において、同一のチューブリン重合阻害剤について終濃度の異なるサンプルを複数用意（例えば１００μＭ，７５μＭ，５０μＭ，２５μＭ，１２．５μＭのサンプルを用意）してそれぞれ細胞毒性を測定し、これらサンプルの濃度と細胞毒性との関係から近似曲線を得ることで５０％細胞増殖阻害濃度(ＩＣ50)を算出することができる。ＩＣ50が低い値であるほど、重合阻害剤としての活性が高い（細胞毒性が高い）ことを示す。
【０１３４】
また、経時的なチューブリン重合阻害活性の測定は、例えば、チューブリン重合アッセイキット（Cytoskeleton Inc., Denver, CO, USA）を用いて調べることができる。チューブリン重合阻害剤とブランクの溶液（ブランクは溶媒のみ）をそれぞれ３７℃にインキュベートし、これにチューブリンを含む５０μLのReaction mixture (1 × Buffer 1（（80 mM Piperazine-N,N'-bis[2-ethanesulfonic acid] sequisodium salt; 2.0 mM Magnesium chloride; 0.5 mM Ethylene glycol-bis(b-amino-ethyl ether) N,N,N',N'-tetra-acetic acid, pH 6.9, 10 μM fluorescent reporter. ）, 10% Glycerol, 1mM GTP, 2 mg/mL Tublin)を加え、変化する反応溶液の蛍光（４２０ｎｍ）を経時的にプロットする方法が挙げられる。このときの蛍光（４２０ｎｍ）が相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表される。
【０１３５】
《チューブリン重合阻害剤の用途》
本発明に係るチューブリン重合阻害剤は、食品（サプリメント、食品添加物等）、化粧料等として用いることができる。これらは、霊芝から水系溶媒による上記抽出で得られる抽出物(霊芝水系溶媒抽出物)を含有しているものである。
【０１３６】
〔食品〕
本発明に係る食品は、上記霊芝水系溶媒抽出物を含有するものであり、細胞増殖に関連する疾患の予防あるいは軽減の各効果が期待できる。本発明に係る食品は、上記霊芝水系溶媒抽出物をそのまま食品として調製したもの、他の食品に添加したもの、あるいは、カプセル、錠剤等、食品または健康食品に通常用いられる任意の形態を挙げることができる。
【０１３７】
また、食品中に上記霊芝水系溶媒抽出物を配合して摂取あるいは投与する場合には、霊芝水系溶媒抽出物を、適宜、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などと混合し、用途に応じて、粉末、顆粒、錠剤等の形に成形して用いることができる。さらには、上記霊芝水系溶媒抽出物を、食品原料中に混合して食品を調製し、機能性食品として製品化することによって摂取することができる。前記食品を摂取したヒト等における血中濃度で、上記霊芝水系溶媒抽出物の濃度が０．１〜１００μＭとなる分量で、上記霊芝水系溶媒抽出物を食品に含有させて製造することが好ましい。
【０１３８】
（サプリメント）
本発明に係るチューブリン重合阻害剤は、サプリメントとして用いることができる。サプリメントとする場合は、例えば、上記霊芝水系溶媒抽出物を、公知の賦形剤を用いて常法により顆粒状・粉末状・ゲル状・カプセル状・ペースト状または錠剤にしたものをサプリメントとして用いることができる。このうち、ペースト状にする場合、チューブリン重合促進剤をサイクロデキストリンに内包させても良い。サプリメント中の上記抽出物の含有量は特に制限はないが、例えば、血中濃度が８〜１２μg/ｍＬとなるような成分量でサプリメントに含有させることが望ましい。
【０１３９】
霊芝１００ｇには、およそ５５ｇのβグルカンが含まれていること、また、１回の摂取で霊芝２５ｇ〜３０ｇを摂取することが望まれるから、サプリメント粒に上記霊芝水系溶媒抽出物を合計１４〜２０ｇ含めることが望ましい。例えば上記抽出物を５ｇ含むサプリメント粒４粒を１回の摂取量とする例が挙げられる。
【０１４０】
（食品添加物）
