(57)【要約】【課題】データ精度が高いハイパースペクトル画像を取得することができる顕微鏡装置を提供する。【解決手段】顕微鏡装置１は、光源１０、照明光学系２０、結像光学系３０、撮像部４０、分光器５１、ステージ６０、駆動部６１および制御部７０を備える。照明光学系２０は、光源１０から出力された近赤外領域の波長帯域の照明光を集光して観察対象物９０に照射する。結像光学系３０は、観察対象物９０への照明光の照射によって観察対象物９０で生じた透過散乱光に基づいて像を形成する。照明光学系２０が観察対象物９０に照明光を照射する際の集光角度をθとしたときのsinθは、観察対象物９０から透過散乱光を入力する対物レンズ３１の開口数を超えない値に設定される。【選択図】図１
2016057348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
近赤外領域の波長帯域の照明光を出力する光源と、
前記光源から出力された照明光を集光して観察対象物に照射する照明光学系と、
前記観察対象物への照明光の照射によって前記観察対象物で生じた透過散乱光を入力する対物レンズを含み、その対物レンズに入力された透過散乱光に基づいて像を形成する結像光学系と、
前記結像光学系により形成された像を取得する撮像部と、
前記撮像部により取得される像に基づいて、前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を求める分光部と、
を備え、
前記照明光学系が前記観察対象物に照明光を照射する際の集光角度をθとしたときのsinθが、前記観察対象物から透過散乱光を入力する前記対物レンズの開口数を超えない、
顕微鏡装置。
【請求項２】
近赤外領域の波長帯域の照明光を出力する光源と、
前記光源から出力された照明光を集光して観察対象物に照射する照明光学系と、
前記観察対象物への照明光の照射によって前記観察対象物で生じた透過散乱光を入力する対物レンズを含み、その対物レンズに入力された透過散乱光に基づいて像を形成する結像光学系と、
前記結像光学系により形成された像を取得する撮像部と、
前記撮像部により取得される像に基づいて、前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を求める分光部と、
を備え、
前記照明光学系が出力する照明光ビーム径が対物レンズの焦点位置での視野領域と同等以下となる、
顕微鏡装置。
【請求項３】
前記照明光学系が前記観察対象物の上方から前記観察対象物に照明光を照射し、
前記対物レンズが前記観察対象物の下方に設けられている、
請求項１または２に記載の顕微鏡装置。
【請求項４】
前記観察対象物を観察する際に前記照明光学系が前記観察対象物に照射する照明光の光量をバックグラウンド計測時より増大させ、
観察時とバックグラウンド計測時との間における照明光のスペクトルの差異を補正する、
請求項１〜３の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項５】
前記照明光学系が、前記撮像部の露光期間に選択的に前記観察対象物に照明光を照射する、
請求項１〜４の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項６】
前記照明光学系が、シリンドリカルレンズを含み、このシリンドリカルレンズによって前記観察対象物において特定方向に長い領域に照明光を照射し、
前記分光部が、前記特定方向に垂直な方向に前記透過散乱光を分光し、
前記撮像部が、前記特定方向に沿った前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を取得する、
請求項１〜５の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項７】
前記照明光学系が、スリットを含み、このスリットによって前記観察対象物において特定方向に長い領域に照明光を照射し、
前記分光部が、前記特定方向に垂直な方向に前記透過散乱光を分光し、
前記撮像部が、前記特定方向に沿った前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を取得する、
請求項１〜５の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【請求項８】
前記照明光学系が、前記撮像部が感度を有する波長帯域の照明光を選択的に前記観察対象物に照射する、
請求項１〜７の何れか１項に記載の顕微鏡装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
観察対象物を観察する場合、光源から出力された照明光を照明光学系により観察対象物に照射し、観察対象物で生じた透過散乱光を入力する対物レンズを含む結像光学系により観察対象物の像を形成し、その像を撮像部により取得して、その取得した像に基づいて観察を行うことができる（特許文献１〜３を参照）。
