(57)【要約】【課題】  簡便且つ短時間で抗酸化力を的確に評価し得る抗酸化力の評価方法及び評価装置を提供する。【解決手段】  電極上の測定試薬溶液に活性酸素または活性酸素発生源を添加することなく電圧を印加し、ラジカルを発生させて化学発光を起こし、抗酸化物質を含む被検物質の添加による発光の抑制に基づいて抗酸化力を評価する。測定試薬は、例えばルミノールである。測定に際しては、作用極、対極、及び参照極が印刷された平面電極を用い、平面電極上に測定試薬溶液を滴下し、電圧の印加を行う。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
電極上の測定試薬溶液に活性酸素または活性酸素発生源を添加することなく電圧を印加し、ラジカルを発生させて化学発光を起こし、
抗酸化物質を含む被検物質の添加による発光の抑制に基づいて抗酸化力を評価することを特徴とする抗酸化力の評価方法
【請求項２】
前記測定試薬がルミノールであることを特徴とする請求項１記載の抗酸化力の評価方法。
【請求項３】
前記抗酸化物質が、カロテノイド類であることを特徴とする請求項１または２記載の抗酸化力の評価方法。
【請求項４】
作用極、対極、及び参照極が印刷された平面電極上に測定試薬溶液を滴下し、電圧の印加を行うことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の抗酸化力の評価方法。
【請求項５】
作用極、対極、及び参照極が印刷形成された平面電極を備え、
作用極上に活性酸素または活性酸素発生源を添加していない測定試薬溶液を滴下し、電圧を印加することでラジカルを発生させて化学発光を起こし、抗酸化物質を含む被検物質の添加による発光の抑制に基づいて抗酸化力を評価する抗酸化力の評価装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業分野や食品分野等において、例えば野菜や果物等に含まれる抗酸化物質の抗酸化力を簡便、且つ的確に把握し得る新規な抗酸化力の評価方法及び評価装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
例えば、食品中には、様々な抗酸化物質が含まれており、活性酸素種も様々な形で存在する。そこで、野菜、果物等の食品の抗酸化力の測定法として、様々な手法が開発されている。以下に、代表的な測定方法を示す。
【０００３】
（１）ＯＲＡＣ（Oxygen Radical Absorbance Capacity）法
ＯＲＡＣ法は、水溶性、脂溶性のどちらのサンプルも測定可能な手法であり、蛍光物質であるフルオレセイン（Fluorescein）を蛍光プローブとして使用するとともに、ＡＡＰＨ[2,2’-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride]をラジカル開始剤として用いて活性酸素を発生させ、これにより分解されるフルオレセインの蛍光強度を経時的に測定し、その変化を指標として抗酸化力を測定する方法である。アメリカ農務省（ＵＳＤＡ）は各食品のもつ抗酸化力の標準指標として、この指標を用いているが、β-カロテンや不飽和脂肪酸はその反応の機序が異なるため測定できないという課題がある。
【０００４】
（２）ＤＰＰＨ （1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）法
ＤＰＰＨラジカルの消去活性を吸光度にて抗酸化力を測定、評価する手法である。一部の抗酸化物質はＤＰＰＨと反応しない。ＤＰＰＨはヒトの生体内に存在しないラジカルであるという問題点がある。
【０００５】
（３）ＦＲＡＰ（Ferric Reducing Ability of Plasma）法
サンプルによってトリピリジルトリアジン第２鉄(ferric-tripyridyltriazine)（Fe(III)-TPTZ）が還元され、生成されたトリピリジルトリアジン第１鉄(ferrous-tripyridyltriazine)（Fe(II)-TPTZ）の吸光度（５９３ｎｍ）を一定の時間測定し抗酸化力を評価する手法である。血清や植物の抗酸化能分析に適しているが、チオール基（−ＳＨ）を有する化合物（グルタチオン、タンパク質）の測定に不向きであるという問題がある。
