(57)【要約】【課題】セルロース系バイオマスの分解・糖化を促進し、セルロース系バイオマスより糖液を効率的に製造することが可能な手法を提供することを目的とする。【解決手段】セルロース系バイオマスより糖液を製造する方法であって、（１）デンプン含量が２重量％未満のバイオマスをアルカリ処理する工程、（２）前記アルカリ処理バイオマスにセルラーゼ及びアミログルコシダーゼを加えて加水分解する工程を含む、上記方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース系バイオマスより糖液を製造する方法であって、
（１）デンプン含量が２重量％未満のバイオマスをアルカリ処理する工程、
（２）前記アルカリ処理バイオマスにセルラーゼ及びアミログルコシダーゼを加えて加水分解する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
アルカリ処理がアンモニア処理であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
セルラーゼがトリコデルマ属糸状菌由来であり、アミログルコシダーゼがアスペルギルス属糸状菌由来であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
セルラーゼによるデンプン含量２重量％未満のセルロース系バイオマスの分解を促進する方法であって、
（１）該バイオマスをアルカリ処理する工程、
（２）セルラーゼを用いて、前記アルカリ処理バイオマスを加水分解する反応系に、アミログルコシダーゼを添加する工程を含む、上記方法。
【請求項５】
アルカリ処理がアンモニア処理であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
セルラーゼがトリコデルマ属糸状菌由来であり、アミログルコシダーゼがアスペルギルス属糸状菌由来であることを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマスが、エリアンサスまたはネピアグラスであることを特徴とする、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルラーゼ及びアミログルコシダーゼを用いて、セルロース系バイオマスを加水分解する工程を含む、セルロース系バイオマスより糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、セルロース系バイオマスを酵素分解、糖化し、更にこれを発酵することによって得られるエタノールや乳酸などを液体燃料もしくは化学原料として利用することが注目を集めている。
【０００３】
セルロース系バイオマスの分解・糖化にはセルラーゼが一般的に用いられている。セルラーゼを大別すると、セルロースの結晶領域に作用するセロビオハイドラーゼ、セルロース分子鎖内部から作用して分子量を低減させるエンドグルカナーゼ、ならびに水溶性オリゴ糖又はセロビオースに作用し、そのβ−グリコシド結合を加水分解する反応を触媒するβグルコシダーゼに分けられる。
【０００４】
セロビオハイドラーゼ及びエンドグルカナーゼは、セルロース分解で生成したセロビオースの蓄積により反応阻害が引き起こされることが知られており、これによってセルロース系バイオマスの分解・糖化効率が低減されることが問題となっている。そこで当該分野にておいては、セルラーゼによるセルロース系バイオマスの分解・糖化を促進することが可能な新たな手段の開発／探索が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、セルロース系バイオマスの分解・糖化を促進し、セルロース系バイオマスより糖液を効率的に製造することが可能な手法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、セルラーゼとアミログルコシダーゼを用いてデンプン含量が２重量％未満のセルロース系バイオマスを加水分解することによって、セルロース系バイオマスの分解・糖化を促進し、生成する糖量を増大させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
［１］  セルロース系バイオマスより糖液を製造する方法であって、
（１）デンプン含量が２重量％未満のバイオマスをアルカリ処理する工程、
（２）前記アルカリ処理バイオマスにセルラーゼ及びアミログルコシダーゼを加えて加水分解する工程を含む、上記方法。
［２］  アルカリ処理がアンモニア処理であることを特徴とする、［１］の方法。
［３］  セルラーゼがトリコデルマ属糸状菌由来であり、アミログルコシダーゼがアスペルギルス属糸状菌由来であることを特徴とする、［１］または［２］の方法。
［４］  セルラーゼによるデンプン含量２重量％未満のセルロース系バイオマスの分解を促進する方法であって、
（１）該バイオマスをアルカリ処理する工程、
（２）セルラーゼを用いて、前記アルカリ処理バイオマスを加水分解する反応系に、アミログルコシダーゼを添加する工程を含む、上記方法。
［５］  アルカリ処理がアンモニア処理であることを特徴とする、［４］の方法。
［６］  セルラーゼがトリコデルマ属糸状菌由来であり、アミログルコシダーゼがアスペルギルス属糸状菌由来であることを特徴とする、［４］または［５］の方法。
