(57)【要約】【課題】出発物質である脂肪酸中の二重結合の立体配置と同一の二重結合の立体配置を有する同位体標識化合物を得ることができる製造方法を提供すること。【解決手段】脂肪酸を出発物質とし、前記脂肪酸の同位体標識化合物を製造する方法であって、前記脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなることを特徴とする、方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪酸を出発物質とし、前記脂肪酸の同位体標識化合物を製造する方法であって、前記脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記減炭工程が、前記脂肪酸を転移反応させることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記転移反応が、ホフマン転移反応、シュミット転移反応またはクルチウス転移反応を含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記転移反応が、クルチウス転移反応である請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記同位体標識化合物は、前記脂肪酸のカルボキシル基中の炭素原子および／または前記カルボキシル基と結合するメチレン基中の水素が、１３炭素（１３Ｃ）または１４炭素（１４Ｃ）、および重水素（２Ｈ）または三重水素（３Ｈ）によりそれぞれ標識された化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記同位体標識化合物中の二重結合における立体配置と、前記脂肪酸中の二重結合における立体配置とが同一である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記同位体標識化合物の分子量が、前記脂肪酸の分子量より２以上大きい、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記減炭工程により、前記脂肪酸より炭素数が１少ない脂肪酸が得られる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪酸が、天然物由来の脂肪酸である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記減炭工程が、転移反応により得られた化合物をアミノ化させるアミノ化反応を含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記減炭工程が、前記アミノ化反応により得られた化合物をアルデヒド化させるアルデヒド化反応を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記減炭工程が、前記アルデヒド化反応により得られた化合物を酸化させる酸化反応を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記増炭工程が、前記酸化反応により得られた化合物をエステル化させるエステル化反応を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記増炭工程が、前記エステル化反応により得られた化合物を還元剤により還元させる還元反応を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記還元剤が、重ヒドリドイオンが発生する還元剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記還元剤が、重水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＤ）または重水素化ホウ酸ナトリウムである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記増炭工程が、前記還元反応により得られた化合物をハロゲン化させる反応を含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増炭工程が、前記ハロゲン化反応により得られた化合物をマグネシウムと反応させることにより有機金属化合物を合成すること、および前記有機金属化合物を二酸化炭素と反応させることを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記二酸化炭素が、１３ＣＯ２または１４ＣＯ２である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法により得られたことを特徴とする、脂肪酸の同位体標識化合物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の同位体標識化合物を含んでなることを特徴とする、診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸の同位体標識化合物の製造方法およびその方法により得られた脂肪酸の同位体標識化合物、ならびに診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は炭水化物、タンパク質と並び食品の３大栄養素の１つである。特に、エネルギー源として炭水化物とタンパク質が４ｋｃａｌ／ｇの熱量を有しているのに対し、脂質は９ｋｃａｌ／ｇと大きな熱量を有し、体内では貯蔵エネルギーとして大量の脂質が蓄えられている。また、脂質はエネルギー源のみだけでなく、細胞膜の構成成分、エイコサノイドの前駆体など生体の恒常性を維持する役割も担っている。しかし、脂質の代謝については未だに不明な点が多く、現在までに多くの研究が行われている。その代謝の研究方法の１つに、同位体でラベル化（標識）した化合物を用いたアイソトープトレーサー法がある。
