(57)【要約】【課題】非対象格子照明方式の照明を行った場合において、対物レンズの開口数やその他の条件に合わせて、最適な角度の２光束で照明を迅速に行うことが可能な照明光学系を提供すること。【解決手段】物体面を照明する照明光学系であって、光源からの光束を第１の光束と第２の光束に分離する分離手段と、第１および第２の光束を平行光束として物体面の共役面に入射させる光学手段と、第1の光束の共役面に対する第１の入射角度を調節可能な第１の調節手段と、第２の光束の共役面に対する第２の入射角度を調節可能な第２の調節手段と、を有し、光学手段は、第１および第２の調節手段を前記共役面に結像する。【選択図】図２
2016206602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物体面を照明する照明光学系であって、
光源からの光束を第１の光束と第２の光束に分離する分離手段と、
前記第１および第２の光束を平行光束として前記物体面の共役面に入射させる光学手段と、
前記第1の光束の前記共役面に対する第１の入射角度を調節可能な第１の調節手段と、
前記第２の光束の前記共役面に対する第２の入射角度を調節可能な第２の調節手段と、を有し、
光学手段は、前記第１および第２の調節手段を前記共役面に結像することを特徴とする照明光学系。
【請求項２】
前記第１および第２の調節手段は、前記第１および第２の調節手段がそれぞれ前記第１および第２の入射角度を調節する際に前記第１および第２の調節手段の中心が不動となるように配置されることを特徴とする請求項１に記載の照明光学系。
【請求項３】
集光作用を持ち、焦点位置が前記光学手段の焦点位置と一致するように配置されている集光手段を更に有することを特徴とする請求項１または２に記載の照明光学系。
【請求項４】
前記第１および第２の光束が前記物体面に配置された試料において生じた干渉パターンと、所定のパターンとを比較する比較手段を更に有することを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の照明光学系。
【請求項５】
前記比較手段の比較結果に基づいて、前記第１および第２の調節手段を用いて前記干渉パターンを補正する補正手段を更に有することを特徴とする請求項４に記載の照明光学系。
【請求項６】
前記干渉パターンは、フォーカス範囲内で撮像された複数の画像から抽出されることを特徴とする請求項４または５に記載の照明光学系。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか１項に記載の照明光学系と、
前記照明光学系により照明された物体面に配置された試料を観察するための結像光学系と、を有することを特徴とする顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光顕微鏡用の照明光学系に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡による生体試料の観察は、医学への応用を含む生物学的研究にとって不可欠である。従来の蛍光顕微鏡では、数μｍ程度の薄さにスライスした試料を観察する。試料が厚みを持つと、試料の中に対物レンズの焦平面から外れる部分が出てくる。対物レンズの焦平面から外れた部分から発せられる蛍光は、いわゆるボケ光である。対物レンズは、本来観察したい合焦平面に位置する試料が発する蛍光とボケ光を区別することなく取り込む。結果として、合焦平面の画像にボケ光が重畳し、コントラストが著しく低下した画像しか得られない。そのため、従来の蛍光顕微鏡では、試料を薄切りにせざるを得ず、二次元的な情報しか観察できなかった。
【０００３】
近年、厚みのある試料の中の興味ある細胞の立体配置を把握したいなど、３次元的な情報を取得したいとのニーズが高まっている。３次元蛍光顕微鏡へのニーズは、所望の合焦平面においてボケ光が除去された試料の断層像を生成すること、つまり、所望の合焦平面の画像だけを選択的に分離し取り出すことで満たされる。代表的な３次元蛍光顕微鏡として、共焦点顕微鏡が広く用いられている。共焦点顕微鏡では、合焦平面からの光の集光点にピンホールを置くことにより、非合焦平面からの収束度合いの緩い光が遮蔽され、所望の合焦点平面からの信号光のみがピンホールを通過する。共焦点顕微鏡は、高精細な画質の画像を生成可能であるが、一時に撮像可能な領域が点状であるため、試料の全領域を観察するためには３次元的な走査が必要である。また、光学系をきわめて高精度に調節する必要があるために非常に高額なコストがかかることや、焦点位置にレーザを集光する機構上、試料に不可逆的損傷を与えてしまう。
