(57)【要約】【課題】新たなアルツハイマー病治療剤の提供。【解決手段】デキストラン硫酸又はその塩を有効成分とするアルツハイマー病治療剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
デキストラン硫酸又はその塩を有効成分とするアルツハイマー病治療剤。
【請求項２】
有効成分がデキストラン硫酸ナトリウムである請求項１記載のアルツハイマー病治療剤。
【請求項３】
デキストラン硫酸又はその塩を有効成分とする、アミロイドβオリゴマーと正常プリオンタンパク質との結合阻害剤。
【請求項４】
有効成分がデキストラン硫酸ナトリウムである請求項３記載のアミロイドβオリゴマーと正常プリオンタンパク質との結合阻害剤。
【請求項５】
デキストラン硫酸又はその塩を有効成分とする、アミロイドβオリゴマーによる長期増強反応低下回復剤。
【請求項６】
有効成分がデキストラン硫酸ナトリウムである請求項５記載のアミロイドβオリゴマーによる長期増強反応低下回復剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなアルツハイマー病治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は認知機能の低下、記憶の喪失を伴う進行性の神経変性疾患である。ＡＤの発症頻度は加齢とともに増加することが知られており、世界人口の高齢化が急速に進んでいるため、ＡＤ患者数は増加傾向にあり，今後も更なる増加が見込まれている（非特許文献１）。現在、ＡＤ治療薬としては、症状の一時的改善と遅延効果を目的として、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンが使用されている（非特許文献２）。
しかし、現在ＡＤ治療薬として使用されている、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンは、アセチルコリンエステラーゼ阻害やＮＭＤＡ型グルタミン酸受容体に作用する薬剤であり、症状の一時的改善や遅延効果のみが認められている対症療法薬にすぎず、ＡＤの進行を止めることができない。
【０００３】
近年、ＡＤの原因は、アミロイドβオリゴマー（アミロイドβと呼ばれるタンパク質の可溶性重合体）であるとする、アミロイドβオリゴマー仮説が提唱されている（非特許文献３）。アミロイドβオリゴマーは直接神経細胞に障害を示し、記憶力の低下や認知機能の障害を引き起こすことが知られている。
【０００４】
さらに、近年、アミロイドβオリゴマーの受容体として正常プリオンタンパク質（ＰｒＰｃ）が報告され（非特許文献４）、アミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃの結合がアミロイドβオリゴマーの神経細胞障害に起因することが報告された（非特許文献５）。また、神経毒性に加えて、アルツハイマー病でのシナプス機能障害におけるアミロイドβオリゴマーの役割に対して、注目されている。例えば、神経細胞における長期増強（Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＬＴＰ）は記憶機能に深く関与すると考えられており、マウスの海馬スライスにおいて、長期増強に対するアミロイドβオリゴマーの阻害効果が報告されている（非特許文献６、７）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】N Engl J Med 362:329-344, 2010
【非特許文献２】Lancet Neurol 9: 702-716, 2010
【非特許文献３】Trens Pharmacol Sci 34:261-266, 2013
【非特許文献４】Nature 457: 1128-1132, 2009
【非特許文献５】Nat Commun 2: 336, 2011
【非特許文献６】Nat Med 14: 837-842, 2008
【非特許文献７】Nature 416: 535-539, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、アルツハイマー病の主原因とされるアミロイドβオリゴマーに作用する新たなアルツハイマー病治療剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、種々の物質を対象としてアミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃの結合を阻害する薬剤のスクリーニングを行った。その結果、全く意外にも、高脂血症治療薬として知られているデキストラン硫酸又はその塩が、アミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合を阻害すること、またＰｒＰｃの安定発現細胞株を用いた評価系においても細胞膜上におけるアミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合を阻害すること、さらには、アミロイドβオリゴマーによる長期増強反応の低下を回復させる作用を有し、アルツハイマー病治療剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。
