(57)【要約】      （修正有）【課題】迅速にかつ生体由来組織の特性を変化させることなく、多数の微小生体組織片を作製する装置及び化合物の高速スクリーニング方法を提供する。【解決手段】微小生体組織片の作製装置１００は、微小生体組織片の載置面を備える複数の微小チップ１と、前記複数の微小チップを所定間隔で配置し、保持する機構とを備える支持装置２と、操作装置３とを備える。並びに、生体組織に特異的に結合する化合物のスクリーニング方法は、前記作製装置を用いて微小生体組織片を作製する工程と、前記微小生体組織片を１以上の候補化合物と接触させる工程と、前記候補化合物の前記微小生体組織片に対する特異的結合を分析する工程とを少なくとも含む。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小生体組織片の載置面を備える複数の微小チップと、
前記複数の微小チップを支持する支持面と、前記複数の微小チップを前記支持面に所定間隔で配置し、保持する機構とを備える支持装置であって、前記支持面を貫通する孔が設けられている支持装置と、
前記支持装置の前記支持面と逆側の面から、前記孔に挿入可能な、複数の可動ピンを備えてなる操作装置と
を備える微小生体組織片の作製装置であって、
前記複数の微小チップが、前記支持面に配置された状態において、前記微小チップの複数の載置面が同一平面上にあり、前記可動ピンが前記複数の微小チップの少なくとも一部を前記同一平面に垂直な方向に移動可能である、微小生体組織片の作製装置。
【請求項２】
前記微小チップと、前記支持装置と、前記操作装置とが、分離可能である、請求項１に記載の微小生体組織片の作製装置。
【請求項３】
前記支持装置が、仕切板によって区切られた、前記微小チップを収容する複数のセルを備えるカセットであって、各セルの底部に少なくとも１つの孔が設けられているカセットである、請求項１または２に記載の微小生体組織片の作製装置。
【請求項４】
イメージング質量分析装置またはイメージング質量顕微鏡により測定する試料を作製するための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の微小生体組織片の作製装置。
【請求項５】
微小生体組織片の作製方法であって、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の微小生体組織片の作製装置の支持装置に、前記微小チップを配置する工程と、
前記複数の微小チップの前記載置面上に、前記複数の載置面を覆うように、生体組織薄片を載置する工程と、
前記複数の可動ピンを、前記支持装置の前記孔を通過させて、前記複数の微小チップの一部に接触させ、微小生体組織片を得る工程と
を含む方法。
【請求項６】
前記生体組織薄片が、凍結組織片である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生体組織薄片が、脳組織片またはがん組織片である、請求項６に記載の方法
【請求項８】
前記微小チップを載置する工程及び前記微小生体組織片を得る工程が、自動化されている、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
生体組織に特異的に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法により、微小チップに添付した微小生体組織片を作製する工程と、
反応用ウェルプレートにおいて、前記微小チップに添付した微小生体組織片を１以上の候補化合物と接触させる工程と、
前記候補化合物の前記微小生体組織片に対する特異的結合を分析する工程と
を含む、方法。
【請求項１０】
前記接触させる工程の後、前記反応用ウェルプレートから、前記微小チップに添付した微小生体組織片を分析用プレートに移動する工程をさらに含み、該工程が、病変組織由来の微小生体組織片と、正常組織由来の微小生体組織片とが隣り合うように、前記微小チップを配列させることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分析が、イメージング質量分析装置またはイメージング質量顕微鏡により実施される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記イメージング質量分析装置による分析法が、金属ナノ粒子を用いるマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触させる工程が、複数の候補化合物を同時に、単一の微小生体組織片に接触することを含み、
前記分析する工程が、前記複数の候補化合物の前記単一の微小生体組織片に対する特異的結合を同時に検出することを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微小生体組織片の作製装置、作製方法、及び化合物のスクリーニング方法に関する。本発明は、特には、生体内に近い状態で存在する病原性蛋白質凝集体に特異的に結合する１または複数の化合物の高速大量スクリーニングを可能とする微小生体組織片の作製装置、作製方法、及び化合物のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、種々の疾患の治療、予防、あるいは診断に有用な化合物を得るために、病原性蛋白凝集体に特異的に結合する化合物のスクリーニングが行われている。このようなスクリーニングにおいては、大腸菌等で生産した遺伝子組換え病原性蛋白から試験管内で人工的に作製した蛋白凝集体が用いられてきた一方、組織切片に一群の蛍光性化合物を添加して蛋白凝集体への結合する化合物を蛍光顕微鏡でスクリーニングする試みもある。
【０００３】
また、このようなスクリーニング方法に、生体由来組織から直接切り出した試料を用いる場合の、組織切片の調製方法が知られている。凍結組織切片から所望の小片を含む部分を切り出す方法としては、レーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ）法が知られている。かかる方法は、光学顕微鏡下で観察した組織標本から特定の領域にレーザーを照射することにより、特定の領域のみを切り出す技術として確立されている。
【０００４】
他には、パラフィン包埋組織切片あるいは凍結組織切片を複数の小切片に分割して取得する装置および方法が知られている（特許文献１を参照）。特許文献１は、主に顕微鏡観察を目的として、生体組織切片を分割可能なチップ基板に貼り付けた後、各チップを互いに平面方向に引き離すことにより切片を引き裂いて小切片とする技術である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／１４９００９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来行われてきた人工的に作製した蛋白凝集体を用いるスクリーニング方法においては、生体組織内と同じ構造を有する蛋白凝集体を試験管内で調製することは技術的に不可能である。すなわち、生体組織内に蓄積する病原性蛋白凝集体の多くは、酸化、リン酸化、糖化、ラセミ化など化学修飾を受けているが、このような構造体は人工的に作製することができなかった。そのため、生体内の凝集体に結合する化合物を見つけることは容易ではなかった。
【０００７】
生体から切り出した組織切片に蛍光性化合物を添加する方法においては、世の中に存在する４００万とも言われる化合物中で蛍光性を有するものは少数であり、スクリーニングに必要な化合物の多様性を確保できないという問題があった。
【０００８】
また、生体から組織切片を得る場合であっても、多数の組織切片をその本来の特性を維持したまま得る方法は確立されていない。すなわち、ＬＭＤ法は、同等の特性を備える生体サンプルを大量に得るための方法としては、時間及び手間の観点から、適していない。特許文献１に記載の生体組織の薄切片の分割方法では、高速スクリーニングを目的として、多数の薄切片を短時間で作製し、全ての薄切片を利用することを意図していないため、分割後の移動や取り扱い等の操作に支障がある。
【０００９】
生体組織内と同じ構造を維持する蛋白質凝集体に対して、特異的に結合する化合物を、大量に、かつ、高効率でスクリーニングするための、所定の特性を十分に保持した微小生体組織片を多数作製するために用いられる微小生体組織片の作製装置、作製方法、及び当該装置により作製された微小生体組織片を用いた、化合物のスクリーニング方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するために、迅速にかつ生体由来組織の特性を変化させることなく、多数の微小生体組織片を作製する装置に関する。さらには、本発明は、かかる装置により作製された多数の微小生体組織片を用いた、化合物の高速スクリーニング方法に関する。
【００１１】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、微小生体組織片の作製装置であって、微小生体組織片の載置面を備える複数の微小チップと、前記複数の微小チップを支持する支持面と、前記複数の微小チップを前記支持面に所定間隔で配置し、保持する機構とを備える支持装置であって、前記支持面を貫通する孔が設けられている支持装置と、前記支持装置の前記支持面と逆側の面から、前記孔に挿入可能な、複数の可動ピンを備えてなる操作装置とを備え、前記複数の微小チップが、前記支持面に配置された状態において、前記微小チップの複数の載置面が同一平面上にあり、前記可動ピンが前記複数の微小チップの少なくとも一部を前記同一平面に垂直な方向に移動可能である。
【００１２】
