(57)【要約】      （修正有）【課題】微生物検出／同定試験、及び酵素活性の検出／同定に有用な蛍光発生／蛍光プローブを提供する。【解決手段】酵素活性を検出するための、特に、ニトロレダクターゼ、アゾレダクターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ及びミエロペルオキシダーゼから選されるの酵素活性を発現する能力の機能において微生物を同定／識別するための、式（Ｉ’’）又は（ＩＩ’’）で例示される蛍光発生プローブ。2016096801.tif 000054【選択図】図１ａ
2016096801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトロレダクターゼ、アゾレダクターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ及びミエロペルオキシダーゼ活性からなる群において選択される酵素活性を検出するための式Ｉ又はＩＩの蛍光発生基質であって；
2016096801.tif 000044
式中、ｑｕ．は、検出する酵素活性に合わせて、
−  −ＮＯ２；
−  −Ｎ＝Ｎ−Ｒ１；  Ｒ１は対応するアゾ結合を覆わない任意の有機基；
−  −ＮＨＣＯ−Ｐｅｐｔ．；  Ｐｅｐｔ．はアミド結合を覆わないペプチド残基又は任意の有機基；
−  −Ｏ−Ｇｌｙｃ．；  Ｇｌｙｃ．は対応するグリコシド結合を覆わないオリゴグリコシド残基；
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２；  −Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）（ＯＲ２’）及び−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２；  Ｒ２及びＲ２’は独立に、対応するエステル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基；
2016096801.tif 000045
；  Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは独立に、対応するアリールエーテル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基；
からなる群において選択される蛍光クエンチャー基であり；
式Ｉ又はＩＩの前記蛍光発生基質が、適切な酵素活性を受けると、式Ｉ’又はＩＩ’：
2016096801.tif 000046
の蛍光レポーター分子を形成する、蛍光発生基質の使用。
【請求項２】
ｑｕ．が−ＮＯ２であり、検出する酵素活性がニトロレダクターゼ活性である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ｑｕ．が−Ｎ＝Ｎ−Ｒ１であり、検出する酵素活性がアゾレダクターゼ活性である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ｑｕ．が−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２；  −Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）（ＯＲ２’）又は−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２であり、検出する酵素活性がカルボキシルエステラーゼ、ホスホエステラーゼ又はスルホエステラーゼ活性である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ｑｕ．が
2016096801.tif 000047
であり、検出する酵素活性がミエロペルオキシダーゼ活性である、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
以下の工程：
ａ）式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
2016096801.tif 000048
（式中、ｑｕ．は、検出する酵素活性に合わせて、
−  −ＮＯ２；
−  −Ｎ＝Ｎ−Ｒ１；  Ｒ１は対応するアゾ結合を覆わない任意の有機基；
−  −ＮＨＣＯ−Ｐｅｐｔ．；  Ｐｅｐｔ．はアミド結合を覆わないペプチド残基又は任意の有機基；
−  −Ｏ−Ｇｌｙｃ．；  Ｇｌｙｃ．は対応するグリコシド結合を覆わないオリゴグリコシド残基；
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２；  −Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）（ＯＲ２’）及び−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２；  Ｒ２及びＲ２’は独立に、対応するエステル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基；  並びに
2016096801.tif 000049
；  Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは独立に、対応するアリールエーテル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基；
からなる群において選択される蛍光クエンチャー基である）の少なくとも１つの蛍光発生基質を含む反応培地を提供する工程と、
ｂ）前記培地に試験される生体試料を接種する工程と、
ｃ）インキュベートする工程と、
ｄ）橙、遠赤外又は近赤外で見える蛍光の起こり得る出現又は増加により、可能性のある探索された酵素活性を検出する工程と
を含む、ニトロレダクターゼ、アゾレダクターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ及びミエロペルオキシダーゼ活性からなる群において選択される酵素活性を、微生物において検出する方法。
【請求項７】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
2016096801.tif 000050
（式中、ｑｕ．は、
−  −ＮＯ２；
−  −Ｎ＝Ｎ−Ｒ１；  Ｒ１は対応するアゾ結合を覆わない任意の有機基；
−  −ＮＨＣＯ−Ｐｅｐｔ．；  Ｐｅｐｔ．は対応するアミド結合を覆わないペプチド残基又は任意の有機基；
−  −Ｏ−Ｇｌｙｃ．；  Ｇｌｙｃ．は対応するグリコシド結合を覆わないオリゴグリコシド残基；
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２；  −Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）（ＯＲ２’）及び−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２；  Ｒ２及びＲ２’は独立に、対応するエステル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基；  並びに
2016096801.tif 000051
；  Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは独立に、対応するアリールエーテル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基
からなる群において選択される）の少なくとも１つの蛍光発生基質を含む、微生物の検出及び／又は同定のための反応培地。
【請求項８】
式（Ｉ’’）又は（ＩＩ’’）：
2016096801.tif 000052
（式中、Ｚは
−  −ＮＨ２及び−ＯＨ
の間で、
又は、
−  −ＮＯ２；
−  −Ｎ＝Ｎ−Ｒ１；  Ｒ１は対応するアゾ結合を覆わない任意の有機基；
−  −ＮＨＣＯ−Ｐｅｐｔ．；  Ｐｅｐｔ．は対応するアミド結合を覆わないペプチド残基若しくは任意の有機基；
−  −Ｏ−Ｇｌｙｃ．；  Ｇｌｙｃ．は対応するグリコシド結合を覆わないオリゴグリコシド残基；
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２；  −Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）（ＯＲ２’）及び−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２；  Ｒ２及びＲ２’は独立に、対応するエステル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基；  並びに
2016096801.tif 000053
；  Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは独立に、ミエロペルオキシダーゼ活性による起こり得る切断を阻まないように、対応するアリールエーテル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基
からなる蛍光クエンチャー基において選択される）の蛍光発生化合物又は蛍光化合物。
【請求項９】
Ｒ１０１−１１０、ＳＲ１０１−ＯＨ、ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２及びＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨからなる群において選択される、請求項８の蛍光化合物。
