(57)【要約】【課題】非ストレス下の生育を抑制することなく微生物及び植物の環境ストレス耐性を向上させる手段を提供する。【解決手段】本発明は、シネココッカス属（Synechococcus sp.）に属するNKBG15041cに由来する、新たなメカニズムに基づく増殖促進遺伝子／新規ストレス耐性遺伝子、該遺伝子がコードするタンパク質、及び細胞増殖能及び／又はストレス耐性が向上した形質転換細胞を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)〜(f)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質、をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質、をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の(a)〜(c)から選択されるタンパク質：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞。
【請求項５】
宿主細胞が植物細胞又は微生物細胞である、請求項４記載の形質転換細胞。
【請求項６】
請求項４又は５記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養液の上清から組換えタンパク質を回収することを特徴とする、細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ストレス耐性遺伝子、該ストレス耐性遺伝子がコードするタンパク質、及びストレス耐性が向上した形質転換細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界に存在する生物は塩、高温及び低温、凍結、乾燥等の種々の環境ストレスに曝されている。特に、塩ストレスは多くの生物の生育を阻害する最も大きな要因の１つである。従って、各種微生物や植物の環境ストレス耐性強化のための検討が活発に進められている。
【０００３】
環境ストレス耐性を強化する機能を有するタンパク質は、大別して適合溶質（グリシンベタイン、マンニトール、トレハロース、プロリン）合成酵素や、イオンホメオスタシスに関与する酵素（Na+/H+ アンチポーター）、及びこれらの遺伝子の発現を制御する転写調節因子に大別することができる。これらのタンパク質を発現した形質転換生物で環境ストレス耐性が強化された事例が多数報告されている。例えば、コリンオキシダーゼをコードする遺伝子が染色体DNA中に導入されたユーカリ属の植物体（特許文献１）、耐塩性藍藻 (Aphanothece halopytica) 由来Na+/H+ アンチポーターをコードするDNA（特許文献２）、植物の細胞内におけるプロリン分解系の酵素をコードする遺伝子の発現を抑制することを特徴とする植物のストレス耐性を上昇させる方法（特許文献３）がそれぞれ報告されている。
【０００４】
一方、自然界にはその進化の過程で強力な耐塩性機構を獲得した植物（塩生植物）がある。このような植物群がもつ耐塩性因子を、単独、あるいは複数組み合わせて使用することで、塩生植物並みの強力な耐塩性を獲得した形質転換体（特に植物）を作出できると期待されている。例えば、本発明者らは塩生植物の一種であるマングローブに着目し、既に培養細胞系が確立されているBruguiera sexangulaの培養細胞の分与を得て、この細胞株を100 mMのNaCl存在下で培養し、培養細胞から抽出したmRNAを基にcDNAライブラリーを作製し、この中からマングローブの耐塩性に関与する遺伝子の探索を試み、単離したストレス耐性に関与する遺伝子群の中の１つの遺伝子を導入することにより、酵母、植物細胞（タバコ培養細胞）、そして植物体（タバコ）の耐塩性を強化させることに成功している（特許文献４）。
【０００５】
また、マングローブの１種である、メヒルギ中に新規な耐塩性増大遺伝子が見出され、その塩基配列及びそれがコードするアミノ酸が決定され、さらに該遺伝子を他の植物に導入してその耐塩性が増大することが確認されている（特許文献５）。
【０００６】
しかしながら、従来報告されているイオンチャンネル、適合溶質合成遺伝子の報告では、環境ストレスに対するダメージをある程度軽減することができるが、これらの遺伝子の過剰発現は非ストレス下の生育を抑制してしまう場合が多く、実用化を目指した際の問題になっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００３−１４３９８８号公報
【特許文献２】特開２００３−１８０３７３号公報
【特許文献３】特開２００３−１８６８７９号公報
【特許文献４】特許第４７５４６７６号
【特許文献５】特開２００３−１１６５４６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、従来知られているイオンチャンネルや適合溶質合成遺伝子との相乗効果が期待できる新たな環境ストレス耐性遺伝子を取得することを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、上記の課題を念頭に、耐塩性強化のための遺伝子資源として海洋ラン藻に着目して種々検討した結果、海洋シアノバクテリアで極めて増殖が早いシネココッカス属（Synechococcus sp.）に属するNKBG15041cにおいて、その増殖に関わると考えられる新規遺伝子を見出した。驚くべきことに、当該遺伝子を発現する大腸菌の可溶性画分には、これを発現しない対照の大腸菌と比較して明らかな変性タンパク質の減少が認められた。それと同時に、当該遺伝子を導入した大腸菌等の細胞において、細胞増殖の促進、各種ストレス耐性（耐塩性、浸透圧耐性、熱耐性）の向上という有利な効果を有することが認められ、本発明に至った。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［６］を提供する。
［１］以下の(a)〜(f)から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質、をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質、をコードするポリヌクレオチド。
［２］以下の(a)〜(c)から選択されるタンパク質：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質。
［３］上記［１］記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
［４］上記［３］記載の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞。
