(57)【要約】【課題】  Ｔａｔタンパク質の非存在下で高力価のレンチウイルスベクターを製造するための核酸、当該核酸を導入した細胞、前記細胞により産生する高力価レンチウイルスベクターの製造方法を提供すること。【解決手段】  ５’側から３’側の方向に、レンチウイルスの完全長５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、及び３’ＬＴＲを含み、前記完全長５’ＬＴＲの５’側又は前記３’ＬＴＲの３’側にＬＴＲとは異種のエンハンサーをさらに有する核酸、当該核酸を導入した細胞、前記細胞を用いた高力価のレンチウイルスベクター製造方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’側から３’側の方向に、レンチウイルスの完全長５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、及び３’ＬＴＲを含み、前記完全長５’ＬＴＲの５’側又は前記３’ＬＴＲの３’側にＬＴＲとは異種のエンハンサーをさらに有する核酸。
【請求項２】
エンハンサーが転写因子ＮＦκＢの結合モチーフを持つエンハンサーである請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
エンハンサーがＣＭＶ由来のエンハンサーである請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
３’ＬＴＲが自己不活化型の３’ＬＴＲである請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
３’ＬＴＲがＵ３領域を欠損したＳＩＮ型の３’ＬＴＲである請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にＲｅｖ応答配列、セントラルポリプリン配列、及び転写後調節配列を含む請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にプロモーターを含む請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
プロモーターがＭＳＣＶ−Ｕ３プロモーターである請求項７に記載の核酸。
【請求項９】
完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子の塩基配列を含む請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にマルチクローニングサイトを含む請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸が搭載された導入ベクタープラスミド、導入ウイルスベクター又はウイルス産生細胞。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸を用いたレンチウイルスベクター製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸を含むレンチウイルスベクター製造用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療の基礎研究や臨床における遺伝子治療に有用なレンチウイルスベクターの製造に使用される核酸、及びその核酸を使用したレンチウイルスベクターの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、先天性遺伝子疾患の治療のほか、癌や感染症の治療を目的として、ウイルスベクターを用いた遺伝子治療が多数試みられている。ウイルスベクターを用いた遺伝子治療としては、従来、レトロウイルスベクターやアデノウイルスベクターについて多くの試みがなされているが、最近ではレトロウイルスベクターの中でもレンチウイルスベクターの安全性が向上し、利用例が増加している。
【０００３】
レンチウイルスはレトロウイルス科に属するウイルスであるが、いくつかのアクセサリータンパク質や調節タンパク質を有することから、分裂していない細胞にも感染して宿主ゲノムにウイルスゲノム由来の塩基配列を導入できる。レンチウイルスは、この点で他のレトロウイルス（オンコレトロウイルスなど）と大きく異なり、近年遺伝子導入用のベクターとして開発が進んできた。
【０００４】
レンチウイルスは、ウイルス粒子の構造タンパク質、プロテアーゼ、逆転写酵素、インテグラーゼなどの前駆体タンパク質をコードするｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子、ＲＮＡの輸送と分配に関わるＲｅｖタンパク質をコードするｒｅｖ遺伝子、転写活性因子であるＴａｔタンパク質をコードするｔａｔ遺伝子、エンベロープ糖タンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子などを有する。これらの遺伝子の両端は、ウイルス遺伝子の転写、ウイルスゲノムＲＮＡからの逆転写、逆転写を経て合成された二本鎖ＤＮＡの宿主ＤＮＡへの組み込みに関わる５’ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）及び３’ＬＴＲで挟まれている。
