(57)【要約】【課題】皮膚細胞を賦活しヒアルロン酸産生を亢進することにより、より高い保湿効果を有する皮膚外用組成物を提供すること。【解決手段】米と米麹を原料とする生もとから分離したリューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属した乳酸菌で米を発酵させた、細胞賦活作用およびヒアルロン酸産生促進作用を有する乳酸菌米発酵物、並びに当該乳酸菌米発酵物を有効成分として含有する保湿剤及び皮膚外用組成物の提供。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）に属する乳酸菌の米発酵液で、細胞賦活作用およびヒアルロン酸産生促進作用を有することを特徴とする皮膚外用組成物。
【請求項２】
前記米発酵液がリューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の米発酵液である、項１に記載の皮膚外用組成物。
【請求項３】
前記米発酵液がリューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＬＫ−１６株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１９１７）である、項１または項２に記載の皮膚外用組成物。
【請求項４】
化粧料または医薬部外品である、項３に記載の組成物。
【請求項５】
保湿用化粧料または医薬部外品である、項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、細胞賦活作用およびヒアルロン酸産生促進作用を有する乳酸菌の米発酵物を含有する保湿剤及び皮膚外用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】  皮膚は紫外線、乾燥などの外的環境による影響や、自然老化、疾病といった内的環境の影響を受け、しわ、しみ、かさつき、ざらつき、肌荒れといった現象が生ずることが知られている。これら皮膚の老化現象を改善するために多くの研究がおこなわれ、現在までに様々な皮膚外用剤が開発され実用されてきた。【０００３】  皮膚中には真皮・表皮のいずれにもヒアルロン酸があることが知られている。ヒアルロン酸はグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンが交互に結合した高分子で、その分子量は数百万にも及び、多くの水分を保持できる事が明らかとなっている。しかしながらこのヒアルロン酸は加齢と共に減少する事が報告されており（特許文献１）、これにより老化に伴う皮膚の保水力の減少を引き起こし、乾燥肌等の原因となると考えられている。それらの症状を改善するためにヒアルロン酸合成促進剤が有効であることが記載されている（特許文献２、特許文献３）。【０００４】  最近は、発酵を通じて得た有効成分を製品に適用することもあり、ザクロ果汁の乳酸菌発酵物（特許文献４）や豆類抽出物の乳酸菌発酵物（特許文献５）を有効成分とするヒアルロン酸合成促進剤が報告されている。また、米の乳酸菌発酵物を利用した化粧料として特許文献６があり皮膚線維芽細胞に対する細胞賦活効果およびコラーゲン合成促進作用があることが報告されているが、ヒアルロン酸合成促進作用については記載されていない。【０００５】  清酒製造における生もと系酒母では、酵母の増殖に先立ち乳酸菌群の遷移が起こることが知られているが、生もと系酒母から分離された乳酸菌株には免疫調節効果や血中脂質の上昇抑制効果など様々な機能性があることも報告されている。【０００６】  植物性原料から得られる乳酸菌は菌の利用できる糖の種類が多く、過酷な環境でも生き抜くことができるなど、動物性原料から得られる乳酸菌とは異なる能力を有する。その作用効果は、菌株特異的であり、同じ種類でも菌株ごとにその効果は異なる。その中には有用な菌株が数多く存在することが期待されるため、植物性原料から分離される乳酸菌の新たな用途への利用に高い関心が集まっている。【０００７】  しかしながら、植物性原料から分離される乳酸菌、特に米と米麹を原料とする生もとより分離される乳酸菌については、あまり研究されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平１０−１８２４０２号公報
【特許文献２】特開２００２−６３６０８１号公報
【特許文献３】特開２００４−５１５７９号公報
【特許文献４】特開２０１３−２４５１７０号公報
【特許文献５】特開２００２−１８７８３８号公報
