(57)【要約】【課題】本発明は、シトクロムP450分子種の活性が誘導されたヒト肝細胞、及び当該細胞からS9を製造する方法を提供することを主な課題とする。【解決手段】インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含む培地でヒト肝細胞を培養し、複数のシトクロムP450活性を誘導する方法、並びに当該処理により得られたヒト細胞からS9画分を製造する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト肝臓由来の培養細胞において、シトクロムP450の活性を誘導する方法であって、インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含む培地で細胞を培養する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ヒト肝臓由来の培養細胞が、ヒト肝がん由来のHep3B細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２いずれか１項に記載の方法により得られる細胞から調製されたことを特徴とするS9画分。
【請求項４】
請求項１又は２いずれか１項に記載の方法により得られる細胞から調製されたことを特徴とするミクロソーム画分。
【請求項５】
請求項３に記載のS9画分と被験物質とを接触させる工程を含む、被験物質の変異原性試験。
【請求項６】
インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含むことを特徴とする、シトクロムP450活性の誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト肝臓由来の細胞において複数のシトクロムP450分子種の活性を誘導する方法、及びシトクロムP450活性が誘導されたヒト肝細胞からin vitro変異原性試験をはじめとする化学物質の安全性試験に有用なS9を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内に取り込まれた食品、医薬品、及び環境汚染物質などの化学物質は、酸化、還元、加水分解、及び抱合反応など一連の代謝反応により水溶性の高い物質へ変換され、最終的に生体外へと排出される。化学物質の中には、代謝過程で不安定な反応中間体となり、タンパク質や核酸と共有結合することにより、細胞毒性、変異原性、及び発がん性などを発現する物質があることが知られている（代謝活性化）。
【０００３】
エームス（Ames）試験などのin vitro変異原性試験においては、化学物質の代謝活性化の有無も評価する必要がある。化学物質の代謝反応には、シトクロムP450をはじめとして種々の薬物代謝酵素が関わっており、特に薬物代謝酵素が多く存在する肝臓は、薬物代謝において中心的な役割を担う臓器である。そこで、生体内における化学物質の代謝反応をin vitroで再現する方法として、肝臓ホモジネートの9,000×g遠心後上清画分（S9）を用いて化学物質を処理し、処理後の化学物質について変異原性を評価する方法が考案されている。現在、薬物代謝酵素誘導剤を投与したラットから調製されるS9（ラット肝S9）が汎用されているが、化学物質の薬物代謝反応は種差が大きく、ラット肝S9を用いて得られた結果がそのままヒトへ外挿できるとは限らないという問題がある。
【０００４】
ヒトにおける薬物代謝反応をより正確に反映するためには、ヒト由来の薬物代謝酵素を用いた代謝活性化法が望まれる。近年、主に献体に由来するヒト肝臓から製造したS9画分（ヒト肝S9）が市販されている。しかしながら、ロット毎に薬物代謝酵素活性のばらつきが大きいことや、供給量が有限であるなどの問題があり、安定した試験系に組み込むことが困難である。
【０００５】
また、生体に近い薬物代謝酵素活性を保持するヒト由来試料として、肝臓から分取した初代肝細胞が知られているが、初代肝細胞は無限に増殖させることが不可能であること、培養によって薬物代謝酵素活性が失われてしまうことなどの問題が存在する。そのため、ヒト肝S9と同様、初代肝細胞を用いて安定した試験系を構築することは困難である。一方、ヒト肝臓組織より樹立された株化細胞は無限増殖能を有しており、安定供給可能なヒト由来試料源と考えられるが、薬物代謝酵素活性が著しく失われているという問題があった。
【０００６】
かかる状況の下、ヒト肝臓由来の株化細胞において薬物代謝酵素活性を増加させる研究が進められている。例えば、特定のシトクロムP450分子種を発現する形質転換細胞についての報告があるが、この方法では遺伝子導入されたシトクロム分子種しか発現されない問題がある（特許文献１）。また、細胞を3次元高密度培養することにより、シトクロムP450活性を増加させる方法が知られている（特許文献2）。しかし、該方法を用いて活性が増加するシトクロムP450は、CYP3A4が明示されているのみであり、薬物代謝に関わる他のシトクロムP450分子種については検証されていない。その他、シトクロムP450を誘導できる化合物（誘導剤）を複数組み合わせてシトクロムP450活性を誘導する方法も報告されている（特許文献3）。該方法は、簡便に複数のシトクロムP450活性を誘導できる点で有用である。しかしながら、シトクロムP450誘導剤で処理した細胞が、ヒトの薬物代謝反応をどの程度反映しているかは検証されていない。
