(57)【要約】      （修正有）【課題】短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材、その製造方法及びそれを用いた細胞培養方法の提供。【解決手段】下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材。（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
【請求項２】
ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基材。
【請求項３】
ブロック（Ｂ）が水に対して溶解性を示すブロックであることを特徴とする請求項１または２に記載の細胞培養基材。
【請求項４】
ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（１）
【化１】
2016192957.tif 000039
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２およびＲ３は各々独立して、水素基、炭素数１〜６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ２とＲ３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項５】
ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（２）
【化２】
2016192957.tif 000040
（式中、Ｒ４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基であり、ａは１〜１０の整数を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項６】
ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（３）
【化３】
2016192957.tif 000041
（式中、Ｒ６は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ７は炭素数１〜６の炭化水素基を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項７】
ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（４）
【化４】
2016192957.tif 000042
（式中、Ｒ８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ１０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項８】
ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（５）
【化５】
2016192957.tif 000043
［式中、Ｒ１４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ１５は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｃ−Ｒ１６（式中、Ｒ１６は水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｂは１〜３００の整数であり、ｃは０〜６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。］
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項９】
ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（６）
【化６】
2016192957.tif 000044
（式中、Ｒ１８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ１９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ２０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ２１、Ｒ２２は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１０】
ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（７）
【化７】
2016192957.tif 000045
（式中、Ｒ２３は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２４、Ｒ２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１１】
ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（８）
【化８】
2016192957.tif 000046
（式中、Ｒ２６は水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１２】
ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（９）
【化９】
2016192957.tif 000047
（式中、Ｒ２７は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２８は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ２９、Ｒ３０は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１３】
全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対するブロック単位（ａ）の比率が５〜９５ｍｏｌ％であることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１４】
ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１５】
数平均分子量（Ｍｎ）が５，０００以上１００，０００以下であることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項１６】
下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸、エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
【請求項１７】
ブロック（Ｂ）が水に対して溶解性を示すブロックであることを特徴とする請求項１６に記載の細胞培養基材。
【請求項１８】
ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（１）
【化１０】
2016192957.tif 000048
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２およびＲ３は各々独立して、水素基、炭素数１〜６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ２とＲ３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６または１７に記載の細胞培養基材。
【請求項１９】
ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（２）
【化１１】
2016192957.tif 000049
（式中、Ｒ４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基であり、ａは１〜１０の整数を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６または１７に記載の細胞培養基材。
【請求項２０】
ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（３）
【化１２】
2016192957.tif 000050
（式中、Ｒ６は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ７は炭素数１〜６の炭化水素基を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６または１７に記載の細胞培養基材。
【請求項２１】
ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（４）
【化１３】
2016192957.tif 000051
（式中、Ｒ８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ１０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６〜２０の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２２】
ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（５）
【化１４】
2016192957.tif 000052
［式中、Ｒ１４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ１５は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｃ−Ｒ１６（式中、Ｒ１６は水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｂは１〜３００の整数であり、ｃは０〜６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。］
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６〜２０の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２３】
ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（６）
【化１５】
2016192957.tif 000053
（式中、Ｒ１８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ１９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ２０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ２１、Ｒ２２は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６〜２０の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２４】
ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（７）
【化１６】
2016192957.tif 000054
（式中、Ｒ２３は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２４、Ｒ２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６〜２０の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２５】
ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（８）
【化１７】
2016192957.tif 000055
（式中、Ｒ２６は水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６〜２０の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２６】
ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（９）
【化１８】
2016192957.tif 000056
（式中、Ｒ２７は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２８は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ２９、Ｒ３０は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする請求項１６〜２０の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２７】
全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対するブロック単位（ａ）の比率が５〜９５ｍｏｌ％であることを特徴とする請求項１６〜２６の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２８】
ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする請求項１６〜２７の何れか１項に記載の細胞培養基材。
【請求項２９】
下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
【請求項３０】
ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする請求項２９に記載の製造方法。
【請求項３１】
下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体
のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
【請求項３２】
下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、基材に化学結合で固定化することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
【請求項３３】
ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする請求項３２に記載の製造方法。
【請求項３４】
下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、基材に化学結合で固定化することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
【請求項３５】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の細胞培養基材を用いて、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）より高い温度で細胞を培養し、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くして増殖細胞を基材から剥離することを特徴とする細胞培養方法。
【請求項３６】
培養した細胞が最大直径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離することを特徴とする請求項３５に記載の細胞培養方法。
【請求項３７】
培養した細胞が単一細胞で剥離することを特徴とする請求項３５または３６に記載の細胞培養方法。
【請求項３８】
請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の細胞培養方法で剥離した細胞を用いて、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法に関する。さらに本発明は、細胞を最大直径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離することを可能にする細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞培養は生化学的な現象の理解や有用物質の産生などに用いられ、また近年、幹細胞の発見や培養技術の進歩により、再生医療を始めとする細胞を用いた治療に大きな注目が寄せられている。
【０００３】
細胞の多くは接着性を有しており、体内においてはコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの生体高分子に接着し、増殖・分化することが知られている。同様に、細胞培養においても接着性を有する細胞の多くは、培養する際に何らかの基材に接着する必要がある。従来、基材としては表面処理したガラスあるいは高分子が用いられていた。例えば、ポリスチレンにγ線照射あるいはシリコーンコーティングを行なった基材がある。また、コラーゲンやフィブロネクチンのような生体高分子を表面に塗布した支持体も用いられる。
【０００４】
増殖する細胞は基材上で培養後、一般的に別の基材に植え継ぐ必要が有り、多くの場合にはタンパク質分解酵素が用いられている。タンパク質分解酵素は細胞表面にあるタンパク質を分解し、細胞と基材の間の結合および細胞間の結合を切る役目を担っている。一方、タンパク質分解酵素は細胞の生存率に大きな影響を与えることが知られており、タンパク質分解酵素を用いずに細胞を基材から分離する手法は細胞にダメージを与えない方法として重要である。再生医療においても同様に、体外で培養した細胞にダメージを与えずに、さらに細胞間の結合を切断しない方法で細胞又は組織化した細胞を基材から分離し、体内に戻すことが求められており、タンパク質分解酵素を用いずに基材から分離する方法が求められている。
【０００５】
