(57)【要約】      （修正有）【課題】老化防止の枠を越え、若返りも可能にする新規な若返り法、及び該若返り法により効果を示す化合物を有効成分とする老化防止剤の提供。【解決手段】細胞質タンパク質合成を制限し、細胞老化の防止及び老化細胞の増殖を再開させる実現される若返り法、及び細胞質タンパク質合成を特異的或いは非特異的に阻害する化合物を有効成分とする老化防止剤。該化合物としては、アーユルヴェーダで使用される健康長寿レシピの中から選ばれる乾燥ハーブ３２種（アムラ、ヤツデアサガオ、ナガコショウ、ベルノキ、木胡蝶、キダチヨウラク、ステレオスペルマム、タイワンウオクサギ、タマツナギ、オオバフジボグサ、モスビーン、テラムナスラビアリス、テンジクナスビ、キミノヤマホロシ、ハゼノキ、ケブラ・ペドラ、ブドウ、イボツヅラフジ、サンナ等）の水抽出物、又はシクロヘキシミドであることが好ましい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質タンパク質合成を制限し、細胞老化の防止および老化細胞の増殖を再開させることにより実現される若返り法。
【請求項２】
細胞質タンパク質合成を特異的あるいは非特異的に阻害する化合物を有効性分として含有する請求項１記載の老化防止剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、細胞質タンパク質の合成を制限することにより実現される美容健康製品（医薬品、健康食品、または化粧品）に関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒト正常細胞は、継代培養を続けると老化する。これを継代老化という。多くの正常またはがん細胞へ老化誘導剤を投与すると、継代老化と同様な現象が生じる。細胞老化は個体の老化の主因であることが、先端生命科学の技術を用いて明らかになっている。従来、細胞老化の作用機序が多くの研究者によって研究されてきたが、普遍的かつ明確な分子機序は不明のままであった。こうした状況を打破するために、申請者は、細胞老化の不均衡増殖モデルを提示している。このモデルに基づき、細胞老化の実用的な抑制法のみならず、老化細胞の若返法を探索した。【０００３】細胞老化は、さまざまな細胞型および誘導手段を用いて誘導できる。また、個体の寿命は、遺伝子欠損や薬物投与などによって短縮することが分かっている。一方、細胞の分裂寿命の延長に関しては、抗酸化物質の投与［例えば、非特許文献１］、ＭＡＰキナーゼ活性の抑制［例えば、非特許文献２］、テロメラーゼ遺伝子の強制発現［例えば、非特許文献３］、ストレス応答機能の不活性化［例えば、非特許文献４］、細胞周期調節因子ｐ２１の破壊［例えば、非特許文献５］等が知られている。しかし、これらの公知技術は、細胞寿命の延長効果は乏しく、実用化および副作用の面からもヒトへの応用は困難である。個体寿命の延長に関しては、科学的な実施例は見当たらない。【０００４】  申請者は、すでに、細胞老化の抑制を目的とする特許を出願している［特許文献１および特許文献２］。前者では、老化誘導剤の投与により老化している細胞へ高濃度タンパク質合成阻害剤を同時添加すると、その後の正常培地における細胞の生存率が上昇することを報告している［特許文献１］。この研究は、本発明のごく一部の側面にのみ言及したものであり、老化誘導剤存在下での細胞の永続的な増殖および細胞の若返りまで言及していない。後者では、ＧＮＧ１１遺伝子の発現をアンチセンスＲＮＡ法で抑制すれば、細胞寿命が延長することを示しているが、老化誘導剤の作用には影響せず、細胞の若返りとは無縁である［特許文献２］。以上のように、これらの類似な特許は本発明とは本質的に異なる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００６−２４９０１５細胞老化抑制剤
【特許文献２】再表２００７／１０２５７２細胞老化抑制剤
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｐａｃｋｅｒ，Ｌ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｒ．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ：ａ  ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，７４，１６４０−１６４１（１９７７）．
【非特許文献２】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．ＥＲＫ１／２  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｕｎｂａｌａｎｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｅｘｃｅｓｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，４２５，８９７−９０１（２０１２）．
