(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
その表面上の貫膜ＬＡＧ−３タンパク質をコードしているＤＮＡを含む、宿主の免疫系による移植片拒絶反応からの防御を誘導することができる、遺伝子操作された細胞。
【請求項２】
ＬＡＧ−３タンパク質をコードしているＤＮＡが外因性であり、そしてＤＮＡが細胞のゲノムの中に安定に組込まれている請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
ＬＡＧ−３タンパク質をコードしているＤＮＡが内因性であり、その発現が、相同的組換えによる調節配列および／または増幅性遺伝子の標的挿入によって活性化されているかまたは修飾されている請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
移植される組織または器官の一部分である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項５】
遺伝子治療宿主細胞である請求項１〜３のいずれかに記載の細胞。
【請求項６】
遺伝子治療が体細胞または「ex vivo」遺伝子治療である請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
ＩＬ１０、ＴＧＦβまたはＦａｓリガンドなどの追加の免疫抑制剤を更に含む請求項１〜６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を更に含み、ｔｋ−ガンシクロビル自殺系に対して感受性である請求項１〜７のいずれかに記載の細胞。
【請求項９】
トランスジェニック動物に由来する請求項１〜８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０】
筋芽細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、胎児性幹細胞、胎児肝細胞、臍静脈内皮細胞またはＣＨＯ細胞から選択される請求項１〜９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１】
目的の治療的物質をコードしている外因性ＤＮＡを更に含む請求項５〜１０のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２】
目的の内因性遺伝子の発現を活性化するかまたは修飾するための調節配列およびまたは増幅性遺伝子をコードしている外因性ＤＮＡを更に含む請求項５または１０のいずれかに記載の細胞。
【請求項１３】
宿主の免疫系による移植片拒絶反応からの防御を誘導するために使用される、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１４】
移植される細胞、組織または器官と混合されることにより、宿主の免疫系による移植片拒絶反応からの防御を誘導するために使用される、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５】
その表面上の貫膜ＬＡＧ−３タンパク質をコードしているＤＮＡを含む、薬剤として用いるための遺伝子操作された請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、移植された器官、組織または細胞の移植片拒絶反応を防止する方法、特に、宿主中に移植された場合にＬＡＧ−３タンパク質を発現するように細胞種類を遺伝子操作することを含むこのような方法に関する。更に詳しくは、本発明は、ＬＡＧ−３タンパク質を表面上で発現する普遍的遺伝子治療宿主細胞の生産に関する。
背景技術の説明
リンパ球活性化遺伝子（ＬＡＧ−３）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ヒト活性Ｔ（ＣＤ４+およびＣＤ８+両方）およびＮＫ細胞中で選択的に転写される（Triebelら，1990年）。配列データ、比較されたエクソン／イントロン体制および染色体局在化は、ＬＡＧ−３がＣＤ４と近縁であることを示した（Baixerasら，1992年）。ＬＡＧ−３とＣＤ４と間の近縁関係は、両者が同じリガンド、すなわち、ＭＨＣクラスII分子を共有しているという証拠によって更に強まった（Baixerasら，1992年）。しかしながら、ＣＤ４とは対照的に、ＬＡＧ−３は、ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１２０を結合しない（Baixerasら，1992年）。in vivoにおいて、ＬＡＧ−３発現は、脾臓、粘膜結合リンパ系組織または正常リンパ節などの主要なリンパ系器官でも見出されなかった。しかしながら、それは、炎症を起こした扁桃、または小胞過形成のあるリンパ節で容易に検出され、in vivoでも活性化後にＬＡＧ−３が発現されるという考えが支持された（Huardら，1994A）。抗ＬＡＧ−３単クローン性抗体（ｍＡｂ）の存在下でのＴ細胞クローンの抗原特異的刺激は、増加したチミジン取込み、活性化マーカーＣＤ２５のより高い発現および促進されたサイトカイン生産をもたらした（Huardら，1994B）。
