(57)【要約】      （修正有）【課題】その機能が十分に解明されていない構造のスフィンゴ糖脂質を含有する蜂の子抽出物の提供。【解決手段】式（１）及びその特定の類縁化合物として表されるスフィンゴ糖脂質を含有する蜂の子抽出物。該糖脂質は、ＮＯ産生抑制効果等を奏し、機能性食品や化粧品、医薬品等へ応用する方法。2016108314.tif 000024蜂の子を有機溶媒と混合し、スフィンゴ糖脂質を含む脂質成分を抽出し、前記脂質成分を精製して、スフィンゴ糖脂質を高濃度に含有する方法。前記スフィンゴ糖脂質成分を、ＮＯ（一酸化窒素）、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の産生抑制剤として使用する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする蜂の子抽出物。
【化１】
2016108314.tif 000012
【化２】
2016108314.tif 000013
【請求項２】
前記スフィンゴ糖脂質が、蜂の子と有機溶媒とを混合することで得られてなる脂質含有成分から抽出されたスフィンゴ糖脂質であることを特徴とする請求項１記載の蜂の子抽出物。
【請求項３】
蜂の子からスフィンゴ糖脂質を得るスフィンゴ糖脂質の製造方法であって、
蜂の子を有機溶媒と混合することで、蜂の子からスフィンゴ糖脂質を含有する脂質含有成分を抽出する抽出工程を有することを特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項４】
前記抽出工程で抽出された脂質含有成分を精製することで、スフィンゴ糖脂質を高濃度で含有するスフィンゴ糖脂質成分を精製する精製工程を有する請求項３記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【請求項５】
前記スフィンゴ糖脂質が、式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする請求項３または４記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
【化３】
2016108314.tif 000014
【化４】
2016108314.tif 000015
【請求項６】
式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＯ（一酸化窒素）産生抑制剤。
【化５】
2016108314.tif 000016
【化６】
2016108314.tif 000017
【請求項７】
式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤。
【化７】
2016108314.tif 000018
【化８】
2016108314.tif 000019
【請求項８】
式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＩＬ−６産生抑制剤。
【化９】
2016108314.tif 000020
【化１０】
2016108314.tif 000021
【請求項９】
式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗炎症剤。
【化１１】
2016108314.tif 000022
【化１２】
2016108314.tif 000023
【請求項１０】
請求項６記載のＮＯ産生抑制剤を含有する機能性食品または化粧品、医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蜂の子抽出物、および蜂の子を用いたスフィンゴ糖脂質の製造方法ならびに当該スフィンゴ糖脂質を含有するＮＯ産生抑制剤やＴＮＦ−α産生抑制剤、ＩＬ−６産生抑制剤、抗炎症剤、機能性食品等に関する。
【背景技術】
【０００２】
蜂の子は、クロスズメバチなどの蜂の幼虫（蛹、成虫も一緒に入れることもある）で、日本では山間部を中心に、蛋白源として古くから食用とされることがある。この蜂の子は、ビタミンやミネラル、アミノ酸等を含むことから、その効用を期待して、甘露煮や佃煮にしたり、炒めたり、蒸し焼きにしたりといった従来の食用の方法等で蜂の子を食すことが見直されている。
【０００３】
一方、スフィンゴ糖脂質は、動物界、植物界に広く存在しており、様々な動植物から抽出することが試みられている。例えば特許文献１は、動植物から有機溶媒や疎水性カラムクロマトグラフィー等を用いて、スフィンゴ糖脂質を精製する方法を開示するものである。
【０００４】
スフィンゴ糖脂質は、具体的な構造により、異なる特性を示すと考えられる。例えば、特許文献２は、特定の構造を有するスフィンゴ糖脂質を開示するものであり、これらのスフィンゴ糖脂質が含まれた化粧品の検討を行っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００３−２２１５９２号公報
【特許文献２】特許第４１７３９４４号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Eugeni V. Entchev, et al. "LET-767 Is Required for the Production of Branched Chain and Long chain Fatty Acids in Caenorhabditis elegans", J. Biol. Chem. 2008, 283:17550-17560, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１には、種々の動植物にはスフィンゴ糖脂質が含まれていることが期待され、そこからスフィンゴ糖脂質を得る方法が記載されているが、具体的にスフィンゴ糖脂質を抽出した原料となる動植物の事例は少ない。また、具体的に得られたスフィンゴ糖脂質の構造は開示されていないため、スフィンゴ糖脂質を利用するには更なる詳しい検討が必要であった。
【０００８】
