(57)【要約】【課題】  本発明は、増幅効率が低減することを抑制させつつＰＣＲ産物の生成時間を短縮させることを目的とする。【解決手段】  本発明の核酸増幅反応用カートリッジ１は、鋳型核酸を含む溶液が導入される容器１０と、この容器１０に収容され、当該溶液との比重とは異なり相分離する液体１２とを備える。この液体１２と相分離して得られる当該溶液の液滴の直径Ｄ２と、当該液滴が移動する流路となる容器１０の円筒部の内径Ｄ１との比は、０．３６以上０．８９以下である。【選択図】    図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型核酸を含む溶液が導入される容器と、
前記容器に収容され、前記溶液とは比重が異なり相分離する液体と
を備え、
前記液体内で前記液体と相分離する前記溶液の液滴の直径と、当該液滴が移動する流路となる前記容器の円筒部の内径との比は、０．３６以上０．８９以下である、
ことを特徴とする核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項２】
前記液滴の液量は０．２μＬ以上２μＬ以下である、
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項３】
前記容器内には、前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬が凍結乾燥されて配置されている、
ことを特徴とする請求項１または２に記載の核酸増幅反応用カートリッジ。
【請求項４】
核酸増幅反応用カートリッジにおける容器の第１領域を標的核酸の変性温度に加熱するとともに、前記第１領域とは独立した前記容器の第２領域を前記標的核酸の合成温度に加熱するヒーターと、
前記容器に収容される液体内で前記液体と相分離する液滴を、前記第１領域から前記第２領域に、または、前記第２領域から前記第１領域に移動させる移動機構と、
前記第１領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、
を備え、
前記液滴には、鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬が添加され、
前記液滴の直径と、前記液滴が移動する流路となる前記容器の円筒部の内径との比は、０．３６以上０．８９以下である、
ことを特徴とする核酸増幅装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸増幅反応用カートリッジおよび核酸増幅装置に関し、増幅反応期間の短縮を通じて、ＰＣＲ産物の生成時間を短縮させる場合に好適なものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ(polymerase chain reaction)法は、ＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)などの核酸における鎖長の違いなどを要因としてその核酸の変性やアニーリングの違いが生じることを利用し、当該核酸に対して温度変化を繰り返し与えることで核酸を増幅する手法である。
【０００３】
このようなＰＣＲ法を用いた核酸増幅装置として、下記特許文献１のＰＣＲ装置が本出願人により提案されている。下記特許文献１のＰＣＲ装置に装着されるバイオチップには、標的核酸などが含まれる液滴状の反応液が移動する流路が形成され、その流路には反応液が収容されるとともに、当該反応液よりも比重が小さく反応液とは混和しない液体が充填されている。
【０００４】
下記特許文献１のＰＣＲ装置には、バイオチップが装着される装着部にそのバイオチップを装着した場合において、当該バイオチップに形成される流路の第１領域を加熱する加熱部と、当該第１領域と異なる温度で第２領域を加熱する加熱部が備えられる。また、下記特許文献１のＰＣＲ装置には、装着部および加熱部の配置を、第１の配置と第２の配置との間で切換える駆動機構が備えられる。この駆動機構によって、装着部に装着されるバイオチップ内にある液滴状の反応液は、互いに異なる温度に加熱される第１の領域と第２の領域との相互に移動される。このような下記特許文献１のＰＣＲ装置によれば、バイオチップ全体の温度を互いに異なる温度に切り替える場合に比べると、増幅反応期間（サイクルタイム）を短縮できるというものである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ところで、上述のＰＣＲ装置におけるＰＣＲ産物の生成時間をより一段と早めるべき要請がある。
