(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンジオジェニン(angiogenin)及び／又はその分解物を有効成分とする骨形成促進又は骨吸収防止剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アンジオジェニン(angiogenin)及び／又はその分解物を有効成分とする骨形成促進及び骨吸収防止剤に関する。また、本発明は、アンジオジェニン(angiogenin)及び／又はその分解物を配合して骨形成促進又は骨吸収防止効果を賦与した飲食品、医薬及び飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く（アンカップリング）。そして、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を生じることになる。このアンカップリングを防止することができれば、骨粗鬆症、骨折、腰痛等の各種骨疾患を予防することができると考えられている。
【０００３】
従来より、アンカップリングを防止し、各種骨疾患を予防あるいは治療する方法として、（１）食餌によるカルシウム補給、（２）軽い運動、（３）日光浴、（４）薬物治療等が行われている。食餌によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されているが、必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。軽い運動はジョギングや散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人では殆ど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ3 の補給という点では良いとされているが、これだけでは不充分である。薬物投与には、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 、カルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であるということが知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、食品素材として使用可能なものではない。
【０００４】
一方、本発明者らは、食品素材として使用可能な骨強化作用や骨吸収防止作用を有する物質を得るために、乳清タンパク質中に存在する骨強化及び骨吸収防止因子の探索を続けてきた。その結果、逆浸透膜や電気透析等の処理により、乳清タンパク質の水溶性画分から乳清由来の塩を除去したタンパク質及びペプチド混合物に骨強化作用があることを見出した（特開平4-183371号公報) 。そして、このタンパク質及びペプチド混合物の水溶液をエタノール処理、加熱処理、加塩処理、限外濾過膜処理をして得られる画分に骨芽細胞増殖促進作用及び骨強化作用があることを見出した（特開平5-176715号公報、特開平5-320066号公報) 。また、乳中に微量存在する塩基性タンパク質に骨芽細胞増殖促進作用、骨強化作用及び骨吸収防止作用があることを見出した（特願平7-207509号) 。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、さらに骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を有する塩基性タンパク質を求め、鋭意研究を進めていたところ、アンジオジェニン(angiogenin)が骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を有することを見出した。そして、アンジオジェニン(angiogenin)の分解物も同様の作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、アンジオジェニン(angiogenin)及び／又はその分解物を有効成分とする骨形成促進又は骨吸収防止剤を提供することを課題とする。また、本発明は、アンジオジェニン(angiogenin)及び／又はその分解物を配合して骨形成促進又は骨吸収防止効果を賦与した飲食品、医薬又は飼料を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明では、骨形成促進作用又は骨吸収抑制作用を賦与するために、アンジオジェニン(angiogenin)及び／又はその分解物を使用する。
【０００７】
このアンジオジェニン(angiogenin)は、ヒト結腸癌細胞より見出されたペプチド性血管新生因子であり、腫瘍由来新生因子として初めてアミノ酸配列及びＤＮＡ塩基配列が明らかにされたものである (J.W.Fett et al., Biochemistry, vol.24, p.5480, 1985)。アンジオジェニン(angiogenin)は、 123個のアミノ酸からなる分子量約14,400の１本鎖のペプチドである。アンジオジェニン(angiogenin)は、ヘパリンに親和性がなく、シグナルペプチドを有し細胞外に分泌される。in vitroアッセイ（卵漿尿膜法あるいは角膜法) では、血管新生作用を示すものの内皮細胞の増殖は刺激しない。アンジオジェニン(angiogenin)のｃＤＮＡが人正常肝ｍＲＮＡから用意されたＤＮＡライブラリーに存在することや血中にそれが存在することが明らかになり(R.Shapiro et al., Biochemistry, vol.26, p.5141, 1987)、アンジオジェニン(angiogenin)が種々の組織に存在する可能性の高いことが示唆されている。なお、アンジオジェニン(angiogenin)の機能については未知な点も多い。
【０００８】
アンジオジェニン(angiogenin)は、乳、臓器、血漿等から分離、精製することにより得ることができる。例えば、乳として、牛乳、人乳、山羊乳、羊乳等の新鮮乳、粉乳、脱脂乳、還元乳等を使用し、加熱処理、加塩処理、エタノール処理、イオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマト処理、限外濾過膜処理等を行うことにより、アンジオジェニン(angiogenin)を調製することができる。また、遺伝子組み換え技術によりアンジオジェニン(angiogenin)を調製することもできる。
