(57)【要約】【課題】オフタルミン酸の新規製造法を提供することを課題とする。【解決手段】  以下のステップ、即ち、（１）yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損した微生物を培養するステップ及び（２）培養後の培養液及び／又は菌体よりオフタルミン酸を回収するステップを行い、オフタルミン酸を得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（１）及び（２）を含む、オフタルミン酸の製造法：
（１）yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損した微生物を培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体よりオフタルミン酸を回収するステップ。
【請求項２】
前記微生物が大腸菌である、請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
前記微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子も欠損している、請求項１又は２に記載の製造法。
【請求項４】
グルタチオン合成を触媒する酵素の遺伝子が前記微生物に導入されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項５】
アラニン−バリントランスアミナーゼ遺伝子が前記微生物に導入されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項６】
２−アミノブチレートを含有する培地を用いて、ステップ（１）の培養を行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項７】
システインを制限した培地を用いて、ステップ（１）の培養を行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項８】
最小培地に２−アミノブチレートを添加した培地を用いて、ステップ（１）の培養を行う、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造法。
【請求項９】
以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、オフタルミン酸の製造法：
（ｉ）２−アミノブチレートを含有する培地を用いて大腸菌を培養するステップ；
（ｉｉ）培養後の培養液及び／又は菌体より、オフタルミン酸を回収するステップ。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造法で得られたオフタルミン酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載のオフタルミン酸を含む組成物。
【請求項１２】
試薬又は食品添加物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損させることを特徴とする、オフタルミン酸高生産微生物の作製法。
【請求項１４】
前記微生物が大腸菌である、請求項１３に記載の作製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はオフタルミン酸（γ-L-Glutamyl-L-2-aminobutyryl-glycine）の新規製造法に関する。詳しくは、微生物を利用したオフタルミン酸の製造法及びその用途等に関する。
【背景技術】
【０００２】
E. coli由来YggSは、ピリドキサール5′-リン酸(PLP)を結合した機能未知タンパク質であり、そのホモログは、ヒトからバクテリア、植物、酵母に至るまで高度に保存されている。アーキアにおけるYggSのホモログは現在のところMethanosarcinaとMethanococcoidesの2種のみでその存在が確認されているのみであるが、バクテリアにおいては全バクテリアの91.3 %がYggSのホモログ遺伝子を有している。そのため、YggSおよびそのホモログは生体内において何らかの重要な機能を有していると予想されるがYggSやそのホモログタンパク質の機能は未知のままである。
【０００３】
E. coliにおいてyggS遺伝子はゲノムマップ上の66.67分に存在し、yggS-yggT-yggU-yggV-yggWといういずれも機能未知遺伝子からなるオペロンを形成している（非特許文献１）。同様のyggS遺伝子を含むオペロン構成はSalmonella enterica、Klebsiella pneumoniae、Pantoeaにおいてもみられる。yggSとオペロンを形成するタンパク質の機能については、よくわかっていないものの、先行研究より、YggTタンパク質をカリウムイオンの取り込み能を欠損したE. coli株で過剰発現させると、同菌の高塩濃度条件下での生育が改善することが示されている（非特許文献２）。一方、β-、γ-プロテオバクテリア、シアノバクテリア、ファーミキューテスなどのバクテリアで、yggSホモログ遺伝子は、グルタミン酸セミアルデヒドからProを合成する酵素をコードするproCと隣接して存在している。
【０００４】
YggSおよびそのファミリータンパク質において、その機能が明らかとなった例は報告されていないものの、現在までに、YggS、およびそのホモログであるサッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）由来Ybl036cpの構造が解析されている。YggS(およびYbl036cp)はタンパク質中で最もよく見られる8つの連続したα/βモチーフから成る(β/α)8-TIM(Triose phosphate isomerase)バレル構造を有したモノマータンパク質であり、PLPはLys残基(YggSではLys36、Ybl036cpではLys49)にシッフ塩基を介して結合している（非特許文献３）。また、この立体構造は、一次配列上の相同性が低いにもかかわらず、細菌アラニンラセマーゼのN末端ドメインと酷似している（非特許文献３）。
【０００５】
このように、YggSファミリータンパクの立体構造がアラニンラセマーゼに酷似していることから、これらタンパク質がアミノ酸ラセマーゼ活性を有する可能性が指摘されている。Ybl036cタンパク質がD-AlaからL-Alaへのラセミ化活性があることを示唆されている。また、枯草菌におけるyggSホモログであるylmE遺伝子とracX遺伝子の二重欠損が、D-Tyr、D-Metの生成を阻害することが報告され、YlmEタンパク質がTyrのラセミ化に関与することが示唆されている（非特許文献４）。なお、枯草菌において、D-TyrやD-Metは定常期において産生され、バイオフィルム形成阻害やバイオフィルムからの細菌の脱離を誘発することが報告されている。
【０００６】
また、E. coliにおけるyggS遺伝子欠損によるフェノタイプがいくつか報告されている。Haraらは、Keio collectionのsingle-gene欠損株3960株を用いて解糖系によるATP生合成活性を検証し、yggS欠損株のATP生合成活性が野生株と比べて2.2倍に増加することを報告した（非特許文献５）。なお、yggS欠損と同様に解糖系によるATP生合成活性が2倍以上高値を示した変異株は全変異株のうち約0.53 %のみであると報告され、興味深いことに、これらは以下の4つのカテゴリーに分類された。すなわち、1. F1-ATPase構成物質、2. グリコーゲン生合成関連物質、3. ピリミジンリボヌクレオチドのde novo合成関連物質、4.phosphotransferase system (PTS)構成物質である。これらの遺伝子の欠損がどのような機構で解糖系によるATP生合成を亢進するかは現在のところ定かではないが、YggSがこの4つのカテゴリーに属する可能性も考えられる。
