(57)【要約】【課題】ｉＰＳ細胞の培養上清を利用して医学的あるいは美容的な効果を得る。【解決手段】本開示に係る医薬組成物および化粧品は、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む。本開示においては前記医薬組成物および化粧品の製造方法、抗加齢組成物、疾患発症抑制方法、疾患治療方法、組織異常治療方法ならびに美容方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記ｉＰＳ細胞を含まない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
無細胞である、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ｉＰＳ細胞培養上清が、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群から選択される１以上によって処理されたものである、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ｉＰＳ細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞に由来するものである、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
血清を含まない、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
対象において疾患または組織異常の発症前に前記疾患または組織異常の発症を抑えるために用いられる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記対象が、前記疾患または組織異常を発病するリスクを有すると判定された対象である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、請求項７または請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記組織異常が老化である、請求項７〜請求項９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記疾患や組織異常が特定の疾患や組織異常に限定されない、ユニバーサルな医薬組成物である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
疾患を治療するために用いられる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
組織異常を治療するために用いられる、請求項１〜請求項６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記組織異常が老化である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
（１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；および
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ、
を含む、医薬組成物の製造方法。
【請求項１７】
体細胞に初期化因子を導入して前記ｉＰＳ細胞を作成するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも１の処理を行うステップをさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記回収した培養上清に追加的成分を添加するステップをさらに含む、請求項１６〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、化粧品。
【請求項２１】
前記ｉＰＳ細胞を含まない、請求項２０に記載の化粧品。
【請求項２２】
無細胞である、請求項２０または請求項２１に記載の化粧品。
【請求項２３】
前記ｉＰＳ細胞培養上清が、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群から選択される１以上によって処理されたものである、請求項２０〜請求項２２のいずれか一項に記載の化粧品。
【請求項２４】
前記ｉＰＳ細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞に由来するものである、請求項２０〜請求項２３のいずれか一項に記載の化粧品。
【請求項２５】
血清を含まない、請求項２０〜請求項２４のいずれか一項に記載の化粧品。
【請求項２６】
シミ、しわ、たるみおよびくすみからなる群から選択される皮膚の状態を改善するために用いられる、請求項２０〜請求項２５のいずれか一項に記載の化粧品。
【請求項２７】
請求項２０〜請求項２５のいずれか一項に記載の化粧品を対象に適用することにより、対象の美容的外観を改善する、美容方法。
【請求項２８】
前記美容的外観の改善が、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成される、請求項２７に記載の美容方法。
【請求項２９】
前記化粧品が対象の皮膚に塗布され、シミ、しわ、たるみおよびくすみからなる群から選択される皮膚の状態を改善する、請求項２７または請求項２８に記載の美容方法。
【請求項３０】
（１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；および
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ、
を含む、化粧品の製造方法。
【請求項３１】
体細胞に初期化因子を導入して前記ｉＰＳ細胞を作成するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも１の処理を行うステップをさらに含む、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記回収した培養上清に追加的成分を添加するステップをさらに含む、請求項３０〜請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、抗加齢組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉＰＳ細胞培養上清を含む医薬組成物、およびその製造方法、化粧品およびその製造方法、抗加齢組成物、疾患発症抑制方法、疾患治療方法、組織異常治療方法ならびに美容方法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の医療によっては治療困難な疾病に対する代替技術として、幹細胞を利用した再生医療が注目されている。
幹細胞を用いた再生医療は、全ての難病にとっての新しい臨床プラットフォームにおける有望なツールである。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）および体性幹細胞を初めとする種々の幹細胞が報告されている。体性幹細胞のうち、骨髄、脂肪組織、皮膚、臍帯、胎盤等の種々の組織から単離される間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が皮膚再生における臨床的応用に特に用いられてきた。
【０００３】
また、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）は、体細胞に数種類の初期化因子を導入することによって作成された細胞であり、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」および未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製性」を有している（例えば、特許第５０９８０２８号明細書参照）。この分化多能性を利用して、ｉＰＳ細胞を分化させて移植材料を得ようとする試みも行われている（例えば、国際公開公報ＷＯ２０１１／１３６３７８号参照）。
【０００４】
一方、幹細胞を培養して得られる幹細胞培養上清を標的組織の損傷部を修復するために用いる試みもなされている（例えば、国際公開公報ＷＯ２０１１／１１８７９５号参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第５０９８０２８号明細書
【特許文献２】国際公開公報ＷＯ２０１１／１３６３７８号
【特許文献３】国際公開公報ＷＯ２０１１／１１８７９５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｉＰＳ細胞を再生医療に用いようとする試みは、ｉＰＳ細胞自体の分化多能性や自己複製性を利用するものであった。この場合、例えば、ｉＰＳ細胞を分化させて得られた移植材料の移植が必要であり、患者に対する負担がかかる。さらに、拒絶を避けようとすれば患者自身の体細胞からｉＰＳ細胞をいちいち作製することが必要であり、治療の準備に要する時間や労力は比較的大きいものとなる。
一方、歯髄幹細胞などの、体内に存在する体性幹細胞を培養して得られた培養上清は、損傷修復において一定の効果を示すものの、適用対象となる組織の種類によってその有効性は変動し、体内の組織一般に対する普遍的な有効性を有するものとは言い難かった。
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、ｉＰＳ細胞の培養上清を利用した新たな医薬組成物およびその製造方法、化粧品およびその製造方法、抗加齢組成物、疾患発症抑制方法、疾患治療方法、組織異常治療方法ならびに美容方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様に係る医薬組成物は、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、医薬組成物である。
本発明の第２の態様に係る医薬組成物の製造方法は、
（１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；および
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ、
を含む、医薬組成物の製造方法である。
本発明の第３の態様に係る使用は、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清の、医薬組成物の製造における使用である。
【０００８】
本発明の第４の態様に係る方法は、前記第１の態様に係る医薬組成物を、疾患または組織異常の発症前の対象に、前記疾患または組織異常の発症を抑えるために有効な量投与することを含む、対象において疾患または組織異常の発症前に前記疾患または組織異常の発症を抑える方法である。
本発明の第５の態様に係る方法は、前記第１の態様に係る医薬組成物を、疾患を有する対象に、前記疾患を治療するために有効な量で投与することを含む、疾患の治療方法である。
