(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を検出するための、新規プライマーの提供。【解決手段】特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの組合せから構成されるプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とするＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の検出方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）  配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（２）  配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（３）  配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（４）  配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；または
（５）  配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
から選択される、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を検出するためのプライマーセット。
【請求項２】
試料より抽出したＤＮＡを鋳型とし、請求項１に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の検出方法。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーセットを含む、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を検出するための、新規プライマー、および当該プライマーを用いるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の検出方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株（目黒研究所）は、プロバイオティクス（宿主の腸管内の環境を改善することで健康に好影響を及ぼす生菌製剤や菌成分含有食品等を指す）として、健康食品や動物用飼料に使用されている。Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株は生菌のまま食品や飼料中に含有され、ヒトまたは動物内に摂取された後、腸管内の環境を改善することができるが、その体内動態についてはほとんど解明されていない。腸管内環境には多種多様なＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が存在するため、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の体内動態を解明するには、他の常在しているＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属とＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株とを区別することが必須となる。そのため、常在する細菌およびＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属が多数存在する環境下でＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を特異的にかつ定量的に検出する簡便な方法が望まれていた。また、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株は胃酸等の影響により死滅して分解されることもあるため、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を腸管内環境に生きたまま効率的に送達できる製品を開発するためにも、特異的かつ定量的に検出する手法が求められていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を特異的に検出するためのプライマー、および当該プライマーを使用したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討した結果、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株に特有な挿入配列（配列番号１１）を見出し、当該特有な配列に由来するプライマーがＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を極めて特異的に検出できることを見出し、本発明を完成した。
【０００５】
本発明は、下記：
（１）  配列番号１に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号２に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（２）  配列番号３に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号４に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（３）  配列番号５に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号６に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
（４）  配列番号７に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号８に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；または
（５）  配列番号９に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号１０に示す塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとから構成される、プライマーセット；
から選択される、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を検出するためのプライマーセットを提供する。
【０００６】
本発明は、試料より抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記に記載のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を指標として判定することを特徴とする、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の検出方法を提供する。
【０００７】
本発明は、上記に記載のプライマーセットを含む、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株検出用キットを提供する。
【０００８】
本発明にかかるプライマーセットは、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を特異的に検出することができるため、近縁種が多数存在する腸内環境のような環境下においても、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を簡易に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動図レーン１〜６  ：Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株ＤＮＡ＋ヒト糞便ＤＮＡレーン７〜１２：糞便ＤＮＡ単独
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株検出用プライマーセットは、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株のドラフトゲノム配列とＧｅｎＢａｎｋに登録されているＥ．  ｆａｅｃｉｕｍのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列を比較することにより見出されたＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株に特有な挿入配列（配列番号１１）をもとに設計した。
