(57)【要約】      （修正有）【課題】より長い生体内寿命を有し、分析すべき組織に十分な濃度、および副作用を避ける低い残存ガドリニウム濃度を与える改善された造影剤の提供。【解決手段】金属イオンを発現する脂質ナノ粒子、および脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤を含む組成物組成物を磁気共鳴イメージングに用いる方法。【選択図】図１０
2016094425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）脂質と、
（ｂ）ポリアルキレン含有脂質と、
（ｃ）脂質含有金属キレート化剤とを含む組成物。
【請求項２】
前記脂質は、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールおよびステロイド誘導体、胆汁酸および誘導体、カルジオリピン、アシル−グリセリドおよび誘導体、糖脂質、アシル−ペプチド、脂肪酸、炭水化物系ポリマー、官能基化シリカ、ポリ無水物ポリマー、ポリラクテート−グリコレートポリマー，およびバイオポリマーからなる群より選択される請求項１の組成物。
【請求項３】
前記脂質はリン脂質である、請求項１の組成物。
【請求項４】
前記リン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；ジパルミトイル  ホスファチジルコリン；ジミリストイル  ホスファチジルコリン；ジオレオイル  ホスファチジルコリン；卵、大豆，亜麻仁などから誘導されたエステル交換リン脂質；およびホスファチジル  エタノールアミンで置換されたホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル  セリン、およびホスファチジン酸からなる群より選択される、請求項３の組成物。
【請求項５】
前記ポリアルキレン含有脂質はポリオキシエチレン含有脂質およびポリオキシプロピレン含有脂質からなる群より選択される、請求項１の組成物。
【請求項６】
前記ポリアルキレン含有脂質がポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質である、請求項１の組成物。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質は、約５００ないし約２０，０００の数平均分子量を有するポリエチレングリコールを含む、請求項６の組成物。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）である、請求項７の組成物。
【請求項９】
前記脂質含有金属キレート化剤は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミンペンタアセチル（ＤＳＰＥ−ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン、テトラアセチル（ガドジアミド）−ＰＥ、脂質官能基化［Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチル］−グリシナト−（５”）］からなる群より選択される、請求項１の組成物。
【請求項１０】
前記脂質含有金属キレート化剤はＰＥＧ化された脂質部分を含む、請求項１の組成物。
【請求項１１】
前記脂質含有金属キレート化剤はＰＥＧ化されたＤＴＰＡである、請求項１の組成物。
【請求項１２】
前記脂質含有金属キレート化剤はＤＳＰＥ−ＢＯＰＴＡ、ＤＳＰＥ−ＤＯ３Ａ、およびＤＳＰＥ−ＤＯＴＡからなる群より選択される、請求項１の組成物。
【請求項１３】
前記ポリアルキレン含有脂質は、脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤の約５ないし約５０モルパーセント存在する、請求項１の組成物。
【請求項１４】
前記脂質含有金属キレート化剤は、脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤の約５ないし約５０モルパーセント存在する、請求項１の組成物。
【請求項１５】
さらにターゲティング成分を含む、請求項１−１４のいずれか１項の組成物。
【請求項１６】
前記ターゲティング成分は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはこれらのフラグメント、小分子、糖もしくは多糖またはこれらの誘導体、および核酸からなる群より選択される、請求項１５の組成物。
【請求項１７】
前記ターゲティング成分は癌細胞またはウイルス感染細胞を標的にする、請求項１５の組成物。
【請求項１８】
ナノ粒子の形態にある、請求項１−１７のいずれか１項の組成物。
【請求項１９】
前記ナノ粒子は約５ｎｍないし約２μｍの直径を有する、請求項１８の組成物。
【請求項２０】
前記ナノ粒子は約５０ｎｍないし約１００μｍの直径を有する、請求項１８の組成物。
【請求項２１】
さらにキレート化された金属イオンを含む、請求項１−２０のいずれか１項の組成物。
【請求項２２】
キレート化された金属イオン：金属キレート化剤の比が０．１−１．０：１．０である、請求項２１の組成物。
【請求項２３】
前記キレート化された金属イオンは常磁性金属イオンである、請求項２１または２２の組成物。
【請求項２４】
前記常磁性金属イオンはＧｄ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋、およびＭｎ２＋からなる群より選択される、請求項２３の組成物。
【請求項２５】
前記キレート化された金属イオンは放射性同位元素のイオンである、請求項２１または２２の組成物。
【請求項２６】
前記放射性同位元素のイオンは６８Ｇａ、５５Ｃｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、および１１１Ｉｎのイオンからなる群より選択される、請求項２５の組成物。
【請求項２７】
キャリアと、請求項１８の複数のナノ粒子とを含む組成物。
【請求項２８】
前記キャリアは薬学的に許容できるキャリアである、請求項２７の組成物。
【請求項２９】
前記キャリアは注射用生理的食塩水または注射用ブドウ糖である、請求項２７の組成物。
【請求項３０】
イメージ化される被験者に有効量の請求項２１−２９のいずれか１項の組成物を投与することを含む、組織をイメージ化する方法。
【請求項３１】
前記組成物を皮下に投与する、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記組成物を静脈内に投与する、請求項３０の方法。
【請求項３３】
前記組織はリンパ球、心血管、肝臓、腎臓、脳、心臓、筋肉、および胃腸管組織、ならびにリンパ系または脈管（血液）系によって到達できる他の組織からなる群より選択される、請求項３０の方法。
【請求項３４】
前記有効量は約０．００１ないし約５ｍｍｏｌ金属／ｋｇ被験者である、請求項３０の方法。
【請求項３５】
前記有効量は約０．００５ないし約０．０５０ｍｍｏｌ常磁性金属／ｋｇ被験者である、請求項３０の方法。
【請求項３６】
前記有効量は約０．０１ｍｍｏｌ常磁性金属／ｋｇ被験者である、請求項３０の方法。
【請求項３７】
癌細胞に有効量の請求項２５または２６の組成物を投与することを含む、癌細胞に放射線癌治療薬剤を配送する方法。
【請求項３８】
前記組成物を皮下に投与する、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記組成物を静脈内に投与する、請求項３７の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は２００９年２月１３日に出願された米国仮出願第６１／１５２，４５９号、および２００９年３月２４日に出願された米国仮出願第６１／１６２，９８９号の利益を主張する。各出願は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府のライセンス権の陳述
この発明は、国立衛生研究所／国立アレルギー・感染症研究所によって授与された契約第ＡＩ  ５２６６３号の下で政府の支援を使ってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の背景