【特許文献６】特開２００７−１３１５７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明の目的は、皮膚細胞を賦活しヒアルロン酸産生を亢進することにより、より高い保湿効果を有する皮膚外用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者らは、上記課題を解決することを主な目的として検討を重ねた結果、米と米麹を原料とする生もとから分離した乳酸菌で米を発酵させた乳酸菌米発酵物が細胞賦活作用およびヒアルロン酸産生促進作用を有しており、角層水分量を増加させる効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】  即ち、本発明は、次の事項に関する。
項１．リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）に属する乳酸菌の米発酵液で、細胞賦活作用およびヒアルロン酸産生促進作用を有することを特徴とする皮膚外用組成物。
項２．前記米発酵液がリューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の米発酵液である、項１に記載の皮膚外用組成物。
項３．前記米発酵液がリューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のＬＫ−１６株（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１９１７）である、項１または項２に記載の皮膚外用組成物。
項４．化粧料または医薬部外品である、項３に記載の組成物。
項５．保湿用化粧料または医薬部外品である、項３に記載の組成物。
【発明の効果】
【００１２】  本発明の乳酸菌米発酵物は、ヒト皮膚線維芽細胞およびヒト表皮角化細胞に対して細胞賦活作用およびヒアルロン酸産生促進作用を有しており、保湿剤として化粧料、医薬部外品などに用いることができる。
本発明の外用組成物を皮膚に用いることにより、皮膚細胞を活性化してヒアルロン酸産生を促進させることで、皮膚の老化を防ぎ、肌をいつまでも美しく保つ効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、試験例１におけるヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞賦活作用を示すグラフである。
【図２】図２は、試験例２におけるヒト表皮角化細胞に対する細胞賦活作用を示すグラフである。
【図３】図３は、試験例３におけるヒト皮膚線維芽細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用を示すグラフである。
【図４】図４は、試験例４におけるヒト表皮角化細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用を示すグラフである。
【図５】図５は、試験例５におけるヒト皮膚の角層水分含量に及ぼす効果を表すグラフである。
【図６】図６は、試験例６におけるヒト皮膚の肌キメに及ぼす効果を表すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】  以下、本発明について、詳細に説明する。
【００１５】  本発明の乳酸菌は、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）に属する乳酸菌である。より好ましくは、リューコノストック・メセンテロイデスＬＫ−１６（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ＬＫ−１６）株である。
【００１６】  本発明の乳酸菌の好適な単離源は、生もと酒母、特に米と米麹を原料とする生もと、米麹などである。この菌株は、本発明者らが、生もとから新たに単離・同定し、平成２６年８月７日に、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８に住所を有する独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センターに寄託された（受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０１９１７）。
【００１７】  この菌株の菌学的性質は、以下のとおりである。
【００１８】  （１）培地上での生育状況
本菌株は、ＭＲＳ培地を用いて、３０℃で、１−２日、通性嫌気条件で静置培養する際に、良好又は普通の生育を示す。
【００１９】  （２）科学的性質
本菌株は、グラム陽性の球菌であり、カタラーゼ陰性、糖類より乳酸およびエタノール、二酸化炭素を産生（ヘテロ乳酸発酵）する。
【００２０】  （３）形態的特徴
コロニーは、前記ＭＲＳ培地を用いて、３０℃で、１〜２日培養する場合、直径１〜２ｍｍ、色調が白色の形態となる。形は円形で、隆起状態は半レンズ状である。周縁は全縁で、表面の形状はスムーズである。また、不透明で、粘稠性である。変異や培養条件、生理的状態によるコロニー形態の変化はない。
