(57)【要約】【課題】複数の微生物種が存在する系においても芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を特異的に検出し、定量することができる芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供すること。【解決手段】本発明の芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌の検出方法は、被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１４０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、増幅産物を検出する第二工程と、を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌の検出方法であって、
被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１４０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、
増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。
【請求項２】
前記芳香族化合物が、（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第二工程において、配列番号２に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１５塩基以上３０塩基以下の塩基配列を含むプローブを用いて、増幅産物を検出する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、配列番号３から６に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第一工程において用いるプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号８に記載の塩基配列を含む第二のプライマーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌の検出に用いられるキットであって、
配列番号７に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号８に記載の塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットと、
配列番号２に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１５塩基以上３０塩基以下の塩基配列を含むプローブと、を含むキット。
【請求項７】
前記プローブが、配列番号３から６に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、請求項６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌の検出方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学や鉄鋼といった重化学工業等における排水は、有機物を除去し、ヒト及び環境生物に対する影響を十分に低下させた状態で自然環境中に排出することが望まれている。有機物を除去するための排水処理方法としては、燃焼処理又は化合物分解性微生物を利用した生物学的処理方法等が用いられている。
【０００３】
化合物分解性微生物を得る方法としては、対象とする化合物を分解する微生物を集積培養して、その分解微生物を特定、単離して純粋培養する方法（単離培養方法）が知られている。また、別の方法としては、活性汚泥の様な混合微生物系の場合、対象化合物を低濃度で栄養源として与え、徐々に濃度を高めていくことにより活性汚泥を対象化合物に馴れさせ、分解能を高める馴養と呼ばれる方法（馴養方法）が知られている。例えば、特許文献１には、有機物である１，４−ジオキサンを廃水から処理するために用いられる活性汚泥の馴養方法が記載されている。
【０００４】
排水に含まれる有機物としては、芳香族化合物がある。芳香族化合物を含む排水を処理するための方法としては、例えば、芳香族化合物を栄養源として用いて馴養された活性汚泥を用いる方法がある。このとき、排水中の芳香族化合物の量及び排水処理に要求されるスピードに応じて、活性汚泥中の芳香族化合物分解微生物の量をモニタリングし、調節することが望まれている。そのためには、複数の微生物種が存在する活性汚泥から芳香族化合物分解微生物のみを迅速に検出及び定量することが課題となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１４−１８８５０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、これまでは複数の微生物が存在する系から、芳香族化合物分解性微生物の特異的な検出及び定量ができなかったため、排水中の芳香族化合物除去反応を制御することが困難だった。
【０００７】
本発明は、上記事情に鑑み、複数の微生物種が存在する系においても芳香族化合物分解性微生物を特異的に検出し、定量することができる芳香族化合物分解性微生物の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、これまでの研究の結果から、芳香族化合物を分解するために用いられている活性汚泥には、芳香族化合物分解性を有する特定のＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌が存在していることを明らかにした。そして、本発明者らは、このＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列（配列番号９）の特定の領域が、複数の微生物種が存在する系における芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の特異的検出及び定量に有用であることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］から［７］に関する。
［１］芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌の検出方法であって、被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１４０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、増幅産物を検出する第二工程と、を有する方法。
［２］芳香族化合物が、（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸である、［１］に記載の方法。
