(57)【要約】      （修正有）【課題】親水性ペプチドの中でも特に糖ペプチドの脱塩に有用な固相抽出カラム用の基剤を見出し、当該基剤を利用して糖ペプチドの脱塩を行う方法を提供する。【解決手段】六方晶系窒化ホウ素（h-BN）が糖ペプチドを含む広範囲のペプチドの保持に優れており、糖ペプチドの脱塩に有用な固相抽出用の基剤になることを見出した。また、h-BNによる固相抽出を両親媒性ポリマーによる固相抽出と組み合わせることにより、効率的に糖ペプチドを濃縮しうることも見出した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料を調製する方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）糖ペプチド含有ペプチド試料を、六方晶系窒化ホウ素に吸着させる工程
（ｂ）洗浄液で当該六方晶系窒化ホウ素を洗浄する工程
（ｃ）溶出液で当該六方晶系窒化ホウ素に保持されたペプチドを溶出し、当該六方晶系窒化ホウ素から溶出されたペプチドを回収する工程
【請求項２】
工程（ｂ）の洗浄液として、酸もしくは塩基を含む水溶液を用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酸がギ酸である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）の溶出液として、酸もしくは塩基と水と有機溶媒を含む混合溶媒を用いる、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
酸がギ酸であり、有機溶媒がアセトニトリルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料を調製する方法であって、下記（ａ）から（ｅ）の工程を含む方法。
（ａ）糖ペプチド含有ペプチド試料を、六方晶系窒化ホウ素に吸着させる工程
（ｂ）洗浄液で当該六方晶系窒化ホウ素を洗浄する工程
（ｃ）溶出液で当該六方晶系窒化ホウ素に保持されたペプチドを溶出し、当該六方晶系窒化ホウ素から溶出されたペプチドを回収する工程
（ｄ）回収したペプチドを両親媒性ポリマーに接触させる工程
（ｅ）当該両親媒性ポリマーに吸着しないペプチドを回収する工程
【請求項７】
工程（ｂ）の洗浄液として、酸もしくは塩基を含む水溶液を用いる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酸がギ酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）の溶出液として、酸もしくは塩基と水と有機溶媒を含む混合溶媒を用いる、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
酸がギ酸であり、有機溶媒がアセトニトリルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
六方晶系窒化ホウ素を充填剤とする、請求項１から１０のいずれかに記載の方法に用いるためのカラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料を調製する方法であって、特に、六方晶系窒化ホウ素を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテオミクスにおいて、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）前に、試料の脱塩のための固相抽出（SPE）が行われるが、この固相抽出としては、オクタデシルシリカ（C18）を基材とする逆相クロマトグラフィーがよく用いられている。しかしながら、C18基材は疎水性ペプチドに偏向し、リン酸化ペプチドや糖ペプチドを含む親水性ペプチドへの結合親和性がかなり低い。このため、Larsenらは、大規模ホスホプロテオミクスとの組み合わせにおいて、C18に代えて、グラファイトカーボン（GC）を使用することを推奨している（非特許文献１）。GC基材は、広範囲の疎水性をカバーすることで特徴づけられている。GC基材は、親水性物質も保持することができるが、いくつかの親水性ペプチドはそのカラムに強く固着し、溶出が困難となってしまうという問題がある。
【０００３】
この点、リン酸化ペプチドについては、固相抽出において両親媒性（HLB）ポリマーを利用した場合、一般に、両親媒性ポリマーに吸着させて簡便に脱塩することができる。
【０００４】
しかしながら、糖ペプチドについては、両親媒性ポリマーには吸着し難く、塩と一緒に流出されて脱塩ができないという問題があった。
【０００５】
そこで、糖ペプチドの脱塩や濃縮においては、従来のC18、GC、および両親媒性ポリマーに代わる新たな固相抽出カラム用基材の開発が望まれていた。
【０００６】
なお、Fischnallerらは、固相抽出における脱塩や濃縮のための基材として、窒化ホウ素（BN）の利用可能性を教示している（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】M.R.  Larsen,  et  al.,  Mol.  Cell.  Proteomics  3  (2004)  456-465.
