(57)【要約】【課題】新規な抗真菌剤を効率的に取得するための、抗真菌剤の候補物質を迅速にスクリーニングする方法を提供すること。【解決手段】真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された酵母株、および該酵母株を用いて候補物質をスクリーニングする方法等が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株。
【請求項２】
真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体が導入された酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株。
【請求項３】
エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ１、ＥＲＧ２およびＥＲＧ２４からなる群から選択される、請求項１または２記載の酵母株。
【請求項４】
エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子がＥＲＧ１１である、請求項３記載の酵母株。
【請求項５】
出芽酵母株である、請求項１〜４のいずれか１項記載の酵母株。
【請求項６】
２以上の真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が各々導入された、２以上の酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株からなるライブラリー。
【請求項７】
真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の２以上の変異体が各々導入された、２以上の酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株からなるライブラリー。
【請求項８】
２以上の酵母株からなるライブラリーであって、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された酵母株および真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体が導入された酵母株を含み、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されているライブラリー。
【請求項９】
エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ１、ＥＲＧ２およびＥＲＧ２４からなる群から選択される、請求項６〜８のいずれか１項記載のライブラリー。
【請求項１０】
エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子がＥＲＧ１１である、請求項９記載のライブラリー。
【請求項１１】
酵母株が出芽酵母株である、請求項６〜１０のいずれか１項記載のライブラリー。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか１項記載の酵母株または請求項６〜１１のいずれか１項記載のライブラリーを抗真菌剤の候補物質の存在下で培養することを特徴とする、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１３】
請求項４記載の酵母株または請求項１０記載のライブラリーを抗真菌剤の候補物質の存在下で培養することを特徴とする、アゾール系抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１４】
請求項２記載の酵母株あるいは請求項７または８記載のライブラリーを抗真菌剤の候補物質の存在下で培養することを特徴とする、薬剤耐性真菌に対する抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか１項記載の酵母株または請求項６〜１１のいずれか１項記載のライブラリーを含む、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングするためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングするための酵母株および該酵母株を用いた抗真菌剤の候補物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
真菌類は、ヒト、動物および植物に感染して様々な疾患をもたらすことが知られている。真菌の感染による真菌症としては、例えば、アスペルギルス症、カンジダ症、クリプトコックス症、白癬（水虫、たむし、およびしらくも等）、マラセチア症、スポロトリコーシス、黒色真菌感染症、接合菌症、コクシジオイデス症、ヒストプラスマ症などが知られており、その病巣部位または組織によって、表在性真菌症、深部皮膚真菌症および深在性真菌症に大別される（非特許文献１参照）。また、農業分野における真菌感染としては、うどんこ病、黒星病、さび病、いもち病等が知られており、これらの真菌感染症は、作物毎に真菌の種類が異なり、非常に多くの植物病原性真菌が存在する。
【０００３】
真菌類は、ウイルスや細菌と異なり、進化学的にヒトなどの高等真核生物と近縁であり、真菌が備える生命機構やそれに関与する蛋白質がかなり共通する。そのため、創薬のターゲットとなりうる部位が少なく、抗真菌剤の開発は困難を極める。現在上市される抗真菌剤も、細胞壁や細胞膜成分のごく限られた違いをターゲットとした限られた数があるにすぎない（非特許文献２〜３参照）。例えば、現在、深在性真菌症の治療薬として国内で認可されている抗真菌剤は、たったの８種類のみである。
【０００４】
現在、抗真菌剤としては、アムホテリシンＢ（ＡＭＰＨ−Ｂ）、オリゴマイシン、ナイスタチンなどのポリエン系の抗真菌剤；フルシトシン（５−ＦＣ）などのピリミジン誘導体の抗真菌剤；アゾール系およびその他のエルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤；ミカファンギン、カスポファンギン、アニデュラファンギンなどのキャンディン系の抗真菌剤；サリチル酸、ヨードチンキ、エキサラミドなどのサリチル酸系の抗真菌剤などが知られている。なかでも、アゾール系薬剤は、ヒトおよび家畜用抗真菌剤、農薬、防かび剤等として世界中で使用され、さらに、特定のアゾール系薬剤でしか治療できない疾患もあることから、最も重要視される抗真菌剤である（例えば、非特許文献４参照）。アゾール系抗真菌剤は、エルゴステロール合成経路の一部であるＥＲＧ１１遺伝子産物、シトクロムＰ４５０ラノステロール１４α−デメチラーゼ（以下、Ｅｒｇ１１ｐともいう）をターゲットとし、Ｅｒｇ１１ｐに配位してその酵素活性を阻害することにより薬効をもたらす（非特許文献５参照）。
【０００５】
同じ薬剤を多用すると耐性病原菌が出現し、その薬剤の効果が得られなくなることはよく知られている（非特許文献２〜３参照）。抗真菌剤についても例外ではなく、多剤耐性真菌出現の報告はないものの、個々の薬剤に対する耐性菌の出現が頻繁に報告されている（例えば、非特許文献４参照）。近年、糖尿病、エイズ、臓器移植、抗癌剤治療に係る免疫低下した患者が増加したことにより、真菌症に罹患する患者が増加の一途をたどっている。したがって、抗真菌剤の使用が増加することにより、病原性真菌が薬剤耐性を獲得する確率も飛躍的に高まっている。限られた数の抗真菌剤しかない現状で、薬剤耐性真菌、特に多剤耐性真菌の出現は、人類にとって大変な脅威となる。したがって、今もなお、新規な抗真菌剤の開発が求められる。
【０００６】
抗真菌剤の従来のスクリーニングは、候補物質が病原性真菌に対して薬効を有するか否かを調べることによって行われる。また、多剤耐性菌に対する抗真菌剤をスクリーニングする方法として、複数の薬剤耐性遺伝子を人工的に組み込んだ多剤耐性カンジダ株を用いる方法が報告されている（特許文献１参照）。しかしながら、前記のように、特定の薬剤耐性菌に対する抗真菌剤だけでなく、多剤耐性真菌の出現を防止するためにも、様々な種類の新規な抗真菌剤の開発が必要とされる。また、そのためには、様々な観点からの選別基準を用いた、新規な抗真菌剤を効率的に取得するための様々な探索方法が求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ２００８／３１８２６７Ａ１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】化学と生物  Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．１２，２００４，ｐｐ．８１８−８２６
