(57)【要約】【課題】同種異系血管およびそれらを作製するための方法を提供すること。【解決手段】血管を再細胞化する(recellularize)方法であって、脱細胞化(decellularize)した血管に細胞の集団を導入する工程と、前記細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養し、それにより、血管を再細胞化する工程とを含む方法により、上記課題を解決する。【選択図】図７
2016144470.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオエンジニアリングによって作製される血管を調製するin vitroまたはex vivoの方法であって、内皮細胞および平滑筋細胞ならびに/または内皮細胞および平滑筋細胞の前駆細胞を含む全血を、管状で無細胞の足場の内腔に導入する工程と、前記細胞を培養する工程であって、培養された前記細胞が前記管状で無細胞の足場に集合し、前記バイオエンジニアリングによって作製される血管を生成する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記管状で無細胞の足場が脱細胞化した血管である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記管状で無細胞の足場の内腔に全血を導入する工程が注射または灌流によるものである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記培養する工程が、内皮細胞培地および/または平滑筋細胞培地の灌流を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記内皮細胞培地および前記平滑筋細胞培地の灌流が交互に行われる、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記交互に行われる灌流を少なくとも2回繰り返す、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞を管状で無細胞の足場の内腔上で培養する工程により、該細胞が内皮細胞および平滑筋細胞に増殖および/または分化する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記内皮細胞が前記管状で無細胞の足場の内壁または内腔を覆い、前記平滑筋細胞が該管状で無細胞の足場の壁に遊走するまたは中層および外層にわたって存在する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記内皮細胞がVE-カドヘリン、AcLDL、vWF、またはCD31を発現する、請求項1、7、または8に記載の方法。
【請求項１０】
前記平滑筋細胞が平滑筋アクチンまたはビメンチンを発現する、請求項1、7、または8に記載の方法。
【請求項１１】
前記血管が静脈または動脈である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管グラフトをそれを必要とする対象に導入する方法における使用のための、再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管であって、
a. 内皮細胞および平滑筋細胞ならびに/または内皮細胞および平滑筋細胞の前駆細胞を含む対象由来の全血を、管状で無細胞の足場の内腔に導入する工程と、
b. 前記細胞を前記管状で無細胞の足場の内腔上で培養し、それにより前記再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管を調製する工程と
を含むin vitroまたはex vivoの方法によって調製される、再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項１３】
前記管状で無細胞の足場が、同種異系ドナー由来の脱細胞化した血管である、請求項12に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項１４】
前記対象由来の全血を管状で無細胞の足場の内腔に導入する工程が、注射または灌流によるものである、請求項12に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項１５】
前記培養する工程が、内皮細胞培地および/または平滑筋細胞培地の灌流を含む、請求項12に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項１６】
前記内皮細胞培地および前記平滑筋細胞培地の灌流が交互に行われる、請求項15に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項１７】
前記交互に行われる灌流を少なくとも2回繰り返す、請求項16に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項１８】
前記細胞を管状で無細胞の足場の内腔上で培養する工程により、該細胞が内皮細胞および平滑筋細胞に増殖および/または分化する、請求項12に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項１９】
前記内皮細胞が前記管状で無細胞の足場の内壁または内腔を覆い、前記平滑筋細胞が該管状で無細胞の足場の壁に遊走するまたは中層および外層にわたって存在する、請求項18に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項２０】
前記内皮細胞がVE-カドヘリン、AcLDL、vWF、またはCD31を発現する、請求項12、18、または19に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項２１】
前記平滑筋細胞が平滑筋アクチンまたはビメンチンを発現する、請求項12、18、または19に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項２２】
静脈または動脈である、請求項12に記載の再細胞化されたバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項２３】
請求項1に記載の方法によって作製される、ヒトの対象のバイオエンジニアリングによって作製される血管。
【請求項２４】
再細胞化された血管グラフトの製造における、請求項23に記載のヒトの対象のバイオエンジニアリングによって作製される血管の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体が本明細書に組み込まれる2012年3月16日出願の米国仮出願第61/611,810号の優先権および利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
血管疾患は、世界中で何百万人が経験している、増加している健康問題の1つである。冠動脈バイパス心臓手術などの一般的な血管に関する外科手技では、多くの場合、血管の外科的交換が必要とされる。移植または埋め込み用の血管の現在の供給源としては、患者自身の血管(すなわち、肢由来)、ドナーからの組織適合血管、動物由来の血管、および人工血管または合成グラフトが挙げられる。残念ながら、これらの交換血管の供給源には多くの不都合および合併症、例えば、使用可能な同種異系血管が不十分であるまたは欠乏していること、ドナーが不足していることおよび利用できないこと、開通性が不十分であること、移植片拒絶反応、長さの制限、免疫抑制、ならびに血栓性合併症などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許第6,753,181号
【特許文献２】米国特許第6,376,244号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、同種異系血管およびそれらを作製するための方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、同種異系血管を作製するための材料および方法を特徴とする。
【０００６】
本発明は、血管を再細胞化する(recellularize)方法であって、脱細胞化(decellularize)した血管に細胞の集団を導入する工程と、前記細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養し、それにより、血管を再細胞化する工程とを含む方法を提供する。
【０００７】
本発明は、血管グラフトを患者に提供するための方法であって、対象由来の細胞の集団を脱細胞化した血管に送達する工程と、前記細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養する工程とを含む方法を特徴とする。いくつかの態様では、脱細胞化した血管は同種異系ドナー由来のものである。
【０００８】
一態様では、細胞の集団は全血、骨髄、または幹細胞由来のものである。
【０００９】
別の態様では、細胞の集団は、内皮細胞および平滑筋細胞を含む。幹細胞はCD133+発現細胞である。
【００１０】
別の態様では、細胞の集団をin vitroにおいて増殖させ、内皮細胞および平滑筋細胞に分化させた後に、脱細胞化した血管に内皮細胞および平滑筋細胞を導入する。
【００１１】
別の態様では、脱細胞化した血管に細胞の集団を注射または灌流によって導入する。
【００１２】
別の態様では、細胞の集団を培養する工程は、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流を含む。内皮細胞培地および平滑筋細胞培地の灌流を交互に実施する。交互に実施することを少なくとも2回繰り返す。
【００１３】
別の態様では、細胞の集団を脱細胞化した血管上で培養する工程により、細胞の集団が内皮細胞および平滑筋細胞に分化する。いくつかの実施形態では、内皮細胞は脱細胞化した血管の外側壁を覆い、前記平滑筋細胞は脱細胞化した血管の内腔壁を覆う。
【００１４】
前述の方法のいずれにおいても、内皮細胞はVE-カドヘリン、AcLDL、vWFまたはCD31を発現する。前述の方法のいずれにおいても、平滑筋細胞は平滑筋アクチンまたはビメンチンを発現する。
【００１５】
一態様では、細胞の集団を培養する工程は、in vitroにおけるものである。
【００１６】
血管は、静脈または動脈である。
【００１７】
本発明は、本明細書に記載の方法のいずれか1つによって作製される血管を特徴とする。
【００１８】
本発明は、埋め込むための、本明細書に記載の方法のいずれか1つによって作製される血管の使用も特徴とする。
【００１９】
特に定義されていなければ、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を用いることができるが、適切な方法および材料が下に記載されている。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含めた本明細書に支配される。
【００２０】