【０００９】
〔１〕デキストラン硫酸又はその塩を有効成分とするアルツハイマー病治療剤。
〔２〕デキストラン硫酸又はその塩を有効成分とする、アミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合阻害剤。
〔３〕デキストラン硫酸又はその塩を有効成分とする、アミロイドβオリゴマーによる長期増強反応低下回復剤。
【００１０】
〔４〕アルツハイマー病の治療に使用するためのデキストラン硫酸又はその塩。
〔５〕アミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合阻害に使用するためのデキストラン硫酸又はその塩。
〔６〕アミロイドβオリゴマーによる長期増強反応低下を回復するためのデキストラン硫酸又はその塩。
【００１１】
〔７〕アルツハイマー病治療剤製造のための、デキストラン硫酸又はその塩の使用。
〔８〕アミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合阻害剤製造のための、デキストラン硫酸又はその塩の使用。
〔９〕アミロイドβオリゴマーによる長期増強反応低下回復剤製造のための、デキストラン硫酸又はその塩の使用。
【００１２】
〔10〕デキストラン硫酸又はその塩の有効量を投与することを特徴とするアルツハイマー病の治療方法。
〔11〕デキストラン硫酸又はその塩の有効量を投与することを特徴とするアミロイドβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合を阻害する方法。
〔12〕デキストラン硫酸又はその塩の有効量を投与することを特徴とするアミロイドβオリゴマーによる長期増強反応低下を回復する方法。
【発明の効果】
【００１３】
デキストラン硫酸又はその塩は、アミロイドβオリゴマー（Ａβオリゴマー）とＰｒＰｃとの結合を阻害し、アミロイドβオリゴマーによる長期増強反応の低下を回復させる作用を有し、アルツハイマー病治療剤として有用である。本発明のアルツハイマー病治療剤は、アミロイドβオリゴマーに直接作用するため、アルツハイマー病の進行を防止し得る新たな治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】アミロイドβモノマー（Ａβモノマー）を一緒にインキュベートすると、そのインキュベートに応じて分子量が高くなり、Ａβオリゴマーになっていくことを示す図である。
【図１Ｂ】ＰｒＰｃやＥｐｈＢ２を９６ｗｅｌｌプレートに張り付けて、ＡβモノマーやＡβオリゴマーを添加して、そのＡβの結合をＥＬＩＳＡで検出した図である。Ａβモノマーに比べて、Ａβオリゴマーの方がＰｒＰｃに結合しやすいことを示す。
【図１Ｃ】ＡβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合領域の抗体（ＩＣＳＭ３５）を用いると結合が阻害されたことを示す図である。
【図１Ｄ】８４０の候補薬剤を用いてスクリーニングした結果、１５個の候補薬剤が選出されたことを示す図である。
【図２Ａ】１５個の修飾薬剤の内、唯一ＥｐｈＢ２に結合能を示さなかったのがデキストリン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）であることを示す図である。
【図２Ｂ】ＤＳＳ及びデキストランの、ＡβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合に対する阻害作用を示す図である。
【図３Ａ】ＣＯＳ−７細胞に、ＰｒＰｃを遺伝子導入してＰｒＰｃを発現させた結果を示す。Ｍｏｃｋは遺伝子導入のためのベクターのみを導入した細胞。
【図３Ｂ】ＰｒＰｃ発現ＣＯＳ−７細胞は、ＭｏｃｋのＣＯＳ−７細胞と比較して、Ａβオリゴマーの結合能が高いこと；ＡβモノマーはＰｒＰｃ発現ＣＯＳ−７細胞、ＭｏｃｋのＣＯＳ−７細胞共に結合能が低いこと；細胞膜でもＡβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合能の評価は、ＰｒＰｃ発現ＣＯＳ−７細胞を用いることによりできることを示す。
【図３Ｃ】ＰｒＰｃ発現ＣＯＳ−７細胞において、ＤＳＳの用量依存的にＡβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合が抑制されたことを示す。
【図３Ｄ】Ｍｏｃｋでは、Ａβオリゴマーが結合しないこと；ＰｒＰｃ発現ＣＯＳ−７細胞ではＡβオリゴマーが結合している（緑）こと、ＤＳＳの用量依存的にＡβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合が抑制されたこと（緑が薄くなっていく）を示す。
【図４Ａ】Ａβオリゴマーは海馬におけるＬＴＰ誘導を阻害すること；Ａβオリゴマーがもたらす海馬におけるＬＴＰ誘導阻害をＤＳＳは抑制した（Ｆｉｇ．４Ｃの一番右）ことを示す。
【図４Ｂ】Ａβオリゴマーの非存在下において、ＤＳＳ単独では、ＬＴＰ誘導には影響が無かったことを示す。
