(57)【要約】      （修正有）【課題】植物が含有する広範な種類の有害物質の抽出に適用可能で、かつ簡便な方法を提供する。【解決手段】加熱処理が施されていない植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理し、酵素反応処理が施された植物から成分を取り出す処理工程を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物に含まれる有害物質を分析するための分析用試料を調製する方法であって、
加熱処理が施されていない植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理し、酵素反応処理が施された植物から成分を取り出す処理工程を含む、方法。
【請求項２】
上記処理工程と並行にか処理工程の後に、処理工程で生じる上記植物由来の残渣、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼを、当該植物から取り出した上記成分と分離する分離工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記分離工程は、上記植物由来の残渣、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼは通さず、かつ当該植物から取り出した上記成分は通す分離膜を用いて行う、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記植物は米、麦、又は豆から選択される何れかである、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記処理工程は、２０℃上で５０℃以下の温度条件下で行う、請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
上記有害物質は、重金属、カビ毒、及び農薬からなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記加熱処理とは、５０℃を超える温度条件下で行う処理である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の方法で調製した、植物から取り出した上記成分中において、目的とする上記有害物質が存在するか否か、又は当該有害物質の量を検出する工程を含む、有害物質の分析法。
【請求項９】
植物に含まれる有害物質を分析するための分析用試料を調製するキットであって、
セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼと、
酵素反応を行う容器と、
分離膜と、を備え、
上記分離膜は、植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理して生じる植物由来の残渣、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼは通さず、かつ酵素反応処理された当該植物から取り出した成分は通す、
キット。
【請求項１０】
請求項９に記載のキットであって、
上記分離膜が、上記容器の内部空間を仕切るように予め設けられている、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農作物等の植物性試料に含まれる有害物質を抽出して分析用試料を調製する方法と、分析用試料の調製のためのキットと、有害物質の分析法とに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、環境保全等の社会的な環境意識及び健康に対する影響への関心の高まりから、産業及び生活に伴う様々な場面における有害物質（環境汚染物質等）の蓄積が問題となっている。特に農作物は、もっぱら食品、及び家畜用飼料等として用いられるものであるから、有害物質に汚染されている場合に、人及び動物の健康へ与える影響が大きい。
【０００３】
農作物等に付着する有害物質には、例えば、カドミウム等の重金属の他に、有機系の農薬及びカビ毒等の有機物質も存在する。
【０００４】
農作物等に含まれる有害物質を分析するためには、農作物等を、酸、又はアルカリ等によって分解するか、あるいは農作物等をホモジナイズして溶媒等により有害物質を抽出、精製する必要がある。例えば、農作物等からカドミウム等の重金属を抽出する方法として酸分解による方法（非特許文献１）が一般に用いられており、農薬等を抽出する方法としては、農作物等をホモジナイズして特定の溶媒によって抽出する方法（非特許文献２〜４）が一般に用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】公定試験法（重金属分析の酸分解法）に関する、日本国厚生労働省公開資料（http://www.mhlw.go.jp/shingi/2009/10/dl/s1006-4c.pdf）
【非特許文献２】日本国厚生労働省  分野別施策[食品中の残留農薬等]  ＧＣ-ＭＳによる農薬等の一斉試験法（農産物）（http://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/iyaku/syoku-anzen/zanryu3/3-001.html）