本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細は、付属図および以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、および利点は、図および発明の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】臨床的手技および外科手技の前後の手術領域の像を示す図である。(A)初回手術前の診断CT血管造影を示す。画像は、肝臓の左側部分に濃縮された肝内門脈流を示す(i)。側枝により門脈が供給されているが、連続した外門脈は見ることができない(ii)。脾臓が拡大し、食道の周りおよび肝門部に側枝を見いだすことができる。(B〜C)SMVと左門脈の間のグラフトを使用した上首尾の外科的矯正を示す(meso-Rex)。幹細胞由来静脈がSMVに吻合されている(i)静脈グラフトが左門脈に吻合されている(ii)手術中の超音波により、グラフトおよび肝内門脈において毎秒25〜40cmの血流が示された。(E)外科手術の1週間後の開通性グラフト(i)を示すCT血管造影を示す。画像はグラフトの方向をよりよく可視化するために3〜4枚の画像を使用して再構築したものである。
【図２】脱細胞化の前後の腸骨静脈の肉眼で見える写真および顕微鏡レベルの写真である。(A)死亡したドナーから得た元の血管を示す。腸骨静脈のヘマトキシリン・エオシン染色により、ネイティブなグラフトに核(青色)が存在すること(B)および明白な内皮層が存在することが示される。同じ静脈の免疫組織学的検査により、ECおよびSMCはMHCクラスIIを構成的に発現しないのでMHCクラスI(C;黒褐色染色)は存在するがMHCクラスIIは存在しないことが示されている(D)。(E)7サイクルの界面活性剤-酵素処理後の半透明の腸骨静脈を示す。脱細胞化した組織は構造的完全性を維持したが、青色に染色された細胞核(F)、MHCクラスI(G)およびMHCクラスII(H)が存在しないことにより、管腔側ならびにマトリックスが完全に無細胞であることが示される。XM-ONEキットを使用してフローサイトメトリー分析を実施して、抗内皮細胞抗体を検出した。代表的なヒストグラムにより、抗内皮細胞抗体の結合が存在しないが(I)、陽性対照血清を用いると陽性反応が得られた(J)ことが実証されている。黒い線は、陰性対照を示す。拡大率はB-H 20×である。
【図３】チャンバースライド上で成長させたレシピエントの内皮細胞および平滑筋細胞の免疫蛍光法染色を示す図である。抗体に対して陽性に染色された細胞は緑色であり、核は青色である。(A)内皮細胞はVE-カドヘリン、AcLDLおよびvWFに対して陽性である。(B)特異的マーカーであるアルファ-アクチンおよびビメンチンに対して陽性に染色された平滑筋細胞を示す。(A)の拡大率は40×であり、(B)の拡大率は20×である。
【図４】バイオエンジニアリングによって作製された静脈グラフトの肉眼で見える写真および顕微鏡レベルの写真である。2つのバイオエンジニアリングによって作製された静脈グラフト(A-グラフト1)および(B-グラフト2)の肉眼写真である。CおよびDは、免疫組織学的検査および免疫蛍光法についての陰性対照を示す。レシピエントの幹細胞と一緒に2週間播種インキュベートした後、血管壁のEC単層が集密であること、および培地中に平滑筋細胞が存在することよって証明されるように、グラフトは完全に再細胞化した(E〜J)。グラフト1由来のパラフィン切片のIHC染色(褐色)により、内腔の90%を覆う内皮細胞(E)および弁(F)が明白に存在することが示されている。(G)培地中に平滑筋細胞が存在することも目に見えた。グラフト2のIF染色により、同様の結果が示された。EC(緑色)が内腔(H)および弁(I)において検出され、SMC(赤色)が培地において検出される。拡大率は20×である。
【図５】移植後の像を示す図である。(A)画像は、移植の1年後に、グラフト(グラフト1)が門脈において狭まったが開通性であったことを示す。画像は、グラフトの全長を可視化するために3〜4枚の画像を使用して再構築したものである。SMV(i)における静脈の直径は6mmであり、左門脈(ii)の4mmに近い。(B)SMV吻合の部位における一次グラフトが示されている(i)。血管は薄い壁で囲まれ、開通性である。(C)左側の門脈吻合(ii)の近くの一次グラフトであり、狭まったグラフトが結腸間膜由来の組織によって部分的に狭窄していることが示されている。したがって、meso-Rexシャントの外科的矯正を、第2の幹細胞由来静脈グラフトを使用して行った。(D)超音波切開器具(CUSA)を使用して左門脈をさらに肝臓まで切開し、結腸間膜における狭窄を引き起こしている組織を放出した後の左門脈吻合の完了を示す画像である(iii)。(E)新しいグラフトを古いSMV吻合にパッチングすることによる遠位吻合の完了を示す画像である。これを24時間後に修正し、SMVの開口部を延長した後に吻合を拡大した。(F)グラフトにおける、毎秒20cmを超える元に戻った血流(G)および毎秒25〜40cmの良好な肝内門脈血流を実証している超音波画像である。
【図６】バイオリアクターの概略図である。示されているように、血管がチャンバーの中央にあり、培地がパイプを通って供給される。矢印の方向はパイプ中の溶液の流れを示す。
【図７】4つのドナー静脈(左側の写真)、脱細胞化後(中央の写真)、および再細胞化後(右側の写真)の一連の写真である。
【図８】正常な静脈(上のパネル)および脱細胞化した静脈(DC、下のパネル)における核のHE染色による組織学的分析を示す図である。9サイクルの脱細胞化後に核の染色は観察されなかった。
【図９】正常な静脈(上のパネル)および脱細胞化した静脈(DC、下のパネル)のマッソントリクローム(MT)染色による組織学的分析を示す図である。9サイクルの脱細胞化後に核の染色は観察されなかった。MT染色によっても、脱細胞化した静脈においてコラーゲンが保存されていることが示された。
【図１０】正常な静脈(上のパネル)および脱細胞化した静脈(DC、下のパネル)のVernhoeff Von Gieson(VVG)染色による組織学的分析を示す図である。9サイクルの脱細胞化後に核の染色は観察されなかった。VVG染色によっても、脱細胞化した静脈においてエラスチン(およびエラスチン環)ならびにコラーゲンが保存されていることが示された。
【図１１】正常な静脈(左側のパネル)および脱細胞化した静脈(DC、右側のパネル)の染色による組織学的分析を示す図である。染色により、脱細胞化した静脈においてI型コラーゲン(上のパネル)およびIV型コラーゲン(下のパネル)が保存されていることが示された。
【図１２】正常な静脈(左側のパネル)および脱細胞化した静脈(DC、右側のパネル)のVernhoeff Von Gieson(VVG)染色による組織学的分析を示す図である。VVG染色により、脱細胞化した静脈においてフィブロネクチン(上のパネル)およびラミニン(下のパネル)が保存されていることが示された。
【図１３】それぞれゲル電気泳動、sircolアッセイ、およびbislycanアッセイによって決定された、脱細胞化後のDNA、コラーゲン、およびグルコサミノグリカン(GAG)のレベルの定量を示す図である。DNAゲル(右上のパネル)は、ラダー対照(L)、脱細胞化した静脈(DC)および正常な静脈(N)を示す。コラーゲンレベルをsircolアッセイによって測定した:表(中央左側)に生のデータが示されており、定量についてはグラフ(中央右側)に示されている。グルコサミノグリカン(GAG)レベルをbislycanアッセイによって測定した:表(下の左側)に生のデータが示されており、定量についてはグラフ(下の右側)に示されている。
【図１４】正常な静脈における17種の血管新生増殖因子のレベルを脱細胞化した静脈と比較して示す図である。生のデータが表(左側)に示されており、定量についてはグラフ(右側)に示されている。
【図１５】HEを用いた組織学的染色を示す図であり、再細胞化した静脈の内層、中層および外層に核が存在することが実証されている。再細胞化した静脈には2サイクルの灌流(上のパネル)または4サイクルの灌流(下のパネル)を行った。
【図１６】マッソントリクローム(MT)を用いた組織学的染色を示す図であり、核、細胞質、および細胞のコラーゲンへの付着が存在することが確認される。
【図１７】Vernhoeff Von Giesen(VVG)を用いた組織学的染色を示す図であり、核、細胞質、および細胞のコラーゲンへの付着が存在することが確認される。
【図１８】内皮細胞マーカーおよび平滑筋細胞マーカーについての免疫蛍光法染色を示す図である。CD31染色(上のパネル)およびVWF染色(中央のパネル)により、静脈の内膜に向かう内皮細胞が存在することが確認された。SMA染色(下のパネル)により、平滑筋細胞が存在することが確認された。
【図１９】平滑筋アクチンについての免疫組織学的染色を示す図であり、静脈の中層および外層に紡錘状の平滑筋細胞が存在することが確認された。
【図２０】デオキシコール酸ナトリウム(SDC)による脱細胞化後の平滑筋アクチンの免疫組織学的染色を示す図である。
【図２１】デオキシコール酸ナトリウム(SDC)による脱細胞化後の平滑筋アクチンの免疫組織学的染色を示す図である。
【図２２】デオキシコール酸ナトリウム(SDC)による脱細胞化後の平滑筋アクチンの免疫組織学的染色を示す図である。
【図２３】引っ張り強さアッセイの定量および静脈調製物および試験の像を示す図である。測定された力の総計(左側のグラフ)および伸長(右側のグラフ)の箱ひげ図は、張力試験の結果を示す。NHVはネイティブなヒト静脈であり、DCHVは脱細胞化したヒト静脈であり、RCHVは再細胞化したヒト静脈である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、外科的に埋め込むために適した血管を、脱細胞化し、その後にグラフトのレシピエント由来の自己細胞によって再細胞化した、死亡したドナー静脈から首尾よくバイオエンジニアリングによって作製することができるという驚くべき発見に基づく。この手法は、血栓症、慢性深部静脈機能不全、静脈閉塞症または静脈逆流に起因してバイパス外科手術または血管静脈シャントを必要とする患者に対して検討することができる。さらに、この技法により、終生免疫抑制の必要性がなくなり、また、この技法は、以前の血管移植による解決法よりも利益が大きくリスクが低い有望かつ安全な臨床的手法である。
【００２３】
本発明は、血管を脱細胞化するための方法を提供する。細胞外マトリックス(ECM)の完全性を保存しながら内在性細胞を除去することを包含する血管を脱細胞化するための方法が本明細書に記載されている。本明細書に記載の脱細胞化のプロセスでは、2種以上の異なる細胞破壊溶液の逐次的処理をいくつかのサイクルで利用する。好ましい実施形態では、脱細胞化は、当技術分野で公知のさまざまな方法によって検出したところ核が残っていない場合に実現され得る。血管は、静脈であっても動脈であってもよい。血管はドナー由来であってよい。いくつかの実施形態では、ドナーは死亡している。他の実施形態では、ドナーは、HLAまたは組織適合ドナー由来であってよい。
【００２４】
本発明は、脱細胞化した血管を再細胞化するための方法であって、脱細胞化した血管に細胞の集団を導入する工程と、前記細胞の集団を脱細胞化した血管上で、およびその中で培養する工程とを含む方法も提供する。本明細書に記載の方法は、細胞の集団を増殖させ、細胞の集団を機能的な内皮細胞および平滑筋細胞に分化させて機能的な血管を作製するために有用である。
【００２５】
