(57)【要約】【課題】本発明は、緩徐進行型１型糖尿病を高精度で診断する技術を提供することを主な課題とする。【解決手段】緩徐進行型１型糖尿病の患者では、１型糖尿病及び２型糖尿病の患者に比べて抗Ｐａｌｍ２抗体が有意に多く発現しているので、体液中の抗Ｐａｌｍ２抗体をバイオマーカーとして使用することにより、高い精度をもって緩徐進行型１型糖尿病の診断が可能になる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液中に含まれる抗ＰＡＬＭ２抗体からなる、緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカー。
【請求項２】
前記体液が、血液、血清、又は血漿である、請求項２に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
被験者から採取した体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体を測定することを特徴とする、緩徐進行１型糖尿病の検査方法。
【請求項４】
前記体液が、血液、血清、又は血漿である、請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
抗ＰＡＬＭ２抗体の測定が、抗ＰＡＬＭ２抗体に対して免疫学的に反応する抗原を利用した免疫学的方法によって行われる、請求項３又は４に記載の検査方法。
【請求項６】
抗ＰＡＬＭ２抗体に対して免疫学的に反応する抗原を含む、緩徐進行１型糖尿病の診断用キット。
【請求項７】
前記抗原が、ＰＡＬＭ２又はその部分断片である、請求項６に記載の緩徐進行１型糖尿病の診断用キット。
【請求項８】
抗ＰＡＬＭ２抗体の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする、緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緩徐進行１型糖尿病を高精度で診断するための指標となるバイオマーカーに関する。また、本発明は、当該バイオマーカーを利用した緩徐進行１型糖尿病の検査方法、及び当該バイオマーカーを利用して緩徐進行１型糖尿病を診断するために使用される診断キットに関する。更に、本発明は、ＰＡＬＭ２を標的分子とする緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生活習慣や社会環境の変化に伴って、糖尿病患者は増加の一途をたどっている。糖尿病は、一旦発症すると、網膜症、神経障害、腎症等の合併症を引き起こしたり、末期には失明したりすることがある。また、糖尿病は、虚血性心疾患、脳卒中等の心血管疾患の発症や進展を促進することも知られている。
【０００３】
糖尿病の病型は１型糖尿病と２型糖尿病に大別される。１型糖尿病は、膵臓のβ細胞の破壊によるインスリンの欠乏を成因として発症する。一方、２型糖尿病は、肥満、過食、運動不足、ストレス等の環境因子が主に関与したインスリン抵抗性を基盤とし、インスリン作用不足によって発症する。このように、１型糖尿病と２型糖尿病では、病因が異なっているため、糖尿病患者には、その病型に応じて異なる治療法が行われている。
【０００４】
一方、１型糖尿病のサブタイプとして緩徐進行１型糖尿病が知られている。緩徐進行１型糖尿病は、初期は２型糖尿病様の病態を呈しつつ、病態が進行すると、インスリン分泌能が低下してインスリン依存状態に移行する１型糖尿病である。緩徐進行１型糖尿病は、早期に診断し、治療介入することで、インスリン分泌機能の廃絶を予防し、有効な治療効果が得られる可能性があることがTokyo Studyによって示されている。
【０００５】
このように、緩徐進行１型糖尿病では、インスリン分泌機能が廃絶する前に適切な治療を行うことが必要とされるが、初期は２型糖尿病と臨床上見分けにくく、的確な診断が困難になっている。従来、抗ＧＡＤ抗体等の血清中抗体が、緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカーとして使用されている（例えば、非特許文献１参照）。しかしながら、抗ＧＡＤ抗体陽性を示す２型糖尿病や、抗ＧＡＤ抗体陰性を示す緩徐進行１型糖尿病も存在しており、抗ＧＡＤ抗体をバイオマーカーとして使用した診断では、緩徐進行１型糖尿病の診断精度の点で問題がある。
【０００６】
このような従来技術を背景として、緩徐進行１型糖尿病を高精度で診断する技術の開発が求められている。それに併せて、緩徐進行１型糖尿病を予防又は治療する新たな治療方策の開発も求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】緩徐進行１型糖尿病（SPIDDM）の診断基準（２０１２）、一般社団法人日本糖尿病学会、インターネット〈URL: http://www.jds.or.jp/modules/study/index.php?content_id=17〉