【０００３】
アイソトープトレーサー法では、目的となる化合物を人為的に同位体でラベル化し、例えばマウスなどの生体に投与を行い、質量分析法（放射性同位体の場合は放射線測定）を用い検出することにより、元々マウスの体内に存在していた内因性の目的化合物と人為的に投与した目的化合物を別けて検出することができる。この様に同位体の導入された化合物をトレーサー（追跡子）として使うことができるため、生物科学分野では、アイソトープトレーサー法が生体内における種々の物質の代謝速度、体内移行、挙動追跡、代謝経路の解明に用いられている。
【０００４】
脂肪酸の同位体標識化合物の合成方法は、アルキンをカップリングさせ炭素骨格に複数箇所の三重結合を導入したのちに、Ｌｉｎｄｌａｒ触媒により三重結合を重水素（２Ｈ）で還元する方法が知られている（非特許文献１、２および３）。天然に存在する脂肪酸はほとんどがｃｉｓ体として存在しており、実際の実験でもｔｒａｎｓ体よりｃｉｓ体の脂肪酸の同位体標識化合物を用いる方がより正確な結果を得られることが予想されるが、上記方法では、一部がｔｒａｎｓ体の形で得られてしまう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】島原健三 著、概説生物化学、三共出版（１９９１）
【非特許文献２】和田俊・後藤直宏 共著、食品機能学―脂質、丸善（２００４）
【非特許文献３】Ｈｏｗａｒｄ  Ｓ．、Ｎｅｗ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｆａｔｔｙ−Ａｃｉｄｓ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｔｏ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １２、５−７（１９９６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、本発明者らは、今般、脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなる脂肪酸の同位体標識化合物の製造方法によれば、出発物質である脂肪酸中の二重結合の立体配置と同一の二重結合の立体配置を有する同位体標識化合物を得ることができるとの知見を得た。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、出発物質である脂肪酸中の二重結合の立体配置と同一の二重結合の立体配置を有する同位体標識化合物を得ることができる製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明による脂肪酸の同位体標識化合物を製造する方法は、脂肪酸を出発物質とし、前記脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなることを特徴とする。
【０００９】
本発明の態様においては、前記減炭工程が、前記脂肪酸を転移反応させることを含んでなることが好ましい。
【００１０】
本発明の態様においては、前記転移反応が、ホフマン転移反応、シュミット転移反応またはクルチウス転移反応を含んでなることが好ましい。
【００１１】
本発明の態様においては、前記転移反応が、クルチウス転移反応であることが好ましい。
【００１２】
本発明の態様においては、前記同位体標識化合物は、前記脂肪酸のカルボキシル基中の炭素原子および／または前記カルボキシル基と結合するメチレン基中の水素が、１３炭素（１３Ｃ）または１４炭素（１４Ｃ）、および重水素（２Ｈ）または三重水素（３Ｈ）によりそれぞれ標識された化合物であることが好ましい。
【００１３】
本発明の態様においては、前記同位体標識化合物中の二重結合における立体配置と、前記脂肪酸中の二重結合における立体配置とが同一であることが好ましい。
【００１４】
本発明の態様においては、前記同位体標識化合物の分子量が、前記脂肪酸の分子量より２以上大きいことが好ましい。
【００１５】
本発明の態様においては、前記減炭工程により、前記脂肪酸より炭素数が１少ない脂肪酸が得られることが好ましい。
【００１６】
本発明の態様においては、前記脂肪酸が、天然物由来の脂肪酸であることが好ましい。
【００１７】
本発明の態様においては、前記減炭工程が、転移反応により得られた化合物をアミノ化させる反応を含むことが好ましい。
【００１８】
本発明の態様においては、前記減炭工程が、前記アミノ化反応により得られた化合物をアルデヒド化させる反応を含むことが好ましい。
【００１９】