リンパ節転移の早期診断はほとんどの種類の癌に対する処置を決定するために必須である。リンパ節切除および組織学評価は現在ゴールドスタンダードであるが、侵襲性で偽陰性を生じることがあるため理想的なわけではない。磁気共鳴（ＭＲ）イメージングは、リンパ節への癌の伝播を検出するための強力で非侵襲性のツールになってきている。標準的なＭＲイメージングはサイズおよび形態の基準に頼ってリンパ節転移を含む潜伏リンパ球組織を決定しているが、これは６０％程度の低い精度である。ＭＲコントラスト増強剤は、早期腫瘍検出でのそれらの有用性により、より広範に使用されるようになってきている。コントラスト増強剤は、転移リンパ節および健全リンパ節中へ異なる速度で拡散して「陰影欠損」を生じさせる。造影剤による陰影欠損を用いてリンパ節転移を予測することは、サイズ基準と対照的に、感度を２９％から９３％へ増加させる。
【０００４】
一般的に、２種のＭＲコントラスト増強剤がある。超常磁性造影剤は低いｒ２／ｒ１比を有し、Ｔ２−およびＴ２＊−強調イメージ中に暗点を作る。これらは通常、酸化鉄粒子をベースにしており、陰性造影剤と呼ばれる。他方、常磁性造影剤はｒ１緩和能を増加させ、高いｒ２／ｒ１比を有し、Ｔ１強調ＭＲイメージ中に明点を作る。これらの造影剤は陽性造影剤として知られ、通常はガドリニウム（Ｇｄ３＋）の錯体である。
【０００５】
Ｔ１短縮は水中のプロトンとの双極子−双極子相互作用によって起こるので、その７個の不対電子をもつＧｄ３＋はＴ１緩和剤に最適な選択肢である。Ｇｄ３＋は重金属毒素であるため、これは通常、強固に結合した直鎖またはマクロなキレートとして配送される。キレート化された形態のＧｄ３＋は、遊離Ｇｄ３＋の細胞取り込みを防止することによって、および腎毒性をもたらす腎臓ろ過に対するクリアランスをほとんど排他的に限定することによって毒性を減少させる。毒性を減少させるにもかかわらず、ガドリニウムキレートの急速なクリアランスおよび小さい分子サイズは低レベルＧｄ３＋がリンパ節中に蓄積することを意味し、これらの薬剤をＭＲリンパ管造影法に対する悪い選択肢にする。加えて、ＦＤＡは、急性または慢性の腎不全をもつ被験者の良好に灌流した組織および器官を同定する、すべての市販されているガドリニウム造影剤について、重篤な腎性全身性線維症の危険性についての警告を公表している。
【０００６】
Ｇｄ３＋を含むリポソームおよび脂質ナノ粒子はリンパ節のＭＲコントラストイメージングにとっていくつかの利点を有する。リポソームならびに脂質ナノ粒子は多量のＧｄ３＋を封入するかまたはそれらの表面に結合することによって毒性を低下させることができる。しかし、静脈内（ＩＶ）投与されたリポソームの急速クリアランスメカニズムは、リンパ節中のリポソーム会合Ｇｄ３＋の蓄積をそれほど改善するわけではない。血液中の一部の脂質ナノ粒子のみが細網内皮細胞によって貪食され、これらの細胞の一部のみがリンパ系へ移動する。したがって、ＩＶ投与されたリポソームはリンパ系およびリンパ節の間接ターゲティングを与える。しかし、この手法はＧｄ３＋担持リポソームの大部分が血液中の細網内皮細胞によって除去されることをもたらす。サイズおよび表面修飾によってリンパ節蓄積に対して血液中のリポソームの薬物動態学を最適化できる。リポソームの直径を２００ｎｍ未満に減少させると、食細胞依存クリアランスを減少させ、血液中の循環時間を増加させる。また、リポソーム表面にポリエチレングリコールを付加すること（ＰＥＧ、通常、ＰＥＧ化という）は循環時間およびリポソームの安定性を増加させることができる。
【０００７】
現在、ジエチレントリアミンペンタアセチル（ＤＴＰＡ）でキレート化されたガドリニウムは、磁気共鳴イメージングにおいてコントラストを与えて病原組織を同定する。都合の悪いことに、臨床用途のために承認された可溶なＧｄ−ＤＴＰＡ錯体（たとえばＯＭＮＩＳＣＡＮ）は数分以内に取り除かれ、リンパ球組織における十分な濃度または時間を与えない。加えて、残りの部分のガドリニウムは腎不全患者に線維症をもたらすことがある。
【０００８】
造影剤の開発の進展にもかかわらず、より長い生体内寿命を有し、分析すべき組織に十分な濃度、および副作用を避ける低い残存ガドリニウム濃度を与える改善された造影剤に対する要望がある。本発明はこの要望を実現し、さらに関連する利点を与えることを追求する。
【０００９】
発明の概要
本発明は金属イオンを発現する組成物およびこの組成物の使用方法を提供する。
【００１０】
一態様において、本発明は脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤を含む組成物を提供する。
【００１１】
代表的な脂質はリン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールおよびステロイド誘導体、胆汁酸および誘導体、カルジオリピン、アシル−グリセリドおよび誘導体、糖脂質、アシル−ペプチド、脂肪酸、炭水化物系 ポリマー、官能基化シリカ、ポリ無水物 ポリマー、ポリラクテート−グリコレート ポリマー、およびバイオポリマーを含む。一実施形態において、脂質はリン脂質である。代表的なリン脂質は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；ジパルミトイル  ホスファチジルコリン；ジミリストイル  ホスファチジルコリン；ジオレオイル  ホスファチジルコリン；卵、大豆，亜麻仁などから誘導されたエステル交換リン脂質；およびホスファチジル  エタノールアミンで置換されたホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル
セリン、およびホスファチジン酸を含む。
【００１２】
代表的なポリアルキレン含有脂質はポリオキシエチレン含有脂質またはポリオキシプロピレン含有脂質を含む。一実施形態において、ポリアルキレン含有脂質はポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質たとえばＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノール−アミン（ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）である。
【００１３】
代表的な脂質含有金属キレート化剤は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミンペンタアセチル（ＤＳＰＥ−ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン、テトラアセチル（ガドジアミド）−ＰＥ、および脂質官能基化−［Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチル］−グリシナト−（５”）］を含む。一実施形態において、脂質含有金属キレート化剤はＰＥＧ化された脂質部分を含む。一実施形態において、脂質含有金属キレート化剤はＰＥＧ化されたＤＴＰＡである。他の実施形態において、脂質含有金属キレート化剤はＤＳＰＥ−ＢＯＰＴＡ、ＤＳＰＥ−ＤＯ３Ａ、およびＤＳＰＥ−ＤＯＴＡである。
【００１４】
一実施形態において、組成物はさらにターゲティング成分を含む。代表的なターゲティング成分は蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはこれらのフラグメント、低分子、糖もしくは多糖またはこれらの誘導体、および核酸を含む。
【００１５】
一実施形態において、本発明の組成物はナノ粒子の形態を有する。一実施形態において、ナノ粒子は約５ｎｍないし約２μｍの直径を有する。一実施形態において、ナノ粒子は約５０ｎｍないし約１００μｍの直径を有する。
【００１６】
本発明の組成物はさらに金属イオンを含んでいてもよい。好適な金属イオンは常磁性金属イオンおよび放射性同位元素のイオンを含む。代表的な常磁性金属イオンＧｄ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋，およびＭｎ２＋イオンを含む。代表的な放射性同位元素のイオンは６８Ｇａ、５５Ｃｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ，および１１１Ｉｎイオンを含む。
【００１７】
他の態様において、本発明はキャリアおよび複数の本発明のナノ粒子を含む投与可能な組成物を提供する。好適なキャリアは薬学的に許容できるキャリアたとえば注射用生理的食塩水または注射用ブドウ糖を含む。
【００１８】
