(57)【要約】【課題】微生物を用いてアルギン酸を含む海藻類由来の炭素源から、Ｌ−アミノ酸を発酵生産する方法を提供する。【解決手段】Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するように改変された細菌を海藻類から抽出された炭素源を含む培地で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収する、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するように改変された細菌を海藻類から抽出された炭素源を含む培地で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収する、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
前記海藻類が褐藻類、紅藻類、および緑藻類に含まれる大型海藻であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記海藻類から抽出された炭素源がアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天から選択される1種以上の炭素源である、請求項１
または２に記載の方法。
【請求項４】
前記海藻類から得られた炭素源がアルギン酸を含有し、アルギン酸をアルギン酸リアーゼによる酵素分解反応または酸による加水分解反応によって行ってから培養を行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌が、アルギン酸リアーゼ活性を増強した細菌である、請求項１〜４のいずれか1
項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌が、アルギン酸取り込み担体の活性を増強した細菌である、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
前記細菌が、ケト酸還元酵素の活性を増強した細菌である、請求項１〜６のいずれか1項
に記載の方法。
【請求項８】
前記アルギン酸取り込み担体が、Kdgタンパク質、Toaタンパク質である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ケト酸還元酵素がNADPH/NADHデヒドロゲナーゼ、D-マンノネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼから選択される酵素である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記アルギン酸リアーゼ、アルギン酸取り込み担体、ケト酸還元酵素が、アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌由来の酵素である、請求項１〜９のいずれか1項に記載の方法
。
【請求項１１】
前記アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、NITE P-01635株である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌が、腸内細菌科に属する微生物、コリネ型細菌である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腸内細菌科に属する細菌が、パントエア・アナナティスまたはエシェリヒア・コリである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
下記(a)及び（b）から選ばれる単離されたDNA。
(a) 配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(b) 配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体をコードするDNA。
【請求項１６】
下記(c) 及び（d）から選ばれる単離されたDNA。
(c) 配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d) 配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１７】
下記(e) 及び（f）から選ばれる単離されたDNA。
(e) 配列番号７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(f) 配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、2−ケト−３−デオキ
シ−6−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１８】
下記(g) 及び（h）から選ばれる単離されたDNA。
(g) 配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(h) 配列番号９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項１９】
下記(i) 及び（j）から選ばれる単離されたDNA。
(i) 配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(j) 配列番号１１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２０】
下記(k) 及び（l）から選ばれる単離されたDNA。
(k) 配列番号１３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(l) 配列番号１３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２１】
下記(m) 及び（n）から選ばれる単離されたDNA。
(m) 配列番号15のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(n) 配列番号15のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体タンパク質をコードするDNA。
【請求項２２】
下記(o) 及び（p）から選ばれる単離されたDNA。
(o) 配列番号17のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(p) 配列番号17のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体タンパク質をコードするDNA。
【請求項２３】
下記(q) 及び（r）から選ばれる単離されたDNA。
(q) 配列番号19のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(r) 配列番号19のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入
もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体タンパク質をコードするDNA。
【請求項２４】
下記(ｓ) 及び（ｔ）から選ばれる単離されたDNA。
(ｓ) 配列番号２１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(ｔ) 配列番号２１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
【請求項２５】
下記(u) 及び（w）から選ばれる単離されたDNA。
(u) 配列番号23のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(w) 配列番号23のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、NADP/NADPHデヒドロゲナーゼ活性をを有するタンパク質をコードするDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌を用いたＬ−アミノ酸を発酵生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用である。
【０００３】
発酵法によるＬ−アミノ酸の工業生産においては、炭素源としてサトウキビやトウモロコシといった食料穀物から生産される糖類、すなわち、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物等が使用されている。
【０００４】
また、近年の世界的な人口増加による食料需要増などに起因する穀物価格上昇により、サトウキビやトウモロコシの茎や葉、ヤトロファ油などの非食料の陸上バイオマスから得られる糖類や油脂類も微生物を用いた発酵の主原料源として産業上有用である。
【０００５】
しかしながら、非食料の陸上バイオマス生産には食料穀物生産と直接には競合しないものの、農地や農業用水、肥料利用などの点で食料穀物生産と間接的に競合するほか、世界的な土地収奪などの問題があることが課題として指摘されている（非特許文献１）。
【０００６】
そこで、微生物を用いた発酵の主原料として海藻を中心とした海洋性バイオマスに着目が集まっている。海洋性バイオマスは農地や農業用水、肥料を使用せず生産できる上、海藻のうち褐藻類には非食料部分も含めてサトウキビの２倍、トウモロコシの５倍の単位面積あたりの発酵主原料生産能力があることが知られている（非特許文献２）。褐藻類は著量にD−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の重合多糖であるアルギン酸、グルコース、マン
ニトールといった糖類を蓄える。
【０００７】
だが、褐藻類が蓄積する糖類を発酵の主原料とする上では、褐藻中の糖類の中に主たる成分として含むアルギン酸が微生物による資化が困難であることが産業上利用する上での課題として挙げられている（非特許文献３、非特許文献４、特許文献１、特許文献２）。
【０００８】
こうした課題を克服するために、アルギン酸資化能を有する微生物にエタノール発酵に必要な異種遺伝子を組み換えて発現させアルギン酸からエタノールを発酵生産する方法（特許文献２）や、異種組み換えによりアルギン酸資化能を付与され、エタノール発酵を行えるようになった微生物でアルギン酸からエタノールを発酵生産する方法（特許文献２）が提案されている。
【０００９】
しかしながら、微生物を用いてアルギン酸を含む海藻類由来の炭素源から、Ｌ−アミノ酸を発酵生産する方法については、これまでのところ報告がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際特許出願WO 2009/046375号
【特許文献２】国際特許出願WO 2011/024858号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Bringezu,et al. Towards sustainable production and use of resources; Assesing Biofuels  (2009) United Nations Environmental Programme
【非特許文献２】Somerville,et al. "Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels" (2010) Science. 329, p790-792.
【非特許文献３】Takeda,et al. Bioethanol production from marine biomass alginate by metabolically engineered bacteria (2011) Energy Environ. Sci.4 p2575-2581
【非特許文献４】Wargacki, et al. "An Engineered Microbial Platform for Direct Biofuel Production from Brown Macroalgae" (2012) Science. 335.p308-313
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、微生物を用いてアルギン酸を含む海藻類由来の炭素源から、Ｌ−アミノ酸を発酵生産する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の発明者は、褐藻類を餌として日常的に摂取していると考えられるサザエ（学名：Turbo cornutus）の消化管から、アルギン酸を資化可能なビブリオ属細菌を分離した。さらに、アルギン酸資化に関連する遺伝子群をＬ−アミノ酸生産菌に導入することにより、アルギン酸からのＬ−アミノ酸の直接発酵に成功した。
【００１４】
［１］  Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するように改変された細菌を海藻類由来のバイオマスから抽出された炭素源を含む培地で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収する、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造方法。
［２］  前記海藻類が褐藻類、紅藻類、および緑藻類に含まれる大型海藻 であることを
特徴とする、前記記載の方法。
［３］  前記海藻類から抽出された炭素源がアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天であることを特徴とする、前記記載の方法。
［４］  前記海藻類から得られた炭素源がアルギン酸を含有し、アルギン酸をアルギン酸リアーゼによる酵素分解反応または酸による加水分解反応によって行ってから培養を行うことを特徴とする、前記記載の方法。
［５］前記細菌が、アルギン酸リアーゼを増強した細菌である、前記記載の方法。
［６］前記細菌が、アルギン酸取り込み担体の活性を増強した細菌である、前記記載の方法。
［７］前記細菌が、ケト酸還元酵素の活性を増強した細菌である、前記記載の方法。
［８］前記アルギン酸取り込み担体が、Kdgタンパク質、Toaタンパク質である、前記記載の方法。
［９］前記ケト酸還元酵素がNADPH/NADHデヒドロゲナーゼ、D-マンノネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ、２−ケトー３−デオキシ−６ホスホグルコン酸アルドラーゼから選択される酵素である、前記記載の方法。
［１０］前記アルギン酸リアーゼ、アルギン酸取り込み担体、ケト酸還元酵素が、アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌由来の酵素である、前記記載の方法。
［１１］前記アルギン酸資化能を有するビブリオ属細菌が、NITE P-01635株である、前記記載の方法。
［１２］前記Ｌ−アミノ酸生産能を有する細菌が、腸内細菌科に属する微生物、コリネ型細菌である、前記記載の方法。
［１３］前記コリネ型細菌が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、前記記載の方法。
［１４］前記腸内細菌科に属する細菌が、パントエア・アナナティスまたはエシェリヒア・コリである、前記記載の方法。
［１５］下記(a) 及び（b）から選ばれる単離されたDNA。
(a) 配列番号３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(b) 配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体をコードするDNA。
［１６］下記(c) 及び（d）から選ばれる単離されたDNA。
(c) 配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d) 配列番号５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［１７］下記(e) 及び（f）から選ばれる単離されたDNA。
(e) 配列番号７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(f) 配列番号７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、2−ケト−３−デオ
キシ−6−ホスホグルコン酸アルドラーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［１８］  下記(g) 及び（h）から選ばれる単離されたDNA。
(g) 配列番号９のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(h) 配列番号９のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［１９］ 下記(i) 及び（j）から選ばれる単離されたDNA。
(i) 配列番号１１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(j) 配列番号１１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［２０］ 下記(k) 及び（l）から選ばれる単離されたDNA。
(k) 配列番号１３のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(l) 配列番号１３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［２１］ 下記(m) 及び（n）から選ばれる単離されたDNA。
(m) 配列番号15のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(n) 配列番号15のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿
入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体タンパク質をコードするDNA。
［２２］下記(o) 及び（p）から選ばれる単離されたDNA。
(o) 配列番号17のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(p) 配列番号17のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体タンパク質をコードするDNA。
［２３］下記(q) 及び（r）から選ばれる単離されたDNA。
(q) 配列番号19のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(r) 配列番号19のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸取り込み担体タンパク質をコードするDNA。
［２４］下記(ｓ) 及び（ｔ）から選ばれる単離されたDNA。
(ｓ) 配列番号２１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(ｔ) 配列番号２１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、
挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、アルギン酸リアーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
［２５］下記(u) 及び（w）から選ばれる単離されたDNA。
(u) 配列番号23のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(w) 配列番号23のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、NADP/NADPHデヒドロゲナーゼ活性をを有するタンパク質をコードするDNA。
【発明の効果】
【００１５】
アルギン酸を含む海藻類由来の炭素源から、Ｌ−アミノ酸を発酵生産することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】Vibrio sp.SA2株とVibrio rumoiensis Type strainとの16S rRNA遺伝子配列比較（上段がVibrio sp.SA2株の配列、下段がVibrio rumoiensis type strain S-株の配列、点線枠はギャップによる相違、実線枠は置換による相違）。
【図２】Viibrio sp. SA2株の16S rRNA遺伝子全長配列による分子系統樹（系統枝横の数字はブートストラップ値を示す）。
【図３】Vibrio sp. SA2株のアルギン酸ナトリウム最少培地での試験管培養結果（1: Vibrio sp. SA2株の波長600nmの濁度、2: MG1655株の波長600nmの濁度）。
【図４】グルコースまたはアルギン酸ナトリウムのみを炭素源とした最少液体培地での最大比増殖速度。
【図５】エシェリヒア・コリのアルギン酸資化代謝経路のモデル図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
＜１＞本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するように改変された細菌である。
【００１８】
＜１−１＞Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物
本発明において、Ｌ−アミノ酸とは、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、グリシン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−プロリン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−オルニチン及びＬ−アスパラギンから選択される１種又はそれ以上のアミノ酸である。
【００１９】
「Ｌ−アミノ酸の生産能」とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、目的物質を細胞又は培地から回収できる程度に、細胞又は培地中に生成および蓄積する能力をいう。Ｌ−アミノ酸の生産能を有する微生物は、非改変株よりも多い量の目的物質を培地に蓄積することができる微生物であってよい。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。また、目的物質の生産能を有する微生物は、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の量の目的物質を培地に蓄積することができる微生物であってもよい。本発明の微生物が生産するＬ−アミノ酸は、１種であってもよく、２種またはそれ以上であってもよい。
【００２０】
細菌としては、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する細菌やコリネ型細菌が挙げられる。
【００２１】
腸内細菌科に属する細菌としては、エシェリヒア（Escherichia）属、エンテロバクタ
ー（Enterobacter）属、パントエア（Pantoea）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セ
ラチア（Serratia）属、エルビニア（Erwinia）属、フォトラブダス（Photorhabdus）属
、プロビデンシア（Providencia）属、サルモネラ（Salmonella）属、モルガネラ（Morganella）等の属に属する細菌が挙げられる。具体的には、NCBI（National Center for Biotechnology Information）のデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347）で用いられている分類法により腸内細菌科に分類されている細菌を用いることができる。
【００２２】
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、Neidhardtらの著書（Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes
of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.
