(57)【要約】【課題】イムノクロマト法を用いた肺炎マイコプラズマ感染の検出に適用可能な特異的抗体及びそれを用いた検出試薬などを提供することを課題とする。【解決手段】肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する特異的抗体を含む、肺炎マイコプラズマ検出試薬及びキット、並びにイムノクロマトグラフィー試験デバイスが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する特異的抗体を含む、肺炎マイコプラズマ検出試薬。
【請求項２】
イムノクロマトグラフィー用である、請求項１に記載の検出試薬。
【請求項３】
前記特異的抗体がモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の検出試薬。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０のハイブリドーマ又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマによって産生される抗体である、請求項３に記載の検出試薬。
【請求項５】
前記特異的抗体が、N末端から95番アミノ酸までを除去した組換えP30タンパク質を抗原として調製した抗体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の検出試薬。
【請求項６】
前記組換えP30タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の検出試薬。
【請求項７】
前記特異的抗体が、着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子で標識されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の検出試薬。
【請求項８】
前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、請求項７に記載の検出試薬。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の検出試薬を含む、肺炎マイコプラズマ検出キット。
【請求項１０】
肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する第１特異的抗体、肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する第２特異的抗体、及び膜担体を備え、
前記第１特異的抗体が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２特異的抗体は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に担持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。
【請求項１１】
前記第１特異的抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマによって産生される抗体であり、
前記２特異的抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０のハイブリドーマによって産生される抗体である、請求項１０に記載の試験デバイス。
【請求項１２】
前記標識物質が着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子である、請求項１０又は１１に記載の試験デバイス。
【請求項１３】
前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、請求項１２に記載の試験デバイス。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイスを用いた肺炎マイコプラズマ感染検査法。
【請求項１５】
生体由来材料を検体に用いる、請求項１４に記載の検査法。
【請求項１６】
前記生体材料が、咽頭拭い液または鼻腔吸引液である、請求項１５に記載の検査法。
【請求項１７】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマが産生する、肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する特異的モノクローナル抗体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の特異的モノクローナル抗体を金属コロイド粒子で標識した標識化抗体。
【請求項１９】
前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、請求項１８に記載の標識化抗体。
【請求項２０】
受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺炎マイコプラズマ検出試薬及びその用途（イムノクロマトグラフィー試験デバイス、肺炎マイコプラズマ感染検査法）等に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性の定型肺炎とは別に、胸部Ｘ線写真で肺湿潤像を呈する非細菌性肺炎の30〜40％の原因は肺炎マイコプラズマである。ヒトから分離されるマイコプラズマの内、病原性が明らかなものは肺炎マイコプラズマである。
【０００３】