上記問題を解決するために、温度応答性ポリマーを基材表面に被覆した細胞培養基材が開示されている。（特許文献１）。このような基材によれば、周囲環境の温度降下による温度応答性ポリマーのゾル転移で基材表面の接着力を弱めて、細胞を剥離させ、ダメージを与えることなく細胞を分別回収することができる。通常、細胞は体温付近で接着・培養する必要があり、培養後、体温以下で細胞を剥離できる基材が必要となる。
【０００６】
水中におけるゾル転移温度［臨界溶解温度（Ｔ）］が体温以下の範囲にある温度応答性ポリマーとして、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（Ｔ＝２１℃）、ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド（Ｔ＝３２℃）、ポリ−Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド（Ｔ＝約２８℃）、ポリ−Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド（Ｔ＝約３５℃）、及びポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド
（Ｔ＝３２℃）等が記載されている（特許文献２、３）。
上記温度応答性ポリマーを細胞培養基材に用いる場合、臨界溶解温度以下に細胞培養基材の温度を下げる必要があるが、同時に細胞を低温化してしまう。さらに、剥離してくる細胞はシート状であり、その後、細胞を加工するためには、低温を維持したまま、ピペッティング等で細胞を分散させる必要があり、冷却時間が長くなってしまっていた。細胞の低温化は細胞の活性低下を及ぼすため、冷却時間の短縮が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ０１／０６８７９９号公報
【特許文献２】特公平０６１０４０６１号公報
【特許文献３】特開平５−２４４９３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、短時間での細胞剥離を可能にする細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法を提供することにある。さらに、もう一つの目的は、細胞を最大直径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離し、細胞の分散化作業を省略できる細胞培養基材、その製造方法およびそれを用いた細胞培養方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、以上の点を鑑み、鋭意研究を重ねた結果、温度応答性の重合体を、親水性の重合体でブロック共重合させたブロック共重合体を基材上に被覆し成膜することで、短時間での細胞剥離を可能にすること、細胞を最大直径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離できることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち本発明によれば、以下のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材が提供される。
［１］下記（Ａ）および（Ｂ）
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
［２］ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする［１］に記載の細胞培養基材。
［３］ブロック（Ｂ）が水に対して溶解性を示すブロックであることを特徴とする［１］または［２］に記載の細胞培養基材。
［４］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（１）
【００１１】
【化１】
2016192957.tif 000002
【００１２】
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２およびＲ３は各々独立して、水素基、炭素数１〜６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ２とＲ３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［５］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（２）
【００１３】
【化２】
2016192957.tif 000003
【００１４】
（式中、Ｒ４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基であり、ａは１〜１０の整数を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［６］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（３）
【００１５】
【化３】
2016192957.tif 000004
【００１６】
（式中、Ｒ６は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ７は炭素数１〜６の炭化水素基を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［７］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（４）
【００１７】
【化４】
2016192957.tif 000005
【００１８】
（式中、Ｒ８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ１０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［８］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（５）
【００１９】
【化５】
2016192957.tif 000006
【００２０】
［式中、Ｒ１４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ１５は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｃ−Ｒ１６（式中、Ｒ１６は水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｂは１〜３００の整数であり、ｃは０〜６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。］
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［９］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（６）
【００２１】
【化６】
2016192957.tif 000007
【００２２】
（式中、Ｒ１８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ１９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ２０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ２１、Ｒ２２は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１０］ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（７）
【００２３】
【化７】
2016192957.tif 000008
【００２４】
（式中、Ｒ２３は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２４、Ｒ２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１１］  ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（８）
【００２５】
【化８】
2016192957.tif 000009
【００２６】
（式中、Ｒ２６は水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１２］  ブロック（Ｂ）の繰り返し単位が下記一般式（９）
【化９】
2016192957.tif 000010
（式中、Ｒ２７は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２８は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ２９、Ｒ３０は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１］〜［６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１３］全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対するブロック単位（ａ）の比率が５〜９５ｍｏｌ％であることを特徴とする［１］〜［１２］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１４］ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする［１］〜［１３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［１５］  数平均分子量（Ｍｎ）が５，０００以上１００，０００以下であることを特徴とする［１］〜［１３］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
また、本発明によれば、以下の細胞培養基材が提供される。
［１６］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
［１７］ブロック（Ｂ）が水に対して溶解性を示すブロックであることを特徴とする［１６］に記載の細胞培養基材。
［１８］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（１）
【化１０】
2016192957.tif 000011
（式中、Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２およびＲ３は各々独立して、水素基、炭素数１〜６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ２とＲ３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］または［１７］に記載の細胞培養基材。
［１９］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（２）
【化１１】
2016192957.tif 000012
（式中、Ｒ４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基であり、ａは１〜１０の整数を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］または［１７］に記載の細胞培養基材。
［２０］ブロック（Ａ）の繰り返し単位が下記一般式（３）
【化１２】
2016192957.tif 000013
（式中、Ｒ６は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ７は炭素数１〜６の炭化水素基を表す。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］または［１７］に記載の細胞培養基材。
［２１］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（４）
【化１３】
2016192957.tif 000014
（式中、Ｒ８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ１０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、互いに独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］〜［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２２］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（５）
【化１４】
2016192957.tif 000015
［式中、Ｒ１４は水素原子またはメチル基を表し、Ｒ１５は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｃ−Ｒ１６（式中、Ｒ１６は水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｂは１〜３００の整数であり、ｃは０〜６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜５のアルキル基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。］
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］〜［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２３］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（６）
【化１５】
2016192957.tif 000016
（式中、Ｒ１８は水素原子又はメチル基であり、Ｒ１９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基であり、Ｒ２０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、Ｒ２１、Ｒ２２は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］〜［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２４］ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（７）
【化１６】
2016192957.tif 000017
（式中、Ｒ２３は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２４、Ｒ２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］〜［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２５］  ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（８）
【化１７】
2016192957.tif 000018
（式中、Ｒ２６は水素原子又はメチル基である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］〜［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２６］  ブロック（Ｂ）の親水性重合体の繰り返し単位が下記一般式（９）
【化１８】
2016192957.tif 000019
（式中、Ｒ２７は水素原子又はメチル基であり、Ｒ２８は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、Ｒ２９、Ｒ３０は各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、Ａ３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合である。）
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックであることを特徴とする［１６］〜［２０］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２７］全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対するブロック単位（ａ）の比率が５〜９５ｍｏｌ％であることを特徴とする［１６］〜［２６］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
［２８］ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）が３，０００以上１，０００，０００以下であることを特徴とする［１６］〜［２７］の何れか１項に記載の細胞培養基材。
また、本発明によれば、以下の製造方法が提供される。
［２９］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
［３０］ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする［２９］に記載の製造方法。
［３１］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
［３２］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、基材に化学結合で固定化することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
