(57)【要約】      （修正有）【課題】結腸直腸癌、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）又は神経芽細胞腫の予防的処置又は治療的処置のための医薬組成物の提供。【解決手段】オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤を含む組成物と、この薬剤と組み合わせた場合に、患者における全ポリアミン含量を低減するようにポリアミン経路を調節する第二の薬剤とを含む医薬組成物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における結腸直腸癌、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）又は神経芽細胞腫の予防的処置又は治療的処置のための方法において使用するための医薬組成物であって、
前記組成物は、前記患者におけるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤を含み、
前記方法は、
ａ）前記患者の少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの＋３１６番目の位置の遺伝子型を決定する試験から結果を得る工程；及び
ｂ）前記結果が、前記ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の少なくとも１つのアレルにおける＋３１６番目の位置の前記患者の遺伝子型がＧであることを示す場合に、
（ｉ）前記組成物と、
（ｉｉ）前記第一の薬剤と組み合わせた場合に、前記患者における全ポリアミン含量を低減するようにポリアミン経路を調節する第二の薬剤と、
を含む医薬治療の効果量を前記患者に投与する工程、
を含む、
医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００９年６月３日に出願の米国仮特許出願第６１／２１７６８２号、２００９年６月３日に出願の同第６１／２１７，６７９号、及び２００９年５月１４日に出願の同第６１／２１６，２１６号の優先権を主張し、これら各出願の全文は参照することにより本明細書に組み入れられたものとする。
【０００２】
（連邦政府後援研究に関する説明）
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成ＣＡ７２００８（ＥＷＧ）、ＣＡ７８１３４（ＨＡＣ）、ＣＡ７８２８５（ＨＡＣ）、及びＣＡ９５０６０（ＥＷＧ）、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からの規約Ｎ０１−ＰＣ−３５１３６、Ｎ０１−ＰＣ−３５１３９及びＮ０１−ＰＣ−５４４０４、並びに疾病対策予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）からの同意１Ｕ５８ＤＰ００８０７−０１のもと、米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は一般的に、癌の生態及び医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、癌腫及びそのリスク因子の診断、予防、及び治療方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌の化学予防研究を臨床業務へと変換する上での主な障害は、薬剤効力の限界及び有効性を上回る毒性であった（Ｐｓａｔｙ  ａｎｄ  Ｐｏｔｔｅｒ，２００６；Ｌｉｐｐｍａｎ，２００６）。例えば、結腸直腸腺腫（ＣＲＡ）患者にＤ，Ｌ−α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ、エフロルニチン）及びスリンダクを併用し、長期にわたり毎日経口投与することが、立証された顕著なポリアミン阻害効果を有することが近年示されたが（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、治療は軽度な無症状の中毒性難聴（ＭｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、及び高い基準の心血管リスクを有する患者での心血管イベントの増加（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）と関連した。特定の予防的又は治療的な治療計画に対する患者の適性を判定する、遺伝的特徴の同定が大きな利益をもたらすだろう。
【０００５】
例えば、結腸直腸癌及びその他の癌腫への、効果的で、かつ、より毒性の低い治療及び予防方法が必要とされている。国立癌研究所によると、２００９年の米国における新たな結腸直腸癌症例はおよそ１４７，０００例であり、５０，０００人が結腸直腸癌により死亡した。現在の、特に大腸癌及びポリープの治療プロトコールは腫瘍の切除、化学療法、及び放射線治療を含む。ヒトＯＤＣ１遺伝子のイントロン−１における一塩基多型（ＳＮＰ）はＯＤＣ１の転写に影響を及ぼし（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、結腸直腸腺腫（ＣＲＡ）リスクの遺伝子マーカーとして研究されてきた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。報告されたマイナーＡアレル頻度はおよそ２５％であり、人種／民族性にわたる差にも関わらず、ＯＤＣ１遺伝子型分布は各人種間においてはハーディ・ワインベルグ平衡を取る（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＯＤＣ１マイナーＡアレルをホモ接合で有する対象は、メジャーＧアレルを有する対象と比較して、腺腫の再発のリスクが低い（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。さらに、ＯＤＣ１のＡアレル（ＡＡ又はＧＡ遺伝子型であってＧＧ遺伝子型ではない）、及び報告されたアスピリンの使用は、結腸ポリープの再発の低下と関連があり（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、進行した腺腫の５０％低下リスクと統計的に有意であった（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＯＤＣ１遺伝子型が、腺腫の再発、組織のポリアミンへの反応、毒性プロファイルに異なって影響を及ぼすのかどうか、及び、予防的及び治療的処置の適性を決定するためにＯＤＣ１遺伝子型をどのようにして用いることができるかが、大きな課題であろう。
【発明の概要】
【０００６】
従って本発明では、少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型を同定することに関する治療、予防及び／又は診断方法が提供される。
【０００７】
１つの態様においては、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型を決定する試験から結果を得る工程；及び
ｂ）その結果が、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の少なくとも１つのアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧであることを示す場合に、
（ｉ）患者におけるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤；と
（ｉｉ）第一の薬剤と組み合わせた場合に、患者における全ポリアミン含量を低減するようにポリアミン経路を調節する第二の薬剤、
とを含む効果量の医薬治療を患者に投与する工程、
を含む、患者における癌腫の予防的又は治療的処置の方法が提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態において第二の薬剤はまた、患者におけるスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を上昇させる。いくつかの実施形態において結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること又は結果を表す患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施形態において試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の１つのアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＧであることを示す。いくつかの実施形態において結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＡであることを示す。
【０００９】
いくつかの実施形態において医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一又は第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一及び第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である。いくつかの実施形態において第二の薬剤は、アスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）である。いくつかの実施形態においてアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤である。いくつかの実施形態においてアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施形態においてアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダクである。
【００１０】
別の態様においては、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルにおける＋３１６番目の位置の、患者の遺伝子型を決定する試験から、結果を得る工程；及び
ｂ）その結果が、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の少なくとも１つのアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧであることを示す場合に、
（ｉ）患者におけるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤；及び
（ｉｉ）第一の薬剤と組み合わせた場合に、患者における全ポリアミン含量を低減するようにポリアミン経路を調節する第二の薬剤、
を含む効果量の医薬治療を患者に投与する工程、
を含む、患者における結腸直腸癌腫リスク因子の治療方法が提供され、
ここでこの方法は、患者における新しい異常腺窩巣、新しい腺腫性ポリープ又は新しい異形成性腺腫の形成を予防する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第二の薬剤はまた、患者におけるスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を上昇させる。いくつかの実施形態において、方法は、患者における新しい異常腺窩巣の形成を予防する。いくつかの実施形態において、方法は、患者における新しい腺腫性ポリープの形成を予防する。いくつかの実施形態において、方法は、患者における新しい異形成性腺腫の形成を予防する。いくつかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること又は結果を表す患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の１つのアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＧであることを示す。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＡであることを示す。
【００１２】
いくつかの実施形態において、医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一又は第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一及び第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である。いくつかの実施形態において、第二の薬剤は、アスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）である。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤である。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダクである。
【００１３】
別の態様においては、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルにおける＋３１６番目の位置の、患者の遺伝子型を決定する試験から、結果を得る工程；及び
ｂ）その結果が、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の少なくとも１つのアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧであることを示す場合、患者におけるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤と、第一の薬剤と組み合わせた場合に患者における全ポリアミン含量を低減するようにポリアミン経路を調節する第二の薬剤との、併用における効果量の医薬治療による治療に対して、この患者が好適だと同定する工程、
を含む、癌腫の予防的又は治療的処置のために患者の適性を評価する方法が提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、第二の薬剤はまた、患者におけるスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を上昇させる。いくつかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること又は結果を表す患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の１つのアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＧであることを示す。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＡであることを示す。いくつかの実施形態において、医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一又は第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一及び第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である。いくつかの実施形態において、第二の薬剤は、アスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）である。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤である。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダクである。
【００１６】
別の態様においては、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルにおける＋３１６番目の位置の、患者の遺伝子型を決定する試験から、結果を得る工程；及び
ｂ）その結果が、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の少なくとも１つのアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧであることを示す場合に、
（ｉ）患者におけるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）を阻害する第一の薬剤；と
（ｉｉ）患者におけるスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼの発現を上昇させる第二の薬剤とを含む、
効果量の医薬治療を患者に投与する工程、
を含む、患者の癌腫瘍を切除可能にする方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること又は結果を表す患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の１つのアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＧであることを示す。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＡであることを示す。
【００１８】
いくつかの実施形態において、医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一又は第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、医薬治療は、患者が既に低用量での医薬治療を受けている場合に、試験の結果を得る工程の前に、第一及び第二の薬剤の用量を増加させる工程をさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、第一の薬剤は、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、第二の薬剤は、アスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）である。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、ＣＯＸ−２選択的阻害剤である。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、スリンダクである。
【００２１】
別の態様においては、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルにおける＋３１６番目の位置の、患者の遺伝子型を決定する試験から、結果を得る工程；及び
ｂ）その結果が、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の少なくとも１つのアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧであることを示す場合に、併用において効果量のα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）とアスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）とを、患者に投与する工程、
を含む、癌腫の発生又は再発のリスクを有する患者における、癌腫の発生又は再発を予防する方法が提供される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること又は結果を表す患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の１つのアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＧであることを示す。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＡであることを示す。
【００２３】
別の態様においては、少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルの＋３１６番目の位置においてＧを有することが同定された癌腫の発生又は再発のリスクを有する患者に、効果量のα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）とアスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）とを投与する工程を含む、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）及びアスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）を用いた治療方法が提供される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレル両方の＋３１６番目の位置における同定された遺伝子型はＧＧである。いくつかの実施形態において、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレル両方の＋３１６番目の位置における同定された遺伝子型はＧＡである。
【００２５】
別の態様においては、
ａ）少なくとも１つのＯＤＣ１プロモーター遺伝子アレルにおける＋３１６番目の位置の、患者の遺伝子型を決定する試験から、結果を得る工程；及び
ｂ）結果が、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の＋３１６番目の位置における少なくとも１つのアレルがＧであることを示す場合に、併用において効果量のα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）とアスピリンを含まない非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）とを患者に投与する工程、
を含む、患者における癌腫の治療方法が提供される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、結果は、前記遺伝子型を含む報告を受け取ること又は結果を表す患者病歴を取得することにより得られる。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の１つのアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、試験は、患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置のヌクレオチド塩基を決定する。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＧであることを示す。いくつかの実施形態において、結果は、ＯＤＣ１プロモーター遺伝子の両方のアレルにおける＋３１６番目の位置の患者の遺伝子型がＧＡであることを示す。
【００２７】
