(57)【要約】【課題】  特発性間質性肺炎のうち、非特異性間質性肺炎や特発性器質化肺炎と特発性肺線維症を鑑別するための新たな方法を提供すること。【解決手段】  鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のマクロファージのサブタイプ（Ｍ１型、Ｍ２型）の存在量や、血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるマクロファージのサブタイプが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量を指標として、非特異性間質性肺炎や特発性器質化肺炎と特発性肺線維症を鑑別することによる。【選択図】  図２
2016218059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ２型マクロファージの存在量を指標にすることによって非特異性間質性肺炎および／または特発性器質化肺炎と特発性肺線維症を鑑別することによる特発性間質性肺炎の病型を鑑別する方法。
【請求項２】
鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ１型マクロファージの存在量とＭ２型マクロファージの存在量の比率を指標にすることによって非特異性間質性肺炎および／または特発性器質化肺炎と特発性肺線維症を鑑別することによる特発性間質性肺炎の病型を鑑別する方法。
【請求項３】
Ｍ２型マクロファージがＣＤ１６３および／またはＣＣＲ２に陽性の細胞表面抗原特性を有する請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
Ｍ１型マクロファージがＭＡＣ３８７に陽性の細胞表面抗原特性を有する請求項２記載の方法。
【請求項５】
特発性間質性肺炎の病型を鑑別するためのマーカとしてのＭ２型マクロファージの使用。
【請求項６】
Ｍ２型マクロファージを認識する抗体を少なくとも含む特発性間質性肺炎の病型を鑑別するためのキット。
【請求項７】
鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量を指標にすることによって非特異性間質性肺炎と特発性肺線維症を鑑別することによる特発性間質性肺炎の病型を鑑別する方法。
【請求項８】
鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率を指標にすることによって非特異性間質性肺炎と特発性肺線維症を鑑別することによる特発性間質性肺炎の病型を鑑別する方法。
【請求項９】
Ｍ１型マクロファージが有する細胞表面抗原がＭＡＣ３８７である請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
Ｍ２型マクロファージが有する細胞表面抗原がＣＤ１６３である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
血液試料が末梢血である請求項７乃至１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特発性間質性肺炎の病型の鑑別方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特発性間質性肺炎（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ：ＩＩＰｓ）は、９つの病型からなるが、そのうち、特発性肺線維症（ＩＰＦ／ＵＩＰ）、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、特発性器質化肺炎（ＣＯＰ）の頻度が高く、ＮＳＩＰとＣＯＰはステロイドなどを用いた抗炎症治療に比較的よく反応して予後良好であるのに対し、ＩＰＦ／ＵＩＰは抗炎症治療に反応せず予後不良である。従って、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することは、治療法の選定や予後予測を行うために極めて重要である。ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別は、現在のところ、病理医による病理組織学的診断に基づいて行われているが、病理医によって判断が異なることがしばしばあることから、病理組織学的診断にかわる方法、あるいは病理組織学的診断を補助する方法が求められている。しかしながら、ＩＰＦ／ＵＩＰの病態の進行度を評価する方法については、例えば特許文献１において肺サーファクタント蛋白Ｃの前駆蛋白質を指標とする方法が提案されているものの、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別するための新たな方法の提案はこれまでのところ存在しない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１０２１３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別するための新たな方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、肺由来の試料中のマクロファージのサブタイプ（Ｍ１型、Ｍ２型）の存在量や、血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるマクロファージのサブタイプが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量を指標として、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することができることを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明のＩＩＰｓの病型を鑑別する方法は、請求項１記載の通り、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ２型マクロファージの存在量を指標にすることによってＮＳＩＰおよび／またはＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することによる。
