(57)【要約】【課題】保存安定性に優れるとともに、散布後の環境拡散、生態系へ与える影響が少なく、とりわけ環境から新しく未知な能力を獲得することのない、新規な微生物触媒を提供する。【解決手段】芳香族化合物の分解反応に関わる一群の酵素を過剰発現させた微生物菌体に、賦形剤を添加し、噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族化合物の分解反応に関わる一群の酵素を過剰発現させた微生物菌体に、賦形剤を添加し、噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒。
【請求項２】
前記乾燥菌体が、核酸を転移し又は複製する能力を不活化した死細菌細胞からなる請求項１に記載の微生物触媒。
【請求項３】
前記賦形剤が、乳糖、スキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス及びアラビアガムからなる群より選択される請求項１又は２に記載の微生物触媒。
【請求項４】
前記酵素が、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを含む請求項１〜３の何れか一項に記載の微生物触媒。
【請求項５】
前記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ若しくはビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ又はこれらの混合物を含む請求項１〜４の何れか一項に記載の微生物触媒。
【請求項６】
リン酸緩衝液に再懸濁した時に、生細胞と同様の細胞形態に分散しうる１〜５の何れか一項に記載の微生物触媒。
【請求項７】
基質特異性の異なる複数の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼのそれぞれを過剰発現させた請求項１〜６のいずれか一項に記載の複数の微生物触媒を組み合わせてなる、ポリ塩化ビフェニル類分解用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢｓ）分解用微生物触媒及びそれを組み合わせてなる複合微生物触媒に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢｓ）は、ビフェニルの１個以上の水素原子を塩素原子で置換した化合物の総称をいう。置換塩素の数及び位置によって多くの異性体が存在するが、理論上２０９種類に別れることが知られている。ＰＣＢｓは化学的性状が極めて安定で、絶縁性や不燃性、高脂溶性、可塑性等に優れるため、電気製品や熱媒体、絶縁油、可塑剤、塗料及びノンカーボン紙の溶剤など、非常に多岐にわたる製品分野に使用されてきた。しかしながら、生体に対する毒性が高く、臓器や脂肪組織に蓄積しやすく、発癌性があり、それに伴い皮膚障害や内臓障害、ホルモン異常なども引き起こすことから、現在ではその使用が国内のみならず国際的にも禁止されている。
【０００３】
国内でこれまでに輸入・製造販売されたＰＣＢｓは、およそ５５，０００トンと推定される。その使用が禁止された上、使用者に対する保管が義務付けられた後、ポリ塩化ビフェニル廃棄物の適正な処理の推進に関する特別措置法等により、所定の期限までに無害化する計画が立てられている。近年、電気機器中の絶縁油に、１ｋｇ当たり数十ｍｇ程度という微量のＰＣＢｓが検出されるものが大量に存在することが明らかとなったが、この微量ＰＣＢｓ汚染油については、使用あるいは保管に関する正確な数量は把握できていない。ＰＣＢｓの分解方法としては、従来からの焼却法に加えて、脱塩素化分解法、水熱酸化分解法、水素供与物質による還元熱化学分解法、紫外線照射法等による光分解法等が知られている。これらのうち、紫外線分解法は、ＰＣＢｓを極性有機溶媒中に溶かして紫外線を照射することにより脱塩素化し、続いて残留するＰＣＢｓを生物処理又は触媒処理等によって無害化するものであり、常温、常圧処理できるため安全性が高く、毒性を有するＰＣＢｓを、生命体である微生物が異化することでその分解物の安全性が高いと想定され、化学処理等に較べて利点があると考えられる。
【０００４】
ＰＣＢｓを分解する菌として、これまでに報告されている微生物は、シュードモナス属細菌（Pseudomonas sp.）ＫＦ７０７株（非特許文献１）、コマモナス・テストステロニ（Comamonastestosteroni）ＴＫ１０２株（非特許文献２）及びバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＬＢ４００株（非特許文献３）などがある。これらの微生物は、ビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）をはじめとする一連のビフェニル分解に関与する酵素群を発現し、その生化学的、遺伝学的な解析が精力的に行われた。
しかしながら、これらのＰＣＢｓ分解菌を別々に培養し、個々のポリ塩化ビフェニル異性体に対する分解特性を詳細に検討することにより、ＰＣＢｓ分解に最適な組み合わせの複数の微生物を配合した複合微生物製剤は知られていない。
【０００５】
さらに、遺伝子組換え生物の使用による生物多様性への悪影響を防止することを目的とした「生物の多様性に関する条約のバイオセーフティに関するカルタヘナ議定書（カルタヘナ議定書）」による規制では、カルタヘナ第一種において、例えば、環境修復技術や金属回収・固定化技術、生物農薬などの分野で、その官庁などからの利用承認アセスメントを、カルタヘナ第二種では、例えば、試薬や工業用原料生産のために遺伝子組換え生物などの拡散防止処置を講ずることが必要とされている。したがって、遺伝子組み換え技術によりＰＣＢ分解に係る一群の酵素を組み込んだ微生物を産業上利用する場合は、これらの規制に適合しなければならない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】末永光他、微生物によるポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の分解：最近の遺伝生化学的研究、Journal of Environmental Biotechnology, Vol.2, No.1, 1-12, 2002
【非特許文献２】Shimura M. et al, Journal of Fermentation and Bioengineering , Vol. 81, No. 6, pp.573-576, 1996.
