(57)【要約】【課題】stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法、システム及びコンピュータプログラム製品を提供することを課題とする。【解決手段】上記患者の血液試料中のGPC3の濃度に基づいて、stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報を提供することにより、上記の課題を解決する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度を測定する工程と、
測定したGPC3濃度の値に基づいて、前記患者が肝切除術を受けた後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供する工程と
を含む、stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法。
【請求項２】
情報提供工程において、GPC3濃度の値と第１の閾値とを比較して、GPC3濃度の値が第１の閾値より小さい場合、前記患者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低いことを示唆する情報を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定工程において、前記血液試料におけるAFPの濃度をさらに測定し、
情報提供工程において、GPC3濃度の値及びAFP濃度の値に基づいて、前記患者における肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
情報提供工程において、GPC3濃度の値と第１の閾値とを比較し、AFP濃度の値と第２の閾値とを比較して、GPC3濃度の値が第１の閾値より小さく、且つ、AFP濃度の値が第２の閾値より小さい場合、前記患者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低いことを示唆する情報を提供する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
根治的治療が、肝切除術、肝移植、経皮的エタノール注入療法、ラジオ波焼灼療法、又は重粒子線治療である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度とを継続的に測定する工程と、
測定したGPC3濃度の値と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度の値とに基づいて、前記患者における肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供する工程と
を含む、stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法。
【請求項７】
情報提供工程において、GPC3濃度の値と第１の閾値とを比較し、AFP濃度を測定している場合はAFP濃度の値と第２の閾値とを比較し、PIVKA-II濃度を測定している場合はPIVKA-II濃度の値と第３の閾値とを比較して、GPC3濃度の値が第１の閾値以上であり、且つ、AFP濃度を測定している場合はAFP濃度の値が第２の閾値以上であり、且つ、PIVKA-II濃度を測定している場合はPIVKA-II濃度の値が第３の閾値以上の場合、肝細胞がん患者における肝細胞がんの再発リスクが高いことを示唆する情報を提供する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
血液試料におけるGPC3濃度が、抗GPC3抗体を用いる免疫学的測定法によって測定される請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
免疫学測定法が、ELISA法である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ELISA法において、2012年４月23日に独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託センター(NPMD)にそれぞれ、受託番号NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及びNITE BP-01337で寄託されたハイブリドーマから選択される少なくとも１種のハイブリドーマにより産生される抗GPC3モノクローナル抗体が用いられる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
抗GPC3モノクローナル抗体が、受託番号NITE P-1336で寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体、及び、受託番号NITE P-1327で寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、下記のステップ：
肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果を取得するステップと、
得られた測定結果に基づいて、前記患者における肝切除術後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供に適するシステム。
【請求項１３】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、下記のステップ：
肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度の測定結果とを取得するステップと、
得られた測定結果に基づいて、前記患者における肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供に適するシステム。
【請求項１４】
コンピュータに読み取り可能な媒体を備え、前記媒体には、下記のステップ：
肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果を取得するステップと、
得られた測定結果に基づいて、前記患者における肝切除術後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品。
【請求項１５】
コンピュータに読み取り可能な媒体を備え、前記媒体には、下記のステップ：
肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度の測定結果とを取得するステップと、
得られた測定結果に基づいて、前記患者における肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、
stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病期がstage Iである早期肝細胞がんの患者の再発リスクの予測を補助するための方法に関する。また、本発明は、stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報を提供するためのシステム、及び該情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品にも関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞がんは原発性肝がんの一つであり、肝細胞から発生する悪性腫瘍である。肝細胞がんの治療では、がん及びその周囲の組織を手術によって取り除く肝切除術などが行われる。一方、肝切除術などの治療を行っても、肝細胞がん患者全体の再発率は、術後３年で70％以上になることが知られている。そのため、肝細胞がん患者は、術後も継続的に検査を受ける必要がある。
【０００３】
