(57)【要約】【課題】微生物触媒を用いて、ポリ塩化ビフェニル類等の汚染物を水性媒体中にて分解する反応において、分解すべき対象であるポリ塩化ビフェニル類を直接定量することなく、前記分解反応をモニタリングする。【解決手段】ポリ塩化ビフェニル類を含む汚染物と、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ複合体を含む微生物触媒と、を水性媒体中にて接触させる工程、及び前記水性媒体中の溶存酸素濃度を測定する工程を含み、前記溶存酸素濃度の時間的な変化から前記分解反応による酸素消費速度及び／又は酸素消費量を算出する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応容器内の水性媒体中で、ポリ塩化ビフェニル類を含む汚染物と、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ複合体を含む微生物触媒と、を接触させる工程、
当該反応容器に外部から酸素を供給する工程、及び
前記水性媒体中の溶存酸素濃度を測定する工程を含み、
前記溶存酸素濃度の時間的な変化から前記分解反応による酸素消費速度及び／又は酸素消費量を算出することを特徴とする、ポリ塩化ビフェニル類の分解反応をモニタリングする方法。
【請求項２】
前記分解反応系の飽和溶存酸素濃度及び総括物質移動係数をあらかじめ決定し、これらに基づいて前記酸素消費速度を算出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分解反応による酸素消費量とポリ塩化ビフェニル類の分解量又は残存濃度とを関連づける請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応容器に供給される酸素が、酸素マイクロバブルの形態にある請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが、ビフェニル-２，３-ジオキシゲナーゼ若しくはビフェニル-３，４-ジオキシゲナーゼ又はこれらの混合物を含む請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記汚染物が油性成分からなり、前記水性媒体と混合してエマルジョンを形成する請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
ポリ塩化ビフェニル類分解の逐次反応に基づく酸素消費速度の時間的変化を検出することをさらに含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリ塩化ビフェニル類の残存濃度と関連づけられた酸素消費量が、前記汚染物が無害化されたか否かを示唆する請求項３に記載の方法。
【請求項９】
通気手段、攪拌手段及び／又は温度制御手段を備えた反応槽と、
前記反応槽と連通し水性媒体、微生物触媒及び／又はポリ塩化ビフェニル類を含む汚染物を導入する試料導入部と、
前記反応槽内の試料にマイクロバブルを供給するマイクロバブル発生手段と、
前記反応槽中の水相に含まれる溶存酸素を測定する溶存酸素濃度測定手段と、前記溶存酸素濃度測定手段に接続され、前記通気手段、前記撹拌手段、前記温度制御手段、及び前記マイクロバブル発生手段を制御する制御手段とを備えるポリ塩化ビフェニル類の分解装置において、
前記溶存酸素濃度の時間的な変化から算出された前記分解反応による酸素消費速度及び／又は酸素消費量に基づいて前記各手段を制御することを特徴とするポリ塩化ビフェニル類の分解装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物触媒を用いて、ポリ塩化ビフェニル類等の汚染物を水性媒体中にて分解する際に、溶存酸素濃度の時間的な変化から前記分解反応の進行を推定し、前記分解反応をモニタリングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢｓ）は、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称をいう。置換塩素の数及び位置によって多くの異性体が存在するが、理論上２０９種類に別れることが知られている。ＰＣＢｓは化学的性状が極めて安定で、絶縁性や不燃性、高脂溶性、可塑性等に優れるため、電気製品や熱媒体、絶縁油、可塑剤、塗料及びノンカーボン紙の溶剤など、非常に多岐にわたる製品分野に使用されてきた。しかしながら、生体に対する毒性が高く、臓器や脂肪組織に蓄積しやすく、発癌性があり、それに伴い皮膚障害や内臓障害、ホルモン異常なども引き起こすことから、現在ではその使用が国内のみならず国際的にも禁止されている。
【０００３】
国内でこれまでに輸入・製造販売されたＰＣＢｓは、およそ５５，０００トンと推定される。その使用が禁止された上、使用者に対する保管が義務付けられた後、ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法等により、所定の期限までに無害化する計画が立てられている。近年、電気機器中の絶縁油に、１ｋｇ当たり数十ｍｇ程度という微量のＰＣＢｓが検出されるものが大量に存在することが明らかとなったが、この微量ＰＣＢｓ汚染油については、使用あるいは保管に関する正確な数量は把握できていない。ＰＣＢｓの分解方法としては、従来からの焼却法に加えて、脱塩素化分解法、水熱酸化分解法、水素供与物質による還元熱化学分解法、紫外線照射法等による光分解法等が知られている。これらのうち、紫外線分解法は、ＰＣＢｓを極性有機溶媒中に溶かして紫外線を照射することにより脱塩素化し、続いて残留するＰＣＢｓを生物処理又は触媒処理等によって無害化するものであり、常温、常圧処理できるため安全性が高く、毒性を有するＰＣＢｓを、生命体である微生物が異化することでその分解物の安全性が高いと想定され、化学処理等に較べて利点があると考えられる。
【０００４】
ＰＣＢｓを分解する菌として、これまでに報告されている微生物は、シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）ＫＦ７０７株（非特許文献１）、コマモナス・テストステロニ（Comamonastestosteroni）ＴＫ１０２株（非特許文献２）及びバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＬＢ４００株（非特許文献３）などがある。これらの微生物は、ビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）をはじめとする一連のビフェニル分解に関与する酵素群を発現し、その生化学的、遺伝学的な解析が精力的に行われた。
しかしながら、従来法によれば、これらのＰＣＢｓ分解菌は分解するＰＣＢｓの異性体によっては炭素源として培養増殖することができないものがあるため、培養分解法に供した際に、菌の濃度を一定に制御・維持することが極めて難しい。さらに、反応系へＰＣＢｓ分解に必要な酸素を十分に供給することが難しく、またポリ塩化ビフェニル異性体に対する分解特性も微生物の種類によって異なることから、ＰＣＢｓ分解に最適な分解反応を行うことは困難であった。そのため本発明者らは、あらかじめＰＣＢｓ分解に必要な酵素を誘導し過剰発現させた複数の菌体を混合して複合化させた組成物を用いて様々なＰＣＢ異性体混合物を分解しうることを報告している（特許文献２参照）。
【０００５】
好気性微生物を用いて、汚染された水質及び土壌を直接浄化する装置を設計する際、または微生物反応装置を運転する際に、最適な微生物生育条件を探ることを目的として、微生物個数濃度、浄化したい汚染物質濃度及び溶存酸素濃度の動特性を評価する方法が報告されている（例えば、特許文献１参照）。しかし、この方法においても、汚染物質の分解と微生物の増殖が同時に行われるため、溶存酸素濃度の変化から汚染物質の分解を正確に把握することは難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−９５４９６号公報
【特許文献２】特開２０１４−１８３７４２号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】末永光他、微生物によるポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の分解：最近の遺伝生化学的研究、Journal of Environmental Biotechnology, Vol.2, No.1, 1-12, 2002
【非特許文献２】Shimura M. et al, Journal of Fermentation and Bioengineering , Vol. 81, No. 6, pp.573-576, 1996.
