(57)【要約】【課題】細胞を培養基板に接着したまま凍結する凍結細胞の製造方法であって、凍結及び解凍後の細胞生存率が高い方法を提供すること。【解決手段】マイクロチップの一壁面上に接着している細胞を、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着した状態で凍結する工程を含む、凍結細胞の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチップの一壁面上に接着している細胞を、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着した状態で凍結する工程を含む、凍結細胞の製造方法。
【請求項２】
マイクロチップの密閉された微小空間が細胞及び細胞培養培地で満たされており、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着している、請求項１に記載の凍結細胞の製造方法。
【請求項３】
マイクロチップの微小空間の高さが、１０〜１００μｍである、請求項１又は２に記載の凍結細胞の製造方法。
【請求項４】
マイクロチップの細胞が接着する壁面上に、単一の細胞を捕捉するためのマイクロポケットが設けられている、請求項１から３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
マイクロチップの一壁面上に接着している細胞を、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着した状態で凍結する工程が、マイクロチップの一壁面上において細胞を３０〜７０％コンフルエントになるまで培養した後に、培地を、凍結保護剤を含む培地に交換し、次いで細胞を凍結する工程である、請求項１から４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の方法により得られる、マイクロチップと、前記マイクロチップの一壁面上に接着している凍結細胞とからなる細胞凍結物。
【請求項７】
（ｉ）請求項１から５の何れか１項に記載の方法により凍結細胞を製造する工程；及び
（ｉｉ）前記凍結細胞を解凍する工程：
を含む、細胞の凍結及び解凍方法。
【請求項８】
（ｉ）請求項１から５の何れか１項に記載の方法により凍結細胞を製造する工程；
（ｉｉ）前記凍結細胞を解凍する工程；
（ｉｉｉ）前記解凍した細胞を被験物質と接触させる工程；及び
（ｉｖ）前記被験物質の前記解凍した細胞に対する作用を検出する工程：
を含む、被験物質の試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチップを用いた凍結細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
実験に使用しない細胞は凍結保存する場合が多い。その際，従来の培養皿やフラスコなどの基板に接着したまま凍結及び解凍を行うと、適当な保存液に浸漬したとしても細胞が傷害を受け、死滅する場合もある。そのため，凍結保存の前に細胞をトリプシンなどを用いて基板から剥離し、保存液に懸濁し、チューブに移して凍結するのが一般的である。しかし、こうして凍結した細胞は、解凍した後に培養皿等の基板に播種して接着させ、さらに適当な細胞密度になるまで培養した後でないと実験に用いることができない。この解凍後の処理には通常数日を要する。
【０００３】
非特許文献１には、細胞を基板に接着したまま凍結及び解凍する技術として、細胞の上からゲルで包む方法が報告されている。また、特許文献１には、ほぼ同一形状の開口部が一定のピッチで複数個穿設されたシートを備えた動物細胞凍結保存用担体であって、上記開口部を形成する内壁の少なくとも一部に曲面部を有し、さらに動物細胞の生存率又は動物細胞の生存細胞密度が所定の条件を満たす動物細胞凍結保存用担体が記載されている。
【０００４】
また、マイクロ流体チップで細胞の凍結保存を行う研究も報告されている（非特許文献２及び３）。これらの技術は懸濁状態の細胞を凍結するものであり、接着状態の細胞を凍結保存するものではない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】R. Malpique, F. Ehrhart, A. Katsen-Globa, H. Zimmermann, P. M. Alves, Tissue Engineering: Part C, 15, 373-386, (2009)
【非特許文献２】E. Berthier et al., Lab Chip, 13, 424-431 (2013)
【非特許文献３】Y. S. Song, et al., Lab Chip, 9, 1874-1881 (2009)