）に記載されたものが挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が挙げられる。エシェリヒア・コリとして、具体的には、例えば、プロトタイプの野生株K12由来のエシェリヒア・コリW3110（ATCC 27325）やエシェリヒア・コリMG1655（ATCC 47076）が挙げられる。
【００２３】
エンテロバクター属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエンテロバクター属に分類されている細菌が挙げられる。エンテロバクター属細菌としては、例えば、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）やエンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）が挙げられる。エンテロバクター・アグロメランスとして、具体的には、例えば、エンテロバクター・アグロメランスATCC12287株が挙げられる。エンテロバクター・アエロゲネスとして、具体的
には、例えば、エンテロバクター・アエロゲネスATCC13048株、NBRC12010株（Biotechonol Bioeng. 2007 Mar 27; 98(2) 340-348）、AJ110637株（FERM BP-10955）が挙げられる
。また、エンテロバクター属細菌としては、例えば、欧州特許出願公開EP0952221号明細
書に記載されたものが挙げられる。なお、Enterobacter agglomeransには、Pantoea agglomeransと分類されている種ものも存在する。
【００２４】
パントエア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりパントエア属に分類されている細菌が挙げられる。パントエア属細菌としては、例えば、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、パントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・シトレア（Pantoea citrea）が挙げられる。パントエア・アナナティスとして、具体的には、例えば、パントエア・アナナティスLMG20103株、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）、AJ13356株（FERM BP-6615）、AJ13601株（FERM BP-7207）
、SC17株（FERM BP-11091）、及びSC17(0)株（VKPM B-9246）が挙げられる。なお、エン
テロバクター・アグロメランスのある種のものは、最近、16S rRNAの塩基配列分析等に基づき、パントエア・アグロメランス、パントエア・アナナティス、パントエア・ステワルティイ等に再分類された（Int. J. Syst. Bacteriol., 43, 162-173 (1993)）。本発明において、パントエア属細菌には、このようにパントエア属に再分類された細菌も含まれる。
【００２５】
エルビニア属細菌としては、エルビニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エル
ビニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）が挙げられる。クレブシエラ属細菌としては、クレブシエラ・プランティコーラ（Klebsiella planticola）が挙げられる。
【００２６】
コリネ型細菌としては、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）属、およびミクロバクテリウム（Microbacterium）属等の属に属
する細菌が挙げられる。
【００２７】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような種が挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Corynebacterium acetoacidophilum）
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Corynebacterium acetoglutamicum）
コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）
コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）
コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）
コリネバクテリウム・メラセコーラ（Corynebacterium melassecola）
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（コリネバクテリウム・エフィシエンス）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens)）
コリネバクテリウム・ハーキュリス（Corynebacterium herculis）
ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）
ブレビバクテリウム・イマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）（Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum)）
ブレビバクテリウム・ロゼウム（Brevibacterium roseum）
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス（Brevibacterium thiogenitalis）
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（コリネバクテリウム・スタティオニス）（Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis)）
ブレビバクテリウム・アルバム（Brevibacterium album）
ブレビバクテリウム・セリナム（Brevibacterium cerinum）
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム（Microbacterium ammoniaphilum）
【００２８】
コリネ型細菌としては、具体的には、下記のような菌株が挙げられる。
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511
Corynebacterium callunae ATCC 15991
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020, ATCC 13032, ATCC 13060，ATCC 13869，FERM BP-734
Corynebacterium lilium ATCC 15990
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 (FERM BP-1539)
Corynebacterium herculis ATCC 13868
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020
Brevibacterium flavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC 14068
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium roseum ATCC 13825
Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066
Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240
Corynebacterium ammoniagenes (Corynebacterium stationis) ATCC 6871, ATCC 6872
Brevibacterium album ATCC 15111
Brevibacterium cerinum ATCC 15112
Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354
【００２９】
なお、コリネバクテリウム属細菌には、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に統合された細菌（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)）も含まれる。また、コリネバクテリウム・スタティオニスには、従来コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネスに分類されていたが、16S rRNAの塩基配列解析等によりコリネバクテリウム・スタティオニスに再分類された細菌も含まれる（Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 60, 874-879(2010)）。
【００３０】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する
登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。
【００３１】
本発明の微生物は、本来的に目的物質の生産能を有するものであってもよく、目的物質の生産能を有するように改変されたものであってもよい。目的物質の生産能を有する微生物は、例えば、上記のような微生物に目的物質の生産能を付与することにより、または、上記のような微生物の目的物質の生産能を増強することにより、取得できる。
【００３２】
目的物質の生産能の付与または増強は、従来、コリネ型細菌又はエシェリヒア属細菌等のアミノ酸生産菌の育種に採用されてきた方法により行うことができる（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。そのよう
な方法としては、例えば、栄養要求性変異株の取得、目的物質のアナログ耐性株の取得、代謝制御変異株の取得、目的物質の生合成系酵素の活性が増強された組換え株の創製が挙げられる。目的物質生産菌の育種において、付与される栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質は、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。また、目的物質生産菌の育種において、活性が増強される目的物質生合成系酵素も、単独であってもよく、２種又は３種以上であってもよい。さらに、栄養要求性、アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。
【００３３】
Ｌ−アミノ酸の生産能を有する栄養要求性変異株、アナログ耐性株、又は代謝制御変異株は、親株又は野生株を通常の変異処理に供し、得られた変異株の中から、栄養要求性、アナログ耐性、又は代謝制御変異を示し、且つ目的物質の生産能を有するものを選択することによって取得できる。通常の変異処理としては、Ｘ線や紫外線の照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００３４】
また、Ｌ−アミノ酸の生産能の付与又は増強は、目的物質の生合成に関与する酵素の活性を増強することによっても行うことができる。酵素活性の増強は、例えば、同酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように微生物を改変することにより行うことができる。遺伝子の発現を増強する方法は、WO00/18935号パンフレット、欧州特許出願公開1010755
号明細書等に記載されている。酵素活性を増強する詳細な手法については後述する。
【００３５】
また、Ｌ−アミノ酸の生産能の付与又は増強は、目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性を低下させることによっても行うことができる。なお、ここでいう「目的物質の生合成経路から分岐して目的物質以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素」には、目的物質の分解に関与する酵素も含まれる。酵素活性を低下させる手法については後述する。
【００３６】
以下、Ｌ−アミノ酸生産菌、およびＬ−アミノ酸の生産能を付与または増強する方法に
ついて具体的に例示する。
【００３７】
＜Ｌ−グルタミン酸生産菌＞
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(gdhA)、グルタミンシンテターゼ(glnA)、グルタミン酸シンターゼ(gltAB)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(icdA)、アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB)、クエン酸シンターゼ(gltA)、メチルクエン酸シンターゼ(prpC)、ホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc)、ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF)、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(aceEF, lpdA)、ホスホエノールピルビン
酸シンターゼ(ppsA)、エノラーゼ(eno)、ホスホグリセルムターゼ(pgmA, pgmI)、ホスホ
グリセリン酸キナーゼ(pgk)、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ(gapA)
、トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)、フルトースビスリン酸アルドラーゼ(fbp)、ホ
スホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）、グルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)、６−ホス
ホグルコン酸デヒドラターゼ（edd）、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸
アルドラーゼ（eda）、トランスヒドロゲナーゼなどが挙げられる。尚、酵素名の後のカ
ッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、例えば、グルタメートデヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、及びメチルクエン酸シンターゼから選択される１またはそれ以上の酵素の活性を増強するのが好ましい。クエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子、および／またはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が増大するように改変された株としては、EP1078989A、EP955368A、及びEP952221Aに開示されたものが挙げられる。また、Ｌ−グルタミン酸生合成系酵素遺伝子の発現が増大するように改変された微生物としては、WO99/07853、及びEP1352966Bに開示されたものも挙げられる。
【００３８】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が低下するように微生物を改変する方法も挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ(sucA)、コハク酸デヒドロゲナーゼ（sdhABCD）、酢酸キナーゼ(ack)、アセトヒドロキシ酸シンターゼ(ilvG)、アセト乳酸シンターゼ(ilvI等)、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl)、乳酸デヒドロゲナーゼ(ldh)、アルコールデヒドロゲナーゼ(adh)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(gadAB)、１−ピロリン−５−カルボキシレートデヒドロゲナーゼ（putA）などが挙げられる。この中では特に、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下又は欠損させることが好ましい。
【００３９】
エシェリヒア属細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開平5-244970号公報及び特開平7−203980号公報などに記載されて
いる。また、コリネ型細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、国際公開95/34672号パンフレットに記載されている。さらに、エンテロバクター属細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、特開2001-333769号公報に開示されている。さらに、パントエア属細
菌、エンテロバクター属細菌、クレブシエラ属細菌、エルビニア属細菌等の腸内細菌においてα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損もしくは低下させる方法は、米国特許6197559号公報、米国特許6682912号公報、米国特許6331419号公報、米国特許8129151号公報に開示されている。さらに、コリネ型細菌、パントエア属細菌で、α―ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性及びコハク酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させる方法は、WO2008/075483号公報に開示されている。
【００４０】
例えば、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるには該酵素のE1oサブ
ユニットをコードするsucA（odhA）遺伝子を改変すればよい。α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性が低下した株として、例えば、以下の株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔS株（国際公開95/34672号パンフレット
）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12821(FERM BP−4172；フランス特許公
報9401748号明細書参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12822 (FERM BP-4173；フランス特許公報9401748号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ12823(FERM BP-4174；フランス特許公報9401748
号明細書参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869 OAGN、OA2-2、OAGN2-2 （国際公開パン
フレット2006/028298号参照）
エシェリヒア・コリW3110sucA::Kmr
エシェリヒア・コリAJ12624（FERM BP-3853）
エシェリヒア・コリAJ12628（FERM BP-3854）
エシェリヒア・コリAJ12949（FERM BP-4881）
ブレビバクテリム・ラクトファーメンタム  ΔS株  （国際公開95/34672号パンフレッ
ト参照）
パントエア・アナナティス  AJ13601 (FERM BP-7207 欧州特許公開明細書1078989)
パントエア・アナナティス  AJ13356 (FERM BP-6615 米国特許6,331,419号)
パントエア・アナナティス  SC17sucA (FERM BP-8646  WO2005/085419)
クレブシエラ・プランティコーラ  AJ13410 (FERM BP-6617 米国特許6,197,559号)
【００４１】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、パントエア・アナナティスAJ13355株（FERM BP-6614）やSC17株（FERM BP-11091）が挙げられる。AJ13355株は、静岡県磐田市の土壌から、低pHでＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む培地で増
殖できる株として分離された株である。SC17株は、AJ13355株から、粘液質低生産変異株
として選択された株である（米国特許第6,596,517号）。SC17株は、平成２１年２月４日
に、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構
特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に寄託され、受託番号FERM BP-11091が付与されている。パントエア・アナナティスAJ13355は、1998年2月19日に、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に、受託番号FERM P-16644とし
て寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-6614が付与されている。
【００４２】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、α-ケトグル
タレートデヒドロゲナーゼ（αKGDH）活性が欠損または低下したパントエア属に属する細菌が挙げられる。このような株としては、AJ13355株のαKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）の欠損株であるAJ13356(米国特許第6,331,419号)、及びSC17株のsucA遺伝子欠損株であるSC17sucA(米国特許第6,596,517号)が挙げられる。AJ13356は、1998年2月19日、工業
技術院生命工学工業技術研究所（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受
託番号FERM P-16645として寄託され、1999年1月11日にブダペスト条約に基づく国際寄託
に移管され、受託番号FERM BP-6616が付与されている。また、SC17sucA株は、ブライベートナンバーAJ417株が付与され、2004年2月26日に産業技術総合研究所特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-08
18、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM BP-08646として寄託されている。
【００４３】
また、Ｌ−グルタミン酸生産菌又はそれを誘導するための親株としては、SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株、AJ13601株、NP106株、及びNA1株が挙げられる。SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB
株は、SC17sucA株に、エシェリヒア・コリ由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ppsA）、およびグルタメートデヒドロゲナーゼ遺伝子（gdhA）を含むプラスミドRSFCPG、並びに、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のクエン酸シンターゼ遺伝子（gltA）を含むプラスミドpSTVCBを導入して得た株である。AJ13601株は、このSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株から低pH下で高濃度の
Ｌ−グルタミン酸に耐性を示す株として選択された株である。また、NP106株は、AJ13601株からプラスミドRSFCPG+pSTVCBを脱落させた株である。AJ13601株は、1999年8月18日に
、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（現、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター、郵便番号：292-0818、住所：千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-17516として寄託され、2000年7月6日にブダペ
スト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-7207が付与されている。
【００４４】
尚、AJ13355は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定されたが
、近年、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。よって、AJ13355、AJ13356、およびAJ13601は、上記寄託機関にEnterobacter agglomeransとして寄託されているが、本明細書ではPantoea ananatisとして記載する。
【００４５】
さらにコリネ型細菌にＬ−グルタミン酸生産能を付与する方法として、yggB遺伝子(NCgl 1221；NP_600492 [gi:19552490]）を増幅する方法、コード領域内に変異を導入した変
異型yggB遺伝子を導入する方法を用いることも可能である（WO2006/070944）。
【００４６】
Ｌ−グルタミン酸生産能は、Ｌ−グルタミン酸排出遺伝子であるyhfK遺伝子（WO2005/085419）やybjL遺伝子（WO2008/133161）を増幅することによっても付与することができる。
【００４７】
Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する別の方法として、有機酸アナログや呼吸阻害剤などへの耐性を付与する方法や、細胞壁合成阻害剤に対する感受性を付与する方法も挙げられる。例えば、モノフルオロ酢酸耐性を付与する方法（特開昭50-113209）、ア