任意の上述した実施形態の変化形において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤはＣＯＸ−２選択的阻害剤である。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤはスリンダク又はセレコキシブである。いくつかの実施形態において、アスピリンを含まないＮＳＡＩＤはスリンダクである。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びスリンダクは全身に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びスリンダクは別個の経路により投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ又はアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは経口的に、動脈内に又は静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯは経口的に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯの効果量は、５００ｍｇ／日である。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯは、静脈内に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯの効果量は、約０．０５〜約５．０ｇ／ｍ２／日である。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、経口投与用に処方される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、固い又は軟らかい、カプセル又は錠剤として処方される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、１２時間毎に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びアスピリンを含まないＮＳＡＩＤは、２４時間毎に投与される。いくつかの実施形態において、スリンダクの効果量は、約１０〜約１５００ｍｇ／日である。いくつかの実施形態において、スリンダクの効果量は、約１０〜約４００ｍｇ／日である。いくつかの実施形態において、スリンダクの効果量は、１５０ｍｇ／日である。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクの前に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクの後に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクの前及び後に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯは、スリンダクと同時に投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯは、少なくとも二度目に投与される。いくつかの実施形態において、スリンダクは、少なくとも二度目に投与される。
【００２８】
任意の上述した実施形態の変化形においては、患者は固形癌を有し、前記方法は、前記固形癌の切除をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びスリンダクは前記切除に先だって投与される。いくつかの実施形態において、ＤＦＭＯ及びスリンダクは前記切除の後に投与される。
【００２９】
任意の上述した実施形態の変化形において、癌腫は、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、脳腫瘍、肺癌、胃癌、血液癌、皮膚癌、精巣癌、前立腺癌、卵巣癌、肝臓癌又は食道癌、子宮頸癌、頭頸部癌、非メラノーマ性皮膚癌、神経芽細胞腫及び膠芽腫である。いくつかの実施形態において、癌腫は、結腸直腸癌である。いくつかの実施形態において、結腸直腸癌は、第Ｉ期である。いくつかの実施形態において、結腸直腸癌は、第ＩＩ期である。いくつかの実施形態において、結腸直腸癌は、第ＩＩＩ期である。いくつかの実施形態において、結腸直腸癌は、第ＩＶ期である。
【００３０】
任意の上述した実施形態の変化形において、方法は、患者における新しい進行性結腸直腸新生物の形成を予防する。いくつかの実施形態において、方法は、患者における中毒性難聴又はそのリスクを予防する。いくつかの実施形態において、方法は、新しい進行性右側結腸直腸新生物の形成を予防する。いくつかの実施形態において、方法は、新しい進行性左側結腸直腸新生物の形成を予防する。
【００３１】
任意の上述した実施形態の変化形において、患者は、結腸、直腸又は虫垂に１つ以上の腺腫性ポリープを有すると同定された。いくつかの実施形態において、患者は、１つ以上の進行した結腸直腸新生物を有すると同定された。いくつかの実施形態において、患者は、１つ以上の左側の進行した結腸直腸新生物を有すると同定された。いくつかの実施形態において、患者は、１つ以上の右側の進行した結腸直腸新生物を有すると同定された。いくつかの実施形態において、患者は、家族性腺腫性ポリポーシスであると診断された。いくつかの実施形態において、患者は、リンチ症候群であると診断された。いくつかの実施形態において、患者は、家族性結腸直腸癌タイプＸであると診断された。いくつかの実施形態において、患者は、アムステルダム基準又はアムステルダム基準ＩＩを満たす。いくつかの実施形態において、患者は、１回以上の結腸直腸腺腫の切除歴を有する。いくつかの実施形態において、患者は、上皮内癌又はＯＤＣの過剰な活性と関連した前癌病変を有する。いくつかの実施形態において、患者は、上皮内癌又は前癌病変及び細胞ポリアミンレベルの上昇を有する。
【００３２】
任意の上述した実施形態の変化形において、患者はヒトである。
【００３３】
請求項及び／又は明遺書中の「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語に関する単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は「１」を意味するが、この語は、「１以上の」、「少なくとも１の」、及び「１又は１を超える」の意味ともまた一致する。
【００３４】
本出願を通して、語「約」は、装置の誤差固有の変化、値を決定するために用いる方法、又は研究対象間に存在する変動、を含む値を示すために用いられる。
【００３５】
用語「含む」、「有する」及び「含有する」は、オープンエンドな連結動詞である。「含む」、「含んでいる」、「有する」、「有している」、「含有する」及び「含有している」のような、１つ以上のこれら動詞の任意の形態又は時制もまた、オープンエンドである。例えば、１つ以上の工程を「含む」、「有する」又は「含有する」任意の方法は、これら１つ以上の工程を有するとは限定されず、その他の記載されていない工程をもまた包含する。
【００３６】
本明細書及び／又は請求項で使用する場合、用語「有効な」は、所望される、期待される、又は目的の結果を達成するのに十分であることを意味する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「ＩＣ５０」は、得られる最大反応の５０％である、阻害用量を指す。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「患者」又は「対象」は、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、又はその種のトランスジェニックのような、生きている哺乳類を指す。特定の実施形態において、患者又は対象は、霊長類である。ヒト対象の非限定的な例は、成人、若年、幼児及び胎児である。
【００３９】
「薬学上許容可能な」は、それが、通常安全で、非毒性であり、そして、生物学的にもその他の点においても望ましい医薬組成物の調整において有用であることを意味し、かつ、それが獣医学的使用並びにヒトへの薬学的使用において許容可能であることを含む。
【００４０】
「予防」又は「予防する」は、（１）対象又はリスクを有する患者及び／又は疾患の素因があるが、まだ、疾患のいずれの又は全ての病理又は徴候を経験又は表していない患者における疾患の発症を阻害すること、及び／又は（２）対象又はリスクを有する及び／又は疾患の素因があるが、まだ、疾患のいずれの又は全ての病理又は徴候を経験又は表していない患者における疾患の病理又は徴候の発症を遅らせること、を含む
【００４１】
「効果量」、「治療上効果量」又は「薬学的効果量」は、疾患を治療するために対象又は患者に投与した場合に、疾患のそのような治療に効果を及ぼすのに十分な量を意味する。
【００４２】
「治療」又は「治療する」は、（１）対象又は疾患の病理又は徴候を経験している又は表している患者における疾患を阻害すること（例えば、病理又は徴候のさらなる発症を阻むこと）、（２）対象又は疾患の病理又は徴候を経験している又は表している患者における疾患を改善すること（例えば、病理及び／又は徴候を反転させること）、及び／又は（３）対象又は疾患の病理又は徴候を経験している又は表している患者の疾患における、任意の測定可能な低下に影響を及ぼすこと、を含む。
【００４３】
上述した定義は、参照することにより本明細書に組み入れられる任意の文献中の、いずれの一致しない定義に優先する。特定の語は定義されたが、定義されない任意の用語は明確でないことを示すと見なされるべきではない。むしろ、用いられる全ての用語は、当業者が本発明の範囲及び実際を理解できるように、本発明を明確に記載すると考えられる。
【００４４】
本開示のその他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示してはいるが、説明するためのみに示されるものであり、そのため、この詳細な説明から、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び調節が当業者には明らかとなるだろう。１つの一般処方に割り当てられた特定の化合物が、別の一般処方に属することができないということを意味するものではないことに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
以下の図表は本明細書の一部分をなし、本開示の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示したこれら図表のうちの１つと特定の実施形態の詳細との組み合わせによって、よりよく理解されるだろう。
【図１】ポリアミン制御に及ぼすＭＡＤ１及びｃ−ＭＹＣの異なる作用を示す図である。模式図は、ＯＤＣ１＋３１６マイナーＡ−アレルに結合したＭＡＤ１及びｃ−ＭＹＣが、ポリアミン制御に異なる効果を及ぼすことを提唱する。ＯＤＣ阻害剤であるＤＦＭＯ（ジフルオロメチルオルニチン）の効果もまた示した。
【図２】結腸直腸癌−特異的生存率の推定値を示す図である。この図は、ＯＤＣ１＋３１６遺伝子型によって分類した第ＩＩＩ期結腸直腸癌の症例における、カプラン・マイヤー結腸直腸癌特異的生存率の推定値を示す。１９９４〜１９９６年の間に診断され、２００８年の３月までフォローアップした、カリフォルニア大学アーバイン校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｒｖｉｎｅ）の、家族性結腸直腸癌の遺伝−環境研究（Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ）からの症例を含む：ＯＤＣ１  ＧＧ（６４例、１５結腸直腸癌による死亡）、ＯＤＣ１  ＧＡ／ＡＡ（６２例、２５結腸直腸癌による死亡）。
【図３】ＯＤＣ１プロモーターＳＮＰの位置及び解析を示す図である。図３ＡはＯＤＣ１プロモーターＳＮＰの位置であるＡを示す。この研究の調査におけるＳＮＰは、ＯＤＣ１転写開始点の３’側３１６番目のヌクレオチド（＊）であった。このＳＮＰ残基は、下線を引いた配列である、２つの保存されているＥボックスの間にあり、ＰｓｔＩ制限酵素部位（枠線）に影響を与える（配列番号５）。図３Ｂは、ＯＤＣ１  ＳＮＰのＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  多型）解析を示す。２種類の細胞型からＤＮＡを得て、ＯＤＣ１  ＳＮＰ部位の周辺の領域をシークエンシングした。ＯＤＣ１  ＳＮＰ遺伝子座では、結腸由来のＨＴ２９細胞がヘテロ接合ＧＡであり、ＨＣＴ１１６細胞がホモ接合ＧＧであることを確認した。各細胞型から得た、３５０−ｂｐのこの領域のＰＣＲ産物をＰｓｔＩを用いて消化した。消化産物が３５０ｂｐよりも小さいことがＡ−アレルである証拠となる。
【図４】Ｅ−ボックスの発現及び免疫沈降解析を示す図である。ＯＤＣ１プロモーターＳＮＰの位置。図４Ａは、結腸由来細胞におけるＥ−ボックスのタンパク質発現を示す。評価するタンパク質発現の＋３１６  ＯＤＣ１  ＳＮＰへの結合をウェスタンブロット解析により評価した。ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞両方の抽出物をｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１、及びＭＡＤ４について評価し、β−アクチンをローディングコントロールとして用いた。図４Ｂは、以下の実施例部分において記載したように実施したクロマチン免疫沈降解析による、アレル特異的な転写因子の結合の証拠資料を示す。ＨＴ２９細胞を、これらの細胞がこの部位におけるヘテロ接合ＧＡであることから、ＯＤＣ１  Ａ−アレルの供給源として用いた。ＨＣＴ１１６細胞をＯＤＣ１  Ｇ−アレルの供給源として用いた。
【図５】ＯＤＣ１活性におけるｃ−ＭＹＣ及びＭＡＤ１発現の効果を示す図である。図５Ａは、ＨＴ２９結腸由来細胞における、ＯＤＣ１アレルに特異的なプロモーター活性に及ぼすｃ−ＭＹＣ発現の効果を示す。ＯＤＣ１プロモーターレポータープラスミドをｐｃＤＮＡ３．０プラスミド又はＣＭＶ−ＭＹＣ発現ベクターと共にトランスフェクションした後に、プロモーター活性を測定した。プロモーター構築物は、−４８５〜−４８０ｂｐに位置する第一のＥ−ボックス要素（野生型配列を「ｗｔ  Ｅ−ボックス１」、突然変異体配列を「ｍｕｔ  Ｅ−ボックス１」とした）の有無によって異なる。構築物はまた、ＯＤＣ１  ＋３１６  ＳＮＰ（「＋３１６  Ｇ」又は「＋３１６  Ａ」）によっても異なる。＊は、ｐｃＤＮＡ３．０と共にトランスフェクションしたプロモーター活性との相対的な比較において、４つそれぞれがＰ≦０．０１３で統計的に有意であることを示す。図５Ｂは、ＨＴ２９結腸腫瘍由来細胞におけるＯＤＣ１アレル−特異的プロモーター活性に及ぼすＭＡＤ１発現の効果を示す。ＯＤＣ１プロモーターレポータープラスミドをｐｃＤＮＡ３．１プラスミド又はｐｃＤＮＡ−ＭＡＤ１プラスミドと共にトランスフェクションした後にプロモーター活性を測定した。プロモーター構築物については、この図のパネルＡの凡例に記載した。＊は、ｐｃＤＮＡ３．１と共にトランスフェクションした場合のプロモーター活性と比較して、Ｐ＝０．０２７で統計的に有意であることを示す。
【図６】腺腫性ポリープの減少を示す図である。この図は、偽薬と比較して、ＤＦＭＯ及びスリンダクで治療した患者の、腺腫性ポリープ再発のパーセンテージを示す。全腺腫の７０％、進行した腺腫の９２％、及び複数の腺腫の９５％が減少した。
【図７】＋３１６  ＯＤＣ１遺伝子型に基づく薬理ゲノム有益性／リスク解析を示す図である。この図は、患者における＋３１６  ＯＤＣ１遺伝子型の機能として、治療群及び偽薬群における、偽薬に対する３年後の腺腫再発の低下（％）及び中毒性難聴（％）を比較する。中毒性難聴は聴力検査により決定した。
【図８】＋３１６  ＯＤＣ１遺伝子型に基づく薬理ゲノム有益性／リスク解析を示す図である。この図は、患者の＋３１６  ＯＤＣ１遺伝子型の機能として、治療群及び偽薬群における３年後の腺腫の再発（％）である利益と中毒性難聴のリスク（％）を比較する。中毒性難聴は聴力検査により決定した。
【図９】Ｍｉｎ／＋マウスにおける、結腸の大きさ当たりの腫瘍の平均数を示す図である。この図は、未処理対照と比較した場合の、３つの治療群における結腸の大きさ当たりの腫瘍の平均数を示す。Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、Ｍｅ．）から購入したマウス、オスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ−ＡｐｃＭｉｎ／＋とメスのＣ５７／ＢＬ６を掛け合わせた。ヘテロ接合Ｍｉｎマウス（ＡｐｃＭｉｎ／Ａｐｃ＋）：（Ａｐｃの８５０番目のコドンにおけるナンセンス変異のヘテロ接合）を、テールチップ（ｔａｉｌ−ｔｉｐ）ＤＮＡを用いたアレル特異的ＰＣＲアッセイにより、離脱を利用したジェノタイピングによって同定した。ホモ接合（Ａｐｃ＋／Ａｐｃ＋）の同腹子を対照とした。１つの治療は、試験の８日目に２％ＤＦＭＯ（Ｍｅｒｒｅｌｌ  Ｄｏｗ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔ．）を含む水を与えることであった。その他の治療においては、試験の２１日目に、１６７ｐｐｍのスリンダク（Ｈａｒｌｅｎ  Ｔｅｋｌａｄ）をＡＩＮ−９３Ｇマウス飼料に添加した。３番目の治療においてはＤＦＭＯ及びスリンダクの組み合わせを用いた。１１４日後、ＣＯ２窒息によりマウスを殺した。マウスから小腸及び結腸片を切除し、縦方向に切り開き、７０％エタノール中で固定し、そして腫瘍を測定するために４℃に静置した。代表的な組織については組織病理学的評価も行った。
【図１０】Ｍｉｎ／＋マウスの小腸における、大きさ当たりの腫瘍の平均数を示す図である。この図は、未処理対照と比較した場合の、３つの治療群における小腸の大きさ当たりの腫瘍の平均数を示す。実験の詳細については上述した図９を参照のこと。
【図１１】Ｍｉｎ／＋マウスにおける治療の機能としての、グレードの高い腺腫の数を示す図である。この図は、治療の型によってどのようにグレードの高い腺腫の数が変動するかを示す。実験の詳細については上述した図９を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
いくつかの態様においては、少なくとも部分的には患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子型に基づいて、適性、効力、毒性及び／又はオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）阻害剤及びスペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ発現アゴニストを含む抗癌併用療法の用量を予測することを含む方法が提供される。
【００４７】
本発明はまた、前癌症状を示している対象の癌の発症を予防するため及び／又は、新しい異常腺窩巣の形成、新しい腺腫性ポリープの形成又は新しい異形成性腺腫のような癌リスク因子の発症を予防するための、治療用化合物の送達をも含む。このカテゴリーの細胞は、少なくとも部分的に患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子型に基づいて、癌状態へ進行する可能性を示している、ポリープ及びその他の前癌病変、前悪性腫瘍、前癌状態又はその他の異常な表現型が含まれる。
【００４８】
Ｉ．ポリアミン代謝
過剰なポリアミンの形成は、長く、上皮癌発症、特に結腸直腸癌発症の原因とされてきた。ポリアミンは、転写、ＲＮＡの安定化、イオンチャネル開閉などを含む様々な過程に関与する、小さく、偏在する分子である（Ｗａｌｌａｃｅ，２０００）。ポリアミン合成における第一の酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）は、哺乳類の正常な発生及び組織の修復に必須であるが、大部分の成熟した組織ではダウンレギュレートされている（Ｇｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，２００４）。ポリアミンの代謝及び輸送における複数の異常は、複数の組織で腫瘍形成を促進することができるポリアミンレベルの上昇を生じる（Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，２００３）。
【００４９】
ポリアミンの代謝は、結腸及びその他の癌への高い危険性と関連する症候群である、家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）を有するヒトの腸上皮組織においてアップレギュレートされる（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００５０】
ＦＡＰは、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制遺伝子における突然変異によって生じると考えられ、また、ヒト細胞（Ｆｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，２００２）及びＦＡＰのマウスモデル両方において、ＡＰＣシグナル伝達がＯＤＣ発現を制御することが示されてきた（Ｅｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００５１】
野生型ＡＰＣの発現はＯＤＣ発現の低下を引き起こすが、突然変異体ＡＰＣはＯＤＣ発現の上昇を引き起こす。ＯＤＣのＡＰＣ依存性制御機構には、転写アクチベーターであるｃ−ＭＹＣと転写リプレッサーであるＭＡＤ１を含む、Ｅ−ボックス転写因子が関与する（Ｆｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，２００２；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ｃ−ＭＹＣは、他のものにより、ＯＤＣ転写を制御することが示された（Ｂｅｌｌｏｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。ポリアミン代謝に含まれるいくつかの遺伝子は、多くの生物の最適な成長に必須の遺伝子であり、増殖していない及び／又は成熟した細胞及び組織においてはダウンレギュレートされている（Ｇｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，２００４）。他にまとめられているように（Ｃｈｉｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ポリアミンは、部分的に遺伝子の発現パターンに作用することにより、特定の細胞表現型に影響を及ぼす。
【００５２】
以下に記載するように、ＯＤＣ（すなわち、ポリアミン合成の律速酵素）活性の阻害及び／又は細胞内ポリアミンレベルの減少を含む方法は、ヒトにおいて、結腸直腸ポリープの再発の予防に顕著な効力を示した。本研究による疫学的及び実験の結果は、ＯＤＣ中の遺伝的多型によるポリアミン恒常性の条件付きの制御を示し、＋３１６  ＯＤＣ  ＳＮＰが結腸腺腫再発への保護となり得る、及び、結腸癌と診断された後の生存に有害となり得るというモデルを示唆するものである。この情報を結腸癌の予後の決定に用いることができる。癌の進行／再発のリスクが高い患者を同定することにより、早期の第三次予防の管理方法を開始することができる。加えてこの研究を、高リスクではあるが、他の点では最適な治療を受けた、第三次癌予防治療が有効だと考えられる局所結腸直腸癌患者を同定するために用いることができる。
【００５３】
ポリアミン（例えばプトレッシン）が、およそ４００ｐｐｍのプトレッシンを含有するオレンジジュースのような、多くの一般的な食物中に存在するという事実から、患者の食事に依存して、過剰ポリアミンの問題が悪化する場合がある。この点において、高ポリアミン食は禁忌であり、本明細書に示されたいくつかの実施形態においては、そのような食事は避けられる。２０１０年５月１４日に出願された、Ｋａｖｉｔｈａ  Ｐ．Ｒａｊ、Ｊａｓｏｎ  Ａ．Ｚｅｌｌ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｅ．ＭｃＬａｒｅｎ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｇｅｒｎｅｒ、Ｆｒａｎｋ  Ｌ．Ｍｅｙｓｋｅｎｓ及びＪｅｆｆｒｅｙ  Ｊａｃｏｂによる米国仮特許出願、名称「Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  Ｃｏｎｔｅｎｔ」を参照のこと。またその全文は、参照することにより本明細書に組み入れられる。
【００５４】
ＩＩ．家族性腺腫性ポリポーシス