【非特許文献２】モダンメディア  ５６巻６号２０１０［真菌］，ｐｐ．１１９−１３８
【非特許文献３】医学のあゆみ  Ｖｏｌ．２０９，Ｎｏ．９，２００４．５．２９，ｐｐ．５５６−５６３
【非特許文献４】日本化学療法学会雑誌  ２０１３，Ｖｏｌ．６１，Ｎｏ．２，ｐｐ．１４９−１５６
【非特許文献５】ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．２，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００２，ｐｐ．７６−８１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
抗真菌剤の従来のスクリーニング方法では、調査できる菌種が限られ、また、個々の真菌の培養条件や薬剤感受性試験の条件が異なることにより、種々の制限や客観性を担保できない等の欠点がある。実際、現状のスクリーニングでは、カンジダやアスペルギルスなどの重要真菌症の標準株を用いた限られた菌種でしか行われていない。さらに、個々の抗真菌剤に対する感受性は菌種により異なるので、どの薬剤がどの真菌に対して薬効を有するのかは、実際に総当たりで試験しなければ分からないという問題がある。また、農業分野では、植物病原性真菌の多くが絶対寄生菌であることから、実験室レベルでのスクリーニングが不可能であるという問題もある。現状では、絶対寄生菌に対するスクリーニングは、圃場や温室において植物個体を用いて行わなければならず、植物の育成も考慮する必要があり、極めて非効率的である。そこで、本発明は、新規な抗真菌剤を効率的に取得するための、抗真菌剤の候補物質を迅速にスクリーニングする方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、抗真菌剤の候補物質のスクリーニング方法を開発するにあたり、エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤に着目した。該抗真菌剤は、エルゴステロール生合成経路をターゲットとし、エルゴステロール生合成に関与するタンパク質に配位して、その酵素活性を阻害することにより薬効をもたらす。鋭意研究の結果、本発明者は、酵母自体のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を破壊し、他の真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した酵母株を作成し、該酵母株を用いることにより、抗真菌剤の候補物質を効率的にスクリーニングできることを見出した。
【００１１】
すなわち、本発明は、
［１］真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株、
［２］真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体が導入された酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株、
［３］エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ１、ＥＲＧ２およびＥＲＧ２４からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の酵母株、
［４］エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子がＥＲＧ１１である、［３］に記載の酵母株、
［５］出芽酵母株である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の酵母株、
［６］２以上の真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が各々導入された、２以上の酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株からなるライブラリー、
［７］真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の２以上の変異体が各々導入された、２以上の酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株からなるライブラリー、
［８］２以上の酵母株からなるライブラリーであって、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された酵母株および真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体が導入された酵母株を含み、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されているライブラリー、
［９］エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ１、ＥＲＧ２およびＥＲＧ２４からなる群から選択される、［６］〜［８］のいずれか１つに記載のライブラリー、
［１０］エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子がＥＲＧ１１である、［９］に記載のライブラリー、
［１１］酵母株が出芽酵母株である、［６］〜［１０］のいずれか１つに記載のライブラリー、
［１２］［１］〜［５］のいずれか１つに記載の酵母株または［６］〜［１１］のいずれか１つに記載のライブラリーを抗真菌剤の候補物質の存在下で培養することを特徴とする、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする方法、
［１３］［４］に記載の酵母株または［１０］に記載のライブラリーを抗真菌剤の候補物質の存在下で培養することを特徴とする、アゾール系抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする方法、
［１４］［２］に記載の酵母株あるいは［７］または［８］に記載のライブラリーを抗真菌剤の候補物質の存在下で培養することを特徴とする、薬剤耐性真菌に対する抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする方法、および
［１５］［１］〜［５］のいずれか１つに記載の酵母株または［６］〜［１１］のいずれか１つに記載のライブラリーを含む、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングするためのキット
を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の酵母株を用いる抗真菌剤のスクリーニング方法では、酵母を同一の宿主として用いるので、様々な種類の病原性真菌について、同一の培養条件下で候補物質の薬効を迅速に評価することができる。また、該評価にあたり、バイオフィルム形成、ターゲットとするエルゴステロール生合成に関与する酵素の発現量、薬剤排出ポンプの発現量といった他の要因を考慮する必要がない。したがって、本発明によれば、膨大な数の候補物質を同一条件下で迅速にスクリーニングすることができる。さらに、本発明によれば、さび病菌やうどんこ病菌などの絶対寄生菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した酵母株を得ることができるので、従来実験室でのスクリーニングが不可能であった絶対寄生菌に対する抗真菌剤の候補物質のスクリーニングも可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例２におけるスポット・アッセイの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子または該遺伝子の変異体が導入された酵母株であって、該酵母株が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている酵母株（以下、本発明の酵母株ともいう）を提供する。本発明の酵母株は、エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤の候補物質をスクリーニングするために使用できる。