【非特許文献２】Martin  Fischnaller,  et  al.,  Analytica  Chimica  Acta  823  1  May  (2014)  40-50.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記従来技術における課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、糖ペプチドの脱塩に有用な固相抽出用の基剤を見出し、当該基剤を利用して糖ペプチドの脱塩を行う方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。ここで、本発明者は、窒化ホウ素（BN）の一つの型（六方晶系窒化ホウ素[h-BN]）が、GCと近似した化学的・構造的特徴を有すること（Y.  Fujinaga,  Y.  Syono,  J  Jpn.  Inst.  Metals  59  (1995)  519-524）に着目した。GCもBNも異なる結晶形が存在し、カーボンには、グラファイトやダイヤモンドの結晶形が、BNには、h-BN、ウルツ鉱型BN[w-BN]、菱面体晶系BN[r-BN]、および立方晶系BN[c-BN]が知られている。GCとh-BNは、一般にホワイトグラファイトと呼ばれており、六角形上に組織された原子で形成される格子が平行に積み重なった構造である点で共通している。そこで、本発明者は、まず、固相抽出材料としてのh-BNの性能につき、リン酸化ペプチドを例に検討を行った。その結果、本発明者は、h-BNは、C18と異なり、親水性の高いリン酸化ペプチドの保持にも優れ、保持されるリン酸化ペプチドの範囲が、C18とGCの双方で保持されるリン酸化ペプチドと同レベルであることを見出した。
【００１０】
上記の通り、リン酸化ペプチドについては、固相抽出において両親媒性（HLB）ポリマーに吸着し易い一方、糖ペプチドについては、両親媒性ポリマーには吸着し難いことが知られている。そこで、本発明者らは、次に、糖ペプチドにつき、両親媒性ポリマーとの比較でh-BNにおける保持能力の検討を行った。その結果、予想通り、両親媒性ポリマーは、非糖ペプチドの保持能力は高いが、糖ペプチドの保持能力が低かった。その一方、予想に反し、h-BNは、糖ペプチドの保持能力に極めて優れていた。また、h-BNを利用して調製したペプチド試料は、両親媒性ポリマーを利用して調製した試料と比較して、質量分析に供した場合のシグナル／ノイズ比（S/N比）が顕著に高かった。これによりh-BNが質量分析用の糖ペプチド試料の調製において極めて優れた性能を発揮することが判明した。
【００１１】
さらに、本発明者らは、このようなh-BNと両親媒性ポリマーの特性から、糖ペプチド含有ペプチド試料につき、まず、h-BNを基剤として固相抽出を行ってその溶出画分を回収し、次いで、この溶出画分につき、両親媒性ポリマーを基剤として固相抽出を行いフロースルー画分を回収することにより、糖ペプチド含有ペプチド試料を脱塩するとともに、試料中の糖ペプチドを濃縮することが可能であることを見出した。
【００１２】
すなわち、本発明は、脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料を調製する方法において、h-BNを固相抽出用の基剤として利用する方法に関し、より詳しくは、以下の方法を提供するものである。
【００１３】
（１）脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料を調製する方法であって、下記（ａ）から（ｃ）の工程を含む方法。
（ａ）糖ペプチド含有ペプチド試料を、六方晶系窒化ホウ素に吸着させる工程
（ｂ）洗浄液で当該六方晶系窒化ホウ素を洗浄する工程
（ｃ）溶出液で当該六方晶系窒化ホウ素に保持されたペプチドを溶出し、当該六方晶系窒化ホウ素から溶出されたペプチドを回収する工程
【００１４】
（２）工程（ｂ）の洗浄液として、酸もしくは塩基を含む水溶液を用いる、（１）に記載の方法。
【００１５】
