(57)【要約】【課題】細胞をインクジェットで吐出する際に同時に吐出される培養液を除去し、かつ必要に応じて新鮮な培養液を供給し、細胞を三次元形状に組織的に配列させ培養させること。【解決手段】細胞を含んだ培養液を供給する供給部と、細胞を配置し培養する培養台を有する培養皿と、培養皿に前記培養液を供給するための培養液供給装置と、培養皿から培養液を除去するための培養液除去装置と、を備えた細胞培養装置を用いる。  また、細胞を含んだ培養液を、複数の貫通穴を有する培養台にインクジェットヘッドで吐出する吐出工程と、培養台の複数の貫通穴より、培養液を供給・除去する供給除去工程と、を含むことを特徴とする細胞培養方法を用いる。【選択図】図１
2016096741.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含んだ培養液を供給する供給部と、
前記細胞を配置し培養する培養台を有する培養皿と、
前記培養皿に前記培養液を供給するための培養液供給装置と、
前記培養皿から前記培養液を除去するための培養液除去装置と、を備えた細胞培養装置。
【請求項２】
前記供給部がインクジェットヘッドである請求項１記載の細胞培養装置。
【請求項３】
さらに、前記培養液の供給と除去を切り替えするための切り替え部を、有する請求項１または２記載の細胞培養装置。
【請求項４】
さらに、
前記培養皿と前記切り替え部を接続するための第１配管と、
前記切り替え部と前記培養液供給装置を接続するための第２配管と、
前記切り替え部と前記培養液除去装置を接続するための第３配管と、を備えた、細胞培養装置。
【請求項５】
前記培養台は前記培養皿の底部より突出をしていることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項６】
前記培養台の前記細胞を培養する上面には、開口径が前記細胞の大きさ以下の貫通孔が複数存在し、かつ、前記上面の位置により前記貫通孔の密度が異なることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項７】
前記培養台の上面の中央部は、前記培養台の上面の外周部より、前記貫通孔の密度が小さいことを特徴とする請求項６に記載の細胞培養装置。
【請求項８】
前記培養台の内部には前記貫通孔だけでなく、直線或いは曲線状の溝が位置するもことを特徴とする請求項６または７記載の細胞培養装置。
【請求項９】
前記貫通孔は２層構造を形成しており、第１層目には前記貫通孔が複数形成され、第２層目には、複数の前記貫通孔と接続し第１の流路が形成されていることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載細胞培養装置。
【請求項１０】
前記第１の流路の幅は前記貫通孔の径よりも大きい幅であることを特徴とする請求項９記載の細胞培養装置。
【請求項１１】
前記培養皿の内部には、複数の前記貫通孔に接続した流路が複数存在し、かつ、異なった前記流路の前記培養液を独立して供給及び除去できることを特徴とする請求項６〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１２】
前記培養台の上面に同心円状に、前記培養台の上面の中央部から外周部方向か、或いは、外周部から中央部方向へ傾斜を設けることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１３】
さらに、前記培養台と前記培養皿の間に配置されるシール材を備え、
前記培養台と前記培養皿とが分離可能である請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項１４】
細胞を含んだ培養液を、複数の貫通穴を有する培養台に吐出する吐出工程と、
前記培養台の複数の貫通穴より、前記培養液を供給・除去する供給除去工程と、を含むことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項１５】
前記供給除去工程では、前記複数の貫通孔から前記培養液を供給するのと同時に、他の前記複数の貫通孔より前記培養液を除去することを特徴とする請求項１４記載の細胞培養方法。
【請求項１６】
前記細胞により前記培養台に形成された細胞シートを、前記培養台の周辺に位置する前記複数の貫通穴から前記培養液を供給することで、前記細胞シートを前記培養台から取り外す取り外し工程を、さらに含むことを特徴とする請求項１４または１５記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養装置と細胞培養方法に関するものである。特に、インクジェット技術を用いた細胞培養装置と細胞培養方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
