(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペクチン酸リアーゼ又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記ペクチン酸リアーゼの酵素活性を保持するペクチン酸リアーゼ。
【請求項２】
アミノ酸の欠失、置換若しくは付加が、配列番号１中１０７位リジン、１２９位リジン及び１３２位アルギニンを保存するようになされたものである請求項１記載のペクチン酸リアーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２記載のペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子。
【請求項４】
配列番号１に示す塩基配列からなるペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子又は該塩基配列の１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ前記ペクチン酸リアーゼの酵素活性を保持するペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子。
【請求項５】
請求項３又は４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
宿主が、微生物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５又は６記載の形質転換体を培養し、培養物からペクチン酸リアーゼを採取することを特徴とする請求項１又は２記載のペクチン酸リアーゼの製造法。
【請求項９】
バチルス属細菌により産出され、下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼ。
（１）作用
ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４    結合を切断すると共に非還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジガラク    ツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性
プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペク    チンに作用する。
（３）最適反応pH
pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸    を基質とした場合）
（４）安定pH
pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中６０分間処    理）
（５）分子量
約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で    は約２６ｋＤａ）
【請求項１０】
下記の酵素学的性質を有するものである請求項９記載のアルカリペクチン酸リアーゼ。
（１）作用
ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４    結合を切断すると共に非還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジガラク    ツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性
プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペク    チンに作用する。
（３）最適反応pH
pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸    を基質とした場合）
（４）安定pH
pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中６０分間処    理）
（５）最適反応温度
５０〜５５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチ    ン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性
約５０℃（pH７．５、５０mMトリス−塩酸緩衝液中、３０分間処理）
（７）分子量
約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法で    は約２６ｋＤａ）
（８）等電点
pH１０．３付近（等電点電気泳動法）
（９）阻害剤
エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤によって阻害される。
（１０）金属イオン
反応にＣａ2+を必要とする。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規ペクチン酸リアーゼ及びその遺伝子に関し、さらに詳細には洗浄剤、食品加工剤、繊維処理剤等として有用なペクチン酸リアーゼ及びその遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペクチンは、高等植物細胞壁の主要成分の一つで、細胞壁間の接着固定に関与しているといわれる。食品工業では古くから、果汁の清澄化にペクチン質分解酵素を用いており、搾汁率の向上、柑橘ジュースパルプからの可溶性固形分の回収、野菜単細胞食品の製造、みかん内果皮の剥皮などに広く用いられてきた。
【０００３】
ペクチン質分解酵素の基質はプロトペクチン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸などに分けられるが、いずれもＤ−ガラクツロン酸がα−１，４結合したポリガラツクロン酸を基本骨格としている。プロトペクチンは水不溶性の重合度１，０００〜２，０００のポリガラクツロン酸単位からなり、５０〜８０％のメトキシル基を有している。一方、ペクチンとペクチニン酸は水溶性で、ポリガラクツロン酸がメトキシル化されたものであり、後者の場合、そのメトキシル基が少量のものを言う。ペクチン酸はメトキシル基を含まないポリガラクツロン酸そのものである。これらの基質に対して作用する酵素は大きく分類すると、４種類存在する。すなわち（１）ペクチンのメチルエステルを加水分解するペクチンメチルエステラーゼ、（２）ペクチンとペクチン酸のα−１，４結合を加水分解するエンド型とエキソ型のポリガラクツロナーゼ、（３）ペクチンとペクチン酸に対しβ−脱離反応でα−１，４結合を切断し、基質の非還元末端にＣ４−Ｃ５不飽和結合を形成するエンド型とエキソ型のペクチンリアーゼとペクチン酸リアーゼ、そして（４）オリゴガラクツロン酸を主な基質とするオリゴガラクツロナーゼである（伊崎，バイオサイエンスとインダストリー，50, 315-321, 1992）。この他、プロトペクチンに対して作用するプロトペクチナーゼも知られるようになってきている（Sakai & Okushima, Agric. Biol. Chem.,42, 2427-2429, 1978;Sakai & Okushima, Agric. Biol. Chem., 46, 667-676, 1982;Sakai & Sakamoto, Agric. Biol. Chem., 54, 879-889, 1990）。この酵素はポリガラクツロナーゼあるいはペクチン酸リアーゼ活性を有するＡ−タイプと、セルロースとペクチン質を結び付けている介在多糖のアラビナンのα−１，５結合性ガラクタンのα−１，４結合を加水分解するＢ−タイプのプロトペクチナーゼに分類されるという（坂井と阪本，繊維工学，45, 19-32, 1992）。
【０００４】
ペクチン酸リアーゼ（EC 4.2.2.2）は、１９６１年、バチルス  ポリミキサ（Bacillus polymyxa）の培養液に初めて見い出されたもので、反応にカルシウムイオンを必要としている（Nagel & Vaughn, Arch. Biochem. Biophys., 94, 328-332, 1961）。一般にPseudomonas属、Erwinia属、Bacillus属などの細菌由来のペクチン酸リアーゼの最適反応pHは８〜９．５付近にある（Rombouts & Pilnik, Eco. Microbiol., 5, 227-282, 1980）。さらに、微生物由来のいくつかのペクチン酸リアーゼは最適pH１０〜１０．５であることが知られている。例えばFusarium oxysporum f. sp. ciceriの生産する２種の酵素（いずれも分子量はゲル濾過法で37kDa）（Arte's & Tena, Physiol. Mol. Plant Pathol., 37, 107-124, 1990）とBacillus sp. YA-14の酵素（ゲル濾過法とソディウムドデシルサルフェイト（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミド電気泳動法で分子量が43kDa）（Han et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 20, 655-662, 1992）は最適pHが１０〜１０．５に存在するが、これらの酵素の場合、pH７〜８付近にも最適pHのピークが存在する。一方、Fusarium solani f. sp. pisiの酵素（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で分子量が29kDa;PelB）の最適pHは１０付近であることが知られている（Guo et al., J. Bacteriol., 177, 7070-7077, 1995）、また、放線菌のAmycolataのある種の株が生産する酵素（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で31kDa,質量分析で30kDa）の最適pHは１０．２５であるという（Bruhlmann, Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585, 1995）。
【０００５】