前記微小生体組織片の作製装置において、前記微小チップと、前記支持装置と、前記操作装置とが、分離可能であることが好ましい。
【００１３】
前記微小生体組織片の作製装置において、前記支持装置が、仕切板によって区切られた、前記微小チップを収容する複数のセルを備えるカセットであって、各セルの底部に少なくとも１つの孔が設けられているカセットであることが好ましい。また、前記カセットを備える微小生体組織片の作製装置において、前記仕切板が、前記底部から仕切板頂部に向かって、テーパー形状をなすことが好ましい。
【００１４】
前記微小生体組織片の作製装置が、イメージング質量分析装置またはイメージング質量顕微鏡により測定する試料を作製するためのものであることが好ましい。
【００１５】
本発明は、別の実施形態によれば、微小生体組織片の作製方法であって、前述のいずれかに記載の微小生体組織片の作製装置の支持装置に、前記微小チップを配置する工程と、前記複数の微小チップの前記載置面上に、前記複数の載置面を覆うように、生体組織薄片を載置する工程と、前記複数の可動ピンを、前記支持装置の前記孔を通過させて、前記複数の微小チップの一部に接触させ、微小生体組織片を得る工程とを含む。
【００１６】
前記微小生体組織片の作製方法において、前記生体組織薄片が、凍結組織片であることが好ましい。
【００１７】
前記微小生体組織片の作製方法において、前記生体組織薄片が、脳組織片またはがん組織片であることが好ましい。
【００１８】
前記微小生体組織片の作製方法において、前記微小チップを載置する工程及び前記微小生体組織片を得る工程が、自動化されていることが好ましい。
【００１９】
本発明は、また別の実施形態によれば、生体組織に特異的に結合する化合物のスクリーニング方法であって、前述のいずれか１に記載の方法により、微小チップに添付した微小生体組織片を作製する工程と、反応用ウェルプレートにおいて、前記微小チップに添付した微小生体組織片を１以上の候補化合物と接触させる工程と、前記候補化合物の前記微小生体組織片に対する特異的結合を分析する工程とを含む。
【００２０】
前記生体組織に特異的に結合する化合物のスクリーニング方法において、前記接触させる工程の後、前記反応用ウェルプレートから、前記微小チップに添付した微小生体組織片を分析用プレートに移動する工程をさらに含み、該工程が、病変組織由来の微小生体組織片と、正常組織由来の微小生体組織片とが隣り合うように、前記微小チップを配列させることが好ましい。
【００２１】
前記生体組織に特異的に結合する化合物のスクリーニング方法において、前記分析が、イメージング質量分析装置またはイメージング質量顕微鏡により実施されることが好ましい。
また、前記イメージング質量分析装置による分析法が、金属ナノ粒子を用いるマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法であることが好ましい。
【００２２】
前記生体組織に特異的に結合する化合物のスクリーニング方法において、前記接触させる工程が、複数の候補化合物を同時に、単一の微小生体組織片に接触することを含み、前記分析する工程が、前記複数の候補化合物の前記単一の微小生体組織片に対する特異的結合を同時に検出することを含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明に係る微小生体組織片の作製装置及び作製方法によれば、生体組織内の病原性蛋白凝集体の構造を維持したまま、迅速に、多数の微小生体組織片を得ることができる。また、この装置により作製された微小生体組織片及びイメージング質量分析装置などの分析装置を用いることで、多様な化学的性質を示す化合物群（化合物ライブラリ）の中から、脳組織やがん組織に存在する病原性蛋白質に特異的に結合する化合物を高速でスクリーニングすることができる。また、生体内に近い状態で存在する病原性蛋白質に特異的に結合する複数化合物の同時高速スクリーニングも可能となる。具体的にはアルツハイマー病やパーキンソン病等の神経変性疾患における病原性蛋白（タウ蛋白凝集体、αシヌクレイン凝集体（レビー小体）、TDP-43凝集体等） に親和性のある化合物のスクリーニングを可能とする。このため、各神経変性疾患の陽電子断層撮影（ＰＥＴ）用化合物（ＰＥＴトレーサー）の開発や、微小がんの診断用ＰＥＴトレーサーの開発にも有用である。このような装置及び方法についてはこれまでに報告がなく、神経変性疾患やがんの早期診断薬の開発、結果としてこれらの疾患に対する治療薬開発に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、本発明の第１実施形態に係る微小生体組織片の作製装置の斜視図を示す。
【図２】図２は、本発明の第１実施形態に係る微小生体組織片の作製装置を構成する支持装置の一例であるカセットを示し、（ａ）は、平面図を、（ｂ）は断面図を示す。
【図３】図３は、本発明の第１実施形態に係る微小生体組織片の作製装置の断面図を示す。
【図４】図４は、本発明の第１実施形態に係る微小生体組織片の作製装置の作動及び、かかる作製装置を用いた微小生体組織片の製造方法を説明する図である。
【図５】図５は、本発明の別の態様に係る微小生体組織片の作製装置を構成する真空ピンセット式の支持装置を示す概念的な斜視図であり、（ａ）は微小チップを載置しない状態の支持装置及び操作装置を、（ｂ）は微小チップを載置した支持装置及び操作装置を示す。
【図６】図６は、本発明の第２実施形態に係る化合物のスクリーニング方法において用いる反応用ウェルプレートの平面図である。
【図７】図７は、本発明の第２実施形態に係る化合物のスクリーニング方法における、カセット及び反応用ウェルプレートにおける、微小生体組織片を添付した微小チップの配置及び移動、ならびにこれらの移動を行うプログラムを模式的に説明する図である。
【図８】図８は、本発明の第２実施形態に係る化合物のスクリーニング方法における、解析形態及び用いる質量分析装置用プレートを模式的に説明する図である。
【図９】図９は、実施例で用いた凍結脳サンプルの免疫組織染色を示す光学顕微鏡写真であり、（ａ）は、アルツハイマー病(AD)脳（ADステージBraak VI）の前頭葉の抗タウAT8抗体の免疫組織染色写真であり、（ｂ）は、対照である正常脳（ADステージBraak 0.5）の前頭葉の抗タウAT8抗体の免疫組織染色写真であり、（ｃ）は、アルツハイマー病(AD)脳（ADステージBraak VI）の前頭葉の抗Aβ11-28抗体の免疫組織染色写真であり、（ｄ）は、対照である正常脳（ADステージBraak 0.5）の前頭葉の抗Aβ11-28抗体の免疫組織染色写真である。
【図１０】図１０は、アルツハイマー病脳組織に特異的に結合する化合物のイメージスクリーニング結果の陽性例を示す出力画面である。
【図１１】図１１は、アルツハイマー病脳組織に特異的に結合する化合物のイメージスクリーニング結果の陰性例を示す出力画面である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下に、本発明の実施の形態を説明する。ただし、本発明は、以下に説明する実施の形態によって限定されるものではない。
【００２６】
［第１実施形態：微小生体組織片の作製装置］
本発明は、第１実施形態によれば、微小生体組織片の作製装置であって、少なくとも、複数の微小チップと、複数の微小チップを支持する支持装置と、操作装置とから構成される。図１は、本発明に係る微小生体組織片の作製装置の一実施形態を示す模式的な斜視図である。図１において、微小生体組織片の作製装置１００は、これを構成する支持装置の一例であるカセット２に、微小チップ１のいくつかが、収容されている。本明細書において、微小生体組織片とは、本実施形態に係る作製装置で作製される結果物となる組織片であって、好ましくは、例えば、約１．０〜約３ｍｍ角で、厚みが約０．５μｍ〜約１００μｍの組織片である。一方、生体組織薄片とは、微小生体組織片に分割される前の生体組織の薄片であって、微小生体組織片と同じ厚みであり、約１５ｍｍ角程度の大きさを持つ薄片をいうものとする。
【００２７】
微小チップ１は、微小生体組織片が載置される、略均一な厚みの板状部材である。図１（ａ）に、カセット２に収容した状態の、（ｂ）にカセット２に収容されていない状態の、微小チップ１の模式的な斜視図を示す。微小チップ１は、微小生体組織片を載置する載置面１１を備える。載置面１１は、所望の微小生体組織片の形状と略同一の形状及び寸法を備える。好ましくは、載置面１１は、略正方形状であって、所望の微小生体組織片よりも、一辺の長さが、０．０３〜０．１５ｍｍ程度小さい。載置面１１は、図示するように、四隅１２の角が除去され、丸く加工されていてもよい。取扱い上、引っ掛かりを防止するため、及び微小チップ１のカセット２への着脱を自動化する場合に、医療用ロボットハンドによる取扱いを容易にするためである。微小チップ１の厚みは、微小生体組織片を支持することができ、かつ、医療用ロボットハンドによる操作が可能な範囲で適宜設計することができる。１つのカセット２に収容される複数の微小チップ１は、同一の形状及び寸法を備える。そして、微小チップ１は、図１（ａ）に示すように、その載置面１１が完全に露出した状態で、かつ複数の微小チップ１の全ての載置面１１が、略同一平面を構成するように、カセット２に収容される。
【００２８】
