(57)【要約】【課題】ＤＮＡにおける変異の有無の新規な判別方法を提供する。【解決手段】複数の変異型を有するＤＮＡの変異の有無を判別する方法であって、ＤＮＡに結合可能な１組のプライマー対と、変異を有するＤＮＡに結合せず、変異を有さないＤＮＡに結合可能で、第１の蛍光物質で標識された第１のプローブと、変異を有するＤＮＡ及び変異を有さないＤＮＡの両方に結合可能で、第１の蛍光物質と異なる蛍光波長の光を放射する第２の蛍光物質で標識された、第２のプローブと、の存在下で、ＤＮＡを増幅するための熱サイクルを行う工程を含む、方法とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の変異型を有するＤＮＡの変異の有無を判別する方法であって、
前記ＤＮＡに結合可能な１組のプライマー対と、
変異を有する前記ＤＮＡに結合せず、変異を有さない前記ＤＮＡに結合可能で、第１の蛍光物質で標識された第１のプローブと、
前記変異を有するＤＮＡ及び前記変異を有さないＤＮＡの両方に結合可能で、第１の蛍光物質と異なる蛍光波長の光を放射する第２の蛍光物質で標識された、第２のプローブと、
の存在下で、ＤＮＡを増幅するための熱サイクルを行う工程を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のプローブが結合する前記ＤＮＡの鎖における塩基配列の位置と、前記第２のプローブが結合する前記ＤＮＡの鎖における塩基配列の位置は、前記一組のプライマー対が結合する前記ＤＮＡの鎖における塩基配列の位置に挟まれている、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のプローブが結合する前記ＤＮＡの鎖は、前記第２のプローブが結合する前記ＤＮＡの相補鎖である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプローブはＴａｑｍａｎプローブであり、
前記第２のプローブはＴａｑｍａｎプローブである、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅工程は、核酸増幅反応装置を用いて行われ、
該核酸増幅反応装置は、
核酸増幅反応液と、前記核酸増幅反応液よりも比重が小さく、かつ、前記核酸増幅反応液とは混和しない液体とが充填された核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、
前記核酸増幅反応容器の第１領域の温度を加熱する第１の加熱部と、
前記核酸増幅反応容器の第２領域の温度を加熱する第２の加熱部と、
前記第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と、
前記第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置と、を切換える駆動機構を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＮＡは、肺炎マイコプラズマ由来のＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡにおける変異の有無の判別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、患者から、マクロライド系薬剤に耐性を示す、薬剤耐性型肺炎マイコプラズマ菌（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が分離されている。
【０００３】
ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法に代表される遺伝子検査法を用いて、マイコプラズマ菌が薬剤耐性型肺炎か否かを判別するには、肺炎マイコプラズマ菌のリボソーム内ｒＲＮＡ遺伝子ドメインＶ領域の２０６３番目及び２０６４番目の変異（正常型はＡ２０６３Ａ及びＡ２０６４Ａ、高度薬剤耐性型はＡ２０６３Ｇ，Ａ２０６３Ｃ、Ａ２０６４ＧまたはＡ２０６４Ｃ、中度薬剤耐性型はＡ２０６３Ｔ）を調べることで判別できる（非特許文献１、２）。そして正常型と高度及び中度薬剤耐性型は、１：９の割合で存在しており、肺炎マイコプラズマ菌の多くが薬剤耐性型であることが知られている。
【０００４】
一方、これまでは、薬剤耐性菌などの変異体の解析は、シークエンス法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、リアルタイムＰＣＲ法等により行われてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−４２４５９号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】平成24年度 希少感染症診断技術研修会 資料 平成25年2月27日  （水）  マイコプラズマ感染症  国立感染症研究所  細菌第二部 見理  剛
【非特許文献２】Antimicrobial Agents and Chemotherapy p. 1108-1109, An  tibiotic Sensitivity of 40 Mycoplasma pneumoniae Isolates and Molecul  ar Analysis of Macrolide-Resistant Isolates from Beijing, China, Fei Zhao, Min   Lv, Xiaoxia Tao, Hui Huang, Binghua Zhang, Zhen Zhang, and Jianzhong Zhang
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、従来からのシークエンス法等によって耐性菌判別を行う場合、実験が煩雑で時間がかかるという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上述の課題の少なくとも一部を解決するためになされたものであり、以下の形態として実現することができる。
【０００９】