肝細胞がんの検査では、血液中の腫瘍マーカーの測定と、画像検査(超音波検査、CT及びMRIなど)とを組み合わせて行われている。肝細胞がんのマーカーとしては、現在、AFP(α-fetoprotein)、PIVKA-II(protein induced by vitamin-K absence II)などが利用されている。また、特許文献１には、肝細胞がんに高発現していることが知られるグリピカン3(GPC3)を、肝細胞がんの再発リスクを予測するためのマーカーとして用いることが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５／１０６４８５号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、肝細胞がん患者は、がんの再発の有無を確認するために術後も継続的に検査を受ける必要があるが、これは患者にとって負担である。もし、がんの再発リスクが低いこと(例えば、術後４年以上無再発であること)を術前に予測できれば、術後の検査負担を軽減できるといったメリットがある。
【０００６】
また、術後の再発予測に関しては、特許文献１に開示されるような分子マーカーを用いた再発リスクの判定法が開発されている。しかし、stage Iの早期肝細胞がんの場合、術後の再発予測が困難であるので、再発リスクの判定法のさらなる精度の向上が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、stage Iの早期肝細胞がん患者を対象として、該患者らについて根治的治療である肝切除術を受ける前及び受けた後の血液中の各種マーカー濃度を測定して、マーカー濃度と再発リスクとの関係を術後長期間にわたり調査した。その結果、GPC3の濃度に基づいて、stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報を提供することが可能となることを見出した。
【０００８】
よって、本発明によれば、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度を測定する工程と、測定したGPC3濃度の値に基づいて、上記の患者が肝切除術を受けた後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供する工程とを含む、stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法が提供される。
【０００９】
また、本発明によれば、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度とを継続的に測定する工程と、測定したGPC3濃度の値と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度の値とに基づいて、上記の患者における肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供する工程とを含む、stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクの予測を補助する方法が提供される。
【００１０】
さらに、本発明によれば、プロセッサ及び該プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備える、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供に適するシステムが提供される。上記のメモリには、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果を取得するステップと、得られた測定結果に基づいて、上記の患者における肝切除術後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供するステップとを、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
【００１１】
また、本発明によれば、プロセッサ及び該プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備える、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供に適するシステムが提供される。上記のメモリには、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度の測定結果とを取得するステップと、得られた測定結果に基づいて、上記の患者における肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供するステップとを、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
【００１２】
さらに、本発明によれば、コンピュータに読み取り可能な媒体を備える、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品が提供される。上記の媒体には、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果を取得するステップと、得られた測定結果に基づいて、上記の患者における肝切除術後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供するステップとを、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
【００１３】
また、本発明によれば、コンピュータに読み取り可能な媒体を備える、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品が提供される。上記の媒体には、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度の測定結果と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度の測定結果とを取得するステップと、得られた測定結果に基づいて、上記の患者における肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供するステップとを、コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者について、該患者が肝切除術を受けた後のがんの再発リスクの予測を補助することが可能になる。また、本発明により、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者について、がんの再発リスクの予測を補助することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】stage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクに関する情報を提供するための判定装置の一例を示した概略図である。
【図２】図１の判定装置の機能構成を示すブロック図である。
【図３】図１に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図４Ａ】図１に示された判定装置を用いた、術前のstage Iの早期肝細胞がん患者についての４年以上無再発に関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
【図４Ｂ】図１に示された判定装置を用いた、術前のstage Iの早期肝細胞がん患者についての４年以上無再発に関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
【図５Ａ】図１に示された判定装置を用いた、術後のstage Iの早期肝細胞がん患者についての肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
【図５Ｂ】図１に示された判定装置を用いた、術後のstage Iの早期肝細胞がん患者についての肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供するための判定のフローチャートである。
【図６】術後がんが再発したstage Iの早期肝細胞がん患者における術前から再発時までのGPC3濃度の推移を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[１．術前の再発リスクの予測]
以下に、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者についての再発リスクの予測を補助する方法について説明する。本実施形態では、まず、肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度を測定する。
【００１７】
