(57)【要約】      （修正有）【課題】殺虫作用を有するピリピロペン類の生合成能を有する害虫抵抗性植物体の提供。【解決手段】ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入することにより、ピリピロペン類の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された植物体を取得することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体であって、単離されたポリヌクレオチドが、下記（Ｉ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、植物体：
（Ｉ）下記の（ｉ）〜（ｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２】
植物体が、デアセチルピリピロペンＥを発現または含んでなる、請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体であって、単離されたポリヌクレオチドが、下記（ＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、植物体：
（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】
植物体が、１１−デアセチルピリピロペンＯおよび７−デアセチルピリピロペンＡからなる群から選択される一種以上を発現または含んでなる、請求項３に記載の植物体。
【請求項５】
植物体が害虫抵抗性植物体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項６】
植物体がタバコまたはイネである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項７】
植物体の製造方法であって、下記（Ｉ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入する工程を含んでなる、製造方法：
（Ｉ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項８】
デアセチルピリピロペンＥを植物体に発現または含ませる工程をさらに含んでなる、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
植物体の製造方法であって、下記（ＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入する工程を含んでなる、製造方法：
（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１０】
１１−デアセチルピリピロペンＯおよび７−デアセチルピリピロペンＡからなる群から選択される一種以上を植物体に発現または含ませる工程をさらに含んでなる、請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
植物体が害虫抵抗性植物体である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の植物体の製造方法。
【請求項１２】
植物体がタバコまたはイネである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の植物体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピリピロペン類生合成遺伝子発現植物体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ピリピロペンＡは、Applied and Environmental Microbiology(1995),61(12),4429-35（非特許文献１）、ＷＯ２００４／０６００６５号（特許文献１）に開示されているように、アメリカタバコガ幼虫に対し殺虫活性を有すること、ピリピロペンＡがコナガ幼虫およびチャイロコメノゴミムシダマシに対して殺虫活性を有することが記載されている。また、これまでに多くの耐害虫性の遺伝子導入植物が報告されているが、その多くは殺虫性のタンパク質、ペプチド等の遺伝子を導入して得られているものであり、複数の生合成工程を経て殺虫性の低分子を発現させた植物を開示しているものはほとんど無い。
【０００３】
一方、ピリピロペンＡの生産菌として、特開平４−３６０８９５号公報（特許文献２）には、アスペルギルス  フミガタスFO-1289株、Applied and Environmental Microbiology（1995），61（12），4429-35．（非特許文献１）には、ユーペニシリウム  レティキュロスポラムNRRL-3446株、ＷＯ２００４／０６００６５号公報（特許文献１）には、ペニシリウム  グリセオフルバムF1959株、および公開技報２００８−５００９９７号（特許文献３）には、ペニシリウム  コピロビウムPF1169株が開示されている。
【０００４】
また、ピリピロペンＡの生合成ルートとして、Journal of Organic Chemistry(1996), 61,882-886.（非特許文献２）およびChemical Review(2005), 105, 4559-4580.（非特許文献３）には、アスペルギルス  フミガタスFO-1289株での推定生合成ルートが開示されており、アスペルギルス  フミガタスFO-1289株においてポリケチド合成酵素およびプレニルトランスフェラーゼのそれぞれによって合成された部分構造が結合され、環化酵素によりピリピロペンＡが合成されることが開示されている。
【０００５】
さらに、ＷＯ２０１３／１７３６８９号（特許文献４）には、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体が開示されている。しかしながら、この文献では、酵素レベルでの発現は確認されておらず、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリヌクレオチド等が導入された植物体において実際にピリピロペン類が発現するかはこれまで明確ではなかった。また、特許文献４には、ピリピロペンＡ生合成に関与する遺伝子として、ピリピロペンＡ生合成経路の中間体合成に関与する遺伝子を導入した植物体が記載されるのみであり、実際に強い殺虫作用を有するピリピロペン類を生合成できる植物体は確認されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０６００６５号
【特許文献２】特開平４−３６０８９５号公報
【特許文献３】公開技報２００８−５００９９７号
【特許文献４】ＷＯ２０１３／１７３６８９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Applied and Environmental Microbiology（1995），61（12），4429-35．
【非特許文献２】Journal of Organic Chemistry(1996), 61,882-886.
【非特許文献３】Chemical Review(2005), 105, 4559-4580.
