(57)【要約】【課題】真正担子菌において、リグニンの分解能を増加させる方法およびリグニン分解能が高められた真正担子菌を提供する。【解決手段】真正担子菌において、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させる方法により、リグニン分解能を高める。プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（ＰＫＡｃ）の活性化によるリグニン分解と共に、ラッカーゼやマンガンペルオキシダーゼを産生することもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真正担子菌においてリグニン分解能を増加させる方法であって、
該真正担子菌のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることを含む方法。
【請求項２】
前記真正担子菌が、白色腐朽菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることが、該プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット遺伝子を高発現させることによってなされる、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることが、プロテインキナーゼＡ調節サブユニットの機能を抑制することによってなされる、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載の方法によってリグニン分解能が高められた真正担子菌。
【請求項６】
リグニン分解能が、野生型の少なくとも１．２倍以上に増加した、請求項５記載の真正担子菌。
【請求項７】
請求項５または６のいずれか１項記載の真正担子菌をリグニンを含む資源に接触させ、リグニンを分解する方法。
【請求項８】
請求項５または６のいずれか１項記載の真正担子菌の培養上清をリグニンを含む資源に接触させ、リグニンを分解する方法。
【請求項９】
真正担子菌においてラッカーゼおよび／またはマンガンペルオキシダーゼを産生する方法であって、
該真正担子菌のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることを含む方法。
【請求項１０】
前記真正担子菌が、白色腐朽菌である、請求項９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真正担子菌のリグニン分解能を増加させる方法に関する。さらには、本発明は、リグニン分解能が高められた真正担子菌、真正担子菌を用いたリグニン分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
木質からは樹脂、糖、バイオエタノールを含む液体燃料、セルロース素材など、石油製品の代替物となり得る多様な製品を生産する（木質バイオリファイナリー）ことが可能である。市場競争力をもつほど安価に多様な木質由来製品を生産するためには、低コストな木質加工法が必要となる。木質加工において、最も大きな障害となっているのが難分解性のリグニンの分解処理である。パルプ産業などにおいてはクラフトパルプ法などの物理化学的な方法でリグニンの除去が行われるが、投入エネルギーや溶媒コストが大きい。改良法などの検討も行われているが、実用的な木質バイオリファイナリーが実現できるほどの効率は未だ達成できていないのが現状である。
【０００３】
真正担子菌類、特に白色腐朽菌は、単独で木質の完全無機化が可能な唯一の存在であり、効率的なリグニン分解系を持つことが最大の特徴である。これを木質バイオリファイナリーにおけるリグニンの分解や分離に利用する事により、白色腐朽菌のリグニン分解能の強さに応じて、消費される電力や溶媒のコストを低減させることができる。
【０００４】
真正担子菌類が産生するラッカーゼは、強力な酸化能力を持ち、リグニンやポリフェノール類を酸化することができることが知られており、広い基質特異性と相俟って、高分子を合成する際の重合化促進剤、パルプ漂白剤、人工色素の脱色反応剤、口臭予防剤、ジュース混濁防止剤、および染髪料、としてなど、様々な用途が考えられる。
【０００５】
その有用性に鑑み、真正担子菌由来のラッカーゼ遺伝子の上流に、別の真正担子菌由来のプロモーター領域やターミネーター領域を結合させて、発現ベクターを構築し、大腸菌、酵母、または真正担子菌を宿主として用いることによりラッカーゼ高生産株を作成して、ラッカーゼを得る試みもされている（例えば特許文献１）。
【０００６】
真正担子菌類が産生するマンガンペルオキシダーゼもまた、酸化還元酵素の１つであり、リグニン分解に関与する酵素である。工場廃液処理などの産業的利用が考えられている。担子菌を特定の培養条件下にて培養し、マンガンペルオキシダーゼの生産性を向上させる方法も提供されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０００−３４２２７５号公報
【特許文献２】特開２００９−１００６８１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、白色腐朽菌のリグニン分解系は未解明の部分も多く、多くの未知因子群の関与が指摘されている。また、一般に白色腐朽菌は十〜数十種類のラッカーゼ遺伝子やマンガンペルオキシダーゼ遺伝子をもっている。それぞれの遺伝子は機能的な違いも持つアイソザイムをコードしており、基質に応じた使い分けが行われていると考えられている。それ故に、特定のラッカーゼ遺伝子やマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現を増加させたとしても、リグニン分解効率を大幅に増加させることは難しい。また、仮に全てのラッカーゼ遺伝子とマンガンペルオキシダーゼ遺伝子の発現を増加させても、リグニン分解関連未知因子群についても高発現を行わない限り、同様の結果になると考えられる。さらに、そもそも、白色腐朽菌において数十以上の遺伝子の発現を同時に増加させる技術は開発されていない。