さらなる態様において、本発明はイメージ化される被験者に有効量の本発明の組成物を投与することを含む、組織のイメージング方法を提供する。この方法によってイメージ化できる代表的な組織は、リンパ球、心血管、肝臓、腎臓、脳、心臓、筋肉、および胃腸管組織、ならびにリンパ系または脈管（血液）系によって到達できる他の組織を含む。
【００１９】
他の態様において、本発明は、放射性同位元素のアニオンを含む有効量の本発明の組成物を癌細胞に投与することを含む、放射線癌治療薬剤を癌細胞へ配送する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
本発明の上述の態様および多くの付随する利点は、添付の図面と関連して考慮したときに、以下の詳細な説明を参照することによってこれらがよりよく理解されるようになるので、より容易に把握されるようになるであろう。
【図１】図１は、本発明の代表的な配合物についてＧｄ３＋：ＤＴＰＡ−ＰＥ（ｍ／ｍ）比の関数としてのカルセインの蛍光の減少を示すグラフである。配合物をカルセインとともに培養してその蛍光を測定した。遊離のＧｄ３＋がカルセインと結合してその蛍光を減少させる。
【図２】図２Ａおよび２ＢはＧｄ３＋ 濃度の関数としての緩和能を比較している。図２ＡはＴ１緩和速度へのＧｄ３＋投与量効果を比較している；本発明の代表的な配合物（Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）について標準的なスピンエコーシーケンスを用いて１．５Ｔの磁気共鳴（ＭＲ）スキャナーで測定したＧｄ３＋濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）のＲ１（１／Ｔ１）値を、他の配合物と比較している。図２ＢはＴ２緩和速度へのＧｄ３＋投与量効果を比較している；本発明の代表的な配合物（Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）について標準的なスピンエコーシーケンスを用いて１．５Ｔの磁気共鳴（ＭＲ）スキャナーで測定したＧｄ３＋濃度（μｍｏｌ／ｍＬ）のＲ２（１／Ｔ２）値を、他の配合物と比較している。
【図３】図３は本発明の代表的な配合物（Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）の注射後２４時間までのブタオザルの腹部腔の時間経過冠状イメージを示す。図３Ａ−３Ｄは投与前（３Ａ）ならびに投与後２０分（３Ｂ）、６時間（３Ｃ）、および２４時間（３Ｄ）の肝臓の時間系列イメージである。上のパネルはリンパ節の時間系列イメージを示す。リンパ節および肝臓は、バックグランドの組織と比較して高いコントラストを示す。
【図４】図４Ａは２４．４μｍｏｌ／ｋｇの本発明の代表的な配合物（Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）の皮下注射後２４時間までのブタオザルのリンパ節（ＬＮ１、ＬＮ２、およびＬＮ３）および肝臓（Ｌｉｖｅｒ）のＭＲダイナミックコントラスト増強イメージ強度を比較するグラフである。結果は図３Ａ−３Ｄに示したイメージについてである。図４Ｂは隣接する対照組織と比較した組織特異的ＭＲ信号（リンパ節）の時間経過を比較するグラフである。
【図５】図５Ａ−５Ｄは本発明の代表的な配合物（０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）の静脈注射後のラットの時間経過ＭＲイメージである：投与前（５Ａ）；５分（５Ｂ）；１４分（５Ｃ）；および２４時間（５Ｄ）。コントラスト増強は５分および１４分でリンパ節の主に血管系および血管新生組織に局在化している。５Ｃにおける矢印は胆汁経路を通しての胃腸管へのガドリニウム除去の開始を示している。２４時間（５Ｄ）までにほとんどの造影剤が除去され、残部が腸に現れる。
【図６】図６Ａ−６Ｃは市販されているガドリニウム系造影剤（０．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｇｄ−ＤＰＴＡ、ＯＭＮＩＳＣＡＮ）の静脈注射後のラットの時間経過ＭＲイメージである：投与前（６Ａ）；５分（６Ｂ）；および１５分（６Ｃ）。コントラスト増強は、５分または１５分で、全体にわたって拡散し、血管系、よく灌流された組織、またはリンパ節に局在化しない。造影剤の末梢および四肢への拡散が認められる。
【図７】図７Ａ−７Ｄは市販されているガドリニウム系造影剤の静脈注射後のラットの時間経過ＭＲイメージ（０．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｇｄ−ＤＰＴＡ、ＯＭＮＩＳＣＡＮ、投与前（７Ａ）、５分（７Ｂ）、および１５分（７Ｃ））本発明の代表的な配合物（０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）投与後１５分のラットのＭＲイメージを比較している。
【図８】図８Ａ−８Ｆは本発明の代表的な配合物（Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）の静脈注射後のラットの投与量応答ＭＲイメージを比較している：０．０ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ａ）；０．００１２５ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｂ）；０．００２５ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｃ）；０．００５ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｄ）；および０．０１０ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｅおよび８Ｆ）。リンパ節は図８Ｆに明確に認められる。
【図９】図９Ａ−９Ｃは２つの市販されているガドリニウム系造影剤（０．０５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭＳ−３２５、９Ａ；０．０５ｍｍｏｌ／ｋｇのＭＡＧＮＥＶＩＳＴ  Ｇｄ−ＤＰＴＡ、９Ｂ）および本発明の代表的な配合物（０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇのＧｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ、９Ｃ）の静脈注射後のラットのＭＲイメージを比較している。イメージは投与後約１ないし２分でニアピーク増強を得た。
【図１０】図１０は代表的な脂質含有ガドリニウムキレート：ＤＳＰＥ−ＤＯＴＡ−Ｇｄの調製の模式的な説明図である。
【図１１】図１１は代表的な脂質含有キレート調製するのに有用な３つの金属キレート化剤：ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ；ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ；およびｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡを示す。
【図１２】図１２は代表的な脂質含有ガドリニウムキレートの調製の模式的な説明図である。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は金属イオンを発現する組成物およびこの組成物を使用する方法を提供する。一実施形態において、組成物は常磁性金属イオンを含み、磁気共鳴イメージングに有用な脂質ナノ粒子である。他の実施形態において、組成物は放射性同位元素のイオンを含み、放射線癌治療薬剤の配送に有用な脂質ナノ粒子である。
【００２２】
一態様において、本発明は磁気共鳴イメージングのための組成物および方法を提供する。前記組成物および方法はガドリニウムの分布およびリンパ管における蓄積を高める。本発明は皮下および静脈内の投与の両方に好適なガドリニウム組成物（本明細書において「Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子」という）を提供する。皮下投与はリンパ系への直接的な到達を可能にする。この組成物はリンパ節におけるＴ１強調ＭＲ信号を高めるとともに、リンパ管における造影剤の滞留時間を増加させる。静脈内投与すると、組成物は血管イメージング薬剤としての可溶なＧｄ−ＤＴＰＡに対して少なくとも１００倍の増強を示し、腎臓のクリアランスよりもむしろ優勢に胆汁を除去する。この組成物は、マカクのリンパ節のＭＲ画像化に対して信号対ノイズ比を３００倍以上まで増加させることが示された。
