(57)【要約】      （修正有）【課題】切断型グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーター及び改変Ｂ型肝炎ウイルス（HBV） Sタンパク質遺伝子を含む組換えポリヌクレオチド並びに該組換えポリヌクレオチドを有するトランスジェニックフラムリナ・ベルティペス(エノキタケ)の提供。【解決手段】特定の配列から選択されるヌクレオチド配列を有するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーター及び特定のヌクレオチド配列を有する改変HBV Sタンパク質遺伝子を含む、組換えポリヌクレオチド。【効果】トランスジェニックフラムリナ・ベルティペスを対象に投与後、対象がHBVに対する抗体の産生に成功できることを見出した。したがって、トランスジェニックフラムリナ・ベルティペスは、HBVに対するワクチンとして使用可能。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1から選択されるヌクレオチド配列を有するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーターおよび配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する改変HBV Sタンパク質遺伝子を含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
フラムリナ属(Flammulina)、アガリクス属(Agaricus)、プレウロタス属(Pleurotus)またはレンチヌラ属(Lentinula)において発現される、請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
フラムリナ・ベルティペス(Flammulina velutipes)、プレウロタス・オストレアタス(ヒラタケ)(Pleurotus ostreatus)、プレウロタス・プルモナリウス(ウスヒラタケ)(Pleurotus pulmonarius)またはプレウロタス・ポプリヌス(Pleurotus populinus)において発現される、請求項1に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項1に記載の組換えポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
キノコプラスミドを含む、請求項4に記載のベクター。
【請求項６】
前記プラスミドがpCAMBIA-0390である、請求項5に記載のベクター。
【請求項７】
pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001である、請求項5に記載のベクター。
【請求項８】
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)に寄託番号DSM 27789で寄託されているトランスジェニックF.ベルティペス。
【請求項９】
配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する切断型gpdプロモーターおよび配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する改変HBV Sタンパク質遺伝子を含む、請求項8に記載の組換えF.ベルティペス。
【請求項１０】
請求項9に規定するトランスジェニックF.ベルティペスを含む、ワクチン組成物。
【請求項１１】
医薬または食品として使用される、請求項10に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
トランスジェニックフラムリナ・ベルティペスの用量が、体重1kg当たりトランスジェニックF.ベルティペス2.0gから200g乾燥重量の範囲である、請求項11に記載のワクチン組成物。
【請求項１３】
鼻腔内、スプレーにより、静脈内、皮内、皮下、経口、エアロゾルにより、または筋肉内に投与される、請求項10に記載のワクチン組成物。
【請求項１４】
アジュバントまたは免疫増強剤もしくは刺激剤をさらに含む、請求項10に記載のワクチン組成物。
【請求項１５】
経口剤形である、請求項10に記載のワクチン組成物。
【請求項１６】
請求項9に規定するトランスジェニックF.ベルティペスの菌糸または子実体を含む、請求項10に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えポリヌクレオチドおよび該組換えポリヌクレオチドを有するトランスジェニックフラムリナ・ベルティペス(エノキタケ)(Flammulina velutipes)に関する。特に、本発明の組換えポリヌクレオチドは、切断型グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーターおよびスモールHBV表面タンパク質(SHB)またはHBV表面抗原(HBsAg)としても知られる改変B型肝炎ウイルス(HBV)Sタンパク質遺伝子を含み、それを有するトランスジェニックF.ベルティペス(F.velutipes)は、HBV感染症に対するワクチンとして使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
