(57)【要約】【課題】従来の電気化学的測定と比較してさらに簡便かつ高感度（100pg/ｍLオーダー）にエンドトキシンの濃度を測定可能な手段を提供する。【解決手段】試料中に含まれるエンドトキシンの濃度を測定する方法であって、（1）第一のエンドトキシン認識分子を固定化した担体に試料を接触させ、試料中のエンドトキシンを担体に捕捉・濃縮する工程、（2）重金属化合物と第二のエンドトキシン認識分子を含むエンドトキシン認識プローブを担体に接触させ、担体上のエンドトキシンにエンドトキシン認識プローブを捕捉する工程、（3）エンドトキシン認識プローブに酸性溶液を反応させ、プローブの重金属化合物から重金属イオンを溶出する工程、および（4）重金属イオンを測定する作用電極を用いて、溶出した重金属イオン量を電気化学的に測定する工程を含み、重金属イオン量を指標として試料中のエンドトキシン濃度を測定する。【選択図】 図１
2016151482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中に含まれるエンドトキシンの濃度を測定する方法であって、以下の工程、
（1）第一のエンドトキシン認識分子を固定化した担体に試料を接触させ、試料中のエンドトキシンを担体に捕捉・濃縮する工程、
（2）重金属化合物と第二のエンドトキシン認識分子を含むエンドトキシン認識プローブを担体に接触させ、担体上のエンドトキシンにエンドトキシン認識プローブを捕捉する工程、
（3）エンドトキシン認識プローブに酸性溶液を反応させ、プローブの重金属化合物から重金属イオンを溶出する工程、および
（4）重金属イオンを測定する作用電極を用いて、溶出した重金属イオン量を電気化学的に測定する工程、
を含み、重金属イオン量を指標として試料中のエンドトキシン濃度を測定することを特徴とするエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項２】
200pg/mL以上の濃度のエンドトキシンを測定可能である請求項１のエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項３】
エンドトキシン認識分子が、ポリεリジン、ポリαリジン、ポリミキシンB、セチルピリニジウム、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリエチレンイミンおよびポリアリルアミンからなる群より選択される少なくとも一種であり、第一のエンドトキシン認識分子と第二のエンドトキシン認識分子は同一または別種である請求項１または２のエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項４】
エンドトキシン認識プローブの重金属化合物が、重金属錯体化合物である請求項１または２のエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項５】
重金属錯体化合物中の重金属が、亜鉛、銀、銅、カドミウム、ニッケル、コバルト、鉛、セレンまたはインジウムである請求項４のエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項６】
作用電極がsp3カーボン結合を40％以上有し、重金属イオンを還元堆積および酸化溶出反応に基づいた電気化学反応によって測定するのに十分な広い電位窓を還元側に有するカーボン薄膜である請求項１または２のエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項７】
カーボン薄膜が、ボロンドープダイヤモンド薄膜、導電性ダイヤモンドライクカーボン薄膜またはスパッタカーボン薄膜である請求項６のエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項８】