【０００７】
すなわち、ヒト細胞において複数のシトクロムP450活性を簡便に増加させることができるだけでなく、化学物質のin vitro安全性試験においてヒトに対する影響を正確に予測することが可能なヒト細胞及びヒト細胞由来S9を製造する技術が強く求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００１−８６８１号
【特許文献２】特許第３９２９９１０号
【特許文献３】特開２００３−１３５０５５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ヒト肝臓由来の細胞において複数のシトクロムP450分子種の活性を誘導する方法、並びに化学物質のin vitro安全性試験においてヒト肝S9を代替可能なヒト細胞由来S9を製造する方法を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記目的に鑑み鋭意研究を重ねた結果、ヒト肝細胞を特定の化合物の存在下で培養する工程を含む方法により、複数のシトクロムP450活性が顕著に誘導されることを発見した。さらに、当該化合物の存在下で培養した細胞から調製したS9が、in vitro変異原性試験においてヒト肝S9と同等の性能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は下記の発明を包含する：
項１、ヒト肝臓由来の培養細胞において、シトクロムP450の活性を誘導する方法であって、インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含む培地で細胞を培養する工程を含む方法。
項２、前記ヒト肝臓由来の培養細胞が、ヒト肝がん由来のHep3B細胞である、項１に記載の方法。
項３、項１又は２いずれか１項に記載の方法により得られる細胞から調製されたことを特徴とするS9画分。
項４、項１又は２いずれか１項に記載の方法により得られる細胞から調製されたことを特徴とするミクロソーム画分。
項５、項３に記載のS9画分と被験物質とを接触させる工程を含む、被験物質の変異原性試験。
項６、インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含むことを特徴とする、シトクロムP450活性の誘導剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒト肝臓由来の細胞において、複数のシトクロムP450分子種の活性を顕著に誘導できる。従って、本発明の方法により、ヒト細胞由来のS9を大量かつ安定して供給することが可能となる。
さらにいえば、本発明により得られるS9はヒト肝細胞に由来するため、ラットS9で懸念される種差の問題を克服することが可能である。
また、本発明法によれば、高い薬物代謝酵素活性を有するヒト細胞S9を安定的、かつ実質的に無限に提供することが可能であり、ヒト肝臓から製造したヒト肝S9で問題となる薬物代謝酵素活性の個人間差、及び供給量の有限性を克服することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
図中の略号は、Cont；DMSO（ジメチルスルホキシド、陰性対照）、IDR；インディルビン、TSA；トリコスタチンA、FSK；ホルスコリン、ATRA；オールトランスレチノイン酸、である。
【図１】Hep3B細胞をインディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸をそれぞれ単独、あるいはすべて含む培地で培養する方法により誘導されるCYP1A1の活性を、化合物を添加しない条件に対する相対値（CYP1A1 activity (fold)）により示す。
【図２】Hep3B細胞をインディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸をそれぞれ単独、あるいはすべて含む培地で培養する方法により誘導されるCYP3A4の活性を、化合物を添加しない条件に対する相対値（CYP3A4 activity (fold)）により示す。
【図３】Hep3B細胞、HuH-7細胞、HepG2細胞をインディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含む培地で培養する方法により誘導されるCYP3A4の活性を、相対値（CYP3A4 activity (fold)）により示す。