［３］第二工程において、配列番号２に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１５塩基以上３０塩基以下の塩基配列を含むプローブを用いて、増幅産物を検出する、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］プローブが、配列番号３から６に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、［３］に記載の方法。
［５］第一工程において用いるプライマーが、配列番号７に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号８に記載の塩基配列を含む第二のプライマーである、［１］から［４］のいずれかに記載の方法。
［６］芳香族化合物分解性スフィンゴモナダセアエ（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）科細菌の検出に用いられるキットであって、配列番号７に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号８に記載の塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットと、配列番号２に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１５塩基以上３０塩基以下の塩基配列を含むプローブと、を含むキット。
［７］プローブが、配列番号３から６に記載の塩基配列から選択される一つの塩基配列を含む、［６］に記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、複数の微生物種が存在する系においても芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を特異的に検出し、定量することができる芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の検出方法、及び、そのために用いられるキットを提供することができる。これにより、例えば、排水処理において、活性汚泥中の芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の検出量に基づき、排水中の芳香族化合物除去反応を制御することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
＜芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の検出方法＞
本実施形態の芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の検出方法は、被検ＤＮＡを鋳型に、配列番号１に記載の塩基配列のうち、連続した１４０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る第一工程と、増幅産物を検出する第二工程と、を有する。
【００１３】
本実施形態に係る芳香族化合物としては、例えば、式（１）又は式（２）で表される芳香族化合物が挙げられる。
【００１４】
【化１】
2016195565.tif 000002
【００１５】
式（１）中、Ｒ１は水素原子又は塩素原子を表し、Ｒ２は、炭素数１〜３のアルキル基又は水酸基を表す。アルキル基としては、直鎖状アルキル基であってもよく、分岐鎖アルキル基であってもよい。式（１）で表される芳香族化合物としては、例えば、（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸、２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸、２−フェニルブタン酸、２−ヒドロキシ−２−（４−クロロフェニル）酢酸、２−フェニル−３−メチルブタン酸が挙げられる。
【００１６】
【化２】
2016195565.tif 000003
【００１７】
式（２）中、Ｒ３は、水素原子、ヒドロキシメチル基、ホルミル基又はカルボキシル基を表し、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は水酸基を表す。式（２）で表される芳香族化合物としては、例えば、カテコール、プロトカテキュ酸、プロトカテキュアルデヒド、安息香酸、ベンズアルデヒドが挙げられる。
【００１８】
本実施形態に係る被検ＤＮＡとしては、例えば、プラスミド、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられる。これらの被検ＤＮＡは、複数種類の微生物種由来のＤＮＡを含むものであってもよく、活性汚泥から調製したＤＮＡであってもよい。被検ＤＮＡとしては、排水中の芳香族化合物除去反応を制御する観点から、活性汚泥から調製したＤＮＡが好ましい。これらの被検ＤＮＡの調製方法は、当業者に周知の方法を用いることができる。活性汚泥からＤＮＡを調製する方法としては、例えば、市販されているＤＮＡ抽出キット等を用いることができる。
【００１９】
［第一工程］
配列番号１は、配列番号９の４９５番目から６７０番目の塩基配列を示す。配列番号９は、芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を示す。１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子には、遺伝子上に種間に共通な配列を含む保存領域、及び種・属等によって異なる配列を含む９つの可変領域（Ｖ１からＶ９）が存在する。配列番号９中、５０６番目から５６７番目の塩基配列がＶ４領域である。
【００２０】
配列番号１に記載の塩基配列は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域を含む領域である。本実施形態に係る第一工程において、増幅産物は、配列番号１の塩基配列内の連続した１４０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製される。増幅産物は、連続した１５０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよく、連続した１６０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を増幅可能なプライマーを用いてヌクレオチドを増幅して調製してもよい。このようなプライマーにより増幅して調製される増幅産物であれば、配列番号１に記載の塩基配列の対応領域に対して、１個から２個の相違するヌクレオチドを有する塩基配列であってもよく、同一のヌクレオチドを有する塩基配列であってもよい。上記塩基配列を含む増幅産物を用いることで、続く第二工程において、芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を特異的に検出することができる。
