(57)【要約】【課題】口臭抑制組成物の提供を課題とする。【解決手段】タイミンタチバナ抽出物を配合した口臭抑制組成物を提供する。一方、タイミンタチバナ抽出物中のミルシノン酸は、水溶性が低く、口臭用組成物に配合した場合、組成物から溶出され辛いという問題がある。これを解決するため、本願発明では、さらに、タイミンタチバナ抽出物を、糖衣に含有する口臭抑制組成物を提供する。一方、糖衣に含ませると、タイミンタチバナ抽出物が分散し辛いという問題があった。これを解決するため、本願発明では、タイミンタチバナ抽出物と乳化剤が糖衣に配合された口臭抑制用組成物を提供する。また、本発明はタイミンタチバナ抽出物と乳化剤を混合し、これを糖衣シロップに混合する工程を含む、糖衣を有するタイミンタチバナ抽出物配合口臭抑制用組成物の製造方法を提供する。本発明の口臭抑制組成物は、ヒトで持続的にＶＳＣｓを抑制することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
タイミンタチバナ抽出物を配合した口臭抑制組成物
【請求項２】
糖衣を有することを特徴とする請求項１の口臭抑制用組成物であって、タイミンタチバナ抽出物が糖衣に配合された口臭抑制用組成物。
【請求項３】
糖衣を有することを特徴とする請求項１の口臭抑制用組成物であって、タイミンタチバナ抽出物と乳化剤が糖衣に配合された口臭抑制用組成物。
【請求項４】
乳化剤のＨＬＢが７以上９．５以下であることを特徴とする請求項３の口臭抑制用組成物。
【請求項５】
乳化剤がジグリセリンモノオレエート、ソルビトール型モノラウレート、ソルビタンモノラウレート、デカグリセリンステアリン酸エステル、ジアセチル酒石酸モノグリセライドであることを特徴とする請求項３または４のいずれか１項に記載の口臭抑制用組成物。
【請求項６】
乳化剤がデカグリセリンステアリン酸エステル、またはジアセチル酒石酸モノグリセライドであることを特徴とする請求項３から５のいずれか１項に記載の口臭抑制用組成物。
【請求項７】
タイミンタチバナ抽出物と乳化剤を混合し、これを糖衣シロップに混合する工程を含む、糖衣を有するタイミンタチバナ抽出物配合口臭抑制用組成物の製造方法。
【請求項８】
タイミンタチバナ抽出物と乳化剤を混合しｐＨを７．１以上に調整し、これを糖衣シロップに混合することを特徴とする請求項７の糖衣を有するタイミンタチバナ抽出物配合口臭抑制用組成物の製造方法。
【請求項９】
乳化剤がジグリセリンモノオレエート、ソルビトール型モノラウレート、ソルビタンモノラウレート、デカグリセリンステアリン酸エステル、ジアセチル酒石酸モノグリセライドであることを特徴とする請求項７または８のいずれか１項に記載の糖衣を有するタイミンタチバナ抽出物配合口臭抑制用組成物の製造方法。
【請求項１０】
乳化剤がデカグリセリンステアリン酸エステル、またはジアセチル酒石酸モノグリセライドであることを特徴とする請求項７から９のいずれか１項に記載の糖衣を有するタイミンタチバナ抽出物配合口臭抑制用組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタイミンタチバナ抽出物を配合した口臭抑制組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１はヤブコウジ科ツルマンリョウ属植物の一種であるタイミンタチバナ（Ｍｙｒｓｉｎｅ  ｓｅｇｕｉｎｉｉ）より抽出される、ミルシノン酸Ａ、ミルシノン酸Ｂ、ミルシノン酸Ｃ、ミルシノン酸Ｅ及びミルシノン酸Ｆの１種または２種以上を有効成分とすることを特徴とするメチオニナーゼ阻害剤を開示し、また、これを有効成分とする口臭抑制のための口腔用組成物を開示する。非特許文献１はミルシノン酸Ｂが歯周病菌のメチオニナーゼの活性を抑制することを開示する。また非特許文献２は、ミルシノン酸Ｂは歯周病菌由来の硫化水素とメチルメルカプタンの産生を抑制することを開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第５０８９１００号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２（９），２４１１−２４１４（２００８）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｒｅａｔｈ  Ｒｅｓ., ０２６００５ （２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
