(57)【要約】      （修正有）【課題】より大きな収量、昆虫または病害虫に対する抵抗性、環境ストレスに対する耐性、より高い農学的品質、より高い栄養価、成長率、及び果実特性を含む、栽培者及び／または消費者が有益であると考える任意の形質を有する、ホウレンソウ雑種の種子ならびに植物の提供。【解決手段】ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ及びそれらの親系統の植物、種子、ならびに組織培養物と、そのような植物自体、または別の遺伝子型の植物などの別のホウレンソウ植物と交配することによって作出されるホウレンソウ植物の作出方法、並びに、そのような交配によって作出される種子及び植物。更には、そのような植物の葉及び配偶子を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆまたはホウレンソウ系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの少なくとも第１の組の染色体を含むホウレンソウ植物であって、前記系統の種子の試料が、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４４及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４３の下で寄託されている、前記ホウレンソウ植物。
【請求項２】
ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆまたはホウレンソウ系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの少なくとも第１の組の染色体を含む種子であって、前記系統の種子の試料が、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４４及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４３の下で寄託されている、前記種子。
【請求項３】
近交系である、請求項１に記載の前記植物。
【請求項４】
雑種である、請求項１に記載の前記植物。
【請求項５】
近交系である、請求項２に記載の前記種子。
【請求項６】
雑種である、請求項２に記載の前記種子。
【請求項７】
前記雑種植物がホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡであり、前記雑種ＳＶ３６５３ＶＡの種子の試料が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４５の下で寄託されている、請求項４に記載の前記植物。
【請求項８】
ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡの種子として定義され、前記雑種ＳＶ３６５３ＶＡの種子の試料が、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４５の下で寄託されている、請求項６に記載の前記種子。
【請求項９】
系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆまたは系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの種子として定義される、請求項２に記載の前記種子。
【請求項１０】
請求項１に記載の前記植物の植物部分。
【請求項１１】
葉、胚珠、花粉、果実、または細胞としてさらに定義される、請求項１０に記載の前記植物部分。
【請求項１２】
請求項７に記載の前記ホウレンソウ植物の生理学的及び形態的特性をすべて有するホウレンソウ植物。
【請求項１３】
請求項１に記載の前記植物の再生可能な細胞の組織培養物。
【請求項１４】
胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、根端、雌蘂、花、種子、及び茎からなる群より選択される植物部分からの細胞またはプロトプラストを含む、請求項１３に記載の前記組織培養物。
【請求項１５】
請求項１３に記載の前記組織培養物から再生されるホウレンソウ植物。
【請求項１６】
請求項１に記載の前記植物の栄養繁殖方法であって、
（ａ）請求項１に記載の植物から繁殖されることが可能な組織を採取するステップと、
（ｂ）前記組織を培養して、増殖した新芽を取得するステップと、
（ｃ）前記増殖した新芽を発根させて、発根した小植物体を取得するステップと、を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記発根した小植物体から少なくとも第１の植物を生育させることをさらに含む、請求項１６に記載の前記方法。
【請求項１８】
ホウレンソウ系統内への所望の形質の導入方法であって、
（ａ）系統ＯＥＢ−６６−１１５０ＦまたはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物を、Ｆ１子孫を作出するための所望の形質を含む第２のホウレンソウ植物と交配することであって、前記系統の種子の試料が、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４４及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４３の下で寄託されている、交配することと、
（ｂ）前記所望の形質を含むＦ１子孫を選択することと、
（ｃ）前記選択されたＦ１子孫を系統ＯＥＢ−６６−１１５０ＦまたはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物と戻し交配して、戻し交配子孫を作出することと、
（ｄ）前記所望の形質、及びホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０ＦまたはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの生理学的及び形態的特性を含む、戻し交配子孫を選択することと、
（ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）を３回以上繰り返して、前記所望の形質を含む選択された第４代以降の戻し交配子孫を作出することと、を含む、前記方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の前記方法によって作出されるホウレンソウ植物。
【請求項２０】
追加された形質を含む植物の作出方法であって、前記方法は、前記形質を雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物に付与する導入遺伝子を導入することを含み、前記雑種及び系統の種子の試料が、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４５、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４４、及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４３の下で寄託されている、前記方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の前記方法によって作出される植物。
【請求項２２】
導入遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の前記植物。
【請求項２３】
前記導入遺伝子が、雄性不稔性、除草剤耐性、耐虫性、病虫害抵抗性、病害抵抗性、改変された脂肪酸代謝、環境ストレス耐性、改変された炭水化物代謝、及び改変されたタンパク質代謝からなる群より選択される形質を付与する、請求項２２に記載の前記植物。
【請求項２４】
単一遺伝子座変換を含む、請求項１に記載の前記植物。
【請求項２５】
前記単一遺伝子座変換が、雄性不稔性、除草剤耐性、耐虫性、病虫害抵抗性、病害抵抗性、改変された脂肪酸代謝、環境ストレス耐性、改変された炭水化物代謝、及び改変されたタンパク質代謝からなる群より選択される形質を付与する、請求項２４に記載の前記植物。
【請求項２６】
雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍのうちの少なくとも１つに由来する植物の種子の作出方法であって、
