(57)【要約】【課題】身体に負荷が少なく，血中尿毒素を軽減させる，慢性腎不全の予防または治療が可能な薬剤などの経口摂取物の開発。【解決手段】水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，慢性腎不全を予防または治療することを特徴とする経口摂取物。本発明では，経済的な負荷とＱＯＬの低下を伴う慢性腎不全患者，さらには糖尿病性腎症の他あらゆる原因に由来する慢性腎不全患者に対して，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有する経口摂取物を摂取させることにより，体への負荷を少なくするとともに，血中尿毒素を軽減させ，慢性腎不全の予防または治療が可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，慢性腎不全を予防または治療することを特徴とする経口摂取物
【請求項２】
水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，血中インドキシルを低下させることを特徴とする経口摂取物
【請求項３】
水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，血中酸化アルブミンを低下させることを特徴とする経口摂取物
【請求項４】
水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，BUNを低下させることを特徴とする経口摂取物
【請求項５】
水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，血清クレアチニンを低下させることを特徴とする経口摂取物
【請求項６】
添加物としてシクロデキストリン化合物を含有することを特徴とする請求項１から５に記載の経口摂取物
【請求項７】
前記シクロデキストリン化合物が，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリン，γ−シクロデキストリンのいずれか又は複数から選択されることを特徴とする請求項６に記載の経口摂取物
【請求項８】
前記水酸化フラーレン誘導体が，ナノ粒子化したコロイド溶液であることを特徴とする請求項１から７に記載の経口摂取物
【請求項９】
前記水酸化フラーレン誘導体において，フラーレン類に結合する水酸基が単位フラーレン類あたり10から40であることを特徴とする請求項１から８に記載の経口摂取物
【請求項１０】
水酸化フラーレン誘導体の有効量が１日あたり0.1から1.0gであることを特徴とする請求項１から９に記載の経口摂取物
【請求項１１】
ヒトから血液を採取し，採取した血液中の血中インドキシル硫酸濃度，血中酸化アルブミン濃度のいずれか又は複数を測定することにより，慢性腎不全の重症度を判断することを特徴とする診断方法
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，水酸化フラーレンを有効量含有する，慢性腎不全の予防または治療のための経口摂取物に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性腎不全は，腎臓の慢性的な病気のために腎臓の機能が徐々に低下し，腎機能が正常時の30％以下程度に落ちた状態をいう。
【０００３】
慢性腎不全においては，腎臓が通常担っている，老廃物，水分，電解質などを尿として排泄することで体の中の恒常性を保つ機能が，低下してしまう。そのため，本来なら尿中に排泄される尿毒素が，体内に蓄積され，尿毒症状があらわれる。この尿毒症により，慢性腎不全の初期の段階では疲労感などの症状が現れる。さらに尿毒症が進み体内に尿毒素が蓄積すると，食欲不振，吐き気などの消化器症状，頭痛，注意力散漫などの神経系の症状があらわれ，さらに進行すると，けいれんや意識障害を起こす。
慢性腎不全のもう一つの症状として，腎機能の低下により尿量が減るという症状がある。この尿量減少により，むくみが生じたり，血圧が上昇するなどし，さらには，酸の排泄能力が低下し血液が酸性に傾くアシドーシスを発症することがある。加えて，高カリウム血症を生じ，エリスロポエチン（造血ホルモン）の分泌減少により貧血になったりする。
【０００４】