【０００９】
本発明の目的は、真正担子菌によって、効率的にリグニンを分解する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の目的はまた、このようにリグニン分解能が高められた真正担子菌を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで、本発明者らは、鋭意検討を行い、真正担子菌のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることで、その真正担子菌によるリグニン分解能を高めることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
本発明は、真正担子菌においてリグニン分解能を増加させる方法であって、該真正担子菌のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることを含む方法、に関する。
【００１３】
上記真正担子菌は、白色腐朽菌であり得る。
【００１４】
上記プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることは、該プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット遺伝子を高発現させることによってなされ得る。
【００１５】
上記プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることが、プロテインキナーゼＡ調節サブユニットの機能を抑制することによってなされ得る。
【００１６】
本発明はまた、上記いずれかの方法によってリグニン分解能が高められた真正担子菌、に関する。
【００１７】
上記いずれかの方法によってリグニン分解能が高められた真正担子菌のリグニン分解能は、野生型の少なくとも１．２倍であり得る。
【００１８】
本発明はまた、上記いずれかの真正担子菌をリグニンを含む資源に接触させ、リグニンを分解する方法に関する。
【００１９】
本発明はまた、上記いずれかの真正担子菌の培養上清をリグニンを含む資源に接触させ、リグニンを分解する方法、に関する。
【００２０】
本発明はまた、真正担子菌においてラッカーゼおよび／またはマンガンペルオキシダーゼを産生する方法であって、
該真正担子菌のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることを含む方法、に関する。
【００２１】
上記真正担子菌は、白色腐朽菌であり得る。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、リグニン分解能が高い株を得てリグニン分解を効率的に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の真正担子菌によるプロテインキナーゼA触媒サブユニット転写物量の経時変化を示す図である。
【図２】本発明の真正担子菌によるプロテインキナーゼA触媒サブユニット転写物量の経時変化を示す図である。
【図３】真正担子菌によるリグニン分解を示す図である。
【図４】真正担子菌によるラッカーゼ活性の経時変化を示す図である。
【図５】真正担子菌によるマンガンペルオキシダーゼ活性の経時変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明では、真正担子菌において、リグニン分解能を増加させることができる。ここで、真正担子菌は、白色腐朽菌であることがより好ましい。ここで、白色腐朽菌とは、木材中のリグニンを二酸化炭素と水にまで分解する能力を有するものを指す。白色腐朽菌は、セルロースとリグニンを同時に分解する非選択的白色腐朽菌と、セルロースはあまり分解せずリグニンを優先的に分解する選択的白色腐朽菌に分けられる。本発明で、白色腐朽菌というときは、非選択的白色腐朽菌も選択的白色腐朽菌もどちらも含む。
【００２５】
白色腐朽菌としては、ヒラタケ、ウスヒラタケ、エリンギ、ヒマラヤヒラタケ等のPleurotus属菌、シイタケ、ナメコ、アラゲカワラタケ、エノキタケ、マイタケ、タモギタケ、カワラタケ、ヒイロタケ、ベッコウタケ、スギヒラタケ、スエヒロタケ、シュタケ、ホシゲタケ、ヤケイロタケ、Phanerochaete chrysosporium、Ceriporiopsis subvermisporaなどが含まれるが、限定はされない。
【００２６】
リグニンとは、あらゆる植物に含まれる難分解性の物質であり、特に木材では、２０重量％〜３０重量％を占める成分で、生育に伴い、道管・仮道管・繊維などの組織で生産される。リグニンは、p-クマリルアルコール(p-ヒドロキシシンナミルアルコール)・コニフェリルアルコール・シナピルアルコールの３種類のリグニンモノマー(モノリグノール)が、植物由来のラッカーゼまたはペルオキシダーゼの触媒の元で高度に重合し、三次元網目構造を形成した、生体高分子である。木質は地球上において最大級の賦存量を持つカーボンニュートラルな再生可能資源であるが、木質を利用しやすい資源へと変換するにあたり、最大の問題となっているのが、難分解性のリグニンの処理である。リグニンの除去後に残るセルロースやヘミセルロースは液体燃料(バイオエタノール)生産にあたり貴重な原料であるが、リグニン除去の為の投入エネルギーや溶媒コストが課題となっている。さらに、セルロースナノファイバーや樹脂原料などの高付加価値素材の生産も含めた木質バイオリファイナリーにおいても、製造過程でのリグニン除去に伴う投入エネルギーや溶媒コストは重要な課題である。リグニン自体もエポキシ樹脂の原料となることが判明しており、将来的な利用が期待されているが、やはり分解処理のコスト高を解決する必要がある。