【００２１】
第一工程において、ヌクレオチドを増幅させ、増幅産物を得る方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）、リアルタイムＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法が挙げられる。これらの方法の中でも、増幅と同時に、第二工程における検出を行えること、及び、増幅産物の定量を行えることから、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００２２】
増幅産物を得るために用いるプライマーセットは、芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ４領域を含む領域を増幅できるように設計することができる。プライマーセットとしては、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマー（フォワードプライマー）及びセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマー（リバースプライマー）からなるセットがある。
【００２３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相同性を含むヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度及びｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、及びＤＮＡ濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。
「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を含むプライマー又はプローブ」としては、例えば、目的とするヌクレオチドと高イオン濃度下［例えば、６×ＳＳＣ（９００ｍＭ塩化ナトリウム、９０ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に６５℃の温度条件でハイブリダイズすることにより、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成し、低イオン濃度下［例えば、０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム）などが用いられる。］に６５℃の温度条件で３０分間洗浄した後でも該ハイブリッドが維持されうるプライマー又はプローブをあげることができる。
【００２４】
１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第一のプライマーとしては、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が２である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が１である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡのセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズする第二のプライマーとしては、例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が２である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列との相違塩基数が１である塩基配列を含むプライマーを挙げることができ、より好ましくは、１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードするＤＮＡの塩基配列に対して相補的な塩基配列中の連続した１８塩基以上の塩基配列を含むプライマーを挙げることができる。
【００２５】
第一及び第二のプライマーは、配列番号１の塩基配列内の連続した１４０塩基以上１７６塩基以下の塩基配列を含むヌクレオチドを増幅することができるように設計されていれば、特に制限されるものではない。プライマーの長さは、より十分な特異性を得る観点から、１８塩基以上が好ましく、２０塩基以上が好ましい。プライマーの長さの上限としては、よりアニーリング効率を高める観点から、３０塩基以下が好ましく、２５塩基以下がより好ましく、２１塩基以下が更に好ましい。第一のプライマーとして、例えば、配列番号７に記載の塩基配列を含むプライマーが挙げられる。第二のプライマーとして、例えば、配列番号８に記載の塩基配列を含むプライマーが挙げられる。
【００２６】
［第二工程］
第二工程において、増幅産物を検出する方法としては、特に制限されるものではなく、当業者に周知の方法を用いることができる。増幅産物を検出する方法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動法、リアルタイムＰＣＲ法、シークエンス解析法、サザンブロッティング法が挙げられる。これらの方法の中でも、特異性に優れるという観点から、プローブを用いる検出方法が好ましい。プローブを用いる検出方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ法又はサザンブロッティング法が挙げられ、中でも、第一工程の増幅が同時に行え、且つ、特異的に検出でき、定量性にも優れるという観点から、リアルタイムＰＣＲ法が好ましい。
【００２７】
検出に用いられるプローブは、第一工程で得られた増幅産物のセンス鎖又はアンチセンス鎖にストリンジェントな条件でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが好ましい。プローブの長さとしては、より特異的に増幅産物を検出する観点から、１５塩基以上３０塩基以下が好ましく、１５塩基以上２５塩基以下がより好ましく、１８塩基以上２３塩基以下が更に好ましい。プローブとして、配列番号２に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするものが好ましい。このようなプローブとしては、例えば、配列番号３から６に記載の塩基配列を含むプローブが挙げられる。
【００２８】
上記プローブをリアルタイムＰＣＲ法に用いる場合、プローブは、５’末端を蛍光物質で、３’末端を蛍光物質が発する蛍光を抑制するためのクエンチャーで、それぞれ修飾される。蛍光物質としては、例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙａｎｉｎｅ５が挙げられる。クエンチャーとしては、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３が挙げられる。プローブの修飾に用いられる蛍光物質及びクエンチャーは、使用するリアルタイムＰＣＲ装置の励起波長及び測定波長に合わせて、適宜選択することができる。