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、今般、強い殺虫作用を有するピリピロペン類、特にピリピロペンＡ、ＯまたはＥを生合成する、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体の作出に成功した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
【０００９】
従って、本発明の目的は、強い殺虫作用を有するピリピロペン類、好ましくはピリピロペンＡ、ＯまたはＥ、特にピリピロペンＡを生合成する植物体を提供することにある。
【００１０】
本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体であって、単離されたポリヌクレオチドが、下記（Ｉ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、植物体：
（Ｉ）下記の（ｉ）〜（ｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、 
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
（２）  植物体が、デアセチルピリピロペンＥを発現または含んでなる、上記（１）に記載の植物体。
（３）  ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体であって、単離されたポリヌクレオチドが、下記（ＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、植物体：
（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、 
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
（４）  植物体が、１１−デアセチルピリピロペンＯおよび７−デアセチルピリピロペンＡからなる群から選択される一種以上を発現または含んでなる、上記（３）に記載の植物体。
（５）  植物体が害虫抵抗性植物体である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の植物体。
（６）  植物体がタバコまたはイネである、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の植物体。
（７）  植物体の製造方法であって、下記（Ｉ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入する工程を含んでなる、製造方法：
（Ｉ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
（８）  デアセチルピリピロペンＥを植物体に発現または含ませる工程をさらに含んでなる、上記（７）に記載の製造方法。
（９）  植物体の製造方法であって、下記（ＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入する工程を含んでなる、製造方法：
（ＩＩ）下記の（ｉ）〜（ｉｖ）に記載されたヌクレオチド配列：
（ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）において記載されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列。
（１０）  １１−デアセチルピリピロペンＯおよび７−デアセチルピリピロペンＡからなる群から選択される一種以上を植物体に発現または含ませる工程をさらに含んでなる、上記（９）に記載の製造方法。
（１１）  植物体が害虫抵抗性植物体である、上記（７）〜（１０）のいずれかに記載の植物体の製造方法。
（１２）  植物体がタバコまたはイネである、上記（７）〜（１１）のいずれかに記載の植物体の製造方法。
【００１１】
本発明によれば、ピリピロペン類の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された植物体を製造することができ、特に、強い殺虫作用を有するピリピロペンＡ生合成植物体を用いれば、害虫抵抗性を有する植物体の産生に多大な貢献をなすものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ｐＩＧ６−ＡＴ−１、ｐＩＧ６−ＡＴ−２のプラスミドマップを表す。
【図２】図２は、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動には、以下のＰＣＲ産物を用いた。Ｍ：分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、１〜７：ＡＴ−１（アセチルトランスフェラーゼ−１、Acetyltransferase-1）遺伝子を導入し形質転換したイネ（ＡＴ−１導入形質転換イネカルス）（７個体）を配列番号１４および１５のプライマーで増幅させたＰＣＲ産物、ＷＴ：野生型イネカルスを配列番号１４および１５のプライマーで増幅させたＰＣＲ産物、ＰＣ：プラスミドｐＩＧ６−ＡＴ−１を配列番号１４および１５のプライマーで増幅させたＰＣＲ産物。
【図３】図３は、ＰＣＲ産物のアガロースゲルによる電気泳動パターンを示す。電気泳動には、以下のＰＣＲ産物を用いた。Ｍ：分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、１〜１４：ＡＴ−２（アセチルトランスフェラーゼ−２、Acetyltransferase-2）遺伝子を導入し形質転換したイネ（ＡＴ−２導入形質転換イネカルス）（１４個体）を配列番号１６および１７のプライマーで増幅させたＰＣＲ産物、ＷＴ：野生型イネカルスを配列番号１６および１７のプライマーで増幅させたＰＣＲ産物、ＰＣ：プラスミドｐＩＧ６−ＡＴ−２を配列番号１６および１７のプライマーで増幅させたＰＣＲ産物。
【図４】図４は、野生株と、ＡＴ−１遺伝子を導入し形質転換したイネ（ＡＴ−１導入形質転換体（個体番号３））の酵素変換試験（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の結果を示す。ＡＴ−１によるデアセチルピリピロペンＥ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ−ＰｙＥ）からピリピロペンＥ（ＰｙＥ）への変換を示す。
【図５】図５は、野生株と、ＡＴ−２遺伝子を導入し形質転換したイネ（ＡＴ−２導入形質転換体（個体番号９））の酵素変換試験（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の結果を示す。ＡＴ−２による１１−デアセチルピリピロペンＯ（Ｄｅａｃｅｔｙｌ−ＰｙＯ）からピリピロペンＯ（ＰｙＯ）への変換を示す。
【図６】図６は、野生株と、ＡＴ−２遺伝子を導入し形質転換したイネ（ＡＴ−２導入形質転換体（個体番号９））の酵素変換試験（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の結果を示す。ＡＴ−２による７−デアセチルピリピロペンＡ（ＤｅＰｙＡ）からピリピロペンＡ（ＰｙＡ）への変換を示す。
【発明の具体的説明】
【００１３】
微生物の寄託
プラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１で形質転換された大腸菌（Escherichia coli EPI300TM-T1R）は、２００８年１０月９日（原寄託日）付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３３（国内寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７０４より移管）（寄託者が付した識別のための表示：Escherichia coli EPI300TM-T1R/pCC1-PP1）として寄託されている。
【００１４】
プラスミドｐＰＰ７で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年１２月２１日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１９（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP7）として寄託されている。
【００１５】
プラスミドｐＰＰ９で形質転換されたAspergillus oryzaeは、２００９年１２月２１日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（旧名称：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２０（寄託者が付した識別のための表示：Aspergillus oryzae PP9）として寄託されている。
【００１６】
植物体
本発明の植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体である。ピリピロペンＡの生合成経路は、ＷＯ２０１１／０９３１８５号公報のスキーム１に記載のとおりであるが、具体的には以下の通りである。
【表１】
2016086759.tif 000002
2016086759.tif 000003
2016086759.tif 000004
【００１７】
