(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）と比較して、Ｎ−末端で１３８アミノ酸だけトランケートされており、かつ天然ＴｄＴと比較してＣｏ２＋イオン含有溶液中で高い酵素活性を有することを特徴とする、仔ウシ胸腺由来のトランケート型ＴｄＴ誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載の仔ウシ胸腺由来のトランケート型ＴｄＴの組換え生産方法であって、以下のステップ：
a)   Ｎ−末端でトランケートされたＴｄＴ断片をコードする核酸断片であって、その後の精製を容易にするタンパク質タグをコードする核酸に融合されたまたは融合されていない該核酸断片を含有する発現プラスミドにより宿主細胞を形質転換すること、
b)  該宿主細胞をそれぞれの宿主細胞に適する培養条件下で培養して、組換えトランケート型ＴｄＴを発現させること、
c)  該組換えトランケート型ＴｄＴを該宿主細胞から単離すること、
d)  該組換えトランケート型ＴｄＴを機能アッセイに使用して、その機能を調べること、
を行うことを特徴とする上記方法。
【請求項３】
オリゴテイリング用途のための請求項１に記載のトランケート型ＴｄＴ誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の条件下で、全長ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）と比べて少なくとも20倍増大した活性を有する仔ウシ胸腺由来の組換えN-末端トランケート型TdT、ならびにその生産方法および使用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）は、脊椎動物由来の高度に保存された酵素であって、一本鎖または二本鎖DNAの3’-ヒドロキシル基への5’-三リン酸の結合を触媒する。それゆえ、この酵素は鋳型非依存的ポリメラーゼとして働く（Koiwaiら(1986), Nucleic Acid Research 14 (14), 5777-5792）。in vivoにおいて、TdTは免疫グロブリンとＴ細胞受容体の高度な多様性に寄与している。天然に存在するヌクレオシド三リン酸に加えて、TdTは通常、放射能標識した三リン酸や非放射能標識した三リン酸（例えば、ジゴキシゲニンまたはビオチンで標識した三リン酸）も受け入れる。このように標識した三リン酸を受け入れることから、このTdTは実験室や産業界での応用（例えば、オリゴテイリング、アポトーシス試験でのin situ細胞死検出）にとって興味深いものとなっている。
【０００３】
全長TdT（分子量 約58000 Da／520アミノ酸）はin vivoで段階的なタンパク質加水分解を受けてより小さな断片となるが、これらの断片は依然として酵素活性を保持している（Changら(1982), J. Biol. Chem. 257(10): 5700-5706）。このタンパク質加水分解プロセッシングは、58 kDa TdTのN-末端から開始して、分子量が56 kDa、44 kDaおよび42 kDaのペプチドをもたらし、これらは全て活性中心がまだ残っている。さらに、42 kDaのペプチドは分子量が32 kDaの活性TdT断片（これは２つのペプチド、すなわち、8 kDaのαペプチドと26 kDaのβペプチドから構成される）へと分解されることが知られている。この32 kDa断片も仔ウシ胸腺から単離する場合の主要な形態である（ChangおよびBollum (1986), CRC Crit. Rev. Biochem. 21(1): 27-52）。
【０００４】
仔ウシ胸腺からTdTを単離することは久しく知られている（DeibelおよびColeman (1979), J. Biol. Chem. 254(17): 8634-8640）。その上、DeibelおよびColemanにより開示された方法は、仔ウシ胸腺が安価な原料であるため、大規模実施の際にも経済的な方法である。しかしながら、この方法の欠点は、上述したタンパク質分解活性化のため、TdTを均一かつ純粋なバンドの形で精製することができず、また、活性のあるTdT断片を不活性なTdT断片から分離することもできないことである。しかも、ウシの原料からこれらの物質を単離することは、BSEに関連した問題からも、現在ではできるだけ回避することが望ましい。
【０００５】
ヒト全長TdTの大腸菌での発現は、Petersonら（1985, J. Biol. Chem. 260(19): 10495-502）および米国特許第5,037,756号（Bollumら）に記載されている。発現されたタンパク質は、TdTに対する抗体を使って大腸菌の粗抽出物中に検出され、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより全長産物として精製された。しかし、この方法におけるTdTの収率はかなり低いと思われる。少なくとも収率と機能試験については全く記載されていない。
【０００６】