再生医療の分野では、細胞培養技術による皮膚や軟骨の形成が実用化されている。将来的には、心臓や肝臓等の重厚な臓器への進歩が期待されている。一般的な細胞培養では、目的の細胞を細胞皿（ディッシュ）に播種し、培養液と呼ばれる栄養分や酸素が含まれた液体を細胞に供給する。このことにより、細胞を増殖させていく方法が取られている。
【０００３】
臓器等を形成しようと考えた場合、多種類の細胞をその位置を制御しながら播種しなければならない。その上に、さらに、臓器は三次元構造をしているので、多量の細胞を三次元的に積層する必要がある。また、細胞は生きていなければならないため、細胞皿上に配置されてから一定期間以内に培養液を供給し培養させる必要がある。このため、三次元構造をある程度短時間で形成しなければならない。
【０００４】
従来、細胞培養方法として、供給部として、インクジェット方法を用いることが知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００２−３５５０２６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来のインクジェット方法では、微少量の細胞を培養液とともに、正確な位置に供給できた。しかし、その供給後、培養液の除去、細胞の成長を継続させるための新たな培養液の供給ができていなかった。培養液を除去しないと細胞の位置が固定できず、三次元構造を形成できない。逆に、培養液を除去しすぎると、細胞の成長が阻害される。また、新たな培養液を供給しないと、細胞の成長が継続しない。
【０００７】
そこで、本願発明の目的は、細胞培養プロセスにおいて、供給部でインクジェット方法で細胞を供給後に、培養液の供給と除去を過不足なくする細胞培養装置と細胞培養方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、細胞を含んだ培養液を供給する供給部と、細胞を配置し培養する培養台を有する培養皿と、培養皿に培養液を供給するための培養液供給装置と、培養皿から培養液を除去するための培養液除去装置と、を備えた細胞培養装置を用いる。
【０００９】
さらに、細胞を含んだ培養液を、複数の貫通穴を有する培養台にインクジェットヘッドで吐出する工程と、培養台の複数の貫通穴より、培養液を供給・除去する工程と、を含む細胞培養方法を用いる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、細胞近傍に存在する余分な培養液の蒸発を待つことなく、細胞吐出と同時に吸引等により培養液を除去できるため、高精度に細胞吐出位置を制御できる。また、単層或いは複層の細胞層を形成した後に、培養液を再供給することにより細胞位置を保持したまま酸素や栄養を供給できるため、生きたままの細胞を活用した高密度な三次元組織を形成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞培養装置の断面図
【図２】（ａ）本発明の実施の形態２における細胞培養装置の培養皿の断面図、（ｂ）（ａ）の平面図
【図３】本発明の実施の形態３における細胞培養装置の培養皿の平面図
【図４】本発明の実施の形態４における細胞培養装置の平面図
【図５】本発明の実施の形態５における細胞培養装置の平面図
【図６】（ａ）本発明の実施の形態６における細胞培養装置の断面図、（ｂ）（ａ）の平面図、（ｃ）（ａ）の拡大図
【図７】（ａ）本発明の実施の形態７における細胞培養装置の断面図、（ｂ）（ａ）の平面図
【図８】（ａ）本発明の実施の形態８における細胞培養装置の平面図、（ｂ）（ａ）の平面図、（ｃ）本発明の実施の形態８における細胞培養装置の平面図、（ｄ）（ｃ）の平面図
【図９】本発明の実施の形態９における細胞培養装置の断面図
【図１０】本発明の実施の形態１０における細胞培養装置の断面図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に、本発明の実施の形態を挙げ、図面を参照しながら説明する。
【００１３】
（実施の形態１）
図１は本発明の実施の形態１における細胞培養装置の断面図（細胞吐出動作時）である。
＜構成＞
細胞培養装置の構成を説明する。実施の形態１の細胞培養装置は、細胞６を含んだ培養液７を吐出するインクジェットヘッド１１と、細胞６を受け培養する培養皿１２と、培養皿１２に培養液７を供給するための培養液供給装置１３と、培養皿１２から培養液７を除去するための培養液除去装置１４とを含む。さらに、実施の形態１の細胞培養装置は、培養皿１２に存在する培養液７の供給と除去を切り替えるための切り替えバルブ１５と、培養皿１２と切り替えバルブ１５を接続するための第１配管１６と、切り替えバルブ１５と培養液供給装置１３とを接続する第２配管１７と、切り替えバルブ１５と培養液除去装置１４を接続する第３配管１８と、を含む。
【００１４】
次に、実施の形態１の細胞培養装置の動作手順を説明する。
＜インクジェットヘッド１１による培養液供給＞
