(57)【要約】【課題】光照射された粒子から発せられる光に基づいて取得される信号のノイズを削減する粒子分析装置を提供する。【解決手段】流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、を含む。【選択図】図２
2016095221.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、
前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、
前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、
前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、
を含む粒子分析装置。
【請求項２】
前記信号処理部は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
請求項１記載の粒子分析装置。
【請求項３】
前記信号処理部は、更に温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
請求項２記載の粒子分析装置。
【請求項４】
前記信号処理部は、更に流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
請求項３記載の粒子分析装置。
【請求項５】
前記信号処理部は、前記粒子の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部で出力された前記第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
請求項４記載の粒子分析装置。
【請求項６】
前記信号処理部は、更に前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する、
請求項５記載の粒子分析装置。
【請求項７】
前記信号処理部にて決定される前記第一の電圧信号及び前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置は、取得開始時間と取得時間範囲とを含む、
請求項６記載の粒子分析装置。
【請求項８】
流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射工程と、
前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射工程と、
前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出工程と、
前記第一照射工程による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射工程による前記第二の光の照射に基づき前記光検出工程で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理工程と、
を含む粒子分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、粒子分析装置及び粒子分析方法に関する。より詳しくは、流路内を通流する粒子に光を照射する粒子分析装置及び粒子分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞や微生物等の生体微小粒子、マイクロビーズなどの微小粒子等を流路中に通流させ、通流させる工程において前記微小粒子の測定、測定された微小粒子の分析を行う装置が開発されている。公知の粒子分析装置の代表的な一例として、フローサイトメーターが知られている。従来から、フローサイトメーターとしては、流路内を通流する粒子に複数の光を照射するものがある（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開昭６１−２８３８４８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
フローサイトメーターに代表される、粒子分析装置では、光が照射された粒子から発せられる光信号に基づいて取得される電圧信号には、ノイズが可及的に含まれないことが望ましい。
これに対し、複数の光を粒子に照射するフローサイトメーターでは、第一の光を照射する第一照射部に対し、前記流路の下流に第二の光を照射する第二照射部が設けられている。このような従来のフローサイトメーターの場合、第二照射部に由来して取得される第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置は固定されているため、前記流路内を通流する粒子の粒径が第二照射部に由来して取得される第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置よりも大きくなる、流速の変化、調整誤差、その他の要因により、第二の電圧信号が当該第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置からはみ出て、もって第二の電圧信号の欠損に繋がる虞がある。
【０００５】
本技術は、前記第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置を決定することができる粒子分析装置及び粒子分析方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、前記の目的を達成するために鋭意研究を行った結果、第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二の光の照射に基づき取得された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定することができることを新たに見出し、本技術を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本技術に係る粒子分析装置は、流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、を含む。
