(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被覆を有する支持体を含む、ブロット検定法において用いられる膜であって、
該支持体が、ニトロセルロース、ナイロン及びポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）よりなる群から選ばれ、
該被覆が、式：
0003992078.tif 000018
［式中、ＭはＮであり、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立して、非置換又はヒドロキシル、アミノ、アミド若しくはウレイド基置換の、１〜２０個の炭素原子を有する、アルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル、アラルキル若しくはアリールであるか、或は、Ｍ原子に対するスピロ結合を介して、複素環（これは、Ｍ原子に加えて１〜２個のＮ、Ｓ又はＯ原子を有する、芳香族、脂肪族、又はその混合である）のオニウム部分を形成するように結合し、Ｘはハロゲン、スルファート基又はスルホナートであり、そしてｎは、重合体の分子量が８００〜２００，０００となるように選ばれる］で示される繰り返し単位を有する重合体から構成され；
該膜が、ドデシル硫酸ナトリウムの溶液で洗浄される、ことを特徴とする膜。
【請求項２】
該重合体が、ポリビニルベンジルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルベンゾイルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリヘキシルアンモニウムクロリド−ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド共重合体、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド−ポリビニルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド共重合体及びポリビニルベンジルフェニルウレイドエチルジメチルアンモニウムクロリド−ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド共重合体よりなる群から選ばれる請求項１記載の膜。
【請求項３】
洗浄された膜が、塩化ナトリウムの溶液で更に洗浄される請求項１記載の膜。
【請求項４】
被検物の成分の存否を測定するブロット検定の実施方法であって、該被検物を請求項１の膜に固定する工程、抗体−酵素複合体及び核酸プローブ−酵素複合体から選ばれる複合体に該膜上の該被検物を接触させる工程、該抗体又は核酸プローブを、該被検物に存在する該成分のいずれかに結合させうる工程、次いで酵素複合体処理被検物を、酵素−開裂性１，２−ジオキセタンと共に温置して酵素によって開裂しやすい保護基を該ジオキセタンから開裂させて、該ジオキセタンを分解させかつ化学発光させる工程、及び得られた化学発光の程度を測定する工程（ここで化学発光の量及び存在は該成分の検出を意味する）、を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
基質１，２−ジオキセタンが、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）又はリン酸３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニル二ナトリウム（ＣＳＰＤ）である請求項４記載の方法。
【請求項６】
被検物の成分の存否を測定するための化学発光ブロット検定を実施するためのキットであって、
（ａ）開裂されたときにジオキセタンを分解させかつ化学発光を生起させる、酵素−開裂性基を有するジオキセタン基質、
（ｂ）抗体−酵素複合体及び核酸プローブ−酵素複合体（ここで、該抗体又は核酸プローブは、該成分に特異的であり、そして該酵素は該酵素によって開裂しやすい保護基を開裂する）よりなる群から選ばれる複合体、及び
（ｃ）上記請求項１記載の膜
からなることを特徴とするキット。
【請求項７】
基質ジオキセタンが、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）又はリン酸３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニル二ナトリウム（ＣＳＰＤ）である請求項６記載のキット。
【請求項８】
被検物の成分の存否を測定するブロット検定の実施方法であって、
該被検物を膜に固定する工程（ここで、膜は、支持体と支持体上の被覆から構成され、被覆は重合体から構成されている）、
抗体−酵素複合体及び核酸プローブ−酵素複合体から選ばれる複合体に膜上の被検物を接触させる工程、