まず、培養液供給方法としては、インクジェットヘッド１１により、細胞６を含んだ培養液７を培養皿１２に吐出する。インクジェット方式では、細胞吐出位置を高精度に制御できるため、培養台１９の上面に細胞をある程度配列することができる。インクジェットヘッド１１はサーマル方式でもピエゾ方式でも構わないが、熱による細胞へのダメージを考慮してピエゾ方式が好ましい。吐出された培養液７は、数百ピコリットルから数ナノリットル程度の液滴としてインクジェットヘッド１１のノズルから吐出され、培養皿１２表面に着弾する。インクジェットヘッド１１より培養液７が吐出されている間は、培養液除去装置１４が連動して動作する。
【００１５】
培養液除去方法としては、真空ポンプ等で真空引きして、一部の培養液７を吸引する。これは、培養台１９の上面に培養液７の液滴が着弾したと同時に、細胞以外の培養液７の一部をすぐに除去する必要があるからである。もし、除去するタイミングが遅れれば、細胞６自身が培養台１９上面で動き回る範囲が広くなり、設計とおりの細胞パターニングをすることができなくなる。
【００１６】
また、細胞６を積層していく場合、細胞６間の隙間にも培養液７が入り込んでしまい、高精度に細胞吐出位置を制御できなくなる。
【００１７】
培養台１９には後述するような数ミクロンから２０ｕｍ以下程度の直径をもつ貫通孔２２が多数形成されている。細胞６は培養台１９上に配置されるが、培養液７はそれらの貫通孔２２から吸引される。
【００１８】
２層目以降も培養液７を除去しながら、細胞６を１層ずつ順次積層する。一定の層数に達成すると、インクジェットヘッド１１からの培養液７の吐出がとまる。それに連動して一定時間後に培養液除去装置１４が停止し、培養皿１２からの培養液除去が停止する。
＜供給装置による培養液供給＞
次に、インクジェットヘッド１１より吐出され積層された細胞６に栄養や酸素を供給するための培養液供給時の動作手順を図１で説明する。
【００１９】
まず、切り替えバルブ１５のバルブを切り替え、第１配管１６と第２配管１７を接続する。その後、培養液供給装置１３が動作し、培養液７が第２配管１７と第１配管１６を介して培養皿１２に供給される。培養液供給方法としては、ポンプ等で培養液供給装置１３内を加圧して、培養液７を押し出す方法がある。
【００２０】
その他、培養液供給装置１３の培養液７液面を培養皿１２よりも高所に設置し、圧力差を活用して培養液７を押し出しても構わない。培養皿１２内の培養液７の液面がある一定の高さになると、培養液７の供給を停止する。つまり、培養液７の供給動作により培養皿１２内の培養液の液面２０を上昇させることが可能になる。その培養液７の液面は積層された細胞６がすべて液面下になる高さが望ましい。
【００２１】
以上が培養液７を培養皿１２に供給する手順だが、この後、更に細胞６を積層する場合は、前述した細胞吐出動作と培養液除去動作を実施すればよい。また、培養皿１２内の培養液を酸素や栄養分を十分に含んだ新鮮な培養液に交換する場合、前述した培養液除去動作後に培養液供給動作を実施すればよい。
【００２２】
具体的には、再度切り替えバルブ１５を切り替えて、培養皿１２と培養液除去装置１４が接続し、その後、培養液除去装置１４が動作し、培養皿１２内の培養液が第１配管及び第３配管１８を介して培養液を培養液除去装置１４に吸引させる。つまり、培養液７の除去動作により培養皿１２内の培養液の液面２０を下降させることが可能になる。
【００２３】
かかる構成によれば、インクジェットヘッド１１の吐出動作タイミングに連動して培養液除去装置１４が、培養皿１２に存在する培養液を除去する工程と、インクジェットヘッド１１の吐出動作停止後に培養液供給装置１３が培養液７を供給する工程と、を交互に実施する。このことにより、培養皿１２内の培養液の液面２０の高さを上下させ、細胞６の三次元組織化構造の形成と積層された複数の細胞層（細胞シートと呼ぶ）への酸素や栄養を供給することができる。細胞シートとは細胞を積層して薄いシート状に形成したものである。さらに、培養液７を除去した後、一度吸引を止めて、大気開放することにより細胞に十分な酸素を供給できる。
【００２４】
また、細胞シート２１の下側に形成されている貫通孔２２を介して培養液７の供給や除去を実施することにより、細胞シート２１と培養台１９との接着力を低減させることができるため、細胞シート２１形成後の剥離工程において細胞シート２１剥離性を向上できるためダメージの少ない細胞シートを作製することが可能になる。
【００２５】
なお、実施の形態１において、細胞吐出と培養液除去動作を同時に実施すると記載したが、培養液除去動作、或いは細胞吐出動作だけを実施しても構わない。例えば、使用する培養液の種類や周囲の環境（温度が高い、湿度が低い等）により、培養皿１２からの培養液の蒸発速度が速い場合が考えられる。この場合、培養液の除去速度を低下させる、あるいは極端な場合、除去が不要になっても構わない。
【００２６】