本実施形態において、stage Iの早期肝細胞がん患者(以下、被験者ともいう)は、TNM分類に基づいてstage Iの肝細胞がんと診断され且つ肝細胞がんの根治的治療を受ける前の患者であれば特に限定されない。ここで、肝細胞がんの根治的治療としては、肝細胞がんを根本から治すことを目指した治療法であれば特に限定されない。例えば、肝切除術、肝移植、経皮的エタノール注入療法、ラジオ波焼灼療法、及び陽子線や炭素線の重粒子線治療などが挙げられる。なお、本実施形態では、被験者は、肝細胞がんの根治的治療の治療効果をより向上させるために当該根治的治療の前に行われる補助的又は予備的な治療を受けていてもよい。stage Iの早期肝細胞がんの根治的治療の前に行われる補助的又は予備的な治療としては、例えば、肝動脈塞栓術、肝動注化学療法やワクチンなどの免疫療法などが挙げられる。そのため、補助的又は予備的な治療として肝動脈塞栓術、肝動注化学療法やワクチンなどの免疫療法などを受けているが、上述の根治的治療をまだ受けていない患者から採取した血液試料も利用することができる。本実施形態では、根治的治療前に採取した血液試料を用いて肝切除後の再発リスクに関する情報を得ることから、上記の被験者としては、血液試料の採取後に根治的治療として肝切除術を行うことが決定された患者が好ましい。
【００１８】
なお、当該技術において、TNM分類に基づくstage Iの肝細胞がんとは、がんの進行の程度が下記の５項目を全て満たしているものを指すことが知られている。
・腫瘍の数が１つである。
・腫瘍の大きさ(径)が２cm以下である。
・腫瘍が脈管(門脈、静脈及び胆管)に広がっていない。
・腫瘍がリンパ節に転移していない。
・腫瘍が遠隔臓器に転移していない。
【００１９】
血液試料としては、上記の被験者から得られる血液、血漿及び血清が挙げられ、好ましくは血清及び血漿である。また、該被験者の血液、血漿又は血清を適切な水性媒体で希釈して得られる希釈液を、血液試料として用いてもよい。そのような水性媒体は、血中タンパク質の濃度測定を妨げない限り特に限定されず、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。GPC3濃度の測定を後述の免疫学的測定法で行う場合は、ブロッキング液で血液試料を希釈してもよい。
【００２０】
本実施形態において、GPC3濃度の測定方法は、血液試料中のGPC3濃度を反映する値又は指標を取得できる方法であれば特に限定されず、当該技術において公知の測定法から適宜選択できる。そのような測定方法としては、抗原抗体反応を利用する免疫学的測定法が好しく、例えば、酵素免疫測定法、化学発光免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、免疫比濁法、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、アフィニティクロマトグラフィ法などが挙げられる。それらの中でも、酵素免疫測定法のELISA法、特にサンドイッチELISA法が好ましい。
【００２１】
本実施形態においては、GPC3濃度の値は、測定値そのものであってもよいし、測定値を検量線に当てはめて取得される値であってもよい。検量線は、濃度が既知のGPC3タンパク質の希釈系列を調製し、これらを血液試料と同様に測定して得られた値から作成できる。この検量線に基づいて、試料中のGPC3濃度を定量することができる。GPC3タンパク質は、HepG2などの肝がん細胞株が分泌する生体由来のタンパク質であってもよいし、組換え型タンパク質であってもよい。
【００２２】
免疫学的測定法において用いられる抗GPC3抗体は、GPC3と特異的に結合する抗体であれば特に限定されず、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体の由来は特に限定されず、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ウマ、ラクダなどのいずれの哺乳動物に由来する抗体であってもよい。また、抗体のアイソタイプは、測定法に応じて適宜選択すればよいが、好ましくはIgGである。なお、抗体には、抗体のフラグメント及びその誘導体も含まれ、例えば、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメントなどが挙げられる。なお、これらの抗体及び抗体フラグメントの作製方法は当該技術において公知である。
【００２３】
本実施形態においては、抗GPC3抗体として、2012年４月23日に独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託センター(NPMD)にそれぞれ、受託番号NITE P-1326、NITE P-1327、NITE BP-01328、NITE P-1329、NITE BP-01330、NITE BP-01331、NITE P-1332、NITE P-1333、NITE P-1334、NITE P-1335、NITE P-1336及びNITE BP-01337で寄託されたハイブリドーマから選択される少なくとも１種のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【００２４】
サンドイッチELISA法でGPC3濃度を測定する場合は、受託番号NITE P-1336で寄託されたハイブリドーマ及び受託番号NITE P-1327で寄託されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を用いることが好ましい。この場合、受託番号NITE P-1336で寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体を、GPC3を捕捉するための抗体(固相化抗体)として用い、受託番号NITE P-1327で寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体を、GPC3を検出するための抗体として用いることがより好ましい。
【００２５】
本実施形態において、抗GPC3抗体は、必要に応じて、当該技術において公知の標識物質により標識されていてもよい。そのような標識物質としては、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ及び125Ｉなどの放射性同位体、フルオレセイン、ローダミン及びAlexa Fluor(登録商標)などの蛍光物質、アルカリフォスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びルシフェラーゼなどの酵素、ビオチン、アビジン及びストレプトアビジンなどが挙げられる。
【００２６】
測定において抗体を捕捉するための固相を用いる場合、固相の種類は特に限定されない。例えば、抗体を物理的に吸着する材質の固相、抗体と特異的に結合する分子が固定化されている固相などが挙げられる。抗体と特異的に結合する分子としては、プロテインA又はG、該抗体を特異的に認識する抗体(すなわち二次抗体)などが挙げられる。また、抗体と固相との間を介在する物質の組み合わせを用いて、両者を結合させることもできる。そのような物質の組み合わせとしては、ビオチンとアビジン(又はストレプトアビジン)、グルタチオンとグルタチオン-S-トランスフェラーゼ、ハプテンと抗ハプテン抗体などの組み合わせが挙げられる。例えば、抗GPC3抗体をあらかじめビオチン修飾している場合、アビジン又はストレプトアビジンが固定化された固相によって該抗体を捕捉できる。
【００２７】
固相の素材としては、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム、コバルト及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。
【００２８】
次いで、本実施形態では、測定したGPC3濃度の値に基づいて、被験者が肝切除術を受けた後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供する。そのような情報としては、例えば、該被験者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低い又は該リスクが実質的に無いことを示唆する情報を提供することが挙げられる。なお、示唆する情報には、「再発するリスクが低い」又は「再発するリスクが実質的に無い」という直接的な情報、及び「＋」や「−」などの間接的な情報が含まれる。例えば、「再発するリスクが低い」又は「再発するリスクが実質的に無い」場合に、「−」との情報を提供することが挙げられる。