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第５１４０１５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
非特許文献１及び特許文献１に記載の技術は、広く普及するには至っていない。これらの技術の問題点は不明であるが、培養環境が従来のものと違いすぎてデータの互換性に不安があること、立体的で顕微鏡観察がしにくいことなどがその理由として考えられる。
【０００８】
本発明は、細胞を培養基板に接着したまま凍結する凍結細胞の製造方法であって、凍結及び解凍後の細胞生存率が高い方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、マイクロチップの底面に接着した細胞を凍結及び解凍した場合、マイクロチップがない場合に比べて細胞の生存率が大幅に向上することを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【００１０】
すなわち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）マイクロチップの一壁面上に接着している細胞を、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着した状態で凍結する工程を含む、凍結細胞の製造方法。
（２）マイクロチップの密閉された微小空間が細胞及び細胞培養培地で満たされており、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着している、（１）に記載の凍結細胞の製造方法。
（３）マイクロチップの微小空間の高さが、１０〜１００μｍである、（１）又は（２）に記載の凍結細胞の製造方法。
（４）マイクロチップの細胞が接着する壁面上に、単一の細胞を捕捉するためのマイクロポケットが設けられている、（１）から（３）の何れかに記載の方法。
（５）マイクロチップの一壁面上に接着している細胞を、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着した状態で凍結する工程が、マイクロチップの一壁面上において細胞を３０〜７０％コンフルエントになるまで培養した後に、培地を、凍結保護剤を含む培地に交換し、次いで細胞を凍結する工程である、（１）から（４）の何れかに記載の方法。
（６）（１）から（５）の何れかに記載の方法により得られる、マイクロチップと、前記マイクロチップの一壁面上に接着している凍結細胞とからなる細胞凍結物。
（７）（ｉ）（１）から（５）の何れかに記載の方法により凍結細胞を製造する工程；及び
（ｉｉ）前記凍結細胞を解凍する工程：
を含む、細胞の凍結及び解凍方法。
（８）（ｉ）（１）から（５）の何れかに記載の方法により凍結細胞を製造する工程；
（ｉｉ）前記凍結細胞を解凍する工程；
（ｉｉｉ）前記解凍した細胞を被験物質と接触させる工程；及び
（ｉｖ）前記被験物質の前記解凍した細胞に対する作用を検出する工程：
を含む、被験物質の試験方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、細胞を基板に接着したまま凍結・解凍することができ、かつ凍結及び解凍後において高い細胞生存率を達成することができる。特に、本発明によれば、従来から広く用いられているプラスチックからなる細胞基材の表面を培養面として、上記培養面に細胞を接着させたまま細胞を凍結保存することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、マイクロチップのデサインを示す。Ａはマイクロチップ全体の写真、Ｂは鉛直方向の写真、Ｃは水平方向の概略、Ｄは、Ｘ部分の拡大図、Ｅはマイクロポケットの拡大図を示す。
【図２】図２は、クロムマスクデザインの概略図を示す。Ａは１層目、Ｂは２層目を示す。
【図３】図３は、マイクロデバイス作製チャートを示す。
【図４】図４は、細胞の接着率と生存率とを示すグラフである。縦軸は接着率（黒色棒）と生存率（灰色棒）の百分率（％）を示し、横軸は、マイクロチップ（Ｃｈｉｐ）又は培養皿（Ｄｉｓｈ）、細胞の種類（ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＣＦ−７、ＰＣ１２）、コラーゲンコーティングの有無を示す。なお、下段の図は、ＨｅＬａ細胞とマイクロチップを用いた実験結果であり、マイクロポケットありの場合（流路の深さは１８μｍ）とマイクロポケットなしの場合（流路の深さは２５μｍ及び６０μｍ）の結果を示す。
【図５】図５は、ＰＣ１２細胞の免疫染色を示す。図５の左は、マイクロチップ上で凍結保存及び解凍後にＮＧＦの添加によりＰＣ１２細胞の神経分化を誘導した場合を示し、図５の中央は、凍結保存後にＮＧＦ処理を行わない陰性コントロールを示す、図５の右は、凍結保存しない細胞について培養皿上でＮＧＦ処理を行った陽性コントロールを示す。