本発明の第６の態様に係る方法は、前記第１の態様に係る医薬組成物を、組織異常を有する対象に、前記組織異常を治療するために有効な量で投与することを含む、組織異常の治療方法である。
本発明の第７の態様に係る化粧品は、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、化粧品である。
【０００９】
本発明の第８の態様に係る美容方法は、前記第７の態様に係る化粧品を対象に適用することにより、対象の美容的外観を改善する、美容方法である。
本発明の第９の態様に係る化粧品の製造方法は、
（１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；および
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ、
を含む、化粧品の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞の培養上清を利用した新たな医薬組成物およびその製造方法、化粧品およびその製造方法、抗加齢組成物、疾患発症抑制方法、疾患治療方法、組織異常治療方法ならびに美容方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、肺線維症発症抑制効果を示す図である。
【図２】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、ランゲルハンス島萎縮抑制効果を示す図である。
【図３】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、肝線維症発症抑制効果を示す図である。
【図４】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、真皮内でのコラーゲン減少抑制効果を示す図である。
【図５】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、学習記憶能力低下についての抑制効果を示す図である。
【図６】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、脳神経変性抑制効果を示す図である。
【図７】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、脳神経細胞数減少抑制についての試験の測定対象部位を示す図である。
【図８】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、脳神経細胞数減少抑制効果を示す図である。
【図９】加齢促進マウスであるＳＡＭＰ８（日本エスエルシー株式会社、６週齢）に対し、１２時間サイクルでｉＰＳ細胞培養上清ミスト処理を行うことによる、寿命延長効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
＜医薬組成物＞
本開示に係る医薬組成物は、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む。
ｉＰＳ細胞は分化多能性および自己複製性を有する。先に述べたとおり、ｉＰＳ細胞を分化させ、得られた分化組織を移植片として用いる試みはあった。しかしながら、ｉＰＳ細胞から分泌される物質に着目して、ｉＰＳ細胞の培養上清を用いて例えば、医学的あるいは美容上の効果を得ようとする試みは無かった。それどころか、ｉＰＳ細胞の培養上清がどのような生物学的な効果を有するのかについて、何ら知られてはいなかった。
【００１３】
本発明の発明者は、ｉＰＳ細胞培養上清を、医学的、美容的等の効果を得るために用いるという、前例の無い試みを初めて行った。その結果、驚くべきことに、ｉＰＳ細胞培養上清は、組織一般に対して広く修復能力を有し、またその修復能力は間葉系幹細胞や造血幹細胞などの体性幹細胞の培養上清が示す修復能力と比べて傑出したものであることを、本発明者は発見した。これは、体性幹細胞から分泌される分泌物（成長因子、サイトカイン等を含む）と比較した場合、分化多能性を有するｉＰＳ細胞から分泌される分泌物はその物質組成が大きく異なっており、その結果として、どの組織であるかを問わずに、広く一般の組織に対して修復能力を示し、またその修復能力の程度も高いものとなっているものと推定される。具体的には、多くの成長因子、サイトカインについて、ｉＰＳ細胞の培養上清における含有量は、体性幹細胞の培養上清における含有量に比べて高く、あるいは、特定の成長因子、サイトカインは、ｉＰＳ細胞の培養上清には含まれるが、体性幹細胞の培養上清には実質的に含まれないと考えられる。また、ｉＰＳ細胞の培養上清は、体性幹細胞の培養上清には含まれないような抗加齢物質（例えば特定の種類のタンパク質）を含んでおり、この結果として、ｉＰＳ細胞の培養上清は、体性幹細胞の培養上清では見られないような優れた抗加齢効果を有すると考えられる。
ただし、本発明は、前記推定に何ら拘束されるものではない。
なお、本開示において「修復」とは、組織異常あるいは疾患によって失われた組織の機能の一部又は全部が、当該組織異常または疾患の生じる前における当該組織の機能と比較して維持又は回復していることを意味し、組織の機能が回復することのみならず、機能的な組織として再生することも広く包含する。機能が維持又は回復していることの評価については、組織異常あるいは疾患が生じている組織において異なるが、外観、対象となる機能の程度を評価するために通常用いられるアッセイ等に基づいて行えばよい。
【００１４】
本開示に係る医薬組成物においては、ｉＰＳ細胞を培養して得られたｉＰＳ細胞培養上清を医薬組成物の有効成分として用いる。当該ｉＰＳ細胞培養上清には、サイトカイン混合物等が含まれているため、種々の組織において修復能力を示す。本発明の一形態では、ｉＰＳ細胞培養上清中のサイトカインの混合物が組織の内在性幹細胞に対する誘導シグナルとして作用することにより、前記内在性幹細胞が、分化し、増殖し得、これが修復能力の発現をもたらし得ると推定できる。ただし、本発明は、前記推定に何ら拘束されるものではない。
【００１５】
本開示におけるｉＰＳ細胞培養上清は、ｉＰＳ細胞を培養して得られるものであるため、以下の説明ではその製法も併せて説明する。
【００１６】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、初期化因子を、体細胞に導入することによって作製された、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｙａｍａｎａｋａ  （２００６）  Ｃｅｌｌ，  １２６：６６３−６７６；  Ｋ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｃｅｌｌ，  １３１：８６１−８７２；  Ｊ．  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７），  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３１８：１９１７−１９２０；  Ｎａｋａｇａｗａ，  Ｍ．ら，Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：１０１−１０６  （２００８）；国際公開ＷＯ  ２００７／０６９６６６）。初期化因子は、例えば、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することが出来る。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディングＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディングＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子としては、例えば、特開２０１３−２４７９４３に挙げられているように、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が挙げられる。
ｉＰＳ細胞は、上記の方法の他にも、これまでに報告された各種ｉＰＳ細胞作製法によって作製することができる。また、今後開発されるｉＰＳ細胞作製法を適用することも当然に想定される。
【００１７】
ｉＰＳ細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトｉＰＳ細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008；Okita K. et al.: Nat Methods 8, 409-412）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
【００１８】
ｉＰＳ細胞作製に際して、初期化因子を導入する対象となる体細胞は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、特開２０１３−２４７９４３に挙げられているように、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液系細胞、免疫系細胞（例、Tリンパ球）、感覚器官の細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞(体性幹細胞も含む)であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に、本開示において体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。中でも、安定性の点からは骨髄由来間葉系幹細胞が好ましい。また、修復能力の点からは、体細胞はヒト由来のものであることが好ましい。また、前記体細胞として、前記医薬組成物の投与対象となる対象自身から得た体細胞を用いることが、拒絶の回避の上で有利な場合がある。
【００１９】
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、特開２０１３−２４７９４３に挙げられているように、例えば、10〜15% FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社）]などが含まれる。
【００２０】
培養法の例としては、たとえば、特開２０１３−２４７９４３に挙げられているように、37℃、5% CO2存在下にて、10% FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4〜7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上に播種し直し、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30〜約45日又はそれ以上後にｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