【００１５】
本発明において、真菌としては、例えば、ツボカビ門；クモノスカビ属、ケカビ属などの接合菌門；子嚢菌門；クリプトコッカス属（例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ等）、マラセチア属（例えば、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ等）、さび病菌などの担子菌門；白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属、黒色真菌などの不完全菌；酵母などが挙げられる。子嚢菌門としては、白癬菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ等）、スポロトリックス属（例えば、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ等）、アスペルギルス属（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニューモシスチス属（例えば、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ等）；カンジダ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒａｂｒａｔａ等）、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）などの出芽酵母、シゾサッカロマイセス属などの分裂酵母などの酵母；アオカビ、コウジカビ、アカパンカビなどのカビ；アミガサタケ、トリュフなどのキノコ、ユーティパ（Ｅｕｔｙｐａ）属、いもち病菌、うどんこ病菌、黒星病菌、さび病菌などが挙げられる。本発明の酵母株に導入されるエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子または該遺伝子の変異体は、前記のいずれの真菌由来のものであってもよく、特に限定されない。
【００１６】
エルゴステロールは、重要な細胞膜成分の一つであり、その生合成経路には、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、スクアレンエポキシダーゼ、Ｃ１４α−デメチラーゼ、Ｃ１４−レダクターゼ、Δ８，７−イソメラーゼ等の複数の酵素が関与することが知られている。エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤は、エルゴステロール生合成経路に関与する酵素タンパク質を阻害することにより、抗真菌作用を示す。エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤としては、アゾール系抗真菌剤、テルビナフィンなどのアリルアミン系抗真菌剤、およびアモロルフィンなどがある。アゾール系抗真菌剤は、エルゴステロールの生合成経路におけるＥＲＧ１１遺伝子産物（Ｃ１４α−デメチラーゼ）に配位してその酵素活性を阻害することにより薬効をもたらし、アリルアミン系抗真菌剤は、エルゴステロールの合成経路におけるＥＲＧ１遺伝子産物（スクアレンエポキシダーゼ）に配位してその酵素活性を阻害することにより薬効をもたらし、アモルフィンは、エルゴステロールの合成経路におけるＥＲＧ２４遺伝子産物（Ｃ１４−レダクターゼ）およびＥＲＧ２遺伝子産物（Δ８，７−イソメラーゼ）に配位してその酵素活性を阻害することにより薬効をもたらすことが知られている。
【００１７】
本発明の酵母株に導入されるエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子は、エルゴステロール生合成に関与するいずれの酵素をコードする遺伝子であってもよく、例えば、ＥＲＧ１、ＥＲＧ１１、ＥＲＧ２４、およびＥＲＧ２が挙げられる。エルゴステロール生合成に関与する酵素のアミノ酸配列および該酵素をコードする遺伝子配列は、主要な真菌において解明されており、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＲｅｑＳｅｑ等の公知のデータベースから得ることができる。さらに、各真菌のデータベースとして、出芽酵母についてＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＳＧＤ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）、分裂酵母についてＰｏｍＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｏｍｂａｓｅ．ｏｒｇ／）、カンジダについてＣａｎｄｉｄａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｄｉｄａｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）、アスペルギルスについてＡｓｐＧＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／）、アカパンカビについてＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｇｅｎｏｍｅ／ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ／ＭｕｌｔｉＨｏｍｅ．ｈｔｍｌ）が知られており、これらのデータベースからも所望の遺伝子配列情報を得ることができる。本発明におけるエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子としては、該酵素の公知のアミノ酸配列または遺伝子配列に基づいて、当該分野で既知の方法を用いて得られたポリヌクレオチドを用いればよい。例えば、前記の公知のデータベースから得られた配列情報に基づいて合成したポリヌクレオチド、または前記の公知のデータベースから得られた配列情報に基づいて適当なプライマーを合成し、該プライマーを用いて各種真菌のゲノムＤＮＡから目的の遺伝子領域を増幅して得られたポリヌクレオチド等を用いることができる。目的の酵素の遺伝子配列が解明されていない真菌については、他の真菌で明らかになった共通配列に基づいてプライマーを合成し、該プライマーを用いて目的の真菌のゲノムＤＮＡから目的の酵素をコードする領域を増幅してポリヌクレオチドを得ることができる。また、各種病原性真菌由来の該酵素遺伝子を合成する際、好ましくは、その塩基配列を宿主酵母のコドン頻度を考慮して最適化することができる。例えば、限定するものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１１として、ＲｅｐＳｅｑアクセッション番号  ＮＭ＿００１１７９１３７．１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、例えば、配列番号２に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのＥＲＧ１１として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＦ７４６５１７．１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、例えば、配列番号３に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓＥＲＧ１１として、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＱ２０２０８２．２に示されるヌ���レオチド配列からなるポリヌクレオチド、例えば、配列番号４に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが使用できる。
【００１８】
