(57)【要約】【課題】サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の保菌の有無を効率的に検査する方法を提供することである。【解決手段】健常人のサルモネラ、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の保菌の有無を検査する方法として、陽性率（陽性数／全検体数）が０．５％以下であるマルチプレックスＰＣＲ法を用いることで、マルチプレックスＰＣＲ法を用いた保菌者のスクリーニング方法の効率性を高めることができた。さらに、スクリーニングの効率化を図る上で、プール糞便からのマルチプレックスＰＣＲと融解曲線解析を用いた検出方法が有効であることを見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックスＰＣＲ法を用いて、健常人の、サルモネラ、腸管出血性大腸菌および赤痢菌の３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検査する方法であって、次の（１）および（２）の工程を含み、かつ、陽性率が０．５％以下である検査方法。
（１）前記３菌種をターゲットとするマルチプレックスＰＣＲを行う工程
（２）得られた増幅産物を分析して前記３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検出する工程
【請求項２】
陽性率が０．２％以下である、請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
検査対象が、便検体である、請求項１または２に記載の検査方法。
【請求項４】
検査対象が、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取した便検体のプール検体である、請求項１−３のいずれかに記載の検査方法。
【請求項５】
前記Ｘが２０以上である、請求項４記載の検査方法。
【請求項６】
工程（２）の検出方法が、蛍光インターカレーターを用いた融解曲線解析である、請求項１−５のいずれかに記載の検査方法。
【請求項７】
工程（２）において、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を増幅産物のＴｍ値の違いによって分離検出する、請求項１−６のいずれかに記載の検査方法。
【請求項８】
工程（２）において、前記３菌種のいずれの増幅産物とも異なるＴｍ値を与えるインターナルコントロール（内部標準）を含む、請求項１に記載の検出方法。
【請求項９】
工程（１）において、前記３菌種の増幅産物のＴｍ値が互いに１℃以上離れるように設計された３組のプライマーペアをプライマーセットとしてマルチプレックスＰＣＲを行う、請求項７に記載の検出方法。
【請求項１０】
プライマーセットが、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）の３群の中からそれぞれ１つずつ選択される３つのプライマーペアの組合せである、請求項９に記載の検出方法。
（Ｉ）以下の（ａ）または（ｂ）で示されるサルモネラ増幅用プライマーペア
（ａ）「配列番号１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号３のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」からなるオリゴヌクレオチドペア
（ｂ）（ａ）のプライマーペアの各塩基配列に対する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドペア
（ＩＩ）以下の（ｃ）または（ｄ）で示される腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用プライマーペア 
（ｃ）「配列番号４のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号６のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号７のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種からなるオリゴヌクレオチドペア
（ｄ）（ｃ）のプライマーペアの各塩基配列に対する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドペア
（ＩＩＩ）以下の（ｅ）または（ｆ）で示される赤痢菌増幅用プライマーペア 
（ｅ）「配列番号８のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号９のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」からなるオリゴヌクレオチドペア
（ｆ）（ｅ）のプライマーペアの各塩基配列に対する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドペア
【請求項１１】
下記の（Ａ）〜（Ｄ）を含む、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌の３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検査するための試薬。
（Ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）［９］または［１０］のいずれかに記載のプライマーセット
（Ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（Ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオンおよびカリウムイオンからなる群のうち１種以上を含む緩衝液
【請求項１２】
さらに下記の（Ｅ）を含む、請求項１１に記載の試薬。
