(57)【要約】【課題】植菌用のサンプル液中の菌液を均一にすること。【解決手段】（1）微生物と；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エステルからなる群から選ばれる、食品添加物として許容されるノニオン界面活性剤と；食品あるいは食品添加物として許容される高分子とを含有する微生物液を準備する工程、及び（2）前記微生物液に超音波を照射する工程、を含む、微生物液の調製方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（1）微生物と；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エステルからなる群から選ばれる、食品添加物として許容されるノニオン界面活性剤と；食品あるいは食品添加物として許容される高分子とを含有する微生物液を準備する工程、
（2）前記微生物液に超音波を照射する工程、
を含む、微生物液の調製方法。
【請求項２】
前記ノニオン界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステルである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ノニオン界面活性剤が、ポリソルベート80である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ノニオン界面活性剤の含有量が、微生物液の全質量を基準にして、０．０５〜０．１質量％である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記高分子が、粘着性多糖類である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記高分子が、寒天である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記高分子の含有量が、微生物液の全質量を基準にして、０．０５〜０．１質量％である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記微生物液に含まれる微生物の数が、１×１０5〜１×１０8個/ｍLである、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、アスペルギルス（Aspergillus）属、バチルス（Bacillus）属からなる群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物が、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）及びバチルス  サブティリス（Bacillus subtilis）から選ばれる、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法により調製した微生物液を収納し、微生物液の撹拌装置をさらに備えており、微生物液を撹拌しながら噴霧可能な噴霧装置を準備する工程、
容積が１０〜１００ｃｍ3である、ブロー成形可能なプラスチック容器の内壁に対し、内壁に噴霧される量が２０〜５０μLとなるよう、前記噴霧装置に収納された微生物液を噴霧する工程、
を含む、微生物液をプラスチック容器に適用する方法。
【請求項１２】
前記噴霧装置が、ノズルと、圧力発生手段とを備えており、該圧力発生手段による圧力が０．０５〜０．１MPaである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスチック容器の開口部先端から前記ノズルまでの距離が−１０〜０mmとなるよう前記噴霧装置を設置する、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物液１００μLあたりの吐出時間が、０．１〜１秒である請求項１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法により微生物液をその内壁に適用した、ブロー成形可能なプラスチック容器の内面を乾燥する工程、
乾燥した前記プラスチック容器に殺菌処理を施す工程、
を含む、殺菌したプラスチック容器の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法により殺菌したプラスチック容器を加熱することによりブロー成形したプラスチック容器を得る工程、
そのブロー成形したプラスチック容器に飲料を充填する工程、