［５］宿主細胞が植物細胞又は微生物細胞である、上記［４］記載の形質転換細胞。
［６］上記［４］又は上記［５］記載の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養液の上清から組換えタンパク質を回収することを特徴とする、細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の新規遺伝子は、各種の細胞の生育を促進すると共に、細胞に環境ストレス耐性（耐塩性、浸透圧耐性、熱耐性）を付与することができる。本発明の遺伝子を各種生物、特に微生物に導入することで、有用物質の生産や農林業への応用が期待できる。
【００１２】
更に、本発明の遺伝子は、従来知られていないタイプの機能を有する遺伝子であり、既知の環境ストレス耐性遺伝子との同時利用による「相乗効果」が期待でき、発酵生産や遺伝子組換え植物への応用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のポリヌクレオチドの塩基配列（配列番号１）を示す。
【図２】本発明のポリヌクレオチドがコードする本発明のタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌DH5αの耐塩性を示す（培地：2YT培地 (amp 50 mg/ml)、37℃）。培地中の塩濃度（NaCl）は、（A)86mM、(B)500mM、(C)1000mMとし、15時間まで培養して、細胞濃度をOD600により測定した。○は本発明の遺伝子を導入した大腸菌、●は対照を示す。
【図４】本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌DH5αの浸透圧耐性及び熱耐性を示す（培地：2YT培地 (amp 50 mg/ml)）。○は本発明の遺伝子を導入した大腸菌、●は対照を示す。(A)1.3 M ソルビトールの存在下、37℃で培養し、浸透圧耐性を評価した。(B)45℃で培養を行い、熱耐性を評価した。
【図５】本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌から抽出したタンパク質の水溶性画分の状態を示す。蛍光分光光度計用セルに、培養した大腸菌水溶性画分（タンパク質濃度は450 μg/3mL）、（A)0M NaCl若しくは（B)1M NaCl、及び300μM ANSを加え、ANS添加から 10 秒後、励起波長 380 nmで、波長 485 nmの蛍光強度を測定した。○は本発明の遺伝子を導入した大腸菌、●は対照を示す。
【図６】本発明のポリヌクレオチドを導入するために用いたベクターpKT::UUP1の構造を示す。
【図７】本発明のポリヌクレオチドを導入したラン藻（Synechocystis sp.PCC6803）の (A)光強度 45μmol m-2s-1、(B)光強度 200μmol m-2 s-1 における生育曲線を示す。○は本発明の遺伝子を導入したSynechocystis sp.PCC6803、●はベクターのみを導入した対照を示す。
【図８】本発明のタンパク質含有画分のSDS-PAGEの結果を示す。M:タンパク質サイズマーカー、C:形質転換大腸菌の粗抽出液（可溶性画分）、E:フロースルー画分、EFT:フロースルー画分、EW：洗浄画分、1−7：溶出画分（精製融合タンパク質）。
【図９】本発明のタンパク質によるクエン酸シンターゼ（CS）熱凝集抑制効果を示す。本発明のタンパク質の添加濃度の増大に伴って、クエン酸シンターゼの熱（45℃）による凝集が抑制される。●は0.15μM CS、▲は0.15μM CS＋0.15μM BSA、○は0.15μM CS＋0.15μMの本発明のタンパク質、◇は0.15μM CS＋0.60μMの本発明のタンパク質、□は0.15μMの本発明のタンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
シネココッカス属（Synechococcus sp.）に属するNKBG 15041c は、海産のラン藻であり、耐塩性を有すると同時に、極めて生育が早いことが報告されている (Sode K.等, (1992) Conjugative gene transfer in marine cyanobacteria: Synechococcus sp., Synechocystis sp. and Pseudanabaena sp. Appl Microbiol Biotechnol 37: 369-373)。
【００１５】
本発明者等は、このラン藻NKBG 15041cからゲノムライブラリーを構築し、大腸菌を用いた機能スクリーニング法 (特許第4754676号) により、その増殖能や耐塩性に関連すると考えられる遺伝子群を探索し、本発明の新規遺伝子を得るに至った。BlastPにより相同遺伝子を探索した結果、本発明の新規遺伝子がコードするタンパク質と既知タンパク質との相同性は確認されず、また、新規遺伝子内に特徴的なモチーフも存在しなかったことから、今回発見された遺伝子は全く新しい増殖促進遺伝子／ストレス耐性遺伝子であると考えられた。
【００１６】
すなわち本発明は、以下の(a)〜(f)から選択されるポリヌクレオチドを提供する：
(a)配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなるポリヌクレオチド
(b)配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質、をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質、をコードするポリヌクレオチド。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードする。
【００１８】
本明細書において、「細胞増殖促進活性」とは、細菌、植物及び動物細胞の増殖を促進することができる活性をいう。例えば、本発明のポリヌクレオチドが導入された大腸菌等の微生物は、導入されていない微生物と比較して、細胞増殖がプラトーに達した時点の（例えば37℃で10〜20時間培養した時点の）OD600で測定した細胞濃度が30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、更に好ましくは２倍以上、３倍以上に増大し得るが、細胞増殖能の測定手段は特に限定されるものではない。また、本発明のポリヌクレオチドが導入されたラン藻等の微生物は、導入されていない微生物と比較して、細胞増殖がプラトーに達した時点の（例えば32℃で10〜20日間培養した時点の）A730で測定した細胞濃度が10％以上に増大し得る。
【００１９】
