(57)【要約】      （修正有）【課題】遺伝子変異の程度がコントロールしやすく、品質を均一化しやすい、標準的なＡＴＬのモデル細胞及びモデル動物を提供する。ＡＴＬの実際の発症要因を備え、ＡＴＬの一般的な病態が反映されたモデル細胞及びモデル動物を提供する。より作製効率が高く、かつ、作製までの時間が短いＡＴＬのモデル細胞及びモデル動物を提供する。【解決手段】ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入され、必要に応じてＣＤＫＮ２ＡがノックアウトされたＴ細胞。当該細胞が導入されたＡＴＬモデル動物。これらの細胞及び動物を用いたＡＴＬ治療又は予防薬の評価方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＴ細胞。
【請求項２】
ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされた、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
アポトーシス抑制遺伝子が、アポトーシス抑制機能を有するＢｃｌ−２ファミリーの遺伝子である、請求項１又は請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
ＴＣＲシグナル関連遺伝子が、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路に含まれる遺伝子である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５】
ＡＴＬ疾患モデル細胞である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６】
動物胎児肝造血幹細胞由来Ｔ細胞に、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子を導入することを備える、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
【請求項７】
動物胎児肝幹細胞を間質細胞上で培養することにより、動物胎児肝幹細胞由来Ｔ細胞を製造することを備える、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
動物胎児肝幹細胞が、ＣＤＫＮ２Ａノックアウト動物胎児肝幹細胞である、請求項６又は請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞を備える非ヒト動物。
【請求項１０】
ＡＴＬ疾患モデル動物である、請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞を、非ヒト動物に導入することを含む、請求項９又は請求項１０に記載の非ヒト動物の作製方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞に、候補物質を接触させることを備える、候補物質のＡＴＬの治療効果又は予防効果の評価方法。
【請求項１３】
請求項９又は請求項１０に記載の非ヒト動物に、候補物質を投与することを備える、候補物質のＡＴＬの治療効果又は予防効果の評価方法。
【請求項１４】
非ヒト動物に候補物質を投与すること、該非ヒト動物に請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞を導入すること、及び、該非ヒト動物におけるＡＴＬの発症の有無又は程度を分析することを備える、候補物質のＡＴＬ予防効果の評価方法。
【請求項１５】
請求項９又は請求項１０に記載の非ヒト動物における遺伝子の量的又は質的変化とＡＴＬ発症の有無又は病態の進展度とを相関させることを含む、ＡＴＬ発症又は増悪化に影響する遺伝子の探索方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の疾患モデル細胞及び動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）は、レトロウイルスであるＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−１）の感染者の約５％が発症する極めて予後の悪い腫瘍である。ＡＴＬ発症の必要要件がＨＴＬＶ−１感染であることは１９８１年に見いだされたが、ＡＴＬの有効な治療法は未だに開発されていない。ＡＴＬの有効な治療法が開発できない理由の一つに、有効な疾患モデルが存在しないことがある。ＨＴＬＶ−１感染細胞又はＡＴＬ患者由来のＴ細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏレベルでは、容易に増殖しないことや、検体に限りがあることから、細胞株を用いた薬効評価を効率的に行うことができなかった。また、患者由来のＴ細胞の単離は非常に困難であるという問題があった。
【０００３】
更に、ＨＴＬＶ−１は感染から発症までの潜伏期間が長く、その間に多数の遺伝子変異を蓄積させるため、患者間でＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞の遺伝子変異プロファイルが異なることが知られている。よって、例えば、ある患者由来の細胞をモデルとして用いて薬剤の奏効性が確認されても、他の患者由来の細胞では奏効性を示さないという問題があった。このため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで容易にＡＴＬの治療効果を評価できる、標準的なモデル細胞株の確立が求められていた。
【０００４】
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルについては、ＨＴＬＶ−１がヒトのみならず動物のリンパ球にも感染することから、既にＨＴＬＶ−１感染動物モデルが作製されている。しかし、ＨＴＬＶ−１はマウスのリンパ球をトランスフォームすることができず、また、マウスやラットはＡＴＬを発症しないことから、マウスやラットのＨＴＬＶ−１感染動物モデルをＡＴＬの疾患モデルとして使用することができなかった。
【０００５】
また、ＨＴＬＶ−１感染ヒトリンパ球を動物に移植することによるモデル動物を作製することも報告されている。しかし、移植したＨＴＬＶ−１感染ヒトリンパ球は、モデル動物のＮＫ細胞により排除されるため、通常モデル動物として用いられる重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）を使用することができない。このため、複数のモデルマウスを掛け合わせて、ＨＴＬＶ−１感染ヒトリンパ球を移植可能なモデル動物を作製することが試みられている。例えば、ＳＣＩＤマウス、１型糖尿病モデルマウス、及びＩＬ−２受容体γ鎖ノックアウトマウスを掛け合わせたＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγｃ  ｎｕｌｌマウスが樹立されている。更に、ヒトの病態に近いモデル動物を作製するため、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ−２Ｒγｃ  ｎｕｌｌマウスにヒトＣＤ１３３陽性造血幹細胞を移植して、ヒトのリンパ球を有するヒト化マウスを作製し、当該ヒト化マウスに放射線処理したヒトＡＴＬ患者由来のＴ細胞株をウイルス源として投与して、ＡＴＬ疾患モデルマウスを作製したことが報告されている（非特許文献１）。
【０００６】
ＨＴＬＶ−１感染からＡＴＬの発症までの間には段階的なプロセスが存在していることが明らかとなっているが、その段階の全てが明らかにされたものではない。同じくＨＴＬＶ−１に感染しているにもかかわらず、ＡＴＬを発症する患者と発症しない患者の違いが生じる理由についても不明である。ＨＴＬＶ−１（又は、ウイルス源としてヒトＡＴＬ患者由来のＴ細胞株）を投与して作製されたモデル動物は、モデルの作製がＨＴＬＶ−１の感染に依存する点において、実際の発症と同じプロセスを経るという利点がある。しかし、上述の通り、ＨＴＬＶ−１の感染からＡＴＬ発症までの間には、段階的なプロセスが存在し、かつ、多数の遺伝子変異が経時的に蓄積するにもかかわらず、ＨＴＬＶ−１を投与することにより作製されたモデル動物の感染後のプロセスの進み具合やその速さ、遺伝子変異の程度を確認する手段が確立されていないため、例えば、薬効評価の時点で実際のＡＴＬの病態と同様に所定のプロセスを経ているか、又は、遺伝子変異が蓄積しているか否かを確認することができない。更に、ＨＴＬＶ−１を投与することにより作製されたモデル動物は、感染後の段階的なプロセスの進み具合や遺伝子変異の程度をコントロールすることができないことから、モデル動物としての品質を均一化することが困難である。
【０００７】
また、ＡＴＬの発症は、単純にＨＴＬＶ−１の感染のみにより引き起こされるものではなく、宿主ゲノムの変化が発病に関与していると考えられている。ＡＴＬを引き起こすために必要な宿主ゲノムの変異の数をワイフル分布（Ｗｅｉｂｕｌｌ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）により推定した結果、約５つであると計算されている（非特許文献２）。しかし、実際のＡＴＬ患者由来のＴ細胞においては、発症までの間に既に多数の遺伝子変異が蓄積していることから、ＡＴＬ患者由来のＴ細胞を用いたゲノム解析からこのようなＡＴＬ発症の真の原因となる変異を特定することは非常に困難であった。
【０００８】
このため、別のアプローチとして、ＨＴＬＶ−１のヒトＴ細胞内における挙動を解析することにより発症機序及び原因因子を突き止め、当該原因因子を利用してモデル動物を作製することが試みられている。ＨＴＬＶ−１は通常のレトロウイルスには存在しない塩基配列であるｐＸ領域を有する。このｐＸ領域にコードされるＴａｘ及びＲｅｘの二つの遺伝子の作用に注目した研究が行われている。特に、Ｔａｘは転写活性化因子であることから、Ｔａｘにより転写が活性化される宿主遺伝子の解析が進んでおり、Ｔａｘが細胞増殖促進遺伝子、細胞増殖抑制遺伝子、がん抑制遺伝子産物、細胞周期チェックポイント、アポトーシス促進遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＤＮＡ修復関連遺伝子を制御可能であることが報告されている。このため、ＡＴＬのモデル動物として、Ｔａｘを導入したトランスジェニックマウスが作製され、報告されている。
【０００９】