を含む、プラスチック容器入り飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスチック容器入り飲料を製造する際、飲料をプラスチック容器に充填する前に、プラスチック容器の殺菌効果を検証するために好適に用いることができる微生物液の調製方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により製造した微生物液をプラスチック容器に適用する方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により微生物液を適用したプラスチック容器の殺菌方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により殺菌したプラスチック容器に飲料を充填したプラスチック容器入り飲料の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
飲食物中に微生物が混入すると、栄養源、温度、水分活性、酸素有無などの条件が整った場合、指数関数的に増加する。その結果、飲食物は、微生物に汚染された事で瞬く間に変敗する。微生物によって変敗した飲食物を人が摂取すると、異味異臭による不快な思いをする。さらに、食中毒等、身体的危害を引き起こす場合もある。
微生物が飲食品に混入する経路は、複数存在する。その経路の一つとして、飲食物を収納する容器が挙げられる。この容器は、飲食物に直接接触することから、微生物の混入と、その後に起きる増殖によって、変敗を引き起こす。したがって、飲食物を収納する容器の飲食物に接触する内面は、十分に衛生性を確保することが求められる。
容器の内面の衛生性を確保する方法には、いくつかの方法がある。その中の一つとして、容器内面について、飲食物を収納する前にあらかじめ殺菌しておく方法が挙げられる。例えば、ペットボトル容器入りの飲料をアセプティックという技術が、これに該当する。
この技術により、プリフォーム（ブロー成型前のプラスチック容器のこと。以降、ＰＦと称することもある）と呼ばれる、食品を収納するためのプラスチック容器を殺菌することができる。このＰＦは、容積が小さくなるよう設計されている。そのため、そのままでは十分な量の飲料を収納することは出来ない。このＰＦは、ブロー成形工程で容器の容積を拡大し、プラスチック容器とされたのちに使用される。ＰＦから成形されたプラスチック容器の中に飲食物を収納する場合、あらかじめプラスチック容器の内面に残存する微生物を殺菌によって確実に除去しなければならない。
ここで、プラスチック容器の内面に残存する微生物を殺菌する操作は、微生物の増殖による飲食物の変敗の発生を予防する上で非常に重要となる。そのため、プラスチック容器の内面に残存する微生物に対する殺菌条件を厳密に設定するための技術を確立する事は、アセプティック技術の全体を適正に運用する上で鍵となる。
プラスチック容器の内面に対する殺菌効果を実験的に検証するためには、まず、指標となる微生物の菌液を調製し、これをＰＦの内面もしくは成形後のプラスチック容器の内面に均一に接種する（以降、「植菌」と称する。）。微生物の均一性確保、作業速度、作業場所の確保等の効率性を考慮すると、ＰＦを用いて実施する方が望ましい。
特許文献１には、各種の除菌装置等による除菌効果を評価する際に、実際に除菌処理が施される状態を想定した被検体を作成することができ、実情に即した実験モデルによって除菌効果を評価することが可能な除菌率の測定方法、菌類の定植・回収率の測定方法、菌類定植システム及び除菌率測定システムが開示されている。
特許文献２には、種菌の供給量をほぼ一定に保ちながら、安定した種菌充填を行うことのできる液状種菌の接種方法とその接種装置が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開2011-130672号公報
【特許文献２】特開2003-134934号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
１）微生物液内の微生物の均一性に関する課題
微生物の中には疎水性が高いものが存在する。このため微生物を分散させた溶液（以降、「微生物液」という。）を調製した場合、菌体同士が凝集し、均一に分散しない事象が発生する。このため、殺菌効果の検証結果の妥当性について、疑念が持たれていた。これは、従来のプラスチック容器内面に対する殺菌効果を実験的に検証するための技術として、微生物液内の微生物の均一性を確保する方法が提供されていないためである。本発明は、プラスチック容器入り飲料を製造する際、飲料をプラスチック容器に充填する前に、プラスチック容器の殺菌効果を検証するために好適に用いることができる微生物液中の微生物を均一にすることを課題として設定し、微生物が均一に分散した微生物液の調製方法を提供することを目的とする。
２）微生物液の噴霧の均一性に関する課題
また、従来、微生物液を均一に噴霧する方法として、家庭用に用いられる霧吹き機に類するものを用いて、手作業で行うのが通常であった。このため、噴霧を実施する際の圧力、流量など調整が不正確であった。この事から、微生物液の噴霧量について、試験者によるばらつきが生じることから、殺菌効果の検証結果の妥当性について、疑念が持たれていた。これは、微生物液をＰＦ内壁面全体に均一に噴霧する方法について提供されていないためである。また、ＰＦ内壁面全体に均一に菌を定着させる方法について提供されていないためである。本発明は、これらの課題に関し、本発明の方法により製造した微生物液をＰＦ内壁面全体に均一に噴霧すること、さらには、本発明の方法により製造した微生物液をＰＦ内壁面全体に均一に微生物を定着させることを課題とし、ひいてはプラスチック容器内面に対する殺菌効果を実験的に検証するための汎用性の高い植菌方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、殺菌したプラスチック容器の製造方法を提供することを目的とする。
