(57)【要約】【課題】基体上の所望のパターンに応じて細胞培養することが可能であり、基板の滅菌を効率的に行うことが可能であり、目詰まり等の問題が抑制され、実用性に優れた細胞培養用基体の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】プラズマ照射によって重合可能なモノマーを含む溶液を、基板上に付着させて、パターンを形成する付着工程と、前記基板にプラズマを照射して、前記モノマーを重合させて重合体とするプラズマ照射工程と、を有する、細胞培養用基体の製造方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラズマ照射によって重合可能なモノマーを含む溶液を、基板上に付着させて、パターンを形成する付着工程と、
前記基板にプラズマを照射して、前記モノマーを重合させて重合体とするプラズマ照射工程と、を有する、
細胞培養用基体の製造方法。
【請求項２】
前記モノマーが、親水性モノマーである、請求項１に記載の細胞培養用基体の製造方法。
【請求項３】
前記モノマーが、疎水性モノマーである、請求項１に記載の細胞培養用基体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養用基体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
基板を利用して細胞を培養する技術が知られている（例えば、特許文献１参照）。また、このような基板の所定箇所に生体材料（例えば、細胞培養制御用物質）をインクジェット法等で付着させ、これを足場材料として基板上の所定の領域に細胞を培養する技術が知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開２００８／１２３６１４号
【特許文献２】特許４１４８５００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献２に記載されるような生体材料の固定化領域を有する細胞培養用基体の製造方法においては、生体材料が吐出装置内で非特異的に吸着したり、変性又は凝集して、吐出穴の目詰まりを起こすという問題がある。また、生体材料の安定性を考慮すれば、たとえ室温であっても長期保存することは困難であり、実用性に乏しいという問題がある。さらに加えて、細胞培養前に基体の滅菌を行う必要があり、製造プロセスが複雑化（多段化）するという問題もある。
【０００５】
本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、基体上の所望のパターンに応じて細胞培養することが可能である細胞培養用基体の製造方法であって、基板の滅菌を効率的に行うことが可能であり、目詰まり等の問題が抑制され、実用性に優れた製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した。その結果、所望の工程を有することにより上記課題を解決できることを見出して、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕
プラズマ照射によって重合可能なモノマーを含む溶液を、基板上に付着させて、パターンを形成する付着工程と、
前記基板にプラズマを照射して、前記モノマーを重合させて重合体とするプラズマ照射工程と、を有する、
細胞培養用基体の製造方法。
〔２〕
前記モノマーが、親水性モノマーである、前項〔１〕に記載の細胞培養用基体の製造方法。
〔３〕
前記モノマーが、疎水性モノマーである、前項〔１〕に記載の細胞培養用基体の製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本実施形態で用い得る処理装置を模式的に示す図である。
【図２】本実施形態で用い得る処理装置に備えられるプラズマ照射機構の断面を模式的に示す図である。
【図３】実施例１で形成した二次元パターンを示す概略斜視図である。
【図４】実施例２で形成した二次元パターンを示す概略斜視図である。
【図５】実施例３で形成した二次元パターンを示す概略斜視図である。
【図６】実施例４で形成した二次元パターンを示す概略斜視図である。
【図７】実施例５で形成した三次元パターンを示す概略斜視図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変形が可能である。なお、図面中、同一要素には同一符号を付すこととし、重複する説明は省略する。また、上下左右などの位置関係は、特に断らない限り、図面に示す位置関係に基づくものとする。さらに、図面の寸法比率は図示の比率に限られるものではない。
【００１０】
〔細胞培養用基体の製造方法〕
本実施形態の細胞培養用基体の製造方法は、プラズマ照射によって重合可能なモノマーを含む溶液を、基板上に付着させて、パターンを形成する付着工程と、前記基板にプラズマを照射して、前記モノマーを重合させて重合体とするプラズマ照射工程と、を有する。
【００１１】
細胞には、疎水性の領域に接着する特性を有するものがある。この特性を利用すると、親水性と疎水性の異なる領域を有する基板を用いることで、所定のパターン上で、細胞を培養することが可能となる。
【００１２】
この点、本実施形態の細胞培養用基体の製造方法においては、細胞培養用基体上に、基板表面と、重合体パターンの性質の異なる２種類の領域を形成することができる。そのため、生体物質を吐出することなく、所望のパターンに応じて細胞培養することができる細胞培養用基体を製造することができる。また、生体物質を吐出することに起因する目詰まり等の問題を回避することができる実用性のより高い製造方法となる。さらに、プラズマ照射により、重合と同時に基板の滅菌を効率的に行うことが可能となるため、製造工程をより簡略化することが可能となる。
【００１３】
〔付着工程〕
付着工程は、プラズマ照射によって重合可能なモノマーを含む溶液を、基板上に付着させて、パターンを形成する工程である。
【００１４】
付着方法としては、特に限定されないが、例えば、マイクロピペット、マイクロディスペンサー、インクジェット記録装置を用いた方法が挙げられる。このなかでも、インクジェット記録装置を用いた方法が好ましい。
【００１５】
〔基板〕