デニン耐性またはチミン耐性を付与する方法（特開昭57-065198）、ウレアーゼを弱化さ
せる方法（特開昭52-038088）、マロン酸耐性を付与する方法（特開昭52-038088）、ベンゾピロンまたはナフトキノン類への耐性を付与する方法（特開昭56-1889）、HOQNO耐性を付与する方法（特開昭56-140895）、α-ケトマロン酸耐性を付与する方法（特開昭57-2689）、グアニジン耐性を付与する方法（特開昭56-35981）、ペニシリンに対する感受性を
付与する方法（特開平4-88994）などが挙げられる。
【００４８】
このような耐性菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ3949 (FERM BP-2632：特開昭50-113209参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11628 (FERM P-5736；特開昭57-065198参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11355 (FERM P-5007；特開昭56-1889号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11368 (FERM P-5020；特開昭56-1889号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11217 (FERM P-4318；特開昭57-2689号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11218 (FERM P-4319；特開昭57-2689号公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11564 (FERM P-5472；特開昭56-140895公報参照)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11439 (FERM P-5136；特開昭56-35981号公報参照)
コリネバクテリウム・グルタミカムH7684 (FERM BP-3004；特開平04-88994号公報参照)
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11426（FERM P-5123；特開平56-048890号
公報参照）
コリネバクテリウム・グルタミカムAJ11440（FERM P-5137；特開平56-048890号公報参照
）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11796（FERM P-6402；特開平58-158192号
公報参照）
【００４９】
また、コリネ型細菌について、Ｌ−グルタミン酸生産能を付与または増強する方法としては、yggB遺伝子の発現を増強する方法やコード領域内に変異を導入した変異型yggB遺伝子を導入する方法も挙げられる（WO2006/070944）。yggB遺伝子は、メカノセンシティブ
チャンネル（mechanosensitive channel）をコードする遺伝子である。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子は、ＮＣＢＩデータベースにGenBank Accession No. NC_003450で登録されているゲノム配列中、1,336,091〜1,337,692の配列の相補配列に相
当し、NCgl1221とも呼ばれる。Corynebacterium glutamicum ATCC13032のyggB遺伝子にコードされるYggBタンパク質は、GenBank accession No. NP_600492として登録されている
。
【００５０】
＜Ｌ−グルタミン生産菌＞
Ｌ−グルタミン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を強化した細菌、グルタミンシンセターゼ（glnA）活性を強化した細菌、およびグルタミナーゼ遺伝子を破壊した細菌が挙げられる（欧州特許出願公開1229121号、1424398号明細書）。グルタミンシンセターゼの活性増強は、グルタミンアデニニルトランスフェラーゼ遺伝子（glnE）の破壊やPII制御タンパク質遺伝子（glnB）の破壊によって
も達成できる（EP1229121）。また、エシェリヒア属に属し、グルタミンシンセターゼの397位のチロシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異型グルタミンシンセターゼを有する菌株も好適なＬ−グルタミン生産菌として例示できる（米国特許出願公開第2003-0148474号明細書）。
【００５１】
また、Ｌ−グルタミン生産能を付与または増強する方法として、6-ジアゾ-5-オキソ-ノルロイシン耐性を付与する方法 (特開平3-232497)、プリンアナログ耐性及びメチオニン
スルホキシド耐性を付与する方法(特開昭61-202694)、α-ケトマレイン酸耐性を付与する方法(特開昭56-151495)などが挙げられる。
【００５２】
Ｌ−グルタミン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11573 (FERM P-5492、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11576 (FERM BP-10381、特開昭56-161495)
ブレビバクテリウム・フラバムAJ12212 (FERM P-8123、特開昭61-202694)
【００５３】
＜Ｌ−プロリン生産菌＞
Ｌ−プロリン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼを保持する細菌や、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌が挙げられる。Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が解除されたγ−グルタミルキナーゼをコードするDNAを用いて細菌を改変する方法は、DandekarとUratsuの文献（J. Bacteriol. 170, 12: 5943-5945 (1988)）に開示されている。また、Ｌ−プロリン分解系が弱化した細菌を得る方法としては、例えば、プロリンデヒドロゲナーゼ遺伝子に酵素活性を低下させる変異を導入する方法が挙げられる。Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ NRRL B-12403株及びNRRL B-12404株 (英国特許 2075056)、エシェリヒア・コリVKPM B-8012株 (米国特許公開2002-0058315)、ドイツ特許3127361号に開示されたプラスミドを保持するエシェリヒア・コリ変異株、な
らびにBloom F.R. らの文献 (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) に開示されたプラスミドを保持するエシェリヒア・コリ変異株が挙げられる。
【００５４】
また、Ｌ−プロリン生産能を有する細菌の具体例としては、3,4-デヒドロキシプロリン、アザチジン−２−カルボキシレート耐性株であるエシェリヒア・コリ702株（VKPMB-8011）や、702のilvA欠損株である702ilvA株（VKPMB-8012株）や、b2682、b2683、b1242又はb3434遺伝子にコードされるタンパク質の活性を増強したE. coli等も挙げられる（特開2002−300874号公報）。
【００５５】
＜Ｌ−アルギニン生産菌＞
Ｌ−アルギニン生産能を付与又は増強するための方法としては、例えば、Ｌ−アルギニン生合成系酵素から選択される１またはそれ以上の酵素の活性が増大するように微生物を改変する方法が挙げられる。そのような酵素としては、特に制限されないが、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸シンターゼ（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）カルバモイルリン酸シンターゼ（carAB）が挙げられる。N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）遺伝子とし
ては、例えば、野生型の１５位〜１９位に相当するアミノ酸配列が置換されたＬ−アルギニンによるフィードバック阻害が解除された変異型の遺伝子を用いると好適である（欧州出願公開1170361号明細書）。
【００５６】
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、α−メチルメチオニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、Ｄ−アルギニン、アルギニンヒドロキサム酸、Ｓ−（２−アミノエチル）−システイン、α−メチルセリン、β−２−チエニルアラニン、又はスルファグアニジンに耐性を有するエシェリヒア・コリ変異株（特開昭56-106598号公報参照）等が挙げ
られる。また、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、Ｌ−アルギニンによるフィードバック阻害に耐性な変異を有し、かつ、高い活性を有するＮ−アセチルグルタミン酸シンターゼを保持するＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ237株（ロシ
ア特許出願第2000117677号）も挙げられる。同株は、2000年４月10日にロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズム（Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika） にVKPM B-7925の受託番号で寄託され、2001年５月18日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管された。また、Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、237株の誘導体で、酢酸資化能
を向上させたＬ−アルギニン生産菌である、エシェリヒア・コリ382株（特開2002-017342号公報）も挙げられる。エシェリヒア・コリ382株は、2000年４月10日にRussian National Collection of Industrial Microorganisms（VKPM）にVKPM B-7926の受託番号で寄託されている。
【００５７】
Ｌ−アルギニン生産能を有する微生物としては、コリネ型細菌野生株；サルファ剤、２−チアゾールアラニン又はα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸等の薬剤に耐性を有するコリネ型細菌；２−チアゾールアラニン耐性に加えて、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニンまたはＬ−トリプトファン要求性を有するコリネ型細菌（特開昭54-44096号）；ケトマロン酸、フルオロマロン酸又はモノフルオロ酢酸に耐性を有するコリネ型細菌（特開昭57-18989号）；アルギニノールに耐性を有するコリネ型細菌（特開昭62-24075号）；または、Ｘ−グアニジン（Ｘは脂肪酸又は脂肪鎖の誘導体）に耐性を有するコリネ型細菌（特開平2-186995号）等も挙げられる。また、Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌としては、５−アザウラシル、６−アザウラシル、２−チオウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−アザシトシ
ン、６−アザシトシン等に耐性な変異株；アルギニンヒドロキサメート、２−チオウラシルに耐性な変異株、アルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシルに耐性な変異株（特開昭49-126819号）；ヒスチジンアナログ又はトリプトファンアナログに耐性な変異株
（特開昭52-114092号）、メチニオン、ヒスチジン、スレオニン、プロリン、イソロイシ
ン、リジン、アデニン、グアニンまたはウラシル（またはウラシル前駆体）の少なくとも一つに要求性を有する変異株（特開昭52-99289号参）；アルギニンヒドロキサメートに耐性な変異株（特公昭51-6754号）；コハク酸要求性又は核酸塩基アナログに耐性な変異株
（特開昭58-9692号）；アルギニン分解能を欠損し、アルギニンのアンタゴニスト及びカ
ナバニンに耐性を有し、リジンを要求する変異株（特開昭52-8729号）；アルギニン、ア
ルギニンヒドロキサメート、ホモアルギニン、Ｄ−アルギニン、及びカナバニン耐性、またはアルギニンヒドロキサメート及び６−アザウラシル耐性の変異株（特開昭53-143288
号）；及び、カナバニン耐性の変異株（特開昭53-3586号）等も挙げられる。
【００５８】
Ｌ−アルギニン生産能を有するコリネ型細菌の具体例としては、下記のような菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11169（FERM BP-6892）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12092（FERM BP-6906）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11336（FERM BP-6893）
ブレビバクテリウム・フラバムAJ11345（FERM BP-6894）
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12430（FERM BP-2228）
【００５９】
また、Ｌ−アルギニン生産菌又はそれを誘導するための親株としては、アルギニンリプレッサーであるArgRを欠損した株（米国特許出願公開2002-0045223号）や細胞内のグルタミンシンテターゼ活性を上昇させた株（米国特許出願公開2005-0014236号公報）も挙げられる。
【００６０】
＜Ｌ−シトルリン生産菌およびＬ−オルニチン生産菌＞
Ｌ−シトルリンおよびＬ−オルニチンは、Ｌ−アルギニンと生合成経路が共通している。よって、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（argA）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、および／またはアセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）の酵素活性を上昇させることによって、Ｌ−シトルリンおよび／またはＬ−オルニチンの生産能を付与または増強することができる（国際公開2006-35831号パンフレット）。
【００６１】
＜Ｌ−フェニルアラニン生産菌＞
Ｌ−フェニルアラニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、コリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼ及びチロシンリプレッサーを欠損したE. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197)(WO03/044191)、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドラターゼをコードする変異型pheA34遺伝子
を保持するE. coli HW1089 (ATCC 55371) (米国特許第 5,354,672号)、E. coli MWEC101-b (KR8903681)、E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限
定されない。また、親株として、フィードバック阻害が解除されたコリスミ酸ムターゼ-
プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を保持するE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びAJ 12604と命名されたE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] (FERM BP-3579)も使用できる(EP 488424 B1)。
さらに、yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148
473 A1及び2003/0157667 A1、WO03/044192)。
【００６２】
＜Ｌ−トリプトファン生産菌＞
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、変異trpS遺伝子によりコードされるトリプトファニル-tRNAシンテターゼが欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによ
るフィードバック阻害を受けないフォスフォグリセリレートデヒドロゲナーゼをコードするserAアレル及びトリプトファンによるフィードバック阻害を受けないアントラニレートシンターゼをコードするtrpEアレルを有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、フォスフォエノールピルビン酸生産能が増大したE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)
などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。yedA遺伝子またはyddG遺伝子にコードされるタンパク質の活性が増大したエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産菌も使用できる(米国特許出願公開2003/0148473 A1及び2003/0157667
A1)。
【００６３】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アントラニレートシンターゼ(trpE)、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ(serA)、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ(aroG)、３-デヒドロキネートシンターゼ(aroB)、シキミ酸デヒドロゲナーゼ(aroE)、シキミ酸キナーゼ(aroL)、５-エノール酸ピ
ルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ(aroA)、コリスミ酸シンターゼ(aroC)、プレフェン
酸デヒドラターゼ、コリスミ酸ムターゼ及び、トリプトファンシンターゼ(trpAB)から選
ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が増強された株も挙げられる。プレフェン酸デヒドラターゼ及びコリスミ酸ムターゼは、２機能酵素（CM-PD）としてpheA遺伝子によってコ
ードされている。これらの酵素の中では、フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼ、３-デオキシ-Ｄ-アラビノヘプツロン酸-７-リン酸シンターゼ、３-デヒドロキネートシンターゼ、シキミ酸デヒドラターゼ、シキミ酸キナーゼ、５-エノール酸ピルビルシキミ酸３-リン酸シンターゼ、コリスミ酸シンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、コリスミン酸ムターゼ-プレフェン酸デヒドロゲナーゼが特に好ましい。アントラニレートシンターゼ
及びフォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼは共にＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けるので、フィードバック阻害を解除する変異をこれらの酵素に導入してもよい。このような変異を有する株の具体例としては、脱感作型アントラニレートシンターゼを保持するE. coli SV164、及び、フィードバック阻害が解除された
フォスフォグリセレートデヒドロゲナーゼをコードする変異serA遺伝子を含むプラスミドpGH5 (WO 94/08031)をE. coli SV164に導入することにより得られた形質転換株が挙げら
れる。
【００６４】
Ｌ−トリプトファン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、阻害解除型アントラニレートシンターゼをコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンが導入された株(特開昭57-71397号, 特開昭62-244382号, 米国特許第4,371,614号)も挙げられる。さらに、トリプトファンオペロン(trpBA)中のトリプトファンシンターゼをコードする遺伝
子の発現を増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を付与してもよい。トリプトファンシンターゼは、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によりコードされるα及びβサブユニットからなる。さらに、イソシトレートリアーゼ-マレートシンターゼオペロンの発現を
増大させることによりＬ−トリプトファン生産能を改良してもよい(WO2005/103275)。
【００６５】
＜Ｌ−ヒスチジン生産菌＞
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli 24株 (VKPM B-5945, RU2003677)、E. coli 80株 (VKPM B-7270, RU2119536)、E. coli NRRL B-121
16 - B12121 (米国特許第4,388,405号)、E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号)、E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げ
られるが、これらに限定されない。
【００６６】
Ｌ−ヒスチジン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大した株も挙げられる。かかる遺伝子の例としては、ATPフォスフォリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)、フォスフォ
リボシルAMPサイクロヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシル-ATPピロフォスフ
ォヒドロラーゼ遺伝子(hisI)、フォスフォリボシルフォルミミノ-5-アミノイミダゾール
カルボキサミドリボタイドイソメラーゼ遺伝子(hisA)、アミドトランスフェラーゼ遺伝子(hisH)、ヒスチジノールフォスフェイトアミノトランスフェラーゼ遺伝子(hisC)、ヒスチジノールフォスファターゼ遺伝子(hisB)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子(hisD)などが挙げられる。
【００６７】
hisG及びhisBHAFIにコードされるＬ−ヒスチジン生合成系酵素はＬ−ヒスチジンにより阻害されることが知られており、従って、Ｌ−ヒスチジン生産能は、ATPフォスフォリボ
シルトランスフェラーゼ遺伝子(hisG)にフィードバック阻害への耐性を付与する変異を導入することにより効率的に増大させることができる(ロシア特許第2003677号及び第2119536号)。
【００６８】
Ｌ−ヒスチジン生産能を有する株の具体例としては、Ｌ−ヒスチジン生合成系酵素をコードするDNAを保持するベクターを導入したE. coli FERM-P 5038及び5048 (特開昭56-005099号)、アミノ酸輸送の遺伝子を導入したE. coli株(EP1016710A)、スルファグアニジン
、DＬ−1,2,4-トリアゾール-3-アラニン及びストレプトマイシンに対する耐性を付与したE. coli 80株(VKPM B-7270, ロシア特許第2119536号)などが挙げられる。
【００６９】
＜Ｌ−スレオニン生産菌＞
Ｌ−スレオニン生産能を有する微生物として好ましいものは、Ｌ−スレオニン生合成系酵素の１種又は２種以上の活性が増強された細菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII（lysC）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒド
ロゲナーゼ（asd）、thrオペロンにコードされるアスパルトキナーゼI（thrA）、ホモセ
リンキナーゼ（thrB）、スレオニンシンターゼ（thrC）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）(aspC)が挙げられる。カッコ内は、その遺伝子の略記号である（以下の記載においても同様）。これらの酵素の中では、アスパルトキナーゼIII、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アスパルトキナー
ゼI、ホモセリンキナーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、及びスレオニン
シンターゼが特に好ましい。Ｌ−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株（特開2001-346578号）等が挙げられる。
【００７０】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素は、最終産物のＬ−スレオニンによって酵素活性が抑制される。従って、Ｌ−スレオニン生産菌を構築するためには、Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないようにＬ−スレオニン生合成系遺伝子を改変することが望ましい。また、上記thrA、thrB、thrC遺伝子は、スレオニンオペロンを構成しているが、スレオニンオペロンは、アテニュエーター構造を形成しており、スレオニンオペロンの発現は、培養液中のイソロイシン、スレオニンに阻害を受け、アテニュエーションにより発現が抑制される。この改変は、アテニュエーション領域のリーダー配列あるいは、アテニュエーターを除去することにより達成出来る。（Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J.
, Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69 (1987); 国際公開第02/26993号パンフレット; 国際公開第2005/049808号パンフレット参照）
【００７１】
スレオニンオペロンの上流には、固有のプロモーターが存在するが、非天然のプロモーターに置換してもよいし（WO98/04715号パンフレット参照）、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファ-ジのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるようなス
レオニンオペロンを構築してもよい。（欧州特許第0593792号明細書参照）また、Ｌ−ス
レオニンによるフィードバック阻害を受けないように細菌を改変するために、α-amino-
β-hydroxyvaleric acid （AHV）に耐性な菌株を選抜することも可能である。
【００７２】
このようにＬ−スレオニンによるフィードバック阻害を受けないように改変されたスレオニンオペロンは、宿主内でコピー数が上昇しているか、あるいは強力なプロモーターに連結し、発現量が向上していることが好ましい。コピー数の上昇は、プラスミドによる増幅の他、トランスポゾン、Mu-ファ-ジ等でゲノム上にスレオニンオペロンを転移させることによっても達成出来る。
【００７３】
Ｌ−スレオニン生合成系酵素以外にも、解糖系、TCA回路、呼吸鎖に関する遺伝子や遺
伝子の発現を制御する遺伝子、糖の取り込み遺伝子を強化することも好適である。これらのＬ−スレオニン生産に効果がある遺伝子としては、トランスヒドロナ-ゼ（pntAB）遺伝子（欧州特許733712号明細書）、ホスホエノ-ルピルビン酸カルボキシラ-ゼ遺伝子（pepC）(国際公開95/06114号パンフレット)、ホスホエノ-ルピルビン酸シンタ-ゼ遺伝子（pps
）(欧州特許877090号明細書)、コリネ型細菌あるいはバチルス属細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（国際公開99/18228号パンフレット、欧州出願公開1092776号明細書）
が挙げられる。
【００７４】
また、Ｌ−スレオニンに耐性を付与する遺伝子、Ｌ−ホモセリンに耐性を付与する遺伝子の発現を強化することや、宿主にＬ−スレオニン耐性、Ｌ−ホモセリン耐性を付与することも好適である。耐性を付与する遺伝子としては、rhtA遺伝子(Res. Microbiol. 154:123-135 (2003))、rhtB遺伝子（欧州特許出願公開第0994190号明細書）、rhtC遺伝子（欧
州特許出願公開第1013765号明細書）、yfiK、yeaS遺伝子（欧州特許出願公開第1016710号明細書）が挙げられる。また宿主にＬ−スレオニン耐性を付与する方法は、欧州特許出願公開第0994190号明細書や、国際公開第90/04636号パンフレット記載の方法を参照出来る
。
【００７５】
Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号、米国特許第5,705,371号)、E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号)、E. coli NRRＬ−21593 (米国特許第5,939,307号)、E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号)、E. coli FERM BP-3519及
びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号)、E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978))、E. coli VL643及びVL2055 (EP 1149911 A)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
TDH-6株はthrC遺伝子を欠損し、スクロース資化性であり、また、そのilvA遺伝子がリ
ーキー(leaky)変異を有する。この株はまた、rhtA遺伝子に、高濃度のスレオニンまたは
ホモセリンに対する耐性を付与する変異を有する。B-3996株は、RSF1010由来ベクターに
、変異thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンを挿入したプラスミドpVIC40を保持する。この
変異thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解除されたアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする。B-3996株は、1987年11月19日、オールユニオン・サイエンティフィック・センター・オブ・アンチビオティクス(Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia)に、受託番号RIA 1867で寄託されている。こ
の株は、また、1987年4月7日、ルシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia) に、受託番号B-3996で寄託されている。
【００７７】
E. coli VKPM B-5318 (EP 0593792B)も、Ｌ−スレオニン生産菌又はそれを誘導するた
めの親株として使用できる。B-5318株は、イソロイシン非要求性であり、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が、温度感受性ラムダファージC1リプレッサー及びPRプロモーターにより置換されている。VKPM B-5318は、1990年5月3日、ルシアン・ナシ
ョナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM)(1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-5318で国際寄託されている。
【００７８】
E. coliのアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードするthrA遺伝子
は明らかにされている(ヌクレオチド番号337〜2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrL遺伝子とthrB遺伝子との間に位置する。Escherichia coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は明らかにされている(ヌクレオチド番号2801〜3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrA遺伝子とthrC遺伝子と
の間に位置する。E. coliのスレオニンシンターゼをコードするthrC遺伝子は明らかにさ
れている(ヌクレオチド番号3734〜5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体において、thrB遺伝子とyaaXオープンリーディ
ングフレームとの間に位置する。これら三つの遺伝子は、全て、単一のスレオニンオペロンとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増大させるには、転写に影響するアテニュエーター領域を、好ましくは、オペロンから除去する(WO2005/049808, WO2003/097839)。
【００７９】
スレオニンによるフィードバック阻害に耐性のアスパルトキナーゼホモセリンデヒドロゲナーゼＩをコードする変異thrA遺伝子、ならびに、thrB遺伝子及びthrC遺伝子は、スレオニン生産株E. coli VKPM B-3996に存在する周知のプラスミドpVIC40から一つのオペロ
ンとして取得できる。プラスミドpVIC40の詳細は、米国特許第5,705,371号に記載されて
いる。
【００８０】
E. coliのrhtA遺伝子は、グルタミン輸送系の要素をコードするglnHPQ オペロンに近いE. coli染色体の18分に存在する。rhtA遺伝子は、ORF1 (ybiF遺伝子, ヌクレオチド番号764〜1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181)と同一であり、pexB遺伝子とompX遺伝子との間に位置する。ORF1によりコードされるタンパク質を発現するユニットは、rhtA遺伝子と呼ばれている(rht: ホモセリン及びスレオニンに耐性)。また、rhtA23
変異が、ATG開始コドンに対して-1位のG→A置換であることが判明している(ABSTRACTS of
the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular
Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A)。
【００８１】
E. coliのasd遺伝子は既に明らかにされており(ヌクレオチド番号3572511〜3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307)、その遺伝子の塩基配列に基づいて作製されたプライマーを用いるPCRにより得ることができる(White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)参照)。他の微生物のasd遺伝子も同様に得ることができる。
【００８２】
また、E. coliのaspC遺伝子も既に明らかにされており(ヌクレオチド番号983742〜984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895)、PCRにより得ることができる。他の
微生物のaspC遺伝子も同様に得ることができる。
【００８３】
＜Ｌ−リジン生産菌＞
以下、Ｌ−リジン生産菌又は及びその構築方法を例として示す。
例えば、Ｌ−リジン生産能を有する株としては、Ｌ−リジンアナログ耐性株又は代謝制御変異株が挙げられる。Ｌ−リジンアナログの例としては、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（AEC）、γ−メチルリジン、
α−クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのリジンアナログに対して耐性を有する変異株は、腸内細菌科に属する細菌を通常の人工変異処理に付すことによって得ることができる。Ｌ−リジン生産菌として具体的には、エシェリヒア・コリAJ11442株（FERM BP-1543、NRRL B-12185；特開昭56-18596号公報及び米国特許
第4346170号明細書参照）、エシェリヒア・コリ VL611株（特開2000-189180号公報）等が挙げられる。また、エシェリヒア・コリのＬ−リジン生産菌として、WC196株（国際公開
第96/17930号パンフレット参照）を用いることも出来る。
【００８４】
また、Ｌ−リジン生合成系の酵素活性を上昇させることによっても、Ｌ−リジン生産菌を構築することが出来る。これらの酵素活性の上昇は、酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、または発現調節配列を改変することによって達成できる。Ｌ−リジン生合成系の酵素をコードする遺伝子のコピー数を細胞内で上昇させること、および発現調節配列を改変することは、後述のgltP、gltS遺伝子の場合と同様の方法によって達成することができる。
【００８５】
Ｌ−リジン生合成系酵素をコードする遺伝子としては、ジヒドロジピコリン酸合成酵素遺伝子（dapA）、アスパルトキナーゼ遺伝子(lysC)、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ遺伝子(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱
水素酵素遺伝子（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経
路の酵素の遺伝子、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ遺伝子（特開2000-157276号
公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等の遺伝子が挙げられる。また、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP 1170376 A)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(pntAB) (米国特許第5,830,716号)、Ｌ−リジン排出
活性を有するタンパク質をコードするybjE遺伝子(WO2005/073390)、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼをコードする遺伝子(gdhA)(Gene23:199-209(1983))、または、これらの任意の組み合わせの遺伝子の発現レベルが増大していてもよい。カッコ内は、それらの遺伝子の略記号である。上記遺伝子の中ではybjE遺伝子が好ましい。ybjE遺伝子としては、配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子、具体的には配列番号５に記載の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
【００８６】
エシェリヒア・コリ由来の野生型ジヒドロジピコリン酸合成酵素はＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、エシェリヒア・コリ由来の野生型Aアス
パルトキナーゼはＬ−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、dapA遺伝子及びlysC遺伝子を用いる場合、これらの遺伝子は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型遺伝子であることが好ましい。
【００８７】
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列
を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ−リジンによるフィード
バック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位の
スレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン酸残基
に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
【００８８】
なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。同プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
【００８９】
さらに、Ｌ−アミノ酸生産菌は、Ｌ−アミノ酸の生合成経路から分岐して他の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ−リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットなどに記載されている。
【００９０】
リジンデカルボキシラーゼ活性を低下または欠損させるためには、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA遺伝子とldcC遺伝子の両方の発現を低下させることが好ましい。両遺伝子の発現低下は、WO2006/078039号パンフレットに記載の方法に従って行うことが
できる。
【００９１】
これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終始コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一〜二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997））。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、又はトランスポゾン、IS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
【００９２】
例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡで腸内細菌科に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来
の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを
用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
【００９３】
好ましいＬ−リジン生産菌として、エシェリヒア・コリWC196ΔcadAΔldcC/pCABD2が挙げられる（WO2006/078039）。この菌株は、WC196株より、リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子を破壊し、リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することにより構築した株である。WC196株は、E.coli K-12に由来するW3110株から取得された株で、352番目のスレオニンをイソロイシンに置換
することによりＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子（米国特許第5,661,012号）でW3110株の染色体上の野生
型lysC遺伝子を置き換えた後、AEC耐性を付与することにより育種された（米国特許第5,827,698号）。WC196株は、Escherichia coli AJ13069と命名され、1994年12月6日、工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託セ
ンター、〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室）に受託番号FERM P-14690として寄託され、1995年9月29日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、
受託番号FERM BP-5252が付与されている(米国特許第5,827,698号)。WC196ΔcadAΔldcC自体も、好ましいＬ−リジン生産菌である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、2008年10月7日工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センター、〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 120号室
）に国際寄託され、受託番号FERM BP-11027が付与されている。
【００９４】
pCABD2は、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸合成酵素（DDPS）をコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のアスパルトキナーゼIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来
のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子
を含んでいる。
【００９５】
上記のようなＬ−リジン生合成に関与する酵素の遺伝子発現を増強する手法、酵素活性を低下させる方法は、その他のＬ−アミノ酸生合成酵素をコードする遺伝子についても同様に適用することができる。
【００９６】
＜Ｌ−バリン生産菌＞
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株(米国特許第5,998,178号)が挙げられるが、これらに限定
されない。アテニュエーションに必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去し、生産されるＬ−バリンによりオペロンの発現が減衰しないようにすることが好ましい。さらに、オペロンのilvA遺伝子が破壊され、スレオニンデアミナーゼ活性が減少することが好ましい。
【００９７】
Ｌ−バリン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、アミノアシルt-RNAシ
ンテターゼの変異を有する変異株(米国特許第5,658,766号)も挙げられる。例えば、イソ
ロイシンtRNAシンテターゼをコードするileS 遺伝子に変異を有するE. coli VL1970が使
用できる。E. coli VL1970は、1988年6月24日、ルシアン・ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・マイクロオルガニズムズ(VKPM) (1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia)に、受託番号VKPM B-4411で寄託されている。
【００９８】
さらに、生育にリポ酸を要求する、及び／または、H+-ATPaseを欠失している変異株(WO96/06926)を親株として用いることができる。
【００９９】
＜Ｌ−イソロイシン生産菌＞
Ｌ−イソロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、６-ジメチルア
ミノプリンに耐性を有する変異株(特開平5-304969号)、チアイソロイシン、イソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに耐性を有する変異株、さらにDＬ−エチ