【０００６】
その他、ＤＭＰＯ（5,5-dimethyl -1-pyrroline-1-ozide）またはＰＢＮ（phenyl t-butyl nitrone）を使用し、ラジカル捕獲剤と反応して安定化したラジカル化合物の生成量を電子スピン共鳴装置を用いて測定し評価する手法や、化学発光による測定方法等も報告されており、さらには、近年、電気化学発光を用いた抗酸化力測定法も提案されている（例えば、特許文献１を参照）。
【０００７】
特許文献１に記載される方法は、被検物質の抗酸化力を評価するため、該被検物質の一定量を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加し、該被検物質が活性酸素を消去する能力を測定する方法において、被検物質の一定量を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加し、これに試薬を加えたものに電気化学発光（電極反応に発光を伴う現象）を生起させ、発光強度を測定して該被検物質が活性酸素を消去する能力を評価するというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２００７−２７９００８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述の通り、抗酸化力を測定する方法は種々提案されているが、いずれも一長一短を有し、そのため、抗酸化力は、世界的な標準化が遅れている測定対象でもある。
【００１０】
例えば、多くの抗酸化力の評価方法がある中で、公定法として制定される可能性が最も高いのが、アメリカ農務省（ＵＳＤＡ）でも採用されているＯＲＡＣ法であるが、ＯＲＡＣ法は、フルオレセインの蛍光強度を経時的に測定し、その変化を指標として抗酸化力を測定する方法であるため、測定時間に２〜３時間を必要とする。また、ＡＡＰＨをラジカル開始剤として用いるため、一重項酸素消去反応を主体とする抗酸化物質（β−カロテン、リコピン、アスタキサンチン等のカロテノイド類）の評価は困難である。
【００１１】
これら方法に比べ、特許文献１に記載される電気化学発光を利用する方法は、短所の少ない方法ということができるが、より一層の簡便さを考えた場合、過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加する必要がある等、煩雑な操作が残されており、未だ改良の余地があると言わざるを得ない。
【００１２】
本発明は、このような従来の実情に鑑みて提案されたものであり、簡便且つ短時間で抗酸化力を的確に評価し得る抗酸化力の評価方法及び評価装置を提供することを目的とし、また、カロテノイド類等の一重項酸素消去反応を主体とする抗酸化物質についても抗酸化力を測定することが可能な抗酸化力の評価方法及び評価装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ルミノールに過酸化水素を加え、鉄等の金属イオンや錯体が触媒を加えることによって発光する化学発光は犯罪現場で血液の痕跡を調べるために用いられる等、広く知られている。また、ルミノールに過酸化水素を加え、電気化学反応を起こすことによって鉄等の金属イオンや錯体の触媒を加えずとも発光することは知られている。ただし、いずれの場合も、これまではルミノールを酸化させるために何らかの過酸化物を加えなければならないと考えられていた。特許文献１記載の発明においても同様であり、被検物質の一定量を含む液体に所定量の過酸化物等の活性酸素若しくは活性酸素発生源を添加することが、必須の構成要件とされている。
【００１４】
本発明者らは、種々検討を重ねた結果、過酸化水素、過酸化物、活性酸素、活性酸素発生源を添加せずとも、通常使用している溶液中の溶存酸素によって電気化学発光させることが可能であることを見出すに至った。
【００１５】
本発明は、このような新規な知見に基づいて案出されたものであり、電極上の測定試薬溶液に活性酸素または活性酸素発生源を添加することなく電圧を印加し、ラジカルを発生させて化学発光を起こし、抗酸化物質を含む被検物質の添加による発光の抑制に基づいて抗酸化力を評価することを特徴とする。
【００１６】