また上記霊芝水系溶媒抽出物は、古来より和漢薬として利用されており安全性に優れ、しかも細胞の増殖を抑制することから、食品添加物（防カビ剤）として清涼飲料水、酒精飲料等に添加して用いることができる。食品添加物とする場合、アルコール、多価アルコール、動植物油など前述したような公知の溶媒、公知の界面活性剤または公知の乳化剤を用いて、上記抽出物を油溶性にして用いてもよく、水・天然ガム質および多糖類などの高分子物質とともに常用の溶剤または乳化剤を用いて乳化して用いても良い。この処理により油溶性とした上記抽出物を油性食品（マヨネーズ等）、或いは、そのまま水性食品（清涼飲料等）に含めても良い。
【０１４１】
〔化粧料〕
本発明に係る化粧料は、上記霊芝水系溶媒抽出物を含有するものである。上記霊芝水系溶媒抽出物は、チューブリンの重合を阻害するため、化粧料としても用いることが好ましい。この化粧料は、皮膚の腫瘍（イボなど）や皮膚における真菌の増殖の抑制、予防に有用であることが期待できる。本発明に係る化粧料は、終濃度として、上記成分を例えば０．１μＭから１００μＭとなるように化粧料に含めることが望ましい。この場合、肌に塗られた抽出成分を細胞内へと効率よく浸透させるために、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、イオン活性剤、エタノール，プロピレングリコール、脂肪酸，脂肪酸エステル等の浸透促進剤（経皮吸収促進剤）を化粧料成分として含有させてもよい。
【０１４２】
本発明に係る化粧料には、上記成分以外に、植物油などの油脂類、ラノリンやミツロウなどのロウ類、炭化水素類、高級アルコール類、各種界面活性剤、色素、香料、ビタミン類、植物や動物の抽出成分、紫外線吸収剤、抗酸化剤、防カビ・防腐剤（霊芝水系溶媒抽出物を除く。）、殺菌剤などを適宜配合してもよい。
【０１４３】
上記化粧料の剤型は、特に限定されず、例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、ジェル、ミスト、スプレー、ムース、ロールオン、スティックなどの他、不織布などのシートに含浸ないし塗布したものなどを挙げることができる。
【０１４４】
〔除カビ剤（草用）〕
本発明に係る防カビ剤（草用）は、上記霊芝水系溶媒抽出物を防カビ剤の有効成分として含有し、一般的な防カビ剤とは異なり、例えば観賞用植物や作物等の幼苗の葉表面に少量散布して、表面に付着するカビ等の微生物の繁殖を防止するものである。作物の幼苗に散布する場合、除草剤を使用した作物を人間が食した場合に防カビ剤の有効成分の人体への悪影響が問題となるが、上述したように食品となりうる成分であることから人体への悪影響は無いに等しい。本発明に係る防カビ剤（草用）は、終濃度として、上記水系溶媒で抽出した抽出物を例えば１μＭから１００μＭで含有していることが望ましい。
【０１４５】
この防カビ剤は、水分が多いことから、植物に寄生して病気を引き起こす糸状菌（Aspergillus族）等の植物病原菌が繁殖する際に水分とともに該植物病原菌の菌体内に取り込まれるため、増殖抑制作用が働いて防カビ効果が得られることが期待される。
【０１４６】
なお、上記説明では、霊芝から、水系溶媒か有機系溶媒の何れか一方の溶媒を用いてチューブリン重合阻害作用(水系溶媒抽出の場合)又は促進作用（有機系溶媒抽出の場合）の何れかを有する重合活性調節剤を溶媒抽出する態様を説明したが、本発明では上記水系溶媒と、上記有機系溶媒のうちで上記水系溶媒に不溶な有機系溶媒とを組合わせた任意量比の混合溶媒（例:水／クロロホルム５０％ずつの混合溶媒）を用いて溶媒抽出し、分液漏斗等で各層（例：水層、クロロホルム層）に溶けた成分をそれぞれ分取して用いてもよい。
【実施例】
【０１４７】
［試験例１］
《霊芝トリテルペノイド（化合物（１）〜（３４））の細胞毒性試験》
試験例１では、化学構造が異なる３４種類の霊芝(Ganoderma lingzhi)由来のトリテルペノイド（化合物（１）〜（３４））について、ヒト乳がん細胞（ＭＣＦ７）に及ぼす細胞毒性を調べた。
【０１４８】
（実験方法）