したがって、ＬＡＧ−３の可溶性組換え体の添加は、抗原特異的Ｔ細胞増殖を阻害し、ＣＤ４+Ｔリンパ球活性化におけるＬＡＧ−３の調節的役割（Huard，1996年）および進行中の免疫応答を消滅させる場合のその関与が示唆された。最近、ＬＡＧ−３は、ＮＫ細胞の共受容体としても作用し、先天性免疫系によって制御された腫瘍細胞致死の様々な機作を規定していることが示された（Miyazakiら，1996年）。
外来（同種異系または異種）タンパク質または細胞または器官に対するＴ細胞応答を開始させる機序は、かなり充分に理解されている。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、（外科的移植によって誘導されることがある）炎症または損傷の部分に引付けられる。末梢におけるＴ細胞のレパートリーは、病原体の形跡または外来（同種異系または異種）組織の存在に関して組織を絶えず監視することである。これら警告シグナルのいずれかが認識されると、ＡＰＣはそのタンパク質を取込み、それを消化し、そしてそれを宿主免疫系へ提示する。
同種異系または同系腫瘍細胞は、腫瘍に対して局所アネルギーをもたらすウイルスＩＬ−１０を発現するように遺伝子操作された。このような処理は、遠位の形質導入されていない腫瘍の拒絶に影響を与えなかった（Suzukiら，1995年）。局所に与えられたＩＬ−１０は、移植された細胞に対して反応性のＴ細胞レパートリーを、細胞溶解性ではなく防御的でさえありうるＴｈ２表現型に変えると考えられる。
Ｆａｓリガンドを自然に発現する細胞は、免疫抑制を用いることなく同種異系または異種の障壁を越えて移植されてきた。宿主Ｔ細胞による植込部位の監視は、Ｆａｓリガンドと接触した場合、それらの致死を引き起こす（Bellgrauら，1995年）。更に、ランゲルハンス島同種異系移植片の拒絶は、Ｆａｓリガンドを発現するように遺伝子操作された同系筋芽細胞の同時移植によって妨げられた（Lauら，1996年）。
免疫系は、異物、罹病組織または炎症を起こした組織を速やかに識別し、そしてそれを速やかに破壊するように充分に用意されている。これが、常に、組織、器官および細胞移植並びに遺伝治療に対する主な障壁であった。主な問題は、概して、慢性免疫抑制、被包（encapsulation）またはイムノアイソレーション（immunoisolation）に関係している。慢性免疫抑制の望ましくない副作用には、日和見感染および腫瘍形成に対する増加した感受性が含まれる。
連続的な免疫抑制の不存在下における移植組織の長期受容への願いは、ヒト用薬剤の長年の目標である。
本明細書中のどの文書の引用も、このような文書が適切な先行技術であると承認するものではないし、または本出願のいずれかの請求の範囲の特許可能性に対する材料と考えるものではない。いずれかの文書の内容または日付に関するどんな記述も、出願時に出願人に入手可能な情報に基づいており、このような記述の正確さに関して承認するものではない。
発明の要旨
ここで、ＬＡＧ−３タンパク質を表面上で発現する細胞の移植は、宿主免疫系による移植片拒絶反応から防御することが発見された。
本発明は、したがって、移植される組織または器官の一部分でありうる遺伝子操作された細胞であって、その表面上の貫膜ＬＡＧ−３タンパク質をコードしているＤＮＡを含み、宿主免疫系による移植片拒絶反応から防御し、そのＤＮＡがゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである上記細胞を提供する。このＤＮＡは、外因性でありうるし、または本発明の具体的な実施態様において内因性ＤＮＡでありうるし、その発現は、相同的組換えによる調節配列および／または増幅性遺伝子の標的挿入によって活性化されるしまたは修飾される。ＬＡＧ−３タンパク質は、ＬＡＧ−３に対して向けられた抗体によって認識されるタンパク質である。
細胞が、移植される組織または器官の一部分である場合、ＬＡＧ−３  ＤＮＡのトランスフェクションは、移植される組織または器官上で直接的に行うことができる。
特に、その細胞は、例えば、体細胞または「ex vivo」遺伝子治療のいずれの種類にも適した普遍的遺伝子治療宿主細胞である。
具体的な実施態様において、遺伝子治療宿主細胞は、目的の治療的物質をコードしている外因性ＤＮＡを更に含み、そしてその遺伝子操作されている細胞を治療的物質として用いる。本明細書中で用いられる「治療的」という用語には、治療および／または予防が含まれる。
もう一つの実施態様において、目的の治療的物質をコードしている遺伝子は、細胞のゲノム中に存在し、そしてその細胞は、目的の内因性遺伝子の発現を活性化するまたは修飾するための調節配列または増幅性遺伝子をコードしている外因性ＤＮＡを更に含む。