（Ｅ）蛍光インターカレーター
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の保菌の有無を検査する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒を予防する上で、食中毒原因菌の保菌者を早期に発見することは重要である。そのため、食品調理従事者に対しては、食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査が行われている。
【０００３】
従来、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査は、塗沫培養法により行われてきた。具体的には、検体を所定条件下において培養してある程度まで増殖させた後、検出したい細菌類のみが増殖し得るような選択培地中で培養を行い、増殖によってできたコロニーを観察することによって検出するという方法である。
【０００４】
しかしながら、このような従来の方法では、（１）培養工程を経るため、結果が得られるまでに時間がかかる点、（２）検出感度が低い点、及び（３）コロニーの観察結果に基づいて客観的な判定を下すのは難しいため、検出結果の客観性を担保するのが難しい点等の問題点があった。
【０００５】
そこで、これら検出方法の問題点を解決するためにＰＣＲ法を用いた検出方法が開発されてきた（非特許文献１）。ＰＣＲ法では、（１）培養工程を経ないため迅速に検出できる、（２）検出感度が高い、（３）検出対象の細菌類の有無を、目的のＤＮＡが増幅したか否かで判定するので、客観性をもって細菌類を検出できる等の利点がある。
【０００６】
ＰＣＲ法によるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査は、その後、塗沫培養法により確定検査がされるのが一般的である（非特許文献２）。これは、ＰＣＲ法では、偽陽性が発生する可能性が高いためであり、実際、ＰＣＲ陽性においても塗沫培養法で陰性となる現象が認められる。その原因は、非特異増幅の発生等、様々な要因が挙げられる。
【０００７】
ＰＣＲ法は塗沫培養法よりも陽性率が高いが、一次スクリーニングとして利用されている。これは、ＰＣＲ法によるスクリーニングを実施した上でＰＣＲ陽性検体を塗沫培養する方が、簡便であり、効率的であることが要因である。しかしながら、ＰＣＲ法の陽性率に関する明確な指標は存在せず、ＰＣＲ法を用いたサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検出に関してより効率的なスクリーニング方法について、改善の余地が残されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ＴａＫａＲａ  ＢＩＯ  ＶＩＥＷ  ５５号  ４８頁  （２００８年）
【非特許文献２】感染症学雑誌８６：７４１−７４８，２０１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＰＣＲ法を用いたサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のスクリーニングは、落とし漏れが発生しないために塗沫培養法よりも陽性率が高い必要性があるが、効率の観点からは、塗沫培養法との相関が高いことが求められる。そこで、本発明が解決しようとする課題は、ＰＣＲ法を用いたサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌をより効率的にスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記事情を鑑み、鋭意研究の結果、健常人のサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の陽性率を低くすることで効率的なスクリーニングを実施できることを見出し、本発明の完成に至った。さらに、スクリーニングの効率化を図る上で、プール糞便からのスクリーニング方法と融解曲線解析を用いた検出方法が有効であることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］マルチプレックスＰＣＲ法を用いて、健常人の、サルモネラ、腸管出血性大腸菌および赤痢菌の３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検査する方法であって、次の（１）および（２）の工程を含み、かつ、陽性率が０．５％以下である検査方法。
（１）前記３菌種をターゲットとするマルチプレックスＰＣＲを行う工程
（２）得られた増幅産物を分析して前記３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検出する工程
［２］陽性率が０．２％以下である、［１］に記載の検査方法。
［３］検査対象が、便検体である、［１］または［２］に記載の検査方法。
［４］検査対象が、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取した便検体のプール検体である、［１］−［３］のいずれかに記載の検査方法。
［５］前記Ｘが２０以上である、［４］に記載の検査方法。
［６］工程（２）の検出方法が、蛍光インターカレーターを用いた融解曲線解析である、［１］−［５］のいずれかに記載の検査方法。
［７］工程（２）において、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を増幅産物のＴｍ値の違いによって分離検出する、［１］−［６］のいずれかに記載の検査方法。
［８］工程（２）において、前記３菌種のいずれの増幅産物とも異なるＴｍ値を与えるインターナルコントロール（内部標準）を含む、［１］に記載の検出方法。
［９］工程（１）において、前記３菌種の増幅産物のＴｍ値が互いに１℃以上離れるように設計された３組のプライマーペアをプライマーセットとしてマルチプレックスＰＣＲを行う、［７］に記載の検出方法。