【図４Ｃ】Ａβオリゴマーの非存在下において、ＤＳＳ単独では、ＬＴＰ誘導には影響が無かったことを示す（図４Ｃの左から２番目）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のアルツハイマー病治療剤の有効成分は、デキストラン硫酸又はその塩である。
【００１６】
デキストラン硫酸は、デキストランの水酸基の一部が硫酸エステル化されたものであり、次の式で表される。
【００１７】
【化１】
2016132619.tif 000002
【００１８】
ここで、デキストランは、スクロースを原料として乳酸菌により発酵させて生産されるグルコースのみからなる多糖類又はその加水分解物である。乳酸菌としては、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓが好ましい。
【００１９】
またデキストラン硫酸の分子量は広く分布しており、平均分子量１６，０００〜５００，０００のものが市販されている。また、ＳＯ3Ｈ基の数は、イオウ含有率として３％〜２０％の範囲であり、３％〜６％のものと、１５％〜２０％のものが市販されている。
【００２０】
デキストラン硫酸の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。このうち、デキストラン硫酸エステルナトリウム塩がより好ましい。
【００２１】
デキストラン硫酸又はその塩としては、デキストラン硫酸ナトリウムが好ましく、特に第１６改正日本薬局方に収載されているデキストラン硫酸エステルナトリウムイオウ１８（イオウ含有率１５〜２０％）、デキストラン硫酸エステルナトリウムイオウ５（イオウ含有率３〜６％）が好ましい。
【００２２】
デキストラン硫酸又はその塩は、後記実施例に示すように、アルツハイマー病の主原因であるＡβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合を阻害し、かつ細胞膜上においてもＡβオリゴマーとＰｒＰｃとの結合を阻害する。さらに、デキストラン硫酸又はその塩は、学習と記憶機能に深く関与している神経細胞の長期増強、特にＡβオリゴマーによる長期増強反応の低下を回復させる作用を有する。従って、デキストラン硫酸又はその塩は、アルツハイマー病治療薬として有用である。デキストラン硫酸又はその塩は、前記のようなＡβオリゴマーに対する作用をするため、アルツハイマー病の神経変性の進行を阻止するとともに、認知機能低下、学習能力の低下等を改善する作用を有する。
【００２３】
本発明のアルツハイマー病治療剤の投与形態としては、注射剤、経口剤（錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤）、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、坐剤等が挙げられる。このうち、経口剤が特に好ましい。これらの医薬組成物の形態とするには、薬学的に許容される担体とともに製剤化することができる。そのような担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ−マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸−水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、デキストラン硫酸又はその塩と混合して使用される。  
【００２４】
さらに、本発明の医薬組成物製剤中における本発明の有効成分の含有量は、製剤の形によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して０．０１〜１００質量％、好ましくは１〜１００質量％である。
【００２５】
本発明のアルツハイマー病治療剤の投与量は、投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、デキストラン硫酸又はその塩として、成人に対して１日あたり１００〜２０００ｍｇであるのが好ましい。またこの投与量は１日に１〜４回に分けて投与することもできる。
【実施例１】
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。
【００２７】
実施例１〜３
Ａ．材料及び方法
（１）材料
ビオチン共役アミロイドβ４２（ビオチン−Ａβ）は、Ａｎａ  Ｓｐｅｃ社製であり、一方、一般的なＡβ４２は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社製であった。Ｈｉｇ−ｔａｇｇｅｄ  ｈｕｍａｎ  ＰｒＰＣは、Ｍｅｒｃｋ社製であった。遺伝子組み換えヒトＥｐｈＢ２は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製であった。ＤＳＳ（平均分子量：５００，０００）及びデキストラン（平均分子量：７０，０００）はＡｐｐｌｉｃｈｅｍ社製であった。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）及びＧ４１８は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製であった。