【００２９】
リアルタイムＰＣＲ装置としては、ＤＮＡをＰＣＲにより増幅することができるサーマルサイクラーと、増幅産物を検出するための分光蛍光光度計と、を備えていれば、特に制限されるものではない。リアルタイムＰＣＲ装置としては、例えば、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）が挙げられる。
【００３０】
第二工程で検出した増幅サンプルは定量することもできる。そのため、本実施形態の検出方法は、被検ＤＮＡから芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を検出するだけでなく、被検ＤＮＡに含まれる芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌由来のＤＮＡ量を定量することもできる。例えば、第二工程で増幅産物の検出にリアルタイムＰＣＲを用いた場合、スタンダードサンプルを用いて得られる検量線から、被検ＤＮＡの量を定量することができる。検量線は、増幅産物がある一定値に達した時のサイクル数を示すＣｔ値及び初期鋳型量に基づき、作成することができる。
【００３１】
本実施形態の検出方法において、第一工程で被検ＤＮＡから増幅産物が得られ、第二工程でその増幅産物を検出することができた場合、その被検ＤＮＡには、芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌由来のＤＮＡが含まれると判定することができる。
【００３２】
＜芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌のキット＞
本実施形態の芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の検出に用いられるキットは、配列番号７に記載の塩基配列を含む第一のプライマー、及び、配列番号８に記載の塩基配列を含む第二のプライマーからなるプライマーセットと、配列番号２に記載の塩基配列を含むヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする１５塩基以上３０塩基以下の塩基配列を含むプローブと、を含む。
【００３３】
第一のプライマー、第二のプライマー及びプローブは、上述した検出方法で用いたものと同様のものを用いることができる。
【００３４】
本実施形態のキットには、第一のプライマー、第二のプライマー及び配列番号１１に記載の塩基配列を含むプローブ以外に、必要に応じて、その他の試薬等を含んでもよい。その他の試薬としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ）、緩衝液、滅菌水、コントロール用ＤＮＡが挙げられる。
【００３５】
本実施形態のキットに緩衝液が含まれる場合、緩衝液としては、例えば、一般的なＰＣＲ法で使用する緩衝液が挙げられる。
【実施例】
【００３６】
実施例１．芳香族化合物分解性Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング及び塩基配列決定
（材料）
・ＬＢ液体培地：５００ｍＬの超純水に対し、ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ，１．１Ｇ  ＰＥＲ  ＴＡＢＬＥＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌をしたもの。
・ＬＢ寒天培地：ＬＢ  Ａｇａｒ（ＳＩＧＭＡ社製）を１０個の割合で溶解し、高圧蒸気滅菌し、これをプラスチックシャーレに約２５ｍＬずつ分注したもの。
・（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−３−メチルブタン酸（化合物１）の分解性を有する微生物群から抽出した鋳型ＤＮＡ
・クローニング用フォワードプライマー（２７ｆ：配列番号１０）
・クローニング用リバースプライマー（１４９２ｒ：配列番号１１）
・シークエンス解析用プライマー（Ｍ１３Ｆ：配列番号１２、Ｍ１３Ｒ：配列番号１３、３３９Ｆ：配列番号１４、５３６Ｒ：配列番号１５、９０７Ｆ：配列番号１６）
【００３７】
（方法）
２５．０μＬの２×ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  ＦＸ（東洋紡社製）、１０．０μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（２ｍＭ）、１．５μＬのクローニング用フォワードプライマー及びクローニング用リバースプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５８μＬの鋳型ＤＮＡ、１０．４μＬの滅菌水、１．０μＬのＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  ＦＸ、１Ｕ／μＬ、東洋紡社製）を、マイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをＰＣＲ装置に供し、鋳型ＤＮＡの増幅反応を行った。反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）５０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）から（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。ＰＣＲ後の増幅産物を精製し、クローニングに用いた。
【００３８】
増幅産物とＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、クローニングを行った。１μＬのｐＣＲＩＩ−Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ、１μＬの増幅産物、１μＬのＳａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、３μＬの滅菌超純水を加えた反応液を室温で５分間混合後し、これを氷中に保存した。２μＬの上記反応液と５０μＬの大腸菌ＤＨ５α（Ｔａｋａｒａ社製）とを混合し、これを氷中に３０分間静置した。静置後、４２℃で３０秒間インキュベートし、これを氷中に保存した。この反応液にＳＯＣ培地を４５０μＬ加えた後、得られた混合物を３７℃、２００ｒｐｍ、１時間振盪培養した。ＬＢプレート（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）に培養液を塗布し、これを培養（３７℃、２０時間）した。
【００３９】
得られた大腸菌ＤＨ５αのコロニーを１２株ピックアップし、ピックアップされた大腸菌ＤＨ５αを４ｍＬのＬＢ培地（カナマイシン終濃度５０μｇ／ｍＬ）で３７℃、１６時間培養した。得られた大腸菌ＤＨ５αからプラスミド抽出装置（ＱＩＡｃｕｂｅ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてプラスミドを抽出することにより、プラスミド溶液を得た。