【請求項１０】
Ｚが−ＮＯ２である、請求項８の蛍光発生化合物。
【請求項１１】
Ｚが-Ｎ＝Ｎ-Ｒ１であり、Ｒ１が、
−  ４-(Ｎ-ブタン酸,Ｎ-メチル)アニリニル
−  ４-(Ｎ-アジドエチル,Ｎ-メチル)アニリニル
−  ４-アミノ(Ｎ-メチル,Ｎ-エチルアニリン)フェニル
−  ４-(Ｎ-３-マレイミジルプロピル,Ｎ-メチル)アニリニル
−  ４-(Ｎ-３-アミノプロピル,Ｎ-メチル)アニリニル
−  ４-(Ｎ,Ｎ-ジメチル)アニリニル
−  ４-(Ｎ,Ｎ-ジ-３-アジドエチル)アニリニル
−  １,１’-((１,１’-((フェニルアザネジイル)ビス(エタン-２,１-ジイル))ビス(１Ｈ-１,２,３-トリアゾール-４,１-ジイル))ビス(メチレン))ビス(１-メチルピロリジン-1-イウム)
−  ３,３’-(１,１’-((１,１’-((フェニルアザネジイル)ビス(エタン-２,１-ジイル))ビス(１Ｈ-１,２,３-トリアゾール-４,１-ジイル))ビス(メチレン))ビス(ピペリジン-１-イウム-１,１-ジイル))ビス(プロパン-１-スルホネート)
からなる群において選択される、請求項８の蛍光発生化合物。
【請求項１２】
ＳＲ１０１−ＮＯ２；  ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈ；  ＳＲ１０１−Ｑ−Ｎ３；  ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＣＨ；  ＳＲ１０１−Ｑ−Ｍａｌ；  ＳＲ１０１−Ｑ−ＮＨ２；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−Ｈｙｐ；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−Ｈｙｐ−（Ｎ３）２；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−Ｈｙｐ−スルホベタイン；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−Ｈｙｐ−アンモニウム；  ＳＲ１０１−ＯＡｃ；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＡｃ；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ−ラウリン酸；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＳＯ３Ｈ）；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＰＯ（ＯＢｎ）２）及びＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＰＯ３Ｈ２）；  ＳＲ１０１−ＮＨＡｃ；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−アミノフェニル）及びＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−ニトロフェニル）からなる群において選択される、請求項８の蛍光発生化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光発生／蛍光プローブ技術分野、及び微生物学技術分野に関する。より詳細には、本発明は、微生物検出／同定試験、及び酵素活性の検出／同定に有用な蛍光発生／蛍光プローブに関する。本発明はまた、少なくとも１つの工程がもっぱら酵素活性スクリーニングに充てられる、試料中の微生物を検出／同定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物学において、特定の酵素活性の検出及び／又は定量は、幾つかの産業部門（例えば製薬、化粧品又は食品産業）に特有の臨床目的及び／又は品質管理検討のために、微生物、例えば細菌の特定の群、属又は種を識別するのに極めて有用である。
【０００３】
この関連において、ここ数年、数多くの酵素活性プローブ、特に蛍光発生／蛍光プローブが開発され、反応培地において実践されている。
【０００４】
おおまかには、そのような蛍光発生／蛍光プローブは、標的酵素の概ね特異的な合成基質として機能し、結合した標的酵素活性により、光学特性が検出／測定され得る蛍光レポーター分子に変換されるように設計された蛍光発生（すなわち非蛍光）分子に存する。
【０００５】
以下表１は、幾つかの既知の蛍光発生基質／蛍光プローブを示す。
2016096801.tif 000003
2016096801.tif 000004
表１：  先行技術の蛍光発生／蛍光プローブの例
【発明の概要】
【０００６】
微生物同定試験において、検出する酵素活性に関してだけでなく、よりプローブ自体に関連した他のパラメーター／基準、例えば特定の培地中でのプローブの可溶性／拡散レベル、プローブの検出波長（励起及び発光波長）に関しても、最大限広範囲の酵素活性を網羅するように極めて多様な利用可能なプローブを有すること、及び使用するプローブを選択する可能性を有することが重要である。
【０００７】
この関連において、本発明は、蛍光レポーター分子が橙、遠赤外及び近赤外（約５５０−７５０ｎｍ）で蛍光の発光（λｅｍ）をもたらす蛍光発生／蛍光プローブの新たなファミリーを提案する。本発明の蛍光発生基質／蛍光プローブは、ニトロレダクターゼ、アゾレダクターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ及びミエロペルオキシダーゼ活性などの酵素活性の検出に特に有用である。
【０００８】
これらの新たな蛍光発生／蛍光プローブは合成しやすく、特に良好な安定性のおかげで、微生物の検出に日常的に使用される極めて多様な反応培地において有利には使用することができる。さらに、これらの蛍光発生基質の幾つかについては、可溶性／拡散性の特性は概ね調節することができる。
【０００９】
本発明の記載をさらに進める前に、本発明の開示を容易にするために以下の定義及び仕様が示される。
【００１０】
「蛍光発生（fluorogenic）（酵素）基質」は、特定の波長の励起光エネルギーに曝露されるときは非蛍光合成分子であって、酵素触媒作用により「フルオロフォア」（すなわち蛍光分子）に改変され得、前記フルオロフォアが同じ前述された特定の波長の励起光エネルギーに提示されると、その蛍光が光学的に検出できる非蛍光合成分子を意味すると理解される。前記酵素触媒作用は、蛍光発生基質に特異的な１つの特定の酵素、又は単独で及び蛍光発生基質に対し同じように作用する異なる酵素、又は蛍光発生基質に対し組み合わせて作用する幾つかの酵素を含み得る。蛍光発生基質酵素からそのようにして得られたフルオロフォアを指すのに、用語「蛍光レポーター分子」もまた使用される。
【００１１】
本発明の化合物（又はプローブ）、すなわち蛍光発生基質及び対応する蛍光レポーター分子は、電離状態が実施される培地／環境のｐＨに従って幾つかの電離状態で観察することができる。その上、本発明の前記化合物は塩化することもでき、すなわちそれらは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、カリウム又はトリフルオロ酢酸塩などの塩の形態で存在し得、及び／又は調製し得る。単純化のために、それらの代表的な使用される化学式及び記載は、１つの特定の電離状態を指す。本発明の化合物は、本明細書に記載された特定の電離状態に限定されない。
【００１２】
「反応培地」は、微生物、細胞又は細胞小器官の代謝の発現及び／又は成長に必要な要素を含む培地を意味すると理解される。反応培地は、フローサイトメトリー、組織酵素学的手法、細胞培養等において使用することができ、又は微生物の検出及び／若しくは同定のための培地として使用することができる。反応培地は固体、半固体又は液体であってもよい。
【００１３】
表現「固体培地」は、例えばゲル培地を意味すると理解される。寒天は、微生物の培養のための微生物学における伝統的なゲル化剤であるが、ゼラチン又はアガロースを使用することができる。例えばコロンビア寒天、トリプケースソイ寒天、マッコンキー寒天、サブロー寒天培地、又はより一般的にはHandbook of Microbiological Media (CRC Press)に記載されているものなど、多くの調製物が市販されている。
【００１４】
反応培地は、「検出及び／又は同定培地」、すなわち可視化培地、又は培養及び可視化培地であってもよい。第１のケースでは、微生物は接種前に培養され、第２のケースでは、検出及び／又は同定培地も培養培地を構成する。
【００１５】
「生体試料」は、生体液の試料、又は任意のタイプの食品から得られた食品試料、あるいは任意の化粧品若しくは医薬品調製物又は任意の環境から得られた化粧品若しくは医薬品試料又は環境試料から得られた臨床試料を意味すると理解される。この試料は故に、気体、液体又は固体であってもよく、臨床血液、血漿、尿又は糞便試料、鼻、喉、皮膚、傷、脳脊髄液からの試料、水、ミルク、果汁などの飲料；ヨーグルト、肉、卵、野菜、マヨネーズ、チーズ；魚等の食品試料、骨粉から得られた特定の試料など、動物飼料から得られた食品試料が挙げられ得るが、これらに限定されない。試料は、臨床環境、育種環境、又は食品、化粧品若しくは医薬品生産環境から採取することもできる。環境から採取される発現試料は、特に表面試料、液体試料、空気、原料又は製品の試料を意味すると理解される。
【００１６】
