(57)【要約】      （修正有）【課題】骨細胞、特に骨前駆細胞の分化を促進させることで骨代謝のバランスを改善することでき、且つ、日常継続的に摂取しやすく、安全性にも心配が無い骨芽細胞分化促進剤、及び該分化促進剤を含有する骨減少性疾患の予防又は症状改善用の組成物の提供。【解決手段】サクラの花の溶媒抽出物を含有する骨芽細胞分化促進剤、及び該抽出物を有効成分とする骨減少性疾患の予防又は症状改善用組成物。【効果】サクラの花の抽出物は濃度依存的にアルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の活性を亢進し、骨芽細胞の分化を促進する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
桜の花の抽出物を含有する骨芽細胞分化促進作用剤。
【請求項２】
請求項１記載の骨芽細胞分化促進作用剤を配合した骨減少性疾患の予防または症状改善用の経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨前駆細胞から骨芽細胞への骨芽細胞分化促進剤およびそれを含有する骨量減少性疾患の予防用・改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織においては常にリモデリングが生じている。このリモデリングにおいて、加齢などの原因で骨吸収量に見合うだけの骨形成量が得られない状態になると、骨粗鬆症に代表される骨重量の減少を伴う骨量減少性疾患を発症する。骨量の減少は、前進においては骨粗鬆症、局所、例えば口腔内においては歯槽骨の退化などを引き起こし、ＱＯＬを大きく損なう大きな要因の一つであるため、特に中高年において正常なリモデリング状態の維持は重要な課題となっている。
【０００３】
骨量減少性疾患の治療または予防の代表的方法としては、カルシウム等の無機化合物の補給；活性型ビタミンＤ、やエストロゲンなどのホルモン製剤の医薬品の投与などが挙げられる。しかし、骨量減少性疾患の予防や治療は長期間継続して行わないと十分な効果が得られないことから、医薬品の投与は予防としては用いることができない上に治療に用いた場合でも副作用が発生するリスクが高いため、使用に際しては医師の厳重な管理下で行なう必要がある。また、無機化合物の摂取だけでは骨代謝の改善効果は少ないため十分な効果を得られない。
【０００４】
そこで、副作用のリスクを伴わない治療または予防法の開発が進められている。長期間継続的に摂取することから、多くの提案は食経験のある動植物等に由来する成分に着眼し、検討がなされている。例えば、動植物に含有される成分に着眼した技術[例えば、イソフラボン（特許文献１〜３）、キサンチン系化合物（特許文献４）、コラーゲン蛋白質等（特許文献５）]や、植物抽出物に着眼した技術（特許文献４〜６）などが挙げられる。しかしながら、上記提案をもってしても骨量減少性疾患の予防や治療を十分に行なう事が出来ず、さらに効果の高い提案が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平６−４６７９７号公報
【特許文献２】特開２０００−１３９４１１号公報
【特許文献３】国際公開２００２／０３２４４１号公報
【特許文献４】特開２００８−３０３１６６号公報
【特許文献５】特開２０１３−１２４２２１号公報
【特許文献６】特開２００２−３６３０８６号公報
【特許文献７】特開２００６−００８６２５号公報
【特許文献８】特開２０１４−０４３４１６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、骨細胞、特に骨前駆細胞の分化を促進させることで骨代謝のバランスを改善することでき、かつ、日常継続的に摂取しやすく、安全性にも心配が無い骨芽細胞分化促進剤、およびそれを含有する骨減少性疾患の予防または症状改善用の組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、かかる事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことにサクラの花の抽出物が骨芽細胞の分化促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、項１ないし項２の経口組成物を提供するものである。
項１．桜の花の抽出物を含有する骨芽細胞分化促進作用剤。