または、前記信号処理部は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
あるいは、前記信号処理部は、更に温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
もしくは、前記信号処理部は、更に流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
または、前記信号処理部は、前記粒子の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部で出力された第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
あるいは、前記信号処理部は、更に前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。
もしくは、前記信号取得部にて決定される前記第一の電圧信号及び第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置は、取得開始時間と取得時間範囲とを含む構成であってよい。
本技術に係る粒子分析方法は、流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射工程と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射工程と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出工程と、前記第一照射工程による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射工程による前記第二の光の照射に基づき前記光検出工程で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理工程と、を含む。
【発明の効果】
【０００８】
本技術によれば、前記第二の電圧信号の時間軸に基づく取得位置を決定することができる。なお、本明細書に記載された効果はあくまで例示であって限定されるものでは無く、また他の効果があってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本技術の第１の実施形態の粒子分析装置に係る構成例を模式的に示す図である。
【図２】本技術の第１の実施形態の粒子分析装置に係る信号処理例を示すタイムチャートである。
【図３】本技術に係る粒子分析方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。また、実施形態の説明は以下の順序で行う。
１．粒子分析装置
（１）光照射部１１
（２）光検出部１２
（３）信号処理部１３
（４）粒子２
（５）流路３
（６）動作例
（７）信号処理例
（８）オフセットの算出方法
２．粒子分析方法
【００１１】
＜１．粒子分析装置１＞
図１は、本技術に係る粒子分析装置１の実施形態を模式的に示す模式概念図である。本技術に係る粒子分析装置１は、流路３を通流する粒子２の特性を分析する装置であり、光照射部１１と、光検出部１２と、信号処理部１３と、を少なくとも備える。各部について、以下に説明する。
【００１２】
（１）光照射部１１
図１に示すように、光照射部１１は、粒子２が通流する流路３の相互に異なる位置Ｐ１、Ｐ２に対して各位置Ｐ１、Ｐ２にそれぞれ対応する複数の光ＬＤ１、ＬＤ２を照射する。各位置Ｐ１、Ｐ２は、粒子２の通流方向に互いに変位している。
光照射部１１によって照射される光の数は、複数であれば図１のような２つには限定されない。以下、通流方向における上流側から数えてｎ番目（ｎは、１〜光の総数）の位置をｎ番目の位置と定義し、ｎ番目の位置に照射される光をｎ番目の光と定義する。
【００１３】
前記光照射部１１は、１番目の光ＬＤ１を照射する第一照射部１１ａと、２番目の光ＬＤ２を照射する第二照射部１１ｂと、を備える。尚、これら第一照射部１１ａ、第二照射部１１ｂの光源は限定されず、例えば、半導体レーザすなわちレーザダイオード、固体レーザまたはガスレーザ等であってもよい。このうち、半導体レーザを用いることで、装置を小型かつ安価に構成することができる。
【００１４】
また、各光ＬＤ１、ＬＤ２の波長は限定されず、互いに異なる波長を適宜選択することができ、１番目の光ＬＤ１は、２番目の光ＬＤ２より短波長の光であることが好ましく、より好ましくは、１番目の光ＬＤ１の波長は青色の光に対応する４８８ｎｍ等であり、２番目の光ＬＤ２の波長は赤色の光に対応する６３８ｎｍ等である。１番目および２番目の位置Ｐ１、Ｐ２は、１番目および２番目の光ＬＤ１、ＬＤ２のそれぞれの焦点であってもよい。本実施形態に係る粒子分析装置では、１番目の光ＬＤ１として青色レーザ光が照射され、２番目の光ＬＤ２として赤色レーザ光が照射されるものを説明する。
【００１５】
１番目および２番目の位置Ｐ１、Ｐ２を粒子２の通流方向に変位させる構成は限定されない。例えば、各光ＬＤ１、ＬＤ２の光源を通流方向に間隔を設けて配置してもよい。
また、光照射部１１が、各光ＬＤ１、ＬＤ２の位置Ｐ１、Ｐ２を調整する位置調整構造を含んでもよい。位置調整構造は、レンズやプリズム等の焦点調整用の光学系を含んでもよい。
【００１６】
（２）光検出部１２