本発明において、植物体とは、特に限定されるものではないが、イネ（米）、麦類（コムギ、オオムギなど）、雑穀類（トウモロコシ、あわ、きび、ひえ、食用ソルガムなど）、果樹類（かんきつ、りんご、ぶどうなど）、野菜類（きゅうり、かぼちゃ、メロン、キャベツ、なす、トマト、いちごなど）、イモ類（ばれいしょ、かんしょ、さといもなど）、豆類（大豆、あずき、いんげんまめなど）、飼料作物（牧草、ソルガム、飼料用トウモロコシなど）、花き類、観葉植物、樹木類、茶、てんさい、さとうきび、ひまわり、ナタネ、ホップ、ワタ、タバコ、コーヒーノキ、芝、きのこ等が挙げられ、好ましくはイネ、麦類、雑穀類、野菜類、イモ類、豆類、花き類、ナタネ、ワタ、タバコ、より好ましくは、イネ、麦類、穀物類、大豆類、さらに好ましくは、イネ、タバコ、コムギ、トウモロコシまたは大豆が挙げられる。また、本発明の植物体は、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、または種子のいずれであってもよく、最終的に上述のような植物個体まで成長できることができる態様であれば、どのような態様であっても、本発明の植物体に含まれる。これらの植物体に、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入することにより、ピリピロペンＡを産生させることができる。本発明の好ましい態様によれば、害虫抵抗性を獲得した植物体が提供される。
【００１８】
本発明の植物体が抵抗性を有する害虫としては、例えば、鱗翅目害虫（例えば、ハスモンヨトウ、ヨトウガ、アワヨトウ、アオムシ、コナガ、シロイチモジヨトウ、ニカメイガ、コブノメイガ、ハマキガ、シンクイガ、ハモグリガ、ドクガ、アグロティス属害虫（Agrotis spp）、ヘリコベルパ属害虫（Helicoverpa spp）、またはヘリオティス属害虫（Heliothis spp）など）、半翅目害虫（例えば、モモアカアブラムシ、ワタアブラムシ、Aphis fabae、トウモロコシアブラムシ、エンドウヒゲナガアブラムシ、ジヤガイモヒゲナガアブラムシ、マメアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、Macrosiphum avenae、Methopolophium dirhodum、ムギクビレアブラムシ、ムギミドリアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ニセダイコンアブラムシ、ユキヤナギアブラムシ、Rosy apple aphid、リンゴワタムシ、コミカンアブラムシ、またはミカンクロアブラムシなどのアブラムシ類（Aphididae、Adelgidae、またはPhy11oxeridae）、ツマグロヨコバイなどのヨコバイ類、チャノミドリヒメヨコバイなどのヒメヨコバイ類、ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、またはセジロウンカなどのウンカ類、シラホシカメムシ、ミナミアオカメムシ、またはアカヒゲホソミドリカスミカメなどのカメムシ類、タバココナジラミ、またはオンシツコナジラミなどのコナジラミ類（A1eyrodidae）、クワコナカイガラムシ、ミカンコナカイガラムシ、または、アカマルカイガラムシなどのカイガラムシ類（Diaspididae、Margarodidae、Ortheziidae、Ac1erdiae、Dacty1opiidae、Kerridae、Pseudococcidae、Coccidae、Eriococcidae、Asterolecaniidae、Beesonidae、Lecanodiaspididae、またはCerococcidea）など）、ミカンキジラミなどのキジラミ類、鞘翅目害虫（例えば、イネミズゾウムシ、アズキゾウムシ、チヤイロコメノゴミムシダマシ、ウェスタンコーンルートワーム、サザンコーンルートワーム、ドウガネブイブイ、ヒメコガネ、キスジノミハムシ、ウリハムシ、コロラドポテトハムシ、イ
ネドロオイムシ、シンクイムシ類、またはカミキリムシ類など）、ダニ目（例えば、ナミハダニ、カンザワハダニ、またはミカンハダニなど）、膜翅目害虫（例えば、ハバチ類）、直翅目害虫（例えば、バッタ類）、双翅目害虫（例えば、イエバエまたはハモグリバエ類）、アザミウマ目害虫（例えば、ミナミキイロアザミウマまたはミカンキイロアザミウマなど）、植物寄生性線虫（例えば、ネコブセンチュウ、ネグサレセンチュウ、イネシンガレセンチュウ、またはマツノザイセンチュウなど）、が挙げられ、好ましい虫種としては、鱗翅目、半翅目、双翅目、アザミウマ目害虫が挙げられ、特に半翅目害虫に強い抵抗性を有する。
【００１９】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の植物体は、害虫抵抗性植物体である。「害虫抵抗性植物体」とは、植物体の体内で、殺虫活性を有するピリピロペン類、好ましくはピリピロペンＡ、ＯまたはＥ、特にピリピロペンＡが生合成され、害虫抵抗性を有する植物体を意味する。害虫抵抗性を有するか否かは、例えば、農薬実験法 １ 殺虫剤編、ソフトサイエンス社、深見順一ら、１９８１年、Ｐ．６４〜１３１に従って判断することができる。また、カルスでの殺虫活性を有するか否かは、例えば、特開２００４−９７２２８号公報などに開示されているように、カルスをエサとして与えた場合の害虫死亡率／発育阻止レベルにより判断することができる。
【００２０】
本発明において、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドは、アセチル化酵素活性を有するポリペプチドであり、好ましくは、アセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１：ＡＴともいわれる）活性を有するポリペプチドまたはアセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２）活性を有するポリペプチドから選択されるポリペプチドである。
【００２１】
本発明の一つの態様によれば、（Ｉ）（ｉ）下記の配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）各ヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｖ）各ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｖ）各ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、から選択された少なくとも一個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド配列またはそれを含んでなる組換えベクターが導入され、形質転換された植物体が提供される。
【００２２】
本発明に一つの態様によれば、（ＩＩ）（ｉ）下記の配列番号１の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）各ヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｖ）各ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｖ）各ヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、から選択された少なくとも一個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド配列またはそれを含んでなる組換えベクターが導入され、形質転換された植物体が提供される。
【００２３】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、アセチル化酵素活性、特にアセチルトランスフェラーゼ−１（Acetyltransferase-1、ＡＴ−１：ＡＴともいわれる）活性を有する。
【００２４】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、アセチル化酵素活性、特にアセチルトランスフェラーゼ−２（Acetyltransferase-2、ＡＴ−２）活性を有する。
【００２５】
配列番号１のヌクレオチド２３２０５番から２４７７３番までは、アセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１）をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号９に記載したアミノ酸配列で示される。
【００２６】
配列番号１のヌクレオチド２５８２４番から２７１７８番までは、アセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２）をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号１０に記載したアミノ酸配列で示される。
【００２７】
本発明において「実質的に同等なアミノ酸配列」とは、一つ若しくは複数個のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入による改変を有するが、ポリペプチドの活性に影響を与えないアミノ酸配列を意味する。アミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列は、改変等される前のアミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに一層好ましくは９８％以上の配列同一性を有することが好ましい。また、改変されるアミノ酸残基の数は、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個である。