【００２３】
本発明の組成物は脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤を含む。一実施形態において、組成物はさらにキレート化された金属イオンを含む。
【００２４】
一実施形態において、本発明の組成物はキレート化剤（または金属キレート）発現粒子である。本明細書で使用する限り、「発現する」という用語は、活性についてキレート化剤またはキレート化された金属の代わりを務めるまたは利用できる粒子について言及する。上述したように、一実施形態において、本発明の組成物はキレート化されたガドリニウムイオン（Ｇｄ＋３）を有する脂質ナノ粒子（たとえば、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子）である。脂質ナノ粒子において、キレート化されたガドリニウムイオンが発現される。
【００２５】
本発明の脂質ナノ粒子は生体適合性があり容易に投与される。ナノ粒子は約５ｎｍないし約２μｍの直径を有する。一実施形態において、ナノ粒子は約１０ｎｍないし約１００μｍの直径を有する。一実施形態において、ナノ粒子は約７０ｎｍの直径を有する。
【００２６】
上述したように、本発明の組成物（たとえば、脂質ナノ粒子）は脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤を含む。
【００２７】
脂質。本発明のナノ粒子の脂質成分はナノ粒子のコアを含む。
【００２８】
組成物において有用な代表的な脂質はリン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールおよびステロイド誘導体、胆汁酸および誘導体、カルジオリピン、アシル−グリセリドおよび誘導体、糖脂質、アシル−ペプチド、脂肪酸、炭水化物系ポリマー（たとえばセルロースポリマー）、好適には官能基化シリカ、親油性ポリマー（たとえば、ポリ無水物、ポリラクテート−グリコレート）、および親油性バイオポリマー（たとえば、蛋白質、糖ポリマー）を含む。
【００２９】
一実施形態において、脂質はジステアロイルアミドメチルアミンである。
【００３０】
一実施形態において、脂質はリン脂質である。代表的なリン脂質は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；ジパルミトイル  ホスファチジルコリン；ジミリストイル  ホスファチジル  コリン；ジオレオイル  ホスファチジル  コリン；卵、大豆、亜麻仁などから誘導されたエステル交換リン脂質；およびホスファチジル  エタノールアミンで置換されたホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル  セリン、およびホスファチジン酸を含む。一実施形態において、リン脂質は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
【００３１】
ポリアルキレン含有脂質。本発明のナノ粒子のポリアルキレン含有脂質成分は表面水和剤として作用する。
【００３２】
代表的なポリアルキレン含有脂質はポリオキシエチレン含有脂質およびポリオキシプロピレン含有脂質を含む。一実施形態において、ポリアルキレン含有脂質はポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質（たとえばＰＥＧ化されたリン脂質）を含む。好適なＰＥＧ化されたリン脂質は約５００ないし約２０，０００の数平均分子量を有するポリエチレングリコールを含む。一実施形態において、ＰＥＧ化されたリン脂質はＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）（本明細書において「ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ」および「ｍＰＥＧ−ＰＥ」ともいう）である。
【００３３】
ポリアルキレン含有脂質に加えて、他の実施形態において、表面水和剤は親水性のバイオ材料たとえば炭水化物ポリマー、ポリアミン、ポリビニルピロリドン、ポリ（アスパルテート）、またはポリ（Ｌ−アミノ酸）である。
【００３４】
他の有用な表面水和剤はポリエトキシル、ポリメチレン  グリコール、またはプロピレン  グリコールと脂質または他の疎水性部分（たとえば、長鎖炭化水素）との共有結合型複合体を含む。
【００３５】
表面水和剤は好ましくは組成物（すなわち、脂質、ポリアルキレン含有脂質（表面水和剤）、および脂質含有金属キレート化剤）の約５ないし約５０モルパーセント存在する。
【００３６】
脂質含有金属キレート化剤。本発明のナノ粒子の脂質含有金属キレート化剤成分はナノ粒子の表面上で発現され、キレート金属イオンとして機能する。好適な脂質含有金属キレート化剤は２つの部分を含む：（１）脂質部分および（２）金属キレート化剤部分である。
【００３７】
代表的な脂質含有金属キレート化剤は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミンペンタアセチル（ＤＳＰＥ−ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン、テトラアセチル（ガドジアミンまたはＯＭＮＩＳＣＡＮ）−ＰＥ、および脂質−官能基化−［Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］エチル］−グリシナト−（５”）］（ＭＡＧＮＥＶＩＳＴ）を含む。
【００３８】
代表的な金属キレート化剤はＢＯＰＴＡ、ＤＯ３Ａ、およびＤＯＴＡキレート化剤を含む。
【００３９】
一実施形態において、金属キレート化剤はＰＥＧ化された脂質部分を含む。代表的なＰＥＧ化された金属キレート化剤はＤＳＰＥ−ＢＯＰＴＡ、ＤＳＰＥ−ＤＯ３Ａ、およびＤＳＰＥ−ＤＯＴＡを含む。一実施形態において、金属キレート化剤はＰＥＧ化されたＤＴＰＡ（ＤＰＴＡ−ＰＥ）を含む。
【００４０】
金属キレート化剤は好ましくは脂質、ポリアルキレン含有脂質（表面水和剤）、および金属キレート化剤の約５ないし約５０モルパーセント存在する。
【００４１】
キレート化された金属イオン。本発明の組成物は金属イオンの効果的なキャリアである。これらの実施形態において、組成物（たとえば、脂質ナノ粒子）はさらにキレート化された金属イオンを含む。
【００４２】
ＭＲ用途のためには、有用な金属イオンは常磁性金属イオンを含む。代表的な常磁性金属イオンはＧｄ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋、およびＭｎ２＋イオンを含む。
【００４３】
他の用途たとえばイメージングおよび治療目的のイオン配送について、有用な金属イオンは放射性同位元素のイオンを含む。代表的な放射性同位元素は６８Ｇａ、５５Ｃｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、および１１１Ｉｎのイオンを含む。
【００４４】
キレート化された金属イオンを含む実施形態について、金属イオン：金属キレート化剤の比は０．１−１．０：１．０である（１：１以下）。
【００４５】
ターゲティング薬剤。本発明の組成物は特定の組織を標的にするのに用いることができる。これらの実施形態において、組成物（たとえば、脂質ナノ粒子）はさらにターゲティング成分を含む。代表的なターゲティング成分は蛋白質、ポリペプチド、およびペプチド；抗体および誘導体（フラグメント）；低分子；糖、多糖、および誘導体；および核酸、たとえばヌクレオチドポリマー（たとえば、アプタマー）、ＤＮＡ；およびＲＮＡを含む。代表的なターゲティング成分の標的は癌細胞およびウイルス感染細胞を含む。
【００４６】
脂質ナノ粒子配合物。本発明の脂質ナノ粒子を配合して投与のための組成物にすることができる。好適な投与のための組成物はキャリアおよび複数の脂質ナノ粒子を含む。代表的なキャリアは薬学的に許容できるキャリア、たとえば注射用生理的食塩水または注射用ブドウ糖を含む。
【００４７】
本発明の脂質ナノ粒子はリポソームではなく、配合したときにリポソームを生成しない。
【００４８】