（ａ）雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍのホウレンソウ植物を、それ自体または第２のホウレンソウ植物と交配するステップであって、前記雑種及び系統の種子の試料が、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４５、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４４、及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４３の下で寄託されている、交配するステップと、
（ｂ）雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来のホウレンソウ植物の種子を形成させるステップと、を含む、前記方法。
【請求項２７】
（ｃ）前記雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、またはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来のホウレンソウ種子から生育させた植物を自殖させて、追加の雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来のホウレンソウ種子を得るステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記追加の雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来のホウレンソウ種子を生育させて、追加の雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来のホウレンソウ植物を得るステップと、
（ｅ）（ｃ）及び（ｄ）の前記交配及び生育ステップを繰り返して、少なくとも第１のさらなる雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来のホウレンソウ植物を生成するステップと、をさらに含む、請求項２６に記載の前記方法。
【請求項２８】
前記第２のホウレンソウ植物が近交ホウレンソウ系統のものである、請求項２６に記載の前記方法。
【請求項２９】
系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆを系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍと交配することを含み、前記系統の種子の試料が、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４４、及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４３の下で寄託されている、請求項２６に記載の前記方法。
【請求項３０】
（ｆ）前記さらなる雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、またはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来のホウレンソウ植物を、第２のホウレンソウ植物と交配して、雑種子孫植物の種子を作出すること、をさらに含む、請求項２７に記載の前記方法。
【請求項３１】
請求項７に記載の前記植物の植物部分。
【請求項３２】
葉、花、果実、胚珠、花粉、または細胞としてさらに定義される、請求項３１に記載の前記植物部分。
【請求項３３】
請求項１に記載の前記植物を、それ自体または第２のホウレンソウ植物と交配して、種子を形成させることを含む、ホウレンソウ種子の作出方法。
【請求項３４】
ホウレンソウの作出方法であって、
（ａ）請求項１に記載の植物であって、成熟まで栽培されている植物を取得することと、
（ｂ）前記植物からホウレンソウを採取することと、を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物育種の分野、より具体的には、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに親ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
野菜育種の目的は、単一の品種／雑種内の様々な望ましい形質を組み合わせることである。そのような望ましい形質は、より大きな収量、昆虫または病害虫に対する抵抗性、環境ストレスに対する耐性、より高い農学的品質、より高い栄養価、成長率、及び果実特性を含む、栽培者及び／または消費者が有益であると考える任意の形質を含み得る。
【０００３】
育種技術は、植物の受粉方法を利用する。一般的な受粉方法は２種類ある：植物は、１つの花からの花粉が同じ植物もしくは植物品種の同じ花または別の花に伝達される場合、自家受粉する。植物は、花粉が異なる植物品種の花からやって来る場合、異花受粉する。
【０００４】
何世代にもわたって、自家受粉し、かつ種類を選択されている植物は、ほぼすべての遺伝子座でホモ接合となり、純種の育種子孫であるホモ接合植物の均一な集団を作出する。異なる遺伝子型の２種類のそのようなホモ接合植物間の交配は、多くの遺伝子座でヘテロ接合である雑種植物の均一な集団を作出する。反対に、各々が多数の遺伝子座でへテロ接合である２種類の植物の交配は、遺伝的に異なり、かつ均一でない雑種植物の集団を作出する。結果として生じる不均一性が、性能を予測不可能にする。
【０００５】
均一な品種の開発は、ホモ接合近交植物の開発、これらの近交植物の交配、及び交配種の評価を必要とする。系統育種及び循環選抜は、育種集団から近交植物を開発するために使用されている育種方法の例である。それらの育種方法は、２種類以上の植物または様々な他の広範の起源からの遺伝子的背景を育種プールに併合し、そこから、それに由来する新しい系統及び雑種が、自殖及び所望の表現型の選択によって開発される。この新しい系統及び雑種を評価して、それらのうちのどれが商業的可能性を有するかを決定する。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
一態様において、本発明は、雑種指定ＳＶ３６５３ＶＡ、ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、またはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍのホウレンソウ植物を提供する。さらに、そのような植物のすべての生理学的及び形態的特性を有するホウレンソウ植物も提供する。これらのホウレンソウ植物の部分、例えば、該植物の花粉、胚珠、接ぎ穂、根茎、果実、及び細胞なども含めて提供する。
【０００７】
本発明の別の態様において、追加された遺伝性形質を含むホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物が提供される。遺伝性形質は、例えば、優性または劣勢対立遺伝子である、遺伝子座を含み得る。本発明の一実施形態において、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物は、単一遺伝子座変換を含むと定義される。本発明の特定の実施形態において、追加された遺伝子座は、例えば、除草剤耐性、耐虫性、病害抵抗性、及び改変された炭水化物代謝などの、１つ以上の形質を付与する。さらなる実施形態において、形質は、戻し交配によってある系統のゲノム内に導入される天然に存在する遺伝子、自然もしくは誘発突然変異、または遺伝形質転換技術を介して植物もしくはその任意の前の世代の先祖に導入される導入遺伝子によって付与され得る。形質転換を介して導入されるとき、遺伝子座は、単一の染色体位置に組み込まれた１つ以上の遺伝子を含み得る。
【０００８】
本発明はまた、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの種子に関する。本発明のホウレンソウ種子は、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍのホウレンソウ種子の本質的に均質な集団として提供され得る。種子の本質的に均質な集団は、一般的に、多数の他の種子を含まない。そのため、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの種子は、種子の少なくとも約９８％、９９％以上などを含む、全種子の少なくとも約９７％で形成すると定義され得る。種子集団を別々に生育させ、ホウレンソウ植物指定ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの本質的に均質な集団を提供してもよい。
【０００９】
