(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式で示されるフッ化β−Ｄ−セロトリオシル。
【化１】
0003884494.tif 000009
【請求項２】
下記構造式で示されるフッ化β−Ｄ−セロテトラオシル。
【化２】
0003884494.tif 000010
【請求項３】
セロビオースオクタアセテートを出発原料とし、該セロビオースオクタアセテートのクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させ、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシルを得ることより成る工程と、
グルコースを出発原料とし、該グルコースをピリジン中、無水酢酸と反応させることによりグルコースペンタアセテートを得て、
次に、該グルコースペンタアセテートのクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることにより、臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルを得て、
次に、該臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシルをベンジルアルコール中で、酸化銀及び無水硫酸カルシウムを反応させることにより、ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリコピラノシドを得て、
次に、該２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシドをメタノール中、ナトリウムメトキシドと反応させることにより、ベンジルβ−Ｄ−グルコピラノシドを得て、
次に、該ベンジルβ−Ｄ−グルコピラノシドをベンズアルデヒドジメチルアセタールと反応させることにより、ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシドを得て、
次に、該ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシドを水素化ナトリウム、引き続いて臭化ベンジルと反応させることにより、ベンジル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシドを得て、
次に、該ベンジル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシドを水素化シアノホウ素ナトリウム並びにＨＣｌと反応させることにより、２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシドを得る工程と、
トリクロロメタンスルホン酸銀、１，１，３，３−テトラメチル尿素及び上記のようにして得られたベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシドのジクロロメタン懸濁液に上記のようにして得られた臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシルのジクロロメタン溶液を滴下反応させることにより、ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシドを得て、
次に、該ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシドをパラジウム−カーボン触媒下、水添反応させることにより、４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕グルコピラノースを得て、
次に、該４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−Ｄ−グルコピラノースをピリジン中、無水酢酸と反応させることにより、セロトリオースウンデカアセテートを得て、
次に、該セロトリオースウンデカアセテートのクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることにより、臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシルを得て、
次に、該臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β、Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシルをアセトニトリル中で、フッ化銀と反応させることにより、フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシルを得て、
次に、該フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシルをメタノール中、ナトリウムメトキシドと反応させることによりβ−Ｄ−セロトリオシルを得る工程とにより、
β−Ｄ−セロトリオシルを得ることを特徴とする請求項１のフッ化β−Ｄ−セロトリオシルの製造方法。
【請求項４】
セロビオースオクタアセテートを出発原料とし、セロビオースオクタアセテートのクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることを含む工程により、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシルを得る工程と、
該臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシルをベンジルアルコール中、炭酸銀並びに、無水硫酸カルシウムと反応させることにより、ベンジル２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−セロビオシドを得て、
次に、該ベンジル２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−セロビオシド（３）をメタノール中、ナトリウムメトキシドと反応させることによりベンジルβ−Ｄ−セロビオシドを得て、
次に、該ベンジルβ−Ｄ−セロビオシドをベンズアルデヒドジメチルアセタールと反応させることにより、ベンジル４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシドを得て、
次に、該ベンジル４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシドに水素化ナトリウム、引き続いて臭化ベンジルを滴下反応させることによりベンジル２，３，６，２′，３′−ペンタ−Ｏ−アセチル−４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシドを得て、
次に、該ベンジル２，３，６，２′，３′−ペンタ−Ｏ−アセチル−４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシドを水素化シアノホウ素ナトリウム並びにＨＣｌと反応させることにより、ベンジル２，３，６，２′，３′，６′−ヘキサ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−セロビオシドを得る工程と、
トリクロロメタンスルホン酸、１，１，３，３−テトラメチル尿素、及び上記のようにして得られたベンジル２，３，６，２′，３′，６′−ヘキサ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−セロビオシドのジクロロメタン懸濁液に上記のようにして得られた臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシルのジクロロメタン溶液を滴下反応させることにより、ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシドを得て、