［７］  前記バイオマスが、エリアンサスまたはネピアグラスであることを特徴とする、［１］から［６］のいずれかの方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、デンプン含量が２重量％未満のセルロース系バイオマスの分解・糖化を促進し、生成する糖量を増大させることができ、セルロース系バイオマスより糖液を効率的に製造することが可能な手法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、酵素剤Ａと所定量のアミログルコシダーゼを用いて、低圧二段アンモニア処理にて前処理したネピアグラスを糖化した場合における、グルコース及びキシロースの各収量を示す。グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合の収量を「１.００」とする相対値にて示す。（比較例２、実施例２〜実施例７に相当する。）
【図２】図２は、市販のセルラーゼと所定量のアミログルコシダーゼを用いて、低圧二段アンモニア処理にて前処理したネピアグラスを糖化した場合における、グルコース及びキシロースの各収量を示す。グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合の収量を「１.００」とする相対値にて示す。（比較例３、実施例８〜実施例１０に相当する。）
【図３】図３は、市販のセルラーゼと所定量のアミログルコシダーゼを用いて、低圧二段アンモニア処理にて前処理したエリアンサスを糖化した場合における、グルコース及びキシロースの各収量を示す。グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合の収量を「１.００」とする相対値にて示す。（比較例４、実施例１１〜実施例１３に相当する。）
【図４】図４は、市販のセルラーゼと所定量のアミログルコシダーゼを用いて、高圧一段アンモニア処理にて前処理したエリアンサスを糖化した場合における、グルコース及びキシロースの各収量を示す。グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合の収量を「１.００」とする相対値にて示す。（比較例５、実施例１４〜実施例１６に相当する。）
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下に、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００１１】
本発明は、セルラーゼ及びアミログルコシダーゼを用いて、セルロース系バイオマスを加水分解する工程を含む、セルロース系バイオマスより糖液を製造する方法、に関する。
【００１２】
「セルロース系バイオマス」とは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、コーンコブ、稲わら、麦わら、椰子殻、などの草本系バイオマス、あるいは樹木、ポプラ、廃建材などの木質系バイオマス、さらに藻類、海草、など水生環境由来のバイオマスのことを指す。こうしたバイオマスには、セルロースおよびヘミセルロース（以下、セルロースとヘミセルロースの総称として「セルロース」という。）の他に芳香族高分子であるリグニン等が含まれていてもよい。本発明において特に好ましくは、エリアンサス又はネピアグラスである。
【００１３】
本発明において「セルロース系バイオマス」は、２重量％未満、好ましくは１重量％未満又は０．５重量％未満のデンプン含量を有するものを用いることができる（ここでデンプン含量は乾燥重量に基づく）。本発明の方法を用いることで、セルロース系バイオマス中のデンプン含量がわずか２重量％未満であるにもかかわらず、そのデンプン含量から予定される量以上のグルコースや、アミログルコシダーゼが基質としないキシラン由来のキシロースを付加的に得ることが可能となる。セルロース系バイオマスにおけるデンプン含量は、下記実施例にて詳述するとおり、セルロース系バイオマスをアミラーゼと反応させて得られたアミラーゼ抽出画分を、次いでアミログルコシダーゼと反応させ、生成された単糖（グルコース）の量に基づいて算出することができる。
【００１４】
また、本発明において「セルロース系バイオマス」は、セルロース含量が１０重量％以上、好ましく２０重量％以上、さらに好ましくは３０重量％以上のものを用いることができる（乾燥重量に基づく）。セルロース系バイオマス中のセルロースの量は公知の手法（例えば、米国ＮＲＥＬ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ）Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇｎｉｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｍａｓｓに準拠した方法）を用いて測定することができる。例えば、セルロース系バイオマスより、濃硫酸と希硫酸を用いて２段階の加水分解を行い、溶出した糖からセルロース系バイオマス中のセルロース量を計算することができる。
【００１５】