抗体又は核酸プローブを、被検物に存在する成分のいずれかに結合させうる工程、
酵素複合体処理被検物を、酵素−開裂性１，２−ジオキセタンと共に温置して酵素によって開裂しやすい保護基をジオキセタンから開裂させて、ジオキセタンを分解させかつ化学発光させる工程、及び
得られた化学発光の程度を測定する工程（ここで化学発光の量及び存在は該成分の検出を意味する）を含み；
ここで、重合体が、式：
0003992078.tif 000019
［式中、ＭはＮであり、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立して、非置換又はヒドロキシル、アミノ、アミド若しくはウレイド基置換の、１〜２０個の炭素原子を有する、アルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル、アラルキル若しくはアリールであるか、或は、Ｍ原子に対するスピロ結合を介して、複素環（これは、Ｍ原子に加えて１〜２個のＮ、Ｓ又はＯ原子を有する、芳香族、脂肪族、又はその混合である）のオニウム部分を形成するように結合し、Ｘはハロゲン、スルファート基又はスルホナートであり、そしてｎは、重合体の分子量が８００〜２００，０００となるように選ばれる］で示される繰り返し単位から構成される重合体である、方法。
【請求項９】
１，２−ジオキセタン基質が、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）又はリン酸３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニル二ナトリウム（ＣＳＰＤ）である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
支持体が、ニトロセルロース、ナイロン及びポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）よりなる群から選ばれる請求項８記載の方法。
【請求項１１】
重合体が、ポリビニルベンジルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルベンゾイルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリヘキシルアンモニウムクロリド−ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド共重合体、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド−ポリビニルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド共重合体及びポリビニルベンジルフェニルウレイドエチルジメチルアンモニウムクロリド−ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド共重合体よりなる群から選ばれる請求項８記載の方法。
【請求項１２】
膜を、ドデシル硫酸ナトリウムの溶液で洗浄する工程を更に含む請求項８記載の方法。
【請求項１３】
膜を、塩化ナトリウムの溶液で洗浄する工程を更に含む請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
被検物の成分の存否を測定するための化学発光ブロット検定を実施するためのキットであって、
（ａ）開裂されたときにジオキセタンを分解させかつ化学発光を生起させる、酵素−開裂性基を有するジオキセタン基質、
（ｂ）抗体−酵素複合体及び核酸プローブ−酵素複合体（ここで、該抗体又は核酸プローブは、該成分に特異的であり、そして該酵素は該酵素によって開裂しやすい保護基を開裂する）よりなる群から選ばれる複合体、及び
（ｃ）支持体と支持体上の被覆から構成される膜（ここで、被覆が重合体から構成され、そして重合体が、式：
0003992078.tif 000020
［式中、ＭはＮであり、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、独立して、非置換又はヒドロキシル、アミノ、アミド若しくはウレイド基置換の、１〜２０個の炭素原子を有する、アルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル、アラルキル若しくはアリールであるか、或は、Ｍ原子に対するスピロ結合を介して、複素環（これは、Ｍ原子に加えて１〜２個のＮ、Ｓ又はＯ原子を有する、芳香族、脂肪族、又はその混合である）のオニウム部分を形成するように結合し、Ｘはハロゲン、スルファート基又はスルホナートであり、そしてｎは、重合体の分子量が８００〜２００，０００となるように選ばれる］で示される繰り返し単位から構成される）
からなることを特徴とするキット。
