(57)【要約】【課題】心臓への移植に適した心筋細胞を得る。具体的には、十分に分化した心筋細胞であって、自律拍動能がなく、癌化の可能性がない心筋細胞を濃縮し、分取する。【解決手段】多能性幹細胞を一定期間心筋へと分化誘導し、プリオン陽性を指標として細胞を分取することにより、心臓への移植に適した心筋細胞を得る。さらに、分化誘導された細胞からプリオン陽性かつＳＳＥＡファミリー陰性を指標として細胞を分取することにより、心筋細胞を分取する時期を拡大させ、安全かつ成熟した心筋細胞を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞由来心筋細胞の取得方法であって、多能性幹細胞を１０日ないし１４日間分化誘導し、心筋マーカー陽性細胞を分取することを特徴とする方法。
【請求項２】
分化誘導が、１１日ないし１４日行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
心筋マーカーがプリオンである請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
分化誘導された細胞を培養器から解離させる際に下記手順：
コラゲナーゼ  タイプＩＩで処理し、
コラゲナーゼ  タイプＩＩとＤＮＡａｓｅＩで同時処理し、次いで
細胞分散用バッファーで解離させる
を行うことを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
多能性幹細胞由来心筋細胞の取得方法であって、多能性幹細胞を１０日ないし１ヶ月間心筋に分化誘導し、分化誘導された細胞から心筋マーカー陽性かつ未分化マーカー陰性細胞を分取することを特徴とする方法。
【請求項６】
分化誘導期間が１０日ないし２４日である請求項５記載の方法。
【請求項７】
分化誘導期間が１１日ないし２１日である請求項６記載の方法。
【請求項８】
心筋マーカーがプリオンであり、未分化マーカーがＳＳＥＡファミリーである請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
未分化マーカーがＳＳＥＡ１である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
分化誘導された細胞を培養器から解離させる際に下記手順：
コラゲナーゼ  タイプＩＩで処理し、
コラゲナーゼ  タイプＩＩとＤＮＡａｓｅＩで同時処理し、次いで
細胞分散用バッファーで解離させる
を行うことを特徴とする、請求項８または９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療および細胞工学の分野に属する。詳細には、本発明は、心臓への移植に適した多能性幹細胞由来の心筋細胞を取得する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性幹細胞から、遺伝子改変技術を用いることなく心筋細胞を採取する技術は安全な再生医療にとって急務である。これに加えて現在、成熟心筋細胞を分取する方法が確立されていないという問題もある。
【０００３】
プリオンタンパクは、ｉＰＳ細胞や胚性幹細胞のような多能性幹細胞から分化した心筋細胞の表面に特異的に発現するために、これをマーカーとして用いて心筋細胞を濃縮することができることがすでに報告されている（非特許文献１）。本発明者らも抗プリオン抗体を用いてＥＳ細胞由来心筋細胞を濃縮できることを報告している（非特許文献２）。
【０００４】
多能性幹細胞由来心筋細胞は、長期に培養しても安定した形質を保ち、移植により癌化の可能性がないことが再生医療の安全性の観点から必須である。未分化心筋細胞は増殖能を有し、癌化する可能性があるので再生医療には適さない。また、自律拍動する心筋細胞は不整脈を誘発するので、心臓への移植に不向きである。これまでのところ、再生医療に適した安全な心筋細胞を得るための条件の詳細な検討はなされていない。
【０００５】
分化誘導を長期間行うことにより、より成熟した心筋細胞を得られる可能性がある。しかしながら、分化誘導を長期間行うと細胞の解離が非常に難しいため、心筋細胞を大量に分取することは困難となる。そのため、これまでの長期の分化誘導後に心筋細胞を分取するという試みは、主流とはなっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】K. Hidaka et al. Circulation Research Vol.106, 111-119 (2010)
