(57)【要約】【課題】治療方針の迅速な決定を可能にするプライマー対、プローブ、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出キット、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法およびＣ型肝炎の予後予測方法を提供する。【解決手段】プライマー対は、遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜４１０番目までに含まれる連続する少なくとも３００塩基を、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の塩基配列中に含むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜４１０番目までに含まれる連続する少なくとも３００塩基を、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の塩基配列中に含むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる、
プライマー対。
【請求項２】
前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマー各々は、
混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドからなる、
請求項１に記載のプライマー対。
【請求項３】
前記フォワードプライマーの塩基配列は、
配列番号２に示され、
前記リバースプライマーの塩基配列は、
配列番号３に示される、
請求項２に記載のプライマー対。
【請求項４】
遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から４５番目〜３７０番目までに含まれる連続する少なくとも２００塩基を、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の塩基配列中に含むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる、
プライマー対。
【請求項５】
前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマー各々は、
混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドからなる、
請求項４に記載のプライマー対。
【請求項６】
前記フォワードプライマーの塩基配列は、
配列番号４に示され、
前記リバースプライマーの塩基配列は、
配列番号５に示される、
請求項５に記載のプライマー対。
【請求項７】
混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドからなり、
前記塩基配列は、
配列番号６〜１５のいずれかに示される、
プローブ。
【請求項８】
請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマー対と、
請求項４から６のいずれか一項に記載のプライマー対と、
請求項７に記載のプローブと、
を備える、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出キット。
【請求項９】
遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルス由来の核酸を鋳型にして、請求項１から３のいずれか一項に記載のプライマー対を用いて増幅されるポリメラーゼ連鎖反応の第１の産物を得る第１の反応ステップと、
前記第１の反応ステップで得られた前記第１の産物を鋳型にして、請求項４から６のいずれか一項に記載のプライマー対を用いて増幅されるポリメラーゼ連鎖反応の第２の産物を得る第２の反応ステップと、
前記第２の反応ステップで得られた前記第２の産物について、請求項７に記載のプローブを用いて前記Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列および３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列の少なくとも一方を決定する決定ステップと、
を含む、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項１０】
前記決定ステップでは、
前記アミノ酸をコードする塩基配列を、侵入型切断構造アッセイ法で決定する、
請求項９に記載の薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法。
【請求項１１】
被検者から採取された試料に含まれる遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムについて、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された塩基配列に基づいて前記被検者のＣ型肝炎の予後を予測する予測ステップと、
を含むＣ型肝炎の予後予測方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プライマー対、プローブ、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出キット、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法およびＣ型肝炎の予後予測方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、Ｃ型慢性肝炎の治療法は、インターフェロンを用いた方法からＮＳ５Ａ阻害剤ダクラタスビル（ＤＣＶ）およびＮＳ３阻害剤アスナプレビル（ＡＳＶ）の２剤併用療法のような非インターフェロン療法へと切り替わってきている。ＤＣＶおよびＡＳＶの２剤併用療法によれば、インターフェロンの無効例および中止例に対しても高い有効性が期待できる。
【０００３】
ＤＣＶおよびＡＳＶの２剤併用療法の治療効果は、ヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のゲノムにおける変異に大きく影響される。ＨＣＶのゲノムにおけるＮＳ５Ａタンパク質をコードするＮＳ５Ａ領域に、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のチロシン（Ｙ）がヒスチジン（Ｈ）に置換される変異（以下、「Ｙ９３Ｈ」とする）、あるいは、３１番目のロイシン（Ｌ）が別のアミノ酸に置換される変異がある場合、ＣＶおよびＡＳＶの２剤併用療法の治療効果が十分に得られないことがある。このため、患者のＨＣＶについて、当該変異の有無を調べることが治療方針の決定に非常に重要である。
【０００４】
ＨＣＶのゲノムの変異を検出する方法としてダイレクトシークエンス法が知られている。ダイレクトシークエンス法によれば、１回の解析で連続する５００〜７００塩基内の変異を検出できる。また、次世代シークエンサーを用いたディープシークエンス法でも変異を検出できる。ディープシークエンス法は、頻度が１％未満の変異でも検出可能なため、感度に優れる。
【０００５】
また、特許文献１では、ＨＣＶのゲノムの変異を検出するために、侵入型切断構造アッセイ法が用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００７−５１７５２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、ダイレクトシークエンス法は、解析から変異の有無の判定までに時間を要することに加え、１０〜２０％未満の低頻度の変異は検出できない。このため、ダイレクトシークエンス法は、変異の有無を調べるには、感度および迅速性の面で十分ではない。一方、ディープシークエンス法は、臨床検査法として広く普及させるには、高コストなうえに、処理の工程が比較的煩雑で時間のかかる方法である。