本発明のさらに別の態様において、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍのホウレンソウ植物の再生可能な細胞の組織培養物が提供される。組織培養物は、好ましくは、出発植物の生理学的及び形態的特性のすべてを発現する能力のあるホウレンソウ植物を再生する能力があり、かつ出発植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生する能力があるものである。雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの生理学的及び形態的特性のいくつかの例としては、本明細書内の表に示される形質が挙げられる。そのような組織培養物内の再生可能な細胞は、例えば、胚、分裂組織、子葉、花粉、葉、葯、根、根端、雌蘂、花、種子、及び茎に由来し得る。依然としてさらに、本発明は、本発明の組織培養物から再生されるホウレンソウ植物を提供し、該植物は、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍのすべての生理学的及び形態的特性を有する。
【００１０】
本発明の依然としてさらに別の態様において、ホウレンソウ種子、植物、及び果実を作出するためのプロセスが提供され、そのプロセスは、一般的に、第１の親ホウレンソウ植物を第２の親ホウレンソウ植物と交配することを含み、第１及び第２の親ホウレンソウ植物のうちの少なくとも１つは、ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０ＦまたはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物である。これらのプロセスは、第１のホウレンソウ植物を異なる別個の遺伝子型の第２のホウレンソウ植物と交配して、その親の一方としてホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０ＦまたはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物を有する雑種を提供する、雑種ホウレンソウ種子または植物を作出するためのプロセスとしてさらに例示され得る。これらのプロセスにおいて、交配により種子の作出がもたらされる。種子作出は、種子が採取されるか否かにかかわらず発生する。
【００１１】
本発明の一実施形態において、「交配」の第１のステップは、受粉が、例えば、媒介昆虫によって仲介されて起こるように、第１及び第２の親ホウレンソウ植物の種子を、多くの場合、近接して蒔くことを含む。代替的に、花粉を手作業で伝達してもよい。植物が自家受粉される場合、受粉は、植物栽培以外は直接的な人間の介入の必要なく起こり得る。
【００１２】
第２のステップは、第１及び第２の親ホウレンソウ植物を、花をつける植物にまで栽培する、または生育させることを含み得る。第３のステップは、花を除雄化すること（すなわち、花粉を死滅させるか、または除去すること）によってなど、植物の自家受粉を妨げることを含み得る。
【００１３】
雑種交配のための第４のステップは、第１及び第２の親ホウレンソウ植物間の異花受粉を含み得る。さらに別のステップは、親ホウレンソウ植物のうちの少なくとも一方から種子を収穫することを含む。収穫された種子を生育させて、ホウレンソウ植物または雑種ホウレンソウ植物を作出することができる。
【００１４】
本発明はまた、第１または第２の親ホウレンソウ植物のうちの少なくとも１つが、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物である、第１の親ホウレンソウ植物を第２の親ホウレンソウ植物と交配することを含むプロセスによって作出されるホウレンソウ種子及び植物も提供する。本発明の一実施形態において、本プロセスによって作出されるホウレンソウ種子及び植物は、別の別個の植物を用いて発明に従って植物を交配することによって作出される第一世代（Ｆ１）雑種ホウレンソウ種子及び植物である。本発明は、そのようなＦ１雑種ホウレンソウ植物の植物部分、及びそれらの使用方法をさらに企図する。したがって、本発明のある特定の例示的な実施形態は、Ｆ１雑種ホウレンソウ植物及びその種子を提供する。
【００１５】
依然としてさらに別の態様において、本発明は、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍに由来する植物の作出方法を提供し、該方法は、（ａ）雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍに由来する子孫植物を調製するステップであって、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物を第２の植物と交配することを含む、調製するステップと、（ｂ）子孫植物をそれ自体または第２の植物と交配して、後続世代の子孫植物の種子を作出するステップと、を含む。さらなる実施形態において、該方法は、（ｃ）後続世代の子孫植物の該種子から後続世代の子孫植物を生育させて、後続世代の子孫植物をそれ自体または第２の植物と交配すること、及び該ステップをさらに３〜１０世代繰り返して、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍに由来する植物を作出することをさらに含み得る。雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍに由来する植物は、近交系統であり得、前述の繰り返される交配ステップは、近交系統を作出するのに十分な同系交配を含むと定義され得る。該方法において、ステップ（ｂ）及び（ｃ）に従う継続した交配のために、ステップ（ｃ）から生じる特定の植物を選択することが望ましい場合がある。１つ以上の望ましい形質を有する植物を選択することによって、系統／雑種の望ましい形質のいくつか、ならびに潜在的に他の選択された形質を所有する、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍに由来する植物が取得される。
【００１６】
ある特定の実施形態において、本発明は、（ａ）ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物あって、成熟まで栽培されている植物を取得することと、（ｂ）該植物から少なくとも１つのホウレンソウを採取することと、を含む、食物または飼料の作出方法を提供する。
【００１７】
本発明の依然としてさらに別の態様において、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの遺伝的相補体が提供される。「遺伝的相補体」という語句は、ヌクレオチド配列の集合体を指すために使用され、その配列の発現が、本発明の場合はホウレンソウ植物、またはその植物の細胞もしくは組織、の表現型を定義する。そのため、遺伝的相補体は、細胞、組織、または植物の遺伝子構造を表し、雑種遺伝的相補体は、雑種細胞、組織、または植物の遺伝子構造を表す。そのため、本発明は、本明細書に開示されるホウレンソウ植物細胞に従う遺伝的相補体を有するホウレンソウ植物細胞、ならびにそのような細胞を含む種子及び植物を提供する。
【００１８】
植物遺伝的相補体は、遺伝子マーカープロファイルによって、及び遺伝的相補体、例えば、アイソザイムタイピングプロファイル、の発現を特徴とする表現型形質の発現によって、評価され得る。雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍは、多くの周知の技術、例えば、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１  ８：６５３１−６５３５，１９９０）、ランダム増幅多型ＤＮＡ法（ＲＡＰＤ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、配列特性化増幅領域（ＳＣＡＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる、ＥＰ５３４  ８５８）、及び一塩基多型（ＳＮＰ）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１０７７−１０８２，１９９８）などのうちのいずれかによって識別され得ることが理解されよう。
【００１９】
依然としてさらに別の態様において、本発明は、本発明のホウレンソウ植物の半数体遺伝的相補体と、第２のホウレンソウ植物、好ましくは別の別個のホウレンソウ植物、の半数体遺伝的相補体との組み合わせによって形成される、ホウレンソウ植物細胞、組織、植物、及び種子によって表されるような、雑種遺伝的相補体を提供する。別の態様において、本発明は、本発明の雑種遺伝的相補体を含む組織培養物から再生されるホウレンソウ植物を提供する。
【００２０】