【図４】インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含む培地で培養したHep3B細胞から調製されたヒト細胞S9のCYP1A1の活性を、ヒト肝S9に対する相対値（CYP1A1 activity (fold)）により示す。
【図５】インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を含む培地で培養したHep3B細胞から調製されたヒト細胞S9のCYP3Aの活性を、ヒト肝S9に対する相対値（CYP3A activity (fold)）により示す。
【図６】Ames試験に使用される各菌株について、ラット肝S9、ヒト肝S9、及び本発明の方法により得られるヒト細胞S9のいずれかを用いて2-アミノアントラセン（2-AA）を処理した場合の、復帰突然変異コロニー数を示す。（A）TA98菌株を用いた場合の復帰突然変異コロニー数を示す。（B)TA100菌株の復帰突然変異コロニー数を示す。（C) TA1535菌株の復帰突然変異コロニー数を示す。（D）TA1537株の復帰突然変異コロニー数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．シトクロムP450活性を誘導する方法
本発明のシトクロムP450活性を誘導する方法は、ヒト肝細胞をインディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸の存在下で培養する工程を含む方法である。本発明の方法は、当該工程を含む、シトクロムP450活性が誘導されたヒト肝細胞の調製方法、並びに細胞由来のS9の調製方法をも提供する。
【００１５】
ヒト肝細胞  本発明のヒト細胞は、ヒト由来である限り特に限定されないが、薬物代謝酵素の大半は肝臓において発現していることから、肝臓由来の細胞を用いることが好ましい。
肝臓由来の細胞としては、例えばヒトの摘出肝臓から公知の方法により採取された初代肝細胞や、ヒト肝がんより樹立された株化細胞を使用することができる。操作の容易性や再現性を考慮すると、継代可能なヒト肝がん由来の株化細胞が好ましく、例えばHep3B、HuH-7、HepG2などの株化細胞が挙げられる。なお、上記の株化細胞は、公知の手段により維持、継代されたものが好適に用いられる。
【００１６】
化合物
本発明の方法は、ヒト肝細胞をインディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸の存在下で培養する工程を含む。
【００１７】
インディルビンは、アリルハイドロカーボン受容体（AhR）にリガンドとして結合することが知られている化合物である。AhRはリガンド依存性の転写因子であり、CYP1A1、CYP1A2、及びCYP1B1の発現を誘導する。すなわち、インディルビンはCYP1A1、CYP1A2、及びCYP1B1の誘導剤と換言することができる。
トリコスタチンAは、ヒストン脱アセチル化酵素の機能を阻害することにより、ヒストンの高アセチル化を引き起こすことが知られている化合物である。一般的に、ヒストンが高アセチル化された染色体領域では、当該領域に存在する遺伝子の発現が活性化される。
ホルスコリンは、アデニル酸シクラーゼの機能を活性化することにより、細胞内のcAMP濃度を高めることが知られている化合物である。
【００１８】
オールトランスレチノイン酸は、核内受容体であるレチノイン酸受容体（RAR）のリガンドとして結合して、細胞の増殖・分化、生体の恒常性維持、形態形成などに関わる様々な遺伝子の発現を調節することが知られている化合物である。
上記化合物の溶液を調製する場合の溶媒は、上記化合物を溶解できるものである限り特に限定されず、蒸留水、細胞に影響を与えない緩衝液（例えば、PBS緩衝液）、有機溶媒（例えば、DMSO）などを用いることができる。
【００１９】
培養
上記化合物の存在下で培養を行う手段は、本発明の効果を損なうものでない限り、特に限定されるものではない。本発明の培養は、上記化合物の存在下での培養であれば特に限定されるものではないが、上記化合物の濃度が0.01〜10重量%程度、より好ましくは0.05〜5重量％程度、特に好ましくは0.1〜1重量％程度となるようにすることが好ましい。
操作の簡便性から、培養を行う具体的手段として、上記化合物を添加した培地で培養を行う手段が例示される。培地は、上記ヒト肝細胞をできる培地であればよく、例えばダルベッコ変法イーグル培地/高グルコース（D-MEM/high Glucose）が例示されるが、これに限定されるものではない。上記培地は、5〜20%程度の牛胎児血清（FBS）等の添加剤を必要に応じて含有させることができる。
【００２０】
培地への上記化合物の添加は、直接添加または上記化合物を含む溶液の添加のいずれによってもよい。溶液を用いる場合、溶媒は上記化合物を溶解できるものである限り特に限定されず、蒸留水、細胞に影響を与えない緩衝液（例えば、PBS緩衝液）、有機溶媒（例えば、DMSO）などを用いることができる。