【０００７】
また、Nicholsらは、抗生物質であるSulfonamidesとTrimethoprimの作用を検証する過程で、yggS遺伝子がglyA遺伝子(セリンヒドロキシルメチルトランスフェラーゼ)と致死性ペアであることを報告している（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−１９２７４６号公報
【特許文献２】国際公開第２０１１／１５８５９０号パンフレット
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ito et al. (2013) J Bacteriol. 195(24):5439-49
【非特許文献２】Ito et al. (2009) Biosci Biotechnol Biochem. 73(12):2698-704
【非特許文献３】Eswaramoorthy S et al. (2003) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59:127-35
【非特許文献４】Kolodkin-Gal I et al. (2010) Science. 328(5978):627-9
【非特許文献５】Hara KY et al. (2009) Metab Eng. 11(1):1-7
【非特許文献６】Nichols RJ et al. (2011) Cell. 144(1): 143-156
【非特許文献７】Soga T et al. (2006) J Biol Chem. 281(24):16768-76
【非特許文献８】Ohsu T et al. (2010) J Biol Chem.285(2):1016-22
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
オフタルミン酸（γ-L-Glutamyl-L-2-aminobutyryl-glycine）はグルタチオン（γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-glycine）のシステイン部が2-アミノブチレート（2-aminobutyrate；2-AB）へと置換されたアナログ化合物である。オフタルミン酸は、酸化ストレスや肝臓疾患のマーカーとして有用であることが報告されている（特許文献１、２、非特許文献７）。また、食品への利用も期待されている（非特許文献８）。本化合物の製造法としては化学合成（ペプチド合成）法のみが知られている。この方法は化学合成を用いるため、オフタルミン酸の製造に多大なコストを要する。
【００１１】
このような状況下、本発明は、診断、食品、更には研究などの分野での利用／応用が期待されるオフタルミン酸の新規製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らの研究グループでは、精製YggSタンパク質やE.coli MG1655株のyggS欠損株を用いて詳細な解析を行ってきた。現在までに、精製YggSタンパク質と各種タンパク質原性アミノ酸やその光学異性体(D体)とのラセミ化活性を含む反応性が検証され、これが前述したようなアミノ酸のラセミ化活性を示さないことが報告された。また、E. coli MG1655株yggS遺伝子の欠損株が、定常期の培地に高濃度のL-Valを蓄積することが報告され、これが対数期の、2-アミノブチレート(2-AB)、2-Ketobutyrate (2-KB)の蓄積に起因する、IleおよびValの代謝酵素群の発現亢進による可能性が提唱されている。さらに、定常期に観察されるL-Valの蓄積がCoAの前駆体であるパントテン酸の添加により解消されることから、YggSがCoAの生合成に関与する可能性も示唆されている（非特許文献１）。
【００１３】
本発明者らは、これまでの研究成果を踏まえ、YggSの機能解明を目標とし、前述したyggS欠損株のフェノタイプの主原因の解明を目指した。その結果、YggSの欠損がKIVからPantoateが生合成される経路のいずれかの過程に影響を与える可能性が示唆されている。また、BW25113株のyggS欠損株がMG1655株でみられたようなL-Valの高蓄積を示さない一方で、高濃度のオフタルミン酸を蓄積することを見出し、さらにこれがMG1655株のyggS欠損株でも観察されることを見出した。即ち、YggSが2-ABの代謝に関与する可能性が示唆され、yggS遺伝子の欠損株がオフタルミン酸の高生産に有用であることが判明した。また、詳細な実験の結果、オフタルミン酸の産生能の向上のためには、（１）γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ggt）遺伝子を欠損させること、（２）グルタチオン合成を触媒する酵素の遺伝子の導入により、グルタチオン合成を触媒する酵素を過剰発現させること、及び（３）アラニン−バリントランスアミナーゼ遺伝子の導入により、アラニン−バリントランスアミナーゼを過剰発現させること、が有効であることが明らかになるとともに、オフタルミン酸の高生産を促す培養条件も見出された。主として以上の成果に基づき、以下の発明が提供される。
［１］以下のステップ（１）及び（２）を含む、オフタルミン酸の製造法：
（１）yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損した微生物を培養するステップ；
（２）培養後の培養液及び／又は菌体よりオフタルミン酸を回収するステップ。
［２］前記微生物が大腸菌である、［１］に記載の製造法。
［３］前記微生物が、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子も欠損している、［１］又は［２］に記載の製造法。
［４］グルタチオン合成を触媒する酵素の遺伝子が前記微生物に導入されている、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の製造法。
［５］アラニン−バリントランスアミナーゼ遺伝子が前記微生物に導入されている、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の製造法。
［６］２−アミノブチレートを含有する培地を用いて、ステップ（１）の培養を行う、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の製造法。
［７］システインを制限した培地を用いて、ステップ（１）の培養を行う、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の製造法。
［８］最小培地に２−アミノブチレートを添加した培地を用いて、ステップ（１）の培養を行う、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の製造法。
［９］以下のステップ（ｉ）及び（ｉｉ）を含む、オフタルミン酸の製造法：
（ｉ）２−アミノブチレートを含有する培地を用いて大腸菌を培養するステップ；
（ｉｉ）培養後の培養液及び／又は菌体より、オフタルミン酸を回収するステップ。
［１０］［１］〜［９］のいずれか一項に記載の製造法で得られたオフタルミン酸。
［１１］［１０］に記載のオフタルミン酸を含む組成物。
［１２］試薬又は食品添加物である、［１１］に記載の組成物。
［１３］yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損させることを特徴とする、オフタルミン酸高生産微生物の作製法。