【００２８】
本発明の好ましい態様によれば、配列番号９のアミノ酸配列から１〜４０個（好ましくは、１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該アミノ酸配列からなるポリペプチドがアセチルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、イネ、タバコ、コムギ、トウモロコシ、または大豆）が提供される。
【００２９】
本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号１０のアミノ酸配列から１〜４０個（好ましくは、１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個）のアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該アミノ酸配列からなるポリペプチドがアセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、イネ、タバコ、コムギ、トウモロコシ、または大豆）が提供される。
【００３０】
本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号９のアミノ酸配列からアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列が、改変等される前の配列番号９のアミノ酸配列に対して、９０％以上（好ましくは、９５％以上、より好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドがアセチルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、イネ、タバコ、コムギ、トウモロコシ、または大豆）が提供される。
【００３１】
本発明の好ましい別の態様によれば、配列番号１０のアミノ酸配列からアミノ酸の置換、欠失、付加、または挿入によって改変されたアミノ酸配列が、改変等される前の配列番号１０のアミノ酸配列に対して、９０％以上（好ましくは、９５％以上、より好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、かつ該改変されたアミノ酸配列からなるポリペプチドがアセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体（好ましくは、イネ、タバコ、コムギ、トウモロコシ、または大豆）が提供される。
【００３２】
そして、活性に影響を与えない改変の例としては、保存的置換が挙げられる。「保存的置換」とは、ポリペプチドの活性を実質的に変化しないように、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基によって置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性アミノ酸残基を別の疎水性アミノ酸残基によって置換する場合、ある極性アミノ酸残基を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられる。極性(中性)アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等が挙げられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジン等が挙げられる。また、負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。
【００３３】
本発明において、「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温度低塩濃度溶液中で行うことを意味し、当業者であればその条件は適宜決定できるものであるが、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％ＳＤＳ溶液中で、６０℃、２０分間の洗浄条件、０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件、または０．２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ溶液中で６５℃、１５分間の洗浄条件を意味する。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００３５】
本発明において、ヌクレオチド配列についての「同一性」（相同性という場合もある）とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基の一致の程度の意味で用いられる。このとき、ギャップの存在およびアミノ酸の性質が考慮される。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。
【００３６】
本発明において、ヌクレオチド配列についての「同一性」は、７０％以上であり、８０％以上であり、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。
【００３７】
本発明において、「ポリヌクレオチドにおいて、１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、または天然に生じ得る程度の複数個のヌクレオチドの置換等により改変がなされたことを意味する。ヌクレオチドの改変の個数は、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、４、５、６、７、８または９個）である。
【００３８】
本発明において、「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列」とは、「そ（れぞれ）のヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質」と同等な活性（例えば、アセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１）活性またはアセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２）活性）を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。
【００３９】
本発明の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、１〜４０個（好ましくは、１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個）のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がアセチルトランスフェラーゼ−１活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
【００４０】
本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、１〜４０個（好ましくは、１〜８個、さらに好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個、特に好ましくは１〜２個）のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がアセチルトランスフェラーゼ−２活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
【００４１】
本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２３２０５番から２４７７３番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの９０％以上（好ましくは、９５％以上、より好ましくは９８％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がアセチルトランスフェラーゼ−１活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
【００４２】
本発明の別の好ましい態様によれば、配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２５８２４番から２７１７８番までのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの９０％以上好ましくは、９５％以上、より好ましくは９８％）の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであって、かつそのヌクレオチド配列がコードするタンパク質がアセチルトランスフェラーゼ−２活性を有する、ポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる、植物体が提供される。
【００４３】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドとして、アセチルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、アセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターとが導入された植物体である。