遺伝子学的、生化学的に充分研究されているBacillus属細菌のペクチン酸リアーゼについては、比較的報告例が少ない。Nagel とVaughnが最適pHが８．９〜９．４のBacillus polymyxaの培養液にペクチン酸リアーゼを発見して以来（Arch. Biochem. Biophys., 93, 344-352, 1961）、Bacillus pumilusで最適pHが８．０〜８．５の酵素（ゲル濾過法で約20kDa）（Dave & Vaughn, J. Bacteriol., 108, 166-174, 1971）、Bacillus subtilisで最適pHが８．５の酵素（ゲル濾過法で分子量が31〜35kDa）（Chesson & Codner, J. Appl. Bacteriol., 44, 347-364, 1978）、好熱性Bacillus属細菌の一種が生産する最適pHが８．５〜９．３の酵素（分子量は不明）（Karbassi & Luh, J. Food Sci., 44, 1156-1161, 1979）が知られている。Bacillus subtilis SO 113 株の生産する酵素は分子量がＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で４２ｋＤａであり、最適pHが８．４であるがさらにpH１０以上にもう一つの活性ピークが存在する（Nasser et al., Biochimie, 72, 689-695, 1990）。最近、Sakamoto ら（Biosci. Biotech. Biochem., 58, 353-358, 1994）は、プロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼをBacillus subtilisＩＦＯ３１３４から精製しているが（protopectinase-N）、最適pHが８．０で、分子量がＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で４３ｋＤａ、ゲル濾過法で３２ｋＤａであるという。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、これら従来のペクチン酸リアーゼは、生産性が低く、高価であるため、工業的利用ができない、酵素活性も充分でない等の問題があり、広く産業界で応用されていない。
従って本発明の目的は、ペクチン質を含む植物性の細胞壁あるいはその断片を含む物質中からペクチン自体を分解する作用に優れ、かつ大量生産可能なペクチン酸リアーゼ及びその遺伝子を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は、ペクチン酸リアーゼを産生する微生物を自然界から探索し、遺伝子工学技術を利用してその遺伝子、その特性及びその大量生産技術を確立すべく種々検討してきたところ、土壌から分離したバチルス属細菌が産生する新規な酵素学的性質を有するペクチン酸リアーゼを見出し、さらにその遺伝子のクローニング、遺伝子組換えによる生産技術の確立、その変異体の調製及びそれら特性の解明に成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるペクチン酸リアーゼ又は該アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ前記ペクチン酸リアーゼの酵素活性を保持するペクチン酸リアーゼを提供するものである。
また、本発明は、上記のペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター及び該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
また、本発明は上記の形質転換体を培養し、培養物からペクチン酸リアーゼを採取することを特徴とする上記のペクチン酸リアーゼの製造法を提供するものである。
また、本発明は下記の酵素学的性質を有するアルカリペクチン酸リアーゼを提供するものである。
（１）作用
ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性
プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応pH
pH１０．３〜１０．７（５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH
pH５〜１１．５（３０℃、４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液中６０分間処理）
（５）分子量
約２０〜２１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ）
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のペクチン酸リアーゼは、配列番号１に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。欠失、置換若しくは付加（以下、変異ということがある）は、ペクチン酸リアーゼ活性を失なわない限り特に制限されないが、配列番号１における１０７位リジン、１２９位リジン及び１３２位アルギニンを保存するような変異であるのが望ましい。また、変異の程度は特に制限されないが、上記１０７位、１２９位及び１３２位を保存する限り、配列番号１中のアミノ酸番号３６〜１３２のうち５５．７％以上の相同性を有しているのが好ましく、７０％以上の相同性を有しているのがより好ましく、８０％以上の相同性を有しているのが特に好ましい。また、配列番号１のアミノ酸配列におけるＮ末端には、１〜数個のアミノ酸が付加していてもよい。該Ｎ末端に付加していてもよいアミノ酸としては、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ａｌａ等が挙げられる。
【００１０】
本発明のペクチン酸リアーゼは、前記の如く土壌から分離したバチルス属に属する微生物（例えばバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５株やそれらの変異株）を培養し、得られた培養物から採取することによって製造できるが、該ペクチン酸リアーゼを産生する微生物から、該ペクチン酸リアーゼをコードする遺伝子を取得し、これを用いて組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物からペクチン酸リアーゼを採取することによっても得られる。
【００１１】
本発明ペクチン酸リアーゼ遺伝子は、例えばＫＳＭ−Ｐ１５株からクローニングすることができる。該クローニング手段としては、既知の手段、例えば（１）適当な制限酵素による染色体ＤＮＡの全分解又は部分分解で得られたＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込み、大腸菌や枯草菌などに導入し発現させるショットガン法、（２）適当なプライマーを合成してＰＣＲ法で目的とする遺伝子をクローニングする方法等が挙げられる。
【００１２】
本発明ペクチン酸リアーゼ遺伝子の塩基配列の一例を配列番号１に示す。該塩基配列は、配列番号１に限定されるものではなく、配列番号１のアミノ酸配列又はその前記変異体をコードするものであればよいが、配列番号１で示される塩基配列、又は該塩基配列の１若しくは２以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。ここで欠失、置換若しくは付加は、前記アミノ酸配列の変異の範囲内であることが好ましい。
【００１３】
前記ペクチン酸リアーゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターにペクチン酸リアーゼ遺伝子を組み込めばよい。かかるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場合、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。
【００１４】
かくして得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、常法、例えばプロトプラスト法、コンピテントセル法等により行われる。宿主としては、特に制限されないが、微生物が好ましく、バチルス  ズブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス  リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルスブレビス（Bacillus brevis）、バチルス  ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス  レンタス（Bacillus lentus）、バチルスアルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス  アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス  サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス  ロータス（Bacillus lautus）、バチルス  ファーマス（Bacillus firmus）、ストレプトマイセス  ムリナス（Streptomyces murinus）等のグラム陽性菌；大腸菌（Escherichia coli）等のグラム陰性菌；サッカロマイセス属酵母、アスペルギルス属カビ等の真菌等が挙げられる。
【００１５】
得られた形質転換体を培養して本発明ペクチン酸リアーゼを採取するには、例えば前記のＫＳＭ−Ｐ１５株を用いた培養、採取、精製の手段に準じればよい。ここで、ＫＳＭ−Ｐ１５株又は上記の形質転換体を用いて本発明ペクチン酸リアーゼを生産するには、菌株を同化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すれば良い。炭素源、窒素源は特に制限はなく、資化しうる炭素源、例えばペクチン質、ガラクトース、グルコース、蔗糖、でんぷん  また、クエン酸、酢酸等があげられる。窒素源としては、無機のアンモニウム塩や硝酸塩、肉エキス、魚肉エキス、コーンスティープリカー、ペプトン、大豆粉、綿実油粕、酵母エキス、尿素等が利用できる。その他、リン酸塩、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｍｎ2+、  Ｎａ+ 、Ｋ+ 等の金属塩など有機、無機微量栄養源を培地中に適宜添加できる。培地のpHの調整には、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等を用い、本酵素の最適生産pHに調整することが望ましい。
