(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２種以上の被検化合物による薬物相互作用の評価方法であって、
（ａ）ＦＬＣ細胞またはＨｅｐＧ２細胞を３次元高密度培養し、当該培養後更にＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導する誘導剤を含む培地で培養することによって得られるＦＬＣ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、またはこれらの細胞から調製された肝ミクロソームと、前記２種以上の被検化合物とを接触させて、インキュベートする工程と、
（ｂ）被検化合物の反応生成物を検出または定量する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記３次元高密度培養したＦＬＣ細胞またはＨｅｐＧ２細胞の密度が１０6個／ｍｌ以上であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記３次元高密度培養したＦＬＣ細胞またはＨｅｐＧ２細胞の密度が１０8個／ｍｌ以上であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導する誘導剤がフェニトイン、カルバマゼピン、リファンピシン、デキサメタゾン、スルフィンピラゾン若しくはバルビツール酸系薬物およびそれらの塩の少なくとも１つである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＹＰ３Ａ４の発現を誘導する誘導剤がリファンピシンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＬＣ細胞が、ＦＬＣ５細胞である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記（ａ）において、細胞の３次元高密度培養が、ホロファイバー型バイオリアクタまたはラジアルフロー型バイオリアクタを用いて行われる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物から分取して継代培養した肝細胞を、シトクロムＰ４５０誘導剤を含む培地で培養することにより得た、シトクロムＰ４５０発現が誘導された肝細胞および該肝細胞から調製された肝ミクロソーム等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の肝機能の研究や、薬物動態学的特性（吸収、分布、代謝、排泄）、毒性特性、２種以上の薬物の相互作用の研究のために、肝細胞の培養は非常に重要であり、医薬品開発の初期段階においては肝ミクロソームや肝細胞を用いたin vitroの代謝試験を行って医薬品候補化合物を評価している。しかし初代培養肝細胞では人種差や性差などに起因する薬物代謝能のばらつきが大きいこと（非特許文献１、２）、入手が困難であり倫理的問題も付随することに加え、単離４日後に薬物代謝関連酵素含量が５０％以下に低下すること（非特許文献３）が知られており、均一で安定した形質を維持した長期間の代謝試験が困難であるという問題があった。一方、継代培養細胞株の場合、薬物代謝関連酵素、とくにシトクロムP４５０の活性がほとんど失われるため、上述のin vitroの代謝試験には有用でなかった。肝臓癌由来細胞株を用いてシトクロムP４５０を発現する形質転換株を樹立する方法に関する報告もあるが（特許文献１）、導入した遺伝子がコードする分子種しか合成されず、操作性や安定性にも問題があった。
【０００３】
【特許文献１】
特開２００１−８６８１号公報
【特許文献２】
特許第２７４４４１８号
【非特許文献１】
Guillouzo et al.; Biochem. Pharmacol. 1985;34:2991-5
【非特許文献２】
Coudouris et al.; Xenobiotica 1993;23:1399-409
【非特許文献３】
Maurel et al.; Adv. Drug Deliver. Rev. 1996;22:105-132
【非特許文献４】
Kobayashi et al.; Science 2000;287:1258-1262
【非特許文献５】
Hasumura et al.; Human Cell 1988;1:238-44
【非特許文献６】
Hasumura et al.; Human Cell 1988;1:98-100
【非特許文献７】
Fujise et al.; Hepato-Gastroenterol. 1990;37:457-460