セルロース系バイオマスは、酸処理、酵素処理、アルカリ処理（アンモニア処理等）、水熱処理などを用いた加水分解処理、あるいは粗粉砕又は細断処理などにより予め前処理されたものを使用する。セルロース系バイオマスに前処理を行うことでセルロース間の結合を緩め、セルラーゼやアミログルコシダーゼによる加水分解を促すことができる。特に好ましくはアルカリ処理（アンモニア処理等）である。
【００１６】
本発明において「セルラーゼ」とはセルロースの分解活性を有していればよく、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、βグルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼの群から選択される１種、２種、３種、４種、又はそれ以上のバイオマス分解酵素を組み合わせて含むことができる。ここで「セロビオハイドラーゼ」とは、セルロースの末端部分から加水分解していくことを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。「エンドグルカナーゼ」とは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４、ＥＣ３．２．１．６、ＥＣ３．２．１．３９、ＥＣ３．２．１．７３としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。「エキソグルカナーゼ」とは、セルロース分子鎖の末端から加水分解することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４、ＥＣ３．２．１．５８としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。「βグルコシダーゼ」とは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβグルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。「キシラナーゼ」とは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。「キシロシダーゼ」とは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とするセルラーゼの総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてキシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００１７】
本発明において「アミログルコシダーゼ」とは、α−グルカンの分解酵素であり、一般的に、デンプンの非還元末端側からα−（１→４）結合やα−（１→６）結合を加水分解することが知られており、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３としてアミログルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００１８】
本発明においてセルラーゼ及びアミログルコシダーゼはそれぞれ、精製されたものであっても、粗精製されたものであっても良い。
【００１９】
セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼは、それらを生産する微生物より得ることができる。セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼを生産する微生物として、糸状菌が知られている。具体例として、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。特に限定されないが本発明において、セルラーゼはトリコデルマ属由来のものを、また、アミログルコシダーゼはアスペルギルス属由来のものを好適に利用することができる。
【００２０】
また、セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼを生産できる限り、上記微生物の変異株も利用することができる。変異株としては、天然の変異株や、紫外線若しくは放射線による照射処理、化学物質（例えば、亜硝酸、塩基類縁化合物（５−ブロモウラシル及び２−アミノプリンなど）、アルキル化剤（ニトロソグアニジン及びエチルメタンサルホネートなど）、アクリジン色素類（アクリフラビンおよびプロフラビンなど）、発がん剤（４−ニトロキノリン−１−オキシド）、抗生物質（マイトマイシンＣなど））による処理に付された微生物より選択し得られたものが挙げられる。
【００２１】
これら微生物は、培養液中にセルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼを産生するために、その培養液を未精製のセルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼとしてそのまま使用してもよいし、また培養液を精製又は粗精製したものを使用してもよい。
【００２２】