次に、該ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシドをパラジウム−カーボン触媒下、水添反応させることにより、４−Ｏ−〔４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノースを得て、
次に、該４−Ｏ−〔４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノースをピリジン中、無水酢酸と反応させることにより、セロテトラオーステトラデカアセテートを得て、
次に、該セロテトラオーステトラデカアセテートのクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることにより臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシルを得て、
次に、該臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシルをアセトニトリル中で、フッ化銀と反応させることにより、フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシルを得て、
次に、該フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（12）をメタノール中に、ナトリウムメトキシドと反応させることにより、フッ化β−Ｄ−セロテトラオシル（13）を得る工程とにより、
フッ化β−Ｄ−セロテトラオシルを得ることを特徴とする請求項２のフッ化β−Ｄ−セロテトラオシルの製造方法。
【請求項５】
アセトニトリルと緩衝液との混合液中で、請求項１のフッ化β−Ｄ−セロトリオシル、又は請求項２のフッ化β−Ｄ−セロテトラオシルにセルラーゼを作用させることを特徴とするセロオリゴ糖の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規なセロトリオース並びにセロテトラオースモノマー及びこれらを出発原料とし、これらにセルラーゼを作用させることを特徴とするセロオリゴマーの製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
セルロースは紙、パルプの原料として使用される他、セルロースアセテート、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等、様々な機能性を有するセルロース誘導体の出発原料として用いられる等、工業原料として極めて重要である。
【０００３】
また、セルロースよりも分子量の低いセロオリゴ糖も食品添加物、医薬品、臨床試験用酵素基質などの分野での利用が期待されている。
【０００４】
一方、従来より、フッ化β−Ｄ−セロビオシルについては、久保ら（日本大学獣医学部学術研究報告書、41、9 、1984）により知られている。また、このフッ化β−Ｄ−セロビオシルを出発原料としてこれにセルラーゼを作用させることによりセルロースオリゴマーが得られることも知られている（特願平１−２３９６１１号）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
セルロースは、一般に木材、綿等の天然繊維素材より、単離、精製することにより、得られているが、森林資源の保護の面から、これに代わる製造方法が求められている。一方、セロオリゴ糖については、前記した如くフッ化β−Ｄ−セロビオシルにセルラーゼを作用させて製造されることが報告されているが、この方法では、重合度の高いセロオリゴ糖を生成することは困難である。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記問題点を解決すべく、鋭意検討を重ねた結果、新規なセロトリオース並びにセロテトラオースモノマーを合成することに成功し、さらにこれらを出発原料とし、これにセルラーゼを作用することにより比較的、高重合度のセロオリゴ糖を製造することに成功し、本発明に想到したものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、下記構造式で示されるセロトリオースモノマーであるフッ化β−セロトリオシルを提供するものである。
【化３】
0003884494.tif 000002
【０００８】
また、本発明は、下記構造式で示されるセロテトラオースモノマーであるフッ化β−Ｄ−セロテトラオシルを提供するものである。
【化４】
0003884494.tif 000003
【０００９】
また、本発明は、後述する反応式Ｉで示される一連の工程を含むフッ化β−Ｄ−セロトリオシルの製造方法を提供するものである。また、本発明は、後述する反応式IIで示される一連の工程を含むフッ化β−Ｄ−セロテトラオシルの製造方法を提供するものである。さらに本発明は、前記フッ化β−Ｄ−セロトリオシル又はフッ化β−Ｄ−セロテトラシルに、アセトニトリルと緩衝液との混合液中で、セルラーゼを作用させることを含むセロオリゴ糖の製造方法を提供するものである。
【化５】
0003884494.tif 000004
【化６】
0003884494.tif 000005
【００１０】
フッ化β−Ｄ−セロトリオシル（16）の製造法
セロトリオースモノマーすなわちフッ化β−Ｄ−セロトリオシル（16）は、以下の反応式（Ｉ）で示される経路により合成することができる。
以下に、この反応式Ｉに従って概略を説明する。なお以下の説明において物質名の後にかっこ書きで示した数字は、反応式Ｉ中において示した化学式の番号である。
【００１１】
セロビオースオクタアセテート（１）のクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることを含む工程により、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル（２）を得る。
次にグルコース（３）をピリジン中、無水酢酸と反応させることを含む工程により、グルコースペンタアセテート（４）を得る。
【００１２】
次にグルコースペンタアセテート（４）のクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることを含む工程により、臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル（５）を得る。
【００１３】
次に臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル（５）をベンジルアルコール中で、酸化銀及び無水硫酸カルシウムを反応させることを含む工程により、ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グリコピラノシド（６）を得る。
【００１４】
次に２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（６）をメタノール中、ナトリウムメトキシドと反応させることを含む工程により、ベンジルβ−Ｄ−グルコピラノシド（７）を得る。
【００１５】
