(57)【要約】【課題】副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症又はリンパ球性下垂体前葉炎の検査方法及び検査試薬を提供する。【解決手段】検体中の、Rab GDIαと免疫学的に反応する抗体を検出することにより副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症又はリンパ球性下垂体前葉炎を検査する。この抗体の検出は、例えば、この抗体と免疫学的に反応する抗原を用いる免疫学的方法により行われる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の、Rab GDIαと免疫学的に反応する抗体を検出することにより副腎皮質刺激ホル
モン単独欠損症又はリンパ球性下垂体前葉炎を検査することを特徴とする副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症又はリンパ球性下垂体前葉炎の検査方法。
【請求項２】
前記抗体が、ヒトRab GDIα又は抗原性を有するその部分断片と免疫学的に反応する請求
項１記載の検査方法。
【請求項３】
前記抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより前記抗体を検出する請求項１又は２に記載の検査方法。
【請求項４】
請求項３記載の検査方法に用いるための、前記抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症又はリンパ球性下垂体前葉炎用の検査試薬。
【請求項５】
前記抗原が、ヒトRab GDIα又は抗原性を有するその部分断片である請求項４記載の検査
試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症又はリンパ球性下垂体前葉炎の検査方法及び検査試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
副腎皮質刺激ホルモン単独欠損症（IAD）は、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）の産生が
不十分であることを特徴とする。副腎皮質刺激ホルモン放出因子に対するACTH応答がないことによって示されるように、IADは下垂体に原因があると思われている。その発症機序
は未だ解明されていないが、部分的にはIADは自己免疫機序によって引き起こされると考
えられている。IADは他の自己免疫障害、例えば、慢性甲状腺炎を伴うことが多い［非特
許文献１］。くわえて、IADは特発性副甲状腺機能低下症および１型糖尿病も伴うことが
あり、すべてではないがIADの幾つかの型に多腺性自己免疫不全プロセスが、関与するこ
とが示唆されている［非特許文献２〜４］。これらの知見は、IADの発症機序に自己免疫
プロセスが関与することを強く示唆する。IADにおいて抗下垂体抗体が存在することを示
唆する証拠が幾つかある［非特許文献５〜９］。さらに、IAD患者の血清が下垂体のACTH
分泌細胞を選択的に標的とすることが報告されている［非特許文献８、１０、１１］。Ｓａｕｔｅｒらは、ラット下垂体組織で間接免疫蛍光法を用いてIAD患者の血清を抗下垂体
抗体の存在に関して検討した［非特許文献８］。陽性免疫染色が前葉および中葉で観察され、免疫陽性の細胞が副腎皮質刺激ホルモン産生細胞の超微細構造上の特徴を有することが免疫電子顕微鏡法によって明らかにされた［非特許文献８］。De Bellisらによる研究
では、若年のヒヒの脳下垂体試料を基質として使用して、IADにおける抗下垂体抗体が下
垂体のACTH分泌細胞を選択的に標的とし、抗体が標的とする副腎皮質刺激ホルモン産生細胞はIAD患者の下垂体およびACTH分泌障害に関わる自己免疫プロセスの信頼できるマーカ
ーと考えられうることが報告されている［非特許文献１０、１１］。よって、自己抗原の同定はIADの病理学に重要な見識をもたらすと思われ、抗下垂体抗体の標的の同定はIADのより信頼できる診断マーカーの開発につながるかもしれない。しかし、IAD患者に存在す
る自己抗原はわかっていない。
【０００３】
また、リンパ球性下垂体前葉炎がIADの原因とも考えられているが、リンパ球性下垂体
前葉炎の有用な診断マーカーは未だない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Murakami T, Wada S, Katayama Y, Nemoto Y, Kugai N, et al. (1993) Thyroid dysfunction in isolated adrenocorticotropic hormone (ACTH) deficiency: case report and literature review. Endocr J 40: 473-478.
【非特許文献２】Kojima I, Nejima I, Ogata E (1982) Isolated adrenocorticotropin deficiency associated with polyglandular failure. J Clin Endocrinol Metab 54: 182-186.