本発明の一実施形態は、複数の変異型を有するＤＮＡの変異の有無を判別する方法であって、ＤＮＡに結合可能な１組のプライマー対と、変異を有するＤＮＡに結合せず、変異を有さないＤＮＡに結合可能で、第１の蛍光物質で標識された第１のプローブと、変異を有するＤＮＡ及び変異を有さないＤＮＡの両方に結合可能で、第１の蛍光物質と異なる蛍光波長の光を放射する第２の蛍光物質で標識された、第２のプローブとの存在下で、ＤＮＡを増幅するための熱サイクルを行う工程を含む、方法である。また、第１のプローブが結合するＤＮＡの鎖における塩基配列の位置と、第２のプローブが結合するＤＮＡの鎖における塩基配列の位置は、一組のプライマー対が結合するＤＮＡの鎖における塩基配列の位置に挟まれていてよい。第１のプローブが結合するＤＮＡの鎖は、第２のプローブが結合するＤＮＡの相補鎖であってよい。第１のプローブはＴａｑｍａｎプローブであり、第２のプローブはＴａｑｍａｎプローブであってよい。また、増幅工程は、核酸増幅反応装置を用いて行われ、核酸増幅反応装置は、核酸増幅反応液と、前記核酸増幅反応液よりも比重が小さく、かつ、前記核酸増幅反応液とは混和しない液体とが充填された核酸増幅反応容器を装着可能な装着部と、前記核酸増幅反応容器の第１領域の温度を加熱する第１の加熱部と、前記核酸増幅反応容器の第２領域の温度を加熱する第２の加熱部と、前記第１領域が前記第２領域より重力の作用する方向に対し下になる第１の配置と、前記第２領域が前記第１領域より重力の作用する方向に対し下になる第２の配置と、を切換える駆動機構を含む方法でよい。ＤＮＡは、肺炎マイコプラズマ由来のＤＮＡであってよい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、ＤＮＡにおける変異の有無の新規な判別方法を提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施形態に係る核酸増幅反応容器の断面図である。ｇは重力の方向を表す。
【図２】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置の斜視図である。（Ａ）は蓋を閉じた状態、（Ｂ）は蓋を開けた状態を示す。
【図３】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の分解斜視図である。
【図４】本発明の一実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置における本体の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。（Ａ）は第１の配置、（Ｂ）は第２の配置を示す。
【図５】本発明の一実施態様に係る、正常型プローブ、有無プローブ及びプライマー対の配置を表す図である。
【図６】本発明の一実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図８】本発明の一実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図１０】本発明の一実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図１１】本発明の一実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図１２】本発明の他の実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図１３】本発明の更に他の実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【図１４】本発明の更に他の実施態様に係る、正常型プローブ及び有無プローブの使用による正常菌と耐性菌の判別結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
（１）ＤＮＡの変異の有無の判別方法
本発明の判別方法は、ＤＮＡにおいて、複数の変異型を有する変異の有無を判別する方法であって、変異を有さないＤＮＡに結合し、変異を有するＤＮＡには結合しないＴａｑｍａｎプローブを用いて、変異の有無を判別することを特徴とする。
【００１４】
以下、肺炎マイコプラズマ菌由来のＤＮＡを例にとり、本発明の判別方法の一実施態様を説明する。薬剤耐性変異を有さない肺炎マイコプラズマ菌（以下、正常菌と称する）由来のＤＮＡに結合でき、薬剤耐性変異を有する肺炎マイコプラズマ菌（以下、耐性菌と称する）由来のＤＮＡに結合できないＴａｑｍａｎプローブ、及び双方のＤＮＡに結合できるＴａｑｍａｎプローブを用いて、正常菌と耐性菌を判別する。
【００１５】
耐性菌が有する薬剤耐性の原因となる変異を表にまとめると、以下の通りである。
【００１６】
【表１】
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従来は、正常菌と耐性菌を判別するのに正常菌及び耐性菌両方のＤＮＡの塩基配列を調べていたところ、本発明は、正常菌のＤＮＡに結合し、耐性菌のＤＮＡには結合しないＴａｑｍａｎプローブ、及び正常菌と耐性菌の両方のＤＮＡに結合するＴａｑｍａｎプローブを用いてＰＣＲを行うことで、従来法より簡便に、正常菌と耐性菌を判別できる。
【００１７】
具体的には、図５に示すように、上記２０６３番目と２０６４番目の塩基が共にＡである場合に結合し、第１の蛍光物質で標識されたＴａｑｍａｎプローブ（正常型プローブと称する）、及び正常菌と耐性菌が同じ塩基配列を有するＤＮＡ部分に結合し、第１の蛍光物質と異なる蛍光波長を放射する第２の蛍光物質で標識されたＴａｑｍａｎプローブ（有無プローブと称する）を用い、これらプローブを挟む位置に、１組のプライマー対を配置し、ＴａｑｍａｎＰＣＲを行う。
【００１８】
正常菌のＤＮＡには、正常型プローブと有無プローブが結合でき、耐性菌のＤＮＡには、正常型プローブは結合できず有無プローブが結合できるため、耐性菌では正常型プローブに由来する第１の蛍光の増加が観察されない。
【００１９】
本実施形態において、正常型プローブは、上記２０６３番目及び２０６４番目を含んでいれば、その前後の長さは任意に設計できる。有無プローブの配列は、正常型及び耐性型で同じ配列を有する配列部分に結合するものであれば、任意に設計できる。
【００２０】
正常型プローブ及び有無プローブの結合するＤＮＡ鎖は、同じＤＮＡ鎖でもよいし、互いの相補鎖のＤＮＡ鎖でもよいが、互いの相補鎖のＤＮＡ鎖であることが好ましい。
【００２１】
正常型プローブ及び有無プローブの蛍光標識の種類は特に限定されず、公知のものを使用できる。第１の蛍光物質と第２の蛍光物質は異なる蛍光波長を放射するが、波長の違いが大きいほど区別がしやすくなり、好ましい。
【００２２】
上記プライマー対も、図１に示すように正常型プローブ及び有無プローブが結合するＤＮＡの部位を挟むように位置するものであれば、任意に設計できる。
【００２３】