次にベンジルβ−Ｄ−グルコピラノシド（７）をベンズアルデヒドジメチルアセタールと反応させることを含む工程により、ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（８）を得る。次にベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（８）を水素化ナトリウム、引き続いて臭化ベンジルと反応させることを含む工程により、ベンジル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（９）を得る。
【００１６】
次に、ベンジル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド（９）を水素化シアノホウ素ナトリウム並びにＨＣｌと反応させることを含む工程により、２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（10）を得る。
【００１７】
次にトリクロロメタンスルホン酸銀、１，１，３，３−テトラメチル尿素及びベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド（10）のジクロロメタン懸濁液に臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−セロビオシル（２）のジクロロメタン溶液を滴下反応させることを含む工程により、ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド（11）を得る。
【００１８】
次に、ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド（11）をパラジウム−カーボン触媒下、水添反応させることを含む工程により、４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕グルコピラノース（12）を得る。
【００１９】
次に、４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−Ｄ−グルコピラノース（12）をピリジン中、無水酢酸と反応させることを含む工程により、セロトリオースウンデカアセテート（13）を得る。次にセロトリオースウンデカアセテート（13）のクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることを含む工程により、臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（14）を得る。
【００２０】
次に、臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β、Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（14）をアセトニトリル中で、フッ化銀と反応させることを含む工程により、フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（15）を得る。
【００２１】
次に、フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（15）をメタノール中、ナトリウムメトキシドと反応させることを含む工程により、β−Ｄ−セロトリオシル（16）を得る。
【００２２】
フッ化β−Ｄ−セロテトラオシル（13）の製造法
セロテトラオースモノマーすなわち、フッ化β−Ｄ−セロテトラオシル（13）は、以下の反応式（II）で示される経路により合成される。
【化７】
0003884494.tif 000006
【化８】
0003884494.tif 000007
【００２３】
以下に、この反応式（II）に従って、概略を説明する。なお、以下の説明において、物質名の後にかっこ書きで示した数字は、反応式（II）中において、示した化学式の番号である。
【００２４】
セロビオースオクタアセテート（１）のクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることを含む工程により、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル（２）を得る。
【００２５】
次に、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル（２）をベンジルアルコール中、炭酸銀並びに、無水硫酸カルシウムと反応させることを含む工程により、ベンジル２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−セロビオシド（３）を得る。
【００２６】
次に、ベンジル２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−セロビオシド（３）をメタノール中、ナトリウムメトキシドと反応させることを含む工程によりベンジルβ−Ｄ−セロビオシド（４）を得る。次にベンジルβ−Ｄ−セロビオシド（４）をベンズアルデヒドジメチルアセタールと反応させることを含む工程により、ベンジル４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド（５）を得る。
【００２７】
次に、ベンジル４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド（５）に水素化ナトリウム、引き続いて臭化ベンジルを滴下反応させることを含む工程によりベンジル２，３，６，２′，３′−ペンタ−Ｏ−アセチル−４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド（６）を得る。
【００２８】
次に、ベンジル２，３，６，２′，３′−ペンタ−Ｏ−アセチル−４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド（６）を水素化シアノホウ素ナトリウム並びにＨＣｌと反応させること含む工程により、ベンジル２，３，６，２′，３′，６′−ヘキサ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−セロビオシド（７）を得る。
【００２９】
次にトリクロロメタンスルホン酸、１，１，３，３−テトラメチル尿素、及びベンジル２，３，６，２′，３′，６′−ヘキサ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−セロビオシド（７）のジクロロメタン懸濁液に臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−セロビオシル（２）のジクロロメタン溶液を滴下反応させることを含む工程により、ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド（８）を得る。
【００３０】
次に、ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド（８）をパラジウム−カーボン触媒下、水添反応させることを含む工程により、４−Ｏ−〔４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノース（９）を得る。
【００３１】
次に、４−Ｏ−〔４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノース（９）をピリジン中、無水酢酸と反応させることを含む工程により、セロテトラオーステトラデカアセテート（10）を得る。
【００３２】
次に、セロテトラオーステトラデカアセテート（10）のクロロホルム溶液にＨＢｒ酢酸溶液を滴下反応させることを含む工程により臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（11）を得る。
【００３３】