［３３］ブロック（Ｂ）が、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体であることを特徴とする［３２］に記載の製造方法。
［３４］下記（Ａ）および（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体を、基材に化学結合で固定化することを特徴とする細胞培養基材の製造方法。
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
また、本発明によれば、以下の細胞培養方法が提供される。
［３５］［１］〜［２８］の何れか１項に記載の細胞培養基材を用いて、ＬＣＳＴより高い温度で細胞を培養し、細胞増殖後に温度をＬＣＳＴより低くして増殖細胞を基材から剥離することを特徴とする細胞培養方法。
［３６］培養した細胞が最大直径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離することを特徴とする［３５］に記載の細胞培養方法。
［３７］培養した細胞が単一細胞で剥離することを特徴とする［３５］または［３６］に記載の細胞培養方法。
［３８］［３５］〜［３７］のいずれか１項に記載の細胞培養方法で剥離した細胞を用いて、細胞を培養することを特徴とする細胞培養方法。
【発明の効果】
【００２７】
温度応答性の重合体を、親水性の重合体でブロック共重合させた、ブロック共重合体から得られる膜を細胞培養基材に被覆すれば、細胞培養後、温度降下による基材表面の親水化が促進され短時間での細胞剥離が可能になる。また、細胞を最大直径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離することによって、シート状で剥離する場合に必要であった細胞の分散化作業を簡素化できる。具体的には、酵素消化による細胞剥離の工程を省略することにより、作業に要する時間、工程の削減、操作者毎の誤差の軽減につなげることができる。またこれによって、細胞培養後、冷却処理を施しても、細胞にダメージを与えることなく、短時間で細胞を分別回収できる細胞培養基材が得られるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を実施するための形態（以下、単に「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。以下の本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明を以下の内容に限定する趣旨ではない。本発明は、その趣旨の範囲内で適宜に変形して実施できる。
本発明の細胞培養基材は、特定の（Ａ）および特定の（Ｂ）のブロックを含むブロック共重合体が表面に被覆された基材である。
本発明の細胞培養基材の一つ（第一の発明）は、下記（Ａ）および（Ｂ）
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、ＨＬＢ値（グリフィン法）が９〜２０の範囲にある親水性重合体のブロック。
のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材である。
【００２９】
本明細書において、下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ；Ｌｏｗｅｒ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）とは、この温度よりも低い温度では高分子が水に溶解して透明の溶液になるが、この温度よりも高い温度では不溶化して白濁するか沈殿が生じ、相分離する温度である。
【００３０】
第一の発明におけるブロック（Ａ）はＬＣＳＴが０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロックである。本発明の培養基材を用いた場合に、体温付近で細胞接着性を付与すると共に、温度降下で細胞を剥離し、ダメージを与えることなく細胞を分別回収することを目的に、ブロック（Ａ）のＬＣＳＴは２５℃〜４５℃の範囲にあることが好ましく、２８℃〜４０℃の範囲にあることがさらに好ましい。ＬＣＳＴが０℃未満であれば細胞にダメージを与えることなく剥離することが困難となり、５０℃を超えれば体温付近で細胞を接着できなくなり、細胞培養が困難となる。
【００３１】
第一の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（１）
【００３２】
【化１９】
2016192957.tif 000020
【００３３】
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００３４】
Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
【００３５】
Ｒ２およびＲ３は各々独立して、水素基、炭素数１〜６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ２とＲ３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。
【００３６】
炭素数１〜６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはｎ−プロピル基、イソプロピル基が用いられる。
【００３７】
第一の発明における一般式（１）で表されるブロック（Ａ）としては、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチルー２−プロペニル）ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピペリジン、１−（１−オキソ−２−メチルー２−プロペニル）ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）モルホリン、４−（１−オキソ−２−メチルー２−プロペニル）モルホリンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドの重合体を、ＬＣＳＴを２８℃〜４０℃の範囲にするために、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体を用いることができる。
【００３８】
第一の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（２）
【００３９】
【化２０】
2016192957.tif 000021
【００４０】
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００４１】
Ｒ４は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
【００４２】
Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基であり、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、炭素数１〜３のアルキル基が用いられる。
【００４３】
炭素数１〜６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基が用いられる。
【００４４】
ａは１〜１０の整数であり、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、１〜３の整数が用いられる。
【００４５】
第一の発明における一般式（２）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくは２−（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの重合体を用いることができる。
【００４６】
第一の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（３）
【００４７】
【化２１】
2016192957.tif 000022
【００４８】
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００４９】
Ｒ６は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
【００５０】
Ｒ７は炭素数１〜６の炭化水素基を表し、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基が用いられる。
【００５１】
第一の発明における一般式（３）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはメチルビニルエーテルの重合体を用いることができる。
本明細書において、ＨＬＢ値（ＨＬＢ；Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅ）とは、Ｗ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｊ．  Ｓｏｃ．  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，  １，  ３１１（１９４９）．に記載の、水と油への親和性の程度を表す値であり、０から２０までの値を取り、０に近いほど親油性が高く、２０に近いほど親水性が高くなる。計算によって決定する方法として、アトラス法、グリフィン法、デイビス法、川上法があるが、本発明においてはグリフィン法で計算した値を使用し、ブロック単位中の親水部の式量とブロック単位の総式量を元に、下記の計算式で求めた。
ＨＬＢ値＝２０×（親水部の式量）÷（総式量）
【００５２】
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない、特定範囲のＨＬＢ値を有する親水性重合体のブロックである。
第一の発明におけるブロック（Ｂ）としては、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの（共）重合体を例示することができる。
【００５３】
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはタンパク質、ペプチド、糖タンパク質等の生体高分子と親和性の無いブロックまたは細胞と親和性の無いブロックであり、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、メトキシエチレン基、フルフリル基、ジアルキルアミノアルキル基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体である。
第一の発明におけるＨＬＢ値は９〜２０の範囲にあるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは１１〜２０の範囲にあり、さらに好ましくは１３〜２０の範囲にある。ＨＬＢ値が９未満である場合は、細胞剥離に必要な冷却時間が長くなり、細胞の活性低下を招く。
また、第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは水に対して溶解性を示すブロックであり、より好ましくは２０℃の水１００ｍＬに０．５ｇ以上溶解するブロックであり、さらに好ましくは２０℃の水１００ｍＬに１ｇ以上溶解するブロックである。
【００５４】
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（４）
【００５５】
【化２２】
2016192957.tif 000023
【００５６】
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００５７】
Ｒ８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。
【００５８】
Ｒ９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１〜１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は−Ｏ−を介して基Ａ１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１〜６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
【００５９】
Ｒ１０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
【００６０】
Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
【００６１】
Ａ１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
【００６２】
第一の発明における一般式（４）で表されるブロック（Ｂ）としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３−アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４−アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６−アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０−アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルエタノールアミン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルエタノールアミン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルエタノールアミン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルエタノールアミン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体を用いることができる。
【００６３】
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（５）
【００６４】
【化２３】
2016192957.tif 000024
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００６５】
Ｒ１４は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。
【００６６】
Ｒ１５は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｃ−Ｒ１６（式中、Ｒ１６は水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｂは１〜３００の整数であり、ｃは０〜６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。
【００６７】
Ｒ１６に用いられる炭素数１〜３０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が用いられる。
【００６８】
Ｒ１７に用いられる炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が用いられる。
【００６９】
第一の発明における一般式（５）で表されるブロック（Ｂ）としては、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルメタクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはポリエチレングリコールメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルアクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を用いることができる。
【００７０】
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（６）
【００７１】
【化２４】
2016192957.tif 000025
【００７２】
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００７３】
Ｒ１８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。
【００７４】
Ｒ１９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１〜１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は−Ｏ−を介して基Ａ１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１〜６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
【００７５】
Ｒ２０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
【００７６】
Ｒ２１及びＲ２２は、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくは、Ｒ２１及びＲ２２が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
【００７７】
Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
【００７８】
Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。
【００７９】