【０００７】
そこで本発明は、増幅反応期間の短縮を通じて、ＰＣＲ産物の生成時間を短縮させることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
増幅反応期間は、第１の領域と第２の領域との間を液滴が移動する時間と、当該領域に移動した液滴の温度が変化する時間と、当該液滴内で反応が進行する時間とに大別される。このうち液滴が移動する時間が増幅反応期間の短縮に効果的であることに本発明者らは着目した。そこで、上記目的を達成するため本発明者らは液滴の移動速度に関して鋭意検討した結果、本発明の核酸増幅反応用カートリッジおよび核酸増幅装置に至った。
【０００９】
本発明の核酸増幅反応用カートリッジは、鋳型核酸を含む溶液が導入される容器と、前記容器に収容され、前記溶液とは比重が異なり相分離する液体とを備え、前記液体内で前記液体と相分離する前記溶液の液滴の直径と、当該液滴が移動する流路となる前記容器の円筒部の内径との比は、０．３６以上０．８９以下である、ことを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の核酸増幅装置は、核酸増幅反応用カートリッジにおける容器の第１領域を標的核酸の変性温度に加熱するとともに、前記第１領域とは独立した前記容器の第２領域を前記標的核酸の合成温度に加熱するヒーターと、前記容器に収容される液体内で前記液体と相分離する液滴を、前記第１領域から前記第２領域に、または、前記第２領域から前記第１領域に移動させる移動機構と、前記第１領域に前記液滴を留める変性段階、および、前記第２領域に前記液滴を留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返すように、前記移動機構を制御する制御部と、を備え、前記液滴には、鋳型核酸および前記鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬が添加され、前記液滴の直径と、前記液滴が移動する流路となる前記容器の円筒部の内径との比は、０．３６以上０．８９以下である、ことを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】核酸増幅反応用カートリッジの断面を示す図である。
【図２】核酸増幅反応用カートリッジの容器内に鋳型核酸溶液が導入される様子を示す図である。
【図３】鋳型核酸溶液によって凍結乾燥状態の試薬が元の状態に戻った場合の様子を示す図である。
【図４】核酸増幅装置のブロック図である。
【図５】回転機構の様子を示す図である。
【図６】核酸増幅反応用カートリッジが装着部に装着された様子を示す図である。
【図７】熱サイクル処理の様子を示す図である。
【図８】増幅曲線を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態を添付図面を用いて例示する。以下に例示する実施形態および実施例は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更、改良することができる。
【００１３】
（１）実施形態
実施形態として、核酸を増幅させる核酸増幅装置に装着される核酸増幅反応用カートリッジを説明した後に、当該核酸増幅装置を説明する。
【００１４】
＝＝＝核酸増幅反応用カートリッジ＝＝＝
図１は、核酸増幅反応用カートリッジ１の断面を示す図である。図１に示すように、核酸増幅反応用カートリッジ１は、試薬１１とオイル１２とが収容される容器１０を備える。本実施形態では容器１０の側壁部１０Ａは円筒状とされ、当該容器１０の底壁部１０Ｂは中空半球状とされる。
【００１５】
容器１０の底壁部１０Ｂに対向する端部は開口しており、当該開口にはキャップ１０Ｃが取り付けられる。キャップ１０Ｃは容器１０の開口を塞ぐ蓋部材であり、本実施形態では容器１０に対して着脱自在とされる。また、本実施形態では容器１０内に収容されるキャップ１０Ｃのシール部位ＳＰは円柱状とされる。