【００１６】
かくして得られた培養液中からのペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて行うことができる。即ち、培養液から遠心分離又はろ過することで菌体を除き、培養上清液から常法の精製手段、例えば塩析法、溶媒沈殿法、等電点沈殿法によってタンパク質を沈殿させたり、限外ろ過により濃縮させて目的酵素を得る。塩析法の例として硫安（３０〜９０％飽和画分）、溶媒沈殿法の例としてエタノール（５０％以上）中で酵素を沈殿させた後、遠心分離、脱塩処理し、凍結乾燥粉末を得ることができる。ここで脱塩方法としては、透析あるいはセファデックスＧ−１０等を用いるゲルろ過の方法が用いられる。このようにして得られる酵素液は、そのまま用いることもできるがさらに公知の方法により精製、結晶化することもできる。
【００１７】
かくして得られる本発明のペクチン酸リアーゼは、前記のようなアミノ酸配列を有し、かつペクチン酸リアーゼ活性を有する限り特に制限されないが、最適反応pHが１０．３〜１０．７であり、またプロトペクチンに対しても強く作用するという特性を有する。
【００１８】
本発明のペクチン酸リアーゼのより詳細な酵素学的性質は、以下の通りである。
【００１９】
（１）作用            ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性      プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。
（３）最適反応pH      pH１０．３〜１０．７（50mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）
（４）安定pH          pH５〜１１．５（３０℃、６０分間処理）
（５）最適反応温度    ４５〜５５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液）
（６）耐熱性          約５０℃（pH７．５、５０mMトリス−塩酸緩衝液）
（７）分子量          約２０．３±１ｋＤａ（超遠心平衡沈降法；ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ）
（８）等電点          pH９．５〜１０．５（等電点電気泳動法）
（９）阻害剤          エチレンジアミンテトラアセテート（EDTA）等のキレート剤によって阻害される。
（１０）金属イオン    反応にＣａ2+を必要とする。
【００２０】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに制限されるものではない。
【００２１】
実施例１：ペクチン酸リアーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王（株）の微生物保存室に保有の菌株を下記の組成を有する寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行った。菌が生育した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を流し込み１０分間靜置した。ポリガラクツロン酸の分解に起因してコロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペクチン酸リアーゼ生産能を検定した。その結果、ペクチン酸リアーゼ生産菌としてバチルス
エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５株を得た。
【００２２】
【表１】
0004025395.tif 000002
【００２３】
ＫＳＭ−Ｐ１５株の菌学的性質を以下に示す。
【００２４】
0004025395.tif 000003
【００２５】
Ｂ  生理学的性質
（ａ）硝酸塩の還元（培地３）    陽性
（ｂ）脱窒反応  （培地３）      陰性
（ｃ）ＭＲテスト（培地４）      陽性（pH５．５）
（ｄ）ＶＰテスト（培地４）      陽性
（ｅ）インドール生成（培地５）  陰性
（ｆ）硫化水素生成（培地６）    陰性
（ｇ）デンプン加水分解（培地７）陽性
（ｈ）クエン酸の利用（培地８）  陽性
（ｉ）無機窒素の利用（培地９）  硝酸塩、アンモニウム塩を利用しない。
（ｊ）色素の生成（培地１０）    無し
（ｋ）ウレアーゼ（培地１１）    陰性
（ｌ）オキシダーゼ（培地１２）  陽性
（ｍ）生育の温度範囲（培地１３）２０℃〜４５℃
（ｎ）生育のpH範囲（培地１４）  pH７〜１０
（ｏ）生育における酸素の影響  （培地１５）    嫌気条件下で生育する。
（ｐ）ＯＦテスト  （培地１６）  生育するが色調の変化は認められない。
（ｑ）グルコースからのガス産生（培地１７）    無し
（ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性（培地１８）  ３％塩化ナトリウム含有培地上で生育できない。
（ｓ）糖からの酸生成（培地１９）  下表に結果を示す。
【００２６】
【表２】
0004025395.tif 000004
【００２７】
0004025395.tif 000005
0004025395.tif 000006
【００２８】
以上の菌学的性質について「Berger's Manual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株はバチルス  サーキュランス（Bacillus circulans）に属させることが妥当である。しかし、バチルス  サーキュランスは、一般的に非常に多様性に富む菌株であり、本菌株の諸性質は既知のバチルス  サーキュランスの諸性質とは完全に一致しない新規な微生物である。そこで、本菌株を工業技術院生命工学研究所にバチルスエスピー  （Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８７）として寄託した。
【００２９】
実施例２：ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養
上述のスクリーニングにより得られたバチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養は、坂口フラスコに５０mlの液体培地を加えて３０℃、２日間振盪培養を行った。培地組成は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
【００３０】
実施例３：ＫＳＭ−Ｐ１５株の精製
バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５株の培養液を遠心分離（１２，０００×ｇ、１５分）し、その上澄液（１２５０ml）に硫酸アンモニウムを９０％飽和となるように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（１２，０００×ｇ、１５分）を行い沈殿物を回収した。これを少量の１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）に溶解し、同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（９００ml）のうち１００mlずつをあらかじめ１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて平衡化しておいたスーパーＱトヨパール６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（２．５×１０cm）へ添着した。平衡化緩衝液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集めた（１１００ml）。次にＢｉｏ  Ｃａｄ  ６０  ＨＰＬＣシステム（日本パーセプティブ社製）を用いて０．２mM塩化カルシウムを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）にて平衡化しておいたスルホプロピルカラムへ上記の非吸着画分を２００mlずつ添着した。０から０．２M の塩化ナトリウムを用いた濃度勾配溶出法により、タンパク質を溶出させた。ペクチン酸リアーゼ活性は０．１M 付近の塩化ナトリウム濃度で単一ピークとして溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいても均一なタンパク質として検出された。上記の操作を繰り返し、精製酵素を得た（以下、ここで得られたペクチン酸リアーゼをＢＰＡＬということがある）。活性収率は約６０％であり、精製倍率は５０倍であった。
【００３１】
実施例４：ＫＳＭ−Ｐ１５株由来ペクチン酸リアーゼの酵素学的性質及びその測定法
（１）標準酵素活性測定法
試験管に０．３mlの０．５M グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの６mM  塩化カルシウム溶液、１．７mlの脱イオン水を加え、３０℃で５分間恒温した後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を加えさらに５分間恒温した。反応は、０．６mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Ｌｏｔ  １４４８２、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）を添加し開始した。３０℃で１０分間恒温した後、３mlの５０mM  塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガラクツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa ＆ Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1966）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液に３mlの５０mM塩酸を加え、その後に０．１mlの酵素液を添加したものを用意した。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツロニドを生成する量とした。
【００３２】
（２）最適反応pH