【０００４】
特許文献１では、「非対称格子照明方式」（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｌａｔｔｉｃｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ：ＡＬＩ方式）の照明光学系が提案されている。ＡＬＩ方式の照明光学系では、ある１つの合焦平面における断層像を取得するために、２通りの照明モードで試料を照明する。第１の照明モードでは、従来の蛍光顕微鏡の照明と同様に、一様な強度分布を持つ励起光で蛍光試料を照明する。第２の照明モードでは、干渉縞などの周期的な強度分布を持つ励起光で試料を照明する。それぞれの照明モード下で１枚ずつ計２枚のデジタル画像データが撮像され、２枚の画像を演算処理することにより、所望の合焦平面付近に位置する試料が発した蛍光情報のみを抽出することができる。各照明モードでは、励起光ビームは点状に絞られずに全視野を照明するため、ピンホールの高精度なアライメントに必要なコストや集光点における蛍光退色といった問題が解決される。顕微鏡のステージを昇降させ、対物レンズの合焦位置を変えて上述の操作を繰り返すことで、３次元的な立体像を得ることができる。
【０００５】
周期的な強度分布を持つ励起光は、例えば互いにコヒーレントな２つの平行光が物体面に対して一定の角度をなして入射することで生成される。ＡＬＩ方式では励起光の強度分布が光軸方向に沿って一様ではなく光軸方向に対しても有限の周期を持つため、光軸方向の分解能を向上させることができる。２光束干渉における強度分布が光軸方向に有限の周期を持つためには、２つの平行光の波数ベクトルの光軸方向成分の値が異なるようにすればよい。これは２つの平行光の蛍光試料に入射する角度が異なることを意味する。光軸方向の分解能を向上させるために好適な２つの平行光の波数ベクトルの選び方は、対物レンズやデジタルカメラなどの撮像光学系の仕様に加えて、試料の特徴によっても異なってくる。したがって、実験状況に応じて２つの平行光の波数ベクトルがそれぞれ適宜好適であるよう自由かつ速やかに調節可能な照明光学系が望まれている。それに加え、照明光学系は、一様な強度分布をもつ励起光で蛍光試料を照明する第１の照明モードとの切り替えをスムーズに行う必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１４−４４２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
図５は、従来のマッハ＝ツェンダー干渉系を用いた照明光学系システムの模式図であり、実験状況に応じて２つの平行光の波数ベクトルがそれぞれ適宜好適であるよう調節可能な照明光学系の一例である。励起光源５４は、コヒーレント光源として直線偏光したレーザであり、コリメートされたレーザビームをマッハ＝ツェンダー型干渉系に入射させる。マッハ＝ツェンダー型干渉系では、レーザビームは等強度の２つの平行光に分割され、各平行光はミラー５２およびハーフミラー５３を通った後、ハーフミラー５３によって合波される。２つの平行光が重なり合う領域が、対物レンズに対する物体面にとって光学的に共役な位置であればよい。生物学的研究に用いる多くの蛍光顕微鏡は、接眼観察をするための双眼鏡のほかに、試料の画像をデジタル撮像するための複数のカメラポート５１を備えている。カメラポート５１は、物体面と共役の位置に設けられるので、そのうちの一つを励起光の入射口として用いることができる。物体面と共役になるのは、視野絞りの位置であるので、ここで２つの平行光を重ね合わせればよい。また、２つの光路のうち片方の光路に遮光板を挿入することにより、一様な強度分布を持つ励起光で蛍光試料を照明するモードを容易に実現できる。マッハ＝ツェンダー干渉系において、ミラー５２およびハーフミラー５３を調節することで、２つの平行光の波数ベクトルがそれぞれ適宜好適であるよう調節可能である。その際、２つの平行光が重なり合う領域は蛍光顕微鏡の光軸に対して横ずれする。すなわち、２つの平行光が重なり合う領域が顕微鏡のカメラポート５１から外れてしまう。２つの平行光の波数ベクトルと、２つの平行光が重なり合う領域の両方が同時に好適であるように調節しなくてはならないが、この作業は容易ではない。
