(57)【要約】      （修正有）【課題】スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法及びその装置の提供。【解決手段】下層チャンバー１と上層チャンバー４から構成されているスフェロイド１２の特定部位に対する培養条件制御デバイス８を用いて、最初にデバイス８に培養液１１Ａを導入し、スフェロイド１２を上層チャンバー４の中に入れ、少量の培養液１１Ａを上層チャンバー４側に足し、その後、上下層チャンバー１，４間の培養液１１Ａの流れによってスフェロイド１２が移動し、スフェロイド１２が上層チャンバー４の底に形成された孔７に固定され、スフェロイド１２が固定された後に、異なる培養液１１を下層チャンバー１の片側からピペット（１３）で流し込み、下層チャンバー１の反対側からアスピレーター（１４）で吸い続けることで、下層チャンバー１内の培養液１１Ａを置き換えるスフェロイド１２の特定部位に対する培養条件制御方法及びその装置。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下層チャンバーと上層チャンバーから構成されているスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイスを用いて、最初に前記デバイスに培養液を導入し、スフェロイドを前記上層チャンバーの中に入れ、少量の前記培養液を前記上層チャンバー側に足し、その後、前記上下層チャンバー間の前記培養液の流れによって前記スフェロイドが移動し、前記スフェロイドが前記上層チャンバーの底に形成された孔に固定され、前記スフェロイドが固定された後に、異なる培養液を前記下層チャンバーの片側からピペットで流し込み、前記下層チャンバーの反対側からアスピレーターで吸い続けることで、前記下層チャンバー内の前記培養液を置き換えることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法。
【請求項２】
請求項１記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記下層チャンバー内の培養条件を連続的かつなだらかに変更できることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法。
【請求項３】
請求項１記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記培養液を前記デバイスに導入する際、前記培養液が前記上層チャンバーに少量残るようにすることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法。
【請求項４】
請求項１記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記スフェロイドが多能性幹細胞からなる胚様体であることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法。
【請求項５】
請求項１記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記スフェロイドに対して特定部位に物質を作用させる際に、培養条件を途中で変更する場合にも、コンタミネーションリスクを減らし、スフェロイドに対してダメージを与えずに安定して培養を続けられるようにすることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法。
【請求項６】
下層チャンバーとドーナツ型の上層チャンバーから構成されるスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイスであって、
前記上層チャンバーのウェルの底に貼られたＰＤＭＳの薄膜と、該薄膜に形成された孔とを備え、
前記デバイスに培養液を導入し、スフェロイドを前記上層チャンバーの中に入れ、少量の前記培養液を前記上層チャンバー側に足し、その後、前記上下層チャンバー間の前記培養液の流れによって前記スフェロイドが移動し、前記スフェロイドが前記上層チャンバー底に形成された孔に固定され、前記スフェロイドが固定された後に、異なる培養液を前記下層チャンバーの片側からピペットで流し込み、前記下層チャンバーの反対側からアスピレーターで吸い続けることで、前記下層チャンバー内の前記培養液を置き換えることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置。
【請求項７】
請求項６記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置において、前記下層チャンバー及び上層チャンバーはシリコーンゴムのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作製されており、前記上層チャンバーの前記ウェルの底に貼られた前記ＰＤＭＳの薄膜の厚さが約２０μｍであることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置。
【請求項８】
請求項６記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置において、前記薄膜の孔の直径が１００μｍ〜３ｍｍであることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置。
【請求項９】