また、複数の細胞層を形成した後に、培養液除去動作と培養液供給動作を交互に実施しても、構わない。これにより、新鮮な培地との交換が可能となるため、さらに、培養が促進されることになる。
【００２７】
また、実施の形態１において、培養皿１２の培養台１９の高さが培養皿１２の底面よりも高い位置にある。これはインクジェットヘッド１１を活用して細胞６を吐出する場合、吐出された細胞の位置を制御するにはインクジェットヘッド１１と培養台１９の距離が重要な要素になるためである。
【００２８】
具体的には、その距離を減少させれば、インクジェットヘッド１１の周辺環境（例えば微風）による影響を最小限に抑制できる。このため、細胞位置の精度ばらつきは少なくなる。
【００２９】
更に、培養皿１２中の培養液を効率よく除去する、或いは、供給するために、培養台１９を高くし、培養台１９の側壁に、培養台１９の外側から培養液を除去及び供給を効率よく実施することが可能になる第６流路４０を形成したほうがよい。
【００３０】
かかる構成によれば、培養台１９は培養皿１２底部より突出した形状にし、培養台１９の側壁に第６流路４０を形成することにより、培養皿１２内の培養液の液面２０を効率よく上下させることができ、細胞シート２１へ酸素や栄養を供給することができる。
【００３１】
（実施の形態２）
図２（ａ）、図２（ｂ）は、本発明の実施の形態２における細胞培養装置の培養皿の概略図である。図２（ａ）は、断面図で、図２（ｂ）は上面図である。
【００３２】
培養台１９には、数ミクロンから２０ミクロン以下程度の直径をもつ貫通孔２２が多数形成されており、貫通孔２２の孔密度は培養台１９の中央部で密度は小さく、外周にいくほど密度は大きくなるように、また、貫通孔２２は全体が四角形状になるように配置されている。
【００３３】
貫通孔２２が形成されている培養台１９の下側には、円筒形の共通流路２４が存在し、すべての貫通孔２２と接続されている。また、その共通流路２４の中央部に第１培養液供給・除去口２３が配置され、第１培養液供給・除去口２３に第１配管１６が接続されている。そのような培養台１９上にインクジェットヘッドにて吐出された細胞６により積層された細胞シート２１を形成している。細胞シート２１とは、前述したように、細胞を積層して薄いシート状に形成したものである。
【００３４】
細胞シート２１を形成するには、前述したようにインクジェットヘッド１１で細胞６を制御良く配置させ積層すればよいが、実際の移植等に使用するには、作製した細胞シート２１を培養台１９から剥離する必要がある。
【００３５】
従来の剥離方法としては、ピンセットでつまんで剥がす方法やピペットにより細胞シート２１の側面から培養液７を吹き付けて剥がす方法が一般的である。しかし、この方法では細胞シート２１自身が破れてしまい、ある程度の大きさを保持したまま細胞シートを剥離することは困難であった。
【００３６】
実施の形態２において、細胞シート２１を剥離する場合、細胞シート２１の下側に形成されている貫通孔２２より培養液７を流入させることにより、培養台１９と細胞シート２１の間にギャップを形成できる。この結果、細胞シート２１と培養台１９との接着強度を低下させることが可能になり、細胞シート２１の剥離が容易になる。
【００３７】
また、この構造では、共通流路２４の体積は貫通孔２２に対して十分大きく、培養台１９の場所にかかわらず、各々の貫通孔２２には同程度の培養液の流れを確保することが可能である。このため、培養台１９の外側の貫通孔密度を増加させておくことにより、細胞シート２１の外側が内側に比べてより剥がれやすくなる。よって、細胞シート２１の外側から徐々に剥離することが可能になるため、細胞シート２１へのダメージも軽減できる。
【００３８】
さらに、四角形状に配置された複数の貫通孔２２上にその四角形の一辺と同等の直径をもつ細胞シート２１を形成する。こうすると、図のようにその四角形の対角線上の４箇所が細胞シート２１端面に位置することになる。よって、これらの部分が、細胞シート２１を剥がす起点となるため、細胞シート２１の剥離が容易になる。
【００３９】
かかる構成によれば、培養台１９中央部は貫通孔密度が小さく、培養台１９の外周方向に貫通孔密度が徐々に大きくすることにより、細胞シート２１形成後の剥離工程において剥離性を向上することで、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００４０】
なお、実施の形態２において、縦横方向にほぼ等間隔で貫通孔２２を配置したが、等間隔でなくても構わない。また、その貫通孔２２が形成されている範囲は、細胞シート２１の大きさにより任意に決定されるが、最外周部分は細胞シート２１の外側に配置されるほうが好ましい。
【００４１】