【０００８】
このような課題を鑑みて、本発明は、非対象格子照明方式の照明を行った場合において、対物レンズの開口数やその他の条件に合わせて、最適な角度の２光束で照明を迅速に行うことが可能な照明光学系を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一側面としての照明光学系は、物体面を照明する照明光学系であって、光源からの光束を第１の光束と第２の光束に分離する分離手段と、前記第１および第２の光束を平行光束として前記物体面の共役面に入射させる光学手段と、前記第1の光束の前記共役面に対する第１の入射角度を調節可能な第１の調節手段と、前記第２の光束の前記共役面に対する第２の入射角度を調節可能な第２の調節手段と、を有し、光学手段は、前記第１および第２の調節手段を前記共役面に結像することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、非対象格子照明方式の照明を行った場合において、対物レンズの開口数やその他の条件に合わせて、最適な角度の２光束で照明を迅速に行うことが可能な照明光学系を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】対物レンズの瞳共役面における光源配置を表す図である。
【図２】照明光学系の模式図である。
【図３】図２の照明光学系とは異なる照明光学系の模式図である。
【図４】セクショニング画像の生成プロセスを説明するためのフローチャートである。
【図５】従来のマッハ＝ツェンダー干渉系を用いた照明光学系システムの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施例について、図面を参照しながら詳細に説明する。各図において、同一の部材については同一の参照番号を付し、重複する説明は省略する。本発明は、蛍光顕微鏡またはデジタルスライドスキャナー等に好適に使用することが可能であり、生物学・病理学的観察の分野において非常に有用である。
【００１３】
まず、説明を容易にするため、励起波長λｅｘと蛍光波長λｆが同一（λｅｘ＝λｆ）として説明をする。励起波長λｅｘと蛍光波長λｆが異なる影響に対する補正に関しては後述する。実際の蛍光試料では、どのような蛍光色素を用いても励起波長λｅｘ＜蛍光波長λｆであり、２波長の差は蛍光色素と励起波長により決まっている。
【００１４】
物体面に照射される互いにコヒーレントな２つの平行光が作る干渉パターンは、できるだけ明瞭であることが望ましい。そのためには２つの平行光の直線偏光の向きを揃える必要があり、２つの平行光がｓ波もしくはＴｒａｎｓｖｅｒｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ＴＥ）波であるようにしなくてはならない。そうすると必然的に、２つの平行光を表す２つの波数ベクトルは、対物レンズの瞳共役面上において、直径上の２点として表わされる（図１）。図１では、水平軸と垂直軸の取り方は任意であり、円で表わされる瞳の半径を１とする。以後、励起光の波数ベクトルの大きさを励起光の波長λｅｘを用いてｋ＝２π／λｅｘとし、対物レンズの開口数をＮＡとすると、瞳の半径は波数ｋＮＡに対応する。図１で第１および第２の励起光を表す波数ベクトルをそれぞれ（ｋｓｉｎθ１，０，ｋｃｏｓθ１），（ｋｓｉｎθ２，０，ｋｃｏｓθ２）とすると、点１および点２の座標はそれぞれ（ｓｉｎθ１／ＮＡ，０），（ｓｉｎθ２／ＮＡ，０）である。このような２つの等強度の光源点が対物レンズの瞳共役面上に配置されたとき、蛍光染色された試料は式（１）で表される強度分布Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）で照明される。式（１）では、水平方向の座標をｘ、光軸方向の座標をｚとし、強度分布Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）は垂直方向の座標ｙには依存しない。
【００１５】
Ｉ（ｘ，ｙ，ｚ）∝ｃｏｓ｛ｋ（ｓｉｎθ１−ｓｉｎθ２）ｘ＋ｋ（ｃｏｓθ１−ｃｏｓθ２）ｚ）｝    （１）