【０００３】
特に観察対象物が生体組織（細胞）である場合、可視領域において細胞が透明であることから、近赤外領域の波長帯域の照明光を好適に用いることができる（特許文献１，２を参照）。また、観察対象物の各位置で生じた透過散乱光のスペクトル情報を有するハイパースペクトル画像を取得し、このハイパースペクトル画像に基づいて観察対象物を分析することができる（特許文献２を参照）。
【０００４】
さらに、観察対象物を置かない状態でバックグラウンド計測を行って、光源の出力スペクトル，照明光学系の透過スペクトル，結像光学系の透過スペクトルおよび撮像部の感度スペクトルを含む全体の波長依存性を求め、このバックグラウンド計測により求めた波長依存性に基づいて観察対象物のハイパースペクトル画像における各位置のスペクトル情報を補正することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２０１９８号公報
【特許文献２】特開２０１２−９８１８１号公報
【特許文献３】特開２００７−３３４３１９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
照明光を平行光として観察対象物に照射して該観察対象物の像を取得する場合、バックグラウンド計測時と比べて観察時には、観察対象物から撮像部に到達する透過散乱光の強度は小さくなるので、観察対象物の画像のデータ精度は低くなる。特に観察対象物のハイパースペクトル画像を取得する場合には、観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度は更に小さくなるので、ハイパースペクトル画像のデータ精度は更に低くなる。
【０００７】
このような問題を解消するために、観察時に照明光学系により照明光を集光して観察対象物に照射することが考えられる。この場合、観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度が大きくなることにより、ハイパースペクトル画像のデータ精度が改善することが期待される。しかし、その一方で、集光角度をθとした場合にsinθが対物レンズの開口数を上回る場合には以下の問題が生じる。一般に集光の際に用いられるレンズには反射防止膜等のコーティングが施されたものを使用するが、反射防止膜に対して入射方向が異なる場合は反射防止効果の波長依存性が異なるため、集光照明光のスペクトルは集光角度に対する波長依存性が存在し、集光角度が高いほどそのスペクトルの差異が大きくなる。そのため対物レンズの開口数を超える集光角度で照明光を散乱体に照射するとバックグラウンド計測とは異なるスペクトルをもつ照明光が試料を通って計測されてしまうため該画像のデータ精度の改善が妨げられる場合がある。
【０００８】
また、観察時に照明光学系により照明光を集光して観察対象物に照射する場合、観察対象物の単位面積当たりに照射される照明光量である照明光量密度が大きくなるため計測精度も向上する。一方観察倍率を上げるとその倍率の二乗に反比例して撮像装置に到達する光密度が減少し、その分計測精度が低下する。そのため、細胞観察等高倍率観察が必要な場合に照明光光源の出力を増大させることで計測精度を維持しようとすると強力な照明光に長時間観察対象がさらされることになり、大きな熱ダメージを与えてしまう。
【０００９】
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、データ精度が高いハイパースペクトル画像を取得することができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。また、本発明は、観察対象物に与える熱ダメージを抑制しつつデータ精度が高いハイパースペクトル画像を取得することができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の顕微鏡装置は、(1) 近赤外領域の波長帯域の照明光を出力する光源と、(2) 前記光源から出力された照明光を集光して観察対象物に照射する照明光学系と、(3) 前記観察対象物への照明光の照射によって前記観察対象物で生じた透過散乱光を入力する対物レンズを含み、その対物レンズに入力された透過散乱光に基づいて像を形成する結像光学系と、(4) 前記結像光学系により形成された像を取得する撮像部と、(5) 前記撮像部により取得される像に基づいて、前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を求める分光部と、を備える。さらに、本発明の顕微鏡装置では、前記照明光学系が前記観察対象物に照明光を照射する際の集光角度をθとしたときのsinθが、前記観察対象物から透過散乱光を入力する前記対物レンズの開口数を超えない。または、前記照明光学系が出力する照明光ビーム径が対物レンズの焦点位置での視野領域と同等以下となる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、データ精度が高いハイパースペクトル画像を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】第１実施形態の顕微鏡装置１の構成を示す図である。