【非特許文献３】Bopp, LH, J. Ind. Microbiol. 53: 23-29, 1986
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、微生物触媒を用いて、ポリ塩化ビフェニル類等の汚染物を水性媒体中にて分解する反応において、分解すべき対象であるポリ塩化ビフェニル類を直接定量することなく、前記分解反応をモニタリングする方法を提供することを課題とする。
また、ＰＣＢｓ分解系のような複合酵素系による逐次反応を統一的に解析し、反応中間体を含むポリ塩化ビフェニル類の残存濃度を推定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、前記課題を解決するための手段として、微生物触媒を用いたＰＣＢｓ分解反応において、溶存酸素濃度の時間的変化に着目し、当該分解反応における酸素消費速度又は酸素消費量からＰＣＢｓ分解の進行を推定しうること、そして分解反応における酸素消費量とＰＣＢｓの残存濃度との関連付けが可能であることを見出して本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下の態様を含む。
［１］反応容器内の水性媒体中で、ポリ塩化ビフェニル類を含む汚染物と、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ複合体を含む微生物触媒とを接触させる工程、当該反応容器に外部から酸素を供給する工程、及び前記水性媒体中の溶存酸素濃度を測定する工程を含み、前記溶存酸素濃度の時間的な変化から前記分解反応による酸素消費速度及び／又は酸素消費量を算出することを特徴とする、ポリ塩化ビフェニル類の分解反応をモニタリングする方法。
［２］前記分解反応系の飽和溶存酸素濃度及び総括物質移動係数をあらかじめ決定し、これらに基づいて前記酸素消費速度を算出する、［１］に記載の方法。
［３］前記分解反応による酸素消費量とポリ塩化ビフェニル類の分解量又は残存濃度とを関連づける［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記反応容器に供給される酸素が、酸素マイクロバブルの形態にある［１］〜［３］の何れかに記載の方法。
［５］前記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが、ビフェニル-２，３-ジオキシゲナーゼ若しくはビフェニル-３，４-ジオキシゲナーゼ又はこれらの混合物を含む［１］〜［４］の何れかに記載の方法。
［６］前記汚染物が油性成分からなり、前記水性媒体と混合してエマルジョンを形成する［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
［７］ポリ塩化ビフェニル類分解の逐次反応に基づく酸素消費速度の時間的変化を検出することをさらに含む、［１］〜［６］の何れかに記載の方法。
［８］前記ポリ塩化ビフェニル類の残存濃度と関連づけられた酸素消費量が、前記汚染物が無害化されたか否かを示唆する［３］に記載の方法。
［９］通気手段、攪拌手段及び／又は温度制御手段を備えた反応槽と、
前記反応槽と連通し水性媒体、微生物触媒及び／又はポリ塩化ビフェニル類を含む汚染物を導入する試料導入部と、前記反応槽内の試料にマイクロバブルを供給するマイクロバブル発生手段と、前記反応槽中の水相に含まれる溶存酸素を測定する溶存酸素濃度測定手段と、前記溶存酸素濃度測定手段に接続され、前記通気手段、前記撹拌手段、前記温度制御手段、及び前記マイクロバブル発生手段を制御する制御手段とを備えるポリ塩化ビフェニル類の分解装置において、前記溶存酸素濃度の時間的な変化から算出された前記分解反応による酸素消費速度及び／又は酸素消費量に基づいて前記各手段を制御することを特徴とするポリ塩化ビフェニル類の分解装置。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のモニタリング方法によれば、分解すべき対象であるポリ塩化ビフェニル類を直接定量することなく、その分解反応の進捗状況を把握することができる。また、ＰＣＢｓ分解系のような複合酵素系による逐次反応に共通な酸素消費速度の解析から、反応中間体を含むポリ塩化ビフェニル類の残存濃度と関連づけて、汚染物が無害化されたか否かを推定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の１つの実施形態に係るＰＣＢｓ分解反応容器の模式図である。
【図２】複合微生物触媒によるＰＣＢｓ分解反応の経時変化を示す。
【図３】複合微生物触媒によるＰＣＢｓ分解反応のスキーム（ａ）と反応混合物の色の時間的変化（ｂ）を示す。
【図４】複合微生物触媒によるＰＣＢｓ分解反応における溶存酸素（ＤＯ）レベルの時間的変化を示す。
【図５】複合微生物触媒によるＰＣＢｓ分解反応中の酸素消費速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＰＣＢｓの分解反応をモニタリングする方法は、反応容器内の水性媒体中で、ポリ塩化ビフェニル類を含む汚染物と、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ複合体を含む微生物触媒と、を接触させる工程を含む。また、前記水性媒体中の溶存酸素濃度を測定する工程を含み、前記溶存酸素濃度の時間的な変化から前記分解反応による酸素消費速度及び／又は酸素消費量を算出することを特徴とする。以下に、本発明の方法に用いる微生物触媒等や、酸素消費速度の算出方法等について詳細に説明する。
【００１４】
（芳香族化合物分解酵素）
本発明の方法に使用しうる芳香族炭化水素（ＰＡＨ：polycyclic aromatic hydrocarbon）分解酵素は、芳香族化合物を含む汚染物質を分解しうる酵素であれば特に限定されるものではなく、多種多様な汚染物質を分解するものとして多くの動物又は微生物由来の酵素を用いることができる。これらの中でも、特に、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ、又はRieske non-heme iron oxygenaseと称される一群の酵素が好ましく、これらは多くの芳香族化合物分解経路での最初の反応であるシス型二水酸化反応を触媒する。トルエンやナフタレンに加えてベンゼン、クメン、フェナントレン、ピレン等の単環・多環の芳香族炭化水素に限らず、ダイオキシン、ジベンゾチオフェン、カルバゾール等のヘテロ環式芳香族化合物、ＰＣＢ等のビフェニル環化合物等の種々の芳香族化合物の好気的代謝経路において、これらの酵素は初発酸化酵素として一連の分解反応の進行の有無を左右する重要な役割を果たしている。芳香環水酸化ジオキシゲナーゼは、基質を認識し酸化反応を行う酸化酵素（ＴＯ：terminal oxygenase）と、電子をＮＡＤ（Ｐ）ＨからＴＯに伝える電子伝達系から構成される複合化酵素である。電子伝達系は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受け取るレダクターゼ（Ｒｅｄ）単独で構成される場合と、Ｒｅｄとフェレドキシン（Ｆｄｘ）の二つで構成される場合がある。
【００１５】
微生物は、芳香族化合物への暴露とそれへの適応、進化を通じて多種多様の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを生み出してきたと考えられ、現在では、数十種以上の化合物の分解酵素として２００以上の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが単離されている。電子伝達鎖の特徴による芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの分類、及び酸化酵素触媒サブユニットのアミノ酸配列アライメントに基づく各酵素の分子系統樹による分類等は、「野尻秀昭他３名、蛋白質核酸酵素Vol.50, No.12, (2005) pp.1519-1526」に記載されており、その全内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