【００１６】
このような容器１０内には鋳型核酸溶液が導入される。鋳型核酸溶液は、鋳型核酸を含む溶液である。容器１０内に鋳型核酸溶液を導入するときにはキャップ１０Ｃが容器１０から取り外され、当該導入後にキャップ１０Ｃが再び容器１０に取り付けられる。
【００１７】
なお、容器１０内に導入される鋳型核酸溶液は、例えば次のようにして得られる。すなわち、綿棒などの採取具によってヒト・細菌などの生物由来の細胞あるいはウイルス粒子などの検体が採取され、既知の抽出手法を用いて鋳型核酸が検体から抽出される。その後、既知の精製手法を用いて、所定濃度となるように鋳型核酸溶液が精製される。なお、鋳型核酸溶液における溶液の組成は、例えば水（蒸留水、滅菌水）や、Ｔｒｉｓ-ＥＤＴＡ(ethylenediaminetetraacetic acid)溶液（ＴＥ）とされる。
【００１８】
試薬１１は、標的核酸の増幅反応に使用される試薬であり、凍結乾燥されて容器１０の底壁部１０Ｂに固定される。この試薬１１として、ＤＮＡ(deoxyribonucleic acid)ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ(deoxyribonucleotide triphosphate)および緩衝液が含有される。なお、試薬１１が凍結乾燥された場合、当該試薬１１における水分が消失するため、緩衝液に含有されるマグネシウムイオンやカリウムイオンなどのイオンが容器１０の底壁部１０Ｂに固定される。
【００１９】
標的核酸は、容器１０内に導入される鋳型核酸溶液中の鋳型核酸において増幅させるべき全部または一部の核酸であり、例えばＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ(complementary  DNA)断片又はＰＮＡ(peptide nucleic acid)である。
【００２０】
なお、鋳型核酸がＲＮＡ(ribonucleic acid)の場合、そのＲＮＡのｃＤＮＡを得るため、逆転写酵素や逆転写酵素用プライマーなども、標的核酸の増幅反応に使用される試薬１１として含有される。また、リアルタイムＰＣＲ法を用いて標的核酸の増幅を定量する場合、ＴａｑＭａｎプローブや、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ、サイクリングプローブといった蛍光色素が結合するプローブや、ＳＹＢＲグリーンといったインターカレーター用蛍光色素など、定量用のプローブも、標的核酸の増幅反応に使用される試薬１１として含有される。
【００２１】
オイル１２は、容器１０内に導入される鋳型核酸溶液の比重よりも比重が小さく、当該鋳型核酸溶液とは相分離する液体であり、例えば２ＣＳシリコーンオイルやミネラルオイルなどとされる。
【００２２】
図２は核酸増幅反応用カートリッジの容器内に鋳型核酸溶液が導入される様子を示す図であり、図３は鋳型核酸溶液によって凍結乾燥状態の試薬が元の状態に戻った場合の様子を示す図である。
【００２３】
図２に示すように、核酸増幅反応用カートリッジ１の容器１０に収容されるオイル１２に鋳型核酸溶液が添加された場合、当該鋳型核酸溶液には界面の表面積を小さくする作用が働くことで、鋳型核酸溶液は容器１０内のオイル１２と相分離し、液滴２０となる。この液滴２０の比重はオイル１２の比重よりも大きいため、当該液滴２０は容器１０における側壁部１０Ａに沿って沈降する。すなわち、容器１０における円筒状の側壁部１０Ａは液滴２０の流路となる。
【００２４】
図３に示すように、液滴２０が容器１０の底壁部１０Ｂにまで沈降した場合、当該液滴２０の水分によって凍結乾燥した試薬１１が元の状態になり、その元の状態になった試薬１１が液滴２０内に取り込まれる。
【００２５】
凍結乾燥状態から元の状態になった試薬１１が液滴２０内に取り込まれた場合、当該液滴２０には鋳型核酸およびその鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１を含むこととなり、当該液滴２０が核酸の増幅反応を進行させる場となる。
【００２６】
