(57)【要約】【課題】マイクロ流体デバイスに備えられた微小な反応場に対する液体試料の流入及び流出を適切に制御し、前記反応場において液体試料を容易に検査することが可能な、液体試料の検査方法の提供。【解決手段】液体試料の検査方法であって、第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１と、第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２と、第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第２内壁面ｗ２に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙと、内側面Ｙに固定された、前記液体試料に含まれる検査粒子に対して結合可能な吸着物質と、を備えるマイクロ流体デバイスを使用して、微細貫通孔Ｔ内において、前記検査粒子と前記吸着物質を接触させることにより、前記検査粒子を前記吸着物質に結合させる操作を含む、液体試料の検査方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料の検査方法であって、
第１空間部を構成する第１内壁面と、第２空間部を構成する第２内壁面と、前記第１内壁面に開口する第一の開口部及び前記第２内壁面に開口する第二の開口部を有し、前記第１空間部と前記第２空間部を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔を構成する内側面と、前記内側面に固定された、前記液体試料に含まれる検査粒子に対して直接的又は間接的に結合可能な吸着物質と、を備えるマイクロ流体デバイスを使用して、
前記液体試料を前記第１空間部に導入し、前記第一の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記液体試料の一部を流入させて、前記検査粒子と前記吸着物質を接触させることにより、前記検査粒子を前記吸着物質に直接的又は間接的に結合させた後、
前記第１空間部から前記液体試料を排出し、続いて、前記液体試料の排出の際に前記微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体試料を、前記微細貫通孔の前記第一の開口部から前記第１空間部へ自動的に流出させる操作を含むことを特徴とする液体試料の検査方法。
【請求項２】
前記検査粒子に予め被検出物質が結合されていることを特徴とする請求項１に記載の液体試料の検査方法。
【請求項３】
さらに、前記被検出物質に結合可能な検知物質を含む液体試薬を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記液体試薬の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記吸着物質に結合した前記検査粒子及び前記被検出物質と、前記液体試薬を接触させることにより、前記吸着物質と前記検査粒子及び前記被検出物質と前記検知物質とが結合した複合体を形成した後、
前記液体試薬を導入した前記空間部から前記液体試薬を排出し、続いて、前記液体試薬の排出の際に前記微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体試薬を、
前記微細貫通孔の前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、前記液体試薬を排出した前記空間部へ、自動的に流出させる操作を含むことを特徴とする請求項２に記載の液体試料の検査方法。
【請求項４】
前記複合体の形成を測定することにより、前記検査粒子に前記被検出物質が結合していることを定性的又は定量的に分析することを特徴とする請求項３に記載の液体試料の検査方法。
【請求項５】
前記複合体の形成を光学的に測定することを特徴とする請求項４に記載の液体試料の検査方法。
【請求項６】
前記検知物質が光学的に測定可能な標識物質を有し、前記標識物質が直接又は間接に発生する光を測定することを特徴とする請求項５に記載の液体試料の検査方法。
【請求項７】
前記標識物質が酵素であることを特徴とする請求項６に記載の液体試料の検査方法。
【請求項８】
さらに、前記酵素の基質を含む基質溶液を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記基質溶液の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記複合体が有する前記酵素と前記基質を接触させることにより、前記基質を蛍光物質に変換する酵素反応を生じさせる操作を含むことを特徴とする請求項７に記載の液体試料の検査方法。
【請求項９】
前記蛍光物質に対して励起光を照射することにより発生する蛍光を測定することを特徴とする請求項８に記載の液体試料の検査方法。
【請求項１０】
さらに、前記酵素と反応する発光物質を含む溶液を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記溶液の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記複合体が有する前記酵素と前記発光物質を接触させることにより、前記発光物質を発光させる酵素反応を生じさせる操作を含むことを特徴とする請求項７に記載の液体試料の検査方法。
【請求項１１】
前記発光物質の発光量を測定することを特徴とする請求項１０に記載の液体試料の検査方法。
【請求項１２】
前記マイクロ流体デバイスを準備する工程として、第１空間部を構成する第１内壁面と、第２空間部を構成する第２内壁面と、前記第１内壁面に開口する第一の開口部及び前記第２内壁面に開口する第二の開口部を有し、前記第１空間部と前記第２空間部を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔を構成する内側面と、を備えるマイクロ流体デバイスを用意して、前記検査粒子に直接的又は間接的に結合可能な吸着物質を含む液体材料を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記液体材料の一部を流入させて、前記微細貫通孔を構成する前記内側面に前記吸着物質を接触させることにより、前記内側面に前記吸着物質を付着させた後、前記液体材料を導入した前記空間部から前記液体材料を排出し、続いて、前記液体材料の排出の際に前記微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体材料を、前記微細貫通孔の前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、前記液体材料を排出した前記空間部へ、自動的に流出させる工程を含むことを特徴とする請求項１〜１１の何れか一項に記載の液体試料の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細貫通孔を備えたマイクロ流体デバイスを使用して、液体試料を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、マイクロスケールからナノスケールの微小な反応場において、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定、化学反応、細胞培養等を行うためのマイクロＴＡＳ、マイクロ流体デバイス、マイクロミキサ等が注目されている。在宅医療、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）、臨床検査、細胞培養等を迅速に少ない試料で行うためには、これらのデバイスの小型化が重要である。
【０００３】
従来のマイクロ流体デバイスとして、流路の途中に細胞培養可能な空間を備え、その下流に細胞が流出しないように堰き止め部を有する流路チップが開示されている（特許文献１）。この堰き止め部の上部には微細な流路が形成されており、細胞は通過し難く、培養液のみが流出し易い構造を有する。培養空間及び流路は透明なプラスチック基板で形成されているため、培養した細胞に対して所望の薬剤を投与し、その反応を光学的に観察することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−１８５００８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マイクロ流体デバイスに設けられた反応場に目的の物質が含有される液体を流入させたり、その反応場から液体を流出させたりする送液方法として、シリンジポンプが一般的に使用されている。しかしながら、近年のマイクロ流体デバイスにおいては、流路だけでなく、流路に接続された反応場の微小化（微細化）が進んでいるため、ポンプ操作のみで微小な反応場の内外に液体を送液する場合には、精密な圧力制御を行い得る高価なポンプが必要である。例えば、マイクロ流体デバイスに備えられた反応場において液体試料を検査する場合に、前記反応場に対する液体試料の流入及び流出を適切に制御するために高価なポンプが使用されている。このため、前記検査コストが高騰する、という問題がある。
仮に、乱暴なポンプ制御で流路内の液体を大きな流速で激しく流入させたり流出させたりすると、流路内に設置した試料や試薬が流路から剥がれる恐れがある。
【０００６】
さらに、マイクロ流体デバイスを構成する流路には、液体だけでなく空気が流入することが一般的であるが、このような気液混合系の流路内における送液をポンプのみで精密に制御することは難しく、前記検査の実施効率が低下する、という問題がある。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、マイクロ流体デバイスに備えられた微小な反応場に対する液体試料の流入及び流出を適切に制御し、前記反応場において液体試料を容易に検査することが可能な、液体試料の検査方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）液体試料の検査方法であって、第１空間部を構成する第１内壁面と、第２空間部を構成する第２内壁面と、前記第１内壁面に開口する第一の開口部及び前記第２内壁面に開口する第二の開口部を有し、前記第１空間部と前記第２空間部を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔を構成する内側面と、前記内側面に固定された、前記液体試料に含まれる検査粒子に対して直接的又は間接的に結合可能な吸着物質と、を備えるマイクロ流体デバイスを使用して、前記液体試料を前記第１空間部に導入し、前記第一の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記液体試料の一部を流入させて、前記検査粒子と前記吸着物質を接触させることにより、前記検査粒子を前記吸着物質に直接的又は間接的に結合させた後、前記第１空間部から前記液体試料を排出し、続いて、前記液体試料の排出の際に前記微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体試料を、前記微細貫通孔の前記第一の開口部から前記第１空間部へ自動的に流出させる操作を含むことを特徴とする液体試料の検査方法。
【０００９】
上記（１）の液体試料の検査方法によれば、マイクロ流体デバイスに備えられた微細貫通孔の内部に液体試料を流入させるために、微細貫通孔が本来的に有する毛細管力（毛細管現象）を利用している。ポンプで発生した高圧力を微細貫通孔に負荷する必要がないため、穏やか且つ確実に微細貫通孔内へ液体試料を流入させることができる。
液体試料には前記吸着物質に結合し得る前記検査粒子が含まれており、前記液体試料を構成する溶媒とともに、前記検査粒子を前記微細貫通孔内に容易に流入させることができる。流入された前記検査粒子は、前記微細貫通孔を構成する内側面に固定された前記吸着物質に接触して結合する。その結果、前記検査粒子は前記吸着物質を介して前記内側面に固定される。その後、前記検査粒子の溶媒である前記液体試料が前記微細貫通孔の外へ流出される。この際、従来行われている様な乱暴なポンプ制御によって、前記微細貫通孔内の液体を大きな流速で激しく流入させたり流出させたりすると、前記検査粒子が前記内側面に充分に固定されなかったり、前記内側面に間接的に固定された前記検査粒子が前記内側面から剥がれたりする恐れがある。しかし、本発明にかかる検査方法においては、毛細管現象によって穏やかに前記液体試料を流入し、その後、前記第１空間部の排出に伴って自発的に起きる流れを利用して、穏やかに前記微細貫通孔から前記液体試料を自然に流出させているため、前記検査粒子が前記内側面から剥がれる恐れは殆どない。つまり、本発明の検査方法によれば、従来方法よりも確実に、前記検査粒子を前記微細貫通孔の内側面に固定できる。
【００１０】
（２）前記検査粒子に予め被検出物質が結合されていることを特徴とする上記（１）に記載の液体試料の検査方法。
【００１１】
上記（２）の液体試料の検査方法によれば、被検出物質を前記検査粒子とともに前記内側面に結合させることができる。結合形態としては、前記被検出物質が前記検査粒子を介して前記内側面に結合してもよいし、前記被検出物質が直接に前記内側面に結合してもよい。後者の場合、前記検査粒子が前記被検出物質を介して前記内側面に結合する。
前記検査粒子が前記内側面に結合していないフリーの状態であると、当該検査粒子の表面全体に前記被検出物質を結合させることができる。一方、前記検査粒子を前記内側面に結合させた後で、前記微細貫通孔内において当該検査粒子に被検出物質を結合させた場合、前述した予め結合させた場合と比べて、当該検査粒子の前記被検出物質を結合可能な面積が減る。したがって、前記検査粒子がフリーな状態で前記被検出物質を予め当該検査粒子に結合させておくことにより、比較的多くの前記被検出物質を備えた前記検査粒子を前記微細貫通孔内に結合させることができる。
【００１２】
（３）さらに、前記被検出物質に結合可能な検知物質を含む液体試薬を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記液体試薬の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記吸着物質に結合した前記検査粒子及び前記被検出物質と、前記液体試薬を接触させることにより、前記吸着物質と前記検査粒子及び前記被検出物質と前記検知物質とが結合した複合体を形成した後、前記液体試薬を導入した前記空間部から前記液体試薬を排出し、続いて、前記液体試薬の排出の際に前記微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体試薬を、前記微細貫通孔の前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、前記液体試薬を排出した前記空間部へ、自動的に流出させる操作を含むことを特徴とする上記（２）に記載の液体試料の検査方法。
【００１３】
上記（３）の液体試料の検査方法によれば、マイクロ流体デバイスに備えられた微細貫通孔の内部に液体試料を流入させるために、微細貫通孔が本来的に有する毛細管力（毛細管現象）を利用している。ポンプで発生した高圧力を微細貫通孔に負荷する必要がないため、穏やか且つ確実に微細貫通孔内へ液体試薬を流入させることができる。