微小チップ１は、厚みが均一な板状部材から切り出すことにより製造することができる。板状部材としては、例えば、金属、ガラス、シリコン、プラスチックなどの任意の材料であってよいが、微小チップ１のその後の分析の目的に合うように、及び／または微小チップ１がその後に接触する物質との関係で、当業者が適宜決定することが好ましい。特に、微小チップ１をその後に質量分析装置による質量分析に供する場合は、導電性の材料を用いるか、または導電性コーティングを施した材料を用いることが好ましい。導電性コーティングは、例えば、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）によるコーティングとすることができ、質量分析装置において用いるために一般的な厚み及び表面抵抗とすることができる。また、場合により、微小チップ１の載置面１１に、生体組織との親和性を高めるための表面処理を施してもよい。板状部材が、金属である場合には、表面処理は不要であり、微小チップ１に表裏の区別は無い。したがって、いずれの面を載置面１１としてもよい。また、本実施形態による微小生体組織片の作製装置で作製された、微小生体組織片を添付した微小チップ１を、イメージング質量分析装置での分析に用いる場合は、ステンレススチールなどの金属チップとすることが好ましい。あるいは、イメージング質量顕微鏡、又は光学顕微鏡での分析に用いる場合は、例えば、表面抵抗が１２Ω／ｓｑ以下の酸化インジウムスズ被覆のガラスチップとすることが好ましい。金属性の微小チップはまた、生体組織との親和性においても好ましく、通常の添付操作によって、生体組織を金属チップ上に十分な強度で固定することができる。
【００２９】
カセット２は、複数の微小チップ１を収容するとともに、操作装置３の可動ピン３１を挿入することにより、微小チップ１を、短時間で相対的に移動可能にするための容器を構成する支持装置である。図１（ａ）を参照すると、カセット２は、底部２１と周縁部２２とにより構成される凹状の収容部を備える。図２（ａ）は、カセット２の平面図であり、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａによる断面図である。収容部は、底部２１に垂直に設けられる、薄い仕切板２４ａ、２４ｂにより区分けされて、同一の形状及び大きさの複数のセル２５を構成する。仕切板２４の底部２１からの高さは特には限定されず、セル２５内で、微小チップを所定位置に固定することができればよい。図示するカセットにおいては、仕切板２４が底部２１から、周縁部２２と概ね同じ高さまで設けられており、周縁部２２の上端部と仕切板２４の上端部は、底部と平行な、概ね同一平面上に位置するが、本発明は特定の仕切板２４の高さには限定されない。底部２１から周縁部２２の上端部及び仕切板２４の上端部の高さはまた、微小チップ１の厚みとも、概ね同一に構成されているが、本発明はかかる構成には限定されない。
【００３０】
仕切板２４は、複数の微小チップ１をカセット２の所定位置に位置決めして収容するセル２５を構成するとともに、好ましくは、隣り合う微小チップ間隙を所定の一定値に保持する機構として設けられる。隣り合う微小チップ間隙は、添付する生体組織薄片の厚みにも依存するが、例えば、１０〜８０μｍとすることが好ましく、生体組織薄片の厚みが１０〜１５μｍの場合には特には、２５〜６５μｍ程度とすることができる。この間隙の存在により、複数の微小チップ１の載置面を覆うように載置された生体組織薄片は、溶融添付するときに瞬間的に収縮し、微小チップ１の間隙に該当する箇所で分離される。仕切板２４は、連続的な板状であってもよいし、不連続に設けられていてもよく、隣り合うセルの境界上であっても、仕切板が存在していない箇所があってもよい。図２（ａ）に示すカセット２においては、紙面上下方向に、等間隔で平行に設けられる３枚の仕切板２４ａは連続的であって、紙面左右方向に設けられる仕切板２４ｂは、不連続である。これは、エンドミルを用いて、連続的に効率よく切削できるようにしたという製造上の理由であり、本発明は特定の仕切板２４の態様には限定されない。仕切板２４の厚みは、仕切板２４の機械的強度を保持しうる範囲で、かつ、隣り合う微小チップの好ましい間隙を実現するように、当業者が適宜決定することができる。例えば、カセットがＳＵＳステンレス製の場合は、厚みが６０μｍ程度以上とすることができ、ＳＫ鋼のような硬度の高い金属を用いれば、さらに薄い仕切板とすることもできる。上記好ましい間隙との関係でも仕切板２４の仕様を決定することができる。仕切板２４は、好ましくは、厚みが均一ではなく、底部から上端部に向けて、厚みが薄く、テーパー形状に形成されている。その際、底部２１への鉛直線と、仕切板２４の側面のなす角度は、例えば、１〜５°とすることができるが、特定の角度には限定されない。また、周縁部２２の内壁も、同様に底部に対する鉛直線から、外側へ１〜５°傾斜していることが好ましい。仕切板２４及び周縁部２２内壁を、このような傾斜をもった形状に形成することにより、各セル２５の開口部面積を底面積よりもわずかに大きくし、セル２５への、微小チップ１の着脱を容易にすることができる。特には、医療用ロボットハンドによる微小チップ１の操作を容易にすることができる。
【００３１】
仕切板２４ａ、ｂにより区切られた複数のセル２５は、それぞれが、１つの微小チップ１を、載置面１１を露出可能に収容する。そして、各セル２５の底部には、底部を貫通する少なくとも１つの孔２６が設けられる。図示する実施形態においては、孔２６は円形状であるが、特定の形状には限定されず、四角形や長方形であってもよい。また、孔は一つでなく、複数設けられていてもよい。一方、各セル２５の底部２１は、孔２６から微小チップ１が脱落することなく、微小チップ１を支持するのに十分な領域を備え、支持装置の支持面として機能する。したがって、１つのセル２５には、１つの微小チップ１を収容することができる。そして、微小チップ２５を収容した状態においては、カセット２の底面から、孔２６を介して、各微小チップ１の底面が視認でき、かつ、カセット２の外部から、前記微小チップ１の底面に接触することが可能である。
【００３２】
図示する実施形態においては、仕切板２４ａ、ｂにより、４行×４列に配置された１６個のセル２５に分割されたカセット２を示すが、本発明は特定の数のセル２５には限定されない。また、特定のセルの配置には限定されない。例えば、５行×５列に配置された２５個のセル、８行×９列に配置された７２個のセル、または１０行×１０列に配置された１００個のセルを備えるカセットであってもよい。１つのカセットあたりのセルの数は、本実施形態の装置により作製される微小生体組織片の数に相当する。したがって、微小生体組織片の使用目的や、任意選択的に、微小生体組織片の使用態様により、セルの数を決定し、所望のカセットを設計することができる。
【００３３】
カセット２の材質は特には限定されず、金属、ガラス、シリコン、プラスチックなどの任意の材料であってよいが、カセット２のその後の分析等の使用の目的に合うように、当業者が適宜決定することが好ましい。特に、カセット２をその後に質量分析装置による質量分析に供する場合は、導電性の材料を用いるか、または導電性コーティングを施した材料を用いることが好ましい。カセット２は、所定の材料の塊から、例えば、図２に示す構造体を切り出すことにより、製造することができる。なお、支持装置は、微小チップを上記のセルと同様に所定位置に配置し、固定する機構を備え、かつ、支持装置に複数の微小チップを配置した場合に、微小チップの複数の載置面が同一平面上にあって、さらに、複数の微小チップを、操作装置を用いて、前記同一平面に対して垂直な方向に移動可能なものであればよく、カセットには限定されない。カセット以外の支持装置の態様については、後述する。
【００３４】
図３は、微小チップ１をカセット２に収容し、操作装置３と組み合わせた状態における、微小生体組織片の製造装置１００の断面図である。微小チップ１をカセット２に収容した状態で、微小チップ１の載置面１１、周縁部２２の頂部並びに仕切板２４の頂部は、同一平面をなしている。操作装置３は、カセット２と分離可能に設けられ、カセット２の外部から微小チップ１に作用して、生体組織薄片を分割し、微小生体組織片に切り分けるとともに、微小チップ１を個別に、例えば医療用ロボットハンド等で把持し、移動することができる状態とする。
【００３５】
操作装置３は、カセット２の底部の孔２６に挿入可能な、複数の可動ピン３１と、任意選択的に固定部３２、ガイド３３並びに図示しない及び駆動部を備えて構成される。複数の可動ピン３１は、固定部３２に所定の間隔及び位置関係にて設けられた管に収容され、可動ピン３１の長手方向に移動可能に配置される。以下、可動ピン３１の長手方向を操作装置３の可動方向とも指称する。可動方向は、操作装置３とカセット２とを作動可能に組み合わせたときに、カセット２の底部及びカセット２に収容されている微小チップ１の載置面１１及び底面に垂直な方向である。
【００３６】
操作装置３において、可動ピン３１は、可動方向と垂直な方向には移動することができない。固定部３２に設けられる複数の管状部により、複数のピン３１の相対的位置が固定される。そして、可動ピン３１の、可動方向と垂直な方向における複数のピン３１の相対的位置関係は、カセット２と操作装置３とを重ねた際に、各可動ピン３１の中心線が、各孔２６の中心と一致するように決定される。図示する実施形態においては、複数の可動ピン３１は、カセット２の孔２６に適合する等間隔で、４列×４行に配されているが、この配列はカセット２のセル２５の配列に従って決定され、特定の配置には限定されない。
【００３７】