本発明の方法は、病原体が複数の変異型を有する変異を有する場合でも、従来法のようにそれぞれの変異に応じたプローブを用意する必要がなく、正常型プローブと有無プローブさえ使用すれば、耐性菌の有無を判別することができ、従来法より簡便且つ低コストで判別が可能である。
【００２４】
（２）本発明の判別方法に使用する反応液
本発明の判別方法に使用する反応液は、上述の正常型プローブ、有無プローブ、プライマー対を含み、更に、ＰＣＲ反応に必要なその他成分を含んでもよい。その他成分は、バッファー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びＭｇＣｌ2などを含んでよい。ＤＮＡポリメラーゼは特に限定されないが、耐熱性の酵素やＰＣＲ用酵素が好ましく、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｆｉポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、あるいはそれらの改良型など、非常に多数の市販品があるが、ホットスタートを行えるＤＮＡポリメラーゼが好ましい。ｄＮＴＰや塩の濃度は、用いる酵素について適した濃度にすれば良いが、通常、ｄＮＴＰを１０〜１０００μＭ、好ましくは１００〜５００μＭ、Ｍｇ2+を１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、Ｃｌ-を１〜２０００ｍＭ、好ましくは２００〜７００ｍＭ、とすれば良く、総イオン濃度は、特に限定されないが、５０ｍＭより高い濃度であってもよく、１００ｍＭより高い濃度が好ましく、１２０ｍＭより高い濃度がより好ましく、１５０ｍＭより高い濃度がさらに好ましく、２００ｍＭより高い濃度がさらに好ましい。上限は、５００ｍＭ以下が好ましく、３００ｍＭ以下がより好ましく、２００ｍＭ以下がさらに好ましい。プライマー用オリゴヌクレオチドは、それぞれ０．１〜１０μＭ、好ましくは０．１〜１μＭが用いられる。試薬は、上記成分の他、界面活性剤を含んでも良い。界面活性剤は特に限定されないが、NP40、Triton-X100、Tween20などが例示できる。界面活性剤の濃度は特に限定されないが、核酸増幅反応を阻害しない濃度が好ましく、０．００１％〜０．１％以下であってもよく、０．００２％〜０．０２％であることが好ましく、０．００５％〜０．０１％であることが最も好ましい。判別対象のＤＮＡ、及び上記試薬を混合し、反応液として、公知の任意のＰＣＲ装置を用いて核酸増幅反応を行うことができる。
【００２５】
（３）本発明の方法及び試薬の用途
本発明の方法及び試薬は、任意の核酸増幅反応装置、例えばＰＣＲ装置において使用できる。
【００２６】
本発明は、複数の変異型を有する任意の変異を含むＤＮＡを対象とすることができる。例えば、病原体において変異を有する病原体の有無を判別するのに使用することができる。病原体とは、生物の疾病の原因となるものであれば特に限定されないが、細菌、ウイルス、リケッチア、マイコプラズマ、黄色ブドウ球菌、肺炎球菌、インフルエンザ菌、ＥＳＢＬ産生菌、淋菌、結核菌、溶血性レンサ球菌、クロストリジウム・ディフィシル、腸内細菌、腸球菌、アシネトバクター、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、カンピロバクター、カンジタ、非チフス性サルモネラ菌、チフス菌、赤痢菌、Ａ群連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、非結核性抗酸菌、スピロヘータ、真菌類等の病原微生物が代表例として挙げられる。
【００２７】
また、低感受性インフルエンザ、レトロウイルスなどの、ＲＮＡを有するものも検査対象となり得る。その場合、ＤＮＡを増幅する前に、逆転写によってＲＮＡをＤＮＡに変換しておくことによって、本発明の方法を適用することができる。
【００２８】
（４）核酸増幅反応装置及び熱サイクル方法
本発明の方法を適用するＰＣＲ装置は特に限定されない。本発明の一実施形態においては、下記に説明するＰＣＲ装置（以下昇降式ＰＣＲ装置）を用いる。
【００２９】
（i）核酸増幅反応容器
本発明の方法で使用する核酸増幅反応容器は、反応液と、反応液と比重が異なり、相分離する液体と、を含む、密閉された容器を有し、反応液が液滴状であり、液体が、オイルと添加剤を含む核酸増幅反応容器である。
【００３０】
図１は、核酸増幅反応容器１００の断面図である。図１は、核酸増幅反応容器に反応液を入れた状態を表す。
【００３１】
本発明に使用する核酸増幅反応容器１００は、容器１５０及び封止部１２０を含んで構成されている。核酸増幅反応容器１００の大きさや形状は、特に限定されないが、例えば、上述の反応液に例示される反応液１４０と混和しないオイル３０の量、熱伝導率、容器１５０及び封止部１２０の形状、あるいは取り扱いの容易さの少なくとも１つを考慮して設計されてもよい。
【００３２】
核酸増幅反応容器１００の容器１５０は透明な材質から形成することができる。それによって、核酸増幅反応容器１００の外部から、容器１５０内の反応液１４０の移動を観察したり、リアルタイムＰＣＲ等の、容器１５０の外部から測定等を行うような用途に使用したりすることができる。なお、本明細書において「透明」という場合には、容器１５０の外部から容器１５０内の反応液１４０を観察できる程度の視認性が確保できるものとし、この条件が満たされる限り、必ずしも核酸増幅反応容器１００の全体が透明でなくても良いものとする。
【００３３】
核酸増幅反応容器１００の用途は特に限定されないが、例えばリアルタイムＰＣＲのような、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、容器１５０は、自発蛍光の小さい材質で形成されることが望ましい。容器１５０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であることが好ましい。また、容器１５０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等による酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。これらの条件を満たす材質としては特に限定されず、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、シクロオレフィンポリマー（例えば、ＺＥＯＮＥＸ（登録商標）４８０Ｒ）、耐熱ガラス（例えばＰＹＲＥＸ（登録商標）ガラス）等やこれらの複合材料であってもよいが、ポリプロピレンが好ましい。