【００２９】
本実施形態では、上記の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報は、GPC3濃度の値と第１の閾値とを比較した結果に基づいて提供することが好ましい。例えば、GPC3濃度の値が第１の閾値(又は第１のカットオフ値ともいう)より小さい場合に、被験者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低いことを示唆する情報を提供できる。
【００３０】
本実施形態では、上記の情報により、医師などが、被験者である肝細胞がんの根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者について、肝切除術後の再発リスク(特に、術後４年以上がんを再発しない可能性)の予測を補助することが可能になる。
【００３１】
本実施形態では、GPC3濃度の値が第１の閾値以上である場合、術後は被験者について経過観察することが望ましい。
【００３２】
本実施形態では、第１の閾値は特に限定されず、例えば、術後４年以上無再発であったstage Iの早期肝細胞がん患者及び術後がんが再発したstage Iの早期肝細胞がん患者についてのデータの蓄積により経験的に設定できる。また、次のようにして、第１の閾値を設定してもよい:１)まず、術後４年以上無再発であったstage Iの早期肝細胞がん患者から術前に得た血液試料と、術後がんが再発したstage Iの早期肝細胞がん患者から術前に得た血液試料のそれぞれについて、GPC3濃度を測定する。２)測定結果に基づいて、無再発の患者のGPC3濃度の値よりも高く、且つ、再発した患者のGPC3濃度の値よりも低い範囲から第１の閾値を設定する。好ましくは、無再発の患者とがんが再発した患者とを高精度に区別し得る値を、第１の閾値として設定する。なお、後述の実施例では、GPC3濃度のカットオフ値を132.1 ng/mLに設定している。
【００３３】
あるいは、肝細胞がん患者ではない者、例えば、健常者又は肝細胞がん以外の疾患の患者についてGPC3濃度のデータを蓄積し、該データに基づいてGPC3の血中濃度の基準値を定め、この基準値を第１の閾値としてもよい。
【００３４】
本実施形態では、再発リスクの予測精度を向上させるために、GPC3と、肝細胞がんのマーカーとして知られるAFPとを組み合わせてもよい。すなわち、この実施形態では、上記の血液試料中のAFPの濃度をさらに測定し、GPC3及びAFPの濃度値に基づいて、上記の患者が肝切除術を受けた後の肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報を提供できる。
【００３５】
血液試料におけるAFP濃度の測定法自体は当該技術において公知である。本実施形態では、AFPの測定はそのような公知の測定法から適宜選択すればよいが、それらの中でも、抗AFP抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。また、市販のAFP測定用試薬又はキットを用いてもよい。そのような試薬及びキットとしては、臨床検査又は体外診断に使用できるものとして承認されている試薬及びキットが好ましく、例えば、エクルーシス(登録商標)試薬AFP II(ロシュ・ダイアグノスティック株式会社)などが挙げられる。
【００３６】
GFP3及びAFPの濃度値を取得している場合では、肝細胞がんの４年以上無再発に関する情報は次のようにして提供できる。GPC3濃度の値と第１の閾値とを比較し、AFP濃度の値と第２の閾値とを比較して、GPC3濃度の値が第１の閾値より小さく、且つ、AFP濃度の値が第２の閾値より小さい場合、上記の被験者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低い又は該リスクが実質的に無いということを示唆する情報を提供できる。ここで、第２の閾値(又は第２のカットオフ値ともいう)は特に限定されず、第１の閾値と同様にして設定してもよい。あるいは、当該技術においてAFPの基準値とされている値を用いてもよい。現在、AFPの血中濃度の基準値は、20 ng/mL(放射免疫測定法又は酵素免疫測定法)とされている。
【００３７】
[２．術後の再発リスクの予測]
以下に、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者についての再発リスクの予測を補助する方法について説明する。なお、以下では、GPC3、AFP及びPIVKA-IIを単に「マーカー」とも呼ぶ。本実施形態では、まず、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者から得た血液試料におけるGPC3の濃度と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度とを継続的に測定する。
【００３８】
本実施形態において、stage Iの早期肝細胞がん患者(被験者)は、TNM分類に基づいてstage Iの肝細胞がんであると診断され且つ肝細胞がんの治療として肝切除術を受けた後の患者であれば特に限定されない。なお、術前の血液試料における各マーカーの濃度値は参考となるので、上記の被験者は、術前に血液試料中の各マーカーの濃度を測定されていてもよい。
【００３９】
血液試料としては、上記の被験者から得られる血液、血漿及び血清が挙げられ、好ましくは血清及び血漿である。また、上記の術前の再発リスクの予測について述べたことと同様に、被験者の血液、血漿又は血清を水性媒体やブロッキング液で希釈して得られる希釈液を、血液試料として用いてもよい。
【００４０】
本実施形態では、術後、被験者の各マーカーの濃度を継続的に測定するが、測定の時期及び頻度などは特に限定されず、適宜決定できる。例えば、第１回目の測定を、肝切除術後２週間以内に行い、以降の測定を第１回目の測定から３〜４ヶ月ごとに行ってもよい。一般に、肝細胞がん患者は、術後しばらくの間は経過観察のために通院する必要があるので、この通院の際に各マーカーの濃度を測定してもよい。
【００４１】
血液試料中のGFP3及びAFPの濃度の測定法などについては、上記の術前の再発リスクの予測について述べたことと同様である。血液試料におけるPIVKA-II濃度の測定法自体は当該技術において公知である。本実施形態では、PIVKA-IIの測定はそのような公知の測定法から適宜選択すればよいが、それらの中でも、抗PIVKA-II抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。また、市販のPIVKA-II測定用試薬又はキットを用いてもよい。そのような試薬及びキットとしては、臨床検査又は体外診断に使用できるものとして承認されている試薬及びキットが好ましく、例えば、ルミパルス(登録商標)PIVKA-II エーザイ(エーディア株式会社)などが挙げられる。
【００４２】
次いで、本実施形態では、測定したGPC3濃度の値と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つの濃度の値とに基づいて、上記の被験者における肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供する。そのような情報としては、例えば、肝細胞がんの再発リスクが高いことを示唆する情報、又は、肝細胞がんがすでに再発していることを示唆する情報などが挙げられる。なお、示唆する情報には、上述と同様に直接的及び間接的な表現が含まれる。すなわち、「肝細胞がんが再発するリスクが高い」又は「肝細胞がんがすでに再発している」という直接的な情報や、「＋」や「−」などの間接的な情報を用いて、情報を提供することが含まれる。例えば、「肝細胞がんが再発するリスクが高い」又は「肝細胞がんがすでに再発している」場合に、「＋」との情報を提供することが挙げられる。
【００４３】
本実施形態では、上記の肝細胞がんの再発リスクに関する情報は、GPC3濃度の値と第１の閾値とを比較し、AFP濃度を測定している場合はAFP濃度の値と第２の閾値とを比較し、PIVKA-II濃度を測定している場合はPIVKA-II濃度の値と第３の閾値とを比較した結果に基づいて提供することが好ましい。例えば、以下の３つの場合では、被験者における肝細胞がんの再発リスクが高いことを示唆する情報を提供できる：