【００２１】  本発明の乳酸菌は生もとより分離される乳酸菌であり、長年にわたる醸造に関わる微生物であるため安全性にも優れる。
【００２２】  本発明の乳酸菌の培養は、一般的な乳酸菌の培養方法で可能である。本乳酸菌の培養方法については、本乳酸菌が良好に生育する条件であれば特に制限はないが、例えば、ＭＲＳ培地等を用いて、静置培養又はｐＨを一定に制御した中和培養で行う方法などが例示される。
【００２３】  本発明の乳酸菌米発酵物は、前記乳酸菌を使用することを特徴とする。
【００２４】  本発明における乳酸菌米発酵物では、例えばコシヒカリ、ササニシキ、アキタコマチ、ヒトメボレなどの粳米や糯米の米粉を用いることができる。
【００２５】  この米粉に水を加え、次いで、液化型アミラーゼを加えてよく混合し、加熱処理することにより、予め澱粉をある程度まで分解して液化する。水の添加量は、原料全体に対して０．５〜１００  重量倍が好ましい。続いて、プロテアーゼ及び糖化型アミラーゼを加えて更に酵素処理する。なお、この工程においても、液化型アミラーゼと糖化型アミラーゼとを併用して分解してもよい。また、液化アミラーゼの処理は省略してもよい。なお、これらの酵素は、いずれも市販されているので、その中から適宜選択して用いることができる。酵素処理は、それぞれの酵素に応じた添加量、温度、ｐＨ、時間を選択して行えばよく、処理条件が同じであれば同時に添加して処理することもでき、また、一種又は二種以上を添加して、二回以上に分けて処理することもできる。
【００２６】  こうして得られた酵素処理液を、次の乳酸発酵の工程における本培養液として用いるが、酵素処理を終了した段階において、必要に応じて、糖類を添加することもできる。糖類としては、例えば、６炭糖類、５炭糖類、２糖類等を用いることができる。
【００２７】  続いて次の工程で、この処理液に乳酸菌を接種して発酵させる。なお、処理液は、本培養液として乳酸発酵に用いる前に、公知の手段により滅菌処理をしておくのが好ましい。通常は、オートクレーブ等に入れ、１２０〜１３０℃で、５〜３０分間程度処理することにより充分な滅菌がなされる。
【００２８】  乳酸菌は、予め前培養した後に、上記本培養液に添加することが好ましい。前培養は、例えば代表的には、ＭＲＳ培地等を用いて、３０℃で１〜２日間程度培養することにより得ることができる。そして、この前培養液を、本培養液に１〜２０重量％添加することが好ましい。
【００２９】  本培養液に、乳酸菌を添加した後、常法にしたがって発酵を行う。培養は、好気的条件下および嫌気的条件下のいずれでもよい。培養温度は通常２０〜４０℃、好ましくは３０℃程度がよい。培養時間は通常５〜３０時間であり、好ましくは１６〜２４時間がよい。また、ｐＨを６〜８、特に６．０で一定になるように調整したジャーファーメンター（微生物培養装置もしくは細胞培養装置）での培養では、さらに活性の高い培養液を調製することができ、この時の培養温度は２８〜３０℃で、培養時間は２０〜２４時間程度が好ましい。
【００３０】  発酵後、必要であれば通常の一般的加熱滅菌操作を行い遠心分離あるいは濾過などの固液分離手段によって液相を分取する。
【００３１】  こうして得られた発酵生成物は、エタノール等の低級アルコールや、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール、またはこれらの任意の混液を添加し、遠心分離、ろ過等により高分子物質を除去してから用いることがより好ましい。必要に応じて、脱臭処理、脱色処理、ｐＨ調製等を行ってもかまわない。
【００３２】  本発明の皮膚外用組成物は、本発明の乳酸菌米発酵物を皮膚外用組成物として調製することにより、化粧料、医薬部外品または医薬などの形態で提供される。
【００３３】  本発明の、乳酸菌米発酵物の皮膚外用組成物への配合量としては、特に限定されず、通常皮膚外用剤に使用される量で良いが、例えば組成物に対し、乳酸菌米発酵物として０．０００１〜５０％、好ましくは０．０１〜２０％、特に好ましくは０．５〜１０％配合すればよい。
【００３４】  本発明の皮膚外用組成物を化粧料または医薬部外品等の形態で提供する場合には、前記有効成分に加えて、薬学的又は香粧学的に許容される担体または基剤と共に提供することができる。さらに、必要に応じて通常使用し得る添加物を加えて常法により所望の形態に調製すればよい。
【００３５】  更に、本発明の効果を損なわない範囲内で、各種の界面活性剤、色素（染料、顔料）、香料、防腐剤、殺菌剤（抗菌剤）、増粘剤、酸化防止剤、清涼化剤、防臭剤、ｐＨ調整剤等の各種添加剤を配合してもよい。また、必要に応じて、保湿剤、紫外線吸収剤、紫外線錯乱剤、ビタミン類、植物エキス、皮膚収斂剤、細胞賦活剤、血行促進剤、皮膚機能亢進剤等の外用剤に配合される公知の薬効成分を配合することもできる。このような添加剤の例は、医薬部外品原料規格、日本汎用化粧品原料集、化粧品種別許可基準、化粧品原料基準外成分規格、ＣＴＦＡ等に記載されている。