【００２７】
本明細書でいうプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（PKAc）とは、プロテインキナーゼA（AキナーゼまたはPKA、EC 2.7.11.11）の2つのサブユニットの内、プロテインキナーゼとして機能する部分である。限定はされないが、特に、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）を例に挙げた場合には、米国DOE Joint Genome Institute（http://jgi.doe.gov）におけるヒラタケPC９株全ゲノム解析（バージョン１．０）におけるタンパク質の識別番号で表すと、85056および114122の2種の配列をコードする遺伝子が例示される（http://genome.jgi.doe.gov/PleosPC9_1/PleosPC9_1.home.html）。さらには、他の白色腐朽菌において、これらの配列に対応する、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットは知られている。
【００２８】
本発明において、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットという時には、識別番号85056または114122のタンパク質とそれぞれBLOSUM６２スコア表に基づく動的計画法によるアミノ酸配列比較において３５％以上、好ましくは、５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質も含む。
【００２９】
本発明者らは、初めて、プロテインキナーゼA触媒サブユニットの活性化が、真正担子菌内でリグニン分解を促進する働きがあることを見出した。プロテインキナーゼA触媒サブユニットには、リグニン分解系発現誘導経路を活性化させる働きがあると推測される。
【００３０】
プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させる方法としては、限定はされないが、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット遺伝子の上流塩基配列部分に、高発現プロモーターを作動可能に結合させ、真正担子菌に導入することで、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット遺伝子またはタンパク質を過剰に発現させる方法が含まれる。
【００３１】
ここで、高発現プロモーターとは、lcc1遺伝子プロモーター、sdi1遺伝子プロモーター、βチューブリン遺伝子プロモーター、gpd遺伝子プロモーターが例示されるが、限定はされない。
【００３２】
プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させる別の方法としては、プロテインキナーゼＡ調節サブユニット（PKAr）の機能を抑制する方法が含まれる。具体的には、プロテインキナーゼＡ調節サブユニット（PKAr）遺伝子またはタンパク質の機能を抑制する方法が含まれる。
【００３３】
ここで、プロテインキナーゼＡ調節サブユニットとは、プロテインキナーゼA（AキナーゼまたはPKA、EC 2.7.11.11）の2つのサブユニットの内、プロテインキナーゼA触媒サブユニットと結合することによりプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットの機能を抑制し、環状アデノシン一リン酸（cAMP）との結合によりプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットから分離する部分である。プロテインキナーゼＡ調節サブユニット遺伝子とは、特に、ヒラタケを例に挙げた場合には、米国DOE Joint Genome Institute（http://jgi.doe.gov）におけるヒラタケPC９株全ゲノム解析（バージョン１．０）におけるタンパク質の識別番号で表すと、83554の配列をコードする遺伝子が例示される（http://genome.jgi.doe.gov/PleosPC9_1/PleosPC9_1.home.html）。さらには、他の白色腐朽菌において、これらの配列に対応する、プロテインキナーゼＡ調節サブユニットは知られている。
【００３４】
本明細書でプロテインキナーゼA調節サブユニット遺伝子に対応するタンパク質は、米国DOE Joint Genome InstituteにおけるヒラタケPC９株全ゲノム解析（バージョン１．０）におけるタンパク質の識別番号83554のタンパク質とそれぞれBLOSUM６２スコア表に基づく動的計画法によるアミノ酸配列比較において３５％以上、好ましくは、５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質である。
【００３５】