可動ピン３１長手方向への可動範囲は、複数の可動ピン３１について、好ましくは同一であり、可動ピン３１によって押し上げられた微小チップ１の載置面１１と、可動ピン３１によって押し上げられていない微小チップ１の載置面１１との高さの差を、例えば０．５ｍｍ程度以上とすることを可能にする態様が好ましいがこれには限定されない。特には、後続の工程で微小チップを把持して移送する好ましい自動化手段であるロボットハンドのチャック爪の構造等によりこのような可動ピン３１の可動範囲を決定することができる。各可動ピン３１は、それぞれが独立に可動であってもよいし、場合により、列ごとに、及び／または行ごとに連動して可動であってもよい。図示する実施形態においては、第１列及び第３列の８本の可動ピン３１が連動するように構成することができるが、そのような態様には限定されない。例えば、可動ピン３１が移動し、微小チップ１を押し上げた際に、隣り合う微小チップ１の高さが異なるように、すなわち、上方に押し上げられて移動する微小チップ１と、移動しない微小チップ１とが交互に位置し、市松模様を構成するように、可動ピン３１を連動させる構成とすることもできる。また、図示しない駆動部を作動させるプログラムにより、列ごとの駆動や、独立した駆動を可能に構成してもよい。図示しない駆動部は、複数の可動ピン３１を独立に、あるいは、配置された列ごともしくは行ごとに、長手方向に、かつ操作装置３からカセット２へ向かう向きに移動させる。駆動部は、例えば、回転軸に円盤カムを取り付けた部材であってよく、操作装置３は全体としてカム装置であってよいが、特定の形態には限定されない。
【００３８】
可動ピン３１は、底部の孔２６と略同一の断面形状を有し、前記カセット２の高さの約３〜２０倍の長さを有する。そして、その頂面にあたるチップ接触面は好ましくは平坦である。
【００３９】
操作装置３は、カセット２の下方に重ねて配置することができるように構成されている。その際、操作装置３とカセット２とは、可動ピン３１が駆動されない状態においては、可動ピン３１のチップ接触面が微小チップ１に接触することなく、かつ、孔２６に正確に挿入されるような位置関係となっている。このような配置を決定するために、カセット２と操作装置３とは、固定部３２に設けられるガイド３３により位置決めすることが好ましい。
【００４０】
微小生体組織片の作製装置を構成する、微小チップ１、カセット２、操作装置３は、それぞれが別個に分離可能である。特に、微小チップ１は後述のスクリーニング方法に関する実施形態において詳細に説明するように、使い捨て可能に構成することができる。一方、カセット２は、好ましくは複数回使用可能に構成することができる。
【００４１】
［微小生体組織片の作製装置の作動方法］
次に、本実施形態による装置を、その作動方法の観点から説明する。なお、微小生体組織片の作製装置の作動方法は、別の局面によれば、微小生体組織片の作製方法ともいうことができる。以下、微小生体組織片の作製装置の作動方法と共に、微小生体組織片の作製方法についても説明する。
【００４２】
微小生体組織片は、生体由来の組織薄片を、図１〜３に示す装置により分割することで、作製することができる。組織片の由来は特には限定されないが、例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラットなどの哺乳動物から得られた凍結組織片である。さらに具体的には、例えば、これらの哺乳動物、好ましくはヒトの脳組織片あるいは、がん細胞組織片等が挙げられるが、これらには限定されない。あるいは、組織片は、パラフィン包埋組織片であってもよい。以下の実施の形態は、主として、凍結組織片からの微小生体組織片の製造方法について説明する。
【００４３】
生体組織薄片の調製は、凍結組織を所定の大きさ、例えば、縦が５ｍｍ〜１０ｃｍ、横が５ｍｍ〜１０ｃｍ、高さが５ｍｍ〜２ｃｍ程度のブロック状に調製する。次いで、クリオスタット等の装置を用いてブロックから薄片を切り出し、さらに、約０．５〜１００μｍの厚みの生体組織薄片にまで調製する。調製は、−２３〜−１８℃で実施することが好ましい。クリオスタット等により切り出されたこの生体組織薄片の厚みが、本実施形態において作成する微小生体組織片の厚みとなる。したがって、生体組織薄片の厚みは、微小生体組織片の使用目的、すなわち、分析手段により、適宜決定することが好ましい。例えば、イメージング質量分析装置を用いて、微小生体組織片への化合物の特異的結合を分析する場合、生体組織薄片の厚みは、８〜１５μｍとすることができるが、この範囲には限定されない。この生体組織薄片が、分割されて微小生体組織片とされる材料であり、図１〜３に示すカセット２に収容された複数の微小チップ１の載置面１１に載置される。したがって、生体組織薄片は、カセット２の全てのセル２５に微小チップ１を収容したときに、複数の微小チップ１の載置面１１全体で構成する方形と、同一の形状であるこことが好ましい。
【００４４】
調製した生体組織薄片は、予め微小チップ１を全てのセル２５に収容した状態としたカセット２の、複数の微小チップ１の載置面１１に載置する。微小チップ１をカセット２に収容する操作は、市販の医療用ロボットハンドを用いて、自動化して行うことが好ましい。図４（ａ）は、生体組織薄片Ｓを載置面１１に載置する工程を模式的に示す図である。図４（ａ）において、１枚の生体組織薄片Ｓが、１６個の微小チップ１の１６の載置面１１を覆うように、載置されている。次いで、カセット２の底部側からごくわずかに加熱して、生体組織薄片Ｓを、載置面１１に溶解添付する。加熱は、手指により、あるいは、温度測定及び温度調節が可能なアルミニウムブロック上に、カセット２を載置することにより実施することができるが、特定の方法には限定されない。この溶解添付操作により、生体組織薄片Ｓは、それぞれの微小チップ１に固着するとともに、瞬間的に収縮して、微小チップ１が存在しない間隙の部分で切断され、分割されて複数の微小生体組織片ｄＳとなる。なお、生体組織薄片Ｓの状態によっては、この段階で完全に切断、分割されないものが残る場合もある。溶解添付後、さらに、２０〜３７℃で、５分〜１時間程度、微小生体組織片ｄＳもしくは完全に切断されずに残存した生体組織薄片Ｓを乾燥固定することが好ましい。これらの溶解添付及び乾燥固定は、微小生体組織片ｄＳもしくは生体組織薄片Ｓを微小チップ１上に密着させるために実施する。溶解添付及び乾燥固定後は、使用まで、生体組織薄片を載置したカセット２ごと、−２０〜４℃、好ましくは、短期保存１〜２週間の場合には、約４℃で、使用まで保管することが好ましい。微小生体組織片ｄＳもしくは生体組織薄片Ｓは、カセット２に添付した状態で、例えば、−２０℃で６ヶ月程度は保管可能である。
【００４５】
生体組織薄片Ｓを溶解添付、乾燥固定させる操作を経たカセット２は、所定の温度で保管されている場合には、使用時に取り出す。この際、結露を防止するために、常温になるまで、生体組織薄片Ｓを添付したカセット２を、乾燥剤を備える容器に収容しておくことが好ましい。次いで、カセット２と、操作装置３を重ねて配置する。かかる操作も、医療用ロボットハンドなどにより自動化することができる。カセット２と操作装置３が所定の位置関係で固定された後、操作装置３を作動させる。これにより、可動ピン３１の一部を鉛直方向上方向に移動させ、孔２６を介して、微小チップ１の底部から、微小チップを押し上げる。
【００４６】
図４（ｂ）は、操作装置３の可動状態を模式的に示す図である。簡略化のために、固定部３２は表示していない。図４（ｂ）において、４行、４列に配置した可動ピン３１のうち、第１列及び第３列に位置する可動ピン３１群を移動させて接触する微小チップを押し上げ、第２列及び第４列に位置する可動ピン３１群をカセット２には接触しない位置に保持している。図中の矢印は、可動ピン３１の移動方向を示す。操作装置３の作動は、図示しない駆動装置によることができるが、駆動装置は自動化プログラムにより駆動させてもよいし、これとは別にあるいは自動化に加えて、手動で操作可能に構成してもよい。なお、可動ピン３１の作動態様は、図示した形態には限定されず、第１行及び第３行に位置する可動ピン３１群を移動させて接触する微小チップを押し上げ、第２行及び第４行に位置する可動ピン３１群をカセット２には接触しない位置に保持することができる。移動させる可動ピン３１群と、保持する可動ピン３１群が、逆であってもよい。この際の可動ピン３１の移動速度は、特には限定されない。可動ピン３１群を移動させる操作は、１回の作製方法において一度であってよい。このような操作により、溶解添付、乾燥固定させる操作を経ても分割されずに残り得る生体組織薄片Ｓも切断、分割され各微小チップ１に対応する大きさの、複数の微小生体組織片ｄＳが得られる。また、各微小チップ１は、可動ピン３１により移動されて、医療用ロボットハンド等の自動化装置で、１枚ずつ個別に把持することが可能な相対位置に置かれる。
【００４７】
複数の微小生体組織片ｄＳは、微小チップ１上に添付されたままで得られる。そして、任意選択的に、微小チップ１を医療用ロボットハンドなどで、カセット２から取り出して、化合物との反応や分析などの次の操作のために所定の場所へ移動させることもできる。
【００４８】
このようにして得られた微小生体組織片は、種々の分析に供するために用いることができる。特には、特に創薬のための、大規模な化合物スクリーニング方法において有用に用いることができる。
【００４９】