【００３４】
図１に示す核酸増幅反応容器１００では、容器１５０は円筒状に形成されており、中心軸方向（図１における上下方向）が長手方向となっている。ここで用いる容器１５０は、チューブであることが好ましく、小型遠心用チューブや、ＰＣＲ用に設計されたチューブであってもよいが、長手方向を有する、即ち細長い形状であることにより、例えば、後述する昇降型のサーマルサイクラーを用いて、容器１５０内のオイル３０に温度の異なる領域が形成されるように核酸増幅反応容器１００を温度制御する場合に、異なる温度の領域の間の距離を長くしやすくなる。これにより、容器１５０内の領域毎に、オイル３０を異なる温度に制御することが容易となるので、ＰＣＲに適した熱サイクルを実現できる。なお、昇降型のサーマルサイクラーとは、容器１５０を満たしたオイル中に少なくとも２つの温度領域を形成し、オイルと相分離する反応液１４０をこれらの温度領域間で往復移動させることによって熱サイクルを実現する装置である。
【００３５】
容器１５０の形状は、長手方向を有する限り、特に限定されないが、昇降型ＰＣＲに用いる場合には、略円筒形状で内径Ｄと長手方向の長さＬとの比が１：５〜１．５：２０の範囲であることが好ましい。さらには、内径Ｄが１．５〜２ｍｍ、長さＬが１０〜２０ｍｍであることがより好ましい。
【００３６】
容器１５０は、開口部及び開口部を封止する封止部１２０を有し、容器１５０中は反応液１４０と、反応液１４０と比重が異なり、相分離する液体１３０を含む。開口部を封止部１２０により封止した場合に、容器１５０内に空気が残らないことが好ましい。容器１５０内に気泡が残ると、反応液１４０の移動が妨げられることがあるからである。封止部１２０は、容器１５０と同様の材質から形成することができる。封止部１２０の構造は、容器１５０を密閉できる構造であればよく、例えば、ねじ蓋、栓、はめ込み等の構造とすることができる。図１においては、封止部１２０はねじ蓋の構造である。
【００３７】
反応液１４０はまた、界面活性剤を含んでよい。界面活性剤は特に限定されないが、NP40、Triton-X100、Tween20などが例示できる。界面活性剤の濃度は特に限定されないが、核酸増幅反応を阻害しない濃度が好ましく、０．００１％〜０．１％以下であってもよく、０．００２％〜０．０２％であることが好ましく、０．００５％〜０．０１％であることが最も好ましい。界面活性剤は、上述の酵素のストック溶液からの持ち込みであってもよいが、それとは独立に界面活性剤溶液を反応液１４０に添加してもよい。
【００３８】
液体１３０は、反応液１４０とは混和しないものを用いることにより、容器１５０に反応液１４０を入れた場合に、反応液１４０と液体１３０とが相分離するため、液体１３０中において反応液１４０を液滴状にすることができる。こうして、反応液１４０が液体１３０中に液滴状で保持されている。
【００３９】
液体１３０は、反応液１４０よりも比重が小さいものが好ましい。この場合、液体１３０中に反応液１４０を入れた場合に、反応液１４０の液滴は液体１３０よりも比重が大きいので、重力の作用によって重力の作用する方向に移動する。また、液体１３０は、反応液１４０よりも比重が大きい液体であってもよい。この場合には、反応液１４０の液滴は液体１３０よりも比重が小さいので、重力の作用によって重力の作用する方向とは反対方向に移動する。
【００４０】
液体１３０はオイルを含むことが好ましく、例えば、シリコーンオイル又はミネラルオイルを使用することができる。ここで、シリコーンとは、主骨格としてシロキサン結合を有するオリゴマーまたはポリマーを意味する。本明細書においては、シリコーンのうち熱サイクル処理に使用する温度帯において液体の状態であるものを特にシリコーンオイルと称する。また、本明細書においては、石油から精製され、熱サイクル処理に使用する温度帯において液体であるものをミネラルオイルと称する。これらのオイルは熱に対する安定性が高く、例えば粘度が５×１０3Ｎｓｍ-2以下の製品も入手しやすいので、昇降型のＰＣＲに好適である。オイルの粘性は特に限定されないが、９０ｃｓ以下であることが好ましく、７０ｃｓ以下であることがより好ましく、５０ｃｓ以下であることがさらに好ましく、３０ｃｓ以下であることがさらに好ましい、というように、小さい方が好ましく、それによって、後述するように溶解液が沈降するとき、よりスムーズに沈降できるようになる。
【００４１】
シリコーンオイルとしては、信越シリコーン社製のＫＦ−９６Ｌ−０．６５ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−１ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−２ｃｓ、ＫＦ−９６Ｌ−５ｃｓ、東レ・ダウコーニング社製のＳＨ２００ Ｃ ＦＬＵＩＤ ５ ＣＳ、あるいはモメンティブ・パフォーマンス・マテリアルズ・ジャパン合同会社製のＴＳＦ４５１−５Ａ、ＴＳＦ４５１−１０等のジメチルシリコーンオイルが例示される。ミネラルオイルとしては、主成分として炭素数１４から２０程度のアルカンを含有するものが例示される。すなわち、ｎ−テトラデカン、ｎ−ペンタデカン、ｎ−ヘキサデカン、ｎ−ヘプタデカン、ｎ−オクタデカン、ｎ−ノナデカン、ｎ−テトラコサンが例示される。
【００４２】
液体１３０は、添加剤を含んでよい。添加剤としては、例えば、X-22-160AS、X-22-3701E、KF-857、KF-859、KF-862、KF-867、 KF-6017 、KF-8005（以上、信越シリコーン社）などの変性シリコーンオイル、SR1000、SS4230、SS4267、YR3370（以上、Momentive社）などのシリコーンレジン、XS66-C1191（Momentive社）などのフルオロ変性シリコーンレジン、などのほか、TSF4703、TSF4708、XF42-C5196、XF42-C5197（以上、Momentive社）などの変性シリコーンオイルを使用することができる。添加剤の濃度は、特に限定されないが、容器の構造、材質、形状などを考慮して決定することができる。例えば、１％（ｖ/ｖ）以上５０％（ｖ/ｖ）以下であることが好ましく、２％（ｖ/ｖ）以上２０％（ｖ/ｖ）以下であることがより好ましく、５％（ｖ/ｖ）であることがさらに好ましい。
【００４３】
（ii）昇降式核酸増幅反応装置
本実施形態では、核酸増幅反応を行う核酸増幅反応容器として、チューブ型の核酸増幅反応容器（核酸増幅反応用チューブ）１００を用いる。以下、ＰＣＲを核酸増幅反応の一例とし、核酸増幅反応容器１００に適した昇降式核酸増幅反応装置（以下、昇降式ＰＣＲ装置とも記す）の一例について、詳細に述べる。
