(57)【要約】      （修正有）【課題】神経幹細胞を高率で分化誘導するアストロサイト分化誘導剤及び細胞線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）発現誘導剤の提供。【解決手段】神経幹細胞をアストロサイトに高率に分化誘導するアストロサイト分化誘導剤であって、スチルベン骨格を有するポリフェノールのスチルベン化合物の一種であるピセアタンノールを有効成分として含有するアストロサイト分化誘導剤。また、神経幹細胞においてＧＦＡＰの発現を高率に誘導するＧＦＡＰ発現誘導剤であって、ピセアタンノールを有効成分として含有するＧＦＡＰ発現誘導剤。ピセアタンノールは化学合成品でも良く、植物等の自然物由来であっても良い。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞をアストロサイトに高率に分化誘導するアストロサイト分化誘導剤であって、
ピセアタンノールを有効成分として含有するアストロサイト分化誘導剤。
【請求項２】
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害に対する予防薬または治療薬である、請求項１に記載のアストロサイト分化誘導剤。
【請求項３】
前記アストロサイトがＧＦＡＰ発現細胞である、請求項１または２に記載のアストロサイト分化誘導剤。
【請求項４】
神経幹細胞においてＧＦＡＰの発現を高率に誘導するＧＦＡＰ発現誘導剤であって、
ピセアタンノールを有効成分として含有するＧＦＡＰ発現誘導剤。
【請求項５】
パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害に対する予防薬または治療薬である、請求項４に記載のＧＦＡＰ発現誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会が進むにつれて認知症などの老化を原因とする各種神経変性疾患が問題となっている。かかる疾患は患者のみならず介護者の日常生活へも大きな負担を生じ、社会レベルでは医療費・介護費の膨大に繋がっている。
【０００３】
また、極度のストレス負荷（例えば、交通事故、過労、いじめ・虐待、犯罪抵触など）を受けることにより各種脳神経機能障害をもたらすことも知られ社会問題にもなっている。神経細胞を増強・促進する事により脳機能を改善したいニーズは従来からあり、安全性が高く、且つ長期摂取可能な医薬品等が求められている。
【０００４】
近年、神経系細胞の分化制御機構は急速に明らかになっているが、安全性が高く、且つ長期摂取可能な神経系細胞の分化促進剤や分化誘導剤は、まだ明らかとなっていない。ゾニサミド（パーキンソン病薬）や冬虫夏草抽出物ではアストロサイトを増殖したという報告があるが、安全性や費用の面からは更なる改善が必要な状況である。
【０００５】
ポリフェノールは、その特性から、医薬、化粧品、食品など様々な分野に利用されている、安価で安全性の高い物質である。
【０００６】
例えば、レスベラトロールはスチルベン類の化合物であり、ブドウに含まれているが、アストロサイトの増殖については影響がないとの報告がある(非特許文献1を参照)。
ピセアタンノールは、例えば、トケイソウ科トケイソウ属（Passiflora）の果物であるパッションフルーツの種子に含まれており、シミ、ソバカス、日焼けなどによる色素沈着の原因となるメラニンの生成を抑制する効果があることが報告されている（特許文献１を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１０２２９８号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Experimental Cell Research (2009) 315(8), 1360-1371
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規なアストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明にかかる一実施態様は、神経幹細胞をアストロサイトに高率に分化誘導するアストロサイト分化誘導剤であって、ピセアタンノールを有効成分として含有するアストロサイト分化誘導剤である。このアストロサイト分化誘導剤は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害に対する予防薬または治療薬であってもよい。このアストロサイトはＧＦＡＰ発現細胞であってもよい。
【００１１】
本発明にかかる他の実施態様は、神経幹細胞においてＧＦＡＰの発現を高率に誘導するＧＦＡＰ発現誘導剤であって、ピセアタンノールを有効成分として含有するＧＦＡＰ発現誘導剤である。このＧＦＡＰ発現誘導剤は、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害に対する予防薬または治療薬であってもよい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、新規なアストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明にかかる一実施例において、２．５μＭのピセアタンノールまたはレスベラトロールで処理した神経幹細胞のＧＦＡＰ発現を観察した顕微鏡写真である。
【図２】本発明にかかる一実施例において、アストロサイトに特徴的な形態を示す細胞の典型的な一例を示す図である。