【非特許文献２】H. Fujii et al. Circulation Journal Vol.76, 2875-2883 (2012)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明が解決すべき課題は、心筋細胞を得るための条件を詳細に検討することにより、不整脈を誘発する可能性がなく、癌化の可能性もない、心臓への移植に適した心筋細胞を濃縮、分取することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、心臓への移植に適した心筋細胞を濃縮、分取することに成功した。すなわち、多能性幹細胞を一定期間心筋へと分化誘導し、心筋マーカーであるプリオン陽性細胞を分取することにより、心臓への移植に適した心筋細胞を得ることに成功した。さらに本発明者らは、分化誘導された細胞からプリオン陽性かつＳＳＥＡ（stage specific embryo antigen）ファミリー陰性細胞を分取することにより、心臓への移植に適した心筋細胞を分取する時期を拡大することに成功した。かくして、本発明者らは本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のものに関する：
（１）多能性幹細胞由来心筋細胞の取得方法であって、多能性幹細胞を１０日ないし１４日間分化誘導し、心筋マーカー陽性細胞を分取することを特徴とする方法。
（２）分化誘導が、１１日ないし１４日行われる（１）記載の方法。
（３）心筋マーカーがプリオンである（１）または（２）記載の方法。
（４）分化誘導された細胞を培養器から解離させる際に下記手順：
コラゲナーゼ  タイプＩＩで処理し、
コラゲナーゼ  タイプＩＩとＤＮＡａｓｅＩで同時処理し、次いで
細胞分散用バッファーで解離させる
を行うことを特徴とする、（３）記載の方法。
（５）多能性幹細胞由来心筋細胞の取得方法であって、多能性幹細胞を１０日ないし１ヶ月間心筋に分化誘導し、分化誘導された細胞から心筋マーカー陽性かつ未分化マーカー陰性細胞を分取することを特徴とする方法。
（６）分化誘導期間が１０日ないし２４日である（５）記載の方法。
（７）分化誘導期間が１１日ないし２１日である（６）記載の方法。
（８）心筋マーカーがプリオンであり、未分化マーカーがＳＳＥＡファミリーである（５）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）未分化マーカーがＳＳＥＡ１である（８）記載の方法。
（１０）分化誘導された細胞を培養器から解離させる際に下記手順：
コラゲナーゼ  タイプＩＩで処理し、
コラゲナーゼ  タイプＩＩとＤＮＡａｓｅＩで同時処理し、次いで
細胞分散用バッファーで解離させる
を行うことを特徴とする、（８）または（９）記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のような多能性幹細胞から、遺伝子改変技術を用いることなく、未分化細胞が除去された心筋細胞集団であって、自律拍動能がない心筋細胞集団を濃縮し、取得することができる。本発明により得られる心筋細胞集団は増殖能がある細胞や未分化細胞が除去されているため、癌化の可能性がなく安全性に優れている。さらに本発明により得られる心筋細胞集団は自律拍動能がないので、不整脈を誘発することがない。本発明により得られる心筋細胞集団は上記のような特徴を有するため、心臓への移植に特に適している。また本発明によれば、心臓への移植に適した心筋細胞への分化誘導期間を拡張できるので、さらに成熟した心筋細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１上段は、分化誘導８日、１４日、２１日におけるプリオン陽性細胞の検出と分取の結果を示す。図１下段は、分化誘導８日、１４日、２１日におけるプリオン陽性細胞率をまとめたものである。
【図２】図２上段は、分化誘導８日、１４日、２１日に分取したプリオン陽性細胞の心筋マーカー遺伝子解析結果を示す。図２下段は、プリオン陽性細胞の抗トロポミオシン抗体による免疫染色の結果を示す。
【図３】図３は、分化誘導期間とプリオン陽性細胞の増殖能の関係を調べた結果を示す。図３上段は、分化誘導１４日目、２１日目に回収したプリオン陽性細胞を用いて形成した凝集体である。図３下段は、分化尤度８日目、１４日目、２１日目のプリオン陽性細胞を培養皿上に播き、７日間培養した結果を示す。ＰｒＰ（−）はプリオンタンパク質陰性細胞、ＰｒＰ（＋）はプリオンタンパク質陽性細胞を示す。
【図４】図４は、プリオン陽性細胞の増殖亢進時期の同定結果を示す。図４上段は、分化誘導９日目に回収したプリオン陽性細胞を用いて形成した凝集体を７日間培養し、増殖しなかった場合と増殖した場合を比較したものである。図４下段は、分化誘導期間と増殖頻度との関係をまとめた。
【図５】図５は、分化誘導７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日でプリオン陽性細胞を回収し、７日間培養してコロニー形成能を調べた結果を示す。カッコ内の数字はデイッシュ内のコロニー数を示す。