本発明の培養を行うにあたり、当該ヒト肝細胞は、上記化合物の非存在下で100%コンフルエントまで培養した後、終濃度1%のDMSOを含む培地でさらに2週間程度培養した細胞が特に好ましい。通常、1×104〜5×104個/mL程度の細胞を播種した後、1日〜1週間、好ましくは4日間程度培養した後、終濃度1%のDMSOを含む培地に交換し、3〜4日おきに培地交換を行いながら2週間培養する（前培養工程）。前培養工程終了後、上記化合物を含む培地へと交換することで、本発明の培養を行うことができる。
【００２１】
インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸の存在下での培養は、特に限定されるものではないが、インディルビンの終濃度は0.5〜2.0μg/mL程度、トリコスタチンAの終濃度は0.1〜0.4μg/mL程度、ホルスコリンの終濃度は1.5〜6.0μg/mL程度、オールトランスレチノイン酸の終濃度は1.5〜6.0μg/mL程度であることが好ましい。また、シトクロムP450活性の誘導効率が顕著に高いとの観点から、上記化合物を含む培地での培養時間は12〜72時間（hr）程度、好ましくは24時間（hr）程度とすることができる。その他の培養条件は、用いるヒト肝細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、培養温度は、36〜38℃程度、特に37℃程度とすることができる。培養時の二酸化炭素濃度は、約5 ％程度とすることができる。このような培養条件は、市販のCO2インキュベータを用いて容易に実現することができる。
【００２２】
シトクロムP450
本発明の方法により、ヒト肝細胞においてシトクロムP450活性が誘導される。
生体において薬物代謝に関わる酵素には、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、モノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、エポキシドヒドラーゼ、エステラーゼ、アミダーゼ、UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼ、シトクロムP450などがあり、中でもシトクロムP450は多くの薬物の酸化を触媒することから、生体の薬物代謝において最も重要な役割を果たしている。
【００２３】
シトクロムP450は、アミノ酸一次構造の相同性に基づき分類され、相同性が40%以上のものを同じ群、55%以上のものを同じ亜群に属するものとして分類される。シトクロムP450の各分子種は、接頭語としてCYPを付け、続けて群番号を数字、亜群番号をアルファベット、最後に固有番号を数字で記載する。薬物代謝に重要な役割を果たすシトクロムP450は、CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7などがあり、中でもCYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4などが特に重要であることが知られている。
本発明の方法により、活性が誘導されるシトクロムP450分子種として、特にCYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4が挙げられる。中でも、CYP1A1、CYP3A4は、活性が特に効率よく誘導される薬物代謝酵素として挙げられる。
【００２４】
ここで、「シトクロムP450の活性」とは、上記のシトクロムP450分子種が固有に有する特定の反応を触媒する活性を指す。シトクロムP450が触媒する反応は主に酸化反応であり、シトクロムP450の各分子種は異なる基質特異性を有する。
「シトクロムP450活性の誘導」とは、対照（例えば、未処理のヒト肝細胞）と比べて、シトクロムP450の活性が亢進することを指す。シトクロムP450の活性が誘導される具体的態様は、シトクロムP450のタンパク質の発現量亢進、シトクロムP450の生理活性の亢進、またはこれらの組み合わせなどが挙げられる。
【００２５】
ヒト肝細胞におけるシトクロムP450の活性誘導は、公知の手段により検証することができる。例えば、シトクロムP450の活性を定量する手段、シトクロムP450をコードするmRNA（転写産物）やシトクロムP450タンパク質の発現量を定量する手段が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
シトクロムP450の活性を定量する手段としては、例えば、
（１）シトクロムP450の基質を細胞培地中に添加し、一定期間培養後、添加した基質の代謝産物を定量する手段、
（２）シトクロムP450の活性により、不活性化型の基質を活性化型へと変換し、活性化型の基質を検出する手段、
などが挙げられる。上記（２）の手段を簡便に実現するための市販品として、シトクロムP450活性によりルシフェリン前駆基質がルシフェリンに変換され、これをルシフェラーゼ反応の基質として検出するP450-GloTM CYP450 Assay System（プロメガ社製）が挙げられる。