しかし、実際のＡＴＬ患者のＴ細胞はしばしばＴａｘを発現しておらず（非特許文献３）、Ｔａｘ以外のＡＴＬ発症原因遺伝子の存在が示唆された。その後、Ｔａｘ遺伝子のアンチセンスがコードするＨＴＬＶ−１  ｂＺＩＰ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＢＺ）が見いだされた（非特許文献４）。ＨＢＺはタンパク質レベルではＴａｘの転写活性を阻害するが、ＲＮＡレベルでは細胞の増殖を促進すること、及び、ほとんどのＡＴＬ患者においてその発現が確認されたことから、ＡＴＬの発症因子の一つであると考えられている。ＨＢＺがＡＴＬを引き起こす可能性があることから、ＡＴＬのモデル動物として、ＣＤ４特異的プロモーターの下流にＨＢＺを組み込んだトランスジェニックマウスが作製され、報告されている（非特許文献５）。
【００１０】
ＨＢＺ導入トランスジェニックマウスは、ＡＴＬ患者においてみられる白血病細胞と類似したリンパ腫細胞（フラワー細胞：Ｆｌｏｗｅｒ  ｃｅｌｌ）を生じることから、ＨＴＬＶ−１の感染に依存することなくＡＴＬの病態を反映していると考えられる。しかし、その発症率はＡＴＬ誘導から１年後に約１０％、２年後に約４０％と低く、発症率の低さと発症までに要する時間が長いことがモデル動物としての利用において問題となっていた（非特許文献５）。
【００１１】
本発明者らは、これまでｉｎ  ｖｉｔｒｏでマウス胎児肝幹細胞からＴ細胞及びＢ細胞を誘導することに成功しており、また、そのように作成したＴ細胞及びＢ細胞にＭｙｃ、Ｂｃｌ２、及びＣｃｎｄ１を導入することによりＴ細胞及びＢ細胞腫瘍を生成せしめることに成功している（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｋｅｎｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、２０１４；  １２３（３）：３４６−３５５
【非特許文献２】Ｔａｋａｓｈｉ  Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｐｎ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９８９；８０：１９１−１９５
【非特許文献３】Ｔａｋｅｄａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ、２００４；  １０９：  ５５９−５６７
【非特許文献４】Ｓａｔｏｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、２００６；１０３：７２０−７２５
【非特許文献５】Ｓａｔｏｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．、２０１１；７（２）：ｅ１００１２７４
【非特許文献６】Ｋｏｔａｒｏ  Ａｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２０１３；４１：７３１−７４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上述のＡＴＬ疾患モデル細胞及び動物における問題を解決可能なモデル細胞及びモデル動物を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、遺伝子変異の程度がコントロールしやすく、品質を均一化しやすい、標準的なＡＴＬのモデル細胞及びモデル動物を提供することを目的とする。別の側面において、本発明は、ＡＴＬの実際の発症要因を備え、ＡＴＬの一般的な病態が反映されたモデル細胞及びモデル動物を提供することを目的とする。更に別の側面において、本発明は、より作製効率が高く、かつ、作製までの時間が短いＡＴＬのモデル細胞及びモデル動物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、ＡＴＬ疾患モデル、特には治療が必要となる急性ＡＴＬ又は急性転化ＡＴＬの疾患モデルとして、より有用なモデル細胞及びモデル動物を作製するため、種々検討を行った。特に、本発明者らはＨＢＺの導入だけでは、ＡＴＬを発症することができず、更なる宿主側の遺伝子変異が必要であると考え検討を重ねた。その結果、マウス（特には、ＣＤＫＮ２Ａノックアウトマウス）胎児肝幹細胞より樹立したＴ細胞に、ＨＢＺ遺伝子、抗アポトーシス遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子の３種類の遺伝子を導入することにより、ＡＴＬ細胞と同様に細胞増殖刺激（サイトカイン）非存在下でも増殖可能な細胞株を作製できることを見出した。このことは、従来の計算によれば、実際にＡＴＬを発症させるためには５因子が必要と考えられていたにも関わらず、３〜４因子でＡＴＬを発症させることができることを初めて見出したものである。
【００１５】
更に、本発明者らは、作製した細胞をマウスに移植することにより、４０〜６０日程度という短期間で、高効率でＡＴＬに特徴的なｆｌｏｗｅｒ  ｃｅｌｌを生じ、ＡＴＬ様症状を発症するモデルマウスの作製可能であることを見いだし、本発明を完成させた。
【００１６】
よって、本発明は、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＡＴＬのモデル細胞／動物を提供するものである。具体的には、本発明は以下の発明を含む：
（１）  ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＴ細胞。
（２）  ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされた、（１）に記載の細胞。
（３）  アポトーシス抑制遺伝子が、アポトーシス抑制機能を有するＢｃｌ−２ファミリーの遺伝子である、（１）又は（２）に記載の細胞。
（４）  ＴＣＲシグナル関連遺伝子が、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路に含まれる遺伝子である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の細胞。
（５）  ＡＴＬ疾患モデル細胞である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の細胞。
（６）  動物胎児肝造血幹細胞由来Ｔ細胞に、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子を導入することを備える、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の細胞の製造方法。
（７）  遺伝子導入前に動物胎児肝造血幹細胞を間質細胞上で培養することにより、動物胎児肝幹細胞由来Ｔ細胞を調製することを備える、（６）に記載の製造方法。
（８）  動物胎児肝造血幹細胞が、ＣＤＫＮ２Ａノックアウト動物胎児肝幹細胞である、（６）又は（７）に記載の製造方法。
（９）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載の細胞を備える非ヒト動物。
（１０）  ＡＴＬ疾患モデル動物である、（９）に記載の非ヒト動物。
（１１）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載の細胞を、非ヒト動物に導入することを含む、（９）又は（１０）に記載の非ヒト動物の作製方法。
（１２）  （１）〜（５）のいずれか１項に記載の細胞に、候補物質を接触させることを備える、候補物質のＡＴＬの治療効果又は予防効果の評価方法。
（１３）  （９）又は（１０）に記載の非ヒト動物に、候補物質を投与することを備える、候補物質のＡＴＬの治療効果又は予防効果の評価方法。
（１４）    非ヒト動物に候補物質を投与すること、該非ヒト動物に（１）〜（５）のいずれか１項に記載の細胞を導入すること、及び、該非ヒト動物におけるＡＴＬの発症の有無又は程度を判定することを備える、候補物質のＡＴＬ予防効果の評価方法。
（１５）  （９）又は（１０）に記載の非ヒト動物における遺伝子の量的又は質的変化とＡＴＬ発症の有無又は病態の進展度とを相関させることを含む、ＡＴＬ発症又は増悪化に影響する遺伝子の探索方法。
【００１７】
一態様において、本発明は、ＡＴＬ疾患モデル細胞に関する。具体的には、本発明は、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＴ細胞に関する。本発明のＡＴＬ疾患モデル細胞は、必要に応じて、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされていてもよい。
【００１８】
本明細書において、「ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子」とは、がん抑制タンパク質であるサイクリン依存性キナーゼ阻害２Ａ（ＣＤＫＮ２Ａ）をコードする遺伝子である。例えば、ヒト、マウス（ハツカネズミ）、ハイイロジネズミオポッサム、ハネジネズミ、ラット（ドブネズミ）、イヌ、ネコ、ウシ、チンパンジー、ブタ、カニクイザル、ミドリザル等のＣＤＫＮ２Ａ遺伝子が報告されている。例えば、マウスの場合、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子として配列番号８に記載の塩基配列を有する遺伝子を挙げることができる。本発明におけるＣＤＫＮ２Ａ遺伝子は、哺乳類動物におけるあらゆるＣＤＫＮ２Ａ遺伝子を含む。また、本発明におけるＣＤＫＮ２Ａ遺伝子は、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子として報告されている核酸配列からなる遺伝子の他、そのような報告のある遺伝子において、１〜複数個（例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個等）の塩基の変異（即ち、置換、欠失、不可、及び／又は挿入）が含まれた遺伝子も含んでいてもよい。
【００１９】
本明細書において、「ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされた」とは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の機能が欠損し、及び／又は、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子が発現できないことを意味し、例えば、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子中に他の配列が挿入されていることを意味していてもよい。あるいは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされたとは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子の全長又はその一部が欠失していることを意味していてもよい。