本発明の遺伝子操作された細胞は、いずれにせよ、目的の治療的ＤＮＡを含有する他の遺伝子治療宿主細胞との混合物で用いられる外因性ＬＡＧ−３  ＤＮＡのみを含有しうる。
本発明の細胞は、好ましくは、筋芽細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、胎児性幹細胞、胎児肝細胞、臍静脈内皮細胞およびＣＨＯ細胞から選択される。
トランスジェニック動物に由来する上のような細胞も、本発明の範囲内である。
本発明のもう一つの目的は、宿主の免疫系による移植片拒絶反応から防御する薬剤の製造における、細胞の表面上で発現されたムテインおよびそれらの変異体を含めた貫膜ＬＡＧ−３タンパク質の使用である。
更に、本発明は、宿主の免疫系による移植片拒絶反応から防御する薬剤の製造における、細胞の表面上で発現された貫膜ＬＡＧ−３タンパク質をコードしているＤＮＡを含む細胞の使用を提供する。
宿主の免疫系による移植片拒絶反応から防御するための、移植される細胞、組織または器官と混合される薬剤の製造における、ＬＡＧ−３タンパク質を表面上で発現するこの細胞の使用も、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
図１  ＬＡＧ−３−ＣＨＯまたはＬＨ−ＣＨＯ細胞で感作されたマウスからの脾臓細胞のＬＨ−ＣＨＯ細胞に対する細胞傷害活性。説明文中で示されたように感作された５匹のマウスからの平均値（±ＳＤ）。２匹の非感作マウスも評価した。
図２  ＬＡＧ−３−ＣＨＯまたはＬＨ−ＣＨＯ細胞で感作されたマウスからの脾臓細胞のＬＡＧ−３−ＣＨＯ細胞に対する細胞傷害活性。説明文中で示されたように感作された５匹のマウスからの平均値（±ＳＤ）。２匹の非感作マウスも評価した。
図３  Ｄα哺乳動物発現ベクターの地図。
用いられた略語：ＤＨＦＲ，デヒドロ葉酸転写単位（Subraimaniら，1981年）；ｐＭＬ，ｐＢＲ３２２の誘導体（LuskyおよびBotchan，1981年）；ｈＡＩＶＳＡ，ヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのイントロンＡからのフラグメント（FiddesおよびGoodman，1981年）；ＭＭＴ−１，マウスメタロチオネイン１のプロモーター（HamerおよびWalling，1982年）。
発明の詳細な説明
心、腎、肝、肺または膵臓不全の結果として、毎年何十万人もの人々が亡くなっている。唯一最も有効な療法は移植である。
細胞、組織または器官の移植に関連した療法は、植込まれた細胞、組織または器官に相対して、宿主において全身免疫防御状態を引き起こす。特に、同種異系移植、異種移植および遺伝子治療において、宿主の免疫系による拒絶反応に対する移植片特異的防御を確立することが望まれる。更に、腫瘍組織に対する寛容性を阻害するかまたはさもなければ宿主の免疫系に腫瘍組織を攻撃させることが望まれる。
したがって、本発明は、貫膜ＬＡＧ−３タンパク質を発現する細胞または組織の移植が、宿主の免疫系による移植片拒絶反応から防御するという知見を用いることに関して上に記載された方法全てに関する。
本発明は、新規に発見された遺伝子、および活性Ｔ細胞および活性ＮＫ細胞上で通常発現されるタンパク質ＬＡＧ−３を用いる。
本明細書中で用いられる「貫膜ＬＡＧ−３タンパク質」という定義は、いずれも細胞の表面上で発現されるＬＡＧ−３の細胞質外ドメイン、その塩、機能性誘導体、前駆体および活性部分並びにその活性突然変異体およびその活性変異体を含有するいずれの貫膜タンパク質も意味する。
その定義は、自然の状態で発現された貫膜タンパク質、または例えば、遺伝子操作することによってグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーなどの別のタンパク質若しくは別の貫膜タンパク質の何等かの適当なフラグメント、例えば、ＴＮＦ受容体、ＭＰＬリガンド若しくは貫膜免疫グロブリンに融合されうる貫膜タンパク質も意味する。
本明細書中で用いられる「塩」という定義は、既知の方法によって入手可能な化合物のカルボキシル基の塩もアミノ官能基の塩も意味する。カルボキシル基の塩は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの無機塩およびトリエタノールアミン、アルギニンまたはリシンのようなアミンと一緒に形成されたような有機塩基との塩を含む。アミノ基の塩は、例えば、塩酸のような無機酸との塩および酢酸などの有機酸との塩を含む。
本明細書中で用いられる「機能性誘導体」という定義は、既知の方法によってアミノ酸残基の側鎖上にまたは末端のＮ若しくはＣ基上に存在する官能基から製造されうる誘導体を意味し、それらが薬学的に許容しうる場合、すなわち、それらがタンパク質活性を破壊しないしまたはそれらを含有する医薬組成物に対して毒性を与えない場合、それらは本発明に含まれる。このような誘導体には、例えば、カルボキシル基のエステルまたは脂肪族アミドおよび遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体または遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体が含まれ、これらは、例えば、アルカノイル基またはアロイル基のようなアシル基で形成される。