一実施形態では、再細胞化のために利用する細胞の集団は、幹細胞もしくは前駆細胞、例えば、骨髄由来の幹細胞もしくは前駆細胞、またはCD133を発現している細胞(CD133+細胞)に由来する。幹細胞または前駆細胞は、当技術分野で公知の方法によって増殖させ、in vitroにおいて内皮細胞および/または平滑筋細胞に分化させることができる。例えば、幹細胞または前駆細胞を、内皮細胞および/または平滑筋細胞への分化を開始させる特定の増殖因子および補充物質の存在下で培養することができる。いくつかの態様では、分化細胞は、脱細胞化した血管に導入する前に最終分化していなくてよいが、少なくとも1種の内皮細胞マーカー(すなわち、CD31もしくはvWF)または少なくとも1種の平滑筋細胞マーカー(すなわち、平滑筋アクチン)を発現している。本明細書に記載の幹細胞に由来する内皮細胞および平滑筋細胞を、脱細胞化した血管に、例えば、灌流によって導入する。内皮細胞および平滑筋細胞を培養する工程は、所望の再細胞化が実現されるまで交互のサイクルで細胞および血管を内皮細胞培地または平滑筋細胞培地と一緒にインキュベートすることを含む。
【００２６】
生後の脈管形成は、循環している内皮前駆細胞(EPC)による成人における新しい血管の形成であり、血管新生は、既存の内皮細胞からの新しい血管の形成である(Ribatti Dら、2001)。これらの2つのプロセスは、血管枝の形成、および創傷治癒、虚血、骨折治癒、腫瘍の成長などのような病原性の状態に寄与する(Laschkeら、2011)。循環中、全血中には内皮細胞および内皮前駆細胞が共存しており、内皮前駆細胞は血管化に寄与する(Asahara Tら、1997)。さらに、平滑筋細胞の前駆細胞も循環している全血中に存在する(Simper Dら、2002)。
【００２７】
別の実施形態では、再細胞化のために利用する細胞の集団は、全血に由来するものである。脱細胞化した血管の再生に全血を使用することにより、骨髄または全血から血管新生前駆細胞の亜集団を単離し、増殖させる必要なく、血管が効率的に再細胞化される。脱細胞化した血管に、例えば、灌流によって全血を導入する。
【００２８】
本発明には、現在利用可能な血管グラフトの選択肢に対する利点が多く存在する。本発明は、以下の利点を有する自己由来の工学的に作製された血管を提供する:1)非免疫原性であり、したがって、グラフト拒絶または有害な免疫応答のリスクが最小である;2)免疫抑制の必要性がなくなり、したがって、患者に対する外科手術後、およびその生涯にわたるリスクが少ない;3)長さの制限がない;4)適合するドナー血管または自己由来の血管と比較して容易に入手可能である;5)天然の構成成分(すなわち、ECM、内皮細胞および平滑筋細胞)で構成され、したがって、残留する血管新生増殖因子および生体力学的完全性の保存を含めた、大部分の合成血管および人工血管よりも優れた品質を有する;6)血管の作製が、移植のために自己由来の血管を採取することと比較して浸潤性が少ない;7)全血細胞の使用により、対象に対する急速かつ低侵襲の手順が可能になる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「対象」とは哺乳動物を包含する。哺乳動物は、例えば、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、鳥類、マウス、ラット、家禽、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジまたはブタであってよい。哺乳動物はヒトであることが好ましい。本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」とは、血管グラフトもしくは移植を必要とする血管疾患もしくは障害を有する対象、または血管グラフトもしくは移植を必要とする血管疾患もしくは障害が発生するリスクが集団全体と比較して増加している対象である。
【００３０】
血管の脱細胞化
本発明は、血管を脱細胞化するための方法および材料を提供する。本明細書で使用される場合、「脱細胞化」とは、細胞外マトリックス(ECM)足場の3次元構造が残存するように血管から細胞を除去するプロセスを指す。物理的方法ならびに化学的作用剤および生物学的作用剤を組み合わせて使用して細胞を溶解し、多くの場合、その後にすすぐ工程を続けて細胞残余物および壊死組織片を除去する。有効な脱細胞化は、組織の密度および組織化、最終産物に望ましい幾何的性質および生物学的性質、ならびに標的化臨床的適用などの因子によって規定される。ECMの完全性を保存しながら血管を脱細胞化し、当業者が、例えば、プロセスの間に特定の作用剤および技法を選択することによって生物活性を最適化することができる。
【００３１】
脱細胞化のために最も有効な作用剤は、血管の細胞充実性、密度、脂質含量、および厚さを含めた多くの因子に左右される。大部分の細胞除去剤および方法によりECM組成が変更され、ある程度の超微細構造の破壊が引き起こされる可能性があるが、これらの望ましくない影響を最小化することが好ましいことが理解されるべきである。当業者は、本明細書に記載の通り、脱細胞化プロセスを容易に最適化して、ECM足場の破壊を最小限にすることができる。
【００３２】
血管を脱細胞化するために1種または複数種の細胞破壊溶液を使用することができる。細胞破壊溶液としては、一般に、SDS、PEG、またはトリトンXなどの少なくとも1種の界面活性剤が挙げられる。特に好ましい界面活性剤はトリトンXである。細胞破壊溶液は水を含む場合があり、したがって当該溶液は浸透圧的に細胞と適合しない。あるいは、細胞破壊溶液は、細胞に対して浸透圧を適合させるための緩衝液(例えば、PBS)を含んでよい。細胞破壊溶液は、これだけに限定することなく、1種または複数種のコラゲナーゼ、1種または複数種のディスパーゼ、1種または複数種のDNase、またはトリプシンなどのプロテアーゼなどの酵素も含んでよい。いくつかの場合には、細胞破壊溶液は、それに加えてまたはその代わりに、1種または複数種の酵素阻害剤(例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、および/またはコラゲナーゼ阻害剤)を含んでよい。
【００３３】
ある特定の実施形態では、血管を、2種以上の異なる細胞破壊溶液を用いて逐次的に処理することができる。例えば、第1の細胞破壊溶液は1%トリトンX-100(×100、Sigma、Sweden)を含有し、第2の細胞破壊溶液は1%トリn-ブチルホスフェート(TNBP)28726.1、VWR、Sweden)を含有し、第3の細胞破壊溶液は0.004mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)(D7291、Sigma、Sweden)を含有する。逐次的処理は、処理の連続において細胞破壊溶液の少なくとも1つを用いて反復処理することを含んでよい。いくつかの態様では、血管を、所望のレベルの脱細胞化が実現されるまで、1種または複数種の細胞破壊溶液の逐次的処理を同じ順序で含む脱細胞化サイクルによって処理することができる。いくつかの実施形態では、好ましい脱細胞化サイクルの数は、少なくとも2サイクル、少なくとも3サイクル、少なくとも4サイクル、少なくとも5サイクル、少なくとも6サイクル、少なくとも7サイクル、少なくとも8サイクル、少なくとも9サイクル、少なくとも10サイクル、少なくとも11サイクル、少なくとも12サイクル、少なくとも13サイクル、少なくとも14サイクル、少なくとも15サイクル、少なくとも16サイクル、少なくとも17サイクル、少なくとも19サイクル、または少なくとも20サイクルである。所望の脱細胞化のために必要なサイクルの数は、核、HLAクラスI抗原またはHLAクラスII抗原、および血管中に細胞が存在することの他の指標の存在をモニタリングすることによって決定する。好ましい脱細胞化のレベルは、脱細胞化した血管に核が存在しないことによって示される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、各細胞破壊溶液は、抗生物質(すなわち、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシン)、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩二水和物(EDTA)、および/またはフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)などの追加的な構成成分をさらに含んでよい。例えば、DNase Iを含む細胞破壊溶液は、酵素を活性化するために塩化カルシウムおよび塩化マグネシウム(A12858、Life Technologies)も含んでよい。
【００３５】
血管を脱細胞化するための細胞破壊溶液を用いて血管を処理するために、灌流方法を使用することができる。灌流の方向を交互にすること(例えば、順行性および逆行性)が、血管を有効に脱細胞化するために役立つ。本明細書に記載の脱細胞化では、基本的に血管を内側から外側に脱細胞化し、それにより、ECMの損傷が非常に少なくなる。組織および特定の界面活性剤のサイズおよび重量ならびに細胞破壊溶液中の界面活性剤の濃度に応じて、血管を、一般に、組織1グラム当たり約2時間〜約12時間、細胞破壊培地を用いて灌流する。洗浄を含めて、最大で組織1グラム当たり約12時間〜約72時間、臓器を灌流することができる。灌流は、一般に、拍動流、速度および圧力を含め、生理的条件に調整する。本明細書に記載の灌流脱細胞化を、例えば、米国特許第6,753,181号および同第6,376,244号に記載の浸漬脱細胞化と比較することができる。
【００３６】
好ましい実施形態では、血管を脱細胞化するために、血管に細胞破壊溶液を満たし、同時に撹拌することができる。異なる細胞破壊溶液を逐次的な順序で加え、所望のレベルの脱細胞化が実現されるまでこの順序を多数回繰り返すことができる。例えば、静脈の一端は開いたままでよいが、残りの開口部(すなわち、剥離および枝)を縫合して漏出を予防した。静脈を、まず、抗生物質(0.5%ペニシリン、0.5%ストレプトマイシンおよび0.5%アンホテリシンB)を含有するPBSですすぐことができる。次いで、静脈を72時間にわたって蒸留水ですすぐことができる。各脱細胞化サイクルは、1%トリトンXと一緒に3時間インキュベートし、その後、1%TnBPと一緒に3時間インキュベートし、0.004mg/mlのDNase Iと一緒に3時間インキュベートすることからなることが好ましい。最後に、血管を、蒸留水を用いて一晩洗浄して、細胞壊死組織片を除去することができる。各インキュベーションにおいて、静脈に、細胞破壊溶液を満たすことができ、クランプして閉じることができる。次いで、静脈を撹拌器に入れ、37℃でインキュベーション時間(3時間または一晩)にわたって穏やかに振とうすることができる。各インキュベーションの最後に、血管の内容物を除去し、血管をPBSですすいだ。撹拌を加えた7〜9サイクル(トリトンXで洗浄、TnBPで洗浄、DNase Iで洗浄および水で洗浄)後、静脈を、PBSを用いて48時間にわたって連続的に洗浄することができ、ここでPBSは6時間ごとに交換した。さまざまな濃度の界面活性剤(トリトンXまたはTnBP)を必要に応じてまたは当業者の自由裁量で利用することができる。さまざまな濃度の酵素、例えば、DNaseなどを必要に応じてまたは当業者の自由裁量で利用することができる。
【００３７】