本発明はまた、プラスチック容器入り飲料の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らが鋭意検討した結果、特定のノニオン界面活性剤と特定の高分子とを含ませた上、超音波を照射することにより、均一な微生物液が得られることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明により、以下の方法を提供する：
１．（1）微生物と；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エステルからなる群から選ばれる、食品添加物として許容されるノニオン界面活性剤と；食品あるいは食品添加物として許容される高分子とを含有する微生物液を準備する工程、
（2）前記微生物液に超音波を照射する工程、
を含む、微生物液の調製方法。
２．前記ノニオン界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステルである、前記１項記載の方法。
３．前記ノニオン界面活性剤が、ポリソルベート80である、前記１項記載の方法。
４．前記ノニオン界面活性剤の含有量が、微生物液の全質量を基準にして、０．０５〜０．１質量％である、前記１〜３のいずれか１項記載の方法。
５．前記高分子が、粘着性多糖類である、前記１〜４のいずれか１項記載の方法。
６．前記高分子が、寒天である、前記１〜５のいずれか１項記載の方法。
７．前記高分子の含有量が、微生物液の全質量を基準にして、０．０５〜０．１質量％である、前記１〜６のいずれか１項記載の方法。
８．前記微生物液に含まれる微生物の数が、１×１０5〜１×１０8個/ｍLである、前記１〜７のいずれか１項記載の方法。
９．前記微生物が、アスペルギルス（Aspergillus）属、バチルス（Bacillus）属からなる群から選ばれる、前記１〜８のいずれか１項記載の方法。
１０．前記微生物が、アスペルギルス  ニガー（Aspergillus niger）及びバチルス  サブティリス（Bacillus subtilis）から選ばれる、前記１〜９のいずれか１項記載の方法。
１１．請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法により調製した微生物液を収納し、微生物液の撹拌装置をさらに備えており、微生物液を撹拌しながら噴霧可能な噴霧装置を準備する工程、
容積が１０〜１００ｃｍ3である、ブロー成形可能なプラスチック容器の内壁に対し、内壁に噴霧される量が２０〜５０μLとなるよう、前記噴霧装置に収納された微生物液を噴霧する工程、
を含む、微生物液をプラスチック容器に適用する方法。
１２．前記噴霧装置が、ノズルと、圧力発生手段とを備えており、該圧力発生手段による圧力が０．０５〜０．１MPaである、前記１１項記載の方法。
１３．前記プラスチック容器の開口部先端から前記ノズルまでの距離が−１０〜０mmとなるよう前記噴霧装置を設置する、前記１１又は１２項記載の方法。
１４．前記微生物液１００μLあたりの吐出時間が、０．１〜１秒である前記１１〜１３のいずれか１項記載の方法。
１５．前記１１〜１４のいずれか１項記載の方法により微生物液をその内壁に適用した、ブロー成形可能なプラスチック容器の内面を乾燥する工程、
乾燥した前記プラスチック容器に殺菌処理を施す工程、
を含む、殺菌したプラスチック容器の製造方法。
１６．前記１５記載の方法により殺菌したプラスチック容器を加熱することによりブロー成形したプラスチック容器を得る工程、
そのブロー成形したプラスチック容器に飲料を充填する工程、
を含む、プラスチック容器入り飲料の製造方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、プラスチック容器内面に対する殺菌効果を実験的に検証するための、ＰＦ容器の内壁全体に均一に植菌できる均一な微生物液を調製することができる。また、当該微生物液を、ＰＦ内壁全体に均一に植菌することが可能となる。これらの事から、容器内面に存在する微生物が確実に殺菌されたか否かの見極めが容易になる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１ａ】図１ａは、実施例で用いた菌液スプレー装置の全体図である。
【図１ｂ】図１ｂは、前記装置のプリフォーム周囲の拡大図である。
【図２】図２は、実施例で用いた菌液スプレー装置の洗浄後、菌が発生しなかったことを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