【０００８】
また、ＨＣＶのゲノムには、非常に多くの変異が存在する。このため、上記特許文献１に開示された侵入型切断構造アッセイ法では、プローブの塩基と標的配列内の塩基との間にミスマッチが生じやすく、変異の有無を精度よく検出できないおそれがある。
【０００９】
このように、ＨＣＶのゲノムに関して、高い精度と感度を担保しつつ、迅速に変異の有無を調べる方法が確立されていないため、Ｃ型肝炎に対して迅速に治療方針を決定できないのが現状である。
【００１０】
本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、治療方針の迅速な決定を可能にするプライマー対、プローブ、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出キット、薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法およびＣ型肝炎の予後予測方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の観点に係るプライマー対は、
遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜４１０番目までに含まれる連続する少なくとも３００塩基を、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の塩基配列中に含むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる。
【００１２】
この場合、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマー各々は、
混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドからなる、
こととしてもよい。
【００１３】
また、前記フォワードプライマーの塩基配列は、
配列番号２に示され、
前記リバースプライマーの塩基配列は、
配列番号３に示される、
こととしてもよい。
【００１４】
本発明の第２の観点に係るプライマー対は、
遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から４５番目〜３７０番目までに含まれる連続する少なくとも２００塩基を、ポリメラーゼ連鎖反応の産物の塩基配列中に含むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる。
【００１５】
この場合、前記フォワードプライマーおよび前記リバースプライマー各々は、
混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドからなる、
こととしてもよい。
【００１６】
また、前記フォワードプライマーの塩基配列は、
配列番号４に示され、
前記リバースプライマーの塩基配列は、
配列番号５に示される、
こととしてもよい。
【００１７】
本発明の第３の観点に係るプローブは、
混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドをからなり、
前記塩基配列は、
配列番号６〜１５のいずれかに示される。
【００１８】
本発明の第４の観点に係る薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出キットは、
上記本発明の第１の観点に係るプライマー対と、
上記本発明の第２の観点に係るプライマー対と、
上記本発明の第３の観点に係るプローブと、
を備える。
【００１９】
本発明の第５の観点に係る薬剤耐性Ｃ型肝炎ウイルスの検出方法は、
遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルス由来の核酸を鋳型にして、上記本発明の第１の観点に係るプライマー対を用いて増幅されるポリメラーゼ連鎖反応の第１の産物を得る第１の反応ステップと、
前記第１の反応ステップで得られた前記第１の産物を鋳型にして、上記本発明の第２の観点に係るプライマー対を用いて増幅されるポリメラーゼ連鎖反応の第２の産物を得る第２の反応ステップと、
前記第２の反応ステップで得られた前記第２の産物について、上記本発明の第３の観点に係るプローブを用いて前記Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列および３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列の少なくとも一方を決定する決定ステップと、
を含む。
【００２０】
この場合、前記決定ステップでは、
前記アミノ酸をコードする塩基配列を、侵入型切断構造アッセイ法で決定する、
こととしてもよい。
【００２１】
本発明の第６の観点に係るＣ型肝炎の予後予測方法は、
被検者から採取された試料に含まれる遺伝子型が１ｂ型であるＣ型肝炎ウイルスのゲノムについて、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定する決定ステップと、
前記決定ステップで決定された塩基配列に基づいて前記被検者のＣ型肝炎の予後を予測する予測ステップと、
を含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、治療方針の迅速な決定が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】ＮＳ５Ａ領域における連続する２１塩基対ごとのメジャーアレル頻度の平均を示す図である。
【図２】侵入型切断構造アッセイ法によるＹ９３Ｈの頻度の推定に関する模式図である。（ａ）および（ｃ）は、試料および標準オリゴヌクレオチドの蛍光強度をプロットした模式図である。（ｂ）は、交差角θ試料と試料中のＹ９３の変異の割合との関係を示す図である。（ｄ）は、交差角θＳｔｄ−ＹＨと補正されたＹ９３の変異の割合との関係を示す図である。
【図３】ＨＣＶのＲＮＡ濃度に対する侵入型切断構造アッセイ法によるＹ９３Ｈの検出能を示す図である。
【図４】ディープシークエンス法によるＹ９３Ｈの頻度に対する侵入型切断構造アッセイ法によるＹ９３Ｈの検出能を示す図である。
【図５】ディープシークエンス法および侵入型切断構造アッセイ法で評価したＹ９３Ｈの頻度の相関を示す図である。
【図６】ＨＣＶのＲＮＡ濃度に対する侵入型切断構造アッセイ法によるＬ３１の変異の検出能を示す図である。
【図７】インベーダーアッセイでＬ３１の変異が検出された試料に関する変異頻度の分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明に係る実施の形態について説明する。なお、本発明は下記の実施の形態および図面によって限定されるものではない。
【００２５】
（実施の形態１）
まず、実施の形態１について詳細に説明する。本実施の形態に係るプライマー対は、遺伝子型が１ｂ型であるＨＣＶ（以下、「ＨＣＶ−１ｂ」とする）のゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜４１０番目までに含まれる連続する少なくとも３００塩基を、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＰＣＲ」とする）の産物の塩基配列中に含むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなる。