組織イメージングのための方法。他の態様において、本発明は組織（たとえば、閉塞組織）をイメージ化するための方法を提供する。一実施形態において、この方法はイメージ化される被験者に診察に有効量の本発明の組成物を投与することを含む。組成物は皮下および静脈内を含む種々の方法によって投与できる。この方法は、リンパ球、心血管、肝臓、腎臓、脳、心臓、筋肉、および胃腸管組織、ならびにリンパ系または脈管（血液）系によって到達できる他の組織のような組織をイメージ化するのに有効である。この方法は上の組織をイメージングして組織が閉塞しているかどうかを決定するのに有効である。磁気共鳴イメージング法については、組成物は常磁性金属イオン（たとえば、Ｇｄ３＋）を含む。
【００４９】
一般的に、有効量は約０．００１ないし約５ｍｍｏｌ金属／ｋｇ被験者である。一実施形態において、有効量は約０．００５ないし約０．０５０ｍｍｏｌ金属／ｋｇ被験者である。一実施形態において、有効量は約０．０１０ｍｍｏｌ金属／ｋｇ被験者である。
【００５０】
放射線癌治療薬剤の配送方法。他の態様において、本発明は癌細胞へ放射線癌治療薬剤を配送する方法を提供する。一実施形態において、この方法は、これを必要とする被験者に、治療に有効量の、キレート化された金属イオンが放射性同位元素（たとえば、６８Ｇａ、５５Ｃｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、および１１１Ｉｎ）である本発明の組成物を投与することを含む。組成物を、皮下および静脈内を含む多様な方法によって投与できる。この方法は、リンパ球、心血管、肝臓、腎臓、脳、心臓、筋肉、および胃腸管組織、ならびにリンパ系または脈管（血液）系によって到達できる他の組織のような組織への配送に有効である。
【００５１】
以下は本発明の代表的な脂質ナノ粒子についての、調製、特性評価、およびイメージングの結果の説明である。
【００５２】
１０モルパーセントの表面結合ＤＴＰＡからなる脂質ナノ粒子を調製した。これらの脂質ナノ粒子はジステアロイル−ホスファチジルコリンおよびＰＥＧ化された脂質、ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥを含む。これらを、さまざまなＧｄ３＋対ＤＴＰＡ−ＰＥモル比でＧｄ３＋と錯化させた（Ｇｄ３＋・・Ｃｌ−と表す）。混合物中の遊離のＧｄ３＋の存在を、カルセインの蛍光を消光させる遊離のＧｄ３＋の能力によって決定した。Ｇｄ３＋対ＤＴＰＡ−ＰＥモル比４までは、カルセイン消光分析によって遊離のＧｄ３＋を検出できなかった。６またはそれより高いＧｄ３＋対ＤＴＰＡ−ＰＥモル比で、遊離のすなわち結合していないＧｄ３＋が検出された（図１参照）。ＤＴＰＡを発現する脂質ナノ粒子へのＧｄ３＋の効果を測定するために、我々は光子相関分光法によって粒径を測定した。ＤＴＰＡを発現する脂質ナノ粒子の直径はＧｄ３＋濃度に依存していた。Ｇｄ３＋対ＤＴＰＡモル比１またはそれ未満で、Ｇｄ３＋の存在は脂質ナノ粒子の直径に影響しなかった。Ｇｄ３＋対ＤＴＰＡモル比２で、Ｇｄ３＋−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子の見かけの直径は約２ないし３倍まで増加するが、ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子と会合するＧｄの度合に見かけの減少はない（表１参照）。室温で２４時間にわたってそれほどの直径の変化は検出されなかったので、これらの脂質ナノ粒子は安定であるように見える。全体として、これらのデータは、Ｇｄ３＋対ＤＴＰＡの比がＧｄ−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子へのＧｄ３＋の組み込みの度合およびそれらの見かけの直径に影響することを示唆している。Ｇｄ３＋対ＤＴＰＡモル比２以下で、実質的にすべてのＧｄ３＋が脂質ナノ粒子と会合している。一実施形態において、本発明の組成物におけるＧｄ３＋対ＤＴＰＡモル比は約1である。
【００５３】
種々のＧｄ３＋配合物の、Ｇｄ３＋のＲ１（１／Ｔ１）緩和能への影響を比較することにより、Ｇｄ３＋発現脂質ナノ粒子のコントラスト特性を測定した。脂質ナノ粒子は、ＰＥＧ化された脂質（ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ、本明細書において「ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ」または「ｍＰＥＧ−ＰＥ」という）ありまたはなしのジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなり、Ｇｄ３＋対ＤＴＰＡモル比を１に固定した。Ｔ１およびＴ２測定を１．５ＴのＭＲスキャナーで収集した。臨床的に用いられているＧｄ−ＤＴＰＡ製剤（ＯＭＮＩＳＣＡＮ、 GE Healthcare, Princeton, NJから市販されている）が比較として含まれている。図２Ａに示すように、本発明の代表的な組成物、ｍＰＥＧ−ＰＥを含むＧｄ−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）は、ＯＭＮＩＳＣＡＮおよびｍＰＥＧを含まない脂質ナノ粒子を含む他の製剤よりかなり高いＲ１値を示した。ｍＰＥＧのＧｄ−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子に対する効果はＴ２測定についてはより少ない（図２Ｂ参照）。しかし、両方のＧｄ−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子組成物（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣおよびＧｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）についてのＲ１およびＲ２値は、可溶なＧｄ−ＤＴＰＡ市販製剤（ＯＭＮＩＳＣＡＮ）または溶液中の遊離のＧｄ３＋（Ｇｄ  ｗ／ｏ  ＤＴＰＡ）のそれよりもかなり高かった。我々の知識では、本発明のＧｄ−ＤＴＰＡナノ粒子についてのＲ１値は、ＰＥＧを含むＧｄ３＋発現リポソームで報告されている値を含み、現在までのところ最高の値である。事実、これらの結果は、ＤＳＰＥに結合したｍＰＥＧの変わりに、卵エステル交換ＰＥにリンクしたＰＥＧ（ＭＷ＝５０００）を発現する卵レクチンおよびコレステロールを含むＧｄ−ＤＴＰＡリポソームで収集されたデータよりも１０倍高かった。
【００５４】
Ｇｄ３＋を含む両方のナノ粒子配合物は可溶なＧｄ−ＤＴＰＡよりも高いＲ１値を有していた。予測されるように、Ｇｄ３＋なしの、ＤＳＰＣおよびＤＳＰＣプラスｍＰＥＧ−２０００−ＰＥの可溶な配合物は、緩和能に対して有意の効果を示さなかった。データは、他の配合物と比較して、ＰＥＧ含有Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子がＲ１のより大きな増加を与えることを示している。市販されているＯＭＮＩＳＣＡＮと比較したとき、１００倍までのＲ１緩和能が達成された。表面ＰＥＧのないＧｄ−ＤＴＰＡナノ粒子配合物（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）もＯＭＮＩＳＣＡＮより高いＲ１値を示したが、ＰＥＧ含有Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子配合物（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）よりもかなり低かった（図２Ａ参照）。
【００５５】