次に、臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（11）をアセトニトリル中で、フッ化銀と反応させることを含むことにより、フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（12）を得る。
【００３４】
次に、フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル（12）をメタノール中に、ナトリウムメトキシドと反応させることを含む工程により、β−Ｄ−セロテトラオシル（13）を得る。
【００３５】
セロオリゴ糖の製造法
上記したフッ化β−Ｄ−セロトリオシル、又はフッ化β−Ｄ−セロテトラオシルを、セルラーゼの存在下で重合し、下記構造式のセロオリゴ糖が生成する。
【化９】
0003884494.tif 000008
【００３６】
なお、セロオリゴ糖の具体的製造法は次の通りである。
すなわち、フッ化β−Ｄ−セロトリオシルまたはフッ化β−Ｄ−セロテトラオシルをアセトニトリルと緩衝液（例えば酢酸緩衝溶液）の混合液に溶かしたものに、セルラーゼを緩衝液（例えば酢酸緩衝液）に溶かしたものを加え攪拌下で反応させる。反応終了後、反応液に過剰量のアセトニトリルを加え、加熱することにより、セルラーゼを失活させ、次いで、溶媒を除去したものを精製・分離することによりセロオリゴ糖が得られる。
【００３７】
【実施例】
実施例１
フッ化β−Ｄ−セロトリオシル（16）の製造方法（上記反応式Ｉを参照して説明する）
臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル〔反応式Ｉの（２）〕
セロビオースオクタアセテート〔反応式Ｉの（１）〕（２５．０ｇ，３６．８４ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１２５ｍｌ）に、３０％臭化水素酢酸溶液（３７．５ｍｌ）をクロロホルム（２５ｍｌ）で希釈した混合溶液を０℃で滴下し、５時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈し、液性が中性になるまで冷食塩水で分液した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、エバポレートして、白色粉末状の臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル〔反応式Ｉの（２）〕（２５．６１ｇ，３６．６１ｍｍｏｌ，９９．３７％）を得た。
【００３８】
グルコースペンタアセテート〔反応式Ｉの（４）〕
グルコース〔反応式Ｉの（３）〕（２０．０ｇ，１１１．０ｍｍｏｌ）、無水酢酸（９２ｍｌ）、ピリジン（１３３ｍｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、氷水６００ｍｌ中に攪拌しながら加え再沈澱させる。これをろ過してグルコースペンタアセテート〔反応式Ｉの（４）〕（４０．７５ｇ，１０４．４ｍｍｏｌ，９４．０５％）を得た。
【００３９】
臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（５）〕
グルコースペンタアセテート〔反応式Ｉの（４）〕（２０．０ｇ，５０．２４ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１６０ｍｌ）に、３０％臭化水素酢酸溶液（６０ｍｌ）をクロロホルム（４０ｍｌ）で希釈した混合溶液を０℃で滴下し、６時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈し、液性が中性になるまで冷食塩水で分液した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、エバポレートして、白色粉末状の臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（５）〕（２０．３４ｇ，４９．４６ｍｍｏｌ、９６．５３％）を得た。
【００４０】
ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（６）〕
暗所、アルゴン雰囲気下、臭化２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（５）〕（３０．５３ｇ，７４．２４ｍｍｏｌ）、酸化銀（３５．０ｇ，１５１．０３ｍｍｏｌ）、及び粉末状の無水硫酸カルシウム（１４０ｇ，１５０℃、３０分乾燥）をベンジルアルコール（１６０ｍｌ）に懸濁させ、１００℃で還流させながら３時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、セライトろ過により銀触媒と硫酸カルシウムを除去した。減圧下、溶媒を除去した後、エーテル／水中で再結晶させ、得られた白色結晶をヘキサンで洗浄しながらろ別することにより、ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（６）〕（１８．９４ｇ，４３．２０ｍｍｏｌ，５８．１９％）を得た。
【００４１】
ベンジルβ−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（７）〕
ベンジル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（６）〕（１８．８０ｇ，４２．８８ｍｍｏｌ）を１０分間脱気後、アルゴン置換を行い、無水メタノール（２００ｍｌ）に溶解させた。これにナトリウムメキシドのメタノール溶液（０．３３４Ｍ，６．２ｍｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、適当量のイオン交換樹脂Amberlite IR-120(H+ ) を加え攪拌した。反応溶液が中性であることを確認した後、メタノールで洗浄しながらろ過し、イオン交換樹脂を除いた。ろ液は減圧下溶媒を除去し、白色粉末状のベンジルβ−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（７）〕（１２．０９ｇ，４４．７３ｍｍｏｌ）とした。
【００４２】
ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（８）〕
ベンジルβ−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（７）〕（１１．９９ｇ，４４．３６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（１００ｍｌ）に、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（１０．１ｇ，６６．３６ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸−水和物（０．５０６ｇ，２．６６０ｍｍｏｌ）を加え室温で１１時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、トリエチルアミン（２ｍｌ）を加え中和した。減圧下、溶媒を除去し、残渣をヘキサン／水で洗浄することにより、白色結晶ベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（８）〕（１３．８０ｇ，３８．５１ｍｍｏｌ，８６．８１％）を得た。
【００４３】
ベンジル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（９）〕
アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム（６０％，４．６０ｇ，１１５．０ｍｍｏｌ）を石油エーテルで数回洗浄し、ミネラルオイルを除いた後ＤＭＦ（２０ｍｌ）を加える。ここにベンジル４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（８）〕（１３．７２ｇ，３８２８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（８０ｍｌ）を滴下し、室温で１時間攪拌した。その後臭化ベンジル（１３．６７ｍｌ，１１４．８ｍｍｏｌ）を０℃で滴下し、室温で１時間30分攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、メタノールを加え未反応の水素化ナトリウムを処理し、エバポレートした。これをクロロホルムで希釈し、冷食塩水で分液した後、有機層を集め無水硫酸ナトリウムで乾燥した。さらに減圧下、溶媒を除去して得られる残渣をエタノール中で再結晶させ、白色結晶ベンジル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（９）〕（１７．３５ｇ，３２．２１ｍｍｏｌ，８４．１４％）を得た。
【００４４】
ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（10）〕
ベンジル２，３−ジ−Ｏ−ベンジル−４，６−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（９）〕（１７．２１ｇ，３１．９５ｍｍｏｌ）、水素化シアノホウ素ナトリウム（２５．０ｇ，３９７．８ｍｍｏｌ）、及び粉末状のモレキュラーシーブ３Ａ（４０．０ｇ）をＴＨＰ（１５０ｍｌ）中に懸濁させ、室温下、塩化水素飽和エーテル（１００ｍｌ）を滴下し、Ｈ2 が発生しなくなるまで攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、水を加えて未反応の水素化シアノホウ素ナトリウムを処理した。エーテルで洗浄しながらセライトろ過し、モレキュラシーブを除去した。ろ液を飽和食塩水で分液し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を除去した。ろ液を飽和食塩水で分液し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を除去した後、フラッシュカラムクロマトグラフ（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝１／４）により精製し、白色結晶ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（10）〕（１１．１５ｇ，２０．６２ｍｍｏｌ，６４．５４％）
【００４５】
ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド（11）〕
暗所、アルゴン雰囲気下、−７８℃において、トリフルオロメタンスルホン酸銀（１．７９９ｇ，７．００２ｍｍｏｌ，１時間乾燥）、１，１，３，３−テトラメチル尿素（０．９ｍｌ，７．５１５ｍｍｏｌ）及びベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（10）〕（１．８３９ｇ，３．４０１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍｌ）懸濁液に、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−セロビオシル（２）（２．５４７ｇ，３．６１４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（８ｍｌ）を滴下しながら攪拌した。滴下終了後、室温して１１時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認後、セライトろ過により銀触媒を除去した。ろ液を冷食塩水で分液し、集めた有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液をエバポレートし、フラッシュカラムクロマトグラフ（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝７／９）により精製し、白色粉末状のベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（11）〕（１．４５８ｇ，１．２５８ｍｍｏｌ．３６．９９％）を得た。
【００４６】
４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕グルコピラノース〔反応式Ｉの（12）〕
パラジウム−カーボン（１０％）（０．７６８ｇ）とメタノール（２ｍｌ）の混合物を約３０秒間脱気した後水素置換を行った。この操作を１０回前後繰り返した後、水素雰囲気下、常圧でベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式Ｉの（11）〕（２．０００ｇ，１．７２５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１２ｍｌ）／メタノール（１０ｍｌ）混合溶液を注入し、４時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認後、セライトろ過により、パラジウム触媒を除去し、減圧下、溶媒を除去して白色粉末状の４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−Ｄ−グルコピラノース〔反応式Ｉの（12）〕（１．２８８ｇ，１．６１３ｍｍｏｌ）を得た。
【００４７】
セロトリオースウンデカアセテート〔反応式Ｉの（13）〕
４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−Ｄ−グルコピラノース〔反応式Ｉの（12）〕（１．２８８ｇ，１．６１３ｍｍｏｌ）を無水酢酸（４．５ｍｌ）、ピリジン（９ｍｌ）に溶解させ微量の４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で１４時間３０分攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認後、トルエンを加え共沸により溶媒を除去し薄黄色粉末状のセロトリオースウンデカアセテート〔反応式Ｉの（13）〕（１．５１２ｇ，１．５６４ｍｍｏｌ，９６．９６％）を得た。
【００４８】
臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（14）〕
セロトリオースウンデカアセテート〔反応式Ｉの（13）〕（１．５０９ｇ，１．５６１ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（３２ｍｌ）に３０％臭化水素酢酸溶液（２．８ｍｌ）をクロロホルム（３ｍｌ）で希釈した混合溶液を０℃で滴下し、５時間３０分反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈し、液性が中性になるまで冷食塩水で分液した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、エバポレートして、白色粉末状の臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（14）〕（１．６６１ｇ，１．６８１ｍｍｏｌ）を得た。
【００４９】
フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（15）〕