【図６】図６は、分化誘導７日、９日、１１日、１３日目にプリオン陽性細胞を回収し、７日間培養して凝集体を再形成した際の拍動数を調べた結果を示す。
【図７】図７は、分化誘導７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日でプリオン陽性細胞を回収し、ＨＣＮ４発現を指標にしてペースメーカ樣細胞の割合を調べた結果を示す。
【図８】図８上段は、分化誘導２１日目に回収した細胞を、プリオン陽性およびＳＳＥＡ１陽性についてソーティングした結果を示す。図８下段左図は、分化誘導２１日目に回収した細胞のうち、プリオン陽性かつＳＳＥＡ１陰性細胞分画、およびプリオン陽性かつＳＳＥＡ１陽性細胞分画をそれぞれ１０日間培養した結果を示す。図８下段右図は、分化誘導２１日目に回収した細胞のうち、プリオン陽性かつＳＳＥＡ１陰性細胞分画、およびプリオン陽性かつＳＳＥＡ１陽性細胞分画をそれぞれ１０日間培養した後１回継代した結果を示す。ＰｒＰ（−）はプリオンタンパク質陰性細胞、ＰｒＰ（＋）はプリオンタンパク質陽性細胞を示す。ＳＳＥＡ１（−）はＳＳＥＡ１タンパク質陰性細胞、ＳＳＥＡ１（＋）はＳＳＥＡ１タンパク質陽性細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、１の態様において、多能性幹細胞由来心筋細胞の取得方法であって、多能性幹細胞を一定期間分化誘導し、心筋マーカー陽性細胞を分取することを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
多能性幹細胞は、生体の様々な組織に分化する能力を有する細胞である。本発明において、多能性幹細胞はヒトを含む動物、好ましくは哺乳動物に由来するものである。多能性幹細胞の例としてはｉＰＳ細胞（誘導多能性幹細胞）およびＥＳ細胞（胚性幹細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は、当業者に公知の方法を用いて、ヒトを含む様々な動物から取得することができる。例えば、ｉＰＳ細胞は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃの４遺伝子を、動物の体細胞に導入することにより得ることができる。ＥＳ細胞もまたヒトを含む様々な動物由来のものがあり、胚盤胞を培養して内部細胞塊を得て、増殖した内部細胞塊由来の細胞を継代することによって得ることができる。
【００１４】
本発明において、多能性幹細胞の分化誘導方法は当業者に公知のいずれの方法であってもよく、特に限定されない。例えば、多能性幹細胞を浮遊培養して胚様体を得て、胚様体をさらに培養することにより心筋細胞へと分化させてもよく、ＯＰ９細胞上で共培養して心筋へと分化誘導してもよく、あるいはサイトカインを用いて心筋へと分化誘導してもよい。
【００１５】
分化誘導処理された細胞集団から心筋細胞を分取する方法も当業者に公知である。例えば、心筋細胞表面の心筋マーカーを標識し、セルソーターを用いて分取することにより心筋細胞を分取することができる。心筋マーカーは当業者に公知であり、プリオン、Ｔｂｘ５、Ｎｋｘ２．５、Ｍｙｌ２、αＭＨＣ、βＭＨＣ、ｃＴｎＴ、αアクチニン、Ｍｙｌ７、Ａｎｐ、Ｔｎｎｔ２、Ｉｓｌ１などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において用いられる好ましい心筋マーカーはプリオンである。プリオンは表面マーカーであること、遺伝子改変なしで分取可能であること、そして複数のモノクローナル抗体が既に作製されていること、また作業心筋様細胞を回収できること等の利点を有する。分化誘導された細胞集団を抗プリオン抗体にて標識し、セルソーターを用いて分化誘導された細胞集団からプリオン陽性細胞を分取することにより、心筋細胞を分取・濃縮することができる。
【００１６】
なお、本明細書において、マーカーという場合はタンパク質およびそれをコードする遺伝子の一方または両方を意味する。例えば、マーカーとしてプリオンという場合は、プリオンタンパク質およびそれをコードする遺伝子の一方または両方を意味する。
【００１７】
心臓への移植に適した心筋細胞は、自律拍動能がないことが必要である。自律拍動能があると不整脈を誘発する危険性がある。さらに、心臓への移植に適した心筋細胞は、癌化する可能性がないことも必要である。癌化の可能性をなくすためには、増殖能を有する細胞や未分化細胞が含まれていないことが必要である。
【００１８】
これまでのところ、上記の特徴を有する移植に適した心筋細胞を取得するための方法や条件は詳細に検討されていなかった。本発明は、上記の特徴を有する心筋細胞を取得するための方法や条件を、初めて詳細に検討し、明らかにしたものである。