ところで、本実施形態の場合、容器１０において液滴２０が移動する円筒状の流路となる側壁部１０Ａの内径Ｄ１と、当該液滴２０の直径Ｄ２との比は、０．３６以上０．８９以下である。なお、液滴２０の液量は０．２μＬ以上２μＬ以下であることが好ましい。また、側壁部１０Ａの内壁は、液滴２０が付着しない程度の撥水性を有することが好ましい。
【００２７】
＝＝＝核酸増幅装置＝＝＝
図４は、核酸増幅装置のブロック図である。図４に示すように、核酸増幅装置５０は、回転機構６０、蛍光測定器７０および制御部８０を有する。
【００２８】
＜回転機構＞
図５は、回転機構の様子を示す図である。図５は回転機構６０の側面図である。以下の核酸増幅装置５０の説明では、図に示すように、上下、前後、左右を定義する。すなわち、核酸増幅装置５０のベース５１を水平に設置したときの鉛直方向を「上下方向」とし、重力方向に従って「上」と「下」とを定義する。また、核酸増幅反応用カートリッジ１の回転軸の軸方向を「左右方向」とし、上下方向及び左右方向に垂直な方向を「前後方向」とする。
【００２９】
図５に示すように、回転機構６０は、回転体６１およびその回転体６１を回転させる回転用モーター６６（図４）を有する。回転体６１には、核酸増幅反応用カートリッジ１を着脱可能な挿入穴６４を有するヒーター部６５が設けられる。回転体６１は、ヒーター部６５とそのヒーター部６５の挿入穴６４に装着される核酸増幅反応用カートリッジ１との相対位置を変えずに、ベース５１に固定された支持台５２に支持される回転軸を中心として回転する。
【００３０】
なお、ヒーター部６５の挿入穴６４が核酸増幅反応用カートリッジ１を着脱可能に保持する保持部を兼ねているが、当該挿入穴６４に挿入される核酸増幅反応用カートリッジ１を着脱可能に保持する保持部が核酸増幅装置５０に設けられていてもよい。また、保持部が装着可能な核酸増幅反応用カートリッジ１の数は、１つに限られず、複数でもよい。
【００３１】
回転用モーター６６（図４）は、制御部８０からの指示にしたがって、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された核酸増幅反応用カートリッジ１が上下反転するように、回転体６１を回転させる。
【００３２】
図６は、核酸増幅反応用カートリッジが装着された様子を示す図である。図６に示すように、ヒーター部６５は、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱するための高温側ヒーター部６５Ｂと、標的核酸の合成反応（アニーリング反応および伸長反応）が進行する温度に加熱するための低温側ヒーター部６５Ｃとを有する。
【００３３】
ヒーター部６５の挿入穴６４で核酸増幅反応用カートリッジ１が保持された場合、その核酸増幅反応用カートリッジ１の容器１０において液滴２０の流路となる側壁部１０Ａの一端側にあたる第１領域３６Ａが高温側ヒーター部６５Ｂに囲まれる。高温側ヒーター部６５Ｂは、第１領域３６Ａを例えば９５〜１００℃に加熱する。
【００３４】
また、ヒーター部６５の挿入穴６４で核酸増幅反応用カートリッジ１が保持された場合、その核酸増幅反応用カートリッジ１の容器１０において液滴２０の流路となる側壁部１０Ａの他端側にあたる第２領域３６Ｂが低温側ヒーター部６５Ｃに囲まれる。低温側ヒーター部６５Ｃは、第２領域３６Ｂを例えば５０〜７５℃に加熱する。
【００３５】
このように核酸増幅反応用カートリッジ１における容器１０の第１領域３６Ａが標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱され、当該容器１０の第２領域３６Ｂが標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱される。
【００３６】
なお、高温側ヒーター部６５Ｂと低温側ヒーター部６５Ｃとの間には、高温側ヒーター部６５Ｂと低温側ヒーター部６５Ｃとの間の熱伝導を抑制するスペーサー６５Ｄが配置されている。このスペーサーでも６５Ｄには、高温側ヒーター部６５Ｂおよび低温側ヒーター部６５Ｃの挿入穴６４の長手方向に沿った位置に貫通孔が形成され、挿入穴６４に対して核酸増幅反応用カートリッジ１の容器１０の挿入を妨げることが防止される。
【００３７】
＜蛍光測定器＞
