(57)【要約】【課題】  物質のタンパク質の吸着性を簡便に評価できる手段の提供である。【解決手段】  基板の少なくとも片面にＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯからなる無機物層と、被験物層をこの順で積層した被験センサーチップの、当該被験物層に、タンパク質を添加した塩の水溶液を接触させる前後の被験物層の厚みを、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置により測定し、その増加量から、被験物のタンパク質吸着性を評価する方法であって、前記タンパク質を添加する塩の水溶液が、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液との組み合わせであることを特徴とするタンパク質吸着性評価方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板の少なくとも片面にＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる無機物層と、被験物層をこの順で積層した被験センサーチップの、当該被験物層に、タンパク質を添加した塩の水溶液を接触させる前後の被験物層の厚みを、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置により測定し、その増加量から、被験物のタンパク質吸着性を評価する方法であって、
前記タンパク質を添加する塩の水溶液が、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液との組み合わせであることを特徴とするタンパク質吸着性評価方法。
【請求項２】
前記被験物が、ポリマーである請求項１記載のタンパク質吸着性評価方法。
【請求項３】
前記ポリマーが疎水性ポリマーである請求項２記載のタンパク質吸着性評価方法。
【請求項４】
前記タンパク質を添加する塩の水溶液が、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される２以上の陰イオンを与える塩の水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される２以上の陰イオンを与える塩の水溶液との組み合わせである請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質吸着性評価方法。
【請求項５】
基板の少なくとも片面にＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる無機物層が形成されてなるセンサーチップと、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩又はその水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩又はその水溶液とを含んでなる、タンパク質吸着性評価キット。
【請求項６】
基板の少なくとも片面にＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる無機物層と、プラスチックからなる被験物層をこの順で積層した被験センサーチップの、当該被験物層に、タンパク質を添加した塩の水溶液を接触させる前後の被験物層の厚みを、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置により測定し、その増加量から、被験物のタンパク質吸着性を評価することによる低タンパク質吸着性プラスチックのスクリーニング方法であって、
前記タンパク質を添加する塩の水溶液が、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液との組み合わせであることを特徴とする低タンパク質吸着性プラスチックのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマー材料のタンパク質吸着性を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を有効成分として含む医薬品は、タンパク質を吸着しにくい容器に保存することが求められている。また、タンパク質を含む試料の検査において用いる基板等も、正確なデータを得るためにタンパク質吸着性の低い材料が求められている。一方、医薬品の容器や検査用基板等は様々な形状をとるため、ガラス製ではなくポリマー製が好まれている。
容器に用いるポリマー材料を検討するに当たり、ポリマーのタンパク質吸着性を評価する必要があり、その方法が多く検討されている。
例えば、特許文献１には、蛍光ラベル化タンパク質を、対象となる材料に接触させた後、蛍光を測定する方法が提案されている。
タンパク質に放射性物質や蛍光体などでラベル化することなく、分子間相互作用を測定する方法として、反射型干渉分光法が検討されている。特許文献２においては、反射型干渉分光法において、ＳｉＮ等の特定の材質からなる層が表面に形成されたセンサーチップを用いることで、任意の非特異吸着能被験物と任意の非特異吸着防止能被験物との間の相対的な非特異吸着性を簡便かつ高精度な評価が可能であることが開示されている。
ところで、脂環構造含有重合体の一種であるシクロオレフィンポリマーが、他のポリマーに比較してＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）の吸着が少ないことが知られている（非特許文献１）。しかしながら、一般的には、極性基を有しないポリマー材料は、タンパク質を吸着しやすいと言われている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−２１７８４８号公報