ＭＲイメージにおいてＧｄ３＋によって生じた陽性コントラストは低いＲ２/Ｒ１比に依存売るので、Ｒ２値も決定した。図２Ｂは、Ｒ２（１／Ｔ２）緩和能測定に対する種々のＧｄ３＋配合物の効果を例示している。やはり、ＰＥＧ化されたＧｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣおよびＧｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）は、他の処方と比較してＲ２の大きな増加を示したが、変化の大きさは小さかった。ｍＰＥＧ化されたＧｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）は、ＯＭＮＩＳＣＡＮと比較して、Ｒ２の約８倍の増加を示した。Ｇｄ−ＤＴＰＡ含有ＤＳＰＣ（ｍＰＥＧなし）ナノ粒子配合物（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）はＲ１よりもＲ２の大きな増加を示し、これは陽性造影剤配合物としてのその有効性を限定するであろう。Ｇｄ３＋なしのＤＳＰＣおよびＤＳＰＣプラスｍＰＥＧ−２０００−ＰＥの対照配合物（ＤＴＰＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣおよびＤＴＰＡ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）はやはり緩和能に対して効果を示さなかった。緩和能実験は、他の配合物と比較して、ｍＰＥＧ化されたＧｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子配合物がＲ１緩和能を非常に増加させることを示している。しかし、高濃度（３μｍｏｌ／ｍｌより高い）では、Ｔ２へのＴ１のスピルオーバーが顕著になり、Ｔ１信号の見かけの減少をもたらす（データは示していない）。最適なＴ１組織コントラストを、最小Ｇｄ３＋濃度で得ることができた。これらのデータは、市販製品ＯＭＮＩＳＣＡＮによって得られるそれよりもかなり高いコントラスト「能力」を明確に示している。
【００５６】
霊長類におけるＭＲイメージング調査のための、ｍＰＥＧ−２０００−ＰＥを含むＧｄ−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣすなわち「Ｇｄ−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子」）の使用を以下に説明する。
【００５７】
図３Ａ−３Ｄは、コントラスト前およびＧｄ３＋−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子の皮下注射に続く２４時間までの両方の、ブタオザルの腹部腔のいくつかの冠状ＭＲイメージを示す。周辺の組織と比較して、高い強度増強度合で副リンパ節が明確に見える（図３トップパネル）。リンパ節の増強は２０分ほどの早さで見ることができるが、２４時間まで続く。図４はダイナミックコントラスト増強ＭＲＩの時間経過を示し、時間に対する種々の期間の相対強度を示している。このデータは、Ｇｄ３＋−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子が注射後２０分以内に急速にリンパ節組織に達し、少なくとも２４時間のあいだコントラスト増強を維持することを示している。可溶なＧｄ−ＤＴＰＡ（ＯＭＮＩＳＣＡＮ製剤）で静脈処置された動物のリンパ系で２０分以内に消失する低い信号と比較して、１回の皮下へのＧｄ−ＤＴＰＡ脂質ナノ粒子投与は、長時間のあいだ非常に増強した信号を与えた。
【００５８】
Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子のＭＲイメージ増強特性を用いて、血管イメージ増強を生じさせ腎臓の負担も減少させるのに必要なＩＶ投与量を最小化することができる。ラットへの０．０１ｍｍｏｌｅ／ｋｇのＧｄ−ＤＴＰＡナノ粒子（ヒトに対する現在の投与量の約１／５）の投与は、５分以内に明確に認識できるラットの中心血管系および末梢血管系による高品質ＭＲイメージを生じた（図５Ｂ）。これは１５分以内に胆汁および腸を通して取り除かれ始め（図５Ｃ）、２４時間までにクリアランスプロセスが完了したように見える（図５Ｄ）。対照的に、０．０５ｍｍｏｌｅの可溶なＧｄ−ＤＴＰＡ（ＯＭＮＩＳＣＡＮ）は、血管の鮮明度なしに拡散したコントラスト局在化を生じる；また、これは四肢の末梢に分布するように見える（図６Ａ）。限定投与量応答調査において、現在のＧｄ−ＤＴＰＡ配合物と比較して、ラットにおける等価またはより良好な鮮明度のコントラスト増強ＭＲイメージを生じるのに、ラットにおいてわずかに約１０−２０倍低い投与量のＧｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子を要する。０．００２５ｍｍｏｌｅ／ｋｇのＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子中のＧｄが、０．０５ｍｍｏｌｅ／ｋｇのＧｄ−ＤＴＰＡ（ＯＭＮＩＳＣＡＮ）製剤の等価なイメージ品質を生じる。したがって、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子は、腎不全および神経毒症状による現在承認されているＧｄ造影剤を用いた臨床使用における難題を克服するであろう。
【００５９】
表面結合したガドリニウムイオンを有する本発明のＰＥＧ化された脂質ナノ粒子は、コントラスト増強ＭＲリンパ管造影法および血管イメージングにおいて他の製剤を超える大きな改善を示した。これらの脂質ナノ粒子は皮下注射後にリンパ節において高度の蓄積を示した。リンパ球組織におけるコントラスト増強は、注射の２０分以内に始まり、２４時間維持された。静脈内に与えた場合、この薬剤は、現在の薬剤よりかなり高い感度で血管系の高品質イメージを生じた。静脈内に投与された脂質ナノ粒子はほとんど胆汁経路を通してのみ取り除かれ、２４時間以内に完了したようである。脂質ナノ粒子にｍＰＥＧを付加することによる表面修飾は水分子の配位によってＧｄ３＋のＭＲ信号を増大させた。これはかなり高いＲ１緩和能およびリンパ節イメージ増強をもたらす。脂質ナノ粒子配合物は、転移性リンパ節識別を増大させ、イメージングについてのかなり広い時間フレームを可能にするために、低い投与量を用いて高い信号対ノイズＭＲコントラスト比を達成することを可能にするであろう。ＭＲコントラスに必要とされる、潜在的に低い投与量およびＧｄ３＋のより好ましい除去経路は、より高い安全性マージンを与えることができるであろう。
【００６０】
本発明の配合物は、現在入手でき、承認されている造影剤と比較して、比較的低い投与量で有効なコントラストを与える。図８Ａ−８Ｆは、本発明の代表的な配合物（Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ）の静脈注射後のラットの投与量応答ＭＲイメージを比較している：０．０ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ａ）；０．００１２５ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｂ）；０．００２５ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｃ）；０．００５ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｄ）；および０．０１０ｍｍｏｌ／ｋｇ（８Ｅおよび８Ｆ）。リンパ節は図８Ｆに明確に認められる。
【００６１】
上述したように、本発明の配合物は、現在入手でき、承認されている造影剤を超える利点を与える。図９Ａ−９Ｃは、２種の市販されているガドリニウム系造影剤（０．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ  ＭＳ−３２５、 EPIX Pharmaceuticals, Inc., Cambridge, MA、図９Ａ；および０．０５ｍｍｏｌ／ｋｇ  ＭＡＧＮＥＶＩＳＴ  Ｇｄ−ＤＰＴＡ、 Bayer HealthCare Pharmaceuticals、図９Ｂ）および本発明の代表的な配合物（０．０１ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｇｄ−ＤＰＴＡ−ＰＥ：ｍＰＥＧ−ＰＥ：ＤＳＰＣ、図９Ｃ）の静脈注射後のラットのＭＲイメージを比較している。イメージは投与後約１ないし２分でニアピーク増強を得た。イメージからわかるように、本発明の代表的な配合物は、現在入手できる薬剤よりもかなり大きいコントラストを示している。
【００６２】