場合によって、脱細胞化した血管を再細胞化工程の前に滅菌することができる。例えば、脱細胞化した血管を滅菌PBS中0.1%過酢酸中で1時間インキュベートし、その後、滅菌水およびPBSを用い、各溶液で4時間洗浄する。
【００３８】
本明細書で示されている通り、脱細胞化した血管は、血管木の細胞外マトリックス(ECM)構成成分から本質的になる。ECMの構成成分は、以下のいずれかまたは全てを含んでよい:フィブロネクチン、フィブリリン、ラミニン、エラスチン、コラーゲンファミリーのメンバー(例えば、I型コラーゲン、III型コラーゲン、およびIV型コラーゲン)、グルコサミノグリカン、基質、細網線維およびトロンボスポンジン、これは、基底板などの定義済みの構造として組織化されたままであってよい。上首尾の脱細胞化とは、標準の組織学的染色手順を使用して、組織学的切片に検出可能な筋フィラメント、内皮細胞、平滑筋細胞、および核が存在しないことと定義される。残留する細胞壊死組織片も脱細胞化した臓器または組織から除去することが好ましいが必要ではない。
【００３９】
同種異系血管を有効に再細胞化し、生成するためには、脱細胞化のプロセスの間およびその後に、ECMの形態および構築様式が維持される(すなわち、実質的にインタクトなままである)ことが重要である。「形態」とは、本明細書で使用される場合、臓器もしくは組織、またはECMの全体的形状を指し、一方「構築様式」とは、本明細書で使用される場合、外面、内面、およびそれらの間のECMを指す。ECMの形態および構築様式を視覚的かつ/または組織学的に検査して、脱細胞化プロセスによりECM足場の3次元構造および生物活性が損なわれないことを検証することができる。脱細胞化した血管の構築様式、ならびにI型コラーゲン、IV型コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンなどのECMの構成成分の保存を可視化するためには、染色(すなわち、H&E、MTまたはVVG)による組織学的分析が有用であり得る。当技術分野で公知の他の方法およびアッセイがグルコサミノグリカンおよびコラーゲンなどのECMの構成成分の保存を決定するために有用であり得る。重要なことに、残留する血管新生因子または増殖因子は、脱細胞化後にECM足場に付随したままである。そのような血管新生因子または増殖因子の例としては、これだけに限定されないが、VEGF-A、FRF-2、PLGF、G-CSF、FGF-1、フォリスタチン、HGF、アンジオポエチン-2、エンドグリン、BMP-9、HB-EGF、EGF、VEGF-C、VEGF-D、エンドセリン-1、レプチン、および当技術分野で公知の他の血管新生因子または増殖因子が挙げられる。
【００４０】
血管の再細胞化
本発明は、再生された血管を生成するための材料および方法を提供する。再生された血管は、本明細書に記載のドナー由来の脱細胞化した血管を細胞の集団と接触させ、前記細胞の集団を脱細胞化した血管上で、およびその中で培養することによって作製することができる。本明細書で使用される場合、「再細胞化」とは、細胞を脱細胞化した血管またはECM足場に導入または送達し、細胞を、細胞が増殖し、かつ/または分化して、最終的に正常な血管のものと同様の構築様式、細胞組織化、および生物活性を有する血管が再生されるように培養するプロセスを指す。
【００４１】
細胞の集団とは、本明細書で使用される場合、脱細胞化した血管を再細胞化するために使用される任意の細胞であってよい。これらの細胞は、全能性細胞、多能性細胞、または多分化能細胞であってよく、また、関係づけられていなくても関係づけられていてもよい。さらに、本発明において有用な細胞は、未分化細胞、部分的に分化した細胞、または完全に分化した細胞であってよい。本発明において有用な細胞としては、前駆細胞、前駆体細胞、および「成体」由来の幹細胞も挙げられる。血管を再細胞化するために使用することができる細胞の例としては、これだけに限定されないが、骨髄由来の幹細胞または前駆細胞、骨髄単核細胞、間葉系幹細胞(MSC)、多分化能成体前駆細胞、全血由来の幹細胞または前駆細胞、例えば、内皮幹細胞、内皮前駆細胞、平滑筋前駆細胞、全血、末梢血、および全血から単離することができる任意の細胞集団などが挙げられる。一部の実施形態では、血管を再細胞化するために使用する細胞の集団は同種異系である。「同種異系の」とは、本明細書で使用される場合、臓器または組織が由来する種と同じ種(すなわち、個体自体または関連する個体または無関係の個体)から得た細胞を指す。特に好ましい実施形態では、細胞はレシピエント由来のものである(すなわち、「自己由来」である)。
【００４２】
細胞の集団は不均一な細胞の集団であってよい。例えば、細胞は、全血細胞であってもよく、全血由来のものであってもよい。これらの細胞としては、赤血球、白血球、血小板、内皮細胞、内皮前駆細胞、および平滑筋前駆細胞が挙げられる。循環している内皮細胞、内皮前駆細胞、および平滑筋細胞の前駆細胞が脈管形成および血管新生に寄与する可能性があることは当技術分野で公知である。したがって、全血細胞を適用することにより、増殖し、脱細胞化した血管に、血管を再生するための内皮細胞および平滑筋細胞に分化することができる細胞を容易に供給することができる。
【００４３】
再細胞化のために利用する細胞の集団は、不均一な細胞の集団から単離することができる。一実施形態では、細胞の集団は、骨髄から単離した幹細胞または前駆細胞であってよい。別の実施形態では、細胞の集団は、全血から単離した内皮細胞または内皮前駆細胞であってよい。不均一な集団から特定の細胞の集団を単離するための方法は当技術分野で公知である。そのような方法としては、リンパ球捕捉(lymphotrap)、密度勾配、分画遠心法、アフィニティークロマトグラフィー、およびFACSフローサイトメトリーが挙げられる。対象とする特定の細胞の集団を同定する当技術分野で公知のマーカーを使用して、不均一な集団から細胞を単離することができる。例えば、CD133は、骨髄に由来する幹細胞または幹様細胞の表面上で発現されることが公知である。CD133+細胞の選択は、MACビーズおよびCD133を認識する特異的な抗体を利用することによって実現することができる。内皮前駆細胞または平滑筋細胞前駆細胞に特異的なマーカーも、対象とする細胞の集団を精製するために利用することができる。
【００４４】
いくつかの態様では、細胞の集団を、脱細胞化した血管に導入する前にin vitroで培養することができる。in vitroで培養する目的としては、細胞数を増大させることおよび細胞を対象とする特定の細胞系列に分化させることが挙げられる。一部の実施形態では、細胞の集団を、in vitroで培養する前に、まず不均一な集団から単離することができる。一部の実施形態では、細胞の集団は骨髄由来の幹細胞または前駆細胞(すなわちCD133+細胞)であってよく、脱細胞化した血管に導入する前にin vitroで分化させることができる。種々の分化プロトコールが当技術分野で公知であり、それらとしては、例えば、内皮細胞または平滑筋細胞への分化を誘導する因子、作用剤、分子または化合物を補充した成長培地で細胞を成長させることが挙げられる。
【００４５】
血管を生成するために脱細胞化した血管に導入する細胞の数は、血管のサイズ(すなわち、長さ、直径、または厚さ)および再細胞化のために使用する細胞型(すなわち、幹細胞であるか、より分化した細胞、例えば全血などであるか)に左右され得る。異なる細胞型は、それらの細胞が達する集団密度に関して異なる傾向を有し得る。例として、脱細胞化した臓器もしくは組織に、少なくとも約1,000個(例えば、少なくとも10,000個、100,000個、1,000,000個、10,000,000個、または100,000,000個)の細胞を「播種」することができる、または、組織1mg(湿重量、すなわち、脱細胞化する前)当たり細胞約1,000個から組織1mg(湿重量)当たり細胞約10,000,000個を付着させることができる。
【００４６】
細胞の集団を、1つまたは複数の位置に注射することによって、脱細胞化した血管に導入(「播種」)することができる。さらに、2種類以上の細胞(すなわち、内皮細胞または平滑筋細胞)を脱細胞化した血管に導入することができる。例えば、内皮細胞を脱細胞化した血管の外側に導入することができ、同時に平滑筋細胞を血管の内腔に導入することができる。注射の代わりに、またはそれに加えて、細胞の集団を灌流によってカニューレを挿入した脱細胞化した血管に導入することができる。例えば、細胞の集団を脱細胞化した血管に灌流によって導入することができる。細胞を灌流した後、増殖および/または分化培地を血管を通して灌流して播種した細胞の成長および/または分化を誘導する。一部の実施形態では、細胞の集団を導入する前、かつ/またはそれと同時にヘパリンなどの抗凝固剤を投与することができる。
【００４７】
本発明において使用される増殖培地および分化培地としては、内皮細胞または平滑筋細胞の増殖、および内皮細胞または平滑筋細胞への分化に必要な補充剤および因子を含有する細胞成長培地が挙げられる。一部の実施形態では、内皮細胞用の分化培地は内皮細胞用の成長/増殖培地と同じであってよい。例えば、内皮の成長培地または分化培地中に存在する追加的な因子または補充剤としては、これだけに限定されないが、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒトVEGF、ヒト線維芽細胞増殖因子、ヒト上皮増殖因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンを挙げることができる。一部の実施形態では、平滑筋細胞用の分化培地は平滑筋細胞用の成長/増殖培地と同じであってよい。例えば、内皮の成長培地または分化培地中に存在する追加的な因子または補充剤としては、これだけに限定されないが、平滑筋成長補充剤、平滑筋分化補充剤、MesenPro、および形質転換増殖因子β1を挙げることができる。増殖培地および分化培地は、最低でも基本培地(すなわち、MCDB 131、M231、またはDMEM)、熱失活血清(例えば、10%において)、グルタミンおよび抗生物質(すなわち、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテリシン)を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、播種した血管を、所望の再細胞化が実現されるまで、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地を交互に用いて、それと一緒にインキュベートすることまたはそれを灌流することができる。一部の実施形態では、内皮細胞培地および平滑筋細胞培地を交互に灌流することを、多数回、例えば、少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも12回、少なくとも13回、少なくとも14回または少なくとも15回繰り返してもよい。一部の実施形態では、内皮細胞培地の灌流の持続時間は平滑筋細胞培地の灌流の持続時間と同じであってよい。あるいは、内皮細胞培地の灌流の持続時間は平滑筋細胞培地の灌流の持続時間と異なってよい。分化培地または成長培地のいずれの灌流の持続時間も、脱細胞化した血管に播種する細胞の集団の特性に左右され得る。分化培地および成長培地の灌流の持続時間は、当業者が決定することができる。