オニン及び／またはアルギニンヒドロキサメートに耐性を有する変異株(特開平5-130882
号).が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、スレオニンデアミナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼなどのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(特開平2-458号, FR 0356739, 及び米国特許第5,998,178号)。
【０１００】
＜Ｌ−メチオニン生産菌＞
Ｌ−メチオニン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、Ｌ−スレオニン要求株、ノルロイシンに耐性を有する変異株が挙げられるが、これらに限定されない(特開2000-139471号)。さらに、メチオニンリプレッサーを欠損した株や、ホモセリントランス
サクシニラーゼ、シスタチオニンγ-シンテースなどのＬ−メチオニン生合成に関与する
タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された組換え株もまた親株として使用できる(
特開2000-139471号)。
【０１０１】
＜Ｌ−ロイシン生産菌＞
Ｌ−ロイシン生産菌又はそれを誘導するための親株の例としては、ロイシン耐性のE. coli株 (例えば、57株 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号))またはβ-２-チエニルア
ラニン、３-ヒドロキシロイシン、４-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンなどのロイシンアナログ耐性のE. coli株(特公昭62-34397号及び特開平8-70879号)、WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法で得られたE. coli株、E. coli H-9068 (特開平8-70879号)などのエシェリヒア属に属する株が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明に用いる細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、好ましくはＬ-ロイシンによるフィードバック阻害が解除されたイソプロピルマレートシンターゼをコ
ードする変異leuA遺伝子(米国特許第6,403,342号)に代表される、leuABCDオペロンの遺伝子が挙げられる。さらに、本発明に用いる細菌は、細菌の細胞からＬ−アミノ酸を排出するタンパク質をコードする遺伝子の１種以上の発現が増大されることにより改良されていてもよい。このような遺伝子の例としては、b2682遺伝子及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP 1239041 A2)が挙げられる。
【０１０３】
＜１−２＞  アルギン酸資化能の付与
本発明の細菌は、アルギン酸の資化性を有するように改変された細菌である。
本発明において、アルギン酸とは、D-マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の重合多糖を意味する。
【０１０４】
本明細書において使用する「アルギン酸」という用語は、β−１，４’−マンヌロノ−１，４’−Ｌ−グルロノグリカンとも呼ばれるβ−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とα−Ｌ−グルロン酸（Ｇ）の２種のウロン酸のピラノース環が主としてβ１→４結合した多糖を指す。アルギン酸中にはβ−Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｍ）」または「Ｍブロック」とも呼ぶ）、α−Ｌ−グルロン酸のホモポリマー（以下、「ポリ（Ｇ）」または「Ｇブロック」とも呼ぶ）、β−Ｄ−マンヌロン酸とα−Ｌ−グルロン酸のヘテロ
ポリマー（以下、「ポリ（ＭＧ）」または「ＭＧブロック」とも呼ぶ）の領域が存在する。アルギン酸の由来には限定なく、例えば、褐藻類などの藻類、細菌類などから得ることができる。
【０１０５】
Ｌ−アミノ酸生産能の付与とアルギン酸資化能の付与はいずれを先に行ってもよい  アルギン酸の資化性を有するように改変されたとは、アルギン酸を主とする炭素源で生育でき、Ｌ−アミノ酸を生産するようにに改変された細菌を意味する。野生株よりアルギン酸を資化するように改変されていることが好ましいが、例えば培地中のアルギン酸を0.5g/L以上、望ましくは1g/L以上、さらに望ましくは2.5g/L以上資化できるように改変されていることが好ましい。
【０１０６】
アルギン酸の資化性は、
i)アルギン酸リアーゼ活性を増強すること
ii) アルギン酸取り込み担体の活性を増強すること
iii) ケト酸還元酵素の活性を増強すること
のいずれか一つ以上の性質を付与する、あるいは全ての性質を付与することによって達成できる。
【０１０７】
本発明において、「アルギン酸リアーゼ」という用語は、アルギン酸に作用するリアーゼを指す。「リアーゼ」は、基質から加水分解や酸化によらず、ある基を脱離させ二重結合を残す反応を触媒する酵素の総称である。詳細には、アルギン酸リアーゼは、β脱離反応によってアルギン酸を分解する。具体的には、アルギン酸の脱離反応により非還元末端に4-deoxy-α-D-mann-4-enuronosyl基をもつオリゴ糖を生成する酵素である。本明細書において使用する「アルギン酸リアーゼ活性」という用語は、上記のような酵素の活性を意味する。
【０１０８】
アルギン酸リアーゼはその基質特異性に基づいて、ポリ（Ｍ）に特異的に作用するもの（ＥＣ４．２．２．３）、ポリ（Ｇ）に特異的に作用するもの（ＥＣ４．２．２．１１）、さらにポリ（ＭＧ）に作用するものなどに分類され得る。本発明のポリペプチドは、いずれの基質に作用するものであってもよく、１つの実施態様において、ポリ（Ｍ）選択的であり、別の実施態様において、ポリ（Ｇ）選択的である。本明細書において使用する「ポリ（Ｍ）選択的」という用語は、アルギン酸リアーゼがポリ（Ｇ）に比較してポリ（Ｍ）に優先的に作用することを指し、本明細書において使用する「ポリ（Ｇ）選択的」という用語は、アルギン酸リアーゼがポリ（Ｍ）に比較してポリ（Ｇ）に優先的に作用することを指す。いずれの場合も、さらにポリ（ＭＧ）に対する作用を有してもよい。
【０１０９】
アルギン酸リアーゼの活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、そのアルギン酸リアーゼ活性を比較することにより、確認できる。アルギン酸リアーゼの活性が増強されたことは、不飽和の反応生成物を235nmの吸
光度を測定することで測定でき、比較対象としては、エシェリヒア・コリW3110やMG1655
、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869, ATCC13032を使用することが出来る。
【０１１０】
本発明のアルギン酸リアーゼは、アゾトバクター属、シュードモナス属、コベティア属、スフィンゴモナス属、クレブシエラ属、アルテノモナス属、ロドバクター属、シェワネラ属由来のものが利用でき、なかでもビブリオ属細菌のアルギン酸リアーゼを使用することが出来る。例えば、Vibrio alginolyticsVibrio splendidus、Vibrio kanaloaei、Vibrio pomeroyi、Vibrio chagasii、Vibrio lentus、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio crassostreae、Vibrio hemicentroti、Vibrio sp. JAM-A9m、Vibrio rumoiensisまたはVibrio alginovoraを利用することが出来る。
【０１１１】
また、ビブリオ属のアルギン酸遺伝子は以下のGenbankのデータベースを利用すること
によって取得できる。
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032
Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020
Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome I, complete sequence; BA000037
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome II, complete sequence; BA000038
【０１１２】
また、ビブリオ属の遺伝子は下記表に記載のGenbankのデータベースのIDを参照するこ
とによって取得できる。具体的には、NCBIのURL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/から下記表のAssembly IDを入力し、各々のAssembly IDについてWGS(Whole Genome Sequence) Projectのページからダウンロードすることによってビブリオ属の遺伝子を取得することができる。
【０１１３】
【表１−１】
2016192903.tif 000002
【０１１４】
【表１−２】
2016192903.tif 000003
【０１１５】
【表１−３】
2016192903.tif 000004
【０１１６】
【表１−４】
2016192903.tif 000005
【０１１７】
【表１−５】
2016192903.tif 000006
【０１１８】
【表１−６】
2016192903.tif 000007
【０１１９】
【表１−７】
2016192903.tif 000008
【０１２０】
【表１−８】
2016192903.tif 000009
【０１２１】
【表１−９】
2016192903.tif 000010
【０１２２】
【表１−１０】
2016192903.tif 000011
【０１２３】
【表１−１１】
2016192903.tif 000012
【０１２４】
アルギン酸リアーゼは、上記に示される海藻及び海藻を食源として生育する生物に付着する微生物から取得され得る。例えば、サザエ、アワビ、タツナミガイ、ウマヅラハギ、ブダイ、マダイ、ベラ等に付着する微生物取得され得る。
【０１２５】
一例を示すと、NITE P-01635由来（以下本明細書では、Vibrio sp. SA2株と示すことがある）のアルギン酸リアーゼを使用することが出来、特に以下に示すポリペプチドを使用することが出来る。NITE P-01635株は、受託番号NITE P-01635株で、独立行政法人製品評価技術基盤機構（千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室）に国内寄託されている（受
託日：２０１３年６月１３日）。
【０１２６】
AlyB  ペリプラズムに局在するアルギン酸リアーゼであり、コードするalyB遺伝子配列を配列番号２０に、アミノ酸配列を配列番号２１に示す。
AlyD  ペリプラズムに局在するアルギン酸リアーゼであり、コードするalyD遺伝子配列を配列番号４にアミノ酸配列を配列番号５に示す。
OalB 細胞質に局在するアルギン酸リアーゼであり、コードするoalB遺伝子配列を配列
番号１０に、アミノ酸配列を配列番号１１に示す。
OalC 細胞質に局在するアルギン酸リアーゼであり、コードするoalC遺伝子配列を配列
番号１２に、アミノ酸配列を配列番号１３に示す。
【０１２７】
本発明のアルギン酸リアーゼ（以下酵素）は、元の機能が維持されている限り、上記例示した本発明のアルギン酸リアーゼのバリアントであってもよい。なお、そのようなバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示した本発明の酵素、例えば各種alyB,alyD,oalB,oalC遺伝子にコードされるタン
パク質、のホモログや人為的な改変体が挙げられる。
【０１２８】
「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントが、元のタンパク質の活性に対応する活性を有することをいう。すなわち、アルギン酸リアーゼについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質がアルギン酸リアーゼ活性を有することをいい、アルギン酸リアーゼ活性についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質がアルギン酸リアーゼ活性ゼ活性を有することを意味する。
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合は、各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体が対応する活性を有することであってよい。すなわち、例えば、アルギン酸リアーゼの各サブユニットについての「元の機能が維持されている」とは、各サブユニットが残りのサブユニットと複合体を形成し、当該複合体がマレートチオキナーゼ活性を有することであってよい。
【０１２９】
上記例示した本発明の酵素のホモログをコードする遺伝子は、例えば、上記例示した本発明の酵素をコードする遺伝子の塩基配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、上記例示した本発明の酵素のホモログをコードする遺伝子は、例えば、細菌や酵母の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。
【０１３０】
上記例示した本発明の酵素の保存的バリアントをコードする遺伝子は、例えば、以下のような遺伝子であってよい。すなわち、本発明の酵素をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限りにおいて、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。この場合、対応する活性は、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加される前のタンパク質に対して、通常60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90％以上が
維持され得る。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個を意味する。
【０１３１】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、
置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場
合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミ
ノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入
、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合など
の天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【０１３２】
さらに、上記のような保存的変異を有する遺伝子は、上記アミノ酸配列全体に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有し、かつ、元の機能が維持されたタンパク質をコードす
る遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を指すことがある。
【０１３３】
また、本発明の酵素をコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、元の機能が維持されたタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相
同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは、68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【０１３４】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、これらの塩基配列を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとして、300 bp程度の長さのDNA断片を用い
る場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【０１３５】
また、本発明の酵素をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、任意のコドンがそれと等価のコドンに置換されたものであってもよい。例えば、本発明の酵素をコードする遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されたものであってもよい。
【０１３６】
なお、上記の遺伝子やタンパク質の保存的バリアントに関する記載は、以下に記載の任意のタンパク質、およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【０１３７】
本発明において、アルギン酸取り込み担体とは、アルギン酸を細胞質外から細胞質内に取り込む機能を有するタンパク質を意味する。
【０１３８】
アルギン酸取り込み担体はアゾトバクター属、シュードモナス属、コベティア属、スフィンゴモナス属、クレブシエラ属、アルテノモナス属、ロドバクター属、シェワネラ属由来のものが好ましく、なかでもビブリオ属細菌のアルギン酸リアーゼを使用することが出来る。例えば、Vibrio alginolytics、 Vibrio splendidus、Vibrio kanaloaei、Vibrio pomeroyi、Vibrio chagasii、Vibrio lentus、Vibrio cyclitrophicus、Vibrio crassostreae、Vibrio hemicentroti、Vibrio sp. JAM-A9mを利用することが出来る。特にビブリ
オ属細菌のアルギン酸担体は、NITE P-01635株から取得されることが好ましい。
【０１３９】
アルギン酸取り込み担体は、外膜、内膜いずれにも存在しており、例えば外膜に存在するタンパク質としては、ポリンを構成するKdgNタンパク質が挙げられる。
【０１４０】
一例として、ビブリオ属NITE P-01635株のKdgNをコードするkdgN遺伝子の配列を配列番
号１４に、KdgNタンパク質を配列番号１５に示す。
【０１４１】
内膜に存在するタンパク質としては、ToaA、ToaB、ToaCが挙げられる。例えばビブリオ属NITE P-01635株のToaAをコードするtoaA遺伝子を配列番号２に、ToaAタンパク質を配列番号３に示す。NITE P-01635株のToaBをコードするtoaB遺伝子を配列番号16に、ToaBタンパク質を配列番号17に示す。NITE P-01635株のToaCをコードするtoaC遺伝子を配列番号18に、ToaCタンパク質を配列番号19に示す。
【０１４２】
アルギン酸取り込み活性が増強されたことは、細胞内外のアルギン酸の濃度をカルバゾール硫酸法によって測定することによって確認することが出来る。（生物化学実験法１  還元糖の定量法）、比較対象としては、エシェリヒア・コリW3110やMG1655、コリネバク
テリウム・グルタミカムATCC13869, ATCC13032を使用することが出来る。
【０１４３】
本発明において、ケト酸還元酵素とは、アルギン酸リアーゼによって生成したウロン酸多糖をピルビン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸に分解する経路に関与する酵素を意味し、具体的には、NADPH/NADHデヒドロゲナーゼ、D-マンノネートデヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ、２−ケト−３−デオキシ６ホスホグルコン酸アルドラーゼから選択される酵素を意味する。
【０１４４】
本発明において、NADPH/NADHデヒドロゲナーゼとは、NADPHまたはNADHの還元力を利用
して4-デオキシ−Ｌ−エリスロ−５−ヘキソセウロースウロン酸（deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid 化合物略称:DEHまたはDEHU)を２−ケト−３−デオキシ−D−グルコン酸（2-keto-3-deoxy-D-gluconate化合物略称：2-keto-3-deoxygluconateまたはKDG）へ還元する酵素）を意味する。
【０１４５】
NADPH/NADHデヒドロゲナーゼが増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、NADPH/NADHデヒドロゲナーゼ活性を比較することにより、確認できる。NADPH/NADHデヒドロゲナーゼ活性がが向上したことの確認はWargackiらの方法により測定することが可能である（Science 335, 308 2012） 、比較対象としては、エシェリヒア・コリW3110やMG1655、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869, ATCC13032を使用することが出来る。
【０１４６】
NADPH/NADHデヒドロゲナーゼは、dehR遺伝子がコードしており、dehR遺伝子は、アルギン酸資化能を有する微生物から取得されることが好ましく、アゾトバクター属、シュードモナス属、コベティア属、スフィンゴモナス属、クレブシエラ属、アルテノモナス属、ロドバクター属、シェワネラ属由来のものが好ましく 、なかでもビブリオ属細菌のアルギ
