(57)【要約】【課題】ハダカイワシの新規な利用法および新規ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を提供する。【解決手段】魚体および／または魚粉をタンパク質分解酵素で処理して得られる組成物であって、Ｌ−Ｒを１０μｇ／ｋｇ以上含有する組成物。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚体および／または魚粉をタンパク質分解酵素で処理して得られる組成物であって、ロイシン−アルギニンを１０μｇ／ｋｇ以上含有する組成物。
【請求項２】
前記魚体および／または魚粉がハダカイワシ由来である請求項１の組成物。
【請求項３】
前記タンパク質分解酵素が中性プロテアーゼ、パパインもしくはエンド型プロテアーゼ／エキソ型プロテアーゼまたはそれらの混合物からなる群から選ばれる酵素である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性のＩＣ５０値（50%阻害濃度）が固形分濃度で１０ｍｇ／ｍＬ以下である請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
請求項１〜３に記載の組成物を有効成分とする、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤。
【請求項６】
ロイシン−アルギニンを有効成分とする、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤。
【請求項７】
ロイシン−アルギニンがハダカイワシ由来である、請求項６のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤。
【請求項８】
請求項１〜４の組成物または請求項５〜７のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を有効成分とする糖尿病、乾癬、前立腺肥大症、ＨＩＶ感染、骨粗鬆症、消化管障害、不妊症、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、腎臓疾患、精神疾患、および／または造血幹細胞移植治療時の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）もしくは移植片生着遅延の予防および／または治療薬。
【請求項９】
ハダカイワシの魚体および／または魚粉の全質量に対し、タンパク質分解酵素を０．１質量％〜１．２質量％添加し、３０〜８０℃、１〜２４時間分解することによるロイシン−アルギニン含有組成物の製造方法。
【請求項１０】
魚体および／または魚粉をタンパク質分解酵素で処理することにより、ロイシン−アルギニン含有量を増加させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハダカイワシ目ハダカイワシ科魚類由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤に関する。さらに本発明は、ＩＩ型糖尿病をはじめとする、ＤＰＰ−ＩＶが関与する状態及び疾患の予防及び／又は治療法に関する。また、医薬品、栄養補助食品、飲料又は食品を製造するための使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）は、ポリペプチド及びタンパク質のアミノ末端から、ジペプチドＸ−Ｐｒｏ又はＸ−Ａｌａ（Ｘは任意のアミノ酸残基）を特異的に加水分解するセリンアミノジペプチダーゼの一つであり、生体内の極めて広範な組織（腸管、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、胎盤、骨髄等の上皮及び内皮細胞）に分布し、様々な生体内反応に関与していると考えられている。その発現様式は、細胞膜貫通型として組織の細胞表面に発現するとともに、細胞膜貫通ドメインを欠く可溶性型としても体液（例えば、血清、血漿、脳脊髄液、関節液や精液等）にも存在する（非特許文献１、２）。
【０００３】
膵臓β細胞からのインスリン分泌及びインスリン抵抗性の障害により、適切な血糖値の調節ができなくなることによる慢性代謝疾患であるＩＩ型糖尿病の患者数は上昇の一途を辿っており、２０３０年には世界中の患者数は３億６千万人以上にのぼると推測されている（非特許文献３）。したがって、様々なアプローチから、ＩＩ型糖尿病に対する対策が検討されている。 
【０００４】
数あるアプローチの中で、腸管ホルモンであるインクレチン（たとえば、ＧＬＰ−１やＧＩＰ）がターゲット因子として注目されている。食事の摂取後、インクレチンは回腸から大腸に多く存在する消化管内分泌細胞（Ｌ細胞）より分泌され、膵臓β細胞からのインスリンの分泌を促進することにより、血糖値の急激な上昇を抑制する。しかしながら、インクレチンは迅速に分解されてしまうため、生体内における半減期は非常に短い（非特許文献４）。
【０００５】
ＤＰＰ−ＩＶはインクレチンを分解して不活性型に変換することが知られており、ＤＰＰ−ＩＶを阻害する物質は、インクレチンの体内半減期を延長することによる食後血糖値の急激な上昇を抑制し、ＩＩ型糖尿病の予防や治療に有効であると考えられている（非特許文献３）。
【０００６】
ＤＰＰ−ＩＶはＴ細胞活性化分子として知られるＣＤ２６と同一分子であり、種々の免疫反応、特に自己免疫疾患への関与が報告されている(たとえば、非特許文献３参照)。ＣＤ２６はＴ細胞の活性化とともに発現が上昇することが知られ、特に免疫記憶に重要な役割をしているメモリーＴ細胞やＴ  ｈｅｌｐｅｒ（Ｔｈ）１細胞においてその発現が高いことが報告されており、ＤＰＰ−ＩＶ（ＣＤ２６）を阻害する物質は、自己免疫疾患や臓器移植時に見られる拒絶反応の治療に有用であると考えられる（非特許文献５、６）。
【０００７】
ＤＰＰ−ＩＶ（ＣＤ２６）は癌細胞に高発現していることが知られている（たとえば、肺腺癌、甲状腺癌、白血病）。T細胞性リンパ腫細胞において、ＤＰＰ−ＩＶ（ＣＤ２６）が細胞接着及び腫瘍形成能を促進することにより、癌の進行を促進していることが報告されている（非特許文献７）。このことから、ＤＰＰ−ＩＶ（ＣＤ２６）を阻害する物質は癌の予防や治療に有用であると考えられる。
【０００８】
