(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非イオン性リン酸緩衝剤，
血清であるブロッキング剤，
グリセロールである可溶化剤，
塩化カリウム，塩化ナトリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群より選択される塩，
ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡからなる群より選択されるキレート化剤，
ＣＨＡＰＳ，コール酸，デオキシコール酸，ジギトニン，ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド，グリコデオキシコール酸，ｎ−ラウロイルサルコシン，硫酸ラウリル，サポニン，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，およびポリエチレングリコールＰ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェニルエーテルからなる群より選択される界面活性剤，および
臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよび抗生物質からなる群より選択される保存剤，
を含む，抗原またはポリペプチドを安定化するための水性試薬であって，ここで，前記試薬は，Ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシンまたはデカノイルＮ−メチルグルコンアミドを含まず，前記試薬は７．５乃至８．５の最終ｐＨである，
ことを特徴とする水性試薬。
【請求項２】
前記ブロッキング剤がウシ胎児血清である請求項１の水性試薬。
【請求項３】
前記塩が塩化ナトリウムである請求項１の水性試薬。
【請求項４】
前記キレート化剤がＥＤＴＡである請求項１の水性試薬。
【請求項５】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである請求項１の水性試薬。
【請求項６】
前記保存剤が臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよびゲンタマイシンである請求項１の水性試薬。
【請求項７】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである請求項１の水性試薬。
【請求項８】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムであり，前記ブロッキング剤がウシ胎児血清であり，前記可溶化剤がグリセロールであり，前記塩が塩化ナトリウムであり，前記キレート剤がＥＤＴＡであり，前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートであり，前記保存剤が臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよびゲンタマイシンである請求項１の水性試薬。
【請求項９】
組織培養培地をさらに含む請求項１の水性試薬。
【請求項１０】
前記組織培養培地がイーグル最小必須培地である請求項９の水性試薬。
【請求項１１】
水性試薬が５０ｍＭと１００ｍＭの間の非イオン性リン酸緩衝剤と，２％と２０％ｖ／ｖの間の血清と，２．５％と１０％ｖ／ｖの間のグリセロールと，５０ｍＭと２Ｍの間の塩と，１０ｍＭと１５ｍＭの間のキレート剤と，０．０５％と０．１％ｖ／ｖの間の界面活性剤と，０．０１％ｗ／ｖと０．５％ｗ／ｖの間の保存剤とを７．５乃至８．５の最終ｐＨで含む請求項１の水性試薬。
【請求項１２】
水性試薬が５０ｍＭと１００ｍＭの間のリン酸ナトリウムと，２％と２０％ｖ／ｖの間のウシ胎児血清と，２．５％と１０％ｖ／ｖの間のグリセロールと，５０ｍＭと２Ｍの間の塩化ナトリウムと，１０ｍＭと１５ｍＭの間のＥＤＴＡと，０．０５％と０．１％ｖ／ｖの間のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートと，０．０１％ｗ／ｖの臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムと，０．５％ｗ／ｖの硫酸ゲンタマイシンとを７．５乃至８．５の最終ｐＨで含む請求項１の水性試薬。
【請求項１３】
溶液中の抗原またはポリペプチドを安定化する方法であって，
非イオン性リン酸緩衝剤，
血清であるブロッキング剤，
グリセロールである可溶化剤，
塩化カリウム，塩化ナトリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群より選択される塩，
ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡからなる群より選択されるキレート化剤，
ＣＨＡＰＳ，コール酸，デオキシコール酸，ジギトニン，ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド，グリコデオキシコール酸，ｎ−ラウロイルサルコシン，硫酸ラウリル，サポニン，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，およびポリエチレングリコールＰ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェニルエーテルからなる群より選択される界面活性剤，および
からなる群より選択される臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよび抗生物質保存剤，
を含む水性試薬に抗原またはポリペプチドを配置することを含み，
ここで，前記試薬はＮ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシンまたはデカノイルＮ−メチルグルコンアミドを含まず，前記試薬は７．５乃至８．５の最終ｐＨである，
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記ブロッキング剤がウシ胎児血清である請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記抗原またはポリペプチドが微生物由来である請求項１３の方法。
【請求項１６】
前記微生物がウイルスである請求項１５の方法。
【請求項１７】
前記微生物が細菌である請求項１５の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスがインフルエンザである請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記インフルエンザがインフルエンザＢである請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記抗原がポリペプチドである請求項１３の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが核タンパク質である請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記水性試薬が組織培養培地をさらに含む請求項１３の方法。
【請求項２３】
前記組織培養培地が最小必須培地である請求項２２の方法。
【請求項２４】
水性溶液中の安定化した抗原またはポリペプチドを検出する方法であって，
ａ）非イオン性リン酸緩衝剤，
血清であるブロッキング剤，
グリセロールである可溶化剤，
塩化カリウム，塩化ナトリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群より選択される塩，
ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡからなる群より選択されるキレート化剤，
ＣＨＡＰＳ，コール酸，デオキシコール酸，ジギトニン，ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド，グリコデオキシコール酸，ｎ−ラウロイルサルコシン，硫酸ラウリル，サポニン，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，およびポリエチレングリコールＰ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェニルエーテルからなる群より選択される界面活性剤，および
臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよび抗生物質からなる群より選択される保存剤，