【特許文献２】特開２０１３−０１１４６３号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｏｎｉｃａｍｉｎｏｌｔａ．ｊｐ／ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｉｆｓ／ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ＿ｓａｍｐｌｅ／ｂｓａ．ｈｔｍｌ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
かかる従来技術の下、極性基を有しない脂環構造含有重合体であるノルボルネン系開環重合体水素化物からなる成形体が、低タンパク質吸着性を示すのは、成形体とタンパク質との間に水分子が介在することで、水分子を介した吸着と脱着との平衡状態にあるためではないかとの仮説を立て、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置を用いてＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列を利用した吸着性比較を行った結果、タンパク質を吸着するポリスチレンからなる成形体はＨｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列に従わない一方、極性基を有しない脂環構造含有重合体であるノルボルネン系開環重合体水素化物からなる成形体は、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列に従った挙動を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
かくして本発明によれば、基板の少なくとも片面にＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる無機物層と、被験物層をこの順で積層した被験センサーチップの、当該被験物層に、タンパク質を添加した塩の水溶液を接触させる前後の被験物層の厚みを、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置により測定し、その増加量から、被験物のタンパク質吸着性を評価する方法であって、
前記タンパク質を添加する塩の水溶液が、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩の水溶液との組み合わせであることを特徴とするタンパク質吸着性評価方法が提供される。
前記被験物は、ポリマーであることが好ましく、更に疎水性ポリマーであることが好ましい。
更に、前記タンパク質を添加する塩の水溶液は、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される２以上の陰イオンを与える塩の水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される２以上の陰イオンを与える塩の水溶液との組み合わせであることが好ましい。
また、本発明によれば、基板の少なくとも片面にＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる無機物層が形成されてなるセンサーチップと、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩又はその水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上の陰イオンを与える塩又はその水溶液とを含んでなる、タンパク質吸着性評価キットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、本発明の実施例において、ノルボルネン系開環重合体水素化物からなる被験物層に対する、ＢＳＡの吸着量を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例において、ノルボルネン系開環重合体水素化物からなる被験物層に対する、ＣＡＩＩの吸着量を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の比較例において、ポリスチレンからなる被験物層に対する、ＢＳＡの吸着量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明に用いる反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置は、試料の光学的薄膜としての特性に着目し、薄膜の反射光における干渉作用を分光法によって測定するものである。光学的薄膜の厚さに変化が生じると、照射された白色光に対する反射光の位相のズレに伴い、反射光の干渉状態が変化し、その結果として分光反射率カーブのボトム波長がシフトすることを利用し、このボトム波長のシフト量を膜の屈折率値を活用して膜厚の変化量に変換する装置である。主な構成としては、白色光源と、分光器と、光伝達部と、制御装置とを有する。このような装置として、コニカミノルタオプト社製「ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）」が挙げられる。
【０００９】
本発明に用いる被験センサーチップは、シリコン等の基板の少なくとも一方の面に、光学的薄膜層となるＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる無機物層が形成されたセンサーチップ上に、被験物層を形成したものである。被験物層は、センサーチップ上にフローセルを配置した後に形成しても良いし、被験物層を形成した後にフローセルを配置しても良い。
