(57)【要約】【課題】  大腸菌においてサリチル酸を高い生産性にて製造する方法を提供すること。【解決手段】  様々な種を対象として、大腸菌におけるサリチル酸の生合成に好適なイソコリスミ酸シンテース（ＩＣＳ）のスクリーニングを行った。その結果、大腸菌由来のＭｅｎＦが最も効率的にサリチル酸生産を可能にするＩＣＳであることを見出した。また、大腸菌において、前記ＭｅｎＦのカルボキシ末端にＰｃｈＢが結合した融合タンパク質を外来的に発現させることによって、そのサリチル酸生産性を更に５倍以上向上できることも見出した。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを外来的に発現させた大腸菌を、炭素源を含む培地にて培養し、該大腸菌の培養物からサリチル酸を採取する工程を含む、サリチル酸の製造方法。
【請求項２】
大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのカルボキシ末端にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが結合した融合タンパク質を、外来的に発現させた大腸菌を、炭素源を含む培地にて培養し、該大腸菌の培養物からサリチル酸を採取する工程を含む、サリチル酸の製造方法。
【請求項３】
前記イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが緑膿菌由来のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ  ＰｃｈＢである、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のベクターを含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の製造方法に用いるためのキット
（ｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのカルボキシ末端にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが結合した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター
（ｉｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチドと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含むベクター
（ｉｉｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含むベクターとの組み合わせ。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターが導入され、形質転換された大腸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サリチル酸の製造方法に関し、より詳しくは、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを用いる、サリチル酸の製造方法に関する。また、本発明は、これら酵素をコードするベクターを含む、前記製造方法に用いるためのキット、並びに前記ベクターが導入され、形質転換された大腸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
サリチル酸は、ベンゼン環にカルボキシル基とヒドロキシル基とを併せ持つ有機化合物であり、解熱・鎮痛作用等を有するため、医薬品として用いられる物質である。また、殺菌性も示すため、化粧品や食品に配合される防腐剤等としても利用される。さらに、サリチル酸から誘導されるムコン酸はプラスチックの原料として用いられており、このように、サリチル酸は、様々な分野において利用されている極めて有用な物質である。
【０００３】
かかる需要度の高いサリチル酸は、主に石油を原料とした化学合成により工業的に生産されている。しかしながら、このような化学合成は、生産過程における環境負荷が大きく、また将来的に懸念される石油の枯渇という問題点があるため、代替の製造方法についての研究、開発が鋭意進められている。
【０００４】
そして、代替の製造方法として、微生物発酵を利用する方法に関心が寄せられている。例えば、非特許文献１においては、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来サリチル酸合成遺伝子の解析を行い、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換するイソコリスミ酸シンテース（ＩＣＳ）、イソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促すイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＩＰＬ）の作用により、コリスミ酸からサリチル酸を生合成できることが示されている。また、これら緑膿菌由来のＩＣＳ（ＰｃｈＡ）及びＩＰＬ（ＰｃｈＢ）を大腸菌において外来的に発現させることにより、サリチル酸を生産させることに成功はしている。しかしながら、その生産性は２０μＭ程度と極めて低く、産業的なプロセスに応用を考えた場合、この方法では不十分であった。
【０００５】
また、このような生合成において、ＩＣＳによるイソコリスミ酸への変換が律速段階となるため（非特許文献２）、サリチル酸の生産において、より酵素活性の高いＩＣＳが有用であることが示唆されている。また、大腸菌においては、ＩＣＳとしてＭｅｎＦ及びＥｎｔＣの２種の酵素の存在が明らかになっており、さらに酵素の触媒速度においてＥｎｔＣ（Ｋｃａｔ＝１７３ｍｉｎ−１）の方がＭｅｎＦ（Ｋｃａｔ＝８０ｍｉｎ−１）よりも２倍以上高いことが報告されている（非特許文献３）。さらに、このようにＩＣＳとして高い酵素活性を有しているＥｎｔＣと緑膿菌由来のＩＰＬ（ＰｃｈＢ）とを大腸菌において外来的に発現させ、該大腸菌を炭素源としてグリセロール及びグルコースを含む培地にて培養することにより、サリチル酸を合成することに成功している（非特許文献４）。しかしながら、依然その生産性は低く、産業上の利用においては未だ有効な生合成方法が開発されていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｅｒｉｎｏ  Ｌ．ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９５年、２４９巻、２号、２１７〜２２８ページ
【非特許文献２】Ｇａｉｌｌｅ  Ｃ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２００３年、２７８巻、１９号、１６８９３〜１６８９８ページ
【非特許文献３】Ｄａｒｕｗａｌａ  Ｒ．ら、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９９７年、１７９巻、１０号、３１３３〜３１３８ページ
【非特許文献４】Ｌｉｎ  Ｙ．ら、Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．、２０１４年、２３巻、６２〜６９ページ