「前駆体」は、ヒトまたは動物体内でＬＡＧ−３に変換される化合物である。
タンパク質の「活性部分」として、本発明は、単独または関連分子との組合せでの化合物自体のポリペプチド鎖のフラグメントまたは前駆体、またはそれに結合した残基、例えば、糖またはリン酸の残基、或いはこのようなフラグメントまたは前駆体が薬剤と同様のＬＡＧ−３活性を示す場合のポリペプチド分子の凝集体を言及している。
好ましい「活性部分」は、ＬＡＧ−３の細胞質外ドメインの４種類のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４の一つまたはそれ以上を含めたＬＡＧ−３タンパク質の細胞外部分からの可溶性部分である。
本明細書中で用いられる「活性突然変異体」という定義は、構造の１個またはそれ以上のアミノ酸が脱離されてまたは他のアミノ酸で置換されて、または１個またはそれ以上のアミノ酸がその配列に付加されて、同様のＬＡＧ−３活性を有するポリペプチドまたはタンパク質が得られている他のタンパク質またはポリペプチドを意味する。例えば、Ａｒｇ７３および／またはＡｒｇ７５および／またはＡｒｇ７６は、異なったアミノ酸、好ましくは、Ｇｌｕで置換されうる。
ＬＡＧ−３の「活性変異体」は、遺伝子のいろいろな切断部位での別のスプライシング機序から誘導される示差的にスプライシングされた変異体、更には、全ての一次遺伝子転写産物である。好ましい変異体は、ＬＡＧ−３の細胞外部分のＤ３および／またはＤ４ドメインを欠いた、場合により、Ｄ２またはＤ３ドメインの後に数個の追加のアミノ酸を含有する可溶性または貫膜タンパク質である。
細胞表面上での貫膜ＬＡＧタンパク質の発現は、免疫反応性の方法によって確かめられる。貫膜タンパク質は、例えば、抗ＬＡＧ−３抗体１１Ｅ３（寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−1612）、１７Ｂ４（寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−1240）または１５Ａ９（寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−1239）によって認識される。
本発明は、上のようなポリペプチドおよび誘導体の混合物も言及している。
本明細書および請求の範囲で用いられる場合、「ＬＡＧ−３」、「ＬＡＧ−３タンパク質」または「ＬＡＧ−３分子」という表現は、天然の、合成のおよび組換え体のポリペプチド、更には、上で報告された定義を全て含む意味である。
本発明の細胞は、一次または二次細胞から選択されうる。本明細書中で用いられる一次細胞という用語には、（細胞をプレーティングする、すなわち、皿またはフラスコなどの組織培養支持体に付着させる前の）脊椎動物組織源から単離された細胞の懸濁液中に存在する細胞、組織に由来する外植片中に存在する細胞、初めてプレーティングされた前の種類の両方の細胞、およびこれらプレーティングされた細胞に由来する細胞懸濁液が含まれる。二次細胞または細胞株という用語は、培養中の引続きの段階全ての細胞を意味する。すなわち、最初に、プレーティングされた一次細胞を培養支持体から取出し且つ再度プレーティングし（継代し）、それを本明細書中において、引続きの継代の細胞全てと同様、二次細胞と称する。二次細胞は、１回またはそれ以上継代された二次細胞から成る細胞株である。細胞株は、（１）１回またはそれ以上継代された；（２）培養物の一定の平均集団倍加数を示す；（３）接触阻害された足場依存性成長の性質を示す（足場依存性は、懸濁培養物中で増殖する細胞に当てはまらない）；および（４）不死化されていない二次細胞から成る。「クローン細胞株」は、１種類の創始細胞に由来する細胞株として定義される。「不均一細胞株」は、２種類またはそれ以上の創始細胞に由来する細胞株として定義される。
本発明は、ゲノム中に安定して組込まれるまたは細胞中でエピソームによって発現される外因性ＤＮＡでトランスフェクションされた線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液の形成要素、筋細胞などの一次および二次体細胞、培養されうる他の体細胞、および体細胞前駆体を含む。得られた細胞をそれぞれ、トランスフェクションされた一次細胞およびトランスフェクション二次細胞と称する。
ＬＡＧ−３分子をコードしている遺伝子が哺乳動物細胞中に挿入され、そしてそれら細胞を同種異系または異種宿主に移植する場合、それら細胞は、宿主免疫系によって認識されるが、免疫応答は開始されない。
