(57)【要約】      （修正有）【課題】効率の良い核酸増幅が可能な新規な核酸増幅反応方法の提供。【解決手段】核酸増幅反応液と、核酸増幅反応液よりも比重が小さく、核酸増幅反応液とは混和しない液体と、が充填された核酸増幅反応容器の第１領域を第１の温度に加熱する工程と、核酸増幅反応容器の第２領域を第１の温度より低い第２の温度に加熱する工程と、第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置を第２領域が第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置に切換える工程と、第２の配置を第１の配置に切換える工程と、を含む核酸増幅方法であって、核酸増幅反応液はプローブを含み、該プローブは人工核酸を含む、核酸増幅方法とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応液と、前記核酸増幅反応液よりも比重が小さく、前記核酸増幅反応液とは
混和しない液体と、が充填された核酸増幅反応容器の第１領域を第１の温度に加熱する工
程と、
前記核酸増幅反応容器の第２領域を前記第１の温度より低い第２の温度に加熱する工程
と、
前記第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置を前記
第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置に切換える工
程と、
前記第２の配置を前記第１の配置に切換える工程と、
を含む核酸増幅方法であって、
前記核酸増幅反応液はプローブを含み、該プローブは人工核酸を含む、核酸増幅方法。
【請求項２】
前記プローブは、天然核酸のみを含むプローブに比べ、鋳型核酸への結合力が大きい、
請求項１に記載の核酸増幅方法。
【請求項３】
前記人工核酸は、ＬＮＡ、３’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣ
ＯＣ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ、ＰＮＡ、ＧＮＡ又はＴＮＡである、請求項１に記載の核
酸増幅方法。
【請求項４】
前記人工核酸は、ＬＮＡである、請求項２に記載の核酸増幅方法。
【請求項５】
前記プローブは、標識されたプローブである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核
酸増幅方法。
【請求項６】
前記標識されたプローブは、ＲＩ標識、蛍光標識又は酵素標識されている、請求項５に
記載の核酸増幅方法。
【請求項７】
核酸増幅反応液と、前記核酸増幅反応液よりも比重が小さく、前記核酸増幅反応液とは
混和しない液体と、が充填された核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、
前記核酸増幅反応容器の第１領域の温度を第１の温度に加熱する第１の加熱部と、
前記核酸増幅反応容器の第２領域の温度を第２の温度に加熱する第２の加熱部と、
前記第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と、前
記第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置と、を切換
える駆動機構と、
を含む核酸増幅反応装置であって、
前記核酸増幅反応液はプローブを含み、該プローブは人工核酸を含む、核酸増幅反応装
置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の利用技術の発展により、遺伝子診断や遺伝子治療など遺伝子を利用した
医療が注目されている他、農畜産分野においても品種判別や品種改良に遺伝子を用いた手
法が多く開発されてきている。遺伝子を利用するための技術として、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの核酸増幅技術が広く普及している。
近年、核酸増幅反応産物を短時間で得ることが可能なＰＣＲ装置が開発されている（例え
ば、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２０８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の発明者らは、特開２０１２−１１５２０８に記載のＰＣＲ装置を使用した核酸
増幅反応において、熱変性およびアニーリング／伸長時間を短くすると、核酸増幅効率が
低下する場合があることを見いだした。そして、その原因を探り、問題を解決すべく、鋭
意努力した結果、当該ＰＣＲ装置において人工核酸を用いることで、効率よく核酸増幅が
可能になることを見いだした。よって本発明の目的は、効率の良い核酸増幅が可能な新規
な核酸増幅方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一実施態様は、核酸増幅反応液と、核酸増幅反応液よりも比重が小さく、核酸
増幅反応液とは混和しない液体と、が充填された核酸増幅反応容器の第１領域を第１の温
度に加熱する工程と、核酸増幅反応容器の第２領域を前記第１の温度より低い第２の温度
に加熱する工程と、第１領域が第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配
置を第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置に切換え
る工程と、第２の配置を第１の配置に切換える工程と、を含む核酸増幅方法であって、核
酸増幅反応液はプローブを含み、プローブは人工核酸を含む、核酸増幅方法である。プロ
ーブは、天然核酸のみを含むプローブに比べ、鋳型核酸への結合力が大きくてよい。人工
核酸は、ＬＮＡ、３’−アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣＯＣ、２’
，４’−ＢＮＡＮＣ、ＰＮＡ、ＧＮＡ又はＴＮＡであってよい。人工核酸は、ＬＮＡであ
ってよい。プローブは、標識されたプローブであってよい。標識されたプローブは、ＲＩ
標識、蛍光標識又は酵素標識されていてよい。
【０００６】
本発明の他の実施態様は、核酸増幅反応液と、核酸増幅反応液よりも比重が小さく、核
酸増幅反応液とは混和しない液体と、が充填された核酸増幅反応容器を装着可能な装着部
と、核酸増幅反応容器の第１領域の温度を第１の温度に加熱する第１の加熱部と、核酸増