【００２０】
「ＨＢＺ遺伝子」とは、ＨＴＬＶ−１ウイルスのｐＸ領域に含まれる、ＨＴＬＶ−１  ｂＺＩＰ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＢＺ）をコードする遺伝子（Ｓａｔｏｕ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、２００６；  １０３：  ７２０−７２５）である。実際には、ＨＢＺ遺伝子をコードする領域はイントロンを含むため、好ましくは、本明細書におけるＨＢＺ遺伝子は、ＨＢＺをコードするｍＲＮＡを鋳型として作製されたｃＤＮＡ（ＨＢＺｃＤＮＡ）である。例えば、本明細書におけるＨＢＺ遺伝子は、ＨＢＺのノンコーディング領域の−１から−３５ｂｐ（配列番号１の１４２番目〜１７６番目のヌクレオチド）からなるポリヌクレオチド、及び／又は、ＨＢＺコーディング配列（配列番号１の１７７番目〜７９７番目）からなるポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。特に、ＨＢＺについてはタンパクだけでなく、５’側のノンコーディング領域が二次構造をとるＲＮＡも重要との報告もあることから（Ｓａｔｏｕ  ｅｔ．ａｌ（２００６）  ＰＮＡＳ  １０３（３）：７２０−７２５）、本願のＨＢＺ遺伝子は、好ましくは、ノンコーディング領域の−１から−３５ｂｐ（配列番号１の１４２番目〜１７６番目のヌクレオチド）を含む。このようなＨＢＺ遺伝子、又は、ＨＢＺｃＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に記載の遺伝子が報告されている。本発明におけるＨＢＺ遺伝子は、ＨＢＺ遺伝子として報告されている核酸配列からなる遺伝子の他、ＨＢＺ遺伝子としての機能を維持する限り、（ｉ）そのような報告のある遺伝子において、１〜複数個（例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個等）の塩基の変異（置換、欠失、不可、及び／又は挿入）が含まれた遺伝子；（ｉｉ）そのような報告がある遺伝子と８０％以上（好ましくは、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上）の相同性を有する遺伝子；又は、（ｉｉｉ）そのような報告がある遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、「ＨＢＺ遺伝子としての機能」とは、Ａｋｔ、ＢｃｌＸＬと協調してｉｎ  ｖｉｔｒｏでサイトカイン非存在下、ストローマ細胞上でマウス胎児由来Ｔ細胞を増殖せしめる機能をいう。候補遺伝子がこのような機能を有するか否かは、本明細書の実施例記載の方法に準じて、当該候補遺伝子、Ａｋｔ、ＢｃｌＸＬを導入したマウス胎児由来Ｔ細胞をサイトカイン非存在下、ストローマ細胞上で培養し、増殖した場合にＨＢＺ遺伝子としての機能を有するとして決定することができる。
【００２１】
本明細書において、「アポトーシス抑制遺伝子」とは、アポトーシスに対して抑制する方向に働く遺伝子を意味する。好ましくは、アポトーシス抑制遺伝子は、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリー遺伝子又はこれらの遺伝子の発現を誘導する遺伝子である。アポトーシス抑制遺伝子は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を抑止し、かつ／又は、カスパーゼ９の活性化を抑制する遺伝子が好ましい。抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリー遺伝子としては、Ｂｃｌ−２、及びＢｃｌ−ｘＬ、Ａ１、Ｂｃｌ−ｗ、Ｍｃｌ−１遺伝子を挙げることができる。また、抗アポトーシスＢｃｌ−２ファミリー遺伝子の発現を誘導する遺伝子としては、Ｊａｋｓ、Ｓｒｃ、Ｅｒｋ１／２、ＰＫＣを挙げることができる。また、本願におけるアポトーシス抑制遺伝子は、ＦＬＩＰ、ｃ−ＩＡＰ  ｆａｍｉｌｙのＢＩＲＣ５（ｓｕｒｖｉｖｉｎとも呼ばれる）、ＮＡＩＰ、ＢＩＲＣ２（ｃ−ＩＡＰ１）、ＢＩＲＣ３（ｃ−ＩＡＰ２とも呼ばれる）、ＸＩＡＰ、ＢＩＲＣ７（ｌｉｖｉｎ、又はＭＬ−ＩＡＰとも呼ばれる）、ＢＩＲＣ８（ＩＬＰ２とも呼ばれる）、ＢＩＲＣ６（Ａｐｏｌｌｏｎ、又はＢｒｕｃｅとも呼ばれる）であってもよい。本発明におけるアポトーシス抑制遺伝子は、アポトーシス抑制遺伝子として報告されている核酸配列からなる遺伝子の他、アポトーシス抑制遺伝子としての機能を維持する限り、（ｉ）そのような報告のある遺伝子において、１〜複数個（例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個等）の塩基の変異（置換、欠失、不可、及び／又は挿入）が含まれた遺伝子；（ｉｉ）そのような報告がある遺伝子と８０％以上（好ましくは、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上）の相同性を有する遺伝子；又は、（ｉｉｉ）そのような報告がある遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、「アポトーシス抑制遺伝子としての機能」とは、当該遺伝子が導入された細胞にアポトーシスを誘導する刺激を付与しても、アポトーシスを抑制する機能をいい、例えば、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を抑止する機能、及び／又は、カスパーゼ９の活性化を抑制する機能であってもよい。好ましくは、Ａｋｔ、ＨＢＺと協調してｉｎ  ｖｉｔｒｏでサイトカイン非存在下でストローマ細胞上でマウス胎児由来Ｔ細胞を増殖せしめる機能をいう。候補遺伝子がこのような機能を有するか否かは、本明細書の実施例記載の方法に準じて、当該候補遺伝子、Ａｋｔ、ＨＢＺを導入したマウス胎児由来Ｔ細胞をサイトカイン非存在下、ストローマ細胞上で培養し、増殖した場合にＨＢＺ遺伝子としての機能を有するとして決定することができる。
【００２２】
本明細書において、「ＴＣＲシグナル関連遺伝子」とは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が抗原ペプチドと結合したＭＨＣ分子からの刺激を受けることにより誘導されるシグナルカスケードに含まれるタンパク質、又は、当該シグナルカスケードで活性化されるリン酸化タンパク質、あるいは、ＴＣＲの活性化を促進する共刺激受容体の補助シグナルカスケードに含まれるタンパク質、又は、当該補助シグナルカスケードで活性化されるリン酸化タンパク質をコードする遺伝子を意味する。このような遺伝子は本技術分野において当業者によく知られている。例えば、ＴＣＲシグナル関連遺伝子は、共刺激受容体であるＣＤ２８の活性化に伴う補助シグナルカスケードに含まれるタンパク質、又は、当該補助シグナルカスケードで活性化されるリン酸化タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。ＴＣＲシグナル関連遺伝子としては、例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路に含まれるタンパク質又はこれらのリン酸化タンパク質をコードする遺伝子であってもよく、具体的には、Ｖａｖ、ＰＫＣθ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、ＮＦκＢ、ＰＩ３Ｋ、ＰＤＫ１、Ａｋｔ、ｍＴＯＲ、又は、これらのリン酸化されたタンパク質を含む。また、ＴＣＲシグナル関連遺伝子は、Ｆｙｎ、Ｌｃｋ、ＺＡＰ−７０、ＬＡＴ、ＳＬＰ−７６、ＰＬＣ−γ，ＰＫＣθ、ＣＡＲＤ１１、ＢＣＬ１０、ＭＡＬＴ１、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ、ＮＦＡＴ、ＲａｓＧＲＰ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、Ｍｅｋ、Ｅｒｋ、Ｅｌｋ−１、ＪＮＫ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｔｅｃ、Ｉｔｋ、又はＢｔｋであってもよい。本発明におけるＴＣＲシグナル関連遺伝子は、ＴＣＲシグナル関連遺伝子として報告されている核酸配列からなる遺伝子の他、ＴＣＲシグナル関連遺伝子としての機能を維持する限り、（ｉ）そのような報告のある遺伝子において、１〜複数個（例えば、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、１〜３個等）の塩基の変異（置換、欠失、不可、及び／又は挿入）が含まれた遺伝子；（ｉｉ）そのような報告がある遺伝子と８０％以上（好ましくは、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上）の相同性を有する遺伝子；又は、（ｉｉｉ）そのような報告がある遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子であってもよい。ここで、「ＴＣＲシグナル関連遺伝子としての機能」とは、発現及び／又は活性化（例えば、リン酸化）することにより、ＴＣＲシグナルを活性化する機能をいい、例えば、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路を活性化する機能、又は、ＩＬ−２産生を促進させる機能を意味する。候補遺伝子がこのような機能を有するか否かは、例えば、当該遺伝子を導入し、発現させた細胞における、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路の活性化、又はＩＬ−２産生の変化を測定することにより判定することができる。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路の活性化は、例えば、ＰＩ３Ｋのリン酸化などの、経路の活性化の指標となる物質を測定して行うことができる。または、ＩＬ−２の産生量を測定し、産生量が増えた場合には、ＩＬ−２産生を促進させるとして判定することができる。
【００２３】