［１４］前記微生物が大腸菌である、［１３］に記載の作製法。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】菌体外アミノ酸分析の結果。MG1655株とBW25113株のWT（野生型）とyggS欠損株の菌体外アミノ酸をHPLCのD,L-アミノ酸分析を用いて解析した。MG1655 yggS欠損株ではL-Valの蓄積が観察された。一方、BW25113 yggS欠損株ではL-Valの蓄積は認められなかった。Ａ  黒：MG1655、灰色：MG1655 yggS欠損株。Ｂ  黒：BW25113  灰色：BW25113 yggS欠損株。
【図２】パントテン酸の未知化合物への影響。MG1655株とBW25113株の未知化合物へのパントテン酸の影響をHPLCのD,L-アミノ酸分析を用いて解析した。両yggS欠損株において未知化合物の蓄積(ピークX)が見出され、この化合物の蓄積はパントテン酸を添加しても解消されなかった。Ａ  黒：MG1655、薄い灰色：MG1655 yggS欠損株、濃い灰色：MG1655 yggS欠損株+1 mM パントテン酸。Ｂ  黒：BW25113、薄い灰色BW25113 yggS欠損株、濃い灰色：BW25113 yggS欠損株+1 mM パントテン酸。
【図３】精製YggSと未知化合物の反応性。MG1655 yggS欠損株のアミノ酸抽出液と精製YggSを作用させ、その反応性をHPLCのD,L-アミノ酸分析を用いて解析した。ピークXの減少は確認されなかったため、YggSは基質ではない可能性が示唆された。黒：MG1655 yggS欠損株、灰色： MG1655 yggS欠損株+精製YggS。
【図４】精製YggSと協調して働く物質の検討。MG1655 yggS欠損株のアミノ酸抽出液と精製YggS、yggS欠損株の破砕後上清とを作用させ、その反応性をHPLCのD,L-アミノ酸分析を用いて解析した。ピークXの減少は確認されなかったため、これがYggSの基質ではない可能性や、検討した反応条件が適切ではない可能性が示唆された。黒：MG1655 yggS欠損株、薄い灰色： MG1655 yggS欠損株+精製YggS、濃い灰色：MG1655 yggS欠損株+精製YggS+、yggS欠損株破砕後上清
【図５】未知化合物とホスファターゼの反応性。BW25113 yggS欠損株のアミノ酸抽出液に内部標準としてO-phospho-L-Serを添加してホスファターゼと作用させ、その反応性をHPLCのD,L-アミノ酸分析を用いて解析した。ピークXの減少は確認されなかったため、YggSはホスファターゼによって脱リン酸化されるようなリン酸基を有する化合物ではないことが示唆された。黒：BW25113 yggS欠損株、灰色： BW25113 yggS欠損株+ホスファターゼ
【図６】EZ:faastを用いた誘導体化。phenomenex（登録商標）社のEZ:faastアミノ酸分析キット用いた誘導体化の詳細を示す。クロロギ酸ノルマルプロピルによってアミノ酸のアミノ基とカルボキシル基は上図に示されたように誘導体化される。
【図７】LC/MS解析の結果。MG1655株とBW25113株のWTとyggS欠損株のアミノ酸抽出液をLC/MS/MS解析した。両yggS欠損株においてm/z 460の化合物が蓄積していることを見出した。Ａ及びＢ  黒：MG1655、灰色：MG1655 yggS欠損株、Ｃ及びＤ  黒：BW25113、灰色：BW25113 yggS欠損株
【図８】LC/MS/MS解析及びLC/MS/MS/MS解析の結果。m/z 460の化合物をLC/MS/MS解析した。更に、得られたそれぞれのフラグメントイオンについてLC/MS/MS/MS解析を行った。LC/MS/MS/MS解析の結果を四角の中に示す。各フラグメントイオンのアルファベットは図１０に示す構造と対応する。
【図９】未知化合物の推定構造。
【図１０】LC/MS/MS解析で得られたフラグメントイオンの帰属。LC/MS/MS解析によって得られたそれぞれのフラグメントイオンの推定構造を示した。また、丸で示した断片の内、どれか1つが解離している。各アルファベットは図８のフラグメントイオンと対応する。
【図１１】未知化合物の前駆体の検討。未知化合物の蓄積が2-ABもしくはGABAのどちらに起因するかを検討するために、BW25113株に2-ABもしくはGABAを添加して培養し、HPLCのD,L-アミノ酸分析を用いてWTにおける未知化合物の存在量の変化を調べた(ピークX)。2-ABを添加した場合にのみ、WTにおいても未知化合物の存在量の増加が認められたた。これにより2-ABが未知化合物の前駆体である可能性が強く示唆された。Ａ  黒：BW25113、薄い灰色：BW25113 yggS欠損株、濃い灰色：BW25113 yggS欠損株+1 mM 2-AB。Ｂ  黒：BW25113、薄い灰色：BW25113 yggS欠損株、濃い灰色：BW25113 yggS欠損株+1 mM GABA
【図１２】グルタチオンのLC/MS/MS解析と比較検討。推定したトリペプチド構造はグルタチオンアナログであるため、グルタチオンのLC/MS/MS解析によるフラグメンテーションを比較したところ、その起こり方が類似していることが確認された。
【図１３】オフタルミン酸標品との保持時間の比較。未知化合物のHPLCのD,L-アミノ酸分析での保持時間をオフタルミン酸標品の保持時間と比較した。未知化合物のピーク(ピークX)とオフタルミン酸標品のピークの保持時間が一致した。黒：BW25113、薄い灰色：BW25113 yggS欠損株、濃い灰色：オフタルミン酸標品
【図１４】オフタルミン酸標品のLC/MS分析。オフタルミン酸標品をLC/MS分析したところ、未知化合物と同じ保持時間に検出された。また、オフタルミン酸標品のm/zは460であり、未知化合物のm/zと一致した。
【図１５】オフタルミン酸標品のLC/MS/MS分析。オフタルミン酸標品をLC/MS/MS分析したところ、未知化合物と同様のフラグメントイオンが得られたことから、未知化合物はオフタルミン酸であると同定した。
【図１６】オフタルミン酸蓄積量の比較。各種変異体を作成し、オフタルミン酸の蓄積量を比較した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の第１の局面はオフタルミン酸の製造法に関する。本発明の製造法では、既存の化学合成法とは異なり、微生物を利用する。微生物を利用した本発明の製造法は、オフタルミン酸の効率的な製造に有効であり、製造コストの低減を図ることができる。
【００１６】
本発明の一態様では、yggS遺伝子を欠損した大腸菌株が高濃度にオフタルミン酸を蓄積した事実と、多くの微生物がyggS遺伝子のホモログ（yggSホモログ遺伝子）を保有している事実に基づき、yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損した微生物を用いる。具体的には、以下の（１）及び（２）のステップを行い、オフタルミン酸を製造する。
（１）yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損した微生物を培養するステップ
（２）培養後の培養液及び／又は菌体よりオフタルミン酸を回収するステップ
【００１７】
