(57)【要約】      （修正有）【課題】これまでの平衡論的な手法では、相互作用が小さすぎて表面と結合しない分子あるいは分子構造のわずかな違いが検出できない分子を、ポンプ光によって誘起された表面状態を用いることによって動的に定性、定量分析する新規な液中成分分析装置を提供する。【解決手段】溶液中に含まれる成分及び濃度を測定する液中成分分析装置は、測定対象溶質分子を含む溶液を収納する測定セルであってポンプ光を透過可能な測定セルと、前記測定セル中に設置する水晶発振子からなる測定基板と、前記水晶発振子に照射するポンプ光の光源と、前記水晶発振子を駆動する発振回路並びに発振回路の振動数を測定する表面状態測定装置又は前記水晶発振子に振動数変えながら交流信号を印加し発振子の振動数及び損失係数を測定する表面状態測定装置と、前記表面状態測定装置から得られたデータを解析するデータ解析装置とを備える。【選択図】図１
2016080389.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中に含まれる成分及び濃度を測定する液中成分分析装置であって、測定対象溶質分子を含む溶液を収納する測定セルであってポンプ光を透過可能な測定セルと、前記測定セル中に設置する水晶発振子からなる測定基板と、前記水晶発振子に照射するポンプ光の光源と、前記水晶発振子を駆動する発振回路並びに発振回路の振動数を測定する表面状態測定装置又は前記水晶発振子に振動数変えながら交流信号を印加し発振子の振動数及び損失係数を測定する表面状態測定装置と、前記表面状態測定装置から得られたデータを解析するデータ解析装置とを備えることを特徴とする液中成分分析装置。
【請求項２】
前記測定基板の表面が測定対象溶質分子と相互作用する物質で処理されていることを特徴とする請求項１に記載の液中成分分析装置。
【請求項３】
前記ポンプ光の光源が、レーザー光を発生する光源であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の液中成分分析装置。
【請求項４】
前記表面状態測定装置が、水晶発振子マイクロバランス法を用いて測定することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の液中成分分析装置。
【請求項５】
前記データ解析装置が、前記表面状態測定装置のデータを入力し、高次の時間応答関数を用いて得られるパラメータから、溶質分子の定性定量分析を行う解析装置であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の液中成分分析装置。
【請求項６】
前記測定基板に照射する測定光を発生する測定光発生装置と、前記測定基板から反射した前記測定光を測定する光検出装置を備え、前記データ解析装置は、前記光検出装置が授光した授光データを入力してデータを解析することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の液中成分分析装置。
【請求項７】
前記測定基板の表面に光干渉を起こす薄膜を形成させてあることを特徴とする請求項６に記載の液中成分分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポンプ光を用い、水晶発振子表面もしくは光干渉層を有する水晶発振子表面の動的変化から液相の溶質成分の定性・定量分析を行う液中成分分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
液相中の溶質成分の分析を行う方法は多くある。例えば、溶質分子そのものの光吸収、あるいは呈色試薬を用いた分光学的手法、液体クロマトグラフ、溶質クロマトグラフ、質量分析法、あるいはクロマトグラフと質量分析を組み合わせた方法、更にはアナライト選択的なリガンドを結合させた固体基板を用いた水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法、局在表面プラズモン法、反射干渉分光法、エリプソメトリーなどが挙げられる。
以上の内リガンドを用いた固体基板式の検出法では、検出できる分子は単一種であり、非特異的な結合種、あるいは結合定数の異なる異分子を区別することは出来ない。
一方で、クロマトグラフィーでは、吸着固定相と検出分子の相互作用の大きさによって保持時間が異なることを利用することで、多種類の分子の定性と定量が可能である。しかしこの方法では、一回の測定に数分から数十分の時間を要し、溶質成分を常時モニタリングすることは出来ない。しかしながら、特定の化学的・空間構造を持つ固体表面と分子の相互作用の大きさの差を、時間の関数として識別・定量するという原理は、より高感度・多成分分析手法の基本的概念として有効であると考えられる。
【０００３】
ところで物質表面や表面吸着分子が高出力のレーザーによって分解、脱離するレーザーアブレーションと呼ばれる現象は、物質の表面処理、加工等に用いられている。また、中程度の強度のレーザー照射により表面吸着分子をイオン化させることでマススペクトルを測定するレーザー脱離イオン化法による質量分析計は、生体高分子分析等に多くの貢献を果たしてきている。一方でこのような高出力の光に対し、数mW程度の弱い光によって引き起こされる表面現象についてはこれまでほとんど検討されてこなかった。しかし近年、いくつかの研究により、気相においては、表面に吸着した水やアルコールが比較的弱い出力の光によって状態変化を起こし、光照射の停止後、元の状態に戻るという現象が見出されている。この光によって誘起される現象の物理的原因はまだ理解されていないものの、水晶発振子を用いた振動数の変化（非特許文献１）、Ｘ線構造解析による吸着水層の構造変化（非特許文献２）として光誘起現象が検出されている。