本発明の態様においては、前記減炭工程が、前記アルデヒド化反応により得られた化合物を酸化させる反応を含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記酸化反応により得られた化合物をエステル化させる反応を含むことが好ましい。
【００２１】
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記エステル化反応により得られた化合物を還元剤により還元させる反応を含むことが好ましい。
【００２２】
本発明の態様においては、前記還元剤が、重ヒドリドイオンが発生する還元剤であることが好ましい。
【００２３】
本発明の態様においては、前記還元剤が、重水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＤ）または重水素化ホウ酸ナトリウムであることが好ましい。
【００２４】
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記還元反応により得られた化合物をハロゲン化させる反応を含むことが好ましい。
【００２５】
本発明の態様においては、前記増炭工程が、前記ハロゲン化反応により得られた化合物をマグネシウムおよび二酸化炭素と反応させることを含むことが好ましい。
【００２６】
本発明の態様においては、前記二酸化炭素が、１３ＣＯ２または１４ＣＯ２であることが好ましい。
【００２７】
本発明による脂肪酸の同位体標識化合物は、上記方法により得られたことを特徴とする。
【００２８】
本発明による診断薬は、上記方法により得られた脂肪酸の同位体標識化合物を含んでなることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、出発物質である脂肪酸中の二重結合の立体配置と同一の二重結合の立体配置を有する同位体標識化合物を得ることができる。すなわち、出発物質として脂肪酸中の二重結合が全てｃｉｓ結合であるものを用いた場合、二重結合が全てｃｉｓ結合である脂肪酸の同位体標識化合物を得ることができ、二重結合の全部または一部がｔｒａｎｓ結合へ変化してしまうことを防止することができる。よって。本発明によれば、天然物由来の脂肪酸そのものへの同位体によるラベル（標識）化が可能となり、脂質ないし脂肪酸
代謝研究を含む診断技術、生化学ないし生理学分野においてすこぶる有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、脂肪酸の同位体標識化合物の合成フローチャートを表す。
【図２】図２は、転移反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図３】図３は、アミノ化反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図４】図４は、アルデヒド化反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図５】図５は、酸化反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図６】図６は、エステル化反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図７】図７は、メチルエステル化反応により得られた化合物のマススペクトルを表す。
【図８】図８は、還元反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図９】図９は、ハロゲン化反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図１０】図１０は、酸化反応の進行を確認したＴＬＣプレートを表す。
【図１１】図１１は、出発物質である脂肪酸と、その脂肪酸の同位体標識化合物のクロマトグラムを表す。
【図１２】図１２は、出発物質である脂肪酸と、その脂肪酸の同位体標識化合物のマススペクトルを表す。
【図１３】図１３は、脂肪酸の同位体標識化合物の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図１４】図１４は、出発物質である脂肪酸の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書において、配合を示す「部」、「％」、「比」などは特に断らない限り重量基準である。
【００３２】
本発明による脂肪酸の同位体標識化合物を製造する方法は、図１に示されるように脂肪酸を出発物質とし、脂肪酸の減炭工程と、それに続く増炭工程とを含んでなることを特徴とする。以下、本発明を構成する工程について説明する。
【００３３】
＜減炭工程＞
減炭工程は、脂肪酸の転移反応を含んでなることが好ましい。より具体的には、ホフマン転移反応、シュミット転移反応またはクルチウス転移反応を含んでなることが好ましく、これらの中でも、短時間で反応が進行するという理由からクルチウス転移反応が好ましい。脂肪酸をクルチウス転移反応させることにより、下記化学式（１）に示されるように、出発物質である脂肪酸に比べ、炭素数が１少ないイソシアネート化合物を得ることができる。下記式（１）にも示される通り、クルチウス転移反応は、脂肪酸とジフェニルホスホリルアジドとを反応させ、加熱することにより、行うことができるが、このときの加熱温度としては、２０〜８０℃であることが好ましく、６０〜８０℃であることがより好ましい。加熱温度が上記数値範囲内であれば、不純物の生成が抑制される。なお、より高純度のイソシアネート化合物を得るため、クルチウス転移反応後、フラッシュカラムなどを用いて精製を行うことが好ましい。また、出発物質である脂肪酸は、天然物由来の脂肪酸であることが好ましい。