項２．項１記載の骨芽細胞分化促進作用剤を配合した骨減少性疾患の予防または症状改善用経口組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、桜湯などで古くから食経験があり安全性の高いサクラの花の抽出物からなる骨芽細胞分化促進剤であるため、日常継続的に摂取しても安全性には問題を生じることが無く、また摂取しやすい骨量減少性疾患の予防用・改善用の経口組成物を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明に用いるサクラの花の抽出物は、バラ科サクラ属サクラ亜属に属する落葉性の樹木の花の抽出物（エキス）を意味する。ここにおいて花とは、花弁を含んでいれば小枝等の他の部位が混在していても良い、好ましくは花柄から花弁までの部分である。また、「サクラ」とはサクラ亜属に属する植物の総称を意味する。サクラ亜属の代表的な品種としては、ヤマザクラ、オオヤマザクラ、カスミザクラ、オオシマザクラなどに代表されるヤマザクラ群、コシノヒガン、シダレザクラ、ベニシダレ、ソメイヨシノなどに代表されるエドヒガン群、マメザクラ、タカネザクラなどに代表されるマメザクラ群、オクチョウジザクラ、ヒナギクザクラなどに代表されるチョウジザクラ群、カワヅザクラ、ツバキカンザクラなどに代表されるカンヒザクラ群、セイヨウミザクラに代表されるミザクラ群、ヤエミヤマザクラに代表されるミヤマザクラ群、コブクザクラ、タイザンフクンに代表されるシナミザクラ群が挙げられるが、サクラは自家不和合性のため、自然交雑して前記以外にも数多くの品種が存在している。本発明では、サクラ亜属に属する植物の花であれば特に限定されない。
【００１１】
サクラの花の抽出物の抽出溶媒は、水系溶媒であれば特に限定されない。例えば、水、エチルアルコール、ソルビトール、超臨界流体としての二酸化炭素や窒素などが使用できる。このうち、水、エチルアルコール若しくはそれらの混液が好ましく、水およびエチルアルコールの混液が最も好ましい。水は、通常、イオン交換水や逆浸透濾過水などの精製水、蒸留水が使用するが、電気分解処理を施した還元水（アルカリイオン水）や酸性水、塩化ナトリウムやスクロース、酢酸などを溶解した水も使用することができる。水−エチルアルコール混液を使用する場合は、両者の混合比率は任意に変えることができる。その中でも、エチルアルコールが１５〜６０質量％が好ましく、２０〜５０質量％がより好ましく、２５〜４０質量％が最も好ましい。また、種々の成分を抽出したり、抽出効率を高める目的で、アルコール含有量の異なる水−エチルアルコール溶媒を用いて抽出することもできる。
【００１２】
抽出方法は植物体の抽出に使用される方法であれば特に限定されない。例えば、溶媒に浸漬し静置条件或いは攪拌条件で放置することで抽出したり、抽出溶媒を循環させる条件で抽出したり、加圧・減圧条件で抽出したり、超臨界状態で抽出する方法、もしくはそれらを組合せた方法を用いることができる。限定するものではないが、抽出温度は０〜１３０℃の範囲で行う。抽出方法や抽出溶媒により最適な抽出温度が相違するため、抽出温度は適宜決定することができる。また、サクラの花の抽出物の風味や外観（特に色）の観点では、一般に抽出温度は低い方が好ましく、抽出効率の観点では一般に温度が高いほうが好ましいことから、サクラの花の抽出物の利用目的も考慮して決定することができる。抽出時間は使用する抽出方法や使用する溶媒によって大きく左右される。例えば、溶媒が水-エチルアルコール混液の場合、通常、１分〜４２時間程度であり、数分〜２４時間程度が好ましく、２０分〜４時間程度がより好ましい。また、溶媒が水の場合、通常、１〜１０６時間程度であるが、１０分〜２４時間程度が好ましく、２０分〜６時間程度がより好ましい。サクラの花と抽出溶媒の割合についても、特に限定されず適宜設定することができるが、抽出時の浴比については、例えば、超臨界抽出や溶媒を循環させる抽出方法、浸漬静置による抽出方法などでは全く異なった最適な抽出条件となる。一般的には、サクラの花１質量部に対して、抽出溶媒を２〜１０００質量部の範囲で設定することが適当であり、好ましくは２〜５０質量部であり、更に好ましくは３〜３０質量部程度である。
【００１３】
前記で得られたサクラの花の抽出物は、必要に応じて濃縮、精製、乾燥等の処理を行うことができる。例えば、保存安定性の向上目的、輸送費用の低減目的、エチルアルコールの除去・低減目的などの理由で減圧濃縮処理、加熱濃縮処理、膜濃縮処理などの濃縮を行ったり、外観・匂いの改善、不純物・エチルアルコールの除去目的、有効成分を高める目的などの理由で、濾過処理、限外濾過膜や逆浸透膜などを用いた膜分離処理、遠心分離処理、活性炭吸着処理、樹脂カラム処理、化学処理などの精製を行ったり、凍結乾燥処理、造粒乾燥処理、スプレードライ処理などの乾燥を行うことができる。得られたサクラの花の抽出物はそのまま摂取することができ、また、他の成分と混合して様々な剤形形態にして使用することができる。例えば、乾燥物に賦形剤を加えた後に錠剤、タブレット、顆粒、粉末などとしたり、他の飲食剤形とすることができる。