【請求項１５】
ジオキセタン基質が、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）又はリン酸３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン｝−４−イル）フェニル二ナトリウム（ＣＳＰＤ）である請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
重合体が、ポリビニルベンジルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルベンゾイルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド、ポリビニルベンジルトリヘキシルアンモニウムクロリド−ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド共重合体、ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド−ポリビニルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド共重合体及びポリビニルベンジルフェニルウレイドエチルジメチルアンモニウムクロリド−ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド共重合体よりなる群から選ばれる請求項１４記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、膜で実施される生物学的検定法、特に、被検物を膜に析出させ、続いて被検物中の推測成分の存否及び量を化学発光の放出によって示すことを含む工程に付す化学発光検定法に関連する用途のための、改良された新規な膜に関する。さらに特定的には、本発明は、リガンド結合対中の酵素及び酵素抱合体によって誘発されて発光しうる１，２−ジオキセタンに基づく化学発光検定法に関連して用いることができる膜に関する。
背景技術
化学発光の検出を利用するブロット検定法は、蛋白質及び核酸の検出のためのますます一般的な方法となっている。慣用的には、そのような検定法は、被検物試料を膜上に遊離させ、抗体−薬剤複合体又は核酸プローブ−薬剤複合体にその膜を接触させることによって実施され、ここでは、この薬剤が、添加された組成物に化学発光を生起させる。その最も広く実施される形態では、この形式のブロット検定法は、分解して光を放出し得る化合物にその分解を生起させて化学発光を与える薬剤として、酵素又は酵素抱合体を利用する。この目的のための最も一般的な化合物は、１，２−ジオキセタン類である。これらの構造は、アダマンチル基若しくは類似の安定化基、又は誘導体化されたアダマンチル基で安定化されるならば、酵素によって開裂しやすい基で保護することができ、この基は、被検物の標的化合物に固着させた抗体又は核酸プローブに結合させた適切な酵素で開裂された場合に、不安定なアニオンを形成し、次いで分解して光を放出する。酵素を用いる場合には、化学発光化合物は基質であり、ジオキセタンの基質中では、ＡＭＰＰＤ、リン酸  ３−（４−メトキシ−スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン］−４−イル）フェニル二ナトリウムが広く用いられる。アダマンチル基が様々な電子活性基で置換された構造的に関連した化合物は、アダマンチル部分が、単に安定化させる作用物からジオキセタンの分解に積極的に影響するそれへと変換されている。とりわけ、塩素置換化合物、又はＣＳＰＤは著しく効果的であることが立証されている。糖、アセタート並びにその他のエーテル及びエステル部分のような、その他の酵素によって開裂しやすい保護基を有する非常に多様なその他の化合物が公知であり、そして効果的である。
そのようなブロット検定法に用いられるプロトコルは慣用的であり、各種のブロット検定法の中でもウェスタンサザンブロット法が広く知られている。そのような検定法では、蛋白質（或は、関連検定法では核酸）を純化し、そして膜支持体に移す。一般的に公知である膜としては、ニトロセルロース、ナイロン、ＰＶＤＦなどがある。この移された材料（被検物）を、探索しようとする化合物（特定の蛋白質又は核酸）に特異的である少なくとも一つの抗体と共に温置する。ウエスタンブロット検定法では、抗体を酵素と複合体化させることができるか、又は酵素と複合体化させた第二の抗体を洗浄段階の後で添加することができる。ＡＭＰＰＤ及びＣＳＰＤの場合、結合剤（抗体又はＤＮＡ／ＲＮＡプローブ）を、酵素アルカリ性ホスファターゼと抱合させる。洗浄に続いて、このブロットを化学発光性の基質と共に温置する。化学発光の放出は、推測化合物又は標的被検物の存在の確認となる。