非特許文献１では、大気条件下に於ける水晶発振子表面に対するレーザー光照射による振動数上昇と、照射停止後の振動数低下による元の状態への回帰は表面に吸着した低分子の光脱着によるものと議論され、いくつかの種類のアルコールのそれぞれ単独の飽和蒸気下での測定では、レーザー照射開始からの時間変化の時定数が、分子構造に依存して変化していると報告している。
【０００４】
以上のことから、気相においては固体表面吸着種の検出に、ポンプ光によって誘起された表面吸着物質相の物理応答の時間成分を利用することができると予想される。しかしながら、液中において特異的にリガンドと結合した吸着分子の脱離が、上述したようなmWレベルのレーザーで引き起こされるかは不明である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T.Kawasaki et al., Anal.Sci., 12, 1069-1075(2009)
【非特許文献２】A.P.Sommer et al., J.Phys.Chem.Lett., 2, 562-565(2011)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、ポンプ光によって誘起された表面吸着物質相、あるいは表面近傍の溶媒の粘度などの物理応答を、吸着物質の種類や量に応じた変化として水晶発振子マイクロバランス法を用いることで、吸着物質ごとの応答性によって定性し、応答の大きさから定量する新規な液中成分分析装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は水晶発振子マイクロバランス法を用い、その測定固体表面へのポンプ光照射によって起こる表面状態変化を測定することで上記課題を解決した。すなわち、本発明は、以下の技術的手段から構成される。
【０００８】
〔１〕  溶液中に含まれる成分及び濃度を測定する液中成分分析装置であって、
測定対象溶質分子を含む溶液を収納する測定セルであってポンプ光を透過可能な測定セルと、
前記測定セル中に設置する水晶発振子からなる測定基板と、
前記水晶発振子に照射するポンプ光の光源と、
前記水晶発振子を駆動する発振回路並びに発振回路の振動数を測定する表面状態測定装置又は前記水晶発振子に振動数を変えながら交流信号を印加し発振子の振動数及び損失係数を測定する表面状態測定装置と、
前記表面状態測定装置から得られたデータを解析するデータ解析装置と、を備えることを特徴とする液中成分分析装置。
〔２〕  前記測定基板の表面が測定対象溶質分子と相互作用する物質で処理されていることを特徴とする前記〔１〕に記載の液中成分分析装置。
〔３〕  前記ポンプ光の光源が、レーザー光を発生する光源であることを特徴とする前記〔１〕又は前記〔２〕に記載の液中成分分析装置。
〔４〕  前記表面状態測定装置が、水晶発振子マイクロバランス法を用いて測定することを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の液中成分分析装置。
〔５〕  前記データ解析装置が、前記表面状態測定装置のデータを入力し、高次の時間応答関数を用いて得られるパラメータから、溶質分子の定性定量分析を行う解析装置であることを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の液中成分分析装置。
〔６〕  前記測定基板に照射する測定光を発生する測定光発生装置と、前記測定基板から反射した前記測定光を測定する光検出装置を備え、前記データ解析装置は、前記光検出装置が授光した授光データを入力してデータを解析することを特徴とする前記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の液中成分分析装置。
〔７〕  前記測定基板の表面に光干渉を起こす薄膜を形成させてあることを特徴とする前記〔６〕に記載の液中成分分析装置。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の液中成分分析装置又は液中成分分析法を用いて溶質成分を測定することにより、これまでの固体表面を用いた検出手法では検出できなかった分子の検出、もしくは既存の方法により検出できたが、低感度であった成分をより高感度で検出することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の液中成分分析装置の概念図。
【図２】実施例１で測定した、カンファースルホン酸修飾水晶発振子へのプロリン存在下での光応答。溶媒のみの応答に対する規格差分。
【図３】比較例１で測定した、ＤＮＡ修飾水晶発振子へのアナライトＤＮＡ結合の通常の水晶発振子の振動数応答。
【図４】実施例２で測定した、ＤＮＡ修飾水晶発振子へのアナライトＤＮＡ存在下での光応答。溶媒のみの応答に対する規格差分。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、溶液中に含まれる成分及び濃度を測定する液中成分分析装置であって、