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、緩徐進行１型糖尿病を高精度で診断する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、緩徐進行１型糖尿病の患者では、１型糖尿病及び２型糖尿病の患者に比べて抗ＰＡＬＭ２抗体の発現量が有意に高く、体液中の当該抗体を緩徐進行型１型糖尿病のバイオマーカーとして使用し得ることを見出した。更に、本発明者等は、緩徐進行１型糖尿病の患者では抗ＰＡＬＭ２抗体の発現量が有意に高いという新たな知見に基づいて、抗ＰＡＬＭ２抗体を標的分子として、その発現又は機能を抑制することによって、緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療が期待されることをも見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。
【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  体液中に含まれる抗Ｐａｌｍ２抗体からなる、緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカー。
項２．  前記体液が、血液、血清、又は血漿である、項２に記載のバイオマーカー。
項３．  被験者から採取した体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体を測定することを特徴とする、緩徐進行１型糖尿病の検査方法。
項４．  前記体液が、血液、血清、又は血漿である、項３に記載の検査方法。
項５．  抗ＰＡＬＭ２抗体の測定が、抗ＰＡＬＭ２抗体に対して免疫学的に反応する抗原を利用した免疫学的方法によって行われる、項３又は４に記載の検査方法。
項６．  抗ＰＡＬＭ２抗体に対して免疫学的に反応する抗原を含む、緩徐進行１型糖尿病の診断用キット。
項７．  前記抗原が、ＰＡＬＭ２又はその部分断片である、項６に記載の緩徐進行１型糖尿病の診断用キット。
項８．  抗ＰＡＬＭ２抗体の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする、緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体を緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカーとして使用することにより、緩徐進行１型糖尿病を罹患しているか否かを高精度に診断することが可能になる。
【００１２】
また、本発明によれば、臨床上２型糖尿病と考えられる症例から緩徐進行１型糖尿病であるか否かを高精度で診断できるので、緩徐進行１型糖尿病の患者において、２型糖尿病と類似の症状を示している段階で、インスリン分泌機能を廃絶する前に緩徐進行１型糖尿病であることを診断することが可能になる。これによって、緩徐進行１型糖尿病の進行、インスリン分泌機能の低下やそれに伴う医療費増大を抑制でき、ひいては、緩徐進行１型糖尿病の進行による合併症が発症することによる患者のＱＯＬの低下、労働力喪失による社会的損失、医療費増大等を未然に防ぐことが可能になる。
【００１３】
更に、本発明によれば、抗ＰＡＬＭ２抗体を標的分子として、その発現又は機能を抑制することによって、緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】膵島ｃＤＮＡ等の各種組織由来のヒトｃＤＮＡからヒトＰＡＬＭ２ ｃＤＮＡ量の分析を行った結果を示す図である。
【図２】緩徐進行１型糖尿病に対する抗ＰＡＬＭ２抗体及び抗GAD抗体のＲＯＣ曲線を示す図である。
【図３】緩徐進行１型糖尿病、１型糖尿病、及び２型糖尿病の各患者における血清中の抗ＰＡＬＭ２抗体の抗体価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本明細書において、単に「１型糖尿病」と記載する場合には、緩徐進行１型糖尿病には分類されない１型糖尿病を意味するものとする。
【００１６】
１．緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカー
本発明のバイオマーカーは、緩徐進行１型糖尿病を罹患しているか否かを診断するために使用されるバイオマーカーであって、体液中に含まれる抗ＰＡＬＭ２抗体からなることを特徴とする。
【００１７】
抗ＰＡＬＭ２抗体は、ＰＡＬＭ２（paralemmin 2）に対して免疫学的に反応する抗体であり、緩徐進行１型糖尿病の患者において高発現している。
【００１８】
本発明において、バイオマーカー（抗ＰＡＬＭ２抗体）の検出対象となる検体として体液を使用する。検体として使用される体液の種類については、特に制限されないが、血清、血漿、血液、尿、髄液、関節液、リンパ液、羊水、腹水、胸水、乳汁、各種組織液、海馬抽出液、各種組織抽出液等が挙げられる。これらの体液の中でも、緩徐進行１型糖尿病をより一層高精度に診断するという観点から、好ましくは、血清、血漿、血液、更に好ましくは血清が挙げられる。