サザンブロット法の手順では、ゲル電気泳動による分離後に核酸試料を膜上にブロットする。標的試料に特異的な領域に対する相補的塩基配列を含む、酵素で標識した（直接的にか、又はビオチン−アビジン架橋若しくは抗体−抗原架橋を介して間接的に標識した）核酸プローブを用いて、ハイブリッド形成を行わせる。洗浄に続いて、再びブロットを化学発光性基質と共に温置し、それに続く光信号の放出が推測核酸配列の存在の確認となる。このブロットする様式は、同定される膜支持体に関連するいくつかの問題をもたらす。化学発光性基質が接触している膜表面の化学的内容は、放出された光を消光又は消光を促進させ、従って化学発光信号の強度を低下させる傾向がある。更に、用いられる膜は、現行の生産工程に起因してロットごとにかなりの変動がある。この結果、工程を標準化すること、及び自動的なデータ収集を提供することの双方が困難になる。直面する個別的な問題の中には、信号の非常に低いレベル、非常に高い非特異的バックグラウンド、並びに化学発光性基質、例えばＡＭＰＰＤ及びＣＳＰＤの膜−開始性の分解がある。
ＡＭＰＰＤのような基質ジオキセタンを扱うときには、これらの化合物は、水性のプロトン性の環境中では化学発光の強さが非常に低いことに留意することが重要である。これは、主として、プロトン移動消光反応によるか、又は基本的に酵素の開裂によって形成される励起状態の暗反応を促進する傾向にある双極子−双極子相互作用によるものと考えられる。プロトン移動反応は、有機化学では全く周知であり、励起状態の寿命の間では、それより数桁も遅い発光と容易に競合することができる。Shizuka：Accounts of Chemical Research., 1985,Vol.18, 141〜147。このことは、ＡＭＰＰＤの化学発光効率は、水性緩衝剤中ではほぼ10-6にすぎないが、疎水性媒体の存在下ではほぼ104まで向上するという事例によって確認できる。
上記の問題に加え、慣用のブロット検定法は、特定の目標は達成できないままであり続けている。とりわけ重要なのは、ブロット法適用の際に同定された核酸フラグメント又は蛋白質のレベルを定量する能力である。現時点では、ブロット検定法は本質的に定性的であり、探索される成分の存否を確認するにすぎない。成分はすべての被検物中に存在するであろうが、しばしば、疾患の診断は、被検物中のその成分のレベルに依存している。現在のブロット技法は、このことに基づいて、区別できない。
ブロット検定法の未達成であるもう一つの目標は、バックグラウンドの不在下で、結合している成分に対応する鮮明に分離された帯域を可能にするような膜を提供することであって、これは、自動化されたデータ収集に適切であるに違いない。一例として、ＤＮＡ配列のような複雑な情報を読み取る際に、走査電荷結合装置を用いることができる。そのような自動化は、より高い効率で誤差のないデータ収集を可能にするであろう。ジオキセタンのような化学発光化合物に基づく現在のブロット検定法は、自動化されたデータ収集を可能にするのに必要な、バックグラウンドの不在下での帯域の鮮明な分離又は高強度の信号を与えない。
従って、酵素で誘導できるジオキセタンに基づく化学発光ブロット検定法に用いて、改良された定量可能な情報を与えることができる膜を得ることは、当業者の目標として残っている。
発明の開示
それ自体は正に帯電したベンジル第四級アンモニウム単量体からなる重合体自体の重合体被覆を膜に備えることによって、上記の目標は達成され、さらに特定的には、以下に述べるその他の改良が得られる。重合体は、膜それ自体を形成するために用いてもよく、又は、膜として用いるために、いかなる支持体をも被覆するために用いてもよい。慣用の膜、例えばナイロン、ＰＶＤＦ及びニトロセルロースがブロット検定法に適していることは周知であるから、本請求の発明の重合体で被覆したこれらの膜は特に適している。しかしながら、該重合体で被覆した実質的にいかなる不活性な支持体をも用い得ることが強調されるべきである。ある場合には、重合体自体を表面に流延し、次いで剥離して、膜として用いることもできる。
好適な実施態様においては、被覆した膜をＳＤＳ溶液で洗浄し、次いで、食塩水及び水で洗浄する。ＳＤＳでの洗浄に付した膜を、ＰＢＳに溶解した１M ＮａＣｌで洗浄し、次いで水洗することによって、より一層の改良を達成することができる。検出限界、バックグラウンド信号の低減、及び帯域分離の鮮明度の実質的改良が達成されているので、同定された成分の定量が可能となる。これらの膜も同様に、ＤＮＡ配列決定のための化学発光検定法に実質的改良をもたらす。
【図面の簡単な説明】
図１〜６は、本発明の膜を用いて実施した検定法から得られた化学発光の結果に対応する。図１、４及び５はニトロセルロース膜に基づく検定法を反映し、図２及び６はナイロン膜に基づく検定法を反映し、そして図３はＰＶＤＦ膜を用いる検定法を反映している。それぞれの場合に、「対照」とは、同一形式の被覆していない膜のことである。