【００４０】
得られたプラスミド溶液３．０μＬと、ＥｃｏＲＩを５Ｕ相当量と、１０×Ｈ  ｂｕｆｆｅｒ  １μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１０．０μＬとした混合液を調製した。この混合液を、３７℃にて２時間インキュベーションした。インキュベーションを行った後、ＥｃｏＲＩ処理したサンプルを１．０％アガロースゲル電気泳動に供し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子断片がＥｃｏＲＩにより切り出されていることを確認した。
【００４１】
プラスミド溶液１５０ｎｇ相当量と、シークエンス解析用プライマー（１０μＭ）０．３２μＬと、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）８．０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２０．０μＬとした反応液を調製した。この反応液をＰＣＲ装置に供し、増幅反応を行った。反応は、（１）９６℃、１分間、（２）９６℃、１０秒間、（３）５０℃、５秒間、（４）６０℃、４分間で行い、（２）から（４）の工程は２５サイクル繰り返し行った。得られた反応液をＤＮＡシーケンス解析に供して、化合物１の分解性を有する微生物群から抽出した鋳型ＤＮＡの塩基配列を決定した。決定した塩基配列はＲＤＰ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒを用いて属レベルで由来を決定した。
【００４２】
（結果）
シークエンス解析で決定された１２例中、７例がＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子であることが示された。このときの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を配列番号９に示す。この塩基配列を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌を、以下Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２と示す。この結果から、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は化合物１分解能を持つことが示唆された。
【００４３】
実施例２．Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２の化合物１分解能の測定
（方法）
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２のグリセロールストックを４．０ｍＬのＬＢ液体培地に植菌し、３０℃で２日間前培養した。前培養液４．０ｍＬを１００ｍＬのＬＢ培地に添加し、３０℃で２日間培養後、化合物１（終濃度１００ｐｐｍ）を添加し、更に１日間培養した。
【００４４】
培養終了後、培養液を６，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離し、菌体を回収した。回収した菌体を生理食塩液２０ｍＬで洗浄後、湿菌体濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した。懸濁液１．０ｍＬと２０００ｐｐｍの化合物１を含むリン酸緩衝液１．０ｍＬとをねじ口試験管に添加して、３０℃、２００ｒｐｍにて３日間反応させた。
【００４５】
反応液２００μＬをサンプリングし、遠心分離により沈殿物を除去し、上清を回収した。回収した上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  １００  Ｋ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）に添加し、１４，０００×gで１０分間遠心分離することにより、限外ろ過を行った。得られたろ液１００μＬを、下記の条件による液体クロマトグラフィーを用いて、化合物１の残存量を検出した。
【００４６】
ＨＰＬＣ条件
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ  ＯＤＳ  Ａ−２１１（４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、５μｍ、住化分析センター社製)
移動相：Ａ液０．０１％ＴＦＡ、Ｂ液アセトニトリル
溶出方法：アイソクラティック
溶出条件：Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０分、４０：６０
２０分、４０：６０
流量：１．０ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
検出：２２０ｎｍ
【００４７】
（結果）
湿菌体濃度５０ｍｇ／ｍＬで１０００ｐｐｍの化合物１を分解することが可能であった。このことから、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２は化合物１分解能を有することが示された。
【００４８】
実施例３．プライマー及びプローブの選抜
（材料）
・表１に示すフォワードプライマー
・表２に示すリバースプライマー
・表３に示すプローブ
・鋳型ＤＮＡ（配列番号９の塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド）
【００４９】
【表１】
2016195565.tif 000004
【００５０】
【表２】
2016195565.tif 000005
【００５１】
【表３】
2016195565.tif 000006
【００５２】
（方法）
表１から３に記載のプライマー及びプローブを組み合わせた１９組のプライマー／プローブセットを用いて、配列番号９で示される塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドを鋳型ＤＮＡとしたリアルタイムＰＣＲを行い、目的とする遺伝子断片を検出可能であるか否かを検討した。
【００５３】
１０μＬの２×ＴａｑＭａｎ  ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、０．３６μＬのフォワードプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）及びリバースプライマー（５０ｐｍｏｌ／μＬ）、０．５０μＬのプローブ、６．７８μＬの滅菌水、２．００μＬの鋳型ＤＮＡをマイクロチューブに加え、混合した。マイクロチューブをリアルタイムＰＣＲ装置（ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に供し、鋳型ＤＮＡの増幅反応を行った。反応は、（１）９５℃、２０秒間、（２）９５℃、１秒間、（３）６０℃、２０秒間で行い、（１）から（３）の工程は５０サイクル繰り返し行った。