【０００９】
アンジオジェニン(angiogenin)分解物は、上記のアンジオジェニン(angiogenin)をトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン、カリクレイン、カテプシン、サーモライシン、Ｖ８プロテアーゼ等のプロテアーゼで限定分解し、分子量を14,000Da以下としたペプチド混合物である。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の骨形成促進及び骨吸収防止剤は、アンジオジェニン(angiogenin)あるいはその分解物を有効成分とする。このアンジオジェニン(angiogenin)あるいはその分解物を、牛乳、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、ビスケット、パン、麺、ソーセージ等の飲食品に配合しても良いし、錠剤や粉末等の医薬としても良い。さらに、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、乳酸カルシウム、卵殻、牛乳由来のカルシウム等の吸収性が良好なカルシウム剤を併用したり、ビタミンＤ等を併用したりすることにより、骨形成促進作用を一層高めることができる。
【００１１】
本発明の骨形成促進及び骨吸収防止剤は、成人の場合、その有効成分を１日当たり 100ng〜10mgを数回に分けて摂取すれば良い。このように、本発明の骨形成促進及び骨吸収抑制剤を摂取することにより、骨粗鬆症等の各種骨疾患を予防又は改善することができる。
【００１２】
なお、これらの有効成分を飼料に含有させて、家畜や家禽等の骨形成を促進させたり、骨吸収を防止させることもできる。
【００１３】
【実施例１】
スルホン化キトパール (富士紡績製) 3,000gを充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄した後、脱脂乳100lを通液した。次に、このカラムを脱イオン水で充分洗浄した後、 0.1〜1.0M塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。そして、アンジオジェニン(angiogenin)を含有する溶出画分を S-Sepharose陽イオン交換クロマトグラフィーで分画し、得られたアンジオジェニン(angiogenin)含有画分を90℃で10分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、このアンジオジェニン(angiogenin)含有画分をMono S陰イオン交換クロマトグラフィー、Superose12ゲル濾過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びC4逆相クロマトグラフィーで順次処理し、アンジオジェニン(angiogenin)55mgを得た。
【００１４】
【実施例２】
スルホン化キトパール (富士紡績製) 1,000gを充填したカラムを脱イオン水で充分洗浄した後、豚血清 10lを通液した。次に、このカラムを脱イオン水で充分洗浄した後、 0.1〜1.0M塩化ナトリウムの直線濃度勾配で溶出した。そして、アンジオジェニン(angiogenin)を含有する溶出画分を S-Sepharose陽イオン交換クロマトグラフィーで分画し、得られたアンジオジェニン(angiogenin)含有画分を90℃で10分間加熱処理し、遠心分離することにより沈澱を除去した。さらに、このアンジオジェニン(angiogenin)含有画分をMono S陰イオン交換クロマトグラフィー、Superose12ゲル濾過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びC4逆相クロマトグラフィーで順次処理し、アンジオジェニン(angiogenin)12mgを得た。
【００１５】
【実施例３】
実施例１で得られたアンジオジェニン(angiogenin) 5mgを水10mlに懸濁し、最終濃度0.01％となるようパンクレアチンを加え、37℃で５時間酵素処理した。そして、90℃で５分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してアンジオジェニン(angiogenin)分解物 4.4mgを得た。
【００１６】
【試験例１】
実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物について、骨芽細胞増殖作用を調べた。すなわち、骨芽細胞MC3T3-E1細胞を10％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地(Flow Labolatories製) で96穴プレートに２×104/mlの細胞数で播種した。次に、５％ＣＯ2 存在下、37℃で24時間培養し試験用培養細胞とした。そして、培地を牛胎児血清を含まないα−ＭＥＭ培地に交換し、実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物を最終濃度10μg/mlとなるよう培地に添加して、37℃で18時間培養した。これに 3Ｈ−チミジン0.02MBq を添加して２時間経過後、セルハーベスターで細胞を濾紙に集め、液体シンチレーションカウンターで 3Ｈ−チミジンの取り込み量を測定した。また、対照として、アンジオジェニン(angiogenin)無添加のものを用い、無添加のものの細胞増殖活性を 100％としたときのそれぞれの細胞増殖活性を (％) で表した。その結果を表１に示す。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物を添加した群はいずれも無添加群に比べ細胞増殖活性が増加しており、骨芽細胞増殖作用を有することが判った。なお、骨芽細胞ＵＭＲ株を使用して行った試験においても、同様の結果が得られた。
【００１９】
【試験例２】