【化１】
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【００３４】
減炭工程は、上記のようにして得られたイソシアネート化合物をアミノ化させる反応を含んでなることが好ましい。例えば、下記化学式（２）に示されるように、イソシアネート化合物を水と反応させ、加熱させることにより、イソシアネート化合物をアミノ化することができる。このときの加熱温度としては、２０〜８５℃であることが好ましく、６０〜８５℃であることがより好ましい。加熱温度が上記数値範囲内であれば、尿素化合物の生成を抑制し、アミン体の収率を向上させることができる。なお、クルチウス転移反応において水を介在させることにより、アミノ化させる反応をクルチウス転移反応と同時に行うことができるが、フラッシュカラムなどを用いた精製を行うことができなくなる。高純度なアミン化合物を得るため、クルチウス転移反応とアミノ化反応を分けて行うことが好ましい。
【化２】
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【００３５】
減炭工程は、上記のようにして得られたアミン化合物をアルデヒド化させる反応を含んでなることが好ましい。例えば、下記化学式（３）に示されるように、アミン化合物を４−ホルミル−１−メチルピリジニウムベンゼンスルホン酸塩（ＦＭＰＢＳ）と反応させ、シッフ塩基とした後、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）などの塩基を反応させ、シッフ塩基中の二重結合の位置を転移させた後、加水分解することにより、アミン化合物をアルデヒド化することができる。
【化３】
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【００３６】
減炭工程は、上記のようにして得られたアルデヒド化合物を酸化させる反応を含んでなることが好ましい。アルデヒド化合物の酸化は、クロムなどの重金属を利用して行うこともできるが、官能基選択性が高く、反応速度も高いことから、下記化学式（４）に示されるように、Ｐｉｎｎｉｃｋ酸化により酸化反応を行うことが好ましい。アルデヒド化合物を酸化することにより、出発物質である脂肪酸に比べ、炭素数が１少ない脂肪酸が得られる。このときの反応温度としては、室温で行い、反応終了を確認後、直ちに後処理（有機層の酸水洗や水洗）をすることが好ましい。反応終了後、直ちに後処理をすることにより副反応を抑制することができ、収率を向上することができる。
【化４】
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【００３７】
＜増炭工程＞
増炭工程は、上記のようにして出発物質である脂肪酸に比べ、炭素数が１少ない脂肪酸をエステル化させる反応を含んでなることが好ましい。脂肪酸のエステル化は、酸性触媒下、過剰のアルコール中において、脂肪酸を酸化することにより行うことができる。アルコールとしては、メタノール、エタノール等の短鎖アルコールを使用することができ、これらの中でも、次工程の還元反応の後処理時に除去しやすいという理由から、メタノールが好ましい。例えば、下記化学式（５）に示されるように、脂肪酸を酸性触媒下、過剰のメタノール中において加熱することにより、脂肪酸をメチルエステル化することができる。このときの加熱温度としては、２０〜６５℃であることが好ましく、５０〜６５℃であることがより好ましい。加熱温度が上記数値範囲内であれば、エステル化反応が速やかに進行し、副反応が抑制することができ、収率を向上させることができる。また、この平衡反応のため加えるアルコールの量は、脂肪酸１重量部に対して、１０重量部であることが好ましい。
【化５】
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【００３８】
増炭工程は、上記のようにして得られたエステル化合物を還元剤により還元させる反応を含んでなることが好ましい。還元剤としては、例えば、重水素化リチウムアルミニウム（ＬＡＤ）、重水素化ホウ酸ナトリウムなどのような重ヒドリドイオンが発生する還元剤が挙げられる。下記化学式（６）に示されるように、還元剤としてＬＡＤを使用した場合、メチレン基および水酸基中の水素が、重水素（２Ｈ）により標識されたアルコール化合物を得ることができる。
【化６】
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【００３９】
増炭工程は、上記のようにして得られたアルコール化合物をハロゲン化させる反応を含んでなることが好ましい。アルコール化合物のハロゲン化は、例えば、下記化学式（７）に示されるように、ジブロモトリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３Ｂｒ２）を用いて行うことができ、この方法によれば、高収率で、臭化アルキル化合物を得ることができる。アルコール化合物のハロゲン化は、ＰＰｈ３Ｂｒ２以外にもＰＰｈ３／ＣＢｒ４や１，４−ジオキサン-臭素錯体などを用いて行うことができる。
