(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、チクロピジン(ticlopidine)及び銀杏葉抽出物を含有する、抗血栓剤。
【請求項２】
血栓症によって誘導される疾患が、虚血性脳血管障害、虚血性心疾患、慢性動脈閉塞症、及び血管又はくも膜下出血手術の手術前の血栓塞栓性の現象である、請求項１記載の抗血栓剤。
【請求項３】
チクロピジンによって引き起こされる好中球減少症及び無顆粒球症の危険を減少する、請求項１記載の抗血栓剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、チクロピジン(ticlopidine)及び銀杏葉抽出物を含有する医薬組成物に関する。より詳細には、抗血栓剤として上記チクロピジンと、PAFの抑制作用と抗酸化作用を有する銀杏葉抽出物を含有する医薬組成物を併用投与することにより、チクロピジンを単独に連用するときにきたす好中球顆粒減少症及び無顆粒症を、その投与過程で自然に抑制することができるように改善された新規なチクロピジン及び銀杏葉抽出物を含有する医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
チエノピリジン(thienopyridine)のグループに所属する血小板凝集阻害剤として、チクロピジンは臨床的に広く用いられている。アスピリンとは異なり、チクロピジンはプロスタサイクリン−スロンボキサンＡ2の生成には影響しない。更に、２−ヒドロキシチクロピジン（２−ＨＴ）等の代謝産物は、糖タンパク質IIB/IIIa受容体の発現を刺激するＡＤＰ、コラーゲン、アラキドン酸、トロンビン又はＰＡＦによって引き起こされる血小板凝集を阻害する。血小板の原形質膜である糖タンパク質IIB/IIIaは、血小板凝集によるプラグの形成に必要である。糖タンパク質IIB/IIIa受容体の発現を抑制することにより、チクロピジンは血小板凝集を阻害する。従って、血小板が麻酔されたような状態でその機能が抑制される。
また、チクロピジンは、血漿中のフィブリノーゲンを減少し赤血球の適応性(plasticity)を増加することにより血液の濃度を低下させる。
従って、チクロピジンは血小板の機能を抑制する合成薬物である。該薬物は、臨床的に動脈硬化と血栓症が重なる脳卒中や狭心症等の虚血性心臓病、間欠性跛行を予防するために広く用いられている。
【０００３】
しかし、チクロピジンを単独で連用すると、主な副作用が可逆性好中球減少症及び無顆粒球症あるという問題が生ずる。好中球減少症とは、血液中の好中球が１２００個／ｍｍ3以下に低下することとして定義される。無顆粒球症とは、血液中の好中球が４５０個／ｍｍ3以下に低下することとして定義される。
上述の毒性は、治療の最初の３ヶ月の間に０．８％の発生率として患者に発生する。顆粒球コロニー刺激因子が該状態を改善するために用いられるが、これは基本的な解決法にはなり得ない。
従って、発作のために第一次の薬物としてアスピリンが用いられ、アスピリンに不耐性の患者の場合には第二次の薬物としてチクロピジンが用いられる。
状態が悪くなると、血小板減少症の結果と共に骨髄毒性を引き起こし、紫斑病及び出血期間の延長を招く。また、問題は再生不良性貧血によって更に複雑になる。
【０００４】
一方、チクロピジンについての好中球減少症と同様の問題に関してのクロザピン(clozapine)の場合、状態を改善するために抗酸化剤であるＬ−アルコルビン酸が組み合わせて用いられている（大韓民国特許第97-700915号）。しかし、Ｌ−アスコルビン酸が抗酸化作用のみを有し、クロザピンの効果を増大しないので、この方法は好ましくない。
【０００５】
【発明の解決しようとする課題】
チクロピジンを抗血栓剤として単独で用いる場合の種々の問題を解決するために、抗酸化作用帯血小板凝集阻害効果を有する銀杏葉抽出物を上記チクロピジンが組み合わせて用いられる。従って、本発明の目的は、血小板凝集阻害を改善すると共に好中球減少症毒性を減少する効果を有する、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を含有する新規な医薬組成物を提供することである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明は、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を含有する医薬組成物に関する。特に、本発明は、チクロピジン及び銀杏葉抽出物の有効成分を有し、抗血栓剤として用いられる、上記医薬組成物に関する。
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、チクロピジン、及びＰＡＦ結構作用及び抗酸化作用を有する銀杏葉抽出物を含有する医薬組成物に関する。本発明を医薬組成物は、チクロピジンを単独で投与することにより引き起こされる好中球減少症及び無顆粒球症を改善するために抗血栓剤として供給される。