【非特許文献３】日本国厚生労働省  分野別施策[食品中の残留農薬等]  ＬＣ-ＭＳによる農薬等の一斉試験法（農産物）（http://www.mhlw.go.jp/topics/bukyoku/iyaku/syoku-anzen/zanryu3/3-002.html）
【非特許文献４】ぶんせき  2007  11  562頁〜568頁（食品中の残留農薬分析）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、上記非特許文献１〜４に記載の方法は何れも特定の有害物質の抽出には優れた方法であるが、例えば、カドミウム等の重金属の抽出にも、有機系の農薬やカビ毒等の有機物質の抽出にも適した、汎用性のある方法ではない。
【０００７】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、より広範な種類の有害物質の抽出に適用可能で、かつ簡便な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者らは上記の課題について鋭意検討した結果として、特定の酵素の組合せを用いて酵素反応処理を行うことで、加熱処理が施されていない植物から、目的とする有機成分及び無機成分を取り出すことが出来ることを見出した。
【０００９】
すなわち、上記の課題を解決するために、本発明は以下の何れかのものを提供する。
１）植物に含まれる有害物質を分析するための分析用試料を調製する方法であって、加熱処理が施されていない植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理し、酵素反応処理が施された植物から成分を取り出す処理工程を含む、方法。
２）上記処理工程と並行にか処理工程の後に、処理工程で生じる上記植物由来の残渣、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼを、当該植物から取り出した上記成分と分離する分離工程を含む、１）に記載の方法。
３）上記分離工程は、上記植物由来の残渣、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼは通さず、かつ当該植物から取り出した上記成分は通す分離膜を用いて行う、１）又は２）に記載の方法。
４）上記植物は米、麦、又は豆から選択される何れかである、１）〜３）の何れかに記載の方法。
５）上記処理工程は、２０℃以上で５０℃以下の温度条件下で行う、１）〜４）の何れかに記載の方法。
６）上記有害物質は、重金属、カビ毒、及び農薬からなる群より選択される少なくとも一つである、１）〜５）の何れかに記載の方法。
７）上記加熱処理とは、５０℃を超える温度条件下で行う処理である、１）〜６）の何れかに記載の方法。
８）上記の１）〜７）の何れかに記載の方法で調製した、植物から取り出した上記成分中において、目的とする上記有害物質が存在するか否か、又は当該有害物質の量を検出する工程を含む、有害物質の分析法。
９）植物に含まれる有害物質を分析するための分析用試料を調製するキットであって、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼと、酵素反応を行う容器と、分離膜と、を備え、上記分離膜は、植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理して生じる植物由来の残渣、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼは通さず、かつ酵素反応処理された当該植物から取り出した成分は通す、キット。
１０）上記の９）に記載のキットであって、上記分離膜が、上記容器の内部空間を仕切るように予め設けられている、キット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、特定の酵素の組合せを用いて酵素反応処理を行うことで、加熱処理が施されていない植物から、目的とする有機成分及び無機成分を取り出すことが出来る。従って、より広範な種類の有害物質の抽出に適用可能で、かつ簡便な方法を提供することが出来るという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る調製用キットの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１３】
〔１．分析用試料の調製方法〕
本発明の一実施形態に係る分析用試料の調製方法は、植物に含まれる有害物質を分析するための分析用試料を調製する方法である。この方法は、加熱処理が施されていない植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理し、酵素反応処理が施された植物から成分を取り出す処理工程を含んでなる。
【００１４】
本発明の一実施形態に係る分析用試料の調製方法を用いれば、試料調製のプロセスにおいて、目的とする成分（有害物質）を変性させるような実質的な加熱処理を行う必要がなくなる。そのため、目的とする有機成分及び無機成分の分解等を抑制しつつ、これら成分を取り出すことが出来る。
【００１５】
（植物）
植物とは、植物体であってもよく、植物体を構成する細胞、組織、又は、器官等であってもよい。植物体、組織、又は、器官は、その全体か一部分であってもよい。植物の器官の一例としては、例えば、繁殖器官である種子、又は、むかご等が挙げられる。
【００１６】