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、大腸菌においてサリチル酸を高い生産性にて製造することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記目的を達成すべく、先ず、様々な種を対象として、大腸菌におけるサリチル酸の生合成に好適なイソコリスミ酸シンテース（ＩＣＳ）のスクリーニングを行った。すなわち、大腸菌において各種由来のＩＣＳと緑膿菌由来のＩＰＬ（ＰｃｈＢ）とを外来的に共発現させ、炭素源としてグルコースを含む培養液において該大腸菌を培養し、当該培養液中に分泌されるサリチル酸の量を測定した。その結果、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５株由来のＭｅｎＦが最も効率的にサリチル酸生産を可能にするＩＣＳであることを見出した。上述の通り、非特許文献４において、ＭｅｎＦと同じ大腸菌由来であるＥｎｔＣを用いることにより、大腸菌においてサリチル酸を生合成できた旨が報告されている。さらに、ＭｅｎＦの酵素活性は、ＥｎｔＣのそれの２分の１以下であることも知られている。しかしながら驚くべきことに、本スクリーニングにおいて、ＭｅｎＦは、ＥｎｔＣと比較して酵素活性が低いにも関わらず、そのサリチル酸の生産性は２倍程高いものであった。
【０００９】
次に、大腸菌において、ＭｅｎＦのカルボキシ末端にＰｃｈＢが結合した融合タンパク質を外来的に発現させ、前記スクリーニング同様に、当該大腸菌により培養液中に分泌されたサリチル酸の量を測定した。その結果、ＭｅｎＦのカルボキシ末端にＰｃｈＢを融合させ、大腸菌において発現させることにより、前述のＭｅｎＦとＰｃｈＢとを共発現させた場合と比較して、サリチル酸の生産性を５倍以上向上できること、ひいては従来のＥｎｔＣとＰｃｈＢとを共発現させた場合と比較して１０倍以上向上できることも見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを用いる、サリチル酸の製造方法に関する。また、本発明は、これら酵素をコードするベクターを含む、前記製造方法に用いるためのキット、並びに前記ベクターが導入され、形質転換された大腸菌に関し、より詳しくは、以下の通りである。
（１）  大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを外来的に発現させた大腸菌を、炭素源を含む培地にて培養し、該大腸菌の培養物からサリチル酸を採取する工程を含む、サリチル酸の製造方法。
（２）  大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのカルボキシ末端にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが結合した融合タンパク質を、外来的に発現させた大腸菌を、炭素源を含む培地にて培養し、該大腸菌の培養物からサリチル酸を採取する工程を含む、サリチル酸の製造方法。
（３）  前記イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが緑膿菌由来のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ  ＰｃｈＢである、（１）又は（２）に記載の製造方法。
（４）  下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のベクターを含む、（１）〜（３）のうちのいずれか一に記載の製造方法に用いるためのキット
（ｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのカルボキシ末端にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが結合した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター
（ｉｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチドと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含むベクター
（ｉｉｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含むベクターとの組み合わせ。
（５）  （４）に記載のベクターが導入され、形質転換された大腸菌。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、大腸菌においてサリチル酸を高い生産性にて製造することが可能となる。例えば、後述の実施例において示す通り、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのカルボキシ末端にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを融合させて発現させた大腸菌を５ｍＬの試験管培養系にて培養することにより、１７ｇ／Ｌのグルコースからおよそ２．１ｇ／Ｌ（対糖収率：１２．４％）という極めて高い生産性にて、サリチル酸を生産することができる。また、かかる高い生産性に基づけば、大腸菌におけるサリチル酸の生合成系を工業的に利用することも可能となる。ひいては、現状のサリチル酸工業生産の原料である石油資源を、非化石原料であるグルコース等（例えば、植物原料）に転換することができ、サリチル酸生産における石油枯渇や環境負荷に関する現状の問題を解消することも可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（サリチル酸の製造方法）
後述の実施例において示す通り、大腸菌におけるサリチル酸の生合成に好適なイソコリスミ酸シンテース（ＩＣＳ）を選抜すべく、大腸菌において各種由来のＩＣＳと緑膿菌由来のＩＰＬ（ＰｃｈＢ）とを外来的に共発現させ、炭素源としてグルコースを含む培養液において該大腸菌を培養し、当該培養液中に分泌されるサリチル酸の量を測定した。その結果、大腸菌(Ｅ．ｃｏｌｉ)ＭＧ１６５５株由来のＭｅｎＦが最も効率的にサリチル酸生産を可能にするＩＣＳであることが明らかになった。
【００１３】
したがって、本発明のサリチル酸の製造方法は、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを外来的に発現させた大腸菌を、炭素源を含む培地にて培養し、該大腸菌の培養物からサリチル酸を採取する工程を含む、方法である。
【００１４】
本発明において、「イソコリスミ酸シンテース」とは、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換する酵素のことを意味し、「ＭｅｎＦ」とはイソコリスミ酸シンテースの中でメナキノンの生合成に関与する酵素のことを意味する。また、本発明にかかる「大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ」とは、由来が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であれば特に制限はないが、好ましくは、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）、ＭＧ１６５５  （ＡＴＣＣ  ４７０７６）等のプロトタイプ野生株Ｋ−１２株由来の大腸菌株由来のＭｅｎＦであり、より好ましくは、ＭＧ１６５５株由来のＭｅｎＦであり、典型的には、配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質）である。