また、セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼは、遺伝子組換え手法を用いて製造された、セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼを生産する遺伝子組換え微生物又は細胞より得ることができる。遺伝子組換え微生物又は細胞は公知の遺伝子組換え手法を用いて作製することができる。例えば、上記セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼを生産する微生物より抽出された全ＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。次いで、公知のデータバンク（ＮＣＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ等）に登録されているセルラーゼ及びアミログルコシダーゼ遺伝子の各塩基配列を基にプライマーを設計し、上記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、セルラーゼ及びアミログルコシダーゼをそれぞれコードするＤＮＡを調製する。
【００２３】
上記のようにして調製したセルラーゼ及びアミログルコシダーゼをコードする各ＤＮＡを、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結することにより、当該ＤＮＡを含む発現ベクターを製造することができる。発現ベクターとしては、細菌プラスミド、酵母プラスミド、ファージＤＮＡ（ラムダファージなど）、レトロウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス等のウイルスＤＮＡ、ＳＶ４０の誘導体など、植物細胞用のベクターとしてのアグロバクテリウムなどが挙げられるが、宿主細胞において複製および生存可能である限り他のいかなるベクターも用いることができる。例えば、宿主が大腸菌である場合、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＢＡＤなどを例示することができる。また、宿主が酵母である場合、ｐＰｉｎｋ−ＨＣ、ｐＰｉｎｋ−ＬＣ、ｐＰｉｎｋα−ＨＣ、ｐＰＣＩＺ、ｐＰＣＩＺα、ｐＰＣＩ６、ｐＰＣＩ６α、ｐＦＬＤ１、ｐＦＬＤ１α、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ９などが挙げられる。プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主が大腸菌である場合、ｌａｃプロモーター、Ｔｒｐプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等が、宿主が酵母である場合、ＡＯＸ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＡＤＥ２プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、ＧＡＬ−Ｌ１プロモーターなどが挙げられる。
【００２４】
宿主細胞としては、大腸菌、バクテリア細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞などを利用することができる。酵母細胞としては、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などが挙げられる。真菌細胞としては、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などが挙げられる。昆虫細胞としてはＳｆ９など、植物細胞としては双子葉植物など、動物細胞としては、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３などが挙げられる。
【００２５】
形質転換または、トランスフェクションは、リン酸カルシウム法、電気穿孔法などの公知の方法で行うことができる。セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼは、上記のように形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞においてプロモーターの制御下にて発現させ、産生物を回収して得ることができる。発現は、宿主細胞をセルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼを発現可能な条件下にて、一定期間培養することにより行うことができる。
【００２６】
セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼが宿主細胞より排出される場合には、培地から直接に、また細胞内に存在する場合には、超音波破砕や機械的破砕などの物理的手段もしくは細胞溶解剤などの化学的手段によって、細胞を破壊した後に、精製又は粗精製することにより得ることができる。
【００２７】
セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼの精製又は粗精製は、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒（エタノール、メタノール、アセトン等）による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を１つまたは複数組み合わせて用いて行うことができる。