【非特許文献３】Tillil H, Kobberling J (1988) Isolated ACTH deficiency and type 1 diabetes mellitus. J Endocrinol Invest 11: 815.
【非特許文献４】Nagai Y, Ieki Y, Ohsawa K, Kobayashi K (1997) Simultaneously found transient hypothyroidism due to Hashimoto's thyroiditis, autoimmune hepatitis and isolated ACTH deficiency after cessation of glucocorticoid administration. Endocr J 44: 453-458.
【非特許文献５】Kikuchi T, Yabe S, Kanda T, Kobayashi I (2000) Antipituitary antibodies as pathogenetic factors in patients with pituitary disorders. Endocr J 47: 407-416.
【非特許文献６】Yamamoto M, Murakami Y, Nishiki M, Kato Y (2002) A case of autoimmune hypophysitis associated with Graves' disease. Endocr J 49: 583-587.
【非特許文献７】Yamamoto T, Fukuyama J, Hasegawa K, Sugiura M (1992) Isolated corticotropin deficiency in adults. Report of 10 cases and review of literature. Arch Intern Med 152: 1705-1712.
【非特許文献８】Sauter NP, Toni R, McLaughlin CD, Dyess EM, Kritzman J, et al. (1990) Isolated adrenocorticotropin deficiency associated with an autoantibody to a corticotroph antigen that is not adrenocorticotropin or other proopiomelanocortin-derived peptides. J Clin Endocrinol Metab 70: 1391-1397.
【非特許文献９】Bensing S, Kasperlik-Zaluska AA, Czarnocka B, Crock PA, Hulting A (2005) Autoantibodies against pituitary proteins in patients with adrenocorticotropin-deficiency. Eur J Clin Invest 35: 126-132.
【非特許文献１０】De Bellis A, Pane E, Bellastella G, Sinisi AA, Colella C, et al. (2011) Detection of antipituitary and antihypothalamus antibodies to investigate the role of pituitary or hypothalamic autoimmunity in patients with selective idiopathic hypopituitarism. Clin Endocrinol (Oxf) 75: 361-366.
【非特許文献１１】De Bellis A, Sinisi AA, Pane E, Dello Iacovo A, Bellastella G, et al. (2012) Involvement of hypothalamus autoimmunity in patients with autoimmune hypopituitarism: role of antibodies to hypothalamic cells. J Clin Endocrinol Metab 97: 3684-3690.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、IAD又はリンパ球性下垂体前葉炎の検査方法及び検査試薬を提供することを
目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用してIAD患者における候補自己抗原を同定し、その結果を候補自己抗原の組換えタン