【０００５】
遺伝子導入用のレンチウイルスベクターの製造は、他のレトロウイルスベクターの製造と同様である（非特許文献１）。即ち、ウイルス粒子の感染力を保ちつつ自己複製を不可能にするため、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子を含む核酸、ｒｅｖ遺伝子を含む核酸、ｔａｔ遺伝子を含む核酸、ｅｎｖ遺伝子を含む核酸、及びウイルス粒子に封入されるＲＮＡを転写しうる核酸を搭載したプラスミド（導入ベクタープラスミド）などを細胞に導入することによって、ウイルス産生細胞を作製し、該細胞の培養上清中に産生された目的のレンチウイルスベクターを採取することが常法とされる。導入ベクタープラスミドは５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、及び３’ＬＴＲを有し、所望の遺伝子が挿入されている。５’ＬＴＲ上のＴＡＲ領域にＴａｔタンパク質が結合することにより導入ベクタープラスミドからＲＮＡが転写され、ＲＮＡはパッケージングシグナル配列の働きによりウイルス粒子にパッケージングされる。
【０００６】
レンチウイルスの各遺伝子及びエレメントの機能が明らかにされつつあり、導入ベクタープラスミドにも多数の改良が行われている。Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ：Ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）は、レンチウイルスのＲｅｖタンパク質が結合しウイルスゲノムＲＮＡが効率よく核から細胞質へ輸送されるのに必要である。また、レトロウイルスは逆転写の際、３’ＬＴＲのすぐ上流にあるポリプリン配列（ＰＰＴ：ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）からプラス鎖の合成が始まるが、レンチウイルスにはゲノムの中央部分にセントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）と呼ばれる配列がもう１ヶ所あり、ここからも合成が行われるため、最終的な２本鎖ｃＤＮＡには中央にＤＮＡフラップと呼ばれる約１００塩基対の３本鎖構造が形成される。この３本鎖構造がプレインテグレーション複合体の核膜孔の通過に関与していると考えられている（特許文献１）。野生型のウイルスｃＰＰＴは、ＤＮＡゲノムの中央から数塩基離れて位置することが知られており、ｃＰＰＴが中央に位置することがウイルスベクターの力価に重要であることされている（特許文献１）。さらに、転写後調節配列（ＰＲＥ：ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）はｍＲＮＡの安定性を高めると考えられており、ウッドチャック肝炎ウイルス由来のＰＲＥ（ＷＰＲＥ）がよく利用されている。
【０００７】
上述のようにレンチウイルスベクターの製造は、ｔａｔ遺伝子を含む核酸を使用している。しかしながら、ｔａｔ遺伝子が相同組換えでウイルスゲノムに組み込まれる可能性は否定できず、Ｔａｔタンパク質の非存在下で高力価のレンチウイルスベクターを製造する方法の開発が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許６６８２９０７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ネイチャー  バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第１５巻、８７１〜８７５頁（１９９７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、Ｔａｔタンパク質の非存在下で高力価のレンチウイルスベクターを製造するための核酸、当該核酸を導入した細胞、前記細胞により産生する高力価レンチウイルスベクターの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、５’側から３’側の方向に、レンチウイルスの完全長５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、及び３’ＬＴＲを含み、前記完全長５’ＬＴＲの５’側又は前記３’ＬＴＲの３’側にＬＴＲとは異種のエンハンサーをさらに有する核酸を用いることにより、Ｔａｔタンパク質の非存在下で高力価のレンチウイルスベクターが得られることを見出した。また、当該核酸を導入した細胞を用いることで、高力価のレンチウイルスベクターを製造できる方法を構築し、本発明を完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明の第一の発明は、