これら尿毒症状や尿量減少など，慢性腎不全の症状が進行して末期腎不全に至ると，腎臓の機能が極度に低下し，そのままでは生命を維持できなくなってしまう。慢性腎不全には，腎臓移植を除いて根治的な治療方法がなく，また，我が国において腎臓移植数は未だ多くはないため，末期腎不全の患者の多くは，人工透析が必要になってくる。
わが国の人工透析患者数は年々増加し，2005年末には25万人を突破した。また，これを反映して，腎不全に関する医療費は，糖尿病全体の医療費とほぼ等しく，年間約１兆5千億円にものぼる。この医療費の額は，実に医療費全体の約5%を占めている。そのため，保存期腎不全を適切に管理し，透析への移行を減らすような予防的医療が，生活の質（QOL）の向上だけでなく，医療経済的な観点からも切望されている。
【０００５】
人工透析患者においては，死亡原因の第1位が心不全，心筋梗塞といった，いわゆる心血管疾患（CVD）である。そのため，透析予備軍である慢性腎不全患者に対しては，腎機能障害の進展抑制に加え，CVDのリスク管理を加味した治療戦略が重要視されてきている。事実，透析導入前の腎不全段階においても，血管内皮の肥厚を始めとした種々の血管傷害を生じていることが数多く報告されている。そのため，腎不全患者におけるCVDのマネージメントは，いかに血管傷害を抑制するかに重点が置かれている。
【０００６】
人工透析患者にCVDが多い背景として，腎不全が代表的な酸化ストレス疾患であるということが挙げられる。
すなわち，腎不全においては，腎機能の悪化に，活性酸素種（ROS）の過剰産生に起因した酸化ストレスが重要な役割を果たしていることが，数多くの報告から明らかにされている（非特許文献１）。事実，酸化ストレスは，血管平滑筋細胞の肥大や増殖，細胞間物質の遊走や調節に関わっており，動脈硬化症，血管再狭窄を引き起こす要因の1つと位置付けられている（非特許文献２,非特許文献３）。そのため，これまでの抗酸化治療としては,ビタミンCあるいはE製剤を始めとしたROSスカベンジャーの投与や，グルタチオン，スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）類似物質といった細胞内抗酸化物質を用いて，いかにROSを消去するかという点に関心が集まっていた（非特許文献４,非特許文献５）。しかしながら，これらの抗酸化剤ではCVDの発症及び腎不全の進行を抑制するという明確なエビデンスは得られておらず，現在ではむしろROSの発生を抑制するような新しいタイプの抗酸化剤の開発が望まれている。
【０００７】
腎不全時に惹起される酸化ストレスの機序については,生理的，物理的，病態的因子など,様々なものが提唱されているが，他の酸化ストレス疾患と大きく異なる点は，いわゆる“尿毒症物質”と称される体内反応代謝産物の尿中排泄が遅延し，それに伴う蓄積が酸化ストレスをさらに惹起している点である。近年，特に，有機アニオン性尿毒症物質との関係が少しずつ明らかにされ注目を集めているおり，代表的な1つが,インドキシル硫酸（IS）である。
ISは,食事中のタンパク質の代謝産物と考えられており，消化管で前駆物質のインドールが吸収された後，肝臓で硫酸抱合を受けて生成される。血中においてISは，大部分がアルブミンと結合した形で存在しており，代謝を受けずに主に腎臓から排泄される。そのため，腎機能の低下によりISは，血清中に高濃度に蓄積するようになり，人工透析患者では血中濃度が正常時の100倍近くまで増加することもある（非特許文献６）。また最近，ISが尿細管上皮細胞やメサンギウム細胞において，ROSの産生を誘導する可能性が明らかになっており，腎におけるISと酸化ストレスの関係に注目が集まっている（非特許文献７,非特許文献８）。さらに，生体内で大部分のISが存在している血中，すなわち全身循環系においてもISの血中への蓄積が,好中球活性化や内皮細胞内への取り込みによるNADPHオキシダ−ゼの活性化による酸化ストレスを惹起している可能性が明らかにされている（非特許文献９）。
【０００８】
このように腎不全の病態には，ISなどを一因として，多種多様な酸化ストレスが大きく関与していることは明らかである。この酸化ストレスについては，腎不全だけでなく酸化ストレス疾患の酸化度合の測定法が確立されている。この測定法においては，血液中の酸化ストレス変動に最も敏感なアルブミンの酸化状態を指標として，健常人から各種疾患患者まで幅広い範囲で酸化ストレスの測定が可能である（非特許文献１０）。また，このアルブミンが酸化された状態である酸化アルブミンは，自ら酸化されるだけでなく，血液中の好中球を活性化し，生体内酸化をさらに促進させる可能性が明らかにされている（非特許文献１１）。