基板の材質としては、特に限定されないが、例えば、特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコーン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド等の樹脂基材；ガラス基材；並びに鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、及び真鍮等の金属基材が挙げられる。このなかでも、樹脂基材又はガラス基材が好ましい。樹脂基材やガラス基材は表面処理が行いやすく、培養したい細胞の種類／特徴に応じて基板表面の濡れ性を調整する場合や、基板表面に凹凸構造やハニカム構造など特徴的な構造を形成させた方が、培養効率が向上する場合に、これらを用いることが特に有利である。
【００１６】
基板に対する水の接触角は後述するプラズマ照射工程によって変動し得る。より具体的には、プラズマ照射工程でプラズマを発生させるために用いるガスによって基板表面の親水性及び疎水性の程度が変化し、基板に対する水の接触角が変化する。これは、プラズマが支持体表面へ付加することなどに由来する支持体への官能基の付与、及びプラズマが支持体表面の化学結合を切断することに由来する支持体への官能基の付与に起因すると考えられるが、特に限定されない。
【００１７】
プラズマ照射工程前の基板に対する水の接触角は、好ましくは４０度以上であり、より好ましくは５０度以上であり、さらに好ましくは６０度以上８０度以下である。基板に対する水の接触角が上記範囲内である基板に親水性モノマーを吐出することで、親水性モノマーが濡れ広がりにくくパターンを描画しやすい傾向にある。
【００１８】
また、プラズマ照射工程の基板に対する水の接触角は、好ましくは４０度未満であり、より好ましくは３５度以下であり、さらに好ましくは３０度以下である。基板に対する水の接触角が上記範囲内である基板に疎水性モノマーを吐出することで、疎水性モノマーが濡れ広がりにくくパターンを形成しやすい傾向にある。
【００１９】
〔溶液〕
溶液は、プラズマ照射によって重合可能なモノマーを含み、必要に応じて、重合開始剤、溶剤、溶液物性調製用の界面活性剤や保湿剤を含んでもよい。
【００２０】
（モノマー）
モノマーは、プラズマ照射によって重合可能な化合物である。「プラズマ照射によって重合可能」とは、ラジカル重合、カチオン重合、又はアニオン重合などで重合可能な重合性官能基を有することをいう。モノマーとしては、親水性モノマーと疎水性モノマーが挙げられる。
【００２１】
（親水性モノマー）
親水性モノマーを用いることにより、溶液の調製がより容易となり、溶液の安定性がより向上する傾向にある。また、インクジェット装置を用いて溶液を吐出する場合においては、インクジェットヘッドの目詰まりや、インクジェット装置内の溶液流路への溶液の付着がより抑制される傾向にある。このような観点から、親水性モノマーを用いることにより、より生産性の高い細胞培養基板を得ることができる。「親水性」とは、水に対する溶解度（２５℃）が２０質量％以上であることをいい、好ましくは３０質量％以上であることをいい、より好ましくは４０質量％以上であることをいう。
【００２２】
親水性モノマーの有する重合性官能基としては、特に限定されないが、例えば、ビニル基が挙げられる。親水性モノマーの有する重合性官能基の数は、好ましくは２〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは３〜４である。具体的には、３以上の重合性基を分子内に有する場合には、３級又は４級炭素を含む分岐構造のアルキレン基によって、又は非芳香族性（シクロアルキレン等）もしくは芳香族性環状基によって、末端に重合性基を有する３以上のポリオキシアルキレン鎖を連結してもよい。親水性モノマーの有する重合性官能基の数が上記範囲内であることにより、架橋構造を有する重合体を得ることができ、重合体が劣化したり、膨潤したりすることによるパターン崩れがより抑制される傾向にある。
【００２３】
親水性モノマーは、ポリオキシアルキレン基（〔ＣmＨ2mＯ〕n（ｍは１から４までの整数とし、ｎは１から１００までの正数とする。））、ポリアルキレンポリアミン基（〔ＣmＨ2mＮＨ〕n（ｍは１から４までの整数とし、ｎは１から１０までの正数とする。））、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、スルホニル基、及びリン酸基からなる群より選ばれる基を１つ以上有していてもよい。また、ポリオキシアルキレン基及びポリアルキレンポリアミン基の有する１又は２以上の水素は、ＯＨ基により置換されていてもよい。
【００２４】
上記のような親水性モノマーとしては、特に限定されないが、例えば、（メタ）アクリル酸、水酸基含有親水性（メタ）アクリル酸エステル、アミノ基含有親水性（メタ）アクリル酸エステル、スルホニル基含有親水性（メタ）アクリル酸エステル、リン酸基含有親水性（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリルアミド等の親水性（メタ）アクリル酸系モノマー；Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピペリジン、ビニルイミダゾール等の窒素含有非（メタ）アクリル酸系親水性モノマー；ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等の硫黄含有非（メタ）アクリル酸系親水性モノマー；ビニルホスホン酸等のリン含有非（メタ）アクリル酸系親水性モノマーが挙げられる。より具体的には、特開２００５−３０７１９８号公報に記載の化合物が挙げられる。
【００２５】
親水性モノマーの含有量は、溶液の総量に対して、好ましくは５．０〜３５質量％であり、より好ましくは１０〜３０質量％であり、さらに好ましくは１５〜２５質量％である。親水性モノマーの含有量が上記範囲内であることにより、溶液調製時の親水性ポリマーと各材料との相溶性、及び、プラズマ照射時の重合効率がより向上する傾向にある。親水性モノマーの含有量が５．０質量％以上であることにより、プラズマ照射により重合した親水性ポリマーの重合度が高くなり、耐水性がより向上するため、長時間の細胞培養により適する傾向にある。一方で、親水性モノマーの含有量が３５質量％以下であることにより、溶液調製時の各材料との相溶性がより向上する傾向にある。
【００２６】
（疎水性モノマー）