測定対象溶質分子を含む溶液を収納する測定セルであってポンプ光を透過可能な測定セルと、前記測定セル中に設置する水晶発振子からなる測定基板と、前記水晶発振子に照射するポンプ光の光源と、前記水晶発振子を駆動する発振回路並びに発振回路の振動数を測定する表面状態測定装置又は前記水晶発振子に振動数変えながら交流信号を印加し発振子の振動数及び損失係数を測定する表面状態測定装置と、前記表面状態測定装置から得られたデータを解析するデータ解析装置とを備えることを特徴とする液中成分分析装置である。
【００１２】
図１に、本発明の液中成分分析装置の概念図を示す。図１を用いて、本発明を以下説明する。
【００１３】
本発明においては、測定対象溶質分子を含む溶液を収納する測定セル中に水晶発振子からなる測定基板を設置して、その測定基板にポンプ光を照射する。従って、測定セルは、ポンプ光を透過可能な材質の測定セルである。
【００１４】
本発明においては、分析対象溶質成分を測定基板としての水晶発振子表面と相互作用させる必要がある。本発明に用いられる測定基板である水晶発振子としては、対象溶質成分が何らかのかたちで相互作用できる表面を有していればよい。
【００１５】
本発明の水晶発振子表面は、単一の組成からなる固体であっても、あるいはその表面に単一、もしくは複数の薄膜の層が被膜されているものであってもよい。同時にこの薄膜は、溶質分子を薄膜層内に吸着する機能を兼ね備えていてもよく、また単に吸着量を増大させるためだけの吸着相としてのみ用いてもよい。
【００１６】
水晶発振子表面の材質としては、合金を含めた金属、ガラス、セラミックス、プラスチック等が挙げられる。
【００１７】
本発明に用いる上記の金属・合金としては特に限定されず用いることができるが、特に表面状態測定法として光学的な手法を併用する場合、溶質相互作用の際の反射干渉における反射率変化の大きい金、あるいは金・銀合金等が好適に用いられる。また、表面の安定性からチタン、ジルコニウム、クロム、アルミニウム、シリコン等、それ自身の酸化被膜が不動態となる金属、あるいはそれらを含むステンレスなどの合金も好適に用いられる。
【００１８】
本発明において水晶発振子表面として用いる上記のガラス、セラミックス、プラスチックとしては、平滑な表面を持ち、特に限定せずに用いることができる。
【００１９】
本発明の測定水晶発振子表面基板に被覆されて用いられる薄膜としては、金属、合金、金属酸化物、有機超薄膜である自己組織化薄膜、合成高分子薄膜、生体高分子薄膜、低分子キャスト膜等を含む有機薄膜、金属錯体薄膜、金属有機構造体を含む有機・無機複合体等が挙げられる。
光学的手法を勘案すれば、反射率変化の大きさ、安定性からより好適には、金薄膜、金・銀合金薄膜、金属酸化物、高分子薄膜がより好適に用いられ、より好適には金単独、もしくは金属チタン表面に酸化チタン薄膜を形成させたものが測定基板として用いられる。
【００２０】
本発明に用いる上記の金属酸化物その他としては、アルミナ、酸化ケイ素、窒化ケイ素、酸化チタン、酸化クロム、酸化ジルコニア、酸化ハフニウム、酸化モリブデン、酸化タングステンなどが用いられ、これらの非酸化金属上に酸化被膜として構築されたものでもよいし、別の固体表面に薄膜として形成されたものであってもよい。
【００２１】
本発明に用いる自己組織化薄膜・合成高分子薄膜・生体高分子薄膜・低分子キャスト膜等を含む有機薄膜としては、ヘキサデカンチオールなどのn-アルカンチオールや末端に水酸基やアミノ基、カルボキシル基などの官能基を有するアルカンチオールや、芳香族系チオール誘導体、ポリスチレン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレートなどの合成高分子、酵素などのタンパク質、DNA・RNAなどの核酸、セルロース、キトサンなどの糖鎖のような生体高分子、更には様々な構造を有する低分子化合物を用いることができる。特に良好な成膜性を有する化合物群としては、天然あるいは合成脂質、各種界面活性剤が挙げられる。
【００２２】
本発明に用いる上記の金属錯体薄膜、金属有機構造体を含む有機・無機複合体等としては、ポルフィリンやフタロシアニン、トリスビピリジルの各種金属錯体、また金属クラスターと有機配位子からなりポーラスな構造を持った金属有機構造体（MOF）をはじめとする有機・無機複合体が挙げられる。
【００２３】
上記例示した溶質相互作用固体表面構成要素はそれぞれ単独で用いてもよいし、層状に組み合わせて用いてもできる。
【００２４】
本発明の装置は、ポンプ光を照射するためにポンプ光を発する光源を備えている。そして、ポンプ光の光源は、ポンプ光を照射及び停止を短時間に繰り返して行えるようにしてあることが好ましい。
本発明のポンプ光としてはレーザーや分光した自然光など様々な光源を用いることができる。
【００２５】
ポンプ光の測定基板表面への導入は、光源から直接照射してもよいし、光ファイバー、光導波路等を介してもよい。
【００２６】
表面状態測定法として水晶発振子マイクロバランス法を用いる本発明においては、表面状態は水晶発振子の振動数変化や損失係数変化としてとらえるために、測定基板である水晶発振子の振動数などのパラメータをネットワークアナライザなどによって計測してもよいし、単に振動数変化を測定する場合は、水晶発振子を駆動する発振回路とその振動数を測定するユニバーサルカウンターによって測定してもよいし、レーザードップラー法を用いた方法を用いてもよい。
