(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンとラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドとの相互作用に適する条件下で、ラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドと非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンとを合わせる工程；
ｂ）ラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドに対する非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのアフィニティーを決定する工程；および
ｃ）工程（ｂ）で決定したアフィニティーを、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン競合剤またはラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドの競合剤の存在下でのアフィニティーと比較する工程、
それによりラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドに対する非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのアフィニティーを評価する、
を含む、ラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドに対する非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのアフィニティーの評価アッセイ。
【請求項２】
下記工程：
ａ）非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドへの結合に適する条件下で、放射性標識された非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン、ラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドおよび試験対象の作用剤を合わせる工程；
ｂ）非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドへの結合の程度を決定する工程；ならびに
ｃ）非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドへの結合に適する条件下で、工程（ｂ）で決定した結合の程度を、試験対象の作用剤の非存在下での結合の程度と比較する工程、
ここで、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドへの結合の程度の減少は、当該作用剤がラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドに対するアフィニティーを有することを示す、
を含む、ラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドに対するアフィニティーを有する作用剤の同定アッセイ。
【請求項３】
下記工程：
ａ）非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドへの結合に適する条件下で、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン、ラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドおよび試験対象の作用剤を合わせる工程；
ｂ）シグナル伝達経路の活性化の程度を決定する工程；ならびに
ｃ）非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのラクトシルセラミド及び／又はガラクトシルセラミドへの結合に適する条件下で、工程（ｂ）で決定した活性化の程度を、試験対象の作用剤の非存在下での活性化の程度と比較する工程、
ここで、シグナル伝達経路の活性化の程度の差は、当該作用剤がシグナル伝達経路の活性化における非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの効果を変化させることを示す、
を含む、シグナル伝達経路の活性化における非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの効果を変化させる作用剤の同定アッセイ。
【請求項４】
活性化の程度が作用剤の非存在下よりも存在下の方が大きい場合、作用剤は、シグナル伝達経路の活性化における非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの効果を高めるものである、または、活性化の程度が作用剤の非存在下よりも存在下の方が小さい場合、作用剤は、シグナル伝達経路の活性化における非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの効果を減少させるものである、請求項３記載のアッセイ。
【請求項５】
シグナル伝達経路の活性化が少なくとも１つの転写調節因子の調節により測定される、請求項３または４記載のアッセイ。
【請求項６】
転写調節因子がＮＦ−κＢ、ＮＦ−ＩＬ６またはｊｕｎ／ｆｏｓファミリーのメンバーからなる群より選ばれるものである、請求項５記載のアッセイ。
【請求項７】
工程（ｂ）が転写調節因子に特異的な32Ｐ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドにより行なわれる、請求項３〜６いずれか記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
関連出願
本願は、１９９６年５月１日出願の米国特許出願第０８/６３７，９３４号の一部継続出願である１９９６年６月１４日出願の米国特許出願第０８/６６４，１７３号の一部継続出願である１９９７年１月３１日出願の米国特許出願第０８/７９７，６９６号の一部継続出願である。これら先願の開示内容はすべて本願に含まれるものとする。
発明の背景
非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン（ＰＧＧ−グルカンまたはベータフェクチン（BetafectinR）ともいう）は、特許製法によって製造される新規な独特の可溶性β−グルカンである。この分子の生理活性は、粒子状またはその他の可溶性β-グルカンと明確に区別される。粒子型および可溶型という両方の型のβ-グルカンにより、アラキドン酸代謝物〔クゾップら（Czop et al.）J. Immunol. 141（9）:3170-3176（1988）〕、サイトカイン〔アベルとクゾップ（Abel and Czop）Intl. J. Immunopharmacol. 14（8）:1363-1373（1992）；ドイタら（Doita et al.）J. Leuk. Biol. 14（2）:173-183（1991）〕、および酸化バースト〔カインら（Cain et al.）Complement 4:75-86（1987）；ガリンら（Gallin et al.）Int. J. Immunopharmacol. 14（2）:173-183（1992）〕が直接的に誘導されることが、多くの試験施設から報告されている。一方、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンは、酸化バースト活性〔マッキンら（Mackin et al.）FASEB J. 8:A216（1994）〕やサイトカイン分泌〔プットシアカら（Putsiaka et al.）Blood 82:3695-3700（1993）〕や増殖〔ワクシュルら（Waksull et al.）J. Cell. Biochem. suppl. 18A:22（1994）〕などの白血球機能を直接的に活性化することはない。その代わり、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンは、細胞に対して、二次的刺激による活性化を受けやすくする〔マッキンら（Mackin et al.）（1994）；ブルンケ−リーセとマッキン（Brunke-Reese and Mackin）FASEB J. 8:A488（1994）；およびワクシュルら（Wakshull et al.）（1994）〕。
β-グルカンの生理活性は、ターゲット細胞上に存在する特異的レセプターを通して媒介される。いくつかの研究グループが、粒子状β-グルカン調製品に結合するレセプターを記載している。たとえば、粒子状β-グルカン（たとえばチモサン様粒子）のレセプターが、クゾップらの研究グループによって記載されている〔クゾップとケイ（Czop and Kay）J. Exp. Med. 173:1511-1520（1991）；スザボら（Szabo et al.）J. Biol. Chem. 270:2145-2151（1995）；およびゴールドマン（Goldman）Immunology 63（2）:319-324（1988）；Exp. Cell. Res. 174（2）:481-490（1988）〕。白血球補体レセプター３（ＣＲ３、ＭＡＣ１またはＣＤ１１ｂ/ＣＤ１８ともいう）は、粒子状β-グルカンと一部の可溶性β-グルカンの両者、ならびにその他の多糖類に結合する能力を有することが示されている〔ソーントンら（Thornton et al.）J.Immunol. 156:1235-1246（1996）〕。可溶性アミノ化β-グルカン調製品がネズミ腹腔マクロファージに結合することが示されており〔コノプスキーら（Konopski et al.）Biochim. Biophys. Acta 1221:61-65（1994）〕、リン酸化β-グルカン誘導体が単球細胞株に結合することが示されている〔ムラーら（Muller et al.）J. Immunol. 156:3418-3425（1996）〕。サケマクロファージ〔エングスタッドとロバートセン（Engstad and Robertsen）Dev. Comp. Immunol. 18（5）:397-408（1994）〕および脳小グリア細胞〔ムラーら（Muller et al.）Res. Immunol. 145:267-275（1994）〕は、おそらくはレセプター媒介プロセスを介して、β-グルカン粒子に対して食作用を示しうることも記載されている。
残念ながら、各研究グループは、原料、調製法、純度、およびキャラクタライーゼーションが大幅に異なるβ-グルカン調製品を使用している。また、初代細胞と樹立細胞株の両者を含む異なる細胞型および細胞種、ならびに異なる機能情報が用いられている。したがって、クゾップが記載しているレセプターはＣＲ３ではないことが明らかであるものの〔スザボら（Szabo et al.）（1995）〕、これらの研究者らが記載している様々なレセプター間の関係は確定していない。
発明の概要
