(57)【要約】【課題】アルギン酸を資化できる微生物、及び、その微生物を用いて目的物質を発酵法により生産する方法を提供する。【解決手段】目的物質生産能を有し、アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を海藻から得られた炭素源を含む培地中で培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、同培地から目的物質を回収することを特徴とする、目的物質の製造法。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌であり、１６ＳリボソームRNA配列が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する、ビブリオ属細菌。
【請求項２】
前記１６Ｓリボソームが配列番号１を有する、請求項１に記載のビブリオ属細菌。
【請求項３】
アルギン酸を単一の炭素源として生育できることを特徴とする、請求項１または２に記載のビブリオ属細菌。
【請求項４】
前記ビブリオ属細菌が、NITE P-01635株である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のビブリオ属細菌。
【請求項５】
目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を海藻類から抽出された炭素源を含む培地中で培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、同培地から目的物質を回収することを特徴とする、発酵法による目的物質の製造法。
【請求項６】
前記アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、１６Ｓリボソーム配列が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、１６Ｓリボソーム配列が配列番号１を有する細菌である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、NITE P-01635株である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記目的物質が、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的物質が、エタノールである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的物質が、イソプロピルアルコール、アセトン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１−プロパノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールからなる群より選択される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌がＬ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強されたビブリオ属細菌である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌がＬ−アミノ酸を排出するタンパク質の活性が増強されたビブリオ属細菌である、請求項５〜９のいずれか一項の記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｌ−アミノ酸を排出するタンパク質がybjLである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記海藻類が褐藻類、紅藻類、および緑藻類に含まれる大型海藻であることを特徴とする、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記海藻類から得られた炭素源がアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天から選択される1種以上の炭素源であることを特徴とする、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記海藻類から得られた糖類抽出物がアルギン酸を含有し、アルギン酸の加水分解をアルギン酸リアーゼによる酵素分解反応または酸による加水分解反応によって行ってから培養を行うことを特徴とする、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いた海藻バイオマスの利用に際し、有用物質生産の発酵生産時の微生物宿主となる新規微生物にかかわる。
【背景技術】
【０００２】
エタノールなどの燃料やＬ−アミノ酸などの食品、飼料、医薬品に用いられる物質の大量生産には微生物を用いた発酵法が用いられ、産業上有用である。
【０００３】
微生物を用いた発酵の主原料にはサトウキビやトウモロコシといった食料穀物から生産される糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されている。
【０００４】
また、近年の世界的な人口増加による食料需要増などに起因する穀物価格上昇により、サトウキビやトウモロコシの茎や葉、ヤトロファ油などの非食料の陸上バイオマスから得られる糖類や油脂類も微生物を用いた発酵の主原料源として産業上有用である。
【０００５】
しかしながら、非食料の陸上バイオマス生産には食料穀物生産と直接には競合しないものの、農地や農業用水、肥料利用などの点で食料穀物生産と間接的に競合するほか、世界的な土地収奪などの問題があることが課題として指摘されている（非特許文献１）。
【０００６】
そこで、微生物を用いた発酵の主原料として海藻を中心とした海洋性バイオマスに着目が集まっている。海洋性バイオマスは農地や農業用水、肥料を使用せず生産できる上、海藻のうち褐藻類には非食料部分も含めてサトウキビの２倍、トウモロコシの５倍の単位面積あたりの発酵主原料生産能力があることが知られている（非特許文献２）。褐藻類は著量にD-マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の重合多糖であるアルギン酸、グルコース、マンニトールといった糖類を蓄える。
【０００７】
だが、褐藻類が蓄積する糖類を発酵の主原料とする上では、褐藻中の糖類の中に主たる成分として含むアルギン酸が微生物による資化が困難であることが産業上利用する上での課題として挙げられている（非特許文献３、非特許文献４、特許文献１、特許文献２）。すなわち、アルギン酸を資化できる微生物を入手することが褐藻類からの海洋性バイオマスを利用して有用物質を微生物によって発酵生産する上で重要であると考えられる。
【０００８】
アルギン酸を単一の炭素源として資化し、迅速に生育できる微生物を新規に単離、入手できれば、海洋性バイオマスからの有用物質生産を行う微生物による発酵法の宿主微生物として有用性があるが、アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を用いて目的物質を発酵法により生産する方法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願WO 2009/046375号
【特許文献２】国際特許出願WO 2011/024858号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Bringezu,et al. (2009) United Nations Environmental Programme
【非特許文献２】Somerville,et al. (2010) Science. 329, p790-792.
【非特許文献３】Takeda,et al. (2011) Energy Environ. Sci.4 p2575-2581
【非特許文献４】Wargacki, et al. (2012) Science. 335.p308-313
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、アルギン酸を資化できる微生物、及び、その微生物を用いて目的物質を発酵法により生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の発明者は、褐藻類を餌として日常的に摂取していると考えられるサザエ（学名：Turbo cornutus）の消化管から、アルギン酸を資化可能なビブリオ属細菌を分離した。さらに、アルギン酸資化可能なビブリオ属細菌にアミノ酸生産能を付与し、アミノ酸生産が可能なことを見出した。
【００１３】
［１］  アルギン酸資化能を有するビブリオ属に属する細菌であり、１６ＳリボソームRNA配列が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する 、ビブリオ属細菌。
［２］  前記１６Ｓリボソームが配列番号１を有する、前記記載のビブリオ属細菌。
［３］  アルギン酸を単一の炭素源として生育できることを特徴とする、前記記載のビブリオ属細菌。
［４］  前記ビブリオ属細菌が、NITE  P-01635株である、前記記載のビブリオ属細菌。
［５］  目的物質生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌を海藻類由来のバイオマス海藻類から得られた炭素源から抽出された炭素源を含む培地中で培養し、該培地中に目的物質を生成蓄積させ、同培地から目的物質を回収することを特徴とする、発酵法による目的物質の製造法。
［６］  前記アルギン酸資化能を有する細菌が、１６Ｓリボソーム配列が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有するビブリオ属細菌である、前記記載の方法。
［７］  前記アルギン酸資化能を有する細菌が、NITE  P-01635株である、前記記載の方法。
［８］  前記目的物質が、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸である、前記記載の方法。
［９］  前記目的物質が、エタノールである、前記記載の方法。
［１０］  前記目的物質が、イソプロピルアルコール、アセトン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１−プロパノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールからなる群より選択される、前記記載の方法。
［１１］  前記細菌がＬ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強されたビブリオ属細菌である、前記記載の方法。
［１２］  前記細菌がＬ−アミノ酸を排出するタンパク質の活性が増強されたビブリオ属細菌である、前記記載の方法。
［１３］  前記Ｌ−アミノ酸を排出するタンパク質が、ybjLである、前記記載の方法。
［１４］  前記海藻類が褐藻類、紅藻類、および緑藻類に含まれる大型海藻であることを特徴とする、前記記載の方法。
［１５］  前記海藻類から得られた炭素源がアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天から選択される1種以上の炭素源である、前記記載の方法。
［１６］  前記海藻類から得られた糖類抽出物がアルギン酸を含有することを特徴とす
る、前記記載の方法。