【図３】本発明にかかる一実施例において、１μＭまたは２．５μＭのピセアタンノールまたはレスベラトロールで処理した神経幹細胞のＧＦＡＰ発現率及びアストロサイトへの分化率を示すグラフである。
【図４】本発明にかかる一実施例において、１μＭまたは２．５μＭのピセアタンノールまたはレスベラトロールで処理した神経幹細胞の細胞生存率を示すグラフである。
【図５】本発明にかかる一実施例において、３、１０ｍｇ／ｋｇ体重のピセアタンノールをマウスに経口投与した時の、海馬内でのGfap遺伝子の発現レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
（１）アストロサイト分化誘導剤またはＧＦＡＰ発現誘導剤に含まれるピセアタンノール
本願発明のアストロサイト分化誘導剤またはＧＦＡＰ発現誘導剤は、ピセアタンノールを有効成分として含有する。ピセアタンノールは、安全性が高く、且つ継続摂取が容易な化合物として知られているので、本願発明の薬剤も、安全性が高く、且つ継続摂取が容易という有利な点を有する。
【００１６】
スチルベン化合物とは、スチルベン骨格を有するポリフェノールの総称であり、ピセアタンノールはその一種である。ピセアタンノールは、化学合成品であってもよいし、植物等の自然物由来であってもよい。
【００１７】
【化１】
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ピセアタンノールを植物から抽出するための方法は公知の方法を用いればよく、特に限定されないが、例えば以下のような方法が考えられる。
【００１８】
植物を、乾燥した後に、破砕、粉砕、または、切断などによって種子等の分解物を得、溶媒を用いて抽出し、残渣を除去することによって抽出液を得ることができる。さらに、抽出液から溶媒を除去することによって、抽出物を得ることができる。抽出物の形状は、特に限定されず、例えば粉体などの固体状、アモルファス状、または、オイル状であっても良い。
【００１９】
アストロサイト分化誘導剤に含有させるピセアタンノールは、植物の抽出液をそのまま用いてもよく、この抽出液から様々な方法でピセアタンノールを精製したり、様々な溶媒で希釈したりして得られた様々な純度や様々な濃度の抽出液を用いてもよいが、植物から抽出物を得る段階のいずれのものも、植物エキスとして、アストロサイト分化誘導剤に使用することができる。また、抽出物を溶媒で溶解して得られた溶液を植物エキスとして用いてもよい。
【００２０】
抽出に用いる溶媒の種類は、当業者であれば適切に選択することができるが、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２−プロパノール、１，４−ジオキサン、ヘキサン、クロロホルム、ジクロロメタン等の有機溶媒または含水有機溶媒、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であっても良く、水、エタノール、１，３−ブチレングリコール、または、これらから選択される２以上の溶媒の混合溶媒であることが好ましく、水、エタノール、または、水およびエタノールの混合溶媒である含水エタノールであることがより好ましい。ここで、「含水有機溶媒」とは「水を含む有機溶媒」の意である。この含水有機溶媒を製造するために有機溶媒に添加する水は特に限定されず、純水でも不純物を含む水でもよく、酸性水溶液であってもアルカリ性水溶液であってもよく、様々なイオンを含んだ緩衝液であってもよい。また、抽出に用いる溶媒の温度は、その溶媒が液体の物性を保つ温度範囲から適宜選択できる。
【００２１】
混合溶媒を用いる場合の、各溶媒の混合比は特に限定されないが、例えば水およびエタノールの混合溶媒を用いる場合には、水とエタノールとの体積比は、１：９９〜９９：１であっても良く、３：９７〜８０：２０であることが好ましく、５：９５〜５０：５０であることがより好ましく、１０：９０〜４０：６０であることが特に好ましい。
【００２２】
溶媒として、水、または、水との混合溶媒を用いる場合には、熱水、または、熱水との混合溶媒であることが好ましい。水、または、水との混合溶媒は塩を含んでいても良く、塩を含む溶媒の例として、バッファー（緩衝液）であっても良い。バッファーのｐＨは、特に限定されず、酸性、中性、または、アルカリ性のいずれであっても良いが、酸性であることが好ましく、ｐＨ６以下の酸性であることがより好ましく、ｐＨ１〜ｐＨ５の酸性であることがさらに好ましい。バッファーに用いる塩の種類は特に限定されず、例として、クエン酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、酢酸塩および炭酸塩などが挙げられる。
【００２３】
抽出液から溶媒を除去する方法は、特に限定されず公知の方法を用いることができる。例えば、減圧留去、凍結乾燥、または、スプレードライ（噴霧乾燥）であっても良いが、凍結乾燥、または、スプレードライであることが好ましく、スプレードライであることがより好ましい。
【００２４】