【００２８】
本発明において、セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼは固相に固定化された状態であっても良い。固相に固定化することによって、セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼは安定化され、連続反復使用が可能となる。固相としては、水不溶性のものであればよく、例えばポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物などが挙げられるが、これらに限定はされない。セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼの固相への固定化は、物理的吸着、イオン結合および共有結合を用いて行うことができる。
【００２９】
また、本発明においては、セルラーゼ及び／又はアミログルコシダーゼとして市販されている酵素製剤も利用することができる。
【００３０】
本発明における糖液の製造は、セルロース系バイオマスをセルラーゼ及びアミログルコシダーゼを用いて糖化することにより行うことができる。
【００３１】
「糖化」とは、セルロース系バイオマスに含まれるセルロースを分解し、オリゴ糖類、二糖類、単糖類およびそれらの混合物にすることをいう。すなわち、本発明において「糖化」とは、セルラーゼ及びアミログルコシダーゼによって、多糖類のグリコシド結合を加水分解することをいう。
【００３２】
セルロース系バイオマスの糖化は、公知の方法を用いて行うことができ、例えば、上記前処理されたセルロース系バイオマスを水性媒体中にて、セルラーゼ及びアミログルコシダーゼと共に、撹拌又は振とうしながら加温することにより行うことができる。反応液のｐＨ及び温度は、セルラーゼ及びアミログルコシダーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、好ましくは４０℃〜９０℃、ｐＨは１〜１１好ましくは３〜７の範囲とすることができる。セルラーゼ及びアミログルコシダーゼはセルロース系バイオマスに対して、同時に反応させてもよいし、逐次的に（例えば、セルラーゼ次いでアミログルコシダーゼの順序にて）反応させてもよい。
【００３３】
セルロース系バイオマスの糖化において、セルロース系バイオマスに対するセルラーゼ及びアミログルコシダーゼの用量は、セルロース系バイオマスの糖化が十分に行われる量であればよく、特に限定はされない。例えば、セルロース系バイオマス１ｇ（乾燥重量）に対して、セルラーゼを０．０５〜２５Ｕ、好ましくは０．２５〜５Ｕの用量にて用いることができる。ここでセルラーゼの「Ｕ」（活性単位）は、ｐＨ５．０で３０℃で反応させて、４−ニトロフェニルラクトシドから１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成することができるセルラーゼの量を意味する。また、セルロース系バイオマス１ｇ（乾燥重量）に対して、アミログルコシダーゼを２〜１００００Ｕ、好ましくは２０〜６０００Ｕの用量にて用いることができる。ここでアミログルコシダーゼの「Ｕ」（活性単位）は、ｐＨ４．３で６０℃で反応させて、可溶性スターチから１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成することができるアミログルコシダーゼの量を意味する。アミログルコシダーゼの「Ｕ」（活性単位）は公知の手法により、測定することが可能であり、例えば、糖化力分別定量キット（例えば、キッコーマン社製）を用いて測定することができる。すなわち、基質である４−ニトロフェニルβ−Ｄ−マルトシドと測定試料に含まれるアミログルコシダーゼならびにα−グルコシダーゼが作用して、４−ニトロフェニルβ−Ｄグルコシド（Ｇ１−β−ＰＮＰ）が生成する。Ｇ１−β−ＰＮＰにはアミログルコシダーゼとα−グルコシダーゼは作用せず、試薬として添加するβ−グルコシダーゼのみが作用して、発色基質である４−ニトロフェノールが遊離する。ここでの４−ニトロフェノール遊離はアミログルコシダーゼ活性とα−グルコシダーゼ活性によるため、別途α−グルコシダーゼ活性のみを測定し、この活性値を糖化力活性から差し引くことでアミログルコシダーゼ活性のみを分別定量する。α−グルコシダーゼ活性は、４−ニトロフェニルα−グルコシドを基質として測定試料と作用させたときに遊離する４−ニトロフェノール量を吸光度測定することにより定量することで算出する。
【００３４】
セルロース系バイオマスの糖化の工程は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
【００３５】
本発明にて製造された糖液は、グルコース、キシロースなどの単糖成分を含むため、エタノール、乳酸などの原料糖として使用することができる。
【００３６】
本発明はまた、セルラーゼを用いて、前処理されたセルロース系バイオマスを加水分解する反応系に、アミログルコシダーゼを添加する工程を含む、セルラーゼによるセルロース系バイオマスの分解を促進する方法、に関する。
【００３７】