植物の種類としては、少なくともセルロース及びヘミセルロースを細胞壁の構成成分として含む種類、より具体的には、陸上の維管束植物、及び藻類の一部が好ましいものとして挙げられ、より好ましくは、シダ類、裸子植物、又は被子植物であり、さらに好ましくは被子植物である。
【００１７】
植物は、具体的な一例では農作物であってもよく、特に食用の農作物か飼料用の農作物（特にその可食部）が好ましい例として挙げられる。農作物としてより好ましいものは、野菜類、穀粒類、豆類、又は種子類から選択されるものであり、有害物質の取り出し難さの観点では、穀粒類、豆類、又は種子類から選択されるものが好ましい。野菜類としては、ホウレンソウ、なす、又はねぎ等が挙げられる。穀粒類としては、米（例えば、精米や玄米。陸稲、水稲の何れでもよい）、麦（例えば、大麦、小麦、ライ麦、等）、蕎麦等が挙げられ、中でも米がより好ましく、豆類としては、大豆、小豆、落花生等が挙げられ、種子類としては、ゴマ、菜種等が挙げられる。
【００１８】
植物は、例えば、収穫した植物の全体かその一部分であってもよいが、収穫した植物を、例えば、乾燥、塩漬、砂糖漬、又は糠漬等の方法で保存した植物の全体かその一部分を用いてもよい。乾燥等の方法で保存している植物も、収穫した植物自体と同様に、有害物質を取り出し難いものであり、本発明を適用する対象として適している。また、植物は、食品中に含まれる形態のものであってもよい。
【００１９】
後述する酵素反応処理に供される植物は、必要に応じて粉砕をしたものであってもよい。粉砕の一例としては、例えば、ミルサ―を用いた微粉砕（参考文献：特開２０１０−１３３９４９号）、又は、乳鉢等を用いた粗粉砕が挙げられる。
【００２０】
後述する酵素反応処理に供される植物は、酵素反応処理に供する前処理としての加熱処理が施されていないものである。ここで、加熱処理のより具体的な一例では、植物を５０℃を超える温度条件下で加熱することを指し、他の例では、植物を７０℃を超える温度条件下で加熱することを指す。かかる加熱処理が施された植物であれば、本発明の一実施形態にかかる処理工程とは別の方法（例えば、より少ない種類の酵素を用いる酵素反応等）によっても、植物から必要な成分（有害物質等）を取り出し得るかもしれないが、加熱処理によって特に、耐熱性に劣る有機物等（例えばカビ毒や農薬）が分解されて検出不能になる可能性もある。
【００２１】
（有害物質）
植物に含まれ得る有害物質の種類は、当該植物を利用する対象（例えば、ヒト、家畜、家禽、ペット等）に害を及ぼす物質であれば特に限定されないが、具体的な一例では有害物質は外来性のもの（植物が生合成するものでない）であり、より具体的には、重金属、カビ毒、及び農薬からなる群より選択される少なくとも一つである。
【００２２】
重金属とは鉄よりも重い金属元素を指す。重金属として、具体的には例えば、カドミウム、ヒ素、亜鉛、マンガン、銅、鉛、及びクロムからなる群から選択される少なくとも一種の金属元素が好ましいものとして挙げられる。
【００２３】
カビ毒とは、カビが生成する毒素（マイコトキシン）を指し、具体的には、例えば、アフラトキシン、ステリグマトシスチン、オクラトキシン、ゼアラレノン等が挙げられる。
【００２４】
農薬として、具体的には例えば、有機リン系、又はピレスロイド系等の有機系の農薬が挙げられる。有機リン系の農薬としては、例えば、フェニトロチオン、ダイアジノン、又はクロルピリホス等が挙げられる。ピレスロイド系の農薬としては、例えば、エトフェンプロックス、ペルメトリン、又はジペルメトリン等が挙げられる。
【００２５】
（セルラーゼ）
セルラーゼは、植物の細胞壁等に含まれるセルロース中のグリコシド結合を加水分解する活性を有する酵素である。セルラーゼを構成する酵素としては、例えば、結晶セルロースの末端からセロビオースを遊離するエキソ型のセロビオハイドロラーゼ、結晶セルロースを分解できないが非結晶セルロース（アモルファスセルロース）鎖をランダムに切断するエンド型のエンドグルカナーゼ、β−グリコシド結合を加水分解する反応を触媒するβグルコシダーゼを挙げることができる。
【００２６】
セルラーゼの由来としては、例えば、Aspergillus niger、Aspergillus foetidus、Alternaria alternata、Chaetomium thermophile、Chaetomium globosus、Fusarium solani、Irpex lacteus、Neurospora crassa、Cellulomonas fimi、Cellulomonas uda、Erwinia chrysanthemi、Pseudomonas fluorescence、Streptmyces flavogriseus、Trichoderma reesei等が挙げらる。
【００２７】
なお、セルラーゼとしては、従来公知のものを適宜使用することができる。また、セルラーゼとしては、化学的に合成されたものでも良いし、微生物の生産物を精製したものでもよい。また、セルラーゼとしては、市販のセルラーゼ製剤を使用することもできる。
【００２８】
（キシラーゼ）
キシラーゼは、キシランのβ−１，４結合を切断し、キシロースに分解する酵素である。キシラーゼはキシラナーゼとも称される。キシラーゼの由来としては、例えば、Trichoderma reesei、Trichoderma longibrachiatum、Aspergillus  niger等が挙げられる。