ＤＰＰ−ＩＶは、様々な神経ペプチド、ホルモン、成長因子、サイトカインやケモカイン等の代謝に関与し、これら因子の活性を変化させることにより、様々な疾患の発症や増悪に関与していると考えられている。たとえば、ＤＰＰ−ＩＶは、ケモカインＳＤＦ−１（Ｓｔｏｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ−１）のペプチド配列を切断することにより、その活性を消失させ、造血幹細胞及び造血前駆細胞の遊走や生存を負に調節していることが知られている（非特許文献８）。同様に、ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＥＰＯのペプチド配列を切断し、その活性を減弱させることにより、造血幹細胞及び造血前駆細胞の増殖や生存を負に調節していることも報告されており（非特許文献９）、ＤＰＰ−ＩＶを阻害する物質は、造血幹細胞の移植治療や癌治療での放射線化学療法時に見られる免疫力低下の改善に有用であると考えられる。
【０００９】
さらに、ＤＰＰ−ＩＶは、乾癬（非特許文献１０）、前立腺肥大症（非特許文献１１）、HIV感染（非特許文献１２）、骨粗鬆症（非特許文献１３）、消化管障害（非特許文献１４）、不妊症（特許文献１）、癌（非特許文献１５、１６）、炎症性疾患（非特許文献１７）、自己免疫疾患（非特許文献１８）、循環器疾患（非特許文献１９）、腎臓疾患（非特許文献２０）、精神疾患（非特許文献２１、２２）等の疾患との関連性が報告されていることから、ＤＰＰ−ＩＶを阻害する物質は、これら疾患の予防及び治療に有用であると考えられる。
【００１０】
ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用を有する化合物は幾つか提案されており、ビルダグリプチン（特許文献２）、シダグリプチン（特許文献３）及びアログリプチン（特許文献４）等は、医薬品として実用化されている。 しかしながら、これらは合成化合物であることから、安全性や副作用の面で十分であるとはいえない。そこで、医薬品や食品素材として使用でき、高い安全性を有し、長期間の日常摂取が可能な天然物由来成分の提供が強く望まれている。
【００１１】
そのような観点から、ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用を有するペプチドを含んだ食品タンパク加水分解物が提案されている。たとえば、チーズ水溶性画分（特許文献５）、コラーゲン及びゼラチン加水分解物（特許文献６、７）、乳タンパク質加水分解物（特許文献８、９）、米糠タンパク質加水分解物（特許文献１０）、トウモロコシタンパク質加水分解物（特許文献１１）、β-ラクトグロブリン加水分解物（特許文献１２）が挙げられる。しかしながら、これらの提案は、原料供給量や原料コストの面で十分とはいえない。
【００１２】
ハダカイワシはハダカイワシ目ハダカイワシ科（Ｍｙｃｔｏｐｈｉｆｏｒｍｅｓ，Ｍｙｃｔｏｐｈｉｄａｅ）に属する魚類の総称であり、３２属２４０種で構成される。体の表面に発光器を有することが特徴的である。世界中の海洋に分布し、沖合の中層から海底近くの深海に生息する。
【００１３】
豊富な資源量にもかかわらず、ハダカイワシ科魚類を対象とした漁業は世界中を通してほとんど行なわれていない。日本では、一部の地方では食用として小規模な消費が行なわれているものの、未利用水産資源の一つであると考えられ、その有効利用が期待されている。
【００１４】
ハダカイワシ科魚類の栄養価並びに健康機能性に関しては、イワハダカ（Ｂｅｎｔｈｏｓｅｍａ  ｐｔｅｒｏｔｕｍ）、センハダカ（Ｄｉａｐｈｕｓ  ｓｕｂｏｒｂｉｔａｌｉｓ）及びハダカイワシ（Ｄｉａｐｈｕｓ  ｗａｔａｓｅｉ）において、ＥＰＡやＤＨＡを豊富に含むことやイワハダカ魚体のタンパク加水分解物が抗酸化活性を有することが報告されているものの、その健康機能性に関する報告はほとんどなされていない（非特許文献２３、２４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２０００／０５６２９６号公報
【特許文献２】国際公開第２０００／３４２４１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００３／０４９９８号パンフレット
【特許文献４】特許第４０６８１１８号公報
【特許文献５】特許第４９１５８３３号公報
【特許文献６】特許第５１７６９６４号公報
【特許文献７】特許第５６１２１３１号公報
【特許文献８】特許第５０６８１７４号公報
【特許文献９】特開２０１３−１８４９６２号公報
【特許文献１０】特開２０１３−４０１１１号公報
【特許文献１１】特開２０１１−１８２７４２号公報
【特許文献１２】特開２０１１−１４４１６７号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】ＦＥＢＳ  Ｊ．２０１０  Ｍａｒ；２７７（５）：１１２６−１１４４
【非特許文献２】Ｂｌｏｏｄ．２０１３  Ｊｕｌ；１２２（２）：１６１−１６９
【非特許文献３】Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ．２０１４  Ｆｅｂ；７３（１）：３４−４６
【非特許文献４】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００７  Ｊａｎ；１１７（１）：２４−３２
【非特許文献５】Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．２００８  Ｊａｎ；１３：２２９９−２３１０
【非特許文献６】Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８  Ｊｕｎ；２９（６）：２９５−３０１
【非特許文献７】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  Ａｕｇ；６５（１５）：６９５０−６９５６
【非特許文献８】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；１６９：７０００−７００８
【非特許文献９】Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｄｅｃ；１８（１２）：１７８６−１７９６
【非特許文献１０】Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９２  Ｍａｙ；１５１（２）：３７８−３８５