口臭抑制組成物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明はタイミンタチバナ抽出物を配合した口臭抑制組成物を提供する。一方、タイミンタチバナ抽出物中のミルシノン酸は、水溶性が低く、センターガムに配合すると、ガムを噛んでも溶出され辛いという問題がある。これを解決するため、本願発明では、さらに、タイミンタチバナ抽出物を、ガムの糖衣に含有する口臭抑制組成物を提供する。一方、糖衣に含ませると、タイミンタチバナ抽出物が分散し辛いという問題があった。これを解決するため、本発明では、タイミンタチバナ抽出物と乳化剤が糖衣に配合された口臭抑制用組成物を提供する。また、本発明はタイミンタチバナ抽出物と乳化剤を混合し、これを糖衣シロップに混合する工程を含む、糖衣を有するタイミンタチバナ抽出物配合口臭抑制用組成物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
効果の高い口臭抑制用組成物およびその製造方法の提供に成功した。従来、タイミンタチバナ抽出物の効果は、インビトロでの揮発性硫黄化合物（ＶＳＣｓ）抑制効果、ＶＳＣｓ産生酵素阻害効果しか明らかにされていなかったが、本発明の組成物は、ヒトで持続的にＶＳＣｓを抑制することができるという特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】乳化剤を添加して調製されたタイミンタチバナ抽出物含有糖衣シロップの状態を示す（実験１）。
【図２】ｐＨによるミルシノン酸の可溶化率の比較検討結果である（実験２）。
【図３】タイミンタチバナ抽出物乳化製剤糖衣配合チューインガムの外観を示す（実験３）。
【図４】タイミンタチバナ抽出物配合ガムあるいはプラセボガム摂取前後の（ａ）口気中硫化水素、（ｂ）メチルメルカプタン、（ｃ）揮発性硫黄化合物（ＶＳＣｓ）（硫化水素とメチルメルカプタンの和として示す）の変化量（ｐｐｂ）を測定した結果を示す（実験４（１））。
【図５】タイミンタチバナ乳化製剤を糖衣に配合したチューインガム、あるいはプラセボガムのガム糖衣溶液のメチオニナーゼ阻害活性を測定した結果を示す（実験４（２））。
【図６】タイミンタチバナ抽出物配合ガムあるいはプラセボガムの摂取前後の口気中の（ａ）硫化水素、（ｂ）メチルメルカプタン、（ｃ）ＶＳＣｓの濃度（ｐｐｂ）を測定した結果を示す（実験５（１））。
【図７】タイミンタチバナ抽出物配合ガムあるいはプラセボガム摂取・メチオニン洗口後の口気中メチルメルカプタン（ｐｐｂ）を測定した結果を示す（実験５（２））。
【図８】（ａ）タイミンタチバナ抽出物配合ガム、プラセボガム、あるいはコントロールの、システイン添加培養唾液から発生する硫化水素を評価した結果を示す（ｂ）タイミンタチバナ抽出物配合ガム、プラセボガム、あるいはコントロールのメチオニン添加培養唾液から発生するメチルメルカプタン抑制効果を評価した結果を示す。（実験５（３））。
【図９】コントロール（ガムなし）、プラセボガム、タイミンタチバナガムの、メチルメルカプタン直接消臭効果試験の結果を示す（実験５（４））。
【図１０】水、タイミンタチバナ抽出物０．１％懸濁液洗口前後の口気中（ａ）硫化水素、（ｂ）メチルメルカプタン、（ｃ）ＶＳＣｓの測定結果を示す（実験６（１））。
【図１１】タイミンタチバナ抽出物添加、ＥＧＣｇ添加あるいはコントロールの培養唾液から発生する硫化水素及びメチルメルカプタンの測定結果を示す（実験６（２））。
【図１２】様々な濃度のタイミンタチバナ抽出物存在下のメチルメルカプタンの測定結果を示す（実験６（３））。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明はタイミンタチバナ抽出物を配合した口臭抑制組成物を提供する。タイミンタチバナ抽出物とは、ヤブコウジ科ツルマンリョウ属植物の一種であるタイミンタチバナ（Ｍｙｒｓｉｎｅ  ｓｅｇｕｉｎｉｉ）より抽出される抽出物である。抽出方法は特に限定されないが、タイミンタチバナの葉を溶媒で抽出し、溶媒留去することにより得られる。好ましくは、溶媒は極性溶媒であり、例として、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、アセトン、酢酸エチル、および水からなる群から選択される極性溶媒の少なくとも１種の溶媒を適用して実施することができ、２種類以上の溶媒を組み合わせてもよい。
【００１０】
本発明の口臭抑制用組成物は口中に留まることにより効果を発揮し、組成物の例としてタブレット、キャンディー、チョコレート、ガム等の形態を挙げることができ、特に好ましい例としてはガムを挙げることができる。しかし、タイミンタチバナ抽出物のうち、特にミルシノン酸は水溶性が低く、これらの組成物、特にガムに配合すると、咀嚼しても本発明の口臭抑制組成物から溶出され辛い。従って本発明の口臭抑制組成物は、さらに、糖衣を有することができ、糖衣にタイミンタチバナ抽出物が配合されていることが好ましい。