また、実施の形態２では、培養台１９の中央部に、培養液供給・除去口２３を配置しているため、培養台１９の中央部の貫通孔密度が最も小さく、外側にいくにつれて貫通孔密度が大きくなる構造になっている。しかし、細胞シート２１の大きさや細胞シートを構成している細胞の種類やその吐出配置により、培養液供給・除去口２３の位置を変えることも考えられる。その場合は、その位置に応じて、貫通孔２２密度分布も変更されることは言うまでもない。
【００４２】
また、実施の形態２では、貫通孔２２の密度は培養台１９の中央部の貫通孔密度が最も小さく、外側にいくにつれて貫通孔密度が大きくなる構造になっているが、貫通孔２２自身の穴径を変えても同じ効果が得られる。具体的には培養台１９の中央部は貫通孔径が最も小さく、外側にいくにつれて貫通孔径を大きくしてもよい。
【００４３】
さらに、少し煩雑にはなるが、培養皿１２を設置するステージに温度調整装置を付加し、培養台１９上に温度応答性ポリマー等の剥離用シートを敷設することでさらに細胞シート２１の剥離性は向上すると思われる。
【００４４】
（実施の形態３）
図３は本発明の実施の形態３における細胞培養装置の培養皿１２の概略図である。
【００４５】
実施の形態２では、貫通孔２２を四角形状に配置したが、本実施の形態のように円形状に配置してもかまわない。
【００４６】
この構造では、実施の形態２で説明したような細胞シート２１が剥離する起点が細胞シート２１の全周に設置されることになる。この結果、より容易に剥離しやすくなる。また、細胞シート２１は、基本的には培養台１９に対して同心円状に形成するが、インクジェットからの細胞吐出角度ばらつきや、実施の形態１で説明したような培養液の供給や除去を繰り返し実施することにより、細胞シート２１の位置がずれることが考えられる。
【００４７】
しかし、実施の形態３のように貫通孔２２を円形状に配置しておくことにより、上記のような細胞シート２１の位置ズレがあっても、ほぼ全周である一定の貫通孔２２が細胞シート２１の端面に位置させることができる。このため、細胞シート２１の剥離が容易になる。
【００４８】
かかる構成によれば、培養台１９中央部は貫通孔密度が小さく、培養台１９の外周方向に貫通孔密度が徐々に大きくし、かつ、貫通孔２２を同心円状に配置する。このことにより、細胞シート２１形成後の剥離工程において、剥離性を向上することで、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００４９】
なお、実施の形態３において、縦横方向にほぼ等間隔で貫通孔２２を配置したが、等間隔でなくても構わない。また、その貫通孔２２が形成されている範囲は細胞シート２１の大きさにより任意に決定されるが、最外周部分は細胞シート２１の外側に配置されるほうが好ましい。
【００５０】
なお、四角形状や円形状について記載したが、細胞シート２１の形状に合わせて貫通孔の位置を変更しても構わない。
【００５１】
（実施の形態４）
図４は本発明の実施の形態４における細胞培養装置の培養皿１２の概略図である。
【００５２】
実施の形態２、３では培養台１９の表面に貫通孔２２を配置しただけだが、本実施の形態のようにさらに直線状の溝２５を付加し任意の貫通孔２２同士を連結している。
【００５３】
この溝２５により貫通孔２２同士の間にバイパスが形成されるため、培養液の供給や除去効率が向上する。また、溝２５が形成されることにより細胞シート２１と培養台１９の接着面積が減少し、細胞シート２１と培養台１９の間にも培養液が入り込みやすくなるため、細胞シート２１の剥離性は大幅に向上する。
【００５４】
かかる構成によれば、培養台１９内に貫通孔２２だけでなく、直線状の溝２５を形成し細胞シート２１の剥離性を向上することで、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００５５】
なお、本実施の形態では多数形成されている貫通孔２２の中央部と最外周部に直線状の溝２５を形成したが、細胞シート２１の大きさや細胞シート２１を構成している細胞の種類やその吐出配置により、培養液供給・除去口２３の位置を変えることも考えられる。その場合は、その位置に応じて、溝２５の形成位置も変更されることは言うまでもない。
【００５６】
（実施の形態５）
図５は、実施の形態５における細胞培養装置の培養皿１２の概略図である。
実施の形態４では、培養台１９の上面の貫通孔２２とその中の任意の貫通孔２２を接続する溝を形成したが、本実施の形態では、同心円状に配置された貫通孔２２に同心円状の溝２５と放射線状の溝２５を形成している。
【００５７】
第１培養液供給・除去口２３が、培養台１９の中央部に設置されている場合、放射線状に形成された溝２５により培養液の供給や除去効率が向上する。また、実施の形態４と同様に、溝２５を形成することにより細胞シート２１と培養台１９の接着面積が減少し、細胞シート２１と培養台１９の間にも培養液が入り込みやすくなるため、細胞シート２１の剥離性は大幅に向上する。
【００５８】
