(57)【要約】      （修正有）【課題】多種類の活性剤の輸送、及び／又は該活性剤の放出、標的能力を有する、官能化された固形脂質シェル及び液状脂質コアを有するカプセル。【解決手段】少なくとも１つのアミン官能基を有する化合物により表面官能化された、液状脂質コア／固形脂質シェルカプセルであって、該脂質コア／脂質シェル構造がナノメートル尺度であること、及び該化合物がアシル転移反応により前記固形脂質シェルへと共有結合されている、カプセル。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアミン官能基を有する少なくとも１つの化合物により表面官能化された液状脂質コア／固形脂質シェルカプセルであって、該脂質コア／脂質シェル構造がナノメートル尺度であること、及び、該化合物がアシル転移反応により該固形脂質シェルに共有結合されていることを特徴とする、前記カプセル。
【請求項２】
該カプセルの表面でグラフト化された該アミノ化合物が、さらに、関心のある分子へと共有結合されている、請求項１に記載のカプセル。
【請求項３】
該アミノ化合物及び／又は該関心のある分子が、タンパク質性、ペプチド性、核酸性、ポリマー性、又は無機性である、又は有機金属性のものさえである、請求項１又は２に記載のカプセル。
【請求項４】
該アミノ化合物が、アルブミン、ゼラチン、ポリペプチド、特にはポリ（アスパラギン酸）、ポリアルギニン、ポリリジン、又は合成ポリマー、特にはポリエチレンイミンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該アミノ化合物及び／又は該関心のある分子が、核酸分子、特にはｓｉＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項６】
該脂質シェルが少なくとも１つの脂溶性界面活性剤を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項７】
該脂溶性界面活性剤が、リン脂質、レシチン、及びホスファチジルコリンから選ばれるものである、請求項６に記載のカプセル。
【請求項８】
該固形脂質シェルが、親油性界面活性剤と非イオン性親水性感熱性界面活性剤とを含む少なくとも１つの界面活性剤系から構成される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項９】
該非イオン性親水性感熱性界面活性剤が、リン脂質、ポリエトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールと脂肪酸とのエステル、ポリエトキシル化脂肪酸、ポリオキシエチレン化脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレン化ノンフェニルエーテル、ポリオキシエチレン化ヒドロキシフェニルエーテル、及びポリエチレングリコール２−ヒドロキシステアレートから選ばれるものである、請求項８に記載のカプセル。
【請求項１０】
該脂質シェルが少なくとも１つのアルコールエステルを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１１】
該アルコールエステルが、炭素数が１２以下の整数、より特には１０以下の整数、さらにより特には８以下の整数であるアルコールエステルから選ばれるものである、請求項１０に記載のカプセル。
【請求項１２】
該アルコールエステルが、以下の式
【化１】
2016128404.tif 000009
に相当するものである、請求項１０又は１１に記載のカプセル。
【請求項１３】
該アシル転移反応が、該脂質シェル中に存在する少なくとも１つの脂溶性界面活性剤と、少なくとも１つのアミン官能基を有する少なくとも１つの化合物との間で起きている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１４】
該アミノ化合物が、該脂質シェル中に存在するレシチンを用いたアシル転移方法により該カプセルの表面でグラフト化される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１５】
該アシル転移反応が、該シェル中に存在する少なくとも１つのアルコールエステルと、少なくとも１つのアミン官能基を有する少なくとも１つの化合物との間で起きている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１６】
該液状脂質コアが、少なくとも１つの液状又は半液状脂肪物質、特には少なくとも１つのトリグリセリト、脂肪酸エステル、又はそれらの混合物から構成された少なくとも１つの油状脂肪相を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１７】
ナノメートル尺度である該脂質コア／脂質シェル構造が、少なくとも１つの活性剤を該コア及び／又は該シェル中に封入する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のカプセル。
【請求項１８】
固形脂質シェル及び液状脂質コアを有するナノカプセルの官能化の為の方法であって、
ｉ）固形脂質シェルと液状脂質コアとを有するナノカプセルを用意すること、
ｉｉ）該ナノカプセルをアルカリ性水性溶液と接触させて、それらの表面をアシル転移反応の為に活性化すること、
ｉｉｉ）該中間物ｉｉ）を、少なくとも１つのアミン官能基を有する少なくとも１つの化合物と接触させて、アシル転移により、期待されるカプセルを形成すること、そして、
必要に応じて、
ｉｖ）得られた官能化されたカプセルを中和すること、そして
ｖ）該官能化されたカプセルを分離すること
からなる工程を少なくとも含む、前記方法。
【請求項１９】
該アミノ化合物が、請求項３〜５のいずれか１項において言及されたものから選ばれる化合物である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該アシル転移反応が、水酸化ナトリウム溶液によるアルカリ化を実施することを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載された方法により得られたカプセル。
【請求項２２】
治療的、化粧的、又は栄養的に関心のある組成物を調製する為に、請求項１〜１７のいずれか１項に記載された少なくとも１つのカプセルを使用する方法。
【請求項２３】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載された少なくとも１つのカプセルを少なくとも１つの生理学的に許容できるビヒクルと一緒に含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のベシクル系、特には固形の脂質エンベロープと液状の脂質コアとを含むカプセルの新規ベシクル系を提案することを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
サイズが５０〜５００ナノメートルであり且つ外側膜により覆われた液状又は半固形のコアから構成されるナノカプセル又はナノドロップレットの系がすでに知られている。
【０００３】
例えば、米国特許第5 961 970号明細書は、活性剤の為のビヒクルとして、サブミクロンスケールでの水中油型エマルジョン、すなわちミニエマルジョンを提案し、そのドロップレットは、脂質性の疎水性コアを有し、リン脂質界面活性剤のような両親媒性及び／又は非イオン性界面活性剤により表面安定化されている。米国特許第5 576 016号明細書は、マクロエマルジョンを記載し、そのドロップレットは、固形の脂質コアから構成され、及び、リン脂質エンベロープにより安定化されている。欧州特許出願公開第1 265 698号明細書、国際公開第09/001019号パンフレット、及び仏国特許第出願公開第2 916 974号明細書は、それらの一部について、液状コア及び脂質性の固形シェルを有するナノカプセルを記載し、それは熱効果による相反転（phase inversion via a thermal effect）の技術により調製されたミクロエマルジョン（PIT  エマルジョン）から得られうる。
【０００４】
これらのナノパーティクル系は、親水性、疎水性又は水分散性でありうるその性質に依存して、コア中に及び／又はシェル中に存在するであろう活性剤の封入に主にささげられる。