宿主免疫系は、他の場合には拒絶されたと考えられる、細胞表面上でＬＡＧ−３分子を発現するように遺伝子操作されなかった細胞を拒絶できなくなる。ＬＡＧ−３は、無関係の細胞種類の細胞表面上で発現され、そして移植される細胞または組織と混合されて、上に記載されたのと同様の結果を伴うこともありうる。したがって、本発明は、全身的免疫抑制を伴わない細胞、組織または器官の移植に関する。
これら細胞、組織または器官は、ある種の疾患を治療するタンパク質を与えるかまたはいくつかの機能を果たすように移植される。それらは、ＬＡＧ−３を宿主の免疫系に提示する技術の使用により宿主によって受容される。
特定の細胞、組織または器官の移植片拒絶反応の防止は、ＬＡＧ−３を発現するように遺伝子操作された線維芽細胞または他の一次若しくは二次細胞の同時投与によって受容者においても行うことができる。この防御状態は、免疫系を媒介する機序の局所または全身阻害のためでありうる。この防御状態は、アネルギー、欠失、非応答性、寛容性または細胞媒介細胞傷害性の防止のためでありうる。防御状態がいったん確立されると、それは、感染耐性などの現象のために、永久的にさえも長期間持続する（Qinら，1993年）。
本発明は、ヒトでの様々な医学的要求のために遺伝子または遺伝子産物を供給する細胞組織、器官または宿主細胞の移植に用いることができる。
ＬＡＧ−３遺伝子発現は、標準的な組換えＤＮＡ技術によってまたは相同的組換えを用いて内因性ＬＡＧ−３遺伝子を活性化する技術によって引き起こすことができる。細胞種類は、特定の組織中でまたは無関係の細胞中で何等かの方法によって発現されたＬＡＧ−３遺伝子を有するトランスジェニック動物から得ることができる。次に、このような細胞を、移植片拒絶反応からの防御が望まれる細胞と混合しうる。これは、免疫防御分子ＬＡＧ−３の局所分泌が全身的に作用しないことを示唆している。ＬＡＧ−３を形質導入された形質転換されていない線維芽細胞は、in vivoで同様に応答する。ＬＡＧ−３を形質導入された線維芽細胞の接種材料の免疫防御作用は、用量依存性であるが、ＬＡＧ−３分子源には依存しない。
ＬＡＧ−３発現性細胞の同時投与は、ドナーＴ細胞を失活させるが、同時に、宿主免疫系からの攻撃を妨げる。この処置は、自己反応性Ｔ細胞に対して防御させる免疫微環境の長期変化を引き続きもたらすことがありうる受容体において、特異的アネルギー、寛容性またはさもなければ、細胞媒介細胞傷害性からの防御を導く。これは、ＬＡＧ−３を発現するように遺伝子操作されたヒト同種異系細胞と一緒に、健康なドナーからの少数の同種異系骨髄細胞を同時投与することによって行うことができる。これは、ミクロキメラ現象の発生によって自己反応性Ｔ細胞を減少させる（Delaneyら，1996年）。
特定の疾患または欠損症のあるヒトは、多くの種々の細胞、組織または器官の同種異系移植の恩恵を受けることができる。例えば、肝、腎臓、心臓、膵臓、小腸などの器官が、一般的に移植されているし、そして島、パーキンソン病または焦点てんかんの治療のための神経組織、化学療法または放射線療法の処置としての造血幹細胞、高コレステロール血症を治療する正常肝細胞、心筋梗塞のための心臓細胞、筋ジストロフィーのための筋細胞などの細胞は、移植に適している。
同種異系骨髄移植は、様々な理由で行うことが困難であった。それらには、移植片拒絶反応、移植片または免疫抑制薬の混入の結果としての日和見感染による感染、または他の理由が含まれる。拒絶反応は、ドナーによる骨髄移植片状態に対する受容者の抵抗性および受容者を攻撃するコンピテント免疫細胞の性質のためでありうる（対宿主性移植片病）。このＧＶＨＤは、Ｔ細胞の移植片の減少または免疫抑制薬の同時投与によって抑制されうる。Ｔ細胞が除かれた場合、移植片状態は還元される。
Ｔ細胞除去の結果として、より一層の移植片不足が起こる。それらは、サイトカインの生産のような移植片状態に重要な機能を提供しうると考えられる（Kernanら，1987年）。
少数の同種異系であるが健康な骨髄細胞だけが、実験モデルにおける自己免疫疾患の発症を減少させるかまたは防止することさえできることが示された。しかしながら、これらのような処置は、対宿主性移植片病を引き起こす。
骨髄移植は、ある種の腫瘍を根絶する方法としても用いられてきた。これは、例えば、対白血病移植片の腫瘍組織を認識し且つ死滅させる同種異系Ｔ細胞の能力によると言われている。
上の場合のいずれにおいても、移植される細胞または器官を、宿主中に移植された場合にＬＡＧ−３タンパク質を発現し且つ移植片を防御するように、ＬＡＧ−３をコードしている遺伝子で遺伝子操作するならば、全身免疫抑制が避けられる。
同種異系移植における最初の問題は、移植可能なヒト組織の不足であり、今日、供給をはるかに越えて器官を必要としている。まだ実験的な方法として考えられているが、異種移植は、実行可能な同種移植に代わる方法であると考えられる。現在、ブタまたはヒヒなどの動物が、器官または細胞ドナーとして考えられている。移植片拒絶反応の防御は、異なった種からの器官の成功した臨床的使用に不可欠でありうる。宿主抵抗性は、例えば、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ細胞に対する抗体を用いて、または移植される動物細胞をマイクロカプセル封入して、少なくとも部分的に克服することができる。本発明によれば、これら動物は、イスリン遺伝子プロモーターおよび標的集中システムまたは他の組織特異的マーカーシステムの使用によって島細胞のようないくつかの細胞種類でＬＡＧ−３遺伝子を発現するようにトランスジェニック変更することができる。