ＡＬＩ方式の照明において、点１，２のｘ座標の差分ｓｉｎθ１／ＮＡ−ｓｉｎθ２／ＮＡ（以下、ρと表す）の絶対値が１であるとき、深さ方向の解像度が高い。また、ＡＬＩ方式では、励起光の強度分布が光軸方向に沿って一様ではなく光軸方向に対しても有限の周期を持つが、そのためには入射角θ１，θ２の絶対値が異なる必要がある。図１において点１，２は垂直軸に関して非対称に配置され、垂直軸の方向が２つの平行光の共通した電場振動方向となる。ＡＬＩ方式の照明を実施する際の好適な入射角θの組は、主たる要因である光学系の仕様のほか、試料や実験条件によっても異なってくる。いずれにしても、顕微鏡の対物レンズの瞳と共役な面に図１で示されるような非対称な光源配置を作る必要がある。点１のｘ座標ｓｉｎθ１／ＮＡ（以下、ρ１と表す）と点２のｘ座標ｓｉｎθ２／ＮＡ（以下、ρ２と表す）の好ましい配分は、対物レンズの開口数ＮＡによって異なる。この配分は、理論的考察により以下のように求められる。
【００１６】
厚さ０で一様の蛍光を発する仮想的な蛍光薄膜に対して、差分ρの絶対値｜ρ｜が１のとき、ＡＬＩ方式の照明によって得られる強度Ｉｒ０を計算する。強度Ｉｒ０は、開口数ＮＡと深さｚによる関数であるので、強度Ｉｒ０（ＮＡ，ｚ）と表す。深さｚは、蛍光薄膜の位置（ｚ＝０）に対する対物レンズの焦点位置と考えてよい。各開口数ＮＡに対して、強度Ｉｒ０（ＮＡ，ｚ）を計算し、強度Ｉｒ０（ＮＡ，０）の値に対して、所定の割合（例えば、１／ｅ２）となる深さｚをＡＬＩ方式の照明における焦点深度Ｚｒ０とする。深さＺｒ０は、開口数ＮＡによる関数であるので、深さＺｒ０（ＮＡ）と表す。蛍光薄膜の位置（ｚ＝０）から焦点位置がずれると、ＡＬＩ方式により計算される蛍光薄膜からの強度Ｉｒ０（ＮＡ，ｚ）はそのずれに従って減少する。焦点位置（深さ）が蛍光薄膜の位置（ｚ＝０）から深さＺｒ０（ＮＡ）だけずれると、焦点が蛍光薄膜に合っている場合（ｚ＝０）に比べて強度Ｉｒ０が十分に小さくなる。例えば、上述したように、Ｉｒ０（ＮＡ，Ｚｒ０（ＮＡ））／Ｉｒ０（ＮＡ，０）＝１／ｅ２となる。
【００１７】
縞パターンの水平ピッチは、式（１）により決まるが、差分ρの絶対値と開口数ＮＡだけで一意的に決まる。一方、ｚ方向へ移動するにつれての縞パターンのずれは、非対称性によって決まる。深さＺｒ０（ＮＡ）の縞パターンは、蛍光薄膜の位置（ｚ＝０）の縞パターンに対して水平方向へ半ピッチずれていることが好ましい。以上の条件から開口数ＮＡに対する対物レンズの瞳共役面内の好ましい光源点位置（点１および点２のｘ座標ρ１，ρ２）が定まる。例えば、開口数ＮＡが０．７の場合、（ρ１，ρ２）＝（−０．８，０．２）と決定される。
【００１８】
次に、図２を参照して装置の構成を説明する。本実施形態では、カメラポートを複数有する顕微鏡を使用する。第１のカメラポートにＣＣＤなどの撮像素子を配置し、第２のカメラポートから蛍光試料上に構造照明を行うための照明光束を入射させることで、ＡＬＩ方式の照明を用いたセクショニング画像の取得を実現する。顕微鏡のカメラポートには一般に、撮像素子の撮像面を配置する所定位置がある。この所定位置の仮想面を単にカメラポート面と呼ぶ。一般にカメラポート面は、顕微鏡内部のチューブレンズと対物レンズにより構成される結像光学系により試料上の合焦面と光学的に共役になっている。つまり、試料の像は結像光学系によりカメラポート面に形成され、逆にカメラポート面上の像は試料上に形成される。
【００１９】
本実施例では、第２のカメラポートのカメラポート面から入射させた２つの光束は、結像光学系を通って試料面に導かれる。２つの光束は、第２のカメラポートのカメラポート面に平行光として入射する。カメラポート面と試料上の対物レンズの合焦面の光学的共役性により、カメラポート面において２つの光束が重なっていれば、２つの光束は顕微鏡の結像光学系を通って試料上の合焦面に照射される際にも平行光であるとともに重なっている。このとき、各光束のカメラポート面での入射角度と試料上での入射角度は、結像光学系の結像倍率により一定の割合で変化する。試料上の合焦面からカメラポート面への結像倍率をｍ倍とすると、試料上の合焦面での入射角度の倍率は光束のカメラポート面での入射角度に対してｍ倍となる。
【００２０】
