(57)【要約】【課題】ゼラチンの粒子状物等を含むプロアントシアニジン分離用組成物等を提供する。【解決手段】熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンの粒子状物、支持体が、熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンで被覆された粒子状物、および、アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する支持体にゼラチンが結合してなる粒子状物からなる群から選択される１以上の粒子状物を使用する。プロアントシアニジンの高重合体を強く結合し、２量体以下のプロアントシアニジンとの結合性が低いため、プロアントシアニジンを結合させた後に溶離液で溶出すると、３〜５量体のプロアントシアニジンを選択的に分離することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンの粒子状物、
支持体が、熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンで被覆された粒子状物、および、
アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する支持体にゼラチンが結合してなる粒子状物からなる群から選択される１以上の粒子状物を含むことを特徴とする、プロアントシアニジン分離用組成物。
【請求項２】
前記ゼラチンは、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチンおよび／またはコハク化ゼラチンであることを特徴とする、請求項１記載のプロアントシアニジン分離用組成物。
【請求項３】
前記熱処理は、温度１３０〜１７０℃、１〜５０時間であることを特徴とする、請求項１または２記載のプロアントシアニジン分離用組成物。 
【請求項４】
前記架橋剤は、アルデヒド系架橋剤、エステル系架橋剤およびアミド縮合剤からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１または２記載のプロアントシアニジン分離用組成物。
【請求項５】
前記支持体は、シリカゲル、アルミナ、シリカアルミナ、活性炭、珪藻土、合成樹脂、セルロース修飾体、および多孔金属からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のプロアントシアニジン分離用組成物。
【請求項６】
前記支持体の平均粒子径は、１〜５，０００μｍであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のプロアントシアニジン分離用組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のプロアントシアニジン分離用組成物を含む、クロマトグラフィー用担体または澱下げ剤。
【請求項８】
平均粒子径１〜５，０００μｍの支持体に濃度０．１〜２０％のゼラチン溶液を加えて前記支持体にゼラチン溶液を吸着させゼラチン吸着支持体を調製する工程と、
前記ゼラチン吸着支持体をアルデヒド系架橋剤、エステル系架橋剤およびアミド縮合剤からなる群から選択される１以上の架橋剤で架橋処理する工程、および／または、酸無水物と反応させて改質処理する工程とを含むことを特徴とする、プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法。
【請求項９】
前記酸無水物が無水コハク酸であり、酸無水物との反応がアルカリ条件下で行われることを特徴とする、請求項８記載のプロアントシアニジン分離用組成物の製造方法。
【請求項１０】
アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する平均粒子径１〜５，０００μｍの支持体に濃度０．１〜２０％のゼラチン溶液を加えて前記支持体にゼラチン溶液を吸着させゼラチン吸着支持体を調製する工程と、
前記ゼラチン吸着支持体を乾燥する工程とを含むことを特徴とする、プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法。
【請求項１１】
ゼラチンの担持量は、組成物１ｇ当たり２〜２００ｍｇであることを特徴とする、請求項８から１０のいずれかに記載のプロアントシアニジン分離用組成物の製造方法。
【請求項１２】
プロアントシアニジン重合体含有溶液と、請求項７に記載のクロマトグラフィー用担体とを混合して、前記クロマトグラフィー用担体に３量体以上のプロアントシアニジン重合体を結合させ、
洗浄液を添加して未結合物を洗浄により除去し、
次いで、溶離液を添加して、３〜５量体のプロアントシアニジン重合体を溶出させることを特徴とする、プロアントシアニジン３〜５量体の製造方法。
【請求項１３】
前記溶離液は、５０〜８０％アセトンであることを特徴とする、請求項１２記載のプロアントシアニジン３〜５量体の製造方法。
【請求項１４】
前記プロアントシアニジン重合体含有溶液は、ブドウ種子抽出物、リンゴ果皮抽出物、黒豆抽出物、緑茶抽出物、赤ワイン、市販のポリフェノール製剤、アズキ抽出液、ブドウ絞りかす、アズキ渋切り液、リンゴ絞りかす、クランベリー抽出液、ブルーベリー抽出液およびセイロンシナモン抽出液からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１２または１３記載のプロアントシアニジン３〜５量体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改質ゼラチンの粒子状物等を含むプロアントシアニジン分離用組成物、前記組成物を含むクロマトグラフィー用担体または澱下げ剤、プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法、およびプロアントシアニジン３〜５量体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロアントシアニジンは、ポリフェノールの一種であり、カテキン、エピカテキンなどのフラバン−３−オールが重合した化合物である。構成成分がカテキンだけのものをプロシアニジンという。酸処理によってアントシアニジンを生成するためプロアントシアニジンと総称されている。植物由来のポリフェノールが、動脈硬化や脳梗塞強の予防に有効であるとして、各種メーカー等がその分離、分析、機能解析を行っている。
【０００３】
プロアントシアニジンには重合体が存在し、重合度によって活性が異なるため、活性に応じた種々の用途が開発されている。例えば、ボイセンベリー種子から抽出されたプロアントシアニジンの２量体または３量体を有効成分とする、血圧上昇抑制剤がある（特許文献１）。また、落花生由来のプロアントシアニジン３量体が抗炎症作用を有することに着目し、これを医薬組成物、化粧品、食品等として使用する方法もある（特許文献２）。更に、アズキから抽出されたプロアントシアニジンと還元剤とを抗ウイルス剤として使用すること（特許文献３）、およびプロアントシアニジンまたはカテキンを有効成分とする、抗ＳＡＲＳコロナウイルス剤も知られている（特許文献４）。
【０００４】
一方、ワイン製造等では、ワインより過剰に含まれるポリフェノールを除き、渋みを減少させ、味を滑らかにするなどの目的で澱下げ剤が使用されている。多量のポリフェノールを含む赤ワインに適用されることが多いが、品種によっては白ワインの製造でも使用されている。醸造されたワインに澱下げ剤を添加し、過剰のポリフェノールを除去している。このような澱下げ剤として、可溶性ゼラチン、卵白アルブミン、二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウムなどが使用されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１３−３５８１０号公報
【特許文献２】特開２０１０−１６８３００号公報
【特許文献３】特開２００８−１４３８４０号公報
【特許文献４】特開２００５−３１４３１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
プロアントシアニジンは、重合度により薬効が異なる場合があり、アズキ由来のプロアントシアニジンを抗ウイルス剤として使用する前記特許文献３では、１量体や２量体は抗ウイルス作用が弱いが、８量体以上ではタンパク質凝集能が高いため細胞毒性を示す場合があると指摘している。また、特許文献４には、重合度による抗ウイルス効果と細胞障害性とが記載されている。ブドウ抽出液の場合、ＳＡＲＳ-コロナウイルスに対する増殖阻害活性に対するＩＣ５０値は４．０（μｇ／ｍｌ）、ブドウ抽出物由来プロアントシアニジンであって平均重合度が１１の高分子画分は、同６．０（μｇ／ｍｌ）であるが、平均重合度４の場合のＩＣ５０値は８．０（μｇ／ｍｌ）、２量体の場合のＩＣ５０値は１１．５（μｇ／ｍｌ）である。一方、ブドウ抽出液の５％細胞障害性（ＣＴＣ５）は１０（μｇ／ｍｌ）であり、高分子画分は１５（μｇ／ｍｌ）、平均重合度４の画分は同２５（μｇ／ｍｌ）、２量体は５０（μｇ／ｍｌ）である。したがって、天然物から粗プロアントシアニジン画分を抽出した後、プロアントシアニジンの３〜５量体を簡便に分離できれば、細胞障害性を低減させ、より安全に有効成分を使用することができる。しかしながら、重合度別に分離精製することは容易でない。
【０００７】
具体的には、前記特許文献１では、ボイセンベリー種由来のプロアントシアニジン２量体および３量体を製造するに際し、オルガノ株式会社製のアンバーライトＸＡＤ−７ＨＰや三菱化学株式会社製のダイヤイオンＨＰ２０などを充填したカラムを使用し、カラムクロマトにより分離精製している。また、特許文献２では、落花生由来のプロアントシアニジン３量体を製造するために、落花生の種子由来の粗プロアントシアニジンを、ダイアイオンＨＰ−２０、トヨパールＨＷ−４０ｃ、逆相クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣなどを用いて分離精製している。また、特許文献３では、小豆抽出液を逆相シリカゲル担体で分離し、２〜１０量体のアズキプロアントシアニジンを得て、３０％エタノールおよび７０％エタノールにより低分子フラボノイド、有機酸、アズキ色素を分取し、ＴＬＣにて確認しつつオリゴマー画分を分取している。また、特許文献４では、還流によって植物からプロアントシアニジンを抽出して粗プロアントシアニジン画分を得て、セファデックス、ポリアミド、シリカゲル、ＯＤＳ等のカラムクロマトグラフ、セルロース膜等を用いた膜分離、酢酸エチル−水等を用いた液−液分離など精製・分離・脱色操作を行うことで、より高純度に有効成分を含有する抽出物を得ることができると記載する。