【００１１】
糖衣とは、甘味料、香料、光沢剤等からなるコーティングを指す。糖衣の製造は一般的な糖衣製品（ガム、タブレット、キャンディー、チョコレート、錠剤など）を製造する際の常法に従う。糖衣の製造方法の例として、糖衣掛けされる組成物に糖質水溶液を掛けてコーティングし、乾燥させる工程を繰り返す方法を挙げることができる。糖衣率に関しても特に制限はないが、嗜好性などの面から糖衣掛けされる組成物の重量に対して１０〜１００重量％が好ましく、更には２０〜６０重量％がより好ましい。一方、糖衣にタイミンタチバナ抽出物を配合すると、糖衣内で、タイミンタチバナ抽出物の分散が不十分となる場合があるため、さらに、好ましくは、糖衣にタイミンタチバナ抽出物と乳化剤が配合された口臭抑制組成物が好ましい。乳化剤は特に限定されることはないが、例としてテトラグリセリン縮合リシノレート、デカグリセリンラウリン酸エステル、クエン酸モノグリセライドオレイン系、デカグリセリンオレイン酸エステル、ジグリセリンモノオレエート、ソルビトール型モノラウレート、ソルビタンモノラウレート、デカグリセリンステアリン酸エステル、ジアセチル酒石酸モノグリセライド、モノラウリン酸ペンタグリセリン、デカグリセリンモノオレエート、モノミリスチン酸デカグリセリン、デカグリセリンカプリル酸エステル、デカグリセリンミリスチン酸エステル、ポリソルベ−ト２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、トリアセチン、プロピレングリコールを挙げることができる。一方、乳化剤はＨＬＢが７以上９．５以下であることが好ましい。また、さらに、シロップの均一性の観点から、ジグリセリンモノオレエート、ソルビトール型モノラウレート、ソルビタンモノラウレート、デカグリセリンステアリン酸エステル、ジアセチル酒石酸モノグリセライドが好ましく、さらに、糖衣の乾きやすさ、乳化剤特有の臭いの少なさの点において、デカグリセリンステアリン酸エステル、ジアセチル酒石酸モノグリセライドが特に好ましい。
【００１２】
また、本発明は、タイミンタチバナ抽出物と乳化剤を混合し、これを糖衣シロップに混合する工程を含む、糖衣を有するタイミンタチバナ抽出物配合口臭抑制用組成物の製造方法を提供する。ミルシノン酸の可溶化率はｐＨ６．９以上で７７％以上となるため、好ましくは、タイミンタチバナ抽出物と乳化剤を混合しｐＨを７．１以上に調整し、これを糖衣シロップに混合することが好ましい。
【実施例】
【００１３】
実験１
乳化剤の検討
（１）タイミンタチバナ抽出物の乳化
タイミンタチバナ葉の７０％エタノール抽出液を溶媒留去し、水を加えることにより沈殿を得た。これをタイミンタチバナ抽出物として用いた。この沈殿に乳化剤を添加し、ｐＨ調整後に加温・乳化した。これをタイミンタチバナ乳化製剤という。
乳化剤の量が多すぎると、乳化剤特有の臭いが強まり、乳化製剤の粘性が高まり、これらの混合物を含有する糖衣の乾きに影響するという問題が生じる。乳化剤の量としては、タイミンタチバナ抽出物固形分に対し１９重量％程度が適していると考えた。
また、タイミンタチバナ抽出物に含まれるミルシノン酸は酸性で溶解性が低下し、中性〜弱アルカリ性にて溶解性が改善する。タイミンタチバナ抽出物の可溶化に適した乳化剤は強い酸性なので、タイミンタチバナ抽出物と乳化剤を混合すると酸性に傾き、ミルシノン酸が不溶化するという問題がある。そこでタイミンタチバナ抽出物と乳化剤の混合物を、アルカリ性のｐＨ調整剤を用いてｐＨを約７に調整してから乳化した。ｐＨ調整剤としては、カセイソーダ水溶液、重曹水溶液が挙げられる。
【００１４】
（２）各種乳化剤を用いたタイミンタチバナ抽出物含有糖衣シロップの比較
タイミンタチバナ抽出物に各種乳化剤を加えて乳化してタイミンタチバナ乳化製剤とし、これを糖衣シロップに混合した際の状態を観察した。タイミンタチバナ抽出物の１９重量％の乳化剤を添加し、７０℃保温して混合後、７０℃に保温した糖衣シロップと混合した。このように調製されたサンプルについて、シロップの均一性および乾きやすさを観察した。
【００１５】
結果
