(57)【要約】【課題】簡便な操作により、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを正確に識別する方法及びキットを提供する。【解決手段】核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別する方法であって、光化学反応及び酵素反応を利用することを特徴とする方法、及び、光応答性官能基を有する核酸を含むキット。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別する方法であって、光化学反応及び酵素反応を利用することを特徴とする方法。
【請求項２】
（ａ）前記核酸試料である第一核酸と、光応答性官能基を有する第二核酸と、５’側が第一核酸と相補的な配列であり、３’側が第二核酸と相補的な配列である第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを近接させる工程と、
（ｂ）波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、近接した前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを光化学反応により共有結合させて連結基を生成し、前記連結基により第一核酸と第二核酸とが連結した第四核酸を生成する工程と、
（ｃ）前記連結基を９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる工程と、
（ｄ）脱アミノ化後の前記連結基に波長２００〜３２０ｎｍの光を照射して、前記連結基を開裂させ、前記シトシン残基が５−メチルシトシン残基であった場合には、第一核酸中の前記シトシン残基がチミン残基に変化した第五核酸を生成し、第一核酸の前記シトシン残基がメチル化されていないシトシン残基であった場合には、前記シトシン残基がウラシル残基に変化した第五核酸を生成する工程と、
（ｅ）第五核酸にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させることにより、ウラシル残基を有する第五核酸からウラシル塩基を除去して脱塩基部位を生成する工程と、
（ｆ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させた第五核酸を９０〜１００℃に加熱して、加水分解により前記脱塩基部位で切断する工程と、
（ｇ）第五核酸の切断を検出する工程と、
（ｈ）第五核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第五核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する工程と、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第五核酸の切断の検出が、リアルタイムＰＣＲにより行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第五核酸が蛍光標識されており、第五核酸の切断の検出が、当該蛍光標識を利用して行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第五核酸の切断の検出が、電気泳動により行われる、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
第二核酸が、固相上に固定化されている、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との存在比率を定量的に測定する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ａ’）前記核酸試料である第一核酸と、第一核酸と相補的な配列を有し、光応答性官能基を有する第六核酸とをハイブリダイズさせ、前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを近接させる工程と、
（ｂ’）波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、近接した前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを光化学反応により共有結合させて連結基を生成し、前記連結基により第一核酸と第六核酸とが連結した第七核酸を生成する工程と、
（ｃ’）前記連結基を９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる工程と、
（ｄ’）脱アミノ化後の前記連結基に波長２００〜３２０ｎｍの光を照射して、前記連結基を開裂させ、前記シトシン残基が５−メチルシトシン残基であった場合には、第一核酸中の前記シトシン残基がチミン残基に変化した第八核酸を生成し、第一核酸の前記シトシン残基がメチル化されていないシトシン残基であった場合には、前記シトシン残基がウラシル残基に変化した第八核酸を生成する工程と、
（ｅ’）第八核酸にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させることにより、ウラシル残基を有する第八核酸からウラシル塩基を除去して脱塩基部位を生成する工程と、
（ｆ’）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させた第八核酸を９０〜１００℃に加熱して、加水分解により前記脱塩基部位を切断する工程と、
（ｇ’）第八核酸の切断を検出する工程と、
（ｈ’）第八核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第八核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する工程と、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第八核酸の切断の検出が、リアルタイムＰＣＲにより行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
第八核酸が蛍光標識されており、第八核酸の切断の検出が、当該蛍光標識を利用して行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
第八核酸の切断の検出が、電気泳動により行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
第六核酸が、固相上に固定化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との存在比率を定量的に測定する、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別するためのキットであって、光応答性官能基を有する核酸を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトシン残基の識別方法及びキットに関する。より詳細には、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別する方法、及び、当該方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞や個体は、同じ遺伝情報を持ちながらも、異なる表現形を有することがある。一卵性双生児やクローンは、個体間での遺伝情報は同じであるが表現形が異なることは代表的な例である。このような現象は、ゲノムＤＮＡのメチル化修飾やヒストン修飾に代表されるエピジェネティックな変化が、遺伝子の発現制御、細胞の発生、分化に大きく影響することに起因している。