HBVは肝臓に感染し、ウイルス性肝炎と一般的に称される炎症を引き起こす。この疾患は、特定の集団、例えば中国およびアジアの他の地域に特有である。世界人口の約三分の一、24億人を超える人々がこれまでにHBVに感染している。HBV感染症は、急性(別の言い方では自然治癒性(self-limiting)として知られる)、または慢性(別の言い方では長期性として知られる)のいずれかであり得る。HBVによる急性感染症は、急性ウイルス性肝炎を伴い、全身の健康障害、食欲不振、吐き気、嘔吐、身体の痛み、微熱、暗色尿により始まり、その後黄疸の発症へと進行する病気である。この病気は、数週間持続し、その後罹患した人々の大部分において徐々に回復する。少数の患者はより重度の肝臓疾患(劇症肝不全)を有することがあり、その結果として死に至ることがある。この感染症は、完全に無症候性であり、認識されずに進行する可能性がある。HBVによる慢性感染症は、無症候性であるか、または肝臓の慢性炎症、慢性肝炎を伴い、数年にわたって肝硬変につながるかのいずれかであると思われる。このタイプの感染症は、肝細胞癌の発生率を劇的に増加させる。アルコールは肝硬変および癌の危険性を増加させるので、慢性キャリアはアルコールの摂取を差し控えることが奨励される。HBVの治療に承認された薬物としては、ラミブジン、アデフォビル、テノフォビル、テルビブジンおよびエンテカビルが挙げられる。しかし、薬剤耐性は、HBV遺伝子の突然変異の観点において薬剤治療の主要な問題である。
【０００３】
HBVは、ヘパドナウイルス科(Hepadnaviridae)、肝臓親和性DNAウイルスの一群に属する。HBVは血液媒介ウイルスであり、小型の部分的に二本鎖のDNAゲノムを含み、このDNAゲノムは4つの広範囲にオーバーラップしたオープンリーディングフレームを有し、HBV表面抗原(「HBsAg」)を含有する膜性エンベロープにより囲まれた、HBVコアタンパク質(「HBcAg」)、ウイルスポリメラーゼおよびウイルスDNAを含む内部ヌクレオカプシドからなる。ウイルスエンベロープは、3種の、異なるが関連する表面抗原タンパク質であるラージ(L)、ミディアム(M)およびスモール(S)を含有し、これらは、共通のカルボキシ末端領域を共有しているが、異なるアミノ末端を有し、連続するオープンリーディングフレーム内の異なる点における開始トリプレットの可変使用から生じる。
【０００４】
米国特許出願公開番号第20060159705号は、ワクチンに使用するために適切なHBV抗原の作製方法であって、システインの存在下における、該抗原の、このような抗原を含むワクチンへの精製を含む方法を提供する。米国特許出願公開番号第20070280962号は、複数の免疫原特異性により特徴付けられるHBVコア抗原粒子を提供する。米国特許出願公開番号第20110165194号は、B型肝炎ウイルス表面抗原のLタンパク質、Mタンパク質およびSタンパク質遺伝子すべてを含み、作製された抗原がウイルス様粒子を形成するHBVワクチンならびに全表面抗原に加えてHBVコア抗原をさらに含む複数抗原ワクチンならびにこれらの調製方法に関する。多数のHBVワクチンが開示されているが、これらのワクチンの大部分は注射により投与され、医療技術者および高いコストを必要とする。経口ワクチンは投与においてより簡便であり、したがって、広範囲に適用してHBV感染症を減らすことができる。
【０００５】
分子製薬農業(molecular pharming)は、酵素、ワクチン、抗体、ホルモンなどを含むさまざまな医薬タンパク質の作製において大きな注目を集めており、Liz Richterら、Nat Biotechnol.2000年11月;18(11):1167-71頁は、タバコの葉およびジャガイモの塊茎を使用して経口HBVワクチンを作製している。食用キノコは、組換えタンパク質の作製、特に食用ワクチンの開発に適した宿主とみなされている。Arakawaらは、ジャガイモの葉および塊茎、タバコの葉、トマト、レタスおよびコメを使用してコレラワクチンを作製している。しかし、トランスジェニック植物は開放環境に植えられ、したがってトランスジェニック植物をタンパク質作製に使用することは、健康および環境に影響を与える可能性がある。分子製薬農業へのキノコの使用は、完全な複製、急速成長、管理された条件下での拡大規模での作製および遺伝子汚染の低減を含む、特有の利益とともに植物ベースの系のすべての有利性を有する。米国特許出願公開番号第20140123345号は、切断型グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターおよび異種性の転写可能ポリヌクレオチド分子に作動可能に連結された本発明のプロモーターを含む構築体および該構築体を含むキノコを提供する。しかし、この先行技術特許出願は、キノコ中の発現可能な切断型グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを提供するだけであり、広範な調査研究および分子製薬農業としてキノコを使用する目的を達成するための技術的問題の克服が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開番号第20060159705号
【特許文献２】米国特許出願公開番号第20070280962号
【特許文献３】米国特許出願公開番号第20110165194号
【特許文献４】米国特許出願公開番号第20140123345号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Liz Richterら、Nat Biotechnol.2000年11月;18(11):1167-71頁
【非特許文献２】GanemおよびSchneiderのHepadnaviridae (2001年)  「The viruses and their replication」  (2923-2969頁)
【非特許文献３】Knipe D Mら編、Fields Virology、第4版Philadelphia、  Lippincott Williams & Wilkins
【非特許文献４】Mamum-Al Mahtabら、2008年、Hepatobiliary Pancrease Dis Int 5:457
【非特許文献５】Schaeffer、2007年、World Gastroenterol.7:14
【非特許文献６】Norderら、1993年、J.Gen Virol.74:1341