【００１６】
好ましい実施形態において、本発明の方法に使用しうる微生物触媒は、上記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを菌体内に発現した微生物触媒であり、二水酸化反応によって生じた中間体生成物をさらに分解して最終的にはアセチルＣｏＡやピルビン酸等のエネルギー物質にまで変換しうるその他の代謝酵素を含む。例えば、ビフェニル分解に関与する一連の酵素群を挙げれば、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼとしてのビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）の他に、ＢｐｈＡの産物から２つの水素を除くジヒドロジオールジヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ酵素）、ＢｐｈＢ産物に酸素１分子が付加してＨＯＰＤＡを生成する２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ酵素）、ついで、ＨＯＰＤＡを安息香酸と２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートとに分解する２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼ（ＢｐｈＤ酵素）、そして、アセチルＣｏＡとピルビン酸に転換する２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートヒドラターゼ（ＢｐｈＥ酵素）、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ（ＢｐｈＦ酵素）及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＧ酵素）等を含む。
【００１７】
このような芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを有する微生物は、自然環境中から対象とする芳香族化合物又はそれと構造の類似する化合物を培地に添加して、当業者に既知の方法によりスクリーニングすることができる。例えば、ＰＣＢｓ分解菌は、ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物からのスクリーニングを繰り返し行うことにより見出される。天然にビフェニル分解酵素を産生する微生物としては、シュードモナス属、コマモナス属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ロドコッカス属、ラルストニア属等に属する多くの細菌があるが、ビフェニル資化性菌のスクリーニング段階でビフェニル分解活性の一つの指標となる黄橙色を示すメタ開裂物質（例えば、２-ｈｙｄｒｏｘｙ-６-ｏｘｏ-６-ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａ-２，４-ｄｉｅｎｏｔｅ）を速やかに生産し、且つ生育速度が速い微生物を選択することで、ＰＣＢ分解活性に優れる微生物の取得が期待できる。
【００１８】
さらに、スクリーニングにより得られた微生物から当該物質の分解に関与する酵素遺伝子、例えば、ビフェニル分解酵素遺伝子をクローン化し、これらに部位特異的突然変異誘発法等によって変異を導入することで、さらにＰＣＢ分解活性の向上した遺伝子群を作製することができる。なお遺伝子に変異を導入する方法には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えば、エラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A. L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001等に記載されている。これらの手法によって作製された突然変異遺伝子を、もとの微生物のゲノムＤＮＡと置換するか、プラスミドＤＮＡやコスミドＤＮＡにクローン化して宿主微生物に導入し、新規な微生物を作製することも可能である。本発明の方法に使用しうる酸素添加酵素、好ましくは芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを産生する微生物は、このような方法により、当業者であれば容易に入手しうると考えられる。
【００１９】
本発明の方法に使用しうる微生物触媒は、基質特異性の異なる２種以上の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを発現する微生物を組み合わせることが好ましい。好気性微生物におけるＰＣＢｓ分解系の最初の酵素であるビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）について、基質特異性の異なる少なくとも２種類を組み合わせることがより好ましい。ＢｐｈＡは４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４）から構成されており、そのうちの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）が二原子酸素添加反応の基質特異性に関与していることが判っている。したがって、本発明の好ましい実施形態では、少なくともＢｐｈＡ１の化学構造が異なり、それによってＰＣＢｓに対する基質特異性も異なった少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）を組み合わせて用いることができる。
【００２０】
本発明において、前記少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼは、少なくとも１種のポリ塩化ビフェニルに対して、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性及び／又はビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する。したがって、２種類のＢｐｈＡを組み合わせる場合、１種類のＢｐｈＡは、ポリ塩化ビフェニルに対するビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有し、他の１種類のＢｐｈＡは、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有することが好ましい。これら２種類のＢｐｈＡを含む限り、さらに別の基質特異性を有する酵素、例えば、ビフェニル−１，２−ジオキシゲナーゼ活性を有するＢｐｈＡが存在してもよい。また、同じビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性であっても基質となるＰＣＢ異性体の種類によって異なる活性を有する複数の酵素を含有していてもよい。
【００２１】
ここで、「ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性」とは、少なくとも１種類のポリ塩化ビフェニル異性体に対して当該ビフェニル環の２位と３位に二原子酸素添加反応を行うことができる酵素活性である。例えば、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡは、２，４’，５−トリクロロビフェニルや２，４，４’−トリクロロビフェニルに対する２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有することが分っている。一方、「ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性」とは、少なくとも１種類のポリ塩化ビフェニル異性体に対して当該ビフェニル環の３位と４位に二原子酸素添加反応を行うことができる酵素活性である。例えば、バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼは、２，５，４’−トリクロロビフェニルや２，５，２’，５’−テトラクロロビフェニルに対して、２，５−ジクロルリングの３，４−位に酸素分子を導入することができる。