【００２１】
あるいは、37℃、5%CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10% FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25〜約30日又はそれ以上の後にES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
【００２２】
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1%以上、15%以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2当たり約5×103〜約5×106細胞の範囲である。
【００２３】
ｉＰＳ細胞は、特開２０１３−２４７９４３に記載されているように、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。また、Fbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。選択された細胞をｉＰＳ細胞として回収する。
【００２４】
得られたｉＰＳ細胞から培養上清を得るには、ｉＰＳ細胞の培養条件として通常用いられる条件をそのまま適用することができる。例えば、ｉＰＳ細胞を作製する際の培地および培養条件としては、上記説明で記載された培地および培養条件が挙げられる。なお、ｉＰＳ細胞を維持する上でフィーダー細胞の使用は必須ではなく、例えばラミニン５１１を用いることでフィーダー細胞を省略することも可能である（A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells
Masato Nakagawa, et al. Scientific Reports 4,Article number:3594doi:10.1038/srep03594 Received 09 October 2013 Accepted 06 December 2013 Published 08 January 2014 (Nature)）。また、培養の際には細胞死を抑制するためにＲＯＣＫ阻害剤を添加してもよい。
【００２５】
本開示に係る医薬組成物は、血清を含まないものであってもよい。血清を含まないことで安全性が高められる場合がある。例えば、血清を含まない培地（無血清培地）でｉＰＳ細胞を培養することによって、血清を含まない培養上清を調製することができる。１回又は複数回の継代培養を行うことにし、最後又は最後から数回の継代培養を無血清培地で培養することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。一方、回収した培養上清から、透析やカラムによる溶媒置換などを利用して血清を除去することによっても、血清を含まない培養上清を得ることができる。
血清を含まない「ｉＰＳ細胞の培養上清」を調製するためには、全過程を通して或いは最後又は最後から数回の継代培養についは無血清培地を使用するとよい。尚、基本培地としてはDMEMの他、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、GIBCO社等）、RPMI1640培地等を用いることができる。二種以上の基本培地を併用することにしてもよい。混合培地の一例として、IMDMとHamF12を等量混合した培地（例えば商品名：IMDM/HamF12（GIBCO社）として市販される）を挙げることができる。また、培地に添加可能な成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清等）、血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）、ウシ血清アルブミン（BSA）、抗生物質、各種ビタミン、各種ミネラルを挙げることができる。
【００２６】
培養上清を得るための培養時間としては、例えば５時間〜７日間であり、また、１日〜６日間であってもよい。培養温度は例えば３６℃〜３８℃、例えば３７℃、であり、ＣＯ２濃度は４〜６％、例えば５％、である。また、培養は、例えば非接着性条件下での三次元培養、例えば浮遊培養(例えば、分散培養、凝集浮遊培養など)により行ってもよい。
【００２７】
培養後に、細胞成分を分離除去することによって、ｉＰＳ細胞の培養上清を得ることができる。本開示において、培養上清とは、培養液から細胞成分を分離除去した上清そのものだけでなく、各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清もその範囲に含む。培養上清の処理方法の詳細は後述する。本開示において培養上清とは、細胞成分を含まない。このため、本開示における培養上清は、培養に用いられたｉＰＳ細胞は含んでいない。
【００２８】
本開示に係る医薬組成物は、上記により得られたｉＰＳ細胞の培養上清を有効成分として含むものであり、ある実施形態においては、前記医薬組成物は組成物全体としても前記ｉＰＳ細胞を含まない。また、別の実施形態では、前記医薬組成物は組成物全体としても細胞（細胞の種類は問わない）を含まない。つまり、無細胞である。当該実施形態の医薬組成物はこの特徴によって、ｉＰＳ細胞自体は当然のこと、ｉＰＳ細胞を含む各種組成物と明確に区別される。この実施形態の典型例は、ｉＰＳ細胞を含まず、ｉＰＳ細胞の培養上清のみで構成された医薬組成物である。
【００２９】
適用される被検体の状態に応じて、期待される治療効果が維持されることを条件として、本開示に係る医薬組成物は他の成分を追加的に含んでもよい。追加的に含まれ得る成分の一例は以下の通りである。
(i)生体吸収性材料
有機系生体吸収性材料としてヒアルロン酸、コラーゲン、フィブリノーゲン（例えばボルヒール（登録商標））等を使用することができる。
【００３０】
(ii)ゲル化材料
ゲル化材料は、生体親和性が高いものを用いることが好ましく、ヒアルロン酸、コラーゲン又はフィブリン糊等を用いることができる。ヒアルロン酸、コラーゲンとしては種々のものを選択して用いることができるが、本開示に係る医薬組成物の適用目的（適用組織）に適したものを採用することが好ましい。用いるコラーゲンは可溶性（酸可溶性コラーゲン、アルカリ可溶性コラーゲン、酵素可溶性コラーゲン等）であることが好ましい。
【００３１】
(iii)その他
製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることもできる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。抗生物質、ｐＨ調整剤、成長因子（例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF））等を含有させることにしてもよい。
【００３２】
本開示に係る医薬組成物の最終的な形態は特に限定されない。形態の例は液体状（液状、ゲル状など）及び固体状（粉状、細粒、顆粒状など）である。本開示に係る医薬組成物は、吸入に適した形態を有していてもよく、例えば、ネブライザーやディフューザーによって霧状に散布可能な液体の形態を有していてもよい。ｉＰＳ細胞の培養上清は、事前の準備や保存の点において、ｉＰＳ細胞自体を用いる場合よりも有利であり、疾患の急性期や亜急性期の治療に特に適するといえる。また、細胞成分を含まず、免疫拒絶の問題を克服し得るという点においても、ｉＰＳ細胞の培養上清の有用性は極めて高い。
【００３３】
近年、細胞を用いた再生医療の実現に向けた研究が数多くの研究グループによって進められている。細胞を利用する場合、生体から採取した細胞を培養、選択、処理などに施し、その後回収して移植物の成分とする。そのような従来の研究においては、通常、一連の操作の過程で培養上清は廃棄或いは生理的緩衝液などに置換される。従って、最終的な移植物は培養上清を積極的に含むものではない。このことに鑑みれば、ｉＰＳ細胞の培養上清を含む点において、本開示に係る医薬組成物は、ｉＰＳ細胞自体の有用性に注目してｉＰＳ細胞を有効成分として使用した組成物などとは、文言上は勿論のこと実質的にも峻別される。
【００３４】
とはいえ、実施形態によっては、本開示に係る医薬組成物はｉＰＳ細胞の培養上清に加えてｉＰＳ細胞を含むものであってもよい。このような場合には、作製後に分化誘導をしていない（換言すれば未分化状態を維持させている）ｉＰＳ細胞を用いることが好ましい。ｉＰＳ細胞を追加的に用いることにより、治療効果が向上する場合がある。
【００３５】
本開示に係る医薬組成物は、ｉＰＳ細胞の培養上清を含有することにより、組織異常や疾患に対して組織を修復する効果を奏する。この効果の程度は、従来の体性幹細胞の培養上清の使用により得られていた効果を遙かに凌駕する。また、本開示に係る医薬組成物は、驚くべきことに、体内の組織一般に対し広く一般的な修復効果を奏する。このため、本開示に係る医薬組成物は、特定の疾患や組織異常に限定されないユニバーサルな医薬組成物として用いることが可能である。つまり、一種の万能薬として用いることが出来る。このため、本発明の医薬組成物は、疾患や組織異常の発症前であるために、当該疾患や組織異常への罹患が未知の段階であっても、対象への投与により対象内における疾患や組織異常の進行を有効に抑制できる。このため、本開示に係る医薬組成物を習慣的に用いることにより、多岐に渡る疾患や状態異常を発症前に治療することが可能である。
【００３６】
本開示においては、
（１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ。
を含む、医薬組成物の製造方法も提供される。この製造方法は、前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施すステップをさらに含んでもよい。このようなステップを含むことにより、医薬組成物の取り扱いや保存、運搬がより容易になる。また、前記製造方法は、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加するステップをさらに含んでいてもよい。そのような追加の成分の添加により、医薬組成物全体の物性を変化させ、その特性を向上することが可能である。また、前記製造方法は、体細胞に初期化因子を導入して前記ｉＰＳ細胞を作成するステップをさらに含んでいてもよい。各々のステップならびに追加の成分等については、本開示に係る医薬組成物の説明において記載した事項がそのまま当てはまる。前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施すステップと、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加するステップの両方を含む場合には、両ステップはどちらを先に行ってもよく、また可能な場合には同時並行して行ってもよい。
【００３７】