請求項６記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置において、前記スフェロイドが多能性幹細胞からなる胚様体であることを特徴とするスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体力学、細胞培養、多能性幹細胞研究などに用いる、スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を利用してさまざまな細胞組織への分化誘導が行われており、先行研究では自己組織化によって細胞が自発的に複雑な構造を形成する例が報告されている（後述の非特許文献１参照）。体内のいくつかの組織では部位特異的な物質分布に反応して形態形成が行われるが、そのような分化現象を分析するには細胞を部位特異的なパターンに従って様々な因子に曝露しなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特願２０１３−１０５８１６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｅｉｒａｋｕ，Ｍ. ，Ｔａｋａｔａ，Ｎ. ，Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｈ. ，Ｋａｗａｄａ，Ｍ. ，Ｓａｋａｋｕｒａ，Ｅ. ，Ｏｋｕｄａ，Ｓ. ，Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ，Ｋ. ，Ａｄａｃｈｉ，Ｔ. ，ａｎｄ  Ｓａｓａｉ、Ｙ. ，“Ｓｅｌｆ−ｏｒｇａｎｉｓｉｎｇ  ｏｐｔｉｃ−ｃｕｐ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ”Ｎａｔｕｒｅ  ４７２，ｐｐ. ５１−５６，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
スフェロイドの特定部位に異なる物質を作用させる方法として、
（１）マイクロ流路内に形成した多層流に曝露する方法
（２）ゲルに埋包したあとにゲルの外側から液性因子を導入して作用させる方法等が提案されてきたが、長期的に同じ濃度で物質を作用させ得るような実験には不十分であった。
【０００６】
そこで、本出願人は、長期的な培養の際でも、一定濃度の物質をスフェロイドに対して部位特異的に作用させることができるインサート型デバイスを開発した。このデバイスは、カルチャーインサート底面の薄膜に形成した孔をふさぐように静水圧によってスフェロイドを固定し, 膜の上下で異なる培養条件で培養を行うというものである（上記特許文献１参照）。
【０００７】
この方法は従来のインサートを筐体とするために、汎用性が高い反面、操作時のコンタミネーションのリスクが高いこと、また培養条件を途中で変更しようとする際には急激な変更しか行えないこと、液面の急激な変動による細胞への物理的な衝撃が大きいことなどの問題があった。
【０００８】
本発明は、上記状況に鑑みて、スフェロイドの特定部位に物質を作用させる際に、培養条件を途中で変更する場合にも、コンタミネーションリスクを減らし、スフェロイドに対してダメージを与えずに長時間安定して培養を続けられるようにすることができる、スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法及びその装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、下層チャンバー（１）と上層チャンバー（４）から構成されているスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（８）を用いて、最初に前記デバイス（８）に培養液（１１Ａ）を導入し、スフェロイド（１２）を前記上層チャンバー（４）の中に入れ、少量の前記培養液（１１Ａ）を前記上層チャンバー（４）側に足し、その後、前記上下層チャンバー（１，４）間の前記培養液（１１Ａ）の流れによって前記スフェロイド（１２）が移動し、前記スフェロイド（１２）が前記上層チャンバー（４）の底に形成された孔（７）に固定され、前記スフェロイド（１２）が固定された後に、異なる培養液（１１Ｂ）を前記下層チャンバー（１）の片側からピペット（１３）で流し込み、前記下層チャンバー（１）の反対側からアスピレーター（１４）で吸い続けることで、前記下層チャンバー（１）内の前記培養液を置き換えることを特徴とする。
【００１０】
〔２〕上記〔１〕記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記下層チャンバー（１）内の培養条件を連続的かつなだらかに変更できることを特徴とする。
【００１１】
〔３〕上記〔１〕記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記培養液（１１Ａ）を前記デバイスに導入する際、前記培養液（１１Ａ）が前記上層チャンバーに少量残るようにすることを特徴とする。
【００１２】
〔４〕上記〔１〕記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記スフェロイドが多能性幹細胞からなる胚様体であることを特徴とする。
【００１３】
〔５〕上記〔１〕記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法において、前記スフェロイドに対して特定部位に異なる物質を作用させる際に、培養条件を途中で変更する場合にも、コンタミネーションリスクを減らし、スフェロイドに対してダメージを与えずに安定して培養を続けられるようにすることを特徴とする。
【００１４】