【００２６】
ＨＣＶは、ゲノムの塩基配列に応じて分類することができる。ゲノム上の所定の領域、例えば、コア領域の塩基配列を公知の方法で決定することでＨＣＶを分類できる。ＨＣＶ−１ｂのゲノムのＮＳ５Ａ領域の塩基配列は、例えば配列番号１に示される。なお、本明細書において、ＨＣＶ−１ｂのゲノムのＮＳ５Ａ領域の塩基配列は、配列番号１を意味する。配列番号１に示す塩基配列は、ＨＣＶ−ＫＴ９（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ４３５１６２）のＮＳ５Ａ領域の塩基配列である。
【００２７】
フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、核酸の断片である。ＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼがフォワードプライマーおよびリバースプライマーを伸長することによって鋳型の二本鎖ＤＮＡの所定の領域を増幅する。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、増幅対象の２本鎖ＤＮＡの両鎖それぞれの３’側と相補的な塩基配列からなる。
【００２８】
ＰＣＲでは、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型となるＤＮＡに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸がフォワードプライマーの３’末端に付加されることによって、フォワードプライマーが、５’末端から３’末端の方向に伸長される。ＰＣＲでは、反応温度の変化により、２本鎖の鋳型のＤＮＡが１本鎖にほどかれ、フォワードプライマーが鋳型のＤＮＡにアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が行われ、伸長されたフォワードプライマーと鋳型のＤＮＡとがほどかれる。リバースプライマーについても同様である。ＰＣＲは上記一連の反応を繰り返すことにより、目的の核酸を増幅することができる。
【００２９】
上記ＮＳ５Ａ領域は、ＮＳ５Ａタンパク質をコードする領域である。ＮＳ５Ａ領域における５’末端から９１番目〜９３番目の塩基配列は、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から３１番目のアミノ酸をコードする。また、ＮＳ５Ａ領域における５’末端から２７７番目〜２７９番目の塩基配列は、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする。そこで、上記プライマー対は、５’末端から２７７番目〜２７９番目の塩基および９１番目〜９３番目の塩基を含む１０番目〜４１０番目までに含まれる連続する３００塩基以上の領域を増幅させるものであればよい。
【００３０】
下記実施例に示すように、ＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜５０番目の領域および３７５番目〜４１０番目の領域は、他の領域と比較して、メジャーアレルの頻度が高い、すなわち変異が少ない領域である。そこで、好適には、フォワードプライマーは、例えば、ＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜５０番目までに含まれる連続する少なくとも１５塩基にアニーリングすればよい。リバースプライマーは、ＮＳ５Ａ領域における５’末端から３７５番目〜４１０番目までに含まれる連続する少なくとも１５塩基にアニーリングすればよい。
【００３１】
ＨＣＶのゲノムには変異が比較的多いため、上記フォワードプライマーおよびリバースプライマー各々は、混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチド、すなわちｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーであるのが好ましい。ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーとは、所定位置の塩基の種類が相違する複数のポリヌクレオチドを含むプライマーをいう。ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーの塩基配列は、ＩＵＰＡＣが定める表記に基づいて、上記所定の位置の塩基を混合塩基で表記する。例えば、「ｒ」は「ａ」または「ｇ」を意味し、「ｙ」は「ｃ」または「ｔ」を意味し、「ｈ」は「ａ」、「ｃ」または「ｔ」を意味する。
【００３２】
好ましくは、本実施の形態に係るプライマー対のフォワードプライマーの塩基配列は、配列番号２に示され、リバースプライマーの塩基配列は、配列番号３に示される。
【００３３】
また、ＮＳ５Ａ領域における５’末端から４５番目〜８５番目の領域および３３０番目〜３７０番目の領域も他の領域と比較して変異が少ない領域である。そこで、本実施の形態に係るプライマー対は、上記ＮＳ５Ａ領域における５’末端から４５番目〜３７０番目までに含まれる連続する少なくとも２００塩基を、ＰＣＲの産物の塩基配列中に含むように設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーからなるものでもよい。
【００３４】
ＮＳ５Ａ領域における５’末端から４５番目〜３７０番目までに含まれる連続する少なくとも２００塩基の領域を増幅するためのフォワードプライマーは、例えば、ＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜５０番目までに含まれる連続する少なくとも１５塩基にアニーリングすればよい。この場合、好適には、リバースプライマーは、ＮＳ５Ａ領域における５’末端から３７５番目〜４１０番目までに含まれる連続する少なくとも１５塩基にアニーリングすればよい。
【００３５】
当該フォワードプライマーおよびリバースプライマー各々は、好適には、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅプライマーである。特に好ましくは、該フォワードプライマーの塩基配列は、配列番号４に示され、該リバースプライマーの塩基配列は、配列番号５に示される。
【００３６】
上述の各プライマー対は、既知の方法で合成することができる。プライマー対は、例えば、固相ホスホルアミダイト法などを含む任意の核酸合成法により化学的に合成される。プライマー対は、トリエステル法でも合成できる。また、種々の自動オリゴヌクレオチド合成装置が市販されており、プライマー対は、当該自動オリゴヌクレオチド合成装置で合成することもできる。また、マルチヌクレオチド合成法も適宜使用することができる。
【００３７】
次に、上述の各プライマー対の使用方法について説明する。上記プライマー対は、ＨＣＶ−１ｂ由来の核酸を鋳型とするＰＣＲで使用する。ＨＣＶ−１ｂ由来の核酸は、例えば、血清試料から公知の方法でＨＣＶの全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応でｃＤＮＡを合成することで調製できる。
【００３８】
ＰＣＲは、市販のＰＣＲ装置で行うのが好ましい。増幅反応の条件は、例えば、９５℃で２分、続いて９５℃で１５秒→６０℃で４５秒→７２℃で６０秒を２０〜４０サイクル繰り返すように設定すればよい。
【００３９】