［１０］プライマーセットが、以下の（Ｉ）から（ＩＩＩ）の３群の中からそれぞれ１つずつ選択される３つのプライマーペアの組合せである、［９］に記載の検出方法。
（Ｉ）以下の（ａ）または（ｂ）で示されるサルモネラ増幅用プライマーペア
（ａ）「配列番号１のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号２のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号３のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」からなるオリゴヌクレオチドペア
（ｂ）（ａ）のプライマーペアの各塩基配列に対する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドペア
（ＩＩ）以下の（ｃ）または（ｄ）で示される腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用プライマーペア 
（ｃ）「配列番号４のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号５のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種、および、「配列番号６のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」と「配列番号７のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」とからなる群のうち少なくとも１種からなるオリゴヌクレオチドペア
（ｄ）（ｃ）のプライマーペアの各塩基配列に対する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドペア
（ＩＩＩ）以下の（ｅ）または（ｆ）で示される赤痢菌増幅用プライマーペア 
（ｅ）「配列番号８のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」、および、「配列番号９のうち１５塩基以上からなるオリゴヌクレオチド」からなるオリゴヌクレオチドペア
（ｆ）（ｅ）のプライマーペアの各塩基配列に対する相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドペア
［１１］下記の（Ａ）〜（Ｄ）を含む、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌の３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検査するための試薬。
（Ａ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）［９］または［１０］のいずれかに記載のプライマーセット
（Ｃ）ＤＮＡ合成基質（デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ））、および、
（Ｄ）マグネシウムイオン、アンモニウムイオンおよびカリウムイオンからなる群のうち１種以上を含む緩衝液
［１２］さらに下記の（Ｅ）を含む、［１１］に記載の試薬。
（Ｅ）蛍光インターカレーター
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、ＰＣＲ法によるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のスクリーニングの効率を高めることを可能とした。これにより、数時間で検査確定が可能な陰性検体数を増やすことが可能であるため、迅速で効率的な検査報告が期待できる。さらに本発明では、迅速に効率良く検出が可能になったことから、特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が多いに期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ゲノムＤＮＡと陽性検体からサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を検出した結果の図である。
【図２】プール糞便からサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を検出した結果の図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明では、陽性率が低いマルチプレックスＰＣＲ法を用いることで、スクリーニングの効率が著しく改善されたことに特徴がある。この陽性率に着目し、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検査を実施した例は存在せず、この陽性率の低さが検出効率を高める大きな要因となった。
【００１５】
本発明の実施形態のひとつは、マルチプレックスＰＣＲ法を用いて、健常人の、サルモネラ、腸管出血性大腸菌および赤痢菌の３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検査する方法であって、次の（１）および（２）の工程を含み、かつ、陽性率が０．５％以下である検査方法である。
（１）前記３菌種をターゲットとするマルチプレックスＰＣＲを行う工程
（２）得られた増幅産物を分析して前記３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検出する工程
【００１６】
マルチプレックスＰＣＲ法とは、同時に複数のターゲットを増幅することが可能な方法であり、複数のターゲットに対するプライマーセットをすべて混合し、ＰＣＲを行うことで実施される。すなわち本発明におけるマルチプレックスＰＣＲとは、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のそれぞれを増幅するためのプライマーをすべて混合し、ひとつの液でＰＣＲを行うことである。