【非特許文献３】Bopp, LH, J. Ind. Microbiol. 53: 23-29, 1986
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、保存安定性に優れるとともに、散布後の環境拡散、生態系へ与える影響が少なく、とりわけ環境から新しく未知な能力を獲得することのない、新規な微生物触媒を提供することを課題とする。
【０００８】
また、このような微生物触媒を用いて、ＰＣＢ汚染油などに含まれる比較的低濃度のポリ塩化ビフェニル類を効率的にしかも基準値（０．５ｍｇ／ｋｇ以下）以下の残存濃度まで分解、無毒化することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
芳香族化合物の分解反応に関わる一群の複合酵素を発現する微生物菌体に、賦形剤を添加して噴霧乾燥したところ、凍結保存菌体に比べて大きく活性低下することなく乾燥菌体を得ることができた。得られた乾燥菌体は保存安定性に優れ、これを用いて効率よくＰＣＢｓを分解、無毒化しうることを見いだし、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明の要旨は以下の態様を含む。
［１］芳香族化合物の（酸化的）分解反応に関わる一群の酵素を過剰発現させた嫌気性ならびに好気性を示す全ての微生物菌体に、賦形剤を添加し、噴霧乾燥してなる乾燥菌体を含む微生物触媒。
［２］前記乾燥菌体が、核酸を転移し又は複製する能力を不活化した死細菌細胞からなる［１］に記載の微生物触媒。
［３］前記賦形剤が、乳糖、スキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス及びアラビアガムからなる群より選択される［１］又は［２］に記載の微生物触媒。
［４］前記酵素が、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを含む［１］〜［３］のいずれかに記載の微生物触媒。
［５］前記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ若しくはビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ又はこれらの混合物を含む［１］〜［４］のいずれかに記載の微生物触媒。
［６］リン酸緩衝液に再懸濁した時に、生細胞と同様の細胞形態に分散しうる［１］〜［５］のいずれかに記載の微生物触媒。
［７］基質特異性の異なる複数の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼのそれぞれを過剰発現させた［１］〜［６］のいずれかに記載の複数の微生物触媒を組み合わせてなる、ポリ塩化ビフェニル類分解用組成物。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係る微生物触媒は、生物多様性の保全から使用が困難であった微生物、例えば、産業上有用な微生物にもかかわらず、核酸を転移し又は複製する能力を有する細胞に該当したり、あるいは遺伝子組換え生物であったりして、その利用ができなかった微生物の利用を可能にすることを特徴とする。
これにより、生物多様性の保全に影響を及ぼすと懸念される遺伝子組換え生物を含む細胞生物の利用が簡便となり、したがって、世界における有用微生物の開放系での利用範囲も大きく拡がるであろうことから、産業の活性化が期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】異なる賦形剤を用いて作製した微生物触媒の酵素活性の評価結果（ｎ＝３）である。
【図２】ＤＬＳ法による微生物触媒の粒子サイズとサイズ分布を表わす。
【図３】凍結保存した生菌体（コントロール）の電顕像である。
【図４】乾燥した微生物触媒の電顕像である。
【図５】リン酸塩緩衝液に再懸濁した微生物触媒の電顕像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の微生物触媒は、産業上有用となる微生物種において、必要とする単独の酵素や、代謝に関わる一連の酵素群を、あらかじめ強発現させた上で、細胞保護作用のある賦形剤、例えば、糖質類などを加えて希釈増量し、スプレードライヤーなどで強制乾燥させることで、微生物としては死滅している（すなわちカルタヘナ法での生物の定義として、核酸を転移し、または複製する能力を有しない生体由来物質となる）が、その細胞の形態や構造を維持させることで、細胞内あるいは細胞表面に存在する酵素活性を維持させる性質や、基質となる物質の細胞膜透過性を保存していることを特徴とする。
【００１４】
（芳香族化合物分解酵素）
本発明の微生物触媒に使用しうる芳香族化合物分解酵素は、芳香族化合物を含む汚染物質を分解しうる酵素であれば特に限定されるものではなく、多種多様な汚染物質を分解するものとして多くの動物又は微生物由来の酵素を用いることができる。これらの中でも、特に、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼ、又はRieske non-heme iron oxygenaseと称される一群の酵素が好ましく、これらは多くの芳香族化合物分解経路での最初の反応であるシス型二水酸化反応を触媒する。トルエンやナフタレンに加えてベンゼン、クメン、フェナントレン、ピレン等の単環・多環の芳香族炭化水素に限らず、ダイオキシン、ジベンゾチオフェン、カルバゾール等のヘテロ環式芳香族化合物、ＰＣＢ等のビフェニル環化合物等の種々の芳香族化合物の好気的代謝経路において、これらの酵素は初発酸化酵素として一連の分解反応の進行の有無を左右する重要な役割を果たしている。芳香環水酸化ジオキシゲナーゼは、基質を認識し酸化反応を行う酸化酵素（ＴＯ：terminal oxygenase）と、電子をＮＡＤ（Ｐ）ＨからＴＯに伝える電子伝達系から構成される多成分酵素である。電子伝達系は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから電子を受け取るレダクターゼ（Ｒｅｄ）単独で構成される場合と、Ｒｅｄとフェレドキシン（Ｆｄｘ）の二つで構成される場合がある。