【化７】
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【００４０】
増炭工程は、上記のようにして得られたハロゲン化アルキル化合物をマグネシウムと反応させることにより、有機金属化合物を合成すること、およびこの有機金属化合物を二酸化炭素と反応させることを含んでなることが好ましい（カルボキシル化反応）。ここで、二酸化炭素として、１２ＣＯ２だけでなく、１３ＣＯ２や１４ＣＯ２も使用することができ、例えば、１３ＣＯ２を使用した場合、下記化学式（８）に示されるように、脂肪酸のカルボキシル基中の炭素原子が、１３炭素（１３Ｃ）により標識された脂肪酸であって、出発物質の脂肪酸の同位体標識化合物である脂肪酸が得られる。
【化８】
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【００４１】
＜同位体標識化合物＞
上記減炭工程および増炭工程を含む方法により得られる同位体標識化合物は、出発物質として用いた脂肪酸と、二重結合における立体配置が同一である。同位体標識化合物の分子量は、出発物質である脂肪酸の分子量より２以上大きいことが好ましく、３以上大きいことがより好ましい。同位体標識化合物の分子量が、出発物質である脂肪酸の分子量より２以上大きいことにより、アイソトープトレーサー法におけるトレーサーとして好適に使用することができる。
【００４２】
また、同位体標識化合物中が有するカルボキシル基中の炭素原子は、１３Ｃまたは１４Ｃにより標識されたものであることが好ましい。カルボキシル基中の炭素原子が標識されていることにより、診断薬として投与した後、体内における脂質代謝（β酸化）を容易に測定が可能となる。
【００４３】
出発物質として用いた脂肪酸の二重結合の立体配置と、その脂肪酸より得られた同位体標識化合物の二重結合の立体配置とが同一であるか否かは、例えば、１３Ｃ−ＮＭＲにより測定することができる。
【００４４】
また、同位体標識化合物の分子量が、出発物質である脂肪酸の分子量よりどの程度大きいかということは、質量分析法と核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）分光法により測定することができる。
【００４５】
＜診断薬＞
本発明による方法により得られた脂肪酸の同位体標識化合物は、診断薬に使用することができる。診断薬としては、例えば、脂質代謝診断薬、糖尿病診断薬またはペルオキシソーム病診断薬などが挙げられる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されるものではない。
【００４７】
＜減炭工程＞
（転移反応）
まず、４つ口フラスコに、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）１ｍｏｌを量り入れ、還流管および温度計を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内をアルゴンで置換した。アルゴンガス下で反応溶媒としてトルエンを加えた後、ジフェニルホスホリルアジド１．５ｍｏｌおよびトリエチルアミン２．５ｍｏｌを加え、８０℃まで加熱し３０分間の撹拌を行った。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いて反応の進行を確認後、ロータリーエバポレーターにて反応溶媒の除去を行った。イソシアネート化合物の収率は６４．０％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図２に表す。なお、本実施例においては、いずれの反応においても、ＴＬＣプレートとして、膜厚０．２５ｍｍのＳｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０ ＴＬＣ（５×１０ｃｍ、Ｍｅｒｃｋ（株）製）、展開溶媒として、ヘキサン／酢酸エチル（９／１（ｖ／ｖ））、検出試薬として、１０％リンモリブデン酸エタノール溶液を用いた。
【００４８】
次いで、反応中に生じた副生成物や未反応物を除去し、目的物であるイソシアネート化合物のみを得るためにフラッシュカラムでの精製を行った。移動相となる有機溶媒にシリカゲルを分散させた状態でクロマトカラム管に詰め、その上部から反応生成物を充填した。移動相を流しながら、一定間隔で流出液を採取し、ＴＬＣを用いて目的物の有無を確認後、イソシアネート化合物のみが含まれる流出液を集め、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去することでイソシアネート化合物を得た。以下にフラッシュカラムの条件を示す。
（フラッシュカラム条件）
・充填剤：ワコーシルＣ−３００（４０〜６４μｍ）（和光純薬工業（株）製）
・充填量：溶媒除去後の反応生成物の重量の１０〜２０倍程度
・移動相：ヘキサン/酢酸エチル=３０／１〜７／３（ｖ／ｖ）
（低極性移動相から高極性移動相へのグラジエント溶出）
【００４９】
（アミノ化反応）