【０００９】
一方，腎不全の治療方法としては，腎移植を除いて根治的な治療が無いことから，その症状の進行を遅らせることを目的として，食事療法や薬物療法が行われている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Mastalerz-Migas et al., J Physiol Pharmacol 57: 199-205 (2006), Sasaki et al., J Pharm Pharmacol 58: 1515-25 (2006)
【非特許文献２】Rajagopalan et al., J Clin Invest 98: 2572-9 (1996), Weberet al., Circ Res 94: 1219-26 (2004)
【非特許文献３】Taniyama et al., Hypertension 42: 1075-81 (2003)
【非特許文献４】McCord et al, Drug Discov Today 9: 781-2 (2004)
【非特許文献５】Day et al., Drug Discov Today 9: 557-66 (2004)
【非特許文献６】Niwa et al., J Lab Clin Med 124: 96-104 (1994)
【非特許文献７】Gelasco et al., Am J Physiol Renal Physiol 290: 1551-8 (2006)
【非特許文献８】Motojima et al., Kidney Int 63: 1671-80 (2003)
【非特許文献９】Shimoishi et al., Pharm Res 24:1283-9 (2007)
【非特許文献１０】Anraku et al., Kidney Int. 66:841-8 (2004)
【非特許文献１１】Mera et al., Biochem Biophys Res Commun. 334:1322-8 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
食事療法としては，蛋白質，塩分，カリウム，リンの摂取を制限した食事療法が行われる。この場合，蛋白質制限により相対的に摂取カロリーが減少するため，油脂系を主体とした高カロリー食も適用される。
食事療法における食事は，必ずしも美味しいものとはいえず，患者によっては，食事を取ること自体が苦痛になる場合も多い。また，水分に関しては適切な量の摂取が必要であるが，一般的には制限される場合が多い。そのうえ，カリウム，リンが多く含まれている野菜・果実は摂取が制限されてしまう。これらのことから，腎不全の食事療法を行う場合，食物繊維の摂取不足となり，多くの患者が重度の便秘の症状で苦しんでいる実態がある。
【００１２】
薬物治療に関しては，慢性腎不全の進行を遅らせることと，合併症を予防する観点で薬剤が処方され，降圧薬，利尿薬，クレメジン，活性型ビタミンＤ，リン吸着薬，カリウム吸着薬，エリスロポエチン製剤，重炭酸ナトリウム，ステロイド・免疫抑制剤，抗酸化薬等がある。特に経口吸着炭薬クレメジンは，腎臓に負担となるような尿毒症を直接吸着・排泄する活性炭を主体とした製剤であり，一般的に処方されるが，カプセルの場合には，１日30カプセルという大量を服用しなければならず，患者に多くの苦痛と負担が生じる。
【００１３】
このように，慢性腎不全においては，過酷でおいしくない食事療法を続けなければならないこと，その副作用による重度の便秘，投薬による負荷，さらに症状が進行した場合は人工透析か腎臓移植を行わなければならず，患者には経済的負担増加とともに，ＱＯＬが著しく低下する。このため，体に負荷のかからず，血中の尿毒素の量を軽減する慢性腎不全予防・治療食品および予防・治療剤が求められている。
上記事情を背景として本発明では，身体に負荷が少なく，血中尿毒素等を軽減させる，慢性腎不全の予防または治療が可能な薬剤などの経口摂取物の開発を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは，鋭意研究の結果，水酸化フラーレンナノコロイド溶液の経口摂取により，腎機能の指標である血清クレアチニン濃度を低下させるだけでなく，生体内酸化促進効果を持つ尿毒症物質であるインドキシル硫酸濃度及び血液中酸化の指標である酸化アルブミンを著しく低減させることを見出し，本発明を完成させた。