【００４４】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の植物体は、植物物体に、ＷＯ２０１１／０９３１８５号に記載のプラスミドｐＣＣ１−ＰＰ１、ｐＰＰ７、およびｐＰＰ９からなる群より選択されるベクターの一種または二種以上を導入し、形質転換することによって提供できる。
【００４５】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、本発明のピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドとして、アセチル化酵素活性を有するポリペプチド以外に、リガーゼ活性を有するポリペプチド、ポリケチド合成酵素活性を有するポリペプチド、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、オキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドおよびアデニル酸合成酵素活性を有するポリペプチドからなる群から選択される一または二種以上のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターがさらに導入されていてもよい。本発明のアセチル化酵素活性を有するポリペプチド以外のピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドは、好ましくは、リガーゼ活性を有するポリペプチド、プレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドおよびオキシゲナーゼ（好ましくは水酸化酵素）活性を有するポリペプチドからなる群から選択される一または二種以上のポリペプチドであり、さらに好ましくは、水酸化酵素活性を有するポリペプチドである。
【００４６】
本発明の一つの態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、（ｉ）下記の配列番号１に記載の断片である各ヌクレオチド配列、（ｉｉ）下記の配列番号２〜８および１１のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）各ヌクレオチド配列の相補配列と厳密な条件でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｉｖ）各ヌクレオチド配列において１もしくは複数個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入もしくは付加されたヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、（ｖ）各ヌクレオチド配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列であり、かつそれぞれのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質をコードするヌクレオチド配列、から選択された少なくとも１個のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターがさらに導入されていてもよい。
【００４７】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の３３４２番から５１５８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、リガーゼ活性、特にＣｏＡリガーゼ（CoA ligase）活性を有することが好ましい。
【００４８】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の５３８２番から１２７７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、ポリケチド合成酵素活性、特にＬｏｖＢ様ポリケチド合成酵素（LovB-like polyketide synthase）（ＰＫＳ）活性を有することが好ましい。
【００４９】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１３２６６番から１５１４４番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、オキシゲナーゼ（例えば、水酸化酵素）活性、特にシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Cytochrome P450 monooxygenase）（１）（Ｐ４５０−１）活性を有することが好ましい。
【００５０】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１６２２０番から１８０１８番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、オキシゲナーゼ（例えば、水酸化酵素）活性、特にシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（Cytochrome P450 monooxygenase）（２）（Ｐ４５０−２）活性を有することが好ましい。
【００５１】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１８５０６番から１９２９６番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、シクラーゼ（Cyclase）活性、特にシクラーゼ(IMP: Integral membrane protein)活性を有することが好ましい。
【００５２】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の１９７７９番から２１３８９番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、オキシゲナーゼ活性、特にＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼ（FAD-dependent monooxygenase）（ＦＭＯ）活性を有することが好ましい。
【００５３】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２１７９３番から２２８７７番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、プレニルトランスフェラーゼ活性、特にＵｂｉＡ様プレニルトランスフェラーゼ（UbiA-like prenyltransferase）（ＵｂｉＡＰＴ）活性を有することが好ましい。
【００５４】
配列番号１で示されるヌクレオチド配列の２７７９８番から３１８５５番までのヌクレオチド配列がコードするタンパク質と実質的に同等なタンパク質は、ＡＴＰ合成酵素活性、特にCation transporting ATPase活性を有することが好ましい。
【００５５】
また、配列番号１のヌクレオチド３３４２番から５１５８番までは、ＣｏＡリガーゼをコードし、その対応するポリペプチドは、配列番号２に記載したアミノ酸配列で示される。
【００５６】
配列番号１のヌクレオチド５３８２番から１２７７７番までは、ＬｏｖＢ様ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号３に記載したアミノ酸配列で示される。
【００５７】
配列番号１のヌクレオチド１３２６６番から１５１４４番まで（以下、このポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質をシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（１）（Ｐ４５０−１）とする）および１６２２０番から１８０１８番まで（以下、このポリヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質をシトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（２）（Ｐ４５０−２）とする）は、シトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードし、対応するポリペプチドは、それぞれ、配列番号４、５に記載したアミノ酸配列で示される。
【００５８】
配列番号１のヌクレオチド１８５０６番から１９２９６番までは、シクラーゼをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号６に記載したアミノ酸配列で示される。
【００５９】
配列番号１のヌクレオチド１９７７９番から２１３８９番までは、ＦＡＤ依存性モノオキシゲナーゼ（ＦＭＯ）をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号７に記載したアミノ酸配列で示される。
【００６０】
配列番号１のヌクレオチド２１７９３番から２２８７７番までは、ＵｂｉＡ様プレニルトランスフェラーゼ（ＵｂｉＡＰＴ）をコードし、対応するポリペプチドは、配列番号８に記載したアミノ酸配列で示される。
【００６１】
配列番号１のヌクレオチド２７７９８番から３１８５５番までは、Cation transporting ATPaseをコードし、対応するポリペプチドは、配列番号１１に記載したアミノ酸配列で示される。
【００６２】