i) GPC3及びAFPの濃度を測定しており、GPC3濃度の値が第１の閾値以上であり且つAFP濃度の値が第２の閾値以上の場合、
ii) GPC3及びPIVKA-IIの濃度を測定しており、GPC3濃度の値が第１の閾値以上であり且つPIVKA-II濃度の値が第３の閾値以上の場合、及び、
iii) GPC3、AFP及びPIVKA-IIの濃度を測定しており、GPC3濃度の値が第１の閾値以上であり且つAFP濃度の値が第２の閾値以上であり且つPIVKA-II濃度の値が第３の閾値以上の場合。
【００４４】
本実施形態では、上記の情報により、医師などが、被験者である肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者について、がんの再発リスクの予測を補助することが可能になる。
【００４５】
本実施形態では、GPC3、AFP及びPIVKA-IIのいずれかの濃度の値がそれぞれに対応する閾値より小さい場合、被験者について経過観察し、本実施形態の方法を継続的に行うことが望ましい。
【００４６】
本実施形態では、第１、第２及び第３の閾値(又は、第１、第２及び第３のカットオフ値ともいう)は特に限定されず、上記の術前の再発リスクの予測に用いる第１の閾値と同様にして設定してもよい。あるいは、術前に被験者のマーカーの濃度値を測定している場合は、次のようにして各閾値を設定してもよい：１)術前のマーカーの濃度値と、術後初めて測定したマーカーの濃度値とを比較して、術後の濃度値が有意に低下しているか否かを確認する。２)低下が認められる場合、その術後の濃度値を閾値として設定する。
【００４７】
第２及び第３の閾値については、それぞれ当該技術においてAFP及びPIVKA-IIの基準値とされている値を用いてもよい。なお、PIVKA-IIの血中濃度の基準値は、40 mAU/mL(電気化学発光免疫測定法)又は１μg/mL(ラテックス凝集法)とされている。
【００４８】
[３．システム及びコンピュータプログラム製品]
本発明には、stage Iの早期肝細胞がん患者(被験者)のがんの再発リスクに関する情報の提供に適するシステムが含まれる。また、本発明には、該被験者のがんの再発リスクに関する情報の提供をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム製品も含まれる。なお、該コンピュータプログラム製品が備える媒体は、コンピュータプログラムが非一時的に記録され、且つ、コンピュータが読取可能な媒体であってもよい。
【００４９】
以下に、上記の本実施形態の方法を実施するのに好適な装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本発明はこの例に示される形態のみに限定されない。図１は、被験者のがんの再発リスクに関する情報を提供するための判定装置の概略図である。図１に示された判定装置１１は、測定装置２２と、該測定装置２２と接続されたコンピュータシステム３３とを含んでいる。
【００５０】
本実施形態において、測定装置の種類は特に限定されず、GFP3、AFP及びPIVKA-IIの測定方法に応じて適宜選択できる。図１に示される例では、測定装置２２は、標識抗体を用いるELISA法により生じるシグナルを検出可能なプレートリーダーである。プレートリーダーは、マーカーの測定に用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されず、標識物質の種類に応じて適宜選択できる。以下に説明する例では、シグナルは、化学発光シグナルや蛍光シグナルなどの光学的情報である。
【００５１】
抗原抗体反応を行ったプレートを測定装置２２にセットすると、測定装置２２は、GFP3と特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報を取得し、得られた光学的情報をコンピュータシステム３３に送信する。なお、測定装置２２に取得される光学的情報には、濃度値の算出ための濃度既知の検体の情報も含まれている。また、AFP及びPIVKA-IIの濃度も測定する場合は、測定装置２２は、AFP及びPIVKA-IIのそれぞれと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報を取得し、得られた光学的情報をコンピュータシステム３に送信する。
【００５２】
コンピュータシステム３３は、コンピュータ本体３３ａと、入力デバイス３３ｂと、検体情報や判定結果などを表示する表示部３３ｃとを含む。コンピュータシステム３３は、測定装置２２から光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム３３のプロセッサは、光学的情報に基づいて、被験者の肝細胞がんの再発リスクに関する情報を提供するプログラムを実行する。
【００５３】
図２は、図１に示された判定装置の機能構成を示すブロック図である。図２に示されるように、コンピュータシステム３３は、取得部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。取得部３０１は、測定装置２２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。なお、算出部３０３と判定部３０４とは、制御部３０６を構成している。
【００５４】
取得部３０１は、測定装置２２から送信された情報を取得する。記憶部３０２は、判定に必要な閾値及び各マーカーの濃度値を算出するための式を記憶する。算出部３０３は、取得部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式にしたがって、各マーカーの濃度値を算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出されたマーカーの濃度値が、記憶部３０２に記憶された閾値よりも小さいか否かを判定する。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、被験者の肝細胞がんの再発リスクに関する情報として出力する。ここで、光学的情報が、肝細胞がんの根治的治療を受ける前の被験者の検体に由来する場合、被験者の肝細胞がんの再発リスクに関する情報は、４年以上がんが再発しない可能性に関する情報である。また、光学的情報が、肝切除術を受けた後の被験者の検体に由来する場合、被験者の肝細胞がんの再発リスクに関する情報は、がんが再発する可能性に関する情報である。
【００５５】
図３は、図１に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。図３に示されるように、コンピュータ本体３３ａは、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３３０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３３１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３３２と、ハードディスク３３３と、入出力インターフェイス３３４と、読出装置３３５と、通信インターフェイス３３６と、画像出力インターフェイス３３７とを備えている。ＣＰＵ３３０、ＲＯＭ３３１、ＲＡＭ３３２、ハードディスク３３３、入出力インターフェイス３３４、読出装置３３５、通信インターフェイス３３６及び画像出力インターフェイス３３７は、バス３３８によってデータ通信可能に接続されている。
【００５６】
ＣＰＵ３３０は、ＲＯＭ３３１に記憶されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ３３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、上述した各機能ブロックが実現される。これにより、コンピュータシステムが、被験者のがんの再発リスクに関する情報を提供するための判定装置としての端末として機能する。
【００５７】
ＲＯＭ３３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３３１には、ＣＰＵ３３０によって実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。