【非特許文献３】Ｋａｕｌ，Ｓ．Ｃ．，Ｙａｇｕｃｈｉ，Ｔ．，Ｔａｉｒａ，Ｋ．，Ｒｅｄｄｅｌ，Ｒ．Ｒ．＆  Ｗａｄｈｗａ，Ｒ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｍｏｒｔａｌｉｎ  （ｍｏｔ−２）／ｍｔｈｓｐ７０／ＧＲＰ７５  ａｎｄ  ｈＴＥＲＴ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２８６，９６−１０１（２００３）．
【非特許文献４】Ｉｄｅ，Ａ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｍ．，Ｎａｋａｂａｂａｓｈｉ，Ｋ．＆  Ａｙｕｓａｗａ，Ｄ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐ５３  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  Ｅ６  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６２，１４５８−１４６０（１９９８）．
【非特許文献５】Ｊ．Ａ．Ｂｏｎｄ，Ｍ．Ｆ．Ｈａｕｇｈｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｒｏｗｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ，Ｖ．Ｇｉｒｅ，Ｄ．Ｗｙｎｆｏｒｄ−Ｔｈｏｍａｓ，＆Ｆ．Ｓ．Ｗｙｌｌｉｅ，Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｐａｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ：Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎａｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍ１  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍ２  Ｃｒｉｓｉｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９，３１０３−３１１４（１９９９）
【非特許文献６】Ｓｕｍｉｋａｗａ，Ｅ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｓａｋｅｍｕｒａ，Ｒ．，Ｆｕｊｉｉ，Ｍ．＆  Ａｙｕｓａｗａ，Ｄ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｕｎｂａｌａｎｃｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｅｃｈａｎｏ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ，３３５，５５８−５６５（２００５）．
【非特許文献７】Ｅｎｎｉｓ，Ｈ．Ｌ．＆  Ｌｕｂｉｎ，Ｍ．Ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ：Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４６，１４７４−１４７６（１９６４）．
【非特許文献８】Ｚｉｎｃｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｖｅｒｇｅ  ｏｎ  Ｅｌｋ−１．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１５，４９３０−４９３８（１９９５）．
【非特許文献９】Ｔｅｒａｄａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１，１１４７７−１１４８１（１９９４）．
【非特許文献１０】Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．，Ｄｕｂｅ，Ｄ．Ｋ．＆  Ｒｏｙ，Ｓ．Ｃ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｍｅｔｉｎｅ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ  ｏｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，１２８，４６１−４６２（１９７２）．
【非特許文献１１】Ｇａｉｎｅｓ，Ｇ，＆  Ａｔｔａｒｄｉ，Ｇ．Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１７２，４５１−４６６（１９８４）．
【非特許文献１２】Ｋｏｚｉｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ  Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｌｏｗｓ  ｄｏｗｎ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ，１３，１０３８−１０４８（２０１４）．