【００１９】
２．バイオマーカーの測定
体液中に含まれる本発明のバイオマーカーを測定する方法については、抗ＰＡＬＭ２抗体を測定可能であることを限度として特に制限されないが、好ましくは免疫学的方法が挙げられる。当該免疫学的方法において、抗ＰＡＬＭ２抗体の測定は、抗ＰＡＬＭ２抗体に対して免疫学的に反応する抗原を使用することによって行うことができる。
【００２０】
抗ＰＡＬＭ２抗体を測定するために使用される抗原の由来については、体液中に存在する抗ＰＡＬＭ２抗体と免疫学的に反応するものであることを限度として特に制限されず、ヒト、非ヒト動物等のいずれであってもよい。抗ＰＡＬＭ２抗体の測定精度を向上させるという観点から、当該抗原の由来は、検体と同種の由来であることが好ましく、例えば、ヒトの体液を検体として使用する場合には、抗原もヒト由来であることが好ましい。
【００２１】
また、抗ＰＡＬＭ２抗体を免疫学的に検出するために使用する抗原としては、具体的には、ＰＡＬＭ２が挙げられる。抗原として使用されるＰＡＬＭ２は、ヒト又は非ヒト動物から精製したものを使用してもよいが、コスト面を考慮すると、遺伝子工学的手法によって製造した組み換え体を使用することが好ましい。ヒトＰＡＬＭ２のアミノ酸配列（UniProKBのアクセッション番号C9JA33）及びそれをコードしている塩基配列（NCBIのアクセッション番号NM_001037293.2）は公知であるので、ヒトＰＡＬＭ２の組み換え体は、公知の遺伝子工学的手法によって製造することができる。
【００２２】
また、抗ＰＡＬＭ２抗体を免疫学的に検出するために使用する抗原として、抗ＰＡＬＭ２抗体と免疫学的に反応する限り、ＰＡＬＭ２の部分断片を使用することもできる。ＰＡＬＭ２の部分断片は、ＰＡＬＭ２を酵素等によって加水分解することにより製造することができ、また遺伝子工学的手法によって組み換え体として製造することもできる。
【００２３】
更に、抗ＰＡＬＭ２抗体を免疫学的に検出するために使用する抗原は、免疫学的測定において固相に固体化し易くするために、ＰＡＬＭ２又はその部分断片を他のタンパク質を融合させた融合タンパク質であってもよい。例えば、ＰＡＬＭ２又はその部分断片とＧＳＴ（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）等の他のタンパク質との融合タンパク質を使用すると、他のタンパク質と反応する抗体を固相に固体化し、当該抗体に当該融合タンパク質を結合させることにより、固相にＰＡＬＭ２又はその部分断片を、抗ＰＡＬＭ２抗体と反応し易い状態で効率的に固定化することが可能になる。
【００２４】
抗ＰＡＬＭ２抗体を免疫学的に測定する方法については、体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体を定量可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、例えば、サンドイッチ法、競合法、凝集法等が挙げられる。また、免疫学的な測定方法は、標識の種類に応じて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法、放射性同位体免疫測定法等があるが、本発明では、これらのいずれを使用してもよい。測定の簡易性や迅速性の観点から、好ましくは酵素免疫測定法が挙げられる。
【００２５】
抗原抗体反応を利用した免疫学的な測定方法自体は公知であり、本発明において、抗ＰＡＬＭ２抗体の測定は測定原理や標識の種類に応じた公知の手法で行うことができる。
【００２６】
３．バイオマーカーの緩徐進行型１型糖尿病の検査・診断
本発明のバイオマーカーである抗ＰＡＬＭ２抗体は、緩徐進行１型糖尿病の患者では、１型糖尿病、及び２型糖尿病の場合に比べて体液中での量が多いため、緩徐進行１型糖尿病の罹患の有無の診断に使用される。
【００２７】
本発明のバイオマーカーを用いた緩徐進行１型糖尿病の検査又は診断の対象者については、緩徐進行１型糖尿病の罹患の有無の検査又は診断が必要とされている患者であればよく、例えば、糖尿病が疑われている者、糖尿病に罹患していると診断されている患者、臨床上２型糖尿病の症状を示している糖尿病者等が挙げられる。特に、臨床上２型糖尿病の症状を示している糖尿病者に対しては、本発明によって緩徐進行１型糖尿病の早期診断ができ、糖尿病の病型に応じた有効な治療方策を早期に決定することが可能になる。
【００２８】
また、本発明のバイオマーカーを用いた緩徐進行１型糖尿病の検査又は診断の対象者としては、ヒトのみならず、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、家畜等の非ヒト哺乳動物であってもよいが、好ましくはヒトである。
【００２９】
本発明のバイオマーカーを用いた緩徐進行１型糖尿病の検査又は診断において、体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価が高い場合には、緩徐進行１型糖尿病を罹患している可能性が高いと判断される。