［１］５’側から３’側の方向に、レンチウイルスの完全長５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、及び３’ＬＴＲを含み、前記完全長５’ＬＴＲの５’側又は前記３’ＬＴＲの３’側にＬＴＲとは異種のエンハンサーをさらに有する核酸、
［２］エンハンサーが転写因子ＮＦκＢの結合モチーフを持つエンハンサーである［１］に記載の核酸、
［３］エンハンサーがＣＭＶ由来のエンハンサーである［２］に記載の核酸、
［４］３’ＬＴＲが自己不活化型の３’ＬＴＲである［１］に記載の核酸、
［５］３’ＬＴＲがＵ３領域を欠損したＳＩＮ型の３’ＬＴＲである［４］に記載の核酸、
［６］完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にＲｅｖ応答配列、セントラルポリプリン配列、及び転写後調節配列を含む［１］に記載の核酸、
［７］完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にプロモーターを含む［１］に記載の核酸、
［８］プロモーターがＭＳＣＶ−Ｕ３プロモーターである［７］に記載の核酸、
［９］完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子の塩基配列を含む［１］に記載の核酸、
［１０］完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にマルチクローニングサイトを含む［１］に記載の核酸、
［１１］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の核酸が搭載された導入ベクタープラスミド、導入ウイルスベクター又はウイルス産生細胞、
［１２］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の核酸を用いたレンチウイルスベクター製造方法、及び
［１３］［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の核酸を含むレンチウイルスベクター製造用キット、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、Ｔａｔタンパク質の非存在下で高力価のレンチウイルスベクターを得ることが可能となる。このレンチウイルスベクターは、遺伝子治療の基礎研究や臨床における遺伝子治療に極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１で作成した導入ベクタープラスミドの構造を示す図である。
【図２】各導入ベクタープラスミドで製造されたレンチウイルスベクターのウイルスタイターの相対値を示す図である。
【図３】実施例４で作成した導入ベクタープラスミドの構造を示す図である。
【図４】各導入ベクタープラスミドで製造されたレンチウイルスベクターのウイルスタイターの相対値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において「レンチウイルスベクター」とは、レトロウイルス科に属するレンチウイルスを基に遺伝子組換え技術により作製されたウイルス粒子を意味する。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１やＨＩＶ−２）に基づくベクターやサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に基づくベクターなどが挙げられる。
【００１６】
本明細書において「ゲノムＲＮＡ」とは、ウイルス粒子においてカプシドに包まれたＲＮＡ鎖を意味する。
【００１７】
本明細書において「５’」とは、核酸における５’側（上流）における領域又は位置を意味する。
【００１８】
本明細書において「３’」とは、核酸における３’側（下流）における領域又は位置を意味する。
【００１９】
本明細書において「ＬＴＲ」とは、レトロウイルス、レトロトランスポゾンなどのプロウイルスＤＮＡの両端に繰り返されている１００〜１０００塩基対からなる配列を意味する。ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の転写、ウイルスゲノムＲＮＡからの逆転写、逆転写を経て合成された二本鎖ＤＮＡの宿主ＤＮＡへの組み込みに関わる。
【００２０】
本明細書において「パッケージングシグナル配列」とは、ウイルス粒子の形成においてレトロウイルスゲノムＲＮＡのウイルス粒子へのパッケージングに必要な、非コード性のシス作用性の配列を意味する。
【００２１】
本明細書において「異種の」とは、物質が別の供給源由来（例えば、別の遺伝子、別の種等に由来する）であることを意味する。
【００２２】