被験物層を形成する方法に、被験物に応じて選択すれば良く、例えば、被験物を溶解させた溶液をセンサーチップに塗布、乾燥する方法など一般的な方法が採用される。
本発明において、被験物は、センサーチップに積層可能なものであれば特に制限されないが、評価の精度の観点からポリマーが好ましく、特に疎水性ポリマーが好ましい。ここで、疎水性ポリマーとは、水接触角６０°以上、好ましくは７０°以上のポリマーである。ここで、接触角は、ＤｒｏｐＭａｓｔｅｒ３００（協和界面科学社製）を用い、プラスチック成形品の表面に水を一滴垂らした時の固体面と液滴の端点における液滴輪郭のなす角度よって数値化する（１０回の平均値）ことにより測定された値である。
好適な例としては、ノルボルネン系重合体、単環の環状オレフィン系重合体、環状共役ジエン系重合体、ビニル脂環式炭化水素系重合体、及びこれらの水素化物などの脂環構造含有重合体が挙げられる。
【００１０】
本発明において、タンパク質を添加する塩の水溶液は、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上、好ましくは２以上の陰イオンを与える塩の水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上、好ましくは２以上の陰イオンを与える塩の水溶液との組み合わせである。また、塩は、アルカリ金属塩又はアンモニウム塩であるのが、操作性の観点から好ましい。
具体的には、チオシアン酸イオンを与える塩としては、チオシアン酸ナトリウム、チアオシアン酸カリウム、チオシアン酸アンモニウム、塩素酸イオンを与える塩としては、塩素酸ナトリウム、塩素酸カリウム、塩素酸アンモニウム等；ヨウ素イオンを与える塩としては、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化アンモニウム等；硝酸イオンを与える塩としては、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム等；が挙げられる。
また、臭素イオンを与える塩としては、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化アンモニウム等；塩素イオンを与える塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等；フッ素イオンを与える塩としては、フッ化ナトリウム、フッ化カリウム、フッ化アンモニウム等；酢酸イオンを与える塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等；硫酸イオンを与える塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム等；が挙げられる。
【００１１】
これらの塩を溶解させる水溶液は、添加するタンパク質の好適ｐＨを考慮して任意に選択することができる。具体的には、純水でも良いが、通常、生化学、生物学、臨床化学等でよく使用する、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ塩酸、ＨＥＰＥＳ（［２−［４−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ］ａｃｉｄ］緩衝液、および広ｐＨ域緩衝溶液などの緩衝溶液を用いることが好ましい。
【００１２】
本発明において、チオシアン酸塩、塩素酸塩、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群は、カオトロピック（Ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）であり、水素イオンとの親和性が弱い陰イオンである。また、本発明において、臭素イオン、塩素イオン、フッ素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群は、コスモトロピック（Ｃｏｓｍｏｔｒｏｐｅｓ）であり、水素イオンとの親和性が強い陰イオンである。コスモトロピックな陰イオンは、成形体とタンパク質分子との界面に存在する水分子と結合し、界面から水分子を取り除きタンパク質を成形体に吸着させる作用を有する。
従って、本発明において、「Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列に従う」とは、コスモトロピック性が高い陰イオンを与える塩の水溶液ほど、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置で測定される成形体表面の膜厚が大きくなる傾向があり、カオトロピック性が高い陰イオンを与える塩の水溶液ほど、膜厚が小さくなる傾向がある、ということである。
そして、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列に従う被験物は、タンパク質の吸着が少ない材料であり、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ系列に従わない被験物は、タンパク質の吸着が多い材料であると判断することができる。
【００１３】
本発明において、塩の水溶液に添加するタンパク質は、被験物に対する吸着性を確認したい任意のタンパク質である。
塩の水溶液にタンパク質を添加する方法に格別な制限はなく、例えば、塩の水溶液を調整した後、タンパク質を添加し、攪拌する方法など一般的な方法が採用される。この時、タンパク質は水溶液に溶解していることが好ましいが、分析に支障のない範囲において、微分散している分散液であっても良い。