発明を実施するための最良の様式
本発明の重合体の膜又は膜被覆物は、一般的には、重合体性のオニウム塩、特に、ホスホニウム、スルホニウム、及び、好ましくは、アンモニウム部分に基づく第四級塩に基づいている。重合体は、下記に示される一般式（Ｉ）：
0003992078.tif 000002
を有する。
この式において、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3のそれぞれは、全部で１ないし２０個の炭素原子を有する、直鎖又は分岐鎖の非置換アルキル基、例えばメチル、エチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ヘキシルなど；１個又はそれ以上のヒドロキシル、アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ若しくはポリオキシエチルエトキシ、アリールオキシ、例えばフェノキシ、アミノ若しくは置換アミノ、例えばメチルアミノ、アミド、例えばアセトアミド若しくはウレイド、例えばフェニルウレイドで置換された、全部で１ないし２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖のアルキル基；或いはフルオロアルカン又はフルオロアリール、例えばヘプタフルオロブチル基、全部で３ないし１２個の炭素環炭素原子を有する非置換モノシクロアルキル基、例えばシクロヘキシル若しくはシクロオクチル、１個又はそれ以上のアルキル、アルコキシ若しくは融合ベンゾ基で置換された、全部で３ないし１２個の環炭素原子を有する置換モノシクロアルキル基、例えばメトキシシクロヘキシル若しくは１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、非置換又は１個若しくはそれ以上のアルキル、アルコキシ若しくはアリール基で置換された、それぞれ全部で５ないし１２個の炭素原子を有する、２個又はそれ以上の融合環を有するポリシクロアルキル基、例えば１−アダマンチル若しくは３−フェニル−１−アダマンチル、非置換又は１個又はそれ以上のアルキル、アリール、フッ素若しくはヒドロキシル基で置換された、少なくとも１個の環及び全部で６〜２０個の炭素原子を有する、アリール、アルカリール又はアラルキル基、例えばフェニル、ナフチル、ペンタフルオロフェニル、エチルフェニル、ベンジル、ヒドロキシベンジル、フェニルベンジル又はデヒドロアビエチルであることができ；Ｒ1、Ｒ2及びＲ3のうち少なくとも二つは、それらが結合している第四級窒素原子と一緒になって、飽和又は不飽和の、全部で３ないし５個の炭素原子及び全部で１ないし以上３個のヘテロ原子を有し、かつ付随ベンゼン環が形成されていてもよい窒素を含有するか、窒素及び酸素を含有するか、又は窒素及び硫黄を含有する、非置換若しくは置換された環、例えば１−ピリジニウム、１−（３−アルキル若しくはアラルキル）イミダゾリウム、モルホリノ、アルキルモルホリニウム、アルキルピペリジニウム、Ｎ−アシルピペリジニウム、ピペリジノ若しくはアシルピペリジノ、ベンゾオキサゾリウム、ベンズチアゾリウム又はベンズアミダゾリウムを形成することができる。
記号Ｘ-は対イオンを表し、単独に、又は結合して、ハロゲン化物、すなわちフッ化物、塩化物、臭化物又はヨウ化物、スルファート、アルキルスルホナート、例えばメチルスルホナート、アリールスルホナート、例えばｐ−トルエンスルホナート、置換アリールスルホナート、例えばアニリノナフチレンスルホナート（種々の異性体）、ジフェニルアントラセンスルホナート、パークロラート、アルカノアート、例えばアセタート、アリールカルボキシラート、例えばフルオレセイン又はフルオレセイン誘導体、ベンゾ複素環のアリールカルボキシラート、例えば７−ジエチルアミノ−４−シアノクマリン−３−カルボキシレートなどの部分を包含することができ、ｐ−テレフタラートなどの有機ジアニオンもＸ-によって表されてよい。
記号ｎは、そのようなポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム）の分子量が、固有粘度又はＬＡＬＬＳ法を用いて測定して、約８００〜約２００，０００（平均分子量）、好ましくは約２０，０００〜約７０，０００の範囲であるような数を表す。
Ｍが窒素であるこれらの重合体、関連共重合体及び関連出発物質の製造法は、G.D. Jonesら：Journal of Polymer Science. 25,201,1958、米国特許第2,780,604号明細書、第3,178,396号明細書、第3,770,439号明細書、4,308,335号明細書、第4,340,552号明細書、第4,424,326号明細書及びドイツ国公開特許第2,447,611号公報に開示されている。