【０００８】
また、過剰のポリフェノールの除去操作は、酒類の澱下げ工程に限定されず、フルーツジュースなどの非アルコール飲料や味醂などの調味料でも重要な工程である。
【０００９】
上記現状に鑑み、本発明は、プロアントシアニジン重合体をカラムにて精製する際に使用しうる、プロアントシアニジン分離用組成物やクロマトグラフィー用担体を提供することを目的とする。
【００１０】
また本発明は、プロアントシアニジンなどのポリフェノールを除去しうる澱下げ剤を提供することを目的とする。
【００１１】
また、前記プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
更に、前記プロアントシアニジン分離用組成物を用いた、プロアントシアニジン３〜５量体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、ゼラチンに対するプロアントシアニジンの結合性がゼラチンの改質によって変動すること、これにより２量体以下のプロアントシアニジンとの結合性が弱く、６量体以上のプロアントシアニジンとの結合性を高く調整できること、溶離液を選択すれば結合した６量体以上のプロアントシアニジンの結合を保持したまま、３〜５量体のプロアントシアニジンを溶出できること、このような改質ゼラチンを粒子状に調製するとクロマトグラフィー用担体や澱下げ剤として使用しうることなどを見出し、本発明を完成させた。
【００１４】
すなわち本発明は、熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンの粒子状物、
支持体が、熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンで被覆された粒子状物、および、
アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する支持体にゼラチンが結合してなる粒子状物からなる群から選択される１以上の粒子状物を含むことを特徴とする、プロアントシアニジン分離用組成物を提供するものである。
【００１５】
また本発明は、前記ゼラチンは、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチンおよび／またはコハク化ゼラチンであることを特徴とする、上記プロアントシアニジン分離用組成物を提供するものである。
【００１６】
また本発明は、前記熱処理が、温度１３０〜１７０℃、１〜５０時間であることを特徴とする、上記プロアントシアニジン分離用組成物を提供するものである。
【００１７】
また本発明は、前記架橋剤が、アルデヒド系架橋剤、エステル系架橋剤およびアミド縮合剤からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、上記プロアントシアニジン分離用組成物を提供するものである。
【００１８】
また本発明は、前記支持体が、シリカゲル、アルミナ、シリカアルミナ、活性炭、珪藻土、合成樹脂、セルロース修飾体、および多孔金属からなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、上記プロアントシアニジン分離用組成物を提供するものである。
【００１９】
また本発明は、前記支持体の平均粒子径が、１〜５，０００μｍであることを特徴とする、上記プロアントシアニジン分離用組成物を提供するものである。
【００２０】
また本発明は、上記プロアントシアニジン分離用組成物を含む、クロマトグラフィー用担体または澱下げ剤を提供するものである。
【００２１】
また本発明は、平均粒子径１〜５，０００μｍの支持体に濃度０．１〜２０％のゼラチン溶液を加えて前記支持体にゼラチン溶液を吸着させゼラチン吸着支持体を調製する工程と、
前記ゼラチン吸着支持体をアルデヒド系架橋剤、エステル系架橋剤およびアミド縮合剤からなる群から選択される１以上の架橋剤で架橋処理する工程、および／または、酸無水物と反応させて改質処理する工程とを含むことを特徴とする、プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法を提供するものである。
【００２２】
また本発明は、前記酸無水物が無水コハク酸であり、酸無水物との反応がアルカリ条件下で行われることを特徴とする、上記プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法を提供するものである。
【００２３】
また本発明は、アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する平均粒子径１〜５，０００μｍの支持体に濃度０．１〜２０％のゼラチン溶液を加えて前記支持体にゼラチン溶液を吸着させゼラチン吸着支持体を調製する工程と、
前記ゼラチン吸着支持体を乾燥する工程とを含むことを特徴とする、プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法を提供するものである。
【００２４】
また本発明は、前記ゼラチンの担持量は、組成物１ｇ当たり２〜２００ｍｇであることを特徴とする、上記プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法を提供するものである。
【００２５】
また本発明は、プロアントシアニジン重合体含有溶液と、上記クロマトグラフィー用担体とを混合して、前記クロマトグラフィー用担体に３量体以上のプロアントシアニジン重合体を結合させ、
洗浄液を添加して未結合物を洗浄により除去し、
次いで、溶離液を添加して、３〜５量体のプロアントシアニジン重合体を溶出させることを特徴とする、プロアントシアニジン３〜５量体の製造方法を提供するものである。
【００２６】
また本発明は、前記溶離液は、５０〜８０％アセトンであることを特徴とする、上記プロアントシアニジン３〜５量体の製造方法を提供するものである。
【００２７】
また本発明は、前記プロアントシアニジン重合体含有溶液は、ブドウ種子抽出物、リンゴ果皮抽出物、黒豆抽出物、緑茶抽出物、赤ワイン、市販のポリフェノール製剤、アズキ抽出液、ブドウ絞りかす、アズキ渋切り液、リンゴ絞りかす、クランベリー抽出液、ブルーベリー抽出液およびセイロンシナモン抽出液からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、上記プロアントシアニジン３〜５量体の製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、入手が容易なゼラチンを使用して、プロアントシアニジン分離用組成物を提供することができる。本発明のプロアントシアニジン分離用組成物によれば、プロアントシアニジンの高重合体と３〜５量体と低重合体とを分離することができる。また、プロアントシアニジン分離用組成物を使用して、クロマトグラフィー用担体や澱下げ剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】実施例２の結果を示す図である。図１Ａは、製造例１で得たプロアントシアニジン粗画分、６量体以上のプロアントシアニジン画分、３〜５量体のプロアントシアニジンの画分、２量体以下のプロアントシアニジンの画分と、実施例１で得た担体Ａとの凝集性を評価した結果を模式的に示す図であり、図１Ｂは、比較のため、ニワトリ赤血球による凝集性を評価した結果を示す図である。
【図２】実施例３の結果を示す図である。担体Ｈを使用してリンゴ果皮粉砕物抽出物を分離した際のＴＬＣの結果であり、Ｍはマーカーを、（１）はリンゴ果皮抽出液を、（２）は未結合画分を、（３）は洗浄液画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【図３】実施例４の結果を示す図である。担体Ｎを使用してブドウ果皮抽出液を分離した際のＴＬＣの結果であり、Ｍはマーカーを、（１）はブドウ果皮抽出液を、（２）は未結合画分を、（３）は洗浄液画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【図４】実施例５の結果を示す図である。担体Ｊを使用してアズキ灰汁を分離した際のＴＬＣの結果であり、Ｍはマーカーを、（１）はアズキ灰汁を、（２）は未結合画分を、（３）は洗浄液画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【図５】実施例６の結果を示す図である。担体Ｆを使用して市販のポリフェノール製剤であるリンゴ果実由来アップルフェノン、ピクノジェノールを分離した際のＴＬＣの結果であり、Ｍはマーカーを、（１）はアップルフェノンまたはピクノジェノールを、（２）は未結合画分を、（３）は洗浄液画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【図６】実施例７の結果を示す図である。担体Ｇを使用して市販のクロマメポリフェノールを含むクロノケアＰ−６０を分離した際のＴＬＣの結果であり、Ｍはマーカーを、（１）はクロノケアＰ−６０を、（２）は未結合画分を、（３）は洗浄液画分−１を、（４）は洗浄液画分−２を、（５）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【図７】実施例７のＬＣの結果を示す図である。
【図８】実施例８の結果を示す図である。担体Ｌを使用してブドウ果皮、ブルーベリー、クランベリー、セイロンシナモンの抽出液を分離した際のＴＬＣの結果である。Ｍはマーカーを、（１）は３０％エタノール抽出画分を、（２）は未結合画分を、（３）は３０％エタノール洗浄画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【図９】実施例９の結果を示す図である。担体Ｊ、担体Ｅ、担体Ｌを使用して小豆抽出液を分離した際のＴＬＣの結果である。Ｍはマーカーを、（１）は３０％エタノール抽出画分を、（２）は未結合画分を、（３）は３０％エタノール洗浄画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【図１０】実施例１０の結果を示す図である。担体Ｄを使用して、市販の緑茶ポリフェノール製剤である「ポリフェノンＧ」を分離した際のＴＬＣの結果である。Ｍはマーカーを、（１）はポリフェノンＧを、（２）はＡＣＤシリカカラムの３０％エタノール溶出画分を、（３）は担体Ｄによる７０％アセトン溶出画分を、（４）はＯＤＳシリカ溶出画分を示す。