本発明の方法は、ＯＲＡＣ法で抗酸化力の評価物質として使用されているトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）で換算できる抗酸化力測定方法であり、ＯＲＡＣ法に準ずる測定方法として使用できる。ＯＲＡＣ法では測定に２〜３時間を要するが、本発明では瞬時に測定が可能である。また、測定試薬（例えばルミノール）を電気化学的に酸化させることで励起一重項状態（３−アミノフタル酸）としているため、ＯＲＡＣ法では測定困難である一重項酸素消去反応を主体とする抗酸化物質（β−カロテン、リコピン、アスタキサンチン等のカロテノイド類）の評価も可能である。
【００１７】
また、本発明の抗酸化力の測定装置は、作用極、対極、及び参照極が印刷形成された平面電極を備え、作用極上に活性酸素または活性酸素発生源を添加していない測定試薬溶液を滴下し、電圧を印加することでラジカルを発生させて化学発光を起こし、抗酸化物質を含む被検物質の添加による発光の抑制に基づいて抗酸化力を評価するものである。
【００１８】
３極が形成された平面電極を使用することで電極上に直接サンプル液を乗せることができ、電極とサンプルの接触効率が高く、電極面積に対するサンプル容量比が小さくなり発生する過酸化物の濃度が相対的に大きくなり効率的な測定が可能となる。また、特許文献１に記されているような特殊な電極セルが不要となり、装置を簡略化することができる。
【００１９】
平面電極を使用することで電気化学発光を検出する検知器を発光部に近づけることができ、効率的に発光を検知器に取り込むことで高感度の検出が可能となる。また、フォトマル（光電子倍増管）をフォトダイオード、光導電素子等の安価な検知器に置き換えることも可能である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、簡便且つ的確に抗酸化力を評価することができ、短時間での測定が可能である。また、測定試薬溶液を脂溶性のアセトニトリルとし、支持電解質として過塩素酸テトラメチルアンモニウムを用いることで、カロテノイド類等の一重項酸素消去反応を主体とする抗酸化物質についても抗酸化力を測定することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】平面電極の構成例を示す概略平面図である。
【図２】平面電極を用いた測定の様子を示す概略斜視図である。
【図３】平面電極を備える測定装置の概略構成を示す図である。
【図４】図１及び図２に示す装置で得られる電気化学測定、電気化学発光の測定結果を示す図である。
【図５】図１及び図２に示す装置で得られた測定結果の部分拡大図である。
【図６】抗酸化物質（標準物質）トロロックスの測定結果を示す図である。
【図７】図１及び図２に示す装置で得られたトロロックスの検量線を示す図である。
【図８】図１及び図２に示す装置で得られたトロロックスの検量線を示す図である。
【図９】ピオーネ（ぶどう）、トマトの測定結果を示す図である。
【図１０】みかん、りんごの測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明を適用した抗酸化力の評価方法の実施形態について詳細に説明する。
【００２３】
本発明の抗酸化力の評価方法は、電気化学発光を用いたものである。この電気化学発光を用いた抗酸化力測定の原理をルミノールを測定試薬とした場合を例に説明すると、化１に示すように、ルミノールは電圧の印加によって電気化学的に酸化され、３−アミノフタル酸の励起一重項状態となる。これが基底状態に戻る時に発光する。抗酸化物質の存在により酸化が阻害されると、発光が減少する。したがって、前記発光の現象の度合いを測定することで、抗酸化物質の酸化力を測定することが可能になる。
【００２４】
【化１】
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【００２５】
前記測定原理に基づき、本発明では、電極上の測定試薬溶液に活性酸素または活性酸素発生源を添加することなく電圧を印加し、ラジカルを発生させて化学発光を起こし、抗酸化物質を含む被検物質の添加による発光の抑制に基づいて抗酸化力を評価する。
【００２６】