本発明に係る微小生体組織片の作製装置を構成する支持装置２としては、図１〜４に具体的に示したカセット２の態様には限定されない。支持装置の別の態様として、図５に、真空ピンセット方式の支持装置を挙げることができる。図５（ａ）を参照すると、真空ピンセット方式の支持装置２は、支持面２７を備えるプレート状の支持装置２本体から構成される。支持装置２本体は、真空ポート２８を備える。真空ポート２８は、図示しないチューブ等に接続され、支持装置２本体の内部を真空引きすることが可能に構成される。支持面２７から支持装置２本体を貫通する孔２６は、操作装置３の可動ピン３１が進入可能に構成される。本実施形態において、孔２６は、支持面２７に微小チップ１を載置した際に、一つの微小チップ１の配置される支持面２７の区画あたりに、複数設けられていることが好ましい。図示する態様においては、一つの微小チップ１の配置される支持面２７の区画あたり、少なくとも３つ以上の孔２６が設けられているが、このような態様には限定されない。操作装置３の可動ピン３１により安定的に微小チップ１を持ち上げ、微小チップを平面に支持できるような機構であれば、図示するような３点支持でもよく、三角形または四角形の太めの可動ピンひとつでもよく、場合により、ひとつひとつの微小チップを、可動ピンにとりつけた別々の微小真空ピンセットで支持することも可能である。孔２６の周囲には真空パッド２９が設けられる。図５（ｂ）を参照すると、支持装置２本体の内部を真空引きすることにより、真空パッド２９が微小チップ１を吸着保持することができる。
【００５０】
図５（ａ）に示す支持装置２において、支持面２７及び真空パッド２９は、多孔質の吸着体とすることが好ましい。真空ピンセット装置の吸着面に好適な多孔質の吸着体は、当業者が適宜選定することができる。また、支持装置２本体及び可動ピン３１は、金属製とすることが好ましい。
【００５１】
すなわち、図５に示す装置においては、図２に示すカセット２の仕切板２４及びセル２５に代えて、支持装置２本体、真空ポート２８、及び真空パッド２９から構成される真空ピンセットが、複数の微小チップ１を、所定位置に、所定の間隙を保持して支持装置に固定する機構として機能する。本実施形態において、複数の微小チップ１間を所定の間隙を保持して支持装置２に配置、固定するためには、支持装置２に配置する前に、予め所望の間隙と同じ厚みの部材、例えば、１０〜１００μｍの紙やフィルム、板状部材等を用いて、支持面に適合する大きさ及び形状の微小チップ１群を配置、配列しておくことができる。あるいは、微小チップ１の側面、すなわち載置面に垂直な面の一部に、所望の間隙と一致する寸法の凸部を設けた構造に設計し、予め複数の微小チップ１を凸部が接触するように配置、配列しておくことができる。次いで、このような微小チップ１群に対し、図５（ａ）に示す支持装置２を、上下逆にして接触させ、真空引きすることにより、真空ピンセットの原理により、微小チップ１群を支持面２７に吸着固定させることができる。
【００５２】
このような真空ピンセット方式の支持装置２と、微小チップ１、操作装置３とを含んで構成される微小生体組織の作製装置の作動については、上記微小チップ１群の配置並びにの支持装置２への載置態様を除き、主に図３、４を参照して説明した第１実施形態と概ね同様である。上記のように、一つの微小チップ１の配置される支持面２７の区画あたり、複数の孔２６が設けられる場合、これらの孔２６に挿入される複数の可動ピン３１は、連動して同じ押し上げ動作を行う。
【００５３】
このような真空ピンセット方式の支持装置２を備える微小生体組織の作製装置によれば、より単純な機構で、微小生体組織の作製を実施できる。また、微小チップ１の配置、固定が、真空ピンセットの原理でより柔軟に行えるため、一つの支持装置２により、種々の形状の微小チップ１に対応することが可能となる点で有利である。
【００５４】
なお、上記第１実施形態は、カセットの底面が、鉛直方向と垂直に設置された形態にて、装置の作動を説明したが、本発明にかかる装置の作動は、特定の設置形態には限定されない。例えば、カセット２に、微小チップ１を係合して保持するための機構をさらに備え、重力による微小チップ１の脱落を防止することにより、カセット２の底面及び微小チップ１の載置面１１が、鉛直方向に平行に、あるいは、鉛直方向から任意の角度を有する方向になるように微小チップ１、カセット２、操作装置３を配置することもできる。真空ピンセット方式の支持装置２を備える微小生体組織の作製装置についても、可動ピン３１による移動後の微小チップ１の脱落を防止する機構を備えることにより、任意の配置とすることができる。また、上記においては、凍結試料について詳細を説明したが、パラフィン包埋試料であっても、同様に上記装置１００を用いて、微小生体組織片とすることができる。この場合、温度管理が必要ない。一方、パラフィン包埋試料は質量分析装置による分析には使用できず、また、微小チップへの添付にあたって、試料を加熱してパラフィンを溶解させ、複数の微小チップの載置面に添付する必要がある。パラフィン包埋試料は、例えば、病理組織標本作製など、形態を維持した観察において有利に用いられる。
【００５５】
［第２実施形態：化合物のスクリーニング方法］
本発明は、第２実施形態によれば、化合物のスクリーニング方法である。特には、生体組織に特異的に結合する化合物のスクリーニング方法であって、第１実施形態に記載の方法により、微小チップに添付した微小生体組織片を作製する工程と、反応用ウェルプレートにおいて、前記微小チップに添付した微小生体組織片を１以上の候補化合物と接触させる工程と、前記候補化合物の前記微小生体組織片に対する特異的結合を分析する工程と
を含む。さらに好ましくは、当該方法は、第１実施形態の装置及び方法を用いて微小生体組織片を作製する第１工程と、得られた微小生体組織片を、前記微小チップ上に添付したまま、反応用ウェルプレートに移動する第２工程と、前記反応用ウェルプレートにおいて、前記微小生体組織片を１以上の候補化合物と接触させる第３工程と、前記微小生体組織片を、前記微小チップ上に載置したまま、前記反応用ウェルプレートから、分析用プレートに移動する第４工程と、前記候補化合物の前記微小生体組織片に対する特異的結合を分析する第５工程とを含む。ここで、候補化合物とは、スクリーニングの対象となる化合物であって、通常、後に詳述するような、所定のライブラリ由来の化合物をいう。
【００５６】
第１工程である、微小生体組織片を作製する工程は、第１実施形態における、装置の作動方法において詳述したとおりであり、本項目では説明を省略する。化合物のスクリーニング方法を目的とした場合、組織は、例えば、ヒトの脳組織である。そして、本実施形態においては、既知の所定の方法により同定されている、特定の症状を有する脳由来の組織と、対照として正常脳由来の組織との両方について、微小生体組織片を作製する。脳組織について、特定の症状は、例えば、アルツハイマー病に罹患した脳である。アルツハイマー病に罹患した脳は、例えば、抗体免疫染色法により特定することができる。あるいは、別の実施形態においては、ヒトの特定臓器から得られたがん組織と、対照として、がん組織の切除の際に通常一緒に切除される周辺の正常組織との両方について、微小生体組織片を作製することができる。本実施形態のスクリーニング方法の説明にあたって、このような疾患組織由来の微小生体組織片と正常組織由来の微小生体組織片とを総称して、試料と指称する場合がある。
【００５７】
第２工程は、得られた微小生体組織片を、前記微小チップ上に添付したまま、反応用ウェルプレートに移動する工程である。反応用ウェルプレートは、複数のウェルを備え、核１つのウェルに、１つの微小チップを配置して、各ウェルにて、候補化合物と微小チップ上の微小生体組織片とを溶液系で接触させることが可能なものであればよい。したがって、市販されている、汎用の９６ウェルプレートを用いて実施することもできる。好ましくは、特殊な反応用ウェルプレートを用いて実施する。
【００５８】
図６は、本実施形態において好ましく用いられる反応用ウェルプレートの平面図である。図示する反応用ウェルプレート４は、９６個のウェル４１を備える。各ウェル４１は、溶液を注入した場合に、微小チップ１が、回転したり、浮上したりすることなく、固定されるのに適した寸法の幅を有する。そして、ウェル４１は、微小チップをウェルの深さに対し、概ね中間の位置に固定するための係止部を備える。ウェル４１の底面は、一方向に傾斜しており、ウェル４１からの溶液の除去を容易にするように構成されている。また、ウェルの内壁面は、疎水性の樹脂、例えば、汎用の蛋白質・ペプチドの低吸着性樹脂などでコーティングすることにより、溶液の除去が容易になっている。
【００５９】
第２工程は、好ましくは、自動化装置により行われる。自動化装置は、第１工程を経て、カセット２に収納された微小チップ１を、一つずつ把持し、反応用ウェルプレート４に移送する手段である。自動化装置としては、例えば、市販の医療用ロボットハンドを用いることができ、好ましい仕様としては、カセット２に確実に微小チップ１を入れる精度をもつ装置を用いることができるが、これらには限定されない。自動化装置は、プログラミングにより、カセット２から、反応用ウェルプレート４に、所定の配置になるように、微小チップ１を移送するように構成される。図７を参照して、自動化装置による移送のシステムを説明する。図７においては、１６個の微小チップを収容するカセット２と、９６個の微小チップを収容する反応用ウェルプレート４に、アルツハイマー脳由来の微小生体組織片と、正常脳由来の微小生体組織片とを配置する場合を例示して説明するが、本発明は、特定の数の微小チップを収容するカセット及び反応用ウェルプレートに限定されるものではない。また、本発明は特定の疾患由来の組織片に限定されるものではない。
【００６０】
図７において、１６個の微小チップ１を収容するカセット２は、アルツハイマー病患者由来の微小脳組織片について、３セット、対照として正常な脳由来の微小脳組織片について、３セット準備される。図中、Ｎａは、アルツハイマー病由来の微小生体組織片を、Ｎｎは、正常脳由来の微小生体組織片を便宜的に表すための、試料番号であり、Ｎは、１〜４８の整数である。第１工程で得られた、微小生体組織片を載置した微小チップ１は、図示するように、カセット２から、反応用９６ウェルプレートに移送される。この時、同じ番号の異なる組織由来の微小生体組織片、すなわち、ＮａとＮｎが、隣り合わせになるような配置で、移送される。そして、隣り合った同一試料番号Ｎを有する疾患組織由来の微小生体組織片及び対照である正常組織由来の微小生体組織片は、反応用ウェルプレート４で、同一の候補化合物もしくは、候補化合物群に浸漬される。この移動態様を示す図７中の矢印Ｐ２は、特定のプログラムを作成することにより、医療用ロボットハンドに実施させることができる。
