(57)【要約】【課題】CYP2C9遺伝子における変異型アレルCYP2C9*3についてホモ及びヘテロの判別並びに野生型アレルの判別を高精度に行う。【解決手段】配列：5’-GAGATACMTTGACCT-3’（配列番号１、MはA又はC）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜６の塩基が付加した配列からなる、全体が１５〜２７塩基長であるオリゴヌクレオチドを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：5’-GAGATACMTTGACCT-3’（配列番号１、MはA又はC）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜６の塩基が付加した配列からなる、全体が１５〜２７塩基長であるオリゴヌクレオチドを含む、CYP2C9*3検出用プローブ。
【請求項２】
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列の5’末端にA、5’-CA-3’、5’-CCA-3’、5’-TCCA-3’、5’-GTCCA-3’及び5’-GGTCCA-3’のいずれかが付加され、上記配列の3’末端にT、5’-TC-3’、5’-TCT-3’、5’-TCTC-3’、5’-TCTCC-3’及び5’-TCTCCC-3’のいずれかが付加された塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする請求項１記載のCYP2C9*3検出用プローブ。
【請求項３】
上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２〜７のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする請求項１記載のCYP2C9*3検出用プローブ。
AGAGATACMTTGACCTT（配列番号２）
CAGAGATACMTTGACCTTC（配列番号３）
CCAGAGATACMTTGACCTTCT（配列番号４）
TCCAGAGATACMTTGACCTTCTC（配列番号５）
GTCCAGAGATACMTTGACCTTCTCC（配列番号６）
GGTCCAGAGATACMTTGACCTTCTCCC（配列番号７）
【請求項４】
請求項１乃至３いずれか一項記載のCYP2C9*3検出用プローブを有するマイクロアレイ。
【請求項５】
被験者由来のゲノムを鋳型としてCYP2C9遺伝子におけるrs1057910で特定される多型部位を含む核酸断片を増幅する工程と、
得られた核酸断片と請求項１乃至３いずれか一項記載のCYP2C9*3検出用プローブとを接触させる工程と、
得られた核酸断片と上記CYP2C9*3検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、
rs1057910の遺伝子型を判定する、薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【請求項６】
上記rs1057910の遺伝子型が変異型アレルCYP2C9*3のホモ又はヘテロである場合に薬剤代謝能が低いと判定することを特徴とする請求項５記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【請求項７】
上記CYP2C9*3検出用プローブとして、rs1057910で特定される多型における野生型アレルに対応するオリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応するオリゴヌクレオチドとを使用することを特徴とする請求項５記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【請求項８】
rs1057910で特定される多型における野生型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドとは、長さが同じである又は２塩基以内の差であることを特徴とする請求項５記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【請求項９】
請求項４記載のマイクロアレイを使用することを特徴とする請求項５記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【請求項１０】
上記核酸断片を増幅する工程で得られた核酸断片は蛍光標識を有し、上記ハイブリダイズを検出する工程では当該蛍光標識の蛍光強度値を測定することを特徴とする請求項５記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【請求項１１】
上記薬物はワルファリンであることを特徴とする請求項５記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物代謝酵素に関与するチトクロームP450 2C9（CYP2C9）遺伝子に存在する変異型アレル（CYP2C9*3）を判定するためのCYP2C9*3検出用プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
チトクロームP450（CYP）は、薬物代謝に関与する酵素である。チトクロームP450には20種以上の分子種が報告されており、“CYP”に続けて、ファミリーを示すアラビア数字、サブファミリーを示すアルファベット及び分子種番号を示すアラビア数字の組合せで表記される。中でも、CYP2C9は、イブプロフェン、ジクロフェナク、フェニトイン、ワルファリン、トルブタミド、ロサルタン、スルファメトキサゾール及び多くの非ステロイド性消炎鎮痛薬等の薬物代謝に関係していることが知られている。