また、本発明のまた別のＩＩＰｓの病型を鑑別する方法は、請求項２記載の通り、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ１型マクロファージの存在量とＭ２型マクロファージの存在量の比率を指標にすることによってＮＳＩＰおよび／またはＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することによる。
また、請求項３記載の方法は、請求項１または２記載の方法において、Ｍ２型マクロファージがＣＤ１６３および／またはＣＣＲ２に陽性の細胞表面抗原特性を有する。
また、請求項４記載の方法は、請求項２記載の方法において、Ｍ１型マクロファージがＭＡＣ３８７に陽性の細胞表面抗原特性を有する。
また、本発明は、請求項５記載の通り、ＩＩＰｓの病型を鑑別するためのマーカとしてのＭ２型マクロファージの使用に関する。
また、本発明は、請求項６記載の通り、Ｍ２型マクロファージを認識する抗体を少なくとも含むＩＩＰｓの病型を鑑別するためのキットである。
また、本発明のまた別のＩＩＰｓの病型を鑑別する方法は、請求項７記載の通り、鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量を指標にすることによってＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することによる。
また、本発明のまた別のＩＩＰｓの病型を鑑別する方法は、請求項８記載の通り、鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率を指標にすることによってＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することによる。
また、請求項９記載の方法は、請求項７または８記載の方法において、Ｍ１型マクロファージが有する細胞表面抗原がＭＡＣ３８７である。
また、請求項１０記載の方法は、請求項８記載の方法において、Ｍ２型マクロファージが有する細胞表面抗原がＣＤ１６３である。
また、請求項１１記載の方法は、請求項７乃至１０のいずれかに記載の方法において、血液試料が末梢血である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別するための新たな方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１における、ＭＡＣ３８７に陽性のＭ１型マクロファージの存在量を指標にした、ＮＳＩＰ、ＣＯＰ、ＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果である。
【図２】同、ＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量を指標にした、ＮＳＩＰ、ＣＯＰ、ＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果である。
【図３】同、ＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量を指標にしたＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果に基づくＲＯＣ曲線である。
【図４】同、ＭＡＣ３８７に陽性のＭ１型マクロファージの存在量とＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量の比率（ＭＡＣ３８７に陽性のＭ１型マクロファージの存在量／ＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量）を指標にした、ＮＳＩＰ、ＣＯＰ、ＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果である。
【図５】実施例３における、ＮＳＩＰ患者の単球細胞のＦＡＣＳ展開図の代表的一例である。
【図６】同、ＣＤ１４強陽性単球の集団におけるＣＤ１６３陽性細胞数を指標にしたＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果である。
【図７】同、ＣＤ１４強陽性単球の集団におけるＭＡＣ３８７陽性細胞数を指標にしたＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果である。
【図８】同、ＣＤ１４強陽性単球の集団におけるＣＤ１６３陽性細胞数とＭＡＣ３８７陽性細胞数の比率（ＭＡＣ３８７陽性細胞数／ＣＤ１６３陽性細胞数）を指標にしたＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明のＩＩＰｓの病型を鑑別する方法は、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料を用いる方法と、血液試料を用いる方法に大別される。以下、それぞれの方法について詳述する。
【００１０】
（１）鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料を用いて行う方法
この方法には、マーカとしてＭ２型マクロファージを利用し、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ２型マクロファージの存在量を指標にすることによってＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法と、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ２型マクロファージの存在量とＭ１型マクロファージの存在量の比率を指標にすることによってＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法がある。