本発明の一態様に関して本明細書において論じられる任意の実施形態は、特に記載のない限り、本発明の他の態様にも同様に適用される。
【００２１】
「約」という用語は、値を決定するために用いられている装置または方法において、該値が平均の標準偏差を含むことを示すために使用される。特許請求の範囲における「または（ｏｒ）」という用語の使用は、代替案のみを指すことが明示されるか、または代替案が相互排他的であるかでない限り、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するために使用される。特許請求の範囲において、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉、または他の非制限的言語と一緒に使用されるとき、「１つ（ａ）」及び「１つ（ａｎ）」は、別途特に記載のない限り、「１つ以上」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語は、無制限連結動詞である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの、これらの動詞の１つ以上の任意の形態及び時制もまた、無制限である。例えば、１つ以上のステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の方法は、それらの１つ以上のステップのみを所有することに制限されず、他の記載されていないステップも包含する。同様に、１つ以上の形質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」、または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」任意の植物は、それらの１つ以上の形質のみを所有することに制限されず、他の記載されていない形質も包含する。
【００２２】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるものとする。しかしながら、当業者には、この詳細な説明から本発明の趣旨及び範囲内で様々な変更及び修正が明らかとなるため、提供される詳細な説明及び任意の具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示しているが、例示としてのみ提供されることが理解されよう。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、またはＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの植物、種子、及び派生物に関する方法及び組成物を提供する。
【００２４】
０９−Ｓ０−ＯＲＮ−３６５３としても知られる、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ  Ｌ．）雑種ＳＶ３６５３ＶＡは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅレースＰｆｓ１〜Ｐｆｓ１１、１３、及び１５に対する抵抗性を示す。
【００２５】
親系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅレースＰｆｓ１〜１０、及び１５に対する抵抗性を示す。親系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆは、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅレースＰｆｓ１〜１１、１３及び１５に対する抵抗性を示す。
【００２６】
該系統の開発を以下のように要約することができる。
【００２７】
Ａ．ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡの起源及び育種の歴史
雑種ＳＶ３６５３ＶＡは、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆを系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍと交配することによって開発された。親系統は均一かつ安定しており、それから作出される雑種も同様である。わずかな割合の変異形は、繰り返される繁殖の経過中、ほとんどの特性において商業的に許容できる制限内で起こり得る。しかしながら、変異形はないと見込まれる。
【００２８】
Ｂ．ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびにホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの生理学的及び形態的特性
本発明の一態様に従って、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ及びその親系統の生理学的及び形態的特性を有する植物が提供される。そのような植物の生理学的及び形態的特性の説明を、表１〜３に提示する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【００２９】
Ｃ．ホウレンソウ植物の育種
本発明の一態様は、ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍを交配することを伴う、ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡの種子の作出方法に関する。代替的に、本発明の他の実施形態において、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ、または系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍを、それ自体もしくは任意の第２の植物と交配してもよい。そのような方法を、雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／もしくはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの繁殖のために使用することができるか、または雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／もしくはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍに由来する植物を作出するために使用することができる。雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍ由来の植物を、ある特定の実施形態において、新たなホウレンソウ品種の開発のために使用してもよい。
【００３０】
１種類以上の出発品種を使用した新たな品種の開発は、当該技術分野において周知である。本発明に従って、新規品種は、雑種ＳＶ３６５３ＶＡを交配した後、そのような周知の方法に従う複数世代の育種を行うことによって創出してもよい。新たな品種を、任意の第２の植物と交配することによって創出してもよい。新規系統の開発の目的で交配するためのそのような第２の植物を選択することにおいては、それら自体が１つ以上の選択された望ましい特性を示す植物、または雑種併合にあるときに所望の特性（複数可）を示す植物のいずれかを選択することが望ましい場合がある。初期交配を行ったら、同系交配及び選択を行って新たな品種を作出する。均一な系統の開発には、多くの場合、５世代以上の自殖及び選択が伴う。
【００３１】
新たな品種の均一な系統はまた、倍加半数体を介しても開発され得る。この技術は、複数世代の自殖及び選択を必要とせずに純種の育種系統の創出を可能にする。この様式では、純種の育種系統をわずか一世代で作出することができる。半数体胚は、小胞子、花粉、葯培養物、または子房培養物から作出され得る。次いで、半数体胚は、自律的に、または化学的処理（例えば、コルヒチン処理）によって、倍加され得る。代替的に、半数体胚を半数体植物に生育させ、染色体倍加を誘発するように処理してもよい。いずれの場合においても、繁殖力のあるホモ接合植物が取得される。本発明に従って、そのような技術のうちのいずれかを本発明の植物及びその子孫とともに使用して、ホモ接合系統を達成し得る。
【００３２】
戻し交配を使用して近交植物を改良することもできる。戻し交配は、ある特定の望ましい形質を、１つの近交系または非近交系源からその形質を持たない近交系に伝達する。これは、例えば、まず、優位の近交系（Ａ）（反復親）を、当該形質のための適切な遺伝子座（１つまたは複数）を保有するドナー近交系（非反復親）に交配することによって達成することができる。次いで、この交配の子孫を優位の反復親（Ａ）に戻って掛け合わせた後、結果として生じる子孫において非反復親から伝達される望ましい形質の選択を行う。望ましい形質の選択を伴う５世代以上の戻し交配後、子孫は伝達されている特性を有するが、大半またはほぼすべての他の遺伝子座は優位の親と同様である。最後の戻し交配世代を自殖させ、伝達されている形質について純種の育種子孫を得る。