蛍光測定器７０は、核酸増幅反応用カートリッジ１における容器１０に収容される液滴２０の蛍光強度を測定する測定器であり、図５に示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着される核酸増幅反応用カートリッジ１の末端に対して所定距離を隔てて対向する状態で配置される。
【００３８】
蛍光測定器７０は、制御部８０（図４）からの測定指示に応じて液滴２０に含有される蛍光色素に対応する励起光を照射し、当該液滴２０で発光する蛍光強度を測定する。また蛍光測定器７０は、測定結果として得られる蛍光強度を示すデータを制御部８０に与える。なお、蛍光測定器７０は、１つの蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであっても、複数の蛍光色素に対応する蛍光強度を測定するものであってもよい。
【００３９】
＜制御部＞
制御部８０は、図４に示すように、記憶部９１を有し、当該制御部８０には入力部９２および表示部９３などが接続される。記憶部９１には、プログラムを格納する領域と、入力部９２から入力される設定データおよび核酸増幅処理によって得られるデータなどの各種のデータを格納する領域と、当該プログラムやデータを展開する領域とが含まれる。
【００４０】
制御部８０は、記憶部９１に格納されるプログラムおよび設定データに基づいて回転機構６０および蛍光測定器７０を適宜制御し、熱サイクル処理または増幅解析処理を適宜実行する。
【００４１】
≪熱サイクル処理≫
図７は、熱サイクル処理の様子を示す図である。具体的に図７の（Ａ）および（Ｂ）は標的核酸の変性段階の様子を示し、図７の（Ｃ）および（Ｄ）は標的核酸の合成段階の様子を示す図である。
【００４２】
すなわち、制御部８０は、例えば熱サイクル処理すべき命令を入力部９２から受けると、回転体６１に設けられた高温側ヒーター部６５Ｂを駆動し、核酸増幅反応用カートリッジ１における容器１０の第１領域３６Ａを、標的核酸の変性反応が進行する温度に加熱する。また、制御部８０は、回転体６１に設けられた低温側ヒーター部６５Ｃを駆動し、核酸増幅反応用カートリッジ１における容器１０の第２領域３６Ｂを、標的核酸の合成反応が進行する温度に加熱する。これにより核酸増幅反応用カートリッジ１の容器１０に充填されるオイル１２には温度勾配が形成される。
【００４３】
高温側ヒーター部６５Ｂおよび低温側ヒーター部６５Ｃが駆動されてから、第１領域３６Ａにおけるオイル１２が例えば９８℃に達し、第２領域３６Ｂにおけるオイル１２が例えば５４℃に達するまでには所定の期間を要する。この期間に標的核酸の増幅反応は適切に進行しないため、制御部８０は当該期間を待機期間として待機する。
【００４４】
このとき、図７の（Ａ）に示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された容器１０におけるキャップ１０Ｃ側が上側に配置され、当該容器１０における底壁部１０Ｂ側が下側に配置される基準位置に回転体６１が位置している。回転体６１が基準位置に位置している場合、図７の（Ｂ）に示すように、液滴２０は自重により沈降して第２領域３６Ｂに留まる。したがって、液滴２０に含有する標的核酸が１回目の変性段階に移行することはない。
【００４５】
制御部８０は、上述の待機期間を経過した場合、回転体６１を１８０度回転させる。この場合、図７の（Ｃ）に示すように、ヒーター部６５の挿入穴６４に装着された容器１０におけるキャップ１０Ｃ側が下側に配置され、当該容器１０における底壁部１０Ｂ側が上側に配置される反転位置に回転体６１が位置することになる。回転体６１が反転位置に位置している場合、図７の（Ｄ）に示すように、液滴２０は自重により沈降して第１領域３６Ａに移動する。したがって、液滴２０に含有する標的核酸は変性段階に移行することになる。
【００４６】
また制御部８０は、回転体６１を１８０度回転し終えた時点（回転体６１を停止した）から標的核酸の変性反応に要する変性段階の期間として設定された変性反応期間だけ、回転体６１を停止させる。これにより液滴２０に含有する標的核酸の変性反応が進行する。なお、変性反応期間は、少なくとも、容器１０において液滴２０の流路となる側壁部１０Ａの一端側にあたる第１領域３６Ａと、当該側壁部１０Ａの他端側にあたる第２領域３６Ｂとの間を液滴２０が移動する期間以上の期間とされる。