〔微生物液の調製方法〕
本発明は、（1）微生物と；グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エステルからなる群から選ばれる、食品添加物として許容されるノニオン界面活性剤と；食品あるいは食品添加物として許容される高分子とを含有する微生物液を準備する工程、
（2）前記微生物液に超音波を照射する工程、
を含む、微生物液の調製方法に関する。
【０００９】
工程（1）において用いることのできる微生物としては、細菌、カビ、酵母があげられる。アスペルギルス（Aspergillus）属、バチルス（Bacillus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、サッカロミケス（Saccharomyces）属、及びケトミウム（Chaetomium）属等から選ぶことができる。アスペルギルス（Aspergillus）属としては、アスペルギルス  ニガー（A. niger）、黄色コウジ菌（A. flavus）、偽巣性コウジ菌（A. nidulans）、コウジ菌（A. oryzae）等があげられる。バチルス（Bacillus）属としては、バチルス  サブティリス（Bacillus subtilis）、炭疽菌（B.anthracis）、バチルス  コアギュランス（B.coagulans）等があげられる。クロストリジウム（Clostridium）属としては、ボツリヌス菌（C. botulinum）、ウェルシュ菌（C. perfringens）、破傷風菌（C. tetani）等があげられる。サッカロミケス（Saccharomyces）属としては、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）等があげられる。ケトミウム（Chaetomium）属としては、ケトミウム  グロボサム（C. globosum）等があげられる。微生物の取り扱い易さや安全性の観点から、微生物が、アスペルギルス  ニガー及びバチルス  サブティリスから選ばれるのが好ましい。
【００１０】
本発明において用いることのできるノニオン界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エステルからなる群から選ばれるものであって、食品添加物として許容されるノニオン界面活性剤である。
ソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンと炭素数１２〜１８の飽和又は不飽和脂肪酸とのモノ-、ジ-又はトリ-エステルがあげられる。具体的には、ソルビタンラウリン酸モノエステル、ソルビタンパルミチン酸モノエステル、ソルビタンステアリン酸モノエステル、ソルビタンステアリン酸トリエステル、ソルビタンオレイン酸モノエステル、ソルビタンオレイン酸トリエステル等があげられる。ソルビタン脂肪酸エステルのエチレンオキサイド付加物を用いることもできる。エチレンオキサイドの平均付加モル数が２０〜９０モルのものを好適に用いることができる。本発明において用いるソルビタン脂肪酸エステルとしては、ポリソルベート80が好ましい。
【００１１】
ショ糖脂肪酸エステルとしては、ショ糖と炭素数１２〜１８の飽和又は不飽和脂肪酸とのモノ-、ジ-又はトリ-エステルがあげられる。具体的には、ショ糖ラウリン酸モノエステル、ショ糖パルミチン酸モノエステル、ショ糖ステアリン酸モノエステル、ショ糖ステアリン酸トリエステル、ショ糖オレイン酸モノエステル、ショ糖オレイン酸トリエステル等があげられる。
前記ノニオン界面活性剤が、ソルビタン脂肪酸エステルであるのが好ましい。ポリソルベート80であるのがより好ましい。
前記ノニオン界面活性剤の含有量は、微生物液の全質量を基準にして、０．０５〜０．１質量％であるのが好ましく、０．０７〜０．０８質量％であるのがより好ましい。ノニオン界面活性剤の含有量がこのような範囲にあると、微生物に損傷を与えることなく微生物液中の菌体凝集を防ぐことができるので好ましい。
【００１２】
本発明において用いることのできる高分子としては、食品あるいは食品添加物として許容されるものであれば特に制限なく用いることができる。前記高分子の重量平均分子量は、３万〜１００万であるのが好ましく、５万〜４０万であるのがより好ましい。このような範囲にあると、微生物液中の菌体の分散を妨げることなく、微生物液の粘性を高めて、ＰＦ内壁面への微生物の定着を促進できるので好ましい。
前記高分子としては、粘着性多糖類、寒天、カルボキシメチルセルロース等があげられる。前記高分子が寒天であるのが好ましい。
前記高分子の含有量が、微生物液の全質量を基準にして、０．０５〜０．１質量％であるのが好ましい。
【００１３】