腫瘍組織でのＬＡＧ−３の発現は、宿主の免疫系からの腫瘍組織に対する細胞媒介攻撃に対する抵抗において重要な役割を果たしていると考えられる。
本発明の具体的な実施態様により、遺伝子治療または少量の腫瘍組織のex vivo処置および再植込みを用いることによって、アンチセンスＬＡＧ−３分子またはＬＡＧ−３メッセージに特異的なリボザイムを発現するように腫瘍組織を遺伝子操作することができる。これは、その組織に対して免疫系を反応させ且つそれを破壊するようにさせると考えられる。少量の腫瘍組織は、ＬＡＧ−３に対する抗体で処理されて、ＬＡＧ−３によって引き起こされるＴ細胞阻害を妨げ、そしてそれに対して細胞性および体液性免疫を誘導させることもできる。
遺伝子治療は、現在、アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ）、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、糖尿病、α−抗トリプシン欠損症、アルツハイマー病などの脳障害および成長障害などの他の疾患および心臓病、例えば、コレステロールが代謝される方法の変化によって引き起こされるもの、および免疫系の欠損が含まれるがこれらに制限されるわけではない様々な疾患の治療に極めて望ましい。
危急の状態にある個体での移植には、種々の細胞を用いることができ、例えば、ジストロフィン供給のための筋芽細胞、ＴＰＯ、ＧＨ、ＥＰＯ、因子ＩＸまたは他の因子などの物質を分泌する細胞、遺伝性血液病の治療のための血液細胞、および内皮細胞、上皮細胞、結合組織細胞、線維芽細胞、間葉細胞、中皮細胞および実質細胞などの他の一次ヒトまたは動物細胞を用いることができる。
遺伝子治療の結果は、多くの問題のために、極めて納得のいくものではなかった。アデノシンデアミナーゼの遺伝子で少女を治療した最新の試行でさえ（ＡＤＡ）、遺伝子治療だけでは効果がないという不安のために、その患者はＰＥＧ−ＡＤＡの注射をまだ毎週受けている。
現在の遺伝子治療プロトコールの欠点の一つは、宿主免疫系による細胞の拒絶反応を妨げることを試みるために宿主細胞の個々の生産が必要とされることである。遺伝子治療は、個体基準によって個々に行われなければならない。更に、導入遺伝子の発現は、通常、遺伝子治療のための自己細胞の使用によってさえも、宿主免疫系に関与する他のウイルスタンパク質の発現のために永久的でないことが判った。
欠陥のあるアデノウイルスベクターが用いられるが、これらには、発現される他のウイルスタンパク質のために免疫応答を引き起こすという問題がある。高濃度のウイルスは、欠陥のあるものでも、炎症反応および免疫攻撃を刺激する。宿主細胞免疫系は、ウイルスベクターを記憶するので、将来の投与は一層有効性が少ないであろう。
ウイルスタンパク質Ｅ１を欠失した複製欠損性アデノウイルスは、遺伝子治療プロトコールおいて日常的に用いられている。残念ながら、それらは、おそらくはアデノウイルスまたは組換えタンパク質に対して向けられた免疫応答の結果として、成人において一時的にしか有効でない免疫担当宿主を有する（KozarskyおよびWilson，1993年；Barrら，1992年；Stratfordら，1992年；Rosenfeldら，1992年；Lemarchandら，1992年）。したがって、免疫原性ではないために、遺伝子操作された細胞の免疫学的防御を可能にする新規ベクターまたは方法を開発することが大いに必要とされる。
これらベクターは、最大１０11プラーク形成単位／ｍｌまでの高力価で製造され、多数の複製性および非複製性細胞に感染する。複製欠損性アデノウイルスを用いて、生理学的レベルの組換えタンパク質を体循環へ供給する。ＬＡＧ−３遺伝子は、好ましくは、偏在的に活性な細胞性ＥＦ１αプロモーターおよび４Ｆ２ＨＣエンハンサーの転写制御下にある（Tripathyら，1994年）。
細胞を被包することによっておよび宿主を免疫抑制することによって、この問題を回避することが試みられた。
本明細書中で記載された方法を用いると、異種または同種異系細胞を、宿主の免疫系による移植片拒絶反応から防御するように、それら表面上でＬＡＧ−３分子を発現する遺伝子治療宿主として用いることができる。それらは、例えば、筋芽細胞、線維芽細胞、造血幹細胞、胎児性幹細胞、胎児肝細胞、臍静脈内皮細胞またはＣＨＯ細胞である。遺伝子治療宿主細胞は、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を発現するように遺伝子操作されることもできる。このような細胞は、ガンシクロビルの添加によって特異的に破壊されうる。