【０００３】
ヒト等の脊椎動物の体細胞におけるゲノムＤＮＡのメチル化は、シトシン塩基の次にグアニン塩基が続く「ＣｐＧ配列」のシトシン塩基に付加される。なお、「ＣｐＧ」の「ｐ」は、シトシンとグアニンの間のホスホジエステル結合を表す。
【０００４】
メチル化を受けるＣｐＧ配列は、ゲノムの多くの領域では散在するが、ＣｐＧ配列が高頻度に出現する領域が存在し、ＣｐＧアイランドと呼ばれる。転写開始点、プロモーター領域を含むＣｐＧ配列は、ゲノムの多くの領域でメチル化されている。また、胚性幹細胞では、ＣｐＧ配列以外でのメチル化も見受けられる（例えば、非特許文献１〜５を参照）。
【０００５】
ゲノムＤＮＡのメチル化は、後天的な遺伝情報の変化がもたらすガン等の疾病に関係が深いとされ重要視されている。ガン発病のメカニズムとして、ガン抑制遺伝子が何らかの作用で変化して転写されないことが発病の原因の１つとして理解されているが、その抑制に関わる変化の１つがゲノムＤＮＡのメチル化である。
【０００６】
このように、疾病等に深い関わりがあるゲノムＤＮＡのメチル化は、研究対象として重要である。このため、ゲノムＤＮＡのメチル化の検出方法については、従来、様々な方法やアプローチが研究され報告されてきた。ゲノムＤＮＡのメチル化の検出方法としては、例えば、シトシンに特異的な加水分解的な反応を用いるバイサルファイト法とＤＮＡシークエンシングとの組合せ、バイサルファイト法とＰＣＲとの組合せ（ＭＳＰ法：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、ビピリジンリガンドを直接的にメチルシトシンに配位させる方法、蛍光や電気化学的な検出方法、抗体を用いた方法、制限酵素がメチル化シトシンを切断できない現象を使った方法等が挙げられる（例えば、特許文献１〜５及び非特許文献６〜９を参照）。
【０００７】
ところで、酵素によるＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の連結と切断は医療、学問の分野を問わず、遺伝子操作や塩基の変異検出に対して常套的に用いられる基礎的な技術である。しかしながら、酵素には反応条件が存在するなどの制約が多く、また、酵素の種類に応じても条件が異なるため、広範囲な系への適用は難しい側面を有する。
【０００８】
一方、種々の有機化合物を用いた核酸の連結法も多く報告されている。その中でも光応答性官能基の光化学反応を利用した核酸の連結（以下、「光連結反応」という場合がある。）は、反応の時間的空間的な制御の自由度が高く、一般的な有機化学反応よりも緩和な条件で反応可能である等の利点を有している（例えば、特許文献６〜９及び非特許文献１０〜１５を参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００９−６９０１３号公報
【特許文献２】特開２００９−２４７２６０号公報
【特許文献３】特開２０１０−６８８００号公報
【特許文献４】特開２０１２−２３００１９号公報
【特許文献５】特開２０１２−２４９６３６号公報
【特許文献６】米国特許第５４４９６０２号明細書
【特許文献７】米国特許第５６８６２４３号明細書
【特許文献８】米国特許第６５９３０８８号明細書
【特許文献９】特許第３７５３９４２号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ehrlich M, et al., Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells, Nucleic Acids Research, 10, 2709-2721, 1982
【非特許文献２】Jones PA and Takai D, The role of DNA methylation in mammalian epigenetics, Science, 293, 1068-1070, 2001
【非特許文献３】Reik W, et al., Epigenetic reprogramming in mammalian development, Science, 293, 1089-1093, 2001
【非特許文献４】Valinluck V and Sowers LC, Inflammation-mediated cytosine damage: a mechanistic link between inflammation and the epigenetic alterations in human cancers, Cancer Res., 67, 5583-5586, 2007
【非特許文献５】Gross H, et al., Three new spongian diterpenes from the Fijian marine sponge Spongia sp., Nature, 19, 315-322, 2009
【非特許文献６】Frommer M, et al., A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 1827-1831, 1992
【非特許文献７】Tanaka K, et al., Direct labeling of 5-methylcytosine and its applications, J. Am. Chem. Soc., 129, 5612-5620, 2007
【非特許文献８】Hatada I, et al., Genome-wide profiling of promoter methylation in human, Oncogene, 25, 3059-3064, 2006
【非特許文献９】Bareyt S and Carell T, Selective detection of 5-methylcytosine sites in DNA, Angew. Chem. Int. Ed., 47, 181-184, 2008
【非特許文献１０】Fujimoto K, et al., Template-Directed Photoreversible Ligation of Deoxyoligonucleotides via 5-Vinyldeoxyuridine, J. Am. Chem. Soc., 122, 5646-5647, 2000
【非特許文献１１】Ihara T, et al., Photochemical ligation of DNA conjugates through anthracene cyclodimer formation and its fidelity to the template sequences., J. Am. Chem. Soc., 126, 8880-8881, 2004
【非特許文献１２】Fujimoto K, et al., Site-specific transition of cytosine to uracil via reversible DNA photoligation, Chem. Commun., 30, 3223-3225, 2006
【非特許文献１３】Ogino M, et al., Highly selective detection of 5-methylcytosine using photochemical ligation, Chem. Commun., 45, 5996-5998, 2008
【非特許文献１４】Matsumura T, et al., Photochemical Site-specific Mutation of 5-Methylcytosine to Thymine, Chem. Lett., 37, 94-95, 2007