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、又は５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５〜１１．０）を用いて最適反応pHを調べたところ、本酵素はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応速度が高く、pH１０．３〜１０．７の範囲内において最高活性の９０％以上の活性を示した。さらにpH１０．０〜１１．０の範囲内において最高活性の７０％以上の活性を示した。
【００３３】
（３）pH安定性
４０mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液（pH３〜１２）中に１mMの塩化カルシウムを添加した系と無添加の系を用い、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後の残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、本酵素は、カルシウムの存在の有無に拘らずpH５〜１１．５の範囲で極めて安定であった。
【００３４】
（４）最適反応温度
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中にて１０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は、１０℃−６５℃の広範囲において作用し、その最適反応温度は５０〜５５℃であった。
【００３５】
（５）耐熱性
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に１mMの塩化カルシウムを添加した系及び無添加系を用意し、酵素を加えて１０℃〜７０℃の各温度で３０分間放置した。その後氷中で急冷し、残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、本酵素は、５０℃まで極めて安定であった。また、カルシウムイオンによる安定化効果は高温側で若干認められた。
【００３６】
（６）分子量
ａ．平衡沈降法による本酵素の分子量は次のように求めた。超遠心機（日立製作所製ＳＣＰ−７０Ｈ型、  ＲＡＰ６０型ローター）を用いダブルセクターセルの一方に酵素サンプル（０．２，０．３，０．４及び０．６mg／ml）を０．１ml、もう一方に０．１mlの脱イオン水を注入し、２０℃、２００００rp    m で２０−２４時間回転させ平衡状態に達した後、ＵＶスキャナ（日立製作所製  ＡＢＳ−７型）を用いて酵素の分布状態を測定し、データ解析装置（日立製作所製  ＤＡ−７型）により分子量を求めた。部分比容値は、０．７４を用い、タンパク質濃度を０に外挿し分子量を求めた結果、本酵素の分子量は、２０．３±１．０ｋＤａであった。
【００３７】
ｂ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（１５％ゲル）により、本酵素の分子量は約２６ｋＤａと見積られた。尚、標準タンパク質としてバイオラッド社製の分子量マーカー（ホスホリラーゼｂ（９７．４ｋＤａ）；牛血清アルブミン（６６．２ｋＤａ）；オボアルブミン（４５ｋＤａ）；カルボニックアンヒドラーゼ（３１ｋＤａ）；トリプシンインヒビター（２１．５ｋＤａ）α−ラクトアルブミン（１４．４ｋＤａ）を用いた。
【００３８】
（７）等電点
pH８−１０．５のアンフォライン（ファルマライト，ファルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動法により、本酵素の等電点はpH１０．３付近であった。
【００３９】
（８）アミノ末端配列
本酵素をＰｒｏＳｏｒｂフィルター（パーキンエルマー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー（６７４型，アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ末端配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結果、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴＦＤＧＫであった。
【００４０】
（９）プロトペクチンに対する作用
基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒指付き・綿、中田久吉商店製）を細かく裁断（１〜２mm四方）した木綿繊維片１０mg（１％ｗ／ｖ）を０．６mM塩化カルシウムを含む１００mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁し、酵素を添加した後、３０℃、６０分間、１２０rpm で反応させた。反応液を遠心分離し上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾール硫酸法により定量した（Sakai, Methods Enzymol., 161, 335-350, 1988）。その結果、０．１U の酵素を用いた場合１０mgの木綿繊維あたりガラクツロン酸として２０〜５０μｇのペクチン遊離量が認められた。このことは、本酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに対して作用していることを示唆し、さらに上澄液中の２３５nmにおける吸光度の上昇が認められたことから、本酵素はＡタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有していることが判った。さらにＷａｒｄとＦｏｇａｒｔｙの方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い調製した酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、ペクチン酸に対する反応速度と同程度の反応速度で分解した。
【００４１】
（１０）基質の分解様式
オストワルド粘度計（イワキガラス社製、Ｎｏ．１）に終濃度が５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．６mM塩化カルシウム、０．７５％ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Lot 14482、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）となるように調製した反応液を加えて、３０℃で恒温した。これに酵素を０．１U添加し、３０℃で１時間反応させた。一定時間ごとに粘度を測定しながら、反応液を１mlずつ採取し、０．５Mエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を０．０４ml加えた後、２３５nmにおける吸光度を測定した。その結果、反応時間に伴い粘度は低下し、初期粘度を１００％とした場合、３０分後には６０％、６０分後には４０％まで減少した。この時の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和物生成量は、基質の構成ガラクツロン酸量を１００％とした場合、６０分後で２％程度であったことから、本酵素はエンド型のペクチン酸リアーゼであることが判った。
【００４２】
（１１）金属イオンの影響
本酵素は、反応にカルシウムイオンを必要とし、そのＫｍ値は０．１４mMであった。１mMのＥＤＴＡにより処理をした酵素（脱イオン水に対して透析したもの）についてカルシウムイオン以外の金属イオンの影響を調べた結果、マンガン、ストロンチウム、コバルトの各イオンを添加した場合に若干の分解反応が認められたが、いずれもカルシウムイオンの場合の１０％以下の反応速度であった。次に１mMのＥＤＴＡ  を含む１０mM  ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）にて希釈した酵素液を最終濃度が５０mM  ＭＯＰＳ緩衝液（pH７．５）、５mMの各金属塩となるように調製した処理液に１／１０量添加し、３０℃で３０分間放置した。処理した酵素液を２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）にて希釈し、標準酵素活性測定法により残存活性を測定した。本酵素は、上記の処理において各種金属イオンに対し極めて安定であったが、水銀イオン及び亜鉛イオンにより若干阻害された（表３）。
【００４３】
【表３】
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【００４４】
（１２）各種化合物の影響
本酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響を調べた。まず、標準酵素活性測定法に各種化合物を添加して酵素反応を行ったところ、１mM ＥＤＴＡ、１mMエチレングリコールテトラアセテート（ＥＧＴＡ）、０．０１％ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、０．１％トリポリリン酸ナトリウムによって完全に阻害された。これは、本酵素がカルシウムイオンを反応に必要とするためにキレーターである上記化合物によってカルシウムイオンが捕捉されることで起きたと考えられた。次に所定濃度の各種化合物を５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）中に添加し、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後に残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、本酵素は、界面活性剤、キレート剤、他の化合物により阻害されることはなかった（表４）。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
実施例５：ＫＳＭ−Ｐ１５株由来ペクチン酸リアーゼのＣ末端配列