1988年に、Changら（J. Biol. Chem. 263(25): 12509-12513）は、ヒト由来の全長TdTのバキュロウイルス系での発現を記載している。この場合の収率は総タンパク質含量のおよそ10％であり、得られた酵素は免疫および酵素活性を示す。この方法の欠点は、原核発現系と比べて収率が低いこと（バキュロウイルス系で異種タンパク質を発現させる際にしばしば認められる）および細胞培養発酵の生産コストが高いことである。
【０００７】
Yangら（1995; Nucleic Acids Research 23(11): 2041-2048）は、ニワトリ由来の全長TdTの大腸菌での発現を記載している。組換えTdTはベクターpET16bにクローニングされ、精製を容易にするためにHisタグと融合された。単離した後の組換えTdTの分析により全長産物が得られたが、それは天然ニワトリTdTの活性の半分の活性しか示さなかった。著者らの見解では、組換えTdTの活性が低い理由は、Hisタグが活性を妨害しているか、翻訳後修飾が存在しないためであるかのいずれかである。
【０００８】
Bouleら（1998, Molecular Biotechnology 10: 199-208）は、マウス由来の全長TdTの大腸菌での発現を記載している。発現率を高めるために強力なプロモーター（T7プロモーター）を使ったことにより、初めは、不活性の発現産物（封入体）が高い割合で産生される結果となった。その後、著者らは、誘導期の生育温度を劇的に下げる（15℃）ことによって、これを回避した。しかし、そのことの難点は、大腸菌細胞の生育が遅れることと、こうした発酵温度では泡の発生が増加することである。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、十分な酵素活性を有する均一な形態のTdTを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の根底にある上記課題は、仔ウシ胸腺由来の全長ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）と比較して、N-末端で最大161アミノ酸だけトランケートされており、Co2+イオン含有溶液中で20〜30倍高い酵素活性を有することを特徴とする、トランケート型のTdT酵素により達成される。
【００１１】
【発明の実施の形態】
特に、本発明によれば、N-末端で100〜160アミノ酸だけ短くなっているTdT酵素が有利であると分かった。中でも、N-末端で138アミノ酸だけ短くなっているTdTが好適である。このようなTdT誘導体は、仔ウシ胸腺由来の全長TdTと比べて、Co2+イオン含有溶液中で20〜30倍高い酵素活性を有する。本発明によるトランケート型TdTは、SDS-PAGEで測定して約36〜46 kDaの分子量、好ましくは40〜46 kDa、特に44〜46 kDaの分子量を有する。
【００１２】
本発明の別の主題は、仔ウシ胸腺由来のトランケート型TdTの組換え生産方法であり、この方法は、以下のステップ：
a)   N-末端でトランケートされたTdT断片をコードする核酸断片であって、その後の精製を容易にするタンパク質タグをコードする核酸に融合されていてもよい該核酸断片を含有する発現プラスミドにより宿主細胞を形質転換すること、
b)  該宿主細胞をそれぞれの宿主細胞に適する培養条件下で培養して、組換えトランケート型TdTを発現させること、
c)  該組換えトランケート型TdTを該宿主細胞から単離すること、
d)  該組換えトランケート型TdTを機能アッセイに使用して、その機能を調べること、
を行うことを特徴とする。
【００１３】
本明細書で用いる「宿主細胞」とは、細胞質において多量のタンパク質を活発に発現させることができる、あらゆる宿主細胞をさす。これらは通常は原核細胞、例えば、大腸菌（Escherichia coli）や枯草菌（Bacillus subtilis）であるが、酵母または真菌細胞、例えば、ピキア・パストリス（Pichia pasroris）、ピキア・メチロトロファ（Pichia methylotropha）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマセス・ポンベ（Schizosaccharomaces pombae）またはアスペルギルス sp.（Aspergillus sp.）も適していると分かった。本発明では、大腸菌細胞を使用することが好ましい。
【００１４】
原則として、仔ウシ胸腺TdTのcDNAから誘導できる断片は、それらがTdT活性をもつタンパク質をコードするかぎり、N-末端でトランケートされたTdT断片をコードする核酸として適している可能性がある。特に、本発明によれば、野生型酵素と比べて、N-末端で最大161アミノ酸を欠くトランケート型TdT酵素をコードする核酸配列が有利であると分かった。配列番号７、配列番号９または配列番号11に示される断片は本発明において特に有利であることが判明した。
【００１５】