上記ステップ（２）においては、ｉＰＳ細胞の培養上清を回収する。例えば、スポイトやピペットなどで培養液を吸引して回収することができる。回収した培養上清はそのまま或いは一以上の処理を経た後に本開示に係る医薬組成物の有効成分として使用される。ここでの処理として、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存（例えば、4℃、-80℃）を例示することができる。尚、ｉＰＳ細胞の培養上清は、複雑高度な精製をしなくとも、所期の作用を示す。このため、本開示に係る医薬組成物は簡便な工程で製造できる。複雑な精製工程を要しないことは、精製に伴う活性の低下を回避できる点においても有利である。
【００３８】
＜ｉＰＳ細胞培養上清の濃縮方法＞
本開示に係る医薬組成物は、製剤化されたものであってもよい。製剤化のためのｉＰＳ細胞培養上清の濃縮方法としては、培養上清の濃縮に通常用いられている方法を適用することができる。濃縮方法の例としては、例えば、以下の二つの方法を挙げることができる。
1. スピンカラム濃縮法
培養上清をAmicon Ultra Centrifugal Filter Units-10K(ミリポア社製)を用いて濃縮する（最大75倍濃縮）。具体的な操作手順は次の通りである。
(i) 培養上清（最大15ml）をAmicon Ultra Centrifugal Filter Units-10Kへ投入し、×4000gで約60分間遠心し、200μlまで濃縮する。
(ii) 上記チューブへ培養上清と同量の滅菌PBSを投入し、再度×4000gで約60分間遠心し、ベース溶液をPBSへ置換する。
(iii) 得られた溶液200μlをマイクロテストチューブへ回収し、濃縮ｉＰＳ細胞培養上清とする。
【００３９】
2. エタノール沈殿濃縮法
培養上清をエタノール沈殿法を用いて濃縮する（最大10倍濃縮）。具体的な操作手順は次の通りである。
(i) 培養上清5mlに対し100%エタノール45mlを加え、混和し、-20℃で60分間放置する。
(ii) 4℃、×15000gで15分間遠心する。
(iii) 上澄みを除去し、90%エタノール10mlを加え、よく攪拌する。
(iv) 4℃、×15000gで5分間遠心する。
(v) 上澄みを除去し、得られたペレットを滅菌水500μlに溶解し、マイクロテストチューブへ回収し、濃縮ｉＰＳ細胞培養上清とする。
【００４０】
＜ｉＰＳ細胞培養上清の凍結乾燥方法＞
また本開示に係る医薬組成物におけるｉＰＳ細胞培養上清は、凍結乾燥されたものであってもよい。これにより、良好な保存安定性が得られる。ｉＰＳ細胞培養上清の凍結乾燥方法としては、培養上清の凍結乾燥に通常用いられている方法を適用することができる。凍結乾燥方法の例としては、例えば、以下の方法を挙げることができる。
(i) 上記方法で得られたｉＰＳ細胞培養上清又は濃縮ｉＰＳ細胞培養上清を-80℃で2時間から半日凍結する。
(ii) 凍結後、サンプルチューブの蓋を開放し、凍結乾燥機へセットする。
(iii) 1〜2日間凍結乾燥を行う。
(iv) 得られたサンプルを凍結乾燥ｉＰＳ細胞培養上清とする（-80℃で保存可能）。
【００４１】
本開示においては、本開示に係る医薬組成物を、疾患または組織異常の発症前の対象に、前記疾患または組織異常の発症を抑えるために有効な量投与することを含む、前記対象において疾患または組織異常の発症前に前記疾患または組織異常の発症を抑える方法、も提供される。前記対象は、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）であってもよい。前記対象は、疾患または組織異常を発病するリスクを有すると判定された対象であってもよい。そのようなリスクは、遺伝子診断、家系分析等により判定することが出来る。例えば、特定の遺伝子における特定のアレルの存在が、特定の疾患への罹患確率に相関することが統計的に明らかにされている例がある。
【００４２】
一般に疾患や組織異常は、進行すればするほど治療はより困難になる。このため、そうした疾患や組織異常の早期発見が重要となる訳であるが、毎年の検診によって早期発見が確実にできるわけではない。この点を考慮すると、疾患や組織異常の発症前に予め治療を開始できることが望ましいが、そのような治療に用いられる薬剤は継続的に用いられるものである以上、投与対象者に与える負担が少ないものであることが望ましく、またその段階ではまだ明らかではない疾患あるいは組織異常の進行を抑えなければならないという点からは、疾患あるいは組織異常一般に広く有効性を有するものであることが望ましい。これらの要求を同時に満たすことは、従来の知見では困難であった。しかし、本開示に係る医薬組成物を用いれば、移植や注射といった侵襲的処置を行わなくても投与可能であり、また前記医薬組成物は疾患あるいは組織異常一般に広く有効性を有する。このことから、前記医薬組成物は、上記のような、発症前における疾患や組織異常の早期処置（進行抑制）に高い有効性を有する。このような発症前における早期処置のことを、本開示においては先制医療と称する。
【００４３】
前記医薬組成物の投与量は、未処理の培養上清の量に換算して、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日であり、また、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。また、投与の方法は特に制限されない。例えば、前記医薬組成物の投与は、非経口投与であることが好ましく、非経口投与としては、全身性投与であっても局所投与であってもよい。局所投与の例としては、目的組織への注入、塗布又は噴霧などを挙げることができる。前記医薬組成物の投与方法の例としては、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経肺投与（経肺吸収）及び鼻腔内投与等を挙げることができる。中でも、鼻腔内投与、経肺投与等は、低侵襲性であり、好ましい。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。
【００４４】
投与方法の選択は、発症抑制の目標となる組織の種類、疾患の種類等に基づいて当業者により行うことができる。例えば、当該組織が頭部にある場合には、血液脳関門の通過を考慮する必要がなく、低侵襲性であることから、鼻腔内投与等を適用することが特に好ましい。例えば、前記組織が脳である場合には、鼻腔内投与が好ましく適用され得る。また、脳梗塞の先制医療において、鼻腔内投与が好ましく適用され得る。経肺投与は、生活環境の中で長時間投与を行うことが出来る点で投与対象者の負担が少なく、ディフューザー等を使用して前記医薬組成物を霧状に噴霧することにより実施できる。
【００４５】
なお、実施形態によっては、本開示に係る医薬組成物に加えてｉＰＳ細胞も投与することが出来る。例えば、前記医薬組成物とｉＰＳ細胞とを同時に、または別々のタイミングで、対象に投与することができる。このような場合には、採取後に分化誘導をしていない（換言すれば未分化状態を維持させている）ｉＰＳ細胞を用いることが好ましい。前記医薬組成物とｉＰＳを併用する場合には、前記医薬組成物を含有する第１構成要素と、ｉＰＳ細胞を含有する第２構成要素とからなるキットを用いて投与を行ってもよい。各構成要素は、例えば各々別々のカプセルであったり、あるいは別々のアンプルあるいはバイアルであってもよい。この場合、第１構成要素を投与した治療対象に対して、第１構成要素の投与と同時又は投与後に第２構成要素を投与してもよい。尚、ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両要素を混合した後に対象へ投与する等、両要素の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両要素の投与が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。
【００４６】
前記疾患は、特に限定はされない。例えば、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、（Ｉ型ＩＩ型糖尿病に見られるような）ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等）、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患（外傷性網膜剥離、網膜裂孔、網膜振盪症、視神経管骨折、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、緑内障、コロイデレミア、レーベル先天盲、錐体ジストロフィ、家族性ドルーゼン、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィ、常染色体優性視神経萎縮など）、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、骨粗鬆症等が挙げられる。前記疾患は、加齢に伴って発生するあるいは進行する疾患であってもよい。また、前記医薬組成物の投与は、加齢に伴う前記疾患の発生あるいは進行を抑えるものであってもよい。
【００４７】
前記組織異常は、若年層における正常な組織と比較した場合の、組織の変性を意味する。いわゆる老化も組織異常の中に含まれる。老化の代表的な症状としては、例えば、視力低下、聴力低下、筋力低下、骨密度減少、腎機能低下、肝機能低下、膵臓機能低下、神経細胞数減少、記憶力低下、などが挙げられる。また、老化の症状は、組織の萎縮、線維化、細胞数の減少、色素沈着、寿命を短縮させるような組織のあるいは全身の変化などであってもよい。また、組織異常には、組織の物理的又は生理的欠陥に起因した傷害部あるいは障害部も包含される
前記疾患あるいは組織異常の発生する部位としては、食道、胃、膵臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、十二指腸、大腸、皮膚、眼、耳、鼻腔、気管、肺、血管、脳、骨、筋肉、咽頭、神経（脊髄、末梢神経等）が挙げられる。
前記組織異常は、加齢に伴って発生するあるいは進行する組織異常であってもよい。また、前記医薬組成物の投与は、加齢に伴う前記組織異常の発生あるいは進行を抑えるものであってもよい。
【００４８】
上記の方法において、疾患または組織異常の発症の抑制は、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成されるものであってもよい。本開示に係る医薬組成物は、サイトカインを始めとする種々の成分を含んでおり、これらの成分は内在性の幹細胞の能力を刺激して、疾患または組織異常の発症を抑制することが可能だからである。
【００４９】
もちろん、本開示に係る医薬組成物の用途は先制医療に制限されるものではない。このため、本開示によれば、本開示に係る医薬組成物を、疾患を有する対象に、前記疾患を治療するために有効な量で投与することを含む、疾患の治療方法も提供される。
前記対象は、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）であってもよい。
【００５０】