【００２７】
シトクロムP450の転写産物を定量する手段としては、例えば、リアルタイムPCR等の公知の手段が挙げられる。シトクロムP450タンパク質の発現量を定量する手段としては、ウェスタンブロッティング、ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)等の公知の手段が挙げられる。
かくして、本発明の方法により、シトクロムP450の活性が顕著に誘導されたヒト肝臓由来の培養細胞が得られる。得られた細胞は、例えば後述の毒性試験において用いられるS9画分又はミクロソーム画分を調製する細胞として、好適に用いることができる。
【００２８】
２．シトクロムP450の活性が誘導されたヒト肝細胞
上記「１．」欄に記載の方法により、シトクロムP450の活性が顕著に誘導されたヒト肝細胞が得られる。従って、本発明は、シトクロムP450の活性が誘導されたヒト肝細胞をも提供する。
本発明のシトクロムP450の活性が誘導されたヒト肝細胞は、上記「１．」欄に記載の方法により調製される。当該ヒト肝細胞においては、シトクロムP450の活性が顕著に誘導されている。本発明のヒト肝細胞において、例えば、シトクロムP450のタンパク質の発現量亢進、シトクロムP450の生理活性の亢進等により、シトクロムP450の活性が誘導されている。
【００２９】
活性が誘導されたシトクロムP450として、上記「１．」欄に記載のシトクロムP450のうち、少なくともCYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1及びCYP3A4；特に少なくともCYP1A1、CYP3A4の活性が、顕著に誘導されている。
ここで、「活性が顕著に誘導」の一態様として、上記化合物の存在下で培養されていないヒト肝細胞と比べて、シトクロムP450の活性が、少なくとも５倍、より好ましくは１０倍、特に好ましくは２０倍誘導された態様が挙げられる。
【００３０】
３．シトクロムP450の活性が誘導されたヒト肝細胞より調製されたS9画分、及びミクロソーム画分
【００３１】
S9画分及びミクロソーム画分は、公知の手法により取得することができる。
本発明の場合、S9画分は、上記のシトクロムP450の活性が誘導されたヒト肝細胞をホモジナイザー、超音波破砕等の手段（好ましくは、ホモジナイザー）により破砕し、得られた細胞破砕液を9,000×g程度の遠心力で所定時間（例えば、20分程度）遠心分離を行い、上清として得られる画分である。すなわち、S9画分とは上記のシトクロムP450の活性が誘導されたヒト肝細胞の、抽出物の上清画分と換言することができる。
ミクロソーム画分は、得られたS9画分をさらに100,000×g程度の遠心力で所定時間（例えば、60分程度）遠心分離を行い、沈降画分として得られる画分である。
なお、遠心分離の操作は、遠心分離機が発する熱によりシトクロムP450が失活することを防止するために、冷却条件下で行うことが好ましい。
【００３２】
４．毒性試験方法
本発明により提供されるシトクロムP450活性が誘導されたヒト肝細胞、及び当該細胞より調製されたS9画分、ミクロソーム画分は、シトクロムP450の活性が高いとの性質に基づき、被験物質のin vitro毒性試験方法に好適に用いることができる。
ここで、「毒性試験」とは、被験物質の毒性を評価できる方法であれば、特に限定されるものではない。
【００３３】
また、「毒性」とは、生物に対する悪影響を指すものであり、特に限定されるものではないが、細胞毒性、変異原性、発がん性（発がんイニシエーター活性、発がんプロモーター活性）、催奇形性などが含まれる。
【００３４】
このような毒性の具体的態様は、公知の手法により評価することができる。例えば、変異原性は、公知のAmes試験、マウスリンフォーマTK試験、染色体異常試験、小核試験、特許第4243716号に基づく試験方法、国際公開広報WO/2013/054846に基づく試験方法などにより好適に行うことができるが、これに限定されるものではない。発がんプロモーター活性は、国際公開広報WO/2009/001939に記載の方法により好適に行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００３５】
本発明の毒性試験においては、上記のシトクロムP450活性が誘導されたヒト肝細胞を用いる。より具体的には、上記のシトクロムP450活性が誘導されたヒト肝細胞から得られる、S9画分又はミクロソーム画分と、被験物質とを接触させる工程を含む方法であることが好ましい。該接触処理により、被験物質の代謝反応をin vitroにおいて再現することが可能となる。
【００３６】
本発明の毒性試験の一態様として、下記の工程を含む方法が例示される：
（i）上記「１．シトクロムP450活性を誘導する方法」欄に記載の方法により、ヒト肝臓由来の細胞において、シトクロムP450の活性を誘導する工程、
（ii）得られた細胞を用いて、S9画分又はミクロソーム画分を得る工程、
