(57)【要約】【課題】メラニンの合成を促進させることができる組成物を提供すること。【解決手段】本発明では、リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成を促進させることを特徴とする組成物を提供する。また、本発明では、リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成におけるＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｋｔ、ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８等の転写因子やシグナル伝達分子をリン酸化させることを特徴とする組成物を提供する。また、本発明では、甘草由来のリクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とすることを特徴とする組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成を促進させることを特徴とする組成物。
【請求項２】
リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成におけるＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｋｔ、ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８等の転写因子やシグナル伝達分子をリン酸化させることを特徴とする組成物。
【請求項３】
甘草由来のリクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とすることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メラニンの合成を促進させる組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
メラニンは、皮膚や毛球などの内部でメラノサイト（メラニン細胞）によって産生される色素である。このメラニンに関しては、皮膚内で過剰に産生された場合には、シミやソバカスなどの色素沈着の原因となることが知られている。従来においては、シミやソバカスなどの色素沈着の予防や治療を行うために、メラニンの合成を抑制する組成物の研究・開発が活発に行われている（たとえば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−９７９４５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
一方、メラノサイトにおけるメラニン合成能の低下や欠落などによって毛球内でメラニンが良好に産生されない場合には、白髪の原因となることが知られている。また、メラノサイトの消失やメラニン合成能の停止などによって皮膚内でメラニンが良好に産生されない場合には、白斑の原因となることが知られている。
【０００５】
しかしながら、白髪に対しては、カラーリング剤で染めることがほとんどで、予防や治療を行うことが成されておらず、また、白斑に対しては、原因が不明であり、有効な対処方法が確立されていないのが現状である。
【０００６】
そこで、本発明者らは、白髪や白斑の予防や治療を目的として鋭意研究を重ねたところ、メラニンの合成を促進させる組成物に関する本発明に至ったのである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
請求項１に係る本発明では、リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成を促進させることを特徴とする組成物を提供する。
【０００８】
また、請求項２に係る本発明では、リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成におけるＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ａｋｔ、ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）、ｐ３８等の転写因子やシグナル伝達分子をリン酸化させることを特徴とする組成物を提供する。
【０００９】
また、請求項３に係る本発明では、請求項１又は請求項２に係る本発明において、甘草由来のリクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とすることを特徴とする組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
そして、本発明では、以下に記載する効果を奏する。
【００１１】
すなわち、本発明では、メラニンの合成における転写因子やシグナル伝達分子をリン酸化させることで、メラニンの合成を促進させることができる。これにより、メラニン合成能の低下等に起因する白髪や白斑などの予防や治療を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】リクイリチン及びリクイリチゲニンのメラニン合成能。
【図２】リクイリチン及びリクイリチゲニンの細胞毒性評価。
【図３】リクイリチン及びリクイリチゲニンのチロシナーゼ活性評価。
【図４】リクイリチン及びリクイリチゲニンのチロシナーゼ、Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＲＰ）−１及びＴＲＰ−２のタンパク質発現への影響。
【図５】リクイリチン及びリクイリチゲニンのＭｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＴＦ）タンパク質発現への影響。