幅反応容器の第２領域の温度を第２の温度に加熱する第２の加熱部と、第１領域が第２領
域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と、第２領域が前記第１領域より重
力の作用する方向に対し下になる第２の配置と、を切換える駆動機構と、を含む核酸増幅
反応装置であって、核酸増幅反応液はプローブを含み、プローブは人工核酸を含む、核酸
増幅反応装置である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によって、効率の良い核酸増幅が可能な新規な核酸増幅方法を提供することがで
きるようになった。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の一実施形態で使用する核酸増幅反応容器の断面図である。ｇは重力の方向を表す。
【図２】本発明の一実施形態で使用する昇降式ＰＣＲ装置の斜視図である。（Ａ）は蓋を閉じた状態、（Ｂ）は蓋を開けた状態を示す。
【図３】本発明の一実施形態で使用する昇降式ＰＣＲ装置における本体の分解斜視図である。
【図４】本発明の一実施形態で使用する昇降式ＰＣＲ装置における本体の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。（Ａ）は第１の配置、（Ｂ）は第２の配置を示す。
【図５】本発明の一実施形態及び比較例における、核酸増幅反応産物量を表す蛍光輝度測定値と熱サイクル数との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には
明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下
に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を
示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定
するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の
記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１０】
（１）核酸増幅方法
本発明の核酸増幅方法は、核酸増幅反応液と、核酸増幅反応液よりも比重が小さく、前
記核酸増幅反応液とは混和しない液体と、が充填された核酸増幅反応容器の第１領域を第
１の温度に加熱する工程と、核酸増幅反応容器の第２領域を第１の温度より低い第２の温
度に加熱する工程と、第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第
１の配置を第２領域が第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置に切換
える工程と、第２の配置を前記第１の配置に切換える工程と、を含む方法であって、核酸
増幅反応液はプローブを含み、プローブは人工核酸を含むことを特徴とする。
【００１１】
核酸増幅反応液は、核酸増幅反応用試薬、及び増幅対象の標的核酸を含んでもよい。標
的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液、組織などの検体から調整されたＤＮＡ
、又は、それらの検体から調製されたＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡなどが挙げられる。核
酸増幅反応用試薬は、標的核酸を増幅するためのプライマー、バッファー、ポリメラーゼ
、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２及び、標的核酸の増幅産物を検出するための蛍光標識などを含ん
でいてもよい。ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素
が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、
あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤ
ＮＡポリメラーゼが好ましい。ｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度に
すれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、
Ｍｇ２＋を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ−を１〜２０００ｍＭ、好ま
しくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０
ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより
高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高
い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好
ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞ
れ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。
【００１２】
本発明において、核酸増幅反応液は、人工核酸を含むプローブを含む。本明細書におい
て、人工核酸とは、ＤＮＡやＲＮＡの塩基と水素結合によって結合できる、天然核酸分子
以外の核酸分子をいう。本発明で用いる人工核酸の種類は、特に限定されないが、特に、
天然核酸のみからなるプローブに比べて、プローブと相補鎖とのＴｍ値を高くし、鋳型核
酸との結合力を高める人工核酸が好ましく、核酸のリボース環の２’位の酸素原子と４’
位の炭素原子をメチレン架橋した、２’，４’−ＢＮＡ（2'-O,4'-C-methano-bridged nu
cleic acid、別名ＬＮＡ（Locked Nucleic Acid））が好ましい。ＬＮＡの化学式を以下
に示す。
【００１３】
【化１】
2016096763.tif 000002
上記式において、塩基は、Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）、Ａ（アデ