パク質および免疫ブロット法を用いて確認した。さらに、IADにおける自己抗体の特異性
を評価した。本発明者は、これらの知見に基づき、本発明を完成した。
【０００７】
本発明は、検体中の、Rab GDIαと免疫学的に反応する抗体を検出することによりIADを検査することを特徴とするIAD又はリンパ球性下垂体前葉炎の検査方法を提供する。
Rab GDIαと免疫学的に反応する抗体は、好ましくは、ヒトRab GDIα又は抗原性を有するその部分断片と免疫学的に反応するものである。Rab GDIαと免疫学的に反応する抗体
は、好ましくは、その抗体と免疫学的に反応する抗原を用いることにより検出される。
【０００８】
また、本発明は、本発明の検査方法に用いるための、Rab GDIαと免疫学的に反応する
抗体と免疫学的に反応する抗原を含む、IAD又はリンパ球性下垂体前葉炎用の検査試薬を
提供する。
抗原は、ヒトRab GDIα又は抗原性を有するその部分断片が好ましい。
【発明の効果】
【０００９】
IAD又はリンパ球性下垂体前葉炎を、Rab GDIαに対する自己抗体の検出により検査できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】IAD患者又は健常者の血清による下垂体前葉タンパク質の認識を示す免疫ブロット法の結果を示す（写真）。Ｓｐ、可溶性の上澄み画分；Ｐ、不溶性のペレット画分。
【図２】組み換え完全長ヒトRab GDIαおよびセロトランスフェリンタンパク質の発現を示す免疫ブロット法の結果を示す（写真）。
【図３】IAD患者血清における抗Rab GDIα抗体の、免疫ブロット法による検出結果を示す（写真）。血清については、HEK293FT細胞に発現させた組み換え完全長ヒトRab GDIα（Rab GDI alpha、左レーン）に加えて、および空ベクターを用いてトランスフェクションしたHEK293FT細胞の全細胞溶解物（HEK293FT、右レーン）の結果も示す。
【図４】下垂体前葉におけるRab GDIαの発現の検出結果を示す（写真）。Ａは免疫ブロット法、Ｂ〜Ｉは免疫組織化学の結果である。スケールバーは１００μｍを示す（Ｂ〜Ｅ）。スケールバーは５０μｍを示す（Ｆ〜Ｉ）。ＡＰ、下垂体前葉；ＰＰ、下垂体後葉；ＩＬ、中葉。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の実施の形態を説明する。先ず、本発明検査方法について説明する。
本発明検査方法は、検体中の、Rab GDIαと免疫学的に反応する抗体(以下、「抗Rab GDIα抗体」とも表記する)を検出することによりIAD又はリンパ球性下垂体前葉炎を検査す
ることを特徴とする。
【００１２】
検出の方法としては、抗Rab GDIα抗体を検出できる限り限定されない。通常には、抗Rab GDIα抗体と免疫学的に反応する抗原または抗体を用いる免疫学的方法が挙げられる。抗体よりも抗原の方が、調製が容易であることから、抗Rab GDIα抗体と免疫学的に反応
する抗原を用いる免疫学的方法が好ましい。免疫学的方法としては、一般に広く使用されているELISA法が挙げられる。
【００１３】
抗原は、検体に存在する抗Rab GDIα抗体と免疫学的に反応するものであればよく、ヒ
トまたは動物から精製したRab GDIαを使用できる。リコンビナント技術によりRab GDIαを調製してもよい。例えば、ヒトRab GDIαのアミノ酸配列（GenBank: BAA08078.1、配列番号１）、及びこれをコードする塩基配列（GenBank: NM_001493.2）が公知である。また、検体に存在するRab GDIα抗体と免疫学的に反応するものである限り、Rab GDIαの部分断片を使用することもできる。
【００１４】
抗Rab GDIα抗体と免疫学的に反応するRab GDIαの部分断片の長さは、免疫学的な反応に十分なもの、すなわち抗原性を有するものであればよい。免疫学的に反応する部分断片は、抗原としてRab GDIαの断片に対応するペプチドを合成し、そのペプチドを用いたELISAを行って、自己抗体に対する抗原性を調べることにより特定できる。Rab GDIαは種間
の相同性が高いため、他の動物由来の場合でも相当する部分断片を使用できる。
【００１５】
測定対象となる検体は、通常には、血清や血漿であるが、反応工程の反応を妨げる物質が含まれていない限り、特に限定はされない。
【００１６】
検出の条件は、従来の免疫学的方法と同様の条件で行うことができる。すなわち、各反応物質の添加順序や量、反応温度、反応時間等の条件は、従来の免疫学的方法と同様でよく、例えば、ビーズ、チューブまたはプレート等などの固相に固定した抗原と、血清を反応させ、血清中に含まれる未結合のIgGを除去した後、抗原に結合した抗体に、酵素標識