【００１７】
本発明の検査方法における陽性率とは、健常人を検査対象とした場合の全検体数に対する陽性検体の割合を意味する。すなわち、後述するプール糞便を使用した場合でも、陽性率の算出には、個別の検体ごとに分割し計算することとなる。例えば、５０００検体分を５０検体ずつプールし、１００プールを検査したとする。このとき、陽性プールが５つ存在した場合は、陽性率は、５÷５０００と計算され、０．１％となる。
【００１８】
本発明の検査方法におけるマルチプレックスＰＣＲの陽性率が低いとは、効率の観点から、０．５％以下であることが好ましい。さらに、より好ましくは、０．２％以下である。効率性については、時間的効率性と、採算性の２点を考慮した上で全検体数に対して、ＰＣＲ陽性により塗沫培養が必要となる枚数の許容範囲を算出される。
【００１９】
本発明の検査方法は、食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種のいずれか１種以上の保菌の有無を検査することが目的であるため、検査対象は特に限定されないが、便検体を使用することが好ましい。たとえば、検便検体を使用することができる。検便検体とは、便から採取された便検体をいう。便検体の採取方法等は、特に限定されないが、例えば便の一部を掻き取ることによって得ることができる。検便検体は、検便のために採取されたものを用いることができる。
【００２０】
本発明の検査方法において便検体は特に限定されない。例えば、哺乳類の便から採取された便検体が挙げられる。哺乳類としては、特に限定されないが、例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等を挙げることができる。また、本発明が適用される便検体は、保存などの目的で、ＤＮＡの破壊が抑えられていることを前提に、希釈・濾過・その他の物理化学的処理が施されたものであってもよい。
【００２１】
本発明の検査方法においては、この便検体から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートして増幅することができる。このゲノムＤＮＡの分離精製は、限定されるものではないが、商業的に入手可能なＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ  −Ｇｅｎｏｍｅ−（ＴＯＹＯＢＯ）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ（タカラバイオ）、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（プロメガ）、ＦｌｅｘｉＧｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｋｉｔ（キアゲン）等を用いることができる。
【００２２】
本発明の検査方法では前述の通り、抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いることができるが、検査の簡便性、迅速性の観点から、ゲノムＤＮＡの分離精製を行っていない便検体を使用することが好ましい。例えば、便検体をそのまま懸濁させた溶液を熱処理、遠心分離後、上清をテンプレートとする方法が挙げられる。ＰＣＲに用いる便検体のＰＣＲ反応液への添加割合は、適切にＰＣＲが行われればよく、特に限定されないが、例えば、１〜２０ｖ／ｖ％の範囲内で適宜調整することができる。
【００２３】
さらに、多検体の検査が必要な場合は、便検体としてプール検体を用いることがより好ましい。ＰＣＲに用いる便検体の添加割合は、適切にＰＣＲが行われればよく特に限定されないが、例えば、１〜２０ｖ／ｖ％の範囲内で適宜調整することができる。本発明において、プール検体とは、Ｘ種（Ｘは２以上の整数を示す。）の便から採取された検便検体からなるものである。
【００２４】
ここでいうＸ種の便とは、Ｘ種の個体が排泄したそれぞれの便であってもよいし、同一個体が排泄したＸ種の便であってもよい。Ｘについては、特に限定されないが、検出しようとするサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種の検出率（１００個の便から採取された便検体のうち、１個の便検体においてその細菌類が検出されるとき、検出率が１％であるとする。）に基づいて最適な数を設定することができる。例えば便検体としてヒトの便から採取された便検体を用い、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検出率が約０．０５％であったとする。この場合、１０００種の便から採取された検便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、これら３菌種が検出される確率は、１０００（検体）×０．０５％＝５０％となる。したがって、順次別々のプール検体を入れ替えて検出をすると、２回に１回の確率で３菌種が検出されることになる。同じ場合に、１００種の便から採取された検便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２０回に１回の確率で３菌種が検出されることになる。同じ場合に、１０種の便から採取された検便検体からなるプール検体を用いて検出を行えば、２００回に１回の確率で３菌種が検出されることになる。順次別々のプール検体を入れ替えて検出をする場合、どの程度の確率でサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌が検出されれば作業を効率的に進めることができるかを考慮して、プール検体に含まれる検便検体の種類を決定することができる。通常は、数十回に１回の確率で３菌種が検出されるようにするのが好ましい。そのため、好ましくは、Ｘが２０以上、より好ましくは３０以上であり、より好ましくは４０以上であり、より好ましくは５０以上である。