を含む水性試薬に抗原またはポリペプチドを配置し，
ここで，試薬はＮ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシンまたはデカノイルＮ−メチルグルコンアミドを含まず，前記試薬は７．５乃至８．５の最終ｐＨであり；そして
ｂ）分析法を用いて前記抗原またはポリペプチドを検出する，
ことを含む方法。
【請求項２５】
前記ブロッキング剤がウシ胎児血清である請求項２４の方法。
【請求項２６】
分析法が免疫測定法である請求項２４の方法。
【請求項２７】
免疫測定法が酵素免疫測定法である請求項２６の方法。
【請求項２８】
免疫測定法が光学的免疫測定法である請求項２６の方法。
【請求項２９】
分析法が核酸ハイブリダイゼーション法である請求項２４の方法。
【請求項３０】
その中で抗原またはポリペプチドを安定化するための水性試薬であって，
非イオン性リン酸緩衝剤，
血清であるブロッキング剤，
グリセロールである可溶化剤，
塩化カリウム，塩化ナトリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群より選択される塩，
ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡからなる群より選択されるキレート化剤，
ＣＨＡＰＳ，コール酸，デオキシコール酸，ジギトニン，ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド，グリコデオキシコール酸，ｎ−ラウロイルサルコシン，硫酸ラウリル，サポニン，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，およびポリエチレングリコールＰ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェニルエーテルからなる群より選択される界面活性剤，および
臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよび抗生物質からなる群より選択される保存剤，
を含み，ここで，前記試薬はＮ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシンまたはデカノイルＮ−メチルグルコンアミドを含まず，前記試薬は７．５乃至８．５の最終ｐＨであることを特徴とする水性試薬。
【請求項３１】
前記ブロッキング剤がウシ胎児血清である請求項３０の水性試薬。
【請求項３２】
前記抗原またはポリペプチドをさらに含む請求項３０の水性試薬。
【請求項３３】
抗原またはポリペプチドが微生物由来である請求項３２の水性試薬。
【請求項３４】
前記微生物がウイルスである請求項３３の水性試薬。
【請求項３５】
前記微生物が細菌である請求項３３の水性試薬。
【請求項３６】
前記ウイルスがインフルエンザである請求項３４の水性試薬。
【請求項３７】
前記インフルエンザがインフルエンザＢである請求項３６の水性試薬。
【請求項３８】
前記抗原が核タンパク質である請求項３２の水性試薬。
【請求項３９】
微生物の懸濁液を安定化するための水性試薬であって，前記試薬は，
非イオン性リン酸緩衝剤，
血清であるブロッキング剤，
グリセロールである可溶化剤，
塩化カリウム，塩化ナトリウム，塩化マグネシウム，硫酸マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群より選択される塩，
ＥＧＴＡおよびＥＤＴＡからなる群より選択されるキレート化剤，
ＣＨＡＰＳ，コール酸，デオキシコール酸，ジギトニン，ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド，グリコデオキシコール酸，ｎ−ラウロイルサルコシン，硫酸ラウリル，サポニン，ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート，およびポリエチレングリコールＰ−１，１，３，３−テトラメチルブチルフェニルエーテルからなる群より選択される界面活性剤，および
臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよび抗生物質からなる群より選択される保存剤，
を含み，ここで，前記試薬はＮ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシンまたはデカノイルＮ−メチルグルコンアミドを含まず，前記試薬は７．５乃至８．５の最終ｐＨであることを特徴とする水性試薬。
【請求項４０】
前記微生物がウイルスである請求項３９の水性試薬。
【請求項４１】
前記微生物が細菌である請求項３９の水性試薬。
【請求項４２】
前記ウイルスがインフルエンザである請求項４０の水性試薬。
【請求項４３】
前記インフルエンザがインフルエンザＢである請求項４２の水性試薬。
【請求項４４】
前記ブロッキング剤がウシ胎児血清である請求項３９の水性試薬。
【請求項４５】
前記塩が塩化ナトリウムである請求項３９の水性試薬。
【請求項４６】
前記キレート化剤がＥＤＴＡである請求項３９の水性試薬。
【請求項４７】
前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである請求項３９の水性試薬。
【請求項４８】
前記保存剤が臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよびゲンタマイシンである請求項３９の水性試薬。
【請求項４９】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムである請求項３９の水性試薬。
【請求項５０】
前記緩衝剤がリン酸ナトリウムであり，前記ブロッキング剤がウシ胎児血清であり，前記可溶化剤がグリセロールであり，前記塩が塩化ナトリウムであり，前記キレート剤がＥＤＴＡであり，前記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートであり，前記保存剤が臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムおよびゲンタマイシンである請求項３９の水性試薬。
【請求項５１】
組織培養培地をさらに含む請求項３９の水性試薬。
【請求項５２】
前記組織培養培地がイーグル最小必須培地である請求項５１の水性試薬。
【請求項５３】
水性試薬が５０ｍＭと１００ｍＭの間の非イオン性リン酸緩衝剤と，２％と２０％ｖ／ｖの間の血清と，２．５％と１０％ｖ／ｖの間のグリセロールと，５０ｍＭと２Ｍの間の塩と，１０ｍＭと１５ｍＭの間のキレート剤と，０．０５％と０．１％ｖ／ｖの間の界面活性剤と，０．０１％ｗ／ｖと０．５％ｗ／ｖの間の保存剤とを７．５乃至８．５の最終ｐＨで含む請求項３９の水性試薬。
【請求項５４】
水性試薬が５０ｍＭと１００ｍＭの間のリン酸ナトリウムと，２％と２０％ｖ／ｖの間のウシ胎児血清と，２．５％と１０％ｖ／ｖの間のグリセロールと，５０ｍＭと２Ｍの間の塩化ナトリウムと，１０ｍＭと１５ｍＭの間のＥＤＴＡと，０．０５％と０．１％ｖ／ｖの間のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートと，０．０１％ｗ／ｖの臭化トリメチルテトラデシルアンモニウムと，０．５％ｗ／ｖの硫酸ゲンタマイシンとを７．５乃至８．５の最終ｐＨで含む請求項３９の水性試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ポリペプチドおよび抗原を安定化するために有用な水性組成物に関する。安定化されたポリペプチドおよび抗原は、抗原特異的検出などの分析法のほか、水溶液中でかかる成分の安定化が望まれる他の薬学用途において有用である。
【０００２】
（背景技術）
以下は、本明細書中に開示される発明に潜在的に関連している文献の考察である。しかし、本明細書中で考察される引例を先行技術であると認めるものではない。
【０００３】
水溶液中のポリペプチドおよび抗原の安定化は困難である場合が多い。例えば、かかる溶液の長期間にわたる室温での貯蔵の結果として、水溶液中に含まれるポリペプチドおよび抗原が劣化する。特に、細菌、ウイルスおよび他の微生物の抗原は、水性培地中に貯蔵すると不安定であることが明らかにされている。その一例が、広範囲の貯蔵温度で時間の経過とともに分解する抗原を含むオルソミクソウイルス科のインフルエンザウイルスなどの、エンベロープを有するウイルスである。当業者は、さまざまな細菌の抗原、例えばある種の毒素の溶液中の安定化も困難であることを理解している。水溶液中での劣化を回避するために、当業者はポリペプチドまたは抗原を保存するための方法として凍結乾燥および凍結を用いている。実際には、凍結乾燥および凍結の広範な使用は、水溶液中でかかる成分を保存する欠点および困難を示している。