疎水性モノマーを用いることにより、比較的耐水性の高い重合体を得ることができる。そのため、細胞培養液に長時間接した場合であっても、重合体が劣化したり、膨潤したりすることによるパターン崩れが抑制される傾向にある。また、プラズマ照射工程における重合効率が比較的低く、重合体内部にモノマーが残留する場合においても、疎水性モノマーであれば、疎水環境である重合体内に留まりやすい。そのため、細胞培養液に接したとしても、重合体から細胞培養液中にモノマーが混入しにくく、細胞培養液が汚染されることをより抑制することができる。このような観点から、疎水性モノマーを用いることにより、長期培養に適した細胞培養用基板を得ることができる。なお、「疎水性」とは、水に対する溶解度（２５℃）が２０質量％未満であることをいい、好ましくは１０質量％以下であることをいい、より好ましくは５質量％以下であることをいう。
【００２７】
疎水性モノマーの有する重合性官能基としては、特に限定されないが、例えば、ビニル基が挙げられる。疎水性モノマーの有する重合性官能基の数は、好ましくは２〜６であり、より好ましくは２〜４であり、さらに好ましくは３〜４である。具体的には、３以上の重合性基を分子内に有する場合には、３級又は４級炭素を含む分岐構造のアルキレン基によって、又は非芳香族性（シクロアルキレン等）もしくは芳香族性環状基によって、末端に重合性基を有する３以上のポリオキシアルキレン鎖を連結してもよい。疎水性モノマーの有する重合性官能基の数が上記範囲内であることにより、架橋構造を有する重合体を得ることができ、重合体が劣化したり、膨潤したりすることによるパターン崩れがより抑制される傾向にある。また、細胞培養液が汚染されることをより抑制できる傾向にある。
【００２８】
疎水性モノマーは、ポリオキシアルキレン基（〔ＣmＨ2mＯ〕n（ｍは１から４までの整数とし、ｎは１から１００までの正数とする。））、ポリアルキレンポリアミン基（〔ＣmＨ2mＮＨ〕n（ｍは１から４までの整数とし、ｎは１から１０までの正数とする。））、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、スルホニル基、及びリン酸基からなる群より選ばれる基を１つ以上有していてもよい。また、ポリオキシアルキレン基及びポリアルキレンポリアミン基の有する１又は２以上の水素は、ＯＨ基により置換されていてもよい。
【００２９】
上記のような疎水性モノマーとしては、特に限定されないが、例えば、（メタ）アクリル酸、水酸基含有疎水性（メタ）アクリル酸エステル、アミノ基含有疎水性（メタ）アクリル酸エステル、スルホニル基含有疎水性（メタ）アクリル酸エステル、リン酸基含有疎水性（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリルアミド等の疎水性（メタ）アクリル酸系モノマー；Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、ビニルピペリジン、ビニルイミダゾール等の窒素含有非（メタ）アクリル酸系疎水性モノマー；ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等の硫黄含有非（メタ）アクリル酸系疎水性モノマー；ビニルホスホン酸等のリン含有非（メタ）アクリル酸系疎水性モノマーが挙げられる。より具体的には、特開２００５−３０７１９８号公報に記載の化合物が挙げられる。
【００３０】
疎水性モノマーの含有量は、溶液の総量に対して、好ましくは５．０〜３５質量％であり、より好ましくは１０〜３０質量％であり、さらに好ましくは１５〜２５質量％である。疎水性モノマーの含有量が上記範囲内であることにより、溶液調製時の疎水性モノマーと各材料との相溶性、及び、プラズマ照射時の重合効率がより向上する傾向にある。疎水性モノマーの含有量が５．０質量％以上であることにより、プラズマ照射により重合した疎水性ポリマーの重合度が高くなり、疎水性がより向上するため、細胞接着用の足場としてより適する傾向にある。一方で、疎水性モノマーの含有量が３５質量％以下であることにより、溶液調製時の各材料との相溶性がより向上する傾向にある。
【００３１】
（重合開始剤）
重合開始剤としては、特に限定されないが、例えば、下記式（１）で表される構造を有する化合物、下記式（２）で表される構造を有する化合物、下記式（３）で表される構造を有する化合物、下記式（４）で表される構造を有する化合物、過硫酸塩が挙げられる。使用する重合開始剤は使用するモノマーとの組み合わせ及び重合効率の観点から適宜選択することができる。このような重合開始剤を用いることにより、重合効率がより向上する傾向にある。なお、重合開始剤は、１種単独で用いても、２種類以上を併用してもよい。
【化１】
2016067315.tif 000002
（式（１）〜（４）中、Ｒ1及びＲ2は、各々独立して、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アルキレングリコール基、アリール基、及びアリールオキシ基を示し、Ｒ3は、水素原子、アルキル基、アルコキシ基、オキシアルキレン基、アリール基、及びアリールオキシ基、−ＳＯ3Ｍ、−ＣＯ2Ｍ、−ＯＭを示し、Ｍは、水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、又はアンモニウムを示す。）
【００３２】
下記式（１）で表される構造を有する化合物、下記式（３）で表される構造を有する化合物、及び下記式（４）で表される構造を有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、特開２００５−３０７１９８号公報に記載の化合物が挙げられる。
【００３３】
下記式（３）で表される構造を有する化合物としては、特に限定されないが、例えば、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−カルボキシエチル）−２−メチルプロピオンアミジン］四水塩、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス（１−イミノ−１−ピロリジノ−２−メチルプロパン）二塩酸塩、２，２’−アゾビス［２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−プロピオンアミド］、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩が挙げられる。
【００３４】
過硫酸塩としては、特に限定されないが、例えば、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、過硫酸カリウム、及び過硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００３５】
