(57)【要約】【課題】凝集した血液からでも、血中希少細胞含有液を製造する方法を提供する。【解決手段】希少細胞を含む血液に血栓溶解薬を添加した後、フィルターを用いて希少細胞を捕捉する工程を含むことで、採決後４８時間以上経過した場合であっても、希少細胞と白血球を効率よく分離して希少細胞を選択的に含有する液を得ることが可能となる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少細胞を含む血液に血栓溶解薬を添加した後、フィルターを用いて希少細胞を捕捉する工程を含む希少細胞含有液の製造方法。
【請求項２】
前記血液を遠心分離した後、該血液から血漿又は血清を除去する工程を更に含む、請求項１に記載の希少細胞含有液の製造方法。
【請求項３】
前記希少細胞ががん細胞である請求項１又は２に記載の希少細胞含有液の製造方法。
【請求項４】
前記フィルターが金属フィルターである請求項１〜３のいずれかに記載の希少細胞含有液の製造方法。
【請求項５】
前記フィルターの最外層が金めっきであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の希少細胞含有液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中の希少細胞、特に血中循環がん細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＴｕｍｏｒＣｅｌｌ、以下、ＣＴＣという）を効率良く濃縮した希少細胞含有液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞濃縮の研究・臨床的意義は極めて大きく、血液中のがん細胞を濃縮することもできれば、がんの診断に応用することができる。例えば、がんの予後および治療の最も重要な要因は、初診時および処置時におけるがん細胞の転移の有無である。がん細胞の初期の拡散が抹消血中に及んだ場合、ＣＴＣを検出することは、がんの病状進行を判断する有用な手段である。しかしながら、血液中には、赤血球や白血球などの血液成分が圧倒的に多く存在するため、極めて少量のＣＴＣの検出は困難な状況にある。
【０００３】
近年、パリレンを用いた樹脂フィルターを使用することで、少量のＣＴＣを効率的に検出する方法が提案されている（特許文献１）。
【０００４】
或いは、樹脂の代わりに金属を用いたフィルターを使用することで、フィルターの強度を向上させ、白血球とがん細胞変形能の違いにより分離する方法も提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／１３５６０３号
【特許文献２】特開２０１３／４２６８９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
フィルターを用いて希少細胞を分離する方法（以下フィルター法と呼ぶ）は血液中の白
【０００７】
血球や赤血球、血小板を効率よく除去できるが、血液状態は個人の体質や、採血後の経過時間により異なる。
【０００８】
フィルター法は白血球の大きさと希少細胞の大きさの違い、変形能の違いで分離する方法である。この方法において、フィルターの材質、孔形状、孔径、開口率、流速を工夫することで、白血球と希少細胞をかなり分離可能である。
【０００９】
しかしながら、血液の状態が悪くなり凝集が進行すると、フィルターの孔を凝集物が塞ぎ、血液がそれ以上濾過できなくなる。又、濾過できても白血球がフィルター上に大量に残留し、希少細胞との分離ができない傾向がある。
【００１０】
通常、血液凝集を防ぐため、採血管にはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（以下、ＥＤＴＡ−２Ｎａという）や、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム等の抗凝固剤が用いられるが、これらの抗凝固剤を用いても、採血後長時間経過すると血液の凝集が進行する。
【００１１】
本発明は、以上のような問題点を鑑みてなされたものであり、凝集した血液からでも、希少細胞含有液を製造する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明者らが鋭意検討した結果、ＥＤＴＡ採血管により採血した血液は、採血後４８時間まではフィルターにて濾過可能であるが、４８時間以降はフィルター孔が目詰まりし濾過不能、もしくはフィルター上に白血球が３００００個以上残留し、希少細胞との効率良い分離ができないことが分かった。