【００１５】
また、自然界において、ヌクレオチド配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、ＭＧ１６５５株由来のＭｅｎＦをコードする遺伝子のヌクレオチド配列情報（配列番号：１に記載のヌクレオチド配列等）が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列（例えば、配列番号：２に記載のアミノ酸配列）とは異なるが、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換する酵素活性を維持した又はより向上させたＭｅｎＦを調製することもできる。
【００１６】
したがって、本発明にかかる「大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ」の他の態様には、「配列番号：２に記載のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。ここで「複数」とは、改変後のＭｅｎＦが、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換する活性を有する範囲におけるアミノ酸の改変数であり、通常１〜８０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜数個（例えば、１〜１０個、１〜８個、１〜４個、１〜２個）である。
【００１７】
このような改変体をコードするポリヌクレオチドは、当業者であれば、ＭｅｎＦをコードする遺伝子のヌクレオチド配列情報に基づき、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等を利用して調製することが可能である。
【００１８】
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、ＭＧ１６５５株由来のＭｅｎＦをコードする遺伝子のヌクレオチド配列情報が得られた場合、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により、ＭＧ１６５５株以外の他の大腸菌株から、ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチド（相同遺伝子）を取得することが可能である。したがって本発明にかかる「大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ」の態様には、「配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（相同遺伝子）がコードするタンパク質」も含まれる。
【００１９】
このような相同遺伝子を単離するためには、通常、厳密な条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。「厳密な条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、２×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍＭクエン酸３ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）、０．５％  ＳＤＳ溶液中で６０℃、２０分間の洗浄条件が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションは、例えば、公知であるＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング・検出システム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２０】
また、このような方法にて取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号：２に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。したがって、本発明にかかる「大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ」の態様には、「配列番号：２に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。配列の同一性は、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラムを利用して決定することができる。また、配列番号：２に記載のアミノ酸配列との同一性は８０％以上あればよいが、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。
【００２１】
また、上述の各種改変体が、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換する活性を有していることは、例えば、非特許文献３において示すように、コリスミ酸及び塩化マグネシウム等を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７〜８）と、アミノ酸配列の改変を伴うＭｅｎＦとをインキュベーションし、得られた溶液中のイソコリスミ酸量をＨＰＬＣ等により定量し、その量又は該量から算出される酵素活性値（例えば、分子活性  Ｋｃａｔ）を、アミノ酸配列改変前のＭｅｎＦにおけるそれらと比較することにより評価することができる。例えば、アミノ酸配列改変後のＭｅｎＦにおけるＫｃａｔが、改変前と比較して通常５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）であれば、上述の各種改変体が、コリスミ酸をイソコリスミ酸に変換する活性を有していると評価することができる。
【００２２】