ここで、測定試薬としては、ルミノール等を例示することができるが、その他、海ホタルルシフェリン類縁体、ホタルルシフェリン、アクリジニウム、シュウ酸エステルと色素等も使用可能である。
【００２７】
測定試薬は、水溶液の抗酸化力の評価の場合は水溶液とし、前記電気化学発光において、溶存酸素を利用する。したがって、測定試薬溶液に用いる水溶液は、溶存酸素を含んでいる必要があるが、溶媒として通常の純水、精製水等を用いれば問題ない。
【００２８】
カロテノイド類等の測定の場合、測定溶液としてアセトニトリルまたはジメチルスルホキシド溶液とし、支持電解質として過塩素酸テトラメチルアンモニを含んだ溶液を用いる必要がある。測定試薬溶液に用いる溶液は、溶存酸素を含んでいる必要があるが、溶媒として通常の純水、精製水等を用いれば問題ない。
【００２９】
測定試薬溶液において、測定試薬ルミノールの濃度は、０．５１ｍＭ〜１ｍＭであることが好ましいしい。測定試薬ルミノールの濃度が０．０１ｍＭよりも低いと、電気化学発光が不十分になるおそれがある。
【００３０】
測定試薬溶液には、電気的に酸化するため、電解質溶液を加える方が良い。アルカリ側の溶液での測定で発光強度が増すため、アルカリ側に緩衝能がある緩衝液、ホウ酸緩衝液が好ましい。水溶液の抗酸化力の評価の場合、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ  ９．６）が好ましい。アルカリ側の緩衝液を用いることで発光強度を上げることができる。
【００３１】
本発明において特徴的なのは、測定試薬溶液に活性酸素や活性酸素発生源を添加することなく電気化学発光を起こしていることである。これまで、電気化学発光においては、過酸化水素や過酸化物等の活性酸素や活性酸素発生源を添加する必要があると考えられてきたが、本発明者らは、活性酸素や活性酸素発生源を添加しなくても溶存酸素を利用して電気化学発光を起こすことが可能であるとの結論を得るに至った。過酸化水素や過酸化物等の活性酸素や活性酸素発生源は、取り扱いに注意を要し、添加する場合、操作が煩雑である。活性酸素や活性酸素発生源を添加しなくて済めば、測定の簡易化に大きく寄与する。
【００３２】
測定には、印刷により形成された平面電極を用いる。平面電極１は、例えば図１に示すように、基板２上に形成されており、カーボンで作成された作用極３と対極４、銀／塩化銀ペーストで作成された参照極５から構成されている。また、場合によっては、作用極３をカーボンではなく導電性ペーストにして透明な電極（作用極３）とすることも可能である。
【００３３】
測定に際しては、図２に示すように、作用極３、対極４、及び参照極５が印刷された平面電極１上に測定試薬溶液Ｗを滴下し、電圧の印加を行う。この時、作用極３を透明電極とすれば、電気化学発光は作用極３の裏面にフォトダイオードやフォトマルをごく近傍まで接近させて測定することができ、電極セル内での発光を検出するより感度を高めることが可能である。なお、基板２には通常ガラスエポキシ基板を使用するが、作用極３を透明電極とする場合には、基板２を透明な基板とする必要があるため、例えばポリエチレンテレフタレート基板等を使用することが好ましい。測定装置の構成は、図３示すようなものであり、平面電極１を備えた発光検出ユニット１１と、トリガ回路を有するポータブルポテンショスタット１２と、電気化学的な信号を表示する表示部を備えたコンピュータ１３とを有する。
【００３４】
前述の平面電極１を用いた測定装置は、手のひらサイズ(小型)で可搬性が高いこと、電極上に測定試料を乗せて測定できるので、サンプル量が数μＬ〜数十μＬあれば測定できること等の利点を有する。さらに通常の電気化学測定用セル等を用いた場合に比べて電極面積に対するサンプル容量の比が著しく小さいため、発生する過酸化物の濃度が相対的に高くなり、高感度に測定できる。
【００３５】
以上、本発明の抗酸化力の評価方法の実施形態について説明してきたが、本発明が前述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の変更が可能であることは言うまでもない。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を適用した具体的な実施例について、実験結果に基づいて説明する。
