(57)【要約】【課題】主としてタンパク質へのカルボニル化・酸化変性、および、脂質・核酸を含む各種生体成分への酸化障害を起こす２．４−ノナジエナール、２−ヒドロキシノネナールやアクロレインなどのフォルミル基含有物質から細胞を保護するγ-グルタミン酸オリゴマーを含有する細胞保護剤。そして、その細胞保護剤を含有する皮膚抗老化外用剤の提供を課題とする。【解決手段】フォルミル基を主とするカルボニル化合物からの細胞保護剤として、γ-ポリグルタミン酸の加水分解で得られるγ-グルタミン酸オリゴマーを含有させることで、生体内や環境中で発生した２．４−ノナジエナール、２−ヒドロキシノネナールやアクロレインなどのフォルミル基含有物質が原因となる障害から細胞を守る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
γ-グルタミン酸オリゴマーを含有することを特徴とする、フォルミル基含有物質からの細胞障害を防御する細胞保護剤。
【請求項２】
フォルミル基含有物物質が２，４−ノナジエナールである請求項１の細胞保護剤。
【請求項３】
γ-グルタミン酸オリゴマーの分子量が４５０〜９０００である請求項１または２の細胞保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ-グルタミン酸オリゴマーを含有することで、フォルミル基含有物質が原因となる細胞障害から細胞を防御することを特徴とする細胞保護剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、老化を抑制する抗老化剤としては、種々のものが開発されている。このような生体の老化は、２つの生物学的要因により起こることが知られている。１つは生理的老化で、他の１つは紫外線等の暴露部に生じる光老化と呼ばれるものである。生理的老化は、生体内で生成した活性酸素が影響し、血管や皮膚の主な構成因子であるコラーゲン線維の変性や生理機能に係わりの深い酵素の変質による活性の低下などに関わる。光老化に関して、紫外線の暴露が原因であるため皮膚に限られる。
【０００３】
生理的老化において、活性酸素種を除去することが主に検討され、スーパーオキサイドアニオン、ヒドロキシルラジカル、一重項酸素、パーオキシナイトライト等に対する除去剤が提示されている。近年、活性酸素以外の老化因子として２−ヒドロキシノネナール、アクロレインや２，４−ノナジエナールなどのフォルミル基含有物質の関与が注目され、それに対する除去剤も提示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００８−２４６００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、上記の如く皮膚の老化に関与する２−ヒドロキシノネナール、アクロレインや２，４−ノナジエナールなどのフォルミル基含有物質は、タンパク質のアミノ基と結合し、酵素などの本来の機能を喪失させてしまい、細胞を死に至らしめてしまう。このようなフォルミル基含有物質から細胞を保護作用持つ成分を提供し、それを含有する皮膚抗老化外用剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記事情を鑑み、本発明者等が鋭意検討を行った結果、γ-グルタミン酸オリゴマーが皮膚の老化の原因となる２−ヒドロキシノネナール、アクロレインや２，４−ノナジエナールなどのフォルミル基含有物質から細胞を保護する作用が著しいことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
即ち、本発明はγ-ポリグルタミン酸を酵素や酸を用いて加水分解したγ-グルタミン酸オリゴマーからなり、２−ヒドロキシノネナール、アクロレインや２，４−ノナジエナールなどのフォルミル基含有物質から細胞を保護する細胞保護剤である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の細胞保護剤は、γ-ポリグルタミン酸を酵素や酸で加水分解したγ-グルタミン酸オリゴマーを、フォルミル基含有物質からの細胞保護剤として化粧料に配合することにより、肌に塗布した際に皮膚に優れた美容効果を期待できる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、γ-ポリグルタミン酸を酵素や酸を用いて加水分解したγ-グルタミン酸オリゴマーからなる。基質となるグルタミン酸の重合物であるポリグルタミン酸は納豆菌などが生産する粘性物質として知られており、天然物として安全性に優れ、化粧料の特徴的な使用感を奏でるために配合される。
【００１０】
ポリグルタミン酸を酵素や酸で加水分解した低分子ポリグルタミン酸は、分子量を小さくすることで皮膚への浸透性を高めることが可能となる。そして、皮膚中でヒアルロン酸を分解するヒアルロニダーゼの活性を抑えることでヒアルロン酸を保護し、皮膚の保湿能の低下を抑える。さらに、グルタミン酸オリゴマーは表皮細胞に働きかけヒアルロン酸の合成能力を向上させることも報告されている。
【００１１】
また、本発明に係る細胞保護剤の各種皮膚外用剤に対する配合量は、皮膚外用剤の実施態様、皮膚外用剤の使用形態等に応じて変動させることができるので特に限定されない。原則的には、有効量存在すれば良いことになるが、一般的には組成物中、乾燥重量に換算して０． ０１〜１００質量％が利用でき、好ましくは１．０〜２０質量％ 、更に好ましくは３．０〜１０．０質量％ である。特に、用時調製のパウダー状の製剤等は、この本願発明に係る細胞保護剤が１００質量％を含めた高配合率で利用されることが想定できる。