表１に各種乳化剤の親水親油バランス（ＨＬＢ）、タイミンタチバナ抽出物含有糖衣シロップの均一性および乾きやすさ、乳化剤の臭い、乳化剤の製品名、乳化剤の名称、乳化剤の性状を示す。シロップの均一性より、ＨＬＢ７〜９．５の乳化剤で、理研ビタミン製のポエムＷ−６０（ジアセチル酒石酸モノグリセライド）、Ｌ−３００（ソルビトール型モノラウレート）、ポエムＤＯ−１００Ｖ（ジグリセリンモノオレエート）、三菱化学フ−ズ製のリョートーＳ−２８Ｄ（デカグリセリンステアリン酸エステル）、リョートーＯ−５０Ｄ（デカグリセリンオレイン酸エステル）、花王製エマゾールＬ−１０Ｖ（ソルビタンモノラウレート）が挙げられる。シロップの均一性の観点から、特に好ましいのはＨＬＢ７．４〜９．５の乳化剤で、理研ビタミン製のポエムＷ−６０（ジアセチル酒石酸モノグリセライド）、Ｌ−３００（ソルビトール型モノラウレート）、ポエムＤＯ−１００Ｖ（ジグリセリンモノオレエート）、三菱化学フ−ズ製のリョートーＳ−２８Ｄ（デカグリセリンステアリン酸エステル）、花王製エマゾールＬ−１０Ｖ（ソルビタンモノラウレート）を挙げられる。さらには、糖衣の乾きやすさ、乳化剤特有の臭いの少なさの点から、ジアセチル酒石酸モノグリセライド、デカグリセリンステアリン酸エステルが特に適していると考えられた。乳化剤を用いずに、タイミンタチバナ抽出物を糖衣シロップに混合したものと、乳化剤を添加して調製されたタイミンタチバナ抽出物含有糖衣シロップの状態を一般的なデジタルカメラを用いてマクロ撮影（高拡大率にて接写撮影）した図を図１に示す。
【００１６】
【表１】
2016094378.tif 000002
【００１７】
実験２
ミルシノン酸の溶解性の確認
タイミンタチバナ抽出物懸濁液を水または苛性ソーダ水溶液と混合し、任意のｐＨのタイミンタチバナ抽出物１％懸濁液を調製した。１，０００×ｇ、５分間、室温にて遠心分離することにより、上清と沈殿を回収した。上清はメタノールにて希釈後フィルターろ過し、沈殿はメタノールにて溶解、希釈後フィルターろ過し、それぞれＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ（島津製ＳＰＤ−Ｍ１０Ａ）にて、カラムに資生堂製Ｃ１８ＭＧ２（４．６φ×２５０ｍｍ）、移動相にＡ：０．１％酢酸水溶液、Ｂ：メタノールを用いたリニアグラジェント溶出、０〜３０ｍｉｎを８０〜１００％Ｂ、流速１ｍＬ／ｍｉｎ、波長２７０ｎｍをフォトダイオードアレイ検出した。沈殿と上清中のミルシノン酸量の総和に対する上清中のミルシノン酸量を、可溶化率として算出した。
【００１８】
結果
ミルシノン酸の可溶化率を表２、図２に示す。タイミンタチバナ抽出物の１％水懸濁液のｐＨは５．３で、ミルシノン酸可溶化率は３０％だった。苛性ソーダ水溶液にて中性〜アルカリ性にするとミルシノン酸の可溶化率は上昇し、ｐＨ７．１では可溶化率８０％、ｐＨ７．４で可溶化率８５％、ｐＨ８．４で可溶化率９８％だった。
これらのことから、酸性に傾いているタイミンタチバナ抽出物と乳化剤の混合物中でミルシノン酸は不溶化しており、ｐＨを中性程度に調製することにより可溶化すると考えられた。
【００１９】
【表２】
2016094378.tif 000003
【００２０】
実験３
タイミンタチバナ抽出物を糖衣に配合したチューインガムからのミルシノン酸溶出率の比較
ポエムＷ−６０と苛性ソーダ水溶液を含有するタイミンタチバナ抽出物乳化製剤を用いて、ガムの糖衣に均一に配合した。タイミンタチバナ抽出物配合チューインガム（ｌｏｔ２０１４０９）の外観を図３に示す。
各種の方法により、タイミンタチバナ抽出物を糖衣に配合したガムから溶出率を測定したところ、乳化剤を用いてタイミンタチバナ抽出物を配合したガムでは、ミルシノン酸の溶出率は高かった。各種の、タイミンタチバナ抽出物を糖衣に配合したガムからのミルシノン酸の溶出率を表３に示す。なお、タイミンタチバナ乳化殺菌製剤配合糖衣ガムとは、素材メーカーにて試作された乳化剤を添加したタイミンタチバナ抽出物配合ガムであり、乳化製剤を９０度に達温させることにより殺菌処理されている。その他のガムは発明者らが自社の研究室で作製し、殺菌処理は行っていない。
本実験の結果、乳化剤を用いてタイミンタチバナ抽出物を配合したガムは、乳化剤を用いずエタノールを添加したガムよりも、ミルシノン酸の溶出率は高かった。 
【００２１】
【表３】
2016094378.tif 000004
溶出率は３連の平均ＳＤで示す。
【００２２】
実験４
タイミンタチバナ抽出物配合ガムの評価
（１）ヒト口臭抑制効果試験
試験方法
被験者は起床後の飲食、飲水、口腔清掃を避け、朝９時〜９時半に口気を分析した。その後、タイミンタチバナ抽出物配合ガム（ｌｏｔ２０１３０８、乳化剤添加、タイミンタチバナ抽出物５ｍｇ／粒含有）またはプラセボガムを２粒、５分間咀嚼し、咀嚼終了直後から３０，６０，９０，１２０分後の口気をガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析した。ＧＣ（島津製作所製ＧＣ−８Ａ）の１０ｍＬサンプルループに口気を採取し、ＧＣ−ＦＰＤ分析した。分析条件は注入口温度１２０℃、カラム温度８０℃、キャリアガスの窒素ガス流量は３５０ｋＰａ、水素ガスは流量１００ｋＰａ、高純度空気ガス流量は７０ｋＰａとした。分析カラムはＰＴＦＥ（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））カラム、カラム充填剤はＳｈｉｍａｌｉｔｅ  ８０−１００  ｍｅｓｈ  ＡＷ−ＤＭＣＳ処理済を用いた。なお、プラセボガムとして、タイミンタチバナ抽出物を配合せず、乳化剤を配合した糖衣シロップを用いて、常法に従って糖衣掛けしたガムを用いた。 