【図２】第２実施形態の顕微鏡装置２の構成を示す図である。
【図３】第３実施形態の顕微鏡装置３の構成を示す図である。
【図４】照明光学系２０の集光角度θを説明する図である。
【図５】観察対象物９０を培養液９１に浸潤した状態で観察するための容器９２を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の顕微鏡装置は、(1) 近赤外領域の波長帯域の照明光を出力する光源と、(2) 前記光源から出力された照明光を集光して観察対象物に照射する照明光学系と、(3) 前記観察対象物への照明光の照射によって前記観察対象物で生じた透過散乱光を入力する対物レンズを含み、その対物レンズに入力された透過散乱光に基づいて像を形成する結像光学系と、(4) 前記結像光学系により形成された像を取得する撮像部と、(5) 前記撮像部により取得される像に基づいて、前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を求める分光部と、を備える。さらに、本発明の顕微鏡装置では、前記照明光学系が前記観察対象物に照明光を照射する際の集光角度をθとしたときのsinθが、前記観察対象物から透過散乱光を入力する前記対物レンズの開口数を超えない。または、前記照明光学系が出力する照明光ビーム径が対物レンズの焦点位置での視野領域と同等以下となる。
【００１４】
本発明の顕微鏡装置は、前記照明光学系が前記観察対象物の上方から前記観察対象物に照明光を照射し、前記対物レンズが前記観察対象物の下方に設けられているのが好適である。
【００１５】
本発明の顕微鏡装置は、前記観察対象物を観察する際に前記照明光学系が前記観察対象物に照射する照明光の光量をバックグラウンド計測時より増大させ、観察時とバックグラウンド計測時との間における照明光のスペクトルの差異を補正するのが好適である。
【００１６】
前記照明光学系が、前記撮像部の露光期間に選択的に前記観察対象物に照明光を照射するのが好適である。
【００１７】
前記照明光学系が、シリンドリカルレンズを含み、このシリンドリカルレンズによって前記観察対象物において特定方向に長い領域に照明光を照射し、前記分光部が、前記特定方向に垂直な方向に前記透過散乱光を分光し、前記撮像部が、前記特定方向に沿った前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を取得するのが好適である。
【００１８】
前記照明光学系が、スリットを含み、このスリットによって前記観察対象物において特定方向に長い領域に照明光を照射し、前記分光部が、前記特定方向に垂直な方向に前記透過散乱光を分光し、前記撮像部が、前記特定方向に沿った前記観察対象物の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を取得するのが好適である。
【００１９】
前記照明光学系が、前記撮像部が感度を有する波長帯域の照明光を選択的に前記観察対象物に照射するのが好適である。
【００２０】
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
【００２１】
（第１実施形態）
図１は、第１実施形態の顕微鏡装置１の構成を示す図である。顕微鏡装置１は、光源１０、照明光学系２０、結像光学系３０、撮像部４０、分光器５１、ステージ６０、駆動部６１および制御部７０を備える。
【００２２】
顕微鏡装置１により観察されるべき観察対象物９０は、例えば細胞であり、培養液とともに容器に容れられてステージ６０上に載置される。
【００２３】
光源１０は、近赤外領域の波長帯域の照明光を出力する。光源１０は、広帯域に出力強度を持つものが好適である。光源１０は、例えばハロゲンランプ、キセノンランプ、スーパーコンテニューム光源（ＳＣ光源）が好適である。
【００２４】
照明光学系２０は、光源１０から出力された照明光を集光して観察対象物９０に照射する。照明光学系２０は、コンデンサレンズ２１およびスリット２２を含む。コンデンサレンズ２１は、光源１０から出力された照明光を収斂させて、その照明光をスリット２２に入射させる。スリット２２は、特定方向に長い形状の開口を有し、コンデンサレンズ２１から到達した照明光のうち開口を通過する照明光を観察対象物９０に照射する。これにより照明光学系２０は、観察対象物９０において特定方向に長い領域に照明光を照射することができる。
【００２５】