４つ口フラスコに転移反応により合成したイソシアネート化合物０．０２ｍｏｌを入れ、還流管および温度計を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で加えたイソシアネート化合物の重量の約１０倍程度の１０％硫酸水溶液を加え、８５℃で１時間の撹拌を行った。ＴＬＣを用いて反応の進行を確認後、室温まで冷却し、２８％アンモニア水溶液を加え、反応液の液性を塩基性にした。その後、反応液を分液漏斗に移し、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。アミン化合物の収率は９７．７％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図３に表す。
【００５０】
（アルデヒド化反応）
４つ口フラスコに、アミノ化反応により合成したアミン化合物１ｍｏｌを量り入れ、還流管および温度計を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒としてジクロロメタン（ＤＣＭ）とＦＭＰＢＳ１．２ｍｏｌを加えた後、５０℃で２．５時間の還流を行った。その後、ＤＢＵ１．０５ｍｏｌを加え、４０℃で３０分の還流を行った後、ｐ−トルエンスルホン酸１水和物１．７ｍｏｌを加え、４０℃で３０分間の還流を行った。この還流中にＴＬＣを用いて反応の進行の確認を行った。続いてロータリーエバポレーターを用いて溶媒を除去し、フラッシュカラムによる精製を行った。なお、精製条件は上記したものと同様とした。ＴＬＣによる合成確認の結果を図４に表す。
【００５１】
（酸化反応）
４つ口フラスコに、アルデヒド化反応により合成したアルデヒド化合物１ｍｏｌを量り入れ、還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒として、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール／水（４／３（ｖ／ｖ））を加えた後、２−メチル−２−ブテン３０ｍｏｌを加えた。その後、若干量の水に溶解させたリン酸二水素ナトリウム２ｍｏｌおよび亜塩素酸ナトリウム４ｍｏｌを加え、室温で３０分間撹拌した。ＴＬＣを用いて反応の進行を確認後、１０％硫酸水溶液を加え、反応液の液性を酸性にした。次に、反応液を分液漏斗に移し、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。このようにして得られた脂肪酸はＥＰＡと比べ、炭素数が１少ない脂肪酸であり、その収率は８０．３％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図５に表す。
【００５２】
＜増炭工程＞
（エステル化反応）
４つ口フラスコに、酸化反応で合成した脂肪酸２．９ｍｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下でメタノール／硫酸（１００／１）を脂肪酸の重量の１０倍程度加え、６５℃で１時間の加熱還流を行い、ＴＬＣを用いて反応の進行およびメチルエステル化合物の合成を確認した。
【００５３】
その後、室温まで冷却を行い、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、反応液の液性を中性にした。次に、反応液を分液漏斗に移し、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。メチルエステル化合物の収率は９１．１％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図６に表す。
【００５４】
また、ガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）によるメチルエステル化合物の合成確認を行った（図７参照）。図７からも明らかなように、脂肪酸から合成したメチルエステル化合物に相当する分子イオンピークが確認された。
（ＧＣ−ＭＳ分析条件）
・分析機器：ＴＲＡＣＥ  ＧＣ  Ｕｌｔｒａ
（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）
・質量分析計：ＩＴＱ １１００
（サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製）
・カラム：ＩｎｅｒｔＣａｐ Ｐｕｒｅ−ＷＡＸ（３０ｍ×０．２５ｍｍｉ．ｄ．、膜厚０．２５μｍ）（ジーエルサイエンス（株）製）
・キャリアーガス：Ｈｅ（１．０ｍｌ／ｍｉｎ）
・試薬ガス：メタン
・カラム温度：１５０〜２５０℃
（８０℃で３分間保持、昇温１０℃／ｍｉｎで１５０℃まで、昇温２０／ｍｉｎで２５０℃まで、２５０℃で１５分間保持）
・注入口温度：２５０℃
・注入方法：スプリットモード（スプリット比１００：１）
・注入量：１μｌ
・イオン化方法：化学イオン化法
【００５５】
（還元反応）
４つ口フラスコにＬＡＤ１．０５ｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒としてテトラヒドラフラン（ＴＨＦ）を加えた後、滴下漏斗を用いて、エステル化反応で合成しメチルエステル化合物１ｍｏｌを加えた。室温で２時間の撹拌を行い、反応の進行をＴＬＣにて確認した後、酢酸エチルを加え、反応を終息させた。次に１０％硫酸水溶液を加え、反応液を分液漏斗に移した。ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後にフラッシュカラムによる精製を行った。アルコール化合物の収率は９６．８％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図８に表す。