本発明において「イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ」とは、イソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促し、サリチル酸に変換する酵素のことを意味する。また、本発明にかかる「イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ」の由来についても特に制限はなく、様々な種由来のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを本発明においては利用することができるが、大腸菌内での発現のし易さ、並びに酵素活性の観点から、緑膿菌（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）由来のＩＰＬであるＰｃｈＢ、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼであるＭｂｔＩ及びエンテロコリチカ菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）由来のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼであるＩｒｐ９が好ましく、ＰｃｈＢがより好ましい。ＰｃｈＢの典型例としては、配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（配列番号：３に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質）が挙げられる。ＭｂｔＩの典型例としては、Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＩＤ：ＹＰ＿１７７８７７．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＩＤ：ＮＣ＿０００９６２．３に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質）が挙げられる。Ｉｒｐ９の典型例としては、Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＩＤ：ＹＰ＿００１００６８１０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＩＤ：ＮＣ＿００８８００．１に記載のヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列からなるタンパク質）が挙げられる。
【００２３】
また、自然界において、ヌクレオチド配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、例えば、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列情報（配列番号：３に記載のヌクレオチド配列、ＮＣ＿０００９６２．３に記載のヌクレオチド配列、ＮＣ＿００８８００．１に記載のヌクレオチド配列等）が得られた場合、そのヌクレオチド配列を改変し、そのコードするアミノ酸配列（例えば、配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿１７７８７７．１に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿００１００６８１０．１に記載のアミノ酸配列等）とは異なるが、イソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促し、サリチル酸に変換する酵素活性を維持した又はより向上させたイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを調製することもできる。
【００２４】
したがって、本発明にかかる「イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ」の他の態様には、例えば、「配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿１７７８７７．１に記載のアミノ酸配列又はＹＰ＿００１００６８１０．１に記載のアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。ここで「複数」とは、改変後のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが、イソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促し、サリチル酸に変換する活性を有する範囲におけるアミノ酸の改変数であり、通常１〜８０個、好ましくは１〜４０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜数個（例えば、１〜１０個、１〜８個、１〜４個、１〜２個）である。このような改変体をコードするポリヌクレオチドは、前述の「大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ」同様に、当業者であれば、公知の部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法等を利用して調製することが可能である。
【００２５】
さらに、現在の技術水準においては、当業者であれば、緑膿菌等由来のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列情報が得られた場合、ハイブリダイゼーション技術やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により、緑膿菌等以外の他の菌等から、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチド（相同遺伝子）を取得することが可能である。したがって、本発明にかかる「イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ」の態様には、「配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿１７７８７７．１に記載のアミノ酸配列又はＹＰ＿００１００６８１０．１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと厳密な条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（相同遺伝子）がコードするタンパク質」も含まれる。なお、この場合の「厳密な条件」は、前述の「大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ」と同様の条件である。
【００２６】
また、このような方法にて取得された相同遺伝子がコードするタンパク質は、通常、配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿１７７８７７．１に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿００１００６８１０．１に記載のアミノ酸配列に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。したがって、本発明にかかる「イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ」の態様には、「配列番号：４に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿１７７８７７．１に記載のアミノ酸配列、ＹＰ＿００１００６８１０．１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質」も含まれる。配列の同一性は、例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴＰ（アミノ酸レベル）のプログラムを利用して決定することができる。また、配列番号：４に記載のアミノ酸配列等との同一性は８０％以上あればよいが、好ましくは９０％以上であり、より好ましくは９５％以上であり、さらに好ましくは９９％以上である。