ニン）、Ｕ（ウラシル）、Ｉ（イノシン）などが例として挙げられるが、特に限定されな
い。メチル化やアセチル化などで修飾された塩基でもよい。また、ＬＮＡを修飾したＬＮ
Ａアナログを使用してもよく、３’アミノ−２’，４’−ＢＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＣ
ＯＣ、又は２’，４’−ＢＮＡＮＣなどが例示できる。又は、ＰＮＡ（Peptide Nucleic 
Acid）、ＧＮＡ（Glycol Nucleic Acid）、若しくはＴＮＡ（Threose Nucleic Acid）、
又はこれらを修飾したアナログを使用してもよい。ＬＮＡアナログ、並びにＰＮＡ、ＧＮ
Ａ、ＴＮＡ及びこれらのアナログにおいても、ＬＮＡと同様、塩基は限定されない。
【００１４】
プローブが含む人工核酸の数は、特に限定されず、標的核酸やプローブの配列等に応じ
て、任意に設定してよい。１つのプローブが複数の種類の人工核酸を有していても構わな
い。
【００１５】
人工核酸を含むプローブは、標的核酸の増幅を検出するため、標識されていることが好
ましい。標識の種類は特に限定されないが、Ｔａｑｍａｎ(登録商標)ＭＧＢプローブ（Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの蛍光標識、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ(登録商標)
などのインターカレーター、３２Ｐに代表される放射性同位体などの放射性物質（ＲＩ）
標識、ビオチンやジゴキシゲニンに代表される酵素標識など、目的に応じて入手可能なも
のから任意に選択してもよい。人工核酸を含むプローブの製造方法も、特に限定されず、
公知の方法で製造できる。
【００１６】
ここで、Ｔｍ値とは、二本鎖の核酸の５０％が一本鎖の核酸に解離する温度、すなわち
融解温度（Melting Temperature）である。Ｔｍ値の算出方法は特に限定されず、一般的
には、ＧＣ％法、最近接塩基対法、又はＷａｌｌａｃｅ法を単独又は組み合わせて、算出
することができる。
【００１７】
このような人工核酸を含むプローブを使用することにより、天然核酸のみを含むプロー
ブを使用した場合より、増幅の立ち上がりが早く、同じサイクル数に対し核酸増幅反応産
物がより多く得られ、最終産物もより多く得られるようになる。言い換えると、変性温度
、アニーリング温度、伸長温度を一定にすると、人工核酸を含むプローブを使用すること
により、天然核酸のみを含むプローブを使用した場合より、短時間で同じ量の増幅産物が
得られる。
【００１８】
核酸増幅反応液はまた、界面活性剤を含んでよい。界面活性剤は特に限定されないが、
NP40、Triton-X100、Tween20などが例示できる。界面活性剤の濃度は特に限定されないが
、核酸増幅反応を阻害しない濃度が好ましく、０．００１％〜０．１％以下であってもよ
く、０．００２％〜０．０２％であることが好ましく、０．００５％〜０．０１％である
ことが最も好ましい。界面活性剤は、上述の酵素のストック溶液からの持ち込みであって
もよいが、それとは独立に界面活性剤溶液を核酸増幅反応液に添加してもよい。
【００１９】
液体１３０は、反応液１４０とは混和しないものを用いることにより、容器１５０に反
応液１４０を入れた場合に、反応液１４０と液体１３０とが相分離するため、液体１３０
中において反応液１４０を液滴状にすることができる。こうして、反応液１４０が液体１
３０中に液滴状で保持されている。
【００２０】
液体１３０は、反応液１４０よりも比重が小さいものが好ましい。この場合、液体１３
０中に反応液１４０を入れた場合に、反応液１４０の液滴は液体１３０よりも比重が大き
いので、重力の作用によって重力の作用する方向に移動する。また、液体１３０は、反応
液１４０よりも比重が大きい液体であってもよい。この場合には、反応液１４０の液滴は
液体１３０よりも比重が小さいので、重力の作用によって重力の作用する方向とは反対方
向に移動する。
【００２１】
液体１３０はオイルを含むことが好ましく、例えば、シリコーンオイル又はミネラルオ
イルを使用することができる。ここで、シリコーンとは、主骨格としてシロキサン結合を
有するオリゴマーまたはポリマーを意味する。本明細書においては、シリコーンのうち熱
サイクル処理に使用する温度帯において液体の状態であるものを特にシリコーンオイルと
称する。また、本明細書においては、石油から精製され、熱サイクル処理に使用する温度
帯において液体であるものをミネラルオイルと称する。これらのオイルは熱に対する安定
性が高く、例えば粘度が５×１０３Ｎｓｍ−２以下の製品も入手しやすいので、昇降型の
ＰＣＲに好適である。
【００２２】
シリコーンオイルとしては、信越シリコーン社製のＫＦ−９６Ｌ−０．６５ｃｓ、ＫＦ
−９６Ｌ−１ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−５ｃｓ、東レ・ダウコーニン
グ社製のＳＨ２００ＣＦＬＵＩＤ５ＣＳ、あるいはモメンティブ・パフォーマンス・マテ
リアルズ・ジャパン合同会社製のＴＳＦ４５１−５Ａ、ＴＳＦ４５１−１０等のジメチル
シリコーンオイルが例示される。ミネラルオイルとしては、主成分として炭素数１４から
２０程度のアルカンを含有するものが例示される。すなわち、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペ
ンタデカン、ｎ−ヘキサデカン、ｎ−ヘプタデカン、ｎ−オクタデカン、ｎ−ノナデカン
、ｎ−テトラコサンが例示される。
【００２３】
液体１３０は、添加剤を含んでよい。添加剤としては、例えば、X-22-160AS、X-22-370
1E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、 KF-6017 、KF-8005（以上、信越シリコーン社）
などの変性シリコーンオイル、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370（以上、Momentive社）
などのシリコーンレジン、XS66-C1191（Momentive社）などのフルオロ変性シリコーンレ
ジン、などのほか、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）
などの変性シリコーンオイルを使用することができる。添加剤の濃度は、特に限定されな