ｔｋ−ガンシクロビル感受性細胞は、それらをいかなる時点でも欠失できるという点で、非感受性細胞にまさる有意の利点を有する（Biら，1993年）。
したがって、本発明によってＬＡＧ−３およびＨｓｖ−ｔｋ遺伝子を細胞表面上で発現するように製造される普遍的宿主細胞は、免疫抑制を用いることなく植込むことができ且つその活性がもはや必要でなくなったどの時点でも破壊することができる普遍的遺伝子治療宿主細胞の生成を可能にする。
本発明の同種異系または異種遺伝子治療宿主細胞は、複製欠損性ウイルス、アデノ関連ウイルス、高性能レトロウイルス、骨髄中へのＤＮＡの直接注射、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、リポソーム中への被包または赤血球ゴースト法などがあるがこれらに制限されるわけではないいずれの遺伝子転移法の使用によっても、導入遺伝子および／またはＬＡＧ−３遺伝子を発現するように遺伝子操作することができる。筋芽細胞またはＣＨＯ細胞などのＬＡＧ−３を発現する細胞は、永久的に植込まれる目的のタンパク質を発現する細胞と一緒に同時投与することができる。一時的なＬＡＧ−３暴露で充分である場合、ＬＡＧ−３でトランスフェクションされた筋芽細胞またはＣＨＯ細胞は、上で報告されているｔｋのような自殺遺伝子を含有できるので、それらはガンシクロビルでの処理によって除去されうる。
この方法は、遺伝子若しくは遺伝子産物の投与によってまたは生体に危険な遺伝子（癌遺伝子など）の除去若しくは失活によって正常な機能を回復させるのに用いることができる。この目的は、リボザイムまたはアンチセンスｃＤＮＡを供給する細胞を植込み、ＨＩＶタンパク質または成長因子などの望ましくないタンパク質の生産を阻害することによっても達成することができる。その方法を用いて、ゴシェ病またはＡＤＡ欠損症などの酵素欠損症を矯正することができる。
もう一つの実施態様により、本発明は、遺伝子治療の方法であって、（ｉ）治療に必要な遺伝子およびＬＡＧ−３分子をコードしている遺伝子を、選ばれたヒトまたは動物細胞中に挿入し；そして（ii）工程（ｉ）から得られた細胞を患者に導入することを含む方法に関する。或いは、上のような遺伝子は、患者の組織器官中にin vivoで、遺伝子それ自体またはこのような組織または器官を標的とするビヒクル中の遺伝子の直接トランスフェクションによって挿入することができる。
例えば、請求の範囲に記載された発現系は、筋細胞のような細胞群中への直接的なまたは（例えば、嚢胞性線維症を治療するために）気道中へ直接投与される裸のＤＮＡまたはウイルスベクターの注射を可能にする。その構築物は、目的の遺伝子（コンダクタンス調節遺伝子（ＣＦＴＲｃＤＮＡ）など）のみならず、その細胞種類で同時発現されるＬＡＧ−３遺伝子も含有して、例えば、反復投与の有効性を制限すると考えられるアデノウイルスキャプシドタンパク質に対して起こりうる体液性免疫応答を妨げる。造血幹細胞中への遺伝子転移は、多剤耐性遺伝子を投与して、免疫細胞を急速に分裂させる化学療法抑制の副作用の一つと戦うのに用いることができる。レトロウイルスベクターは、幹細胞の分裂を促進するＳｌ因子、キットリガンド、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＩＬ１２などのサイトカインとの組合せで用いることができる。
選ばれた細胞は、ＬＡＧ−３遺伝子に加えて、ＩＬ１０、ＴＧＦβ、Ｆａｓリガンドなどの他の免疫抑制剤をコードしている遺伝子で同時トランスフェクションすることができる。
本発明の具体的な実施態様として、上記の方法を用いて、宿主の免疫系による感染耐性によって細胞、組織または器官の次の投与に対して宿主を寛容にさせるＬＡＧ−３遺伝子を発現するように遺伝子操作された少数の目的の細胞で受容者を処置する。
ここで、本発明を、次の実施例に関して単なる例示として記載する。
実施例１
方法
貫膜ＬＡＧ−３を発現するＣＨＯ細胞の世代
ＬＡＧ−３ｃＤＮＡを、ｐＣＤＭ８プラスミド（Invitrogen  San  Diego  CA）からの１６２０ｂｐ  Ｘｈｏフラグメントとして切取り、アガロースゲル電気泳動によって精製した。
そのフラグメントを、Ｘｈｏで消化されたｐＣＬＨ３ＡＸＳＶ２ＤＨＦＲｈαＩＶＳＡ（Ｄα）哺乳動物発現ベクター（図３）中にサブクローン化した。ＣＨＯ−ＤＵＫＸ（ＤＨＦＲ-）細胞を、ＣａＰＯ4沈降法によってＤαＬＡＧ−３構築物でトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、選択培地（デオキシ−およびリボヌクレオチド不含ＭＥＭ培地＋１０％透析ウシ胎児血清＋１％Ｌ−グルタミン＋０．０２μＭメトトレキセート）中で成長させた。ＬＡＧ−３の発現は、溶解細胞膜標品上でのウェスタンブロッティングによって、および定期的に、抗ＬＡＧ−３単クローン性抗体１７Ｂ４を用いるフローサイトメトリー分析によって検査した。