液体試薬には前記被検出物質に結合し得る検知物質が含まれているため、前記微細貫通孔内に前記検知物質を容易に流入させることができる。前記微細貫通孔内に流入された前記検知物質は、前記内側面に固定された前記検査粒子及び前記被検出物質に接触して結合する。その結果、前記検知物質は前記被検出物質、前記検査粒子、及び前記吸着物質を介して前記内側面に固定される。すなわち、前記内側面において、前記吸着物質と、前記検査粒子及び前記被検出物質と、前記検知物質とが結合した複合体が形成される。その後、前記検知物質の溶媒である前記液体試薬が前記微細貫通孔の外へ流出される。この際、従来行われている様な乱暴なポンプ制御によって、前記微細貫通孔内の液体を大きな流速で激しく流入させたり流出させたりすると、前記検知物質が前記被検出物質及び前記検査粒子に充分に固定されなかったり、前記検知物質が前記被検出物質及び前記検査粒子から剥がれたりする恐れがある。しかし、本発明にかかる検査方法においては、毛細管現象によって穏やかに前記液体試薬を流入し、その後、前記液体試薬を導入した前記第１空間部又は前記第２空間部における前記液体試薬の排出に伴って自発的に起きる流れを利用して、穏やかに前記微細貫通孔から前記液体試薬を自然に流出させているため、前記検知物質が前記被検出物質及び前記検査粒子から剥がれる恐れは殆どない。つまり、本発明の検査方法によれば、従来方法よりも確実に、前記検知物質を前記微細貫通孔の内側面に間接的に固定して前記複合体を形成できるため、高い精度で被検出物質を検出し、分析することができる。
【００１４】
（４）前記複合体の形成を測定することにより、前記検査粒子に前記被検出物質が結合していることを定性的又は定量的に分析することを特徴とする上記（３）に記載の検査方法。
（５）前記複合体の形成を光学的に測定することを特徴とする上記（４）に記載の検査方法。
（６）前記検知物質が光学的に測定可能な標識物質を有し、前記標識物質が直接又は間接に発生する光を測定することを特徴とする上記（５）に記載の検査方法。
（７）前記標識物質が酵素であることを特徴とする上記（６）に記載の検査方法。
（８）さらに、前記酵素の基質を含む基質溶液を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記基質溶液の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記複合体が有する前記酵素と前記基質を接触させることにより、前記基質を蛍光物質に変換する酵素反応を生じさせる操作を含むことを特徴とする上記（７）に記載の液体試料の検査方法。
（９）前記蛍光物質に対して励起光を照射することにより発生する蛍光を測定することを特徴とする上記（８）に記載の液体試料の検査方法。
（１０）さらに、前記酵素と反応する発光物質を含む溶液を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記溶液の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記複合体が有する前記酵素と前記発光物質を接触させることにより、前記発光物質を発光させる酵素反応を生じさせる操作を含むことを特徴とする上記（７）に記載の液体試料の検査方法。
（１１）前記発光物質の発光量を測定することを特徴とする上記（１０）に記載の液体試料の検査方法。
【００１５】
（１２）前記マイクロ流体デバイスを準備する工程として、第１空間部を構成する第１内壁面と、第２空間部を構成する第２内壁面と、前記第１内壁面に開口する第一の開口部及び前記第２内壁面に開口する第二の開口部を有し、前記第１空間部と前記第２空間部を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔を構成する内側面と、を備えるマイクロ流体デバイスを用意して、前記検査粒子に直接的又は間接的に結合可能な吸着物質を含む液体材料を前記第１空間部又は前記第２空間部に導入し、前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記液体材料の一部を流入させて、前記微細貫通孔を構成する前記内側面に前記吸着物質を接触させることにより、前記内側面に前記吸着物質を付着させた後、前記液体材料を導入した前記空間部から前記液体材料を排出し、続いて、前記液体材料の排出の際に前記微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体材料を、前記微細貫通孔の前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、前記液体材料を排出した前記空間部へ、自動的に流出させる工程を含むことを特徴とする上記（１）〜（１１）の何れか一項に記載の液体試料の検査方法。
【００１６】
以下の（１３）〜（３１）に記載の液体試料の検査方法は好ましい方法である。
（１３）液体試料の検査方法であって、第１空間部を構成する第１内壁面、第２空間部を構成する第２内壁面、・・・、及び第ｎ空間部（ｎは３以上の整数を表す。）を構成する第ｎ内壁面、を含むｎ個の内壁面と、
前記第１内壁面に開口する第一の開口部及び前記第２内壁面に開口する第二の開口部を有し、前記第１空間部と前記第２空間部を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔を構成する第１内側面、・・・、及び前記第１内壁面に開口する第一の開口部及び前記第ｎ内壁面に開口する第二の開口部を有し、前記第１空間部と前記第ｎ空間部を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔を構成する第（ｎ−１）内側面、を含む（ｎ−１）個の内側面と、
前記（ｎ−１）個の内側面のうち少なくとも１個の内側面に固定された、前記液体試料に含まれる検査粒子に対して直接的又は間接的に結合可能な吸着物質と、を備えるマイクロ流体デバイスを使用して、
前記液体試料を前記第１空間部に導入し、前記（ｎ−１）個の内側面によって構成される各微細貫通孔が有する前記第一の開口部から、毛細管現象により前記各微細貫通孔内に前記液体試料の一部を流入させて、前記検査粒子と前記吸着物質を接触させることにより、前記検査粒子を前記吸着物質に直接的又は間接的に結合させた後、前記第１空間部から前記液体試料を排出し、続いて、前記液体試料の排出の際に前記各微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体試料を、前記各微細貫通孔の前記第一の開口部から前記第１空間部へ自動的に流出させる操作を含むことを特徴とする液体試料の検査方法。
【００１７】
上記（１３）の液体試料の検査方法においても、上記（１）の検査方法と同様の効果が奏される。すなわち、本発明にかかる検査方法においては、毛細管現象によって穏やかに前記液体試料を流入し、その後、前記第１空間部の排出に伴って自発的に起きる流れを利用して、穏やかに前記各微細貫通孔から前記液体試料を自然に流出させているため、前記検査粒子が前記内側面に固定された前記吸着物質から剥がれる恐れは殆どない。つまり、本発明の製造方法によれば、従来方法より確実に、前記検査粒子を前記各微細貫通孔の内側面において固定することができる。
【００１８】
（１４）前記検査粒子に予め被検出物質が結合されていることを特徴とする上記（１３）に記載の液体試料の検査方法。
【００１９】
上記（１４）の液体試料の検査方法においても、上記（２）の検査方法と同様の効果が奏される。
【００２０】
（１５）さらに、前記被検出物質に結合可能な、少なくとも１種の検知物質を含む、少なくとも１種の液体試薬を前記第１空間部〜前記第ｎ空間部のうち何れか１つ以上の空間部に導入し、前記液体試薬を導入した前記空間部に開口する前記微細貫通孔が有する前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により、前記微細貫通孔内に前記液体試薬の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記吸着物質に結合した前記検査粒子及び前記被検出物質と、前記液体試薬を接触させることにより、前記吸着物質と前記検査粒子及び前記被検出物質と前記検知物質とが結合した複合体を形成した後、前記液体試薬を導入した前記空間部から前記液体試薬を排出し、続いて、前記液体試薬の排出の際に前記微細貫通孔内に一時的に残留した前記一部の液体試薬を、前記微細貫通孔が有する前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、前記液体試薬を排出した前記空間部へ自動的に流出させる操作を含むことを特徴とする上記（１４）に記載の液体試料の検査方法。
【００２１】
上記（１５）の液体試料の検査方法においても、上記（１４）の検査方法と同様の効果が奏される。すなわち、本発明にかかる検査方法においては、毛細管現象によって穏やかに各微細貫通孔内に前記液体試薬を流入し、その後、穏やかに各微細貫通孔から前記液体試薬を自然に流出させているため、各微細貫通孔の内側面において形成された前記複合体が、前記内側面から剥がれる恐れは殆どない。つまり、本発明の検査方法によれば、従来方法よりも確実に、前記検知物質を前記微細貫通孔の内側面に固定して前記複合体を形成できるため、高い精度で被検出物質を検出し、分析することができる。
【００２２】
また、互いに異なる検知物質を含んだ複数種類の液体試薬を各空間部に対してそれぞれ独立に導入することも可能である。ｎ個の内壁面によって構成される各空間部に対してそれぞれ異なる液体試薬を導入することにより、（ｎ−１）個の内側面によって構成される各微細貫通孔に対してそれぞれ異なる液体試薬を流入させることができる。したがって、（ｎ−１）種類の検査を単一の前記マイクロ流体デバイスにおいて実施することができる。
【００２３】
（１６）前記第１内側面〜前記第ｎ内側面に固定された前記吸着物質が、それぞれ互いに異なる検査粒子に対して結合可能であることを特徴とする上記（１３）〜（１５）の何れか一項に記載の液体試料の検査方法。
（１７）前記複合体の形成を測定することにより、前記検査粒子に前記被検出物質が結合していることを定性的又は定量的に分析することを特徴とする上記（１５）又は（１６）に記載の検査方法。
（１８）前記複合体の形成を光学的に測定することを特徴とする上記（１７）に記載の検査方法。
（１９）前記検知物質が光学的に測定可能な標識物質を有し、前記標識物質が直接又は間接に発生する光を測定することを特徴とする上記（１８）に記載の検査方法。
（２０）前記標識物質が酵素であることを特徴とする上記（１９）に記載の検査方法。
（２１）さらに、前記酵素の基質を含む基質溶液を前記第１空間部〜前記第ｎ空間部のうち何れか１つ以上の空間部に導入し、前記基質溶液を導入した前記空間部に開口する前記微細貫通孔が有する前記第一の開口部又は前記第二の開口部から、毛細管現象により前記微細貫通孔内に前記基質溶液の一部を流入させて、前記微細貫通孔内で、前記複合体が有する前記酵素と前記基質試薬を接触させることにより、前記基質を蛍光物質に変換する酵素反応を生じさせる操作を含むことを特徴とする上記（２０）に記載の液体試料の検査方法。
（２２）前記蛍光物質に対して励起光を照射することにより発生する蛍光を測定することを特徴とする上記（２１）に記載の液体試料の検査方法。
【００２４】
（２３）前記吸着物質が、前記検査粒子に対して、特異的又は非特異的に結合する吸着物質であることを特徴とする上記（１）〜（２２）の何れか一項に記載の検査方法。
（２４）前記吸着物質が、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ＰＶＣ、シリコーン、又は水溶性コラーゲンであることを特徴とする上記（１）〜（２３）の何れか一項に記載の検査方法。
（２５）前記吸着物質が、金、銀、銅、チタン、又はクロムであることを特徴とする上記（１）〜（２３）の何れか一項に記載の検査方法。
（２６）前記検査粒子を構成する材料が、ポリスチレン、ＰＭＭＡ、ＰＶＣ、シリコーン、又は水溶性コラーゲンであることを特徴とする上記（１）〜（２５）の何れか一項に記載の検査方法。
（２７）前記検査粒子を構成する材料が、金、銀、銅、チタン、又はクロムであることを特徴とする上記（１）〜（２５）の何れか一項に記載の検査方法。
（２８）前記検査粒子として、互いに異なる構成材料からなる２種以上の検査粒子を使用することを特徴とする上記（１）〜（２７）の何れか一項に記載の検査方法。
（２９）前記検査粒子の平均粒子径が１０ｎｍ〜５００μｍであることを特徴とする上記（１）〜（２８）の何れか一項に記載の検査方法。
（３０）前記検知物質が、抗体、核酸アプタマー、ペプチド、ヘム、前記抗体を除くタンパク質又は糖鎖であることを特徴とする上記（３）〜（９）及び（１５）〜（２２）の何れか一項に記載の検査方法。
（３１）前記検査粒子が金属製であり、前記金属製の検査粒子の表面プラズモン共鳴の測定によって、前記複合体の形成を測定することを特徴とする上記（５）又は（１８）に記載の検査方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の検査方法によれば、マイクロ流体デバイスに備えられた微細貫通孔の内部に液体試料を流入させるために、微細貫通孔が本来的に有する毛細管力（毛細管現象）を利用している。ポンプで発生した高圧力を微細貫通孔に負荷する必要がないため、穏やか且つ確実に、微細貫通孔内へ液体試料を流入させることができる。
前記液体試料には前記検査粒子が含まれているため、前記微細貫通孔内に前記検査粒子を容易に流入させることができる。流入された前記検査粒子は、前記微細貫通孔の内側面に予め固定された前記吸着物質に直接的又は間接的に結合される。その後、前記検査粒子の溶媒である前記液体試料が前記微細貫通孔の外へ流出される。この際、従来行われている様な乱暴なポンプ制御によって、前記微細貫通孔内の液体試料を大きな流速で激しく流入させたり流出させたりすると、前記検査粒子が前記吸着物質に充分に結合されなかったり、結合された前記検査粒子が前記吸着物質から解離したりする恐れがある。しかし、本発明にかかる検査方法においては、毛細管現象によって穏やかに前記液体試料を流入し、その後、前記液体試料を導入した空間部の排出に伴って自発的に起きる流れを利用して、穏やかに前記微細貫通孔から前記液体試料を自然に流出させているため、前記検査粒子が前記吸着物質から解離する恐れは殆どない。つまり、本発明の検査方法によれば、従来方法よりも確実に、前記検査粒子を前記微細貫通孔の内側面において固定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明にかかる液体試料の検査方法において使用可能なマイクロ流体デバイス１０の模式的な断面図である。
【図２】図１の要部を示す図であり、マイクロ流体デバイス１０における送液の様子を示した模式図である。
【図３】図１の要部を示す図であり、マイクロ流体デバイス１０における送液の様子を示した模式図である。
【図４】図１の要部を示す図であり、マイクロ流体デバイス１０における送液の様子を示した模式図である。
【図５Ａ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｂ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｃ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｄ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｅ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｆ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｇ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｈ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図５Ｉ】本発明にかかる検査方法の一例として、生化学検査の一例を行う様子を示した、マイクロ流体デバイスの要部の模式的な断面図である。