遺伝性ポリポーシス症候群である家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）は、大腸腺腫性ポリポーシス（ＡＰＣ）腫瘍抑制遺伝子の生殖細胞突然変異の結果である（Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。さまざまな表現型となる、この常染色体優性条件は、散発性結腸癌と診断される平均年齢よりも２０歳早い４０代における、一様に腺癌へと進行する、数百もの結腸癌の発生と関連する（Ｂｕｓｓｅｙ，１９９０）。ＦＡＰ発症前の対象についてのこれまでの研究において、正常に見える結腸直腸生検におけるポリアミン（スペルミジン及びスペルミン、並びにそのジアミン前駆体であるプトレッシン）のレベルが、正常な家系員対照よりも上昇していることが検出された（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。哺乳類のポリアミン合成における第一の、かつ律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性もまた、ＦＡＰ患者由来の正常に見える結腸粘膜生検で上昇している（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｕｋ  ａｎｄ  Ｂａｙｌｉｎ，１９８４）。ポリアミンが適正な細胞増殖に必須であることから、これらの発見は注目されている（Ｐｅｇｇ，１９８６）。さらに、酵素により活性化される不可逆性の阻害剤であるＤＦＭＯを用いたＯＤＣ活性の抑制は、発癌性物質を処理した齧歯類−における結腸癌の発症を阻害する（Ｋｉｎｇｓｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｔｅｍｐｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【００５５】
以下に詳細に議論されるように、変異したＡＰＣ／ａｐｃ遺伝子型がＦＡＰと共通するＭｉｎ（多重腸新生物）マウス（Ｌｉｐｋｉｎ，１９９７）を、ヒトＦＡＰ患者への有用な実験動物モデルとして用いた。Ｍｉｎマウスは、１２０日間の生存の間に、ＧＩ出血、閉塞及び死亡を引き起こす、１００を超える胃腸腺腫／腺癌を胃腸管全体に発生させることができる。ＤＦＭＯ及びスリンダクの併用療法が、これらのマウスにおける腺腫の減少に効果的であることが示された（米国特許第６，２５８，８４５号；Ｇｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，２００４）。Ｍｉｎマウスを、ＤＦＭＯ単独、スリンダク単独、又はＤＦＭＯとスリンダクとの併用のいずれかを用いて処理した場合の、結腸又は小腸いずれかでの腫瘍形成における結果を図９〜１１に示す。
【００５６】
ＩＩＩ．オルニチンデカルボキシラーゼ−１多型
ポリアミン合成における第一の酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の活性は、正常な成長に必要であり、またその活性は結腸直腸癌を含む多くの癌において上昇している。本明細書においては、ＣＲＣ症例における、＋３１６  ＯＤＣ一塩基多型（ＳＮＰ）と結腸直腸癌（ＣＲＣ）特異的生存との間の関連について試験し、そしてその結腸癌細胞における機能的異議について調査した。
【００５７】
ヒトＯＤＣ１遺伝子のイントロン−１中にある一塩基多型（ＳＮＰ）は、ＯＤＣ１転写に影響を及ぼし（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、結腸直腸腺腫（ＣＲＡ）リスクに対する遺伝子マーカーとして研究されてきた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。報告されたマイナーＡ−アレル頻度はおよそ２５％であり、人種／民族性による差に関わらず、各人種におけるＯＤＣ１遺伝子型分布はハーディ・ワインベルグ平衡を取る（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＯＤＣ１マイナーＡ−アレルホモ接合の対照は、メジャーＧ−アレルホモ接合の対照と比較して腺腫再発のリスクが低い（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。さらに、ＯＤＣ１  Ａ−アレル（ＡＡ又はＧＡ遺伝子型、であってＧＧ遺伝子型ではない）及び報告されたアスピリンの使用は、結腸ポリープ再発の減少（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、及び統計的に有意な進行した腺腫の５０％低下（Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）と関連した。
【００５８】
Ｅ−ボックス転写因子のＯＤＣアレル特異的結合について研究を行い、２つのＥ−ボックス（図２Ａに図示したＥ−ボックス２及び３）の間に位置する＋３１６  ＯＤＣ  ＳＮＰの機能的意義を評価した。各細胞株遺伝子型は、この領域中に保存されているＰｓｔＩ制限酵素部位に影響を及ぼす。図２Ｂは、ヒト結腸ＨＴ２９細胞をからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物はＰｓｔＩ切断に対して部分的に感受性であったことを示し、このことはこれらの細胞が少なくとも１つのＯＤＣ  Ａ−アレルを含むことを示唆している。同じプライマーを用いたヒト結腸ＨＣＴ１１６細胞からのＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩの作用に対して非感受性であり、このことはこれらの細胞がＯＤＣ  Ｇ−アレルのみを含むことを意味している。この結果は、ダイレクトＤＮＡシークエンシングにより確認した。
【００５９】
転写アクチベーターであるｃ−ＭＹＣ及び複数の転写リプレッサーを含む、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞においてＥ−ボックスに特異的に結合するタンパク質（例えばＭＡＤ１及びＭＡＤ４）の発現を、ウェスタンブロットにより実証した（図３Ａ）。これらのタンパク質に対する抗体を用いて、ＯＤＣプロモーターの＋３１６周辺領域のクロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）解析を行った。図３Ｂに示したように、ｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１又はＭＡＤ４に対する抗体を用いたクロマチンの免疫沈降後に得たＨＴ２９  ＤＮＡから、ＯＤＣプロモーターに特異的なＰＣＲ産物を合成した。同様のクロマチン免疫沈降後にＨＣＴ１１６  ＤＮＡから合成したＰＣＲ産物は、ＨＴ２９  ＤＮＡから合成したＰＣＲ産物と比較して、実質的に少なかった。これらの結果の定量は、ｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１、及びＭＡＤ４のＯＤＣ  ＳＮＰ領域への結合が、ＯＤＣ−Ｇアレルのみを含むＨＣＴ１１６細胞と比較して、１つのＯＤＣ−Ａアレルを含むＨＴ２９細胞において４〜１４倍高いことを示した。
【００６０】
ＯＤＣアレル−特異的プロモーター活性を評価した。Ｅ−ボックスのアクチベーター及びリプレッサーの発現に依存して、＋３１６  ＯＤＣ  ＳＮＰがＯＤＣの発現に影響を及ぼすという仮説を、以下のように試験した。ＯＤＣアレル特異的プロモーター構築物と、転写アクチベーターであるｃ−ＭＹＣ又はリプレッサーであるＭＡＤ１のいずれかを発現しているベクターとを同時に導入することにより、結腸癌由来ＨＴ２９細胞の一過性のトランスフェクションを行った（図４Ａ及び図４Ｂ）。標準誤差の線は、重複して行った単一の代表的な実験での、３回の測定における変動を反映している。これらの実験で用いたアレル特異的プロモーター−レポーターには、図２Ａに示した３つ全てのＥ−ボックスが含まれた。図４Ａに示したように、ｃ−ＭＹＣの発現は、３つの保存されたＥ−ボックス及びＯＤＣ−Ａアレルを含むプロモーターに対して高い刺激効果を有した（ｗｔ  Ｅ−ボックス１  ＋３１６  Ａ、Ｐ＝０．００１４）。上流のＥ−ボックスを欠損させるとプロモーター活性が低下したが、ｃ−ＭＹＣの発現はこの活性を刺激し続けた（ｍｕｔ  Ｅ−ボックス１  ＋３１６  Ａ、Ｐ＝０．００１３）。＋３１６  ＳＮＰ位置でＧをＡに置換すると、完全な５’に隣接した保存されたＥ−ボックスがあっても、ｃ−ＭＹＣのプロモーター活性を刺激する能力が低下した。５’に隣接した保存されたＥ−ボックスへの変異の導入とＯＤＣ−Ｇアレルとの組み合わせでは、プロモーター活性がさらに低下した。
【００６１】
ｃ−ＭＹＣよりも、ＭＡＤ１をＯＤＣアレル−特異的プロモーターレポーターと共にトランスフェクションした場合（図４Ｂ）、リプレッサーは、３つ全てのＥ−ボックス及び野生型＋３１６  Ａ−アレルを含むＯＤＣプロモーターの活性のみを低下させることができた（Ｐ＝０．０２７）。上流のＥ−ボックスを欠損させると（ｍｕｔ  Ｅ−ボックス１  ＋３１６  Ａ）、ＭＡＤ１のＯＤＣプロモーター活性に及ぼす効果が有意に低下した。＋３１６位置のＧをＡに置換すると、２つ又は３つのＥ−ボックスを含むプロモーターはＭＡＤ１による抑制に非感受性となった。
【００６２】
ＩＶ．ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）
エフロルニチンとしても知られるＤＦＭＯは、２−（ジフルオロメチル）−ｄｌ−オルニチンという化学名を有する。これは、ポリアミン生合成経路の律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の、酵素によって活性化される不可逆的な阻害剤である。ポリアミン合成のこの阻害の結果、この化合物は、多くの器官系での癌形成の予防、癌の成長の阻害、及び腫瘍サイズの低減において効果的となる。また、これはその他の抗腫瘍薬との相乗作用を有する。
【００６３】
ＤＦＭＯがマウスにおけるＡＰＣ依存性腸腫瘍形成を減少させることが示されてきた（Ｅｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ヒトにＤＦＭＯを毎日経口投与すると、ＯＤＣ酵素活性及び多くの上皮組織におけるポリアミン含量が抑制される（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。近年発明者らは、無作為化臨床試験において、ＤＦＭＯが、非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）スリンダクと併用することで、偽薬群と比較して、結腸腺腫を有する個体における腺腫再発率を顕著に低下させることを報告した（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００６４】
ＤＦＭＯは当初、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ｍｅｒｒｅｌｌ、Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇにより、合成された。現在、ＦＤＡによる認可には
・アフリカ睡眠病。高用量全身性ＩＶ用量形態−市販されない（Ｓａｎｏｆｉ／ＷＨＯ）
・男性型多毛症（アンドロゲン誘導性の過剰な体毛の成長）局所用量形態
が含まれ、現在、経口処方は認可されていない。
【００６５】
良性前立腺肥大症の治療におけるＤＦＭＯ及びその使用は、米国特許第４，４１３，１４１号、及び同第４，３３０，５５９号の２つの特許に記載されている。米国特許第４，４１３，１４１号には、ＤＦＭＯがインビトロ及びインビボの両方において、ＯＤＣの強力な阻害剤であることが記載されている。ＤＦＭＯの投与は、通常は積極的に生産されるポリアミンである、プトレッシン及びスペルミジンの細胞中での濃度低下をもたらす。加えて、標準的な腫瘍モデルに投与した場合に、ＤＦＭＯが新生細胞の増殖を遅らせることができることが示されてきた。米国特許第４，３３０，５５９号では、良性前立腺肥大症の治療におけるＤＦＭＯ及びＤＦＭＯ誘導体の使用について記載されている。良性前立腺肥大症は、早い細胞増殖によって特徴付けられる多くの疾患状態と同様に、ポリアミン濃度の異常な上昇によって生じる。この文献中に記載された治療は、経口的又は非経口的のいずれかにより、患者に投与することができる
【００６６】
有意な抗腫瘍効果のあるＤＦＭＯを継続的に投与することができる。この薬剤は、０．４ｇ／ｍ２／日というヒトへの低い用量では比較的毒性が低いが、腫瘍においてプトレッシン合成を阻害する。ラット腫瘍モデルを用いた研究は、ＤＦＭＯの注入が、末梢の血小板の数を抑制することなく、腫瘍プトレッシンレベルを９０％低下させることを示している。
【００６７】
ＤＦＭＯの使用に伴って観察される副作用には、４ｇ／Ｍ２／日の高用量での聴力に及ぼす影響が挙げられるが、これは薬剤を中止することによって解消される。これらの聴力に及ぼす影響は、０．４ｇ／Ｍ２／日の低用量を１年間まで投与した場合には観察されない（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。加えて、ふらつき／めまいの症例がいくつか見られたが、薬剤を中止することで解消した。主に高「治療」用量のＤＦＭＯ（＞１．０ｇ／ｍ２／日）、そして第一に、これまでに化学療法を受けていた癌患者、又は骨髄損傷を有する患者を用いた研究において、血小板減少症が報告された。ＤＦＭＯ治療に関連する毒性は通常、その他の型の化学療法と同程度には重症でないが、限られた臨床試験においては、用量依存的に血小板減少症を促進することが認められている。さらに、ラットを用いた実験では、ＤＦＭＯを１２日間持続注入すると、対照と比較して、血小板の数が有意に低下することが示されている。その他の研究においても、血小板減少症が継続的なＤＦＭＯの静脈内治療による主要な毒性であるという、同様の観察がなされた。これらの発見は、ＤＦＭＯが巨核球の骨髄前駆体のＯＤＣ活性を有意に阻害し得ることを示唆するものである。ＤＦＭＯは上皮創傷治癒のような、増殖性の修復過程を阻害し得る。
【００６８】
第第３相臨床試験では、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）とスリンダク、又はマッチした偽薬を用いた３６ヶ月の治療後の腺腫性ポリープの再発を評価した。一時的な聴力の低下がＤＦＭＯによる治療の既知の毒性であり、そのため一連の空気伝導聴力を解析するための包括的な方法が開発された。一般化された推定式は、周波数での繰り返し行った測定による、対象内での相関を評価することにより、治療群間での空気伝導純音閾値の平均差を推定した。２９０人の対象の結果、偽薬を投与した対象と比較した、ＤＦＭＯ及びスリンダクを投与した対象間における、基準値、年齢、及び周波数で補正した平均差は０．５０ｄＢであった（９５％信頼区間、−０．６４〜１．６３ｄＢ；Ｐ＝０．３９）。通常の会話音域は５００〜３，０００Ｈｚであり、推定される差の平均は０．９９ｄＢ（−０．１７〜２．１４ｄＢ；Ｐ＝０．０９）であることを検出した。用量強度によっては、モデルに対する情報は加えられなかった。試験した全音域帯にわたり、連続した２つ以上の周波数で基準値から少なくとも１５ｄＢの聴力低下を経験した対象は、ＤＦＭＯ及びスリンダクの群では１５１人中１４人（９．３％）、及び偽薬群で１３９人中４人（２．９％）であった（Ｐ＝０．０２）。治療後、少なくとも６ヶ月間継続した空気伝導検査は、治療群において聴力閾値の差の平均が１．０８ｄＢ（−０．８１〜２．９６ｄＢ；Ｐ＝０．２６）に修正されたことを示した。偽薬群と比較して、ＤＦＭＯ及びスリンダク群において臨床的に有意な聴力低下を経験した対象の割合には有意な差はなかった。この薬剤が原因となる、中毒性難聴の推定されるリスクは８．４％（９５％信頼区間、−２．０％〜１８．８％；Ｐ＝０．１２）である。偽薬を投与した患者と比較して、ＤＦＭＯ及びスリンダクを投与した患者の平均閾値の差は、＜２ｄＢである。この研究の結果は、ＭｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８において詳細に議論されており、その全文は参照することにより本明細書に組み入れられる。本明細書においては、ＤＦＭＯ及びスリンダクのような薬剤を投与した患者での中毒性難聴を低減する及び／又は予防する方法が提供される。
【００６９】
Ｖ．ＮＳＡＩＤ
ＮＳＡＩＤは非ステロイド性の抗炎症性薬である。抗炎症性作用に加えて、それらは鎮痛性、解熱性、及び血小板阻害作用を有する。それらは第一に、慢性関節炎の状態の治療、並びに疼痛及び炎症と関連する特定の軟部組織障害の治療に用いられる。それらは、アラキドン酸を、プロスタグランジンの前駆体である環状エンドペルオキシドに変換するシクロオキシゲナーゼを阻害し、プロスタグランジンの合成を遮断することによって作用する。プロスタグランジン合成の阻害が、それらの鎮痛性、解熱性、及び血小板阻害作用の主な要因であり、その他の機序もそれらの抗炎症性効果に寄与していると考えられる。特定のＮＳＡＩＤはまた、リポキシゲナーゼ酵素又はホスホリパーゼＣを阻害する場合があり、又はＴ−細胞の機能を調節する場合がある。（ＡＭＡ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  Ａｎｎｕａｌ，１８１４−５，１９９４）。
【００７０】
アスピリン、イブプロフェン、ピロキシカム（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、インドメタシン（Ｎａｒｉｓａｗａ，１９８１）、及びスリンダク（Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）を含む非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、ＡＯＭで処理したラットモデルにおいて効果的に結腸癌の発症を阻害する。ＮＳＡＩＤはまた、活性化されたＫｉ−ｒａｓを有する腫瘍の発生をも阻害する（Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ，１９９５）。ＮＳＡＩＤは、腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導を介して癌の発症を阻害すると考えられる（Ｂｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ，１９９６；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ｂ）。数多くの研究が、アポトーシスの誘導を含むＮＳＡＩＤの化学予防特性が、プロスタグランジン合成を阻害するそれらの能力の機能であることを示唆している（総説ＤｕＢｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ，１９９６；Ｖａｎｅ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔｉｎｇ，１９９７）。しかしながら、研究はＮＳＡＩＤが、プロスタグランジン−依存性及び−非依存性機序の両方を介して作用し得ることを示している（Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ａ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｈａｎｉｆ，１９９６）。ＮＳＡＩＤスリンダクの代謝産物であるスルホン化スリンダクは、ＣＯＸ−阻害活性を欠くが、腫瘍細胞におけるアポトーシスを誘導し（Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７ｂ）、そして癌発症の複数の齧歯類モデルにおける腫瘍の発生を阻害する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，１９９７ａ）。
【００７１】
ヒト臨床試験において、いくつかのＮＳＡＩＤの効果が試験されてきた。イブプロフェンの第２ａ相試験（１ヶ月）が遂行され、３００ｍｇ／日の用量でさえも、扁平粘膜におけるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルの有意な減少が認められた。３００ｍｇ用量のイブプロフェンは非常に低用量であり（治療用量は１２００〜３０００ｍｇ／日以上）、長期の使用においても毒性は見られないようである。しかしながら、動物化学予防モデルにおいては、イブプロフェンはその他のＮＳＡＩＤに比べて効果が低い。
【００７２】
Ａ．スリンダク及びその主要な代謝産物である、スルホン化スリンダク及びスリンダク硫化物
スリンダクは、（Ｚ）−５−フルオロ−２−メチル−１−（（４（メチルスルフィニル）フェニル）メチレン）１Ｈ−インデン−３−酢酸という化学名を有する、非ステロイド性の、抗炎症性インデン誘導体である（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９９）。インビボにおいてスルフィニル部分は、可逆的な還元により硫化代謝産物へと変換され、そして不可逆的な酸化によりスルホン化代謝産物（エクシスリンド）へと変換される。その全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，２５８，８４５号を参照のこと。Ｋｉ−ｒａｓの活性化をも阻害するスリンダクは、ＣＯＸを阻害する能力において異なるが、その両方ともがアポトーシスの誘導を介して化学予防効果を示すことができる、２つの異なる分子に代謝される。スルホン化スリンダクはＣＯＸ阻害活性を欠き、そしてプロスタグランジン合成とは独立した方法でアポトーシスの誘導を促進するようである。入手可能な証拠は、硫化物誘導体が生物学的に活性な化合物のうちの少なくとも１つであることを示している。これに基づき、スリンダクをプロドラッグとして検討することができる。
【００７３】
スリンダク（クリノリル（登録商標））は、例えば、１５０ｍｇ及び２００ｍｇの錠剤として入手可能である。成人への最も一般的な用量は１５０〜２００ｍｇを１日２回、最大１日用量は４００ｍｇである。経口投与の後には、約９０％の薬が吸収される。空腹患者においては約２時間後、食事と共に投与した場合には３〜４時間後にピーク血漿レベルに達する。スリンダクの平均半減期は７．８時間であり、硫化代謝産物の平均半減期は１６．４時間である。その両方の全文が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第３，６４７，８５８号及び同第３，６５４，３４９号はスリンダクの調製物を包含する。
【００７４】
スリンダクは、変形性関節症、関節リウマチ、硬直性脊椎炎、急性痛風、及び急性肩胛痛徴候の徴候及び症状の、急性及び長期間の軽減のために適用される。スリンダク（１日当たり４００ｍｇ）によってもたらされる鎮痛性及び抗炎症効果は、アスピリン（１日当たり４ｇ）、イブプロフェン（１日当たり１２００ｍｇ）、インドメタシン（１日当たり１２５ｍｇ）、及びフェニルブタゾン（１日当たり４００〜６００ｍｇ）による効果と同等である。スリンダクの副作用としては、腹痛及び悪心が主訴である、約２０％の患者における中等度の胃腸への作用が挙げられる。眠気、頭痛、及び神経過敏が主訴であると報告された、ＣＮＳの副作用が最大で１０％の患者において見られる。皮膚発疹及びかゆみが５％の患者に生じる。スリンダクを用いた慢性治療は、出血、潰瘍形成、及び穿孔のような重篤な胃腸毒性を引き起こす可能性がある。
【００７５】
癌、具体的には結腸直腸ポリープ、の化学予防におけるスリンダクの使用可能性について、よく研究されてきた。最近の２つの特許、米国特許第５，８１４，６２５号及び同第５，８４３，９２９号は、ヒトにおける、スリンダクの化学予防としての使用可能性について詳述している。両特許の全文が参照により本明細書に組み入れられる。米国特許第５，８１４，６２５号において請求されたスリンダクの用量は１日当たり１０ｍｇ〜１５００ｍｇの範囲であり、好ましい用量は１日当たり５０ｍｇ〜５００ｍｇである。しかしながら、より高い用量での化学予防における単一の薬剤としてのスリンダクの使用に関わる最も大きな問題は、周知の毒性及び不耐性への中程度に高いリスクである。６０歳を超える対象においては副作用の頻度がより高いことから、高齢者は特に作用を受けやすいようである。この年齢群の対象が最も結腸直腸癌を発生しやすく、そのため、最も化学予防からの恩恵を受けやすいことが知られている。