重合開始剤の含有量は、溶液の総量に対して、好ましくは０．２５〜７．５質量％であり、より好ましくは０．５０〜５．０質量％であり、さらに好ましくは１．０〜４．０質量％である。重合開始剤の含有量が上記範囲内であることにより、ラジカル種の失活が抑えられ、重合効率がより向上する傾向にある。
【００３６】
（溶剤）
溶剤としては、特に限定されないが、例えば、水又は水溶性有機溶剤、又はこれらの混合溶剤が挙げられる。特に、上記親水性モノマーを用いる場合には溶液が水を含むことが好ましい。また、上記疎水性モノマーを用いる場合には溶液が水溶性有機溶剤を含むことが好ましい。
【００３７】
（水）
水としては、例えば、イオン交換水、限外濾過水、逆浸透水、及び蒸留水等の純水、並びに超純水のような、イオン性不純物を極力除去したものが挙げられる。また、紫外線照射又は過酸化水素の添加等によって滅菌した水を用いると、溶液を長期保存する場合にカビやバクテリアの発生を防止することができる。これにより貯蔵安定性がより向上する傾向にある。
【００３８】
親水性モノマーを用いる場合における水の含有量は、溶液の総量に対して、好ましくは６０〜９０質量％であり、より好ましくは６５〜８５質量％であり、さらに好ましくは７０〜８０質量％である。水の含有量が上記範囲内であることにより、各材料と水との相溶性がより向上する傾向にある。
【００３９】
（水溶性有機溶剤）
水溶性有機溶剤としては、特に限定されないが、例えば、モノアルコール類、ポリオール類が挙げられる。モノアルコール類としては、特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、プロノール、ブタノールが挙げられる。ポリオール類としては、特に限定されないが、例えば、炭素数２〜３のアルカンに対して水酸基を２個以上有する化合物、又は、複数の該化合物がエーテル結合で結びついた化合物が挙げられる。より具体的には、グリセリン、エチレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−プロパンジオール、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコールなどが挙げられる。
【００４０】
疎水性モノマーを用いる場合における水溶性有機溶剤の含有量は、溶液の総量に対して、好ましくは６５〜９５質量％であり、より好ましくは７０〜９０質量％であり、さらに好ましくは７５〜８５質量％である。水溶性有機溶剤の含有量が上記範囲内であることにより、各材料と水溶性有機溶剤との相溶性がより向上する傾向にある。
【００４１】
〔プラズマ照射工程〕
プラズマ照射工程は、基板にプラズマを照射して、モノマーを重合させて重合体とする工程である。これにより、基板の洗浄殺菌と、モノマーの重合を同時に達成することができる。また、基板自体の表面の親水性及び疎水性を制御することも同時に達成することができる。このように、プラズマ照射により、効率的に、所定のパターンの親水性領域及び疎水性領域を有する基板を製造することができる。また、親水性及び疎水性の度合いも調整することができる。また、重合と同時に基板の洗浄及び滅菌をすることができるため、微生物等によって細胞の培養が阻害されることを防ぐことができる。
【００４２】
親水性及び疎水性の度合いは、基板表面と水の接触角で評価することができる。基板上の親水性領域における水の接触角は、好ましくは４０度未満であり、より好ましくは３５度以下であり、さらに好ましくは３０度以下である。親水性領域における水の接触角が上記範囲内であることにより、基板上の親水性領域に対する細胞の接着がより抑制される傾向にある。また、基板上の疎水性領域における水の接触角は、好ましくは４０度以上７０度未満であり、より好ましくは４５度以上６５度以下であり、さらに好ましくは５０度以上６０度以下である。疎水性領域における水の接触角が上記範囲内であることにより、基板上の疎水性領域に細胞が効率的に接着し細胞培養効率がより向上する傾向にある。接触角は、実施例に記載の方法により測定することができる。
【００４３】
なお、親水性モノマーを重合することにより、親水性を有する重合体を得ることができ、疎水性モノマーを重合することにより、疎水性を有する重合体を得ることができる。それぞれの場合において、基板と得られた重合体のうち疎水性の高い方（水の接触角の高い方）が、疎水性領域となり、親水性の高い方（水の接触角の低い方）が親水性領域となる。
【００４４】
本実施形態の製造方法によれば、基板上に重合体からなる三次元形状を形成する場合に、付着工程及びプラズマ処理工程をそれぞれ２回以上繰り返し行ってもよい。より具体的には、第１の付着工程及び第１のプラズマ処理工程を行い、第１のプラズマ処理工程において形成された重合体の少なくとも一部に対して、再度、モノマーを含む溶液を付着させる第２の付着工程及び付着した溶液に対してプラズマを照射する第２のプラズマ処理工程を行うことができる。この工程を繰り返し行うことにより、重合体からなる三次元形状を基板上に形成することができる。
【００４５】
このような三次元形状を有する基板は、スフェロイドな細胞の三次元構造物を培養する際において特に有用に用いることができる。
【００４６】
また、プラズマ照射工程では、モノマーが付着した領域に、プラズマ照射を行なえばよく、基板の表面の全域にプラズマ照射を行うものであってもよい。また、基板上の任意の箇所に異なるガス種でプラズマを照射することで、基板上に所定の官能基が密集した領域を分けて形成することもできる。これにより、基板上に親水性及び疎水性の程度の異なる複数の領域を形成することが可能となる。さらに、基板上の同一の領域に異なるガスを用いてプラズマ照射をすることで、基板上の同一の領域に複数の官能基を付与した領域を形成することもできる。これにより、基板上に形成される親水性領域又は疎水性領域の親水性及び疎水性の程度をより精密に制御することが可能となる。
【００４７】
〔処理条件〕
次に、プラズマ照射工程の処理条件について説明する。本実施形態において、「プラズマ」とは、コロナ放電、グロー放電、及びアーク放電等により発生させることができるものを含む。
【００４８】