本発明は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンが、ヒト白血球膜（ＨＬＭ）上に存在する新規レセプターに特異的に結合するという発見に関する。本明細書で説明するように、放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンを用いて、ヒト白血球ならびに様々なネズミおよびヒト細胞株に由来する膜レセプターへの該β-グルカンの結合を測定した。非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのレセプターは、特異的かつ飽和可能な膜結合性を示し、可溶性β-グルカンの１つのサブクラスに対して高度に選択的である。本明細書で説明する研究結果から、この非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターがキャラクタライズされ、該レセプターが、従来記載の粒子状または可溶性β-グルカンのレセプターと明確に区別され、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの生理活性の機構に関する重要な情報が提供される。
本発明はまた、たとえばレセプター陽性細胞、すなわち非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのレセプターを含む細胞内の１つ以上の転写調節因子をモジュレートすることによって、シグナル伝達経路を変化（たとえば活性化または不活化）させる方法に関する。本発明の１つの態様においては、ＮＦ-κＢおよび/またはＮＦ-ＩＬ６および/またはｊｕｎ/ｆｏｓファミリーの転写調節因子に由来する１つ以上の転写調節因子によって、シグナル伝達経路をモジュレートまたは調節する。たとえば、ＮＦ−κＢ、ＮＦ-ＩＬ６、またはＡＰ-１が転写調節因子であってよい。
本発明の方法によって変化させることができる上記以外のシグナル伝達経路としては、ｒａｓ/ｒａｆ-１/ＭＡＰキナーゼ経路、Ｇタンパク質/ホスホリパーゼＣ/プロテインキナーゼＣ経路、ＪＡＫ/ＳＴＡＴ経路、ホスホリパーゼＡ経路、Ｇタンパク質/ホスホリパーゼＤ/ホスファチジン酸経路、およびｃ-ＡＭＰ依存性経路などが挙げられる。各経路において、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンをレセプターに結合させることによって、当該シグナル経路に適した活性化物質または指標物質を活性化させるが、この結合をモジュレートすることで、対応するシグナル伝達を変化させることができる。
本発明の方法によれば、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの結合を通じて、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのレセプターの活性を活性化させることで、１つ以上の転写調節因子（たとえばＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ６、またはｊｕｎ/ｆｏｓファミリー由来のもの）が活性化されるように、シグナル伝達プロセスが活性化される。これらの転写調節因子の活性化を利用して、関連するシグナル伝達経路の活性化を測定することができる。とりわけ、レセプターの活性化は、レセプター高次構造の変化、リガンド−レセプター複合体の形成、またはリガンド−レセプター複合体の変化であってよい。あるいは、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの結合および活性化能力を模倣する作用剤によって、レセプターの活性化を開始することができる。特定の態様においては、転写調節因子は、リガンド結合の結果として活性化される。別の態様においては、レセプターに結合する（したがって、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンを排除する）が、レセプターを活性化させる能力を欠く作用剤をレセプターに結合させることによって、転写調節因子の活性を部分的または完全に低下させる。
本発明はまた、レセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの結合を変化（たとえば増大または低下）させる作用剤を同定するアッセイに関する。該アッセイは、放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプター、および試験対象の作用剤を、レセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合に適した条件下で合わせることを特徴とする。試験対象の作用剤の存在下でのレセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合の程度を決定し、試験対象の作用剤の非存在下での結合の程度と比較する。結合の程度に差があれば、その剤はレセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合を変化させることになる。剤の存在下で結合の程度が増大すれば、その剤は結合を強化、すなわち延長または増大させる、すなわち非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプターのアゴニストであることになる。作用剤の存在下で結合の程度が低下すれば、その剤は結合を弱化、すなわち短縮または低下させる、すなわち非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプターのアンタゴニストであることになる。本発明はまた、本明細書で説明するアッセイによって同定される作用剤に関し、したがって、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン活性のアゴニストおよびアンタゴニストに関する。
本発明はまた、転写調節因子の活性化など、細胞シグナル伝達経路に及ぼす非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの効果を変化（たとえば増大または減少）させる作用剤を同定する新規なアッセイに関する。このアッセイは、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプター、および試験対象の剤を、レセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合が起きる条件（すなわち非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合に適した条件）下で合わせることを特徴とする。レセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合により、そのレセプターが活性化され、ひいてはＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ６、またはｊｕｎ/ｆｏｓファミリー由来のものなど１つ以上の転写調節因子のモジュレートによって例証または測定されるシグナル伝達が活性化される。試験対象の作用剤の存在下での特定の転写調節因子の活性化の程度を決定し、試験対象の作用剤の非存在下での特定の転写調節因子の活性化の程度と比較する。活性化の程度に差があれば、その作用剤は転写調節因子の活性化に及ぼす非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの効果を変化させることになる。作用剤の存在下で転写調節因子の活性化が増大すれば、その剤は活性化を強化、すなわち延長または増大させることになる。作用剤の存在下で転写調節因子の活性化が低下すれば、その剤は活性化を弱化、すなわち短縮または低下させることになる。
本発明のアッセイおよび方法を利用すれば、感染症、炎症、自己免疫疾患、虚血再灌流障害、癌、喘息、および過敏障害の治療に使用する作用剤および医薬品を見つけることができる。本明細書で説明するアッセイおよび方法はまた、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン作用を延長する医薬品を同定する目的にも用いることができるため、免疫調節、造血、感染症の予防および治療、血小板産生、末梢血前駆細胞易動化、および創傷治癒などの目的に非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンを用いることができる治療または予防手段に用いることができる。これらの作用剤または医薬品は、たとえばレセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合またはその効果を延長することによって、該グルカンの効果を強化する作用を示す。
本発明はまた、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプター上の非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合部位を考慮して設計されたペプチドまたは小型有機分子などの作用剤または医薬品に関するが、これらの例に限定されない。１つの態様においては、上記作用剤または医薬品は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンに結合することで、レセプターへの結合に利用可能なβ（１−３）-グルカンの量を減少させ、シグナル伝達などの下流事象の活性化を低下させるように、レセプター結合部位の活性を模倣するように、設計することができる。本発明はまた、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合、および非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターの活性化に係る非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン活性のアゴニストまたは模倣物質に関する。あるいは、該医薬品または作用剤は、レセプター結合部位に結合して、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合に利用できなくするように、設計することができる。本発明はまた、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合活性のアンタゴニストに関する。
本明細書で説明する発明は、多くの分野への応用が期待できる。たとえば、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン製造工程のモニタリングや市販公開のための製品キャラクタライゼーションに用いたり、液体中のβ-グルカンの測定や非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターと相互作用を示す作用剤の構造と活性の関係の評価および同定に用いることができる。また、本発明は、医薬品や小型分子をはじめとする様々な作用剤のターゲット化送達や、末梢多型核白血球、単球、マクロファージ、および上皮細胞などのレセプター陽性細胞への応用が期待できる。本明細書で説明する成果は、レセプター陽性細胞とレセプター陰性細胞の両者の純度を高める精製スキーム、ならびに診断目的の抗レセプター抗体の生成にも利用することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ヒト白血球膜への放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合の経時的変化を示したグラフ図である。全結合量を黒丸付き実線で示し、非特異的結合量を白抜き四角付き破線で示す。データポイントは３反復試料の平均±標準偏差を表す。