【００１５】
微生物は、芳香族化合物への暴露とそれへの適応、進化を通じて多種多様の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを生み出してきたと考えられ、現在では、数十種以上の化合物の分解酵素として２００以上の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼが単離されている。電子伝達鎖の特徴による芳香環水酸化ジオキシゲナーゼの分類、及び酸化酵素触媒サブユニットのアミノ酸配列アライメントに基づく各酵素の分子系統樹による分類等は、「野尻秀昭他３名、蛋白質核酸酵素Vol.50, No.12, (2005) pp.1519-1526」に記載されており、その全内容は参照により本願に組み込まれるものとする。
【００１６】
好ましい実施形態において、本発明の微生物触媒は、上記芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを菌体内に発現した微生物触媒であり、二水酸化反応によって生じた中間体生成物をさらに分解して最終的にはアセチルＣｏＡやピルビン酸等のエネルギー物質にまで変換しうるその他の代謝酵素を含む。例えば、ビフェニル分解に関与する一連の酵素群を挙げれば、芳香環水酸化ジオキシゲナーゼとしてのビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ酵素）の他に、ＢｐｈＡの産物から２つの水素を除くジヒドロジオールジヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ酵素）、ＢｐｈＢ産物に酸素１分子が付加してＨＯＰＤＡを生成する２，３−ジヒドロキシビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ酵素）、ついで、ＨＯＰＤＡを安息香酸と２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートとに分解する２−ヒドロキシル−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸ヒドロラーゼ（ＢｐｈＤ酵素）、そして、アセチルＣｏＡとピルビン酸に転換する２−ヒドロキシペンタ−２，４−ジエノエートヒドラターゼ（ＢｐｈＥ酵素）、４−ヒドロキシ−２−オキソバレレートアルドラーゼ（ＢｐｈＦ酵素）及びアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＧ酵素）等を含む。
【００１７】
このような芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを有する微生物は、自然環境中から対象とする芳香族化合物又はそれと構造の類似する化合物を培地に添加して、当業者に既知の方法によりスクリーニングすることができる。例えば、ＰＣＢｓ分解菌は、ビフェニルを単一の炭素源として生育し得る微生物からのスクリーニングを繰り返し行うことにより見出される。天然にビフェニル分解酵素を産生する微生物としては、シュードモナス属、コマモナス属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ロドコッカス属、ラルストニア属等に属する多くの細菌があるが、ビフェニル資化性菌のスクリーニング段階でビフェニル分解活性の一つの指標となる黄橙色を示すメタ開裂物質（例えば、２−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｏｘｏ−６−ｐｈｅｎｙｌｈｅｘａ−２，４−ｄｉｅｎｏｔｅ）を速やかに生産し、且つ生育速度が速い微生物を選択することで、ＰＣＢ分解活性に優れる微生物の取得が期待できる。
【００１８】
さらに、スクリーニングにより得られた微生物から当該物質の分解に関与する酵素遺伝子、例えば、ビフェニル分解酵素遺伝子をクローン化し、これらに部位特異的突然変異誘発法等によって変異を導入することで、さらにＰＣＢ分解活性の向上した遺伝子群を作製することができる。なお遺伝子に変異を導入する方法には、Kunkel法、Gapped duplex法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えば、エラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A. L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A., Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins. Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001等に記載されている。これらの手法によって作製された突然変異遺伝子を、もとの微生物のゲノムＤＮＡと置換するか、プラスミドＤＮＡやコスミドＤＮＡにクローン化して宿主微生物に導入し、新規な微生物を作製することも可能である。本発明の方法に使用しうる酸素添加酵素、好ましくは芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを産生する微生物は、このような方法により、当業者であれば容易に入手しうると考えられる。
【００１９】