【００５８】
ＲＡＭ３３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３３２は、ＲＯＭ３３１及びハードディスク３３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３３０の作業領域として利用される。
【００５９】
ハードディスク３３３は、ＣＰＵ３３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(被験者のがんの再発リスクに関する情報を提供するためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００６０】
読出装置３３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３３５は、可搬型記録媒体３４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
【００６１】
入出力インターフェイス３３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３３４には、キーボード、マウスなどの入力デバイス３３ｂが接続されている。操作者は、当該入力デバイス３３ｂを使用することにより、コンピュータ本体３３ａにデータを入力することが可能である。
【００６２】
通信インターフェイス３３６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータシステム３３は、通信インターフェイス３３６により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。測定装置２２は、通信インターフェイス３３６により、コンピュータシステム３３への測定データ(光学的情報)の送信が可能である。
【００６３】
画像出力インターフェイス３３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３３ｃに接続されている。これにより、表示部３３ｃは、ＣＰＵ３３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００６４】
次に、判定装置１１による、被験者のがんの再発リスクに関する情報の提供の処理手順を説明する。図４Ａは、図１に示された判定装置を用いた４年以上無再発に関する情報の提供のフローチャートである。ここでは、GPC3と特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報からGPC3の濃度値を取得し、得られた濃度値を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００６５】
まず、ステップＳ１−１において、判定装置１１の取得部３０１は、測定装置２２から光学的情報を取得する。次に、ステップＳ１−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得した光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、GPC3の濃度値を算出する。
【００６６】
その後、ステップＳ１−３において、判定部３０４は、算出部３０３で算出された濃度値と、記憶部３０２に記憶された閾値とを用いて、被験者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低いかを判定する。ここで、GPC3の濃度値が第１の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ１−４に進行し、判定部３０４は、被験者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、GPC3の濃度値が第１の閾値よりも小さくないとき(すなわち、GPC3の濃度値が第１の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ１−５に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００６７】
そして、ステップＳ１−６において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、根治的治療を受ける前の被験者における肝切除術後の４年以上無再発に関する情報を医師などに提供することができる。
【００６８】
図４Ｂは、AFPをさらに測定する場合のフローチャートである。ここでは、GPC3及びAFPのそれぞれと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報から、GPC3及びAFPの濃度値を取得し、得られた濃度値を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００６９】
まず、ステップＳ２−１において、判定装置１の取得部３０１は、測定装置２から光学的情報を取得する。次に、ステップＳ２−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得したGPC3及びAFPについての光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、GPC3及びAFPの濃度値を算出する。
【００７０】
その後、ステップＳ２−３において、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたGPC3濃度値と、記憶部３０２に記憶された第１の閾値とを比較する。ここで、GPC3濃度値が第１の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ２−４に進行し、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたAFP濃度値と、記憶部３０２に記憶された第２の閾値とを用いて、被験者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低いかを判定する。ここで、AFP濃度値が第２の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ２−５に進行し、判定部３０４は、被験者が肝切除術を受けた後４年以上、肝細胞がんが再発するリスクが低いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００７１】
ステップＳ２−３においてGPC3濃度値が第１の閾値よりも小さくないとき(すなわち、GPC3濃度値が第１の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ２−６に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、ステップＳ２−４において、AFP濃度値が第２の閾値よりも小さくないとき(すなわち、AFP濃度値が第２の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ２−６に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。なお、本実施形態においては、ステップＳ２−３とステップＳ２−４との判定ステップは順番を入れ替えることができる。そして、ステップＳ２−７において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。
【００７２】
図５Ａは、図１に示された判定装置を用いた、術後の被験者におけるがんが再発するリスクに関する情報の提供のフローチャートである。ここでは、ここでは、GPC3及びAFPのそれぞれと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報から、GPC3及びAFPの濃度値を取得し、得られた濃度値を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。なお、この例においては、AFP濃度に代えてPIVKA-II濃度を取得して、GPC3及びPIVKA-IIの濃度値を用いて判定を行ってもよい。
【００７３】