かかる構成によれば、培養台１９内に貫通孔２２だけでなく、曲線状の溝を形成し細胞シート２１の剥離性を向上することで、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００５９】
なお、本実施の形態では多数形成されている貫通孔２２の最外周部に２重に同心円状状の溝２５を形成したが、細胞シート２１の大きさや細胞シート２１を構成している細胞の種類やその吐出配置により、培養液供給・除去口２３の位置を変えることも考えられる。その場合は、その位置に応じて、溝２５の形成位置も変更されることは言うまでもない。
【００６０】
（実施の形態６）
図６は本発明の実施の形態６における細胞培養装置の培養皿の概略図で、図６（ａ）は断面図、図６（ｂ）は上面図である。
【００６１】
実施の形態２では、培養台１９は平面状だが、本実施の形態では第１培養液供給・除去口２３が培養台１９の中央部に設置され、培養台１９の中央部分が凸型に突出し、培養台１９の外周部にいくほど培養台１９の高さが徐々に減少する形状になっている。
【００６２】
この場合、培養台１９が凸型をしているため、その上に形成される細胞シート２１も同様に凸型形状になる。図６（ｃ）は貫通孔部の拡大図である。
【００６３】
この貫通孔２２に、培養液７を供給すると、細胞シート２１には矢印Ａの方向に押し上げ力が働くことになる。その押し上げ力を培養台１９に垂直な方向と水平な方向に分けて考えると、Ａｙ方向の力で細胞シート２１を剥離する力だけでなく、Ａｘ方向の力で細胞シート２１と培養台１９の隙間に培養液が入り込もうとする力が働くことになる。
【００６４】
よって、この場合は培養台１９の中央部方向に培養液が流れ込もうとするため、培養台１９の中央部に液だまりが形成され、結果として細胞シート２１の中央部から剥離しやすくなる。
【００６５】
また、逆に第１培養液供給・除去口２３が培養台１９の中央部に設置され、培養台１９の中央部分が凹型にへこみ、培養台１９の外周部にいくほど培養台１９の高さが徐々に増加する形状になっていても同様な効果が得られる。但し、この場合はＡｘ方向の力の向きが培養台の外側に向くので、培養液が外周部に向かう方向に流れ込もうとし、結果として外側から剥離しやすくなる。
【００６６】
かかる構成によれば、培養台１９に同心円状に、培養台１９の中央部から外周部方向か或いは外周部から中央部方向へ傾斜を設け、細胞シート２１の剥離性を向上させることで、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００６７】
なお、本実施の形態では培養液供給・除去口２３を１つ培養台１９の中央に設置したが、培養台１９内に複数配置しても構わない。その場合でもそれらの培養液供給・除去口２３を中心に培養台に傾斜を持たせればよい。
【００６８】
（実施の形態７）
図７（ａ）、図７（ｂ）は、本発明の実施の形態７における細胞培養装置を示す図である。図７（ａ）は、断面図、図７（ｂ）は、上面図である。実施の形態２では培養台１９に貫通孔２２を複数形成した構造をしていたが、本実施の形態では、培養台１９の最外周部に配置されている複数の貫通孔２２のみが２層構造を形成しており、共通流路２４と接している側（下部）で、複数の貫通孔２２が合体した第１流路２６が形成されている。
【００６９】
この第１流路２６を形成することにより、培養液供給・除去口２３から供給された培養液が培養台１９の外周方向へ拡散していく過程において、最外周に位置する貫通孔２２により効率的に培養液７を供給することが可能になる。そのため、最外周部の貫通孔２２より供給される培養液７の供給速度が他の貫通孔２２より増加するため、細胞シート２１が剥離しやすくなる。
【００７０】
かかる構成によれば、貫通孔部は２層構造を形成しており、上の第１層目には貫通孔２２が複数形成されている。下の第２層目は、最外周部の貫通孔２２のみ複数の貫通孔２２が合体し、第１流路２６が形成されている。
【００７１】
このことにより、外周の培養液７の流量が多くなり、細胞シート２１の剥離性を向上させることができる。結果、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００７２】
なお、第１流路２６の流路幅は貫通孔２２の直径よりも大きいほうが望ましい。また、この構造においても、細胞シート２１の大きさや含まれる細胞の種類やその配置により、培養液供給・除去口２３の位置を変えることも考えられる。その場合は、その位置に応じて、第１流路２６の位置も変更されることは言うまでもない。
【００７３】
（実施の形態８）
図８は本発明の実施の形態８における細胞培養装置の培養皿を示す図である。図８（ａ）は断面図、図８（ｂ）は上面図である。
【００７４】
実施の形態２では、貫通孔２２の下側に全貫通孔に接続される円筒形の共通流路２４を形成していたが、本実施の形態では、複数の貫通孔２２ごとに第２流路２７、第３流路２８、第４流路２９を形成し、かつ各々の流路にそれぞれ培養液供給・除去口や第１配管に相当する配管を設置し、それぞれの配管は独立に培養液供給装置と培養液除去装置に接続されている。