［１７］  前記海藻類から得られた糖類抽出物がアルギン酸を含有し、アルギン酸の加水分解をアルギン酸加水分解酵素または酸による前処理によって行ってから培養を行うことを特徴とする、前記記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
海洋性バイオマスからの有用物質生産が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Vibrio sp.SA2株とVibrio rumoiensis Type strainとの16S rRNA遺伝子配列比較（上段がVibrio sp.SA2株の配列、下段がVibrio rumoiensis type strain S-株の配列、点線枠はギャップによる相違、実線枠は置換による相違）。
【図２】Viibrio sp. SA2株の16S rRNA遺伝子全長配列による分子系統樹（系統枝横の数字はブートストラップ値を示す）。
【図３】Vibrio sp. SA2株のアルギン酸ナトリウム最少培地での試験管培養結果（1: Vibrio sp. SA2株の波長600nmの濁度、2: MG1655株の波長600nmの濁度）。
【図４】グルコースまたはアルギン酸ナトリウムのみを炭素源とした最少液体培地での最大比増殖速度。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
＜１＞本発明の細菌
本発明のビブリオ属細菌は、アルギン酸資化能を有するビブリオ属に属する細菌であり、１６ＳリボソームRNA配列が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する、ビブリオ属細菌である。
【００１７】
本発明においてアルギン酸とは、D-マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の重合多糖を意味する。本明細書において使用する「アルギン酸」という用語は、β−１，４’−マンヌロノ−１，４’−Ｌ−グルロノグリカンとも呼ばれるβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の２種のウロン酸のピラノース環が主としてβ１→４結合した多糖を指す。アルギン酸中にはβ−Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｍ）」または「Ｍブロック」とも呼ぶ）、α−Ｌ−グルロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｇ）」または「Ｇブロック」とも呼ぶ）、β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸のヘテロポリマー（以下、「ポリ（ＭＧ）」または「ＭＧブロック」とも呼ぶ）の領域が存在する。本発明のアルギン酸は、海藻類から取得されることが好ましい。
【００１８】
本発明において「海藻類」とは、アオサ、アオノリなどの緑藻植物、アマノリ、オゴノリなどの紅藻植物、コンブ、アラメ、カジメ、ワカメ、ホンダワラなどの褐藻植物等、およびこれらから選択される複数種の組み合わせを指す。特に好ましくは、Macroalgaeと呼ばれる大型藻類である、褐藻植物である。褐藻植物は、光合成の初期同化産物として糖アルコールであるマンニトールを多く貯蔵している点において好ましい。本発明において用いうる褐藻植物には、褐藻綱カヤモノリ目（Ｓｃｙｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）、シオミドロ目（Ｅｃｔｏｃａｒｐａｌｅｓ）、ウイキョウモ目（Ｄｉｃｔｙｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）、ナガマツモ目（Ｃｈｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、イソガワラ目（Ｒａｌｆｓｉａｌｅｓ）、ケヤリモ目（Ｓｐｏｒｏｃｈｎａｌｅｓ）、ウルシグサ目（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａｌｅｓ）、コンブ目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）、ムチモ目（Ｃｕｔｌｅｒｉａｌｅｓ）、ウスバオオギ目（Ｓｙｒｉｎｇｏｄｅｒｍａｔａｌｅｓ）、クロガシラ目（Ｓｐｈａｃｅｌａｒｉａｌｅｓ）、アミジグサ目（Ｄｉｃｔｙｏｔａｌｅｓ）、チロプテリス目（Ｔｉｌｏｐｔｅｒｉｄａｌｅｓ）、アスコセイラ目（Ａｓｃｏｓｅｉｒａｌｅｓ）、ヒバマタ目（Ｆｕｃａｌｅｓ）、ドゥルビアエラ目（Ｄｕｒｖｉｌａｅａｌｅｓ）に属するものが挙げられるが、好ましくはマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）
である。マコンブは海洋バイオマスとして非常に生産量が高く、また大型であることから、目的物質生産のための原料として安定して大量に供給することができる。
【００１９】
本発明において海藻は、生のもの、乾燥したものいずれも利用することが可能であるが、好ましくは生のものを利用する。生の海藻を利用することによって、エネルギー消費量が極めて高い海藻の乾燥工程を省略することができ、また海藻糖化液を得る工程において水を別途添加する必要性がほとんどなく有利である。本発明において海藻は必要に応じて膨潤させてもよい。
【００２０】
本発明において海藻は、必要に応じて細片化されていても良い。海藻の細片化は公知の方法によって行うことができ、例えば、ハサミ、ミキサー、超音波処理、フレンチプレス、石臼、乳鉢、ホモジナイザー、ガラスビーズ、ミリングマシーンなどを用いて所望の大きさになるまで細片化することができる。
【００２１】
海藻に含まれるアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天などの炭素源は海藻から以下の方法で抽出される。
(1)抽出工程
原料海藻をよく洗浄した後、アルカリを加えて加熱し、藻体中のアルギン酸を可溶化する。海藻に含まれているアルギン酸は、海水中のミネラルと塩をつくり、不溶性のゼリー状態で細胞壁間に充填されている。海藻にナトリウム塩を加えることで、アルギン酸の不溶性塩が水溶性のアルギン酸ナトリウムに置換され、藻体外に溶出する。
(2)ろ過工程
アルギン酸が十分に溶け出したら、ろ過して不溶性成分を除き、アルギン酸ナトリウムの溶液を得る。可溶化したアルギン酸の粘性により、抽出液は高い粘性を帯びる。これをろ過するためには大量の水を加えて希釈し、粘性を下げる。
(3)析出
アルギン酸ナトリウムの水溶液に酸を加えて pH を下げ、再び不溶性のアルギン酸として析出させる。酸の代わりにカルシウム塩を用いると、これも不溶性のアルギン酸カルシウムとして析出させることもできる。
(4)乾燥
析出したアルギン酸を脱水した後よく洗浄し、乾燥させてアルギン酸を得る。このアルギン酸をアルカリで中和すれば、アルギン酸塩となる。中和に用いるアルカリにナトリウムを使えばアルギン酸ナトリウムに、カリウムを使えばアルギン酸カリウムとなる。
【００２２】
上記のような工程で取得されたアルギン酸は、アルギン酸リアーゼによる酵素分解反応または酸による加水分解反応を行った後に、培地の炭素源として用いることが望ましい。例えば、海藻から発酵の主たる原料となる炭素源を得るには、海藻に塩酸やリン酸のような無機酸、硫酸のようなスルホン酸、酢酸、ギ酸のようなカルボン酸といった酸を添加して酸処理することにより海藻中の多糖の分解、すなわち糖化を促した海藻糖化液を得ることができる。
【００２３】
また、海藻から発酵の主たる原料となる炭素源を得るにはアルギン酸リアーゼ（EC.4.2.2.3）またはλ-カラギナーゼ(Lambda-carrageenase、EC 3.2.1.162)またはペクチナーゼの酵素活性を持つ酵素で酵素処理することが望ましい。酵素処理することで海藻中の多糖の分解、すなわち糖化を促した海藻糖化液を得ることができる。
前述の海藻糖化液を得るための工程である海藻の細片化、膨潤、酸処理、酵素処理の工程はそれぞれを独立して連続して行ってもよいし、いずれかの工程を同時に行ってもよい。また、これらの工程の順序を変えて行ってもよい。
【００２４】
アルギン酸リアーゼは、上述した酵素を利用することが出来、細胞内で直接発現させて
使用することも出来るし、別途単離したアルギン酸リアーゼを海藻処理物と反応させてアルギン酸を得てもよい。
【００２５】
ペクチナーゼはポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼなどが利用できる。
【００２６】
海藻に含まれるセルロースは、アルギン酸を含む多糖類を抽出、分離した後に、セルラーゼを加えることによって分解することが出来る。本発明において、セルラーゼとは、エンド−１，４−β−グルカナーゼとも称し、セルロースのβ１→４グルコシド結合を加水分解し、おもにセロビオースを生成する酵素を意味する。セルラーゼは、高等植物、細菌、糸状菌、木材腐朽菌、軟体動物などに存在する。本発明においては、セルラーゼの由来は問われず、微生物から抽出・精製したもの、或いは分子生物学的に製造したものを用いることもできる。
【００２７】
本発明の微生物は上記に例示される抽出工程により精製したアルギン酸塩を資化出来る微生物である。本発明においてアルギン酸塩とは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムを意味し、本発明の微生物は、アルギン酸、アルギン酸塩を炭素源として最少培地で生育できる微生物が好ましい。例えば培地中のアルギン酸を0.5g/L以上、望ましくは1g/L以上、さらに望ましくは2.5g/L以上資化できる微生物が好ましい。本発明においては、微生物の栄養増殖に必要な成分を最小限に含む培地を最少培地とする。
【００２８】
なお、本発明の微生物は、ビブリオ属細菌に属し、種名は、Vibrio rumoiensis  またはVibrio alginovoraから選択される。
【００２９】
本発明の微生物は、１６ＳリボソームRNA配列が配列番号１と95％以上の相同性を示す配列を有する特徴があるが、望ましくは96％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を有することが好ましい。定義される16SリボソームRNAを有するかどうかは、例えば16SリボソームRNA遺伝子の塩基配列データと既知種の配列データとを比較し、既知種の配列データとを比較し系統解析を行って決定することができる。系統解析及び系統樹の作成方法は、例えば以下の手順に従って行なう。
【００３０】
まず細菌から鋳型となるゲノムＤＮＡを抽出する。細菌からＤＮＡを抽出する方法は公知であり、いずれの方法を使用してもよい。一般的には、細胞をリゾチームなどの細胞壁分解酵素で処理する方法、ガラスビーズによる物理的破壊方法、凍結融解を繰り返す処理方法などが使用される。また市販のＤＮＡ抽出用の試薬も使用することができる。ゲノムＤＮＡは必ずしもインタクトな状態で抽出されなくてもよい。従って、試料のコンタミネーションの可能性が低く、操作が簡単で、迅速に行なうことのできる方法を適宜選択することができる。
【００３１】
次にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により１６ＳリボソームＲＮＡをコードする標的ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲにおいて使用されるプライマーの配列は、少なくともラクノスピラ科に属する全ての既知細菌の１６ＳリボソームＲＮＡをコードする標的ＤＮＡが増幅されるよう適宜設計することができるが、通常、生物種を超えて保存された配列からなるプライマー（ユニバーサルプライマー）が使用される。またＰＣＲの条件は特に限定されず、通常用いられる範囲内で適宜選択することができる。市販のＰＣＲ用試薬を使用して、添付の説明書に従って反応を行うことができる。