【００４９】
再細胞化の間、脱細胞化した血管を、播種した細胞の少なくとも一部が脱細胞化した血管の中でおよびその上で増加し、かつ/または分化する条件下で維持することができる。これらの条件としては、限定することなく、適切な温度および/または圧力、電気的活性および/または機械的活性、力、適量のO2および/またはCO2、適量の湿度、ならびに滅菌または滅菌に近い条件が挙げられる。再細胞化の間、脱細胞化した血管およびそれに付着した細胞を適切な環境で維持する。例えば、細胞は、栄養補給剤(例えば、栄養分および/もしくは炭素源、例えば、グルコースなど)、外因性のホルモンまたは増殖因子、ならびに/または特定のpHを必要とする場合がある。
【００５０】
本発明は、本明細書に記載の通り適切な条件下で血管を再細胞化するためのバイオリアクターも提供する。詳細には、バイオリアクターは、再細胞化する血管を合わせるのに十分な大きさであり、滅菌することができる完全に閉じたチャンバー、ポンプ機構(すなわち、蠕動ポンプ)に接続された、細胞および/または培地を供給するためのチューブ、血管の一端が接続された構造体、ならびに2つの入口および2つの出口を含む。血管とポンプに関連してチューブを設定することにより、細胞または培地が血管の内腔を通して流れ、周囲を流れる、または血管の外側に浸漬する。例示的なバイオリアクターの設定を示す概略図が図6に示されている。
【００５１】
いくつかの場合には、本明細書に記載の方法によって生成される血管は、患者に移植するためのものである。これらの場合には、脱細胞化した血管を再細胞化するために使用する細胞は、患者から得ることができ、したがって、再生用細胞は患者にとって「自己由来」である。患者由来の細胞は、例えば、血液、骨髄、組織、または臓器から、生涯の異なる段階(例えば、出生前に、新生児期にまたは周産期に、青年期に、または成人として)において当技術分野で公知の方法を使用して得ることができる。あるいは、脱細胞化した臓器または組織を再細胞化するために使用する細胞は患者と同系(すなわち、一卵性双生児の片方由来)であってもよく、細胞は、例えば、患者の親類または患者とは無関係のHLA適合個体由来のヒトリンパ球抗原(HLA)適合の細胞であってもよく、細胞は、例えば、HLA不適合ドナー由来の患者と同種異系のものであってもよい。
【００５２】
再細胞化の間、播種した細胞の進展をモニタリングすることができる。例えば、脱細胞化した血管または組織の中またはその上の細胞の数を、再細胞化の間の1つまたは複数の時点において生検材料を取得することによって評価することができる。さらに、細胞が受けた分化の量を、細胞または細胞の集団において種々のマーカーが存在するかどうか決定することによってモニタリングすることができる。異なる細胞型およびそれらの細胞型についての異なる分化の段階に関連するマーカーは当技術分野で公知であり、抗体および標準のイムノアッセイ、免疫蛍光法、免疫組織化学的検査または組織学的検査技法を使用して容易に検出することができる。例えば、内皮細胞または内皮系列に分化した細胞が存在することを確認するために、当技術分野で公知の任意の内皮マーカーをアッセイすることができる。好ましい内皮マーカーとしては、これだけに限定されないが、CD31、VWR、VE-カドヘリンおよびAcLDLが挙げられる。例えば、平滑筋細胞、または平滑筋細胞系列に分化した細胞が存在することを確認するために、当技術分野で公知の任意の平滑筋細胞マーカーをアッセイすることができる。好ましい平滑筋細胞マーカーとしては、これだけに限定されないが、平滑筋アクチンおよびビメンチンが挙げられる。再細胞化は、工学的に作製された血管の表面の少なくとも1種の内皮マーカーおよび工学的に作製された血管の内腔の少なくとも1種の平滑筋マーカーが適切に発現されると実現される。
【００５３】
一部の実施形態では、工学的に作製された血管の引っ張り強さを試験することができる。引っ張り強さの試験は当技術分野で公知である。例えば、工学的に作製された血管を横方向に切って環状セグメントにし、半径方向の変形によって試験することができる。試料を完全に破壊するために使用した力の総計および力の総計の50%における伸長を算出して、引っ張り強さを決定することができる。一部の実施形態では、再細胞化した血管では、脱細胞化した血管と比較して引っ張り強さの増強が実証される。例えば、本発明の工学的に作製された血管では、脱細胞化した血管と比較して10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%またはそれ以上大きな力の総計に抵抗することができることが実証される。他の実施形態では、再細胞化した血管では、正常な血管と同様の、またはほぼ同じ引っ張り強さが実証される。
【実施例】
【００５４】
(実施例1)
骨髄を使用してバイオエンジニアリングによって作製された血管
この実施例では、EHPVOの10歳の女児における、自己由来の幹細胞を用いて再細胞化した脱細胞化ドナー静脈を使用したmeso Rex手順が記載されている。
【００５５】
肝外門脈閉塞症(EHPVO)は、上腸間膜静脈(SMV)、脾静脈(SV)、冠状静脈(CV)からの門脈(PV)を通る求肝性の血流が損なわれた状態である。
【００５６】
方法
1歳の女児が血小板減少症および脾腫を有することが発見された。彼女は特発性血小板減少性紫斑病(ITP)と有すると考えられ、地方の病院で数年にわたって経過観察された。彼女が9.5歳の時にさらに調査し、食道静脈瘤および脾腫が確認された。INRはわずかに上昇した。プロテインSおよびプロテインCについては正常なレベルが示され、APC抵抗性については除外された。彼女には、門脈圧亢進症を軽減するためにベータ遮断薬が投薬された。
【００５７】
エラストグラフィー(Fibroscan)は正常であった(凝りスコア4.6)。CT-血管造影により、肝靭帯における側副循環および開いた上腸間膜静脈(SMV)を伴う門脈血栓症が明らかになった(図1A)。ベータ遮断薬およびプロトンポンプ阻害剤を用いた治療を開始した。門脈圧亢進症および発展性食道静脈瘤に起因して、彼女を評価し、バイパス手順(meso Rex)が承諾された。臍帯静脈を開通性にすべきでない場合には、レスキュー手順として自己由来の幹細胞由来静脈グラフトを計画した。代替法は、患者由来または同種異系ドナー由来の別の血管を使用することまたは肝移植を実施することのいずれかであり、後者2つは終生免疫抑制を必要とする。内頸静脈の両側面が開通性であったが(超音波およびCT)、推定されるグラフトの長さが左門脈からSMVまでの距離よりも短かった。肝内門脈血管床は可視化することが難しかった。これは、ほぼ9年にわたるEHPVOによって引き起こされる可能性があった。
【００５８】
ドナー静脈の脱細胞化
進行中の感染症または他の疾患を有さない健康な30歳の臓器移植ドナーから9cmの静脈セグメントを取り出した。静脈の一端を開いたままにし、残りの開口部を縫合して漏出を予防した。静脈を0.5%ペニシリン、0.5%ストレプトマイシン、および0.5%アンホテリシンBを含有するリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいだ。最初に、組織を蒸留水(D/W)で72時間にわたってすすいだ。各脱細胞化サイクルは、1%トリトンXと一緒にインキュベートし(3時間)、その後1%トリnブチルホスフェートと一緒にインキュベートし(3時間)、1Mの塩化ナトリウム中0.004mg/mlのデオキシリボヌクレアーゼIと一緒にインキュベートする(全てSigma、Gothenburg、Sweden)(3時間)ことからなった。グラフトの一端を開いたままにし、他方をクランプし、内腔に1%トリトンX(Sigma、Gothenburg、Sweden)を満たした。次いで、他方の端をクランプし、撹拌器に入れ、37℃で3時間穏やかに振とうした。インキュベーション時間の最後に、検体の一端を開き、内腔の内容物を空にし、検体をPBSで洗浄した。トリnブチルホスフェート(Sigma)、およびDNase(Sigma)を用いた処理について同じ手順を続けた。最後に、検体を蒸留水で一晩洗浄して細胞壊死組織片を除去した。7サイクルを実行した。脱細胞化プロセスの最後に、グラフトをPBSで48時間連続して洗浄した(6時間ごとに交換した)。脱細胞化のために使用した溶液は全て上記の抗生物質を含有した。各サイクル後に、組織の小片を核、HLAクラスI抗原およびHLAクラスII抗原の存在についてスクリーニングし、標準の手順を使用して組織学的に検証した。
【００５９】
レシピエントの自己由来の内皮細胞および平滑筋細胞の調製
自己由来のレシピエント細胞を、レシピエントから得た骨髄20mlから調製した。骨髄をまずLymphoprepで分離し、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で3回洗浄した。内皮細胞を、CD133でコーティングしたMini MACSビーズを製造者の説明書に従って用いて単離した。トリパンブルーを使用して、得られたCD133+細胞の数を計数し、生存能力を試験した。CD133+細胞を、0.2%ゼラチンでコーティングした培養ウェル中、37℃、95%空気および5%CO2の加湿雰囲気中で培養した。完全培地の調製について:基本培地MCDB 131+10%熱失活ヒトAB血清、1%L-グルタミンおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンにアスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒト血管内皮増殖因子、ヒト線維芽細胞増殖因子、ヒト上皮増殖因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンを含有するEGM-2 Single Quote Kit(Lonza、Walkersville、MD USA)を補充した。培地を2〜3日ごとに交換した。全てのウェルから集密した細胞をトリプシン処理によって剥離し、プールし、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄した。第1継代時に培養した自己由来のレシピエント内皮細胞を、2色免疫蛍光法を用いてVEカドヘリン、アセチル化LDLおよびフォン・ヴィルブランド因子について染色し、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を用いて対比染色して、内皮表現型を確認した後に、バイオリアクター内のマトリックスに付着させた。
【００６０】
平滑筋細胞に関しては、骨髄から単離した細胞を市販の平滑筋細胞培地(Cascade Biologies-medium231+増殖因子補充剤Cat番号S-007-25)中で成長させた。細胞を計数し、75cm2のフラスコ中に1mL当たり1×106個の密度で播種した。細胞を完全培地中で成長させ、培地を3日ごとに交換した。細胞が90%集密に達したら、上清を除去し、細胞をPBSで洗浄し、次いで1×トリプシン-EDTAを用いて継代した。平滑筋分化を誘導するために、培養培地を、平滑筋細胞分化補充剤(Cascade Biologies-Cat番号S-008-5)を含有する完全培地と取り換えた。培養した自己由来のレシピエント平滑筋細胞を、免疫蛍光組織学的検査を用いてアルファアクチンおよびビメンチンについて染色し、DAPIを用いて対比染色して、平滑筋細胞表現型を確認した後に、バイオリアクター内のマトリックスに付着させた。