【非特許文献１１】Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９２  Ｊｕｎ；３０（６）：３３３−３３８
【非特許文献１２】Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３  Ｄｅｃ；２６２（５１４２）：２０４５−２０５０
【非特許文献１３】Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．１９８８  Ｄｅｃ；３４（１２）：２４９９−２５０１
【非特許文献１４】Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２０００  Ｎｏｖ；１４１（１１）：４０１３−４０２０
【非特許文献１５】Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９９  Ｍａｒ；７９（７−８）：１０４２−１０４８
【非特許文献１６】Ｊ  Ａｎｄｏｌ．２０００  Ｍａｒ；２１（２）：２２０−２２６
【非特許文献１７】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１  Ｆｅｂ；１６６（３）：２０４１−２０４８
【非特許文献１８】Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９３  Ｊｕｌ；２６１（５１２０）：４６６−４６９
【非特許文献１９】Ｃｕｒｒ  Ｄｉａｂ  Ｒｅｐ．２０１４  Ｍａｒ；１４（５）：４８３
【非特許文献２０】Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２０１４  Ｊａｎ；２３（１）：５４−６０
【非特許文献２１】Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．２００７  Ｆｅｂ；２８（２）：２５７−２６８
【非特許文献２２】Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔ；５７（３）：４４３−４４９
【非特許文献２３】Ｊ  Ｏｌｅｏ  Ｓｃｉ．２０１４；６３（５）：４６１−４７０
【非特許文献２４】Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１２；４６：１１８−１２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ハダカイワシの新規な利用法および新規ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（１）魚体および／または魚粉をタンパク質分解酵素で処理して得られる組成物であって、ロイシン−アルギニンを１０μｇ／ｋｇ以上含有する組成物。
（２）前記魚体および／または魚粉がハダカイワシ由来である（１）の組成物。
（３）前記タンパク質分解酵素が中性プロテアーゼ、パパインもしくはエンド型プロテアーゼ／エキソ型プロテアーゼまたはそれらの混合物からなる群から選ばれる酵素である、（１）または（２）の組成物。
（４）ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性のIC50値（50%阻害濃度）が固形分濃度で１０mg/ml以下である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の組成物。
（５）（１）〜（４）のいずれか１に記載の組成物を有効成分とする、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤。
（６）ロイシン−アルギニンを有効成分とする、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤。
（７）ロイシン−アルギニンがハダカイワシ由来である、（５）または（６）のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤。
（８）（１）〜（４）の組成物または（５）〜（７）のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を有効成分とする糖尿病、乾癬、前立腺肥大症、HIV感染、骨粗鬆症、消化管障害、不妊症、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、腎臓疾患、精神疾患、および／または造血幹細胞移植治療時の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）もしくは移植片生着遅延の予防および／または治療薬。
（９）ハダカイワシの魚体および／または魚粉の全質量に対し、タンパク質分解酵素を０．１％〜１．２質量％添加し、３０℃〜８０℃、６０分〜２４時間分解することによるロイシン−アルギニン含有組成物の製造方法。
（１０）魚体および／または魚粉をタンパク質分解酵素で処理することにより、ロイシン−アルギニン含有量を増加させる方法。
【００１９】
（１１）ロイシン−アルギニンを用いてＤＰＰ−ＩＶを阻害する方法。
（１２）ロイシン−アルギニンを用いて糖尿病、乾癬、前立腺肥大症、HIV感染、骨粗鬆症、消化管障害、不妊症、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、腎臓疾患、精神疾患、および／または造血幹細胞移植治療時の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）もしくは移植片生着遅延を予防および／または治療する方法。
（１３）糖尿病治療薬を製造するための、（１）〜（４）の組成物、（５）〜（７）のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤またはロイシン−アルギニンの使用。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ハダカイワシの新規な利用法およびDDPIV阻害剤が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、各種酵素処理によるＤＤＰ−ＩＶの阻害活性を示す図である。
【図２】図２は、酵素濃度とＤＤＰ−ＩＶの阻害活性の関係を示す図である。
【図３】図３は、各種酵素の組合せ処理によるＤＤＰ−ＩＶの阻害活性を示す図である。
【図４】図４は、酵素処理の温度とｐＨがＤＤＰ−ＩＶの阻害活性に与える影響を示す図である。