図２Ａおよび２Ｂは、ヒト白血球膜への放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合の濃度依存性を示したグラフ図である。図２Ａは、様々な濃度の放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの全結合量（実線、黒丸）、非特異的結合量（破線、白抜き四角）、および特異的結合量（破線、白抜き菱形）を示す。データポイントは３反復試料の平均±標準偏差を表す。図２Ｂは、結合データのスキャッチャード分析を示す。
図３は、ヒト白血球膜への放射性標識β（１−３）-グルカンの結合に及ぼすインキュベーション温度の効果を示したグラフ図である。全結合量を斜線ブロックで示し、非特異的結合量を白抜きブロックで示す。データは３７℃における全結合量に対する百分率で表し、データポイントは３反復試料の平均±標準偏差を表す。
図４は、ネズミマクロファージ細胞株ＢＭＣ２．３における非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンによるＮＦ-κＢ活性化の経時的変化を、対照およびリポ多糖と比較したオートラジオグラフである。ＮＦ−κＢのレーンを矢印で示す。
図５は、ネズミマクロファージ細胞株ＢＭＣ２．３における非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンによるＮＦ-ＩＬ６活性化の経時的変化を、対照と比較したオートラジオグラフである。ＮＦ−ＩＬ６のレーンを矢印で示す。
図６は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのエキソグルカナーゼ処理が競合的結合に及ぼす効果を示したグラフ図である。
図７は、ＮａＯＨ処理が非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合競合能に及ぼす効果を示したグラフ図である。
図８は、ヒト白血球膜のグリシン/ｐＨ２．５または１Ｍ  ＮａＣｌ処理が結合に及ぼす効果を示したグラフ図である。ベタぬりカラムは食塩水対照を示し、点カラムは非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン試料を示す。
図９は、ヒト白血球膜のＣＨＡＰＳでの前処理が結合に及ぼす効果を示したグラフ図である。ベタぬりカラムは食塩水対照を示し、点カラムは非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン試料を示す。白抜きカラムは、デキストラン試料を示す。
図１０は、ヒト白血球膜の２-メルカプトエタノール処理が膜への放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合に及ぼす効果を示したグラフ図である。ベタぬりカラムは食塩水対照を示し、点カラムは非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン試料を示す。
図１１は、ヒト白血球膜のクロロホルム/メタノール/ＨＢＳＳ抽出が特異的結合に及ぼす効果を示したグラフ図である。
図１２は、ヒト白血球膜の過ヨウ素酸ナトリウム前処理が結合活性に及ぼす効果を示したグラフ図である。
図１３は、タンパク質一部除去ヒト白血球膜の過ヨウ素酸ナトリウム前処理が結合活性に及ぼす効果を示したグラフ図である。
図１４は、３通りのアッセイフォーマットにおける、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンおよび１本鎖の3Ｈ-非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合競合を比較したグラフ図である。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンまたは１本鎖グルカンを、図に示した濃度で用い、９６穴プレートにおける3Ｈ-非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）への結合（三角）、または再構成膜におけるラクトシルセラミドへの結合（四角）、またはヒト白血球膜への結合（丸）に関して競合させた。白抜き記号は非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンを示し、黒塗り記号は１本鎖を示す。各タイプのアッセイにおいて競合剤として用いた非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの最高濃度における競合を、最大競合とした。
図１５は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンおよび高分子量非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン〔ネットワーク（Network）〕は、１本鎖またはラミナリンよりも、９６穴プレートアッセイにおける3Ｈ-非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのラクトシルセラミドへの結合に関してより効果的に競合することを示すデータのグラフ図である。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（丸）、１本鎖（黒塗り四角）、ラミナリン（バツ印）、および高分子量非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン〔ネットワーク（Network）〕（ハッチング四角）を、図に示した濃度で用い、９６穴プレートアッセイにおける3Ｈ-非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのラクトシルセラミド（ウシ由来）への結合について競合させた。「％対照結合量」は、競合剤非存在下の結合量の百分率を示す。
図１６Ａおよび１６Ｂは、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン誘導体がヒト好中球における核転写因子ＮＦ−κＢおよびＮＦ−ＩＬ６を活性化することを示した写真である。図１６Ａは、核転写因子ＮＦ−κＢの結果を示す。図１６Ｂは、核転写因子ＮＦ−ＩＬ６の結果を示す。いずれの例でも、精製ヒト好中球を、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（３μｇ/ｍｌ）またはデキストラン（３μｇ/ｍｌ）の存在下または非存在下、３７℃で６０分間インキュベートした。核抽出物を調製し、タンパク質/ＤＮＡ複合体形成量を電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により判定した。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンは、ＮＦ−κＢまたはＮＦ−ＩＬ６特異的32Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブへの核抽出物タンパク質の結合を、対照またはデキストラン処理好中球の抽出物と比べて、増大させた。水平の矢印は、タンパク質/ＤＮＡ複合体の位置を示す。
発明の詳細な説明
発明は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（１９９２年８月２１日出願の米国特許出願第０７/９３４，０１５号参照、該文献の開示内容は参照により本願に含まれるものとする）が、ヒト白血球膜（ＨＬＭ）上に存在する新規レセプターに特異的に結合するという発見に関する。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンは、米国特許出願第０８/４００，４８８号、０８/４３２，３０３号、０７/９３４，０１５号、０８/３７３，２５１号、および０８/４６９，２３３号、ならびに米国特許第５，３２２，８４１号、５，４８８，０４０号、および５，５３２，２２３号にも記載されている。本明細書に記載の発明の成果は、この非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（ＰＧＧグルカンともいう）レセプターをキャラクタライズし、該レセプターを従来記載のβ-グルカンレセプターと明確に区別する一方、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの生理活性の機構に関する重要な情報を提供するものである。
非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプターは、主にヒト血球、とくに好中球および単核白血球（単球およびリンパ球）中に存在する。本明細書で使用する場合、「レセプター」という用語は、従来のレセプター分子ならびに結合部位を包含するものとし、そのような結合部位は、それ自体が効果を有するものであってもよいし、何らかの効果を発揮させるように第２の分子または結合部位を誘導または活性化させるものであってもよい〔第２の部位の「アンマスキング」ともいう；サンドベルグら（Sandberg et al.）Infect. Immun. 63（7）:2625-2631（1995）〕。本明細書で使用する場合、「レセプター」という用語は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンに対するアフィニティーを有する化合物も含む。これらの化合物は、レセプター模倣物であってもよいし、レセプターアナログであってもよく、天然のソースから単離されたものであってもよいし、化学的または合成的に製造されたものであってもよい。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプターは、β（１−３）-グルカン、とくに３本鎖構造の非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンに対して選択性を示す。