本明細書において、アミノ酸配列又は核酸配列の相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて当業者が通常用いる方法により決定することができる。また、本明細書において、ストリンジェントな条件でハイブリダイズか否かは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば、ストリンジェントなハイブリダイズの条件は、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０，２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ、その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。
【００２４】
本明細書において、「Ｔ細胞」とは、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４糖タンパク質を細胞表面に発現しているＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）のことである。Ｔ細胞の由来としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サル、ヒト等の哺乳動物を挙げることができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞であるか否かは、標識化抗ＣＤ４抗体を用いて細胞を染色し、染色された細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞であると判定することにより確認することができる。
【００２５】
本明細書において「ＡＴＬ疾患モデル細胞」とは、ＡＴＬ患者由来のＡＴＬ細胞の代わりに当該細胞のモデルとして用いられる細胞を意味する。ＡＴＬ疾患モデル細胞は、全てのＡＴＬ患者由来のＡＴＬ細胞の特徴を有する必要はなく、ＡＴＬの腫瘍化／急性転化／増悪化に必須の特徴を備えていればよい。例えば、ＡＴＬ疾患モデル細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、サイトカイン非存在下で細胞増殖能を維持する細胞、及び／又は、フラワーセルを生じる細胞である。また、ＡＴＬ疾患モデル細胞は、動物に移植することにより、腫瘍（例えば、胸腺腫大、リンパ節腫脹、及び／又は肝脾腫大）を形成することができる細胞であってもよい。更には、ＡＴＬ疾患モデル細胞は、動物に移植することにより、ＡＴＬに特徴的な異常細胞であるフラワー細胞を生じさせる細胞であってもよい。本明細書において、「ＡＴＬ疾患モデル細胞」は、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよく、好ましくは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされ、かつ、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００２６】
別の態様において、本発明は、ＡＴＬ疾患モデル動物に関する。具体的には、本発明は、上述の細胞を備える非ヒト動物に関する。本明細書において「（ＡＴＬ疾患モデル）細胞を備える非ヒト動物」とは、上述の（ＡＴＬ疾患モデル）細胞が移植された非ヒト動物を意味する。このような動物としては、疾患モデル動物として利用可能な動物であれば特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、サルを挙げることができる。好ましくは、移植する細胞と移植先の動物は同種である。
【００２７】
本明細書において「ＡＴＬ疾患モデル動物」とは、ＡＴＬ患者のモデルとして用いられる動物、例えば、ＡＴＬ様の病態を示すＴ細胞性腫瘍を惹起させる動物を意味する。ＡＴＬ疾患モデル動物は、全てのＡＴＬ患者の特徴を有する必要はなく、ＡＴＬの腫瘍化／急性転化／増悪化に必須の特徴を備えていればよい。例えば、ＡＴＬ疾患モデル動物は、腫瘍（例えば、胸腺腫大、リンパ節腫脹、及び／又は肝脾腫大）を形成することができる動物であってもよいし、かつ／又は、ＡＴＬに特徴的な異常細胞であるフラワー細胞を生じる動物であってもよい。本明細書において、「ＡＴＬ疾患モデル動物」は、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞が導入された動物であってもよく、好ましくは、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされ、かつ、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子が導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞が導入された動物である。好ましくは、ＡＴＬ疾患モデル動物は、骨髄、胸腺、脾臓、腫大しているリンパ節において、ＨＢＺ、ＢＣＬ−ＸＬ、及び、ｍｙｒＡｋｔが導入された細胞が生着している動物である。なお、ここでの生着とは、すべての細胞がＨＢＺ、ＢＣＬ−ＸＬ、及び、ｍｙｒＡｋｔ導入細胞であることを必要とするものではなく、その一部又は大半（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上）がＨＢＺ、ＢＣＬ−ＸＬ、及び、ｍｙｒＡｋｔ導入細胞であればよい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】レトロウィルスベクターの模式図である。上から順に、ＨＢＺ導入用ｐＳＩＮ−ｐｇｋ−ＨＢＺ−ｉｒｅｓ−ｈＣＤ８ベクター、ｍｙｒＡｋｔ導入用ＭＳＣＶ−ｍｙｒＡｋｔ−ｉｒｅｓ−ＧＦＰベクター、及び、Ｂｃｌ−ｘｌ導入用ＭＳＣＶ−ＢＣＬ−ＸＬ−ｉｒｅｓ−ｈＣＤ４ベクターを示す。
【図２】サイトカイン存在下で培養した遺伝子導入細胞における、各タンパク質の発現をＦＡＣＳ解析した結果を示すグラフ（Ａ〜Ｃ）、及び、サイトカイン存在下における該細胞の増殖を示すグラフ（Ｄ）である。「ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ」は、ＨＢＺ、Ｂｃｌ−ｘｌ、及びｍｙｒＡｋｔを導入したＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を示し、「ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ」はＢｃｌ−ｘｌ、及びｍｙｒＡｋｔを導入したＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を示す。図２Ａにおいて、Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ｍｙｒＡｋｔ（ＧＦＰ）及びＨＢＺ（右図）またはｈＣＤ８  ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ（ＥＶ）（左図）が導入された細胞の割合を示す。図２Ｂにおいて、Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ｍｙｒＡｋｔ及びＢＣＬ−ＸＬ（ｈＣＤ４）が導入された細胞の割合を示す。図２Ｃは、ｍｙｒＡｋｔでゲートかけた結果であり、Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ＣＤ４及びＣＤ８の割合を示す。図２Ｄにおいて、縦軸は細胞数を示し、横軸は遺伝子導入が確認された日を第０日とした経過時間（日）を示す。黒四角は、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を示し、黒丸はＥＶ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔを導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を示す。
【図３】サイトカイン非存在下で培養した遺伝子導入細胞における、各タンパク質の発現をＦＡＣＳ解析した結果を示すグラフ（Ａ〜Ｃ）、及び、サイトカイン非存在下における該細胞の増殖を示すグラフ（Ｄ）である。図３Ａにおいて、Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ｍｙｒＡｋｔ（ＧＦＰ）及びＨＢＺ（ｈＣＤ８）が導入された細胞の割合を示す。図３Ｂにおいて、Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ｍｙｒＡｋｔ及びＢＣＬ−ＸＬ（ｈＣＤ４）が導入された細胞の割合を示す。図３Ｃは、ｍｙｒＡｋｔでゲートをかけた結果であり、Ｘ軸及びＹ軸は、それぞれ、ＣＤ４及びＣＤ８の割合を示す。図３Ｄにおいて、縦軸は細胞数を示し、横軸は遺伝子導入が確認された日を第０日とした経過時間（日）を示す。黒四角はＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を示し、黒丸はＥＶ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔを導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を示す。
【図４】ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の１次移植マウスについての解析結果を示す。（Ａ）ＡＫＴ＋ＢＣＬ−ＸＬ、ＨＢＺ＋ＡＫＴ＋ＢＣＬ−ＸＬ、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ、及び、ＨＢＺ＋ｍｙｒＡｋｔの組み合わせで各遺伝子を組み合わせて導入したＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞、及び、ネガティブコントロールベクターを導入したＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を１次移植したマウスの生存曲線を示すグラフである。（Ｂ）移植後６２日目のＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の１次移植マウスの解剖写真である。（Ｃ）移植前の細胞と、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の１次移植マウスの各臓器（骨髄、胸腺、脾臓）から回収した細胞のＦＡＣＳ解析の結果を示す。左図の横軸はｍｙｒＡｋｔ（ＧＦＰ）、縦軸はＨＢＺ（ｈＣＤ８）、中図の横軸はｍｙｒＡｋｔ、縦軸はＢＣＬ−ＸＬ（ｈＣＤ４）が導入された細胞の割合をそれぞれ示す。右図は、ｍｙｒＡｋｔでゲートをかけた細胞のＣＤ４（横軸）／ＣＤ８（縦軸）マーカーの割合を示す。（Ｄ）ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の１次移植マウスの脾臓細胞の写真である。