さらに発明者らは，経口摂取物の発明完成の過程において，インドキシル硫酸と酸化アルブミンが相関関係にあり，腎不全の症状と関連性を有することを見出し，この知見から，血中のインドキシル硫酸ないし酸化アルブミンを測定することにより，腎不全の重症度を測る診断法の発明を完成させた。
本発明は，以下の構成からなる。
【００１５】
本発明の第一の構成は，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，慢性腎不全を予防または治療することを特徴とする経口摂取物である。
本発明の第二の構成は，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，血中インドキシルを低下させることを特徴とする経口摂取物である。
本発明の第三の構成は，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，血中酸化アルブミンを低下させることを特徴とする経口摂取物である。
本発明の第四の構成は，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，BUNを低下させることを特徴とする経口摂取物である。
本発明の第五の構成は，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有し，血清クレアチニンを低下させることを特徴とする経口摂取物である。
【００１６】
本発明の第六の構成は，添加物としてシクロデキストリン化合物を含有することを特徴とする第一から第五の構成に記載の経口摂取物である。
本発明の第七の構成は，前記シクロデキストリン化合物が，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリン，γ−シクロデキストリンのいずれか又は複数から選択されることを特徴とする第六の構成に記載の経口摂取物である。
本発明の第八の構成は，前記水酸化フラーレンが，ナノ粒子化したコロイド溶液であることを特徴とする第一から第七の構成に記載の経口摂取物である。
【００１７】
本発明の第九の構成は，前記水酸化フラーレン誘導体において，フラーレン類に結合する水酸基が単位フラーレン類あたり10から40であることを特徴とする第一から第八の構成に記載の経口摂取物である。
本発明の第十の構成は，水酸化フラーレン誘導体の有効摂取量が１日あたり0.1から1.0gであることを特徴とする第一から第九の構成に記載の経口摂取物である。
本発明の第十一の構成は，ヒトから血液を採取し，採取した血液中の血中インドキシル硫酸濃度，血中酸化アルブミン濃度のいずれか又は複数を測定することにより，慢性腎不全の重症度を判断することを特徴とする診断方法である。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により，身体に負荷が少なく，血中尿毒素等を軽減させる，慢性腎不全の予防または治療が可能な薬剤などの経口摂取物の提供が可能となった。
すなわち，経済的な負荷とＱＯＬの低下を伴う慢性腎不全患者，さらには糖尿病性腎症の他あらゆる原因に由来する慢性腎不全患者に対して，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有する経口摂取物を摂取させることにより，体への負荷を少なくするとともに，血中尿毒素を軽減させ，慢性腎不全の予防または治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】水酸化フラーレン摂取4週後のインドキシル硫酸濃度変化
【図２】水酸化フラーレン摂取4週後の酸化ストレス変化
【図３】水酸化フラーレン摂取4週後のクレアチニン変化
【図４】水酸化フラーレン摂取4週後のBUN変化
【図５】水酸化フラーレンのインドールの吸着量
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の水酸化フラーレン誘導体を有効量含有する経口摂取物として，薬剤を例にとり説明を行う。
【００２１】
本発明に使用する水酸化フラーレン誘導体は，フラーレン類に水酸基を付加した化合物として定義される。また，フラーレン類は，5員環および6員環から構成される単位炭素数60個（以下，C60）のフラーレンをはじめとして，その疎水性から分子内にインドールを吸着しうるフラーレンであれば特に限定する必要はなく，C70，C74など，C60より多い単位炭素数を有するフラーレンを採用することができる。