また、本発明の酵母株には、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体を導入することもできる。ここで、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体とは、野生型の該酵素をコードする遺伝子の塩基配列とは異なる配列を有する遺伝子を意味する。該変異体としては、特に限定されず、いずれの変異体であってもよい。例えば、個々の病原性真菌で耐性が確認されたエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体が用いられる。実際、カンジダ症やアスペルギルス症などの真菌症の患者から分離した病原性真菌において、アゾール耐性を示す変異型のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子、例えばＥＲＧ１１の変異体が多数同定されている。例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓのアゾール耐性株の研究において、アゾール耐性に関与するＥｒｇ１１ｐの主要なアミノ酸変異として、Ｅｒｇ１１ｐのアミノ酸配列における５４位のグリシンのグルタミン酸、リジン、アルギニン、バリン、またはトリプトファンでの置換、９８位のロイシンのヒスチジンでの置換、２２０位のメチオニンのリジン、イソロイシン、スレオニン、バリン、アルギニン、またはトリプトファンでの置換、２２位のアスパラギンのアスパラギン酸での置換、５２位のセリンのスレオニンでの置換、１３８位のグリシンのシステインまたはアルギニンでの置換、１４１位のグルタミンのヒスチジンでの置換、１４７位のヒスチジンのチロシンでの置換、２１６位のプロリンのロイシンでの置換、２３６位のメチオニンのリジン、スレオニン、またはバリンでの置換、２９７位のセリンのスレオニンでの置換、３９４位のプロリンのロイシンでの置換、４３１位のチロシンのシステインでの置換、４３４位のグリシンのシステインでの置換、４４０位のスレオニンのアラニンでの置換、４４８位のグリシンのセリンでの置換、４９１位のチロシンのヒスチジンでの置換、４９５位のフェニルアラニンのイソロイシンでの置換等が同定されている（例えば、非特許文献４参照）。このような既に同定されている抗真菌剤耐性に寄与するアミノ酸変異に基づいて、該アミノ酸変異を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを合成し、本発明の酵母株に導入してもよい。合成する変異体ポリヌクレオチドに含まれる変異は、すなわち、該ポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列に含まれるアミノ酸変異は、１個または２個以上であってもよい。また、エルゴステロール生合成に関与する酵素のアミノ酸配列は真菌の菌種間で相同性があるので、ある菌種で薬剤耐性に関与するアミノ酸変異が同定されている場合、別の菌種のアミノ酸配列中の対応する位置に同様のアミノ酸変異が生じるようなポリヌクレオチドを合成し、本発明の酵母株に導入してもよい。あるいは、真菌症患者から単離した薬剤耐性真菌株から直接、エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体を得てもよい。真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体は、当該分野で既知の方法を用いて得ることができる。
【００１９】
本明細書において、「耐性」とは、菌がある薬剤に対して抵抗力を示すことをいう。たとえば、ある菌の変異株および野生株に対して抗真菌剤を投与したとき、変異株の増殖度が野生株に比して高い場合に、その変異株はその抗真菌剤に対して「耐性」を有するといえる。また、本明細書において、「多剤耐性」とは、複数の抗真菌剤に対して耐性を示すことをいう。かかる複数の抗真菌剤は、同じ系に分類される薬剤であってもよいし、異なる系に分類される薬剤であってもよい。
【００２０】
本発明において、エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子または該遺伝子の変異体を導入する酵母（以下、宿主酵母ともいう）としては、出芽酵母または分裂酵母のいずれであってもよく、特に限定されない。例えば、カンジダ属（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｒａｂｒａｔａ等）、サッカロマイセス属（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ等）、シゾサッカロマイセス属（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（例えば、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、アルカン資化酵母（例えば、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、メタノール資化酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などの酵母が挙げられる。遺伝子導入操作および取り扱いの簡便性の観点から、好ましくは、出芽酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが用いられる。
【００２１】
本発明の酵母株は、当該分野で知られたいずれかの遺伝子導入方法より、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子または該遺伝子の変異体を酵母に導入することによって得られる。酵母への遺伝子導入方法はよく確立されており、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。該遺伝子または該変異体は、宿主酵母のプラスミド中に導入してもよく、またはゲノム中に導入してもよい。一方、宿主酵母自身が本来有するゲノム中の、該導入する遺伝子または変異体に対応する遺伝子は破壊する。ここで、宿主酵母自身が本来有するゲノム中の遺伝子の「破壊」とは、該遺伝子を完全に機能しない状態にすること、あるいは該遺伝子または該遺伝子産物の発現が検出できない状態にすることをいう。宿主酵母自身が本来有するゲノム中の該遺伝子の破壊は、当該分野で既知の方法で行うことができ、例えば、ワンステップ遺伝子破壊法（例えば、生物化学実験法３９  酵母分子遺伝学実験法、大嶋泰治編著、学会出版センター参照）によって行うことができる。
【００２２】
本発明において、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子または該遺伝子の変異体は、プロモーターやターミネーターなどの調節領域と共に宿主酵母中に導入する。該調節領域としては、例えば、導入遺伝子が由来する真菌のものであってもよく、または宿主酵母のものであってもよい。後記する本発明のライブラリーにおいて、各酵母株において同一の調節領域を使用すると、各酵母株における導入遺伝子の発現量を均一にすることができ、好ましい。好ましくは、宿主酵母の調節領域が使用される。
【００２３】
本発明は、２以上の本発明の酵母株からなるライブラリーを提供する。一の態様において、本発明のライブラリーは、２以上の本発明の酵母株から構成され、該２以上の酵母株には各々、異なる真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入されており、各酵母株自身が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている。例えば、本発明のライブラリーを構成する酵母株は、各々異なる真菌由来のＥＲＧ１１を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーを構成する酵母株は、各々異なる真菌由来のＥＲＧ１を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーを構成する酵母株は、各々異なる真菌由来のＥＲＧ２を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーを構成する酵母株は、各々異なる真菌由来のＥＲＧ２４を含んでいてもよい。
【００２４】