【００２５】
プール検体を用いた場合の効率の計算において、マルチプレックス法における陽性率が最も重要となる。例えば、マルチプレックスＰＣＲ法における陽性率が０．２％の検体を５０検体プールした検査を実施した場合、塗沫枚数を全検体数の１０％とすることが可能となる。この１０％は時間的、採算的に有意義な数値であることから、本発明では、陽性率が０．２％以下であることがより好ましいとしている。
【００２６】
本発明の検査方法において、マルチプレックスＰＣＲ後に、得られた増幅産物を分析して前記３菌種のうちいずれか１種以上の保菌の有無を検出する方法は、電気泳動であってもよく、蛍光インターカレーターを用いた融解曲線解析であってもよいが、検査の簡便性の観点からは、融解曲線解析を用いることが好ましい。さらに、融解曲線解析では、増幅産物のＴｍ値が３菌種で互いにそれぞれ異なるようにすることで、３菌種の分離検出が可能となるため、３菌種をＴｍ値により分離検出が可能なプライマーを用いることがより好ましい。
【００２７】
本発明の検査方法では、マルチプレックスＰＣＲ法におけるプライマーの設計は、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の陽性率を低くするように行えばよく、前述の陽性率を満たすものであれば特に限定されない。
【００２８】
マルチプレックスＰＣＲに用いるプライマーは特に限定されないが、増幅されるＤＮＡ断片の長さは、例えば２０〜１０００塩基、より好ましくは５０〜７００塩基、さらに好ましくは１００〜５００塩基が挙げられる。さらに、本発明におけるプライマーの長さとしては、好ましくは１３〜３５塩基であり、より好ましくは１６塩基以上であり、また、３０塩基以下が好ましい。
【００２９】
また本発明に使用するプライマーセットは、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの群も検出できるようにするために、多くの群に共通の遺伝子を増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３０】
例えば、サルモネラとしては２菌種（Ｓ．  ｅｎｔｅｒｉｃａ、及びＳ．  ｂｏｎｇｏｒｉ）、６亜種、並びに血清型２５０１種が知られている。サルモネラを検出しようとする場合、細胞侵入性タンパク質ｉｎｖＡの遺伝子を増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３１】
例えば、Ｏ−１５７をはじめとする腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）としてはベロ毒素としてＶＴ１、並びにＶＴ２、ＶＴ２ｖｈａ、ＶＴ２ｖｈｂ、及びＶＴ２ｖｐが知られている。腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を検出しようとする場合、ＶＴ１及びＶＴ２の遺伝子をそれぞれ増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３２】
例えば、赤痢菌としてはＡ〜Ｄ群（Ａ群として１３種血清型；Ｂ群として６種血清型；Ｃ群として１８種血清型；Ｄ１群として１種血清型）が知られている。赤痢菌を検出しようとする場合、病原性因子ｉｐａＨの遺伝子を増幅しうるプライマーセットを用いることが好ましい。
【００３３】
サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの群も検出できるようにする方法として、複数のプライマーを使用することが可能である。例えば、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を増幅するために、ＶＴ１増幅用のプライマーセットとＶＴ２増幅用のプライマーセットの計４本を腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）を増幅するためのプライマーセットとして使用することができる。
【００３４】
また、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの群も検出できるようにするために縮重プライマーを使用することもできる。縮重プライマーを使用することで、いずれの群において可能性のある塩基配列をすべて含むようなプライマーを設計することが可能となる。
【００３５】
本発明の検査方法に用いるプライマーセットは、前述の条件に加え、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種の増幅産物のＴｍ値のちがいによって分離検出できることが好ましく、より好ましくは、Ｔｍ値の差異が１℃以上、より好ましくは２℃以上であり、より好ましくは３℃以上である。この各増幅産物のＴｍ値は、各リアルタイムＰＣＲ装置、解析ソフトウェアにより求められる。
【００３６】
本発明におけるプライマーセットは特に限定されないが、配列番号１−９に示すプライマーセットを例として挙げることができる。配列番号１、２に記載のプライマーが、サルモネラ増幅用フォワードプライマーであり、配列番号３に記載のプライマーがサルモネラ増幅用リバースプライマーである。配列番号４，５に記載のプライマーが腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用フォワードプライマーであり、配列番号６、７に記載のプライマーが腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用リバースプライマーである。配列番号８に記載のプライマーが赤痢菌増幅用フォワードプライマーであり、配列番号９に記載のプライマーが赤痢菌増幅用リバースプライマーである。
【００３７】