【００２９】
（アミラーゼ）
アミラーゼの範疇には、α−アミラーゼとβアミラーゼとが含まれ、何れか一方を用いてもよいし両方を用いてもよい。α−アミラーゼは、デンプンやグリコーゲン中のα−１，４グリコシド結合を不規則に切断し、多糖やオリゴ糖を生成する酵素である。β−アミラーゼは、デンプンやグリコーゲン中のα−１，４グリコシド結合を切断して麦芽糖（還元性二糖）を生成する酵素である。
【００３０】
α−アミラーゼおよびβ−アミラーゼの由来として、動物、植物、微生物等広く挙げられる。動物としては、例えば、ヒト、ブタ等が挙げられ、より具体には、ヒトの唾液、ヒトの膵臓、およびブタの膵臓等が挙げられる。植物としては、Oryza sativa等が挙げられる。微生物としては、Bacillus licheniformis、Bacillus subtilis、Bacillus macerans、Bacillus scereus、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Klebusiella aerogenes、Streptomyces griseus、Pseudomonas stutzeri等の糸状菌、放射菌、細菌等が挙げられる。
【００３１】
（処理工程）
本発明の一実施形態に係る分析用試料の調製方法において、処理工程とは、加熱処理が施されていない植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理し、酵素反応処理が施された植物から成分を取り出す工程を指す。
【００３２】
酵素反応処理の条件は、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼが植物に対して作用する限りにおいて特に限定されないが、温度条件は、例えば、２０℃以上で５０℃以下の温度範囲内であることが好ましく、３０℃以上で５０℃以下の温度範囲内であることがより好ましい。
【００３３】
酵素反応処理における酵素の濃度は特に限定されないが、セルラーゼは、１００ｍｇ／Ｌ以上で２００００ｍｇ／Ｌ以下の範囲内であることが好ましく、５００ｍｇ／Ｌ以上で８０００ｍｇ／Ｌ以下の範囲内であることがより好ましい。キシラーゼは、１００ｍｇ／Ｌ以上で２００００ｍｇ／Ｌ以下の範囲内であることが好ましく、５００ｍｇ／Ｌ以上で８０００ｍｇ／Ｌ以下の範囲内であることがより好ましい。アミラーゼは、１００ｍｇ／Ｌ以上で５０００ｍｇ／Ｌ以下の範囲内であることが好ましく、５００ｍｇ／Ｌ以上で２０００ｍｇ／Ｌ以下の範囲内であることがより好ましい。
【００３４】
酵素反応処理における酵素の重量比率は特に限定されないが、セルラーゼが、キシラーゼやアミラーゼより多く含まれることが好ましい。一例では、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼの重量比が、順に、１．５〜４．５：０．８〜１．２：０．８〜１．２であることがより好ましく、１．５〜２．５：０．８〜１．２：０．８〜１．２であることがより好ましく、１．８〜２．２：０．８〜１．２：０．８〜１．２であることがさらに好ましく、１．９〜２．１：０．９〜１．１：０．９〜１．１であることが特に好ましい。
【００３５】
なお、対象とする植物の種類によっては、酵素反応処理に用いる酵素を、セルラーゼ、キシラーゼ及びアミラーゼからなる群から選択される一部のみ（ただし、セルラーゼは含まれていることが好ましい）を用いるようにしてもよい。例えば、植物がホウレンソウ等の野菜類の場合は、酵素反応処理に用いる酵素としてセルラーゼとキシラーゼとを用い、アミラーゼは用いなくてもよい。
【００３６】
酵素反応処理の時間は、温度条件、用いる酵素の種類、及びその他の条件に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．５時間以上で１６時間以下の範囲内であり、好ましくは１時間以上で１０時間以下の範囲内であり、より好ましくは１時間以上で５時間以下の範囲内である。
【００３７】
酵素反応処理の反応液中に含まれる植物の量は、温度条件、用いる酵素の種類、及びその他の条件に応じて適宜設定すればよいが、例えば、０．１ｇ／Ｌ以上で５００ｇ／Ｌ以下の範囲内であることが好ましく、１０ｇ／Ｌ以上で２００ｇ／Ｌ以下の範囲内であることがより好ましい。
【００３８】
処理工程においては、酵素反応処理が施された植物から成分を取り出す。植物が、分析可能な程度に有害物質を含む場合は、取り出された成分中に有害物質も含まれることとなる。成分の取り出しは、１）抽出操作を別途行うことなく、酵素反応処理が施された植物から水に対して成分が漏れ出す（溶出する）ことであってもよいし、２）酵素反応処理が施された植物に対して、目的とする成分（すなわち目的とする有害物質）の抽出操作を行うことであってもよい。
【００３９】
目的とする成分の抽出操作としては、例えば、目的とする成分が重金属のときは、酵素反応処理が施された植物に対して、塩酸溶液、硝酸溶液、ＥＤＴＡ溶液等の抽出溶媒を接触させることで、重金属を抽出溶媒中に溶出させることが出来る（例えば、非特許文献１も参照できる）。また、目的とする成分が、カビ毒及び農薬（特に有機系の農薬）のときは、酵素反応処理が施された植物に対して、アセトニトリル、エタノール、水、等の抽出溶媒を接触させることで、カビ毒及び農薬を抽出溶液中に溶出させることが出来る（例えば、非特許文献２〜４、特に非特許文献２〜３も参照できる）。