【００４４】
図２は、昇降式ＰＣＲ装置１の一例を示す。（Ａ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を閉じた状態、（Ｂ）は昇降式ＰＣＲ装置１の蓋５０を開けた状態であり、装着部１１に核酸増幅反応容器１００が装着された状態を表す。図３は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の分解斜視図である。図４は、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１における本体１０の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。
【００４５】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、図２（Ａ）に示すように、本体１０及び駆動機構２０を含む。図３に示すように、本体１０は、装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３を含む。第１加熱部１２と第２加熱部１３との間にはスペーサー１４が設けられている。本実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２が底板１７の側、第２加熱部１３が蓋５０の側に配置されている。本実施形態の本体１０においては、第１加熱部１２、第２加熱部１３、及びスペーサー１４はフランジ１６、底板１７及び固定板１９に固定されている。
【００４６】
装着部１１は、後述する核酸増幅反応容器１００を装着する構造である。図２（Ｂ）および図２に示すように、本実施形態の装着部１１は、核酸増幅反応容器１００を差し込んで装着するスロット構造であり、第１加熱部１２の第１ヒートブロック１２ｂ、スペーサー１４、及び第２加熱部１３の第２ヒートブロック１３ｂを貫通する穴に核酸増幅反応容器１００を差し込む構造となっている。装着部１１の数は複数であってもよく、図２（Ｂ）の例では、２０個の装着部１１が本体１０に設けられている。
【００４７】
この昇降式ＰＣＲ装置１は、核酸増幅反応容器１００を第１加熱部１２及び第２加熱部１３に対して所定の位置に保持する構造を含む。より具体的には、図４に示すように、後述する核酸増幅反応容器１００を構成する流路１１０の、第１領域１１１を第１加熱部１２によって、第２領域１１２を第２加熱部１３によって、加熱できる。本実施形態においては核酸増幅反応容器１００の位置を定める構造は底板１７であり、図４（Ａ）に示すように、核酸増幅反応容器１００を底板１７に接触する位置まで差し込むことで、第１加熱部１２及び第２加熱部１３に対して核酸増幅反応容器１００を所定の位置に保持できる。
【００４８】
第１加熱部１２は、装着部１１に核酸増幅反応容器１００を装着した場合に、後述する核酸増幅反応容器１００の第１領域１１１を第１の温度に加熱する。図４（Ａ）に示す例では、第１加熱部１２は本体１０において、核酸増幅反応容器１００の第１領域１１１を加熱する位置に配置されている。
【００４９】
第１加熱部１２は、熱を発生させる機構と、発生した熱を核酸増幅反応容器１００に伝える部材とを含んでもよい。図３に示す例では、第１加熱部１２は第１ヒーター１２ａ及び第１ヒートブロック１２ｂを含む。本実施形態においては、第１ヒーター１２ａはカートリッジヒーターであり、導線１５によって図示しない外部電源に接続されている。第１ヒーター１２ａは第１ヒートブロック１２ｂに挿入されており、第１ヒーター１２ａが発熱することで第１ヒートブロック１２ｂが加熱される。第１ヒートブロック１２ｂは、第１ヒーター１２ａから発生した熱を核酸増幅反応容器１００に伝える部材である。本実施形態においてはアルミニウム製のブロックである。
【００５０】
第２加熱部１３は、装着部１１に核酸増幅反応容器１００を装着した場合に、核酸増幅反応容器１００の第２領域１１２を、第１の温度とは異なる第２の温度に加熱する。図４（Ａ）に示す例では、第２加熱部１３は本体１０において、核酸増幅反応容器１００の第２領域１１２を加熱する位置に配置されている。図２に示すように、第２加熱部１３は、第２ヒーター１３ａ及び第２ヒートブロック１３ｂを含む。第２加熱部１３は、加熱する核酸増幅反応容器１００の領域及び加熱する温度が第１加熱部１２と異なる以外は、第１加熱部１２と同様である。
【００５１】
本実施形態においては、第１加熱部１２及び第２加熱部１３の温度は、図示しない温度センサー及び後述する制御部によって制御される。第１加熱部１２及び第２加熱部１３の温度は、核酸増幅反応容器１００が所望の温度に加熱されるように設定されることが好ましい。本実施形態においては、第１加熱部１２を第１の温度に、第２加熱部１３を第２の温度に制御することで、核酸増幅反応容器１００の第１領域１１１を第１の温度に、第２領域１１２を第２の温度に加熱できる。本実施形態における温度センサーは熱電対である。
【００５２】
駆動機構２０は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３を制御する機構であり、それにより第１領域と第２領域の配置を制御する。本実施形態においては、駆動機構２０は図示しないモーター及び駆動軸を含み、駆動軸と本体１０のフランジ１６とが接続されている。本実施形態における駆動軸は、装着部１１の長手方向に対して垂直に設けられており、モーターを動作させると駆動軸を回転の軸として本体１０が回転する。
【００５３】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、図示しない制御部を含む。制御部は、後述する第１の温度、第２の温度、第１の時間、第２の時間、及び熱サイクルのサイクル数のうち、少なくとも１つを制御する。制御部が第１の時間または第２の時間を制御する場合には、制御部は駆動機構２０の動作を制御することによって、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が所定の配置に保持される時間を制御する。制御部は、制御する項目ごとに異なる機構を設けても、全項目を一括して制御するものであってもよいが、本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１における制御部は電子制御であり、上記項目を全て制御する。本実施形態の制御部は図示しないＣＰＵ等のプロセッサー、及び、ＲＯＭ（Read Only Memory）やＲＡＭ（Random Access Memory）等の記憶装置を含む。記憶装置には上記各項目を制御するための各種プログラム、データ等が記憶されている。また、記憶装置は各種処理の処理中データ、処理結果などを一時的に記憶するワークエリアを有する。