【０００３】
また、CYP2C9遺伝子の変異解析により、薬物代謝活性の低下に関与する遺伝子変異が同定されている。特に、CYP2C9のアミノ酸配列における359番目のイソロイシンがロイシンに置換されると、ワルファリンS体の代謝活性を低下させることが知られている。この置換変異は、CYP2C9遺伝子における1075番目のアデニンがシトシンに変異する一塩基多型に起因する。この置換変異を伴う一塩基多型に付与されているrs番号はrs1057910であり、当該多型における変異アレルをCYP2C9*3と表記し、野生型アレルをCYP2C9*1と表記している。
【０００４】
すなわち、変異型アレルCYP2C9*3をホモで有する個体、ヘテロで有する個体は、野生型の個体と比較して、薬物代謝が遅延する。このため、CYP2C9*3をホモで有する個体及びヘテロで有する個体は、野生型の個体と比較して薬物投与量が少量となる。このように、薬物投与対象者について、投与前にCYP2C9*3の存否を調べることで適切な薬物投与量を決定することができる。
【０００５】
例えば、特許文献１には、CYP2C9遺伝子におけるCYP2C9*3と、VKORC1遺伝子における所定の多型とを解析する２種類のプライマーセットが開示されている。具体的に、特許文献１には、CYP2C9*3を挟み込むように設計されたプライマーセットにより所定の領域を増幅し、増幅した断片に含まれる多型をプローブにより検出することが記載されている。特許文献１において多型検出用プローブとしては、多型部位を含む１７〜２２塩基長のプローブが開示されている。
【０００６】
また、特許文献２には、ワルファリンの最適用量を決定するために、VKORC1遺伝子のハプロタイプを検出し、これに基づいて上記最適用量を決定することが開示されている。特許文献２には、また、特許文献２には、VKORC1遺伝子のハプロタイプを検出するとともに、CYP2C9遺伝子の多型を検出することも開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特許第5224526号
【特許文献２】特表2008-516630号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、従来、CYP2C9遺伝子における変異型アレルCYP2C9*3について、ホモ及びヘテロの判別、並びに野生型アレルの判別を高精度に行える技術は知られていなかった。例えば、特許文献１には、特定のプライマーセットで増幅した断片に含まれる変異型アレルCYP2C9*3を検出するためのプローブが開示されるものの、検出の感度は十分とは言えなかった。
【０００９】
そこで、本発明は、上述した実情に鑑み、CYP2C9遺伝子における変異型アレルCYP2C9*3についてホモ及びヘテロの判別並びに野生型アレルの判別を高精度に行うことができるCYP2C9*3検出用プローブ及びこれを用いた薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上述した目的を達成するために鋭意検討した結果、CYP2C9遺伝子における変異型アレルCYP2C9*3を検出することができる適切な塩基配列を見いだし、本発明を完成するに至った。なお、多型の遺伝子型を判定するためのプローブは、遺伝子多型の場所さえ解明すれば任意に製造できるものではなく、当該多型の変異ごとに適当な塩基配列を有するプローブを見出す必要がある。
【００１１】
（１）配列：5’-GAGATACMTTGACCT-3’（配列番号１、MはA又はC）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜６の塩基が付加した配列からなる、全体が１５〜２７塩基長であるオリゴヌクレオチドを含む、CYP2C9*3検出用プローブ。
（２）上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列の5’末端にA、5’-CA-3’、5’-CCA-3’、5’-TCCA-3’、5’-GTCCA-3’及び5’-GGTCCA-3’のいずれかが付加され、上記配列の3’末端にT、5’-TC-3’、5’-TCT-3’、5’-TCTC-3’、5’-TCTCC-3’及び5’-TCTCCC-3’のいずれかが付加された塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする（１）記載のCYP2C9*3検出用プローブ。
（３）上記オリゴヌクレオチドの塩基配列が、配列番号２〜７のいずれかの塩基配列又は当該塩基配列に対して相補的配列であることを特徴とする（１）記載のCYP2C9*3検出用プローブ。
AGAGATACMTTGACCTT（配列番号２）
CAGAGATACMTTGACCTTC（配列番号３）
CCAGAGATACMTTGACCTTCT（配列番号４）
TCCAGAGATACMTTGACCTTCTC（配列番号５）
GTCCAGAGATACMTTGACCTTCTCC（配列番号６）
GGTCCAGAGATACMTTGACCTTCTCCC（配列番号７）
（４）上記（１）乃至（３）いずれか記載のCYP2C9*3検出用プローブを有するマイクロアレイ。
（５）被験者由来のゲノムを鋳型としてCYP2C9遺伝子におけるrs1057910で特定される多型部位を含む核酸断片を増幅する工程と、