いが、容器の構造、材質、形状などを考慮して決定することができる。例えば、１％（ｖ
/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下であることが好ましく、２％（ｖ/ｖ）以上２０％（ｖ/ｖ
）以下であることがより好ましく、５％（ｖ/ｖ）であることがさらに好ましい。
【００２４】
以下、本発明の核酸増幅方法の一実施形態として、シャトルＰＣＲ（２段階温度ＰＣＲ
）による核酸増幅方法を説明する。シャトルＰＣＲは、高温と低温の２段階の温度処理を
繰り返し反応液に施すことにより、反応液中の核酸を増幅させる手法である。高温の処理
においては２本鎖ＤＮＡの解離が、低温の処理においてはアニーリング（プライマーが１
本鎖ＤＮＡに結合する反応）及び伸長反応（プライマーを始点としてＤＮＡの相補鎖が合
成される反応）が起こる。
【００２５】
本発明の方法では、核酸増幅反応液よりも比重が小さく、前記核酸増幅反応液とは混和
しない液体と、が充填された核酸増幅反応容器を用い核酸増幅反応容器の第１領域を第１
の温度に加熱し、核酸増幅反応容器の第２領域を第１の温度より低い第２の温度に加熱す
る。ここでは、第１領域ら第２領域へ向けて温度が低くなる温度勾配が形成される。第１
の温度を２本鎖ＤＮＡの解離に適した温度、第２の温度をアニーリング及び伸長反応に適
した温度とし、第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配
置を一定時間保って２本鎖ＤＮＡの解離を行い、第２領域が第１領域より重力の作用する
方向に対し下になる第２の配置を一定時間保ってアニーリング及び伸長反応を行う。この
第１及び第２の配置を一定回数切換えることで、核酸を増幅する。核酸増幅反応液と液体
との比重の違いから、核酸増幅反応液は、第１の配置においては第１領域に、第２の配置
においては第２領域に存在する。
【００２６】
一般に、シャトルＰＣＲにおける高温は８０℃から１００℃の間の温度、低温は５０℃
から７０℃の間の温度である。各温度における処理は所定時間行われ、高温に保持する時
間は低温に保持する時間よりも短いことが一般的である。例えば、高温が１秒から１０秒
程度、低温が１０秒から６０秒程度としてもよく、反応の条件によってはこれよりも長い
時間であってもよいが、低温に保持する時間は短い方が好ましく、１８秒以下であっても
よく、１２秒以下であることが好ましく、６秒以下であることがより好ましい。
【００２７】
なお、使用する試薬の種類や量によって、適切な時間、温度およびサイクル数（高温と
低温を繰り返す回数）は異なるので、試薬の種類や核酸増幅反応液の量を考慮して適切な
プロトコールを決定した上で反応を行うことが好ましい。
【００２８】
また、本実施の形態では、核酸増幅方法として、２種類の温度で核酸増幅反応を行うシ
ャトルＰＣＲを用いて説明したが、熱変性、アニーリング、及び伸長反応で温度を変える
ＰＣＲ法（３段階温度ＰＣＲ）を用いてもよい。この場合、アニーリング温度に加えて伸
長反応温度を設定し、核酸増幅反応液をアニーリング温度に維持した後、所定時間、伸長
反応温度に維持すればよい。
【００２９】
（２）核酸反応増幅容器  
本発明の一実施形態として、本発明の方法で使用する核酸増幅反応容器を以下に説明す
る。本発明の方法で使用する核酸増幅反応容器は、核酸増幅反応液と、核酸増幅反応液と
比重が異なり核酸増幅反応液と混和しない液体と、を含む、密閉された容器を有し、核酸
増幅反応液が液滴状であり、液体が、オイルと添加剤を含む核酸増幅反応容器である。
【００３０】
図１は、核酸増幅反応容器１００の断面図である。図１は、核酸増幅反応容器に反応液
を入れた状態を表す。
【００３１】
本発明に使用する核酸増幅反応容器１００は、容器１５０及び封止部１２０を含んで構
成されている。核酸増幅反応容器１００の大きさや形状は、特に限定されないが、例えば
、核酸増幅反応液１４０（以下反応液１４０とも記す）と混和しない液体１３０の量、熱
伝導率、容器１５０及び封止部１２０の形状、あるいは取り扱いの容易さの少なくとも１
つを考慮して設計されてもよい。液体１３０及び核酸増幅反応液１４０は、「（１）核酸
増幅方法」に記載したものから選択される。
【００３２】
核酸増幅反応容器１００の容器１５０は透明な材質から形成することができる。それに
よって、核酸増幅反応容器１００の外部から、容器１５０内の反応液１４０の移動を観察
したり、リアルタイムＰＣＲ等の、容器１５０の外部から測定等を行うような用途に使用
したりすることができる。なお、本明細書において「透明」という場合には、容器１５０
の外部から容器１５０内の反応液１４０を観察できる程度の視認性が確保できるものとし
、この条件が満たされる限り、必ずしも核酸増幅反応容器１００の全体が透明でなくても
良いものとする。
【００３３】
核酸増幅反応容器１００の用途は特に限定されないが、例えばリアルタイムＰＣＲのよ
うな、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、容器１５０は、自発蛍光の小さい材質で
形成されることが望ましい。容器１５０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であるこ
とが好ましい。また、容器１５０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラ
ーゼ等による酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。これらの条件を満たす材
質としては特に限定されず、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィン
ポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）、耐熱ガラス（例えばＰＹＲＥ
Ｘ（登録商標）ガラス）等やこれらの複合材料であってもよいが、ポリプロピレンが好ま
しい。
【００３４】
図１に示す核酸増幅反応容器１００では、容器１５０は円筒状に形成されており、中心
軸方向（図１における上下方向）が長手方向となっている。ここで用いる容器１５０は、
チューブであることが好ましく、小型遠心用チューブや、ＰＣＲ用に設計されたチューブ
であってもよいが、長手方向を有する、即ち細長い形状であることにより、例えば、後述
する昇降型のサーマルサイクラーを用いて、容器１５０内の液体３０に温度の異なる領域