【００３２】
ＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片は、必要に応じてスピンカラムなどを用いて精製されたのち、その塩基配列が決定される。塩基配列の決定は定法に従って行なうことができる。
【００３３】
決定された塩基配列は、適当な遺伝子配列データベース及び相同性検索プログラムを用いて、既知の細菌１６ＳリボソームＤＮＡ配列とのホモロジー検索を行うことにより、最も高い相同性を示す既知配列を抽出することができる。例えば、日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）のホームページを通じて、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡが利用できる。プログラムとしてｂｌａｓｔｎやｆａｓｔａを選択し、決定された塩基配列をクエリーとし、検索対象データベースとして１６Ｓ ｒＲＮＡ（Prokaryotes）を選択して検索を実施すれば、高い相同性を示す既知配列が抽出され出力される。細菌の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列のデータセットを含む限り、いかなる他の遺伝子配列データベースも利用することができる。また、上記以外の自体公知の相同性検索プログラムを用いることもできる。
【００３４】
増幅したＤＮＡの塩基配列に基づき分子進化系統樹を推定し、単離された細菌の分類学的位置を特定することもできる。分子進化系統樹解析ソフトはインターネット等でも公開されており、それらを利用することができる（ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等）。系統樹解析の結果、単離された細菌がラクノスピラ科に属する細菌と同じクラスターにある場合、当該細菌を本発明のビブリオ属に属する細菌として同定することができる。
【００３５】
本発明の微生物は、上記に示される海藻及び海藻を食源として生育する生物から取得されえる。例えば、サザエ、アワビ、タツナミガイ、ウマヅラハギ、ブダイ、マダイ、ベラ等から取得されえる。
【００３６】
一態様において、本発明の細菌は、配列番号１で表される核酸配列と９５％以上の相同性を有する核酸配列を含む１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子、好ましくは配列番号１で表される核酸配列を含む１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有する。ここで配列番号１は、後述するビブリオ属に属する本発明の細菌の１つ（NITE P-01635株）の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列を示す。核酸配列間の相同性は、上記の相同性検索プログラムＢＬＡＳＴを使用して計算される
【００３７】
細菌が上記１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子を有することは、上述の１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析方法を用いて確認することができる。あるいは、下記に詳述する本発明の検出用試薬及び検出方法に従って、該遺伝子を特異的に検出し得るプライマー又はプローブを用いて、自体公知の方法（ＰＣＲ、サザンブロッティング、ＤＮＡアレイ等）により調べることが出来る。
【００３８】
本発明者らが単離した、本発明の細菌の一例の菌株（NITE P-01635株 本明細書中では、Vibrio sp. SA2とも呼ぶ）は、受託番号NITE P-01635で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に国内寄託されている（受託日：２０１３年６月１３日）。
【００３９】
なお、本発明の微生物は、さらに物質生産能を有するように改変されていることが好ましい。
【００４０】
本発明において、目的物質とは、本発明の微生物を用いて、目的物質が生産されれば、目的物質は問わないが、例えば、Ｌ−アミノ酸、核酸、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、プロピレン、１，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１−プロパノール、１，３−プロパンジオール、１，２−プロパンジオール、エチレングリコール、およびイソブタノールが望ましい。
【００４１】
本発明において、Ｌ−アミノ酸とは、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−
ロイシン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン及びＬ−アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸を意味する。
【００４２】
本発明において、核酸とは、プリンヌクレオシド、およびプリンヌクレオチドが挙げられる。プリンヌクレオシドとしては、イノシン、グアノシン、キサントシン、およびアデノシンが挙げられる。本発明の細菌は、１種のプリンヌクレオシドの生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上のプリンヌクレオシドの生産能を有していてもよい。本発明においては、１種のプリンヌクレオシドが製造されてもよく、２種またはそれ以上のプリンヌクレオシドが製造されてもよい。プリンヌクレオチドとしては、プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルが挙げられる。プリンヌクレオシドの５’−リン酸エステルとしては、イノシン酸（イノシン−５’−リン酸エステル；ＩＭＰ）、グアニル酸（グアノシン−５’−リン酸エステル；ＧＭＰ）、キサンチル酸（キサントシン−５’−リン酸エステル；ＸＭＰ）、およびアデニル酸（アデノシン−５’−リン酸エステル；ＡＭＰ）が挙げられる。
【００４３】
本発明において、Ｌ−アミノ酸の生産能力を有するように改変するためには、以下の方法が選択される。
【００４４】
＜アミノ酸生産菌＞
Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌は、上記のようなビブリオ属細菌の野生株にＬ−アミノ酸生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ−アミノ酸生産能を付与するためには、従来のコリネ型細菌、エシェリヒア属細菌等の育種に使用されてきた、栄養要求性変異株、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、または代謝制御変異株、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性が増強された組み換え株等の創製法を利用して育種することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター）。Ｌ−アミノ酸生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ−アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、Ｌ−アミノ酸生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
以下、各種アミノ酸生産能を付与するための方法を例示する。
【００４５】
Ｌ−リジン生産菌
例えば、Ｌ−リジン生産菌は、Ｌ−ホモセリン、又はＬ−スレオニン及びＬ−メチオニンを要求する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）-Ｌ−システイン、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム、ＤＬ−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ−ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。特にＬ−リジンアナログとして、S-(2-アミノエチル)-Ｌ−システイン（AEC）に耐性を有する変異株として育種することが好ましい。
【００４６】
ビブリオ属細菌から変異株を得るための変異処理法としては、紫外線照射、またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、ビブリオ属細菌の自然突然変異株を選択することによっても、Ｌ−アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を得ることができる。
【００４７】
Ｌ−アミノ酸アナログ耐性変異株は、例えば、変異処理したビブリオ属細菌を種々の濃度のＬ−アミノ酸アナログを含有する寒天培地に接種し、コロニーを形成する菌株を選択
することにより、取得することができる。
【００４８】
また、栄養要求性変異株は、ビブリオ属細菌のコロニーを目的の栄養物質（例えば、Ｌ−アミノ酸）を含む寒天培地に形成させ、これを前記栄養物質を含まない寒天培地にレプリカし、同栄養物質を含まない寒天培地で生育できない菌株を選択することにより、取得することができる。
【００４９】
次に、Ｌ−リジン生合成系酵素の活性の増強によってＬ−リジン生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
【００５０】
Ｌ−リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
【００５１】
ビブリオ属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、ビブリオ属で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをビブリオ属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
【００５２】
DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、ビブリオ属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株及びビブリオ・ナトリージェンスIFO15636株等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12やビブリオ・ナトリージェンスIFO15636等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。
【００５３】
また、ビブリオ属の遺伝子は以下のGenBankのデータベースを利用することによって取得できる。
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032
Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020
Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome I, complete sequence; BA000037