エンドトキシンが、内毒素、リポ多糖、発熱物質およびパイロジェンからなる群より選択される少なくとも一種である請求項１から7のいずれかのエンドトキシン濃度測定方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかのエンドトキシン濃度測定方法を実施するためのキットであって、第一のエンドトキシン認識分子を固定化した担体、重金属化合物と第二のエンドトキシン認識分子を含むエンドトキシン認識プローブおよび酸性溶液を含むことを特徴とするエンドトキシン濃度測定キット。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかのエンドトキシン濃度測定方法を実施するためのデバイスであって、第一のエンドトキシン認識分子を固定化した担体と作用電極を備えた電気化学セル、電極への電圧印加手段および電流測定手段を含むことを特徴とするエンドトキシン濃度測定デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、グラム陰性菌が有するエンドトキシンの濃度測定方法とこの方法を実施するためのキットおよびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンは、大腸菌やサルモネラ菌をはじめとするグラム陰性菌の外膜を構成している毒性物質の総称であり、その本体はリポ多糖（Lipopolysaccharide；LPS）である。
【０００３】
エンドトキシンは、医薬品の生産プロセス中に生息する細菌が破壊（死滅・溶菌）することによって遊離し、医薬品に混入する可能性がある。例えば、輸液や注射製剤等の非経口医薬品は、主に発酵技術や遺伝子組換え技術により製造されており、製造工程において宿主細胞壁成分からの混入が懸念される。エンドトキシンは、極微量（たとえば、ng/mLオーダー）でも血液中に混入すると、発熱作用、ショック死、血管内血液擬固、または敗血症等を引き起こす。そのため、これらの製剤中のエンドトキシン含有量は法的に規制されており、これら医薬品の安全性を確保する上でエンドトキシン含有量を、簡便かつ高感度に測定することは必須となっている。
【０００４】
エンドトキシンの濃度測定、定量方法としては、リムルス試験が主流となっている。このリムルス試験は、カブトガニの血球抽出液がエンドトキシンにより凝固する現象を利用したものである。リムルス試薬の凝固反応は、哺乳類の血液擬固系に類似したカスケード反応で起こる。したがって、少量のエンドトキシンのシグナルを増幅して擬固が引き起こされるもので、非常に高感度な測定系である（たとえば、特許文献１参照）。最近では、遺伝子改変されたルシフェラーゼと発光合成基質を使用し、その発光量から試料中のエンドトキシン濃度を測定する方法も開発されている（たとえば、特許文献２参照）。
【０００５】
しかしながら、上記のような従来のリムルス試験およびリムルス試験を基にした測定方法は、測定装置および試薬ともに高価であり、オンサイト測定が困難であった。また、多段階にわたる反応を経る凝固過程の経時変化を測定原理としていることからも明らかなように、特に低濃度のエンドトキシンほどその凝固時間（測定時間）を要すること、さらには測定者間により測定値にばらつきが生じること等の問題があった。
【０００６】
ところで、試料中の目的成分の定量法において、簡便かつ高感度な測定方法としては電気化学的な測定方法がある。この方法では、溶液中の目的成分あるいは目的成分の濃度変化に対応して濃度が変化する特定成分について、その濃度あるいは濃度変化を電極上での電流信号として変換、出力することを特徴としている。
【０００７】
上記のような背景から、本発明は、リムルス試験に替わる新規なエンドトキシンの測定法として、簡便かつ高感度化の目標に最適の方法である電気化学的手法による簡便かつ高感度なエンドトキシンの測定法を提供するものである。しかしながら、測定対象であるエンドトキシンを構成する主要成分は多糖類と脂質類であり、それら自体は何ら電気化学的な活性を示さないため、本発明者らは、エンドトキシンを認識するボロン酸やポリミキシンBを導入した可逆的酸化還元能を持つ化合物を開発し、これがエンドトキシンと錯体形成を起こすこと、そのため結果的にその変化を引き起こすエンドトキシン量を定量的、かつ簡便、高選択的に電気化学的手法によって測定できることを見いだした（特許文献３、非特許文献１、２）。上記特許文献３、非特許文献１および２に記載の測定方法は、エンドトキシンの電気化学的測定を可能とし、ボロン酸およびその誘導体を使用した場合、検出限界濃度が100〜500ng/mLであり、ポリミキシンB使用時で検出限界濃度が50ng/mLと優れた測定方法であった。最近さらなるエンドトキシンの濃度測定の検出感度向上を目指し、以下に示す新たな検出方法を提案した（特許文献４、非特許文献３）。