（iii）得られたS9画分又はミクロソーム画分と被験物質とを接触させる工程、及び
（iv）S9画分又はミクロソーム画分と接触させた被験物質又はその反応産物の毒性を評価する工程。
【００３７】
４．シトクロムP450活性の誘導剤
上記の通り、ヒト肝細胞をインディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸の存在下で培養する工程を含む方法により、シトクロムP450活性を誘導することができる。従って、本発明は、当該特定化合物を含む、シトクロムP450活性の誘導剤をも提供する。また、当該特定化合物のシトクロムP450活性の誘導剤としての使用も提供される。
【実施例】
【００３８】
以下本発明の実施例について詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
【００３９】
［実施例１］  インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸によるHep3B細胞でのCYP1A1活性の誘導
＜方法＞
3×104個/mLに調製したヒト肝がん由来の細胞株Hep3B（DSファーマバイオメディカル株式会社より購入）を、100μL/穴（3×103個/穴）ずつ細胞培養用96穴プレート（コーニング製、Cat.#3595）に播種し、終濃度10％の牛胎児血清（FBS）を含むダルベッコ変法イーグル培地/高グルコース（D-MEM/high Glucose）を用いて、37℃で4日間培養した。次いで、終濃度10％のFBS及び終濃度1％のDMSOを含む培地に交換し、3〜4日おきに培地交換しながら2週間培養を継続した（前培養工程）。
前培養工程終了後、終濃度10％のFBSを含むD-MEM/high Glucose培地に交換し、終濃度1.0μg/mLのインディルビン、終濃度0.2μg/mLのトリコスタチンA、終濃度3.0μg/mLのホルスコリン、終濃度3.0μg/mLのオールトランスレチノイン酸を添加してさらに24hr培養した。
【００４０】
次いで、培地を除去し、細胞をPBS（−）で洗浄した後、P450-GloTM CYP1A1 Assay（プロメガ製、Cat.#V8752）に付属の発光基質を含む10%FBS/D-MEM/high Glucose培地を50μL/穴ずつ添加し、37℃で1時間インキュベートした。反応終了後、反応液25μLを発光測定用の96穴プレート（コーニング製、Cat.#3912）に移し、等量のルシフェリン検出試薬（luciferin detection reagent）を加え、室温で20分間静置した。このプレートを、マルチモードマイクロプレートリーダーTriStarLB941T（ベルトールド製）にセットし、CYP1A1活性を測定した。
【００４１】
［比較例１］
前培養工程終了後、DMSOのみ（最終濃度0.1重量％）あるいは各化合物を単独で添加すること以外、実施例１と同様の操作を行い、CYP1A1活性を測定した。
＜結果＞
図１に、CYP1A1活性を、DMSOのみを添加した条件に対する相対値により示す。インディルビン単独でCYP1A1活性が247.5倍に増加したが、トリコスタチンA、ホルスコリン、及びオールトランスレチノイン酸は、単独ではほとんどCYP1A1活性を増加させなかった。一方、化合物4種をすべて添加した場合には、CYP1A1活性が643.9倍に増加した。このことから、各化合物を単独で添加した場合と比較して、すべて添加した場合の方がCYP1A1活性の増加が顕著であることが確認できる。
【００４２】
［実施例２］  インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸によるHep3B細胞でのCYP3A4活性の誘導
＜方法＞
P450-GloTM CYP1A1 Assayに代えて、P450-GloTM CYP3A4 assay Luciferin-IPA（プロメガ製、Cat.# V9002）を用いること以外、上記実施例1と同様の操作を行い、CYP3A4活性を測定した。
【００４３】
［比較例２］
前培養工程終了後、DMSOのみ（最終濃度0.1重量％）あるいは各化合物を単独で添加すること以外、実施例２と同様の操作を行い、CYP3A4活性を測定した。
＜結果＞
図2に、CYP3A4活性を、DMSOのみを添加した条件に対する相対値により示す。インディルビン単独でCYP3A4活性が39.1倍に増加したが、トリコスタチンA、ホルスコリン、及びオールトランスレチノイン酸は、単独ではほとんどCYP3A4活性を増加させなかった。一方、化合物4種をすべて添加した場合には、CYP3A4活性が105.9倍に増加した。このことから、各化合物を単独で添加した場合と比較して、すべて添加した場合の方が、CYP3A4活性の増加が顕著であることが確認できる。
【００４４】
［実施例３］  インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸によるHuH-7細胞、HepG2細胞でのCYP3A4活性の誘導