図１０は、ＤＳＰＥをｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡと反応させた後にＧｄメタレーションを行うことによる本発明において有用な代表的なＧｄ錯体（ＤＳＰＥ−ＤＯＴＡ−Ｇｄ）を調製する合成スキームである。図１１は、リン脂質に対して反応性であり、本発明において有用な３種の代表的なキレート化薬剤（イソチオシアネート、−Ｎ＝Ｃ＝Ｓまたは−ＮＣＳ）（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡ、ＣＨＸ−Ａ”−ＤＴＰＡ、およびｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＴＰＡ）を示す。図１２は、４種の代表的な親油性化合物（ＤＳＡ、ジエーテルＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミン、およびＤＳＰＥ）、およびＤＳＰＥをｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＤＯＴＡと反応させた後にＧｄメタレーションを行うことによる、本発明において有用な代表的なＧｄ錯体（ＤＳＰＥ−ＤＯＴＡ−Ｇｄ）を調製するための合成スキームを示す。本発明において有用な脂質含有金属キレート化剤は図１０および１２に示すように容易に調製される。好適な反応性の金属キレート化剤（たとえば、イソチオシアネート官能基化金属キレート化剤、図１１参照）は、好適に反応性である基（たとえば、ＤＳＰＥのアミノ基、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ（２０００）アミン、ジエーテルＰＥ、ＤＳＡ、図１０および１２参照）を含む脂質化合物と反応して、脂質部分が金属キレート化剤と共有結合した脂質含有金属キレート化剤を与える。イソチオシアネート官能基化した金属キレート化剤および反応性アミン含有脂質については、生成脂質含有金属キレート化剤は、脂質をキレート化剤へ結合させるチオウレア（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−）結合を含む。他の好適に反応性の金属キレート化剤（たとえば、イソシアネート）および好適に反応性である基（たとえば、アルコール）を含む脂質化合物は、本発明において有用な脂質含有金属キレート化剤を与えうることが認識されるであろう。キレート化剤のメタレーションは金属イオン含有化合物を与える。
【表１】
2016094425.tif 000003
【００６３】
aＤＴＰＡはＤＳＰＣ、ｍＰＥＧ−ＰＥおよびＤＴＰＡ−ＰＥ（８：１：０．９モル比からなる脂質ナノ粒子上で発現されている。例１に記載。
【００６４】
b指示したＤＴＰＡ対Ｇｄ３＋モル比でナノ粒子をＧｄＣｌ３にさらした。
【００６５】
cＤＴＰＡ発現ナノ粒子の径を光子相関分光法によって測定し、発現データは表示した時点での４連サンプルの平均±ＳＤである。
【００６６】
d未結合すなわち遊離のＧｄ３＋の存在をカルセインの蛍光消光分析により見積もった。
【００６７】
以下の例は、本発明を限定するのではなく、説明する目的で提供している。
【００６８】
例
例１
材料および方法
脂質ナノ粒子の調製。１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Avanti Polar Lipids, AL）、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ、Genzyme, MA）、および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＤＴＰＡ（ＤＳＰＥ−ＤＴＰＡ、Avanti Polar Lipids, AL）を、クロロホルム（ＤＳＰＣ：ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ−ＤＴＰＡ）中において８：２：１の比で化合させ、窒素下、次に高真空下で終夜乾燥させて薄膜にした。種々の分子量（すなわち鎖長）のＰＥＧポリマーを含むｍＰＥＧ−ＤＳＰＥもGenzyme, MAから購入している。この時点でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を膜に加えて、バスタイプ超音波処理器（Laboratory Supplies Company, New York）中で超音波処理した。Malvern Zetasizer 5000の光子相関分光法（Malvern Instruments, PA）を用いて動的光散乱によって測定したところ、ベシクル径は５０ｎｍであった。懸濁液中のナノ粒子を塩化ガドリニウム（III）六水和物（Aldrich, St Louis, MO）と示したモル比で２０分間混合して、Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子を制裁させた。結合していないＧｄ３＋を測定するために、ナノ粒子をカルセイン（０．５μＭ）（Sigma, St Louis, MO）とともにＰＢＳ中、ｐＨ７．４で培養し、Victor3V 1420マルチラベルカウンター（PerkinElmer, Waltham, MA）を用いて４８５／５３５ｎｍで蛍光を測定した。遊離のイオン性Ｇｄ３＋は［Ｇｄ３＋］に依存する仕方でカルセイン蛍光を消光させる。最終的なＧｄ濃度を測定するために、誘導結合プラズマ発光分光を用いて、元素Ｇｄ質量を測定した。本明細書に記載した調査には、これらの粒子とともに、Ｇｄ３＋を含まない可溶な粒子を用いた。
【００６９】
緩和能調査。Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子の希釈液を、０−５μｍｏｌ／ｍｌのあいだのＧｄ３＋濃度で調製した。比較のために、市販の薬剤たとえばＯＭＮＩＳＣＡＮ（Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ＢＭＡ）から０−５μｍｏｌ／ｍｌのＧｄ３＋濃度でいくつかのサンプルを調製した。ＲＦレシーバーとしてボリュームヘッドコイルをもつ１．５ＴＭＲスキャナーで標準的なスピンエコーシーケンスを用いて緩和時間Ｔ１を測定した。Ｔ１測定について、ＴＥを９ｍｓに、ならびに７つのＴＲをそれぞれ１３３、２００、３００、５００、７５０、１０００および２０００ｍｓに固定した。Ｔ２測定について、ＴＲを２０００ｍｓに、ならびに４つのＴＥをそれぞれ１５、３０、４５、および６０ｍｓに固定した。イメージング強度をフィッチングして対応するＴ１およびＴ２の値を得て、これらをＧｄ３＋濃度に対してプロットした。
【００７０】
霊長類のリンパ管ＭＲＩ調査。ダイナミックコントラスト増強（ＤＣＥ）ＭＲＩのためのＧｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子を用いてリンパ節の生体内イメージングを、１．５ＴのＭＲスキャナーで実施した。ブタオマカク（ブタオザル）に吸入イソフルオラン（１−２％）で麻酔をかけ、実験中に詳しくモニターした。霊長類のコントラスト前イメージを記録して、適当なリンパ節位置を測定し、イメージングパラメーターを微調整した。動物をＭＲスキャナーから取り出して４個所に皮下注射した。各々の注射部位に、それぞれ２、５、５、および８．５ｍＬの６．１μｍｏｌ／ｍｌ  Ｇｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子を入れて、投与量効果および注射部位からのコントラスト拡散のプロービングを可能にした。Ｇｄの全投与量は霊長類調査について２４．４μｍｏｌ／ｋｇであると見積もられた。表面コイル１２×１２インチ２を用いてSignaの１．５Ｔスキャナーでイメージを記録した。標準的なスピンエコーイメージングシーケンスを、ＴＲ＝５００ｍｓ、ＴＥ＝１５ｍｓ、３ｍｍのスライス厚さ、２１スライス、スライスギャップ＝０．５ｍｍ、ＦＯＶ（視野）＝３２０×３２０ｍｍ２、マトリックスサイズ＝５１２×５１２で用い、これは０．６３×０．６３ｍｍ２の面内分解能を与え、時間分解能は３．１分である。
【００７１】
ラットの血管のＭＲＩ調査。ダイナミックコントラスト増強（ＤＣＥ）ＭＲＩのためのＧｄ−ＤＴＰＡ−脂質ナノ粒子を用いてラットの生体内イメージングを、３．０ＴのＭＲスキャナーで実施した。ラット（ＳＤ）に吸入イソフルオラン（１−２％）で麻酔をかけ、実験中に詳しくモニターした。ラットのコントラスト前イメージを記録して、適当な位置、方向を測定し、イメージングパラメーターを微調整した。動物をＭＲスキャナーから取り出して、大腿静脈を通して、４００μＬの指示したＧｄ造影剤を注射した。表面コイル１２×１２インチを用いてSignaの１．５Ｔスキャナーでイメージを記録した。標準的なスピンエコーイメージングシーケンスを、ＴＲ＝５００ｍｓ、ＴＥ＝１５ｍｓ、３ｍｍのスライス厚さ、２１スライス、スライスギャップ＝０．５ｍｍ、ＦＯＶ（視野）＝３２０×３２０ｍｍ２、マトリックスサイズ＝５１２×５１２で用い、これは０．６３×０．６３ｍｍ２の面内分解能を与え、時間分解能は３．１分である。