【図１１】実施例１１の結果を示す図である。Ｍはマーカーを、番号１〜５は、それぞれ担体Ａを０、２、４、６、８ｍｇ加えて遠心した後の上清を、番号６〜９は担体Ａを２、４、６、８ｍｇ添加して得た沈渣のアセトン溶出画分を、番号１０はリンゴ由来プロアントシアニジンを示す。
【図１２】実施例１２の結果を示す図である。担体Ｆを使用してブドウ果皮抽出液を分離した際のＴＬＣの結果である。図１２において、Ｍはマーカーを、（１）は担体Ｆによる７０％アセトン溶出画分を、（２）はＧＳＥを、（３）〜（１６）はＬＰ−Ｓの溶出画分を示す。
【図１３】製造例１の結果を示す図である。図１３Ａは、ＬＰ−Ｓで溶出した各画分のＴＬＣとウイルス増殖抑制活性の結果を示し、図１３Ｂは、画分１０のＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示し、図１３Ｃは、アズキ由来のプロアントシアニジンの粗画分、高重合度画分、３〜５量体画分、低重合度画分のＴＬＣであり、図１３Ｂの結果から推定した重合度の指標を付したものである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の第一は、熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンの粒子状物、支持体が、熱処理、架橋剤による架橋処理、および／または酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンで被覆された粒子状物、および、アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する支持体にゼラチンが結合してなる粒子状物からなる群から選択される１以上の粒子状物を含むことを特徴とする、プロアントシアニジン分離用組成物である。ゼラチン粒子を改質すると、プロアントシアニジンの重合度に応じて結合性が変化するが、このような改質として熱処理、架橋処理、酸無水物との反応などがある。ゼラチンのみからなる粒子状物であってもよく、支持体をゼラチンで被覆した粒子状物であってもよく、ゼラチンを改質できる置換基を有する支持体にゼラチンを結合させた粒子状物であってもよい。以下、本発明を詳細に説明する。
【００３１】
（１）プロアントシアニジン分離用組成物
本発明のプロアントシアニジン分離用組成物は、熱処理、架橋処理、酸無水物との反応による改質処理を行ったゼラチンの粒子状物（以下、便宜のため改質ゼラチン粒子状物とも称する。）の他、熱処理、架橋処理、酸無水物との反応による改質処理してなるゼラチンで支持体が被覆された粒子状物、および置換基を有する支持体にゼラチンが結合してなる粒子状物（以下、便宜のため、支持体を含むものを支持体含有改質ゼラチン粒子状物とも称する。）を含む。ゼラチンを使用したのは、プロアントシアニジンとの結合能に優れ、かつゼラチンの原料であるコラーゲンは動物種による組成の変動も少ないからである。本発明では、ゼラチンに、熱処理や架橋処理、酸無水物との反応などの改質を行ったものを使用するが、コラーゲン組成の変動が少ないために改質処理を均一に行うことができる。なお、本願発明における「組成物」とは、改質ゼラチン粒子状物において熱処理、架橋処理、改質処理に幅があり、その平均粒子径にも幅があること、支持体含有改質ゼラチン粒子状物においても支持体の平均粒子径に幅があり、熱処理、架橋処理、改質処理に幅があって組成物をなしていることを意味する。
【００３２】
前記ゼラチンは、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳類、トリなどの鳥類、タイ、ティラピアなどの魚類など、その他いずれの動物種に由来するものであってもよい。ゼラチンは、前処理を水酸化ナトリウムや水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどのアルカリで行ったアルカリ処理ゼラチンであっても、塩酸、酢酸などの酸で行った酸処理ゼラチンであってもよい。好ましくは、アルカリ処理ゼラチンである。ゼラチンの分子量は、３，０００〜３００，０００であり、好ましくは３０，０００〜１５０,０００である。
【００３３】
ゼラチンは、熱処理し、架橋剤によって架橋処理、または酸無水物との反応で改質したものである。これらの処理により少なくともゼラチンの一部の特性を変化させると、プロアントシアニジンとの結合性が変化することが判明した。プロアントシアニジンはポリフェノールであり、多数の水酸基が存在する。ゼラチンを改質することで、これら水酸基との相互作用が変化したと推定される。これら改質により、プロアントシアニジン３量体以上の結合性と、溶離液によるプロアントシアニジン３〜５量体の溶出性を確保することができる。上記改質により、この特異な結合・溶出特性に加え、ゼラチンの溶解性が低下して不溶になるため、プロアントシアニジン分離用組成物としての取り扱い性を向上させることもできる。
【００３４】
前記した結合・溶出特性を確保するための前記熱処理は、温度１３０〜１７０℃、より好ましく１４０〜１６０℃である。加熱時間は、１〜５０時間、より好ましくは２〜３０時間、特に好ましくは３〜１０時間である。上記熱処理により、ゼラチンが水に不溶性となることから、その少なくとも一部が熱架橋されると推定される。
【００３５】
また、架橋処理を行う際に使用する架橋剤としては、グルタルアルデヒド、アセトアルデヒドなどのアルデヒド系架橋剤、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）などのエステル系架橋剤、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどのアミド縮合剤、ＮＨＳエステル／マレイミド系架橋剤などのコハク化剤、トランスアミナーゼなどの酵素剤がある。その他、タンパク質を架橋しうる他の架橋剤を適宜使用することができる。本発明では、アルデヒド系架橋剤、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド）架橋剤、エステル系架橋剤が特に好ましい。
【００３６】
酸無水物と反応させる場合には、無水酢酸、無水安息香酸、無水プロピオン酸、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水フタル酸、トリメリット酸無水物、ピロメリット酸無水物などのカルボン酸無水物、ピロリン酸などのリン酸無水物を使用することができる。本発明では、特に無水コハク酸を好適に使用することができる。
【００３７】
上記により改質されたゼラチンは、粒子状物であることが好ましい。粒子状物であれば、単位体積あたりの表面積が高く、前記結合・溶出特性を効率的に発揮しうるからである。また、クロマトグラフィー用担体等として使用する際の取扱い性にも優れる。なお、粒子状物は、球形に限定されない。澱下げ剤などとして使用する場合には、何れの形状であっても、澱下げ剤としての機能を発揮しうるからである。
【００３８】
本発明のプロアントシアニジン分離用組成物は、ゼラチンと共に支持体を使用することで、プロアントシアニジン分離用組成物の単位体積当たりの質量を調整することができ、支持体の形状がプロアントシアニジン分離用組成物の形状に反映されるため、プロアントシアニジン分離用組成物の形状の選択が容易となる。更に、特定の置換基を有する支持体を使用することで、ゼラチンを改質しうることも判明した。
【００３９】
支持体としては、シリカゲル、アルミナ、シリカアルミナ、活性炭、珪藻土、合成樹脂、セルロース修飾体、多孔金属などから調製することができる。シリカゲルは、シラノール基をＣＯＯＨに置換させたシリカ（ＳＧ−ＣＯＯＨ）であってもよい。更に、置換されたＣＯＯＨ基が、他の置換基で更に置換されたものであってもよい。例えば、ＣＯＯＨ基にＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）を作用させてＮＨＳ化したものを例示することができる。このような支持体にゼラチンを作用させると、ＮＨＳとゼラチンとが反応し、ゼラチンが改質されることが判明した。アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基は、前記ＮＨＳに限定されるものではない。このような置換基を支持体に導入しうる試薬として、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドなどのカルボン酸の活性化剤や、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、水溶性カルボジイミドなどの縮合剤などがある。支持体に応じて適宜選択することができる。これにより、前記した結合・溶出特性を確保することができる。
【００４０】
支持体の平均粒子径は、１〜５，０００μｍであり、好ましくは１〜３，０００μｍである。担体の比表面積は、１０〜１，０００ｍ２/ｇであることが好ましく、より好ましくは５０〜７００ｍ２/ｇである。用途に応じて適宜選択することができる。例えば、プロアントシアニジン分離用組成物をカラムクロマトグラフィー用の充填剤として使用する場合には、カラムサイズや処理液量、その他に応じて適宜選択する。
【００４１】
なお、本発明のプロアントシアニジン分離用組成物において、ゼラチンの担持量は、プロアントシアニジン分離用組成物１ｇ当たり２〜２００ｍｇ、より好ましくは５〜１５０ｍｇである。
【００４２】
（２）プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法
プロアントシアニジン分離用組成物の製造方法に限定はないが、例えば以下の方法で調製することができる。
【００４３】
（ｉ）改質ゼラチンの粒子状物