【図５】図５は、酵素濃度、処理時間とＤＤＰ−ＩＶの阻害活性の関係を示す図である。
【図６】図６は、魚体内在性酵素またはサモアーゼを失活させた場合のＤＤＰ−ＩＶの阻害活性を示す図である。
【図７】図７は、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分画とそのＤＤＰ−ＩＶ活性の関係を示す図である。
【図８】図８はゲル濾過活性画分の逆相HPLCによる分画とその分画物のＤＤＰ−ＩＶ活性の関係を示す図である。
【図９】図９は逆相HPLCによる再分画とその分画物のＤＤＰ−ＩＶ活性を示す図である。
【図１０】図１０は、ＬＲのＤＤＰＩＶの阻害活性を示す図である。
【図１１】図１１は、イオンクロマトグラフィーによる保持時間と質量分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書において、「ハダカイワシ（裸鰯）」とは、ハダカイワシ目ハダカイワシ科に属する魚類の総称である。ハダカイワシ科に含まれるものとしては、メハダカ、ダイコクハダカ、タマハダカ、チギレハダカ、シロハナハダカ、スイトウハダカ、サガミハダカ、クマドリハダカ、ナミダハダカ、ハダカイワシ、フタツボシハダカ、ミホハダカ、エビスハダカ、チカメハダカ、トドハダカ、クロシオハダカ、コビトハダカ、オトメハダカ、ニラミハダカ、ガンテンハダカ、センハダカ、トックリハダカ、ホクロハダカ、マヨイハダカ、カンムリハダカ、ツノハダカ、アガリハダカ、チビハダカ、タカハダカ、ボウハダカ、ハナレハダカ、ツクシハダカ、ヒロハダカ、ソコハダカ、ホクトハダカ、イワハダカなどが挙げられる。本発明では、ハダカイワシ科を用いるが、好ましくはイワハダカとセンハダカを言う。
【００２３】
本発明は、魚体および／または魚粉（魚を粉砕した粉末）、好ましくはハダカイワシの魚体および／または魚粉をタンパク質分解酵素で分解することでＤＤＰ−ＩＶ阻害活性のある成分を増加させることを特徴とする。ここで、タンパク質分解酵素は、内在性のものをそのまま使用してもよく、外部からタンパク質分解酵素を含む組成物を添加して処理してもよい。本発明の「魚体および／または魚粉をタンパク質分解酵素で処理して得られる組成物」には、内在性のタンパク質分解酵素のみで処理したもの、内在性のタンパク質分解酵素に加えて外部から添加したタンパク質分解酵素の両方で処理したもの、内在性タンパク質分解酵素を失活させた後、外部からタンパク質分解酵素を含む組成物を添加して処理したものを全て含む。
【００２４】
本明細書において、「魚体」とは、生のまま、または、加熱、凍結もしくは乾燥などの処理を加えた魚の全身または一部をいい、例えば、生魚体、冷凍魚体、凍結乾燥魚体、茹でた魚体、煮た魚体、天日乾燥魚体および機械乾燥魚体ならびにそれらの一部などをいう。「魚粉」とは、魚体を粉末化したものをいう。粉末化は、乳鉢と乳棒、ワーリングブレンダー、ミル、カッターなどを用いて行うことができる。
【００２５】
本発明の組成物は、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を有する。本発明の組成物のＤＰＰ−ＩＶ阻害活性のＩＣ５０値（５０％阻害濃度）は、固形分濃度で１０ｍｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは５ｍｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは２ｍｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは１．２ｍｇ／ｍＬ以下、最も好ましくは０．６ｍｇ／ｍＬ以下である。なお、本明細書においてＤＰＰ−ＩＶをＤＰＰＩＶと表記する場合もあるが両者は同じものである。
【００２６】
インクレチンはインシュリンの分泌を促進し、グルカゴンの分泌を抑制することから食後の高血糖時に血糖を下げる働きがある。ＤＰＰ−ＩＶはインクレチンを分解するため、インクレチンは通常短時間で分解される。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤によりＤＰＰ−ＩＶを阻害することで、インクレチンの分解を抑制できるので、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は糖尿病治療薬、特にＩＩ型糖尿病治療薬として用いられている。
【００２７】
本発明の組成物および／またはロイシン−アルギニンは、ＤＰＰ−ＩＶを阻害する効果があるので、糖尿病治療薬として使用できる。
【００２８】
タンパク質分解酵素としては、好ましくは、中性プロテアーゼ、パパインもしくはエンド型プロテアーゼ／エキソ型プロテアーゼまたはそれらの混合物からなる群から選ばれる酵素があげられるがこれらに限られない。要はタンパク質を分解し、ロイシン−アルギニン含有量を増加できるタンパク質分解酵素であれば使用できる。
【００２９】
酵素使用量は各プロテアーゼの力価などにより一概に言えないが、３０，０００ユニット/ｇ以上のタンパク質分解活性を有していれば良い。
【００３０】
好ましい酵素の比活性は、精製パパイン４００，０００〜１，０００，０００ユニット、オリエンターゼ５Ｎ  ５０，０００ユニット／ｇ以上（ＣＦＡ法）、スミチームＬＰ  ５０，０００ユニット／ｇ以上、スミチームＦＰ  ５０，０００ユニット以上（ＣＦＡ法）、コクラーゼＰ  ４８，０００〜６２，０００ユニット／ｇ、アルカラーゼ  ２．４ＡＵ／ｇ以上、サモアーゼＰＣ１０Ｆ  ９０，０００ユニット／ｇ以上（フォリン法）、フレバーザイム  １，０００ＬＡＰＵ／ｇ以上（ロイシンアミノペプチダーゼ単位）である。
【００３１】
酵素処理は、例えば、魚体および／または魚粉全質量に対し、タンパク質分解酵素を０．１％〜１．２質量％添加し、３０℃〜８０℃、１〜２４時間処理することが好ましいがこれらに限られない。要は、ロイシン−アルギニン含有量が必要な濃度になるように酵素濃度、処理条件を決定すればよい。
【００３２】
魚体および／または魚粉をプロテアーゼ処理して得られる組成物中のロイシン−アルギニンの濃度としては、１０μｇ／ｋｇが好ましく、より好ましくは、１００μｇ／ｋｇ、さらに好ましくは５００μｇ／ｋｇ、よりさらに好ましくは１ｍｇ／ｋｇ、特に好ましくは３ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１０ｍｇ／ｋｇである。
【００３３】