【非特許文献８】
Homma et al.: Human Cell 1990;3:152-7
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
薬物代謝酵素の誘導に関しては動物間での種差の存在が明らかとなっているため、動物実験の結果を直接ヒトへ外挿することが困難であり、特に医薬品開発においては生体内での機能を維持したヒトの培養肝細胞株の提供が切望されている。
即ち本発明は、in vitroの薬物代謝試験に有用であり、安定した供給が可能な継代培養肝細胞および肝ミクロソームを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、肝細胞を非常に高密度に継代培養し、かつ培地にシトクロムＰ４５０誘導剤を添加することによりシトクロムＰ４５０のｍＲＮＡ発現量が高度に誘導されること、ならびに、誘導されたシトクロムＰ４５０が生体内における基質代謝能をin vitroでも維持していることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、
（１）肝細胞を３次元高密度培養し、当該培養後更にシトクロムＰ４５０誘導剤を含む培地で培養することにより得た、シトクロムＰ４５０発現が誘導された肝細胞；
（２）前記３次元高密度培養した肝細胞の密度が１０６個／ｍｌ以上であることを特徴とする前記（１）に記載の肝細胞；
（３）前記３次元高密度培養した肝細胞の密度が１０８個／ｍｌ以上であることを特徴とする前記（１）に記載の肝細胞；
（４）前記肝細胞に誘導されたシトクロムＰ４５０がＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１またはＣＹＰ３Ａ４である、前記（１）に記載の肝細胞；
（５）前記シトクロムＰ４５０誘導剤がフェニトイン、カルバマゼピン、リファンピシン、デキサメタゾン、スルフィンピラゾン若しくはバルビツール酸系薬物およびそれらの塩の少なくとも１つである、前記（１）に記載の肝細胞；
（６）ヒト肝細胞を３次元高密度培養し、当該培養後更にリファンピシンを含む培地で培養することにより得た、シトクロムＰ４５０発現が誘導された肝細胞；
（７）前記（１）から（６）のいずれか１項に記載の肝細胞から調製されたことを特徴とする肝ミクロソーム；
（８）（ａ）肝細胞を３次元高密度培養すること；および（ｂ）前記３次元高密度培養後の肝細胞をシトクロムＰ４５０誘導剤を含む培地で培養することを含む、シトクロムＰ４５０の発現が誘導された肝細胞の製造方法；
（９）（ａ）ヒト肝細胞をホロファイバー型バイオリアクタまたはラジアルフロー型バイオリアクタを用いて３次元高密度培養すること；および（ｂ）前記３次元高密度培養後のヒト肝細胞をリファンピシンを含む培地で培養することを含む、シトクロムＰ４５０の発現が誘導されたヒト肝細胞の製造方法；
（１０）（ａ）前記（１）から（６）のいずれか１項に記載の肝細胞または前記（７）に記載の肝ミクロソームと、被検化合物とを接触させることを含む、シトクロムＰ４５０による代謝に対する、被検化合物の感受性の評価方法；
（１１）（ａ）前記（１）から（６）のいずれか１項に記載の肝細胞または前記（７）に記載の肝ミクロソームと被検化合物を接触させてインキュベートすること；（ｂ）前記（ａ）で得られた反応生成物を抽出すること；（ｃ）前記（ｂ）で得られた反応生成物を分析することをさらに含む前記（１０）に記載の評価方法；
（１２）被検化合物として、少なくとも２つの化合物を用いることを特徴とする前記（１１）に記載の評価方法。
（１３）薬物相互作用評価方法である、前記（１２）に記載の評価方法、に関する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下に本願明細書において記載する記号、用語等の意義、本発明の実施の形態等を示して、本発明を詳細に説明する。
【０００７】
本発明に用いる肝細胞は、哺乳動物の肝臓から公知の方法により分取することにより得られるが、哺乳動物の肝臓癌から分取したものが好ましい。肝臓癌由来細胞は、継代培養が可能であり細胞株として樹立することが比較的容易である。肝臓癌とは肝臓に発生した悪性腫瘍をいい、肝細胞癌、肝芽腫などが挙げられるが、分取した細胞が継代培養できるものであれば特に限定されない。例えば、ヒト肝芽腫由来細胞株としてＨｅｐＧ２、ヒト肝細胞癌由来細胞株としてＢ１６などが挙げられる。