ゼラチンは、コラーゲンから分解して調製したものでもよく、市販品を使用してもよい。市販品には、粉末状、板状、顆粒状などのゼラチンの乾燥物が存在する。本発明では、これら乾燥物をそのまま、または所定の形状に粉砕等した後に、熱処理、架橋処理、酸無水物との反応などの改質を行うことができる。乾燥物に代えて、予め濃度０．１〜２０％、より好ましくは０．５〜１０％のゼラチン溶液を調製し、これに熱処理や架橋処理を行ってもよい。なお、ゼラチンを溶解する溶液は、水、緩衝液、生理食塩水などを使用することができる。
【００４４】
熱処理は、例えば、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどに乾燥状態のゼラチンやゼラチン溶液を仕込み、温度１３０〜１７０℃、好ましくは１４０〜１６０℃で、減圧条件で加熱する。その他、電熱乾燥、熱風乾燥、真空乾燥を用いてもよい。これにより、熱処理したゼラチンを得ることができる。また、熱処理の後に粉砕し、粒子状物に成形してもよい。その後、必要に応じて、水洗、乾燥、分級し、所望の粒子径のゼラチン粒子状物を得る。
【００４５】
架橋剤による架橋処理を行う場合は、前記ゼラチンにグルタルアルデヒドやアセトアルデヒド、酢酸スルホスクシンイミジルなどの架橋剤を添加する。その後、必要に応じて中和、水洗および乾燥し、分級する。なお、架橋処理の後に熱処理を行ってもよい。熱処理は、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーターなどで、温度１３０〜１７０℃、好ましくは１４０〜１６０℃で、減圧条件で加熱する。その他、電熱乾燥、熱風乾燥、真空乾燥を用いてもよい。
【００４６】
酸無水物と反応は、定法に従い行うことができる。なお、酸無水物との反応に代えて、酸無水物に対応する酸が導入されたゼラチンを使用してもよい。
【００４７】
(ｉｉ)支持体含有改質ゼラチン粒子状物
製造方法に限定はないが、支持体にゼラチン溶液を吸着させたゼラチン吸着支持体を調製し、このゼラチン吸着支持体に熱処理、架橋処理、酸無水物との反応などの改質を行うことが好ましい。
使用する支持体の平均粒子径や材質等は、前記した支持体のなかで吸水性のあるものが好適である。例えば、シリカゲル、アルミナ、シリカアルミナ、活性炭、珪藻土を好適に使用することができる。支持体の形状は、球形であれば球形の支持体含有改質ゼラチン粒子状物となる。
【００４８】
支持体に吸収させるゼラチン溶液の濃度は、０．１〜２０％であることが好ましく、より好ましくは０．１〜１０％、特に好ましくは０．１〜５％である。ゼラチンは加温により溶解するため、ゼラチン溶液は温度５０〜７０℃に加温して使用する。したがって、支持体の吸水量を勘案して、支持体にゼラチン溶液を加えることが好ましい。ゼラチン溶液が残存する場合には、支持体を追加してゼラチン溶液を吸水させてもよい。なお、ゼラチンの担持量は、プロアントシアニジン分離用組成物１ｇ当たり２〜２００ｍｇ、より好ましくは５〜１００ｍｇである。したがって、上記範囲となるように、支持体の吸水量を勘案し、ゼラチン溶液の濃度を選択する。これにより、支持体がゼラチン溶液を吸水し、ゼラチン吸着支持体が得られる。
【００４９】
ゼラチン吸着支持体を熱処理することで、支持体含有改質ゼラチン粒子状物を製造することができる。熱処理は、温度１３０〜１７０℃で１〜５０時間加熱すればよい。支持体表面に吸着されたゼラチンが熱処理によって改質され、かつゼラチンが支持体に固定化される。
【００５０】
ゼラチン吸着支持体を架橋剤によって架橋処理する場合には、例えばゼラチン吸着支持体にグルタルアルデヒド、アセトアルデヒド、酢酸スルホスクシンイミジルなどの架橋剤を含む溶液を加えて架橋処理をおこなう。ゼラチンに架橋処理を行う際には、架橋剤に至適なｐＨに調整してもよい。なお、架橋処理の後に熱処理を行ってもよい。熱処理は、ロータリーエバポレーター、フラッシュエバポレーター、その他通常の恒温器などで、温度１３０〜１７０℃、好ましくは１４０〜１６０℃で、減圧条件で加熱する。その他、電熱乾燥、熱風乾燥、真空乾燥を用いてもよい。架橋処理や熱処理の後、必要に応じて中和し、水洗し、乾燥させればよい。乾燥は、室温でもよいが、通常、１００℃以下、好ましくは９０℃で行うと変性もなく、乾燥効率に優れる。
【００５１】
酸無水物と反応させる場合は、前記ゼラチン吸着支持体を水に懸濁し、酸無水物を添加して反応させる。酸無水物が無水コハク酸の場合には、ゼラチンにサクシニル基が導入される。コハク化ゼラチン吸着支持体を乾燥すれば支持体含有改質ゼラチン粒子状物を得ることができる。無水コハク酸と反応させる場合は、アンモニア添加による弱アルカリ条件で行っても、酢酸添加による弱酸性条件で行ってもよい。なお、得られたコハク化ゼラチン吸着支持体などの改質ゼラチン吸着支持体に、更に他の置換基を導入してもよい。例えば、前記コハク化ゼラチン吸着支持体にアミノ酸を反応させ、サクシニル基とアミノ酸のアミノ基とを反応させてもよい。
【００５２】
本発明では、ゼラチンに代えてコハク化ゼラチンなど、予め酸無水物と反応してなるゼラチン溶液を使用し、ゼラチン吸着支持体を得てもよい。例えばコハク化ゼラチンは、ゼラチンに無水物コハク酸などの酸無水物を反応させた物に該当する。これを乾燥すれば、支持体含有改質ゼラチン粒子状物を得ることができる。
【００５３】
熱処理、架橋処理、酸無水物との反応による改質は、いずれか１種に限定されず、２種以上を併用するものであってもよい。例えば、ゼラチン吸着支持体を得た後に架橋剤による架橋処理を行い、その後に熱処理をおこなってもよい。また、ゼラチン吸着支持体に熱処理を行い、その後に酸無水物と反応させてもよい。
【００５４】
本発明では、支持体として、アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する平均粒子径１〜５，０００μｍの支持体を使用することができる。これに濃度０．１〜２０％のゼラチン溶液を加えて前記支持体にゼラチン溶液を吸着させゼラチン吸着支持体を調製し、このゼラチン吸着支持体を乾燥する。ゼラチン吸着支持体に熱処理、架橋処理、改質処理を行うと、プロアントシアニジンとの結合性が変化するが、このような改質処理を行わない場合でも、アミノ基またはカルボキシル基と反応しうる置換基を有する支持体を使用することで、ゼラチンの特性が変化することが判明した。このような支持体として、シラノール基をＣＯＯＨに置換させたシリカ（ＳＧ−ＣＯＯＨ）が例示される。更に、ＳＧ−ＣＯＯＨにＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）などのカルボン酸の活性化剤などを作用させたものであってもよい。このような支持体にゼラチンを吸着してなるゼラチン吸着支持体は、これを乾燥するだけで、プロアントシアニジンとの結合特性が変化した、支持体含有改質ゼラチン粒子状物となる。なお、前記した結合・溶出特性を奏することを条件に、更に熱処理や架橋処理を行ってもよい。
【００５５】
（３）プロアントシアニジン分離用組成物の用途
本発明のプロアントシアニジン分離用組成物は、プロアントシアニジンの重合度によって結合の程度が相違する。所定の溶離液を使用することで、重合度に応じてプロアントシアニジン分離用組成物に吸着したプロアントシアニジンを離脱させることができる。この結合・溶出特性を応用し、プロアントシアニジン精製用のクロマトグラフィー用担体として好適に使用することができる。
【００５６】
なお、クロマトグラフィー用担体としては、前記プロアントシアニジン分離用組成物を固定相とするものを広く対象とすることができ、カラムクロマトグラフィー用充填剤として使用されるものであっても、薄層クロマトグラフィー用担体であってもよい。
【００５７】
また、６量体以上の高重合度のプロアントシアニジンとの結合性が高いため、ワイン、清酒、梅酒、ウイスキー、味醂などのアルコール食品や、フルーツジュース、食酢、醤油、発酵エキス、などの非アルコール食品の澱下げ剤としても使用することができる。
【００５８】
（４）プロアントシアニジン重合体の製造方法
本発明のプロアントシアニジン分離用組成物は、プロアントシアニジンの重合度に応じて結合能が異なる。ニワトリ赤血球はウイルスと結合して凝集することが知られているが、後記する実施例に示すように、プロアントシアニジンとも結合して凝集する。そこで、２量体以下のプロアントシアニジン、３〜５量体のプロアントシアニジン、６量体以上のプロアントシアニジンそれぞれの段階希釈液と、本発明のプロアントシアニジン分離用組成物との凝集反応を評価したところ、６量体以上のプロアントシアニジンはプロアントシアニジン分離用組成物と強く結合して凝集し、２量体以下のプロアントシアニジンは結合が極めて弱く、３〜５量体のプロアントシアニジンはその中間であることが判明した。
【００５９】
この事実を応用し、プロアントシアニジン重合体含有溶液と本発明のプロアントシアニジン分離用組成物とを混合したところ、プロアントシアニジン分離用組成物に３量体以上のプロアントシアニジンが結合し、未結合のプロアントシアニジンを回収すれば、２量体以下のプロアントシアニジンを分取することができた。また、３量体以上のプロアントシアニジンが結合した後に溶離液を加えると、３〜５量体がプロアントシアニジン分離用組成物から離脱して溶出され、プロアントシアニジン３〜５量体を分取することができた。６量体以上の高重合体は、プロアントシアニジン分離用組成物に結合したまま保持された。
【００６０】
すなわち、本発明のプロアントシアニジン分離用組成物は、プロアントシアニジン３〜５量体製造用のクロマトグラフィー用担体として使用することができ、プロアントシアニジン重合体含有溶液から重合度に応じてプロアントシアニジンを分取することができる。
【００６１】
プロアントシアニジン重合体含有溶液としては、プロアントシアニジンを含油する植物からの抽出液、プロアントシアニジンを含有する飲料、その他いずれであってもよい。例えば、ブドウ、リンゴ、イチゴ、クランベリー、ブルーベリー、その他の果実の果皮からの浸出液やこれらの有機溶媒抽出液、茶葉、黒豆、小豆その他の豆類の煎じ液、プロアントシアニジンを含有する市販の飲料などをプロアントシアニジン重合体含有溶液とすることができる。プロアントシアニジンを含有する植物その他の種類、含まれるプロアントシアニジンの構造その他に応じて、適宜選択することができる。
【００６２】