【図６】図６は、細胞毒性アッセイの結果を示す。図６の上段は、９６穴プレートを用いた場合、図６の中段はマイクロチップを用いて凍結しない場合、図６の下段はマイクロチップを用いて凍結解凍後の場合の結果を示す。縦軸は生存率の百分率（％）を示し、横軸は、シスプラチン濃度（μＭ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明についてさらに具体的に説明する。
本発明による凍結細胞の製造方法は、マイクロチップの一壁面上に接着している細胞を、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着した状態で凍結する工程を含む方法である。本発明においては、凍結保存された細胞を解凍した後に培養皿等の基板に播種して接着させ、さらに適当な細胞密度になるまで培養するという操作が不要であり、マイクロチップの一壁面上に接着した細胞を解凍した後３０分程度で、前記細胞を使用する目的の実験を開始することができる。
【００１４】
本発明で用いるマイクロチップにおいては、内部に微小空間（好ましくは流路）が設置されている。好ましくは、微小空間の底面、側面及び上面は、容器の壁面で囲まれている。即ち、微小空間は、入口及び出口を有すること以外は密閉された微小空間であることが好ましい。なお、微小空間の数は一つ以上であればよく、一つ又は二つ以上の微小空間を設置することができる。
【００１５】
本発明においては、微小空間の底面、側面及び上面のうちの一壁面上において細胞を培養することにより、細胞は上記一壁面上に接着する。以下、細胞が接着している壁面を培養面とも言う。細胞が接着する面に、必要に応じてコーティング（例えば、コラーゲン）をしてもよい。本発明において、主に底面、側面および上面のうちの少なくとも１つの壁面の上に細胞を接着させることが意図されるが、その他の壁面の上に細胞が接着してもよい。特に好ましくは、微小空間の底面上において細胞を培養して接着させることができる。
【００１６】
マイクロチップの培養面を底面とした場合における微小空間の高さ（即ち、底面とそれに対向する上面との間の距離；マイクロチップが流路である場合には、流路の高さ）は、本発明の効果が達成できる限り、特に限定されないが、一般的には１０μｍ〜１ｍｍ未満であり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜６０μｍであり、さらに好ましくは１５〜６０μｍであり、さらに好ましくは１５〜３０μｍであり、特に好ましくは１８〜２５μｍである。微小空間の高さが１０μｍ未満では細胞が存在するスペースとして不十分となり好ましくなく、また微小空間の高さが１ｍｍ以上になると細胞生存率の向上という本発明の効果が達成しにくくなるため好ましくない。
【００１７】
微小空間が、底面、側面及び上面から構成される直方体の場合、底面の大きさは特に限定されないが、一般的には、横幅は１００μｍ〜２ｍｍ程度であり、好ましくは２００μｍ〜１ｍｍ程度であり（図１においては５００μｍ）、縦幅は５００μｍ〜５０ｍｍ程度であり、好ましくは１ｍｍ〜５ｍｍ程度（図１においては３ｍｍ）である。
あるいは、微小空間の大きさは、細胞が接着するために十分に大きく、かつ凍結融解後の細胞の生存率を上昇させるために十分に小さいことが好ましい。凍結融解後の細胞の生存率は、例えば、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上である。凍結融解後の細胞の生存率は、微小空間を有しない通常の培養ディッシュ上での凍結融解後の細胞の生存率に比較して、例えば、１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍高い。
【００１８】
好ましいくは、マイクロチップは、培養面（細胞が接着する壁面）上に、単一の細胞（１個の細胞）を捕捉するためのマイクロポケットが設けられている。マイクロポケットの構造は特に限定されないが、培養面上に細胞を流した場合に、１個の細胞を捕捉するのに適した構造と大きさを有することが好ましく、本明細書の実施例で使用したマイクロチップに設けたマイクロポケットの構造（図１のＤ及びＥを参照）などが好ましい。具体的には、横幅５〜２５μｍ（図１Ｅにおいては１０μｍ）、縦幅２０〜４０μｍ（図１Ｅにおいては３０μｍ）、高さ３〜１０μｍ（図１Ｅにおいては５μｍ）の構築物であって、一方の側面側から直径１０〜２０μｍ（図１Ｅにおいては１５μｍ）の半円柱を取り除いた構造である。
【００１９】