【非特許文献１５】Masayuki Ogino, et al., Detection of methylcytosine by DNA photoligation via hydrophobic interaction of the alkyl group, Org. Biomol. Chem., 7, 3163-3167, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述したように、ゲノムＤＮＡのメチル化、特に、シトシン残基がメチル化されているか否かを識別する方法が複数知られている。しかしながら、例えば、バイサルファイト法では、サンプルＤＮＡの非特異的な分解が起こるため、核酸試料の識別対象のシトシン残基のメチル化の割合が正確に識別できない場合がある。更に、同法は、発明されてから多くの点で改善が成されているものの、反応の段階が多く、操作が煩雑である。
【００１２】
また、制限酵素を用いたシトシン残基の識別方法では、様々な配列に対応可能であるものの、酵素によって最適なバッファー条件が異なるため、複数箇所のシトシン残基を識別しようとすると、反応系の構築・準備が煩雑になる場合がある。
【００１３】
そこで、本発明は、簡便な操作により、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを正確に識別する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、上記の方法のためのキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は以下の通りである。
（１）核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別する方法であって、光化学反応及び酵素反応を利用することを特徴とする方法。
（２）（ａ）前記核酸試料である第一核酸と、光応答性官能基を有する第二核酸と、５’側が第一核酸と相補的な配列であり、３’側が第二核酸と相補的な配列である第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを近接させる工程と、
（ｂ）波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、近接した前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを光化学反応により共有結合させて連結基を生成し、前記連結基により第一核酸と第二核酸とが連結した第四核酸を生成する工程と、
（ｃ）前記連結基を９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる工程と、
（ｄ）脱アミノ化後の前記連結基に波長２００〜３２０ｎｍの光を照射して、前記連結基を開裂させ、前記シトシン残基が５−メチルシトシン残基であった場合には、第一核酸中の前記シトシン残基がチミン残基に変化した第五核酸を生成し、第一核酸の前記シトシン残基がメチル化されていないシトシン残基であった場合には、前記シトシン残基がウラシル残基に変化した第五核酸を生成する工程と、
（ｅ）第五核酸にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させることにより、ウラシル残基を有する第五核酸からウラシル塩基を除去して脱塩基部位を生成する工程と、
（ｆ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させた第五核酸を９０〜１００℃に加熱して、加水分解により前記脱塩基部位で切断する工程と、
（ｇ）第五核酸の切断を検出する工程と、
（ｈ）第五核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第五核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する工程と、
を含む、（１）に記載の方法。
（３）第五核酸の切断の検出が、リアルタイムＰＣＲにより行われる、（２）に記載の方法。
（４）第五核酸が蛍光標識されており、第五核酸の切断の検出が、当該蛍光標識を利用して行われる、（２）に記載の方法。
（５）第五核酸の切断の検出が、電気泳動により行われる、（２）に記載の方法。
（６）第二核酸が、固相上に固定化されている、（２）に記載の方法。
（７）識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との存在比率を定量的に測定する、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）（ａ’）前記核酸試料である第一核酸と、第一核酸と相補的な配列を有し、光応答性官能基を有する第六核酸とをハイブリダイズさせ、前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを近接させる工程と、
（ｂ’）波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、近接した前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを光化学反応により共有結合させて連結基を生成し、前記連結基により第一核酸と第六核酸とが連結した第七核酸を生成する工程と、
（ｃ’）前記連結基を９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる工程と、
（ｄ’）脱アミノ化後の前記連結基に波長２００〜３２０ｎｍの光を照射して、前記連結基を開裂させ、前記シトシン残基が５−メチルシトシン残基であった場合には、第一核酸中の前記シトシン残基がチミン残基に変化した第八核酸を生成し、第一核酸の前記シトシン残基がメチル化されていないシトシン残基であった場合には、前記シトシン残基がウラシル残基に変化した第八核酸を生成する工程と、
（ｅ’）第八核酸にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させることにより、ウラシル残基を有する第八核酸からウラシル塩基を除去して脱塩基部位を生成する工程と、
（ｆ’）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させた第八核酸を９０〜１００℃に加熱して、加水分解により前記脱塩基部位を切断する工程と、
（ｇ’）第八核酸の切断を検出する工程と、
（ｈ’）第八核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第八核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する工程と、
を含む、（１）に記載の方法。
（９）第八核酸の切断の検出が、リアルタイムＰＣＲにより行われる、（８）に記載の方法。
（１０）第八核酸が蛍光標識されており、第八核酸の切断の検出が、当該蛍光標識を利用して行われる、（８）に記載の方法。
（１１）第八核酸の切断の検出が、電気泳動により行われる、（８）に記載の方法。
（１２）第六核酸が、固相上に固定化されている、（８）に記載の方法。