【０００４】
当業界の多数の刊行物は、凍結乾燥された試薬の安定性を増大させる手段、および同技術水準内でも固有な困難を開示している。例えば、米国特許第５，９５５，４４８号、第４，４９６，５３７号、およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／０４８０１はすべて凍結乾燥法における改善を開示している。しかし、タンパク質を含有する溶液の凍結乾燥は、多大なコストや製造者および最終消費者に不便を課すほか、再構成エラーや汚染のリスク増大をもたらす。また、溶液の凍結は特殊な装置を必要とし、頻繁に繰り返すと最終的にタンパク質の分解につながりうる。商業用途としては、水溶液中のポリペプチドおよび抗原の劣化は、かかる溶液がわずかに短い貯蔵寿命後に交換を必要とするため損失が大きい。
【０００５】
本発明は、溶液中のポリペプチドおよび他の非タンパク質性化合物の安定性を増強する水性安定化試薬または希釈液に関する。炭水化物、タンパク質、リポタンパク質、リポ多糖類、多糖類、核酸、核タンパク質のほか、タンパク質、脂質、および他の成分と複合した炭水化物などの抗原は、本発明を用いて安定化されうる種類の抗原の実例である。新規の試薬成分を用いることにより、本発明は現在市販の希釈液または当業界において記載された希釈液におけるポリペプチドおよび抗原の安定性を改善する。本発明は、かかる成分の安定な水溶液を必要とする診断的分析または他の用途における対照試薬として用いられる抗原およびポリペプチドを安定化するために特に有用である。本発明の安定化希釈液は、長時間にわたり約２°〜８℃、室温および約４５℃の温度で貯蔵するためのポリペプチドおよび抗原を安定化するために有用である。
【０００６】
ＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／１５９０１は、抗原、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗原の安定化のための希釈液を開示している。このＨＣＶ希釈液は、ＨＣＶ抗原を還元型で維持する還元剤を含む。同出願は、希釈液中に還元剤を含めることにより７日間までＨＣＶ抗原の免疫反応性が維持されたことを報告している。報告された希釈液は、ｐＨ６．５のリン酸ナトリウム（または他の緩衝剤）、ＥＤＴＡ（または他のキレート剤）、ＤＴＴ（または他の還元剤）、ゼラチン（または他のタンパク質ブロッキング源）、チオシアン酸アンモニウム（または他のカオトロピック剤）、アジ化ナトリウム（または他の保存剤）およびＳＤＳ（または他の界面活性剤）をさらに含む。しかし、希釈液中の還元剤の包含は、他の微生物由来の多くの抗原の安定性において無効であり、またはこれに対して有害でありうる。
【０００７】
米国特許第４，９５６，２７４号は、相補性分析において使用するためのβ−ガラクトシダーゼ由来のペプチド断片を安定化するための方法に関する。米国特許第４，９５６，２７４号に開示された溶液は、イオン界面活性剤または糖残基由来の界面活性剤を含み、β−ガラクトシダーゼペプチド断片の分解を遅延させた。しかし、これらの界面活性剤は酵素断片も変性させるため、除去または中和して、酵素断片がその正確な高次構造に戻って酵素活性を回復することを可能とする必要があった。このことは、溶液が未変性の形態のタンパク質を安定化しなかったことを示す。これらの界面活性剤は、シクロデキストリンを用いることにより分析の直前に中和される。あるいは、界面活性剤の作用は高濃度の血清でマスクされた。開示された試薬の別の成分にはキレート化剤、緩衝剤、殺菌剤、マグネシウムまたは他のイオン、還元剤、エチレングリコールのような溶媒などの可溶化剤、および非イオン性界面活性剤が含まれていた。当業者には明らかであるように、タンパク質または酵素断片の変性および再生は一部の抗原エピト−プを損傷し、それらを不活性にすることがありうる。
【０００８】
米国特許第５，４５９，０３３号は、ウイルスの凝集を予防するために有用な溶液を開示している。この溶液は、Ｎ−ラウリルサルコシンまたは他の陰イオン界面活性剤を含有することが報告された。この溶液は、ウイルス粒子、特に肝炎ウイルスおよびヘルペスウイルスが疎水的誘引により凝集し感度を低下させるという仮定に基づき安定性を増強すると述べられた。この希釈液は抗原の触媒活性または免疫原性を改善または保存することは報告されていないが、凝集を阻止することが報告された。また、溶液が使用できる前に、１５時間乃至１０日間、２〜３５℃でインキュべートし、一貫した安定性を確保する必要があることが報告されており、これは最終産物の製造可能性に対する重要な制限を付加する。
【０００９】
米国特許第５，６６０，９７８号は、抗原の濃縮溶液（血清など）の中に抗原特異的抗体またはその一部（特にＦａｂ）を組み入れてタンパク質分解または酸化を阻止することにより、抗原、具体的には変動性タンパク質抗原、特に酵素を安定化する方法を開示している。血清または非特異的ＩｇＧの導入は、かかる希釈液の所望の保護または保護の特異性を提供することが期待されない。さらに、安定化は希釈液中に抗原を配置する前に完了した。これに対し、本発明は希釈液そのものにより安定化される。また、本発明は、この特許発明が示す段階ではなく、最初から比較的希薄な溶液を安定化する。抗原を構造的に安定化する抗体の使用は、１つまたはそれ以上の抗原性部位が免疫学的測定法の標的である場合は特に問題となろう。また、当業者は、抗原を高次構造的に保存するが特異的酵素活性を阻害しない、’９７８号特許に開示されたものなどの希釈液を一貫して製造することは困難であろう。この発明は、本質的に、化学的固定液の代わりに、固定試薬として抗体タンパク質を利用しているため、真に安定化希釈液を記載するものではない。
【００１０】
Ｌａｎｄｉ，ＳおよびＨｅｌｄ，ＨＲ（Ｔｕｂｅｒｃｌｅ５９（１９７８）１２１−１３３）は、希釈溶液中へのＴｗｅｅｎ−８０の添加を報告し、ツベルクリンＰＰＤの安定性がこの添加により界面活性剤の抗吸着性のため増強されることを示した。Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＬＴＤにより製造されたツベルクリン調製物は、ツベルクリンＰＰＤ、０．３％のフェノール（保存剤として作用すると報告されている）、およびＰＢＳ中０．０００５％のＴｗｅｅｎ−８０を含有する。フェノールは本発明においては容認できない有害物質であり、一部のタンパク質を変性させる可能性がある。
【００１１】
希釈液の処方および凍結乾燥貯蔵法における利点にもかかわらず、溶液中に貯蔵されたさまざまなポリペプチドおよび抗原、特に微生物由来の抗原の長期の安定性を十分に改善する希釈液が依然として必要とされている。
【００１２】
（発明の要約）
本発明はポリペプチドおよび抗原を安定化するための試薬を特徴とする。この試薬は分析法において用いられる対照または基準の抗原の安定化のために特に有用である。炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド断片、リポタンパク質、リポ多糖類、多糖類、核酸、核タンパク質のほか、ポリペプチド、脂質、および他の化合物と複合した炭水化物などの抗原は、本発明を用いて安定化されうる種類の抗原の実例である。
【００１３】
開示された試薬は、低温および高温の両方でポリペプチドおよび抗原の安定性のための以前の調製物を凌ぐものである。ポリペプチドおよび抗原を可溶性型の試薬中で長時間にわたり、約０．５℃乃至約５０℃以上、好ましくは約２〜８℃、約室温（一般的には約２３℃乃至約２８℃であり、２５℃が特に好ましい）および約４２℃乃至約４３℃、特に約４５℃のさまざまな温度で貯蔵することができる。４５℃での安定性は抗原の長期安定性を提供する試薬の能力を予測的に示している。また、開示された試薬は、ポリペプチドおよび抗原を安定化する目的のための単一の水溶液である利点を有する。
【００１４】
第１の態様において、本発明はポリペプチドまたは抗原の安定性を増強する水性試薬組成物を特徴とする。ある好ましい実施態様において、試薬は１つまたはそれ以上の以下のものを含む：緩衝剤、ブロッキング剤、溶剤、塩、キレート剤、界面活性剤、および保存剤。試薬はＮ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシンまたはデカノイル−Ｎ−メチルグルコンアミドを含まないことが好ましい。試薬は組織培養培地または市販の希釈液などの成分をも含みうる。
