(57)【要約】【課題】芳香族化合物の分解能を有する微生物、微生物製剤及びこれらを用いた芳香族化合物の分解方法を提供すること。【解決手段】本発明のスフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の同一性を示す塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、芳香族化合物の分解能を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の同一性を示す塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、芳香族化合物の分解能を有する、スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌。
【請求項２】
前記芳香族化合物が、式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物である、請求項１に記載の細菌。
【化１】
2016195562.tif 000013
（式（１）中、Ｒ１は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ２は、炭素数１〜３のアルキル基又は水酸基を表す。）
【化２】
2016195562.tif 000014
（式（２）中、Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシメチル基、ホルミル基又はカルボキシル基を表し、Ｒ４は及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は水酸基を表す。）
【請求項３】
前記式（１）で表される芳香族化合物において、前記Ｒ１が塩素原子であり、前記Ｒ２がイソプロピル基である、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
更に、アルカリホスファターゼ活性、エステラーゼ（Ｃ４）活性、及びエステラーゼリパーゼ（Ｃ８）活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項５】
配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２として寄託された、スフィンゴモナダセアエ科細菌。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌を含む、微生物製剤。
【請求項８】
前記式（１）又は前記式（２）で表される芳香族化合物に、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細菌又は請求項７に記載の微生物製剤を作用させることを含む、前記式（１）又は前記式（２）で表される芳香族化合物の分解方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芳香族化合物の分解能を有するスフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌、該細菌を含む微生物製剤、及びこれらを用いた芳香族化合物の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学や鉄鋼といった重化学工業等における排水は、有機物を除去し、ヒト及び環境生物に対する影響を十分に低下させた状態で自然環境中に排出することが望まれている。
【０００３】
排水に含まれる有機物は工場等によって様々であるが、例えば、芳香族化合物が含まれることがある。
【０００４】
有機物を除去するための排水処理方法としては、燃焼処理又は化合物分解性微生物を利用した生物学的処理方法等が用いられている。例えば、特許文献１には、有機物を含む排水を６００℃以上に加熱したチャンバー内に噴霧して含有有機物を熱分解・燃焼する排水の処理方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−７３９３８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
排水の燃焼処理は、有機物を除去するという観点からは有用な手段である。しかしながら、近年、地球環境に対する意識が社会全体で高まってきており、より環境に与える影響の少ない生物学的処理方法が注目されてきている。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑み、芳香族化合物の分解能を有する微生物、微生物製剤及びこれらを用いた芳香族化合物の分解方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、芳香族化合物を含む培地で活性汚泥を馴養し、その活性汚泥からスクリーニングすることで、芳香族化合物の分解能を有する新規のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を取得し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［８］に関する。
［１］配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の同一性を示す塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、芳香族化合物の分解能を有する、スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌（以下、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌と記すことがある。）。
［２］芳香族化合物が、式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物である、［１］に記載の細菌。
【化１】
2016195562.tif 000002
（式（１）中、Ｒ１は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ２は、炭素数１〜３のアルキル基又は水酸基を表す。）
【化２】
2016195562.tif 000003
（式（２）中、Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシメチル基、ホルミル基又はカルボキシル基を表し、Ｒ４は及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は水酸基を表す。）