【００３６】  前記皮膚外用組成物は、皮膚や粘膜に適用可能である限り、その形態については、特に制限されるものではない。一例として、液状、乳液状、粉末状、固形状、懸濁液状、クリーム状、軟膏状、ムース状、顆粒状、錠剤状、ゲル状、ゼリー状、ペースト状、ジェル状、エアゾール状、スプレー状、リニメント剤、パック剤等の形態を挙げることができる。
【００３７】  また、前記皮膚外用組成物は、例えば、基礎化粧料（例えば、乳液、クリーム、ローション、美容液、オイル及びパック等）、清拭剤、清浄剤（例えば、洗顔料、クレンジング、ボディ洗浄料等）等として調製することができる。
【００３８】  本発明の乳酸菌米発酵物を皮膚外用組成物として調製する場合、該組成物中の前記有効成分の配合割合については、前述する割合の範囲内で適宜設定すればよい。
【００３９】  化粧料または医薬部外品などの皮膚外用組成物として調製された前記乳酸菌米発酵物は、その使用を通して、皮膚や粘膜に適用されることによって、細胞賦活作用ならびにヒアルロン酸産生促進作用を発揮することができる。当該皮膚外用組成物を適用する量並びに回数については、有効成分の種類や濃度、使用者の年齢や性別、適用形態、期待される程度等に応じて、有効量を、一日に１〜３回程度、皮膚や粘膜に適用すればよい。
【００４０】  本発明の皮膚外用組成物は、好適には保湿用皮膚外用組成物として用いられ、特に、保湿化粧料または医薬部外品などとして好ましく用いられる。
【実施例】
【００４１】  以下、製造例、試験例および実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。【００４２】製造例１
乳酸菌米発酵物の調製
米粉に２０倍量の水を加え、さらにα−アミラーゼとグルコアミラーゼをそれぞれ米粉の０．１重量％、プロテアーゼを米粉の０．５重量％加えて５５℃で２０時間撹拌した。終了後、１２１℃で３０分間処理して冷却したのち、ＭＲＳ培地で前培養した上記乳酸菌のリューコノストック・メセンテロイデスＬＫ−１６の菌液を接種し、ジャーファーメンターを用いて３０℃、２４時間発酵させた。発酵終了後、１２１℃で３０分間処理したものをろ過して得られた清澄液を乳酸菌米発酵物とした。【００４３】試験例１
細胞培養による細胞賦活作用の測定（１）：
（細胞培養）試験細胞として、正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いた。この細胞を９６ウェルプレートに播種（６×１０３  ｃｅｌｌｓ／０．１ｍｌ／ｗｅｌｌ）し、１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ培地中、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養した。細胞が接着したのち、上記製造例１で製造した乳酸菌米発酵物を添加した１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地に交換して３日間同様に培養した。対照として、乳酸菌米発酵物の変わりにＰＢＳを添加したものを同様にして培養した。【００４４】（細胞賦活作用の測定方法）３日間の培養後、新しい１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）に交換し、５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ溶液を１０μｌ添加して３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で３時間培養した。その後、１０％ＳＤＳを０．１ｍｌ添加して３７℃で一晩インキュベートし、プレートリーダーによって５５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度から細胞の代謝活性を算出し、対照に対する代謝活性の増加率から細胞賦活作用を評価した。【００４５】  結果は図１に示した。図１より、乳酸菌米発酵物には、正常ヒト皮膚線維芽細胞に対する細胞賦活作用があることが分かった。【００４６】試験例２
細胞培養による細胞賦活作用の測定（２）
（細胞培養）試験細胞として、正常ヒト表皮角化細胞を用いた。この細胞を４８ウェルプレートに播種（２．３×１０３  ｃｅｌｌｓ／０．２ｍｌ／ｗｅｌｌ）し、ＤｅｒｍａＬ
2016074647.tif 000002