本明細書において、「塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性」とは、耐塩性、熱耐性、及び浸透圧耐性のいずれか１つ以上の耐性を向上させることができる活性をいう。
【００２０】
「耐塩性」とは、塩ストレスに対する耐性をいい、「耐塩性」が高い生物とは、対照生物と比較して、塩ストレス（高塩濃度条件）下、例えば500mM〜1000mMのNaCl存在下での生存率・増殖率がより高いものをいう。例えば、耐塩性向上活性を有するタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドが導入された微生物は、導入されていない微生物と比較して、高塩濃度条件下で統計学上有意に優れた増殖を示す。例えば本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌等の微生物は、導入していない対照の微生物と比較して、高塩濃度条件下での細胞増殖がプラトーに達した時点の（例えば37℃で15時間培養した時点の）OD600で測定した細胞濃度が30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、更に好ましくは２倍以上、３倍以上に増大し得る。
【００２１】
「熱耐性」とは、高温に対する耐性をいい、例えば、熱耐性向上活性を有するタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドが導入された微生物は、導入されていない微生物と比較して、熱ストレス（高温度条件）下、例えば45℃において統計学上有意に優れた増殖を示す。例えば本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌等の微生物は、導入していない対照の微生物と比較して、熱ストレス条件下での細胞増殖がプラトーに達した時点の（例えば45℃で15時間培養した時点の）OD600で測定した細胞濃度が30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、更に好ましくは２倍以上、３倍以上に増大し得る。
【００２２】
「浸透圧耐性」とは、高浸透圧に対する耐性をいい、例えば所定濃度の多価アルコール、例えばソルビトール存在下での耐性をいう。例えば、浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードする本発明のポリヌクレオチドが導入された微生物は、導入されていない微生物と比較して、所定濃度、例えば1.3 M のソルビトール存在下において統計学上有意に優れた増殖を示す。例えば本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌等の微生物は、導入していない対照の微生物と比較して、高浸透圧下での細胞増殖がプラトーに達した時点の（例えば37℃で15時間培養した時点の）OD600で測定した細胞濃度が30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは70％以上、更に好ましくは２倍以上、３倍以上に増大し得る。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチドは、一実施形態において、(a)配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列からなる。「ポリヌクレオチド」とは、当分野において通常用いられる場合と同じ意味を有し、DNA、RNAを含み、また天然であっても合成されたものであってもよい。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチドは、一実施形態において、(b)配列番号１に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２５】
本発明において、「１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列を意味する。
【００２６】
１若しくは数個の塩基が欠失、置換又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドは、例えば、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することができる。具体的には、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、例えばDNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、例えばMolecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異DNAを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。アミノ酸の置換は保存的置換であっても非保存的置換であってもよいが、好ましくは保存的置換である。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドは、一実施形態において、(c)配列番号１に示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、配列番号１又は配列番号２に示される配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて目的の遺伝子が存在することが予測されるcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００２９】
具体的には、本発明の遺伝子が単離されたラン藻（シネココッカス属 NKBG 15041c）より、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記cDNAの起源としては、上記植物由来の各種の細胞又は組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全RNAの分離、mRNAの分離や精製、cDNAの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をcDNAライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００３０】