【００２７】
発振子による測定データの取り込みは、ポンプ光の照射開始、停止と同期して行い、ポンプ光を複数回パルス照射する場合は、パルスごとにデータを積算することでSN比を向上させることができる。
【００２８】
表面状態測定装置としてはいくつか挙げられるが、代表的には以下の二つの方法が挙げられる。一つは前記水晶発振子を駆動する発振回路並びに発振回路の振動数を測定する表面状態測定装置であり、もう一つは前記水晶発振子に振動数変えながら交流信号を印加し発振子の振動数及び損失係数を測定する表面状態測定装置である。
【００２９】
表面状態測定装置で測定されたデータは、前記データ解析装置に送られ解析される。
【００３０】
前記データ解析装置では、前記振動数の変化のデータをマイクロバランス法を用いて重量に変換する。
【００３１】
一般に水晶発振子マイクロバランス法とは、水晶発振子の共振周波数を測定し、その周波数の変化量を発振子表面への物質の吸脱着量に換算する方法である。測定周波数の値をパソコンなどのデータ解析装置にポンプ光の照射・停止と同期して取り込み、時間変動として解析する。振動数変化量を表面への物質吸着量に換算するには、以下のSauerbreyによる式（１）が用いられる。
Δｍ  = -(ΔＦＡ（ρｑμｑ）１／２）／（２Ｆ０２）        （１）
ここでΔｍは表面吸着物質量変化、ΔＦは測定された初期値からの振動数変化、Ａは発振子電極面積、ρｑは水晶の密度、μｑは水晶のずり弾性率、Ｆ０は物質が吸着する前の水晶発振子自体の共振周波数である。
【００３２】
まず、前記水晶発振子を駆動する発振回路並びに発振回路の振動数を測定する表面状態測定装置について説明する。
この方法では、水晶発振子を発振回路によって駆動して共振周信波数で発信させ、その共振周波数をユニバーサルカウンターなどによって測定し、その周波数の変化量を発振子表面への物質の吸脱着量に換算する方法である。測定周波数の値をパソコンなどのデータ解析装置にポンプ光の照射・停止と同期して取り込み、時間変動として解析する。
【００３３】
次に、前記水晶発振子に振動数変えながら交流信号を印加し発振子の振動数及び損失係数を測定する表面状態測定装置について説明する。
また、単に水晶発振子の共振周波数のみをユニバーサルカウンターによって測定するだけではなく、水晶発振子をネットワークアナライザに接続し、共振周波数とともに損失係数を測定する手法も用いられる。この方法では、水晶発振子に振動数を変えながら交流信号を印加し、インピーダンスを測定することで共振周波数とともに損失係数を測定することができる。ネットワークアナライザとユニバーサルカウンターで測定した共振周波数の変動数は等価である。また、損失係数は表面吸着物質の粘弾性に関する情報を含んでおり、表面状態を評価する指標として有用な情報を含んでいる。この手法においても、各時間での共振周波数と、損失係数をパソコンなどのデータ解析装置にポンプ光の照射・停止と同期して取り込み、時間変動として解析する。
【００３４】
水晶発振子マイクロバランス法では、水晶発振子基板上に吸着した物質量（重さ）を振動数変動から検出する。本法ではこれを応用し、レーザーの照射・停止に伴う振動数、あるいは損失係数変動の動力学的挙動から吸着物質の定性・定量分析を行う。データ解析装置は、レーザーの照射開始、あるいは停止直後からの振動数変化、損失係数変化をたとえば以下の式（２）のような指数関数を用いカーブフィッティングによって解析する。
Δｙ＝ｙ０＋Ａ１ｅｘｐ（−ｔ／τ１）＋Ａ２ｅｘｐ（−ｔ／τ２）
＋Ａ３ｅｘｐ（−ｔ／τ３）          （２）
式中、Δｙは、振動数変化からの吸着量あるいは損失係数変化からの粘弾性変化などの表面状態変化量、y0は、飽和表面状態変化量、ｔは、時間、Ａ１、Ａ２、Ａ３は、それぞれ三つの動力学成分の構成率、τ１、τ２、τ３は、それぞれ三つの動力学成分の半減期である。
τ１、τ２、τ３の組み合わせから定性分析を、Ａ１、Ａ２、Ａ３の大きさから定量分析を行う。
【００３５】
また、特に動力学成分の解析を行わず、溶質を省いた溶媒のみからなる光応答の時間応答をリファレンスとして、溶質存在下での応答を差分として表示し、その応答の違いから解析を行ってもよい。
つまり、目的検出物質存在下でのレーザー照射・停止の時間応答から、溶媒のみのレーザー照射・停止の時間応答をグラフ上で差し引いて図示することで、直接パターン認識により定性・定量解析を簡易的に行うこともできる。
【００３６】
次に、前記水晶発振子によるデータ解析に光学的手法を加えて表面状態測定する方法につて説明する。
【００３７】
本発明の表面状態解析法に、水晶発振子マイクロバランス法と反射干渉分光法を組み合わせて用いる場合は、固体上に薄膜状の光干渉層を構築する方法としては、薄膜が金属、合金、低分子有機化合物、金属錯体の場合は真空蒸着を用いることができる。光干渉薄膜が金属酸化物等の場合は、スパッタ法を用いればよく、金属上にその金属の酸化層を構築する場合には、加熱処理等による直接酸化、あるいは陽極酸化を用いた電気化学的な手法を用いることができる。とくにチタンやアルミなどでは、陽極酸化の条件を規定することで、任意の大きさの細孔を有するポーラスな表面を構築することができ、溶質成分の吸着量を大きくし、測定感度を上げる方法としては、極めて有効である。