表現「試料」は、したがって、本来の試料（スワブ、糞便、食品等）、及び前記試料から得られた微生物のコロニー（例えば前記試料を接種されたゲル培養培地、又は増菌培地で単離後の）を意味すると理解される。
【００１７】
本発明の目的のために、用語「微生物」は、細菌、特にグラム陰性及びグラム陽性細菌、酵母、カビ、及びより一般的には、実験室で増殖及び操作することができる、一般的には単細胞であり肉眼では見えない生物を対象とする。
【００１８】
「有機基」は、飽和又は不飽和の直鎖状又は環状炭化水素置換基を意味すると理解される。有機基には、アルキル、アルケニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル及びそれらの誘導体（酸化、ニトロ化、硫化、ハロゲン化、「金属」誘導体を含む）などの置換基が含まれる。「有機基」は、場合により分岐及び／又は官能化されてもよい（すなわち、有機基は、ハロゲン化基（フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、ヒドロキシル、チオール、カルボニル、アルデヒド、エステル（炭酸エステル、リン酸、硫酸）、アミド、カルボキシレート／カルボキシル、エーテル、スルフィドアルキルオキシ、ペルオキシ、アミン／アンモニウム、ピリジル、ホスホノ…などの少なくとも１つの官能基を含む）。
【００１９】
「アルキル置換基」は、特にＣ１−Ｃ２０アルキル、すなわち、１から２０個の炭素原子を有する直鎖状又は分岐アルキルなどの飽和炭化水素鎖を意味すると優先的に理解される。例として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル及びヘキシルが挙げられ得る。「アリール置換基」は、特に芳香Ｃ６−Ｃ１０環、特にフェニル、ベンジル、１−ナフチル又は２−ナフチルなどの芳香環に由来する置換基を意味すると優先的に理解される。
【００２０】
本発明は、したがって、式Ｉ’’又はＩＩ’’：
2016096801.tif 000005
（式中、Ｚは
−  −ＮＨ２及び−ＯＨ
の間で、
又は、
−  −ＮＯ２；
−  −Ｎ＝Ｎ−Ｒ１；  Ｒ１は、アゾレダクターゼ活性による起こり得る切断を阻まないように、対応するアゾ結合を覆わない任意の有機基；
−  −ＮＨＣＯ−Ｐｅｐｔ．；  Ｐｅｐｔ．は、ペプチダーゼ活性による起こり得る切断を阻まないように、対応するアミド結合を覆わないペプチド残基若しくは任意の有機基；
−  −Ｏ−Ｇｌｙｃ．；  Ｇｌｙｃ．は、グリコシダーゼ活性による起こり得る切断を阻まないように、対応するグリコシド結合を覆わないオリゴグリコシド残基；
−  −Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２；  −Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）（ＯＲ２’）；  −Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２；  Ｒ２及びＲ２’は独立に、適切なエステラーゼ活性（すなわち、カルボキシルエステラーゼ、ホスホエステラーゼ又はスルホエステラーゼ活性）による起こり得る切断を阻まないように、対応するエステル結合（カルボキシルエステル、ホスホエステル又はスルホエステル結合）を覆わない水素原子若しくは任意の有機基；  並びに
2016096801.tif 000006
；  Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅは独立に、ミエロペルオキシダーゼ活性による起こり得る切断を阻まないように、対応するアリールエーテル結合を覆わない水素原子若しくは任意の有機基
からなる蛍光クエンチャー基において選択される）の蛍光発生化合物又は蛍光化合物に関する。
【００２１】
本発明はまた、酵素活性、すなわち、ニトロレダクターゼ、アゾレダクターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ及びミエロペルオキシダーゼ活性からなる群において選択される酵素を検出するための、そのような蛍光／蛍光発生プローブの特定の使用にも関する。
【００２２】
この関連において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
2016096801.tif 000007
（式中、ｑｕ．は以前に定義されたような蛍光クエンチャー基である）の蛍光発生基質が使用される。
【００２３】
使用される蛍光発生基質を構成するこの蛍光クエンチャー基（ｑｕ．）は、検出する酵素活性に合わせて以前に列挙されたような蛍光クエンチャーの中で選択される。その結果、この蛍光発生基質が適切な酵素活性を受けると、該基質は、式Ｉ’又はＩＩ’：
2016096801.tif 000008
の蛍光レポーター分子を形成する。
【００２４】
本発明の蛍光発生基質のそのような使用は、目的とする酵素活性（複数可）を発現する能力の機能において微生物を同定／識別する目的で有利には実施することができる。この点に対し、本発明はまた、以下の工程：
ａ）以前に定義されたような、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の少なくとも１つの蛍光発生基質を含む反応培地を提供する工程と、
ｂ）前記培地に試験される生体試料を接種する工程と、
ｃ）インキュベートする工程と、
ｄ）橙、遠赤外又は近赤外で見える蛍光の起こり得る出現又は増加により、可能性のある探索された酵素活性を検出する工程と
を含む、ニトロレダクターゼ、アゾレダクターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ及びミエロペルオキシダーゼ活性からなる群において選択される酵素活性を、微生物において検出する方法にも関する。
【００２５】
本発明はまた、酵素活性、すなわち、ニトロレダクターゼ、アゾレダクターゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ及びミエロペルオキシダーゼ活性からなる群から選択される酵素を検出するための検出剤にも関し、前記検出剤は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
2016096801.tif 000009
（式中、ｑｕ．は以前に定義されたような蛍光クエンチャー基である）の蛍光発生基質を含む。
【００２６】
本発明は故に、スルホキサンテンに由来し式Ｉ’’又はＩＩ’’（式中、Ｚは−ＮＨ２又は−ＯＨである）の化合物に対応する以下のフルオロフォア：
2016096801.tif 000010
（ＳＲ１０１−１１０及びＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２に対して付けられたｐＫａ値は、それぞれの酸−塩基結合ＲＮＨ３＋／ＲＮＨ２及びＲＮＨ２／ＲＮＨ−を指す）
の興味深い蛍光特性の観察に基づく。
【００２７】
これらのフルオロフォアは、「Chevalier A.ら, Chem. Eur. J., 2014、20： 8330-8337」において本発明者らにより初めて開示された。
【００２８】
以前に言及された吸収及び発光波長は、リン酸緩衝生理食塩水中で２５℃で測定される。
【００２９】
これらの蛍光芳香族コアから、蛍光発生（すなわち非蛍光）酵素基質のセットが設計された：
2016096801.tif 000011
【００３０】
それらの各々は、特定の「蛍光クエンチャー基」ｑｕ．を含み、該ｑｕ．は、
−  芳香族コアに共有結合されると、その蛍光のスイッチを著しく切るようにその電子環境を改変する、及び
−  適切な酵素活性下で前記芳香族コアから放出され、これによりその−ＮＨ２又は−ＯＨ機能を、したがってその蛍光を取り戻す。
【００３１】
この点において、硝酸塩基（−ＮＯ２）は、本発明による式Ｉ又はＩＩの化合物を構成する芳香族コアの電子環境を、その自家蛍光を消光する／スイッチを切るように十分に妨害する能力を有することが示された。この蛍光は次いで、ニトロレダクターゼ活性に接して放出される。その結果、以前に定義されたような、及びｑｕ．が−ＮＯ２基である式Ｉ又はＩＩの化合物は、ニトロレダクターゼ活性を検出するための蛍光発生酵素基質として有利には使用することができる。
【００３２】
その上、−ＮＯ２基のように、任意のクエンチャー基ｑｕ．は、
−  対応する芳香族コアとの直接結合を伴う、
−  アゾ結合、アミド結合、グリコシド結合、エステル結合（カルボキシルエステル、ホスホ（モノ又はジ）エステル及びスルホエステルを含む）及びアリールエーテル結合からなる群において選択される
ことを条件に、本発明による式Ｉ又はＩＩの蛍光発生基質の調製に関して想定され得ることも示された。
【００３３】
検討される芳香族コアでのそのような直接結合の唯一の存在は、対応するアミノ化又はヒドロキシル化芳香族コアに本来備わっている蛍光の消光を可能にする。クエンチャー基ｑｕ．の残りの部分（すなわち、式Ｉ’’及びＩＩ’’においてＲ１、Ｐｅｐｔ．、Ｇｌｙｃ．、Ｒ２、Ｒ２’、及びＲａからＲｅにより示された基）は、検出する酵素活性により標的にされる結合を物理的に覆わないように、したがって、この標的結合が適切な酵素活性（複数可）に接近できるように慎重に選択される。消光基ｑｕ．の前記残りの部分の、標的結合を物理的に覆わない能力は、本質的に又はもっぱら、前記標的結合の領域における立体障害に関係する。実際には、消光基ｑｕ．の前記残りの部分は扱いにくすぎるべきでなく、及び／又は前記標的結合と立体相互作用を生じるべきでない。
【００３４】