【００２７】
また、上述の各種改変体が、イソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促し、サリチル酸に変換する活性を有していることは、例えば、前述の「大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ」同様に、イソコリスミ酸等を含む緩衝液と、アミノ酸配列の改変を伴うイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼとをインキュベーションし、得られた溶液中のサリチル酸量をＨＰＬＣ等により定量し、その量又は該量から算出される酵素活性値（例えば、分子活性  Ｋｃａｔ）を、アミノ酸配列改変前のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼにおけるそれらと比較することにより評価することができる。例えば、アミノ酸配列改変後のイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼにおけるＫｃａｔが、改変前と比較して通常５０％以上（好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上）であれば、上述の各種改変体が、イソコリスミ酸の脱ピルビン酸を促し、サリチル酸に変換する活性を有していると評価することができる。
【００２８】
本発明において、大腸菌における、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼの「外来的な発現」とは、これらタンパク質が宿主となる大腸菌において内因的に発現するものではないことを意味する。例えば、これら酵素をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを大腸菌に導入することにより、これら酵素を該大腸菌において外来的に発現させることができる。なお、かかるベクター及び該ベクターの大腸菌への導入方法等に関しては、後述を参照のこと。
【００２９】
また、大腸菌におけるこれら酵素の外来的な発現は、各々別のタンパク質としての発現であってもよいが、これら酵素が結合してなる１の融合タンパク質としての発現であってもよい。
【００３０】
本発明にかかる「融合タンパク質」においては、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのアミノ末端、カルボキシ末端のいずれに結合させてもよいが、サリチル酸の生産性がより高くなるという観点から、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのカルボキシ末端にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが結合した融合タンパク質が好ましい。また、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦとイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼとは直接的に融合させてもよく、またリンカーを介して間接的に融合させてもよい。リンカーペプチドの長さは、通常、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜５０アミノ酸、より好ましくは１〜１０アミノ酸（例えば、ＧＳリンカー（Ｎ末−ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Ｃ末、配列番号：１４））である。
【００３１】
また、本発明において、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを大腸菌において外来的に発現させる際には、これら酵素又はこれら酵素を含む融合タンパク質に、他の機能性タンパク質が融合されていてもよい。この場合、他の機能性タンパク質は、前記酵素のアミノ末端、カルボキシ末端のどちらか一方又は両側に直接的に又は間接的に融合させることができる。また、前記融合タンパク質である場合には、該融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端のどちらか一方若しくは両側、又は該融合タンパク質を構成する酵素間に、直接的に又は間接的に他の機能性タンパク質を融合させることができる。他の機能性タンパク質としては特に制限はなく、外来的に発現させるタンパク質に付与したい機能に応じて適宜選択される。例えば、付与したい機能がタンパク質の精製や検出等であれば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼタンパク質、Ｍｙｃ−タグ（ｔａｇ）タンパク質、Ｈｉｓ−タグタンパク質、ヘマグルチン（ＨＡ）−タグタンパク質、ＦＬＡＧ−タグタンパク質（登録商標、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タンパク質が挙げられる。
【００３２】
また、これらタンパク質を外来的に発現させる大腸菌としては特に制限はないが、好ましくは、シキミ酸経路（フェニルアラニン合成経路）が活性化されていることにより、サリチル酸生合成の原料となるコリスミ酸をフェニルアラニンの中間体としてより生産性高く合成できるという観点から、フェニルアラニン生産性大腸菌株が好ましい。フェニルアラニン生産性大腸菌株としては、例えば、ＡＴＣＣ３１８８２株、ＡＴＣＣ３１８８３株、ＡＴＣＣ３１８８４株が挙げられるが、ＡＴＣＣ３１８８２株がより好ましい。
【００３３】
本発明にかかる大腸菌を培養する培地としては、大腸菌の培養に必要な成分の他、サリチル酸生合成の原料となる炭素源を含むものであればよい。
【００３４】
本発明にかかる「炭素源」としては、炭素を含むものであれば特に制限されないが、サリチル酸生合成の原料となるコリスミ酸の他、解糖系において生成されたホスホエノールピルビン酸とペントースリン酸経路において生成されたエリトロース４−リン酸との縮合反応を開始反応とするシキミ酸経路によって、コリスミ酸は生合成されるという観点から、好ましくは、解糖系の炭素源（グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、グリセロール、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１，６−ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、１，３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、２−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸、アセチルＣｏＡ等）、ペントースリン酸経路の炭素源（グルコース−６−リン酸、６−ホスホグルコノ−１，５−ラクトン、６−ホスホグルコン酸、リブロース−５−リン酸、キシルロース−５−リン酸、リボース−５−リン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、セドヘプツロース−７−リン酸、フルクトース−６−リン酸、エリトロース−４−リン酸、フルクトース−６−リン酸等）であり、より再生可能資源であるバイオマスを原料に用いたクリーンなサリチル酸の製造方法を提供し易いという観点から、バイオマスの主成分であるグルコースがより好ましい。また、本発明にかかる培地に含まれる炭素源の量としては、含まれる炭素源の種類、培養する大腸菌の種類等に応じて適宜調整され得るが、通常、２０〜２００ｇ／Ｌであり、好ましくは２０〜５０ｇ／Ｌである。