また、正常肝細胞であっても、ＳＶ４０Ｔ遺伝子を細胞内で発現させて不死化し、これを継代培養し増殖させた後にＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを用いてＳＶ４０Ｔ遺伝子を除去することで得られるいわゆる「初代化」した肝細胞（非特許文献４）も本発明に用いることができる。
このように継代培養した肝細胞を用いることにより、性状にばらつきのない細胞を安定して供給することが可能である。
【０００８】
本願明細書における「３次元培養」とは、細胞の培養方法のうち、単層培養法を除いた培養方法をいい、「高密度培養」とは、細胞の密度が少なくとも１０６個／ｍｌ、好ましくは１０８個／ｍｌ以上となる培養をいう。ここで単層培養法とは、細胞が培養容器の底面に２次元的に増殖し、１層の細胞層を形成する培養法をいう。
「単層培養法を除いた培養方法」としては、浮遊培養(suspension culture)のほか、軟寒天、メチルセルロース、コラーゲンゲルを基質として用いる包埋培養、ホロファイバー型バイオリアクタやラジアルフロー型バイオリアクタ（特許文献２）を用いた培養方法などが挙げられるが、中でも高密度な培養を実現できるホロファイバー型バイオリアクタやラジアルフロー型バイオリアクタを用いた培養方法が好ましい。特に、ラジアルフロー型バイオリアクタでは、１００日以上の長期培養が可能で、酵素の誘導実験や阻害実験に使用することができる。培養の際、ｐＨは約６．５〜７．５が好ましく、温度は０℃から４０℃、好ましくは約３７℃前後とする。
【０００９】
本発明に用いられるシトクロムＰ４５０誘導剤は、本発明にかかる継代培養した肝細胞の培地に加えられることにより、この肝細胞内にシトクロムＰ４５０の発現を誘導する。シトクロムＰ４５０は肝臓や腸などに存在する薬物代謝酵素であり、ＮＡＤＰＨの存在下で薬物を酸化的に代謝する。シトクロムＰ４５０の一次構造には基質認識部位が６ヶ所存在し、この違いにより多数の分子種が存在するので、各分子種は「ＣＹＰ」（シトクロムＰ４５０を表す。）の後に、ファミリーを数字で、サブファミリーをアルファベットで、固有名を数字で後に付記して表現される。本発明にかかる肝細胞で誘導されるＣＹＰ分子種は、薬物代謝において特に重要であるとされるＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４であり、特に限定されないが、なかでも市販される薬物の約５０％が代謝されるＣＹＰ３Ａ４が重要である。本発明に用いるシトクロムＰ４５０誘導剤は特に限定されないが、好ましくはＣＹＰ３Ａ４誘導剤であり、例えばフェニトイン、カルバマゼピン、リファンピシン、デキサメタゾン、スルフィンピラゾン、フェノバルビタール等のバルビツール酸系薬物などが挙げられる。
【００１０】
本発明にかかる肝ミクロソームは、本発明にかかるシトクロムＰ４５０の発現が誘導された肝細胞から調製される。調製には通常の方法を用いることができ、例えば本発明にかかる肝細胞のホモジネートから分画遠心によって核、ミトコンドリア、リソソームを沈降させた上清を、さらに１００，０００×ｇ、１時間程度の超遠心分離にかけ、沈殿として得られる画分を再懸濁することで行うことができる。肝ミクロソームには、その細胞に含まれるシトクロムＰ４５０のすべての分子種に加えて抱合反応に関連する酵素も含まれているので、特に医薬品開発の初期段階におけるin vitro の薬物代謝試験に有用であり、２以上の薬物の相互作用の解析に用いることもできる。また、細胞に比べて保存や運搬が容易なので、複数の細胞株に由来するミクロソームを使用して、代謝試験の結果を比較することも可能である。肝臓の代謝酵素の活性には、人種差、性差、種差が存在することが明らかとなっているため、この特性はとくに望ましい。従来の継代培養細胞では、ミクロソーム画分を調製する処理の前に多くの酵素が失活してしまい、十分に酵素活性を維持したミクロソーム画分を得ることが困難であったが、本発明の方法によれば、シトクロムＰ４５０活性を非常に高く維持した状態の細胞から均一なミクロソーム画分を大量に調製することが可能である。
【００１１】
本発明にかかる肝細胞および肝ミクロソームとしては、ヒトの肝臓から分取した細胞に由来するものが最も好ましい。特に本発明者らが樹立した日本人由来ヒト肝細胞癌株であるＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｖｅｒ  Ｃｅｌｌ（以下「ＦＬＣ」という。）（非特許文献５−８）に由来する細胞は、アルブンミン産生などの肝機能が比較的維持されているので本発明に用いる肝細胞として好ましく、中でも７株のＦＬＣのうちＣＹＰ３Ａ４の誘導がかかることも確認されているＦＬＣ−５細胞株がさらに好ましい。また、無血清培地での培養が可能なことから、後述するin vitro代謝試験の際、血清タンパク質の影響を除外して検討することも可能である。