図２において、光束１１は、レーザなどのコヒーレントな平行光束であり、分離用ハーフミラー（分離手段）１２により第１の光束１３および第２の光束１４に分離される。第１の光束１３は、第１の可動ミラー（第１の調節手段）１５により反射され、集光作用を持つ第１の集光レンズ（集光手段）１６により集光された後、合成用ハーフミラー１７に入射する。第２の光束１４は、第２の可動ミラー（第２の調節手段）１８により反射され、集光作用を持つ第２の集光レンズ（集光手段）１９により集光された後、合成用ハーフミラー１７に入射する。第１および第２の光束１３，１４はそれぞれ、一部の成分が合成用ハーフミラー１７により合成され、コリメータレンズ（光学手段）２０により平行光となり、第２のカメラポート面２１から顕微鏡内部に導かれる。第１および第２の光束１３，１４がコリメータレンズ２０により平行光となるように、第１および第２の集光レンズ１６，１９のそれぞれの焦点位置２２，２３は合成用ハーフミラー１７を介して光学的にコリメータレンズ２０の前側焦点位置と一致する。波長板２４は、第２の光束１４の光路上に挿抜可能に配置されている。前述したように、ＡＬＩ方式の照明では、一様に分布する照明で蛍光試料を励起した画像と、周期的な強度分布を持つ照明で蛍光試料を励起した画像の２枚の画像が１つの焦点位置で必要である。波長板２４が第２の光束１４の光路上から退避した状態では、第１および第２の光束１３，１４は、蛍光試料面を照明する際、干渉して周期的な強度分布を持つ照明を形成する。波長板２４が光路上に挿入された状態では、第２の光束１４は偏光が９０°回転し、第１の光束１３との干渉性を失い、蛍光試料上の照明は一様な照明となる。ＮＤフィルタ２５は、第１および第２の光束１３，１４の光量バランスを取るために、波長板２４が第２の光束１４の光路上に挿入された際に第１の光束１３の光路上に挿入される。
【００２１】
第１の集光レンズ１６、合成用ハーフミラー１７、およびコリメータレンズ２０によって構成される光学系は、第１の可動ミラー１５の回転中心をカメラポート面２１に倍率ｍ１で結像する。同様に、第２の集光レンズ１９、合成用ハーフミラー１７、およびコリメータレンズ２０によって構成される光学系は、第２の可動ミラー１８の回転中心をカメラポート面２１に倍率ｍ２で結像する。つまり、第１の可動ミラー１５の回転中心とカメラポート面２１、および第２の可動ミラー１８の回転中心とカメラポート面２１は、それぞれ光学的共役の関係になる。また、第１および第２の可動ミラー１５，１８の中心は、各可動ミラーが回転したとしても不動である。
【００２２】
第１および第２の可動ミラー１５，１８は、入射する各光束に垂直な面に対して所定の角度だけ傾斜するように配置されている。分離用ハーフミラー１２および合成用ハーフミラー１７は、第１および第２の光束１３，１４がカメラポート面２１に対し垂直かつカメラポート面２１の中心に到達するように配置されている。また、分離用ハーフミラー１２は、第１および第２の光束１３，１４がそれぞれ第１および第２の可動ミラー１５，１８の回転中心に導かれるように配置されている。
【００２３】
次に、所望の縞パターンを発生するための設定について説明する。前述したような所定のピッチと傾きを持った縞パターンを試料上に発生させるためには、対物レンズから照射される２つの平行光がそれぞれ試料に対して所定の角度を持つことが必要である。前述したように、開口数ＮＡに対する対物レンズの瞳共役面内の好ましい光源点位置（点１および点２のｘ座標ρ１，ρ２）が定められ、光源点位置が定まると試料に対する２つの光束の入射角度θ１，θ２が求められる。
【００２４】
第１および第２の光束１３，１４が試料に対して入射角度θ１，θ２で入射する場合、計測機構付のアクチュエータ（不図示）が第１および第２の可動ミラー１５，１８をそれぞれθ１／（２・ｍ１・ｍ）およびθ２／（２・ｍ２・ｍ）だけ初期位置から傾ける。アクチュエータとしては、従来のステッピングモータを用いる。また、アクチュエータは、十分な精度が得られるような制御（例えば、ステッピングモータに掛けるパルス数による回転角の制御やマグネスケールなどの計測部材からの測定信号を用いた回転角の制御）で駆動される。第１の可動ミラー１５の回転中心とカメラポート面２１、および第２の可動ミラー１８の回転中心とカメラポート面２１の光学的共役関係により、各可動ミラーが傾いても第１および第２の光束１３，１４はカメラポート面２１の中心から外れることはない。
【００２５】