した抗IgG抗体を結合させ、酵素の反応により検出する方法が挙げられる。
【００１７】
抗Rab GDIα抗体の量は、通常には、標識の測定値として算出される。あるいは、既知
濃度の抗Rab GDIα抗体を含む標準試料により検量線を作成して検量線により濃度を求め
てもよい。
【００１８】
陽性の判定は、健常者の値と比較することによって行うことができる。同時に測定した、あるいは、予め測定された健常者の値から有意に値が高い場合（例えば、2.5 SD以上高い、統計学的テストにより有意に高い）に、陽性と判定できる。陽性には、IAD又はリン
パ球性下垂体前葉炎の疑いがあることも含まれる。
【００１９】
本発明検査方法により測定される抗Rab GDIα抗体の上昇は、IAD又はリンパ球性下垂体前葉炎と関連しているため、本発明検査方法によれば、IAD又はリンパ球性下垂体前葉炎
が疑われる場合において、IAD又はリンパ球性下垂体前葉炎の鑑別に有用な指標を提供で
きる。また、本発明検査方法は、IAD又はリンパ球性下垂体前葉炎の鑑別のためにさらに
他の検査を行うべき対象をスクリーニングする方法として有用である。
【００２０】
次に、本発明検査試薬について説明する。本発明検査試薬は、本発明検査方法を実施するためのものであって、抗Rab GDIα抗体と免疫学的に反応する抗原を含む。
【００２１】
抗Rab GDIα抗体と免疫学的に反応する抗原については、本発明検査方法に関し説明し
た通りである。
【００２２】
さらに、本発明検査試薬は、免疫学的測定に必要な試薬類、例えば、陽性コントロール、緩衝液等を必要に応じ含んでいてもよく、キットとして提供することもできる。
【００２３】
本発明検査試薬の各構成要素は、溶液状態であってもよいし、凍結乾燥品などの乾燥状態であってもよい。乾燥状態である場合には、使用前に溶液状態にするための緩衝液等をさらに本発明検査試薬に含めてもよい。各構成要素の量や形態は、測定方法の条件に合わせて調整される。
【００２４】
例えば、ELISAのキットの場合、抗原を固定した固相プレート、洗浄液、検体希釈液、
酵素標識抗Rab GDIα抗体溶液、基質液、及び、反応停止液を含むキットとすることがで
きる。また、イムノクロマト法のキットでは、反応デバイス及び展開液を含むキットとすることができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により本発明を説明する。なお、実施例中、「％」は、特記しない限り重量％を示す。
【００２６】
＜実施例１＞IAD患者における抗Rab GDIα抗体の検出
（１）IAD患者
IAD患者の全員において、８：００〜１０：００に測定した、ACTHおよびコルチゾール
の朝のベース血清レベルは低く、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（CRH）に対するACTHの応答は無かった。CRHテストでは、ヒトCRHの単回投与（100μｇ）を静注した。注射前ならびに注射の３０分後、６０分後、９０分後、および１２０分後に血液試料を採取した。また、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、成長ホルモン（GH）、黄体形成ホルモン（LH）、
卵巣刺激ホルモン（FSH）を含む他の下垂体ホルモンの血清レベル、ならびにそれぞれの
標的器官のホルモン（遊離Ｔ４、遊離Ｔ３、インスリン様成長因子Ｉ、テストステロン、およびエストラジオール）も、正常ベースレベルの範囲内であった。くわえて、TSH、GH
、LH、およびFSHは、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン２、
および黄体形成ホルモン放出ホルモン刺激を含む刺激テストに適切に応えた。血清プロラクチンのベースレベルは正常であった。尿崩症はいずれの患者でもみられなかった。異常所見は磁気共鳴映像法によって観察されなかった。いずれの患者でも下垂体手術も放射線
療法も行われなかった。患者は全員、IADの原因が不明であった。ヒドロコルチゾン（15
〜20ｍｇ／日）がIAD患者全員に投与された。IAD患者のプロファイルは次の通りであった。＃１、男性、７７歳；＃２、男性、６７歳；＃３、女性、７０歳；＃４、男性、６２歳；＃５、男性、３３歳。IAD発症から血液試料採取までの期間は、それぞれ約１年、１年
、１年、１３年、および２年であった。対照として、ストックサンプルから健常者（健康な対象）の５つのサンプルを無作為に選んだ。健康な対象のプロファイルは次の通りであった。男性、３０歳；男性、３１歳；男性、３３歳；男性、５１歳；女性、５３歳。試料は名古屋大学および日本の別の施設から、各施設の施設内審査委員会のプロトコールの認可を受けた後に入手した。