ステップ（１）では、yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損した微生物を用意し、培養に供する。微生物の種は特に限定されない。微生物の例を挙げれば、大腸菌、枯草菌、乳酸菌（ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、リューコノストック属など）、酵母（サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属など）である。好ましくは大腸菌を用いる。大腸菌の場合には、yggS遺伝子を欠損した大腸菌株が用いられる。一方、その他の微生物の場合には、yggSホモログ遺伝子を欠損したものが用いられることになる。yggS遺伝子／yggSホモログ遺伝子の欠損には、標準的な遺伝子組換え技術を用いればよい（例えばMolecular Cloning（Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或いはCurrent protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987）が参考になる）。標的遺伝子をノックアウトするための試薬やキットが数多く市販されており、それらを利用することもできる。紫外線照射や薬剤処理等によって突然変異を誘発することによって得られた、yggS遺伝子／yggSホモログ遺伝子を欠損した微生物を用いることもできる。また、自然界に見出される欠損株を用いることにしてもよい。尚、大腸菌については、yggS遺伝子欠損株をナショナルバイオリソースプロジェクト（NBRP）などから入手することができる。
【００１８】
大腸菌yggS遺伝子の具体例（塩基配列）を配列番号１（GenBank DEFINITION: Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, complete genome. ACCESSION: NC_000913 REGION: 3095098..3095802）に示す。また、yggSホモログ遺伝子の具体例として、枯草菌(Bacillus subtilis)の保有するものを配列番号２（GenBank DEFINITION: Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 chromosome, complete genome. ACCESSION: NC_000964 REGION: 1610170..1610862）に、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の保有するものを配列番号３（GenBank DEFINITION: Saccharomyces cerevisiae S288c chromosome II, complete sequence. ACCESSION: NC_001134 REGION: complement(150447..151220)）にそれぞれ示す。
【００１９】
本発明の一態様では、yggS遺伝子／yggSホモログ遺伝子に加えて、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ggt）遺伝子も欠損している微生物を用いる。ggt遺伝子はオフタルミン酸の分解に関与する酵素をコードする遺伝子であり、これを欠損させることにより、産生されたオフタルミン酸の分解を抑制することができ、オフタルミン酸の収量が増大する。実際、ggt遺伝子欠損株ではオフタルミン酸の蓄積量が増加し、当該戦略の有効性が裏づけられた（後述の実施例を参照）。ggt遺伝子の具体例を配列番号４（GenBank DEFINITION: Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, complete genome. ACCESSION: NC_000913 REGION: complement(3585081..3586823)）、配列番号５（GenBank DEFINITION: Bacillus subtilis gamma-glutamyltranspeptidase (ggt) gene, complete cds. ACCESSION: U49358
）に示す。
【００２０】
本発明の別の一態様では、yggS遺伝子／yggSホモログ遺伝子が欠損しているとともに、グルタチオンの合成を触媒する酵素の遺伝子が導入されている微生物を用いる。当該微生物は、グルタチオンの合成を触媒する酵素を過剰発現する。グルタチオンの合成は、γ-グルタミルシステイン合成酵素（GhsA, Glutamate--cysteine ligase (EC 6.3.2.2)）と、グルタチオン合成酵素（GshB, γ-L-glutamyl-L-cysteine:glycine ligase（EC 6.3.2.3））によって段階的に合成される。これらの二つの酵素が、「グルタチオンの合成を触媒する酵素」に該当する。本発明では、ghsA遺伝子又はgshB遺伝子、或いはこれらの両者が導入された微生物が用いられる。グルタチオンの合成を触媒する酵素の遺伝子を導入した微生物を用いると、オフタルミン酸の合成が促され、オフタルミン酸の収量が増大する。実際、ghsA遺伝子又はgshB遺伝子を導入すると、オフタルミン酸の蓄積量が増加し、当該戦略の有効性が裏づけられた（後述の実施例を参照）。ghsA遺伝子の具体例を配列番号６（GenBank DEFINITION: Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, complete genome. ACCESSION: NC_000913 REGION: 2814883..2816439）、配列番号７（GenBank DEFINITION: Saccharomyces cerevisiae S288c glutamate--cysteine ligase (GSH1), mRNA. ACCESSION: NM_001181534）に示す。同様に、gshB遺伝子の具体例を配列番号８（GenBank DEFINITION: Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, complete genome. ACCESSION: NC_000913 REGION: 3091878..3092828）、配列番号９（GenBank DEFINITION: Saccharomyces cerevisiae S288c chromosome XV, complete sequence. ACCESSION: NC_001147 REGION: 238619..240094）に示す。
【００２１】
本発明の更に別の一態様では、yggS遺伝子／yggSホモログ遺伝子が欠損しているとともに、アラニン−バリントランスアミナーゼ（AvtA）遺伝子が導入されている微生物を用いる。当該微生物はAvtAを過剰発現する。AvtAは、オフタルミン酸の中間体である2-ABの合成を触媒できる。従って、当該微生物を用いれば中間体が豊富に供給される結果、オフタルミン酸の合成量の増加を望める。実際、avtA遺伝子を導入すると、オフタルミン酸の蓄積量が増加し、当該戦略の有効性が裏づけられた（後述の実施例を参照）。avtA遺伝子の具体例を配列番号１０（GenBank DEFINITION: Escherichia coli str. K-12 substr. W3110, complete genome. ACCESSION: NC_007779 REGION: complement(3899457..3900710)）、配列番号１１（GenBank DEFINITION: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Abaetetuba str. ATCC 35640, complete genome. ACCESSION: CP007532 REGION: 925673..926911）に示す。
【００２２】