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（ＨＲＰ−ストレプトアビジン）はＧｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ社製であった。ＡＢＴＳ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍは、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製であった。ＰｒＰＣに対する抗体（ＩＣＳＭ１８及びＩＣＳＭ３５）は、Ｄ−Ｇｅｎ社製であった。Ａβに対する抗体（６Ｅ１０）又はアクチンは、それぞれＣｏｖａｎｃｅ社製又はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製であった。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８共役ストレプトアビジン、リポフェクタミン及び血清低減培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製であった。ＶＥＣＴＡＳＨＥＩＬＤは、ＶＥＣＴＯＲ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製であった。ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、フェノールレッドフリーＤＭＥＭ及び１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２プロパノール（ＨＦＩＰ）は、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製であった。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）はＤｏｊｉｎｄｏ社製であった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（生後４〜５週）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社から購入した。
【００２８】
（２）プラスミド
ＰｒＰＣの発現プラスミドの構築のため、ＰｒＰＣ  ｃＤＮＡの全長に相当するＤＮＡフラグメントは、テンプレートとしてＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）細胞のｃＤＮＡライブラリーを用いＰＣＲによって調製した。フラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）のＢａｍＨ１−ＥｃｏＲ１部位に挿入して、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰｒＰＣを構築した。プライマーとして、５’−cgggatcccgaccatggcgaaccttggctg−３’（配列番号１）と５’−ggaattcctcatcccactatcaggaagatg−３’（配列番号２）を使用した。
【００２９】
（３）Ａβモノマー及びオリゴマーの調製
Ａβ４２又はビオチン−Ａβ４２をＨＦＩＰに溶解させ、室温条件下で１時間インキュベートし、その後、氷上で１０分間インキュベートした。ＨＦＩＰを蒸発させ、そしてペプチドを、１０ｍＭの最終濃度でＤＭＳＯに溶解させた。ペプチドをフェノールレッドフリーＤＭＥＭで希釈して、最終濃度１００μＭとし、１０分間の超音波処理（ＡＩＷＡ社製）に付した。
Ａβオリゴマーの調製の場合、上述のサンプルを２２℃で１６時間インキュベートし、２０，４００×ｇにて１５分間遠心分離した。上澄み液を液体窒素（液体Ｎ２）中で凍らせて、−８０℃にて保存した。
ビオチン−Ａβオリゴマーの調製の場合、上述のサンプルを３７℃で１６時間インキュベートし、２０，４００×ｇにて１５分間遠心分離した。上澄み液を液体窒素（液体Ｎ２）中で凍らせて、−８０℃にて保存した。ビオチン−Ａβモノマーの調製の場合、３７℃での１６時間のインキュベートをせず、サンプルを、同様の方法で遠視分離し、そして保存した。
【００３０】
（４）ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーのｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ａｓｓａｙ系
ヒトＰｒＰＣ又はヒトＥｐｈＢ２をＰＢＳに最終濃度０．５μｇ／ｍＬにて溶解させ、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ａｓａｈｉ  Ｇｌａｓｓ社製）に施与し、４℃で一晩放置した。各ウェルを０．０５％のＴｗｅｅｎ８０含有のＰＢＳ（Ｔ−ＰＢＳ）で洗浄し、室温条件下、２％のＢＳＡで１時間ブロックした。各ウェルをＴ−ＰＢＳで洗浄し、そして室温条件下、ビオチン−Ａβ（２００ｎＭ）と各試験薬の両方で、１時間インキュベートした。各ウェルをＴ−ＰＢＳで洗浄し、そして室温条件下、ＰＢＳ（１：２０００希釈）中でＨＲＰ−ストレプトアビジンでインキュベートした。製造手続きに従って、各ウェルをＴ−ＰＢＳで洗浄し、そしてＡＢＴＳ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍに付した。プレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００、ＴＥＣＡＮ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用いて４１２ｎｍの吸光度を測定し、そしてＰｒＰＣに結合するビオチン−Ａβを、下式により計算した。