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列を有するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーターおよび配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する改変HBV Sタンパク質遺伝子を含む、組換えポリヌクレオチドを提供する。一実施形態において、本発明の組換えポリヌクレオチドは、キノコにおいて発現可能である。ある実施形態において、キノコは、フラムリナ属(Flammulina)、アガリクス属(Agaricus)、プレウロタス属(Pleurotus)またはレンチヌラ属(Lentinula);より好ましくは、F.ベルティペス(F.velutipes)、プレウロタス・オストレアタス(ヒラタケ)(Pleurotus ostreatus)、プレウロタス・プルモナリウス(ウスヒラタケ)(Pleurotus pulmonarius)またはプレウロタス・ポプリヌス(Pleurotus populinus);最も好ましくは、F.ベルティペスである。
【０００９】
本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供する。一実施形態において、ベクターはキノコプラスミドを含み、好ましくは、該プラスミドはpCAMBIA-0390である。一実施形態において、ベクターはpCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001である。
【００１０】
本発明は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託番号DSM27789で寄託されているトランスジェニックF.ベルティペスもまた提供する。本発明のトランスジェニックF.ベルティペスは、配列番号1に示されるヌクレオチド配列を有する切断型gpdプロモーターおよび配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する改変HBV Sタンパク質遺伝子を含む。
【００１１】
本発明は、本発明のトランスジェニックF.ベルティペスを含むワクチン組成物をさらに提供する。一実施形態において、ワクチン組成物は、医薬または食品として使用可能である。一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、医薬または食品として使用可能である。一実施形態において、ワクチン組成物は、本発明のトランスジェニックF.ベルティペスの菌糸または子実体を含む。一実施形態において、ワクチン組成物は、鼻腔内、スプレーにより、静脈内、皮内、皮下、経口、エアロゾルにより、または筋肉内に投与される。別の実施形態において、トランスジェニックF.ベルティペスの用量は、体重1kg当たりトランスジェニックF.ベルティペス2.0gから10g乾燥重量の範囲である。さらなる実施形態において、ワクチン組成物は、アジュバントまたは免疫増強剤もしくは刺激剤をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】mHBsAgの合成手順を示す図である。
【図２】ベクターpCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001のマップを示す図である。
【図３】PCRによるトランスジェニックF.ベルティペスのmHBsAg遺伝子検出を示す図である。レーンP:プラスミドpCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001を使用した陽性対照;レーンM:DNAマーカー;レーンWT:F.ベルティペス野生型。
【図４】ウェスタンブロットアッセイによるトランスジェニックF.ベルティペスのHBsAgタンパク質検出を示す図である。レーンP:Abcamから購入した市販のHBsAgタンパク質を使用した陽性対照;レーンM:タンパク質マーカー;レーンWT:F.ベルティペス野生型。
【図５】トランスジェニックF.ベルティペスの菌糸を投与されたブタにおいて産生された、HB抗体の力価を示す図である。
【図６】トランスジェニックF.ベルティペスの子実体を投与されたブタにおいて産生された、HB抗体の力価を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、切断型グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーターおよび改変HBV Sタンパク質遺伝子を含む組換えポリヌクレオチドならびに該組換えポリヌクレオチドを有するトランスジェニックF.ベルティペスを作製する。本発明は、驚くべきことに、トランスジェニックF.ベルティペスを対象に投与後、対象がHBVに対する抗体の産生に成功できることを見出した。したがって、トランスジェニックF.ベルティペスは、HBVに対するワクチンとして使用可能である。
【００１４】
実施形態に関する下記の記述は、単なる例示であり、本発明を実行に移すために必要な特徴の組み合わせを限定するものではない。記載されている見出しは、本発明のさまざまな実施形態を限定する意味のものではない。「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(comprise)」、「含む(includes)」、「含む(including)」および「含む(include)」などの用語は、限定を意味するものではない。加えて、単数形(a/an)の使用は複数形を含み、「または」は特に明示されない限り「および/または」を意味する。本明細書において特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１５】