【００７５】
この構造にすることにより、それぞれの共通流路に個別に培養液７の供給や除去が可能になる。例えば、第１培養液供給・除去口２３に供給される培養液量Ｑ１、第２培養液供給・除去口３０に供給される培養液量Ｑ２、第３培養液供給・除去口３１に供給される培養液量Ｑ３としたときに、培養液量Ｑ３＞培養液量Ｑ２＞培養液量Ｑ１となるように培養液７の流量を調整することで、外周部ほど細胞シート２１が剥離しやすくすることができる。この時の例を図８（ｃ）に示す。図８（ｃ）は、培養液供給流量を各々変化させた場合の培養液の流速分布を示す。
【００７６】
また、ある程度の大きさや厚みを持った細胞シート２１を形成する場合、細胞シート２１内に複数の細胞や細胞外マトリックスを配置する必要がある。特に多層構造になっている細胞シート２１の最下層面では、ある場所には心筋細胞を、また、他の場所には内皮細胞を配置するといった複数の異なった細胞を同一平面上に配置することが考えられる。
【００７７】
その場合、細胞の種類等により細胞６と培養台１９との接着強度が場所により異なることが予想される。しかし、それぞれの細胞が配置される場所に応じて共通流路を形成することにより、それぞれに個別に培養液供給量や除去量を調整することが可能になり、結果として細胞シート２１の剥離性を制御し、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００７８】
また、それぞれの配管に接続されている切り替えバルブを操作することで、培養液の供給や除去も個別に制御可能になる。例えば、第１培養液供給・除去口２３と第３培養液供給・除去口３１から培養液を供給し、同じタイミングで第２培養液供給・除去口３０から除去する。すると、培養液が流出する貫通孔３２から培養液が矢印の方向へ流れ出し、培養液が流入する貫通孔３３へ流れていくことにより、培養台１９と細胞シート２１界面を流れる培養液の流速を増加させ、細胞シート２１の剥離性を向上させることで、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。この時の例を図８（ｄ）に示す。図８（ｄ）は培養液供給と培養液除去を同じタイミングで実施したときの培養液の流速分布を示したものである。
【００７９】
かかる構成によれば、培養皿面内で複数の貫通孔に接続した共通流路が複数存在し、かつそれぞれの共通流路に異なった流量の培養液を供給或いは除去できることで細胞シート２１の剥離性を培養台内で制御し、ダメージの少ない細胞シート２１を形成することができる。
【００８０】
なお、本実施の形態では貫通孔密度も実施の形態２と同様に、外周方向に貫通孔密度が高くなるように形成されているが、別に均一でも構わない。なぜならそれぞれの領域で培養液の供給量を変化できるので、例えば外周部への培養液供給量を増加させることで同様の効果が得られるからである。
【００８１】
（実施の形態９）
図９は、本発明の実施の形態９における細胞培養装置の培養皿の概略図（断面図）である。実施の形態２〜８では、培養台１９の側壁部にも複数の貫通孔２２が存在し、貫通孔２２を介して細胞シート２１の下面から培養液７を供給あるいは除去しつつ、側壁部に存在する貫通孔を介して培養皿底部へも同時に培養液が供給或いは除去されていた。
【００８２】
しかしこの実施の形態では、培養台１９の側壁部には、貫通孔２２が存在せず、培養皿の内壁３５と培養皿の外壁３６の間に形成された第５流路３４が設置されている。
【００８３】
細胞シート２１を形成するには、細胞を生きたまま状態で細胞６を吐出し、細胞６をシート状に形成し、その後の移植のためにダメージ無く細胞シート２１を剥離することが重要である。
【００８４】
細胞を生存させるためには、栄養分と酸素が必要であるが、新鮮な培養液を供給することで細胞自身にそれらを与えることができるが、細胞自身もほぼ水で構成されているため、乾燥させないようにすることが重要である。吐出工程や培養工程においても周辺の温度や湿度は一定に保たれている環境で実施されているが、吐出工程において同時に培養液を除去しているため、培養台の１部が乾燥してしまう可能性が考えられる。そこで、培養台周辺に乾燥を防ぐための培養液を配置することも重要なことである。
【００８５】
本実施の形態では、細胞を含んだ培養液を吐出する工程において、培養台１９上に培養液７が溜まることになるが、それらの一部は培養台１９の外側の第５流路３４に溜まることになる。また、培養液７を供給した場合でも、貫通孔２２を介して流入した培養液７の一部は、同様に第５流路３４に溜まることになる。
【００８６】
その後、培養液７を除去した場合、これまでの実施の形態では培養台側壁にある複数の貫通孔から培養液はすべて除去されることになるが、本実施の形態では、第５流路３４に溜まった培養液７はそのまま維持することができる。これにより、培養台１９近傍の湿度を常に一定に保持することで細胞自身の乾燥を防ぐことができ、生きたままの細胞で細胞の三次元組織化構造を形成することができる。