【非特許文献１６】Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐａｍｙｃｉｎ  ｆｅｄ  ｌａｔｅ  ｉｎ  ｌｉｆｅ  ｅｘｔｅｎｄｓ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，４６０，３９２−３９５（２００９）．
【非特許文献１７】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｂ．Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｂｏｔｈ  ｓｔｒｅｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｔｏ  ｙｅａｓｔ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ９７７２９（２０１４）．
【非特許文献１８】Ｔａｎｒｉｋｕｌｕ−Ｋｕｃｕｋ，Ｓ．＆  Ａｄｅｍｏｇｌｕ，Ｅ．Ｄｉｅｔａｒｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｇｉｎｇ：ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，９０，９２４−９２８（２０１２）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の目的は、効果的かつ根本的に細胞老化を防止し、さらに、老化した細胞の増殖を再開させることにより、実用的価値の高い老化防止法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本願発明者らは、種々の細胞老化誘導系において、低濃度シクロヘキシミドを投与すると、（１）細胞老化の誘導が抑制されること、（２）細胞は細胞老化の特徴を示さずに増殖すること、（３）正常細胞の分裂寿命が著しく延長すること、（４）継代老化によって完全に老化したヒト正常細胞が増殖を再開すること、（５）個体老化のモデルとされる線虫の生存寿命が顕著に延長すること、を見いだした。とくに、（４）の発見は老化研究の常識を覆すものであり、新規性が極めて高い。シクロヘキシミドは細胞質タンパク質の合成を特異的に阻害するので、細胞質タンパク質量を調節すれば、細胞老化は起こらないことが明らかとなり、本発明が完成した。【０００９】  本発明は、細胞質タンパク質の合成を制御する活性を有する化学物質、又は植物エキス、又は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、又はタンパク質性因子等を有効成分として含有する老化防止剤を提供する。
【発明の効果】
【０００１０】  本発明によれば、多様な細胞傷害に起因する組織の老化を防止でき、さらに、老化細胞の再生戦略に基づく組織の若返りも可能であるので、従来想到できなかった種々の応用が可能である。例えば、老化防止および若返り効果のある医薬品、健康食品・サプリメント、化粧品等の提供が例示できる。
【図面の簡単な説明】
【０００１１】
【図１】種々のタンパク質合成阻害剤の添加およびメチオニン飢餓が、老化誘導剤の添加によるＨｅＬａ細胞の老化誘導に及ぼす効果である。（左パネル）ＨｅＬａ細胞に符号で示した老化誘導剤とタンパク質合成阻害剤を同時に添加し、２週間の培養の後にコロニーをＣＢＢ色素で染色した。（右パネル）符号で示したメチオニン濃度を含む培養液を用いて、ＨｅＬａ細胞の老化誘導試験を行った。
【図２】符号で示すシクロヘキシミドと老化誘導剤を同時に添加したとき、ＨｅＬａ細胞の増殖がどうなるか示した図である。（左パネル）ＨｅＬａ細胞へ試薬を添加し、経時的に細胞数を計測し、３回の測定の平均値で示した。（右パネル）培養７日後に細胞形態と細胞老化特異的β−ガラクトシターゼの染色像を示した。
【図３】シクロヘキシミドのＴＩＧ−７細胞の継代老化へ及ぼす効果である。（上パネル）老化直前のＴＩＧ−７細胞（６７  ＰＤＬ）へ符号で示すシクロヘキミドを添加し、１ヶ月間培養した。細胞を老化特異的β−ガラクトシターゼで染色した後、ＣＢＢ色素で染色した。（下パネル）若いＴＩＧ−７細胞（３７  ＰＤＬ）へ符号で示すシクロヘキミドを添加し、最大分裂寿命を測定した。矢印はシクロヘキミドの添加時期、測定値は４回の実験の平均値で示した。
【図４】シクロヘキシミドまたはハーブエキスの添加が老化したＴＩＧ−７細胞へ及ぼす効果である。完全に老化したＴＩＧ−７細胞（７２  ＰＤＬ）へ符号で示したシクロヘキミドあるいはハーブエキスを添加し、１ヶ月間の培養後に細胞をＣＢＢ色素で染色した。
【図５】シクロヘキシミドまたはハーブエキスをカンプトテシンの添加により老化したＴＩＧ−７細胞へ添加したとき、細胞容積とタンパク質含量へ及ぼす効果を示した図である。若いＴＩＧ−７細胞へ符号で示したカンプトテシンとシクロヘキシミドまたはハーブエキスを添加し、７日間培養した。次いで、細胞容積と細胞当たりの全タンパク質含量を測定した。数値は３−４回の測定の平均値を示す。