得られた核酸断片と上記（１）乃至（３）いずれか記載のCYP2C9*3検出用プローブとを接触させる工程と、
得られた核酸断片と上記CYP2C9*3検出用プローブとのハイブリダイズを検出する工程とを含み、
rs1057910の遺伝子型を判定する、薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（６）上記rs1057910の遺伝子型が変異型アレルCYP2C9*3のホモ又はヘテロである場合に薬剤代謝能が低いと判定する（５）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（７）上記CYP2C9*3検出用プローブとして、rs1057910で特定される多型における野生型アレルに対応するオリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応するオリゴヌクレオチドとを使用することを特徴とする（５）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（８）rs1057910で特定される多型における野生型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドと、変異型アレルに対応する上記オリゴヌクレオチドとは、長さが同じである又は２塩基以内の差であることを特徴とする（５）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（９）上記（４）記載のマイクロアレイを使用することを特徴とする（５）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１０）上記核酸断片を増幅する工程で得られた核酸断片は蛍光標識を有し、上記ハイブリダイズを検出する工程では当該蛍光標識の蛍光強度値を測定することを特徴とする（５）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
（１１）上記薬物はワルファリンであることを特徴とする（５）記載の薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは、rs1057910を含む領域を増幅した核酸断片に対して、rs1057910の遺伝子型に応じて特異的にハイブリダイズすることができる。したがって、本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブを利用することによって、rs1057910の遺伝子型をハイブリダイズといった簡便な処理によって高精度に判定することができる。
【００１３】
また、本発明に係るDNAチップは、上記CYP2C9*3検出用プローブを備えるため、rs1057910の遺伝子型を判定する際に利用することができる。すなわち、本発明に係るDNAチップを利用することで、rs1057910の遺伝子型を簡便な処理によって高精度に判定することができる。
【００１４】
さらに、本発明に係る薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法は、上記CYP2C9*3検出用プローブを利用し、被験者のゲノムにおけるrs1057910の遺伝子型を簡便に且つ高精度に判定した結果を利用している。したがって、本発明に係る薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法によれば、簡便な処理によって当該データを得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは、rs1057910で特定される一塩基多型を含む所定の領域に対応する配列：5’-GAGATACMTTGACCT-3’（配列番号１、MはA又はC、以下同様）若しくは当該配列に対して相補的配列からなる、又は当該配列若しくは当該相補的配列の両端に１〜６の塩基が付加した配列からなる、全体が１５〜２７塩基長であるオリゴヌクレオチドを含むものである。
【００１６】
言い換えると、本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは、配列：GAGATACMTTGACCTからなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列：GAGATACMTTGACCTの3’末端及び/又は5’末端に１〜６の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、5’末端に付加してもよい１〜６の塩基とは、具体的にA、5’-CA-3’、5’-CCA-3’、5’-TCCA-3’、5’-GTCCA-3’及び5’-GGTCCA-3’である。また、3’末端に付加してもよい１〜６の塩基とは、具体的にT、5’-TC-3’、5’-TCT-3’、5’-TCTC-3’、5’-TCTCC-3’及び5’-TCTCCC-3’である。
【００１７】
或いは、本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは、配列：GAGATACMTTGACCTの相補的配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良いし、配列：GAGATACMTTGACCTの相補的配列の3’末端及び/又は5’末端に１〜６の塩基が付加した配列からなるオリゴヌクレオチドであっても良い。ここで、5’末端に付加してもよい１〜６の塩基とは、具体的にA、5’-CA-3’、5’-CCA-3’、5’-TCCA-3’、5’-GTCCA-3’及び5’-GGTCCA-3’の相補鎖である。また、3’末端に付加してもよい１〜６の塩基とは、具体的にT、5’-TC-3’、5’-TCT-3’、5’-TCTC-3’、5’-TCTCC-3’及び5’-TCTCCC-3’の相補鎖である。