前記疾患の治療方法における、前記医薬組成物の投与量は、未処理の培養上清の量に換算して、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日であり、また、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。また、投与の方法は特に制限されない。例えば、前記医薬組成物の投与は、非経口投与であることが好ましく、非経口投与としては、全身性投与であっても局所投与であってもよい。局所投与の例としては、目的組織への注入、塗布又は噴霧などを挙げることができる。前記医薬組成物の投与方法の例としては、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経肺投与（経肺吸収）及び鼻腔内投与等を挙げることができる。中でも、鼻腔内投与、経肺投与等は、低侵襲性であり、好ましい。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。
【００５１】
なお、本開示において「治療」の範囲には、疾患や組織異常を根治する処置だけでなく、根治に至らないまでも疾患や組織異常の進行を停止させる、あるいは処置をしない場合に比べて遅らせる、処置も含まれる。例えば、加齢による疾患や組織異常の進行を停止させるあるいは遅らせることも、治療の範囲に含まれる。また、本開示において治療の開始時期は、発症が見られてからでもよく、また、前述のとおり発症前に未然に行うものであってもよい。
【００５２】
前記疾患の治療方法における、投与方法の選択は、疾患組織の種類、疾患の種類等に基づいて当業者により行うことができる。例えば、当該組織が頭部にある場合には、血液脳関門の通過を考慮する必要がなく、低侵襲性であることから、鼻腔内投与等を適用することが特に好ましい。例えば、前記組織が脳である場合には、鼻腔内投与が好ましく適用され得る。また、脳梗塞の治療に対して、鼻腔内投与が好ましく適用され得る。経肺投与は、生活環境の中で長時間投与を行うことが出来る点で投与対象者の負担が少なく、ディフューザー等を使用して前記医薬組成物を霧状に噴霧することにより実施できる。
【００５３】
なお、実施形態によっては、本開示に係る医薬組成物に加えてｉＰＳ細胞も投与することが出来る。例えば、前記医薬組成物とｉＰＳ細胞とを同時に、または別々のタイミングで、対象に投与することができる。このような場合には、採取後に分化誘導をしていない（換言すれば未分化状態を維持させている）ｉＰＳ細胞を用いることが好ましい。前記医薬組成物とｉＰＳを併用する場合には、前記医薬組成物を含有する第１構成要素と、ｉＰＳ細胞を含有する第２構成要素とからなるキットを用いて投与を行ってもよい。各構成要素は、例えば各々別々のカプセルであったり、あるいは別々のアンプルあるいはバイアルであってもよい。
【００５４】
この場合、第１構成要素を投与した治療対象に対して、第１構成要素の投与と同時又は投与後に第２構成要素を投与してもよい。第１構成要素と第２構成要素を同時に投与するという使用法は急性期や亜急性期の疾患への適用に特に適する。尚、ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両要素を混合した後に対象へ投与する等、両要素の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両要素の投与が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。
【００５５】
前記疾患の治療方法によって治療される疾患は、特に限定はされない。例えば、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、（Ｉ型ＩＩ型糖尿病に見られるような）ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患（筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病、パーキンソン病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症等）、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患（外傷性網膜剥離、網膜裂孔、網膜振盪症、視神経管骨折、糖尿病網膜症、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、緑内障、コロイデレミア、レーベル先天盲、錐体ジストロフィ、家族性ドルーゼン、中心性輪紋状脈絡膜ジストロフィ、常染色体優性視神経萎縮など）、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、骨粗鬆症等が挙げられる。
【００５６】
前記疾患の部位としては、食道、胃、膵臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、十二指腸、大腸、皮膚、眼、耳、鼻腔、気管、肺、血管、脳、骨、筋肉、咽頭、神経（脊髄、末梢神経等）が挙げられる。前記疾患は、加齢に伴って発生するあるいは進行する疾患であってもよい。また、前記医薬組成物の投与は、加齢に伴う前記疾患の発生あるいは進行を抑えるものであってもよい。
【００５７】
上記の方法において、疾患の治療は、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成されるものであってもよい。本開示に係る医薬組成物は、サイトカインを始めとする種々の成分を含んでおり、これらの成分は内在性の幹細胞の能力を刺激して、疾患の治療を達成することが可能だからである。
【００５８】
また、本開示によれば、本開示に係る医薬組成物を、組織異常を有する対象に、前記組織異常を治療するために有効な量で投与することを含む、組織異常の治療方法、も提供される。
前記対象は、ヒト、またはヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等）であってもよい。
前記組織異常の治療方法における、前記医薬組成物の投与量は、未処理の培養上清の量に換算して、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日であり、また、１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日であってもよい。また、投与の方法は特に制限されない。例えば、前記医薬組成物の投与は、非経口投与であることが好ましく、非経口投与としては、全身性投与であっても局所投与であってもよい。局所投与の例としては、目的組織への注入、塗布又は噴霧などを挙げることができる。前記医薬組成物の投与方法の例としては、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経肺投与（経肺吸収）及び鼻腔内投与等を挙げることができる。中でも、鼻腔内投与、経肺投与等は、低侵襲性であり、好ましい。投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、対象の性別、年齢、体重、病態などを考慮することができる。
【００５９】
前記組織異常の治療方法における、投与方法の選択は、組織異常を生じている組織の種類、疾患の種類等に基づいて当業者により行うことができる。例えば、当該組織が頭部にある場合には、血液脳関門の通過を考慮する必要がなく、低侵襲性であることから、鼻腔内投与等を適用することが特に好ましい。例えば、前記組織が脳である場合には、鼻腔内投与が好ましく適用され得る。経肺投与は、生活環境の中で長時間投与を行うことが出来る点で投与対象者の負担が少なく、ディフューザー等を使用して前記医薬組成物を霧状に噴霧することにより実施できる。
【００６０】
なお、実施形態によっては、本開示に係る医薬組成物に加えてｉＰＳ細胞も投与することが出来る。例えば、前記医薬組成物とｉＰＳ細胞とを同時に、または別々のタイミングで、対象に投与することができる。このような場合には、採取後に分化誘導をしていない（換言すれば未分化状態を維持させている）ｉＰＳ細胞を用いることが好ましい。
【００６１】
この場合、第１構成要素を投与した治療対象に対して、第１構成要素の投与と同時又は投与後に第２構成要素を投与してもよい。第１構成要素と第２構成要素を同時に投与するという使用法は急性期や亜急性期の組織異常への適用に特に適する。尚、ここでの「同時」は厳密な同時性を要求するものではない。従って、両要素を混合した後に対象へ投与する等、両要素の投与が時間差のない条件下で実施される場合は勿論のこと、片方の投与後、速やかに他方を投与する等、両要素の投与が実質的な時間差のない条件下で実施される場合もここでの「同時」の概念に含まれる。
【００６２】
前記組織異常としては、視力低下、聴力低下、筋力低下、骨密度減少、腎機能低下、肝機能低下、膵臓機能低下、神経細胞数減少、記憶力低下、などに代表される老化の他、物理的外傷や、組織が化学物質にさらされることにより生じる化学的外傷、などが挙げられる。また、組織の物理的又は生理的欠陥に起因した傷害部あるいは障害部も含まれる。また、前記老化の症状は、組織の萎縮、線維化、細胞数の減少、色素沈着、寿命を短縮させるような組織のあるいは全身の変化などであってもよい。
前記組織異常の部位としては、食道、胃、膵臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、十二指腸、大腸、皮膚、眼、耳、鼻腔、気管、肺、血管、脳、骨、筋肉、咽頭、神経（脊髄、末梢神経等）が挙げられる。
前記組織異常は、加齢に伴って発生するあるいは進行する組織異常であってもよい。また、前記医薬組成物の投与は、加齢に伴う前記組織異常の発生あるいは進行を抑えるものであってもよい。
【００６３】
上記の方法において、組織異常の治療は、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成されるものであってもよい。本開示に係る医薬組成物は、サイトカインを始めとする種々の成分を含んでおり、これらの成分は内在性の幹細胞の能力を刺激して、組織異常の治療を達成することが可能だからである。
【００６４】
本開示によれば、また、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清の、医薬組成物の製造における使用も提供される。前記ｉＰＳ細胞培養上清、前記医薬組成物および使用方法の詳細については、前述の説明（本開示に係る医薬組成物およびその製造方法、ならびに本開示に係る各種治療方法の説明等を参照）のとおりである。
【００６５】
本開示によれば、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む化粧品も提供できる。ｉＰＳ細胞培養上清およびその製法の詳細については、前記の医薬組成物およびその製法の詳細と同様である。
【００６６】