【００３３】
本発明の植物は、植物の遺伝子的背景の優良な性質に基づく新たな系統の開発に特に良く適している。新規ホウレンソウ系統を開発する目的で、ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに／またはホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍと交配するための第２の植物の選択において、典型的には、それ自体が１つ以上の選択された望ましい特性を示す植物、または雑種併合にあるときに所望の特性（複数可）を示す植物のいずれかを選択することが好ましい。望ましい形質の例としては、特定の実施形態において、高い種子収量、高い種子発芽、苗生長力、高い果実収量、病害耐性または抵抗性、ならびに土壌及び気候条件に対する適応性が挙げられ得る。果実の形状、色、食感、及び味などの消費者主導の形質は、本発明によって開発されるホウレンソウ植物の新たな系統に組み入れられ得る形質の他の例である。
【００３４】
Ｄ．性能特性
上記のように、雑種ＳＶ３６５３ＶＡは、ホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍによって付与されるような望ましい形質を示す。雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびにホウレンソウ系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの性能特性は、他の品種と比較した性能形質の客観的分析の対象であった。分析の結果を以下に提示する。
【００３５】
雑種ＳＶ３６５３ＶＡは、べと病（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）レースＰｆｓ１〜Ｐｆｓ１１、１３、及び１５）に対する抵抗性のあるとげ無し種子を有する中早抽だい東洋雑種として特徴付けることができる。さらに、該雑種は、極濃及び極直立の平たい葉の組み合わせによってすべての周知の材料とは表現型的に性質が異なる。ＳＶ３６５３ＶＡに最も酷似していると見られる雑種は、モンサント品種Ｑｕｉｎｔｏである。２種の雑種を主に区別する比較特性は、抵抗性、成熟期、及び葉色を含むが、これらに限定され得ない。対象品種ＳＶ３６５３ＶＡは、Ｑｕｉｎｔｏと比較して、異なる抵抗性パターン、より濃い葉、及びより遅い成熟期を有する。
【００３６】
親系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆは、べと病（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）レースＰｆｓ１〜１１、１３及び１５）に対する抵抗性のある丸い種子を有する中早抽だい系統として特徴付けることができる。さらに、該系統は、雌雄発現、葉形状、及び葉習性の組み合わせによってすべての周知の材料とは表現型的に性質が異なる。ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆに最も酷似していると見られる親系統は、モンサント雑種Ｗａｌｌｉｓである。２種の系統を主に区別する比較特性は、開花、葉形状、及び葉習性を含むが、これらに限定され得ない。対象系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆは雌雄同株であり、雌株開花は、Ｗａｌｌｉｓと比較して、典型的には、東洋／剣先葉、及び直立葉習性を有する。
【００３７】
親系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍは、べと病（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）レースＰｆｓ１〜１０、及び１５）に対する抵抗性がありとげ有種子を有する早抽だい系統として特徴付けることができる。さらに、該系統は、抵抗性、成熟、植物習性（全盛市場段階での広がりｃｍ）の組み合わせによってすべての周知の材料とは表現型的に性質が異なる。ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍに最も酷似していると見られる親系統は、モンサント親系統ＯＥＢ６６−１０２６Ｄである。２種の系統を主に区別する比較特性は、抵抗性及び植物習性を含むが、これらに限定され得ない。対象系統ＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍは、Ｐｆｓ１〜１０、及び１５に対する抵抗性を示し、ＯＥＢ−６６−１０２６Ｄと比較して、成熟はより遅く、全盛市場段階でよりコンパクトな広がりを有する。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００３８】
Ｅ．本発明のさらなる実施形態
本発明のある特定の態様において、本明細書に記載される植物は、少なくとも第１の所望の遺伝性形質を含むように改変されて提供される。そのような植物は、一実施形態において、戻し交配技術を介して植物内に伝達される遺伝子座に加えて、品種の本質的にすべての形態的及び生理学的特性が復元される、戻し交配と称される植物育種技術によって開発され得る。単一遺伝子座変換植物という用語は、本明細書において使用される場合、戻し交配技術を介して植物に伝達される単一遺伝子座に加えて、品種の本質的にすべての形態的及び生理学的特性が復元される、戻し交配と称される植物育種技術によって開発されるホウレンソウ植物を指す。本質的にすべての形態的及び生理学的特性とは、戻し交配または導入遺伝子の直接導入中に生じ得る偶発的な変異形質以外の、同じ環境において比較したときに別途存在している植物の特性が復元されることを意味する。
【００３９】
本発明とともに戻し交配法を使用して、現品種を改良する、または現品種に特性を導入することができる。所望の特性のための遺伝子座に寄与する親ホウレンソウ植物は、非反復またはドナー親と称される。この用語は、非反復親は戻し交配プロトコルにおいて１回使用され、したがって繰り返されないことを指す。非反復親からの遺伝子座（１つまたは複数）が伝達される親ホウレンソウ植物は、戻し交配プロトコルにおいて数回使用されるため、反復親として知られる。
【００４０】
典型的な戻し交配プロトコルでは、目的の最初の品種（反復親）を、伝達される対象の単一遺伝子座を保有する第２の品種（非反復親）に交配させる。次いで、この交配から結果として生じる子孫を再び反復親と交配させ、非反復親からの単一伝達遺伝子座に加えて、単一反復親の本質的にすべての形態的及び生理学的特性が変換植物において復元されるホウレンソウ植物が取得されるまでこのプロセスを繰り返す。
【００４１】
好適な反復親の選択は、戻し交配手順の成功のために重要なステップである。戻し交配プロトコルの目的は、最初の品種における単一の形質または特性を変更または置換することである。これを達成するために、反復品種の単一遺伝子座は、改変されるか、または非反復親からの所望の遺伝子座で置換されるが、最初の品種の残りの所望の遺伝子構成、したがって所望の生理学的及び形態的構成の本質的にすべてが維持される。特定の非反復親の選択は、戻し交配の目的に依存することとなり、主な目的の１つは、いくつかの商業的に望ましい形質を植物に付加することである。厳密な戻し交配プロトコルは、変更されている特性または形質、及び反復親と非反復親との間の遺伝的距離に依存することとなる。戻し交配法は、伝達されている特性が優性対立遺伝子であるときに簡略化されるが、劣性対立遺伝子、または相加対立遺伝子（劣性と優性との間）も伝達され得る。この場合、所望の特性の伝達に成功したかどうかを判定するために子孫の試験を導入することが必要であり得る。
【００４２】
一実施形態において、本明細書に記載される植物が反復親である戻し交配の子孫ホウレンソウ植物は、同じ環境条件において生育させたときに有意レベル５％で判定される、（ｉ）非反復親からの所望の形質、及び（ｉｉ）ホウレンソウ反復親のすべての生理学的及び形態的特性を含む。
【００４３】
新たな品種はまた、２種類より多くの親から開発することもできる。改変された戻し交配として知られる技術は、戻し交配中に異なる反復親を使用する。改変された戻し交配を使用して、最初の反復親をある特定のより望ましい特性を有する品種と置き換えてもよく、または複数の親を使用して、それぞれから異なる望ましい特性を取得してもよい。