ここで、植物の種類は、ピセアタンノールを含む植物であれば特に限定されず、例えば、パッションフルーツ（例えば、Passiflora edulis、Passiflora alata、Passiflora amethystine、Passiflora antioquiensis、Passiflora biflora、Passiflora buonapartea、Passiflora capsularis、Passiflora cearensis、Passiflora coccinea、Passiflora cochinchinesis、Passiflora filamentosa、Passiflora herbertiana、Passiflora laurifolia、Passiflora ligularis、Passiflora lunata、Passiflora lutea、Passiflora maliformis、Passiflora mixta、Passiflora mucronata、Passiflora mollissima、Passiflora nibiba、Passiflora organensis、Passiflora pallida、Passiflora parahypensis、Passiflora pedeta、Passiflora pinnatistipula、Passiflora popenovii、Passiflora quadrangularis、Passiflora riparia、Passiflora rubra、Passiflora serrate、Passiflora tiliaefolia、Passiflora tripartite、Passiflora villosa、Passiflora warmingiiなど）、テンニンカ（例えば、Rhodomyrtus tomentosaなど）、ブラシノキ（例えば、マキバブラシノキCallistemon speciosus、Callistemon rigidusなど）などが挙げられる。抽出するのは、ピセアタンノールが含まれていれば、植物全体のうち、どの部分であっても良く、例えば、果実、花、種子、葉、枝、樹皮、幹、茎、または、根であっても良いが、パッションフルーツを用いる場合は種子であることが好ましく、テンニンカである場合には果実であることが好ましく、ブラシノキである場合には茎であることが好ましい。
【００２５】
（２）アストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤
ピセアタンノールは、医薬または試薬として用いられる薬剤として、in vivoまたはin vitroで用いて、神経幹細胞においてＧＦＡＰ（Glial fibrillary acidic protein：グリア細胞線維性酸性タンパク質）を高率に発現させることができるＧＦＡＰ発現誘導剤とすることができる。ここで、「ＧＦＡＰ発現誘導」及び「神経幹細胞においてＧＦＡＰを高率に発現させる」とは、一つの神経幹細胞に対しては、その薬剤がない場合より高い確率でＧＦＡＰを発現させることを意味し、神経幹細胞の集団に対しては、その薬剤がない場合より高い割合でＧＦＡＰを発現させることを意味する。
【００２６】
また、ＧＦＡＰはアストロサイトの特異的マーカーであるので、この際、アストロサイトへの分化を高率に誘導することができるアストロサイト分化誘導剤とすることもできる。ここで、「アストロサイト分化誘導」及び「アストロサイトへの分化を高率に誘導する」とは、一つの神経幹細胞に対しては、その薬剤がない場合より高い確率でアストロサイトへ分化誘導することを意味し、神経幹細胞の集団に対しては、その薬剤がない場合より高い割合でアストロサイトへ分化誘導することを意味する。
【００２７】
本発明に係る薬剤は、有効成分の他、必要に応じて、一般に用いられる各種成分をさらに含み得るものであり、例えば、1種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤などを含み得る。
【００２８】
＝＝in vivoでの使用＝＝
in vivoで用いる場合、投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状などに応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与できる。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。直接投与する場合、神経幹細胞が局在する海馬や側脳室またはそれらの近傍に投与することが好ましい。
【００２９】
経口用固形製剤を調製する場合は、有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などを製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などを、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどを、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などを、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどを、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などを例示できる。
【００３０】
経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤などを加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤などを製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウムなどが、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどを挙げることができる。