〔６〕スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置において、下層チャンバー（１）とドーナツ型の上層チャンバー（４）から構成されるスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（８）であって、前記上層チャンバーのウェルの底に貼られたＰＤＭＳの薄膜（６）と、この薄膜に形成された孔とを備え、前記デバイス（８）に培養液（１１Ａ）を導入し、スフェロイド（１２）を前記上層チャンバー（４）中に入れ、少量の前記培養液（１１Ａ）を前記上層チャンバー（４）側に足し、その後、前記上下層チャンバー（１，４）間の前記培養液（１１Ａ）の流れによって前記スフェロイド（１２）が移動し、前記スフェロイド（１２）が前記上層チャンバー（４）の底に形成された孔（７）に固定され、前記スフェロイド（１２）が固定された後に、異なる培養液（１１Ｂ）を前記下層チャンバー（１）の片側からピペット（１３）で流し込み、前記下層チャンバー（１）の反対側からアスピレーター（１４）で吸い続けることで、前記下層チャンバー（１）内の前記培養液を置き換えることを特徴とする。
【００１５】
〔７〕上記〔６〕記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置において、前記下層チャンバー（１）及び上層チャンバー（４）はシリコーンゴムのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で作製されており、前記上層チャンバー（４）の前記ウェル（５）の底に貼られた前記ＰＤＭＳの薄膜（６）の厚さが約２０μｍであることを特徴とする。
【００１６】
〔８〕上記〔６〕記載のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御装置において、前記薄膜の孔（７）の直径が１００μｍ〜３ｍｍであることを特徴とする。
【００１７】
〔９〕上記〔６〕記載のスフェロイドの部位の培養条件制御装置において、前記スフェロイドが多能性幹細胞からなる胚様体であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、スフェロイドの特定部位に物質を作用させる際に、培養条件を途中で変更する場合にも、コンタミネーションリスクを減らし、スフェロイドに対してダメージを与えずに安定して培養を続けられるようにすることができる。  
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の実施例を示すスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）の下層チャンバーの構成図である。
【図２】本発明の実施例を示すスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）のドーナツ型の上層チャンバーの構成図である。
【図３】本発明の実施例を示す下層チャンバー上に上層チャンバーが組み合わされたスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）を示す図である。
【図４】本発明の実施例を示すスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）に培養液と細胞のスフェロイドが満たされた様子を示す斜視図である。
【図５】本発明の実施例を示す下層チャンバー内の培養液を換える様子を示す斜視図である。
【図６】本発明のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御プロセスを示す断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法は、下層チャンバー１と上層チャンバー４から構成されているスフェロイド１２の特定部位に対する培養条件制御デバイス８を用いて、最初に前記デバイス８に培養液１１Ａを導入し、スフェロイド１２を前記上層チャンバー４の中に入れ、少量の前記培養液１１Ａを前記上層チャンバー４側に足し、その後、前記上下層チャンバー間の前記培養液１１Ａの流れによって前記スフェロイド１２が移動し、前記スフェロイド１２が前記上層チャンバー４の底に形成された孔７に固定され、前記スフェロイド１２が固定された後に、異なる培養液１１Ｂを前記下層チャンバー１に片側からピペット１３で流し込み、前記下層チャンバー１の反対側からアスピレーター１４で吸い続けることで、下層チャンバー１内の前記培養液を置き換える。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００２２】
図１は本発明の実施例を示すスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）の下層チャンバーの構成図であり、図１（ａ）はその平面図、図１（ｂ）はその斜視図、図２は本発明の実施例を示すスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）のドーナツ型の上層チャンバーの構成図であり、図２（ａ）はその平面図、図２（ｂ）はその斜視図、図３は本発明の実施例を示す下層チャンバー上に上層チャンバーが組み合わされたスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）を示す図、図４は本発明の実施例を示すスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）に培養液と細胞のスフェロイドが満たされた様子を示す斜視図、図５は本発明の実施例を示す下層チャンバー内の培養液を換える様子を示す斜視図である。
【００２３】