本発明の好ましい態様によれば、本発明の植物体は、植物物体に、ＷＯ２０１１／０９３１８５号に記載のプラスミドｐＰＰ２、ｐＰＰ３、およびｐＰＰ６からなる群より選択されるベクターの一種または二種以上をさらに導入し、形質転換することによって提供できる。
【００６３】
＜組換えベクター＞
本発明による組換えベクターは、例えば、上記に記載のポリヌクレオチドのいずれか一または二以上を、例えば、［サンブルーク(Sambrook, J.)ら著,「モレキュラー・クローニング(Molecular cloning):ア・ラボラトリー・マニュアル(a laboratory manual)」,(米国),第２版,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory),1989年］に記載の遺伝子組換え技術の常法に従って目的に応じて適当な形態に修飾し、ベクターに連結することによって作製することができる。
【００６４】
本発明において使用される組換えベクターは、ウイルス、プラスミド、フォスミド、またはコスミドベクター等から適宜選択することができる。
【００６５】
使用されるプラスミドの内の少なくとも一つは、形質転換体を選抜するための選択マーカーを含むのが好ましく、選択マーカーとしては薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を使用することができる。その好ましい具体例としては、カナマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子などが挙げられる。
【００６６】
また、本発明において利用される発現ベクターとしてのＤＮＡ分子は、各遺伝子の発現に必要なＤＮＡ配列、例えばプロモーター、転写開始信号、リボソーム結合部位、翻訳停止シグナル、転写終結信号などの転写調節信号、翻訳調節信号を有しているのが好ましい。プロモーターとしては、ＣａＭＶ ３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、ＣａＭＶ １９Ｓ ＲＮＡプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター、トウモロコシユビキチンプロモーター、イネアクチンプロモーター等が好ましく用いることができるものとして挙げられる。
【００６７】
本発明による組換えベクターは、好ましくは、プラスミドｐＩＧ６−ＡＴ−１およびｐＩＧ６−ＡＴ−２からなる群より選択される組換えベクターである。
【００６８】
フォスミドｐＣＣ１−ＰＰ１（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３３の大腸菌を用いて作成できる）、プラスミドｐＰＰ７（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１９のAspergillus oryzaeを用いて作成できる）およびプラスミドｐＰＰ９（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２０）に含まれるヌクレオチド配列を鋳型として、以下に示すプライマー対を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する。
【表２】
2016086759.tif 000005
【００６９】
＜形質転換された植物体＞
本発明による単離されたポリヌクレオチドを導入する植物体は、用いるベクターの種類に応じて、適宜選択されて良い。
【００７０】
形質転換された植物体は、後述する実施例に記載の方法により得ることができる。実施例では、植物体としてイネを用いているが、他の植物体にも同様に行うことができる。例えば、特表２０１０−５２６５３５号公報には、グリホサート等抵抗性遺伝子を含む植物体の製造方法が開示されており、ある活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を常法に従い組換えベクターを用いて様々な植物体（トウモロコシ、シロイヌナズナ、タバコ、ワタ、キャノーラなど）に導入すると、植物体の種類による差はなく、形質転換された植物体を得ることができたことが開示されている。
【００７１】
組換えベクターの植物体への導入方法としては、接合伝達、ファージによる形質導入、さらにカルシウムイオン法、リチウムイオン法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法といった形質転換の方法の中から、供試する植物体に応じて用いれば良い。
【００７２】
本発明において複数の遺伝子を植物体（植物細胞）に導入する場合には、各遺伝子は同一または別々のＤＮＡ分子に含まれていても良い。
【００７３】
本発明による植物体は、好ましくは、プラスミドｐＩＧ６−ＡＴ−１、ｐＩＧ６−ＡＴ−２からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上を含んでなる植物体である。
【００７４】
本発明の好ましい態様によれば、ピリピロペンＡの製造のための、プラスミドｐＩＧ６−ＡＴ−１、ｐＩＧ６−ＡＴ−２からなる群より選択されるベクターを一種またはそれ以上を含んでなる（形質転換された）植物体の使用が挙げられる。
【００７５】
本発明の一つの態様によれば、本発明の植物体は、導入されたポリヌクレオチドがコードするピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドの基質を、発現する、あるいは、含んでなる。基質は、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドがアセチルトランスフェラーゼ−１の場合は、デアセチルピリピロペンＥであり、アセチルトランスフェラーゼ−２の場合は、７−デアセチルピリピロペンＡまたは１１−デアセチルピリピロペンＯから選択される一種である。
【００７６】
本発明において、「植物体が基質を含んでなる」とは、植物体内に基質が含まれる状態を意味する。このような植物体は、植物体の生育において、土壌または肥料中に、基質、または基質を発現する微生物を添加し発現させ、その基質を栄養として体内に取り込ませることによって得られる。
【００７７】
植物の生育方法は、土壌、肥料、温度などの条件を決定する必要がある。
【００７８】
本発明において、「植物体が基質を発現する」とは、植物体が体内で、導入されたポリヌクレオチドがコードするピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドの基質を発現することを意味する。このような植物体は、植物体に基質を生合成するポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入することによって得られ、例えば、ピリピロペンＡの生合成に関与する少なくとも一種のポリペプチドがアセチルトランスフェラーゼ１の場合は、シクラーゼ活性をコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入することより得られ、アセチルトランスフェラーゼ−２の場合は、Ｐ４５０−１活性を有するポリペプチドおよびＰ４５０−２活性を有するポリペプチドからなる群から選択される一または二種以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターをさらに植物体に導入することにより得られる。
【００７９】
本発明の好ましい態様において、本発明の形質転換された植物体は、アセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターが導入された植物体である。
【００８０】
本発明のより好ましい態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドとして、アセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、Ｐ４５０−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターとが導入された植物体である。
【００８１】
本発明のより好ましい態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドとして、アセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、Ｐ４５０−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、Ｐ４５０−１活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターとが導入された植物体である。
【００８２】
本発明のより好ましい態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドとして、アセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、Ｐ４５０−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、Ｐ４５０−１活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、アセチルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターとが導入された植物体である。
【００８３】