「セルラーゼによるセルロース系バイオマスの分解を促進する」とは、以下より選択される一以上を意味する：
セルラーゼにより触媒されるセルロース系バイオマスの加水分解反応の進行を促す；
セルラーゼにより触媒されるセルロース系バイオマスの加水分解反応の速度を高める；
セルラーゼにより触媒されるセルロース系バイオマスの加水分解反応の生成物であるところの単糖（グルコースやキシロース等）の生成量を増大させる。
【００３８】
本発明によれば、セルラーゼによるセルロース系バイオマスの加水分解する反応系に、アミログルコシダーゼを添加することによって、セルラーゼによるセルロース系バイオマスの分解を促進することができる。アミログルコシダーゼの添加によりもたらされるグルコース生成量の増大は、セルロース系バイオマスに含まれるデンプンがアミログルコシダーゼにより加水分解されて生成されるグルコースの生成量よりも大きく、当該効果は単に、セルロース系バイオマスに含まれるデンプンがアミログルコシダーゼにより加水分解されてもたらされるものでない。また、アミログルコシダーゼの添加によりもたらされるキシロース生成量の増大は、アミログルコシダーゼはそもそもキシランを基質としないことから、当該効果は単に、セルロース系バイオマスに含まれるキシランがアミログルコシダーゼにより加水分解されてもたらされるものでない。
【００３９】
本発明は、セルラーゼによるセルロース系バイオマスの加水分解する公知の反応系に、アミログルコシダーゼを添加することにより行うことができる。アミログルコシダーゼの反応系への添加は、セルラーゼと同時に行ってもよいし、逐次的に（例えば、セルラーゼ次いでアミログルコシダーゼの順序にて）行ってもよい。あるいは、アミログルコシダーゼとセルラーゼを含む酵素剤の形態で反応系に添加されてもよい。
【００４０】
セルラーゼによるセルロース系バイオマスの加水分解する反応系に、アミログルコシダーゼを添加することによって、セルラーゼによるセルロース系バイオマスの分解を、１．０５倍以上、１．１倍以上、１．１５倍以上、１．２倍以上、１．２５倍以上、１．３倍以上、１．３５倍以上、１．４倍以上、１．４５倍以上、１．５倍以上、１．５５倍以上、１．６倍以上、１．７倍以上、１．８倍以上、１．９倍以上、２倍以上、又はそれ以上に促進することができる。
【実施例】
【００４１】
以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４２】
Ｉ．実験方法
１．バイオマスの前処理
（１）高圧一段アンモニア処理
原料バイオマスをカッターミル及びハンマーミルを用い、平均粒径約２００μｍとなるように粉砕した。次に、それぞれの粉砕したバイオマス約２００ｇを内容積５Ｌの高圧容器に入れ、ここに別の容器中にて約８０℃に予熱した液体アンモニア約５００ｇを導入し、１００℃、６．３ＭＰａの条件下、液相のアンモニアにて２時間処理を行った。
【００４３】
（２）低圧二段アンモニア処理
所定温度・所定量のアンモニア存在下に、原料バイオマス中のヘミセルロース−リグニン間のエステル結合をアミド化開裂（化学処理）させて、エステル開裂処理品を得た。常温で所定量の液体アンモニア存在下で、前記エステル開裂処理品中のセルロースを嵩高いＩＩＩ型へ変態させ（物理処理）、低圧二段アンモニア処理品を得た。
上記「化学処理」及び「物理処理」について、以下に詳述する。
【００４４】
（化学処理）
実容量５．３５Ｌの反応器（５Ｌ）を用いて化学処理した。原料バイオマス（ネピアグラス）１００ｇを反応器（５Ｌ）に入れ、上部フランジを閉じ、系内を窒素で置換した。大気圧になるまで窒素を排気後、ＣａＣｌ２水溶液−ドライアイスを用いて反応器内温が−１０℃以下になるまで冷却し、アンモニアボンベの蒸気圧との差圧を利用して、反応器内へアンモニアガスを移送した。バッチカウンター付きのマスフローメーターを用いてアンモニアガスを反応器に５２．７ＮＬ（４０ｇ）供給した。直ちに、反応器内温の制御温度を１２０℃に設定し、最高温度を１５５℃に設定した鋳込みヒーターを用いて昇温した。反応器内温が１１５℃に達した時を処理開始とし、２．５時間処理した。２．５時間の平均温度、圧力を処理温度圧力とした。処理終了後直ちに脱圧し、窒素によってアンモニアを除去し、エステル開裂処理品を得た。
【００４５】
（物理処理）
反応器（０．２５Ｌ）を用いて物理処理した。前記エステル開裂処理品４０ｇを反応器（０．２５Ｌ）に入れ、上部フランジを閉じ、処理に先立ち、系内を窒素で置換し、さらに、アンモニアガスで置換した。ＣａＣｌ２水溶液−ドライアイス用いて反応器内温が−３０℃以下になるまで冷却し、アンモニアボンベの蒸気圧との差圧を利用して、反応器内へアンモニアガスを移送した。バッチカウンター付きのマスフローメーターを用いてアンモニアガスを反応器に４４．８ＮＬ（３４ｇ）供給した。アンモニア供給後直ちに冷却バスを外し、室温雰囲気下にて１時間結晶膨潤化処理をした。その時の平均温度、圧力は−８．５℃、０．３ＭＰａであった。処理終了後直ちに脱圧し、最高温度を５０℃に設定した鋳込みヒーターを用いて加温しながら、反応槽内温を４０℃以下（エステル開裂反応が進行しないことを確認している温度）に制御した状態で、窒素によってアンモニアを除去し、低圧二段アンモニア処理品を得た。
【００４６】
２．糖化性の評価方法