【００５４】
（結果）
表４に結果を示す。配列番号９で示される塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド(１ｐｇ／μＬ)を検出可能であったものを○、検出不可能であったものを×と記した。１９組のプライマー／プローブセット中、１０組のプライマー／プローブセット（１０から１９番）が、配列番号９で示される塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子含むプラスミド１ｐｇ／μＬを検出することができた。
【００５５】
【表４】
2016195565.tif 000007
【００５６】
実施例４．プライマー／プローブセットを用いた定量性の確認
（材料）
・表４における１２から１５番のプライマー／プローブセット
【００５７】
（方法）
配列番号９で示される塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド（終濃度１、０．１、０．０１、０．００１ｐｇ／μＬ）を鋳型ＤＮＡとしたこと以外は、実施例３に記載の方法で、リアルタイムＰＣＲを行い、検量線のＲ２値を算出した。
【００５８】
（結果）
表５に結果を示す。いずれのプライマー／プローブセットを用いても、Ｒ２値は０．９９以上であり、１２から１５番のプライマー／プローブセットは、１、０．１、０．０１、０．００１ｐｇ／μＬの範囲で定量性が良好であることが示された。
【００５９】
【表５】
2016195565.tif 000008
【００６０】
実施例５．一種類のプラスミドを用いた特異性試験及び定量性試験
（材料）
・表４における１２番のプライマー／プローブセット
・表６に記載の微生物由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド
【００６１】
（方法）
種々の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド（終濃度１ｐｇ／μＬ）を鋳型ＤＮＡとしたこと以外は、実施例３に記載の方法で、リアルタイムＰＣＲを行い、増幅産物を定量した。
【００６２】
（結果）
リアルタイムＰＣＲによる定量の結果を、表６に示す。この結果から、１２番のプライマー／プローブセットは、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドを特異的に検出することが示された。なお、検出限界以下とは、配列番号９で示される塩基配列を有する１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド（１、０．１、０．０１、０．００１ｐｇ／μＬ）を用いて作成した検量線から濃度を算出した結果、０．００１ｐｇ／μＬ以下のものである。
【００６３】
【表６】
2016195565.tif 000009
【００６４】
実施例６．複数種の混合プラスミドを用いた特異性試験及び定量性試験
（材料）
・表４における１２又は１５番のプライマー／プローブセット
・表６に記載の微生物由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド
【００６５】
（方法）
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミド（終濃度１ｐｇ／μＬ、０．１ｐｇ／μＬ、０．０１ｐｇ／μＬ又は０．００１ｐｇ／μＬ）、と種々の細菌由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドの混合物（それぞれ終濃度１ｐｇ／μＬ）とを混合したプラスミド混合液を鋳型ＤＮＡとしたこと以外は、実施例３に記載の方法で、リアルタイムＰＣＲを行い、増幅産物を定量した。
【００６６】
（結果）
リアルタイムＰＣＲによる定量の結果を、表７に示す。この結果から、１２又は１５番のプライマー／プローブセットは、複数種のプラスミドが存在する系においても、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２由来の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドを特異的に検出及び定量できることが示された。
【００６７】
【表７】
2016195565.tif 000010
【００６８】
実施例７．一種類のゲノムＤＮＡを用いた特異性試験
（材料）
・表４における１２番のプライマー／プローブセット
・表８に記載の微生物由来ゲノムＤＮＡ
【００６９】
（方法）
種々の細菌由来のゲノムＤＮＡ（終濃度１ｎｇ／μＬ）を鋳型ＤＮＡとしたこと以外は、実施例３に記載の方法で、リアルタイムＰＣＲを行った。
【００７０】
（結果）
表８には、試験に用いたゲノムＤＮＡの由来となる細菌と、それらのゲノムＤＮＡの検出結果を示す。１２番のプライマー／プローブセットによれば、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２のゲノムＤＮＡを０．００１ｎｇ／μＬの濃度まで検出することができた。一方で、それ以外の細菌由来のゲノムＤＮＡは検出限界（０．００１ｎｇ／μＬ）以下であった。この結果から、１２番のプライマー／プローブセットは、ゲノムＤＮＡを用いたとしても、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を特異的に検出することができることが示された。
【００７１】
【表８】
2016195565.tif 000011
【００７２】
実施例８．複数種のゲノムＤＮＡを用いた特異性試験及び定量性試験
（材料）
・表４における１２番のプライマー／プローブセット
・表９に記載の微生物由来ゲノムＤＮＡ
【００７３】
【表９】
2016195565.tif 000012
【００７４】
（方法）
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２由来のゲノムＤＮＡ（終濃度１００ｐｇ／μＬ、１０ｐｇ／μＬ、１ｐｇ／μＬ又は０．１ｐｇ／μＬ）、と種々の細菌由来のゲノムＤＮＡの混合物（それぞれ終濃度１００ｐｇ／μＬ）とを混合したゲノムＤＮＡ混合液を鋳型ＤＮＡとしたこと以外は、実施例３に記載の方法で、リアルタイムＰＣＲを行い、増幅産物を定量した。
【００７５】
（結果）
リアルタイムＰＣＲによる定量の結果を、表１０に示す。１２番のプライマー／プローブセットは、複数種のゲノムＤＮＡが存在する系においても、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０２２由来のゲノムＤＮＡを特異的に検出及び定量できることが示された。
【００７６】
【表１０】
2016195565.tif 000013
【配列表】
2016195565000001.app