(57)【要約】      （修正有）【課題】検体中のエボラウイルスの迅速簡易検出のためのラマン分光検出方法を提供する。【解決手段】プラズモン金属錯体水溶液中にエボラウイルス抗原から作成したエボラウイルス抗体を添加し、これをプラズモン金属錯体の還元電位近傍の電極電位を示す金属基板上に滴下してプラズモン金属錯体と上記抗体とが複合化した量子結晶を析出させて抗体を固相化し、該固相化抗体上に被検者の体液または組織、たとえば唾液をそのまま塗布又は不活性化して滴下してエボラウイルス抗原またはその関連物質（核蛋白）を結合させ、レーザーを照射して微量のエボラウイルス関連捕獲ラマンスペクトルを検出する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体を含むエボラウイルス抗原から作成されたモノクロールまたはポリクロール抗体（以下エボラウイルス抗体）を５００〜２０００ｐｐｍ濃度のプラズモン金属錯体水溶液中に添加し、プラズモン金属錯体とエボラウイルス抗体との複合水溶液を準備する工程と、
b）エボラウイルス抗体を含むプラズモン金属錯体溶液をプラズモン金属錯体の還元電位近傍の電極電位を有する金属基板上に滴下して抗体が結合したプラズモン金属錯体量子結晶を凝集させてエボラウイルス抗体を固相化したエボラウイルス抗体固相化基板を用意する工程と、
c）該基板上で被検体の体液または組織をそのまままたは不活性化して接触させ、前記エボラウイルス抗原またはその関連物質を捕獲させる工程と、
d）前記エボラウイルス抗原またはその関連物質を捕獲した固相化結晶にレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得る工程、を含むことを特徴とするエボラウイルスのラマン分光検出方法。
【請求項２】
エボラウイルス抗体が抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体であって、上記ｂ）工程では上記複合水溶液をプラズモン金属錯塩の酸化還元電位より卑なる電極電位を有する金属基板上に滴下して抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体と共にプラズモン金属量子結晶を金属基板上に凝集させ、被検体の核蛋白を捕獲してそれをラマン分光に付する請求項１記載のエボラウイルス抗原のラマン分光測定方法。
【請求項３】
エボラウイルス抗体とともにチオ硫酸銀錯体の量子結晶を銅合金基板上に凝集させてプラズモン金属量子結晶の凝集域をエボラウイルス抗体でコートして金属表面上に形成し、固相化したことを特徴とするエボラウイルス抗体固相化基板。
【請求項４】
エボラウイルス抗体が抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体であって、エボラウイルス抗原として検体の核蛋白を捕獲することを特徴とする請求項３記載のエボラウイルス抗体固相化基板。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エボラウイルス抗原のラマン分光を利用する新規測定方法に関するものであり、簡素化された操作により検体中のエボラウイルス抗原を迅速に測定する方法及びそれに用いるエボラウイルス抗体固相化基板に関する。
【背景技術】
【０００２】
エボラ出血熱はフィロウイルス科エボラウイルスによる感染症で、その致死率は50〜90％と非常に高い。自然宿主は不明で、ワクチン・治療薬もない。これまでアフリカのガボン、スーダン、コンゴ共和国（旧ザイール）、象牙海岸、ウガンダで流行がみられ、非流行地での発生は、ガボンから南アフリカへ移動した医師の発症（死亡）例があるに過ぎない。2007年には、新種のエボラウイルス（ブンディブギョエボラウイルス）がウガンダで分離され、また、2008年フィリピンの養豚施設のブタに感染が流行し、同時期にヒトへの感染も確認されている。このように、エボラウイルスは、ヒトへの病原性の強さからレベル4 の病原体に分類されるにもかかわらず、その診断は、エボラウイルスの分離、RT-PCRによるゲノムの検出、ELISAによるウイルス抗原の検出、さらに蛍光抗体法あるいはELISAを用いた特異抗体の検出があるものの、実験室的で抜本的な方法でない。そのため、診断に当たっては、患者の本感染症の発生地であるガボン、スーダン、コンゴ共和国、象牙海岸、ウガンダまたはその周辺国へ旅行・滞在、あるいは熱帯雨林地域への立ち入りの有無を参考にしているが、自然宿主からヒトへの感染経路は不明であり、しかもヒトからヒトへの２次感染は血液、体液、排泄物等との直接接触によるものとされ、アフリカでの大流行の感染の拡大を留めるには、まずもって迅速な検査方法が求められる。