本発明においては，水酸化フラーレン誘導体が消化管内において，インドールを吸着することにより，血中のインドキシル硫酸濃度を顕著に抑制するだけでなく，酸化ストレスの亢進も抑制することが可能となる。また，血清クレアチニンや血液尿素窒素（BUN）なども低下させる。結果として，腎不全の予防・回復に効果を発揮することが可能となる。
【００２２】
水酸化フラーレン誘導体において水酸基は，フラーレン自体の自己凝集を防ぐとともに，親水基の導入により他の添加物との親和性を向上させ，薬剤としての取扱性や薬物動態を向上させる機能を果たす。そのため，水酸化フラーレン誘導体においては，これらの機能を果たすべく，薬効の発揮や薬剤の剤型などにより，水酸基の割合を適宜調整することが可能である。水酸基の割合として，例えば，炭素60個あたり，10程度の水酸基があればよく，好ましくは40個以下とすることができる。
単位炭素当たりの水酸基の調整については，従来用いられる種々の方法を用いることができるが，例えば，30％過酸化水素中で反応温度を40℃から80℃，反応時間を４日間以上とするなどして，比較的，水酸基付加数の多い水酸化フラーレン誘導体を製造することができる。
【００２３】
本発明において，水酸化フラーレン誘導体に加え，シクロデキストリン化合物を添加物として用いることが好ましい。これにより，本発明の水酸化フラーレン誘導体をナノ粒子化したコロイド状とすることが容易になり，液体の経口薬剤として用いることが可能となることから，薬剤としての取扱性を向上させる効果を有する。
本発明に用いるシクロデキストリン化合物については，人体への毒性が低く安全性の高いシクロデキストリン化合物を用いればよく，例えば，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリンやγ−シクロデキストリンなどが挙げられる。
シクロデキストリン化合物としては，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリンを用いることが最も好ましい。これにより，水酸化フラーレン誘導体の薬剤としての安定性を，より向上させる効果を有する。
加えて，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリンを用いて水酸化フラーレン誘導体と物理混合で調製することにより，DLSにより水酸化フラーレン誘導体の平均粒子径を測定することが可能となる。
【００２４】
水酸化フラーレン誘導体は，ナノ粒子化したコロイド状のものを用いることが好ましい。これにより，液体の経口薬剤として用いることが可能となることから，薬剤としての取扱性を向上させる効果を有する。
粒子径としては，水酸化フラーレン誘導体の水酸化率や剤型により適宜調整することが可能であり，好ましくは100nmとすることができる。この場合，水酸化フラーレン誘導体を，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリンと減圧下，4〜15℃で３時間以上混合粉砕することで得ることができる。
【００２５】
本発明の薬剤は，消化管内において作用を発揮するというメカニズムから経口剤として調製する必要がある。そのため，本発明の薬剤においてその剤型は，経口摂取が可能な限り特に限定する必要はなく，錠剤や液剤，カプセル剤など種々の剤型を採用することができる。
一つの例として，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリンにより水酸化フラーレン誘導体ナノコロイド溶液を調製し，これをそのままもしくはカプセル剤として飲用摂取するなどすることができる。
【００２６】
本発明の薬剤の投与量については，安全性等を勘案して薬剤としての薬効を発揮しうるに十分な量として適宜調整することができる。その他，患者の症状の重さや体格など，種々の観点から調整が可能である。
投与量の一例として，成人1日あたり，有効成分1gを，3回に分割して服用するなどが挙げられるが，当然のことながらこれに限定する意図ではない。
【００２７】
これまで薬剤を例に挙げ本発明の説明を行ってきたが，本発明の経口摂取物においては，必ずしも薬剤に限定する必要はない。経口摂取が可能な構成として，例えば，サプリメントや食材として混合するなど，種々の構成を採用することができる。