【００４４】
特定の形質と関連付けられた分子マーカーの開発によって、ここに提示されるような確立した胚種系統内に追加の形質を付加し、新たな形質（１つまたは複数）の付加で実質的に同じ基部生殖質を最終的にもたらすことが可能である。分子育種は、例えば、Ｍｏｏｓｅ  ａｎｄ  Ｍｕｍｍ，２００８（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１４７：９６９−９７７）、及び他の場所に記載されるように、単一もしくは複数の形質またはＱＴＬを優良系統に組み込むための機序を提供する。この分子育種で促進される、形質（１つまたは複数）の優良系統への移動は、隣接または関連マーカーアッセイを使用した、組み込まれたゲノム断片の識別の機序による、目的とする特定の形質と関連付けられた特定のゲノム断片の優良系統への組み入れを包含し得る。ここに提示される実施形態において、例えば、１、２、３、または４つのゲノム遺伝子座を、この方法論を介して優良系統に組み込んでもよい。追加の遺伝子座を含むこの優良系統を、別の親優良系統とさらに交配して、雑種の子を作出するとき、次いで少なくとも８つの別個の追加の遺伝子座を雑種に組み入れることが可能である。これらの追加の遺伝子座は、例えば、病害抵抗性としてのそのような形質または果実品質形質を付与し得る。一実施形態において、各遺伝子座は、別個の形質を付与し得る。別の実施形態において、遺伝子座は、雑種内に形質を付与するために、ホモ接合であり、かつ各親系統内に存在する必要があり得る。さらに別の実施形態において、複数の遺伝子座を組み合わせて、所望の形質の単一のロバストな表現型を付与してもよい。
【００４５】
新たな近交系の開発においては規則的に選択されないが、戻し交配技術によって改良することができる多くの単一遺伝子座形質が識別されている。単一遺伝子座形質は、遺伝子組換えであってもなくてもよく、これらの形質の例としては、除草剤抵抗性、細菌、真菌、もしくはウイルスに対する対抗性、耐虫性、改変された脂肪酸もしくは炭水化物代謝、及び変更された栄養質が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、一般的に細胞核から受け継ぐ遺伝子を含む。
【００４６】
直接選択は、単一遺伝子座が優性形質として働く場合に適用され得る。この選択プロセスでは、初期交配の子孫は、戻し交配前に、ウイルス抵抗性、及び／または対応する遺伝子の存在について分析される。選択は、所望の遺伝子及び抵抗性形質を有しないいかなる植物も除去し、該形質を有する植物のみがその後の戻し交配において使用される。次いで、このプロセスを、すべての追加の戻し交配世代で繰り返す。
【００４７】
育種のためのホウレンソウ植物の選択は、必ずしも植物の表現型に依存するわけではなく、代わりに遺伝子調査に基づくことができる。例えば、目的の形質に遺伝的に密接に関連している好適な遺伝子マーカーを利用することができる。これらのマーカーのうちの１つは、ある特定の交配の子における形質の有無を識別するために使用することができ、かつ継続した育種のための子孫の選択に使用することができる。この技術は、マーカー補助選択として一般に称される。植物における目的の形質の相対的な有無を識別することができる任意の他の種類の遺伝子マーカーまたは他のアッセイもまた、育種目的に有用であり得る。マーカー補助選択の手順は、当該技術分野において周知である。そのような方法は、劣性形質及び可変的な表現型の場合、または従来のアッセイがより高価、時間がかかる、または別の様式で不利であり得る場合に、特に有用である。本発明に従って使用され得る遺伝子マーカーの種類としては、単純配列長多型（ＳＳＬＰ）（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１  ８：６５３１−６５３５，１９９０）、ランダム増幅多型ＤＮＡ法（ＲＡＰＤ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、配列特性化増幅領域（ＳＣＡＲ）、任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）（参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれる、ＥＰ５３４  ８５８）、及び一塩基多型（ＳＮＰ）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８０：１０７７−１０８２，１９９８）が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【００４８】
Ｆ．遺伝子工学によって派生される植物
戻し交配によって、ならびに直接植物に導入することができる多くの有用な形質は、遺伝形質転換技術によって導入されるものである。したがって、遺伝形質転換は、選択された導入遺伝子を本発明の植物内に挿入するために使用され得るか、または、代替的に、戻し交配によって導入することができる導入遺伝子の調製のために使用され得る。当業者に周知であり、かつ多くの作物種に適用可能な植物の形質転換方法としては、電気穿孔、マイクロプロジェクタイル衝撃、アグロバクテリウム媒介形質転換、及びプロトプラストによる直接のＤＮＡ取込みが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
電気穿孔による形質転換を果たすためには、細胞もしくは胚発生カルスの懸濁培養物などの脆性組織を用い得るか、または代替的に、未熟胚もしくは他の形成された組織を直接的に形質転換し得るかのいずれかである。この技術では、選択した細胞の細胞壁を、ペクチン分解酵素（ペクトリアーゼ）曝露することによって部分的に分解するか、または制御された様式で機械的に組織に傷をつける。
【００５０】
形質転換ＤＮＡ断片を植物細胞に送達するための効率的な方法は、マイクロプロジェクタイル衝撃である。この方法では、粒子を核酸でコーティングし、推進力によって細胞内に送達する。例示的な粒子としては、タングステン、白金、及び好ましくは金からなるものが挙げられる。衝撃のため、懸濁液中の細胞を、フィルタまたは固形培地上で濃縮する。代替的に、未熟胚または他の標的細胞を固形培地上に配列してもよい。衝撃される細胞は、マクロプロジェクタイル停止プレートの下方に適切な距離で配置される。
【００５１】
加速によってＤＮＡを植物細胞内に送達するための方法の実例的な実施形態は、ＤＮＡまたは細胞でコーティングされた粒子を、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンなどのスクリーンを介して、標的細胞で被覆された表面上に推進させるために使用することができる、バイオリスチックス（Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）  粒子送達方法である。スクリーンが粒子を分散させるため、粒子は大きな集合体内のレシピエント細胞には送達されない。マイクロプロジェクタイル衝撃技術は、広く適用可能であり、事実上いかなる植物種をも形質転換するために使用され得る。
【００５２】
アグロバクテリウム媒介伝達は、遺伝子座を植物細胞内に導入するための別の広く適用可能なシステムである。この技術の利点は、ＤＮＡを植物組織全体に導入することができ、それによって、プロトプラストからの無傷植物の再生の必要性を回避することである。近年のアグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌ならびにアグロバクテリウム内での複製能があり、簡便な操作を可能にする（Ｋｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（７）：６３７−６４２，１９８５）。さらには、アグロバクテリウム媒介遺伝子伝達のためのベクターにおける最近の技術進歩が、様々なポリペプチドコードディング遺伝子を発現する能力のあるベクターの構築を促進するために、様々なベクター内の遺伝子及び制限部位の配列を改善している。記載されるベクターは、プロモーター、及び挿入されたポリペプチドコーディング遺伝子の直接発現のためのポリアデニル化部位に隣接して便利なマルチリンカー領域を有する。加えて、武装Ｔｉ遺伝子及び非武装Ｔｉ遺伝子の双方を含むアグロバクテリウムを、形質転換のために使用することができる。
【００５３】
アグロバクテリウム媒介形質転換が効率的であるそれらの植物株では、遺伝子座伝達の安易かつ明確な性質が理由で、それが選択の方法である。ＤＮＡを植物細胞内に導入するためのアグロバクテリウム媒介植物組み込みベクターの使用は、当該技術分野において周知である（Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：６２９−６３５，１９８５；米国特許第５，５６３，０５５号）。