【００３０】
具体的には、対象者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価が、１型糖尿病又は２型糖尿病の患者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価よりも高い場合、緩徐進行１型糖尿病を罹患している可能性が高いと診断される。
【００３１】
本発明のバイオマーカーを用いた緩徐進行１型糖尿病の検査又は診断では、緩徐進行１型糖尿病の罹患の有無を判定し易くするために、予め、健常者、或いは既に診断結果が確定している１型糖尿病、２型糖尿病、又は緩徐進行１型糖尿病の患者の体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価を求めておき、当該既知の抗体価と、対象者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価を対比することが望ましい。
【００３２】
より具体的には、対象者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価が、１型糖尿病の患者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価よりも、１．４倍以上である場合には、緩徐進行１型糖尿病を罹患している可能性が高いと診断される。また、対象者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価が、２型糖尿病の患者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価よりも、１．３倍以上である場合には、緩徐進行１型糖尿病を罹患している可能性が高いと診断される。
【００３３】
また、対象者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価が、既に診断結果が確定している緩徐進行１型糖尿病の患者から得られた体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価と同等（例えば０．８〜１．３倍程度）である場合にも、緩徐進行１型糖尿病を罹患している可能性が高いと判断される。
【００３４】
４．緩徐進行１型糖尿病の診断キット
本発明は、更に、緩徐進行１型糖尿病を診断するための診断キットを提供する。当該診断キットは、緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカーである抗ＰＡＬＭ２抗体を免疫学的手法によって測定するために、抗ＰＡＬＭ２抗体に対して免疫学的に反応する抗原が含まれていればよい。当該抗原の種類については、前述する通りである。
【００３５】
当該診断キットには、前記抗原以外に、更に免疫学的手法の原理や標識の種類に応じて、他の試薬や器具が含まれていてもよい。例えば、酵素免疫測定法を選択する場合、前記抗原以外に、測定プレート、色原性基質溶液、反応停止液、洗浄液、標準溶液等が含まれていてもよい。また、サンドイッチ法を採用する場合には、前記抗原は、固相に固定化された状態で提供されてもよい。
【００３６】
更に、当該診断キットには、緩徐進行１型糖尿病に罹患しているか否かを判断し易くするために、既に診断結果が確定している１型糖尿病、２型糖尿病、又は緩徐進行１型糖尿病の患者の体液中の抗ＰＡＬＭ２抗体価を示した診断基準書が添付されていてもよい。
【００３７】
５．緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療剤
本発明の緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療剤は、抗ＰＡＬＭ２抗体の発現又は機能を抑制する物質を有効成分とすることを特徴とする。
【００３８】
本発明の予防又は治療剤では、有効成分として、抗ＰＡＬＭ２抗体の発現又は機能を抑制する物質を使用する。緩徐進行１型糖尿病患者では、抗ＰＡＬＭ２抗体の発現量が高くなっており、抗ＰＡＬＭ２抗体の発現又は機能を抑制することによって、緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療が期待できる。
【００３９】
「抗ＰＡＬＭ２抗体の発現又は機能を抑制する物質」としては、薬学的に許容され、且つ生体内での抗ＰＡＬＭ２抗体産生を抑制、又は生体内で産生された抗ＰＡＬＭ２抗体の機能を抑制できることを限度として特に制限されないが、具体的には、ＰＡＬＭ２、及びそのペプチド断片が挙げられる。本発明の予防又は治療剤をヒトに投与する場合には、前記ＰＡＬＭ２及びそのペプチド断片は、ヒト由来であることが好ましい。また、ＰＡＬＭ２及びそのペプチド断片としては、生体から単離したＰＡＬＭ２、生体から単離したＰＡＬＭ２を加水分解したもの等を使用してもよいが、常法に従って遺伝子工学的に作製したものを使用してもよい。