また、特許文献２等に開示されているように、スフィンゴ糖脂質は、その構造によっては異なる機能が期待されるため、従来から利用されてきた構造のスフィンゴ糖脂質とは異なるスフィンゴ糖脂質を発見、精製、製造し、その機能を解明することが求められている。
【０００９】
非特許文献１には、従来、化粧品等に適用することが検討されてきたスフィンゴ糖脂質とは異なる構造のスフィンゴ糖脂質が開示されている。一方で、非特許文献１に開示されているスフィンゴ糖脂質は、食経験がないモデル生物由来のものである。スフィンゴ糖脂質は、その構造を考慮すると、化学的方法で合成することは難しい。
【００１０】
また、生体等におけるスフィンゴ糖脂質の含有量を考慮すると、極めて高い純度の精製を行うことは難しい、あるいは作業量が多くなりすぎるため現実的ではない。よって、食経験がない原料を由来とする場合、食用等のヒトが利用することに適さない。すなわち、非特許文献１に開示されている生物からスフィンゴ糖脂質を得ようとする場合、食経験がなく不純物として含有されるものが未知のため、食用等に利用しにくく、検討や利用が進まないという問題があった。
【００１１】
また、食用としての蜂の子が見直されているのはそのアミノ酸、ビタミン、ミネラル等の効果を見直すものであり、その脂質に着目するものは少なく、その食用としての態様も従来の食用製法によるものであった。本発明はかかる状況下、その機能が十分に解明されておらず、一方でその機能を解明することでヒトが利用しやすいスフィンゴ糖脂質を製造する方法を提供するものである。また、特定の脂質に注目した蜂の子抽出物を提供するものである。さらに、この特定の構造のスフィンゴ糖脂質を用いるＮＯ産生抑制剤等を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、下記の発明が上記目的に合致することを見出し、本発明に至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
＜１＞  式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする蜂の子抽出物。
【００１４】
【化１】
2016108314.tif 000002
【００１５】
【化２】
2016108314.tif 000003
＜２＞  前記スフィンゴ糖脂質が、蜂の子と有機溶媒とを混合することで得られてなる脂質含有成分から抽出されたスフィンゴ糖脂質である前記＜１＞記載の蜂の子抽出物。
＜３＞  蜂の子を有機溶媒と混合することで、蜂の子からスフィンゴ糖脂質を含有する脂質含有成分を抽出する抽出工程を有することを特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜４＞  前記抽出工程で抽出された脂質含有成分を精製することで、スフィンゴ糖脂質を高濃度で含有するスフィンゴ糖脂質成分を精製する精製工程を有する前記＜３＞記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜５＞  前記スフィンゴ糖脂質が、前記式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする前記＜３＞または＜４＞記載のスフィンゴ糖脂質の製造方法。
＜６＞  前記式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＯ（一酸化窒素）産生抑制剤。
＜７＞  前記式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有するＴＮＦ−α産生抑制剤。
＜８＞  前記式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有するＩＬ−６産生抑制剤。
＜９＞  前記式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有する抗炎症剤。
＜１０＞  前記＜６＞記載のＮＯ産生抑制剤を含有する機能性食品または化粧品、医薬品。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の蜂の子抽出物は、特定の構造のスフィンゴ糖脂質を含有するためＮＯ産生抑制効果を有する。さらに、本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法によれば、種々の用途に使用しやすいスフィンゴ糖脂質を得ることができる。ここで、蜂の子は、スフィンゴ糖脂質の原料としてはこれまでほとんど着目されてこなかった。一方で、蜂の子は、従来から食経験があるものであった。この食経験がある蜂の子を原料とする本発明のスフィンゴ糖脂質を含有する蜂の子抽出物は経口投与等する用途への応用が行いやすいといった利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明により蜂の子のスフィンゴ糖脂質を抽出した溶液をカラムクロマトグラフィーにより精製した画分のＴＬＣ試験結果である。
【図２】本発明により蜂の子のスフィンゴ糖脂質を抽出した溶液をＨＰＬＣにより精製した画分のＴＬＣ試験結果である。
【図３】本発明のスフィンゴ糖脂質混合したときの細胞試験におけるＮＯ産生量を測定した結果である。
【図４】本発明のスフィンゴ糖脂質混合したときの細胞試験における生細胞率を測定した結果である。
【図５】本発明のスフィンゴ糖脂質混合したときの細胞試験におけるＴＮＦ−α産生量を測定した結果である。
【図６】本発明のスフィンゴ糖脂質混合したときの細胞試験におけるＩＬ−６産生量を測定した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明するが、以下に記載する構成要件の説明は、本発明の実施態様の一例（代表例）であり、本発明はその要旨を変更しない限り、以下の内容に限定されない。
【００１９】
本発明の抽出物は、式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とする蜂の子抽出物に関する。この蜂の子抽出物に含まれるスフィンゴ糖脂質は、これまで有効な入手方法が知られていなかったスフィンゴ糖脂質である。また、このスフィンゴ糖脂質を含有する蜂の子抽出物は、ＮＯ産生抑制効果等をしめす。