すなわち、（１）第一のエンドトキシン認識分子を固定化した電極上にエンドトキシンを添加し、電極上でエンドトキシンを捕捉する工程、（２）エンドトキシンを捕捉した電極に、可逆的酸化還元物質または可逆的酸化還元物質を生成可能な酵素のいずれかで修飾された第二のエンドトキシン認識分子を添加し、第二のエンドトキシン認識分子を捕捉する工程、（３）電極に電圧を印加した際の電流変化を測定し、電極上に濃縮された可逆的酸化還元物質量もしくは濃縮された酵素により生成する可逆的酸化還元物質量に基づく測定値からエンドトキシンの濃度を測定する工程からなるエンドトキシンの電気化学測定法である。しかしながら、上記特許文献４、非特許文献３の方法では1.67〜2ng/mL程度のエンドトキシンまで測定が可能な電気化学測定方法であるが、ng/mLオーダーで敗血症等を引き起こすエンドトキシンの測定方法としては、さらなる検出感度の向上が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平06-324047号公報
【特許文献２】国際公開2009/063840号パンフレット
【特許文献３】特開2007-093378号公報
【特許文献４】特開2014-52224号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 1527-1531
【非特許文献２】Biosensors and Bioelectronics 26 (2011) 2080-2084
【非特許文献３】Electroanalysis 26 (2014) 618-624
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上のとおりの背景から、本発明は、従来の電気化学的測定よりもさらに簡便かつ高感度にエンドトキシンの濃度を測定することのできる方法と、この方法を実施するためのエンドトキシン濃度測定キットおよびデバイスを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、先に述べた電気化学的なエンドトキシンの測定方法の開発（特許文献３、４）を踏まえて、鋭意研究したところ、エンドトキシンを高選択的に認識する第一のエンドトキシン認識分子が修飾された微粒子などの担体表面に、試料中のエンドトキシンを捕捉・濃縮した後に、電気化学シグナルを得ることのできる重金属化合物が修飾されたエンドトキシン認識プローブを捕捉・濃縮させ、最終的には捕捉されたプローブから溶出させた重金属イオンを堆積・脱離可能な電極上で測定することで、エンドトキシンの濃度が電気化学シグナル量から求められることを見いだし、本発明を完成したものである。本発明では、エンドトキシンの微粒子担体表面上への濃縮、ならびに重金属イオンの電極上への濃縮という二段階の濃縮過程の組合せと、最終的に重金属イオンを低濃度まで安定に測定可能な作用電極（例えば、カーボン電極：特許4513093号）によって、低濃度のエンドトキシンに対しても電気化学応答を増幅させ高感度で測定することが可能になるものである。
【００１２】
すなわち、本願発明は、前記の課題を解決するための第１の発明として、試料中に含まれるエンドトキシンの濃度を測定する方法であって、以下の工程、
（1）第一のエンドトキシン認識分子を固定化した担体に試料を接触させ、試料中のエンドトキシンを担体に捕捉・濃縮する工程、
（2）重金属化合物と第二のエンドトキシン認識分子を含むエンドトキシン認識プローブを担体に接触させ、担体上のエンドトキシンにエンドトキシン認識プローブを捕捉する工程、
（3）エンドトキシン認識プローブに酸性溶液を反応させ、プローブの重金属化合物から重金属イオンを溶出する工程、および
（4）重金属イオンを測定する作用電極を用いて、溶出した重金属イオン量を電気化学的に測定する工程、
を含み、重金属イオン量を指標として試料中のエンドトキシン濃度を測定することを特徴とするエンドトキシン濃度測定方法を提供する。
【００１３】
このエンドトキシン濃度測定方法は、200pg/mL以上の濃度のエンドトキシンを測定可能である。
【００１４】
このエンドトキシン濃度測定方法における態様の一つは、エンドトキシン認識分子が、ポリεリジン、ポリαリジン、ポリミキシンB、セチルピリニジウム、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリエチレンイミンおよびポリアリルアミンからなる群より選択される少なくとも一種であり、第一のエンドトキシン認識分子と第二のエンドトキシン認識分子は同一または別種である。
【００１５】