【００６１】
細胞の播種
内皮細胞を培養フラスコから剥離し、それらの成長に特異的な培地中に希釈し、マイクロシリンジを用いてマトリックスの内面に縦方向に適用した。グラフト表面1平方センチメートル当たりに播種したECの平均数は7.5×104個であった。開放端をクランプし、マトリックスを37℃で、5%CO2のロッキングローラーにおいた。3日後に、内面に平滑筋細胞分化培地に浮遊させた平滑筋細胞を同じ密度で播種し、さらに3日間インキュベートした。次いでマトリックスをバイオリアクター内に入れた。血清を伴わない内皮細胞培地(無血清培地)を内部に加え(25ml)、無血清SMC分化培地を外部に加え(25ml)、回転を毎分1〜5回転で開始した(37℃、5%CO2)。外部培地および内部培地を72時間ごとに取り換えた。抽出した培地を、微生物コロニー形成について市販のキット(Invitrogen、Sweden、Cat番号C-7028)を使用して試験した。バイオリアクター培養の総期間は2週間であった。
【００６２】
外科手技
静脈グラフトの用意ができた日に手術を計画した。静脈グラフトは外科手術時にバイオリアクターから低温貯蔵溶液に移した。患者をMercedes様切開術で切り開き、肝靭帯および門を露出させた。臍から肝臓まで円形の靭帯を慎重に周囲から分離した。臍帯静脈が見いだされ、これは非常に小さく、部分的にのみ開通性であった。腹部の左側部分に静脈瘤が見いだされ、また拡大した脾臓が左側の季肋部を占めていた。静脈瘤は質が悪く、バイパスには適さなかった。手術前の頸静脈の長さは、バイパスのためには短すぎると推定されたので探査しなかった。
【００６３】
門の切開を円形の靭帯をたどって、開通性が見いだされた左門脈に至るまで開始した。肝外右門脈は薄く、膵臓の上の共通の門脈は見いだされなかった。左門脈のさらなる切開は、接合部において臍帯静脈を切り開くことを含んだ。繊維状靭帯を、拡張を伴って取り出すことができたことが見いだされ、これにより、良好な逆流を伴う良好な左門脈が示される。内腔は15mmに拡張した。右門脈は同定されず、セグメント3からセグメント4までの小さな枝が見られた。
【００６４】
次の工程は、上腸間膜静脈(SMV)を見いだすことを含んだ。トライツ靭帯を同定し、十二指腸を周囲から分離して下腸間膜静脈を露出させた。この静脈をたどることにより、脾静脈およびSMVを容易に周囲から分離することができた。SMVは開通性であり、拡大していた。
【００６５】
頸静脈、腸骨静脈または伏在静脈の組合せを使用した広範囲にわたる追加的な外科手術を伴わずに小児自身の静脈を使用する良好な代替法がなかったので、幹細胞由来静脈を使用するという決定を行った。バイパスなしでは、肝臓または多臓器の移植が選択肢になった。
【００６６】
幹細胞を播種した静脈を手術室に運んだ。適切な長さのY形状グラフトを選択し、バイパス用に調製した。まず、SMVに対する吻合を、SMVを周囲から分離した後にクランプすることによって行った。5-0 Surgipro(登録商標)を用いてグラフトを端側縫合し、次いでグラフト上の血管クランプを用いてクランプをはずした(図1B)。グラフトを膵臓より上、結腸および胃より下に置いた。グラフトに漏出がないことを再保証するために血管クランプを徐々に移動させた。次に、クランプを肝内左門脈に置き、グラフトを門脈と吻合した(図1C)。グラフトは門脈よりも大きかったが、縫合を調整することによってこれを克服した。
【００６７】
手術後のモニタリング
再灌流は順調であった。門脈において毎秒25〜30cmおよび動脈において毎秒40cmの良好な血流が手術中に測定され、超音波で確認された(図1D)。手術中の門脈圧は手順の開始時に20mm Hgであったが、門脈の再灌流後には測定しなかった。患者を、第1週には1日2回、次いで第2週には毎日、超音波を用いて経過観察した。血流は、一部の左門脈枝では毎秒80cmにまで達したが、右門脈では毎秒15cmの低流が見られた。外科手術の1週間後にCT血管造影を使用してグラフトを可視化し、開通性であることが見いだされた(図1E)。手術後の超音波により、手術後7日目に、門脈吻合の部位において血管壁の輪郭の変化が認められ、放射線科医はこの部位における血栓症を除外することができなかった。したがって、手術後、患者は毎日6回Heparin(登録商標)1000IEを静脈内に受け、1日2回超音波で経過観察され、この所見がモニタリングされた。数日後に、患者は創傷被覆材から出血し、ヘモグロビンが減少したが、輸血は必要なかった。同じ日にAPTTが>210であることが見いだされ、これはヘパリン処置によって引き起こされたと思われ、したがって、一時的に停止した。患者を最初の1ヶ月連続して、ドナー抗原、肝酵素についての逐次的な血液検査および超音波を使用した血流スピードの画像化の実施を伴ってモニタリングした。同様の試験を移植の3ヶ月後、6ヶ月後、9ヶ月後、および12ヶ月後に実施した。
【００６８】
抗内皮細胞抗体スクリーニング
抗内皮細胞抗体についてのスクリーニングを移植前および移植後の両方で実施した。血清試料を移植の1ヶ月前、1週間後、3週間後、1ヶ月後、3ヶ月後、6ヶ月後、9ヶ月後および12ヶ月後に収集した。それぞれの場合に、アンジオポエチン受容体Tie-2を発現している末梢血単核細胞(PBMC)を患者の血液試料から市販のXM-ONE(登録商標)キットを製造者(AbSorber AB、Stockholm、Sweden)の説明書に従って使用して新鮮に単離した。細胞をすぐにGuavaフローサイトメーター(Millipore、Gothenburg、Sweden)でGuava解析ソフトウェアを使用して解析した。いかなる抗体も有さないことが分かっている健康な輸血されていない血液型ABの男性由来の血清が陰性対照としての機能を果たした。多数回の輸血または臓器移植の結果として同種異系抗体が形成された患者由来の血清のプールを陽性対照として使用した。死体ドナー由来の凍結リンパ球も、上記の抗ドナーHLA抗体および抗内皮細胞抗体をスクリーニングするための標的として使用した。
【００６９】
結果
トリトン、TnBPおよびDNaseを使用して、ドナー静脈は7サイクル後に首尾よく脱細胞化された。脱細胞化の前後の腸骨静脈の肉眼的形態が図2A〜Hに示されている。しかし、脱細胞化した静脈の構築様式はネイティブな対照とは異なった(図2B)。サイクル7の最後に、脱細胞化した静脈グラフトにおいて核またはHLAクラスI抗原またはHLAクラスII抗原の発現は見いだされなかった(図2F〜H)。脱細胞化手順全体には12日かかり、その最後に、静脈が首尾よく脱細胞化されたことが見いだされた(組織学的所見に基づいて)。患者の骨髄から単離されたCD133+幹細胞は、VE-カドヘリン、AcLDLおよびvWFを発現する成熟内皮細胞に非常に容易に分化した(図3)。同様に、平滑筋細胞を骨髄細胞から首尾よく成長させることができ、これは後に、アルファ-平滑アクチンおよびビメンチンを発現する細胞に分化した(図3)。ECおよびSMCの単離および増殖のための総時間はおよそ15日であった。
【００７０】
4回目の継代の両方の細胞型を、静脈グラフトを再細胞化するために使用した。使用した2つのグラフトの肉眼的像が図4Aおよび図4Bに示されている。全ての細胞を播種する直前にもう一度特徴付け、必要な表現型マーカーを発現することが見いだされた。免疫組織化学的検査および免疫蛍光法によって検出された通り、再細胞化した静脈において、内腔内にECが見いだされ、SMCは組織の壁に移動していた(図4)。さらに、どちらの細胞型も、バイオリアクター内で培養した後、それらの特異的マーカーを発現した(図4E〜H)。この図において見られるように、患者への埋め込み前に、内腔のおよそ80〜90%が内皮層に覆われていることが見いだされた。グラフト内の弁の大部分が再内皮化されたことも見いだされた(図4Eおよび4H)。これらの結果に基づいて、移植を進行することが決定された。バイオリアクター内で培養することを含めた、骨髄吸引後の移植用のグラフトを調製するための総時間はおよそ1ヶ月であった。
【００７１】
患者は手順の3週間後に退院し、肝機能検査(LFT)は、INR(1.4)以外は正常であった。彼女は、移植前よりも迅速に応答し、機敏であった。4.5週間の経過観察時に、患者の肝臓値は、手術前の1.4から改善されたINR(1.2)を含め正常であった。彼女は疲労が著しく減り、生活の質が改善されたことが親から報告された。3ヶ月および6ヶ月時点の検診時に、患者は、超音波および通常の検査室での検査で開通性グラフトを伴い順調であった。移植前および/または移植後に、いかなる抗内皮細胞抗体も検出されなかった(図2Iおよび図2J)。6ヶ月時点の検診後に、患者はより疲労していたが、検査室での検査は、血小板数の減少以外は正常であった。来診後に実施したCT血管造影により、内腔が8mmから4〜6mmまで減少していることが示された(図5A)。超音波により、門脈流の減少が確認された。小児チームおよび親による徹底的な検討の後、患者を探査する決定を行った。
【００７２】
最初の手順の1年後、患者を再度探査した。可能であれば狭くなったグラフトを矯正するか、左側の内頸静脈由来の代替の自己由来静脈を使用することが決定された。予防措置として、新しい幹細胞由来静脈を、必要な許可を得た後に上記の通り調製した(図4Bおよび図4H〜J参照)。
【００７３】
SMVとの吻合部位では、直径8mmの開通性グラフトが見いだされた(図5B)。グラフトは、結腸間膜を通過する部位で圧縮されて、血管がグラフトの後ろの組織に「しっかりくっつく」ことが可能になっている。左門脈側のグラフトの残りの部分は直径4〜6mmに狭まっていたが、開通性であった(図5C)。グラフトは、壁は薄く、正常に見えた。1年前に最初の手順の外科的記録において認められたSMVの部位における後腹膜の肥厚が検出された。血管の圧縮を引き起こしている組織を除去すると、グラフトはさらに拡張したが、左側の門脈吻合の近くのグラフトが短くなっていたので、最良の解決法はこの部位に新しい静脈を置き、同時に吻合を探査することであった。内頸静脈は短すぎると判断された。したがって、新しく調製した幹細胞由来静脈グラフトを使用するという決定を行った。
【００７４】
新しいグラフトを、超音波切開器具(CUSA)を使用して左門脈をさらに肝臓まで切開した後に門から置き、SMV吻合をパッチングした(図4Dおよび図4E)。グラフトおよび門脈において毎秒20cmを超える血流を手術前および手術後に記録することができた(図4Fおよび図4G)。外科手術の24時間後に、血流が低下したので患者を探査した。SMVとの遠位吻合に血餅があり、再び行った。門脈圧は、外科手術前には20mm Hgであり、グラフトの再灌流後には13mm Hgであった。胃の小さい方の湾曲と大きい方の湾曲に沿った側枝をライゲーションした後に、患者の切開部を閉じた。患者はいかなる免疫抑制薬も受けなかったが、サリチル酸75mgを1日1回およびオメプラゾール10mgを初回手術後6ヶ月にわたって受けた。外科手術当日にベータ遮断薬を中止した。2回目の手術後に、患者にヘパリンを2週間にわたって静脈内注入し、また、抗凝固薬を手順後6〜12ヶ月にわたって投与した。
【００７５】
患者は、身長および体重のどちらについても改善を示し、1年で137cmから142.5cmまで成長し、体重が30.2kgから35kgに増加した。
【００７６】
考察