（１３）識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との存在比率を定量的に測定する、（８）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別するためのキットであって、光応答性官能基を有する核酸を含む、キット。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、簡便な操作により、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを正確に識別する方法及びキットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】シトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｙとの光化学反応を説明する図である。
【図２】第１実施形態に係るシトシン残基の識別方法の（ａ）工程を説明する図である。
【図３】第１実施形態に係るシトシン残基の識別方法の（ｂ）工程を説明する図である。
【図４】第１実施形態に係るシトシン残基の識別方法の（ｃ）工程を説明する図である。
【図５】第１実施形態に係るシトシン残基の識別方法の（ｄ）工程を説明する図である。
【図６】第１実施形態に係るシトシン残基の識別方法の（ｅ）工程及び（ｆ）工程を説明する図である。
【図７】第２実施形態に係るシトシン残基の識別方法の（ａ’）〜（ｄ’）工程を説明する図である。
【図８】ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図９】ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。
【図１０】リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
＜シトシン残基の識別方法＞
１実施形態において、本発明は、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別する方法であって、光化学反応及び酵素反応を利用することを特徴とする方法を提供する。
【００１８】
本実施形態の方法によれば、簡便な操作により、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを正確に識別することができる。
【００１９】
核酸試料としては、ＤＮＡ又はＲＮＡであれば特に限定されるものではなく、天然のものであっても合成されたものであってもよい。天然の核酸としては、動物、植物、微生物、培養細胞等の生物から抽出されたゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ等が挙げられる。また、合成された核酸としては、β−シアノエチルホスフォロアミダイト法、ＤＮＡ固相合成法等の公知の化学的合成法により合成されたＤＮＡ、ＰＣＲ等の公知の核酸合成法により合成された核酸、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等が挙げられる。
【００２０】
核酸試料は、識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と、識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との混合物であってもよい。
【００２１】
本実施形態の方法は、光照射により核酸の残基と可逆的に連結することができる光応答性官能基による光化学反応及び酵素反応を利用することを特徴とする。
【００２２】
図１は、シトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｙとの光化学反応を説明する図である。図１におけるシトシン残基Ｘは、メチル化されているか否かの識別対象であり、光連結反応の対象である。図１においては、核酸のハイブリダイゼーションを利用して、光応答性官能基Ｙと、シトシン残基Ｘとを近接させている。
【００２３】
図１において、第一核酸は、識別対象のシトシン残基Ｘを含む核酸である。また、第二核酸は、末端に光応答性官能基Ｙを有する核酸である。また、第三核酸は、第一核酸及び第二核酸と相補的な配列を有する核酸である。これらの核酸をハイブリダイズさせることにより、光応答性官能基Ｙと、シトシン残基Ｘとを近接させることができる。
【００２４】
続いて、長波長側の紫外光を照射すると、光応答性官能基Ｙとシトシン残基Ｘとが共有結合し、連結基Ｚを形成する。この光連結反応は可逆的であり、上記の連結基Ｚに短波長側の紫外光を照射することにより、再び光応答性官能基Ｙと、シトシン残基Ｘとに解離させることができる。具体的な光応答性官能基や紫外光の波長については後述する。
【００２５】
本実施形態の方法は、上記の光化学反応及び酵素反応を利用することを特徴とする。その概要は次の通りである。上記連結基Ｚを加熱すると、上記の連結基Ｘのシトシン残基Ｘに由来する部分を容易に脱アミノ化させることが可能である。この脱アミノ化後の連結基Ｚに短波長側の紫外光を照射すると、連結基Ｚが解離する。ここで、もとのシトシン残基Ｘが５−メチルシトシン残基であった場合には、上記の脱アミノ化により生成されたチミン残基と光応答性官能基Ｙとに解離する。また、もとのシトシン残基Ｘがメチル化されていないシトシン残基であった場合には、上記の脱アミノ化により形成されたウラシル残基と光応答性官能基Ｙとに解離する。
【００２６】
そこで、上記の連結基Ｚの形成、脱アミノ化及び解離後に、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させると、ウラシル残基からは、ウラシル塩基が除去された脱塩基部位が生成される。これに対し、チミン残基は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの基質にならないため変化を受けない。
【００２７】
脱塩基部位は、加熱すると容易に切断することができるため、この切断を検出することにより、識別対象のシトシン残基Ｘが、５−メチルシトシン残基であったか、メチル化されていないシトシン残基であったかを識別することができる。
【００２８】
〔第１実施形態〕
１実施形態において、本発明に係るシトシン残基の識別方法は、次の工程により行うことができる。
（ａ）識別対象のシトシン残基を含有する核酸試料である第一核酸と、光応答性官能基を有する第二核酸と、５’側が第一核酸と相補的な配列であり、３’側が第二核酸と相補的な配列である第三核酸とをハイブリダイズさせ、前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを近接させる工程、
（ｂ）波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、近接した前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを光化学反応により共有結合させて連結基を生成し、前記連結基により第一核酸と第二核酸とが連結した第四核酸を生成する工程、
（ｃ）前記連結基を９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる工程、
（ｄ）脱アミノ化後の前記連結基に波長２００〜３２０ｎｍの光を照射して、前記連結基を開裂させ、前記シトシン残基が５−メチルシトシン残基であった場合には、第一核酸中の前記シトシン残基がチミン残基に変化した第五核酸を生成し、第一核酸の前記シトシン残基がメチル化されていないシトシン残基であった場合には、前記シトシン残基がウラシル残基に変化した第五核酸を生成する工程、
（ｅ）第五核酸にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させることにより、ウラシル残基を有する第五核酸からウラシル塩基を除去して脱塩基部位を生成する工程、