【００３８】
有機薄膜の固体上への構築法としては、貴金属上へのチオール類の固定化には、溶液中での自発的な薄膜生成プロセスである自己組織化の手法を用いればよい。また、高分子あるいは低分子化合物、錯体等を用いる場合には、溶液中での吸着、スピンコート、ディッピング法、キャスト法、交互浸漬法、電気化学的吸着など、固体基板と薄膜構成要素に応じた最適な手法を選択することができる。
【００３９】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、固体基板上に光干渉薄膜を構築する際の膜厚は、光干渉による測定が高感度に行えるように、材質の屈折率、消衰係数に応じて決定すればよい。屈折率の高い酸化チタンなどでは、5nmから200nm程度が良い。ポーラスな酸化チタンの場合は空隙率に応じて膜厚を大きくすればよい。膜厚が小さいと反射スペクトルはブロードとなるので、溶質吸着による反射率変化は小さくなるが、測定系が安定する。膜厚が大きい場合反射スペクトルの形はよりシャープになり、微小変化へ対応しやすいが、ダイナミックレンジが狭まり、測定系の選択がシビアになる。いずれにしても上述の方法によれば、測定対象の特性に応じて目的に適った膜厚を選択設計することが可能である。
【００４０】
表面状態測定法として光学的手法を用いる場合、入射と反射の条件によって、測定部にポンプ光が入らない場合においては白色光も用いることができるが、測定に用いる光の波長に重ならないことが望ましい。光の出力としては、ある程度の脱離量が期待でき、しかし、熱的な影響を避けるために0.1から30mW程度が望ましい。そして、レーザー光は、単色性、直進性が良いため、照射位置と領域を規定しやすいことから、ポンプ光として用いるにはより望ましい。
【００４１】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、本発明においては、測定基板表面の吸着分子の吸着・脱離等による表面相互作用分子層の光学厚み変化としてとらえるために、測定基板表面に測定光を照射し、その反射光を計測する。
前記前記測定光として白色光、もしくは単独あるいは複数の特定の波長の光源を用いることができる。
【００４２】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、本発明の装置において、測定基板に照射された測定光は、測定基板により反射され反射光となって、光検出装置で授光される。
【００４３】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、測定光の表面への照射と、反射光の測定部への導入は、光源、反射表面からから直接行ってもよいし、光ファイバー、光導波路等を介してもよい。
【００４４】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、前記光検出装置が授光した授光データは、データ解析装置によって解析される。
【００４５】
以下に表面状態変化としての光学膜厚変化を測定する手法について述べる。
【００４６】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、本発明の液中成分分析方法は、測定対象の溶質を固体基板の表面に光干渉を起こす薄膜を形成させた測定基板に吸着させ、前記吸着した溶質の分子をポンプ光の照射によって脱着させ、この動的吸着量変化を反射干渉分光法により測定し、溶質成分の分析を行うことを特徴とする。
【００４７】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、本発明の液中成分分析方法は、測定基板の表面へのポンプ光照射によって起こる表面吸着分子の脱着を精密に測定する手法である反射干渉分光法を用いることを特徴としている。
前記反射干渉分光法では、表面での光の干渉を利用するので多くの場合、干渉層の光学厚み、即ち本発明においては溶質成分の吸着量に応じて反射スペクトルのフリンジパターンがシフトする。そのため測定光として白色光を用い、反射光強度測定装置として回折格子あるいはプリズムとフォトダイオードアレイからなるような分光光度計を用いて測定した場合、溶質吸着量によって反射スペクトルのフリンジパターンが変化し、特定の波長の反射光強度が上昇するところと低下するところがある。ポンプ光由来の光を除いた領域の反射スペクトルの測定データを膜厚に依存した理論的なスペクトル曲線でフィットすることで光学膜厚変化を精密に計算することができる。このようにして、光学膜厚変化に基づく反射スペクトル変化は、幾何光学のレベルで正確に予想することができる。
【００４８】
また表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、上記の反射光強度の変化の極大値及び極小値の波長は、測定基板表面に依存して一定波長となるので、時間分解能の向上、測定装置の簡便化の為に、全波長領域のスペクトルを取得する代わりに極大及び／又は極小波長又はその付近の波長の反射光強度をモニターするだけでもよい。
【００４９】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、基本的には、ポンプ光に重ならないところで、最も大きく上昇する波長、あるいはもっとも低下する波長の反射光強度のみをモニターすることで、簡便に且つ高速にわずかな吸着量変化を測定することが可能である。