本明細書において使用する場合、「HBV」および「B型肝炎ウイルス」という用語は交換可能に使用され、ヘパドナウイルス科の任意のメンバーを指す(例えば、GanemおよびSchneiderのHepadnaviridae (2001年)「The viruses and their replication」(2923-2969頁)、Knipe D Mら編、Fields Virology、第4版Philadelphia、Lippincott Williams & Wilkinsまたは後続版を参照されたい)。広範囲な系統発生学的分析により、B型肝炎ウイルスの8種の主要な遺伝子型(AからH)への分類が導かれ、少なくとも8%の配列分散が示される。さまざまなHBV遺伝子型は、異なる地理的分布を示し、異種性疾患症状および/または臨床成績を表し得る。さまざまなHBVは、HBsAg関連血清学と関係して、9種の異なるサブタイプ(ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq+およびadqr-)に分類される(Mamum-Al Mahtabら、2008年、Hepatobiliary Pancrease Dis Int 5:457;Schaeffer、2007年、World Gastroenterol.7:14;Norderら、1993年、J.Gen Virol.74:1341による総説を参照されたい)。各遺伝子型および血清型は、異なるHBV株および単離株を包含する。単離株は、HBVの特定の供給源(例えば、親試料または他の生物学的HBVリザーバー)から単離された特定ウイルスに対応し、一方、株は、ゲノム配列に関して互いに非常に近いさまざまな単離株を包含する。
【００１６】
本明細書において使用する場合、「ベクター」という用語は、発現および非発現のベクター両方を指し、ウイルス性および非ウイルス性のスベクターを含み、染色体外ベクター(例えば、マルチコピープラスミド)および宿主染色体内に組み込まれるように設計された組込み型ベクターを含む。本発明に関連して、ウイルスゲノム中の核酸分子を移入するためのベクター(いわゆる遺伝子移入ベクター)、免疫療法に使用するためのベクター(すなわち、宿主生物に核酸分子を送達可能なベクター)ならびにさまざまな発現系または宿主生物において使用するための発現ベクターが、特に重要である。
【００１７】
本明細書において使用する場合、「作動可能に連結された」という用語は、物理的または機能的に関連する2つの核酸配列を指す。例えば、2つの配列が作動可能に連結されている、またはレギュレーターDNA配列が、コーディングまたは構造DNA配列の発現レベルに影響を与えるように位置づけられている場合、プロモーターまたは制御DNA配列は、RNAまたはタンパク質をコードするDNA配列「を伴う」と言われる。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「ポリヌクレオチド構築体」という語句は、任意の供給源に由来し、ゲノムの組込みまたは自己複製が可能であり、1または複数のポリヌクレオチド分子が機能的に作動可能な様式で連結されているポリヌクレオチド分子を含む、任意の組換えポリヌクレオチド分子、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、ファージまたは線状もしくは環状の一本鎖もしくは二本鎖のDNAもしくはRNAポリヌクレオチド分子を指す。「ポリヌクレオチド構築体」および「構築体」という用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「形質転換された」という用語は、外来ポリヌクレオチド分子、例えば構築体が導入された細胞、組織、器官または生物を指す。好ましくは、導入されたポリヌクレオチド分子は、レシピエントの細胞、組織、器官または生物のゲノムDNA内に、導入されたポリヌクレオチド分子が、後続の子孫により受け継がれるように組み込まれる。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「発現」という用語は、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾および分泌を含む、ポリペプチドの産生に関連する任意のステップを含む。
【００２１】
一態様において、本発明は、配列番号1から選択されるヌクレオチド配列を有するグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(gpd)プロモーターおよび配列番号2に示されるヌクレオチド配列を有する改変HBV Sタンパク質遺伝子を含む、組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００２２】
配列番号1の配列およびそれらの作製は、本明細書にその全体が組み込まれる米国特許出願公開番号第20140123345号を参照する。配列番号1および2の配列を下記に挙げる。
配列番号1
1 GCATTACTTC GCTCTACGAT GAGGTTTTGC ACAGAACCTT AGGTCGGGTG TCGGGCCCCT
61 GCTGACCCGA GCTACTTAAT ACTTTCTTTC CTTCGACTTT GCTCAAACTT AAACGAGAGT
121 AAGTACCGGT TCTGACAGTC ACTCAATATT CGTCTGATGC TCTCTCGGGG GAAATCTCTC
181 TCCAACGACC ATTCTTTATT ATCTGAAGCT GGTTGTCTTC GATCGAGTAT ACGACGTCCT
241 GGGGCTTGTC TTAGTCTCAC GAAGGCCGAC TCTATCGCTC TAGGACTCGC TTGATATAGA
301 TGTGCGTAAC TTTAAGTGAG CTCGTATTCA TCTTATTCCA TTCCCATTGA GTCGTGGGTC
361 CAGCATTTTG TTCGAGAGAG TCAAGACTCG AGGATACCGC TAGTCGCCTG TGGTCTGGAT
421 CGTTCCTTCT ATGTTCGGTG TCTGGAGCAT GGCCTTTCTA GACTCTTGGC TGGTACTGGA
481 CGACCAATCA CGAGGTGCCT GTGGCGCACA TTATGGCTCT CCGTGTGCTC CAGCCAATTA
541 GGTTCCGGGG AGGGGTTATG CATTAGAAAC GATCTGTTCA TCTGAAAGGT GGTATCGCGT
601 TTGTTGTGTG GATGACCACC CTAGATGAGG CCTGGATGAT ACTGCCTTAA AATTGGAGGC
661 GCGTCCAGGG CGCGTCGTTC TCCGAGTCTG TTCCGCTGAT GAATTTTGCC TGCTCGACAT