光検出部１２は、各レーザ光ＬＤ１、ＬＤ２の照射によって粒子２から発せられた蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）に基づいて電圧信号を取得する構成である。光検出部１２の態様は限定されないが、好ましい態様の一例として、図１に示すように、光検出部１２は、光分離素子１２１、蛍光検出部１２２及び散乱光検出部１２３を備えてもよい。更に、光検出部１２は、０次光除去素子１２４を備えてもよい。
【００１７】
［光分離素子１２１］
光分離素子１２１は、１番目のレーザ光ＬＤ１の照射によって粒子２から発せられた光信号を、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）と散乱光Ｓとに分離し、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）を蛍光検出部１２２に導光する。光分離素子１２１は、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）を透過させ、散乱光Ｓを反射させる構成でもよい。本実施形態に係る粒子分析装置１では、２番目のレーザ光ＬＤ２の照射によって粒子２から発せられた光信号は、光分離素子１２１によって分離されず、蛍光ＦＬ（ＬＤ２）として前記蛍光検出部１２２に導光する。尚、光分離素子１２１は、２番目のレーザ光ＬＤ２の照射によって粒子２から発せられた蛍光ＦＬ（ＬＤ２）を、散乱光と分離する構成でもよい。光分離素子１２１は、各レーザ光ＬＤ１、ＬＤ２にそれぞれ対応するように複数配置されていてもよい。
【００１８】
光分離素子１２１は、粒子２からの光信号の入射方向に対して傾きを有するように配置されていてもよい。光分離素子１２１は、特定の波長以上の波長の光を透過させ、特定の波長未満の波長の光を反射させる波長選択式のミラー等であってもよい。ミラーは、ダイクロイックミラー等であってもよい。
【００１９】
［蛍光検出部１２２］
蛍光検出部１２２は、光分離素子１２１に対して蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）の進行方向側に配置されている。蛍光検出部１２２には、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）が入射する。蛍光検出部１２２は、入射した蛍光ＦＬ（ＬＤ１）、ＦＬ（ＬＤ２）を電圧信号に変換して信号処理部１３に出力する。蛍光検出部１２２は、ＰＭＴ(Photomultiplier Tube)等であってもよい。
【００２０】
［散乱光検出部１２３］
図１に示すように、本開示の粒子分析装置１は、光分離素子１２１に対して散乱光Ｓの進行方向側の位置に、散乱光検出部１２３を有する。散乱光検出部１２３には、光分離素子１２１によって分離された散乱光Ｓが入射する。散乱光検出部１２３は、入射した散乱光Ｓを電圧信号に変換して信号処理部１３に出力する。散乱光検出部１２３は、フォトディテクタ等であってもよい。
【００２１】
［０次光除去素子１２４］
０次光除去素子１２４は、散乱せずに直進してきたレーザ光ＬＤ１、ＬＤ２などの０次光ＺＬ１、ＺＬ２を遮断する。０次光除去素子１２４は、マスクや特定光を選択的に遮断する光学フィルタなどであってもよいが、これに限定されない。０次光除去素子１２４の配置位置も限定されず、蛍光検出部１２２の手前の好適な位置を選択してもよい。
【００２２】
（３）信号処理部１３  
前記信号処理部１３は、光照射部１１の照射を制御する構成である。すなわち、信号処理部１３は、前記蛍光検出部１２２及び散乱光検出部１２３から出力された電圧信号を処理する構成である。この信号処理部１３は、前記第一照射部１１ａによる１番目の青色レーザ光ＬＤ１の照射に基づいて前記光検出部１２により出力された第一の電圧信号と、前記粒子２の流速とに基づいて、前記第二照射部１１ｂによる前記２番目の赤色レーザ光ＬＤ２の照射に基づき前記光検出部１２で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成である。
【００２３】
前記信号処理部１３は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子２の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。また、前記信号処理部１３は、前記流路３における温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。また、前記信号処理部１３は、流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。更に、前記信号処理部１３は、前記粒子２の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部１２で出力された第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。また更に、前記信号処理部１３は、前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する構成であってもよい。当該信号処理部１３による前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置の決定機構については後述する。
【００２４】
前記信号処理部１３には、初期設定時に、本技術に係る前記粒子２の流速、前記流路３における位置Ｐ１から位置Ｐ２までの距離（以下、「スポット間距離」という）、前記粒子２の大きさに基づき定義される値（以下、「ウィンドウエクステンション（window extension）という）が記憶されている。ここで、前記粒子２の流速及び大きさは、本技術に係る粒子分析装置のユーザーによって適宜変更・設定することが可能である。