【００７２】
本発明の好ましい実施形態を説明し記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その中で種々の変更をなしうることが理解されるであろう。
【００７３】
独占的所有または権利を主張している本発明の実施形態は下記のように定義される。
【図１】
2016094425.tif 000004
【図２】
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【図４】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2016094425.tif 000014
【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年12月18日(2015.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）脂質と、
（ｂ）ポリアルキレン含有脂質と、
（ｃ）脂質含有金属キレート化剤とを含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
独占的所有または権利を主張している本発明の実施形態は下記のように定義される。
以下に、出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  （ａ）脂質と、
（ｂ）ポリアルキレン含有脂質と、
（ｃ）脂質含有金属キレート化剤とを含む組成物。
［２］  前記脂質は、リン脂質、スフィンゴ脂質、コレステロールおよびステロイド誘導体、胆汁酸および誘導体、カルジオリピン、アシル−グリセリドおよび誘導体、糖脂質、アシル−ペプチド、脂肪酸、炭水化物系ポリマー、官能基化シリカ、ポリ無水物ポリマー、ポリラクテート−グリコレートポリマー，およびバイオポリマーからなる群より選択される［１］の組成物。
［３］  前記脂質はリン脂質である、［１］の組成物。
［４］  前記リン脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；ジパルミトイル  ホスファチジルコリン；ジミリストイル  ホスファチジルコリン；ジオレオイル  ホスファチジルコリン；卵、大豆，亜麻仁などから誘導されたエステル交換リン脂質；およびホスファチジル  エタノールアミンで置換されたホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル  セリン、およびホスファチジン酸からなる群より選択される、［３］の組成物。
［５］  前記ポリアルキレン含有脂質はポリオキシエチレン含有脂質およびポリオキシプロピレン含有脂質からなる群より選択される、［１］の組成物。
［６］  前記ポリアルキレン含有脂質がポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質である、［１］の組成物。
［７］  前記ポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質は、約５００ないし約２０，０００の数平均分子量を有するポリエチレングリコールを含む、［６］の組成物。
［８］  前記ポリエチレングリコールで官能基化されたリン脂質は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｍＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ）である、［７］の組成物。
［９］  前記脂質含有金属キレート化剤は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ジエチレントリアミンペンタアセチル（ＤＳＰＥ−ＤＴＰＡ）、テトラアザシクロドデカン、テトラアセチル（ガドジアミド）−ＰＥ、脂質官能基化［Ｎ，Ｎ−ビス［２−［ビス（カルボキシメチル）アミノ］−エチル］−グリシナト−（５”）］からなる群より選択される、［１］の組成物。
［１０］  前記脂質含有金属キレート化剤はＰＥＧ化された脂質部分を含む、［１］の組成物。
［１１］  前記脂質含有金属キレート化剤はＰＥＧ化されたＤＴＰＡである、［１］の組成物。
［１２］  前記脂質含有金属キレート化剤はＤＳＰＥ−ＢＯＰＴＡ、ＤＳＰＥ−ＤＯ３Ａ、およびＤＳＰＥ−ＤＯＴＡからなる群より選択される、［１］の組成物。
［１３］  前記ポリアルキレン含有脂質は、脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤の約５ないし約５０モルパーセント存在する、［１］の組成物。
［１４］  前記脂質含有金属キレート化剤は、脂質、ポリアルキレン含有脂質、および脂質含有金属キレート化剤の約５ないし約５０モルパーセント存在する、［１］の組成物。
［１５］  さらにターゲティング成分を含む、［１］−［１４］のいずれか１項の組成物。
［１６］  前記ターゲティング成分は、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体またはこれらのフラグメント、小分子、糖もしくは多糖またはこれらの誘導体、および核酸からなる群より選択される、［１５］の組成物。
［１７］  前記ターゲティング成分は癌細胞またはウイルス感染細胞を標的にする、［１５］の組成物。
［１８］  ナノ粒子の形態にある、［１］−［１７］のいずれか１項の組成物。
［１９］  前記ナノ粒子は約５ｎｍないし約２μｍの直径を有する、［１８］の組成物。
［２０］  前記ナノ粒子は約５０ｎｍないし約１００μｍの直径を有する、［１８］の組成物。
［２１］  さらにキレート化された金属イオンを含む、［１］−［２０］のいずれか１項の組成物。
［２２］  キレート化された金属イオン：金属キレート化剤の比が０．１−１．０：１．０である、［２１］の組成物。
［２３］  前記キレート化された金属イオンは常磁性金属イオンである、［２１］または［２２］の組成物。
［２４］  前記常磁性金属イオンはＧｄ３＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ３＋、Ｆｅ２＋、およびＭｎ２＋からなる群より選択される、［２３］の組成物。
［２５］  前記キレート化された金属イオンは放射性同位元素のイオンである、［２１］または［２２］の組成物。
［２６］  前記放射性同位元素のイオンは６８Ｇａ、５５Ｃｏ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、および１１１Ｉｎのイオンからなる群より選択される、［２５］の組成物。
［２７］  キャリアと、［１８］の複数のナノ粒子とを含む組成物。
［２８］  前記キャリアは薬学的に許容できるキャリアである、［２７］の組成物。
［２９］  前記キャリアは注射用生理的食塩水または注射用ブドウ糖である、［２７］の組成物。
［３０］  イメージ化される被験者に有効量の［２１］−［２９］のいずれか１項の組成物を投与することを含む、組織をイメージ化する方法。
［３１］  前記組成物を皮下に投与する、［３０］の方法。
［３２］  前記組成物を静脈内に投与する、［３０］の方法。
［３３］  前記組織はリンパ球、心血管、肝臓、腎臓、脳、心臓、筋肉、および胃腸管組織、ならびにリンパ系または脈管（血液）系によって到達できる他の組織からなる群より選択される、［３０］の方法。
［３４］  前記有効量は約０．００１ないし約５ｍｍｏｌ金属／ｋｇ被験者である、［３０］の方法。
［３５］  前記有効量は約０．００５ないし約０．０５０ｍｍｏｌ常磁性金属／ｋｇ被験者である、［３０］の方法。
［３６］  前記有効量は約０．０１ｍｍｏｌ常磁性金属／ｋｇ被験者である、［３０］の方法。
［３７］  癌細胞に有効量の［２５］または［２６］の組成物を投与することを含む、癌細胞に放射線癌治療薬剤を配送する方法。
［３８］  前記組成物を皮下に投与する、［３７］の方法。
［３９］  前記組成物を静脈内に投与する、［３７］の方法。
【外国語明細書】
2016094425000001.pdf