【図６Ａ】マイクロ流体デバイスに備えられた、第１空間部、第２空間部及び複数の微細貫通孔を表す模式的な断面図である。
【図６Ｂ】図６Ａのマイクロ流体デバイスにおける複数の微細貫通孔をＡ−Ａ’方向で切断した時の各微細貫通孔の断面形状の一例を示した模式図である。
【図６Ｃ】図６Ａのマイクロ流体デバイスにおける複数の微細貫通孔をＡ−Ａ’方向で切断した時の各微細貫通孔の断面形状の一例を示した模式図である。
【図６Ｄ】図６Ａのマイクロ流体デバイスにおける複数の微細貫通孔をＡ−Ａ’方向で切断した時の各微細貫通孔の断面形状の一例を示した模式図である。
【図６Ｅ】図６Ａのマイクロ流体デバイスにおける複数の微細貫通孔をＡ−Ａ’方向で切断した時の各微細貫通孔の断面形状の一例を示した模式図である。
【図７】本発明にかかる液体試料の検査方法において使用可能なマイクロ流体デバイス２０の模式的な断面図である。
【図８】本発明にかかる液体試料の検査方法において使用可能なマイクロ流体デバイス３０の模式的な断面図である。
【図９】本発明にかかる液体試料の検査方法において使用可能なマイクロ流体デバイス４０の模式的な断面図である。
【図１０】マイクロ流体デバイスを構成する第一基板及び第二基板の模式的な断面図である。
【図１１】マイクロ流体デバイスを構成する第一基板及び第二基板の模式的な断面図である。
【図１２】マイクロ流体デバイスの微細貫通孔Ｔを含む要部の模式的な断面図である。
【図１３】マイクロ流体デバイスの微細貫通孔Ｔを含む要部の模式的な断面図である。
【図１４】マイクロ流体デバイスの微細貫通孔Ｔを含む要部の模式的な断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
《検査デバイスの製造方法》
図１に示すマイクロ流体デバイス１０は、本発明にかかる検査デバイスの製造方法の第一実施形態において使用可能なマイクロ流体デバイスの一例である。図１はマイクロ流体デバイス１０の模式的な断面図を示している。
【００２８】
マイクロ流体デバイス１０は、第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１と、第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２と、第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第２内壁面ｗ２に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を空間的に連結する一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙと、を含む本体部４を少なくとも備えている。マイクロ流体デバイス１０において、本体部４に内在される第１空間部Ｓ１及び第２空間部Ｓ２は、複数の微細貫通孔Ｔによって互いに空間的に連結している（連通している）。
【００２９】
第一実施形態の検査デバイスの製造方法においては、第１空間部Ｓ１に加工用の液体を導入し、第一の開口部Ｔａから、毛細管現象（毛細管力）により各微細貫通孔Ｔ内に前記液体の一部を流入させた後、第１空間部Ｓ１から前記液体を排出し、続いて、前記液体の排出の際に各微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の液体を、各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから第１空間部Ｓ１へ自動的に流出させる送液方法（１）を採用する。
【００３０】
＜送液方法（１）＞
送液方法（１）の説明は、流入ステップ、排出ステップ、流出ステップの３ステップに分けられる。
流入ステップは、第１空間部Ｓ１に任意の液体を導入するとともに、第１空間部Ｓ１に開口する各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に前記液体の一部を流入させるステップである。
排出ステップは、各微細貫通孔Ｔ内に流入された前記一部の液体を残したまま、第１空間部Ｓ１から前記液体を排出するステップである。
流出ステップは、前記排出の後、各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、各微細貫通孔Ｔ内に残留された前記液体を第１空間部Ｓ１へ自動的に流出させるステップである。
以下、各ステップを順に説明する。
【００３１】
（流入ステップ）
図２に示す様に、マイクロ流体デバイス１０を構成する本体部４の表面に開口する開口部から第１空間部Ｓ１へ液体Ｑを導入すると、第１空間部Ｓ１に開口する各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、毛細管現象（毛細管力）により各微細貫通孔Ｔ内に液体Ｑの一部が流入する。この際、各微細貫通孔Ｔ内の空気は第２空間部Ｓ２へ自然に押し出される。
【００３２】
微細貫通孔Ｔの孔径（長手方向に直交する断面の直径又は長径）は、上記毛細管現象が起きる範囲であれば特に制限されず、使用する液体Ｑの表面張力や粘度等にもよるが、通常１ｎｍ〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。
【００３３】
微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから流入して進む液体Ｑの先端部は、第２空間部Ｓ２に開口する第二の開口部Ｔｂに達してもよいし、達しなくてもよい。第二の開口部Ｔｂに達した場合、その先端部を構成する液体Ｑの一部が第二の開口部Ｔｂから流出しても構わないが、基本的には第二の開口部Ｔｂから流出せずに、第二の開口部Ｔｂで液体Ｑの先端部の進行が止まる。この理由は、毛細管力が液体Ｑを微細貫通孔Ｔ内に留めるため、及び第二の開口部Ｔｂにおいて液体Ｑの先端部に働く表面張力が液体Ｑを微細貫通孔Ｔ内に留めるため、だと推測される。
【００３４】
第１空間部Ｓ１に液体Ｑが充分に導入されると、各微細貫通孔Ｔの内部も液体Ｑの一部によって満たされる（図３参照）。この際、第１空間部Ｓ１に継続して液体Ｑを導入し続けてもよいし、第１空間部Ｓ１の液体Ｑの流通を止めて、第１空間部Ｓ１を液体Ｑで満たした状態を保ってもよい。
【００３５】
（排出ステップ）
次に、図４に示す様に、各微細貫通孔Ｔ内に流入された前記一部の液体Ｑを残したまま、第１空間部Ｓ１から液体Ｑを排出する。排出方法は特に制限されず、重力を利用した自然排出であってもよいし、シリンジポンプ、ペリスターポンプ等を利用した強制排出であってもよい。排出速度は特に制限されず、第１空間部Ｓ１が陰圧になる程に勢いよく排出しても構わないが、通常、より穏やかに排出することが好ましい。すなわち、液体Ｑの排出によって、第１空間部Ｓ１が陰圧になってもよいし、陰圧にならなくてもよい。
【００３６】
（流出ステップ）
第１空間部Ｓ１から液体Ｑを排出すると、液体Ｑが排出されて第１空間部Ｓ１に空気が流入し、この空気に接した順に、各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、各微細貫通孔Ｔ内に残されていた液体Ｑが自動的に第１空間部Ｓ１へ流出する。
【００３７】
この自動的な流出が発生する要因の一つとして、第１空間部Ｓ１から液体Ｑを排出した直後に、各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａが開口する第１空間部Ｓ１の第１内壁面ｗ１に、液体Ｑからなる薄い膜Ｍが形成されることが考えられる。この膜Ｍが第１空間部Ｓ１に流入した空気によって徐々に乾燥し、その膜Ｍの厚みが徐々に薄くなり、最終的には膜Ｍが無くなる。この乾燥過程に伴って、各微細貫通孔Ｔ内の液体Ｑと膜Ｍの間に張力が働き、各微細貫通孔Ｔ内の液体Ｑが膜Ｍの方向に引き寄せられて第一の開口部Ｔａから流出する、というメカニズムが働いていると推測される。このメカニズムにより、空気に触れる順番が速い第一の開口部Ｔａを有する微細貫通孔Ｔから順に（図４においては、紙面の上から下に並んだ複数の微細貫通孔Ｔのうち、上側の微細貫通孔Ｔから順に）、ある程度の時間差を伴って、各々の微細貫通孔Ｔの内部に残された液体Ｑが第１空間部Ｓ１へ自動的に流出する。
【００３８】
以上の各ステップにより、第１空間部Ｓ１に導入した液体Ｑの一部を各微細貫通孔Ｔ内に流入させ、所望に応じてその状態を保持し、続いて、第１空間部Ｓ１から液体Ｑを排出することにより、一時的に各微細貫通孔Ｔ内に残された液体Ｑの一部を第１空間部Ｓ１へ流出させることができる。
【００３９】
以上の説明においては、第１空間部Ｓ１に液体Ｑを導入する場合を説明したが、この場合と同様に第２空間部Ｓ２に液体Ｑを導入すれば、第２空間部Ｓ２に開口する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから各微細貫通孔Ｔ内に液体Ｑの一部を流入させることができる。次いで、第２空間部Ｓ２内の液体Ｑを排出することにより、各微細貫通孔Ｔ内の液体Ｑを第二の開口部Ｔｂから第２空間部Ｓ２へ流出させることができる。第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２の構造及び構成は互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００４０】
＜検査デバイスの製造方法の第一実施形態＞
前述した送液方法（１）の液体Ｑとして、微細貫通孔Ｔの内側面Ｙを加工する材料を含む液体（液体材料）を使用することにより、マイクロ流体デバイス１０を材料として検査デバイス１０’を製造することができる。
【００４１】
第一実施形態の検査デバイスの製造方法においては、液体材料として、検査対象である液体試料に含まれる検査粒子に対して直接的又は間接的に結合可能な吸着物質が含まれた液体を使用する。この液体材料をマイクロ流体デバイス１０の第１空間部Ｓ１に導入し、第一の開口部Ｔａから、毛細管現象により微細貫通孔Ｔ内に液体材料の一部を流入させて、微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙに前記吸着物質を固定した後、第１空間部Ｓ１から液体材料を排出し、続いて、液体材料の排出の際に微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の液体材料を、微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから第１空間部Ｓ１へ自動的に流出させる。
【００４２】
本実施形態の検査デバイスの製造方法によれば、マイクロ流体デバイス１０に備えられた微細貫通孔Ｔの内部に液体材料を流入させるために、微細貫通孔Ｔが本来的に有する毛細管力（毛細管現象）を利用している。ポンプで発生した高圧力を微細貫通孔Ｔに負荷する必要がないため、穏やか且つ確実に微細貫通孔Ｔ内へ液体材料を流入させることができる。
【００４３】
液体材料には前記吸着物質が含まれているため、マイクロ流体デバイス１０に備えられた各微細貫通孔Ｔ内に前記吸着物質を容易に流入させることができる。流入された前記吸着物質は、各微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙに固定される。例えば、前記吸着物質と内側面Ｙとの分子間力による物理化学的結合により、前記吸着物質を直接的に内側面Ｙに固定する方法が挙げられる。前記液体材料を構成する溶媒が流出すると、内側面Ｙの表面に吸着物質が残留する。前記吸着物質が内側面Ｙに析出したように見えることもある。
【００４４】
各微細貫通孔Ｔ内へ液体材料を流入させた後、前記吸着物質の溶媒である液体材料が各微細貫通孔Ｔの外へ流出される。この際、従来行われている様な乱暴なポンプ制御によって、各微細貫通孔Ｔ内の液体材料を大きな流速で激しく流入させたり流出させたりすると、前記吸着物質が内側面Ｙに充分に固定されなかったり、内側面Ｙに固定された前記吸着物質が内側面Ｙから剥がれたりする恐れがある。しかし、本実施形態においては、毛細管現象によって穏やかに液体材料を流入し、その後、第１空間部Ｓ１における液体材料の排出に伴って自発的に起きる流れを利用して、穏やかに各微細貫通孔Ｔから液体材料を自然に流出させている。このため、前記吸着物質が内側面Ｙから剥がれる恐れは殆どない。つまり、本実施形態によれば、従来方法よりも確実に、前記吸着物質を各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに固定することができる。
【００４５】
このように製造された検査デバイス１０’を使用して前記送液方法を実施することにより、各微細貫通孔Ｔを物理、化学、生物学（バイオテクノロジー）に関する反応場として利用することができる。具体的には、例えば、免疫化学反応を利用した生化学的検査デバイスとして、検査デバイス１０’を使用することができる。
【００４６】
《検査方法（１）》
前述した送液方法（１）を利用して、検査デバイス１０’を使用することにより、被検出物質が結合されている又は結合されている可能性がある検査粒子を含む、液体試料を検査することができる。
【００４７】
本発明にかかる液体試料の検査方法の第一実施形態においては、第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１と、第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２と、第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第２内壁面ｗ２に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙと、内側面Ｙに固定された、前記液体試料に含まれる検査粒子に対して直接的又は間接的に結合可能な吸着物質（不図示）と、を備える図１に示すマイクロ流体デバイス１０（検査デバイス１０’）を使用する。
【００４８】
第一実施形態の検査方法は、前記液体試料を第１空間部Ｓ１に導入し、第一の開口部Ｔａから、毛細管現象により微細貫通孔Ｔ内に前記液体試料の一部を流入させて、微細貫通孔Ｔ内で、前記検査粒子と前記吸着物質を接触させることにより、前記検査粒子を前記吸着物質に直接的又は間接的に結合させた後、第１空間部Ｓ１から前記液体試料を排出し、続いて、前記液体試料の排出の際に微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の液体試料を、微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから第１空間部Ｓ１へ自動的に流出させる操作を含む検査方法である。
【００４９】
第一実施形態の検査方法においては、第１空間部Ｓ１に流入する前記液体試料には、前記検査粒子が含まれていることが必須である。一方、前記被検出物質は、前記液体試料に含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【００５０】