（ｆ）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させた第五核酸を９０〜１００℃に加熱して、加水分解により前記脱塩基部位で切断する工程、
（ｇ）第五核酸の切断を検出する工程、
（ｈ）第五核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第五核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する工程。
【００２９】
［（ａ）工程］
本工程では、核酸試料の識別対象のシトシン残基と光応答性官能基とを近接させ、光化学反応が可能な状態にする。
【００３０】
識別対象のシトシン残基と光応答性官能基とを近接させるために、核酸のハイブリダイゼーションを利用してもよい。例えば、識別対象のシトシン残基を有する核酸試料である第一核酸と、光応答性官能基を有する第二核酸と、５’側が第一核酸と相補的な配列であり、３’側が第二核酸と相補的な配列である第三核酸とのハイブリダイゼーションを利用することができる。
【００３１】
図２は、（ａ）工程を説明する図である。識別対象のシトシン残基Ｘを有する第一核酸、光応答性官能基Ｙを有する第二核酸及び第三核酸をハイブリダイズさせることにより、シトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｙとを近接させることができる。ここで、第二核酸、第三核酸の塩基配列を適切に設計することにより、任意の核酸試料において、光応答性官能基Ｙを識別対象のシトシン残基Ｘに近接させることが可能となる。
【００３２】
ハイブリダイゼーションは、通常の温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等の条件下で行うことができるが、後述する光連結反応を行う溶液と同一の溶液中で行うと簡便である。
【００３３】
ハイブリダイゼーションの反応溶液は、緩衝作用のある塩を含むことが好ましい。緩衝作用のある塩としては、カコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩等を挙げることができるが、カコジル酸塩であることが好ましい。緩衝作用のある塩の濃度は５〜２５０ｍＭであることが好ましく、１０〜１００ｍＭであることがより好ましい。ハイブリダイゼーションの反応溶液は、更に、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましい。アルカリ金属又はアルカリ土類金属の塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。ハイブリダイゼーションの反応溶液のｐＨは６．５〜８．５であることが好ましく、ｐＨ６．７〜７．７であることがより好ましい。
【００３４】
本実施形態の方法において使用できる光応答性官能基Ｙとしては、５−カルボキシビニルウラシル、その他ビニル基を有する核酸誘導体等が挙げられる。また、上記の第二核酸は、これらの光応答性官能基Ｙを塩基部分に有するヌクレオチドを末端に有する核酸であってもよい。
【００３５】
［（ｂ）工程］
本工程では、（ａ）工程により近接させたシトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｙに波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、シトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｙとが光化学反応により共有結合した連結基Ｚを生成し、前記連結基Ｚにより第一核酸と第二核酸とが連結した第四核酸を生成する。
【００３６】
図３は、（ｂ）工程を説明する図である。近接させたシトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｙに光を照射することにより、連結基Ｚが生成される。本工程は、（ａ）工程と同一の反応溶液中で行うことができる。
【００３７】
この反応は、上記の光応答性官能基Ｙが、中性の水溶液中で紫外光照射されることで、核酸配列中のピリミジン塩基と［２＋２］光環化反応を起こして共有結合するものであり、光照射のＯＮ、ＯＦＦで反応の進行を制御することができる。
【００３８】
光連結のための光照射に使用される光の波長は、例えば３００〜４００ｎｍであってよい。本実施形態で使用する光応答性官能基Ｙは、π（パイ）共役系を形成可能な置換基を有することが特徴であり、π（パイ）共役系を拡張することにより長波長の紫外光、例えば３６０〜４００ｎｍ、例えば３７０〜４００ｎｍ、例えば３８０〜４００ｎｍ、例えば３８０〜３９０ｎｍの範囲の波長の光によって、光連結することができる。
【００３９】
光照射に好適な光としては、上記の波長から選択された単波長のレーザー光が挙げられる。長波長の光は、短波長の光よりもエネルギーが低いために、生きた細胞に対しても安心して照射することができる。
【００４０】
光照射の時間は操作上の観点からは短時間であることが好ましく、光反応の完全な進行の観点からは長時間であることが好ましい。
【００４１】
光照射の時間は、１秒以上、１０秒以上、３０秒以上、１分間以上、５分間以上、１０分間以上、又は１５分間以上の時間とすることができ、６０分間以下、４５分間以下、又は３０分間以下の時間とすることができる。光照射の時間は、例えば１〜６０分間、例えば１〜４５分間、例えば５〜４５分間、例えば５〜３０分間、例えば１０〜３０分間、例えば１５〜３０分間等とすることができる。
【００４２】
光照射時の反応溶液の温度は０〜６０℃が好ましく、０〜３０℃がより好ましい。
【００４３】
［（ｃ）工程］
本工程において、上記連結基Ｚを９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる。図４は、（ｃ）工程を説明する図である。上記連結基Ｚの脱アミノ化により、連結基Ｚ’が生成される。本工程は、（ａ）工程と同一の反応溶液中で行うことができる。
【００４４】
脱アミノ化は、溶液を加熱することにより行う。加熱時間は０．５〜２時間が好ましく、１〜２時間がより好ましい。
【００４５】
この工程により、識別対象のシトシン残基Ｘがメチル化されていないシトシン残基であった場合には、光応答性官能基Ｙとの共有結合により生じた５，６−ジヒドロシトシン類縁体（連結基Ｚ）から４位のアミノ基が加水分解し、５，６−ジヒドロウラシル類縁体（連結基Ｚ’）に変化する。
【００４６】
［（ｄ）工程］
本工程において、脱アミノ化後の上記連結基Ｚ’に波長２８０〜３１５ｎｍの光を照射して、前記連結基Ｚ’を解離させる。図５は、（ｄ）工程を説明する図である。上記連結基Ｚ’に光を照射することにより、連結基Ｚ’が解離し、第五核酸と第二核酸とに分離する。本工程は、（ａ）工程と同一の反応溶液中で行うことができる。
【００４７】
本工程で生成される第五核酸では、（ｃ）工程における脱アミノ化により、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘが、残基Ｘ’に変化している。試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘが５−メチルシトシン残基であった場合、第五核酸中の残基Ｘ’はチミン残基である。一方、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘがメチル化されていないシトシン残基であった場合、第五核酸中の残基Ｘ’はウラシル残基である。
【００４８】