更に、信号処理部１３における処理には、信号の定量化、蛍光補正および画像の生成などといった粒子２の特性を分析するための各種の処理が含まれてもよいが、これらに限定されない。
また、信号処理部１３は、電子装置等によって構成してもよい。電子装置は、ＣＰＵやＭＰＵ等の演算処理装置およびＲＡＭやＲＯＭなどの記憶装置等を備えてもよい。ＲＯＭには、信号処理部１３の機能を実現するためのプログラムやデータを格納してもよい。演算処理装置は、ＲＯＭに格納されたプログラムを実行することで、信号処理部１３の機能を実現してもよい。ＲＡＭは、演算処理装置の作業領域等として利用してもよい。ただし、かかる構成に限定されない。
【００２５】
（４）  粒子２
本技術に係る粒子分析装置１によって分析される粒子２は、細胞、微生物及びリボゾームなどの生体関連微小粒子、ラテックス粒子、ゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子及び前記粒子分析装置１の初期設定に用いられるサンプル粒子等が広く含まれてもよい。
【００２６】
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リボゾーム、ミトコンドリア及びオルガネラすなわち細胞小器官などが含まれてもよい。また、細胞には、植物細胞、動物細胞及び血球系細胞などが含まれてもよい。更に、微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類及びイースト菌などの細菌等が含まれてもよい。
生体関連微小粒子には、核酸や蛋白質及びこれらの複合体などの生体関連高分子も包含されてもよい。
【００２７】
工業用粒子は、有機高分子材料、無機材料又は金属材料などで形成された粒子でもよい。有機高分子材料としては、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン及びポリメチルメタクリレートなどを使用してもよい。無機材料としては、ガラス、シリカ及び磁性材料などを使用してもよい。金属材料としては、例えば金コロイド及びアルミニウムなどを使用してもよい。微小粒子の形状は、球形または非球形であってもよく、大きさや質量も特に限定されない。
【００２８】
また、本技術に適用可能な粒子２には、光検出部１２が信号を検出できるように、蛍光色素等の蛍光物質、放射性物質、インターカレーター、またはマイクロビーズなどの標識物質で修飾しておくことが好ましい。例えば、蛍光色素を用いる場合、その種類は特に限定されず、公知のあらゆる蛍光色素を用いることができる。
【００２９】
（５）流路３
流路３は、マイクロチップ３０に設けられている。流路３内には、粒子２を含むサンプル液が導入される。マイクロチップ３０は、ガラスや、ポリプロピレン、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマー及びポリジメチルシロキサンなどといった各種プラスチックによって形成してもよい。マイクロチップ３０の材質は特に限定されないが、好ましい態様の一例として、透光性を有する光学誤差が少ない材質を採用してもよい。この流路３は、本技術に係る粒子分析装置１に予め備えていてもよいが、市販の流路などを、粒子分析装置に設置して分析を行うことも可能である。
【００３０】
本技術に係る粒子分析装置１に用いることができる流路３の形態は特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、公知の２次元又は３次元のプラスチックやガラス等の基板Ｔ内に形成したものや、従来のフローサイトメーターで用いられているようなものも、本技術に係る粒子分析装置１に用いることができる。
【００３１】
また、前記流路３の流路幅、流路深さ、流路断面形状も特に限定されず、自由に設計することができる。例えば、流路幅１ｍｍ以下のマイクロ流路も、本技術に係る粒子分析装置に用いることが可能である。
【００３２】
（６）粒子分析装置の動作例
本技術に係る粒子分析装置１の動作例を説明する。
【００３３】
先ず、前記流路３を通流する粒子２が１番目の位置Ｐ１に到達すると、当該粒子２に対して第一照射部１１ａにより青色レーザ光ＬＤ１が照射される。これによって当該粒子２から発せられた光信号は前記光分離素子１２１によって、散乱光Ｓと、蛍光ＦＬ（ＬＤ１）に分離される。前記散乱光Ｓは、前記散乱光検出部１２３に入射され、当該散乱光検出部１２３は散乱光Ｓを電圧信号に変換して信号処理部１３に出力する。
【００３４】
次いで、前記粒子２が１番目の位置Ｐ１を通過し、２番目の位置Ｐ２に到達すると、当該粒子２に対して第二照射部１１ｂにより赤色レーザ光ＬＤ２が照射される。これによって粒子２から発生された光信号は、蛍光ＦＬ（ＬＤ２）として蛍光検出部１２２によって検出され、電圧信号に変換される。  
【００３５】
このように、二つ以上の光が照射される粒子分析装置において、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の取得開始時間及び取得時間範囲（以下、「２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の時間軸に基づいた取得位置」ともいう）が固定されていると、前記流路３を通流する粒子２の粒径が２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の時間軸に基づいた取得位置よりも大きい場合、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２により取得される電圧信号の欠損を招く虞がある。または、前記流路３を通流する粒子２の粒径が２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の取得時間範囲よりも小さい場合、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号にノイズの不要な増大を招く虞がある。