しかしながら、単一波長のモニターでは、光源の出力揺らぎや光路長の温度変化による光強度の増減など外部の影響を完全に除外することは難しい。そこで上述の溶質吸着によって反射光強度が大きく上昇する点と低下する点の二つの点の差分をとることが望ましい。これによって光学系の揺らぎが相殺されて解消し、同時に応答量が大きくなることでＳＮ比が大きく改善される。この目的のためには、出力揺らぎに波長依存性があることは好ましくなく、波長に対応した複数の光源を用いるよりも、各波長での出力が安定な白色光源を用いることがより好適である。
【００５０】
さらに表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、二点以上の複数の点でモニターすることでよりＳＮ比を向上させることもできる。
【００５１】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合で特定の複数の波長における反射光強度を同時測定する場合には、目的に応じた波長の光を持つ光源を用いればよい。白色光を用いてもよいし、複数の光源を組み合わせて用いてもよい。
【００５２】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合で特定の複数の波長の反射光強度を同時測定する場合には、反射光を分光光度計に導入し、任意の波長の反射光強度を測定するか、反射光を光ファイバー等を用いて分岐し、バンドパスフィルターなどの光学フィルターを装着して特定の波長の強度を検出できるようにした光センサを、測定する波長の数ほど用いればよい。
【００５３】
上記のように、本発明の測定光と反射測定光検出システムは、自由に設計して組み合わせることができる。
【００５４】
表面状態測定法として光学的手法を併用する場合、特定の一点の波長における反射光強度を測定するシステムの１例として、測定基板表面として金を用いる場合を挙げることができる。すなわち、測定基板表面として金を用いる場合には、金の異常反射を利用するので、４７０ｎｍ近傍の波長の光の反射強度の増減をモニターすれば良いので、光源として４７０ｎｍの単色光を用いる場合には、ポンプ光カットフィルターを装着した光電子増倍管や半導体光センサを用いればよい。また、測定光として白色光を用いるのであれば、光センサへは４７０ｎｍのバンドパスフィルターを介して反射光を導入すればよい。
【００５５】
続いて、表面状態測定法として光学的手法を併用する場合の、光検出装置と、前記光検出装置が授光した授光データを解析するデータ解析装置における授光データの解析方法について説明する。
反射光強度は、解析に用いる波長の強度を測定する必要がある。複数の波長を用いる場合は同時にその強度を測定する。方法として以下の三つを例示する。
（１）  単一波長の測定光の強度を測る場合、測定光としては単一波長の光を出力する光源を用い、ポンプ光をカットする光学フィルター、もしくは測定に用いる波長の光のみを通すバンドパスフィルターを介して光検出装置で反射光強度を測定し、その出力をデジタル変換した値をポンプ光の照射・停止と同期した時間の変数としてコンピューターなどに送る。
（２）  複数の波長の反射光強度を測定する場合の一つ目の方法としては、白色光源、もしくは複数の測定に用いる波長の光を出力する光源を組み合わせて用い、測定に用いる波長を通すバンドパスフィルターを介して測定に用いる波長に合わせた複数の光検出装置で反射光強度を同時に測定し、光検出装置毎の出力をデジタル変換し、ポンプ光の照射・停止と同期した時間の変数としてコンピューターなどに送る。
（３）  複数の波長の反射光強度を測定する場合のもう一つの方法としては、回折格子あるいはプリズムとフォトダイオードアレイからなるような分光光度計を用いたものがある。この場合は白色光源を用い、反射光の全波長の強度、即ち反射スペクトルを時間ごとに取得することができる。この時、時間ごとに得られる反射スペクトルを理論的なフリンジパターンを用い、コンピューター上でフィッティングしてその時間での膜厚を求めてもよいし、特定の波長の出力を前記（２）のバンドパスフィルターを用いた場合と同様に、ポンプ光の照射・停止と同期した時間の関数としてデジタルデータを取得してもよい。複数の波長の値をデータとして取得する場合は、受光素子でデジタル変換する際差分データとしてコンピューターへ送ってもよいし、一旦複数のデータをコンピューターへ送った後、コンピューター上で差分計算してもよい。
【００５６】
パルスに同期した反射光変化（光学膜厚変化）、発振子パラメータ変化（振動数変化など）は式（３）によってコンピューター上でカーブフィッティング機能を持つソフトウエア―でフィットする。この式は三つの半減期を持つ3次の指数関数であり、都合7つのパラメータが得られることになり、これらを用いて定性と定量を行う。パラメータの取得はパルスごとに行い平均をとっても良いし、複数のパルスによって取得された反射光（光学膜厚）の時間変化を平均化し、これについてカーブフィッティングを行いパラメータを取得してもよい。
また、ポンプ光に同期した反射光変化（光学膜厚変化）のデジタル変換とパラメータの解析を専用の装置で行ってもよい。
Δｙ＝ｙ’＋Ａ４ｅｘｐ（−ｔ／τ４）＋Ａ５ｅｘｐ（−ｔ／τ５）