ghsA遺伝子、gshB遺伝子及びavtA遺伝子の導入は、yggS遺伝子やyggSホモログ遺伝子等の欠損と同様に、標準的な遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。
【００２３】
ggt遺伝子の欠損、グルタチオン合成を触媒する酵素の遺伝子の導入及びavtA遺伝子の導入の二つ以上を併用することにしてもよい。これらの戦略は、オフタルミン酸の合成経路／代謝経路の異なる作用点を標的にしたものであり、併用すれば複合的な効果が発揮され、オフタルミン酸合成量の一層の増大を望める。
【００２４】
培養法及び培養条件は、オフタルミン酸の産生ないし蓄積が促されるものである限り特に限定されない。換言すれば、目的物であるオフタルミン酸が産生されることを条件として、使用する微生物の培養に適合した方法や培養条件を適宜設定できる。培養法としては液体培養、固体培養のいずれでも良いが、好ましくは液体培養が利用される。
【００２５】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地を選択する。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。
【００２６】
好ましくは、低栄養培地を用いて培養を行う。本明細書において「低栄養培地」とは、LB培地やブイヨン培地などの富栄養培地と対照をなす培地であり、栄養素の量が制限された培地である。本発明では、アミノ酸の含量が少ない低栄養培地を使用することが特に好ましい。また、培地中にシステインを含むと、グルタチオンの産生が促され、結果としてオフタルミン酸の産生量が低減する。従って、好ましくは、システインを制限した培地（典型的にはシステインを含まない培地）を用いる。オフタルミン酸の合成に必要な２−アミノブチレートを培地に添加することは、オフタルミン酸の収量の増大に有効であることから、好ましくは、２−アミノブチレートを添加した培地を用いる。２−アミノブチレートの添加量は特に限定されないが、例えば10 μM〜10 mMである。
【００２７】
オフタルミン酸の収量の増大に最も適した培地の一例として、オフタルミン酸を添加した最小培地を挙げることができる。最小培地とは、微生物の生育に最低限必要な栄養で構成された培地である。最小培地としてM9最小培地、Davis-Mingioli最小培地、RCV最小培地、MOPS最小培地などが知られており、本発明においてもこれらの最小培地を採用できる。２−アミノブチレートを高産生する微生物（典型的には、avtA遺伝子が導入されており、AvtAを過剰発現する微生物）を用いた場合には、培地に２−アミノブチレートを添加しなくともオフタルミン酸の効率的な産生を望める。この態様の場合には、２−アミノブチレートを添加しない、又は２−アミノブチレートの添加量の少ない最小培地を利用することにし、製造コストの低減を図ることができる。
【００２８】
ここで、本発明者らの検討の結果（実施例）を踏まえると、大腸菌がオフタルミン酸を合成する潜在能力を持っており、２−アミノブチレートが添加された培地を用いれば、yggS遺伝子を欠損していない大腸菌株であっても、オフタルミン酸の製造に利用できることが示唆される。この知見に基づき、本発明の一態様では、２−アミノブチレートを含有する培地（好ましくは、２−アミノブチレートを添加した最小培地）を用いて大腸菌を培養に供し、オフタルミン酸を産生させる。
【００２９】
培地に微生物を接種して培養を開始するが、必要に応じて前培養を行っても良い。培養に供する微生物として２種類以上の微生物を併用することにしてもよい。培地のpHは例えば3〜10、好ましくは7〜8程度に調整し、培養温度は例えば10〜60℃、好ましくは約20〜40℃程度にするとよい。後述の実施例に示した実験の結果を踏まえると、オフタルミン酸の産生量を高めるためには、比較的低温（例えば約30℃）での培養が好ましいといえる。
【００３０】
培養時間は特に限定されないが、産生されたオフタルミン酸が分解（再吸収）し、収量が減ることから、過度に長期間の培養は避けると良い。好ましくは、対数増殖期が終了する際に培養を完了し、次の操作、即ち、オフタルミン酸の回収（ステップ（２））を行う。最適な培養時間は、使用する菌株、目的とする収量、培養条件、培養スケールなどによって異なるが、予備実験を通して設定することができる。培養時間の具体例を示すと、6時間〜3日である。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００３１】
培養後、培養液又は菌体よりオフタルミン酸を回収する（ステップ（２））。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、凍結乾燥等による濃縮、各種クロマトグラフィー、再結晶等を適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより、オフタルミン酸を得ることができる。
【００３２】
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、酸・アルカリ、もしくは有機溶媒などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことによりオフタルミン酸を得ることができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００３３】
以上のように回収等の処理を行えば、純度の高いオフタルミン酸が得られる。一方、本発明の一態様では、オフタルミン酸が蓄積された培養液、又はオフタルミン酸を蓄積した菌体をそのまま、或いはろ過、濃縮及び／又は乾燥させた後、各種利用に供する。
【００３４】
本発明の第２の局面は、本発明の製造法で得られたオフタルミン酸及びその用途に関する。本発明の製造法で得られたオフタルミン酸は、例えば、試薬、食品添加物など、各種組成物の形態で提供される。オフタルミン酸が酸化ストレスや肝臓疾患のマーカーとして有用であることが報告されており、診断分野でのオフタルミン酸の利用、応用が期待される。一方、オフタルミン酸の機能、役割などについては不明な点も多く、研究対象としても注目に値する。オフタルミン酸を含有する本発明の組成物は診断分野、研究分野等で利用され得る。具体的には、例えば、標品（標準試薬）として本発明の組成物を利用することができる。一方、オフタルミン酸は旨味ないしコク味成分として有用である（非特許文献８）。この特徴を活かし、旨味ないしコク味の増強剤として本発明の組成物を用いることも可能である。旨味ないしコク味の増強剤としての本発明の組成物を適用可能な食品の例として、スープ、アルコール飲料（ビール、発泡酒などのビール系飲料、果実酒、リキュールなど）、清涼飲料水、果汁飲料、野菜汁飲料、加工総菜（缶詰、瓶詰め、レトルト食品など）を挙げることができる。
【００３５】
本発明の更なる局面は、yggS遺伝子を欠損させた大腸菌株がオフタルミン酸の高生産に有用であるとの知見に基づき、yggS遺伝子又はyggSホモログ遺伝子を欠損させることを特徴とする、オフタルミン酸高生産微生物の作製法を提供する。本発明の作製法に供する微生物は特に限定されず、例えば大腸菌、枯草菌、乳酸菌（ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属、ペディオコッカス属、リューコノストック属など）、酵母（サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属等を用いる。
【実施例】
【００３６】
＜E. coli由来YggSの機能解明＞
E. coli由来YggSの機能を解明するため、yggS欠損株のフェノタイプの主原因を特定すべく、以下の検討を行った。