別の態様として、本発明のライブラリーは、２以上の本発明の酵母株から構成され、該２以上の酵母株には各々、真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の２以上の変異体が導入されており、各酵母株自身が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている。ここで、「真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の２以上の変異体」は、異なる真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体であってもよく、同じ真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の異なる変異体であってもよく、またはこれらの変異体の組み合わせであってもよい。例えば、本発明のライブラリーは、各々異なる真菌由来のＥＲＧ１１の変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、各々同じ真菌由来のＥＲＧ１１の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、または各々異なる真菌由来のＥＲＧ１１の変異体が導入された２以上の酵母株および各々同じ真菌由来のＥＲＧ１１の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーは、各々異なる真菌由来のＥＲＧ１の変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、各々同じ真菌由来のＥＲＧ１の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、または各々異なる真菌由来のＥＲＧ１の変異体が導入された２以上の酵母株および各々同じ真菌由来のＥＲＧ１の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーは、各々異なる真菌由来のＥＲＧ２の変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、各々同じ真菌由来のＥＲＧ２の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、または各々異なる真菌由来のＥＲＧ２の変異体が導入された２以上の酵母株および各々同じ真菌由来のＥＲＧ２の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーは、各々異なる真菌由来のＥＲＧ２４の変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、各々同じ真菌由来のＥＲＧ２４の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよく、または各々異なる真菌由来のＥＲＧ２４の変異体が導入された２以上の酵母株および各々同じ真菌由来のＥＲＧ２４の異なる変異体が導入された２以上の酵母株を含んでいてもよい。
【００２５】
また別の態様として、本発明のライブラリーは、２以上の本発明の酵母株から構成され、真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された１以上の酵母株および真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体が導入された１以上の酵母株を含み、各酵母株自身が本来有するゲノム中の前記遺伝子に対応する遺伝子は破壊されている。該ライブラリーは、異なる真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が導入された１または２以上の酵母株、ならびに異なる真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体が導入された１または２以上の酵母株および／または同じ真菌由来の同じエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の異なる変異体が導入された１または２以上の酵母株を含んでいてもよい。例えば、本発明のライブラリーは、異なる真菌由来のＥＲＧ１１が導入された１または２以上の酵母株、ならびに異なる真菌由来のＥＲＧ１１の変異体が導入された１または２以上の酵母株および／または同じ真菌由来のＥＲＧ１１の異なる変異体が導入された１または２以上の酵母株を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーは、異なる真菌由来のＥＲＧ１が導入された１または２以上の酵母株、ならびに異なる真菌由来のＥＲＧ１の変異体が導入された１または２以上の酵母株および／または同じ真菌由来のＥＲＧ１の異なる変異体が導入された１または２以上の酵母株を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーは、異なる真菌由来のＥＲＧ２が導入された１または２以上の酵母株、ならびに異なる真菌由来のＥＲＧ２の変異体が導入された１または２以上の酵母株および／または同じ真菌由来のＥＲＧ２の異なる変異体が導入された１または２以上の酵母株を含んでいてもよい。また例えば、本発明のライブラリーは、異なる真菌由来のＥＲＧ２４が導入された１または２以上の酵母株、ならびに異なる真菌由来のＥＲＧ２４の変異体が導入された１または２以上の酵母株および／または同じ真菌由来のＥＲＧ２４の異なる変異体が導入された１または２以上の酵母株を含んでいてもよい。
【００２６】
また別の態様として、本発明のライブラリーは、２以上の本発明の酵母株から構成され、該２以上の酵母株には各々、同じ真菌由来の異なるエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子および／または該遺伝子の変異体が導入されていてもよい。
【００２７】
本発明のライブラリーを構成する酵母株の数が多いほど、後記するスクリーニング方法における効率が上がり、好ましい。したがって、本発明は、２以上の真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子および／または該遺伝子の変異体が各々導入された、２以上の酵母株からなるライブラリーを提供し、好ましくは、３以上の真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子および／または該遺伝子の変異体が各々導入された、３以上の酵母株からなるライブラリーを提供し、さらに好ましくは、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子および／または該遺伝子の変異体が各々導入された、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の酵母株からなるライブラリーを提供する。
【００２８】
本発明の酵母株またはライブラリーは、抗真菌剤の候補物質のスクリーニングに使用することができる。本明細書において、抗真菌剤とは、ヒト用医薬、家畜用医薬、農薬、殺菌剤および防かび剤として使用されるいずれの抗真菌剤も含まれる。
【００２９】
本発明において使用される候補物質は、天然由来物質または化学合成物質のいずれであってもよく、特に限定されない。本発明においてスクリーニングする候補物質は、エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤の候補物質である。エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤としては、アゾール系抗真菌剤、例えば、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロミダゾール、クロトリマゾール、クロコナゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、ケトコナゾール、イソコナゾール、ミコナゾール、ネチコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、ラノコナゾール、フルコナゾール、テルコナゾール、ヘキサコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、ボリコナゾールイトラコナゾール、ボリコナゾールなど、テルビナフィン、ブテナフィンなどのアリルアミン系抗真菌剤、およびアモロルフィンなどが知られている。さらに、アゾール系農薬としては、例えば、フェナリモール、フルオトリマゾール、トリアジメフォン、トリアジメノール、ジクロブトラゾール、ジニコナゾール、トリフミゾール、プロピコナゾール、フルトリアホール、ＤＰＸ−Ｈ６５７３、ペンコナゾール、ブチオベート、プロクロラズ、テブコナゾール、エクロメゾール、メトコナゾール、ヒドロキシイソキサゾール、ビテルタノール、シメコナゾール、テトラコナゾールなどが知られている。本発明においては、例えば、上述した既知の抗真菌剤の化学構造を基礎として、例えば置換基を付加、変更、または除去するなどの変更を加えた化合物を合成し、候補物質として用いてもよい。