しかしながら、現在のところ感染性のあるエボラウイルスの取り扱いが認められていないので、血清学的診断のための抗原の作製にエボラウイルスを用いることができない。そこで組換え核蛋白を抗原とした診断法として、今のところ迅速なウイルス感染の証明としてウイルス抗原検出ＥＬＩＳＡが広く利用されているが、国立感染症研究所のエボラ出血熱診断マニュアルによれば、ウイルス抗原検出ELISAの測定原理は以下のように、１．抗エボラウイルス核淡白モノクロール抗体をコートしたプレートで患者材料（血清、組織乳剤）中の核蛋白を捕獲し、２．核蛋白ウサギポリクロール抗体を捕獲された核蛋白を反応させ、３．反応したウサギ抗体を、酵素標識した抗ウサギIgG抗体で検出し、４．酵素に対する発色基質を加えて、捕獲された核蛋白を発色により検出する方法を採用している（非特許文献１）。 
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】エボラ出血熱診断マニュアル：国立感染症研究所  平成２４年３月発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ウイルス抗原検出ELISAの測定は迅速とはいっても、その操作は煩雑であるだけでなく、検査を行えるのは国立感染症研究所等に限られており、長時間を要するという難点がある。したがって、現状ではそのため、飛行場、税関等での迅速な検出が望まれる場所での検疫は不可能である。それだけでなく、かなりのウイルス量とならなければ検出できないという最大の問題がある。そこで、患者の体液、たとえば検体が唾液であって、ウイルスがごく微量であっても、検出可能な簡易迅速測定法の提供が望まれる。そこで、本発明者らは、従来のエボラウイルス抗原検出ELISAの測定の問題点を改善し、少ない検体であっても、微量のエボラウイルス抗原の迅速な測定を可能とする方法を提供することを目的とし、鋭意研究の結果、測定方法を抜本的変更する必要があることに着目した。その結果、ラマン分光法の利用が適切と見込まれるが、表面プラズモン増強作用を利用してエボラウイルス抗体によるエボラウイルス抗原との反応を検出するにはプラズモン増強効果を発揮する金属微粒子上に如何にして抗体を結合させるか、抗体が金属微粒子に結合または吸着しても抗体とエボラウイルス抗原との反応がラマン分光で検出できるかが問題であった。ところが、銀錯塩を代表とするプラズモン金属錯体の水溶液にウイルス抗体を溶解し、金属表面で金属微粒子（量子結晶）を形成させると、該微粒子の表面には抗体の核蛋白が集積しており、微量エボラウイルス抗原の検出がラマンスペクトル測定により可能なことを見出し、本発明を完成させた。
【０００５】
本発明は、a)抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体を含むエボラウイルス抗原から作成されたモノクロールまたはポリクロール抗体（以下エボラウイルス抗体）を５００〜２０００ｐｐｍ濃度のプラズモン金属錯体水溶液中に添加し、プラズモン金属錯体とエボラウイルス抗体との複合水溶液を準備する工程と、
b）エボラウイルス抗体を含むプラズモン金属錯体溶液をプラズモン金属錯体の還元電位近傍の電極電位を有する金属基板上に滴下して抗体が結合したプラズモン金属錯体量子結晶を凝集させてエボラウイルス抗体を固相化したエボラウイルス抗体固相化基板を用意する工程と、
c）該基板上で被検体の体液または組織をそのまままたは不活性化して接触させ、前記エボラウイルス抗原またはその関連物質を捕獲させる工程と、
d）前記エボラウイルス抗原またはその関連物質を捕獲した固相化結晶にレーザービームを照射し、表面増強ラマン散乱スペクトルを得る工程、を含むことを特徴とするエボラウイルスのラマン分光検出方法にある。
【０００６】
本発明において、エボラウイルス抗体としては抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体を用いるのが好ましい。これにより上記ｂ）工程では上記複合水溶液をプラズモン金属錯塩の酸化還元電位より卑なる電極電位を有する金属基板上に滴下して抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体と共にプラズモン金属量子結晶を金属基板上に凝集させ、被検体の核蛋白を捕獲することができる。
【０００７】