【０００５】
本発明の為に、表現「活性剤の封入」は、親水性、疎水性、又は水分散性でありうるその性質に従い、ナノカプセルのコア又はシェルへのその組み込みを意味することが意図される。
【０００６】
しかしながら、これらのベシクル系は、多種類の活性剤の輸送及び／又はそれらの放出する及び／又は標的とする能力の完全な制御に同時には適していない。実際に、これらの系は、比較的低い分子量の活性剤だけの、特には約５０００ダルトンより低い又は約５０００ダルトンと等しい分子量の活性剤だけのカプセル化を許す。さらに、例えばそれらが輸送する活性剤の時宜を得ない何らかの放出を防ぐ為にこれらのナノカプセルのカプセル構造を強化することができること、又は、例えば胃液のような攻撃的な生物学的媒体に対するそれらのエンベロープの抵抗性を増加することができることが有利だろう。また、例えばそれらを特定の標的に対して専用のものとする目的で、それらを容易に表面官能化できることは、特に有利でありうる。すなわち、これらのナノカプセルを、肝細胞により発現されたレセプターへ向ける為に、ガラクトースタイプのリガンドを活用すること、又は、いくつかの高度に血管新生した腫瘍により発現されるαVβ3インテグリンを標的とする為にアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ＲＤＧペプチドタイプのリガンドを活用することが、特に有利でありうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、具体的には、上記言及された有利点をそれらに授けることを可能とするこれらベシクル系を官能化する方法を提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
予想外に、本発明者らは、そのような官能化が特定の条件下で行われるならば、ナノカプセルの外側表面がそのような官能化に役立つことに気付いた。
【０００９】
あらゆる予想に反して、これらのナノカプセルの該表面官能化は、動的光散乱測定により又は透過型電子顕微鏡イメージングにより本明細書以下の実施例において確認されるとおり、それらの安定性に影響せず且つそれらの解離をもたらさない。
【００１０】
すなわち、その局面の第一に従い、本発明は、少なくとも１つのアミン官能基を有する少なくとも１つの化合物により表面官能化された液状脂質コア／固形脂質シェルカプセルであって、該脂質コア／脂質シェル構造がナノメートル尺度であること及び該化合物がアシル転移反応により該固形脂質シェルへと共有結合されていることを特徴とする、前記カプセルに向けられる。
【００１１】
その局面の他に従い、本発明は、固形脂質シェル及び液状脂質コアを有するナノパーティクルの官能化の為に役立つ方法に向けられており、該方法は
ｉ）固形脂質シェル及び液状脂質コアを有するナノカプセルを用意すること、
ｉｉ）該ナノカプセルをアルカリ性の水性溶液と接触させて、それらの表面をアシル転移反応の為に活性化すること、
ｉｉｉ）該中間物ｉｉ）を、少なくとも１つのアミン官能基を有する少なくとも１つの化合物と接触させて、アシル転移により、期待されるカプセルを形成すること、そして、
必要に応じて、
ｉｖ）得られた官能化されたカプセルを中和すること、そして
ｖ）該官能化されたカプセルを分離すること
からなる工程を少なくとも含む。
【発明の効果】
【００１２】
確かに、欧州特許出願公開第0 693 963号明細書は、エステル化した多糖からの、「ゲル化」されていると呼ばれているシェルを有する粒子の調製を記載し、該多糖は、考慮下の粒子のシェル中に存在しており、そしてアシル転移反応によりポリアミンと反応することができる。
【００１３】
しかしながら、それらの性質に加えて、それは、本発明に従う考慮下のものと非常に異なっており、アシル転移反応を受ける出発粒子は数マイクロメートル〜１０ミリメートルのサイズを有する。
【００１４】
たまたま、より小さなサイズの粒子、特にはナノメートル尺度の粒子が、高いコロイド状安定性を有する。このように官能化された該ナノ粒子が、凝集又は集合に耐え、且つ、より長い寿命を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ヒト血清アルブミンの一定量の存在下における、添加されたNaOH（１N）の（μｌにおける）体積の関数としての、本発明の調製方法に従い得られたナノカプセルの（ｎｍにおける）サイズの変化を示す図である。
【図２】ヒト血清アルブミンの一定量の存在下における、添加されたNaOH（１０N）の（μｌにおける）体積の関数としての、本発明の調製方法に従い得られたナノカプセルの（ｎｍにおける）サイズの変化を示す図である。
【図３】ヒト血清アルブミンの一定量の存在下における、反応時間の関数としての及び５００μｌのNaOH（１０N）の固定された体積についての、本発明の調製方法に従い得られたナノカプセルの（ｎｍにおける）サイズの変化を示す図である。
【図４】添加されたポリリジンの（μｌにおける）体積の関数としての、本発明の調製方法に従い得られたナノカプセルの（ｍVにおける）ゼータ電位の変化を示す図である。
【図５】本発明の調製方法に従い得られた、修飾された又は修飾されていない、ナノカプセルの濃度の関数としての、細胞株U87MGに対する（％としての）相対的細胞生存率における変化を示す図である。
【図６】アシル転移により修飾されたLNCの濃度の関数としてのI/I0比の変化を示す図である。Iは、これらのLNC上に吸着されたBSA-FITC蛍光複合体の蛍光強度を表し、一方でI0は、溶液中の遊離BSA-FITCの蛍光強度を表す。
【図７】アシル転移により修飾されたLNCの濃度の関数としてのI/I0比の変化を示す図である。Iは、これらのLNC上に吸着された蛍光ｓｉＲＮＡ-FITC複合体の蛍光強度を表し、一方でI0は、溶液中のｓｉＲＮＡ-FITCの蛍光強度を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の目的の為に、語「官能化されたナノカプセル」は、固形脂質シェルを有するナノカプセルを意味することが意図され、その表面は、官能化されていない状態にあるナノカプセルの表面と比べて修飾された構造を有し、この修飾された構造は特には少なくとも１つのアミン官能基を有する少なくとも１又はそれより多い化合物の表面グラフト化の結果である。
【００１７】
簡素化の目的の為に、これらの化合物はまた、本明細書以下でアミノ化合物とも示される。そのような化合物は、有利には、少なくとも２つの、少なくとも３つの、又はより多くさえの、アミン官能基を有しうる。
【００１８】
そのような分子のアンカリングが、このように官能化された該ナノカプセルに、その当初の（すなわち官能化されていない）サイズよりも大きなサイズを与えることを理解することは容易である。すなわち、もし該当初のナノカプセルが１５０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満、より好ましくは５０ｎｍ未満の平均サイズを有するならば、それらの官能化後に得られる該カプセルは、それらの一部について、１５０ｎｍ超、又は２００ｎｍ超さえの平均サイズを有しうる。そのプロセスの制御、特には反応時間の制御は、該官能化されたナノカプセルの最終サイズ（これは有利には２５０ｎｍ未満のままでありうる）を制御することを可能にする。
【００１９】
また、本発明に従うカプセルの表面に取り付けられる該アミノ化合物は、関心のある１以上の（１又はそれより多い）分子の取り付けに適しうる。
【００２０】
すなわち、本発明の目的の為に、語「アミノ化合物」は、関心のある分子とも呼ばれる、活性剤それ自体、すなわち生物学的、薬理学的、化粧的又は植物衛生的な活性を有する実体、又は、１又はそれより多い補足的な官能性（functionalities）を該ナノカプセルに与えることができる化学的又は生物学的実体、特にはそれらの外側構造を強化することができる及び／又は該付随する活性剤の特異的な標的化を許すことができる化学的又は生物学的実体を包含する。
【００２１】
有利には、該アミノ化合物及び／又は該関心のある分子は、タンパク質性、ペプチド性、核酸性、ポリマー性、又は無機性のものであり、又は有機金属性のものさえである。
【００２２】
考慮下の該ナノカプセルの観点から、本発明に従う方法は、
それらのナノカプセル構造を強化する為に、