【００３０】
真菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の変異体を導入した酵母株または該酵母株を含むライブラリーを用いた場合、既存の抗真菌剤に対して耐性を示す真菌にも効果がある抗真菌剤をスクリーニングすることが可能になる。この場合、スクリーニングする候補物質としては、新規な化合物を用いることもできるが、該真菌が耐性を示す抗真菌剤以外の既存の抗真菌剤を用いることもできる。
【００３１】
エルゴステロール合成阻害薬である抗真菌剤のなかでも、アゾール系抗真菌剤は、ヒト用および家畜用抗真菌剤、農薬、または防かび剤として多方面にわたって世界中で使用される重要な抗真菌剤である。アゾール系抗真菌剤は、イミダゾール環やトリアゾール環等のヘテロ芳香環を持つ以外は種々の構造を有し得る自由度があるため、無数の候補物質を作り出すことができる。したがって、本発明における候補物質としては、好ましくは、アゾール化合物が用いられる。
【００３２】
本明細書において、アゾール化合物とは、窒素、硫黄または酸素を１個以上含む５員または６員のヘテロ芳香環化合物を意味し、例えば、イミダゾール環、トリアゾール環、またはピリミジン環を有する化合物を包含する。現在、抗真菌剤としては、イミダゾール系またはトリアゾール系などの５員環を有するアゾール系薬剤が商業的に成功した例が多い。したがって、本発明のスクリーニングにおける候補物質としては、例えば、窒素、硫黄または酸素を１個以上含み、２個の二重結合を有するヘテロ５員環化合物が用いられる。候補物質としてのアゾール化合物は、当該分野で既知のいずれかの方法で合成することによって得ることができる。例えば、既知のアゾール系抗真菌剤の化学構造を基礎として、置換基を付加、変更、または除去するなどの変更を加えた化合物を合成することにより、膨大な数の候補物質を作り出すことができる。
【００３３】
本発明の抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする方法は、上記した本発明の酵母株またはライブラリーを抗真菌剤の候補物質の存在下で培養することによって行う。例えば、各種候補物質を含む培地を作成し、各培地中で酵母株またはライブラリーを構成する各酵母株を培養する。酵母株またはライブラリーの培養は、該酵母株または該ライブラリーを構成する各酵母株が生育できる条件であればよく、特に限定されない。培地としては、例えば、ＹＰＤ培地、最小合成完全培地（ＳＣ培地）、栄養要求性培地等を用いることができる。培養温度は、酵母が生育できる通常の温度であればよく、特に限定されないが、例えば、２５℃〜３７℃、例えば３０℃が挙げられる。培養期間は、酵母株の生育状況が確認できる期間であればよく、使用する候補物質の種類および濃度ならびに酵母の種類にもよるが、例えば、２４時間〜７２時間、例えば、１〜２日間が挙げられる。培地中の候補物質の濃度および培地に添加する酵母株の量は、特に限定されず、培養された該酵母株の生育状況を観察できる範囲で当業者によって適宜決定される。
【００３４】
かくして、本発明の酵母株または本発明のライブラリーを構成する各酵母株を候補物質の存在下で培養して、酵母株の生育状況を観察する。その結果、候補物質を含有する培地中で培養した酵母株が、候補物質を含有しない培地中で培養した場合と比較して生育不良の場合、その候補物質が、その酵母株に導入された遺伝子が由来する真菌に対して抗真菌作用を有することを示す。一方、候補物質を含有する培地中で培養した酵母株が、候補物質を含有しない培地中で培養した場合と比較して生育良好または同程度に生育した場合、その候補物質が、その酵母株に導入された遺伝子が由来する真菌に対して抗真菌作用を有さないことを示す。本発明において、「抗真菌作用」とは、真菌の増殖を抑制する静菌的作用または真菌を死滅させる殺菌的作用を有することをいう。静菌とは、一定濃度のある薬剤下で、真菌が生存はしているが増殖できない状態を指す。殺菌とは、一定濃度のある薬剤下で、真菌が完全に死滅する状態を指す。
【００３５】
酵母株の生育状況は、酵母株の増殖度を測定することによって確認することができる。酵母株の増殖度の測定は、当該分野で既知の方法によって行うことができ、例えば、後記の実施例において記載するスポット・アッセイによって行うことができる。
または、９６穴プレートを用いて最小発育阻止濃度（minimum inhibitory concentration：ＭＩＣ）を算出して各酵母株の増殖度を比較することができる。あるいは、日本医真菌学会の「酵母の抗真菌薬感受性試験法」（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｙｃｏｌ．，Ｖｏｌ．５１，１５３−１６３，２０１０）、またはＣｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）のＭ２７−Ａ２法に基づいて行ってもよい。
【００３６】
好ましくは、本発明において、スクリーニングする候補物質としてアゾール化合物を用いる場合、すなわち、アゾール系抗真菌剤の候補物質をスクリーニングする場合、真菌由来のＥＲＧ１１遺伝子またはＥＲＧ１１遺伝子の変異体が導入された酵母株、または各種真菌由来のＥＲＧ１１遺伝子が導入された酵母株から構成されるライブラリーまたはＥＲＧ１１遺伝子の変異体が導入された酵母株を含むライブラリーをスクリーニングに用いる。また、本発明において、スクリーニングする候補物質としてアリルアミン系化合物を用いる場合は、好ましくは、真菌由来のＥＲＧ１遺伝子またはＥＲＧ１遺伝子の変異体が導入された酵母株、または各種真菌由来のＥＲＧ１遺伝子が導入された酵母株から構成されるライブラリーまたはＥＲＧ１遺伝子の変異体が導入された酵母株を含むライブラリーをスクリーニングに用いる。また、本発明において、スクリーニングする候補物質としてアモルフィン系化合物を用いる場合は、好ましくは、真菌由来のＥＲＧ２４またはＥＲＧ２遺伝子あるいはＥＲＧ２４またはＥＲＧ２遺伝子の変異体が導入された酵母株、または各種真菌由来のＥＲＧ２４またはＥＲＧ２遺伝子が導入された酵母株から構成されるライブラリーあるいはＥＲＧ２４またはＥＲＧ２遺伝子の変異体が導入された酵母株を含むライブラリーをスクリーニングに用いる。
【００３７】
本発明においては、１つの本発明の酵母株を用いて候補物質をスクリーニングすることもできるが、２以上の本発明の酵母株からなるライブラリー、すなわち、本発明のライブラリーを用いることにより、効率的に候補物質をスクリーニングすることができる。本発明のライブラリーを用いれば、エルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の塩基配列の違い、すなわち、発現される酵素のアミノ酸配列の立体構造の違いを除き、全て同一の条件下で候補物質をスクリーニングすることができる。
【００３８】
また、本発明の酵母株またはライブラリーを用いれば、薬剤排出ポンプの発現量の増加やバイオフィルム形成などの抗真菌剤耐性の要因を排除して、候補物質を評価することができる。さらに、真菌の属間での比較は、培地、培養環境、培養時間、薬効判定方法など困難を伴うが、本発明の酵母株を用いれば、全て同一条件で比較することができる。したがって、本発明のスクリーニング方法を用いれば、膨大な数の候補物質を、様々な病原性真菌対する抗真菌作用の有無について同一条件下で迅速に検索することが可能である。したがって、本発明のスクリーニング方法は、特に、新規な抗真菌剤の一次スクリーニングとして有用であり、次いで、二次スクリーニングとして、選抜された候補物質を実際の病原性真菌を用いて検証することにより、迅速かつ効率的に新規抗真菌剤を取得することができる。