【００１８】
より具体的に、本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブとしては、配列番号１〜７のいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとすることが好ましい。
5’-GAGATACMTTGACCT-3’（配列番号１）
5’-AGAGATACMTTGACCTT-3’（配列番号２）
5’-CAGAGATACMTTGACCTTC-3’（配列番号３）
5’-CCAGAGATACMTTGACCTTCT-3’（配列番号４）
5’-TCCAGAGATACMTTGACCTTCTC-3’（配列番号５）
5’-GTCCAGAGATACMTTGACCTTCTCC-3’（配列番号６）
5’-GGTCCAGAGATACMTTGACCTTCTCCC-3’（配列番号７）
【００１９】
rs1057910は、CYP2C9遺伝子内に座位する一塩基多型であり、野生型はAであり野生型アレル：CYP2C9*1と表記され、変異型はCであり変異型アレル：CYP2C9*3と表記される。変異型アレル：CYP2C9*3は、薬物の代謝能を低下させる変異として知られている。よって、変異型アレル：CYP2C9*3をホモ又はヘテロで有する個体は、野生型アレルをホモで有する個体と比較して薬物代謝が遅延することが知られている。
【００２０】
ここで、CYP2C9が代謝に関与する薬剤としては、例えば、ワルファリン（商品名：ワーファリン）、イブプロフェン、ジクロフェナク、フェニトイン、トルブタミド、ロサルタン、スルファメトキサゾール、トラセミド、グリベンクラミド、グリピジド、セレコキシブ、グリメピリド、Δ9-テトラヒドロカンナビノール、フルバスタチン、フルオキセチン、ヘキソバルビタール、非ステロイド性消炎鎮痛薬（ピロキシカム、フルルビプロフェン、メフェナム酸、セレコキシプ）等を挙げることができる。
【００２１】
本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは、好ましくは核酸であり、より好ましくはDNAである。DNAには二本鎖も一本鎖も含まれるが、本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは好ましくは一本鎖DNAである。
【００２２】
本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは、例えば、核酸合成装置によって化学的に合成することで取得することができる。核酸合成装置としては、DNAシンセサイザー、全自動核酸合成装置、核酸自動合成装置等と呼ばれる装置を使用することができる。
【００２３】
本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブは、その5’末端を担体上に固定化することにより、マイクロアレイ（例えばDNAチップ）の形態で用いるのが好ましい。このとき、マイクロアレイは、rs1057910における遺伝子型のうち野生型アレルであるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドと、変異型アレルであるシトシンに対応する配列のオリゴヌクレオチドとからなる一対のCYP2C9*3検出用プローブを有することが好ましい。野生型と変異型に対応する一対のCYP2C9*3検出用プローブを利用することによって、rs1057910がアデニンのホモ接合型であるか、シトシンのホモ接合型であるか、アデニンとシトシンのヘテロ接合型であるかを正確に同定することができる。
【００２４】
ここで、rs1057910における遺伝子型のうち野生型アレルであるアデニンに対応する配列のオリゴヌクレオチドと、変異型アレルであるシトシンに対応する配列のオリゴヌクレオチドとは、長さが２塩基以内の差であることが好ましく、長さが同じであることがより好ましい。
【００２５】
また、マイクロアレイは、rs1057910における遺伝子型のうち変異型であるシトシンに対応する配列のオリゴヌクレオチドのみをCYP2C9*3検出用プローブとして有するものであってもよい。rs1057910の少なくとも一方のアレルがシトシンであるとき、すなわちrs1057910の遺伝子型がC/C（シトシンのホモ接合型）又はA/C（アデニンとシトシンのヘテロ接合型）である場合、薬物代謝が遅いと判断できるためである。
【００２６】
担体の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されない。例えば、白金、白金黒、金、パラジウム、ロジウム、銀、水銀、タングステンおよびそれらの化合物などの貴金属、およびグラファイト、カ−ボンファイバ−に代表される炭素などの導電体材料；単結晶シリコン、アモルファスシリコン、炭化ケイ素、酸化ケイ素、窒化ケイ素などに代表されるシリコン材料、SOI（シリコン・オン・インシュレータ）などに代表されるこれらシリコン材料の複合素材；ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、セラミクス、フォルステライト、感光性ガラスなどの無機材料；ポリエチレン、エチレン、ポリプロビレン、環状ポリオレフィン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリル・ブタジエンスチレン共重合体、ポリフェニレンオキサイドおよびポリスルホンなどの有機材料等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、好ましくは平板状である。