【００１１】
この方法において、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料としては、例えば対象者から手術やバイオプシーによって取り出された肺組織が挙げられる。その調製は病理組織学的検査を行う際などにおいて採用される自体公知の方法によって行うことができる。また、肺由来の試料は、肺洗浄液などであってもよい。
【００１２】
鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ２型マクロファージの存在量を指標にすることによってＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法の具体例としては、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるＭ２型マクロファージの発現量のそれぞれの基準値を予め設定しておき（それぞれの基準値としては例えば病理組織学的診断によって確定されたそれぞれの集団のＭ２型マクロファージの存在量の平均値が挙げられる）、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ２型マクロファージの存在量を基準値と対比し、対象者の存在量がいずれの基準値に該当するか、あるいは近似するかを判定することによる方法が挙げられる。また、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるそれぞれの基準値から両者の境界値を設定し、境界値よりも多い時はＮＳＩＰやＣＯＰであるかその蓋然性が高いと判定し、境界値よりも少ない時はＩＰＦ／ＵＩＰであるかその蓋然性が高いと判定することによって、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することもできる。
【００１３】
また、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ１型マクロファージの存在量とＭ２型マクロファージの存在量の比率を指標にすることによってＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法の具体例としては、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるＭ１型マクロファージの存在量とＭ２型マクロファージの存在量の比率のそれぞれの基準値を予め設定しておき（それぞれの基準値としては例えば病理組織学的診断によって確定されたそれぞれの集団のＭ１型マクロファージの存在量とＭ２型マクロファージの存在量の比率の平均値が挙げられる）、鑑別を必要とする対象者の肺由来の試料中のＭ１型マクロファージの存在量とＭ２型マクロファージの存在量の比率を基準値と対比し、対象者の比率がいずれの基準値に該当するか、あるいは近似するかを判定することによる方法が挙げられる。また、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるそれぞれの基準値から両者の境界値を設定し、境界値よりも多いか少ないかによってＮＳＩＰやＣＯＰかＩＰＦ／ＵＩＰを判定することもできる。例えばＭ１型マクロファージの存在量とＭ２型マクロファージの存在量の比率を、Ｍ１型マクロファージの存在量／Ｍ２型マクロファージの存在量として算出する場合、境界値よりも多い時はＩＰＦ／ＵＩＰであるかその蓋然性が高いと判定し、境界値よりも少ない時はＮＳＩＰやＣＯＰであるかその蓋然性が高いと判定することによって、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することができる。
【００１４】
この方法において、存在量の測定対象とするＭ２型マクロファージは、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＣＲ２などに陽性の細胞表面抗原特性を有するものであってよいが、なかでもＣＤ１６３に陽性のものが好適である。Ｍ１型マクロファージの存在量を測定する場合、測定対象とするＭ１型マクロファージは、ＭＡＣ３８７、ＮＯＳ２、ＴＬＲ４、ＣＣＲ７などに陽性の細胞表面抗原特性を有するものであってよいが、なかでもＭＡＣ３８７に陽性のものが好適である。
【００１５】
肺由来の試料中のＭ２型マクロファージの存在量の測定は、例えば抗原抗体反応を利用する免疫学的手法、具体的には、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法、ラテックス凝集比濁法、フローサイトメトリー法などにより、それぞれの方法の標準的なプロトコルに従って行うことができる。こうした方法に用いる抗体は、Ｍ２型マクロファージを特異的に認識する抗体が好適である。抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体や公知の抗体であってもよいし、自家作製した抗体であってもよい。Ｍ２型マクロファージを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体としては、例えばＣＤ１６３を特異的に認識するモノクローナル抗体が挙げられる（中でもＣＤ１６３の第１ドメインを認識するものが鑑別精度が優れる点において適しているようである）。抗体は、容易かつ簡便にＩＩＰｓの病型を鑑別することができるように、洗浄液などとともにキット化してもよい。肺由来の試料中のＭ１型マクロファージの存在量を測定する場合も同様であり、例えばＭ１型マクロファージを特異的に認識する抗体を用いて抗原抗体反応を利用して測定すればよい。Ｍ１型マクロファージを特異的に認識する抗体は、Ｍ２型マクロファージを特異的に認識する抗体とともに、キット化することができる。
【００１６】