【００３１】
注射剤を調製する場合は、有効成分にpH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどを挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、 エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、チオグリコール酸、チオ乳酸などを挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどを挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが例示できる。
【００３２】
坐剤を調製する場合は、有効成分に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライドなどを、さらに必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤などを加えた後、常法により製造することができる。
【００３３】
軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤などが必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどを挙げることができる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどを挙げることができる。
【００３４】
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペーストなどを常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタンなどのフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００３５】
薬剤に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量や投薬の回数などにより適宜決定できる。用量は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無など）、および担当医師の判断など応じて適宜選択される。一日投与量は1日1回乃至数回に分けて投与することができる。
【００３６】
投与する動物種は即に限定されず、脊椎動物であってもよいが、ほ乳類であることが好ましく、ヒトであることが最も好ましい。ピセアタンノールを含む薬剤を生体に投与すると、in vivoで、神経幹細胞に対しＧＦＡＰ発現が高率で誘導され、また神経幹細胞がアストロサイトに高率で分化誘導されるようになる。
【００３７】
＝＝in vitroでの使用＝＝
in vitroで用いる場合、ピセアタンノールを含む薬剤を、神経幹細胞を含む培養細胞や培養組織を培養する培地に添加すればよい。培地中の濃度は特に限定されず、培養する細胞や組織によって、適宜決めることができるが、例えば、１０μＭ以下であってもよく、５μＭ以下であってもよく、２．５μＭ以下であってもよく、１μＭ以下であってもよい。
【００３８】
用いる神経幹細胞の由来は特に限定されず、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ミューズ細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などの多能性幹細胞、または間充織幹細胞や臍帯血幹細胞などの幹細胞から誘導された神経幹細胞でも、生体から単離された神経幹細胞でも構わない。
【００３９】
神経幹細胞をアストロサイトに分化誘導する条件下で、本発明のアストロサイト分化誘導剤を神経幹細胞に適用すると、神経幹細胞は高率でアストロサイトに分化するようになる。アストロサイトに分化させる条件は特に限定されず、公知の分化条件を用いればよい。
【００４０】
また、神経幹細胞をアストロサイトに分化誘導する条件下で、神経幹細胞に本発明のＧＦＡＰ発現誘導剤を適用すると、神経幹細胞が高率にＧＦＡＰを発現するようになる。アストロサイトに分化させる条件は特に限定されず、公知の分化条件を用いればよい。
【００４１】
（３）アストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤の医薬としての使用
近年、アストロサイトは、従来考えられていたような、神経細胞の支持や神経細胞に対する栄養供給だけでなく、神経回路形成促進、神経伝達物質濃度調節、細胞外イオン濃度調節、オリゴデンドロサイトの髄鞘形成活性の亢進、記憶形成などの高次機能への関与、精神病性障害への関与など多様な機能を有することが明らかになっている。
【００４２】
そこで、本発明にかかるアストロサイト分化誘導剤及びＧＦＡＰ発現誘導剤は、神経系疾患、特に中枢神経系疾患の治療に用いることができる。この神経系疾患には、神経変性疾患、神経障害、神経損傷、脳脊髄炎、精神病性障害、二次的神経障害などが含まれ、例えば、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、多発性硬化症、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、外傷性神経損傷、脊髄損傷、脳卒中、脳出血、脳血栓、脳塞栓、黄斑変性、作動振顫、遅発性ジスキネジア、パニック障害、不安障害、うつ病、アルコール依存症、不眠症、躁病、アルツハイマー病、てんかん、糖尿病神経障害などが例示できる。