【００２３】
結果
プラセボガム、タイミンタチバナ抽出物配合ガム（ｌｏｔ２０１３０８）について各４日間の摂取前における測定値の平均を０とした測定値の変化量の平均、平均±ＳＤを表４〜６、図４に示す。タイミンタチバナ抽出物配合ガム（ｌｏｔ２０１３０８）の摂取によってプラセボガムよりも硫化水素（Ｈ２Ｓ）、メチルメルカプタン（ＣＨ３ＳＨ）、揮発性硫黄化合物（ＶＳＣｓ）（硫化水素とメチルメルカプタンの和として示す）が減少し、その効果はガム摂取後１２０分間持続した。
【００２４】
表４は、タイミンタチバナ抽出物配合ガム（ｌｏｔ２０１３０８）、あるいはプラセボガムを摂取する前の測定値の平均値を０とした口気中硫化水素の濃度の変化量、表５は同じくメチルメルカプタン濃度の変化量、表６は同じくＶＳＣｓ濃度の変化量を示す。
【００２５】
【表４】
2016094378.tif 000005
【００２６】
【表５】
2016094378.tif 000006
【００２７】
【表６】
2016094378.tif 000007
【００２８】
２）メチオニナーゼ阻害試験
試験方法
メチルメルカプタン産生酵素であるメチオニナーゼに対するタイミンタチバナ抽出物配合ガムの酵素活性阻害効果を評価した。Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ  （Ｆ．ｎ）ＪＣＭ８５３２を３．０ｇ／Ｌのイーストエクストラクトと５ｍｇ／Ｌのへミンおよび０．５ｍｇ／Ｌのメナジオンを含むトリプチケースソイブロス培地中、嫌気条件下で３７℃にて１日間、前培養した。その後本培養用のトリプチケースソイブロス培地に前培養液を２０％植菌し、嫌気性条件下で３７℃にて２日間培養した。８０００×ｇ、４℃で遠心分離して菌体を回収し、１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．６）に懸濁、超音波破砕機（トミー精工製ｍｏｄｅｌ  ＵＲ−２００Ｐ）を用い、出力２０Ｗにて０℃で７．５分間処理した。２０，０００×ｇ、４℃にて２０分間遠心分離して上清を回収後−８０℃保存し、使用時に溶解して使用した。粗酵素液はＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ, ＭＡ， ＵＳＡ）を用い、タンパク濃度を算出した。粗酵素液のタンパク濃度は２．７ｍｇ／ｍＬであり、反応系で０．３ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬに希釈して用いた。
Ｆ．ｎ  ＪＣＭ８５３２菌体破砕液上清をメチオニナーゼ粗酵素とし、メチルメルカプタン産生反応の副生成物であるα−ケト酪酸を以下の方法により検出した。０．３ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ粗酵素、３０ｍＭメチオニン、５０μＭピリドキサールリン酸及びサンプルのガム糖衣懸濁液を１ｍＬの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で混合し、３７℃で６０分間反応させた。ガム糖衣懸濁液はｌｏｔ２０１３０８（乳化剤添加、タイミンタチバナ抽出物５ｍｇ／粒含有）とｌｏｔ２０１３０３（エタノール添加、タイミンタチバナ抽出物５ｍｇ／粒含有）あるいはプラセボのいずれかの糖衣を水に懸濁させたものを希釈した。０．５ｍＬの６％過塩素酸水溶液を添加して反応を停止後、３，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を得た。５０ｍＬの０．０５％  ３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン水溶液と１００ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）からなる検出試薬１．２ｍＬを上清０．４ｍＬに添加して５０℃で３０分間反応後、室温に戻してＯＤ３３５を測定した。
【００２９】
結果
メチオニナーゼ活性の相対値について、各３連の平均、平均ＳＤを表７、図５に示す。