【００４０】
（分離工程）
本発明の一実施形態に係る分析用試料の調製方法においては、必要に応じて、上述の処理工程と並行にか処理工程の後に、処理工程で生じる上記植物由来の残渣、酵素（例えば、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼ）を、植物から取り出した成分と分離する分離工程を行ってもよい。
【００４１】
分離工程を行う方法は特に限定されないが、１）処理工程後の組成物に対して遠心分離を行って、植物由来の残渣、酵素（例えば、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼ）を沈殿させる方法や、２）分離膜を用いる方法、等が挙げられる。分離膜を用いる方法では、植物由来の残渣、酵素（例えば、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼ）は通さず、かつ植物から取り出した成分（有害物質を含む）は通す分離膜を用いる。すなわち、分離膜を挟んで一方側に酵素（例えば、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ）、植物、及び水を加えて酵素反応処理を行うことによって、酵素反応処理が施された植物から水へ溶出した成分（有害物質等）が分離膜を透過して他方側に出てくる。なお、分離膜の他方側には、浸透圧を適切に調整した精製液を配置して、植物から水へ溶出した成分（有害物質等）が分離膜を通過することを促進してもよい。好ましい分離膜の種類等については、後述の〔３．キット〕欄で記載する。
【００４２】
（分析用試料）
上記の処理工程と、必要に応じて行われる上記の分離工程等を経て、酵素反応処理が施された植物から取り出された成分を含んでいる分析用試料が調製される。分析用試料は、例えば、水を媒体として含む液体試料である。植物が、目的とする成分（有害物質）を検出可能な程度に含んでいる場合は、分析用試料はこの有害物質を含有する。
【００４３】
液体試料としての分析用試料は、分析に供する前に、必要に応じて濃縮等の追加の操作を行ってもよい。分析用試料に対してはさらに、分析に悪影響を及ぼさない限りにおいて、目的とする成分（有害物質）を安定化させる安定化剤等を添加してもよい。安定化剤の一例としては、目的とする成分が重金属元素の場合は、金属のキレート剤等が挙げられる。
【００４４】
〔２．有害物質の分析法〕
上記〔１．分析用試料の調製方法〕欄で説明した方法で調製した分析用試料は、分析工程に供される。分析工程は、植物から取り出した成分中において、有害物質（目的とする成分）が存在するか否か、又は有害物質の量（濃度等）を検出する工程である。
【００４５】
分析工程は、有害物質の種類に応じて、公知の分析手法を用いればよい。例えば、有害物質が重金属の場合は、例えば、イムノアッセイ法、ＩＣＰ法、原子吸光法、蛍光エックス線法、ボルタンメトリー法、及び、化学分析法等の方法を用いればよい。有害物質が、カビ毒の場合は、例えば、イムノアッセイ法、ＨＰＬＣ法、等の方法を用いればよい。有害物質が、農薬の場合は、例えば、ＨＰＬＣ−ＭＳ法、イムノアッセイ法、等の方法を用いればよい。
【００４６】
〔３．キット〕
本発明の一実施形態にかかるキットは、植物に含まれる有害物質を分析するための分析用試料を調製することをその用途とする。このキットは、１）酵素としてセルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼと、２）酵素反応を行う容器と、３）分離膜と、を備える。
【００４７】
分離膜は特定の大きさ以下の分子や特定のイオンのみを透過させる性質を持つもので、本実施形態においては、植物を、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水の存在下で酵素反応処理して生じる植物由来の残渣、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼは通さず、かつ酵素反応処理された植物から溶出した成分（有害物質等）は通す性質を有するものである。分離膜の具体的な例として、有害物質が重金属の場合は、浸透膜、イオン交換膜等の半透膜が挙げられる。有害物質がカビ毒や農薬の場合は、浸透膜（特に分子量により分別可能なもの）等の半透膜が挙げられる。
【００４８】
酵素反応を行う容器の容量は特に限定されないが、分析用試料の調製という用途に鑑み、０．１ｍＬ以上で１０００ｍＬ以下の範囲内であることが好ましく、１ｍＬ以上で５０ｍＬ以下の範囲内であることがより好ましい。このような容器の一例としては、試験管、エッペンドルフチューブ（商品名）、ファルコンチューブ（商品名）、遠沈管、スピッツ管（商品名）等が挙げられる。
【００４９】
本発明の一実施形態にかかるキットでは、酵素と分離膜とは予め酵素反応を行う容器内に格納されていてもよいが、酵素反応を行う容器とは別に包装されていてもよい。分離膜が予め酵素反応を行う容器内に格納されている場合には、分離膜が、容器の内部空間を仕切るように（好ましくは、容器の内部空間を、上側空間と下側空間に仕切るように）予め設けられていればよい。
【００５０】