第一実施形態の検査方法においては、前記検査粒子に予め被検出物質が結合されていることが好ましい。前記被検出物質を前記検査粒子とともに、微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙに固定された前記吸着物質に結合させることができる。
【００５１】
前記検査粒子と前記吸着物質の結合の形態としては、前記検査粒子と前記吸着物質とが直接的に結合していてもよいし、前記検査粒子が他の物質を介して間接的に前記吸着物質に結合していてもよい。ここで、前記他の物質は特に限定されないが、前記被検出物質であることが好ましい。
【００５２】
また、前記被検出物質は前記検査粒子を介して前記吸着物質に結合してもよいし、前記被検出物質が直接に前記吸着物質に結合してもよい。後者の場合、前記検査粒子が前記被検出物質を介して前記吸着物質に結合する。
【００５３】
前記検査粒子が内側面Ｙに結合していないフリーの状態である場合、当該検査粒子の表面全体に前記被検出物質を結合させることができる。一方、前記被検出物質が未結合の検査粒子を内側面Ｙに結合させた後で、微細貫通孔Ｔ内において当該検査粒子に前記被検出物質を結合させた場合、前述した予め結合させた場合と比べて、当該検査粒子の前記被検出物質を結合可能な面積が減る。したがって、前記検査粒子がフリーな状態で前記被検出物質を予め当該検査粒子に結合させておくことにより、比較的多くの前記被検出物質を備えた前記検査粒子を微細貫通孔Ｔ内に結合させることができる。
【００５４】
前記検査粒子と前記被検出物質を予め結合させる方法は、特に制限されず、例えば、前記検査粒子及び前記被検出物質を含む溶液中で両者を接触させながら撹拌混合する方法が挙げられる。前記検査粒子と前記被検出物質の結合形態としては、非特異的結合であってもよいし、特異的結合であってもよい。
【００５５】
前記非特異的結合としては、例えば、分子間力（ファンデルワールス力）、水素結合、疎水性結合、クーロン力、等の公知の物理化学的結合が挙げられる。前記非特異的結合を利用する場合、前記溶液中に含まれる夾雑物質（目的の被検出物質以外の物質）が検査粒子に結合する可能性がある。前記溶液として、生体から取得した試料（例えば、血液や尿等の体液）を含む場合には、前記溶液中に夾雑物質が目的の被検出物質と共存することが通常である。
【００５６】
前記特異的結合としては、例えば、抗原抗体反応が挙げられる。抗原抗体反応を利用する場合、予め検査粒子に前記被検出物質に結合し得る抗体を固定しておくことが好ましい。検査粒子と抗体の結合は公知方法により実施することができる。例えば、前記抗体を備えた検査粒子及び前記被検出物質を含む溶液中で両者を接触させながら撹拌混合する方法によって、前記検査粒子に予め結合する前記被検出物質の割合を高めることができる。
【００５７】
一方、前記検査粒子に予め前記被検出物質を結合させない場合には、まず、微細貫通孔Ｔに前記検査粒子を固定し、続いて、当該微細貫通孔Ｔ内に前記被検出物質を含む液体を流入させることにより、微細貫通孔Ｔ内において、前記検査粒子と前記被検出物質を接触させて、前記検査粒子と前記被検出物質を非特異的又は特異的に結合させても構わない。
【００５８】
第一実施形態の検査方法においては、さらに、前記被検出物質に結合可能な少なくとも１種の検知物質を含む液体試薬を第１空間部Ｓ１又は第２空間部Ｓ２に導入し、第一の開口部Ｔａ又は第二の開口部Ｔｂから、すなわち、
第１空間部Ｓ１に前記液体試薬を導入した場合には、第一の開口部Ｔａから、
第２空間部Ｓ２に前記液体試薬を導入した場合には、第二の開口部Ｔｂから、
毛細管現象により微細貫通孔Ｔ内に前記液体試薬の一部を流入させることができる。
【００５９】
前記流入により、微細貫通孔Ｔ内において、前記吸着物質に結合した前記検査粒子及び前記被検出物質と、前記液体試薬を接触させることにより、前記吸着物質と前記検査粒子及び前記被検出物質と前記検知物質とが結合した複合体を形成することができる。
【００６０】
その後、前記液体試薬を導入した前記空間部である、第１空間部Ｓ１又は第２空間部Ｓ２から前記液体試薬を排出し、続いて、前記液体試薬の排出の際に微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の液体試薬を、
第一の開口部Ｔａ又は第二の開口部Ｔｂから、すなわち、
前記液体試薬を導入した前記空間部が第１空間部Ｓ１である場合には、微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、
前記液体試薬を導入した前記空間部が第２空間部Ｓ２である場合には、微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから、
前記液体試薬を排出した前記空間部へ、自動的に流出させる。
【００６１】
第一実施形態の検査方法において、前記複合体の形成を測定することにより、前記検査粒子に前記被検出物質が結合していることを定性的又は定量的に分析することができる。
前記複合体の形成を測定する方法は特に限定されず、例えば、微細貫通孔Ｔ内を検鏡する方法や、微細貫通孔Ｔ内で形成された前記複合体から直接又は間接に発信されるシグナルを測定する方法が挙げられる。前記シグナルとしては、マイクロ流体デバイスの外部から測定し易いシグナルが好ましく、例えば、光、放射線等が挙げられる。これらのうち、前記シグナルを光学的に測定する方法が容易に実施できるため好ましい。
【００６２】
前記複合体の形成を光学的に測定する方法としては、例えば、前記複合体を構成する前記検知物質が光学的に測定可能な標識物質を有する場合、前記標識物質が直接又は間接に発生する光を測定する方法が挙げられる。
【００６３】
前記標識物質が蛍光物質である場合、微細貫通孔Ｔ内に励起光を照射して、前記蛍光物質から発せられる蛍光の有無を検出することにより、前記複合体形成の有無を調べることができる。すなわち、微細貫通孔Ｔに固定された前記検査粒子に前記被検出物質が結合されていることを定性的に調べることができる。また、測定された蛍光強度に基づいて、前記検査粒子に結合した前記被検出物質の含有量を定量的に分析することもできる。
【００６４】
前記標識物質が酵素である場合、さらに、前記酵素の基質を含む基質溶液を第１空間部Ｓ１又は第２空間部Ｓ２に導入し、第一の開口部Ｔａ又は第二の開口部Ｔｂから、毛細管現象により微細貫通孔Ｔ内に前記基質溶液の一部を流入させて、微細貫通孔Ｔ内で、前記複合体が有する前記酵素と前記基質試薬を接触させることにより、前記基質を蛍光物質に変換する酵素反応を生じさせる操作を行うことができる。
【００６５】
前記酵素反応の後、生成された蛍光物質から発せられる蛍光の有無を検出することにより、複合体形成の有無を調べることができる。すなわち、微細貫通孔Ｔに固定された前記検査粒子に前記被検出物質が結合されていることを定性的に調べることができる。また、測定された蛍光強度に基づいて、前記検査粒子に結合した前記被検出物質の含有量を定量的に分析することもできる。
前記酵素反応を継続することによって生成される蛍光物質の量を増加させることができるので、蛍光測定が容易になり、形成された前記複合体の検出感度が一層高まる。このため、前標識物質として酵素を用いることがより好ましい。前記酵素及び基質としては、例えば、生物発光及び化学発光の分野で使用される公知物質が適用できる。
【００６６】
前記標識物質が酵素である場合、さらに、前記酵素と反応し得る発光物質を含む溶液を第１空間部Ｓ１又は第２空間部Ｓ２に導入し、第一の開口部Ｔａ又は第二の開口部Ｔｂから、毛細管現象により微細貫通孔Ｔ内に前記溶液の一部を流入させて、微細貫通孔Ｔ内で、前記複合体が有する前記酵素と前記発光物質を接触させることにより、前記発光物質を発光させる酵素反応を生じさせる操作を行うことができる。
【００６７】
前記酵素反応の後、発光物質から発せられる発光の有無を検出することにより、複合体形成の有無を調べることができる。すなわち、微細貫通孔Ｔに固定された前記検査粒子に前記被検出物質が結合されていることを定性的に調べることができる。また、測定された発光強度に基づいて、前記検査粒子に結合した前記被検出物質の含有量を定量的に分析することもできる。
前記酵素反応を継続することによって生成される発光物質の量を増加させることができるので、発光測定が容易になり、形成された前記複合体の検出感度が一層高まる。このため、前標識物質として酵素を用いることがより好ましい。前記酵素及び基質としては、例えば、生物発光及び化学発光の分野で使用される公知物質が適用できる。前記発光物質として、例えば、ルミノール、シュウ酸エステル等が挙げられる。
【００６８】
＜検査方法（１）の具体例＞
検査デバイス１０’の製造と使用の一例として、マイクロ流体デバイス１０に備えられた微細貫通孔Ｔに、前記吸着物質としての水溶性コラーゲンが固定された検査用デバイス１０’の製造と使用が挙げられる。以下に、図５Ａ〜図５Ｉを参照して説明する。
【００６９】
まず、水溶性コラーゲンを含む第一の液体Ｑ１（液体材料の一例）が第１空間部Ｓ１に導入されると、液体Ｑ１が第１空間部Ｓ１を徐々に満たすとともに、毛細管力によって各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから内部へ液体Ｑ１が流入する（図５Ａ）。各微細貫通孔Ｔに流入した液体Ｑ１に含まれる水溶性コラーゲンは、各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに吸着して、固定される。
【００７０】
全ての微細貫通孔Ｔ内に液体Ｑ１が満たされた後、第１空間部Ｓ１から液体Ｑ１を排出すると、第１空間部Ｓ１に空気が流入する。第１空間部Ｓ１に開口する各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａのうち、空気に接触した順序が速い第一の開口部Ｔａから順に、各微細貫通孔Ｔの内部に残された液体Ｑ１が第１空間部Ｓ１へ流出する（図５Ｂ）。この際、各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに吸着した水溶性コラーゲン（図中のColla.）は、内側面Ｙに固定された状態を維持する。水溶性コラーゲンは、内側面Ｙの表面を被覆する膜を構成する。このようにして、各微細貫通孔Ｔの内部の液体Ｑ１が全て排出された後においても、水溶性コラーゲンが各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに固定された検査デバイス１０’を製造することができる（図５Ｃ）。
【００７１】
ここで、予め前記検査粒子に被検出物質を結合させる処理を行い、前記液体試料を調製する。生体から取得した試料（例えば血液）を緩衝液に懸濁し、分析対象の被検出物質が含まれ得る生体試料溶液を公知方法により調製する。この生体試料溶液に前記検査粒子を投入し、十分に撹拌混合することによって、前記被検出物質が前記生体試料溶液に含まれる場合には、前記被検出物質が表面に結合していると想定される前記検査粒子が得られる。ここで得られた検査粒子を生体試料溶液から取り出して、別に用意した緩衝液に当該検査粒子を懸濁し、検査デバイス１０’に導入するための液体試料を調製する。或いは、当該検査粒子を取り出さずに、当該検査粒子を含んだ前記生体試料溶液を、検査デバイス１０’に導入するための液体試料として使用する。
【００７２】
続いて、上記で準備した液体試料Ｑ２が検査デバイス１０’の第１空間部Ｓ１に導入されると、液体試料Ｑ２が第１空間部Ｓ１を徐々に満たすとともに、毛細管力によって各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから内部へ液体試料Ｑ２が流入する（図５Ｄ）。各微細貫通孔Ｔに流入した液体試料Ｑ２に含まれる検査粒子Ｐは、各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに固定された水溶性コラーゲンに対する物理化学的な親和性によって結合する。
【００７３】
全ての微細貫通孔Ｔ内に液体試料Ｑ２が満たされた後、第１空間部Ｓ１から液体試料Ｑ２を排出すると、第１空間部Ｓ１に空気が流入する。第１空間部Ｓ１に開口する各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａのうち、空気に接触した順序が速い第一の開口部Ｔａから順に、各微細貫通孔Ｔの内部に残された液体試料Ｑ２が第１空間部Ｓ１へ流出する（図５Ｅ）。この際、各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに固定された水溶性コラーゲンは検査粒子Ｐを結合した状態を維持する。各微細貫通孔Ｔの内部の液体試料Ｑ２が全て排出された後においても、水溶性コラーゲンは検査粒子Ｐを結合した状態を維持している（図５Ｆ）。
【００７４】
次に、前記被検出物質に対する結合性が予め付与された一次抗体Ａｂ１（検知物質の一例）を含む液体試薬Ｑ３が第２空間部Ｓ２に導入されると、液体試薬Ｑ３が第２空間部Ｓ２を徐々に満たすとともに、毛細管力によって各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから内部へ液体試薬Ｑ３が流入する（図５Ｇ）。各微細貫通孔Ｔに流入した液体試薬Ｑ３に含まれる一次抗体Ａｂ１は、各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙにおいて検査粒子Ｐに結合した前記被検出物質を認識して結合し、水溶性コラーゲンと検査粒子Ｐ及び前記被検出物質と一次抗体とによって構成される複合体Ｃｏｍｐ．を形成する。
【００７５】
全ての微細貫通孔Ｔ内に液体試薬Ｑ３が満たされた後、第２空間部Ｓ２から液体試薬Ｑ３を排出すると、第２空間部Ｓ２に空気が流入する。第２空間部Ｓ２に開口する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂのうち、空気に接触した順序が速い第二の開口部Ｔｂから順に、各微細貫通孔Ｔの内部に残された液体試薬Ｑ３が第２空間部Ｓ２へ流出する（図５Ｈ）。この際、各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙにおいて形成された複合体Ｃｏｍｐ．は、水溶性コラーゲンを介して内側面Ｙに結合された状態を維持する。各微細貫通孔Ｔの内部の液体試薬Ｑ３が全て排出された後においても、複合体Ｃｏｍｐ．は、水溶性コラーゲンを介して内側面Ｙに結合した状態を維持している（図５Ｉ）。
【００７６】
一次抗体Ａｂ１には、予め発光性標識物質が結合（コンジュゲート）されているため、例えば、微細貫通孔Ｔに励起光を照射すると、微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに形成された複合体Ｃｏｍｐ．に含まれる発光性標識物質が蛍光を発する。この蛍光の発光量は複合体Ｃｏｍｐ．の存在量に依存する。したがって、蛍光の発光量を測定することにより、液体試料Ｑ２に含まれていた検査粒子Ｐが結合していた前記被検出物質の含有量を定量することができる。ここで得られた定量値から、前記生体から取得した試料中に含まれる前記被検出物質の量を算出することも可能である。
【００７７】