タイミンタチバナ抽出物を配合した糖衣はいずれもメチオニナーゼ活性を濃度依存的に阻害した。乳化剤の添加の有無によってタイミンタチバナ抽出物による酵素阻害活性にほとんど差はなかったが、乳化剤無添加のものよりもわずかながら、乳化剤を添加したもののほうが、メチオニナーゼ阻害活性が高いことが示唆された。タイミンタチバナ抽出物を含有せず、乳化剤のみ含有するプラセボガムにメチオニナーゼ活性阻害効果はほとんど認められなかった。
【００３０】
【表７】
2016094378.tif 000008
【００３１】
実験５
タイミンタチバナ抽出物配合ガムの評価
（１）ヒト口臭抑制効果試験
（試験方法）
被験者は起床後の飲食、飲水、口腔清掃を避け、朝７〜８時に口気を分析した。その後、ガム（ｌｏｔ２０１３０３：エタノール添加、タイミンタチバナ抽出物１０ｍｇ／粒含有），あるいはプラセボガムを２粒、５分間咀嚼し、咀嚼終了直後から３０分，６０分，９０分，１２０分，１５０分，１８０分後の口気を分析した。１ｍＬ容トップ製シリンジを用いて口気１ｍＬを採取し、０．５ｍＬをアビメディカル製オーラルクロマに注入して分析した。各ガムについて６日間ずつ評価を繰り返した。プラセボガムとして、タイミンタチバナ抽出物を配合しない糖衣シロップを用いて、常法に従って糖衣掛けしたガムを用いた。
【００３２】
（結果）
プラセボガム、タイミンタチバナ抽出物配合ガムについて各６日分の測定値の平均、平均ＳＤを表８〜１０、図６に示す。表８は、タイミンタチバナ抽出物配合ガムあるいはプラセボガムの摂取前後の口気中硫化水素濃度、表９は同じくメチルメルメルカプタン濃度、表１０は同じくＶＳＣｓ濃度を示す。タイミンタチバナガムの摂取によって硫化水素、メチルメルカプタン、ＶＳＣｓが減少し、その効果はガム摂取後１８０分間持続した。
【００３３】
【表８】
2016094378.tif 000009
【００３４】
表９は、タイミンタチバナ抽出物配合ガムあるいはプラセボガムの摂取前後の口気中メチルメルカプタン濃度（ｐｐｂ）を示す。
【００３５】
【表９】
2016094378.tif 000010
【００３６】
【表１０】
2016094378.tif 000011
【００３７】
（２）ヒト口臭抑制効果試験（メチオニン洗口モデル）
試験方法
被験者は起床後の飲食、飲水、口腔清掃を避け、朝９〜１０時に口気を分析した。その後、タイミンタチバナ抽出物配合ガム（ｌｏｔ２０１３０３：エタノール添加、タイミンタチバナ抽出物１０ｍｇ／粒含有）あるいはプラセボガムを２粒、５分間咀嚼し、直後に５ｍＭメチオニン溶液２０ｍＬで洗口した。ガム咀嚼前、洗口直後、１５分，３０分，６０分，９０分，１２０分後に１ｍＬ容トップ製シリンジをくわえて３分間口を閉じて安静を保ったあと、口気１ｍＬを採取し、０．５ｍＬをアビメディカル製オーラルクロマに注入して分析した。各ガムについて７日間ずつ評価を繰り返した。
【００３８】
結果
プラセボガム、タイミンタチバナ抽出物配合ガムを咀嚼した結果について各７日分の測定値の平均、平均±ＳＤを表１１、図７に示す。メチオニン洗口後に発生するメチルメルカプタン量は、プラセボガム摂取後よりもタイミンタチバナ抽出物配合ガム摂取後の方が少なかった。
【００３９】
【表１１】
2016094378.tif 000012
【００４０】
（３）システインまたはメチオニン添加唾液培養法
試験方法
タイミンタチバナ抽出物配合ガム（ｌｏｔ２０１３０３：エタノール添加、タイミンタチバナ抽出物１０ｍｇ／粒含有）あるいはプラセボガム２粒（３ｇ）を５ｍＬの水に懸濁し、ガム糖衣懸濁液として用いた。ＶＳＣｓの基質であるシステインまたはメチオニンを添加した唾液を用いて評価した。被験者（３名）は、朝食摂取および歯磨きの後、飲食を避け、午前１１〜１２時にパラフィンを咀嚼した刺激唾液１０ｍＬをチューブに吐出した。刺激唾液は、直ちに氷中に保管して、ボルテックスで撹拌し、ガ−ゼでろ過した。１８ｍＬ容の密閉バイアル中、唾液１．４ｍＬとガム糖衣懸濁液または水０．４ｍＬを混合し、１０ｍＭ  Ｌ−システインまたはＬ−メチオニンの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）溶液０．２ｍＬを添加して嫌気条件下にて３７℃で３時間インキュベートした。反応後、ヘッドスペースガス２００μＬをＧＣ分析した。ＧＣ分析条件は、ＧＣ６８９０Ｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ），カラムＤＢ−１（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ），注入口温度２００℃，検出器温度２００℃，カラム温度３５℃（２ｍｉｎ），３５→１８０℃（４０℃／ｍｉｎ），１８０℃（１．５ｍｉｎ），Ｈ２流量５０ｍＬ／ｍｉｎ，Ａｉｒ流量６０ｍＬ／ｍｉｎ，定流量カラム＋Ｎ２メ−クアップ流量１５ｍＬ／ｍｉｎとした。