が形成されるように核酸増幅反応容器１００を温度制御する場合に、異なる温度の領域の
間の距離を長くしやすくなる。これにより、容器１５０内の領域毎に、オイル３０を異な
る温度に制御することが容易となるので、ＰＣＲに適した熱サイクルを実現できる。なお
、昇降型のサーマルサイクラーとは、容器１５０を満たした液体中に少なくとも２つの温
度領域を形成し、オイルと相分離する反応液１４０をこれらの温度領域間で往復移動させ
ることによって熱サイクルを実現する装置である。
【００３５】
容器１５０の形状は、長手方向を有する限り、特に限定されないが、昇降型ＰＣＲに用
いる場合には、略円筒形状で内径Ｄと長手方向の長さＬとの比が１：５〜１．５：２０の
範囲であることが好ましい。さらには、内径Ｄが１．５〜２ｍｍ、長さＬが１０〜２０ｍ
ｍであることがより好ましい。
【００３６】
容器１５０は、開口部及び開口部を封止する封止部１２０を有し、容器１５０中は反応
液１４０と、反応液１４０と比重が異なり、相分離する液体１３０を含む。開口部を封止
部１２０により封止した場合に、容器１５０内に空気が残らないことが好ましい。容器１
５０内に気泡が残ると、反応液１４０の移動が妨げられることがあるからである。封止部
１２０は、容器１５０と同様の材質から形成することができる。封止部１２０の構造は、
容器１５０を密閉できる構造であればよく、例えば、ねじ蓋、栓、はめ込み等の構造とす
ることができる。図１においては、封止部１２０はねじ蓋の構造である。
【００３７】
（３）核酸増幅反応装置の装置構成
本実施形態では、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応容器として、チューブ型の核酸増幅
反応用チューブ１００を用いる。以下、ＰＣＲを核酸増幅反応の一例とし、核酸増幅反応
用チューブ１００に適した核酸増幅反応装置（以下、昇降式ＰＣＲ装置とも記す）の一例
について、詳細に述べる。なお、昇降式ＰＣＲ装置については、特開２０１２−１１５２
０８に詳細に開示されている。
【００３８】
図２は、昇降式ＰＣＲ装置１の一例を示す。（Ａ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を閉
じた状態、（Ｂ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を開けた状態であり、装着部１１に核酸
増幅反応用チューブ１００が装着された状態を表す。図３は、実施形態に係る昇降式ＰＣ
Ｒ装置１における本体１０の分解斜視図である。図４は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装
置１における本体１０の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図であ
る。
【００３９】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、図２（Ａ）に示すように、本体１０及び駆動機構２０を含
む。図３に示すように、本体１０は、装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３を
含む。第１加熱部１２と第２加熱部１３との間にはスペーサー１４が設けられている。本
実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２が底板１７の側、第２加熱部１３が蓋５
０の側に配置されている。本実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２、第２加熱
部１３、及びスペーサー１４はフランジ１６、底板１７及び固定板１９に固定されている
。
【００４０】
装着部１１は、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を装着する構造である。図２（
Ｂ）および図２に示すように、本実施形態の装着部１１は、核酸増幅反応用チューブ１０
０を差し込んで装着するスロット構造であり、第１加熱部１２の第１ヒートブロック１２
ｂ、スペーサー１４、及び第２加熱部１３の第２ヒートブロック１３ｂを貫通する穴に核
酸増幅反応用チューブ１００を差し込む構造となっている。装着部１１の数は複数であっ
てもよく、図２（Ｂ）の例では、２０個の装着部１１が本体１０に設けられている。
【００４１】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、核酸増幅反応用チューブ１００を第１加熱部１２及び第２
加熱部１３に対して所定の位置に保持する構造を含む。より具体的には、図４に示すよう
に、後述する核酸増幅反応用チューブ１００を構成する流路１１０の、第１領域１１１を
第１加熱部１２によって、第２領域１１２を第２加熱部１３によって、加熱できる。本実
施形態においては核酸増幅反応用チューブ１００の位置を定める構造は底板１７であり、
図４（Ａ）に示すように、核酸増幅反応用チューブ１００を底板１７に接触する位置まで
差し込むことで、第１加熱部１２及び第２加熱部１３に対して核酸増幅反応用チューブ１
００を所定の位置に保持できる。
【００４２】
第１加熱部１２は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、後
述する核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を第１の温度に加熱する。図４（
Ａ）に示す例では、第１加熱部１２は本体１０において、核酸増幅反応用チューブ１００
の第１領域１１１を加熱する位置に配置されている。
【００４３】
第１加熱部１２は、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１０
０に伝える部材とを含んでもよい。図３に示す例では、第１加熱部１２は第１ヒーター１
２ａ及び第１ヒートブロック１２ｂを含む。本実施形態においては、第１ヒーター１２ａ
はカートリッジヒーターであり、導線１５によって図示しない外部電源に接続されている
。第１ヒーター１２ａは第１ヒートブロック１２ｂに挿入されており、第１ヒーター１２
ａが発熱することで第１ヒートブロック１２ｂが加熱される。第１ヒートブロック１２ｂ
は、第１ヒーター１２ａから発生した熱を核酸増幅反応用チューブ１００に伝える部材で
ある。本実施形態においてはアルミニウム製のブロックである。
【００４４】