前記化粧品の製造においても、上述のとおり、ｉＰＳ細胞の培養後に、細胞成分を分離除去することによって、ｉＰＳ細胞の培養上清を得ることができるが、培養上清は、培養液から細胞成分を分離除去した上清そのもののみを指すわけではなく、各種処理（例えば、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩、保存等）を適宜施した培養上清であってもよい。培養上清の処理方法の詳細は、前記医薬組成物における培養上清の処理方法として前述したとおりである。
【００６７】
本開示に係る化粧品は、上記により得られたｉＰＳ細胞の培養上清を有効成分として含むものであり、ある実施形態においては、前記化粧品は組成物全体としても前記ｉＰＳ細胞を含まない。また、別の実施形態では、前記化粧品は組成物全体としても細胞（細胞の種類は問わない）を含まない。つまり、無細胞である。
【００６８】
適用される被検体の状態に応じて、期待される治療効果が維持されることを条件として、本開示に係る医薬組成物は他の成分を追加的に含んでもよい。追加的に含まれ得る成分の例としては、エモリエント剤、界面活性助剤、外用鎮痛剤、角質柔軟剤、可塑剤、滑沢剤、可溶化剤、還元剤、緩衝剤、忌避剤、殺虫剤、起泡剤、吸着剤、キレート剤、結合剤、減粘剤研磨・スクラブ剤、抗アクネ剤、抗う蝕剤、抗黴剤、抗菌剤、口腔衛生剤、口腔ケア剤、抗ケーキング剤、酵素剤、抗フケ剤、香味剤、香料、殺菌剤、酸化剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤・散乱剤、収れん剤、消臭剤、消泡剤、人工爪剤、親水性増粘剤、制汗剤、洗浄剤、増量剤、褪色防止剤、帯電防止剤、脱毛剤、着色剤、爪コンディショニング剤、乳化安定剤、乳化剤、粘着剤、パーマネント・ウェーブ用還元剤、剥離剤、非活性剤系分散剤、非水系増粘剤、皮膚コンディショニング剤、皮膚ブリーチ剤、皮膚保護剤、皮膜形成剤、表面改質剤、腐蝕防止剤、物理的脱毛剤、不透明化剤、分散剤、噴射剤、ヘアコンディショニング剤、ヘアスタイリング剤、閉塞剤、pH調整剤、変性剤、防腐剤、保湿・湿潤剤、保水剤、毛髪着色剤、口腔ヘルスケア用医薬品、および皮膚防御剤溶剤などが挙げられる。
【００６９】
本開示に係る化粧品の最終的な形態は特に限定されない。形態の例は、液状、乳液状、クリーム状、軟膏状、スプレー状、ゲル状などである。
【００７０】
本開示においては、
（１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ。
を含む、化粧品の製造方法も提供される。この製造方法は、前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施すステップをさらに含んでもよい。また、前記製造方法は、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加するステップをさらに含んでいてもよい。また、前記製造方法は、体細胞に初期化因子を導入して前記ｉＰＳ細胞を作成するステップをさらに含んでいてもよい。各々のステップについては、本開示に係る医薬組成物の説明において記載した事項がそのまま当てはまる。追加的成分については、本開示に係る化粧品の説明において記載した事項がそのまま当てはまる。前記回収された培養上清に遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、および脱塩の中から選択される一つ以上の処理を施すステップと、前記回収された培養上清に、追加の成分を添加するステップの両方を含む場合には、両ステップはどちらを先に行ってもよく、また可能な場合には同時並行して行ってもよい。
【００７１】
本開示によれば、本開示に係る化粧品を対象に適用することにより対象の美容的外観を改善する美容方法、も提供される。
対象は、例えばヒトであり、対象組織は例えば、皮膚や毛髪である。前記化粧品は、例えば、顔や首、腕、足といった部位に適用できる。また、火傷や外傷の痕を消すために、こうした部位に適用することも可能である。
適用は、一日一回〜三回程度行ってもよく、あるいは、ディフューザーなどを使用して霧状に噴霧することで、連続して適用することも可能である。
【００７２】
本開示に係る化粧品は、ｉＰＳ細胞培養上清を含むため、例えば皮膚のしわの原因となるコラーゲンやエラスチン組織への傷害などの、美容的外観を損なう変化を修復する作用を示す。これによって、本開示に係る化粧品は、対象における美容的外観に関係する部位に適用されることで、対象の美容的外観を改善する効果を示すものと考えられる。
本開示に係る化粧品は、加齢に伴って発生するあるいは進行する美容上の欠陥、例えばしわ、たるみ、くすみ、シミ、などの発生あるいは悪化を抑えるものであってもよい。
【００７３】
上記のとおり、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清は、加齢に伴う疾患、組織異常、美容上の欠陥などの発生または進行を幅広く抑えることが出来る。このため、本開示によれば、ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ培養上清を含む、抗加齢組成物も提供できる。抗加齢組成物に含まれるｉＰＳ培養上清について、その製法、由来、予備的処理、形態、含有量などの詳細については、上記の医薬組成物についての説明において説明された内容と同様である。加齢の発現は、組織の萎縮、線維化、細胞数の減少、色素沈着、寿命を短縮させるような組織のあるいは全身の変化などであってもよい。また、対象に前記抗加齢組成物を、抗加齢作用を発揮するのに有効な量投与することを含む、対象における加齢を抑制する方法も提供される。対象への前記抗加齢組成物の投与は、対象の寿命を延長するものであってもよい。
【００７４】
本発明の実施形態には以下のものが含まれる。
＜１＞  ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、医薬組成物。
＜２＞  前記ｉＰＳ細胞を含まない、＜１＞に記載の医薬組成物。
＜３＞  無細胞である、＜１＞または＜２＞に記載の医薬組成物。
＜４＞  前記ｉＰＳ細胞培養上清が、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群から選択される１以上によって処理されたものである、＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜５＞  前記ｉＰＳ細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞に由来するものである、＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜６＞  血清を含まない、＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【００７５】
＜７＞  対象において疾患または組織異常の発症前に前記疾患または組織異常の発症を抑えるために用いられる、＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜８＞  前記対象が、前記疾患または組織異常を発病するリスクを有すると判定された対象である、＜７＞に記載の医薬組成物。
＜９＞  前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、＜７＞または＜８＞に記載の医薬組成物。
＜１０＞  前記組織異常が老化である、＜７＞〜＜９＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜１１＞  前記疾患や組織異常が特定の疾患や組織異常に限定されない、ユニバーサルな医薬組成物である、＜７＞に記載の医薬組成物。
＜１２＞  疾患を治療するために用いられる、＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜１３＞  前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、＜１２＞に記載の医薬組成物。
【００７６】
＜１４＞  組織異常を治療するために用いられる、＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物。
＜１５＞  前記組織異常が老化である、＜１４＞に記載の医薬組成物。
＜１６＞  （１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；および
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ、
を含む、医薬組成物の製造方法。
＜１７＞  体細胞に初期化因子を導入して前記ｉＰＳ細胞を作成するステップをさらに含む、＜１６＞に記載の方法。
＜１８＞  前記回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも１の処理を行うステップをさらに含む、＜１６＞または＜１７＞に記載の方法。
＜１９＞  前記回収した培養上清に追加的成分を添加するステップをさらに含む、＜１６＞〜＜１８＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２０＞  ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清の、医薬組成物の製造における使用。
【００７７】
＜２１＞  前記医薬組成物が前記ｉＰＳ細胞を含まない、＜２０＞に記載の使用。
＜２２＞  前記医薬組成物が無細胞である、＜２０＞または＜２１＞に記載の使用。
＜２３＞  前記ｉＰＳ細胞培養上清が、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群から選択される１以上によって処理されたものである、＜２０＞〜＜２２＞のいずれか一項に記載の使用。
＜２４＞  前記ｉＰＳ細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞に由来するものである、＜２０＞〜＜２３＞のいずれか一項に記載の使用。
＜２５＞  前記医薬組成物が血清を含まない、＜２０＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の使用。
＜２６＞  前記医薬組成物が、対象において疾患または組織異常の発症前に前記疾患または組織異常の発症を抑えるために用いられる、＜２０＞〜＜２５＞のいずれか一項に記載の使用。
＜２７＞  前記対象が、前記疾患または組織異常を発病するリスクを有すると判定された対象である、＜２６＞に記載の使用。
【００７８】
＜２８＞  前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、＜２６＞または＜２７＞に記載の使用。
＜２９＞  前記組織異常が老化である、＜２６＞〜＜２８＞のいずれか一項に記載の使用。
＜３０＞  前記疾患や組織異常が特定の疾患や組織異常に限定されず、前記医薬組成物がユニバーサルな医薬組成物である、＜２６＞に記載の使用。