このようなプロテインキナーゼＡ調節サブユニット（PKAr）遺伝子またはタンパク質の機能抑制には、限定はされないが、プロテインキナーゼＡ調節サブユニット（PKAr）遺伝子の破壊、干渉、抑制、サブユニット同士の結合と解離の調節、またはプロテインキナーゼＡ調節サブユニットの破壊または抑制などが含まれる。ここで、サブユニット同士の結合と解離の調節とは、限定はされないが、例えば、プロテインキナーゼＡ調節サブユニットをプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットから解離させ、常時プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットが活性状態となるように保持することなどをいう。
【００３６】
プロテインキナーゼA調節サブユニット遺伝子の破壊には、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットまたはプロテインキナーゼA調節サブユニット、あるいはその両方に対して、サブユニット同士の相互作用に重要なアミノ酸の部位を変異させることを含む。
【００３７】
プロテインキナーゼＡ調節サブユニット遺伝子の破壊の目的が達成できれば、特に破壊する手段としてのアミノ酸の変更位置は限定はされない。
【００３８】
このような変異を起こさせる方法としては、当該遺伝子への部位特異的変異導入方法を用いた組換え遺伝子の作成と宿主細胞への導入が挙げられる。あるいは、菌へのUV照射、放射線照射、および各種の変異原性剤を用いて、遺伝子の様々な箇所にランダムに変異を起こさせた後に、最適な手法で、目的の箇所が変異した遺伝子を取得することも可能である。さらには、相同組換えにより、目的の部位のアミノ酸置換を行うこともできる。
【００３９】
変異原性剤としては、限定はされないが、ニトロアミン、ニトロソグアニジンなどのニトロソ化合物；BrdUなどの塩基類似化合物；エチル化剤、N-エチル-N-ニトロソウレア(ENU)、メタンスルホン酸メチル (EMS)などのアルキル化剤；ベンゾピレン、クリセンなどの多環芳香族炭化水素；ベンゾビレン、臭化エチジウムなどのDNAインターカレーター；シスプラチン、マイトマイシンCなどのDNA架橋剤；活性酸素；放射線；および紫外線などの公知の変異原性剤が含まれる。
【００４０】
このような変異原性剤を、公知の方法により、対象の例えば真正担子菌株に暴露することができる。
【００４１】
ランダムな変異体群から目的の箇所が変異した遺伝子を選抜する方法としては、限定はされないが、ＴＩＬＬＩＮＧ（Targeting Induced Local Lesions In Genomesゲノム中の標的化誘発局所的損傷McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457）法やＨＲＭ（高感度融解温度曲線解析（High Resolution Melting analysis））法などが挙げられる。
【００４２】
プロテインキナーゼＡ調節サブユニット遺伝子の破壊や干渉等の具体的方法としては、転写または翻訳のレベルで調整する方法が例示される。具体的には、プロテインキナーゼＡ調節サブユニットmRNAの翻訳を、リボザイム、アンチセンス分子、siRNA、またはmRNAをターゲットとする小分子阻害剤を使用して阻害することができる。アンチセンス技術によって、トリプル-ヘリックス形成またはアンチセンスDNAもしくはRNAを介して遺伝子発現を制御することもできる。
【００４３】
アンチセンスRNAまたはDNAがインビボで発現してプロテインキナーゼＡ調節サブユニットの発現を阻害するようなアンチセンス発現構築物を細胞に送達することができる。このような構築物は、当該技術分野において周知である。
【００４４】
アンチセンス分子としては、例えば、１５bp以上２５bp以下のプロテインキナーゼＡ調節サブユニット遺伝子のmRNA配列の相補ヌクレオチドを用いることができる。
【００４５】
RNA干渉分子には、例えば、１５bp以上２５bp以下のプロテインキナーゼＡ調節サブユニット遺伝子のヌクレオチドを用いることができる。好ましくは、RNA干渉分子は、2つのヌクレオチドの3'オーバーハングを有する。
【００４６】
ここで、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（PKAc）の活性化は、例えば遺伝子過剰発現あるいは高発現として示すことができる。この場合、全く同条件下における培養条件の野生型と比較して、同条件、同量の培養上清液で比較した場合に、定量的逆転写PCR法で測定して、遺伝子発現量（タンパク質発現量）が、１．５倍以上、好ましくは２倍以上、より好ましくは３倍以上発現量が増加している状態をいう。
【００４７】
本発明において、リグニン分解能の増加とは、クラーソンリグニン法において検出できる値として、リグニン分解量が、同条件での接触あるいは培養下での野生型と比較して、少なくとも１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上増加している状態をいう。活性測定は、培養開始後６日から５０日の間のいずれかに行い、例えば、３５日後に行う。具体的な測定手法は実施例２に準じる。
【００４８】
本明細書でいうラッカーゼは、ポリフェノールオキシダーゼ、ウルシオールオキシダーゼとも称されるフェノールオキシダーゼの一種であり、基質酸化活性を有し、o-, p-ジフェノール、p-フェニレンジアミン、アスコルビン酸などを酸化する反応を触媒するマルチ銅酵素である。ラッカーゼの触媒能力は、種々の化学反応に応用可能である。例えば、毒性の強いフェノール性化合物や芳香族アミンを含む廃液の処理、パルプ製造処理等におけるリグリンの除去、電極触媒、人口漆の製造、有機化合物の合成、紅茶の褐変処理、化粧品用メラニン製造、食品のゲル化剤、臨床検査試薬、漂白剤としての利用等である。さらには、電極を電子供与体とすることも知られており、適当な炭素電極との組合せにより、バイオ電池やバイオセンサー用の電極触媒としての産業利用も考えられる。