本発明に関連して、Ｒ１、Ｐｅｐｔ．、Ｇｌｙｃ．、Ｒ２、Ｒ２’、及びＲａからＲｅは、それらの固有特性、特にそれらの親水性／疎水性特性に関して、例えば、後者が実践されることになる培地（例えば、液体、固体又は半固体反応培地）と調和した、得られた蛍光発生基質の拡散性の特性を調節するように有利には選択され得る。
【００３５】
有利には、及び本発明によれば、Ｐｅｐｔ．、Ｇｌｙｃ．、Ｒ２及びＲ２’の選択は標的酵素にも依存する。Ｐｅｐｔ．、Ｇｌｙｃ．、Ｒ２及びＲ２’は、したがって有利には標的酵素の天然の基質を模倣するように設計され、より具体的には、標的酵素により認識されるパターンを含む。
【００３６】
本発明の蛍光発生／蛍光プローブを用いる本発明による酵素活性の検出の一般原理は、スキーム１にまとめられている。使用される蛍光発生基質ごとに、適切なクエンチャー基ｑｕ．（より具体的には、芳香族コアとのその結合）が検出する特定の酵素活性に合わせて選択される。
2016096801.tif 000012
スキーム１：  本発明による酵素活性の蛍光検出
【００３７】
本発明による蛍光発生／蛍光プローブの性能を最適化するために、フルオロフォアのｐＫａに関して培地ｐＨをコントロールしながら該プローブを使用することが勧められる。
【００３８】
第１の好ましい実施態様によれば、並びにスキーム２により概略的及び部分的に図示されているように、本発明は、以前に定義されたようにｑｕ．が−ＮＯ２基を示す式Ｉ又はＩＩの少なくとも１つの蛍光発生基質が使用される、ニトロレダクターゼ活性を検出する方法、及びニトロレダクターゼ活性を発現する微生物を検出／同定する方法に関する。
【００３９】
これに関して、「ニトロレダクターゼ活性」により、スキーム２に概略的に表される化学反応を部分的又は全体的に触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の蛍光発生ニトロ基質を本発明のアミノフルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−１１０又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２）又は以下の中間型：
2016096801.tif 000013
に変換することができる任意の酵素活性と理解され、本発明のアミノフルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−１１０又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２）へのこれらのヒドロキシルアミノ生成物の還元は、酵素反応又は化学反応のどちらかをさらに伴い得る。
2016096801.tif 000014
スキーム２：  本発明によるニトロレダクターゼ活性の蛍光検出
【００４０】
前述されたヒドロキシルアミノ生成物もまた蛍光化合物であることに留意することも都合がよい。したがって、本発明のニトロ蛍光発生基質は、ニトロ還元反応の第１段階においてさえ蛍光を発する利点を有する。
【００４１】
操作するために、ニトロ還元活性に関与する幾つかの酵素は、補酵素としてのフラビンモノヌクレオシド（ＦＭＮ）などのフラビン、及び／又は補因子としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする。ニトロレダクターゼ活性が生体試料において探索される場合、生体試料がＦＭＮ並びにＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ（例えば、試験微生物自体により内因的に提供される）を既に含んでいる可能性があっても、さらに、適切な蛍光発生基質に対して、フラビン（例えばＦＭＮ）の追加量、並びにＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの考えられる追加量が有利には使用される。
【００４２】
第２の好ましい実施態様によれば、並びにスキーム３により概略的及び部分的に図示されているように、本発明は、ｑｕ．が−Ｎ＝Ｎ−Ｒ１を示す式Ｉ又はＩＩの少なくとも１つの蛍光発生基質が使用され、Ｒ１がアゾ結合（芳香族コアに直接結合された）を覆わない任意の有機基である、アゾレダクターゼ活性を検出する方法、及びアゾレダクターゼ活性を発現する微生物を検出／同定する方法に関する。
【００４３】
これに関して、「アゾレダクターゼ活性」により、以下のスキーム３に概略的に図示された化学反応を触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の蛍光発生アゾ基質を本発明のアミノフルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−１１０又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２）に変換することができる酵素活性と理解される。
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スキーム３：  本発明によるアゾレダクターゼ活性の蛍光検出
【００４４】
ニトロレダクターゼのように、アゾレダクターゼは、操作するのにＦＭＮなどのフラビン、及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする酵素である。アゾレダクターゼ活性が生体試料において探索される場合、生体試料がＦＭＮ並びにＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ（例えば、試験微生物自体により内因的に提供される）を既に含んでいる可能性があっても、さらに、本発明の適切な蛍光発生基質に対して、フラビン（例えばＦＭＮ）の追加量、並びにＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨの考えられる追加量が有利には使用される。
【００４５】
本発明によれば、Ｒ１は、対応するアゾ結合を覆わない任意の有機基を示す。有利には、Ｒ１は、１から３０個の原子（大部分が炭素原子、場合により窒素、酸素及び／又は硫黄原子）により形成された主鎖を有する有機基である。また、前記主鎖は、少なくとも１つの有機側鎖により場合により官能化及び／又は分岐される。
【００４６】
有利には、及び同じ実施態様によれば、前記主鎖及び／又は前記少なくとも１つの有機側鎖は、アルキル、アルケニル（モノ又はポリ不飽和）、アリール、シクロアルキル及び／又はシクロアルケニル（モノ又はポリ不飽和）からなる群において選択されるＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖に対応する。
【００４７】
有利には、及び本発明によれば、Ｒ１は分岐及び／又は官能化アリール、より優先的には分岐及び／又は官能化フェニルであり、さらにより優先的には、Ｒ１は、
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からなる群から選択される。
【００４８】
第３の好ましい実施態様によれば、並びにスキーム４により概略的及び部分的に図示されているように、本発明は、ｑｕ．が−ＮＨＣＯ−Ｐｅｐｔ．を示す式Ｉ又はＩＩの少なくとも１つの蛍光発生基質が使用され、Ｐｅｐｔ．が任意のペプチド残基、又は芳香族コアに直接結合されたアミド結合を覆わない任意の有機基である、ペプチダーゼ活性を検出する方法、及びペプチダーゼ活性を発現する微生物を検出／同定する方法に関する。
【００４９】
これに関して、「ペプチダーゼ活性」により、以下のスキーム４に概略的に図示された化学反応を触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の蛍光発生ペプチド基質を本発明のアミノフルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−１０１又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２）に変換することができる任意の酵素活性と理解される。
2016096801.tif 000017
スキーム４：  本発明によるペプチダーゼ活性の蛍光検出
【００５０】
さらに、「ペプチド残基」は、Ｃ末端アミノ酸残基が芳香族コアとアミド結合を形成する、１から１０個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド鎖を意味すると理解される。
【００５１】
前記オリゴペプチド鎖は、場合によりそのＮ末端にブロッキング剤を含んでもよい。例として、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、スクシノイル（ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−ＣＯ）などの可溶化剤、あるいは非代謝性アミノ酸、すなわち、ピペコリン酸、イソニペコチン酸、又はＤ型のアミノ酸（Ｄ−フェニルアラニン、アルファ−スルホ−ベータ−アラニン及び４−アミノ−２−スルホ酪酸などの）などの非天然アミノ酸が挙げられ得る。
【００５２】
有利には、及びこの第３の実施態様によれば、Ｐｅｐｔ．は標的ペプチダーゼの天然の基質を模倣しないように設計され、具体的には、Ｐｅｐｔ．は、特定のペプチダーゼにより認識されるペプチドパターンを含む（例えば、Orengaら, J. Microbiol. Meth., 2009, 79： 139-155；及びRawlingsら, Nucleic Acids Res., 2014、42参照）。
【００５３】