別の態様は、エンドトキシン認識プローブの重金属化合物が、重金属錯体化合物であり、この重金属錯体化合物中の重金属が、亜鉛、銀、銅、カドミウム、ニッケル、コバルト、鉛、セレンまたはインジウムである。
【００１６】
また別の態様は、作用電極がsp3カーボン結合を40％以上有し、重金属イオンを還元堆積および酸化溶出反応に基づいた電気化学反応によって測定するのに十分な広い電位窓を還元側に有するカーボン薄膜であり、さらにはこのカーボン薄膜が、ボロンドープダイヤモンド薄膜、導電性ダイヤモンドライクカーボン薄膜またはスパッタカーボン薄膜である。
【００１７】
以上のエンドトキシン濃度測定方法において、エンドトキシンは、内毒素、リポ多糖、発熱物質およびパイロジェンからなる群より選択される少なくとも一種である。
【００１８】
第２の発明は、前記のエンドトキシン濃度測定方法を実施するためのキットであって、第一のエンドトキシン認識分子を固定化した担体、重金属化合物と第二のエンドトキシン認識分子を含むエンドトキシン認識プローブおよび酸性溶液を含むことを特徴とするエンドトキシン濃度測定キットである。
【００１９】
第３の発明は、前記のエンドトキシン濃度測定方法を実施するめのデバイスであって、第一のエンドトキシン認識分子を固定化した担体と作用電極を備えた電気化学セル、電極への電圧印加手段および電流測定手段を含むことを特徴とするエンドトキシン濃度測定デバイスである。
【発明の効果】
【００２０】
本発明のエンドトキシンの濃度測定方法、濃度測定キットおよび濃度測定デバイスによれば、電気化学的測定を活用して、使用者の熟練度を問わずに、簡便かつ高感度（ng/mLオーダー以下）でエンドトキシンの濃度を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本願発明におけるエンドトキシンの濃度測定方法の原理を示した概念図である。
【図２】実施例１において、スパッタカーボン薄膜電極を作用電極として用いて、様々な濃度の亜鉛イオンを測定した際の矩形波ボルタモグラムを示す。また、図２（b）は、図２（a）のボルタモグラムから得られたピーク電流値と亜鉛イオン濃度との関係を示す図である。
【図３】実施例２において、スパッタカーボン薄膜電極を作用電極として用いて、ETクリーンs上にエンドトキシンを含む試料溶液を作用させ、続いてエンドトキシン認識プローブを捕捉した後に、亜鉛イオンを溶出した溶液を測定した際のエンドトキシン濃度と応答電流値の関係を示したグラフである。
【符号の説明】
【００２２】
１  エンドトキシン認識微粒子とエンドトキシン認識プローブを用いた測定系
２  担体
３  第一のエンドトキシン認識分子
４  エンドトキシン
５  エンドトキシン認識プローブ
６  電極
７  重金属イオン
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本願発明は、電気化学的測定方法による、試料中に含まれるエンドトキシンの濃度測定方法である。本願発明のエンドトキシンの濃度測定の原理を以下に説明する。また、図１に、本願発明におけるエンドトキシンの濃度測定方法の原理を概略図として例示した。
【００２４】
図1に例示したように、本発明は、第一のエンドトキシン認識分子（３）を化学架橋固定した担体（２）をエンドトキシン（４）の捕捉材として用いる。本発明の担体は、第一のエンドトキシン認識分子を固定化する事が出来れば、その様態に制限はなく、球状・不定形の粒子、微粒子でも良く、繊維状、膜状、平板状、柱状でも良い。また担体は、多孔質であっても良く、無孔質であっても良い。入手の用意さを考慮すれば、免疫測定用の微粒子、球状やモノリス状のクロマトグラフィー用担体、フィルター、繊維などが好ましく利用できる。担体（２）にエンドトキシン試料を添加し、捕捉する。次にここへ重金属化合物部位を有するエンドトキシン認識プローブ（５）を作用させ、エンドトキシン（４）へ捕捉させる。この時、担体（２）へ捕捉されたエンドトキシン（４）の量に応じて、エンドトキシン認識分子プローブ（５）が捕捉される。続いて、プローブ（５）が捕捉された担体（２）に酸溶液を添加することで、プローブ（５）中から重金属を重金属イオン（７）として溶出させる。重金属イオン（７）を含有している溶出液を所定の緩衝液に添加し、該重金属イオン（７）の電気化学測定が可能な作用電極（６）を用い、溶出液中の重金属イオン濃度を定量する。ここで重金属イオンの電気化学測定とは、アノーディックストリッピングボルタンメトリー(ASV)法である。ASV法は金属イオンを電極上に一度還元堆積させ、堆積した金属を酸化させる際に得られる酸化電流値を検出する分析法であり、非常に高感度な分析手法でありながら、安価で測定装置の小型化が可能であり、オンサイト分析に適した分析法である。