【００２２】
（微生物の培養法）
本発明の方法に使用しうる微生物触媒を作製する上で、主要な原料となる、上記ビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル代謝経路で働く一連の酵素種を、自らの細胞内に過剰発現することができる微生物種について述べる。
【００２３】
ビフェニルを唯一の炭素源として、０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体あるいは固形培地を用いスクリーニングして（例えば、特開２０１３−１７９８９０号公報参照）その候補とした、シュードモナス属やコマモナス属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ロドコッカス属、ラルストニア属、アクロモバクター属、ステノトロフォモナス属などの細菌を用いる。これらの細菌種では、ＰＣＢｓの分解に関連する酵素群が、細胞内で発現する。
【００２４】
あるいは遺伝子組換えにより、ＰＣＢｓの分解に関連する酵素種を単独、あるいは複数、遺伝子組換え技術でもって作創した過剰発現細菌なども、本微生物種に含まれる。とりわけ、過剰発現細菌において発現したＰＣＢｓ分解酵素種は極めて不安定であるため、一般的な包括法、架橋法及び担体結合法等で微生物菌体を固定化したものを用いてもよい。固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリツアミド、カラギーナン、アルギン酸及び光架橋樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。酵素を固定化することで、より安定した触媒として利用が可能になることから、本発明のモニタリング方法としても極めて新しく、且つ有為な手段と考えられる。
【００２５】
次に、上記で示したＰＣＢｓ分解酵素群を高発現する細菌体を、速やかに、高い回収率で得る培養法について述べる。
培地は、K. Kimbara et. al. Agric. Biol. Chem., 52 (11), 2885-2891, 1988. を参考に、ｐＨが６．８〜７．０までとなるように調整した合成培地が良く、さらにビフェニルを炭素源として０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えたものが望ましい。さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良い。本培養に至る前に３段階の前培養を行うことが、細菌を効率良く増殖させる上で望ましい。手順は、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに、前に述べたビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地を２〜３ｍＬまで入れ、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ菌体量としてＯＤ６６０＝０．１〜０．８までとなるように、−８０℃以下で凍結保存した細菌株を、できるだけ速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養し、次に培地量で５倍以上の容積のフラスコなどに入れた、同じくビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７〜３０ｍＬに、その全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養し、さらに培地量の５倍以上の容積のフラスコなどにビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７０〜３００ｍＬに、全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養する。本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備し、その翼形状はタービン型で良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく合成培地２．７〜３Ｌまでに対し、ビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように加えて、そこへ、前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良い。細菌の生育と共に炭素源であるビフェニルが消費されるが、さらにビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるよう、継続的に加えていくことが望ましく、さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良く、最終的に、より高塩素化されたＰＣＢｓの分解活性を獲得した細菌が得られる。培養中の培養液のｐＨは、細菌の最終収量に影響を与えるため、その範囲は７．０〜９．０までとするのが望ましく、ｐＨの調整には、必要に応じて、アンモニウム塩を０．０２％〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように断続的に加えるのが良く、硫酸アンモニウムでも良い。また硫酸アンモニウムの添加は、培養中に窒素源も消費する場合において望ましい。最終の培養液のＯＤ６６０＝２．５〜３．０までで、湿重量が１５〜２０ｇまでの高活性なＰＣＢｓ分解細菌が得られる。
【００２６】
さらに、遺伝子組換えで作創したＰＣＢｓ過剰発現細菌株の培養法について述べる。
培地は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）（以下、「ＬＢ培地」とする）、あるいはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈを改変したイースト・エキストラクト２．４％とトリプトン１．２％を主成分とし（以下、「ＴＢ改変培地」とする）、リン酸水素二ナトリウム塩とリン酸二水素ナトリウム塩それぞれ７０ｍＭを、６対４の比率で配合した緩衝成分を含み、オートクレーブによる滅菌の後にｐＨ６．８〜７．０で調整したものが望ましい。
本培養に至る前に、二段階の前培養を行う事が望ましく、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに、上記のいずれかの培地を２〜３ｍＬまで、薬剤耐性遺伝子を含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細菌を培養する場合は、抗生物質を１００μｇ／ｍＬあるいは適量を加え、抗生物質の種類としては、アンピシリンやネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリンなどを含み、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ、ＯＤ６６０＝０．１〜０．９までとなるように−８０℃以下で凍結保存した細菌株を速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、３〜５時間まで培養し、次にＴＢ改変培地を３００ｍＬまでに、直ちにその全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、７〜９時間まで培養する。
【００２７】