【００５６】
（ハロゲン化反応）
４つ口フラスコにトリフェニルホスフィン１．５ｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた後に真空ポンプを利用し、フラスコ内のアルゴン置換を行った。アルゴンガス下で反応溶媒としてＤＣＭを加え後、臭素１．３ｍｏｌを加え、１時間室温で撹拌を行った。次に、ピリジン１．６ｍｏｌおよびアセトニトリル１．６ｍｏｌを加えた後、アルコール化反応で合成したアルコール化合物１ｍｏｌを滴下漏斗を用いて加えた。その後、２時間室温で撹拌した後、ＴＬＣにて反応の進行を確認し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒の除去を行った。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。臭化アルキル化合物の収率は６４．０％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図９に表す。
【００５７】
（カルボキシル化反応）
４つ口フラスコにマグネシウム１．３ｍｏｌを量り入れ、温度計および還流管を取り付けた。真空ポンプを利用し、フラスコ内を減圧状態にするとともに、ヒートガンを用いてフラスコを加熱し、マグネシウムおよびフラスコ内の乾燥を行った。マグネシウム片が乾燥し、フラスコの壁面に付着しないようになったら、フラスコ内のアルゴン置換を行い、アルゴンガス下で反応溶媒としてＴＨＦ、マグネシウムの活性剤としてヨウ素１片、１，２−ジブロモエタン０．１５ｍｏｌを加えた。ヨウ素の色が消えるまで１０分程度室温で撹拌した後、滴下漏斗を用いて、ハロゲン化反応で合成した臭化アルキル化合物１ｍｏｌを加え、室温で２時間撹拌した。
【００５８】
その後、反応液を１０℃程度まで冷却し、１３ＣＯ２を反応液中に吹き込み、室温で２時間の撹拌を行った。次に１０％硫酸水溶液を加え、反応液を分液漏斗に移した。次いで、ヘキサンにて水層から３回抽出を行い、有機層をまとめた。飽和食塩水を用い、液性が中性になるまで有機層の洗浄を行い、無水硫酸ナトリウムを用いて、有機層の脱水を行った後、ロータリーエバポレーターで溶媒を除去した。最後に上記した条件と同様の条件にてフラッシュカラムによる精製を行った。脂肪酸の収率は４１．７％であった。ＴＬＣによる合成確認の結果を図１０に表す。
【００５９】
得られた脂肪酸の構造を質量分析法と核磁気共鳴（１３Ｃ−ＮＭＲ）分光法により確認した。
【００６０】
（質量分析法）
カルボキシル化反応により得られた脂肪酸約１０ｍｇをねじ口試験管に量り入れ、１４％ ３フッ化ホウ素／メタノール溶液２ｍＬを加え、ボルテックスミキサーで激しく混ぜた。１００℃で３０秒間加熱し、室温に戻るまで静置した。そして、ヘキサン１ｍＬ及び飽和食塩水５ｍＬを加えてボルテックスミキサーで激しく混ぜ、有機層を分析用試料としてＧＣ−ＭＳに供した。また、比較用として、出発物質として用いたＥＰＡの分析も行った。その結果を、クロマトグラムおよびマススペクトルにてそれぞれ図１１および１２に表す。図１１から、脂肪酸と、出発物質であるＥＰＡは同じ保持時間でピークが出現しており、これらは同様の構造を有していることが確認された。また、図１２から、脂肪酸では、ＥＰＡより３大きい分子イオンピークが確認され、また、両者のフラグメンテーションパターンが同様であること確認された。これらの結果から、ＥＰＡより分子量が３大きい同位体標識化合物が製造されたことが確認できた。なお、ＧＣ−ＭＳ分析条件は上記したものと同様の条件とした。
【００６１】
（１３Ｃ−ＮＭＲ分光法）
カルボキシル化反応により得られた脂肪酸２０ｍＬ、出発物質であるＥＰＡ２０ｍＬを、それぞれ別の重クロロホルム溶液に溶解させ、ＮＭＲ分析計に供し、吸収スペクトルを下記条件にて測定した。測定結果をそれぞれ図１３および１４に表す。図１３と図１４を比較すると、ほぼ同様のＮＭＲスペクトルとなっているものの、図１３では、重水素（２Ｈ）の導入に起因すると考えられる、３３ｐｐｍ付近のシグナルスピリット、および１３炭素（１３Ｃ）の導入に起因すると考えられる１８０ｐｐｍ付近のシグナル強度の増加が確認された。このことから、脂肪酸のカルボキシル基中の炭素原子が、１３炭素（１３Ｃ）により、カルボキシル基と結合するメチレン基中の水素が重水素（２Ｈ）により標識されたＥＰＡより分子量が３大きい同位体標識化合物が製造されたことが確認できた。また、ＣＨ＝ＣＨ由来の9本のシグナル近傍にトランス由来のシグナルが観察されなかったために全ての二重結合がシス体であることが確認された。
（ＮＭＲ分析条件）
・機器名：ＥＣＡ  ５００ＭＨｚ  ＦＴ−ＮＭＲ（日本電子株式会社製）
・ＮＭＲデータ処理ソフトウエアー：Ｄｅｌｔａ  ＮＭＲ  ｓｏｆｔｗａｒｅ
・測定方法：１３Ｃ−ＮＭＲ（標準設定値）
・使用溶媒：重クロロホルム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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