721 CGTTTCTGCG GACATGCGAT CGACGAGATC TTTGCGTTAG ACGCCGTTGG GAAGGGACTC
781 GGAGGTGGGT TTAGACCTGC GTGGTAGAAG AATGGGACGA GTATATGAGT AGAGTACCGC
841 GTCGATACCG CGTAACCGTG CATGTGCTAC TACTCCTTGA CCGCTGATTG GTTGCGAACT
901 CGACATGATC TAGGTCGTCC TCGTCTGGAC TCCTAATCAA GAGAGACAAG AGAATGGTTG
961 AGGAGCTGCT CAAATTTTGG CGGATAACGT CGTCGGTATC CTATGAATCT ACGTTGTGTA
1021 TCTCTAATGC TTTGTACGTC TTTGACGCGG TAAGAATTTA GGACGGAATG CAGACGAAAT
1081 GACAGCGATG ACGTAACATC CGATTATCAG CGCGACAGTA TAAAAGGCGC AGAATTTTGA
1141 CATCTCTCCT TTCTGCAACC GCCATCTTCC TCACTTCAAT CTCTTTACCA TCTCCTCATC
1201 TACAA
配列番号2
1 ATGGAGAACA TCACATCCGG ATTTCTCGGA CCGCTGCTCG TGCTTCAAGC TGGGTTCTTC
61 TTGTTGACGA GAATCCTCAC GATCCCGCAA TCCCTCGACT CGTGGTGGAC TTCTCTCAAC
121 TTTCTCGGTG GCACGACCGT TTGCCTGGGC CAGAATTCGC AAAGTCCAAC CTCCAATCAC
181 TCGCCAACCT CTTGTCCTCC GACTTGTCCT GGGTATCGCT GGATGTGCCT GCGCCGTTTC
241 ATCATCTTTC TCTTCATTCT GCTGCTCTGC CTCATCTTCT TGTTGGTGCT GCTGGACTAT 301 CAAGGCATGT TGCCCGTCTG TCCTCTCATT CCTGGATCCT CCACGACCTC TACGGGACCC
361 TGCCGCACCT GCATGACGAC GGCGCAAGGC ACCTCCATGT ATCCCTCCTG CTGCTGTACC
421 AAACCTTCGG ATGGGAACTG CACCTGCATT CCCATCCCAT CCTCCTGGGC TTTCGGGAAA
481 TTCCTCTGGG AATGGGCCTC CGCCCGTTTC TCCTGGCTCT CTCTCCTCGT GCCATTTGTT
541 CAATGGTTTG TCGGACTGTC TCCCACTGTT TGGCTGTCCG TGATCTGGAT GATGTGGTAC
601 TGGGGACCAA GTCTGTACAG CATCTTGAGT CCCTTTCTCC CGCTGCTCCC GATCTTCTTC
661 TGCCTTTGGG TCTACATTGC TAGTCATGAT GAACTGTAA
【００２３】
本発明に使用されるmHBsAgは、HBV Sタンパク質遺伝子から、キノコにおいて発現可能なように改変される。HBV Sタンパク質は、免疫応答を誘導する抗原として使用可能である。真のHBV表面抗原は、慢性HBVキャリアの血漿から、P24およびそのグリコシル化誘導体GP27として公知の2つのタンパク質から構成される約22nmの粒子として回収可能であり、これらは両方とも、Sタンパク質コーディング配列またはHBV S-遺伝子として公知のHBVゲノム上の226アミノ酸のコード配列によりコードされる。本発明は、HBV Sタンパク質遺伝子を改変し、驚くべきことに、配列番号2に示される改変配列が、キノコ、好ましくはフラムリナ属、アガリクス属、プレウロタス属またはレンチヌラ属;より好ましくは、F.ベルティペス、プレウロタス・オストレアタス(ヒラタケ)、プレウロタス・プルモナリウス(ウスヒラタケ)およびプレウロタス・ポプリヌス;最も好ましくは、フラムリナ.ベルティペスにおいて発現されるために最適であることを見出した。
【００２４】
本発明において、gpdプロモーターは、mHBsAgに、好ましくはポリヌクレオチド分子の3'転写末端に作動可能に連結される。組換えポリヌクレオチドは、追加の制御ポリヌクレオチド分子を含んでもよく、この制御ポリヌクレオチド分子は、限定するものではないが、翻訳開始において重要な役割を果たすことができ、キノコ発現構築体において遺伝要素でもあり得るmRNAポリヌクレオチド分子の5'非翻訳領域(5'UTR)を含む。これらの追加の上流および下流制御ポリヌクレオチド分子は、プロモーター構築体に存在する他の要素に関して、天然または異種性である供給源に由来することができる。
【００２５】
一態様において、本発明は、本発明の組換えポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。非常にさまざまな発現系が、本発明のベクターとして使用可能である。このようなベクターとしては、特に、染色体、エピソームおよびウイルスに由来するベクター、例えば、さまざまなキノコプラスミドに由来するベクター、細菌プラスミドに由来するベクター、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス、例えばバキュロウイルス、SV40などのパポバウイルス、ワクチニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスに由来するベクターならびにこれらの組み合わせに由来するベクター、例えば、コスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するベクターが挙げられる。発現系ベクターは、発現を制御および発生させる調節領域を含有してもよい。一般的に、宿主細胞において、ポリヌクレオチドを維持、伝播または発現させる、および/または組換えポリヌクレオチドを発現させるために適切な任意の系またはベクターは、この点に関して発現に使用することができる。適切なDNA配列は、さまざまな周知の常法に従う技術のいずれか、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manualに記載の技術によって、発現系に挿入することができる。好ましくは、ベクターはpCAMBIA-0390を含有し、より好ましくは、ベクターは、pCAMBIA-0390-MM-Fv-B-001である。