それらのカプセル化された活性成分の放出キネティクスを修正する為に、
必要に応じて、
消化管などの攻撃的な生物学的媒体に対するそれらの抵抗性を増加する為に、
１又はそれより多い活性剤を有する該油状コアをいずれかの外部の攻撃（酸化、光）に対して保護する為に、
アシル転移後に反応することができる高分子量分子又は親水性ポリマー、例えば核酸、siRNA、ヘパリン及びヘパリン誘導体、負に又は正に荷電したタンパク質及びポリペプチド、又はマクロポリアニオンなど、を輸送する為にこれらのナノ粒子を利用する為に、
及び／又は
これらのナノ粒子の表面で、免疫系と相互作用する分子の提示を許す為に、
最も特に有利であることが分かる。
【００２３】
その対象の他に従い、本発明はまた、本発明に従うカプセルを、組成物を調製する為に使用する方法にも向けられる。
【００２４】
すなわち、本発明は、本発明に従う少なくとも１つのカプセルを、治療的、化粧的、又は栄養的に関心のある組成物を調製する為に使用する方法に関する。
【００２５】
それ故に、本発明は、本発明に従う少なくとも１つのカプセルを、少なくとも１つの生理学的に許容できるビヒクルと一緒に含む組成物、特には医薬的組成物にも向けられている。
【００２６】
カプセル
【００２７】
以下の文章において、語「LNC」は、「脂質ナノカプセル」を意味する。
【００２８】
上記で示されたとおり、本発明に従うカプセルは、実際には、固形脂質シェル及び液状脂質コアを有するナノカプセルに相当し、これはアシル転移プロセスにより表面官能化されている。
【００２９】
得られるカプセルは、７０〜２５０ｎｍの平均サイズを有する。もちろん、より大きなサイズのカプセルが、該プロセスのパラメータを適切に変えることにより得られうる。
【００３０】
そのような変更は、もちろん、当技術分野の当業者の範囲内である。
【００３１】
そのようなカプセルは、動的光散乱及び小角中性子散乱により分析されうる。
【００３２】
上記で示されたとおり、該カプセルの外側シェルは、その表面でアシル転移反応により共有結合的にグラフト化された少なくとも１つのアミノ化合物を含む。
【００３３】
本発明に従い、語「結合した」及び「グラフト化された」は、区別無く、該シェルと該アミノ化合物との間で共有結合が起きていることを意味し、アシル転移反応に由来するこの結合は該２つの実体の間で起きている。
【００３４】
第一の変形に従い、このアミノ化合物は、それ自体、上記で記載されたとおり、関心のある分子であり、上記で記載されたとおり、それは本発明に従うカプセルにより輸送することが有利である。
【００３５】
上記で特定されたとおり、この関心のある分子は、タンパク質性、ペプチド性、核酸性、又はポリマー性のものでありうる。
【００３６】
それは特には、タンパク質であり、好ましくは親水性タンパク質又は親水性、すなわち水溶性又は水分散性となるように処理されたタンパク質、フリーのアミノ基、ポリペプチド又はポリマーを含む、から選ばれうる。
【００３７】
本発明において用いられうる及び親水性であることの要件を満たす又は親水性であるように処理されうるタンパク質の例は、アルブミン、例えば血清アルブミン、特にはヒト血清アルブミン、オボアルブミン又はα−ラクトアルブミン、グロブリン、フィブリノーゲン、カゼイン、植物タンパク質、例えば大豆タンパク質又は小麦タンパク質など、グルテニン（これは好ましくは減成されているであろう）、可溶化硬タンパク質、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、ゼラチン加水分解物、ペプトン、ヘモグロビン、酵素、例えばカタラーゼ又はアルカリホスファターゼなど、ホルモン、イムノグロブリン又は抗体、例えばモノクローナル抗体など、である。
【００３８】
有利には、ポリペプチドの例として、ポリ（アスパラギン酸）、ポリアルギニン又はポリリジンが言及されうる。
【００３９】
ポリマーの例として、合成ポリマー、より特にはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が言及されうる。
【００４０】
核酸の例として、特にsiRNAが言及されうる。
【００４１】
必要に応じて第一の変形に内在しうる第二の変形に従い、該アミノ化合物は、付属の活性剤、より特にはその標的化する能力及び／又は標識する能力の観点から考慮される付属活性剤を輸送する為に用いられる。該アミノ化合物は、より特には、これらの目的の為に、すなわち関心のある分子をナノカプセルに結合しなければならない剤として考慮される場合、モノクローナル抗体、ＲＧＤリガンド、アミノ糖及びポリリジンから選ばれるアミノ化合物の選択がより特に好ましい。
【００４２】
該活性剤により代表される該関心のある分子に関して、それは、該アミノ化合物について、上記で提示された定義に従いうる。
【００４３】
それは、例えば、例えば蛍光、発光、又はリン光の実体を有する、診断の為に関心のある物質であってもよく、又は、生物学的活性を有する分子、例えば酵素、ホルモン、抗体、又はヘモグロビンなど、であってもよい。
【００４４】
さらに他の変形に従い、該アミノ化合物は、該ナノカプセルの外側表面抵抗性を強化するその能力の観点から関心のあるものである。すなわち、それは、ポリエチレングリコールユニットを有する任意の分子でありうる。そのような化合物に基づく表面コーティングは、実際には、肝臓マクロファージによるナノカプセルの取り込みの有意な減少の故に、増加した小胞残留性（persistence）を与えるのに有利である。
【００４５】
さらなる他の実施態様に従い、本発明に従うカプセルは、それらが、それらの外側表面で、或る数の反応性付属ユニット、例えば付属実体へとカップリングする為に適したアミンユニット及び酸ユニットなど、を有しうるということに関して有利でもある。そのようなユニットは、有利には、該ナノカプセルを官能化する為に用いられた該アミノ化合物上に存在する。すなわち、さらに他の実施態様変形に従い、本発明に従う考慮下の該アミノ化合物は、当初のナノカプセルに、これらのナノカプセルの表面へのアシル転移反応により取り付けられたそれらのアミンユニットを介して、治療的効果の点で、標識する点で、標的化する点で、及び／又は周囲媒体により引き起こされるいずれかの有りうる減成に対して保護する点で関心のある他の分子と結びつける能力を授けるという非常に大きな利点を有しうる。
【００４６】
アミノ化合物に共有結合されることができる関心のある分子（それ自体は、該カプセルの脂質シェルの表面でグラフト化されている）は活性剤、特には親水性活性剤（これはより特には負に荷電している）、又は、特には標的化する／標識する点で又は該ナノカプセルの抵抗性及び安定性を強化する目的で、該ナノカプセルに付属機能を備えることにささげられる分子のいずれかでありうる。
【００４７】
該活性剤は、治療的に関心のある化合物であってよく、これは特には医薬的に活性であり、化粧的に活性であり、又は、植物防疫において又は食品若しくは栄養分野において活性である。
【００４８】
一つの好ましい実施態様に従い、この活性剤は、上記で定義されたとおりの医薬的に活性な成分である。
【００４９】
本発明のナノカプセルは、より特には、以下の活性成分の投与に適している：抗感染剤、このうち抗真菌剤；抗生物質；抗ガン剤；免疫抑制剤；血液脳関門を通過しなければならない中枢神経系の為の活性成分、例えば抗パーキンソン病剤、鎮痛剤、及びより一般には、神経変性疾患を処置する為の活性成分。
【００５０】
有利には、そのような活性剤は、タンパク質性、ポリペプチド性、又はペプチド性のものでありうるが、核酸、例えばＤＮＡプラスミド又は干渉ＲＮＡ（又はsiRNA）、又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアプタマーなど、であってもよい。必要に応じて、該脂質シェルに直接に又は付属アミノ化合物を介して結合された、活性剤により官能化された該カプセルは、それらの外側表面を、該取り付けられた活性剤の保護を強化するために、付属化合物、例えばポリリジンなど、により官能化することに向けられた追加の処理を受けうる。
【００５１】
このように形成されたカプセルは、多層系に連結されうる。
【００５２】
そのような実施態様変形は、実施例９に説明されている。
【００５３】
上記で示された通り、本発明に従うカプセルは、固形の脂質シェルを含む。
【００５４】
固形脂質シェル
【００５５】