マイクロチップの原材料としては、耐冷性（−８０℃以下）を有していれば特に限定されず、例えば、高分子材料、ガラス、又はシリコンを用いることが可能である。例えば、高分子材料の１つであるゴムは、固体のミクロ構造がかなり疎であり、かつ固体分子の運動自由度が相当に大であるので、気体が固体中に入り込み易く、非常に多くの気体が溶解する固体材料である。このように非常に多くの気体が溶解可能な固体材料であるゴムなどの高分子材料によって、マイクロチップを形成することが好ましい。ゴムの具体例としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのシリコーンゴムを用いることができる。
【００２０】
本発明において用いるマイクロチップの製造方法について説明する。
所定の高さのマイクロ流路を成形するための反転パターンを形成するために、超厚膜フォトレジスト（ＳＵ−８；Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社製、米国）をシリコン基板の上にスピンコートし、製造者メーカーの指示に従って処理する。その後、反転パターンを露光し、現像する。
【００２１】
さらに、マイクロポケットを設ける場合には、上記で作製した構造物の上から、フォトレジストをスピンコートし、製造者メーカーの指示に従って処理する。その後、反転パターンを露光し、現像する。これにより、２種類の高さを有するフォトレジストの構造が得られる。
【００２２】
現像後に、接着を強化するために、炉中で４分間１５０℃で焼き、次いで、１〜２時間かけて室温まで徐冷する。型離れをよくするために、シリコン基板は、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）機械（ＲＩＥ−１０ＮＲ；サムコインターナショナル研究所社製、日本）中で、ＣＨＦ3プラズマにより重合化されたフロロカーボン層を２分間成膜する。そのときの条件は、例えば、ＣＨＦ3ガス流量５０ｓｃｃｍ、圧力２０Ｐａ、電力２００Ｗとすることができる。
【００２３】
更に、ＰＤＭＳ（例えばＳｙｌｇａｒｄ １８４；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、米国）の未重合液体を、当該溶液を保持する型枠を使用してシリコン基板上に注ぐ。これに対して、６５℃で１時間の第１の硬化工程と、１００℃で１時間の第２の硬化工程を行う。硬化されたＰＤＭＳチップは、シリコン基板から剥離される。こうして製造されたＰＤＭＳチップを培養皿の底に置くと、ＰＤＭＳ表面の粘着性により両者は接着する。これにより、本発明で使用するマイクロチップを作製することができる。
【００２４】
本発明においては、細胞は、マイクロチップの培養面に接着した状態で、細胞培養培地とともに凍結されている。好ましくは、マイクロチップの密閉された微小空間が細胞及び細胞培養培地で満たされており、前記マイクロチップの一壁面（培養面）上に細胞が接着している。微小空間が細胞及び細胞培養培地で満たされているとは、微小空間の９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、特に好ましくは１００％が、細胞及び細胞培養培地で満たされている状態を意味する。
【００２５】
本発明においては、マイクロチップの一壁面上に接着している細胞を、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着した状態で凍結する。細胞の凍結方法は、特に限定されないが、好ましくは、マイクロチップの一壁面上において細胞を３０〜７０％コンフルエント（好ましくは４０〜６０％コンフルエント、より好ましくは４５〜５５％コンフルエント、例えば５０％コンフルエント）になるまで培養した後に、培地を、凍結保護剤を含む培地に交換し、次いで細胞を凍結することができる。
【００２６】
本発明で使用する細胞の種類は特に限定されず、微生物、細菌、動物細胞、植物細胞のいずれでもよいが、好ましくは動物細胞であり、例えば、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトなど）、鳥類（ニワトリ、ダチョウなど）、爬虫類、両生類、魚類（ゼブラフィッシュ、メダカなど）などの脊椎動物、昆虫（カイコ、ガ、ショウジョウバエなど）などの非脊椎動物の細胞が挙げられる。細胞は、より好ましくは動物細胞であり、特に好ましくは哺乳類細胞である。動物細胞を使用する場合、例えば、動物細胞の細胞株を使用してもよいし、哺乳類等の動物から採取した臓器、組織又は体液（血液、リンパ液、および精液を含む）に由来する細胞を使用してもよいし、あるいは遺伝子工学的手法により得られた形質転換細胞を使用してもよい。なお、細胞としては、体細胞、生殖細胞、又は幹細胞の何れでもよい。
【００２７】