様々な多糖類につき、放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合に関する競合能力を試験した。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプターは、β（１−３）-グルカンと、デキストラン、マンナン、グリコーゲン、およびリポ多糖（ＬＰＳ）などの非β（１−３）-グルカンを区別する（表１）。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン試料は非特異的結合を示す。カードランの還元アミノ化により調製されたアミノ化グルカンを、ロルフ・セルジェリッド博士（Rolph Seljelid）（University of Tromso, Tromso, Norway）から供与された。エキソグルカナーゼ試料として、未標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンをエキソグルカナーゼ処理した後、放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合との競合に用いた。抗イディオタイプ抗体は、マウスモノクローナル抗ラミナリン抗体に対するウサギモノクローナル抗イディオタイプ抗体を用いた〔クゾップら（Czop et al.）J. Immunol. 145（3）:995-1001（1990）〕。β（１−３）-グルカンであるラミナリンおよびアミノ化グルカンは、ヒト白血球膜上に存在するレセプターへの放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合を阻害しないことから、このグループの多糖類間でも選択性があることがわかる。
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未標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（１ｍｇ）を、０．１３単位の１，３-エキソグルカナーゼ（Penicillium pinophilumから部分精製したもの）で一夜処理した。処理は、酵素の熱不活化の前後に５０℃で行った。次いで、未標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（０．２ｍｇ/ｍｌ）の存在下または非存在下、ヒト白血球を放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンとともに保温した。対照として、未標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの非存在下、結合反応系にエキソグルカナーゼを加えた。結果を図６に示した。
非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（１ｍｇ/ｍｌ）を室温で３０分間、１Ｍ  ＮａＯＨで処理した後、０．１ｍｇ/ｍｌまで希釈した。ゲル濾過クロマトグラフィーで単離した解離非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン含有画分につき、放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合の競合をアッセイした。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンと解離非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの両者は、２３μｇ/ｍｌで結合アッセイに用いた。結果を図７に示した。
ヒト白血球膜を、ＨＢＳＳ、０．１Ｍグリシン/ｐＨ２．５、または１Ｍ  ＮａＣｌの存在下、氷上で１時間インキュベートした後、４℃、１８０，０００ｘｇで６０分間の遠心分離によりペレット化し、洗浄し、結合アッセイに用いた。１８０，０００ｘｇ遠心分離上清につき、タンパク質含有率（ＢＣＡ試薬、Pierce社製）を測定したところ、ＨＢＳＳ対照と比較して、それぞれ１２％と２０％の全タンパク質が塩処理膜とグリシン処理膜から放出されたことが判明した。この結果（図８に示す）から、高塩分および低ｐＨ値は、ヒト白血球膜への非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合を変化させなかったことがわかる。したがって、結合は、末梢タンパク質を除去する条件の影響を受けないことになり、よって、結合部位が末梢タンパク質である可能性は低いものと思われる。
ヒト白血球膜を、０．２５％ＣＨＡＰＳの存在下または非存在下、氷上で、ＨＢＳＳ中で５分間保温した後、１８０，０００ｘｇ、４℃、４５分間の遠心分離に付した。最終濃度が１ｍｇ/ｍｌになるように加えた非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンまたはデキストラン〔平均分子量７１，０００、シグマケミカル社製（Sigma Chemical Co., MO）〕との結合測定にペレットを用いた。結果を図９に示す。界面活性剤オクチルグルコシドの場合と同様の特異的結合強化が見られた。これらの結果から、結合部位は、おそらく膜の疎水性部分と関連する領域を含んでいることがわかる。
図１０に示した濃度（０、０．１、および１Ｍ）の２-メルカプトエタノールの存在下、結合アッセイを行った。同濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いた場合も、同様の結果が得られた。結合に影響を及ぼすために高濃度の還元剤を要したことから、結合部分は、結合に不可欠のアクセスしやすいジスルフィド結合を含まないことがわかる。
実施例の説明に従い、ヒト白血球膜をクロロホルム/メタノール/ＨＢＳＳ（３：２：１）で抽出した。タンパク質含有率を下げた画分を、図１１に示した競合物質、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン、またはデキストランを１ｍｇ/ｍｌの最終濃度で加えた結合アッセイ（非油／スクロース法）で用いた。これらの結果（図１１に示す）から、結合部分はクロロホルム/メタノール処理に耐えることがわかる。
ヒト白血球膜（５００μｇタンパク質）を、図１２に示した濃度（１０および１００ｍＭ）の過ヨウ素酸ナトリウムとともに室温で３０分間インキュベートした後、１２，０００ｘｇ、１０分間の遠心分離に付し、リンスし、結合アッセイに用いた（非油／スクロース；図１２参照）。タンパク質除去膜（１．８７ｍｇのヒト白血球膜タンパク質由来のもの）を、０．１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム中でインキュベートし、上記同様に処理した（図１３）。
結果から、膜を塩や低ｐＨで前処理しても、レセプターは影響を受けないこと、および膜を界面活性剤で前処理することでレセプターが強化されることがわかる。結合活性は、過ヨウ素酸ナトリウム処理および高濃度の還元剤により低下する。さらに、結合部位は、クロロホルム／メタノール／水による抽出が可能であると思われる。これらのデータを総合すると、末梢タンパク質が結合部位である可能性は低く、結合部位はおそらく膜の疎水性部分と関連する領域を含んでいることがわかる。過ヨウ素酸ナトリウムが結合に及ぼす効果からみて、グリココンジュゲートが非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの膜ターゲットであるらしいことがわかるが、このことは、結合部分がクロロホルム／メタノール処理に耐えるという知見と一致する。糖脂質または糖タンパク質であるグリココンジュゲートレセプターは当該分野において公知であるため〔サンドベルグら（Sandberg et al.）Infect. Immun. 63（7）:2625-2631（1995）〕、グリココンジュゲートの炭水化物部分はタンパク質、脂質、または両者と関連している可能性がある。
様々な細胞型に由来する膜への放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合を評価することで、様々な細胞系およびヒト組織における非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプターの分布を調べた（表２参照）。放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合量は、膜タンパク質１ｍｇあたりｎｇ単位で、平均±標準偏差で表した。１００倍以上過剰量の未標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの存在下の放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合量を、非特異的結合量とした。特異的結合量は、（全結合量）−（非特異的結合量）で求めた。表２の括弧内の数字は全結合量の百分率を示す。補体レセプター３（ＣＲ３）の定量は、蛍光標識抗ＣＤ１１ｂを用いるフローサイトメトリーによって行い、データは、任意の蛍光単位で、平均チャンネル蛍光強度（ＭＣＦ）で表した。インタイプ対照に対するバックグランドの蛍光を差し引いた。好中球試料は、組織学的に９５パーセントを超える好中球を含んでいた。単核球試料は、組織学的に約４０〜５０パーセントの単球を含んでいた。
ヒト末梢血中でレセプターを発現する主な細胞型は好中球であり、単核白血球（単球およびリンパ球）は、好中球による発現量測定値の２０％未満しか発現しない。ヒト単球細胞株Ｕ９３７は、検出可能量の放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンと結合しないのに対して、ネズミマクロファージ細胞株ＢＭＣ２．３〔ケネス・ロック博士（Kenneth Rock）Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA〕、ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ）、およびＰ３８８Ｄ（１）（ＡＴＣＣ）は様々な結合活性量を発現する。これら３つの細胞株につき、フローサイトメトリーでＣＲ３発現量をアッセイしたところ、Ｐ３８８Ｄ（１）細胞はＣＲ３を欠いていることが判明した。すなわち、放射性標識非誘導体化水溶性β（１-３）-グルカン結合とＣＲ３発現の間には相関がなかった。ＣＲ３は、放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合活性をほとんど示さなかった血液単球中で高度に発現されるという事実は、この知見と一致する。最後に、ネズミＢおよびＴ細胞株（それぞれＬＰ２７．４およびＤＯ１１）は、放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンと結合しなかった。
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放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（１μｇ/ｍｌ）をヒト白血球膜（２ｍｇ/ｍｌ）とともに３７℃または２２℃で６０分間インキュベートしたところ、結合は環境温度依存性が非常に高いことが明らかになった（図３）。２２℃のインキュベーション時間を４時間まで延長するか、インキュベーションを４℃で行った場合も同様の結果が得られたのに対して、非特異的結合は温度の影響を受けなかった。