【００２８】
このように経口摂取が可能な構成により，水酸化フラーレン誘導体を有効量含有した経口摂取物を，慢性腎不全患者や糖尿病患者など，腎機能が低下し始めたヒトに経口摂取させることができる。これにより，消化管内で産生された尿毒症前駆物質であるインドールを水酸化フラーレン誘導体が吸着し，インドールが糞中に排泄される。結果として，慢性腎不全患者等の尿毒症症状の改善及び透析導入を遅延させることが可能となる。
また，インドキシル硫酸は，腎のみでなく血中でも酸化ストレスを惹起する。このことから，腎不全においては，先の消化管内での水酸化フラーレン誘導体の吸着により，血中内へのインドキシル硫酸の放出を抑制することが可能となる。その結果，血中の代表的な蛋白質であるアルブミンの酸化物を減少させ，血液内の酸化ストレスの低下にもつながることとなり，最終的にはCVD発症リスクの軽減にもつながる可能性が期待される。
【００２９】
また本発明の診断方法においては，後述する実施例からも明らかなとおり，血中のインドキシル硫酸値と血中酸化アルブミン値が慢性腎不全の病態によく相関し，慢性腎不全の病状診断に有効であることが明らかとなっている。この知見から，ヒトにおいて，血液を採取し，その血液中のインドキシル硫酸濃度，酸化アルブミン濃度のいずれか又は複数を測定することにより，慢性腎不全の重症度の診断を可能とするものである。
【実施例】
【００３０】
本発明の経口摂取物について，実施例を用いてさらに詳述する。本実施例では，腎不全モデルラットを用いて，本発明の薬剤の有効性を実証する。
【００３１】
慢性腎不全の予防効果及び治療効果の指標として血中クレアチニン値，血中尿素窒素値等が知られている。
一方，インドキシル硫酸は，体内ではトリプトファン由来のインドールが肝臓で硫酸化されて合成される尿毒症毒素の原因物質で，腎機能低下時において高い血中濃度を示す尿毒症物質である。インドキシル硫酸は，腎障害の進展因子であること，腎の線維化及び糸球体硬化などに関与すること，活性酸素の誘導・ラジカルスカベンジャーの減少を引き起こすことが知られており，腎障害を悪化・進展させるリスク因子として知られている。
さらに，酸化アルブミンは，血液中の酸化ストレス変動に最も敏感なアルブミンの酸化状態を指標とする酸化ストレス疾患のマーカーとして広く使用されている。
本実施例においては，これらの背景から，血中クレアチニン値，尿中タンパク，インドキシル硫酸，酸化アルブミンを，腎不全モデルラットの症状のマーカーとして用いた。
【００３２】
＜Ｉ．薬剤調整＞
水酸化フラーレンは，炭素60個あたり10個の水酸基を有する水酸化フラーレンを購入して用いた。この水酸化フラーレンを，2-ヒドロキシルプロピル-β-シクロデストリンと物理混合後超音波処理，水酸化フラーレンナノコロイド溶液に調製し，試料として用いた（以下，「水酸化フラーレンナノコロイド溶液」）。
【００３３】
＜II．動物試験のプロトコール＞
1．腎不全モデルラットを用いた水酸化フラーレン誘導体の作用
腎臓の５／６を摘出して作製した腎不全ラットに水酸化フラーレンナノコロイド溶液を経口的に摂取させ，その経時的な変動をインドキシル硫酸濃度の変動を含む血液生化学的検査および抗酸化作用により検討した。
2．試験材料および試験方法，試験動物
(1)  日本エスエルシー株式会社で生産および作成された８週齢の５／６腎臓摘出ラットを使用した。
(2)  ８日間の馴化期間中，一般状態の観察と，体重測定を行ない，９週齢で実験に使用した。
(3)  動物は，温度２３±２℃，相対湿度５５±１０％，換気回数１２〜１８回／時間，照射時間１２時間（７：００〜１９：００）に調整されたゲージ内にて飼育し，飼料は放射滅菌した市販の高蛋白粉末飼料を自由に摂取させた。
3．投与方法
(1)  投与液については，実施例が水酸化フラーレン誘導体を有効成分とするコロイド溶液を用いた。比較例として水酸化フラーレンを含まないもの（ネガティブコントロール），クレメジン（ポジティブコントロール）を含むものを用いた。
(2)  腎不全ラット３群（水酸化フラーレン10mg/day，水酸化フラーレン無添加群，クレメジン投与群1g/day）を設定し，動物数は，腎不全ラット群で各4匹とした。
4．試験方法  
血清クレアチニン値が0.8 mg/dl以上を示した固体を群分け後，水酸化フラーレンコロイド溶液をゾンデにより，クレメジンは飼料に混ぜることにより，毎日経口投与し，１か月後に全例剖検した。