【図６】シクロヘキシミドまたはハーブエキスの線虫の寿命に及ぼす効果である。（上パネル）符号で示したシクロヘキシミドを含むＮＧＭ寒天培地へ１００匹の成虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を移植し、２５．５℃で新鮮な同培地で生育させた。毎日、線虫の生死を観察し、生存率を求めた。（下パネル）符号で示したハーブエキスを含有する同培地で同様な実験を行った。
【図７】ヒト被験者を用いたハーブエキスの若返り効果を示す表である。４７人の被験者が１ヶ月間、毎日２０ｍＬのハーブエキスを経口摂取した。次いで、該当する若返り効果についてアンケートを実施した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】  一般に、タンパク質の合成を制限する方法は幾つかある。下記の実施例に記載されているように、ラパマイシン、エメチン、アクチノマイシンＤ、メチオニン飢餓、アミノ酸飢餓などはタンパク質合成を阻害する。しかし、微量のシクロヘキシミドのみが、効果的かつ普遍的に細胞および個体の老化を防止した。したがって、細胞質タンパク質合成を特異的に阻害するシクロヘキシミドあるいはこれと同等な活性を有する形態が本発明で提案する老化防止剤として好ましい。
【００１３】  本発明による老化防止剤は、細胞質タンパク質合成を特異的に阻害する物質を有効成分として含有する。有効成分とは、化学物質、微生物生産物、植物エキスおよびその精製標品を挙げることができる。また、現時点では実現性に乏しいが、タンパク質合成に関与する遺伝子に対するアンチセンス核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ、抗体、ペプチド等を有効成分として例示することができる。
【００１４】  経口摂取により腸管から吸収され、肝臓の解毒反応をすり抜け体全体に浸透できる形態として、低分子化合物又は微生物生産物又は植物由来の有機化合物を含有する製剤が挙げられる。副作用の軽減等を考慮すれば、臨床試験で安全性がすでに確立されている東洋伝統医学で用いる植物エキスが本発明の実施に最適である。場合によっては、植物エキスを組み合わせて用いることもできる。この場合、東洋伝統医学の確立された処方箋に従うのが望ましい。
【００１５】１．本発明を医薬品として用いる場合、
本発明の老化防止剤は、特定疾患を対象とする医薬品として用いることができる。医薬品としては、より具体的には、老人性神経疾患、老人性皮膚疾患、アレルギー、アトピー、動脈硬化症、高血圧症、糖尿病、肥満等の疾患を対象とするまた、医学的に老化防止措置を目的とすることもできる。
【００１６】  医療機関等においては、本発明の老化防止剤は、経口、皮内、皮下、静脈または筋肉に投与することが可能である。医療行為として実施する場合には、上記に示した多様な原材料から作成した老化防止剤の使用が可能となる。好ましくは、化学物質、微生物生産物、植物エキスおよびその精製標品が望ましい。
【００１７】    本発明形態が有機化合物を含有する場合、活性成分を単独でまたは製剤上許容し得る担体との組み合わせで、経口、非経口または局所のいずれかの経路により投与することが可能である。かかる投与は単一または複数用量にて実施する。一般に、活性成分を種々の製剤上許容し得る担体と組み合わせて、種々の溶液製剤（例えば、無菌水溶液、水性懸濁液および食用油溶液）を作製できる。水溶液は適宜緩衝化し、該溶液を血液と等張にするために十分量の塩またはグルコースを含有させる。水性懸濁液は適切な分散剤または懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを含有してもよい。経口投与用に水性懸濁剤および／またはエリキシルを所望する場合には、活性成分を種々の甘味剤または矯味剤、着色剤または色素と組み合わせ、所望により、希釈剤、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび種々のそれらの併合剤とともに乳化剤および／または懸濁化剤も組み合わせることができる。
【００１８】  本発明形態は、錠剤、粉末、カプセル、ロゼンジ、トローチ、硬化キャンディ、粉剤、噴霧剤、クリーム、ろう膏、坐剤、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション、軟膏、懸濁剤、溶液剤、エリキシル、シロップなども可能である。かかる製剤には、溶媒、賦形剤、コーティング剤、塩基、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、可溶化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤などを添加することができる。錠剤は、デンプン、乳糖、グルコース、微結晶性セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタンなどの賦形剤、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロースなどのコーティング剤、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロースなどの結合剤、およびデンプン、寒天、ゼラチン、炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤、を含有してもよい。更に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの潤滑剤も錠剤の調製には有用である。ゼラチンカプセルを充填剤として採用した場合、好適な物質として乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールを採用することができる。
【００１９】  本発明の老化防止剤を静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等の非経口投与や経口投与により患者の全身に投与する場合、シクロヘキシミド（モル質量２８１．３５ｇ）の最適投与量は、通常、体重１ｋｇ当たりの一日量として０．０２μｇ／ｋｇである。また、特定の組織を標的とする場合、組織の増殖状態およびタンパク質合成能力を考慮し、好ましくは約０．００１μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇを単回または分割投与する。しかし、治療を受ける患者の体重および状態、採用する活性成分の種類、治療すべき病状、および選択した特定の投与経路により適宜変更し得る。かかる投与条件では、通常の体内組織のタンパク質合成活性は（無投与の対照群）の数パーセント〜約９０％まで低下することが期待される。したがって、シクロヘキシミドと同様な活性を有する化合物を含有する本発明形態を採用する場合には、その体内組織のタンパク質合成活性の抑制度合は、対照群と比較して数パーセント〜約９０％まで低下するレベルを採用することが望ましい。
【００２０】  本発明化合物が核酸製剤の場合、オリゴＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、遺伝子ノックダウン用オリゴＲＮＡ、Ｓ−オリゴなどの形態をもつ老化防止剤を注射又は点滴等により、体内へ注入できる。アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡｉ法に用いる配列は、タンパク質合成の伸長因子遺伝子（ＥＦ−１、ＥＦ−２）やリボソームを構成するタンパク質成分を標的とする。伸長因子は、ＲＮＡからタンパク質を合成する「翻訳」において、ポリペプチド鎖の伸長を促進するタンパク質。ＥＦ−１はアミノアシルｔＲＮＡをリボソームのＡ部位に正しく供給し、ＥＦ−２は、次のｔＲＮＡが入れるように、リボソームのＡ部位の場所を空ける。リボソームは多くのタンパク質成分から構成されるタンパク質の製造工場である。ＲＮＡｉ法は標的とするＲＮＡの部分領域と同一の塩基配列を有する二本鎖ＲＮＡが、標的とするＲＮＡの前記部分領域を切断する作用を利用した技術である。ヒト細胞では、塩基数２１〜２３の二本鎖の短鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、該ｓｉＲＮＡのうちの一本の鎖と同じ塩基配列を有するＲＮＡを切断することがわかっているので、このようなｓｉＲＮＡを利用して標的遺伝子の発現を阻害することが可能である。すでに、ｓｉＲＮＡの設計と作成法は確立しており、とくにそれを記載するに及ばない。核酸製剤の場合、有効成分を単に生理緩衝食塩液等の薬剤として許容できる媒体に溶解または懸濁しても、核酸が機能する細胞内へ浸透する効率が極めて低いという難点がある。細胞内への核酸の取り込みを増加させるため、電気パルス法や超音波法の併用、また遺伝子導入用脂質からなるリポソームで核酸を包み込んでもよい。これにより、細胞膜を構成している脂質二重膜を核酸が通過しやすくなる。しかし、核酸製剤を用いる効果的な遺伝子発現阻害法は前記の低分子化合物や植物エキスおよびその精製標品を用いる本発明の形態に比べると、現在の科学水準を考慮すると現実的ではない。
【００２１】  本発明化合物がタンパク質製剤の場合、上記タンパク質合成の伸長因子（ＥＦ−１、ＥＦ−２）やリボソームタンパク質の合成を阻害するタンパク質性因子も当然ながら本発明の老化防止剤の有効成分として用いることができる。このような物質として、ＥＦ−１又はＥＦ−２又はリボソームタンパク質に対する抗体を挙げることができる。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、ポリクローナル抗体であれば、対象とするタンパク質の全てのエピトープに対する抗体が含まれるので、対象とするタンパク質の機能を阻害する可能性が高い。また、タンパク質成分は他のサブユニットと特異的に結合するので、それらの因子の結合ドメインも抗体と同様に用いることができる。しかし、標的タンパク質は細胞内で機能するので、抗体を用いる標的タンパク質の効果的な阻害法は現在の科学水準を考慮すると現実的ではない。
【００２２】２．本発明を健康食品として用いる場合