放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合活性は、β（１−３）-特異的エキソグルカナーゼに対して感受性を示すことから、リガンドの結合活性はβ（１−３）-グルカンによるものであることがわかる。しかしながら、結合は、クゾップ（Czop, 1990）の抗イディオタイプ抗体または抗補体レセプター３抗体〔ＯＫＭ１；ダイアモンドら（Diamond et al.）J. Cell Biol. 120:1031-1043（1993）〕のいずれによっても阻害されない。このデータを、アミノ化グルカンによる阻害がないことと考え合わせると、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプターは新規の白血球炭水化物レセプターであることがわかる。
非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（１０００μｇ/ｍｌ）の存在下または非存在下、１μｇ/ｍｌの放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンを２．５ｍｇ/ｍｌのヒト白血球膜とともに３７℃で様々な時間にわたりインキュベートすることによって、ヒト白血球膜への放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合の経時的変化と濃度依存性を決定した。結合した放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンを、２層密度勾配遠心分離法によって未結合リガンドから分離し、膜ペレットを可溶化させ、放射能を測定した。１μｇ/ｍｌの放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン濃度で、３７℃で６０分間経過後、平衡結合が得られた（図１）。
５０倍過剰量の未標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの存在下（非特異的結合量）または非存在下（合計結合量）、２．２ｍｇ/ｍｌのヒト白血球膜を、濃度を上げる放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンとともに３７℃で６０分間インキュベートすることによって、ヒト白血球膜への放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合の濃度依存性を決定した。実施例の記載に従い、反応混合物をスクロース/油密度勾配遠心分離に付した後、膜の放射能を決定した。特異的結合量は、全結合量から非特異的結合量を差し引くことによって求めた。直線回帰分析法により、データを下記式にあてはめた。
Ｂ＝Ｂmax（Ｓ/（Ｓ＋Ｋｍ））
〔式中、Ｂ＝放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン、Ｂmax＝最大結合量、Ｓ＝放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン濃度、およびＫｍ＝５０％の最大結合量における放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン濃度を示す。〕
飽和結合は、約２．５μｇ/ｍｌの濃度で得られた（図２Ａ）。スキャッチャード分析（図２Ｂ）で、１ｎＭの見かけのアフィニティーおよび約５６ｆｍ/ｍｇタンパク質の最大結合量が得られ、見かけ解離定数は約１２ｎＭであった。
非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンによる１つ以上の転写調節因子のモジュレートによって例証されるシグナル伝達の活性化を評価するために、ＢＭＣ２．３細胞を３μｇ/ｍｌの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンとともに３７℃で様々な時間にわたりインキュベートした。核抽出物を調製し、ＮＦ−κＢまたはＮＦ-ＩＬ６に対して特異的な32Ｐ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドとともにインキュベートした。ゲル電気泳動（電気泳動移動度シフトアッセイ、ＥＭＳＡ）により、タンパク質−32Ｐ  ＤＮＡ複合体を未結合32Ｐ  ＤＮＡから分離した。結果（図４および５）は、タンパク質−ＤＮＡ複合体が経時的に増大することを示しており、これらの転写因子が、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンによって活性化されたことがわかる。未標識ＤＮＡプローブによるこの複合体の形成が阻害されること、および突然変異体プローブによる阻害は起きないことから、この相互作用は特異的であることが明らかである（データは示さず）。
非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン（３μｇ/ｍｌ）またはデキストラン（３μｇ/ｍｌ）の存在下または非存在下、精製ヒト好中球を３７℃で６０分間インキュベートした。核抽出物を調製し、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）により、タンパク質/ＤＮＡ複合体形成量を測定した。図１６Ａおよび１６Ｂに示したように、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンは、対照またはデキストラン処理好中球の抽出物と比べて、ＮＦ−κＢまたはＮＦ−ＩＬ６特異的32Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブへの核抽出物タンパク質の結合を増大させた。
可溶性および粒子状の両方の型のβ-グルカンのレセプターが従来記載されているが、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンとヒト白血球膜上のレセプターの結合相互作用のキャラクタライゼーションを行うと、本明細書で説明するβ-グルカンレセプターは従来記載のレセプターとは明確に区別される分子種であることがわかる。
クゾップ（Czop, 1990）が記載している粒子状β-グルカンレセプターは、ヒト単球およびＵ９３７細胞上に存在する。非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合は、末梢多型核球（ＰＭＭ）と比較した単球上の相対値であり、Ｕ９３７細胞上では結合が認められなかった。さらに、クゾップ（Czop, 1990）が作製した、おそらくグルカン結合部位を占有する抗イディオタイプ抗体は、単球中のグルカン粒子食作用を効果的に阻害するが、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合の阻害には無効である。
ネズミ腹腔マクロファージ上に存在するアミノ化グルカンレセプター〔コノプスキーら（Konopski et al.）（1994）〕は、彼らが記載したアミノ化グルカンに４℃で結合するのに対して、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンは室温以下ではレセプターに結合しない。また、可溶性アミノ化グルカンの試料は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターへの結合に関して競合しなかった（表１）。
ソーントンら〔Thornton et al.（1996）〕が記載しているＣＲ３のβ-グルカン結合活性は、ＣＲ３のＩドメインに対するモノクローナル抗体によって阻害される。これらの抗体の１つとして、ＯＫＭ１がある。このものは、上記系内でグルカン結合を阻害したが、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合に対しては阻害作用を示さなかった。ヒト末梢血ＰＭＮは、単核細胞と比べて、５ないし１０倍高い特異的非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合性を示したが、ＰＭＮと単球はいずれも高レベルのＣＲ３を発現することが知られている。
ごく最近、Ｕ９３７細胞中で非常に高レベルで発現されるβ-グルカンのリン酸化誘導体のレセプターが記載されている〔ムラーら（Muller et al.）J. Immunol. 156:3418-3425（1996）〕。この場合も、Ｕ９３７膜においては、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合は認められなかった。
ゴールドマンら〔Goldman et al., Exp. Cell. Res. 174（2）:481-490（1988）〕が記載している粒子状β-グルカンレセプターは、サイズ範囲２，０００〜４，０００ダルトンの可溶性グルカンによって阻害することができるのに対して、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合は、ラミナリン（分子量約５，０００ダルトン）や分子量１８，０００ダルトンのβ-グルカンの単鎖コンホーマーによっては阻害されない。ゴールドマンらのレセプターは、レチノイン酸または１α，２５-ヒドロキシビタミンＤ３による誘導後しか発現されないのに対して〔ゴールドマン（Goldman）Immunology 63（2）:319-324（1988）〕、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンは非誘導Ｐ３８８Ｄ（１）細胞に結合する。サケマクロファージによるグルカン粒子の食作用は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合に対して影響を及ぼさなかった（データは示さず）高濃度（８００μＭ）のラミナリヘプトース〔エングスタッドとロバートセン（Engstad and Robertsen）（1994）〕によってほぼ完全に阻害することができる。
本明細書で説明するように、ポリスチレン製９６穴プレート上に固定化した、ラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）（様々なソースに由来するもの）、ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）、グロボトリアオシルセラミド、およびアシアロガングリオシド-ＧＭ１をはじめとする数種類のグリコスフィンゴ脂質は、3Ｈ非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンへの有意な特異的結合を示した（表３参照）。これらの化合物はいずれも末端ガラクトースを有してるため、3Ｈ非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンとグリコスフィンゴ脂質の結合相互作用に関与している可能性がある。しかしながら、サイコシン（１-ガラクトシルスフィンゴシン）は検出可能な結合を示さないため、末端ガラクトースは単独では結合に不十分である。この化合物はセラミドの脂肪酸部分を欠いている。
ＨＬＭ由来のＨＰＬＣで分画したＬａｃＣｅｒについて表４で示したように、ＬａｃＣｅｒ中の数種類の脂肪酸構造が3Ｈ非誘導体化水溶性グルカンの結合を支えている一方で、市販のジヒドロ−スフィンゴシンＬａｃＣｅｒは結合しないため、Ｃ１８：１スフィンゴシンに存在する炭素間二重結合が結合に重要であることが明白である。