記号Ｍはリン又は硫黄を表してもよく、ここで、対応するスルホニウム又はホスホニウム重合体は先行技術に記載されている（米国特許第3,236,820号及び第3,065,272号明細書）。
本発明の二つの重合体の製造法は、引用した米国特許に説明されており、本発明自体のいかなる面も構成しない。
２個またはそれ以上の異なる懸垂オニウム基を有する共重合体も、ここに述べた本発明では利用してよい。
0003992078.tif 000003
記号Ｘ、Ｍ’、Ｒ1'、Ｒ2'及びＲ3'はＸ、Ｍ、Ｒ1〜Ｒ3について上記に説明したとおりである。記号ｙ及びｚは、共重合体を構成する個々の単量体のモル分率を表す。したがって、記号ｙ及びｚは、合計は常に１に等しいままで個別に０．０１から０．９９まで変動してよい。
好適な部分としては、ＭはＮであり、Ｒ1〜Ｒ3は、個々に独立に、１〜２０個の炭素原子を有する、非置換又はヒドロキシル、アミノ、アミド、ウレイド基で更に置換された、アルキル、シクロアルキル、ポリシクロアルキル、例えばアダマンタン、アラルキル若しくはアリールであるか、或は、Ｍ原子とのスピロ結合を介して、複素環（これは、場合により他のＮ、Ｓ又はＯというヘテロ原子を含む芳香族、脂肪族若しくはその混合である）のオニウム部分を形成するように結合する。
Ｘは、好ましくは、溶解度を向上させ、そしてイオン強度を望みどおりに変えるように選ばれ、好ましくは、ハロゲン、スルファート又はスルホナートである。共重合体においては、Ｒ1〜Ｒ3は、それぞれ対応するＲ1〜Ｒ3'と同一であるか、又は異なっていてもよい。好適な重合体の例としては、下記のものを含む：
0003992078.tif 000004
ポリビニルベンジルフェニルウレイドエチルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＵＤＭＱ）、
0003992078.tif 000005
ポリビニルベンジルジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（ＤＭＥＱ）、
0003992078.tif 000006
ポリビニルベンジルベンゾイルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＡＥＤＭＱ）、
0003992078.tif 000007
ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＭＱ）、
0003992078.tif 000008
ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド（ＴＢＱ）、
0003992078.tif 000009
ポリビニルベンジルトリヘキシルアンモニウムクロリド−ポリビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド共重合体（ＴＨＱ−ＴＢＱ）、
0003992078.tif 000010
ポリビニルベンジルベンジルジメチルアンモニウムクロリド−ポリビニルアミノエチルジメチルアンモニウムクロリド共重合体（ＢＤＭＱ−ＡＥＤＭＱ）。
これらのビニルベンジル第四級アンモニウム塩重合体は、適切な前駆単量体の遊離基による重合、又はポリ塩化ビニルベンジル、若しくは懸垂塩化ベンジル官能基を有する共重合体での、対応する第三級アミンの徹底的アルキル化によって製造することができる。他の重合体性アルキル化剤、例えばクロロメチル化したポリフェニレンオキシド又はポリエピクロロヒドリンを用いて、この同じ方法を用いることができる。同じ重合体性アルキル化剤は、オキサゾリン環開裂重合の開始剤としても用いることができ、これによって、加水分解後にポリエチレンイミングラフト共重合体が形成される。そのような共重合体は、次いで、好ましくはアラルキル基を用いて四級化して、目的重合体を得ることができる。
ポリビニルアルコールと、一般式（III）：
0003992078.tif 000011
［式中、それぞれＲ4は、同一又は異なる脂肪族置換基であり、Ｘ1はアニオンである］を有する、Bronstein-Bonteらの米国特許第4,124,388号明細書に開示かつ請求されたような、ホルミルベンジル第四級アンモニウム塩との水溶性アセタールも本発明を実施するために用いることができる。また、上記の式（Ｉ）のポリ（ビニルベンジル第四級アンモニウム塩）を製造するために用いられる個々のビニルベンジル第四級アンモニウム塩単量体も、第四級アンモニウムの官能性を保有しない他のエチレン性不飽和単量体と共重合させて、Landらの米国特許第4,322,489号明細書、Bronstein-Bonteらの米国特許第4,340,522号明細書、Landらの米国特許第4,424,326号明細書、Bronstein-Bonteの米国特許第4,503,138号明細書、Bronstein-Bonteの米国特許第4,563,411号明細書及びCohenらの米国特許第3,898,088号明細書に開示かつ請求されたとおりの重合体を与えることができ、これら重合体も、すべて本発明を実施する際の増強物質（enhancer substance）として用いることができる。好ましくは、これらの四級化された重合体は、式（Ｉ）のポリビニルベンジル第四級アンモニウム塩について上記に示した範囲内の分子量を有する。