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome II, complete sequence; BA000038
【００５４】
アルギン酸リアーゼ活性を持ちアルギン酸を分解できることが知られているビブリオ属
細菌としては以下の微生物種を挙げることができる
Vibrio alginolytics
Vibrio splendidus 
Vibrio kanaloaei
Vibrio pomeroyi
Vibrio chagasii
Vibrio lentus 
Vibrio cyclitrophicus
Vibrio crassostreae
Vibrio halitiocoli
【００５５】
また、ビブリオ属の遺伝子は下記表に記載のGenBankのデータベースのIDを参照することによって取得できる。具体的には、NCBIのURL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/から下記表のAssembly IDを入力し、各々のAssembly IDについてWGS(Whole Genome Sequence) Projectのページからダウンロードすることによってビブリオ属の遺伝子を取得することができる。
【００５６】
【表１−１】
2016192902.tif 000003
【００５７】
【表１−２】
2016192902.tif 000004
【００５８】
【表１−３】
2016192902.tif 000005
【００５９】
【表１−４】
2016192902.tif 000006
【００６０】
【表１−５】
2016192902.tif 000007
【００６１】
【表１−６】
2016192902.tif 000008
【００６２】
【表１−７】
2016192902.tif 000009
【００６３】
【表１−８】
2016192902.tif 000010
【００６４】
【表１−９】
2016192902.tif 000011
【００６５】
【表１−１０】
2016192902.tif 000012
【００６６】
【表１−１１】
2016192902.tif 000013
【００６７】
本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。ビブリオ属由来の野生型DDPSはＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、ビブリオ属由来の野生型AKIIIはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、ビブリオ属細菌に導入するdapA及びlysCは、それぞれＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであることが好ましい。
【００６８】
尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
【００６９】
また、アルパルトキナーゼをコードする遺伝子は、ホモログが存在することがあり、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、遺伝子源は限定されない。
【００７０】
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、１×Ｓ
ＳＣ、0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、さらに好ましくは、68℃、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００７１】
なお、アスパルトキナーゼ活性は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法によって測定することができる。また遺伝子はいずれも野生型遺伝子には限られず、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、各遺伝子の上記のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、上記機能が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。
【００７２】
保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。
【００７３】
各遺伝子の上記オープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の相同性を有し、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
【００７４】
遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
【００７５】
また、ビブリオ属で機能するベクターとは、例えばビブリオ属で自律複製出来るプラスミドであれば、いずれでも用いることが出来る。ベクタープラスミドとしては、pUC系、pACYC184系、IncQ由来のoriを持つvector plasmidならどのようなものでも使用できる．選択に用いるマーカー遺伝子としてはTn903由来カナマイシン耐性遺伝子、Tn9由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる。
【００７６】
dapA及びlysCとビブリオ属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。dapA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
【００７７】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００７８】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００７９】
上記のように調製した組換えＤＮＡをビブリオ属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。
【００８０】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA及び／又はlysCをビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。ビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び／又はlysCを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及び／又はlysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。
【００８１】
DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA及び／又はlysCのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。発現調節配列の置換は、dapA及び／又はlysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
【００８２】
なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡ
の調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
【００８３】
DDPS活性及び／又はAK活性の増強に加えて、他のＬ−リジン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
【００８４】
本発明のビブリオ属細菌はＬ−リジン排出活性を増強させることによってＬ−リジン生産能が高められた細菌であってもよい。例えば、ybjE遺伝子の発現量を増加させること、lysE遺伝子の発現量を増加させることでＬ−リジン排出活性を高めることができる（特開2005-237379、WO97/23697号パンフレット）。
【００８５】
さらに、本発明の細菌は、さらに、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分岐してＬ−アミノ酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットを参照にして構築できる。
【００８６】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、又はIS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００８７】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでビブリオ属に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来
の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００８８】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素活性を増強する方法、酵素活性を低下させる方法は、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種にも同様に適用することができる。以下、他のＬ−アミノ酸生産菌の育種方法について述べる。
【００８９】
Ｌ−トリプトファン生産菌は、例えば、アントラニル酸合成酵素活性、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ活性もしくはトリプトファンシンターゼ活性のうち、１又は２以上の活性が増強するように改変することによって構築できる。ここで、アントラニル酸合成酵素及びホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼは、それぞれＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるため、脱感作型の変異酵素を保持させることにより、酵素活性をより強化することができる。具体的には、例えば、アントラニル酸合成酵素遺伝子（trpE）、及び／又はホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ遺伝子（serA）を、フィードバック阻害を受けないように変異させ、得られた変異型遺伝子をビブリオ属に属する細菌に導入することによって、脱感作型酵素を保持する細菌を取得することができる。（国際公開第94/08031号パンフレット参照）
【００９０】
また、トリプトファンオペロンを含む組換えＤＮＡが導入された細菌も、好適なＬ−トリプトファン生産菌である。具体的には、脱感作型アントラニル酸合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンを導入する方法が挙げられる。（特開昭57-71397号公報、特開昭62-244382号公報、米国特許第4,371,614明細書）。また、トリプトファンオペロンのうち、トリプトファンシンターゼをコードする遺伝子（trpBA）の発現を強化することによっても、Ｌ−トリプトファン生産能を向上又は付与することができる。トリプトファンシンターゼは、α及びβサブユニットからなり、それぞれtrpA、trpBによってコードされている。
【００９１】