【００３５】
また、大腸菌の培養に必要な成分としては特に制限はないが、酵母抽出エキス、ポリペプトン、トリペプトン、カゼイン及びその代謝物、コーンスティープリカー、大豆タンパク質、肉エキス、魚肉エキス等の窒素源が挙げられ、かかる窒素源が大腸菌の増殖に必要な量にて、本発明にかかる培地に添加されていることが好ましい。また、本発明にかかる培地には、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩、マンガン塩等の金属塩が添加されていることが好ましい。金属塩の具体例としては、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩＩ）、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、クエン酸鉄、硫酸アンモニウム鉄、塩化カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化銅、硫酸マンガン、塩化マンガンが挙げられる。さらに必要に応じ、ビオチン、ニコチン酸、チアミン、リボフラビン、イノシトール、ピリドキシンといったビタミン類、核酸関連物質等を培地に添加してもよい。
【００３６】
また、本発明にかかる培地には、例えば、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼの発現を誘導するための後述の物質（ＩＰＴＧ等）や、後述の本発明のベクターがコードし得る薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（例えば、ペニシリン系、β−ラクタム系、マクロライド系、クロラムフェニコール系、テトラサイクリン系、アミノグリコシド系、ケトライド系、ポリエンマクロライド系、グリコペプチド系、核酸系、ポリドンカルボン酸系等の抗生物質）を添加してもよい。
【００３７】
また、本発明にかかる培地としては液体培地であってもよく、寒天等を含む固体培地であってもよいが、生成されるサリチル酸は大腸菌外に分泌されるため、サリチル酸を回収し易いという観点から、液体培地であることが好ましい。
【００３８】
また、本発明にかかる培養の条件としては、本発明にかかる大腸菌が前記培地中にて増殖することができ、かつサリチル酸を生合成できる条件であればよく、当業者であれば、大腸菌の種類、用いる培地等に合わせて、培養温度、空気の添加の有無、酸素の濃度、二酸化炭素の濃度、培地のｐＨ、培養の際の振盪速度培養時間、湿度等を適宜調整し、設定することができるが、培養温度に関しては通常２５℃〜４０℃であり、大腸菌の増殖速度を最大にし易いという観点から、好ましくは３７℃である。また、大腸菌を培養するために好適な培地のｐＨは７．０であり、培養の際の振盪速度としては、通常１８０〜３００ｒｐｍであり、好ましくは１８０〜２００ｒｐｍである。
【００３９】
本発明において、「培養物」とは、前述の大腸菌を、前述の培地で培養することによって得られる、増殖した大腸菌、該大腸菌の分泌産物及び該大腸菌の代謝産物等を含有する培地のことであり、それらの希釈物、濃縮物を含む。
【００４０】
このような培養物から、サリチル酸を採取する方法としては特に制限はなく、例えば、該培養物を酢酸エチル等の有機溶剤によって処理することにより単離・精製することができる。また、必要に応じ、遠心分離、フィルター（例えば、孔径０．２μｍ以下のフィルター）処理によって大腸菌等の不溶成分を除いた後、例えば、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法、活性炭を用いる方法等の方法を単独でまたは組み合わせることによって、サリチル酸を採取することができる。
【００４１】
（サリチル酸製造のためのキット）
上述の通り、大腸菌において、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを外来的に発現させることにより、サリチル酸を生産性高く製造することができる。したがって、本発明は、これら酵素を大腸菌において外来的に発現させるために有用な、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかに記載のベクターを含む、サリチル酸の製造に用いるためのキット
（ｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのカルボキシ末端にイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼが結合した融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター
（ｉｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチドと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含むベクター
（ｉｉｉ）大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含むベクターとの組み合わせ。
【００４２】
本発明において、「ベクター」とは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えば、プラスミドを基本に構築することができる。また、かかるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
【００４３】
本発明のベクターは、これを大腸菌に導入して大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦ及びイソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを発現させるために、これら酵素をコードするポリヌクレオチドの他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や形質転換された大腸菌を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが望ましい。
【００４４】
発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）等がこれに含まれる。また、前記発現を制御するＤＮＡ配列以外に発現を誘導するＤＮＡ配列を含んでいても良い。かかる発現を誘導するＤＮＡ配列としては、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により、下流に配置された遺伝子の発現を誘導することのできるラクトースオペロンが挙げられる。本発明における遺伝子マーカーは、形質転換された大腸菌の選択の方法に応じて適宜選択されてよいが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