この特定の好ましい実施態様によれば、Ｐｅｐｔ．は１から６個のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド残基である。さらにより優先的には、Ｐｅｐｔ．は、Ｌ−アラニル、Ｌ−グリシル、ピロ−グルタミル、ベータ−アラニル、Ｌ−プロリル、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａからなる群において選択される。
【００５４】
第４の好ましい実施態様によれば、並びにスキーム５により概略的及び部分的に図示されているように、本発明は、ｑｕ．が−Ｏ−Ｇｌｙｃ．を示す式Ｉ又はＩＩの少なくとも１つの蛍光発生基質が使用され、Ｇｌｙｃ．が芳香族コアに直接結合されたグリコシド結合を覆わないオリゴグリコシド残基である、グリコシダーゼ活性を検出する方法、及びグリコシダーゼ活性を発現する微生物を検出／同定する方法に関する。
【００５５】
これに関して、「グリコシダーゼ活性」により、以下のスキーム５に概略的に図示された化学反応を触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の蛍光発生グリコシル基質を本発明のヒドロキシル化フルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−ＯＨ又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ）に変換することができる任意の酵素活性と理解される。
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スキーム５：  本発明によるグリコシダーゼ活性の蛍光検出
【００５６】
さらに、「オリゴグリコシド残基」は、モノグリコシド又はポリグリコシド（ホモ又はヘテロポリグリコシド）の残基を意味すると理解される。より具体的には、本発明によるオリゴグリコシド残基は、各グリコシド単位がグルコシル、ガラクトシル、マンノシル、フルクトシル、グルクロニル、ヘキソサミニル、アラビノシル、フコシル、キシロシル及びリボシルからなる群において選択される、１から５個のグリコシド単位を優先的に含む。
【００５７】
有利には、及び本発明によれば、Ｇｌｙｃ．は、グリコシド、アラビノシド、フコシド、キシロシド、セロビオシド、ガラクトシド、マンノシド、グルクロニド、ヘキソサミニド、キトシド、マルトシド及びリボシドの残基からなる群において選択される。
【００５８】
標的グリコシダーゼに合わせて、当業者は適切なＧｌｙｃ．を有する本発明の適切な蛍光発生基質を選択することが完全に可能である。
【００５９】
有利には、及び本発明によれば、前記グリコシダーゼ活性は、グルコシダーゼ、アミラーゼ、アラビノシダーゼ、フコシダーゼ、キシロシダーゼ、セロビオシダーゼ、ガラクトシダーゼ、マンノシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘキソサミニダーゼ、キトビオシダーゼ、マルトシダーゼ及びリボシダーゼからなる群において選択される。
【００６０】
スキーム６ａから６ｃにより概略的及び部分的に図示されているように、第５の好ましい実施態様によれば、本発明は、以前に定義されたような式Ｉ又はＩＩの少なくとも１つの蛍光発生基質が使用され、並びにｑｕ．が、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ２）（ＯＲ２’）及び−Ｏ−Ｓ（Ｏ）２−Ｒ２からなる群において選択され；  Ｒ２及びＲ２’がエステル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基である、エステラーゼ活性−より詳細には、カルボン酸エステラーゼ（又はカルボキシルエステラーゼ）活性、ホスファターゼ（又はリン酸エステラーゼ若しくはホスホエステラーゼ）活性、又はスルファターゼ（又は硫酸エステラーゼ、若しくはスルホエステラーゼ）活性−を検出する方法、及びエステラーゼ活性を発現する微生物を検出／同定する方法に関する。
【００６１】
水素原子を指定しない場合、Ｒ２及びＲ２’は、１から３０個の原子（大部分が炭素原子、場合により窒素、酸素及び／又は硫黄原子）により形成された主鎖を有する有機基である。また、前記主鎖は、少なくとも１つの有機側鎖により場合により官能化及び／又は分岐される。優先的には、前記主鎖及び／又は前記少なくとも１つの有機側鎖は、アルキル、アルケニル（モノ又はポリ不飽和）、アリール、シクロアルキル及び／又はシクロアルケニル（モノ又はポリ不飽和）からなる群において選択されるＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖に対応する。
【００６２】
有利には、及び特定の実施態様によれば、Ｒ２及びＲ２’は、水素原子、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｔ−ブチル、フェニル及びベンジルからなる群において独立に選択される。
【００６３】
より具体的には、「カルボキシルエステラーゼ活性」（又はカルボン酸エステル加水分解酵素）により、以下のスキーム６ａに概略的に表された化学反応を触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の蛍光発生カルボキシエステルを本発明のヒドロキシル化フルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−ＯＨ又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ）に変換することができる任意の酵素活性と理解される。
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スキーム６ａ：  本発明によるカルボキシルエステラーゼ活性の蛍光検出
【００６４】
その上、「ホスファターゼ活性」により、以下のスキーム６ｂに概略的に図示された脱リン酸化反応を触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の適切な蛍光発生ホスホエステル（ホスホモノエステル又はホスホジエステル）を本発明のヒドロキシル化フルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−ＯＨ又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ）に変換することができる任意の酵素活性と理解される。
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スキーム６ｂ：  本発明によるホスファターゼ活性の蛍光検出
【００６５】
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）が、生理的条件においてリン脂質（例えば、ホスファチジルイノシトール-４,５-ビスリン酸、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドキシルミオ-イノシトール-１-リン酸、アンモニウム塩、５-ブロモ-４-クロロ-３-インドキシルコリンリン酸などの）の切断に関与するホスファターゼの特定のクラスを指すことに留意することは都合がよい。
【００６６】
本発明の蛍光発生ホスホエステルは、ホスホリパーゼＣ活性を含む極めて多様なホスホエステラーゼ活性を検出するための蛍光発生基質として調製及び使用することができる。
【００６７】
さらに、本発明の意味において、「スルファターゼ活性」により、以下のスキーム６ｃに概略的に表された反応を触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の適切な蛍光発生硫酸エステルを本発明のヒドロキシル化フルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−ＯＨ又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ）に変換することができる酵素活性と理解される。
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スキーム６ｃ：  本発明によるスルファターゼ活性の蛍光検出  
【００６８】
第６の好ましい実施態様によれば、並びにスキーム７により概略的及び部分的に図示されているように、本発明は、ｑｕ．が
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を示す式Ｉ又はＩＩの少なくとも１つの蛍光発生基質が使用され、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅが、芳香族コアに直接結合されたアリールエーテル結合を覆わない水素原子又は任意の有機基である、ミエロペルオキシダーゼ活性を検出する方法、及びミエロペルオキシダーゼ活性を発現する微生物を検出／同定する方法に関する。
【００６９】
これに関して、「ミエロペルオキシダーゼ活性」により、以下のスキーム７に概略的に図示された化学反応を触媒することができる任意の酵素活性、すなわち、本発明の蛍光発生アリールエーテル基質を本発明のヒドロキシル化フルオロフォア（すなわちＳＲ１０１−ＯＨ又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ）に変換することができる任意の酵素活性と理解される。
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スキーム７：  本発明によるミエロペルオキシダーゼ活性の蛍光検出