これらの結果により、脱細胞化したヒト腸骨静脈が自己由来の幹細胞を使用して上首尾に再細胞化されたことが実証され、これをその後、門脈血栓症の患者における上腸間膜静脈と肝内左門脈の間のバイパス手順のために使用した。
【００７７】
組織学的検査結果により、トリトン-X-TnBPおよびDNaseを用いた脱細胞化が完全なものであり、それにより細胞外マトリックスの適切な保存が可能になることが示された。早くも4サイクル後に、ヒト静脈を、核の残余物を伴って脱細胞化することができる。Na-デオキシコール酸の代わりにトリトン-X-TnBPを使用することにより、はるかに良好な細胞外マトリックス、例えば、エラスチンおよびフィブロネクチンなどが保持されることも見いだされた。したがって、ドナー細胞が存在しないことによって検証される通り、脱細胞化プロトコールはヒト静脈組織に首尾よく適用された。
【００７８】
in vitroにおける平滑筋細胞の培地への遊走は、インタクトな内皮の存在下で容易になることが仮定された。したがって、まず、内皮細胞を播種し、それが3日以内にグラフト上に層を形成した。この後に、平滑筋細胞を静脈の内腔に播種し、24時間後にこれらの細胞が包埋されたことが見いだされた。しかし、静脈の完全な再細胞化には合計で2週間かかった。当該手法により、SMCを伴う静脈の培地が首尾よく再配置されたことが見いだされたのでSMCの外部播種は実施しなかった。脱細胞化した静脈の再播種は灌流を使用して実施しなかったが、これは重要である。内腔内の最適なEC内層には、ずり応力が必要であることが公知である。血管の灌流再細胞化の使用が開発されている。
【００７９】
データにより、死亡したドナー由来の同種異系ヒト組織を、上首尾の「個人向けの」またはテーラーメードの移植のために、自己由来の幹細胞を使用して再度工学的に作製することができるという概念の証拠が示された。動静脈瘻の患者において、透析または冠動脈バイパス外科手術のための外科的使用のために動脈を再現する、さらに新しい研究の領域が開発される。
【００８０】
(実施例2)
全血を使用した同種異系血管
生後の脈管形成は、循環している内皮前駆細胞(EPC)が寄与する成体における新しい血管の形成であり、血管新生は、既存の内皮細胞からの新しい血管の形成である。これらの2つのプロセスは、血管枝の形成、および創傷治癒、虚血、骨折治癒、腫瘍の成長などのような病原性の状態に寄与する。循環中では内皮細胞および内皮前駆細胞が共存しており、内皮前駆細胞は血管化に寄与する。さらに、血管における別の重要な細胞型である平滑筋細胞の前駆細胞も循環血液中に存在する。
【００８１】
世界的に臨床的に実行可能な信頼できる再現性のある手順が開発された。循環している血管新生細胞は全血中に存在するので、静脈を再生するために全血を使用することにより、骨髄または全血から血管新生前駆細胞の亜集団を単離し、増殖させる必要なく、血管の効率的な再細胞化がもたらされる。
【００８２】
本発明では、5つのヒト腸骨静脈を、灌流と撹拌の組合せによって脱細胞化し、次いで、全末梢血を灌流し、その後、内皮細胞成長培地および平滑筋細胞成長培地をそれぞれ灌流することによって再細胞化した。再細胞化プロセスが上首尾であることを、内皮細胞および平滑筋細胞が存在することによって、ならびに機械的特性によっても確認した。in vivoにおける開通性を試験するために、肝外門脈閉塞症(EPHVO)に罹患している患者2人を選択し、自己由来の末梢血を使用して再生した、組織工学的に作製した静脈を移植した。患者を8ヶ月および6ヶ月にわたって経過観察した。結果により、血管疾患を有する患者に対する治療におけるこの方法の臨床的潜在性が証明されている。
【００８３】
材料および方法
静脈の脱細胞化
約7〜9cmのヒト腸骨静脈を死体の臓器ドナーから取り出し、抗生物質を伴う滅菌PBS中に保管し、実験室に輸送した。静脈をすぐに蒸留水で洗浄して、全血を除去した。静脈の末端の両方を蓋付きの接続器具に接続し、他の剥離、枝を縫合し、漏出を予防した。脱細胞化サイクルは、静脈を、1%トリトン-x 100(×100、Sigma、Sweden)、1%トリn-ブチルホスフェート(TNBP)(28726.291、VWR、Sweden)および4mg/LのデオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)(D7291、Sigma、Sweden)を用い、各溶液と一緒に4時間ずつ、37℃、160RPMのスピードで、撹拌器内で撹拌することを含んだ。トリトン溶液およびTNBP溶液を、抗生物質ペニシリン200U/ml、ストレプトマイシン0.2mg/mlおよびアンホテリシン2ug/ml)(Sweden)、5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)二ナトリウム塩二水和物(ED2SS、Sigma、Sweden)および0.4mMのフッ化フェニルメチルスルホニル(PMSF)(93482、Sigma、Sweden)を含有する蒸留水中に調製した。塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを伴うDulbecos PBS(A12858、Life Tecnologies)中DNase I溶液を調製した。脱細胞化を9サイクル継続し、各サイクルの間に蒸留水を灌流することによって洗浄した。脱細胞化後、組織を、滅菌PBS中0.1%過酢酸を用いて1時間にわたって滅菌し、その後、滅菌蒸留水およびPBSを用い、各溶液につき24時間にわたって洗浄した。
【００８４】
脱細胞化した静脈の特徴付け
9サイクル後に、脱細胞化した静脈から生検材料を取得し、免疫組織化学的検査、免疫蛍光法、DNA定量、ルミネックス、走査型電子顕微鏡および透過型電子顕微鏡レベルの分析、引っ張り強さおよび細胞外マトリックス定量のために処理した。
【００８５】
組織学的検査、免疫組織化学的検査および免疫蛍光法
正常な、脱細胞化し、再細胞化した静脈生検材料を同じプロトコールに従って処理した。生検材料を4%緩衝ホルマリン中に48時間にわたって固定して、パラフィンブロックおよびcryoblock用のtissue tech OCTを調製し、液体窒素で凍結させた。厚さ5umのパラフィンおよび凍結切片を染色のために切り取った。パラフィン切片を下降性の一連のアルコール中で水分を元の状態に戻した後、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色、マッソントリクローム(MT)染色、vernhoeff von gieson(VVG)染色および免疫組織化学的検査を用いて染色した。HE染色では、スライドをMeyersヘマトキシリンおよびエオシンアルコール液中でそれぞれ7分および1分インキュベートし、その後、間に蒸留水を用いて10分洗浄し、後で脱水し封入した。MT(25088-1、Polysciences、Germany)染色およびVVG(25089-1、Polysciences、Germany)染色を製造者の説明書に従って実施した。
【００８６】
免疫組織化学的検査を行って、ECMタンパク質および平滑筋アクチンを観察した。プロトコールは製造者の説明書に従い、一次抗体濃度はI型コラーゲン(1:100)、IV型コラーゲン(1:500)、フィブロネクチン(1:500)、ラミニン(1:100)および平滑筋アクチン(1:50)であった。
【００８７】
DNA定量
約20mgの正常な生検材料5つおよび脱細胞化した生検材料5つを5つの異なる静脈から収集し、DNeasy血液および組織キットプロトコール(69506、Qiagen、Sweden)に従ってDNAを単離した。nanodropを用いて存在するDNAの量を測定した。
【００８８】
ルミネックス
血管新生増殖因子17種のパネルを、正常な静脈組織3つ、およびそれと比較して脱細胞化した静脈組織3つにおいて定量した。組織試料約30mgを取得し、総タンパク質を単離した(2140、Millipore、Germany)。タンパク質の量を、BSA標準物質のセットを用いてBradford法によって測定し、ELISAリーダー(Synergy2、Biotek、USA)を使用して595nmにおいて測定した。全ての組織のタンパク質量を、TM緩衝液(millipore)を用いて同じ濃度に正規化し、ルミネックスプレートにローディングした。ヒト血管新生/増殖因子磁気ビーズパネル1供給者のプロトコール(Millipore、Sweden)に従ってルミネックスを実施した。簡単に述べると、ルミネックスプレートを、アッセイ緩衝液200ulを用いて活性化した。正規化されたタンパク質25ul、標準物質および対照をそれぞれのウェルに加え、アッセイ緩衝液をブランクとして使用した。ウェル中の試料をアッセイ緩衝液25ulで希釈し、標準物質および対照をTM緩衝液25ulで希釈した。抗体をコーティングした磁気ビーズをボルテックスし、ビーズ25ulを全てのウェルに加え、穏やかなプレート振とう機において4℃で20時間インキュベートした。プレートを磁石上で1分静置し、洗浄緩衝液を用いて洗浄した。検出抗体25ulを加え、1時間インキュベートし、その後、ストレプトアビジン-フィコエリトリン25ulを加え、30分インキュベートした。後でプレートを洗浄説明書に従って洗浄緩衝液で洗浄し、シース液100ulを全てのウェルに加え、磁気ビーズを5分振とうすることによって懸濁させ、ルミネックスで読み取った。
【００８９】
コラーゲンおよびGAG定量
コラーゲンおよびGAG定量を、Biocolor CompanyからのSircol Collagen Assay KitおよびBislycan GAGs Assay Kitを使用して行った。簡単に述べると、コラーゲンを、酢酸に溶解させたペプシンを24時間にわたって用いて、組織約20mgから抽出し、濃縮試薬を用いて濃縮し、精製した。抽出されたコラーゲンをsircol色素試薬1mlに浸し、その後、酸-塩洗浄試薬を用いて洗浄した。コラーゲン-色素ペレットをアルカリ試薬中に放出させ、555nmにおいて読み取った(Synergy2、Biotek、USA)。GAGを、組織20mgから、パパイン抽出試薬中、65℃で3時間にわたって抽出した。抽出されたGAGを振とう機においてbislycan色素試薬1mlに30分浸し、次いで、遠心分離してペレットGAG-色素複合体にした。結合した色素を色素解離試薬0.5ml中に放出させ、656nmにおいて読み取った(Synergy2、Biotek、USA)。コラーゲンおよびGAGを、キット内に供給された既知濃度のコラーゲンおよびGAGを用いた標準グラフに基づいて定量した。
【００９０】
引っ張り強さ測定
静脈セグメントについて、Instron 5566(Instron、Norwood USA)を用いて張力試験した。前負荷は0.1Nであり、使用した試験スピードは毎分50mmであった。張力テスターの正確度は力が0.5%であり、伸長が0.5%である。静脈を幅がおよそ4mmの環状試料に切り取った。切片の最小幅をカリパスで測定し、記録した。2つの円柱状の5mmのグリップ(それぞれ高さ2.5mm、幅5mm)を環試料の内側に置いた後に、半径方向の変形を実施した。測定された力を、負荷を受ける部分である環の最小の幅で割ることによって力を正規化した(血管壁は不均一すぎると考えられたので、応力を算出しなかった)。前負荷後の試料の伸長も測定した。試料を完全に破壊するために使用した力の総計および力の総計の50%における伸長を算出した。
【００９１】
バイオリアクター