本発明のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）８は、下層チャンバー１とドーナツ型の上層チャンバー４から構成されている。上下層チャンバー１，４はシリコーンゴムのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で製作されており、それぞれ図１、図２に示したようなウェル２, ５が形成されている。上層チャンバー４のウェル５の底には厚さ約２０μｍのＰＤＭＳの薄膜６が貼られている。その薄膜６には孔７が形成されている。なお、孔７の直径は具体的には１００μｍ以上であり、培養するスフェロイド１２のサイズにより変動するが、好適には１００μｍ〜３ｍｍ、さらに好適には１００μｍ〜５００μｍである。
【００２４】
培養時には図４に示すように、上層チャンバー４内にスフェロイド１２が配置されており、上層チャンバー４と下層チャンバー１には培養液１１（ここでは、最初の培養液１１Ａ）が満たされている。スフェロイド１２の特定部位に対する培養条件を変更する場合には、図５に示すように下層チャンバー１へ異なる培養液１１Ｂを導入する。その詳細を図６で説明する。
【００２５】
図６は本発明のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御プロセスを示す断面図である。
【００２６】
まず、培養液を入れていない状態〔図６（ａ）参照〕のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）８に対して、上層チャンバー４から培養液１１Ａを入れると、孔７を通して培養液１１Ａは下層チャンバー１へも流れ込み、下層チャンバー１が満たされる。このとき、上層チャンバー４も全て満たすのではなく、上層チャンバー４には少し培養液１１Ａが残るようにする〔図６（ｂ）参照〕。次いで、スフェロイド（ここでは多能性幹細胞の集合体である胚様体）１２を入れ、少量の培養液１１Ａを上層チャンバー４に足すと、スフェロイド１２は直ぐに孔７上に固定される〔図６（ｃ）参照〕。次いで、下層チャンバー１の培養液１１Ａをアスピレーター１４で吸いながら異なる培養液１１Ｂをピペット１３で入れていく〔図６（ｄ）参照〕。下層チャンバー１の片側からピペット１３で培養液（１１Ｂ）を入れると、図６（ｅ）のように反対側では培養液１１Ａの表面張力によって培養液１１Ａの表面が球面状に高くなってくるので、この球面部分をアスピレーター１４で吸い取るようにしてもよい〔図６（ｆ）参照〕。この作業を繰り返すことで、下層チャンバー１内を異なる培地に交換することができる。
【００２７】
このように、使用方法として、図６に示すように、最初にデバイス８に培養液１１Ａを導入する。次に、細胞のスフェロイド１２を上層チャンバー４の中に入れ、少しの培養液１１Ａを上層側に足す。すると、上下チャンバー１，４間の培養液１１Ａの流れによってスフェロイド１２が移動し、スフェロイド１２が孔７に固定される。スフェロイド１２が固定された後に、異なる培養液１１Ｂを下層チャンバー１にピペット１３で流し込み、反対側からアスピレーター１４で吸い続けることで、下層チャンバー１内の培養液を換えることができる。
【００２８】
従来のインサート型デバイスでは、下層チャンバーに対応する部分の培養条件を変更するためには、インサートを他のウェルに移し替える必要があったため、操作時にコンタミネーションが起こるリスクや液面が急激に動くことによる細胞への影響などを回避することが難しかった。これに対して、本発明では、スフェロイドが固定された上層チャンバーを移動させることなく、下層チャンバーの培養条件を変更することが可能であるため、それらを回避することが可能である。さらに下層チャンバー内の培養条件を連続的かつなだらかに変更することもできる。
【００２９】
すなわち、
（１）スフェロイド（胚様体）の特定部位に対して物質を作用させる実験を行う際に、コンタミネーションのリスクを減らし、細胞にダメージを与えずに安定して培養を続けられる。
（２）スフェロイド（胚様体）の特定部位の培養条件を時間的に連続かつなだらかに変化させることができる。
【００３０】
なお、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、スフェロイド（多能性幹細胞の集合体である胚様体）に対して特定の部位に物質を作用させる際に、培養条件を途中で変更する場合にも、コンタミネーションのリスクを減らしつつ安定的にスフェロイド（胚様体）の特定部位に異なる物質を作用させることができるため、さらに複雑な組織を体外で誘導しうるようなスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御方法及びその装置として利用できる。
【００３２】
また、実際に、多能性幹細胞から形成されるスフェロイドである胚様体に対して実験を行ったところ、部位特異的に異なる分化状態を誘導できることを確認できている。
【００３３】
本発明のスフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス（装置）内で神経系等の形成を再現するなどさらに複雑な組織形成を試みることによって、胎児の先天異常などが再現可能になれば、治療薬開発のためのスクリーニングなどへの応用が考えられる。
【符号の説明】
【００３４】
１    下層チャンバー
２，５    ウェル
６    薄膜
４    上層チャンバー
７    孔
８    スフェロイドの特定部位に対する培養条件制御デバイス
１１、１１Ａ、１１Ｂ    培養液
１２    スフェロイド
１３    ピペット
１４    アスピレーター
【図１】
2016096740.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2016096740.tif 000007
【図６】
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