【００８７】
かかる構成によれば、培養皿の内壁３５と培養皿の外壁３６の間に形成され、共通流路２４とは独立した第５流路３４を設置することで、細胞シート２１の乾燥を防ぐことができ、生きた細胞による三次元組織化構造が形成できる。
【００８８】
（実施の形態１０）
図１０は、本発明の実施の形態１０における細胞培養装置の培養皿の概略図（断面図）である。実施の形態２から９では培養台１９が突出した構造をした培養皿について記載したが、本実施の形態では、上記の突出した細胞を配置する培養台１９をもつ第１の培養皿３７（培養台）と、その第１の培養皿３７の外側に配置される第２の培養皿３８（培養皿）と、第１の培養皿３７に培養液７を供給、除去する第１培養液供給・除去口２３と、シール材３９と、を含む。
【００８９】
第１の培養皿３７の構造は、前述した実施の形態２と同様で貫通孔が複数形成されている。その外側に第１の培養皿３７の底部の中央部に貫通孔２２が存在し、その貫通孔部に第１培養液供給・除去口２３が設置され、その第１培養液供給・除去口２３は第１の培養皿３７に接続されている。記載しない事項は上記実施の形態と同様である。
【００９０】
第１の培養皿３７と第２の培養皿３８とは、シール材３９を介して接続され、第２の培養皿３８に流入した培養液７は、第１の培養皿３７の裏側に回りこめない構造になっている。
【００９１】
この構造により、第１の培養皿３７と第２の培養皿３８とは、シール材３９のところで、分離可能である。結果、細胞シート２１形成後に第１の培養皿３７のみを取り出すことが可能になるため、運搬が容易になる。また、培養皿上の体積も縮小するため、細胞シート２１の運搬時に必要な培養液の量を減少させることができる。
【００９２】
また、現状の細胞シート２１を移植する際は、現状、ピンセットで直接剥離させるか、ピペット等で培養液を細胞シート２１の側面に吹き付けながら培養皿より細胞シート２１を剥離し、そのあと、ピンセット等で広げながら、最後は、へらのような平坦な平面上に、細胞シート２１をのせた状態で心臓等の患部までもっていき、へら上でずらしながら貼り付けるという作業を行われている。
【００９３】
しかし、この作業はかなり専門的な作業で時間をかなり要するものになっている。そこで、本実施の形態では、移植する間際まで細胞シート２１を広げた状態で保管が可能で、移植直前に培養台より剥離し、更に一時的に第１培養液供給・除去口２３から吸引することで細胞シート２１を培養台１９に保持し、移植時に大気開放することにより、細胞シート２１の収縮量を減少させ、かつ可能な限り広げたまま、ダメージのない状態で心臓等の患部に細胞シート２１を貼り付けることが可能になる。
【００９４】
かかる構成によれば、細胞を配置し培養する第１の培養皿３７と、その第１の培養皿３７を配置する第２の培養皿３８と、第１培養液供給・除去口２３と、第１の培養皿３７と第２の培養皿３８の間に配置するシール材３９とで構成される。
【００９５】
このことにより、細胞シート２１形成時には細胞シート２１の乾燥を防ぐとともに、細胞シート２１作製後の保管、運搬がそのままの状態で可能となり、さらにピンセット等で細胞シート２１を操作することなく、直接心臓等の患部へ貼り付けることができるため、ダメージの少ない細胞シート２１を作製及び運搬、移植まで実施することができる。
＜なお書き＞
実施の形態は、組み合わせることができる。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の細胞培養装置は再生医療や創薬開発、動物実験の代替に利用可能である。特に、産業としては、心臓や肝臓等の臓器や角膜や皮膚の治療として活用される細胞シート２１を作製する装置として利用できる。
【符号の説明】
【００９７】
６  細胞
７  培養液
１１  インクジェットヘッド
１２  培養皿
１３  培養液供給装置
１４  培養液除去装置
１５  切り替えバルブ
１６  第１配管
１７  第２配管
１８  第３配管
１９  培養台
２０  液面
２１  細胞シート
２２  貫通孔
２３  培養液供給・除去口
２４  共通流路
２５  溝
２６  第１流路
２７  第２流路
２８  第３流路
２９  第４流路
３０  第２培養液供給・除去口
３１  第３培養液供給・除去口
３２  培養液が流出する貫通孔
３３  培養液が流入する貫通孔
３４  第５流路
３５  内壁
３６  外壁
３７  第１の培養皿
３８  第２の培養皿
３９  シール材
４０  第６流路
Ｑ１  培養液量
Ｑ２  培養液量
Ｑ３  培養液量
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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