ン酸リアーゼを使用することが出来る。例えば、Vibrio alginolytics、Vibrio splendidus 、Vibrio kanaloaei、Vibrio pomeroyi、Vibrio chagasii、Vibrio lentus、 Vibrio cyclitrophicus、Vibrio crassostreae、Vibrio hemicentroti、Vibrio sp. JAM-A9mを利用することが出来る。
【０１４７】
特に本発明においてはビブリオ属細菌由来のdehR遺伝子を使用することが望ましい。一例を示すと、ビブリオ属  NITE P-01635株のdehR遺伝子を配列番号22に、dehR遺伝子を配列番号23に記載する。
【０１４８】
本発明において、D-マンノネートデヒドラターゼとは、EC Number: 4.2.1.8 に示され
るD-マンヌロン酸を脱水し、2-dehydro-3-deoxy-D-gluconateを生成する酵素を意味する
。D-マンノネートデヒドロゲナーゼは、マンヌロン酸デヒドロゲナーゼ、D-マンノネートハイドロリアーゼとも呼ばれる。
【０１４９】
D-マンノネートデヒドラターゼ活性が増大したことは、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、D-マンノネートデヒドラターゼ活性を比較することにより、確認できる。NADPH/NADHデヒドロゲナーゼ活性がが向上したことの確認はD-マンノネートデヒドロゲナーゼ活性は、2-dehydro-3-deoxy-D-gluconateの定量により活性測
定できる。（Methods Enzymol. 1982  （90） p288-94.）、比較対象としては、エシェリヒア・コリW3110やMG1655、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869, ATCC13032を
使用することが出来る。
【０１５０】
D-マンノネートデヒドラターゼは、腸内細菌科に属する微生物や、アルギン酸資化能力を有する微生物に広く存在しており、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、ビブリオ属由来の遺伝子を使用することが出来る。本発明において、D-マンノネートデヒドラターゼは特にビブリオ属細菌、エシェリヒア・コリ由来のものを使用することが好ましい。
【０１５１】
エシェリヒア・コリ由来の、D-マンノネートデヒドラターゼをコードする遺伝子uxuAを配列番号54に、UxuAタンパク質を配列番号55に記載する。
【０１５２】
本発明において、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼとは、EC Number: 2.7.1.178/2.7.1.45に示される2-dehydro-3-deoxy-D-gluconateから、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸を生成する反応を可逆的に触媒する酵素である。２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ活性は、ケトデオキシグルコノキナーゼ、KDGキナーゼとも呼ば
れる。
【０１５３】
２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼの活性の増強は、例えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ活性を比較することにより、確認できる。
【０１５４】
２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼ活性の増強はMandran-Berthlot M-Aらの論文1984年 Jornal of Bacteriology Vol.160 p600-606に記載のADPの増加を酵素的に測定す
る方法で確認することが出来る。、比較対象としては、エシェリヒア・コリW3110やMG1655、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869, ATCC13032を使用することが出来る。
【０１５５】
本発明において、２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼは、腸内細菌科に属する微生物や、アルギン酸資化能力を有する微生物に広く存在しており、エシェリヒア属、エンテロバクター属、パントエア属、ビブリオ属由来の遺伝子を使用することが出来る 。本
発明において、D-マンノネートデヒドラターゼは特にビブリオ属細菌、エシェリヒア・コリ由来のものを使用することが好ましい。
【０１５６】
ビブリオ属NITE P-01635由来の２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼをコードするkdgK遺伝子配列を配列番号８に、KdgKタンパク質を配列番号９に示す。
【０１５７】
エシェリヒア・コリのの２−ケト−３−デオキシグルコノキナーゼをコードするkdgK遺伝子配列を配列番号５６に、KdgKタンパク質を配列番号５７に示す。
【０１５８】
本発明において、２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼとはEDAと称されるEC番号EC Number: 4.1.2.14の２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸（2-keto-3-deoxygluconate 6-phosphate）をピルビン酸とD-グリセルアルデヒド−３
−リン酸（D-glyceraldehyde 3-phosphate   別称Glyceraldehyde 3-phosphate)に分解する酵素を意味する。
【０１５９】
２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼ（以下EDA）活性は、例
えば、改変前の微生物と、改変後の微生物より粗酵素液を調製し、EDA活性を比較するこ
とにより、確認できる。
【０１６０】
EDA活性は、生成されるPyruvateを市販酵素LDHの反応でNADHの340nmの吸光度を用いて
測定することが出来る。、比較対象としては、エシェリヒア・コリW3110やMG1655、コリ
ネバクテリウム・グルタミカムATCC13869, ATCC13032を使用することが出来る。
【０１６１】
２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸アルドラーゼは、エントナー・ドゥドルフ経路を有するグラム陰性細菌由来の遺伝子を使用することが出来る。例えばエシェリヒア・コリ、ビブリオ属細菌、パントエア属細菌が挙げられる。EDAはコリネバクテリウ
ム・グルタミカムも有している。
【０１６２】
エシェリヒア・コリのEDA遺伝子としては、配列番号58に記載のeda遺伝子、配列番号59に記載のEDAタンパクが挙げられる。
【０１６３】
ビブリオ属細菌由来のeda遺伝子は配列番号６に記載の遺伝子、配列番号７に記載のタ
ンパク質を使用することが出来る。
【０１６４】
本発明において、i) アルギン酸リアーゼ活性を増強すること
ii) アルギン酸取り込み担体の活性を増強すること
iii) ケト酸還元酵素の活性を増強すること
いずれか一つ以上の形質が付与されていればよいが、より好ましくは全ての形質が付与されていることが好ましい。 エシェリヒア・コリを例とした場合の、全ての形質が付与さ
れた微生物のアルギン酸資化代謝経路のモデルを図５に示す。
【０１６５】
＜１−３＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、タンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【０１６６】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が野生株や親株等の非改変株に対して増大していることを意味する。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることをいう。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）またはタンパク質の量を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」とは、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することを含む。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、微生物が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。なお、本発明において「タンパク質」と酵素は同義である。
【０１６７】
タンパク質の活性は、非改変株と比較して増大していれば特に制限されないが、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその酵素活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【０１６８】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子
の発現を上昇させることによって達成される。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株と比較して、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。
【０１６９】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【０１７０】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主微生物の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（MillerI, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入さ
れてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復DNA配列（repetitive DNA）、トランスポゾンの
両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)法（Datsenko,
K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたtransduction法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやMini-Muを用いて染色体上にランダムに導入することも
できる（特開平2-109985号公報、US5,882,888、EP805867B1）。
【０１７１】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【０１７２】
また、遺伝子のコピー数の増加は、標的遺伝子を含むベクターを宿主微生物に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主微生物を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主微生物の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであるのが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。ベクターは、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等であってよい。エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとして、具体的には、例えば、pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184、pBR322、pSTV29（いずれもタカラバイオ社より入手可）、pMW219（ニッポンジ
ーン社）、pTrc99A（ファルマシア社）、pPROK系ベクター（クロンテック社）、pKK233‐2（クロンテック社製）、pET系ベクター（ノバジェン社）、pQE系ベクター（キアゲン社
）、広宿主域ベクターRSF1010が挙げられる。コリネ型細菌で自律複製可能なベクターと
して、具体的には、例えば、pHM1519(Agric, Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984))；pAM330（Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903(1984)）；これらを改良した薬剤耐性遺伝子を
有するプラスミド；特開平3-210184号公報に記載のプラスミドpCRY30；特開平2-72876号
公報及び米国特許5,185,262号明細書公報に記載のプラスミドpCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX
、pCRY31、pCRY3KE及びpCRY3KX；特開平1-191686号公報に記載のプラスミドpCRY2およびpCRY3；特開昭58-192900号公報に記載のpAJ655、pAJ611及びpAJ1844；特開昭57-134500号
公報に記載のpCG1；特開昭58-35197号公報に記載のpCG2；特開昭57-183799号公報に記載
のpCG4およびpCG11が挙げられる。
【０１７３】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に本発明の微生物に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の微生物で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【０１７４】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の微生物に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１７５】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を
鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同
遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい。
【０１７６】
なお、タンパク質が複数のサブユニットからなる複合体として機能する場合、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、それら複数のサブユニットの全てを改変してもよく、一部のみを改変してもよい。すなわち、例えば、遺伝子の発現を上昇させることによりタンパク質の活性を増大させる場合、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強してもよく、一部の発現のみを増強してもよい。通常は、それらのサブユニットをコードする複数の遺伝子の全ての発現を増強するのが好ましい。また、複合体を構成する各サブユニットは、複合体が目的のタンパク質の機能を有する限り、１種の生物由来であってもよく、２種またはそれ以上の異なる生物由来であってもよい。すなわち、例えば、複数のサブユニットをコードする、同一の生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよく、それぞれ異なる生物由来の遺伝子を宿主に導入してもよい。
【０１７７】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、公知の高発現プロモーターであるT7プロモーター、trpプロモーター、lacプロモーター、thrプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、およびPLプロモーターが挙げられる。また、コリネ型細菌を用いる場
合には、人為的に設計変更されたP54-6プロモーター（Appl.Microbiol.Biotechnolo., 53, 674-679(2000)）、コリネ型細菌内で酢酸、エタノール、ピルビン酸等で誘導できるpta、aceA、aceB、adh、amyEプロモーター、コリネ型細菌内で発現量が多い強力なプロモー
ターであるcspB、SOD、tufプロモーター（Journal of Biotechnology 104 (2003) 311-323, Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8587-96.）等のプロモーターを用いるこ
とができる。また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の-35、-10領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第00/18935号）。高活性型プロモーターとしては、各種tac様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やpnlp8プロモーター（WO2010/027045）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文（Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)）等に記載されている。
【０１７８】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列（リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう）をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列(5’-UTR)における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、ある
いは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。
【０１７９】
本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（WO2005/010175）により行うことが
できる。
【０１８０】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。エシェリヒア・コリ等において、ｍＲＮＡ分子の集団内に見出される６１種のアミノ酸コドン間には明らかなコドンの偏りが存在し、あるｔＲＮＡの存在量は、対応するコドンの使用頻度と直接比例するようである（Kane, J.F., Curr. Opin. Biotechnol., 6(5), 494-500 (1995)）。すなわち、過剰のレアコドンを含むｍＲＮＡが大量に存在すると翻訳の問題が生じ
うる。近年の研究によれば、特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＧＡ、又はＣＣＣコドンのクラスターが、合成されたタンパク質の量および質の両方を低下させ得ることが示唆されている。このような問題は、特に異種遺伝子の発現の際に生じうる。よって、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (20
00)）に開示されている。
【０１８１】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０１８２】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０１８３】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性の増強には、フィードバック阻害の低減および解除も含まれる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エ
チルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処
理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強させる手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【０１８４】
形質転換の方法は特に限定されず、従来知られた方法を用いることができる。例えば、エシェリヒア・コリ K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウム
で処理してDNAの透過性を増す方法（Mandel, M. and Higa, A.,J. Mol. Biol. 1970, 53,
159-162）や、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを導入する方法（Duncan, C. H., Wilson, G. A. and Young, F. E.., 1997. Gene 1: 153-167）を用いることができる。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類、及び酵母について知られているような、DNA受容菌の細胞を、組
換えDNAを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法（Chang, S.and Choen, S.N., 1979.Mol. Gen. Genet. 168: 111-115; Bibb, M. J., Ward, J. M. and Hopwood, O. A. 1978.Nature 274: 398-400; Hinnen, A., Hicks, J. B. and Fink, G. R. 1978. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 75: 1929-1933）も応用できる。