本発明の老化防止剤は、体全体の老化を防止するために健康食品の成分として用いることもできる。すなわち、本発明の健康食品は、上記の細胞質タンパク質合成を制御する物質を活性成分として含有する。本明細書中、「健康食品」という用語は、飲料、サプリメント、栄養補助食品などを含む広範な概念の用語として用いられる。健康食品は、上記活性成分を、液状、ゲル状あるいは固形状の食品、例えばジュース、清涼飲料、茶、スープ、豆乳、サラダ油、ドレッシング、ヨーグルト、ゼリー、プリン、ふりかけ、育児用粉乳、ケーキミックス、粉末状または液状の乳製品、パン、クッキー等に添加したり、必要に応じてデキストリン、乳糖、澱粉等の賦形剤や香料、色素等とともにペレット、錠剤、顆粒等に加工したり、またゼラチン等で被覆してカプセルに成形加工することによって調製することができる。綿実油、ごま油、やし油または落花生油のような食用油を食用油溶液用に採用することができる。これらの健康食品の製造に際しては、適宜、着香料、着色料、呈味料、安定剤、増量剤などを併用することができる。なお、健康食品中の活性成分の含有量はとくに限定されることなく、例えば、全身あるいは特定組織のタンパク質合成活性を１〜９９％低下させるレベルの含有率を採用できる。
【００２３】３．本発明を化粧品として用いる場合
本発明の老化防止剤は、皮膚の再生、しわ取り、しみ取り等を目的とする化粧品の成分として用いることもできる。この場合は、好ましくは標準的な手法に従って、クリーム、ゼリー、ゲル、ペースト、軟膏などの形態に調製する。本発明の化粧品は、細胞老化抑制作用を有するので、とくに、抗しわ剤、しわ取り剤、しみ取り剤として好適である。本発明の化粧品は、常法にしたがい、化粧水、クリーム、乳液、ファンデーション、油性化粧料、パック剤、皮膚洗浄剤、スプレー剤、エアゾール剤等の化粧品および薬用化粧品（医薬部外品）、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、乳剤等の薬用外用剤に調製して使用することができる。本発明の化粧品に適した基剤としては、従来から一般に用いられている種々の基礎化粧料基剤、例えば、各種アルコール類、炭化水素類、脂肪酸類、リン脂質、油脂類、ロウ類が挙げられ、これらを、単独でまたは組み合わせて用いることができる。いずれの基剤を用いた場合であっても、好ましくは、本発明の外用剤は水およびアルコールおよい脂質を含む。
【００２４】  本発明の化粧品には、皮膚内への吸収を高めるため、吸収促進剤として、例えば、界面活性剤、テルペン類、１−アルキルピロリドン類、テシルメチルスルホキシド、イソプロピルミリステート、リン脂質微小球またはそれらの混合物を含有させることができる。本発明の化粧品の製造には、化粧品、薬用化粧品または外用剤の技術分野において通常用いられる方法を使用することができる。製造にあたり、所望により適宜、防腐剤、芳香剤、保湿剤、安定剤、老化防止剤、色素類、ホルモン類、ビタミン類を適宜選択して添加することができる。なお、健康食品中の活性成分の含有量はとくに限定されることなく、例えば、皮膚などの特定組織のタンパク質合成活性を１〜９９％低下させるレベルの含有率を採用できる。
【実施例】
【００２５】  以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００２６】１．材料及び方法【００２７】１）細胞培養
本実験では、おもにヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−７とヒト子宮頚癌由来ＨｅＬａ細胞株（ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手可能）を用いた。細胞は、３７℃、５％の二酸化炭素、９５％の湿気の下、ダルベッコ改変イーグル培地に５−１０％のウシ胎仔血清を添加し、プラスチックデッシュで培養した。本実験では、集団倍加レベル（Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ、ＰＤＬ）３２のＴＩＧ−７細胞を若い細胞として用いた。通常の培養条件では、ＴＩＧ−７細胞はＰＤＬ７０手前で分裂を停止し、老化する。【００２８】２）コロニー形成試験
細胞をディッシュに均一に撒き。コロニーを形成させた。コロニーの形態を光学顕微鏡で観察した後、メチレンブルーで染色し、写真撮影を行った。【００２９】３）細胞増殖曲線
細胞を各種培養条件で培養し、経時的にディッシュから細胞をトリプシンで剥がした。細胞をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液に懸濁し、その一部について血球計算盤を用いて計測した。計測は数回繰り返し、平均値で示した。【００３０】４）細胞容積と高分子の定量