一晩培養した。細胞が接着したのち、上記製造例１で製造した乳酸菌米発酵物を添加した新しい培地に交換して３日間同様に培養した。対照として、乳酸菌米発酵物の変わりにＰＢＳを添加したものを同様にして培養した。【００４７】（細胞賦活作用の測定方法）３日間の培養後、培地を吸引除去して０．２２ｍｌの０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ／ＰＢＳを添加して３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で３時間培養した。その後、１０％ＳＤＳを０．２２ｍｌ添加して３７℃で一晩インキュベートし、５５０ｎｍの吸光度を測定した。得られた吸光度から細胞の代謝活性を算出し、対照に対する代謝活性の増加率から細胞賦活作用を評価した。【００４８】  結果は図２に示した。図２より、乳酸菌米発酵物には、正常ヒト表皮角化細胞に対する細胞賦活作用があることが分かった。【００４９】試験例３
細胞培養によるヒアルロン酸産生促進作用の測定（１）
（細胞培養）試験細胞として、正常ヒト皮膚線維芽細胞を用いた。この細胞を２４ウェルプレートに播種（５×１０４  ｃｅｌｌｓ／０．５ｍｌ／ｗｅｌｌ）し、１０％ＦＢＳ含ＲＰＭＩ培地中、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で３日間培養した。培養後、上記製造例１で製造した乳酸菌米発酵物を添加した１％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地に交換して３日間同様に本培養した。対照として、乳酸菌米発酵物の変わりにＰＢＳを添加したものを同様にして培養した。【００５０】（ヒアルロン酸の測定方法）
上記のように３日間の本培養を行った培養上清を採取し、ＱｎＥ  Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ  （ＨＡ）  ＥＬＩＺＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（フナコシ）を使用してヒアル
2016074647.tif 000003
ｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて定量し、タンパク質量あたりのヒアルロン酸量を算出した。対照のヒアルロン酸量を１００とした場合のヒアルロン酸相対値（％）を求めた結果を図３に示す。【００５１】  図３より、乳酸菌米発酵物には、正常ヒト皮膚線維芽細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用があることが分かった。【００５２】試験例４
細胞培養によるヒアルロン酸産生促進作用の測定（２）
（細胞培養）試験細胞として、正常ヒト表皮角化細胞を用いた。この細胞を２４ウェルプレートに播種（５×１０４  ｃｅｌｌｓ／０．５ｍｌ／ｗｅｌｌ）し、ＤｅｒｍａＬｉｆ
2016074647.tif 000004
ｏｍｐ  ｋｉｔ培地に交換して２日間同様に本培養した。対照として、乳酸菌米発酵物の変わりにＰＢＳを添加したものを同様にして培養した。【００５３】（ヒアルロン酸の測定方法）
試験例３と同様にして行った。対照のヒアルロン酸量を１００とした場合のヒアルロン酸相対値（％）を求めた結果を図４に示す。【００５４】  図４より、乳酸菌米発酵物には、正常ヒト表皮角化細胞に対するヒアルロン酸産生促進作用があることが分かった。【００５５】試験例５
角層水分含量測定
試験には、製造例１で製造した乳酸菌米発酵物の５％水溶液（０．８％フェノキシエタノール含有）（以下、５％乳酸菌米発酵物）と、対照として水（０．８％フェノキシエタノール含有）を用いた。健常人女性８名の左右どちらかの前腕内側部に５％乳酸菌米発酵物を、もう片方に対照を、１日２回塗布してもらった。塗布前、塗布２週間、塗布４週間、
2016074647.tif 000005
ｋａ）を用いて定法に従って塗布部位の角層水分含量（キャパシタンス）を測定した。【００５６】  塗布前からの角層水分量の増加率を図５に示す。図５より、５％乳酸菌米発酵物は、ヒト皮膚の角層水分含量を増加させる効果がことから、保湿効果があることが示唆された。【００５７】試験例６
キメ面積測定
試験例５と同様にして健常人女性８名に５％乳酸菌米発酵物と対照を塗布してもらった。塗布前、塗布２週間、塗布４週間、塗布終了後１週間のタイミングで塗布部位のレプリカを採取後、レプリカ画像を画像解析ソフトｉｍａｇｅＪで処理し、肌キメが整った領域の面積を測定した。【００５８】  塗布前からの面積の増加率を図６に示す。図６より、５％乳酸菌米発酵物には、肌キメを整える効果があることが分かった。
【受託番号】
【００５９】ＮＩＴＥ  Ｐ−０１９１７
【図１】
2016074647.tif 000006
【図２】
2016074647.tif 000007
【図３】
2016074647.tif 000008
【図４】
2016074647.tif 000009
【図５】
2016074647.tif 000010
【図６】
2016074647.tif 000011