本工程において照射する光の波長は、２００〜３２０ｎｍが好ましく、３００〜３２０ｎｍがより好ましい。また、光照射の時間は、例えば５〜３０分間、例えば５〜１５分間、例えば５〜１０分間であってよい。また、光照射時の反応溶液の温度は８０〜１００℃が好ましく、９５〜１００℃がより好ましい。
【００４９】
［（ｅ）工程］
本工程において、上記の第五核酸にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させることにより、第五核酸の脱塩基処理を行う。
【００５０】
図６は、（ｅ）工程及び（ｆ）工程を説明する図である。第五核酸の残基Ｘ’がウラシル残基であった場合、すなわち、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘがメチル化されていないシトシン残基であった場合、残基Ｘ’からウラシル塩基が除去されて脱塩基部位が生成される。一方、第五核酸の残基Ｘ’がチミン残基であった場合、すなわち、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘが５−メチルシトシン残基であった場合、チミン残基はウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの基質とならないため、脱塩基部位は生成されない。
【００５１】
ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの反応温度及び反応時間は適宜設定することができ、例えば３７℃、１時間程度であってよい。
【００５２】
［（ｆ）工程］
本工程において、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させた第五核酸を９０〜１００℃に加熱し、脱塩基部位を切断する。
【００５３】
図６は、（ｅ）工程及び（ｆ）工程を説明する図である。加熱の結果、第五核酸に脱塩基部位が存在した場合、すなわち、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘがメチル化されていないシトシン残基であった場合には、第五核酸が加水分解により当該脱塩基部位で切断され、図６に示すように断片１及び断片２を生じる。一方、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘが５−メチルシトシン残基であった場合には、第五核酸に脱塩基部位が存在しないため、第五核酸は切断されない。
【００５４】
したがって、第五核酸の切断を検出することにより、識別対象のシトシン残基Ｘが５−メチルシトシン残基であったか、メチル化されていないシトシン残基であったかを識別することができる。
【００５５】
本工程における加熱の時間は、例えば５〜３０分であってよく、例えば５〜１０分であってよい。
【００５６】
［（ｇ）工程］
本工程において、第五核酸の切断を検出する。例えば、第五核酸の切断の検出はＰＣＲにより行われてもよい。識別対象のシトシン残基Ｘを含む領域をＰＣＲ増幅するプライマーを使用してＰＣＲ反応を行った場合、第五核酸が切断されているとＰＣＲの基質とならないため、増幅が見られない。一方、第五核酸が切断されていない場合にはＰＣＲ増幅が行われる。したがって、ＰＣＲ増幅の有無により、第五核酸の切断を検出することができる。
【００５７】
また、第五核酸の切断の検出は、リアルタイムＰＣＲにより行われてもよい。リアルタイムＰＣＲにより、第五核酸の切断の検出を定量的に行うことができる。例えば、核酸試料中の、識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との存在比率を定量的に測定することができる。
【００５８】
また、第五核酸の切断の検出は、電気泳動により行われてもよい。これは、切断による第五核酸の分子サイズの変化を検出するものである。
【００５９】
また、第五核酸が蛍光標識されており、第五核酸の切断の検出が、当該蛍光標識を利用して行われてもよい。より具体的には、例えば、（ｆ）工程より前（切断前）の第五核酸の５’末端又は３’末端に蛍光物質を予め標識しておく。続いて、（ｆ）工程を実施し、第五核酸を切断する。
【００６０】
続いて、切断処理後の第五核酸を、第五核酸の一部に相補的な核酸プローブが固定された固相とハイブリダイズさせる。固相としては、基板やビーズ等が挙げられる。その後、固相に結合した第五核酸の存在を蛍光検出する。ここで、核酸プローブを適切に設計することにより、第五核酸の切断を検出することができる。例えば、第五核酸の５’末端に蛍光物質を標識し、第五核酸の切断部位より３’側にハイブリダイズする核酸プローブが固定された固相と反応させた場合、第五核酸が切断されていると、固相には蛍光物質が固定化されない。一方、第五核酸が切断されていない場合には、固相に蛍光物質が固定化される。この原理を利用して、第五核酸の切断を検出することができる。
【００６１】
第五核酸の蛍光標識は、（ｆ）工程の前であればいずれの段階で行ってもよい。例えば、（ａ）工程を実施する前の核酸試料を蛍光標識してもよい。
【００６２】
［（ｈ）工程］
本工程により、核酸試料の識別対象のシトシン残基を判定する。第五核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第五核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する。
【００６３】
以上のように、本実施形態の各工程は、簡便であり、中性条件下の単一の反応溶液中で有害物質を使用することなく行うことができ、制御も容易である。このため、装置化、キット化等が比較的容易であり、臨床検査等に適用することができる。
【００６４】
［変形例］
１実施形態において、上記の第二核酸は、固相上に固定化されていてもよい。これにより、例えば、（ａ）工程のハイブリダイゼーションの後に洗浄操作を行うことが可能となる。洗浄操作によって夾雑物を除去することにより、バックグラウンドを低減させて検出感度を高めることが容易になる。夾雑物としては、例えば、第二核酸とハイブリダイズしなかった第一核酸、第三核酸等が挙げられる。
【００６５】
〔第２実施形態〕
１実施形態において、本発明に係るシトシン残基の識別方法は、次の工程により行うことができる。
（ａ’）識別対象のシトシン残基を含有する核酸試料である第一核酸と、第一核酸と相補的な配列を有し、光応答性官能基を有する第六核酸とをハイブリダイズさせ、前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを近接させる工程と、
（ｂ’）波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、近接した前記シトシン残基と前記光応答性官能基とを光化学反応により共有結合させて連結基を生成し、前記連結基により第一核酸と第六核酸とが連結した第七核酸を生成する工程と、
（ｃ’）前記連結基を９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる工程と、
（ｄ’）脱アミノ化後の前記連結基に波長２００〜３２０ｎｍの光を照射して、前記連結基を開裂させ、前記シトシン残基が５−メチルシトシン残基であった場合には、第一核酸中の前記シトシン残基がチミン残基に変化した第八核酸を生成し、第一核酸の前記シトシン残基がメチル化されていないシトシン残基であった場合には、前記シトシン残基がウラシル残基に変化した第八核酸を生成する工程と、
（ｅ’）第八核酸にウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させることにより、ウラシル残基を有する第八核酸からウラシル塩基を除去して脱塩基部位を生成する工程と、