【００２０】
【化３】
2016108314.tif 000004
【００２１】
【化４】
2016108314.tif 000005
【００２２】
本発明の製造方法は、蜂の子を有機溶媒と混合することで、蜂の子からスフィンゴ糖脂質を含有する脂質含有成分を抽出する抽出工程を有することを特徴とするスフィンゴ糖脂質の製造方法に関する。この製造方法は、従来スフィンゴ糖脂質の原料として着目されなかった蜂の子からスフィンゴ糖脂質を得るものであり、食経験がある原料を用いることから応用性に優れたスフィンゴ糖脂質を得ることができるものである。また、この抽出工程によって、式（１）および／または（２）で表されるスフィンゴ糖脂質の含有量が多い蜂の子抽出物を得ることができ、この抽出物は、これらのスフィンゴ糖脂質によるＮＯ産生抑制効果等が優れている。
【００２３】
本発明の蜂の子抽出物およびスフィンゴ糖脂質の製造方法は、蜂の子を用いるものに関する。蜂の子とは、蜂の幼虫や蛹であり、本発明においてはスフィンゴ糖脂質を得ることができる態様であれば幼虫および蛹いずれも用いることができる。また、蜂は、スズメバチ、クロスズメバチ、ミツバチ、アシナガバチ等、いずれの蜂を用いても良い。蜂の子は、採取した状態の蜂の子をそのまま用いてもよいし、スフィンゴ糖脂質が残存するような手法で乾燥や粉砕等の後処理を行ったものを用いても良い。なお、蜂の子から得られるスフィンゴ糖脂質は、蜂の子１匹あたり０．１〜２．０μｇ程度と考えられる。
【００２４】
本発明の製造方法は、スフィンゴ糖脂質の製造方法に関するものである。本発明の製造方法により得られるスフィンゴ糖脂質は、単独の構造のスフィンゴ糖脂質のみからなるものではなくてもよく、複数の構造のスフィンゴ糖脂質を含有する組成物であってもよく、ここでは特に断りがない場合、組成物も含めてスフィンゴ糖脂質と呼ぶ。また、本発明のスフィンゴ糖脂質は、前述のように食経験がある原料を用いることから高度な精製を行わないでも食用に利用しやすい。この本発明の製造方法は、スフィンゴ糖脂質として、モノヘキソース含有型スフィンゴ脂質を含有するスフィンゴ糖脂質の製造方法とすることができる。
【００２５】
ここで、式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質について詳述する。この式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、Ｎ−２´−２−ヒドロキシドコサノイル−ｌ−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル−３−ヒドロキシ−１５−メチル−２−アミノヘキサデカン−１，３−ジオール（N-2'-2-hydroxydocosanoyl-l-O-beta-D-glycosl-3-hydroxy-15-methyl-2-aminohexadecane-1,3-diol，Ｃ45Ｈ87Ｏ9Ｎ1）である。
【００２６】
【化５】
2016108314.tif 000006
【００２７】
また、式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質は、Ｎ−２´−２−ヒドロキシ−３―ドコセノイル−ｌ−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル−３−ヒドロキシ−１５−メチル−２−アミノヘキサデカン−１，３−ジオール（N-2'-2-hydroxy-3-docosenoyl-l-O-beta-D-glycosl-3-hydroxy-15-methyl-2-aminohexadecane-1,3-diol，Ｃ45Ｈ85Ｏ9Ｎ1）である。
【００２８】
【化６】
2016108314.tif 000007
【００２９】
この式（１）で表されるスフィンゴ糖脂質は、前述の非特許文献１において報告があるのみである。また、この式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質は、前述の非特許文献１に類似する構造のスフィンゴ糖脂質が報告されているのみである。また、これらのスフィンゴ糖脂質は、具体的な機能等の検討が行われていないスフィンゴ糖脂質である。本発明の製造方法によれば、この式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を高濃度で含有するスフィンゴ糖脂質を効率よく製造することができ、さらに、各種試験に利用しやすい。
【００３０】
本発明のスフィンゴ糖脂質は、内服、皮膚外用等の使用方法により皮膚の保湿剤等としての効果を得ることができる。また、式（１）や式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質は、動物や植物、キノコ等に含まれるスフィンゴ糖脂質とは異なる構造を有しており、各種免疫細胞の賦活化能を示し、免疫賦活剤として使用することが期待される。また、これらの効果を利用して、機能性食品や、化粧品、医薬として使用することができる。
【００３１】
本発明のスフィンゴ糖脂質の製造方法は、蜂の子からスフィンゴ糖脂質を含有する脂質含有成分を抽出する抽出工程を有することを特徴とする。また、本発明の蜂の子抽出物は、脂質含有成分を主たる抽出対象として抽出するこの抽出工程で得ることが好ましい。ここで、脂質を選択的に抽出するために、有機溶媒等を使用した抽出工程により、蜂の子から抽出されるスフィンゴ糖脂質を含有する脂質含有成分を抽出する。この脂質含有成分をそのままスフィンゴ糖脂質として用いたり、適宜、スフィンゴ糖脂質の純度が高い精製物として利用することができる。抽出工程を行うための抽出溶媒としては有機溶媒を用いることが一般的である。ここで使用する有機溶媒としては、原料およびスフィンゴ糖脂質と抽出中に反応し、本発明の効果を損なうものでなければいかなるものでも使用できる。また、一種類の溶媒を単独で用いても複数の溶媒を混合して用いても良い。かかる有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、tert−ブタノールなどのアルコール類や、ヘキサン、ペンタン、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチルなどが挙げられる。