【００４９】
限定はされないが、特に、ヒラタケを例に挙げた場合には、米国DOE Joint Genome InstituteにおけるヒラタケPC９株全ゲノム解析（バージョン１．０）におけるタンパク質の識別番号で表すと、90578、116143、123288、65894、81104、60400、81107、81117、90573、137777、および90834の１１種の配列をコードする遺伝子が例示される。さらには、他の白色腐朽において、これらの対応するタンパク質は、識別番号90578、116143、123288、65894、81104、60400、81107、81117、90573、137777、または90834のタンパク質とそれぞれBLOSUM６２スコア表に基づく動的計画法によるアミノ酸配列比較において３５％以上、好ましくは、５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質である。
【００５０】
本発明でいうマンガンペルオキシダーゼとは、酸化還元酵素の１つであり、リグニン分解に関与する酵素である。マンガンペルオキシダーゼは、メディエータであるMn3+を酸化し、生じたMn3+を介してリグニンを分解する酵素である。また、Mn3+を介せずに基質やリグニンを直接分解することも可能なマンガンペルオキシダーゼも知られており、特に万能型ペルオキシダーゼと言われているが、これも含む。
【００５１】
限定はされないが、特に、ヒラタケを例に挙げた場合には、米国DOE Joint Genome InstituteにおけるヒラタケPC９株全ゲノム解析（バージョン１．０）におけるタンパク質の識別番号で表すと、137760、137764、137740、121638、137765、51713、137757、137766、および123383の９種の配列をコードする遺伝子が例示される（これらの内、万能型ペルオキシダーゼは137757、137766、123383）。さらには、他の白色腐朽菌において、これらの対応するタンパク質は、識別番号137760、137764、137740、121638、137765、51713、137757、137766、および123383のタンパク質とそれぞれBLOSUM６２スコア表に基づく動的計画法によるアミノ酸配列比較において３５％以上、好ましくは、５０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質である。
【００５２】
＜高発現プロモーターを用いたプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現菌の入手＞
例えば、白色腐朽菌ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）PC9ホモカリオン株におけるプロテインキナーゼA触媒サブユニットである識別番号114122または85056をコードする遺伝子、PKAc1およびPKAc2のcDNAにおけるオープンリーディングフレーム部分をクローン化し、βチューブリン遺伝子などのヒラタケにおいて高発現する遺伝子のプロモーター配列と結合した組換え遺伝子をヒラタケ野生型株に導入することによって、PKAc高発現菌を得る。
【００５３】
＜プロテインキナーゼＡ調節サブユニット破壊によるプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（PKAc）高活性化菌の入手＞
例えば、白色腐朽菌ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）PC9ホモカリオン株におけるプロテインキナーゼA調節サブユニットである識別番号83554をコードする遺伝子のアンチセンスＲＮＡまたは二本鎖RNA、あるいはそれらのRNA分子を生産する組換え遺伝子を調製し、ヒラタケ野生型株に導入することによって、PKAc高活性化菌を得る。
【００５４】
＜プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（PKAc）高発現菌または高活性化菌によるラッカーゼ産生＞
このようにして得られる株を最適な培地で培養し、細胞外に分泌されるラッカーゼを常法により回収することができる。ここでいう最適な培養条件とは、限定はされないが、ポテトデキストロース、グルコースペプトン液体培地、などにおける、pH5〜8、20℃〜40℃における培養などをいう。限定はされないが、例えば、ポテトデキストロース寒天培地に植菌し、20℃〜40℃、好ましくは28℃程度、暗黒条件下で3日から14日ほど静置培養し、これを切り出し、菌叢ディスクを作成する。次に、例えば500 ml容三角フラスコ中のポテトデキストロース液体培地に酵母エキスを添加した培地（PDY培地）150 mlに対して菌叢ディスクを約24個植菌して125 rpm、28℃、暗黒条件下、好気的な環境で振とう培養する。約5日間培養した培養液を15 ml分収し、500 ml容三角フラスコ中のPDY培地150 mlに加えて同様の条件で振とう培養する。培養2日目の培養液にラッカーゼ誘導物質として500 μM硫酸銅および2 mMフェルラ酸を添加する。その後、2日から10日培養してラッカーゼを回収する。
または、木質分解終了後に木粉を洗浄し、木粉に付着したラッカーゼを回収する。
【００５５】
真正担子菌が生産するラッカーゼの回収は、培地の上清などを回収することで効率的に行うことができる為に非常に好都合である。
【００５６】
＜プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（PKAc）高発現菌または高活性化菌によるマンガンペルオキシダーゼ産生＞