マイコプラズマ肺炎は幼児、学童に多く見られる。潜伏期間は平均14日である。多彩な合併症の報告があり、小児には脳炎、ギランバレー症候群、発疹などの皮膚炎などの合併症が多い。細菌性肺炎は激減しているが、肺炎全体の中でマイコプラズマ肺炎の比率は高まっている。肺炎マイコプラズマは、市中肺炎の原因菌として、肺炎球菌に次いで多い。
【０００４】
マイコプラズマは自己増殖可能な最小の微生物であり、光学顕微鏡での観察は難しい。他の細菌と異なり細胞壁を持たないため、ペニシリンおよびセフェム系抗生剤に感受性を示さず、治療にはテトラサイクリン系又はマクロライド系の抗生剤が一般的に使用されている。
【０００５】
肺炎マイコプラズマ感染の診断のために、以下のような種々の方法が利用されている。咽頭拭い液、喀痰からの分離培養法は確定診断に用いられているが、特殊な培地および長い日数（2〜4週間）を要するために、迅速診断に応用できない。肺炎マイコプラズマ感染で生じる抗体の検出法では、例えば、粒子凝集法（PA）、赤血球凝集反応（IHA）などを利用して、血清抗体が検出されている。しかし、いずれも急性期の診断には応用できない。
【０００６】
咽頭拭い液、喀痰などの検体中の肺炎マイコプラズマ核酸の遺伝子増幅技術を利用した検出法においてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による判断は、確定診断である分離培養法の結果と非常に相関している。また、PCRより簡便な手段としてLAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法の利用も報告されている。しかし、いずれも複雑な操作が必要であり、測定には多大な労力を要し迅速な診断には応用できない。
【０００７】
マイコプラズマ肺炎では、有効とされる抗生剤が限られているために、感染初期に肺炎マイコプラズマ感染の有無を判定したいという、医療現場のニーズが高い。一般的には、特異的な抗体が得られれば、ELISA法などのエンザイムイムノアッセイ（EIA）が利用できる。また、化学発光法、色素法、蛍光法など、様々な測定法に応用可能である。しかしながら、いずれの方法も各々専用の測定装置を必要とする点で、医療現場のニーズを捉えているとは言えない。一方、イムノクロマトグラフィー法（以下、イムノクロマト法という）は操作が簡便であり、特別な装置は不要であり、更には短時間（例えば10〜20分）での測定が可能である。但し、EIA法で検出可能な抗体がイムノクロマト法にも応用できるとは限らず、一層高い特異性及び高感度な抗体を必要とする場合が多い。肺炎マイコプラズマ感染に関しては、現在、抗P1タンパク質モノクローナル抗体（特許文献１）や抗Ribosomal Protein L7/L12タンパク質特異的抗体を使用したイムノクロマト用試薬（特許文献２）が市販され診断に応用されているが、感度が高いとはいえず、臨床現場でのニーズに応える十分な性能を示すとは言い難い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１３−７２６６３号公報
【特許文献２】特開２０１２−６９６８号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Varshney AK et al., Clin Vaccine Immunol. Feb 2008; 15(2): 215-220.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで本発明は、イムノクロマト法を用いた肺炎マイコプラズマ感染の検出に適用可能な特異的抗体及びそれを用いた検出試薬などを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決すべく検討を進める中で本発明者らは、P1タンパク質よりも高感度で肺炎マイコプラズマ感染を検出し得る標的タンパク質としてP30タンパク質に注目した。P30はプロリンに富む（20.7％）、分子量29,743の接着タンパク質である。これまでに、P30分子が同定され、P30に対する抗体も取得されている。また、当該抗体を利用した測定法としてELISA法の報告があるが（非特許文献１）、当該抗体のイムノクロマト法への応用は報告されていない。今回、新たに、イムノクロマト法に適した抗体の作製を試みた結果、優れた性能を示す抗体が得られた。当該抗体を用いたイムノクロマト法では、P1タンパク質に対する抗体を用いた場合よりも明らかに高感度の検出が可能であった。
以下の発明は上記の成果に基づく。
［１］肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する特異的抗体を含む、肺炎マイコプラズマ検出試薬。
［２］イムノクロマトグラフィー用である、［１］に記載の検出試薬。
［３］前記特異的抗体がモノクローナル抗体である、［１］又は［２］に記載の検出試薬。
［４］前記モノクローナル抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０のハイブリドーマ又は受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマによって産生される抗体である、［３］に記載の検出試薬。
［５］前記特異的抗体が、N末端から95番アミノ酸までを除去した組換えP30タンパク質を抗原として調製した抗体である、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の検出試薬。
［６］前記組換えP30タンパク質が配列番号２のアミノ酸配列からなる、［５］に記載の検出試薬。