まず、ステップＳ３−１において、判定装置１の取得部３０１は、測定装置２から光学的情報を取得する。次に、ステップＳ３−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得したGPC3及びAFPについての光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、GPC3及びAFPの濃度値を算出する。
【００７４】
その後、ステップＳ３−３において、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたGPC3濃度値と、記憶部３０２に記憶された第１の閾値とを比較する。ここで、GPC3濃度値が第１の閾値よりも小さくないとき(すなわち、GPC3濃度値が第１の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ３−４に進行し、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたAFP濃度値と、記憶部３０２に記憶された第２の閾値とを用いて、被験者について肝細胞がんが再発するリスクが高いかを判定する。ここで、AFP濃度値が第２の閾値よりも小さくないとき(すなわち、AFP濃度値が第２の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ３−５に進行し、判定部３０４は、被験者について肝細胞がんが再発するリスクが高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００７５】
なお、AFP濃度に代えてPIVKA-II濃度を用いる場合、ステップＳ３−４では、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたPIVKA-II濃度値と、記憶部３０２に記憶された第３の閾値とを用いて、被験者について肝細胞がんが再発するリスクが高いかを判定する。ここで、PIVKA-II濃度値が第３の閾値よりも小さくないとき(すなわち、PIVKA-II濃度値が第３の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ３−５に進行する。
【００７６】
ステップＳ３−３においてGPC3濃度値が第１の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ３−６に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。また、ステップＳ３−４において、AFP濃度値が第２の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ３−６に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。なお、本実施形態においては、ステップＳ３−３とステップＳ３−４との判定ステップは順番を入れ替えることができる。
【００７７】
そして、ステップＳ３−７において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、肝切除術後の被験者における肝細胞癌の再発リスクに関する情報を医師などに提供することができる。
【００７８】
図５Ｂは、PIVKA-IIをさらに測定する場合のフローチャートである。ここでは、GPC3、AFP及びPIVKA-IIのそれぞれと特異的に結合した標識抗体に基づく光学的情報から、GPC3、AFP及びPIVKA-IIの濃度値を取得し、得られた濃度値を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
【００７９】
まず、ステップＳ４−１において、判定装置１の取得部３０１は、測定装置２から光学的情報を取得する。次に、ステップＳ４−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得したGPC3、AFP及びPIVKA-IIについての光学的情報から、記憶部３０２に記憶された濃度値を算出するための式にしたがって、GPC3、AFP及びPIVKA-IIの濃度値を算出する。
【００８０】
その後、ステップＳ４−３において、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたGPC3濃度値と、記憶部３０２に記憶された第１の閾値とを比較する。ここで、GPC3濃度値が第１の閾値よりも小さくないとき(すなわち、GPC3濃度値が第１の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ４−４に進行し、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたAFP濃度値と、記憶部３０２に記憶された第２の閾値とを比較する。ここで、AFP濃度値が第２の閾値よりも小さくないとき(すなわち、AFP濃度値が第２の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ４−５に進行し、判定部３０４は、算出部３０３で算出されたPIVKA-II濃度値と、記憶部３０２に記憶された第３の閾値とを用いて、被験者について肝細胞がんが再発するリスクが高いかを判定する。ここで、PIVKA-II濃度値が第３の閾値よりも小さくないとき(すなわち、PIVKA-II濃度値が第３の閾値以上であるとき)、処理は、ステップＳ４−６に進行し、判定部３０４は、被験者について肝細胞がんが再発するリスクが高いことを示す判定結果を出力部３０５に送信する。
【００８１】
ステップＳ４−３においてGPC3濃度値が第１の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ４−７に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。ステップＳ４−４において、AFP濃度値が第２の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ４−７に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。ステップＳ４−５において、PIVKA-II濃度値が第３の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップＳ４−７に進行し、判定部３０４は、被験者について経過観察が必要であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。なお、本実施形態においては、ステップＳ４−３、ステップＳ４−４及びステップＳ４−５の判定ステップは順番を入れ替えることができる。そして、ステップＳ４−８において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。
【００８２】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００８３】
実施例１
(１)対象及び試料
TNM分類に基づいてstage Iの肝細胞がんと診断され且つ肝切除術を受けた患者(27症例)を対象とした。27症例の対象のうち、術後がんが再発し且つ術前から再発時まで継続的に採血できた患者(再発症例という)は14症例であった。再発の診断は画像検査の結果に基づいて行った。再発例の術後から再発時までの期間は、最短で99日、最長で1070日であり、平均で577.5日であった。再発例のうち、術後から再発時までの期間が２年以上であった患者は５症例であった。一方、27症例の対象のうち、術後４年以上無再発であって且つ術前から継続的に採血できた患者(４年以上無再発症例という)は８症例であった。なお、年齢をマッチさせた非肝疾患(胆膵がん)の術後患者(39症例)を対照とした。本実施例では、各患者の血液から得られた血清を試料とした。
【００８４】
(２)腫瘍マーカーの測定
(2-1)GPC3の測定
(i)抗GPC3モノクローナル抗体の調製