これらの中で好ましい有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ヘキサン、アセトン、クロロホルムが挙げられ、特に好ましい例としてはメタノール、エタノール、クロロホルムが挙げられる。特に、スフィンゴ糖脂質を高効率で抽出でき、かつ揮発性が高いため抽出後に除去しやすいクロロホルムとメタノールの混合溶媒が好ましい。クロロホルムとメタノールの混合溶媒を用いる場合、クロロホルム：メタノールの混合比率は、クロロホルム：メタノール（容量比）として、１００：1〜１：１００程度が好ましく、１０：１〜１：１０程度がより好ましい。また、これらの有機溶媒で抽出する際には抽出効率をあげるために例えば水、界面活性剤などの添加物を本発明の効果を損なわない範囲で加えることができる。
【００３２】
抽出に使用する有機溶媒の量は、原料となる蜂の子１重量部に対して、好ましくは１〜３０重量部、さらに好ましく１〜１０重量部用いる。溶媒の使用量が少なすぎる場合、原料全体に溶媒が浸透せず、抽出が不十分になる恐れがあり、多すぎる溶媒を添加しても蜂の子からの抽出量に影響はなく、抽出工程後の溶媒中のスフィンゴ糖脂質濃度が低くなる。
【００３３】
抽出工程における抽出温度は、使用する溶媒の沸点にもよるが、好ましくは、０〜８０℃、さらに好ましくは室温程度から６０℃の範囲がよい。抽出温度が低すぎる場合、抽出効率が低下し、抽出温度が高すぎる場合、溶媒が揮発してしまい十分な抽出ができなかったり、抽出成分が劣化したりするおそれがある。
【００３４】
抽出時間は、好ましくは０．５〜４８時間、より好ましくは０．５〜２０時間である。抽出時間が短い場合、十分に抽出が行われない場合があり、この範囲を超えていたずらに長く時間をかけて抽出を行う必要性はない。
【００３５】
なお、抽出操作は１回のみの回分操作に限定されるものではない。抽出後の残渣に再度新鮮な溶媒を添加し、抽出操作を施すこともできるし、抽出溶媒を複数回抽出原料に接触させることも可能である。すなわち、抽出操作としては、回分操作、半連続操作、向流多段接触操作のいずれの方式も使用可能である。また、ソックスレー抽出など種々の抽出操作によって抽出を行ってもよい。
【００３６】
前記抽出工程で抽出された脂質含有成分を分離精製することで、抽出残渣を分離除去しより高濃度でスフィンゴ糖脂質を含有するスフィンゴ糖脂質を得ることができる。この高濃度とは、抽出のみをおこなったものよりもスフィンゴ糖脂質濃度として高くなったものをさす。まず、残渣等を分離する方法は特に限定されず、例えば吸引ろ過、フィルタープレス、シリンダープレス、デカンター、遠心分離器、ろ過遠心機などの公知の方法を用いることができる。
【００３７】
次に、適宜、残渣等を分離したスフィンゴ糖脂質（脂質成分）を含有する抽出液は濃縮工程により濃縮することができる。濃縮方法は特に限定されず、例えばエバポレーターのような減圧濃縮装置や加熱による溶媒除去などにより、濃縮することができる。
【００３８】
本発明においては、例えば、疎水性カラムクロマトグラフィーを用いて精製を行なうことができる。この疎水性カラムクロマトグラフィーを用いる操作に先立ち、他の方法で精製操作を行なっておくこともできる。このような精製操作としては、例えば、水や有機溶媒による洗浄、アルカリ性溶液による洗浄、他のカラムクロマトグラフィーによる精製、活性炭による精製、極性の異なる溶媒による分配、再結晶法などが挙げられる。これらの中でも水やアルカリ性水溶液による洗浄工程を有することが好ましい。
【００３９】
本発明においては、精製工程として、疎水性カラムクロマトグラフィーによる精製を行うことができる。疎水性カラムクロマトグラフィーとは、疎水性相互作用によって吸着脱離をするものであり、細孔を有する多孔性樹脂や、表面に官能基を結合した樹脂といった種々の樹脂を用いる方法が知られており、スフィンゴ糖脂質を精製することに適した方法を適宜採用することができる。
【００４０】
疎水性カラムクロマトグラフィーを行う際に使用するカラムの内径や長さは特に限定されず、処理する抽出液の量や樹脂の量にあわせてカラムを選定すればよい。カラムへの樹脂の充填方法は、樹脂をカラムに充填後展開溶媒（流動層）を導入する乾燥法、樹脂と展開溶媒をあらかじめ混合したものを流し入れる湿潤法のいずれも用いることができるが、展開溶媒により樹脂が膨潤あるいは収縮するものが多いことから湿潤法を用いることが好ましい。
【００４１】
本発明において疎水性カラムクロマトグラフィーで用いられる展開溶媒は、使用する樹脂によって適するものが異なる傾向にあるが、一般的にはスフィンゴ糖脂質が溶解し、樹脂に悪影響を及ぼさないものならば特に限定されない。かかる溶媒として好ましいものには、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、tert−ブタノールなどのアルコール類、ヘキサン、ペンタン、ジエチルエーテル、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、水などが挙げられる。これらの中で好ましい例としては、メタノール、エタノール、ヘキサン、アセトン、水が挙げられ、特に好ましい例としてはメタノール、エタノール、水が挙げられる。また、これらの溶媒は単独で使用しても良いし、２種類以上の溶媒を混合して用いても良い。
【００４２】
カラムへの抽出物のアプライは、抽出物を１倍〜５０倍の溶媒に溶解させた状態で行うことが好ましい。抽出液のアプライ後、所定の溶媒を樹脂１００ｍＬ当り、０．０２〜２０ｍＬ／分程度の流速で流し、展開することが好ましい。
【００４３】