細胞をトリプシンで剥がし、ＰＢＳに懸濁した。光学顕微鏡で写真を撮り、５０個の細胞について直径を計測し、細胞容積を算出した。細胞をトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷上で１分間超音波を照射し、細胞を破壊した。細胞破壊液を５分間、４℃で遠心（１５，０００回転／分）し、上清を細胞抽出液とした。ＤＮＡ濃度はＤＮＡ測定キット（ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ  ｄｓＤＮＡ）、ＲＮＡ濃度はＲＮＡ測定キット（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量した。タンパク質濃度は、測定キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を用いて定量した。【００３１】５）老化特異的β−ガラクトシダーゼアッセイ
細胞を２％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒドで５分間固定した。次に、染色液（１ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル  β−Ｄ−ガラクトシド、２９．４８ｍＭ  クエン酸（ｐＨ６．０）、５８．９６ｍＭ  リン酸水素２ナトリウム、５ｍＭ  フェリシアン化カリウム、５ｍＭ  フェロシアン化カリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、２ｍＭ  塩化マグネシウム）を加え、３７℃で１６時間保温した。ＰＢＳで洗浄後、光学顕微鏡で観察、写真撮影を行った。【００３２】６）ハーブエキスの調製
アーユルヴェーダで使用される健康長寿レシピ（チャバナリスタ）が含有するハーブの中から乾燥ハーブ３２種（原材料名：アムラ、ヤツデアサガオ、ナガコショウ、ベルノキ、木胡蝶、キダチヨウラク、ステレオスペルマム、タイワンウオクサギ、タマツナギ、オオバフジボグサ、モスビーン、テラムナスラビアリス、テンジクナスビ、キミノヤマホロシ、ハゼノキ、ケブラ・ペドラ、ブドウ、イボツヅラフジ、サンナ、ナハカノコソウ、シャタバリ、スイレン、コウキシタン、アダトダウァシカ、アシュワガンダ、マルバノホロシ、着生蘭、カルダモン、セイロンニッケイ、タマラニッケイ、セイロンテツボク、ミロバラン）を選び、配合レシピに従って混合した。この混合物２４７ｇへ水１リットルを加え、１００℃で３時間抽出した。煎じ液を濾過し、約半分の容積になるまで濃縮した。【００３３】２．結果
１）タンパク質合成阻害剤による細胞老化の誘導抑制
本実験では、ヒト正常線維芽細胞ＴＩＧ−７細胞と子宮頸部癌由来のＨｅＬａ細胞をおもに使用し、おもに１．５ｍＭ過剰チミジン（ＤＮＡ前駆体プールの不均衡を誘発し、ＤＮＡ複製を遅滞させる）、１．５μＭカンプトテシン（ＤＮＡの一本鎖を切断し、ＤＮＡ複製を遅滞させる）、１．５μＭアフィディコリン（ＤＮＡポリメラーゼαを阻害し、ＤＮＡ複製を遅滞させる）を細胞老化誘導法に採用した。なお、本実験結果は、細胞種や老化誘導剤の種類に依存しない一般的な現象である。細胞老化の指標として、老化細胞特有な形態変化、老化特異的β−ガラクトシダーゼ活性、コロニーの形成率（分裂能の喪失）等を採用した。【００３４】  種々のタンパク質合成阻害剤を用いて、ＨｅＬａ細胞の老化を抑制する最適濃度を求めた。低濃度のシクロヘキシミド（１０−１００ｎＭ）を使用した場合、細胞老化の特徴は完全に抑制された。シクロヘキシミドとは作用機序が異なるタンパク質合成阻害として、アニソマイシン、ラパマイシン、エメチン、アクチノマイシンＤなどが知られている。また、培養液中のアミノ酸（とくにメチオニン）濃度を低下させ、タンパク質合成を阻害する方法も知られている。これらの効果を調べた結果、すべてシクロヘキシミドには及ばなかった（図１）。この理由として、シクロヘキシミドだけが細胞質のタンパク質合成を特異的に阻害することが挙げられる。他の阻害剤あるいはアミノ酸飢餓は、シグナル伝達系の阻害、ミトコンドリアタンパク質合成の阻害、ＲＮＡ合成阻害などの副作用をもつため、細胞老化の抑制効果が劣ると考えられる。【００３５】次に、上記の細胞老化誘導剤の存在下で、シクロヘキシミドのＨｅＬａ細胞の増殖へ及ぼす効果を調べた。その結果、低濃度のシクロヘキシミドが同時に存在すると、ＨｅＬａ細胞はほぼ正常に増殖し、細胞形態も正常に戻った（図２）。ＴＩＧ−７細胞でも同様な結果が得られた。以上より、低濃度のシクロヘキシミドは細胞老化誘導剤による増殖阻害を解除した。【００３６】２）サイクロヘキシミドによる継代老化の抑制
若いＴＩＧ−７細胞（５０−６０ＰＤＬ）または老化直前ＴＩＧ−７細胞（６７ＰＤＬ）へ低濃度のシクロヘキシミドを添加し、分裂寿命の推移を観察した。細胞形態、老化特異的β−ガラクトシダーゼの染色像、コロニー形成率を評価した。その結果、シクロヘキシミドを添加した細胞では、細胞の分裂レベル（ＰＤＬ）に関係なく、分裂寿命を顕著に延長した（図３）。前記のように、正常線維芽細胞の分裂寿命を延長させる試みはいくつかなされているが、本実験結果は既知のどの方法より優れた結果を提供した。【００３７】３）サイクロヘキシミドによる老化細胞の増殖再開の誘導