【００２７】
本発明においては、担体として、好ましくは表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体を用いる。表面にカーボン層と化学修飾基とを有する担体には、基板の表面にカーボン層と化学修飾基とを有するもの、およびカーボン層からなる基板の表面に化学修飾基を有するものが包含される。基板の材料としては、当技術分野で公知のものを使用でき、特に制限されず、上述の担体材料として挙げたものと同様のものを使用できる。
【００２８】
本発明に係るマイクロアレイにおいては、微細な平板状の構造を有する担体が好適に用いられる。形状は、長方形、正方形および丸形など限定されないが、通常、1〜75mm四方のもの、好ましくは1〜10mm四方のもの、より好ましくは3〜5mm四方のものを用いる。微細な平板状の構造の担体を製造しやすいことから、シリコン材料や樹脂材料からなる基板を用いるのが好ましく、特に単結晶シリコンからなる基板の表面にカーボン層および化学修飾基を有する担体がより好ましい。単結晶シリコンには、部分部分でごくわずかに結晶軸の向きが変わっているものや（モザイク結晶と称される場合もある）、原子的尺度での乱れ(格子欠陥)が含まれているものも包含される。
【００２９】
本発明において基板上に形成させるカーボン層としては、特に制限されないが、合成ダイヤモンド、高圧合成ダイヤモンド、天然ダイヤモンド、軟ダイヤモンド（例えば、ダイヤモンドライクカーボン）、アモルファスカーボン、炭素系物質（例えば、グラファイト、フラーレン、カーボンナノチューブ）のいずれか、それらの混合物、またはそれらを積層させたものを用いることが好ましい。また、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウム、炭化モリブデン、炭化クロム、炭化バナジウム等の炭化物を用いてもよい。ここで、軟ダイヤモンドとは、いわゆるダイヤモンドライクカーボン（DLC：Diamond Like Carbon）等の、ダイヤモンドとカーボンとの混合体である不完全ダイヤモンド構造体を総称し、その混合割合は、特に限定されない。カーボン層は、化学的安定性に優れておりその後の化学修飾基の導入や分析対象物質との結合における反応に耐えることができる点、分析対象物質と静電結合によって結合するためその結合が柔軟性を持っている点、UV吸収がないため検出系UVに対して透明性である点、およびエレクトロブロッティングの際に通電可能な点において有利である。また、分析対象物質との結合反応において、非特異的吸着が少ない点においても有利である。前記のとおり基板自体がカーボン層からなる担体を用いてもよい。
【００３０】
本発明においてカーボン層の形成は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマCVD(Chemical vapor deposit）法、ECRCVD(Electric cyclotron resonance chemical vapor deposit）法、ICP(Inductive coupled plasma）法、直流スパッタリング法、ECR(Electric cyclotron resonance)スパッタリング法、イオン化蒸着法、アーク式蒸着法、レーザ蒸着法、EB(Electron beam)蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。
【００３１】
高周波プラズマCVD法では、高周波によって電極間に生じるグロー放電により原料ガス（メタン）を分解し、基板上にカーボン層を合成する。イオン化蒸着法では、タングステンフィラメントで生成される熱電子を利用して、原料ガス（ベンゼン）を分解・イオン化し、バイアス電圧によって基板上にカーボン層を形成する。水素ガス1〜99体積％と残りメタンガス99〜1体積％からなる混合ガス中で、イオン化蒸着法によりカーボン層を形成してもよい。
【００３２】
アーク式蒸着法では、固体のグラファイト材料（陰極蒸発源）と真空容器（陽極）の間に直流電圧を印加することにより真空中でアーク放電を起こして陰極から炭素原子のプラズマを発生させ蒸発源よりもさらに負のバイアス電圧を基板に印加することにより基板に向かってプラズマ中の炭素イオンを加速しカーボン層を形成することができる。
【００３３】
レーザ蒸着法では、例えばNd:YAGレーザ（パルス発振）光をグラファイトのターゲット板に照射して溶融させ、ガラス基板上に炭素原子を堆積させることによりカーボン層を形成することができる。
【００３４】
基板の表面にカーボン層を形成する場合、カーボン層の厚さは、通常、単分子層〜100μm程度であり、薄すぎると下地基板の表面が局部的に露出する可能性があり、逆に厚くなると生産性が悪くなるので、好ましくは2nm〜1μm、より好ましくは5nm〜500nmである。
【００３５】