ＬａｃＣｅｒへの3Ｈ非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合は、ＨＬＭの場合と同様の温度依存性を示すこともわかった。表５に示したように、結合は３７℃で起き、４℃では起きない。温度特異性は２種類のＬａｃＣｅｒソースで見られた。
3Ｈ非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合の競合のコンホーマー特異性も、上記ＨＬＭの場合と同様であった。図１４に示したように、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンは、９６穴アッセイおよび再構成アッセイのいずれにおいても同程度に、ＨＬＭおよびＬａｃＣｅｒへの3Ｈ非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合に関して競合する。一方、１本鎖（ＳＨ）グルカンは上記アッセイのいずれにおいても有効な競合を示さない。また、主に３本鎖高次構造を取る分子量１００万以上のグルカンから成るグルカン調製品であるネットワーク（Network）は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンと同様の競合を示すのに対して、ラミナリンは、９６穴プレートアッセイにおいて、ＬａｃＣｅｒへの3Ｈ非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン結合に関して有効な競合を示さない（図１５参照）。
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上記結果から、ＬａｃＣｅｒは非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのイン・ビボレセプターの１つであると思われる。しかしながら、上記のようにして試験した他の化合物も非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンに対するアフィニティーを有する。これらの化合物は、本明細書で説明する「レセプター」という用語の定義範囲に含まれるものとする。たとえば、これらの化合物は、本明細書で説明するアッセイにおいてＬａｃＣｅｒレセプターの代わりに用いることができる。本発明から、ある化合物の非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンに対するアフィニティーを決定する特性が３つあると思われる。すなわち、化合物の脂肪酸鎖長、化合物に末端ガラクトースが存在すること、および化合物のスフィンゴシン部分における２重結合の有無である。具体的には、本明細書で非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンに対するアフィニティーを有することが示されている化合物は、長さ約１６ないし約２４炭素数の脂肪酸鎖を有し、末端ガラクトースを有し、スフィンゴシン部分に２重結合を含むものである。ところが、１６未満や２４を超える炭素数の脂肪酸鎖を有する化合物も、本発明の対象となる。さらに、本明細書で使用する場合、「末端ガラクトース」という用語は、未修飾ガラクトース、ならびにスルホン化ガラクトースなど誘導体化または修飾ガラクトースを包含するものとする。したがって、これらの特性を有する化合物は本発明に含まれ、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンに対するアフィニティーを有する他の化合物とともに、本明細書で説明する方法における使用に適している。
本明細書で説明した研究の結果、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン製造工程をモニターし、生成物をキャラクタライズすることが可能になる。すなわち、試験試料を、通常の競合レセプター結合アッセイに付し、相対的なレセプターアフィニティーに関して分子のキャラクタライゼーションを行うことができる。このキャラクタライゼーションは、以下の特性の一部または全部に関する情報を提供するものである。すなわち、バッチ間品質、生成物が特定の高次構造を有するβ（１−３）-グルカンであることの確認、および生成物の純度である。
本明細書で説明する研究のさらに別の結果により、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターを用いて液体中のβ-グルカンを測定することができる。試験試料を通常の捕捉または競合アッセイに付し、既知のβ-グルカン標準品で作成した標準曲線と比較することができる。この方法を利用すれば、真菌血症の診断手段として、血清、血漿、尿、滑液、脳脊髄液、肺洗浄液、胆汁、およびその他の体液中の可溶性β-グルカンを測定することができる。また、真菌汚染の有無を試験したり、酵母発酵をモニターしたりする目的で、食品製造工程におけるβ-グルカン値の測定にも利用できる。
また、試験試料を通常の捕捉または競合アッセイに付し、標準試料と比較して、構造と活性の関係を解明することもできる。あるいは、放射性標識後に試験試料結合を直接的に試験することもできる。試料は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターを介するアッセイにおいて、これらの機能の阻害または刺激の有無を調べる目的で試験することもできる。たとえば、上記アッセイは、ポリマーまたは小型分子レセプターアゴニストの開発や、免疫抑制療法実施中に真菌日和見感染に伴い起きる可能性がある移植拒絶反応を予防するなどの目的で、不適当な免疫強化を阻害するレセプターアンタゴニストの開発に用いることができる。
本明細書で開示した発見を利用すれば、様々な作用剤のレセプター陽性細胞への送達をターゲット化することもできる。たとえば、様々な作用剤を、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンとコンジュゲート化（たとえば化学的コンジュゲート化、架橋、または共有結合）させて、ＰＭＮやマクロファージなどのレセプター陽性細胞にターゲット化することができるコンジュゲート分子を作製することができる。このようなターゲット化送達系を利用すれば、耐性細胞内病原体（たとえばミコバクテリア、リューシュマニア、マラリア）に対する抗微生物剤、レセプター陽性白血病に対するサイトトキシン、遺伝子治療用遺伝子（たとえばサイトカイン産生の強化または機能不全酵素の置換）、または特異的抗体の提示または産生の強化またはＴ細胞活性化用抗原などの作用剤の送達を強化することができる。
レセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合特異性は、レセプター陽性細胞とレセプター陰性細胞（すなわちレセプターを含まない細胞）の両者の精製法を提供する。たとえば、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンを固体マトリックスに付着させたものを、親和性マトリックスとして用いて、レセプター陽性細胞の陽性選択を行ったり、レセプター陰性細胞の陰性選択を行うことができる。同様に、抗レセプター抗体を、固定化非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの代わりに用いることができる。この方法で精製した細胞は、細胞療法用に増殖させることができる。
さらに、本発明は、診断目的の抗レセプター抗体の生成を可能にする。高含有率化または精製したレセプター調製品を用いて、常法によりモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を製造することができる。したがって、本発明は、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターに結合する抗体にも関する。たとえば、上記レセプターに結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は本発明の範囲に含まれる。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳類を、免疫原型のレセプター（すなわち、抗体応答惹起性を有するレセプターの抗原性部分）で免疫化することができる。免疫原性を付与する技術としては、たとえば、担体へのコンジュゲート化または当該分野において公知のその他の技術などが挙げられる。該抗原は、アジュバントの存在下で投与することができ、免疫化の進行は、血漿または血清中の抗体価を検出することでモニターすることができる。上記免疫原を抗原としたものと、通常のＥＬＩＳＡまたはその他の免疫アッセイを用いて、抗体価を評価することができる。本明細書で説明する糖脂質レセプターに対する抗体を、たとえば既報〔コシエラックら（Koscielak et al.）Immunochemistry 5:441（1968）；ハコモリ（Hakomori）Methods of Enzymol. 28:232-236（1972）、およびマルクスとジャニス（Marcus and Janis）J. Immunol. 104:1530（1970）〕に記載のものなどの常法により、製造することができる。上記抗体を用いて、疾患病態を反映するレセプター陽性またはレセプター陰性細胞集団における変化（たとえば潜在する真菌感染または白血病に対する応答）を同定することができる。
本発明はまた、たとえばレセプター陽性細胞、すなわち非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンを含む細胞内の転写調節因子をモジュレートすることによって、シグナル伝達経路を変化（たとえば活性化または不活化）させる方法に関する。本発明の１つの態様においては、転写調節因子は、ＮＦ-κＢおよび/またはＮＦ-ＩＬ６および/またはｊｕｎ/ｆｏｓファミリーの転写調節因子に由来するものである。たとえば、転写調節因子はＮＦ−κＢ、ＮＦ-ＩＬ６、またはＡＰ-１であってよい。
本発明の方法によれば、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの結合により、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンのレセプターの活性を活性化させることで、転写調節因子（たとえばＮＦ-κＢ、ＮＦ-ＩＬ６、またはｊｕｎ/ｆｏｓファミリー由来のもの）が活性化されるように、シグナル伝達経路を活性化させる。とりわけ、レセプターの活性化は、レセプター高次構造の変化、リガンド−レセプター複合体の形成、またはリガンド−レセプター複合体の変化を特徴とするものである。
あるいは、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの結合および活性化能力を模倣する作用剤によって、レセプターの活性化を図ることができる。特定の態様においては、リガンド結合の結果、転写調節因子が活性化される。別の態様においては、レセプターに結合するが（したがって、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンを排除するが）、レセプターを活性化させる能力を欠く作用剤を結合させることによって、転写調節因子の活性を部分的または完全に低下させることができる。