【００１５】
本明細書中で用いられる「緩衝剤」という用語は、溶液のｐＨの変化を最小限に抑えるように作用する当業者には公知の組成物を指す。好ましい緩衝剤は７と９の間のｐＨで有効な緩衝を提供するｐＫａを有する。好ましい緩衝剤は、ＡＣＥＳ、ＡＤＥ、ＢＥＳ、ビシン、ビス−トリス、ＣＡＰＳ、ＣＨＥＳ、マロン酸ジエチル、グリシルグリシン、グリシンアミドＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、イミダゾール、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＳ、トリシン、トリス、炭酸水素塩、およびホウ酸塩である。特に好ましいものはリン酸緩衝剤である。好ましい緩衝剤濃度は２Ｍ未満であり、最も好ましい濃度は０．２Ｍ、０．１Ｍ、０．０５Ｍ、０．０５Ｍ、０．０２Ｍ、０．０１Ｍ、０．００５、０．００１、および０．０００１Ｍであり、７、７．２５、７．５、７．７５、８、８．２５、８．５、８．７５、および９のｐＨを有する。
【００１６】
本明細書中で用いられる「ブロッキング剤」という用語は、タンパク質および／またはポリペプチドの混合物を含有し、脂質、炭水化物、塩、およびヘムなどの補助因子などの１つまたはそれ以上の追加の成分を含みうるタンパク質豊富源を指す。「タンパク質豊富」という用語は本明細書中で定義されている。かかるブロッキング剤を用いて、本明細書中に記載された組成物および方法において、１つまたはそれ以上のタンパク質、ポリペプチド、および／または抗原を安定化することができる。好ましいブロッキング剤は、約６．５と約８．５の間のｐＨ、および／または約２５０と約３５０ｍＯｓｍ／Ｋｇ  Ｈ2Ｏの間の重量オスモル濃度を有する。特に好ましいブロッキング剤は、ウマ血清、ウシ新生児血清、子ウシ血清、成体ウシ血清、ヒト血清、ウサギ血清、ヒツジ血清等などの血清、および当業者には周知の血清代替物である。ブロッキング剤として最も好ましいのは、ウシ胎児血清である。
【００１７】
本明細書中で用いられる「タンパク質豊富」という用語は、タンパク質および／またはポリペプチドの混合物を含有し、約１ｇ％と約５０ｇ％の間、最も好ましくは約３ｇ％と約１０ｇ％の間の総タンパク質濃度を有する溶液を指す。例えば、ウシ胎児血清は約３ｇ％と約４．５ｇ％の間の総タンパク質含量を有するが、成体ウシ血清は約４．５ｇ％と約８．５ｇ％の間の総タンパク質含量を有する。
【００１８】
本明細書中で用いられる「溶剤」または「可溶化剤」という用語は、組成物の他の成分を分散することが可能な液体物質を指す。好ましい溶剤は水、グリセロール、ＤＭＳＯ、エタノール、メタノール等などのアルコール、アセトン、ジメチルスルホキシド、アセトニトリル、およびジメチルホルムアミドである。
【００１９】
本明細書中で用いられる「塩」という用語は、金属、または金属と同様に作用する要素による酸の一部または全部の酸性水素の置換から生じる１つまたはそれ以上の化合物を指す。好ましい塩は、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、およびＣａＣｌ2である。好ましい塩濃度は４Ｍと０．１ｍＭの間であり、好ましくは２Ｍと５０ｍＭの間である。
【００２０】
本明細書中で用いられる「キレート剤」という用語は、通常、分子内の２つまたはそれ以上の錯形成基に結合することにより金属イオンを結合する分子を指す。キレート剤は当業界において公知であり、一部のタンパク質およびポリペプチドのほか、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などの小分子を含む。好ましいキレート剤濃度は１００ｍＭと０．０１ｍＭの間であり、２０ｍＭと１ｍＭの間であることが最も好ましい。
【００２１】
本明細書中で用いられる「界面活性剤」という用語は、油を乳化することが可能であり、湿潤剤として作用する当業界において公知の化合物を指す。好ましい界面活性剤としては、ＣＨＡＰＳ、コール酸、デオキシコール酸、ジギトニン、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、グリコデオキシコール酸、ｎ−ラウロイルサルコシン、硫酸ラウリル、サポニン、Ｔｗｅｅｎ２０、およびトリトンＸ−１００が挙げられる。好ましい界面活性剤濃度は、約０．００１％と約５％の間である。最も好ましいのは、組成物が約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１．０％、および２％を含むことである。
【００２２】
本明細書中で用いられる「保存剤」という用語は、当業者には公知である微生物の成長を阻止する化合物を指す。好ましい保存剤としては、チメロサール、ソルビン酸、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ミクロサイドＩＩ（臭化トリメチルテトラデシルアンモニウム）、およびゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質が挙げられる。好ましい保存剤濃度は１０％と０．００１ｍＭの間であり、１％と０．１％の間であることが最も好ましい。
【００２３】
本明細書中で用いられる「ポリペプチド」はアミノ酸のポリマーを指し、生成物の特異的長さを指すものではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、およびその断片はこの定義内に含まれる。「ポリペプチド」という用語は、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などの、ポリペプチドの翻訳後修飾を除外しない。
【００２４】
本明細書中で用いられる「抗原」としては、炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、リポタンパク質、リポ多糖類、多糖類、核酸のほか、ポリペプチド、脂質、および他の化合物と複合した炭水化物が挙げられる。抗原は機能的免疫系を有する動物における免疫応答を誘発する能力がありうる。好ましい実施態様において、安定化される抗原はポリペプチド抗原である。これらのポリペプチド抗原は単独でまたは他の分子と結合して見出しうる。特に好ましい実施態様において、安定化されるポリペプチドは核タンパク質抗原である。核タンパク質抗原は任意の数の源に由来するものであることができ、単独でまたは他の分子と結合して見出しうる。
【００２５】
「核タンパク質抗原」とは、核複合体と結合または付着して見出される任意のポリペプチドを意味する。
【００２６】
特に好ましい核タンパク質は、インフルエンザウイルス、特にＢ型インフルエンザ由来の核タンパク質である。
【００２７】
「抗原の安定性」とは、試薬を設定温度で所定の時間にわたり貯蔵した後に、測定法または分析法、特に診断的測定法または免疫測定法において、１つの試薬により発生される一貫した信号を維持する能力を意味する。典型的な貯蔵温度は約２°〜３０℃である。抗原の安定性は高温で短時間、抗原の劣化を測定することによっても評価することができる。加速安定性試験の一般的な温度は約３０°乃至６０℃である。
【００２８】
「微生物」とは、原核生物、酵母菌などの真核生物、ウイルス、プリオンまたは他の感染性粒子を意味する。
【００２９】
「分析法」とは、１つまたはそれ以上の抗原の特異的な検出を可能にする方法を意味する。分析法としては、すべての検出形式の免疫測定法および核酸ハイブリダイゼーションが挙げられ、その多くの例が当業界において周知である。特に好ましい光学的免疫測定法が米国特許第５，５５０，０６３号；第５，９５５，３７７号；および第５，５４１，０５７号に記載されている。
【００３０】
第２の態様において、本発明は、抗原が微生物由来である抗原またはポリペプチドの安定性を増強する水性試薬組成物を特徴とする。好ましい実施態様において、微生物はウイルスおよび／または細菌を含む。本発明はウイルス分析物とともに使用するために特に好ましい。最も特に好ましい実施態様において、本発明はインフルエンザ由来の抗原およびポリペプチド、特にインフルエンザＢ由来のポリペプチドおよび抗原を安定化するための試薬組成物を特徴とする。
【００３１】
第３の態様において、本発明はインフルエンザウイルスの核タンパク質、特にインフルエンザＢ由来の核タンパク質を安定化するための試薬組成物を特徴とする。
【００３２】
第４の態様において、本発明は分析法に関連する対照または基準試薬として使用される抗原調製物を安定化するための水性試薬組成物を特徴とする。