［３］式（１）で表される芳香族化合物において、Ｒ１が塩素原子であり、Ｒ２がイソプロピル基である、［２］に記載の細菌。
［４］更に、アルカリホスファターゼ活性、エステラーゼ（Ｃ４）活性、及びエステラーゼリパーゼ（Ｃ８）活性を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の細菌。
［５］配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する、［１］〜［４］のいずれかに記載の細菌。
［６］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２として寄託された、スフィンゴモナダセアエ科細菌。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載の細菌を含む、微生物製剤。
［８］式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物に、［１］〜［６］のいずれかに記載の細菌又は［７］に記載の微生物製剤を作用させることを含む、式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物の分解方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、芳香族化合物の分解能を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌、該細菌を含む微生物製剤及びこれらを用いた芳香族化合物の分解方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌による化合物１分解の経時的変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
本明細書において、「芳香族化合物の分解能」とは、芳香族化合物を代謝して異なる化合物に変換する能力を指す。例えば、芳香族化合物として（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸（以下、化合物１という場合もある。）を用いた場合には、最終的に二酸化炭素と水に分解される。
【００１４】
（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌）
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌は、配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の同一性を示す塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、芳香族化合物の分解能を有する。本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が配列番号１に記載の塩基配列と、９９．３％以上の同一性を示してもよく、９９．４％以上の同一性を示してもよく、９９．５％以上の同一性を示してもよく、９９．６％以上の同一性を示してもよく、９９．７％以上の同一性を示してもよく、９９．８％以上の同一性を示してもよく、９９．９％以上の同一性を示してもよい。本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列と比較し、塩基の相違数が１塩基以下の塩基配列を有していてもよい。
【００１５】
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌は、芳香族化合物の分解能を有している。芳香族化合物としては、例えば、式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物が挙げられる。
【００１６】
【化３】
2016195562.tif 000004
【００１７】
式（１）中、Ｒ１は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ２は、炭素数１〜３のアルキル基又は水酸基を表す。アルキル基としては、直鎖状アルキル基であってもよく、分岐鎖アルキル基であってもよい。式（１）で表される芳香族化合物としては、例えば、（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸、２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸、２−フェニルブタン酸、２−ヒドロキシ−２−（４−クロロフェニル）酢酸、２−フェニル−３−メチルブタン酸が挙げられる。
【００１８】
【化４】
2016195562.tif 000005
【００１９】
式（２）中、Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシメチル基、ホルミル基又はカルボキシル基を表し、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は水酸基を表す。式（２）で表される芳香族化合物としては、例えば、カテコール、プロトカテキュ酸、プロトカテキュアルデヒド、安息香酸、ベンズアルデヒドが挙げられる。
【００２０】
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の芳香族化合物分解活性は、反応条件（基質の種類及び濃度、反応液の組成、温度、ｐＨ、菌体数等）によって変化する。例えば、後述する本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の代表的菌株を５０ｍｇ／ｍＬの湿菌体濃度で用いることで、１０００ｐｐｍの化合物１を３日間で、ほぼ完全に分解することができる。
【００２１】
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌は、芳香族化合物分解性の他に、更に、アルカリホスファターゼ活性、エステラーゼ（Ｃ４）活性、及びエステラーゼリパーゼ（Ｃ８）活性を有していてもよい。アルカリホスファターゼ活性とは、アルカリ性条件下でリン酸エステル化合物を加水分解する活性である。リン酸エステル化合物としては、例えば、２−ナフチルフォスフェイトが挙げられる。エステラーゼ（Ｃ４）活性とは、炭素鎖長４のカルボン酸エステル化合物を加水分解する活性である。炭素鎖長４のカルボン酸エステル化合物としては、例えば、２−ナフチルブチレイトが挙げられる。エステラーゼリパーゼ（Ｃ８）活性とは、炭素鎖長８のカルボン酸エステル化合物を加水分解する活性である。炭素鎖長８のカルボン酸エステル化合物としては、例えば、２−ナフチルカプリレイトが挙げられる。