カーボン層が形成された基板の表面に化学修飾基を導入することにより、オリゴヌクレオチドプローブを担体に強固に固定化できる。導入する化学修飾基は、当業者であれば適宜選択することができ、特に制限されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、エポキシ基、ホルミル基、ヒドロキシル基および活性エステル基が挙げられる。
【００３６】
アミノ基の導入は、例えば、カーボン層をアンモニアガス中で紫外線照射することによりまたはプラズマ処理することにより実施できる。または、カーボン層を塩素ガス中で紫外線を照射して塩素化し、さらにアンモニアガス中で紫外線照射することにより実施できる。または、メチレンジアミン、エチレンジアミンで等の多価アミン類ガス中を、塩素化したカーボン層と反応させることによって実施することもできる。
【００３７】
カルボキシル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な化合物を反応させることにより実施できる。カルボキシル基を導入するために用いられる化合物としては、例えば、式：X-R1-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R1は炭素数10〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるハロカルボン酸、例えばクロロ酢酸、フルオロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、2-クロロプロピオン酸、3-クロロプロピオン酸、3-クロロアクリル酸、4-クロロ安息香酸；式：HOOC-R2-COOH（式中、R2は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸；ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、トリメリット酸、ブタンテトラカルボン酸などの多価カルボン酸；式：R3-CO-R4-COOH（式中、R3は水素原子または炭素数1〜12の2価の炭化水素基、R4は炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるケト酸またはアルデヒド酸；式：X-OC-R5-COOH（式中、Xはハロゲン原子、R5は単結合または炭素数1〜12の2価の炭化水素基を表す）で示されるジカルボン酸のモノハライド、例えばコハク酸モノクロリド、マロン酸モノクロリド；無水フタル酸、無水コハク酸、無水シュウ酸、無水マレイン酸、無水ブタンテトラカルボン酸などの酸無水物が挙げられる。
【００３８】
エポキシ基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に適当な多価エポキシ化合物を反応させることによって実施できる。あるいは、カーボン層が含有する炭素＝炭素２重結合に有機過酸を反応させることにより得ることができる。有機過酸としては、過酢酸、過安息香酸、ジペルオキシフタル酸、過ギ酸、トリフルオロ過酢酸などが挙げられる。
【００３９】
ホルミル基の導入は、例えば、前記のようにアミノ化したカーボン層に、グルタルアルデヒドを反応させることにより実施できる。
【００４０】
ヒドロキシル基の導入は、例えば、前記のように塩素化したカーボン層に、水を反応させることにより実施できる。
【００４１】
活性エステル基は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味する。エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N-ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。より具体的には、活性エステル基としては、たとえばp-ニトロフェニル基、N-ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられ、特に、N-ヒドロキシスクシンイミド基が好ましく用いられる。
【００４２】
活性エステル基の導入は、例えば、前記のように導入したカルボキシル基を、シアナミドやカルボジイミド（例えば、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド)などの脱水縮合剤とN-ヒドロキシスクシンイミドなどの化合物で活性エステル化することにより実施できる。この処理により、アミド結合を介して炭化水素基の末端に、N-ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基が結合した基を形成することができる（特開2001-139532）。
【００４３】
本発明に係る多型検出用プローブを、スポッティング用バッファーに溶解してスポッティング用溶液を調製し、これを96穴もしくは384穴プラスチックプレートに分注し、分注した溶液をスポッター装置等によって担体上にスポッティングすることにより、多型検出用プローブが担体に固定化されたマイクロアレイを製造することができる。または、スポッティング溶液をマイクロピペッターにて手動でスポッティングしてもよい。
【００４４】
スポッティング後、多型検出用プローブが担体に結合する反応を進行させるため、インキュベーションを行うことが好ましい。インキュベーションは、通常−20〜100℃、好ましくは0〜90℃の温度で、通常0.5〜16時間、好ましくは1〜2時間にわたって行う。インキュベーションは、高湿度の雰囲気下、例えば、湿度50〜90％の条件で行うのが望ましい。インキュベーションに続き、担体に結合していないDNAを除去するため、洗浄液（例えば、50mM TBS/0.05% Tween20、2×SSC/0.2%SDS溶液、超純水など）を用いて洗浄を行うことが好ましい。