（３）酸がギ酸である、（２）に記載の方法。
【００１６】
（４）工程（ｃ）の溶出液として、酸もしくは塩基と水と有機溶媒を含む混合溶媒を用いる、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
（５）酸がギ酸であり、有機溶媒がアセトニトリルである、（４）に記載の方法。
【００１８】
（６）脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料を調製する方法であって、下記（ａ）から（ｅ）の工程を含む方法。
（ａ）糖ペプチド含有ペプチド試料を、六方晶系窒化ホウ素に吸着させる工程
（ｂ）洗浄液で当該六方晶系窒化ホウ素を洗浄する工程
（ｃ）溶出液で当該六方晶系窒化ホウ素に保持されたペプチドを溶出し、当該六方晶系窒化ホウ素から溶出されたペプチドを回収する工程
（ｄ）回収したペプチドを両親媒性ポリマーに接触させる工程
（ｅ）当該両親媒性ポリマーに吸着しないペプチドを回収する工程
【００１９】
（７）工程（ｂ）の洗浄液として、酸もしくは塩基を含む水溶液を用いる、（６）に記載の方法。
【００２０】
（８）酸がギ酸である、（７）に記載の方法。
【００２１】
（９）工程（ｃ）の溶出液として、酸もしくは塩基と水と有機溶媒を含む混合溶媒を用いる、（６）から（８）のいずれかに記載の方法。
【００２２】
（１０）酸がギ酸であり、有機溶媒がアセトニトリルである、（９）に記載の方法。
【００２３】
（１１）六方晶系窒化ホウ素を充填剤とする、（１）から（１０）のいずれかに記載の方法に用いるためのカラム。
【発明の効果】
【００２４】
h-BNを固相抽出用の基剤として利用する本発明によれば、糖ペプチド含有ペプチド試料を効率的に脱塩することが可能であり、ペプチド試料において糖ペプチドを濃縮することも可能である。特に、h-BNを利用した固相抽出に、両親媒性ポリマーを利用した固相抽出を組み合わせた場合には、ペプチド試料における糖ペプチドの濃縮効率を顕著に高めることが可能である。また、こうして調製された糖ペプチド含有ペプチド試料を利用すれば、優れたシグナル／ノイズ比で質量分析などを行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】脱塩におけるC18、GC、およびh-BNの比較を示す図である。A：C18およびGCによる脱塩操作の流れを示す図。B：C18で捕捉されたリン酸化ペプチドのクロマトグラム。C：C18で捕捉されず、GCで捕捉されたリン酸化ペプチドのクロマトグラム。D：C18＋GCで捕捉されたリン酸化ペプチドのクロマトグラム。E：h-BNで捕捉されたリン酸化ペプチドのクロマトグラム。
【図２】h-BN（BNカートリッジ）および両親媒性ポリマー（Supel-select  HLB  SPE  cartridge）のペプチド捕捉性能を比較した結果を示すマススペクトル（質量電荷比2050〜3050）である。上がh-BNを用いた結果で、下が両親媒性ポリマーを用いた結果である。左がフロースルー画分（捕捉されなかったペプチド）の結果で、右が溶出画分（捕捉されたペプチド）の結果である。試料としては、トリプシン消化したIgGを用いた。
【図３】h-BNおよび両親媒性ポリマーに捕捉されたペプチドを比較した結果を示すマススペクトルである。上がh-BNを用いた結果で、下が両親媒性ポリマーを用いた結果である。試料としては、トリプシン消化したIgGを用いた。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料を調製する方法を提供する。本発明の方法の第一の態様は、h-BNを基剤として固相抽出を行う方法である。h-BNを利用することで効率的に糖ペプチド含有ペプチド試料の脱塩を行うことができ、その後の質量分析などによる解析において、高いシグナル／ノイズ比を実現することが可能となる。
【００２７】