パクリタキセル（Paclitaxel）、ビンブラスチン（Vinblastine）及び霊芝(Ganoderma lingzhi)由来のトリテルぺノイド（化合物（１）〜（３４））の乳がん細胞(ＭＣＦ７)に対する細胞毒性をＭＴＴ法により調べた。
【０１４９】
すなわち、９６ウェルプレートからなるＥＭＥＭ培地の各ウェルに、１．０×１０4ｃｅｌｌｓ/ｗｅｌｌでＭＣＦ７細胞溶液（ＥＭＥＭ培地）を播種した。２４時間５％ＣＯ2・３７℃条件下で培養後、培地交換とともにサンプルとして上記化合物（１）〜（３４）、パクリタキセル、ビンブラスチンのいずれかを添加した。コントロール（Control）については、サンプル等の化合物を一切添加せず、前記培養した液のみとした。
【０１５０】
その後、５％ＣＯ2・３７℃条件下で７２時間培養後、各ウェルにＭＴＴ溶液を２０μＬ加え、５％ＣＯ2・３７℃条件下で４時間培養した。培地を捨て、各ウェルに塩酸イソプロパノール溶液を１００μＬ加えて遮光条件下にて室温で４時間置いた後、５７０ｎｍの吸光度を測定した。各サンプルごとにウェル内最終濃度１００μＭ、７５μＭ、５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭの５種類で細胞毒性を測定し、近似曲線を得ることで５０％細胞増殖阻害濃度 (ＩＣ50)を算出した。その結果を下記表３に示す。このＩＣ50は、チューブリン重合促進活性を表し、より小さい値の方がより高い活性であることを示す。
【０１５１】
（結果と考察）
実験に供した化合物（１）〜（３４）等の化学構造、化合物名及び得られた細胞毒性の結果を下記表３に示す。コントロール（Control）群と比較した細胞増殖率が５０％を示す濃度が１００μＭ以下の化合物は、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデリックアシッドＳ（３）、ルシアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＬＭ２（６）、ガノデリックアシッドＹ（１２）、ガノデロールＡ(１８)の６種類であった。ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）は強い細胞毒性を示したが、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）は細胞毒性が確認されなかった。また、ガノデロールＡ（１８）は強い細胞毒性を示したが、ガノデロールＢ（１９）は細胞毒性が確認されなかった。さらに、細胞毒性を示した他の多くの霊芝トリテルペノイドの３位はカルボニル基であった。これらのことから、霊芝トリテルペノイドの３位がカルボニル基であることが細胞毒性を示すために重要であると考えられる。また、細胞毒性が見られなかった化合物について、その多くが１１位にカルボニル基を有することから、本置換基も細胞毒性の有無に何か関与しているのではないかと考えられる。
【０１５２】
以上のことから、本発明の目的、効果との関係では、上記６種類の化合物がチューブリン重合促進剤として非常に優れている。特に、上記６種類の化合物を含む、細胞毒性に有意差がある化合物（３）〜（７）、（１０）、（１２）、（１４）、（１６）〜（２３）、（２５）、（２８）、（３０）〜（３２）については、パクリタキセルと同等かそれ以上に細胞に作用してチューブリンの脱重合を阻害（重合を促進）し、細胞をアポトーシスに導いて殺傷したと考えられ、パクリタキセルと同等以上の効果を有するチューブリン重合阻害剤として有用であるといえる。
【０１５３】
逆に、上記有意差を示さなかった化合物（１）、（２）、（８）、（９）、（１１）、（１３）、（１５）、（２４）、（２６）、（２７）、（２９）、（３３）については、細胞毒性を示さないが、チューブリンの重合を阻害する化合物として、どのような作用機構でそのような結果となっているかを調べるための研究試薬として特に有用である。
【０１５４】
【表３】
2016013981.tif 000039