これらの酵素活性は、アピザイム（シスメックス・ビオメリュー社製）等を用いた網羅的な酵素活性試験を行うことにより、測定してもよい。各酵素について公知の基質を用いる通常の酵素活性測定方法により上記酵素活性を測定してもよい。このような方法としては、例えば、市販されている酵素活性の評価キットを用いる方法であってもよく、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）等により、基質の分解物を測定する方法であってもよい。
【００２２】
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌としては、配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌が挙げられる。代表的な菌株としては、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌（受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２、原寄託日：２０１５年３月６日）として、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ、住所：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）にブダペスト条約に基づいて寄託されている菌株を挙げることができる。該菌株の菌学的性質については、後述する表１〜５に示す。
【００２３】
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌は、対象微生物の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の解析及び芳香族化合物の分解能の測定により、特定することができる。具体的には、対象微生物が、配列番号１に記載の塩基配列と９９％以上の同一性を示す塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有し、且つ、芳香族化合物の分解能を有していれば、その対象微生物は、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌であると特定できる。
【００２４】
塩基配列解析において、対象微生物のＤＮＡから１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅させる方法としては、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができるユニバーサルプライマーを用いるＰＣＲ法等がある。ＰＣＲ法により得られた増幅産物を、ＤＮＡシークエンサー等に供し、塩基配列を解析することができる。
【００２５】
芳香族化合物の分解能を調べる方法としては、例えば、対象微生物と、式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物とを、適切な培地又は緩衝液中で一定時間反応させた後、培地又は緩衝液中における式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物の分解を調べる方法が挙げられる。分解を調べる方法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＴＬＣ、ＮＭＲ、ＧＣ等を用いて上記芳香族化合物の量の減少を検出する方法等が挙げられる。これらの塩基配列解析及び芳香族化合物の分解能の試験の結果に基づき、対象微生物が本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌であるかを判断できる。
【００２６】
本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌は、これらの芳香族化合物の分解能を有することから、芳香族化合物を多く含む排水の処理等に有用である。
【００２７】
（微生物製剤）
本実施形態の微生物製剤は、上記Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を含む。
【００２８】
微生物製剤は、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の他に、必要に応じて、各種添加剤や担体を含むことができる。本実施形態の微生物製剤の具体例としては、細菌、添加剤及び担体を含み、細菌が、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌から実質的になる微生物製剤を挙げることができる。
【００２９】
担体としては、例えば、無機微粒子担体が挙げられる。無機微粒子担体としては、材質が金属及びその無機塩類又は酸化物であってもよく、炭素を含有するものであっても化学的に無機物に分類されるものであってもよく、又は有機態炭素の含有量が１％程度未満の純物質又は混合物であってもよい。無機微粒子担体としては、例えば、アルミナ（酸化アルミニウム）、ヒドロキシアパタイト（カルシウムリン酸ヒドロキシド）等の工業製品（規格外品や副産物、廃品を含む）、活性汚泥等の有機性廃棄物の焼却灰並びに火力発電又はコークス炉の燃えかすである石炭焼却灰等が挙げられる。
【００３０】
無機微粒子担体としては、中でも、安価であり、簡便な操作で得ることができ、また微生物の活性発現が短期間で生じるといった観点から、石炭焼却灰が好ましい。石炭焼却灰の中でも、クリンカアッシュ又はフライアッシュが好ましく、ふるい分け等を行わなくても中心粒子径が１００μｍ以下であることから、フライアッシュがより好ましい。無機微粒子担体としては、クリンカアッシュも粉砕して中心粒子径を調整することで、フライアッシュと同様に用いることができる。クリンカアッシュ又はフライアッシュの組成は、特に制限されるものではない。
【００３１】
無機微粒子担体の中心粒子径は、１μｍ〜１００μｍが好ましく、４μｍ〜７５μｍがより好ましく、１３μｍ〜２５μｍが更に好ましい。中心粒子径がこのような範囲の場合、対象化合物分解性微生物を含むバイオマス及び無機微粒子担体を混合した際に、両者が凝集しやすくなり、好適な量の対象化合物分解性微生物を含むバイオマスが無機微粒子担体に担持されやすくなる傾向にある。