また、トリプトファンオペロンのリプレッサーであるtrpRを欠損させたり、trpRに変異を導入することによっても好適なＬ−トリプトファン生産菌が得られる（米国特許第4,371,614号公報、国際公開第WO2005/056776号パンフレット）。
【００９２】
さらに、Ｌ−トリプトファン生産菌は、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン要求性の形質を有するように改変することによっても構築できる。
【００９３】
また、Ｌ−トリプトファン生産菌としては、３−フォスフォセリンフォスファターゼ（serB）活性を増大した株（US4,371,614）すること、フォスフォエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（pckA）を増大した株することによっても構築できる。
【００９４】
Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシンは共に芳香族アミノ酸で生合成系が共通しており、芳香族アミノ酸の生合成系酵素をコードする遺伝子としては、デオキシアラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼ(aroG)、３−デヒドロキネートシンターゼ（aroB）、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ（aroL）、５−エノール酸ピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ（aroA）、コリスミ酸シンターゼ(aroC)が挙げられる。（欧州出願公開763127号明細書）従って、これらの酵素をコードする遺伝子をプラスミド、あるいはゲノム上で多コピー化することにより、芳香族アミノ酸の生産能を向上させることができる。また、これらの遺伝子はチロシンリプレッサー（tyrR）によって制御さ
れることが知られており、tyrR遺伝子を欠損させることによって、芳香族アミノ酸の生合成系酵素活性を上昇させてもよい。（欧州特許763127号明細書参照）また、それぞれのアミノ酸生産能を強化する場合、目的とする芳香族アミノ酸以外の生合成系を弱化させてもよい。例えば、目的アミノ酸がＬ−トリプトファンの場合、Ｌ−フェニルアラニン生合成系、Ｌ−チロシン生合成系を弱化させてもよい。（US4,371,614）
【００９５】
また、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロン酸−７−リン酸シンターゼ（aroF、aroG）は、芳香族アミノ酸によるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を受けないように改変してもよい。例えば、エシェリヒア・コリのaroFを用いる場合、Ｎ末端より１４７番目のＬ−アスパラギン酸または１８１番目のＬ−セリンを他のアミノ酸残基に、aroGの場合、Ｎ末端より１４６番目のＬ−アスパラギン酸、１４７番目のＬ−メチオニン、１５０番目のＬ−プロリンもしくは２０２番目のＬ−アラニンの１アミノ酸残基、または１５７番目のＬ−メチオニン及び２１９番目のＬ−アラニンの２アミノ酸残基を他のアミノ酸に置換した変異型aroF、aroG遺伝子を宿主に導入することによって、芳香族アミノ酸生産菌を得ることができる。（EP0488424）
【００９６】
Ｌ−フェニルアラニン生産菌としては、上述のような改変のほかに、tyrA,tyrRを欠損させた株や、フェニルアラニン排出遺伝子であるyddG、又はyedA遺伝子を増幅した株を用いることができる。
【００９７】
Ｌ−スレオニン生産能を有するビブリオ属に属する細菌として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素を強化するように改変することによって取得できる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、アスパルトキナーゼIII遺伝子（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI遺伝子（thrA）、ホモセリンキナーゼ遺伝子（thrB）、スレオニンシンターゼ遺伝子（thrC）が挙げられる。これらの遺伝子は２種類以上導入してもよい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたビブリオ属に属する細菌に導入してもよい。例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性を低下させることによって、スレオニン分解を抑制することができる。
【００９８】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンにより阻害を受け、また、アテニュエーションにより発現が抑制される。したがって、この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）。
【００９９】
また、Ｌ−スレオニンによるフィ−ドバック阻害を受けないようにビブリオ属細菌を改変するために、α−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（AHV）に耐性を付与してもよい。
【０１００】
また、アスパルトキナ−ゼIII遺伝子（lysC）は、Ｌ−リジンによるフィ−ドバック阻害を受けないように改変した遺伝子を用いることが望ましい。このようなフィ−ドバック阻害を受けないように改変したlysC遺伝子は、上述に記載した遺伝子より取得できる。
【０１０１】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子やそ
れらの遺伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することもＬ−スレオニン生産菌の育種に好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナーゼ遺伝子（pntAB）（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）が挙げられる。
【０１０２】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、及び／又はＬ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、及び／又はＬ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123−135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る。
【０１０３】
Ｌ−グルタミン酸生産能を有するビブリオ属細菌を構築するためには、Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増大するように改変することが望ましい。Ｌ−グルタミン酸生合成に関与する酵素としては、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「GDH」ともいう）（gdhA）、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF,
lpdA)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)などが挙げられる。これらの酵素遺伝子の中では、CS、PEPC及びGDHのいずれか１種以上が好ましく、３種全てがより好ましい。（米国特許6,197,559号、6,331,419号明細書、欧州特許0999282号明細書）
【０１０４】
また、さらに６−ホスホグルコン酸デヒドラターゼ活性もしくは２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性、又はこれらの両方の活性が増大するように改変してもよい（欧州特許出願公開1352966号明細書）し、Ｌ−グルタミン酸を排出するタンパク質をコードするyhfK遺伝子（WO2005/085419号パンフレット）やybjL遺伝子（WO2008/133161パンフレット）エシェリヒア・コリ由来のybjL遺伝子を配列番号２に、アミノ酸配列を配列番号３に示す。
【０１０５】
また、Ｌ−グルタミン酸生産能を有するビブリオ属に属する細菌としては、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下または欠損させた細菌を用いてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素としては、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼなどが挙げられる。この中では特に、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましく、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損した菌株は、欧州特許0952221号公報、0955368号公報、米国特許5,378,616号公報を参照にして構築することが出来る。
【０１０６】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する細菌としては、Ｌ−ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量が増大した細菌を用いてもよい。Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ATP フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、フォスフォリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ（hisI）、フォスフォリボシル-ATP ピロフォスフォヒドラーゼ（phosphoribosyＬ−ATP pyrophosphohydrolase）（hisIE）、フォスフォリボシルフォルミミノ−５−アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼ（phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase）（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（amidotransferase）(hisH）、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチヂノールフォスファターゼ（hisB）、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ（hisD）等が挙げられる。
【０１０７】
また、スルファグアニジン、D,Ｌ−1,2,4-triazole-3-alanine、及びストレプトマイシン耐性を付与することによってもＬ−ヒスチジン生産菌が得られる（ロシア2119536号）。
【０１０８】
Ｌ−システイン生産菌を構築するためには、シスタチオニン−β−リアーゼ活性が低下するように改変すること（特開2003-169668号公報）や、Ｌ−システインによるフィードバック阻害が低減されたセリンアセチルトランスフェラーゼを保持させるように改変することが好ましい。（特開平11-155571号公報）
【０１０９】