また、上記(b)及び(c)のポリヌクレオチドとしては、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチド、例えばDNA断片を利用し、他の生物体等より、該DNAのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる他、前述の変異DNAの作製方法により調製することもできる。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、一実施形態において、下記の本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００３２】
また、本発明は、以下の(a)〜(c)から選択されるタンパク質を提供する：
(a)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質
(c)配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質。
【００３３】
本発明のタンパク質は、一実施形態において、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３４】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来の単離されたタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来の単離されたタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞又は組織から、タンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせることにより、本発明のタンパク質を取得することができる。化学合成によりタンパク質を調製する場合には、例えば、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBOC法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。遺伝子組換え技術によりタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるDNAを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。
【００３５】
例えば、遺伝子組換え技術によって、本発明のタンパク質を調製する場合、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。また、本発明のタンパク質が細胞膜に発現している場合は、細胞膜分解酵素を作用させた後、上記の精製処理を行うことにより精製標品を得ることができる。
【００３６】
本発明のタンパク質はまた、一実施形態において、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質である。
【００３７】
「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を意味する。アミノ酸の置換は保存的置換であっても非保存的置換であってもよいが、好ましくは保存的置換である。
【００３８】
本発明のタンパク質はまた、一実施形態において、配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質である。
【００３９】
さらに、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、当業者であれば、配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいて、適宜調製又は取得することができる。例えば、配列番号１に示される塩基配列又はその一部を有するポリヌクレオチドをプローブとして、シネココッカス属 NKBG 15041c 以外の生物より、該ポリヌクレオチドのホモログDNAを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログDNAの全長DNAをクローニング後、発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させることにより、該ホモログDNAによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００４０】
また、上記本発明のタンパク質は、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、HRP等の酵素、抗体のFc領域、GFP等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、HA、FLAG、Myc等のエピトープタグや、GST、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ni-NTAとHisタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製、本発明のタンパク質の検出、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００４１】
上記本発明のポリヌクレオチドやタンパク質を用いることによって、植物・動物及びそれらの組織、器官、細胞並びに細菌、酵母、カビ等の微生物の耐塩性、浸透圧耐性（ソルビトール耐性）、熱耐性等の環境ストレス耐性を向上させることができ、また非ストレス条件下における細胞増殖を促進することができる。
【００４２】
本発明のタンパク質を抗原として用い、本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を作製することができる。かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の抗体、及びこれらの免疫原性断片を挙げることができる。これら抗体は、例えば、細胞増殖促進活性及び環境ストレス耐性向上活性を有する本発明のタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００４３】
上記抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質又はエピトープを含むその断片、類似体若しくはこれらを含む細胞を投与することにより産生される。モノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ技法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びEBV−ハイブリドーマ技法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985）など任意の技法を用いることができる。一本鎖抗体をつくるためには、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778 号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