ここでは一次抗体Ａｂ１に発光性標識物質が結合されている場合を説明したが、一次抗体Ａｂ１ではなく、一次抗体Ａｂ１に結合可能な二次抗体Ａｂ２に前記発光性標識物質が結合されていてもよい。一次抗体Ａｂ１と同様の方法で、二次抗体Ａｂ２を微細貫通孔Ｔに導入することにより、複合体Ｃｏｍｐ．を構成する一次抗体Ａｂ１に二次抗体Ａｂ２を結合させることができる。二次抗体Ａｂ２が有する発光性標識物質に由来する蛍光発光量を定量することにより、検査粒子Ｐに結合していた前記被検出物質を定量することができる。なお、一次抗体Ａｂ１には、前記被検出物質に対する結合性が公知方法により予め付与されており、二次抗体Ａｂ２には、一次抗体Ａｂ１に対する結合性が公知方法により予め付与されている。
【００７８】
励起光照射による蛍光測定を実施する前に、水溶性コラーゲン又は前記被検出物質に対して非特異的に吸着した一次抗体Ａｂ１又は二次抗体Ａｂ２を洗浄する目的で、洗浄液を微細貫通孔Ｔ内に流入した後、流出させてもよい。また、抗原抗体反応を微細貫通孔Ｔ内で行うまえに、スキムミルク等のブロッキング溶液を微細貫通孔Ｔ内に導入して、抗体の非特異的吸着を防ぐ目的のブロッキング処理を行ってもよい。
【００７９】
一次抗体Ａｂ１及び／又は二次抗体Ａｂ２が結合する発光性標識物質としては、外部からの光照射を受けて励起された発光性標識物質自身が蛍光を発する蛍光物質であってもよいし、他の基質を化学発光する発光物質に変換する触媒物質であってもよい。
【００８０】
前記蛍光物質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、量子ドット等が挙げられる。前記触媒物質としては、例えば、ＥＬＩＳＡで使用される公知の酵素が適用可能であり、具体例として、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、イクオリン等の酵素が挙げられる。この酵素の基質としては、例えば、３−（ｐ−ハイドロオキシフェノール）プロピオン酸及びその類似体、ルシフェリン及びルシフェリン類似体、セレンテラジン及びセレンテラジン類似体等が挙げられる。
【００８１】
１種類の発光性標識物質が単独で使用されてもよいし、２種類以上の発光性物質が併用されてもよい。２種類以上の蛍光物質が併用されてもよいし、２種類以上の酵素及び基質が併用されてもよいし、１種類以上の蛍光物質と、１種類以上の酵素及び基質とが併用されてもよい。二次抗体Ａｂ２に種々の発光性標識物質を結合させる方法は特に限定されず、公知方法が適用可能である。
【００８２】
微細貫通孔Ｔ内に存在する物質をトレースするための標識物質は、上記の様に発光性標識物質であってもよいし、非発光性標識物質であってもよい。非発光性標識物質としては、例えば、公知のラジオイムノアッセイ法で使用される様な放射性標識物質が挙げられる。
【００８３】
以上で説明した検査デバイスの使用の一例は、検査対象である液体試料Ｑ２中に含まれる前記検査粒子に前記被検出物質が結合しているか否かを定性的に分析すること、又は液体試料Ｑ２中に含まれる前記検査粒子に結合している前記被検出物質の量を定量的に分析することを目的としている。このため、前記被検出物質に対して特異的又は非特異的に結合する一次抗体Ａｂ１及び二次抗体Ａｂ２を予め準備しておく必要がある。このような抗体は公知方法により取得される。
【００８４】
＜液体試料＞
検査対象である液体試料には、前記検査粒子が含まれる。
前記液体試料を構成する溶媒の種類は、前記検査粒子を分散可能であり、微細貫通孔Ｔ内に流入可能な溶媒であれば特に制限されず、公知の水系溶媒及び非水系溶媒が適用可能である。例えば、イムノアッセイ分野で一般に使用されるｐＨ緩衝液、界面活性剤含有水溶液、各種のアルコール、アセトニトリル等が挙げられる。上記溶媒を構成する化合物の種類は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００８５】
前記検査粒子を構成する材料は、前記被検出物質を表面及び／又は内部に結合可能であり、前記溶媒に分散（懸濁）可能な材料であり、前記吸着物質を介して微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに吸着可能であれば特に制限されず、公知の有機材料及び無機材料が適用可能である。例えば、樹脂（高分子材料）、金属、非金属、半導体、セラミックス等が挙げられる。より具体的には、ポリスチレン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）、シリコーン、ラテックス、水溶性コラーゲン等の高分子材料、金、銀、銅、チタン、クロム等の金属が例示できる。前記検査粒子を構成する材料の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。つまり、互いに異なる構成材料からなる２種以上の検査粒子を本発明にかかる検査方法において使用してもよい。
【００８６】
前記検査粒子の構成材料が金属である場合、当該金属は表面プラズモン共鳴が起こりうる金属であることが好ましく、金（Ｃｕ）であることがより好ましい。微細貫通孔Ｔ内の検査粒子Ｐに対して入射光（励起光）を照射し、検査粒子Ｐにおける表面プラズモン共鳴を測定することにより、複合体Ｃｏｍｐ．の形成の有無又は複合体Ｃｏｍｐ．の形成量を分析することができる。
【００８７】
前記検査粒子の平均粒子径は、前記微細貫通孔Ｔ内に流入可能な大きさであれば特に制限されず、前記液体試料における分散性を考慮して、例えば、１０ｎｍ〜５００μｍが好ましく、５０ｎｍ〜２５０μｍがより好ましく、１００ｎｍ〜１００μｍが更に好ましい。ここで、平均粒子径は、複数の検査粒子の直径又は最も長い径としての長径を顕微鏡観察で測定して得られる平均値として求められる。より正確な平均値を求めるためには、１００個程度の検査粒子の直径を測定することが好ましい。
【００８８】
前記検査粒子の形状は、微細貫通孔Ｔ内に流入可能な形状であれば特に制限されず、例えば、球に近似できる形状、回転楕円体に近似できる形状、棒状、フィルム状等が挙げられる。前記検査粒子は、多孔質であってもよいし、非多孔質であってもよい。
【００８９】
前記検査粒子に結合する前記被検出物質は特に限定されず、例えば、前記検査粒子に対して特異的又は非特異的に結合し得る抗原、所定の抗原に対して特異的又は非特異的に結合し得る抗体、任意の有機化合物、無機化合物、金属等が挙げられる。
前記抗原の種類は特に制限されず、検査の目的に応じて適宜選定される。前記抗原の具体例としては例えば、風邪、肝炎、後天的免疫不全等を惹起するウイルス、細菌等の病原体に由来するタンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖等が挙げられる。
前記検査粒子に結合する前記被検出物質は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。
【００９０】
前記検査粒子と前記被検出物質の結合の形態は、非特異的結合であってもよいし、特異的結合であってもよい。非特異的結合及び特異的結合の好適な具体例としては、前述した例が挙げられる。
【００９１】
＜吸着物質＞
微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙには、前記吸着物質が固定される。
前記吸着物質は前記検査粒子に対して特異的に結合してもよいし、非特異的に結合してもよい。前記吸着物質としては、内側面Ｙに固定可能であり、前記検査粒子が当該吸着物質に吸着可能であれば特に限定されず、公知の有機材料及び無機材料が適用可能である。前記吸着物質は、前記検査粒子の吸着効率を高める観点から、内側面Ｙを被覆する被覆膜を形成可能な物質であることが好ましい。前記被覆膜の厚みは特に限定されないが、例えば１〜１００ｎｍが好ましい。
【００９２】
具体的な前記吸着物質としては、例えば、樹脂（高分子材料）、金属等が挙げられる。より具体的には、ポリスチレン、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）、シリコーン、ラテックス、水溶性コラーゲン等の高分子材料、金、銀、銅、チタン、クロム等の金属が例示できる。前記吸着物質は、前記検査粒子の構成材料と同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【００９３】
内側面Ｙに固定される吸着物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。２種類以上の吸着物質が内側面Ｙに固定される場合、例えば、２種類以上の吸着物質が混合された状態で１層の被覆膜が内側面Ｙに形成されてもよいし、第一の吸着物質からなる第一の被覆膜が内側面Ｙに形成され、その上に第二の吸着物質からなる第二の被覆膜が形成された、多層構造の被覆膜が内側面Ｙに形成されてもよい。２種類以上の吸着物質は、それぞれ互いに異なる検査粒子を結合してもよい。
【００９４】
＜検知物質＞
前記検査粒子に結合された前記被検出物質に結合する検知物質としては、微細貫通孔Ｔ内に導入可能であり、前記被検出物質に特異的又は非特異的に結合可能であれば特に制限されない。前記被検出物質としては、例えば、抗体、抗原、ペプチド（ペプチドアプタマー）、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、ＤＮＡ及びＲＮＡ以外の核酸からなるアプタマー、糖鎖、タンパク質、脂質等が挙げられる。
【００９５】
前記検知物質は、微細貫通孔Ｔ内において当該検知物質が前記被検出物質に結合したことを外部から測定可能な標識物質が付されていることが好ましい。前記標識物質としては、例えば、前記発光性標識物質、前記放射性標識物質等が挙げられる。前記検知物質に結合される前記標識物質の種類は、１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。前記検知物質に前記標識物質を結合させる方法は、公知方法が適用される。
【００９６】
＜マイクロ流体デバイス＞
検査デバイスの製造において使用可能なマイクロ流体デバイスの例として、以下に、マイクロ流体デバイス１０，２０，３０，４０の構成を説明する。
【００９７】
図１に示すマイクロ流体デバイス１０を構成する複数の微細貫通孔Ｔは、それぞれ第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａと、第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２に開口する第二の開口部Ｔｂとを有する。各微細貫通孔Ｔは、マイクロ流体デバイス１０を構成する本体部４に内在して第一の流路を形成する第１空間部Ｓ１と、本体部４に内在して第二の流路を形成する第２空間部Ｓ２とを空間的に連結している（連通している）。つまり、各微細貫通孔Ｔの第一の端部が第一の開口部Ｔａを構成し、各微細貫通孔Ｔの第二の端部が第二の開口部Ｔｂを構成している。
【００９８】
本体部４に内在する第１空間部Ｓ１は、本体部４が有する第１内壁面ｗ１によって形成されている。第１空間部Ｓ１は本体部４の表面の任意の箇所に少なくとも２つの開口部を有する。何れかの開口部から任意の液体Ｑを注入すると、第１空間部Ｓ１内に液体Ｑが導入される。その後、所望のタイミングで第１空間部Ｓ１内の液体Ｑを何れかの開口部から排出する。第１空間部Ｓ１における液体Ｑの導入及び排出を制御するために、マイクロ流体デバイス１０にポンプ又はバルブが取り付けられてもよい。
【００９９】
第１空間部Ｓ１の形状は、第一の開口部Ｔａが開口する第１内壁面ｗ１を有する形状であれば特に限定されず、例えば、公知の流体デバイスを構成する流路と同じ形状であってもよいし、立方体、直方体、球、回転楕円体等の任意の立体形状であってもよい。第１空間部Ｓ１の形状が長手方向を有する形状である場合、その長手方向に直交する断面の形状は矩形、円形、楕円形等の任意の形状でよい。前記断面の直径又は長径（最大径）は特に限定されず、例えば、１μｍ〜３０μｍ程度が好ましい。この範囲であると、第１空間部Ｓ１に開口する各微細貫通孔Ｔ内に対して、穏やか且つ確実に、液体Ｑが流入し得る。
【０１００】
第２空間部Ｓ２の形状及びサイズは、第１空間部Ｓ１と同じであってもよいし、異なっていてもよい。第２空間部Ｓ２が構成する第二の流路の経路と、第１空間部Ｓ１が構成する第一の流路の経路とは互いに異なるが、両方の経路の一部が重複したり交差したりしても構わない。各流路における液体Ｑの流れの制御は、公知方法で行えばよく、例えば流路上に設けられたバルブ又はポンプ（不図示）によって制御することができる。その他の第２空間部Ｓ２に関する説明は、上記の第１空間部Ｓ１の説明と同様であるため省略する。
【０１０１】
微細貫通孔Ｔの孔径、すなわち微細貫通孔Ｔの長手方向に直交する断面の直径又は長径（最大径）は、上記毛細管力による液体Ｑの流入及び上記自動的な液体Ｑの流出が容易になるため、第一の開口部Ｔａから第二の開口部Ｔｂまで均一であることが好ましい。前記孔径は、前述した様に１ｎｍ〜１０００μｍ程度の範囲であることが好ましい。この範囲であると、上記毛細管力による液体Ｑの流入及び上記自動的な液体Ｑの流出が、穏やか且つ確実に行われ得る。
【０１０２】
微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａ及び第二の開口部Ｔｂの形状（微細貫通孔Ｔの両端部が第１内壁面ｗ１及び第２内壁面ｗ２にそれぞれ形成する縁の輪郭）は、上記毛細管力による液体Ｑの流入及び上記自動的な液体Ｑの流出が起こることを妨げる形状でなければ特に制限されない。上記流入及び流出がより容易に起きるため、第一の開口部Ｔａ及び第二の開口部Ｔｂの形状は、これら開口部Ｔａ，Ｔｂを両端に有する微細貫通孔Ｔの長手方向に直交する断面の形状と同じであることが好ましい。
【０１０３】
微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａと第二の開口部Ｔｂの形状は互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、マイクロ流体デバイス１０の様に、微細貫通孔Ｔがデバイス内に複数備えられている場合には、各微細貫通孔Ｔの長手方向に直交する断面の形状、及び各微細貫通孔Ｔの開口部Ｔａ、Ｔｂの形状は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。
【０１０４】
マイクロ流体デバイスが有する複数の微細貫通孔Ｔを図６ＡのＡ−Ａ’方向で切断したときの各微細貫通孔Ｔの断面形状の具体例を次に示す。図６Ｂは楕円形状の断面を有する複数の微細貫通孔Ｔが直線的に配列された例である。図６Ｃは矩形状の断面を有する複数の微細貫通孔Ｔが直線的に配列された例である。図６Ｄは楕円形状の断面を有する複数の微細貫通孔Ｔが三本の直線状に配列された例である。図６Ｅは図６Ｂよりも扁平で長径の方向が異なる楕円形状の断面を有する複数の微細貫通孔Ｔが直線的に配列された例である。マイクロ流体デバイスに備えられた複数の微細貫通孔Ｔは、互いに同じ断面形状を有していてもよいし、異なる断面形状を有していてもよい。
【０１０５】
微細貫通孔Ｔの長手方向の長さは、上記毛細管力による液体Ｑの流入及び上記自動的な液体Ｑの流出が起こる長さであれば特に制限されず、例えば、１００μｍ〜５０００μｍ程度が好ましい。この範囲であると、微細貫通孔Ｔにおける液体Ｑの流入及び流出を、穏やか且つ確実に起こすことができる。
【０１０６】
マイクロ流体デバイス１０に備えられた微細貫通孔Ｔが複数である場合、各微細貫通孔Ｔ同士の距離（離間距離）及び各微細貫通孔Ｔの開口部Ｔａ，Ｔｂ同士の距離（離間距離）は特に制限されず、例えば１μｍ〜１００μｍ程度が好ましい。各微細貫通孔Ｔの長手方向に沿う中心軸線の方向（中心軸が指す方向）は、互いに平行であってもよいし、非平行であってもよい。
【０１０７】