本発明の微生物触媒は、基質特異性の異なる２種以上の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを発現する微生物を組み合わせることが好ましい。好気性微生物におけるＰＣＢｓ分解系の最初の酵素であるビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）について、基質特異性の異なる少なくとも２種類を組み合わせることがより好ましい。ＢｐｈＡは４つのサブユニット（ＢｐｈＡ１、ＢｐｈＡ２、ＢｐｈＡ３及びＢｐｈＡ４）から構成されており、そのうちの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）が二原子酸素添加反応の基質特異性に関与していることが判っている。したがって、本発明の好ましい実施形態では、少なくともＢｐｈＡ１の化学構造が異なり、それによってＰＣＢｓに対する基質特異性も異なった少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ）を組み合わせて用いることができる。
【００２０】
本発明において、前記少なくとも２種類のビフェニルジオキシゲナーゼは、少なくとも１種のポリ塩化ビフェニルに対して、ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性及び／又はビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有する。したがって、２種類のＢｐｈＡを組み合わせる場合、１種類のＢｐｈＡは、ポリ塩化ビフェニルに対するビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有し、他の１種類のＢｐｈＡは、ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性を有することが好ましい。これら２種類のＢｐｈＡを含む限り、さらに別の基質特異性を有する酵素、例えば、ビフェニル−１，２−ジオキシゲナーゼ活性を有するＢｐｈＡが存在してもよい。また、同じビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性であっても基質となるＰＣＢ異性体の種類によって異なる活性を有する複数の酵素を含有していてもよい。
【００２１】
ここで、「ビフェニル−２，３−ジオキシゲナーゼ活性」とは、少なくとも１種類のポリ塩化ビフェニル異性体に対して当該ビフェニル環の２位と３位に二原子酸素添加反応を行うことができる酵素活性である。例えば、コマモナス・テストステロニＹＡＺ２株由来のＢｐｈＡは、２，４’，５−トリクロロビフェニルや２，４，４’−トリクロロビフェニルに対する２，３−ジオキシゲナーゼ活性を有することが分っている。一方、「ビフェニル−３，４−ジオキシゲナーゼ活性」とは、少なくとも１種類のポリ塩化ビフェニル異性体に対して当該ビフェニル環の３位と４位に二原子酸素添加反応を行うことができる酵素活性である。例えば、バークホルデリア属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼは、２，５，４’−トリクロロビフェニルや２，５，２’，５’−テトラクロロビフェニルに対して、２，５−ジクロルリングの３，４−位に酸素分子を導入することができる。
【００２２】
（微生物の培養法）
本発明の微生物触媒を作製する上で、主要な原料となる、上記ビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル代謝経路で働く一連の酵素種を、自らの細胞内に強発現することができる微生物種について述べる。
【００２３】
ビフェニルを唯一の炭素源として、０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）を含む液体あるいは固形培地を用いスクリーニングして（例えば、特開２０１３−１７９８９０号公報参照）その候補とした、シュードモナス属やコマモナス属、バークホルデリア属、スフィンゴモナス属、ロドコッカス属、ラルストニア属、アクロモバクター属、ステノトロフォモナス属などの細菌を用いる。これらの細菌種では、ＰＣＢｓの分解に関連する酵素群が、細胞内で発現する。
【００２４】
あるいは遺伝子組換えにより、ＰＣＢｓの分解に関連する酵素種を単独、あるいは複数、遺伝子組換え技術でもって作創した過剰発現細菌なども、本微生物種に含まれる。とりわけ、過剰発現細菌において発現したＰＣＢｓ分解酵素種は極めて不安定であるため、本発明を用い、酵素を固定化することで、より安定した触媒として利用が可能になることから、極めて新しく、且つ有為な手段と考える。
【００２５】
次に、上記で示したＰＣＢｓ分解酵素群を高発現する細菌体を、速やかに、高い回収率で得る培養法について述べる。
培地は、K. Kimbara et. al. Agric. Biol. Chem., 52 (11), 2885-2891, 1988. を参考に、ｐＨが６．８〜７．０までとなるように調整した合成培地が良く、さらにビフェニルを炭素源として０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えたものが望ましい。さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良い。本培養に至る前に３段階の前培養を行うことが、細菌を効率良く増殖させる上で望ましい。手順は、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに、前に述べたビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地を２〜３ｍＬまで入れ、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ菌体量としてＯＤ６６０＝０．１〜０．