【００４４】
本発明はまた、上記本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクターを提供する。
【００４５】
本発明の組換えベクターとしては、前記本発明のポリヌクレオチドを含み、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されず、例えば本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。
【００４６】
細菌用の発現ベクターとしては、例えば、pBTrP2、pBTac1、pBTac2(いずれもべ一リンガーマンハイム社製)、pKK233-2(Pharmacia社製)、pSE280(Invitrogen社製)、pGEMEX-1(Promega社製)、pQE‐8(QIAGEN社製)、pQE‐30(QIAGEN社製)、pKYP10(特開昭58-110600)、pKYP200〔Agrc.Biol.Chem., 48, 669(1984)〕、PLSA1〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277(1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、pTP5、pC194、pUC18〔Gene, 33, 103(1985)〕、pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕、pSTV28(宝酒造社製)、pSTV29(宝酒造社製)、pKT-Pcpc〔Appl Microbiol Biotechnol 99(3): 1521-9, 103(2015)〕等を例示することができる。また、目的に応じて、例えばGST融合タンパク質発現ベクター（例えばpGEX-6p-2、GE Health Care社製）等を使用することもできる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター（Plac）、PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、SP01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーター、フィコシアニンプロモーター等を挙げることができる。
【００４７】
酵母用の発現ベクターとして、例えば、pYES2（Invitrogen社製）、YEp13（ATCC 37115）、YEp24（ATCC 37051）、Ycp5O（ATCC 37419）、pHS19、pHS15等を例示することができる。酵母用のプロモーターとしては、例えば、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、MFα1プロモーター、CUP1プロモーター等のプロモーターを具体的に挙げることができる。
【００４８】
植物細胞用の発現ベクターとしては、Tiプラスミド（Tumor inducing plasmid）、pSPORT1、pT7Blue-Ｔベクター、pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕、pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕などのプラスミド、あるいはタバコモザイクウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルスなどの植物ウイルスベクター等を例示することができる。植物細胞用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス 35Sプロモーター〔Mol.Gen.Genet (1990) 220, 389-392〕、ルブロースビスフォスフェートカルボキシラーゼスモールサブユニットプロモーター等を挙げることができ、ターミネーターとしては、例えばノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができる。
【００４９】
本発明はまた、上記の組換えベクターを宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を提供する。
【００５０】
本発明の形質転換細胞は、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつ細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質を発現する形質転換細胞であり、形質転換細菌（大腸菌等）、形質転換酵母、形質転換植物細胞、形質転換動物細胞を挙げることができる。
【００５１】
形質転換細菌の作製に用いられる細菌の宿主細胞の具体例としては、エッシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、バチラス（Bacillus）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、セラチア（Serratia）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、エルウニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ザイモモナス（Zymomonas）属、シネコシスティス（Synechocystis）属等に属する微生物を挙げることができる。細菌宿主へ組換えベクターを導入する方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法やプロトプラスト法等を挙げることができる。
【００５２】
上記細菌の中で、シネコシスティス（Synechocystis）属等のラン藻は水と微量ミネラルと光があれば増殖できる微生物であるため、近年ではバイオ燃料生産ホストとして注目が集まっている。特に、Synechocystis sp. PCC6803は既に遺伝子系が確立され、幅広く利用されている株である（http://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/9106/9106_biomedia_3.pdf）。
【００５３】
宿主細胞として光合成を行うラン藻を用いた場合には、培養時の光強度が生育に影響し得る。本発明のポリヌクレオチドが導入されたラン藻は特に、光強度が強くなった場合にも強光阻害を受けづらくなっており、幅広い光強度での生育促進が認められる。このことは、時間と共に光強度が変化する太陽光を利用した場合にも、本遺伝子が極めて有効であることを示す。