上述の各プライマー対は、非特異的な増幅を防止するためのｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲで用いられるのが特に好ましい。ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、目的とする領域を増幅させた最初のＰＣＲの産物を鋳型にして、最初に使用したプライマー対の位置より、両側とも内側の領域に設計したプライマー対を用いて、さらにＰＣＲを行う方法である
【００４０】
すなわち、ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲは、次の２段階の反応ステップを含む。まず、第１の反応ステップでは、ＨＣＶ−１ｂ由来の核酸を鋳型にして、配列番号２および配列番号３に示される塩基配列のプライマー対（以下、「外側プライマー対」ともいう）を用いて増幅されるＰＣＲの第１の産物を得る。次に、第２の反応ステップでは、第１の反応ステップで得られた第１の産物を鋳型にして、配列番号４および配列番号５に示される塩基配列のプライマー対（以下、「内側プライマー対」ともいう）を用いて増幅されるＰＣＲの第２の産物を得る。
【００４１】
ＰＣＲの産物の塩基配列の解析は、市販の配列解析装置を用いて行うことができる。また、塩基配列の解析は、例えば、ジデオキシ法、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法などの公知の方法でも行うことができる。
【００４２】
ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から３１番目および９３番目のアミノ酸はＨＣＶの薬剤耐性に関与しているため、上記プライマー対は、ＨＣＶ−１ｂの当該アミノ酸をコードする５’末端から９１番目〜９３番目および２７７番目〜２７９番目の塩基配列を決定するための核酸の増幅に有用である。したがって、上記各プライマー対の用途は、薬剤耐性ＨＣＶの検出であってもよい。
【００４３】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るプライマー対は、ＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａ領域内の変異が少ない部分に対して設計されているため、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から３１番目および９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む核酸を特異的に増幅させることができる。増幅させたＰＣＲの産物を解析することで、当該塩基配列を精度よく決定することできる。ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から３１番目および９３番目のアミノ酸はＨＣＶの薬剤耐性に関与しているため、当該塩基配列に基づいて、治療方針を迅速に決定することができる。
【００４４】
また、上記フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドであってもよいこととした。ＨＣＶのゲノムは変異が多いため、所定位置の塩基の種類に幅を持たせることで、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列を含む核酸をさらに確実に増幅することができる。
【００４５】
なお、上記フォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列は、ＨＣＶ−１ｂのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から１０番目〜４１０番目までに含まれる連続する少なくとも３００塩基の領域をＰＣＲで増幅できるものであれば、特に限定されず任意である。
【００４６】
（実施の形態２）
続いて、実施の形態２について詳細に説明する。本実施の形態に係るプローブは、ＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａタンパク質をコードする領域における該ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定するために使用される。プローブとは、核酸の相補性に基づいたハイブリダイゼーションを利用して核酸またはその塩基配列中の特定の部位（以下、「標的塩基」ともいう）について解析するための核酸の断片をいう。
【００４７】
当該プローブは、ＨＣＶ−１ｂのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から２５０番目〜２９０番目までに含まれる連続する少なくとも１５塩基を塩基配列中に含む核酸、または該核酸に相補的な核酸にハイブリダイズすればよい。効率よくハイブリダイズさせるために、当該プローブは、混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドからなる。
【００４８】
当該プローブは、標的塩基が相補的である核酸とはハイブリダイズするが、標的塩基が相補的ではない核酸とはハイブリダイズしないものであれば、その塩基配列において１もしくは複数の置換、欠失または付加を含んでいてもよい。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質などによって標識されたものであってもよい。
【００４９】
ハイブリダイゼーションの条件は、標的塩基を識別するのに十分な条件であればよい。例えば、ハイブリダイゼーションの条件は、プローブが、標的塩基が一の種類である核酸とはハイブリダイズするが、標的塩基が他の種類である核酸とはハイブリダイズしない、ストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）などに基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。
【００５０】
上記プローブを用いたＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする塩基配列の決定は、例えば、侵入型切断構造アッセイ法、より具体的には、インベーダー（登録商標）アッセイで行うことができる。インベーダーアッセイでは、試料中の核酸に対して相補的なインベーダーオリゴと、５’のフラップ構造を有し、核酸に相補的なシグナルプローブと、を使用する。シグナルプローブは、標的塩基の種類それぞれに相補的な塩基を含む。シグナルプローブは、核酸上の標的塩基の部位で、インベーダーオリゴとオーバーラップするように設計される。
【００５１】
インベーダーアッセイでは、まず、試料中の核酸に対してインベーダーオリゴとシグナルプローブとをハイブリダイズさせる。次に、インベーダーオリゴとシグナルプローブとがオーバーラップする部位にフラップ・エンドヌクレアーゼを作用させる。標的塩基とその塩基に対応するシグナルプローブの塩基とが相補的である場合には、シグナルプローブのフラップがフラップ・エンドヌクレアーゼによって切断される。切断されたフラップが、蛍光色素で標識された検出用のＤＮＡ基質とハイブリダイズして新たなフラップを形成する。このフラップをフラップ・エンドヌクレアーゼが認識し、切断することで蛍光色素が遊離する。シグナルプローブを異なる蛍光色素で標識しておくことによって、蛍光色素に基づく蛍光シグナルを検出することにより、標的塩基の種類を決定することができる。
【００５２】