【００２６】
一態様において、本発明は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに、寄託番号DSM27789で寄託されているトランスジェニックF.ベルティペスを提供する。トランスジェニックF.ベルティペスを含有する寄託は、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh (本明細書において(「DSMZ」)、Inhoffenstrasse 7B 38124 Braunschweig Germanyに2013年9月25日に寄託され、寄託番号27789を割り当てられた。
【００２７】
寄託されている株は、配列番号2に示されるヌクレオチド配列およびgpdプロモーター(配列番号1)を有する改変されたスモールHBV表面タンパク質遺伝子(mHBsAg)を含有する。本明細書における配列の任意の記載と矛盾する場合、寄託株に含有されるポリヌクレオチの配列ならびにそれらによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が優先する。
【００２８】
F.ベルティペスの細胞は、本発明の発現ベクターを使用して形質転換させることができ、それによって、上記のように宿主細胞は、本発明の1または複数の組換えポリヌクレオチドにより形質転換される。本発明のプロモーターを含有する形質転換構築体は、F.ベルティペス細胞内に、任意の形質転換方法により導入することができる。本発明の実践においてキノコ発現構築体をキノコゲノムへ導入することによる、キノコを形質転換する方法および材料としては、エレクトロポレーション、アグロバクテリウム媒介性形質転換およびプロトプラスト形質転換を含む、周知の実証された方法を挙げることができる。得られた形質転換されたF.ベルティペス細胞を数世代培養し、次いでHBV抗原を発現可能なF.ベルティペスを得るように選択し、これをDSMZに寄託番号27789により寄託する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、本発明のトランスジェニックF.ベルティペスを含むワクチン組成物を提供する。一実施形態において、本発明のワクチン組成物は、医薬または食品として使用可能である。一実施形態において、ワクチン組成物は、本発明のトランスジェニックF.ベルティペスの菌糸または子実体を含む。
【００３０】
本発明のトランスジェニックF.ベルティペスは、薬学的に許容されるワクチン組成物に一般的に製剤化される。ワクチン組成物は、投与経路に応じて製剤化され、活性抗原性物質に適合する。活性抗原性物質は、例えば、本発明に従った1または複数のトランスジェニックF.ベルティペスである。
【００３１】
投与されるべき本発明のワクチン組成物の有用な投薬量は、ワクチン接種される動物の年齢、体重、投与の様式および経路ならびにワクチン接種が求められる病原体のタイプに依存して変動すると思われる。ワクチンは、免疫応答を惹起するために十分な、任意の用量のトランスジェニックF.ベルティペスを含んでよい。体重1kg当たりトランスジェニックF.ベルティペス2.0gから200g乾燥重量の間の範囲の用量が、適切な用量である。体重1kg当たりトランスジェニックF.ベルティペス3.0gから150g、3.0gから100g、3.0gから50g、3.0gから30g、3.0gから25g、3.0gから20g、3.0gから15g、3.0gから10gまたは3.0gから6.0gの間の用量がより好ましく、体重1kg当たりトランスジェニックF.ベルティペス3.0gから5.5g、3.0gから4.3gまたは4.3gから5.6gがより好ましい。
【００３２】
場合により、アジュバント活性を有する1または複数の化合物をワクチンに加えてもよい。アジュバントは、免疫系の非特異的刺激因子である。アジュバントは、宿主のワクチンに対する免疫応答を強化する。当分野において公知のアジュバントの例は、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ビタミンE、非イオン性ブロックポリマー、MDP(ムラミルジペプチド)、ISCOM(免疫刺激複合体)、サポニン、鉱物油、植物油およびカーボポール(Carbopol)である。場合により、ワクチン組成物は、免疫増強剤または刺激剤(同時投与または連続投与、例えばワクチン接種の前後)を含む。適切な免疫刺激剤は、限定するものではないが、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、リンパ球の細胞培養由来の上清、単球、リンパ系器官由来の細胞、細胞調製物または細胞抽出液(例えば、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)またはリポ多糖類調製物)またはマイトジェンを含む。
【００３３】
一実施形態において、ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体を含んでよい。薬学的に許容される担体は、水程度に単純であってよい。別の適切な担体は、例えば、生理的塩濃度の溶液である。本発明において有用な薬学的に許容される担体、または希釈剤の他の例は、SPGAなどの安定剤、炭水化物(例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン)、アルブミンまたはカゼインなどのタンパク質、ウシ血清またはスキムミルクなどのタンパク質含有物質および緩衝液(例えばリン酸緩衝液)を含む。
【００３４】