第２加熱部１３は、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した場合に、核
酸増幅反応用チューブ１００の第２領域１１２を、第１の温度とは異なる第２の温度に加
熱する。図４（Ａ）に示す例では、第２加熱部１３は本体１０において、核酸増幅反応用
チューブ１００の第２領域１１２を加熱する位置に配置されている。図２に示すように、
第２加熱部１３は、第２ヒーター１３ｂ及び第２ヒートブロック１３ｂを含む。第２加熱
部１３は、加熱する核酸増幅反応用チューブ１００の領域及び加熱する温度が第１加熱部
１２と異なる以外は、第１加熱部１２と同様である。
【００４５】
本実施形態においては、第１加熱部１２及び第２加熱部１３の温度は、図示しない温度
センサー及び後述する制御部によって制御される。第１加熱部１２及び第２加熱部１３の
温度は、核酸増幅反応用チューブ１００が所望の温度に加熱されるように設定されること
が好ましい。本実施形態においては、第１加熱部１２を第１の温度に、第２加熱部１３を
第２の温度に制御することで、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１を第１の
温度に、第２領域１１２を第２の温度に加熱できる。本実施形態における温度センサーは
熱電対である。
【００４６】
駆動機構２０は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３を制御する機構で
あり、それにより第１領域と第２領域の配置を制御する。本実施形態においては、駆動機
構２０は図示しないモーター及び駆動軸を含み、駆動軸と本体１０のフランジ１６とが接
続されている。本実施形態における駆動軸は、装着部１１の長手方向に対して垂直に設け
られており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体１０が回転する。
【００４７】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、図示しない制御部を含む。制御部は、後述する第
１の温度、第２の温度、第１の時間、第２の時間、及び熱サイクルのサイクル数のうち、
少なくとも１つを制御する。制御部が第１の時間または第２の時間を制御する場合には、
制御部は駆動機構２０の動作を制御することによって、装着部１１、第１加熱部１２並び
に第２加熱部１３が所定の配置に保持される時間を制御する。制御部は、制御する項目ご
とに異なる機構を設けても、全項目を一括して制御するものであってもよいが、本実施形
態の昇降式ＰＣＲ装置１における制御部は電子制御であり、上記項目を全て制御する。本
実施形態の制御部は図示しないＣＰＵ等のプロセッサー、及び、ＲＯＭ（Read Only Memo
ry）やＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶装置を含む。記憶装置には上記各項目を
制御するための各種プログラム、データ等が記憶されている。また、記憶装置は各種処理
の処理中データ、処理結果などを一時的に記憶するワークエリアを有する。
【００４８】
本実施形態の本体１０は、図３及び図４（Ａ）の例に示すように、第１加熱部１２と第
２加熱部１３との間にスペーサー１４が設けられている。本実施形態のスペーサー１４は
、第１加熱部１２または第２加熱部１３を保持する部材である。本実施形態においては、
スペーサー１４は断熱材であり、図４（Ａ）の例においては、装着部１１はスペーサー１
４を貫通している。
【００４９】
本実施形態の本体１０は、固定板１９を含む。固定板１９は、装着部１１、第１加熱部
１２及び第２加熱部１３を保持する部材である。図２（Ｂ）及び図３に示す例においては
、２枚の固定板１９がフランジ１６に嵌め合わされており、第１加熱部１２、第２加熱部
１３及び底板１７が固定されている。
【００５０】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、蓋５０を含む。図２（Ａ）及び図４（Ａ）の例で
は、装着部１１は蓋５０によって覆われている。蓋５０は、固定部５１によって本体１０
に固定されてもよい。本実施形態においては、固定部５１は磁石である。図２（Ｂ）及び
図３の例に示すように、本体１０の蓋５０の接触する面には磁石が設けられている。図２
（Ｂ）及び図３には示されていないが、蓋５０にも、本体１０の磁石が接触する位置に磁
石が設けられており、蓋５０で装着部１１を覆うと、磁力によって蓋５０が本体１０に固
定される。
【００５１】
なお、固定板１９、底板１７、蓋５０、フランジ１６は断熱材を用いて形成されること
が好ましい。
【００５２】
（４）昇降式ＰＣＲ装置を用いた熱サイクル処理
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における
断面を模式的に示す断面図である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１に
核酸増幅反応用チューブ１００が装着された状態を示す。図４（Ａ）は第１の配置、図４
（Ｂ）は第２の配置を示す。以下では、本発明の核酸増幅方法の一実施形態として、核酸
増幅反応用チューブ１００を用いた場合の、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１を用いた
熱サイクル処理について説明する。
【００５３】
図１の例に示すように、実施形態に係る核酸増幅反応用チューブ１００は流路１１０及
び封止部１２０を含む。流路１１０には、反応液１４０と、反応液１４０よりも比重が小
さく、かつ、反応液１４０とは混和しない液体１３０とが充填され、封止部１２０によっ
て封止されている。
【００５４】
流路１１０は、対向する内壁に近接して反応液１４０が移動するように形成されている
。ここで、流路１１０の「対向する内壁」とは、流路１１０の壁面の、向かい合う位置関
係にある２つの領域を意味する。「近接」とは、反応液１４０と流路１１０の壁面との距
離が近いことを意味し、反応液１４０が流路１１０の壁面に接触する場合を含む。したが
って、「対向する内壁に近接して反応液１４０が移動する」とは、「流路１１０の壁面の
、向かい合う位置関係にある２つの領域の両方に対して距離が近い状態で、反応液１４０
が移動する」こと、すなわち、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動することを意味