【００７０】
有利には、及びこの第６の実施態様によれば、いずれかのＲａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ及びＲｅの１つは−ＮＯ２又は−ＮＨ２であり、他は水素原子である。より優先的には、Ｒｃは−ＮＯ２又は−ＮＨ２であり、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｄ及びＲｅは水素原子である。
【００７１】
本発明はまた、本発明による特定の酵素活性を検出する方法を微生物において実施することを可能にする反応培地にも関する。微生物の検出及び／又は同定に特に有用な前記反応培地は、以前に開示されているように、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の少なくとも１つの蛍光発生基質を含む。
【００７２】
より良好な成果のために、前記反応培地は多量のＮＡＤＨ及び／又はＮＡＤＰＨ、及び場合により多量のフラビン（例えばＦＭＮ）を含むこともできる。
【００７３】
本発明はまた、本発明の蛍光発生基質及び／又は蛍光レポーター分子、酵素活性を検出するためのプローブとしての前記化合物の使用、酵素活性を微生物において検出する方法、並びに上記又は下記に言及された特徴の全て又は一部による組み合わせを特徴とする本発明の蛍光発生基質を含む反応培地（例えば、微生物の検出及び／又は同定に有用な）にも関する。
【００７４】
本発明のさらなる特徴、目的及び利点は、添付図面を参照しながら、非限定例により本発明の実施態様を示す以下の記載を読むことから現れるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１ａ】適切な触媒活性（すなわちニトロレダクターゼ、エタノエートエステラーゼ、及びスルファターゼ活性、並びに化学刺激ミエロペルオキシダーゼ活性）の作用下で、本発明のフルオロフォアへの本発明の蛍光発生基質（ＳＲ１０１−ＮＯ２）の変換を示す、蛍光の出現及びその強度の増大を示す図である。
【図１ｂ】本発明の特定の蛍光発生基質（ＳＲ１０１−ＮＯ２）を含む反応培地の２つの状態に関する、２つの赤色蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図２】ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈのアゾ還元を示す、蛍光の出現及びその強度の増大を示す図である。
【図３】カンジダ・アルビカンスによる種々の濃度でのＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈのアゾ還元を示す、蛍光の出現及びその強度の増大を示す図である。
【図４ａ】異なる微生物により行われたＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈのアゾ還元を示す、蛍光の出現及びその強度の増大を示す図である。
【図４ｂ】異なる微生物により行われたＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈのアゾ還元を示す、蛍光の出現及びその強度の増大を示す図である。
【図５ａ】５４０ｎｍの励起波長下で発光した６００ｎｍの蛍光強度の進展を示す図である。
【図５ｂ】５３０ｎｍの励起波長下で発光した６００ｎｍの蛍光強度の進展を示す図である。
【図６】５４０ｎｍの励起波長下で発光した６００ｎｍの蛍光強度の進展を示す図である。
【図７】５４０ｎｍの励起波長下で発光した６５０ｎｍの蛍光強度の進展を示す図である。
【実施例】
【００７６】
実施例１−本発明の化合物の合成
Ａ）本発明の４つの蛍光化合物の合成
本発明４つの蛍光化合物は、以下の一般的手順に従って合成することができる。
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スキーム８：  本発明の蛍光化合物の合成
【００７７】
８-ヒドロキシジュロリジン（１等量）及び４-ホルミルベンゼン-１,３-ジスルホン酸、ジカリウム塩（１等量）の混合物をメタンスルホン酸に溶解させ、混合物を密閉チューブを用いて１５０℃で１５分間加熱する。その後、室温まで冷ますと、フェノール反応パートナー（１等量）を添加し、混合物を１５０℃で撹拌する。反応の完了をＲＰ−ＨＰＬＣにより確認し、超純水で希釈し、最後にセミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。生成物含有分画を凍結乾燥してＴＦＡ塩としての標的蛍光化合物を得る。
【００７８】
以下の表２に、本発明の４つの異なる蛍光スルホキサンテン誘導体の調製について、この合成手順を実施のさらなる詳細を示す。
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表２：  本発明の蛍光化合物の合成
【００７９】
Ｂ）本発明の蛍光発生基質の合成
１．  本発明の蛍光発生アゾレダクターゼ基質の合成
本発明の幾つかの蛍光発生アゾ基質は、本発明のアミノフルオロフォア（ＳＲ１０１−１１０；  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２）から以下の一般的手順を実施して合成することができる。
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スキーム９：  本発明の蛍光発生アゾレダクターゼ基質の合成
【００８０】
本発明のアミノフルオロフォアのＴＦＡ塩（１等量）及びＴＥＡ（１等量）を乾燥ＣＨ３ＣＮ（０．３８ｍＬ）に溶解させ、混合物を０℃まで冷却し、アルゴン雰囲気下で維持する。次いで、固体ＮＯＢＦ４（１．５等量）を添加し、反応混合物を０℃で１５分間撹拌する。
【００８１】
その後、ＡｃＯＮａ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝４．０）を両方に添加してジアゾニウム塩（又はＮ−ニトロソ）中間体の完全可溶化を得、過剰なＮＯＢＦ４をクエンチする。官能化３級アニリン（１．１等量）をＣＨ３ＣＮ（０．１ｍＬ）に溶解させ、この溶液を、予め形成したジアゾニウム塩中間体に滴下する。反応混合物を室温で３０分間撹拌する。
【００８２】
その後、粗混合物を水性０．１％ＴＦＡで希釈し、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。生成物含有分画を凍結乾燥して標的蛍光発生アゾ基質のＴＦＡ塩を得る。
【００８３】
以下の表３に、本発明による蛍光発生アゾレダクターゼ基質の特定の例の調製について、以前の合成方法の実施のさらなる詳細を示す。
2016096801.tif 000027
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表３：  本発明の蛍光発生アゾレダクターゼ基質の例
【００８４】
以前のアゾ誘導体から、
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などの他の蛍光発生アゾレダクターゼ基質を得ることができる。
【００８５】
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−Ｈｙｐ−スルホベタインは、以下の手順で調製することができる。
【００８６】
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−（Ｎ３）２（１等量）及び３-(１-(プロプ-２-イン-１-イル)ピペリジン-１-イウム-１-イル)プロパン-１-スルホネート（２．１等量）を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及び水（１：１、ｖ／ｖ）の混合物に溶解させる。アスコルビン酸ナトリウムの水性溶液（０．５等量）及びＣｕＳＯ４．５  Ｈ２Ｏ（０．２５等量）を連続的に添加し、得られた反応混合物をアルゴン雰囲気下で２時間、室温で撹拌する。反応をの完了をＲＰ−ＨＰＬＣにより確認する。反応の完了後、混合物を次いで水性ＴＥＡＢ（重炭酸トリエチルアンモニウム、５０ｍＭ、ｐＨ７．５）緩衝液で希釈し、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、凍結乾燥後、濃青色の非晶質粉末を得る。
2016096801.tif 000030
：  ３-(１-(プロプ-２-イン-１-イル)ピペリジン-１-イウム-１-イル)プロパン-１-スルホネート
【００８７】
同じように、ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−Ｈｙｐ−アンモニウムは、ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＮＨ２−Ｈｙｐ−（Ｎ３）２及び１-メチル-１-(プロプ-２-イン-１-イル)ピロリジン-１-イウム  ブロミド(３-(１-(プロプ-２-イン-１-イル)ピペリジン-１-イウム-１-イル)プロパン-１-スルホネートの代わりに）から調製する。
2016096801.tif 000031
：  １-メチル-１-(プロプ-２-イン-１-イル)ピロリジン-１-イウム  ブロミド
【００８８】
２．  本発明の蛍光発生ニトロレダクターゼ基質の合成
本発明による蛍光発生ニトロレダクターゼ基質を調製する１つの戦略は、スキーム１０により概ね図示されているように、ＳＲ１０１−Ｂｒ又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＢｒの芳香族求核置換に存し得る。