BALB/cマウスに放射線(3.5 Gy)を照射し、３日後にプリスタンをマウスの腹腔に接種した。放射線照射から７日後に、１x105個以上のハイブリドーマをマウスの腹腔に接種した。ここで、用いたハイブリドーマは、2012年４月23日に独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託センター(NPMD)に、受託番号NITE P-1336で寄託されたハイブリドーマ(クローン名10A4)及び受託番号NITE P-1327で寄託されたハイブリドーマ(クローン名2E11)の２種類である。ハイブリドーマの接種から１〜２週間後にマウスの腹水を回収した。回収した腹水を15000 rpmで30分間遠心して不溶性粒子を除去した後、0.45 μmポアサイズのシリンジフィルター(Nunc社製)を用いて濾過した。濾過した腹水をPBSで５倍希釈した。得られた希釈液を、Protein G Sepharose(GE healthcare社製)を充填したカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィに付した。抗GPC3モノクローナル抗体を吸着させたカラムをPBSで洗浄して夾雑物を除去し、0.1 M グリシン-HCl(pH 2.7)を用いて抗体を酸溶出した。得られた抗体溶液と１M Tris-HCl(pH 8.0)とを直ちに混合してpHを中性付近に調整した。得られた精製抗体の溶液について280 nmの紫外線吸収の測定値及び分子吸光係数1.4から抗体濃度を算出した。なお、本実施例では、ハイブリドーマ10A4由来の抗GPC3モノクローナル抗体をGPC3捕捉用抗体と呼び、ハイブリドーマ2E11由来の抗GPC3モノクローナル抗体をGPC3検出用抗体と呼ぶ。
【００８５】
(ii)抗体のビオチン標識
上記のGPC3検出用抗体を、NHS-LC-Biotinylation reagent(Pierce社)及びNHS-LC-LC-Biotinylation reagent(Pierce社)を用いてビオチン標識した。なお、抗体のビオチン標識の具体的な操作は、試薬に添付のマニュアルに従って行った。
【００８６】
(iii)サンドイッチELISA法
96ウェルmaxisorpプレート(Nunc社製)の各ウェルに、PBSで５μg/mLの濃度に調整したGPC3捕捉用抗体の溶液を50μLずつ添加し、室温で１時間以上インキュベートした。抗体溶液を除去し、各ウェルに１〜２％ブロックエース(DSファーマバイオメディカル社)を添加して、ブロッキングした。各患者の血清を0.1％ブロックエースで２〜４倍に希釈して測定試料を得た。また、検量線作成のために、GPC3を分泌する細胞株HepG2の培養上清から、GPC3標準タンパク質をアフィニティー精製により得た。抗GPC3モノクローナル抗体を固定化したプレートの各ウェルに測定試料を50μLずつ添加し、４℃にて12時間インキュベートした。測定試料を除去し、0.05％ Tween 20含有PBSで各ウェルを洗浄した。洗浄したプレートの各ウェルに、ビオチン標識したGPC3検出用抗体を50μLずつ添加し、室温で２時間以上インキュベートした。抗体溶液を除去し、0.05％ Tween 20含有PBSで各ウェルを洗浄した。洗浄したプレートの各ウェルにアビジン-セイヨウワサビペルオキシダーゼ(Thermo Scientific社)を添加し、室温で30分間インキュベートした。酵素溶液を除去し、0.05％ Tween 20含有PBSで各ウェルを洗浄した。洗浄したプレートの各ウェルに1-step Ultra-TMB-ELISA(Thermo Scientific社)を添加して発色させた。５〜10分後、各ウェルに0.18 M硫酸を添加して発色を停止させた。Multiplate reader(BioRad社製)を用いて、450〜540 nmにおける吸光度を測定した。濃度既知の標準タンパク質溶液の希釈系列についても同様に測定して、検量線を作成した。この検量線を用いて、GPC3濃度を定量した。また、カットオフ値の設定のために、対照の患者由来の血清についても同様に測定して、GPC3濃度を定量した。
【００８７】
(2-2)AFPの測定
各患者の血液から得られた血清中のAFPの濃度を、AFP測定用試薬キット(エクルーシス(登録商標)試薬AFP II、ロシュ・ダイアグノスティック株式会社)を用いて測定した。具体的な測定操作は、試薬キットに添付のマニュアルに従った。
【００８８】
(2-3)PIVKA-IIの測定
各患者の血液から得られた血清中のPIVKA-IIの濃度を、PIVKA-II測定用試薬キット(ルミパルス(登録商標)PIVKA-II エーザイ、エーディア株式会社)を用いて測定した。具体的な測定操作は、試薬キットに添付のマニュアルに従った。
【００８９】
(３)閾値(カットオフ値)の設定
対照患者の血清中GPC3濃度の測定結果から、平均値(Ave)、標準偏差(SD)及び標準誤差(SE)を算出した。これらの値からカットオフ値の候補を算出し、各候補について偽陽性数及び特異性を求めた(表１参照)。本実施例では、GPC3濃度のカットオフ値を132.1 ng/mLに設定した。
【００９０】
【表１】
2016095233.tif 000002
【００９１】
本実施例では、AFP濃度のカットオフ値を20 ng/mLに設定し、PIVKA-II濃度のカットオフ値を40 mAU/mLに設定した。これらのカットオフ値は、当該技術においてAFP及びPIVKA-IIの基準値とされている値である。
【００９２】
(４)結果
再発症例(n=14)の術前及び術後(再発時)の各マーカー濃度の値を、それぞれのカットオフ値と比較した。そして、各マーカー及びそれらの組み合わせについて、カットオフ値を超える症例の割合(陽性率)を算出した。結果を表２に示す。また、再発症例のうち、一部の患者のGPC3濃度の推移を、図６に示す。
【００９３】
【表２】
2016095233.tif 000003
【００９４】
また、４年以上無再発症例(n=8)の術前の各マーカー濃度の値を、それぞれのカットオフ値と比較した。そして、各マーカー及びそれらの組み合わせについて、カットオフ値を超える症例の割合(陽性率)を算出した。結果を表３に示す。
【００９５】
【表３】
2016095233.tif 000004
【００９６】
表２に示されるように、再発例において、術後の再発時では、GPC3の陽性率は、従来マーカーであるAFP及びPIVKA-IIの陽性率よりも高かった。さらに、術後の再発時ではGPC3単独の陽性率は、AFP及びPIVKA-IIを組み合わせた場合よりも高かった。これらのことから、GPC3は、肝切除術を受けた後のstage Iの早期肝細胞がん患者の再発リスクの予測に有用なマーカーであることが示された。特に、GPC3と、AFP及びPIVKA-IIから選択される少なくとも１つとを組み合わせることで、予測の精度がより向上することが示された。
【００９７】
上述のとおり、再発の診断は画像検査により行っているが、画像検査では、がんがある程度の大きさまで増殖していなければその存在を確認することは難しい。ここで、図６に示されるGPC3濃度の推移を見ると、GPC3濃度は、術前に高値であり、肝切除術の直後に顕著に減少するが、その後、再発の診断時には濃度が再び高値となっている。したがって、術後まもなくからGPC3の濃度値を継続的に測定して値の推移をモニターすれば、画像検査で再発診断が可能となる時期よりも前に、再発のリスクを予測できることが示唆される。
【００９８】
表３に示されるように、４年以上無再発症例では、術前のGPC3及びAFPの陽性率が低かった。ここで、表２に示される再発例における術前の陽性率と比べても、４年以上無再発症例におけるGPC3及びAFPの陽性率は低いことがわかった。一方で、術前のPIVKA-IIの陽性率は、４年以上無再発症例及び再発例のいずれにおいても高いことが分かった。これらのことから、根治的治療(本実施例では肝切除術)の前に採取した血液試料中のGPC3濃度が低い場合、根治的治療を受ける前のstage Iの早期肝細胞がん患者が術後４年以上、がんの再発リスクが低いことを予測できることが示された。また、GPC3とAFPとを組み合わせることで偽陰性が低減し、予測の精度がより向上すると考えられる。
【符号の説明】
【００９９】
１１    判定装置
２２    測定装置
３３    コンピュータシステム
３３ａ  コンピュータ本体
３３ｂ  入力デバイス
３３ｃ  表示部
【図１】
2016095233.tif 000005
【図２】
2016095233.tif 000006
【図３】
2016095233.tif 000007
【図４Ａ】
2016095233.tif 000008
【図４Ｂ】
2016095233.tif 000009
【図５Ａ】
2016095233.tif 000010
【図５Ｂ】
2016095233.tif 000011
【図６】
2016095233.tif 000012