【００５４】
本実施形態の本体１０は、図３及び図４（Ａ）の例に示すように、第１加熱部１２と第２加熱部１３との間にスペーサー１４が設けられている。本実施形態のスペーサー１４は、第１加熱部１２または第２加熱部１３を保持する部材である。本実施形態においては、スペーサー１４は断熱材であり、図４（Ａ）の例においては、装着部１１はスペーサー１４を貫通している。
【００５５】
本実施形態の本体１０は、固定板１９を含む。固定板１９は、装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３を保持する部材である。図２（Ｂ）及び図３に示す例においては、２枚の固定板１９がフランジ１６に嵌め合わされており、第１加熱部１２、第２加熱部１３及び底板１７が固定されている。
【００５６】
本実施形態の昇降式ＰＣＲ装置１は、蓋５０を含む。図２（Ａ）及び図４（Ａ）の例では、装着部１１は蓋５０によって覆われている。蓋５０は、固定部５１によって本体１０に固定されてもよい。本実施形態においては、固定部５１は磁石である。図２（Ｂ）及び図３の例に示すように、本体１０の蓋５０の接触する面には磁石が設けられている。図２（Ｂ）及び図３には示されていないが、蓋５０にも、本体１０の磁石が接触する位置に磁石が設けられており、蓋５０で装着部１１を覆うと、磁力によって蓋５０が本体１０に固定される。
【００５７】
なお、固定板１９、底板１７、蓋５０、フランジ１６は断熱材を用いて形成されることが好ましい。
【００５８】
（iii）昇降式ＰＣＲ装置を用いた熱サイクル処理
図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１の、図２（Ａ）のＡ−Ａ線における断面を模式的に示す断面図である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、昇降式ＰＣＲ装置１に核酸増幅反応容器１００が装着された状態を示す。図４（Ａ）は第１の配置、図４（Ｂ）は第２の配置を示す。以下では、核酸増幅反応容器１００を用いた場合の、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理について説明する。
【００５９】
図１の例に示すように、実施形態に係る核酸増幅反応容器１００は流路１１０及び封止部１２０を含む。流路１１０には、反応液１４０と、反応液１４０よりも比重が小さく、かつ、反応液１４０とは混和しない液体１３０としてのオイルと、が充填され、封止部１２０によって封止されている。
【００６０】
流路１１０は、対向する内壁に近接して反応液１４０が移動するように形成されている。ここで、流路１１０の「対向する内壁」とは、流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域を意味する。「近接」とは、反応液１４０と流路１１０の壁面との距離が近いことを意味し、反応液１４０が流路１１０の壁面に接触する場合を含む。したがって、「対向する内壁に近接して反応液１４０が移動する」とは、「流路１１０の壁面の、向かい合う位置関係にある２つの領域の両方に対して距離が近い状態で、反応液１４０が移動する」こと、すなわち、対向する内壁に沿って反応液１４０が移動することを意味する。
【００６１】
図１の例では、核酸増幅反応容器１００の外形は円柱状であり、中心軸方向（図１における上下方向）に流路１１０が形成されている。流路１１０の形状は、流路１１０の長手方向に対して垂直な方向の断面、すなわち流路１１０のある領域における反応液１４０が移動する方向に対して垂直な断面（これを流路１１０の「断面」とする）が円形の筒状である。したがって、本実施形態の核酸増幅反応容器１００においては、流路１１０の対向する内壁は、流路１１０の断面の直径を構成する流路１１０の壁面上の２点を含む領域であり、対向する内壁に沿って反応液１４０が流路１１０の長手方向に移動する。
【００６２】
核酸増幅反応容器１００の第１領域１１１は、第１加熱部１２によって第１の温度に加熱される、流路１１０の一部の領域である。第２領域１１２は、第２加熱部１３によって第２の温度に加熱される、第１領域１１１とは異なる流路１１０の一部の領域である。本実施形態の核酸増幅反応容器１００においては、第１領域１１１は、流路１１０の長手方向における一方の端部を含む領域であり、第２領域１１２は、流路１１０の長手方向における他方の端部を含む領域である。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、流路１１０の封止部１２０側の端部を含む点線で囲まれた領域が第２領域１１２であり、封止部１２０から遠い側の端部を含む点線で囲まれた領域が第１領域１１１である。
【００６３】
図１に示すように、流路１１０は、反応液１４０と、反応液１４０とは混和しない液体１３０としてのオイルと、を含む。液体１３０と反応液１４０は、（１）核酸増幅反応用チップの記載に従って準備される。
【００６４】
以下、図４（Ａ）及び図４（Ｂ）を参照しながら、実施形態に係る昇降式ＰＣＲ装置１を用いた熱サイクル処理を説明する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）においては、矢印ｇの方向（図における下方向）が重力の作用する方向である。本実施形態においては、熱サイクル処理の例としてシャトルＰＣＲ（２段階温度ＰＣＲ）を行う場合を説明する。なお、以下に説明する各工程は熱サイクル処理の一例を示すものである。必要に応じて工程の順序を入れ替えたり、２以上の工程を連続的にあるいは並行して行ったり、工程を追加したりしてもよい。
【００６５】
シャトルＰＣＲは、高温と低温の２段階の温度処理を繰り返し反応液に施すことにより、反応液中の核酸を増幅させる手法である。高温の処理においては２本鎖ＤＮＡの解離が、低温の処理においてはアニーリング（プライマーが１本鎖ＤＮＡに結合する反応）及び伸長反応（プライマーを始点としてＤＮＡの相補鎖が合成される反応）が起こる。
【００６６】
一般に、シャトルＰＣＲにおける高温は８０℃から１００℃の間の温度、低温は５０℃から７０℃の間の温度である。各温度における処理は所定時間行われ、高温に保持する時間は低温に保持する時間よりも短いことが一般的である。例えば、高温が１秒から１０秒程度、低温が１０秒から６０秒程度としてもよく、反応の条件によってはこれよりも長い時間であってもよい。