【００５７】
このようにして得られる株を最適な培地で培養し、細胞外に分泌されるマンガンペルオキシダーゼを常法により回収することができる。ここでいう最適な培養条件とは、ここでいう最適な培養条件とは、限定はされないが、ポテトデキストロース、グルコースペプトン液体培地、などにおける、pH5〜8、20℃〜40℃における培養などをいう。限定はされないが、例えば、ポテトデキストロース寒天培地に植菌し、28℃、暗黒条件下で3日から14日ほど静置培養し、これを切り出し、菌叢ディスクを作成する。次に、500 ml容三角フラスコ中のポテトデキストロース液体培地に酵母エキスを添加した培地（PDY培地）150 mlに対して菌叢ディスクを約24個植菌して125 rpm、28℃、暗黒条件下、好気的な環境で振とう培養する。約5日間培養した培養液を15 ml分収し、500 ml容三角フラスコ中のPDY培地150 mlに加えて同様の条件で振とう培養する。培養2日目の培養液にマンガンペルオキシダーゼ誘導物質として20 mMから270 mMの硫酸マンガンを添加する。その後、2日から10日培養してマンガンペルオキシダーゼを回収する。
または、木質分解終了後に木粉を洗浄し、木粉に付着したマンガンペルオキシダーゼを回収する。
【００５８】
真正担子菌が生産するマンガンペルオキシダーゼの回収は、培地の上清などを回収することで効率的に行うことができる為に非常に好都合である。
【００５９】
また、本発明で開発された方法によりプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット産生能が高まった株を簡易に育種することができるので、自然界から単離された菌に本発明を適用してプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット産生能を高め、リグニン分解反応を進めることが可能である。シイタケ、ナメコ、エノキタケ、ヒラタケ、マイタケ、タモギタケなど、食用の栽培きのこには白色腐朽菌が多く含まれているが、これらのきのこに本発明を適用することで、きのこ栽培時に、ラッカーゼあるいはマンガンペルオキシダーゼの産生をすることが可能となる。
【００６０】
あるいは、得られるプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株を、直接リグニンを含有する木材、木材チップなどに接触させることで、リグニン分解可能である。具体的には、金株と木材とを共に培養し、リグニンの分解を行うこともできる。リグニン分解のための菌処理の条件としては、限定はされないが、木粉、または木材チップ1 g当たりに水を1 mlから5 ml程度添加し、20℃〜40℃、好ましくは28oC、暗黒条件下で14日から42日間静置培養する。乾燥を防ぐため相対湿度は60%以上が好ましい。初期段階での菌生育速度を増加させるため、酵母エキスや米ぬかや小麦ぬかなどを補助栄養剤として添加しても良い。
【００６１】
＜プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット（PKAc）高発現菌または高活性化菌によるリグニン分解＞
【００６２】
得られるプロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現菌または高活性化菌を培養した後、培養上清を、リグニンを含有する木材、木材チップなどと共に培養し、リグニンの分解を行うこともできる。菌の培養には、酵母エキスや米ぬかや小麦ぬかなどを含む培地を用いることができる。リグニン分解のための培養上清とリグニンとの接触は、限定はされないが、木粉、または木材チップ1 g当たりに水を1 mlから5 ml程度添加し、20℃〜40℃、好ましくは28oC、暗黒条件下で14日から42日間静置培養する。乾燥を防ぐため相対湿度は60%以上が好ましい。
【００６３】
本発明のリグニン分解方法においては、培養上清等から得られるタンパク質を精製してリグニン分解に使用することもできる。
【００６４】
本発明は、以下の態様を含む。
【００６５】
すなわち、本発明は、真正担子菌においてリグニン分解能を増加させる方法であって、
該真正担子菌のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることを含む方法である。
【００６６】
上記真正担子菌は、白色腐朽菌であり得る。
【００６７】
ここで、リグニン分解能の増加は、元の野生株と比較した場合、少なくとも１．２倍以上になることであり得る。
【００６８】
プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化は、遺伝子の転写物量として、少なくとも野生型の１．５倍以上、より好ましくは２倍以上であることをさす。
【００６９】
上記プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることは、該プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット遺伝子を高発現させることによってなされることが好ましく、そのような高発現は、高発現プロモーターを当該遺伝子に作動可能に結合させ、それを真正担子菌株に導入することによって達成されうる。
【００７０】
ここで、高発現プロモーターは、βチューブリン遺伝子プロモーターであり得る。
【００７１】
前記プロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることは、プロテインキナーゼＡ調節サブユニットの機能を抑制することによってなされ得る。
【００７２】