する。
【００５５】
図１の例では、核酸増幅反応用チューブ１００の外形は円柱状であり、中心軸方向（図
１における上下方向）に流路１１０が形成されている。流路１１０の形状は、流路１１０
の長手方向に対して垂直な方向の断面、すなわち流路１１０のある領域における反応液１
４０が移動する方向に対して垂直な断面（これを流路１１０の「断面」とする）が円形の
筒状である。したがって、本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、流路
１１０の対向する内壁は、流路１１０の断面の直径を構成する流路１１０の壁面上の２点
を含む領域であり、対向する内壁に沿って反応液１４０が流路１１０の長手方向に移動す
る。
【００５６】
核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域１１１は、第１加熱部１２によって第１の温
度に加熱される、流路１１０の一部の領域である。第２領域１１２は、第２加熱部１３に
よって第２の温度に加熱される、第１領域１１１とは異なる流路１１０の一部の領域であ
る。本実施形態の核酸増幅反応用チューブ１００においては、第１領域１１１は、流路１
１０の長手方向における一方の端部を含む領域であり、第２領域１１２は、流路１１０の
長手方向における他方の端部を含む領域である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では
、流路１１０の封止部１２０側の端部を含む点線で囲まれた領域が第２領域１１２であり
、封止部１２０から遠い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第１領域１１１である。
【００５７】
図１に示すように、流路１１０は、液体１３０と、反応液の液滴１４０とを含む。液体
１３０と反応液１４０は、（１）核酸増幅反応用チップの記載に従って準備される。
【００５８】
以下、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）を参照しながら、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１
を用いた熱サイクル処理を説明する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）においては、矢印ｇの方
向（図における下方向）が重力の作用する方向である。本実施形態においては、熱サイク
ル処理の例として、「（１）核酸増幅方法」で説明したシャトルＰＣＲ（２段階温度ＰＣ
Ｒ）を行う場合を説明する。なお、以下に説明する各工程は熱サイクル処理の一例を示す
ものである。必要に応じて工程の順序を入れ替えたり、２以上の工程を連続的にあるいは
並行して行ったり、工程を追加したりしてもよい。
【００５９】
まず、核酸増幅反応用チューブ１００を、装着部１１に装着する。本実施形態では、液
体１３０が充填された流路１１０に反応液１４０を導入後、封止部１２０によって封止さ
れた核酸増幅反応用チューブ１００を装着部１１に装着する。反応液１４０の導入は、マ
イクロピペットやインクジェット方式の分注装置等を用いて行うことができる。装着部１
１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着した状態においては、第１加熱部１２は第１領
域１１１を、第２加熱部１３は第２領域１１２を、それぞれ含む位置において核酸増幅反
応用チューブ１００に接している。
【００６０】
ここで、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３、の配置は第１の配置であ
る。図４（Ａ）に示すように、第１の配置は、核酸増幅反応用チューブ１００の第１領域
１１１を、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置させる。第１の配置に
おいては、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に第１領域１１１が位置する
ので、液体１３０よりも比重の大きい反応液１４０は、第１領域１１１に位置する。本実
施形態においては、装着部１１に核酸増幅反応用チューブ１００を装着したら、蓋５０に
よって装着部１１を覆い、昇降式ＰＣＲ装置１を作動させる。
【００６１】
次に、第１加熱部１２及び第２加熱部１３により核酸増幅反応用チューブ１００を加熱
する。第１加熱部１２と第２加熱部１３とは、核酸増幅反応用チューブ１００の異なる領
域を異なる温度に加熱する。すなわち、第１加熱部１２は第１領域１１１を第１の温度に
加熱し、第２加熱部１３は第２領域１１２を第２の温度に加熱する。これにより、流路１
１０の第１領域１１１と第２領域１１２との間には、第１の温度と第２の温度との間で温
度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、第１領域１１１から第２領域１１２
へ向けて温度が低くなる温度勾配が形成される。本実施形態の熱サイクル処理はシャトル
ＰＣＲであるので、第１の温度は２本鎖ＤＮＡの解離に適した温度、第２の温度はアニー
リング及び伸長反応に適した温度とする。
【００６２】
装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置は第１の配置であるので、核
酸増幅反応用チューブ１００を加熱すると、反応液１４０は第１の温度に加熱される。第
１の時間が経過したら、駆動機構２０によって本体１０を駆動し、装着部１１、第１加熱
部１２並びに第２加熱部１３の配置を第１の配置から第２の配置へ切換える。第２の配置
は、第２領域１１２を重力の作用する方向において流路１１０の最下部に位置させる配置
である。換言すると、第２領域１１２は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部
１３が、第１の配置とは異なる所定の配置にある場合に、重力の作用する方向における流
路１１０の最下部に位置する領域である。本実施形態の熱サイクル装置１においては、制
御部の制御によって駆動機構２０が本体１０を回転駆動する。駆動軸を回転の軸として、
モーターによってフランジ１６を回転駆動すると、フランジ１６に固定されている装着部
１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３が回転する。駆動軸は装着部１１の長手方向に