【００１２】
本発明に係る皮膚外用剤の適用範囲は、特に限定されない。つまり、この発明の有効成分が有する作用効果に応じて、各作用効果を利用できる全ての皮膚外用剤に適用できる。
【００１３】
例えば、本発明に係る細胞保護剤を各種皮膚外用剤基剤等に配合して、クリーム、乳液、化粧水、パック剤、洗顔料等に対して適用できる。また、前記各種皮膚外用剤の実施態様は、ローション、エマルジョン、軟膏、ゾル、ゲル、パウダー、スプレー、固形等の各種態様で適用できる。
【００１４】
更に、本発明に係る細胞保護剤は分子量が小さく、酸性アミノ酸のオリゴマーであるためマイナスの電荷を帯びている。そのため、カルボニル化合物から細胞保護剤を配合した皮膚外用剤を皮膚に塗布し、イオン導入の処置を行うことにより速やかに皮膚深部へ目的物を届けることが可能となる。
【００１５】
以下、本発明の実施形態について詳述する。
【実施例】
【００１６】
[実施例１：γ-グルタミン酸オリゴマーの製造]
ｐＨ７．１に調製した０．０１Ｍリン酸緩衝液に、γ-ポリグルタミン酸（分子量１万〜１０万）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度となるよう、溶解し、γ-グルタミン酸デポリメラーゼ２０μｇ／ｍＬをそれぞれ添加して、２５℃で反応させた。γ-ポリグルタミン酸がγ-グルタミン酸デポリメラーゼによる酵素分解によって露出するα-アミノ基を、ＴＮＢＳモニター（東京化成工業、Ｔ２０２４）により、計測し、適正な酵素分解時間を検討した。結果として、反応時間約３０時間で５〜７量体のγ-グルタミン酸オリゴマーが、４．６５ｗｔ％得られた。
【００１７】
なお、γ-グルタミン酸オリゴマーの定量分析は、ＨＴＬＣ（高性能薄層クロマトグラフィ）および、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィ）によるアミノ酸分析によって実施した。ＨＴＬＣは、シリカゲルプレート (ＴＬＣ―Ｐｌａｓｔｉｃ  ｓｈｅｅｔｓ  ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，Ｍｅｒｃｋ社製)を用いて、展開溶媒としてｎ−Ｂｕｔｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ：Ａｃｅｔｉｃａｃｉｄ：Ｈ２Ｏ＝３：２：１（ｖ ／ ｖ）を用い、ニンヒドリン試薬で発色して検出した。
【００１８】
アミノ酸分析によるγ-グルタミン酸オリゴマーの検出は、ＨＰＬＣ装置（ＬＣ−９Ａ、島津製作所製)、および、アミノ酸分析用カラムとして、強酸性陽イオン交換樹脂カラムＳｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＩＳＣ−０７型を用い、反応試薬としてο-フタルアルデヒドを用いて、励起波長＝３４８ｎｍ, 蛍光波長＝４５０ｎｍによる蛍光測定によって定量した。γ -グルタミン酸ポリマーに、セタブロン（セチルトリメチルアンモニウムブロミド；ＣＥＴ）を添加した複合体の濁度を６６０ｎｍで測定し、γ-グルタミン酸ポリマーの濃度を算出した。
【００１９】
[実施例２：２，４−ノナジエナールによるヒト皮膚細胞死に対する防御作用]
つづいて、上記実施例１において製造したγ-グルタミン酸オリゴマー（重量分子量６６０〜１９５０）と比較対象としてのγ-ポリグルタミン酸（重量分子量１万〜１０万）とで２，４−ノナジエナールによるヒト皮膚細胞死に対する防御作用について比較した。
【００２０】
下準備として、ヒト皮膚角化細胞ＨａＣａＴをＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ の１０％牛胎児血清含有培地において、５％炭酸ガス、３７℃で１００％湿度の条件下、２４ウェルマルチプレート中で培養した。そして、６０μＭ２，４‐ノナジエナールを加え、γ-グルタミン酸オリゴマーまたはγ-ポリグルタミン酸をそれぞれｐＨ中和して、無投与及び濃度が３重量％、６重量％、１０重量％となるように細胞に投与し、７２時間培養を行った。それぞれの試料はｎ=４で行った。２，４‐ノナジエナール処理を行わず、γ-グルタミン酸も投与しない群をコントロールとして同様に培養した。
【００２１】
細胞内ミトコンドリア脱水素酵素活性によるテトラゾリウム還元に伴って生じるフォルマザンを計測するために、（ｐｈｅｎｙｌ）−５−（２−ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ, ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔを酸化還元指示薬として用いて計測し、吸光マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでの吸光度を測定して細胞生存率を算出した。２，４−ノネジエナールの処理を行わない群を１００％として他の群の生存率を表した。
【００２２】
結果を表1に示した。結果において、２，４−ノナジエナールで処理した群は、未処理と比較して２２．７％まで落ちているが、未処理のγ-ポリグルタミン酸では未投与の群に比べて生存率はわずかに高く、２，４−ノネジエナールの細胞に対する障害からわずかな防御作用がみられた。それに対して、γ-グルタミン酸オリゴマーは濃度依存的に生存率は高くなり、２，４−ノネジエナールの細胞に対する障害から強い防御作用を示すことを確認できた。