細胞を３０〜７０％コンフルエントになるまで培養する際に使用する培地は、使用する細胞の種類に応じて適切な細胞培養培地を選択して使用することができる。細胞が動物細胞の場合には、動物細胞培養用培地、培養用血清および／または血清代替物を好適に用いることができる。好ましくは、血清または血清代替物を５〜２０％含有する動物細胞培養用培地である。動物細胞培養用培地としては、イーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（α−ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（Ｆ−１２）等を好ましく用いることができる。培養用血清としては、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ウマ血清等が挙げられる。また、血清代替物としては、ヒト自己血清、ヒト他家血清、ヒト血小板由来物、アルブミン／アルブミン代替物、インスリン／インスリン代替物、およびトランスフェリンの単独または併用、あるいは、ノックアウト血清代替物（ＫｎｏｃｋＯｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；ＫＳＲ、インビトロジェン・ライフテクノロジー社製）等を好ましく用いることができる。
【００２８】
本発明においては、細胞を凍結する前に、培地を、凍結保護剤含有培地に交換することが好ましい。凍結保護剤とは、水分子との親和性が高く、培地中に溶かした際に氷晶の成長を抑制する効果の高い物質を指し、例として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセリン、トレハロース、ショ糖、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシル化ポリリジン等が挙げられる。培地中における凍結保護剤の濃度は５質量％〜２０質量％であることが好ましく、７質量％〜１５質量％であることがさらに好ましい。
【００２９】
細胞の凍結方法は、常法により行うことができる。即ち、壁面に接着した細胞を有するマイクロチップを、−４０℃以下（例えば、−８０℃など）の超低温フリーザーに入れること、液体窒素によって急速冷却すること、またはプログラムフリーザーに入れて細胞を徐々に凍結する方法などが挙げられる。凍結した細胞の保存方法は、例えば、凍結させた温度にそのまま保持すること、またはプログラムフリーザーで凍結させた場合では、その後液体窒素中に保持することが挙げられる。
【００３０】
上記した本発明に方法により得られる、マイクロチップと、前記マイクロチップの一壁面上に接着している凍結細胞とからなる細胞凍結物も本発明の範囲内である。本発明の細胞凍結物においては、好ましくは、マイクロチップの密閉された微小空間は、細胞及び細胞培養培地で満たされており、前記マイクロチップの一壁面上に細胞が接着している状態にある。
【００３１】
更に本発明によれば、本発明の方法により凍結細胞を製造する工程；及び前記凍結細胞を解凍する工程を含む、細胞の凍結及び解凍方法が提供される。
【００３２】
細胞を解凍する方法としては、例えば、凍結保存されたマイクロチップを室温で放置することにより解凍することができる。
【００３３】
更に本発明によれば、本発明の方法により凍結細胞を製造し、次いで前記凍結細胞を解凍した後に、得られた解凍した細胞に接触させた被験物質の作用を検出することによって、被験物質を試験（アッセイ）することができる。試験は任意の生物学的試験でよく、例えば、薬効及び／又は毒性の評価である。即ち、本発明の方法により細胞を凍結した後に解凍して得られる細胞は、マイクロチップの一壁面上に接着しているので、そのまま、または培地交換をした後に、すぐにマイクロチップ中で生物学的試験に供することができる。また、本発明の方法により細胞を凍結した後に解凍して得られる細胞は、凍結する前の細胞と同様の表現型を有することから、凍結する前の細胞と同様に、被験物質の試験のために使用することができる。従って本発明によれば、ready-to-useのアッセイ用マイクロチップが提供され、例えばヒト細胞を用いて、被験物質の試験を行うことができる。
【００３４】
本発明で用いることができる被験物質としては任意の物質を使用することができる。被験物質の種類は特に限定されず、個々の低分子化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。あるいは、被験化合物はまた、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。被験物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００３５】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００３６】
実施例１：マイクロチップ（ポケットあり、深さ２５ミクロンの場合）の作製