【００７６】
スリンダク及びそのスルホン化代謝物であるエクシスリンドは、複数の型の癌の予防及び治療のために試験されてきており、臨床試験が続けられている。米国国立衛生研究所のデータベースであるＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖは、２０１０年５月１０日時点での、以下の概観を提供している。
【表１】
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【００７７】
Ｂ．ピロキシカム
４−ヒドロキシ−２−メチル−Ｎ−２−ピリジル−２Ｈ−１，２−ベンゾチアジン−３−カルボキサミド１，１−ジオキシドという化学名を有する薬剤は、関節リウマチ及び変形性関節症の治療においてよく確立された非ステロイド性抗炎症薬である。その有用性は、筋骨格障害、月経困難症、及び術後疼痛の治療において示されてきた。半減期が長いことから、１日１回の投与を行うことができる。この薬は、直腸内に投与すると有効であることが示されてきた。副作用として報告される主訴は胃腸の病気である。
【００７８】
近年のＩＩｂ試験においては副作用を示したが、動物モデルにおいてピロキシカムが有効な化学予防薬であることが示されてきた（Ｐｏｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｌｕｃｋｅｒｔ，１９８９；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。ＮＳＡＩＤの副作用の大規模メタ解析もまた、ピロキシカムがその他のＮＳＡＩＤよりも多くの副作用を有することを示している（Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。スリンダクが家族性腺腫性ポリポーシス（ＦＡＰ）患者の腺腫の退行をもたらすことが示されてきたが（Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、散発性腺腫についての少なくとも１つの研究においてはそのような効果は認められなかった（Ｌａｄｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【００７９】
ＤＦＭＯは、それぞれの薬剤を個別に投与した場合、Ｋｉ−ｒａｓ突然変異及び腫瘍形成においてピロキシカムよりも高い抑制効果を及ぼすが（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ＤＦＭＯ及びピロキシカムの併用がＡＯＭを処理した結腸癌発症のラットモデルにおいて相乗的な化学予防効果を有することが示された（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。１つの研究においては、ＤＦＭＯ又はピロキシカムをＡＯＭを処理したラットに投与すると、Ｋｉ−ｒａｓ突然変異を有する腫瘍の数が、９０％から、それぞれ３６％及び２５％に減少した（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。両薬剤とも、存在する腫瘍における生化学的に活性なｐ２１ｒａｓの量を低下させた。
【００８０】
Ｃ．ＮＳＡＩＤの併用
様々なＮＳＡＩＤの併用もまた、様々な目的のために使用される。２つ以上のＮＳＡＩＤを低用量で使用することにより、高用量の個々のＮＳＡＩＤと関連する副作用又は毒性を低減することが可能である。例えば、いくつかの実施形態において、スリンダクをセレコキシブと共に使用することができる。いくつかの実施形態において、１つ又は両方のＮＳＡＩＤはＣＯＸ−２選択的阻害剤である。単独又は併用において用いることが推奨されるＮＳＡＩＤの例としては、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、又はエトリコキシブが挙げられるが、これらには限定されない。
【００８１】
ＶＩ．エフロルニチン／スリンダク併用療法
対象に薬剤を低用量で併用して投与した化学予防薬の前臨床研究では、腺腫予防における付加的な毒性のほとんどない顕著な効果が示され、このことは、低用量での併用が腺腫再発予防のリスク対利益率を改善する方法であることを示唆している。
【００８２】
上述したように、ＦＡＰと共通な変異型ＡＰＣ／ａｐｃ遺伝子型を有するＭｉｎ（多重腸新生物）マウスは、ヒトＦＡＰ患者に対する有用な実験動物モデルとなる（Ｌｉｐｋｉｎ、１９９７）。Ｍｉｎマウスは生後１２０日目までに、胃腸管全体に、ＧＩ出血、閉塞及び死亡を引き起こす、１００を超える胃腸腺腫／腺癌を発症することができる。ＤＦＭＯとスリンダクの併用療法が、これらマウスにおいて腺腫の減少に効果的であることが示された（米国特許第６，２５８，８４５号；Ｇｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，  ２００４）。Ｍｉｎマウスを、ＤＦＭＯ単独、スリンダク単独、又はＤＦＭＯとスリンダクとの併用のいずれかを用いて処理した場合の、結腸又は小腸いずれかでの腫瘍形成における結果を図９及び図１０に示す。図９は、未処理対照と比較した場合の、３つの治療群における結腸の大きさ当たりの腫瘍の平均数を示す。図１０は、未処理対照と比較した場合の、３つの治療群における小腸の大きさ当たりの腫瘍の平均数を示す。図１１は、単独又は併用の治療によってどのようにグレードの高い腺腫の数が変動するかを示す。
【００８３】
ＶＩＩ．患者プロファイルに基づくポリアミン阻害治療の効力
Ｄ，Ｌ−（−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ、エフロルニチン）とスリンダクを併用して、長期間、毎日ＣＲＡ患者に経口投与した場合に、ポリアミン阻害効力があること示されたが（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、治療は中等度の無症状の中毒性難聴（ＭｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、及び高い基準値の心血管リスクを有する患者における心血管イベントの数の増加と関連した（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。本発明者らは今回、偽薬群と比較して、ＯＤＣ１遺伝子型が、腺腫再発、組織ポリアミン反応、又はエフロルニチンとスリンダクとの治療後の毒性プロファイルに差次的に作用することを決定した。
【００８４】
腺腫（≧３ｍｍ）の切除歴を有する３７５人の患者を、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）５００ｍｇ及びスリンダク１５０ｍｇの投与を１日１回３６ヶ月受ける群と、マッチした偽薬を受ける群とに無作為に割り当て、試験開始時での低用量のアスピリン（８１ｍｇ）の使用及び臨床現場とにより分類した。無作為化又は試験脱落の３年後に、追跡調査のための結腸鏡検査を行った。群間における結腸直腸腺腫再発を対数二項回帰を用いて比較した。偽薬の投与を受けた患者でのアウトカムを、積極的な介入を受けた患者と比較した。結果は、（ａ）１つ以上の腺腫の再発が４１．１％及び１２．３％（リスク率、０．３０；９５％信頼区間、０．１８〜０．４９；Ｐ＜０．００１）であり；（ｂ）１つ以上の進行した腺腫有する患者は偽薬群では８．５％であり、治療群では０．７％であった（リスク率、０．０８５；９５％信頼区間、０．０１１〜０．６５；Ｐ＜０．００１）；及び（ｃ）最終的な結腸鏡検査では、１７人（１３．２％）の患者が複数（＞１）の腺腫を有したが、治療群では１人（０．７％；リスク率、０．０５５；０．００７４−０．４１；Ｐ＜０．００１）であった。重篤な有害事象（グレード≧３）は偽薬群の８．２％の患者において生じたが、積極的な介入を受けた群では１１％であった（Ｐ＝０．３５）。基準値と比較して、聴力に変化があったと報告された患者の割合には、両群において有意な差は見られなかった。腺腫性ポリープの再発は、ほとんど副作用なく、ＤＦＭＯ及びスリンダクの低経口用量での併用によって顕著に減少した。この試験の詳細については以下で議論され、またその全文が参照により本明細書に組み入れられるＭｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８中で議論されている。
【００８５】
本試験は、２６７人の試験後の結腸鏡検査が終了した後に、Ｄａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）により中止された（試験が効力エンドポイントに達したため）。ＤＳＭＢは、全ての安全性及び効力エンドポイントをモニタリングした。実施例部分において詳細に議論したように、この試験は、複数の機関における第３相結腸腺腫予防試験からの患者のデータの解析を含む。その全文が参照により本明細書に組み入れられる、Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８をもまた参照のこと。
【００８６】
Ａ．ＯＤＣ１遺伝子型分布
カリフォルニア大学アーバイン校でのＣＲＣ  ｇｅｎｅ−ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｓｔｕｄｙから同定された、全４４０の結腸直腸癌（ＣＲＣ）症例をケースのみの解析（ｃａｓｅ−ｏｎｌｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に用いた。フォローアップ期間の中間値は１１年であった。２７０（６１％）の結腸癌症例、１６２（３７％）の直腸癌症例、及び８（２％）の位置が特定されなかったＣＲＣ症例があった。表１に結腸及び直腸癌の臨床病理学的データを示す。全ＣＲＣ症例におけるＯＤＣ  ＋３１６遺伝子型分布は、５３％がＧＧ、４１％がＧＡ、及び７％がＡＡであった。ＣＲＣ症例におけるＯＤＣ  ＋３１６遺伝子型分布は、家族歴の有無に関わらず同様であった。年齢（Ｐ＝０．３８）、性別（Ｐ＝０．５６）、家族歴（Ｐ＝０．９４）、結腸直腸中の部位（Ｐ＝０．５５）、病歴（Ｐ＝０．４６）又は腫瘍悪性度（Ｐ＝０．７３）によるＯＤＣ遺伝子型分布の有意な差はなかった。診断での期によってもＯＤＣ遺伝子型分布に有意な差はなかった：Ｉ期（４９％ＧＧ、４２％ＧＡ、８％ＡＡ）、ＩＩ期（５６％ＧＧ、３８％ＧＡ、６％ＡＡ）、ＩＩＩ期（５１％ＧＧ、４３％ＧＡ、６％ＡＡ）、ＩＶ期（５９％ＧＧ、３７％ＧＡ、４％ＡＡ）（Ｐ＝０．８７）。民族性によりＯＤＣ遺伝子型分布が有意に異なることが明かであった：カフカス人（３８２例：５３％ＧＧ、４１％ＧＡ、６％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝２６％）、アフリカ系アメリカ人（７例：７１％ＧＧ、２９％ＧＡ、０％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝１５％）、ヒスパニック（２１例：５７％ＧＧ、４３％ＧＡ、０％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝２１％）、及びアジア人（２７例：３３％ＧＧ、４１％ＧＡ、２６％ＡＡ、マイナー−Ａアレル頻度＝４６％）（Ｐ＝０．００９）。しかしながら、各人種中でのＯＤＣ遺伝子型分布はハーディ・ワインベルグ平衡を取った（カフカス人Ｐ＝０．３６、アフリカ系アメリカ人Ｐ＝０．６６、ヒスパニックＰ＝０．２１、アジア人Ｐ＝０．３５）。
【００８７】
Ｂ．腺腫の再発
ＯＤＣ１遺伝子型分布は、１２６  ＧＧ（５５％）、８７  ＧＡ（３８％）、及び１５  ＡＡ（７％）であった。表１に示したように、試験開始時の臨床的特徴は異なった。年齢、性別、人種、アスピリンの使用、治療、ＯＤＣ１遺伝子型、及び治療を予測変数として用いた回帰モデルでは、治療は、腺腫再発、組織ポリアミン反応、及び中毒性難聴の差のみに関連する因子であった。偽薬患者での腺腫再発のパターンがＧＧ−５０％、ＧＡ−３５％、ＡＡ−２９％であるのに対し、エフロルニチン／スリンダク患者でのパターンがＧＧ−１１％、ＧＡ−１４％、ＡＡ−５７％であるように、ＯＤＣ１遺伝子型及び腺腫再発の治療のフルモデル（Ｐ＝０．０２１）においては、統計的に有意な相互作用が検出された。
【００８８】
ＯＤＣ１遺伝子型と、このモデルでの治療との間には統計的に有意な相互作用が認められた（Ｐ＝０．０３８）。ＯＤＣ１遺伝子型と、組織プトレッシン反応又はこのフル回帰モデル中での反応におけるスペルミジン：スペルミン比との間には有意な関連はなかった（データは示さない）。補正を行ったあとの、このフル回帰モデルにおける治療に関連した腺腫再発の相対リスク（ＲＲ）は０．３９（９５％ＣＩ  ０．２４〜０．６６）であった。心血管又は胃腸での有害事象に関しては、治療とＯＤＣ１遺伝子型群との間に有意な関連は見られなかった（表３及び表４）。
【００８９】
アスピリンの投与により腺腫再発のリスクが低下したＣＲＡ患者が少なくとも１つのＡ−アレルを有していることを示した先の報告とは対照的に（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ここでは、エフロルニチンとスリンダクとの腺腫阻害剤効果がメジャーＧのホモ対合ＯＤＣ１遺伝子型を有する患者でより高いことが認められた。ＯＤＣ１遺伝子型分布は先のアスピリンを使用した試験（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）と同様であり、これまでの報告（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）と一致して、Ａ−アレルは偽薬群における、有意でないより低い腺腫再発のリスクと関連した。腺腫再発及び中毒性難聴発症発症リスクが上昇する可能性の点についてはＡ−アレル、特にＡＡホモ接合、保有者への効果はより少なく、これらの結果は、長期間のエフロルニチン及びスリンダクへの曝露に対する反応は、ＯＤＣ１  Ａ−アレル保有者とＧＧ遺伝子型患者とでは異なることを示した。
【００９０】
Ｃ．生存解析
４４０のＣＲＣ症例のうち、１３８人（３１％）は解析時点では死亡していた。症例のうち、死亡した６４人（４６％）はＧＧ遺伝子型を保有し、対して、死亡した７４人（５４％）がＡＡ／ＡＧ遺伝子型であった。死亡した１３８人のＣＲＣ症例のうち、１０２人の死因が特定できた。ＣＲＣ症例のうち８５人（８３％）はＣＲＣが原因で死亡した。少なくとも１つのＡ−アレル（ＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ）の症例（１０年生存率＝７６％；Ｐ＝０．０３１）と比較すると、ＯＤＣ  Ｇ−アレルのホモ接合を有する全ＣＲＣ症例において、統計的に有意なＣＲＣ特異的生存の改善が見られた（１０年生存率＝８４％）。期ごとのＣＲＣ特異的生存の解析により、ＡＪＣＣのＩ期（Ｐ＝０．０５５）、ＩＩ期（Ｐ＝０．６１）、又はＩＶ期（Ｐ＝０．６５）ＣＲＣにおいては、生存の差に有意差がないことが明らかになった。しかしながら、ＩＩＩ期ＣＲＣ患者においては、ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型は、ＣＲＣ特異的な１０年生存率の改善と関連した：ＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ遺伝子型症例において７５％対６０％；Ｐ＝０．０２４（図１）。結腸癌症例においては、ＯＤＣＧＧ遺伝子型を有する場合にＯＤＣＧＡ／ＡＡである例と比較して、統計的に有意なＣＲＣ特異的な生存への有益性が認められた（１０年生存率＝８７％対７９％；Ｐ＝０．０２９）。このことは直腸癌の症例には見られなかった（ＯＤＣ  ＧＧの１０年生存率＝７８％対ＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ例７２％；Ｐ＝０．４２）。
【００９１】
年齢（年）、性別、民族性、ＣＲＣの家族歴、診断時でのＴＮＭ病期、結腸中での腫瘍の位置、組織学的サブタイプ、外科的治療、放射線治療、及び化学療法を用いて補正した後の、全ＣＲＣ症例におけるＯＤＣ遺伝子型に基づくＣＲＣ特異的な生存予測値は以下の通りである：ＯＤＣ  ＧＧハザード率（ＨＲ）＝１．００（基準値）、ＯＤＣ  ＧＡ  ＨＲ＝１．７３、及びＯＤＣ  ＡＡ遺伝子型ＨＲ＝１．７３（Ｐ−ｔｒｅｎｄ＝０．０２８３）。結腸例のみにおいては、上述した臨床変数で補正後のＣＲＣ特異的生存解析は、ＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰがＣＲＣ特異的生存の独立した予測変数であることを明らかにした。ＯＤＣ  ＧＧ結腸癌症例と比較した場合の、死亡のＣＲＣ特異的リスクは（ＨＲ）、ＯＤＣ  ＧＡ遺伝子型については２．３１（１．１５〜４．６４）であり、ＯＤＣ  ＡＡ遺伝子型については３．７３（０．９３〜１４．９９）であった（Ｐ−ｔｒｅｎｄ＝０．００６）（表２）。これらの結腸癌症例の全生存解析は、ＣＲＣ特異的生存解析と一致した（表２）。直腸癌症例において、上述した臨床変数で補正後のＣＲＣ特異的生存解析は、ＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰがＣＲＣ特異的生存についての独立した予測変数ではないことを明らかにした。ＯＤＣ  ＧＧ直腸癌の例（ＨＲ＝１．００、基準値）と比較した場合、死亡のＣＲＣ特異的リスク（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡヘテロ接合については１．７２（０．８３〜３．５７）であり、ＯＤＣ  ＡＡホモ接合については１．９３（０．５６〜６．６７）であった（Ｐ−ｔｒｅｎｄ＝０．１２）。
【００９２】
上述したように、ＯＤＣ  ＋３１６遺伝子型分布は民族性によって異なる。偶然でない限り、観察された死亡リスクはＯＤＣ遺伝子型に基づく差を反映するようであるが、このリスクは特定の民族群に限定され得る。そのため、単一の民族グループ内における遺伝子型特異的死亡リスクを評価するために、多変量解析をカフカス人の結腸癌症例について行った。２３４人のカフカス人の結腸癌症例において、３７人はＣＲＣが原因で死亡した。多変量ＣＲＣ特異的生存解析により、前述した明かな臨床変数を用いて補正した後には、カフカス人の結腸癌症例においてはＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰがＣＲＣ特異的生存の独立した予測変数であることが明らかになった。ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型（ＨＲ＝１．００、基準値）と比較した場合、死亡のＣＲＣ特異的リスク（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡ遺伝子型については２．６７（１．２２〜５．８２）であり、ＯＤＣ  ＡＡ遺伝子型については６．２８（１．４６〜２６．９５）であった（Ｐ−ｔｒｅｎｄ＝０．００１８）。
【００９３】
ＣＲＣ症例における遺伝子型特異的な生存の差は結腸癌症例に限られた：ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型症例（ＨＲ＝１．００、基準値）と比較して、補正したＣＲＣ−ＳＳハザード率（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡ症例については２．３１（１．１５〜４．６４）であり、ＯＤＣ  ＡＡ３．７３（０．９３〜１４．９９）症例については（Ｐ−ｔｒｅｎｄ＝０．００６）であった。結腸癌細胞では、２つのＥ−ボックスに隣接したＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰは、ＯＤＣプロモーター活性を規定する。Ｅ−ボックスのアクチベーターであるｃ−ＭＹＣ及びリプレッサーであるＭＡＤ１とＭＡＤ４は、培養細胞においては、メジャーＧアレルよりもマイナーＡアレルに優先的に結合する。
【００９４】
結腸直腸癌症例を１１年間フォローアップしたこの集団ベースの解析に基づき、＋３１６  ＯＤＣ  ＳＮＰが結腸癌症例における結腸直腸癌特異的生存と関連することが観察された。それぞれの付加的なＯＤＣ  Ａ−アレルを有する、すなわちＯＤＣ  ＧＧからＧＡ及びＡＡ（Ｐ−ｔｒｅｎｄ＝０．００６）の結腸癌症例においては、年齢、性別、民族性、腫瘍の病期、ＣＲＣの家族歴、腫瘍の位置、組織学、外科的治療、放射線治療、及び化学療法を用いて補正した後、統計的に有意なＣＲＣ特異的死亡リスクが上昇した。
【００９５】
Ｄ．アレル特異的な転写因子の制御
ここに示した実験データは、我々の臨床観察の根底にある可能性のある、生物学的な機序への洞察を提供する。結腸癌上皮細胞ではＥ−ボックス転写因子が、Ｇアレルを含むプロモーターよりもＡアレルを含むプロモーターにより多く結合するという証拠に見られるように、ＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰが機能的に有意であることが示されてきた。アクチベーターであるｃ−ＭＹＣ及びリプレッサーであるＭＡＤ１の両方が、ＧアレルよりもＡアレルを含むレポーターエレメントのプロモーター活性に対して高い効果を及ぼすことを示した。これらの結果は、Ｅ−ボックス転写因子による、ＯＤＣのアレル特異的な制御を示唆するものである。ＯＤＣ転写に作用すると我々が考えるＯＤＣタンパク質の酵素活性は、ＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰ遺伝子型からは影響を受けないようである。
【００９６】
結腸細胞では、正常な結腸粘膜で発現する遺伝子である野生型ＡＰＣの条件付きの発現がｃ−ＭＹＣの発現を抑制し、ＭＡＤ１の発現を上昇させることが示されてきた（Ｆｕｌｔｚ  及び  Ｇｅｒｎｅｒ，２００２）。さらに、＋３１６  ＳＮＰに依存して、野生型ＡＰＣがＯＤＣのプロモーター活性を制御することができることが報告されてきた（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＦＡＰには罹患していない対象の正常に見える結腸粘膜では野生型ＡＰＣが発現するが、散発性結腸腺腫の大部分においては変異した又は欠損したＡＰＣが発現するという証拠が示されている（Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＭＹＣは、正常な腸粘膜においては低いレベルで発現するが、そのレベルはＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの腸腺腫では上昇する。腸上皮におけるＭＹＣの発現の条件付きノックアウトは、ＡＰＣＭｉｎ／＋マウスの腸腫瘍形成を抑制する（Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。上述したように、我々のグループ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）及びその他のグループ（Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔａｌ．，２００８）によるこれまでの研究は、予防試験における結腸ポリープ再発に対するＯＤＣＡ−アレルの、特にアスピリン使用者においての、保護的な役割を示した。しかしながら、ここに示した集団ベースの研究では、ＯＤＣＡ−アレルは低い生存と関連した。この明かな矛盾は、Ｅ−ボックスのアクチベーター及びリプレッサーの両方がＯＤＣ  Ａ−アレルに選択的に結合するという、本明細書に示す結果によって説明され得る。本発明者らは、Ｅ−ボックスのリプレッサーを発現する正常な上皮から新生上皮への移行が、ＯＤＣＡ−アレルを有する対象においては遅延され得ると推測する。この効果がポリアミン合成の抑制をもたらし得る。しかしながら、形質転換した上皮がＥ−ボックス  アクチベーター（ｃ−ＭＹＣのような）を発現し始めた場合、その後の癌の進行は、ＯＤＣＡ遺伝子型を有する対象において生じやすいようである。結腸癌特異的死亡リスクに関する我々の結果は、その他の結果で示されている、特定の対象においては遺伝子環境相互作用の結果、ＯＤＣ  Ａ−アレルが前立腺癌のリスクと関連し得る、という結果と一致する（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。そのような結腸癌の進行は、前立腺癌について示されてきたように（Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ポリアミン合成が高められた結果であると考えられる。