本発明のより好ましい態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドとして、アセチルトランスフェラーゼ−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、Ｐ４５０−２活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、Ｐ４５０−１活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、アセチルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターと、シクラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターとが導入された植物体である。
【００８４】
本発明の特に好ましい態様によれば、本発明の形質転換された植物体は、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチド全てのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを導入してなる植物体である。
【００８５】
本発明の形質転換された植物体において、各ポリペプチドをコードする単離させたポリヌクレオチドは、一つのベクターに含ませて、植物体に導入されたものであってもよいし、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを別々のベクターに含ませて、同時期に又は別々の時期に植物体に導入されたものであってもよい。
【００８６】
植物体の製造方法
本発明の一つの態様によれば、本発明の植物体の製造方法は、上記（Ｉ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入する工程を含んでなる、製造方法である。本発明の好ましい態様によれば、本発明の植物体の製造方法は、デアセチルピリピロペンＥを植物体に発現または含ませる工程をさらに含んでなる。
【００８７】
本発明の一つの態様によれば、本発明の植物体の製造方法は、上記（ＩＩ）に記載されたヌクレオチド配列から選択された少なくとも１個の単離されたポリヌクレオチドまたはそれを含んでなる組換えベクターを植物体に導入する工程を含んでなる、製造方法である。本発明の好ましい態様によれば、本発明の植物体の製造方法は、１１−デアセチルピリピロペンＯおよび７−デアセチルピリピロペンＡからなる群から選択される一種以上を植物体に発現または含ませる工程をさらに含んでなる。
【００８８】
本発明の植物体の製造方法に用いられるポリヌクレオチドおよび組換えベクターは、上記の本発明の植物体に記載のポリヌクレオチドおよび組換えベクターと同じであってよく、また組換えベクターの植物体への導入方法についても上記と同様であってよい。
【００８９】
また、本発明の組換えベクターを導入する工程は、ピリピロペンＡの生合成に関与する全てのポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、一つのベクターに含ませて、植物体に導入してもよく、ピリピロペンＡの生合成に関与するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを別々のベクターに含ませて、同時期に又は別々の時期に植物体に導入してもよい。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００９１】
植物形質転換用ベクターｐＩＧ６を用いて、ピリピロペン類生合成遺伝子の内、以下のピリピロペン類生合成遺伝子を有するプラスミドを作製し、アグロバクテリウム法によりイネに導入し、得られた形質転換体を分子生物学的及び生化学的に解析した。
【００９２】
なお、ｐＩＧ６は、ｐＣＡＭＢＩＡ１３９０（８８６０ｂｐ。全塩基配列はGenbank accession number: AF234307に記載）のEcoRIと、HindIIとの間に、ｐＵＢＡ（Plant Physiology, 1992年, 100巻, p.1503）のトウモロコシユビキチンプロモーター、次いでSpeI-SacI-PacI-MluI-PmeI-KpneI-PvuII-Sse8387I-BamHIからなるマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）、およびノパリンシンターゼターミネーターが導入された植物形質転換用発現ベクターであり、その構造を図１に示す。
【００９３】
アセチル化酵素：アセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１、Acetyl-transferase-1）及びアセチル化酵素：アセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２、Acetyl-transferase-2）生合成遺伝子導入イネ
１）ｐＩＧ６−ＡＴ−１の作製
フォスミドｐＣＣ１−ＰＰ１（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３３の大腸菌を用いて作成できる）を鋳型として、プライマー対AT1 F with Sse8387I（配列番号１４）と、AT1 R with MluI（配列番号１５）とを用いたＰＣＲ法によりＡＴ−１遺伝子を増幅し、精製したＤＮＡ断片を制限酵素Sse8387IとMluIとで二重切断し、ｐＩＧ６の同部位にライゲーションし、大腸菌DH5αを形質転換することによって、図１に示すｐＩＧ６−ＡＴ−１を取得した。
【００９４】
２）ｐＩＧ６−ＡＴ−２の作製
フォスミドｐＣＣ１−ＰＰ１を鋳型として、プライマー対AT2 F with Sse8387I（配列番号１６）と、AT2 R with MluI（配列番号１７）とを用いたＰＣＲ法によりＡＴ−２遺伝子を増幅し、精製したＤＮＡ断片を制限酵素Sse8387IとMluIとで二重切断し、ｐＩＧ６の同部位にライゲーションし、大腸菌DH5αを形質転換することによって、図１に示すｐＩＧ６−ＡＴ−２を取得した。
【００９５】
３）ｐＩＧ６−ＣＬ、ｐＩＧ６−ＡＴ−１およびｐＩＧ６−ＡＴ−２を導入したアグロバクテリウムの作製
植物分子・細胞工学マニュアル（山田康之著、講談社、第１版、１９９２年）に記載された三者接合法により、各々のプラスミドをAgrobacterium tumefaciens（A. tumefaciens）EHA105株に導入した。プラスミドの導入が成功したか否かを、コロニーＰＣＲ法により確認した。コロニーＰＣＲ法に用いたプライマー対は、アセチルトランスフェラーゼ−１においては、AT1 F with Sse8387I（配列番号１４）と、AT1 R with MluI（配列番号１５）、アセチルトランスフェラーゼ−２においては、AT2 F with Sse8387I（配列番号１６）と、AT1 R with MluI（配列番号１７）を用いた。
【００９６】
４）アグロバクテリウム法によるイネ形質転換
土岐の方法 (Plant Molecular Biology, 1997年, 15巻, p.16-21)に従い、宿主としてイネを用いたアグロバクテリウム感染法を実施した。すなわち、イネ（品種：日本晴）（宿主）に、A. tumefaciens EHA105株/pIG6-AT-1、A. tumefaciens EHA105株/pIG6-AT-2を各々感染させ、共存培養、ハイグロマイシン選抜を経て、目的とする形質転換体（形質転換カルス）を取得した。得られた形質転換カルスと、対照としたイネカルス（野生型イネカルス）とから、常法によりゲノムＤＮＡアライメントを抽出し、ゲノムＰＣＲ法を用いてアセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１）遺伝子またはアセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２）遺伝子の導入の有無を確認した。ゲノムＰＣＲ法に用いたプライマー対は、アセチルトランスフェラーゼ−１においては、AT1 F with Sse8387I（配列番号１４）と、AT1 R with MluI（配列番号１５）、アセチルトランスフェラーゼ２においては、AT2 F with Sse8387I（配列番号１６）と、AT1 R with MluI（配列番号１７）であった。導入遺伝子特異的プライマー対の他に内部標準遺伝子としてアクチン遺伝子に対するアクチンプライマー対actin F（配列番号１２）と、actin R（配列番号１３）も使用した。
【００９７】
全ての供試カルスにおいてアクチン遺伝子の増幅（２８５ｂｐ）がみられ、アセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１）遺伝子およびアセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２）遺伝子を導入した形質転換カルスにおいて、それぞれアガロース電気泳動において期待される位置にバンドが確認された（図２および図３参照））。
【００９８】
５）酵素変換試験
形質転換カルスの酵素変換能を測定する方法としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、ピリピロペンＡ生合成酵素の基質と、イネカルスとをインキュベートし、その後抽出し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて代謝産物を測定する方法を採用した。
【００９９】
［基質の調整］
（ｉ）デアセチルピリピロペンＥの合成および構造解析
