(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
同時に一定量ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラーと、それに結合された分岐ラインに結合し、分離基材上に塩基配列を合成によって得られた、それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を固定した、一体構造をしたモノリス型カラムからなるアフィニティーカラムの複数に、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラムにサンプルを一斉ロード、一斉検出することを特徴とするマルチカラム・アフィニティー検出システム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば遺伝子診断及び生理機能診断等に使用される、多数の機能分子の認識を可能にするアフィニティー検出システムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出するアフィニティー法検出は、大変鋭敏な検出法であり、例えば特定の酵素を用いて特定のタンパクを検出するアフィニティーカラムとして、液体クロマトグラフにおいて用いられてきた。しかしながら、この液体クロマトグラフ法におけるアフィニティー法は、特定の分子のみの情報を与えるにすぎず、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段にはなっていない。
【０００３】
現在、例えば遺伝子の変異、特に一塩基（配列）の変異による多型の検出は、突然変異に起因する疾患、例えば、ガンの診断等に有効なだけでなく、薬剤応答性や副作用の指針に必要であり、多因子疾患の病因関連遺伝子の解析や予測医療にも貢献する。この検出にアフィニティー法の一種である、いわゆるＤＮＡチップの使用が有効であることが知られている。従来利用されてきた、短いＤＮＡ鎖を固定化したＤＮＡチップ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のいわゆるＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐは、通常約１ｃｍ角のシリコンもしくはガラス基板上に、フォトリソグラフィー技術を用いて１万以上のオリゴＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）を作り込んだものである。このＤＮＡチップ上に、たとえば蛍光標識した、調べたいＤＮＡ資料を流すと、上記ＤＮＡチップ上のプローブと相補的な配列を有するＤＮＡ断片はプローブと結合し、その部分だけが蛍光により識別でき、ＤＮＡ試料中のＤＮＡ断片の特定配列を認識・定量することができる。この方法により、既に、ガン遺伝子の突然変異の検出や、遺伝子多型の検出が可能であることが示されている。
また、ｃＤＮＡをスライドガラス上に配列したマイクロアレーも用いられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これらのチップ化したアフィニティー法は、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段として大変有効であるが、反面、エリアが小さいことなどから充分な信号強度がとれないことなどから、液体クロマトグラフ法などで用いられるような吸光分析は使えず、もっぱら蛍光検出による高感度分析を用いており、特定の領域での分析に使えるだけであった。従って、いわゆるプロテオーム分析においては、二次元電気泳動などの手段で分析するほかなかった。
また、液体クロマトグラフィーにおけるアフィニティー法では、特定の分子に関する情報が得られるが、多数の分子に対する情報を同時に得ることは困難であった。
【０００５】
従って、特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出するだけではなく、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段であり、かつ無理なく高感度分析ができる検出手段が求められている。
本発明は、このような従来の課題に鑑みてなされたものであり、充分な信号強度がとれ、蛍光検出に伴う困難さを低減した、反応性プローブ物質を用い、多数の分子について同時にその存在を高感度分析できるマルチカラム・アフィニティー検出システムを提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、下記手段により上記課題を解決できる。
（１）同時に一定量ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラーと、それに結合された分岐ラインに結合し、分離基材上に塩基配列を合成によって得られた、それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を固定した、一体構造をしたモノリス型カラムからなるアフィニティーカラムの複数に、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラムにサンプルを一斉ロード、一斉検出することを特徴とするマルチカラム・アフィニティー検出システム。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
（マルチカラム・アフィニティー検出システム）
図１は、マルチカラム・アフィニティー検出システムの２つのイメージを示す。  一個のカラム１は、それぞれ一種類の特異的反応プローブ（「プローブ分子」ともいう）２（図２参照）を固定しており、特定の反応性を持った物質と特異的親和性を示す。例えば、特定の抗体をプローブ分子２としたとき、これに反応する抗原は、強くこのプローブ分子２と吸着する。従って、通常の溶離条件に於いては溶出することなく、例えば保持を維持できなくなるような溶媒濃度下もしくは塩の存在下、あるいはｐＨ条件によってしか溶出してこない。通常の液体クロマトグラフにおけるアフィニティーカラムの場合、この現象を用いて、特定の酵素を濃縮するなどの手段として用いられてきた。