本発明においては、エボラウイルス抗体とともにチオ硫酸銀錯体の量子結晶を銅合金基板上に凝集させてプラズモン金属量子結晶の凝集域を抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体でコートして金属表面上に形成し、固相化したエボラウイルス抗体固相化基板を提供することができる。特に、エボラウイルス抗体が抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体であって、エボラウイルス抗原として検体の核蛋白を捕獲することができるので、この核蛋白を検出してもよいが、さらにこの核蛋白に抗核蛋白ウサギポリクロール抗体を反応させ、これをラマン分光で検出してもよい。さらにまた、反応したウサギ抗体を酵素標識した抗ウサギIgG抗体で検出し、これにラマン分光で検出し、患者材料（血清、組織乳剤）中の核蛋白である確認検査とすることができる。
【０００８】
上記ａ）工程はプラズモン金属錯塩を含有する水溶液は５００〜２０００ｐｐｍの範囲で、エボラウイルス抗体に混合し、プラズモン金属錯塩水溶液をプラズモン金属錯塩水溶液で希釈することによって行なわれるのが好ましい。
上記ｂ）工程は上記混合水溶液をプラズモン金属錯塩の酸化還元電位より卑なる電極電位を有する金属基板上に滴下してエボラウイルス抗体と共にプラズモン金属量子結晶を金属基板上に凝集させることにより行なわれるのが好ましい。
上記ｃ）及びｄ）工程は金属基板上にエボラウイルス抗体とともにプラズモン金属量子結晶を凝集した領域にエボラウイルス抗原を含有する水溶液を滴下してエボラウイルス抗体とエボラウイルス抗原とを水溶液中で反応させつつ、又は反応させた後反応領域にレーザービームを照射して表面増強ラマン光を得、それによりエボラウイルス抗原を検出することにより行なわれるのが好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、従来法に比して簡易かつ安価に微量のエボラウイルス抗原またはその関連物質（たとえば核蛋白）が測定できる。すなわち、従来実施されているウイルス抗原検出ELISAの比色分析法によるエボラウイルス抗原測定に比して簡易なラマン分光操作で、エボラウイルス抗原を測定することができ、測定時間は１／１０以下の数分と迅速に測定結果が得られる。なお、本発明において、プラズモン金属はパラジウム、プラチナ、金、銀、及び銅からなる群から選ばれる一種である。また、本発明によれば、本発明方法を容易に実施できるラマン分光用測定基板が提供され、エボラウイルス抗体と結合したプラズモン金属量子結晶の凝集域を金属表面上に形成したことを特徴とする。本発明において、プラズモン金属量子結晶はチオ硫酸銀錯体量子結晶であって、粒径１０〜５００ｎｍの六角板状結晶であるのが好ましい。また、前記金属基板は銅合金であるのが好ましく、特に銅、リン、錫を主要構成成分とするリン青銅板が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】金属板表面に作製されたエボラウイルス抗原測定用器具の電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明において、重要な技術はプラズモン金属錯体水溶液が好ましくは５００〜２０００ｐｐｍという希薄な領域であって、錯体の安定度定数と相関するその酸化還元電位の近傍で選ばれた担体金属が平衡電位より卑なる電極電位を有する場合に、その希薄なプラズモン金属錯体水溶液から析出する結晶がプラズモン金属錯体であって、プラズモン増強効果のあるナノ金属的性質を有する一方、水中でエボラウイルス抗体が吸着しやすい電荷を有するため、被検体がプラズモン増強を受けるに必要な電荷移動錯体を容易に形成することにある。
【００１２】
本発明では、プラズモン金属錯体溶液から担体金属上に析出させた金属錯体量子結晶にエボラウイルス抗体を固定し、これにエボラウイルス抗原（または核蛋白）を結合させ、形成された多数個のホットスポットより、表面増強ラマン散乱スペクトルを利用してエボラウイルス抗原またはその関連物質を検出することを特徴する。
【００１３】
量子結晶は図１に示すように、イオン濃度が１０００ｐｐｍのチオ硫酸銀錯体水溶液の場合、リン青銅板上に滴下して３分間放置すると１００ｎｍ前後の六角柱状に形成され、各六角柱状の量子結晶は数ｎｍオーダの凹凸を持つことがＳＥＭ像から確認された。金属ナノ結晶に特有のファセットは確認できず、ＥＤＳ元素分析で銀及び錯体配位子由来の元素を検出されたため、全体は銀錯体のナノ結晶であって、その表面に現れる凹凸は錯体中の銀がクラスタとして量子ドットを形成して広がっていると推測される。