８までとなるように、−８０℃以下で凍結保存した細菌株を、できるだけ速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養し、次に培地量で５倍以上の容積のフラスコなどに入れた、同じくビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７〜３０ｍＬに、その全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養し、さらに培地量の５倍以上の容積のフラスコなどにビフェニルを０．０５〜０．１％（ｗ／ｖ）まで加えた合成培地２７０〜３００ｍＬに、全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、ＯＤ６６０＝０．４〜０．８まで培養する。本培養は、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備し、その翼形状はタービン型で良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。前培養と同じく合成培地２．７〜３Ｌまでに対し、ビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように加えて、そこへ、前培養した培養液全量を投入する。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良い。細菌の生育と共に炭素源であるビフェニルが消費されるが、さらにビフェニルを０．０２〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるよう、継続的に加えていくことが望ましく、さらにビフェニルは、あらかじめジメチルスルホキシドにて溶解したものを加えても良く、最終的に、より高塩素化されたＰＣＢｓの分解活性を獲得した細菌が得られる。培養中の培養液のｐＨは、細菌の最終収量に影響を与えるため、その範囲は７．０〜９．０までとするのが望ましく、ｐＨの調整には、必要に応じて、アンモニウム塩を０．０２％〜０．０５％（ｗ／ｖ）までとなるように断続的に加えるのが良く、硫酸アンモニウムでも良い。また硫酸アンモニウムの添加は、培養中に窒素源も消費する場合において望ましい。最終の培養液のＯＤ６６０＝２．５〜３．０までで、湿重量が１５〜２０ｇまでの高活性なＰＣＢｓ分解細菌が得られる。
【００２６】
さらに、遺伝子組換えで作創したＰＣＢｓ過剰発現細菌株の培養法について述べる。
培地は、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）（以下、「ＬＢ培地」とする）、あるいはＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈを改変したイースト・エキストラクト２．４％とトリプトン１．２％を主成分とし（以下、「ＴＢ改変培地」とする）、リン酸水素二ナトリウム塩とリン酸二水素ナトリウム塩それぞれ７０ｍＭを、６対４の比率で配合した緩衝成分を含み、オートクレーブによる滅菌の後にｐＨ６．８〜７．０で調整したものが望ましい。
本培養に至る前に、二段階の前培養を行う事が望ましく、培地量の１０倍以上の容積の試験管などに、上記のいずれかの培地を２〜３ｍＬまで、薬剤耐性遺伝子を含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細菌を培養する場合は、抗生物質を１００μｇ／ｍＬあるいは適量を加え、抗生物質の種類としては、アンピシリンやネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリンなどを含み、１５〜１８％（ｗ／ｗ）までに調整したグリセロールへ、ＯＤ６６０＝０．１〜０．９までとなるように−８０℃以下で凍結保存した細菌株を速やかに解凍したものを播種し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、３〜５時間まで培養し、次にＴＢ改変培地を３００ｍＬまでに、直ちにその全量を投入し、振盪回転を１２０ｒｐｍ、温度を３０〜３５℃まで、７〜９時間まで培養する。
【００２７】
本培養は、羽根付きフラスコと恒温振盪培養機との組み合わせで行うことができ、温度と空気または酸素の曝気を制御でき、さらに撹拌翼を装備しその翼形状はタービン型でも良く、回転数も制御できるファーメンターなどの自動培養装置を用いるのが望ましい。培養装置を限定するものではないが、試作においては、エイブル株式会社製、微生物培養装置ＢＭＳ−０５ＮＣを用いることができる。抗生物質の添加の有り無しなど、前培養と同条件に整えた２×ＹＴ培地あるいはＴＢ改変培地２．７〜３Ｌまでに対し、そこへ前培養した培養液を全量投入する。この場合の菌液の濁度は、０．０３〜０．０８までとなるように調整するのが良く、０．０５が望ましい。撹拌翼の回転数は４００〜６００ｒｐｍまでとし、空気の場合は４〜５Ｌ／分までとし、温度は３０〜３５℃までとなるように調節する。培養液中の酸素濃度を高めるために排圧ユニットを用いるとなお良い。その場合は排圧を０．００５〜０．０１ＭＰａまでとなるよう調節すると良く、培養は６〜１０時間まで行うのが良く、８時間が望ましい。誘導性プロモーターを含む組換え発現ベクターで形質転換した宿主細菌を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）などを、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡＡ）などを培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主細胞に適した条件下で行われる。最終的に、湿重量１Ｌあたり９ｇ以上の遺伝子組換え型ＰＣＢｓ分解細菌が得られる。
【００２８】
（賦形剤）