当業者には明白であると思われるとおり、カチオン性ミクロゲル又は架橋ラテックスの使用は、流延膜の直接的形成に一層適切であるが、予め形成された膜の被覆にも用いることができる。そのような材料は、写真用媒染剤として周知であり、二つのエチレン性不飽和基で置換された架橋結合部分を有する単量体混合物を用いて合成することができる。第四級アンモニウム塩又はホスホニウム塩を含有するラテックスは、Campbellらの米国特許第3,958,995号明細書に記載された方法論を用いて製造することができる。式（IV）：
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［式中、記号Ｘ-、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、上記のとおりである］は、そのような水溶性ラテックス共重合体の有用な一下位群を一般的に表している。記号ｘ、ｙ及びｚは、１を与えるように共に加えねばならないモル分率である。膜は、重合体上に薄い被覆を形成させることによって製造される。重合体に膜それ自体を構成させようとするならば、剥離液で被覆した支持基材、例えばガラス上にこの膜を被覆する。単量体性の溶液は、脱イオン水中で、溶解度を改善するためのエタノール、又は他の慣用の溶媒を用いて調製することができる。それ自体を流延すれば、５０〜１５０℃で約１５分間乾燥することによって、重合体が形成される。
上記したように、この重合体は、単独で膜として、又は、重合体に安定性を付与するために他の支持体上に被覆として用いることができる。支持体が満たすべき唯一の必要条件は、それが検定法の物理的操作の際に用いるのに適していて、検定の成分に関して不活性でなければならないことである。ガラス板、不活性重合体などは、本発明の重合体で被覆するための許容しうる支持体となり得る。これに代えて、これらの第四級重合体及び共重合体を、ナイロン、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース及びその他の重合体性結合剤との混合物からの単一層として被覆することもできる。好適な一つの実施態様では、ブロット検定法での使用に適するとして既に立証された膜、例えばナイロン膜、ＰＶＤＦ、及び特にニトロセルロース膜が、本発明の重合体で被覆された支持体として機能することができる。基質に被覆するには、重合体溶液を膜の細長小片上に析出させ、例えばゴム管を用いて膜表面全体にならして、膜全体を覆う均一な被覆とする。これに代わる被覆方法、例えば浸漬、噴霧などを用いてもよい。被覆された膜を、オーブン中で、５０〜１００℃で約１５分間乾燥する。
分離度を向上させ、バックグラウンド信号を更に低減するには、本発明の膜の重合体被覆をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄することができる。代表的には、膜の細長小片をＳＤＳ又は他の有機スルホン酸塩で洗浄し、次いで水洗する。非ナイロン膜では、ＳＤＳ洗浄によって一層の向上を達成することができる。それ以上の向上はＳＤＳ洗浄後に塩洗浄を実施することによって達成できる。従って、ＳＤＳ洗浄後の膜の細長小片を塩化ナトリウム溶液で洗浄し、再び水洗する。
実施例
本発明は、蛋白質についてのウエスタンブロット法の代表例としての、ＤＮＡ及びマウスＩｇＧの化学発光検定で示した。それぞれを下記に詳細に考察した。各検定において、異なる７種類の重合体Ａ〜Ｇを用いた。これらの重合体は、上記の好適実施例中に説明したもの及びその共重合体から選んだ。用いた特定の配合は下記のとおりである：
Ａ．ＰＵＤＭＱ／ＢＤＭＱ：０．５／０．５
Ｂ．ＰＵＤＭＱ／ＢＤＭＱ：０．３／０．７
Ｃ．ＤＭＥＱ
Ｄ．ＢＡＥＤＭＱ
Ｅ．ＴＢＱ
Ｆ．ＴＨＱ−ＴＭＱ共重合体
Ｇ．ＢＤＭＱ−ＡＥＤＭＡ共重合体。
ＤＮＡ検定及び蛋白質検定の双方に対して、現在商業的に入手可能なニトロセルロース、ＰＶＤＦ及びナイロンの膜のそれぞれを、上記の方法により、指示した濃度の重合体溶液で被覆した。具体的には、５％のメタノールを含有する脱イオン水中に、１．０％、０．２％、そしていくつかの例では０．０２％及び０．００２％の濃度で被覆液を調製した。膜細長小片の一端に被覆液を溜りを形成させ、鋼のロッドで内側から支持された１本のタイゴンゴム管を用いて、被覆液を乾燥した膜の全表面に均一に被覆した。次いでこの膜を、下記に示したように、洗剤洗浄、次いで塩化ナトリウム洗浄を行った後に検定に付した。結果を、手持ち反射濃度計（Tobias Association of Pennsylvania）で測定した写真画像の濃度として第１表及び第２表に示した。「バックグラウンド」及び「２１０での信号」の欄の数字は、濃度計で読み取った実際の反射濃度単位である。「検出限界」欄は、検出されたＤＮＡのピコグラムで表した最少量に対応する。