この方法においては、まず、糖ペプチド含有ペプチド試料を、h-BNに吸着させる（工程（ａ））。本発明における「h-BN」は、窒化ホウ素の一つの型であり、黒鉛類似の層状構造を有する。本発明における「糖ペプチド含有ペプチド試料」は、ペプチドとして糖ペプチドおよび非糖ペプチドを含む試料であってもよく、ペプチドとして糖ペプチドのみを含む試料であってもよい。糖ペプチド含有ペプチド試料は、生体試料から調製したものであっても、人工的に製造したものであってもよい。生体試料としては、例えば、細胞、組織、全血、血清、血漿、尿、唾液、ウイルスなどが挙げられるが、これらに制限されない。糖ペプチド含有ペプチド試料は、目的に応じて、プロテアーゼ処理などの前処理がなされていてもよい。
【００２８】
h-BNに適用する糖ペプチド含有ペプチド試料は、h-BNへの適用前に、必要に応じて、トリフルオロ酢酸などの酸で前処理してもよい。
【００２９】
糖ペプチド含有ペプチド試料をh-BNへ吸着させる方法としては、特に制限はない。例えば、h-BNを充填剤とするカラムにロードすることにより、また、h-BNを入れたチューブやマイクロプレートに加えることにより、糖ペプチド含有ペプチド試料をh-BNへ吸着させることができる。
【００３０】
h-BNを充填剤とするカラムは、例えば、空のカラムにh-BNを充填し、充填剤の両端にフィルター（フリット）を装備することにより作製することができる。当該カラムは、糖ペプチド含有ペプチド試料をロードする前に、コンディショニングおよび平衡化することが好ましい。カラムは、例えば、最初に1M水酸化アンモニウムで、次いで100％アセトニトリルで洗浄することによりコンディショニングし、1％トリフルオロ酢酸で平衡化することができる。
【００３１】
本発明の方法においては、次いで、洗浄液でh-BNを洗浄する（工程（ｂ））。糖ペプチド含有ペプチド試料をh-BNを充填剤とするカラムに吸着させた場合には、当該カラムに洗浄液を通過させることにより、h-BNを洗浄することができる。カラム上部から圧力をかけることにより、また、カラム下部から吸引することにより、効率的に、カラムに洗浄液を通過させることができる。また、糖ペプチド含有ペプチド試料をチューブやマイクロプレートに入れたh-BNに吸着させた場合には、当該チューブやマイクロプレートに洗浄液を加え、上清を除去することにより、h-BNを洗浄することができる。
【００３２】
洗浄液としては、脱塩が可能であり、かつ、目的物質を溶出させないものであれば特に制限はないが、例えば、酸もしくは塩基を含む水溶液を用いることができる。酸もしくは塩基を含む水溶液を用いる場合、酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸、ギ酸、塩基としては、例えば、アンモニア水、ピロリジン、トリエチルアミンが挙げられる。酸もしくは塩基の濃度は、通常、0.01〜10％である。
【００３３】
本発明の方法においては、次いで、溶出液でh-BNに保持されたペプチドを溶出し、当該h-BNから溶出されたペプチドを回収する（工程（ｃ））。糖ペプチド含有ペプチド試料をh-BNを充填剤とするカラムに吸着させた場合には、当該カラムに溶出液を通過させることにより、h-BNから溶出されたペプチドを回収することができる。カラム上部から圧力をかけることにより、また、カラム下部から吸引することにより、効率的に、カラムに溶出液を通過させることができる。また、糖ペプチド含有ペプチド試料をチューブやマイクロプレートに入れたh-BNに吸着させた場合には、当該チューブやマイクロプレートに溶出液を加え、上清を回収することにより、h-BNから溶出されたペプチドを回収することができる。
【００３４】
溶出液としては、目的物質を溶出しうるものであれば特に制限はないが、例えば、酸もしくは塩基と水と有機溶媒を含む混合溶媒を用いることができる。酸もしくは塩基と水と有機溶媒を含む混合溶媒を用いる場合、酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸、ギ酸、塩基としては、例えば、アンモニア水、ピロリジン、トリエチルアミンが挙げられ、有機溶媒としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが挙げられる。酸もしくは塩基の濃度は、通常、0.01〜10％であり、有機溶媒の濃度は、通常、30〜99％である。