【００１９】
本発明において、多能性幹細胞を一定期間分化誘導する。本発明者らは、分化誘導期間について、以下のことを見いだしている。分化誘導期間が短いと、得られる心筋細胞数が少ない。また、分化誘導期間が短いと、得られる心筋細胞集団は自律拍動能を有する細胞を多く含むものとなり、心臓に移植した際に不整脈を誘発する可能性がある。分化誘導期間が長いと、得られる心筋細胞集団中の未分化細胞がかえって増加してしまう。未分化細胞は増殖して癌化するおそれがあるので、移植に適さない。このような点から、本発明により取得される心筋細胞は、癌化のおそれがない作業心筋細胞ということもできる。
【００２０】
本発明における分化誘導の一定期間は、分化誘導方法によってあまり影響を受けない。当該一定期間は約１０日ないし約１４日であり、好ましくは約１１日ないし約１３日、または約１１日ないし約１４日である。
【００２１】
心筋細胞マーカーが陽性であることに加えて、未分化マーカーが陰性であること、あるいは分化マーカーが陽性であることを指標とすることにより、未分化細胞を含まない心筋細胞集団を得ることができる分化誘導期間（上記一定期間）を拡張することができる。
【００２２】
したがって、本発明は、もう１つの態様において、多能性幹細胞由来心筋細胞の取得方法であって、多能性幹細胞を一定期間分化誘導し、分化誘導された細胞から心筋マーカー陽性かつ未分化マーカー陰性細胞を分取することを特徴とする方法を提供する。
【００２３】
未分化マーカーや分化マーカーは当業者に公知であり、適宜選択して用いることができる。好ましくは、未分化マーカーが陰性であることを指標とする。未分化マーカーとしては、ＳＳＥＡファミリー（ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４など）、Ｃｄｈ１、ＴＲＡ−１（ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８３など）、アルカリホスファターゼ、レクチンへの結合能などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、好ましい未分化マーカーはＳＳＥＡファミリーであり、検出感度や分離能などの点からＳＳＥＡ１がより好ましい。
【００２４】
当該拡張された一定期間は、通常は約１０日ないし約１ヶ月、例えば約１０日ないし約２１日、約１０日ないし約２４日、約１０日ないし約２７日、約１０日ないし約３０日、または約１０日ないし約３３日などであり、好ましくは約１１日ないし約１ヶ月、例えば例えば約１１日ないし約２１日、約１１日ないし約２４日、約１１日ないし約２７日、約１１日ないし約３０日、または約１１日ないし約３３日などである。分化誘導期間を拡張することにより、上記のような移植に適した性質を有する、より成熟した心筋細胞を得ることができる。また、ＳＳＥＡファミリーなどの未分化マーカーが陰性であることを指標にすることにより、癌化の可能性のある細胞をより確実に排除し、安全な心筋細胞を得ることができる。
【００２５】
本発明において、分化誘導された細胞を培養器から解離させる際に、以下の手順：
コラゲナーゼ  タイプＩＩで処理し、
コラゲナーゼ  タイプＩＩとＤＮＡａｓｅＩで同時処理し、次いで
細胞分散用バッファーで解離させる
を行うと、回収される細胞中の生細胞数の割合を約５０％に高めることができる。コラゲナーゼ  タイプＩＩおよびＤＮＡａｓｅＩは公知であり、市販品を用いることができる。これらの酵素を用いる細胞の処理方法も公知である。また、細胞分散用バッファーも公知であり、Invitrogen社やGibco社などから市販されている。細胞分散用バッファーでの細胞解離方法も当業者に公知である。
【００２６】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２７】
実施例１  プリオン陽性を指標とした心筋細胞の取得
多能性幹細胞としてマウスＥＳ細胞を用い、これまで検討を行っていなかった分化誘導８日、１４日、２１日の細胞にプリオン陽性細胞が存在するか解析するため、コラゲナーゼ  タイプＩＩ処理と細胞分散用バッファーにより解離し、フローサイトメーターによる解析を行った。その結果、分化誘導の日数に関わらずプリオン陽性細胞を検出することに成功した。さらにこのプリオン陽性細胞をセルソーターにより分取することにも成功した。図１に結果を示す。プリオン陽性率は、分化誘導８日、１４日、２１日において、それぞれ１９．５％、１５．１％、１９．４％であった。
【００２８】
具体的な実験方法は以下のとおりであった。
１．分化誘導