【図６】リクイリチン及びリクイリチゲニンのＣＲＥＢ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８のリン酸化の誘導。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の実施形態を具体的に説明する。なお、以下の説明は一実施例であり、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００１４】
［実験例１］  メラノーマ培養細胞におけるメラニン合成促進効果の評価
（１）試験方法
マウス由来のメラノーマ細胞Ｂ１６−Ｆ１及びＢ１６−４Ａ５を用いて、リクイリチン、リクイリチゲニンのメラニン合成促進作用を調べた。
【００１５】
（１−１）被験化合物
リクイリチン及びリクイリチゲニンは株式会社常磐植物化学研究所から入手した。
【００１６】
（１−２）細胞の培養方法とリクイリチン及びリクイリチンの処理方法
マウスメラノーマ細胞Ｂ１６−Ｆ１及びＢ１６−４Ａ５の培養は、１０％牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を使用した。各細胞を２４ウェルプレートに１×１０４個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。２４時間後、培地にリクイリチン又はリクイリチゲニンを添加（培地中最終濃度１２．５〜５０μＭ）した。４８時間後、新しい培地に交換し、再度リクイリチン又はリクイリチゲニンを添加し、２４時間培養した。また、ポジティブコントロールとしてα−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）を用いた。
【００１７】
（１−３）細胞中のメラニン量測定法
上記のように培養後、培地を除去し、ウェル中に１Ｎ  ＮａＯＨを１２０μｌ加え細胞を溶解した。細胞溶解液を８０℃、３０分加熱し、メラニンを溶解させた。その後、得られた細胞溶解液を９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（４０５ｎｍ）を測定することでメラニン合成能を評価した。
【００１８】
（２）結果
Ｂ１６−Ｆ１細胞におけるリクイリチン及びリクイリチゲニンのメラニン合成能の結果を図１に示す。メラニン量及び細胞溶解液の写真を見て明らかなように、非処理の細胞（コントロール）と比べて、リクイリチン又はリクイリチゲニン処理した細胞溶解液ではメラニンが増加していることが分かる。また、その効果はリクイリチゲニンの方が強い。また同様な結果がＢ１６−４Ａ５細胞でも確認された。以上の結果から、リクイリチン及びリクイリチゲニンはメラニン合成誘導能を持つことが明らかになった。
【００１９】
［実験例２］  メラノーマ培養細胞における細胞毒性の評価
（１）試験方法
Ｂ１６−Ｆ１細胞を用いて、リクイリチン、リクイリチゲニンの細胞毒性を調べた。
【００２０】
（１−１）リクイリチン及びリクイリチンの処理方法と細胞毒性評価
Ｂ１６−Ｆ１細胞を９６ウェルプレートに２×１０３個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。２４時間後、培地にリクイリチン又はリクイリチゲニンを添加（培地中最終濃度１２．５〜５０μＭ）した。４８時間後、新しい培地に交換し、再度リクイリチン又はリクイリチゲニンを添加し、２４時間培養した。細胞性依存率評価は、３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２,５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＭＴＴ）法を用いた。培養後、各ウェルにＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を１０μｌずつ添加し、４時間培養した。その後、各ウェルに酸性イソパノールを１００μｌずつ加え生成した沈殿を完全に溶解した後、マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（５９５ｎｍ）を測定し、細胞生存率を評価した。
【００２１】
（２）結果
Ｂ１６−Ｆ１細胞におけるリクイリチン及びリクイリチゲニンの細胞毒性評価の結果を図２に示す。コントロールと比べて、リクイリチン又はリクイリチゲニン処理した細胞では細胞生存率には有意な差は見られなかった。この結果から、リクイリチン又はリクイリチゲニンは細胞毒性がなくメラニン合成を誘導していることが確認された。
【００２２】
ここで、メラニンは、細胞内のメラノソームにおいてＬ−チロシンを出発物質として生合成される。一連の合成反応はチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２などの酵素により調節されている。また、これらチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のタンパク質発現には、転写因子であるＭＩＴＦが関与している。ＭＩＴＦは活性化されると核内へ移行し、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２遺伝子のプロモーター領域のＭ−ｂｏｘに結合することにより転写活性を高める。また、ＣＲＥＢはＭＩＴＦ遺伝子の転写調節を担い、ＣＲＥＢはシグナル伝達分子のＡｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８がリン酸化を受けることで活性化される。また、ｐ３８及びＥＲＫは直接的にＭＩＴＦを誘導することも報告されている。
【００２３】