インベーダーアッセイの場合、本実施の形態に係るプローブは、上記のインベーダーオリゴまたはシグナルプローブである。好ましくは、インベーダーオリゴの塩基配列は、配列番号６に示される。ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸がチロシンである野生型（Ｙ９３）に対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号７に示される。一方、当該アミノ酸がヒスチジンである変異型（Ｙ９３Ｈ）に対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号８に示される。
【００５３】
また、本実施の形態に係るプローブは、ＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａタンパク質をコードする領域における該ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定するために使用されるものであってもよい。
【００５４】
好適には、上記プローブは、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から３１番目のアミノ酸が、野生型であるロイシン（Ｌ３１）であるところ、メチオニン（Ｌ３１Ｍ）、イソロイシン（Ｌ３１Ｉ）またはバリン（Ｌ３１Ｖ）に変異していることを検出するために使用される。
【００５５】
当該プローブは、ＨＣＶ−１ｂのゲノムのＮＳ５Ａ領域における５’末端から７０番目〜１２０番目までに含まれる連続する少なくとも１５塩基を塩基配列中に含む核酸、または該核酸に相補的な核酸にハイブリダイズすればよい。
【００５６】
上述のインベーダーアッセイでＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定する場合、当該アミノ酸は、複数種へのアミノ酸への変異が認められるため、複数のインベーダーオリゴおよびシグナルプローブを組み合わせて変異を検出するのが好ましい。特に、Ｌ３１ＭとＬ３１Ｉとは、１箇所の塩基では識別できない。そこで、Ｌ３１ＭとＬ３１Ｉを検出するために、まず、Ｌ３１をコードする塩基配列か、変異型（Ｌ３１ＭおよびＬ３１Ｉのいずれか）をコードする塩基配列かを決定する。ここで、例えば、Ｌ３１をコードする塩基配列か変異型をコードする塩基配列かを識別する際のインベーダーオリゴの塩基配列は、配列番号９に示される。Ｌ３１に対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１０に示される。一方、変異型に対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１１に示される。
【００５７】
次いで変異型として決定された試料に関して、Ｌ３１Ｍをコードする塩基配列か、あるいはＬ３１Ｉをコードする塩基配列かを決定する。この場合のインベーダーオリゴの塩基配列は、例えば、配列番号１２に示され、Ｌ３１Ｍに対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１３に示される。一方、Ｌ３１Ｉに対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１４に示される。
【００５８】
Ｌ３１をコードする塩基配列か、Ｌ３１Ｖをコードする塩基配列かを決定するためには、上記と同様に、インベーダーオリゴおよびＬ３１に対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブとして、それぞれ配列番号９および配列番号１０に示されるものを用いることができる。一方、Ｌ３１Ｖに対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１５に示される。
【００５９】
プローブを用いたＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目および３１番目のアミノ酸をコードする塩基配列の決定は、インベーダーアッセイに限らず、ＴａｑＭａｎ（登録商標）法およびデオキシ法などで行ってもよい。
【００６０】
本実施の形態に係るプローブは、上記実施の形態１のプライマー対と同様に、既知の方法で合成することができる。
【００６１】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るプローブは、混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドを含むため、変異が比較的多い領域に位置する、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目または３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を、迅速かつ精度よく決定することができる。
【００６２】
なお、本実施の形態に係るプローブは、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目または３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定することができるものであれば、センス鎖のみならずアンチセンス鎖にアニーリングするものであってもよい。
【００６３】
（実施の形態３）
次に、実施の形態３について詳細に説明する。本実施の形態に係る薬剤耐性ＨＣＶの検出キットは、上記実施の形態１に記載の外側プライマー対と、内側プライマー対と、上記実施の形態２に記載のプローブとを備える。
【００６４】
ＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のチロシンがヒスチジンに置換されている場合、あるいは、Ｎ末端から３１番目のロイシンが別のアミノ酸に置換されている場合、当該ＨＣＶは、ＤＣＶおよびＡＳＶの２剤併用療法に耐性を示す。本実施の形態に係る検出キットによれば、試料に含まれるＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目または３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定することができるので、試料中の薬剤耐性ＨＣＶの検出、さらには試料中のＨＣＶにおけるＹ９３ＨまたはＬ３１の変異の頻度、および試料中のＨＣＶに占める薬剤耐性ＨＣＶの割合を評価することができる。
【００６５】
当該検出キットに含まれる外側プライマー対、内側プライマー対およびプローブは、上記の既知の方法で合成することができる。なお、当該検出キットは、各種制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液などを含んでもよい。また、当該検出キットは、薬剤耐性ＨＣＶを検出するための使用方法が記載されたマニュアルをさらに備えてもよい。
【００６６】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る薬剤耐性ＨＣＶの検出キットによれば、ＨＣＶのゲノムにおけるＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目または３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を迅速に決定できるので、ＤＣＶおよびＡＳＶの２剤併用療法の採用または不採用を迅速に決定することができる。また、薬剤耐性ＨＣＶの有無は、下記実施例に示すように、Ｃ型肝炎の各種検査データおよび表現型と関連があるため、Ｃ型肝炎の予後を考慮して治療方針を決定することができる。
【００６７】
（実施の形態４）