ＥＳ細胞の心筋細胞への分化誘導は、胚様体の形成を経ることにより行った。ＥＳ細胞としては、１２９Ｓ７／ＳｖＥｖＢｒｄ系統由来のＥＳ細胞であるＡＢ１細胞を用いた。２０μｌのＥＳ細胞懸濁液（２．５〜１０ｘ１０４個／ｍｌ）を、１０〜２０％非動化ＦＢＳ（Wako製）、１ｘペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液（Wako製）、１ｘＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Wako製）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール（Sigma製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Wako製）および１００ｍＭアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地（Wako製）を入れた培養皿の縁に播き、懸滴培養を２日間行うことによって胚様体を得た。胚様体を培地中に移し、浮遊または付着状態で所定の日数培養して分化誘導した後、分析した。
２．フローサイトメトリー解析
所定の日数培養した胚様体から、コラゲナーゼ  タイプＩＩ（Worthington製）で処理し、その後細胞分散用バッファー（酵素不含、Hank's-based、Invitrogen製）で５〜８分間処理することにより細胞を解離させた。PE Labeling Kit-NH2（Dojindo Molecular Technologies製）を製造者の説明書に従って用いることにより、ＰＥ結合抗−プリオン抗体（SPI-Bio製、マウスモノクローナルクローンＳＡＦ８３）にて細胞を染色した。ＳＳＥＡ１に関する細胞染色は、一次抗体として抗ＳＳＥＡ１抗体（アフィメトリックス社、マウスモノクローナルクローンMC-480）を用い、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＭ抗体（ライフテクノロジー社、A-21042）を用いて蛍光標識することにより行った。７−ＡＡＤ（BD製）またはDraq7（Milteny製）を用いて死滅した細胞を除去した。
プリオン、ＳＳＥＡ１またはＧＦＰ陽性細胞の割合を、フローサイトメトリー（BD FACS Canto ＩＩ, CA, USA製）により調べた。２％ ＦＢＳおよび７−ＡＡＤ（BD製）またはDraq7（Milteny製）を含むHank's balanced salt solutionに細胞を再懸濁し、１００倍に希釈し、Summit softwareを装備したセルソーター（Moflo XDP, Beckman Coulter, USA製）に供した。
【００２９】
なお、細胞の解離を以下の手順で行うと、生細胞の割合を約３０％から約５０％に高めることができた。
コラゲナーゼ  タイプＩＩでの処理、
コラゲナーゼ  タイプＩＩとＤＮａｓｅＩでの同時処理、次いで
細胞分散用バッファー（Invitrogen社）での解離。
【００３０】
ＲＴ−ＰＣＲ法により、分取したプリオン陽性細胞の遺伝子発現解析を行ったところ、複数の心筋のマーカー遺伝子が発現していることが確認された（図２上段）。また、抗トロポミオシン抗体による免疫染色により、サルコメア構造を有する細胞が確認されたことから、細胞レベルで心筋細胞の存在が確認された（図２下段）。
【００３１】
回収したプリオン陽性細胞を用いて凝集体を再形成させたところ、分化誘導２１  日由来の凝集体は日を追う毎に大きくなり、一方で１４日のプリオン陽性細胞では凝集体の成長は認められなかった（図３上段）。また、分化誘導８日、１４日、２１日のプリオン陽性細胞を培養皿上に播種し、７日間培養したところ、８日目と１４日目の細胞ではコロニー形成能を殆ど示さなかったのに対して、２１日目の細胞では顕著なコロニー形成能を示した（図３下段）。
【００３２】
さらに詳細に増殖能が亢進する時期を特定するために、分化誘導７日、９日、１１日、１３日、１５日、１７日でプリオン陽性細胞を回収し、凝集体の再形成時における増殖能（図４）とコロニー形成能（図５）を評価した。その結果、１３日までは増殖能が認められないか、非常に低かったのに対して、１５日以降では増殖能が亢進していることが分かった。
【００３３】
得られた細胞集団に増殖能があるということは、癌化の可能性があるということであり、心臓への移植に適さない。また、移植後にむやみに増殖することも避けるべきである。したがって、上記実験から、多能性幹細胞由来心筋細胞を取得するための分化誘導期間の上限は、１４日または１３日であると考えられた。
【００３４】
拍動能を評価するために、分化誘導７日、９日、１１日、１３日のプリオン陽性細胞を回収し、凝集体を７日間再形成した際の拍動数を数えた。結果を図６に示す。分化誘導９日で最も早く拍動し、一方で１１日以降では拍動しないか、拍動が非常に遅いことが分かった。