この脂質シェルは、固形であり、且つ、アシル転移反応によりアミノ化合物と反応することができる少なくとも１つの化合物を含む。それは一般的には、少なくとも１つのエステル基を有する化合物である。
【００５６】
該エステル基を有するこの化合物は、該固形脂質シェルの形成及び構造に並行して貢献する化合物、例えば親油性界面活性剤など、又は、アシル転移反応が起きる為だけに該脂質シェルへと導入された付属化合物さえでありうる。
【００５７】
すなわち、該固形脂質シェルは、少なくとも１つの脂溶性又は親油性界面活性剤を含む。
【００５８】
有利には、該親油性界面活性剤は、周囲温度で固形である。
【００５９】
該親油性界面活性剤は、より特には、それらの生体適合的性質の観点から有利であるリン脂質に基づく。
【００６０】
該リン脂質のうち、ホスファチジルコリン（レシチン）が、最も特に有利である。
【００６１】
他のリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、及びホスファチジルエタノールアミンでありうる。
【００６２】
該リン脂質誘導体は、天然の源から単離されてよく、又は、合成により調製されてもよい。
【００６３】
リン脂質に由来する市販の製品として、
EPICURON  120（商標） (Lukas  Meyer、ドイツ)、これは約70%のホスファチジルコリン、12%のホスファチジルエタノールアミン、及び約15%の他のリン脂質の混合物である;
OVOTINE  160（商標）(Lukas  Meyer、ドイツ)、これは 約60%のホスファチジルコリン、18%のホスファチジルエタノールアミン、及び12%の他のリン脂質を含む混合物である;
製品Lipoid  E75（商標）又はLipoid  E-80（商標）(Lipoid、ドイツ)のような精製されたリン脂質の混合物、これは約80重量%のホスファチジルコリン、8重量%のホスファチジルエタノールアミン、3.6重量%の非極性脂質、及び2%のスフィンゴミエリンを含むリン脂質の混合物である、
が特には言及されうる。
【００６４】
好ましい実施態様に従い、該親油性界面活性剤は、ホスファチジルコリンの割合が、４０〜８０重量％であるレシチンである。
【００６５】
Lipoid  S75-3（商標）(Lipoid  GmbH、ドイツ)が、ホスファチジルコリンの源として最も特に適している。それは大豆レシチンである。後者は、約69%のホスファチジルコリン及び9%のホスファチジルエタノールアミンを含む。この構成は、そのフォーミュレーション（formulation）において３７℃で及び周囲温度で固形である唯一の構成である。ポリグリセリル-6-ジオレエート(Plurol（商標）)もまた用いられうる。
【００６６】
有利には、上記言及された界面活性剤が、共活性剤（cosurfactant）、例えば他のリン脂質など、と組み合わせられうる。この点において、ホスファチジルコリン（レシチン）が特に有利である。
【００６７】
本発明に適した他のリン脂質は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、及びホスファチジルエタノールアミンでありうる。
【００６８】
有利には、一つの実施態様変形に従い、該固形脂質シェルは、上記で定義されたとおりの脂溶性界面活性剤及び非イオン性親水性感熱性界面活性剤を含む少なくとも１つの界面活性剤系から構成される。
【００６９】
有利には、非イオン性親水性感熱性界面活性剤は、両親媒性親水性界面活性剤である。
【００７０】
通常用いられる該乳化する界面活性剤は、８〜１８のＨＬＢ（ＨＬＢ＝親水性親油性バランス）を有する。
【００７１】
これらの界面活性剤は、エトキシル化脂肪アルコール、エトキシル化脂肪酸、エトキシル化脂肪酸の部分グリセリド（partial  glyceride）、ポリエトキシル化脂肪酸トリグリセリド、及びそれらの混合物から選ばれうる。
【００７２】
エトキシル化脂肪アルコールとして、例えば、ラウリルアルコールとエチレンオキシドとの付加の産物、特には９〜５０のオキシエチレン基を含むもの（CTFA 名においてlaureth-9〜laureth-50）；ベヘニルアルコールとエチレンオキシドとの付加の産物、特には９〜５０のオキシエチレン基を有するもの（ＣＴＦＡ名においてbeheneth-9〜beheneth-50）；セトステアリルアルコール（セチルアルコール及びステアリルアルコールの混合物）とエチレンオキシドとの付加の産物、特には９〜３０のオキシエチレン基を有するもの（ＣＴＦＡ名においてceteareth-9〜ceteareth-30）；セチルアルコールとエチレンオキシドとの付加の産物、特には９〜３０のオキシエチレン基を有するもの（ＣＴＦＡ名においてceteth-9〜ceteth-30）；ステアリルアルコールとエチレンオキシドとの付加の産物、特には９〜３０のオキシエチレン基を有するもの（ＣＴＦＡ名においてsteareth-9〜steareth-30）；イソステアリルアルコールとエチレンオキシドとの付加の産物、特には９〜５０のオキシエチレン基を有するもの（ＣＴＦＡ名においてisosteareth-9〜isosteareth-50）；及びそれらの混合物が言及されうる。
【００７３】
エトキシル化脂肪酸として、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、又はベヘン酸とエチレンオキシドとの付加の産物及びそれらの混合物、特には９〜５０のオキシエチレン基を有するもの、例えばPEG-9〜PEG-50のラウレート（ＣＴＦＡ名においてPEG-9  laurate〜PEG-50  laurate）；PEG-9〜PEG-50のパルミテート（ＣＴＦＡ名においてPEG-9  palmitate〜PEG-50  palmitate）；PEG-9〜PEG-50のステアレート（ＣＴＦＡ名においてPEG-9  stearate〜PEG-50  stearate）；PEG-9〜PEG-50のパルミト−ステアレート；PEG-9〜PEG-50のベヘネート（CTFA名において、PEG-9  behenate〜PEG-50  behenate）；及びそれらの混合物など、が言及されうる。
【００７４】
脂肪アルコール及び脂肪酸のこれらオキシエチレン化誘導体の混合物も用いられうる。
【００７５】
これらの界面活性剤もまた、該リン脂質のような天然化合物であってよく、又は、合成化合物、例えばポリソルベートなど（これはポリエトキシル化ソルビトール脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ（商標））である）、ポリエチレングリコールと脂肪酸（例えばキャスター油（Cremophor（商標））に由来する）とのエステル、ポリエトキシル化脂肪酸、例えばステアリン酸（Simulsol  M-53（商標））、ポリオキシエチレン化脂肪アルコールエーテル（Brij（商標））、ポリオキシエチレン化ノンフェニルエーテル（Triton  N（商標））、又はポリオキシエチレン化ヒドロキシフェニルエーテル（Triton  X（商標））など、でありうる。
【００７６】
より特には、それは、ポリエチレングリコール２−ヒドロキシステアレート、及び特にはＢＡＳＦ社（ドイツ）により名称Solutol（商標）HS15下で販売される製品でありうる。
【００７７】
一つの好ましい実施態様に従い、該シェルは、レシチン及びポリエチレングリコール２−ヒドロキシステアレート（特には名称Solutol（商標）HS15下で販売される製品）から構成される少なくとも１つの界面活性剤系を含む。
【００７８】
第一の実施態様変形に従い、少なくとも１つの上記言及された界面活性剤は、それがエステル基を有するならば、さらに、本発明に従う考慮下の少なくとも１つのアシル転移反応に関与する。
【００７９】
第二の実施態様変形に従い、該脂質シェルは、少なくとも１つの該上記言及された界面活性剤に加えて、該界面活性剤と異なる少なくとも１つのアルコールエステル（本発明に従い要求される少なくとも１つのアシル転移反応を与えるように存在する）を含む。
【００８０】
有利には、該アルコールエステルの炭素数は、１２以下（１２と同じであるか又は１２未満）、より特には１０以下、さらにより特には８以下である整数である。
【００８１】
そのようなエステルは、実施例６において説明されている。
【００８２】