動物またはヒトに投与するために、本発明に従ったワクチンは、特に、鼻腔内、スプレーにより、静脈内、皮内、皮下、経口、エアロゾルにより、または筋肉内に与えることができる。簡便という理由により好ましい方法は、スプレーによる投与、鼻腔内投与および経口投与である。
【実施例】
【００３５】
(実施例1)
本発明の組換えポリヌクレオチドを有するベクターの調製
配列番号2に示されるmHBsAg配列を、PCRにより合成する。mHBsAg配列の合成手順を、図1に示す。F.ベルティペス(F.velutipse)のコドン使用頻度の偏りに従って20のプライマー、1から10および1'から10'を設計して、配列番号2の断片を連続して引き続き合成した。配列番号2を、これらの断片をオーバーラップPCRにより組み合わせることによって合成した。
【００３６】
配列番号1を有する切断型グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを、実施例においてFve D1と呼ぶ。6.8kbのサイズのプラスミドpCAMBIA-0390(CAMBIA、Canberra、Australia)は、アグロバクテリウム媒介性形質転換系において使用されるバイナリベクターである。ノパリン合成酵素(NOS)3'UTRポリAシグナルおよびpUC9の多重クローニング部位(MCS)を保有するLBA4404 582bp T-DNAを、25bp LB(左側境界)および25bp RB(右側境界)の間のプラスミド内に構築した。ベクターの骨格は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼを含有し、これは、細菌性選択可能マーカーとして使用される、カナマイシン耐性遺伝子である。
【００３７】
ベクター、pCAMBIA-039-MM-Fv-B001(図2)を、Fve D1含有第1イントロン、mHBsAgおよびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の選択可能マーカーとしてハイグロマイシンB耐性遺伝子(ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、hph)をpCAMBIA-0390のMCSに挿入することによって構築した。この構築体の配列は、シーケンシングにより確認する(Genomics、Taipei)。
【００３８】
DNAマニュピレーションおよびプラスミド保持のための宿主細胞として使用した大腸菌(Escherichia coli)DH5α(GIBCOBRL、Life Technologies、Grand Island、NY、USA)を、ルリア-ベルターニ(Luria-Bertani)(LB;Sigma Chem.Co.、St.Louis、MO、USA)ブロス培地または寒天プレートにおいて、37℃で250rpmにおいて振とうしながら培養した。
【００３９】
pCAMBIA-039-MM-Fv-B001を保有する大腸菌DH5αを、50μg/mlのカナマイシンを含有するLBにおいて37℃で250rpmにおいて振とうしながら16時間培養した。遠心分離を行い、上清を除去後、プラスミドを、プラスミドミニプレップ精製キット(Plasmide miniprep purification kit)(Genemark、Taipei)により抽出した。
【００４０】
LB寒天プレート上のアグロバクテリウム・ツメファシエンスの単一コロニーをピックアップし、3mlのLBブロス培地中に接種し、30℃で250rpmにおいて振とうした。48時間後、1mlのA.ツメファシエンス(A.tumefaciens)溶液を、100mlのLBに加え、次いで上記と同じ条件において一晩培養した。A.ツメファシエンスがOD600値1.5-2.0に成長した時に、細菌溶液を、3000gで4℃において10分間遠心分離にかけた。上清を除去し、細胞堆積物を100mlの4℃滅菌水に再懸濁した。遠心分離および再懸濁の手順を6回繰り返した。最後に、細胞を、400μlの4℃の10%の滅菌グリセロールに再懸濁し、40μl/微小遠心管に分割し、A.ツメファシエンスコンピテント細胞として-80℃において保存した。
【００４１】
2μlのプラスミドを、40μlのA.ツメファシエンスコンピテント細胞に加え、得られた混合物を、氷上で2分間維持し、その後0.2cmのギャップのキュベット(BTX、San Diego、CA、USA)に移した。プラスミドを、その後、A.ツメファシエンス内にエレクトロポレーションにより(コンデンサ:25μF、抵抗:200オーム、電圧:1.25kV/cm、電界強度:12.5kV/cm、パルス時間:5.0ミリ秒)BTX Electro Cell manipulator 630を介して形質転換した。エレクトロポレーション後、400μlのLBを細菌溶液に加え、微小遠心管に入れた。2.5時間後、50μlの溶液を、50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天プレート上に撒き、30℃で48時間培養した。推定A.ツメファシエンス形質転換体を、特異的プライマーによるコロニーPCR分析を介してスクリーニングした。
【００４２】
F.ベルティペスの菌糸を0.2%のトリプトン、0.2%の酵母エキス、1%のマルトースおよび2%のグルコースを含有するCYM寒天またはブロスにおいて25℃で2〜3週間成長させ、維持し、次いで培養した菌糸の寒天プレートを、改変菌糸ペレット(MMP)として、パンチャーにより型抜きした。標的プラスミド保有A.ツメファシエンス株を、24時間、50μg/mlカナマイシン含有LB培地において28℃で250rpmにおいて振とうしながら培養し、その後、F.ベルティペスMMPと、200Mのアセトシリンゴンを含有する誘導培地(IM)中で6時間、23℃において混合した。誘導後、MMPを、続いて新鮮なIM寒天プレートに移し、23℃で3〜6日置いた。次いで、処理したMMPを滅菌水で5回洗浄し、アグロバクテリウムを除去し、30μg/mlハイグロマイシンBおよび200mMのセフォタキシム(MDBio、Taipei、Taiwan)を含有する選択可能な寒天プレートに移し、25℃で2〜3週間、F.ベルティペスのハイグロマイシンB耐性菌糸が出現するまで置いた(IM;下記のTable1(表1)を参照されたい)。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