（２）鑑別を必要とする対象者の血液試料を用いて行う方法
この方法には、鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量を指標にすることによってＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法と、鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率を指標にすることによってＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法がある。
【００１７】
この方法において、鑑別を必要とする対象者の血液試料としては、ＣＤ１４陽性単球が含まれるものであればどのようなものであってもよく、通常の血液検査のために採血される循環血、例えば末梢血であってよい。この方法では、鑑別を必要とする対象者の試料を取得するための外科的措置を必要としないので、対象者に対して多大な身体的や金銭的や時間的な負荷を負わせることがない。
【００１８】
鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量を指標にすることによってＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法の具体例としては、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるＭ１型マクロファージの発現量のそれぞれの基準値を予め設定しておき（それぞれの基準値としては例えば病理組織学的診断によって確定されたそれぞれの集団のＭ１型マクロファージの存在量の平均値が挙げられる）、鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＭ１型マクロファージの存在量を基準値と対比し、対象者の存在量がいずれの基準値に該当するか、あるいは近似するかを判定することによる方法が挙げられる。また、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるそれぞれの基準値から両者の境界値を設定し、境界値よりも多い時はＩＰＦ／ＵＩＰであるかその蓋然性が高いと判定し、境界値よりも少ない時はＮＳＩＰであるかその蓋然性が高いと判定することによって、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することもできる。
【００１９】
また、鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率を指標にすることによってＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別する方法の具体例としては、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるＣＤ１４陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率のそれぞれの基準値を予め設定しておき（それぞれの基準値としては例えば病理組織学的診断によって確定されたそれぞれの集団のＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率の平均値が挙げられる）、鑑別を必要とする対象者の血液試料中のＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率を基準値と対比し、対象者の比率がいずれの基準値に該当するか、あるいは近似するかを判定することによる方法が挙げられる。また、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰにおけるそれぞれの基準値から両者の境界値を設定し、境界値よりも多いか少ないかによってＮＳＩＰかＩＰＦ／ＵＩＰを判定することもできる。例えばＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量とＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の比率を、Ｍ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量／Ｍ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量として算出する場合、境界値よりも多い時はＩＰＦ／ＵＩＰであるかその蓋然性が高いと判定し、境界値よりも少ない時はＮＳＩＰであるかその蓋然性が高いと判定することによって、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することができる。
【００２０】
この方法において、存在量の測定対象とするＣＤ１４陽性単球の集団における細胞が陽性を示すＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原は、ＭＡＣ３８７、ＮＯＳ２、ＴＬＲ４、ＣＣＲ７などであってよいが、なかでもＭＡＣ３８７が好適である。Ｍ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量を測定する場合、測定対象とする細胞が陽性を示すＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原は、ＣＤ３６、ＣＤ１６３、ＣＤ２０６、ＣＣＲ２などであってよいが、なかでもＣＤ１６３が好適である。
【００２１】
血液試料中のＣＤ１４陽性単球の集団は、例えば蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法により、標準的なプロトコルに従って選択することができる。ゲーティングによってＣＤ１４陰性単球の集団から分別したＣＤ１４陽性単球の集団から、さらなるゲーティングによってＣＤ１４強陽性単球の集団を選択してもよい。選択された集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の測定も、例えば蛍光抗体を用いたフローサイトメトリー法により、標準的なプロトコルに従って行うことができる。Ｍ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性に陽性の細胞の存在量の測定も、同様の方法で行うことができる。