【表１】
2016067231.tif 000002
【００１１】
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株に特有な配列（配列番号１１）をもとに設計されたプライマーセットには、下記（１）〜（５）のプライマーセットが挙げられる：
（１）ＢＩＯ−１Ｆ（配列番号１）とＢＩＯ−１Ｒ（配列番号２）；
（２）ＢＩＯ−２Ｆ（配列番号３）とＢＩＯ−２Ｒ（配列番号４）；
（３）ＢＩＯ−３Ｆ（配列番号５）とＢＩＯ−３Ｒ（配列番号６）；
（４）ＢＩＯ−４Ｆ（配列番号７）とＢＩＯ−４Ｒ（配列番号８）；
（５）ＢＩＯ−５Ｆ（配列番号９）とＢＩＯ−５Ｒ（配列番号１０）。
【００１２】
上記のようにして得られたプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行うと、試料にＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株が含まれる場合は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株に特異的な増幅産物が得られる。これにより、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を他の微生物と区別して特異的に検出することができる。
【００１３】
上記のプライマーセットはキットとすることもできる。本発明のキットは、上記プライマーセットを含むものであればよい。必要に応じて、ＤＮＡ抽出用試薬、ＰＣＲ用緩衝液やＤＮＡポリメラーゼ等のＰＣＲ用試薬、リアルタイムＰＣＲ試薬、電気泳動用ゲル等の検出用試薬、ＰＣＲの陽性コントロールとなる標的配列を含むＤＮＡ分子、説明書などを含んでいてもよい。
【００１４】
本発明は、上記のプライマーセットを用いたＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の検出方法を提供する。本方法は、試料より抽出したＤＮＡを鋳型とし、上記のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、該ＰＣＲによる増幅産物の有無を指標として検出することを特徴とする。
【００１５】
試料は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株が含有され得るものであれば、限定されない。例えば、糞便中のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を検出することで、経口摂取したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株が腸管に到達したことを確認することができる。
また定量ＰＣＲ法、例えばリアルタイムＰＣＲ法により、試料中に含まれるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の細胞数を定量することができるため、試料中のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を定量的に把握することができる。
【００１６】
試料からのＤＮＡの抽出は、核酸抽出法として当業者に知られる方法を用いて行うことができる。例えば、フェノール／クロロホルム法、ガラスビーズによる物理的破砕、界面活性剤による細胞溶解、プロテアーゼ酵素による細胞溶解などにより行うことができる。市販の各種ＤＮＡ抽出キットを用いてもよい。
【００１７】
試料から得られたＤＮＡを鋳型として、上述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅産物の有無を検出する。ＰＣＲ条件（温度サイクル、サイクルの回数等）やＰＣＲ反応液の組成は、プライマーの長さやその塩基組成などに応じて適宜設定することができる。一連のＰＣＲ操作は、市販のＰＣＲキットやＰＣＲ装置を利用して、その説明書に従って行ってもよい。
【００１８】
ＰＣＲで標的の増幅産物が得られたかどうかは、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡハイブリダイゼーション、増幅産物に特異的な標識プローブを用いる等の公知の方法を用いて確認することができる。標的の増幅産物のサイズは、挿入配列（配列番号１１）の内、両プライマーの塩基数と当該両プライマーに挟まれる範囲の塩基数を合わせた数となる。
【００１９】
下表に本発明のプライマーセット（１）〜（５）、およびその増幅産物のサイズを示す。
【表２】
2016067231.tif 000003
【実施例】
【００２０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの例に限定されない。
【００２１】
実施例１
プライマーの設計
（１）Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株ドラフトゲノム配列の比較解析
８８のコンティグ配列からなるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株のドラフトゲノム配列を作成し、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている４株のＥ．ｆａｅｃｉｕｍのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列とＢＩＯ株のドラフトゲノム配列を比較した。
使用したＥ．ｆａｅｃｉｕｍのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列情報は以下の通りである。
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  Ａｕｓ００８５（ＰＲＪＮＡ２１４４３２）；
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＤＯ（ＰＲＪＮＡ５５３５３）；
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  Ａｕｓ０００４（ＰＲＪＮＡ８７０２５）；
Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＮＲＲＬ  Ｂ−２３５４（ＰＲＪＮＡ１８８４７７）；
［（）内はＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔのＩＤ］。
これらのｃｏｍｐｌｅｔｅゲノム配列をレファレンス配列として、ＧｅｎｏｍｅＭａｔｃｈｅｒ（http://www.ige.tohoku.ac.jp/joho/gmProject/gmhomeJP.html）のＣｏｎｔｉｇＡｌｉｇｎｅｒを用いて、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株のドラフトゲノム配列と比較した。
その結果、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  Ａｕｓ０００４における遺伝子番号ＥＦＡＵ００４＿００２３３とＥＦＡＵ００４＿００２３４の遺伝子間領域に関し、４つのレファレンス配列ではその対応する領域は約１８０ｂｐ程度であるのに対し、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の染色体上では、５４９５ｂｐの挿入配列の存在が見出された。
この挿入配列について、Ｂｌａｓｔ（Basic Local Alignment Search Tool）検索を用いて、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている既知配列と比較し、最も相同性の低かった約８００ｂｐ（配列番号１１）を抽出し、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株特異的なプライマーの設計に利用した。
この配列より下記の５つのプライマーセット
（１）ＢＩＯ−１ＦＲ：ＢＩＯ−１Ｆ（配列番号１）／ＢＩＯ−１Ｒ（配列番号２）；
（２）ＢＩＯ−２ＦＲ：ＢＩＯ−２Ｆ（配列番号３）／ＢＩＯ−２Ｒ（配列番号４）；
（３）ＢＩＯ−３ＦＲ：ＢＩＯ−３Ｆ（配列番号５）／ＢＩＯ−３Ｒ（配列番号６）；