（各化合物名；Ganoderic acid Z (1), Ganoderic acid N (2), Ganoderic acid S (3), Ganoderic acid F (4), Ganoderic acid SZ (5), Ganoderic acid LM2 (6), Ganoderic acid DM (7), Ganoderic acid A (8), Ganoderic acid AM1 (9), Ganoderic acid B (10), Ganoderic acid D (11), Ganoderic acid Y (12), Ganoderic acid TN (13), Ganoderic acid T-Q (14), Ganolucidic acid A (15), Ganodermanontriol (16), Ganodermanondiol (17), Ganoderol A (18), Ganoderol B (19), Ganoderiol F (20), Lucialdehyde A (21), Lucialdehyde B (22), Ganoderic acid C1 (23), Ganoderic acid C2 (24), Ganoderic acid C6 (25), Ganoderic acid H (26), Ganoderic acid K (27), Ganoderic acid TR (28), Ganoderenic acid A (29), Ganoderenic acid C (30), Ganoderenic acid D (31), Ganoderenic acid F (32), Ganoderenic acid H (33), Ganoderic acid DM methyl ester (34)）
【０１５５】
［試験例２］
（霊芝由来のトリテルペノイドのチューブリン重合促進活性の評価）
３４種類の霊芝(Ganoderma lingzhi)由来のトリテルぺノイド（１）〜（３４）のチューブリン重合度に与える影響について着目し、チューブリン脱重合阻害活性物質の網羅的探索及びその構造活性相関に関する知見の集積を行った。なお、実験には表３に示す３４種類の霊芝由来のトリテルペノイド（化合物（１）〜（３４））を使用し、ポジティブコントロールとしてパクリタキセル（タキソール）を用いた。
【０１５６】
（実験方法）
各霊芝由来のトリテルペノイドについて、「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)を用いて、チューブリン脱重合阻害活性（チューブリン重合促進活性）を評価した。９６ウェルプレートにバッファーとチューブリンを加えた後、系内最終濃度がパクリタキセル（Paclitaxel）(ポジティブコントロール)は２．７３μＭ、各霊芝トリテルペノイド（化合物（１）〜（３４））は、１８．２μＭとなるように反応系に添加した。各霊芝トリテルペノイドは純水：ＤＭＳＯ＝９:１の混合溶液に溶解させた。バッファーには、チューブリンの重合体である微小管に結合することで３６０ｎｍの励起強度、及び４２０ｎｍの蛍光強度が増大する蛍光物質ＤＡＰＩ(励起光波長（Ｅｘ）＝３６０ｎｍ、蛍光波長（Ｅｍ）＝４２０ｎｍ)が含まれており、本試験例２では蛍光強度を測定することで各ウェルのチューブリン重合度の測定を行った。蛍光強度の測定は測定開始後０分から６０分までの間毎分行われ、計６１回測定された。
【０１５７】
（結果と考察）
各化合物について、得られた蛍光強度ＲＦＵの６１回測定における平均値（ΔＲＦＵ平均）を下記表４に示す。また、各化合物（１）〜（１６）を含めたチューブリン重合反応における蛍光強度ＲＦＵの経時変化を図７及び図８に示す。３４種類全ての霊芝トリテルペノイド（化合物（１）〜（３４））にてネガティブコントロールよりも高い蛍光強度、つまりチューブリン重合促進活性が見られ、最も活性が強い化合物はガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）であった。ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）は、ガノデリックアシッドＳ（３）の１５位の炭素がアセトキシ化された化合物であり（図１および表３参照）、両化合物の間で活性の強さに大きな差異があることから、ガノデリックアシッドＴ−Ｑのチューブリン重合促進活性は、１５位のアセトキシ基が活性部位して強く関与していると考えられる。また全体として７位、８位の炭素間及び９位、１１位の炭素間に二重結合を有する化合物では活性が強く、８位、９位の炭素間に二重結合を有する化合物では活性が弱い傾向が見られた。