【図５】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｔ細胞への遺伝子導入方法の概略図である。
【図６】各種遺伝子のＡＴＬ患者検体のｍＲＮＡ発現解析データを示すグラフである。左図は、主な抗アポトーシス遺伝子（ＢＣＬ２、ＢＣＬ−ＸＬ、ＭＣＬ１、ＢＣＬ−ｗ、ＢＣＬ２Ａ１）の発現を示す。右図は、ＣＤＫＮ２ＡとＡＫＴ１の発現を示す。グラフ中、黒丸は、ＡＴＬ患者個別の発現量（ｎ＝３７）、白丸は、健常人由来のＣＤ４＋細胞の発現量（ｎ＝６）を示す。縦軸は、各ｍＲＮＡ発現量のｌｏｇ２の値を示す。
【図７】２次移植マウスについての解析結果を示す。（Ａ）２次移植後４７日目のマウスを解剖した写真である。（Ｂ）  各臓器（骨髄、胸腺、脾臓、ｔｕｍｏｒ）のフローサイトメトリー解析の結果を示す。左図の横軸はｍｙｒＡｋｔ（ＧＦＰ）、縦軸はＨＢＺ（ｈＣＤ８）、中図の横軸はｍｙｒＡｋｔ、縦軸はＢＣＬ−ＸＬ（ｈＣＤ４）が導入された細胞の割合をそれぞれ示す。右図は、ｍｙｒＡｋｔでゲートをかけた細胞のＣＤ４（横軸）／ＣＤ８（縦軸）マーカーの割合を示す。（Ｃ）Ｔｕｍｏｒ細胞のサイトスピン標本の写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
一態様において、本発明は、動物胎児肝造血幹細胞由来Ｔ細胞に、ＨＢＺ遺伝子、アポトーシス抑制遺伝子、及びＴＣＲシグナル関連遺伝子を導入することを備える、ＡＴＬ疾患モデル細胞の製造方法に関する。本発明の方法は、具体的には以下のとおり行うことができる。
【００３０】
１．遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の作製
（１）レトロウイルスプラスミドの調製
（１−１）ＨＢＺ遺伝子を含むレトロウイルスベクター
ＨＴＬＶ−１  ｐｌａｓｍｉｄを鋳型として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりＨＢＺ遺伝子の所望の領域を伸長し、得られたＰＣＲ産物をレトロウイルスプラスミドの制限酵素サイトに挿入する。例えば、ＫＯＤ酵素を用いて、５８℃からのｔｏｕｃｈ  ｄｏｗｎ  ＰＣＲを行うことができる。また、ＰＣＲにおいて、１０％ＤＭＳＯ／ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えてもよい。得られたＰＣＲ産物を制限酵素で処理し、同じ制限酵素で処理したレトロウイルスベクターに挿入することができる。
【００３１】
（１−２）Ａｋｔ遺伝子を含むレトロウイルスベクター
Ａｋｔ遺伝子は、ヒト、ラット又はマウス等のＡｋｔの遺伝子又はｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより調製することができる。得られたＰＣＲ産物をレトロウイルスプラスミドの制限酵素サイトに挿入する。
【００３２】
（１−３）ＢＣＬ−ＸＬ遺伝子を含むレトロウイルスベクター
ＢＣＬ−ＸＬ遺伝子は、米国ミシガン大学Ｇ．  Ｎｕｎｅｚ教授より分与されたｐＢＳ−ｈｕＢｃｌ−ｘＬからＥｃｏＲＩで切り出し、レトロウイルスベクターにサブクローニングすることにより調製することができる（Ｂｏｉｓｅ ＬＨら，Ｃｅｌｌ．（１９９３）  Ａｕｇ  ２７；７４（４）：５９７−６０８）。
【００３３】
（２）Ｔ細胞の作製
Ｔ細胞（特には、ＣＤ４＋Ｔ細胞）は、本発明者らが既に報告した方法（Ａｒｉｔａ，Ｋ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（２０１３）４１：７３１−７４１）に準じて作成することができる。たとえば、マウスＴ細胞（特には、ＣＤ４＋Ｔ細胞）は、以下の方法により得ることができる。交尾後７〜２１日目（例えば、胎生１４日目）のマウス胎児（例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス）のｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒから胎児肝細胞を得る。Ｔｅｒ１１９マーカーネガティブの細胞をセレクションして、マウスＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（Ｆｌｔ３）リガンド（例えば、１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、５ｎｇ／ｍＬ）、及び、マウスＩＬ−７産生細胞株（例えば、Ｊ５５８Ｌ−ＩＬ７）培養物から得られた培養上清（例えば、０．１〜１０％、好ましくは、０．５〜１％）（又は、マウスＩＬ−７（例えば、０．１〜５０  ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、５  ｎｇ／ｍｌ％））の存在下、１０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ倍地中、Ｘ線を照射（例えば、１５Ｇｙ）した間質細胞（例えば、ＯＰ９−ＤＬ１間質細胞）と共培養する。細胞を回収し、０．１〜１００×１０４細胞／ウェルでフレッシュな間質細胞（例えば、ＯＰ９−ＤＬ１）層（フィーダー）上に播種する（０日目）。７日毎に新しいフィーダー上に５×１０４個／ｗｅｌｌを継代する。培養開始から１４日目〜２１日目にＴ細胞マーカーのＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の割合が最大となる。Ｔ細胞（特には、ＣＤ４＋Ｔ細胞）が作製できたことは、ＣＤ４、及び、必要に応じてＣＤ８の発現をフローサイトメトリーなどで検出することにより確認することができる。よって、ある態様において、本発明は動物胎児肝幹細胞を間質細胞上で培養することにより、動物胎児肝幹細胞由来Ｔ細胞を製造することを備える、ＡＴＬ疾患モデル細胞の製造方法に関する。
【００３４】
ある態様において、本発明はＣＤＫＮ２Ａノックアウト由来胎児肝造血幹細胞をＤＰ９／ＤＬ１間質細胞上で培養することにより、ＣＤＫＮ２Ａノックアウト動物胎児肝造血幹細胞由来Ｔ細胞を製造することを備える、ＡＴＬ疾患モデル細胞の製造方法に関する。ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子がノックアウトされたＣＤ４＋細胞は、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子ノックアウト動物（例えば、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子ノックアウトマウス）由来の胎児肝細胞を用いることにより作製することができる。なお、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子ノックアウト動物（例えば、ＣＤＫＮ２Ａ遺伝子ノックアウトマウス）は、当業者周知の方法により、適宜作製することができる。
【００３５】
（３）Ｔ細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入
ウィルス濃縮は、例えば、Ｐｅｇ−ｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行うことができる。マウス胎児肝細胞の共培養開始から１０〜２０日目（例えば、１５日目）にレトロネクチンを使って濃縮ウィルスを培養Ｔ細胞に感染させて遺伝子導入を行う。遺伝子導入から３〜１０日後に導入効率をフローサイトメトリーで確認することができる。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導Ｔ細胞への遺伝子導入の概略を図５に示す。
【００３６】
２．遺伝子導入Ｔ細胞の動物への導入（ＡＴＬ疾患モデル動物の作製）
上述の方法により作製した遺伝子導入Ｔ細胞（特には、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を、バルクで０．１〜１０×１０７個ずつ正常マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ６マウス）に経静脈的又は腹腔内に移植することにより、遺伝子導入Ｔ細胞（特には、ＣＤ４＋Ｔ細胞）を動物へ導入することができる（１次移植マウス）。また、１次移植マウスのＴ細胞を別の正常マウス（例えば、Ｃ５７ＢＬ６マウス）に同様に移植することにより、２次移植マウスを作製することができる。
【００３７】
３．候補物質のＡＴＬの治療効果又は予防効果の評価方法
（１）ＡＴＬ疾患モデル細胞を用いた評価方法
本発明のＡＴＬ疾患モデル細胞は、候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法に用いることができる。具体的には、本発明のＡＴＬ疾患モデル細胞は、ＡＴＬ細胞と同様にサイトカイン非存在下でも増殖を続けるため、候補物質添加によるＡＴＬ疾患モデル細胞の増殖抑制（例えば、増殖抑制率）を指標として、候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果を評価することができる。具体的には、本発明の候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法は、ＡＴＬ疾患モデル細胞に候補物質を接触させることを含む。より具体的には、本発明の候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法は、（ｉ）ＡＴＬ疾患モデル細胞に候補物質を接触させること、（ｉｉ）前記（ｉ）により得られた細胞、及び、当該候補物質を接触させないＡＴＬ疾患モデル細胞（コントロール）を培養すること、（ｉｉｉ）一定期間（例えば、２〜２８日間）培養後、両細胞の細胞数を比較して、当該候補物質を接触させたＡＴＬ疾患モデル細胞の細胞数がコントロールの細胞数よりも少ない場合には、当該候補物質はＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果がある物質であると判定することを含んでいてもよい。ＡＴＬ疾患モデル細胞への候補物質の接触は、（ｉｉ）の培養期間前及び／又は培養期間中に任意の期間（例えば、培養期間の一部の間、又は、全培養期間中）行うことができる。
【００３８】