＋Ａ６ｅｘｐ（−ｔ／τ６）          （３）
式中、ｙ’は、光学膜発変化、ｙ’は、飽和膜厚変化量、ｔは、時間、Ａ４、Ａ５、Ａ６は、それぞれ三つの動力学成分の構成率、τ４、τ５、τ６は、それぞれ三つの動力学成分の半減期である。τ４、τ５、τ６のパラメータの組み合わせから定性分析を、Ａ４、Ａ５、Ａ６の大きさから定量分析を行う。
【００５７】
また、特に動力学成分の解析を行わず、溶質を省いた溶媒のみからなる光応答の時間応答をリファレンスとして、溶質存在下での応答を差分として表示し、その応答の違いから溶質の定性、定量分析を行ってもよい。
【００５８】
本発明は、水晶発振子マイクロバランス法単独とポンプ光の照射の組み合わせでも成立するが、この水晶発振子マイクロバランス法と反射干渉分光法を組み合わせて、ポンプ光を測定基板に照射することによる表面状態変化の動力学解析から、吸着物質の定性と定量を行う測定法とすることもできる。これら二つの測定法を組み合わせることの意味について以下に述べる。
【００５９】
水晶発振子マイクロバランス法は、一般的にはその振動数変化から式１を用いて表面物質吸着量を重さとして検出する手法である。しかし、吸着する物質の弾性率が水晶と同じである場合に式（１）が厳密に成立するが、弾性率が異なる物質が吸着した場合は誤差が大きくなる場合がある。乾燥された気相系では物質による弾性率の違いが小さいため比較的誤差は小さいが、液相系では吸着物質の粘弾性が溶媒和の程度にも依存するため理想の値からずれる場合の多いことが分かっている。そのため測定した共振振動数変化ΔＦには吸着物質量変化による部分と粘弾性変化の部分が含まれて測定される。
これに対し反射干渉分光法から得られる光学膜厚は物質の動的な特性である粘弾性には依存せず、単純に吸着物質の屈折率と吸着膜厚を乗じた光学膜厚値として変化量を測定することができる。
上述の水晶発振子マイクロバランス法と反射干渉分光法の特性を利用して組み合わせることで、吸着物質の粘弾性の評価を行うことが可能となる。反射干渉分光法から得られる光学膜厚変化に対して、水晶発振子マイクロバランス法による振動数（質量）変化が相対的に大きければ、その吸着物質は粘弾性の高い物質であり、小さければ粘弾性の小さい物質であると評価することができる。たとえば種類の異なるたんぱく質が表面に吸着した場合、反射干渉分光法による光学膜厚変化が同じ場合でも、同時測定した水晶発振子マイクロバランス法による振動数変化が2倍程度異なることがある。これは各たんぱく質の圧縮弾性率の違いに基づく溶液中での粘弾性の違いによっている。このように光学膜厚変化で規格化して振動数変化を測定することで、表面に吸着した物質の粘弾性を定量化することが可能となる。
表面への光応答を観察する場合も、これら二つの変化量を比較することで、より精密に表面状態変化を評価することができる。たとえば光照射時の、光学膜厚変化がなく水晶発振子の振動数応答のみ減少すれば、光によって吸着膜の粘弾性のみが変化したことがわかる。このように光照射時の、水晶発振子あるいは光学膜厚変化の動力学パラメータを組み合わせて解析することによって分析精度が向上する。
水晶発振子マイクロバランス法において、損失係数からも簡易的に粘弾性の議論は可能であるが、この値にも部分的に振動数変化に依存する成分が不可分で存在するので、精度よく粘弾性を議論するには、光学的な膜厚測定法を組み合わせるほうがよい。
【００６０】
本発明は、水晶発振子マイクロバランス法単独とポンプ光の照射の組み合わせでも成立するが、この水晶発振子マイクロバランス法と反射干渉分光法を組み合わせて、ポンプ光を測定基板に照射することによる表面状態変化と光学膜厚変化の動力学解析から、吸着物質の定性と定量を行う測定法とすることもできる。この時、それぞれの測定法による動力学成分の解析を式（２）および式（３）で行えば、それぞれから得られるパラメータτ１、τ２、τ３、τ４、τ５、τ６、ｙ０、ｙ’、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６の都合１４個のパラメータを得ることができ、より精度よく定性および定量分析が可能となる。
【００６１】
表面状態測定法として上記水晶発振子マイクロバランス法のみを用いる場合でも、上述の測定原理に基づくと、測定基板近傍の測定溶媒もしくは表面修飾層よりも粘弾性が大きく異なる溶質であれば、結合量が小さくても粘弾性変化としてのΔＦから高感度で検出可能である。さらにこのような物質において、光照射による脱溶媒等が進行すれば粘弾性変化が大きく観察されることが期待される。このようなものとして、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、糖鎖のような生体高分子、あるいはポリエチレングリコール、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸などの合成高分子などが挙げられる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１〕
(+)あるいは(-)カンファースルホン酸を等モルのNaOHで中和した。終濃度は170 mMとした。また、ポリスチレンスルホン酸（PSS）ナトリウム塩をCSAに対してモノマーユニット換算で100分の1入れた。電解重合モノマーである3,4-エチレンジオキシチオフェンを液滴の状態で水溶液中に入れて攪拌し、飽和させた。