Ｌ−アルギニン生産菌を得るためには、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するように改変することが好ましい。また、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するように改変することも、Ｌ−アルギニン生産菌の育種法として好適である。
【０１１０】
またＬ−アルギニン生産能を有するビブリオ属細菌として、Ｌ−アルギニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現量を増大させた細菌を用いることが出来る。例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素しては、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。中でもN-アセチルグルタミン酸シンターゼ遺伝子（argA）としては、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換され、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型酵素をコードする変異型遺伝子を用いるとより好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【０１１１】
Ｌ−ロイシン生産菌は、ilvE遺伝子にコードされる分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼを不活性化させ、tyrB遺伝子にコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を増大させること（特開2004-024259）、または4-アザロイシン又は5,5,5−トリフルオロロイシン耐性を有するように改変することによって取得することができる。また、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作する用に改変すること、（欧州特許第1067191号明細書）、β−２−チエニルアラニン及びβ−ヒドロキシロイシンに耐性を有するように改変すること（米国特許第5,763,231号明細書）によっても好適なＬ−ロイシン生産菌を構築することが出来る。
【０１１２】
Ｌ−イソロイシン生産菌は、６−ジメチルアミノプリン耐性（特開平5-304969号公報）
、Ｌ−イソロイシンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）、チアイソロイシン耐性（特開平5-130882号公報）、ＤＬ−エチオニン耐性（特開平5-130882号公報）、またはアルギニンハイドロキサメート耐性（特開平5-130882号公報）を付与することによって取得することができる。また、組換え体ビブリオ属細菌は、Ｌ−イソロイシン生合成酵素であるスレオニンデアミナーゼあるいはアセトヒドロキシ酸シンターゼをコードする遺伝子をプラスミドで増強する方法（特開平2-458号公報、特開平2-42988号公報、特開平8-47397号公報）等によって得られる。
【０１１３】
Ｌ−バリン生産菌は、WO96/06926に記載されているような、生育のためにリポ酸を要求する変異または／及びプロトンATPaseを欠損する変異を有するように改変すること、あるいは、少なくともilvG、ilvM、ilvE及びilvDの各遺伝子を発現し、ilvGMEDAオペロンを含むＤＮＡ断片を細胞内に導入することによって構築することができる。尚、ilvGMEDAオペロンは、Ｌ−バリン及び／又はＬ−イソロイシン及び／又はＬ−ロイシンによるオペロンの発現調節（アテニュエーション）を受けるので、生成するＬ−バリンによる発現抑制を解除するために、アテニュエーションに必要な領域が除去又は変異されていることが好ましい（米国特許5,998,178号明細書）。また、ilvGMEDAオペロンは、スレオニンデアミナーゼ活性を発現しないことが好ましい。
【０１１４】
また、本発明に用いるＬ−アミノ酸生産菌は、固有の生合成系酵素をコードする遺伝子以外に、糖の取り込み、糖代謝（解糖系）、エネルギー代謝に関与する遺伝子が増幅されていてもよい。
【０１１５】
糖代謝に関与する遺伝子としては、解糖系酵素をコードする遺伝子や糖の取り込み遺伝子が挙げられ、グルコース６−リン酸イソメラーゼ遺伝子（pgi；国際公開第01/02542号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;  欧州出願公開877090号明細書）、ホスホグルコムターゼ遺伝子（pgm；国際公開03/04598号パンフレット）、フルクトース二リン酸アルドラーゼ遺伝子（fba;国際公開03/04664号パンフレット）、ピルビン酸キナーゼ遺伝子（pykF;国際公開03/008609号パンフレット）、トランスアルドラーゼ遺伝子（talB;国際公開03/008611号パンフレット）、フマラーゼ遺伝子（fum;国際公開01/02545号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子（pps;欧州出願公開877090号パンフレット）、non-PTSシュクロース取り込み遺伝子遺伝子（csc;欧州出願公開149911号パンフレット）、シュクロース資化性遺伝子（scrABオペロン；国際公開第90/04636号パンフレット）が挙げられる。
【０１１６】
エネルギー代謝に関与する遺伝子としては、トランスヒドロゲナーゼ遺伝子（pntAB;米国特許 5,830,716号明細書）、cytochromoe bo type oxidase遺伝子(cyoB 欧州特許出願公開1070376号明細書)が挙げられる。
【０１１７】
＜イソプロピルアルコール生産菌＞
イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、イソプロピルアルコール生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、アセ卜酢酸デカルボキシラーゼ、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ、CoAトランスフェラーゼ、及びチオラーゼが挙げられる（WO2009/008377A1）。特に、これら４種酵素全ての活性を増強するのが好ましい。また、イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、GntR（gntR）の活性が低下するように微生物を改変する方法が挙げられる。GntRとは、グルコン酸の代謝系をコードするオペロンの発現を負に制御する転写因子を指す。同オペロンは、具体的には、グルコン酸の取り込み系とグルコン酸のリン酸化酵素をコードする。例えば、エシェリヒア・コリには、２つのグルコン酸の代謝系、GntI系とGntII系、が存在するが、GntRはそれら両方の発現を抑制
する。
【０１１８】
イソプロピルアルコール生産能を有する微生物は、乳酸デヒドロゲナーゼの活性が低下するように改変されていてよい。このような改変により、酸素供給が制限された培養条件下においても、乳酸の生産が抑制され、イソプロピルアルコールを効率よく生産することができる。酸素供給が制限された培養条件とは、気体として空気のみを用いる場合には、一般的に０．０２ｖｖｍ〜２．０ｖｖｍ（ｖｖｍ；通気容量〔ｍＬ〕／液容量〔ｍＬ〕／時間〔分〕）、回転数２００〜６００ｒｐｍのことをいう。
【０１１９】
＜アセトン生産菌＞
アセトンは、イソプロピルアルコール生産におけるイソプロピルアルコールの前駆体である。よって、アセトン生産能は、イソプロピルアルコール生産能を付与又は増強するための方法を一部利用することにより、付与又は増強することができる。例えば、アセトン生産能は、イソプロピルアルコールデヒドロゲナーゼ以外の上記例示したイソプロピルアルコール生合成系酵素、すなわちアセ卜酢酸デカルボキシラーゼ、CoAトランスフェラーゼ、及びチオラーゼ、から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変することにより、付与又は増強することができる。
【０１２０】
＜エタノール生産菌＞
また、エタノール生産能を有する微生物としては、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ldhA）を欠損し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhB）が導入された変異株や、同株のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppc）をさらに欠損させた株が挙げられる（J Mol Microbiol Biotechnol 2004, 8, 243-254）。また、エタノール生産能を有する微生物としては、ピルビン酸・ギ酸リアーゼ遺伝子（pfl）およびフマル酸レダクターゼ遺伝子（frd）を欠損し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas
mobilis）由来のピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（pdc）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（adhB）が導入された株も挙げられる（Ann N Y Acad Sci. 2008, 1125, 363-372）。
【０１２１】
＜２＞本発明の製造法
本発明の目的物質の製造法は、上述の方法によって目的物質生産能を有するように育種されたビブリオ属に属する微生物を海藻から得られた炭素源を含む培地で培養して、目的物質を該培地中に生成蓄積させ、該培地又は菌体より目的物質を回収する方法である。
【０１２２】
使用する培地は、微生物を用いた目的物質の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、海藻から得られた炭素源を用いることが出来る。
【０１２３】
海藻から得られた炭素源とは、アルギン酸、セルロース、グルコース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天が挙げられる。褐藻類ではアルギン酸とマンニトールとグルコースを5:8:1の割合で含む(20 January 2012 VOL335 SCIENCE)    
培地には海藻から得られた炭素源が含まれていれば、その他の糖源例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、グリセロール、エタノールが含まれていても構わない。
【０１２４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて
、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。また、本発明の微生物を培養する際には、ある一定濃度の塩を含んでいることがなお好ましい。塩とは目的物質がカウンタイオンと結合して塩化したものでもよいし、食塩（NaClでもよい）なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【０１２５】
また生育や生産性を向上させるようなＬ−アミノ酸を添加する場合がある。例えばＬ−リジン発酵の場合、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシンを、Ｌ−スレオニン発酵の場合、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ホモセリンを、Ｌ−トリプトファン発酵では、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等を添加することが好ましい。添加濃度は0.01-10g/L程度である。