【００２５】
したがって、既知のエンドトキシン量とそれに応じ捕捉されたエンドトキシン認識プローブ中の重金属化合物を構成する重金属イオン量との間で検量線を作成し、該重金属イオンを測定すれば、試料中のエンドトキシンの量を知ることが可能となる。
【００２６】
本発明は、基本的には電子の授受により生ずる、電極に流れる電流を測定することにより重金属イオンの量を測定して、エンドトキシン量を把握するものであるが、この測定電流は電極表面への重金属イオンの堆積（濃縮）過程を経る。したがって、エンドトキシン上に捕捉されたエンドトキシン認識プローブすなわち重金属成分が微量であっても、重金属イオンの電極表面への濃縮効果が含まれており、これにより高感度でエンドトキシン量を測定し得る点に特徴を有する。
【００２７】
これら一連の反応は、エンドトキシン認識分子を固定化した担体表面への濃縮に加え、エンドトキシン認識プローブを構成する重金属イオンの作用電極上への堆積濃縮によって可能となったものであり、従来の液相でのエンドトキシンの濃度測定方法では実現不可能であった測定濃度の検出限界の向上をもたらすものである。
【００２８】
本願発明において利用される電極の材質としては特に制限はないが、最終的な重金属イオンをASV測定可能な広い電位窓を有する電極素材の観点から、カーボン系の材料が好都合に使用される。
【００２９】
また、担体表面に固定する第一のエンドトキシン認識分子は主に、タンパク質、ポリペプチド、ポリアミノ酸、核酸から構成される生体分子やポリカチオン合成分子であり、具体的には、ポリεリジン、ポリαリジン、ポリミキシンB、セチルピリジニウム、LPS結合タンパク質、エンドトキシン中和タンパク質、抗LPS抗体、ポリペプチド、オリゴペプチド、オリゴヌクレオチド（アプタマー）、ポリエチレンイミン、ポリアリルアミンのように、エンドトキシンと特異的に結合する能力を持つ認識分子を使用することができる。上述のポリεリジンのLPSに対する特異的吸着性については、例えば特開2002-263486およびAnalytical Biochemistry 385 (2009) 368-370に記載されている。
【００３０】
本発明において使用される、第二のエンドトキシン認識分子と重金属化合物から構成されるエンドトキシン認識プローブにおいて、プローブを構成する第二のエンドトキシン認識分子としては、上述したエンドトキシン認識能を有する物質群のうち少なくとも一種から構成される分子を適宜に使用することができる。また、上記エンドトキシン認識プローブを構成する重金属化合物としては、溶出した重金属イオンが最終的に電極上で堆積、脱離反応が進み、電気化学測定が可能な重金属種であれば特に制限はないが、安定で、安価なものが好都合に利用される。具体的には、重金属化合物を合成、形成しやすい亜鉛、ニッケル、銅などが配位された金属錯体（例えば、ピコリル基等の配位子と重金属から成る錯体）や、ナノ粒子を形成可能な銀や、カドミニウム、鉛、亜鉛、セレン、インジウムなどから構成される量子ドット、ニッケル、亜鉛、銅などの重金属などと配位結合を形成可能なヒスチジン残基からなるペプチド残基（His-tag）などが適宜利用できる。さらに、本発明において使用される重金属としては、毒性が比較的低く安全に使用できる観点から、亜鉛、銀、銅、コバルト、セレンなどがより好ましく使用できる。一例として、重金属化合物であるジピコリルアミン−亜鉛錯体とエンドトキシン認識分子である臭化セチルピリジニウムから構成されるエンドトキシン認識プローブの構造式を示す。
【００３１】
【化１】
2016151482.tif 000003
【００３２】