【００３１】
【数１】
2016132619.tif 000003
【００３２】
（５）細胞培養及びプラスミドトランスフェクション
ＣＯＳ−７（サルの繊維芽細胞）細胞を、３７℃の条件下、９５％空気と５％ＣＯ２の湿気のある環境で１０％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ中において培養した。
ＰｒＰＣ発現細胞の構築のため、細胞を２４ウェルプレートにシードした。製造指針書に従い、リポフェクタミンを用いて、細胞をｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰｒＰＣでトランスフェクションした。ＰｒＰＣを発現するクローンを、免疫ブロッティング分析によって選択した。陽性クローンを、６００μｇ／ｍＬのＧ４１８の存在下で保持した。
【００３３】
（６）免疫ブロッティング分析
各サンプルのタンパク質濃度を、ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法によって測定した。サンプルをポリアクリルアミドＳＤＳゲルに施与し、電気泳動法に付し、その後、各抗体でタンパク質を免疫ブロットした。
【００３４】
（７）ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーのセルベースアッセイ系
ＰｒＰＣを発現するＣＯＳ−７細胞を、２×１０５細胞／ウェルの密度で、コラーゲン被覆９６−ウェルプレートにおいて培養し、そしてビオチン−Ａβ（５００ｎＭ）及び各試験薬で４℃の条件下、１時間インキュベートした。その後、細胞を、室温条件下に４％のＰＦＡと１０分間に亘って固定し、そして室温条件下、メタノール中の０．３％のＨ２Ｏ２で１０分間インキュベートした。細胞をＴ−ＰＢＳで洗浄し、そして室温条件下、２％のＢＳＡで１時間ブロックした。その後、細胞をＴ−ＰＢＳで洗浄し、室温条件下、ＰＢＳ中のＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：２０００希釈）で３０分間インキュベートした。細胞をＴ−ＰＢＳで洗浄し、ＡＢＴＳ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍに付し、モニターした。
【００３５】
（８）免疫ブロッティング分析
ＰｒＰＣを発現するＣＯＳ−７細胞を、５×１０３細胞／ウェルの密度で、８ウェルチャンバースライドにおいて培養し、そして２４時間、プレインキュベートした。細胞をビオチン−Ａβ（５００ｎＭ）及び各試験薬と４℃の条件下、１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、そして室温条件下に４％のＰＦＡと２０分間に亘って固定した。ＰＢＳで洗浄し、そして室温条件下、２％のＢＳＡで３０分間ブロックした後、細胞をＴ−ＰＢＳで洗浄し、そして室温条件下、０．１％のＢＳＡ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．１％のＮａＮ３を含むＰＢＳ中において、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｏ−４８８共役ストレプトアビジン（１：８００希釈）及びＤＡＰＩ（最終濃度で２μｇ／ｍＬ）で１時間インキュベートした。Ｔ−ＰＢＳで洗浄した後、サンプルをＶＥＣＴＡＳＨＥＩＬＤに搭載し、そして共焦点蛍光顕微鏡法（ＦＶ−１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）により、検査した。
【００３６】
（９）電気生理学的分析
マウスに麻酔をかけ、断頭した。脳を取り除き、そして、９５％のＯ２と５％のＣＯ２からなる混合ガスを連続的に泡立てながら、氷冷スクロースベースの人工脳脊髄液（２５２ｍＭのスクロース、３．５ｍＭのＫＣｌ、１．３ｍＭのＭｇＳＯ４、２．４ｍＭのＣａＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、及び１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）に浸した。海馬スライス（３５０μｍ）を、ＬＥＩＣＡ  ＶＴ１２００Ｓビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で作製した。スライスを、室温条件下、人工脳脊髄液（ＡＣＦ）（１２４ｍＭのＮａＣｌ、３．０ｍＭのＫＣｌ、１．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ｍＭのグルコース、及び１．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４）中で１時間インキュベートし、その後、９５％のＯ２と５％のＣＯ２からなる混合ガスを連続的に泡立てながら３０℃で１時間インキュベートした。