本明細書において「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激することができる塩基配列を意味する。
【００２３】
以下に本発明を具体的に説明する。
（１）本発明のレンチウイルスベクター製造用核酸
本発明のレンチウイルスベクター製造用核酸は、５’側から３’側の方向に、レンチウイルスの完全長５’ＬＴＲ、パッケージングシグナル配列、及び３’ＬＴＲを含み、前記完全長５’ＬＴＲの５’側又は前記３’ＬＴＲの３’側にＬＴＲとは異種のエンハンサーをさらに有している。
【００２４】
上記製造用核酸は、細胞内に導入された際に、レンチウイルス粒子の形成に必要な各種要素（Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質、Ｅｎｖタンパク質等）の供給によってレンチウイルス粒子を産生し得るものであれば、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはヌクレオチドアナログのいずれで構成されていてもよい。また、当該核酸はレンチウイルスのゲノムＲＮＡを転写できるものであれば１本鎖、２本鎖、環状、直鎖状のいずれであってもよい。
【００２５】
本発明の核酸においてエンハンサーは、完全長５’ＬＴＲのプロモーター活性を刺激することができる塩基配列であれば特に限定はなく、いずれの方向（正の方向又は負の方向）で本発明の核酸に配置することができ、また、その位置も５’ＬＴＲの５’側又は３’ＬＴＲの３’側のどちらでもよい。エンハンサーは、通常１０〜３００ｂｐの鎖長であり、シスで機能する。エンハンサーには、プロモーター活性を促進する転写因子（ＮＦκＢ、ＣＲＥＢ、ＡＰ１など）が結合するＤＮＡ配列が存在する。ＮＦκＢはｋａｐｐａ−Ｂモチーフと呼ばれる配列ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号９、「転写因子ＮＦκＢの結合モチーフ」とも呼ばれる）に結合し、ＣＲＥＢはｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ：ｃＡＭＰ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と呼ばれる配列ＴＧＡＣＧＴＣＡ（配列番号１０）に結合する。特に限定はされないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来、アデノウイルス由来、及びＳＶ４０由来のエンハンサーが例示される。例えば、配列表の配列番号１記載の塩基配列で示されるサイトメガロウイルス由来のエンハンサーが好適に使用できる。
【００２６】
前記完全長５’ＬＴＲは、少なくともウイルス遺伝子の転写、ウイルスゲノムＲＮＡからの逆転写、逆転写を経て合成された二本鎖ＤＮＡの宿主ＤＮＡへの組み込みに関わるＵ３領域、Ｒ領域及びＵ５領域から構成されるものが好ましい。当該完全長５’ＬＴＲはプロモーター活性を有することが好ましい。特に限定はされないが、ＨＩＶ−１由来、ＨＩＶ−２由来、又はＳＩＶ由来の完全長５’ＬＴＲが例示される。例えば、配列表の配列番号２記載の塩基配列で示されるＨＩＶ−１由来の完全長５’ＬＴＲが好適に使用できる。
【００２７】
特に限定はされないが、前記完全長５’ＬＴＲは、野生型５’ＬＴＲでもよい。ここで、「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離されたその遺伝子又は遺伝子産物のうち、集団において最も高頻度で観察されるものを意味する。これは、天然に存在するか、又は組換体として産生させ得る。一方、「変異型」とは、野生型遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／又は機能的特性が改変された遺伝子又は遺伝子産物を指す。変異型遺伝子は、自然に変異が生じることにより、又は人為的に遺伝子を修飾して配列を変異させることにより産生される。
【００２８】
本発明の核酸においてパッケージングシグナル配列は、「プサイ（ｐｓｉ）配列」又は「ψ配列」と呼ばれるウイルス粒子の形成においてレトロウイルスＲＮＡ鎖のキャプシド形成及びウイルス粒子へのパッケージングに必要な、非コード性のシス作用性の配列を有するものが好適に使用できる。特に限定はされないが、ＨＩＶ−１由来、ＨＩＶ−２由来、又はＳＩＶ由来のパッケージングシグナル配列が例示される。例えば、ＨＩＶ−１由来のパッケージングシグナル配列が好適に使用できる。
【００２９】
本発明の核酸において３’ＬＴＲは、完全長のものでもよく、その内部配列の一部が欠損したものや、その内部配列に変異を有するものでもよい。例えば、Ｕ３領域を欠損した自己不活化（ＳＩＮ：ｓｅｌｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）型の３’ＬＴＲやＵ３領域に変異を有するＳＩＮ型の３’ＬＴＲでもよい。特に限定はされないが、ＨＩＶ−１由来、ＨＩＶ−２由来、又はＳＩＶ由来の３’ＬＴＲを改変したＳＩＮ型の３’ＬＴＲが例示される。例えば、配列表の配列番号３記載の塩基配列で示されるＨＩＶ−１由来のＳＩＮ型の３’ＬＴＲが好適に使用できる。