２８０nmの吸光度が２〜３の本酵素を脱塩した後、５０μｌを１５０μｌの８M 尿素溶液に加え３７℃で１時間保持した。この処理液１００μｌにｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（島津製作所）１５０μｌ、３．３pmol／μｌのリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬）５μｌを加えて、３７℃で１３時間保持した。酵素処理液４０μｌにｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ５μｌを加え、ＤＩＴＣポリマービーズ・カラム（三菱化学）に注入した後、Ｃ末端フラグメント自動分取装置（ＣＴＦＦ−１：島津製作所）によりＣ末端フラグメントを分取した。このサンプルをＰｒｏＳｏｒｂフィルターにブロッティングし、プロティン  シークエンサーによりＮ−末端アミノ酸配列を決定したところ、ＶＶＩＧＡＰＡＡＤＧＶＨであった。
【００４７】
実施例６：ペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニング
（１）Ｐ１５株染色体ＤＮＡの調製
Ｐ１５株を液体培地（ペクチン０．５％；ポリペプトン３．０％；肉エキス１．０％、酵母エキス（Difco）０．５％；リン酸二カリウム０．１５％；塩化カルシウム０．００１％、炭酸ナトリウム０．５％（別滅菌））５０mlで１５時間３０℃で振とう培養した培養液を遠心し、菌体を回収した。得られた菌体からＳａｉｔｏとＭｉｕｒａの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629,1963）で染色体ＤＮＡを調製した。
【００４８】
（２）プライマーの調製
実施例４（８）及び実施例５の結果から、プライマー１及びプライマー２を合成した（図１）。
（３）クローニング
このプライマー１と２を用い、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｐ１５の染色体ＤＮＡ（０．５μｇ）を鋳型として、ＰＣＲの条件を解離９４℃（１分間）、アニーリング３７℃（１分間）、伸長７２℃（１分間）を３０サイクル行って増幅を行った。得られた増幅断片をＰＣＲ断片精製キット（ベーリンガー・マンハイム社）で精製した後、プラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に導入してクローン化した。得られたクローン５０個の塩基配列を決定したところ、目的とするペクチン酸リアーゼ遺伝子配列の一部が検出され、推定アミノ酸配列も推定できた（図２参照）。
次に、上述のＰＣＲ増幅断片の上流と下流の領域を増幅するためにインバースＰＣＲ（inverse PCR）を行った。図２中に認められる塩基配列、プライマー３とプライマー４を用いた。ＫＳＭ−Ｐ１５株の染色体（１μｇ）を、あらかじめＰｓｔＩで消化し、フェノール／クロロホルム抽出して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて分子内結合（環状化ＤＮＡ結合）させて鋳型とした。ＰＣＲは、解離９４℃（１分）、アニーリング５０℃（１分）、伸長６８℃（３分）を３０サイクルの条件で、Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＰＣＲキット（TaKaRa社）を用いて行った。その結果約２．０kbp の増幅断片が検出され、ダイレクトシークエンスによってこのＤＮＡ断片の配列を行ったところ、Ｎ−末端アミノ酸配列から終止コドン（TAA）の前のアミノ酸までの１９７アミノ酸からなるペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列及び塩基配列（配列番号１）を決定した。ＫＳＭ−Ｐ１５株の生産するペクチン酸リアーゼ（分泌型成熟酵素）の分子量は、この配列から２０９２４Ｄａ（約21kDa）と推定される。
【００４９】
実施例７
まず、ＫＳＭ−Ｐ１５株の産生するペクチン酸リアーゼのＮ−末端アミノ酸Ａｌａの直上流に存在する、推定シグナルペクチナーゼ認識配列Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａと、用いた宿主のベクター由来のシグナル配列が連結するように上流側のプライマー（プライマー５，図３参照）をデザインした。下流側のプライマー（プライマー６，図３参照）は、ペクチン酸リアーゼ遺伝子の終止コドン（TAA）から３７２bp下流に位置する２６bpからなる配列をデザインした。使用したベクターｐＨＳＰ６４（Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 872-877, 1992）のシグナル配列コード部分の３′側に存在するＳａｌＩ部位とその１１bp下流に存在するＳｍａＩ部位間に、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片を挿入することとした。
【００５０】
すなわち、プライマー５と６を用い、ＫＳＭ−Ｐ１５株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約１kbｐＤＮＡ断片が増幅された。これをＳａｌＩで消化しておき、ＳａｌＩとＳｍａＩで切断されたｐＨＳＰ６４とリガーゼで連結した（図４を参照）。
この組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換させ、実施例１の寒天平板培地で生育させたところ、溶解斑を集落の囲りに形成した。得られた本発明の遺伝子をコードする組換えプラスミドをｐＨＳＰ−Ａ１５６と命名した。
【００５１】
次にｐＨＳＰ−Ａ１５６で枯草菌ＩＳＷ１２１４を形質転換し、以下に示した液体培地中で３０℃で３日間培養したところ菌体外に著量のペクチン酸リアーゼを生産した。
【００５２】
【表５】
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【００５３】
実施例８
実施例７で得られたペクチン酸リアーゼの粗酵素液を実施例３に従って完全精製した（以下、ここで得られたペクチン酸リアーゼをｒＰＡＬということがある）。実施例４と同じ手法でこの酵素のＮ−末端アミノ酸配列を決定したところ、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴＦＤＧＫを含む配列が検出された。
【００５４】
実施例９
実施例３と８で得られたペクチン酸リアーゼのpH−活性曲線を調べた。その結果を図５に示したがポリガラクツロン酸を基質とした時、両酵素のpH−活性曲線は、ほぼ完全に一致し、最適反応pHは両方ともに、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中でpH１０．３〜１０．７であった。
【００５５】
実施例１０
実施例３と８で得られたペクチン酸リアーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（１５％アクリルアミド）により、分子量を測定したところ、いずれの酵素の分子量も２４〜２７ｋＤａの範囲にあることが判明した（図６）。用いた標準タンパク（バイオラッド社製）はホスホリラーゼｂ（９７．４kDa）、牛血清アルブミン（６６．２kDa）、オボアルブミン（４５kDa）、カルボニックアンヒドラーゼ（３１kDa）、トリプシンインヒビター（２１．５kDa）、α−ラクトアルブミン（１４．４kDa）である。又、超遠心機（日立ＳＣＰ−７０Ｈ型，ＲＡＰ６０型ロータを使用）を用い、２０℃で２０〜２４時間、２０，０００rpm で平衡化させた後、偏比容０．７４（ｇ／ml）として両酵素の分子量を算出したところ２０．３±１．０ｋＤａとなり、推定アミノ酸配列から計算した分子量（２０９２４Da）とほぼ一致した。
この様にＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（約２５kDa）と平衡沈降法（約２０．３kDa）や推定アミノ酸配列から計算される分子量（２０９２４Da）には解離が認められる。このような測定法による分子量の解離は他のペクチン酸リアーゼでもしばしば観察されている。Amycolataの一株が生産する酵素の場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法では３１ｋＤａであるが、ゲル濾過法は１９ｋＤａである（Bruhlmann, Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585, 1995）。Erwinia chrysanthemiのＰｅｌＢとＰｅｌＥと称される酵素の場合、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法では４４ｋＤａであるが、遺伝子配列から推定される分子量はいずれも約３８ｋＤａである（Keenan & Tamaki, J. Bacteriol., 168, 595-606, 1986）。同様な報告は、Erwinia chrysanthemiの酸性ペクチン酸リアーゼ（PLa）（Favey et al., J. Gen. Microbiol, 138, 499-508, 1992）、Aspergillus nigerの酵素（PLA）（Kusters-van Someren et al., Curr. Genet., 20, 293-299, 1991）やBacillus subtilisの酵素（protopectinase-N）（Sakamoto et al., Biosci. Biotech. Biochem., 58, 353-358, 1994）などでも知られている。
【００５６】
実施例１１
基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒指付き・綿，中田久吉商店製）を細かく裁断した木綿繊維片１０mgを０．６mM  ＣａＣｌ2を含む０．１M グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁し、実施例３及び８で得られたペクチン酸リアーゼを添加後、３０℃、１時間、１２０rpm で反応させた。反応終了液を遠心分離し、上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾール硫酸法（Sakai, Methods Enzymol., 161, 335-350, 1988）で定量した。その結果、０．１Uの酵素を用いた場合、いずれの酵素でも１ｇの木綿繊維あたりガラクツロン酸として２〜５mgのペクチン遊離量が認められた。又、市販木綿糸４０mg（カネボウ社製カタン糸３０番手）に１．９mlの５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）を加え、実施例３及び８で得られたペクチン酸リアーゼを０．１ml（０．２４U）添加し、３０℃、１時間反応させた。その結果、木綿糸１ｇあたり０．５〜１．５mgのペクチン遊離量が認められた。このことは両酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに作用していることを意味しており、さらに上澄液の２３５nmにおける吸光度も上昇していることが判明したので、Ａ−タイプのプロトペクチナーゼ活性を有していると判定される。
