(57)【要約】【課題】細胞傷害性Ｔ細胞の分化過程を研究する新たな研究用ツールである、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。また、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法及びＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞並びに免疫関連疾患の治療又は予防剤を提供する。【解決手段】Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を産生するＥｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物；上記トランスジェニック非ヒト動物からＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を採取する工程を備えるＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法、及びＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞；Ｅｏｍｅｓ遺伝子を発現可能な組換えベクターを有効成分として含有する免疫関連疾患の治療又は予防剤；Ｅｏｍｅｓタンパク質を有効成分として含有する免疫関連疾患の治療又は予防剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（Ｅｏｍｅｓ）＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を産生する、Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２】
請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト動物からＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を採取する工程を備える、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法。
【請求項３】
Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞。
【請求項４】
配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の発現ベクター、又は
配列番号１に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質をコードする核酸の発現ベクター、
を有効成分として含有する、免疫関連疾患の治療又は予防剤。
【請求項５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は
配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質、
を有効成分として含有する、免疫関連疾患の治療又は予防剤。
【請求項６】
前記免疫関連疾患が、癌、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患である、請求項４又は５に記載の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（Ｅｏｍｅｓ）遺伝子トランスジェニック非ヒト動物、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞、及び免疫関連疾患の治療又は予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス等の細胞内に寄生した病原体に対して、ヒトやマウスの免疫系は、その病原体を直接攻撃するのではなく、感染細胞自体を傷害し、細胞死を誘導するという戦略をとっている。この役割を担っているのがＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞やＮＫ細胞等の細胞傷害性細胞であり、これらの細胞が感染細胞を感知して行う細胞傷害は、病原体に対する免疫応答の重要な部分を占めている。
【０００３】
細胞傷害性細胞の細胞傷害性機能発現や分化に重要な分子として、Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（Ｅｏｍｅｓ）等の転写調節因子が知られている。例えば、非特許文献１では、インビトロ及びインビボにおいて、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞でＥｏｍｅｓ遺伝子の発現が誘導されることが報告されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Pearce E. L., et al., Control of effector CD8+ T cell function by the transcription factor Eomesodermin, Science, 302 (5647), 1041-3, 2003.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、リンパ球の細胞傷害機能におけるＥｏｍｅｓ遺伝子の役割には未だ不明な点が多い。そこで、本発明は、細胞傷害性Ｔ細胞の分化過程を研究する新たな研究用ツールである、トランスジェニック非ヒト動物を提供することを目的とする。また、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法及びＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を提供することを目的とする。また、ヘルパーＴ細胞に細胞傷害活性を付与するという原理に基づく、免疫関連疾患の治療又は予防剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は以下の通りである。
（１）Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を産生する、Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物。
（２）（１）に記載のトランスジェニック非ヒト動物からＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を採取する工程を備える、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法。
（３）Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞。
（４）配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の発現ベクター、又は配列番号１に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質をコードする核酸の発現ベクター、を有効成分として含有する、免疫関連疾患の治療又は予防剤。
（５）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質、を有効成分として含有する、免疫関連疾患の治療又は予防剤。