１．２５ｇの前処理したバイオマスを５０ｍＬ容ファルコンチューブに秤取り、１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）３．７５ｍＬ、酵素剤０．５ｍＬを添加し、水を加えて２５ｍＬにメスアップした。これに攪拌羽根をセットし、５０℃に熱したヒートブロックで加熱しながら２４時間攪拌した。残渣を遠心分離で取り除いた上清に含まれる単糖（グルコース、キシロース）の濃度を王子計測機器製バイオセンサーＢＦ−７で測定した。得られた単糖から酵素剤添加無しで同様に２４時間攪拌した上清から得られた単糖を差し引いたものをバイオマスからの酵素糖化産物とし、バイオマス１ｋｇから得た単糖の量（ｇ）を「収量」とした。また、バイオマスを硫酸加水分解して得られる単糖（グルコース、キシロース）を分母とし、酵素糖化で得られた単糖を分子として、糖化率（％）を計算した。
【００４７】
セルラーゼは、トリコデルマ由来のセルラーゼ、ヘミセルラーゼに、β−グルコシダーゼを含む酵素剤（以下、「酵素剤Ａ」と記載する）、又は、市販酵素セルクラスト（ノボザイムジャパン）をバイオマス１ｇに対してセルラーゼ２Ｕを用いた。
【００４８】
アミログルコシダーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇａｒ由来のものであり、天野エンザイム社の商品名グルクザイムＮＬ４．２を、所定の用量にて用いた。
【００４９】
３．デンプン含量の測定方法
原料バイオマスを２ｇ分取し、ミキサーミルＭＭ４００で微粉砕した。微粉砕物をバイアル瓶に移し、４０℃で一晩真空乾燥した。得られた微粉砕試料を、ロックつき２ｍＬ丸底チューブに２０ｍｇ分取し、８０％ＥｔＯＨを５００μＬ添加し、５分間振とう撹拌後、遠心し上清を取り除いた。同操作を３回繰り返し、次いで９９．５％ＥｔＯＨを５００μＬ添加し、５分間振とう撹拌後、遠心し上清を取り除いた。同操作を２回繰り返し、４０℃で一晩真空乾燥した。得られた乾燥試料を３７℃で２．５時間、アミラーゼと反応させたのち、遠心により上清のみを回収し、アミラーゼ抽出画分とした。アミラーゼ抽出画分を５５℃で４０分間アミログルコシダーゼと反応させ、グルコース濃度を測定しデンプン含量を算出した。
【００５０】
ＩＩ．実験結果
（実施例１）アミログルコシダーゼ添加の評価
低圧二段アンモニア処理にて前処理したネピアグラス、並びに、酵素剤Ａ及びアミログルコシダーゼを用いて、上記手法にて糖化性の評価を行った。アミログルコシダーゼは、反応系１ｍＬに５４．３Ｕを添加した。
【００５１】
比較例１においては、アミログルコシダーゼを添加しなかった以外は、実施例１と同じ条件にて糖化性の評価を行った。
【００５２】
結果を表１に示す。
上記の手法によりアミログルコシダーゼを添加した実施例１では、添加しなかった比較例１に比べ、グルコース及びキシロースの収量の大幅な向上が認められた。
【００５３】
ネピアグラスの糖組成を表２に示す。アミログルコシダーゼの基質となるデンプンは全グルカンの１００分の１程度であることから、このグルコースの収量は予想外に多い量であった。さらに、アミログルコシダーゼはキシランを基質としないため、このキシロースの生成自体が予想外の効果であり、キシロースの収量は予想外の量であった。
【００５４】
【表１】
2016096751.tif 000002
【００５５】
【表２】
2016096751.tif 000003
【００５６】
（実施例２〜７）アミログルコシダーゼ添加量への依存性の評価
上記「実施例１」において、ベースとなる酵素剤Ａの添加量は一定とし、添加するアミログルコシダーゼの量を変化させ、他の条件は同じ条件のもと糖化性の評価を行い、アミログルコシダーゼ添加量による糖収量への影響を確認した。
【００５７】
結果を表３及び図１に示す。なお、表３及び図１において、グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合（比較例２）の収量を「１.００」とする相対値にて示す。絶対値としては、グルコースの収量は２２０ｇ／ｋｇバイオマス、キシロースの収量は１０８ｇ／ｋｇバイオマスである。
【００５８】
グルコース及びキシロースの各収量はアミログルコシダーゼ添加量が増えるとともに増加した。
【００５９】
この結果より、アミログルコシダーゼ添加による糖化の効果は、アミログルコシダーゼの用量に依拠して増大することが明らかとなった。また、ネピアグラスに含まれるデンプン含量に比較して、このグルコースの収量向上は予想外に多い量であった。さらに、アミログルコシダーゼが基質としないキシラン由来のキシロースの収量向上も確認できた。
【００６０】
【表３】
2016096751.tif 000004
【００６１】
（実施例８〜１０）市販のセルラーゼを用いた場合の評価
上記「実施例５〜７」において、セルラーゼを酵素剤Ａを市販酵素セルクラストに代えて、他の条件は同じ条件のもと糖化性の評価を行い、アミログルコシダーゼ添加量による糖収量への影響を確認した。
【００６２】
結果を表４及び図２に示す。なお、表４及び図２において、グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合（比較例３）の収量を「１.００」とする相対値にて示す。絶対値としては、グルコースの収量は２１７ｇ／ｋｇバイオマス、キシロースの収量は６７ｇ／ｋｇバイオマスである。
