(57)【要約】【課題】物質の歯肉粘膜上皮透過量の測定及び透過した物質の有効性評価を同時かつ簡便に行うことができる経粘膜吸収評価装置及びその評価方法を提供すること。【解決手段】歯肉粘膜上皮等価物と線維芽細胞を組み合わせた共培養装置を用いることにより、物質の粘膜累積透過量の測定と透過した物質が線維芽細胞に作用して得られる有効性評価を同時かつ簡便に行うことができることを見出し、口腔化粧品、医薬部外品及び医薬品の歯肉組織に対する有効性を評価できる装置の完成に至った。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯肉粘膜上皮等価物と評価対象細胞とを用いて、物質の粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うことができることを特徴とする経粘膜吸収評価装置。
【請求項２】
前記歯肉粘膜上皮等価物が、培養粘膜であることを特徴とする請求項１に記載の経粘膜吸収評価装置。
【請求項３】
前記歯肉粘膜上皮等価物が、再構成粘膜であることを特徴とする請求項１又は２に記載の経粘膜吸収評価装置。
【請求項４】
前記評価対象細胞が、線維芽細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の経粘膜吸収評価装置。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の経粘膜吸収評価装置を使用して、歯肉粘膜上皮等価物の経粘膜透過量の測定と、歯肉粘膜上皮等価物及び／又は前記評価対象細胞からのコラーゲン産生量、ヒアルロン酸産生量、各種サイトカイン産生量、各種分泌酵素およびタンパク質量及び／又は活性から選択される１種又は２種以上の測定とを同時に行うことを特徴とする評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、物質の歯肉粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うことができることを特徴とする経粘膜吸収評価装置及びその評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、物質の経粘膜吸収は、動物からの摘出組織などを利用して透過した物質量を測定するものであった。一方、物質の有効性評価は、細胞に直接物質を暴露させてその生理活性を評価してきた。そのため、歯肉粘膜に吸収された物質が、実際に標的とする細胞までどのくらい送達されるのか、そして、送達された物質が本当に有効性を示すのかを同時に評価する方法はなく、間接的に考察するのみであった。
【０００３】
ところで、共培養物を利用した技術及び評価方法としては、動物細胞の培養構築物として、賦活化する物質をスクリーニングすること等に応用できる共培養物に関する技術（特許文献１）が報告されている。また、皮膚を対象として、物質の有効性や安全性を容易に試験するための装置として、再構成組織のサンプルと、物理的、生物学的及び／又は化学的刺激がサンプルに与える影響、又はサンプルが物理的、生物学的及び／又は化学的刺激に与える影響を検出システムと関連づけた装置や（特許文献２）、再構成皮膚と、評価対象細胞とを用い、物質の皮膚透過量と透過した物質の効果を同時に測定できることを特徴とする経皮吸収評価装置（特許文献３）の報告はされているが、これらの対象は、皮膚であり、歯肉粘膜を対象としていない。
【０００４】
歯肉粘膜上皮等価物を利用し、物質の有効性を容易に試験するための装置として、物質の歯肉粘膜透過量と透過した物質の有効性の評価を同時に測定できることを特徴とする経粘膜吸収評価装置及びその評価方法についての報告は、これまでにない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−１１９０１０号公報
【特許文献２】特表２００８−５２０１９９号公報
【特許文献３】特開２０１１−２００２２４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述の通り、従来、物質の歯肉粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うことができることを特徴とする経粘膜吸収評価装置及びその評価方法については知られていない。従って、新規の物質の歯肉粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時かつ簡便に行うことができる経粘膜吸収評価装置及びその評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、物質の歯肉粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うことができることを特徴とする経粘膜吸収評価装置及びその評価方法について鋭意研究した結果、歯肉粘膜上皮等価物と、評価対象細胞とを用いた装置、より好ましくは歯肉粘膜上皮等価物として培養粘膜と評価対象細胞とを共培養した装置を用いることにより、物質の歯肉粘膜透過量と透過した物質の有効性の評価を同時に測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【０００８】
従来、物質の歯肉粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うには困難があったが、本発明に記載の経粘膜吸収評価装置を用いることにより、簡便かつ迅速に、物質の歯肉粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うことができる。従って、物質及び／又は物質を含む外用組成物がもつ、歯肉粘膜に対する効果を直接的に測定できることから、実際に歯肉粘膜に塗布して有効に作用する物質及び／又は物質を含む外用組成物の開発を効率よく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明に係る、経粘膜吸収評価装置である。