＜３１＞  前記医薬組成物が、疾患を治療するために用いられる、＜２０＞〜＜２５＞のいずれか一項に記載の使用。
＜３２＞  前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、＜３１＞に記載の使用。
＜３３＞  前記医薬組成物が、組織異常を治療するために用いられる、＜２０＞〜＜２５＞のいずれか一項に記載の使用。
＜３４＞  前記組織異常が老化である、＜３３＞に記載の使用。
【００７９】
＜３５＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物を、疾患または組織異常の発症前の対象に、前記疾患または組織異常の発症を抑えるために有効な量投与することを含む、対象において疾患または組織異常の発症前に前記疾患または組織異常の発症を抑える方法。
＜３６＞  前記対象が、前記疾患または組織異常を発病するリスクを有すると判定された対象である、＜３５＞に記載の方法。
＜３７＞  前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、＜３５＞または＜３６＞に記載の方法。
＜３８＞  前記組織異常が老化である、＜３５＞〜＜３７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３９＞  前記疾患や組織異常が特定の疾患や組織異常に限定されず、前記医薬組成物がユニバーサルな医薬組成物である、＜３５＞に記載の方法。
＜４０＞  前記疾患または組織異常の発症抑制が、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成される、＜３５＞〜＜３９＞のいずれか一項に記載の方法。
【００８０】
＜４１＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物を、疾患を有する対象に、前記疾患を治療するために有効な量で投与することを含む、疾患の治療方法。
＜４２＞  前記疾患が、胃潰瘍、肝硬変、肝不全、胆石、胆道炎、黄疸、心臓の加齢変化、高血圧、虚血性心疾患、心臓弁膜疾患、不整脈、心不全、動脈硬化、肺炎、肺気腫、肺線維症、ランゲルハンス島萎縮、肝線維症、慢性気管支炎、脳卒中、脳虚血、脳梗塞、認知症、てんかん、神経変性疾患、脳虚血や脳内出血等に伴う脳梗塞による神経細胞の変性・脱落、脳室周囲白質軟化症、神経細胞の障害を伴う網膜疾患、神経難病、歯周病、皮膚潰瘍、および骨粗鬆症からなる群から選択される、＜４１＞に記載の方法。
＜４３＞  前記疾患の治療が、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成される、＜４１＞または＜４２＞に記載の方法。
＜４４＞  ＜１＞〜＜６＞のいずれか一項に記載の医薬組成物を、組織異常を有する対象に、前記組織異常を治療するために有効な量で投与することを含む、組織異常の治療方法。
＜４５＞  前記組織異常が老化である、＜４４＞に記載の方法。
＜４６＞  前記組織異常の治療が、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成される、＜４５＞に記載の方法。
＜４７＞
前記医薬組成物の投与が、静脈内投与、動脈内投与、門脈内投与、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、経肺投与及び鼻腔内投与からなる群より選択された方法により行われる、＜４１＞〜＜４６＞のいずれか一項に記載の方法。
【００８１】
＜４８＞  前記医薬組成物の投与が、経肺投与または鼻腔内投与にてより行われる＜４１＞〜＜４７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４９＞  ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、化粧品。
＜５０＞  前記ｉＰＳ細胞を含まない、＜４９＞に記載の化粧品。
＜５１＞
無細胞である、＜４９＞または＜５０＞に記載の化粧品。
＜５２＞
前記ｉＰＳ細胞培養上清が、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群から選択される１以上によって処理されたものである、＜４９＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の化粧品。
＜５３＞
前記ｉＰＳ細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞に由来するものである、＜４９＞〜＜５２＞のいずれか一項に記載の化粧品。
＜５４＞
血清を含まない、＜４９＞〜＜５３＞のいずれか一項に記載の化粧品。
＜５５＞
シミ、しわ、たるみおよびくすみからなる群から選択される皮膚の状態を改善するために用いられる、＜４９＞〜＜５４＞のいずれか一項に記載の化粧品。
【００８２】
＜５６＞
＜４９＞〜＜５４＞のいずれか一項に記載の化粧品を対象に適用することにより、対象の美容的外観を改善する、美容方法。
＜５７＞
前記美容的外観の改善が、内在性の幹細胞の能力に基づいて達成される、＜５６＞に記載の美容方法。
＜５８＞
前記化粧品が対象の皮膚に塗布され、シミ、しわ、たるみおよびくすみからなる群から選択される皮膚の状態を改善する、＜５６＞または＜５７＞に記載の美容方法。
＜５９＞
（１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；および
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ、
を含む、化粧品の製造方法。
＜６０＞
体細胞に初期化因子を導入して前記ｉＰＳ細胞を作成するステップをさらに含む、＜５９＞に記載の方法。
【００８３】
＜６１＞
前記回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも１の処理を行うステップをさらに含む、＜５９＞または＜６０＞に記載の方法。
＜６２＞
前記回収した培養上清に追加的成分を添加するステップをさらに含む、＜５９＞〜＜６１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６３＞  ｉＰＳ細胞を培養することによって得られたｉＰＳ細胞培養上清を含む、抗加齢組成物。
＜６４＞  前記ｉＰＳ細胞を含まない、＜６３＞に記載の抗加齢組成物。
＜６５＞  無細胞である、＜６３＞または＜６４＞に記載の抗加齢組成物。
＜６６＞  前記ｉＰＳ細胞培養上清が、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群から選択される１以上によって処理されたものである、＜６３＞〜＜６５＞のいずれか一項に記載の抗加齢組成物。
＜６７＞  前記ｉＰＳ細胞が、骨髄由来間葉系幹細胞に由来するものである、＜６３＞〜＜６６＞のいずれか一項に記載の抗加齢組成物。
＜６８＞  血清を含まない、＜６３＞〜＜６７＞のいずれか一項に記載の抗加齢組成物。
＜６９＞  （１）ｉＰＳ細胞を培養するステップ；および
（２）前記ｉＰＳ細胞の培養により得られた培養上清を回収するステップ、
を含む、抗加齢組成物の製造方法。
＜７０＞  体細胞に初期化因子を導入して前記ｉＰＳ細胞を作成するステップをさらに含む、＜６９＞に記載の方法。
＜７１＞  前記回収した培養上清に対して、遠心処理、濃縮、溶媒の置換、透析、凍結、乾燥、凍結乾燥、希釈、脱塩及び保存からなる群より選択される少なくとも１の処理を行うステップをさらに含む、＜６９＞または＜７０＞に記載の方法。
＜７２＞  前記回収した培養上清に追加的成分を添加するステップをさらに含む、＜６９＞〜＜７１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７３＞  対象に＜６３＞〜＜６８＞のいずれか一項に記載の抗加齢組成物を、抗加齢作用を発揮するのに有効な量投与することを含む、対象における加齢を抑制する方法。
【００８４】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
【実施例】
【００８５】
実施例１：老化促進モデルマウスにおける種々の組織における先制医療
老化促進モデルマウス（Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ｍｏｕｓｅ：ＳＡＭ）を用いて、本開示に係るｉＰＳ細胞培養上清を投与した場合と投与しない場合における疾患および組織変性における差異を調べた。
具体的には、下記のようにして、ヒトｉＰＳ細胞の培養上清を得た。なお、下記において培養はいずれも３７℃で行った。
（ｉＰＳ細胞）
ｉＰＳ細胞の作製元となる細胞としてヒト骨髄由来間葉系細胞を用いた以外は、Takahashi K, et al. "Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors" Cell. 131(5): 861-72 (2007)に記載された方法に従い作成されたｉＰＳ細胞を、国立大学法人京都大学から入手した。具体的には、ヒトＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃを含む、レトロウィルス（pMXベクター）をヒト骨髄由来間葉系細胞に導入し、導入６日後に細胞をトリプシン処理し、マイトマイシンＣで処理されたＳＮＬフィーダー細胞上にプレーティングした（McMahon and Bradley, 1990）。翌日、培地を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭから、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（primate ES cell culture、株式会社リプロセル製）に変えた。
約２週間後に、ヒトＥＳ細胞様の形態を有する球状コロニーが現れた。約２５日目に平坦で、ヒトＥＳ細胞に類似したコロニーが観察された。各細胞の形態はヒトＥＳ細胞のものに類似し、コロニーの中央においては時折自発的な分化も見られた。また、フィーダー細胞依存性を有していたり、マトリゲル被覆プレート上マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化霊長類ＥＳ細胞用培地では未分化な状態を保つものの、無調整培地においては未分化状態を保たないといった点においても、得られた細胞はヒトＥＳ細胞に類似した性質を示した。
こうして得られたヒトｉＰＳ細胞を用いて、ｉＰＳ細胞培養上清の作製を行った。
【００８６】
（培養上清の調製）