プロアントシアニジン分離用組成物をカラムクロマトグラフィー用担体として使用する場合には、予めカラムにカラムクロマトグラフィー用担体を充填し、前記プロアントシアニジン重合体含有溶液をカラムに添加する。これにより、プロアントシアニジン重合体含有溶液に含まれる３量体以上のプロアントシアニジンが担体に結合する。カラム末端からプロアントシアニジン重合体含有溶液を排出させると、主として２量体以下の低重合のプロアントシアニジンを回収することができる。
【００６３】
カラムクロマトグラフィー用担体に結合しなかった低重合度のプロアントシアニジンを回収するため、更にカラムに洗浄液を添加してもよい。このような洗浄液は、含まれるプロアントシアニジンの種類や、プロアントシアニジン重合体含有溶液の組成、その他に応じて適宜選択することができる。例えば、プロアントシアニジンを含む植物からエタノール抽出した抽出液をプロアントシアニジン重合体含有溶液とする場合は、エタノール含有溶媒を洗浄液とすることができる。例えば、３０％エタノールを使用して抽出した場合に３０％エタノールを洗浄液とする。その他、予め少量の試料を用いて低重合度のものが溶出される溶媒を適宜選択し、使用することができる。
【００６４】
低重合度のプロアントシアニジンを排出した後に前記カラムに溶離液を添加すると、３〜５量体のプロアントシアニジンが溶離液により溶出され、６量体以上の高重合度のプロアントシアニジンは充填剤に結合したまま維持される。このような、３量体以上のプロアントシアニジンを回収するために使用される溶離液としては、メタノールやエタノールなどの炭素数２〜５のアルコール、アセトン、エーテル、トルエンなどの有機溶媒を好適に使用することができる。その後の溶媒の除去操作を考慮すると、アルコールやアセトンなどの有機溶媒が好ましい。本発明では、アセトンを好ましく使用することができる。なお、アセトンは、１００％に限定されず、４０％以上であればよく、５０〜８０％アセトンも好適に使用することができる。また、低重合度のプロアントシアニジンを排出したカラムにエタノールを添加して、３〜５量体を溶出させることもできる。エタノールは１００％に限定されず、２０〜６０％のエタノールであってもよい。使用する溶離液は、プロアントシアニジンの種類やプロアントシアニジン重合体含有溶液の組成その他に応じて予備試験を行い、適当な溶媒を適宜選択することができる。本発明のプロアントシアニジン重合体の製造方法によれば、プロアントシアニジン分離用組成物からなるカラムクロマトグラフィー用担体を使用し、プロアントシアニジン重合体含有溶液に含まれるプロアントシアニジンを重合度別に分離することで、例えば３〜５量体を主成分とするプロアントシアニジンなど、所望のプロアントシアニジンを製造することができる。
【００６５】
前記した溶離液によって溶出される３〜５量体は、更に他の精製方法によって精製してもよい。
また、プロアントシアニジン重合体含有溶液から分取された２量体以下の低重合度のプロアントシアニジンも他の精製方法で精製し単量体と２量体とに分離してもよい。
【００６６】
カラムクロマトによって分取するプロアントシアニジンの重合度は、例えばＴＬＣによって判断することができる。一方、重合度によってＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０値が異なることが知られているプロアントシアニジンの場合は、ＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０値を測定し、含まれる重合体の指標とすることができる。
【００６７】
本発明では、ワイン、日本酒、焼酎などの醸造アルコール飲料、ブドウ、リンゴ、イチゴ、クランベリー、ブルーベリー、緑茶、セイロンシナモンなどの非アルコール飲料、黒豆、小豆、大豆、その他の豆類の抽出液、ブドウ絞りかす、リンゴ絞りかす、その他の絞りかすなど、３量体以上のプロアントシアニジンを含むもの、またはこれらの水溶液をプロアントシアニジン重合体含有溶液として使用することができる。
更に、市販のポリフェノール製剤などから高重合体を除去することも可能である。
【実施例】
【００６８】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、ＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０値の測定は以下の方法によった。
【００６９】
ウイルスの細胞内増殖抑制作用およびＩＣ５０値の測定
（１)ウイルスストック液の調製と力価の測定
ベロ細胞（アフリカミドリザル腎臓由来、株式会社大日本製薬製）を１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンを添加したダルベッコ変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）にて５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。９０％単層を形成した培養細胞に、細胞１個当たりのＳＡＲＳ−コロナウイルスの数が０．１となる条件でウイルス感染を行い、３７℃で１６時間培養し、上清を回収してこれをウイルスストック液とした。なお、ＳＡＲＳ−コロナウイルスとして、フランクフルト大学医学部のドエル博士より分与されたＦＦＭ−１株を用いた。
【００７０】
ウイルスストック液をウイルス希釈液（１％ウシ血清アルブミンを加えたＰＢＳ（−）（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋を含まない０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０））で１０倍階段希釈した。ベロ細胞で９０％単層が形成された２４穴ウェルに各希釈液ウイルス液０．２ｍｌを添加し、２５℃、６０分間感染させ、１．０％メチルセルロースを加えたＤＭＥＭ（５％ウシ胎児血清含有）を加えて７日間培養した。培養後、培養液を取り除き、細胞を２．５％クリスタルバイオレットで染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄および脱色した。各ウェルのプラーク数を測定し、ウェル３個のプラーク数の平均値を１ｍｌに含まれるウイルス量（ＰＦＵ）とした。このプラーク法によるウイルスストック液の力価は、５×１０７ＰＦＵ／ｍｌであった。
【００７１】
（２）ＩＣ５０値の測定
ベロ細胞を細胞数２×１０６個となるように培養した６穴ウェルに、前記ウイルス液０．２ｍｌを添加し、２２℃で１時間感染させた。次いで、各ウェルに、各プロアントシアニジンを培養液１ｍｌあたり０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌとなるように加え、０．９％メチルセルロースを加えたＤＭＥＭ（５％ウシ胎児血清含有）で７日間培養した。培養後、前記プラーク法によってウイルス量を測定し、各プロアントシアニジンのＩＣ５０値を求めた。
【００７２】
（実施例１）
下記方法に従い、各種のプロアントシアニジン分離用組成物を調製した。この組成物は、プロアントシアニジンのカラムクロマトグラフィー用担体として使用するため、実施例では「担体」と称する。なお、担体Ｂおよび担体Ｍは比較用担体である。
【００７３】
（ｉ）担体Ａ（Ｇｅｌ（ＨＴ））：
ゼラチン（株式会社ニッピ製、商品名「Ｅ−３」、牛アルカリ処理ゼラチン、平均分子量２５，０００）の２％水溶液を調製し、ロータリーエバポレーターで温度１５０℃で、６時間加熱処理した。この画分を水洗して可溶性成分を除去し、加熱乾燥した。加熱処理後に、粒子分級器して粒子径５０μｍの画分を分取した。この粒子状物を、担体Ａとした。
【００７４】
（ｉｉ）担体Ｂ：
シリカゲル（富士シリシア化学株式会社製、商品名「クロマトレックス  ＭＢ１００  ７５／２００」、平均粒子径１００μｍ）を水洗および乾燥した。これを担体Ｂとした。
【００７５】
（ｉｉｉ）担体Ｃ：
担体Ａの１質量部に対して担体Ｂの４質量部を混合および撹拌し、混合物を得た。この混合物を担体Ｃとした。
【００７６】
（ｉｖ）担体Ｄ（ＳＧ／Ｇｅｌ−ＧＡＬ）：
ゼラチン（株式会社ニッピ製、商品名「Ｅ−３」、牛アルカリ処理ゼラチン、平均分子量２５，０００）の１％水溶液を調製し、酸性条件下（酢酸存在下）、その１００ｍｌを２０ｇのシリカゲル（富士シリシア化学株式会社製、商品名「クロマトレックス  ＭＢ１００  ７５／２００」、平均粒子径１００μｍ）に６０℃に温めながら添加および吸着させ、ゼラチン吸着シリカゲルを得た。次いで、ゼラチン吸着シリカゲルを０．２５Ｍのグルタルアルデヒド溶液（キシダ化学株式会社製）で３０℃、５時間処理後、過剰の水で水洗し、加熱（９０℃）乾燥し、平均粒子径１００μｍの架橋ゼラチン担持粒子状物を得た。これを担体Ｄとした。
【００７７】
（ｖ）担体Ｅ（ＳＧ／Ｇｅｌ（ＨＴ））：
温度６５℃に加熱した１００ｍｌゼラチン（株式会社ニッピ製、商品名「Ｅ−３」、牛アルカリ処理ゼラチン、平均分子量２５，０００）の２％水溶液に、シリカゲル（富士シリシア化学株式会社製、商品名「クロマトレックス  ＭＢ１００  ７５／２００」、平均粒子径１００μｍ）１１０ｇを添加および撹拌し、シリカゲルにゼラチン水溶液の全量を吸着させ、ゼラチン吸着シリカゲルを得た。次いで、ゼラチン吸着シリカゲルを温度７０℃で乾燥し、次いで、温度１５０℃で、６時間加熱処理した。その後、水洗し、７０℃にて乾燥し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。これを担体Ｅとした。なお、水洗時の洗浄液を回収してタンパク質量を測定（バイオ・ラッド社、ＤＣプロテイン  アッセイ試薬）したところ、仕込み量の９５％のゼラチンが担持Ｅに結合していることを確認した。
【００７８】
（ｖｉ）担体Ｆ（ＳＧ／Ｇｅｌ（ＧＡＬ））：
上記担体Ｅ１００ｇを２００ｍｌの２％のグルタルアルデヒド（ナカライテスク株式会社）で２２℃、１６時間処理し、１Ｍトリス−アミノメタン（ｐＨ７．５）で２時間中和し、水洗し、および温度７０℃で加熱乾燥し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。得られた粒子状物を担体Ｆとした。
【００７９】
（ｖｉｉ）担体Ｇ（ＳＧ／Ｇｅｌ（ＡＡＬ））：