本発明に適する該アルコールエステルのうち、以下の式に相当するエステルが特に有利である：
【化１】
2016128404.tif 000002
【００８３】
本発明に従う脂質ナノカプセルの処方へのこれらのエステルの組み込みは、該脂質シェルの形成の為の考慮下の界面活性剤とエステルとの混合物の合計重量に対して、約１〜２５重量％、より特には５〜２０重量％の重量割合で実施されうる。
【００８４】
一般に、本発明に従うカプセルは、該処方の無機物質だけを考慮に入れて、それらの全重量に対して、それらが他に含む界面活性剤と異なる、約１〜１０重量％のアルコールエステルを含みうる。
【００８５】
本発明に従うアルコールエステルの使用は、該ＬＮＣの当初の特性の安定性を、特にはそれらのコロイド状安定性及びそれらのステルス（stealth）の点で、有意に強化することを可能とする。本発明に従うカプセルの該脂質シェルのレベルでのアシル転移反応の為の部位としてのそのようなアルコールエステルの使用により授けられる他の利点は、このアシル転移工程の間に潜在的に用いられうる反応物へのそれらの大きな接近可能性に基づき、実施例において見られるとおり、結果として、付加収率（the  attachment  yeild）における改善を伴う。
【００８６】
もちろん、上記言及された２つのアシル転移反応実施態様変形は、もちろん、もし該カプセルの該シェルが、該界面活性剤、特には親油性界面活性剤に加えて、上記で定義された少なくとも１つのアルコールエステルを含むならば、本発明に従う１つのカプセルにおいて共に存在しうる。
【００８７】
必要に応じて、該シェルは、少なくとも１つの活性剤も封入しうる。この場合において、それは、むしろ、脂溶性又は脂分散性の性質の活性剤であろう。
【００８８】
有利には、そのような脂溶性又は脂分散性の活性剤は、本発明に従う調製方法の工程ｉ）において用いられる出発ナノカプセル中にすでに存在する。
【００８９】
一つの実施態様に従い、該固形脂質シェルは、タンパク質を欠いている。本発明に従うカプセルは、さらに、液状脂質コアを含む。
【００９０】
液状脂質コア
【００９１】
該液状脂質コアは、少なくとも１つの液状又は半液状（semi-liquid）脂肪物質、特には少なくとも１つのトリグリセリド、脂肪酸エステル、又はそれらの混合物から構成される少なくとも１つの油状の脂肪相を含む。
【００９２】
該脂肪酸エステルは特には、C8〜C18、特にはC8〜C12の脂肪酸エステル、特には、エチルパルミテート、エチルオレエート、エチルミリステート、イソプロピルミリステート、オクチルドデシルミリステート、及びそれらの混合物から選ばれうる。
【００９３】
用いられる該トリグリセリドは、合成のトリグリセリド又は天然由来のトリグリセリドでありうる。該天然の源は、動物脂肪又は植物油、例えば大豆油、又は長鎖トリグリセリド（ＬＣＴ）源を含みうる。
【００９４】
関心のある他のトリグリセリドは、中鎖脂肪酸（または中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）とも呼ばれる）から主に構成される。中鎖トリグリセリド（ＭＣＴ）油は、炭化水素鎖が８〜１２の炭素原子を有するトリグリセリドである。
【００９５】
そのようなＭＣＴ油は市販入手可能である。
【００９６】
これらのＭＣＴ油の例として、ＴＣＲ製品（約９５％の脂肪酸鎖が８又は１０の炭素原子を有するトリグリセリド混合物についての、Societe  Industrielle  Des  Oleagineux、フランス、からのトレードネーム）、及びMiglyol（商標）812（カプリル酸グリセリドトリエステル及びカプリン酸グリセリドトリエステルの混合物についての、Dynamit  Nobel社、スウェーデン、により販売されるトリグリセリド）が言及されうる。
これらのトリグリセリドの脂肪酸ユニットは、不飽和、モノ不飽和、又はポリ不飽和でありうる。種々の脂肪酸ユニットを有するトリグリセリドの混合物もまた許容できる。
【００９７】
ＨＬＢ値、すなわち親水性親油性バランスは、C. Larpent in Traite K.342 of the Editions Techniques de l'Ingenieur、により定義されるとおりである。
【００９８】
名称Labrafac  WL  1349（商標）下で販売されるトリグリセリドは、本発明に最も特に適している。
【００９９】
一つの好ましい実施態様において、該脂肪相は脂肪酸トリグリセリドである。
【０１００】
上記で示されたとおり、該液状脂質コアは、必要に応じて、その中に活性剤を封入しうる。この活性剤は、好ましくは脂溶性である。しかしながら、水溶性又は水分散性の性質の活性剤もまた、該脂質コア中に封入されうる。この場合において、それは、その封入の前に、フォーミュレーション（formulation）を受ける必要があるであろう。
【０１０１】
例えば、該活性剤は、例えば国際公開第09/001019号パンフレット及び仏国特許出願公開第2 916 974号明細書にそれぞれ記載されるとおり、逆ミセル又はミクロエマルジョンの形にありうる。
【０１０２】
本発明に従い封入されうる活性剤の非限定的な説明として、特に、ドキソルビシン及び、医薬的に許容できる酸とのその付加塩、より特には塩酸塩、及び低分子量ヘパリンが言及されうる。
【０１０３】
本発明に従うカプセルを調製する為の方法
【０１０４】
上記で示されたとおり、該ナノ粒子状態にあるカプセルは、それらの固形脂質エンベロープの少なくとも１つの構成要素と少なくとも１つのアミノ化合物との間のアシル転移反応を受ける。
【０１０５】
このアシル転移反応は、上記で記載されたとおりの、該脂質エンベロープの化合物、好ましくは界面活性剤、特には脂溶性界面活性剤、又は、もし存在するならば、アルコールエステルと、考慮下の該アミノ化合物との間で、１又は複数のアシル基が交換される反応に相当する。
【０１０６】
一つの好ましい実施態様変形に従い、該脂溶性界面活性剤はレシチンである。
【０１０７】
有利には、そのような反応は、実施することが簡単であり、そして、いずれの難しい取り扱いを要求しない。
【０１０８】
この反応の第一工程は、アシル転移反応に関して、該ナノカプセルの表面を、これらのナノカプセルと少なくとも１つのアルカリ性水性溶液との接触により、アルカリ化してそれらを活性化することからなる。
【０１０９】
有利には、該アシル転移反応を開始する為に、該ナノカプセルが直接に分散される該水性相に添加されるべきアルカリ剤の量は、ナノカプセルの水性懸濁物のｐＨが８〜１４、より好ましくは８〜１０であるようなものである。
【０１１０】
該アシル転移反応を開始する為に添加されるべき該アルカリ剤は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、又はアミノ化合物、例えばトリエチルアミンなど、から選ばれうる。
【０１１１】
この反応の第二工程は、これらのアルカリ化されたナノカプセルを、少なくとも１つのアミノ化合物と、該アシル転移に適した条件下で、接触させることからなる。該反応は、好ましくは、該反応が起こるのに必要な時間、すなわち５分〜３０分間、撹拌することに置かれる。
【０１１２】
例えば、該アシル転移反応が発生する為に該アルカリ性溶液中に該粒子が維持される時間は、５分〜１時間、好ましくは５分〜３０分でありうる。より好ましくはそれは１５分である。
【０１１３】
本発明に従う該ナノカプセルを官能化する該アシル転移反応において用いられる該アミノ化合物は、有利には、上記で定義されたとおりのものである。
【０１１４】
該アシル転移反応からの収率は、該アシル転移反応の持続時間を増加することにより及び／又は該アシル転移反応を開始する該アルカリ性溶液の組成物におけるバリエーションにより、特には該アルカリ性溶液を調製する為に用いられるアルカリ性剤の量を増加することにより、増加されうる。
【０１１５】
有利には、アシル転移反応の最後で、該反応媒体を中和する最後の工程が、適切な濃度、一般には0.l mol/リットル〜6 mol/リットルの間の濃度、の塩化水素酸の溶液を添加することにより実施され、そのｐＨは、7〜7.4の値に戻される必要がある。
【０１１６】
該アシル転移反応後の粒子の水性懸濁物を中和する為に用いられる酸性剤は、例えば、任意的にアルコール基を有していてもよい有機モノカルボン酸又は有機ポリカルボン酸、例えば酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、リンゴ酸、若しくは乳酸など、又は無機酸、例えば塩化水素酸又は硫酸など、から選ばれうる。