【００１３】
フィルターの上に目詰まりした凝集物を顕微鏡観察したところ、繊維状物質に希少細胞と白血球が吸着し、凝集塊を形成していることが分かり、本発明に至った。
【００１４】
すなわち本発明は、血液に血栓溶解薬を添加した後、フィルターを用いて希少細胞を捕捉する工程を含む希少細胞含有液の製造方法に関する。発明者が鋭意観察した結果、採血後、血液は時間の経過と共に繊維素が生成し、繊維素と希少細胞及び白血球が絡まりあい、希少細胞と白血球の分離が困難になることを見出した。そのような血液に血栓溶解薬を添加することによって、繊維素が溶解し、白血球と希少細胞が分離し、フィルター法によって希少細胞を選択的に捕捉することが可能となると考えている。
【００１５】
なお、採血後間もない新鮮な血液であったとしても、抗凝固剤との混合が不十分な場合があり、そのような場合に対しても本発明の血栓溶解薬を加えることによって、支障なく希少細胞を捕捉することが可能となる。
【００１６】
なお、前記希少細胞ががん細胞である場合、好ましく適用できる。又、フィルターが金属フィルターである場合、強度が向上し、白血球と希少細胞の変形能の違いにより分離することが可能となるため好ましい。金属フィルター表面は、細胞毒性が低い金めっきであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によって、凝集した血液からでも、希少細胞含有液を得ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本実施形態に係るフィルターについて説明する図である。
【図２】本実施形態に係るＣＴＣ捕捉装置の構成を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の製造方法は、希少細胞を含む血液を遠心分離した後、該血液から血漿又は血清を除去する工程、残渣に血栓溶解薬を添加した後、フィルターを用いて希少細胞を捕捉する工程を含むことを特徴とする。このような製造方法にすることによって、凝集した血液からでも、フィルター法を用いて希少細胞を捕捉し、希少細胞含有液を得ることができるようになる。
【００２０】
本発明にかかる希少細胞について説明する。本発明の製造方法において、希少細胞は、血液中を循環する白血球、赤血球及び血小板以外の細胞を指す。希少細胞としては、ＣＴＣ、血中循環上皮細胞、がん幹細胞等が挙げられる。
【００２１】
本発明にかかる遠心分離について説明する。遠心分離は、試料を高速で回転させて遠心力を加え、試料中の特定の成分を分離又は分画する方法である。
【００２２】
血液を試料として用いた場合、回転数は１００〜１５００×ｇであることが好ましく、２００〜１３００×ｇがより好ましく、３００〜１０００×ｇがさらに好ましい。回転数が１００×ｇ以上であれば、血液より血球成分の分離ができ、１５００×ｇ以下であれば細胞が遠心力で破壊されるリスクを抑えることができる。
【００２３】
遠心時間は１〜６０分が好ましく、３〜３０分がより好ましく、５〜１５分がさらに好ましい。遠心時間が１分以上であれば、血液より血球成分の分離ができ、６０分以下であれば、作業時間の観点から好ましい。
【００２４】
本発明にかかる血漿及び血清について説明する。血漿は、抗凝固剤入り採血管で採血して放置又は遠心分離した場合に、血球成分の沈殿によりできる上澄みである。この血漿は凝固因子を含む。一方で、抗凝固剤の入らない採血管又はシリンジで採血して放置した場合、抗凝固剤が入らないため、血球成分が凝固因子により凝血する。その後更に放置又は遠心分離をした場合の上澄みが血清であり、血清は凝固因子を欠く。
【００２５】
血液を採取する際の採血管は、抗凝固剤が入ったものが好ましい。こうしたものの中にはＥＤＴＡ−２ＮａやＥＤＴＡ−２Ｋ、クエン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、ヘパリン等が挙げられる。
【００２６】
本発明にかかる血栓溶解薬について説明する。血栓溶解薬は、血液中に生じた血栓を溶解する試薬である。血栓溶解薬は、繊維素分解酵素であるプラスミンの前駆体であるプラスミノーゲンを活性化するか、プラスミノーゲンを活性化する作用を持つ因子を活性化することで、血栓を溶解する。繊維素溶解作用を持つ試薬として、ウロキナーゼ、アルテプラーゼ、モンテプラーゼ、パミテプラーゼ、Ａｎｔｉ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ  （Ｇｅｎｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）等が挙げられる。