マイクロ流体デバイス１０の本体部４において、微細貫通孔Ｔが連通する第１空間部Ｓ１及び第２空間部Ｓ２は、二つの平行な流路を形成している。各流路において、微細貫通孔Ｔの長手方向に沿う中心軸線が各流路を通過する方向の流路径は特に限定されないが、各流路から微細貫通孔Ｔ内へ液体が流入し易くなる観点から、例えば１００μｍ〜５０００μｍ程度が好ましい。
【０１０８】
前記各流路の長手方向に沿う中心軸線と、各微細貫通孔Ｔの長手方向に沿う中心軸線との「なす角」は特に制限されず、９０度であってもよいし、鈍角であってもよいし、鋭角であってもよい。前記なす角が特に制限されない理由は、各微細貫通孔Ｔにおける液体Ｑの流入及び流出に対して支配的な力は、上記毛細管力、及び、各第一の開口部Ｔａ周辺の第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１において形成される液体Ｑからなる膜Ｍの移動（乾燥）の際に発生する張力であり、上記なす角の寄与は小さいからである。
【０１０９】
マイクロ流体デバイス１０においては、第１空間部Ｓ１及び第２空間部Ｓ２を構成する第１内壁面ｗ１及び第２内壁面ｗ２、並びに複数の微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙが、本体部４を構成する基材（基板）に含まれている。
【０１１０】
次に、マイクロ流体デバイス１０の変形例として、マイクロ流体デバイス２０（図７参照）、マイクロ流体デバイス３０（図８参照）を説明する。
マイクロ流体デバイス２０，３０を使用して、前述したマイクロ流体デバイス１０と同様に、流入ステップ、排出ステップ及び流出ステップによって送液することができる。
したがって、マイクロ流体デバイス１０を使用して検査デバイス１０’を製造する方法と同様に、前述した送液方法（１）により、マイクロ流体デバイス２０，３０を使用して検査デバイス２０’，３０’を製造することができる。
【０１１１】
図７に示すマイクロ流体デバイス２０は、第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１及び第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２を含む本体部４と、第１空間部Ｓ１に面して開口する第一の開口部Ｔａ及び第２空間部Ｓ２に面して開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を空間的に連結する（連通する）一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙを含む副本体部５（チップ）と、を備えている。
【０１１２】
マイクロ流体デバイス２０においては、副本体部５が本体部４の内部に設置されている。副本体部５の第一の表面５ｕは、本体部４の第１内壁面ｗ１と一体化して第１空間部Ｓ１を構成している。副本体部５に含まれる各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａは、第１空間部Ｓ１に面するように第一の表面５ｕに開口している。同様に、副本体部５の第二の表面５ｖは、本体部４の第２内壁面ｗ２と一体化して第２空間部Ｓ２を構成している。副本体部５に含まれる各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂは、第２空間部Ｓ２に面するように第二の表面５ｖに開口している。
【０１１３】
図８に示すマイクロ流体デバイス３０は、第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１及び第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２を含む本体部４と、第１空間部Ｓ１を構成する第１副内壁面ｗｗ１及び第２空間部Ｓ２を構成する第２副内壁面ｗｗ２を含み、更に、第１副内壁面ｗｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第２副内壁面ｗｗ２に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を空間的に連結する（連通する）一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙを含む副本体部５（チップ）と、を備えている。
【０１１４】
マイクロ流体デバイス３０においては、副本体部５が本体部４の内部に設置されている。副本体部５の第１副内壁面ｗｗ１は、本体部４の第１内壁面ｗ１に接続されて、全体として一つの第１空間部Ｓ１を形成している。副本体部５に含まれる各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａは、第１空間部Ｓ１に面するように第１副内壁面ｗｗ１に開口している。同様に、副本体部５の第２副内壁面ｗｗ２は、本体部４の第１内壁面ｗ２に接続されて、全体として一つの第２空間部Ｓ２を形成している。副本体部５に含まれる各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂは、第２空間部Ｓ２に面するように第２副内壁面ｗｗ２に開口している。
【０１１５】
マイクロ流体デバイス２０，３０を構成する副本体部５（チップ）は、本体部４から取り外すこと及び本体部４に取り付けることが可能なように設置されていてもよいし、本体部４から取り外すことができないように接着又は接合された状態で設置されていてもよい。
【０１１６】
副本体部５を構成する基体の形状は、本体部４に設置可能な形状であれば特に限定されない。前記基体の形状としては、例えば直方体、立方体等の箱型形状（チップ形状）が挙げられる。前記基体の材料は特に限定されず、本体部４を構成する基体の材料と同じ材料が適用可能である。
【０１１７】
本体部４又は副本体部５を構成する基体に、微細貫通孔Ｔ、第１空間部Ｓ１及び第２空間部Ｓ２を形成する方法は特に限定されず、公知の微細加工技術を適用できる。マイクロ流体デバイス１０の製造方法を代表例として、後で詳述する。
【０１１８】
以上で説明したマイクロ流体デバイス１０，２０，３０は、２つの空間部Ｓ１、Ｓ２を備えたデバイスである。
以下に、３つ以上の空間部を備えたマイクロ流体デバイス４０を、図９を参照して例示する。
【０１１９】
マイクロ流体デバイス４０は、第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１と、第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２と、・・・第ｎ空間部Ｓｎを構成する第ｎ内壁面ｗｎと、の合計ｎ個の内壁面を含む。前記「ｎ」は３以上の整数（序数）を表す。
【０１２０】
さらに、マイクロ流体デバイス４０は、第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第２内壁面ｗ２に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を空間的に連結する一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する第１内側面Ｙ１と、・・・第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第ｎ内壁面ｗｎに開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第ｎ空間部Ｓｎを空間的に連結する（連通する）一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する第（ｎ−１）内側面Ｙ（ｎ−１）と、の合計（ｎ−１）個の内側面を含む。１つの内側面は１本以上の微細貫通孔を構成する。前記「ｎ」は３以上の整数（序数）を表す。
【０１２１】
ここで、「第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１と、第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２と、・・・第ｎ空間部Ｓｎを構成する第ｎ内壁面ｗｎ」の表記における「・・・」は、第３空間部Ｓ３を構成する第３内壁面ｗ３、第４空間部Ｓ４を構成する第４内壁面ｗ４、第５空間部Ｓ５を構成する第５内壁面ｗ５、・・・の順序で、任意のｎ個の空間部が繰り返されることを表す。前記「ｎ」は３以上の整数（序数）を表し、図９においてはｎ＝５の場合を例示している。
【０１２２】
同様に、「・・・第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第ｎ内壁面に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第ｎ空間部Ｓｎを空間的に連結する（連通する）一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する第（ｎ−１）内側面Ｙ（ｎ−１）と、」の表記における「・・・」は、
第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第３内壁面に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第３空間部Ｓ３を空間的に連結する（連通する）一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する第２内側面Ｙ２と、
第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第４内壁面に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第４空間部Ｓ４を空間的に連結する（連通する）一つ以上の微細貫通孔Ｔを構成する第３内側面Ｙ３と、・・・
の順序で、任意の（ｎ−１）個の内側面が繰り返されることを表す。前記「ｎ」は３以上の整数（序数）を表し、第ｎ空間部Ｓｎにおける「ｎ」と同一の整数である。よって、図９においてはｎ＝５の場合を例示している。
【０１２３】
マイクロ流体デバイス４０は、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を連通する一つ以上の微細貫通孔Ｔからなる第１微小空間群Ｇ１、第１空間部Ｓ１と第３空間部Ｓ３を連通する一つ以上の微細貫通孔Ｔからなる第２微小空間群Ｇ２、・・・第１空間部Ｓ１と第ｎ空間部Ｓｎを連通する一つ以上の微細貫通孔Ｔの第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）を有する。ここでも、「・・・」の表記は前述と同様の順序で、任意の（ｎ−１）個の微小空間群が繰り返されることを表す。前記「ｎ」は３以上の整数（序数）を表し、第ｎ空間部Ｓｎにおける「ｎ」と同一の整数である。よって、図９においてはｎ＝５の場合を例示している。
【０１２４】
＜送液方法（２）＞
マイクロ流体デバイス４０における第一の送液方法（送液方法（２））は、前述したマイクロ流体デバイス１０等と同様に、流入ステップ、排出ステップ及び流出ステップによって実施することができる。
【０１２５】
第一の送液方法において、流入ステップは、第１空間部Ｓ１に液体Ｑを導入するとともに、第１空間部Ｓ１に開口し、第１微小空間群Ｇ１を構成する各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａ、・・・及び第１空間部Ｓ１に開口し、第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）を構成する各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に液体Ｑの一部をそれぞれ流入させるステップである。排出ステップは、各微細貫通孔Ｔ内に流入された前記一部の液体Ｑを残したまま、第１空間部Ｓ１から液体Ｑを排出するステップである。流出ステップは、前記排出後、各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、各微細貫通孔Ｔ内の液体Ｑを第１空間部Ｓ１へ自動的に流出させるステップである。なお、ｎは３以上の整数（序数）を表す。
【０１２６】
第一の送液方法においては、マイクロ流体デバイス４０が有する第１微小空間群〜第（ｎ−１）微小空間群を構成する各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａが共通に開口している第１空間部Ｓ１に、液体Ｑを導入することによって、第１微小空間群〜第（ｎ−１）微小空間群の各微細貫通孔Ｔに同一の液体Ｑを流入し、その後流出させている。
【０１２７】
＜検査デバイスの製造方法の第二実施形態＞
前述した送液方法（２）の液体Ｑとして、微細貫通孔の内側面を加工する材料を含む液体（液体材料）を使用することにより、マイクロ流体デバイス４０を材料として検査デバイス４０’を製造することができる。
【０１２８】
検査デバイスの製造方法の第二実施形態においては、液体材料として、検査対象である液体試料に含まれる検査粒子に対して結合可能な、吸着物質が含まれた液体を使用する。この液体材料をマイクロ流体デバイス４０の第１空間部Ｓ１に導入し、微細貫通孔Ｔの各々が有する第一の開口部Ｔａから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に液体材料の一部を流入させて、各微細貫通孔Ｔを構成する各内側面に前記吸着物質を固定した後、第１空間部Ｓ１から液体材料を排出し、続いて、液体材料の排出の際に各微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の液体材料を、各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから第１空間部Ｓ１へ自動的に流出させる。
【０１２９】
検査デバイスの製造方法の第二実施形態によれば、前述した検査デバイスの製造方法の第一実施形態と同様の効果が奏される。すなわち、第二実施形態の製造方法においては、毛細管現象によって穏やかに液体材料を流入し、その後、第１空間部Ｓ１の排出に伴って自発的に起きる流れを利用して、穏やかに各微細貫通孔Ｔから液体材料を自然に流出させているため、前記吸着物質が各微細貫通孔の内側面から剥がれる恐れは殆どない。つまり、第二実施形態の製造方法によれば、従来方法より確実に、前記吸着物質を各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙに固定することができる。
【０１３０】
第二実施形態の製造方法によって製造された検査デバイス４０’においては、各微小空間群Ｇ１〜Ｇ（ｎ−１）のそれぞれに対して独立に、種々の互いに異なる液体を流入させたり流出させたりすることができる。よって、検査デバイス４０’に備えられた各微小空間群における微細貫通孔Ｔを独立した反応場として使用することができる。
【０１３１】
＜送液方法（３）＞
前述の第一の送液方法（送液方法（２））とは異なる第二の送液方法（送液方法（３））として、第１微小空間群〜第（ｎ−１）微小空間群のそれぞれの群に対して、異なる液体を流入及び流出させることも可能である。
【０１３２】
マイクロ流体デバイス４０における第二の送液方法（送液方法（３））は、前述の流入ステップ、排出ステップ及び流出ステップの一部を変更して実施される。第二の送液方法においては、各微細貫通孔Ｔが有する第二の開口部Ｔｂから液体Ｑを流入する。
【０１３３】