【００３７】
標準物質の抗酸化力測定
試作した電気化学発光測定装置を用いて、抗酸化物質の基準として用いられているトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ）の抗酸化力測定を行なった。実験方法は、１００ｍＭ  ホウ酸バッファー（ｐＨ９．６）でトロロックスを各種濃度に希釈し、１ｍＭ  ルミノール溶液［１００ｍＭ  ホウ酸バッファー（ｐＨ９．６）］と等量混合して電気化学発光を行なった。電気化学測定はサイクリックボルタンメトリー（CV）で行った。
ＣＶ実験条件      走査電圧  -1V⇔0⇔1V  /  Scan  Rate  50mv/s
発光測定条件  Counting  Time  100ms  /Mesurement  Point  900point
【００３８】
結果
図４が電気化学発光測定装置によって得られるトロロックス１ｍＭの測定結果である。本装置では、電気化学測定と発光測定の両方の結果が同時に得られる。発光測定の横軸は装置より得られる値をＲＬＵ（Relative light unit）として評価した。図５の本装置で得られた結果の拡大図から電気化学測定の結果からは０Ｖ付近でトロロックスの酸化還元ピークが見られ、０．４Ｖ付近にルミノールの酸化ピークが見られる。発光測定の結果からは、０．４Ｖ付近のルミノールの酸化の直後より発光が見られ、電気的な酸化によって３−アミノフタル酸の励起一重項状態になって発光していることが明らかである。図６に示すようにトロロックスの濃度が高くなるに従い電気化学発光が弱くなっていった。これは電気化学によって発生したルミノールを酸化させるための活性酸素（ラジカル）が、抗酸化物質であるトロロックスによって消費され、３−アミノフタル酸が生成しないため電気化学発光が弱くなっていったことによるものと推測される。ルミノール酸化後の発光ピークをプロットすると図７のようにトロロックスの検量線が得られる。
【００３９】
果物４種の抗酸化度
図７の結果よりトロロックス濃度が直線になる評価できる部分での検量線を作製し、果物４種の果汁の電気化学発光を測定し、ＯＲＡＣ法で得られた値と比較した。
【００４０】
［検量線作成］
１）（Ａ液）１ｍＭ−Ｌｕｍｉ／１００ｍＭホウ酸バッファー（ｐＨ９．６）を用意した。
２）凍結させておいた１０ｍＭ−トロロックス（１００ｍＭホウ酸バッファー）を解凍し、０．５、１．０、２．０ｍＭに希釈した。
３）Ａ液と２）で調製した溶液を等量ずつ混合して、電気化学発光測定を行った。電気化学測定はサイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）で行った。
ＣＶ実験条件      走査電圧  -1V⇔0⇔1V  /  Scan  Rate  50mv/s
INTENSITY測定条件  Counting  Time  100ms  /Mesurement  Point  900point
本実験で得られたトロロックスの検量線は、図８に示すようなものとなった。
【００４１】
４種の果物の果汁を各種希釈倍率で希釈して溶液を作成し、Ａ液と希釈した果汁液を等量ずつ混合して、ＣＶ測定し、電気化学発光測定を行った。（３回測定）果汁は、ＯＲＡＣ法でも抗酸化力の測定が行われた。電気化学発光、ＯＲＡＣ法によってより得られたトロロックス換算値の比較を行った。
【００４２】
検量線を図８に、電気化学測定結果を図９，図１０に示す。表１に電気化学発光、ＯＲＡＣ法によってより得られたトロロックス換算濃度の比較を行った結果を示す。
【００４３】
ピオーネ（ブドウ）果汁１０倍希釈、トマト果汁５倍希釈、みかん果汁２５倍希釈、リンゴ果汁１０倍希釈で電気化学発光測定を行ったところ、図９，図１０の結果が得られた。３回測定の平均値ＲＬＵから果汁のトロロック換算濃度を算出し、ＯＲＡＣ法で得られた果汁のトロロックス換算濃度と比較を行った。表１に示すようにいずれもＯＲＡＣ法の結果とほぼ同等のトロロックス換算濃度となった。
【００４４】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図３】
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