本発明の一実施形態にかかるキットは、さらに、キットの取扱説明書を備えていてもよい。キットの取扱説明書には、例えは、上記〔１．分析用試料の調製方法〕欄に記載したような、調製方法の手順等が記載されている。キットの取扱説明書は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。
【００５１】
本発明の一実施形態にかかるキットは、さらに、酵素反応を行うために必要な水を含む液体（浸透圧、ｐＨ等の条件を酵素反応に好適な条件に整えていてもよい）や、酵素反応を行う側とは反対側（分離膜の他方側）に配置される、浸透圧を適切に調整した精製液、等をその構成として有していてもよい。
【００５２】
なお、対象とする植物の種類によっては、酵素反応処理に用いる酵素を、セルラーゼ、キシラーゼ及びアミラーゼからなる群から選択される一部のみ（ただし、セルラーゼは含まれていることが好ましい）を用いるようにしてもよい。例えば、植物がホウレンソウ等の野菜類の場合は、酵素反応処理に用いる酵素としてセルラーゼとキシラーゼとを用い、アミラーゼは用いなくてもよい。
【００５３】
図１に、本発明の一実施形態にかかるキット１０を例示する。キット１０は、試験管（容器）２内を浸透精製液５で満たし、浸透精製液５内に透析膜（分離膜）１を配置した構成となっている。透析膜１によって、試験管２の内部空間は、上側空間（中筒）と下側空間（外筒）とに仕切られており、上側空間と下側空間との間の成分の移動は透析膜１を介してのみ可能である。そして、上側空間には、玄米等の植物４と、セルラーゼ、キシラーゼ、アミラーゼ、及び水を含む酵素液３とが配置され、下側空間には浸透精製液５が配置される。酵素反応処理の進展に伴って、植物４の崩壊と酵素液３への成分の溶出とが進み、透析膜１を通過して浸透精製液５中に取り出される。
【００５４】
なお、本発明においては、目的や対象とする植物等に応じて、セルラーゼ、キシラーゼ、及びアミラーゼの他に、他の酵素を組合わせて使用することもできる。
【００５５】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。
【実施例】
【００５６】
＜実施例１＞
〔試料の調製〕
まず、検出対象に合わせた試料の調製方法を以下に説明する。必要に応じて、検出対象ごとに１０の試料を一組として調製した。
【００５７】
（酵素抽出試料の調製）
Aspergillus niger由来のセルラーゼ（０．７５％）、Trichoderma reesei由来のキシラナーゼ（０．１５％）およびBacillus subtilis由来のアミラーゼ（０．１５％）を含んでいる２０ｍＬの酵素溶液、ならびに２ｇの精米を、酵素抽出試料の調製に使用した。酵素溶液を入れたチューブに精米を加えて、チューブ内を４０℃に維持しながら８時間にわたって静置した。８時間後に４０μＬの５Ｎの塩酸をチューブに加え、ボルテックスにかけて内容物を撹拌した。撹拌後に、３０００ｒｐｍにおいて１分にわたって遠心分離した。遠心分離後の上清を、金属検出用およびヒ素検出用の試験試料１として使用した。
【００５８】
金属検出用およびヒ素検出用の試料とは別のチューブに、遠心分離後に２０ｍｌのアセトニトリルを加え、ボルテックスにかけて内容物を振盪混和させた。次に、３ｇの塩化ナトリウムおよび４ｇの硫酸マグネシウムをチューブに加え、ふたたびボルテックスにかけて内容物を振盪混和させた。１０ｍｌの上清を、農薬検出用の試験試料２として使用した。
【００５９】
次に、ホウレンソウの酵素抽出試料を調製した。その調製方法は、粗く（２〜３ｃｍ程度に）切断した２ｇのホウレンソウを、２ｇの精米の代わりに使用した点のみにおいて、試験試料１の調製方法と異なる。得られた試験試料３をカドミウム検出に使用した。
【００６０】
さらに、精米の他の酵素抽出試料を調製した。その調製方法は、Aspergillus niger由来のセルラーゼ（０．７５％）を含んでいる２０ｍＬの酵素溶液を使用した点のみにおいて、試験試料１の調製方法と異なる。得られた試験試料４をカドミウム検出に使用した。
【００６１】
（比較試料の調製）
５００ｍＬのチューブに入っている２０ｇの精米に、４０ｍＬの水および４０ｍＬの硝酸を加えた。チューブの内容物を十分に混和させた後に、穏やかに加熱した。しばらく加熱した後に放冷し、２ｍＬの硫酸を加えて、ふたたび加熱した。内容物が、淡黄色から無色透明になった時点で、加熱を中止し、冷却する。０．５ｍＬのイットリウム溶液をチューブに加えた後に、０．１ｍｏｌ／Ｌの硝酸を、内容物が１００ｍＬになるまで加えた。この内容物を、金属検出用の比較試料１として使用した。非常に細かく刻んだ２０ｇのホウレンソウを酸分解することによって、酵素抽出試料と比較するための、カドミウム検出用の比較試料３を調製した。
【００６２】
１００μｍ以下の大きさまで微粉砕した５ｇの精米のうち、２ｇを入れた５０ｍＬのスピッツ管に、２０ｍＬのイオン交換水を加えた。スピッツ管を、メタルバスにおいて９５℃に２時間にわたって加熱した。スピッツ管内の液体を、０．４５μｍ孔のディスポーザブルフィルターに通して、加圧ろ過した。加圧ろ過後のろ液を、ヒ素検出用の比較試料２として使用した。
【００６３】
〔各成分の検出およびその検出結果〕
以上において調製した試料に含まれている金属、ヒ素および農薬成分をそれぞれ、以下の手順にしたがって検出した。
【００６４】
（カドミウムおよび鉛の検出）