【００３２】
無機微粒子担体の比重は、特に制限されないが、１．２〜３．５が好ましい。
【００３３】
無機微粒子担体は、培養初期の歩留まりを向上させることを目的として、必要に応じて、各種凝集剤を用いて凝集させてもよい。凝集剤としては、例えば、ノニオン性、カチオン性、アニオン性の高分子凝集剤等が挙げられる。
【００３４】
微生物製剤の製造方法としては、例えば、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌から実質的になる培養液又はバイオマス（活性汚泥等）と無機微粒子担体とを混合し、無機微粒子担体上に本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を担持させ、これを培養して得られる微生物製剤を回収する方法が挙げられる。
【００３５】
培養方法としては、回分、半回分、流加、連続のいずれの方式を用いてもよい。培養方法としては、例えば、増殖が遅く菌体収率の低い微生物を効率的に調製するという観点から、特開平９−１８７２７２号公報に記載されるように、微生物を培養する容器（以下、反応槽という）へ供給する対象化合物の濃度を培養時間の経過に伴い、対数増加させる連続培養方式を用いてもよい。
【００３６】
（芳香族化合物の分解方法）
本実施形態の式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物の分解方法は、式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物に、上記Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌又は上記微生物製剤を作用させることを含む。
【００３７】
式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物に作用させる際のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌又は微生物製剤の量は、対象となる芳香族化合物の種類、濃度、反応系の容積等を考慮し、適宜設定することができる。
【００３８】
本実施形態の分解方法における反応条件としては、本発明のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌が死滅しない又は該細菌が有する芳香族化合物の分解能が失われない条件であれば、特に制限されるものではない。このような条件としては、例えば、温度が２０〜３５℃であってもよく、２５〜３０℃であってもよく、ｐＨが６．５〜８．０であってもよく、７．０〜７．５であってもよい。
【００３９】
分解の確認方法は、特に制限されるものではなく、当業者が通常用いることができる方法により行われる。このような確認方法としては、例えば、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＴＬＣ、ＮＭＲ、ＧＣ等を用いて芳香族化合物の量の減少を検出する方法等が挙げられる。
【実施例】
【００４０】
実施例１．（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸（化合物１）分解性微生物群の探索
（方法）
化合物１を炭素源とした培地を用いて活性汚泥中に存在する微生物群を培養することにより、化合物１を分解する微生物を集積培養した。次に、集積培養された微生物群から、数菌株を単離し、単離された菌株の化合物１分解能を評価した。
【００４１】
（結果）
単離した数菌株のうち、一菌株に化合物１分解能が認められた。
【００４２】
実施例２．化合物１分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング及び塩基配列解析
（材料）
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，１．１Ｇ  ＰＥＲ  ＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をしたもの。
・ＬＢ寒天培地：ＬＢ  Ａｇａｒ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌し、これをプラスチックシャーレに約２５ｍＬずつ分注したもの。
・クローニング用フォワードプライマー（２７ｆ：配列番号２）
・クローニング用リバースプライマー（１４９２ｒ：配列番号３）
・シークエンス解析用プライマー（Ｍ１３Ｆ：配列番号４、Ｍ１３Ｒ：配列番号５、３３９Ｆ：配列番号６、５３６Ｒ：配列番号７、９０７Ｆ：配列番号８）
【００４３】
（方法）
実施例１で単離された一菌株からＤＮＡを抽出し、クローニングの鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００４４】
２５．０μＬの２×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）、１０．０μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（２ｍＭ）、１．５μＬのクローニング用フォワードプライマー及びクローニング用リバースプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５８μＬの鋳型ＤＮＡ、１０．４μＬの滅菌水、１．０μＬのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  ＦＸ、１Ｕ／μＬ、東洋紡社製）を、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをＰＣＲ装置に供し、鋳型ＤＮＡの増幅反応を行った。反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）５０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。ＰＣＲ後の増幅産物を精製し、クローニングに用いた。
【００４５】