前記ヒトｉＰＳ細胞は接着培養用シャーレで接着培養することにより維持した。培養に際しては、４ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（無血清；株式会社リプロセル製；以後このｂＦＧＦ添加霊長類ＥＳ細胞用培地を、ｉＰＳ細胞用培地と称する）を用いた。培養中は１週間毎に継代が必要であるが、これはヒトｉＰＳ細胞を０．２５％トリプシン、０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、１ｍＭのＣａＣｌ２および２０％のＫＳＲを含む溶液で処理することにより行った。
上記の通り維持されたヒトｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞解離液（株式会社リプロセル製）を用いて接着培養用シャーレから剥がし、非接着培養用シャーレに入れたｉＰＳ細胞用培地中で１週間浮遊培養した。この結果、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏ  Ｂｏｄｙ：ＥＢ）が形成された。
形成された胚様体（ＥＢ）を接着培養用シャーレ上に播種し、１０％ＦＢＳおよび１％アンチアンチ（登録商標、抗真菌剤）を含有するＤＭＥＭ中で１週間成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）させた（細胞のoutgrowthについては、Stem Cells Dev. 22, 102-113, 2013を参照）。
次に、上記ヒトｉＰＳ細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて接着培養用シャーレから剥がし、新たな接着培養用シャーレに播種した。これにより、ヒトｉＰＳ細胞はｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ化した。培地として１０％ＦＢＳおよび１％アンチアンチ（登録商標、抗真菌剤）を含有するＤＭＥＭを用い、一週間培養した。
ヒトｉＰＳ細胞が７０〜８０％以上コンフルエントになったことを確認した後に、培地を無血清培地（ＦＢＳを含まない、１％アンチアンチ（登録商標、抗真菌剤）含有ＤＭＥＭ）に置換し、２日間（４８時間）培養後、上清を回収した。回収した上清を１５００回転で５分遠心し、上清を再度回収した後に３０００回転で３分遠心し、上清を再度回収したものを以後の実験においてヒトｉＰＳ細胞培養上清として用いた。前記遠心はトミー精工製卓上多本架遠心機LC-120を用いて行った。
【００８７】
ＳＡＭＰ８（６週齢、日本エスエルシー株式会社）を準備した。また、上記で得られたｉＰＳ細胞培養上清を精製水にて１％濃度に希釈したものを超音波にて霧状にして、動物ケージ内に充満させた。また、ｉＰＳ細胞培養上清を用いずに、精製水のみを霧状にして動物ケージ内に充満させた。実験群（雄雌それぞれｎ＝５）に対しては、上記のｉＰＳ細胞培養上清含有ミストで充満した動物ケージ内に１２時間、次に上記ミストを含まない動物ケージ内に１２時間、のサイクルを行った。対照群（雄雌それぞれｎ＝５）に対しては、上記の精製水ミストで充満した動物ケージ内に１２時間、次に上記ミストを含まない動物ケージ内に１２時間、のサイクルを行った。
【００８８】
実験開始後７週目、４０週目および６０週目に、竹田俊男によって提唱された老化度判定基準（ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｃｏｒｅ  ｓｙｓｔｅｍ；"Grading score system: a method for evaluation of the degree of senescence in senescence accelerated mouse (SAM)" authored by Hosokawa M, Kasai R, Higuchi K, Takeshita S, Shimizu K, Hamamoto H, Honma A, Irino M, Toda K, Matsumura A, et al., Mech Ageing Dev. 1984 Jul;26(1):91-102）に基づいて評価を行い、観察期間中の生存期間を計測した。
【００８９】
１００％の湿度の環境下では、上記マウスは、肺胞を介して１呼吸サイクル毎に約２％の水分を吸収する。上記のｉＰＳ細胞培養上清を含むミストの吸収により、１呼吸サイクル毎に約０．０１％の培養上清が吸収されることになる。マウスの呼吸数は１分間に約５０回であるため、１分間に約０．５％のｉＰＳ細胞培養上清が血中に吸収されたと考えられる。
【００９０】
図１には、６週齢（実験開始時）における肺の状態、および３０週齢における実験群（ｉＰＳ−ＣＭ）と対照群それぞれの肺の状態を示す。図１から分かるように、対照群においては肺線維症が進行しているのに対して、実験群では肺線維症の進行は顕著に抑えられている。このことから、本開示に係る医薬組成物には、肺線維症を始めとする肺疾患や肺の組織異常の発症を抑制する効果があることが分かる。
【００９１】
図２には、６週齢（実験開始時）における膵臓ランゲルハンス島の状態、および３０週齢における実験群（ｉＰＳ−ＣＭ）と対照群それぞれの膵臓ランゲルハンス島の状態を示す。図２から分かるように、対照群においてはランゲルハンス島の萎縮が進行しているのに対して、実験群ではランゲルハンス島萎縮の進行は顕著に抑えられている。このことから、本開示に係る医薬組成物には、（Ｉ型ＩＩ型糖尿病に見られるような）ランゲルハンス島萎縮を始めとする膵臓疾患や膵臓の組織異常の発症を抑制する効果があることが分かる。
【００９２】
図３には、６週齢（実験開始時）における肝臓の状態、および３０週齢における実験群（ｉＰＳ−ＣＭ）と対照群それぞれの肝臓の状態を示す。図３から分かるように、対照群においては肝線維症が進行しているのに対して、実験群では肝線維症の進行は顕著に抑えられている。このことから、本開示に係る医薬組成物には、肝線維症を始めとする肝臓疾患や肝臓の組織異常の発症を抑制する効果があることが分かる。
【００９３】
図４には、７週齢、３０週齢および７０週齢におけるラット真皮内におけるコラーゲン蓄積の状態を示す。図４から分かるように、対照群においてはすでに７週齢でコラーゲン含有量の減少が起こっているのに対し、実験群ではコラーゲン含有量の減少は４０週齢や７０週齢でも顕著に抑えられている。このことから、本開示に係る医薬組成物には、コラーゲン含有量の減少を始めとする皮膚疾患や皮膚の組織異常の発症を抑制する効果があることが分かる。
【００９４】
図５には、３２週齢において、実験群および対照群のそれぞれに対してモリスの水迷路学習課題（Morris, R (May 1984). "Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat", Journal of neuroscience methods 11 (1): 47−60）を実施した結果を示す。具体的には、直径１５０ｃｍの円筒状容器内に３０ｃｍの深さまで水を張り、その中に水面より１ｃｍ〜２ｃｍまで立ち上がっている視認できないプラットフォームを設けた。このプラットフォームを利用して水迷路を脱出するまでの時間を測定したところ、対照群と比較して、実験群においては実験回数の増加と共に所要時間が顕著に減少しており、高い学習記憶能力が維持されていることが分かる。
この結果から、本開示に係る医薬組成物には、学習記憶能力低下を始めとする脳機能低下や脳疾患の発症を抑制する効果があることが分かる。
【００９５】
図６には、３０週齢における脳内の状態を示す。図６から分かるように、対照群においては神経の変性、神経細胞の減少が起こっているのに対し、実験群では神経組織は正常に保たれ、神経細胞の減少も顕著に抑えられている。このことから、本開示に係る医薬組成物には、神経変性の防止、神経細胞減少の防止を始めとする脳疾患や脳の組織異常の発症を抑制する効果があることが分かる。
【００９６】
図７には、３０週齢における脳内の神経細胞数測定の対象部位を示す。神経細胞数測定の結果を図８に示す。図８中で「Ｐｒｅ」は対照群、「Ｐｏｓｔ」は実験群を表し、縦軸は細胞数の減少を表している。図８から分かるように、対照群においては神経細胞の減少が起こっているのに対し、実験群では神経細胞数の減少は顕著に抑えられている。このことから、本開示に係る医薬組成物には、神経細胞減少の防止を始めとする脳疾患や脳の組織異常の発症を抑制する効果があることが分かる。
【００９７】
図９には、実験群（ｉＰＳ−ＣＭ群）および対照群それぞれについての、生存曲線を示した。図９から分かるように、対照群においては、雄の場合も雌の場合も、実験開始後早い時期から生存率が低下し始め、６３週の平均寿命であった。一方、実験群においては雄の場合も雌の場合も大幅な寿命の延長が見られ、１２０週の平均寿命であった。このことから、本開示に係る医薬組成物には、老化の進行を抑制する効果があることが分かる。
【００９８】
（プラスミドを用いて作製したヒトｉＰＳ細胞）
また、ｉＰＳ細胞の作製元となる細胞としてヒト骨髄由来間葉系細胞を用いた以外は、Okita K. et al.: Nat Methods 8, 409-412に記載された方法に従って作製されたヒトｉＰＳ細胞でも実験を行った。具体的には、プラスミドpCXLE-hOCT3/4-shp53（OCT3/4を有するpCXLE-hOCT3/4 (Addgene accession code 27076)のBamHIサイトにマウスU6プロモータに駆動された、p53用shRNA発現カセットを挿入したもの）、pCXLE-hSK（Addgene accession code 27078、SOX2およびKLF4を有する）およびpCXLE-hUL（Addgene accession code 27080、L-MYCおよびLIN28を有する）を用意し、１００μｌキットと共にマイクロポレーター（インビトロゲン社）を用いて6×105個のヒト骨髄由来間葉系細胞にエレクトロポレーションで導入した。導入条件は、１８００Ｖ、２０ｍｓ、一回のパルスであった。導入の７日後に細胞をトリプシン処理し、１×１０５細胞をＳＮＬまたはＭＥＦフィーダー層で覆われた１００ｍｍディッシュに再プレーティングした。次の日に培地を上記ｉＰＳ細胞用培地に交換した。プレーティングの２６〜３２日後にコロニーをカウントした。ヒトＥＳ細胞に類似したコロニーを選抜した。こうして得られたヒトｉＰＳ細胞を用いて、培養上清の作製を、上記と同様にして行った。そして、この培養上清を用いて上記と同様にＳＡＭＰ８マウスに吸入させた場合の効果を調べた。
その結果、レトロウィルスを用いて作製されたヒトｉＰＳ細胞の場合と同様の結果が得られた。このように、ｉＰＳ細胞の作製方法によらず、ｉＰＳ細胞培養上清は先制医療や抗加齢などの点において優れた性質を有していた。
【００９９】
以上説明したとおり、本開示に係るｉＰＳ細胞培養上清が有するユニバーサルかつ強力な作用により、本開示に係る医薬組成物や化粧品を用いれば、疾患や組織異常の先制医療や治療（進行抑制も含む）あるいは美容的外観の維持を達成することが可能となる。
【０１００】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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