【００２７】
本発明において、使用する血栓溶解薬は、プラスミノーゲンを活性化する作用、或いはプラスミノーゲン活性化因子を活性化する作用、またはその両方の作用を及ぼす成分を備えることが好ましい。
【００２８】
血栓溶解薬の反応時間は１〜６０分が好ましく、３〜３０分がより好ましく、５〜１５分がさらに好ましい。反応時間が１分以上であれば繊維素溶解反応が進行して、繊維素を溶解することができ、６０分以下であれば、作業時間の観点から好ましい。
【００２９】
血栓溶解薬の反応温度は２０〜３７℃が好ましく、２５〜３７℃がより好ましく、３０〜３７℃がさらに好ましい。反応温度が２０℃以上であれば血液中の繊維素を溶解することができ、３７℃以下であれば血栓溶解薬の成分の変性を抑え、特性を落とすことなく反応させることができる。
【００３０】
繊維素溶解反応を行う際は、血液試料を遠心分離し、血漿又は血清を除き、残渣に血栓溶解薬を加えたときに、マイクロピペットにより５〜３０秒間ピペッティングすることで、繊維素溶解反応を促進することができる。
【００３１】
遠心分離後の残渣に加える血栓溶解薬の量は、血液３ｍＬに対して２〜１０ｍＬが好ましく、３〜８ｍＬがより好ましく、４〜６ｍＬがさらに好ましい。加える量が２ｍＬ以上であれば、血液中の繊維素を溶解することができ、１０ｍＬ以下であれば、コスト及びフィルターを用いた捕捉の際の処理時間が短縮されるという観点から好ましい。
【００３２】
本発明にかかるフィルターについて説明する。本発明におけるフィルターは、血液から赤血球、白血球、及び血小板等の血液成分を取り除き、前記血液成分とは異なる性質を持つ希少細胞を捕捉するフィルターである。形状は、プラスチック又は金属の薄膜に、多数の貫通孔が形成されている。
【００３３】
フィルターを作製するための基板として使用する材料は銅（めっきが銅の場合はニッケル）が好ましい。銅は薬液による化学的溶解で容易に除去可能であり、フォトレジストとの密着力においても他の材料に比べると優れている。
【００３４】
フィルターの材質は金属からなることが好ましい。金属は加工性に優れている為、フィルターの加工精度を高めることができる。これにより、捕捉対象とする成分の捕捉率を更に向上させることができる。また、金属はプラスチックなどの他の材料と比べて剛直である為、外部から力が加わってもそのサイズや形状が維持される。この為、貫通孔よりも若干大きな成分を変形させて通過させる場合、より高精度の分離・濃縮が可能となる。
【００３５】
金属の主成分としては、ニッケル、銀、パラジウム、銅、イリジウム、ルテニウム、クロムのいずれか、もしくはこれらの合金が好ましい。
【００３６】
パラジウムやイリジウムは酸化還元電位が高く、難溶性で特性が良好だが高価である。ニッケルは水素よりも酸化還元電位が低いため、溶解しやすいが安価である。銀やパラジウムは貴金属であり、パラジウムやイリジウムに比べると比較的安価である。
【００３７】
貫通孔の開口形状は長方形或いは角丸長方形であることが好ましい。角丸長方形とは２つの等しい長さの長辺と２つの半円形からなる形状である。この形状であることにより、貫通孔に目詰まりしにくく、捕捉対象とする成分の捕捉率を更に向上させることができる。
【００３８】
本発明にかかる希少細胞の捕捉及び濃縮について説明する。本発明における捕捉とは、血液中より、通常の血液成分とは異なる性質を持つ希少細胞を、血液をフィルターで濾過することにより、血液成分と分離し、フィルター上に残留させることをいう。濃縮とは、ある溶液中における希少細胞の血液細胞に対する比率を高めることをいう。即ち、フィルターによる希少細胞の捕捉は、濃縮の一形態である。
【００３９】
フィルター上に捕捉した希少細胞は、フィルター上より回収を行い、希少細胞含有液を得ることができる。回収方法としては、逆洗、マイクロマニピュレーション、ピペッティング等が挙げられ、何れを用いても構わない。
【００４０】
逆洗について説明する。逆洗とは、フィルターの細胞捕捉面の反対側より液を流し、フィルター上に捕捉された希少細胞をはがし取ることをいう。
【００４１】
マイクロマニピュレーションについて説明する。マイクロマニピュレーションとは、ピコピペットを用いて希少細胞１つ１つを回収することをいう。
【００４２】