［７］前記特異的抗体が、着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子で標識されている、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の検出試薬。
［８］前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、［７］に記載の検出試薬。
［９］［１］〜［８］のいずれか一項に記載の検出試薬を含む、肺炎マイコプラズマ検出キット。
［１０］肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する第１特異的抗体、肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する第２特異的抗体、及び膜担体を備え、
前記第１特異的抗体が前記膜担体に固定化されて検出部を構成し、
前記第２特異的抗体は標識物質で標識されており、且つ前記検出部から離れた位置に担持されている、イムノクロマトグラフィー試験デバイス。
［１１］前記第１特異的抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマによって産生される抗体であり、
前記２特異的抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０のハイブリドーマによって産生される抗体である、［１０］に記載の試験デバイス。
［１２］前記標識物質が着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子である、［１０］又は［１１］に記載の試験デバイス。
［１３］前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、［１２］に記載の試験デバイス。
［１４］［１０］〜［１３］のいずれか一項に記載のイムノクロマトグラフィー試験デバイスを用いた肺炎マイコプラズマ感染検査法。
［１５］生体由来材料を検体に用いる、［１４］に記載の検査法。
［１６］前記生体材料が、咽頭拭い液または鼻腔吸引液である、［１５］に記載の検査法。
［１７］受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマが産生する、肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する特異的モノクローナル抗体。
［１８］［１７］に記載の特異的モノクローナル抗体を金属コロイド粒子で標識した標識化抗体。
［１９］前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である、［１８］に記載の標識化抗体。
［２０］受託番号がＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０又はＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１のハイブリドーマ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】テストストリップの構成の一例。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、肺炎マイコプラズマの検出に有用な試薬（肺炎マイコプラズマ検出試薬）及びキットを提供する。本発明の肺炎マイコプラズマ検出試薬は、イムノクロマト法にも適用可能な点に特徴を有する（EIA法やウエスタンブロット法などに適用することを妨げるものではない）。即ち、本発明の試薬は、イムノクロマト法を利用した高感度の肺炎マイコプラズマ感染の検出を可能とする。本発明のキットは主要構成要素として本発明の試薬を含む。検出法を実施する際に使用するその他の試薬（展開用溶媒、緩衝液など）及び／又は装置ないし器具（容器、反応装置など）をキットに含めてもよい。また、抗原（P30タンパク質又はその一部）をキットに含めてもよい。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
【００１４】
本発明の試薬の有効成分は、肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する特異的抗体である。本発明の試薬を構成する抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが、特に感度の点からモノクローナル抗体であることが好ましい。
【００１５】
P30タンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体は、常法に従って作製できる。例えば、必要に応じて適切なアジュバンドと混合したP30タンパク質を、適切な哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ）の皮下または腹腔内に投与する。初回免疫後、2〜3週間目に常法に従って追加免疫を行うと、力価の高い抗血清が得られる。例えば最終免疫から1週間後に血液を採取し、血清を分離し、硫酸アンモニウムによる塩析、イオンクロマトグラフィーなどの通常の抗体の精製と同様な方法によって免疫グロブリン分画を取得する。
【００１６】