【００３５】
本発明者らは、ペースメーカ細胞を可視化することのできるＥＳ細胞（ＨＣＮ４の発現をＧＦＰにより可視化できるようになっている）を樹立しており（K. Morikawa, I. Hisatome et,al. Pacing Clin Electrophysiol. 33(3):290-303.(2010)）、以下の実験においては、この細胞を用いてプリオン陽性細胞にペースメーカ細胞が含まれるか、フローサイトメトリーによる解析を行った。結果を図７に示す。分化誘導１１日目以降において、プリオン陽性細胞にペースメーカ細胞はほとんど含まれていないことが明らかとなった。
【００３６】
得られた細胞集団に自律拍動能があると、心臓に移植した際に不整脈を誘発する危険性がある。上記実験から、多能性幹細胞由来心筋細胞を取得するための分化誘導期間の下限は１０日、好ましくは１１日であると考えられた。
【００３７】
分化誘導８日のプリオン陽性細胞を培養皿上で７日間再培養すると、ＮａｎｏｇやＯｃｔ４などの多能性マーカーの発現が亢進する傾向を見いだした。また再培養後、稀に形成されるコロニーはＣｄｈ１陽性であることから、未分化な細胞が混入して増殖していることが示唆された。
【００３８】
分化誘導１４日のプリオン陽性細胞は培養皿上で７日間再培養の前後でほぼ同じ遺伝子発現パターンを示した。さらに、再培養後にはＣｄｈ１陽性の細胞集団は確認されなかった。
【００３９】
分化誘導２１日のプリオン陽性細胞は細胞分取の時点でＮａｎｏｇやＯｃｔ４などの多能性マーカーを発現し、さらに培養皿上で７日間再培養することでさらに、多能性マーカーの発現が亢進した。また再培養後、Ｃｄｈ１陽性のコロニーが複数観察された。
【００４０】
これらの結果から、分化誘導８日目および２１日目のプリオン陽性細胞には未分化細胞がかなり含まれており、細胞の癌化の観点からすると移植には不適であり、分化誘導１４日目のプリオン陽性細胞は移植に適することが再確認された。
【実施例２】
【００４１】
実施例２  プリオン陽性かつＳＳＥＡ１陰性を指標とした心筋細胞の取得
実施例１に記載したのと同様の方法により心筋細胞への培養およびフローサイトメトリー解析を行った。ＥＳ細胞としては、１２９Ｓ７／ＳｖＥｖＢｒｄ系統由来のＡＢ１細胞を用いた。
マウスの多能性マーカーとして知られるＳＳＥＡ１抗体をプリオン抗体と併用して、分化誘導２１日目の細胞をフローサイトメトリー解析、およびセルソーティングを行ったところ、プリオン陽性分画にはＳＳＥＡ１陰性細胞のほかにＳＳＥＡ１陽性の未分化細胞が存在することがわかった（図８上段右パネル）。プリオン陽性かつＳＳＥＡ１陽性分画の細胞を１０日間培養したところコロニーが出現し、増殖能を示すことがわかった（図８下段左パネルの右シャーレ）。さらに継代培養を行うと、非常に強い増殖能が見られた。（図８下段右パネルの右シャーレ）。一方、プリオン陽性かつＳＳＥＡ１陰性分画の細胞を１０日間培養しても増殖能を示さないことが明らかとなった（図８下段左パネルの左シャーレ）。さらに継代培養しても増殖能を示さなかった（図８下段右パネルの左シャーレ）。これは、ＳＳＥＡ１陰性を指標とすることにより、未分化細胞が除かれたためと考えられる。
【００４２】
これらの結果から、プリオン陽性であることに加えて、未分化マーカー陰性であることを指標にして心筋細胞を取得する場合において、分化誘導期間の上限は２１日以上であり、約１ヶ月であってもよく、例えば約２１日、約２４日、約２７日、約３０日、約３３日などであってもよいと考えられた。
【００４３】
上記実験で得られた分化誘導２１日の細胞のうちプリオン陽性かつＳＳＥＡ１陰性分画（図８の左上の分画）の細胞を回収して 凝集体を形成後、乳酸を添加したグルコース不含培地で培養して、心筋細胞の成熟化を行った。細胞の増殖能は認められず、さらに通常の培養条件よりも凝集体は小さく、また拍動する凝集体も確認出来なかった。
【００４４】
これらの結果から、プリオン陽性であることに加えて、未分化マーカー陰性であることを指標にして心筋細胞を取得することにより、分化誘導期間を延長しても安全な心筋細胞が得られ、成熟した心筋細胞を得ることも可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、移植に適した心筋細胞を提供する。このような心筋細胞は、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞を用いた再生医療に必須のものである。したがって、本発明は、再生医療や細胞工学に関連する諸産業において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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