以上に説明した実験例１及び実験例２より、リクイリチン又はリクイリチゲニンは細胞毒性がなくメラニン合成を誘導していることが確認された。しかしながら、メラニン合成能の低下等に起因する白髪や白斑などの予防や治療を行うためにリクイリチン又はリクイリチゲニンを用いる場合、効能の増大や副作用の排除などを行って実用化する必要がある。そのために、リクイリチン又はリクイリチゲニンが上述したメラニンの合成過程のいずれか又はそれ以外において有効に作用しているかを検討することが重要である。そこで、以下に説明する実験例３〜実験例５を行った。
【００２４】
［実験例３］  ｉｎ ｖｉｔｒｏでのチロシナーゼ活性の評価
（１）試験方法
チロシナーゼはメラニン合成の律速酵素として知られており、チロシナーゼ活性が高まるとメラニン合成が促進される。そこでｉｎ ｖｉｔｒｏで、リクイリチン、リクイリチゲニンのチロシナーゼ活性への影響を調べた。
【００２５】
（１−１）ｉｎ ｖｉｔｒｏでのチロシナーゼ活性評価
メラニン生成の中間体である３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−Ｌ− ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｌ−ＤＯＰＡ）を基質として、チロシナーゼによるＤＯＰＡクロム産生量を測定することで評価した。９６ウェルプレートにＬ−ＤＯＰＡ（２．５ｍＭ）９０μｌ及びクイリチン又はリクイリチゲニン２０μｌ（最終濃度１２．５〜５０μＭ）を添加し、さらにマッシュルーム由来のチロシナーゼ（２１．１２５ ｕｎｉｔ／ｍｌ）１２０μｌを加えた。５分後、ＤＯＰＡクロム産生量をマイクロプレートリーダーにて吸光度（４０５ｎｍ）を測定し、チロシナーゼ活性を評価した。
【００２６】
（２）結果
リクイリチン及びリクイリチゲニンのチロシナーゼ活性評価の結果を図３に示す。コントロールと比べて、リクイリチン又はリクイリチゲニンではチロシナーゼ活性に顕著な差は見られなかった。
【００２７】
［実験例４］  メラノーマ培養細胞におけるチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のタンパク質発現への影響
（１）試験方法
Ｂ１６−Ｆ１細胞を用いて、リクイリチン、リクイリチゲニンのチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２などの３酵素のタンパク発現への影響を調べた。
【００２８】
（１−１）リクイリチン及びリクイリチンの処理方法と細胞溶解液の調製
Ｂ１６−Ｆ１細胞を６ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。２４時間後、培地にリクイリチン又はリクイリチゲニンを添加（培地中最終濃度１２．５〜５０μＭ）した。また、ポジティブコントロールとしてα−ＭＳＨを用いた。４８時間後、培養液を除去しリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄した。２００μｌのＲＩＰＡ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（サンタクルズ社）をディッシュに加え、細胞を溶解し溶解液をマイクロチューブに移した。１００００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を細胞溶解液とした。得られた細胞溶解液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイキット（バイオ・ラッド社）を用いた。
【００２９】
（１−２）ウエスタンブロット法による３酵素のタンパク質の検出
上記細胞溶解液中の３酵素のタンパク質の検出は、ウエスタンブロット法を用いて行った。３酵素及びβ−アクチンに対する抗体はサンタクルズ社から入手した。
【００３０】
（２）結果
リクイリチン及びリクイリチゲニンのチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のタンパク質発現への影響を図４に示す。コントロールに比べてリクイリチン及びリクイリチゲニンはチロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のタンパク質発現を誘導した。この時、内部標準として用いたβ−アクチンの発現は大きな差が見られなかった。この結果より、リクイリチン及びリクイリチゲニンのメラニン合成促進能は、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２のタンパク質発現を高めることに起因することが示唆された。
【００３１】
［実験例５］  メラノーマ培養細胞における転写因子及びシグナル伝達分子への影響
（１）試験方法
リクイリチン及びリクイリチゲニンの転写因子（ＭＩＴＦ、ＣＲＥＢ）及びシグナル伝達分子（Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８）への影響を調べた。
【００３２】
（１−１）リクイリチン及びリクイリチンの処理方法と細胞溶解液の調製
Ｂ１６−Ｆ１細胞を６ｃｍディッシュに３×１０５個／ディッシュで播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。２４時間後、ＭＩＴＦの場合は、培地にリクイリチン又はリクイリチゲニンを添加（培地中最終濃度１２．５〜５０μＭ）し、４８時間培養した。Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８の場合は、リクイリチン又はリクイリチゲニンを添加（培地中最終濃度５０μＭ）し、経時間的（０．５、1、２時間）に処理した。また、ポジティブコントロールとしてα−ＭＳＨを用いた。培養後、培養液を除去しＰＢＳで細胞を洗浄した。２００μｌのＲＩＰＡ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒをディッシュに加え、細胞を溶解し溶解液をマイクロチューブに移した。１００００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を細胞溶解液とした。得られた細胞溶解液のタンパク質濃度は、プロテインアッセイキットを用いた。