さらに、ＷａｒｄとＦｏｇａｒｔｙの方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に準じて調製した酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、実施例３及び８のペクチン酸リアーゼはペクチン酸と同じ速度で分解した。
【００５７】
実施例１２
実施例３及び８で得られたペクチン酸リアーゼの木綿繊維（スムス織木綿手袋）からのペクチン遊離活性のpH依存性を次の様にして検定した。すなわち、５００μｌの８０mMブリットン・ロビンソン緩衝液（pH４〜pH１３）、６０μｌの１０mM  ＣａＣｌ2、標準測定した（pH１０．５，５０mMグリシン−水酸化ナトリウム）２U ペクチン酸リアーゼ／mlの溶液１００μｌ、１０mg木綿繊維、３４０μｌの脱イオン水の反応系で３０℃、１時間反応させた。各pHにおけるペクチン遊離量をカルバゾール硫酸法で定量し、最大活性値を与えるpHのペクチン量を１００として、図７に表示した。図からもわかるように、両酵素共に、プロトペクチナーゼ活性の最適反応pHは４０mMブリットン・ロビンソン緩衝液中で、pH１０近傍であり、それぞれの相対活性曲線はほぼ完全に一致している。同様の条件下で０．１M グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中での最大活性は、いずれもpH９．５近傍に観察された（図８）。これらの結果から、本発明の遺伝子産物であるペクチン酸リアーゼと天然型ペクチン酸リアーゼはアルカリペクチン酸リアーゼ活性と同時にアルカリプロトペクチナーゼ活性を有することがわかる。
【００５８】
実施例１３
実施例３と８のペクチン酸リアーゼを用いて、特異的阻害剤の影響を調べた。すなわち、５０mM トリス−塩酸緩衝液（pH７．５）中で、酵素標品を各阻害剤（適当濃度）で３０℃、１時間処理した後、残存活性を常法により測定した。その結果、両酵素は２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（１mM）で約７５〜８０％、Ｎ−ブロモスクシミド（０．１mM）で３０〜４０％の阻害を受けた。一方、ｐ−クロロマーキューリ安息香酸（０．５mM）、Ｎ−エチルマレイミド（１mM）、ヨード酢酸（１mM）、ジエチルピロカーボネート（１mM）、５，５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（１mM）、ジチオスレイトール（１mM）、グリオキサール（１mM）では若干阻害されるか、又は全く影響を受けなかった。
【００５９】
実施例１４
実施例３と８のペクチン酸リアーゼに及ぼすＨ2Ｏ2の影響を調べた。両酵素の溶液２５０μｌ、Ｈ2Ｏ2（０〜３０％）５０μｌ、５０mM トリス−塩酸緩衝液（pH７．５）２５０μｌを混合し、３０℃で３０分間保温した。その後０．５mg／mlのカタラーゼ（ベーリンガー社製）１００μｌを加えて、５分間保持しＨ2Ｏ2を分解除去した。この処理液を常法により、残存活性を測定したところ、両酵素とも、少なくとも３％以上のＨ2Ｏ2が存在しても全く失活しなかった。
【００６０】
実施例１５
本発明のペクチン酸リアーゼと既知のペクチン酸リアーゼとのアミノ酸配列の相同性について検討した。
配列番号１中、アミノ酸番号３６〜１３２の間で、他の酵素との相同性を検討すると、図９に示すように、カビのFusariumに由来するＰｅｌＡ（Crawford & Kolattukudy, Arch. Biochem. Biophys., 258, 196-205, 1987、Gonzalez-Candelas & Kolattukudy, J. Bacterirol., 174, 6343-6349, 1992)、ＰｅｌＢ（Guo et al., J. Bacteriol., 177, 7070-7077, 1995）、ＰｅｌＣ（Guo et al., Arch. Biochem. Biophys., 323, 352-360, 1995）、ＰｅｌＤ（Guo et al., Arch. Biochem. Biophys., 332, 305-312, 1996）で、それぞれ５４．６％、５２．６％、５０．５％、５４．６％の相同性があるにすぎない。従って、本発明酵素のアミノ酸配列とアミノ酸番号３６から１３２の間で適切にアライメントした時、これら以上の相同性がある酵素は、本発明に含まれると解すべきである。すなわち、本発明で用いる原料ＤＮＡとそれから推定されるアミノ酸配列の相同性は図１０に示したアミノ酸配列（配列番号１におけるアミノ酸番号３６〜１３２）に対して５５．７％以上が好ましい。
【００６１】
この中で最も相同性の高いＰｅｌＡと本発明ペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列を通常の相同性を調べる方法でマッチングすると、相同性はさらに低くなる。すなわち、アミノ酸番号１１のＶａｌから１３２のＡｒｇまでの本発明の酵素のアミノ酸配列に対し、ＰｅｌＡは４５．５％の相同性しかなく、全アミノ酸配列（アミノ酸番号１のＡｌａから１９７のＴｙｒ）と比較すると３３．０％の相同性まで低下する（図１１）。
【００６２】
実施例１６
図１０に示したアミノ酸残基中、活性発現と立体構造維持に必須なアミノ酸残基を特定することによって、本発明酵素の特徴をさらに明確にすることが可能である。従来、Ｙｏｄｅｒら（Science, 260, 1503-1307, 1993）がErwinia chrysanthemiのＰｅｌＣアイソザイムの立体構造から類推しているように、特定のアミノ酸残基（Ａｓｐ−１３１，Ｇｌｕ−１６６とＡｓｐ−１７０）が活性発現に必須なＣａ2+イオンの結合部位である。Bacillus subtilisのＰＬではそのアミノ酸残基がＡｓｐ−２１０、Ａｓｐ−２４４とＡｓｐ−２４７と想定されている（Nasser at al., EEBS Lett., 335, 319-326, 1993）その後のＰＬの立体構造解析から推定されるＣａ2+結合部位はＡｓｐ−１８４、Ａｓｐ−２２３とＡｓｐ−２２７であることがわかっている（Pickersgill et al., Struct. Biol. USA., 1, 717-723, 1994）又、Ｙｏｄｅｒらによると、このＣａ2+イオンの結合部位近傍にあるＴｙｒ残基を含む“領域Ｉ”とＨｉｓ残基を含む“領域II”が触媒部位であると推定しており、Bacillus subtilisのペクチン酸リアーゼでも同様の二つの領域が存在する。しかしながら本発明酵素のアミノ酸配列は、通常のコンピューター支援検索では「相同性無し」と判定され、これらのＣａ2+イオン結合部位と２領域を比較することは不可能である。さらに、Bacillus subtilisのペクチン酸リアーゼには一個のＣｙｓを含んでおり（Ｃｙｓ−２２０）、ＳＨ阻害剤で活性が阻害されることより、このＣｙｓ−２２０のＳＨ基が触媒に関与していると推定されている（Nasser et al., FEBS Lett., 335, 319-326, 1993）。ところが、本発明の成熟分泌酵素（実施例３と７）はＣｙｓを３個含んでおり、Ｃｙｓ−６７、Ｃｙｓ−７１とＣｙｓ−１４８、この３個の残基の機能は全くわかっていない。又、Bacillus subtilisのペクチン酸リアーゼ（ＢｓＰｅｌ）の立体構造から、Ｐｉｃｋｅｒｓｇｉｌｌら（Struct. Biol., U.S.A., 1, 717-723, 1994）は、Ａｒｇ２７９−Ａｌａ２８０−Ｐｒｏ２８１（ＲＡＰ配列）のＡｒｇ２７９が触媒に関与していると推定しているが、本発明の酵素のアミノ酸配列の中にそのようなものは存在していない。従って、活性発現（触媒作用）と立体構造維持などに係わる必須アミノ酸残基を確定することによって、本発明をさらに明確にすることができるので、以下にその詳細を記述する。
【００６３】
（１）本発明ペクチン酸リアーゼの変異タンパクの創製
ＴａＫａＲａ社のＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＫＭ  ｋｉｔのプロトコールに従って、本発明の遺伝子の任意の変異タンパクを人工的に創製した。
【００６４】
▲１▼変異導入用プラスミドベクターｐＫＦ１９Ｋへの本発明遺伝子の導入。
本発明ペクチン酸リアーゼを高生産するｐＨＡＰＡＬ上の高発現プロモーター領域から構造遺伝子を含む約１．５kbp 断片をＲＣＲによって増幅した後、プラスミドｐＫＦ１９ＫのＳｍａＩ部位に挿入した（これをｐＫＦＰＡＬと命名）。
【００６５】
▲２▼変異導入ＰＣＲ
まず、リアクションチューブ（０．５ml）に以下の反応液を調製した。反応液組成は鋳型ＤＮＡ（ｐＫＦＰＡＬ）１０ng、セレクションプライマー５pmol、リン酸化済み変異導入プライマー  ５pmol、１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ＢｕｆｆｅｒII５μｌ、ｄＮＴＰ混合液（各２．５mM）８μｌ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑ０．５μｌ、計５０μｌ。解離９４℃、１分間、アニール５５℃、１分間、伸長７２℃、３分間を２５サイクル、その後４℃、１０分間の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ断片精製キット（ベーリンガーマンハイム社）によって増幅ＤＮＡを精製し形質転換に用いた。
【００６６】
▲３▼大腸菌ＭＶ１１８４株への導入と変異の確認
大腸菌ＭＶ１１８４コンピテントセル（ＴａＫａＲａ社）を用い通常のコンピテントセル法でＰＣＲ産物を大腸菌ＭＶ１１８４株へ導入した。カナマイシン（５０μｇ／ml）を含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム１％、寒天１．５％）上に生育してきたコロニー数個からプラスミドＤＮＡを調製し、配列解析を行って変異導入プラスミドを選択した。
【００６７】
変異に用いたプライマー配列は次の通りである。
（アミノ酸番号は配列番号１に従っており、略記号の左側は本来のアミノ酸残