【０１１７】
この粒子中和時間、すなわち該酸の該反応媒体への添加後に必要な撹拌時間は、５分〜１時間、好ましくは５分〜３０分であってよく、より好ましくはそれは１５分である。
【０１１８】
該修飾されたナノカプセルは、続いて、当技術分野の当業者によく知られた精製方法、例えば透析若しくはろ過技術又はクロマトグラフィー技術（ＨＰＬＣ、例えばイオン交換カラム、サイズ排除分離）など、に従い精製されうる。
【０１１９】
出発ナノカプセルを調製する為の方法
【０１２０】
本発明の目的の為に、語「ナノカプセル」は、ナノスフィアと区別される。マトリックス粒子である、すなわちその全マスが固形であるナノスフィアと対照的に、語「ナノカプセル」は、周囲温度で固形であるフィルム又はシェルにより覆われた、周囲温度で液状又は半液状であるコアからなる粒子を意味することが意図される。すなわち、ナノスフィアが医薬的に活性な成分を含む場合、該成分は該固形マトリックス中に細かく分散されている。
【０１２１】
有利には、本発明に従う方法の工程ｉ）のナノカプセル、すなわち官能化されていない状態にあるナノカプセル、すなわちいずれのアシル転移も受けていないナノカプセルは、１５０ｎｍ未満、好ましくは１００ｎｍ未満、より好ましくは５０ｎｍ未満の平均サイズを有する。これらのサイズは、光子相関分光法、走査型電子顕微鏡法、又は低温観察モードにある透過電子顕微鏡法により決定されうる。
【０１２２】
該固形フィルム又はシェルの厚さは、有利には、2〜10 nmである。それは、該粒子の直径とおおよそ同じ〜該直径の１０分の１である。この厚さは、マスバランス（mass balance）により計算されてよく、又はネガティブ染色透過電子顕微鏡法（negative-shadow  transmission  electron  microscopy）により又は代わりに低温観察モードにある透過電子顕微鏡法により又は小角中性子散乱により視覚化されうる。
【０１２３】
それらのサイズを考えると、該出発ナノカプセルは、コロイド状脂質粒子である。
【０１２４】
本発明のナノカプセルの多分散度指標は、有利には、5〜15%である。この指標は、光子相関分光法により得られるサイズヒストグラムについて決定される。
【０１２５】
該ナノカプセルそれぞれは、周囲温度で固形である本質的に脂質のシェルにより覆われた、周囲温度で液状又は半液状である本質的に脂質のコアからなる。
【０１２６】
本発明の目的の為に、表現「本質的に脂質の」は、本発明に従うナノカプセルを形成する該コア及び該シェルが、５０重量％超、特には７５重量％超、特には８０重量％超、又はそれらのそれぞれの重量の９０％超さえ、より特には９５％超さえ、又は完全にさえの、１又はそれより多い脂質（疎水性）化合物からなることを意味する。これらのパーセンテージは、存在している界面活性剤が該液相の一部を形成することを考慮することにより評価される。
【０１２７】
本発明の目的の為に、表現「周囲温度」は、１８〜２５℃の温度を意味する。
【０１２８】
該出発ナノカプセルは、有利には、
ａ）エマルジョンの相反転（phase  inversion）により調製され（formulated）、且つ、上記で定義されたとおりの少なくとも１つの脂溶性界面活性剤を含む少なくとも１つの界面活性剤系により安定化されたミクロエマルジョンを用意すること、
ｂ）該ミクロエマルジョンを急冷して、周囲温度で液状である脂質コアから構成され且つ周囲温度で固形である脂質フィルムにより覆われているナノカプセルを得ること
からなる工程を少なくとも含む方法に従い得られうる。
【０１２９】
出発ナノカプセルの形成に最も特に適しているミクロエマルジョンは、少なくとも１つの油状脂肪相、１つの水性相、及び、上記で定義されたとおりの少なくとも１つの親油性界面活性剤及び好ましくは非イオン性親水性感熱性界面活性剤をも含む、１つの界面活性剤系、並びに、必要に応じて、少なくとも１つのアルコールエステル（その炭素数は優先的には１２以下の（１２と同じ又は１２より小さい）整数、より特には１０以下の整数、さらにより優先的には８以下の整数である）を含む。
【０１３０】
そのようなミクロエマルジョンは例えば、以下のように調製されうる。
【０１３１】
該ミクロエマルジョンを形成する為に意図される構成成分の全てが、容器中に秤量される。その混合物が、例えばRayneriミキサーにより３５０ｒｐｍでホモジナイズされ、そして温度を水浴により徐々に、相反転温度Ｔ２以上（より高い又はそれと同じ）の温度へと、すなわちより粘性な白い相が得られるまで（これは逆エマルジョンが得られたことを示す）、上げることにより加熱される。次に、該加熱が停止され、そして、該撹拌が、周囲温度が再度達せられるまで維持され、相反転温度Ｔ１（すなわち透明な又は半透明な相の形にある期待されるミクロエマルジョンを形成する温度）を通過する。温度が、相反転温度（Ｔ１）より低い領域へ下がってきた場合、出発エマルジョンが再度得られることが注意されるべきである。この一連の操作は、有利には繰り返され、そして、温度が再度相反転温度（Ｔ１）になった場合、期待されるナノカプセルを形成する為に冷却が行われる。
【０１３２】
そのような技術は、より特には、上記言及された文献、仏国特許出願公開第2 916 974号明細書及び欧州特許出願公開第1 265 698号明細書に記載されている。
【０１３３】
活性剤、特には親油性の性質を有する活性剤を該脂質コア内に封入することが望まれる場合、そのような出発ナノカプセルは、上記言及された工程ａ）とｂ）との間に２つの追加工程
該ミクロエマルジョンと異なり且つ少なくとも１つの活性剤から全部が又は一部が構成される第２の組成物を用意すること、
該ミクロエマルジョンを、該第２の組成物と、該活性剤と該ミクロエマルジョンとの間の相互作用に適した条件下で接触させること、
を含む同様の調製方法に従い得られうる。
【０１３４】
そのような方法は、より特には、仏国特許出願公開第2 916 974号明細書に詳述されている。
【０１３５】
代わりに、活性剤を封入しているそのような出発ナノカプセルは、
上記で定義されたとおりの少なくとも１つの親油性界面活性剤により安定化されており且つその親水性相中に、少なくとも１つの活性剤、特には上記で言及されたとおりの親水性又は水分散性の性質を有する少なくとも１つの活性剤を含む、油中水型性質の少なくとも１つの第一のミクロエマルジョンを用意すること、
エマルジョンの相反転により調製され且つ上記で言及されたとおりの少なくとも１つの非イオン性親水性感熱性界面活性剤により安定化された、該第一のミクロエマルジョンと異なる少なくとも１つの第２のミクロエマルジョンを用意すること、
該第一のミクロエマルジョンを、該第２のミクロエマルジョンへと、該活性剤をその親水性相中に内在化する新規ミクロエマルジョンの形成に適した条件下で、添加すること、そして、
前記添加する工程において得られた該ミクロエマルジョンを急冷して、期待されるナノカプセルを得ること、
からなる工程を少なくとも含む調製方法に従い調製されうる。
【０１３６】
一つの実施態様変形に従い、該ミクロエマルジョンの少なくとも１つ、好ましくは該第一のミクロエマルジョンは、該界面活性剤と異なる少なくとも１つのアルコールエステルも含む。
【０１３７】
本発明は、本発明の領域の非限定的な説明として与えられる以下の実施例及び図面により説明される。
【実施例１】
【０１３８】
ヒト血清アルブミンにより官能化されたナノカプセルの調製
【０１３９】
１．活性剤を充填されていないミクロエマルジョンの調製
【０１４０】
75mgのLipoid  S75-3（商標）、504mgの親油性Labrafac  WL  1349（商標）、504 mgのSolutol  HS（商標）、15.383 gの水、及び88mgの塩化ナトリウムを含む５ｇのエマルジョンが調製される。
【０１４１】
全部が同じビーカー中で一緒にされ、そして、磁力で撹拌される。それが、８５℃の温度が達せられるまで加熱される。磁力での撹拌となお一緒に、該系は、６０℃の温度へと冷めることが許される。これらの温度サイクル（８５℃と６０℃との間）が、3回実施されて、次第に構造化されたミクロエマルジョンを得る。該系は次に、それを、相反転領域に含まれる（又は相反転領域にごく接近した）温度で（この場合は６５℃）で安定化することにより、そのミクロエマルジョン形態に維持される。