本培養は、羽根付きフラスコと恒温振盪培養機との組み合わせで行うことができ、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備しその翼形状はタービン型でも良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。培養装置を限定するものではないが、試作においては、エイブル株式会社製、微生物培養装置ＢＭＳ-０５ＮＣ、あるいは同等の装置を用いることができる。抗生物質の添加の有り無しなど、前培養と同条件に整えた２×ＹＴ培地あるいはＴＢ改変培地２．７〜３Ｌまでに対し、そこへ前培養した培養液を全量投入する。この場合の菌液の濁度は、０．０３〜０．０８までとなるように調整するのが良く、０．０５が望ましい。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧制御ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良く、培養は６〜１０時間まで行うのが良く、８時間が望ましい。誘導性プロモーターを含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細菌を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）などを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。最終的に、湿重量１Ｌあたり９ｇ以上の遺伝子組換え型ＰＣＢｓ分解細菌が得られる。
【００２８】
（賦形剤）
前述の方法で得られた細菌体は、重力あるいは遠心による回収時において、生理食塩水あるいは２０ｍＭのリン酸塩緩衝液で少なくとも２回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム塩を用いるのが良い。その後、菌体に対し細胞保護作用を示す賦形剤を添加する。例えば、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムなどの糖質を用い、菌体濃度５〜１５％（ｗ／ｖ）までに対し１〜３％（ｗ／ｖ）まで加えると、最終的に−２０〜−８０℃までに温度制御された冷凍庫などで保存できる。とりわけ乳糖は、費用対効果や細胞保護作用の面で優れているので、これを用いることが望ましい。
【００２９】
（微生物菌体の乾燥方法）
得られた野生型、あるいは遺伝子組換え型を含むＰＣＢｓ分解酵素群を高発現する細菌体の乾燥法、すなわち、最終形態である微生物触媒の好ましい触媒化法について述べる。
賦形剤とした糖質類と混合した湿菌体の乾燥は、凍結乾燥機やドラムドライヤー、スプレードライヤーを用いることができるが、スプレードライヤーが望ましい。発明を限定するものでないが、例えば、試作用としては、ＥＹＥＬＡ製ＳＤ-１０００型を用いることができる。本機は、乾燥経路において、蒸発缶とサイクロンを備える。乾燥に重要な入口温度として、蒸発缶前の吸気管に温度センサーが取り付けてあり、また出口温度として、蒸発缶とサイクロンの間に温度センサーが取り付けてある。本乾燥工程においては、本機の入口温度を１００〜１２０℃まで、出口温度を６０〜７０℃までの範囲で設定することが望ましい。その他に、ブロア風量は毎分０．７５立米までとし、噴霧圧力は７０〜９０ｋＰａ、送液量は毎分５〜１５ｍＬまでとする。
【００３０】
賦形剤とした糖質、０．４〜０．６ｇまでと混合して凍結した菌体、あるいは培養後、糖質と混合して凍結せず用意した湿菌体を２〜３ｇまでを用い、最終液量２２〜２８ｍＬまでに調製した試料を、上記に示す設定を施したスプレードライヤーなどが指定する試料容器に入れて、取り付ける。実際に乾燥作業に入る前に、蒸留水などを通液して、出口温度を適値へと調節してから行うことが望ましい。本乾燥工程から回収された乾燥菌体は０．２〜０．７ｇまでとなり、投入した原材料の重量に対する紛体の収率は３２〜４９％（ｗ／ｗ）までとなる。
【００３１】
他方で、菌体のみ、及び賦形剤を含む菌体原液両方を加温加熱、水分のみを蒸発させ、その残留固形分を秤量した結果から、原液固形分濃度（スラリー濃度）を導き出した結果、菌体のみで０．０３ｇ／ｍＬ、賦形剤とした糖質で、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムを含む菌体の全てで０．０５ｇ／ｍＬだった。したがって、触媒中の菌体量は６０％（ｗ／ｗ）であり、賦形剤とした糖質は４０％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする微生物触媒が完成する。
【００３２】
あるいは、これらの微生物触媒を担体物質中に取り込んで固定化微生物触媒とすることができる。例えば微生物触媒と担体物質（又はその前駆体）の混合溶液を不溶解性液体中に滴下して液体中で液滴を固化させて微生物触媒担持担体粒子の分散物を作る方法、微生物触媒と担体物質（又はその前駆体）の混合溶液を低温化、ゲル化剤や固化剤の添加などの方法で固化させた後、固化体を適当なサイズに裁断して微生物触媒を担持した直方体粒子を得る方法、微生物触媒と担体物質（又はその前駆体）の混合溶液を押し出しノズルから不溶解性液体中に注入して液体中で固化させて微生物触媒担持担体の糸状の固化物を得てこれを適当に裁断して円筒状粒子を作る方法、またこのときの押し出し成形のダイを環状として円環状（チューブ状）の微生物触媒担持担体粒子を得る方法を挙げることができる。
【００３３】
最も一般的には、合成高分子の含水ゲル中に固定化する方法が挙げられる。その代表例であるアクリルアミドの場合は、架橋剤（例えば、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド）を含有したアクリルアミドモノマー溶液と微生物触媒とを懸濁し、重合促進剤（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）、重合開始剤（例えば、過硫酸カリウム）を添加し、所定の成型形に入れ、２０℃で重合し、重合終了後、成型形から押し出し、一定の長さに切断して得られる。固定化ゲルの表面の細孔は、微生物菌体より小さいため、包括固定化した微生物菌体はリークせずに内部で維持される。基質としてのＰＣＢｓ及びマイクロバブル状の酸素のみが細孔よりゲル内部に入り込み、内部の微生物触媒により分解される。
【００３４】
（ポリ塩化ビフェニルの分解反応）
本発明に係るＰＣＢｓの分解方法は、上記で得られた微生物触媒、好ましくは乾燥した菌体又は固定化微生物触媒を水性媒体に分散させたものとＰＣＢｓとを接触させることを特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、このようにして得られた微生物触媒を、比較的低濃度のＰＣＢｓ汚染油と接触させたときに高いＰＣＢｓ分解活性を発揮することができる。
【００３５】
本発明で対象となるＰＣＢｓとしては、ビフェニル化合物に塩素原子が置換した化合物が含まれ、その置換塩素原子の数は１〜１０個である。平均置換塩素原子数は、一般に２〜６個である。本発明では、これらのＰＣＢｓから選択された少なくとも一種を用いることができ、それぞれ単独で又は二種以上を任意に組み合わせたものも用いることができる。一般に、ＰＣＢｓは単一化合物として存在せずに、塩素原子の数や置換位置が異なる配合物として存在する。従って、塩素原子の数及び置換位置の組み合せからして、理論上２０９種類の異性体が存在し、市販品には、およそ７０から１００、あるいはこれらを越える数の異性体が配合存在している。
【００３６】
本発明の分解あるいは無害化の方法で処理できるＰＣＢｓとしては、特徴的には、３，４，４’，５−テトラクロロビフェニルや３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３，３’，４，４’−ペンタクロロビフェニル、２，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２’，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニルに加えて、２，２’，４，４’−テトラクロロビフェニルや２，２’，４，５−テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’−テトラクロロビフェニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