【００４０】
本発明の予防又は治療剤は、緩徐進行１型糖尿病患者の治療目的で使用できるが、緩徐進行１型糖尿病の予防が求められている者、糖尿病が疑われている者、糖尿病に罹患していると診断されている患者、臨床上２型糖尿病の症状を示している糖尿病者等において、緩徐進行１型糖尿病患者の予防目的で使用してもよい。
【００４１】
本発明の予防又は治療剤の投与形態については、緩徐進行１型糖尿病の予防又は治療効果が得られることを限度として、経口投与又は非経口投与のいずれであってもよい。本発明の予防又は治療剤の投与形態として、具体的には、経口投与；注射投与（静脈注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔注射、患部への局所注射等）、座薬投与等の非経口投与が挙げられる。また、本発明の予防又は治療剤の投与量については、使用する有効成分の種類、投与形態、適用対象となる癌の種類、患者の症状の程度等に応じて適宜設定される。
【００４２】
本発明の予防又は治療剤は、有効成分の種類や投与形態に応じた製剤形態に調製される。本発明の予防又は治療剤の製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、坐剤等の固形製剤；液剤、懸濁剤、乳剤、注射剤等の液状製剤等が挙げられる。
【００４３】
また、本発明の予防又は治療剤は、その製剤形態に応じて、薬学的に許容される担体や添加剤を加えて製剤化される。例えば、固形製剤の場合であれば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を用いて製剤化することができる。また、液状製剤の場合であれば、生理食塩水、緩衝液等を用いて製剤化することができる。
【実施例】
【００４４】
以下に本発明を試験例により詳細に説明するが、本発明はこれらの試験例に限定されて解釈されるものではない。なお、以下に示す試験は、公立大学法人京都府立医科大学の倫理委員会による承認の下で行った（RBMR-C-1237-1）。
【００４５】
試験例
１．血清サンプル
公立大学法人京都府立医科大学の内分泌・代謝内科学において、病型が確認されている糖尿病患者について、インフォームドコンセントを得た後に、治療時に採血を行い、血清サンプルを得た。なお、１５２名の糖尿病患者の内、１型糖尿病患者は１５名、２型糖尿病患者は１０１名、及び緩徐進行１型糖尿病患者は３６名である。また、１５２名の糖尿病患者の糖尿病歴は、平均１３．８±１２．２年である。
【００４６】
２．タンパク質マイクロアレイによる分析
タンパク質マイクロアレイ（ProtoArrays version 5.0; Invitrogen）を使用して、その製品が定めるプロトコールに従って、各血清サンプルに含まれる抗体の分析を行った。具体的には、アレイをquadriPERM培養皿（Greiner Bio One）に入れ、ブロッキング緩衝液と４℃で６０分間反応させた後、５ｍｌ洗浄液（０．１容量％ Tween 20及び１w/v％牛胎児血清を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ））中で１：５００希釈した血清サンプルと４℃で９０分間、水平振盪機上（５０ｒｐｍ）で反応させた。洗浄後、Alexa Fluor 647標識のヤギ抗ヒト抗体（Invitrogen）をアッセイバッファーで１：２，０００希釈し、これを４℃で９０分間反応させた。次いで、アレイを再度洗浄した後に、遠心して乾燥させたアレイ上の各スポットの蛍光強度median値（relative fluorescence units, rfu）をGenePix Pro Software（Molecular Devices）を搭載したマイクロアレイスキャナー(GenePix Professional 4200A Software; Molecular Devices)で読み取った。
【００４７】
タンパク質アレイ法によって得たデータは、次に示す方法で補正及び標準化を行った。偽陽性を防ぐために、蛍光強度median値は、２点の内で低い値を蛍光強度として採用した。更に、アレイの２つのロット間で異なる抗原に起因する反応性の相違を避けるために、製造元から提供されたＱＣデータについて矛盾や不足している情報を持つ全ての抗原は本分析から除外した（削除した抗原は、全抗原の２％）。
【００４８】
このタンパク質アレイ法による抗体の分析は、１３名の糖尿病患者（緩徐進行１型糖尿病患者６名及び２型糖尿病患者７名））から得られた血清に対して行った。
【００４９】
この結果、緩徐進行１型糖尿病患者から得られた血清中の抗ＰＡＬＭ２抗体量は、２型糖尿病患者から得られた血清中の抗ＰＡＬＭ２抗体量に比べて、有意に高いことが確認された（各蛍光強度は、２型糖尿病患者で0.54±0.26、緩徐進行1型糖尿病患者で0.72±0.38、ｐ値＝0.0016）。
【００５０】
３．リアルタイムＰＣＲによる膵島におけるＰＡＬＭ２の検出