【００９７】
ＯＤＣ  ＳＮＰのような因子が、癌発症の促進及び阻害両方の効果を有し得るというこの発見は特異なものではない。例えば、形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−登録商標）は、癌の発症及び癌の進行において、種々の役割を有する（Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｐａｒｄａｌｉ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｔａｋａｓ，２００７；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，２００３）。形質転換されていない細胞中のＴＧＦ（登録商標）は、細胞の増殖を阻害し、そしてアポトーシスを引き起こす。さらにこれはヒトの全腫瘍中で過剰発現し、癌のゆっくりとした進行、特に腫瘍の浸潤及び転移と関連する。ヒト結腸直腸腫瘍におけるＯＤＣ活性について報告している１つの研究では、ＯＤＣの高い発現レベルが生存の改善と有意に関連があることが示された（Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。このことは、ＯＤＣの過剰発現はヒトの結腸直腸腺腫の形成を促進するが、確立された病変においてはＯＤＣの過剰発現が、増殖の増強を誘導することが可能であり、そして抗増殖治療に対する反応の改善と関連することを示唆するものである。しかしながら、その研究はＯＤＣ遺伝子型による層別化を含まないため、これらの効果がＯＤＣ遺伝子型から独立したものであるかについては分かっていない。
【００９８】
観察されたＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰとＣＲＣ特異的死亡との関連は、結腸癌症例に限定された。結腸癌症例中では、カフカス人に対して特に強い効果が観察された。その他の報告と同様に、ＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰのアレル頻度は民族性によりかなり異なる（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。本発明者らが、生存解析をカフカス人のみに限定した場合（すなわち、そのような解析に対して適切な、単一の民族群について解析した場合）、ＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰの関連は有意であり、推定値は、全コホートについて観察された推定値よりもかなり高いかった。
【００９９】
疫学的研究は、併発条件の欠如、一般状態、及び用いられた特定の化学療法を含む、その他の集団ベース解析と同様の制限を有する。加えて、ＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒの参加者から得られた組織生検試料がパラフィンに包埋された試料であるため、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた組織ポリアミンの量の正確な評価に用いることができない。また、ＣＲＣ診断の診断から研究への登録までに平均して１６ヶ月の遅れがあったため、ＣＲＣ生存者の比較的健康な群に有利な選択バイアスがかかる可能性がある。本研究では評価しなかったポリアミン代謝に作用を及ぼすその他の因子が、我々の観察を説明する可能性がある。例えば、アスピリンは、ポリアミンのアセチル化及び輸送を活性化し、ＯＤＣ  Ａ−アレルと共に細胞及び組織でのポリアミン含量の低下に機能する（Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｂｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０１００】
要約すると、発明者らは、結腸癌症例中のＣＲＣ特異的死亡における、ＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰの臨床結果を観察した。加えて発明者らは、ヒト結腸癌細胞中のこの遺伝子の、ｃ−ＭＹＣ−及びＭＡＤ１依存性転写におけるＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰの機能的意義をさらに確立した。これらの実験及び疫学的な発見は合わせて、これまでに報告された結腸腺腫の進行における役割とは異なる、結腸癌の進行におけるＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰの役割を示唆するものである。これらの発見は、結腸癌進行のリスクを評価するために用いることができ、患者特異的薬理遺伝学的管理の指導、疾病監視、並びに二次的及び三次的な結腸癌予防に対する新規の標的方法の告知に用いることができる。
【０１０１】
Ｅ．まとめ
偽薬  患者における腺腫再発のパターンがＧＧ−５０％、ＧＡ−３５％、ＡＡ−２９％であったのに対してエフロルニチン／スリンダク患者ではＧＧ−１１％、ＧＡ−１４％、ＡＡ−５７％であったように、腺腫再発のフルモデルにおいては、ＯＤＣ１遺伝子型と治療との間に統計的に有意な相互作用が検出された（Ｐ＝０．０２１）。ここでは、ＣＲＡ患者のうち、アスピリンの投与を受けて腺腫再発のリスクが低下した患者は少なくとも１つのＡ−アレルを有するというこれまでの報告とは対照的に（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、エフロルニチン及びスリンダクの腺腫阻害効果は、メジャーＧホモ接合ＯＤＣ１遺伝子型を有する対象においてより高かった。これらの結果は、ＧＧ遺伝子型患者とは異なり、長期間のエフロルニチン及びスリンダクの曝露に対するＯＤＣ１  Ａ−アレル保有者の反応は種々であり、Ａ−アレル保有者、特にＡＡ  ホモ接合の対象は、腺腫再発、及び中毒性難聴発生のリスクが上昇する可能性があるという点では、薬の効果を受けにくいことを示すものである。
【０１０２】
ＶＩＩＩ．多型  解析
患者のＯＤＣ１プロモーター遺伝子の、＋３１６の位置における遺伝子型は、実施例部分に記載した特定の方法を含む、以下に示した方法を用いて決定することができる。これらの方法をさらに、当業者によって適用されるように、分子生物学の原理及び技術を用いて、変更及び最適化することができる。そのような原理及び技術は、例えば、参照することにより本明細書に組み入れられる、Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）で教示される。一塩基多型（ＳＮＰ）を同定するために用いられる一般的な方法を以下に示す。Ｋｗｏｋ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ（２００３）及びＫｗｏｋ（２００１）による参考文献において、これらの方法のうちのいくつかについての概観が示されており、この両方は特に参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０１０３】
ＯＤＣ１上のＳＮＰを、任意のこれらの方法又はその好適な変更型の使用にによって特徴付けることができる。そのような方法には、部位の直接的な若しくは間接的なシークエンシング、部位の各アレルが制限酵素部位を作出若しくは壊す場合の制限酵素の使用、アレル特異的ハイブリダイゼーションプローブの使用、多型の異なるアレルによってコードされるタンパク質に特異的な抗体の使用、又は任意のその他の生化学的解釈が挙げられる。
【０１０４】
Ａ．ＤＮＡ  シークエンシング
多型の解析に一般的に用いられる方法は、多型に隣接した及び多型を含む遺伝子座のダイレクトＤＮＡシークエンシングである。そのような解析は、「サンガー法」（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）としても知られる「ダイデオキシ介在性連鎖停止法」、又は「マクサム・ギルバート法」（Ｍａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）としても知られる「化学的分解法」により行うことができる。目的の遺伝子の回収を促進するためには、ポリメラーゼ連鎖反応のような、ゲノム配列特異的増幅と組み合わせたシークエンシングを用いてもよい（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；欧州特許出願第５０，４２４号；欧州特許出願第８４，７９６号、欧州特許出願第２５８，０１７号、欧州特許出願第２３７，３６２号；欧州特許出願第２０１，１８４号；米国特許第４，６８３，２０２号；同第４，５８２，７８８号；及び同第４，６８３，１９４号）、上記全ては参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０１０５】
Ｂ．エキソヌクレアーゼ抵抗性
多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するために用いることができるその他の方法には、特殊なエキソヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド誘導体の使用がある（米国特許第４，６５６，１２７号）。研究においては、多型部位のすぐ３’側の対立配列に相補的なプライマーがＤＮＡにハイブリダイズする。ＤＮＡ上の多型部位が、存在する特定のエキソヌクレオチド抵抗性ヌクレオチド誘導体に相補的なヌクレオチドを含む場合、ポリメラーゼにより誘導体がその後ハイブリダイズしたプライマーの末端に組み入れられる。そのような組み込みによって、プライマーはエキソヌクレアーゼによる開裂に対して抵抗性になり、そしてプライマーを検出できるようになる。エキソヌクレオチド抵抗性ヌクレオチド誘導体の同一性が既知であるため、ＤＮＡの多型部位中に存在する特定のヌクレオチドを決定することができる。
【０１０６】
Ｃ．マイクロシークエンシング法
ＤＮＡ中の多型部位を評価するための、その他の複数のプライマーを用いた組み込み技術についてが記載されてきた（Ｋｏｍｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓｏｋｏｌｏｖ，１９９０；Ｓｙｖａｎｅｎ  １９９０；Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１；Ｐｒｅｚａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｕｇｏｚｚｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｎｙｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）。これらの方法は、多型部位中の塩基を識別するために、標識したデオキシヌクレオチドを組み込むことに基づいている。シグナルは組み込まれたデオキシヌクレオチドの数に比例するため、同じヌクレオチドの解析中に生じる多型は、解析の長さに比例するシグナルを生じる（Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。
【０１０７】
Ｄ．溶液中での伸長
仏国特許第２，６５０，８４０号明細書及び国際公開第９１／０２０８７号では、多型部位でのヌクレオチドの単一性の決定するための、溶液ベースの方法が議論されている。これらの方法では、多型部位のすぐ３’側の対立配列に相補的なプライマーが使用される。その部位のヌクレオチドの単一性は、プライマーが多型部位のヌクレオチドに相補的な場合にプライマーの末端に組み込まれる標識されたダイデオキシヌクレオチド誘導体を用いて決定される。
【０１０８】
Ｅ．ジェネティックビット（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ）解析又は固相での伸長
国際公開第９２／１５７１２号では、多型部位の３’配列に相補的な、標識されたターミネーター及びプライマー混合物を使用した方法が記載されている。標識されたターミネーターが組み込まれるとき、そのターミネーターは評価する標的分子の多型部位に存在するヌクレオチドに相補的であり、そのため同定することができる。この場合、プライマー又は標的分子は固相上に固定化される。
【０１０９】
Ｆ．オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）
これは、異なる方法論を用いた、別の固相での方法である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。標的ＤＮＡの１本の鎖に隣接した配列にハイブリダイズすることができる、２本のオリゴヌクレオチドを使用する。これらオリゴヌクレオチドのうちの１本をビオチン化し、もう１本は検出できるように標識する。標的分子中に正確に相補的な配列がある場合、オリゴヌクレオチドが隣接した末端に、ライゲーション基質を作出するようにハイブリダイズする。ライゲーションにより、アビジンを用いた標識オリゴヌクレオチドの検出が可能になる。この方法に基づいたＰＣＲとの組み合わせによる、その他の核酸検出アッセイについてもまた記載がある（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。この方法では、ＰＣＲは標的ＤＮＡの指数関数型増幅を達成するために用いられ、その後標的ＤＮＡがＯＬＡを用いて検出される。
【０１１０】
Ｇ．リガーゼ／ポリメラーゼ介在性ジェネティックビット（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉ）解析
米国特許第５，９５２，１７４号では、標的分子に隣接した配列にハイブリダイズすることができる２本のプライマーを含む方法がまた記載されている。ハイブリダイゼーション産物は、標的が固定化された固相支持体上に形成される。この方法では、単一ヌクレオチドの間隔で、プライマー同士が分離されるようにハイブリダイゼーションが起こる。ポリメラーゼ存在下においてこのハイブリダイゼーション産物をインキュベートすると、リガーゼと少なくとも１つのデオキシヌクレオシド三リン酸を含むヌクレオシド三リン酸との混合物が、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドに隣接した任意の対と結合することができる。リガーゼを添加することにより、シグナル、伸長及びライゲーションに必要な２つの反応を生じる。この方法は、伸長又はライゲーションいずれかを単独で用いた方法よりも高い特異性及び低い「ノイズ」を提供し、またポリメラーゼを用いたアッセイとは異なり、固相に結合されるシグナルに対する二回目のハイブリダイゼーション及びライゲーション工程を組み合わせることにより、この方法はポリメラーゼ  工程の特異性を高める。
【０１１１】
Ｈ．侵襲的開裂反応（Ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）
侵襲的開裂反応は、特定の多型について、細胞ＤＮＡを評価するために用いることができる。ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）と呼ばれる技術がそのような反応を利用している（例えば、ｄｅ  Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，参照することにより組み入れられる）。通常、１）標的部位の上流のオリゴヌクレオチド（「上流オリゴ」）、２）標的部位をカバーするプローブであるオリゴヌクレオチド（「プローブ」）、及び、３）標的部位を含む一本鎖ＤＮＡ（「標的」）、の３種類の核酸分子を用いる。上流オリゴ及びプローブは、重複しないが連続した配列を含む。プローブは、フルオレセインのようなドナーフルオロフォア、及びＤａｂｃｙｌのようなアクセプター色素を含む。上流オリゴの３’末端にあるヌクレオチドは、プローブ−標的複合体の最初の塩基と重複（「侵襲」）する。その後プローブは、フルオロフォア／クエンチャー対の分離を生じる構造−特異的５’ヌクレアーゼにより開裂され、これにより検出される蛍光の量が増加する。Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４を参照のこと。
【０１１２】
いくつかの例においては、アッセイは固相表面上又はアレイ形態において実施される。
【０１１３】
Ｉ．ＳＮＰを検出するためのその他の方法
多型を同定及び検出するための複数のその他特定の方法を以下に示し、これらの方法は本発明のＯＤＣ１遺伝子の多型の同定に関してそれ自体又は好適な変更を伴って用いることができる。複数のその他の方法はまた、ワールドワイドウェブのＮＣＢＩのＳＮＰウェブサイト、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰにも記載されており、このサイトは参照することにより本明細書に組み入れられる。
【０１１４】
特定の実施形態においては、どのＳＮＰが余剰であり、どのＳＮＰが関連する研究に必須であるかを正確に同定することを可能にする、集団における任意の指定された遺伝子座における拡散したハプロタイプを決定することもできる。関連する研究に必須なＳＮＰは「ハプロタイプ  タグＳＮＰ（ｈｔＳＮＰ）」と呼ばれ、遺伝子又は連鎖不均衡な領域のハプロタイプを捕らえることができるマーカーである。方法の例としては、それぞれが参照することにより本明細書に組み入れられる、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）及びＫｅ及びＣａｒｄｏｎ（２００３）を参照のこと。
【０１１５】
ＶＤＡ−アッセイは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ試薬及びその他の標準的な反応条件を用いたｌｏｎｇ  ＰＣＲ法による、ゲノムセグメントのＰＣＲによる増幅を利用する。ｌｏｎｇ増幅では、約２，０００〜１２，０００ｂｐの大きさのＤＮＡを増幅することができる。産物のｖａｒｉａｎｔ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ａｒｒａｙ（ＶＤＡ）へのハイブリダイゼーションは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒにより行い、そしてコンピュータ化されたソフトウェアを用いて解析することができる。
【０１１６】
チップアッセイと呼ばれる方法は、標準的な又はｌｏｎｇ  ＰＣＲプロトコールによる、ゲノムセグメントのＰＣＲ増幅を利用する。ハイブリダイゼーション産物はＶＤＡにより解析される（参照することにより本明細書に組み入れられる、Ｈａｌｕｓｈｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９））。ＳＮＰは通常、ハイブリダイゼーションパターンのコンピュータ解析に基づいて「確実な（ｃｅｒｔａｉｎ）」又は「可能性が高い（Ｌｉｋｅｌｙ）」に分類される。ヌクレオチドシークエンシングのような別の検出方法との比較により、「確実な」ＳＮＰの１００％が確認され、この方法では７３％の「可能性が高い」ＳＮＰが確認された。
【０１１７】
その他の方法は単に、ＰＣＲでの増幅と、続く関連する制限酵素による消化を含む。さらにその他の方法は、既知のゲノム領域由来の、精製したＲＣＲ産物のシークエンシングを含む。
【０１１８】
さらなる別の方法においては、個々のエキソン又は大きなエキソンの重複している断片がＰＣＲによって増幅される。プライマーは報告されている又はデータベース上の配列に基づいて設計され、ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は以下の条件により行われる：鋳型ＤＮＡ  ２００ｎｇ、プライマーそれぞれ０．５μＭ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰそれぞれ８０［Ｍ、５％  ホルムアミド、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、Ｔａｑ  ポリメラーゼ０．５  Ｕ、並びにＴａｑ緩衝液０．１  容量。サーマルサイクラーによる増幅を行い、得られたＰＣＲ産物を様々な条件下で、例えば１５％の尿素を含む５又は１０％  ポリアクリルアミドゲルを用い、５％  グリセロールを含む又は含まない条件で、一本差高次構造多型（ＰＣＲ−ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）解析により解析する。電気泳動は一晩かけて行われる。移動度のシフトを示すＰＣＲ産物を再度増幅し、そしてヌクレオチドの変異を同定するためにシークエンシングする。
【０１１９】
ＣＧＡＰ−ＧＡＩ  （ＤＥＭＩＧＬＡＣＥ）と呼ばれる方法では、配列データ及びアライメントデータ（ＰＨＲＡＰ．ａｃｅファイルから）、配列ベースコールの品質スコア（ＰＨＲＥＤ品質ファイルから）、距離情報（ＰＨＹＬＩＰ  ｄｎａｄｉｓｔ及びｎｅｉｇｈｂｏｕｒプログラムから）並びにベースコールデータ（ＰＨＲＥＤ「−ｄ」ｓｗｉｔｃｈから）をメモリにロードする。配列をアライメントし、得られたアセンブリーの一致しない部分についての縦方向のひとまとまり（「スライス（ｓｌｉｃｅ）」）を解析する。任意のそのようなスライスが候補ＳＮＰだと考えられる（ＤＥＭＩＧＬＡＣＥ）。真に多型を示しているのではないと考えられるスライスを除去するために、ＤＥＭＩＧＬＡＣＥでは、数多くのフィルターが用いられる。これらのフィルターには、（ｉ）ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ配列品質スコアが４０％以上低下する場合に、示されたスライス中のいずれの配列をもＳＮＰとしての検討からは除外するフィルター；（ｉｉ）ピークの大きさが、そのヌクレオチド型についての全ベースコール中の１５パーセンタイルよりも低い場合に、そのコールを除外するフィルター；（ｉｉｉ）一致を含む多数の不一致を有する領域をＳＮＰの計算に含めないようにするフィルター；（ｉｖ）コールされたピーク中に、２５％以上の面積を占める別のコールが存在するベースコールを、検討から除去するフィルター；（ｖ）１方向からの読みのみにおいて生じた変異を除去するフィルター、が含まれる。ＰＨＲＥＤ品質スコアは、スライス中の各ヌクレオチドについての誤識別率値に変換された。ある特定の位置にヌクレオチド不均一性の証拠があるという事後確率を計算するためには、標準的なベイズ法が用いられる。
【０１２０】
ＣＵ−ＲＤＦ（ＲＥＳＥＱ）と呼ばれる方法では、それぞれのＳＮＰに特異的プライマーを用いて、血液から単離されたＤＮＡからＰＣＲ増幅を行い、一般的な精製プロトコールにより用いられなかったプライマー及び遊離ヌクレオチドを除去した後に、同じプライマーまたはネスティッドプライマーを用いて、ダイレクトシークエンシングを行う。
【０１２１】
ＤＥＢＮＩＣＫ（ＭＥＴＨＯＤ−Ｂ）と呼ばれる方法では、クラスター化したＥＳＴ配列の比較分析を行い、蛍光を用いたＤＮＡ配列決定によって確認しる。ＤＥＢＮＩＣＫ（ＭＥＴＨＯＤ−Ｃ）と呼ばれる関連方法では、クラスター化したＥＳＴ配列の比較分析（ミスマッチ部位でのｐｈｒｅｄ品質が＞２０、ＳＮＰの５’側及び３’側の５塩基にわたって平均ｐｈｒｅｄ品質が＞＝２０、ＳＮＰの５’側及び３’側の５塩基でミスマッチなし、それぞれのアレルが少なくとも２回出現する）を行い、トレースを調べることによって確認する。