【００５４】
形質転換酵母の作製に用いられる酵母宿主の具体例としては、サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisae)、シゾサッカロミセス・ボンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クリュイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pu11ulans)、シュワニオミセス・アルビウス(Schwanniomyces a11uvius)等を挙げることができる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００５５】
形質転換植物細胞の作製に用いられる宿主植物細胞としては、その種類は特に限定されず、花卉、果実植物、野菜、根菜、穀類、観葉植物、果樹を含む樹木などの植物、例えばナス科、イネ科、アブラナ科、キク科、ゴマ科、モクセイ科、フトモモ科、バラ科、マメ科、ヤシ科又はアカネ科に属する植物の培養細胞のうちから適宜選択することができる。形質転換植物細胞を作製するには、本発明の組換えベクターを植物細胞内に導入し、植物細胞内のゲノムDNA中に本発明のポリヌクレオチドを導入する方法を採用することができる。植物の形質転換は、植物の種類等に応じて、リーフディスク共存培養法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等の公知の方法を適宜用いて行うことができる。その他、物理的又は化学的に植物細胞の透過性を高めて本発明の組換えベクターを受容体細胞内に直接取り入れて形質転換植物を作製する方法を採用することもできる。
【００５６】
本発明はまた、上記の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養液の上清から組換えタンパク質を回収することを特徴とする、細胞増殖促進活性、及び／又は塩、熱及び／若しくは浸透圧耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法を提供する。
【００５７】
組換えタンパク質の発現に用いられる宿主−ベクター系としては、例えば、IMPACT-CN System（宿主: E. coli strain ER2566、ベクター:pTYB1、pYB2、pYB11、pYB12 (BioLabs社製)）、あるいはpET Expression System（宿主: Epicurian Coli BL21、ベクター:pET3シリーズ(Novagen社製)）を挙げることができる。宿主細胞へのベクターの導入法としては、当業者に公知の方法、例えば、エレクトロポレーション法やヒートショック法が挙げられる（遺伝子ライブラリーの作製法、羊土社（1994）、植物細胞工学入門、学会出版センター（1998））。また、組換えタンパク質を発現させるための形質転換体の培養は、当業者に一般的に用いられている方法および条件にて行なうことができる。発現させたタンパク質は、例えば、IMPACT-CNの系を利用した場合にはキチンビーズ(BioLabs社製)で、pET発現系を利用した場合にはHis Bind Resin（Novagen社製）により精製できる。
【００５８】
本発明は更に、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られる、塩、熱及び／又は浸透圧耐性が強化されたトランスジェニック植物も提供することができる。
【００５９】
本発明のポリヌクレオチドを用いてトランスジェニック植物を作出する生物種としては特に限定されるものではないが、高等植物、例えばイネ、小麦、トウモロコシ、大豆、タバコ、ニンジン等であることが好ましい。かかるトランスジェニック植物の作出は、本発明のポリヌクレオチドの植物細胞内での発現を保証するベクターに挿入して植物細胞に導入し、得られた形質転換植物細胞を再生させることにより有利に行うことができる。
【００６０】
トランスジェニック植物の作出に用いられるベクターとしては、例えば、東洋紡から市販されているpBI101、あるいはpIG121Hm (Plant J, Vol 6, p271-282(1994)) を好適に用いることができる。植物細胞の形態としては、例えば、プロトプラスト、カルス、植物体の部分(リーフディスク、ヒポコチル等) がある。宿主植物細胞へのベクターの導入法としては、アグロバクテリウム法が好適であるがその他にも、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを用いることができる(モデル植物の実験プロトコール、秀潤社(1996))。
【００６１】
ベクターの導入された植物細胞を植物体へ再生させる方法は、植物種により異なる。例えば、イネの場合、完熟種子からカルス誘導を行い、これにcDNAを導入したアグロバクテリウムを感染させ、共存培養を経て、選抜培地に移し培養する。約３週間後カルスを再分化培地に移し、再分化するまで培養する。４、５日馴化させた後ポットに移すことで形質転換体を再生させる（モデル植物の実験プロトコール、秀潤社（1996））。また、ニンジン、タバコ等の再生の方法としては、それぞれ加藤、庄野等の方法（「植物組織培養の技術」朝倉書店（1983））を好適に例示することができる。
【００６２】
これによりトランスジェニック植物体が得られれば、さらに該植物体から繁殖材料（例えば、植物の種類に応じて、種子、塊根、切穂、メリクローン等の培養増殖）を得て、これを基に本発明のトランスジェニック植物を量産することが可能である。
【００６３】
本発明は更に、別の態様として、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のタンパク質を含む、細胞増殖促進剤及び／又はストレス耐性向上剤を提供することができる。
【００６４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６５】
［実施例１]
シネココッカス属（Synechococcus sp.）NKBG 15041c 由来ゲノムライブラリーの作製
シネココッカス属（Synechococcus sp.）NKBG 15041c （農工大カルチャーコレクションhttp://www.tuat.ac.jp/~biomol/marine.html  において増殖が早いラン藻として分離されている）は、3％ NaCl (w/v) を添加したBG11 培地を用い、30℃、LC-LED 450 W (タイテック株式会社) 50μmol m-2 s-1中で対数増殖期後期まで培養した。