ヒト由来の肝細胞は採取について倫理的な問題も付随し、入手が困難であるが、本発明にかかる継代培養されたヒト由来の肝細胞は、シトクロムＰ４５０の活性が高く維持され、非常に有用である。
【００１２】
本発明にかかる肝細胞の製造方法は、肝細胞を３次元高密度培養することと、継代培養後の肝細胞をさらにシトクロムＰ４５０誘導剤を含む培地で培養することを含む。例えば継代培養に用いた培養液にＰ４５０誘導剤を添加しても良いし、継代培養後の細胞をＰ４５０誘導剤を含む培地に移しかえても良い。上述のように３次元高密度培養は、ホロファイバー型バイオリアクタまたはラジアルフロー型バイオリアクタを用いることが好ましく、これらを用いる場合は高密度培養後、例えばＰ４５０誘導剤として５０μＭのリファンピシンを培養液に添加し、還流すればよい。シトクロムＰ４５０誘導剤が水溶性でない場合は、ＤＭＳＯ等の有機溶媒で溶解しＤＭＳＯの最終濃度が０．２５％となるように希釈して添加する。尚、培養温度は０℃〜４０℃、好ましくは約３７℃前後とし、ｐＨは約６．５〜７．５が好ましい。シトクロムＰ４５０誘導剤を含む培地での培養は、少なくとも誘導剤の効果が十分に現れる時間行うことが好ましい。例えば、リファンピシンの場合は添加後４８時間から７２時間後に効果が最大になるため、この間にin vitro 試験に用いたり、肝ミクロソームの調製に用いたりすることが望ましい。一度誘導剤を添加して効果がピークに達した後、その効果が持続しないようであれば、適当な時間の経過後に繰り返し添加することにより誘導の効果が維持される。また、誘導後、すぐに使用しない場合は、効果がピークに達した時点で凍結保存することが可能である。
【００１３】
本発明にかかるシトクロムＰ４５０の発現が誘導された肝細胞または肝ミクロソームと、被検化合物とを接触させることによって、シトクロムＰ４５０による代謝に対するこの被検化合物の感受性を評価することができる。被検化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性天然物、合成化合物、発酵生産物等特に限定されず、これらの化合物は原体、溶液、その他細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などの組成物として本方法に用いることができる。評価方法は公知の方法と同様またはそれに準じて行うことができるが、例えばＰ４５０の発現が誘導された肝細胞の培地に被検化合物を添加し、被検化合物が代謝されるのに十分な時間が経過した後この細胞または培養液中の代謝産物を検出することによって行うことができる。被検化合物が水溶性でない場合は、ＤＭＳＯ等の有機溶媒で溶解し、ＤＭＳＯの最終濃度が十分に低くなるよう希釈される条件で培地に添加することが可能である。本発明において特に著しく誘導されるＣＹＰ３Ａ４は、市販の医薬品の約５０％を代謝することが知られており、ＣＹＰ３Ａ４が誘導された肝細胞または肝ミクロソームを用いれば、被検化合物のＣＹＰ３Ａ４による感受性を評価することが可能となるので非常に有用である。
【００１４】
また、本発明にかかるシトクロムＰ４５０の発現が誘導された細胞または肝ミクロソームと、少なくとも２つの被検化合物とを接触させることにより、これらの被検化合物の相互作用を評価することができる。具体的には、例えばＰ４５０の発現が誘導された肝細胞の培地に複数の被検化合物を同時に添加し、各被検化合物のＰ４５０による代謝産物を検出、定量することによって行うことが可能である。
現在では臨床において多剤併用が実施されるため、前臨床試験や臨床試験の段階で複数の薬物の相互作用を評価しておくことが必要である。例えば、ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物（Ａ）とＣＹＰ３Ａ４阻害剤（Ｂ）とを併用すると、薬物（Ａ）の代謝が阻害され血中濃度が上昇する。ＣＹＰ３Ａ４により代謝される薬物（Ａ）とＣＹＰ３Ａ４誘導剤（Ｃ）を併用すると、薬物（Ａ）の代謝が促進され血中濃度が低下する。また、ＣＹＰ３Ａ４で代謝される薬物を複数併用すれば、競合的に代謝が阻害されいずれかの薬物の血中濃度が上昇する可能性がある。上述の相互作用は人体に予想外の影響をもたらすことがあり、安全な臨床試験を実施するためにも前臨床試験の初期の段階でin vitroでの試験によって十分に評価されることが求められている。継代培養が可能で安定に供給され、薬物代謝能を維持している本発明にかかる肝細胞または肝ミクロソームはこれらの評価試験に非常に有用である。