本発明において、チクロピジン（５−[（２−クロロフェニル）メチル]−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ[３，２−Ｃ]ピリジン）はチエネオ−ピリジン(thieneo-pyridine)グループに属し、その抗血栓特性のために血小板凝集阻害剤として広く用いられる。チクロピジンは、血小板原形質膜におけるフィブリノーゲン受容体である糖蛋白質IIb/IIIaの発現を抑制し、それによってＡＤＰによって引き起こされる血小板の凝集を抑制する。また、上記チクロピジンは、血小板が麻酔されたかのように、コラーゲン、アラキドン酸、トロンビン及びＰＡＦによる血小板凝集を阻害する。すなわち、上記チクロピジンは抗血栓作用を有すると判断される。チクロピジンは、血漿中のフィブリノーゲンを減少することにより血液の粘度を減少し、赤血球の適応性を改善する効果を有する。上記利点にもかかわらず、好中球の減少、無顆粒球症等に関して問題は残っている。
【０００７】
従って、本発明は、上記チクロピジン、及び上記問題を改善する間に、血小板凝集における抑制効果を改善するために適当量の銀杏葉抽出物を含有する医薬組成物によって特徴づけられる。
本発明においては、主題に関係する分野の当業者に一般に知られている方法によって製造された銀杏葉抽出物が用いられる。フラボン−グリコシド、テルペン−ラクトン及びアルキル−フェノール化合物を１５質量％以上含有する銀杏葉抽出物を用いるのが好ましい。
このような方法により得られた銀杏葉抽出物は、抗酸化作用及び細胞保護効果を有するフラボン−グリコシドを含有することが一般に知られている。テルペン−ラクトンを含有する銀杏葉抽出物が、血管拡張及び心血管効果に加え、ＰＡＦ及びＡＤＰによる血小板凝集における抑制効果を有することが報告されている。
銀杏葉抽出物は、その抗酸化特性により、好中球減少症及び無顆粒球症の状態を改善する効果を有すると推定される。すなわち、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を組み合わせて用いた場合、チクロピジンによって引き起こされた過酸化物陰イオンのような反応性代謝産物のフリーラジカルが有効に除去される。このような条件下では、骨髄パーオキシダーゼ及び白血球から由来する求核試薬、すなわちタンパク質及びグルタチオンにおいて共有結合が欠如し、好中球減少症及び無顆粒球症を有意に減少する効果がある。
【０００８】
本発明によれば、組成物中の銀杏葉抽出物は、チクロピジンの１００質量部に対し、１０〜２４０質量部含まれる。銀杏葉抽出物は、１日４０ｍｇ〜４８０ｍｇ、好ましくは８０ｍｇ〜２４０ｍｇの量で投与される。銀杏葉抽出物の量が１０質量部未満であると、本発明における目的が有意に達成されない。２４０質量部を越えて用いると、推奨される投与量を越え、他の好ましくない副作用が発生する。一方、１日の投与量が４０ｍｇ未満であると、有意な効果が得られない。もし、４８０ｍｇを越えて用いると、推奨される投与量を越え、他の好ましくない副作用が発生する。
本発明の医薬組成物は、腸を経由した、すなわち経口投与により投与され得る。特に、上記組成物は錠剤、発疱薬、顆粒又はカプセル剤の形態で製造される。この点において、投与形態は、医薬製剤に通常に用いられる賦形剤、担体及びアジュバントに加え、指定量のチクロピジン及び銀杏葉抽出物を含有する。例えば、錠剤は活性化充填剤、顆粒、賦形剤、結合剤、溶解剤(resolvant)、滑沢剤、安定剤、色素、甘味料又は香料を含む。
上述のように形成された単位投与量は、５０ｍｇ〜６００ｍｇのチクロピジン、又は好ましくは１００ｍｇ〜２５０ｍｇを含有する。銀杏葉抽出物の単位投与量は、２０ｍｇ〜２４０ｍｇ、又は好ましくは４０ｍｇ〜１２０ｍｇを含有すべきである。本発明の医薬組成物の一日投与量は投与方法又は治療条件によるが、経口投与の時に成人の場合には、１日１〜４回投与することが好ましい。
このように製造された、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を含有する医薬組成物は、繰り返し使用しても、好中球減少症及び無顆粒球症に関して問題を引き起こさない。また、上記組成物は、結局、細胞毒性等のいかなる副作用なしで、チクロピジンの抗血栓作用により、抗血栓及び抗塞栓剤として作用する。
【０００９】
本発明を、限定的でない、以下の実施例に基づいて更に詳細に説明する。
製造例
乾燥粉末の形態の１００ｇの銀杏葉抽出物を遠心管に入れた。銀杏葉の粉末が効率的に注入されるように、９３０ｍｌの６０v/v％アセトン水溶液を入れた。１２時間後、溶液を減圧下にろ過し、濾液を減圧下に１５０ｍｌまで濃縮した。その後、全量を２００ｍｌにするように水を加え、激しく混合した。次いで、溶液を１５℃に１２時間冷却し、その後上清及び沈殿をろ過して分離した。
撹拌しながら、５０ｇの硫酸アンモニウムを加えた。１５分後、３７ｍｌのメチルエチルケトン及び２５ｍｌのアセトンを加えた。次いで、その有機溶媒層を、メチルエチルケトンとアセトンの同量混合物により３回抽出及び分離した。メチルエチルケトン及びアセトンの層の全量が１０ｇと等量になるような点まで、減圧下、溶液を濃縮した。６８ｍｌの５０v/v％エタノール溶液を上記濃縮液に加えて溶解し、その後、該溶液をDiaplo(R)限外ろ過層(Amicone Co., USA)を用いて４気圧の圧力下にろ過した。
次いで、該濾液を減圧下に５ｇまで濃縮し、２５ｍｌの９０v/v％エタノール溶液で溶解した。該溶液を室温に１日保存した。次いで、該溶液を透明になるまでろ過し、最大温度６０℃で減圧下に乾燥した。結果として、２．１６ｇの有効成分（黄色粉末）が得られた。