増幅産物とＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、クローニングを行った。１μＬのｐＣＲＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ、１μＬの増幅産物、１μＬのＳａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３μＬの滅菌超純水を加えた反応液を室温で５分間混合後し、これを氷中に保存した。２μＬの上記反応液と５０μＬの大腸菌ＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ社製）とを混合し、これを氷中に３０分間静置した。静置後、４２℃で３０秒間インキュベートし、これを氷中に保存した。この反応液にＳＯＣ培地を４５０μＬ加えた後、得られた混合物を３７℃、２００ｒｐｍ、１時間振盪培養した。ＬＢプレート（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）に培養液を塗布し、これを培養（３７℃、２０時間）した。
【００４６】
得られた大腸菌ＤＨ５αのコロニーを１０株ピックアップし、ピックアップされた大腸菌ＤＨ５αを４ｍＬのＬＢ培地（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）で３７℃、１６時間培養した。得られた大腸菌ＤＨ５αからプラスミド抽出装置（ＱＩＡｃｕｂｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出することにより、プラスミド溶液を得た。
【００４７】
得られたプラスミド溶液３．０μＬと、ＥｃｏＲＩを５Ｕ相当量と、１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ  １μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１０．０μＬとした混合液を調製した。この混合液を、３７℃にて２時間インキュベーションした。インキュベーションを行った後、ＥｃｏＲＩ処理したサンプルを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子断片がＥｃｏＲＩにより切り出されていることを確認した。
【００４８】
プラスミド溶液１５０ｎｇ相当量と、シークエンス解析用プライマー（１０μＭ）０．３２μＬと、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）８．０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０．０μＬとした反応液を調製した。この反応液をＰＣＲ装置に供し、増幅反応を行った。反応は、（１）９６℃、１分間、（２）９６℃、１０秒間、（３）５０℃、５秒間、（４）６０℃、４分間で行い、（２）〜（４）の工程は２５サイクル繰り返し行った。得られた反応液をＤＮＡシーケンス解析に供して、化合物１の分解性を有する微生物群から抽出した鋳型ＤＮＡの塩基配列を決定した。決定した塩基配列はＲＤＰ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いて属レベルで由来を決定した。
【００４９】
（結果）
シークエンス解析に供した１０例全てが、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子であることが示唆された。１０例中８例は、配列番号１に記載の塩基配列を有しており、２例はＰＣＲ過程でエラーが入ったと思われる一塩基違いの配列を有していた。この結果から、配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌は、化合物１分解能を持つことが示唆された。以下、配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌を、本菌株と表すこともある。
【００５０】
実施例３．配列番号１に記載の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を有する細菌の同定試験
（方法）
本菌株について、形態観察及び生理・生化学的性状試験を行った。これらの試験は、光学顕微鏡による形態観察、ＢＡＲＲＯＷらの方法（Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｅｌ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９３、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ．）及びＡＰＩ２０ＮＥ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製、Ｌｙｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）によって行った。
【００５１】
（結果）
表１〜５に、本菌株の形態観察及び生理・生化学的性状試験の試験結果を示す。配列番号１に記載の塩基配列は、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属やＨｅｐｈａｅｓｔｉａ属などのＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に対して高い相同性を示し、中でも、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓａｎｘａｎｉｇｅｎｅｎｓ  ＮＸ０２株に対し、９８．２％の最も高い相同性を示した。しかし、配列番号１に記載の塩基配列と完全に一致する微生物は存在しなかった。また、今回の解析では、本菌株がＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属とＨｅｐｈａｅｓｔｉａ属のいずれに帰属するかは明らかではなかった。そのため、本菌株はＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌と推定された。
【００５２】
本菌株は、アルカリホスファターゼ活性、エステラーゼ（Ｃ４）活性、及びエステラーゼリパーゼ（Ｃ８）活性を有しているが（表５）、従来のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ属細菌にはこのような特徴がみられなかった。そのため、本菌株の帰属の推定はできず、新種であることが示唆された。本菌株をＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２とした。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
【表２】
2016195562.tif 000007