安定なものを得るために数回継代培養した、F.ベルティペス推定形質転換体のハイグロマイシンB耐性菌糸を、続いてPCR分析を介してスクリーニングし、これをmHBsAgのゲノムへの遺伝子組込みを確認するために使用した。形質転換体のゲノムDNAを、GenomicDNAミニキット(Geneaid、Taipei)により抽出した。PCR産物をゲル電気泳動に供して、特異的mHBsAg断片、0.7kbの出現を確認した。データを図3に示す。選択したトランスジェニックF.ベルティペスを、DSMZに寄託番号27789で寄託した。
【００４５】
(実施例2)
本発明のトランスジェニックF.ベルティペスの投与による、抗HBV抗体のin vivo産生
実施例1から得られたトランスジェニックF.ベルティペス菌糸を、おがくずビンに播種し、25℃で1〜2ヶ月置いた。菌糸の成長後、ボトルを15℃で2〜4週間置き、子実体の成長を誘導した。子実体を回収し、乾燥させ、粉末を得た。50mgの試料粉末を、0.5mlタンパク質抽出緩衝液(50mMのリン酸ナトリウム、300mMのNaCl、1mMのPMSF、0.1%のTritonX-100、pH=7.4)と、氷上で1時間混合した。13,000gで30分間遠心分離後、全可溶性タンパク質(total soluble protein)(TSP)として上清を回収した。タンパク質濃度を、Pierce(商標)BCA Protein Assay kit(Pierce Biotechnology、USA)を使用して決定した。ウシ血清アルブミン(Pierce、Rockford、USA)を使用して、基準液(0mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/mlおよび1mg/ml)を調製した。10μlの基準液および試料を、96ウェルマイクロプレート中の200μlのBCA試薬(試薬A:B、50:1、v/v)に暗所において30分間加えた。562nmにおける吸光度値を、96ウェルプレートリーダー(VERSAmax、Sunnyvale、CA)を使用して測定した。
【００４６】
TSP中のmHBsAgタンパク質を、ウエスタンブロット分析により測定した。F.ベルティペスの形質転換体および野生型の子実体および菌糸を回収し、続いて、液体窒素中で乳鉢および乳棒によりすりつぶした。合計50mgの試料粉末を、0.5mlのタンパク質抽出緩衝液と、氷上で1時間混合した。混合物を、13000gにおいて30分間遠心分離後、上清をTSPとして回収し、サンプル緩衝液[50mMのTris-HCl(pH7.4)、2%のSDS、0.1%のブロモフェノールブルー、10%のグリセロール、400mMのDTTおよび800mMの2-メルカプトエタノール]により20分間煮沸し、12%のドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分離した。タンパク質試料を、Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell(Bio-Rad、USA)を介してPVDF膜(Millipore、Bedford、MA、USA)に転写した。タンパク質の検出を、マウスモノクローナル抗HBsAg抗体(Abcam、Taiwan、Taipei)およびヤギ抗マウスIgG抗体標識アルカリホスファターゼ(AP)ならびにNBT/BCIP反応(PerkinElmer)を、製造業者による記載の通りに使用して実施した。データを図4に示す。
【００４７】
菌糸および子実体のTSP中のmHBsAgタンパク質の定量化を、SURASE B-96(GENERAL BIOLOGICALS CORP.、Taiwan、Taipei)を使用して測定した。抗HBsAg抗体でコーティングされたプレートウェルを、50μlのTSPおよび抗HBsAg抗体標識ペルオキシダーゼと一緒に37℃において90分間インキュベートした。各試料アッセイは、各プレートに関して三連で繰り返した。このインキュベーション期間の最後に、プレートウェルを洗浄溶液により6回洗浄し、100μlのTMB-HRPマイクロウェル基質(BioFX、Owings Mills、MD)を各ウェルに加えた。37℃において30分後、反応を、100μlの2N硫酸を加えることによって停止させ、各ウェルの450nmにおける吸光度を、96ウェルプレートリーダー(VERSAmax、Sunnyvale、CA)を使用して測定した。
【００４８】
9gのトランスジェニックF.ベルティペスの菌糸粉末を、ブタに、3日に1回、6週間経口投与した。続いて、この豚に1週間に1回、2週間投与した。投与完了後2日目に、ブタの血液試料を採取し、抗体価を、Elecsys Anti-HBs(Roche)を使用することによって測定した。続いて、血液試料を10日後ごとに、ELISAアッセイのために採取した。図5に示すように、投与後44日、57日および75日に、血液試料は抗HBV抗体を含有し、したがって、実施例1のトランスジェニックF.ベルティペスの菌糸が、実際にブタにおいて免疫応答を誘導可能であることを示している。
【００４９】
9gのトランスジェニックF.ベルティペスの子実体粉末を、4匹のブタに、3日に1回、6週間経口投与した。その後、このブタに、1週間に1回、14週間投与した。血液試料を、投与6週後に採取し、ELISAアッセイにより抗体価を測定した。その後、血液試料を2週間に1回、8回採取した。図6に示すように、2匹のブタは、それぞれ、12および18週後に抗体応答を表した。これは、実施例1の組換えフラムリナ・ベルティペスの子実体が、ブタにおいて実際に免疫応答を誘導可能であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【外国語明細書】
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