【００６１】
第３工程は、前記反応用ウェルプレート４において、前記微小生体組織片ｄＳを１以上の候補化合物と接触させる工程である。第３工程では、微小生体組織片ｄＳを、微小チップ１に添付したまま、ウェル４１に配置し、候補化合物溶液と接触させることにより、１枚のウェルプレートで、微小生体組織片ｄＳに特異的に結合する複数の化合物を、一度に、大量スクリーニングすることが可能となる。第３工程は、具体的には、反応用ウェルプレート４に移送された、微小生体組織片ｄＳを添付した微小チップ１に、希釈した候補化合物溶液を注入する工程と、化合物溶液を注入した反応用ウェルプレート４を所定時間にわたって静置する工程と、静置後、各ウェル４１から化合物溶液を除去する工程と、微小生体組織片ｄＳを添付した微小チップ１を乾燥する工程とから構成される。
【００６２】
候補化合物は、スクリーニング目的により異なるが、利用可能な化合物ライブラリの提供を受けて、例えば、５０００以上、９０００以上といった膨大な数の候補化合物をスクリーニング対象とすることができる。例えば、ＰＥＴトレーサーとして用いられる低分子化合物の探索を目的とする場合には、創薬用低分子化合物ライブラリを使用することが好ましい。本発明においては、候補化合物は、低分子化合物には限定されず、目的に応じて、任意のライブラリを用いて、スクリーニングを実施することができる。
【００６３】
分析手段として、イメージング質量分析法を用いる場合には、化合物ライブラリから利用可能な化合物のうち、イメージング質量分析法により検出しやすい化合物を、プリカーサイオン分析法により選択して、これらを候補化合物とすることが好ましい。
【００６４】
候補化合物は、微小生体組織片と接触させるにあたって、予め所定の組成を有する溶液に、所定の濃度で溶解し、希釈溶液としておくことが好ましい。この際の溶液組成は、当業者が適宜決定することができるが、例えば、化合物の溶解性及び後続のイメージング質量分析装置への適用性の観点から、両親媒性の溶媒であるアセトニトリルで希釈した後、さらにエタノールで希釈することが好ましい。候補化合物を含む希釈溶液は、安定性の観点から、調製後、直ぐに使用しない場合には、−２０℃で保管することが好ましい。
【００６５】
微小生体組織片ｄＳを添付した微小チップ１に、希釈化合物溶液を注入する工程では、予め調製し、所定温度で保管しておいた希釈化合物溶液を、注入する。かかる工程に先だって、微小生体組織片を添付した微小チップを、例えば、５０体積％エタノールなどで洗浄することが好ましい。これは、組織切片を膨潤し化合物の浸透をよくすると同時に、脂質成分に富んだ脳組織からある程度の脂溶性成分を除去するためである。洗浄は、反応用ウェルプレート４の各ウェル４１に、５０体積％エタノールを添加し、１〜５分で除去することにより実施することができる。
【００６６】
候補化合物を含む希釈溶液をウェルに注入する際、１つのウェルあたり、１種類の候補化合物が含まれるようにしてもよいし、１つのウェルあたり、複数の候補化合物が含まれるようにしてもよい。１つのウェルあたり、複数の候補化合物が含まれるようにする場合は、予め複数の候補化合物が含まれる希釈溶液を調製しておいて、各ウェルに注入してもよいし、各ウェルへの注入時に所定の濃度になるように混合してもよい。
【００６７】
最大で８０種類の化合物を同時に一つのウェルに添加することができる。これは、後に詳述する分析方法として、イメージング質量分析法を用いる場合に、同時検出可能な最大限の化合物数である。すなわち、後述する好ましいイメージング質量分析装置においては、質量分析スペクトルの、検出ｍ／ｚが、５おきに、１００から５００までのｍ／ｚの化合物を同時に検出することが可能であるため、検出ｍ／ｚが少なくとも５以上異なる複数の化合物を選択することで、一つのウェルあたりに、複数化合物を添加することが可能である。したがって、一つのウェルあたり、理論上最大８０種類、例えば、１０〜２０種類、１０〜３０種類、１０〜４０種類、１０〜５０種類、好ましくは、１０〜２０種類の化合物を同時に添加することが可能であり、これらの化合物の微小生体組織片への特異的結合を同時に検出することができる。
【００６８】
所定時間の静置後、希釈化合物溶液をウェルから除去する。次いで、好ましくは、微小生体組織片ｄＳを添付した微小チップ１を洗浄した後、乾燥する。微小チップ１の乾燥は、常温下、３０分〜１時間にわたって実施することが好ましい。乾燥操作により、後続の分析に適した状態とすることができる。
【００６９】
第３工程による一連の操作は、市販のラボラトリーオートメーションシステムにより、自動化して実施することが好ましい。
【００７０】
第４工程は、前記微小生体組織片を、前記微小チップ上に載置したまま、前記反応用ウェルプレートから、分析用プレートに移動する工程である。分析用プレートに移動するに先立って、微小チップ１は、カセットに移動され、カセットごと分析用プレートに移動することが好ましい。カセットは、第１工程で用いたカセット２を再利用することもできるし、他のカセットを使用することもできる。本実施形態において、好ましくは、カセットは、第１工程で用いた、微小生体組織片の製造装置１００を構成するカセット２である。また、第４工程は、自動化装置により実施することが好ましい。第４工程において、自動化装置は、第３工程を経た、反応用ウェルプレート４に収納された微小チップ１を、一つずつ把持し、カセット２に移送する。自動化装置としては第２工程と同様の、好ましくは同一の医療用ロボットハンドを用いて実施する。自動化装置は、プログラミングにより、反応用ウェルプレート４からカセット２に、所定の配置になるように、微小チップ１を移送するように構成される。再び図７を参照して、自動化装置による移送のシステムを説明すると、同じ番号の異なる組織由来の微小生体組織片、すなわち、ＮａとＮｎが、隣り合わせになるような配置で、移送される。また、連続するＮ、例えば１ａ〜８ａと、１ｎ〜８ｎが、一つのカセットに収容されるように移動される。この移動態様を示す図７中の矢印Ｐ３は、特定のプログラムを作成することにより、医療用ロボットハンドに実施させることができる。それぞれのカセットは、任意選択的にナノマトリクスを噴霧した後、自動化装置を用いて、さらに分析用プレートに移動する。図８に、複数のカセットを収容した分析用プレートの一例を示す。図示する質量分析装置用プレート５は、一枚に２８セットのカセット２を収容可能であるが、分析用プレートは、分析装置により種々の形態を使用可能である。
【００７１】
第５工程は、前記候補化合物の前記微小生体組織片に対する特異的結合を分析する工程である。かかる工程は、好ましくは、イメージング質量分析法により、前記微小生体組織片に特異的に結合する候補化合物を分析し、識別する。イメージング質量分析法を実施するに当たって、測定試料である微小生体組織片ｄＳに、ナノマトリクスを添加することが好ましい。低分子化合物を測定に適した状態にイオン化することができる。ナノマトリクスとしては、当業者に公知の種々の組成が知られており、例えば、Taira et al.（Analyst, 2012, 137, 2006）に開示された組成を用いることができるが、これらには限定されない。低分子化合物の検出目的で通常用いられる、任意のナノマトリクスを用いることができる。微小生体組織片ｄＳへのナノマトリクスの添加は、反応用ウェルプレート４からカセットに移送した後、分析用プレートに移送する前に、通常の方法に従って、ナノマトリクスを調製し、噴霧することで実施することができる。あるいは、Arakawa et al.（ANALYTICAL SCIENCES DECEMBER 2010, VOL. 26）に開示された方法で、ナノストラクチャーによる表面処理を実施したものを用いることもできる。
【００７２】
イメージング質量分析法による分析には、市販のイメージング質量分析装置を用いることができる。例えば、株式会社島津製作所製のＡＸＩＭＡ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ、日本電子株式会社製のＪＭＳ−Ｓ３０００、Ｂｒｕｋｅｒ製のａｕｔｏｆｌｅｘ  ｓｐｅｅｄといった装置を用いることができるが、これらには限定されない。
【００７３】
図８は、イメージング質量分析法による、カセット２に配置した微小生体組織片のイメージングを模式的に示す図である。特定疾患組織由来の微小生体組織片を添付した微小チップと、正常組織由来の微小生体組織片を添付した微小チップとを、並べて配置し、両者にまたがる領域を同時にスキャンすることで、特定疾患組織あるいは正常組織への候補化合物の特異的結合を分析することが可能となる。また、１つの質量分析装置用プレート５において、例えば６カセットに１カセットの割合で、ネガティブコントロールとなるカセットを配置し、組織由来のピークを差し引くことができる。ネガティブコントロールとなるカセットは、候補化合物を添加しない以外は全て、前述と同様にして第１工程〜第４工程を経て得られた微小チップを配置したカセットであってよい。
【００７４】