ポケットの構造以外は、Kondo et al. J. Biosci. Bioeng., Vol.118, No.3, 356-358, 2014に記載の方法と同様の方法により、以下の手順により図１に構造を示すマイクロチップを作製した。ポケットの構造は、図１Ｅを参照。５μｍ×５μｍの貫通穴が設けた。
【００３７】
本マイクロチップは、灌流装置を必要とせず、灌流は入口と出口の間の数μｍの水頭差による重力による流れによって達成される（図１Ｂ）。本マイクロチップは、フィルターゾーンと細胞培養ゾーンの２つの領域を有する（図１Ｃ）。フィルターゾーンは、大きな細胞凝集物を除外するため２０μｍのスリットのアレイを有している。個々の細胞は、細胞を捕捉するためのマイクロポケットのアレイを有する５００μｍ幅の細胞培養ゾーンに導入される（図１Ｄ）。
【００３８】
（１）鋳型の作製
シリコン基板上にフォトレジストの構造を２枚のフォトマスクを使って作製した（図２）。
（１−１）
シリコン基板上にフォトレジストＳＵ−８  ５（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ，ＵＳＡ）を３，０００ｒｐｍで１５秒スピンコートした後，オーブンで９０℃で３０分加熱した。
（１−２）
１枚目のマスクを使って露光した（図３Ａ）。露光装置はＰＥＭ−８００（ユニオン光学）で露光時間１５秒とした。
（１−３）
オーブンで９０℃で３０分加熱した。
（１−４）
ＳＵ−８現像液（ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）で５分間現像した。
（１−５）
上記で作成した厚み５ミクロンの構造の上からＳＵ−８  ２５  （ＭｉｃｒｏＣｈｅｍ）を３０００ｒｐｍで１５秒間スピンコートした後、オーブンで９０℃で３０分間加熱した。
（１−６）
２枚目のマスクを使って露光、現像（図３Ｂ，条件は上記（１−２）〜（１−４）と同様）を行った。上記により、５ミクロンと２５ミクロンの２種類の高さをもったフォトレジストの構造を作製した。
【００３９】
（１−７）
接着を強化するために、炉中で４分間１５０℃で焼き、それから１〜２時間かけて室温まで徐冷した。型離れをよくするために、シリコン基板は、反応性イオンエンッチング（ＲＩＥ）機械（ＲＩＥ−１０ＮＲ：サムコインターナショナル研究所社製，日本）中で、ＣＨＦ３プラズマにより重合化されたフロロカーボン層を２分間成膜した。その時の条件は、ＣＨＦ３ガス流量５０ｓｃｃｍ、圧力２０Ｐａ、電力２００ｗである。
【００４０】
（２）ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）チップの製作
ＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ１８４，Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）の主剤と重合開始剤を重量比１０：１で混合し，鋳型上に流し込んだ。真空中で１０分程度脱泡を行った後、オーブンで６５℃で１時間加熱して１段階目の硬化を行った（図３Ｃ）。ＰＤＭＳチップを鋳型からはがし取り，周りの不要部分をナイフで切り落とした後、入り口部分に金属パイプを使って直径２．５ｍｍの貫通穴を開けた。その上にリザーバとなるシリコーンチューブの断片（内径５ｍｍ，長さ７ｍｍ）を未硬化のＰＤＭＳを使って接着した。ＰＤＭＳチップをオーブンで１００℃で一晩加熱して２段階目の硬化を行った。
【００４１】
（３）ＰＤＭＳチップを培養皿の底に置き、ＰＤＭＳ表面の粘着性により両者が接着させた（図３Ｅ）。
【００４２】
実施例２：マイクロチップのバリエーション
バリエーション１：ポケットあり、深さ１８ミクロンの場合
上記（１−５）の回転数を３５００ｒｐｍとすること以外は、実施例１と同様にしてマイクロチップを作製した。
【００４３】
バリエーション２：ポケットなし，深さ２５ミクロン
ポケットのないマスクを使った１段露光で，上記（１−５）から開始すること以外は、実施例１と同様にしてマイクロチップを作製した。
【００４４】
バリエーション３：ポケットなし，深さ６０ミクロン
ポケットのないマスクを使った１段露光で、上記（１−５）から開始すること、並びに上記（１−５）のスピンコートの回転数を１０００ｒｐｍとすること以外は、実施例１と同様にしてマイクロチップを作製した。
【００４５】
実施例３：細胞の調整