【００２７】
（２）IAD患者の血清と反応する下垂体自己抗原を検出するためのウェスタンブロット解
析
雄スプラーグ・ドーリーラット（体重250〜300ｇ；中部科学資材株式会社（Chubu Science Materials）、名古屋、日本）を、自由に飼料および水にアクセスさせ、２２℃の室
温にて１２時間／１２時間の明／暗サイクルで無菌施設において飼育し、７〜８週齢のときに使用した。犠牲にした際に、スプラーグ・ドーリーラットのラット下垂体を取り、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ・アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス、アメリカ合衆国）を補充したRIPAバッファー（シグマ・アルドリッチ社）中でホモジナイゼーションした。可溶性の上澄みおよび不溶性のペレット画分を、文献［Wang S, Watanabe T, Noritake J, Fukata M, Yoshimura T, et al. (2007) J Cell Sci 120: 567-577.］に記
載されているように超遠心分離によって分離し、−８０℃で保存した。上澄みおよびペレットを分離し、SDS-PAGEに供した後、タンパク質をPVDF膜（ミリポア社、アメリカ合衆国）に移した。次に、膜を４％脱脂乳でブロックし、４℃にて一晩、患者および健康な対象の血清（１：１００）とインキュベーションした。
【００２８】
結果を図１に示す。免疫ブロット法において、下垂体前葉抽出物の不溶性のペレット画分(P)中の〜５１ｋＤａバンド（図中、矢尻で示す）および可溶性の上澄み画分(Sp)中の
〜７５ｋＤａバンド（図中、矢印で示す）が、２名のIAD患者（患者１および２）の血清
試料によって検出されたが、健康な対象の血清試料によっては検出されなかった。IAD患
者の血清は脳下垂体前葉の自己抗原を認識することが示唆された。
【００２９】
（３）ゲル内消化および質量分光分析
自己抗原を同定するために、〜５１ｋＤａバンドおよび〜７５ｋＤａバンドについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【００３０】
上記（２）で分画した下垂体前葉タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、和光銀染色キット（和光純薬工業株式会社（Wako）、東京、日本）を用いた銀染色に供した。次に、IAD患者血清が認識するタンパク質に対応するゲルのバンドを切り取り、アセトニトリル（ACN）を用いて脱染色した。タンパク質を１０ｍＭのDTTを用いて還元した後、ヨードアセ
トアミドを用いてそれらをアルキル化し、トリプシン（プロメガ社）を用いて消化した。結果として得られたペプチドを、ACN中の０．１％トリフルオロ酢酸（TFA）を用いてゲルから順次抽出した。抽出物を蒸発させ、５％ACN中の０．１％TFAを用いて溶かした。固相抽出チップ（Ｃ−チップ）を用いて脱塩を行った。次に、試料を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）システム（Paradigm MS4；ＡＭＲ社）にかけ、文献［Amano M, Tsumura Y, Taki
K, Harada H, Mori K, et al. (2010) PLoS One 5: e8704.、及びKato K, Yazawa T, Taki K, Mori K, Wang S, et al. (2012) Mol Biol Cell 23: 2593-2604.］に記載されているように、ＬＣシステムに直接つなげたタンデムＭＳ／ＭＳ（LTQ Orbitrap XL；サーモ
フィッシャーサイエンティフィック社）によって分析した。直径が0.1ｍｍで長さが50ま
たは150ｍｍのMagic C18AQカラム（ミクロム・バイオリソーシズ社（Michrom BioResources））を付けたParadigm MS4 HPLCシステムに試料を注入した。逆相クロマトグラフィー
を、溶媒Ａ（０．１％ギ酸を含む２％ACN）と溶媒Ｂ（０．１％ギ酸を含む９０％ACN）の直線勾配（０分、５％Ｂ；１００分、５０％Ｂ）を用いて１μＬ／分の推定流量で行った。イオン化した後、400〜2000の質量電荷比（ｍ／ｚ）を用いて前駆体イオンスキャンを