プラズマ照射工程において用いるガスとしては、特に限定されないが、例えば、水素、ヘリウム、希ガス、酸素、窒素、ハロゲン、アンモニア、二酸化炭素、水蒸気、及び亜酸化窒素、並びにこれらの混合ガスが挙げられる。モノマーの重合作用のほか具体的な作用としては、特に限定されないが、例えば、酸素を用いると、基板の洗浄殺菌、及び基板へのヒドロキシル基（ＯＨ基）の付与ができる。希ガスを用いると、基板の洗浄殺菌、及び基板表面の化学結合の切断による、基板へのＯＨ基、アミノ基（ＮＨ2）基等の付与ができる。窒素を用いると、基板の洗浄殺菌、及び基板へのＮＨ2基の付与ができる。アンモニアを用いると、基板の洗浄殺菌、及び基板へのＮＨ2基の付与ができる。二酸化炭素を用いると、基板の洗浄殺菌、及び基板へのカルボキシル基（ＣＯＯＨ基）の付与ができる。さらに、メタンを用いると基板への疎水基（ＣＨ3等）の付与ができる。また、混合ガスを用いることにより、これらの複合的な効果を得ることができる。このようにして、モノマーの重合の他、モノマーが付着していない基板表面領域の親水性及び疎水性を制御することができる。
【００４９】
プラズマ照射工程１回当たりにおける照射口から流出するガス流量は、好ましくは２．５〜５０Ｌ／ｍｉｎである。ガス流量が２．５Ｌ／ｍｉｎ以上であることにより、一定量以上のプラズマが安定的に発生し、重合効率、及び、特定官能基の基板への付与効率がより向上する傾向にある。また、ガス流量が５０Ｌ／ｍｉｎ以下であることにより、過剰量のプラズマが発生することを抑制し、基板表面や、形成される重合体への損傷を抑えることができる。
【００５０】
プラズマ照射工程においては、リモート方式でプラズマを照射しても、ダイレクト方式でプラズマを照射してもよい。このなかでも、リモート方式でプラズマを照射することが好ましい。リモート方式を用いることにより、基板の損傷をより防止でき、また、形成される重合体の損傷をより防止できる傾向にある。ここで、「リモート方式」とはプラズマを発生させるためのプラズマ発生部を直接被照射物に接触させない状態で、被照射物の表面にプラズマを照射する方式をいい、「ダイレクト方式」とはプラズマを発生させるためのプラズマ発生部を直接被照射物の表面に接触させた状態で、被照射物の表面にプラズマを照射する方式をいう。
【００５１】
リモート方式において、照射ギャップ（射出口と基板との距離）は、好ましくは１．０〜２０ｍｍであり、より好ましくは３．０〜７．０ｍｍである。照射ギャップが１．０ｍｍ以上であることにより、プラズマガスが基板表面に局所的に照射され、基板表面が損傷することを抑制できる。また、照射ギャップが２０ｍｍ以下であることにより、発生したプラズマガスの拡散を抑え基板表面を効率よく処理できる。
【００５２】
プラズマ照射工程１回当たりにおける照射時間は、好ましくは１０〜６００秒である。照射時間が１０秒以上であることにより、重合効率がより向上し、特定官能基が基板表面に安定的に導入される傾向にある。一方、照射時間が６００秒以下であることにより、基板表面や、形成される重合体を損傷せずに、特定官能基を付与することができる。
【００５３】
プラズマ照射工程１回当たりにおける、電極で消費される電力量は、供給したガスからプラズマを発生させることができる量であれば特に限定されるものではないが、例えば、２０Ｗｈ以上２００Ｗｈ以下とすることができる。
【００５４】
プラズマ照射工程１回当たりにおける、電源から供給される電流の周波数は、供給したガスからプラズマを発生させることができる量であれば特に限定されるものではないが、例えば、５０Ｈｚ以上３０ＭＨｚ以下とすることができる。
【００５５】
〔処理装置〕
次に、プラズマ照射工程を実施するための処理装置について説明する。本実施形態で用い得る処理装置は、モノマーが付着した基板を処理する処理装置であって、基板を収容する収容部と、プラズマを発生させるためのガスを貯留するガス貯留部と、該ガス貯留部から供給されたガスをプラズマ化させるプラズマ発生部、及び、プラズマ化したガスを収容部内に収容された基板に射出する射出口を備えるプラズマ照射機構と、プラズマ照射機構を制御する制御部と、を有する。
【００５６】
以下、本実施形態で用い得る処理装置を模式的に示す図１、本実施形態で用い得る処理装置に備えられるプラズマ照射機構の断面を模式的に示す図２を用いて、本実施形態で用い得る処理装置をより詳細に説明する。
【００５７】
〔収容部〕
収容部２は、基板３を収容するチャンバである。収容部２には、プラズマ照射機構４が備えられており、そのほか、キャリアガスライン５、排ガスライン６などが備えられていてもよい。キャリアガスライン５は、プラズマガス以外の不活性ガスを収容部２に供給する配管であり、キャリアガス貯留部７に接続されている。キャリアガスライン５から収容部２へのキャリアガスの供給は制御部８により制御される。また、排ガスライン６は、プラズマガス及びキャリアガスを収容部２より排出するよう設けられている。キャリアガスライン５によりガスを供給したり、排ガスライン６によりガスを排出したりすることにより、収容部２内の内圧を制御することができる。
【００５８】
図２の例では、プラズマ照射機構４は、基板３から所定の距離離間しているため基板３に接触せず、照射口２５が基板３に対向するように備えられている。射出口２５は、基板３の幅方向の全域にプラズマを照射できるように、基板３の幅方向に沿って複数配列されていてもよい。また、プラズマ照射量を増加させるという観点から、プラズマ照射機構４を複数設けたり、射出口２５を複数設けたりしてもよい。
【００５９】
〔ガス貯留部〕
ガス貯留部９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄは、プラズマを発生させるためのガスを貯留するタンクである。異なるガスを貯留するために、２以上のガス貯留部を有することが好ましい。なお、ガス貯留部の数はこれに限定されない。ガス貯留部９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄは、制御部８により制御されるバルブを介してプラズマ照射機構４に接続される。
【００６０】
〔プラズマ照射機構〕
図２に示すように、プラズマ照射機構４は、ガス貯留部９ａ−９ｄから供給されたガスをプラズマ化させるプラズマ発生部２１、及び、プラズマ化したガスを収容部内に収容された基板に射出する射出口２５を備える。
【００６１】
プラズマ発生部２１は、ガス貯留部９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄと接続されたガス供給室２２と、ガス供給室２２の少なくとも一部に対向するように設けられた電極対２３と、電源２４と、射出口２５と、排気管２６と、を備える。
【００６２】