核標的化ＥＧＦＰ遺伝子を安定ニトランスフェクションすることによってＮＩＨ３Ｔ３細胞から得たＮｇ３Ｔ３細胞（Abe, T.,et.al. Genesis, 49, 579e590 (2011)）を、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース（和光純薬）を含有し、１０％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＨｅＬａ及びＭＣＦ−７は、１０％ウシ胎児血清、非必須アミノ酸、１００ｍｇ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（和光純薬）を補充したイーグル最小必須培地（和光純薬）で培養した。ＰＣ１２細胞は、１０％ウマ血清、５％ウシ胎児血清、１００ｍｇ／ｍＬペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で培養した。
【００４６】
実施例４：凍結保存
ＨｅＬａ、ＰＣ１２、ＮＩＨ３Ｔ３及びＭＣＦ−７細胞を、各マイクロチップに添加し、培養した。この際、マイクロチップ内の微小空間の底面である培養皿表面上に細胞を接着させて培養した。５０％コンフルントの時点で、マイクロチップの遠心により、培地を凍結保護剤含有培地（１０％ＤＭＳＯを含有する培地）に交換し、マイクロチップを−８０℃の冷蔵庫に保管した。なお、ポケットなしのマイクロチップへの細胞導入は以下の手順で行った。細胞懸濁液１００μＬを入口に添加し、３０秒程度静置した。重力による液の流れを止めるため、液体培地を３５ｍｍ培養皿に、マイクロチップが完全に沈むまで入れた。５％ＣＯ2で３７℃の恒温槽で１時間インキュベーションし、マイクロチップ内の微小空間の底面である培養皿表面上に、細胞を接着させた。細胞接着を確認した後、チップ外の液体培地をアスピレーターで回収した。入口に１００μＬの液体培地をいれ、５％ＣＯ2で３７℃の恒温槽で細胞を目的の密度（５０％コンフルエント）まで培養した（Kondo et al. J. Biosci. Bioeng., Vol.118, No.3, 356-358, 2014を参照）。５０％コンフルントの時点で、マイクロチップの遠心により、培地を凍結保護剤含有培地（１０％ＤＭＳＯを含有する培地）に交換し、マイクロチップを−８０℃の冷蔵庫に保管した。
【００４７】
−８０℃での３６時間の凍結保存後に、５０μｌの培地を、マイクロチップの入口及び出口に滴下し、マイクロチップを室温で１０分間解凍した。培地を、培養培地に交換した。５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間インキュベーションした後、凍結保存した細胞の生存率を評価した。死細胞の核をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。その後、全細胞の核をヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８で染色した。生存率を、ＰＩ陽性細胞及びヘキスト陽性細胞の数から計算した。
【００４８】
対照として、バルク細胞培養皿（dish）上の細胞を凍結保存した。５０％コンフルントの時点で、培地を８００μｌの凍結保護剤含有培地に交換した。細胞培養皿を−８０℃の冷蔵庫に保管した。凍結保存後に、細胞培養皿(dish)を室温で１０分間解凍した。培地を、培養培地に交換した。５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間インキュベーションした後、凍結保存した細胞の生存率を上記と同様に評価した。
【００４９】
上記の評価の結果を図４に示す。
図４の上段のグラフから分かるように、マイクロチップ上で凍結保存した細胞は、細胞培養皿(dish)上で凍結保存した細胞より高い生存率を示した。また、マイクロチップ上で凍結保存した細胞は、培養基材のコラーゲン処理の有無に拘わらず、高い生存率を示した。
図４の下段のグラフから分かるように、ポケットがある場合及びポケットがない場合の何れにおいても高い生存率であったが、ポケットがありの場合には高い細胞接着率と高い生存率を達成することができる。
【００５０】
実施例５：ＰＣ１２細胞の分化及び免疫染色
細胞の表現型に対する凍結保存の効果を調べるために、凍結保存後にＰＣ１２細胞の神経分化を誘導した。ＰＣ１２細胞を、１００μｇ／ｍＬの神経成長因子（ＮＧＦ）を含む培地中で培養した。ＮＧＦで４日間処理した後、ＰＣ１２細胞を免疫染色した。細胞をＰＢＳ中に４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３０分間脱メンブレン化した。ＴＢＳＴでリンスした後、細胞を、ＴＢＳＴ中の２％ヤギ血清アルブミンで室温で１時間ブロッキングした。次に、細胞を一次抗体であるウサギ抗βＩＩＩチューブリン抗体（ａｂｃｏｍａｂ１８２０７）とともに一晩４℃でインキュベートした。ＴＢＳＴでリンスした後、細胞を、二次抗体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８で標識した抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ−１１００８）及びＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８とともに室温で１時間インキュベートした。細胞をＴＢＳＴでリンスした後、蛍光顕微鏡で観察した。