対して垂直な方向の軸であるので、モーターの動作によって駆動軸が回転すると、装着部
１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が回転する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示
す例では、本体１０を１８０°回転させる。これにより、装着部１１、第１加熱部１２並
びに第２加熱部１３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。
【００６３】
ここで、第１領域１１１と第２領域１１２との重力の作用する方向における位置関係が
第１の配置とは逆になるので、反応液１４０は重力の作用によって第１領域１１１から第
２領域１１２へと移動する。装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が
第２の配置に達した場合に、駆動機構２０の動作が停止すると、装着部１１、第１加熱部
１２並びに第２加熱部１３の配置が第２の配置に保持される。第２の配置において、第２
の時間が経過したら、再度回転し、所定の回数が来るまで、このようにして第１の位置と
第２の位置を入れ替えながら回転することにより、核酸増幅反応が行われる。第１の位置
と第２の位置を一回入れ替えることを、１サイクルとする。
【００６４】
また、本実施の形態では、核酸増幅方法としてシャトルＰＣＲを用いたが、「（１）核
酸増幅方法」でも述べたように、熱変性、アニーリング、及び伸長反応で温度を変えるＰ
ＣＲ法（３段階温度ＰＣＲ）を用いてもよい。この場合、アニーリング温度に加えて伸長
反応温度を設定し、核酸増幅反応液をアニーリング温度に維持した後、所定時間、伸長反
応温度に維持すればよい。
【実施例】
【００６５】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されな
い。
【００６６】
上述の昇降式ＰＣＲ装置を用いて、実施例として人工核酸を含むプローブを、比較例と
して天然核酸のみを含むプローブを用い、肺炎マイコプラズマのプラスミドＤＮＡ２５コ
ピーを鋳型とし、核酸増幅反応を行った。本実施例では、蛍光標識されたプローブを用い
、人工核酸は、２’，４’−ＢＮＡ（2'-O,4'-C-methano-bridged nucleic acid、別名Ｌ
ＮＡ（Locked Nucleic Acid））を使用した。
【００６７】
反応液の組成、プライマー配列、実施例及び比較例のプローブの配列、並びに核酸増幅
反応条件は下記の通りである。なお、下記に記載の各成分の液量は、全反応液量10μL中
の液量を表す。
【００６８】
（反応液組成）
Platinum Taq（ポリメラーゼ）                                 0.4μL
dNTP (10mM)                                                0.5μL
5 x buffer（※）                                               2.0μL
マイコプラズマ検出用 forward プライマー (20μM)              0.8μL
マイコプラズマ検出用 reverse プライマー (20μM)               0.8μL
マイコプラズマ検出用 TaqManプローブ (10μM)                0.6μL
肺炎マイコプラズマプラスミドDNA（テンプレート）             1.0μL
水                                                            3.9μL
計 10μL
※５x bufferの組成 ： MgCl2:25mM、Tris-HCl(PH9.0):250mM、KCl:125mM
（プライマー配列）
forward プライマー：5’ ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3’  （配列番号１）
reverse プライマー：5’ CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3’  （配列番号２）
（プローブ配列）
通常蛍光プローブ（天然核酸のみを含むプローブ、比較例）
5’ FAM-CGGGACGGAAAGACC-BHQ1 3’  （配列番号３）
人工核酸導入蛍光標識プローブ（人工核酸を含むプローブ、実施例）
5’ FAM-CGGGACGGAAAGACC-BHQ1 3’  （配列番号４）
※下線部は、その核酸が人工核酸ＬＮＡであることを表す
（核酸増幅反応条件）
ホットスタート：９８℃、１０秒
（以上、１サイクル）
熱変性：９８℃、４秒
アニーリング及び伸長：５４℃、６秒
（以上、５０サイクル）
結果を図５に示す。横軸はサイクル数を表す。縦軸は蛍光輝度測定値を表し、蛍光輝度
測定値は、核酸増幅反応産物の量を表す。
【００６９】
図５から明らかなように、人工核酸を含むプローブを使用した場合の方が、天然核酸の
みを含むプローブを使用した場合より、増幅の立ち上がりが早く、同じサイクル数に対し
核酸増幅反応産物がより多く得られ、最終産物もより多く得られる。また、同じ量の産物
を合成するのに、人工核酸を含むプローブを使用した場合の方が、天然核酸のみを含むプ
ローブを使用した場合より、少ないサイクル数で達成できる。
【符号の説明】
【００７０】
１…昇降式ＰＣＲ装置、１０…本体、１１…装着部、１２…第１加熱部、１２ａ…第１
ヒーター、１２ｂ…第１ヒートブロック、１３…第２加熱部、１３ａ…第２ヒーター、１
３ｂ…第２ヒートブロック、１４…スペーサー、１５…導線、１６…フランジ、１７…底
板、１９…固定板、２０…駆動機構、５０…蓋、５１…固定部、１００…核酸増幅反応容
器又は核酸増幅反応用チューブ、１１０…流路、１１１…第１領域、１１２…第２領域、
１２０…封止部、１３０…液体、１４０…核酸増幅反応液、１５０…容器。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2016096763.tif 000006
【図５】
2016096763.tif 000007
【配列表】
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