実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物について、Woessnerの方法(Woessner,J.F., Arch Biochem. Biophys., vol.93, pp.440-447, 1961) に従い、コラーゲン合成促進作用を調べた。すなわち、骨芽細胞MC3T3-E1細胞を10％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地(Flow Labolatories製) で96穴プレートに２×104/mlの細胞数で播種した。次に、５％ＣＯ2 存在下、37℃で24時間培養し試験用培養細胞とした。そして、培地を牛胎児血清を含まないα−ＭＥＭ培地に交換し、実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物を最終濃度10μg/mlとなるよう培地に添加して、37℃で３日間培養し、合成されたコラーゲン量を測定した。なお、コラーゲン量は、細胞破砕液を6N塩酸で加水分解し、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドでハイドロキシプロリンを定量することにより求めた。また、対照として、アンジオジェニン(angiogenin)無添加のものを用い、無添加のもののハイドロキシプロリン量を 100％としたときのそれぞれのハイドロキシプロリン量を (％) で表した。その結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物を添加した群はいずれも無添加群に比べハイドロキシプロリン量が増加しており、骨芽細胞のコラーゲン合成が促進されることが判った。
【００２２】
【試験例３】
実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物について、骨吸収防止作用を調べた。すなわち、生後10〜20日齢のＩＣＲ系マウスの長管骨を摘出し、軟組織を除去した後、５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液中で骨を機械的に細切し、破骨細胞を含む全骨髄細胞を得た。この細胞を象牙片の上に約２×106 細胞を５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液でスポットした。２時間後、試験試料が最終濃度で10μg/mlとなるよう５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液を加え、５日間培養し、既存の破骨細胞の骨吸収活性を調べた。
【００２３】
培養後、象牙片上の細胞を剥がしてヘマトキシリン染色し、PIASLA-555により画像解析して骨吸収窩(pit) の数を測定した。そして、対照として、アンジオジェニン(angiogenin)無添加のものを用い、無添加のものの骨吸収窩(pit) の数を 100％としたときのそれぞれの骨吸収窩(pit) の数を (％) で表し、骨吸収活性とした。その結果を表３に示す。
【００２４】
【表３】
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【００２５】
実施例１〜３で得られたアンジオジェニン(angiogenin)又はその分解物を添加した群はいずれも無添加群に比べ骨吸収活性が抑制されることが判った。
【００２６】
【実施例４】
表４に示した配合で原料を混合した後、容器に充填し、加熱滅菌して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与した飲料を製造した。
【００２７】
【表４】
0003929088.tif 000005
【００２８】
【実施例５】
表５に示した配合で原料を混合した後、加圧成型して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与した錠剤を製造した。
【００２９】
【表５】
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【００３０】
【実施例６】
表６に示した配合で原料を混合し、ドウを作成して成型した後、焙焼して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与したビスケットを製造した。
【００３１】
【表６】
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【００３２】
【実施例７】
表７に示した配合で原料を混合した後、容器に充填し、加熱滅菌して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与したゼリーを製造した。
【００３３】
【表７】
0003929088.tif 000008
【００３４】
【実施例８】
表８に示した配合で原料を混合した後、85℃で乳化して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与したプロセスチーズを製造した。
【００３５】
【表８】
0003929088.tif 000009
【００３６】
【実施例９】
12重量％還元脱脂乳に90℃で20分間加熱殺菌した後、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)及びストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus) をそれぞれ接種し、２種類のスターターカルチャーを得て両者を等量混合した。そして、表９に示した配合で原料を混合した後、発酵させて、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与したヨーグルトを製造した。
【００３７】
【表９】
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【００３８】
【実施例１０】
表１０に示した配合で原料を混合して、骨形成促進作用及び骨吸収防止作用を賦与したイヌ飼育用飼料（ドッグフード）を製造した。
【００３９】
【表１０】
0003929088.tif 000011
【００４０】
【発明の効果】
本発明のアンジオジェニン(angiogenin)あるいはその分解物を有効成分とする骨形成促進剤及び骨吸収防止剤は、骨粗鬆症等の各種骨疾患の予防や改善に有用である。また、アンジオジェニン(angiogenin)あるいはその分解物を含有する飲食品、医薬又は飼料は各種の骨疾患を同様に予防したり改善したりすることができる。