【０１８５】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１８６】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０１８７】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR等が挙げられる(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量は、非改変株と比較して
、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１８８】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)）。タンパク質の量は、非改変株と比較して、例えば、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１８９】
＜２＞本発明の製造法
本発明の製造法は、前述の細菌を用いてＬ−アミノ酸生産能を有し、かつアルギン酸資化能を有するように改変された細菌を海藻類から抽出された炭素源を含む培地で培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地からＬ−アミノ酸を回収する、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造方法である。
【０１９０】
本発明において「海藻類」とは、Macroalgaeと呼ばれる大型藻類を意味し、アオサ、アオノリなどの緑藻植物、アマノリ、オゴノリなどの紅藻植物、コンブ、アラメ、カジメ、ワカメ、ホンダワラなどの褐藻植物等、およびこれらから選択される複数種の組み合わせを指す。特に好ましくは、褐藻植物である。褐藻植物は、光合成の初期同化産物として糖アルコールであるマンニトールを多く貯蔵している点において好ましい。本発明において用いうる褐藻植物には、褐藻綱カヤモノリ目（Ｓｃｙｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）、シオミドロ目（Ｅｃｔｏｃａｒｐａｌｅｓ）、ウイキョウモ目（Ｄｉｃｔｙｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ）、ナガマツモ目（Ｃｈｏｒｄａｒｉａｌｅｓ）、イソガワラ目（Ｒａｌｆｓｉａｌｅｓ）、ケヤリモ目（Ｓｐｏｒｏｃｈｎａｌｅｓ）、ウルシグサ目（Ｄｅｓｍａｒｅｓｔｉａｌｅｓ）、コンブ目（Ｌａｍｉｎａｒｉａｌｅｓ）、ムチモ目（Ｃｕｔｌｅｒｉａｌｅｓ）、ウスバオオギ目（Ｓｙｒｉｎｇｏｄｅｒｍａｔａｌｅｓ）、クロガシラ目（Ｓｐｈａｃｅｌａｒｉａｌｅｓ）、アミジグサ目（Ｄｉｃｔｙｏｔａｌｅｓ）、チロプテリス目（Ｔｉｌｏｐｔｅｒｉｄａｌｅｓ）、アスコセイラ目（Ａｓｃｏｓｅｉｒａｌｅｓ）、ヒバマタ目（Ｆｕｃａｌｅｓ）、ドゥルビアエラ目（Ｄｕｒｖｉｌａｅａｌｅｓ）に属するものが挙げられるが、好ましくはマコンブ（Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ
）である。マコンブは海洋バイオマスとして非常に生産量が高く、また大型であることから、目的物質生産のための原料として安定して大量に供給することができる。
【０１９１】
本発明において海藻は、生のもの、乾燥したものいずれも利用することが可能であるが、好ましくは生のものを利用する。生の海藻を利用することによって、エネルギー消費量が極めて高い海藻の乾燥工程を省略することができ、また海藻糖化液を得る工程において水を別途添加する必要性がほとんどなく有利である。海藻を水に浸し膨潤させることにより、海藻中の無機塩類を抽出することができる。本発明において海藻は必要に応じて膨潤させてもよい。
【０１９２】
本発明において海藻は、必要に応じて細片化されていても良い。海藻の細片化は公知の方法によって行うことができ、例えば、ハサミ、ミキサー、超音波処理、フレンチプレス、石臼、乳鉢、ホモジナイザー、ガラスビーズ、ミリングマシーンなどを用いて所望の大きさになるまで細片化することができる。
【０１９３】
海藻に含まれるアルギン酸、セルロース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天などの炭素源は海藻から以下の方法で抽出される。
(1)抽出工程
原料海藻をよく洗浄した後、アルカリを加えて加熱し、藻体中のアルギン酸を可溶化する。海藻に含まれているアルギン酸は、海水中のミネラルと塩をつくり、不溶性のゼリー状態で細胞壁間に充填されている。海藻にナトリウム塩を加えることで、アルギン酸の不溶性塩が水溶性のアルギン酸ナトリウムに置換され、藻体外に溶出する。
(2)ろ過工程
アルギン酸が十分に溶け出したら、ろ過して不溶性成分を除き、アルギン酸ナトリウムの溶液を得る。可溶化したアルギン酸の粘性により、抽出液は高い粘性を帯びる。これをろ過するためには大量の水を加えて希釈し、粘性を下げる。
(3)析出
アルギン酸ナトリウムの水溶液に酸を加えて pH を下げ、再び不溶性のアルギン酸として析出させる。酸の代わりにカルシウム塩を用いると、これも不溶性のアルギン酸カルシウムとして析出させることもできる。
(4)乾燥
析出したアルギン酸を脱水した後よく洗浄し、乾燥させてアルギン酸を得る。このアルギン酸をアルカリで中和すれば、アルギン酸塩となる。中和に用いるアルカリにナトリウムを使えばアルギン酸ナトリウムに、カリウムを使えばアルギン酸カリウムとなる。
【０１９４】
上記のような工程で取得されたアルギン酸は、アルギン酸リアーゼによる酵素分解反応または酸による加水分解反応を行った後に培地の炭素源として用いることが好ましい。
例えば、海藻から発酵の主たる原料となる炭素源を得るには、海藻に塩酸やリン酸のような無機酸、硫酸のようなスルホン酸、酢酸、ギ酸のようなカルボン酸といった酸を添加して酸処理することにより海藻中の多糖の分解、すなわち糖化を促した海藻糖化液を得ることができる。
【０１９５】
また、海藻から発酵の主たる原料となる炭素源を得るにはアルギン酸リアーゼ（EC.4.2.2.3）またはλ-カラギナーゼ(Lambda-carrageenase、EC 3.2.1.162)またはペクチナーゼ、セルラーゼの酵素活性を持つ酵素で酵素処理することが望ましい。酵素処理することで海藻中の多糖の分解、すなわち糖化を促した海藻糖化液を得ることができる。
【０１９６】
前述の海藻糖化液を得るための工程である海藻の細片化、膨潤、酸処理、酵素処理の工程はそれぞれを独立して連続して行ってもよいし、いずれかの工程を同時に行ってもよい。また、これらの工程の順序を変えて行ってもよい。
【０１９７】
アルギン酸リアーゼは、上述した酵素を利用することが出来、細胞内で直接発現させて使用することも出来るし、別途単離したアルギン酸リアーゼを海藻処理物と反応させてアルギン酸を得てもよい。
【０１９８】
ペクチナーゼはポリガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼなどが利用できる。
【０１９９】
海藻に含まれるセルロースは、アルギン酸を含む多糖類を抽出、分離した後に、セルラーゼを加えることによって分解することが出来る。本発明において、セルラーゼとは、エンド−１，４−β−グルカナーゼとも称し、セルロースのβ１→４グルコシド結合を加水分解し、おもにセロビオースを生成する酵素を意味する。セルラーゼは、高等植物、細菌、糸状菌、木材腐朽菌、軟体動物などに存在する。本発明においては、セルラーゼの由来は問われず、微生物から抽出・精製したもの、或いは分子生物学的に製造したものを用いることもできる。
【０２００】
本発明の微生物は上記に例示される抽出工程により精製したアルギン酸塩を資化出来る微生物である。本発明においてアルギン酸塩とは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムを意味し、本発明の微生物は、アルギン酸、アルギン酸塩を主とした炭素源として生育できる微生物が好ましい。
【０２０１】
使用する培地は、微生物を用いた目的物質の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその
他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、海藻から得られた炭素源を用いることが出来る。
【０２０２】
海藻から得られた炭素源とは、アルギン酸、セルロース、グルコース、マンニトール、ペクチン、ガラクツロン酸、カラギーナン、寒天が挙げられる。典型的な褐藻類ではアルギン酸とマンニトールとグルコースを5:8:1の割合で含む（20 January Vol335 SCIENCE）
。
【０２０３】
培地には海藻から得られた炭素源が含まれていれば、その他の糖源例えば、グルコース、スクロース、フルクトース、グリセロール、エタノールが含まれていても構わない。
【０２０４】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ−ホモセリンなどの要求
物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。また、本発明の微生物を培養する際には、ある一定濃度の塩を含んでいることがなお好ましい。塩とは目的物質がカウンタイオンと結合して塩化したものでもよいし、食塩（NaClでもよい）なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【０２０５】
また生育や生産性を向上させるようなＬ−アミノ酸を添加する場合がある。例えばＬ−リジン発酵の場合、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−イソロイシンを、Ｌ−スレオニン発酵の場合、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ホモセリンを、Ｌ−トリプトファン発酵では、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン等を添加することが好ましい。添加濃度は0.01-10g/L程度である。
【０２０６】
培養は好気的条件下で１〜７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃〜４０℃、培養中のｐＨは５〜９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。発酵液からのＬ−アミノ酸の回収は通常イオン交換樹脂法、沈殿法その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ−アミノ酸が蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ−アミノ酸を回収することができる。
【参考例】
【０２０７】
＜参考例１＞Vibrio sp. SA2株の取得
石川県七尾市灘浦地区で採取されたサザエ をアルギン酸資化可能新規微生物のスクリ
ーニングに用いた（採取された場所  北緯：37.0981  東経：137.0499付近の海）。
【０２０８】
120℃、0.15MPaで20分間オートクレーブ処理することにより滅菌したダイゴ人工海水SP溶液(和光純薬社製、組成は下記参照)に、前述のサザエの殻をハンマーで砕き、緑褐色の消化管内容物を青エーゼで1ループすくいとって懸濁した。重合度2000以上のアルギン酸
ナトリウム（和光純薬社製一級試薬  300-400cP カタログ番号：192-09995）のみを炭素
源として含むアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地（組成は下記参照）にサザエ消化管の懸濁液を適宜ダイゴ人工海水で希釈してプレーティングした。培養温度25℃で培養時間75時間静置培養し、多数のコロニー形成を確認した。
【０２０９】
エーゼでコロニーをかきとり、生理食塩水に懸濁した後生理食塩水で3回洗浄した後、
新たに調製したアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地にプレーティングし、培養温度37℃で
培養時間50時間静置培養し、コロニー形成を確認した株をさらにアルギン酸ナトリウム選抜寒天培地でSIして、LB液体培地に15g/LのNaCl を追加添加した培地4mLに懸濁して試験
管培養を行った。培養温度は37℃、往復撹拌速度120rpmの条件で試験管振とう培養して吸光度600nmのODが0.3程度になったところで等量の滅菌20%グリセロールを加え-80℃で冷凍してグリセロールストックを作製し、超低温庫で保存した。最も早期にシングルコロニーを形成した菌株をSA2株と命名した。
【０２１０】
ダイゴ人工海水SP組成
MgCl2・6H2O         9.474g/L
CaCl2・2H2O         1.328g/L
Na2SO4              3.505g/L
KCl                 0.597g/L
NaHCO3              0.171g/L
KBr                 0.085g/L
Na2B4O7・10H2O       0.034g/L
SrCl2                0.012g/L
NaF                   3mg/L
LiCl                  1mg/L
KI                   0.07mg/L
CoCl2・6H2O          0.0002mg/L
AlCl3・6H2O          0.008mg/L
FeCl3・6H2O          0.006mg/L
Na2WO4・2H2O        0.0002mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O  0.0008mg/L
NaCl                 20.747g/L
【０２１１】
アルギン酸ナトリウム選抜寒天培地 組成
アルギン酸ナトリウム    5g/L
Na2HPO4                  6g/L
KH2PO4                   3g/L
NaCl                    0.5g/L
NH4Cl                    1g/L
NaCl                    21.247g/L
MgSO4・7H2O              0.246g/L
Thiamine・HCl           10mg/L
MgCl2・6H2O              9.474g/L
CaCl2・2H2O              1.328g/L
Na2SO4                   3.505g/L
KCl                     0.597g/L
NaHCO3                   0.171g/L
KBr                      0.085g/L
Na2B4O7・10H2O            0.034g/L
SrCl2                    0.012g/L
NaF                      3mg/L
LiCl                     1mg/L
KI                       0.07mg/L
CoCl2・6H2O              0.0002mg/L
AlCl3・6H2O              0.008mg/L
FeCl3・6H2O              0.006mg/L
Na2WO4・2H2O             0.0002mg/L
(NH4)6Mo7O24・4H2O        0.0008mg/L
Bacto Agar              15g/L
【０２１２】
＜参考例２＞
Vibrio sp. SA2株の分子系統樹解析
SA2株のグリセロールストック50μLをLB液体培地に15g/LのNaClを添加した寒天培地で37℃、16時間静置培養して得た菌体から、PurElute Bacterial Genomid Kit(Edgebio社製)を用いて全ゲノムDNAを抽出した。得られた全ゲノムDNAを次世代シークエンサーMiseq(イルミナ社製)にて分析し、BLAST解析（Altshul, et al. "Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs '' (1997) Nucleic Acids Research. 25.p3389-3402）によって16S rRNA遺伝子全長の配列を取得した（配列番号１）。そ
の結果、SA2株はVibrio rumoiensis type strain S-1株(DSM19141株)と16S rRNA遺伝子全長配列の比較において99.5%の相同性を示した(2塩基のギャップによる相違と6塩基の置換による相違を含む。図１）
【０２１３】
得られたSA2株の16S rRNA遺伝子全長配列から分子系統樹推定ソフトウェアMEGA ver.5.0(非特許文献Tamura, et al. (2011) Mol.Biol.Evol.28.p2731-2739)を用いて近隣結合法（非特許文献Saitou, et al. (1987) Mol.Biol.Evol.4.p406-425）によって分子系統樹を作製した（図２）。近隣結合法に用いる塩基置換モデルとしてはKimura 2-parameter modelを用いた。(非特許文献imura. (1980) J.Mol.Evol.16.p111-120参照)また作製した分子系統樹の樹形の信頼性を評価するため、1000回反復してブートストラップ法による検証を行った。（Felsenstein (1985) Evolution.39.p783-791参照）
【０２１４】
分子系統解析の結果、SA2株はVibrio属の種によって形成されるクラスターに属するこ
とが明らかとなった。SA2株は、Vibrio rumoiensis、Vibrio litoralis、Vibrio caseiにより形成されるクラスターに属することがブートストラップ値98％で支持された。また、SA2株はVibrio rumoiensisとクラスターを形成し、そのクラスターは89％のブートストラップ値で支持された。以上の結果より、SA2株はVibrio属の近縁種であることが明らかに
なった。そのため、SA2株をVibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）と命名した。
【０２１５】
＜参考例３＞
DNA-DNAハイブリダイゼーション法によるVibrio sp. SA2株の種の同定
Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）は、BLAST解析から、16S rRNA遺伝子全長配列の
相同性が、Vibrio rumoiensisと99.5%、Vibrio litoralisと97.9%、Vibrio caseiと96.3%であった。16S rRNA遺伝子全長配列の相同性が98.7%未満の微生物種は別種であると判断
できるとの報告があるため、Vibrio sp. SA2株はVibrio rumoiensisとのみ同種の微生物
である可能性が考えられた。（Stackebrandt, et al.  (2006)Microbiol. Today. 33.p152-155.）
【０２１６】
そこで発明者らは、DNA-DNAハイブリッド形成試験によるVibrio sp. SA2株の種の同定
をVibrio sp. SA2株とVibrio rumoiensis type strain の間で固定側DNAとプローブ側DNAを交換して3回ずつ実施した（川村好章著‘’細菌の系統分類と同定方法’’(2000)日本
細菌学雑誌.55.p545-584、鈴木健一朗ら編‘’微生物の分類・同定実験法  分子遺伝学・分子生物学的手法を中心に’’(2000)p34-47参照）。
【０２１７】
その結果、Vibrio sp. SA2株とVibrio rumoiensis type strainのゲノムDNAは36−39％の値を示し、平均で37.5％の相同値を示した(下記表２)。現在、微生物の種はDNA-DNAハ
イブリッド形成試験による相同値の比較の結果、70％以上の相同値を示す菌株同士を同種とすると定義されている（Wayne, et al. "Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics." (1987)Int. J. Syst. Bacteriol.3
7.p463-464.参照）。そのため、Vibrio sp. SA2株はVibrio rumoiensis type strainと別種に属する新規種の微生物であるとわかった。
【０２１８】
【表２】
2016192903.tif 000013
【０２１９】
＜参考例４＞
Vibrio sp. SA2株の最少培地での試験管培養
従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株の特徴として、40℃では高温すぎるため生
育不可能であることと、アルギン酸リアーゼ活性を持たず、アルギン酸資化能がないことが報告されていた（Garrity, et al.（2005）Bergey‘s manual of systematic bacteriology  2nd  Edition PartB p526-527）。そこで、発明者らはVibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl 15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーテ
ィングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後、メインの培養として下記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続9時間試験管培養を行なった。その結果、Vibrio sp.