【００６６】
培養液からゲノムDNAを抽出し、制限酵素Sau3AIで部分消化した後、大腸菌発現ベクターpBluescript SKの制限酵素BamH1サイト（アルカリフォスファターゼ処理済）にクローニングした。得られたゲノムライブラリの総クローン数は1.16×105、平均インサートサイズは2.2 kbであり、スクリーニングに十分な規模のゲノムライブラリーが構築できたと考えられた。
【００６７】
［実施例２］
環境ストレス耐性遺伝子の探索
実施例１で得られたゲノムライブラリーから、大腸菌を用いた機能スクリーニング法による耐塩性関連遺伝子の探索を行った。
【００６８】
ゲノムライブラリーによる大腸菌の形質転換は、ヒートショック法を用いた。コンピテントセルとゲノムライブラリーを混和し、氷上に20分間静置した後、42℃で45秒のヒートショックを与え、氷上に3分間静置した。次に、SOC 培地を加え、37℃で60分間培養を行った。
【００６９】
形質転換された大腸菌 (DH5α)を、0.6 M NaClを含む 2YT 培地 (amp 50 μg/ml)上で37℃で15 時間培養し、生育の良いクローンを選抜した。2次選抜として、0.8 M NaClを含む2YT培地上でスポットテストを行った。スポットテストでは、1 次選抜で獲得したプラスミドを大腸菌に形質転換後、2YT 液体培地で 37℃ 10 時間培養した後の菌体懸濁液を OD600 = 10-2、10-3、10-4 に調製し、寒天培地上にそれぞれ 10μL 滴下し、37℃で15時間の培養を行った。耐塩性向上効果が確認された遺伝子に関して導入遺伝子の配列を決定した。
【００７０】
上記のスクリーニングの結果、終始コドンを含めて322アミノ酸からなるタンパク質（配列番号２、図２）をコードするDNA（配列番号１、図１）が導入された大腸菌で、顕著な耐塩性の向上が確認された。
【００７１】
［実施例３］
形質転換大腸菌における耐塩性向上効果
実施例２と同様の方法によって本発明のポリヌクレオチドで形質転換した大腸菌（DH5α）を、非ストレス条件下、又は塩ストレス条件下で培養した（（A)86mM、(B)500mM、(C)1000mMのNaClを含む2YT培地 (amp 50 mg/ml)）。細胞濃度をOD600により測定した結果、37℃で15時間まで培養した時点で、いずれの条件においても細胞増殖がほぼプラトーに達しており、いずれの塩濃度においても、本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌の方が、空ベクターを形質転換した大腸菌と比較して、明らかに高い細胞増殖能を有することが示された。この細胞増殖能は、図３(A)に示す非ストレス条件下でも観察され、本発明のポリヌクレオチドが非ストレス条件下及び塩ストレス条件下のいずれにおいても細胞増殖を促進し得ることが明らかになった。
【００７２】
得られた結果から本発明のポリヌクレオチドの導入による細胞増殖促進活性を数値で示すと、37℃で15時間培養して、対照の大腸菌の増殖と比較して(A)86mM NaCl存在下で約２倍、(B)500mM NaCl存在下で約２倍、(C)1000mM NaCl存在下で約３倍の細胞増殖の増大が観察された。
【００７３】
［実施例４］
形質転換大腸菌における浸透性耐性及び熱耐性向上効果
本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌（DH5α）を、浸透圧ストレス又は熱ストレス条件下で培養した（培地：2YT培地 (amp 50 mg/ml)）。その結果、(A)1.3 M ソルビトールの存在下、37℃で培養した場合、及び(B)45℃で培養を行った場合、のいずれにおいても、本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌の方が、空ベクターを形質転換した大腸菌と比較して、明らかに高い細胞増殖能を有しており、導入したポリヌクレオチドが浸透圧耐性及び熱耐性の向上活性を有することが確認された（図４）。
【００７４】
得られた結果から本発明のポリヌクレオチドの導入によるストレス耐性向上活性を数値で示すと、対照の大腸菌の増殖と比較して(A)1.3Mソルビトール存在下で37℃で18時間培養して約６倍、又は(B)45℃で18時間培養して約７倍の細胞増殖の増大が観察された。
【００７５】
［実施例５］
細胞内タンパク質変性抑制効果
本発明のポリヌクレオチドの大腸菌に対する生育促進効果や、複数のストレス耐性向上活性のメカニズムを解明するために、本発明のポリヌクレオチドを発現した大腸菌の合成したタンパク質の状態を検討した。
【００７６】
評価のために、タンパク質の疎水性領域と結合した場合に480 nm付近に蛍光を発し、タンパク質の構造変化などのフォールディングの状態の評価に用いられる疎水性蛍光プローブ 8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(1,8 ANS) を使用した (Chaurasia AK.及びApte SK. (2009) Overexpression of the groESL Operon Enhances the Heat and Salinity Stress Tolerance of the Nitrogen-Fixing Cyanobacterium Anabaena sp. Strain PCC7120. Applied and Environmental Microbiology 75 6008-6012)。
【００７７】
まず、本発明のポリヌクレオチドをpBluescript SKのEcoR1/Xho1サイトにクローニングし、これを大腸菌DH5αに形質転換した。50 μg/mL ampを含む2YT液体培地に植菌し、37℃、170 rpmで定常期まで培養した（10 時間）。対照として、空ベクターを形質転換した大腸菌DH5αを用いた。これらを4℃、3,300×gで15分間遠心分離し、PBSバッファ（pH 7.5）で洗浄後、1/1000量の2-メルカプトエタノールを含む PBS（pH 7.5）バッファに再懸濁した。これを15 mLチューブに移し、氷冷しながら超音波破砕した。破砕後4℃、20,400×gで5分間遠心分離し、上清を回収した。上清中のタンパク質濃度はブラッドフォード法で定量し、450μg/100μLとなるように調製し、蛍光分光光度計用セル（1.5 mLチューブ）に100μLずつ分注した。分注した大腸菌抽出液には、終濃度 (A)0 M 及び(B)1.0 M となるようにNaClを添加した。続いて各セルに300μM 1,8 ANSを加え、1,8 ANS添加から10秒後、励起波長380nmで、波長485 nmの蛍光強度を測定した。