タンパク質の濃度は、複数の濃度で設定することが好ましく、例えば、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、及び１０００μｇ／ｍｌのような濃度の組み合わせなどが挙げられる。
【００１４】
本発明においては、被験センサーチップを、分子間相互作用測定装置に設置し、特開２０１３−０１１４６３号公報段落００１９〜段落００７６などを参考に、フローセルに沿って、タンパク質が添加された塩の水溶液を流し、タンパク質が添加された塩の水溶液を流す前後の分光反射率から膜厚増加量を求める。タンパク質が添加された塩の水溶液を流す速度（流速）は、１０μｌ／ｍｉｎから１００μｌ／ｍｉｎの範囲にあるときが好ましく、より好ましくは２０μｌ／ｍｉｎから５０μｌ／ｍｉｎである。
【００１５】
本発明のタンパク質吸着性評価キットは、反射型干渉分光法による分子間相互作用測定装置を用いた、本発明のタンパク質吸着性評価方法に用いる上述したセンサーチップと上述した塩又はその水溶液とを含む。
センサーチップは、基板の少なくとも片面にＳｉＮ、Ｔａ２Ｏ５、Ｎｂ２Ｏ５、ＨｆＯ２、ＺｒＯ２またはＩＴＯ（酸化インジウム錫）からなる無機物層が形成されたものである。
塩又はその水溶液は、チオシアン酸イオン、塩素酸イオン、ヨウ素イオン、及び硝酸イオンからなる群から選択される１以上、好ましくは２以上の陰イオンを与える塩又はその水溶液と、臭素イオン、塩素イオン、酢酸イオン、及び硫酸イオンからなる群から選択される１以上、好ましくは２の陰イオンを与える塩又はその水溶液とである。
【００１６】
こうしたタンパク質吸着性評価を利用し、被験物としてプラスチックを用いることにより、低タンパク質吸着性プラスチックのスクリーニングを行うことができる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（被験センサーチップの作成）
ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）１４２０Ｒ（日本ゼオン社製、ノルボルネン系開環重合体水素化物）をシクロヘキサンに３．０重量％溶解させた。その後、スピンコーター（成膜条件：回転数３０００ｒｐｍ、回転時間６０秒）を用いて窒化ケイ素基板上に薄膜を作成した。得られた薄膜を８０℃で１時間乾燥させ、シクロヘキサンを完全に気化させた。
【００１８】
（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ塩溶液の調製）
５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ＝７．０）に５００ｍＭの濃度となるように硫酸ナトリウムを溶解させ、水溶液（Ａ）を調製した。また、同様の操作で、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオシアン酸ナトリウム、及びチオシアン酸カリウムをそれぞれ５０ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液に溶解させ、水溶液（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、及び（Ｅ）を調製した。
（試験方法及び測定方法）
材料に対するタンパク質の吸着性は分子間相互作用測定装置「ＭＩ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）」（コニカミノルタオプト社製）を用いて測定した。
得られた被験センサーチップを装置にセットし、専用のフローセルを載せ被験センサーチップ上に流路を作製した。前記の流路に、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を１０００μｇ／ｍＬの濃度になるように添加した水溶液（Ａ）〜（Ｅ）を、それぞれ、２０μｌ／ｍｉｎの速度で流した。その後、再び薄膜の厚みを測定して、その増加量を算出し、タンパク質の吸着量の指標とした。結果を図１に示す。
次に、用いるタンパク質をＢＳＡからＣＡＩＩ（Ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒａｓｅＩＩ）に代え、水溶液濃度を２０００μｇ／ｍＬとして、同様の操作で、タンパク質の吸着量を測定した。結果を図２に示す。
更に、ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）１４２０Ｒの代わりに、ポリスチレンを用いたこと以外は、同様にして、窒化ケイ素基板上に薄膜を形成した被験用センサーチップとＢＳＡを１０００μｇ／ｍＬの濃度になるように添加した水溶液（Ａ）〜（Ｅ）とを用い、同様の操作でタンパク質の吸着量を測定した。結果を図３に示す。
【００１９】
この結果から、被験物がノルボルネン系開環重合体水素化物である場合、コスモトロピックな塩を使用した場合にタンパク質の吸着量が多くなり、カオトロピックな塩を使用した場合、タンパク質の吸着量が少なくなる（図１、２）一方、被験物がポリスチレンである場合、Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ塩とタンパク質の吸着量の相関が得られない（図３）ことから、疎水性ポリマーであるノルボルネン系開環重合体水素化物は、ポリスチレンに比較して、タンパク質の吸着量が少ないことがわかる。
【図１】
2016024140.tif 000002
【図２】
2016024140.tif 000003
【図３】
2016024140.tif 000004