マウスへのＣＨＯ細胞移植
トランスフェクションされていない（野生型）かまたは全長ヒトＬＡＧ−３若しくはヒトＬＨ  ｃＤＮＡでトランスフェクションされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、プラスチックフラスコから剥がし、ダルベッコ修飾最少必須培地（ＤＭＥＭ）中に細胞１．７５×１０7個／ｍｌの濃度で懸濁させた。７〜９週令のＣ５７ＢＬ／６雌マウス２６匹を、表１で示されたように７群に配分し、そして細胞３．５×１０6個を含有する指示された細胞懸濁液２００ｍｌを、各被験動物の右側腹部に皮下注射した。３、６および７の群では、同じマウスの右側腹部にＬＡＧ−３でトランスフェクションされた細胞および反対側に対照細胞（ＬＨでトランスフェクションされたまたはトランスフェクションされていない）を与えた。注射から４日後に、マウスをＣＯ2吸入によって屠殺し、その皮膚を開いて注射部位を調べた。
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ＣＨＯ細胞に対する細胞傷害性の評価
１群につき５匹のＣ５７ＢＬ／６雌マウスに、ヒトＬＨかまたはヒトＬＡＧ−３  ｃＤＮＡでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞４×１０5個を皮下注射した。１４日後、それらマウスを屠殺し、その脾臓を摘出して脾臓細胞懸濁液を得た。脾臓細胞懸濁液（エフェクター）を培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ウシ胎児血清＋抗生物質）に細胞１０7個／ｍｌで希釈し、そして異なった希釈度で三組プレーティングして、目標比率までのいろいろなエフェクターを得た。それぞれの懸濁液に２個のプレートを作成した。51Ｃｒで標識された細胞５×１０3個／１００μｌの標的細胞（ＬＨかまたはＬＡＧ−３でトランスフェクションされた細胞）をプレート（それぞれの標的に１個のプレート）に加えた。３７℃で２０時間後、上澄み２０μｌを各ウェルから取り、51Ｃｒの放出を液体シンチレーションによって評価した。細胞傷害活性は、次の式
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（式中、spontおよびmaxは、エフェクター懸濁液の代わりに培地（標的細胞からの自然のＣｒ放出）およびトリトンＸ１％（最大Ｃｒ放出）をそれぞれ含むウェルを示す）
によって溶解百分率として計算した。
結果
マウスへのＣＨＯ細胞移植
ＬＡＧ−３でトランスフェクションされた細胞を与えられた大部分のマウスは、野生型ＣＨＯで処置された被験動物でも、ＬＨでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を与えられた被験動物でも見られなかった白色小結節を注射部位に示した。野生型ＣＨＯ細胞の注射は、大部分のマウスの注射部位に拡散性出血の徴候を示した。この現象は、ＬＨでトランスフェクションされた細胞を与えられた被験動物ではあまり明らかではなかった。野生型およびＬＡＧ−３でトランスフェクションされた細胞の両方を別々の部位に注射されたマウスの場合、この小結節は、後者を注射された部位でのみ見られ、もう一方の部位では出血が見られた（表２）。
同様の実験で従来行われた組織学的分析は、小結節中に異種細胞の存在を示した。実験の結果を添付の図面で示し（マウスの識別については表１を参照されたい）、表３で要約する。
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ＣＨＯ細胞に対する細胞傷害性
ＣＨＯ細胞表面上でのＬＡＧ−３の発現は、異種細胞に対して免疫学的に感作されるマウスの能力に影響を与えなかった。実際に、ＬＡＧ−３−ＣＨＯ細胞を注射されたマウスからの脾臓細胞は、両方の標的細胞を、ＬＨ−ＣＨＯ細胞で感作されたマウスからのものと同程度におよび非感作マウスよりも効率よく溶解した。しかしながら、細胞表面上でのＬＡＧ−３の発現は、図１および図２の溶解百分率を比較することによって分かるように、標的に対するマウスの免疫感作によって引き起こされる細胞傷害活性に対する低下した感受性に関係していた。非感作マウスからの脾臓細胞によって示される「自然の」細胞傷害性は、ＬＡＧ−３の表面発現によって低下しない。これは、ＬＡＧ−３表面発現が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性の遠心性分岐を減少させることを示している。ＣＴＬは、移植された器官の拒絶反応において主要な役割を果たすエフェクターの一つであるので（G.Berke，1993年）、それらの機能の阻害は、同種異系移植片の生存を延長させることができる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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