結果の解析には、上記代表的なイメージング質量分析装置に附属した解析用のソフトウェアを用いることができる。さらに、複数の候補化合物を、１つのウェルに添加する実施形態においては、BioMap software (http://www.maldi-msi.org/)などの解析用のソフトウェアを用いることもできる。
【００７５】
あるいは、第５工程は、イメージング質量顕微鏡により実施することもできる。イメージング質量顕微鏡により実施する場合には、微小チップ１の材質を、酸化インジウムスズ被覆ガラスとすること以外は、上記と同様に第１工程〜第４工程を実施し、これに加えて、切片添付後の微小チップに抗体免疫組織染色を実施し、イメージング質量顕微鏡により分析することができる。イメージング質量顕微鏡としては、例えば、株式会社島津製作所製のｉＭＳｃｏｐｅ  ＴＲＩＯといった装置を用いることができるが、これらには限定されない。
【００７６】
第２実施形態によれば、第１実施形態により作製した、微小生体組織片を添付した微小チップを用い、所定の質量分析装置と組み合わせることで、短時間に、かつ迅速に、大量のスクリーニングが可能となる。このようなスクリーニング方法は、生体条件により近い状態で存在する病原性蛋白凝集体あるいは正常な蛋白凝集体に特異的に結合する化合物のスクリーニングにおいて特に有用である。特には、ＰＥＴトレーサーとなる化合物を探索する場合に、上記方法にてライブラリの代表化合物をスクリーニングし、有望な化合物の周辺化合物をさらにスクリーニングすることができる。周辺化合物のスクリーニングにも、本発明の方法を同様に実施することができる。なお、本実施形態においても、支持装置として、カセット２を用いて具体的に説明したが、本発明は図示するようなカセットを用いたスクリーニング方法に限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
以下に、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
【００７８】
（１）材料
生体組織片としては、病態を代表するヒトの凍結脳（東京都健康長寿医療センター・ブレインバンクより供与）を用いた。アルツハイマー病（ＡＤ）脳としてＡＤステージＢｒａａｋ  ＶＩの前頭葉、図９ａに示すように抗タウＡＴ８抗体の免疫組織染色により神経原線維変化（ＮＦＴ）及び組織全面が染色陽性、図９ｃに示すように、抗Ａβ１１−２８抗体にても相当量の老人班（ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅ）とびまん性染色（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｐｌａｑｕｅ）を認める部位、対照として正常脳の前頭葉（ＡＤステージＢｒａａｋ  ０．５）、図９ｂに示すように抗タウＡＴ８抗体にて染色を認めず、図９ｄに示すように、抗Ａβ１１−２８抗体においては相当量の老人班とびまん性染色を認める部位を用いた。創薬用低分子化合物ライブラリとしては、東京大学創薬オープンイノベーションセンターより供与された、構造多様性をもつ代表低分子化合物セット（９６００化合物）を用いた。
【００７９】
（２）装置仕様
（２−１）２．４チップ、１６カセット
組織または樹脂等の薄切片を載せる微小チップ（以下、実施例において、２．４チップと指称する）は、１ｍｍ厚ＳＵＳ３０４ステンレス板から、ワイヤカット法を用いて、図１（ｂ）に示す形状（２．４ｍｍ角、Ｒ０．１ｍｍ）の微小チップを作製した。ワイヤカット後に残るバリは、微細ヤスリを用いて、注意深く除去した。この２．４チップを、４列×４行で１６個配置するカセットを１６カセットと称し、金属加工により図２に示す図の通り一枚のＳＵＳ３０４ステンレス板より削り出した。仕切板２４及び周縁部に接するセルの側壁部には３°のテーパーエンドミルを用いて切削し、２．４チップの出し入れを容易にする工夫を施した。
【００８０】
（２−２）化合物浸漬用特殊９６穴ウェルプレート
２．４チップをライブラリの個々の候補化合物に浸漬するために、図６に示す通りの特殊な形状をもつ９６穴ウェルプレートを金型より作製した。９６穴ウェルプレートは、株式会社リッチェル製のマイクロレシコ（登録商標）によりコーティングし、生体物質の吸着を防止した。
【００８１】
（２−３）ロボットハンドシステム・カムシステム
ＤＥＮＳＯ製のＶＰ−Ｇ２型医療用ロボットハンドを用いて２．４チップ、１６カセット及び化合物浸漬用特殊９６ｗｅｌｌプレートをハンドリングするロボットハンドシステムを構築した。ロボットハンド用プログラムとして、２．４チップをスタッカーから１６カセットに詰める専用プログラム（Ｐ１）、１６カセットから操作装置により２．４チップを分離し（図３）、特殊９６穴プレートに移動する（図７）専用プログラム（Ｐ２）、化合物の浸漬を終えた後に２．４チップを９６穴プレートから１６カセットに移動する（図７）専用プログラム（Ｐ３）を開発した。
【００８２】
プログラムＰ２にて分離して得られた微小生体組織片は、図７を参照すると、９６穴反応用ウェルプレート４において、ＡＤ脳と正常脳に由来するものが隣り合わせになるように配置した。図７の１６カセットの模式図において、２．４チップに記された数値ＮａはＡＤ脳のサンプル番号（Ｎは１〜１６）、数値Ｎｎは正常脳のサンプル番号（Ｎは１〜１６）を示す。そして、９６穴反応用ウェルプレート４においては、左右に並んだ１対の微小チップを同じ候補化合物に浸漬した。浸漬方法は後述する。これらを３セットのカセットについて行い、９６穴ウェルプレート１枚にて、４８の候補化合物の浸漬を可能とした。候補化合物に浸漬した後乾燥した小チップは、専用プログラムＰ３概要に示すようにセット１〜３の６個の１６カセットに順番に載せた。次いで、これを、図８に示す質量分析装置用プレート５上に移動し、イメージング質量分析（方法の詳細は後述）を行った。質量分析装置用プレート５は後述する質量分析装置の専用のものである。
【００８３】
（３）化合物の希釈及び浸漬方法
既存のラボラトリーオートメーションシステムを用いて、専用の浸漬自動化プログラムを開発して使用した。化合物プリカーサイオン解析用スポッティング、化合物希釈の自動化プログラムでは、Ｂｉｏｍｅｋ  ＮＸ（ベックマン・コールター株式会社製）を用い、化合物希釈用プレート、ライブラリ化合物プレート、ナノマトリクス添加用プレート、質量分析装置用プレートを準備して実施した。化合物浸漬用自動化プログラムでは、Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸ（ベックマン・コールター株式会社製）を用い、ライブラリ化合物プレート、化合物希釈用プレート、５０体積％エタノール、９６穴反応用ウェルプレートを準備して実施した。上記化合物ライブラリは濃度１０ｍＭで提供された。これを５０体積％アセトニトリル、０．１体積％トリフルオロ酢酸水溶液にて１００分の１に希釈し１００μＭ溶液とした。希釈した溶液は、２Ｄコード検索式の保管システム（STT1000kiwi, Liconic Instruments, Liechtenstein and Boston）にて、−２０℃で保管した。
【００８４】
（４）プリカーサイオンの解析・選別方法
イメージング質量分析に使用する候補化合物については、上記の希釈済み１００μＭ溶液０．８μＬを後述するナノマトリクスを用いた飛行時間型質量分析（使用装置：株式会社島津製作所製、ＡＸＩＭＡ（登録商標）  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：正イオンモード、レーザー強度６０にて２ショット＊１２１点解析の集積）にて、化合物の分子量（あるいはＮａイオンを付加した分子量）±０．９のｍ／ｚに検出強度１２０００以上のピークを検出する化合物を選別した。使用したライブラリ化合物のうち強い検出のあった７２９化合物（３０９０化合物中）をイメージング質量分析の対象とした。
【００８５】
（５）ナノマトリクスの仕様
イメージング質量分析及びプリカーサイオンの解析においては、平ら（Analyst, 2012, 137, 2006）が開発したナノマトリクスを使用した。このマトリクスは低分子化合物のイオン化に優れるため、今回のような創薬用低分子化合物の分析に適している。
【００８６】
ナノマトリクスは以下の方法にて調製した。２ｇのＦｅＣｌ２−４Ｈ２Ｏを、メルクミリポア社製の超純水システム：Milli-Qシリーズで製造した超純水（以下、ミリＱ水と指称する）１００ｍｌに溶かした。１００ｍｌの３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）をビーカーに入れ、スターラーで混ぜながら、ＦｅＣｌ２溶液を一気に注いだ。この時点で、溶液は、６０℃程度となった。これを、室温で３０分放置して、軽くスターラーで混和しながら、冷却した。この溶液を、５０ｍｌのチューブに１／５ずつ分注し、４℃で、１２０００ｘｇの条件で２０分間遠心し、上清を廃棄した。ミリＱ水を３５ｍｌを加え、沈殿を砕きつつ、５分〜７分間、超音波処理をした。再び、４℃で、１２０００ｘｇの条件で２０分間遠心し、上清を廃棄した。超音波処理を除き、ミリＱ水への交換工程を３回繰り返した。９９．５体積％のエタノールを３５ｍｌ加え、３分間、ｖｏｒｔｅｘ撹拌装置による振とう処理及び超音波処理を行った後、４℃で、１２０００ｘｇの条件で２０分間遠心し、上清を廃棄した。４５℃で３時間置くことにより、エタノールを除去した。得られたナノマトリクスは、使用まで、４℃のデシケータで保存した。
【００８７】