照明光学系２０は、光源１０の形状等が撮像部４０に映り込むことを防止する為に、集光位置が観察対象物９０に存在せずに観察対象物９０より上方または下方に存在するようにするのが好ましい。観察対象物９０に照射される照明光の光量がバックグラウンド計測と比較して減少しにくい点で、照明光の集光位置が観察対象物９０より光源１０側に存在するようにするのがさらに望ましい。
【００２６】
結像光学系３０は、観察対象物９０への照明光の照射によって観察対象物９０で生じた透過散乱光に基づいて像を形成する。結像光学系３０は、対物レンズ３１および結像レンズ３２を含む。対物レンズ３１は、観察対象物９０への照明光の照射によって観察対象物９０で生じた透過散乱光を入力する。結像レンズ３２は、対物レンズ３１とともに、対物レンズ３１に入力された透過散乱光に基づいて像を形成する。スリット２２が特定方向に長い形状の開口を有することに対応して、結像光学系３０により形成される像は特定方向に長い。
【００２７】
分光器５１は、結像光学系３０により形成された特定方向に長い像を入力し、特定方向に垂直な方向に透過散乱光を分光する。分光器５１は、プリズムやグリズム等の分光素子を含む。
【００２８】
撮像部４０は、特定方向に沿った観察対象物９０の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度を取得する。撮像部４０は、近赤外帯域に感度をもつカメラ等であれば良く、ＩｎＧａＡｓ、ＨｇＣｄＴｅ等の２次元素子を備えるカメラが好適である。撮像部４０が取得する像は、上記特定方向については観察対象物９０上の位置を表し、上記特定方向に垂直な方向については波長を表す。
【００２９】
ステージ６０は、観察対象物９０である細胞および培養液を入れた容器を載置する。ステージ６０は、駆動部６１により駆動されて、対物レンズ３１の光軸に垂直な２方向に移動が可能であり、対物レンズ３１の光軸に平行な方向にも移動が可能である。
【００３０】
制御部７０は、駆動部６１に対してステージ６０の移動を制御し、撮像部４０に対して画像の取得を制御する。特に、制御部７０は、対物レンズ３１の光軸および上記特定方向の双方に垂直な方向にステージ６０を移動させるとともに、その移動の際の各位置において撮像部４０により像を取得させる。このようにすることで、観察対象物９０のハイパースペクトル画像を取得することができる。
【００３１】
また、光源１０または照明光学系２０は、観察対象物９０への照明光の照射および遮断をするシャッタを備えるのが好適であり、また、観察対象物９０への照明光の照射光量を調整するＮＤフィルタを備えるのが好適である。制御部７０は、これらのシャッタまたはＮＤフィルタを調整することで、照明光学系２０による照明光の照射を制御する。また、制御部７０は、シャッタの開閉と撮像部４０による撮像とを互いに同期させて、撮像部４０の露光期間に選択的に観察対象物９０に照明光を照射するよう制御するのも好適である。
【００３２】
照明光を平行光として観察対象物９０に照射して該観察対象物９０の像を取得する場合、対物レンズ３１による観察視野が狭いと、充分な照明光量を確保するのは困難であり、観察対象物９０の画像のデータ精度は低くなる。特に観察対象物９０のハイパースペクトル画像を取得する場合には、観察対象物９０の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度は更に小さくなるので、ハイパースペクトル画像のデータ精度は更に低くなる。
【００３３】
観察時に照明光学系２０により照明光を集光して観察対象物９０に照射する場合、観察対象物９０の各位置で生じた透過散乱光の各波長成分の強度が大きくなり、ハイパースペクトル画像のデータ精度が改善することが期待される。また、視野幅に対して対物レンズの焦点面での照明光照射領域の最大長さが５倍以内であれば試料への熱ダメージも少なく好適である。しかし、その一方で、照明光学系２０が観察対象物９０に照明光を照射する際の集光角度が大きすぎると、照明光学系２０と観察対象物９０との間の距離が小さくなるので、照明光学系２０と容器との間の物理的な干渉が生じ易くなり、また、得られるハイパースペクトル画像におけるスペクトル情報に容器や培養液のスペクトル情報が多く含まれることになる。
【００３４】
そこで、本実施形態では、照明光学系２０が観察対象物９０に照明光を照射する際の集光角度をθとしたときのsinθは、観察対象物９０から透過散乱光を入力する対物レンズ３１の開口数を超えない値に設定される。このようにすることで、バックグラウンド計測を行う際に撮像部に入射しない対物レンズの開口数を超える照明光が試料観察時に試料内で散乱されて撮像部に入射し計測データに混入することを防ぐことができ、データ精度が高いハイパースペクトル画像を取得することができる。なお、図４に示されるように、集光角度θは、最大光束密度の１０％となる光束が集光する角度の１／２とする。
【００３５】