実施の形態４について詳細に説明する。本実施の形態に係る薬剤耐性ＨＣＶの検出方法は、上記第１の反応ステップと、上記第２の反応ステップと、決定ステップとを含む。第１の反応ステップおよび第２の反応ステップは、実施の形態１に記載のｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲと同様であるので、以下では、主に決定ステップについて説明する。
【００６８】
決定ステップでは、第２の反応ステップで得られた第２の産物について、上記のプローブを用いてＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列および３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列の少なくとも一方を決定する。塩基配列の決定は、実施の形態２に記載のように、インベーダーアッセイで行うのが好ましい。この場合、第２の反応ステップで得られた第２の産物は、インベーダーアッセイの鋳型として使用すればよい。その際、第２の産物を含む溶液を適宜希釈してもよい。
【００６９】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係る薬剤耐性ＨＣＶの検出方法によれば、ＰＣＲを２段階で行う第１の反応ステップと第２の反応ステップとを含むので、非特異的な核酸断片の増幅を防ぐことができる。さらに、決定ステップで用いるプローブは、混合塩基を含む塩基配列で示される複数種のポリヌクレオチドを含むため、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目または３１番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を、高精度かつ高感度で決定することができる。
【００７０】
（実施の形態５）
実施の形態５について詳細に説明する。本実施の形態に係るＣ型肝炎の予後予測方法は、決定ステップと、予測ステップと、を含む。まず、決定ステップについて説明する。決定ステップでは、被検者から採取された試料に含まれるＨＣＶ−１ｂのゲノムについて、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定する。
【００７１】
被検者とは、ヒトである。試料とは、任意の生物学的試料であって、ＨＣＶ−１ｂを含むものであればよい。試料は、例えば、血液および血清などである。ＨＣＶ−１ｂは、ゲノムとしてプラス一本鎖ＲＮＡを有するため、決定ステップでは、公知の方法によって、試料から全ＲＮＡを抽出し、逆転写させることでｃＤＮＡを合成するのが好ましい。当該ｃＤＮＡにおいて、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を決定することで、試料に含まれるＨＣＶ−１ｂの当該部位の塩基配列を決定することができる。
【００７２】
ＨＣＶ−１ｂの当該部位の塩基配列は、上記実施の形態４で説明したように、第１の反応ステップ、第２の反応ステップおよび決定ステップによって、決定することができる。
【００７３】
次に、予測ステップを説明する。予測ステップでは、決定ステップで決定された塩基配列に基づいて当該被検者のＣ型肝炎の予後を予測する。下記実施例に示すように、上記アミノ酸がヒスチジンの場合、チロシンの場合と比較して、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＬＴ」とする）濃度が低く、血清中のＨＣＶのＲＮＡ濃度が高く、肝細胞癌（以下、「ＨＣＣ」とする）リスクが低い。これらのマーカーは、Ｃ型肝炎の病態進展に関する有益な情報であるため、当該被検者の肝炎の予後を予測することができる。
【００７４】
また、決定ステップで塩基配列を決定した結果、ＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸がヒスチジンの場合、該アミノ酸がチロシンの場合よりもＨＣＣを発症する確率が低いことが予測される。一方、該アミノ酸がチロシンの場合、該アミノ酸がヒスチジンの場合よりもＨＣＣを発症する確率が約２．０倍高いと予測される。
【００７５】
以上詳細に説明したように、本実施の形態に係るＣ型肝炎の予後予測方法によれば、Ｃ型肝炎の病態進展を示唆するマーカーに関連するＮＳ５Ａタンパク質のＮ末端から９３番目のアミノ酸をコードする部位の塩基配列を迅速に高精度かつ高感度に決定できるので、早期に予後を予測できる。Ｃ型肝炎の予後予測によって、Ｃ型肝炎の診療方針を適切に計画することができる。
【００７６】
他の実施の形態では、決定ステップと、決定ステップで決定された塩基配列に基づいて、被検者のＣ型肝炎にＤＣＶおよびＡＳＶの２剤併用が有効であるか否かを判定する判定ステップとを含むＣ型肝炎の薬剤耐性判定方法が提供される。
【００７７】
また、別の実施の形態では、本実施の形態に係る上記決定ステップと、該決定ステップで決定された塩基配列がコードするアミノ酸がチロシンの場合、ＤＣＶおよびＡＳＶを被検者に投与する投与ステップをさらに含む、Ｃ型肝炎の治療方法が提供される。
【００７８】
なお、上記各実施の形態における塩基配列および塩基配列における位置は、ＨＣＶ−ＫＴ９のＮＳ５Ａ領域の塩基配列に限らず、その他のＨＣＶ−１ｂの対応するＮＳ５Ａ領域の塩基配列および塩基配列における位置であってもよい。例えば、ＨＣＶ−ＫＴ９のＮＳ５Ａ領域の塩基配列とその他のＨＣＶ−１ｂのゲノムの塩基配列とを、公知の方法でアライメントすることで当該ＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａ領域の塩基配列が特定される。また、アライメントに基づいて、ＨＣＶ−ＫＴ９のＮＳ５Ａ領域の塩基配列における所定の位置に対応する塩基配列を、当該ＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａ領域の塩基配列において特定することができる。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【００８０】
実施例１
（血清試料の取得）
ＮＳ５Ａ阻害剤を投薬されたことがない慢性Ｃ型肝炎患者の血清を採取した。血清中のＨＣＶのＲＮＡは、ＨＣＶのＲＮＡの抽出、増幅および検出までの全工程が自動化されているＲｏｃｈｅ  ＣＯＢＡＳ  ＴａｑＭａｎ  ＨＣＶ  Ａｕｔｏ  ａｓｓａｙ（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて測定した。ＨＣＶの遺伝子型を、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）増幅およびダイレクトシークエンス法で決定した。ＨＣＶ−１ｂに感染した患者７０２人の血清試料を以下の解析対象とした。
【００８１】
（ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡの合成）
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（商標）  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社製）を、説明書に従って用いて、各血清試料１５０μｌからＨＣＶの全ＲＮＡを抽出した。次に、ｇＤＮＡ  ＥｒａｓｅｒおよびオリゴｄＴプライマー（タカラバイオ社製）とともにＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡを合成した。
【００８２】
（プライマーおよびプローブの設計）
ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲで用いるプライマーおよびインベーダープローブを設計するために、データベース（Ｓｈｉｎ  ＩＴ、外３名、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｄａｔａｂａｓｅ．」、Ｈｅｐａｔｏｌ  Ｒｅｓ、  ２００８、３８、ｐ．２３４−２４３）からＨＣＶ−１ｂのＮＳ５Ａ領域の２４０個の塩基配列を利用した。すべての塩基配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷプラグラムを用いてアライメントした。各塩基の位置におけるメジャーアレル頻度を算出し、算出したメジャーアレル頻度から連続する２１塩基対ごとのメジャーアレル頻度の平均を算出し、ＮＳ５Ａ領域の５’末端から７５０ｂｐの範囲をプロットした（図１参照）。
【００８３】
メジャーアレル頻度の平均値が高いほど、その位置の変異が少ないことを示唆している。したがって、メジャーアレル頻度の平均値が高い領域がＰＣＲプライマーの設計に好適である。図１によれば、５’末端から１８〜４０番目の塩基、５５〜７６番目の塩基、３４１〜３６２番目の塩基、および３８３〜４０３番目の塩基を含む領域におけるメジャーアレル頻度の平均が高い傾向がある。これらの領域は、変異が少ないと言えるため、第一段階のＰＣＲに用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、それぞれ１８〜４０番目および３８３〜４０３番目の塩基配列に対して設計した。同様に、第二段階のＰＣＲに用いるフォワードプライマーおよびリバースプライマーを、それぞれ５５〜７６番目および３４１〜３６２番目の塩基配列に対して設計した。
【００８４】
本実施例では、複数の部位における塩基の種類が相違するプライマーが混合されたｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄプライマーを用いた。第一段階のＰＣＲに用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号２および配列番号３に示す。第二段階のＰＣＲに用いたフォワードプライマーおよびリバースプライマーの塩基配列を、それぞれ配列番号４および配列番号５に示す。
【００８５】
ｃＤＮＡからＮＳ５Ａ領域内の３０８ｂｐの断片を、次のようにｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲで増幅した。第一段階のＰＣＲにおける増幅反応の条件は、９５℃で２分、続いて９５℃で１５秒→６０℃で４５秒→７２℃で６０秒を３５サイクル繰り返した後、４℃である。第一段階のＰＣＲにおける反応液（１０μｌ）の組成を次に示す。
精製水：    ４．５６４μｌ
１０×Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ：    １μｌ
５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２：    ０．９３６μｌ
２５ｍＭ  ｄＮＴＰ（タカラバイオ社製）：    ０．６μｌ
ＤＭＳＯ：    ０．５μｌ
１００μＭ  フォワードプライマー：    ０．２μｌ
１００μＭ  リバースプライマー：    ０．２μｌ
２．５Ｕ／μｌ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）：    １μｌ
１０ｎｇ／μｌ  ｃＤＮＡ：    １μｌ
【００８６】
第二段階のＰＣＲにおける増幅反応の条件は、９５℃で２分、続いて９５℃で１５秒→６０℃で４５秒→７２℃で４０秒を２０サイクル繰り返した後、４℃である。第二段階のＰＣＲにおける反応液（１０μｌ）の組成は、第一段階と同様で、ｃＤＮＡとして第一段階のＰＣＲ産物を使用した。アガロースゲル電気泳動によって、第二段階のＰＣＲで得られたＰＣＲ産物のサイズが妥当であることを確認した。
【００８７】
（インベーダーアッセイ）
インベーダーアッセイのためにインベーダーオリゴと、シグナルプローブとを設計した。インベーダーオリゴおよびシグナルプローブについても、複数の部位における塩基の種類が相違するものを用いた。インベーダーオリゴの塩基配列は、配列番号６に示される。野生型をコードする塩基配列を認識するシグナルプローブ（以下、「Ｙ９３プローブ」とする）の塩基配列は、配列番号７に示される。変異型をコードする塩基配列を認識するシグナルプローブ（以下、「Ｙ９３Ｈプローブ」とする）の塩基配列は、配列番号８に示される。Ｙ９３プローブは、蛍光レポーターとして、それぞれＹａｋｉｍａ−Ｙｅｌｌｏｗを含むＦＲＥＴプローブと結合させた。一方、Ｙ９３Ｈプローブは、蛍光レポーターとして、６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ａｍｉｎｏ  ｈｅｘｙ（ＦＡＭ）を含むＦＲＥＴプローブと結合させた。
【００８８】
変異の割合を検定するために、標準のオリゴヌクレオチド（Ｓｔｄ−ＹＹ、Ｓｔｄ−ＹＨおよびＳｔｄ−ＨＨ）を合成した。Ｓｔｄ−ＹＹは、ＮＳ５ＡのＮ末端から９３番目のアミノ酸が野生型（Ｙ）となる塩基配列を２つ含む。Ｓｔｄ−ＹＨは、ＮＳ５ＡのＮ末端から９３番目のアミノ酸がＹとなる塩基配列と変異型（Ｈ）となる塩基配列とを含む。Ｓｔｄ−ＨＨは、ＮＳ５ＡのＮ末端から９３番目のアミノ酸がＨとなる塩基配列を２つ含む。また、標準のオリゴヌクレオチドは、第二段階のＰＣＲに用いたプライマーとのアニーリング部位を含む。標準のオリゴヌクレオチドの塩基配列には、干渉を防ぐために、さらに４個のヌクレオチドが挿入されている。Ｓｔｄ−ＹＹ、Ｓｔｄ−ＹＨおよびＳｔｄ−ＨＨの塩基配列は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８である。各アッセイにおいて、標準のオリゴヌクレオチドを段階希釈したものを３重に評価した。
【００８９】
インベーダーアッセイでは、３８４ウェルの反応プレートを用いて、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で解析した。ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲの第二段階で増幅したＰＣＲ産物を２０倍に希釈してテンプレートとして使用した。反応プレートを６３℃で保温し、４０分間または非特異的な蛍光が検出されるまで、２分間ごとに蛍光強度を検出した。各試料について同一プレートで３重に評価した。
【００９０】
（ディープシークエンス法）
ＮＳ５Ａの塩基配列は、ウルトラディープシークエンス法で決定した。すべてのＰＣＲ産物の断片の分布を、Ｂｉｏ−Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で解析した。増幅した断片をＩｏｎ  Ｘｐｒｅｓｓ  Ｐｌｕｓ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて改変し、配列解析をＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して行った。ＨＣＶ−ＫＴ９の参照配列（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号  ＡＢ４３５１６２）へのリードマッピングは、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（ＣＬＣ  ｂｉｏ社製）で行った。本手法において、ゲノムのユニーク領域における部位あたり、１００００リードを超える平均カバー倍数の程度（ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｄｅｐｔｈ）が示された。Ｙ９３Ｈの変異頻度の最低検出閾値は、野生型のＣ型肝炎ウイルス発現プラスミドｐＨＣＶ−ＫＴ９を用いて評価した。