【００３７】
１．実験材料及び方法
（１）菌株、プラスミド及び形質転換体
菌株
大腸菌MG1655株、大腸菌MG1655DyggS (Kmr)株、大腸菌BW25113株、大腸菌BW25113ΔyggS (Kmr)株は過去に作成したものを用いた(非特許文献１、２)。作成方法を簡単に説明すると、まず、yggS遺伝子の両端約40bpをそれぞれカナマイシン耐性遺伝子に連結したPCR産物を準備する。これをエレクトロポレーション法によってE.coli内へ導入し、相同組み換えによって当該遺伝子がカナマイシン遺伝子と置換された変異株を選別する。
【００３８】
プラスミド
pUC19をInvitrogen社から購入し、下表のプラスミドを作成した（非特許文献１、２)。尚、pUC19にyggS遺伝子はMCSにプロモーターとは逆向きに挿入されている。また、6×Hisは各タンパク質のC端に付加されている。
【表１】
2016042846.tif 000002
【００３９】
形質転換体
Inoue法により、MG1655株、MG1655DyggS株、BW25113株、BW25113DyggS株についてコンピテントセル作成した。そのコンピテントセルと上記のプラスミドを用いて下表のように形質転換を行った。
【表２】
2016042846.tif 000003
【００４０】
（２）培地組成
LB培地
1% ポリペプトン
0.5% 酵母エキス
1% NaCl
pH調整なし
【００４１】
M9最少培地
0.6% Na2HPO4
0.3% KH2PO4
0.1% NH4Cl
0.05% NaCl
上記組成をオートクレーブ後、0.2μmフィルター滅菌した下記組成を添加した。
0.2% グルコース
0.001% チアミン-HCl
1mM MgSO4
10μM CaCl2
10μM FeSO4
100μg/ mL アンピシリン
【００４２】
（３）培養方法、集菌
最少培地での培養、集菌、洗菌
(1) 12.5%グリセロールストックからアンピシリン(100μg/mL)添加LB培地に植菌する。
(2) 30℃にて一晩浸透培養し、前培養液とする。
(3) 下記に組成を示すPBSで洗菌し、M9最少培地(200 mL)にO.D.600=0.01となるように前培養から植えつぐ。
(4) 30℃にて培養し、本培養液とする。
(5) O.D.600=0.5になったら集菌する。
(6) PBSに懸濁させ、遠心して洗菌し、使用するまで-20℃で保存する。
【００４３】
PBS
140mM  NaCl
2.7mM  KCl
10mM  Na2HPO4・12H2O
1.8mM  KH2PO4
【００４４】
（４）アミノ酸抽出液、菌体破砕後上清
アミノ酸抽出液
洗菌後の菌体を用いた。
(1) 菌体量の10倍量の5% TCA溶液に再懸濁
(2) 時々攪拌しながら、氷上で30分インキュベートする。
(3) 遠心(15,000rpm, 15分, 4℃)し、上清をとる。
(4) サンプルと等量以上の水飽和ジエチルエーテルを加え、攪拌(5分, R.T.)する。
(5) 遠心(6,000rpm, 5分, R.T.)し、ジエチルエーテル層を除く。
(6) (4)、(5)のステップをさらに2回繰り返す。
(7) 凍結乾燥を行い、5倍濃縮となるようにMilli-Qに再溶解する。
尚、HPLCにて測定を行う際は、上記(7)処理後のサンプルを5倍希釈して用いた。
【００４５】
菌体破砕後上清
洗菌後の菌体を用いた。
(1) 破砕バッファーを調製
100mM  KPB (pH 7.5)
0.5mM  DTT
20%  グリセロール
(2) 菌体量の10倍量の破砕バッファーに再懸濁する。
(3) 超音波破砕(80%, 15秒)する。
(4) 遠心(15,000rpm, 20分, 4℃)し、上清をとる。
【００４６】
尚、HPLCにて測定を行う際は、以下の系で30℃一晩インキュベートしたものをサンプルとして用いた。
アミノ酸抽出液    20μl
破砕後上清    4μl
0.5Mリン酸ナトリウムバッファー    20μl
0.2M PLP    4μl
PBS    2μl
Milli-Q    50μl
5倍濃縮アミノ酸抽出液    5μL
Antarctic phosphatase    1μL
10×AP buffer    5μL
50μM O-phospho-L-Ser    25μL
Milli-Q    14μL
【００４７】
（５）YggSの精製
(1) BL21(DE3)STARのコンピテントセルを作成する。
(2) pET101/D-TOPO（登録商標）- yggS -Hisを形質転換する。
(3) 12.5%グリセロールストックからアンピシリン(100μg/mL)添加LB培地に植菌する。
(4) 37℃にて一晩浸透培養し、前培養液とする。
(5) アンピシリン(100μg/mL)添加LB培地に植菌する。
(6) 培養開始から5時間後終濃度0.1 mMとなるようIPTGを添加する。
(7) さらに4.5時間培養した後、集菌する。
(8) His-Bind Resin (Novagen)添付のプロトコルに従い、下記の結合バッファーに懸濁し、
超音波破砕処理(70%, 45秒×4回)を行う。
(9) 遠心 (15,000rpm, 30分, 4℃)し、上清をフィルター滅菌後カラムへ供する。
(10)下記バッファーを用いて、レジン添付のプロトコルに従い精製する。
(11)PBSで透析する。
SDS電気泳動を用いた精製の確認を図１に示す。
結合バッファー（pH 7.9）
0.5M  NaCl
20mM  Tris-HCl
5mM  イミダゾール
洗浄バッファー（pH7.9）
0.5M  NaCl
20mM  Tris-HCl
60mM  イミダゾール
溶出バッファー（pH7.9）
0.5M  NaCl
20mM  Tris-HCl
1M  イミダゾール
【００４８】
尚、HPLCにて測定を行う際は、以下の系で30℃一晩インキュベートしたものをサンプルとして用いた。
アミノ酸抽出液    20μL
精製YggS    2μL
0.5Mリン酸ナトリウムBuffer    20μL
0.2M PLP    4μL
Milli-Q    54μL
【００４９】
（６）HPLCによるD,L-アミノ酸分析
N-α-tBoc-L-Cys-OH (Boc), O-Phthal Aldehyde (OPA)を用いてアミノ酸のアミノ基を蛍光標識し、0.1 M酢酸バッファー (pH 6.0)、アセトニトリル9〜50%でグラジエントをかけ、アセトニトリルの濃度を上げて疎水性を増加させることで各アミノ酸を分離・溶出した。各溶液や分析条件は以下の通りである。
移動相
移動相A
0.1M  酢酸バッファー(pH 6.0)
9%  アセトニトリル
移動相B
0.1M  酢酸バッファー(pH 6.0)
50%  アセトニトリル
【００５０】
Boc-OPA/Methanol (要時調製)
Boc    5mg
OPA    5mg
メタノール 500μLに溶解させた後、低温遮光
【００５１】
測定液組成
サンプル    5μL
Boc-OPA/メタノール    50μL
0.4M ホウ酸-NaOH (pH 9.0)    195μL
このうち、20μLをHPLCにアプライした。
【００５２】
分析機器
機器：LCsolution
CBM-20A ：システムコントローラ (SHIMADZU CORPORATION)
LC-20AB ：送液ユニット (SHIMADZU CORPORATION)
SIL-10AXL ：検出器 (SHIMADZU CORPORATION)
CTO-20AC ：オートサンプラ (SHIMADZU CORPORATION)
【００５３】
カラム
Nacalai tesque COSMOSIL 5C18-AR-II (φ4.6 mm ×150 mm) (nakarai tesque)