ピリピロペンＥは、特開平８−２３９３８５号公報に記載の方法で取得した。ピリピロペンＥ（２９ｍｇ）をメタノール−水（１９：１、１ｍＬ）に溶解して、炭酸カリウム（５３ｍｇ）を加えた。４４時間撹拌した後、減圧下で溶媒を留去し、クロロホルム−メタノール（１０：１）の混合溶媒を加えた。濾過により不溶物を取り除き、減圧下で溶媒を留去することで、粗生成物を得た。粗生成物を分取薄層クロマトグラフィー（Ｍｅｒｃｋ  シリカゲル６０Ｆ２５４  ０．５ｍｍ、クロロホルム：メタノール＝１０：１）にて精製して、デアセチルピリピロペンＥ（１８ｍｇ）を得た。
ESI-MS；m/z 410 (M+H)+
1H-NMR (CDCL3) δ(ppm) 0.82 (3H, s), 0.92 (3H, s), 1.00-1.03 (1H, m), 1.04 (3H, s), 1.12 (1H, dt, J = 4.0, 13.2 Hz), 1.27 (3H, s), 1.41-1.53 (2H, m), 1.59-1.75 (3H, m), 1.80-1.84 (2H, m), 2.15 (1H, dt, J = 3.2, 12.4 Hz), 2.18-2.29 (1H, m), 2.54 (1H, dd, J = 3.2, 17.6 Hz), 3.25 (1H, dd, J = 4.4, 11.2 Hz), 6.43 (1H, s), 7.39 (1H, dd, J = 4.8, 8.0 Hz), 8.11 (1H, d, J = 8.0 Hz), 8.65 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.99 (1H, d, J = 1.6 Hz)
【０１００】
（ｉｉ）１１−デアセチルピリピロペンＯの合成および構造解析
ピリピロペンＯ は、J. Antibiot. 1996, 49, 292に記載の方法で取得した。ピリピロペンＯ（３０ｍｇ）をメタノール−水（１９：１、２ｍＬ）に溶解して、炭酸カリウム（２０ｍｇ）を加えた。２２時間撹拌した後、酢酸（０．１ｍｌ）を加え、減圧下で溶媒を留去した。酢酸エチルと水を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去することで、１位、１１位デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（３０ｍｇ）を得た。
【０１０１】
１位、１１位デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（２３ｍｇ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．４ｍＬ）に溶解してトリエチルアミン（８ｍｇ）、無水酢酸（７ｍｇ）を加えた。室温で２３時間撹拌した後、水を加えて、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去することで、１−デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（２８ｍｇ）を得た。
【０１０２】
１−デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（２８ｍｇ）をトルエンに溶解して、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（２０ｍｇ）を加えた。７０℃で２０時間撹拌した後、放冷し、酢酸エチルと水を加え、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧下で溶媒を留去することで、１１−デアセチルピリピロペンＯの粗生成物（２０ｍｇ）を得た。
【０１０３】
得られた粗生成物をメタノールで溶解後サンプルとし、ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製ＬＣ−６ＡＤ，ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ  ＰＤＡ，ＣＢＭ−２０Ａ，Ｃｏｌｕｍｎ；Ｗａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ  Ｃ１８  （Φ４．５ｘ５０ｍｍ、５μｍ）で移動相３０％アセトニトリル水から２５分で５５％アセトニトリル水（リニアグラジエント）、流速１．０ｍｌ／分、保持時間１８分〜１９分を繰り返し分取し１１−デアセチルピリピロペンＯ（４．０ｍｇ）を得た。
ESI-MS；m/z 468 (M+H) +
1H-NMR (CDCl3) δ(ppm); 0.68 (3H, s), 0.95 (3H, s), 1.21-2.21 (10H, m), 1.25 (3H, s), 2.05 (3H,s), 2.20 (1H, dd, J = 4.63, 17.3 Hz), 2.50 (1H, dd, J = 4.63, 17.3 Hz), 2.94 (1H, d, J = 12.5 Hz), 3.33 (1H, d, J = 12.5 Hz), 4.87 (1H, dd, J = 4.6, 12.2 Hz), 6.48 (1H, s), 7.57 (1H, dd, J = 5.1, 8.1 Hz), 8.29(1H, d, J = 8.3 Hz), 8.68 (1H, d, J = 4.6 Hz), 9.04 (1H, s)
【０１０４】
（ｉｉｉ）７−デアセチルピリピロペンＡの合成
７−デアセチルピリピロペンＡは、特開平８−２５９５６９号公報に記載の方法で合成された。
【０１０５】
［ｉｎ  ｖｉｖｏ反応］
野生型、アセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１）遺伝子導入またはアセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２）遺伝子導入イネカルスを各３粒程度（約０．１６ｇ）、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに量りとり、Ｎ６Ｄ液体培地１ｍｌを加えて２８〜３０℃、１６時間明条件、８時間暗条件の周期で２日間培養した。この際、各イネカルスには、ＤＭＳＯ（分子生物学用ジメチルスルホキシド，＞９９．９％、ＳＩＧＭＡ社）に溶解した各基質、すなわち１１−デアセチルピリピロペンＯ（ｄｅＡｃＰｙＯ）、デアセチルピリピロペンＥ（ｄｅＡｃＰｙＥ）及び７−デアセチルピリピロペンＡ（ｄｅＡｃＰｙＡ）を各１０ｐｐｍとなるように加えた。
【０１０６】
［酢酸エチル抽出］
カルス及び培養液１ｍｌをマイクロチューブホモジナイザ―で粉砕し、１７，７００×ｇ、１０分間遠心分離した。その後、上清液を別のチューブに移し、上清：酢酸エチル＝１：１の割合で混合した。これをよく撹拌し、１７，７００×ｇ、１０分間遠心分離した。有機層を採取し、減圧デシケーターを用いて乾燥させた。乾燥後、メタノール１ｍｌで溶解し、カートリッジ（０．２２μｍ）を通過させて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳに供した。
【０１０７】
［ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析］
上述のサンプルは、ＡＰＩ３２００ＴＭＬＣ／ＭＳ／ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（エービーサイエックス社）およびＳｈｉｍａｄｚｕ社製ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ２０Ａ）により測定解析を行なった。なお、測定操作方法は、メーカーの指示に従った。溶媒は、Ａ：２０％アセトニトリル、Ｂ：１００％アセトニトリルを用いた。また、カラムは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製Ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ  ＸＲ−ＯＳＤ／−Ｃ８／−Ｐｈｅｎｙｌを用いた。
【０１０８】
標準曲線の作成には、測定する化合物をＭｅＯＨで溶解した希釈サンプルを任意の濃度に調整して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる測定を行い、標準曲線とした。
【０１０９】
その結果、アセチルトランスフェラーゼ−１（ＡＴ−１）遺伝子導入カルスにおいては、デアセチルピリピロペンＥからピリピロペンＥへのアセチル化変換活性が確認された（図４参照）。また、アセチルトランスフェラーゼ−２（ＡＴ−２）遺伝子導入カルスにおいては、１１−デアセチルピリピロペンＯからピリピロペンＯへのアセチル化変換活性（図５参照）、及び７−デアセチルピリピロペンＡからピリピロペンＡへのアセチル化変換活性（図６参照）が確認された。なお、全てにおいて野生型カルスでのアセチル化変換活性は認められなかった。
【受託番号】
【０１１０】
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１３３
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２１９
ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２２０
【図１】
2016086759.tif 000006
【図２】
2016086759.tif 000007
【図３】
2016086759.tif 000008
【図４】
2016086759.tif 000009
【図５】
2016086759.tif 000010
【図６】
2016086759.tif 000011
【配列表】
2016086759000001.app