（ｆ’）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを作用させた第八核酸を９０〜１００℃に加熱して、加水分解により前記脱塩基部位を切断する工程と、
（ｇ’）第八核酸の切断を検出する工程と、
（ｈ’）第八核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第八核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する工程と、
を含む、（１）に記載の方法。
【００６６】
［（ａ’）工程］
図７は、本実施形態の（ａ’）〜（ｄ’）工程を説明する図である。（ａ’）工程では、核酸試料の識別対象のシトシン残基と光応答性官能基とを近接させ、光化学反応が可能な状態にする。本工程を、上述した第１実施形態の（ａ）工程と比較すると、シトシン残基と光応答性官能基とを近接させる方法が異なっている。
【００６７】
第１実施形態の（ａ）工程では、識別対象のシトシン残基を有する核酸試料である第一核酸と、光応答性官能基を有する第二核酸と、５’側が第一核酸と相補的な配列であり、３’側が第二核酸と相補的な配列である第三核酸とのハイブリダイゼーションを利用して、シトシン残基と光応答性官能基とを近接させる。
【００６８】
これに対し、本実施形態の（ａ’）工程では、識別対象のシトシン残基Ｘを有する核酸試料である第一核酸と、第一核酸と相補的な配列を有し、光応答性官能基Ｗを有する第六核酸とをハイブリダイズさせ、前記シトシン残基Ｘと前記光応答性官能基Ｗとを近接させる。
【００６９】
本実施形態の方法において使用できる光応答性官能基としては、芳香族基又はオレフィン基を有する核酸類縁体、芳香族オレフィン化合物、芳香族化合物等が挙げられる。また、上記の第六核酸は、これらの光応答性官能基を塩基部分に有するヌクレオチドを末端に有する核酸であってもよい。
【００７０】
［（ｂ’）工程］
本工程では、（ａ’）工程により近接させたシトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｗに波長３００〜４００ｎｍの光を照射して、シトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｙとが光化学反応により共有結合した連結基Ｖを生成し、前記連結基Ｖにより第一核酸と第六核酸とが連結した第七核酸を生成する。
【００７１】
図７は、本実施形態の（ａ’）〜（ｄ’）工程を説明する図である。近接させたシトシン残基Ｘと光応答性官能基Ｗに光を照射することにより、連結基Ｖが生成される。その他の点については、第１実施形態の（ｂ）工程と同様である。
【００７２】
［（ｃ’）工程］
本工程において、上記連結基Ｖを９０〜１００℃に加熱して脱アミノ化させる。図７は、本実施形態の（ａ’）〜（ｄ’）工程を説明する図である。上記連結基Ｖの脱アミノ化により、連結基Ｖ’が生成される。その他の点については、第１実施形態の（ｃ）工程と同様である。
【００７３】
［（ｄ’）工程］
本工程において、脱アミノ化後の上記連結基Ｖ’に波長２８０〜３１５ｎｍの光を照射して、前記連結基Ｖ’を開裂させる。図７は、本実施形態の（ａ’）〜（ｄ’）工程を説明する図である。上記連結基Ｖ’に光を照射することにより、連結基Ｖ’が解離し、第八核酸と第六核酸に分離する。
【００７４】
本工程で生成される第八核酸では、（ｃ’）工程における脱アミノ化により、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘが、残基Ｘ’に変化している。試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘが５−メチルシトシン残基であった場合、第八核酸中の残基Ｘ’はチミン残基である。一方、試料核酸の識別対象のシトシン残基Ｘがメチル化されていないシトシン残基であった場合、第八核酸中の残基Ｘ’はウラシル残基である。その他の点については、第１実施形態の（ｄ）工程と同様である。
【００７５】
［（ｅ’）〜（ｆ’）工程］
（ｅ’）工程において上記の第八核酸の脱塩基処理を行い、（ｆ’）工程において脱塩基部位を切断する。これらの工程は、第１実施形態の（ｅ）〜（ｆ）工程と同様である。
【００７６】
［（ｇ’）工程］
本工程において第八核酸の切断を検出する。第八核酸の切断の検出は、第１実施形態における第五核酸の切断の検出と同様に行うことができる。第八核酸の切断の検出はＰＣＲにより行われてもよく、リアルタイムＰＣＲにより行われてもよく、電気泳動により行われてもよい。また、核酸試料中の、識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との存在比率を定量的に測定してもよい。また、第八核酸が蛍光標識されており、第八核酸の切断の検出が、当該蛍光標識を利用して行われてもよい。
【００７７】
［（ｈ’）工程］
本工程において、核酸試料の識別対象のシトシン残基を判定する。第八核酸の切断が検出された場合には、識別対象のシトシン残基はメチル化されていないシトシン残基であったと判定し、第八核酸の切断が検出されなかった場合には、識別対象のシトシン残基は５−メチルシトシン残基であったと判定する。
【００７８】
［変形例］
上記の第六核酸は、第１実施形態の第二核酸と同様に、固相上に固定化されていてもよい。これにより、第１実施形態と同様に、例えば、洗浄操作によって夾雑物を除去することにより、バックグラウンドを低減させて検出感度を高めることができる。本実施形態における夾雑物としては、例えば、第六核酸とハイブリダイズしなかった第一核酸等が挙げられる。
【００７９】
＜シトシン残基の識別用キット＞
１実施形態において、本発明は、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを識別するためのキットであって、光応答性官能基を有する核酸を含む、キットを提供する。
【００８０】
本実施形態のキットが、上述した第１実施形態の識別方法用である場合には、光応答性官能基としては、５−カルボキシビニルウラシル、その他ビニル基を有する核酸誘導体等が使用できる。
【００８１】
また、本実施形態のキットが、上述した第２実施形態の識別方法用である場合には、光応答性官能基としては、芳香族基又はオレフィン基を有する核酸類縁体、芳香族オレフィン化合物、芳香族化合物等が使用できる。
【００８２】
本実施形態のキットは、更に、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含んでいてもよい。また、本実施形態のキットは、核酸試料中の、識別対象のシトシン残基が５−メチルシトシン残基である核酸と識別対象のシトシン残基がメチル化されていないシトシン残基である核酸との存在比率を定量的に測定するためのものであってもよい。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００８４】
〔実験例１〕
上述した第１実施形態の識別方法を実施した。まず、表１に示す第一核酸、第二核酸及び第三核酸を準備した。第一核酸としては、５’末端から数えて３０番目の塩基がシトシンであるもの（第一核酸（Ｃ））と５−メチルシトシンであるもの（第一核酸（Ｍ））とを準備した。表１中、第一核酸（Ｍ）の塩基配列における「Ｍ」は、５−メチルシトシン残基を示す。また、第二核酸の塩基配列のＣＶＵは５−カルボキシビニル−２’−デオキシウリジンを示す。
【００８５】
【表１】