【実施例】
【００４３】
（１）ＧＦＡＰ発現誘導活性の測定
ＧＦＡＰ発現誘導活性の測定はマウス胚性幹(ＥＳ)細胞Ｊ１を用いて行った。まず、マウスＥＳ細胞の培養を行う上で必要なフィーダー細胞(マウス胎仔線維芽細胞：MEF)の培養を行った。 
６ｃｍディッシュ（ＴＰＰ社）の底面を覆うように０．１％ゼラチン溶液（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃で、３０分静置した。その後、０．１％ゼラチン溶液を除去し、凍結保存してあるＭＥＦ（北山ラベス社）を６ｃｍディッシュ１枚辺り４×１０５個播種した。その際の培養液として、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｗｅｓｔ社）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ−ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社）を含むＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ社）を用いた。
【００４４】
翌日、凍結保存してあるマウスＥＳ細胞をＭＥＦの上に６ｃｍディッシュ１枚辺り４×１０５個播種し、ＬＩＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を培養液の１０００倍希釈濃度で添加した。その際の培養液として、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）、１％Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ社）、１％非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ社）、０．１％５５ｍＭ  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＤＭＥＭを用いた。
【００４５】
３日後に、６ｃｍディッシュで培養したＥＳ細胞をＰＢＳ（ＴａＫａＲａ社）で洗浄し、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（ＳＩＧＭＡ社）を加え、５分間インキュベート後、培養液を加えてから、上清を取って遠心分離（１２００ｒｐｍ、４分間）した。得られた細胞に再び培養液を加え、さらに３０分インキュベートした。その後、上清を取り、再び遠心分離（１２００ｒｐｍ、４分間）した。得られた細胞に再び培養液を加え、３０分インキュベートし上清に含まれる細胞を以降の実験で用いた。得られた細胞（１ｍｌ辺り３．７５×１０５個）を含む培地２０μｌの液滴を培養皿のふたの裏側に形成した。３日間インキュベートして胚様体（ＥＢ）を形成させた。
【００４６】
形成させたＥＢをピペットで回収後、２ｍｌ神経細胞用培養液（住友ベークライト社）を３５ｍｍ細菌培養用ディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ社）に加え、そこにＥＢを添加した。その際に２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ社）と２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ社）を培養皿に添加し、１日おきに２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２と２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦを加え、浮遊培養を続けた。
【００４７】
４日後、新しい６ｃｍディッシュに１ｍｌ  ５０倍希釈Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社）を添加した。１時間インキュベートした後、Ｍａｔｒｉｇｅｌを除去し、２ｍｌ  ＤＭＥＭで洗浄しＥＢをｄｉｓｈに移した。その際の培養液として、２％Ｂ−２７（Ｇｉｂｃｏ社）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ社）を用いた。一日おきに培地交換を行い、１０日間接着培養を続け、ＥＢの周りに放射状に増殖した神経幹細胞のみを回収し、凍結保存した。
【００４８】
凍結保存した神経幹細胞を９６穴ディッシュに１ウエル辺り１×１０４個の密度で播種し、アストロサイト分化誘導条件下においた。培養液としては、２％Ｂ−２７、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２、２０ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＥＧＦを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍを用い、５％ＣＯ２、３７℃の条件で培養した。その２日後に培地交換を行い、その翌日に培地を神経細胞用培養液に変更し、その際に、２．５μＭまたは１μＭの濃度でピセアタンノールおよびレスベラトロールを添加した。さらに、その２日後に培地交換を行いその翌日に以下に記述の免疫染色を行った。なお、コントロールとして、化合物を添加しないサンプルについて、平行して実験を行った。
【００４９】