＜方法＞
Hep3B細胞に代えて、ヒト肝がん由来の細胞株HepG2（独立行政法人医薬基盤研究所JCRB細胞バンクより購入）、あるいはヒト肝がん由来の細胞株HuH-7（独立行政法人医薬基盤研究所JCRB細胞バンクより購入）を用いること以外は実施例2と同様の操作を行い、CYP3A4活性を測定した。
＜結果＞
図3に、CYP3A4活性を、Hep3B細胞を用いた実施例2に対する相対値により示す。インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸を添加して誘導されるCYP3A4活性は、Hep3B細胞を用いた場合に顕著に高いことが確認できる。
［実施例４］  インディルビン、トリコスタチンA、ホルスコリン、オールトランスレチノイン酸によりシトクロムP450活性を誘導したHep3B細胞からのS9画分調製
＜方法＞
3×104個/mLに調製したHep3Bを、245mm squre dish（コーニング製、Cat.#431110）に135mL（4×106個）播種し、終濃度10％のFBSを含むD-MEM/high Glucose培地を用いて、37℃で4日間培養した。4日間培養後、終濃度10％のFBS及び終濃度1％のDMSOを含む培地に交換し、3〜4日おきに培地交換しながら2週間培養を継続した。
上記培養終了後、終濃度10％のFBSを含むD-MEM/high Glucose培地に交換し、終濃度1.0μg/mLのインディルビン、終濃度0.2μg/mLのトリコスタチンA、終濃度3.0μg/mLのホルスコリン、終濃度3.0μg/mLのオールトランスレチノイン酸を添加してさらに24hr培養した。
次いで、培地を除去し、細胞をPBS（−）で洗浄した後、20mL/dishの細胞破砕用buffer（150mM KCl、50mM Tris-HCl、2mM EDTA、pH7.4）を用いて細胞を回収した。回収した細胞を1,000×g、4℃で5分間遠心した後、得られた沈殿重量あたり0.5倍量の細胞破砕用bufferを用いて細胞を再懸濁した。細胞懸濁液をポッター型ホモジナイザーにより破砕した後、9,000×g、4℃で20分間遠心し、得られた上清をS9画分（ヒト細胞S9）とした。
【００４５】
［実施例5］  ヒト細胞S9のCYP1A1活性
＜方法＞
実施例4で得られたヒト細胞S9のタンパク質濃度をDC Protein Assay（バイオラッド製）により測定した。
次いで、発光測定用96穴プレートに5μLのヒト細胞S9を分注し、リン酸カリウムbuffer（1M、pH7.4）を5μL、蒸留水を14.7μL、及びP450-GloTM CYP1A1 Assayに付属の発光基質を0.3μL添加し、混合後37℃で10分間静置した。次いで、25μLの2×NADPH Reagent System（NADPH Regeneration System (プロメガ製、Cat.# V9510)に付属のSolution A 2.5μL、Solution B 0.5μL、及び蒸留水22μLを混合して調製）を添加し、さらに37℃で10分間静置した。反応終了後、プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーTriStarLB941Tにセットし、オートインジェクションにより50μLのルシフェリン検出試薬を添加し、CYP1A1活性を測定した。
P450-GloTM CYP1A1 Assayにより得られたCYP1A1活性を、DC Protein Assayにより得られたタンパク質濃度で補正することにより、ヒト細胞S9タンパク質1mg当たりのCYP1A1活性を算出した。
【００４６】
［比較例3］
ヒト細胞S9の代わりに、150名のヒト肝組織をプールして調製されたヒト肝S9（BDバイオサイエンス製、Cat.#452116）を用いること以外、実施例5と同様の操作を行い、ヒト肝S9タンパク質1mg当たりのCYP1A1活性を測定した。
＜結果＞
図4に、タンパク質1mg当たりのヒト細胞S9のCYP1A1活性を、ヒト肝S9に対する相対値により示す。実施例4で得られるヒト細胞S9は、ヒト肝S9の30.3倍のCYP1A1活性を示すことが確認された。
【００４７】
［実施例6］  ヒト細胞S9のCYP3A群酵素の活性
＜方法＞
実施例4で得られたヒト細胞S9のタンパク質濃度をDC Protein Assay（バイオラッド製）により測定した。
次いで、発光測定用96穴プレートに5μLのヒト細胞S9を分注し、蒸留水を18.75μL、及びP450-GloTM CYP3A4 Assay Luciferin-PFBEに付属の発光基質を1.25μL添加し、混合後37℃で10分間静置した。次いで、25μLの2×NADPH Reagent System（NADPH Regeneration Systemに付属のSolution A 2.5μL、Solution B 0.5μL、リン酸カリウムbuffer（1M、pH7.4） 10μL、及び蒸留水12μLを混合して調製）を添加し、37℃で10分間静置した。反応終了後、プレートをマルチモードマイクロプレートリーダーTriStarLB941Tにセットし、オートインジェクションにより50μLのルシフェリン検出試薬を添加し、CYP3A群酵素の活性を測定した。