【００３６】
そこで、本技術に係る粒子分析装置１では、前記信号処理部１３により、主に、第二照射部１１ｂが照射する２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号の時間軸に基づいた取得位置の決定が行われる。
【００３７】
（７）  粒子分析装置の信号処理例
以下、前記信号処理部１３による信号処理例について、図２を用いて説明する。図２は、前記信号処理部１３による信号処理例を示すタイムチャートである。
先ず、１番目の青色レーザ光ＬＤ１と２番目の赤色レーザ光ＬＤ２のうち少なくとも一方に基づいて蛍光を発する検出対象の粒子２を通流させる。
これにより、１番目の青色レーザ光ＬＤ１及び２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号４０，５０が信号処理部１３に出力される。その結果、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づく電圧信号４０が閾値６０を超えた時間４１（以下、「クロスアップ」という）が前記信号処理部１３に記憶される。
【００３８】
これと同時に、前記粒子２の大きさに基づき定義されるプレウィンドウエクステンション４２により、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づく電圧信号４０の取得開始時間４３が決定される。更に、前記信号処理部１３に対して、前記電圧信号４０が閾値６０以上で出力されている時間４４（以下、「トリガ区間４４」という）が記憶される。その結果、トリガ区間４４、前記プレウィンドウエクステンション４２、前記粒子２の大きさに基づき定義されるポストウィンドウエクステンション４５に基づいて、前記電圧信号４０の取得時間範囲４６が決定される。ここで、前記プレウィンドウエクステンション４２及びポストウィンドウエクステンション４５は、前記粒子２の大きさに基づき定義される値であり、適宜変更することができる値である。そして、このプレウィンドウエクステンション４２は、図２に示すように、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づく電圧信号４０の取得時間範囲４６の開始時間から前記トリガ区間４４の開始時間までの時間を指す。また、前記ポストウィンドウエクステンション４５は、図２に示すように、前記トリガ区間４４の終了時間、すなわち、１番目の青色レーザ光ＬＤ１に基づいて取得された電圧信号４０が閾値６０を割る時間から当該電圧信号４０の取得時間範囲４６の終了時間までの時間を指す。
【００３９】
また、前記信号処理部１３により、当該信号処理部１３に予め記憶されたスポット間距離を前記粒子２の流速で除した値４８（以下、「インターバル４８」という）が検出される。これにより、信号処理部１３により、クロスアップ４１と、インターバル４８と、に基づいて、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０が閾値６０を超える時間５１が決定される。
【００４０】
更に、前記信号処理部１３により、前記インターバル４８と、前記粒子２の流速に基づいて算出されるプレオフセット５２、及びプレウィンドウエクステンション５３に基づき、以下の式（１）に即して、２番目の光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４が決定される。
式（１）  クロスアップ４１  ＋  インターバル４８  −  プレオフセット５２  −  プレウィンドウエクステンション５３
【００４１】
ここで、前記式（１）に係るプレオフセット５２とは、前記粒子２の流速に基づいて算出される値であり、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０を漏れなく取得するために設けられる値（マージン）である。そして、このプレオフセット５２は、図２に示すように、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４から前記プレウィンドウエクステンション５３の開始時間までの時間を指す。また、前記式（１）に係るプレウィンドウエクステンション５３は、前記粒子２の大きさに基づいて算出される値であり、適宜変更することができる値である。そして、このプレウィンドウエクステンション５３は、図２に示すように、前記プレオフセット５２の終了時間から２番目の赤色レーザ光ＬＤ２から取得された電圧信号５０が閾値６０に到達した時間までの時間を指す。
【００４２】
そして、信号処理部１３により、粒子２の流速に基づいて算出されたプレオフセット５２及びポストオフセット５６、前記信号処理部１３に予め記録されたプレウィンドウエクステンション５３及びポストウィンドウエクステンション５７、前記トリガ区間４４と、に基づいて、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいて取得される電圧信号５０の取得時間範囲５８が決定される。
具体的には、以下の式（２）に即して、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいて取得される電圧信号５０の取得時間範囲５８が決定される。
式（２）  プレオフセット５２  ＋  プレウィンドウエクステンション５３  ＋  トリガ区間４４  ＋  ポストウィンドウエクステンション５７  ＋  ポストオフセット５６