【００３３】
（１−２）ウエスタンブロット法による転写因子及びシグナル伝達分子タンパク質の検出
上記細胞溶解液中の転写因子及びシグナル伝達分子タンパク質の検出は、ウエスタンブロット法を用いて行った。リン酸化又はトータルＣＲＥＢ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８に対する抗体はＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社から、ＭＩＴＦ及びβ−アクチンに対する抗体はサンタクルズ社から入手した。
【００３４】
（２）結果
リクイリチン及びリクイリチゲニンのＭＩＴＦタンパク質発現への影響を図５に示す。コントロールに比べてリクイリチン及びリクイリチゲニンはＭＩＴＦのタンパク質発現を誘導した。この時、内部標準として用いたβ−アクチンの発現は大きな差が見られなかった。
【００３５】
図６はリン酸化又はトータルＣＲＥＢ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８を調べたものである。ＣＲＥＢ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８はリクイリチン及びリクイリチゲニンの処理後５分よりリン酸化が誘導され、時間経過とともにリン酸化が消失した。以上の結果より、リクイリチン及びリクイリチゲニンはＣＲＥＢ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８のリン酸化を誘導することでＭＩＴＦの活性化を引き起こし、メラニン合成を促進している可能性が示唆された。
【００３６】
以上に説明したように、リクイリチン又はリクイリチゲニンは、細胞毒性がなくメラニン合成を誘導していることが確認された（上記実験例１、２を参照。）。そこで、本発明では、リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成を促進させることを特徴とする組成物を提供する。
【００３７】
また、リクイリチン及びリクイリチゲニンはＣＲＥＢ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８のリン酸化を誘導することでＭＩＴＦの活性化を引き起こし、メラニンの合成を促進させることが確認された（上記実験例３〜５を参照。）。そこで、本発明では、リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成におけるＣＲＥＢ、Ａｋｔ、ＥＲＫ、ｐ３８等の転写因子やシグナル伝達分子をリン酸化させることを特徴とする組成物を提供する。
【００３８】
また、リクイリチンは、甘草フラボノイドの１種であり、リクイリチゲニンはそのアグリコンである。そこで、本発明では、甘草由来のリクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とすることを特徴とする組成物を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成28年9月21日(2016.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成におけるＭＩＴＦ（Microphthalmia-associated Transcription Factor）を活性化させることでメラニンの合成を促進させることを特徴とする組成物。
【請求項２】
チロシナーゼ、ＴＲＰ（Tyrosinase related protein）−１、ＴＲＰ（Tyrosinase related protein）−２のタンパク質発現を高めることによって前記ＭＩＴＦを活性化させることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＣＲＥＢ（cAMP Response Element Binding Protein）、Ａｋｔ、ＥＲＫ（Extracellular Signal-regulated Kinase）をリン酸化させることによって前記チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２のタンパク質発現を高めることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
請求項１に係る本発明では、リクイリチン又はリクイリチゲニンを有効成分とし、メラニンの合成におけるＭＩＴＦ（Microphthalmia-associated Transcription Factor）を活性化させることでメラニンの合成を促進させることを特徴とする組成物を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
また、請求項２に係る本発明では、チロシナーゼ、ＴＲＰ（Tyrosinase related protein）−１、ＴＲＰ（Tyrosinase related protein）−２のタンパク質発現を高めることによって前記ＭＩＴＦを活性化させることを特徴とする請求項１に係る組成物を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
また、請求項３に係る本発明では、ＣＲＥＢ（cAMP Response Element Binding Protein）、Ａｋｔ、ＥＲＫ（Extracellular Signal-regulated Kinase）をリン酸化させることによって前記チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２のタンパク質発現を高めることを特徴とする請求項２に記載の組成物を提供する。