ピペッティングについて説明する。本発明の製造方法におけるピペッティングによる回収とは、フィルター上の液体をマイクロピペットを用いて混合し、フィルター上に捕捉された細胞をはがし取ることをいう。
【実施例】
【００４３】
（フィルター１）
【００４４】
感光性樹脂組成物（ＰＨＯＴＥＣ  ＲＤ−１２２５：厚さ２５μｍ、日立化成株式会社製）を２５０ｍｍ角の基板（ＭＣＬ−Ｅ６７９Ｆ：ＭＣＬの表面にピーラブル銅箔を貼り合わせた基板、日立化成株式会社製）の片面にラミネートした。ラミネート条件はロール温度９０℃、圧力０．３ＭＰａ、コンベア速度２．０ｍ／分で行った。
【００４５】
次に、光の透過部の形状が角丸長方形、サイズが７．８（短孔径）×１００（長孔径）ｍで開口率６．７％となるように設計したガラスマスクを基板のフォトレジストラミネート面に静置した。本実施例においては同一の方向を向いた角丸長方形が長軸及び短軸方向に一定のピッチで整列したガラスマスクを使用した。
続いて、６００ｍｍＨｇ以下の真空下において、ガラスマスクを載置した基板上部から紫外線照射装置によって露光量３０ｍＪ／ｃｍ２の紫外線を照射した。
【００４６】
短孔径、長孔径、開口率は図１のように定義する。即ち、角丸長方形の長辺が長孔径、短辺が短孔径であり、開口率（％）＝開口部分の面積／総面積×１００％とし、総面積とは、最も外側の開口部端部同士を結んでなり、全ての貫通孔を含むように形成された領域の面積を指す。
【００４７】
次に、１．０％炭酸ナトリウム水溶液で現像を行い、基板上に長方形のフォトレジストが垂直に立ったレジスト層を形成した。このレジスト付き基板の銅露出部分にｐＨが４．５になるように調整したニッケルめっき液中温度５５℃、約２０分間約２０μｍめっきを行った。ニッケルめっき液の組成を表１に示す。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
次に、得られたニッケルめっき層を基板のピーラブル銅箔とともに剥離し、このピーラブル銅箔を温度４０℃で約１２０分間、攪拌処理での薬液による化学的溶解（メックブライトＳＦ−５４２０Ｂ、メック株式会社）によって除去することにより金属フィルターとなる自立膜（２０ｍｍ×２０ｍｍ）を取り出した。
【００５０】
最後に、自立膜内に残ったフォトレジストを温度６０℃で約４０分間、超音波処理でのレジスト剥離（Ｐ３  Ｐｏｌｅｖｅ、Ｈｅｎｋｅｌ）によって除去し、微細貫通孔を有する金属フィルターを作製した。
これによって、シワ・折れ・キズ・カール等のダメージはなく、十分な精度の貫通孔を有する金属フィルターを作製した。
【００５１】
次に、酸性脱脂液Ｚ−２００（ワールドメタル製：商品名）に金属フィルターを浸漬し、金属フィルター上の有機物の除去を行った（４０℃３分）。
【００５２】
水洗後、非シアン系の無電解金めっきであるＨＧＳ―１００（日立化成製商品名）から金供給源である亜硫酸金を抜いた液により８０℃１０分の条件で置換金めっき前処理を行った。
【００５３】
次に非シアン系の置換型無電解金めっきであるＨＧＳ―１００（日立化成製商品名）に８０℃２０分浸漬し、置換金めっきを行った。置換金めっきの厚みは０．０５μｍであった。
【００５４】
水洗後、非シアン系還元型無電解金めっきであるＨＧＳ―５４００（日立化成製商品名）に６５℃１０分浸漬し、金めっきを行い、水洗後乾燥を行った。金めっきのトータル厚みは０．２μｍであった。
（実験）
（非小細胞肺がん細胞株の調製）
【００５５】
非小細胞がん細胞株であるＮＣＩ−Ｈ３５８細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて、３７℃、５％  ＣＯ２条件下にて静置培養した。トリプシン処理により培養皿から細胞を剥離させて回収し、リン酸緩衝液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）を用いて洗浄後、２ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ（以下洗浄液という。）に懸濁し、細胞懸濁液を得た。尚、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水であり和光純薬工業製製品コード１６６−２３５５５を用いた。ＢＳＡはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｎａｍｅ  ：  Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ−Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｐｏｗｄｅｒ，  Ｂｉｏ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のものを用いた。ＥＤＴＡは２Ｎａ（エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸二ナトリウム塩二水和物）（和光純薬工業製製品コード３４５−０１８６５）を用いた。