ナノマトリクスは以下の方法にて使用した。上記方法で得られたナノマトリクスに、９９．５体積％のアセトニトリルを１ｍｌ加え、ペレットミキサーにて粉砕した。その後、５分間の超音波処理を行い、４℃で、１００００ｘｇの条件で１０分間遠心し、上清を分取した。アセトニトリルの添加と遠心及び上清の分取を５回繰り返した。これを、メタノールにて１／１０希釈し、１６カセット３セット分あたり、希釈液２ｍｌを、８ｃｍの距離から工アブラシにより塗布した。なお、プリカーサイオン検出には上記を希釈せず質量分析用３８４ウェルターゲットプレートの１ウェルあたり０．８μｌを使用した。
【００８８】
（６）微小生体組織片を添付した微小チップの作製
ヒトの凍結脳は、７ｍｍ厚の前頭葉冠状断一片として供与されたものをマイナス１８℃環境において、スズキ株式会社製超音波カッターＳＵＷ−３０を用いて、約１４ｍｍ角に形を整え、四角のブロック状とした。この脳ブロックを、ライカマイクロシステムズ株式会社製クリオスタットＣＭ１９５０のサンプル台に、低温硬化性樹脂（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｃｈ製  ＯＣＴコンパウンド）を最小量用いて固定化した。１４ｍｍ角、１２μｍ厚の切片を作製し、２．４チップを１６個配置した１６カセット上に載せた。手指で、カセットの裏から熱を加えて溶解添付後、３７℃１時間の乾燥固定を行い使用まで４℃に保管した。１６カセットを４℃保存から室温に戻す際には、乾燥剤を入れた室温の密封箱に入れ１０分おいて、結露を防いだ。このカセットを操作装置３とともに所定位置に配置し、ロボットハンドシステムにて上記の専用プログラムＰ２を用いて、２．４チップを１６カセットから分離し、ＡＤ脳由来の微小生体組織片、対照脳由来の微小生体組織片の載ったチップが隣り合わせになるよう９６穴ウェルプレートに移動した。
【００８９】
（６）イメージング質量分析における化合物の添加方法
ＡＤ脳由来の微小生体組織片、正常脳由来の微小生体組織片が載った微小チップに、化合物浸漬自動化プログラムを用いて候補化合物を浸漬した。初めに、全ての２．４チップに５０体積％エタノールを添加して２分後に除去した。続いて保管システムより取り出した希釈済み該当化合物溶液を５０体積％エタノールにより１０分の１希釈し１０μＭ溶液としたものを二分した。これらを、ＡＤ脳由来の微小生体組織片、正常脳由来の微小生体組織片が載った微小チップにそれぞれ５５μＬずつ添加した（化合物浸漬用特殊９６穴プレート使用の場合）。或いは複数化合物に同時に浸漬する場合には、プリカーサイオン検出時のｍ／ｚ値の重ならない８種類の候補化合物を選択した。１００μＭ希釈済みの化合物溶液７．５μＬずつを１９０μＬの５０体積％エタノール溶液中に添加して総量を２５０μＬとし、各化合物濃度を３μＭに調製した混合化合物溶液を、上記同様、微小チップに５５μＬずつ添加した。室温にて１時間浸漬後に化合物溶液を除去し、５０体積％エタノールで２分間１回洗浄した。次いで、室温にて１時間以上乾燥した。続いてロボットハンドの専用プログラムＰ３（図７）によりＡＤ脳薄切片の載った小チップ及び正常脳の載った小チップが隣り合わせになるように１６カセット上に２．４チップを再配置した。２．４チップがセットされた１６カセットにエアスプレー装置（ＧＳＩクレオス製ＰＳ２７０及びＰＳ３１３）を用いて、ナノマトリクスを噴霧した。
【００９０】
（７）イメージング質量分析
イメージング質量分析は、飛行時間型質量分析装置（株式会社島津製作所製、ＡＸＩＭＡ（登録商標）  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を用いた。測定には、図８に概念的に示したＡＸＩＭＡ用特殊イメージング質量分析プレート上に載せた１６カセット上の２．４チップ２つ（ＡＤ及び正常脳）にまたがる２ｍｍ＊１ｍｍの領域を、正イオンモード、レーザー強度６５にて３５μｍ間隔で２ショット＊１６８２点のイメージングイオン検出を行った。検出後、装置付属のＭＡＬＤＩ−ＭＳソフトウェア上にて、Intensity Mapping機能を用いてイメージング解析を行い、結果を得た。複数化合物同時イメージング解析には、上記同様に質量分析装置により取得したデータを、BioMap software (http://www.maldi-msi.org/)に出力して使用した。
【００９１】
（８）結果
図１０にＡＤ脳親和性（陽性）の検出例、図１１に正常脳親和性（陰性）の検出例を示す。negative controlのチップセットを同時に解析し、positive画像からnegative画像を差し引くことでチップごとの検出個体差をある程度緩和した。なお、negative controlのチップセットとは、希釈化合物溶液を調製する際に、ライブラリからの化合物を添加しない以外は、上記と同様にして得られた試料である。図８に示す質量分析装置用プレート５に設置した１６カセットのうち、６つに１つは、negative controlのチップセットを設置した。negative controlのチップセットには、他のチップセットと同様に、AD脳由来の組織片と、正常脳由来の組織片とが隣り合うように配置した。
【００９２】
図１０のイメージング解析画面を参照すると、AD脳組織試料である左上のパネルのpositive画像は、正常脳組織試料である右上のパネルのpositive画像と比較して、検出強度と場所を示す黒い点の大きさ及び密度が高いことから、化合物の存在量が高いことが視覚的に確認できる。また、左下のAD脳組織のnegative画像、右下の正常脳組織のnegative画像をそれぞれの画像から差し引くことにより、より顕著に確認できる。右２段目に示したスペクトル上でも、図１０において使用した化合物は、ＡＤ脳親和性がポジティブであることが結論付けられる。図１１においては、正常脳組織試料である右上のパネルのpositive画像が、AD脳組織試料である左上のパネルのpositive画像よりも黒い点の密度が高いことが視覚的に確認でき、同様にして、正常脳親和性がポジティブであることが結論付けられる。
【００９３】
このようにして、ＡＤ脳親和性がポジティブと考えられる化合物にＡＤ＋の評価をつけた。その逆の場合にＮ＋（Ｎｏｒｍａｌ＋）の評価をつけ、それらの中間の場合に両方ポジティブ（ｂｏｔｈ＋）または検出されなかった場合は両方ネガティブ（ｂｏｔｈ−）等の評価を行った。プリカーサイオン解析を行った３０９０化合物のうち、比較的強いイオン検出を示した７２９化合物において、ひとつの化合物あたりイメージング質量分析を３回以上行った結果、少なくとも３回のＡＤ脳親和性を示した化合物が１１種類得られた。これら１１種類の化合物については、顕著にＡＤ脳への親和性を示すものと考えられる。
【００９４】
複数化合物同時イメージングの結果を、下記表１に示す。Ｓｅｔ１、Ｓｅｔ２とも、化合物番号Ａ００１は、ポジティブコントロールとして用いた化合物である。表１の結果から、８種類の化合物を同時イメージングした場合でも、１種類ずつイメージングした場合と同様に、それぞれの化合物について、ＡＤ脳親和性、正常脳親和性についての結果が得られることがわかった。これにより、適正な濃度の化合物を添加することで、多数の化合物を、同時にイメージング質量分析により親和性解析をすることが可能と考えられる。特に高速なスクリーニングが必要な大規模ライブラリのスクリーニングにおいては、強力なシステムとなり得る。
【００９５】
【表１】
2016080531.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【００９６】
現時点で有効な根本治療薬のないアルツハイマー病やパーキンソン氏病において、早期または発症前診断法の開発が喫緊の課題となっている。これらの疾患に特徴的な病原性蛋白凝集体を非侵襲的に可視化できるＰＥＴトレーサーは早期診断に利用でき、早期医療介入の手助けとなる。特にアルツハイマー病ではタウ凝集体、パーキンソン氏病ではレビー小体を可視化できるＰＥＴトレーサーが必要とされている。本発明はこれらＰＥＴトレーサーの開発スピードを格段に高めるのみならず、病原性蛋白凝集体を標的として治療薬の開発にも有用であり、結果として医療費の抑制をもたらすことが期待される。加えて、早期の微小ながんの診断用ＰＥＴトレーサーの開発にも有用である。このことより、現在の製薬・医療業界にて早急に必要となる技術であると考えられる。
【符号の説明】
【００９７】
１００      微小生体組織片の作製装置
１          微小チップ
１１        載置部
１２        角
２          支持装置（カセット）
２１        底部
２２        周縁部
２４ａ、ｂ  仕切板
２５        セル
２６        孔
２７        支持面
２８        真空ポート
２９        真空パッド
３          操作装置
３１        可動ピン
３２        固定部
３３        ガイド
４          反応用ウェルプレート
４１        ウェル
５          質量分析装置用プレート
Ｓ          生体組織薄片
ｄＳ        微小生体組織片
【図１】
2016080531.tif 000004
【図２】
2016080531.tif 000005
【図３】
2016080531.tif 000006
【図４】
2016080531.tif 000007
【図５】
2016080531.tif 000008
【図６】
2016080531.tif 000009
【図７】
2016080531.tif 000010
【図８】
2016080531.tif 000011
【図９】
2016080531.tif 000012
【図１０】
2016080531.tif 000013
【図１１】
2016080531.tif 000014