【０００９】
しかしながら、アフィニティー法クロマトグラムの場合、特異的吸着を起こすことだけに注目すれば、その分子の存在を示すのに、従来のように溶出させることを前提とせず、特異的保持することだけに着目した分離モードがあっても良い。しかもこのモードに於いては、極めて保持容量の小さなカラム１を用いることが好ましく、分離基材が膜状である、いわゆるメンブレンクロマトグラフ、あるいは一体化分離基材であるモノリスカラムシステムを用いることができるが、通常の充填型カラムを用いても良いことはいうまでもない。
また、この検出法としては、カラム１に分析対象分子を一定量ロードしたときに非保持物質として溶出するか、あるいは保持されてしまうことを利用したネガティブデータを利用し、特定の構造を持つ分子を検出することに特化したカラムを用いることに特徴があり、特定分子に特化したプローブ分子２が固定化された複数のカラム１をマルチに使用することを特徴とする。
【００１０】
プローブ分子２としては、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびその断片、任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチド、抗原、抗体あるいはエピトープ、酵素、タンパク質あるいはその機能部位ポリペプチド鎖を用い、ｃＤＮＡあるいは各種タンパクを検出することに使用出来るが、いわゆるアフィニティー法に属する検出プローブ及び対象物の組み合わせであれば、これら以外の組み合わせも使用できる。
【００１１】
また、ここで言う分離材が膜状である、いわゆるメンブレンクロマトグラフの素材は、ガラス繊維不織布、ガラス繊維ろ紙などの無機素材、再生セルロースメンブレン、アセテートメンブレンなどであり、上記プローブ分子２を固定出来るものであれば形態・素材を問わず、あるいはプローブ分子２を固定した粒子を固定しても良い。これらのメンブレンカラムの場合、厚さは好ましくは０．１〜１ｍｍ程度であり、直径５ｍｍ程度で何らかの方法でカラムに保持されていればよい。
【００１２】
一体化分離基材であるモノリスカラムシステムの場合、多孔質ガラス柱状体、ポリマー焼結体が使用でき、サイズは厚さ２〜５ｍｍ、直径２〜５ｍｍ程度が好ましく、特に厚さ３〜４ｍｍ、直径３〜４ｍｍが好ましいが、当然これ以下の大きさであれ以上であれ使用できる。例えば、モノリスカラムの場合、厚さ４ｍｍ、直径４ｍｍの一体の多孔質ガラス柱状体を用いるとき、これは周囲を合成樹脂製の筒状体ないしリング状体で囲み、それを筒状体のホルダーに入れてカラムを形成するが、前記の多孔質ガラス柱状体は内部がほぼ同一内径の連通孔を有しているため、液体クロマトグラフ法において極めて大きい分離段数を得ることができるものであり、優れている。このカラムは極めて小型でコストも僅かなため、多数個のカラムを組み合わせても全体のシステムのコストは安いものとなる。
カラム１は、１個ずつ独立したものを多数組み合わせても良いが集合し一体化したものでも良い。
【００１３】
サンプルの導入検出法としては、（ａ）連続的に作動するサンプラー３と連動した切り替えバルブ４と切り替えられたラインに結合し、それぞれに異なった特異な結合反応を起こすプローブ分子２を固定した複数のカラム１に、同一のサンプルを同一量ずつ順次導入し、これを合流させた後に一個の検出器５に導入することにより、異なった複数のカラム１にサンプルを順次ロード、順次検出する方法、あるいは（ｂ）同時に一定量ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラー（分配サンプラー）６と、それに結合された分岐ラインからそれぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子２を固定した複数のカラム１に、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラム１にサンプルを一斉検出する方法のいずれを採用しても良く、前者（ａ）はコストメリット、後者（ｂ）は短時間検出という特徴を持つ。
【００１４】
図２は、この分離基材１１内部にプローブ分子を固定したものの概念図である。図２は、分離基材１１として多孔質ガラスを用いた場合の例であり、多孔質ガラスは多数の均一な内径をもつ細孔１４を有しており、細孔１４の内面にプローブ分子２が固定されている。図３及び４は、これらのプローブ分子２の固定方法を示す図であるが、例えば、いわゆるｃＤＮＡとして知られているプローブ分子２を固定するときには、何らかのリンカー７を用い、分離基材１１内部に固定すればよい。なお、このとき分離基材１１はたくさんの単独分離基材１１をまとめて、反応容器中で同時に結合反応させることができるので大変効率がよく、また、これらの分離基材１１は同一の品質が保たれることから、抜き取り検査によりプローブの担持量など管理しやすい。
【００１５】
同じく、いわゆるオリゴヌクレオチドをプローブ分子２として使用する場合は、例えばホスホアミダイト法として知られる手法を用いて、分離基材１１内部に塩基配列を合成していけばよく、これもたくさんの単独分離基材をまとめて、反応容器中で同時に結合反応させることができるので大変効率がよく、また、これらの分離基材１１は同一の品質が保たれることから、抜き取り検査によりプローブ２の担持量などを管理しやすいだけでなく、切り出し精製などの必要がなく、低コストで作製できる。また比較的大きな孔の中で合成するために、１００塩基などある程度大きなオリゴヌクレオチドプローブも容易に作製することができる。なお、８は塩基ブロックである。図５はこれらの各種分離基材１１をカラムに装着する工程を示した概念図であるが、機械的に組み合わせて大きな束にして配列させるが、どのプローブ分子を固定したカラムがどの位置にくるかが、明確化されなければならない。図５中、９はＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）リング、１０はホルダーである。
【００１６】
（反応）