【００３０】
本発明の核酸において完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にＲＲＥ、ｃＰＰＴ、及びＰＲＥを含んでもよい。
【００３１】
前記ＲＲＥとしては、レンチウイルスのｅｎｖ遺伝子内に存在する約２４０塩基の配列であり、ＲＲＥを含有するＲＮＡはこの配列の領域で複雑な２次構造をとりＲｅｖタンパク質が結合する機能を有する配列のものが好ましい。当該ＲＲＥを含有する構築物に搭載された遺伝子は、Ｒｅｖタンパク質に依存して効率的に発現することができる。特に限定はされないが、ＨＩＶ−１由来、ＨＩＶ−２由来、又はＳＩＶ由来のＲＲＥが例示される。例えば、ＨＩＶ−１由来のＲＲＥが好適に使用できる。
【００３２】
また、セントラルポリプリン配列（ｃＰＰＴ）としては、レンチウイルスゲノムのほぼ中央に存在する約１５塩基の配列を意味し、これはレンチウイルスゲノムＲＮＡからの二本鎖ＤＮＡ合成の過程でプラス鎖ＤＮＡ合成のためのプライマー結合部位として働く配列であれば特に限定はされない。当該ｃＰＰＴは、レンチウイルスのＲＮＡゲノムが逆転写される際、セントラル終結配列（ＣＴＳ：ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と共に機能し、ＤＮＡフラップと呼ばれる３本鎖構造を形成するものが好ましい。特に限定はされないが、ＨＩＶ−１由来、ＨＩＶ−２由来、又はＳＩＶ由来のｃＰＰＴが例示される。例えば、ＨＩＶ−１由来のｃＰＰＴが好適に使用できる。
【００３３】
さらに、ＰＲＥとしては、細胞内で遺伝子から転写されたｍＲＮＡのポリアデニレーションの促進、ｍＲＮＡの核外輸送の促進又はｍＲＮＡの翻訳の活性化に寄与するものが好ましい。当該配列をレトロウイルスベクターの所望の遺伝子の非翻訳領域に挿入することにより、所望の遺伝子の発現が向上することができる。特に限定はされないが、ウッドチャック肝炎ウイルス由来のＰＲＥ（ＷＰＲＥ）が例示される。
【００３４】
本発明の核酸の態様としては、本発明の核酸は完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間にプロモーターを含んでもよい。プロモーターは、外来遺伝子を標的細胞内で発現できるものであれば特に限定はなく、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＭＳＣＶ（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）由来のＵ３プロモーター等が例示され、目的に応じて選択することができる。組織特異的プロモーターを用いれば、組織特異的に外来遺伝子を発現させることができる。特に限定はされないが、肝臓特異的プロモーターであるα１ＡＴプロモーターを用いれば肝細胞特異的に、骨格筋特異的α−アクチンプロモーターを用いれば骨格筋細胞特異的に、神経特異的エノラーゼプロモーターを用いれば神経細胞特異的に、血管内皮細胞特異的ｔｉｅプロモーターを用いれば血管内皮細胞特異的に、胃癌特異的ＣＥＡプロモーターを用いれば胃癌細胞特異的に、又は肝癌特異的ＡＦＰプロモーターを用いれば肝癌細胞特異的にそれぞれ外来遺伝子を発現させることができる。例えば、配列表の配列番号４記載の塩基配列で示されるＭＳＣＶ由来のＵ３プロモーターが好適に使用できる。
【００３５】
本発明の核酸は、レンチウイルスの完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に所望の遺伝子の塩基配列を挿入することができる。そのため本発明の核酸は、完全長５’ＬＴＲと３’ＬＴＲの間に複数の制限酵素の認識／切断配列で構成されたマルチクローニングサイトを含んでもよい。即ち、本発明の核酸を使用して所望の遺伝子を保持するレンチウイルスベクターを作製する場合、当該マルチクローニングサイトに所望の遺伝子を挿入すればよい。
【００３６】
本発明の核酸が搭載された導入ベクタープラスミド、導入ウイルスベクター又はウイルス産生細胞は本発明に包含される。本発明の核酸が搭載された導入ベクタープラスミドは、その製造の観点からは、大腸菌等の汎用宿主で機能する複製開始点を有するものが好ましい。
【００３７】
（２）本発明の核酸を用いたレンチウイルスベクター製造方法
本発明の核酸を用いたレンチウイルスベクター製造方法の特徴としては、Ｔａｔタンパク質を供給する必要がないことが挙げられる。
【００３８】