【００４３】
ここで、式（２）に係るポストウィンドウエクステンション５７とは、前記粒子２の大きさに基づいて算出される値であり、適宜変更することができる値である。そして、このポストウィンドウエクステンション５７は、図２に示すように、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいて取得された電圧信号５０が閾値６０を割る時間から前記ポストオフセット５６の開始時間までの時間を指す。
また、前記式に係るポストオフセット５６とは、粒子２の流速に基づいて算出される値であり、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０を漏れなく取得するために設けられる値である。そして、このポストオフセット５６は、図２に示すように、前記ポストウィンドウエクステンション５７の終了時間から２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８の終了時間までの時間を指す。
【００４４】
本技術に係る粒子分析装置１では前記信号処理部１３により、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４と、当該電圧信号５０の取得時間範囲５８と、が決定される構成であるが、これらの決定は、前記散乱光検出部１２３により検出される散乱光に基づく第一の電圧信号をトリガとすることで行うことができる。あるいは、前記蛍光検出部１２２により検出される蛍光に基づく第一電圧信号をトリガとすることで行うこともできる。
【００４５】
以上のように、本技術に係る粒子分析装置１では前記信号処理部１３により、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得開始時間５４と、当該電圧信号５０の取得時間範囲５８と、が決定されるものの、粒子２の流速は、流路３の温度変化に応じて流動変動する。
ここで、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８を決定するプレオフセット５２及びポストオフセット５６は、粒子２の流速に基づいて算出される。すなわち、プレオフセット５２及びポストオフセット５６は、前記流路３の温度変化に応じて変動する。
プレオフセット５２及びポストオフセット５６が必要以上に大きな値に設定されると、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８も大きな値に設定される。その結果、例えば、レーザ光に起因するノイズが、第二の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０に不要に増大する虞がある。
このため、プレオフセット５２及びポストオフセット５６の値はできる限り小さい値とすることが好ましい。このオフセットを算出する方法として以下の方法が考えられる。尚、以下に示す方法は、オフセットを求めるための方法の例示に過ぎず、オフセットを求める方法はこれらに限定されるわけではない。
【００４６】
（８）オフセットの算出方法
［第一の方法：流速調整センター値を使用する方法］
（第一工程）１番目の青色レーザ光ＬＤ１及び２番目の赤色レーザ光ＬＤ２の両方の光に基づいて蛍光を発するサンプル粒子を流路３に対して通流させてサンプル粒子の流速を調整する。
この際、調整誤差をサンプル粒子の流速に対して±５％の範囲で取り、流速調整センター値を求める。
（第二工程）第一工程により算出された流速調整センター値（流速）と、信号処理部１３に記憶されたスポット間距離とに基づいて、前記インターバルを算出する。
そして、予め信号処理部１３に記憶された第一工程における流速調整誤差と、温度変化による流動変動とを考慮し、オフセットを算出する。
【００４７】
以下、実数値を用いた第一の方法によるオフセットの求め方を説明する。
すなわち、第一工程におけるサンプル粒子の流速が５ｍ／ｓである場合、４．７５〜５．２５ｍ／ｓの範囲を調整誤差の範囲とする。
更に、スポット間距離が８０ｕｍとした場合、インターバルは、１６ｕｓ（８０ｕｍ÷５ｍ／ｓ）となる。
そして、温度変化による流動変動を±１．５％の流速の振れ幅とし、更に、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいた電圧信号にノイズが発生することを可及的に防ぐため、±２．０％のマージンを確保した場合、これら流速調整誤差、温度変化による流動変動の振れ幅、マージンを考慮した結果、１．３６ｕｓ（１６＊（５＋１．５＋２）／１００）のオフセットが算出される。
【００４８】
［第二の方法：流速調整時の測定値を使用する方法］
（第一工程）１番目の青色レーザ光ＬＤ１及び２番目の赤色レーザ光ＬＤ２の両方の光に基づいて蛍光を発するサンプル粒子を流路３に対して通流させ、サンプル粒子の流速を測定する。
（第二工程）第一工程にて測定された流速の値から、インターバルを算出する。
そして、温度変化による流動変動を考慮して、オフセットを算出する。
実数値を用いてこの第二の方法を説明する。
第一の方法と同様、インターバルは１６ｕｓとなる。
更に、この第二方法では、第一工程における測定値を用いていることから、流速調整誤差を考慮する必要がない。このため、温度変化による流動変動の振れ幅とマージンのみを考慮してオフセットを算出することができ、オフセットは、０．５７ｕｓ（１６＊（１．５＋２）／１００）となる。
【００４９】
［第三の方法：流速調整時の測定値と温度変化を使用する方法］
この第三の方法における第一工程と、第二工程は、前記第二の方法の第一工程及び第二工程と同一であるため、ここではこれらの説明を割愛する。