次に、疎水性カラムクロマトグラフィーで精製した出液のいずれの画分にスフィンゴ糖脂質が含まれているかを確認するには、シリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いる方法や紫外分光光度計を用いる方法、光散乱検出器を用いる方法などがある。ＴＬＣ法は、所定量の試料をシリカゲルプレートにアプライし、クロロホルム：メタノール：水系などの混合溶媒の入った展開層に導入し、展開する。展開後はシリカゲルプレートをドライヤーなどで乾燥し、オルシノール７０％硫酸を噴霧して加熱することによって発色し、スフィンゴ糖脂質のスポットの発色によって確認することができる。紫外分光光度計を用いる場合には、２１０ｎｍ〜２８０ｎｍの波長で吸収ピークを観測し、確認することができる。光散乱検出器を用いる場合でも紫外分光光度計の場合と同様にして確認することができる。除去されるべきステロール配糖体も同様の方法で測定することができる。
【００４４】
スフィンゴ糖脂質が高純度で含まれていることを確認したら、その流出液を混合し、溶媒を留去してスフィンゴ糖脂質を濃縮することができる。濃縮する方法は、本発明の効果を損なうものでなければいかなる方法も使用することができる。例えばエバポレーターのような減圧濃縮装置や遠心式薄膜真空蒸発装置を用いたり、加熱による溶剤除去などにより濃縮することができる。濃縮したものは、真空乾燥機などを用いて溶媒を除去し、易揮発性成分を除去したスフィンゴ糖脂質を得ることができる。
【００４５】
上述したような方法により得られた精製物には、望ましくはスフィンゴ糖脂質が１０〜１００質量％含有されることが好ましい。スフィンゴ糖脂質含量が低い場合は、食品や化粧品の添加物として使用する際に多量の添加が必要であったり、不純物を含有するために水や油性原料への分散が困難になったり、効果が低減する可能性がある。このようにして得られる蜂の子抽出物やスフィンゴ糖脂質は、機能性食品や、化粧品、医薬として使用することができる。
【００４６】
本発明のＮＯ産生抑制剤は、式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＮＯ（一酸化窒素）産生抑制剤に関する。
【００４７】
【化７】
2016108314.tif 000008
【００４８】
【化８】
2016108314.tif 000009
【００４９】
また、本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＴＮＦ−α産生抑制剤に関する。
【００５０】
また、本発明のＩＬ−６産生抑制剤は、式（１）および／または式（２）で表されるスフィンゴ糖脂質を含有することを特徴とするＩＬ−６産生抑制剤に関する。
【００５１】
このスフィンゴ糖脂質は、前述したように効率的な入手方法が提案されていなかったが、蜂の子から抽出することで効率よく得ることができる。このスフィンゴ糖脂質は、ＮＯ産生抑制効果を奏するため、ＮＯ産生抑制剤として使用することができる。また、ＴＮＦ−α産生抑制効果により、ＴＮＦ−α産生抑制剤として使用することができる。また、ＩＬ−６産生抑制剤として使用することができる。
【００５２】
ここで、ＮＯは一酸化窒素であり、ＮＯは、生体内で多彩な機能を示す生理活性物質であることが知られている。このＮＯは、マクロファージ等でも産生されるが、このＮＯが体内で大量に産生されると、自己組織の破壊を引き起こしたり、炎症が生じたり悪化したり、リウマチや糖尿病の原因となったりし、生体にとって害があることが指摘されている。本発明のＮＯ産生抑制剤を用いることで、このＮＯの過剰な産生を抑制することができる。このＮＯ産生抑制剤は、これを薬学的に許容できる含む量となるように調製した製剤を用いて、経口摂取したり、皮膚外用として用いることでその効果を奏する。
【００５３】
ＴＮＦ−α：腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ）は、主にマクロファージにより産生されるサイトカインの一種である。ＴＮＦ−αの過剰産生は、関節リウマチ、乾癬、糖尿病・高脂血症、敗血症、骨粗しょう症、炎症などの疾患の発症の原因となることが指摘されている。本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤を用いることで、このＴＮＦ−α産生を抑制することができる。本発明のＴＮＦ−α産生抑制剤は、これを薬学的に許容できる含む量となるように調製した製剤を用いて、経口摂取したり、皮膚外用として用いることでその効果を奏する。
【００５４】
ＩＬ−６：インターロイキン−６は、Ｔ細胞やマクロファージ等により産生されるサイトカインの一種である。ＩＬ−６の過剰産生は、炎症、関節リウマチ、免疫病などの疾患の発症の原因となることが指摘されている。本発明のＩＬ−６産生抑制剤を用いることで、このＩＬ−６産生を抑制することができる。本発明のＩＬ−産生抑制剤は、これを薬学的に許容できる含む量となるように調製した製剤を用いて、経口摂取したり、皮膚外用として用いることでその効果を奏する。
【００５５】
このＮＯ産生抑制剤等（ＴＮＦ−α産生抑制剤、ＩＬ−６産生抑制剤）を経口摂取する場合、この蜂の子抽出物のようにスフィンゴ糖脂質を含むものを用いてソフトカプセルや、ハードカプセル、打錠剤等のカプセル型錠剤のような、固形の製剤形態としたり、ゼリー状や、液状等の経口投与に適した製剤の剤形に調製して摂取することができる。また、皮膚外用に用いる場合、このスフィンゴ糖脂質を、軟膏やクリーム、乳液、ローション、パック、リップクリーム、入浴剤整髪料等に用いて皮膚に接することでその効果を奏することができる。
【００５６】
さらに、本発明は、このＮＯ産生抑制剤のＮＯ産生抑制効果等を利用して、抗炎症剤として使用することができる。また、このスフィンゴ糖脂質は、サイトカインレベルでＩＬ−６やＴＮＦ-αの産生を抑制する。これらのＮＯや、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αは生体において炎症に関与していることがしられており、ＮＯ産生抑制、ＩＬ−６産生抑制やＴＮＦ−α産生抑制といった効果を奏することから抗炎症剤として使用することができる。この抗炎症剤として使用する場合も、ＮＯ産生抑制剤を経口摂取や、皮膚外用するときの例として示したような公知の態様で用いて摂取することができる。
【００５７】