アフィニティー検出分析チップへのサンプルの反応は、図６に示すように順次カラム１にサンプルが導入されることによりおこる。この際、図７に示すようにサンプル１２はカラム１内部を流れ、特異反応があればカラム分離基材１１内部にある細孔１４に保持される。この際流すサンプルに、吸収が無ければ、何らかの標識染料１３により染色してもよく、場合によれば蛍光剤によりラベルしてもよい。
【００１７】
（検出）
通常のクロマトグラフ分析においては、経時的なサンプルの溶出を検出することにより、検出対象物を特定する、あるいは溶離液の組成を変化させて、それに伴う溶出を検出することが検出の要点であった。その中で、これまでカラムに強く吸着されて溶出しない現象は、カラム劣化の視点でしか捉えられてこなかった。
しかしながら、本発明者は、アフィニティー条件下での検出に於いてはカラムに吸着されてしまう現象そのものが検出に役立つことに思い至った。即ち、反応したカラム１からはサンプル１２が溶出しない、あるいは一定の保持挙動を示す。従って特定分子に対するアフィニティーカラムに於いては対象分子が特定される。またこの際、特定の分子に対する吸着現象は極めて短いカラムで検出可能である。もちろん、場合によっては、保持させた後、アフィニティー条件を解消し溶出する条件で溶出する分子を検出しても良く、カラムを再生して繰り返し使用することも可能である。
【００１８】
（システム及び装置）
本発明のシステム及び装置は、以上述べた検出システムを実行する、サンプル１２を、それぞれ特定のプローブ分子２を持ったカラム１に正確に導入し、検出データを管理するコンピューターを備えた検出システムと装置である。
【００１９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに説明する。ただし、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものでない。
【００２０】
実施例１
細孔の内径２ミクロン、全体の大きさが直径４ｍｍ、長さ４ｍｍの多孔質ガラス製分離基材をアミノ化処理した後、グルタルアルデヒドをリンカーとして各種ライブラリーから得たｃＤＮＡを結合した。これをポリテトラフルオロエチレンフロンリングを用いてステンレス製ホルダーに固定したモノリスカラムを５０個用意し、連続的に作動するサンプラーと連動した切り替えバルブと切り替えられたラインに結合した。
これに、蛍光標識を付けた対象ｃＤＮＡを流した。特定のカラムから溶出しなかった。
【００２１】
実施例２
フィラメント径５ミクロンのガラス繊維ろ紙を活性化させ、アミノ化処理した後、コハク酸をリンカーとしてホスホアミダイト法を用いて、各種の５０塩基のオリゴヌクレオチドを合成した。これを１０枚重ねた構造のホルダーに固定しメンブランカラムを１００個用意し、同時に一定ずつ分割して供給することが可能なスプリット型サンプラーとそれに結合された分岐ラインに結合し、それぞれに異なった特異的な結合反応を起こすプローブ分子を固定した複数のカラムに、同一のサンプルを同一量ずつ同時に導入し、これを個別の検出器に導入することにより、異なった複数のカラムにサンプルを一斉ロード、一斉検出した。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、フォトリソグラフィー設備等の特別な設備を要することなく、任意の構成を持つタンパク質もしくは任意の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドなどの反応性プローブ物質、すなわち、特定の分子と選択的に結合する物質を用い、それに対応する物質を選択的に検出するだけではなく、多数の分子について同時にその存在情報を与える分析手段であり、かつ無理なく高感度分析ができ、検出速度が大きい検出手段を容易に提供することができる。
【００２３】
また、各種反応性物質を担持したカラムを準備しておけば、様々な種類の反応性物質プローブを固定化したアフィニティー検出分析システムを、必要なときに必要な組み合わせでより簡便に供給できる。本発明は、さらに低コストかつ安定性の高いアフィニティー検出分析システムを提供することができる。従って、各個人の必要に対応したＤＮＡなどのアフィニティー検出分析システムの作製が可能となり、オーダーメイドの医療に貢献できる。
【００２４】
また、より高感度かつサンプルに負担のない検出、すなわちサンプルの蛍光指示薬とのマッチング等が不要であったり、各種色素を同時に使用できることから、同時多種分析法が可能になったり、これまでのいわゆるＤＮＡチップと異なり、タンパク検出など新しい領域の検出手段を与えるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマルチカラム・アフィニティー検出システムの全体イメージ像を示す説明図で、（ａ），（ｂ）ともマルチカラムとサンプル導入部及び検出概念の説明図である。
【図２】本発明のアフィニティー検出システムの内部にプローブ分子が固定されたカラムの概念図である。
【図３】分離基材内部へのブローブ分子、ｃＤＮＡの固定を示す概念図である。
【図４】分離基材内部へのブローブ分子、オリゴヌクレオチドの固定を示す概念図である。
【図５】分離基材のホルダーへの装着法の一例を示す概念説明図である。
【図６】アフィニティー検出システムへのサンプル導入の一例を示す概念図である。
【図７】システムを構成する単カラム中の分離基材へのサンプルのアフィニティー結合操作を説明する斜視図である。
【符号の説明】
１    カラム
２    プローブ分子
３    サンプラー
４    切り替えバルブ
５    検出器
６    分配サンプラー
７    リンカー
８    塩基ブロック
９    ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）リング
１０Ａ  上部ホルダー
１０Ｂ  下部ホルダー
１１    分離基材
１１Ａ  モノリス型分離基材
１２    サンプル
１３    標識染料
１４    細孔
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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