また、本技術に係る粒子分析装置では、外部装置等により流路３における水圧を一定とすることにより、温度変化による流動変動を可及的に抑えることができる。
更に、この第三の方法では、前記サンプル粒子の流速を随時測定し、この流速に基づいてインターバルを検出する。
このため、第三の方法では、マージンのみを考慮してオフセットを算出することができる。
すなわち、±２．０％のマージンを確保した場合、オフセットは、０．３２ｕｓ（１６＊２／１００）となる。
【００５０】
以上のように、本技術の粒子分析装置１では、図２に示した如く、前記信号処理部１３により、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づいた電圧信号５０の取得開始時間５４、及び当該電圧信号５０の取得時間範囲５８を決定することができ、もって従来よりも第二の電圧信号５０を高精度に取得することが可能となる。これにより、Ｓ／Ｎ比(signal-noise ratio)を向上させることができ、これに伴って、粒子２の分析精度を向上させることも可能となる。
【００５１】
また、本技術の粒子分析装置１において、前記粒子２の流速だけでなく、温度変化に基づく流動変動と、流速調整誤差と、を考慮することで、前記オフセットの値を小さくすることできる。その結果、２番目の赤色レーザ光ＬＤ２に基づく電圧信号５０の取得時間範囲５８を必要な範囲で小さくすることができ、もって従来よりも確実に高精度な第二の電圧信号５０を取得することが可能となる。これにより、Ｓ／Ｎ比(signal-noise ratio)を向上させることができる。更に、オフセットを算出する上で、前記粒子２の流速の実際の測定値を用いることにより、温度変化に基づく流動変動を主としてオフセットを算出することが可能となる。その結果、オフセットを更に小さい値に設定することができるため、より確実に高精度な第二の電圧信号５０を取得することが可能となる。
【００５２】
＜２．粒子分析方法＞
図３は、本技術に係る粒子分析方法のフロー図である。本技術に係る粒子分析方法は、大別すると、第一照射工程Ｉ、第二照射工程ＩＩ、光検出工程ＩＩＩ、信号処理工程ＩＶを少なくとも行う方法である。なお、第一照射工程Ｉ、第二照射工程ＩＩ、光検出工程ＩＩＩ、信号処理工程ＩＶの詳細は、前述した本技術に係る粒子分析装置１の第一照射部１１ａ、第二照射部１１ｂ、光検出部１２、信号処理部１３が、それぞれ行う方法と同一であるため、ここでは説明を省略する。
【００５３】
また、本技術は、以下のような構成をとることもできる。
（１）流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射部と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射部と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出部と、前記第一照射部による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射部による前記第二の光の照射に基づき前記光検出部で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理部と、を含む粒子分析装置。
（２）前記信号処理部は、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間と、前記粒子の流速に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（１）記載の粒子分析装置。
（３）前記信号処理部は、更に温度変化に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（２）記載の粒子分析装置。（４）前記信号処理部は、更に流速調整誤差に基づく流動変動に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（３）記載の粒子分析装置。
（５）前記信号処理部は、前記粒子の大きさに基づき定義される値と、前記第一の電圧信号が閾値を超えた時間とに基づき、前記光検出部で出力された第一の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（４）記載の粒子分析装置。
（６）前記信号処理部は、更に前記粒子の大きさに基づき定義される値に基づいて、前記第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する（５）記載の粒子分析装置。
（７）前記信号処理部にて決定される前記第一の電圧信号及び第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置は、取得開始時間と取得時間範囲とを含む（６）記載の粒子分析装置。（８）流路上の第一の位置で前記流路を通流する粒子に第一の光を照射する第一照射工程と、前記第一の位置の下流の第二の位置で前記粒子に第二の光を照射する第二照射工程と、前記粒子から発せられた光信号を取得し、電圧信号を出力する光検出工程と、前記第一照射工程による前記第一の光の照射に基づき出力された第一の電圧信号と、前記粒子の流速とに基づいて、前記第二照射工程による前記第二の光の照射に基づき前記光検出工程で出力された第二の電圧信号の時間軸に基づいた取得位置を決定する信号処理工程と、を含む粒子分析方法。
【符号の説明】
【００５４】
１１ａ  第一照射部
１１ｂ  第二照射部
１２  光検出部
１３  信号処理部
２  粒子
３  流路 
【図１】
2016095221.tif 000003
【図２】
2016095221.tif 000004
【図３】
2016095221.tif 000005