本発明のＮＯ産生抑制剤は、このようなＮＯ産生抑制作用を有することから、これを含有する機能性食品または化粧品、医薬品として用いることができる。また、ＴＮＦ−α産生抑制剤、ＩＬ−６産生抑制剤を含有する機能性食品または化粧品、医薬品として用いることもできる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を変更しない限り以下の実施例に限定されるものではない。
【００５９】
＜１．蜂の子由来のスフィンゴ糖脂質の製造・精製・構造特定＞
［評価項目］
［スフィンゴ糖脂質］
分離精製工程で精製された画分に、スフィンゴ糖脂質が含有されることを確認するために、以下のＴＬＣと、フラグメント解析を行った。
【００６０】
［ＴＬＣ］
スフィンゴ糖脂質の一種であるセレブロシドを標準物質として、シリカゲルクロマトグラフィーやＨＰＬＣ等で精製された画分にスフィンゴ糖脂質が存在するかを評価した。
装置（器具）名：ａｄｖａｎｔｅｃ  ＣＨ０００９００展開槽
シリカゲル：メルク社製シリカゲル６０（２０ｃｍ×２０ｃｍ）
【００６１】
［フラグメント解析］
精製された画分に含まれるスフィンゴ糖脂質の構造を特定するために、精製された画分のＥＳＩ-ＭＳ/ＭＳを測定した。また、モデル生物であるＣ．ｅｌｅｇａｎｓｅのスフィンゴ糖脂質のＥＳＩ−ＭＳ/ＭＳの測定結果と、精製された画分の測定結果とを比較し、質量が一致するもののＣ．ｅｌｅｇａｍｓのスフィンゴ糖脂質の構造から、精製された画分のスフィンゴ糖脂質の構造を特定した。
装置：ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
条件：ＨＣ  Ｕｌｔｒａ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，  Ｂｒｅｍｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使って質量分析は行った。乾燥したサンプルを、混合溶媒（クロロホルム／メタノール（１：１））５０μＬに溶かし、メタノール９５０μＬに、さらに溶解させた。サンプルはイオントラップスペクトロメトリーに、コンスタント流量３μＬ／ｍｉｎのオンラインシリンジポンプで注入した。また、４Ｌ／ｍｉｎかつ３００℃の窒素ガスが、脱溶媒和のために、かつ１０ｐｓｉのネブライザガスとして吹き込まれた。検出はポジティブイオンモードでｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｖｏｌｔａｇｅを４ｋＶに、ｅｎｄ  ｐｌａｔｅ  ｏｆｆｓｅｔを０．５ｋＶに設定した。質量は５０−１５００ｍ／ｚの範囲のものを４０００ｍ／ｚ／秒のスキャンスピードで検索した。ヘリウムガスを衝突ガスとして多段階ＭＳを解析した。Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎは４ｕの幅で選択した。１．０Ｖの開裂強度で２次のＭＳまで解析し、４０ｍｓｅｃの間隔で３０〜２００％の単一のスペクトルを取り、開裂のカットオフ値はｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｉｏｎのｍ／ｚの２７％とした。
【００６２】
［精製工程に用いた装置］
［シリカゲルクロマトグラフィー］
内径３ｃｍ、長さ３０ｃｍのエンプティカラムに、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ社製シリカゲル６０）を充填して試験を行った。
【００６３】
「ＨＰＬＣ」
ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製「ＬＣ  ＬＣ２０ＡＴ」に、カラムとしてＧＬサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＳＩＬ１００Ａ」を用いてＨＰＬＣの精製工程を行った。
【００６４】
［原料］
・蜂の子：ミツバチの蜂の巣から採取した蜂の子を使用した。
・セレブロシド：標準物質として、Ｍａｔｒｅｙａ社製牛脳のセレブロシドを使用した。
【００６５】
［実施例１］ミツバチの蜂の子由来スフィンゴ糖脂質の製造
［抽出工程（スフィンゴ糖脂質を含有する抽出液の抽出）］
（１）粉末状にした蜂の子０．１５ｇに対し、混合有機溶媒（ａ１）(クロロホルム:メタノール＝１：１)１ｍｌに溶かした後、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。
（２）撹拌後、０．８Ｍ水酸化カリウムメタノールを加えて、その後、４２℃の水中で３０分間インキュベートした。
（３）各試験管にクロロホルム２．５１ｍＬと、蒸留水１．１２５ｍＬを加え完全に乳化させるために、ボルテックスミキサーを用いて３２００ｒｐｍで５分間遠心した。
（４）撹拌後、液の上層をスポイトで吸いとり除去した。その後、下層に残った脂質成分を吸い上げエバポレーター用試験管に移し、エバポレーターにて乾燥させることで、蜂の子から抽出されたスフィンゴ糖脂質を含有し、乾燥された脂質成分（ａ）を得た。
【００６６】
［シリカゲルクロマトグラフィーによる精製工程（１）］
（１）前記抽出工程で得られた脂質成分（ａ）２．４ｇに対して４．５ｍＬのヘキサンを加えて、超音波処理をして、脂質成分（ａ）のヘキサン溶液（ａ´）を調製した。
（２）シリカゲルクロマトグラフィーを行うための流動層として、混合有機溶媒（ａ２）（酢酸エチル：メタノール＝９：１）を使用して、前記脂質成分（ａ）のヘキサン溶液（ａ´）を、オープンカラムクロマトグラフィー法により精製した。なお、精製された画分は１０ｍＬ置きにサンプリングし、それぞれの画分をエバポレーターで乾燥させた。
【００６７】
［精製工程（１）後のＴＬＣ］
（１）前記精製工程（１）で得られた乾燥された画分を、混合有機溶媒（ａ３）（クロロホルム：メタノール＝２：１）に溶かして超音波処理を行った溶液を、ＴＬＣにスポットした。
（２）標準物質基準であるセレブロシドを１倍希釈、２倍希釈、４倍希釈したものをスポットした。
（３）スポット後、溶液をより吸着させるために数分間乾燥させた。
（４）展開層（展開溶媒は、クロロホルム：メタノール：酢酸：蒸留水＝２０：３．５：２．３：０．７（体積比）に調製したものを用いた。）で２０分間展開した。