【００４５】
また、上記CYP2C9*3検出用プローブ又はマイクロアレイを用いることで、被検者（薬物投与対象者）における、rs1057910で特定される一塩基多型の遺伝子型を判定することができる。本発明では、被検者由来の試料からDNAを抽出する工程と、抽出したDNAを鋳型とし、rs1057910を含む領域を増幅する工程と、上記CYP2C9*3検出用プローブ又はマイクロアレイを用いて、増幅された核酸に含まれるrs1057910で特定される一塩基多型の遺伝子型を同定する工程とを含む。
【００４６】
被検者は通常ヒトであり、人種等には特に限定されないが、特に、黄色人種、好適には東アジア人種、特に好適には日本人とする。被検者由来の試料は特に制限されない。例えば、血液関連試料（血液、血清、血漿など）、リンパ液、糞便、がん細胞、組織または臓器の破砕物および抽出物などが挙げられる。
【００４７】
まず、被検者から採取した試料からDNAを抽出する。抽出手段としては、特に限定されない。例えばフェノール／クロロホルム、エタノール、水酸化ナトリウム、CTABなどを用いたDNA抽出法を用いることができる。
【００４８】
次に、得られたDNAを鋳型として用いて増幅反応を行い、rs1057910を含む領域、好ましくはDNAを増幅させる。増幅反応としては、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）、ICAN（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法等を適用することができる。増幅反応においては、増幅後の領域を識別できるように標識を付加することが望ましい。このとき、増幅された核酸を標識する方法としては、特に限定されないが、例えば増幅反応に使用するプライマーをあらかじめ標識しておく方法を使用してもよいし、増幅反応に標識ヌクレオチドを基質として使用する方法を使用してもよい。標識物質としては、特に限定されないが、放射性同位元素や蛍光色素、あるいはジゴキシゲニン（DIG）やビオチンなどの有機化合物などを使用することができる。
【００４９】
またこの反応系は、核酸増幅・標識に必要な緩衝剤、耐熱性DNAポリメラーゼ、増幅領域に特異的なプライマー、標識ヌクレオチド三リン酸（具体的には蛍光標識等を付加したヌクレオチド三リン酸）、ヌクレオチド三リン酸および塩化マグネシウム等を含む反応系である。
【００５０】
増幅反応に用いるプライマーは、rs1057910を含む領域を特異的に増幅できるものであれば特に制限されず、当業者であれば適宜設計できる。例えば、
プライマー１：5'- GAACGTGTGATTGGCAGAAA -3'（配列番号８）及び
プライマー２：5'- TCGAAAACATGGAGTTGCAG -3'（配列番号９）
からなるプライマーのセットが挙げられる。
【００５１】
また、プライマーにより増幅される核酸断片は、rs1057910を含んでいれば特に限定されず、例えば1kbp以下が好ましく、800bp以下がより好ましくは、400bp以下が更に好ましく、200bp以下が特に好ましい。
【００５２】
上記のようにして得られた増幅核酸と本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、CYP2C9*3検出用プローブにハイブリダイズした核酸の量を、例えば標識を検出することにより測定できる。標識からのシグナルは、例えば、蛍光標識を用いた場合は、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナル検出し、これを画像解析ソフトによって解析することによりシグナル強度を数値化することができる。また、CYP2C9*3検出用プローブにハイブリダイズした増幅核酸は、例えば、既知量のDNAを含む試料を用いて検量線を作成することにより、定量することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、好ましくはストリンジェントな条件下で実施する。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、50℃で16時間ハイブリダイズ反応させた後、2×SSC/0.2% SDS、25℃、10分および2×SSC、25℃、5分の条件で洗浄する条件をさす。或いは、ハイブリダイズする温度としては、塩濃度が0.5×SSCのとき、45〜60℃とすることができ、CYP2C9*3検出用プローブの鎖長が短い場合にはハイブリダイズ温度をこれより低くすることがより好ましく、CYP2C9*3検出用プローブの鎖長が長い場合にはハイブリダイズ温度をこれより高くとすることがより好ましい。塩濃度が高くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は高くなり、逆に塩濃度が低くなると特異性を有するハイブリダイズ温度は低くなることはいうまでもない。
【００５３】
上記ハイブリダイゼーション反応においては、本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブが担体上に固定化されたマイクロアレイを用い、該マイクロアレイに増幅核酸を含む溶液を作用する方法が好ましい。
【００５４】