本発明におけるプライマーセットとしては、これら配列番号１−９に示すプライマーと、相補的配列を使用してもよい。また、変異に対応するために、配列番号１−９に示す配列の数塩基の置換が含まれていてもよい。ここでいう数塩基とは、１０塩基以下、より好ましくは５塩基以下、より好ましくは４塩基以下、より好ましくは３塩基以下、より好ましくは２塩基以下、より好ましくは１塩基以下である。
【００３８】
また、前記の３菌種のそれぞれを対象として増幅するための各プライマーは、その少なくとも一つが、前記の配列番号１から９のいずれかに記載されている塩基配列（またはそれらの相補的配列）の一部分から構成されていてもよい。たとえば、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）および赤痢菌のうち少なくとも１組のプライマーペアにおいて、フォワードプライマーおよび／またはリバースプライマーが、各配列番号のうち１５塩基以上、より好ましくは１８塩基以上からなるオリゴヌクレオチドから構成されていればよい。
別の言い方をすると、配列番号１から９に記載されている塩基配列のうち一番長いものは２３塩基、一番短いものは１９塩基であるが、前記のフォワードプライマーまたはリバースプライマーの長さは、各塩基配列で示される配列の全長を有することが最も好ましい。前記「塩基配列の一部分」については、全長が１５塩基未満とならない範囲内であれば、その配列の連続性を維持する前提で、少なくともいずれかの末端を欠いてもよい。その場合の塩基配列の長さは、長いほうが好ましい。例えば配列番号１であれば１５塩基以上であれば良いが、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より好ましくは１９塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２１塩基以上、より好ましくは２２塩基以上、最も好ましくは２３塩基である。また、例えば配列番号４であれば１５塩基以上であれば良いが、より好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、最も好ましくは１９塩基である。
さらに、前記の３菌種のそれぞれを対象として増幅するためのプライマーペアは、前記のいずれかに記載されている塩基配列を含めば、いずれかの末端に数塩基が付加されていてもよい。いずれかの末端に塩基を付加することで、プライマーの全長が、１８塩基以上となることが好ましく、より好ましくは、２０塩基以上、より好ましくは、２３塩基以上となることが好ましい。この場合、プライマー全長の上限は、３５塩基であることが好ましく、さらに好ましくは３２塩基、さらに好ましくは３０塩基である。
【００３９】
本発明に用いるプライマー濃度は限定されず、適宜調整すればよいが、ピークが高くなる増幅産物を与えるプライマー比を下げ、ピークのバランスを揃えることが好ましい。また、必要であればプライマーの濃度を通常のＰＣＲを行う場合よりも高濃度とする。
【００４０】
本発明では偽陰性発生を防止させるためにインターナルコントロール（内部標準）を含むことがより好ましい。陰性の場合、インターナルコントロール（内部標準）の増幅のみが認められ、ＰＣＲが成功したことを確認することができる。一方、ＰＣＲの阻害や試薬の添加忘れが発生した場合は、インターナルコントロール（内部標準）の増幅が認められないため、ＰＣＲが失敗したことが確認できる。
【００４１】
インターナルコントロール（内部標準）は、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種のＴｍ値、あるいは増幅長が異なれば、特に限定されない。Ｔｍ値が異なる場合は、インターナルコントロール（内部標準）のＴｍ値が、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌のいずれの増幅産物とも異なるＴｍ値を与えるものであればよく、たとえば３菌種すべてのＴｍ値に対して、それより低温であっても、高温であってもよい。また、３菌種のいずれかの中間でもよい。また、増幅長が異なる場合は、インターナルコントロール（内部標準）の増幅長が、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の増幅長よりも長鎖であっても、短鎖であってもよい。また、３菌種のいずれかの中間でもよい。
【００４２】
インターナルコントロール（内部標準）として、検査対象に含まれないターゲットとそのターゲットを増幅するためのプライマーセットを用いればよい。また、インターナルコントロール用にプライマーを別に添加せず、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌増幅用プライマーを用いて増幅した場合に３菌種とは異なるＴｍ値あるいは増幅長を与えるテンプレートのみを添加し、インターナルコントロール（内部標準）としてもよい。
【００４３】
本発明の検査方法において、マルチプレックスＰＣＲ反応時の組成は、前述の陽性率を満たせば特に限定されず、従来公知の成分が挙げられ、その割合も限定されるものではない。前記組成成分として、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ合成基質（たとえば、１種類以上のデオキシヌクレオチド三リン酸または、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体）、緩衝剤、及び塩よりなる群のうち少なくとも１つを含有することが好ましい。
【００４４】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されず、従来公知の耐熱性細菌由来のポリメラーゼが使用できる。具体的には、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠損、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列を有する変異体であってもよく、特に限定されない。
【００４５】