【００４７】
次いで制御部８０は、変性反応期間を経過すると、回転体６１を１８０度回転させて、当該回転体６１を反転位置から基準位置に切り替え、図７の（Ｂ）に示すように、第２領域３６Ｂに液滴２０を移動させる。これにより液滴２０に含有する標的核酸は合成段階に移行することになる。
【００４８】
また制御部８０は、回転体６１を１８０度回転し終えた時点（回転体６１を停止した）時点から標的核酸の合成反応に要する合成段階の期間として設定された合成反応期間だけ、回転体６１を停止させる。これにより液滴２０に含有する標的核酸のアニーリング反応および伸長反応が進行する。なお、合成反応期間は、上述の変性期間と同様に、少なくとも第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとの間を液滴２０が移動する期間以上の期間とされる。
【００４９】
このように制御部８０は、上述の反転位置と基準位置とを交互に切り替えて、第１領域３６Ａに液滴２０を移動させて留める変性段階および第２領域３６Ｂに液滴２０を移動させて留める合成段階を経るサイクルを複数回繰り返す。繰り返すべきサイクル数は制御部８０に設定され、例えば５０回とされる。
【００５０】
≪増幅解析処理≫
増幅解析処理は、熱サイクル処理と同時期に並行して実行される。すなわち、制御部８０は、蛍光測定器７０に対して合成反応期間ごとに測定指示を与え、当該測定指示結果として蛍光測定器７０から与えられる蛍光強度を示すデータを記憶部９１に記憶する。
【００５１】
なお、図７の（Ａ）および（Ｂ）に示したように、合成反応期間では回転体６１が基準位置にあるため、容器１０内の液滴２０は底壁部１０Ｂに向かって沈降していく。しかしながら、回転体６１が基準位置になった直後では、液滴２０が底壁部１０Ｂに到達していない場合がある。したがって、制御部８０が蛍光測定器７０に対して測定指示を与える時期は、回転体６１を反転位置から基準位置にまで回転し終えた時点から所定時間経過した後であることが望ましい。特に、基準位置から反転位置に回転させる直前であることが望ましい。
【００５２】
また制御部８０は、入力部９２から入力される命令に応じて、繰り返すべきサイクル数として設定される回数分の蛍光強度を示すデータを記憶部９１から読み出し、当該データに基づいてサイクル数に対する蛍光強度の推移を示す増幅曲線を生成する。そして制御部８０は、増幅曲線を生成した場合、その増幅曲線に基づいて基準の増幅効率に対する良否を判定し、当該判定結果と増幅曲線との双方またはいずれか一方を適宜表示部９３に表示させる。
【００５３】
＜小括＞
以上のとおり、本実施形態の場合、核酸増幅反応用カートリッジ１の容器１０に収容されるオイル１２と相分離する鋳型核酸溶液の液滴２０の直径Ｄ２と、当該液滴２０が移動する流路となる円筒状の側壁部１０Ａの内径Ｄ１との比は、０．３６以上０．８９以下である。この場合、増幅効率が低減することなく、容器１０における円筒状の側壁部１０Ａを移動する液滴２０の移動速度が速まることが見出された。このことは下記の実施例を一例として述べる。
【００５４】
したがって、本実施形態における核酸増幅反応用カートリッジ１および核酸増幅装置５０によれば、増幅反応期間の短縮を通じて、ＰＣＲ産物の生成時間を短縮させることができる。
【００５５】
また、側壁部１０Ａの内径Ｄ１と液滴２０の直径Ｄ２との比が以上０．８９以下であり、かつ、当該液滴２０の液量が０．２μＬ以上２μＬ以下である場合、側壁部１０Ａを移動する液滴２０の移動速度を速めつつ増幅効率がより一段と向上することが見出された。このことも下記の実施例を一例として述べる。
【００５６】
（２）変形例
上記実施形態では、容器１０の側壁部１０Ａは円筒状とされ、当該容器１０の底壁部１０Ｂは中空半球状とされた。しかしながら、液滴２０が移動する流路となる部分が円筒であれば、当該容器１０の底壁部１０Ｂの形状や、当該容器１０の側壁部１０Ａの外周側にあたる外形形状など、種々の形状とすることができる。
【００５７】