【００５５】
【表３】
2016195562.tif 000008
【００５６】
【表４】
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【００５７】
【表５】
2016195562.tif 000010
【００５８】
実施例４．Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２の芳香族化合物分解能解析
（方法）
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２のグリセロールストックを４．０ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で２日間前培養した。前培養液４．０ｍＬを１００ｍＬのＬＢ培地に添加し、３０℃で２日間培養後、化合物１（終濃度１００ｐｐｍ）を添加し、さらに１日間培養した。
【００５９】
培養終了後、培養液を６，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を生理食塩液２０ｍＬで洗浄後、湿菌体濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。懸濁液１．０ｍＬと２００〜２０００ｐｐｍの基質を含むリン酸緩衝液１．０ｍＬとをねじ口試験管に添加して、３０℃、２００ｒｐｍにて定期的にサンプリングしながら最大６日間反応させた。各種基質については表１及び２に示す。
【００６０】
反応液２００μＬをサンプリングし、遠心分離により沈殿物を除去し、上清を回収した。回収した上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  １００  Ｋ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に添加し、１４，０００×gで１０分間遠心分離することにより、限外ろ過を行った。得られたろ液１００μＬを、下記の条件による液体クロマトグラフィーを用いて解析した。
【００６１】
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１１（４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、５μｍ、住化分析センター社製)
移動相：Ａ液０．０１％ＴＦＡ、Ｂ液アセトニトリル
溶出方法：アイソクラティック
溶出条件：Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０分、４０：６０
２０分、４０：６０
流量：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【００６２】
・基質分解活性評価
反応前の反応液中の基質量に対する、反応後の反応液中の基質量をＨＰＬＣで解析し、基質残存率を評価した。このとき、基質の終濃度を１００ｐｐｍとした。各種評価は、◎：基質残存率０％、○：基質残存率０％以上５０％未満、△：５０％以上、とした。
【００６３】
・部分分解物生成評価
反応後の反応液中の基質及び部分分解物が、ＨＰＬＣチャート上ピークとして認められるか否かの評価を行った。このとき、基質の終濃度を１００ｐｐｍとした。各種評価は、○：ＨＰＬＣチャート上、部分分解物のピークが検出されなかった、×：ＨＰＬＣチャート上、部分分解物のピークが検出された、とした。
【００６４】
（結果）
図１には、湿菌体濃度５０ｍｇ／ｍＬのＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２を用いて、各種濃度の化合物１を分解した時の経時変化を示す。この結果、湿菌体濃度５０ｍｇ／ｍＬのＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は、化合物１濃度が１０００ｐｐｍであったとしても、３日間で化合物１を完全に分解できることが示された。
【００６５】
表６には、フェニル酢酸類縁体を基質としたときの結果を示す。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は、フェニル酢酸のα炭素に置換基（水酸基、エチル基、イソプロピル基）を有する芳香族化合物に対して分解活性が認められた。２−フェニル−３−メチルブタン酸及び２−（４-クロロフェニル）−３−メチルブタン酸に対しても分解活性が認められたことから、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は、ベンゼン環のパラ位が無置換でも塩素原子に置換されていても当該芳香族化合物を分解可能であることが示唆された。
【００６６】
表７には、カテコール類縁体を基質としたときの結果を示す。Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は、カテコールの水素原子が、ホルミル基又はカルボキシル基に置換されたプロトカテキュアルデヒド又はプロトカテキュ酸に対しても分解活性が認められた。更に、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は、これらの水酸基が脱離したベンズアルデヒド及び安息香酸に対しても、分解活性が認められた。
【００６７】
これらの結果から、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は、１０００ｐｐｍの化合物１を分解できることが示された。また、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２の芳香族化合物分解能を検討した結果、α炭素に置換基を有する４−クロロフェニル酢酸等のフェニル酢酸類縁体、並びに、カテコール及びその類縁体化合物に対しても、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は分解活性を示した。
【００６８】
【表６】
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【００６９】
【表７】
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【図１】
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【配列表】
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