（５）ＴＬＣ展開後、スフィンゴ糖脂質と反応して発色するオルシノール７０％硫酸を噴霧し、１００℃のオーブンで４０分間処理した。これにより、セレブロシドのバンドと、前記精製工程（１）で得られた乾燥された画分のバンドとを比較し、いずれの画分にスフィンゴ糖脂質が存在するかの評価を行った。
評価結果の写真を、図１に示す。第９〜２２画分に、セレブロシドと同様のバンドが確認され、蜂の子からスフィンゴ糖脂質を得ることができることが確認された。
【００６８】
［ＨＰＬＣによる精製工程（２）］
（１）混合有機溶媒（ａ３）（クロロホルム：メタノール＝２：１）に、前記精製工程（１）で得られた乾燥された画分のうち、スフィンゴ糖脂質を含有する画分の混合物を溶かして、ＨＰＬＣ精製用溶液を調製した。
（２）このＨＰＬＣ調製用溶液はフィルターにかけて、エッペンへ入れた。
（３）ＧＬサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＳＩＬ１００Ａ」カラムを用いて、エッペンから取り出したＨＰＬＣ精製用溶液を精製した。この精製においては、流動層として、流動層溶媒（Ｈ１）（クロロホルム）と、流動層溶媒（Ｈ２）（メタノール：蒸留水＝９５：５）を用いた。流動層のフローは、グラジエントプログラムを設定し、運転開始時は流動層溶媒（Ｈ１）１００％、運転開始から１５分時点で流動層溶媒の混合比率を（Ｈ１）：（Ｈ２）＝７５：２５とし、２０〜４０分は（Ｈ１）：（Ｈ２）＝１０：９０として、徐々に（Ｈ２）比率が高いものとなるように精製した。なお、流量は、０．７ｍＬ／ｍｉｎとした。
（４）ＨＰＬＣにより精製された溶液を、所定の溶液量毎にサンプリングし、ＨＰＬＣにより精製された画分を得た。なお、各画分はエバポレーターにより乾燥させて保管した。
【００６９】
前述の精製工程後のＴＬＣの作業に準じて、精製工程（２）後の画分も、ＴＬＣによりスフィンゴ糖脂質が存在する画分の特定を行い、特定された画分の乾燥物を、蜂の子から製造されたスフィンゴ糖脂質とした。
評価結果の写真を、図２に示す。第６画分と、第１１〜１５画分中心に、セレブロシドと同様のバンドが確認され、これらの画分から蜂の子のスフィンゴ糖脂質（Ａ）を得ることができることが確認された。
【００７０】
［参考例１］Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからのスフィンゴ糖脂質の製造
モデル生物であるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を用いて、実施例１のミツバチの蜂の子由来スフィンゴ糖脂質の製造に準じて、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓからのスフィンゴ糖脂質の製造をおこなった。
ＴＬＣの評価結果等から、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにもスフィンゴ糖脂質が確認され、同様の方法でＣ．ｅｌｅｇａｎｓのスフィンゴ糖脂質（Ｂ）を得ることができることが確認された。
【００７１】
［実施例２］蜂の子のスフィンゴ糖脂質（Ａ）の構造特定
［フラグメント解析］
蜂の子のスフィンゴ糖脂質（Ａ）と、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのスフィンゴ糖脂質（Ｂ）を、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析して、その分析結果を比較した。蜂の子のスフィンゴ糖脂質（Ａ）には、ｍ／ｚが、約８０６、約８０８の特徴的なスペクトルが検出された。
さらに、蜂の子のスフィンゴ糖脂質（Ａ）とＣ．ｅｌｅｇａｎｓのスフィンゴ糖脂質（Ｂ）について、それぞれのＭＳスペクトルを比較した結果、特に、ｍ／ｚが、５３９．２、５５７．２、６５７．３、７６１．４、６５８．３においてほぼ一致した。
このようにＭＳスペクトルを比較し、蜂の子スフィンゴ糖脂質（Ａ）に含まれ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのスフィンゴ糖脂質とほぼ一致したものから推定されるスフィンゴ糖脂質には、式（１）および式（２）で表される特徴的な構造のスフィンゴ糖脂質が含まれていることが確認された。
【００７２】
【化９】
2016108314.tif 000010
【００７３】
【化１０】
2016108314.tif 000011
【００７４】
＜２．スフィンゴ糖脂質の機能性評価＞
前記［ＨＰＬＣによる精製工程（２）］において、式（１）および式（２）で表される特徴的な構造のスフィンゴ糖脂質が含まれていることを確認した画分の乾燥物を、後述するマクロファージ試験にスフィンゴ糖脂質（α）として用いた。なお、各試験条件でのスフィンゴ糖脂質（α）の終濃度は、それぞれの終濃度に希釈したときの液をＴＬＣに展開した濃さを、市販のグリコシルセラミドの標準試料を用いて濃度の検量をしたものと比較して測定したものである。
【００７５】
［マクロファージ試験］
マクロファージ細胞（理研バイオリソース社製「ＲＡＷ２６４．  ７  ＤＳ」：「ＭΦ」と略記。）を、1% penicillin/streptomycin(Life technologies Gibco), 10% FBS(Thermo scientific Hyclone)含有ＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製「DMEM(1.0g/l Glucose) with L-Gln and Sodium Pyruvate, liquid」（製品番号０８４５６―６５））を用いて、マクロファージ細胞数が４．０×１０5ｓｐｍとなるようにマクロファージ培養液を調製した。
次に、このマクロファージ培養液を、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに、２００μＬずつ添加し、約１８時間、３７℃・５％二酸化炭素下のインキュベータで培養して、試験用マクロファージ播種ｗｅｌｌを準備した。
【００７６】
［スフィンゴ糖脂質濃度の調製］