【００３３】
特に好ましい実施態様において、試薬組成物は緩衝剤、ブロッキング剤、塩、キレート剤、可溶化剤、非イオン性界面活性剤、および保存剤を含む。試薬はＮ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグリシンまたはデカノイル−Ｎ−メチルグルコンアミドを含まないことが最も好ましい。
【００３４】
さらに別の好ましい実施態様において、試薬は組織培養培地、Ｓｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤（ＢＳＩ，Ｉｎｃ．）、およびホルマリン不活性化ウイルス含有細胞培養培地をも含みうる。
【００３５】
さらに他の好ましい実施態様において、試薬は、リン酸ナトリウム緩衝剤、ウシ胎児血清、グリセロール、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）界面活性剤（モノラウリル酸ポリオキシエチレンソルビタン）、ミクロサイドＩＩ（登録商標）保存剤（四級アンモニウム化合物；Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｅ４２３）、硫酸ゲンタマイシンを含み、ショ糖、組織培養培地およびＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤（ＢＳＩ，Ｉｎｃ．）を含みうる。溶液のｐＨは約７と約９の間であり、７．５と８．５の間であることが最も好ましい。当業者は、同様の試薬が上記の試薬の代替となりうることを理解している。例えば、ＥＤＴＡの代わりにＥＧＴＡを用いることができ、ミクロサイドＩＩ（登録商標）またはゲンタマイシンの代わりに他の抗菌剤を用いることができる。上記試薬の好ましい濃度は以下の通りである：リン酸ナトリウムについては、０．１ｍＭ乃至１０００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ乃至２００ｍＭ、最も好ましくは５０ｍＭ乃至１００ｍＭであり；ウシ胎児血清については、０．１％乃至４０％ｖ／ｖ、最も好ましくは２％乃至２０％ｖ／ｖであり；グリセロールについては、０．１％乃至３０％ｖ／ｖ、最も好ましくは２．５％乃至１０％ｖ／ｖであり；塩化ナトリウムについては、０．１ｍＭ乃至４Ｍ、最も好ましくは５０ｍＭ乃至２Ｍであり；ＥＤＴＡについては、０．０１ｍＭ乃至１００ｍＭ、さらに好ましくは１ｍＭ乃至２０ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ乃至１５ｍＭであり；Ｔｗｅｅｎ−２０については、０．００１％乃至１％、さらに好ましくは０．０１％乃至０．１％、最も好ましくは０．５％であり；ミクロサイドＩＩについては、０．００１％乃至１％ｗ／ｖ、最も好ましくは０．００２％乃至０．１％ｗ／ｖであり；硫酸ゲンタマイシンについては、０．０１％乃至１０％ｗ／ｖ；さらに好ましくは０．％乃至２．５％、最も好ましくは０．２５％乃至１％であり；ショ糖については、０．０１％乃至５％ｗ／ｖ、最も好ましくは０．１％乃至０．５％である。
【００３６】
特に好ましい実施態様において、希釈液は、約５０ｍＭ以上の量のリン酸ナトリウム；約２％ｖ／ｖ以上の量のウシ胎児血清；約１０％ｖ／ｖ以上の量のグリセロール；約５０ｍＭ以上の量の塩化ナトリウム；約１０ｍＭ以上の量のＥＤＴＡ；約０．０５％ｗ／ｖ以上の量のＴｗｅｅｎ−２０界面活性剤；約０．０１％ｗ／ｖ以上の量のミクロサイドＩＩ保存剤；および約０．５％ｗ／ｖ以上の量の硫酸ゲンタマイシンを含む。試薬は０．５％までのショ糖、１５％までのＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤および抗原調製物からのまたは個別添加により２０％までの組織培養培地をも含みうる。溶液の好ましいｐＨは約７．５乃至約８．５の間である。緩衝剤および／または塩の代わりにある濃度の予備調製組織培養培地（例えば、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製のイーグル最小必須培地またはダルベッコ改変イーグル培地）を用いることも可能でありうる。
【００３７】
第５の態様において、本発明は微生物由来のポリペプチドおよび抗原を安定化するための方法を特徴とする。好ましい実施態様において、前記方法は分析法に関連する対照または基準試薬としての使用のために、または医薬製剤における使用のために、微生物由来の抗原調製物を安定化するために用いられる。
【００３８】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
Ａ.  はじめに
本発明の理解を容易にするために、特定の用途、すなわちインフルエンザ由来抗原の安定化について、試薬組成物の開発を記載する。しかし、試薬組成物を安定化する一般的な有用性は、同様の実験を行うことにより他の抗原またはポリペプチドで示すことができる。
【００３９】
診断的分析成分または他の使用のための試薬開発中に、試薬の長期安定性の測定が必要である。最初は、実時間の測定が完了する前に試薬の有効期間を評価するために加速安定性の確認を完了する。加速安定性試験は直ちに行うことができ、安定性を予測するために当業者により用いられる場合が多い。これを行う１つの手段は高温で試薬をインキュべートし、比較的短時間の間隔で分析することである。例えば、３７℃、４５℃、および他の高温での３乃至７日間のインキュべーションをアレニウス式を用いて分析して、試薬が約２°〜８℃で長時間にわたり安定のままであるかどうか予測する。この方法は現在、試薬の欠陥の予測において最も正確であると考えられている。試薬が高温の負荷に耐えることができない場合は、通常の貯蔵条件下で長期にわたり安定である可能性は低い。高温の安定性は、減衰率を正確に予測することがないため、長期の安定性の予測はあまり良くないが、試薬の欠陥の予想点を識別することにより安定性の指標を示す。高温での安定性の喪失が減少するにつれて、実環境の欠陥の可能性も減少する。
【００４０】
加速確認に加えて、試薬がポリペプチドまたは抗原を安定化する潜在能力を評価するために実時間の長期試験も必要である。実時間試験の条件は当業者には周知である。例えば、実時間評価の条件として、試薬の欠陥点に達するまで約２°〜８℃の通常の貯蔵温度下または室温（１８°〜３０℃）下に試薬を貯蔵することが挙げられる。
【００４１】
インフルエンザウイルスの免疫測定法のための陽性対照試薬の開発において、Ａ型とＢ型のホルマリン不活性化インフルエンザウイルスを、タンパク質ベースの希釈液における安定性について評価した。免疫測定法において検出されたエピト−プがウイルスの核タンパク質由来である場合、不活性化インフルエンザＡは単純希釈液および市販の安定化希釈液において不活性化インフルエンザＢよりも有意に安定である。インフルエンザＡとＢの検出のための新しい生成物の商業的な実行可能性を保証するには、不活性化インフルエンザＢを安定化する手段が必要であった。両方の型の不活性化インフルエンザウイルスの懸濁液に対して安定性を与える希釈液が調製された。この希釈液は、溶液中において、以前の希釈液調製液よりも長時間にわたり、不活性化インフルエンザＢの安定性を改善する能力を示した。
【００４２】
インフルエンザＡは単純タンパク質ベースの希釈液において安定であることが示されている。かかる希釈液はＰＢＴとも称され、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴｗｅｅｎ−２０（登録商標）界面活性剤を含む。第２の調製物は市販の製品、Ｓｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤（ＢＳＩ，Ｉｎｃ．）であり、インフルエンザＡを安定化することも示されている。しかし、これらの溶液のうちいずれもインフルエンザＢを安定化することはできなかった。実施した測定法において異なる株を検出するモノクローナル抗体は２つの核タンパク質上の異なるエピトープを認識する可能性がある。これらのエピトープは不活性化および貯蔵条件により異なるように影響されうる。また、測定法において用いられるモノクローナル抗体の最初の調製において用いられる免疫原が異なるように調製され、異なるように確認されたエピトープを認識するモノクローナルの製造に有利であったとみられる。われわれは、本明細書中に記載された希釈液組成物が、不活性化インフルエンザＡの核タンパク質に対して、不活性化インフルエンザＢの核タンパク質に対するのと同様の安定化効果を有すると考えている。また、他のウイルスおよび細菌のタンパク質も安定化されると考えられる。