ハダカイワシに元々含まれるプロテアーゼは失活させてもよく、失活させずにそのまま使用してもよい。
【００３４】
本発明の組成物は豊富な旨味と力強い味を特徴とする。そのため、個性を主張した食品の単独製品（単独食品）として利用できる。単独食品としては、例えば、ふりかけ、お茶漬けのり、だし、調味料、ベビーフード、飼料（ペットフードを含む）が挙げられる。
【００３５】
また、本発明の組成物は適度な素材感を持った自然な味と食感を有するため、他の食材と調和を保つ添加物として利用可能である。添加物としては、即席食品類としては、例えば、即席麺、カップ麺、即席スープ、即席味噌汁・吸い物、レトルト食品、調味缶詰（スープも含む）、電子レンジ食品等；冷凍食品類としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等；小麦粉食品類としては、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、お好み焼き粉、たこ焼き粉、から揚げ粉、ケーキミックス、パン粉等；水産及び畜産加工品類としては、例えば、水産缶詰め魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、つくだ煮類、畜産缶詰め、ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等；農産加工食品類としては、農産缶詰め、漬物、煮豆類、農産乾物類、穀物加工品等；基礎及び複合調味料類としては、例えば、しょうゆ、みそ、だし、ソース類、みりん類、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類等が挙げられるがこれらに限られない。
【００３６】
本発明が利用できる飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられるがこれらに限られない。
【００３７】
本発明が利用できる菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子等が挙げられるがこれらに限られない。
【００３８】
本発明の組成物は、飽きのこない、伸びと広がりを持ったおいしさが特徴である。
【００３９】
本発明の組成物は、風味を阻害しない限り、従来の食品添加剤が通常含有するような他の成分を任意の量にて含有していてもよい。他の成分としては、特に限定されないが、例えば、賦形剤が挙げられる。賦形剤としては、特に限定されないが、例えば、糖質および糖アルコールならびにガム類が挙げられる。糖質としては特に限定されないが、例えば、単糖類、オリゴ糖類、多糖類が挙げられる。単糖類としては、特に限定されないが、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、およびフルクトースが挙げられる。オリゴ糖類としては、特に限定されないが、例えば、乳糖、ショ糖、および麦芽糖が挙げられる。多糖類としては、特に限定されないが、例えば、デンプン、ペクチン、およびデキストリンが挙げられる。糖アルコールとしては、特に限定されないが、例えば、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、およびキシリトールが挙げられる。ガム類としては、特に限定されないが、例えば、グアーガムおよびキサンタンガムが挙げられる。本発明の食品添加剤において、これらの成分の含有量は、当業者により、任意の量が設定され得る。
【００４０】
本発明はまた、ロイシン−アルギニンを有効成分とする、ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤を提供する。ＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は上述のように糖尿病の予防・治療薬として使用できる。また、本発明のＤＰＰ−ＩＶ阻害剤は、糖尿病以外に、例えば、乾癬、前立腺肥大症、HIV感染、骨粗鬆症、消化管障害、不妊症、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、循環器疾患、腎臓疾患、精神疾患、および／または造血幹細胞移植治療時の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）もしくは移植片生着遅延の予防および／または治療剤としても使用できるがこれらに限られない。治療剤は医薬であってもよい。
【００４１】
本発明の製剤において、ロイシン−アルギニンの含有量は、製剤の形態によって相違するが、通常、製剤全体に対するロイシン−アルギニンの量として０．０００１質量％以上、好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．０１質量％以上程度である。上限は製剤化できる限り、１００質量％でもよく、より好ましくは９５質量％以下、さらに好ましくは９０質量％以下である。
【００４２】
投与量はロイシン−アルギニンの種類、投与ルート、症状、患者の年令などによっても異なるが、例えば、糖尿病の成人患者に経口的に投与する場合、1日当たり体重1kgあたりロイシン−アルギニンとして約０．３〜３００ｍｇ、さらに好ましくは約１〜１００ｍｇを１〜数回程度に分割投与できる。
【００４３】
本発明の組成物は、さらに、担体（結合剤、賦形剤、崩壊剤から選択された少なくとも１つの成分）を含有していてもよい。
【００４４】
賦形剤としては、例えば、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、エリスリトール、キシリトールなどの糖アルコール、乳糖、ブドウ糖、果糖、白糖、粉末還元麦芽糖水アメなどの糖類、結晶セルロース、粉末セルロース、デンプン類（バレイショデンプン、トウモロコシデンプンなど）、デキストリン、β−シクロデキストリン、カルメロースナトリウム、含水二酸化ケイ素、二酸化ケイ素、沈降性炭酸カルシウム、無水リン酸水素カルシウム、酸化マグネシウム、酸化チタン、乳酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト、タルク、カオリンなどが例示できる。賦形剤としては、糖類、結晶セルロース、デンプン類、無水リン酸水素カルシウムなどを用いる場合が多い。賦形剤の使用量は、活性成分及び吸着剤の全量１００質量部に対して、１〜１００質量部、好ましくは３〜７５質量部、さらに好ましくは５〜５０質量部程度であってもよい。なお、第１及び／又は第２の吸着剤を賦形剤として機能させることができるため、賦形剤は必ずしも必要ではない。そのため、賦形剤の使用量は、活性成分及び吸着剤の全量１００質量部に対して、０〜３０質量部、好ましくは３〜２０質量部（例えば、５〜１０質量部）程度であってもよい。