【００１０】
実施例１：錠剤
上記製造例から抽出した銀杏葉抽出物と共に、表１に示す成分及び含量で経口投与のために通常に用いられる方法により錠剤を製造した。特に、上記成分をよく混合し、個々の錠剤を圧縮して製造した。
【００１１】
【表１】
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【００１２】
実施例２：発疱薬
上記製造例から抽出した銀杏葉抽出物と共に、表２に示す成分及び含量で経口投与のために通常に用いられる方法により発疱薬を製造した。特に、上記成分をよく混合し、個々の錠剤を圧縮して製造した。
【００１３】
【表２】
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【００１４】
実施例３：顆粒剤
上記製造例から抽出した銀杏葉抽出物と共に、表３に示す成分及び含量で経口投与のために通常に用いられる方法により顆粒剤を製造した。
【００１５】
【表３】
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【００１６】
実施例４：カプセル剤
上記製造例から抽出した銀杏葉抽出物と共に、表４に示す成分及び含量で経口投与のために通常に用いられる方法によりカプセル剤を製造した。
【００１７】
【表４】
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【００１８】
実験例１：生体外(Ex vivo)血小板凝集抑制効果
チクロピジンを、５０、１００又は２００ｍｇ／ｋｇ／日、メスのラットに３日間投与した。５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジンにチクロピジンの８０％（すなわち、Ｔ：Ｇ＝５：４）、又は同量の４０ｍｇ／ｋｇの銀杏葉抽出部物を投与した。検体への最後の投与の１時間後、ラットに麻酔をかけた。血液凝固を阻止するため、抗凝固剤である、３．８％のクエン酸ナトリウム溶液を入れた注射器を用いて血液試料を採取した。その後、１×１０-5MのＡＤＰにより引き起こされる血小板凝集における効果を研究した。結果を表５に示す。
【００１９】
【表５】
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【００２０】
２００ｍｇ／ｋｇのチクロピジンを単独で投与した場合、ＡＤＰによる血小板凝集は９８％抑制された。チクロピジンの投与量を１００ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇに減少した場合、抑制率は、それぞれ６７％及び６５％ｐであった。
５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジンと４０ｍｇ／ｋｇの銀杏葉抽出物とを組み合わせて投与した場合、チクロピジン単独投与の１．５倍有効である、９５％の抑制率が示された。組み合わせによる投与は、２００ｍｇ／ｋｇのチクロピジンを投与した場合に示される血小板凝集と同じ効果を示した。
【００２１】
実験例２：マウスの急性血栓モデルにおける回復率の増加
マウスに、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を含む療法(regimen)を３日間投与した。最終療法を投与して１時間後に、コラーゲン及びエピネフリンを含む混合溶液（コラーゲン１１００μｇ＋エピネフリン１１０μｇ／１０ｍｌ）を尾部の静脈に注射した。麻痺又は肺梗塞による死亡の状態、及びそれからの回復を正式に記録した。結果を表６に示す。
【００２２】
【表６】
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【００２３】
上記実験によると、コラーゲン及びエピネフリンを含む混合溶液を静脈に注射すると、短時間のうちに肺動脈における閉塞の結果により大量の血栓が生ずる。注射後、１分以内に、身体の大部分が麻痺し、瞳孔が拡張する。てんかんに続いて呼吸が起こる。５分以内に、マウスの約７０〜８０％が死亡する。残りのマウスについては、ほとんどのマウスが１５分以内に死亡するか麻痺が持続した。表６に示すように、コントロール群のたった２０％のマウスが回復して１５分以内に自由に動いた。しかし、５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのチクロピジンを投与した場合、それぞれ３８％及び４７％の回復率が見られ、チクロピジンの投与による急性血栓モデルにおける抗血栓作用が確認された。また、５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジンと、２０ｍｇ／ｋｇ又は４０ｍｇ／ｋｇの銀杏葉抽出物を組み合わせて投与すると、それぞれ４３％及び７１％の回復率が記録され、チクロピジン単独投与より回復率が高かった。
【００２４】
実験例３：動-静脈短絡（以下、A-V短絡という）による血栓形成及び血小板凝集における効果
５０又は１００ｍｇ／ｋｇのチクロピジンの第１の療法、及び５０ｍｇのチクロピジン及び２０（５：２）又は４０ｍｇ（５：４）の銀杏葉抽出物の第２の療法をメスのラットに９日間投与した。その後、A-V短絡における綿糸における血栓形成の重量を測定し、表７に示す。このとき、血栓の重量は実験直後の湿重量により、及び完全に乾燥した後の乾燥重量を測定した。コントロールラットのA-V短絡における重量から、血栓形成抑制率(％)を計算した。