第一の発明における一般式（６）で表されるブロック（Ｂ）としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、またはジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウムまたはジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を用いることができる。
【００８０】
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（７）
【００８１】
【化２５】
2016192957.tif 000026
【００８２】
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００８３】
Ｒ２３は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。
【００８４】
Ｒ２４、Ｒ２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。
【００８５】
第一の発明における一般式（７）で表されるブロック（Ｂ）としては、アクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を用いることができる。
【００８６】
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（８）
【００８７】
【化２６】
2016192957.tif 000027
【００８８】
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロックを用いることができる。
【００８９】
Ｒ２６は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的にメチル基が用いられる。
【００９０】
第一の発明における一般式（８）で表されるブロック（Ｂ）としては、Ｎ−ビニルピロリドンの（共）重合体を用いることができる。
第一の発明におけるブロック（Ｂ）は、特に限定は無いが、下記一般式（９）
【化２７】
2016192957.tif 000028
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ２７は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
Ｒ２８は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１〜６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
Ｒ２９及びＲ３０は、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ２９及びＲ３０が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
Ａ３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
第一の発明における一般式（９）で表されるブロック（Ｂ）としては、アミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノメチル（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３−アミノプロピル（メタ）アクリレート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロピル（メタ）アクリレート、３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−プロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミドメチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、（メタ）アクリルアミドエチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、３−（メタ）アクリルアミドプロピルアミン、ジメチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミン、ジエチル［３−（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの（共）重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体である。
【００９１】
第一の発明の細胞培養基材に用いるブロック共重合体は、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはブロック単位（ａ）からなる（共）重合体のブロック（Ａ）、およびブロック単位（ｂ）からなる（共）重合体のブロック（Ｂ）を含むブロック共重合体を用いることができる。さらに好ましくは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体のブロック（Ａ）と２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体のブロック（Ｂ）を含むブロック共重合体を用いることができる。
【００９２】
全ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対する（ａ）の比率は１〜９５ｍｏｌ％であり、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、５〜８５ｍｏｌ％であることが好ましい。１ｍｏｌ％未満であれば細胞接着性が低下し、９５ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。
【００９３】
第一の発明に用いるブロック共重合体は、ブロック（Ａ）または（Ｂ）中に、ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を含有できる。
ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーとしては、スチレン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、９−ビニルアントラセン、１−ビニルピレンおよびその誘導体等の芳香族ビニル化合物、Ｎ−ｎ−オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−デシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクタデシル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−ビニル−ｎ−オクチルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−デシルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−ドデシルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−ヘキサデシルアミド等のＮ−ビニルアミド化合物、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド等のＮ−アルキルマレイミド化合物、フマル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、フマル酸ジ−ｎ−ブチル等のフマル酸ジエステル化合物、塩化ビニル、酢酸ビニル、（メタ）アクリロニトリル、Ｎ−ビニルイミダゾール、Ｎ−ビニルカルバゾールを例示できる。
【００９４】
さらに、第一の発明に用いるブロック共重合体は、ブロック（Ａ）または（Ｂ）以外の重合体ブロックを含むことができる。
【００９５】
ブロック（Ａ）または（Ｂ）以外の重合体ブロックを生成するモノマーとしては、前記ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーを例示できる。
第一の発明に用いるブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は３，０００以上１，０００，０００以下の範囲にあり、好ましくは４，０００以上５００，０００以下、さらに好ましくは５，０００以上１００，０００以下である。３，０００未満の場合は細胞培養基材に被覆しても細胞培養中に基材から培地中に溶出してしまう。また、１，０００，０００を越える場合は溶液粘度が高くなり、細胞培養基材への被覆が困難になる。
【００９６】
第一の発明に用いるブロック共重合体の合成方法としては、特に限定はないが、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１〜２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて、共重合する方法を用いることができる。
【００９７】
重合するモノマーの順番としては、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを（共）重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）または（ｂ）以外のモノマー単位を生成するモノマーを（共）重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ｂ）を生成するモノマーを（共）重合する方法を例示することができる。
本発明のもう一つの細胞培養基材（第二の発明）は、下記（Ａ）および（Ｂ）
（Ａ）水に対する下限臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）が０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロック。
（Ｂ）下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の要件を満たすブロック。
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物が生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
のブロックを含むブロック共重合体で表面を被覆した細胞培養基材である。
第二の発明におけるブロック（Ａ）はＬＣＳＴが０℃〜５０℃の範囲にある温度応答性重合体のブロックである。本発明の培養基材を用いた場合に、体温付近で細胞接着性を付与すると共に、温度降下で細胞を剥離し、ダメージを与えることなく細胞を分別回収するために、ブロック（Ａ）のＬＣＳＴは２５℃〜４５℃の範囲にあることが好ましく、２８℃〜４０℃の範囲にあることがさらに好ましい。ＬＣＳＴが０℃未満であれば細胞にダメージを与えることなく剥離することが困難となり、５０℃を超えれば体温付近で細胞培養が困難となる。
第二の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（１）
【化２８】
2016192957.tif 000029
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ１は水素原子又はメチル基であり、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
Ｒ２およびＲ３は各々独立して、水素基、炭素数１〜６の炭化水素基、フルフリル基またはテトラヒドロフルフリル基であり、Ｒ２とＲ３は互いに結合してピロリジン環、ピペリジン環もしくはモルホリン環を形成しても良い。
炭素数１〜６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはｎ−プロピル基、イソプロピル基が用いられる。
第二の発明における一般式（１）で表されるブロック（Ａ）としては、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド、１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチルー２−プロペニル）ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピペリジン、１−（１−オキソ−２−メチルー２−プロペニル）ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）モルホリン、４−（１−オキソ−２−メチルー２−プロペニル）モルホリンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミドの重合体を、ＬＣＳＴを２８℃〜４０℃の範囲にするために、さらに好ましくはＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの重合体を用いる。
第二の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（２）
【化２９】
2016192957.tif 000030
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ４は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
Ｒ５は、水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基であり、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、炭素数１〜３のアルキル基が用いられる。
炭素数１〜６の炭化水素基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基が用いられる。
ａは１〜１０の整数であり、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、１〜３の整数が用いられる。
第二の発明における一般式（２）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくは２−（２−エトキシ）エトキシエチルビニルエーテルの重合体が用いられる。
第二の発明におけるブロック（Ａ）は、特に限定は無いが、下記一般式（３）
【化３０】
2016192957.tif 000031
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ａ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ６は水素原子またはメチル基を表し、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、水素原子が用いられる。
Ｒ７は炭素数１〜６の炭化水素基を表し、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはメチル基、エチル基が用いられる。
第二の発明における一般式（３）で表されるブロック（Ａ）としては、ＬＣＳＴを２５℃〜４５℃の範囲にするために、好ましくはメチルビニルエーテルの重合体が用いられる。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）
（ｉ）０℃〜５０℃の範囲にＬＣＳＴを持たない。
（ｉｉ）カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸金属塩、スルホン酸基、スルホン酸エステル基、スルホン酸金属塩、ヒドロキシ基、アルコキシ基、フェノキシ基、アミド基、アミノアルキル基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、カルバメート基、リン酸基、リン酸基の金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基の金属塩、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの親水性重合体である。
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の重合体中に、芳香族ビニル化合物モノマーが生成するモノマー単位、（メタ）アクリルアミド化合物が生成するモノマー単位、フマル酸ジエステル化合物が生成するモノマー単位、塩化ビニルが生成するモノマー単位、酢酸ビニルが生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが生成するモノマー単位から選ばれる少なくとも１種のモノマー単位を含有する。
の要件を満たすブロックである。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはタンパク質、ペプチド、糖タンパク質等の生体高分子と親和性の無いブロックまたは細胞と親和性の無いブロックであり、ホスホベタイン基、スルホベタイン基、カルボベタイン基、ポリエチレングリコール基、メトキシエチレン基、フルフリル基、ジアルキルアミノアルキル基、ピロリドン基から選ばれる少なくとも１種の親水性基を有するモノマーの重合体を親水性重合体に用いたブロックである。
また、第二の発明におけるブロック（Ｂ）は、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは水に対して溶解性を示すブロックであり、より好ましくは２０℃の水１００ｍＬに０．５ｇ以上溶解するブロックであり、さらに好ましくは２０℃の水１００ｍＬに１ｇ以上溶解するブロックである。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（４）