上記担体Ｅ１００ｇを２００ｍｌの２％アセトアルデヒド（ナカライテスク株式会社）で２２℃、１６時間処理後、１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン（ｐＨ７．５）で２時間中和し、水洗し、および温度７０℃で乾燥し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。得られた粒子状物を担体Ｇとした。
【００８０】
（ｖｉｉｉ）担体Ｈ（ＳＧ／Ｇｅｌ（Ｓ−ＮＨＳ−Ａｃ））：
上記担体Ｅ１０ｇに５０ｍｇの酢酸スルホスクシンイミジル（Ｓ−ＮＨＳ−Ａｃ）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）水溶液を加え、温度２２℃で１時間処理した後、１Ｍトリス−アミノメタン（ｐＨ７．５）で２時間中和し、水洗し、および温度７０℃で加熱乾燥し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。得られた粒子状物を担体Ｈとした。
【００８１】
（ｉｘ）担体Ｊ（ＳＧ／Ｇｅｌ−ＳＡＩ）：
温度６５℃に加熱した１％ゼラチン（株式会社ニッピ製、商品名「ＢＰ２５０」、牛アルカリ処理ゼラチン、平均分子量６０，０００）溶液１００ｍｌに１１０ｇのシリカゲル（富士シリシア化学株式会社、商品名「クロマトレックス  ＭＢ１００  ７５／２００」、平均粒子径１００μｍ）を添加し、ゼラチン吸着シリカゲルを得た。次いで、ゼラチン吸着シリカゲルを温度７０℃で乾燥し、温度１５０℃で６時間の熱処理を行った。これを２００ｍｌの水に懸濁し、アンモニアでｐＨ９に調製しつつ無水コハク酸１２０ｍｇを撹拌しながら添加し、室温で５時間反応させた。反応後、グリシンを０．１Ｍになるように加え、さらに５時間反応させた。水洗後、温度７０℃で乾燥し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。これを担体Ｊとした。なお、仕込み量の９５％のゼラチンが担持Ｊに結合していた。
【００８２】
（ｘ）担体Ｌ（ＳＧ／ＳＡ−Ｇｅｌ（ＨＴ））：
ゼラチンに代えてコハク化ゼラチン（株式会社ニッピ製、商品名「ＴＹＣＰ」）５００ｍｇを３０ｍＬの蒸留水に加え、加温溶解し、５０ｇのシリカゲル（富士シリシア化学株式会社、商品名「クロマトレックス  ＭＢ１００  ７５／２００」、平均粒子径１００μｍ）に加温しながら一昼夜吸着させ、コハク化ゼラチン吸着シリカゲルを得た。このコハク化ゼラチン吸着シリカゲルを蒸留水で洗浄した後、温度１５０℃で６時間加熱処理し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。これを担体Ｌとした。なお、仕込み量の８５％のゼラチンが担体Ｌに結合していた。
【００８３】
（ｘｉ）担体Ｍ（ＳＧ／Ｇｅｌ（Ｎ））：
温度６５℃に加熱した１００ｍｌゼラチン（株式会社ニッピ製、商品名「Ｅ−３」、牛アルカリ処理ゼラチン、平均分子量２５，０００）の２％水溶液に、シリカゲル（富士シリシア化学株式会社、平均粒子径１００μｍ）１１０ｇを添加および撹拌し、シリカゲルにゼラチン水溶液の全量を吸着させ、ゼラチン吸着シリカゲルを得た。このゼラチン吸着シリカゲルを水洗し、９０℃にて乾燥し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。これを担体Ｍとした。
【００８４】
（ｘｉｉ）担体Ｎ（ＣＯＯＨ−ＳＧ／Ｇｅｌ）：
ＣＯＯＨ−シリカ（富士シリシア化学株式会社、「クロマトレックスＣＯＯＨ」、平均粒子径１００μｍ）５ｇを５０ｍＬ遠沈管にとり、脱水ジクロロメタンを３０ｍＬ、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）を０．５ｇ、ＤＣＣ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製、ジシクロヘキシルカルボジイミド）０．８９ｇ、ＤＭＰＡ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製、ジメチルアミノピリジン）２６５ｍｇを加え、一晩反応後ろ過し、シリカゲルをクロロホルムと酢酸エチルで洗浄し、ＮＨＳ／ＣＯＯＨシリカとした。ゼラチン（株式会社ニッピ製、商品名「Ｅ−３」、牛アルカリ処理ゼラチン、平均分子量２５，０００）０．５ｇを３０ｍＬのｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水に加え、加温溶解させ、そこにＮＨＳ／ＣＯＯＨシリカ５ｇを加えた。一昼夜反応後、エタノールアミン１ｍＬを加え、さらに一昼夜反応させた後、シリカをろ取し、１％ｔｗｅｅｎ２０溶液、アセトン、水で洗浄し、真空乾燥し、平均粒子径１００μｍの粒子状物を得た。これを担体Ｎとした。
【００８５】
上記担体の調製方法を表１に示す。
【００８６】
【表１】
2016209802.tif 000002
【００８７】
(製造例１）
エリモショウズを蒸留水３００ｍｌで９０℃、２０分、撹拌抽出してアズキの渋切り液を得た。これを１０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、０．８μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過し、粗抽出液２００ｍｌを得た。Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｓｅｐｈａｄｅｘ（シグマアルドリッチジャパン合同会社製、「ＬＰ−Ｓ」）を直径２５ｍｍ、長さ３００ｍｍのカラムに充填し、前記した粗抽出液を吸着させ、着色が無くなるまで７０％エタノールで洗浄した後、７０％アセトンで溶出し、溶出液を乾燥した。次いで、アセトンで平衡化したＬＰ−Ｓカラムでゲルろ過した。各画分を減圧、乾固後、ＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）を測定した。
【００８８】
前記ＬＰ−Ｓで溶出した各画分のＴＬＣとウイルス増殖抑制活性の結果を図１３Ａに示す。なお、ＴＬＣは、薄層クロマトとしてメルク社のシリカゲル６０を使用し、ブタノール：酢酸：水＝４：２：１の溶媒で展開した。検出は、０．１％ＦｅＣｌ３と０．１％:Ｋ３[Ｆｅ(ＣＮ)６]の等量混合液で発色させた。図１３Ａにおいて、Ｍはマーカー(リンゴサポニン、分子量８７２)、Ｃはアズキの渋切り液、番号６〜１３は、ＬＰ−Ｓによる溶出画分を示す。図１３Ａの画分６〜８を高重合度画分、画分９〜１１を３〜５量体画分、画分１２および１３を低重合度画分とした。図１３Ａに示すように、３〜５量体画分は高重合度画分および低重合度画分より、ウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）が低くなる傾向が観察された。
【００８９】
合成の３量体、４量体、５量体をＴＬＣ用マーカーとして使用すると分離特性に劣ることが判明した。そこで、図１３Ａの各画分を用いて、ＴＯＦ−ＭＳ分析（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｅ  Ｆｌｅｘ、Ｂｒｕｋｅｒ社）を行い、ＴＬＣ上の重合体の位置を、図１３Ｂに示すＴＯＦ−ＭＳによる分析結果との比較によって推定することとした。ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を図１３Ｂに示す。図１３Ａに示すように、画分１０は４量体および５量体を主成分とし、少量の３量体および６量体を含む。そこで、これらの分子量の測定と各画分の分子量測定からＴＬＣ上の重合体の位置を決めた。
【００９０】
図１３Ｃに、アズキの渋切り液、エリモショウズ由来の高重合度画分、３〜５量体画分、低重合度画分のＴＬＣと重合度の指標を示す。図１３Ｃにおいて、Ｍはマーカー（分子量１０５１．２９）、Ｃはアズキの渋切り液、（１）は高重合度画分、（２）は３〜５量体画分、（３）は低重合度画分を示す。なお、図２以降において、重合度の指標を、図１３Ｃに準じて記載した。
【００９１】
(実施例２）
９６ウェルに製造例１で得た各画分のプロアントシアニジンをリン酸緩衝液[ＰＢＳ（−）、（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋を含まない０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）］で０．２ｍｌの２倍階段希釈列を作製した。各ウェルに、０．２ｍｌの、実施例１で得た担体Ａ（Ｇｅｌ（ＨＴ））溶液［５ｍｇ／ｍｌ、ＰＢＳ（−）］を加え撹拌し、２２℃で６０分後に凝集の有無を評価した。併せて、プロアントシアニジンとニワトリ赤血球との凝集反応も評価した。結果を図１に示す。なお、図１Ａにおいて、ゼラチン粒子は、半透明で上質の写真が得られないため模式図を採用した。−は未凝集、＋は凝集、±は不完全凝集を示す。
【００９２】
ニワトリ赤血球はウイルスと反応して凝集することが知られているが、図１Ｂに示すようにプロアントシアニジンと反応して凝集し、図１Ａに示すように担体Ａとも反応して凝集した。図１Ａに示すように、プロアントシアニジンと担体Ａとの凝集性は、プロアントシアニジンの重合度に応じてその程度が相違した。
【００９３】
（実施例３）
リンゴ（品種「津軽」）の果皮粉砕物１００ｇ（湿重量）に３００ｍｌの３０％エタノールを加え、温度２５℃で１６時間静置した。静置後、抽出液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を除去した。抽出液を０．８μｍのフィルターでろ過した。
上記実施例１で得た担体Ｈ（ＳＧ／Ｇｅｌ（Ｓ−ＮＨＳ−Ａｃ））１０ｇを、直径１５ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラムに充填し、前記抽出液を添加し、カラム末端から担体Ｈに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、カラムを３０％エタノール１５ｍｌで洗浄し、洗浄液を回収した。
その後、カラムに７０％アセトン１０ｍｌを添加し溶出物を回収した。未結合画分、洗浄液画分、および７０％アセトン溶出画分の乾燥重量（ｍｇ）と、リンゴ果皮抽出液乾燥質量に対する各画分の回収率（％）、および各画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）の測定結果を表２に示す。また、各画分のＴＬＣを図２に示す。図２において、Ｍはマーカー（カテキン）、（１）はリンゴ果皮抽出液、（２）は未結合画分、（３）は洗浄液画分、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【００９４】