【０１２６】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜３７℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【０１２７】
尚、本発明においては、NaClを培地中に0.5％以上存在させることが好ましく、好ましくは０．５〜４％、さらに好ましくは０．７〜３．５％培地中に存在させることが好ましい。
【実施例】
【０１２８】
＜実施例１＞Vibrio sp. SA2株の取得
石川県七尾市灘浦地区で採取されたサザエをアルギン酸資化可能新規微生物のスクリーニングに用いた（採取された場所  北緯：37.0981  東経：137.0499付近の海）。
【０１２９】
120℃、0.15MPaで20分間オートクレーブ処理することにより滅菌したダイゴ人工海水SP溶液(和光純薬社製、組成は下記参照)に、前述のサザエの殻をハンマーで砕き、緑褐色の消化管内容物を青エーゼで1ループすくいとって懸濁した。重合度2000以上のアルギン酸ナトリウム（和光純薬社製一級試薬  300-400cP カタログ番号：192-09995）のみを炭素源として含むアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地（組成は下記参照）にサザエ消化管の懸濁液を適宜ダイゴ人工海水で希釈してプレーティングした。培養温度25℃で培養時間75時間静置培養し、多数のコロニー形成を確認した。
【０１３０】
エーゼでコロニーをかきとり、生理食塩水に懸濁した後生理食塩水で3回洗浄した後、新たに調製したアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地にプレーティングし、培養温度37℃で培養時間50時間静置培養し、コロニー形成を確認した株をさらにアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地でSIして、LB液体培地に15g/LのNaClを追加添加した培地4mLに懸濁して試験管培養を行った。培養温度は37℃、往復撹拌速度120rpmの条件で試験管振とう培養して吸光度600nmのODが0.3程度になったところで等量の滅菌20%グリセロールを加え-80℃で冷凍してグリセロールストックを作製し、超低温庫で保存した。最も早期にシングルコロニーを形成した菌株をSA2株と命名した。
【０１３１】
ダイゴ人工海水SP組成
MgCl2・6H2O       9.474g/L
CaCl2・2H2O       1.328g/L
Na2SO4             3.505g/L
KCl                0.597g/L
NaHCO3            0.171g/L
KBr                0.085g/L
Na2B4O7・10H2O    0.034g/L
SrCl2               0.012g/L
NaF                  3mg/L
LiCl                  1mg/L
KI                   0.07mg/L
CoCl2・6H2O          0.0002mg/L
AlCl3・6H2O          0.008mg/L
FeCl3・6H2O          0.006mg/L
Na2WO4・2H2O        0.0002mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O  0.0008mg/L
NaCl                 20.747g/L
【０１３２】
アルギン酸ナトリウム選抜寒天培地 組成
アルギン酸ナトリウム     5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NaCl                    0.5 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   21.247g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
MgCl2・6H2O         9.474g/L
CaCl2・2H2O         1.328g/L
Na2SO4               3.505g/L
KCl                  0.597g/L
NaHCO3              0.171g/L
KBr                  0.085g/L
Na2B4O7・10H2O      0.034g/L
SrCl2                 0.012g/L
NaF                    3mg/L
LiCl                   1mg/L
KI                    0.07mg/L
CoCl2・6H2O          0.0002mg/L
AlCl3・6H2O          0.008mg/L
FeCl3・6H2O          0.006mg/L
Na2WO4・2H2O        0.0002mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O   0.0008mg/L
Bacto Agar               15g/L
【０１３３】
＜実施例２＞Vibrio sp. SA2株の分子系統樹解析
SA2株のグリセロールストック50μLをLB液体培地に15g/LのNaClを添加した寒天培地で37℃、16時間静置培養して得た菌体から、PurElute Bacterial Genomid Kit(Edgebio社製)を用いて全ゲノムDNAを抽出した。得られた全ゲノムDNAを次世代シークエンサーMiseq(イルミナ社製)にて分析し、BLAST解析（非特許文献  Altshul, et al. ''Gapped BLAST and
PSI-BLAST: new generation of protein database search programs '' (1997) Nucleic
Acids Research. 25.p3389-3402）によって16S rRNA遺伝子全長の配列を取得した（配列
番号１）。その結果、SA2株はVibrio rumoiensis type strain S-1株(DSM19141株)と16S rRNA遺伝子全長配列の比較において99.5%の相同性を示した(2塩基のギャップによる相違と6塩基の置換による相違を含む。図１)。
【０１３４】
得られたSA2株の16S rRNA遺伝子全長配列から分子系統樹推定ソフトウェアMEGA ver.5.0(非特許文献Tamura, et al. ''MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods '' (2011) Mol.Biol.Evol.28.p2731-2739)を用いて近隣結合法（非特許文献Saitou, et al. ''The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenic trees''
(1987) Mol.Biol.Evol.4.p406-425）によって分子系統樹を作製した（図２）。近隣結合法に用いる塩基置換モデルとしてはKimura 2-parameter modelを用いた (非特許文献imura. ''A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences'' (1980) J.Mol.Evol.16.p111-120
参照) 。また作製した分子系統樹の樹形の信頼性を評価するため、1000回反復してブートストラップ法による検証を行った。（Felsenstein.''Confidence limits on phylogenics: an approach using the bootstrap'' (1985) Evolution.39.p783-791参照）
【０１３５】
分子系統解析の結果、SA2株はVibrio属の種によって形成されるクラスターに属することが明らかとなった。SA2株は、Vibrio rumoiensis、Vibrio litoralis、Vibrio caseiにより形成されるクラスターに属することがブートストラップ値98％で支持された。また、SA2株はVibrio rumoiensisとクラスターを形成し、そのクラスターは89％のブートストラップ値で支持された。以上の結果より、SA2株はVibrio属の近縁種であることが明らかになった。そのため、SA2株をVibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）と命名した。
【０１３６】
＜実施例３＞DNA-DNAハイブリダイゼーション法によるVibrio sp. SA2株の種の同定
Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）は、BLAST解析から、16S rRNA遺伝子全長配列の相同性が、Vibrio rumoiensisと99.5%、Vibrio litoralisと97.9%、Vibrio caseiと96.3%であった。16S rRNA遺伝子全長配列の相同性が98.7%未満の微生物種は別種であると判断できるとの報告があるため、Vibrio sp. SA2株はVibrio rumoiensisとのみ同種の微生物である可能性が考えられた。（Stackebrandt, et al.''Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards.'' (2006)Microbiol. Today. 33.p152-155.）
【０１３７】
そこで発明者らは、DNA-DNAハイブリッド形成試験によるVibrio sp. SA2株の種の同定をVibrio sp. SA2株とVibrio rumoiensis type strain の間で固定側DNAとプローブ側DNAを交換して3回ずつ実施した。（川村好章著‘’細菌の系統分類と同定方法’’(2000)日本細菌学雑誌.55.p545-584、鈴木健一朗ら編‘’微生物の分類・同定実験法  分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に’’(2000)p34-47参照）
【０１３８】
その結果、Vibrio sp. SA2株とVibrio rumoiensis type strainのゲノムDNAは36−39％の値を示し、平均で37.5％の相同値を示した(下記表２)。現在、微生物の種はDNA-DNAハイブリッド形成試験による相同値の比較の結果、70％以上の相同値を示す菌株同士を同種とすると定義されている（Wayne, et al.''Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics.'' (1987)Int. J. Syst. Bacteriol.37.p463-464.参照）。そのため、Vibrio sp. SA2株はVibrio rumoiensis type strainと別種に属する新規種の微生物であるとわかった。
【０１３９】
【表２】
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【０１４０】