（６）前記免疫関連疾患が、癌、自己免疫疾患又はアレルギー性疾患である、（４）又は（５）に記載の治療又は予防剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、細胞傷害性Ｔ細胞の分化過程を研究する新たな研究用ツールである、トランスジェニック非ヒト動物及びＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を提供することができる。また、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法を提供することができる。また、ヘルパーＴ細胞に細胞傷害活性を付与するという原理に基づく、免疫関連疾患の治療又は予防剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック（Ｔｇ）マウスの作製に用いたトランスジーンの構造を示す模式図である。
【図２】実験例２におけるフローサイトメトリーによる代表的な解析結果を示すグラフである。
【図３】（ａ）は、実験例３におけるＩＬ−４の定量結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３におけるクロム遊離試験の結果を示すグラフである。
【図４】（ａ）及び（ｂ）は、実験例４におけるフローサイトメトリーによる代表的な解析結果を示すグラフである。
【図５】（ａ）は、実験例５におけるＩＬ−４の定量結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例５におけるＩＬ−５の定量結果を示すグラフである。
【図６】実験例６におけるフローサイトメトリーによる解析結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物］
１実施形態において、本発明は、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を産生する、Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物を提供する。
【００１０】
後述するように、本実施形態のトランスジェニック非ヒト動物は、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を産生することができ、Ｔ細胞の分化過程を研究する研究用ツールとして有用である。
【００１１】
インビトロでＣＤ４＋Ｔ細胞を維持するためには、抗原刺激を行うことが必要になる。このため、インビトロでナイーブＴ細胞、すなわち、抗原刺激を受けていないＴ細胞を解析することは困難である。したがって、インビトロでＣＤ４＋Ｔ細胞にＥｏｍｅｓ遺伝子を導入し、Ｅｏｍｅｓ遺伝子のみの影響を解析することは困難である。
【００１２】
これに対し、発明者らは、本実施形態のトランスジェニック非ヒト動物が、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を産生することができることを見出した。これは、Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物を実際に作製して初めて確認できる現象である。したがって、本実施形態のトランスジェニック非ヒト動物を用いて抗原刺激を受けていないＣＤ４＋ナイーブＴ細胞におけるＥｏｍｅｓ遺伝子の影響を解析することができる。例えば、Ｔ細胞が細胞傷害活性を獲得するために、抗原刺激が必要であるのか否かを検討することができる。
【００１３】
（非ヒト動物）
本実施形態のトランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物にＥｏｍｅｓ遺伝子の発現ベクターを導入することにより作製することができる。非ヒト動物としては特に制限されず、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、サル、ニワトリ等が挙げられる。
【００１４】
（Ｅｏｍｅｓ遺伝子）
本実施形態のトランスジェニック非ヒト動物がトランスジーンとしてゲノム上に保持するＥｏｍｅｓ遺伝子としては、例えば、非ヒト動物がマウスである場合には、配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。配列番号３に記載の塩基配列は、マウスＥｏｍｅｓ遺伝子の塩基配列である。
【００１５】
非ヒト動物がマウスである場合、トランスジーンとしてのＥｏｍｅｓ遺伝子は、配列番号３に記載の塩基配列からなる遺伝子に限られず、配列番号３に記載の塩基配列と、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性（相同性）を有し、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００１６】
ここで、「Ｅｏｍｅｓ活性」とは、転写因子であるＥｏｍｅｓタンパク質と同様の転写活性を意味する。ここで、「Ｅｏｍｅｓタンパク質と同様の転写活性」とは、Ｅｏｍｅｓタンパク質の発現により転写が活性化される遺伝子と実質的に同一の遺伝子の転写を活性化する活性を意味する。ここで、「実質的に同一」とは、例えば、Ｅｏｍｅｓタンパク質の発現により転写が活性化される遺伝子の種類と、対象となるタンパク質の発現により転写が活性化される遺伝子の種類が、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上一致することを意味する。Ｅｏｍｅｓタンパク質の発現により転写が活性化される遺伝子の種類は、例えばマイクロアレイを用いた網羅的な解析等により解析することができる。
【００１７】
非ヒト動物がマウス以外の動物である場合、トランスジーンとしてのＥｏｍｅｓ遺伝子は、上記のＥｏｍｅｓ遺伝子の当該非ヒト動物におけるホモログ遺伝子、又は当該ホモログ遺伝子と、例えば８０％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性を有し、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００１８】
（発現ベクター）
発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等の大腸菌由来のプラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等の枯草菌由来のプラスミド；ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等の酵母由来プラスミド；λファージ等のバクテリオファージ；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス等のウイルス；及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。
【００１９】
上記の発現ベクターにおいて、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の発現用プロモーターとしては特に制限されず、例えば、ＣＤ２プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ｔｋプロモーター等を使用することができる。
【００２０】
上記の発現ベクターは、更に、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を含有していてもよい。
【００２１】
上記発現ベクターを、例えば、顕微鏡下でマイクロキャピラリー等を用いて非ヒト動物から採取した受精卵前核に注入し、その受精卵をレシピエント動物の卵管内に移植する。続いて、発生した個体から、体細胞及び生殖細胞中にＥｏｍｅｓ遺伝子が組み込まれた個体を選別することにより、目的とするＥｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物を得ることができる。
【００２２】
また、生殖細胞にＥｏｍｅｓ遺伝子が組み込まれた個体を野生型の非ヒト動物と交配させることにより得られたＦ１動物から、ヘテロ接合体を得ることができる。更に、Ｅｏｍｅｓ遺伝子のヘテロ接合体同士を交配させ、得られたＦ１動物から、ホモ接合体を得ることができる。
【００２３】