緩衝剤としては、例えば、トリス（ＴＲＩＳ）、トリシン（ＴＲＩＣＩＮＥ）、ビス−トリシン（ＢＩＳ−ＴＲＩＣＩＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（ＰＩＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）などが挙げられるが、特に限定されない。
また、反応バッファー中には、１．０〜５ｍＭ、好ましくは１．５〜２．５ｍＭ程度の濃度でＭｇ２＋を含むことが好ましい。更には、ＫＣｌを含んでいてもよい。
また、必要に応じて、界面活性剤を含んでいてもよい。
【００４６】
さらに、反応バッファー中には、アルブミン、グリセロール、ヘパリン、トレハロース、ベタイン等を含んでいてもよい。これらの添加割合は、ＰＣＲ反応を阻害しない範囲で添加すればよい。
【００４７】
検出方法が蛍光インターカレーターを用いた融解曲線解析の場合は、蛍光インターカレーターを添加する。蛍光インターカレーターの添加は、ＰＣＲ反応液にあらかじめ添加してもよく、ＰＣＲ後添加してもよいが、簡便性の観点からＰＣＲ反応液にあらかじめ添加しておくことが好ましい。
【００４８】
蛍光インターカレーターとは、二本鎖ＤＮＡに挿入（インターカレート）することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに挿入して蛍光を発する色素である。
【００４９】
多数のインターカレーターが当技術分野で公知である。例えば、Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ、シアニン色素（例えば、ＴＯＴＯ（登録商標）、ＹＯＹＯ（登録商標）、ＢＯＢＯおよびＰＯＰＯ）、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  ＥＲ、ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ（登録商標）  ＤＸ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＬＣＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯＸ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ、ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ、ヨウ化プロピジウム、Ａｃｒｉｄｉｎｅ  ｏｒａｎｇｅ、７−アミノ−アクチノマイシン  Ｄ、ＣｙＱＵＡＮＴ（登録商標）  ＧＲ、ＳＹＴＯ（登録商標）９，  ＳＹＴＯ（登録商標）１０、ＳＹＴＯ（登録商標）１３、ＳＹＴＯ（登録商標）１４、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、ＦＵＮ−１などが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００５０】
本発明におけるサルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌を分離検出するためには、融解曲線解析が可能な機器を使用する。融解曲線解析を実施可能な機器として、リアルタイムＰＣＲ機器が挙げられるが限定されるものではない。具体例としては、ロッシュ・ダイアグノスティック社のライトサイクラー（登録商標）、アプライドバイオシステム社のＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７０００  ／  ７７００、７５００  ／  ７５００  ＦＡＳＴ  リアルタイムＰＣＲシステム、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム、ＳｔｅｐＯｎｅ  ／  ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム、キアゲン社のＲｏｔｏｒ  Ｇｅｎｅ、タカラバイオ社のＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、バイオ・ラッド社のＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎ、ＣＦＸ３８４  Ｔｏｕｃｈ、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ、アジレント・テクノロジー社のＭｘ３０００Ｐ、Ｍｘ３００５Ｐ、Ｍｘ４０００等が挙げられる。また、ＰＣＲ反応については、上記のリアルタイムＰＣＲ機器を使用してもよいが、融解曲線解析と独立して、サーマルサイクラーを使用してもよい。
【００５１】
ＰＣＲにおける温度サイクルは、使用するプライマーに応じて適宜設定することができる。また、融解曲線解析については、取得するデータの温度範囲は、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌、インターナルコントロール（内部標準）を含む場合はインターナルコントロール（内部標準）のＴｍ値の範囲内であればよく、温度上昇速度（データポイント数）等は、各リアルタイムＰＣＲ装置に適した条件を設定すればよい。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００５３】
実施例１：ゲノムＤＮＡと陽性検体からの３菌種の検出
サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種を検出するプライマーとしてＴｍ値により分離検出が可能なプライマーセット（配列番号１−９）を設計した。配列番号１、２に記載のプライマーが、サルモネラ増幅用フォワードプライマーであり、配列番号３に記載のプライマーがサルモネラ増幅用リバースプライマーである。配列番号４，５に記載のプライマーが腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用フォワードプライマーであり、配列番号６、７に記載にプライマーが腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）増幅用リバースプライマーである。配列番号８に記載にプライマーが赤痢菌増幅用フォワードプライマーであり、配列番号９に記載にプライマーが赤痢菌増幅用リバースプライマーである。また、偽陽性を防ぐため、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の３菌種よりもＴｍ値が低温になるインターナルコントロール増幅用プライマー（配列番号１０、配列番号１１）を設計した。このインターナルコントロール増幅用プライマーは、ｐＢＲ３２２をテンプレートとする。
【００５４】
本実施例では、ＰＣＲ試薬としてＢｌｅｎｄ  Ｔａｑ  −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ）、蛍光インターカレーターとして、ＥｖａＧｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用した。また、プライマー濃度は、それぞれの菌を検出するプライマー濃度が１．２μＭとなるように各プライマーで均等に分配し添加した。すなわち、サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌を検出するプライマーセットとして、ＰＣＲ反応液に３．６μＭのプライマーが含まれることになる。また、インターナルコントロール増幅用プライマー濃度は、フォワードプライマー、リバースプライマーそれぞれ０．５μＭとし、テンプレートとして、２．５μＭ／μＬのｐＢＲ３２２を添加した。
【００５５】
本実施例では上記ＰＣＲ反応液を２０μＬ系にて調製した。この２０μＬの反応液に、検査対象として陽性実検体を１０％程度になるように水で懸濁し、９５℃、５分熱処理、遠心分離後の上清液を２μＬ添加した。また、コントロールとして、糞便の代わりに、精製したサルモネラ、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７、赤痢菌ゲノムＤＮＡ１００コピーを鋳型として増幅を実施した。
【００５６】
調製したサンプルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎにて、９４℃、２分の初期変性の後、変性：９４℃、１０秒、アニーリング：５５℃、１５秒、伸長：６８℃、３０秒を４０サイクル繰り返すＰＣＲを実施後、融解曲線解析を０．５℃／Ｓｔｅｐにて実施した。
【００５７】
これらの結果を図１に示す。サルモネラ、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）、赤痢菌の検出が可能であり、それぞれを分離検出することができた。
【００５８】
実施例２：プール糞便からの３菌種の検出 
本実施例では陽性実検体を１検体含むプール糞便について、実施例１に記載のＰＣＲ反応液、サイクル条件にて検査した。プール糞便は、採便管内の糞便少量を、滅菌水（１ｍＬ程度）の入った試験管に懸濁したものを採便管毎に調製し、２０個と５０個の検便検体をそれぞれ等量ずつ（数μＬ程度）１本のチューブにプールした検便検体を、９５℃、５分熱処理し、遠心分離後の上清を使用した。
【００５９】
これらの結果を図２に示す。その結果、プール糞便に対しても同様な結果が得られ、より簡便、迅速に多検体のサンプルを検査できることが示された。
【００６０】
実施例３：陽性率の確認とその有効性の検証 
４７００件の実検体を実施例２に記載の方法にて５０件ずつプールした。プールした９４件について、実施例１に記載の条件にて検査を実施した。また、有効性を検証するために、４７００件をすべて個別に塗沫培養法にて検査を実施した。
【００６１】
その結果、サルモネラ５件、腸管出血性大腸菌３件が陽性と判定され、マルチプレックスＰＣＲによる陽性率は、８件／４７００検体であり、０．１７％であった。この結果より、本実施例のプライマー設計、反応液は、陽性率の条件を満たしていることが確認された。
【００６２】
そこで、この有効性について検証した。４７００検体を塗沫培養法により検査した結果、ＰＣＲ法で陰性と判定された８６プール分の４３００検体は陰性と判定された。また、ＰＣＲ陽性と判定された８プール中、２プールにおいて陽性検体が認められた。この結果より、マルチプレックスＰＣＲ法では、偽陰性が発生しないことが確認され、プール糞便を用いたマルチプレックスＰＣＲのスクリーニングについて、有効性が確認された。
【００６３】
本実施例のケースでは、９４プール中、マルチプレックスＰＣＲ陽性が８件であることから、塗沫培養が必要な割合は、全検体数に対し、８×５０／４７００＝８．５％となる。この値は、陽性率がコントロールされたマルチプレックスＰＣＲ法を用いることで達成された値であり、マルチプレックスＰＣＲ法によるスクリーニング方法の効率化の点で十分に意義のある結果となった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
健常人のサルモネラ、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の保菌の有無を検査する方法として、陽性率（陽性数／全検体数）が０．５％以下であるマルチプレックスＰＣＲ法を用いることで、マルチプレックスＰＣＲ法を用いた保菌者の一次スクリーニング方法の効率性を高めることができた。これにより、数時間で検査確定が可能な陰性検体数を増やすことが可能であるため、迅速で効率的な検査報告が期待できる。さらに本発明では、迅速に効率良く検出が可能になったことから、特に多サンプルの処理が必要な産業用途での利用が多いに期待できる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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