基、右側は変異されたアミノ酸残基を示している）。
Ｌｙｓ４１Ａｌａ    ５′ＧＣＧＧＡＧＡＡＴＣＡＧＧＣＧＣＣＧＡＴＣＴＴＴＣＧ３′
Ｃｙｓ６７Ａｌａ    ５′ＣＧＧＧＧＴＧＣＡＣＧＣＣＴＡＣＧＧＧＧＡＴＴＧＴＡＣ３′
Ｃｙｓ７１Ａｌａ    ５′ＴＡＣＧＧＧＧＡＴＧＣＴＡＣＧＡＴＴＡＣＡＡＡＴＧＴＣ３′
Ｌｙｓ８９Ａｌａ    ５′ＧＣＧＣＴＧＡＣＧＣＴＴＧＣＡＴＣＧＴＣＣＧＧＡＡＣＧ３′
Ｌｙｓ１０７Ａｌａ  ５′ＡＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＣＧＣＧＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣ３′
Ｌｙｓ１２９Ａｌａ  ５′ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＧＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＡＧ３′
Ａｒｇ１３２Ａｌａ  ５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＣ３′
（塩基配列中下線のトリプレットコドンが置換されるアミノ酸をコードしてい
る）
【００６８】
▲３▼次に変異遺伝子を含むペクチン酸リアーゼ遺伝子でBacillus subtilisを形質転換して、各変異ペクチン酸リアーゼを著量菌体外に生産させた後、精製して活性の検定を行った（実施例７参照）。以上の変異タンパク創製の手順を図４に示した。
【００６９】
（２）変異タンパクの活性の検定
得られたｒＰＡＬ、Ｌｙｓ４１Ａｌａ、Ｃｙｓ６７Ａｌａ、Ｃｙｓ７１Ａｌａ、Ｌｙｓ８９Ａｌａ、Ｌｙｓ１０７Ａｌａ、Ｌｙｓ１２９Ａｌａ、Ａｒｇ１３２Ａｌａはいずれも、立体構造を維持したまま組換え生産され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっても明瞭なタンパクのバンドとして検出される（図６）。これらの変異タンパクを精製し（実施例３参照）、それぞれの活性を実施例１に記載の標準測定法によって検討した。
【００７０】
【表６】
0004025395.tif 000010
【００７１】
表６に示したように、配列番号１に存在する二つのＣｙｓをＡｌａに置換しても、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでみる限り立体構造は維持され、かつ活性も充分有しており、少なくとも活性発現と立体構造に対して本質的な役割をになっていないことがわかる。ネイティブなタンパクの中でこれらの内、たとえジスルフィド結合を形成していようがいまいが活性に対して本質的なアミノ酸残基ではないとを示している。Ｃｙｓ残基が本発明酵素の活性発現に関与していないことは、ＳＨ阻害剤によって酵素活性阻害がかからないことが、証拠となるであろう。すなわち、本発明酵素に対して、実施例１３に示した様に各種ＳＨ阻害剤（ｐ−クロロマーキュリー安息香酸、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸など）を添加しても、ほとんど阻害されない。又、Ｈ2Ｏ2はＭｅｔとＣｙｓの側鎖の含硫基を強力に酸化して、しばしば酵素活性を消失させることがあるが（例えばStauffer & Etson. J. Biol. Chem., 244, 5333-5338, 1969;Estel et al., J. Biol. Chem., 260, 6518-6521, 1985;秦田ら、特願平9-80299号）、本発明の酵素は高濃度のＨ2Ｏ
2で処理しても失活しない（実施例１４参照）。
【００７２】
【表７】
0004025395.tif 000011
【００７３】
一方、アミノ酸配列Ｉに存在する４個のＬｙｓ残基から、他のアミノ酸への置換は、本発明に決定的な特徴付けを与える。すなわち、表７に示したように、Ｌｙｓ８９Ａｌａ、Ｌｙｓ１０７ＡｌａとＬｙｓ１２９Ａｌａの各変異酵素は、著しい酵素比活性の低下が認められる。特にＬｙｓ１０７ＡｌａとＬｙｓ１２９Ａｌａの変異酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで立体構造が維持されているにもかかわらず、酵素活性は認められず、これらの位置におけるＬｙｓ残基には触媒活性に対する本質的な関与があることを示している。又、Ｌｙｓ８９Ａｌａも活性が残存するものの、実施例８のペクチン酸リアーゼ（ｒＰＡＬ；未変異）の比活性の約２０％までに低下している。この変異酵素もＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から単一のタンパクとして完全精製され、分子量も何ら他の変異体あるいは未変異体と変わることはない。従って、何らかの機構で、ペクチン酸リアーゼ活性に影響を与えるＬｙｓ残基であることを示している。これらＬｙｓ残基の触媒に係わる重要性は、本発明酵素と相同性が認められないErwinia chrysanthemi EC16（Kita et al., J. Biol. Chem., 271, 26529-26535, 1996）以外の過去の如何なるペクチン酸リアーゼを含むペクチン分解酵素群でも知られておらず、本発明で初めて明らかにしたものである。このＬｙｓ残基の本質的役割は、Ｌｙｓ残基の特異的阻害剤であるトリニトロベンゼンスルホン酸を本発明ペクチン酸リアーゼに加えると、大幅に活性が低下することからも（実施例１３）疑いの余地の無いこととなった。
【００７４】
次にＬｅｖｙらの方法（J. Biol. Chem., 238, 3654-3651,1963）に従って、本発明酵素活性とトリニトロベンゼンスルホン酸濃度の関係を調べた。活性の半減期の長さ（ｔ1/2）の逆数の対数〔ｌｏｇ（１／ｔ1/2）〕とｌｏｇ〔トリニトロベンゼンスルホン酸〕の傾きから０．７３という値が得られ、特定のアミノ酸、Ｌｙｓ、１個が少なくとも関与していることが判明した。従って、部位特異変異の結果（表７）とも考え合わせると、少なくとも４個のＬｙｓ残基のうち、少なくとも１個以上のＬｙｓ残基が活性発現に関与していることは、ここでも明白な事実となった。
【００７５】
一方、本発明のアミノ酸配列中、図９中に示した箇所で、ＰｅｌＡ〜ＰｅｌＤまでの配列と相同性があるのが４１位のＬｙｓである（配列番号１参照）。当然、この位置のＬｙｓも触媒に関係する可能性があったが、図６で示したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一なタンパクバンドを与えるにもかかわらず、酵素の比活性は、何ら天然型酵素と変わることは無い。従って、本発明においてこの位置のＬｙｓ残基は、触媒に直接係っていない基であることを示唆している。この推定は以下の様にして、証明した。
実施例８で得たペクチン酸リアーゼ（ｒＰＡＬ）をイオン交換水で脱塩濃縮し、２８０nmにおける吸光度が約４になるように調整した。この酵素液１００μｌ（約０．６mgのタンパクを含む）、１００μｌの０．５M ホウ酸緩衝液（pH９．５）、３００μｌの脱イオン水を順次加え、次いで５０μｌの０．２２M トリニトロベンゼンスルホン酸を加えて３０℃で３０分間、暗所に保持した。この処理液をＤＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で脱塩して、過剰のトリニトロベンゼンスルホン酸と緩衝液を除去した。脱塩サンプル（５００μｌ）に５０μｌの１M リン酸緩衝液（pH８．０）、２０μｌの０．１M ＥＤＴＡ（pH７．０）、１０μｌの１mg／mlのＶ８プロテアーゼを加えて３７℃で５時間処理して、消化した。沸騰水中で５分間処理して反応を停止し、遠心分離（１２，０００×ｇ，１０分間）で不溶物を除去した後、上清２００μｌをＯＤＳカラム（TSK gel ODS 80Ts, φ4.6mm×300mm;東ソー社製）に注入した。アセトニトリルの０→６０％／６０分、次いで６０→１００％／２０分間の２段階濃度勾配法で溶出分画（１ml／画分）したところ、３５０nmに吸収を存する画分が３つ得られた（画分５５，６４，７３）。これらの画分について、５００μｌをＰｒｏ  ＳｏｒｂフィルターにブロッティングしてＡＢＩ社の６７４型プロテイン・シークエンサーでＮ−末端アミノ酸配列を決定した。その結果、画分５５と７３からは明瞭なアミノ酸配列が読み取ることができなかったが、これからは、トリニトロフェニル化されたＬｙｓ残基がＮ−末端に存在していることが予想された。一方、画分６４からはＡｓｎ−Ｇｌｎ−Ｘ−Ｐｒｏのアミノ酸配列が認められた。このＸがトリニトロフェニル化Ｌｙｓ残基とすると、これは４１位Ｌｙｓ残基である。この様に、４１位のＬｙｓ残基は、トリニトロベンゼンスルホン酸により、トリニトロフェニル化されているにもかかわらず、表７に示した様にこの位置でのＡｌａへの置換による比活性の低下が全く認められないのであるから、本発明において、この位置のＬｙｓは触媒に関与していないと結論した。
【００７６】
一方、図９のアミノ酸配列中、１３２位のＡｒｇ残基が他の比較した酵素のアミノ酸配列の相当位置のＡｒｇ残基と完全に相同性が認められる。このことは、Ｌｙｓと同じ塩基性アミノ酸であるＡｒｇも、本発明の酵素の触媒に直接関係している可能性があった。
【００７７】
【表８】
0004025395.tif 000012
【００７８】
事実、図６と表８で示されるように、１３２位のＡｒｇをたとえばＡｌａに置換すると、驚いたことに、変異酵素は、ほとんど活性を失なう。従って、上述のＬｙｓ同様、この位置のＡｒｇが触媒機能発現のために必須の残基と考えざるを得ない。そこで、アルギニン修飾剤である２，３−ブタンジオンを実施例１３の方法に従って、未変異ペクチン酸リアーゼに加えて、その影響を調べた。すなわち、両酵素を０．１M ホウ酸緩衝液（pH９．５）中で２mMの２，３−ブタンジオンを加えて、３０℃で３０分間保持して、残存活性を測定したところ、両酵素とも約４０％以上の阻害を受けることが判明した。この結果は、同じ塩基性アミノ酸残基の１０７位と１２９位のＬｙｓ残基が、Ａｒｇ又はＨｉｓでも良い可能性を想起する。また、１３２位のＡｒｇ残基を他の塩基性アミノ酸残基に代えても活性を保持可能性ある。そこで、これらのＬｙｓ残基とＡｒｇ残基を以下の変異プライマーを用いて、それぞれの位置に他の塩基性アミノ酸残基で置換した変異酵素を、前述の方法で発現させた後、完全精製した。
【００７９】
Ｌｙｓ１０７Ａｒｇ  ５′ＡＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣ３′