＜実施例４＞Vibrio sp. SA2株の最少培地での試験管培養
従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株の特徴として、40℃では高温すぎるため生育不可能であることと、アルギン酸リアーゼ活性を持たず、アルギン酸資化能がないことが報告されていた（Garrity, et al.（2005）Bergey's manual of systematic bacteriology  2nd  Edition PartB p526-527）。そこで、発明者らはVibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後、メインの培養として下記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続9時間試験管培養を行なった。その結果、Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のアルギン酸資化による有意な生育が見られた。そのため、Vibrio sp. SA2株は従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株とは異なったアルギン酸資化能を有する新規微生物株であることが示された。
【０１４１】
アルギン酸ナトリウム最少液体培地 組成
アルギン酸ナトリウム     2.5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   15.5g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
【０１４２】
＜実施例５＞Vibrio sp. SA2株の最少培地での比最大増殖速度測定
Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl 15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後、上記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。
【０１４３】
同様の試験管培養をメインの培養に用いた培地を下記に示す２種の、グルコースを単一炭素源とするM9最少培地にそれぞれ変更して37℃、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。結果を表３及び図３に示す。得られた生育のデータから、各々の条件での比最大増殖速度を測定した（図４）。その結果、アルギン酸ナトリウム最少液体培地でのVibrio sp. SA2株の比最大増殖速度がエシェリヒア・コリMG1655株のグルコースM9液体培地
での比増殖速度の約2倍であることが明らかとなった。
【０１４４】
グルコースM9液体培地 組成
グルコース               2.5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   0.5g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
【０１４５】
グルコースM9 NaCl液体培地 組成
グルコース               2.5g/L
Na2HPO4                6 g/L
KH2PO4                 3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                   15.5g/L
MgSO4・7H2O           0.246g/L
Thiamine・HCl         10mg/L
【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
＜実施例６＞Vibrio sp. SA2株のアルギン酸ナトリウム最少培地での生育可能温度測定
Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養した。また、Vibrio rumoiensis S-1株(DSM 19141株)のグリセロールストックをLB NaCl15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度31.5℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後、上記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、培養温度条件を37℃から43℃まで１℃ずつ変更した上、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。その結果、表４に示すようにVibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）は40℃の培養温度でアルギン酸ナトリウム最少液体培地で良好に生育し、Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）が40℃でアルギン酸ナトリウムを資化可能な微生物であることが示された。以上の実験結果より、Vibrio sp. SA2株は従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株とは異なった40℃の高温で生育可能なアルギン酸資化能を有する新規微生物種に属する新規微生物株であることが示された。
【０１４８】
【表４】
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【０１４９】
＜実施例７＞Vibrio sp. SA2株へのＬ−グルタミン酸生産能付与
エシェリヒア・コリMG1655株のゲノムDNAをPurElute Bacterial Genomic kit(Edgebio社製)を用いて抽出した。得られたゲノムDNAをテンプレートとして、配列番号３に示したYbjLタンパク質をVibrio sp. SA2株において異種発現させるため、配列番号４、配列番号５に示したプライマーでPCR反応を行い、増幅されたDNAを定法にしたがい精製し、制限酵素HindIII、SalIで消化したベクターpMW219（ニッポンジーン社製）にIn-Fusion HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて連結して、ybjL増幅発現用プラスミドpMW219-ybjLを構築した。
【０１５０】
Vibrio sp. SA2株を、LB NaCl 15g/L液体培地40mLで坂口フラスコ2本にてOD600nmが0.5前後まで培養温度37℃、撹拌速度120rpmにて振とう培養した。得られた培養液80mLを回転速度7000rpm、運転時間7min、温度4℃の条件で遠心集菌した。氷上で冷やした滅菌された2mM HEPES, 100mM Sucrose,5mM CaCl2溶液15mLで2回洗浄（懸濁後、回転速度7000rpm、運転時間7min、温度4℃の条件で遠心集菌）の後、滅菌された10% グリセロール溶液1mLに懸濁し、Vibrio sp. SA2株のエレクトロコンピテントセルを取得した。Vibrio sp. SA2株の100μLにエタノール沈殿したpMW219-ybjLプラスミドDNA(1μg以上)を加え、1.8kV 25μFでエレクトロポレーションして、Vibrio sp. SA2株にpMW219-ybjLを導入した。エレクトロポレーションしたエレクトロコンピテントセルに、LB NaCl 15g/L液体培地を0.5mL添加し、37℃で2.5時間静置培養して回復培養としたあと、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L寒天培地で24時間静置培養を行い、コロニー形成を確認した。得られたコロニーをさらに40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L寒天培地でSIして、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L液体培地4mLに懸濁して試験管培養を行った。培養温度は37℃、往復撹拌速度120rpmの条件で試験管振とう培養して吸光度600nmのODが0.3程度になったところで等量の滅菌20%グリセロールを加え-80℃で冷凍してグリセロールストックを作製し、得られた株のグリセロールストックをVibrio sp. SA2/ pMW219-ybjL株のグリセロールストックと命名した。
【０１５１】
アルギン酸ナトリウム5gを100mLの3N 硫酸に添加し、65℃で3時間加温処理を行った。得られたアルギン酸ナトリウム加水分解物溶液をKOHを加えてpHが7.0となるように調製し、アルギン酸ナトリウム加水分解物糖液を取得した。得られたアルギン酸ナトリウム加水分解物糖液を用いて下記に示すアルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地を調製した。
【０１５２】
アルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地 組成
アルギン酸ナトリウム加水分解物     2.5g/L
Na2HPO4                          6 g/L
KH2PO4                           3 g/L
NH4Cl                             1 g/L
NaCl                            15.5g/L
MgSO4・7H2O                   0.246g/L
Thiamine・HCl                   10mg/L
カナマイシン                       40mg/L
【０１５３】
Vibrio sp. SA2/ pMW219-ybjL株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、40 mg/Lのカナマイシンを含むLB NaCl 15g/L寒天培地に均一に塗布し、30℃にて48時間静置培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、0.5mLの生理食塩水にけん濁し分光光度計U-2000（日立社製）で波長600nmの濁度を測定した。得られた菌を含むけん濁液を、L字試験管にはりこんだ5 mLの前述のアルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地に、波長600nmの濁度が0.05になる液量を接種し、振とう培養装置TN-1506 (アドバンテック東洋社製)で回転攪拌数70rpm、34℃において22時間培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量をバイオテックアナライザーAS310（サクラ精機社製）を用いて測定した。
【０１５４】
結果を表５に示す。表５に示すように、アルギン酸を単一の炭素源として資化できる微生物として単離したVibrio sp. SA2株に、pMW219-ybjLを導入してＬ−グルタミン酸生産能を付与した菌株は、アルギン酸を単一の炭素源とする培地にて著量のＬ−グルタミン酸を蓄積した。
【０１５５】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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