【図２】本発明の実施例１に係る経粘膜吸収評価装置（セッティング）の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の構成を更に詳細に説明する。
本発明に係わる経粘膜吸収評価装置は、歯肉粘膜上皮等価物と、評価対象細胞とを用いるものである。本発明に係わる経粘膜吸収評価装置は、物質の粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うことができる。
【００１１】
本発明で用いる歯肉粘膜上皮等価物としては、培養再構成歯肉粘膜ＨＧＥ再生ヒト粘膜モデルを用いるのが望ましい。なお、種類の異なる単層培養細胞を共培養するためには、培地の最適化やｐＨの選定など非常に煩雑な作業を要するが、再構成歯肉粘膜を用いることで簡便に評価対象細胞との安定かつ効率的に共培養物を作成することができる。
【００１２】
評価対象細胞としては、線維芽細胞、脂肪細胞、血管内皮細胞などが挙げられる。これらは、有効性の評価目的によって適宜選択されるべきであり、本発明においては線維芽細胞が好ましい。評価対象細胞として線維芽細胞を用いた場合、経粘膜吸収した物質が線維芽細胞におけるコラーゲン産生作用、ヒアルロン酸産生作用、エラスチン産生作用、細胞増殖促進及び／又は抑制作用、各種サイトカイン産生促進及び／又は抑制作用の評価、フィブリリン産生作用、コラーゲナーゼ活性及び／又は産生阻害などの評価をおこなうことができる。各種サイトカインとしては、特に限定されるものではないが、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＦＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、エイコサノイド、ＳＣＦ、ＭＣＰ及びＣＳＦなどが挙げられる。これらの評価をすることで、抗炎症作用、抗老化作用などの有効性を評価することができる。
【００１３】
評価対象となる物質は、主に口腔化粧品、医薬部外品及び／又は医薬品に利用できる成分を対象とし、そのまま歯肉粘膜上皮等価物に塗布することもできるし、水、油性成分、各種溶媒などに溶解又は分散物として、更に乳化製剤として適用することもできる。また、口腔化粧品、医薬部外品、医薬品製剤などを塗布することができる。
【００１４】
口腔化粧品及び／又は医薬品に利用できる成分のうち、生理活性成分としては、アスコルビン酸、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、テトライソパルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、トラネキサム酸及びその誘導体、エラグ酸、ルシノール、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アミノ酸、糖類、ムコ多糖、セラミド、ステロール及びその誘導体、リン脂質及びそれらの誘導体、レチノール及びそれらの誘導体、ビタミンＡ酸およびそれらの誘導体、トコトリエノール、ユビキノン、アロエ、オウゴン、各種ビタミン類やその誘導体、トコフェロール、酢酸トコフェロール、ＳＯＤ、β−カロテン、カテキン、ポリフェノール、カフェイン、カカオ、セイヨウキズタ、ビスナジンなどのスリミング剤、カモミラ、シソ、カルニチン、リン脂質及びそれらの誘導体、機能性多糖などが挙げられる。
【００１５】
また、生理活性成分などがより効率的に経粘膜吸収され、有効性がより発現される口腔化粧品又は医薬品の剤型を検討するための方法としても利用できるため、口腔化粧品又は医薬品の処方設計の検討に利用すると非常に効率的にそれらの開発を進めることができる。
【００１６】
物質の歯肉粘膜上皮透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うには、図１の培地をサンプリングすればよい。物質の粘膜透過量は例えば、高速液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーを用いて定量することができ、透過した物質の有効性の評価は、例えば評価対象細胞として線維芽細胞を用いてコラーゲン産生促進作用を評価する場合は、ＥＬＩＳＡ法により、また、コラーゲナーゼ活性作用を評価する場合は、擬似基質を用いた活性測定法により評価することができる。
【００１７】
図１は、歯肉粘膜上皮等価物と、評価対象細胞とを用いることを特徴とする、物質の粘膜透過量の測定と透過した物質の有効性評価を同時に行うことができることを特徴とする経粘膜吸収評価装置である。
本経粘膜吸収評価装置は、歯肉粘膜上皮等価物３を支持するバスケット２を収容するウェル１を含む。ウェル１が配置されるバスケット２は、ウェル１を着脱可能に固定できてもよい。バスケット２は歯肉粘膜上皮等価物３を支持する底壁７を含む。底壁７は貫通穴８を有する。また、バスケット２に、底膜７を固定するためのインサート９を有するものもある。バスケットという用語は制限的な意味で使用するものではなく、ウェル１内に配置された任意の支持体を含む。
【００１８】
ウェル１は、複数（例えば１２個）のウェルを有するプレートの一部を固定することができる。ウェル２には、溶液５（例えば、培地など）が充填されている。
歯肉粘膜上皮等価物３は、例えば前述の培養粘膜などである。
評価対象細胞４は、前述の線維芽細胞である。
評価対象となる物質６は、例えば口腔化粧品、医薬部外品及び／又は医薬品に利用できる成分、それを含む溶液、溶解又は分散物、乳化製剤、また、化粧品、オーラルケア製品、医薬品製剤などである。
歯肉粘膜上皮等価物は、例えば、０．２〜５ｃｍ２の範囲の面積を有する。
【００１９】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００２０】
リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウムを含有する溶液による、経粘膜吸収性を加味した線維芽細胞のＩ型コラーゲン産生作用
１．試験の概要