【表２】
2016209802.tif 000003
【００９５】
図２に示すように、７０％アセトン溶出画分には、３〜５量体のプロアントシアニジンが主成分であった。表２に示すように、ＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性のＩＣ５０値は、７０％アセトン溶出画分で最も高い結果となった。プロアントシアニジンには、抗ウイルス効果が存在するが、３〜５量体のプロアントシアニジンによって、高い抗ウイルス増殖抑制効果を有する画分を製造することができた。
【００９６】
（実施例４）
ブドウ（品種「スチューベン」）の果皮粉砕物５０ｇ（湿重量）に３００ｍｌの３０％エタノールを加え、２２℃で１６時間静置した。静置後、抽出液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を除去した。抽出液を０．８μｍのフィルターでろ過した。抽出液は２５０ｍｌであった。
上記実施例１で得た担体Ｎ（ＣＯＯＨ−ＳＧ／Ｇｅｌ）２０ｇを、直径１５ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラムに充填し、前記抽出液を添加し、カラム末端から担体Ｎに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、カラムを３０％エタノール５０ｍｌで洗浄し、洗浄液を回収した。
その後、カラムに７０％アセトン溶液２０ｍｌを添加し、溶出液を回収した。各画分の乾燥重量（ｍｇ）と、リンゴ果皮抽出液乾燥質量に対する各画分の回収率（％）、および各画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）の測定結果を表３に示す。また、各画分のＴＬＣを図３に示す。図３において、Ｍはマーカー（カテキン）、（１）はブドウ果皮抽出液、（２）は未結合画分、（３）は洗浄液画分、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【００９７】
【表３】
2016209802.tif 000004
【００９８】
図３に示すように、７０％アセトン溶出画分は、３量体および４量体を主成分とするものであった。また、表３に示すように、７０％アセトン溶出画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性ＩＣ５０値は１０μｇ／ｍｌであり、３〜５量体以上のプロアントシアニジンを効率的に製造することができた。
【００９９】
（実施例５）
５０ｍｌのアズキ渋液（灰汁）（株式会社虎屋提供、５０ｍｌ中り８３７．５ｍｇの乾燥固形物を含む）を１０、０００回転、１０分遠心後、０．８μｍのフィルターでろ過した。
上記実施例１で得た担体Ｊ（ＳＧ／Ｇｅｌ−ＳＡＩ）を、直径１５ｍｍ、長さ１００ｍｍのカラムに充填し、前記ろ液を添加し、カラム末端から担体Ｊに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、３０％エタノール３０ｍｌでカラムを洗浄し、洗浄液を回収し、その後、カラムに７０％アセトン溶液２０ｍｌを添加し、溶出液を回収した。それぞれの画分を減圧乾燥後、３０％エタノールに１０ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、ＴＬＣおよびＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）を評価した。各画分の回収率（％）、および各画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）の測定結果を表４に示す。また、各画分のＴＬＣを図４に示す。図４において、Ｍはマーカー（カテキン）、（１）はアズキ渋液、（２）は未結合画分、（３）は洗浄液画分、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【０１００】
【表４】
2016209802.tif 000005
【０１０１】
図４に示すように、未結合画分および洗浄液画分は、２量体以下の低分子量のプロアントシアニジンを含むものであった。また、表４に示すように、７０％アセトン溶出画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性ＩＣ５０値は２０μｇ／ｍｌと、洗浄液画分より低値であった。
【０１０２】
（実施例６）
市販のポリフェノール製剤であるリンゴ果実由来アップルフェノン（アサヒ飲料社製）、ピクノジェノール（ホファー社製）の各３００ｍｇを２０ｍｌの３０％エタノールに溶解し、溶解液を得た。
上記実施例１で得た担体Ｆ（ＳＧ／Ｇｅｌ（ＧＡＬ））１０ｇを、直径１５ｍｍ、長さ１００ｍｍのカラムに充填し、３０％エタノールで平衡化した。
前記溶解液をカラムに添加し、カラム末端から担体Ｆに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、３０％エタノール２０ｍｌでカラムを洗浄し、洗浄液を回収した。
その後、７０％アセトン溶液７ｍｌで結合物を溶出した。各画分の乾燥重量（ｍｇ）と、各画分の回収率（％）を表５、表６に示す。また、各画分のＴＬＣを図５に示す。図５において、Ｍはマーカー（カテキン）を、（１）はアップルフェノンまたはピクノジェノールを、（２）は未結合画分を、（３）は洗浄液画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【０１０３】
【表５】
2016209802.tif 000006
【０１０４】
【表６】
2016209802.tif 000007
【０１０５】
担体Ｆを使用して精製すると、アップルフェノンとピクノジェノールの双方の場合において、図５に示すように、７０％アセトン溶出画分には２量体以下の低重合体がほとんど存在しないことがわかる。また表５、表６に示すように、７０％アセトン溶出画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性ＩＣ５０値は５または１０μｇ／ｍｌと低く、３量体以上の重合体を効率的に製造することができた。
【０１０６】
(実施例７）
クロマメポリフェノール(フジッコ株式会社製、商品名「クロノケアＰ−６０」)５００ｍｇを５０ｍｌのミリＱ水に溶解し、これを１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を除去し、次いで０．８μｍのフィルターでろ過し、溶解液を得た。
上記実施例１で得た担体Ｇ（ＳＧ／Ｇｅｌ（ＡＡＬ））２０ｇを、直径１５ｍｍ、長さ１２０ｍｍのカラムに充填し、前記溶解液を添加し、カラム末端から担体Ｇに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、３０％エタノール３０ｍｌで２回、カラムを洗浄し、洗浄液を回収した。
その後、７０％アセトン溶液１５ｍｌで結合物を溶出した。各画分の乾燥重量（ｍｇ）と、各画分の回収率（％）、および各画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）の測定結果を表７に示す。なお、表７において、洗浄液画分−１とは３０％エタノール３０ｍｌの最初の洗浄液画分であり、洗浄液画分−２とは３０％エタノール３０ｍｌによる２度目の洗浄液画分を意味する。また、各画分のＴＬＣを図６に示す。図６において、Ｍはマーカー(カテキン)を、（１）はクロノケアＰ−６０を、（２）は未結合画分を、（３）は洗浄液画分−１を、（４）は洗浄液画分−２を、（５）は７０％アセトン溶出画分を示す。また、図７に７０％アセトン画分のＬＣの分析結果を示す。ＭＳ分析によって、７０％アセトン画分には、３量体に相当する分子量８６６、４量体に相当する分子量１１７０および５量体に相当する分子量１４４２の物質が含まれることが確認された。
【０１０７】
【表７】
2016209802.tif 000008
【０１０８】
（実施例８）
湿重量にて、ブドウ（品種「巨峰」）の果皮１００ｇ、ブルーベリー１００ｇ、クランベリー１００ｇ、セイロンシナモン樹皮３０ｇに３００ｍｌの３０％エタノールを加え、温度２５℃で１６時間静置した。静置後、抽出液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を除去した。抽出液を０．８μｍのフィルターでろ過し、各抽出液を調製した。
上記実施例１で得た担体Ｌ（ＳＧ／Ｇｅｌ（ＨＴ））２０ｇを、直径１５ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラムに充填し、前記抽出液を添加し、カラム末端から担体Ｌに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、カラムを３０％エタノール５０ｍｌで洗浄し、洗浄液を回収した。
その後、７０％アセトン溶液２０ｍｌで溶出した。各画分の乾燥重量（ｍｇ）と、各サンプル乾燥質量に対する各画分の回収率（％）、および各画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）の測定結果を表８に示す。また、各画分のＴＬＣを図８に示す。なお、図８において、Ｍはマーカー(カテキン）を、（１）は３０％エタノール抽出画分を、（２）は未結合画分を、（３）は３０％エタノール洗浄画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【０１０９】
【表８】
2016209802.tif 000009
【０１１０】
表８に示すように、ブドウ果皮抽出液、ブルーベリー、クランベリーの７０％アセトン溶出画分は、３０％エタノール抽出画分と比較してＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０値が大きく低減し、抗ウイルス活性に優れる３〜５量体が分離精製により製造されたことが明確であった。
【０１１１】
（実施例９）
小豆（エモリショウズ）２０ｇを水１００ｍｌに加え、温度９０℃で２０分加熱し抽出し、抽出液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を除去した。抽出液を０．８μｍのフィルターでろ過し、抽出液を調製した。