前述の方法で得られた細菌体は、重力あるいは遠心による回収時において、生理食塩水あるいは２０ｍＭのリン酸塩緩衝液で少なくとも２回洗浄することが望ましく、リン酸塩はリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム塩を用いるのが良い。その後、菌体に対し細胞保護作用を示す賦形剤を添加する。例えば、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムなどの糖質を用い、菌体濃度５〜１５％（ｗ／ｖ）までに対し１〜３％（ｗ／ｖ）まで加えると、最終的に−２０〜−８０℃までに温度制御された冷凍庫などで保存できる。とりわけ乳糖は、費用対効果や細胞保護作用の面で優れているので、これを用いることが望ましい。
【００２９】
（微生物菌体の乾燥方法）
得られた野生型、あるいは遺伝子組換え型を含むＰＣＢｓ分解酵素群を高発現する細菌体の乾燥法、すなわち、発明品の最終形態となる触媒化法について述べる。
賦形剤とした糖質類と混合した湿菌体の乾燥は、凍結乾燥機やドラムドライヤー、スプレードライヤーを用いることができるが、スプレードライヤーが望ましい。発明を限定するものでないが、例えば、試作用としては、ＥＹＥＬＡ製ＳＤ−１０００型を用いることができる。本機は、乾燥経路において、蒸発缶とサイクロンを備える。乾燥に重要な入口温度として、蒸発缶前の吸気管に温度センサーが取り付けてあり、また出口温度として、蒸発缶とサイクロンの間に温度センサーが取り付けてある。本乾燥工程においては、本機の入口温度を１００〜１２０℃まで、出口温度を６０〜７０℃までの範囲で設定することが望ましい。その他に、ブロア風量は毎分０．７５立米までとし、噴霧圧力は７０〜９０ｋＰａ、送液量は毎分５〜１５ｍＬまでとする。
【００３０】
賦形剤とした糖質、０．４〜０．６ｇまでと混合して凍結した菌体、あるいは培養後、糖質と混合して凍結せず用意した湿菌体を２〜３ｇまでを用い、最終液量２２〜２８ｍＬまでに調製した試料を、上記に示す設定を施したスプレードライヤーなどが指定する試料容器に入れて、取り付ける。実際に乾燥作業に入る前に、蒸留水などを通液して、出口温度を適値へと調節してから行うことが望ましい。本乾燥工程から回収された乾燥菌体は０．２〜０．７ｇまでとなり、投入した原材料の重量に対する紛体の収率は３２〜４９％（ｗ／ｗ）までとなる。
【００３１】
他方で、菌体のみ、及び賦形剤を含む菌体原液両方を加温加熱、水分のみを蒸発させ、その残留固形分を秤量した結果から、原液固形分濃度（スラリー濃度）を導き出した結果、菌体のみで０．０３ｇ／ｍＬ、賦形剤とした糖質で、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムを含む菌体の全てで０．０５ｇ／ｍＬだった。したがって、触媒中の菌体量は６０％（ｗ／ｗ）であり、賦形剤とした糖質は４０％（ｗ／ｗ）であることを特徴とする微生物触媒が完成する。
【００３２】
（ポリ塩化ビフェニルの分解反応）
本発明の微生物触媒を用いるＰＣＢｓの分解方法は、上記で乾燥した菌体を水性媒体に分散させたものとＰＣＢｓとを接触させることを特徴とする。本発明の好ましい実施形態では、このようにして得られた微生物触媒を、比較的低濃度のＰＣＢｓ汚染油と接触させたときに高いＰＣＢｓ分解活性を発揮することができる。
【００３３】
本発明で対象となるＰＣＢｓとしては、ビフェニル化合物に塩素原子が置換した化合物が含まれ、その置換塩素原子の数は１〜１０個である。平均置換塩素原子数は、一般に２〜６個である。本発明では、これらのＰＣＢｓから選択された少なくとも一種を用いることができ、それぞれ単独で又は二種以上を任意に組み合わせたものも用いることができる。一般に、ＰＣＢｓは単一化合物として存在せずに、塩素原子の数や置換位置が異なる配合物として存在する。従って、塩素原子の数及び置換位置の組み合せからして、理論上２０９種類の異性体が存在し、市販品には、およそ７０から１００、あるいはこれらを越える数の異性体が配合存在している。
【００３４】
本発明の分解あるいは無害化の方法で処理できるＰＣＢｓとしては、特徴的には、３，４，４’，５−テトラクロロビフェニルや３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３，３’，４，４’−ペンタクロロビフェニル、２，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、２’，３，４，４’，５−ペンタクロロビフェニルに加えて、２，２’，４，４’−テトラクロロビフェニルや２，２’，４，５−テトラクロロビフェニル、２，２’，３，５’−テトラクロロビフェニル等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
ＰＣＢｓは、通常ＰＣＢ単体の配合物として市販されており、これがコンデンサーやトランスに使用されている。その具体例としては、鐘淵化学（株）が製造販売したカネクロールＫＣ−２００（２塩化ビフェニル）やＫＣ−３００（３塩化ビフェニル）、ＫＣ−４００（４塩化ビフェニル）、ＫＣ−５００（５塩化ビフェニル）、ＫＣ−６００（６塩化ビフェニル）、ＫＣ−１０００（ＫＣ５００／トリクロルべンゼン＝６０／４０（質量比）の配合物）や、三菱モンサント（株）が製造販売したアロクロール１２５４（５４％Ｃｈｌｏｒｉｎｅ）等も挙げられる。
【００３６】