また、本発明のＡＴＬ疾患モデル細胞を用いた評価は、既存薬との比較であってもよい。すなわち、本発明の候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法は、（ｉ）ＡＴＬ疾患モデル細胞に候補物質を接触させること、（ｉｉ）別のＡＴＬ疾患モデル細胞に比較対象薬を接触させること、（ｉｉｉ）前記（ｉ）により得られた細胞、及び、前記（ｉｉ）により得られた細胞（コントロール）を培養すること、（ｉｖ）一定期間（例えば、２〜２８日間）培養後、両細胞の細胞数を測定（及び比較）して、当該候補物質を接触させたＡＴＬ疾患モデル細胞の細胞数（又は増殖率）が当該比較対象薬を接触させたＡＴＬ疾患モデル細胞の細胞数（又は増殖率）よりも少ない（低い）場合には、当該候補物質は当該比較対象薬よりも優れたＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果がある物質であると判定することを含む方法であってもよい。ＡＴＬ疾患モデル細胞への既存薬及び候補物質の接触は、（ｉｉｉ）の培養期間前及び／又は培養期間中に任意の期間（例えば、培養期間の一部の間、又は、全培養期間中）行うことができる。また、本段落記載の既存薬との比較試験と同時に、全段落記載の非接触のＡＴＬ疾患モデル細胞（コントロール）との比較試験を行っても良い。
【００３９】
（２）ＡＴＬ疾患モデル動物を用いた評価方法
本発明のＡＴＬ疾患モデル動物は、候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法に用いることができる。具体的には、本発明のＡＴＬ疾患モデル動物は、ＡＴＬ様の病態を示すため、候補物質添加によるこのような病態の変化（改善）を指標として候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果を評価することができる。このような病態には、Ｔ細胞性腫瘍（例えば、胸腺腫大、リンパ節腫脹、及び／又は肝脾腫大）の形成；ＡＴＬに特徴的な異常細胞であるフラワー細胞の生成；並びに／あるいは、ＡＴＬ疾患モデル動物の（ＡＴＬによる）死亡が含まれる。具体的には、本発明の候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法は、ＡＴＬ疾患モデル細胞を導入した非ヒト動物（又は、ＡＴＬ疾患モデル動物、本段落において以下同様）に候補物質を接触させることを含む。より具体的には、本発明の候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法は、（ｉ）ＡＴＬ疾患モデル細胞を導入した非ヒト動物に候補物質を投与すること、（ｉｉ）前記（ｉ）により得られた動物、及び、当該候補物質を投与していないＡＴＬ疾患モデル細胞を導入した非ヒト動物（コントロール）を飼育すること、（ｉｉｉ）一定期間（例えば、２０〜１００日間）飼育後、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの判定方法により判定することを含んでいてもよい：（ａ）両非ヒト動物のＴ細胞性腫瘍（例えば、胸腺腫大、リンパ節腫脹、及び／又は肝脾腫大）の形成を比較して、当該候補物質を投与した非ヒト動物におけるＴ細胞性腫瘍の形成がコントロールにおけるＴ細胞性腫瘍の形成よりも軽度である場合には、当該候補物質はＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果がある物質であると判定する；（ｂ）両非ヒト動物から採取したＣＤ４＋Ｔ細胞を比較して、当該候補物質を投与した非ヒト動物におけるフラワーセルの細胞数（又は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるフラワーセルの割合）がコントロールにおけるフラワーセルの細胞数（又は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるフラワーセルの割合）よりも少ない（又は、低い）場合には、当該候補物質はＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果がある物質であると判定する；及び、（ｃ）両非ヒト動物の生存率を比較して、当該候補物質を投与した非ヒト動物の生存率がコントロールの生存率よりも高い場合には、当該候補物質はＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果がある物質であると判定する。なお、本段落に記載の候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法は、必要に応じて、上述の遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の動物への導入（ＡＴＬ疾患モデル動物の作製）方法、及び／又は、遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の作製方法を含んでいてもよい。また、本試験において、更に、比較対象として、ＡＴＬ疾患モデル動物へ既存薬を投与する群を設けても良い。ＡＴＬ疾患モデル動物への既存薬の投与は、上述の候補物質の投与に準じて行うことができる。ＡＴＬ疾患モデル動物への候補物質及び既存薬の投与は、例えば、一日当たり１〜５回の投与を、飼育期間中に１回（単回投与）又は複数回（反復投与）行うことができ、最大では飼育期間中毎日投与することができる。
【００４０】
（３）モデル動物におけるＡＴＬ疾患を誘導することを含む評価方法
また、本発明のＡＴＬ疾患モデル動物は、ＡＴＬ疾患モデル細胞を導入後比較的短期間（２０〜１００日程度）でＡＴＬを発症することから、候補薬剤の予防効果の評価に利用することができる。すなわち、候補薬剤投与後、動物にＡＴＬ疾患モデル細胞を導入してＡＴＬを発症させ、候補物質添加によるＡＴＬ発症の有無又は病態の進展度を指標として候補物質のＡＴＬ予防効果を評価することができる。よって、本発明は、非ヒト動物に候補物質を投与すること、該非ヒト動物にＡＴＬ疾患モデル細胞を導入すること、及び、該非ヒト動物におけるＡＴＬの発症の有無又は程度を分析することを備える、候補物質のＡＴＬ予防効果の評価方法を含む。具体的には、本発明は、
（ｉ）非ヒト動物に候補物質を投与すること、
（ｉｉ）前記（ｉ）により得られた非ヒト動物、及び、候補物質を投与していない非ヒト動物（コントロール）にＡＴＬ疾患モデル細胞を導入すること、
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）により得られた非ヒト動物を飼育すること、
（ｉｖ）一定期間（例えば、２０〜１００日間）飼育後、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも一つの判定方法により判定すること：
（ａ）両非ヒト動物のＴ細胞性腫瘍（例えば、胸腺腫大、リンパ節腫脹、及び／又は肝脾腫大）の形成を比較して、当該候補物質を投与した非ヒト動物におけるＴ細胞性腫瘍の形成がコントロールにおけるＴ細胞性腫瘍の形成よりも軽度である場合には、当該候補物質はＡＴＬ予防効果がある物質であると判定する；（ｂ）両非ヒト動物から採取したＣＤ４＋Ｔ細胞を比較して、当該候補物質を投与した非ヒト動物におけるフラワーセルの細胞数（又は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるフラワーセルの割合）がコントロールにおけるフラワーセルの細胞数（又は、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるフラワーセルの割合）よりも少ない（又は、低い）場合には、当該候補物質はＡＴＬ予防効果がある物質であると判定する；及び、（ｃ）両非ヒト動物の生存率を比較して、当該候補物質を投与した非ヒト動物の生存率がコントロールの生存率よりも高い場合には、当該候補物質はＡＴＬ予防効果がある物質であると判定する。本方法における、非ヒト動物へのＡＴＬ疾患モデル細胞の導入は、上述の遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の動物への導入（ＡＴＬ疾患モデル動物の作製）方法に準じて行うことができる。なお、本段落に記載の候補物質のＡＴＬ治療効果及び／又は予防効果の評価方法は、必要に応じて、上述の遺伝子導入ＣＤ４＋Ｔ細胞の作製方法を含んでいてもよい。また、本試験において、更に、比較対象として、ＡＴＬ疾患モデル動物へ既存薬を投与する群を設けても良い。ＡＴＬ疾患モデル動物への既存薬の投与は、上述の候補物質の投与に準じて行うことができる。ＡＴＬ疾患モデル動物への候補物質及び既存薬の投与は、例えば、一日当たり１〜５回の投与を、１回（単回投与）又は複数回（反復投与）（例えば、２〜５回）行うことができる。
【００４１】
４．ＡＴＬ発症又は増悪化に影響する遺伝子の探索方法
本発明のＡＴＬ疾患モデル細胞及びＡＴＬ疾患モデル動物は、３〜４遺伝子と非常に少ない数の遺伝子を操作しているにも拘らず、遺伝子導入（又は細胞導入）から比較的短期間でＡＴＬ様の病態を呈することから、ＡＴＬの発症に必須の因子を備えていると考えられる。即ち、本発明のモデルは、ＡＴＬ初期からＡＴＬ増悪化に至る間に起こる遺伝子変化の追跡を可能とするものである。よって、本発明のＡＴＬ疾患モデル細胞及びＡＴＬ疾患モデル動物は、新規ＡＴＬ治療剤／予防剤の開発のための新規標的候補を探索する目的で使用することができる。よって、一態様において、本発明は、ＡＴＬ疾患モデル動物における任意の遺伝子の量的又は質的変化とＡＴＬ発症の有無又は病態の進展度とを相関させることを含む、ＡＴＬ発症又は増悪化に影響する遺伝子の探索方法に関する。例えば、本発明は、（ｉ）ＡＴＬを発症したＡＴＬ疾患モデル細胞を導入した非ヒト動物（ＡＴＬ疾患モデル動物）とＡＴＬ疾患モデル細胞を導入していない当該非ヒト動物（コントロール）から、ＣＤ４＋Ｔ細胞を取得すること、（ｉｉ）前記（ｉ）において得られたＣＤ４＋Ｔ細胞における遺伝子発現をｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで測定すること、（ｉｉｉ）ＡＴＬ疾患モデル動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞における任意の候補遺伝子のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルとコントロール由来のＣＤ４＋Ｔ細胞における前記候補遺伝子のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを比較すること、（ｉｖ）コントロール由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＡＴＬ疾患モデル動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが高い遺伝子を、増加することによりＡＴＬの発症又は増悪化を促進させる遺伝子と判定し、及び／又は、コントロール由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＡＴＬ疾患モデル動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが低い遺伝子を、減少することによりＡＴＬの発症又は増悪化を促進させる遺伝子と判定することにより相関させることを含む、ＡＴＬ発症又は増悪化に影響する遺伝子の探索方法に関する。本方法において、「ＡＴＬを発症した」とは、ＡＴＬ様の症状を呈することを意味するが、すべてのＡＴＬの症状を呈する必要はなく、例えば、Ｔ細胞性腫瘍（例えば、胸腺腫大、リンパ節腫脹、及び／又は肝脾腫大）の形成が認められれば、ＡＴＬを発症したとすることができる。