絶縁油となるＰＣＢｓは、かつてＰＣＢ単体の配合物として市販された経緯であり、これがコンデンサーやトランスに使用された。その具体例としては、鐘淵化学（株）が製造販売したカネクロールＫＣ−２００（２塩化ビフェニル）やＫＣ−３００（３塩化ビフェニル）、ＫＣ−４００（４塩化ビフェニル）、ＫＣ−５００（５塩化ビフェニル）、ＫＣ−６００（６塩化ビフェニル）、ＫＣ−１０００（ＫＣ５００／トリクロルべンゼン＝６０／４０（質量比）の配合物）や、三菱モンサント（株）が製造販売したアロクロール１２５４（５４％Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等も挙げられる。
【００３８】
本発明の方法に係るＰＣＢｓの分解反応は、ＰＣＢｓを含む油性成分と、上記微生物触媒及び場合により界面活性剤を含む水性媒体と、を混合してエマルジョン化する工程と、前記エマルジョンを通気、攪拌する工程と、を含む。分解すべきＰＣＢｓは、エマルジョン全量に対し０．０５〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ程度含むことができ、当該エマルジョン中に、本発明の微生物触媒を０．２〜２０重量％、好ましくは２〜１２重量％程度添加することにより行うことができる。エマルジョン化しない場合は、トライトンＸ−１００等の界面活性剤０．００５％を加え、さらに必要な場合は超音波を加えて均質化させる。さらにエマルジョン化を促進するために、あらかじめＰＣＢｓを含む油の粘性を下げる処理（例えば、アルコール化等）を行っても良い。反応条件は、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは約３０℃に調温し、ｐＨは６〜９とし、攪拌した状態で約１２〜７２時間処理することができ２４時間以内が好ましい。このような処理は、密閉式で攪拌でき、そこへ酸素マイクロバブルを供給できる反応装置を用いて行うことができ、すなわち小型の専用装置を用いて行うことが好ましい。この方法の特徴は、ポリ塩化ビフェニル類分解反応装置が非常に小型化できることにあり、微量ＰＣＢｓを保管するような貯蔵所でも直接処理作業を行うことができる（参考文献として特願２０１３-１４１３８３を参照できる）。
【００３９】
本発明の方法に用いる微生物触媒は、水性媒体と混合した際、元の微生物菌体粒子まですぐに分散して均一な分散液を形成することが、ＰＣＢｓの分解反応を促進する上で好ましい。油性成分に溶解しているＰＣＢｓは、水性媒体と混合して形成されるエマルジョン中で、本発明の微生物触媒の細胞膜を透過し、あるいは細胞膜の近くで、一群のＰＣＢｓ分解酵素と接触することでその分解反応が進むと考えられる。したがって、当該微生物触媒の分散性は、基質であるＰＣＢｓとの接触頻度を増加させる上で反応速度論的にも極めて重要な性質である。
さらに本発明の微生物触媒は、基質特異性の異なる複数の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを、それぞれ過剰発現させた複数の微生物触媒を組み合わせることが好ましい。上述したように、分解すべきＰＣＢｓは、その置換塩素原子の数と位置において極めて不均一な化合物集団であるから、それぞれの汚染油に含まれるＰＣＢｓの性状に合わせて、複数の微生物触媒の混合比率を調整し、最適なＰＣＢｓ分解用組成物を調製しうることも本発明の１つの利点である。
【００４０】
（マイクロバブル含有水性媒体）
本明細書において、用語「マイクロバブル」とは、概ね直径１ｍｍ以下、好ましくは直径１００μｍ以下の気泡をいう。外部から酸素や空気等の気体を供給して気泡を形成してもよいし、水性媒体中に溶存している酸素や空気等を用いてもよいが、水性媒体の溶存酸素濃度を高めるためには、酸素ガスを外部から供給しつつマイクロバブルを発生させることが好ましい。マイクロバブルは体積当たりの表面積が広く浮上速度も極めて遅いため、効果的に酸素等の気体を液体に溶解させることができる。また、電荷を帯びることで液中に均一に分散し、水性媒体中で油性成分のエマルジョン化を促進する。マイクロバブルは負の表面電荷を有するため、一般に正の表面電荷を持つ微生物菌体等との相互作用を介して、これらを水性媒体中で均一に分散させることが可能になる。
【００４１】
水性媒体にマイクロバブルを分散させる工程は、汚染物質を含む油性成分との混合前であってもよいし、あるいは、水性媒体と汚染物質を含む油性成分とを混合した後に、これらの混合液中へマイクロバブルを発生させてもよい。マイクロバブルを発生させる方法は、微小孔を有する管又は多孔質体を通じて気体を液体中に噴出させる方法、噴流や旋回流中で生じるせん断力を利用して気相を液相に巻き込む方法、超音波を利用して気液界面振動させて微細な気泡を生成させる方法等いずれの方法を用いてもよい。
【００４２】
本発明の方法では、少なくとも水性媒体中における飽和溶存酸素濃度を超える量の酸素を当該水性媒体に含有させることが好ましく、そのため酸素ガス又は空気よりも酸素分圧の高い混合ガスを流しながら超音波処理を行うことによりマイクロバブルを発生させることが好ましい。以下、これを酸素マイクロバブルと呼ぶ。水溶液中の飽和溶存酸素濃度は、気圧、水温、溶存塩濃度等によって変化するが、大気圧下、３０℃における蒸留水中の溶存酸素濃度は約７．５ｍｇ／Ｌである。本発明の方法において、水性媒体中の溶存酸素濃度は、３０℃において、少なくとも初期濃度で約８ｍｇ／Ｌであり、１５ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、２５ｍｇ／Ｌ（ｐｐｍ）以上がさらに好ましい。１つの実施形態において、上記超音波発生法により酸素マイクロバブルを水性媒体中へ充填した場合、その溶存酸素濃度は実測値で２８ｍｇ／Ｌ程度である。一般に水性媒体中に溶解した高濃度状態の酸素は、周辺環境中の酸素濃度と均衡を保とうとする性質から減少に転じると考えられる。したがって、酸素添加酵組成物による汚染物質の分解反応を最適化するためには、２８ｍｇ／Ｌ程度まで上昇した溶存酸素濃度を維持することが望ましく、適宜マイクロバブル発生器により連続、あるいは断続的に酸素マイクロバブルを供給し続けることが望ましい。
【００４３】
（ＰＣＢｓ分解用反応装置）
次に本発明の方法に使用しうるＰＣＢｓ分解用反応装置を、図面を参照しながら説明する。図１において、本発明の方法に使用しうるＰＣＢｓ分解用反応装置１は、通気手段を兼ねた攪拌翼１８を供えた反応容器１０と、当該反応容器と連通し、水性媒体を供給するための加圧酸素ガス溶解タンク２０と、汚染物質を供給するタンク３０と、微生物触媒投入口４０と、これらに酸素ガスを供給又は排出するための通気管１９及び排気管２３とを備えている。この実施形態においてＰＣＢｓ等の汚染物質は専用のタンクから反応容器に供給されるが、特にこれに限定されるものではなく、バッファータンクと兼用しても良い。反応容器には、さらに超音波の振動伝達体５０と、超音波振動子５１とからなるマイクロバブル発生部が備えられている。
【００４４】
上記の反応容器１０に導入された水性媒体と汚染物質を含む油性成分との混合液に上記マイクロバブル発生部から酸素を流しながら超音波処理を行って、水性媒体中にマイクロバブルを含有させることができる。あるいは、加圧酸素ガス溶解タンク２０中にてあらかじめ水性媒体にマイクロバブルを含有させてからマイクロバブル含有水性媒体と汚染物質を含む油性成分とを混合してもよい。このためのマイクロバブル発生装置としては、超音波型のマイクロバブル発生装置や加圧型マイクロバブル発生装置のいずれも使用することができる。
【００４５】