本発明の製造方法に用いる本発明の核酸は、「ウイルス産生細胞」の作製に使用できる。当該細胞は、本発明の核酸に由来するゲノムＲＮＡを包含するレンチウイルス粒子を産生する細胞であれば、特に限定はされない。好適には、レンチウイルスベクターの製造に使用された実績のある細胞がウイルス産生細胞の作製に使用される。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＬｅｎｔｉＸ−２９３細胞、１９３Ｔ／１７細胞などが好適に使用できる。これらの細胞に、Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質、Ｅｎｖタンパク質、Ｒｅｖタンパク質等のレンチウイルス粒子形成に必要とされるタンパク質を産生する能力を付与し、さらに本発明の核酸を導入することにより、レンチウイルス産生細胞を得ることができる。なお、本発明では、レンチウイルス産生細胞はＴａｔタンパク質を産生する能力を有する必要はない。
【００３９】
本発明の核酸が導入されたレンチウイルス産生細胞の培養は、通常の培養条件で行うことができる。前記培養条件として、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。培養は、例えば３０〜３７℃で実施できるが、所望の細胞の増殖、レンチウイルスベクターの産生が達成できる温度であれば前記の範囲以外の温度で実施してもよい。本発明では、こうして得られる培養液より上清を採取して、レンチウイルスベクターを得る。本発明において、レンチウイルスベクターは前記の上清のまま、上清をフィルターろ過して得られたろ液、公知の方法により濃縮もしくは精製されたウイルスベクター等の種々の形態で製造され、適切な方法により、例えば凍結して、使用するまで保存される。上記のウイルス産生細胞の培養により、従来の培養方法より高い力価のレンチウイルスベクターを得ることができる。
【００４０】
本発明の製造方法において製造されたレンチウイルスベクターの評価は、力価の測定により実施することができる。当該力価とは、実験的に測定されるレンチウイルス粒子数のことである。力価測定の方法には特に限定はなく、公知の方法で行うことができる。例えばレンチウイルスベクターのＲＮＡをリアルタイムＰＣＲで測定する方法、ウイルスベクターを標的細胞に感染させた後に、導入遺伝子の発現の検出、細胞の形状が変化する現象（細胞変性）の検出、導入されたプロウイルスコピー数の測定、等を行う方法が使用可能である。
【００４１】
（３）本発明の核酸を含むレンチウイルスベクター製造用キット
本発明の核酸を含むレンチウイルスベクター製造用キットは、本発明の一態様である。好適には、本発明の核酸に加え、レンチウイルス粒子形成に必要なタンパク質を細胞に供給するための核酸を含有するキットが例示される。なお、本発明キットではＴａｔタンパク質を供給する必要がないため、Ｔａｔタンパク質供給用の核酸を含む必要はない。本発明のキットに含有される各種の核酸は、例えばプラスミドの形態であってもよい。レンチウイルス粒子形成に必要なタンパク質を細胞に供給するための核酸として、Ｇａｇ／Ｐｏｌタンパク質を供給するための核酸、Ｅｎｖタンパク質を供給するための核酸が例示されるが、さらにＲｅｖタンパク質を供給するための核酸が含まれていてもよい。Ｅｎｖタンパク質はレンチウイルス由来のＥｎｖであってもよいが、他のタンパク質、例えばテナガザル白血病ウイルス由来のＥｎｖタンパク質やＶＳＶ−Ｇタンパク質等を供給するための核酸に置き換えた場合には、シュードタイプのレンチウイルスベクターを製造することができる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００４３】
実施例１  導入ベクタープラスミドの作製
配列表の配列番号５に示す塩基配列を有する人工合成遺伝子を作製した。この人工合成遺伝子は、５’側からＭＳＣＶ−Ｕ３プロモーター、マルチクローニングサイト、蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎ１をコードするＯＲＦを有する。この人工合成遺伝子を、ｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ  Ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（タカラバイオ社製）のＣｌａＩサイトとＭｌｕＩサイトの間にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用してクローニングし、ＭＳＣＶ−Ｕ３プロモーターの制御下にＺｓＧｒｅｅｎ１が発現する導入ベクタープラスミドＡを作製した。
【００４４】
Ｃｏｓｍｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｐＡｘＣＡｗｔｉｔ２（タカラバイオ社製）を制限酵素ＳｐｅＩ（タカラバイオ社製）にて消化することで、ＣＡＧプロモーター断片（ＣＭＶエンハンサーとβアクチンプロモーター及びβアクチンイントロンを含む）を作製した。上記ＣＡＧプロモーター断片を、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２  Ｂｌｕｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を大腸菌に形質転換して得られた環状プラスミドを制限酵素ＢｌｎＩ（タカラバイオ社製）にて消化したプラスミドへクローニングし、ｐＴ７Ｂｌｕｅ２−ＣＡＧｐプラスミドを作製した。次に、ｐＴ７Ｂｌｕｅ２−ＣＡＧｐプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＸｂａＩ（タカラバイオ社製）にて消化し、ＣＭＶエンハンサーとβアクチンプロモーターを含む断片を得た。
【００４５】
また、前記導入ベクタープラスミドＡを鋳型として配列表の配列番号６及び配列番号７に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行った。得られた増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及び制限酵素ＸｂａＩにて消化し、前記ＣＭＶエンハンサーとβアクチンプロモーターを含む断片と常法によりライゲーションを行い、ｐＣＡＧ−ＬＶＳＩＮプラスミドを作製した。ｐＣＡＧ−ＬＶＳＩＮプラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＸｂａＩにて消化することによりβアクチンプロモーターを除き、次いでＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑化した後、セルフライゲーションを行って、完全長５’ＬＴＲの上流にＣＭＶエンハンサーを持つ導入ベクタープラスミドＢを作製した。
【００４６】
ｐＴ７Ｂｌｕｅ２−ＣＡＧｐプラスミドを制限酵素ＮｃｏＩ及び制限酵素ＥｃｏＲＶ（タカラバイオ社製）にて消化して得られたＣＭＶエンハンサー断片の末端をＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて平滑化した。その後、上記ＣＭＶエンハンサー断片を導入ベクタープラスミドＡのＳｔｕＩサイトへ常法によりクローニングし、３’ＬＴＲの下流にＣＭＶエンハンサーを持つ導入ベクタープラスミドを作製した。導入ベクタープラスミドＣではＣＭＶエンハンサーが正の向きに挿入され、導入ベクタープラスミドＤではＣＭＶエンハンサーが負の向きに挿入されている。
【００４７】
以上のように作製した導入ベクタープラスミドの構造を図１に示す。図１中、５’ＬＴＲはＵ３領域とＲ領域及びＵ５領域から成る完全長５’ＬＴＲ、ψはパッケージングシグナル配列、ＲＲＥはＲｅｖ応答配列、ｃＰＰＴはセントラルポリプリン配列、ＭＳＣＶ  Ｕ３ｐはＭＳＣＶ−Ｕ３プロモーター、ＺｓＧｒｅｅｎはＺｓＧｒｅｅｎ１遺伝子、３’ＬＴＲはＵ３領域を欠損したＳＩＮ型の３’ＬＴＲ、ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節配列、ＥＮはＣＭＶエンハンサーである。
【００４８】
実施例２  レンチウイルスベクター液の作製
実施例１で作製した４種の導入ベクタープラスミドにより大腸菌ＪＭ１０９（タカラバイオ社製）をそれぞれ形質転換し、形質転換体を得た。これら形質転換体の保持する導入ベクタープラスミドをＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉ（マッハライナーゲル社製）を用いてそれぞれ精製することにより、トランスフェクション用ＤＮＡを作製し、以下の操作に供した。
【００４９】
前記トランスフェクション用ＤＮＡのそれぞれとＧａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、Ｒｅｖ発現プラスミド、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドより構成されるＶｉｒａＰｏｗｅｒ（登録商標）  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジー社製）を、２９３Ｔ／１７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）にトランスフェククトした。トランスフェクション試薬にはＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ社製）を使用し、同製品のプロトコールに従ってトランスフェクトを行った。得られた形質導入細胞の培養上清を０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）  ＨＶ、ミリポア社製）にてろ過し、４種のレンチウイルスベクター液を作製した。
【００５０】
実施例３  レンチウイルスベクターの感染−１