【化３１】
2016192957.tif 000032
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
Ｒ９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１〜１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は−Ｏ−を介して基Ａ１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１〜６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
Ｒ１０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
Ａ１は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
第二の発明における一般式（４）で表される親水性重合体としては、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３−アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４−アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６−アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０−アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、２−アクリロイルオキシエチルホスホリルエタノールアミン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルエタノールアミン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルエタノールアミン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルエタノールアミン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルエタノールアミン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルエタノールアミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの重合体を用いることができる。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（５）
【化３２】
2016192957.tif 000033
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ１４は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
Ｒ１５は−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｂ−（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ）ｃ−Ｒ１６（式中、Ｒ１６は水素原子、炭素数１〜３０のアルキル基であり、ｂは１〜３００の整数であり、ｃは０〜６０の整数である。）で表されるポリオキシアルキレン基、−ＣＨ２−Ｏ−Ｒ１７（式中、Ｒ１７は水素原子、炭素数１〜６の炭化水素基である。）で表される置換基、フルフリル基、テトラヒドロフルフリル基、水素原子を示す。
Ｒ１６に用いられる炭素数１〜３０のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が用いられる。
Ｒ１７に用いられる炭素数１〜６のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ．−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために好ましくはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が用いられる。
第二の発明における一般式（５）で表される親水性重合体としては、ポリエチレングリコールメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレート、２−メトキシエチルメタクリレート、フルフリルアクリレート、フルフリルメタクリレート、テトラヒドロフルフリルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルメタクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはポリエチレングリコールメタクリレート、２−メトキシエチルアクリレートまたはテトラヒドロフルフリルアクリレートから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（６）
【化３３】
2016192957.tif 000034
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ１８は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
Ｒ１９は、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、又は（ポリ）オキシエチレン基：−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは本発明のブロック共重合体に適切な親水性と生体適合性を付与するブロック（Ｂ）の機能を損なわない限り特に限定されず、例えば１〜１０である。なお、該（ポリ）オキシエチレン基は−Ｏ−を介して基Ａ１と結合する。）であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１〜６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
Ｒ２０は、炭素数１〜４の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン等のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
Ｒ２１及びＲ２２は、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ２１及びＲ２２が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
Ａ２は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
Ｘはスルホン酸アニオン基、カルボン酸アニオン基、リン酸アニオン基ある。
第二の発明における一般式（６）で表される親水性重合体としては、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、またはジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、好ましくはジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（４−スルホナトブチル）アミニウムまたはジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウムから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（７）
【化３４】
2016192957.tif 000035
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ２３は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
Ｒ２４、Ｒ２５は各々独立して水素原子又はメチル基である。
第一の発明における一般式（７）で表される親水性重合体としては、アクリルアミドまたはＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（８）
【化３５】
2016192957.tif 000036
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ２６は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
第二の発明における一般式（８）で表される親水性重合体としては、Ｎ−ビニルピロリドンの重合体を用いることができる。
第二の発明におけるブロック（Ｂ）の親水性重合体は、特に限定は無いが、下記一般式（９）
【化３６】
2016192957.tif 000037
で表されるブロック単位の内、少なくとも１種類のブロック単位（ｂ）からなる重合体のブロックを用いることができる。
Ｒ２７は水素原子またはメチル基を表し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するためにメチル基が用いられる。
Ｒ２８は炭素数１〜１０の２価の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の炭素数１〜６の２価のアルキレン基であり、更に好ましくはエチレンである。
Ｒ２９及びＲ３０は、各々独立して、水素原子又は炭素数１〜４の炭化水素基であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくは、Ｒ２９及びＲ３０が同時に水素原子またはメチル基であり、更に好ましくは同時にメチル基である。
Ａ３は、エステル結合、アミド結合、ウレタン結合、及びエーテル結合からなる群から選択される２価の結合であり、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはエステル結合、アミド結合であり、特に好ましくはエステル結合である。
第二の発明における一般式（９）で表される親水性重合体としては、アミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノメチル（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、３−アミノプロピル（メタ）アクリレート、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロピル（メタ）アクリレート、３−（Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ）−プロピル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミドメチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、（メタ）アクリルアミドエチルアミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、ジエチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミン、３−（メタ）アクリルアミドプロピルアミン、ジメチル［３−（メタ）アクリルアミドプロピル］アミン、ジエチル［３−（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を例示できるが、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルアミノメチル（メタ）アクリレート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ジメチル［（メタ）アクリルアミドメチル］アミン、ジメチル［（メタ）アクリルアミドエチル］アミンから選ばれる少なくとも１つのモノマーの重合体を用いることができる。
第二の発明において上述の親水性重合体中に更に含有するモノマー単位としては、スチレン、１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン、９−ビニルアントラセン、１−ビニルピレンおよびその誘導体等の芳香族ビニル化合物が重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ−ｎ−オクチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−デシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−ドデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−オクタデシル（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリルアミド化合物が重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ−ビニル−ｎ−オクチルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−デシルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−ドデシルアミド、Ｎ−ビニル−ｎ−ヘキサデシルアミド等のＮ−ビニルアミド化合物が重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ−シクロヘキシルマレイミド、Ｎ−フェニルマレイミド等のＮ−アルキルマレイミド化合物が重合することによって生成するモノマー単位、フマル酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、フマル酸ジ−ｎ−ブチル等のフマル酸ジエステル化合物が重合することによって生成するモノマー単位、塩化ビニルが重合することによって生成するモノマー単位、酢酸ビニルが重合することによって生成するモノマー単位、（メタ）アクリロニトリルが重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルイミダゾールが重合することによって生成するモノマー単位、Ｎ−ビニルカルバゾールが重合することによって生成するモノマー単位を用いることができる。
第二の発明において、ブロック単位［（ａ）＋（ｂ）］に対する（ａ）の比率は１〜９５ｍｏｌ％であり、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、５〜８５ｍｏｌ％であることが好ましい。１ｍｏｌ％未満であれば細胞接着性が低下し、９５ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。
第二の発明において、ブロック共重合体を構成する全ブロック単位の量に対するブロックＡを構成するブロック単位（ａ）の量が４〜９４ｍｏｌ％であり、基材に被覆した場合に、細胞接着性を付与すると共に、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮するために、１０〜８５ｍｏｌ％であることが好ましい。４ｍｏｌ％未満であれば細胞接着性が低下し、９４ｍｏｌ％を超えれば細胞剥離に必要な冷却時間が長くなる。
第二の発明に用いるブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）は３，０００以上１，０００，０００以下の範囲にあり、好ましくは４，０００以上５００，０００以下、さらに好ましくは５，０００以上１００，０００以下である。３，０００未満の場合は細胞培養基材に被覆しても細胞培養中に基材から培地中に溶出してしまう。また、１，０００，０００を越える場合は溶液粘度が高くなり、細胞培養基材への被覆が困難になる。
第二の発明に用いるブロック共重合体の合成方法としては、特に限定はないが、株式会社エヌ・ティー・エス発行、“ラジカル重合ハンドブック”、ｐ．１６１〜２２５（２０１０）に記載のリビングラジカル重合技術を用いて、共重合する方法を用いることができる。