前記マイクロバブル発生部は、前記反応容器内で水性媒体と油性成分との混合液と接触する位置に配置することが出来れば良く、特に形状は限定されない。超音波型のマイクロバブル発生部を構成する超音波振動子５１は特に限定されず、公知の超音波振動子から適宜選択される。用いる超音波の周波数、振幅はマイクロバブル発生の目的に応じて、１０μｍ以上、１０ｋＨｚ以上の範囲で適宜選択される。周波数については、公知の超音波振動子が多数存在する１５ｋＨｚ〜１００ｋＨｚが望ましく、より好ましくは振幅を大きくとることが可能な２０ｋＨｚ〜４０ｋＨｚの範囲が望ましい。また、超音波の印加は連続的な印加でも、印加する超音波周波数以下の周波数で発生と停止を繰り返すバーストモードの印加でも良い。
【００４６】
（加圧型マイクロバブル発生装置）
さらに、マイクロバブル発生装置としては、基質を含む気体を加圧溶解した水を減圧して、マイクロバブルを発生させてバッファータンク２０内の水性媒体に供給する装置も用いることができる。あるいは、気液二相流を突起物や衝突体に衝突させて、気泡を剪断してマイクロバブルとして反応容器１０内の混合液中に供給する装置等、いずれの装置も用いることができる。
【００４７】
（微生物触媒によるＰＣＢｓ分解の酸素消費量の推定）
ＰＣＢｓ分解反応における酸素消費量とＰＣＢｓの分解との関係を調べるために、反応容器に供給された酸素と、分解反応のために消費された酸素との２つのデータセットに分類してＤＯレベルを解析した。まず、溶存酸素濃度の時間的変化を表す微分方程式について説明する。液中に空気又は酸素バブル等を供給する装置を介して、水性媒体中に供給した酸素は、水中でガス吸収されて溶存酸素になる。溶存酸素濃度の時間的変化は、水相の温度や圧力、混合物濃度によって決まる飽和酸素濃度と、現存する溶存酸素濃度の差（ＤＯ＊−ＤＯ）を推進力として増加する。これに対して、推進力に対する抵抗は、液側基準の物質移動係数（ｋＬ）と、気液接触面積（ａ）との積で示した総括物質移動係数（ｋＬａ）であり、水中における気泡の表面積、水流の乱れの強さにより決定されると考えられる。すなわち、複合微生物触媒を添加せずに酸素のみを供給したときの反応容器内のＤＯレベルの時間導関数は、以下の式で表される：
【数１】
2016096733.tif 000003
ここで、ＤＯは溶存酸素濃度、ＤＯ＊は飽和溶存酸素濃度、ｋＬａは総括物質移動係数を意味する。
【００４８】
一方、複合微生物触媒を添加してＰＣＢｓの分解反応を行った時の酸素消費は、反応容器中の酸素ガスの物質収支から、反応容器内のＤＯ変化は、酸素供給速度から酸素消費速度（ｄＯｃ／ｄｔ）を差し引いた値に等しいと考えられる。
したがって、式（１）に、微生物触媒による酸素消費速度の項を追加して以下の式（２）のように表すことができる：
【数２】
2016096733.tif 000004
ここで、ｄＯｃ／ｄｔは酸素消費速度を意味する。
【００４９】
（ポリ塩化ビフェニル類の分解反応のモニタリング方法）
本発明のモニタリング方法は、水性媒体中の溶存酸素濃度の時間的な変化から算出された、ＰＣＢｓ分解反応における酸素消費速度又はこれを積分して得られる酸素消費量に基づいて、ＰＣＢｓの分解反応をモニタリングすることを特徴とする。
最初に、式（１）において、ｋＬとａについては同一の装置と条件であればほぼ一定とみなされるため、微生物触媒及びＰＣＢｓを添加せずに、酸素を供給するのみの条件で装置の気体供給能力を実験データとモデルをフィッティングすることで、ｋＬａ（総括物質移動係数)を算出することができる。なお、以下の実施例と同じ条件で、最小二乗法により求めたｋＬａは０．０８５１／分、ＤＯ＊は３５．７ｍｇ／Ｌであった。
【００５０】
続いて、上記式（２）において、あらかじめ決定されたｋＬａを用い、左辺に実験値から求めたＤＯの時間変化のデータ、右辺第一項も酸素濃度の測定値とｋＬａとＤＯ＊を代入すれば酸素供給速度（ｄＯｃ／ｄｔ）が算出できる。よって、上記二つのデータを用いることで右辺第二項の酸素消費速度を算出することが可能となる。
ここで、酸素消費速度（ｄＯｃ／ｄｔ）を算出するためには、必ずしもＤＯレベルが時間的に変化する必要はないが、所定の範囲内で時間的に変化することが好ましく、飽和溶存酸素濃度（ＤＯ＊）値から−５０％、好ましくは−２５％の範囲内で変化することが好ましい。ＤＯレベルの時間的変化があまりに小さいか又は極端に大きいと、ｄＯｃ／ｄｔの精度が小さくなり分解反応のモニタリングが難しい。したがって、ＤＯレベルの変化の程度に合わせてデータ取得の時間間隔を適度に調整する必要がある。
【００５１】
また、酸素消費速度（ｄＯｃ／ｄｔ）についても、必ずしも時間的に変化する必要はなく、一定であってもよいが、ＰＣＢｓ分解の進行をモニタリングするためには、その時間的な変化が検出可能であることが好ましい。すなわち、ＰＣＢｓの分解反応は、酸素を要求する反応とそうでない反応が逐次的に進行する場合があり、酸素消費速度（ｄＯｃ／ｄｔ）の時間的な変化を監視することで、これら一連の反応の進行状況を推測することができる。このような、ＤＯレベル及び酸素消費速度（ｄＯｃ／ｄｔ）の時間的変化を好ましい範囲に制御するためには、例えば、反応容器内へ通気する酸素量を制御することができ、この酸素通気量は、分解反応中一定の量でもよく、あるいは分解反応途中で変化させてもよい。
特に、本発明に係るＰＣＢｓの分解反応は、複合酵素系による多段階反応であるから初発酵素であるビフェニルジオキシゲナーゼの反応を測定するだけでは、その分解経路全体の反応を監視することが難しい。このため、複数の酵素反応を同時にモニタリングすることにより、すなわち、２種類のジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ及びＢｐｈＣ）による２分子の酸素消費速度を解析することにより、精度よくＰＣＢｓ分解反応をモニタリングすることができる。したがって、本発明の１つの実施形態において、ポリ塩化ビフェニル類分解の逐次反応に基づいて、酸素消費速度が時間的に変化することを検出可能とするように、前記反応容器に供給する酸素供給量を制御する工程を含むことが好ましい。
【００５２】
本発明のさらに好ましい実施形態では、分解反応における酸素消費量とポリ塩化ビフェニル類の残存濃度とを関連付けることができ、酸素消費量からＰＣＢｓを含む汚染物が完全に無害化されたか否かを示唆することができる。本明細書において、用語「無害化」とは 、生体に対する毒性を低下させることを意味し、必ずしも汚染物質を完全に分解する必要はないが、環境中に放出された場合でも生物への悪影響を軽減できるように、好ましくはそれぞれの物質について一般的に安全であると認められるか、あるいは法律等で定められた基準値を下回るような濃度まで低下させることをいう。好ましい実施形態において、ＰＣＢ廃棄物特別措置法で定められている微量ＰＣＢ廃棄物の廃棄可能基準値は、０．５ｍｇ／ｋｇ（あるいは、０．５ｍｇ／Ｌ）以下である。
【実施例】
【００５３】
以下に本発明の詳細について実施例等を挙げて説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５４】
[実施例１]  微生物触媒の調製
野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株（特開２０１３−１７９８９０号公報参照）と、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現大腸菌株とを複合化することにより、ＰＣＢ異性体の分解特性が異なる２種類のジオキシゲナーゼを含む微生物触媒を調製した。
【００５５】
ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現菌体の調製は、Burkholderia xenovorans ＬＢ４００株（以下、ＬＢ４００株）のゲノムからクローン化した４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１、Ａ２、Ａ３及びＡ４）の遺伝子を含むＤＮＡ配列を使用した（ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号：ＢｐｈＡ１；ＡＡＢ６３４２５、ＢｐｈＡ２；ＹＰ＿５５６４０８、ＢｐｈＡ３；ＹＰ＿５５６４０６、及びＢｐｈＡ４；ＹＰ＿５５６４０５）。発現用プラスミドｐＥＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地を用いて、温度３０℃、ＯＤ６６０＝４．０〜５．０、望ましくは５．０まで培養し、ＩＰＴＧを終濃度０．２ｍＭとなるように添加してから９０分後に集菌した。集菌した菌体は緩衝液で洗浄後、洗浄と同様の緩衝液に再懸濁したものを使用した。