（血栓溶解薬処理した血液サンプル中のＣＴＣの捕捉・濃縮）
【実施例１】
【００５６】
３ｍＬの血液サンプルとして、ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有真空採血管に採血し、７２時間以上経過した健常者血液に、がん細胞が１０００個となる量の細胞懸濁液を加え、血液サンプル１を得た。
【００５７】
３ｍＬの血液サンプル１を４００×ｇ、１０分間遠心し、血漿成分と血球成分に分離し、血漿成分をマイクロピペットにて取り除いた。
【００５８】
血液サンプル１の残渣に、血栓溶解薬としてＡｎｔｉ  Ｃｌｏｔｔｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔを５ｍＬ加え、マイクロピペットで３０秒間よく混合し、混合液を調製した。
【００５９】
前記混合液を３７℃に設定したウォーターバスを用いて１０分加温し、繊維素溶解反応を行い、サンプル１を得た。
【００６０】
実施例で作製したフィルター１をカートリッジにセットした図２に示すＣＴＣ捕捉装置を用いて実験を行った。
【００６１】
ＣＴＣ捕捉装置は、被検液となる血液をフィルターによってろ過することで血液中に含まれるＣＴＣを捕捉する装置である。また、フィルターにより捕捉されたＣＴＣについて、染色液等の処理液を用いて染色することで、ＣＴＣの特定及びがん細胞の個体数のカウント等が行われる。
【００６２】
図２に示すように、ＣＴＣ捕捉装置１００は、ＣＴＣを捕捉するためのフィルターが内部に設けられたフィルターユニット１、フィルターユニット１に対して処理液（試薬）を供給するための軟質チューブからなる流路３（処理液流路／下流側流路）、フィルターユニット１に対して血液を供給するための軟質チューブからなる流路４（血液流路）が設けられている。流路３の上流側には、複数の処理液収納容器５に対して互いに異なる処理液（試薬）が入れられている。処理液収納容器５に投入される処理液としては、ＣＴＣを染色するための染色液、フィルターに捕捉されたＣＴＣ等を洗浄するための洗浄液、リンス液等が挙げられる。これらの複数の処理液収納容器５に対してはそれぞれ軟質チューブ６が挿入されて個別の流路（処理液流路／上流側流路）を形成している。そして、これらの流路が選択バルブ８に対して接続されており、選択バルブ８（選択バルブ）を回転させることにより流路３に対して接続する処理液（処理液収納容器５）が選択される。
【００６３】
フィルターユニット１に対して接続する流路４には、内部に血液が納められた血液収納容器１０（以下リザーバーとする）が接続されている。フィルターユニット１に対しては、処理液及び血液を同時に供給するのではなくいずれか一方を供給する構成となっているが、処理液及び血液のうちいずれの液体を供給するかの制御は流路３、４のそれぞれに対して取り付けられたバルブ１２、１３よって切り替える。例えば、血液をフィルターユニット１に対して供給する流す場合は、バルブ１２を閉とし、バルブ１３を開とする。バルブ１２、１３としては、軟質チューブを加圧変形させてその流れを遮断するピンチバルブを用いることができる。
【００６４】
また、フィルターユニット１に対して処理液及び血液のうちのいずれかの液体を供給する場合、フィルターユニット１の下流に設けられたポンプ１４（供給手段）によって吸引することで液体の供給が行われる。ポンプ１４は回転数変化により流路中の液体の流速を変えることが可能な構造となっている。ポンプ１４としては、例えば軟質チューブに対する加圧による蠕動点を順次移動させる蠕動ポンプ（ペリスタルティックポンプ）を用いることができる。ポンプ１４の駆動により、試薬・血液等の液体は流路３又は流路４の内部をフィルターユニット１に向かう方向に流れフィルターユニット１に供給される。そして、フィルターユニット１を通過した液体は、廃液タンク１６に流れ込む構造となっている。これらの構造により、血液中のＣＴＣがフィルターユニット１内の流路上に設けられたフィルターによって捕捉されると共に、染色液によりＣＴＣが染色される。