【００６３】
グルコース及びキシロースの各収量は、市販酵素セルクラストの存在下においてもアミログルコシダーゼ添加量が増えるとともに増加した。また、ネピアグラスに含まれるデンプン含量に比較して、このグルコースの収量向上は予想外に多い量であった。さらに、アミログルコシダーゼが基質としないキシラン由来のキシロースの収量向上も確認できた。
【００６４】
この結果より、アミログルコシダーゼ添加による糖化の効果は、特定のセルラーゼに限定されないことが明らかとなった。
【００６５】
【表４】
2016096751.tif 000005
【００６６】
（実施例１１〜１３）ネピアグラス以外の原料バイオマスを用いた場合の評価
上記「実施例８〜１０」において、低圧二段アンモニア処理にて前処理したネピアグラスを低圧二段アンモニア処理にて前処理したエリアンサスに代えて、他の条件は同じ条件のもと糖化性の評価を行い、アミログルコシダーゼ添加量による糖収量への影響を確認した。
【００６７】
結果を表５及び図３に示す。なお、表５及び図３において、グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合（比較例４）の収量を「１.００」とする相対値にて示す。絶対値としては、グルコースの収量は２３３ｇ／ｋｇバイオマス、キシロースの収量は１００ｇ／ｋｇバイオマスである。また、エリアンサスの糖組成を表６に示す。
【００６８】
グルコース及びキシロースの各収量は、前処理したエリアンサスを用いた場合においてもアミログルコシダーゼ添加量が増えるとともに増加した。また、エリアンサスに含まれるデンプン含量に比較して、このグルコースの収量向上は予想外に多い量であった。さらに、アミログルコシダーゼが基質としないキシラン由来のキシロースの収量向上も確認できた。
【００６９】
この結果より、アミログルコシダーゼ添加による糖化の効果は、特定の原料バイオマスに限定されないことが明らかとなった。
【００７０】
【表５】
2016096751.tif 000006
【００７１】
【表６】
2016096751.tif 000007
【００７２】
（実施例１４〜１６）高圧一段アンモニア処理にて前処理したエリアンサスを用いた場合の評価
上記「実施例１１〜１３」において、低圧二段アンモニア処理にて前処理したエリアンサスを高圧一段アンモニア処理にて前処理したエリアンサスに代えて、他の条件は同じ条件のもと糖化性の評価を行い、アミログルコシダーゼ添加量による糖収量への影響を確認した。
【００７３】
結果を表７及び図４に示す。なお、表７及び図４において、グルコース及びキシロースの各収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった場合（比較例５）の収量を「１.００」とする相対値にて示す。絶対値としては、グルコースの収量は２５８ｇ／ｋｇバイオマス、キシロースの収量は１０９ｇ／ｋｇバイオマスである。
【００７４】
グルコース及びキシロースの各収量は、高圧一段アンモニア処理にて前処理したエリアンサスを用いた場合においてもアミログルコシダーゼ添加量が増えるとともに増加した。また、エリアンサスに含まれるデンプン含量に比較して、このグルコースの収量向上は予想外に多い量であった。さらに、アミログルコシダーゼが基質としないキシラン由来のキシロースの収量向上も確認できた。
【００７５】
この結果より、アミログルコシダーゼ添加による糖化の効果は、特定の前処理方法により処理された原料バイオマスに限定されないことが明らかとなった。
【００７６】
【表７】
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【００７７】
（実施例１７〜２２）アミログルコシダーゼ添加後のオリゴ糖も含めたグルコース収量の評価
上記実施例１１〜１６及び比較例４〜５の条件下における、オリゴ糖も含めたグルコースの収量について評価した。オリゴ糖も含めたグルコース収量は、酵素糖化後の反応液からバイオマス残渣を取り除いた糖化液を硫酸で加水分解し得られたグルコース量として測定した。
【００７８】
結果を表８及び表９に示す。なお、表８及び表９において、各グルコース収量は、アミログルコシダーゼを添加しなかった比較例４〜５における収量を「１.００」とする相対値にて示す。比較例４におけるオリゴ糖も含めたグルコースの収量の絶対値としては、２３３ｇ／ｋｇバイオマスである。比較例５におけるオリゴ糖も含めたグルコースの収量の絶対値としては、２５８ｇ／ｋｇバイオマスである。
各グルコース収量は、アミログルコシダーゼ添加量が増えるとともに増加した。
【００７９】
これらの結果より、アミログルコシダーゼによる糖化促進効果がエンドグルコシダーゼ活性の増加であることが推定されるとともに、β−グルコシダーゼ活性を追加するとさらに高い糖収量が得られることが示唆される。
【００８０】
【表８】
2016096751.tif 000009
【００８１】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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