【００１５】
以下本発明の実施例について詳細に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
[実施例１]  ヒト肝臓癌細胞株の製造と維持
ヒト肝細胞癌（HCC）細胞系由来のヒト肝臓癌細胞FLC-5を、ASF-104無血清培地（味の素株式会社）中に懸濁し、培養装置を5％CO2を含む非常に高湿な空気中で37℃に維持した。細胞の継代の際は、2％EDTA溶液に25USP unit/mlトリプシン（Difco co., Ltd.）を添加して細胞を分離した。
【００１６】
[実施例２]  ラジアルフロー型バイオリアクタによる３次元高密度培養
ラジアルフロー型バイオリアクタ（以下「RFB」と略記することもある。）RA-15（エイブル株式会社）およびmass flow controller RAD925（エイブル株式会社）によって、直径1-2mm、ポアサイズ200μm以下のヒドロキシアパタイトビーズ（ＰＥＮＴＡＸ）を用い、指示書に従って３次元高密度培養を行った。5×107個のFLC-5細胞をRFBに注入し、培地は初めASP-104無血清培地、次いで2％FBSおよび3g/lを加えて細胞がビーズに接着しやすいようにし、接着後ASF-104に戻した。これにより、108個/ml以上の高密度培養が可能となり、走査電子顕微鏡による観察では、培養されたFLC-5細胞がヒドロキシアパタイトビーズの表面に重層して生着していることが確認された。また、透過電子顕微鏡により、細胞間が密着しており、毛細胆管様構造と細胞間結合装置も発達していることが観察された。細胞は球形あるいは立方形をしており、立体的な３次元培養が実現された。
【００１７】
[実施例３]  リアルタイムPCR法によるmRNAの発現解析
上述の方法で培養した細胞から、SV total RNA extraction kit (PROMEGA)によって総RNAを抽出した。リファンピシンン（Sigma）は、解析の48時間前にFLC-5細胞の培養液に50μMとなるよう添加した。YP3A4用のプライマーとTaqManプローブはGenBankのデータベースを使用して、NCBIにAF182273の番号で登録されているcDNA配列に従い、Primer Express TMソフトウエア（Perkin-Elmer Applied Biosystems）にて設計し調製した。AF209389の番号で登録されているゲノムDNA配列の情報から、プローブはExon/Intron junctionにかけるように設計し、ゲノムDNAの混入を完全に排除した。プライマーとプローブを以下に示す。
Forward Primer Sequence: 5’ GCAGGAGGAAATTGATGCAGTT
Reverse Primer Sequence: 5’ GTCAAGATACTCCATCTGTAGCACAGT
TaqMan Probe Sequence: 5’ TACCCAATAAGGCACCACCCACCTATGA
これらのプライマーとプローブを使用し、ABI Prism 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer Applied Biosystems)を用いて付属の指示書に従って逆転写反応およびシグナルの検出を行った。検量線には単層培養したFLC-5細胞から回収した総RNAを使用して、1000ng総RNA/50μl反応系から5倍公比で0.32ng総RNA/50μl反応系までの定量範囲を調べた。特異性はGAPDHのmRNAを内在性コントロールとした。結果を図１に示す。CYP3A4mRNA発現量は、リファンピシン非誘導下で単層培養に比べて３次元高密度培養では7.7倍増加していた。また、単層培養ではリファンピシン非誘導に比してリファンピシン誘導で2.4倍しか発現量が増加しなかったのに対し、３次元高密度培養ではリファンピシン非誘導に比してリファンピシン誘導では33.8倍増加した。単層培養でのリファンピシン誘導群と比較すると、３次元高密度培養でのリファンピシン誘導群ではCYP3A4mRNA発現量が108.4倍増加したことになる。
【００１８】
[実施例４]  ミクロソームの調製とウェスタンブロッティング