バイオリアクターを、静脈の寸法に応じて実験室において固有に調製した。バイオリアクターは、ポリエチレンチューブおよびシリコンチューブと接続したポリプロピレンチューブの囲まれた設定からなった。バイオリアクターおよびチューブを使用する前にオートクレーブ内で滅菌した。血液および培地を、蠕動ポンプを使用して毎分2mlのスピードで灌流した。
【００９２】
静脈が完全に閉じたチャンバーに合うようにバイオリアクターを設計し、必要な培地は全て蠕動ポンプを用いてパイプを通じて供給した(図6)。バイオリアクターは約15cmのチューブ、それぞれ入口1つおよび出口1つを有する2つの蓋、入口に接続することができるゴム製の円錐形構造、ならびに両方の蓋からの漏出を予防する2つのバイサー(vicer)を含む。2つの蓋は、入口が蓋の内外を通り、したがってパイプを外側から容易に接続することができ、円錐形のゴムを、静脈が結び付けられている内側の側面に固定することができるように設計する。出口は、単に外側に伸び、表面から培地を収集する。底部の蓋にある出口は、培地パイプを収集するために使用され、外側から容易に接続することができ、上部の蓋の出口は、直径がわずかに大きく、パイプがそれを通過することができるが、気密が維持される。これは、血管を内側から引き寄せ、それを直鎖状に伸びた状態に維持するために使用される。静脈の一端はまず円錐形のゴムに接続され、入口に固定され、第2の端は上部の蓋の出口を通過するパイプを含有する接続器具と接続される。灌流培地は入口を通って底部から血管に進入し、血管を通過し、パイプを通って上部の蓋から退出し、上部の蓋の入口を通ってバイオリアクターに再度進入し、したがって、静脈の外側も同じ培地で満たされる。静脈の外側が満たされたら、バイオリアクターを逆さまに回転させ、満たされた後に、正常な状態に戻し、接続器具を用いて入口のパイプに接続する。バイオリアクターの部品およびパイプは全て、使用する前にオートクレーブを用いて滅菌した。
【００９３】
採血
再細胞化当日に、血液30mlを健康なドナー(年齢群25〜35)それぞれから収集し、滅菌ヘパリンコーティングバキュテナーチューブ中に入れ、できるだけ早く実験室に輸送した。必要な血液量は血管の長さおよびパイプの長さに左右される。長さ9cm、直径1cmの静脈は、血液30mlを用いて再細胞化することができる。動脈または静脈から収集した血液のいずれも再細胞化のために使用することができる。
【００９４】
静脈の再細胞化
再細胞化プロセス全体を極めて滅菌条件下で実施し、灌流は全て、5%CO2を供給した37℃のインキュベーター内で行った。再細胞化の前に、静脈にヘパリン(Leo)をPBS 1ml当たり50IUの濃度で2時間灌流した。ヘパリンを流し出し、すぐに全血を毎分2mlのスピードで48時間灌流した。次いで、血液を流し出し、静脈を、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンを含有するPBSを用いて3〜5分、または血液が完全に除去されるまで洗浄した。その後、静脈に内皮培地および平滑筋培地を交互に12日間灌流した(各培地を3日間)。完全な内皮培地を、10%熱失活ヒトAB血清(34005100、Life technologies、Sweden)、1%グルタミン(25030、Lonza、Denmark)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アンホテリシンを補充したMCDB 131(10372、Life technologies、Sweden)基本培地、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、トランスフェリン、インスリン、組換えヒトVEGF、ヒト線維芽細胞増殖因子、ヒト上皮増殖因子、ヘパリンおよび硫酸ゲンタマイシンを含有するEGM2 single quote kit(CC-4176、Lonza、Denmark)を使用して調製した。完全な平滑筋培地を、10%熱失活ヒトAB血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシンアンホテリシンを補充した培地231(M231、Life technologies、Sweden)500mlおよび平滑筋成長補充剤(SMGS)(S-007-25、Life Technologies、Sweden)20mlおよび平滑筋分化補充剤(SMDS)(S-008-5、Life technologies)5mlを使用して調製した。最初のサイクルのためには、SMGSのみを含有する平滑筋培地を使用し、第2のサイクルではSMGSおよびSMDSを両方使用した。
【００９５】
再細胞化した静脈の特徴付け
再細胞化の14日後に、静脈から生検材料を取得して、前に説明されている通りcryoblockおよびパラフィンブロックを調製した。内皮細胞の存在を可視化するために、CD31(1:1000)マーカーおよびVWF(1:100)マーカーを選択し、免疫蛍光法によって染色し、一方、平滑筋細胞を可視化するために、平滑筋アクチン(1:50)を免疫組織化学的検査によって染色した。再細胞化した静脈についても、前に説明されている通り機械的強度について張力を試験した。
【００９６】
結果
静脈の脱細胞化
1%トリトンおよび1%TNBPを用いた撹拌と灌流の組合せによる脱細胞化により、腸骨静脈が9サイクルで首尾よく脱細胞化された。DVの肉眼的形態は、白色および半透明に見えたが、サイズの変化および漏出は見いだされなかった(図7)。HE染色、MT染色およびVVG染色によって組織学的分析を行った。9サイクル後に、全てのDVにおいて核の染色(HE-青色およびMT-黒色染色)は観察されなかった(図8、図9および図10)。
【００９７】
脱細胞化した静脈中に存在する細胞外マトリックス
MT染色により、脱細胞化後に豊富な量のコラーゲンが存在することが示された(青色、図3)。VVE染色では、エラスチンおよび核は黒色になり、コラーゲンは赤色になる(図10)。VVE染色により、脱細胞化後にさえエラスチン環が存在することが観察された。DVにおける、主要なECMタンパク質であるラミニン、フィブロネクチン、IV型コラーゲンおよびI型コラーゲンについての免疫組織化学的検査染色によっても、重要なECMタンパク質が保存されていることが示された(図11および図12)。それぞれsircolアッセイおよびbislycanアッセイを用いたコラーゲンおよびGAGの定量によっても、脱細胞化後にコラーゲンおよびGAGの有意な減少は示されなかった(図13)。脱細胞化プロトコールにより、DNA量も、正常な静脈における組織1mg当たり193±ngから脱細胞化した静脈における15±8ng/mgまで減少した(図13)。ルミネックス、増殖因子レプチン、およびEGFによって試験した17種の血管新生増殖因子のうち、13種の増殖因子がDVになお存在した(図14)。DVに保持された増殖因子は少ないが減少倍率は7〜9分の1であった。脱細胞化した静脈において検出されなかった増殖因子は、正常な静脈では少量存在していた。これらの結果の全てにより、この脱細胞化したECMが再細胞化のための適切な足場になり得ることが示された。
【００９８】
静脈の再細胞化
バイオリアクターシステムを用いて、長さが7〜9cmの静脈5つを、血液を2日間、および内皮培地および平滑筋培地を交互に、各培地を3日間ずつ12日間用いて再細胞化した。再細胞化後の静脈の肉眼的形態はピンク色がかって見え、外膜を有した。静脈はバイオリアクターを用いて納得のいくように作動した。HEを用いた組織学的染色により、静脈の内層、中層および外層に多数の核が存在することが示された。MT染色によっても、黒色に染色された核および赤色の細胞質および青色のI型コラーゲンへの細胞の付着が存在することが確認された(図15、図16および図17)。
【００９９】
再細胞化した静脈の特徴付け
内皮細胞マーカーVWFを用いた免疫蛍光法染色により連続した緑色が示され、CD31抗体を用いた緑色の点在する出現により静脈の内膜に向かって内皮細胞が存在することが確認された(図18)。平滑筋アクチンを用いた免疫組織化学的検査染色によって、静脈の中層および外層全体にわたって紡錘状の平滑筋細胞が存在することも確認された(図19)。平滑筋細胞は静脈全体に分布し、内皮内膜のすぐ下に平滑筋細胞の薄い環が存在する。脱細胞化を、デオキシコール酸ナトリウムを用いて行った場合には同様の結果は得られなかった(図20、図21および図22)。
【０１００】
張力試験
正常な静脈と比較した脱細胞化した静脈の引っ張り強さは、破壊するために必要な力および破壊される前に伸長する長さの減少を示し、これは、脱細胞化した静脈が抵抗し得る圧力の量が正常な静脈と比較して少ないことを示す。しかし、これらの性質はどちらも、再細胞化には回復し、正常な静脈に近づいた(図23)。
【０１０１】
考察
これらの実験により、ex vivoにおける全血を使用した静脈の3次元培養が実証された。このグラフト調製および手順のための技術は、血管疾患を有する患者において臨床使用するために安全であると考えられる。固有に調製したバイオリアクターシステムは組織の成長に役立ち、灌流の圧力が軽度であることに起因して、リアクターの内側の静脈が膨張したままに保たれ、したがって表面領域全体を栄養分に曝露させることができる。TNBPおよびトリトンを用いた腸骨静脈の脱細胞化により、ECMの構成成分および強度が保護された足場ももたらされた。しかし、静脈を脱細胞化するために必要なサイクルの数はドナー間、および組織内の位置間で変動する。これらの実験では、総腸骨静脈、外腸骨静脈および内腸骨静脈を使用した。総腸骨静脈では9サイクルかかり、外腸骨静脈および内腸骨静脈は7サイクル後に脱細胞化された。6〜7サイクルの灌流後に継続的にモニタリングすることが必要であり、脱細胞化手順は核が存在しなくなったらすぐに停止することができる。
【０１０２】
バイオリアクターシステム全体を、再細胞化する前にヘパリンを用いて灌流することにより、静脈、循環しているパイプにおける血餅形成が予防され、最も重要なことに、機能が多面的であり、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞などの成長を刺激するFGFが活性化される。ルミネックスによって分析された通り、FGFは脱細胞化後でさえも大量に存在する。理由は分からないが、VEGFは、脱細胞化された組織に正常な組織と比較して多く存在するが、これは非常に有利である。VEGFは血管内皮細胞に対する潜在的なマイトジェンである。残留する組織の増殖因子は脱細胞化後にもなお存在し、ECMタンパク質であるフィブロネクチン、コラーゲン、エラスチンおよびラミニンが重要な役割を果たし、組織におけるこれらの細胞の付着および成長を増強すると考えられる。代替の内皮細胞培地および平滑筋細胞培地を用い、各培地を3日間ずつ、2回灌流することが、連続するVWFおよびCD31層が存在することを特徴とする内皮層を再配置させるために十分であることが見いだされた。また、組織に平滑筋アクチンが存在することにより、静脈が同じコンプライアンスを有し、血液を心臓に向かって押し出す伸縮の動きを助けることが示される。この手順は、任意の年齢のレシピエントに対して使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【外国語明細書】
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