前記スフィンゴ糖脂質（α）を、各ｗｅｌｌ内に混合して試験時の終濃度を所定の値となるようにＤＭＳＯで溶解した後０．５％ｗ／ｖＤＭＳＯになるようにＤＭＥＭ培地に添加し、０．５％ｗ／ｖ  ＤＭＳＯで希釈した。それぞれの終濃度に合わせて希釈した前記スフィンゴ糖脂質を、試験用マクロファージ播種ｗｅｌｌの各ｗｅｌｌに２０μＬずつ添加して、１５〜３０分培養した。
その後、ＬＰＳ（和光純薬社製「Lipopolysaccharide, from E. coli O111：B4」）を最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるように、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌに２０μＬずつ添加して、３７℃・５％二酸化炭素下のインキュベータで約２２時間培養して、ＬＰＳ誘導型ＭΦに対して所定濃度のスフィンゴ糖脂質を含有する条件での細胞試験を行った。
【００７７】
［実施例３］［ＮＯ  Ａｓｓａｙの測定方法］  
Ｇｒｉｅｓｓ試薬Ｉ（和光純薬社製「７．５％リン酸」―和光純薬社製「１％スルファニルアミド」）と、Ｇｒｉｅｓｓ試薬ＩＩ（和光純薬社製「０．５％  Ｎ―１―Ｎａｐｈｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ」）を用いて、Ｇｒｉｅｓｓ法によりＮＯ濃度の測定を行った。ＬＰＳ誘導型ＭΦとスフィンゴ糖脂質とを混合した混合した９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅでのＮＯ  Ａｓｓａｙは、ＧｒｉｅｓｓＩ：ＧｒｉｅｓｓＩＩ＝２：１（容量比）で混合した試薬を用いて評価した。ＮＯ濃度の特定のために、ＭΦ培養培地とＮＯ試薬とを用いたＮＯ標準試料の濃度と対比して、ＮＯ濃度を求めた。また、測定条件は、測定波長５４５ｎｍ／参照波長６５０ｎｍとした。また、測定時にはｗｅｌｌの配置をランダム化処理して行った。ＮＯ産生量の測定結果を、図３に示す。
【００７８】
［実施例４］［ＷＳＴ−８  Ａｓｓａｙの測定方法］
ナカライテスク社製「Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ」（以下、「ＷＳＴ−８溶液」）を用いて、ＷＳＴ−８法により、生細胞数の測定を行った。ＤＭＥＭ（ＭΦ培養に用いている培地）：ＷＳＴ−８＝４９：１（容量比）で混合してＷＳＴ−８希釈液を調整した。このＷＳＴ−８希釈液を、９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌから不要な培地を取り除いた後、１００μＬずつ添加し、３７℃・５％二酸化炭素下のインキュベータで５時間培養した。培養後に、測定条件として測定波長５４５ｎｍ／参照波長６３０ｎｍおよび測定波長５４５ｎｍ／参照波長６３０ｎｍの測定結果から、生細胞率を求めた。また、測定時にはｗｅｌｌの配置をランダム化処理して行った。生細胞率の測定結果を、図４に示す。
【００７９】
［サイトカイン産生量］
スフィンゴ糖脂質含有抽出物（α）の影響によるサイトカイン産生量に関して、下記する「ＴＮＦ−α」および「ＩＬ−６」濃度をＥＬＩＳＡ法により評価した。
【００８０】
［実施例５］［ＴＮＦ−α］
Ｂｉｏｗｏｒｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ製の「Ｒａｔ  ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （９６Ｔ）」のを用いるＥＬＩＳＡ法により、このキットの使用方法に則ってＴＮＦ−α産生量の測定を行った。プレートリーダは「Ａｗａｒｅｎｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｒｏｍａｔｅ４３００」を用いた。また、測定時にはｗｅｌｌの配置をランダム化処理して行った。
ＴＮＦ−α産生量の測定結果を、図５に示す。
【００８１】
［実施例６］［ＩＬ−６］
Ｂｉｏｗｏｒｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ製の「Ｈｕｍａｎ  ＩＬ―６  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  （４８Ｔ）」のを用いるＥＬＩＳＡ法により、このキットの使用方法に則ってＩＬ−６産生量の測定を行った。プレートリーダは「Ａｗａｒｅｎｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｒｏｍａｔｅ４３００」を用いた。また、測定時にはｗｅｌｌの配置をランダム化処理して行った。
ＩＬ−６産生量の測定結果を、図６に示す。
【００８２】
［測定結果について］
図４に示すように、スフィンゴ糖脂質含有抽出物（α）を混合することで、生細胞率に影響がみられるが大きなものではなかった。そして、図３、５および６に示すように、スフィンゴ糖脂質含有抽出物（α）を混合することで、ＮＯ産生量の抑制、ＴＮＦ−α産生量の抑制、ＩＬ−６産生量の抑制といった効果が確認された。これらの結果より、ＮＯ産生抑制剤、ＴＮＦ−α産生抑制剤、ＩＬ−６産生抑制剤として用いることができることが確認された。また、ＮＯ産生量の抑制、ＴＮＦ−α産生量の抑制、ＩＬ−６産生量の抑制といった効果を奏することから、抗炎症剤として使用することができる。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明の蜂の子抽出物は、特殊な構造のスフィンゴ糖脂質を含有し、ＮＯ産生抑制剤等として用いることができる。また、スフィンゴ糖脂質の製造方法によれば、食経験がある原料から特殊な構造のスフィンゴ糖脂質も含むスフィンゴ糖脂質を得ることができる。このスフィンゴ糖脂質は、その効果によって、機能性食品や化粧品、医薬品等として利用することが期待されるものであり、本発明はこれらを得るために適したものであり産業上の利用可能性がある。
【図１】
2016108314.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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