本発明の微生物触媒を用いるＰＣＢｓの分解反応は、ＰＣＢｓを含む油性成分と、上記微生物触媒及び場合により界面活性剤を含む水性媒体と、を混合してエマルジョン化する工程と、前記エマルジョンを通気、攪拌する工程と、を含む。分解すべきＰＣＢｓは、エマルジョン全量に対し０．０５〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／Ｌ程度含むことができ、当該エマルジョン中に、本発明の微生物触媒を０．２〜２０重量％、好ましくは２〜１２重量％程度添加することにより行うことができる。エマルジョン化しない場合は、トライトンＸ−１００等の界面活性剤０．００５％を加え、さらに必要な場合は超音波を加えて均質化させる。さらにエマルジョン化を促進するために、あらかじめＰＣＢｓを含む油の粘性を下げる処理（例えば、アルコール化等）を行っても良い。反応条件は、約２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃、さらに好ましくは約３０℃に調温し、ｐＨは６〜９とし、攪拌した状態で約１２〜７２時間処理することができ２４時間以内が好ましい。このような処理は、密閉式で攪拌でき、そこへ酸素マイクロバブルを供給できる反応装置を用いて行うことができ、すなわち小型の専用装置を用いて行うことが好ましい。ポリ塩化ビフェニル類分解反応装置が小型化できることにより、微量ＰＣＢｓを保管するような貯蔵所でも直接処理作業を行うことができる（参考文献として特願２０１３−１４１３８３を参照できる）。
【００３７】
本発明の微生物触媒は、水性媒体と混合した際、元の微生物菌体粒子まですぐに分散して均一な分散液を形成することが、ＰＣＢｓの分解反応を促進する上で好ましい。油性成分に溶解しているＰＣＢｓは、水性媒体と混合して形成されるエマルジョン中で、本発明の微生物触媒の細胞膜を透過し、あるいは細胞膜の近くで、一群のＰＣＢｓ分解酵素と接触することでその分解反応が進むと考えられる。したがって、当該微生物触媒の分散性は、基質であるＰＣＢｓとの接触頻度を増加させる上で反応速度論的にも極めて重要な性質である。
さらに本発明の微生物触媒は、基質特異性の異なる複数の芳香環水酸化ジオキシゲナーゼを、それぞれ過剰発現させた複数の微生物触媒を組み合わせることが好ましい。上述したように、分解すべきＰＣＢｓは、その置換塩素原子の数と位置において極めて不均一な化合物集団であるから、それぞれの汚染油に含まれるＰＣＢｓの性状に合わせて、複数の微生物触媒の混合比率を調整し、最適なＰＣＢｓ分解用組成物を調製しうることも本発明の１つの利点である。
【実施例】
【００３８】
以下に本発明の詳細について実施例等を挙げて説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３９】
[実施例１]  微生物触媒を用いた生存確認試験
本試験は、微生物触媒中に生存する細菌が存在しないことを確認する目的で行った。
本試験には、本発明である触媒化処理を施したビフェニルジオキシゲナーゼゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種（ロット番号：ＹＵ１３０９２６ＳＤ−１）を用いた（以下、「本触媒」とする）。本触媒は、ビフェニルに対し特異的に反応し、反応においては黄色を呈することが判っている。
【００４０】
本触媒を無機液体培地に懸濁し、１４ｍｇ／ｍＬ（菌濁度において、ＯＤ６６０＝１０．８、細菌細胞数にして約１×１０１０個／ｍＬに相当）に調製した。無機液体培地は、表１を成分で構成されるものを用いた。
上記懸濁液１０μＬ（約１×１０８個の細菌細胞を含む）を、０．１％ビフェニルを含む無機液体培地２ｍＬに添加し、温度３０℃、１２０ｒｐｍで、５日間振盪培養を行ったが、菌体の生育による顕著な濁度の上昇は確認されなかった。
また、無機培地を主成分とした固形培地が入った培養皿に、唯一の炭素源として、ビフェニルをその蓋に固定し、上記で調製した本触媒の懸濁液を無機培地で１×１０−４倍に希釈した溶液４０μＬ（約４０，０００個の細菌細胞を含む）を播種して、温度３０℃で一定とした環境で、５日間の培養を試みた。一方、ＬＢ培地（１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）を１／５に希釈した栄養固形培地を用いて、上記同様の培養実験も試みた。その結果、両試験において、本触媒特有の、ビフェニル分解を示す黄色の呈色ならびに、菌コロニー形成・発育を認めなかった。
以上の結果から、本発明において作製した微生物触媒中に、生存菌体は含まれていないことが示された。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
[実施例２]  異なった糖質で作製した微生物触媒の活性確認試験
本試験では、微生物触媒中の酵素活性の残存評価を目的に試験を行った。
本試験には、本発明である触媒化処理を、賦形剤とした糖質である、乳糖やスキムミルク、トレハロース、ショ糖、マルトデキストリン、酵母エキス、アラビアガムを用いて、それぞれ施したビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種（ロット番号：ＹＵ１２０９１７ＳＤ−１〜８）を用いた（以下、「本触媒」とする）。
【００４３】
微生物触媒液の調整は、乾燥した本触媒を、適量の２０ｍＭリン酸塩緩衝液で再懸濁することで試験溶液を調製した。
次に、試験反応溶液を、材質が全てガラスか少なくとも容器の内面がガラスライナーとなった反応容器にて、前述の試験溶液をＯＤ６６０＝１０となるようこれへ投入し、基質としては、５ｍｇ／ＬのカネクロールＫＣ−３００を、反応液全量が５００μＬとなるように投入した。
【００４４】
反応は５０ｒｐｍで転倒撹拌し、反応温度は３０℃にて、全体の温度が均一となるよう、３時間または２４時間行った。分解反応物後の、各反応溶液中の未分解のポリ塩化ビフェニルの残量とするガスクロマトグラフィー質量分析計（以下、ＧＣ／ＭＳとする）（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ７８９０Ａ／５９７５Ｃ）で測定した結果を、以下の表２及び図１に示した。
【００４５】