【００３９】
さらに、本発明の酵母株またはライブラリーを構成する各酵母株には、絶対寄生菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入することができるので、該酵母株またはライブラリーを用いることにより、試験管培養ができない絶対寄生菌に対する抗真菌剤の候補物質もスクリーニングすることが可能である。
【００４０】
さらに、本発明は、上記の本発明の酵母株またはライブラリーを含む、抗真菌剤の候補物質をスクリーニングするためのキットを提供する。該キットはさらに、培地および／または培養容器を含んでいてもよい。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。なお、以下の実施例において、酵母の分子遺伝学的実験手法は、以下の実験書に基づいて行った。
・Ｄ．Ｃ．Ａｍｂｅｒｇ，Ｄ．Ｊ．Ｂｕｒｋｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｎ．Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ：ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００５．
・水野貴之、バイオ実験イラストレイテッド７  使おう酵母  できるＴｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ、秀潤社．
また、分子生物学実験の各種方法は、以下のマニュアルを用いて行った。
・Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９．
【００４２】
実施例１  本発明の酵母株の作製
（１）宿主酵母および導入遺伝子
宿主酵母として、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを用いた。宿主酵母に導入するエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ由来のＥＲＧ１１を用いた。後記の方法にしたがい、ＥＲＧ１１をコードするポリヌクレオチドを得て、出芽酵母プラスミドＹＣｐｌａｃ１１１中に導入し、該プラスミドをＥＲＧ１１を破壊した宿主酵母株に導入した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＥＲＧ１１のコード配列を各々、配列番号２、３、および４に示す。
【００４３】
（２）出芽酵母ＥＲＧ１１を持つプラスミド（ＹＣｐｌａｃ１１１−ｓｃ  ＥＲＧ１１およびＹＥｐｌａｃ１９５−ｓｃＥＲＧ１１）の作製
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＢＹ４７４２株を文部科学省ナショナルバイオリソースプロジェクト［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏ−Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＮＢＲＰ）］「酵母」より入手した。該出芽酵母株から常法により、ゲノムＤＮＡを抽出した。
該ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法を用いて、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１１のコード領域と調節領域を含む領域を増幅した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１１のコード領域と調節領域（プロモーターおよびターミネーター）を含む配列を配列番号１に示す。ＰＣＲに使用したプライマーは、ＳＣ  ＥＲＧ１１−４５９ＵＰ（ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＣＡＣＧＡＡＡＡＡＣＧＡＧＡＣＡ）（配列番号５）およびＳＣ  ＥＲＧ１１−３００２ＬＯＷ（ＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴＧＡＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＣ）（配列番号６）である。前者のプライマーには５’末端側にＢａｍＨＩサイトを、後者にはＥｃｏＲＩサイトを新たに付加している。ＰＣＲ反応液の組成は、鋳型を１μｌ、ｄＮＴＰｓを最終濃度０．４ｍＭ、両プライマーを最終濃度０．３μＭ含み、加えてＫＯＤ−ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ）１Ｕと添付のバッファーを加えた。ＰＣＲプログラムは、９５℃で２分につづいて、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で３分を３０サイクル行った。アガロースゲル電気泳動により３ｋｂｐ程度の増幅産物を確認した後、新たに電気泳動を行ってゲルから目的ＤＮＡを回収した。
出芽酵母プラスミドＹＥｐｌａｃ１９５およびＹＣｐｌａｃ１１１（どちらも、ＮＢＲＰ「酵母」より入手）の両プラスミドと共に、前記の回収した目的ＤＮＡをＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで連結反応を行い、大腸菌に形質転換を行った。
【００４４】
（３）カンジダ菌ＥＲＧ１１を持つプラスミド（ＹＣｐｌａｃ１１１−ｃａ  ＥＲＧ１１およびＹＣｐｌａｃ１１１−ｃｇ  ＥＲＧ１１）の作製
Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ（系統名ＮＢＲＣ０６２２）およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（系統名  ＮＢＲＣ１３９３）を独立行政法人製品評価技術基盤機構より購入した。これらのカンジダ菌株から、常法により、ゲノムＤＮＡを抽出した。
該ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法を用いて、各カンジダ菌のＥＲＧ１１のコード領域を増幅した。使用した５’末端をリン酸化したプライマーは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓについて、ＣＡ  ＥＲＧ１１−１０００ＵＰ（ＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＴ）（配列番号７）およびＣＡ  ＥＲＧ１１−２５６８ＬＯＷ  （ＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＣＴＣ）（配列番号８）であり、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａについて、ＣＧ  ＥＲＧ１１−１０００ＵＰ（ＡＴＧＴＣＣＡＣＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＴＣ）（配列番号９）およびＣＧ  ＥＲＧ１１−２５８３ＬＯＷ（ＣＴＡＧＴＡＣＴＴＴＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴ）（配列番号１０）である。なお、これらのプライマーで増幅されるＤＮＡは各々のＥＲＧ１１のスタートコドンに始まって停止コドンまでの読み枠部分で、それ以外の配列を含まない。前記（２）と同様の手法（但し、ＰＣＲの伸長時間を１．５分に変更）により、１．５ｋｂｐ程度の断片を増幅し、精製した。
これらの断片を連結するプラスミドは、以下のように調製した。前記（２）で作製したＹＣｐｌａｃ１１１−ｓｃ  ＥＲＧ１１を鋳型にして、出芽酵母由来の調節領域とプラスミドをＰＣＲで増幅した。使用したプライマーは、ＳＣ  ＥＲＧ１１−２５９４ＵＰ（ＧＧＴＴＴＧＴＡＡＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＡ）（配列番号１１）およびＳＣ  ＥＲＧ１１−９８１ＬＯＷ（ＣＣＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＣＧＴＴＴＧＴＴ）（配列番号１２）である。これらのプライマーにより、ＹＣｐｌａｃ１１１−ｓｃ  ＥＲＧ１１の出芽酵母ＥＲＧ１１の読み枠だけが抜けた一本鎖ＤＮＡがＰＣＲにより増幅される。