【００２５】
【表７】
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【００２６】
上記表７によると、５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのチクロピジンを単独で投与した時、血栓形成抑制率は、２６％（湿）、２５％（乾燥）、及び３６％（湿）、３１％（乾燥）であった。５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジン及び２０ｍｇ／ｋｇの銀杏葉抽出物を組み合わせて投与した場合、血清形成抑制率は３９％（湿）及び３６％（乾燥）が記録され、単独投与に見られる結果より、血清凝集抑制効果が有意に改善された。組み合わせ投与群における結果は１００ｍｇ／ｋｇのチクロピジン投与に見られる結果と同様であった。また、５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジン及び４０ｍｇ／ｋｇの銀杏は抽出物を組み合わせて投与した場合、血清形成抑制率は４５％（湿）及び４２％（乾燥）が記録され、１００ｍｇ／ｋｇのチクロピジン単独投与より優れていた。
【００２７】
実験例４：A-V短絡における血小板凝集における影響
上記実験例３において用いたものと同じ療法を９日間投与した後、A-V短絡後の生体外(ex vivo)の血小板凝集における影響を研究するために集めた血液の試料として、A-V短絡における血栓形成の重量を測定した。特に、それぞれの血液試料から調製したＰＲＰ（血液試料を２００×ｇで１０分間遠心した後の上清）に、血小板凝集阻害剤である、３×１０-6ＭのＡＤＰを凝集を引き起こすために加えた。
A-V短絡を行ったラットの血小板は、コントロール群のものより活性であった。A-V短絡を行っていないラットの生体外(ex vivo)血小板凝集効果を研究するため、１×１０-5Ｍより低い濃度のＡＤＰを用いた。A-V短絡を行ったコントロール群におけるラットの最大血小板凝集率を１００とし、種々の凝集率を比較した。結果を表８に示す。
【００２８】
【表８】
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【００２９】
ＡＤＰをコントロール群におけるＰＲＰに加えて２．４分後に最大凝集が生じた。それから３分後、８９％の凝集が維持された。完全な脱凝集には５．７分かかった。
一方、５０ｍｇ／ｋｇ又は１００ｍｇ／ｋｇのチクロピジンを単独投与されたラットについては、最大凝集はコントロール群の７８％及び７２％であった。２分及び３分の間隔では、凝集率はそれぞれ、７４％、４５％、６２％、２１％であった。時間の経過に従って、凝集率はコントロール群に比較して有意に低くなった。また、５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジン及び２０ｍｇの銀杏葉抽出物（５：２）を組み合わせて投与する群については、最大凝集率、及び２分及び３分間隔の凝集率は、１００ｍｇ群において示された結果と同じ、それぞれ６７％、５８％及び２７％であった。しかし、５０ｍｇのチクロピジン及び４０ｍｇの銀杏葉抽出物（５：４）を組み合わせて投与する群については、最大凝集率、及び２分及び３分間隔の凝集率はすべて、５０ｍｇのチクロピジン及び２０ｍｇの銀杏葉抽出物の群より高かった。
最大凝集及び完全な脱凝集を形成する時間間隔については、個々の投与にういては１００ｍｇ群は５０ｍｇ群より短かった。５０ｍｇのチクロピジン及び２０ｍｇの銀杏葉抽出物を組み合わせて投与する場合、時間間隔は１００ｍｇのチクロピジンを単独で投与する場合の時間間隔と同じ、それぞれ１．６分及び３．４分であった。５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジン及び４０ｍｇ／ｋｇの銀杏葉抽出物を組み合わせて投与する場合、４．０分の全凝集及び１．８分の血小板の最大凝集についての時間間隔よりも短かった。
【００３０】
実験例５：出血時間の延長
チクロピジン及び銀杏葉抽出物の療法をメスのラットに５日間投与した。最後の療法を投与した１時間後、麻酔のために２５０ｍｇ／ｋｇのケタミンを筋肉細胞に注射した。尾の末端をかみそりの刃で２ｍｍ切開し、その後、そこからでた血液を５秒おきにろ紙に吸い取り、出血の停止までの時間を測定した。それぞれの時間を表９に示す。
【００３１】
【表９】
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【００３２】
表９に示されるように、５０ｍｇ／ｋｇの群についての出血時間は、アラビアゴムのみを投与したコントロール群における時間から１．５倍増加した。また、１００ｍｇ／ｋｇの群についての出血時間はコントロール群における時間から２倍増加した。５０ｍｇ／ｋｇのチクロピジン及び２０ｍｇ／ｋｇの銀杏葉抽出物を組み合わせて投与した場合、コントロール群における時間から時間は増加したが、５０ｍｇ／ｋｇ群についての時間からは増加しなかった。しかし、銀杏葉抽出物を、５：４の比で組み合わせて投与した場合、時間間隔は１００ｍｇ／ｋｇのチクロピジン単独投与から延長された。