第二の発明において重合するモノマーの順番としては、１）親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、２）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合する方法、３）親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、更に未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合する方法、４）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと芳香族ビニル化合物を共重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、５）親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、６）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合する方法、７）親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、更に未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合する方法、８）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリルアミド化合物を共重合し、更に未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、９）親水性基を有するモノマーとフマル酸ジエステル化合物を共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１０）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーとフマル酸ジエステル化合物を共重合する方法、１１）親水性基を有するモノマーと塩化ビニルを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１２）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと塩化ビニルを共重合する方法、１３）親水性基を有するモノマーと酢酸ビニルを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと酢酸ビニルを共重合する方法、１４）親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリロニトリルを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１５）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーと（メタ）アクリロニトリルを共重合する方法、１６）親水性基を有するモノマーとＮ−ビニルイミダゾールを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１７）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーとＮ−ビニルイミダゾールを共重合する方法、１８）親水性基を有するモノマーとＮ−ビニルカルバゾールを共重合し、未反応モノマーを除いた後、ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合する方法、１９）ブロック単位（ａ）を生成するモノマーを重合し、未反応モノマーを除いた後、親水性基を有するモノマーとＮ−ビニルカルバゾールを共重合する方法を例示することができる。
【００９８】
本発明の細胞培養基材は、上記ブロック共重合体を例えば、各種溶媒に溶解させ、基材に塗布後、乾燥することによって製造することができる。
塗布に用いる溶媒としては残留していても培養細胞に及ぼす影響が小さい、エタノール、
水とエタノールの混合溶媒が好ましく用いられる。
【００９９】
基材としては、特に限定はないが、好ましくは各種疎水性ポリマー材料が用いられる。疎水性ポリマー材料としては、例えば、ポリメタクリル酸メチル等のアクリル系ポリマー、ポリジメチルシロキサン等の各種シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。また、金属基材、セラミックス基材あるいはガラス基材にシランカップリング剤で表面処理したものも用いることができる。
【０１００】
また、基材の形状は、特に限定はないが、例えば、板状、ビーズ状および繊維状の形状のほか、板状の基材に設けられた穴や溝や突起なども挙げられる。
【０１０１】
基材に塗布する方法としては、例えば、はけ塗り、ディップコーティング、スピンコーティング、バーコーティング、流し塗り、スプレー塗装、ロール塗装、エアーナイフコーティング、ブレードコーティングなど通常知られている各種の方法を用いることが可能である。
【０１０２】
本発明の培養基材に被覆されたブロック共重合体の厚さは１ｎｍ以上１０μｍ以下であり、好ましくは１０ｎｍ以上５μｍ以下であり、より好ましくは３０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であり、さらに好ましくは５０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である。１ｎｍ未満の場合は細胞培養基材に被覆した時に細胞剥離に必要な冷却時間が長くなってしまう。１０μｍを越える場合は細胞培養基材に被覆した時に細胞の接着性が低下する。
【０１０３】
本発明の培養基材の表面は、細胞培養後、温度降下による基材表面の親水化を促進し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、ミクロ相分離構造を有することが好ましい。
【０１０４】
ミクロ相分離構造のドメイン径およびドメイン間隔は、各ブロック単位の比率、ブロック共重合体の分子量、塗布方法および塗布条件で任意に制御できる。細胞培養後、温度降下による基材表面の親水化を促進し、細胞剥離に必要な冷却時間を短縮することを目的に、ドメイン径およびドメイン間隔を細胞増殖因子よりも大きく、細胞よりも小さいことが好ましい。
【０１０５】
本発明の細胞培養基材の製造方法としては、特に限定はないが、ブロック共重合体を前記塗布／乾燥する方法に加え、ブロック共重合体を化学結合で固定化する方法を用いることができる。
【０１０６】
化学結合で固定化する方法としては、特に限定はないが、ブロック共重合体を合成後、化学固定する方法と、ブロック重合体の合成と同時に固定化する方法を用いることができる。
【０１０７】
ブロック共重合体を合成後、化学固定する方法としては、特に限定はないが、ブロック共重合体中に予め特定の官能基を含有するモノマー単位を導入しておき、基材上の特定官能基と化学結合させる方法、ブロック共重合体を基材に塗布した後、電子線を照射して固定化する方法、ブロック共重合体の溶液中にラジカル発生剤（ベンゾフェノン等）を添加しておき、塗布した後、紫外線を照射する方法を例示することができる。
【０１０８】
ブロック共重合体中の官能基と基材上の官能基との化学結合で固定化する場合に用いる官能基の組み合わせとしては、特に限定は無いが、水酸基とアミノ基、メルカプト基とアミノ基、メルカプト基とマレイミド基、メルカプト基とメルカプト基、カルボキシル基とアミノ基、カルボキシル基と水酸基、水酸基と水酸基を例示することができる。
【０１０９】
ブロック共重合体中の官能基と基材上の官能基との反応において、特に限定はないが縮合試薬または架橋剤を添加することができる。
【０１１０】
ブロック共重合体の合成と同時に基材に固定化する方法としては、表面開始リビングラジカル重合技術を用いることができる。
【０１１１】
表面開始リビングラジカル重合は、ブロック共重合体鎖の起点となる基材表面に、重合開始剤を化学結合させ、該重合開始剤を始点として、リビングラジカル重合を行うことで、ブロック共重合体鎖を形成する手法であり、たとえば、特開２００９−５９６５９号公報や特開２０１０−２１８９８４号公報に記載された方法などを適用することができる。
【０１１２】
表面開始リビングラジカル重合で用いる基材としては、特に限定はないが、鋳鉄、鋼、ステンレス鋼などの鉄や鉄合金、アルミニウム、銅などの非鉄及び非鉄合金、さらには、シリコンウエハ、ガラス、石英などの非金属などを用いることができるが、本発明の細胞培養基材を、表面開始リビングラジカル重合で製造するために必要となる、重合開始剤をその表面に化学結合可能な材料、具体的には、シリコンウエハ、雲母の剥離片などの劈開性の鉱物、表面上に水酸基などの反応性置換基が存在する平面基材などが好ましく用いられる。
【０１１３】
重合開始剤としては、特に限定されないが、基材に化学結合可能な基と、ラジカル発生基とを有する化合物が好ましく、たとえば、特開２０１０−２１８９８４号公報に開示されている重合開始剤、すなわち、ＴＥＭＰＯ系、ＡＴＲＰ系、ＲＡＦＴ系、ＲＴＣＰ系の重合開始剤を用いることができる。これらのなかでも、ＴＥＭＰＯ系、ＲＡＦＴ系、ＲＴＣＰ系の重合開始剤がより好ましい。また、ＴＥＭＰＯ系の重合開始剤の中では、特にＤＥＰＮ系の重合開始剤が好ましい。なお、基材に化学結合可能な基としては、たとえば、−ＳｉＣｌ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）Ｃｌ２、−Ｓｉ（ＣＨ３）  ２Ｃｌ、−Ｓｉ（ＯＲ）３（これらの式中、Ｒはメチル、エチル、プロピルまたはブチルを示す。）などが挙げられる。
【０１１４】
基材表面に上記重合開始剤を化学結合させる方法としては、特に限定されないが、重合開始剤を溶剤に溶解あるいは分散することで、重合開始剤溶液を調製し、調製した重合開始剤溶液中に基材を浸漬する方法などが挙げられる。
【０１１５】
重合開始剤を化学結合させた基材を、モノマーを含有する重合反応溶液に浸漬し、必要に応じて加熱することで、基材表面に、ブロック共重合体鎖を形成することができる。なお、重合反応溶液には、モノマーの他、各種ラジカル開始剤や、溶剤など重合反応に必要な成分を含有させることができる。
【０１１６】
本発明の細胞培養基材による細胞培養は、培養基材の表面に被覆されたブロック共重合体のＬＣＳＴよりも高い温度で行われるが、ヒト由来細胞を用いる場合は、高い培養効率を得ることを目的に体温付近で行うことが好ましく、３５〜３９℃の温度範囲で行うことがより好ましく、３６〜３８℃の温度範囲で行うことがさらに好ましい。その他の培養条件は特に限定されず、当分野において通常行われる条件下で培養を行ってよい。例えば、培地としては、ウシ胎児血清等の血清が添加されているものでもよいし、無血清培地でもよい。
【０１１７】
培養後、増殖細胞を細胞培養基材から剥離するには、周囲の温度をＬＣＳＴよりも低い温度、好ましくはＬＣＳＴより１０℃低い温度以下に変化させるだけでよく、細胞を培養していた培養液中においても、その他の培地溶液中においても可能であり、目的に応じて選択することができる。その際、増殖細胞を効果的にかつ容易に剥離させるため、細胞培養基材を軽くたたいたり、揺らしたり、更にはピペット等を使用して培地を撹拌するなどしてもよい。
本発明の培養方法において、好ましくは培養した細胞が冷却のみで最大径５μｍ〜３００μｍの大きさで剥離することができる。さらに好ましくは冷却のみで単一細胞の形状で剥離することができる。剥離細胞の大きさ、形状は、ブロック共重合体の組成および分子量、細胞培養基材の構造、細胞培養基材の製造方法、細胞培養方法、培養される細胞の種類を選択することによって調整できる。例えば、ブロック共重合体の中のブロック（Ｂ）の比率を上げること、細胞培養基材の製造方法によってブロック共重合体の厚さを増加させること、培養基材表面の凹凸を増加させることによって、細胞凝集塊の大きさを小さくでき、さらに単一細胞で剥離することができる。
【０１１８】
本発明の細胞培養基材を用いて培養される細胞としては、温度降下による刺激付与前の表面に接着可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９細胞、ヒト胎児腎臓由来細胞ＨＥＫ２９３細胞やヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、種々の組織に存在する幹細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等を用いることができる。これら以外でも、血液、リンパ液、髄液、喀痰、尿又は便に含まれる細胞（生細胞）や、体内あるいは環境中に存在する微生物、ウイルス、原虫等を例示できる。
【実施例】
【０１１９】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例によりなんら制限されるものではない。なお、断りのない限り、試薬は市販品を用いた。
【０１２０】
＜本ポリマーの組成＞  
核磁気共鳴測定装置（日本電子製、商品名ＪＮＭ−ＧＸ２７０）を用いたプロトン核磁気共鳴分光（１Ｈ−ＮＭＲ）スペクトル分析、およびフーリエ変換赤外分光光度計（ＦＴ−ＩＲ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、商品名ＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＮＥ）より求めた。
【０１２１】
＜樹脂の物性＞
重量平均分子量（Ｍｗ）、数平均分子量（Ｍｎ）および重量平均分子量（Ｍｗ）と数平均分子量の比（Ｍｗ／Ｍｎ）は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって測定した。ＧＰＣ装置としては東ソー（株）製  ＨＬＣ−８１２０ＧＰＣを用い、カラムとしては、東ソー製  ＴＳＫｇｅｌ  α−Ｍを用い、カラム温度を４０℃に設定し、溶離液として１０ｍＭ−ＬｉＢｒ  メタノール／水溶液（メタノール：水＝７０ｖｏｌ％：３０ｖｏｌ％）を用いて測定した。測定試料は２．０ｍｇ／ｍＬで調製し、０．１ｍＬ注入して測定した。分子量の検量線は、分子量既知のポリエチレンオキサイド試料を用いて校正した。なお、ＭｎとＭｗはポリエチレンオキサイド換算の値として求めた。
＜膜の物性＞
膜の厚さは細胞培養基材断面の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察により求めた。
実施例１
［ガラス製シャーレ表面への重合開始剤の導入］
固定化開始剤としての３−（３−（トリエトキシシリル）プロピルチオ）プロピル−２−ブロモ−２−メチルプロパネート０．５ｇ、エタノール５０ｇ、およびアンモニア２．８ｇを混合した溶液に、φ２５ｍｍガラス製シャーレを浸漬し、２４時間静置した。その後、エタノールで洗浄・乾燥を行うことで、表面に重合開始剤が導入されたシャーレを得た。
【０１２２】
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコ中において、窒素ガス雰囲気下で、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを２．０ｇ、塩化銅（Ｉ）１８．５ｍｇ、塩化銅（ＩＩ）２．８ｍｇ、およびビピリジル６５ｍｇを、エタノール１０ｇに溶解することで、重合反応溶液を調製した。
【０１２３】
次いで、上記にて製造した表面に重合開始剤が導入されたガラス製シャーレを、上記にて調製した重合反応溶液に浸漬させ、６５℃に加熱し、撹拌することで反応を開始した。反応時間は６時間とし、反応終了後エタノールにて洗浄を行うことで、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素８個、水素１７個、窒素１個、酸素６個、リン１個の合計（２５４．２）であり、ブロック単位の総式量は２９５．３であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１７であった。
【０１２４】
［細胞培養基材の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコ中において、窒素ガス雰囲気下で、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２ｇ、塩化銅（Ｉ）１８．５ｍｇ、塩化銅（ＩＩ）２．８ｍｇ、およびビピリジル６５ｍｇを、エタノール１０ｇに溶解することで、重合反応溶液を調製した。
【０１２５】
次いで、上記にて製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを、上記にて調製した重合反応溶液に浸漬させ、６５℃に加熱し、撹拌することで反応を開始した。反応時間は６時間とし、反応終了後エタノールにて洗浄を行うことで、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは４５０ｎｍであった。
【０１２６】
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１２７】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液は１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地（１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）を用いた。細胞増殖が確認され、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。
［剥離細胞の培養評価］
上記細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。１５分間で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。コーニング製の細胞培養表面処理φ３５ｍｍディッシュを用いて、上述にて剥離したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液は１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを用いた。細胞は２４時間後に９５個／ｍｍ２に、７２時間後に６６０個／ｍｍ２まで増加した。
参考例１
［細胞培養評価］
実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例２
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
反応時間を４８時間としたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。
【０１２８】
［細胞培養基材の合成］
上記重合体ブロック（Ｂ）を用い、反応時間を４８時間としたこと以外は実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは５００ｎｍであった。
【０１２９】
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１３０】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径１９μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。
［剥離細胞の培養評価］