このようにして得られたＹＣｐｌａｃ１１１−ｓｃ  ＥＲＧ１１由来のＤＮＡ断片と、前記のカンジダ菌由来のＤＮＡ断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼで連結した後、大腸菌に形質転換を行った。
【００４５】
（４）ＥＲＧ１１遺伝子破壊宿主酵母株の作製
出芽酵母ではＥＲＧ１１は生育に必須の遺伝子であるために、直接一倍体細胞の当該アレルを破壊すると致死となる。そこで、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＢＹ４７４３株由来の２倍体変異株ＥＲＧ１１／ｅｒｇ１１Δ：：ｋａｎＭＸ（片方のアレルが野生型ＥＲＧ１１であり、残りがカナマイシン耐性マーカーで破壊された株）（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社より購入）に、ＹＥｐｌａｃ１９５−ｓｃＥＲＧ１１プラスミドを導入して、ゲノム上のＥＲＧ１１遺伝子を破壊した一倍体出芽酵母株を作製した。この一倍体出芽酵母株は、ゲノム上のＥＲＧ１１は破壊されているが、導入したプラスミド上のＥＲＧ１１により生育することができる。
該２倍体変異株に前記（２）で作製したＹＥｐｌａｃ１９５−ｓｃＥＲＧ１１を導入し、該プラスミドのウラシル選択マーカーを指標にして導入株を選択した。つづいて、該導入株に減数分裂を行わせて、胞子（一倍体細胞）を生成させた。流動パラフィン抽出法により、生成した胞子を二倍体細胞から分離した。回収した胞子をウラシル欠乏合成培地にＧ４１８を添加した培地に植え付けた。この培地で生育したコロニーからマスタープレートを作製して、５−ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸）を含むプレートとＳＤ培地へレプリカした。ＹＥｐｌａｃ１９５のウラシル選択マーカーＵＲＡ３は、５−ＦＯＡを５−フルオロウラシルに変換し、宿主細胞に致死性を与える。３日程度培養を行って、ＳＤ培地で良好に生育して、かつ５−ＦＯＡ培地で生育できなかったものを目的の細胞として選択した。
【００４６】
（５）各種ＥＲＧ１１を導入した出芽酵母株の作製
前記（４）で作製した宿主酵母株に、前記（２）で作製したＹＣｐｌａｃ１１１−ｓｃ  ＥＲＧ１１、ＹＣｐｌａｃ１１１−ｃａ  ＥＲＧ１１、およびＹＣｐｌａｃ１１１−ｃｇ  ＥＲＧ１１を各々導入した。ロイシン欠乏培地で生育したコロニーをひろってマスタープレートを作製して、５−ＦＯＡを含むプレートとＳＤ培地へレプリカした。３日程度培養を行って、５−ＦＯＡ培地で生育した株を目的株とした。
かくして得られた酵母株は、各々、ゲノム上のＥＲＧ１１が破壊され、かつ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの調節領域に連結された各種ＥＲＧ１１が導入されたプラスミドを持つ株である。
【００４７】
実施例２  薬剤感受性試験（スポット・アッセイ法）
（１）酵母終夜培養希釈液の調製
実施例１（５）で得たＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＥＲＧ１１を有する酵母株、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａのＥＲＧ１１を有する酵母株、およびＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのＥＲＧ１１を有する酵母株を各々、クリーンベンチ内でＹＰＤ固形培地に植菌した。培地を３０℃に設定した培養器内で３日程度保温して、コロニーを形成させた。次に、クリーンベンチ内で、各々の株のコロニー１つを滅菌した竹串でかきとり、試験管内の１ｍｌのＹＰＤ液体培地に移植した。その試験管を同様に３０℃の培養器内で２４時間以上振とう培養を行った。培養が終了した試験管を用いて、クリーンベンチ内で以下の操作を行った。まず、滅菌したサンプルチューブに０．９ｍｌのＰＢＳを加え、それを一株につき５本用意した。良く撹拌した液体培養から０．１ｍｌをマイクロピペットで取り出し、用意した一本のチューブに加えて混合した。この操作により、１０倍希釈液を作製した。さらに、この希釈液から０．１ｍｌ取り出し、新しいチューブへ移し混合することで、さらに原液の１００倍希釈液を作製した。この操作を繰り返して、最終的に５本の希釈系列（１０倍、１００倍、・・・）を各株で作製した。
【００４８】
（２）各薬剤を含有するＹＰＤ固形培地の作製
各薬剤を含有する試験用固形培地は、以下のようにして作製した。ミコナゾール（Miconazole）、ボリコナゾール（Voriconazole）、アムホテリシンＢ（Amphotericin B）、およびカスポファンギン（Caspofungin）を和光純薬、東京化成工業またはシグマ・アルドリッチから入手した。各々の抗真菌剤をＤＭＳＯで溶解したストック溶液を作製した。メディウム瓶にＹＰＤと最終濃度２％になるように寒天末を加えて、オートクレーブ滅菌を行った。終了後、培地はウォーター・バスで６５℃に保温した。クリーンベンチ内で、３０ｍｌの培地を滅菌ピペットで取り出し、滅菌済のカップへ移した。そこへ、目的の最終濃度となるように、各薬剤のストック溶液をマイクロピペットを用いて加えて、十分に混合を行った。そして、滅菌シャーレに本液体を注ぎ、クリーンベンチ内で固化させると共に十分に乾燥を行った。同時に、対照として、薬剤を含有しないＹＰＤ固形培地も作製した。
【００４９】
（３）スポット・アッセイの実施
前記（２）で得られた固形培地をクリーンベンチ内に並べて、各酵母株の液体培養の希釈培養液をスポットした。スポットする際は、液体培養の入ったチューブを十分に攪拌したのち、マイクロピペットで１０μｌずつ固形培地の数ミリ上方から培地上に滴下を行った。全ての培養希釈系列を滴下して乾燥を行い、シャーレのふたをして、３０℃の培養器で２日間培養を行い、各培地上での酵母株の生育状況を観察した。
【００５０】
（４）結果
結果を図１に示す。図１から明らかなように、各種ＥＲＧ１１を有する酵母株において、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａは、アゾール系抗真菌剤のなかでもミコナゾールに対して同等の感受性を示したが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓはそれよりも耐性を示した。同様に、アゾール系抗真菌剤のなかでもボリコナゾールに対して、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａは同等の感受性を示したが、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓは、ミコナゾールの場合とは逆に、感受性を示した。一方、エルゴステロール生合成をターゲットとしない他の抗真菌剤アムホテリシンＢおよびカスポファンギンでは、これら３つの酵母株間で、感受性の変化は観察されなかった。したがって、本発明のＥＲＧ１１を有する酵母株がアゾール系抗真菌剤の候補物質のスクリーニングに有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明の酵母株を用いる抗真菌剤のスクリーニング方法では、酵母を同一の宿主として用いるので、様々な種類の病原性真菌について、均一の培養条件下で候補物質の薬効を評価することができる。また、該評価にあたり、バイオフィルム形成、ターゲットとするエルゴステロール生合成に関与する酵素の発現量、薬剤排出ポンプの発現量といった他の要因を考慮する必要がない。したがって、本発明によれば、膨大な数の候補物質を同一条件下で迅速にスクリーニングすることができる。さらに、本発明によれば、さび病菌やうどんこ病菌などの絶対寄生菌由来のエルゴステロール生合成に関与する酵素をコードする遺伝子を導入した酵母株を得ることができるので、従来実験室でのスクリーニングが不可能であった絶対寄生菌に対する抗真菌剤の候補物質のスクリーニングも可能となる。
【図１】
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【配列表】
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