本発明は、上記いずれかの方法によってリグニン分解能が高められた真正担子菌に関する。
【００７３】
リグニン分解能は、元の野生株と比較した場合、少なくとも１．２倍以上、好ましくは2倍以上に増加し得る。
【００７４】
本発明は、上記真正担子菌をリグニンを含む資源に接触させ、リグニンを分解する方法にも関する。ここで、接触とは、共に培養することを含む。
【００７５】
本発明は、上記真正担子菌の培養上清をリグニンを含む資源に接触させ、リグニンを分解する方法にも関する。
【００７６】
真正担子菌においてラッカーゼおよび／またはマンガンペルオキシダーゼを産生する方法であって、
該真正担子菌のプロテインキナーゼＡ触媒サブユニットを活性化させることを含む方法にも関する。
【００７７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。しかしながら、本実施例は、本発明の具体例を示すのみで、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
＜プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株の作成＞
まず、白色腐朽菌ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）PC9ホモカリオン株において、PKAc遺伝子を過剰発現させた。ヒラタケPKAc遺伝子（PKAc1またはPKAc2）（タンパク質における識別番号（およびtranscript識別番号）114122および85056）のcDNAのオープンリーディングフレーム部分をクローン化し、ヒラタケβチューブリン遺伝子プロモーターに結合させて組換え遺伝子を構築し、PC9株に導入、PKAc過剰発現に成功した。
【００７９】
PKAc過剰発現は、定量的RT-PCRによる転写物量測定にて確認した。まず、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株を、300ml容の三角フラスコに入れた20mlのグルコース・ペプトン液体培地（グルコース20g/l、イースト 2g/l、ペプトン5g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、MnSO4 0.065g/l）に接種し、28℃、暗黒条件で培養した。その後、６、９、12日後に菌体を回収し、QIGEN社製のRNeasy mini kitを用いて全RNAを抽出した。得られた全RNAをDNase Iで処理することで、残存ゲノムDNAを分解した後に、タカラバイオ社製のPrimeScript(R) RT reagent Kitを用いて、全RNAをテンプレートとして逆転写を行い、cDNAライブラリーを作製した。定量的RT-PCRとして、SYBR(R) Premix Ex TaqTM II（TaKaRa）、Thermal Cycler DiceTM（TaKaRa）、及び各遺伝子の特異的プライマーを用いた。また、内部標準にはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（gpd）の転写物量を用いた。PCRは（ｉ）95℃ 10秒間で1本鎖に変性し、（ｉｉ）95℃ 5秒間、 60℃30秒間でアニーリング、及び伸長反応させ、（ｉｉ）のステップを40サイクル行った。なお、予め、それぞれの遺伝子由来のPCR産物を作成し、濃度を測定し、希釈系列を鋳型として同様の操作を行い、絶対定量用の検量線を作成した。
結果として、PKAc1またはPKAc2過剰発現株において、それぞれの遺伝子の転写物量が野生型PC9株と比較して2倍から6倍になった。（図１および図２）
【００８０】
（実施例２）
＜プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株によるリグニン分解能の評価＞
得られた過剰発現株によるブナ木粉菌処理実験を行った。30〜60メッシュのブナ木粉2 g、0.2%酵母エキス10 mlを200 ml容量の三角フラスコに入れ、菌を植菌し、好気的に28oCで5週間静置培養した。この結果、野生型よりも2倍程度増加したリグニン分解が観察された。この結果を図３に示す。すなわち、菌未処理の脱脂木粉中1 g当たりに含まれるリグニン量は約0.3 gだが、野生型（PC9株）で処理した場合は平均約0.23 gにまで減少した。さらに、実施例１PKAc過剰発現株は平均約0.16ｇになった。リグニン量測定は以下に示すクラーソンリグニン法で行った。
【００８１】
（クラーソンリグニン法の手順）
測定する木粉を円筒濾紙に入れ、更に、ソックスレー抽出機にセットし（必要に応じて脱脂綿で木粉の上に蓋をする）、エタノール・ベンゼン混合溶剤（1:2 v/v）で6時間煮沸還流する。
【００８２】
上記の脱脂木粉0.2 gをビーカーに移し、3mlの72%(w/w)硫酸を加えて、ガラス棒で撹拌、4時間室温で放置することで十分に木粉を膨潤させる。112 mlの蒸留水と共に200 ml容のSPC三角フラスコへ移す（硫酸濃度は3%となる）。SPCリービッヒ冷却管を装着し、ホットプレートで4時間還流する（水温が100oC程度になるように温める）ことにより酸不溶性リグニン以外を溶解させる。放冷した後にガラスフィルター（1G4）で吸引濾過して、不溶性リグニンを濾しとる（濾液には酸可溶性リグニンが含まれる。広葉樹の場合は測定用に濾液を分収し、5の操作を行う）。ガラスフィルターに蒸留水を通して洗浄、105oCで乾燥し、デシケーター内で放冷、重量を測定する。
【００８３】