従来では、透過配置でハイパースペクトル画像を取得しようとする場合、バックグラウンド計測を行う際には、空隙した状態または容器のみを設置した状態で計測を行うことから、受光光量が観察時と比較して多くなり、ダイナミックレンジの設定や照明光量等が試料計測のために適切に設定できなくなる問題がある。簡易的な解決手段としては、光源１０の出力をバックグラウンド計測と試料観察時とで変更することが考えられるが、光源１０の出力を変更すると、光源スペクトルが変化してしまう問題がある。
【００３６】
そこで、本実施形態では、観察対象物９０を観察する際に光源１０の出力は変更せずに照明光学系２０が観察対象物９０に照射する照明光の光量をバックグラウンド計測時より増大させ、観察時とバックグラウンド計測時との間における照明光のスペクトルの差異を補正するのが好ましい。このようにすることで、上記の問題を解消することができる。具体的には、可能な限り波長特性のないＮＤフィルタを用い、このＮＤフィルタの透過波長特性を予め計測し、その透過スペクトルデータを登録した上で、バックグラウンド計測時と試料観察時との間で照明光の光量及び照明光スペクトルの補正を合わせて行う。また、ＮＤフィルタを用いない場合は、予め光源１０の出力の変更に応じたスペクトルの変動データを取得し、そのスペクトルデータを登録した上でバックグラウンド計測時と試料観察時との間で照明光の光量及び照明光スペクトルの補正を合わせて行うとしても良い。
【００３７】
本実施形態では、照明光学系２０は、スリット２２によって観察対象物９０において特定方向に長い領域に照明光を照射するのが好ましい。このように、観察対象物９０の限られた領域のみに照明光を照射することにより、観察対象物９０に与える熱ダメージを軽減することができる。例えば、スリット２２の開口の長手方向（特定方向）についての照明光の集光角度をαとしたときのsinαが０.１であり、スリット２２の特定方向に垂直な幅方向についての照明光の集光角度をβとしたときのsinβが０.０２であり、対物レンズ３１のＮＡが０.１５であるとする。この場合、スリット２２によって照明光は減光されないが、観察対象物９０に照射される照明光は概ね１／５程度の領域に限定され、観察対象物９０を走査して計測する場合には観察対象物９０への熱ダメージも概ね１／５程度に減少させることができる。
【００３８】
本実施形態では、照明光学系２０は、撮像部４０の露光期間に選択的に観察対象物９０に照明光を照射するのが好ましい。このように、撮像部４０の露光期間以外の期間には観察対象物９０に照明光を照射せず、撮像する時間のみ照明光を照射することにより、観察対象物９０に与える熱ダメージを軽減することができる。
【００３９】
また、本実施形態では、照明光学系２０は、撮像部４０が感度を有する波長帯域の照明光を選択的に観察対象物９０に照射するのが好ましい。このように、観察に寄与しない帯域の光を観察対象物９０に照射しないようにすることにより、観察対象物９０に与える熱ダメージを軽減することができる。
【００４０】
（第２実施形態）
図２は、第２実施形態の顕微鏡装置２の構成を示す図である。図１に示された第１実施形態の顕微鏡装置１の構成と比較すると、図２に示される第２実施形態の顕微鏡装置２は、分光器５１に替えて分光フィルタ５２を備える点で相違し、また、照明光学系２０がスリット２２を含まない点で相違する。
【００４１】
分光フィルタ５２は、コンデンサレンズ２１と観察対象物９０との間の光路上に設けられている。分光フィルタ４２は、光源１０から出力される照明光のうちから各波長成分を順次に選択して透過させ、その選択した波長成分の照明光を観察対象物９０に照射する。なお、分光フィルタに替えて音響光学素子フィルタ等を用いてもよい。
【００４２】
制御部７０は、分光フィルタ５２による波長選択と撮像部４０による撮像とを互いに同期させて制御する。すなわち、制御部７０は、分光フィルタ５２により各波長成分の照明光を観察対象物９０に照射しているときに、結像光学系３０により形成された観察対象物９０の像を撮像部４０に取得させる。このようにすることで、観察対象物９０のハイパースペクトル画像を取得することができる。
【００４３】
本実施形態でも、照明光学系２０が観察対象物９０に照明光を照射する際の集光角度をθとしたときのsinθは、観察対象物９０から透過散乱光を入力する対物レンズ３１の開口数を超えない値に設定される。このようにすることで、データ精度が高いハイパースペクトル画像を取得することができる。
【００４４】
また、本実施形態でも、観察対象物９０を観察する際に照明光学系２０が観察対象物９０に照射する照明光の光量をバックグラウンド計測時より増大させ、観察時とバックグラウンド計測時との間における照明光のスペクトルの差異を補正するのが好ましい。照明光学系２０は、撮像部４０の露光期間に選択的に観察対象物９０に照明光を照射するのが好ましい。また、照明光学系２０は、撮像部４０が感度を有する波長帯域の照明光を選択的に観察対象物９０に照射するのが好ましい。
【００４５】
（第３実施形態）