膵島ｃＤＮＡ等の各種組織由来のヒトｃＤＮＡをライフ・テクノロジー（CA）から購入し、TaqMan遺伝子発現アッセイ（StepOnePlus装置、Life technologies）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。
【００５１】
FAM標識したヒトＰＡＬＭ２に対する特異的プローブ、又はVIC標識したヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１に対する特異的プローブを使用し、製品のプロトコールに従って３重反応を行った。各反応では、５０℃で２分間と９５℃で１０分間を１サイクル行い、９５℃で１５秒間と６０℃で１分間を５０サイクル行った。データは、SDS 2.3ソフトウェア（Life technologies）を用いて分析した。分析結果を図１に示す。この結果から、膵島にＰＡＬＭ２の発現を確認した。
【００５２】
４．糖尿病患者の血清中の自己抗体の定量
４−１．ＧＳＴ融合組み換えヒトＰＡＬＭ２の作製
ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）誘導性の細菌発現ベクター（BL21株）を用いて、ＧＳＴ（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）融合組換えヒトＰＡＬＭ２の作製を行った。具体的な作製手法については、文献（Einarson MB, Pugacheva EN, Orlinick JR. Identification of Protein-Protein Interactions with Glutathione-S-Transferase (GST) Fusion Proteins. CSH Protoc [Internet]. 2007 Jan [cited 2014 Oct 2];2007:pdb.top11. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21357153）に記載されている方法に従った。本試験では、ヒトＰＡＬＭ２のｃＤＮＡとして、ＮＣＢＩのリファレンス配列（NM_001037293.2）からなるものを使用した。先ず、５’末端にＥｃｏＲＩサイトと３‘末端にＢａｍ Ｈ１サイトを含む１１４６ｂｐのフラグメントをｐＧＥｘ−ＨＴベクターに挿入した。ＰＡＬＭ２ ｃＤＮＡを含むベクターをＢＬ２１に導入し、当該ベクターが導入されたＢＬ２１の単一コロニーを単離した。次いで、単離したＢＬ２１を培養し、ＩＰＴＧ刺激によってＧＳＴ融合組み換えヒトＰＡＬＭ２を産生させた。超音波処理とＧＳＴカラム精製システムによって、ＧＳＴ融合組み換えヒトＰＡＬＭ２を精製した。
【００５３】
４−２．血清中の抗ＰＡＬＭ２抗体の定量
以下の方法に従って、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）により各血清中の抗ＰＡＬＭ２抗体価を測定した。酵素免疫定量法の各洗浄工程では、０．０５％のTween 20を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で３回の洗浄を行った。抗ＧＳＴ抗体でコートした９６穴プレート（Thermo scientific）の各穴に、１ｐｇ／μｌのＧＳＴ融合組み換えヒトＰＡＬＭ２を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５０μｌを添加し、４℃で終夜インキュベートした。次いで、プレートを洗浄した後に、各穴にブロッキングバッファー（１％牛胎児血清を含むＰＢＳ）２００μｌを添加して室温で１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートを洗浄し、各穴に血清サンプルをブロッキングバッファーで１００倍希釈した溶液１００μｌ添加して（同一サンプルをそれぞれ２穴に添加）、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、ブロッキングバッファーで４０００倍に希釈したＨＲＰ（horse radish peroxidase）標識したヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体の溶液を各穴に１００μｌ添加し、室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄した後に、テトラメチルベンジジン基質溶液１０００μｌを各穴に添加して室温で３分間インキュベートし、各穴に０．１８ＭのＨ2ＳＯ4溶液１００μｌ添加することにより反応を停止させ、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍの吸光度を測定した。抗ＰＡＬＭ２抗体に関するＯＤ値のカットオフ値は、Youden indexに基づいて、≧０．５９に設定した。
【００５４】
４−３．他の自己抗体（抗ＧＡＤ抗体、抗ＩＡ−２抗体、及び抗ＺｎＴ８抗体）の定量