長期増強（ＬＴＰ）アッセイのため、スライスを、３０℃のＡＣＦによるかん流の多電極アレイシステム（ＭＥＡ６０  Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ社製）中の記録ディッシュに移した。シャッファー側副路に刺激を与えて、ＣＡ１エリアの放線状層においてフィールド興奮性シナプス後電位（ｆＥＰＳＰ）を誘発させた。０〜１００μＡの二相パルス（各１００μｓ）を施して、刺激誘発半数反応を測定し、これを以下の実験でＬＴＰ誘発を測定するために用いた。単一の二相パルスを施して、ｆＥＰＳＰを３０秒毎に記録した。ＬＴＰを、２列の、１００回の刺激（１００Ｈｚ）と２０秒のインタートレイン間隔からなる高周波刺激（ＨＦＳ）によって誘発させた。ｆＥＰＳＰの傾きを、解析ソフト（ピーク分析、ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析した。
【００３７】
（10）統計的分析
全ての数値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．又はＳ．Ｄ．として表す。テューキー試験に従う一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、３群超の間の差を評価した。差を、Ｐ＜０．０５の値に対して有意とみなした。
【００３８】
Ｂ．結果
（１）ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーの阻害剤のスクリーニング（実施例１）
ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅアッセイ系を用いて、ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーを検出した。ビオチン−Ａβオリゴマーを、ＰｒＰＣ被覆ウェルに施し、洗浄後、付着したＡβオリゴマーを、ＨＲＰストレプトアビジンによって測定した。
ビオチン−Ａβオリゴマーは、３７℃で１６時間のインキュベーションによって調製した。図１Ａに示すように、高分子量の帯域は、インキュベーションの従属形態で観察され、そしてＡβオリゴマー化の度合いは、ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーをレポートした以前の論文で観察されたのと同程度であった。よって、この断片を、以下の実験でＡβオリゴマーとして使用した。
【００３９】
最初に、ＰｒＰＣに対する結合を、Ａβのモノマーの形態とオリゴマーの形態で比較した。図１Ｂに示すように、Ａβモノマーと比較して、ＰｒＰＣに対する高く、有効な結合が、Ａβオリゴマーに関して観察された。更に、ＰｒＰＣのＡβオリゴマー結合ドメインに対する抗体（ＩＣＳＭ３５）は、ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーを阻害した（図１Ｃ）。ＰｒＰＣの別のドメインに対する抗体（ＩＣＳＭ１８）についても、結合を阻害するものの、阻害の程度は、ＩＣＳＭ３５を用いたほど十分ではなかった（図１Ｃ）。これらの結果に基づき、当該ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅアッセイ系を、ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーの阻害剤のスクリーニングに使用可能であったという結論に至った。
【００４０】
臨床で既に使用されている医薬のライブラリーから（８４０種の薬剤）、ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーを抑制することが可能な化合物を選別し、各々の化合物（１０又は１００μＭ）を、Ａβオリゴマーと同時にｃｅｌｌ−ｆｒｅｅアッセイ系に添加し、結合したＡβオリゴマーの量を測定した（図１Ｄ）。
１００μＭでＰｒＰＣに結合する５０％超のＡβオリゴマーを阻害可能であった１５種類の候補化合物を選択した。ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーを特異的に阻害する化合物を選択するために、ＥｐｈＢ２に結合するＡβオリゴマーに対する、これらの候補化合物の効果を試験した。ＤＳＳを除く全ての候補化合物は、ＥｐｈＢ２に結合するＡβオリゴマーに対して阻害効果を示し、そして我々は、以下に記載する更なる実験にＤＳＳを選択した。
【００４１】