【００４３】
不活性化ウイルス保存懸濁液の成分をそれぞれの希釈形式に組み込むことは、ウイルス不活性化および希釈の過程に固有であることに注意すべきである。不活性化ウイルス保存懸濁液の成分は、５０％のホルマリン不活性化ウイルス含有細胞培養培地（ＩＣＣ）および５０％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤から構成されている。試験したそれぞれの陽性対照組成物は若干量のこの保存懸濁液を含む。
【００４４】
Ｂ．  新しい希釈液の調製
新しい希釈液の調製は、ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ−２０、およびＰＢＳ溶液を含む単純タンパク質希釈液であるＰＢＴから開始した。不活性化インフルエンザＡウイルスの安定性を維持または増強すると同時に不活性化インフルエンザＢウイルスを安定化するその能力についてそれぞれの成分を評価した。抗原調製物の安定性の増大を以下のようにして評価した。その対照試薬を市販する予定の分析試験法のために、信号強度が所望の強さになるよう不活性化ウイルス物質を希釈した。一般に、対照試薬については、対応する分析法において低位乃至中位の信号強さが選択される。選択した抗原希釈でのさまざまな試薬組成物を適切な分析法で直ちに試験する。さまざまな試薬組成物（抗原含有）をさまざまな貯蔵条件で配置し、次に分析法で定期的に再試験する。最初の信号を保持し、または貯蔵条件の範囲にわたり最初の信号強さの最小の劣化のみを有する試薬組成物は、安定性の増強を提供すると判定される。信号強さは定性的に、定量的に、視覚的に、または計測手段により評価しうる。成分の選択過程中、ＰＢＴ希釈液にはいくつかの変更が行われた。まず、ウシ胎児血清などの異なるブロッキング剤をＢＳＡの代わりに用いた。次に、グリセロールなどの可溶化剤およびＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのキレート剤を添加して安定性を増強した。さらに、Ｔｗｅｅｎ−２０（登録商標）界面活性剤などの非イオン性界面活性剤を包含することは安定性には必須であると判定された。ミクロサイドＩＩと硫酸ゲンタマイシンの併用などの保存剤を抗菌剤として包含した。
【００４５】
特に好ましい実施態様において、本発明の希釈液は、５０ｍＭ以上の量のリン酸ナトリウム、２％ｖ／ｖ以上の量のウシ胎児血清、１％ｖ／ｖ以上の量のグリセロール、５０ｍＭ以上の量の塩化ナトリウム、５ｍＭ以上の量のＥＤＴＡ、０．０５％ｗ／ｖ以上の量のＴｗｅｅｎ−２０界面活性剤、０．０１％ｗ／ｖ以上の量の四級アンモニウム化合物、および０．５％ｗ／ｖ以上の量の硫酸ゲンタマイシンを含む。試薬は１５％までのＳｔａｂｉｌｃｏａｔ緩衝剤および抗原調製物からのまたは個別添加により２０％までの組織培養培地をも含みうる。溶液の好ましいｐＨは約７．５乃至約８．５の間である。緩衝剤および／または塩の代わりに、ある濃度の予備調製組織培養培地（例えば、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製のイーグル最小必須培地またはダルベッコ改変イーグル培地）を用いることも可能でありうる。
【００４６】
特定の理論に縛られることを望まないが、最初の希釈液に対する変更は以下の機序によりポリペプチドまたは抗原の安定性を増強しうる。ウシ胎児血清は、それが精製タンパク質ではなく総血清生成物であるため、ＢＳＡよりも豊富なタンパク質源を提供しうる。これは他の安定化物質を含みうる。グリセロールは水素結合により抗原の水和を増加させうる。キレート剤は陽イオンを除去することにより安定性を増大しうるが、これはポリペプチドまたは抗原そのものに負に影響するかもしれず、または抗原やポリペプチドを損傷し、または抗原上の触媒部位を阻害しうるある種の分解酵素の活性に必要であるかもしれない。界面活性剤は抗原またはポリペプチドの重要な二次構造および支持結合を維持するかもしれないが、重要でないまたは分解性の構造／相互作用を崩壊させるかもしれない。
【００４７】
本発明は、最初に、上述した単純ＢＳＡタンパク質希釈液（ＰＢＴ）における抗原の安定性を基準とすることにより評価した。典型的には、試薬の開発において、４５℃で約３日までの陽性の保持が低温における長期の安定性を評価するのに十分である。当業者は、高温での約１４日までの安定性が十分に安定化した抗原を示すと考えている。さらに、試薬が４５℃で活性を保持する時間が長いほど、約２°〜８℃下および室温などの低温で安定である時間が長くなる可能性が高い。まず、ホルマリン不活性化インフルエンザ懸濁液の保存液を、当業界において一般に周知であり、以下の実施例１に記載された方法で作成した。次に、インフルエンザＡとインフルエンザＢの不活性化保存液をそれぞれ、１：２と１：４の希釈で単純タンパク質希釈液に加えた。これらの希釈では、試験希釈液は、その全体において、それぞれ５０％の希釈液、２５％のＩＣＣ、および２５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ緩衝剤、または７５％の希釈液、１２．５％のＩＣＣ、および１２．５％のＳａｔｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を含んでいた。これらの抗原希釈液は、反応試験器具の目視検査で中等度の陽性信号を供給するために選択した。結果として生じる２つの溶液の陽性について、ＦＬＵ  ＯＩＡ（登録商標）試験キット（Ｂｉｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）により０日目、４℃で３日目、および４５℃で３日目に試験した。試験は添付文書のとおり行った。不活性化インフルエンザＢは４５℃で３日目にすべての陽性を失い、不活性化インフルエンザＡはその陽性の一部を失った。試験は試薬の欠陥のためその後の時点では行われなかった。ＰＢＴタンパク質希釈液は所望の程度まで抗原の安定性を維持しなかった。
【００４８】
さらに、抗原被覆表面を保護し安定化するように調製されている市販の希釈液であるＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤（ＢＳＩ，Ｉｎｃ．）を、上記の抗原希釈を用いて試験した。Ｓｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）由来の対照試薬の安定性は、試験点が０日目および４日目（４℃および４５℃の貯蔵条件）であったことを除き上記のとおり評価した。これらの条件下で、希釈液の完全な組成は、７５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤および２５％のＩＣＣであった。組織培養培地の存在下でも、Ｓｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）は４日を超えて不活性化インフルエンザＢ抗原の安定性を維持することができず、その長期貯蔵能力の欠如を示した。
【００４９】
次に、本発明の試薬組成物を上記のとおり試験し、その性能を評価した。この場合には、希釈液の完全な組成は、不活性化インフルエンザＡ溶液については５０％の希釈液、２５％のＩＣＣ、および２５％のＳｔａｂｌｉｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を含み、不活性化インフルエンザＢ溶液については７５％の希釈液、１２．５％のＩＣＣ、および１２．５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を含んでいた。４５℃での３日目に、不活性化インフルエンザＡとＢは一部の陽性を失ったが、依然として明らかに陽性であった。不活性化インフルエンザＢ試薬を７日目、１４日目、および２１日目に評価した。最終的に、４５℃での２１日後に、不活性化インフルエンザＢはすべての陽性を失った。以前の試験でも、不活性化インフルエンザＡはその陽性の大部分を２１日までに失うことが示された。これらの特定の分析条件下における不活性化インフルエンザＡの増強は、欠陥まで試験されなかったためデータには示されていない。しかし、これらの条件下の不活性化インフルエンザＡの安定性はきわめて高い可能性があり、試験した時点を超えて拡張しうる。これらのまたは他の分析条件下に欠陥まで試験すれば、本発明の希釈液はインフルエンザＡ抗原の安定性も増強するはずである。したがって、単純ＰＢＴタンパク質希釈液およびＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）に比べ、本発明の組成物は貯蔵用の溶液中において抗原をはるかに良く安定化することができる。