【０１５８】
したがって、化合物（１）〜（１６）はチューブリン重合促進活性を有し、チューブリン重合促進剤として用いることができることを十分に確認することができた。
また、図８、９に示すように、化合物（１）〜（１６）はチューブリンの重合開始時点（０分）から１２〜１８分経過した時点からチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）が増加し始めるのに対して、パクリタキセルは、４〜５分経過した時点からチューブリン重合体の量（ＲＦＵ）が増加し始めている。これらのことから、化合物（１）〜（１６）は、パクリタキセルと異なる機構でチューブリンの重合を促進している可能性がある。
【０１５９】
従って、本発明の目的、効果との関係では、チューブリンの重合を阻害して機構を解明するための研究試薬とて有用といえる。
【０１６０】
【表４】
2016013981.tif 000040
【０１６１】
［試験例３］
（霊芝由来のトリテルペノイドとチューブリンのドッキングシミュレーション）
パクリタキセル（タキソール）をはじめとするチューブリン重合促進剤は、チューブリンと相互作用することでその活性を示すことが知られている。霊芝(Ganoderma lingzhi)由来のトリテルペノイド（化合物（１）〜（３４））についても、そのチューブリン重合促進活性はパクリタキセル（タキソール）との相互作用の場合と同様に、「チューブリン−パクリタキセル（タキソール）の結合部位」と同様な部位に相互作用することで発現している可能性が考えられる。
【０１６２】
本発明では、表３に示した３４種類の霊芝由来のトリテルペノイド（化合物（１）〜（３４））のうち、立体構造が完全に同定されている化合物２２種類（ガノデリックアシッドＺ（１）、ガノデリックアシッドＳ（３）、ガノデリックアシッドＦ（４）、ガノデリックアシッドＳＺ（５）、ガノデリックアシッドＬＭ２（６）、ガノデリックアシッドＤＭ（７）、ガノデリックアシッドＡ（８）、ガノデリックアシッドＢ（１０）、ガノデリックアシッドＹ（１２）、ガノデリックアシッドＴＮ（１３）、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）、ガノデルマノントリオール（１６）、ガノデルマノンジオール（１７）、ガノデロールＡ（１８）、ガノデロールＢ（１９）、ガノデリオールＦ（２０）、ルシアルデヒドＡ（２１）、ルシアルデヒドＢ（２２）、ガノデリックアシッドＣ１（２３）、ガノデリックアシッドＣ２（２４）、ガノデリックアシッドＴＲ（２８）、ガノデリン酸ＤＭメチルエステル（３４））について、ソフトウェア「Molgro Virtual Docker」」（Northern Science Consulting Inc.）について、パクリタキセル（タキソール）が結合することが知られているβチューブリンの結合部位へのドッキングシミュレーションを行った。
【０１６３】
（実験方法）
パクリタキセル（タキソール）とチューブリンの結晶構造(PDBコード 1JFF)を用いてドッキングシミュレーションを行った。本来であれば、パクリタキセルが結合物質（リガンド）として、タンパク質であるβチューブリンに結合するが、本試験例３では、リガンドとしてトリペノイド類（１）、（３）〜（８）、（１０）、（１２）〜（１４）、（１６）〜（２４）、（２８）、（３４）をβチューブリンにそれぞれドッキングさせるシミュレーションを行い、このシミュレーションの際の各リガンドのタンパク質との相互作用エネルギー(E1)と、各リガンドの内部エネルギー(E2)との和(E1+E2)であるE-total値をそれぞれ求めることで、各霊芝トリテルペノイド（化合物（１）、（３）〜（８）、（１０）、（１２）〜（１４）、（１６）〜（２４）、（２８）、（３４））とチューブリンとの相互作用の強さを求めた。