従って、銀杏葉抽出物を組み合わせて投与する場合、チクロピジンの有効性に妥協することなく、その投与量を減少させることができる。
【００３３】
実験例６：医薬組成物の投与１６週後の好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ及びリンパ球の比の変化
本発明における医薬組成物の効果を明らかにするため、投与実験を実施するために以下の試薬及び装置を用いた。
遠心機、ＣＢＣ瓶、５ｍｌガラス管＋ヘパリン（２００Ｕ／ｍｌ）  ２９μｌ／tube、２ｍｌのエッペンドルフ(Ephendorph)管、３ｍｌ注射器＋２１Ｇ針の１０ｍｌ注射器、生理食塩水、血球計算器(cytometer)、スライドガラス、１０％ホルマリン溶液、コールターカウンター(Coulter Electronics Inc., Hialeah, Fla. 33010 and Mississauga, Ontario)、ミクロトーム、ＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラフィー(Kontron 420, Supelco Inc. Bellefonte, PA)
また、本実験で用いられた事件動物としては、体重が６０ｇの６週齢のラット(Spraque-Dawley)を購入し、適宜飼料及び水を与え、２３℃及び５０％湿度を維持した。ラットを、コントロール群、チクロピジン投与群、チクロピジン＋銀杏葉抽出物を５：１、５：２及び５：４の種々の比で投与する群に分けた。
投与量及び配合比による変化を以下のように設定した。臨床的な応用に関して、チクロピジン錠剤は１００ｍｇ又は２５０ｍｇであり、１日投与量は２００ｍｇ〜６００ｍｇである。一方、銀杏葉抽出物の１個の錠剤は４０ｍｇ、８０ｍｇ、１２０ｍｇであり、１日投与量は１２０ｍｇ〜２４０ｍｇである。チクロピジン及び銀杏葉抽出物の配合比は、５：１、５：２及び５：４である。
【００３４】
【表１０】
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【００３５】
上記試薬及び装置を用い、チクロピジン単独、又は銀杏葉抽出物を５：１、５：２及び５：４で１６週間にわたって経口投与した。麻酔をした後、腹部大動脈から採血し、コールターカウンターを用いて白血球数を計測した。細胞化学染色法を用い、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ及びリンパ球の比を測定した。結果を表１１に示す。
【００３６】
【表１１】
ラットにおける白血球数における、チクロピジンの単独又は組み合わせによる１６週間の投与による影響
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【００３７】
結果として、１６週間にわたりチクロピジンを投与した場合、血液中の白血球数はコントロール群に比べて減少する経口を示したが、統計的に有意性のある相違はなかった。また、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：１、５：２、５：４の比で組み合わせて１６週間投与した場合、コントロール群又はチクロピジン単独投与群に比べ、有意のある相違はなかった。
一方、好酸球、好塩基球、マクロファージ又はリンパ球に関しては、チクロピジン単独、又は５：１、５：２、５：４の組み合わせで１６週間投与した場合、コントロール群から有意な相違はなかった。
しかし、好中球の場合、正常ラットは14.3±1.5％を示したが、チクロピジン単独投与群は、10.5±1.1％(P<0.05)に減少した。チクロピジンを、銀杏葉抽出物と５：２の比で組み合わせて投与した場合、結果は15.0±1.8％(P<0.05)であり、チクロピジン単独投与から有意に回復された。
【００３８】
実験例７：１６週間の薬物投与後に２週間投与を中止した時の好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ又はリンパ球の数の変化
ラットに、実験例６と同じ療法を１６週間投与し、２週間別々に投与を中止した。特に、表１２に示すように、６週齢のラットをコントロール群、チクロピジン投与群、及びチクロピジン＋銀杏葉抽出物を組み合わせた（５：２）投与群に分けた。１６週間投与し、２週間中止した後、白血球の数、及び好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ及びリンパ球の比を、実験例６と同じ方法を用いて測定した。
【００３９】
【表１２】
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【００４０】
結果を表１３に示す。
【００４１】
【表１３】
１６週間のチクロピジン単独処理又は銀杏葉抽出物との組み合わせ処理後の２週間中止による、ラットにおける白血球数に対する影響
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【００４２】