トランケート型TdTタンパク質をコードする核酸分子は、発現されたTdTのその後の精製を容易にするタンパク質をコードする核酸配列と融合させることができる。適当な精製タンパク質タグおよびそれらをコードするDNA断片は、当業者によく知られている。(ポリ)Hisタグのほかに、例えば、ビオチン化タンパク質、Streptacin（登録商標）（”Inst. Fur Bioanalytik, IBA”, ゲッチンゲン/ドイツ）のようなストレプトアビジン結合性タンパク質、マルトース結合性タンパク質（例えば、米国特許第5,643,758号）、GSTおよびHAタグ（例えば、米国特許第5,654,176; WO 98/17691）を本発明に従って使用することが可能である。
【００１６】
本発明の他の主題は、宿主細胞の細胞質からトランケート型ターミナルトランスフェラーゼ誘導体を精製することである。組換えターミナルトランスフェラーゼを精製するための出発材料として、特にターミナルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現する大腸菌K12 UT5600細胞が使用された。
【００１７】
TdTの精製は通常４℃で行う。細胞溶解および核酸の分離（これらは公知の方法で行う）後、一連のクロマトグラフィー工程を実施する。本発明では、最初に、核酸を取り除いた画分を、例えば、Poros HS 50カラムを使って、イオン交換クロマトグラフィー（カチオン交換体）にかける。(ポリ)His、ビオチン化ペプチド、Streptacin（登録商標）またはマルトース結合性タンパク質のような精製助剤として働くタンパク質タグが、TdT誘導体に結合されている、すなわち、共発現されている場合は、続いてアフィニティークロマトグラフィーを実施する。(ポリ)Hisペプチドに結合されたTdT発現産物の場合は、市販されているニッケル-キレートカラムがその精製工程に特に適している。得られるTdT画分はその後、適当な疎水性クロマトグラフィー、例えば、フェニルセファロースファーストフロー（ff）でさらに精製する。上記の精製法により、混入酵素活性のない極めて純粋なターミナルトランスフェラーゼが得られる。SDSゲルでのモル質量が45.3 kDaのΔ138-TdTの純度を一例として図１に示す。
【００１８】
本発明によるトランケート型の組換えターミナルトランスフェラーゼペプチドは、驚いたことに、コバルト（Co2+）イオン含有溶液（いわゆるCo系）中での活性試験において、天然のターミナルトランスフェラーゼ誘導体よりも実質的に高い酵素活性を有する。天然のターミナルトランスフェラーゼは、Zn/Mg系と比べてCo系ではおよそ３〜４倍高い酵素活性を示す。これに対して、組換えN-末端トランケート型TdT誘導体は、20〜30倍増加した活性を示す。例えば、Δ138-TdT誘導体はZn/Mg系と比べてCo系では約23倍高い活性を有する。それゆえ、天然のターミナルトランスフェラーゼとは対照的に、組換えΔ138-TdTはCo系において格別高い酵素活性を有する。
【００１９】
さらに、組換えΔ138-TdT誘導体が機能試験において天然のターミナルトランスフェラーゼよりも著しく良好な性能を示すということは予想外のことである。30merオリゴヌクレオチド（5’-pTTG GGT AAC GCC AGG GTT TTC CCA GTC ACG OH-3’）をテイリング反応（tailing reaction）の鋳型として用いた。反応が完了した後、テイリング実験の反応産物を６％アガロースゲルで分離し、評価した（図２）。組換えTdTからは、テイリング反応のより長い（それゆえ、より良好な）産物が得られた。
【００２０】
配列表の説明
配列番号１  仔ウシ胸腺由来のTdTのcDNA配列（22〜1581位）
配列番号２  仔ウシ胸腺由来のTdTのアミノ酸配列（520アミノ酸）
配列番号３  5’プライマー（58ヌクレオチド）
配列番号４  5’プライマー（63ヌクレオチド）
配列番号５  5’プライマー（60ヌクレオチド）
配列番号６  3’プライマー（42ヌクレオチド）
配列番号７  Hisタグをもつトランケート型TdT、Δ138-TdTをコードする核酸配列（1187ヌクレオチド）
配列番号８  Hisタグをもつトランケート型TdT、Δ138-TdTのアミノ酸配列（392アミノ酸）
配列番号９  Hisタグをもつトランケート型TdT、Δ152-TdTをコードする核酸配列（1148ヌクレオチド）
配列番号10  Hisタグをもつトランケート型TdT、Δ152-TdTのアミノ酸配列（379アミノ酸）
配列番号11  Hisタグをもつトランケート型TdT、Δ161-TdTをコードする核酸配列（1121ヌクレオチド）
配列番号12  Hisタグをもつトランケート型TdT、Δ161-TdTのアミノ酸配列（370アミノ酸）
【００２１】
【実施例】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明する。
【００２２】
組換えDNA法