前記微生物と、前記ノニオン界面活性剤と、前記高分子を準備し、これらを生理食塩水に投入する。超音波を照射して、前記微生物を生理食塩水中に分散させる。照射する超音波の条件は、当業者であれば適宜設定することができるであろう。例えば、生理食塩水溶液１００ｍＬに対して、周波数１５〜５０kＨｚで６０〜６００秒間、超音波を照射することにより、微生物液を調製することができる。微生物が均一に分散しているか否かは、顕微鏡観察により確認できる。
カビ、酵母、細菌など、用いる微生物により異なるが、これら微生物が有する菌糸や粘性物質（多糖類など）を、超音波を照射する前に除去してもよい。除去は、濾過等、公知の手段で行うことができる。また、除去前にホモジナイズを行うことで、微生物をさらに均一に分散することができる。
前記微生物液に含まれる微生物の数が、１×１０5〜１×１０8個/ｍLであるのが好ましく、１×１０6〜１×１０7個/ｍLであるのがより好ましい。微生物の数がこのような範囲にあると、微生物液中の菌体が過度に凝集することなく、ＰＦ内壁面の殺菌装置による殺菌効果を算出するために最適な範囲の菌数をＰＦ内壁面に付着させることができるので好ましい。
【００１４】
〔微生物液をプラスチック容器に適用する方法〕
本発明はまた、本発明の方法により調製した微生物液を収納し、微生物液の撹拌装置をさらに備えており、微生物液を撹拌しながら噴霧可能な噴霧装置を準備する工程、
容積が１０〜１００ｃｍ3である、ブロー成形可能なプラスチック容器の内壁に対し、内壁に噴霧される量が２０〜５０μLとなるよう、前記噴霧装置に収納された微生物液を噴霧する工程、
を含む、微生物液をプラスチック容器に適用する方法に関する。
【００１５】
微生物液内の微生物の凝集を抑制し、均一に保つために、微生物液の撹拌装置を備えていることが好ましく、その微生物液の撹拌手段は特に限定されないが、撹拌は、撹拌羽を用いて行うこともできるし、エアー（バブル）を吹き込んだり、振動を与えたりすることによっても行うことができる。撹拌は、噴霧作業中、連続的に行っても断続的に行ってもよい。撹拌条件、例えば撹拌羽の回転速度や大きさ、羽の枚数、羽の先端から内壁までの距離、エアーの吹き込み速度や吹き込み量、振動を与える道具、振動の大きさなどは、特に限定されず、当業者であれば、適宜設定することができよう。
また、プリフォームへの植菌に当たり、作業者間で噴霧菌量にバラツキが生じる恐れがあるため、本発明で用いる噴霧装置は、微量微圧制御可能であるのが好ましい。本発明で用いる噴霧装置は小型であるのが好ましい。具体的には、噴霧装置のノズル先端から微生物液収納容器最上部までの高さが３０ｃｍ程度であるものが、作業性が良いので好ましい。
【００１６】
本発明に用いられるプリフォームは、平均内径２０〜３０ｍｍであり、且つ、長さが５０〜１５０ｍｍである。プリフォームは円柱でなく、側面に一以上のくびれがあり、成形後に底面となる部分は半球状である。プリフォームの高さは、その半球の頂点から、垂直方向にプリフォーム口部端部と交差する点までの長さを指す。
本発明に用いられる容器の材質は、プリフォームから成型可能であり、本発明の効果が得られれば特に制限はないが、好ましくはポリプロピレン、ポリエチレン、またはポリエチレンテレフタレートであり、より好ましくはポリエチレンテレフタレートである。
プリフォーム内壁への噴霧量は、容積１０〜１００ｃｍ3に対し、１０〜１００μＬとなる量である。２０〜５０μＬであるのが好ましい。噴霧量がこのような範囲にあると、ＰＦ内壁に噴霧した微生物液が凝集し液だれを発生することなく、ＰＦ内壁底面まで微生物液を定着させることができるため好ましい。
【００１７】
前記噴霧装置はさらに、ノズルと、圧力発生手段とを備えており、該圧力発生手段による圧力が０．０５〜０．１MPaであるのが好ましい。
圧力発生手段として、無菌ガスを用いることができる。無菌ガスは、高純度空気や窒素ガスなどをフィルターに通すことにより得ることができる。
前記プラスチック容器の開口部先端から前記ノズルまでの距離が好ましくは−１０〜０mm、より好ましくは−１０〜−５mmとなるよう前記噴霧装置を設置するのが良い。容器開口部先端からノズルまでの距離がこのような範囲にあると、微生物液がＰＦ周辺に過度に飛散することなく、ＰＦ内壁底面まで微生物液を定着させることができるため好ましい。
前記微生物液100μLあたりの吐出時間が、０．１〜１秒であるのが好ましく、０．５〜１秒であるのがより好ましい。吐出時間がこのような範囲にあると、植菌作業を迅速に行いながら、ＰＦ内壁に微生物液を均一に定着させることができるため好ましい。
【００１８】
〔殺菌方法〕
本発明はまた、前記微生物液をプラスチック容器に適用する方法により微生物液をその内壁に適用した、ブロー成形可能なプラスチック容器の内面を乾燥する工程、
乾燥した前記プラスチック容器に殺菌処理を施す工程、及び
を含む、殺菌方法に関する。
【００１９】
乾燥は、プリフォームを加熱することなく、室温で放置することにより行うのが良い。これにより、プリフォーム内壁に適用した微生物が、ブロー成型時の熱で死滅してしまうことを防ぐことができる。
殺菌処理を、乾燥した前記プラスチック容器に過酸化水素を適用することにより行うことができる。過酸化水素の濃度は、殺菌剤として通常使用する濃度であり、具体的には、２．５〜３．５w/v％である。これより高い濃度で用いてもよい。