【００９１】
（統計解析）
統計解析にはＲ統計パッケージを使用した。スチューデントのｔ検定またはカイ二乗検定を好適に用いた。すべての統計解析は、両側で行い、ｐ＜０．０５を有意とした。
【００９２】
（結果）
図２の（ａ）は、試料、Ｓｔｄ−ＹＹおよびＳｔｄ−ＨＨの蛍光強度をプロットした模式図である。Ｘ軸は、Ｙ９３に対応するＹａｋｉｍａ−Ｙｅｌｌｏｗの強度である。Ｙ軸は、Ｙ９３Ｈに対応するＦＡＭの強度である。図２の（ｂ）に示す式１によって、交差角θ試料から試料中のＹ９３Ｈの割合（Ｙ９３Ｈ％）が算出される。θ試料に対するＹ９３Ｈの割合の曲線は、ほぼ直線となった。
【００９３】
図２の（ｃ）に示すように、Ｓｔｄ−ＹＨが必ずしもＳｔｄ−ＹＹとＳｔｄ−ＨＨとの間の中間に位置しないということが起こりうる。これは、Ｙ９３とＹ９３Ｈとが等量の場合に、２種類の蛍光シグナルの測定強度が必ずしも同じであるとは限らないことを示している。図２の（ｄ）に示す式２によって、Ｓｔｄ−ＹＹとＳｔｄ−ＨＨとの間の交差角θＳｔｄ−ＹＨを用いて、Ｙ９３Ｈ％から補正されたＹ９３Ｈの割合であるＹ９３Ｈ％ｃｏｒｒを推定した。推定には、非特異的な蛍光が検出される前の適切な時点のデータを用いた。
【００９４】
図３は、市販の定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって評価したＨＣＶの力価に対して、インベーダーアッセイで検出できた試料（測定可能）と検出できなかった試料（測定不能）のヒストグラムを示す。全体の成功率は、９８．７％であった。ＨＣＶの力価が低い試料においても、半分以上の試料で測定できていた。ＨＣＶのＲＮＡ濃度の検出下限は、ほぼ１ｌｏｇオーダーであると考えられる。
【００９５】
インベーダーアッセイの結果を、ＨＣＶ−１ｂに感染した５６人の患者由来の試料に対するディープシークエンス法のデータと比較することで、インベーダーアッセイのＹ９３Ｈの検出感度を評価した。これらの血清は、様々な割合でＹ９３Ｈを有するＨＣＶ（変異株）を含む。図４に示すように、２．８％より多くの変異株を含む試料において、インベーダーアッセイによって変異株を検出できた。変異株の割合が１〜２％以上であれば、本手法で変異株を検出できる。
【００９６】
図５に示すように、インベーダーアッセイで決定した変異株の頻度と、ディープシークエンス法で決定した変異株の頻度との間には、有意な正の相関が見られた（ｒ＝０．８５、ｐ＜０．００１）。このため、本実施例のインベーダーアッセイによる変異株の検出は、高精度であることが示された。
【００９７】
次に、変異株と臨床検査で得られた各種パラメータ、ＨＣＣリスクおよびインターフェロンによる治療歴との関係を調べた。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（以下、「ＡＳＴ」とする）、ＡＬＴおよびγＧＴＰは、ＪＳＣＣ標準化対応法（関東化学社）で測定した。ヘモグロビンは、ＳＬＳ−ヘモグロビン法（シスメックスＸＥ−５０００）で定量した。白血球数および血小板数は、フローサイトメトリー法（シスメックスＸＥ−５０００）で評価した。ＨＣＣ（＋：−）は、経過中にＨＣＣを発症した人を「＋」、発症していない人を「−」として計数した。
【００９８】
表１に示すように、変異株を有する患者は、野生株を有する患者と比較して、有意にＡＬＴ濃度が低く（ｐ＝８．８×１０−４）、血清中のＨＣＶのＲＮＡ濃度が高く（ｐ＝４．３×１０−７）、ＨＣＣリスクが低かった（ｐ＝６．９×１０−３）。
【００９９】
【表１】
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【０１００】
実施例２
（Ｌ３１の変異の検出）
上記実施例１と同じプライマー対を用いてｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲで増幅した試料に関して、インベーダーアッセイによりＬ３１の変異を検出した。ＨＣＶ−１ｂに感染した患者８６８人の血清試料を以下の解析対象とした。インベーダーアッセイでは、Ｌ３１、Ｌ３１ＭおよびＬ３１Ｉの検出を２段階で行った。
【０１０１】
Ｌ３１とＬ３１ＭまたはＬ３１とを識別するためのインベーダーオリゴの塩基配列は、配列番号９に示される。Ｌ３１に対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１０に示される。一方、Ｌ３１ＭおよびＬ３１Ｉに対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１１に示される。
【０１０２】
次に、Ｌ３１ＭまたはＬ３１Ｉであると決定された試料に関して、Ｌ３１ＭとＬ３１Ｉとを識別するためのインベーダーオリゴの塩基配列は、配列番号１２に示され、Ｌ３１Ｍに対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１３に示される。Ｌ３１Ｉに対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、配列番号１４に示される。
【０１０３】
Ｌ３１とＬ３１Ｖとの識別では、インベーダーオリゴの塩基配列、Ｌ３１に対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列およびＬ３１Ｖに対応する標的塩基を識別するためのシグナルプローブの塩基配列は、それぞれ配列番号９、１０および１５に示される。なお、配列番号９、１０および１５に示されるシグナルプローブは、アンチセンス鎖にアニーリングするように設計されている。
【０１０４】
上記実施例１と同様に、変異の割合を検定するための標準のオリゴヌクレオチドを合成した。ＮＳ５ＡのＮ末端から３１番目のアミノ酸が野生型（Ｌ）となる塩基配列を２つ含むＳｔｄ−Ｌ３１−ＬＬの塩基配列を配列番号１９に示す。該アミノ酸がＬとなる塩基配列と変異型（Ｍ）となる塩基配列とを含むＳｔｄ−Ｌ３１−ＬＭの塩基配列を配列番号２０に示す。該アミノ酸がＬとなる塩基配列を２つ含むＳｔｄ−Ｌ３１−ＭＭの塩基配列を配列番号２１に示す。該アミノ酸がＬとなる塩基配列と変異型（Ｖ）となる塩基配列とを含むＳｔｄ−Ｌ３１−ＬＶの塩基配列を配列番号２２に示す。該アミノ酸がＶとなる塩基配列を２つ含むＳｔｄ−Ｌ３１−ＶＶの塩基配列を配列番号２３に示す。
【０１０５】
図６は、ＨＣＶの力価に対して、インベーダーアッセイで検出できた試料（測定可能）と検出できなかった試料（測定不能）のヒストグラムを示す。全体の成功率は、９７．１％であった。ＨＣＶのＲＮＡ濃度の検出下限は、２ｌｏｇオーダー未満であると考えられる。
【０１０６】
図７は、インベーダーアッセイでＬ３１の変異（Ｌ３１Ｍ、Ｌ３１ＩおよびＬ３１Ｖ）が検出された試料９４例における変異頻度（対数）の分布を示す。本実施例において、１〜２％の低い頻度であってもＬ３１の変異を検出できた。
【０１０７】
上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内およびそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明は、Ｃ型肝炎の薬剤耐性ＨＣＶ−１ｂの検出に好適である。本発明は、Ｃ型肝炎に対する治療方針の迅速な決定を可能にするため、Ｃ型肝炎の治療に貢献できる。ひいては、本発明はＣ型肝炎患者の生活の質の向上に寄与する。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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