マイクロ流体デバイス４０における各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂは、第２空間部〜第ｎ空間部の何れかにそれぞれ開口している。これら各空間部に第１液体〜第（ｎ−１）液体をそれぞれ導入すると、これら各液体が、第２空間部〜第ｎ空間部に開口する各微細貫通孔Ｔ、すなわち第１微小空間群〜第（ｎ−１）微小空間群、の内部に毛細管力によって流入する。各空間部における各液体の導入及び排出は、それぞれ独立に制御することができるため、第２空間部〜第ｎ空間部に開口する各微細貫通孔Ｔに対して、個別の液体を、所望のタイミングで、それぞれ独立に流入させたり流出させたりすることができる。
以下に、第二の送液方法（送液方法（３））を具体的に詳述する。
【０１３４】
マイクロ流体デバイス４０を使用した第二の送液方法においては、第１微小空間群〜第（ｎ−１）微小空間群の各群がそれぞれ独立に、流入ステップ、排出ステップ及び流出ステップを行う。その流入ステップにおいては、各群を構成する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂが群ごとに個別に開口する、第２空間部Ｓ２〜第ｎ空間部Ｓｎのそれぞれに対して所望の液体を導入する。
【０１３５】
第１微小空間群Ｇ１を構成する各微細貫通孔Ｔに所定の液体Ａを流入及び流出させる際には、第２空間部Ｓ２において液体Ａを導入及び排出すればよい。この第１微小空間群Ｇ１における液体Ａの流入及び流出とは独立に、第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）に液体Ｂを流入及び流出させる際には、第ｎ空間部Ｓｎに液体Ｂを導入し、その後排出すればよい。
【０１３６】
第２空間部Ｓ２に導入された液体Ａの一部は、第１微小空間群Ｇ１を構成する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから各微細貫通孔Ｔ内に流入する。次いで、第２空間部Ｓ２から液体Ａを排出すると、第１微小空間群Ｇ１を構成する各微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した液体Ａの一部が第二の開口部Ｔｂから第２空間部Ｓ２へ流出する。
第ｎ空間部Ｓｎに導入された液体Ｂの、第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）における流入及び流出についても、第２空間部Ｓ２に導入された液体Ａの場合と同様である。
【０１３７】
つまり、第二の送液方法は、本体部４と、本体部４に内在する第１空間部Ｓ１、第２空間部Ｓ２、・・・及び第ｎ空間部Ｓｎ（ｎは３以上の整数を表す。）と、本体部４に内在し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を連通する一本以上の微細貫通孔Ｔからなる第１微小空間群Ｇ１、・・・及び第１空間部Ｓ１と第ｎ空間部Ｓｎを連通する一本以上の微細貫通孔Ｔからなる第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）と、を備えたマイクロ流体デバイス４０を使用して、以下で説明するように、第１微小空間群Ｇ１における送液、・・・、第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）における送液をそれぞれ独立に行う送液方法である。
【０１３８】
ここでも、「・・・」の表記は前述と同様の順序で、任意の（ｎ−１）個の微小空間群が繰り返されることを表す。前記「ｎ」は３以上の整数（序数）を表し、第ｎ空間部Ｓｎにおける「ｎ」と同一の整数である。よって、図９においてはｎ＝５の場合を例示している。
【０１３９】
第１微小空間群Ｇ１における送液は、第２空間部Ｓ２に第１の液体を導入するとともに、第２空間部Ｓ２に開口する第１微小空間群Ｇ１を構成する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に前記液体の一部を流入させる流入ステップと、第１微小空間群Ｇ１を構成する各微細貫通孔Ｔ内に流入された前記一部の液体を残したまま、第２空間部Ｓ２から前記液体を排出する排出ステップと、前記排出後、第１微小空間群Ｇ１を構成する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから、各微細貫通孔Ｔ内の液体を第２空間部Ｓ２へ自動的に流出させる流出ステップと、を有する。
【０１４０】
第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）における送液は、第ｎ空間部Ｓｎに第（ｎ−１）の液体を導入するとともに、第ｎ空間部Ｓｎに開口する第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）を構成する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に前記液体の一部を流入させる流入ステップと、第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）を構成する各微細貫通孔Ｔ内に流入された前記一部の液体を残したまま、第ｎ空間部Ｓｎから前記液体を排出する排出ステップと、前記排出後、第（ｎ−１）微小空間群Ｇ（ｎ−１）を構成する各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから、各微細貫通孔Ｔ内の液体を第ｎ空間部Ｓｎへ自動的に流出させる流出ステップと、を有する。
【０１４１】
マイクロ流体デバイス４０を使用した第二の送液方法においては、各群に対してそれぞれ独立に、同一の液体を送液してもよいし、異なる液体を送液してもよい。
【０１４２】
＜検査デバイスの製造方法の第三実施形態＞
前述した送液方法（３）の液体Ｑとして、微細貫通孔の内側面を加工する材料を含む液体（液体材料）を使用することにより、マイクロ流体デバイス４０を材料として検査デバイス４０”を製造することができる。
【０１４３】
第三実施形態の検査デバイスの製造方法においては、液体材料として、検査対象である液体試料に含まれる検査粒子に対して結合可能な、吸着物質がそれぞれ含まれた第１液体〜第（ｎ−１）液体を使用する。
【０１４４】
第三実施形態の検査デバイスの製造方法は、第１操作〜第（ｎ−１）操作を有する。ここで、ｎは３以上の整数であり、マイクロ流体デバイス４０が有する「第ｎ空間部」における「ｎ」と同じ整数である。
【０１４５】
第１操作は、検査対象である液体試料に含まれる検査粒子に対して結合可能な第１吸着物質が含まれた第１液体を、第２空間部Ｓ２に導入し、第１内側面Ｙ１によって構成される一本以上の微細貫通孔Ｔ（微小空間群Ｇ１）が有する各第二の開口部Ｔｂから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に第１液体の一部を流入させて、各微細貫通孔Ｔを構成する第１内側面Ｙ１に第１吸着物質を固定した後、第２空間部Ｓ２から第１液体を排出し、続いて、第１液体の排出の際に各微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の第１液体を、各微細貫通孔の第二の開口部から第２空間部Ｓ２へ自動的に流出させる操作である。
【０１４６】
第（ｎ−１）操作は、前記液体試料に含まれる検査粒子に対して結合可能な第（ｎ−１）吸着物質が含まれた第（ｎ−１）液体を、第ｎ空間部Ｓｎに導入し、第（ｎ−１）内側面Ｙｎによって構成される一本以上の微細貫通孔Ｔ（微小空間群Ｇ（ｎ−１））が有する第二の開口部Ｔｂから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に第（ｎ−１）液体の一部を流入させて、各微細貫通孔Ｔを構成する第（ｎ−１）内側面Ｙｎに第（ｎ−１）吸着物質を固定した後、第ｎ空間部Ｓｎから第（ｎ−１）液体を排出し、続いて、第（ｎ−１）液体の排出の際に各微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の第（ｎ−１）液体を、各微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから第ｎ空間部Ｓｎへ自動的に流出させる操作である。
【０１４７】
第三実施形態の検査デバイスの製造方法においては、（ｎ−１）個の操作を行う。すなわち、第１操作、第２操作、第３操作、第４操作、・・・、及び第（ｎ−１）操作を行う。
ここで、ｎは、全て同一の３以上の整数（序数）であり、使用するマイクロ流体デバイス４０が有する「第ｎ空間部」を表すｎと一致する整数である。
【０１４８】
上記の各操作は独立に制御可能であるため、各操作を同時に行ってもよいし、個別に所望のタイミングで行ってもよい。
【０１４９】
第三実施形態の検査デバイスの製造方法によれば、第一実施形態の検査デバイスの製造方法と同様の効果が奏される。すなわち、第三実施形態の検査デバイスの製造方法においては、第２空間部〜第ｎ空間部に対する液体材料の導入をそれぞれ独立に制御して、毛細管現象によって穏やかに液体材料を各微細貫通孔Ｔに流入することにより、前記吸着物質を各内側面Ｙｎに効率よく固定することができる。その後、第２空間部〜第ｎ空間部においてそれぞれ独立に制御される液体材料の排出に伴って自発的に起きる流れを利用して、穏やかに各微細貫通孔Ｔから液体材料を自然に流出させることができる。このように、各微細貫通孔Ｔにおける液体材料の流入及び流出を穏やかに行うことができるため、各内側面Ｙｎに固定された前記吸着物質が剥がれる恐れは殆どない。つまり、本実施形態の検査デバイスの製造方法によれば、従来方法より確実に、前記吸着物質を前記各微細貫通孔Ｔの内側面に固定することができる。
【０１５０】
第三実施形態の製造方法によって製造された検査デバイス４０”においては、各微小空間群Ｇ１〜Ｇ（ｎ−１）のそれぞれに対して独立に、種々の互いに異なる液体を流入させたり流出させたりすることができる。よって、検査デバイス４０”に備えられた各微小空間群における微細貫通孔Ｔを独立した反応場として使用することができる。
【０１５１】
《検査方法（２）》
前述した送液方法（２）及び送液方法（３）を利用して、検査デバイス４０’又は検査デバイス４０”を使用することにより、被検出物質を結合している又は結合している可能性がある検査粒子が含まれた液体試料を検査することができる。
【０１５２】
本発明にかかる液体試料の検査方法の第二実施形態においては、第１空間部Ｓ１を構成する第１内壁面ｗ１、第２空間部Ｓ２を構成する第２内壁面ｗ２、・・・、及び第ｎ空間部（ｎは３以上の整数を表す。）を構成する第ｎ内壁面ｗｎ、を含むｎ個の内壁面と、第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第２内壁面ｗ２に開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第２空間部Ｓ２を空間的に連結する１本以上の微細貫通孔Ｔを構成する第１内側面Ｙ１、・・・、及び第１内壁面ｗ１に開口する第一の開口部Ｔａ及び第ｎ内壁面ｗｎに開口する第二の開口部Ｔｂを有し、第１空間部Ｓ１と第ｎ空間部Ｓｎを空間的に連結する１本以上の微細貫通孔Ｔを構成する第（ｎ−１）内側面、を含む（ｎ−１）個の内側面と、前記（ｎ−１）個の内側面のうち少なくとも１個の内側面に固定された、前記液体試料に含まれる検査粒子に対して結合可能な吸着物質と、を備える図９に示すマイクロ流体デバイス（検査デバイス４０’又は検査デバイス４０”）を使用する。
【０１５３】
第二実施形態の検査方法は、まず、前述した第一の送液方法（送液方法（２））によって、前記液体試料を第１空間部Ｓ１に導入し、前記（ｎ−１）個の内側面によって構成される各微細貫通Ｔ孔が有する第一の開口部Ｔａから、毛細管現象により各微細貫通孔Ｔ内に前記液体試料の一部を流入させて、各微細貫通孔Ｔ内で、前記液体試料に含まれる前記検査粒子と前記吸着物質を接触させることにより、前記検査粒子を前記吸着物質に結合させた後、第１空間部Ｓ１から前記液体試料を排出し、続いて、前記液体試料の排出の際に各微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の液体試料を、各微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから第１空間部Ｓ１へ自動的に流出させる操作を含む検査方法である。
【０１５４】
第二実施形態の検査方法においては、第１空間部Ｓ１に流入する前記液体試料に、前記検査粒子が含まれていることが必須である。一方、被検出物質は、前記液体試料に含まれていてもよいし、含まれていなくてもよい。
【０１５５】
第二実施形態の検査方法においては、前記検査粒子に予め少なくとも１種の被検出物質が結合されていることが好ましい。前記少なくとも１種の被検出物質を前記検査粒子とともに、微細貫通孔Ｔを構成する内側面Ｙに固定された前記吸着物質に結合させることができる。
前記検査粒子と前記吸着物質の結合の形態としては、前記被検出物質が前記検査粒子を介して前記吸着物質に結合してもよいし、前記被検出物質が直接に前記吸着物質に結合してもよい。後者の場合、前記検査粒子が前記被検出物質を介して前記吸着物質に結合する。
【０１５６】
第二実施形態の検査方法においては、さらに、前記検査粒子に結合された前記少なくとも１種の被検出物質に結合可能な、少なくとも１種の検知物質を含む、少なくとも１種の液体試薬を第１空間部Ｓ１〜第ｎ空間部Ｓｎから任意に選ばれる何れか１つ以上の空間部に導入し、
第一の開口部Ｔａ又は第二の開口部Ｔｂから、すなわち、
第１空間部Ｓ１に前記液体試薬を導入した場合には、第一の開口部Ｔａから、
第２空間部Ｓ２〜第ｎ空間部Ｓｎの何れかに前記液体試薬を導入した場合には、第二の開口部Ｔｂから、
毛細管現象により、各空間部に開口する各微細貫通孔Ｔ内に前記液体試薬の一部を流入させることができる。
【０１５７】
前記流入により、各微細貫通孔Ｔ内で、前記吸着物質に結合した前記検査粒子及び前記被検出物質と前記液体試薬を接触させることにより、前記吸着物質と、前記検査粒子及び前記被検出物質と、前記検知物質とが結合した複合体を形成することができる。
【０１５８】
次に、前述した第二の送液方法（送液方法（３））によって、前記液体試薬を導入した前記各空間部のうち少なくとも何れか１つの空間部から前記液体試薬を排出し、続いて、前記液体試薬の排出の際に前記空間部に開口する微細貫通孔Ｔ内に一時的に残留した前記一部の液体試薬を、
微細貫通孔Ｔが有する第一の開口部Ｔａ又は第二の開口部Ｔｂから、すなわち、
前記液体試薬を導入した前記空間部が第１空間部Ｓ１である場合には、微細貫通孔Ｔの第一の開口部Ｔａから、
前記液体試薬を導入した前記空間部が第２空間部Ｓ２〜第ｎ空間部Ｓｎの何れかの空間部である場合には、前記空間部に開口する微細貫通孔Ｔの第二の開口部Ｔｂから、
前記液体試薬を排出した前記空間部へ自動的に流出させる。
【０１５９】
第二実施形態の検査方法において、前記複合体の形成を測定することにより、前記検査粒子に前記被検出物質が結合されていることを定性的又は定量的に分析することができる。
前記複合体の形成を測定する方法は特に限定されず、前述した第一実施形態の検査方法において説明した測定方法を同様に適用することができる。
【０１６０】