実施例２で作製した４種のレンチウイルスベクター液を３０倍から２４３０倍まで段階希釈して得た希釈液を使用し、ヒトＴリンパ球性白血病由来細胞株ＳｕｐＴ１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９４２）に対し１回感染を行った。その後フローサイトメーターを使用し、ウイルス感染３日後の細胞のＺｓＧｒｅｅｎ１陽性細胞の割合（陽性率）を測定した。陽性率が２０％以下のデータを用いて、下記式に従ってウイルスタイターを算出した。本実施例では、式中、感染細胞数は１×１０５個であり、感染時液量は０．５ｍＬである。
【００５１】
式：  ウイルスタイター（ＩＦＵ／ｍＬ）＝感染細胞数×レンチウイルスベクター液希釈率×（陽性率％／１００）×（１／感染時液量（ｍＬ））
【００５２】
上記式により算出した各ウイルスタイターについて、プラスミドＡで製造されたレンチウイルスベクターのウイルスタイターを１とした時の相対値を図２に示す。図２中、縦軸はウイルスタイターの相対値、横軸は各プラスミドで製造されたレンチウイルスベクターの種類を示す。図２に示されるように、ＣＭＶエンハンサーを付加した３つのプラスミド（Ｂ、Ｃ、Ｄ）で製造されたレンチウイルスベクターは、対照としたプラスミドＡで製造されたレンチウイルスベクターと比べてウイルスタイターの大幅な上昇が確認された。
【００５３】
実施例４  レンチウイルスベクターの感染−２
配列表の配列番号８に示す塩基配列を有する人工合成遺伝子（合成遺伝子Ｔ）を作製した。この合成遺伝子Ｔは、５’側からＮｏｔＩサイト、コザック配列、がん抗原ＷＴ１を特異的に認識するＴＣＲ（以下、ＷＴ１−ＴＣＲと記載する）のβ鎖領域及びα鎖領域をコードするＯＲＦ及びＸｈｏＩサイトを有する。当該合成遺伝子Ｔを制限酵素ＮｏｔＩと制限酵素ＸｈｏＩで切断して得た断片を実施例１で作製したプラスミドＡのＮｏｔＩサイトとＸｈｏＩサイトの間に挿入し、プラスミドＡＴを作製した。また、プラスミドＢを制限酵素ＰｖｕＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＰｍａＣＩ（タカラバイオ社製）にて消化して得た断片をプラスミドＡＴのＰｖｕＩサイトとＰａｍＣＩサイトの間に挿入し、プラスミドＢＴを作製した。
【００５４】
以上のように作製した導入ベクタープラスミドの構造を図３に示す。図３中、ＴＣＲβはＴＣＲ−β遺伝子領域、２ＡはＳＧＳＧリンカー及びＰ２Ａペプチド、ＴＣＲαはＴＣＲ−α遺伝子領域であり、それ以外は図１に示した領域の説明と同じである。
【００５５】
実施例２と同様に、２種のレンチウイルスベクター液を作製した。さらに、レンチウイルスベクター液を１０倍から８１０倍まで段階希釈して得た希釈液を使用し、ＳｕｐＴ１に対し１回感染を行った。ウイルス感染３日後の細胞をＰＥ標識抗ＴＣＲαβ抗体（ベクトンディッキンソン社製）で染色した後、フローサイトメーターを使用し、ＴＣＲ陽性細胞の割合（陽性率）を測定した。陽性率が２０％以下のデータを用いて、前記式に従ってウイルスタイターを算出した。本実施例では、式中、感染細胞数は５×１０４個であり、感染時液量は０．２５ｍＬである。プラスミドＡＴで製造されたレンチウイルスベクターのウイルスタイターを１とした時の相対値を図４に示す。図４中、縦軸はウイルスタイターの相対値、横軸は各プラスミドで製造されたレンチウイルスベクターの種類を示す。図４に示されるように、ＷＴ１−ＴＣＲを発現させた場合でもＣＭＶエンハンサーを付加したプラスミドＢＴで製造されたレンチウイルスベクターは、対照としたプラスミドＡＴで製造されたレンチウイルスベクターと比べてウイルスタイターの上昇が確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、Ｔａｔタンパク質の非存在下で高力価のレンチウイルスベクターを得ることが可能となる。このレンチウイルスベクターは、遺伝子治療の基礎研究や臨床における遺伝子治療に極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００５７】
SEQ ID NO:1: CMV enhancer sequence
SEQ ID NO:2: Complete 5' LTR sequence
SEQ ID NO:3: SIN-type 3' LTR sequence
SEQ ID NO:4: MSCV-U3 promoter sequence
SEQ ID NO:5: Synthetic gene sequence
SEQ ID NO:6: A-F primer sequence
SEQ ID NO:7: A-R primer sequence
SEQ ID NO:8: Synthetic gene T sequence
SEQ ID NO:9: kappa-B motif
SEQ ID NO:10: cAMP response element
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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