洗剤による膜の洗浄
被覆した膜の各片を水で湿らせ、下記の方式で処理した：初めに、膜細長小片を１％ＳＤＳ中で６５℃で１時間温置し；リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．１％Tween-20中で室温でそれぞれ１０分ずつ４回洗浄し；１０分ずつ２回水洗し、次いで室温で空気乾燥した。被覆しなかった膜の対照片も同一条件下で洗浄した。
ＮａＣｌによる膜の洗浄
ＳＤＳで予め洗浄した膜細長小片（プロトコル２のように）を、下記のようにしてＮａＣｌで更に処理した：乾燥膜細長小片を、ＰＢＳ中の１％ＳＤＳで湿らせ、２回水で濯いだ。ＰＢＳ中の１M ＮａＣｌにより６５℃で１時間洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の０．１％Tween-20で１０分ずつ２回、次いで水で１０分ずつ２回洗浄し、空気乾燥した。
被覆された膜の化学発光の評価
ビオチニル化したｐＢＳ３２２−３５merの一連の希釈液を、すべての膜細長小片上にスポットした。スポットしたＤＮＡの最終量は、１スポットあたり２１０、１０５、５２．５、２６．２５、１３．１３、６．５６、３．２８及び１．６４ピコグラムであった。次いで、５分間のＵＶ照射によって、ＤＮＡを膜細長小片に固定した。次いで、この膜を下記の方式で処理した：初めに、ＳＳＣで１回湿らせ、ＰＢＳ中の、０．２％カゼイン、０．１％Tween-20で３０分間ブロックし、０．２％カゼインＰＢＳ中でＡｖｉｄｘアルカリ性ホスファターゼの１〜１０，０００倍希釈液とともに温置した。次いで、膜細長小片を、ＰＢＳ中の、０．２％カゼイン、０．１％Tween-20で５分間ずつ２回洗浄し、０．３％Tween-20で５分間ずつ２回洗浄し，基質緩衝液（０．１Mジエタノールアミン、１mMＭｇＣｌ2、pH１０．０）中で５分間ずつ２回洗浄し；基質緩衝液中の０．２５mMＡＭＰＰＤ中で温置し、プラスチックに包み；そしてコダック（kodakd）社のＸＡＲのＸ線フィルムに露光させた。
蛋白質の検出：ウエスタンブロット法
マウスＩｇＧを１０μｌあたり２０、１０、５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、０．０７８及び０．０３９ナノグラムの希釈としてゲルに装荷し、電気泳動によって分離し、次いで下記の膜細長小片に移した：
Ａ．ＳＤＳ洗浄のニトロセルロース、
Ｂ．未洗浄ニトロセルロース（ニトロブロックなし）、
Ｃ．ＨＴＱ−ＴＢＱで被覆し、洗浄（ＳＤＳ）したニトロセルロース、
Ｄ．ＨＴＱ−ＴＢＱで被覆し、洗浄（ＳＤＳ及びＮａＣｌの両者）したニトロセルロース、
Ｅ．ニトロブロックを施したニトロセルロース。
１．Biodyne A（ナイロン）、
２．ＨＴＱ−ＴＢＱで被覆し、洗浄（ＳＤＳ）したBiodyne A、
３．ＨＴＱ−ＴＢＱで被覆し、洗浄（ＳＤＳ及びＮａＣｌの両者）したBiodyne A。
続いて、ＰＢＳ中の、０．２％カゼイン、０．１％Tween-20中で３０分間膜細長小片をブロックし、次いでＰＢＳ／０．１％Tween-20中で抗マウスＩｇＧ−アルカリ性フォスファターゼ抗体（１〜１０，０００倍希釈）と共に温置した。次いで膜細長小片をＰＢＳ／０．１％Tween-20中で３回洗浄し、基質緩衝液（０．１Mジエタノールアミン、１mMＭｇＣｌ2、pH１０．０）中で洗浄し、最後にＣＳＰＤ中で温置して、Ｘ線フィルムに露光させた。
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上記の検定結果を図１〜６に図示した。これらの図のそれぞれは、慣用の膜（対照）、及び下記に示した本発明の被覆膜を比較したものである。
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本発明は、一般的配合及び特定の実施例に関して上記に説明されている。実施例は、そのように指示されていない限り、限定的ではなく、当技術の通常の習熟者には変法が着想されるものと思われる。変法の中では、特定の重合体の配合、被覆の強度、膜支持体、化学発光性ジオキセタンなどは、当業者には発明能力を訓練することなく着想されるものと思われ、下記に列挙した請求範囲の限定を除いて、発明の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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