【００５４】
植物プロトプラストの形質転換はまた、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール処理、電気穿孔、及びこれらの処理の組み合わせに基づく方法を使用して達成することもできる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３−１８８，１９８５、Ｏｍｉｒｕｌｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１（３）：４１５−４２８，１９９３、Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：７９１−７９３，１９８６、Ｕｃｈｉｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４：２０４，１９８６、Ｍａｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：４５４，１９８８を参照）。植物の形質転換及び外来遺伝要素の発現は、Ｃｈｏｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，１３：３４４-３４８，１９９４）、及びＥｌｌｕｌら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１０７：４６２-４６９，２００３）に例示される。
【００５５】
多数のプロモーターは、選択可能マーカー、スコラブル（ｓｃｏｒａｂｌｅ）マーカー、病害虫耐性、病害抵抗性、栄養強化のための遺伝子、及び農学的に重要な任意の他の遺伝子を含むが、これらに限定されない、任意の目的の遺伝子のための植物遺伝子発現に対して有用性がある。植物遺伝子発現に有用な構成的プロモーターの例としては、単子葉植物（例えば、Ｄｅｋｅｙｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：５９１，１９９０、Ｔｅｒａｄａ  ａｎｄ  Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２０：３８９，１９９０）を含め、大半の植物組織において構成的高レベル発現を付与する（例えば、Ｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０，１９８５を参照）、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）Ｐ−３５Ｓプロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの縦列重複型である増強３５Ｓプロモーター（Ｐ−ｅ３５Ｓ）；ｌノパリンシンターゼプロモーター（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８８：５４７，１９８８）；オクトピンシンターゼプロモーター（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：９７７，１９８９）；ならびに米国特許第５，３７８，６１９号に記載されるようなゴマノハグサモザイクウイルス（Ｐ−ＦＭＶ）プロモーター、及びＰ−ＦＭＶのプロモーター配列が縦列に重複されるＦＭＶプロモーターの増強型（Ｐ−ｅＦＭＶ）；カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓプロモーター；サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター；ツユクサキイロ斑紋ウイルスプロモーター；ならびに植物細胞内で発現することが知られる他の植物ＤＮＡウイルスプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
環境信号、ホルモン信号、化学信号、及び／または発達信号に応答して調節される様々な植物遺伝子プロモーターもまた、植物細胞における操作可能に結合した遺伝子の発現のために使用することができ、（１）熱（Ｃａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８８：９６５，１９８８）、（２）光（例えば、エンドウｒｂｃＳ−３Ａプロモーター、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：４７１，１９８９；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター、Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｅｅｎ，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，３：９９７，１９９１；もしくはクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質プロモーター、Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２７２３，１９８５）、（３）アブシジン酸などのホルモン（Ｍａｒｃｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：９６９，１９８９）、（４）創傷（例えば、ｗｕｎｌ、Ｓｉｅｂｅｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：９６１，１９８９）、または（５）ジャスモン酸メチル、サリチル酸、もしくは毒性緩和剤などの化学物質、によって調節されるプロモーターを含む。器官特異的プロモーターを用いることもまた有利であり得る（例えば、Ｒｏｓｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１１５５，１９８７、Ｓｃｈｅｒｎｔｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，７：１２４９，１９８８、Ｂｕｓｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：８３９，１９８９）。
【００５７】
本発明の植物に導入され得る例示的な核酸は、例えば、別の種からのＤＮＡ配列もしくは遺伝子、または同じ種を起源とする、もしくは同じ種に存在する遺伝子もしくは配列さえ含むが、古典的な再生または育種技術よりもむしろ遺伝子工学法によってレシピエント細胞に組み入れられる。しかしながら、「外因性」という用語は、形質転換されている細胞内には通常存在しないか、またはおそらくは単に、形質転換ＤＮＡ断片もしくは遺伝子内で見られるような形態、構造体等では存在しない遺伝子、あるいは通常に存在し、例えば過剰発現すること等、天然の発現パターンとは異なる様式で発現することが所望される遺伝子を指すことも意図する。このため、「外因性」遺伝子またはＤＮＡという用語は、同様の遺伝子がかかる細胞内にすでに存在し得るかどうかにかかわらず、レシピエント細胞に導入される任意の遺伝子またはＤＮＡ断片を指すことを意図する。外因性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの種類としては、すでに植物細胞内に存在しているＤＮＡ、別の植物からのＤＮＡ、異なる有機体からのＤＮＡ、または遺伝子のアンチセンスメッセージを含むＤＮＡ配列、あるいは合成遺伝子もしくは修飾遺伝子をコードするＤＮＡ配列などの外部で生成されたＤＮＡ、を挙げることができる。
【００５８】
数千とまではいかないにしても数百もの異なる遺伝子が知られており、本発明に従ってホウレンソウ植物内に導入される可能性がある。ホウレンソウ植物内に導入するために選択され得る特定の遺伝子及び対応する表現型の非限定的な例としては、バチルスチューリンゲンシス（Ｂ．ｔ．）遺伝子などの害虫耐性、真菌性の病気制御のための遺伝子などの病害虫耐性、グリホセート耐性を付与する遺伝子などの除草剤耐性のための１つ以上の遺伝子、及び収量、栄養強化、環境もしくはストレス耐性、または植物の生理機能、成長、発達、形態もしくは植物生成物（複数可）における任意の望ましい変化などの品質改善のための遺伝子が挙げられる。例えば、構造遺伝子としては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ９９／３１２４８、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６８９，０５２号、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，５００，３６５号及び同第５，８８０，２７５号に記載されるような、バチルス属害虫制御タンパク質遺伝子を含むがこれに限定されない、害虫耐性を付与する任意の遺伝子が挙げられ得る。別の実施形態において、構造遺伝子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３３，４３５号に記載されるようなアグロバクテリウム株ＣＰ４グリホセート抵抗性ＥＰＳＰＳ遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４）、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５，４６３，１７５号に記載されるようなグリホセート酸化還元酵素遺伝子（ＧＯＸ）を含むが、これらに限定されない遺伝子によって付与されるような、除草剤グリホセートに対する耐性を付与することができる。