【００５４】
分析条件
・流速  0.8mL/分
・タイムプログラム (下表)
・検出方法
Excitation wavelengths 344nm
Emission wavelengths 443nm
・カラムオーブン 25.0℃
【表３】
2016042846.tif 000004
【００５５】
（７）EZ:faastを用いたLC/MS分析
EZ:faast(phenomenex（登録商標）)を用いてアミノ酸分析を行った。アミノ酸抽出液をEZ:faastのプロトコルに従って陽イオン交換樹脂が充填されたチップで精製後、誘導体化し、逆相カラムによって各アミノ酸を分離・溶出したものをEsqure3000でESI MSにかけた。
誘導体化に用いた試薬(EZ:faast,, phenomenex（登録商標）) 
Reagent 1    0.2mM ノルバリン, 10% N-プロパノール
Reagent 2    Na2CO3
Reagent 3A    水酸化ナトリウム
Reagent 3B    N-プロパノール
Reagent 4    クロロホルム
Reagent 5    イソオクタン
Reagent 6    80% イソオクタン, 20% クロロホルム
【００５６】
移動相
移動相A
10 mM ギ酸アンモニウム水溶液
移動相B
10 mM ギ酸アンモニウム・メタノール溶液
【００５７】
分析機器
Agilent 1100 Series HPLC system (Agilent Technologies, USA)
Esquire 3000 ion trap system (Bruker Daltonics, USA)
【００５８】
カラム
EZ:faast付属 4μ AAA-MS 250 x 2.0 mm
【００５９】
分析条件
HPLC
・流速  0.25mL/分
・タイムプログラム(下表)
・カラムオーブン  25.0℃
・サンプルアプライ量  10μL
【表４】
2016042846.tif 000005
【００６０】
MS
・Mode    Positive Ion
・Scan range    100-600m/z
・ESI ion temperature    365℃
・Nebulizer  40.0psi
・Dry gas  7.0L/分
・Dry temperature  320℃
・Target mass    281m/z
・Compound stability    50%
・Trap drive revel    100%
・Optimize    Normal
【００６１】
２．結果
（１）WTと欠損株の対数期におけるアミノ酸組成
これまでの研究成果によれば、MG1655株とBW25113株ではyggS遺伝子を欠損させたときのフェノタイプが異なることが明らかとなっている。そこで、両菌のWTと欠損株をM9最少培地で30℃にて対数期まで培養し、菌体内アミノ酸組成をHPLCのD,L-アミノ酸分析によって解析した。その結果を図１に示す。MG1655株のyggS欠損株ではWTの17.6倍量のL-Valの蓄積が確認された(図１Ａ)のに対し、BW25113株のyggS欠損株では1.06倍とL-Valの蓄積は認められなかった(図１Ｂ)。しかし、BW25113株のyggS欠損株において保持時間(R.T.) 21.2分にある、一種類の化合物がWTの4.66倍と高濃度に蓄積していることを見出した(図２ＢのピークX)。この化合物は、MG1655株のyggS欠損株においてもR.T. 20.7 分にWTの22.7倍と高濃度に蓄積していることが確認された（図２ＡのピークX)。また、過去の検討によって、MG1655株のyggS欠損株において、パントテン酸を添加するとL-Valの蓄積が解消することが明らかとなっているが、この化合物の蓄積については1mMのパントテン酸を添加して同様に培養を行っても解消されなかった(図２Ａ及びＢのピークX)。
【００６２】
（２）未知化合物の諸性質検討
両菌のyggS欠損株に共通して蓄積していた未知化合物の同定を目的に、諸性質の検討を行った。まず、未知化合物がYggSの基質である可能性を検証するために、YggSの精製を行った。SDSゲル電気泳動でYggSの精製を確認した。MG1655株yggS欠損株をM9最少培地で30℃にて対数期まで培養し、菌体内のアミノ酸を抽出して、アミノ酸抽出液と精製YggSを「実験材料および方法」に示す反応系で一晩作用させ、HPLCのD,L-アミノ酸分析を用いて解析した(図３)。未知化合物のピークに変化は認められなかったため、YggSの未知化合物への反応性は認められなかった。YggSは結合しているPLPのsi面が溶媒に露出している。そのため、YggSがPLPを補酵素としてアミノ酸と反応するためには、si面側から作用するアミノ酸残基が必要であることも予想される。YggSと協調して働く物質の存在を考慮し、yggS欠損株のアミノ酸抽出液を精製YggSとyggS欠損株の破砕後上清と「実験材料および方法」に示す反応系で一晩作用させた(図４)。この際にも、未知化合物のピークの変化は観察されなかった。以上の結果は、未知化合物がYggSの基質ではない可能性や、基質であったとしても検討した反応条件が適切でなかったことなどを示唆している。
【００６３】
次に、未知化合物と56種類のアミノ酸標品（タンパク質原性アミノ酸とその光学異性体(39種類)、アミノピメリン酸、α-アミノアジピン酸、α-アミノ酪酸、β-アミノイソ酪酸、シスチン、シトルリン、シスタチオニン、γ-アミノ酪酸、グリシン-プロリン、δ-ヒドロキシリジン、4-ヒドロキシプロリン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、オルニチン、プロリン-ヒドロキシプロリン、サルコシン、チオプロリン）のHPLCからの溶出時間を比較した。しかしながら、R.T.が一致するアミノ酸は検討した56種類のアミノ酸中には見出せなかった(データ示さず)。
【００６４】
この未知化合物は、アミノ酸分析においては、AspやGluといった酸性アミノ酸やSerなどの極性アミノ酸の近辺に検出される。このことから、未知化合物は極性が大きいジカルボン酸やリン酸化物である可能性が予想された。そこで、BW25113株のyggS欠損株アミノ酸抽出液に内部標準としてO-phospho-L-Serを添加してホスファターゼと30℃にて一晩作用させることでリン酸化物である可能性を検討した(図５)。未知化合物のピークはホスファターゼを添加しても減少しなかったため、未知化合物はホスファターゼによって分解されるようなリン酸基を有した化合物ではないと予想された。
【００６５】
（３）LC/MSを用いた未知化合物の構造推定
未知化合物の構造を推定するために、phenomenex（登録商標）社のEZ:faastアミノ酸分析キットを用いてyggS欠損株(MG1655株、BW25113株)の対数期のアミノ酸抽出液のアミノ酸分析を行った。このキットにおいてアミノ酸をクロロギ酸ノルマルプロピルで誘導体化を行った（図６）。誘導体化後、逆相HPLCで分離・溶出した後、ESI MSによって分析を行った。MG1655株のアミノ酸抽出液の全イオンクロマトグラム（Total ion chromatogram）を図７Ａに示した。一方、BW25113株のアミノ酸抽出液の全イオンクロマトグラム（Total ion chromatogram）を図７Ｃに示した。両yggS欠損株においてR.T. 7.0分に突出したピークが存在することを見出した(図７Ａのピークａ、図７Ｃのピークｂ)。このピークは、m/z 460の化合物の蓄積に起因することが判明した。m/z 460のイオンクロマトグラム（Ion chromatogram）を抽出すると、WTに比べて明らかにyggS欠損株で460の分子量の化合物が多量に存在していることを見出した(図７Ｂ、Ｄ)。この化合物は、両yggS欠損株で蓄積が確認されたため、HPLCを用いたD,L-アミノ酸分析において蓄積が確認された未知化合物と同一のものであると推定される。また、この分子量は前述の56種類のアミノ酸の分子量とは異なる。