Ｌｙｓ１０７Ｈｉｓ  ５′ＡＡＧＧＣＧＴＡＴＧＡＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣ３′
Ｌｙｓ１２９Ａｒｇ  ５′ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＡＧ３′
Ｌｙｓ１２９Ｈｉｓ  ５′ＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＧＧＣＡＴＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣＡＧ３′
Ａｒｇ１３２Ｌｙｓ  ５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＡＡＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＣ３′
Ａｒｇ１３２Ｈｉｓ  ５′ＧＧＧＡＡＧＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧＡＧＧＣ３′
【００８０】
その結果、少なくとも１０７位と１２９位のＬｙｓ残基は、ＡｒｇとＨｉｓに置換すると、ほとんど活性を失ない、また１３２位のＡｒｇ残基をＬｙｓに置換するともはや活性は認められないことが判明した。
【００８１】
【表９】
0004025395.tif 000013
【００８２】
従って、少なくとも１０７位と１２９位のＬｙｓ残基及び１３２位のＡｒｇ残基は、他のアミノ酸に置き換えが不可能であり、それぞれＬｙｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ残基が特異的に活性発現に関与すると言える。
【００８３】
一方、Ｔｒｐ残基は配列番号１中には一個しか存在せず、ＰｅｌＡ〜ＰｅｌＤとの相同性との比較においてよく保存されている（図９）。最近、種々の酵素で、Ｔｒｐ残基が触媒部位や基質結合部位にあって、何らかの機構により、活性発現に必要であることが示されている（例えば、Kawaminami et al., J. Biol. Chem., 269, 28752-28756, 1994;Ara et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 62-65, 1992など）。事実、本発明の酵素も、特異的トリプトファン酸化剤であるＮ−ブロモスクシミドを処理すると大幅に阻害される。そこで当該Ｔｒｐ残基（７８位）を下記のプライマーを用いて、Ａｌａ、Ｐｈｅ及びＴｙｒ残基に置換した。
【００８４】
Ｔｒｐ７８Ａｌａ  ５′ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＧＣＧＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＴ３′
Ｔｒｐ７８Ｐｈｅ  ５′ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＴ３′
Ｔｒｐ７８Ｔｙｒ  ５′ＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＡＣＧＡＧＧＡＴＧＴＴＧＧＴ３′
【００８５】
その結果、変異タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一に精製されるが（図６）、表１０に示したようにＴｒｐ残基をＡｌａ残基に置換すると完全に活性を失なうが、Ｐｈｅ残基又はＴｙｒ残基に置換すると天然型酵素に匹敵する酵素活性を維持していることが判明した。他のアミノ酸では活性を有さないことから、７８位のアミノ酸残基には芳香族アミノ酸が必要であることを示している。
【００８６】
【表１０】
0004025395.tif 000014
【００８７】
さらに、本発明酵素のアミノ酸配列の比較図（図９）で、１２０位にＡｒｇ残基がＰｅｌＡ〜ＰｅｌＤに相異して特徴的に存在する。本アミノ酸残基が他の塩基性アミノ酸と置換可能か否かは非常に興味深い。そこで以下の変異プライマーを作製し、前述の方法で変異タンパクの完全精製品を調製した。
【００８８】
Ａｒｇ１２０Ｌｙｓ  ５′ＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＣＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＣＣ３′
【００８９】
その結果を図６と表１１に示したが、１０７位と１２９位のＬｙｓ残基、１３２位のＡｒｇ残基とは異なり、１２０位のＡｒｇ残基は少なくともＬｙｓ残基に置換しても同等の活性を有していた。
【００９０】
【表１１】
0004025395.tif 000015
【００９１】
以上の結果から、本発明ペクチン酸リアーゼは、そのアミノ酸配列中、１０７位Ｌｙｓ残基、１２９位Ｌｙｓ残基及び１３２位Ａｒｇ残基がその酵素活性発現に強く関与しており、この位置を保存するように変異させることが望ましい。
【００９２】
【発明の効果】
本発明によれば、アルカリ側に最適反応pHを有する、全く新しいペクチン酸リアーゼ、その遺伝子及びその製造法が提供される。この酵素は、プロトペクチンに対しても作用し、洗浄剤、食品加工剤、繊維処理剤として有用である。
【００９３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ペクチン酸リアーゼ遺伝子クローニング用プライマー１及び２のＤＮＡ配列を示す図である。
【図２】プライマー１とプライマー２の間のＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列及びプライマー３とプライマー４の位置を示す図である。
【図３】本発明ペクチン酸リアーゼ全領域を増幅するためのプライマー５とプライマー６を示す図である。実施例５で示したＰＣＲ増幅用プライマーで、生成する増幅断片（約１kbp）はＳａｌＩで消化された後、ＳａｌＩとＳｍａＩで消化されたｐＨＳＰ６４に連結される。
【図４】ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ）遺伝子の分泌ベクター（ｐＨＳＰ６４）への導入と創製されたペクチン酸リアーゼ発現分泌ベクターｐＨＳＰ−Ａ１５６を示す図である。
Ａｍｐ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子
Ｔｅｔ：テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子
【図５】本発明ペクチン酸リアーゼである、ＢＰＡＬ（実施例３）とｒＰＡＬ（実施例８）の完全精製標品のpH−活性曲線を示す。５０mM  グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液で最大活性を示すpH約１０．５の値をそれぞれ１００％として、相対活性を表示した。
−○−：ｒＰＡＬ、・・・●・・・：ＢＰＡＬ
【図６】本発明ペクチン酸リアーゼと各種変異ペクチン酸リアーゼの完全精製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を示す。
それぞれの酵素のタンパクバンドの横にある矢印は、分子量測定用に用いた標準タンパクの分子量を示している。各レーンの酵素は次の通り。１：実施例３のＢＰＡＬ、２：実施例８のｒＰＡＬ、３：Ｃｙｓ６７Ａｌａ、４：Ｃｙｓ７１Ａｌａ、５：Ｔｒｐ７８Ａｌａ、６：Ａｒｇ１２０Ｌｙｓ、７：Ｌｙｓ４１Ａｌａ、８：Ｌｙｓ８９Ａｌａ、９：Ｌｙｓ１０７Ａｌａ、１０：Ｌｙｓ１２９Ａｌａ、１１：Ａｒｇ１３２Ａｌａ
【図７】本発明ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ（実施例３）とｒＰＡＬ（実施例８））による木綿からのペクチン遊離活性のpH依存性（ブリットン−ロビンソン緩衝液中）を示す。
それぞれの酵素を４０mMの各pHに設定したブリットン−ロビンソン緩衝液中で木綿に反応させた。ＢＰＡＬとｒＰＡＬのプロトペクチナーゼ活性は最適pHが約１０であり、これを１００％として相対活性で表示している。
−○−：ＢＰＡＬ、−●−：ｒＰＡＬ
【図８】本発明ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ（実施例３）とｒＰＡＬ（実施例８））による木綿からのペクチン遊離活性のpH依存性（グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中）を示す。
図７と同じ条件で、０．１M グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で反応させ、両酵素の最適pH９．５の活性を１００％として表示している。
−○−：ＢＰＡＬ、−●−：ｒＰＡＬ
【図９】本発明ペクチン酸リアーゼと他の酵素のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
アミノ酸番号は、配列番号１の３６から１３２を基準として、他のアミノ酸配列と相同性を合わせた。＊印は５種の酵素で保存されているアミノ酸残基を示す。
ＢＰＡＬ：本発明のペクチン酸リアーゼ
ＰｅｌＡ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチン酸リアーゼＡ
ＰｅｌＢ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチン酸リアーゼＢ
ＰｅｌＣ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチン酸リアーゼＣ
ＰｅｌＤ：Fusarium solani f. sp. pisi由来のペクチン酸リアーゼＤ
【図１０】本発明ペクチン酸リアーゼと他の酵素との相同性の比較に用いた部分アミノ酸配列を示す図である。
【図１１】本発明ペクチン酸リアーゼ（ＢＰＡＬ）とＰｅｌＡのアミノ酸配列のマッキシマムマッチングによるアミノ酸配列の相同性を示す図である。
ＰＡＬのアミノ酸番号１は、成熱酵素のＮ−末端アミノ酸Ａｌａ残基から数える。ＰｅｌＡはオープン・リーディングフレームのＮ−末端Ｍｅｔ残基を１としている。＊は相同部位を示し、縦の破線はコンピューターが計算した相同領域を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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