【００４５】
結合剤としては、例えば、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、ビニルピロリドン共重合体（コポリビドン）、アクリル酸系高分子、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、アルファー化デンプン、カンテン、トラガント、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、白糖などが例示できる。結合剤としては、セルロース誘導体（ＭＣ、ＨＰＣ、ＨＰＭＣなど）、ポビドンなどを用いる場合が多い。結合剤の使用量は、活性成分及び吸着剤の全量１００質量部に対して、１〜５０質量部、好ましくは３〜３０質量部、さらに好ましくは５〜２５質量部（例えば、５〜１５質量部）程度であってもよい。
【００４６】
崩壊剤としては、例えば、カルメロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム（カルメロースカルシウム）、クロスカルメロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ−ＨＰＣ）、クロスポビドン、デンプン類（トウモロコシデンプンなど）、ヒドロキシプロピルスターチ、部分アルファー化デンプン、アルギン酸、ベントナイトなどが例示できる。崩壊剤としては、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（Ｌ−ＨＰＣ）、クロスポビドン、デンプン類などを用いる場合が多い。崩壊剤の使用量は、活性成分及び吸着剤の全量１００質量部に対して、１〜３０質量部、好ましくは３〜２５質量部、さらに好ましくは５〜２０質量部（例えば、５〜１５質量部）程度であってもよい。
【００４７】
本発明の組成物は、他の担体又は添加剤、例えば、滑沢剤（ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、硬化油、ポリエチレングリコール、ジメチルポリシロキサン、ミツロウ、サラシミツロウなど）；抗酸化剤（ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、没食子酸プロピル、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェロール、クエン酸など）；保存剤（パラオキシ安息香酸エステル類など）；着色剤（ウコン抽出液、リボフラビン、カロチン液、タール色素、カラメル、酸化チタン、ベンガラなど）；界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタン脂肪酸エステル（モノステアリン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタンなど）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン、ポリソルベート類、ラウリル硫酸ナトリウム、マクロゴール類、ショ糖脂肪酸エステルなど）；流動化剤（ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、軽質無水ケイ酸、タルク、含水二酸化ケイ素など）；可塑剤（クエン酸トリエチル、ポリエチレングリコール、トリアセチン、セタノールなど）；甘味剤又は矯味剤（ショ糖、マンニトール、Ｄ−ソルビトール、キシリトール、アスパルテーム、アセスルファムカリウム、スクラロース、アスコルビン酸、ステビア、メントール、カンゾウ粗エキス、単シロップなど）；着香剤又は香料（メントール、ジンジャーオイルなど）；色素、清涼化剤、防腐剤又は保存剤、湿潤剤、帯電防止剤などが挙げられる。これらの担体又は添加剤は単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。
【００４８】
［剤形］
本発明の製剤（医薬組成物）の形態は特に制限されず、種々の固形製剤（経口固形製剤）、例えば、散剤、顆粒剤（細粒又は顆粒剤）、丸剤、錠剤、カプセル剤、チュアブル錠などであってもよい。前記組成物は、通常、造粒物（散剤、粒剤）又は錠剤の形態である場合が多く、粒剤には、細粒剤及び顆粒剤が含まれる。
【実施例】
【００４９】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら制限されるものではない。
【００５０】
（試験例１）
ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定は、以下の方法に従って行なった。９６ウェルブラックプレートの各ウェルに、サンプル溶液もしくは超純水を２０μｌ添加し、１００μｌの２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）と４０μｌの超純水を用いて全量を１６０μｌに調整した。その後、２０μｌの ｈｕｍａｎ  ＤＰＰ−ＩＶ溶液及び２０μｌの０．５ｍＭ  Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ（Ｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ  ４−ｍｅｔｈｙｌ  ｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅ）を添加し（全量２００μｌ）、撹拌しながら３７℃で１時間酵素反応を行なった。また、ｈｕｍａｎ  ＤＰＰ−ＩＶ溶液の代わりに超純水を添加したウェルを対照区とした。ＤＰＰ−ＩＶ酵素反応の測定は蛍光マイクロプレートリーダー（Ｆｌｅｘ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ＩＩ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を使用し、ＤＰＰ−ＩＶ酵素反応によって遊離するＡＭＣ（７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）量を測定した（励起波長は３６０ｎｍ、測定波長は４４０ｎｍ）。ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性は、サンプルの代わりに超純水を添加したウェルの活性を１００％とし、サンプルを添加したウェルの相対的な活性を算出した。