【００７８】
その結果、本発明のポリヌクレオチドを導入した大腸菌は、空ベクターを導入した対照の大腸菌と比較して、高濃度NaClの存在下及び非存在下のいずれにおいても1,8 ANSによる蛍光の強度が低く抑えられ、細胞内タンパク質の変性が抑制されていることが確認された（図５）。
【００７９】
上記の結果から、本発明のポリヌクレオチドが大腸菌に対して各種ストレス耐性を付与できる理由の１つとして、細胞内タンパク質を安定化させることができるという可能性が考えられる。つまり、本発明のポリヌクレオチドは、細胞内タンパク質の変性を抑制することによって、塩、熱、浸透圧ストレス条件下での耐性を向上させるだけでなく、非ストレス条件下においても細胞内のタンパク質の状態を安定化させることができると考えられる。
【００８０】
［実施例６］
形質転換ラン藻の生育評価
本発明のポリヌクレオチドをラン藻発現ベクターpKT-Pcpc（Yoshino et al., Appl Microbiol Biotechnol 99(3): 1521-9, 2015）に導入した。構築したプラスミド（図６）及び空ベクターを用いて、エレクトロポレーション法によりシネコシスティス属のラン藻（Synechocystis sp. PCC6803）を形質転換させ（Ludwig et al., Appl Microbiol Biotechnol 78 (4): 729-35, 2008）、ストレプトマイシン耐性(20 μmol/l)を指標にして形質転換体を取得した。光強度45及び200 μmol m-2s-1の条件で各形質転換体を32℃、120 rpmで振とう培養した。波長730 nmにおける吸光度で生育を評価したところ、本発明のポリヌクレオチドを導入した形質転換ラン藻は空ベクターを導入した対照と比較して生育が促進しており、特に光強度が高い条件下で生育促進効果が高いことが確認された（図７）。すなわち、本発明のポリヌクレオチドは、非ストレス環境下においても形質導入細胞の生育を抑制することなく、細胞増殖を促進することができることが確認された。
【００８１】
［実施例７］
本発明のタンパク質の精製
本発明のポリヌクレオチドをGST融合タンパク質発現ベクターpGEX-6p-2（GE Health Care）に導入し、大腸菌 BL21 (DE3) を形質転換させた。コロニーを50μg/ml ampを含む LB 液体培地 (LB/amp 液体培地) 5 mlに植菌し、37℃、170 rpmで一晩振とう培養した。菌体懸濁液 1 mlをLB/amp 液体培地200 mlに加え、OD600 = 0.5-0.6 になるまで30℃、150 rpmで培養した。その後IPTGを終濃度 1 mMとなるように添加し、16℃、150 rpmで24 時間発現誘導した。
【００８２】
菌体懸濁液を遠心分離 (3,300×g、15 分、4℃) し、上清を捨て、沈殿を0.1 M KPi バッファー (pH 7.5) で再懸濁した後、再び遠心分離し、菌体を回収した。これを結合バッファー (0.1 M KPi、0.15 M NaCl、pH 7.5) で懸濁し、超音波破砕した。破砕後、遠心分離 (3,300×g、15 分、4℃) し、回収した上清を0.22μmフィルターを通した。この一部をSDS-PAGE用サンプルとして保存した (粗画分(C))。
【００８３】
上清をフィルターに通した後、結合バッファーで平衡化した GST-tag精製カラム GStrap FF 1 mlに添加した。フロースルーした抽出液を合計3回カラムに再度添加した (フロースルー画分 1(E))。10 mlの結合バッファーでカラムの洗浄を行った (洗浄画分 1)。10 ml の 溶出バッファー (0.1 M KPi、0.15 M NaCl、20 mM 還元型グルタチオン、pH 8.0-8.3) をカラムに流し、溶出液を回収した。その一部を SDS-PAGE サンプルとして保存した (溶出画分 1)。
【００８４】
溶出バッファーで溶出した画分を、洗浄と平衡化を行ったカラムに再度添加し、上と同様の操作を行うことでフロースルー画分 2(EFT)、洗浄画分 2(EW)、溶出画分 2を得た。溶出画分 2は 500 μlずつ回収した (溶出画分 1〜7)。粗画分(C)、フロースルー画分 1(E)、フロースルー画分 2(EFT)、洗浄画分 2(EW)、溶出画分 1〜7をSDS-PAGEにかけて精製度を確認した（図８）。目的の融合タンパク質は溶出画分6までにほぼ回収できたと考えられたため、溶出画分1〜6をAmicon Ultra-4で限外ろ過濃縮し、得られた精製タンパク質のタンパク質濃度をBradford 法で測定し、以降の試験に用いた。
【００８５】
［実施例８］
細胞内タンパク質熱凝集抑制効果
タンパク質の変性状態を調べるためによく利用されるクエン酸シンターゼ（CS）（例：Yamada et al. Plant Cell Physiol 43(9) 1043-1048 2002）を用いて、本発明のタンパク質の存在下及び非存在下におけるCSの熱凝集を検討した。
【００８６】
熱凝集抑制効果の評価には蛍光分光光度計を用い、45℃条件下の500 nmにおける散乱光強度をCSの熱凝集の指標とした（Abe et al., J. Biochem 150(4): 403-409, 2011）。撹拌子をいれて、45℃に保温したセルに、実施例７で精製した融合タンパク質を終濃度0.15μM又は0.60μMになるように加えた。その後、CSを終濃度 0.15μMとなるように加えて、撹拌しながらモニタリングした。対照としてウシ血清アルブミン (BSA) を用いた。
【００８７】
その結果、本発明のタンパク質の非存在下では、CSは45℃条件下で変性・析出し、急激に散乱光強度が増大したのに対し、本発明のタンパク質を添加した場合、その添加濃度の増大に伴い、CSの熱変性が抑制される割合が高まることが確認された（図９）。これらの結果から、本発明のタンパク質は他のタンパク質を安定化させる効果を有していることが明らかになった。このことから、本発明のタンパク質による細胞増殖の促進は細胞内タンパク質の安定化によるものである可能性が考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明の遺伝子を導入した微生物は、各種の環境ストレス条件に対する耐性が向上するだけでなく、非ストレス条件下においても増殖が促進されるため、微生物を用いた発酵生産や、形質転換された微生物やトランスジェニック植物を利用したバイオ燃料生産等の分野に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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