各血清サンプルにおける抗ＧＡＤ抗体、抗ＩＡ−２抗体、及び抗ＺｎＴ８抗体の定量を行った。抗ＧＡＤ抗体は、緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカーとして既知の自己抗体である。抗ＩＡ−２抗体及び抗ＺｎＴ８抗体は、１型糖尿病のバイオマーカーとして既知の自己抗体である。
【００５５】
抗ＧＡＤ抗体及び抗ＩＡ−２抗体の血清サンプル中の抗体価の測定は、検査機関（SRL Inc. Tokyo）に委託することにより行った。
【００５６】
また、抗ＺｎＴ８（Zinc Transporter 8）抗体は、以下の方法に従って、ＥＬＩＳＡキット（RZnT8/96R Zinc Transporter 8 Autoantibody, Human, ELISA Kit, VioBendor）を使用して測定した。酵素免疫定量法の各洗浄工程では、希釈した洗浄液で３回の洗浄を行った。キャリブレーター、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、血清サンプルを各々２５μｌを各穴に添加した（同一サンプルをそれぞれ２穴に添加）。次いで、プレートにカバーをした状態で、プレートシェーカーで約５秒間振盪した後に、４℃で１６〜２０時間静置してインキュベートした。インキュベート後、プレートを洗浄し、各穴に冷却したビオチン標識ＺｎＴ８の溶液を１００μｌ添加し、４℃で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、各穴にストレプトアビジン標識ペルオシダーゼの溶液を１００μｌ添加して、プレートシェーカーで振盪（500 shakers／分）しながら、室温で２０分間インキュベートした。その後、洗浄を繰り返し、更に純水での洗浄を１回行うことにより、最終的にプレートを反転させてタッピングして乾燥させる前に、起泡を完全に除去した。その後、各穴にペルオキシダーゼの基質溶液を１００μｌを添加し、暗所の室温で２０分間インキュベートした後に、反応停止液１００μｌを各穴に添加して、プレートシェーカー状で５秒間振盪させ、各穴の溶液を均一化した。次いで、マイクロプレートリーダーを用いて各穴の４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５７】
キャリブレーター濃度（ｌｏｇスケール）をＸ軸、キャリブレーターの吸光度をＹ軸（線形スケール）にプロットし、検定曲線を作成した。この、検定曲線に基づいて、各血清中の抗ZnT8抗体濃度を読み取った。抗ZnT8抗体濃度のカットオフ値は、式：２型糖尿病患者１０１名におけるＺｎＴ８濃度の平均値＋２ＳＤに基づいて≧８００ｐｇ／ｍＬに設定した。
【００５８】
４−４．統計分析
SPSS statistical package, version 21（SPSS, Inc., Chicago, IL)を用いて、全ての統計分析を行った。Ｐ値が０．０５未満の場合に、統計的に有意差があると判断した。
【００５９】
また、受信者操作特性（ROC、receiver operating characteristic）曲線下面積（AUC、area under curve）の値を分析し、緩徐進行１型糖尿病の診断における検出率の有意性を確認した。２つの群間のカテゴリー値（categorical values）は、Mann-Whitney U testにて評価した。連続値（continuous values）は、median ( 95% confidential intervenesとして表し、２つの群間の連続値は、Mann-Whitney U testにて評価した。
【００６０】
４−５．結果
図２に、緩徐進行１型糖尿病患者の血清における抗ＰＡＬＭ２抗体及び抗ＧＡＤ抗体のＲＯＣ曲線を示す。また、図３には、緩徐進行１型糖尿病、１型糖尿病、及び２型糖尿病の各患者における血清中の抗ＰＡＬＭ２抗体の抗体価を示す。この結果から、緩徐進行１型糖尿病の患者の血清中の抗ＰＡＬＭ２抗体価は、１型糖尿病及び２型糖尿病の患者の場合に比べて、有意に高くなっており、抗ＰＡＬＭ２抗体を緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカーとして使用できることが確認された。また、抗ＰＡＬＭ２抗体は、緩徐進行１型糖尿病のバイオマーカーとして既知の抗ＧＡＤ抗体よりも、高精度に緩徐進行１型糖尿病の診断が行えることも明らかとなった。
【００６１】
また、表１に、１型糖尿病のバイオマーカーとして既知の自己抗体である抗ＩＡ−２抗体及び抗ＺｎＴ８抗体の抗体価を測定した結果を示す。この結果から、抗ＩＡ−２抗体及び抗ＺｎＴ８抗体をマーカーとして使用しても、緩徐進行１型糖尿病と２型糖尿病を峻別できないことが確認された。
【００６２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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