ろ液に含まれる酸可溶性のリグニンも計算するため、ろ液を3%硫酸水溶液にて205-210 nm付近の最大吸光（つまり、スペクトラムをとり、極大値を探す）が0.3-0.7の範囲になるように適当に薄めて測定する。3%硫酸水溶液をブランク（分光光度計にブランクをセットすることが出来なければ、コントロールとして測定して計算から引く）として用いる。以下の計算式で酸可溶性リグニンを計算し、ガラスフィルターに残存したリグニン量に加えることで、リグニン量を算出する。
酸可溶性リグニン(g)={希釈率×濾液量(L)×吸光度}÷{リグニンの吸光係数(L g-1 cm-1)}÷光路（cm）
【００８４】
（実施例３）
＜プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株によるラッカーゼ産生と回収＞
ヒラタケの野生型PC9株、PC9株を粛として作成したPKAc1過剰発現株、PKAc2過剰発現株について、培養ろ液に含まれるラッカーゼ活性を測定した。
【００８５】
酵素活性の測定は、以下のようにして行った。
すなわち、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株を、300ml容の三角フラスコに入れた20mlのグルコース・ペプトン液体培地（グルコース20g/l、イースト 2g/l、ペプトン5g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、MnSO4 0.065g/l）に接種し、28℃、暗黒条件で培養した。その後、６、８、10、12日後に得られる菌培養液を遠心分離した。その上清を酵素液とし、酵素活性測定に用いた。
【００８６】
酵素活性は１Mクエン酸ナトリウム緩衝液（pH 3.0）50μl、5mM 2,2'-azino-bis(3-ethilbenzthiazoline-6-sulfonate)(ABTS)50μl、上記得られた上清400μlを加え、反応の結果生じるABTSの酸化物を436nmの吸光度増加を時間を追って記録することにより行った。1分間に1μmolのABTSを酸化できる酵素量を１ユニットとした（ABTSのモル吸光係数はOD436において29300M-1cm-1）。上記培養上清中に酵素活性が野生型のヒラタケの場合には培養開始１２日目で20ユニット/Lしか認められなかった。プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株の場合において培養開始１２日目で120ユニット/Lで認められた。すなわち、変異体で野生型の3倍もの活性が見出された。（図４）
【００８７】
（実施例４）
＜プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株によるマンガンペルオキシダーゼ産生と回収＞
ヒラタケの野生型PC9株、PC9株を粛として作成したPKAc1過剰発現株、PKAc2過剰発現株について、培養ろ液に含まれるマンガンペルオキシダーゼ活性を測定した。
【００８８】
酵素活性の測定は、以下のようにして行った。
すなわち、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株を、300ml容の三角フラスコに入れた20mlのグルコース・ペプトン液体培地（グルコース20g/l、イースト 2g/l、ペプトン5g/l、KH2PO4 1g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、MnSO4 0.065g/l）に接種し、28℃、暗黒条件で培養した。その後、６、８、10、12日後に得られる菌培養液を遠心分離した。その上清を酵素液とし、酵素活性測定に用いた。
【００８９】
酵素活性は、0.4 mM グアイヤコール、50 mM 乳酸ナトリウムバッファ（pH 4.5）、0.2 mM 硫酸マンガン、0.1 mM 過酸化水素、5% v/v 粗酵素液を混合して反応させた。マンガン無添加活性測定条件として、0.4 mM Guaiacol、50 mM Na-lactate buffer（pH 4.5）、0.1 mM H2O2、反応溶液に対して5% の容量の粗酵素液を混合して反応させた。グアイヤコールのモル吸光係数はOD465において12100M-1cm-1であるため、吸光度変化量から酸化物生成量を測定した。上述した酵素活性測定用混合液の調製直後を測定開始時間とし、吸光光度計にて吸光度測定を行い、3分間反応させた後に再び吸光度を測定し、1分間あたりの平均吸光度変化量を求めた。そして、マンガン添加活性測定条件における平均吸光度変化量の値からマンガン無添加活性測定条件における平均吸光度変化量の値を差し引いた値をマンガン依存性の吸光度変化量とした。1 μmol/minの速度で基質を酸化する酵素量を1 Uとした。測定時期は培養4日目、6日目、8日目、10日目、12日目、14日目とした。1分間に1μmolのグアイヤコールを酸化できる酵素量を１ユニットとした。上記培養上清中に酵素活性が野生型のヒラタケの場合には培養開始１２日目で約20ユニット/Lしか認められなかった。プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株の場合において培養開始１２日目で        60ユニット/Lで認められた。すなわち、プロテインキナーゼＡ触媒サブユニット高発現株で野生型の3倍もの活性が見出された（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明により、真正担子菌、特には白色腐朽菌を利用したリグニン分解が効率的にできるようになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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