【００２３】
【表１】
2016222567.tif 000002
[実施例３：イオン導入効率の比較]
【００２４】
上記実施例１において製造したγ-グルタミン酸オリゴマー（重量分子量６６０〜１９５０）と、比較対象としてのγ-ポリグルタミン酸（重量分子量１万〜２０万）とでイオン導入効率について比較した。
【００２５】
試験方法としては、まず、ヒト皮膚再構成組織として（角質層 + 表皮:角化細胞 + 真皮:繊維芽細胞)を作製する。具体的には、改変ブロノフ拡散チェンバー内において、Ｉ型コラーゲンゲルの中にヒト皮膚繊維芽細胞ＯＵＭＳ−３６を播種し、次いで、ＩＶ型コラーゲン含有再構成基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌを塗布して、その上にヒト皮膚角化細胞ＨａＣａＴを重層し、その後Ａｉｒ  Ｌｉｆｔして表層部分の細胞に対して穏やかに乾燥細胞死を起こさせて角質層を形成させて３次元皮膚組織モデルを作製した。
【００２６】
続いて、試料サンプルを含浸させたパッドを作製した３次元皮膚組織モデル含有改変ブロノフ拡散チェンバーに載置し、そこにマイナス電極端子を接触させ、３次元皮膚組織モデルを含む改変ブロノフ拡散チェンバーのハウジングをボイデン二重拡散チェンバーの底にプラス電極端子を接続して電気サーキットを形成した。そして、回路途中にマルチメータを介在させた。
【００２７】
上記両電極端子を有するイオン導入器により、エリプソイド波形の１５００Ｈｚ、０．４ｍＡで８分間イオン導入する。その後、３次元皮膚組織モデルをハウジングから切り出して、ＥＤＴＡ/コラゲナーゼを穏やかに作用させ、表皮層と真皮層に分かれた各層をＰＢＳ（−）で３回リンスし、粉砕後、冷却しつつ遠心し、上清を収集する。さらに沈殿物をＰＢＳ（−）に懸濁して、再度遠心し、再度上清を採取して、最初の上清と合一した。
【００２８】
その上清をＨＴＬＣ及びＨＰＬＣにより定量分析したところ、γ-グルタミン酸オリゴマーでは表皮３６．７±８．０ μｇ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ、真皮９．１±３．３ μｇ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ、高分子γ-グルタミン酸オリゴマーでは表皮８．５±２．４μｇ／ｇ ｔｉｓｓｕｅ、真皮１．７±０．２μｇ／ｇ ｔｉｓｓｕｅという結果が得られた（表２参照）。この結果から、本発明のγ-グルタミン酸オリゴマーは、γ-ポリグルタミン酸よりも、イオン導入効率が著しく向上することがわかった。
【００２９】
【表２】
2016222567.tif 000003
【００３０】
以下に本発明の処方例を挙げる。
＜ 処方例１ ＞ 化粧水
（ 成分名）                                                 （ 質量％ ）
γ-グルタミン酸オリゴマー                                     ２．０
グリセリン                                                    ５．０
ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ ２０Ｅ０）       １．５
エタノール                                                    ８．０
クエン酸トリエチル                                            ２．０
防腐剤・酸化防止剤                                            適量
精製水                                                        残部
【００３１】
＜処方例２＞ 化粧用クリーム
（成分名）                                               （ 質量％ ）
γ-グルタミン酸オリゴマー                                      ５．０
ミツロウ                                                       ２．０
ステアリルアルコール                                           ５．０
ステアリン酸                                                   ８．０
スクワラン                                                   １０．０
自己乳化型グリセリルモノステアレート                           ３．０
ポリオキシエチレンセチルエーテル（ ２ ０ Ｅ ． ０ ）           １．０
グリセリン                                                     ５．０
水酸化カリウム                                                 ０．３
香料                                                            適量