【００４１】
結果
プラセボガム、タイミンタチバナガムについて各３連の測定値の平均、平均ＳＤを表１２、図８に示す。システイン添加唾液から発生する硫化水素は、コントロ−ル（ガム糖衣懸濁液無添加）およびプラセボガムよりもタイミンタチバナガムで抑制された。メチオニン添加唾液から発生するメチルメルカプタンも同様にコントロ−ル（ガム糖衣懸濁液無添加）およびプラセボガムよりもタイミンタチバナガムで抑制された。
【００４２】
【表１２】
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【００４３】
（４）直接消臭試験による評価
試験方法
バイアル瓶（２５ｍＬ容）に細かく裁断したガム（ｌｏｔ２０１３０３：エタノール添加、タイミンタチバナ抽出物１０ｍｇ／粒含有）あるいはプラセボガム、３ｇと２００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５）５ｍＬを加え、３７℃で４０分間攪拌してガムから効果成分を溶出させた。さらに２５ｐｐｍメチルメルカプタンＮａ溶液０．５ｍＬを加え、テフロン（登録商標）コートされたゴム栓で封をして、３７℃にて３０分間反応させた。反応後のバイアル瓶中のヘッドスペースガス０．２ｍＬをＧＣ−ＦＰＤ分析した（ＧＣ６８９０Ｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ），カラムＨＰ−５（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ），スプリット比１５：１，注入口温度２００℃，検出器温度２００℃，カラム温度５０℃一定，Ｈ２流量５０ｍＬ／ｍｉｎ，Ａｉｒ流量６０ｍＬ／ｍｉｎ，定流量カラム＋Ｎ２メークアップ流量６０ｍＬ／ｍｉｎ）。
【００４４】
結果
コントロール（ガムなし）、プラセボガム、タイミンタチバナガムについて各４連の測定値の平均、平均ＳＤを表１３、図９に示す。タイミンタチバナガムはコントロールおよびプラセボガムよりもメチルメルカプタンを直接消臭する効果が高かった。
【００４５】
【表１３】
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【００４６】
実験６
タイミンタチバナ抽出物の評価
（１）ヒト口臭抑制効果
試験方法
苛性ソーダ水溶液を用いてｐＨ８に調製したタイミンタチバナ抽出物の０．１重量％懸濁水１０ｍＬまたは水１０ｍＬにて３０秒間洗口した前後の口気１０ｍＬをＧＣ８Ａにて分析した。
【００４７】
結果
３日間の摂取前における測定値の平均を０とした、測定値の変化量の平均、平均±ＳＤを表１４〜１６、図１０に示す。表１４は硫化水素、表１５はメチルメルカプタン、表１６はＶＳＣｓの測定結果を示す。タイミンタチバナ抽出物懸濁液の洗口によって硫化水素、メチルメルカプタン、ＶＳＣｓが減少し、その効果は洗口後１２０分間持続した。
【００４８】
【表１４】
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【００４９】
【表１５】
2016094378.tif 000016
【００５０】
【表１６】
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【００５１】
（２）唾液培養法
試験方法
１８ｍＬ容の密閉バイアル中、唾液１．８ｍＬとエピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）溶液、タイミンタチバナ抽出物の懸濁液、あるいはコントロールとして蒸留水０．２ｍＬを混合して３７℃で嫌気条件下にて約２０時間インキュベートした。反応系でＥＧＣｇあるいはタイミンタチバナ抽出物の濃度は０．１％（１ｍｇ／ｍＬ）であった。インキュベート後、バイアルを氷中保管し、３７℃にて２０分間振とう後、ヘッドスペースガス１０μＬを６連でＧＣ分析した。なお、ＧＣの分析条件は、上述の、システインまたはメチオニン添加唾液培養法の試験方法と同様である。
【００５２】
結果
コントロール、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、タイミンタチバナ抽出物について硫化水素、メチルメルカプタン、ＶＳＣｓの測定結果を、各６連の測定値の平均、平均ＳＤで表１７、図１１に示す。タイミンタチバナ抽出物は培養唾液から発生する硫化水素とメチルメルカプタンを抑制し、その効果はＥＧＣｇよりも強かった。
【００５３】
【表１７】
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【００５４】
（３）直接消臭試験
試験方法