ＩＣＰ−ＯＥＳ法にしたがって、試験試料１および比較試料１に含まれているカドミウムおよび鉛の濃度をそれぞれ測定した。測定には、ＩＣＰ−ＯＥＳ装置（入手先：エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社（現：株式会社日立ハイテクサイエンス））を用いた。
【００６５】
（ヒ素の検出）
ＨＰＬＣ−ＩＣＰ／ＭＳ法にしたがって、試験試料１および比較試料２に含まれているヒ素の濃度を測定した。測定には、ＨＰＬＣ−ＩＣＰ／ＭＳ装置（入手先：パーキンエルマージャパン）を用いた。
【００６６】
（農薬の検出）
ＬＣ−ＭＳ法にしたがって、試験試料２に含まれているフェニトロチオンおよびエトフェンプロックスの濃度を測定した。測定には、ＬＣ−ＭＳ装置（入手先：アジレントテクノロジー株式会社）を用いた。検出精度を決定するために、独立行政法人産業総合技術研究所が、残留農薬分析用に提供している標準認証物質（玄米粉末）に含まれているフェニトロチオンおよびエトフェンプロックスの濃度（認証値と呼ばれる）を、比較対象にした。
【００６７】
（検出結果）
精米の各試料から検出されたカドミウムの濃度、および酸分解に対する酵素抽出における抽出率を以下の表１にまとめた。
【００６８】
【表１】
2016057301.tif 000003
【００６９】
精米の各試料から検出された鉛の濃度、および酸分解に対する酵素抽出における抽出率を以下の表２にまとめた。
【００７０】
【表２】
2016057301.tif 000004
【００７１】
精米の各試料から検出されたヒ素（有機物および無機物）の濃度、および熱水抽出に対する酵素抽出における抽出率を以下の表３にまとめた。
【００７２】
【表３】
2016057301.tif 000005
【００７３】
精米の試料から検出された農薬成分の濃度および成分の回収率を以下の表４にまとめた。
【００７４】
【表４】
2016057301.tif 000006
【００７５】
ホウレンソウの各試料から検出されたカドミウムの濃度、および酸分解に対する酵素抽出における回収率を以下の表５にまとめた。
【００７６】
【表５】
2016057301.tif 000007
【００７７】
試験試料４および比較試料１から検出されたカドミウムの濃度、および酸分解に対する酵素抽出における抽出率を以下の表６にまとめた。
【００７８】
【表６】
2016057301.tif 000008
【００７９】
＜実施例２＞
〔試料の調製〕
まず、検出対象に合わせた試料の調製方法を以下に説明する。
【００８０】
（酵素抽出試料の調製）
Aspergillus niger由来のセルラーゼ（０．７５％）、Trichoderma reesei由来のキシラナーゼ（０．１５％）およびBacillus subtilis由来のアミラーゼ（０．１５％）を含んでいる酵素溶液、ならびに玄米を、酵素抽出試料の調製に使用した。はじめに、玄米を破砕機（株式会社ケツト科学研究所製ＴＱ-１００等の簡便な圧砕器）で粗く破砕した。次いで、酵素溶液を入れたチューブに、破砕した玄米を加えて、チューブ内を、２０℃（室温程度）、３０℃、又は４０℃の３条件に維持しながら８時間にわたって静置した。なお、破砕した玄米と酵素溶液との比率は、２ｇ（玄米）対２０ｍｌ（溶液）、２ｇ（玄米）対１０ｍｌ（溶液）、及び、２ｇ（玄米）対５ｍｌ（溶液）のものをそれぞれ準備した。８時間後に４０μＬの５Ｎの塩酸をチューブに加え、ボルテックスにかけて内容物を撹拌した。撹拌後に、３０００ｒｐｍにおいて１分にわたって遠心分離した。遠心分離後の上清を、ヒ素検出用の試験試料として使用した。
【００８１】
（比較試料の調製）
１００μｍ以下の大きさまで微粉砕した５ｇの玄米のうち、２ｇを入れた５０ｍＬのスピッツ管に、２０ｍＬのイオン交換水を加えた。スピッツ管を、メタルバスにおいて９５℃に２時間にわたって加熱した。スピッツ管内の液体を、０．４５μｍ孔のディスポーザブルフィルターに通して、加圧ろ過した。加圧ろ過後のろ液を、ヒ素検出用の比較試料として使用した。
【００８２】
〔ヒ素の検出およびその検出結果〕
ＨＰＬＣ−ＩＣＰ／ＭＳ法にしたがって、試験試料および比較試料に含まれているヒ素の濃度を測定した。測定には、ＨＰＬＣ−ＩＣＰ／ＭＳ装置（入手先：パーキンエルマージャパン）を用いた。
【００８３】
（検出結果）
玄米の各試料から検出されたヒ素の濃度、および、比較試料の抽出率を１００とした場合の酵素抽出における抽出率（回収率）を以下の表７にまとめた。
【００８４】
【表７】
2016057301.tif 000009
【００８５】
抽出温度を２０℃（室温付近）〜４０℃（使用した酵素の至適温度）の温度範囲で変化させても、玄米と酵素溶液との比率を２．５倍（２ｇ対５ｍｌ）〜１０倍（（２ｇ対２０ｍｌ））までの範囲内で変化させても、何れの条件でも充分にヒ素を回収できることが示された。
【００８６】
＜実施例３＞
〔試料の調製〕
まず、検出対象に合わせた試料の調製方法を以下に説明する。
【００８７】
（酵素抽出試料の調製）
Aspergillus niger由来のセルラーゼ（０．７５％）、Trichoderma reesei由来のキシラナーゼ（０．１５％）およびBacillus subtilis由来のアミラーゼ（０．１５％）を含んでいる酵素溶液２０ｍｌ、ならびに玄米２ｇを、酵素抽出試料の調製に使用した。はじめに、玄米を破砕機（株式会社ケツト科学研究所製ＴＱ-１００等の簡便な圧砕器）で粗く破砕した。次いで、酵素溶液を入れたチューブに、破砕した玄米を加えて、チューブ内を、２０℃（室温程度）に維持しながら８時間にわたって静置した。８時間後に４０μＬの５Ｎの塩酸をチューブに加え、ボルテックスにかけて内容物を撹拌した。撹拌後に、３０００ｒｐｍにおいて１分にわたって遠心分離した。遠心分離後の上清を、鉛検出用の試験試料として使用した。