表１１に示したように、１６週間にわたりチクロピジンを経口投与した場合、白血球の全数は減少傾向を示し、好中球数も有意な減少を示した。チクロピジンを１６週間にわたり経口投与し、２週間中止した場合、好中球数はコントロール群のように正常な回復を示した。また、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：２の比で組み合わせて投与した場合、コントロール群及びチクロピジン単独投与群と同じ結果を示した。
【００４３】
実験例８：医薬組成物を１６週間にわたって投与した後の骨髄細胞数の変化
チクロピジンによる、骨髄における白血球の前駆細胞の減少を測定するため、、チクロピジン単独又は５：１、５：２、５：４の比の銀杏葉抽出物の組み合わせを６週齢のラットに１６週間にわたり投与した。その後、骨髄細胞の数を測定した。
詳細には、白血球の前駆細胞の数を測定するため、筋細胞周辺を除去した大腿部の部分を切開した。次いで、療法の骨端を切開し、約２ｃｍの大腿骨を得た。材料を、３ｍｌの注射器（２１Ｇ）を用いて１ｍｌの生理食塩液で流した。灌流液をエッペンドルフ管に集め、２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去した後、１０％酢酸及び白血球のための色素を含有するTurks溶液１ｍｌを加え、細胞層を沈殿させた。次いで、試験管を穏やかに混合し、２，０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を除去した後、１ｍｌの生理食塩液を加え、細胞層を沈殿させた。再び、試験管を穏やかに混合して２，０００ｒｐｍで５分間遠心し、その後細胞を洗浄した。次いで、再び上清を除去し、０．５ｍｌの生理食塩液を加え、細胞層を沈殿させ、混合した。血球計算器に一滴落とし、５部分のRRRRR（４隅及び中央）における細胞数を計測した。以下の式を用い、骨髄細胞数を計算した。
計測した数×５０×１０×１０3＝白血球の前駆細胞／大腿骨
大腿骨における骨髄細胞の数を図１に示す。特に、チクロピジンを１６週間にわたって繰り返し投与した場合、骨髄における白血球数はコントロール群から有意な減少を示した。一方、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：２の比で１６週間に亘って投与した場合、数は、チクロピジン単独投与に比べ、有意に回復を示した。
また、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：１又は５：４の比で組み合わせて１６週間にわたり投与した場合、数はチクロピジン単独投与に比べ増加する傾向を示したが、統計的に有意のある相違はなかった。結果は、上述した、好中球の数における変化と同様の傾向を示した。
【００４４】
実験例９：１６週間にわたり医薬組成物を投与し、２週間中止した後の骨髄細胞の数の変化
実験例８と同様の方法を用い、チクロピジン単独、又は銀杏葉抽出物との５：２の比の組み合わせを６週齢のラットに１６週間にわたり投与し、次いで２週間中止した。次いで、骨髄細胞の数を測定した。結果を図２に示す。
図１に示すように、チクロピジンを１６週間にわたって経口投与した場合、骨髄細胞の数は有意に減少したが、組み合わせ投与による数は、コントロールの数と同じであった。一方、チクロピジンを１６週間にわたり投与し、次いで２週間中止した場合、大腿骨における骨髄細胞の数は正常レベルにまで回復した。また、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を組み合わせて投与した場合、数は、コントロール及びチクロピジンを単独投与した場合と同じであった。
【００４５】
実験例１０：医薬組成物を１６週間投与した後の骨髄細胞の組織学的試験
チクロピジンによる骨髄における白血球前駆細胞の数の減少を測定するため、チクロピジン単独、又はチクロピジン及び銀杏葉抽出物の５：１、５：２、５：４の比の組み合わせを、６週齢のラットットに１６週間にわたり投与した。その後、骨髄細胞を組織学的に試験した。
詳細には、骨髄細胞の組織学を試験するため、各群からのラットの大腿骨を切開し、１０％ホルマリン溶液中に保存した。このように抽出した大腿骨を脱灰溶液で脱灰し、通常の組織学処理の後にパラフィンで包埋した。このようにパラフィンで包埋された大腿骨組織を４μｍの厚みにスライスしヘマトキシリン及びエオシンで染色した。次いで、スライドを４００ｘにおける光学顕微鏡で試験した。
チクロピジン単独、又は銀杏葉抽出物を５：１、５：２、５：４の比で組み合わせて６週齢のラットに１６週間にわたり投与した場合について、大腿骨骨髄細胞の組織学的試験による写真を図３に示す。
コントロール群に比べ、チクロピジン単独投与の場合における骨髄細胞の密度は、脂肪細胞の血管外遊走により引き起こされる悪性の液胞を示した。血小板の前駆細胞である巨核球の密度は、コントロール群に比べ骨端で減少した。白血球の前駆細胞から増殖段階である骨髄球は、コントロール群より著しく減少したが、白血球の成熟段階であるバンド顆粒球(band-granulocyte)は変化を示さなかった。
【００４６】
【表１４】
ラットにおける白血球数の、チクロピジン単独、又は銀杏葉抽出物との組み合わせの１６週間にわたる投与の影響
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【００４７】