この溶液に金電極を有し、一方の面を被覆した水晶発振子を浸し、定電圧装置の陽極に接続した。対極として銅線を用い、1.5 Vで電解重合を行った。重合時間は3秒とした。これで水晶発振子の振動数減少量で数kHz分のカンファースルホン酸、ポリスチレンスルホン酸PEDOT複合膜（CSA/PSS/ PEDOT）が水晶発振子の金電極表面上に形成された。
このCSA/PSS/ PEDOT修飾発振子を発振回路に接続して発振させ、この表面に対するレーザー応答を振動数変化として測定した。純水中でまず応答を測定し、これにL-プロリンあるいはD-プロリンを終濃度が2 mMになるように打ち込み、更にレーザー応答を測定した。照射30 sec/停止30 secを30回測定し、その平均を取った。用いたレーザーは636 nm, 8.5 mW、振動数測定にはAgilent社製53131Aユニバーサルカウンターを用いた。レーザーのon/off制御は自家製ソフトウェアを用い、ユニバーサルカウンターからの入力に同期して行った。
【００６３】
図２に各(+)あるいは(-)-CSA/PSS/ PEDOTの純水中のレーザー応答に対する、L-プロリン（○）あるいはD-プロリン（▲）存在下でのレーザー応答の差分を示した。この図では、それぞれのサンプルおよびリファレンスのレーザー応答の最大値で規格化しており、レーザーon時の応答がプラス、またレーザーoff時の応答がマイナスの場合は純水よりも速いレーザー応答が起きていることを示している。左図(+)-CSA/PSS/ PEDOTに対するレーザー応答ではL-プロリン存在下で早い応答が観察されており、逆に右図(-)-CSA/PSS/ PEDOTに対するレーザー応答では反転し、D-プロリン存在下でQCMのレーザー応答が速くなっている。
この複合膜表面そのものに対するプロリンの結合は通常のQCMでは確認できておらず、レーザー照射状態で初めて複合膜フィルムとプロリンとの相互作用が動的に確認されたことになり、さらに膜のキラリティーに応じた、キラル分子の識別ができたことを示している。このようなことはこれまでのQCMでは知り得ることのできない分子認識がレーザー照射による動的解析によってできたことを示している。
【００６４】
〔比較例１〕
メルカプトプロピオン修飾後の水晶発振子の金電極表面に対し、ＮＨＳと水溶性カルボジイミドを用いる一般的な手法によりアビジンを固定化した。これにビオチン化した10merのＤＮＡ(bio-5’AGCTTGGGAA3’)を固定化した。洗浄後、修飾発振子をTE Buffer (pH 7.8, NaCl 150 mM)を入れたセルに入れて発振させ、安定化させた。これに一塩基ミスマッチのある10mer DNA(3’TCGAACCCTT5’)、あるいは完全相補10mer DNA(3’TCGAACCCTT5’)を所定濃度になるように加えながら打ち込んだ。振動数変化を追跡した。
【００６５】
図３にDNA修飾発振子に対し、一塩基ミスマッチ鎖（破線）、完全相補鎖（実線）を濃度を上げながら投入した時の振動数変化を示した。一塩基ミスマッチのあるDNAを打ち込んでも、ほとんど振動数は変化せず、発振子を修飾したプローブDNAにはこの条件ではミスマッチが一つあるとほとんどDNAは結合しないことが分かる。一方、完全相補鎖を打ち込むと濃度とともに振動数が大きく減少し、結合していくことが分かる。但し、40 nMではほとんど結合が見えておらず、このシステムでの検出限界はこのあたりであることが分かる。
【００６６】
〔実施例２〕
比較例１と同様の方法により、一塩基ミスマッチ鎖、あるいは完全相補鎖を所定濃度となるように打ち込み、実施例１と同様の方法によりレーザー応答を測定した。各濃度において、アナライト非存在下でのレーザー応答との規格化差応答を調べた。
【００６７】
図４に各DNAアナライトが600 nM, 100 nM, 40 nM, 10 nM存在する条件でのレーザー応答を示した。完全相補鎖（実線）の場合、レーザー照射による振動数変動はアナライト非存在の場合に比べて早く、また、高濃度であるほどレーザー応答の大きさが大きくなっていることが分かる。これに対し一塩基ミスマッチ鎖（破線）では、通常のQCMでは高濃度でも検出できなかったのにも係らず、低い濃度領域から遅い成分としてレーザー応答が確認でき、その大きさも濃度に依存している。以上のことは、これまでの手法では不可能であったDNAの定量および一塩基の違いの解析がこの方法で出来たということを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明の液中成分分析法は、これまで定性分析が不可能であった、平衡論的に結合力が弱い分子を測定対象とすることが可能であり、低分子のみならずDNAの一塩基の違いも検出できる。この一塩基多形を検出することは、それが関わる遺伝病の診断や、適切な薬を選択するいわゆるテーラーメード医療にとって重要なことである。
また、本法はRNAの検出にも適用可能である。近年、血中にごく微量存在するマイクロRNAが疾病のバイオマーカーとして有用であることが分かってきており、これを検出する手法として本法は応用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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