暗所、アルゴン雰囲気下、微粉砕したフッ化銀（１．９０７ｇ，１５．０３ｍｍｏｌ，１４０℃，１時間脱気乾燥）に臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（14）〕（１．６６１ｇ，１．６８１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２５ｍｌ）を加え、室温で１４時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了後、セライトろ過により、銀触媒を除去し、さらに減圧下、溶媒を除去して黒褐色の結晶を得た。これをフラッシュカラムクロマトグラフ（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝８／７）により精製し、白色粉末状のフッ２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（15）〕（０．８２４ｇ，０．８８９ｍｍｏｌ，５２．８９％）を得た。
【００５０】
フッ化β−Ｄ−セロトリオシル〔反応式Ｉの（１６）〕
フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式Ｉの（15））（０．８２４ｇ，０．８８９ｍｍｏｌ）を１時間３０分間脱気後、アルゴン置換を行い、メタノール（２６ｍｌ）に溶解させた。これにナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．４３７Ｍ，０．６１ｍｌ）を加え、０℃で４時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認後、適当量のイオン交換樹脂Amberlite IR-120(H+ ) を加え攪拌した。反応溶液が中性であることを確認した後、イオン交換樹脂をろ別した。減圧下溶媒を除去し、薄黄色粉末状のフッ化β−Ｄ−セロトリオシル〔反応式Ｉの（16）〕（０．４５０ｇ，０．８８９ｍｍｏｌ，１００％）を得た。
【００５１】
得られたフッ化β−Ｄ−セロトリオシル（16）の 1ＨＮＭＲ，13ＣＮＭＲは次の通りである（各々図１，図２に示す）。
1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）：δ５．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−１，Ｊ1,F ＝５２．５，Ｊ1,F ＝７．１２），４．３２（２Ｈ，ｔ，Ｈ−１′，Ｈ−１″），３．８−３．０（１８Ｈ，ｍ，suger −Ｈ）
13ＣＮＭＲ（６２．５ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）：δ１０９．７３（ｄ，Ｃ−１，Ｊ1,Ｆ  ＝２１０．８），１０３．４０（Ｃ−１″），１０３．１５（Ｃ−１′），７９．２３（Ｃ−４），７８．４１（Ｃ−４′），７６．８１（Ｃ−５″），７６．３２（Ｃ−３″），７５．６５（Ｃ−５，Ｃ−５′），７４．１４（Ｃ−３，Ｃ３″），７３．７５（Ｃ−２′），７３．４２（Ｃ−２″），７０．２８（Ｃ−４″），６１．４０（Ｃ−６″），６０．５７（ｄ，Ｃ−６，Ｃ−６′）
【００５２】
実施例２
フッ化β−Ｄ−セロテトラオシル（16）の製造方法（上記反応式ＩＩを参照して説明する）
臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル〔反応式IIの（２）〕
セロビオースオクタアセテート〔反応式IIの（１）〕（２５．０ｇ，３６．８４ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１２５ｍｌ）に、３０％臭化水素酢酸溶液（３７．５ｍｌ）をクロロホルム（２５ｍｌ）で希釈した混合溶液を０℃で滴下し、５時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈し、液性が中性になるまで冷食塩水で分液した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、エバポレートして、白色粉末状の臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル〔反応式IIの（２）〕（２５．６１ｇ，３６．６１ｍｍｏｌ，９９．３７％）を得た。
【００５３】
ベンジル２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（３）〕
暗所、アルゴン雰囲気下、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシル〔反応式IIの（２〕（２５．６１ｇ，３６．６１ｍｍｏｌ）、炭酸銀（３１．５０ｇ，１１４．２ｍｍｏｌ）、及び粉末状の無水硫酸カルシウム（１１１．８ｇ，１５０℃，３０分乾燥）をベンジルアルコール（１３３ｍｌ）に懸濁させ、還流させながら２時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、セライトろ過により銀触媒と硫酸カルシウムを除去した。減圧下、溶媒を除去した後、エタノールより再結晶させ、得られた白色結晶をろ別することのより、ベンジル２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（３〕（１６．５６ｇ，２２．７９ｍｍｏｌ，６２．２５％）を得た。
【００５４】
ベンジルβ−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（４）〕
ベンジル２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（３）〕（１６．５６ｇ，２２．７９ｍｍｏｌ）を１０分間脱気後、アルゴン置換を行い、無水メタノール（１９６ｍｌ）に溶解させた。これにナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．６６０Ｍ，３．０ｍｌ）を加え、室温で４時間３０分攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、適当量のイオン交換樹脂Amberlite IR-120(H+ ) を加え攪拌した。反応溶液が中性であることを確認後、メタノールで洗浄しながらろ過し、イオン交換樹脂を除いた。ろ液は減圧下溶媒を除去し、白色粉末状のベンジルβ−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（４）〕（８．２９ｇ，１９．１７ｍｍｏｌ，８４．１２％）とした。
【００５５】
ベンジル４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（５）〕
ベンジルβ−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（４）〕（８．２９ｇ，１９．１７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１００ｍｌ）に、ベンズアルデヒドジメチルアセタール（５．８８ｇ，３８．６３ｍｍｏｌ）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（０．２７０ｇ，１．４１９ｍｍｏｌ）を加え還流させながら２時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、トリエチルアミン（２ｍｌ）を加え中和した。減圧下、溶媒を除去し残渣をメタノール／ヘキサン混合溶媒中で再結晶させ、白色結晶ベンジル４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（５）〕（４．０５ｇ，７．７８１ｍｍｏｌ，４０．５９％）を得た。