ガス供給室２２は、図示しないガス供給管によってガス貯留部９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄと接続されており、ガス貯留部９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄに貯留されたガスが流入可能な状態になっている。ガス供給室２２の任意の位置には、電極対２３が設けられている。電極対２３は、対向するように設置された電極２３ａ及び電極２３ｂを備える。電極２３ａ及び電極２３ｂには、電圧が印加できるように、電源２４が接続されている。
【００６３】
射出口２５は、ガス供給管（図示せず）とは異なる位置でガス供給室２２に設けられている。射出口２５から、電極２３ａ及び電極２３ｂの間を通過して発生したプラズマが照射される。射出口２５は、基板と対向する位置に設けられている。
【００６４】
排気管２６は、余剰ガスを吸引、排気しながらプラズマ照射を行うことで、プラズマ照射ノズル２５から放射されるプラズマ照射範囲を適正化し、所望の範囲を局地的に処理するために設置される。排気管２６の設置位置は、特に限定されるものではないが、例えば図３の例では、２つの排気管２６ａ及び排気管２６ｂを備えており、ガス供給室２２に沿って設けられている。
【００６５】
電源２４によって電極２３ａ及び電極２３ｂに電圧が印加されると、電極２３ａと電極２３ｂとの間に放電が生じる。このように放電が生じている状態で、ガス供給室２２にガスを供給して、電極２３ａ及び電極２３ｂとの間にガスを通過させることで、ガスのプラズマが生じる（すなわち、ガスの少なくとも一部がプラズマ化する）。このようにして発生したプラズマは、射出口２５に送られて、射出口２５から基板１の表面に向かって照射される。すなわち、プラズマ発生部２１で発生させたプラズマは、プラズマ発生部が基板１に接触しない状態で基板１の表面に照射される。
【００６６】
プラズマ照射機構４としては、ライン状のプラズマ射出口を備えたライン型と、スポット状のプラズマ照射口を備えたスポット型のいずれをも採用することが可能である。基板３の上面に平行かつ互いに直交する２つの方向をＸ方向及びＹ方向とした場合、ライン型のプラズマ照射機構は、Ｘ方向またはＹ方向のうち、一方の方向に走査される。スポット型の場合は、Ｘ方向およびＹ方向に走査される。
【００６７】
プラズマ照射機構４は、大気圧下でプラズマを発生させて照射する大気圧プラズマ装置である。処理装置１は、真空などの減圧雰囲気下でプラズマを発生させて照射する減圧プラズマ装置であってもよい。しかし、減圧プラズマ装置は、一般的に、非常に大がかりで汎用性の低い装置である。減圧プラズマ装置に、プラズマ処理以外の工程を実施する他の機構を組み込んだり、減圧プラズマ装置によるプラズマ処理と、プラズマ処理以外の他の処理とをインラインで（連続で）実施したりすることは、非常に困難である。一方、本実施形態のように、大気圧プラズマ装置を採用すれば、装置の小型化が図れる。また、後述するように、処理装置１にインクジェット記録装置１０を組み込んだり、プラズマの照射とインクジェット記録装置１０による処理とをインラインで（連続で）行えたりするといった利点がある。
【００６８】
ガス供給室２２には、１種類のガスが供給されてもよいし、２種以上のガスを混合して得られる混合ガスが供給されてもよい。なお、ガス供給室２２に供給されるガスの流量は、ガス供給室２２の容量、ガスの種類、基板の種類等に応じて適宜設定することができ、特に制限されるものではない。
【００６９】
〔制御部〕
制御部８は、プラズマ照射機構４を制御するコンピュータ装置である。制御部８により、ガス貯留部９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄからプラズマ照射機構４にガスを供給するラインの開閉を制御し、かつ、プラズマ照射機構４の電気量などのプラズマ照射工程に関する条件を制御することができる。また、制御部８は、キャリアガスの供給量や、排ガスライン８の開閉なども制御することができる。さらに、制御部８は、収容部２内におけるプラズマ照射機構４の位置を移動させることもでき、これにより、基板２上の任意の部分のみに任意のプラズマを照射することができる。
【００７０】
〔インクジェット記録装置〕
本実施形態で用い得る処理装置１は、さらに、インクジェット記録装置１０を備えている。インクジェット記録装置１０は、溶液を吐出するためのヘッド１４を備えている。ヘッド１４は、カートリッジ１１ａ，１１ｂ，１１ｃに接続される。カートリッジ１１ａ，１１ｂ，１１ｃは、それぞれ、モノマー種の異なる溶液を収容する。ヘッド１４は、インクジェット方式により、カートリッジ１１ａ，１１ｂ，１１ｃ，に収容された溶液を吐出して、基板３に付着させるインクジェットヘッドである。ヘッド１４は、Ｘ方向またはＹ方向のうち一方の方向に走査されるライン型でも、Ｘ方向およびＹ方向に走査されるシリアル型でも良い。本実施形態において、インクジェット記録装置１０は処理装置１と一体的に設けられており、ヘッド１４は制御部８によって制御される。インクジェット記録装置１０は、処理装置１とは別に設けても良い。その場合、記録装置１０は、記録装置１０独自の制御部１８によって制御される。
【００７１】
〔用途〕
本実施形態の製造方法により得られた細胞培養用基板は、基板と、該基板上に形成された重合体パターンと、を有する。言い換えれば、本実施形態の製造方法により得られた細胞培養用基板は、基板と、該基板上に形成された重合体パターンと、を有し、該重合体パターンが、親水性領域又は疎水性領域の一方を形成し、前記重合体パターン以外の部分が、親水性領域又は疎水性領域の他方を形成する。
【００７２】
細胞培養用基板は、その表面上で細胞を培養することができる。より具体的には、細胞が接着しやすい疎水性領域を細胞培養領域として使用し、細胞が接着しにくい親水性領域を細胞培養領域を区画する区画領域として使用することにより、基板表面の２次元のパターン（親水性領域及び疎水性領域からなるパターン）に従い細胞を培養することができる。また、重合体からなる三次元形状を有する基盤においては、その三次元形状に従って細胞を培養することができる。
【００７３】
細胞培養用基板上への細胞の付与方法としては、特に限定されないが、例えば、細胞培養用基板に対して、インクジェット方式により、細胞を含む溶液を付着させる方法、生体分子が固定された基板を、細胞を含む溶液に浸漬する方法が挙げられる。本実施形態の細胞培養用基板を用いることにより、インクジェット方式を用いなくとも、基板上の任意の箇所に任意の量の細胞を付与することが可能となる。
【００７４】
また、培養方法としては、特に限定されず、細胞の種類により適宜高知の方法を選択することができる。