なお、E-totalの値が小さい(：符号が負（−）で絶対値が大きい)ほど、リガンドとタンパク質が相互作用しやすいことを表す。各化合物のE-total値を表５に示している。
【０１６４】
（結果と考察）
全ての霊芝トリテルペノイド類（１）、（３）〜（８）、（１０）、（１２）〜（１４）、（１６）〜（２４）、（２８）、（３４）の中で、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）のE-total値が最小となった（表５参照）。
【０１６５】
【化３６】
2016013981.tif 000041
パクリタキセル（タキソール）とチューブリンの結合様式(上記化学式、図４)より、パクリタキセル（タキソール）はβ-チューブリンの第２７６番目のアミノ酸残基のスレオニンと水素結合を有することが分かる。
【０１６６】
【化３７】
2016013981.tif 000042
【０１６７】
一方、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）とチューブリンの結合様式(上記化学式［Ａ３］、図１)について、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）はその１５位のアセトキシ（Acetoxy）基を介して、同じくβ-チューブリンの第２７６番目のアミノ酸残基のスレオニンと水素結合を有することから、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）はその15位のアセトキシ基がチューブリン重合促進の活性部位として関与していることを裏付ける結果が得られた。
【０１６８】
また、同じく１５位にアセトキシ基を有する化合物であるガノデリックアシッドＴＮ（１３）の結合様式 (図２)について、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）とガノデリックアシッドＴＮ（１３）の構造的な違いは前者では3位がカルボニル（Carbonyl）基、後者では3位がヒドロキシ（Hydroxy）基であるという点のみである。それにもかかわらずE-total値に大きな差異が見られたことから、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（１４）の3位がカルボニル基であることにより、15位のアセトキシ基を介したチューブリンとの相互作用は安定する可能性が考えられる。
【０１６９】
従って、霊芝トリペノイド類（１）、（３）〜（８）、（１０）、（１２）〜（１４）、（１６）〜（２４）、（２８）、（３４）とチューブリンとの相互作用の安定性を示す上記E-total値から、食品、化粧材、防カビ剤等の各種用途の有効成分として用いた場合に腫瘍抑制能や防カビ性能の各効果を推認することができる。
【０１７０】
このうち、ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（化合物（１４））は、特にチューブリンに強く相互作用し、この結果チューブリン重合促進活性が高く、チューブリン重合阻害剤等として優れているといえる。
【０１７１】
また、各化合物（１）、（３）〜（８）、（１０）、（１２）〜（１４）、（１６）〜（２４）、（２８）、（３４）について、Ｅtotal値やβチューブリンとの結合様式が異なることから、霊芝由来のトリテルペノイドについてさらに高いチューブリン重合阻害活性を有するトリテルペノイドを探索する際の化合物（研究試薬）として有用であるだけでなく、化合物ごとに、どのシグナル伝達系を介して細胞にアポトーシスを引き起こすか等の解析を行うための化合物（研究試薬）としても有用である。
【０１７２】
【表５】
2016013981.tif 000043
【０１７３】
［試験例４］
（霊芝のクロロホルム抽出物と熱水抽出物のチューブリンの重合度に与える影響）
霊芝(Ganoderma lingzhi)のエキスにもチューブリン重合促進効果があるか否かを調べるために、２種類の霊芝エキスすなわち霊芝の熱水抽出物と霊芝のクロロホルム抽出物についてチューブリン重合度測定試験を行った。
【０１７４】
（実験方法）
・霊芝の熱水抽出物