【００６７】
なお、使用する試薬の種類や量によって、適切な時間、温度およびサイクル数（高温と低温を繰り返す回数）は異なるので、試薬の種類や反応液１４０の量を考慮して適切なプロトコールを決定した上で反応を行うことが好ましい。
【００６８】
まず、核酸増幅反応容器１００を、装着部１１に装着する。本実施形態では、液体１３０が充填された流路１１０に反応液１４０を導入後、封止部１２０によって封止された核酸増幅反応容器１００を装着部１１に装着する。反応液１４０の導入は、マイクロピペットやインクジェット方式の分注装置等を用いて行うことができる。装着部１１に核酸増幅反応容器１００を装着した状態においては、第１加熱部１２は第１領域１１１を、第２加熱部１３は第２領域１１２を、それぞれ含む位置において核酸増幅反応容器１００に接している。
【００６９】
ここで、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３、の配置は第１の配置である。図４（Ａ）に示すように、第１の配置は、核酸増幅反応容器１００の第１領域１１１を、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置させる。第１の配置においては、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に第１領域１１１が位置するので、液体１３０よりも比重の大きい反応液１４０は、第１領域１１１に位置する。本実施形態においては、装着部１１に核酸増幅反応容器１００を装着したら、蓋５０によって装着部１１を覆い、昇降式ＰＣＲ装置１を作動させる。
【００７０】
次に、第１加熱部１２及び第２加熱部１３により核酸増幅反応容器１００を加熱する。第１加熱部１２と第２加熱部１３とは、核酸増幅反応容器１００の異なる領域を異なる温度に加熱する。すなわち、第１加熱部１２は第１領域１１１を第１の温度に加熱し、第２加熱部１３は第２領域１１２を第２の温度に加熱する。これにより、流路１１０の第１領域１１１と第２領域１１２との間には、第１の温度と第２の温度との間で温度が漸次変化する温度勾配が形成される。ここでは、第１領域１１１から第２領域１１２へ向けて温度が低くなる温度勾配が形成される。本実施形態の熱サイクル処理はシャトルＰＣＲであるので、第１の温度は２本鎖ＤＮＡの解離に適した温度、第２の温度はアニーリング及び伸長反応に適した温度とする。
【００７１】
装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置は第１の配置であるので、核酸増幅反応容器１００を加熱すると、反応液１４０は第１の温度に加熱される。第１の時間が経過したら、駆動機構２０によって本体１０を駆動し、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置を第１の配置から第２の配置へ切換える。第２の配置は、第２領域１１２を重力の作用する方向において流路１１０の最下部に位置させる配置である。換言すると、第２領域１１２は、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が、第１の配置とは異なる所定の配置にある場合に、重力の作用する方向における流路１１０の最下部に位置する領域である。本実施形態の昇降式PCＲ装置１においては、制御部の制御によって駆動機構２０が本体１０を回転駆動する。駆動軸を回転の軸として、モーターによってフランジ１６を回転駆動すると、フランジ１６に固定されている装着部１１、第１加熱部１２及び第２加熱部１３が回転する。駆動軸は装着部１１の長手方向に対して垂直な方向の軸であるので、モーターの動作によって駆動軸が回転すると、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３が回転する。図４（Ａ）及び図４（Ｂ）に示す例では、本体１０を１８０°回転させる。これにより、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第１の配置から第２の配置へ切換えられる。
【００７２】
ここで、第１領域１１１と第２領域１１２との重力の作用する方向における位置関係が第１の配置とは逆になるので、反応液１４０は重力の作用によって第１領域１１１から第２領域１１２へと移動する。装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第２の配置に達した場合に、駆動機構２０の動作が停止すると、装着部１１、第１加熱部１２並びに第２加熱部１３の配置が第２の配置に保持される。第２の配置において、第２の時間が経過したら、再度回転し、所定の回数が来るまで、このようにして第１の位置と第２の位置を入れ替えながら回転することにより、核酸増幅反応が行われる。第１の位置と第２の位置を一回入れ替えることを、１サイクルとする。
【００７３】
核酸増幅反応液１４０が、第１領域から第２領域へ移動する時間は任意に設定できるが、より短い方が好ましい。例えば、その時間は５秒以内であってもよいが、２秒以内であることがより好ましく、１秒以内であることが最も好ましい。
【００７４】
上述の核酸増幅反応容器及び昇降式ＰＣＲ装置を用いてこの熱サイクル処理を行うことで、微小な液滴である反応液の温度を素早く変えることできる。例えばシャトルＰＣＲにおいて、反応液の温度が、高温からアニーリング及び伸長反応に適した設定温度へ下降する時間、またはその逆が非常に短いために、アニーリング及び伸長可能な温度以外の温度である時間も非常に短い。
【実施例】
【００７５】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。以下の実施例では、実施形態において例示した昇降式ＰＣＲ装置及び熱サイクル方法を用いた。
【００７６】
＜実施例１＞
（１）反応液の調製
正常型肺炎マイコプラズマ菌（以下正常菌）、及び薬剤耐性型肺炎マイコプラズマ菌（以下耐性菌）由来のプラスミド２５コピーを用意した。プラスミドは以下の６種類であった。
【００７７】
(i)正常型：肺炎マイコプラズマのリボソーム内２３S rRNAの2063番目が「A」、2064番目が「A」
(ii)耐性型１：肺炎マイコプラズマのリボソーム内２３S rRNAの2063番目が「G」、2064番目が「A」