RFBによりFLC-5細胞を３次元高密度培養した後、リファンピシン誘導下および非誘導下で培養し、ビーズに付着した状態のまま−８０℃で凍結保存した。FLC-5細胞が付着したヒドロキシアパタイトビーズ0.5-1.0gに対して、それぞれ2倍量のホモジネート用緩衝液（10% sucrose、0.01M K2HPO4、1mM DTT、pH7.30）を加え、振とう撹拌する。ビーズを自然沈降させ、破壊された細胞成分を含む上清を3000rpmで5分間遠心分離し、上清を回収してさらに3500gで13分間遠心分離する。ここで得た上清を24000gで30分間遠心分離し、沈殿を緩衝液（0.15M K2HPO4、1mM DTT、pH7.30）に再懸濁してリファンピシン誘導および非誘導ミクロソーム画分を得る。調製したミクロソーム懸濁液のタンパク質定量をローリー法により行った後、4-20％勾配のゲルを用意し、各レーンに10μgのミクロソームタンパク質を配して、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動終了後、タンパク質をゲルからPVDF膜に転写した。PVDF膜を3％BSAを含む反応液（0.025M Tris、0.15M NaCl、pH7.4）内で30分間振とうし、ブロッキングした。抗ヒトCYP3A4抗体（Gentest Corp.）を室温で1時間反応させ、さらに抗ウサギIgGアルカリホスファターゼコンジュゲート（Gentest Corp.）を室温で1時間反応させた。洗浄後、アルカリホスファターゼ緩衝液（0.1M NaCl、0.05M MgCl2、0.1M Tris、pH9.5）に浸し、NBT（Sigma）とBCIP（Sigma）を混合した基質溶液で反応させて発色させた。
結果を図２に示す。リファンピシン誘導した細胞のミクロソーム（右）には、タンパク質レベルでも明らかに高いCYP3A4の発現が認められた。
【００１９】
[実施例５]  ３次元高密度培養FLC-5細胞を用いたテストステロンの代謝実験
RFBにより３次元高密度培養したFLC-5細胞の培養液15mlに、50μMのCYP3A4の代表的基質であるテストステロンを添加して還流した。6時間後に培養液と細胞の付着したビーズを回収し、−40℃で凍結保存した。リファンピシン誘導群では、テストステロンを添加する48時間前に培養液に50μMのリファンピシン（Sigma）を添加した。テストステロン（Wako）はDMSOで溶解し、培養液中でDMSOの最終濃度が0.25％以下になるようにした。凍結保存したサンプルから、テストステロン濃度をHPLCで計測した。HPLCの内部標準としてNitrazepam(Wako)を適宜培養液に加え、さらに酢酸エチルを加えて10分間振とうする。3200rpmで5分間遠心分離し、上層の有機層4.5mlをガラスチューブに移してエバポレーターで乾燥した後、HPLC移動層溶媒250μlを加えて溶解した。移動層はDW:methanol（40％：60％）とし、H3PO4でpH3.4に調製して脱気した。カラムは逆相CAPCELLPAK C18 UG120(資生堂)を、検出器はSPD-10AVP型紫外線吸収検出器（島津製作所）を用いた。サンプル70μlを注入し、流速0.7ml/mnで移動層溶媒を流し、244nmでの吸光度を測定した。
リファンピシン誘導群を用いた代謝実験の結果を図３のＡに、リファンピシン非誘導群を用いた結果を図３のＢに示す。リファンピシン誘導群では、細胞内および培養液に、テストステロンのCYP3A4による代謝産物である６β−ヒドロキシテストステロンのピークを検出することができた。一方、リファンピシン非誘導群では、細胞内の６β−ヒドロキシテストステロンは検出されたものの非常にわずかであり、培養液では検出感度以下であった。
【００２０】
【発明の効果】
本発明により、シトクロムＰ４５０を高濃度に含む継代培養された肝細胞および該肝細胞由来の肝ミクロソームを提供することができた。本発明にかかる肝細胞および肝ミクロソームは、シトクロムＰ４５０による薬物代謝能をin vitroで維持しており、薬物代謝試験に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  単層培養したＦＬＣ−５細胞と三次元高密度培養したＦＬＣ−５細胞をリファンピシン処理した場合のＣＹＰ３Ａ４ｍＲＮＡの発現を、リアルタイムＰＣＲ法を用いて測定した結果を示す。
【図２】  三次元高密度培養したＦＬＣ−５細胞にリファンピシン処理をした場合としなかった場合のＣＹＰ３Ａ４量をウェスタンブロッティング法により測定した結果を示す。
【図３】  三次元高密度培養したリファンピシン誘導または非誘導ＦＬＣ−５細胞におけるテストステロンの代謝実験の結果を示す。
【図１】
0003929910.tif 000002
【図２】
0003929910.tif 000003
【図３】
0003929910.tif 000004