【０１２２】
ＥＲＯ（ＲＥＳＥＱ）として認識される方法では、電子的に公表されたＳＴＳに対して新しいプライマーセットを設計し、１０種類のマウス系統からＤＮＡを増幅するために用いる。次いで、それぞれの系統からの増幅産物をゲル精製し、３３Ｐ標識ターミネーターを用いた標準的なジデオキシサイクルシークエンシング法を用いて配列を決定する。次いで、全てのｄｄＡＴＰ反応終結物を、シークエンシングゲルの隣接するレーンにロードし、その後、全てのｄｄＧＴＰ反応物をロードする（以下同様）。放射線像を視覚的に走査することにより、ＳＮＰを同定する。
【０１２３】
ＥＲＯ（ＲＥＳＥＱ−ＨＴ）として認識される別の方法では、電子的に公表されたマウスＤＮＡ配列に対して新しいプライマーセットを設計し、１０種類のマウス系統からＤＮＡを増幅するために用いる。それぞれの系統からの増幅産物を、エキソヌクレアーゼＩ及びエビアルカリホスファターゼによる処理によってシークエンシング用に調製する。シークエンシングはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて行い、そして配列試料を３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  （９６キャピラリーシーケンサー）にかける。
【０１２４】
ＦＧＵ−ＣＢＴ（ＳＣＡ２−ＳＮＰ）は、ＳＮＰ含有領域をプライマーＳＣＡ２−ＦＰ３及びＳＣＡ２−ＲＰ３を用いてＰＣＲ増幅する方法である。最終濃度にして５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ  ＫＣｌ、０．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０５％  ゼラチン、２０ｐｍｏｌの各プライマー、及び０．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含む５０ｍｌ反応液中で、約１００ｎｇのゲノムＤＮＡを増幅する。試料を変性、アニール、伸長させ、そしてＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り出したバンドから（例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて）精製し、ダイターミネーター法を用いてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７自動ＤＮＡシーケンサーとＰＣＲプライマーを使用してシークエンシングする。
【０１２５】
ＪＢＬＡＣＫ（ＳＥＱ／ＲＥＳＴＲＩＣＴ）として識別される方法では、ゲノムＤＮＡを用いて２つの独立したＰＣＲ反応を行う。第１の反応からの産物をシークエンシングにより解析し、唯一のＦｓｐＩ制限部位を明かにする。第２のＰＣＲ反応産物中の変異を、ＦｓｐＩで消化することにより確認する。
【０１２６】
ＫＷＯＫ（１）により記載された方法では、ＰＣＲ産物を、ダイターミネーター化学を用いたダイレクトＤＮＡシークエンシングすることにより、無作為に選択された４人の対象からの高品質なゲノム配列データを比較することによって、ＳＮＰを同定する（Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照のこと）。ＫＷＯＫ（２）として識別される関連方法では、重複するラージインサートクローン（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１人工染色体（ＰＡＣ））からの高品質ゲノム配列データを比較することにより、ＳＮＰを同定する。次いで、このＳＮＰを含むＳＴＳが開発し、様々な集団におけるＳＮＰの存在を、プールされたＤＮＡのシークエンシングにより確認する（Ｔａｉｌｌｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８参照のこと）。ＫＷＯＫ（３）と呼ばれる別の類似する方法では、重複するラージインサートクローン（ＢＡＣ又はＰＡＣ）からの高品質ゲノム配列データを比較することにより、ＳＮＰを同定する。このアプローチによって発見されたＳＮＰは、２つのドナー染色体間のＤＮＡ配列変異に相当するが、一般集団におけるアレル頻度はまだ決定されていない。ＫＷＯＫ（５）の方法では、ホモ接合性ＤＮＡ試料及び１つ以上のプールされたＤＮＡ試料からの高品質ゲノム配列データを、ダイターミネーター化学を用いたＰＣＲ産物のダイレクトＤＮＡシークエンシングを用いて比較することによってＳＮＰを同定する。使用されるＳＴＳは、公的に入手可能なデータベースで見られる配列データを用いて開発する。具体的には、全ての遺伝子座でホモ接合性であることが分かっている全胞状奇胎（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｈｙｄａｔｉｄｉｆｏｒｍ  ｍｏｌｅ：ＣＨＭ）及び８０人のＣＥＰＨ親からのＤＮＡ試料プールをＰＣＲすることにより、これらのＳＴＳを増幅する（Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照のこと）。
【０１２７】
別のこのような方法であるＫＷＯＫ（Ｏｖｅｒｌａｐ  Ｓｎｐ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙ  Ｂａｙｅｓ）では、ラージインサートヒトゲノムクローン配列の重複領域の自動コンピュータ解析により、ＳＮＰを発見する。データ取得のために、クローン配列を大規模シークエンシングセンターから直接入手する。これは、ベースクオリティ（ｂａｓｅ  ｑｕａｌｉｔｙ）配列が存在しない／ＧｅｎＢａｎｋを介して入手できないために必要である。生データ処理は、一貫性のため、クローン配列及び付随するベースクオリティ情報の分析を伴う。関連するベースクオリティ配列のない、完成した（「ベースパーフェクト（ｂａｓｅ  ｐｅｒｆｅｃｔ）」、誤識別率１／１０，０００ｂｐ未満）配列には、一定のベースクオリティ値４０（１／１０，０００ｂｐの誤識別率）を割り当てる。ベースクオリティ値のないドラフト配列は拒否される。処理した配列をローカルデータベースに入力する。マスキングした既知のヒト反復を含む、各配列のバージョンも格納する。リピートマスキング（ｒｅｐｅａｔ  ｍａｓｋｉｎｇ）はプログラム「ＭＡＳＫＥＲＡＩＤ」を用いて行う。重複検出：推定重複はプログラム「ＷＵＢＬＡＳＴ」を用いて検出する。その後に、偽の重複検出結果（すなわち、真の重複と相対するものとして、配列重複のために生じる一対のクローン配列間の類似性）を除去するために、いくつかのフィルタリング工程を行う。重複の全長、全パーセント類似性、高いベースクオリティ値「高品質ミスマッチ」を有するヌクレオチド間の配列差異の数。結果をまた、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒのゲノムクローン制限断片地図の結果、完成者の重複に関する報告、及びＮＣＢＩの配列コンティグ構築の取り組みの結果とも比較する。ＳＮＰ検出：重複するクローン配列対は、「ＰＯＬＹＢＡＹＥＳ」ＳＮＰ検出ソフトウェアを用いて、候補ＳＮＰ部位について分析する。配列対間の配列差異は、配列決定の誤りと相対するものとして、真の配列変異を表す確率についてスコア付けする。この処理には、両配列のベースクオリティ値が存在することが必要である。ハイスコア候補を抽出する。この検索は置換型一塩基対変異に限定される。候補ＳＮＰの信頼スコア（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｓｃｏｒｅ）はＰＯＬＹＢＡＹＥＳソフトウェアを用いて計算する。
【０１２８】
ＫＷＯＫ（ＴａｑＭａｎアッセイ）として識別される方法では、９０人の無作為対象の遺伝子型を決定するために、ＴａｑＭａｎアッセイを用いる。ＫＹＵＧＥＮ（Ｑ１）として識別される方法では、指定された集団のＤＮＡ試料をプールし、ＰＬＡＣＥ−ＳＳＣＰによって解析する。ＤＮＡプールを対象とした解析における各対立遺伝子のピークの高さを、ヘテロ接合体における各アレルのピークの高さによって補正し、その後、アレル頻度の計算に用いる。この方法により、１０％を超えるアレル頻度が確実に定量される。アレル頻度＝０（ゼロ）は、そのアレルが個体間で見られたが、対応するピークがプール解析においては見られなかったことを意味する。アレル頻度＝０〜０．１は、マイナーアレルがプールにおいて検出されるが、ピークが小さすぎて確実に定量できないことを示す。
【０１２９】
ＫＹＵＧＥＮ（方法１）として認識されるさらに別の方法では、ＰＣＲ産物を蛍光色素で後標識し、ＳＳＣＰ条件（ＰＬＡＣＥ−ＳＳＣＰ）の下、自動キャピラリー電気泳動装置を用いて分析する。一連の実験においては、２種類のプールされたＤＮＡ（日本人プール及びＣＥＰＨ親プール）を使用して、又は使用せずに、４種類以上の個々のＤＮＡを分析する。アレルを目視検査によって同定する。異なる遺伝子型を有する個々のＤＮＡをシークエンシングし、ＳＮＰを同定する。ヘテロ接合体におけるピークの高さを用いてシグナルバイアスを補正した後、プールした試料のピークの高さからアレル頻度を概算する。ＰＣＲプライマーには、両鎖を後標識するために末端に５’−ＡＴＴ又は５’−ＧＴＴを有するようにタグがつけられている。緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３又は９．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、０．２５μＭの各プライマー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、及び０．０２５単位／μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（抗Ｔａｑ抗体と予め混合されている））を含む反応混合液中で、ＤＮＡ試料（１０ｎｇ／μｌ）を増幅する。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片の交換反応により、ＰＣＲ産物の２本の鎖を別々に、Ｒ１１０及びＲ６Ｇで修飾されたヌクレオチドで標識する。この反応をＥＤＴＡの添加によって停止し、取り込まれなかったヌクレオチドは仔ウシ腸アルカリホスファターゼを添加することにより脱リン酸化する。ＳＳＣＰの場合、蛍光標識ＰＣＲ産物及びＴＡＭＲＡ標識内部マーカーの一部分が脱イオン化ホルムアミドに添加され、変性される。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、電気泳動をキャピラリー内で行う。データ収集及びデータ処理のためにＧｅｎｅｓｃａｎソフトウェア（Ｐ−Ｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる。ＳＳＣＰにおいて異なる遺伝子型を示したものを含む対象（２〜１１人）のＤＮＡを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０シーケンサーを用いた、ビックダイターミネーター化学によるダイレクトシークエンシングにかける。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０から得られた複数の配列トレースファイルをＰｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐによって処理及び整列し、Ｃｏｎｓｅｄビューアを用いて閲覧する。ＳＮＰをＰｏｌｙＰｈｒｅｄソフトウェア及び目視検査によって同定する。
【０１３０】
ＫＹＵＧＥＮ（方法２）として識別されるさらに別の方法では、変性ＨＰＬＣ（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ＨＰＬＣ）（ＤＨＰＬＣ）又はＰＬＡＣＥ−ＳＳＣＰ（Ｉｎａｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）によって、異なる遺伝子型を有する個体を調査し、ＳＮＰを同定するために、これらの配列を決定する。ＰＣＲは、両鎖の後標識のために末端に５’−ＡＴＴ又は５’−ＧＴＴのタグが付けられたプライマーを用いて行う。ＤＨＰＬＣ分析は、ＷＡＶＥ  ＤＮＡ断片改正装置（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて行う。ＰＣＲ産物をＤＮＡＳｅｐカラムに注入し、ＷＡＶＥ  Ｍａｋｅｒプログラム（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）を用いて決められた条件下で分離する。ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片の交換反応により、ＰＣＲ産物の２本の鎖を別々に、Ｒ１１０及びＲ６Ｇで修飾されたヌクレオチドで標識する。この反応をＥＤＴＡの添加によって停止させ、取り込まれなかったヌクレオチドは仔ウシ腸アルカリホスファターゼを添加することによって脱リン酸化する。電気泳動の後、ＳＳＣＰをＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてキャピラリー内で行う。Ｇｅｎｅｓｃａｎソフトウェア（Ｐ−Ｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。個体（ＤＨＰＬＣ又はＳＳＣＰにおいて異なる遺伝子型を示した個体を含む）のＤＮＡを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０シーケンサーを用いた、ビックダイターミネーター化学によるダイレクトシークエンシングかける。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１０から得られた複数の配列トレースファイルをＰｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐにより処理及び整列し、Ｃｏｎｓｅｄビューアを用いて閲覧する。ＳＮＰをＰｏｌｙＰｈｒｅｄソフトウェア及び目視検査によって同定する。ＵｎｉｇｅｎｅにおけるＥＳＴ配列のトレースクロマトグラムデータをＰＨＲＥＤを用いて処理する。ＳＮＰの可能性がある塩基を同定するために、ＰＨＲＡＰ、ＢＲＯ、及びＰＯＡプログラムによって作成された、各Ｕｎｉｇｅｎｅクラスターについての多重配列アラインメントから、一塩基ミスマッチが報告される。ＢＲＯは、可能性のある、誤って報告されたＥＳＴ方向を修正したのに対して、ＰＯＡは、偽のＳＮＰを生じることがある遺伝子の混合／キメラを示す非直線アラインメント構造を同定及び解析した。生クロマトグラムの高さ、鋭さ、重複、及び間隔；配列決定の誤り率；文脈依存性（ｃｏｎｔｅｘｔ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）；ｃＤＮＡライブラリーの由来などのデータを評価しながら、配列決定の誤り、ミスアラインメント、又はあいまい性（ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）、ミスクラスタリング又はキメラＥＳＴ配列と比べて、真の多型の証拠を評価するためには、ベイズ推論を用いる。
【０１３１】
ＩＸ．医薬製剤及び投与経路
本開示の治療用化合物は、例えば、経口又は注入（例えば皮下、静脈内、腹腔内など）による、様々な方法によって投与することができる。活性化合物を不活性化し得る酸及びその他の天然の条件の作用から化合物を保護するために、投与経路に依存して、活性化合物を材料中に被覆加工してもよい。疾患又は損傷部位に、それらをまた持続的な潅流／注入によって投与してもよい。
【０１３２】
治療用化合物を非経口投与以外の方法で投与するには、治療用化合物をその不活化から保護する化合物で被覆すること、又は不活化から保護する化合物と共に投与することが必要な場合がある。例えば、治療用化合物を、リポソーム、又は希釈剤のような適切な担体中において患者に投与することができる。薬学上許容可能な希釈剤としては、生理的食塩水及び水溶性緩衝液が挙げられる。リポソームには、水中油中水型ＣＧＦ乳剤並びに標準的なリポソームが含まれる（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。
【０１３３】
治療用化合物を、非経口的、腹膜内、髄腔内、又は大脳内に投与してもよい。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びその混合物並びに油中に分散剤を調製することができる。一般的な保管及び使用条件下では、これらの調整物に微生物の成長を防ぐための保存料を加えても良い。
【０１３４】
注入での使用に好適な医薬組成物は、無菌の水溶性溶液（水溶性の場合）又は分散剤、及び無菌的で注入可能な溶液又は分散剤を即時調製するための無菌的な粉末を含む。いずれの場合にも、組成物は無菌的でなくてはならず、かつ、容易にシリンジを用いて注入できる（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）程度の流動性を有していなければならない。組成物は製造及び保管条件下では安定でなければならず、かつ細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなどのような）、好適なその混合物、及び植物油を含む、溶媒又は分散剤、であってもよい。適当な流動性を、例えば、レシチンのような包被剤の使用、分散剤の場合には必要とされる粒子サイズの維持、及び界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物による作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの様々な抗細菌及び抗菌薬によって達成することができる。多くの場合、組成物中に、例えば、糖、塩化ナトリウム、又は、マンニトール及びソルビトールのような多価アルコールなどの等張剤を加えることが好ましい。組成物に、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンのような、吸収を遅らせる薬剤を加えることによって、注入可能な組成物を持続的に吸収させることができる。
【０１３５】
無菌的な注入可能溶液は、治療用化合物と上に列挙した成分の１つ又は組み合わせとを、必要な量の適切な溶媒に組み入れること、そして必要な場合にはその後滅菌することにより、調製することができる。通常、分散剤は、基本的な分散媒及び上に列挙したもののうちの必要とされるその他の成分とを含む無菌的な担体中に、治療用化合物を組み入れることにより調製される。無菌的な注入可能溶液調製用の、無菌的な粉末剤を調製する場合に好ましい方法は、活性成分（すなわち、治療用化合物）と任意の付加的に所望される成分（予めフィルターを通して滅菌したその溶液から）との粉末を得るために、真空乾燥及び凍結乾燥することである。
【０１３６】
治療用化合物を、例えば、不活性な希釈剤又は吸収可能で食用の担体と共に、経口的に投与することができる。治療用化合物及びその他の成分を、外側が堅い又は軟らかいゼラチンのカプセル中に封入しても、錠剤に打錠しても、又は対象の食事に直接組み入れてもよい。経口での治療用投与のために、治療用化合物を賦形剤と共に組み入れてもよく、そして摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシール、懸濁液、シロップ、ウェハースなどの剤型において使用してもよい。当然のことながら、組成物及び調整物中の治療用化合物のパーセンテージは多様になりうる。そのような治療に有用な組成物中の治療用化合物の量は、得られるだろう好適な用量である。
【０１３７】
投与を容易にするため及び用量を均一にするために、非経口用組成物を、用量単位形態で処方することは特に有効である。本明細書で使用する場合、用量単位形態とは、治療する対象への単一用量の投与に適した、物理的に個別の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と共に、所望される治療効果を生じるように予め計算された量の治療用化合物を含む。本発明における容量単位形態についての詳述は、（ａ）治療用化合物の独特な特徴及び達成される特定の治療効果、並びに（ｂ）選択された条件下での患者の治療における、そのような治療用化合物の配合に関しての当該分野において内在する制限、により規定され、かつそれらに直接的に依存する。
【０１３８】
治療用化合物を局所的に、皮膚、目、又は粘膜に、投与してもよい。あるいは、肺への局所的送達が所望される場合には、治療用化合物を乾燥粉末又はエアロゾル製剤の形態において吸入によって投与してもよい。
【０１３９】
活性化合物は、患者における条件と関連する条件を治療するのに効果的な治療上効果量の用量において、投与される。例えば、化合物の効力を、ヒト疾患の治療における効力の予測となりうる、動物モデル系（実施例及び図表において示したようなモデル系）において評価することができる。
【０１４０】
対象に投与される、本開示の化合物又は本開示の化合物を含む組成物の実際の用量は、年齢、性別、体重、症状の重篤度、治療する疾患の型、これまでの又は同時の治療介入、対象の特発性疾患及び投与経路のような物理的及び生理学的な因子により決定され得る。これらの因子は、熟練した技術者により決定され得る。一般的には、投与に関する施術者が、個々の対象における組成物中の活性成分の濃度、及び適切な用量を決定するだろう。いずれかの合併症が生じた場合、各医師は用量を調節してもよい。
【０１４１】
典型的には、１日１回以上の又は数日に渡る投与用量での効果量は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約７５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、約１０．０ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇと、多様になるだろう（当然のことながら、投与形態及び上記で議論した因子による）。その他の好適な用量範囲は、１日当たり１ｍｇ〜１００００ｍｇ、１日当たり１００ｍｇ〜１００００ｍｇ、１日当たり５００ｍｇ〜１００００ｍｇ、及び１日当たり５００ｍｇ〜１０００ｍｇ、を含む。いくつかの特定の実施形態においては、その量は、１日当たり１０，０００ｍｇ未満であり、１日当たり７５０ｍｇ〜９０００ｍｇの範囲である。
【０１４２】
効果量は、１ｍｇ／ｋｇ／日未満、５００ｍｇ／ｋｇ／日未満、２５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、１００ｍｇ／ｋｇ／日未満、５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、２５ｍｇ／ｋｇ／日未満又は１０ｍｇ／ｋｇ／日未満となり得る。あるいは、１ｍｇ／ｋｇ／日〜２００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲となり得る。例えば、糖尿病性患者の治療に関しては、単位用量は、未治療対象と比較して、血中グルコースを少なくとも４０％低下させる量となり得る。別の実施形態においては、単用量は、血中グルコースレベルを非糖尿病対象の血中グルコースレベルの±１０％まで低下させる量である。
【０１４３】