完全に老化した細胞は分裂能を喪失しているというのが従来の定説である。そこで、上記のように継代老化で分裂が停止したＴＩＧ−７細胞（７０ＰＤＬ）をさらに１ヶ月間培養し、分裂細胞の消失を確認した。この細胞へ低濃度のシクロヘキシミドを添加し、定期的に培養液を交換し、細胞の変化を観察した。その結果、細胞はゆっくりと正常細胞の形態を示し、約１ヶ月後にはほぼすべての細胞が増殖を再開した（図４）。また、ハーブエキス（最終濃度１０万倍希釈）を添加しても同様な結果が得られた。このとき、抗酸化剤を同時に添加すると、シクロヘキシミドの効果はさらに高まった。以上から、細胞質タンパク質を制限することにより、老化細胞の増殖を再開できた。この発見は老化研究における従来の常識を覆すものである。【００３８】４）シクロヘキシミドおよびハーブエキスの細胞サイズマーカーへ及ぼす効果
シロヘキシミド添加時の細胞の大きさおよびタンパク質量を測定した（図５）。ＴＩＧ−７細胞へ上記細胞老化誘導剤を添加すると、細胞当たりのタンパク質量は共に３−４倍に増加した。このとき、低濃度シクロヘキシミドを添加すると、タンパク質含量は２−４割程度減少した。一方、細胞容積は両者ともに４−６倍に増加し、低濃度シクロヘキシミドが共存すると、すべての実験系で約５０％減少した。ハーブエキス（最終濃度１０万倍希釈）を添加しても同様な結果が得られた。また、ＨｅＬａ細胞でも同様な結果が得られた。これらの結果は、細胞質タンパク質量をわずかに減少させることで、細胞容積は顕著に改善されることを示している。以上より、細胞質タンパク質含量が細胞老化の誘導に関与する重要な因子であることが示された。【００３９】５）シクロヘキシミドおよびハーブエキスによる線虫の寿命延長
線虫は哺乳動物の老化研究のモデル生物として汎用されている。その理由は、線虫で得られた研究結果がヒトにもよく当てはまることが立証されているからである。また、最大の利点は、小型生物（１ｍｍ）であり、実験操作が容易であること、寿命が約１ヶ月と短いことも挙げられる。そこで、孵化して成虫になった線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を種々の濃度のシクロヘキシミドを含有する培地へ移植し、培養を続けた。その結果、シクロヘキシミドは濃度依存的に寿命を延長した（図６）。本培養では、シクロヘキシミドは大腸菌の餌と一緒に摂取される。したがって、実験条件を改善すれば、寿命延長効果はさらに改善できると思われる。また、ハーブエキス（最終濃度３％）を培地に添加しても同様な結果が得られた。以上から、シクロヘキシミドは細胞レベルだけではなく、個体レベルでも老化防止作用を有することが実証された。【００４０】３．考察
本研究によって、細胞質タンパク質量を制限することにより、細胞老化のすべての特徴が消滅した。細胞老化現象は、さまざまな細胞種と多くの老化誘導剤を用いて観察されている。発明者は、任意の細胞老化誘導系において、細胞質タンパク質量の制限が細胞老化現象を打ち消すことを実証した。さらに、老化細胞の増殖再開は、定説を打ち破る新規な発見であり、特筆に値する。学術的価値が高いのみならず、実用的価値を提供する。培養細胞の老化のおもな引き金は酸化ストレスとされている。しかし、生体内で発生する酸化ストレスは通常の細胞培養条件下ほど高くない。むしろ、老廃物や毒素の蓄積による細胞障害が細胞老化の主因であるとされている。生体は毎日多量のタンパク質を分解し、再利用されている。その過程で生じる有害なペプチドは、成人病や慢性疾患の主因とされている。タンパク質量の制御は、老化防止のみならず、健康維持に有益なことが本研究によって示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００４１】  本発明は申請者の細胞老化の長年の基礎研究から生まれた新規な発見であり、その産業上の有用性は大きい。本発明により、細胞および個体の老化防止、さらに若返り作用を含有する医薬品、健康食品・化粧品、健康サプリメントなどの提供が可能になった。これらの製品形態は、健康長寿の実現、成人病や神経疾患の治療、また美容促進などに有益である。昨今の高齢化社会において、平均寿命と健康長寿の乖離（女性１３年、男性９年）の解消が最重要課題になっている。本発明はこの問題解決に貢献することが期待できる。
【符号の説明】
【００４２】  １  試薬なし
２  チミジン  ２ｍＭ
３  カンプトテシン  ７．５ｎＭ
４  アフィディコリン  ０．３μＭ
５  シクロヘキシミド  ０．１５μＭ
６  アニソマイシン  ０．０６μＭ
７  ラパマイシン  ０．０６μＭ
８  エメチン  ０．０３μＭ、
９  アクチノマイシンＤ  ０．８ｎＭ
１０  メチオニン  ３ｍｇ／Ｌ
１１  メチオニン  １０ｍｇ／Ｌ
１２  メチオニン  ２０ｍｇ／Ｌ
１３  メチオニン  ３０ｍｇ／Ｌ
１４  メチオニン  １００ｍｇ／Ｌ
１５  ハーブエキス  １０万倍希釈液
１６  シクロヘキシミド  ０．０９４μＭ
１７  シクロヘキシミド  ０．９４μＭ
１８  シクロヘキシミド  ９．４μＭ
１９  ハーブエキス  ３％液
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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