【実施例】
【００２２】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２３】
実施例１：
学校法人岩手医科大学などにおいて診断されたＩＩＰｓのうち、ＩＰＦ／ＵＩＰ１９例、ＮＳＩＰ１７例、ＣＯＰ８例、肺癌切除肺健常部１２例について、パラフィン包埋組織ブロックから得られた薄切された組織片を試料として用いて以下の実験を行った。
【００２４】
免疫染色を常法に従って次の方法で行った。まず、未染標本に対し、一次抗体として、Ｍ１型マクロファージが有する細胞表面抗原であるＭＡＣ３８７を特異的に認識するモノクローナル抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃｈ，×３００）と、Ｍ２型マクロファージが有する細胞表面抗原であるＣＤ１６３を特異的に認識するモノクローナル抗体（第１ドメインを認識するクローン５Ｃ６由来のもの、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，×２００）のそれぞれを４℃で一晩反応させた。その後、デキストランポリマーとペルオキシダーゼを用いる増感法試薬（ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｄｕａｌ  Ｌｉｎｋ  ＨＲＰ：Ｄａｋｏ）を用いて室温で３０分間二次抗体反応を行った。
【００２５】
免疫染色の数値化とその統計解析を次の方法で行った。ＩＰＦ／ＵＩＰは線維化の程度が局所によってかなりばらつきがある。従って、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰの比較可能性を考慮し、Ａｓｈｃｒｏｆｔによる線維化ｇｒａｄｅの０−３を評価の対象として、２００倍視野で無作為に抽出した２０カ所の各視野におけるＣＤ１６３とＭＡＣ３８７のそれぞれに対する陽性細胞数をカウントした。この際、肺の縮みによる計測上の偏りを除外するために、計測対象領域の間質組織の密度をポイントカウンティング法によって測定し（ＡＡ（ｉｎｔ））、各陽性細胞数（ＮＡ（ｃｅｌｌ））の間質密度による補正を行った。それぞれの病型において間質密度で補正した陽性細胞数（ＮＡ（ｃｅｌｌ）／ＡＡ（ｉｎｔ））を計測し、ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡによる多群間比較を行った上でＴｕｋｅｙ’ｓ  ｔｅｓｔによって各群間比較を行い、ｐ＜０．０５を有意差「有」とみなした。その結果、図１から明らかなように、ＭＡＣ３８７に陽性のＭ１型マクロファージの発現量は、ＩＰＦ／ＵＩＰ、ＮＳＩＰ、ＣＯＰのいずれも、健常肺（ＮＴＣ）に比較して有意に多かった（＊ｐ＜０．０５，＊＊＊ｐ＜０．００１）。他方、図２から明らかなように、ＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの発現量は、ＩＰＦ／ＵＩＰは健常肺とさほど異ならなかったが、ＮＳＩＰとＣＯＰはいずれも、ＩＰＦ／ＵＩＰと健常肺に比較して有意に多かった（＊＊＊ｐ＜０．００１）。この定量結果から、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別精度を、Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ（ＲＯＣ曲線）により解析したところ、ＣＤ１６３陽性細胞数のｃｕｔｏｆｆ＝８．０で、感度８６．９％、特異度８３．３％、ＡＵＣ＝０．９６４であり、鑑別精度が高いことが裏付けられた（図３）。よって、ＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量を指標にすることで、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することができることがわかった。また、図４から明らかなように、ＭＡＣ３８７に陽性のＭ１型マクロファージの存在量とＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量の比率（ＭＡＣ３８７に陽性のＭ１型マクロファージの存在量／ＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量）を算出すると、ＮＳＩＰとＣＯＰはいずれも、健常肺とさほど異ならなかったが、ＩＰＦ／ＵＩＰは、健常肺、ＮＳＩＰ、ＣＯＰに比較して有意に高かった（＊ｐ＜０．０５）。以上の結果から、この比率を指標にすることによってもＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することができることがわかった。さらに、ＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量を指標にするとともに、ＭＡＣ３８７に陽性のＭ１型マクロファージの存在量とＣＤ１６３に陽性のＭ２型マクロファージの存在量の比率を指標にすることによって、ＩＰＦ／ＵＩＰと健常肺を鑑別することもできることがわかった。
【００２６】
実施例２：
ＣＣＲ２に陽性のＭ２型マクロファージの存在量を指標とすること以外は実施例１と同様の実験を行ったところ、実施例１における結果と同様の傾向が認められた。
【００２７】
実施例３：
学校法人岩手医科大学において診断されたＩＰＦ／ＵＩＰ患者５名とＮＳＩＰ患者４名、および健常人２名の正中静脈からの採血で得た末梢血を試料として用いて以下の実験を行った。
【００２８】