その他の非限定的な例において用量は、１投与当たり、体重１キログラム当たり約１マイクログラム、体重１キログラム当たり約５マイクログラム、体重１キログラム当たり約１０マイクログラム、体重１キログラム当たり約５０マイクログラム、体重１キログラム当たり約１００マイクログラム、体重１キログラム当たり約２００マイクログラム、体重１キログラム当たり約３５０マイクログラム、体重１キログラム当たり約５００マイクログラム、体重１キログラム当たり約１ミリグラム、体重１キログラム当たり約５ミリグラム、体重１キログラム当たり約１０ミリグラム、体重１キログラム当たり約５０ミリグラム、体重１キログラム当たり約１００ミリグラム、体重１キログラム当たり約２００ミリグラム、体重１キログラム当たり約３５０ミリグラム、体重１キログラム当たり約５００ミリグラム、から体重１キログラム当たり約１０００ｍｇ以上、及びここから導き出せる任意の範囲を含み得る。本明細書において挙げた数値から導き出せる範囲の非限定的な例においては、上述した数値に基づいて、体重１キログラム当たり約５ｍｇから体重１キログラム当たり約１００ｍｇ、体重１キログラム当たり約５マイクログラムから体重１キログラム当たり約５００ミリグラム、などの範囲を投与することができる。
【０１４４】
特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の本開示の化合物を含んでいてもよい。その他の実施形態においては、本開示の化合物は例えば、単位重量の約２％〜約７５％、又は約２５％〜約６０％、及びそこから導き出せる任意の範囲を占めていてもよい。
【０１４５】
薬剤の単回又は複数回投与も検討される。複数回投与についての所望される時間間隔は、慣習的な実験のみしか行わない当業者によっても決定することができる。一例として、対象は、およそ１２時間間隔で、１日２回の投与を受ける場合がある。いくつかの実施形態において、薬剤は１日１回投与される。
【０１４６】
薬剤は、慣習的か計画に則って投与され得る。本明細書で使用する場合、慣習的な計画とは、予め設定された期間を指す。慣習的な計画は、計画が予め決められる限りにおいて、その長さが同一又は異なる期間を包含し得る。例えば、慣習的な計画は、１日２回、毎日、隔日、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週に１回、月に１回又はこれらの間で設定される任意の日数又は週での投与を含み得る。あるいは、予め決められた慣習的な計画は、第１週では１日２回、その後数ヶ月にわたっては１日１回、などの投与計画を含み得る。その他の実施形態においては、本発明は、経口で摂取され、かつ食事の時間に影響を受ける又は影響を受けない薬剤を提供する。従って、例えば、対象が食事を済ませた後又は食事の前に、毎朝及び／又は毎晩、その薬剤を摂取することができる。
【０１４７】
Ｘ．併用療法
効果的な併用療法は、単一の組成物若しくは両方の薬剤を含む薬理学的な製剤、又は、１つの組成物が本発明の化合物を、そして別の組成物が第二の薬剤を含み、同時に投与される２つの別個の組成物又は製剤によって達成され得る。あるいは、治療は、数分から数ヶ月の範囲の間隔で、その他の薬剤による治療の前にもその後になってもよい。
【０１４８】
「Ａ」が第一の薬剤（例えば、ＤＦＭＯ）を、そして「Ｂ」が第二の薬剤（例えば、スリンダク）を示すような、様々な組み合わせを用いることができ、それらの非限定的な例を以下に記載する。
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１４９】
ＸＩ．実施例
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すための実施例を含む。発明者らにより、本発明を実施する上でよく機能することが発見された技術を示す、実施例において開示された技術は、従って、技術の実施の好ましい形態を構成すると考えることできることを当業者は理解すべきである。しかしながら、本開示を踏まえて、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお好ましい又は同様の結果を得ることができることを当業者は理解するべきである。
【０１５０】
実施例１−疫学的研究：ＣＲＣ特異的生存とＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰとの関連
実験デザイン：研究では、集団ベース研究であるＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  ＣＲＣ（１９９４〜１９９６の間に診断し、２００８年３月までフォローアップした）からの、偶発的ＣＲＣ症例を有する４４０人を対象とした。ＯＤＣ遺伝子型（ＧＧ対ＡＡ／ＧＡ）に依存するＣＲＣ特異的生存（ＣＲＣ−ＳＳ）を一次アウトカムとした。ウェスタンブロット及びクロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）アッセイにより、ヒト結腸癌細胞株におけるＥ−ボックス転写因子のＯＤＣアレル特異的な結合を決定した。プロモーター構築物を、転写アクチベーターであるｃ−ＭＹＣ又はリプレッサーであるＭＡＤ１のいずれかを発現しているベクターと組み合わせて使用することにより、ＯＤＣアレル特異的プロモーター活性を決定した。
【０１５１】
結果：ＣＲＣ症例における遺伝子型特異的生存の差は、結腸癌症例に限定された。ＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型症例（ＨＲ＝１．００、基準値）と比較して、補正したＣＲＣ−ＳＳハザード率（ＨＲ）は、ＯＤＣ  ＧＡ症例では２．３１（１．１５〜４．６４）、ＯＤＣ  ＡＡ症例では３．７３（０．９３〜１４．９９）であった（Ｐ−ｔｒｅｎｄ＝０．００６）。結腸癌細胞では、２つのＥ−ボックスに隣接したＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰは、ＯＤＣのプロモーター活性を規定するものである。培養細胞においては、Ｅ−ボックスのアクチベーターである−ＭＹＣ並びにリプレッサーであるＭＡＤ１及びＭＡＤ４は、メジャーＧアレルと比較して、マイナーＡアレルに優先的に結合する。
【０１５２】
対象母集団：我々は、１９９４〜１９９６に行われ２００８年３月までフォローアップされた、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｇｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  （Ｐｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に登録された、侵襲性ＣＲＣの偶発的症例について研究を行った。本研究は、結腸直腸癌症例の大規模な集団ベースコホートにおけるＨＮＰＣＣの頻度を決定するようにデザインされた。２００８年４月のデータを用い、Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｃｏｕｎｔｙ／Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌの集団ベース癌登録から対象者を決定した。元の研究では（Ｐｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、１９９４から１９９６に診断した、ＣＲＣを有する全対象（Ｏｒａｎｇｅ  Ｃｏｕｎｔｙ、ＣＡ在住の全ての年齢の）を確認した。１９９４から１９９５の間にＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ａｎｄ  Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｕｎｔｉｅｓ、ＣＡで診断した、６５歳より高齢の全対象もまた確認した。その後、彼らが研究に適格であり（その時点で生存していることが確認され、連絡先が分かっている場合）、かつ、主治医が接触を許可した場合に、その症例の対象に連絡を取った。研究の登録時に、対象者は採血及び医学情報の提供を許可する同意書にサインした。本研究は、ＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（＃９３−２５７）により認可された。生命状態及びフォローアップを含む臨床的及び人口統計学的データは、先に記載された局所性癌登録データベース（Ｐｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）との連携から得た。腫瘍、節、転移（ＴＮＭ）の病期分類の決定は、入手可能な場合には、存在するＡＪＣＣコードからのものであり、これまでに報告されているように（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）疾患コードの評価に変換した。一親等血縁者の癌の家族歴を、登録時に実施した電話による面談中の自己申告によって確認した（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｚｉｏｇａｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｏｎ−Ｃｕｌｖｅｒ，２００３）。アムステルダム基準によって定義されている、遺伝性非ポリポーシス結腸癌（ＨＮＰＣＣ）を有する２２症例を同定し、解析から除外した。ＣＲＣの診断から研究への登録（すなわち、家族歴についての面談を行った日時）までの平均期間は１６ヶ月であった（９５％  ＣＩ  １２〜２３ヶ月）。
【０１５３】
ＤＮＡの抽出及びＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰ遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）。
ＱＩＡＧＥＮ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉ又はＭｉｎｉ  Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造業者による説明書に従って、２．０  ｍＬの赤血球塊試料からＤＮＡを抽出した。＋３１６での多型塩基を含む１７２ｂｐの断片を増幅するように設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰの遺伝子型決定を行った（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。異なる５’標識（６−カルボキシフルオレセイン又はＶＩＣ）及び同じ３’クエンチャー色素（６−カルボキシテトラメチルローダミン）（２３）を用いて、アレル特異的ＴａｑＭａｎプローブを合成した。これまでに報告されているように（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、各ＰＣＲ反応（全量５μＬ）には、１０ｎｇの対象ＤＮＡ、３０ｐｍｏｌの各プライマー、１２．５ｐｍｏｌの各ＴａｑＭａｎプローブ、及び１ｘＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）が含まれた。
【０１５４】
統計分析−集団ベース研究
予測されたＯＤＣ  ＧＧ遺伝子型対ＯＤＣ  ＧＡ／ＡＡ遺伝子型の１：１の比率に基づき（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２００６；Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、標本サイズを決定した。ＵＣ  ＩｒｖｉｎｅでのＧｅｎｅ−Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  ＣＲＣにおける、結腸及び直腸癌１１５４症例からのデータの先の解析は、ＣＲＣ特異的１０年生存率がおよそ６６％であることを明らかにした（Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。発明者らは、ＯＤＣ遺伝子型のみに基づくＣＲＣ特異的生存においては、我々の標本サイズの計算では、１５％より大きい差が生じると提案した。従って、有意水準５％、検出力８０％で２群間でのＣＲＣ特異的１０年生存における提案された差（第１群５５％対第２群７０％）を検出するために、全３１５対象を必要とした。４８１のＤＮＡ試料のうち４４０についての遺伝子型決定が成功した。ＤＮＡ濃度が低かったこと、及び／又はＤＮＡの質が良くなかったことから、４１例（８．５％）についてはＯＤＣ  ＋３１６遺伝子型の決定はできなかったが、遺伝子型決定が成功した例と成功しなかった例との間には、臨床病理学的な差は観察されなかった。従って、この研究は一次エンドポイントを検討するのに十分であった。
【０１５５】
結腸及び直腸症例間での、人口統計学的、臨床的、及び病理学的な変数の比較を、名義変数についてはピアソンのカイ二乗統計又はフィッシャーの直接確率検定を用いて、そして連続変数についてはスチューデントのｔ検定を用いて行った。結腸直腸癌特異的生存は、ＣＲＣそのものによる死亡として定義し、フォローアップ終了時に生存している、フォローアップの喪失、又はＣＲＣ以外の原因による死亡、の例においてはデータ取得を打ち切った。全生存（ＯＳ）は、何らかの原因による死亡として定義した。カプラン・マイヤー法を用いて結腸及び直腸癌症例についての生存曲線を構築し、単変量解析については対数ランク検定を用いて解析した。全ＣＲＣ症例、結腸癌症例、及び直腸癌症例については、診断からプロファイルまでの時間（ＯＤＣ遺伝子型に基づく、全及びＣＲＣ特異的死亡の補正したリスク）を用いてコックスの比例ハザードモデル解析を行った。生存におけるＯＤＣ遺伝子型（ＧＧ、ＧＡ、又はＡＡ）の効果を、年齢、性別、民族性、ＣＲＣの家族歴、診断時におけるＴＮＭの病期、結腸中での腫瘍の位置、組織学的サブタイプ、外科的治療、放射線治療、及び化学療法などの共変数を考慮して、コックスモデルを使用して解析した。モデル中の各変数はダミー変数を用いてコード化した。全ての解析はＳＡＳ  ９．２  統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて行った。両側Ｐ値が＜０．０５のときに統計的に有意であるとみなした。
【０１５６】
実施例２−実験的研究：結腸癌細胞におけるＯＤＣ  ＋３１６  ＳＮＰの制御
細胞培養
ヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６をＭｃＣｏｙの５Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で維持した。使用した全ての培地には１０％  ＦＢＳと１％  ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を添加した。培養を、３７℃、加湿、５％ＣＯ２雰囲気下で維持した。
【０１５７】
遺伝子型決定アッセイ
多型のＰｓｔＩ部位を検出するために、ＨＴ２９及びＨＣＴ１１６細胞由来のＤＮＡ試料をＰＣＲ−ＲＦＬＰ法にかけた。以下のプライマー（５’−ＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＴＴＣＧ−３’（配列番号２））を用い、ＰＣＲにより配列を増幅した。各反応液は、１μｌ  ＤＮＡ、４ｐｍｏｌの各プライマー、１２．５μｌ  ２ｘＰＣＲ  Ｐｒｅ  Ｍｉｘｅｓ  緩衝液「Ｇ」（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）及び０．５単位のＴａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを最終容量２５μｌ中に含んだ。予測されるＰＣＲ産物のサイズは３５１ｂｐであった。増幅した後、１０〜２０μｌのＰＣＲ産物を３０μｌ反応液中、１０単位のＰｓｔＩを用いて、３７℃で２時間消化した。ＰｓｔＩ部位を含むＨＴ２９細胞（ＧＡ）由来のＤＮＡからは、１５６及び１９５ｂｐの２つの断片が得られた。
【０１５８】
ウェスタンブロット解析
細胞を回収、溶解し、そしてタンパク質を１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離した。電気泳動により、タンパク質をＨｙｂｏｎｄ−Ｃメンブレン上に移した。Ｂｌｏｔｔｏ  Ａ（ＴＴＢＳ溶液に溶解したブロッキンググレードの脱脂粉乳５％）を用いて膜のブロッキングを行い、そしてＢｌｏｔｔｏ  Ａで１：３００に希釈した一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いてプロービングした。一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、その後適切なＨＲＰ−タグ二次抗体（１：１０００  希釈）は１時間、室温でインキュベートした。ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて化学発光の検出を行い、Ｂｉｏｍａｘ  ＸＡＲ  フィルム（Ｋｏｄａｋ）に露光した。
【０１５９】
クロマチン免疫沈降（ＣＨＩＰ）
製造業者によって推奨されている方法で、市販のキットを用いてＣＨＩＰアッセイを行った（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）。簡単に説明すると、ＤＮＡとタンパク質が架橋するように細胞を１％のホルムアルデヒドで処理し、ＤＮＡ−タンパク質複合体を２００〜１０００ｂｐの長さになるように超音波処理により破壊した。溶解物を、プロテアーゼ阻害剤を含む免疫沈降（ＩＰ）希釈緩衝液により１０倍に希釈した。クロマチンを沈降させるためにｃ−ＭＹＣ、ＭＡＤ１及びＭＡＤ４に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用い、さらなる試料には抗体を加えずに、抗体を含まない（−Ａｂ）対照とした。試料を回転させながら、４℃で一晩免疫沈降させた。６０μｌのサケ精子ＤＮＡ／プロテインＡアガローススラリーを添加して回転させながら４℃で１時間インキュベートし、その後軽く遠心分離（１０００ｒｐｍ、１分）を行うことで、免疫複合体を得た。プロテインＡアガロースの沈殿を低塩緩衝液、高塩緩衝液、ＬｉＣｌ緩衝液及びＴＥ緩衝液を用いて洗浄した。その後、２５０μｌの溶出緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、１％  ＳＤＳ）を２回添加することにより、複合体を溶出させ、そして０．２Ｍ  ＮａＣｌと共に６５℃で４時間加熱することによりＤＮＡ−タンパク質間架橋を反転させた。操作は、抗体を含むＤＮＡ及び−Ａｂ  ＤＮＡ対照を含む全ての試料について行った。ＤＮＡを３０μｌのｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＰＣＲ産物及びそのサイズの可視化のために、標準的なＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲに用いたＯＤＣプライマー配列は、５’−ＣＣＴＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号３）１７ｍｅｒ）及び５’−ＡＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡ−３’（配列番号４）（１７ｍｅｒ）であった。ＴａｑＭａｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用い、ＡＢＩ７７００配列検出システム上で定量的リアルタイムＰＣＲを行った。相対的な結合の計算についての詳細は、製造業者のウェブサイト上で見ることができる  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／）。
【０１６０】
一過性トランスフェクション
一過性のトランスフェクションを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造業者によるプロトコールに従って、添付の書類中で詳細に述べたように、行った。ＨＣＴ１１６及びＨＴ２９細胞を、１μｇのｐＧＬ３−ＯＤＣ／Ａ又はｐＧＬ３−ＯＤＣ／Ｇプラスミド（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を用いて、０．０１μｇのＲｅｎｉｌｌａ−ＴＫプラスミドと共にトランスフェクションした。Ｒｅｎｉｌｌａ−ＴＫプラスミドはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入し、全てのプロモーター−レポーター  トランスフェクション実験におけるトランスフェクション効率の対照として用いた。ｃ−ＭＹＣを用いた実験では、ＯＤＣ  ｐＧＬ３−プラスミドを、ｐｃＤＮＡ  ３．０又はＣＭＶ−ｃ−ＭＹＣ発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のいずれかと共にトランスフェクションした。ＭＡＤ１を用いた実験では、ＯＤＣプラスミドを、ｐｃＤＮＡ  ３．１又はｐｃＤＮＡ−ＭＡＤ１のいずれかと共にトランスフェクションした。ｃ−ＭＹＣとＭＡＤ１とを共にトランスフェクションする実験では、ＯＤＣ遺伝子の最初の１．６Ｋｂを含むＯＤＣプロモーターレポーター構築物をｐＧＬ３ベクター中にクローニングした。この構築物は、完全なＥ−ボックス１（−４８５〜−４８０ｂｐ）（ｗｔ  Ｅ−ボックス  １）又は欠損したＥ−ボックス１（ｍｕｔ  Ｅ−ボックス１）を含んだ。加えて、＋３１６  ＯＤＣ  ＳＮＰの両変異体を用い、全部で４種類の異なる構築物を作出した。６時間インキュベートした後、細胞を２０％  ＦＢＳを含む完全培地に加え、一晩生育させた。トランスフェクションの翌日、２０％  ＦＢＳを含む完全培地を１０％  ＦＢＳを含む培地と交換した。トランスフェクションした４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  アッセイ  キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  緩衝液中で溶解した。Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ＴＤ−２０／２０  ルミノメーターを用い、製造業者による通りに二重ルシフェラーゼ活性を測定し、そして相対的なルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表した。実験には３セットの試料を用い、少なくとも２回繰り返して行った。
【０１６１】
統計分析−実験的研究
一過性のトランスフェクション実験には、２標本ｔ検定を用いた（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｒｅｄｍｏｎｄ，  ＷＡ）。ＨＴ２９結腸癌細胞における、ｃ−ＭＹＣ発現のＯＤＣアレル特異的プロモーター活性への効果を、第一のＥ−ボックス要素の部分が異なる（（ａ）野生型（ｗｔ）Ｅ−ボックス１ｍ＋３１６  Ｇ、（ｂ）突然変異体（ｍｕｔ）Ｅ−ボックス１  ＋３１６  Ｇ、（ｃ）ｗｔ  Ｅ−ボックス１  ＋３１６  Ａ、及び（ｄ）ｍｕｔ  Ｅ−ボックス１  ＋３１６  Ａ）ＯＤＣ  プロモーター構築物を用いて評価した。２標本ｔ検定を用いて、各プロモーター構築物をｐｃＤＮＡ３．０プラスミドと共にトランスフェクションした細胞とＣＭＶ−ｃ−ＭＹＣ発現ベクターと共にトランスフェクションした細胞との間のプロモーター活性を比較した。同様に、ＭＡＤ１発現のＯＤＣアレル特異的プロモーター活性への効果を評価するために、２標本ｔ検定を用いて、ｐｃＤＮＡ３．０プラスミドと共にトランスフェクションしたプロモーター構築物とｐｃＤＮＡ−ＭＡＤ１プラスミドと共にトランスフェクションしたプロモーター構築物との間のプロモーター活性を比較した。両側Ｐ値が＜０．０５のときに統計的に有意であると見なした。
【０１６２】
実施例３−ＯＤＣ１遺伝子型の異なる作用