以上説明したように、本実施形態の照明光学系では、ＡＬＩ方式の照明を用いたセクショニング画像の取得に必要な構造照明のピッチおよび傾きを容易に設定可能である。なお、図２で示した構成は、本実施形態の代表的な構成であるが、本発明はこの構成に限られてはいない。本実施形態の構造照明を行う照明光学系は、以下の条件を満たすことで図２の構成以外でも同様にＡＬＩ方式によるセクショニング画像の取得に必要な構造照明のピッチおよび傾きを容易に設定可能である。なお、平行光束とは、完全に平行な光束だけでなく、多少傾いている光束（略平行光束）を含むものである。
・可干渉な光束を第１および第２の光束に分離する部材を備える
・第１の光束の試料面に対する入射角度を調節する第１の調節部材および第２の光束の試料面に対する入射角度を調節する第２の調節部材を備える
・第１および第２の調節部材の中心を試料共役面に結像する光学系を備える
・試料共役面で第１および第２の光束を平行光束に変換する光学系を備える
上記条件を満たし、図２とは異なる構成の一例について、図３を用いて説明する。図３の構成は、レンズの構成で図２の構成と異なる。集光作用を持つ集光レンズ１６は、第１および第２の光束１３，１４に共通であり、分離用ハーフミラー１２の手前に配置されている。図２の光学系と同様、第１および第２の光束１３，１４の各々の光路上の集光レンズ１６の焦点位置２２，２３は、コリメータレンズ２０の前側焦点と一致している。また、コリメータレンズ２０は、第１および第２の可動ミラー１５，１８の回転中心をカメラポート面２１に結像している。
【００２６】
次に、励起波長λｅｘ＜蛍光波長λｆである場合にどのような補正を加えるかについて説明する。実際に対物レンズが受ける光は蛍光波長λｆであるので、これまで示した説明は蛍光波長λｆに対して成立している。つまり、今まで説明した縞パターンと傾きを持つ照明分布を励起波長λｅｘで実現することが必要である。ここでは、蛍光波長λｆにおいて成り立つ２つの光束の入射角度をθ１，θ２、同一のピッチと傾きを持つ干渉パターンを発生させる励起波長λｅｘの２つの光束の入射角度をθ１’，θ２’と表す。励起波長λｅｘの２つの光束により生成したい縞パターンは、水平ピッチＰｘｙ（＝λｆ／（ｓｉｎθ１−ｓｉｎθ２））で傾きα（＝（θ１＋θ２）／２）だけ傾いた縞パターンである。縞パターンを生成する励起波長λｅｘの２つの光束の入射角度θ１’，θ２’について、水平ピッチが同じことより式（２）が成立し、傾きが同じことより式（３）が成立する。
【００２７】
λｅｘ／（ｓｉｎθ１’−ｓｉｎθ２’）＝λｆ／（ｓｉｎθ１−ｓｉｎθ２）  （２）
（θ１’＋θ２’）／２＝（θ１＋θ２）／２  （３）
式（２），（３）の右辺の値は、対物レンズの開口数ＮＡや蛍光波長λｆなどの設定値を用いた算出方法について説明したので、既知の値として扱う。式（２）よりｓｉｎθ１’−ｓｉｎθ２’＝λｅｘ／λｆ・（ｓｉｎθ１−ｓｉｎθ２）と求められる。三角関数の公式よりｓｉｎθ１’−ｓｉｎθ２’＝２・ｓｉｎ（（θ１’−θ２’）／２）・ｃｏｓ（（θ１’＋θ２’）／２）と表される。式（３）より（θ１’＋θ２’）／２の値は求められるので、ｃｏｓ（（θ１’＋θ２’）／２）の値が求まる。ｓｉｎ（（θ１’−θ２’）／２）の値が求められるので、（θ１’−θ２’）／２の値が求まる。（θ１’＋θ２’）／２および（θ１’−θ２’）／２の値が両方とも求められると、θ１’，θ２’の値が求まる。したがって、第１および第２の可動ミラー１５，１８をそれぞれθ１’／（２・ｍ１・ｍ）、およびθ’２／（２・ｍ２・ｍ）だけ初期位置から傾ければよい。
【００２８】
顕微鏡システムは、構造照明画像から縞パターンのピッチを確認し、フィードバックする機構を備えてもよい。構造照明光学系の構成は、図２の構成と同一である。対物レンズの開口数ＮＡから縞パターンの適切なピッチおよび傾きが算出され、縞パターンを形成するための２つの光束の入射角度θ１，θ２が定まり、それを満たすために第１および第２の可動ミラー１５，１８の角度を調節する。ここで、第１および第２の可動ミラー１５，１８の両方または一方に角度誤差が生じている場合や、構造照明光学系の他の部分に誤差が生じている場合、２つの光束の入射角度がずれている可能性がある。その結果、形成される縞パターンのピッチが所定のピッチｐ０からずれ、傾きが所定の傾きα０（＝（θ１＋θ２）／２）からずれている可能性がある。