本発明の方法によって変化させることができる上記以外のシグナル伝達経路としては、ｒａｓ/ｒａｆ-１/ＭＡＰキナーゼ経路、Ｇタンパク質/ホスホリパーゼＣ/プロテインキナーゼＣ経路、ＪＡＫ/ＳＴＡＴ経路、ホスホリパーゼＡ経路、Ｇタンパク質/ホスホリパーゼＤ/ホスファチジン酸経路、およびｃ-ＡＭＰ依存性経路などが挙げられる。各経路において、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンをレセプターに結合させることによって、当該シグナル経路に適した活性化物質または指標物質を活性化させるが、この結合をモジュレートすることで、対応するシグナル伝達を変化させることができる。
本発明はまた、転写調節因子の活性化など、シグナル伝達経路に及ぼす非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの効果を変化させる作用剤を見つける新規アッセイに関する。本アッセイは、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカン、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンのレセプター、および試験対象の作用剤を、レセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合が起きる条件（すなわち非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンレセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合に適した条件）下で合わせることを特徴とする。レセプターへの非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの結合により、該レセプターが活性化され、ひいてはＮＦ−κＢおよび/またはＮＦ-ＩＬ６および/またはｊｕｎ/ｆｏｓファミリー由来のものなどの転写調節因子が発現するシグナル伝達が活性化される。試験対象の作用剤の存在下、特定の転写調節因子の活性化の程度を決定し（たとえば、実施例におけるように転写調節因子に対して特異的な放射性標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる）、試験対象の作用剤の非存在下での特定の転写調節因子の活性化の程度と比較する。活性化の程度に差があれば、その作用剤は転写調節因子の活性化に及ぼす非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンの効果を変化させることになる。作用剤の存在下で転写調節因子の活性化が増大すれば、その剤は活性化を強化、すなわち延長または増大させることになる。作用剤の存在下で転写調節因子の活性化が低下すれば、その剤は活性化を弱化、すなわち短縮または低下させることになる。
本発明はまた、炭水化物と糖脂質の相互作用の特異性を評価するアッセイまたは方法に関する。本発明の方法によれば、特定の炭水化物と特定の糖脂質を、両者の相互作用に適した条件下で合わせて、該炭水化物と糖脂質の相互作用の程度を決定する。この相互作用度を、別の糖脂質または炭水化物の存在下での該特定の糖脂質と特定の炭水化物の相互作用の程度と比較する。
たとえば、特定の炭水化物に対するある糖脂質のアフィニティーを決定するために、両者を適当な条件下で合わせて、相互作用の程度を決定する。通常、相互作用は結合である。次いで、相互作用の程度を、特定の競合剤炭水化物の存在下での相互作用の程度と比較する。このようにして、糖脂質と特定の炭水化物の相互作用の特異性を、糖脂質と競合剤炭水化物の相互作用と比較し、相対的な特異性を決定することができる。
同様に、特定の糖脂質に対するある炭水化物のアフィニティーを決定するために、両者を適当な条件下で合わせて、相互作用の程度を決定する。次いで、相互作用の程度を、特定の競合剤糖脂質の存在下での相互作用の程度と比較する。このようにして、炭水化物と特定の糖脂質の相互作用の特異性を、炭水化物と競合剤糖脂質の相互作用と比較し、相対的な特異性を決定することができる。本発明の特定の態様においては、ＬａｃＣｅｒが該糖脂質である。本発明の別の態様においては、非誘導体化水溶性β（１−３）-グルカンが該炭水化物である。
下記実施例は、本発明を説明する目的で示すものであって、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書で引用する引例の開示内容はすべて参照により本願に含まれるものとする。
実施例
材料
以下に記載のように、ラクトシルセラミド（ＨＬＭ）をヒト白血球膜から精製した。マトレヤ社（プレザント  ギャップ、ＰＡ）製のラクトシルセラミド（ブタ）を除いて、すべての他のスフィンゴ脂質、セラミド、リン脂質は、シグマケミカル社（セントルイス、ＭＯ）製であった。ＳＯＬＶＡＢＬＥTMは、デュポン、ＮＥＮ（ボストン、ＭＡ）製であった。９６ウェルのポリスチレンプレートは、コーニング（ニューヨーク）製であった。
放射性標識非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンの調製
非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン（ＰＧＧ−グルカン、１７ｍｇ；ＨＰＤ０１４４、アルファ−べータテクノロジー、ウォーセスター、ＭＡ）を、滅菌した発熱物質を含まない（ＳＰＦ）水中、室温で７２時間ＮａＯ4（２２５ｍｇ；シグマ、セントルイス、ＭＯ）とともにインキュベートした。過ヨウ素酸塩は、５０ｍｇのグリセロールの添加により消光させた。非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンを、ＳＰＦ水に対して透析し、次いで、１００ｍＣｉのＮａＢ3Ｈ4（ニューイングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ）で還元的に標識した。放射性標識された非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンを、トリチウム化低分子量の副産物から透析（１０Ｋカットオフ）により分離して、限外濾過した。標識された生成物の純度は、ゲル透過クロマトグラフィーにより評価した。
ヒト好中球の調製
新鮮な全血を、抗凝固剤として酸性クエン酸デキストロースを用いて、正常のヒトボランティアから得た。デキストラン沈降の後、細胞を遠心分離（４００ｘｇ、７分間）して、オートロガス血漿に再懸濁した。次いで、細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配（リンパ球分離培地；オルガノンテクニカ、ダーハム、ＮＣ）上に重層して、遠心分離（４００ｘｇ、３０分間）した。ペレットから回収した細胞を、低張的に溶解させて、残りのＲＢＣを除去した。残存している細胞は、形態学的な基準により判定して、９５％を超える好中球であった。
ヒト白血球膜の調製
ヒトドナー由来のバフィーコート細胞（赤十字、デドハム、ＭＡ）を、３％デキストラン中で１５〜２０分間室温でインキュベートして、赤血球から白血球を分離した。白血球を豊富に含む上清をペレット化（５００ｘｇ、７分間）し、氷冷したリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ；ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ＮＹ）で１回洗浄した。その後のすべての操作は、４℃で行なった。残りの赤血球を低張溶解により除去し、白血球を遠心分離（８５０ｘｇ、７分間）により回収した。当該細胞ペレットを、約３〜４倍の容量のＰＢＳに再懸濁し、プロテアーゼインヒビター（５ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０μｇ／ｍｌアプロチニン、１μＭペプスタチンＡ、１μｇ／ｍｌロイペプチン、５０μＭ  ＰＭＳＦ）を添加した。当該細胞をプローブ音波処理（５０ワット、３０ｘ１秒パルス）により破壊した。細胞の破壊は、顕微鏡によりモニターした。核と残りの無傷な細胞を、低速遠心分離（７００ｘｇ、７分間）により除去した。場合によっては、低速ペレットを再び音波処理して、もう１回低速遠心分離に供した。次いで、低速上清を高速超遠心分離（１８０，０００ｘｇ、１時間）により回収した。膜ペレットを、Ｃａ++とＭｇ++を含有するハンクスのバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した。膜蛋白質は、ＢＣＡまたはクーマシー法（ピアース、ロックランド、ＩＬ）を用いて決定した。ウシ血清アルブミン（シグマ、セントルイス、ＭＯ）は、１０ｘストックから１ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、膜は、液体窒素中、４〜５ｍｇ／ｍｌで保存した。いくつかの場合において、膜は、蛋白質の添加なしに凍結させて保存した；しかしながら、結合における変化は、異なる保存条件の結果として観察されなかった。
いくつかの場合において、新鮮なヒト白血球を酸性クエン酸デキストロースで採集した全血から調製した。赤血球をデキストラン沈降により除去し、白血球の豊富な層を集め、前記のように処理した。最後に、精製した好中球と単核白血球（単球とリンパ球を含む）は、オートロガス血漿中の白血球の豊富な層の細胞を再懸濁し、当該細胞をリンパ球分離培地（ＬＳＭ；オルガノンテクニカ）上に重層した後、遠心分離（７００ｘｇ、３０分間）することにより調製した。好中球が濃縮されたペレットと密度の中間層に存在する単核細胞とを、氷冷したＰＢＳで洗浄し、膜を前記のように調製した。染色サイトスピン（シャンドン製）標品により、好中球標品は、９５％を超える純度であり、単核標品は、約４０％〜５０％の単球を含むことが示された。
細胞株からの膜の調製
非接着性の細胞株を遠心分離（５００ｘｇ、７分間）により回収し、氷冷したＰＢＳで洗浄し、当該膜を前記のように調製した。軽く接着した細胞株は、氷冷したＰＢＳで洗浄し、セルスクレーパー（コスター製）で優しく掻き取ることにより除去した。９０％を超える細胞は、色素排除により決定されるように、この処理の間生存を維持していた。細胞をＰＢＳとプロテアーゼインヒビター中に再懸濁した。強固に接着した細胞は、氷冷したＰＢＳで洗浄し、次いで、ＰＢＳと前記プロテアーゼインヒビターとでインキュベートした。次いで、細胞を掻き取りにより除去し、遠心分離（５００ｘｇ、７分間）により回収した。次いで、接着細胞由来の膜を前記のように調製した。
結合アッセイ（油／スクロース法）