一方、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を組み合わせて投与した場合、それらの密度は、悪性の欠如のためにコントロール群と同じであった。５：４群については、密度によって、無意味な減少があった。他の骨髄細胞は、密度に関してコントロール群と同一であった。
実際、コントロール群に比べ、チクロピジン単独投与は、骨髄細胞の萎縮、すなわち空胞化の増加及び密度の減少を示した。白血球細胞の前駆細胞である、骨髄球の密度の減少は、好中球減少症に関して抑制効果を変化させると考えられる。
チクロピジン及び銀杏葉抽出物を組み合わせて投与した場合、比によって有意な変化はなかった。しかし、５：２群に関しては、骨髄の密度及び細胞の組成はコントロール群のそれと同じであった。
【００４８】
実験例１１：１６週間にわたり医薬組成物を投与し、２週間中止した後の骨髄細胞の組織学的試験
チクロピジンによる、骨髄における白血球細胞の前駆細胞の数の減少を測定するため、チクロピジン単独、又は銀杏葉抽出物との組み合わせを５：１、５：２、５：４の比で６週齢のラットに１６週間投与し、２週間中止した。その後、骨髄細胞を組織学的に試験した。
また、チクロピジンを１６週間投与し２週間中止した群においては、骨髄細胞の密度は悪性なしでコントロール群と同じであった（表１５及び図４参照）。
【００４９】
【表１５】
ラットにおける白血球数におけるチクロピジンを１０週間単独で、又は銀杏葉抽出物と組み合わせて投与し２週間中止した効果
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【００５０】
また、増殖段階における骨髄球について、組み合わせ投与についての白血球前駆細胞については、単独投与に比べ、具体的な増加傾向があった。従って、チクロピジンを１６週間投与し２週間中止すると、萎縮の消失、及び骨髄球の減少に見られるように、回復の傾向があった。また、血小板の前駆細胞である、大腿骨における巨核球の密度はコントロール群の点でほとんど増加した。対照的に、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：２の比で投与し２週間中止した場合、骨髄球においてわずかな減少が見られた。
【００５１】
実験例１２：ＣＦＵ−Ｃ分析
マウスの大腿骨から骨髄細胞を分離した。比重１．１のパーコール(Percoll)試薬により、骨髄細胞中の単核細胞を、比重が１．０９０、１．０７５及び１．０６３の３層に分離した。細胞を、密度勾配遠心分離を用いて、それぞれ分離した。特に、骨髄細胞を２５ｍｌの遠心管に入れ、２０ｍｌの上記溶液を注ぎ３層を形成した。管を４℃で２，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。次いで、骨髄細胞を中心の層から得た。Ｔ−リンパ球を、羊赤血球細胞を用いるＥ−ロゼッテ(E-rosette)生成法により除去した。得られた細胞をHank balanced salt solution（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、Iscove modified Dubecco medium（ＩＭＤＭ  ＧＩＢＣＯ）に分散させた。
培養液中で、培養中のコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｃ）を以下のように試験した。０．３％寒天（ＤＩＦＣＯ）、１５％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）、１００Ｕの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＣＳＦ−ＣＨＵＧＡＩ）、０．０２ｍｌのチクロピジン単独又は銀杏葉抽出物との組み合わせを含む、１ｍｌのＩＭＤＭに、２×１０5の骨髄細胞を、懸濁して培養した。この点において、チクロピジンの濃度は３０ｍｇ／ｍｌであった。
また、３０ｍｇ／ｍｌのチクロピジンに対して、銀杏葉抽出物を５：１、５：３、５：４の比で組み合わせて用い、５％ＣＯ2、３７℃、及び１００％の湿度を用いたインキュベーター内で１０日間培養した。この点において、５０個以上の細胞を含むコロニーの数を倒立顕微鏡を用いて計算し、コントロール群に比較した百分率として細胞抑制効果を計算した。
【００５２】
一方、ＣＧＵ−Ｃに対して約５０％の抑制効果を示した３０ｍｇ／ｍｌのチクロピジンを、銀杏葉抽出物と５：１、５：２、５：４の比で用いた場合、ＣＦＵ−Ｃにおける変化を図５に示す。チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：１及び５：４の比で用いた場合、チクロピジン単独処理群に比べ、有意な相違はなかった。チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：２の比で用いた場合、コントロール群と同じ、回復の傾向が見られた。
上述した結果は、上記の生体内実験から１６週間にわたってチクロピジンを経口投与した時に血液中の好中球数及び骨髄細胞数の減少を招いた結果と一致する。また、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を５：２の比で投与した場合、好中球数及び骨髄細胞数の減少がコントロール群と同様に回復した結果とも一致する。
【００５３】