【００４２】
あるいは、本発明のＡＴＬ発症又は増悪化に影響する遺伝子の探索方法は、ＡＴＬモデル細胞を導入した同一モデル動物の異なる時期に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞における遺伝子発現の変化を調べることにより、ＡＴＬ発症又は増悪化に関与する遺伝子を決定することにより行ってもよい。具体的には、本発明は、
（ｉ）ＡＴＬを発症していないか、又は、症状が軽度であるＡＴＬ疾患モデル細胞を導入した非ヒト動物（ＡＴＬ疾患モデル動物）からＣＤ４＋Ｔ細胞を取得すること、
（ｉｉ）前記（ｉ）において得られたＣＤ４＋Ｔ細胞における遺伝子発現をｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで測定すること、
（ｉｉｉ）前記ＡＴＬを発症していないか、又は、症状が軽度であるＡＴＬ疾患モデル動物を、ＡＴＬを発症するか、又は、症状が重度となるまで、一定期間飼育すること、
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）の飼育後のＡＴＬ疾患モデル動物からＣＤ４＋Ｔ細胞を取得すること、
（ｖ）前記（ｉｖ）において得られたＣＤ４＋Ｔ細胞における遺伝子発現をｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで測定すること、
（ｖｉ）前記（ｉ）において得られたＣＤ４＋Ｔ細胞における任意の候補遺伝子のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルと前記（ｉｖ）において得られたＣＤ４＋Ｔ細胞ＣＤ４＋Ｔ細胞における前記候補遺伝子のｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを比較すること、
（ｖｉｉ）前記（ｉ）において得られたＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、前記（ｉｖ）において得られたＣＤ４＋Ｔ細胞において、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが高い遺伝子を、増加することによりＡＴＬの発症又は増悪化を促進させる遺伝子と判定し、及び／又は、コントロール由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較して、ＡＴＬ疾患モデル動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞において、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルが低い遺伝子を、減少することによりＡＴＬの発症又は増悪化を促進させる遺伝子と判定することにより相関させることを含む、ＡＴＬ発症又は増悪化に影響する遺伝子の探索方法に関する。
【００４３】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００４４】
（実施例１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞の誘導、レトロウイルス感染及び移植
既に報告された方法（Ａｒｉｔａ，Ｋ．ら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（２０１３）４１：７３１−７４１）に従って、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を誘導した。ＣＤＫＮ２Ａ−／−  マウスは米国ＮＣＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）より提供を受けた。ＡＴＬの複合的な遺伝子異常による発症を解明するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導したＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞（以下、「ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞」という）に、複数の遺伝子の発現ベクターを作製してこれらの遺伝子を導入した。
【００４５】
（統計解析）
すべての解析はＥＺＲ（Ｓａｉｔａｍａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｊｉｃｈｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより入手）で行った。
【００４６】
（１）候補遺伝子の決定
候補遺伝子を決定するため、ＡＴＬ患検体ＡＴＬ３７例と正常人ＣＤ４＋細胞６例で比較した。すなわち、発現解析の結果をｌｏｇ２変換し、それぞれの遺伝子についてＡＴＬ患者と健常人ＣＤ４＋細胞でＴ−ｔｅｓｔを行ったところ、ＡＫＴとＢＣＬ−ＸＬはそれぞれＡＴＬ患者において確かに優位な発現差が見られた（ｐ＜０．０５；図６）。ＢＣＬ−ＸＬについては他の主な抗アポトーシス遺伝子についても調べたが、ＡＴＬで優位に高発現しているのはＢＣＬ−ＸＬのみだった。そこで、ＨＢＺ、ＢＣＬ−ＸＬ、及びｍｙｒＡｋｔ遺伝子を選択し、これらの発現ベクターをＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞に導入した。
【００４７】
また、ＨＢＺ、ＢＣＬ−ＸＬ、及び、ｍｙｒＡｋｔを導入したＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞（ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞）の他、コントロールとしてＥｍｐｔｙベクター（ＥＶ）、ＢＣＬ−ＸＬ、及び、ｍｙｒＡｋｔを導入したＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞（ＥＶ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞）も作製した。
【００４８】
（２）レトロウイルスベクター
ＨＢＺ遺伝子を含むレトロウイルスベクターは、東京大学石田尚臣先生から提供を受けたＨＴＬＶ−１  ｐｌａｓｍｉｄを鋳型として、ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりノンコーディング領域の−１から−３５ｂｐを含む蛋白質コード領域ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐＳＩＮ−ｐｇｋ−ｉｒｅｓ−ｈＣＤ８プラスミドのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩサイトに挿入することにより作製した。ＨＴＬＶ−１がコードするＨＢＺについてはタンパク質だけでなく、５’側のノンコーディング領域が二次構造をとるＲＮＡも重要との報告があることから（Ｓａｔｏｕ  ｅｔ．ａｌ  ＰＮＡＳ  ２００５、前掲）、ノンコーディング領域の−１から−３５ｂｐを含む発現ベクターを作製した（図１）。
具体的には、１回目のＰＣＲを、センスプライマー：５’−ＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧＧＣＧＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＴＴ−３’（配列番号３）、及び、アンチセンスプライマー：５’−ＴＴＡＴＴＧＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＴＣ−３’（配列番号４）のプライマーセットを用いて行った。２回目のＰＣＲは、センスプライマー：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＣＧＧＣＡＧＡＡＣＧＣＴＴＣＡＡＣＣＧ−３’  （配列番号５）、及び、１回目と同じアンチセンスプライマー（配列番号４）のプライマーセットを用いて行った。使用した酵素はＫＯＤで５８℃からのｔｏｕｃｈ  ｄｏｗｎ  ＰＣＲを行った。その際に１０％ＤＭＳＯ／ｇｌｙｃｅｒｏｌを加えた。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩで処理し、同じ制限酵素で処理したｐＳＩＮ−ｐｇｋ−ｉｒｅｓ−ｈＣＤ８ベクターに挿入した。
【００４９】
Ａｋｔ遺伝子は、ラットＡｋｔのｃＤＮＡ（神戸大学バイオシグナル研究所  吉川  潮教授より供与）を鋳型としてＰＣＲを行うことにより調製した。
【００５０】
ＢＣＬ−ＸＬ遺伝子は、Ｎｕｎｅｚ  Ｇ先生からいただいたコンストラクトをＥｃｏＲＩサイトで切り出し、ＭＳＣＶ−ｉｒｅｓ−ｈＣＤ４ベクターにサブクローニングすることにより調製した（Ｂｏｉｓｅ  ｅｔ．ａｌ．  Ｃｅｌｌ  １９９３）。
（３）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導Ｔ細胞への遺伝子導入
胎生１４日目のマウスｆｅｔａｌ  ｌｉｖｅｒから取り出した細胞をＴｅｒ１１９マーカーネガティブの細胞をセレクションし、ＯＰ９−ＤＬ１上で１０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ、０．５％マウスＩＬ−７、５ｎｇ／ｍｌＦｌｔ３Ｌを加えて６ｗｅｌｌディッシュで培養する。１週間ごとに新しいｆｅｅｄｅｒに５×１０４個／ｗｅｌｌずつ継代すると、Ｄａｙ１４〜２１にかけてＴ細胞マーカーのＣＤ４及びＣＤ８陽性細胞の割合が最大となった。