Ａβオリゴマー結合に対する阻害効果に関するＤＳＳの用量反応プロファイルを、ＰｒＰＣとエフリン受容体Ｂ２（ＥｐｈＢ２）との間で比較した。図２Ａに示すように、１０μｇ／ｍＬのＤＳＳはＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーを阻害するものの、この薬剤により、１０００μｇ／ｍＬでもＥｐｈＢ２に結合するＡβオリゴマーに影響を与えることができないので、ＤＳＳは、これらの間の結合に対する阻害効果に関し、ＡβオリゴマーよりもＰｒＰＣに対して作用することを示唆している。また、ＤＳＳでのＰｒＰＣのプレインキュベーションにより、ＡβオリゴマーとＰｒＰＣとの結合に対する阻害効果を増強するものの、プレインキュベーション単独では、そのように広く結合を阻害することはできなかったことから、ＤＳＳは、ＰｒＰＣの機能に対して不可逆的に影響を及ぼさないことを示唆している。
ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーに対する阻害効果に関するＤＳＳの重要な構造を試験するために、デキストランの効果を試験した。図２Ｂに示すように、デキストランは、ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーに対して不活性であったことから、ＤＳＳにおける硫酸塩部分が、ＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーに対する阻害効果に重要であることを示唆している。
【００４２】
（２）細胞膜で発現されるＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーに対するＤＳＳの効果（実施例２）
細胞膜で発現されるＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーに対するＤＳＳの効果を試験した。この目的のため、ＰｒＰＣを発現するＣＯＳ−７細胞を準備した。この発現は、免疫ブロッティング分析によって確認された（図３Ａ）。ＰｒＰＣ発現細胞と対照細胞との間で、細胞に結合するＡβオリゴマー又はモノマーの用量反応プロファイルを比較した。図３Ｂに示すように、Ａβオリゴマー結合の高い有効性が、対照細胞よりもＰｒＰＣ発現細胞において観察された。Ａβオリゴマーと比較して、Ａβモノマー結合は、ＰｒＰＣ発現細胞と対照細胞の両方において、低い有効性であった（図３Ｂ）。これらの結果により、当該セルベースアッセイ系は、細胞膜で発現されるＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーに対するＤＳＳの効果を試験するのに適当であることを示唆している。
【００４３】
ＰｒＰＣを発現するＣＯＳ−７細胞と対照細胞に結合するＡβオリゴマーに対するＤＳＳの効果を試験した。図３Ｃに示すように、ＤＳＳは、ＰｒＰＣを発現するＣＯＳ−７細胞に結合するＡβオリゴマーを、用量依存形態で阻害し、そして結合を阻害するのに必要なＤＳＳの濃度は、ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅアッセイ系と同じであった（図２Ａ）。ＤＳＳは、ＰｒＰＣ発現細胞において明らかに見られるように、対照細胞に結合するＡβオリゴマーを阻害しなかった（図３Ｃ）。結果として、細胞に結合するＰｒＰＣ発現依存性Ａβオリゴマーは、ＤＳＳによってほぼ完全に阻害され、すなわち、ＤＳＳの存在下に、Ａβオリゴマー結合は、ＰｒＰＣ発現細胞と対照細胞との間で区別可能であった（図３Ｃ）。
【００４４】
細胞膜で発現されるＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーに対するＤＳＳの効果を免疫染色によって試験した。図３Ｄに示されるように、Ａβを、ＰｒＰＣ発現細胞の細胞膜において検出したものの、対照細胞において検出しなかった。細胞をＤＳＳで処理することにより、プリオン発現細胞中の細胞膜におけるＡβ濃度を、用量依存形態にて低減した。図３における結果は、ＤＳＳにより、細胞膜で発現されるＰｒＰＣに結合するＡβオリゴマーを阻害することを示している。
【００４５】
（３）ＬＴＰ誘導のＡβオリゴマー依存性阻害に対するＤＳＳの効果（実施例３）
Ａβオリゴマーの病理的作用に対するＤＳＳの効果を評価するために、Ａβオリゴマーの存在下、シナプス可逆性に対するＤＳＳの効果を試験することが重要である。この目的のため、海馬スライスにおいて、ＬＴＰ誘導のＡβオリゴマー依存性阻害に対するＤＳＳの効果を試験した。海馬スライスにおけるＬＴＰの誘導は、ＨＦＳ後のｆＥＰＳＰの傾きによって判断した。図４Ａ及び４Ｃに示すように、Ａβオリゴマーでの海馬スライスのプレインキュベーションにより、ＬＴＰ誘導を阻害した（ＨＦＳ後、ｆＥＰＳＰの傾きが連続的に増大した）。Ａβオリゴマーの存在下、プレインキュベーション工程段階でＤＤＳにてスライスをｓｉｍｕｌｔａｎｏｕｅ処理することにより、ＬＴＰ誘導を修復した（図４Ａ及びＣ）。一方、ＤＳＳは、Ａβオリゴマーの不在下でＬＴＰ誘導に影響を及ぼさなかった（図４Ｂ及びＣ）。これらの結果から、ＤＳＳは、Ａβオリゴマーの存在下でＬＴＰ誘導を、おそらくＡβオリゴマーとＰｒＰＣとの間の結合に対する阻害効果によって修復可能であったことを示唆している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【配列表】
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