【００１４】
本願発明の骨芽細胞分化促進剤を含有する骨量減少性疾患の予防用・改善用経口組成物は、液体若しくは液状、粘稠体、ゼリー、固形ゲル、粉末、顆粒、ブロックなど種々の形態とすることができる。この中でも、飲料として摂取できる形態、例えば液体、液状、粉末、顆粒の形態は、手軽に多量摂取できることから好ましい。特に、病者用食品、嚥下困難者用食品、特定保健用食品などの特定用途食品や栄養機能食品及びいわゆる栄養補助食品として使用することができる。
【００１５】
骨量減少性疾患の予防用・改善用組成物には、上記化合物のほかに、本願発明の効果を損なわない範囲であれば、その他の成分をさらに含有してもよい。例えば、乳化剤、甘味料、酸化防止剤、着色料、調味料、ビタミン類、ミネラル類、香料、着色料、増粘多糖類等の従来公知の食品添加物等、従来食品に添加される他の成分（食品添加物の他食品も含む）を含んでもよい。
【実施例】
【００１６】
以下、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、以下特に断りのない限り「％」は「質量％」を示す。
【００１７】
サクラの花の抽出物のアルカリフォスファターゼ活性化効果
１０％ＦＢＳ添加α-ＭＥＭ培地を使用して培養したマウス骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３-Ｅ１）を１０％ＦＢＳ添加α-ＭＥＭ培地に１．０×１０５cells/ｍＬの濃度で懸濁し、その細胞懸濁液を９６ウェルプレートに各々１００μlずつ播種した。１サンプルにつき試験数は３とした。培養は７日間とし、その間、３〜４日間隔で培地を交換した。各々の培養条件にて得られたアルカリフォスファターゼ（以下「ＡＬＰ」と略する。）活性測定用細胞をウェルプレート毎、冷凍保存した。
ＡＬＰ活性測定は、前記冷凍保存した細胞をウェルプレートのまま解凍し、細胞溶解剤であるＣｅｌｌ-ＬｙＥＸ１にプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦを２ｍＭとなるように添加して作製した混合液を、各ウェルに４０μＬ添加し室温で１５分間撹拌した。その後、遠心分離して得られた上清を、ＡＬＰ活性測定用サンプルとした。
ＡＬＰ活性測定および蛋白質含有量の測定は、各々、LabAssay ALP (和光純薬社製)および Micro BCA Protein Assay Reagent Kit（PIERCE社製）を使用し、測定は各々の測定キットのプロトコルに従い、下記に示す方法で行った。
（ＡＬＰ活性測定）
基質緩衝液のp-ニトロフェニルりん酸を含む炭酸塩緩衝液  １００μlとサンプルまたはＡＬＰ標準原液各２０μlを前記方法で調製したウェルに添加し、プレートミキサーを用いて１分間攪拌した。攪拌後、３７℃で１５分間インキュベートして発色処理した後に、反応停止液水酸化ナトリウム溶液を８０μl添加し、プレートミキサーで1分間混和後、プレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長４０５ｎｍ）を測定した。なお、ＡＬＰ活性の標準曲線は０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５ｍmol/ＬのＡＬＰ標準溶液を用いて作成し、測定値より検体中のＡＬＰ活性（ｍmol/min）を算出した。
（蛋白質の測定）
反応液１００μlとサンプルまたはＢＳＡ濃縮標準溶液各１００μlを前記方法で調製したウェルに添加し、プレートミキサーを用いて１分間攪拌した。攪拌後、３７℃で１５分間インキュベートして発色処理した後、直ちにプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長５６２ｎｍ）を測定した。なお、ＢＳＡ活性の標準曲線は、１．２５、２．５５、１０、２０、４０、８０μｇ/ｍｌのＢＳＡ標準溶液を用いて作成し、測定値より検体中の蛋白質含有量（ｍｇ/ｍＬ）を算出した。
ＡＬＰ活性化効果は、ＡＬＰ活性測定値（ｍmol/min）を蛋白質量（ｍｇ/ｍＬ）で除した、「蛋白質量あたりのＡＬＰユニット量」を算出し、評価した。算出した結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
表１に示したとおり、サクラの花の抽出物は濃度依存的にＡＬＰ活性を亢進することがわかった。特に、１０μg/mlにおいては、コントロールに比べて５％の危険率で有意に高いＡＬＰ比活性を認めた。骨芽細胞におけるＡＬＰの発現は骨芽細胞の分化の指標として知られていることから、サクラの花の抽出物は、骨芽細胞の細胞分化を促進することが示唆される。