実験例１３：骨髄細胞についての脂質過酸化の測定
ラットの大腿骨の部分を切開し、周囲の筋肉細胞を除去して大腿骨を得た。材料を、３ｍｌの注射器を用いて１ｍｌの生理食塩液で流した。灌流液を管に集め、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。上清を除去した後、沈着した骨髄細胞をＩＭＤＭに分散し、血球計算板で細胞数を測定することにより、１０7細胞／ｍｌに希釈した。細胞を３群、すなわち、コントロール、チクロピジン処理、及びチクロピジン+銀杏葉抽出物群（５：２）に分けた。コントロール群に、１０ミリモル／ＬのＨ2Ｏ2（２０μＬ）を加えた。チクロピジン処理群に、１０-5ｇ／ｍｌを加えた。チクロピジン＋銀杏葉抽出物群に、１０-5ｇ／ｍｌのチクロピジン及び４×１０-6ｇ／ｍｌの銀杏葉抽出物を加えた。３つの全ての群を３７℃で１時間培養した。その後、骨髄細胞中の脂質過酸化のレベルを、ＴＢＡ法により測定した。特に、ＴＢＡ試料溶液との反応から生成するマロンジアルデヒドの量を分光光度計で測定し、結果を図６に示す。コントロール群のＴＢＡ測定は０．２３±０．０２であり、チクロピジン処理（１０-5ｇ／ｍｌ）は０．３０±０２であり、この相違はチクロピジンによる細胞障害を明らかに示唆する。しかし、銀杏葉抽出物（４×１０-6ｍｇ／ｍｌ）を組み合わせて用いた場合、結果はコントロール群と同じ０．２４±０．０１であり、チクロピジン単独投与の結果から有意に減少した。故に、抗酸化効果により、銀杏葉抽出物はチクロピジンによる細胞障害を抑制すると考えられる。
【００５４】
実験例６〜１３から、６週齢のラットに１００質量部のチクロピジン（約３００ｍｇ／ｋｇ／日）を飲料水に溶解し１６週間にわたって投与した。その後、血液及び骨髄中における好中球減少毒性の存在が確認された。また、抗酸化効果を有する銀杏葉抽出物を、それぞれ２０、４０、８０質量部組み合わせて用い、好中球減少の減少が測定された。チクロピジンを１６週間投与した後、骨髄細胞、及び白血球細胞の前駆細胞である骨髄球を含む好中球減少が検出された。
上記抑制効果は、チクロピジンを１６週間投与した後２週間中止した後に正常なレベルにまで回復した。更に、４０質量部の銀杏葉抽出物を組み合わせて投与した時に、骨髄細胞における減少、すなわち好中球減少はコントロール群のレベルにまで回復した。しかし、チクロピジン及び銀杏葉抽出物を２０又は８０質量部組み合わせて投与した場合、有意な抑制効果はなかった。
【００５５】
一方、in vitro試験における顆粒球の前駆細胞の培養により細胞増殖の抑制効果を測定した場合、チクロピジンは用量依存的な抑制効果により細胞毒性を示した。しかし、銀杏葉抽出物との組み合わせ投与の場合、抑制効果に減少はなかった。更に、骨髄細胞中のペルオキシダーゼによる酸化反応によるin vitro試験においてチクロピジンにより細胞毒性は増加したが、銀杏葉抽出物を組み合わせた場合は抑制された。
以上の結果によると、チクロピジンが代謝産物よりもそれ自体として骨髄中にある好中球の前駆細胞に対する細胞毒性を通じて血液中の好中球減少症を生じ、抗酸化作用を有する銀杏葉抽出物は上記チクロピジンの毒性を抑制することを示す。特に、in vivo試験において、１００質量部のチクロピジンに対して４０質量部の銀杏葉抽出物の投与が最も有効であることが示された。
要するに、チクロピジンを銀杏葉抽出物と共に併用処理した場合に、投与量、投与期間及び作用の測定方法により結果に差はあるが、チクロピジンを単独投与した場合と比較して類似か、著しく強い抗血小板、抗血栓作用を有することが認められた。従って、チクロピジンを銀杏葉抽出物と共に併用処理することにより、チクロピジンの投与用量を低くすることができるこ期待でき、チクロピジンの副作用を最小にすることができると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ラットの大腿骨の骨髄細胞数における、１６週間にわたりチクロピジンを単独で、及びチクロピジン及び銀杏葉抽出物を組み合わせた使用の効果を示すグラフである。
【図２】  ラットの大腿骨の骨髄細胞数における、１６週間にわたりチクロピジンを単独で、及びチクロピジン及び銀杏葉抽出物を組み合わせて使用し２週間中止した効果を示すグラフである。
【図３】  コントロール群と、１６週間にわたってチクロピジンを単独、又は銀杏葉抽出物と組み合わせて（５：１、５：２、５：４）使用した場合の白いマウスの大腿骨骨髄細胞の組織学の写真（×４００）である。
【図４】  １６週間にわたってチクロピジンを単独、又は銀杏葉抽出物と組み合わせて（５：２）使用した場合の白いマウスの大腿骨骨髄細胞の組織学の写真（×４００）である。
【図５】  チクロピジンを単独で、又は銀杏葉抽出物と組み合わせて用いた場合にチクロピジン（３０ｍｇ／ｍｌ）により引き起こされるＣＦＵ−Ｃの抑制効果を示す棒グラフである。
【図６】  チクロピジン（１０-4Ｍ）を単独で、又は銀杏葉抽出物と組み合わせて（５：２）用いた場合に骨髄細胞からの過酸化水素によって引き起こされる脂質過酸化の効果を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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