【００２９】
このような事態を避けるために、本撮影の前に、縞パターンのピッチおよび傾きを測定した後、比較手段（不図示）を用いて所定の縞パターンのピッチおよび傾きと比較する。そして、比較手段の比較結果に基づいて、補正手段（不図示）がフィードバック補正を行う。測定方法は後述するが、発生している縞パターンの水平ピッチＰｘｙ’（ＸＹ平面内ピッチ）と垂直方向ピッチＰｚ’（Ｚ軸方向のピッチ）が計測された場合、以下の式が成立する。両ピッチが計測されると、実際に形成されている縞パターンの傾きα１および２つの光束のｚ軸と成す入射角度θ１１’，θ１２’を算出できる。
【００３０】
Ｐｘｙ’＝λｅｘ／（ｓｉｎθ１１’−ｓｉｎθ１２’）    （４）
Ｐｚ’＝λｅｘ／（ｃｏｓθ１１’−ｃｏｓθ１２’）      （５）
縞パターンのｚ軸に対する傾きは（θ１１’＋θ１２’）／２であるので、Ｐｘｙ’／Ｐｚ’＝ｔａｎ（（θ１１’＋θ１２’）／２）が成り立つ。したがって、測定値であるＰｘｙ’，Ｐｚ’から（θ１１’＋θ１２’）／２の値を算出できる。また、式（４）または式（５）を使って、（θ１１’−θ１２’）／２を算出できる。例えば、式（５）から（ｃｏｓθ１１’−ｃｏｓθ１２’）＝Ｐｚ’／λｅｘが得られ、三角関数の公式、既に算出された（θ１１’＋θ１２’）／２、測定値Ｐｚ’、および既知である励起波長λｅｘを用いて（θ１１’−θ１２’）／２を計算できる。
【００３１】
以上の手順で（θ１１’＋θ１２’）／２、および（θ１１’−θ１２’）／２の値が水平ピッチＰｘｙ’、垂直方向ピッチＰｚ’、および励起波長λｅｘの値を用いて決められ、これらの値から入射角度θ１１’，θ１２’が算出される。比較手段は、励起波長λｅｘである２つの光束のあらかじめ設定された入射角度θ１’，θ２’と実際の２光束の入射角度θ１１’，θ１２’との差分を算出する。補正手段は、差分が閾値を超える場合（ずれが大きい場合）、第１および第２の可動ミラー１５，１８をそれぞれ、（θ１’−θ１１’）／（２・ｍ１・ｍ）および（θ２’−θ１２’）／（２・ｍ２・ｍ）だけ現状位置から傾けることで補正を行う。水平ピッチＰｘｙ’は、縞パターン下において撮像された画像をＦａｓｔ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ＦＦＴ）などの周波数解析により求めることができる。垂直方向ピッチＰｚ’は、ｚ方向を送りながら撮像した縞パターン下における複数の画像の局所領域の出力変化をＦＦＴなどの周波数解析により求めることができる。
【００３２】
図４（ａ）は、セクショニング画像の生成プロセスを説明するためのフローチャートである。ステップＳ３１では、ユーザが表１に示されるパラメータの入力を行う。これらの情報は、ユーザがキーボードなどでコンピュータを通じて入力してもよい。また、使用する対物レンズを自動認識し、あらかじめ登録されたテーブルから開口数ＮＡを読み取ってもよいし、開口数ＮＡから定まる焦点深度を元に第１のフォーカス範囲と第１のフォーカスステップを自動生成してもよい。
【００３３】
ステップＳ３２では、コンピュータがステップＳ３１で入力された情報のうち励起光源の波長、蛍光波長、および対物レンズの開口数ＮＡから構造照明の好適なピッチおよび傾きを算出する。そして、第１および第２の可動ミラー１５，１８の回転角度を算出し、２つの可動ミラーを算出した回転角度分だけ回転させる。
【００３４】
ステップＳ３３では、縞パターンを取得する。図４（ｂ）は、縦パターン取得を説明するフローチャートである。ステップＳ３３１では、一様照明下でフォーカス自動調節を行う。ステップＳ３３２では、構造照明に切換え構造照明画像を取得する。ステップＳ３３３では、さらにステップＳ３１で設定された第１のフォーカス範囲内を第１のフォーカスステップだけフォーカスを送りながら構造照明画像を複数枚取得する。ここで取得する構造照明画像の枚数は、（第１のフォーカス範囲／第１のフォーカスステップ）から得られる数値を四捨五入または切り捨て、切り上げなどで整数化したものである。どのような整数化をするかはステップＳ３１で設定してもよい。ステップＳ３３４では、フォーカスステップが完了したかどうかを判断し、完了している場合は図４（ａ）のフローに戻り、完了していない場合はステップＳ３３２に戻る。
【００３５】