ヘテロ接合体又はホモ接合体の選択は、例えば、Ｆ１動物から採取した染色体ＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション又はＰＣＲ法によりスクリーニングすることにより行うことができる。
【００２４】
［Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法］
１実施形態において、本発明は、上記のトランスジェニック非ヒト動物からＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を採取する工程を備える、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法を提供する。
【００２５】
Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞をインビトロで製造することは非常に困難であるが、本実施形態の方法により、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を容易に製造することができる。
【００２６】
本実施形態の方法により製造されたＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞は、Ｔ細胞の分化過程を研究する研究用ツールとして有用である。
【００２７】
トランスジェニック非ヒト動物からＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を採取する方法としては、例えば次のものが挙げられる。
【００２８】
まず、Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック非ヒト動物の血液を採取する。続いて、この血液を、遠心管に入れた適切な密度勾配遠心分離媒体上に重層し、密度勾配遠心分離を行うことにより、血球を分離して回収する。
【００２９】
続いて、回収した血球を抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ４４抗体で染色し、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４＋ＣＤ４４low+細胞画分をソーティングして回収する。これにより回収された細胞がＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞である。
【００３０】
あるいは、フローサイトメトリーの代わりに、マグネティックビーズ等を用いてＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を回収してもよい。
【００３１】
［Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞］
１実施形態において、本発明は、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を提供する。本実施形態のＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞は、上述した製造方法により製造することができ、細胞傷害性Ｔ細胞の分化過程を研究する研究用ツールとして有用である。
【００３２】
［免疫関連疾患の治療又は予防剤］
（発現ベクター）
１実施形態において、本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸の発現ベクター、又は配列番号１に記載の塩基配列と８０％以上の同一性を有し、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質をコードする核酸の発現ベクター、を有効成分として含有する、免疫関連疾患の治療又は予防剤を提供する。
【００３３】
配列番号１に記載の塩基配列は、ヒトＥｏｍｅｓ遺伝子の塩基配列である。上記の発現ベクターは、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸を発現可能に保持する。
【００３４】
また、上記の発現ベクターが発現可能に保持する核酸は、配列番号１に記載の塩基配列からなる核酸に限られず、配列番号１に記載の塩基配列と８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性を有し、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。「Ｅｏｍｅｓ活性」とは、上述したものと同様の活性を意味する。なお、配列番号３に記載の塩基配列は、マウスＥｏｍｅｓ遺伝子の塩基配列であり、配列番号１に記載の塩基配列と８６％の同一性を有する。
【００３５】
発現ベクターとしては特に制限されず、例えば、上述したトランスジェニック非ヒト動物の作製に使用されるものと同様のものを用いることができる。
【００３６】
（タンパク質）
別の実施形態において、本発明は、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質、を有効成分として含有する、免疫関連疾患の治療又は予防剤を提供する。
【００３７】
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、ヒトＥｏｍｅｓタンパク質のアミノ酸配列である。本実施形態の治療又は予防剤が有効成分として含有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上の同一性（相同性）を有するアミノ酸配列からなり、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質であってもよい。「Ｅｏｍｅｓ活性」とは、上述したものと同様の活性を意味する。なお、配列番号４に記載のアミノ酸配列は、マウスＥｏｍｅｓタンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して８９％の同一性を有する。
【００３８】
本実施形態の治療又は予防剤が有効成分として含有するタンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＥｏｍｅｓ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３９】
ここで、「１若しくは数個」とは、例えば１〜１００個、例えば１〜５０個、例えば１〜３０個、例えば１〜１０個、例えば１〜５個、例えば１〜３個を意味する。なお、配列番号４に記載のアミノ酸配列は、マウスＥｏｍｅｓタンパク質のアミノ酸配列であり、配列番号２に記載のアミノ酸配列と比較して、７６個の欠失、置換若しくは付加を有する。より具体的には、欠失１０個、置換５８個、付加８個を有する。
【００４０】
（医薬組成物）
本実施形態の治療又は予防剤は、上記の発現ベクター又はタンパク質そのものであってもよく、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、注射剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、坐剤等の剤型に製剤化されていてもよい。
【００４１】
本実施形態の治療又は予防剤は、例えば、対象の血液から分離したＴ細胞等の血球細胞に生体外で投与した後、当該血球細胞を再び対象に戻す方法により投与してもよい。あるいは、本実施形態の治療又は予防剤を、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等の他、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的又は経口的に、当業者に公知の方法により対象に投与してもよい。投与量は、対象の体重、年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００４２】