【００５１】
（実施例１）
イワハダカ及びセンハダカの魚体１００ｇに水２００ｍｌ及びスミチームＦＰ（新日本化学工業社製）、オリエンターゼ５Ｎ（ＨＢＩ  Ｅｎｚｙｍｅｓ社製）、精製パパインＦ（アサヒフード＆ヘルスケア社製）又はフレバーザイム（Ｎｏｂｏｚｙｍｅｓ社製）を０．３ｇ添加し、撹拌しながら５０℃で１、２又は３時間酵素処理をおこなった。その後、９０℃で５分間加熱して酵素を失活させた。得られた酵素分解物を１５分間遠心分離（１００００ｘｇ）することにより沈殿を除去した後、上清を珪藻土濾過（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ社製、Ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  ５Ｃ）することにより、不溶性物質を除去した濾過液を得た。この濾過液を凍結乾燥し、ハダカイワシ蛋白加水分解物の粉末を得た。この粉末を超純水に１０ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解し、試験例１の記載に従って、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定を行なった（サンプル最終濃度１ｍｇ／ｍｌ）。結果を図１に示す。イワハダカ及びセンハダカの魚肉蛋白加水分解物はいずれも良好なＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示した。また、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の強度は、酵素の種類や処理時間によって大きく変動しなかった。
【００５２】
（実施例２）
イワハダカの魚体５０ｇをそのまま凍結乾燥した後、小型食品粉砕機を用いて魚体粉末を得た。この粉末１２５ｍｇに水１ｍｌ及び蛋白分解酵素を０．３７５ｍｇ添加した。酵素分解には、スミチームＦＰ、オリエンターゼ５Ｎ、フレバーザイム、精製パパインＦ、スミチームＬＰ（新日本化学工業社製）、コクラーゼＰ（三菱化学フーズ社製）、アルカラーゼ（Ｎｏｂｏｅｎｚｙｍｅｓ社製）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（アマノエンザイム社製）を１種類もしくは２種類使用し、５５℃で一昼夜（１４時間）反応を行なった。その後、９０℃で５分間加熱して酵素を失活させた。得られた酵素分解物を１５分間遠心分離（１００００ｘｇ）することにより沈殿を除去し、不溶性物質を除去した液体を得た。この液体を凍結乾燥し、イワハダカ蛋白加水分解物の粉末を得た。この粉末を超純水に溶解し、試験例１の記載に従って、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定を行なった。結果を図２及び図３に示す。単独の酵素処理では、種類に関わらず良好なＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が見られ、その活性はサンプル濃度依存性であった（図２）。２種類の酵素組合せによる処理では、いずれの条件においてもＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が見られたが、阻害活性に対する処理酵素の相乗効果は見られなかった（図３）。
【００５３】
（実施例３）
実施例２の記載に従って、イワハダカの凍結乾燥魚体から粉末を得た。この粉末１．２５ｇに水２０ｍｌ及びサモアーゼＰＣ１０Ｆを３．７５ｇ加えた後、１Ｎ塩酸及び１Ｎ水酸化ナトリウムを用いてｐＨ（ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０）を調整した。これら混合溶液を一定温度条件下（３０℃〜８０℃）で２４時間酵素分解した。反応終了後、９０℃で５分間加熱し、酵素を失活させた。得られた酵素分解物に珪藻土を添加して撹拌後、１５分間遠心分離（５０００ｘｇ）することにより沈殿を除去し、不溶性物質を除去した液体を得た。この液体を凍結乾燥し、イワハダカ蛋白加水分解物の粉末を得た。この粉末を超純水に溶解し、試験例１の記載に従って、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定を行なった。結果を図４に示す。溶液のｐＨ及び温度に関して、いずれの条件においてもＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が見られた。特に、低いｐＨかつ高い温度域（例えばｐＨ５．０において７０℃処理）で分解されたサンプルにおいて、強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が見られた。
【００５４】
（実施例４）
実施例２の記載に従って、イワハダカの凍結乾燥魚体から得た粉末１０ｇに水２００ｍｌを加えた後、１Ｎ塩酸を用いてｐＨ５．０に調整した。この溶液にサモアーゼＰＣ１０Ｆを原料に対する最終濃度０％〜１．２％の範囲で添加し、７０℃の温度で撹拌しながら酵素分解を行なった。反応時間は０時間〜２４時間の範囲で行なった。反応後、９０℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。得られた酵素分解物に珪藻土を添加して撹拌後、１５分間遠心分離（５０００ｘｇ）することにより沈殿を除去し、不溶性物質を除去した液体を得た。この液体を凍結乾燥し、イワハダカ蛋白加水分解物の粉末を得た。この粉末を超純水に溶解し、試験例１の記載に従って、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定を行なった。結果を図５に示す。酵素濃度及び反応時間に依存してＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が強い分解物が得られることがわかった。
【００５５】
（実施例５）