ＭＳ／ＭＳ分析前に行った。データをMascotソフトウェア（マトリックスサイエンス社、マサチューセッツ州ボストン、アメリカ合衆国）を用いて解析して、Swiss-Protデータベース検索した。＞９５．０％の確率をもつ少なくとも２つの同定ペプチドを含んでなるタンパク質同定を許容した［Kato K, et al. (2012) Mol Biol Cell 23: 2593-2604.］。
【００３１】
分析の結果、切り取ったバンド中に数種のタンパク質を検出した。Swiss-Protデータベースに対する検索から分子量がバンドのサイズに相当するタンパク質を取得した。ＧＤＰ解離阻害因子（GDI）１（Rab GDIα）（mascotスコア、１７３．０；配列包括度、１０．０％）およびセロトランスフェリン（mascotスコア、３，４１２．２；配列包括度、５１．２％）が、それぞれ５１ｋＤａおよび７５ｋＤａバンドにおいて高いスコアで検出された。ラットRab GDIα（UniProtKB/Swiss-Prot：P50398）は、４４７個のアミノ酸残基を
含み、５０，５３７Ｄａの分子量を有する。ラットセロトランスフェリン（UniProtKB／Swiss−Prot：P12346）は、６９８個のアミノ酸残基を含み、７６，３９５Ｄａの分子量を有する。これらの二種のタンパク質を自己抗原候補とした。
【００３２】
（４）プラスミドおよび組換えタンパク質
IAD患者の血清によるRab GDIαおよびセロトランスフェリンの認識を確認するために、組み換え完全長ヒトタンパク質を発現するHEK293FT細胞を作成した。
【００３３】
Rab GDIαおよびセロトランスフェリンの完全長cDNAを含有するベクトルは、オープン
バイオシステムズ社から購入した。各オープンリーディングフレームをPCRによって増幅
し、発現ベクターpcDNA3.1D/V5-His-TOPO（インビトロジェン社、カリフォルニア州カー
ルズバッド、アメリカ合衆国）に挿入し、ジェネティックアナライザシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー、アメリカ合衆国）を使って配列を完全に読んだ。文献［Wang S, Watanabe T, Noritake J, Fukata M, Yoshimura T, et al. (2007) J Cell Sci 120: 567-577.］に記載されているように、リポフェ
クタミン2000試薬（インビトロジェン社）を用いて、１０ｃｍディッシュで培養したHEK293FT細胞に各ベクターまたは対照空ベクターを製造業者の取扱説明書に従ってトランスフェクションした。４８時間後、トランスフェクションしたHEK293FT細胞を集めた。各組換えタンパク質の発現を抗Ｖ５抗体（インビトロジェン）を用いたウェスタンブロッティングによって確認した（図２）。
【００３４】
（４）患者血清における抗自己抗原候補タンパク質抗体の検出および抗Rab GDIα抗体の
保有率
患者血清試料に抗体が存在することを評価するために、上記（３）のHEK293FT細胞から調製した、Rab GDIαまたはセロトランスフェリン組み換え完全長ヒトタンパク質および
対照溶解物を７．５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、PVDF膜に移し、それを各血清試料（１：５０希釈）または陽性対照として抗Ｖ５抗体（１：１，０００）を用いた免疫ブロット法に供した。
【００３５】
患者１、２および３並びに健康な対象１名の結果を図３に示す。ヒトRab GDIαのアミ
ノ酸残基の数は、ラットRab GDIαのアミノ酸残基の数と同じであり、ヒトとラットのア
ミノ酸配列相同性は高い（９８．７％）。質量分光分析と一致して、２名のIAD患者（患
者１および２）の血清は、組み換えRab GDIαを認識した一方で、健康な対象の血清は認
識しなかった。組み換えセロトランスフェリンは、IAD患者の血清によっても健康な対象
の血清によっても認識されなかった（データ示さず）。抗Rab GDIα自己抗体は、残り３
名のIADの患者のうち１名（患者３）で検出されたが、４名の健康な対象で存在しなかっ
た（データ示さず）。これらのデータを表１にまとめる。全体で、抗Rab GDIα抗体の検
出に関する感度はIAD患者において６０％（５中３）であった（表１）。抗Rab GDIα自己抗体は５名の健康な対象には存在しなかった。なお注目すべきは、患者（患者１、２、および３）の試料におけるIAD発症から血液試料採取までの期間は１年以内であった。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
以上から、少なくとも発症後一定期間におけるIAD患者の血清は組み換え完全長ヒトRab
GDIαを認識することが示された。
【００３８】