ステップＳ３４では、ステップＳ３３で取り込まれた所定枚数の構造照明画像から構造照明のピッチおよび傾きが適切かどうかを判断する。各構造照明画像の周波数解析を例えばＦＦＴなどにより行い、設定されたピッチに対応する周波数μ０の周辺で高いパワー値を示す周波数μｘｙ’を抽出し、同時に周波数μ０に対応するパワー値を記憶する。周波数μｘｙ’は、実際に生じている縞パターンの水平ピッチＰｘｙ’に対応する周波数である。また、デフォーカスしながら撮像した複数の構造照明画像のＸＹ面の所定の１点または所定の小領域の信号のＺ軸に対する分布に関してＺ軸方向に関して周波数解析を行い、設定された周波数γ０周辺で高いパワー値を示す周波数γ’を抽出する。周波数γ’は、実際に生じている縞パターンのＸＺ平面におけるＺ軸方向の垂直方向ピッチＰｚ’に対応する周波数である。周波数μｘｙ’に対応するピッチＰｘｙ０（周波数μ０に対応）および周波数γ’に対応するＰｚ０（周波数γ０に対応）があらかじめ設定していた基準値よりもずれている場合は、そのずれを補正する。前述したように、水平ピッチＰｘｙ’および垂直方向ピッチＰｚ’から実際の２つの光束の入射角度θ１１’，θ１２’が算出できる。そして、あらかじめ設定された入射角度θ１’，θ２’からの誤差分を第１および第２の可動ミラー１５，１８を現状の角度に対して加えて回転することで、縞パターンを補正する。
【００３６】
ステップＳ３５では、本撮影を行う。図４（ｃ）は、本撮影を説明するフローチャートである。ステップＳ３５１では、一様照明下でフォーカス自動調節を行う。ステップＳ３５２では、ステップＳ３４までのプロセスで縞パターンを補正し、設定通りの縞パターンによる構造照明画像と一様画像を取得する。ステップＳ３５３では、ステップＳ３１で設定された第１のフォーカス範囲内を第１のフォーカスステップだけフォーカスを送りながら構造照明画像を複数枚取得する。ステップＳ３５４では、フォーカスステップが完了したかどうかを判断し、完了している場合は画像をコンピュータ（不図示）に記憶させるとともに図４（ａ）のフローに戻り、完了していない場合はステップＳ３５２に戻る。
【００３７】
ステップＳ３６では、前述した方法により、各Ｚ位置（高さ）におけるセクショニング画像の生成を行う。必要ならば各Ｚ位置におけるセクショニング画像により、３次元画像を生成する。なお、ステップＳ３４において、どのＺ位置においても周波数解析結果で周波数μ０の周辺で高いパワー値を示す周波数成分がない場合や、パワー値の分布がブロードになった場合は、構造照明画像において縞パターンのコントラストが低い可能性が有る。この場合は、開口数ＮＡから定まる最適なピッチよりもピッチを大きく再設定してプロセスをやり直すことも可能である。ＡＬＩ方式の照明におけるｚ方向の解像度は、ピッチが細かいほど高くなるが、縞パターンのコントラストが低い場合は縞パターンを細かくしても縞パターンに対応する周波数成分を読み取れずにセクショニング画像を生成する際に誤差が大きくなる可能性がある。縞パターンのコントラストに関する解析および縞ピッチの再設定の有無、および再設定の基準をステップＳ３１で入力してもよい。
【００３８】
【表１】
2016206602.tif 000003
【００３９】
[数値実施例１]
表２に、図２の蛍光顕微鏡システムの照明光学系の数値例の一例を示す。
【００４０】
【表２】
2016206602.tif 000004
【００４１】
[数値実施例２]
表３に、図３の蛍光顕微鏡システムの照明光学系の数値例の一例を示す。
【００４２】
【表３】
2016206602.tif 000005
【００４３】
以上、本発明の好ましい実施例について説明したが、本発明はこれらの実施例に限定されないことはいうまでもなく、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。
【符号の説明】
【００４４】
１１    光束
１２    分離用ハーフミラー（分離手段）
１３    第１の光束
１４    第２の光束
１５    第１の可動ミラー（第１の調節手段）
２０    コリメータレンズ（光学手段）
２１    カメラポート（共役面）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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