(iii)耐性型２：肺炎マイコプラズマのリボソーム内２３S rRNAの2063番目が「C」、2064番目が「A」
(iv)耐性型３：肺炎マイコプラズマのリボソーム内２３S rRNAの2063番目が「A」、2064番目が「G」
(v)耐性型４：肺炎マイコプラズマのリボソーム内２３S rRNAの2063番目が「A」、2064番目が「C」
(vi)耐性型５：肺炎マイコプラズマのリボソーム内２３S rRNAの2063番目が「A」、2064番目が「T」
上記プラスミドのいずれかと下記判別用試薬とを混合して反応液を調整した。反応液の組成は下記の通りである。各成分の液量は、反応液全量１０μｌ当たりの液量である。
【００７８】
PlatinumTaq（ポリメラーゼ）                                   0.4μL
dNTP (10mM)                                                 0.5μL
5 x buffer（※）                                              2.0μL
forward プライマー (20μM)                                    0.8μL
reverse プライマー (20μM)                                    0.8μL
正常型プローブ （TaqManプローブ、10μM）                    0.6μL
有無プローブ （TaqManプローブ、10μM）                      0.6μL
テンプレートDNA                                             1.0μL
水                                                      up to 10μL
※５ x bufferの組成：MgCl2:25mM, Tris-HCl(PH9.0):250mM, KCl:125mM
プライマー及びプローブの配列は下記の通りである。正常型プローブ及び有無プローブは、その結合するＤＮＡ鎖が、互いに相補鎖となるよう設計した。正常型プローブ及び有無プローブを標識する蛍光色素として、それぞれＦＡＭ及びＣｙ５．５を使用した。
【００７９】
forward プライマー：5' ATCCAGGTACGGGTGAAGACAC 3'（配列番号１）
reverse プライマー：5' CGCATCAACAAGTCCTAGCGAAC 3'（配列番号２）
正常型プローブ：5' FAM-CGGGACGGA(2063)A(2064)AGACC-BHQ1 3'（配列番号３）
有無プローブ：5' Cyanine5.5-GTCCTGATCAATATTAAGCT-BHQ3 3'（配列番号４）
【００８０】
（２）ＰＣＲ条件
昇降型ＰＣＲ装置を用い、１．４μｌの反応液を用い、下記の条件で核酸増幅反応を行った。
【００８１】
ホットスタート：98℃,10秒
（以上、1サイクル）
熱変性：98℃,4秒
アニーリング/伸長：54℃, 6秒
（以上、50サイクル）
なお、核酸増幅反応にかかった時間は８分であった。
【００８２】
（３）正常菌及び耐性菌の判別
上記(i)正常型から(vi)耐性型５について、上記核酸増幅反応で生じた蛍光の検出結果を、それぞれ図６〜１１に示す。上の線グラフは正常型プローブを用いて増幅した結果、下の線グラフは有無プローブを用いて増幅した結果を示す。縦軸は蛍光輝度、横軸はサイクル数を表す。ＦＡＭ及びＣｙ５．５の蛍光輝度が上昇した場合には正常菌、Ｃｙ５．５の蛍光輝度のみ上昇した場合には耐性菌であると判別できる。
【００８３】
図６〜１１に示すように、どの変異型においても、１種類のプライマーと、プローブとして正常型プローブと有無プローブの２種類のみを用いて、正常菌及び耐性菌を判別できた。
【００８４】
＜実施例２＞
プラスミドのコピー数を、実施例１の２５コピーから１０7コピーに変更した以外は、実施例１と同様の条件で核酸増幅反応及び蛍光検出を行い、正常菌及び耐性菌を判別した。
【００８５】
図１２に示すように、過剰量のプラスミドを用いても、正常菌及び耐性菌を正確に判別できた。なお、図１２の縦軸は蛍光輝度、横軸はサイクル数を表す。
【００８６】
＜実施例３＞
６種のプラスミドに代えて、正常菌由来のゲノムＤＮＡ２５コピーを用いた以外は実施例１と同様の条件で核酸増幅反応及び蛍光検出を行い、正常菌及び耐性菌を判別した。
【００８７】
図１３に示すように、ゲノムＤＮＡを用いた場合でも、正常菌を判別できた。なお、図９の縦軸は蛍光輝度、横軸はサイクル数を表し、上の線グラフは正常型プローブを用いて増幅した結果、下の線グラフは有無プローブを用いて増幅した結果を示す。
【００８８】
＜実施例４＞
６種のプラスミドに代えて、呼吸器系疾患を罹患する患者から得た検体に含まれる耐性菌由来のゲノムＤＮＡであって、実施例１の「(ii)耐性型１」の変異を有するＤＮＡ、正常菌由来のゲノムＤＮＡ２５コピー及び正常菌由来の正常型プラスミド２５コピーを用いた以外は、実施例１と同様の条件で核酸増幅反応及び蛍光検出を行い、正常菌及び耐性菌を判別した。
【００８９】
図１４に示すように、ゲノムＤＮＡを用いた場合でも、正常菌及び耐性菌を判別できた。なお、図１４の縦軸は蛍光輝度、横軸はサイクル数を表す。
【符号の説明】
【００９０】
１…昇降式ＰＣＲ装置、１０…本体、１１…装着部、１２…第１加熱部、１２ａ…第１ヒーター、１２ｂ…第１ヒートブロック、１３…第２加熱部、１３ａ…第２ヒーター、１３ｂ…第２ヒートブロック、１４…スペーサー、１５…導線、１６…フランジ、１７…底板、１９…固定板、２０…駆動機構、５０…蓋、５１…固定部、１００…核酸増幅反応容器、１１０…流路、１１１…第１領域、１１２…第２領域、１２０…封止部、１３０…液体、１４０…核酸増幅反応液、１５０…容器。
【図１】
2016086811.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図５】
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【図１２】
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【図１４】
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【配列表】
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