【００５６】
ベンジル２，３，６，２′，３′−ペンタ−Ｏ−アセチル−４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（６）〕
アルゴン雰囲気下、水素化ナトリウム（６０％，２．５０ｇ，６１．２２ｍｍｏｌ）を石油エーテルで４回洗浄し、ミネラルオイルを除いた後、ベンジル４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（５）〕（４．０５ｇ，７．７８１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（７６ｍｌ）を滴下し、室温で１時間１０分攪拌した。その後臭化ベンジル（７．４ｍｌ，６２．１３ｍｍｏ）を０℃で滴下し、室温で１時間３０分攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、メタノールを加え未反応の水素化ナトリウムを処理し、エバポレートした。これをクロロホルムで希釈し、冷食塩水で分液した後、有機層を集め無水硫酸ナトリウムで乾燥した。さらに減圧下、溶媒を除去して得られる残渣をアセトン中で再結晶させ、白色結晶ベンジル２，３，６，２′，３′−ペンタ−Ｏ−アセチル−４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（６）〕（６．１２ｇ，６．３０１ｍｍｏｌ，８０．９８％）を得た。
【００５７】
ベンジル２，３，６，２′，３′，６′−ヘキサ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（７）〕
ベンジル２，３，６，２′，３′−ペンタ−Ｏ−アセチル−４′，６′−Ｏ−ベンジリデン−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（６）〕（６．１２ｇ，６．３０１ｍｍｏｌ）、水素化シアノホウ素ナトリウム（３．８０ｇ，６０．４７ｍｍｏｌ）、及び粉末状のモレキュラーシーブ３Ａ（１８．８０ｇ）をＴＨＦ（８４．８ｍｌ）中に懸濁させ、室温下、塩化水素飽和エーテル（８０ｍｌ）を滴下し、２時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、水を加えて未反応の水素化シアノホウ素ナトリウムを処理した。デカントにより有機層を集めた後、セライトろ過し、モレキュラシーブを除いた。これをエーテルで希釈し、飽和食塩水で分液し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を除去した後、フラッシュカラムクロマトグラフ（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝１／５）により精製し、白色結晶、ベンジル２，３，６，２′，３′，６′−ヘキサ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（７）〕（１．０５９ｇ，１．０８８ｍｍｏｌ，１７．２７％）を得た。
【００５８】
ベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式IIの（８）〕
暗所、アルゴン雰囲気下、−７８℃において、トリフルオロメタンスルホン酸銀（０．９９７ｇ，３．８８０ｍｍｏｌ，１時間乾燥）、１，１，３，３−テトラメチル尿素（０．５ｍｌ，４．１７５ｍｍｏｌ）及びベンジル２，３，６，２′，３′，６′−ヘキサ−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−セロビオシド〔反応式IIの（７）〕（１．０５４ｇ，１．０８３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１１ｍｌ）懸濁液に、臭化２，３，６，２′，３′，４′，６′−ヘプタ−Ｏ−アセチル−α−セロビオシル（２）（２．５５０ｇ，３．５７４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（８ｍｌ）を滴下しながら攪拌した。滴下終了後、室温にて、１５時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認後、セライトろ過により銀触媒を除去した。ろ過を冷食塩水で分液し、集めた有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥させた。溶液をエバポレートし、フラッシュカラムクロマトグラフ（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝７／９）により精製し、白色粉末状のベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式IIの（８）〕（１．１０９ｇ，０．６９６７ｍｍｏｌ，６４．３６％）を得た。
【００５９】
４−Ｏ−〔４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノース〔反応式IIの（９）〕
パラジウム−カーボン（１０％）（０．５６５ｇ）とメタノール（２ｍｌ）の混合物を約３０秒間脱気した後水素置換を行った。この操作を１０回前後繰り返した後、水素雰囲気下、常圧でベンジル２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−ベンジル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシド〔反応式IIの（８）〕（１．０９３ｇ，０．６８６７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）／メタノール（８ｍｌ）混合溶液を注入し、３時間半攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認後、セライトろ過により、パラジウム触媒を除去し、減圧下、溶媒を除去して白色粉末状の４−Ｏ−〔４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノース〔反応式IIの（９）〕（０．６９１ｇ，０．７１９ｍｍｏｌ）を得た。
【００６０】
セロテトラオーステトラデカアセテート〔反応式IIの（10）〕
４−Ｏ−〔４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノース〔反応式IIの（９）〕（０．６７４ｇ，０．７０１ｍｍｏｌ）を無水酢酸（２．２ｍｌ）、ピリジン（４．５ｍｌ）に溶解させ微量の４−ジメチルアミノピリジンを加え室温で１６時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認後、トルエンを加え共沸により溶媒を除去し、セロテトラオーステトラデカアセテート〔反応式IIの（10）〕（０．９１０ｇ，０．７２５ｍｍｏｌ）を得た。
【００６１】
臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式IIの（11）〕
セロテトラオーステトラデカアセテート〔反応式IIの(10)〕（０．８８１ｇ，０．７０２ｍｍｏｌ）のクロロホルム溶液（１８ｍｌ）に３０％臭化水素酢酸溶液（１．５ｍｌ）をクロロホルム（１．５ｍｌ）で希釈した混合溶液を０℃で滴下し、７時間反応させた。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、クロロホルムで希釈し、液性が中性になるまで冷食塩水で分液した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムにより乾燥した後、エバポレートして、白色粉末状の臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式IIの（11）〕（０．８８６ｇ，０．６９４ｍｍｏｌ，９８．８６％）を得た。