【００８８】
（比較試料の調製）
細かく粉砕した玄米２ｇを、６０％硝酸を用いて約４時間加熱し酸分解酸分解することによって、酵素抽出試料と比較するための、鉛検出用の比較試料を調製した。
【００８９】
〔鉛の検出およびその検出結果〕
ＩＣＰ−ＯＥＳ法にしたがって、試験試料および比較試料に含まれている鉛の濃度を測定した。測定には、ＩＣＰ−ＯＥＳ装置（入手先：エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社（現：株式会社日立ハイテクサイエンス））を用いた。
【００９０】
（検出結果）
玄米の各試料から検出された鉛の濃度、および比較試料の抽出率を１００とした場合の酵素抽出における抽出率を以下の表８にまとめた。
【００９１】
【表８】
2016057301.tif 000010
【００９２】
＜実施例４＞
〔試料の調製〕
まず、検出対象に合わせた試料の調製方法を以下に説明する。
【００９３】
（酵素抽出試料の調製）
Aspergillus niger由来のセルラーゼ（０．７５％）、Trichoderma reesei由来のキシラナーゼ（０．１５％）およびBacillus subtilis由来のアミラーゼ（０．１５％）を含んでいる酵素溶液２０ｍｌ、ならびにネギ２ｇを、酵素抽出試料の調製に使用した。はじめに、ネギを、チューブに入るようにハサミで長さ１ｃｍ〜２ｃｍに切断した。次いで、酵素溶液を入れたチューブに、切断したネギを加えて、チューブ内を、４０℃に維持しながら８時間にわたって静置した。８時間後に４０μＬの５Ｎの塩酸をチューブに加え、ボルテックスにかけて内容物を撹拌した。撹拌後に、３０００ｒｐｍにおいて１分にわたって遠心分離した。遠心分離後の上清を、カドミウム検出用の試験試料として使用した。
【００９４】
（比較試料の調製）
非常に細かく刻んだ２０ｇのネギを、60％硝酸を用いて約4時間加熱し酸分解することによって、酵素抽出試料と比較するための、カドミウム検出用の比較試料を調製した。
【００９５】
〔カドミウムの検出およびその検出結果〕
ＩＣＰ−ＯＥＳ法にしたがって、試験試料および比較試料に含まれているカドミウムの濃度を測定した。測定には、ＩＣＰ−ＯＥＳ装置（入手先：エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社（現：株式会社日立ハイテクサイエンス））を用いた。
【００９６】
（検出結果）
ネギの各試料から検出されたカドミウムの濃度、および、比較試料の抽出率を１００とした場合の酵素抽出における抽出率（回収率）を以下の表９にまとめた。
【００９７】
【表９】
2016057301.tif 000011
【００９８】
＜実施例５＞
〔試料の調製〕
まず、検出対象に合わせた試料の調製方法を以下に説明する。
【００９９】
（酵素抽出試料の調製）
Aspergillus niger由来のセルラーゼ（０．７５％）、Trichoderma reesei由来のキシラナーゼ（０．１５％）およびBacillus subtilis由来のアミラーゼ（０．１５％）を含んでいる酵素溶液２０ｍｌ、ならびにホウレンソウ１ｇを、酵素抽出試料の調製に使用した。はじめに、ホウレンソウを、チューブに入るようにハサミで１ｃｍ〜２ｃｍ角に切断した。次いで、酵素溶液を入れたチューブに、切断したホウレンソウを加えて、チューブ内を、４０℃に維持しながら８時間にわたって静置した。８時間後に４０μＬの５Ｎの塩酸をチューブに加え、ボルテックスにかけて内容物を撹拌した。撹拌後に、３０００ｒｐｍにおいて１分にわたって遠心分離した。遠心分離後の上清を、カドミウム検出用の試験試料として使用した。
【０１００】
（比較試料の調製）
非常に細かく刻んだ２０ｇのホウレンソウを６０％硝酸を用いて約４時間加熱し酸分解酸分解することによって、酵素抽出試料と比較するための、カドミウム検出用の比較試料を調製した。
【０１０１】
〔カドミウムの検出およびその検出結果〕
ＩＣＰ−ＯＥＳ法にしたがって、試験試料および比較試料に含まれているカドミウムの濃度を測定した。測定には、ＩＣＰ−ＯＥＳ装置（入手先：エスアイアイ・ナノテクノロジー株式会社（現：株式会社日立ハイテクサイエンス））を用いた。
【０１０２】
（検出結果）
ホウレンソウの各試料から検出されたカドミウムの濃度、および、比較試料の抽出率を１００とした場合の酵素抽出における抽出率（回収率）を以下の表１０にまとめた。
【０１０３】
【表１０】
2016057301.tif 000012
【０１０４】
以上のように、酵素抽出を利用した試料の調製方法によれば、植物に含まれている種々の有害物質を、適切に検出可能な試料を容易に調製し得る。また、当該調製方法は、種々の植物から容易に試料を調製可能である。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本発明は、植物に含まれる有害物質の分析の分野に用いることができる。
【符号の説明】
【０１０６】
１    透析膜（分離膜）
２    試験管（容器）
３    酵素液
４    植物
５    浸透精製液
１０  キット
【図１】
2016057301.tif 000013