5．観察および検査項目
(1)  一般状態ならびに生死の確認を１日１回以上，体重測定を週１回および剖検日に行なった。
(2)  また，群分け２日前，2週間後，４週間後ならびに剖検（１か月）時の３回，尾静脈より採血し，血中クレアチニン，尿中蛋白，インドキシル硫酸濃度および抗酸化作用等の測定を行なった。
(3)  剖検時には，各器官ならびに組織の肉眼的異常の有無を観察した。
【００３４】
＜III．試験成績＞
１．血液生化学的変化の経時的変動
(1)  血液生化学的検査において，血中クレアチニン，尿中アルブミン，インドキシル硫酸の各値は，両分子量水酸化フラーレンの１か月間の給餌によって正常値への回復傾向を示した。これらの結果から，腎不全を発現したラットに対して，水酸化フラーレンは，クレアチニン値およびインドキシル硫酸濃度の増悪化を抑制し，アルブミンの尿細胞における再吸収能を維持しているものといえる。
(2)  インドキシル硫酸濃度の変動についての結果を図１に示す。水酸化フラーレンは，ネガティブコントロールと比較して有意にインドキシル硫酸を低下させ，ポジティブコントロールであるクレメジンと同等程度の低下能を示した。
(3)  酸化ストレスの変化の結果を図２に示す。水酸化フラーレンは，ネガティブコントロールと比較して有意に酸化ストレスを低下させ，ポジティブコントロールであるクレメジンと同等程度の低下能を示した。
(4)  水酸化フラーレンについて，抗酸化作用において，酸化アルブミンの変動により評価した結果，血中クレアチニンならびに尿中アルブミンともに，水酸化フラーレンの１か月間の給餌によって正常値への回復傾向を示した。
(5)  血中クレアチニンならびに血中尿素窒素の変化の結果を，それぞれ図３，図４に示す。いずれのマーカーについても，投与後4週間においてクレメジンと同等まで減少しており，腎機能が改善していることが明らかとなった。
(6)  また，インドキシル硫酸と酸化アルブミンの変動の関連性について検討を行ったところ，インドキシル硫酸濃度の変動と酸化アルブミンの変動間に有意な相関関係が観察されたことから，腎不全を発現したラットに対して，水酸化フラーレンはインドキシル硫酸の血中への放出を抑制することにより血中の抗酸化作用を維持しているものといえる。
2．図１中の結果からも明らかのように，腎不全ラットにおける水酸化フラーレンの投与前後のインドキシル硫酸濃度の上昇は，未添加群（対照群）に比べ有意に少なく，クレメジンと同等の効果を示した。
3．図２中の結果からも明らかのように，腎不全ラットにおける水酸化フラーレンの投与前後の酸化アルブミン変動の測定による酸化ストレスの上昇は，未添加群（対照群）に比べ有意に少なく，クレメジンと同等の効果を示した。
4．インドキシル硫酸濃度の変動と酸化アルブミンの変動間に有意な相関関係が観察された。
5．したがって，これらの試験結果から判断すると，腎不全ラットに対する水酸化フラーレンの投与は，低下した腎機能を回復，または増悪化を抑制するだけでなく，血中の酸化ストレスを抑制するものといえる。
6．図５中の結果からも明らかのように，in vitroにおけるインドールの吸着実験を行ったところ，水酸化フラーレンは，クレメジンと同等の高い吸着作用を有した。
7．本発明の有効成分である水酸化フラーレンを腎不全の治療に用いる場合には，被験者の体格や症状等を勘案して有効性を示す適切な量とすればよいが，例えば，１日０．１〜１ｇを経口的に投与すればよいと考えられる。その場合の投与製剤剤形としては，クレメジンと比べて飲みやすい液剤とすることができる。
8．以上のように本発明は，水酸化フラーレンが消化管内において，インドールを吸着することにより，血中のインドキシル硫酸濃度を顕著に抑制するだけでなく，酸化ストレスの亢進も抑制することによって，低下した腎機能を回復することができる。特に腎不全患者における長期透析患者に合併症として発症するCVDを治療する点においても新規なものであり，その医療上の効果は多大なものであるといえる。
９．加えて，血中インドキシル硫酸値及び／または血中酸化アルブミン値が慢性腎不全の病態によく相関し，慢性腎不全の病状診断に有効であることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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