2016096801.tif 000032
スキーム１０：  本発明の蛍光発生ニトロレダクターゼ基質の合成
【００８９】
ＳＲ１０１−ＮＯ２は、この戦略を用いて調製することができる。
2016096801.tif 000033
【００９０】
これを行うために、ＳＲ１０１−Ｂｒ（１等量）のＴＦＡ塩、Ｋ３ＰＯ４（１０等量）、及びＮａＮＯ２（１０等量）をＮＭＰ（２００μＬ）に溶解させる。混合物をアルゴン雰囲気下で維持し、室温で１２時間撹拌する。反応完了をＲＰ−ＨＰＬＣにより評価する。その後、粗混合物を水性０．１％ＴＦＡ（１．５ｍＬ）で希釈し、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。
【００９１】
ＳＲ１０１−Ｂｒは、以前のスキーム８の手順を用いて予め調製し、フェノールパートナーとして３−ブロモフェノールで達成した。
2016096801.tif 000034
【００９２】
３．  本発明の蛍光発生カルボキシルエステラーゼ基質の合成
−  ＳＲ１０１−ＯＡｃの調製：
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ＳＲ１０１−ＯＨ（１等量）を無水酢酸（Ａｃ２Ｏ）に溶解させる。乾燥ピリジン（１．２等量）を滴下し、得られた反応混合物を室温で２時間撹拌する。反応の完了をＲＰ−ＨＰＬＣにより確認し、氷酢酸（ＡｃＯＨ）を添加して過剰のピリジンをクエンチする。次いで、粗混合物を水性０．１％ＴＦＡで希釈し、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより直接精製する。
【００９３】
−  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＡｃの調製：
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ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＡｃは、出発物質としてＳＲ１０１−ＯＨをＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ（１等量）に置き換えてＳＲ１０１−ＯＡｃと同じように調製する。凍結乾燥すると、ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＡｃは紫色の非晶質粉末として現れる。
【００９４】
−  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ−ラウリン酸の調製：
2016096801.tif 000037
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ（１等量）を乾燥ＤＭＦ（５００μＬ）及びＴＥＡ（５等量）に溶解させ、塩化ラウロイル（５等量）を連続的に滴下する。得られた反応混合物を５０℃で４時間撹拌する。反応の完了をＲＰ−ＨＰＬＣにより確認し、氷ＡｃＯＨを添加して過剰のＴＥＡをクエンチする。粗混合物を分取ＴＬＣ（厚いシリカ層：  ０．２５ｍｍ、溶離液としてのＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ（８５：１５、ｖ／ｖ））により精製する。最後に、過剰のＴＥＡ塩を除去するために、混合物をＲＰ−Ｃ１８カートリッジで自動フラッシュ精製にかける。生成物含有分画を凍結乾燥して紫色の固体としてのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ−ラウリン酸を得る。
【００９５】
４．  本発明の蛍光発生スルファターゼ基質の合成
−  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＳＯ３Ｈ）の調製
2016096801.tif 000038
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ（１等量）を乾燥ＤＭＦ（３００μＬ）に溶解させ、ＳＯ３．Ｍｅ３Ｎ錯体（３０等量）を添加する。得られた反応混合物を室温で一晩撹拌する。その後、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）を添加し、新たに形成された沈殿物を遠心分離及により回収し、その後、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して紫色の固体としてのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＳＯ３Ｈ）のＴＥＡ塩を得る。
【００９６】
５．  本発明の蛍光発生ホスファターゼ基質の合成
−  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＰＯ（ＯＢｎ）２）の調製
2016096801.tif 000039
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ（１等量）を乾燥ＣＨ３ＣＮに溶解させる。ＤＭＡＰ（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン；  ０．３等量）、ＣＣｌ４（テトラクロロメタン；  ５等量）及びＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；  ２．１等量）を連続的に添加し、得られた混合物を０℃で撹拌する。次いで、亜リン酸ジベンジル（１．４５等量）を添加し、得られた反応混合物を０℃で３０分間、次いで室温で２時間、撹拌下で維持する。
【００９７】
その後、混合物を減圧下で濃縮し、Ｅｔ２Ｏを添加する。新たに形成された沈殿物を遠心分離により回収し、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、紫色の固体としてのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＰＯ（ＯＢｎ）２）のＴＦＡ塩を得る。
【００９８】
−  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＰＯ３Ｈ２）の調製
2016096801.tif 000040
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＰＯ（ＯＢｎ）２）（１等量）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及び水（１０：１、ｖ／ｖ）の混合物に溶解させ、得られた溶液を室温で２時間撹拌する。その後、粗体を減圧下で濃縮し、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより直接精製して、凍結乾燥後に紫色の固体としての標的蛍光発生基質のＴＥＡ塩を得る。
【００９９】
６．  本発明の蛍光発生ペプチダーゼ基質の合成
−  ＳＲ１０１−ＮＨＡｃの調製
2016096801.tif 000041
ＳＲ１０１−ＮＨ２（１等量）をＡｃ２Ｏ（濃度：  ０．１Ｍ）に溶解させ、乾燥ピリジン（４等量）を添加する。得られた反応混合物を８０℃で３時間撹拌する。その後、混合物をジエチルエーテルに注ぎ、得られた沈殿物を濾過により回収し、その後、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して凍結乾燥後に赤色固体としての標的蛍光発生基質を得る。
【０１００】
７．  本発明の蛍光発生ミエロペルオキシダーゼ基質の合成
−  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−アミノフェニル）の調製
2016096801.tif 000042
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−ニトロフェニル）（１等量）を混合物Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＯＨ（１：１、ｖ／ｖ、５．０ｍＬ）に溶解させ、Ｐｄ／Ｃ（１０ｗｔ．％ローディング、３０ｍｇ）を添加し、得られた混合物をアルゴン雰囲気下で維持する。次いで、Ｈ２雰囲気を確立し、反応混合物を室温で４時間撹拌する。反応の完了をＲＰ−ＨＰＬＣにより確認する。その後、溶液をセライト５４５のパッドを通じて濾過し、ＣＨ３ＯＨ（５０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮する。粗混合物をセミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して紫色の固体としてのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−アミノフェニル）のＴＦＡ塩を得る。
【０１０１】
−  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−ニトロフェニル）の調製
2016096801.tif 000043