【００２０】
〔飲料の充填方法〕
本発明はまた、前記殺菌方法により殺菌したプラスチック容器を加熱することによりブロー成形したプラスチック容器を得る工程、
そのブロー成形したプラスチック容器に飲料を充填する工程、
を含む、飲料の充填方法に関する。
ブロー成型の条件及び手段、及びそのブロー成型したプラスチック容器に飲料を充填する条件及び手段は、当業者であれば適宜設定することができよう。
【実施例】
【００２１】
１．微生物液の調製
（1）A.nigerをポテトデキストロース寒天培地（PDA培地）に植菌し、２５℃において７日間培養した。
（2）Tween８０  ０．０７w/w%、寒天（重量平均分子量１１６，０００）０．０７w/w%を生理食塩水に加えて分散液を調製し、この分散液を用いて、７日間培養後のA.niger胞子をコンラージ棒で掻き取った。
（3）硝子ホモジナイズ及びキムワイプ濾過作業により菌糸を除去した。
（4）超音波洗浄装置（３０kＨｚ）で１０分間、上記微生物液を処理し、A.niger胞子を分散させた。
（5）顕微鏡観察によりA.niger胞子の分散性を確認した。
【００２２】
２．プリフォーム内壁への微生物液の適用
（1）ポリエチレンテレフタラート製プリフォーム１００本を準備した。
（2）噴霧装置は、株式会社サンエイテック製二流体ノズルSV91型に改良を加えたものを使用した。
具体的には、プリフォーム１は、変形させたジョイントクリップにネックグリップのイメージで装着し、スプレーノズル２や液剤圧調整バルブはクランプを用いて設置させた。それらを角型モッフとスタンドを用いて各部材が垂直かつ並行になるようにバランスを取りながら設置した。菌液が外部に飛散しないように、装置全体を簡易クリーンブース（陰圧・除菌装置付）３にて覆うことで安全対策、工程汚染リスク軽減を行った。また、供給エアーは純エアー アルファガス２（エア・リキード社)を使用し、孔径０．００３μmインラインフィルター（Entegris社）をレギュレーター４の直後に装着した。全体図を図１ａに示す。
（3）上で調製した微生物液をプリフォーム内に噴霧した。噴霧液は、試験の間中、撹拌羽で撹拌した。圧力は、無菌空気を用いて負荷した。
（4）以下の表に示した項目を種々変更し、プリフォーム内壁全体に均一に噴霧されているか否かを判定した。
（5）判定は、目視観察により、以下の基準で行った。なお、ＰＦは透明であることから、微生物液の内面への付着状態を目視観察により、容易に識別することが可能である。この事から、ＰＦ内壁への噴霧の均一性については、以下の方法に基づき目視観察により評価した。
【００２３】
2016195575.tif 000002
【００２４】
結果を下記表に示す。なお、微生物液を準備する工程において、Tween８０や寒天を用いなかった場合には、微生物液内の微生物が凝集し、また、Tween８０のみを用いた場合には、プリフォーム内で微生物液が液だれを起こし、また、微生物液に超音波を照射しなかった場合には、超音波を照射した場合に比べて微生物の分散性が悪かった。
【００２５】
【表１】
2016195575.tif 000003
【００２６】
プリフォーム内の菌を洗い出して回収菌数を測定し、付着菌数計算値と比較することにより、噴霧条件が噴霧量に与える影響を評価した。
【００２７】
【表２】
2016195575.tif 000004
【００２８】
噴霧量が３５μＬよりも２５μＬの方が、菌の回収率が高かった。
【００２９】
なお、菌量水準の切替え時に以下の洗浄作業を行い、スプレー装置を無菌化した。
（1）超音波洗浄後にオートクレーブ滅菌を行った部品（SUS部材）と交換した。
（2）パッキン類は、アルコール滅菌し、交換した。
（3）液剤攪拌羽は、バーナーで火炎滅菌した。
（4）専用グリスを塗布した後、各種部品を装着した。
（5）液剤圧力０．２MPa、バルブストローク１５目盛開放に設定した。
（6）スプレー圧を０Mpaにした（場合により、スプレー用配管のみはずした）。
（7）洗浄用シリンダを装着し滅菌水を装置内の液剤流路に５０ml流した。
（8）７０%エタノールを装置内の液剤流路に５０ml流した。
（9）除菌エアーを装置内の液剤流路に３分間以上連続的に流した。
【００３０】
A.niger胞子液（１×１０7個/ml）をスプレー装置に流した後、上記洗浄作業を行った。洗浄後、滅菌水を５０ml程度スプレー装置に流し、装置を通過した滅菌水を採取した。その全量を０．４５μｍフィルターで濾過し、PDA培地にて２５℃において７２時間培養を行った。その結果、菌の発生は認められなかった（図２）。
【符号の説明】
【００３１】
１  プリフォーム
２  スプレーノズル
３  簡易クリーンブース（陰圧・除菌装置付）
４  レギュレーター
５  撹拌羽付き液剤シリンダ
【図１ａ】
2016195575.tif 000005
【図１ｂ】
2016195575.tif 000006
【図２】
2016195575.tif 000007