SA2株（NITE P-01635株）のアルギン酸資化による有意な生育が見られた。そのため、Vibrio sp. SA2株は従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株とは異なったアルギン酸資
化能を有する新規微生物株であることが示された。
【０２２０】
アルギン酸ナトリウム最少液体培地 組成
アルギン酸ナトリウム     2.5g/L
Na2HPO4                  6 g/L
KH2PO4                   3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                    15.5g/L
MgSO4・7H2O              0.246g/L
Thiamine・HCl           10mg/L
【０２２１】
＜参考例５＞Vibrio sp. SA2株の最少培地での比最大増殖速度測定
Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養
した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mLの滅菌生理食
塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定した。その後
、表4に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、37℃、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。
【０２２２】
同様の試験管培養をメインの培養に用いた培地を下記に示す２種の、グルコースを単一
炭素源とするM9最少培地にそれぞれ変更して37℃、70rpmの条件で連続24時間試験管培養
を行なった。結果を表３及び図３に示す。得られた生育のデータから、各々の条件での比最大増殖速度を測定した（図4）。その結果、アルギン酸ナトリウム最少液体培地でのVibrio sp. SA2株の比最大増殖速度がエシェリヒア・コリMG1655株のグルコースM9液体培地
での比増殖速度の約2倍であることが明らかとなった。
【０２２３】
グルコースM9液体培地 組成
グルコース               2.5g/L
Na2HPO4                  6 g/L
KH2PO4                   3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                     0.5g/L 
MgSO4・7H2O              0.246g/L
Thiamine・HCl           10mg/L
【０２２４】
グルコースM9 NaCl液体培地 組成
グルコース               2.5g/L
Na2HPO4                  6 g/L
KH2PO4                   3 g/L
NH4Cl                    1 g/L
NaCl                    15.5g/L
MgSO4・7H2O              0.246g/L
Thiamine・HCl           10mg/L
【０２２５】
【表３】
2016192903.tif 000014
【０２２６】
＜参考例６＞Vibrio sp. SA2株のアルギン酸ナトリウム最少培地での生育可能温度測定
Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のグリセロールストックと、比較対照株としてエシェリヒア・コリMG1655株(ATCC 47076株)のグリセロールストックをLB NaCl15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度37℃で16時間静置培養
した。また、Vibrio rumoiensis S-1株(DSM 19141株)のグリセロールストックをLB NaCl 15g/L添加寒天培地に50μLずつプレーティングし、シード培養として培養温度31.5℃で16時間静置培養した。シード培養後、寒天培地上で増殖した菌体をエーゼでかきとって1mL
の滅菌生理食塩水に懸濁し、吸光度600nmの濁度を分光光度計U-2000（日立社製）で測定
した。その後、上記に示す唯一の炭素源としてアルギン酸ナトリウムを添加した最少液体培地5mLに、吸光度600nmの濁度が0.05となるように植菌した。恒温振とう培養装置TVS062CA(アドバンテック社製)を用いて、培養温度条件を37℃から43℃まで１℃ずつ変更した上、70rpmの条件で連続24時間試験管培養を行なった。その結果、表４に示すようにVibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）は40℃の培養温度でアルギン酸ナトリウム最少液体培地で
良好に生育し、Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）が40℃でアルギン酸ナトリウムを資化可能な微生物であることが示された。以上の実験結果より、Vibrio sp. SA2株は従来のVibrio rumoiensisに属する微生物株とは異なった40℃の高温で生育可能なアルギン酸資
化能を有する新規微生物種に属する新規微生物株であることが示された。
【０２２７】
【表４】
2016192903.tif 000015
【実施例】
【０２２８】
＜実施例１＞
Vibrio sp. SA2株(NITE P-01635株)ゲノム中のアルギン酸資化機能性遺伝子の同定
Vibrio sp. SA2株の全ゲノムDNAを次世代シークエンサーMiseq(イルミナ社製)にて分析し、BLAST解析（Altshul, et al.  (1997) Nucleic Acids Research. 25.p3389-3402））によって既報のVibrio splendidusが持つアルギン酸資化機能性遺伝子の配列（Wargacki,
et al. (2012) Science. 335.p308-313NCBI:Number AAMR0000  V12B）と相同性を持つVibrio sp. SA2株ゲノム中の新規遺伝子の塩基配列情報とそれらがコードする新規タンパク質のアミノ酸配列情報を取得した（表５）。この解析により、Vibrio sp. SA2株（NITE P-01635株）のゲノム中にアルギン酸資化機能性遺伝子が存在する可能性が示唆された。これらのVibrio sp. SA2株ゲノム中の新規遺伝子をエシェリヒア・コリで異種発現させるため、プラスミドの構築を後述の実施例で行った。
【０２２９】
【表５】
2016192903.tif 000016
【０２３０】
＜実施例２＞
Vibrio sp. SA2株ゲノム中のアルギン酸資化機能性遺伝子発現プラスミド構築の概要
Vibrio sp. SA2株ゲノム中に存在する上述の11個の遺伝子（配列番号２（toaA）、配列番号４（alyD） 、配列番号６（eda）、配列番号８（kdgK）、配列番号１０（oalB）、配列番号１２（oalC）、配列番号１４（kdgN）、配列番号１６（toaB）、配列番号１８（toaC）、配列番号２０（alyB）、配列番号２２（dehR））をエシェリヒア・コリ株において異種発現させるため、それぞれの遺伝子配列を増幅、搭載したプラスミドの構築を行った。手順としては、市販のプラスミドpSTV29(タカラバイオ社製)とpMW219(ニッポンジーン
社製)に複数の遺伝子断片を一度に連結してプラスミドに搭載できるIn Fusion HD cloning kit(タカラバイオ社製)を用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNAをテンプレートとして増幅したpSTV29-kdgN-alyB-toaA,pMW219-dehR-oalB-toaB-toaC,pMW219-oalC,pMW219-alyD-eda-kdgNを構築し、これらをテンプレートに再度PCRで増幅してIn Fusion HD cloning kitを用いてプラスミドを集約し、pSTV29-kdgN-alyB-toaA-oalC(pSA2S2と命名  配列番号２４)とpMW219-dehR-oalB-toaB-toaC-alyD-eda-kdgK(pSA2M4と命名  配列番号２５)を構築した。以下に構築に用いたプライマー配列と構築の手順を示す。
【０２３１】
（２−１）Vibrio sp. SA2株ゲノム中のアルギン酸資化機能性遺伝子発現プラスミドpSAS2の構築
配列番号２６、配列番号２７に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNA
をテンプレートとしてkdgN遺伝子を増幅した。配列番号２８、配列番号２９に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNAをテンプレートとしてalyB遺伝子を増幅した
。配列番号３０、配列番号３１に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNA
をテンプレートとしてtoaA遺伝子を増幅した。得られた３つの断片をHindIII,SalIで処理して精製したpSTV29にIn Fusion HD cloning kitを用いて連結し、pSTV29-kdgN-alyB-toaAを構築した。
【０２３２】
同様に、配列番号３２、配列番号３３に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNAをテンプレートとしてoalC遺伝子を増幅しをHindIII,SalIで処理して精製したpMW219にIn Fusion HD cloning kitを用いて連結し、pMW219-oalCを構築した。
【０２３３】
さらに、配列番号３４、配列番号３５に示したプライマーを用いてpSTV29-kdgN-alyB-toaA全長を、配列番号３６、配列番号３７に示したプライマーを用いてoalC遺伝子を含む
断片をPCRで増幅し両者をIn Fusion HD cloning kitを用いて連結し、pSA2S2（配列番号
２４)を構築した。
【０２３４】
（２−２）Vibrio sp. SA2株ゲノム中のアルギン酸資化機能性遺伝子発現プラスミドpSAM4の構築
配列番号３８、配列番号３９に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNA
をテンプレートとしてdehR遺伝子を増幅した。配列番号４０、配列番号４１に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNAをテンプレートとしてoalB遺伝子を増幅した
。配列番号４２、配列番号４３に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNA
をテンプレートとしてtoaB遺伝子とtoaC遺伝子をまとめて増幅した（toaB遺伝子とtoaC遺伝子はゲノム中で隣接して存在している）。得られた３つの断片をHindIII,SalIで処理して精製したpMW219にIn Fusion HD cloning kitを用いて連結し、pMW219-dehR-oalB-toaB-toaCを構築した。
【０２３５】
同様に、配列番号４４、配列番号４５に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNAをテンプレートとしてalyD遺伝子を増幅した。配列番号４６、配列番号４７に示
したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNAをテンプレートとしてeda遺伝子を増幅した。配列番号４８、配列番号４９に示したプライマーを用いてVibrio sp. SA2株ゲノムDNAをテンプレートとしてkdgK遺伝子を増幅した。得られた３つの断片をHindIII,SalI
で処理して精製したpMW219にIn Fusion HD cloning kitを用いて連結し、pMW219-alyD-eda-kdgKを構築した。
【０２３６】
さらに、配列番号５０、配列番号５１に示したプライマーを用いてpMW219-dehR-oalB-toaB-toaC全長を、配列番号５２、配列番号５３に示したプライマーを用いてalyD遺伝子、eda遺伝子、kdgK遺伝子を含む断片をPCRで増幅し両者をIn Fusion HD cloning kitを用いて連結し、pSA2M4（配列番号２５)を構築した。
【０２３７】
（２−３）Ｌ−グルタミン生産エシェリヒア・コリ MG1655ΔsucA株へのpSA2S2,pSA2M4の導入
エシェリヒア・コリ MG1655ΔsucA株（US7090988号公報参照）について定法にしたがいエレクトロコンピテントセルを作製し、エタノール沈殿したpSA2S2プラスミドDNA(1μg以上)を加え、1.8kV 25μFでエレクトロポレーションして、MG1655ΔsucA/pSA2S2株を構築
した。MG1655ΔsucA/pSA2S2株について定法にしたがいエレクトロコンピテントセルを作
製し、エタノール沈殿したpSA2M4プラスミドDNA(1μg以上)を加え、1.8kV 25μFでエレクトロポレーションして、MG1655ΔsucA/pSA2S2,pSA2M4株を構築した。
【０２３８】
＜実施例３＞
エシェリヒア・コリＬ−グルタミン酸生産株を用いたアルギン酸を単一の炭素源とする培地でのＬ−グルタミン酸生産
（３−１）アルギン酸加水分解物を炭素源とする培地の作製
アルギン酸ナトリウムを3Nの硫酸に終濃度75g/Lとなるよう加え、加えウォーターバス
にて65℃で3時間加温処理を行い酸によるアルギン酸の加水分解を行った。得られたアル
ギン酸ナトリウム溶液をKOHでpH7.0となるよう調製し、アルギン酸ナトリウム溶液を作製した。得られたアルギン酸ナトリウム加水分解溶液と各種塩類を添加し、下記に示したアルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地を調製した。
【０２３９】
アルギン酸ナトリウム加水分解物最少液体培地 組成
アルギン酸ナトリウム加水分解物    2.5g/L
Na2HPO4                           6 g/L
KH2PO4                            3 g/L
NaCl                              0.5 g/L
NH4Cl                             1 g/L
(NH4) 2 SO4                        1.25g/L
MgSO4・7H2O                       0.246g/L
Thiamine・HCl                    10mg/L
カナマイシン                     40mg/L
クロラムフェニコール             40mg/L
【０２４０】
（３−２）MG1655ΔsucA/pSA2S2,pSA2M4株によるアルギン酸加水分解物からのＬ−グルタミン酸生産
MG1655ΔsucA/pSA2S2,pSA2M4株のグリセロールストックを融解し、各100μLを、40 mg/Lのカナマイシンと40mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地に均一に塗布し、37
℃にて16時間静置培養した。得られたプレートのおよそ1/4量の菌体を、0.5mLの生理食塩水にけん濁し分光光度計U-2000（日立社製）で波長600nmの濁度を測定した。得られた菌
を含むけん濁液を、L字試験管にはりこんだ5 mLの前述のアルギン酸ナトリウム加水分解
物最少液体培地に、波長600nmの濁度が0.15になる液量を接種し、振とう培養装置TN-1506
(アドバンテック東洋社製)で回転攪拌数70rpm、39℃において72時間培養した。培養終了後、培地中に蓄積したＬ−グルタミン酸の量をバイオテックアナライザーAS310（サクラ
精機社製）を用いて測定した。
【０２４１】
結果を表６に示す。表６に示すように、アルギン酸資化機能性遺伝子相同性遺伝子を11個発現させたMG1655ΔsucA/pSA2S2,pSA2M4株は、アルギン酸加水分解物を単一の炭素源とする培地にて比較対照のベクターコントロールと比べて著量のＬ−グルタミン酸を蓄積した。
【０２４２】
【表６】
2016192903.tif 000017
【図１】
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【図２】
2016192903.tif 000019
【図３】
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【図４】
2016192903.tif 000021
【図５】
2016192903.tif 000022
【配列表】
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