一方、P30タンパク質モノクローナル抗体は、本明細書の情報を参考にすれば、常法に従って作製したハイブリドーマから得ることができる。例えば、必要に応じて適切なアジュバンドと混合したP30タンパク質で適切な哺乳動物（例えばマウス、ラットなど）を免疫する。そして、該動物の脾臓細胞、Ｂリンパ球などの抗体産生細胞を、適切な動物（例えばマウス、ラットなど）由来の骨髄腫細胞と融合させることにより、ハイブリドーマを得ることができる。細胞融合は、例えば適切な培地中で抗体産生細胞と骨髄腫細胞とをポリエチレングリコールなどの存在下で融合させるポリエチレングリコール（PEG）法などにより行うことができる。細胞融合後、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプレリン、チミジンを含む培地）などの選択培地でハイブリドーマを選別し、P30タンパク質を認識する抗体を産生するハイブリドーマの能力について、常法（例えば、EIA法）に従ってスクリーニングを行う。次いで、所望の抗体を産生するハイブリドーマを常法（例えば限界希釈法）に従ってクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する。
【００１７】
抗体作製の際の免疫に使用するP30タンパク質（抗原）は、遺伝子組換えによって大腸菌で大量生産することができる。P30は274個のアミノ酸からなるタンパク質だが、N末端から95番目までの配列中に疎水性の膜貫通ドメインが2つ存在している。このためP30タンパク質全長を大腸菌で生産すると、溶解性が悪く扱いにくい。そこで、好ましくは95番目までのアミノ酸配列を除去した組換えP30タンパク質（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）を発現させて調製し、抗原タンパク質として利用する。
【００１８】
後述の実施例に示す通り、本発明者らはP30タンパク質を特異的に認識する複数のモノクローナル抗体の取得に成功した。これらの抗体には、識別のために、＃1〜＃19のクローン番号が付与された。これらの抗体の中でも、イムノクロマト法で高い感度を示した抗体＃3を産生するハイブリドーマクローン＃3、及び抗体＃9を産生するハイブリドーマクローン＃9は下記の通り、所定の寄託機関に寄託されている。
＜ハイブリドーマクローン＃3＞
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818）  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
寄託日：２０１４年６月２３日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０
【００１９】
＜ハイブリドーマクローン＃9＞
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818）  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
寄託日：２０１４年６月２３日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１
【００２０】
抗P30タンパク質抗体（ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）は、必要に応じて標識化される。標識化は常法で行えばよい。標識化に利用する標識物質としては不溶性粒状物質が望ましい。不溶性粒状物質としては、ラテックス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタクリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの合成高分子を色素分子で標識して得られる着色合成高分子粒子、金属コロイド粒子（金、銀、銅、鉄、白金、パラジウム、これらの混合物（例えば、金と白金の混合物、金と銀の混合物、パラジウムと白金の混合物）のコロイド粒子）、赤血球などが挙げられる。変化を目視で簡便かつ迅速に観察できる粒子が好ましく、着色合成高分子粒子又は金属コロイド粒子を採用するとよい。粒子の粒径は、例えば15〜100nm、好ましくは30〜80nmである。金属コロイド粒子は市販品を用いても良いし、常法により調製しても良い。金属コロイド粒子の中でも、利用し易い等の理由から、金コロイド粒子が好ましい。
【００２１】
金属コロイド粒子の場合を例として標識化の方法を説明すると、金属コロイド粒子溶液（通常、540nmにおける吸光度が約2.0）１Lに対して、通常、0.1〜100mg、好ましくは0.5〜20mgの抗P30タンパク質抗体を添加し、冷蔵または室温で5分〜24時間撹拌する。次いで、ウシ血清アルブミン（BSA）（通常、0.01〜10ｇ、好ましくは0.1〜2g）などでブロッキングし、遠心分離後の沈殿として、金属コロイド粒子で標識された抗P30タンパク質抗体を得ることができる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液などを用いることができる。緩衝液のpHは通常4.5〜9.5、好ましくは5.5〜8.5の範囲である。
【００２２】
抗P30タンパク質抗体を用い、肺炎マイコプラズマ感染検出用の試験器具（イムノクロマトグラフィー試験デバイス）を構築することができる。即ち、本発明は、抗P30タンパク質抗体を用いた、イムノクロマトグラフィー試験デバイスも提供する。本発明のデバイスでは、肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する第１特異的抗体（第１抗P30タンパク質抗体）、及び肺炎マイコプラズマのP30タンパク質に対する第２特異的抗体（第２抗P30タンパク質抗体）、及び膜担体を備える。そして、第１抗P30タンパク質抗体が膜担体に固定化されて検出部を構成する。一方、第２特異的抗体は標識物質で標識されており、検出部から離れた位置に担持されている。