また上記実施形態では、容器１０に対してキャップ１０Ｃが着脱自在とされ、当該容器１０からキャップ１０Ｃが取り外された状態で鋳型核酸溶液が導入された。しかしながら、容器１０に対してキャップ１０Ｃが固定され、当該キャップ１０Ｃに貫通される針を介して鋳型核酸溶液が導入されてもよい。
【００５８】
また上記実施形態では、キャップ１０Ｃのシール部位ＳＰが円柱状とされた。しかしながら、シール部位ＳＰにおいて容器１０の底壁部１０Ｂに対向する部分に半球状や円錐状の窪みが形成されていてもよい。この窪みが、容器１０の側壁部１０Ａから離れるほど先細りとなる場合、液滴２０を定位置に静止させることができるため、より同じ条件で液滴２０を加熱させることが可能となる。なお、容器１０の底壁部１０Ｂが、当該容器１０の側壁部１０Ａから離れるほど先細りとなっていてもよい。
【００５９】
また上記実施形態では、凍結乾燥状態にある試薬１１が容器１０内に固定され、その容器１０内に収容されるオイル１２に鋳型核酸溶液が導入されて鋳型核酸溶液の液滴２０が得られ、当該液滴２０によって試薬１１が元の状態に戻され液滴２０に取り込まれた。すなわち、鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１とを含む液滴２０が、容器１０内で形成されることにより容器１０内に収容された。しかしながら、鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１とを含む溶液が、容器１０外で調整され、当該溶液がオイル１２に導入されることで容器１０内に液滴２０が収容されていてもよい。この場合、凍結乾燥した試薬１１を容器１０内に予め配置しておくことが省略される。要するに、鋳型核酸を含む溶液が容器１０に導入されればよく、当該鋳型核酸および鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１を液滴２０に添加する手法は問わない。
【００６０】
また上記実施形態では、液滴２０の比重がオイル１２の比重よりも大きくされた。しかしながら、液滴２０の比重がオイル１２の比重よりも小さくされていてもよい。このようにしても上記実施形態と同様の効果を奏する。要するに、容器１０に導入される溶液の比重とは異なる比重を有し、当該溶液とは相分離する液体が適用可能である。このような液体に溶液が導入された場合、上記実施形態の場合と同様に、当該液体内には溶液の液滴２０が形成される。
【００６１】
また上記実施形態では、変性反応期間および合成反応期間の始期が回転体６１を１８０度回転し終えた（回転体６１を停止した）時点とされたが、当該回転体６１を１８０度回転し始める時点とされてもよい。
【００６２】
また上記実施形態では、核酸増幅反応用カートリッジ１における容器１０内の液滴２０を第１領域３６Ａと第２領域３６Ｂとに交互に移動させる機構として回転機構６０が採用された。しかしながら、容器１０において標的核酸の変性温度にされる第１領域と、その第１領域とは独立した領域であって標的核酸の合成温度にされる第２領域とに液滴２０を交互に移動させる機構であれば、上記回転機構６０以外の種々の移動機構を適用することが可能である。
【００６３】
上記実施形態では、高温側ヒーター部６５Ｂおよび低温側ヒーター部６５Ｃを備えた核酸増幅装置５０が適用された。しかしながら、容器１０の内部に温度勾配を形成できるのであれば、上記実施形態の核酸増幅装置５０以外の核酸増幅装置が適用されてもよい。例えば、高温側ヒーターのみが備えられていてもよく、低温側ヒーター部６５Ｃが冷却器に変更されてもよい。あるいは、回転体６１の外部に高温側ヒーターおよび低温側ヒーターが備えられていてもよい。あるいは、高温側ヒーター部６５Ｂを設ける部位と、低温側ヒーター部６５Ｃを設ける部位とが逆にされてもよい。
【００６４】
また上記実施形態では、蛍光測定器７０が備えられたが省略されていてもよい。蛍光測定器７０を省略する場合、核酸の増幅を定量することができないが、当該核酸を増幅させることは可能である。
【実施例】
【００６５】
まず、鋳型核酸と、その鋳型核酸における標的核酸の増幅に使用される試薬１１と、着色用のインクとを試験管に投入した後、蒸留水を加えて１０μＬの溶液を調整した。
鋳型核酸は、肺炎マイコプラズマの標準物質であるプラスミドDNA（105コピー／μＬ）とし、１．０μＬだけ試験管に投入した。
【００６６】