【００５０】
本発明の別の評価において、本発明の安定化希釈液を用いてさらに感受性の光学的分析法を行った。この方法に対する陽性対照では、ホルマリン不活性化インフルエンザＡおよびホルマリン不活性化インフルエンザＢのいずれについても１：１０の希釈に希釈した抗原を用いて、かかる対照溶液に必要な中等度の信号を達成する。この評価において用いられる抗体は、用いられる表面の種類に対する最適な分析性能に基づき選択された。分析表面での反応性部位は、それぞれの分析表面が１つのインフルエンザＡ反応性部位と１つのインフルエンザＢ反応性部位を含むように、モノクローナル抗インフルエンザＡ抗体またはモノクローナル抗インフルエンザＢ抗体を表面上にストリッピングすることにより好ましい方法で作成した。それぞれの表面を乾燥させ、室温下に保存剤でオーバーコーティングした。抗体表面は熱ステーキング装置を用いて、多孔性表面の中または周りを溶液が流れることを可能にするポリスチレンリングに熱シールした。プラスチックリングは、取り扱いを容易にする支持および多孔性表面を真空源に取り付ける手段を供給し、多孔性表面からの流体の除去および多孔性表面の乾燥を補助する。この実験の目的のために、貫流様式で分析を行った。貫流とは、試料が分析表面に接触し、分析処置時に分析表面の中、上、または周りを流れたことを示す。
【００５１】
この実験では、本発明の安定化希釈液の成分として、抗原の安定性を増強する細胞培養培地（ＥＭＥＭ、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃａｔ．＃１２  １３６Ｑ）の能力を試験した。４つの試験溶液を作成した：（Ａ）７５％の本発明の希釈液、１２．５％のＥＭＥＭおよび１２．５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ緩衝剤、（Ｂ）ＥＭＥＭが追加的に２％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン、および０．５％のペニシリン／ストレプトマイシン／フンギゾン（抗菌溶液、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｃａｔ．＃１７−７４５Ｈ）を含有する溶液Ａ、（Ｃ）７５％の本発明の希釈液および２５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ希釈液、および（Ｄ）本発明の希釈液のみ。４つの希釈液のそれぞれについて、それぞれの試験希釈液で最初に１：４の希釈を作成し、その後に１：２．５の希釈を作成することにより不活性化インフルエンザＢ保存懸濁液の１：１０の希釈を作成した。各溶液を４℃で３日目および４５℃で３日目に試験した。溶液Ａは４５℃で３日目に最良の安定性を示し、溶液Ｂ、ＤおよびＣがそれに続いた。それぞれの結果は、抗原の希釈を増加させる条件下で細胞培養培地／Ｓｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）を希釈液の中に組み込むことにより抗原の安定性が増強（溶液Ａの安定性を溶液Ｄの安定性と比較）することを示す。唯一の他の成分として高濃度のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を利用すること（溶液Ｃ）は、（溶液Ａに比べて）抗原の安定性に対して有害であることがわかった。
【００５２】
したがって、これらの結果は、本発明が水性培地、特にインフルエンザの培地においてタンパク質抗原を安定化する能力がその種類の他の希釈液を大きく凌ぐことを明らかに示している。
【００５３】
以下の実施例は、限定としてではなく例示として提供され、本発明のさまざまな態様および実施態様をさらに説明するためのものである。実施例により特許請求の範囲の限定が意図されるものではない。
【００５４】
（実施例）
実施例１：
１ＸダルベッコのＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０界面活性剤、２％のＢＳＡ、０．０１％のミクロサイドＩＩ保存剤、および０．５％の硫酸ゲンタマイシンを含む単純タンパク質希釈液（ＰＢＴ）中の抗原の安定性を評価した。まず、不活性化インフルエンザウイルス懸濁保存液を以下のとおり調製した。コンフルエントのＭＤＣＫ  ｐ８３細胞をインフルエンザＡ（フラスコ当りＡ／香港６８の１：１０，０００希釈）またはインフルエンザＢ（フラスコ当りＢ／パナマ４５／９０の１：１０００希釈）に感染させ、９０〜１００％のＣＰＥ（細胞変性効果）が確認されるまでイーグルＭＥＭ維持培地（２％の熱不活性化ＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン、および０．５％のペニシリン／ストレプトマイシン／フンギゾンを含有）中で増殖させた。細胞懸濁液をボルテックスで攪拌して遠心分離することによりウイルスを収集した。得られた上清を、３７％のホルムアルデヒド溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｆ−１２６８）を総量の０．２％まで（２μｌ／ｍｌ）添加し、室温で１時間インキュべートすることにより不活性化した。次に、ウイルス含有溶液を同量のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤（ＢＳＩ，Ｉｎｃ．）と混合し、分割し、使用するかまたは直ちに凍結した。
【００５５】
１ｍｌの不活性化インフルエンザＡ保存液を１ｍｌの単純希釈液に添加し、別の容器中で０．５ｍｌの不活性化インフルエンザＢ保存液を１．５ｍｌの単純希釈液に添加することにより、不活性化インフルエンザＡおよびインフルエンザＢのウイルス懸濁保存液をそれぞれ１：２および１：４で単純ＢＳＡ希釈液に加えた。これらの希釈では、試験希釈液は、その全体において、それぞれ５０％の希釈液、２５％のＩＣＣ、および２５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ緩衝剤、または７５％の希釈液、１２．５％のＩＣＣ、および１２．５％のＳａｔｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を含んでいた。次に、それぞれ得られた溶液の陽性について、ＦＬＵ  ＯＩＡ（登録商標）試験キット（Ｂｉｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて０日目に試験した。試験は添付文書のとおり行い、反応したＦＬＵ  ＯＩＡ試験装置の視覚解釈により信号の質または陽性を以下のとおり評価した：（０）負；（１）陰；（２）きわめて弱い陽性；（３）きわめて弱いと弱いの間の陽性；（４）弱い陽性；（５）弱いと中等度の間の陽性；（６）中等度の陽性；（７）中等度と強いの間の陽性；（８）強い陽性の結果。２〜８に評価された場合は信号を陽性と判断した。
【００５６】
希釈後、各溶液を２つの部分に分けた。１つは４℃で、もう１つは４５℃で３日間貯蔵した。４つの溶液をすべて３日目に０日目と同じ方法で再試験した。０日目と４℃の対照は予想された中等度の陽性信号を示した。不活性化インフルエンザＢは４５℃で３日目にすべての陽性を失い、不活性化インフルエンザＡはその陽性の一部を失った。試薬の欠陥のため、これ以降の時点での試験は行わなかった。典型的には、試薬の開発において、４５℃で３日までの陽性の保持が低温での長期の安定性を評価するのに十分である。試薬が４５℃で活性を保持する時間が長いほど、約２°〜８℃および室温などの低温での安定性と相関する。したがって、この単純ＰＢＴ調製物は所望の程度まで抗原の安定性を維持することができなかった。
【００５７】
実施例２：
抗原被覆表面を保護し安定化するように調製されている市販の希釈液であるＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤（ＢＳＩ，Ｉｎｃ．）について、試薬を０日目および４日目（４℃および４５℃の貯蔵条件）に試験したことを除き、実施例１に記載したとおりに試験した。希釈液の完全な組成は、７５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ緩衝剤および２５％のＩＣＣであったことに注意されたい。Ｓｔａｂｉｌｃｏａｔも４日を超えて不活性化インフルエンザＢ抗原の安定性を維持することができず、その長期貯蔵能力の欠如を示した。