次に、本発明の一実施形態について、一例を挙げて詳細に説明する。ここではスパッタカーボン薄膜を例に説明する。まず、第一のエンドトキシン認識分子であるポリεリジンをセルロース微粒子（直径40-130μm）上に化学架橋固定したエンドトキシン捕捉微粒子（ETクリーンs、JNC(株)製）にエンドトキシン試料を滴下し、エンドトキシンをETクリーンs表面に捕捉する。次に、第二のエンドトキシン認識分子である臭化セチルピリジニウムと重金属化合物であるジピコリルアミン−亜鉛錯体から構成されるエンドトキシン認識プローブを作用させ、エンドトキシン上へさらに捕捉させる。この時、エンドトキシンの量に応じて、エンドトキシン認識プローブが捕捉される。ここへ酸溶液を添加し、吸着したプローブ中の亜鉛を亜鉛イオンとして溶出させ、溶出液を回収する。このような処理を施した亜鉛イオンを含有する試料溶液を適当な緩衝液中に添加し、ここに作用電極と、適当な対向電極、参照電極と組み合わせて、電気化学測定を行うことで、エンドトキシン量に応じて捕捉された亜鉛イオンの酸化電流値が得られる。
【００３３】
微粒子担体表面上に捕捉されたエンドトキシンに作用させるエンドトキシン認識プローブの濃度に特に制限はないが、明瞭な電流応答を与え得る濃度として1-100 μmol/L 程度が好都合である。また、使用する緩衝液の種類とそのpHについては、使用するプローブ中の重金属イオンが溶出後に緩衝液を構成する分子と錯体を形成し電極へ堆積しやすい電解質とpHを有する緩衝液の使用が好ましい。例えば上記亜鉛錯体を有するエンドトキシン認識プローブを使用する場合においては、弱アルカリ性のpH8.0、濃度10-100 mmol/Lのアンモニア緩衝液が好都合に用いられる。
【００３４】
具体的には、エンドトキシン認識プローブとして亜鉛錯体を有するエンドトキシン認識プローブを用いた場合、pH 8.0でASV測定を行うと、電極上で以下の反応が生ずる。
（ａ）Zn2+ + 2e → Zn（電極上への堆積反応）
次に、電極上へ正の電圧を印加すると、以下の酸化反応が生ずる（金属の脱離反応）。
（ｂ）Zn→ Zn2+ + 2e
この時に、上記反応式(b)中ｅの量、つまり電極における電流は、試料中に存在する亜鉛イオン、ならびに、(a)の堆積反応に要する作用電極への印加電圧、印加電圧時間に依存する。
【００３５】
すなわち、電極表面に濃縮、堆積された亜鉛が脱離反応を起こす際に酸化電流を与える。このときの酸化電流は電極表面に堆積された亜鉛量にほぼ比例する。したがって、試料中のエンドトキシン濃度の増加に応じて、電極表面に堆積される亜鉛量が増加するため、得られる電流も増加する。いいかえれば、電流の増加の度合いから、存在するエンドトキシンの量（濃度）を把握することが出来る。
【００３６】
前記実施形態では、亜鉛錯体−臭化セチルピリジニウムの組合せによる例を説明したが、もちろん、亜鉛錯体−LPS認識ペプチド、あるいは他の重金属化合物−LPS認識ペプチドなど、ASV測定が可能な重金属化合物とLPS認識分子から構成される他のプローブの組み合わせでもよい。
【００３７】
また、本願発明における測定対象となるエンドトキシンは、特に限定されるものではないが、例えば、内毒素（細胞壁の成分であり積極的には分泌されない毒素）、リポ多糖、発熱物質およびパイロジェンの少なくともいずれかであると、より効率よく測定できる。
【００３８】
本願発明のエンドトキシンの測定キットならびにデバイスは、少なくともエンドトキシン認識分子を固定化した微粒子や基板などの固相担体と測定用作用電極を備えている電気化学セル、エンドトキシン認識プローブ、重金属を抽出するための酸試薬、重金属を測定するための緩衝液とを具有していることを特徴としている。さらに、洗浄液、ｐＨ調整剤、電流測定装置、フローセル構築のポンプ等、本発明の測定系を構築するための部材あるいは試薬等を組み合わせて測定キットやデバイスとしてもよい。
【００３９】
上記のとおりの本願発明の測定方法および測定キット、測定デバイスは、培養液、生体試料、注射液、輸液、透析液等の医薬品およびそれらの原材料である精製水の製造、貯蔵、分析、利用等に係る分野において利用される。例えば、注射製剤など非経口医薬品は主に発酵技術や遺伝子組換え技術により製造されており、宿主細胞壁成分からの混入が懸念されるため、これらの製剤を生体に接種した場合に有害な障害を引き起こすエンドトキシンを除去する必要がある。また、敗血症患者の治療法においては、血液中エンドトキシンを体外循環により人工透析的に除去させる。これらエンドトキシンの除去が、目的通り行われたか否かの判別のためには微量のエンドトキシンを簡便に測定するための方法が必要である。さらに、注射器、透析膜等の医療器具の製造においても、エンドトキシンの確認試験が必要不可欠である。このような状況の中で、本願発明の測定方法および測定キットは、これらエンドトキシンを測定する上で極めて有効であり、また、本願発明の測定キットにおいては、使用者の熟練度を問わずに、エンドトキシンの濃度を測定することができる。その際の具体的な形態は、上記測定キットに特に限定されるものではなく、例えば、フローインジェクション分析用の検出器として使用してもよい。この場合、人工透析等の治療後の最終工程に組み込んで行う形態がより好ましい。