上記の製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を用いて、周知の方法で製造することができる。
【００４３】
賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
【００４４】
結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００４５】
崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００４６】
滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
【００４７】
乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００４８】
安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。
【００４９】
希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００５０】
注射剤用溶剤としては、水、生理食塩水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン等が挙げられる。
【００５１】
（免疫関連疾患）
本実施形態の治療又は予防剤が対象とする免疫関連疾患としては、細胞傷害性Ｔ細胞による異物の排除を適切に行うことができないことに起因する疾患が挙げられ、例えば、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等が挙げられる。
【００５２】
（治療方法）
本実施形態の治療又は予防剤を用いた免疫関連疾患の治療方法としては、例えば以下のようなものが挙げられる。
【００５３】
例えば、癌患者からヘルパーＴ細胞を採取し、これに本実施形態の治療又は予防剤を導入することにより、ヘルパーＴ細胞に細胞傷害活性を付与する。その後、細胞傷害活性を付与したヘルパーＴ細胞を患者に戻す。すると、このヘルパーＴ細胞が、患者の細胞傷害性Ｔ細胞で攻撃できなかった癌細胞を攻撃し、癌の病態が改善することが期待される。
【００５４】
また、ヘルパーＴ細胞に細胞傷害活性を付与し、自己抗体産生Ｂ細胞を傷害するという原理に基づいて、自己免疫疾患を治療又は予防することができると考えられる。
【００５５】
また、ヘルパーＴ細胞に細胞傷害活性を付与し、Ｔ細胞を活性化する抗原提示細胞を傷害するという原理に基づいて、強すぎる免疫応答（すなわちアレルギー性疾患）を治療又は予防することができると考えられる。
【００５６】
また、後述するように、Ｅｏｍｅｓの強制発現により、ＩＬ−５の産生が抑制され、ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｈ２細胞が形成されない可能性が考えられた。このことから、Ｅｏｍｅｓの強制発現により、ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｈ２細胞の形成を抑制するという原理に基づいてアレルギー性疾患を治療又は予防することができると考えられる。
【実施例】
【００５７】
次に、実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
【００５８】
［実験例１］
（Ｅｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニックマウスの作製）
マウスＥｏｍｅｓ遺伝子のｃＤＮＡを、ＣＤ２プロモーター及びＣＤ２エンハンサーを有するベクターである「ＶＡ  ＣＤ２  ｃａｓｓｅｔｔｅ」（Zhumabekov et al., J. Immunol. Methods 185: 133, 1995）のマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位に挿入したトランスジーンを作製した。図１は、トランスジーンの構造を示す模式図である。このトランスジーン断片（全長約１３．４ｋｂ）をマイクロインジェクション法によりＣ５７ＢＬ／６マウスの受精卵に導入した。得られた受精卵をもとにＥｏｍｅｓ遺伝子トランスジェニック（Ｔｇ）マウスを作製した。
【００５９】
［実験例２］
（Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスの解析１）
Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス、及び同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウスの末梢血中のリンパ球をフローサイトメトリーで解析した（ｎ＝５）。図２は、フローサイトメトリーによる代表的な解析結果を示すグラフである。図中、「Ｔｇ」はＥｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスを示し、「ｎｏｎ−Ｔｇ」はＥｏｍｅｓ遺伝子が導入されていないマウスを示す。「Ｔｇ」及び「ｎｏｎ−Ｔｇ」の意味は以下の図においても同様である。その結果、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の双方ともに割合が減少していた。具体的には、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が９．１±３．３％であったのに対し、ｎｏｎ−Ｔｇマウスでは１９．１±５．１％であった。また、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が７．５±２．６％であったのに対し、ｎｏｎ−Ｔｇマウスでは１５．３±２．１％であった。
【００６０】
また、ＣＤ４＋Ｔ細胞についてＥｏｍｅｓタンパク質の発現を解析したところ，ｎｏｎ−ＴｇマウスではＥｏｍｅｓタンパク質の発現が認められなかったが、Ｅｏｍｅｓ遺伝子ＴｇマウスではＥｏｍｅｓタンパク質の高い発現が認められた。
【００６１】
［実験例３］
（Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスの解析２）
Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス及び同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウス（各２匹ずつ）の脾臓より、セルソーターを用いてＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏｗ＋細胞を分離した。
【００６２】
続いて、分離した各ＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏｗ＋細胞を、Ｔｈ２細胞分化条件下、すなわち、ＩＬ−４及び抗ＩＦＮ−γ抗体の存在下で、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化した。得られた細胞を１週間後に再度抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を用いて刺激し、１５時間後、ＥＬＩＳＡ法を用いて各細胞の培養上清中のＩＬ−４を定量した。図３（ａ）は、ＩＬ−４の定量結果を示すグラフである。その結果、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏｗ＋細胞からもＩＬ−４の正常な産生が認められ、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２細胞へ分化誘導することができることが確認された。
【００６３】