【００６２】
フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式IIの（12）〕
暗所、アルゴン雰囲気下、微粉砕したフッ化銀（１．９１０ｇ，１５．０５ｍｍｏｌ，１４０℃，１時間脱気乾燥）に臭化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式IIの（11）〕（０．８２５ｇ，０．６４７ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２５ｍｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。ＴＬＣにより反応終了を確認した後、セライトろ過により、銀触媒を除去し、さらに減圧下、溶媒を除去して褐色のシロップを得た。これをフラッシュカラムクロマトグラフ（展開溶媒；酢酸エチル／ヘキサン＝３／２）により精製し白色粉末状のフッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式IIの（12）〕（０．４４０ｇ，０．３６２ｍｍｏｌ，５６．０％）を得た。
【００６３】
フッ化β−Ｄ−セロテトラオシル〔反応式IIの(13)〕
フッ化２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−〔２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−｛２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシル｝−β−Ｄ−グルコピラノシル〕−β−Ｄ−グルコピラノシル〔反応式IIの（12）〕（０．２７８ｇ，０．２２９ｍｍｏｌ）を１０分間脱気後、アルゴン置換を行い、メタノール（６ｍｌ）に溶解させた。これにナトリウムメトキシドのメタノール溶液（０．１２１Ｍ，０．５４ｍｌ）を加え、０℃で４時間攪拌した。反応進行と共に生成物が析出し反応系は不均一となる。ＴＬＣにより反応終了を確認後、適当量のイオン交換樹脂Amberlite IR-120(H+ ) を加え攪拌した。反応溶液が中性であることを確認した後、イオン交換樹脂をろ別した。メタノール不溶部は水に溶解させた。減圧下メタノールを除去し、更に凍結乾燥させることにより、白色粉末状のフッ化β−Ｄ−セロテトラオシル〔反応式IIの（13）〕（０．１５３ｇ，０．２２９ｍｍｏｌ，１００％）を得た。
【００６４】
フッ化β−Ｄ−セロテトラオシルの 1ＨＮＭＲ，13ＣＮＭＲは次の通りである（各々を図３，図４に示す）。
1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）：δ５．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｈ−１，Ｊ1,F ＝５３．２，Ｊ1,F ＝６．９５），４．３３（３Ｈ，ｔ，Ｈ−１′，Ｈ−１″，Ｈ−１′′′），３．８２−３．１５（２４Ｈ，ｍ，suger −Ｈ）
13ＣＮＭＲ（６２．５ＭＨｚ，Ｄ2 Ｏ）：δ１０９．７３（ｄｄ，Ｃ−１，Ｊ1,F ＝２１１．９），１０３．４０（Ｃ−１′′′），１０３．１８（Ｃ−１′，Ｃ−１″），７９．２５（Ｃ−４），７９．１３（Ｃ−４′，Ｃ−４″），７６．８２（Ｃ−５′′′），７６．３３（Ｃ−３′′′），７５．６６（Ｃ−５，Ｃ−５′，Ｃ−５″），７４．８７（Ｃ−２，Ｃ−３′，Ｃ−３″），７３．９８（Ｃ−２′′′），７３．７６（Ｃ−２″，Ｃ−２′）７０．３０（Ｃ−４），６１．４２（Ｃ−６′′′），６０．７３（Ｃ−６，Ｃ−６′，Ｃ−６″）
【００６５】
実施例３
実施例１で得られたフッ化β−Ｄ−セロトリオシル５ｍｇをアセトニトリル０．２６ｍｌと酢酸緩衝液（０．０１Ｍ，ｐＨ５）０．０７４ｍｌとの混合液に溶解させた。別容器にTrichoderma viride由来のセルラーゼ０．０１ｍｇをクエン酸緩衝溶液（０．０５Ｍ，ｐＨ３．５）０．０５８ｍｌに加えたものを調製し、これをβ−Ｄ−セロトリオシル溶液に加え温度３０℃で１時間、マグネチックスターラーにより攪拌した。反応終了後、反応液に過剰量のアセトニトリルを加え、１００℃油浴中に１０分間浸すことによりセルラーゼを失活させ、エバポレーターにより溶媒を除去し、粗反応生成物を得た。次にこの粗反応生成物を高性能液体クロマトグラフィーにより分解しセロオリゴ糖２ｍｇを得た。得られたオリゴ糖のアセチル化物の 1ＨＮＭＲは次の通りであった。
【００６６】
セロオリゴ糖アセチル化物の 1ＨＮＭＲスペクトル
重合によって生成したセロオリゴ糖をアセチル化し、ＣＤＣｌ3 中で測定した（図５に示す）。
各ピークは以下のように解析される。
６．３ｐｐｍ（還元末端グルコースユニットのＨ１プロトン、α体）
５．７ｐｐｍ（還元末端グルコースユニットのＨ１プロトン、β体）
３．０〜５．５ｐｐｍ（上記以外のグルコース環プロトン）
１．８〜２．５ｐｐｍ（アセチルのメチルプロトン）
【００６７】
実施例４
実施例２で得られたβ−Ｄ−セロテトラオシル５ｍｇをアセトニトリル０．２０ｍｌと酢酸緩衝液（０．０１Ｍ，ｐＨ５）０．０４ｍｌとの混合液に溶解させた。別容器にTrichoderma viride由来のセルラーゼ０．０１ｍｇをクエン酸緩衝溶液（０．０５Ｍ，ｐＨ３．５）０．０５８ｍｌに加えたものを調製し、これをβ−Ｄ−セロテトラオシル溶液に加え、温度３０℃で１時間、マグネチックスターラーにより攪拌した。反応終了後、反応液に過剰量のアセトニトリルを加え、１００℃油浴中に１０分間浸すことによりセルラーゼを失活させ、エバポレーターにより溶媒を除去し、粗反応生成物を得た。次にこの粗反応生成物を高性能液体クロマトグラフィーにより分解し、実施例３で得られたものと同様のオリゴ糖２ｍｌを得た。
【００６８】
【発明の効果】
上記したところから明かなように、本発明によれば、高重合度のセロオリゴ糖の製造方法、及び該セロオリゴ糖の原料モノマーとして優れている新規なセロトリオース並びにセロテトラオースモノマーが提供される。本発明を実施することによって得られるセロオリゴ糖は、食品添加物、医薬品、臨床試験用酵素基質などの分野で利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明によって得られたフッ化―β−Ｄ−セロトリオシルの 1Ｈ  ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明によって得られたフッ化―β−Ｄ−セロトリオシルの13Ｃ  ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明によって得られたフッ化―β−Ｄ−セロテトラオシルの 1Ｈ
ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明によって得られたフッ化―β−Ｄ−セロテトラオシルの13Ｃ
ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明によって得られたセロオリゴ糖アセチル化物の 1Ｈ  ＮＭＲの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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