図３は、第３実施形態の顕微鏡装置３の構成を示す図である。図１に示された第１実施形態の顕微鏡装置１の構成と比較すると、図３に示される第３実施形態の顕微鏡装置３は、正立配置に替えて倒立配置の構成を有する点で相違し、また、照明光学系２０がスリット２２に替えてシリンドリカルレンズ２３を含む点で相違する。
【００４６】
照明光学系２０は、コンデンサレンズ２１およびシリンドリカルレンズ２３を含む。コンデンサレンズ２１は、光源１０から出力された照明光を収斂させて、その照明光をシリンドリカルレンズ２３に入射させる。シリンドリカルレンズ２３は、コンデンサレンズ２１から到達した照明光を一方向についてのみ集光して、その照明光を観察対象物９０に照射する。これにより照明光学系２０は、観察対象物９０において特定方向に長い領域に照明光を照射することができる。
【００４７】
制御部７０は、駆動部６１に対してステージ６０の移動を制御し、撮像部４０に対して画像の取得を制御する。特に、制御部７０は、対物レンズ３１の光軸および上記特定方向の双方に垂直な方向にステージ６０を移動させるとともに、その移動の際の各位置において撮像部４０により像を取得させる。このようにすることで、観察対象物９０のハイパースペクトル画像を取得することができる。
【００４８】
本実施形態でも、照明光学系２０が観察対象物９０に照明光を照射する際の集光角度をθとしたときのsinθは、観察対象物９０から透過散乱光を入力する対物レンズ３１の開口数を超えない値に設定される。このようにすることで、データ精度が高いハイパースペクトル画像を取得することができる。
【００４９】
また、本実施形態でも、観察対象物９０を観察する際に照明光学系２０が観察対象物９０に照射する照明光の光量をバックグラウンド計測時より増大させ、観察時とバックグラウンド計測時との間における照明光のスペクトルの差異を補正するのが好ましい。照明光学系２０は、撮像部４０の露光期間に選択的に観察対象物９０に照明光を照射するのが好ましい。また、照明光学系２０は、撮像部４０が感度を有する波長帯域の照明光を選択的に観察対象物９０に照射するのが好ましい。
【００５０】
本実施形態の顕微鏡装置３は倒立配置の構成を有している。すなわち、照明光学系２０は観察対象物９０の上方から観察対象物９０に照明光を照射し、対物レンズ３１は観察対象物９０の下方に設けられている。
【００５１】
図１および図２に示されるような正立配置の構成では、下方から照射される照明光は、観察対象物（細胞）９０および培養液のうち先ず観察対象物９０に入射する。これに対して、図３に示されるような倒立配置の構成では、上方から照射される照明光は、観察対象物９０および培養液のうち先ず培養液に入射する。したがって、倒立配置の構成では、水を主成分とする培養液及び細胞にとって有害な波長成分が減衰された上で、照明光が観察対象物９０である細胞に照射されるので、観察対象物９０に与える熱ダメージを軽減することができる。
【００５２】
（第４実施形態）
また、第３実施形態に示す倒立配置の構成において、図５に示されるように、観察対象物９０である細胞を培養液９１などに浸潤した状態で観察するための容器９２に観察対象物９０を保持して観察する際には、容器９２の上端開口部の内部に収まる最大円の半径をｒとし、容器９２の内部の高さをｈとしたときに、sinβ＝ｒ／(ｒ2＋ｈ2)1/2 となるβを照明集光角度が超えない場合には、容器９２の側面のスペクトルが混在する可能性が低くなり、計測精度を向上させることができる。
【００５３】
また、試料サイズ２ａが既知であれば、sinγ＝(ｒ−ａ)／((ｒ−ａ)2＋ｈ2)1/2 となるγを照明集光角度が超えない場合には、容器９２の側面のスペクトルが混在する可能性がさらに低くなるので、計測精度をさらに向上させることができる。
【００５４】
（変形例）
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、種々の変形が可能である。上記の各実施形態では、空間方向に波長情報を直接的に取得した例（第１および第３実施形態）、および、時間方向に波長情報を直接的に取得した例（第２実施形態）を示したが、本発明は、波長情報のフーリエ変換であるインターフェログラムを取得した後にフーリエ変換することにより波長情報を得ることとしてもよい。
【符号の説明】
【００５５】
１〜３…顕微鏡装置、１０…光源、２０…照明光学系、２１…コンデンサレンズ、２２…スリット、２３…シリンドリカルレンズ、３０…結像光学系、３１…対物レンズ、３２…結像レンズ、４０…撮像部、５１…分光器、５２…分光フィルタ、６０…ステージ、６１…駆動部、７０…制御部、９０…観察対象物、９１…培養液、９２…容器。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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