【００４５】
また、大腸菌において、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼとを、各々別のタンパク質として発現させる場合には、（ｉｉｉ）に記載のベクターの組み合わせを用いる他、（ｉｉ）に記載のベクターを用いることもできる。（ｉｉ）に記載のベクターを用いる場合には、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするｍＲＮＡと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするｍＲＮＡとを、各々別の転写産物として発現させてもよく、またこれらｍＲＮＡを含む一の転写産物として発現させてもよい。
【００４６】
また、大腸菌において、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼとを、一の融合タンパク質として発現させる場合には、（ｉｉ）に記載のベクターを用いることもできる。この場合、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦをコードするポリヌクレオチドと、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼをコードするポリヌクレオチドとは、それらの読み枠がずれることなく、一の転写産物として発現させることとなる。また、上述の通り、かかる転写産物がコードする融合タンパク質は、イソコリスミ酸ピルビン酸リアーゼを、大腸菌由来のイソコリスミ酸シンテース  ＭｅｎＦのアミノ末端、カルボキシ末端のいずれに融合させているものであってもよいが、カルボキシ末端に融合させているものが好ましい。言い換えれば、（ｉ）に記載のベクターは（ｉｉ）に記載のベクターのより好適な態様である。
【００４７】
また、上述の通り、本発明のベクターがコードする前記酵素等には他の機能性タンパク質が融合していてもよい。さらに、前記酵素等の発現効率をより向上させるという観点から、当該酵素等を発現させる大腸菌に合わせて、コドンを最適化した前記酵素等をコードするポリヌクレオチドが、本発明のベクターには挿入されていてもよい。
【００４８】
さらに、本発明のベクターにおいては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。また、本発明のキットにおいては、本発明のベクターは、後述の当該ベクターが導入され、形質転換された大腸菌の態様にて含まれていてもよい。さらに、本発明のベクターの他、該ベクターを導入するための大腸菌、該大腸菌を培養するための培地、及びそれらの使用説明書等が、本発明のキットには含まれていてもよい。かかる使用説明書は、本発明のベクターや後述の形質転換された大腸菌等を本発明の方法に利用するための説明書である。説明書は、例えば、本発明の方法の実験手法や実験条件、及び本発明のベクター等に関する情報（例えば、ベクターのヌクレオチド配列等が示されているベクターマップ等の情報、大腸菌の由来、性質、当該大腸菌の培養条件等の情報）を含むことができる。
【００４９】
（サリチル酸製造のための大腸菌）
本発明によれば、前述の本発明のベクターが導入され、形質転換された大腸菌（形質転換体）も提供される。なお、本発明のベクターによる大腸菌の形質転換は、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。かかる慣用法としては、例えば、ヒートショック法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法が挙げられる。また、かかる形質転換体においては本発明のベクターが導入され、サリチル酸を生合成できるものであれば特に制限はないが、好ましくは対糖収率が２％以上であり、より好ましくは５％以上であり、さらに好ましくは１０％以上である。なお、本発明における「対糖収率」とは、炭素源としてグルコース１ｇに対し、サリチル酸１ｇが製造された場合を１００％とした際の数値を意味する。
【００５０】
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明においては、ＭｅｎＦ等を外来的に発現させる細胞として、大腸菌を用いる上記実施形態の他、大腸菌以外の他の細胞を用いることもできる。これらタンパク質を外来的に発現させる細胞としては特に制限はないが、好ましくは、コリスミ酸を生産することが可能な微生物である。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５２】
本発明者らは、大腸菌においてサリチル酸を高い生産性にて製造することができる方法を開発すべく、先ず、様々な種を対象として、大腸菌におけるサリチル酸の生合成に好適なイソコリスミ酸シンテース（ＩＣＳ）のスクリーニングを行った。すなわち、大腸菌において各種由来のＩＣＳと緑膿菌由来のＩＰＬ（ＰｃｈＢ）とを外来的に共発現させ、炭素源としてグルコースを含む培養液において該大腸菌を培養し、当該培養液中に分泌されるサリチル酸の量を測定した。以下にその方法を示す。
【００５３】
なお、サリチル酸生産のための宿主として、フェニルアラニン生産性大腸菌株であるＡＴＣＣ３１８８２株を用いた。また、ＩＣＳとしては、大腸菌由来のＩＣＳであるＭｅｎＦ及びＥｎｔＣ、緑膿菌（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｏｇｉｎｏｓａ）由来のＩＣＳであるＰｃｈＡ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＩＣＳであるＡｔＩＣＳ、並びにブラキポディウム（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）由来のＩＣＳであるＢｒＩＣＳを、本スクリーニングの対象として用いた。
【００５４】
また、今回用いたＭｅｎＦ、ＥｎｔＣ、ＰｃｈＡ、ＡｔＩＣＳ及びＢｒＩＣをコードする各ポリヌクレオチドの配列を、配列番号：１、６、８、１０及び１２に各々示し、また各ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を、配列番号：２、７、９、１１及び１３に各々示す。
【００５５】
＜ベクターの構築＞
１のベクターにてＩＣＳ及びＩＰＬを大腸菌にて発現させることができるよう、ｐＺＥ１２ＭＣＳ（ＥＸＰＲＥＳＳＹＳ社製）に、各ＩＣＳをコードするＤＮＡとＩＰＬをコードするＤＮＡとを、それぞれリボソームバインディングサイト（ＲＢＳ）を挟んでタンデムになるよう挿入した。なお、該ベクターにおいて、５’側にＩＣＳが、３’側にＩＰＬが配置されている。
【００５６】
より具体的には、先ず、ＰＣＲ法を用いて各細菌等の染色体上よりＩＣＳ遺伝子フラグメントを増幅した後、大腸菌遺伝子発現用ベクターｐＺＥ１２のＫｐｎＩサイトにインフュージョン法を用いて導入し、ｐＺＥ１２−ＩＣＳを構築した。さらに、大腸菌用にコドンを最適化したＩＰＬ遺伝子（配列番号：５に記載のヌクレオチド配列からなる遺伝子）を設計して化学合成し、それを鋳型としてＰＣＲ法によりＩＰＬフラグメントの増幅を行った。そして、増幅した断片をｐＺＥ１２−ＭｅｎＦのＨｉｎｄＩＩＩサイトにインフュージョン法を用いて導入し、ＩＣＳ及びＩＰＬを大腸菌にて発現させるためのベクターを構築した。