【００５１】
結果を図５に示す。図５の左は、本発明の方法により凍結保存した後の細胞において、チューブリンリッチな神経突起様構造の成長が観察されることを示す。この構造は、陽性コントロール（図５の右）においても観察されたが、ＮＧＦでの処理を行わない陰性コントロール（図５の真ん中）においては観察されなかった。この結果は、本発明によるマイクロチップ上での凍結保存は、ＰＣ１２細胞の神経分化に悪影響を及ぼさないことを示す。即ち、マイクロチップ上での接着細胞の凍結保存は、接着細胞の表現型を維持できることが示された。
【００５２】
実施例６：細胞毒性アッセイ
ポケットありのマイクロチップ（流路の高さは２５μｍ）を用いて以下の実験を行った。
液体培地にＨｅＬａ細胞（１．０ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を懸濁させ、懸濁液を入口に添加し、遠心によってポケットに導入した。毎日培地を交換し、液体培地を循環させることにより、５０％コンフルエントまで培養した。
【００５３】
写真撮影後、培地を凍結保存液（１０％ＤＭＳＯ入り細胞培養液）に遠心によって置換し、−８０℃のディープフリーザーに静置した。３６時間後、入口と出口に５０μＬずつの液体培地を滴下し、室温で１０分間静置し解凍した。解凍後、入口を１００μＬの液体培地に置換後、５％ＣＯ2及び３７℃で１時間の回復培養を行った。回復培養を行った後に、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）（和光純薬）０〜１０００μＭ（０μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ）の液体培地を入口に入れ、５％ＣＯ2及び３７℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション後にヨウ化プロピジウム−Ｈｏｅｃｈｅｓｔの二重染色を行った。ＰＢＳで洗浄後、１μｇ／ｍＬのＰＩで２０分間染色した。４％パラホルムアルデヒドアで１０分固定した後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（和光純薬）、１μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（ＰＢＳ中）で染色した。ＰＢＳで洗浄後、蛍光顕微鏡で撮影した。蛍光顕微鏡（ＺＥＩＳＳ，  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ）を用いて画像撮影をした。生細胞数を数え、シスプラチン０μＭの平均生細胞数を１００％として、各シスプラチン濃度での相対細胞生存率を算出した。
【００５４】
（９６ウエルでの細胞毒性アッセイ）
ＨｅＬａ細胞を懸濁し、９６ウェルプレートの各ウェルに３００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように撒いた。５％ＣＯ2３７℃で１晩インキュベーションをした。続いて、各ウェルにシスプラチンを終濃度０〜１００μＭ（０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）になるように加えた。５％ＣＯ2３７℃で２４時間インキュベーションをした。インキュベーション後に、マイクロチップと同様にヨウ化プロピジウム−Ｈｏｅｃｈｅｓｔの二重染色を行った。
【００５５】
（結果）
それぞれの結果を図６に示す。エラーバーはプラスマイナス標準偏差（ｎ  ＝  ３）  を表す。曲線は測定点に最もよくあてはまる４パラメータのロジスティック関数
ｙ＝（ａ−ｄ）／（１＋（ｘ／ｃ）b）＋ｄ
である。ここでａ，ｂ，ｃ，ｄはフィッティングパラメータであり、最小二乗法により最適化した。その際、重みとして各測定点の分散の逆数を用いた。この関数から生存率が５０％となるシスプラチン濃度、すなわちＩＣ50（５０％阻害濃度）を求めると、９６ウェルプレートでは１．２μＭであり、マイクロチップで凍結を行わない条件では８．９μＭであり、本発明により凍結保存及び解凍した後では７．３μＭとなった。実験結果には凍結保存による顕著な影響は見られず、本発明により凍結保存した細胞が毒性評価試験に有用であることが示唆された。
【図１】
2016067330.tif 000002
【図２】
2016067330.tif 000003
【図３】
2016067330.tif 000004
【図４】
2016067330.tif 000005
【図５】
2016067330.tif 000006
【図６】
2016067330.tif 000007