上記細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。１５分間で細胞は最大直径１９μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。剥離したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ２）を、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に９５個／ｍｍ２に、７２時間後に７００個／ｍｍ２まで増加した。
参考例２
［細胞培養評価］
実施例２［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例３
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりに２−メトキシエチルアクリレート２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１．５ｇを不溶部無しに溶解できた。２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素３個、水素４個、酸素３個の合計（８８．１）であり、ブロック単位の総式量は１３０．１であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１４であった。
【０１３１】
［細胞培養基材の合成］
上記２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりに１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピロリジン１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは４００ｎｍであった。  
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１３２】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で８５％剥離した。
参考例３
［細胞培養評価］
実施例３［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２−メトキシエチルアクリレート重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例４
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。２−メトキシエチルアクリレートジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素６個、水素１０個、窒素１個、酸素４個の合計（１６０．１）であり、ブロック単位の総式量は２１５．２であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１５であった。
【０１３３】
［細胞培養基材の合成］
上記ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりに１−（１−オキソ−２−プロペニル）ピペリジン１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは３５０ｎｍであった。  
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１３４】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で９０％剥離した。
参考例４
［細胞培養評価］
実施例４［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例５
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素５個、水素１１個、窒素１個、酸素４個、硫黄１個の合計（１８１．２）であり、ブロック単位の総式量は２７８．４であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１３であった。
【０１３５】
［細胞培養基材の合成］
上記ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりに４−（１−オキソ−２−プロペニル）モルホリン１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは３８０ｎｍであった。
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１３６】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２１μｍの単一細胞の形状で８０％剥離した。
［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。３０分間で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。剥離したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ２）を、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に９３個／ｍｍ２に、７２時間後に６４０個／ｍｍ２まで増加した。
参考例５
［細胞培養評価］
実施例５［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例６
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにポリエチレングリコールメタクリレート（ｂ＝８．５，  ｃ＝０，  Ｒ１６＝メチル基）２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、ポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１０ｇを不溶部無しに溶解できた。ジメチル（２−メタクリロイルアミノプロピル）（３−スルホナトプロピル）アミニウムポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素１８個、水素３４個、酸素１０．５個の合計（４１８．５）であり、ブロック単位の総式量は４７４．６であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１８であった。
【０１３７】
［細胞培養基材の合成］
上記ポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりにＮ−ｎ−プロピルメタクリルアミド１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは４００ｎｍであった。  
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１３８】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。
参考例６
［細胞培養評価］
実施例６［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にポリエチレングリコールメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）のみが導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例７
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりに２−ヒドロキシエチルメタクリエレート２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られた２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、５ｇを不溶部無しに溶解できた。２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素３個、水素５個、酸素３個の合計（８９．１）であり、ブロック単位の総式量は１３０．１であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１４であった。
【０１３９】
［細胞培養基材の合成］
上記２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりにＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは２５０ｎｍであった。  
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１４０】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で９０％剥離した。
参考例７
［細胞培養評価］
実施例７［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例８
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン２．０ｇの代わりにＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート２．０ｇを用いたこと以外は実施例１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを得た。得られたＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレを硫酸処理して、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロックを単離し、２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、５ｇを不溶部無しに溶解できた。Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）のブロック単位中の親水部の式量は炭素５個、水素１０個、窒素１個、酸素２個の合計（１１６．１）であり、ブロック単位の総式量は１５７．２であり、ＨＬＢ値（グリフィン法）は１５であった。
［細胞培養基材の合成］
上述のＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２ｇの代わりにＮ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド１．２ｇを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは２００ｎｍであった。  
得られた細胞培養基材を硫酸処理して、ブロック共重合体を単離し、ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
［細胞培養評価および剥離評価］
上述にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で９０％剥離した。
参考例８
［細胞培養評価］
実施例７［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面にＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート重合体ブロック（Ｂ）が導入されたガラス製シャーレ（基材）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例９
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに２−ヒドロキシエチルメタクリエレート２．０ｇ、４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド０．０７３ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ジエチルエーテルで再沈し、２−ヒドロキシエチルメタクリエレートの重合体ブロック（Ｂ）を得た。得られた２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）を２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、５ｇを不溶部無しに溶解できた。
【０１４１】
［ブロック共重合体の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに上記重合体ブロック（Ｂ）１．２ｇ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド１．２ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：２混合溶液１５ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ヘキサンで再沈し、ブロック共重合体を得た。ポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１４２】
［細胞培養基材の合成］
上記にて製造したブロック共重合体１００重量部と、架橋剤としてヘキサメトキシメチルメラミン３０重量部と。光酸発生剤としてトリフェニルスルホニウムトリフレート１０重量部を、溶媒としてジアセトンアルコール２５０部に溶解し、塗布溶液とした。ガラス基板上に上記塗布溶液をスピンコーターの回転速度３０００ｒｐｍでスピンコートした。塗布後８０℃で５分間加熱処理して溶媒を揮発させ、膜厚１．８μｍの塗膜を得た。高圧水銀ランプを用いて、塗膜への露光を行った。露光後、１２０℃で５分間加熱処理を行い、露光によって発生した酸による酸触媒反応によって架橋反応を進行させた。その後、水で洗浄し、１２０℃で３０分間加熱乾燥した。膜の厚さは２５ｎｍであった。
【０１４３】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造したガラス基板をガラス製シャーレに入れ、細胞培養基材として用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で２４％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径５ｍｍのシート状で９０％剥離した。
参考例９
［細胞培養基材の合成］
実施例９［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した表面に２−ヒドロキシエチルメタクリエレート重合体ブロック（Ｂ）のみをブロック共重合体の替わりに用いたこと以外は、実施例９［細胞培養基材の合成］と同様の方法でガラス基材を合成した。
［細胞培養評価］
上述のガラス基板を用いたこと以外は、実施例８［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例１０
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコにＮ−ビニルピロリドンを１．０ｇ、スチレン１．３ｇ、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド０．０７３ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ジエチルエーテルで再沈し、Ｎ−ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を得た。得られたＮ−ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、０．５ｇを不溶部無しに溶解できた。
【０１４４】
［ブロック共重合体の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに上記ランダム共重合体ブロック（Ｂ）１．２ｇ、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド１．２ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：２混合溶液１５ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後ヘキサンで再沈し、ブロック共重合体を得た。
【０１４５】
得られたブロック共重合体のポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
【０１４６】
［細胞培養基材の合成］
上記にて製造したブロック共重合体０．１０ｇをエタノール４９．９０ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作成した。φ２５ｍｍガラス製シャーレにブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を２．５ｍＬ加え、３０分間静置した。その後ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液をピペットで抜き取り、デシケータで乾燥することで表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を合成した。膜の厚さは６５ｎｍであった。  
【０１４７】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で７５％剥離した。
参考例１０
［細胞培養基材の合成］