１２１℃ ２０分 オートクレーブ（通常のオートクレーブ滅菌と同じ条件）により調製。なお、上記霊芝は、株式会社東洋丹芝園より購入した。
・霊芝のクロロホルム抽出物
室温 ３日間 振とう抽出により調製
霊芝の熱水抽出物、霊芝のクロロホルム抽出物の各抽出物について、ポジティブコントロールとしてパクリタキセルを用いるとともに、ネガティブコントロールとしてＤＭＳＯを用いて、「Tubulin Polymerization Assay Kit」(Cytoskelton, Inc.)によりチューブリン重合活性（ΔＲＦＵ平均）を評価した。９６ウェルプレートにバッファーとチューブリンを加えた後、系内最終濃度がパクリタキセル（タキソール）(ポジティブコントロール)は２．７３μＭ、霊芝の熱水抽出物と霊芝のクロロホルム抽出物は１８．２μＭとなるよう上記抽出物等をサンプルとして添加した。なお、ネガティブコントロールについては化合物等を一切添加しなかった。全てのサンプルは純水：ＤＭＳＯ＝９：１の混合溶液に溶解させた。バッファーには、チューブリンの重合体である微小管に結合することで３６０ｎｍの励起強度及び４２０ｎｍの蛍光強度が増大する蛍光物質ＤＡＰＩ(励起波長（Ex）:３６０ｎｍ，蛍光波長（Em）:４２０ｎｍ)が含まれており、本試験例４では蛍光強度を測定することで各ウェルのチューブリンの重合度の測定を行った。蛍光強度の測定は測定開始後０分から６０分までの間毎分行われ、計６１回測定した。ΔＲＵＦ平均は、単位時間（１分）当たりのＲＦＵの平均値を示す。
【０１７５】
（結果と考察）
【０１７６】
【表６】
2016013981.tif 000044
【０１７７】
霊芝(Ganoderma lingzhi)の熱水抽出物及びクロロホルム抽出物について、得られた蛍光強度（ＲＦＵ）の61回測定における平均値（ΔＲＦＵ平均）を表６に示す。霊芝のクロロホルム抽出物にてNegative controlよりも高い蛍光強度、つまり、チューブリン重合促進活性が見られた。また、クロロホルム抽出物については、０．１３６ｍｇ／ｍＬ以上でチューブリン重合促進活性が得られることが確認されているが、また、クロロホルム抽出物について濃度を低下させていった場合に、コントロールと同じΔＲＦＵ平均の値となる直前の濃度までは、チューブリンの重合活性促進効果が期待できる。
【０１７８】
一方、上記表６に示すように、霊芝の熱水抽出物については、ネガティブコントロールよりさらにΔＲＦＵ平均の値が低く、チューブリンの重合を阻害する活性がみられた。
図７を参照すると、熱水抽出物の濃度を１.８２０ｍｇ／ｍＬに設定した場合には、ΔＲＦＵ平均はさらに低い値（１０〜２０程度低い値）であることが理解できる。
【０１７９】
したがって、熱水抽出物のチューブリン重合阻害活性は、０．０４５５ｍｇ／ｍＬ以上〜１.８２０ｍｇ／ｍＬ以下まで、少なくともチューブリン重合阻害効果が得られ、溶解上限まで同様の効果が期待できる。
【０１８０】
［試験例５］
（霊芝クロロホルム抽出物中の霊芝トリテルペノイドの存在確認）
試験例４の霊芝(Ganoderma lingzhi)のクロロホルム抽出物及び該霊芝のトリテルペノイド標品についてＬＣＭＳ解析を行い、該クロロホルム抽出物に霊芝トリテルペノイドが含まれるのかどうか検証を行った。
【０１８１】
上記クロロホルム抽出物及び標品混合物(スタンダード１〜４)を下記濃度で１００％メタノールに溶かしてＬＣＭＳ分析用のサンプル（Ａ）〜（Ｅ）を調整した。
（Ａ）試験例３のクロロホルム抽出物;２ｍｇ／ｍＬ
（Ｂ）スタンダード１：ガノデリックアシッドＡ(０．２５ｍｇ／ｍＬ)＋ガノデリックアシッドＢ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）＋ガノルシド酸Ａ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）＋ガノデリオールＦ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）
（Ｃ）スタンダード２：ガノデリックアシッドＡ(０．２５ｍｇ／ｍＬ)＋ガノデリックアシッドＤＭ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）＋ガノデルマノントリオール（０．１７ｍｇ／ｍＬ）＋ルシアルデヒドＡ（０．１７ｍｇ／ｍＬ）