【００４０】
また、本明細書に用いられる用語は、異なる定義が無い限り、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書及び関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、又は、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
【００４１】
以下、本願発明について実施例及び比較例を用いて詳細に説明するが、本願発明はこれらの実施例に限定されるものではない。電気化学的な測定法として下記では矩形波ボルタンメトリーによる実施例を示すが、その他にも、サイクリックボルタンメトリー、微分パルスボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、交流ボルタンメトリー、等の手法が適宜使用可能である。
【実施例】
【００４２】
実施例１：スパッタカーボン薄膜電極での亜鉛イオンの測定性能評価
作用電極として、シリコンウェハ―上に成膜されたスパッタカーボン薄膜電極を用いた。作製されたスパッタカーボン薄膜上に直径2mmの穴を開けた絶縁テープを貼り付けて、電極面積が既知のスパッタカーボン薄膜電極とした。この薄膜電極を、100 mmol/Lのアンモニア緩衝液（pH8.0）中に挿入し、ポテンシオスタット（CHIインスツルメンツ社製、ALS1240B）に塩橋を施した参照電極（銀−塩化銀：Ag/AgCl）、対向電極（白金：Pt）とともに接続した。
【００４３】
次に、アンモニア緩衝液中に亜鉛イオン（Zn2+）の濃度が0〜1000ng/mLとなるようにそれぞれ調整し、還元堆積電位-1.5 V、堆積時間240秒に設定して、各濃度ごとに溶液中の亜鉛イオンを電極表面へ堆積した。続いて、周波数40Hz、電位増加分2mV、振幅25mVに設定して、各濃度ごとに矩形波ボルタンメトリー測定を行った。測定結果を図２に示した。図２（a）において、横軸は印加電圧、縦軸は亜鉛の酸化溶出に伴う酸化電流である。得られた測定結果より、亜鉛濃度に伴う酸化電流増加が明確に観測された。実際に亜鉛濃度と酸化電流値の関係は、図２（b）に示すように、5〜1000ng/mLの濃度範囲で直線性を示し、5ng/mLという低濃度領域まで定量性のある亜鉛イオンの検出が可能であることがわかった。
実施例２：ETクリーンｓおよび亜鉛錯体プローブによるエンドトキシンの濃度測定
ETクリーンｓをマイクロチューブに１０ｍｇ秤り取り、ここに濃度が異なる日本薬局方エンドトキシン標準品を200μL滴下し、室温で120分間振盪しエンドトキシンを吸着させた後、ETクリーンｓ表面をTris緩衝液生理食塩水（TBS）で洗浄した。続いて100μmol/Lのエンドトキシン認識プローブ（ジピコリルアミン-亜鉛錯体と臭化セチルピリジニウムから構成）TBS溶液を200μL滴下し、室温で60分間振盪し、吸着したエンドトキシンを介してプローブもETクリーンｓ表面上に吸着させた後、ETクリーンｓ表面をTBSで洗浄した。この操作により、ETクリーンｓ表面上にプローブを捕捉することができる。さらに、ここへ0.1mol/Lの硫酸水溶液を200μL滴下し、10分間振盪することでプローブ中の亜鉛を亜鉛イオンとして溶出させ、溶出液を回収した。この溶出液を50mMアンモニア緩衝液（pH8.0）で100倍希釈した溶液を測定溶液とした。
【００４４】
上述の測定溶液を実施例１に記載の操作を、スパッタカーボン薄膜電極を作用電極として用いて行い、各濃度のエンドトキシンを作用させて得られた測定溶液の矩形波ボルタンメトリー測定を行った。測定結果を図３に示した。図３において、横軸はエンドトキシン濃度、縦軸は応答電流値である。図３から明らかなように、ETクリーンｓに添加したエンドトキシン濃度に依存した電流増加が認められた。本法ではおよそ200ｐg/mLのエンドトキシンの定量が可能と見積もられた。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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