【００６５】
上記の各部の制御は、制御部４８（選択手段、送液手段）による制御により行われる。具体的には、選択バルブ８の制御は、制御部４８からの指示に基づいて選択バルブドライバ４９により行われる。また、バルブ１２、１３については、それぞれに対して接続された２つのバルブドライバ５０により制御が行われる。また、ポンプ１４の駆動についても、ポンプドライバ５１により制御が行われ、例えば、ポンプの回転数を変更させることで流量を可変とし、決められた最適な流量をフィルターユニット１に供給することで、血液中のＣＴＣの捕捉、捕捉したＣＴＣの染色を最適な流量条件で行うことを可能としている。制御部４８には、選択バルブ８、バルブ１２、１３、ポンプ１４のそれぞれについて駆動／停止等の制御を可能とするプログラムを入力するためのプログラム入力機能が備えられていて、これにより入力されたプログラムによって上記したように各機器を順に動作させる駆動機構が付加されている。
【００６６】
まず、リザーバーに洗浄液を導入し、フィルター上を満たした。続いて、サンプル１をリザーバーに導入し、ペリスタルティックポンプを使用して流速２００μＬ／分で送液を開始した。約１５分後、処理液収納容器５から３ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
【００６７】
次にＰＢＳに４％  ＰＦＡを溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。洗浄液で洗浄後、ＰＢＳに０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を溶かした液をカートリッジに入れ、細胞を１５分浸した。
【００６８】
洗浄液で洗浄後、処理液収納容器５から、２ｍＬの細胞染色液（ＦＩＴＣ標識抗Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体、１  μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）を導入し、フィルター上のがん細胞又は白血球を蛍光染色した。フィルター上に捕捉された細胞に対して３０分間染色を行った後、処理液収納容器５より３ｍＬの洗浄液を導入して細胞の洗浄を行った。
【００６９】
続いて、コンピューター制御式電気ステージ及び冷却デジタルカメラ（ＤＰ７０、オリンパス株式会社）を装備した蛍光顕微鏡（ＢＸ６１、オリンパス株式会社）を使用してフィルターを観察し、フィルター上のがん細胞及び白血球の数をカウントした。
ＦＩＴＣ、ＰＥ及びＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２由来の蛍光を観察するために、それぞれＢＮＡ、ＧＷ及びＵＮＡフィルター（オリンパス株式会社）を用いて画像を取得した。画像取得及び解析ソフトにはＬｕｍｉｎａ  Ｖｉｓｉｏｎ（三谷商事株式会社）を用いた。結果を表１に示す。細胞回収率（％）＝フィルターに回収されたＦＩＴＣ陽性細胞数／血液サンプルに混合したがん細胞数×１００％。白血球の数はＰＥで染色された細胞数とした。
【実施例２】
【００７０】
前記の血液サンプル１を用い、遠心分離及び血漿除去を行わなかったサンプル２を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【実施例３】
【００７１】
前記の血液サンプル１を用い、加える血栓溶解薬の量を２ｍＬとしたサンプル３を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【実施例４】
【００７２】
前記の血液サンプル１を用い、加える血栓溶解薬の量を１０ｍＬとしたサンプル４を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【実施例５】
【００７３】
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬の反応時間を１分としたサンプル５を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【実施例６】
【００７４】
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬の反応時間を６０分としたサンプル６を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【実施例７】