P450-GloTM CYP3A4 Assay Luciferin-PFBEにより得られたCYP3A群酵素の活性を、DC Protein Assayにより得られたタンパク質濃度で補正することにより、ヒト細胞S9タンパク質1mg当たりのCYP3A群酵素の活性を算出した。
【００４８】
［比較例4］
ヒト細胞S9の代わりに、150名のヒト肝組織をプールして調製された市販のヒト肝S9（BDバイオサイエンス製）を用いること以外、実施例6と同様の操作を行い、ヒト肝S9タンパク質1mg当たりのCYP3A群酵素の活性を測定した。
＜結果＞
図5に、タンパク質1mg当たりのヒト細胞S9のCYP3A群酵素の活性を、ヒト肝S9に対する相対値により示す。実施例4で得られるヒト細胞S9は、ヒト肝S9の1.9倍のCYP3A群酵素活性を示すことが確認された。
【００４９】
［実施例7］  ヒト細胞S9のAmes試験による性能評価
＜方法＞
被験物質は、Ames試験の代謝活性化法における陽性対照物質である2−アミノアントラセン（2-AA）を用いた。DMSOに溶解させた2-AAを0.03、0.06、0.13、0.25、0.5 μg/50μLとなるよう調製し、試験管に50μLずつ分注した。また、2-AAに代えて、同容量のDMSOを分注したものを陰性対照として、以下同様の操作を行った。
実施例4で得られたヒト細胞S9 50μLとCo-factor A（オリエンタル酵母工業製）450μLを混合してS9-mixとし、2-AAを分注した試験管に500μLずつ分注し混合した。続いて、ニュートリエントブロス培地で一晩培養したTA98菌株液を100μL加えて混合した後、37℃に設定したウォーターバスで20分間振盪した。振盪培養後、45℃に保温したトップアガー液を2mL加え、最小グルコース寒天培地（オリエンタル酵母工業製）にプレーティングした。固化後、プレートを37℃で48時間培養し、生じた復帰突然変異コロニー数を計測した。
【００５０】
［比較例5］
ヒト細胞S9に代えて、ヒト肝S9（BDバイオサイエンス製）あるいはラット肝S9（オリエンタル酵母工業製）を用いること以外、実施例7と同様の操作を行い、生じた復帰突然変異コロニー数を計測した。
【００５１】
［比較例6］
TA98菌株に代えてTA100菌株を用いること、及び2-AAの濃度が0.06、0.13、0.25、0.5、1.0 μg/plateであること以外、実施例7及び比較例5と同様の操作を行い、生じた復帰突然変異コロニー数を計測した。
【００５２】
［比較例7］
TA98菌株に代えてTA1535菌株を用いること、及び2-AAの濃度が0.13、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/plateであること以外、実施例7及び比較例5と同様の操作を行い、生じた復帰突然変異コロニー数を計測した。
【００５３】
［比較例8］
TA98菌株に代えてTA1537菌株を用いること、及び2-AAの濃度が0.13、0.25、0.5、1.0、2.0 μg/plateであること以外、実施例7及び比較例5と同様の操作を行い、生じた復帰突然変異コロニー数を計測した。
＜結果＞
図6にAmes試験の結果を示す。(A)はTA98菌株、（B）はTA100菌株、（C）はTA1535菌株、（D）はTA1537菌株における復帰突然変異コロニー数である。図6の（A）〜(D)より、ヒト細胞S9で処理した2-AAの反応性は、いずれの菌株においてもヒト肝S9と同様であり、ラット肝S9とは顕著に異なっていることが確認された。このことから、ヒト細胞S9はヒトの薬物代謝反応を反映していることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明法により得られるヒト肝細胞及びヒト細胞S9は、化学物質の毒性評価に利用することが可能である。具体的には、本発明により作製したヒト細胞S9を用いて化学物質の変異原性を評価する方法が挙げられる。本発明により作製したヒト細胞S9は、ヒト肝S9の性質を反映していることから、ヒト細胞S9を用いて得られた結果から化学物質のヒトに対する変異原性を正確に予測することが可能となる。
また本発明法によれば、高いシトクロムP450活性を有するヒト肝細胞及びヒト細胞S9を安定的、かつ実質的に無限に提供することが可能となり、ラット肝S9で懸念される種差の問題だけでなく、初代肝細胞やヒト肝S9で問題となる薬物代謝酵素活性の個人間差、及び供給量の有限性をも克服することができ、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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