【００６６】
詳細な構造推定のため、m/z 460の未知化合物をLC/MS/MS解析し、さらに、LC/MS/MSによって得られたそれぞれのフラグメントイオンについてLC/MS/MS/MS解析を行った(図８)。460の分子量の化合物から得られるフラグメントイオンのm/zは、343.4、315.4、258.3、203.3、172.2であった。それぞれのフラグメントイオンLC/MS/MS/MSで得られたm/zを図８の四角に中に示す。LC/MS/MS/MSで得られたm/z 258やm/z 172はGluのフラグメントイオンと一致していることから、未知化合物中にGluの含有が示唆された。一方で、LC/MS/MSで得られたm/z 343は、Glyの含有を示していることを見出した。これらの解析を踏まえ、γ-Glu-2-AB-Glyとγ-Glu-γ-Aminobutyrate (GABA)-Glyの２種のトリペプチドの構造を推定した(図９)。なお、LC/MS、LC/MS/MSから得られたフラグメンテーションの帰属を図１０に示した。
【００６７】
Glu、Glyは菌体内に多量に存在するため、2-ABもしくはGABAの蓄積がこの未知化合物の蓄積に起因する可能性が考えられる。そこで、BW25113株のWTとyggS欠損株に1 mMの2-ABもしくはGABAを添加してM9最少培地で30℃にて対数期まで培養し、WTにおける未知化合物の存在量の変化を検証した(図１１)。2-ABを添加した場合、WTの未知化合物が未添加の場合に比べて3.85倍蓄積したのに対し(図１１ＡのピークX)、GABAを添加してもWTの未知化合物は未添加と比べて0.66倍であり存在量の増加は認められなかった(図１１ＢのピークX)。
【００６８】
以上の結果から、両yggS欠損株に蓄積する未知化合物は、γ-Glu-2-AB-Glyのトリペプチド(オフタルミン酸)である可能性が示唆された。この推定トリペプチドの構造は、2残基目の側鎖が異なるグルタチオンアナログである。そこで、グルタチオンのLC/MS/MSとフラグメンテーションを比較した(図１２)。未知化合物のLC/MS/MSにおけるフラグメンテーションの起こり方がグルタチオンのフラグメンテーションと類似していることが確認でき、この未知化合物がグルタチオンアナログである可能性が支持された。以上より、YggSは2-ABの代謝に関与すると示唆された。
【００６９】
（４）未知化合物の同定
未知化合物のHPLCのD,L-アミノ酸分析での溶出時間をオフタルミン酸標品の溶出時間と比較した。未知化合物とオフタルミン酸標品のピークが重なった(図１３のピークX)。さらに、オフタルミン酸標品のLC/MS、LC/MS/MS分析を行い、未知化合物の分析結果と比較した。LC/MS分析したところ、未知化合物と同様の保持時間に溶出され、m/zが一致した（図１４）。また、オフタルミン酸標品のLC/MS/MS分析により未知化合物と同様のフラグメントイオンが検出されたことから（図１５）、未知化合物をオフタルミン酸であると同定した。
【００７０】
＜オフタルミン酸産生能の向上＞
オフタルミン酸を効率的に製造する方法の実現を目指し、各種遺伝子の導入／欠損と、オフタルミン酸産生能との関係を調べた。
【００７１】
１．方法
（１）グルタチオンの合成を触媒する酵素を過剰発現する大腸菌株の作成
E.coli由来gshAもしくはE. coli由来gshB遺伝子を含んだpCA24Nプラスミド（NBRPより購入）を前述のInoue法によってMG1655DyggS株もしくはBW25113DyggS株へ導入することで作製した。
【００７２】
（２）yggS遺伝子及びγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ggt）遺伝子欠損株の作成
ggt遺伝子欠損大腸菌を、前述の＜E. coli由来YggSの機能解明＞１．−（１）に示した方法によってyggS遺伝子を欠損させた。尚、yggS遺伝子及びggt遺伝子の欠損に加え、ghsA遺伝子又はgshB遺伝子が導入された変異株も作成した。
【００７３】
（３）アラニン−バリントランスアミナーゼ（AvtA）を過剰発現する大腸菌株の作成
E. coli avtA遺伝子を挿入したpCA24Nプラスミド（NBRPより購入）を前述のInoue法によってMG1655DyggS株もしくはBW25113DyggS株へ導入することで作製した。
【００７４】
（４）培養方法
以下の条件で培養した。即ち、LB培地にて30℃にて一晩浸透培養した前培養液をPBSで洗菌し、M9最少培地(200 mL)にO.D.600=0.01となるように前培養から植えついだ。その後30℃にて振盪培養する。この際IPTGを終濃度で0.01〜1mM程度加えても良い。その後O.D.600が0.5〜2になった時点で遠心し、集菌した。尚、培養温度の影響を調べるため、37℃での培養も行った。
【００７５】
（５）オフタルミン酸産生量の評価
以下の方法で評価した。培養後の菌体を菌体量の10倍量の5% TCA溶液に再懸濁し、時々攪拌しながら、氷上で30分インキュベートした。遠心(15,000rpm, 15分, 4℃)し、上清を回収し、サンプルと等量以上の水飽和ジエチルエーテルを加え、攪拌(5分, R.T.)した。
遠心(6,000rpm, 5分, R.T.)し、ジエチルエーテル層を除く操作を除き、このエーテル抽出操作はさらに2回繰り返した。その後凍結乾燥によって5倍濃縮となるようにMilli-Qに再溶解した。HPLCを用い、オフタルミン酸量を定量した。
【００７６】
２．結果
実験結果を図１６に示す。まず、yggSの欠損によってオフタルミン酸の蓄積量が約7倍上昇した。yggS欠損株にグルタチオンの合成を触媒する酵素(GhsA、GshB)を過剰発現させると、オフタルミン酸蓄積量が増加した。一方、yggSの欠損に加え、ggt遺伝子をノックアウトすると、わずかではあるものの、オフタルミン酸の蓄積量は増加した。ΔyggSΔggt二重変異株にghsA遺伝子又はgshB遺伝子を導入することで、オフタルミン酸の合成量は更に高められた。また、2-ABの合成に関与し得るavtA遺伝子の導入によってもオフタルミン酸の合成量が高められた。ΔyggSを37℃で培養した場合にはオフタルミン酸の蓄積が認められなかった。
【００７７】
以上の通り、オフタルミン酸の蓄積量を向上させるための戦略として、yggSの欠損に加え、ggt遺伝子の欠損、グルタチオン合成を触媒する酵素の過剰発現、及びAvtAの過剰発現が有効であることが判明した。また、比較的低温で培養するとオフタルミン酸の蓄積が促されることも明らかとなった。尚、培地の組成についても検討した結果、2-アミノブチレートの添加はオフタルミン酸の蓄積を促す一方で、メチオニンやホモセリンなどの添加はオフタルミン酸の蓄積量を低下させた（データ示さず）。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、微生物によるオフタルミン酸の発酵生産が可能となる。オフタルミン酸は酸化ストレスや肝臓疾患のマーカーとして有用であることが報告されており、食品への利用も期待されている。本発明は、オフタルミン酸の供給を通して、オフタルミン酸の利用ないし応用に貢献し得る。
【００７９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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