【００５８】
実施例３：
次に、実施例１に記載したものと同様の実験において本発明の試薬組成物を試験した。希釈液を以下のとおり２０ｍｌの量で作成した。円錐形の管に、２ｍｌの１Ｍリン酸ナトリム緩衝剤および８ｍｌのｄＨ2Ｏを添加し（１００ｍＭ）、混合し、ｐＨを７．５に調節した。次に、０．１７５ｇのＮａＣｌ（１５０ｍＭ）を添加し混合した。次に、０．１ｍｌの１０％Ｔｗｅｅｎ−２０溶液（０．０５％）を添加し混合した。次に、ミクロサイド（登録商標）ＩＩ保存剤の１％保存液０．２ｍｌ（０．０１％）および０．１ｍｌの硫酸ゲンタマイシン（０．５％）を管に添加し混合した。次に、２ｍｌのグリセロール（１０％）および１ｍｌのウシ胎児血清（５％）を添加し混合した。次に、ＥＤＴＡの５００ｍＭ保存液０．４ｍｌ／ｄＨ2Ｏ（１０ｍｍ）の混合物を添加し混合し、ｐＨを７．５に調節した。ｄＨ2Ｏで総量を２０ｍｌとした。
【００５９】
５ｍｌの希釈液を５ｍｌの不活性化インフルエンザＡウイルス保存液（１：２希釈）に、または７．５ｍｌの希釈液を２．５ｍｌの不活性化インフルエンザＢウイルス保存液（１：４希釈）に添加し十分に混合することによりウイルス試験試薬を作成した。この場合には、希釈液の完全な組成は、不活性化インフルエンザＡ溶液については５０％の希釈液、２５％のＩＣＣ、および２５％のＳｔａｂｌｉｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を含み、不活性化インフルエンザＢ溶液については７５％の希釈液、１２．５％のＩＣＣ、および１２．５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を含んでいた。それぞれ実験の全体を通じて各試験試薬についてＦＬＵ  ＯＩＡ試験を添付文書のとおり行った。この実験は抗原の安定性の増強のため２１日まで行った。４５℃での３日目に、不活性化インフルエンザＡとＢはいずれも若干の陽性を失ったが依然として明らかに陽性であった。７日目、１４日目、および２１日目に不活性化インフルエンザＢ試薬を評価した。最終的に、４５℃での２１日目に、不活性化インフルエンザＢはすべての陽性を失った。不活性化インフルエンザＡも他の試験においてこの時間後にその活性の大部分を失うことが示されている。０〜８の主観的尺度に基づき、分析結果を以下のとおり視覚的に解釈した：（０）負；（１）陰；（２）きわめて弱い陽性；（３）きわめて弱いと弱いの間の陽性；（４）弱い陽性；（５）弱いと中等度の間の陽性；（６）中等度の陽性；（７）中等度と強いの間の陽性；（８）強い陽性の結果。２〜８に評価された場合は信号を陽性と判断した。本発明の希釈液におけるインフルエンザＢの増強された安定性が図１に示されている。
【００６０】
実施例４：
本発明の別の評価において、陽性対照としてホルマリン不活性化インフルエンザＡおよびホルマリン不活性化インフルエンザＢの１：１０の希釈に希釈した抗原を用いて、かかる対照溶液に必要な中等度の信号を達成した異なる分析において安定化希釈液を用いた。不活性化ウイルス懸濁保存液を実施例１におけるように調製し、安定化希釈液を実施例３に記載したとおり調製した。表面が反射性を与えるシリコンの光学層、Ｓｉ３Ｎ４の抗反射層、および国際特許公開番号ＷＯ／９８／１８９６２によるダイヤモンド状の炭素の付着層で被覆されたトラックエッチングしたポリカーボネート膜である、光学的に調製された多孔性表面を被覆するように抗体を選択した。この評価において用いた抗体は、用いられる表面の種類に対する最適な分析性能に基づき選択された。分析表面の反応性部位は、それぞれの分析表面が１つのインフルエンザＡ反応性部位と１つのインフルエンザＢ反応性部位を含むように、モノクローナル抗インフルエンザＡ抗体（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１％ショ糖中４０μｇ／ｍｌ）またはモノクローナル抗インフルエンザＢ抗体（０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１％ショ糖、１５０ｍＭのＮａＣｌ中４０μｇ／ｍｌ）を表面上にストリッピングすることにより好ましい方法で作成した。表面はＢｉｏＪｅｔ（登録商標）器具でストリッピングし、乾燥させ、室温下に保存溶液でオーバーコーティングした。抗体表面は熱ステーキング装置を用いて、多孔性表面の中または周りを溶液が流れることを可能にするポリカーボネートリングに熱シールした。プラスチックリングは、取り扱いを容易にする支持および多孔性表面を真空源に取り付ける手段を供給し、多孔性表面からの流体の除去および多孔性表面の乾燥を補助する。被覆表面を使用前に２〜８℃で貯蔵した。この実験の目的のために、貫流様式で分析を行った。貫流とは、試料が分析表面に接触し、分析処置時に分析表面の中、上、または周りを流れたことを示す。
【００６１】
この実験では、細胞培養培地（ＥＭＥＭ）が本発明の安定化希釈液の成分として抗原の安定性を増強する能力を試験した。４つの試験溶液を作成した：（Ａ）７５％の本発明の希釈液、１２．５％のＥＭＥＭおよび１２．５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ緩衝剤、（Ｂ）ＥＭＥＭが追加的に２％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン、および０．５％のペニシリン／ストレプトマイシン／フンギゾンを含有する溶液Ａ、（Ｃ）７５％の本発明の希釈液および２５％のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ希釈液、および（Ｄ）本発明の希釈液のみ。４つの希釈液のそれぞれについて、それぞれの試験希釈液で最初に１：４の希釈を作成し、その後に１：２．５の希釈を作成することにより不活性化インフルエンザＢ保存懸濁液の１：１０の希釈を作成した。４つの溶液のそれぞれ（３０μｌ）を１６５μｌの抽出試薬を含有する個別の管に添加し、１分間インキュべートした。各試料の全体を上記の表面上に移し、３分間インキュべートした。次に、１００μｌのコンジュゲート（ＨＲＰにコンジュゲートさせた抗インフルエンザＡ抗体とＨＲＰにコンジュゲートさせた抗インフルエンザＢ抗体を混合）をさらに３分間、表面上に配置した。次に、表面の下部に減圧をかけ、表面から試料／コンジュゲートの混合物を除去した。表面上に水性洗浄溶液を配置し、減圧下で表面が乾燥するまで溶液が表面を通って流れるようにすることにより、表面を３回洗浄した。減圧を止め、７５μｌの沈殿ＴＭＢ基質を分析表面上に配置し、６分間インキュべートした。基質を表面から剥がし、表面を１回洗浄し、上記のとおり乾燥させた。次に分析信号を実施例３におけるように解釈した。
【００６２】
各溶液を４℃で３日目および４５℃で３日目に試験した。溶液Ａは４５℃で３日目に最良の安定性を示し、続いて溶液Ｂ、ＤおよびＣであった。それぞれの結果は、抗原の希釈を強める条件下に細胞培養培地／Ｓｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）を希釈液の中に組み込むと抗原の安定性が増強（溶液Ａの安定性を溶液Ｄの安定性と比較）することを示す。唯一の他の成分として高濃度のＳｔａｂｉｌｃｏａｔ（登録商標）緩衝剤を利用すること（溶液Ｃ）は、抗原の安定性に対して有害であることがわかった。図２は前述の実験について得られた結果を示す。
【００６３】
これらの結果は、本発明が水溶液中のタンパク質抗原、特にインフルエンザのタンパク質抗原を安定化するその能力において他の希釈液を大きく凌ぐことを明らかに示している。上記の各文献、特許、または特許出願はその全体が本明細書中において参考として援用される。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様を記載してきたが、当業者であれば、発明の精神および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、さまざまな変更、改変および改造がなされうることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  不活性化インフルエンザＢの安定性に対する本発明の希釈液の利点を示す図である。
【図２】  細胞培養培地が本発明の希釈液の安定化特性をさらに増強する能力を示す図である。
【図１】
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【図２】
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