実施例１０［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成したＮ−ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）をブロック共重合体の代わりに用いたこと以外は実施例１０［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面にＮ−ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を合成した。
［細胞培養評価］
上述にて製造した表面にＮ−ビニルピロリドンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例１１
［重合体ブロック（Ｂ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを１．５ｇ、スチレン１．３ｇ、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド６ｍｇ、アゾビスイソブチルニトリル１ｍｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で７２時間反応させた。反応後アセトンで再沈し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を得た。得られた２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）を２０℃の水１００ｍＬに溶解させた結果、１．０ｇを不溶部無しに溶解できた。
［ブロック共重合体の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコに上記ランダム共重合体ブロック（Ｂ）０．８ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．９ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００３ｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：１混合溶液１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で２４時間反応させた。反応後ヘキサンで再沈し、ブロック共重合体を得た。
得られたブロック共重合体のポリマー組成、Ｍｗ、Ｍｎ、およびＭｗ／Ｍｎを評価した結果を表１に示す。
［細胞培養基材の合成］
上述のブロック共重合体０．０１ｇをエタノール４．９９ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作製した。  さらに、０．２ｗｔ％エタノール溶液１ｍＬとエタノール９ｍＬを混合し、０．０２ｗｔ％エタノール溶液を調製した。コーニング社製直径３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ（Ｎｏ．４３０１６５）に０．０２ｗｔ％エタノール溶液を０．４４ｍＬ加え、室温で乾燥した。さらに、減圧乾燥を６時間行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を合成した。膜の厚さは１００ｎｍであった。
［細胞培養評価および剥離評価］
上述にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で９０％剥離した。
参考例１１
［細胞培養基材の合成］
実施例１１［重合体ブロック（Ｂ）の合成］で合成した２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）をブロック共重合体の代わりに用いたこと以外は実施例１１［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を合成した。
［細胞培養評価］
上述にて製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロックが導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例１２
［細胞培養評価および剥離評価］
実施例１１［細胞培養基材の合成］で製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用い、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ細胞）（１１４個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液はＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ−Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）を用いた。細胞増殖が確認され、７２時間培養したところで、１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認し、４２５個／ｍｍ２まで増殖していた。基材を１０℃に冷却後、アスピレーターで剥離した細胞を除去し、再度１０×１０倍の顕微鏡で細胞数を確認した。１５分冷却することで細胞は最大直径２２μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。
［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で７２時間培養した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ−Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）基礎培地を添加して、１０℃に冷却した。１５分間で細胞は最大直径２２μｍの単一細胞の形状で１００％剥離した。コーニング社製直径３５ｍｍ細胞培養表面処理ディッシュ（Ｎｏ．４３０１６５）を用いて、上記にて剥離したＮＨＤＦ細胞（５０個／ｍｍ２）を、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。培養液はＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ−Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）を用いた。細胞は２４時間後に１５０個／ｍｍ２に、７２時間後に４６０個／ｍｍ２まで増加した。
実施例１３
［細胞培養評価および剥離評価］
実施例１１［細胞培養基材の合成］で製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認された。また、培養細胞が基材の１００％を覆うまで培養した後、基材を１０℃に冷却することによって、１５分で細胞は最大直径１８μｍの単一細胞の形状で７０％剥離した。
参考例１２
［細胞培養評価］
参考例１１［細胞培養基材の合成］で製造した表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロックのみが導入された細胞培養基材を用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の細胞培養評価を５日間行ったが、細胞は基材に接着せず、増殖は確認できなかった。
実施例１４
［細胞培養基材の合成］
実施例１１［ブロック共重合体の合成］で合成したブロック共重合体０．０４ｇをエタノール２０ｇに溶解し、ブロック共重合体の０．２ｗｔ％エタノール溶液を作製した。  さらに、０．２ｗｔ％エタノール溶液２０ｍＬとエタノール１８０ｍＬを混合し、０．０２ｗｔ％エタノール溶液を調製した。３００ｍＬガラス製フラスコに上述のブロック共重合体０．０２ｗｔ％エタノール溶液を１８０ｍＬ添加した後、エタノール溶液をスターラーで撹拌しながら、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｒ）  Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ（Ｎｏ．４６２５）１０ｇを添加し、室温で３０分間撹拌した。得られた培養基材懸濁液から、減圧下でエタノールを除去し、減圧下、室温で乾燥することによって、表面に２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとスチレンのランダム共重合体ブロック（Ｂ）とＮ−イソプロピルアクリルアミド重合体ブロック（Ａ）からなるブロック共重合体からなる温度応答性膜が導入された細胞培養基材を合成した。
［細胞培養評価および剥離評価］
上記細胞培養基材をリン酸緩衝整理食塩水（ＰＢＳ）溶液に分散させ、オートクレーブ滅菌を行った。その後、血球計算盤上に０．５μＬを添加し、ビーズ濃度を計算した。（株）セルシード製ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（Ｒ）３．５ｃｍディッシュに細胞培養基材を１×１０４ビーズ／ｍＬ、Ｌ９２９細胞を１００ｃｅｌｌｓ／ビーズとなるように加え、３７℃で培養を行った。７２時間培養後、培養液をチューブにに移し、培養液を２ｍＬ加え、１０分間静置した後、上澄みを捨てることで、未接着の浮遊細胞および細胞凝集塊を除いた。さらにセルストレーナー（メッシュサイズ４０μｍ）で浮遊細胞をろ過し、ろ物を培地２ｍＬ中で再分散させた。その後、１０℃のインキュベーターで１５分間インキュベートし、細胞は最大直径２０μｍの単一細胞の形状で剥離した。セルストレーナー（メッシュサイズ４０μｍ）で剥離した細胞をろ過し、血球計算盤を用いて細胞数を計算した。また、対照実験として、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で処理を行った際の細胞剥離数を計測した。１０℃への温度低下により剥離した細胞は４×１０５個で、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液中での処理により剥離した細胞（４×１０５個）とほぼ同等であり、温度低下によってほぼ１００％細胞を回収することができた。
比較例１
［重合体ブロック（Ａ）の合成］
１００ｍＬの２口ナス型フラスコにｎ−ブチルメタクリレート２．２４０ｇ、ＲＡＦＴ剤として４−シアノ−４−［（ドデシルスルフォニルチオカルボニル）スルフォニル］ペンタノイックアシッド０．０７３ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン１０ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後、メタノールで再沈し、ｎ−ブチルメタクリレートの重合体を得た。得られたｎ−ブチルメタクリレート重合体ブロック０．５ｇを２０℃の水１００ｍＬに添加した結果、不溶部が存在し完全に溶解できなかった。
【０１４８】
さらに１００ｍＬの２口ナス型フラスコにｎ−ブチルメタクリレート重合体１．２００ｇ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド１．２１０ｇ、アゾビスイソブチルニトリル０．００４ｇを加え、１，４−ジオキサン／エタノール＝１：２混合溶液１５ｍＬに溶解した。窒素バブリングを３０分行った後、６５℃で１２時間反応させた。反応後、純水で再沈し、ｎ−ブチルメタクリレートとＮ−イソプロピルアクリルアミドがブロック共重合したポリマーを得た。
【０１４９】
［細胞培養基材の合成］
上記にて製造した重合体を用いたこと以外は、実施例１０［細胞培養基材の合成］と同様の方法で合成を行い、表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を得た。膜の厚さは１００ｎｍであった。
【０１５０】
［細胞培養評価および剥離評価］
上記にて製造した表面に温度応答性膜が導入された細胞培養基材を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で２４％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径８ｍｍのシート状で６０％剥離した。
【０１５１】
比較例２
［細胞培養評価および剥離評価］
セルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３５ｍｍφディッシュを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で３０％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径１ｃｍのシート状で６５％剥離した。
［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、新たにＤＭＥＭ培地を添加して、１０℃に冷却した。１時間で細胞は最大直径１ｃｍのシート状で１００％剥離した。剥離したＬ９２９細胞をピペェッティングで分散化させた後、５０個／ｍｍ２の細胞密度で播種し、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に８０個／ｍｍ２に、７２時間後に４５０個／ｍｍ２まで増加し、本発明の細胞培養基材から剥離した細胞よりも増殖速度が遅かった。
比較例３
［細胞培養評価および剥離評価］
コーニング製の細胞培養表面処理φ３５ｍｍディッシュを用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認されたが、細胞増殖後の細胞剥離評価では、１５分冷却しても細胞は全く剥離しなかった。
［トリプシンによる剥離および剥離細胞の評価］
上述の細胞培養評価で基材の１００％を覆うまで増殖した細胞から培地成分を除いた後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（和光純薬工業（株）製）１ｍＬを添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で１０分間放置し、細胞を剥離した。剥離した細胞とトリプシンＥＤＴＡ溶液の混合物を遠心管中に移送し、１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地１ｍＬを追加し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄みを除去した後、新たに１０ｖｏｌ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ培地を添加して、トリプシン処理で剥離したＬ９２９細胞を回収した。回収したＬ９２９細胞（５０個／ｍｍ２）を、実施例１［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で培養した。細胞は２４時間後に８０個／ｍｍ２に、７２時間後に４８０個／ｍｍ２まで増加し、本発明の細胞培養基材から冷却により剥離した細胞よりも増殖速度が遅かった。
比較例４
［細胞培養評価および剥離評価］
セルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）３５ｍｍφディッシュを用いたこと以外は、実施例１２  ［細胞培養評価および剥離評価］と同様に評価を行い、細胞増殖が確認され、７２時間培養したところで３８４個／ｍｍ２まで増殖していた。基材を１０℃に冷却し、１５分冷却することで細胞は最大直径１．２ｃｍのシート状で９０％剥離した。
［剥離細胞の培養評価］
上述の細胞培養評価で得られた細胞をピペッティングで分散化させた後、用いたたこと以外は、実施例１２［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で評価を行った。細胞は２４時間後に２１０個／ｍｍ２に、７２時間後に８８０個／ｍｍ２まで増加した。
比較例５
［細胞培養評価および剥離評価］
コーニング製の細胞培養表面処理φ３５ｍｍディッシュを用いたこと以外は、実施例１２  ［細胞培養評価および剥離評価］と同様に評価を行い、細胞増殖が確認され、７２時間培養したところで２６６個／ｍｍ２まで増殖していた。基材を１０℃に冷却し、６０分冷却したが細胞は剥離しなかった。
［トリプシンによる剥離および剥離細胞の評価］
上述の細胞培養評価で得られた細胞から培地成分を除いた後、０．２５％トリプシンＥＤＴＡ溶液（和光純薬工業（株）製）１．５ｍＬを添加し、３７℃、ＣＯ２濃度５％で２分間放置し、細胞を剥離した。剥離した細胞とトリプシンＥＤＴＡ溶液の混合物を遠心管中に移送し、ＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ−Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）基礎培地２ｍＬを追加し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄みを除去した後、新たに、ＤＳファーマバイオメディカル（株）製ＣＳ−Ｃ培地キット（Ｎｏ．ＣＳ４Ｚ０５００Ｒ）基礎培地を添加して、トリプシン処理で剥離したＮＨＤＦ細胞を回収した。回収したＮＨＤＦ細胞（５０個／ｍｍ２）を用いたたこと以外は、実施例１２［剥離細胞の培養評価］と同様の方法で評価を行った。細胞は２４時間後に１５０個／ｍｍ２に、７２時間後に６９０個／ｍｍ２まで増加した。
比較例６
［細胞培養評価および剥離評価］
セルシード（株）製ＵｐＣｅｌｌＲ３５ｍｍφディッシュを用い、マウス結合組織Ｌ９２９細胞（１００個／ｍｍ２）の代わりにチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞（１００個／ｍｍ２）を用いたこと以外は、実施例１［細胞培養評価および剥離評価］と同様の評価を行い、細胞増殖が確認され、細胞増殖後の細胞剥離評価では、３分冷却することで細胞はシート状で１５％剥離した。また１５分冷却することで細胞は最大直径１．２ｃｍのシート状で５０％剥離した。
【表１】
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