（５）下垂体におけるRab GDIαの発現を検出するためのウェスタンブロット解析及び免
疫組織化学
下垂体前葉でのRab GDIαの発現を調べた。
【００３９】
ウェスタンブロット解析によるRab GDIαの発現の評価には、下垂体の前葉および後葉
溶解物をSDS-PAGEによって分離し、PVDF膜に移した。次に、その膜を４℃にて一晩、ヤギ抗Rab GDIα抗体（１：２００、sc-20447、サンタクルーズバイオテクノロジー社、テキ
サス州ダラス、アメリカ合衆国）とインキュベーションした。ツイーン２０を含有するリン酸緩衝食塩水（PBST）で３回洗浄した後、文献［Iwama S, De Remigis A, Callahan MK, Slovin SF, Wolchok JD, et al. (2014) Sci Transl Med. 6: 230ra245.］に記載され
ているように、膜を室温にて１時間、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合ヒトIgGまたは抗ヤギIgG-HRP抗体（１：２００、ダコ社、アメリカ合衆国）と６０分間インキュベ
ーションした。PBSTで１０分間３回洗浄した後、膜を増感化学発光（ＧＥヘルスケア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ、アメリカ合衆国）とインキュベーションし、Ｘ線フィルム（コダック社、東京、日本）に当てた。
【００４０】
免疫組織化学については、経心腔的灌流によって投与したエーテル深麻酔下で犠牲にしたラットの脳下垂体のクライオスタット切片（７μｍ）を、リン酸緩衝食塩水中の４％パラホルムアルデヒドを用いて作製した。免疫染色を文献［Takagi H, Sugimura Y, Suzuki
H, Iwama S, Izumida H, et al. (2014) Kidney Int. 86(5):954-64.］に記載されてい
るように行った。蛍光染色された切片はすべて、蛍光顕微鏡（BZ-8000；キーエンス社、
大阪、日本）を用いて調べた。次の抗体を使用した。マウスモノクローナル抗ACTH抗体（１：５０、ab8615；アブカム社、マサチューセッツ州ケンブリッジ、アメリカ合衆国）、ヤギ抗Rab GDIα抗体（１：５０、sc-20447、サンタクルーズバイオテクノロジー社）、
ロバ抗マウスIgG AlexaFluor 488（インビトロジェン）、およびロバ抗ヤギIgG AlexaFluor 594（インビトロジェン）。すべての手順は、アメリカ国立衛生研究所の動物管理ガイドラインに準拠する名古屋大学の動物管理に関する施設ガイドラインに従って行った。
【００４１】
結果を図４に示す。Rab GDIαが下垂体前葉に発現していたことが示された（図４のＡ
）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析および免疫ブロット法の結果と一致して、免疫組織化学的分析は、Rab GDIα免疫反応性が主に下垂体前葉で観察されることを示した（図４のＢ〜Ｉ）
。くわえて、Rab GDIαの発現は部分的にACTHの発現と共局在した（図４のＢ〜Ｉ）。Rab
GDIαは下垂体前葉に発現していることが示された。下垂体前葉でRab GDIαが実際に発
現していることから、IAD患者で観察される抗Rab GDIα抗体は自己抗体であると考えられる。
【００４２】
以上の結果から、IADと抗Rab GDIα抗体とが相関することが示された。したがって、抗Rab GDIα抗体の検出が、IADの検査や診断に有用であることが分かる。
【００４３】
IADは、リンパ球性下垂体前葉炎に随伴すると考えられている（Jensen MD, Handwerger
BS, Scheithauer BW, Carpenter PC, Mirakian R, et al. (1986)  Ann Intern Med 105: 200-203、Escobar-Morreale H, Serrano-Gotarredona J, Varela C (1994) J Endocrinol Invest 17: 127-131、Caturegli P, Newschaffer C, Olivi A, Pomper MG, Burger PC, et al. (2005) Endocr Rev 26: 599-614）。したがって、抗Rab GDIα抗体の検出は、
リンパ球性下垂体前葉炎の検査や診断にも有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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