防腐剤・酸化防止剤                                              適量
精製水                                                          残部
【００３２】
＜処方例３＞ 乳液
（成分名）                                                 （ 質量％ ）
γ-グルタミン酸オリゴマー                                     １．０
スクワラン                                                    ８．０
ワセリン                                                      ２．０
ミツロウ                                                      ０．５
ソルビタンセスキオレエート                                    ０．８
ポリオキシエチレンオレイルエーテル（ ２ ０ Ｅ ． ０ ）        １．２
カルボキシビニルポリマー                                      ０．２
グリセリン                                                    １．５
水酸化カリウム                                                ０．１
エタノール                                                    ７．０
香料                                                          適量
防腐剤・酸化防止剤                                            適量
精製水                                                        残部
【００３３】
＜処方例４＞ パック剤
（成分名）                                                 （ 質量％ ）
γ-グルタミン酸オリゴマー                                      ０．５
酢酸ビニル樹脂エマルジョン                                   １５．０
ポリビニルアルコール                                         １０．０
ホホバ油                                                       ３．０
グリセリン                                                     ５．０
酸化チタン                                                     ８．０
カオリン                                                       ７．０
エタノール                                                     ５．０
香料                                                            適量
防腐剤・酸化防止剤                                              適量
精製水                                                          残部
【００３４】
＜処方例５＞ 軟膏
（成分名）                                                 （ 質量％ ）
γ-グルタミン酸オリゴマー                                    ０．０１
酢酸トコフェロール                                             ０．５
パラジメチルアミノ安息香酸オクチル                             ４．０
ブチルメトキシベンゾイルメタン                                 ４．０
ステアリルアルコール                                         １８．０
モクロウ                                                     ２０．０
グリセリンモノステアリン酸エステル                             ０．３
ワセリン                                                     ３３．０
香料                                                            適量
防腐剤・酸化防止剤                                              適量
精製水                                                          残部