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【００８６】
［（ａ）工程］
一反応あたり全量が１０μＬとなるように、微量試験チューブ内で、第一核酸（０．１μＭ）、第二核酸（４μＭ）、第三核酸（４μＭ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ｐＨ８．０、２０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２．５ｍＭ）及び蒸留水からなる反応液を調製した。第一核酸としては、上述した第一核酸（Ｃ）を用いたものと第一核酸（Ｍ）を用いたものをそれぞれ調製した。
【００８７】
続いて、ＰＣＲ用の装置を用いて、各反応液を９５℃で２分間加熱した後、２５℃に冷却してハイブリダイズさせた。
【００８８】
［（ｂ）工程］
続いて、微量試験チューブの上蓋をはずした状態で、氷浴下にてＬＥＤ光源の３６６ｎｍのＵＶ光照射を３０分間行った。
【００８９】
以上の操作の後、１５％ポリアクリルアミドゲル（モノアクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）で各反応液を電気泳動し、反応の確認を行った。
【００９０】
図８は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。図中「Ｃ」は、第一核酸として第一核酸（Ｃ）を用いたことを示し、「Ｍ」は、第一核酸として第一核酸（Ｍ）を用いたことを示す。レーン１は、第一核酸（Ｃ）を用いた反応液の光照射前の結果である。レーン２は、第一核酸（Ｃ）を用いた反応液の光照射後の結果である。レーン３は、第一核酸（Ｍ）を用いた反応液の光照射前の結果である。レーン４は、第一核酸（Ｍ）を用いた反応液の光照射後の結果である。
【００９１】
第一核酸（Ｃ）を用いた反応液と、第一核酸（Ｍ）を用いた反応液とのいずれの反応液においても、光照射後に第四核酸のバンドが新たに出現していることが確認できた。以下、第一核酸（Ｃ）に由来する第四核酸を第四核酸（Ｃ）という。同様に、第一核酸（Ｍ）に由来する第四核酸を第四核酸（Ｍ）という。
【００９２】
［（ｃ）工程］
光照射で得られた第四核酸（Ｃ）及び（Ｍ）を、それぞれポリアクリルアミドゲルから切り出して分離精製した。続いて、蒸留水を用いて濃度調整を行い、一反応あたり全量が１０μＬで、回収した第四核酸の終濃度が０．１μＭとなるよう反応液を調製した。続いて、ＰＣＲ用の装置を用いて、各反応溶液を９５℃で２時間加熱して脱アミノ化反応を行った。
【００９３】
［（ｄ）工程］
脱アミノ化後、微量試験チューブの上蓋をはずした状態で、室温にてトランスイルミネーターを用いて３０２ｎｍの光を３０分間又は６０分間照射した。以上の操作の後、１５％ポリアクリルアミドゲル（モノアクリルアミド：ビスアクリルアミド＝１９：１）で各反応液を電気泳動し、反応の確認を行った。
【００９４】
図９は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。図中「Ｃ」は、第四核酸として第四核酸（Ｃ）を用いたことを示し、「Ｍ」は、第四核酸として第四核酸（Ｍ）を用いたことを示す。
【００９５】
レーン１は、脱アミノ化後の第四核酸（Ｃ）の光照射前の結果である。レーン２は、脱アミノ化後の第四核酸（Ｃ）の光照射３０分後の結果である。レーン３は、脱アミノ化後の第四核酸（Ｃ）の光照射６０分後の結果である。レーン２及びレーン３には、第一核酸（Ｃ）の５’末端から数えて３０番目のシトシンがウラシルに変換された第五核酸のバンドが認められる。以下、この第五核酸を第五核酸（Ｕ）という。
【００９６】
また、レーン５は、脱アミノ化後の第四核酸（Ｍ）の光照射前の結果である。レーン６は、脱アミノ化後の第四核酸（Ｍ）の光照射３０分後の結果である。レーン７は、脱アミノ化後の第四核酸（Ｍ）の光照射６０分後の結果である。レーン６及びレーン７には、第一核酸（Ｍ）の５’末端から数えて３０番目の５−メチルシトシンがチミンに変換された第五核酸のバンドが認められる。以下、この第五核酸を第五核酸（Ｔ）という。
【００９７】
［（ｅ）工程］
（ｄ）工程における光照射の後、各反応液５μＬにウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを４μＬと添付の１０ｘバッファーを１μＬ加えた全量１０μＬの脱塩基反応液を調製した。続いて、ＰＣＲ用の装置を用いて、調製した反応液を３７℃で１時間静置した。これにより、ウラシル残基が脱塩基された脱塩基部位が形成された。
【００９８】
［（ｆ）工程］
続いて、（ｅ）工程で脱塩基反応を行った後の反応液を９５℃で１０分間加熱した。これにより、第五核酸の脱塩基部位が加水分解により切断された。
【００９９】
［（ｇ）工程］
続いて、ポリアクリルアミドゲルで各反応液を電気泳動し、反応の確認を行った。図９は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す写真である。レーン４は、第五核酸（Ｕ）を、脱塩基処理及び切断処理した結果である。レーン８は、第五核酸（Ｔ）を、脱塩基処理及び切断処理した結果である。その結果、第五核酸（Ｕ）は脱塩基処理及び切断処理により切断され断片化したが（図９、レーン４）、第五核酸（Ｔ）は、脱塩基されないため断片化しなかった（図９、レーン８）。
【０１００】
〔実験例２〕
実験例１の（ｇ）工程をリアルタイムＰＣＲにより行った。実験例１の（ｆ）工程後の第５核酸（Ｕ）及び第５核酸（Ｔ）を鋳型に用いた。また、ネガティブコントロールとして、蒸留水を鋳型に用いた。ＰＣＲに用いたプライマーの塩基配列を表２に示す。また、ＰＣＲの反応液の組成を表３に示す。
【０１０１】
調製したＰＣＲの反応液をリアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ社、商品名「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ」）にセットし、９５℃で１４分間保持した後、９５℃３０秒、６３℃４５秒、７２℃２５秒の３ステップＰＣＲを５０サイクル行い、最後に７２℃１０分間の加熱を行って反応を終了させた。
【０１０２】
図１０は、リアルタイムＰＣＲの結果を示すグラフである。横軸はＰＣＲのサイクル数を示し、縦軸は蛍光強度を示す。図中、「第五核酸（Ｔ）」は、第五核酸（Ｔ）を鋳型に用いた結果であることを示し、「第五核酸（Ｕ）」は、第五核酸（Ｕ）を鋳型に用いた結果であることを示す。
【０１０３】
図１０の結果から、ＰＣＲによる増幅の程度は、第五核酸（Ｔ）を鋳型に用いたものの方が、第五核酸（Ｕ）を鋳型に用いたものと比較して、より少ないＰＣＲサイクル数で上昇したことが確認された。この結果から、第五核酸（Ｔ）は、実験例１の（ｆ）工程で断片化されなかったのに対し、第五核酸（Ｕ）は、実験例１の（ｆ）工程で断片化されたことが確認された。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【０１０６】
本発明によれば、簡便な操作により、核酸試料の識別対象のシトシン残基が、５−メチルシトシン残基であるか、メチル化されていないシトシン残基であるかを正確に識別する方法及びキットを提供することができる。
【符号の説明】
【０１０７】
Ｘ…シトシン残基、Ｙ，Ｗ…光応答性官能基、Ｚ，Ｚ’,Ｖ,Ｖ’…連結基、Ｘ’…残基。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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