イワハダカ魚体を９０℃で３０分間加熱することにより、魚体に含まれる内在性蛋白分解酵素を失活させた。その後、実施例２の記載に従って、イワハダカ魚体を凍結乾燥した後、小型食品粉砕機を用いて魚体粉末を得た。比較対照として、加熱処理による酵素失活を行なわないサンプルも用意した。この粉末１０gに水を２００ｍｌ加えた後、１Ｎ塩酸を用いてｐＨ５．０に調整した。この溶液にサモアーゼＰＣ１０Ｆを０．０３ｇ添加した。比較対照として、サモアーゼＰＣ１０Ｆを添加しないサンプルも用意した。７０℃で撹拌を行いながら２４時間反応させた。反応後、９０℃で１５分間加熱し、酵素を失活させた。得られた酵素分解物を１５分間遠心分離（１００００ｘｇ）することにより沈殿を除去した後、上清を珪藻土濾過することにより、不溶性物質を除去した濾過液を得た。得られた濾過液を凍結乾燥することにより粉末化した。この粉末を超純水に溶解し、試験例１の記載に従って、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性の測定を行なった。結果を図６に示す。魚体に含まれる内在性蛋白分解酵素の失活の有無については、失活有りのサンプルでは非常に弱いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が見られたのに対し、失活無しのサンプルではその活性が顕著に増強されたことから、蛋白質の分解産物であるペプチドがＤＰＰ−ＩＶ阻害活性に重要であることが推測された。一方、魚体に含まれる内在性蛋白分解酵素の失活の有無に関わらず、サモアーゼＰＣ１０Ｆによる蛋白質分処理されたサンプルは、顕著なＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示した。
【００５６】
（実施例６）
ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性成分を同定するために、実施例２のイワハダカ魚肉蛋白加水分解物をゲル濾過分画した。イワハダカ魚肉蛋白加水分解物３ｇを１０ｍｌの０．１Ｍ酢酸に溶解し、０．２μｍフィルターで処理した後、その１ｍｌをゲル濾過カラムに注入した。分画にはＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、カラムはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５  Ｍｅｄｉｕｍカラム（Φ１．６ｘ７０ｃｍ）を２５℃で使用した。移動相には０．１M酢酸を用いて０．３ｍｌ／ｍｉｎの流速で分画を行い、検出はＵＶ２１４ｎｍ及びＵＶ２８０ｎｍで検出した。注入後、１００〜６５０分の間を１０分間隔で溶出液を分取した。それぞれのサンプルを遠心エバポレーター（ＥＣ‐２０００；Ｓａｋｕｍａ）で乾固した後、２００μｌの超純水に再溶解し、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を試験した。結果を図７に示す。すべてのサンプルに広く阻害活性が見られたが、一部のフラクションで特に活性が強かった。このようにして、活性成分を分画することも可能である。
【００５７】
（実施例７）
実施例６で得られたゲル濾過フラクションの中で、顕著なＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示したＦｒａｃｔｉｏｎ２０（２５μｌ）とＦｒａｃｔｉｏｎ２１（２５μｌ）を１：１の割合で混合した後、０．４５μｍフィルター処理し、その全量（５０μｌ）をカラムに注入した。カラムはＪＵＰＩＴＥＲ  Ｐｒｏｔｅｏ９０Ａ  ４．６＊２５０ｍｍ（フェノメネクス社）を４０℃で使用した。溶出は０→８０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ）／１００分のグラジエントで、１ｍｌ／ｍｉｎの流速で行なった。検出はＵＶ２１４ｎｍで検出した。サンプルは１分間隔で分取した。遠心エバポレーターで乾固した後、５０μｌの超純水に再溶解し、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を試験した。結果を図８に示す。すべてのサンプルに広く阻害活性が見られたが、一部のフラクションで特に活性が強かった。このようにして、活性成分を詳細に分画することも可能である。
【００５８】
（実施例８）
実施例７で得られた逆相ＨＰＬＣフラクションの中で、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性が強かったフラクション（Ｆｒａｃｔｉｏｎ１９）をさらに精製し、各フラクションについてＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を試験した。その結果、強いＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を持った精製フラクションを得た（図９）。このサンプルについてマススペクトル（ＭＳ）による解析を行なった結果、ジペプチドＬｅｕｃｉｎｅ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ（ＬＲ）が同定された（図１１）。
【００５９】
（実施例９）
ＭＳで推定されたジペプチドＬＲを合成し、蒸留水に溶解したものについて、試験例１の記載に従って、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を試験した。比較対照として、ＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示さないことが知られているＡｌａｎｉｎｅ−Ａｌａｎｉｎｅ（ＡＡ）及びＡｒｇｉｎｉｎｅ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ（ＲＩ）についても試験した。結果を図１０に示す。ＬＲは濃度に依存してＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示した。一方、ＡＡ及びＲＩは同濃度域でＤＰＰ−ＩＶ阻害活性を示さなかった。このように、ＬＲはハダカイワシ魚肉加水分解物が有するＤＰＰ−ＩＶ阻害活性における有効成分の一つであることがわかる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2016175862.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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