各ウエルの培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ社）を添加し、４℃で３０分間静置し固定した。パラホルムアルデヒドを除去後、ＰＢＳで３回洗浄し０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ社）、５％スキムミルク（Ｗａｋｏ社）を含むＰＢＳを添加し４℃で３０分間ブロッキングを行った。一次抗体を含む５％  スキムミルク含有ＰＢＳを添加し、４℃で一晩静置し抗原抗体反応を行った。なお、一次抗体にはマウスモノクローナル抗ＧＦＡＰ抗体（ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を５００倍希釈にして用いた。
【００５０】
一次抗体を除去し、５％スキムミルクを含むＰＢＳ溶液で３回洗浄を行った。溶液を除去後、蛍光標識した二次抗体を含む５％スキムミルク含有ＰＢＳを添加し室温で３０分間静置した。なお、二次抗体にはｃｈｒｏｍｅｏ４８８標識ゴートポリクローナル抗マウスＩｇＧ抗体  （Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ社）を２００倍希釈で使用した。
【００５１】
二次抗体を除去し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳで３回洗浄した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（ＤＯＪＩＮＤＯ社）を１０００倍希釈で添加した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を使用し、各条件あたり８ウエルについて、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞数とＧＦＡＰ陽性細胞数の数をカウントした。各化合物を２．５μＭ添加したサンプルの観察写真例を図１に示す。
【００５２】
ＧＦＡＰはアストロサイト分化マーカーとして広く知られている（Kimelbrg, Neurochem Int., 2004, 45, 191-202）。また、アストロサイトは複数の突起を周囲に伸ばす形態を成している（Bushong et al, Int J Dev Neurosci., 2004, 22, 73-86）。本発明ではこれらをアストロサイトの指標とし、ＧＦＡＰ陽性かつアストロサイトに特徴的な形態を示す細胞（図２に典型的な一例を示す）の数を数え、（ＧＦＡＰ陽性細胞数）／（Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２陽性細胞数）の平均値をＧＦＡＰ陽性率またはアストロサイト分化率として算出した（図３）。また、コントロールのＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞数を１００としたときの、各サンプルのＨｏｅｃｈｓｔ陽性細胞数の割合を、細胞生存率として算出した（図４）。
【００５３】
（２）ＧＦＡＰ発現誘導活性の測定結果（図３）
ピセアタンノール（pice）は、２．５μＭにおいて、コントロール（control）と比較してＧＦＡＰ陽性率またはアストロサイト分化率が有意に（１９％）増加した。一方、レスベラトロール（res）は有意な変化を与えなかった。このように、ピセアタンノールは、神経幹細胞に対して、レスベラトロールより強いＧＦＡＰ発現誘導能及びアストロサイト分化誘導能を有する。
【００５４】
（３）細胞生存率の測定結果（図４）
ピセアタンノール（pice）およびレスベラトロール（res）は１μＭ及び２．５μＭの濃度で細胞生存率を減少させず、むしろ細胞数を増加させる傾向にあった。このように、これらの濃度では各化合物の細胞毒性は無い。
（４）in vivoにおけるアストロサイト分化誘導
成体では、海馬や側脳室で神経幹細胞の増殖が認められている。本実施例では、成体マウスの海馬において、ピセアタンノールがアストロサイト分化誘導能を有することを示す。
９週齢の雄マウス(BALB/cByJJcl、日本クレア、ｎ＝４)に対し、１４日間にわたって、毎日３、１０ｍｇ／ｋｇ体重の量のピセアタンノールを経口投与した。なお、ピセアタンノールは、０．５％ＣＭＣ中０．３７５ｍｇ／ｍＬあるいは１．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた溶液を用いた。コントロールとして、ピセアタンノールを溶解させていないＣＭＣを投与した。１４日後、頸椎脱臼して３分以内に大脳を摘出し、氷冷した金属板上に移して海馬を単離・凍結した。その後、ＲＮＡを抽出し、逆転写を行ってｃＤＮＡを得、リアルタイムＰＣＲを行うことで、海馬におけるアストロサイトの分化マーカーであるGfap遺伝子の発現解析を行った。発現量はGapdh遺伝子を内部標準として揃えた後、各個体ごとにトリプレットでＰＣＲを行って個体ごとの発現量を決定し、４個体の発現量の平均値±標準偏差をグラフに示した（図５）。その結果、10 mg/kg体重 で投与したマウスにおいて、コントロールと比較してGfap遺伝子の発現レベルの有意な上昇（p=0.015）が確認された。
このように、ピセアタンノールは、in vivoにおいてもアストロサイト分化誘導能を有する。
【図５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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