【０１４２】
２．ＬＮＣを得る
【０１４３】
該相反転温度で安定化された該ミクロエマルジョンが、急に冷却されるか又は冷水により希釈されて、ＬＮＣの懸濁物を形成する。
【０１４４】
３．ヒト血清アルブミンの結合
【０１４５】
１０ｍｌの「ＬＮＣ」ナノカプセルが、１０分間、撹拌しながら、ＮａＯＨ（１Ｎ）存在下において（０から２０００μｌへと体積を変える）、インキュベートされる。次に、５００μｌの５重量％でのヒト血清アルブミン溶液が添加される。該混合物が、15分間置かれて反応させられ、そして次に、該溶液が、１Ｍの濃度を有する塩化水素酸の溶液により中和され、その体積は、出発時で用いられる水酸化ナトリウムの量に依存する。得られた結果が図１に示されている。
【実施例２】
【０１４６】
ヒト血清アルブミンにより官能化されたナノカプセルの調製
【０１４７】
官能化されたＬＮＣが、実施例１に記載された方法と類似の方法により調製され、今回はNaOH (10N)の溶液を用いる。
【０１４８】
得られた結果が図２に示されている。
【実施例３】
【０１４９】
ヒト血清アルブミンにより官能化されたナノカプセルの調製
【０１５０】
官能化されたＬＮＣが、実施例２において記載された方法と類似の方法により調製され、今回は反応時間を０から３０分に変える。
【０１５１】
得られた結果が図３に示されている。
【実施例４】
【０１５２】
ポリリジンＦＩＴＣにより官能化されたナノカプセルの調製
【０１５３】
該調製は、実施例１の調製方法と類似の方法により行われ、今回は、添加されるポリリジンの体積を０から２００μｌに変える。ゼータ電位は、添加されたポリリジンの体積の関数として測定される。
【０１５４】
得られた結果が図４に示されている。
【０１５５】
修飾された脂質ナノカプセルのゼータ電位と反応混合物中に導入されたポリリジンの量との間の依存関係があること、すなわち該脂質ナノカプセルに結合したポリリジンの量と前者のゼータ電位との間の関係があることが非常に明らかに明白であり、これはそれらの、負に荷電した親水性分子を結合する能力を条件づける。
【０１５６】
さらに、製造工程にわたって、該脂質ナノカプセルに結合したタンパク質の量を追跡することが可能である。
【０１５７】
以下の表１は、透析工程の前及び後でタンパク質をアッセイした結果を与える。該アッセイは、μＢＣＡ法に基づく。
【０１５８】
μＢＣＡは、アッセイされるべきタンパク質とμＢＣＡ試薬とにより形成された複合体による光の吸収に基づく分光光度アッセイ方法である。この方法は、既知濃度のタンパク質溶液(PIERCEからのμBCA)から用意された較正範囲の使用を要求する。
【０１５９】
【表１】
2016128404.tif 000003
【実施例５】
【０１６０】
siRNA複合体形成の為のポリリジンＦＩＴＣにより官能化されたナノカプセルの使用
【０１６１】
ポリリジンＦＩＴＣにより官能化されたナノカプセルが、実施例１の調製方法と類似の方法により、0.5 μlの50 nmのLNC及び400 μlのPLL-FITCの不在下において調製される。全体が、透析され、そしてろ過され、そしてそのｐＨが７．４に調節される。
【０１６２】
ポリリジンＦＩＴＣにより官能化されたこれらの粒子は次に、0.001 μmol/mlの濃度を有する、種々の体積(2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15 及び20 μl)のｓｉＲＮＡ(20 bp、すなわち16000 ダルトン)との接触に付される。
【０１６３】
このように調製された混合物の全てが、電気泳動ゲル上で特徴づけられる。
【０１６４】
比較目的の為に、ｓｉＲＮＡ単独、及び、代表的な低分子量20 bp PCRスタンダードも、電気泳動ゲル上に流される。
【０１６５】
2μlから15 μlの該siRNA溶液のそれぞれから形成された混合物の全てについて、電気泳動ゲル上に、複合体化したsiRNAに相当するシングルスポットが現れることが注目される。
【０１６６】
他方、15 μl超では、該ｓｉＲＮＡの一部の複合体形成だけが今観察される。それ故に、のsiRNAの15 μl(0.001 μmol/ml)超では、ＬＮＣの結合能力が超されるとみえる。
【実施例６】
【０１６７】
アルコールエステルにより官能化されたナノカプセルの調製
【０１６８】
１）エステル合成
【０１６９】
２つのアルコールエステル、エステル１及びエステル２、が合成され、そして以下の化学構造を有する。
【化２】
2016128404.tif 000004
【０１７０】
これら２つのエステルは、以下のプロトコルに従い合成される。
【０１７１】
0.1molのオクタノイルクロリド(ref. O4733, Sigma-Aldrich)又はパルミトイルクロリド(ref.P78, Sigma-Aldrich)がそれぞれ、最初に、２５０ｍｌの三つ首丸底フラスコへと導入され、次に１５０ｍｌのジエチルエーテル(ref. 346136, Sigma-Aldrich)が導入される。磁力による撹拌の後、該混合物が、氷冷水浴を用いて冷却され、その後0.15 molのアルコールそして次に0.15 molのトリエチルアミン (ref. T0886, Sigma-Aldrich)の逐次的導入が行われる。
【０１７２】
該氷冷水浴から取り出した後、該混合物が２時間、還流に付される。
【０１７３】
加熱及び冷却の中断後、該反応混合物がろ紙によりろ過され、その後、ジクロロメタン(ref. 443484, Sigma-Aldrich)による液−液抽出が行われる。
【０１７４】
その有機相が、水（２回、５００ｍｌ）そして次に塩化ナトリウムの飽和溶液により逐次的に洗浄される。該有機相は次に、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥され、そして次に、溶媒を蒸発除去する為に減圧下に置かれる。
【０１７５】
所望の生成物が、無色の液状（エステル１）の形又は白い結晶状固形物（エステル２）の形で得られる。減圧下での生成物の乾燥後、該生成物が秤量され、そして、反応の収率が計算される。
【０１７６】
該収率は90〜95%である。
【０１７７】
２）エステルを充填されたＬＮＣを得る
【０１７８】
活性剤を充填されていないナノカプセルが、実施例１に記載された方法により得られた。該エマルジョンが、今回また、該エマルジョン中に存在する界面活性剤の量の１０〜２０重量％の量のエステル１、エステル２、又はSpan 40（商標）を含む(Solutol HS-15及びLipoid S75-3)。
【０１７９】
Span40（商標）(ref 85545, Fluka)は、以下の式を有するエステルである。
【化３】
2016128404.tif 000005
【０１８０】
３）ヒト血清アルブミンの結合
【０１８１】
該ＬＮＣが、実施例１に記載されたプロトコルに従い官能化される。
【０１８２】
４）結果
【０１８３】
このようにして作られた脂質ナノカプセルの物理化学的特徴が以下の表２に報告される。
【０１８４】
【表２】
2016128404.tif 000006
【実施例７】
【０１８５】
エステルの存在下におけるアシル転移収率の測定
【０１８６】
精製後、アシル転移反応物が、上記言及されたエステルの使用に関連付けられるアシル転移収率における増加を可視化する為に、アッセイされた。
【０１８７】
そのアッセイ方法は、o-フタルジアルデヒド(OPA)の反応物としての使用に基づき、及び、以下の経験式に従い行われる。
【化４】
2016128404.tif 000007
【０１８８】
生成されたインドール誘導体は、蛍光性であり、そして、ナノカプセルの試料中に存在する合計の１級アミン基を定量することを可能とする。
【０１８９】
まず最初に、アッセイされるべき物質の較正範囲が用意される。これを行う為に、該物質が、種々の濃度(50、100、150、及び200 μg/ml)で、水中に、ｐＨ７．４で溶解される。これらの溶液の蛍光が、355 nmの励起波長について、460 nmで評価される。
【０１９０】
関心のある物質が、次に、300 μlのOPAを30 μlのLNC溶液に添加することにより、該脂質ナノカプセル試料中においてアッセイされる。
【０１９１】
この溶液の蛍光が、460 nmで測定され、そして、該物質の濃度が該較正範囲を用いて計算される。