【００２３】
本明細書において、「固定」とは、抗体が移動しないように膜等の担体に配置されることを意味する。「担持」とは、担体の中又は表面を移動可能に配置されることを意味する。以下、図１（具体例であるテストストリップ）を参照しながら、試験デバイスの構成を説明する。第１特異的抗体と第２特異的抗体はいずれもP30タンパク質に対して特異的である。第１特異的抗体と第２特異的抗体は、P30タンパク質に対して特異性の異なる抗体、例えば、別個の抗P30タンパク質抗体であることが好ましい。第１特異的抗体は捕捉抗体であり、担体に固定されて検出部を構成する。「検出部」とは、抗原抗体反応によって形成される、検体中の抗原と第１特異的抗体の複合体を捕捉し、抗原の存在を検出する部位をいう。
【００２４】
担体には、静電作用や疎水相互作用等の物理的作用によりタンパク質を結合でき、且つ検体中の成分、抗原−第１特異的抗体体複合体、対照用標識物質などを展開できる材質のものが用いられる。膜担体の材質としてニトロセルロース、ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）、セルロースアセテートを挙げることができる。好ましくは、担体は膜状（膜担体）である。検出部に加え、検体が適切に展開されたか否かを確認するための対照部を担体が備えることが好ましい。対照部には、対照用標準物質に結合可能な物質が固定されている。好ましくは、検出部と対照部は、担体上に、展開方向を横断する方向で線状に設置され得る（それぞれ「テストライン」および「コントロールライン」とも称される）。担体上の検出部及び対照部の位置関係は限定されないが、通常は、検出部よりも下流側に対照部が形成される。
【００２５】
補足抗体、及び対照用標識物質に結合可能な物質の固定方法は、担体の種類に応じて、常法に従って行うことができる。例えば、適切に希釈した抗体溶液を、市販の抗体塗布機を用いて塗布し、乾燥することで固定することができる。検出部位に固定される捕捉抗体の量は、好ましくは0.05〜10μgであり、より好ましくは0.1〜3μgである。
【００２６】
第２特異的抗体は、標識物質で標識された抗体、即ち「標識抗体」であり、検出部位とは離れた位置において膜などの担体に担持されている。典型的には、標記抗体を担持する担体は、捕捉抗体を固定化する担体とは別の部材である。但し、捕捉抗体を固定化する担体に標識抗体を担持させることにしてもよい。第２特異的抗体（標識抗体）を担持している標識抗体担持部材は、検出部よりも上流側に配置される。標識抗体担持部材は、乾燥状態で標識抗体を担持し、液体で浸潤すると標識抗体を放出する。標識抗体担持部材の材質としては、グラスファイバー、セルロースファイバー、プラスチックファイバーなどが挙げられる。標識抗体を含む適切な緩衝液に標識抗体担持部材を含浸させるか、または標識抗体を含む適切な緩衝液を標識抗体担持部材に添加して乾燥することにより、標識抗体担持部材に標識抗体を担持させることができる。標識抗体担持部材に担持させる標識抗体の量は好ましくは0.01〜1μgであり、より好ましくは0.03〜0.3μgである。
【００２７】
検体添加部材は、標識抗体担持部材の上流側に配置され、好ましくは、検体添加部材中の少なくとも下流側領域の下面が、標識抗体担持部材中の上流側の領域の上面と接触している。標識抗体担持部材の一部が、検体担持部材の下面と担体の上流側の領域の上面との間に挟み込まれていることが好ましい。好ましくは、担体の下流に配置される吸収部材が備えられる。吸収部材は、その上流側領域の下面が、担体の検出部よりも下流側に存在する領域の上面と接触するよう配置される。
【００２８】
本発明の試験デバイスでは、必要に応じて前処理した液体状の検体を検体添加部材に滴下すると、標識抗体担持部材に浸潤し、検体と標識抗体との混合物が担体（典型的には膜担体）に移動し、担体中にて検出部位に向けて展開する。検体にP30タンパク質（抗原）が含まれる場合（即ち、肺炎マイコプラズマ感染症例の場合）、当該抗原と標識抗体とが免疫複合体を形成する。そして、検出部において抗原抗体反応によって、当該複合体が捕捉抗体に捕捉され、集積して発色する。従って、検出部における呈色の度合いを目視で観察し、検体中の抗原の有無を判定することが可能となる。担体が対照部を備える場合には、標識抗体担持部材から放出された対照用標識物質が、対照部の対照用標識物質に結合可能な物質に捕捉され、集積して発色する。標識抗体を対照用標識物質としても用いる場合には、検体中の抗原と複合体を形成せずに残留する標識抗体が検出部位を素通りし、下流の対照部に固定された標識抗体に結合可能な物質に捕捉され、集積して発色することになる。
【００２９】
本発明の試験デバイスに供する検体は、肺炎マイコプラズマを含む可能性のある検体である。検体として用いることが可能な生体由来材料としては、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、鼻腔洗浄液、喀痰、肺胞洗浄液などが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００３０】