上記実施例１で得た担体Ｊ（ＳＧ／Ｇｅｌ−ＳＡＩ）、担体Ｅ（ＳＧ／Ｇｅｌ（ＨＴ））、担体Ｌ（ＳＧ／ＳＡ−Ｇｅｌ（ＨＴ））２０ｇを、直径１５ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラムに充填し、前記抽出液を添加し、カラム末端から担体Ｊ、担体Ｅ、または担体Ｌに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、カラムを３０％エタノール３０ｍｌで洗浄し、洗浄液を回収した。
その後、７０％アセトン溶液１５ｍｌで結合物を溶出した。各画分の乾燥重量（ｍｇ）と、各サンプル乾燥質量に対する各画分の回収率（％）、および各画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）の測定結果を表９に示す。また、各画分のＴＬＣを図９に示す。図９において、Ｍはマーカー(カテキン）を、（１）は３０％エタノール抽出画分を、（２）は未結合画分を、（３）は３０％エタノール洗浄画分を、（４）は７０％アセトン溶出画分を示す。
【０１１２】
【表９】
2016209802.tif 000010
【０１１３】
ゼラチン吸着シリカを熱処理した担体Ｅとコハク化ゼラチン吸着シリカを熱処理した担体ＬのＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０値を比較すると、担体Ｌの７０％アセトン溶出画分の方がＩＣ５０値が低いことから、３〜５量体のプロアントシアニジン精製効率が高いと推測される。また、担体Ｌとゼラチンを支持体に吸着させた後にコハク化した担体ＪのＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０値を比較すると、担体Ｌの数値が低いことから、担体Ｌの方が３〜５量体のプロアントシアニジン精製効率が高いと推測される。なお、実施例５と実施例９とを比較すると、同じ担体Ｊを使用してアズキ由来物質を分離した場合でも抽出液の調製方法によってＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０値が相違する。これは、使用したアズキの原料により含まれるプロアントシアニジンの量、組成が異なることを示している。
【０１１４】
（実施例１０）
緑茶ポリフェノール（三井農林社製、商品名「ポリフェノンＧ」）１ｇを１００ｍｌのミリＱ水に溶解し、溶解液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を除去し、次いで０．８μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過した。
ＡＣＤシリカ（富士シリシア化学株式会社製、商品名「ＣＯＯＨシリカ」）を直径５０ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラムに充填し、ミリＱ水で平衡化し、前記溶解液を添加し、次いで、着色が殆ど無くなるまでミリＱ水で洗浄し、次いで３０％エタノールで溶出し着色画分を回収し、着色画分溶液を得た。
次いで、上記実施例１で得た担体Ｄ（ＳＧ／Ｇｅｌ−ＧＡＬ）１５ｇを、直径１０ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラムに充填し、次いで３０％エタノールで平衡化し、前記着色画分溶液を添加し、カラム末端から担体Ｄに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収した。
次いで、カラムを３０％エタノール洗浄液３０ｍｌで洗浄し、洗浄画分を得た。
その後、カラムに７０％アセトンを加え、７０％アセトン溶出画分を回収した。
次いで、直径１５ｍｍ、長さ２００ｍｍのＯＤＳ-シリカゲルカラム（富士シリシア化学株式会社製、商品名「クロマトレックスＯＤＳ」）を０．５％リン酸緩衝液（ｐＨ３．０)：メタノール＝３９：１１の溶液で平衡化し、このカラムに、先に回収した画分を結合させ、０．５％リン酸緩衝液（ｐＨ３．０)で分画した。
担体Ｄカラムの未結合画分および洗浄画分、７０％アセトン溶出画分、およびＯＤＳ-シリカゲルカラムの溶出画分の乾燥重量（ｍｇ）と、各画分の回収率（％）、および各画分のＳＡＲＳ−コロナウイルス増殖抑制活性に対するＩＣ５０(μｇ／ｍｌ）の測定結果を表１０に示す。また、図１０に、ポリフェノンＧ、ＡＣＤシリカカラムの３０％エタノール溶出画分、担体Ｄ（ＳＧ／Ｇｅｌ−ＧＡＬ）の７０％アセトン溶出画分、およびＯＤＳ-シリカゲルカラムの溶出画分のＴＬＣを示す。なお、ＴＬＣは、ＯＤＳ-シリカＰ６０（メルク社）を用い、メタノール：ミリＱ水＝６：４で展開した。図１０において、Ｍはマーカーを、（１）はポリフェノンＧを、（２）はＡＣＤシリカカラムの３０％エタノール溶出画分を、（３）は担体Ｄによる７０％アセトン溶出画分を、（４）はＯＤＳシリカ溶出画分を示す。
【０１１５】
【表１０】
2016209802.tif 000011
【０１１６】
表１０および図１０に示すように、担体Ｄを使用することで、ＡＣＤシリカの３０％エタノール溶出画分を更に精製することができた。
【０１１７】
（実施例１１）
赤ワイン（チリ産、サンカルベネ・ソービニヨン）各２ｍｌに、実施例１で得た担体Ａ（Ｇｅｌ（ＨＴ））を０、２、４、６、８ｍｇ加え、２２℃で１２０分振盪後、２２℃で１，０００ｒｐｍにて２分遠心分離し、上清を得た。また、沈渣に７０％アセトン溶液を加えて撹拌し、１０分静置した後に上記と同様に操作してアセトン溶出画分を得た。各上清およびアセトン溶出画分をＴＬＣで評価した。結果を図１１に示す。なお、図１１において、Ｍはマーカー（９２２Ｄａ）であり、番号１〜５は、それぞれ担体Ａを０、２、４、６、８ｍｇ加えて遠心した後の上清を、番号６〜９は担体Ａを２、４、６、８ｍｇ添加して得た沈渣のアセトン溶出画分を、番号１０はリンゴ由来プロアントシアニジンを示す。
【０１１８】
図１１の番号１〜５を比較してわかるように、４量体以下の低重合度のプロアントシアニジン量は担体Ａの使用量に関わらず略一定であったが、５量体以上の高重合体の含有量は担体Ａの添加量に応じて低減した。なお、アセトン溶出画分は、担体Ａの使用量に準じて溶出量が増加した。
【０１１９】
(実施例１２）
ブドウ（品種「スチューベン」）の果皮粉砕物５０ｇ（湿重量）に３００ｍｌの３０％エタノールを加え、２２℃で１６時間、随時攪拌しながら粗抽出液を作成した。１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心して不溶物を除去後、０．８μｍのフィルター（ミリポア社）でろ過し、２５０ｍｌの抽出液を得た。
上記実施例１で得た担体Ｆ（ＳＧ／Ｇｅｌ（Ｇａｌ））２０ｇを、直径１５ｍｍ、長さ１５０ｍｍのカラムに充填し、前記抽出液を添加し、カラム末端から担体Ｆに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を除去し、次に５０ｍｌの３０％エタノールでカラムを洗浄した。その後、カラムに２０ｍｌの７０％アセトン溶液を添加し、溶出液を回収した。
【０１２０】
一方、市販のブドウ種子エキス（株式会社キッコーマン社製、商品名「ＧＳＥ」）２００ｍｇを、７０％アセトンで平衡化した親水性セファデックス（ＬＰ−Ｓ）を充填した直径１５ｍｍ、長さ９００ｍｍのカラムでゲルろ過した。前記７０％アセトン溶液画分、ＧＳＥ、およびＧＳＥのＬＰ−Ｓカラムでの各分画をＴＬＣにて分析した。結果を図１２に示す。図１２において、Ｍはマーカーを、（１）は担体Ｆによる７０％アセトン溶出画分を、（２）はＧＳＥを、（３）〜（１６）はＬＰ−Ｓカラムによる溶出画分を示す。図１２に示すように、番号（１）は、番号（１１）に近似した。これにより、担体Ｆを用いることによりＬＰ−Ｓと比較して少ないカラム操作で３〜５量体のプロアントシアニジンを分取できることが示された。
【０１２１】
(実施例１３）
ブドウ（スチューベン）果皮５０ｇを３０％エタノール２５０ｍｌで抽出した。
この抽出画分を遠心した後に０．８μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過した。
実施例１で調製した担体Ｃを直径１．８ｃｍ、長さ１０ｃｍのカラムに添加し、前記ろ液を添加し、カラム末端から担体Ｃに結合しないプロアントシアニジンを含む未結合画分を回収し、その後、カラムに３０％エタノール３０ｍｌを添加して洗浄液画分を得て、更にカラムに７０％アセトン１０ｍｌを添加して７０％アセトン溶出画分を得た。その結果、担体Ｃに低分子量のプロアントシアニジンが吸着すること、洗浄液画分に色素の溶出が多少見られること、７０％アセトン溶出画分には高重合度のプロアントシアニジンが溶出しないことが確認された。
【０１２２】
（比較例１）
担体Ｃに代えて担体Ｂを使用した以外は実施例１３と同様に操作した。その結果、プロアントシアニジンは、未結合画分および洗浄液画分にプロアントシアニジンの全量が溶出された。
【０１２３】
(比較例２）
担体Ｎに代えて担体Ｍを使用した以外は、実施例４と同様に操作した。その結果、未結合画分には糖分が多く含まれるがプロアントシアニジンはほとんど溶出されず、洗浄液画分にはガロカテキン、カテキンなどの低重合度のプロアントシアニジンや色素が溶出し、７０％アセトン溶出画分には溶出物が少なく、３量体以上のプロアントシアニジンは溶出されなかった。このことは、未改質ゼラチンはプロアントシアニジンとの結合性が非常に強いことを示している。
【図７】
2016209802.tif 000012
【図１】
2016209802.tif 000013
【図２】
2016209802.tif 000014
【図３】
2016209802.tif 000015
【図４】
2016209802.tif 000016
【図５】
2016209802.tif 000017
【図６】
2016209802.tif 000018
【図８】
2016209802.tif 000019
【図９】
2016209802.tif 000020
【図１０】
2016209802.tif 000021
【図１１】
2016209802.tif 000022
【図１２】
2016209802.tif 000023
【図１３】
2016209802.tif 000024