リン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウム（以下、ＶＣＰＭｇ）溶液適用後のＶＣＰＭｇの歯肉粘膜上皮等価物に対する累積透過量及び組織中量、線維芽細胞共培養における透過ＶＣＰＭｇによるＩ型コラーゲン産生量を、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法及びＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００２１】
２．実験方法
経粘膜吸収試験の前日に線維芽細胞を播種し、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製、歯肉粘膜上皮等価物）をプレインキュベーションした。試験当日ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥと線維芽細胞を細胞維持培地で共培養し、試料を適用した。図２は、経粘膜吸収試験のセッティングである（歯肉粘膜等価物３はＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥ、評価対象細胞４は線維芽細胞、評価対象となる物質６はＶＣＰＭｇ溶液）。ＶＣＰＭｇ溶液適用後、４８時間までインキュベーションし、経時的にＶＣＰＭｇ累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、４８時間後にＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥをホモジナイズし、ＶＣＰＭｇの歯肉粘膜上皮における組織中量をＨＰＬＣにて測定した。また、共培養した培地を採取し、培養液中のＩ型コラーゲン産生量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
【００２２】
３．結果
ＶＣＰＭｇのＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥ累積透過量を表１に、４８時間後の組織中量を表２に、共培養によるＩ型コラーゲン産生量を表３に示した。ＶＣＰＭｇ累積透過量は、適用した濃度および時間依存的に増加した。４８時間後のＶＣＰＭｇ組織中量および共培養培地中のコラーゲン産生量は、ＶＣＰＭｇの濃度依存的に増加した。
本結果より、本経粘膜吸収評価装置は、物質の粘膜透過量及び透過した物質が評価対象細胞である線維芽細胞に作用してＩ型コラーゲン産生量を増加する効果を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【実施例２】
【００２３】
グリチルリチン酸２カリウムを含有する溶液による、経粘膜吸収性を加味したサイトカイン産生抑制作用
１．試験の概要
ドデシル硫酸ナトリウム（以下、ＳＤＳ）による炎症惹起処理した歯肉粘膜上皮等価物を用いた、グリチルリチン酸２カリウム（以下、ＧＫ２）溶液適用後のＧＫ２の歯肉粘膜上皮等価物に対する累積透過量及び組織中量、線維芽細胞共培養における透過ＧＫ２によるインターロイキン−１アルファ（ＩＬ−１α）産生量を、それぞれ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）測定法及びＥＬＩＳＡ法にて測定した。
【００２４】
２．実験方法
経粘膜吸収試験の前日に線維芽細胞を播種し、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製、歯肉粘膜上皮等価物）をプレインキュベーションした。試験当日ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥにＳＤＳを１時間適用することで炎症を惹起した。その後ＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥと線維芽細胞を細胞維持培地で共培養し、試料を適用した。図２は、経粘膜吸収試験のセッティングである（歯肉粘膜等価物３はＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥ、評価対象細胞４は線維芽細胞、評価対象となる物質６はＧＫ２溶液）。ＧＫ２溶液適用後、２４時間までインキュベーションし、経時的にＧＫ２累積透過量をＨＰＬＣにて測定した。また、２４時間後にＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥをホモジナイズし、ＧＫ２の歯肉粘膜上皮における組織中量をＨＰＬＣにて測定した。また、共培養した培地を採取し、培養液中のＩＬ−１α産生量をＥＬＩＳＡ法にて測定した。コントロールとして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。
【００２５】
３．結果
ＧＫ２のＳｋｉｎＥｔｈｉｃＴＭ  ＨＧＥ累積透過量を表４に、２４時間後の組織中量を表５に、ＩＬ−１α産生量を表６に示した。ＧＫ２累積透過量は、適用した濃度および時間依存的に増加した。２４時間後のＧＫ２組織中量は適用した濃度依存的に増加した。ＳＤＳによる炎症惹起で増加した共培養培地中のＩＬ−１α産生量は、ＧＫ２の濃度依存的に減少した。
本結果より、本経粘膜吸収評価装置は、物質の粘膜透過量及び透過した物質が評価対象細胞に作用してＩＬ−１α産生量を指標とした抗炎症作用を同時にかつ簡便に評価できることが明らかとなった。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【符号の説明】
【００２６】
１  ウェル
２  バスケット
３  歯肉粘膜上皮等価物
４  評価対象細胞
５  溶液
６  物質
７  底壁
８  貫通穴
９  インサート
【図１】
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【図２】
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