検体の前処理として、肺炎マイコプラズマの感染が疑われる被検体から採取された生体由来材料を前処理試薬に溶解し、試験デバイスに滴下するための液体を調製することが挙げられる。このような前処理は、検体を展開可能にするため、或いは検体の良好な展開を可能にするために行われる。前処理試薬には各種緩衝液を用いることができる。緩衝液としては、免疫学的試験に通常使用される緩衝液、例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液などを用いることができる。非特異的結合反応を低下させる目的で前処理試薬に界面活性剤を含有させても良い。界面活性剤としてはTriton X-100(商品名、ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル）、Tween20（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、Tween80（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）、CHAPS（3-[(3- コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルフォン酸）、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）などを用いることができる。２種類以上の界面活性剤を併用してもよい。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
１．肺炎マイコプラズマP30タンパク質に特異的なモノクローナル抗体の作製
１−１．抗原タンパク質の調製
P30タンパク質（配列番号１）には、N末端から95番目までの配列中に疎水性の膜貫通ドメインが2つ存在している。N末端から95番アミノ酸までを除去した組換えP30タンパク質（アミノ酸配列を配列番号２に示す。）を大腸菌で発現させ、抗原タンパク質として利用することにした。以下、抗原タンパク質を調製する手順の概要を示す。まず、肺炎マイコプラズマ(M. Pneumoniae) M129株のゲノムDNAを鋳型にして、PCR法によってP30遺伝子の断片を増幅する。PCRのプライマー配列としてAGGCATATGGGACTGCCAATTGTGAAGCG（配列番号３）とCAGGTCGACTTAGCGTTTTGGTGGAAAAC（配列番号４）を使用する(下線部はそれぞれ制限酵素NdeIとSalIによって切断される部位である)。増幅したP30遺伝子断片をタカラバイオ社のpcold ProS2発現べクターのNdeI-SalI部位に組み込み、組換えP30発現ベクターとする。P30発現ベクターを大腸菌 BL21株に導入し、1mM のイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加と、15℃での低温培養によって、組換えP30タンパク質を発現させる。大腸菌で発現させた組換えP30タンパク質はHis-tag精製カラムとゲルろ過によって精製する。精製した組換えP30タンパク質を定量し、適当な量を免疫用抗原として使用する。
【００３２】
１−２．免疫及び抗体の精製
以下の方法で、抗原タンパク質に対する特異的モノクローナル抗体の取得を試みた。
＜材料＞
（１）抗原
組換えP30精製タンパク質
（２）免疫動物
BALB/cAマウス  6週齢メス（日本クレア株式会社）  3匹
（３）アジュバンド
TiterMaxGold（G-3 フナコシ）
（４）マウスミエローマ細胞
P3U1
（５）培地・器材・試薬
RPMI-1640培地（11875-119 GIBCO)
ピルビン酸ナトリウム溶液（11360-070 GIBCO)
ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン溶液(10378-016 GIBCO)
HATサプリメント(21060-017 GIBCO)
HTサプリメント(11067-030 GIBCO)
FBS (S1560 BWT社）
PEG1500(783641 ロッシュ)
DMS0 (D2650 SIGMA)
96ウェル培養プレート(92696 TPP)
24ウェル培養プレート(92424 TPP)
滅菌シャーレ(34153 ニプロ)
凍結用チューブ(MS-4503 住友ベークライト)
（６）抗体スナリーニング器材・試薬
ELISAマイクロプレート（442404 nunc)
抗マウスIgG標識抗体（1030-04 コスモバイオ）
モノクローナル抗体アイソタイピングキット(1493027 ロッシュ）
（７）マウス腹水化・抗体精製
BALB/cAマウス  リタイヤメス（日本クレア株式会社）
プリスタン（42-002 コスモバイオ）
HiTrapProtein G（17-0404-03 GEヘルスケア）
【００３３】
＜方法＞
（１）マウスへの免疫感作
1.6mg/mlに調整したP30タンパク質とTiterMaxGoldを等量混合し、ガラスシリンジを用いエマルジョンを調製した。BALB/cAマウスの皮下へ100μg相当の抗原を2週間を空けて2回に分けて投与し、その1〜2週間後にP30抗原溶液のみを40μg皮下投与、その3日後に麻酔下で全採血を行い、脾臓及び各種リンパ節を採取した。
【００３４】
（２）ミエローマ細胞の培養
マウスミエローマ細胞（P3U1）はRPMI1640培地にピルビン酸とグルタミン酸、ペニシリン−ストレプトマイシンを添加した培地（RPMI培地）にFBSを10%となるように加え継代培養を行った。細胞融合には対数増殖期の形態のしっかりしたものを用いた。
【００３５】
（３）細胞融合