（４）ＢＩＯ−４ＦＲ：ＢＩＯ−４Ｆ（配列番号７）／ＢＩＯ−４Ｒ（配列番号８）；
（５）ＢＩＯ−５ＦＲ：ＢＩＯ−５Ｆ（配列番号９）／ＢＩＯ−５Ｒ（配列番号１０）；
を設計した。
【００２２】
実施例２
＜プライマーの特異性の評価＞
ＤＮＡ抽出
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を１ｍＬのＢＨＩ（Brain Heart Infusion）培地にて３７℃一晩静置培養した。抽出液＜（ＴＥ１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ｐＨ８．０］）飽和フェノール５００μＬ；溶菌Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍエチレンジアミン四酢酸［ｐＨ８．０］）２５０μＬ；１０％  ＳＤＳ  ５０μＬ；および、ガラスビーズ（φ０．１ｍｍ）０．３ｇ＞に上記の培養液２００μＬを添加し、ＦａｓｔＰｒｅｐ２４（ＭＰ）を用いて、パワーレベル５．０で３０秒間縦方向に激しく振とうし、菌体を破砕した。遠心分離により上清を回収しフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを用いてタンパク質を変性した後、イソプロパノール沈殿によりＤＮＡを析出させ、１００μＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸［ｐＨ８．０］）に溶解して、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の鋳型ＤＮＡとして使用した。
加えて、ヒト糞便（一般的にＥ．ｆａｅｃｉｕｍ属細菌が多数存在する）よりＤＮＡを抽出し、鋳型ＤＮＡとして使用した。抽出方法は健常人糞便０．１ｇを１ｍＬの生理食塩水（０．８％  ＮａＣｌ）に懸濁したものをサンプル液として、上記のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株ＤＮＡの抽出方法のうち培養液を該サンプル液と置き換えて、同様にＤＮＡ抽出を行った。
【００２３】
ＰＣＲ増幅
上記で抽出したＤＮＡについて、市販のＰＣＲ用試薬（タカラバイオ（株）製）とＭｙ  ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を用いて、ＰＣＲを行った。
１０×Ｅｘ  Ｔａｑバッファ２．０μＬ、ｄＮＴＰ溶液（原液２．５ｍＭ）１．６μＬ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ０．８μＬ、抽出したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株ＤＮＡ１０ｎｇおよび糞便ＤＮＡ５０ｎｇ、ならびにＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ）０．１Ｕを混合し、プライマーセットを０．５ｍＭの濃度となるように添加し、滅菌蒸留水を用いて総反応液量２０μＬにして反応液を調製した。
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株ＤＮＡを添加せず糞便ＤＮＡを６０ｎｇ添加した反応液を陰性コントロールとして使用した。
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株以外のＥ．ｆａｅｃｉｕｍ由来ＤＮＡも増幅するプライマーとして、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍの種特異的なプライマー：ＥＭ１ＡおよびＥＭ１Ｂ（Cheng S1, McCleskey FK, Gress MJ, Petroziello JM, Liu R, Namdari H, Beninga K, Salmen A, DelVecchio VG., Journal of Clinical Microbiology1997 May;35(5):1248-50）を使用した。
全てのプライマーセットについて同条件でＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ反応条件を、表３に示す。
【表３】
2016067231.tif 000004
【００２４】
ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、検出を行った。
ＰＣＲ増幅産物のアガロースゲル電気泳動図を図１に示す。
Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株ＤＮＡ＋ヒト糞便ＤＮＡでは、本願発明にかかる５つのプライマーセットおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍの種特異的なプライマーセットで、増幅が確認された。
ヒト糞便ＤＮＡ単独では、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍの種特異的なプライマーセットでのみ増幅が確認され、本願発明にかかる５つのプライマーセットでは増幅が確認されなかった。
【００２５】
実施例３
＜ヒト糞便中からのＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の定量＞
被験者（４名）に、一粒あたりＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株を６．５×１０９ｃｆｕ含むタブレットを、１個／１日、７日間摂取させた。摂取７日目の被験者の糞便中に含まれるＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の菌数を、リアルタイムＰＣＲにより定量した。ＰＣＲ用試薬として、市販のリアルタイムＰＣＲ用試薬（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ、ＴＯＹＯＢＯ製）を使用した。
プライマーセットＢＩＯ−１ＦＲで増幅したＰＣＲ産物を精製カラム（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ、プロメガ製）で精製し、濃度からコピー数を計算したものを、菌数の定量のスタンダードサンプルとして使用した。
ＢＩＯ−１ＦＲプライマーセットを使用して、上記実施例２の方法と同様にＰＣＲを行った。
結果を表４に示す。
４名の被験者全員について、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株含有タブレット摂取前には糞便からＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株は検出されなかったのに対し、摂取後（摂取期間７日）にはＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株が検出された。
また、当該摂取期間（７日間）終了の翌日から３日後には、糞便からＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株は検出されなくなった。
【表４】
2016067231.tif 000005
【００２６】
上記の結果は、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の特異的プライマーがＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株の定量に利用できることを立証するものである。
腸内に存在する糞便等の量は数リットルといわれる。投与したＥ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株（６．５×１０９ｃｆｕ／日、７日間）が腸内環境では数千倍に希釈されることを考慮すると、４名中２名の被験者の糞便から１０８ｃｆｕもの細胞数が検出されたことは、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株が腸内で増殖したためと考えられる。少なくともこの２名については、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ  ＢＩＯ株が生きたまま腸管内に到達したと判断した。
【図１】
2016067231.tif 000006
【配列表】
2016067231000001.app