ウィルス濃縮は、Ｐｅｇ−ｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。Ｄａｙ１５にＰｅｇ  ｉｔで濃縮したウィルスをさらにレトロネクチン（ＴａＫａＲａ）を使って培養Ｔ細胞に感染させて遺伝子導入を行った。Ｄａｙ２１に継代とともに導入効率をフローサイトメトリーで確認し、遺伝子が導入された細胞はｉｎ  ｖｉｖｏ／ｖｉｔｒｏアッセイに用いた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導Ｔ細胞への遺伝子導入の概略を図５に示す。
【００５１】
（３）フローサイトメトリー分析及びセルソーティング  
各臓器の細胞は回収後、１×ＡＣＫで溶血処理した。表面マーカーは、抗ヒトＣＤ８−ビオチン、ＣＤ４−ビオチン、抗マウスＣＤ４−ビオチン、ＣＤ８−ＰＥ、ＣＤ２５−ＰＥ、ＣＤ３−ビオチン、アビジン−ＡＰＣ（全て、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して検出した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳ  ｃａｌｌｉｂｅｒ（ＢＤ）を用いて行い、セルソーティングは、ＪＳＡＮ（ベイバイオサイエンス）を用いて解析した。ＨＢＺが発現すると、ヒトＣＤ８が表面に発現し、ＢＣＬ−ＸＬが発現すると、表面にヒトＣＤ４が発現することから、ＨＢＺはヒトＣＤ８，ＢＣＬｘＬはヒトＣＤ４，ＡｋｔはＧＦＰで確認した。
【００５２】
（４）増殖活性測定
ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞と、ＥＶ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の２種類について、遺伝子が導入されたことをＦＡＣＳにて確認した時点を第０日目（Ｄａｙ０）とし、それぞれのバルク細胞を１×１０５個ずつＯＰ９−ＤＬ１ストローマ細胞上でサイトカイン（５ｎｇ／ｍｌ  マウスＦｌｔ３  ｌｉｇａｎｄと０．５％マウスＩＬ−７）存在下で培養した。ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞と、ＥＶ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の２種類についてサイトカインを抜いて増殖実験を行った。いずれも、第７日目（Ｄａｙ７）に、ｍｙｒＡｋｔ（ＧＦＰ）、ＨＢＺ、ＥＶ（ｈＣＤ８）、ＢＣＬ−ＸＬ（ｈＣＤ４）、ＣＤ４及びＣＤ８の各タンパク質の存在についてＦＡＣＳ解析を行った（左図）。
【００５３】
（６）結果
サイトカイン存在下で培養した各細胞の第７日目（Ｄａｙ７）におけるＦＡＣＳ解析の結果を図２Ａ−Ｃに示す。また、サイトカイン存在下で培養した各細胞の増殖曲線を図２Ｄに示す。また、サイトカイン非存在下で培養した各細胞の第７日目（Ｄａｙ７）におけるＦＡＣＳ解析の結果を図３Ａ−Ｃに示す。また、サイトカイン非存在下で培養した各細胞の増殖曲線を図３Ｄに示す。コントロールであるＥＶ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞はサイトカイン存在下では増殖し続けたが（図２Ｄ）、非存在下では増殖しなかった（図３Ｄ）。一方、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞は、サイトカイン非存在でも増殖能を維持していた。すなわち、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔを導入することにより、ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞はサイトカインがなくてもＯＰ９−ＤＬ１上で増殖することが確認された。また、ＦＡＣＳ解析の結果から、サイトカイン非存在下で増殖した細胞は、ＨＢＺ、ＢＣＬ−ＸＬ、ｍｙｒＡｋｔが、９０％以上の細胞に導入されていることが確認された（図３Ａ−Ｃ）。
【００５４】
（実施例２）ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞導入ＡＴＬ疾患モデル動物の作製と評価
（１）ＡＴＬ疾患モデル動物の作製
ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞をバルクで０．５〜１×１０７個ずつ正常Ｃ５７ＢＬ６マウス（チャールズリバー）に移植した（ｎ＝８）。比較対照として、ｐＳＩＮ−ｈＣＤ８とＭＳＣＶの空ベクター（ＥＶ）を導入した細胞（ｎ＝２）（陰性対象）、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ＭＩＧ（ｎ＝５）、ＨＢＺ＋ｍｙｒＡｋｔ＋ＭＳＣＶ−ｈＣＤ４（ｎ＝３）、又は、ｐＳＩＮ−ｈＣＤ８ベクター＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴ（ｎ＝５）を導入した細胞の０．５〜１．０×１０７細胞をそれぞれ正常Ｃ５７ＢＬ６マウス（チャールズリバー）に移植した。移植日を第０日として、毎日各マウスの生存について調べた。生存曲線はＥＺＲで解析し、ｌｏｇｒａｎｋ検定を行った。また、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の１次移植マウスは、細胞移植後６２日目に衰弱したため、解剖した。また、移植前の細胞と、移植後のマウスから得られた骨髄、胸腺、脾臓から細胞を回収し、１×ＡＣＫで溶血処理した。回収した細胞についてＦＡＣＳ解析を行い、ＨＢＺ、Ｂｃｌ−ｘｌ、ｍｙｒＡｋｔ、ＣＤ４、ＣＤ８の発現を確認した。
また、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞移植マウス由来の５×１０４個の脾臓細胞からサイトスピン標本を作製し、メイギムザ染色したものを４００倍で観察した。
【００５５】
（２）結果
生存曲線を図４Ａに示す。Ｌｏｇｒａｎｋ検定を行うと、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を移植したマウスは、他の群と比較して早期に全例が死亡した（ｐ＝０．１３３）。衰弱したマウス（ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞の１次移植マウス）を解剖すると胸腺の腫大が観察された（図４Ｂ）。ＦＡＣＳ解析により、移植前のほとんどの細胞において、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴの３つの遺伝子の導入が確認された。移植したマウスから回収した細胞においても導入したＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡＫＴの３つの遺伝子の全てを持つ細胞が検出された（図４Ｃ）。特に腫大していた胸腺から回収した細胞は、ほとんどの細胞が３つの遺伝子全てを持っていた（約８３％）。３つの遺伝子の全てを持つ細胞は、骨髄には生着していなかったが、脾臓においては生着が確認された（７．８％）。移植したマウスの胸腺細胞のｐｈｅｎｏｔｙｐｅはＣＤ４／８ＤＰ（ＣＤ４及びＣＤ８ダブルポジティブ、以下同様）細胞がほとんどであった。一方、脾臓の移植細胞は一部がＣＤ４ＳＰ（ＣＤ４シングルポジティブ、以下同様）になっていた（３２％）。
また、ＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞移植マウス由来の５×１０４個の脾臓細胞からサイトスピン標本を作製し、メイギムザ染色したものを４００倍で観察した結果を図４Ｄに示す。マウスの脾臓から回収した細胞から、急性型ＡＴＬに特徴的な核に切れ込みのある核分葉を示す異常リンパ球のｆｌｏｗｅｒ  ｃｅｌｌが検出された（約１０％）。このような細胞は、他の臓器の標本では観察されなかった。
【００５６】
（実施例３）２次移植マウスの作製と解析
（１）二次移植マウスの作製
胸腺が腫大していた１次移植マウスの胸腺細胞を別の正常Ｃ５７ＢＬ６マウスに移植することにより、２次移植マウスを作製し、同様に観察及び解析を行った。２次移植後４７日目で衰弱、顎下に腫瘤が認められたため、解剖した。腫大している顎下リンパ節と思われる部位を「ｔｕｍｏｒ」とした。
各臓器（骨髄、胸腺、脾臓、ｔｕｍｏｒ）のフローサイトメトリー解析を、１次移植の時と同様に行った。
また、ＪＳＡＮにてｔｕｍｏｒのＣＤ４ＳＰ細胞をソート後、サイトスピン標本を作製し、メイギムザ染色し、４００倍で観察した。
（２）結果
２次移植後４７日目のマウスを解剖したところ、１次移植のマウスと同様に胸腺が腫大していた（図７Ａ）。顎下リンパ節と思われる部位も腫大していた（以降、この部位をｔｕｍｏｒとした）。
各臓器（骨髄、胸腺、脾臓、ｔｕｍｏｒ）のフローサイトメトリー解析の結果、３つの遺伝子が導入された細胞が骨髄（８３．５％）、胸腺（約８８．８％）。脾臓（３９．８％）に生着していた（図７Ｂ）。Ｔｕｍｏｒから回収した細胞は、ほとんどが遺伝子導入細胞であった（９１．３％）。ＣＤ４とＣＤ８のフラクションはＧＦＰ（ｍｙｒＡＫＴ）でゲートされた細胞を観察しており、２次移植マウスの胸腺細胞はＣＤ４／８ＤＰ細胞だけでなく、ＣＤ４ＳＰ細胞の割合が１次移植マウスより増えていた（２３．９％）。また、骨髄、及びＴｕｍｏｒでもＣＤ４ＳＰ細胞が観察された（２６．１％と３６％）。ＪＳＡＮにてｔｕｍｏｒのＣＤ４ＳＰ細胞をソート後、サイトスピン標本を作製し、メイギムザ染色した（図７Ｃ）。４００倍で観察したところ、Ｆｌｏｗｅｒ  ｃｅｌｌが検出された。このことからＨＢＺ＋ＢＣＬ−ＸＬ＋ｍｙｒＡｋｔ導入ＣＤＫＮ２Ａ（−／−）Ｔ細胞を移植したマウスにおいて、ＡＴＬ様の病態を示すＴ細胞性腫瘍を惹起させることができることが確認された。
【００５７】
これらの結果より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導Ｔ細胞の系において、ＨＢＺと遺伝子異常を組み合わせることで、正常Ｔ細胞を増殖促進することができた。また、Ｃ５７ＢＬ６マウスでＡＴＬ様の腫瘍を簡便に再現させることに成功した。更に、ＡＴＬの遺伝子異常の組み合わせの重要な１パターンを決定することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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