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＨ（１等量）を乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３（５等量）及び１−フルオロ−４−ニトロベンゼン（３等量）を連続的に添加する。得られた反応混合物を５０℃で一晩撹拌する。反応の完了をＲＰ−ＨＰＬＣにより確認する。その後、ジエチルエーテルを添加し、新たに形成された沈殿物を遠心分離により回収し、その後、セミ分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して紫色の固体としてのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−ニトロフェニル）のＴＦＡ塩を得る。
【０１０２】
実施例２−標的酵素活性を検出するための本発明による式Ｉの蛍光発生基質の使用
Ａ）ニトロレダクターゼ活性を検出するためのＳＲ１０１−１１０−ＮＯ２の使用
反応速度試験を、約５μＭの濃度でＰＢＳ中、３７．５℃で基質ＳＲ１０１−ＮＯ２をインキュベートして実施した。
【０１０３】
ＮＡＤＨ及び大腸菌由来のニトロレダクターゼ（ＮｆｓＡ＝４×２．５μｇ）の連続添加を行い、５００ｎｍの励起波長下で５７５ｎｍの蛍光（ＳＲ１０１−１１０の発光極大）を測定した。得られた結果（図１ａ）は、この試験中に得られた蛍光強度の進展を示す。
【０１０４】
ＮＡＤＨ（０．５ｍＭ）の添加は、２．５μｇのニトロレダクターゼの初回添加後にのみ現れる蛍光の進展に影響を与えなかった。最初のレベルに達し、１０μｇの合計量まで酵素をさらに３回添加することが、３７．５℃、１時間のインキュベーション後の５μＭのＳＲ１０１−ＮＯ２の完全な還元に必要であった。
【０１０５】
発光された蛍光をＳＲ１０１−ＮＯ２の還元の前後で記録し、１５倍の蛍光増大で９２％の消光効率を示した（図１ｂ参照）。
【０１０６】
Ｂ）アゾレダクターゼ活性を検出するためのＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈの使用
反応速度試験を、ＮＡＤＰＨ（５００又は１０００μＭ）、ＦＭＮ（５μＭ）及び大腸菌由来のアゾレダクターゼ（ＡｚｏＲ）１０ｍｇ／Ｌの存在下、約１００μＭの濃度でリン酸緩衝液中、３７℃で基質ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈをインキュベートして実施した（Mercier C.ら, J. Appl. Microb., 2013, 15： 1012-1022）。５５０ｎｍで励起時の５８０ｎｍの蛍光発光を測定した。
【０１０７】
アゾレダクターゼ、ＡｚｏＲ、及び様々な濃度のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ（１×＝５００μＭ、２×＝１０００μＭ）の存在下、得られた結果（図２）は得られた蛍光強度の進展を示すものである。ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈの還元は極めて瞬間的であり、利用可能なＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの量により限定される。ＡｚｏＲの非存在下、１５時間のインキュベーション後でさえＮＡＤＨ（不図示）又はＮＡＤＰＨによる還元は全くない。
【０１０８】
Ｃ）微生物におけるアゾレダクターゼ活性を検出するためのＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈの使用
１．  ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈの細菌還元をメチルレッド（アゾ色素）の１つと比較した。大腸菌Ｋ１２の７．５＊１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ）の存在下、トリプケースソヤブロス中１００μＭの各分子を、３７℃で一晩インキュベートした。メチルレッドのアゾ還元により生成された蛍光を、２５０ｎｍの励起波長下、３９５ｎｍで測定した。ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈのアゾ還元により生成された蛍光は、５５０ｎｍの励起波長下、５８０ｎｍで測定した。メチルレッドに関して、細菌を含む培地と細菌を含まない培地の比は４６９／１８４（×２．５）であった。ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈに関して、それは１９倍上、すなわち１７２６９／３６３（×４８）であった。
【０１０９】
２．  微生物の異なる種に属する株がトリプケースソヤブロス中のＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈを還元する能力を、３７℃で２４時間追跡した。様々な濃度のＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈ（５；  １０；  ２０；  ５０；  １００μＭ）をテストした。株の選択は、病原性種又は頻繁に遭遇する種、すなわち、酵母株１種類（カンジダ・アルビカンス）、グラム陰性菌３種類（大腸菌、緑膿菌及びネズミチフス菌）及びグラム陽性菌３種類（大便連鎖球菌、リステリア・モノサイトゲネス、表皮ブドウ球菌）にわたる。細胞の初期濃度は、およそ細菌が１０５ｃｆｕ、酵母が１０４であった。５８０ｎｍの蛍光を５５０ｎｍの励起波長下で測定した。
【０１１０】
カンジダ・アルビカンスに関して、蛍光の最終レベルは５０μＭにまでなったが、初期蛍光のレベルがより低かったことから（図３）、ＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈの最適濃度は２０μＭであった。
【０１１１】
テストした生物の全てがＳＲ１０１−Ｑ−ＣＯ２Ｈを還元し、低濃度の蛍光発生基質でさえ高レベルの蛍光を生成した（図４ａ及び図４ｂ）。
【０１１２】
Ｄ）カルボキシルエステラーゼ活性を検出するためのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＡｃ又はＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ−ラウリン酸の使用
１．  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯＡｃの反応速度試験は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に約５μＭの濃度で予め溶解させたこの蛍光発生基質を、３７℃で１０単位のブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）とインキュベートして実施した。
【０１１３】
５４０ｎｍの励起波長下で発光した６００ｎｍの蛍光強度の進展を記録し、図５ａに示す。
【０１１４】
示されているように、カルボキシルエステラーゼの添加後、著しい蛍光増大が観察される。
【０１１５】
２．  ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ−ラウリン酸の反応速度試験は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に約５μＭの濃度で予め溶解させたこの蛍光発生基質を、３７℃で１０単位のブタ肝臓エステラーゼ（ＰＬＥ）とインキュベートして実施した。
【０１１６】
５３０ｎｍの励起波長下で発光した６００ｎｍの蛍光強度の進展を記録し、図５ｂに示す。
【０１１７】
示されているように、該酵素の添加後、著しい蛍光増大が観察される。
【０１１８】
Ｅ）スルファターゼ活性を検出するためのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＳＯ３Ｈ）の使用
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（ＳＯ３Ｈ）の反応速度試験は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に約１０μＭの濃度で予め溶解させたこの蛍光発生基質を、３７℃で７．８単位のヘリックス・ポマティア（Helix pomatia）由来のスルファターゼとインキュベートして実施した。
【０１１９】
５４０ｎｍの励起波長下で発光した６００ｎｍの蛍光強度の進展を記録し、図６に示す。
【０１２０】
示されているように、該酵素の添加後、著しい蛍光増大が観察される。
【０１２１】
Ｆ）ミエロペルオキシダーゼ活性を検出するためのＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−アミノフェニル）の使用
ＳＲ１０１−ＮａｐｈｔＯ（パラ−アミノフェニル）酸の反応速度試験は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）に約１０μＭの濃度で予め溶解させたこの蛍光発生基質を、２５℃で１５０等量の次亜塩素酸ナトリウムとインキュベートして実施した。
【０１２２】
次亜塩素酸ナトリウムを用いるこの化学手順は、ミエロペルオキシダーゼ活性を刺激するために日常的に使用される（Shepherdら, Chemistry and Biology, 2007, 14： 1221-1231）。
【０１２３】
５４０ｎｍの励起波長下で発光した６５０ｎｍの蛍光強度の進展を記録し、図７に示す。
【０１２４】
示されているように、次亜塩素酸ナトリウム（ＣｌＯ−）の添加後、著しい蛍光増大が観察される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【外国語明細書】
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