感作されたマウスから採取した各リンパ組織を＃200メッシュの上で細切りし、シリコン栓を装着したガラス棒で軽く押さえ、培地を加えながらリンパ球を濾過、採取した。1200rpm 10分の遠心処理で細胞を洗浄し、細胞数をカウントした。ミエローマ細胞は50mlコニカルチューブへ移し、細胞数をカウントし、1000rpm 5分の遠心処理により洗浄した。その後、リンパ球とミエローマ細胞の比率を5:1〜10:1の範囲になるように細胞数を調整し混合、遠心（1200rpm 10分）することで細胞ペレットを得た。
【００３６】
細胞融合は、細胞ペレットへ1mlのPEG液を1分かけてゆっくりかき混ぜながら加え、その後2分間攪拌しながら反応させた。その後、RPMI1640液1mlを1分かけて加え、同様の操作を3回行い、更に3分かけて12mlのRPMI1640液を添加した。37℃のインキュベータにて10分間静置した後に1000rpm 5分の遠心により細胞を集め、HATサプリメントを添加した15%FBSを含むRPMI培地に浮遊させ、96ウェル培養プレート10枚へ播いた。その際、フィーダー細胞としてマウス胸腺細胞を使用した。
【００３７】
CO2インキュベータにて1週間培養し、ハイブリドーマを選択増殖させた。
【００３８】
（４）抗体スクリーニング
ELISA用96ウェルマイクロプレートへPBSにて1μ/mlに希釈したP30タンパク質50μlを入れ、室温で2時間又は冷蔵で一晩反応させ、その後、0.5%のスキムミルク100μlを加え、ブロッキングを行い、抗原結合プレートとした。
【００３９】
細胞融合から1週間目に、それぞれの培養プレートから無菌的に培養上清およそ50μlを採取し、抗原結合プレートへ入れ、室温1時間反応させた。その後に生理食塩水にて3回のプレート洗浄を行い、続いて0.5%スキムミルクにて2500倍に希釈した酵素標識抗マウスIgG抗体を室温で1時間反応させた。同様に洗浄を行った後に酵素基質液にて発色させ、抗原と結合するモノクローナル抗体陽性ウェルを選択した。
【００４０】
（５）クローニング
ELISAにて選択されたハイブリドーマに対して限界希釈法によるクローニングを行った。すなわち、前もってフィーダー細胞を播いた96ウェル培養プレートへハイブリドーマ細胞が1ウェルあたり1個になるように細胞浮遊液を調製し播いた。1週間後に増殖したコロニーを確認し、同様の抗体スクリーニングを行った。クローニングは2回行い完全に単一な細胞であることを確認した。尚、培地には15%FBSとHTサプリメントを加えたRPMI培地を用いた。
【００４１】
（６）クローン樹立、細胞凍結
単一の細胞となったハイブリドーマは24ウェル培養プレートからシャーレでの拡大培養を行い、2〜5×108個/チューブにて凍結保存を行った。凍結培地には15％ FBSとHTサプリメントを含むRPMI培地に10%になるようにDMSOを加えた培地を用い、ペーパータオルに包んで-85℃の超低温フリーザーに保管した。
【００４２】
（７）サブクラス測定
サブクラスの測定は、十分にクローニングされた培養上清を用い、市販のイムノクロマト法によりマニュアル通りに行った。
【００４３】
（８）マウス腹水化、抗体精製
1週間以上前にプリスタン0.5mlを腹腔内投与したBALB/cAリタイヤマウスの腹腔へ0.5〜1×107個のハイブリドーマ細胞を接種し、およそ7〜10日後に貯留した腹水を得た。腹水は十分に凝固させ3000rpm 15分の遠心処理により固形物を沈殿させ、上清を分離した。上清には防腐剤として0.1%にアジ化ナトリウムを添加し精製まで冷蔵で保存した。
【００４４】
腹水からの抗体精製には、HiTrapProteinGカラムを用い、プロテインGカラムへの抗体結合と洗浄にはPBSを、洗浄後の抗体溶出には0.1Mグリシン塩酸Buffer pH2.8を用い、溶出したIgGの中和には1M Trisを用いた。溶出された抗体は50%飽和硫安にて濃縮を行い十分にPBSに透析し0.05%アジ化ナトリウムを加え冷蔵保存した。
【００４５】
精製抗体の純度検定にはセルロースアセテート膜電気泳動を行い、γ領域に単一なバンドとして確認した。
【００４６】
＜結果＞
マウス3匹を用いて細胞融合実験を行った。その結果、No.1マウスからは14クローン、No.2マウスからは1クローン、No.3マウスからは14クローンが1次スクリーニングで選択された。その後、非特異的な反応やコロニー増殖を検討し合計19クローンについてクローニングを進め、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを樹立した（クローン＃1〜＃19）。樹立されたハイブリドーマはマウス腹水化を行い2〜7mlの腹水を得た。得られた腹水は、セルロースアセテート膜電気泳動にて抗体含量を確認し、その後HiTrapProteinGにてIgGに精製した。各精製抗体は、イムノクロマト法で評価を行った。19クローンの内、クローン＃3と＃9の組み合せで良好な結果が得られ、測定系への利用が可能となった。サブクラスは、＃3、＃9共にIgG1κであった。ハイブリドーマクローン＃3及び＃9は、以下の通り寄託した。
＜ハイブリドーマクローン＃3＞
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818）  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
寄託日：２０１４年６月２３日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８０
【００４７】
＜ハイブリドーマクローン＃9＞
寄託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（〒292-0818）  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室