【００７５】
〔細胞〕
培養される細胞としては、特に限定されないが、例えば、臓器由来の細胞、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、腎臓細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、赤血球、白血球、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織、皮膚組織、骨髄組織、角膜組織などの組織に存在する細胞；皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、さい帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などの器官に存在する細胞；並びに種々のタイプの細菌及び植物細胞、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞といった多能性幹細胞が挙げられる。
【実施例】
【００７６】
以下、本発明を実施例及び比較例を用いてより具体的に説明する。本発明は、以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
【００７７】
〔実施例１：親水性モノマーを疎水性表面（ポリスチレン基板ＰＳ基板）に吐出する例〕
（細胞培養用基板の作製方法）
下記式（５）で表される親水性モノマー２０質量％、下記式（６）で表される重合開始剤２質量％、グリセリン３質量％、及びイオン交換水７５質量％を、スターラーを用いて十分に混合し、溶液を調製した。この際、０．２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を用いて溶液のｐＨを８．５に調整した。次に、調製した溶液を専用の溶液カートリッジに充填し、インクジェット記録装置にセットした後、市販のポリスチレン基板（ＰＳ基板）上に、溶液を吐出し特定の二次元パターンを形成させた（図３）。
【化２】
2016067315.tif 000003
（式（５）中、ｘ、ｙ、及びｚは、ｘ+ｙ+ｚ＝６を満たす。）
【００７８】
パターンが形成された基板に、酸素ガスとヘリウムガスを含む混合ガスをプラズマ源として発生させたプラズマガスを、リモート方式で、ガス流量１０Ｌ／ｍｉｎとして、９０秒間照射することで、親水性モノマーをプラズマ重合させると同時に、基板の滅菌を行い、細胞培養用基板を作製した。この際、酸素ガスとヘリウムガスの混合比は７：３とした。
【００７９】
（接触角の測定方法）
作製した細胞培養用基板に対して、純水を２μＬ滴下し、細胞培養用基板の各領域における水に対する接触角を測定した。測定部位の任意の２０箇所の接触角を測定し、その平均値を接触角として用いた。以下、接触角については同様の方法で測定した。
【００８０】
親水性モノマーをプラズマ重合させた領域の接触角は１８度であり、親水性モノマーが付着していない領域（ＰＳ表面）の接触角は５８度であった。なお、プラズマ照射前のＰＳ基板の接触角７０度以上であった。
【００８１】
（細胞培養）
二次元パターンを形成させた細胞培養用基板をガラスシャーレに静置し、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）２０μｇ／ｍＬと、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）２％と、を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s minimum essential medium）培地をガラスシャーレに加え、マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２を、５％ＣＯ2を含む湿潤空気中で３７℃、９６時間培養した。この際、培養液のｐＨを７．０に制御した。
【００８２】
培養後の細胞培養用基板を顕微鏡で観察すると、親水性モノマーがプラズマ重合した領域では細胞が増殖せず、親水性モノマーが付着していない領域（ＰＳ表面）では細胞が細胞培養用基板に接着して増殖している様子が観察された。
【００８３】
〔実施例２：親水性モノマーを親水性表面（ガラス基板）に吐出する例〕
（細胞培養用基板の作製方法）
基板として、ＰＳ基板に代えてガラス基板を用いたこと以外は実施例１と同様の方法で、ガラス基板上に二次元パターンを形成させた（図４）。
【００８４】
次に、二次元パターンを形成した基板に、メタンとヘリウムを含む混合ガスをプラズマ源として発生させたプラズマガスを、リモート方式で、ガス流量１０Ｌ／ｍｉｎとして、９０秒間照射することで、親水性モノマーをプラズマ重合させると同時に、ガラス基板の滅菌と、親水性モノマーが付着していない領域のガラス基板表面の疎水化を行い、細胞培養用基板を作製した。この際、メタンガスとヘリウムガスの混合比は７：３とした。
【００８５】
細胞培養用基板の水に対する接触角は、親水性モノマーをプラズマ重合させた領域で１８度であり、親水性モノマーが付着していない領域（ガラス基板表面）で５１度であった。なお、プラズマ照射工程前のガラス基板の接触角は２６度であった。
【００８６】
（細胞培養）
二次元パターンを形成させた細胞培養用基板をガラスシャーレに静置し、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）２０μｇ／ｍＬと、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）２％と、を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s minimum essential medium）培地をガラスシャーレに加え、マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２を、５％ＣＯ2を含む湿潤空気中で３７℃、９６時間培養した。この際、培養液のｐＨを７．０に制御した。
【００８７】
培養後の細胞培養用基板を顕微鏡で観察すると、親水性モノマーがプラズマ重合した領域では細胞が増殖せず、親水性モノマーが付着していない領域（ガラス基板表面）では細胞が増殖している様子が観察された。
【００８８】
〔実施例３：疎水性モノマーを親水性表面（ガラス基板）に吐出する例〕
（細胞培養用基板の作製方法）