第二実施形態の検査方法において、各空間部に導入する前記液体試薬は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、前記各空間部に導入する前記液体試薬に含まれる前記検知物質は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。
また、各空間部に導入する各液体試料には、互いに同じ検査粒子が含まれていてもよいし、異なる検査粒子が含まれていてもよい。前記各液体試料に含まれる各検査粒子は、互いに同じ被検出物質を結合していてもよいし、異なる被検出物質を結合していてもよい。
【０１６１】
例えば、互いに異なる検知物質を含んだ複数の液体試薬を各空間部に対してそれぞれ独立に導入し、ｎ個の内壁面によって構成される各空間部に対してそれぞれ異なる液体試薬を導入することにより、（ｎ−１）個の内側面によって構成される各微細貫通孔に対してそれぞれ異なる液体試薬を流入させることができる。したがって、（ｎ−１）種類の検査を単一の前記マイクロ流体デバイスにおいて実施することができる。
【０１６２】
＜検査方法（２）の具体例＞
検査デバイス４０”を使用した第二の送液方法（送液方法（３））においては、各微小空間群Ｇ１〜Ｇ（ｎ−１）に対してそれぞれ独立に、同一の液体を送液してもよいし、異なる液体を送液してもよい。例えば、各微小空間群Ｇ１〜Ｇ（ｎ−１）において異なる抗原を検出するＥＬＩＳＡ(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)を実施することができる。各微小空間群におけるＥＬＩＳＡは独立に行うことができるため、複数のＥＬＩＳＡを同時並行で実施することも可能である。
【０１６３】
本実施形態の検査方法において、第二の送液方法と第一の送液方法を組み合わせた送液方法を実施してもよい。この送液方法により、各微小空間群の独立性を活かして、効率の良い送液を実現することができる。具体例として、以下のように、検査デバイス４０”の製造と使用（検査）を連続して行う例が挙げられる。
【０１６４】
まず、マイクロ流体デバイス４０において、第一の送液方法によって、全ての微小空間群Ｇ１〜Ｇ（ｎ−１）を構成する微細貫通孔Ｔに対して一括して、プロテインＡ（第一の吸着物質の一例）を含む溶液を送液する。この送液によって、各微小空間群を構成する各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙ１〜Ｙ（ｎ−１）にプロテインＡを吸着させた後、第一の送液方法によって、アルブミン（第二の吸着物質）が含まれた溶液を送液して、全ての微小空間群を構成する各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙ１〜Ｙ（ｎ−１）をブロッキングする。
【０１６５】
次に、第二の送液方法によって、各微小空間群に対してそれぞれ独立に、所望の抗原特異性を有する個別の一次抗体を含む溶液を送液する。この送液によって、前記プロテインＡと一次抗体が結合して、各微小空間群を構成する各微細貫通孔Ｔの内側面Ｙ１〜Ｙ（ｎ−１）に個別の一次抗体（第三の吸着物質）が固定される。この一次抗体は前記吸着物質であり、一次抗体が微細貫通孔Ｔの内側面に固定されたマイクロ流路デバイス４０は、検査デバイス４０”である。
【０１６６】
上記のように製造（作製）された検査デバイス４０”において、第一の送液方法によって、全ての微小空間群Ｇ１〜Ｇ（ｎ−１）を構成する微細貫通孔Ｔに対して一括して、洗浄液を送液した後、全ての微小空間群に対して一括して、検査対象の液体試料を送液する。この送液によって、液体試料に含まれる被検出物質を結合した検査粒子が、各微小空間群の各微細貫通孔Ｔに固定された第三の吸着物質である一次抗体に結合し得る。各微細貫通孔Ｔに固定されたそれぞれの第三の吸着物質は、互いに異なる被検出物質を結合し得る。したがって、各微細貫通孔Ｔに固定されたそれぞれの第三の吸着物質は互いに異なる検査粒子を結合し得る。
【０１６７】
続いて、第二の送液方法によって、各微小空間群に対してそれぞれ独立に、各微小空間群を構成する微細貫通孔Ｔ内に既に固定された前記個別の一次抗体（第三の吸着物質）と同じ抗原特異性を有する、標識物質が結合された一次抗体（検知物質の一例）を含む溶液を送液する。この送液によって、各微小空間群を構成する微細貫通孔Ｔ内において、前記第三の吸着物質に結合した前記検査粒子に予め結合された前記被検出物質に対して、前記標識物質が結合された一次抗体（検知物質の一例）が結合する。つまり、各微小空間群の各微細貫通孔Ｔ内において、第三の吸着物質としての一次抗体と、前記被検出物質及び前記検査粒子と、前記検知物質の一例としての前記標識物質を有する一次抗体と、が結合した複合体が形成され得る。
【０１６８】
最後に、各微細貫通孔Ｔを洗浄した後、各微細貫通孔Ｔ内の前記複合体を構成する前記標識物質を検出又は測定することにより、各微小空間群においてそれぞれ独立したＥＬＩＳＡを実施することができる。つまり、前記複合体の形成を測定することにより、前記検査粒子に前記被検出物質が結合していることを定性的又は定量的に分析することができる。
【０１６９】
《マイクロ流体デバイスの製造方法》
前述したマイクロ流体デバイスは公知の微細加工技術を適用することにより製造することができる。
マイクロ流体デバイスの本体部４の材料は特に制限されず、例えば、ガラス、プラスチック（樹脂）、半導体、金属、セラミックス等が挙げられる。本体部４の形状は特に制限されず、本体部４を他のデバイス（例えばポンプ、試薬瓶、廃液溜め等）に接続したり、設置したりすることが容易になるため、立方体、直方体等の箱型の形状であることが好ましい。このような形状の本体部４を「基板」と称する。以下、本体部４が基板によって構成されている場合のマイクロ流体デバイスの製造方法を説明するが、本体部４が基板以外の形状であっても同様に製造することができる。
【０１７０】
基板（本体部４）に内在する微細貫通孔Ｔを形成する方法として、例えば、第一の形成方法と第二の形成方法の２つの形成方法が例示できる。
【０１７１】
（第一の形成方法）
第一の形成方法は、図１０及び図１１に示す様に、第一基板４Ａの表面に溝Ｙａ（凹部）を形成し、その表面に第二基板４Ｂを接合して、溝Ｙａに天井を形成することにより微細貫通孔Ｔを形成する方法である。
【０１７２】
図１０及び図１１は、本体部４の微細貫通孔Ｔを含む要部を拡大した模式的な断面図である。本体部４は、第一基板４Ａと第二基板４Ｂを接合してなる。微細貫通孔Ｔは、両基板の界面に形成されている。図１０の場合は、断面が矩形状の微細貫通孔Ｔを１つ形成した場合である。図１１の場合は、断面が矩形状の微細貫通孔Ｔを複数形成した場合である。
【０１７３】
図１１に示す様に、溝Ｙａの高さＨ１が、隣接する微細貫通孔Ｔ同士の離間距離Ｌ２よりも大きい場合（Ｈ１＞Ｌ２の場合）、各微細貫通孔Ｔの表面積（微細貫通孔を構成する内側面の面積）の合計は、図１０に示した一つの大きな微細貫通孔Ｔの表面積（微細貫通孔を構成する内側面の面積）よりも大きくなる。したがって、本体部４に内在される微細貫通孔Ｔが有する表面積、すなわち液体Ｑと微細貫通孔Ｔを構成する内側面との接触面積、を増やしたい場合は、図１１の様に微細貫通孔Ｔを複数形成すればよい。前記表面積（接触面積）を更に増やすためには、各微細貫通孔Ｔのアスペクト比（高さＨ１／底辺Ｌ１）を１より大きくすればよい。アスペクト比を大きくする程、前記表面積を増やすことができる。
【０１７４】
第一基板４Ａに溝Ｙａを形成する方法として、第一基板４Ａの材料に応じて種々の公知方法が挙げられる。
【０１７５】
第一基板４Ａとして樹脂基板を使用する場合には、例えば、ソフトリソグラフィ技術によって作製した微細なパターンを転写して形成するモールディング、ナノインプリント、射出成形などの公知方法を適宜組み合わせる形成方法が挙げられる。
【０１７６】
第一基板４Ａとしてガラス基板を使用する場合には、例えば、フォトリソグラフ、レーザー加工、機械加工、ドライエッチング、ウェットエッチングなどの公知方法を適宜組み合わせる方法が挙げられる。ナノスケールの溝Ｙａを形成する場合には、短パルスレーザー加工による基板改質とウェットエッチングの組み合わせが好ましい。
【０１７７】
第一基板４Ａと第二基板４Ｂとを接合する方法としては、例えば、接着剤によって接着する方法、陽極接合法、自己溶着法、表面改質を併用した低温圧着法等の公知方法が挙げられる。
【０１７８】
第一基板４Ａと第二基板４Ｂの材質は、互いに同じであってもよいし、異なっていてもよい。具体的には、両基板ともガラス基板であってもよいし、ガラス基板とシリコン基板との組み合わせであってもよいし、ガラス基板とプラスチック基板との組み合わせであってもよいし、両基板とも樹脂基板であってもよい。
【０１７９】
プラスチック基板の種類は特に限定されず、例えば、ＰＥＴ（ポリエチレンテレフタレート）、ＰＳ（ポリスチレン）、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）、ＡＳ（アクリロニトリルスチレン）樹脂、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＬＡ（ポリ乳酸）等が挙げられる。ガラス基板を構成するガラスの種類も特に限定されず、例えば、石英ガラス、ホウ珪酸ガラス、ソーダ石灰ガラス等が挙げられる。
【０１８０】
（第二の形成方法）
第二の形成方法は、図１２、図１３及び図１４に示す様に、第一基板４Ｃの内部に微細貫通孔Ｔを直接的に形成する方法である。基板の内部に短パルスレーザー光の焦点（集光部）を結び、基板内に微細貫通孔Ｔを形成する部位を走査することにより、その走査した部位（改質部）のエッチング耐性を弱める様に改質する。その後、ウェットエッチングによって基板内から改質部を除去することにより、基板内部に微細貫通孔Ｔを形成することができる。
【０１８１】
図１２、図１３及び図１４は、本体部４に形成された複数の微細貫通孔Ｔを含む要部の模式的な断面図である。本体部４は、単一の基板４Ｃによって構成されている。微細貫通孔Ｔは、基板４Ｃの内部に形成されている。
【０１８２】
図１２の場合は、複数の楕円状の断面を有する微細貫通孔Ｔが、基板厚さ方向Ｋと直交する方向（基板の平面方向）に一列で配列した場合である。前記楕円の長径は基板厚さ方向Ｋに沿っているため、前記断面が真円である場合よりも、基板の平面方向における微細貫通孔４の集積密度を高めることができる。集積密度を高めることにより、単位体積当たりの計測サンプル数が増加するため、測定精度が向上し得る。
【０１８３】
図１３の場合は、複数の楕円状の断面を有する微細貫通孔Ｔが、基板厚さ方向Ｋと直交する方向（基板の平面方向）に二列で配列した場合である。図において上段に配列された微細貫通孔Ｔと下段に配列された微細貫通孔Ｔとは、基板の厚み方向Ｋに見て互いに重ならない様に配列している。このように配列することにより、各微細貫通孔Ｔを基板厚さ方向Ｋに観察する際の容易さを損なうことなく、複数の微細貫通孔Ｔの集積密度を高めることができる。
【０１８４】
図１４の場合は、複数の楕円状の断面を有する微細貫通孔Ｔが、基板厚さ方向Ｋに一列で配列した場合である。このように配列すると、微細貫通孔Ｔの長径が基板平面方向に沿っている（微細貫通孔Ｔの短径が基板厚さ方向Ｋに沿っている）ため、基板厚み方向Ｋに沿って光（例えば、励起光、内部を観察するためのバックライト等）を微細貫通孔Ｔに照射した際、その照射光が屈折され難く、照射光を透過させ易い。したがって、微細貫通孔Ｔの内部に光を照射し易く、微細貫通孔Ｔ内部における発光を基板の厚み方向Ｋから観察し易い。
【０１８５】
（第二の形成方法の具体例）
本具体例においては、フェムト秒レーザーであるチタンサファイアレーザー光を発生する装置を使用するが、他の種類のレーザー光を発生する装置を使用しても構わない。
まず、精密ステージに設置した石英ガラス基板の第一面からレーザー光を基板内部に入射させ、レーザー光の焦点を基板内部の所定位置に結び、レーザー光の伝搬方向（光軸）に対して垂直の方向にレーザー光の焦点を走査する。この際、走査方向に対してレーザー偏波が垂直であると、ナノオーダー（例えば１０ｎｍ〜５００ｎｍ程度）の短径を有する微細貫通孔Ｔを容易に形成することができる。また、レーザー光の照射強度は、加工下限閾値以上且つ加工上限閾値未満に設定されることが好ましい。最適な照射強度は、予め同じ種類の石英ガラス基板を用いて調べておくことが好ましい。
一例として、例えば以下の照射条件が挙げられる。
【０１８６】
・波長（中心波長）＝８００ｎｍ、スペクトル幅＝１０ｎｍ（±５ｎｍ）、パルス時間幅＝〜２５０ｆｓ、対物レンズの開口数（N.A.）＝０．５、偏波＝直線偏波、光軸と走査方向とのなす角度＝約９０度
・ピーク強度（１パルス当りのレーザーフルエンス／パルス時間幅）＝９ＴＷ／ｃｍ２
・走査速度(μｍ/sec)＝１，０００μｍ/sec、繰り返し周波数(kHz)＝２００ｋＨｚ
・１パルス毎の焦点が重なるようにシフトさせながら一定の速度で走査
【０１８７】
上記のように石英基板に対してレーザー光を照射することにより、レーザー光の焦点及びその周辺を含む集光部が走査した領域に、エッチング耐性が低下した改質部が形成される。例えば、基板表面に対して略平行に延在し、その延在する方向に対して直交方向の断面の形状が楕円形（略矩形）である改質部を形成することができる。一例として、長径（縦の長さ）（基板厚み方向Ｋの長さ）が約５μｍであり、短径（横の長さ）（基板平面方向の長さ）が約３０ｎｍである改質部を形成することができる。このようなレーザー加工によって、互いに平行に並んだ複数の改質部を形成することができる。
【０１８８】
次に、各改質部の両端が表面に露出した石英基板を、フッ酸又は水酸化カリウム水溶液に浸漬してエッチングを行う。このエッチングにおいて、各改質部の両端から各改質部の内部にエッチング溶液が浸透し、各改質部が石英基板内から除去される。この結果、石英基板を貫通する複数の微細貫通孔Ｔを形成することができる。一例として、両端部が石英基板の表面に開口し、長手方向に対して直交する方向の断面の形状が楕円形（略矩形）であり、長径（縦の長さ）（基板厚み方向Ｋの長さ）が約５．５μｍであり、短径（横の長さ）（基板平面方向の長さ）が約３００ｎｍである微細貫通孔を形成することができる。
【０１８９】
石英基板に改質部を形成した際に、その改質部の両端部が基板表面に露出していない場合には、エッチングの前に、フォトリソグラフ、研削、研磨等の方法により、改質部の両端部が基板表面に露出するように予備加工すればよい。
【０１９０】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。
【産業上の利用可能性】
【０１９１】
本発明にかかる液体試料の検査方法は、医療検査の分野等に広く利用することができる。
【符号の説明】
【０１９２】
１０，２０，３０，４０…マイクロ流体デバイス、Ｓ１…第１空間部、Ｓ２…第２空間部、Ｓ３…第３空間部、Ｓ４…第４空間部、Ｓ５…第５空間部、ｗ１…第１内壁面、ｗ２…第２内壁面、ｗ３…第３内壁面、ｗ４…第４内壁面、ｗ５…第５内壁面、Ｔａ…第一の開口部、Ｔｂ…第二の開口部、Ｔ…微細貫通孔、Ｙ…内側面、４…本体部、５…副本体部、Ｍ…液体からなる膜、Ｇ１…第１微小空間群、Ｇ２…第２微小空間群、Ｇ３…第３微小空間群、Ｇ４…第４微小空間群、Ｑ…液体、Ｑ１…第一の液体、Ｑ２…第二の液体、Ｑ３…第三の液体、Ａｂ１…一次抗体、Ａｇ…抗原、Ｃｏｍｐ．…複合体、Colla.…水溶性コラーゲン、Ｐ…検査粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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