試薬１１に含有されるＤＮＡポリメラーゼは、Life Technologies社製のPlatinumTaqとし、０．４μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有されるｄＮＴＰは、Roche社製のPCR Nucleotide Mixとし、０．５μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有されるプライマーは、マイコプラズマ検出用forwardプライマーおよびマイコプラズマ検出用reverseプライマーとし、当該forwardプライマーを０．８μＬだけ試験管に投入し、当該reverseプライマーを０．８μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有される緩衝液は、MgCl2が２５ｍＭ、Tris-HCl(PH9.0)が２５０ｍＭ、KClが１２５ｍＭの組成のものとし、２．０μＬだけ試験管に投入した。
試薬１１に含有されるプローブは、マイコプラズマ検出用TaqManプローブとし、０．６μＬだけ試験管に投入した。
【００６７】
なお、プライマーおよびプローブの配列は下記表１に示す。
【表１】
2016192931.tif 000003
【００６８】
上記表１における“FAM”は、フルオレセインアミノヘキシル（fluorescein aminohexyl）の略語であり、レポーター蛍光色素の１つである。また、上記表１における“BHQ”は、ブラックホールクエンチャー（Black Hole Quencher）の略語であり、クエンチャー蛍光色素の１つである。
【００６９】
次に、側壁部１０Ａの内径Ｄ１が２ｍｍである容器１０を複数用意し、これら容器１０に上記溶液をそれぞれ異なる液量で導入し、当該容器１０に液滴２０を収容した。その後、上記核酸増幅装置５０におけるヒーター部６５の挿入穴６４に容器１０を装着し、当該容器１０ごとに同じ条件で熱サイクル処理および増幅解析処理を実行させた。
熱サイクル処理におけるサイクル数は５０回とし、変性反応期間は４秒とし、合成反応期間は６秒とし、高温側ヒーター部６５Ｂの温度は９８℃とし、低温側ヒーター部６５Ｃの温度は５４℃とした。
【００７０】
また、熱サイクル処理を実行させているときに、フレームレートが３０ｆｐｓでなるカシオ社製のデジタルビデオカメラで容器１０を撮影し、その撮影結果として得られるデータを用いて容器１０の側壁部１０Ａを移動する液滴２０の移動時間を測定した。この測定結果を下記表２に示し、当該熱サイクル処理と同時に実行した増幅解析処理の処理結果（増幅曲線）を図８に示す。
なお、移動時間は、回転体６１を回転し始めた時点から液滴２０が第１領域３６Ａから第２領域３６Ｂ（又は第２領域３６Ｂから第１領域３６Ａ）に到達した時点までのフレーム数の平均を取得し、当該平均とフレームレートとから求めた。
また、フレームに映る容器１０の側壁部１０Ａの内径Ｄ１が２ｍｍであることを確認した上で、そのフレームに映る液滴２０の直径Ｄ２を取得し、当該側壁部１０Ａの内径Ｄ１と液滴２０の直径Ｄ２との比を求めた。
【００７１】
【表２】
2016192931.tif 000004
【００７２】
上記表２および図８に示されるように、容器１０において液滴２０が移動する流路となる円筒状の側壁部１０Ａの内径Ｄ１と、当該液滴２０の直径Ｄ２との比が０．３６以上０．８９以下である場合、増幅効率が低減することなく、当該液滴２０の移動速度が速まることが確認された。
【００７３】
また、側壁部１０Ａの内径Ｄ１と液滴２０の直径Ｄ２との比が０．３６〜０．８９とされ、かつ、当該液滴２０の液量が０．２μＬ以上２μＬ以下である場合、液滴２０の移動速度を速めつつ増幅効率がより一段と向上することが確認された。
【符号の説明】
【００７４】
１・・・核酸増幅反応用カートリッジ、１０・・・容器、１０Ａ・・・側壁部、１０Ｂ・・・底壁部、１０Ｃ・・・キャップ、１１・・・試薬、１２・・・オイル、２０・・・液滴、５０・・・核酸増幅装置。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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