１８ｍＬ容のねじ付ガラス製試験管中、タイミンタチバナ抽出物（２００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７）懸濁液、終濃度の１．５倍濃度）１ｍＬを３７℃保温後、２５ｐｐｍメチルメルカプタンナトリウム水溶液（Ｔｏｋｙｏ  Ｋａｓｅｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を０．５ｍＬ加え、３７℃にて３０分間保温後、ヘッドスペースガス０．０２ｍＬをＧＣ分析した（ＧＣ６８９０Ｎ，カラムＨＰ−５（１９０９５Ｊ−１２１，１０ｍ×Ｉ．Ｄ．０．５３０μｍ×Ｆｉｌｍ２．６５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ），分析条件：Ｈｅ１０ｍＬ／ｍｉｎ，スプリット１５０ｍＬ／ｍｉｎ，スプリット比１：１５，カラム温度５０℃，注入口２００℃，ＦＰＤ温度２００℃）。試験は６連で実施した。
【００５５】
結果
メチルメルカプタンの濃度を、各６連の測定値の平均、平均ＳＤで表１８、図１２に示す。タイミンタチバナ抽出物は濃度依存的にメチルメルカプタンを直接消臭した。
【００５６】
【表１８】
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【００５７】
３）歯周病原性菌に対する作用
（試験方法）
Ｆ．ｎ  ＪＣＭ８５３２，Ｆ．ｎ  ＪＣＭ１１０２３，Ｆ．ｎ  ＪＣＭ１１０２４，Ｆ．ｎ  ＪＣＭ１２９９０，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ（Ｐ．ｍ）ＪＣＭ６３２５，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｎ）ＪＣＭ６３２２はＪａｐａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（Ｒｉｋｅｎ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）より、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ（Ｐ．ｇ）Ｗ８３，Ｐ．ｇ  ＦＤＣ３８１，Ｐ．ｇ  ＡＴＣＣ３３２７７，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ（Ｐ．ｉ）ＡＴＣＣ２５６１１はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）より入手した。各口臭原因菌はＥＧ  ｐｌａｔｅにて嫌気条件下３７℃にて平板培養し、３〜４日毎に継代した。継代後２日目の菌をＧＡＭブイヨン（Ｎｉｓｓｕｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）５ｍＬ中、嫌気条件下３７℃にて１日間培養した。タイミンタチバナ抽出物あるいはチモールは少量のエタノールを添加して滅菌および溶解させ、滅菌水を添加することにより１．６ｍｇ／ｍＬ  ２％エタノール滅菌水溶液または懸濁液を調製した。９６ウェルマイクロプレートにて２％エタノール滅菌水を用いて１００μＬを２倍段階希釈し、１．６ｍｇ／ｍＬ，０．８ｍｇ／ｍＬ，０．４ｍｇ／ｍＬ，０．２ｍｇ／ｍＬ，０．１ｍｇ／ｍＬの系列を準備した。嫌気ボックス内にて２倍濃度の培地に前培養液を１０％植菌して本培養液とし、９６ウェルマイクロプレートに１００μＬアプライした。ブランクは菌液の代わりに培地を用いた。プレートを嫌気条件下３７℃にて５日間培養後、ウェルの濁度を目視で観察およびＯＤ６６０測定（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ  ＳＨ−１０００，ＣＯＲＯＮＡ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ，Ｉｂａｒａｋｉ，Ｊａｐａｎ）し、各測定値からブランクを差し引いた値がコントロール（タイミンタチバナ抽出物またはチモールなし）の２５％以下の濁度を示す濃度を最少生育阻止濃度（ＭＩＣ）とした。試験は４連で実施した。
【００５８】
結果
ＭＩＣを表１９に示す。歯周病原性細菌に対するタイミンタチバナ抽出物のＭＩＣは、抗菌性が知られているチモールよりも低かった。そのため、タイミンタチバナ抽出物の抗菌性はほとんどないか、ごく弱いと考えられた。
【００５９】
【表１９】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図３】
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