この研究は、多施設第３相結腸腺腫予防試験（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）からの患者データの解析を含む。３７５患者が登録され、２６７患者の試験終了時の結腸鏡検査が完了した後にＤａｔａ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｂｏａｒｄ（ＤＳＭＢ）により打ち切られた（研究がその効力エンドポイントに達したため）。ＤＳＭＢは、安全性及び効力エンドポイントをモニタリングした。ＯＤＣ１  ＳＮＰの重要性を示すデータ（２）  を考慮してプロトコールを変更した２００２年１１月以降に、研究に賛同した２２８人の患者から（２４６患者中、先に無作為化した１５９人を含み、１２９患者中の６９人はこの日付以降に無作為化した）、遺伝子型決定解析用の血液試料を回収した。患者由来のゲノムＤＮＡ上のＯＤＣ１（ｒｓ２３０２６１５）遺伝子型決定は、アレル特異的ＴａｑＭａｎプローブを用いて、これまでに記載されているように行った（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。直腸組織におけるポリアミン含量は、無作為に選択した８つの直腸粘膜生検試料のうち３つを用いて、これまでに記載されているように決定した（Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｓｅｉｌｅｒ及びＫｎｏｄｇｅｎ，１９８０）。組織ポリアミン反応は、２５％から４５％までの範囲の反応値について行った。
【０１６３】
ＯＤＣ１遺伝子型を、優性モデル（ＡＡ／ＧＡ対ＧＧ患者）において解析した。２つの遺伝子型群にわたる非正規に分布した連続変数については、ウイルコクソン順位和検定を行った。基準カテゴリー変数及び遺伝子型群との間の関連を評価するためには、カイ二乗検定又はフィッシャー直接確率検定を用いた。一次アウトカム（腺腫再発）については、予測変数（治療群、年齢、性別、人種（カフカス人対その他）、アスピリンの使用、ＯＤＣ１遺伝子型（優性モデルにおいては）、及び遺伝子型相互作用による治療を示す期間）を用いた対数２項回帰（Ｌｏｇ  ｂｉｎｏｍｉａｌ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を行った。二次アウトカム（直腸組織ポリアミン反応、毒性）については、治療群の効果、遺伝子型、及び治療と遺伝子型との相互作用を、フルログ２項モデル（ｆｕｌｌ  ｌｏｇ  ｂｉｎｏｍｉａｌ  ｍｏｄｅｌ）を用いて試験した。統計分析は、ＳＡＳ  ９．２  統計ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｃ．  Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて行った。試験への登録及び試料の回収／解析については、患者からの書面によるインフォームドコンセントを取得した。本研究は、全委員による審査の後でＵＣ  Ｉｒｖｉｎｅ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ＃２００２−２２６１）により、及び参加型研究の部分においては各ローカルＩＲＢにより、認可された。
【０１６４】
ＯＤＣ１遺伝子型分布は、１２６ＧＧ（５５％）、８７ＧＡ（３８％）、及び１５ＡＡ（７％）であった。表１に示したように、基準となる臨床特徴は差を明かにした。補正後のフル回帰モデルにおける治療に関連した腺腫再発の相対リスク（ＲＲ）は０．３９（９５％ＣＩ  ０．２４〜０．６６）であった。偽薬又は治療それぞれを受けた患者においては、ＯＤＣ１  ＧＧ患者では２３％対２２％、ＯＤＣ１  ＧＡ患者では２０％対２１％、及びＯＤＣ１  ＡＡ患者では０％（７人中０人）対５７％（７人中４人）の割合で中毒性難聴が発症した。
【０１６５】
【表２】
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【０１６６】
【表３】
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【０１６７】
【表４】
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【０１６８】
【表５】
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【０１６９】
本明細書において開示し、請求した全ての方法は、本開示を踏まえた不当な実験を用いることなく、実施及び遂行することができる。好ましい実施形態の観点から、本発明の方法を記載してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書において記載した方法及び工程又は工程の順序の変形型を適用し得ることが当業者には明かだろう。さらに具体的には、同じ又は同様の結果を得るために、本明細書において記載した薬剤を、化学的及び生理学的の両方で関係した薬剤と置換してもよい。そのような当業者に明かな全ての置換及び変更は、添付の請求項によって規定されるように、本発明の精神、範囲及び概念に含まれると見なされる。
【０１７０】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書において示す方法の例又はその他の詳細を捕捉する範囲において、特に参照することにより本明細書に組み入れられる。
米国特許第３，６４７，８５８号
米国特許第３，６５４，３４９号
米国特許第４，３３０，５５９号
米国特許第４，４１３，１４１号
米国特許第４，５８２，７８８号
米国特許第４，６５６，１２７号
米国特許第４，６８３，１９４号
米国特許第４，６８３，２０２号
米国特許第５，８１４，６２５号
米国特許第５，８４３，９２９号
米国特許第５，９５２，１７４号
米国特許第６，２５８，８４５号
Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐ．，（２２）：１８−２３，１９９５．．
ＡＭＡ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  Ａｎｎｕａｌ，１８１４−１８１５，１９９４．
Ｂａｂｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３９４：３１７−２４，２００６．
Ｂａｂｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７８（４８）：４７７６２−４７７７５，２００３．
Ｂａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９８（２０）：１４９４−５００，２００６．
Ｂｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（９）：１８１１−１８１６，１９９５．
Ｂｅｌｌｏｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８０４−８，１９９３．
Ｂｕｓｓｅｙ，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１２（１）：１７５−６．１９９０
Ｃｈｉｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６０：１３９４−１４０６，２００３．
ｄｅ  Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．，２（５）：４８７−４９６，２００２．
Ｄｅｒｙｎｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２９：１１７−２９，２００１．
ＤｕＢｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：７３３−７３７，１９９６．
Ｅｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２０：１７０９−１３，１９９９．
欧州特許出願第２０１，１８４号
欧州特許出願第２３７，３６２号
欧州特許出願第２５８，０１７号
欧州特許出願第５０，４２４号
欧州特許出願第８４，７９６号
仏国特許出願第２，６５０，８４０号
Ｆｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｇｅｒｎｅｒ，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，３４：１０−８，２００２．
Ｇｅｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍｅｙｓｋｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，４：７８１−９２．，２００４．
Ｇｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｏｉｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，３：３２５−３３０，１９９４．
Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（５７）：１９９−２０１，１９９７．
Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６０（２２）：６３１４−６３１７，２０００．
Ｈａｌｕｓｈｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２２（３）：２３９−２４７，１９９９．
Ｈａｎｉｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，（５２）：２３７  ２４５，１９９６．
Ｈｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，１４（８）：２３０３−９，２００８．
Ｉｇｎａｔｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，５（１２）：１６５８−６４，２００６．
Ｉｎａｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，７（１１）：１０９４−１１０３，１９９７．
Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２１：１９３５−４０，２０００．
Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２９（２）：２３３−２３７，２００１．
Ｋｅ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｏｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１９（２）：２８７−２８８，２００３．
Ｋｅｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２（４  Ｓｕｐｐｌ  １）：Ｓ１４０−９，２００３．
Ｋｉｎｇｓｎｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４３（９）：４０３５−８，１９８３．
Ｋｏｍｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：７７７９−７７８４，１９８９．
Ｋｕｐｐｕｓｗａｍｙ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１１４３−１１４７，１９９１．
Ｋｗｏｋ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ｃｕｒｒ  Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ａｐｒ；５（２）：４３−６０，２００３．
Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２３（１）：１３８−１４４，１９９４．
Ｋｗｏｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２：２３５−２５８，２００１．
Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３１（１）：１２３−６，１９９６．
Ｌａｄｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０８：１０８３−１０８７，１９９５．
Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７−１０８０，１９８８．
Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５５：１３７１−１３７７，１９９５．
Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１７：１９５０−６２，２００８．
Ｌｉｐｋｉｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，２８−２９：１４４−７，１９９７．
Ｌｉｐｐｍａｎ，Ｎａｔ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒａｃｔ．Ｏｎｃｏｌ．，３（１０）：５２３，２００６．
Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８５：７３２−７，１９９３．
Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ．，３（６）：１５４４−５６，２００４．
Ｌｕｋ  ａｎｄ  Ｂａｙｌｉｎ  Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１１（２）：８０−８３，１９８４．
Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔ．Ｐｒｅｖ．，２０（６）：６３４−６３７，１９９６．
Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：７８５９−６４，２００３．
Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１：６６５−７１，１９９５．
Ｍａｘａｍ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５６０，１９７７．
ＭｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣａｎｃｅｒＰｒｅｖ．Ｒｅｓ．，１（７）：５１４−２１，２００８．
Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．Ｒｅｓ．，１（１）：３２−８，２００８．
Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．，８６（１５）：１１２２−１１３０，１９９４．
Ｍｅｙｓｋｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９０（１６）：１２１２−８，１９９８．
Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３，１９８６．
Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，７４：１８４７−１８５４，１９９４．
Ｎａｒｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４１（５）：１９５４−１９５７，１９８１．
Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：８９２３−８９２７，１９９０．
Ｎｙｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０８：１７１−１７５，１９９３．
Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．，４１（２）：１２０−３，２００４．
Ｐａｒｄａｌｉ  ａｎｄ  Ｍｏｕｓｔａｋａｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１７７５：２１−６２，２００７．
国際公開第９１／０２０８７号
国際公開第９２／１５７１２号
Ｐｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９２：１５１７−２２，２０００．
Ｐｅｇｇ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３４（２）：２４９−２６２，１９８６．
Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａ，Ｍｏｎｔｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．，１７４５−１７４７，１９９９
Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（５５）：３１１  ３１１６，１９９５．
Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（５７）：２４５２−２４５９，１９９７ａ．
Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（５７）：２９０９−２９１５，１９９７ｂ．
Ｐｏｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｌｕｃｋｅｒｔ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９：６４７１−６４７３，１９８９．
Ｐｒｅｚａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．，１：１５９−１６４，１９９２．
Ｐｓａｔｙ  ａｎｄ  Ｐｏｔｔｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３５５（９）：９５０−２，２００６．
Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（５５）：１４６４−１４７２，１９９５．
Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（５０）：２５６２−２５６８，１９９０．
Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：５３４０−５３４６，１９８７．
Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．，  ２（９）：８８５−９２，  ２００３．
Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：８６２１−３，２００３．
Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，９４：４４１，１９７５．
Ｓｅｉｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋｎｏｄｇｅｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，２２１（２）：２２７−２３５，１９８０．
Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１７：２９２−９，２００８．
Ｓｉｍｏｎｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９３：５７−９，２００１．
Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎａｌｓ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（７６８）：２０５  ２０９，１９９５．
Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，（１５）：１３１７  １３２３，１９９４．
Ｓｍａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３４７：１１３５−１１４２，２００２．
Ｓｏｋｏｌｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：３６７１，１９９０．
Ｓｔｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４：１９８−２０３，２００３．
Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４（１）：１７１−１８４，１９８４．
Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２５６）：６６８−６７０，１９９２．
Ｓｙｖａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ８：６８４−６９２，１９９０．
Ｔａｉｌｌｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，８（７）：７４８−７５４，１９９８．
Ｔｅｍｐｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４９（２１）：５７９３−７，１９８９．
Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７：１１３−２６，２００３．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，（８７）：１２５−１２６０，１９９５．
Ｕｇｏｚｚｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＡＴＡ  ９：１０７−１１２，１９９２．
Ｖａｎｅ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔｉｎｇ，Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．，４３３：１３１−８，１９９７．
Ｖｉｓｖａｎａｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１７１（２  Ｐｔ  １）：６５２−５，２００４．
Ｗａｌｌａｃｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，３０：１−３，２０００．
Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｐｒｅｖ．，１７：３１３４−４０，２００８．
Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．Ｒｅｓ．，２（３）：２０９−１２，２００９．
Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１５（１９）：６２０８−１６，２００９．
Ｚｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２０：４５９−６８，２００７．
Ｚｉｏｇａｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｏｎ−Ｃｕｌｖｅｒ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２４：１９０−８，２００３．
【図１】
2016074672.tif 000013
【図２】
2016074672.tif 000014
【図３】
2016074672.tif 000015
【図４】
2016074672.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【図７】
2016074672.tif 000019
【図８】
2016074672.tif 000020
【図９】
2016074672.tif 000021
【図１０】
2016074672.tif 000022
【図１１】
2016074672.tif 000023