ＧＣ／ＭＳへ導入する試料の調製法については、文献（Ｍｉｙａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ＪＯＵＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ Ｖｏｌ．１０５， Ｎｏ．６， ６２８−６３５． ２００８）を参考に、あらかじめポリ塩化ビフェニルの分析ピークに重ならない物質を内部標準物質としたアントラセンと塩酸を添加したポリ塩化ビフェニル抽出反応液にその倍量の酢酸エチルを加えて、遠心分離を２，７００〜６，４００×ｇまでで１０分間行い、有機相側の上清を回収した。遠心分離の際、有機相と水相の間にエマルジョンが解消されない場合は、少量のエタノールを添加すると良い。またポリ塩化ビフェニルの抽出効率を高めるために、この操作を２回繰り返した。抽出液を硫酸ナトリウムにて脱水後、適宜、酢酸エチルでＧＣ／ＭＳの感度に応じて希釈し、ＧＣ／ＭＳへ注入して計測した。
【００４６】
【表２】
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【００４７】
以上の結果から、表２ならびに図１が示したように、本触媒の酵素活性の低下は、コントロールである凍結菌体と比較して、およそ２０％〜３０％までの範囲で抑えることができると示された。また、糖質の中でも、最も高い活性保存性を示したのがショ糖であったが、活性が高く再現性にも優れ、リン酸緩衝液への溶解性、対費用効果に優れるなど、産業利用上、乳糖が賦形剤としては最も優れていると考えられた。
【００４８】
[実施例３]  微生物触媒の粒子サイズとサイズ分布
微生物触媒の物理化学的特性を確認する目的で、乳糖を用いて微生物触媒化した試料の、粒子サイズとサイズ分布の確認を行った。
ドライスプレーでの乾燥工程において、糖質が細胞全体を均一に包み込みながら乾燥することで、複数の細胞が凝集することが懸念される。その結果、微生物触媒全体から見た、基質と細胞との接触面積が減少することから、触媒活性に大きな影響を及ぼすことが想定された。本試験では、微生物触媒が細胞ごとに均一に糖質で包含され乾燥し、反応時のリン酸塩緩衝液へ懸濁されても良く分散されているかを観察した。
本試験には、本発明である触媒化処理を施したビフェニルジオキシゲナーゼをはじめとするビフェニル分解酵素群を高発現するコマモナス属細菌種（ロット番号：ＹＵ１３０９２６ＳＤ−１）を用いた（以下、「本触媒」とする）。
【００４９】
試験懸濁液は、本触媒がＯＤ660＝０．１となるよう、適量の２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ＝７．５）を用い、再懸濁して調製した。
試験懸濁液内の微生物触媒の粒子サイズとサイズ分布は、動的光散乱法（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ法（以下、「ＤＬＳ法」とする）を用いて調べた。測定機器は、Ｍａｌｖｅｒｎ社製、ゼータサイザーナノＺＳを使用した。本機器の設定パラメーターは、微生物細胞のＲｅｆｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘを、１．３７〜１．３９までの範囲（Ｋａｔｚ ｅｔ ａｌ． ＪＯＵＮＡＬ ＯＦ ＳＥＬＥＣＴＥＤ ＴＯＰＩＣＳ ＩＮ ＱＵＡＮＴＵＭ ＥＬＥＣＴＲＯＮＩＣＳ Ｖｏｌ．９， Ｎｏ．２， ２７７−２８７． ２００３）で、１．３９が望ましく、蒸留水となる溶媒のＲｅｆｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘを１．３３、Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｍｐｌｅを１ Ｃｅｎｔｉｐｏｉｓｅ（ＣＰ）、Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ Ｔｉｍｅを１２０秒、Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅを２５℃として、計測を行った。
【００５０】
上記の結果から、図２に示すように、本触媒の平均粒子サイズは９０４．２ｎｍで、おおよそ一般的微生物細胞のサイズに近似であることが判った。
【００５１】
[実施例４]  微生物触媒の電顕像
微生物触媒の物理化学的特性を確認する目的で、乳糖を用いて微生物触媒化した試料の、細胞膜の形態や構造の保存性確認を行った。
走査型電子顕微鏡を用いて行った。分析機器はキーエンス株式会社製、ＶＥ−９８００を用いた。
【００５２】
微生物細胞の固定法は、最初に、適量の微生物触媒を懸濁した溶液を１ｍＬ用意し、これをメンブレン膜（メルクミリポア社製、アイソポア０．２μｍ ＧＴＴＰ）で濾過して微生物細胞を固定する。次に、このメンブレン膜を２％グルタルアルデヒド溶液に１時間浸漬させた後、蒸留水で流洗し、５０％〜９０％まで１０％毎、最後は９８％の水エタノール溶液へ順次、３０分間、浸漬して脱水を完了させる。微生物触媒が固定されたメンブレン膜は、１００％エタノールで保存でき、あるいは脱水後速やかに、日本電子株式会社製のＦｉｎｅ ｃｏａｔ ｉｏｎ ｓｐｕｔｔｅｒ ＪＦＣ−１１００を用いて金を蒸着させた後、検鏡することができる。
【００５３】
以上の結果から、図３ならびに図４、図５が示すように、最も酵素活性が高く凍結保存された菌体と同様に、乾燥状態の微生物触媒やリン酸塩緩衝液に再懸濁した微生物触媒も、微生物細胞全体の形態が良く保たれ、細胞膜の構造にも大きなダメージを受けていないことが示された。したがって、本発明によって作製された微生物触媒は、形態的や構造的から見た場合、細胞膜内外に適切に酵素を固定化できており、基質の細胞膜透過性を維持していることが、本試験から示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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