下記式（７）で表される疎水性モノマー２０質量％、重合開始剤IRGACURE2959（BASF社製）１質量％、及びメタノール７９質量％を、スターラーを用いて十分に混合し、溶液を調製した。次に、調製した溶液を専用の溶液カートリッジに充填し、インクジェット記録装置にセットした後、市販のガラス基板上に、溶液を吐出し特定の二次元パターンを形成させた（図５）。
【化３】
2016067315.tif 000004
【００８９】
次に、二次元パターンを形成したガラス基板に、ヘリウムガスをプラズマ源として発生させたプラズマガスを、リモート方式で、ガス流量１０Ｌ／ｍｉｎとして、９０秒間照射することで、疎水性モノマーをプラズマ重合させると同時に、ガラス基板の滅菌を行い、細胞培養用基板を作製した。
【００９０】
細胞培養用基板の水に対する接触角は、疎水性モノマーをプラズマ重合させた領域で５５度であり、疎水性モノマーが付着していない領域（ガラス基板表面）で２６度であった。
【００９１】
（細胞培養）
二次元パターンを形成させた細胞培養用基板をガラスシャーレに静置し、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）２０μｇ／ｍＬと、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）２％と、を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s minimum essential medium）培地をガラスシャーレに加え、マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２を、５％ＣＯ2を含む湿潤空気中で３７℃、９６時間培養した。この際、培養液のｐＨを７．０に制御した。
【００９２】
培養後の細胞培養用基板を顕微鏡で観察すると、疎水性モノマーがプラズマ重合した部分のみで細胞が増殖している様子が観察された。
【００９３】
〔実施例４：疎水性モノマーを疎水性表面（ポリオレフィン基板）に吐出する例〕
（細胞培養用基板の作製方法）
基板として、ガラス基板に代えてポリオレフィン基板を用いたこと以外は実施例３と同様の方法で、ポリオレフィン基板上に同様の二次元パターンを形成させた（図６）。
【００９４】
次に、二次元パターンを形成した基板に、二酸化炭素とヘリウムを含む混合ガスをプラズマ源として発生させたプラズマガスを、リモート方式で、ガス流量１０Ｌ／ｍｉｎとして、９０秒間照射することで、親水性モノマーをプラズマ重合させると同時に、ガラス基板の滅菌と、疎水性モノマーが付着していない領域のポリオレフィン基板表面の親水化を行い、細胞培養用基板を作製した。この際、二酸化炭素ガスとヘリウムガスの混合比は８：２とした。
【００９５】
細胞培養用基板の水に対する接触角は、疎水性モノマーをプラズマ重合させた領域で５７度であり、疎水性モノマーが付着していない領域（ポリオレフィン基板表面）で２５度であった。なお、プラズマ照射工程前のポリオレフィン基板の接触角は８９度であった。
【００９６】
（細胞培養）
二次元パターンを形成させた細胞培養用基板をガラスシャーレに静置し、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）２０μｇ／ｍＬと、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）２％と、を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s minimum essential medium）培地をガラスシャーレに加え、マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２を、５％ＣＯ２を含む湿潤空気中で３７℃、９６時間培養した。この際、培養液のｐＨを７．０に制御した。
【００９７】
培養後の細胞培養用基板を顕微鏡で観察すると、疎水性モノマーがプラズマ重合した部分のみで、細胞が増殖している様子が観察された。
【００９８】
〔実施例５：三次元の実施例（親水性モノマーを疎水性基板上（ＰＳ基板）に吐出）〕
（細胞培養用基板の作製方法）
実施例１と同様の方法により、ＰＳ基板上に特定の二次元パターンを形成した。二次元パターンを形成した基板に、酸素とヘリウムガスをプラズマ源として発生させたプラズマガスを、リモート方式、ガス流量１０Ｌ／ｍｉｎ、１２０秒間照射することで（リモート方式、ガス流量１０Ｌ／ｍｉｎ）、親水性モノマーをプラズマ重合させると同時に、ＰＳ基板の滅菌を行った。この操作を１５回繰り返すことで、親水性モノマーがプラズマ重合したポリマーから成る厚みのある三次元パターンを形成させた（図７）。この際、酸素ガスとヘリウムガスの混合比は７：３とした。
【００９９】
（細胞培養）
三次元パターンを形成させた細胞培養用基板をガラスシャーレに静置し、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂ−ＦＧＦ）２０μｇ／ｍＬと、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）２％と、を含むＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s minimum essential medium）培地をガラスシャーレに加え、マウス骨格筋細胞Ｃ２Ｃ１２を、５％ＣＯ２を含む湿潤空気中で３７℃、９６時間培養した。この際、培養液のｐＨを７．０に制御した。
【０１００】
培養後の細胞培養用基板を顕微鏡で観察すると、細胞が三次元的に増殖している様子が観察された。
【符号の説明】
【０１０１】
１…処理装置、２…収容部、３…基板、４…プラズマ照射機構、５…キャリアガスライン、６…排ガスライン、７…キャリアガス貯留部、８…制御部、９ａ，９ｂ，９ｃ，９ｄ…ガス貯留部、１０…インクジェット記録装置、１１ａ,１１ｂ，１１ｃ…カートリッジ、１４…ヘッド、１８…制御部、２０…プラズマ照射手段、２１…プラズマ発生部、２２…ガス供給室、２３…電極対、２３ａ，２３ｂ…電極、２４…電源、２５…プラズマ照射ノズル、２６（２６ａ，２６ｂ）…排気管、２９…ガス貯留部
【図１】
2016067315.tif 000005
【図２】
2016067315.tif 000006
【図３】
2016067315.tif 000007
【図４】
2016067315.tif 000008
【図５】
2016067315.tif 000009
【図６】
2016067315.tif 000010
【図７】
2016067315.tif 000011