本発明に係る薬物代謝能を予測するためのデータ取得方法は、本発明に係るCYP2C9*3検出用プローブにハイブリダイズした上記増幅核酸の量に基づいて、被験者のゲノムにおけるrs1057910の遺伝子型が、変異型アレルをホモで有するかヘテロで有するか特定する。そして、rs1057910の遺伝子型が変異型アレル：CYP2C9*3をホモ又はヘテロで有する場合に当該被験者について、薬物代謝速度が遅いと判断できる。このため、変異型アレル：CYP2C9*3をホモで有する個体及びヘテロで有する個体は、野生型アレルをホモで有する個体と比較して、上述した薬物の投与量を少量とすることができる。
【００５５】
特に、変異型アレル：CYP2C9*3をホモで有する個体と、変異型アレル：CYP2C9*3をヘテロで有する個体とを比較した場合には、変異型アレル：CYP2C9*3をホモで有する個体における薬物代謝速度がより遅いと判断できる。よって、変異型アレル：CYP2C9*3をホモで有する個体に対する薬物投与量は、変異型アレル：CYP2C9*3をヘテロで有する個体に対する薬物投与量よりも少量とすることができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが本発明の技術的範囲は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００５７】
〔実施例１〕
本実施例では、rs1057910の遺伝子型を判別するための一対のCYP2C9*3検出用プローブを有するDNAチップを作製した。DNAチップに搭載した核酸プローブの一覧を表１に示した。
【００５８】
【表１】
2016192941.tif 000002
【００５９】
本実施例では、PCR法により、蛍光標識を有する、rs1057910を含む核酸断片を増幅し、得られた核酸断片を以上のように作製したDNAチップに対して作用させ、核酸断片と多型検出用プローブとのハイブリダイズを蛍光強度にて検出した。
【００６０】
蛍光標識プライマーの作製は、5’末端をアミノ基で標識した表２に示すオリゴヌクレオチドC2C93-R（ライフテクノロジーズジャパン製）と、IC5-OSu（同仁化学研究所製）をりん酸緩衝液（pH8.0）中で4℃にて１昼夜反応させた後、MicroSpin G-25 Columns（GEヘルスケア製）を用いて精製することにより作製した。得られた精製物の260nm及び640nmの吸光度を測定することにより、プライマーの濃度及び蛍光色素の濃度を算出した。
【００６１】
【表２】
2016192941.tif 000003
【００６２】
得られた蛍光標識プライマーに蛍光未標識プライマー（C2C93-F）を加え、表２の濃度のプライマーを等量ずつ混合し、プライマーミックスを調整した。表３に示す条件にてPCRを行った。具体的にPCRは、表４に示す組成で反応液を調整し、これに野生型検体として2pg/μLに調製した野生型配列をもつプラスミドDNA、変異型配列を持つプラスミドDNA及びヘテロ相当として調整したプラスミドDNAを5μLずつ反応チューブにそれぞれ加えた後、PCRをサーマルサイクラー（ABI製）を用いて行った。
【００６３】
【表３】
2016192941.tif 000004
【００６４】
【表４】
2016192941.tif 000005
【００６５】
以上のようにして得られた増幅産物をDNAチップにハイブリダイズさせる際には、先ず、規定温度（４５、５０、５５、６０℃のいずれか）に設定したチャンバー内に湿箱を載置し、チャンバー及び室箱をあらかじめ十分予熱しておいた。新しいサンプルチューブにハイブリダイズ緩衝液（2.25×SSC/0.23%SDS）を1.5μLと増幅産物を3μL入れ、混合した。この混合液のうち3μLをDNAチップ上に滴下し、カバーをかけ、十分に予熱しておいた湿箱に入れ、湿箱をチャンバー内に載置した。その後、規定温度で１時間DNAチップと増幅産物を反応させた。
【００６６】
その後、直ちにカバーを外し、1×SSC/0.1%SDS溶液に５分間静置した後、検出するまで室温の1×SSC溶液に静置した。ハイブリダイズの検出には、BIOSHOT（東洋鋼鈑製）を使用した。このとき、露光時間を５秒に設定した。また、各スポット径内の画素の数値から、中央値を求めた。同じプローブスポットは中央値の平均を求め、各スポットの出力値とした。
【００６７】
特異性の評価に当たっては、各スポットの蛍光強度値を以下の判定式に代入して得られる判定値を指標とした。
【００６８】
【数１】
2016192941.tif 000006
【００６９】
本実施例のうち、ハイブリダイズ温度を変化させて得られた判定値を表５に示した。また、野生型アレル及び変異型アレルに対応する一対のCYP2C9*3検出用プローブを異なる塩基長のものを使用したときに得られた判定値を表６に示した。
【００７０】
【表５】
2016192941.tif 000007
【００７１】
【表６】
2016192941.tif 000008
【００７２】
表５から分かるように、本実施例で設計した15〜27塩基のCYP2C9*3検出用プローブであれば、45〜60℃のハイブリダイズ反応温度で、各遺伝子型から得られる判定値に0.2以上の差が見られ、遺伝子型判別が可能であることが明らかとなった。また、表６に示すように、本実施例で設計した15〜27塩基のCYP2C9*3検出用プローブであれば、塩基長が2塩基異なる場合であっても特異性を有していることが確認された。
【配列表】
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