【００３５】
本発明の方法の第二の態様は、h-BNを利用した固相抽出と両親媒性ポリマーを利用した固相抽出との組み合わせに係る方法である。両親媒性ポリマーによる固相抽出を組み合わせることにより、脱塩された糖ペプチド含有ペプチド試料における糖ペプチドを効率的に濃縮することが可能となる。
【００３６】
この方法においては、まず、h-BNよる固相抽出（上記（ａ）〜（ｃ）の工程）を実施し、その結果、回収したペプチドを、両親媒性ポリマーに接触させる（工程（ｄ））。
【００３７】
「両親媒性ポリマー」としては、例えば、疎水性ポリマーをベースとして親水性基を導入したポリマーが挙げられる。疎水性ポリマーとしては、例えば、スチレン／ジビニルベンゼン共重合体が挙げられ、導入する親水性基としては、例えば、N-ビニルピロリドン基が挙げられる。また、市販品としては、例えば、Supel-select  HLB  SPE  cartridge（Sigma-Aldrch社）が挙げられる。
【００３８】
糖ペプチド含有ペプチド試料を両親媒性ポリマーに接触させる方法としては、特に制限はない。例えば、両親媒性ポリマーを充填剤とするカラムにロードすることにより、また、両親媒性ポリマーを入れたチューブやマイクロプレートに加えることにより、糖ペプチド含有ペプチド試料を両親媒性ポリマーに接触させることができる。
【００３９】
両親媒性ポリマーを充填剤とするカラムは、例えば、空のカラムに両親媒性ポリマーを充填し、充填剤の両端にフィルター（フリット）を装備することにより作製することができる。当該カラムは、糖ペプチド含有ペプチド試料をロードする前に、活性化および平衡化することが好ましい。カラムは、例えば、最初に100％メタノールで、次いで水で洗浄することによりコンディショニングすることができる。
【００４０】
この方法においては、次いで、当該両親媒性ポリマーに吸着しないペプチドを回収する（工程（ｅ））。
【００４１】
両親媒性ポリマーに吸着しないペプチドを回収する方法としては、特に制限はない。例えば、両親媒性ポリマーを充填剤とするカラムに洗浄液を通過させ、洗浄液を回収することにより、両親媒性ポリマーに吸着しないペプチドを回収することができる。カラム上部から圧力をかけることにより、また、カラム下部から吸引することにより、効率的に、カラムに洗浄液を通過させることができる。また、両親媒性ポリマーを入れたチューブやマイクロプレートに洗浄液を加え、上清を回収することにより、両親媒性ポリマーに吸着しないペプチドを回収することができる。
【００４２】
洗浄液としては、両親媒性ポリマーに吸着した物質を流出させず、吸着しない物質を流出させるものであれば特に制限はないが、例えば、酸もしくは塩基を含む水溶液を用いることができる。酸もしくは塩基を含む水溶液を用いる場合、酸としては、例えば、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸、ギ酸、塩基としては、例えば、アンモニア水、ピロリジン、トリエチルアミンが挙げられる。酸もしくは塩基の濃度は、通常、0.01〜10％である。
【００４３】
本発明は、また、h-BNを充填剤とする、上記方法に用いるためのカラムをも提供するものである。本発明の方法の第二の態様においては、さらに、両親媒性ポリマーを充填剤とするカラムを組み合わせてもよい。
【００４４】
上記の本発明の方法を経て回収した糖ペプチド含有ペプチド試料は、クロマトグラフィ（例えば、HPLC）、質量分析（例えば、MALDI-TOF  MS）、クロマトグラフィと質量分析の組み合わせ（例えば、LC-MS）などの公知の分析方法に適用して、各ペプチドの構造や量などの分析を行うことができる。検出されたペプチドの同定においては、公知のペプチドデータベースを利用することができる。
【実施例】
【００４５】