【００７５】
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬の反応温度を２０℃としたサンプル７を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【実施例８】
【００７６】
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬を加えたときにピペッティングを行わなかったサンプル８を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【比較例】
【００７７】
前記の血液サンプル１を用い、血栓溶解薬を加えず、反応、ピペッティング等を行わなかったサンプル９を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
【参考例】
【００７８】
サンプルとして、ＥＤＴＡ−２Ｎａ含有真空採血管でし、採血後６時間以内の健常者血液に、がん細胞が１０００個となる量の細胞懸濁液を加え、血栓溶解薬処理を行わなかったサンプル１０を用いた以外は、実施例１と同様の方法で行った。
（結果）
【００７９】
各実験例の実験条件を表２に示す。また、評価結果を表３に示す。実施例１に示すように、遠心分離の後、血漿を除去し、血栓溶解薬と反応させてフィルターにより処理を行うと、がん細胞の回収率が高く、白血球の残りも少ない。
【００８０】
【表２】
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【００８１】
【表３】
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【００８２】
実施例１及び２は、血漿除去の有無を変更した場合である。血漿を除去しない場合、血漿を除去したものと比較して若干特性が劣るが、フィルター法に適用可能であり、依然良好な特性を示す。
【００８３】
実施例１、３及び４は添加する血栓溶解薬の量を変更した場合である。５ｍＬ程度以上の添加量の場合、がん細胞回収率が高く、フィルター上に残存する白血球数が少ない。採血後の経過時間が短く、凝集の起きていない血液を使用した参考例と比較して、より濃縮の程度が高く、良好な特性を示す。添加量を２ｍＬまで減少させると、添加量が多い場合と比較して若干特性が劣るものの、依然として良好な特性を示す。反応に関与するプラスミノーゲン活性化因子濃度が一定度以上必要であることが示唆される。
【００８４】
実施例５及び６は繊維素溶解反応の反応時間を変更した場合である。反応時間が１０分程度以上の場合、良好な特性を示す。１分の場合、良好な特性を示すものの効果が小さい。これは、プラスミノーゲン活性化因子により、プラスミノーゲンがプラスミンに活性化され、プラスミンが繊維素を溶解する反応に必要な時間が５〜１０分程度であるためと考えられる。
【００８５】
実施例７は、反応温度を３７℃から２０℃に変更した場合である。この場合、３７℃で反応させた場合よりも若干効果は劣るが、依然良好な特性を示す。
【００８６】
実施例８は、ピペッティングによる繊維素溶解反応の促進を行わなかった場合である。この場合、良好な特性を示すもののピペッティングを行った場合よりも特性は劣る。これは、ピペッティングによる機械刺激を与えることが、繊維素溶解に有用であることを示唆している。
【００８７】
比較例は処理を何も行わずにフィルター処理を行った場合である。この場合、血液の凝集物によってフィルターが目詰まりし、液が流れなくなるため、測定不可能である。
【００８８】
参考例は採血からの経過時間が６時間以内と短く、血栓溶解薬で処理しない場合である。この場合、血液の凝集が起きていないため、良好な特性を示す。
【００８９】
以上示したように、本発明で示した血液への血栓溶解薬の添加とフィルターを用いた濾過の組み合わせにより、従来使用不可能であった凝集血液を使用可能とし、希少細胞の濃縮の程度が向上する。
【符号の説明】
【００９０】
１・・・フィルターユニット、３、４、６・・・流路、５・・・処理液収納容器、８・・・選択バルブ、１０・・・血液収納容器、１２、１３・・・バルブ、１４・・・ポンプ、１６・・・廃液タンク、４８・・・制御部、４９・・・選択バルブドライバ、５０・・・バルブドライバ、５１・・・ポンプドライバ、１００・・・ＣＴＣ捕捉装置
【図１】
2016086736.tif 000006
【図２】
2016086736.tif 000007