膜を、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの存在および非存在でＨＢＳＳ中、２〜５ｍｇ／ｍｌに希釈した。反応混合物は、２８０μｌの膜（２〜４ｍｇ／ｍｌの最終濃度）、３５μｌの食塩水または試験試料（種々の濃度で）および３５μｌの放射性標識された非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン（１μｇ／ｍｌの最終濃度）からなっていた。結合は、３７℃で６０〜１２０分間進行させた。インキュベーションの終わりに、反応混合物の１００μｌのアリコートを、４００μｌの遠心分離管（ブリンクマン製）中で１００μｌのジブチルフタレート（下層）と１００μｌのＰＢＳ中８％スクロース（上層）からなる二重層の密度勾配の上に重層させた。当該管を１５，０００ｘｇで４〜５分間遠心分離し、膜ペレットを含むチップを除去し、３００μｌのＳＯＬＶＡＢＬＥTM（ニューイングランドニュークレア、ボストン、ＭＡ）中、５０℃で一晩インキュベートしてペレットを溶解させ、次いで、液体シンチレーション計数により放射能を決定した。添加した膜の非存在下で油層には放射能は見られなかった。あるいは、膜をインキュベーションチューブ中、１５，０００ｘｇ、３７℃で４〜５分間直接遠心分離し、ペレットをＨＢＳＳで洗浄し、次いで、ペレットを溶解させて、放射能を液体シンチレーション計数により決定した。
結合アッセイ（非油／スクロース法）
油／スクロース勾配を用いる方法に対する代替法は、結合アッセイの１００μｌのアリコートをミクロヒュージチューブ中で１２，０００ｘｇで５分間遠心分離した後、得られたペレットをＨＢＳＳでリンスすることを含んでいた。次いで、ペレットをＳＯＬＶＡＢＬＥTMに溶解して、前記のように放射能を決定した。
クロロホルム／メタノール／緩衝液での膜の抽出
前記のように調製したヒト白血球膜（５ｍｇ蛋白質／ｍｌ）を５倍容量の３：２クロロホルム／メタノール（体積比）とともにボルテックスし、１，５００ｘｇで遠心分離して層を分離した。上部の水層と下部の有機層を蛋白質の中間層から分離し、合わせて、アルゴン流の下で約５０μｌまで濃縮した。残渣をＨＢＳＳに再懸濁し、短時間で音波処理し、遠心分離（１２，０００ｘｇ、１０分間）して膜をペレット化した。当該ペレットを５００μｌのＨＢＳＳに再懸濁し、３５０μｌの結合アッセイ当たり１００μｌを使用した。ＢＣＡ試薬（ピアース製）を用いる蛋白質に関するアッセイにより、約８５％の蛋白質が再懸濁画分から除去されたことがわかった。
電気泳動による移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）（ネズミ）
１０％ウシ胎児血清を補足したＤＭＥＭ中のＢＭＣ２．３細胞を、３μｇ／ｍｌの非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンと種々の期間インキュベートした。ディグナム（Dignam）ら、（Nuc. Acid Res. 11:1475-1489（1983））の方法により、核抽出物を調製した。次いで、核抽出物を、32Ｐ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドと室温で２０分間インキュベートした。プローブとして用いたオリゴヌクレオチドの配列は、ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ（配列番号：１）であった。次いで、反応混合物を４％ポリアクリルアミドゲル上で分離し、結果をオートラジオグラフィーにより記録した。
電気泳動による移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）（ヒト）
前記のように精製したヒト好中球（４．５ｘ１０6細胞／ｍｌ；合計１０ｍｌ）を、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ（シグマケミカル社製）中で３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカンまたはデキストラン（両方とも３μｇ／ｍｌで）を添加して、インキュベーションをさらに３７℃で６０分間続けた。対照の細胞には何も添加しなかった。インキュベーションの終わりに、細胞を氷冷ＰＢＳ＋２０ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄し、核抽出物を調製して、前記のようにＥＭＳＡを行なった。
ヒト白血球膜（ＨＬＭ）からのラクトシルセラミド（ＬａｃＣｅｒ）の精製
１．  クロロホルム／メタノール／緩衝液での膜の抽出
１ｍＬのＨＢＳＳ中のＨＬＭ（１５ｍｇ蛋白質）を、クロロホルム（３ｍＬ）とメタノール（２ｍＬ）で１分間ボルテックスすることにより抽出した後、１５００ｘｇで１０分間遠心分離して層を分離した。上層と蛋白質の中間層を捨てた。下層をアルゴン流の下で乾燥させ、２００μＬのクロロホルム／メタノール（１０：１）に再懸濁した。
２．  ＬａｃＣｅｒの薄層クロマトグラフィー分析
分析対象の試料をＨＰＴＬＣシリカゲルプレート上にスポットし、市販のＬａｃＣｅｒ標準品とともにクロロホルム／メタノール／水（８０：２０：２）で展開した。ＬａｃＣｅｒをオルシノールスプレー試薬で可視化した（シュナール（Schnaar）、Methods in Enzymology 230:380（Academic Press, 1994）。
３．  シリカゲルクロマトグラフィー
１００μＬの前記抽出物を、クロロホルムで平衡化したシリカゲルカラム（２ｍＬ、６０オングストローム、２００−４００メッシュ）にかけた。当該カラムをクロロホルム（８ｍＬ）、次いでアセトン（１６ｍＬ）で洗浄した後、アセトン／メタノール（９：１、１６ｍＬ）でグリコスフィンゴ脂質画分を溶出した。当該アセトン／メタノール画分を乾燥するまで濃縮し、アセトン／メタノール（１０：１）に再懸濁した。
４．  ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィー
シリカクロマトグラフィー由来のアセトン／メタノール画分を、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５カラム（１ｍＬのアセテート型樹脂、クロロホルム／メタノール（１：２）で調製）にかけた。当該カラムを６０ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２）で洗浄した。中性のグリコスフィンゴ脂質は、この画分に含まれており、それを乾燥させ、クロロホルム／メタノール（５：１）に再懸濁した。
５．  最終のシリカゲルクロマトグラフィー
ＤＥＡＥ−セファデックス由来の画分を、クロロホルムで平衡化したシリカゲルカラム（２５ｘ０．８ｃｍ）にかけた。当該カラムをクロロホルム（６０ｍＬ）、次いでクロロホルム／メタノール（７．５：１）（６０ｍＬ）で洗浄した。ＬａｃＣｅｒをクロロホルム／メタノール（５：１）（６０ｍＬ）、次いでクロロホルム／メタノール（２：１）（６０ｍＬ）で溶出した。
６．  ＨＰＬＣによる分別
ＬａｃＣｅｒの個々の成分への分別を、逆相シンメトリーＣ１８カラム（３．９ｘ１５０ｍｍ、ウォーターズ社、ミルフォード、ＭＡ）と１ｍＬ／分の流速でメタノール中３．５％の０．２Ｍ酢酸アンモニウムの移動相を用いて、ヒューレットパッカード１０９０  ＨＰＬＣで行なった。２０６ｎｍのｕ．ｖ．吸光度でのピークを集め、乾燥させて、ＴＬＣにより分析してＬａｃＣｅｒを含む画分を同定した。単離した画分を、４５℃でＳ．Ｅ．Ｄ．Ｅ．Ｒ．Ｅ．Ｓｅｄｅｘ５５蒸発質量検出器（アルフォルトヴィル、フランス）を用いて定量した。
７．  ＧＣ−ＭＳ分析
各単離されたＬａｃＣｅｒ画分について、３つの異なる分析を行なった。アリコートをメタノール処理し、当該メタノール溶液をヘキサンで抽出した。抽出された脂肪酸メチルエステルを、ＧＣ−ＭＳにより分析した（Irieら、J. Biochem. 108:531-536（1990）。メタノール層を乾燥させ、トリメチルシリル化してヘキサンに溶解した。得られたトリメチルシリル化メチルグリコシドを、ＧＣ−ＭＳにより分析した（Irieら、1990）。第２のアリコートを、セラミドグリカナーゼで処理（下記を参照）し、凍結乾燥させた。得られたアシル化スフィンゴシンとオリゴサッカリドをトリメチルシリル化し、ヘキサンに溶解し、ＨＴ−５アルミニウム被覆キャピラリーカラムでのＧＣ−ＭＳにより分析した。
再構成された膜での結合アッセイ
レセプター陰性細胞株Ｕ９３７から膜を調製し、前記のようにクロロホルム／メタノールで抽出した。蛋白質の中間層の除去後、上層と下層を合わせ、結合アッセイ対象の試料（ラクトシルセラミドまたは精製品由来の画分）とともにアルゴン流の下で乾燥させた。
あるいは、精製したリン脂質の混合物を結合アッセイに用いる試料とともに乾燥させた。当該リン脂質混合物は、ホスファチジルコリン（１３２μｇ）、ホスファチジルエタノールアミン（１１２μｇ）、ホスファチジルイノシトール（３６μｇ）およびホスファチジルセリン（５６μｇ）を含んでいた。
乾燥した脂質／試料標品を、短時間の音波処理によりＨＢＳＳ（５００μＬ）に再懸濁して、１２，０００ｘｇで１０分間遠心分離した。この遠心分離由来の上清を捨て、ペレットをＨＢＳＳ（５６０μＬ）に再懸濁した。２８０μＬのアリコートを、食塩水（３５μＬ）または未標識の非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン（３５μＬの１０ｍｇ／ｍＬストック）および3Ｈ−非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン（３５μＬの１０μｇ／ｍＬストック）を含有するチューブに添加した。３７℃で１時間アッセイをインキュベートし、その時間の後３つの１００μｌのアリコートを除去して、ミクロフュージチューブ中、１２，０００ｘｇ、室温で５分間遠心分離した。上清を捨てて、ペレットを１５０μＬのＨＢＳＳでリンスした。次いで、ペレットをＳＯＬＶＡＢＬＥTMに溶解し、シンチレーション液を添加して、放射能を測定した。
９６ウエルプレートでの結合アッセイ
ラクトシルセラミドまたは測定対象の試料をエタノールに懸濁させた。一定のアリコートを９６ウエルプレートのウエルに三連で添加して、風乾させた。下記成分：食塩水（１０μＬ）または未標識の非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン（１０μＬの１０ｍｇ／ｍｌストック）、3Ｈ−非誘導体化水溶性β（１−３）−グルカン（１０μＬの１０μｇ／ｍｌストック）およびＨＢＳＳ（８０μＬ）を前もって混合し、次いで、１００μＬを各ウエルに添加した。プレートを３７℃で１．５〜２時間インキュベートし、次いで、各ウエルから上清を除去して捨てた。ウエルをＨＢＳＳ（２００μＬ）でリンスし、ＳＯＬＶＡＢＬＥTM（１００μＬ）を添加した。当該プレートを６０℃で５分間インキュベートし、次いで、上清を除去して計数した。
均等物
当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識でき、又は確認することができるだろう。かかる均等物は下記の請求の範囲の範疇に含まれるものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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