以下、参考例および実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
[参考例１]  h-BNのペプチドの固相抽出への適用可能性
本参考例においては、リン酸化ペプチドを例に、h-BN、GC、およびC18の性能の比較を行った。Wienkoopら（S.  Wienkoop,  et  al.,  Mol.  Cell.  Proteomics  7  (2008)  1725-1736）に従って、シロイヌナズナCol-0の葉から全タンパク質を抽出し、Lys-Cを含む8M尿素バッファーおよびトリプシンを含む2M尿素バッファーで500μgのタンパク質を消化した。消化後、異なる脱塩プロトコールを適用した。
【００４７】
C18脱塩については、製造業者の説明に従って、SPEC  C18  96ウェルプレート（Varian社製）を使用した。すなわち、C18固相抽出カラムを2×200μlの100%メタノールで活性化し、4×400μlの水で平衡化した。次いで、試料を結合させ、4×400μlの水で洗浄することにより塩を除去した。最後に、ペプチドを2×200μlの100%メタノールで溶出した。
【００４８】
消化フロースルーとC18脱塩からの水洗を回収し、プールし、その後、GC固相抽出カラムに移した。GC（20mg）をスピンカラム（MoBiTec社製）に充填し、Termo  Scientific  Pieceのグラファイトスピンカラムの指示に従い使用した。すなわち、試料を50%トリフルオロ酢酸（TFA）で酸性化し、pHを2.0未満にした。GC固相抽出カラムを、最初に2×100μlの1M水酸化アンモニウム（NH4OH）で、次いで1×100μlの100％アセトニトリル（ACN）でコンディショニングし、2×100μlの1%トリフルオロ酢酸で平衡化した。その試料をカラムにロードし、10分間結合させた。2×200μlの1%トリフルオロ酢酸で洗浄することにより塩を除き、最後に、0.1％ギ酸を含む50%アセトニトリルの4×100μlでペプチドを溶出した。
【００４９】
BNはSigma-Aldrch社から購入し、X線回折によりその結晶構造はほとんどがh-BNであることを確認した。BN（30mg）を各端にポリエチレンフリットを有する空のSPEカートリッジ（66×7.6mm  i.d.）に詰めた。GCとBNの構造的類似性のため、GC固相抽出に用いたのと同様の脱塩工程をBN固相抽出に用いた。
【００５０】
脱塩後、Chenら（Y.  Chen,  et  al.,  Plant  J.  63  (2010)  1-17）に記載されたプロトコールを用いて、リン酸化ペプチドを二酸化チタン（TiO2）で濃縮した。濃縮は、C18、GCで脱塩したC18フロースルー、およびBNに対して行った。また、GC+18においては、それぞれの溶出プールを濃縮前に混合した。実験は、n=3で行った。濃縮したリン酸化ペプチドを、0.1nmの内径を持つ150mmのChromolith  CapRod  monolithic  column（Merck社製）にロードし、95分間の直列的な水／メタノールの勾配（5〜70%の移動相Bの勾配）にて流速500nl/分で分離した（移動相A：0.1%[v/v]FAを含む水；移動相B：0.1%[v/v]FAを含む90%[v/v]メタノール）。
【００５１】
質量分析は、LTQ-Orbitrap  XL  device（Thermo社製）を用いて行った。ペプチドを、アラビドプシスTAIR10タンパク質データベースに対して、SEQUESTアルゴリズムを持つProteome  Discovererを用いて同定した。
【００５２】
その結果、C18は、疎水性の高いリン酸化ペプチド（これは遅れて溶出される）の保持に優れていたが、親水性の高いリン酸化ペプチド（これは早く溶出される）の保持には向いていなかった（図1B）。GCは、C18で保持できなかった親水性の高いリン酸化ペプチド（C18のフロースルー画分）を捕捉することができた（図1C）。一方、h-BNに保持されるリン酸化ペプチドの範囲は、C18とGCの双方で保持されるリン酸化ペプチドと同レベルであった（図1D、E）。これら事実から、h-BNが疎水性の高いリン酸化ペプチドから親水性の高いリン酸化ペプチドまで幅広く捕捉できることが明らかとなった。