【００５７】
また、このようにして調製したベクターを、発現させる各ＩＣＳの名称に合わせて、ｐＺＥ１２−ＭｅｎＦ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＥｎｔＣ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＰｃｈＡ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＡｔＩＣＳ−ＩＰＬ及びｐＺＥ１２−ＢｒＩＣＳ−ＩＰＬと各々名付けた。
【００５８】
さらに、ＭｅｎＦに関しては、ＩＰＬと融合して大腸菌にて発現させることができるよう、融合型タンパク質発現用ベクターも構築した。すなわち、ＭｅｎＦとＩＰＬとの間をＧＳリンカー（Ｎ末−ＧＧＧＳＧＧＧＳ−Ｃ末、配列番号：１４）にて融合したタンパク質をコードするＤＮＡをＰＣＲ法により調製し、ｐＺＥ１２ＭＣＳのＫｐｎＩサイトにインフュージョンを用いて挿入することにより、当該ベクターを構築した。
【００５９】
なお、このようにして、ＭｅｎＦがＮ末に配置された融合タンパク質を発現するベクター、及び、ＭｅｎＦがＣ末に配置された融合タンパク質を発現するベクターを調製し、ｐＺＥ１２−ＭｅｎＦ−ｆ−ＩＰＬ及びｐＺＥ１２−ＩＰＬ−ｆ−ＭｅｎＦと名付けた。
【００６０】
＜大腸菌の形質転換＞
以上の通りにして調製した各プラスミドを、エレクトロポレーション法により大腸菌ＡＴＣＣ３１８８２株に導入した。形質転換体の選抜にはアンピシリンを用いて行った。ｐＺＥ１２−ＭｅｎＦ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＥｎｔＣ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＰｃｈＡ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＡｔＩＣＳ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＢｒＩＣＳ−ＩＰＬ、ｐＺＥ１２−ＭｅｎＦ−ｆ−ＩＰＬ及びｐＺＥ１２−ＩＰＬ−ｆ−ＭｅｎＦを各々導入して取得した形質転換体を、３１８８２／ＭｅｎＦ−ＩＰＬ、３１８８２／ＥｎｔＣ−ＩＰＬ、３１８８２／ＰｃｈＡ−ＩＰＬ、３１８８２／ＡｔＩＣＳ−ＩＰＬ、３１８８２／ＢｒＩＣＳ−ＩＰＬ、３１８８２／ＭｅｎＦ−ｆ−ＩＰＬ及び３１８８２／ＩＰＬ−ｆ−ＭｅｎＦと各々名付けた。
【００６１】
＜形質転換体の培養＞
以上の通りにして取得した各形質転換体を、先ずは５ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、一晩培養（前培養）した。次いで、該培養液を、炭素源として２質量％（２０ｇ／Ｌ）のグルコースを含むＬＢ培地５ｍＬに、初期ＯＤ６００が０．０５となるように植菌し、ＯＤ６００が０．５となるまで培養した後、終濃度が１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。そして、培養開始から２４、４８及び７２時間後のサンプルを採取した。なお、形質転換体の前記培養は、３７℃にて振盪速度を１８０ｒｐｍにして行った。また、形質転換体の増殖は、該形質転換体の培養液における吸光波長ＯＤ６００を分光光度計（株式会社島津製作所製）にて測定することにより分析した。
【００６２】
＜分析方法＞
前記７２時間培養後の培養液中のサリチル酸（形質転換体が生産し、培養液中に分泌されたサリチル酸の量）を、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣＭＳ）を用いて定量的に測定した。該定量的測定に際しては、内部標準物質としてピメリン酸を用い、先ず、培養液５μＬと１ｍＭピメリン酸溶液１０μＬとを遠心乾固した後、ＴＭＳ化を行った。そして、誘導化後のサンプルを、ガスクロマトグラフ質量分析計（製品名：ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０  Ｕｌｔｒａ、株式会社島津製作所製）により分析することにより、サリチル酸の量を測定した。また、形質転換体の培養液におけるグルコースの減少量はグルコース測定キット（製品名：テストＷａｋｏ、和光純薬工業株式会社製）を用いて定量した。
【００６３】
以上の方法に基づき各形質転換体におけるサリチル酸生産性の評価を行った結果、３１８８２／ＰｃｈＡ−ＩＰＬ、３１８８２／ＡｔＩＣＳ−ＩＰＬ、３１８８２／ＢｒＩＣＳ−ＩＰＬの３株については、サリチル酸の生産がほとんど認められなかった。一方、３１８８２／ＥｎｔＣ−ＩＰＬにおけるサリチル酸の生産量は約０．２ｇ／Ｌであり、３１８８２／ＭｅｎＦ−ＩＰＬにおけるサリチル酸の生産量は、約０．４ｇ／Ｌであった。
【００６４】
このように、大腸菌におけるサリチル酸生産において、ＭｅｎＦが極めて有用であることが見出された。特に、非特許文献３において、その有用性が確認されているＥｎｔＣに比べ、サリチル酸生産性において約２倍優れていることが明らかになった。
【００６５】
さらに、ＩＰＬとＩＣＳとを融合タンパク質にて発現させる形質転換体を用いた場合には、３１８８２／ＭｅｎＦ−ｆ−ＩＰＬにおいて、サリチル酸の生産量は、約２．１ｇ／Ｌにまで達した。このように、ＩＣＳのカルボキシ末側にＩＰＬを融合させて発現させることにより、これら酵素を共発現させた場合と比較して、サリチル酸生産性が５倍以上も向上することが明らかになった、なお、３１８８２／ＩＰＬ−ｆ−ＭｅｎＦにおいて、サリチル酸の生産量は４０〜５０ｍｇ／Ｌ程度であった。
【００６６】
また、３１８８２／ＭｅｎＦ−ｆ−ＩＰＬの培養におけるグルコース消費量は、１７ｇ／Ｌであったことから、ＩＰＬとＩＣＳとを融合タンパク質にて発現させる形質転換体を用いた場合には、対糖収率：１２．４％という、極めて高い生産性にてサリチル酸を生産することができることも明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上説明したように、本発明によれば、大腸菌においてサリチル酸を高い生産性にて製造することが可能となる。そして、かかる高い生産性に基づけば、大腸菌におけるサリチル酸の生合成系を工業的に利用することも可能となる。ひいては、現状のサリチル酸工業生産の原料である石油資源を、非化石原料であるグルコース等（例えば、植物原料）に転換することができ、サリチル酸生産における石油枯渇や環境負荷に関する現状の問題を解消することも可能となる。したがって、本発明は、サリチル酸の製造において極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００６８】
配列番号：５ 
＜２２３＞  大腸菌における発現のためコドンが最適化された配列
配列番号：１４
＜２２３＞  ＧＳリンカーの配列
【配列表】
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