それぞれの末梢血サンプルを、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで倍に希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ  １．０７３（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた３０分間の×３００ｇの比重遠心法によって多核球を分別し、単球層の細胞集団をピペットにて抽出して０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した。５．０×１０５個の単球細胞をｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｔｕｂｅ中で１００μＬの１％ＢＳＡ−ＰＢＳに懸濁させた。ヒトＦｃリコンビナントブロッキング試薬（ＢＤ）をｔｕｂｅに入れて１０分間定温放置し、一次抗体の単球Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒへの非特異的結合を阻害した後、ＣＤ１４−ＰＥ（ｃｌｏｎｅ：ＨＣＤ１４）、ＣＤ１６３−ＡＰＣ（ＧＨＩ／６１）、ＭＡＣ３８７−ＦＩＴＣ（ＭＡＣ３８７）の各一次抗体（いずれもＢＤ）を用いて３０分間遮光定温放置し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄してから、ＦＡＣＳ（Ｃａｎｔｏ  ＩＩ，ＢＤ）にて解析を行った。なお、陰性対照として各一次抗体のｉｓｏｔｙｐｅを用いた。ゲーティングによって選択したＣＤ１４強陽性単球の集団において末梢血単球数との懸け合わせでＣＤ１６３陽性細胞数とＭＡＣ３８７陽性細胞数を算出し、グループ間の比較を行った。また、ＣＤ１６３陽性細胞数とＭＡＣ３８７陽性細胞数の比率（ＭＡＣ３８７陽性細胞数／ＣＤ１６３陽性細胞数）を算出し、グループ間の比較を行った。末梢血サンプルの取得からＦＡＣＳによる解析までの過程は８時間以内に行った。図５にＮＳＩＰ患者の単球細胞のＦＡＣＳ展開図の代表的一例を示す。また、図６にＣＤ１４強陽性単球の集団におけるＣＤ１６３陽性細胞数を指標にしたＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果、図７にＣＤ１４強陽性単球の集団におけるＭＡＣ３８７陽性細胞数を指標にしたＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果、図８にＣＤ１４強陽性単球の集団におけるＣＤ１６３陽性細胞数とＭＡＣ３８７陽性細胞数の比率（ＭＡＣ３８７陽性細胞数／ＣＤ１６３陽性細胞数）を指標にしたＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰの鑑別結果をそれぞれ示す。図６から明らかなように、Ｍ２型マクロファージが有する細胞表面抗原であるＣＤ１６３に陽性の細胞数は、ＩＰＦ／ＵＩＰ、ＮＳＩＰいずれも、健常人に比較して多く、さほど異ならなかった。他方、図７から明らかなように、Ｍ１型マクロファージが有する細胞表面抗原であるＭＡＣ３８７に陽性の細胞数は、ＩＰＦ／ＵＩＰは健常人に比較して多かったが、ＮＳＩＰは健常人に比較して少なかった。よって、ＣＤ１４強陽性単球の集団におけるＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原であるＭＡＣ３８７に陽性の細胞数を指標にすることで、ＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することができることがわかった。また、図８から明らかなように、ＣＤ１６３陽性細胞数とＭＡＣ３８７陽性細胞数の比率（ＭＡＣ３８７陽性細胞数／ＣＤ１６３陽性細胞数）を算出すると、ＩＰＦ／ＵＩＰは健常人に比較して多かったが、ＮＳＩＰは健常人に比較して少なかった。以上の結果から、この比率を指標にすることによってもＮＳＩＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別することができることがわかった。
【００２９】
まとめ：
実施例１〜３の結果によれば、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別するに際しての、マクロファージのサブタイプ（Ｍ１型、Ｍ２型）が有する細胞表面抗原特性の有用性は、組織（成熟）マクロファージと循環血中単球で逆である、即ち、組織（成熟）マクロファージにおいてはＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性が有用であってＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性が有用でないのに対し、循環血中単球においてはＭ１型マクロファージが有する細胞表面抗原特性が有用であってＭ２型マクロファージが有する細胞表面抗原特性が有用でない。しかしながら、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰの間での両者の比率の違いの傾向は、組織（成熟）マクロファージでも循環血中単球でも同じである。以上の知見はまったく予測し得なかった非常に興味深いものである。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、ＮＳＩＰやＣＯＰとＩＰＦ／ＵＩＰを鑑別するための新たな方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図６】
2016218059.tif 000003
【図７】
2016218059.tif 000004
【図８】
2016218059.tif 000005
【図１】
2016218059.tif 000006
【図２】
2016218059.tif 000007
【図３】
2016218059.tif 000008
【図４】
2016218059.tif 000009
【図５】
2016218059.tif 000010