寄託日：２０１４年６月２３日
受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１８８１
【００４８】
２．イムノクロマト試験デバイスの作製
２−１．標識抗体担持部材の調製
以上の結果を踏まえ、ハイブリドーマクローン＃3が産生する抗P30モノクロ―ナル抗体（P30-3）を標識抗体に用いることにした。抗P30モノクロ―ナル抗体（P30-3）を5mMリン酸緩衝液（pH7.4）で0.05mg／mlの濃度になるように希釈した。金コロイド懸濁液（BBI:平均粒子60nm） 0.5mlに0.1mlの50mMリン酸緩衝液（pH 7.4）を加えて混合した後、上記希釈した抗P30モノクローナル抗体溶液0.1mlをさらに加えて、室温にて10分間放置した。静置後の溶液に、10mM リン酸緩衝液で希釈した10質量％のウシ血清アルブミン（BSA）溶液0.1mlを加えて、十分撹拌した後、8,000xｇにて15分間遠心分離した。再度、上清を除去し、残渣にpH 7.4の10mMリン酸緩衝液を加えて超音波破砕機にてよく分散させ、標識抗体溶液とした。この標識抗体溶液を幅16mmx長さ100mmのグラスファイバー製パッド（ミリポア社製：GFCP203000）に均一に添加した後、真空乾燥機にて乾燥させ、標識抗体担持部材を得た。
【００４９】
２−２．検出部及び対照部を備えたニトロセルロース膜担体の調製
上記２−１の標識抗体とは異なる抗P30モノクローナル抗体（ハイブリドーマクローン＃9が産生するモノクローナル抗体であるP30-9）を5質量％のイソプロピルアルコールを含むリン酸緩衝液（pH 7.4）で1.3mg／mlの濃度になるように希釈し、検出部固定用抗体（捕捉抗体）溶液として調製した。この検出部固定用抗体溶液を長さ25cmx幅2.5cmのニトロセルロース膜（ミリポア社製：HF120）の長軸側の一端（この端を展開方向の上流側端、反対側を下流側端とする）から１cm離れた位置に、抗体塗布機（BioDot社製）を用いて1μl／cmの塗布量で線状に塗布した。さらに、ニトロセルロース膜の上流側端から、1.5cm離れた位置に、抗マウスIgG抗体を１mg／mlの塗布量で線状に塗布した。塗布後、42℃にて60分間乾燥させ、検出部及び対照部を備えたニトロセルロース膜担体を得た。
【００５０】
２−３．イムノクロマト試験デバイスの作製
上記２−２のニトロセルロース膜担体の抗体塗布面（この面を上面とする）の反対側（この面を下面とする）に、プラスチック製バッキングシートを接着した。次いで、上記２−１の標識抗体担持部材をニトロセルロース膜担体の上面に、ニトロセルロース膜の上流側端が2mm重なるように配置して貼り付け、さらに幅5mmx長さ23mmのグラスファイバー製サンプルパッド（ポール社製：8000006801）を、標識抗体担持部材の上面に2mm重なるように配置して貼り付けた。一方、幅5mmx長さ25mmの吸収パッド（ポール社製）を、ニトロセルロース膜担体の上面に、ニトロセルロース膜担体の下流側端が15mm重なるように張り付けた。最後に、長軸方向に沿って5mmずつ切断し、イムノクロマト試験デバイスを得た。
【００５１】
３．肺炎マイコプラズマ検出感度の比較
マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumonia）FH株（ATCC）をChanock培地を用いて７日間37℃で培養した。この培養液を検体として用い、抗P30モノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法（上記イムノクロマト試験デバイスを使用）と抗P1モノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法の感度を比較した。用いたモノクローナル抗体は次の通りである。尚、後者の方法に使用する試験デバイスは、抗P1モノクローナル抗体（P1-4及びP1-115：富山研究所）を用い、上記の方法に準じて作製した。
＜P30イムノクロマト法＞
標識抗体（金コロイド感作用）：P30-3
捕捉抗体（メンブラン感作用）：P30-9
＜P1イムノクロマト法＞
標識抗体（金コロイド感作用）：P1-4
捕捉抗体（メンブラン感作用）：P1-115
【００５２】
実験結果を以下の表に示す。
【表１】
2016031353.tif 000002
【００５３】
表に示した通り、抗P30モノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法の検出感度は、抗P1モノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法の検出感度を遙かに凌駕した。
【００５４】
以上の通り、優れた特性の抗P30モノクローナル抗体の取得に成功し、既存の方法よりも遙かに高感度で肺炎マイコプラズマを検出可能なイムノクロマト法を実現できた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明はイムノクロマト法に適用可能な抗P30モノクローナル抗体を提供する。当該モノクローナル抗体を用いたイムノクロマト法によれば、肺炎マイコプラズマ感染の簡便、迅速且つ高感度の検出が可能となる。
【００５６】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
2016031353.tif 000003
【配列表】
2016031353000001.app