【００５３】
[実施例１]  h-BNによる糖ペプチドの固相抽出
リン酸化ペプチドについては、固相抽出において両親媒性ポリマーに吸着し易い一方、糖ペプチドについては、両親媒性ポリマーには吸着し難いことが知られている。そこで、本発明者は、h-BNが糖ペプチドの保持能力を有するか否かを検討した。具体的には、糖ペプチドの代表例であるIgGを対象に、h-BNと両親媒性（HLB）ポリマーにおける糖ペプチドの保持能力を比較した。
【００５４】
IgGは市販のもの（Fully  human  IgG1  isotype  control  monoclonal  antibody  produced  recombinantly  in  CHO  cells  under  serum-free  conditions(code:ET901,  EUREKA社)を用い、トリプシンを含む重炭酸塩バッファーでIgGを消化した。消化後、h-BN（BNカートリッジ）もしくは両親媒性ポリマー（Supel-select  HLB  SPE  cartridge；Sigma-Aldrch社）を用いて脱塩を行った。h-BNとHLBポリマーは比較のため、コンディショニング、洗浄、溶出はすべて同じ条件で行った。コンディショニングは100％メタノールとMilliQで行った。次いで、これら基剤に試料を吸着させ、0.1％のギ酸水で洗浄することにより塩を除去した。最後に0.1％ギ酸を含む60％アセトニトリルで溶出した。脱塩後、濃縮したペプチドをAXIMA  Resonance（Shimadzu/Kratos社製)を用いて解析した。
【００５５】
なお、BNをSigma-Aldrch社から購入し、X線回折によりその結晶構造はほとんどがh-BNであることを確認した。BN（30mg）を各端にポリエチレンフリットを有する空のSPEカートリッジ（66×7.6mm  i.d.）に詰めて使用した（図2、図3では、このカートリッジを「BNカートリッジ」と称している）。
【００５６】
その結果、両親媒性ポリマーでは、主として、非糖ペプチドが溶出画分に検出され、糖ペプチドはフロースルーに検出された（図2）。一方、h-BNでは、IgGをトリプシン消化して生じる糖ペプチドおよび非糖ペプチドともに溶出画分に検出されたが、フロースルーにはこれらペプチドは検出されなかった（図2）。また、h-BNでは、質量分析におけるシグナル／ノイズ比（S/N比）が1000である一方、両親媒性ポリマーでは200であった（図3）。
【００５７】
これら事実から、h-BNは高い脱塩効果を持ち、生物試料のような塩を含む条件下での酵素消化処理後のクリーニングに適しているだけでなく、極性の高い糖ペプチドに対しても高い脱塩効果と保持能力を発揮することが判明した。一方、両親媒性ポリマーは、糖ペプチドに対して保持能力を持たなかったが、糖質を持たないペプチドとの分離は可能であることが判明した。
【００５８】
このようなh-BNと両親媒性ポリマーの特性から、ペプチド試料につき、まず、h-BNを利用して固相抽出を行い、その溶出画分につき、次いで両親媒性ポリマーを利用して固相抽出を行い、そのフロースルー画分を回収することにより、効率的に脱塩された糖ペプチド試料を調製することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、質量分析などに適した糖ペプチド含有ペプチド試料を効率的に調製することが可能であることから、本発明は広く糖ペプチド研究に貢献しうるものである。糖ペプチドは、バイオ医薬品としての開発も進められていることから、本発明はバイオ医薬品の品質評価なども含め医療分野においても貢献しうるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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