【０１９２】
このアッセイ方法は、アシル転移工程の間に該脂質ナノカプセル上にグラフト化された該反応物をアッセイする為に成功裏に用いられた。それぞれの反応物(ポリ-L-リジン(PLL)及びポリエチレンイミン(PEI))について、特定の較正範囲が用いられた。該試料の精製後に実施された該アッセイの結果が、以下の表３に報告される。
【０１９３】
【表３】
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【０１９４】
結合収率は、ＬＮＣ上にグラフト化された物質の量（ＣＲ）対この物質の最大の理論量（ＣＴ）の比に相当する。
【０１９５】
該グラフト化された物質は、ＯＰＡ法により、該ＣＲを得る為に、アッセイされる。結合収率Ｒは、次に、以下の通りに書き表されうる。
R= (CR/CT)×100
【０１９６】
この表において観察されうるとおり、アシル転移反応が慣用の脂質ナノカプセル(LNCs 50 nm アシル転移ポリ-L-リジン)について製造される場合、結合収率は1%に近い。
【０１９７】
フォーミュレーション（the  formulation）中への10又は20%のエステル2又はSpan 40の導入は、この収率を２〜３倍増加することを可能にする。
【０１９８】
フォーミュレーション中への10又は20%のエステル１の導入は、一方で、収率における１５〜２５倍の増加をもたらす。
【実施例８】
【０１９９】
該アシル転移方法により得られたナノカプセルの毒性の評価
【０２００】
該アシル転移方法により修飾された脂質ナノカプセルの毒性が、MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)テストを用いて評価された。
【０２０１】
この試験は、該ナノ粒子の毒性を、対照として取り扱われるナノ粒子により処理されていない細胞に対する、ナノ粒子にさらされた細胞の相対的生存率を測定することにより測定することを目的とする。
【０２０２】
該ＭＴＴ反応物により含まれるテトラゾリウム環は、活発に生きている細胞のミトコンドリアコハク酸デヒドロゲナーゼによりホルマザンへと還元される。
【０２０３】
次に、培地の色が、黄から紫がかった青へと変化し、この着色の強度が、試験の間に存在する生存細胞の数に比例的であり、またそれらの代謝活性にも比例的である。
【０２０４】
この試験の為に、文献"Mosmann T., Journal of immunological methods 65 (1-2): 55-63,December 1983"及び"Cory et al., Cancer communications 3 (7): 207-12, July 1991"に記載された試験が参照されうる。
【０２０５】
この試験は、ヒト腫瘍細胞株、U87MG cells (HTB-14, LGC standard)、について実施された。
【０２０６】
該試験の良い統計的有意を確保する為に、それぞれのアッセイは５重に実施された。
【０２０７】
得られた結果が図５に示される。
【０２０８】
それぞれのグラフについて、相対的細胞生存率が、修飾された又は修飾されていないナノカプセルの濃度の関数として表される。ナノ粒子により処理されていないU87MG細胞が参照として用いられる。これらの細胞により得られた値は、１００％の細胞生存率を表す。
【０２０９】
概して、該アシル転移工程の間に修飾されたナノカプセルは、出発ナノカプセルのプロファイルに匹敵する毒性プロファイルを示すことが観察されうる。
【０２１０】
得られた結果を考慮すると、天然の又は合成のポリマーのグラフト化は、いずれの追加的な毒性も引き起こさない。
【０２１１】
実際に、アシル転移により得られたナノカプセルは、当初懸濁物の1/300未満の濃度について毒性を示さないことが観察された。
【実施例９】
【０２１２】
アシル転移により修飾された脂質ナノカプセル周囲の多層構造の開発
【０２１３】
アシル転移が、２５℃で、40 μlの5%ポリ-L-リジン (PLL)溶液を用いて、15分間、実施例１に記載された方法に従い得られた５０ｎｍＬＮＣの懸濁物２ｍｌについて、実施される。混合物は、次に、ｐＨ２．２での２ｍｌの０．５Ｍグリシンバッファーの添加により中和される。
【０２１４】
ミリＱ水に対する透析後、50 μlのアシル転移されたＬＮＣが、0.045ナノモルのsiRNAとの接触に付され、そして次に、2.95 mlのミリＱ水により希釈される。該siRNAの全てが、次に、該ＬＮＣに結合する。該siRNAの濃度は、１リットル当たり１５ナノモルである。
【０２１５】
これは、該粒子の流体力学的直径の増加、及びそれらのゼータ電位の反転も結果し、すなわち、ＬＮＣ上へのsiRNAの吸着を確認する。
【０２１６】
ポリマー（ポリ-L-リジン）の層が、次に、以下のプロトコールに従い、ＬＮＣ上に吸着される。
【０２１７】
5μlの該5%ポリリジン溶液が、LNCs-siRNAの懸濁物へと添加されて、LNCs-siRNA-PLL系を成し、これは次に、１０ｍＭのＮａＣｌ溶液に対する透析により精製されうる。
【０２１８】
得られたＬＮＣは、正のゼータ電位を有し、すなわち、多層構造におけるポリマーの吸着を裏付ける。
【実施例１０】
【０２１９】
モデルタンパク質の、アシル転移により修飾されたナノカプセルへの結合
【０２２０】
この研究は、該修飾されたＬＮＣ上への蛍光タンパク質又は核酸の吸着からなる。
【０２２１】
１）ＢＳＡ−ＦＩＴＣ蛍光タンパク質
【０２２２】
実験は、BSA-FITCにより、種々の濃度、0.5 mg/ml, 0.33 mg/ml,0.25 mg/ml, 0.2 mg/ml、及び0.1 mg/ml、で実施された。
【０２２３】
これらのＦＩＴＣ標識されたタンパク質は、以下のプロトコルに従い得られた。
【０２２４】
ｐＨ９での、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム中の2.77 mg/mlでのＢＳＡの溶液の９００μｌが、ジメチルスルホキシド中の4mg/mlでのＦＩＴＣの溶液の250 μlと混合され、反応が、暗所で２５℃で２時間撹拌される。該標識されたタンパク質が次に、Sephadex G-25（商標）ゲル上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、反応していないＦＩＴＣから分離される。
【０２２５】
タンパク質の量及び該タンパク質に結合したＦＩＴＣの量が、次に、以下のプロトコルに従いアッセイされる。
【０２２６】
ＢＳＡ較正範囲及びＦＩＴＣ較正範囲が、5 mMのPBSにおいて用意され、吸収が、ＢＳＡについて280 nmで、及び、ＦＩＴＣについて490 nmで、測定される。
【０２２７】
標識されたタンパク質の溶液の280 nm及び490 nmでの吸収が、次に、測定され、そして、ＢＳＡ及びＦＩＴＣのそれぞれの濃度を決定するために、該較正範囲と比較される。ＦＩＴＣ濃度対ＢＳＡ濃度の比が、次に、計算されうる。
【０２２８】
アシル転移されたＬＮＣと蛍光タンパク質との間の複合体形成の工程は、次に、以下のプロトコルに従い実施される。
【０２２９】
I0蛍光値を得る為に、既知の濃度を有するＢＳＡ−ＦＩＴＣの溶液の蛍光及び蛍光強度が測定される。BSA-FITCの同じ溶液が次に、アシル転移されたナノカプセルの増加する濃度の存在下において調製される。これらの溶液の蛍光及び蛍光強度も測定される(I)。
【０２３０】
(I-I0)/I0比が修飾されたＬＮＣのそれぞれの濃度について比較される場合、修飾されたＬＮＣの濃度が増加するに従い、蛍光強度における減少が観察される。
【０２３１】
得られた蛍光測定結果が、図６において表される。
【０２３２】
同様の実験が、あらかじめアシル転移されていないＬＮＣにより実施された場合、蛍光強度における変化は観察されなかった。
【０２３３】
２）siRNA-FITC
【０２３４】
同じ実験が、ＢＳＡ−ＦＩＴＣの代わりにsiRNA-FITCにより実施された。修飾されたＬＮＣの濃度が増加するにつれて、蛍光強度における同じ減少が観察される。
【０２３５】
siRNA-FITCにより得られた蛍光測定結果が、図７に表される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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