【００５９】
代替的に、ＤＮＡコード配列は、例えばアンチセンス媒介性またはコサプレッション媒介性の機序を介して、内在性遺伝子の発現の標的化阻害を引き起こす非翻訳可能なＲＮＡ分子をコードすることによって、これらの表現型に影響を及ぼすことができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎ．Ｒｅｖ．，９：２０７，１９９１を参照）。ＲＮＡはまた、所望の内在性ｍＲＮＡ産物を切断するように操作される触媒ＲＮＡ分子（すなわち、リボザイム）であってもよい（例えば、Ｇｉｂｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｌｌｉｔｏ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７：１２５，１９９７を参照）。このため、目的の表現型または形態変化を発現するタンパク質またはｍＲＮＡを産出する任意の遺伝子が、本発明の実施に有用である。
【００６０】
Ｇ．定義
本明細書内の説明及び表において、多くの用語が使用される。本明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する：
【００６１】
対立遺伝子：遺伝子座の任意の１つ以上の代替的形態であり、それら対立遺伝子のすべては、１つの形質または特性に関する。二倍体細胞または有機体において、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上に対応する遺伝子座を占有する。
【００６２】
戻し交配：栽培者が、雑種子孫、例えば、第一世代雑種（Ｆ１）をその雑種子孫の親の一方に戻って繰り返し交配するプロセス。戻し交配を使用して、ある遺伝子的背景からの１つ以上の単一遺伝子座変換を別の遺伝子的背景に導入することができる。
【００６３】
交配：２つの親植物を掛け合わせること。
【００６４】
異花受粉：異なる植物からの２つの配偶子の結合による受精。
【００６５】
二倍体：２組の染色体を有する細胞または有機体。
【００６６】
除雄化：植物の雄性器官の除去、または細胞質もしくは核の遺伝要素、あるいは雄性不稔性を付与する化学薬剤を用いた器官の不活性化。
【００６７】
酵素：生物学的反応において触媒として機能し得る分子。
【００６８】
Ｆ１雑種：２種類の非同系植物の交配の第一世代子孫。
【００６９】
遺伝子型：細胞または有機体の遺伝子構成。
【００７０】
半数体：二倍体内の２組の染色体のうちの１組を有する細胞または有機体。
【００７１】
リンケージ：同じ染色体上の対立遺伝子が、偶然にそれらの伝達が独立している場合に予測されるよりも高頻度で、一緒に分離する傾向にある現象。
【００７２】
マーカー：好ましくは、共優性方式で受け継がれる（二倍体ヘテロ接合体内の遺伝子座にある双方の対立遺伝子が容易に検出可能である）、容易に検出可能な表現型、環境分散構成要素なし、すなわち、遺伝率１。
【００７３】
表現型：細胞または有機体の検出可能な特性であって、遺伝子発現の明示である特性。
【００７４】
量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）：量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、通常は継続的に分配される数値的に表現できる形質をある程度まで制御する遺伝子座を指す。
【００７５】
対抗性：本明細書内で使用される場合、「対抗性」及び「耐性」という用語は、特定の生物害虫、病原体、非生物的影響、または環境条件に対して症状を示さない植物を記載するために互換的に使用される。これらの用語は、いくらかの症状を示すが、依然として許容可能な収量で商品を作出することができる植物を記載するためにも使用される。抵抗性または耐性と称されるいくつかの植物は、植物が発育不良であり、収量が低減したとしても、依然として作物を作出し得るという意味でのみ対抗性または耐性である。
【００７６】
再生：組織培養物からの植物の発育。
【００７７】
王立園芸協会（ＲＨＳ）カラーチャート値：ＲＨＳカラーチャートは、任意の色の厳密な識別を可能にする標準化された参照資料である。このチャート上での色の指定は、その色調、明度、及び彩度を記載する。色は、ＲＨＳカラーチャートによって、グループ名、シート番号、及び文字を識別することにより、例えば、Ｙｅｌｌｏｗ−Ｏｒａｎｇｅ  Ｇｒｏｕｐ１９ＡまたはＲｅｄ  Ｇｒｏｕｐ４１Ｂと、正確に命名される。
【００７８】
自家受粉：同じ植物の葯から柱頭への花粉の伝達。
【００７９】
単一遺伝子座変換（Ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ／Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）植物：戻し交配と称される植物育種技術によって開発される植物であり、戻し交配技術を介して及び／または遺伝形質転換によってホウレンソウ品種に伝達される単一遺伝子座の特性に加えて、該品種の本質的にすべての形態的及び生理学的特性が復元される。
【００８０】
実質的に等価：比較したときに、平均からの統計学的有意差（例えば、ｐ＝０．０５）を示さない特性。
【００８１】
組織培養物：同じもしくは異なる型の単離された細胞を含む組成物、またはある植物の部分に組織化されるそのような細胞の集合体。
【００８２】
導入遺伝子：形質転換によってホウレンソウ植物のゲノム内に導入されている配列を含む遺伝子座。
【００８３】
Ｈ．寄託情報
上に開示され、特許請求の範囲において列挙されるホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに近交親系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍの寄託は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ２０１１０−２２０９で行っている。寄託日は、２０１４年７月３１日であった。ホウレンソウ雑種ＳＶ３６５３ＶＡ、ならびに近交親系統ＯＥＢ−６６−１１５０Ｆ及びＯＥＢＳ０１１−１１５５Ｍのそれらの寄託された種子の受託番号は、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４５、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４４、及びＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２１４４３である。特許が付与されると、寄託物に対するすべての制約は解除されることになり、寄託物は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０１−１．８０９のすべての要件を満たすことが意図される。寄託物は、保存所に３０年間、もしくは最後の要求から５年間、または特許の有効期間のうちの長い方で維持されることとなり、その期間中に必要な場合は置き換えられることとなる。
【００８４】
前述の発明は、明瞭性及び理解の目的のために例示及び実施例としていくらか詳細に記載されているが、ある特定の変更及び修正が、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるような本発明の範囲内で実施され得ることは明白であろう。
【００８５】
本明細書内に引用されるすべての参考文献は、これによって参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【外国語明細書】
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