（Ｄ）スタンダード３：ガノデリックアシッドＡ(０．２５ｍｇ／ｍＬ)＋ガノデリックアシッドＣ１（０．２５ｍｇ／ｍＬ）＋ルシアルデヒドＢ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）＋ガノデリックアシッドＨ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）
（Ｅ）スタンダード４：ガノデリックアシッドＡ(０．２５ｍｇ／ｍＬ)＋ガノデリックアシッドＴ−Ｑ（０．２７ｍｇ／ｍＬ）＋ガノデロールＡ（０．１８ｍｇ／ｍＬ）＋ガノデルマノンジオール（０．１４ｍｇ／ｍＬ）
各サンプル（Ａ）〜（Ｅ）を下記条件で「ＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ」(ＬＣＭＳ−２０２０，島津製作所)に供した。一般に霊芝トリテルペノイドは252 nmに極大吸収波長をもつため、検出波長は252 nmとした。
【０１８２】
（条件）
・使用カラム; ＳＨＩＳＥＩＤＯ社製「CAPCELL PACK  Ｃ１８」(カラム内径：１ｍｍ、カラム長さ：１５０ｍｍ、充填剤の各粒子の平均粒径：５μｍ)
・注入量：５μＬ
・流速：０．１ｍＬ／ｍｉｎ
・ＬＣ検出波長：２５２ｎｍ
・カラム温度：３０℃
・溶離液組成(グラジエント)：
ラインＡ：0.1%AcOH-Water,
ラインＢ：0,1%AcOH-AcCN, 25-35% B in 0-35 min, 35-45% B in 35-45 min, 45-100% in 45-145 min, 100% B in 145-160 min
【０１８３】
（結果と考察）
スタンダード１〜４より得られた各標品のＭＳスペクトル、ＭＳ／ＭＳスペクトルと保持時間を図１０〜図１８に示す。また、クロロホルム抽出物のクロマトグラムを図１９に示す。図１９中の数字１〜３で示したピークのＭＳスペクトルをそれぞれ図２０〜図２２に示す。図２０〜図２２中各ピークについてその保持時間とＭＳスペクトルから、ピーク1はガノデリックアシッドＢ、ピーク2はガノデリックアシッドＡ、ピーク３はガノデリックアシッドＤＭであると推定される。
【０１８４】
以上、本発明に係るチューブリン重合活性調節剤について、実施形態および各試験例に基づいて詳細に説明してきたが、本発明は上記実施形態等に限定されず、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しないかぎり、設計変更は許容される。
【図１】
2016013981.tif 000045
【図２】
2016013981.tif 000046
【図３】
2016013981.tif 000047
【図４】
2016013981.tif 000048
【図５】
2016013981.tif 000049
【図６】
2016013981.tif 000050
【図７Ａ】
2016013981.tif 000051
【図７Ｂ】
2016013981.tif 000052
【図７Ｃ】
2016013981.tif 000053
【図７Ｄ】
2016013981.tif 000054
【図７Ｅ】
2016013981.tif 000055
【図８】
2016013981.tif 000056
【図９】
2016013981.tif 000057
【図１０】
2016013981.tif 000058
【図１１】
2016013981.tif 000059
【図１２】
2016013981.tif 000060
【図１３】
2016013981.tif 000061
【図１４】
2016013981.tif 000062
【図１５】
2016013981.tif 000063
【図１６】
2016013981.tif 000064
【図１７】
2016013981.tif 000065
【図１８】
2016013981.tif 000066
【図１９】
2016013981.tif 000067
【図２０】
2016013981.tif 000068