本発明の銀錯体量子結晶を作成するためには１）錯体水溶液が５００〜２０００ｐｐｍという希薄な領域であること、２）金属錯体水溶液の平衡電位に対し担持金属の電極電位がわずかに卑であること、３）電極電位差で金属錯体が凝集させることが重要であると思われる。
【００１４】
本発明におけるプラズモン金属は、特に金、銀、プラチナまたはパラジウムから選ばれるのが好ましい。
【００１５】
本発明で言う検体とは、エボラウイルス抗原測定の対象となる体液または組織であれば、特に限定されるものではなく、患者からの採取が容易な唾液、尿、汗などが挙げられる。検体が唾液、尿、汗、血清である場合、特に血清である場合はTritonX-100を最終濃度が１％になるように加え、混和する。TritonX-100を加えることはウイルスを不活性化するだけでなくウイルス粒子中の核蛋白を粒子外に放出して測定準備するために必要である。処理した検体はブロッキングが終了するまで４℃で保存する。使用時には希釈バッファーで５倍希釈して用いるのがよい。
【００１６】
エボラウイルス抗体は精製抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体（国立感染症研究所ウイルス第１部外来性ウイルス室にて培養上清もしくはマウス復水より精製したクローン３−３D）を使用し、これを量子結晶上にコートして検体中の核蛋白を捕獲するのがよい。
【００１７】
採取した検体液を金属表面の微粒子に所定量接触させ、速やかにラマンスペクトル測定を開始することにより、エボラウイルス抗原またはその核蛋白を測定することが出来る。
【実施例１】
【００１８】
以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
１．標準エボラウイルス抗体の水溶液調製
エボラウイルス抗体として精製抗エボラウイルス核蛋白モノクロール抗体（クローン３−３D）を１μｇ/mlにPBS（−）で希釈し、調製する。
２．エボラウイルス抗原測定器具の作製
エボラウイルス抗体０．２ｍｌに塩化銀に対しチオ硫酸ナトリウムが２以上５倍迄の混合溶液を等量添加し、リン青銅合金板に滴下し、室温で３分間静置したのちに水溶液を除去し、エボラウイルス抗原測定器具を作製する。
３．エボラウイルス抗原の測定
測定器具に検体をそのまま、または希釈して塗布する。検体が血清である場合はTritonX-100を最終濃度が１％になるように加え混和することが推奨される。６３３又は、７８５ｎｍのレーザ光を照射してラマンスペクトルを測定しスペクトル強度の経時的変化を追跡する。通常、時間経過とともにピークは大きくなる。エボラウイルス抗体量を変化させて測定器具を作製し、標準エボラウイルス抗原濃度の異なる検体液でスペクトル強度の変化を測定することにより最適な組み合わせを検討するのがよい。
【実施例２】
【００１９】
測定用器具の作製
塩化銀試薬の濃度が９．１ｍＭ、チオ硫酸ナトリウム試薬の濃度が塩化銀濃度の2以上3倍以下となる割合で蒸留水に投入し、完全に溶解するまで攪拌混合した。該水溶液は孔径０．２μｍのセルロースアセテートメンブランフィルターでろ過し、細菌や微少な不溶解物質を除去した。該硝酸銀-チオ硫酸水溶液０．２ｍｌをオートクレーブ滅菌したマイクロピペット（以下、マイクロピペット）で国立感染症研究所培養のエボラウイルス抗体（クローン３．３D ）をガラス容器に投入し、ボルテックスミキサーで攪拌した。該溶液０．０６ｍｌを直径が７ｍｍで円盤状の銅合金板の表面にマイクロピペットで滴下し、室温下で静置した。３分後に防塵スプレーの気化ガスを用いて溶液を除去し、エボラウイルス抗原測定用器具を作製した。図１に銅合金基板で作製した測定用器具の電子顕微鏡画像を示す。銅合金板には認められない六角形の結晶状微粒子が、該溶液の滴下と除去により形成される。
【実施例３】
【００２０】
標準エボラウイルス抗原を希釈バッファー３．４ｍｌをマイクロピペットで加えて溶解した後に、さらに希釈してエボラウイルス抗原水溶液を調製する。室温で該水溶液０．０６ｍｌをマイクロピペットで測定器具に滴下し、ラマン分光計に取り付けて７８５ｎｍまたは、６３３ｎｍのレーザ光を照射しラマン散乱スペクトルを測定する。続いて、１５分後、３０分後、６０分後、９０分後にラマン散乱スペクトルを測定する。ラマン散乱スペクトルは、測定器具のスペクトルピーク７８０ｃｍ-1と１０４５ｃｍ-1の主要ピークに加えてエボラウイルス特有の新しいピークが出現する。ピークの強度は時間の経過と共に高くなってくることから、該ピークがエボラウイルス抗原によるエボラウイルス抗体の反応によるものである。
【図１】
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