【００５６】
一方、野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株の調製は、特開２０１３−１７９８９０号公報に記載の方法で培養し、ビフェニルを添加して発現を誘導した。培養終了後に遠心操作により培養液から菌体を回収し、発現したビフェニルジオキシゲナーゼの失活を防ぐために液体窒素で速やかに凍結し、直ちに−８０℃の冷凍庫に保存した。複合微生物触媒の調製は、凍結融解した野生型菌株と、培養終了直後の組換え菌体とを、ＯＤ６６０の濁度比で１対４となるよう配合した。
【００５７】
[実施例２]  ＰＣＢｓの分析方法
反応後の溶液中に残存するＰＣＢｓ量は、ガスクロマトグラフィー質量分析計（Agilent Technologies 7890A/5975C）（以下、ＧＣ／ＭＳ）を用いて測定した。ＧＣ／ＭＳの分析条件は、日本機械学会、第２３回環境工学総合シンポジウム２０１３講演論文集、Ｎｏ．１３−１５に掲載の「ビフェニルジオキシゲナーゼ高発現細菌製剤の超音波利用型マイクロバブルによる触媒反応制御（著者：原富次郎、幕田寿典、高塚由美子、佐野克典、新國時生）」にしたがった。分析手順は、反応溶液に適量の塩酸を加えて反応を停止させた後、内部標準物質としたアントラセンを、反応開始時点のＰＣＢｓ濃度５ｐｐｍに対して１．６ｐｐｍとなるように添加し、反応溶液の１から２倍量、望ましくは２倍量の酢酸エチル（和光純薬工業、特級品）で液液抽出した。抽出繰返し回数は２回以上が望ましい。次に、反応溶液中の残存ＰＣＢｓが移行した有機溶媒層を無水硫酸ナトリウムで脱水した後、ＧＣ／ＭＳの検出限界感度に応じて、適宜、酢酸エチルで希釈しＧＣ／ＭＳへ注入した。この場合のＧＣ／ＭＳの検出限界は１０ｐｐｔ以下であることが望ましい。
【００５８】
ＧＣ／ＭＳ分析は、アジレントテクノロジー社のモデル７８９０Ａ／５９７５Ｃシステムにより、ＨＰ−５ｍｓカラム（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）を用いて以下の条件により行った：線形速度１．５ｃｍ／ｓのヘリウムキャリアーガス（９９．９９９９％）、８０℃にて２分間の後、２０℃／分で１３０℃まで加熱し、最終的に８℃／分にて３００℃まで加熱した。イオン源温度は２３０℃に、四重極の温度は１５０℃にし、そしてインターフェースの温度は３００℃に設定した。データ収集は、ＭＳＤケムステーションソフトウェア（アジレントテクノロジー社）を用いて行った。化合物は、ＮＩＳＴ０８マススペクトルライブラリーを用いて確認した。分解率（％）は、複合微生物触媒で処理しなかった対照ＰＣＢ混合物との比較において計算した。
【００５９】
［実施例３］複合微生物触媒を用いたＰＣＢｓの分解
ＰＣＢ異性体の分解特性が異なる２種類のジオキシゲナーゼを発現する、ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４（ＬＢ４００）発現大腸菌株と野生型コマモナス・テストステロニＹＵ１４−１１１株を複合化した微生物触媒を使用し、酸素マイクロバブル発生機構を搭載した小型分解装置（図１）を用いてＰＣＢｓを分解した。
【００６０】
本実施例において、酸素マイクロバブルを発生させることができる小型分解装置は、加圧法でマイクロバブルを発生することができる機構を搭載するものを用いた。以下に、反応操作の手順を説明する。１Ｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を加圧酸素ガス溶解タンクへ注入し、酸素ガスを０．５ＭＰａの値で導入した。圧力を十分にかけつつ酸素を緩衝液へ溶解させた後に反応容器へ導入した。その後、４０ｍｇ／ＬのＰＣＢｓ、０．００５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤トリトンＸ-１００、及び湿菌体で１６ｇの複合微生物触媒を投入口から投入した。反応条件は、反応温度３０℃、撹拌速度６００ｒｐｍ及び酸素曝気圧１０ｋＰａとした。反応混合物中のＤＯ値は、タカハタ電子株式会社でプログラミングしたソフトウェアを用いて取得した。
【００６１】
７０種類の異性体を含むＰＣＢｓ（４０ｍｇ／Ｌ）と複合微生物触媒を接触開始してから５分、１時間、３時間、６時間、および２４時間後のそれぞれの時点において反応溶液の一部を採取して、残存ＰＣＢｓ量の経時的変化を実施例２に記載のＧＣ−ＭＳ法を用いて測定し、その結果を図２に示した。測定の結果、反応開始１時間後には、当初投入した４０ｐｐｍのＰＣＢｓは８．７ｍｇ／Ｌまで急速に減少し、３時間後にはさらに３．７ｍｇ／Ｌまで減少した。２４時間後には、０．４ｍｇ／Ｌまで分解され、環境省の定める卒業判定基準である０．５ｍｇ／Ｌを下回る極めて高活性および高効率な分解性能を示した。以上の解析は、分析回数ｎ＝３で行った。
【００６２】
本実施例において、酸素マイクロバブルの添加が、微生物触媒によるＰＣＢｓ分解反応を促進させるものと考えた。図３（ａ）に示すＰＣＢ分解経路において、２種類のジオキシゲナーゼによる反応は、２つの酸素原子をＰＣＢの芳香環へ導入することから、多くの酸素を要求する。図３（ｂ）は、ＢｐｈＣによる反応において生成される代謝産物であるＨＯＰＤＡが黄色を呈することから、分解反応の経過と共に、反応混合物の色の変化を観測した結果である。
【００６３】
[実施例４]  分解反応中のＤＯレベルと酸素消費量の時間的変化の測定
ＰＣＢｓ分解反応中のＤＯ値と酸素消費速度の経時変化をそれぞれ図４及び５に示す。図４に示したように、ＰＣＢｓ分解反応中のＤＯ値は二度の減少及び増加を繰り返し、最後に飽和レベルに達した。図４におけるパルス状のＤＯ変化が生じているのは、偶発的にＤＯセンサーに酸素バブルが付着したためと考えられる。ＰＣＢｓ分解反応の進行に伴って、酸素消費速度について２つの明確なピークが見られ（図５）、これはＤＯレベルの減少時期と一致していた。
ＰＣＢｓ分解の触媒経路は、図３に示したように２種類のジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ及びＢｐｈＣ）による工程で２分子の酸素を消費する。それ故、１７０分及び１０６０分経過した時の酸素消費速度の第一及び第二のピークは、ＰＣＢｓとジヒドロキシ（塩化）ビフェニルのそれぞれの分解に基づくと推定した。
ＰＣＢｓの完全分解に至る過程においては、ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ）の反応が完了すると共に酸素の消費も終了するため、酸素濃度が飽和に達すると考えた。ここで云うＰＣＢｓの完全分解とは、即ちＨＯＰＤＡが生成されたところまでと定義し、ここで生成したＨＯＰＤＡを含む反応溶液は、ラットを用いた４週間の急性毒性（予備）実験において、安全であることが判っている。
本実施例では、ＰＣＢｓの分解のために、酸素バブルの供給が約１日（少なくとも１３３０分）必要であった。図５に示したｄＯｃ／ｄｔカーブの積分値から、分解反応の総酸素消費量を計算することができ、その結果、１４ｍｍｏｌ／Ｌの酸素が反応容器に供給されたことが判った。１モルのＰＣＢｓを分解するために２モルの酸素が使用されることから、分解反応に用いたＰＣＢｓの濃度と平均分子量から計算される理論酸素消費量は０．３４ｍｍｏｌと推定した。これらの推定によれば、本実施例における複合微生物触媒によるＰＣＢｓ分解では、理論値の４０倍以上もの過剰の酸素を供給したことが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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