続いて、これらのＴｈ２細胞について、５１Ｃｒを用いたクロム遊離試験により細胞傷害活性を解析した。図３（ｂ）は、クロム遊離試験の結果を示すグラフである。その結果、対照であるｎｏｎ−Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞には細胞傷害活性がほとんど認められなかったのに対し、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞には高い細胞傷害活性が認められた。この結果は、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス由来のＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏｗ＋Ｔ細胞を刺激することにより、当該細胞に細胞傷害活性を付与することができたことを示す。
【００６４】
［実験例４］
（Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスの解析３）
Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス及び同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウスの末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞について、フローサイトメトリーによりＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの発現を解析した。ＣＤ４４は、抗原刺激によりエフェクター細胞やメモリーＴ細胞に分化すると発現が上昇する細胞表面マーカーであり、ＣＤ６２Ｌは、ナイーブＴ細胞で高発現しており、抗原刺激を受けると発現が低下する細胞表面マーカーである。図４（ａ）は、フローサイトメトリーによる代表的な解析結果を示すグラフである。その結果、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスの脾臓内ＣＤ４＋Ｔ細胞ではＣＤ４４の発現の上昇が見られた。
【００６５】
続いて、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス及び同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウスの胸腺におけるＣＤ４＋成熟Ｔ細胞及びＣＤ８＋成熟Ｔ細胞について、フローサイトメトリーによりＣＤ４４の発現を解析した。図４（ｂ）は、フローサイトメトリーによる代表的な解析結果を示すグラフである。その結果、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスでは、胸腺で成熟したばかりの細胞においてもＣＤ４４の発現上昇が観察された。この結果から、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の強制発現によるＣＤ４４の発現上昇は、抗原刺激に依存していない可能性が高いと考えられる。また、この結果は、Ｅｏｍｅｓ遺伝子の強制発現が、通常、メモリーＴ細胞への分化の後に認められる変化の一部を誘導するのに十分であることを示す。
【００６６】
［実験例５］
（Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスの解析４）
Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス及び同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウス（各２匹ずつ）の脾臓より、セルソーターを用いてＣＤ４＋Ｔ細胞を分離した。続いて、分離した各ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈ２細胞分化条件下、すなわち、ＩＬ−４及び抗ＩＦＮ−γ抗体の存在下で、抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化し、Ｔｈ２細胞へ分化誘導した。得られた細胞を再度抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体を用いて刺激し、１５時間後、ＥＬＩＳＡ法を用いて各細胞の培養上清中のＩＬ−４及びＩＬ−５を定量した。
【００６７】
図５（ａ）はＩＬ−４の定量結果を示すグラフである。図５（ｂ）はＩＬ−５の定量結果を示すグラフである。その結果、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞と、対照であるｎｏｎ−Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞との間でＩＬ−４の産生量に違いは認められなかった。これに対し、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞では、ｎｏｎ−Ｔｇマウス由来のＴｈ２細胞と比較して、ＩＬ−５の産生量が有意に低下していた。この結果は、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスでは、ＩＬ−５産生性のｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｔｈ２細胞が誘導されにくいことを示唆していると考えられる。
【００６８】
［実験例６］
（Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスの解析５）
Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウス及び同腹のｎｏｎ−Ｔｇマウスの脾臓より、セルソーターを用いてＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏｗ＋Ｔ細胞を分離した。図６は、フローサイトメトリーにより、ソーティング前とソーティング後の各細胞集団のＣＤ４及びＣＤ４４の発現を解析した結果を示すグラフである。
【００６９】
その結果、Ｅｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスからもｎｏｎ−Ｔｇマウスと同様にＣＤ４＋ＣＤ４４ｌｏｗ＋Ｔ細胞を分離することができた（図６、右下）。この細胞集団は、（１）細胞を採取したＥｏｍｅｓ遺伝子Ｔｇマウスが抗原刺激を受けていないこと、（２）ｎｏｎ−ＴｇマウスのＣＤ４４ｈｉ＋細胞と比較するとＣＤ４４の発現が低いこと、（３）この細胞集団をインビトロでＴｈ２細胞に分化誘導することができること、等から、いずれかのエフェクター細胞にコミットした細胞ではなく、ナイーブＴ細胞であると結論付けられた。すなわち、この細胞集団は、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞である。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、細胞傷害性Ｔ細胞の分化過程を研究する新たな研究用ツールである、トランスジェニック非ヒト動物及びＥｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を提供することができる。また、Ｅｏｍｅｓ＋ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞の製造方法を提供することができる。また、ヘルパーＴ細胞に細胞傷害活性を付与するという原理に基づく、免疫関連疾患の治療又は予防剤を提供することができる。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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