DNAを操作するために、Sambrook, J.ら (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載されるような標準方法を採用した。キットを使用する場合は製造業者の推奨どおりに行い、また、分子生物学的試薬は製造業者の説明書に従って使用した。
【００２３】
実施例１
トランケート型TdTの作製
配列番号２に示す仔ウシ胸腺由来のターミナルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の完全なリーディングフレームを含む、配列番号１に示す1923 bpの挿入断片を含有するcDNAクローン（Kowaiら(1986), Nucleic Acids Res. 14: 5777-5792）に基づいて、配列番号３〜６に示すオリゴヌクレオチド（PCRにより完全なリーディングフレームからのトランケート型遺伝子の単離を可能にするオリゴヌクレオチド）を設計した。5’プライマー（配列番号３〜５）のそれぞれは、それらがコード領域の下流にアミノ酸 Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-Hisのコドンを含むように、それゆえに、トランケート型TdTペプチドがN-末端でHisタグと融合されるように、設計した。5’プライマーは制限エンドヌクレアーゼの認識配列を含まないが、平滑末端によって5’末端にクローン化されるべきである。一方、3’プライマーにはコード領域の下流に制限エンドヌクレアーゼHindIIIの認識配列がある。
【００２４】
N-末端で138アミノ酸だけトランケートされたTdT（Δ138-TdT）をコードする遺伝子を単離するために、配列番号３（5’プライマー）と配列番号６（3’プライマー）に示すオリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を実施した。配列番号８に示すHisタグをもつΔ138-TdTをコードする、配列番号７に示す得られたPCR産物を配列決定により確認した。
【００２５】
N-末端で152アミノ酸だけトランケートされたTdT（Δ152-TdT）をコードする遺伝子を単離するために、配列番号４（5’プライマー）と配列番号６（3’プライマー）に示すオリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を実施した。配列番号10に示すHisタグをもつΔ152-TdTをコードする、配列番号９に示す得られたPCR産物を配列決定により確認した。
【００２６】
N-末端で161アミノ酸だけトランケートされたTdT（Δ161-TdT）をコードする遺伝子を単離するために、配列番号５（5’プライマー）と配列番号６（3’プライマー）に示すオリゴヌクレオチドを用いてPCR反応を実施した。配列番号12に示すHisタグをもつΔ161-TdTをコードする、配列番号11に示す得られたPCR産物を配列決定により確認した。
【００２７】
トランケート型TdTペプチドの発現プラスミドの構築
TdTを発現させるために、それぞれのトランケート型遺伝子を、該構造遺伝子が適当なプロモーター、好ましくはIPTG誘導プロモーター（例えば、lac、lacUV5、tacまたはT5プロモーター）、特に好ましくはlacプロモーターの制御下に正しい方向で挿入されるように、発現ベクターにクローニングした。そのために、それぞれのPCR産物を3’末端でHindIIIにより再切断したが、5’末端に変化はなかった。この制限混合物をアガロースゲル電気泳動により分離したが、Δ138-TdT遺伝子については1181 bpの断片をアガロースゲルから単離し、Δ152-TdT遺伝子については1139 bpの断片を単離し、Δ161-TdT遺伝子については1115 bpの断片を単離した。それぞれの断片はHisタグをコードする核酸を含んでいた。発現のために種々の発現プラスミド、例えば、pUC、pDS、pQE、pKK、好ましくは、pUC18（Yanisch-Perronら(1985) Gene 33: 103-119）を使用した。トランケート型TdTペプチドの遺伝子を挿入するため、pUC18を最初にEcoRI（Roche Diagnostics）で製造業者の説明書に従って切断し、この制限エンドヌクレアーゼEcoRIを65℃で15分インキュベートして失活させた。生じた突出端を、Klenowポリメラーゼ（Roche Diagnostics）を製造業者の説明書に従って用いてフィルインし、平滑末端を形成させた。Klenowポリメラーゼを、この場合も65℃で15分インキュベートして失活させた。続いて、ベクター断片をHindIII（Roche Diagnostics）で切断し、制限混合物をアガロースゲル電気泳動で分離し、約2656 bpのベクター断片をアガロースゲルから単離した。このようにして得られたベクター断片を分離し、トランケート型TdTペプチドの単離されたPCR産物と連結させた。これらの遺伝子の正しい挿入を、制限コントロールおよび配列決定により確かめた。得られたプラスミpUC18Δ138-TdT、pUC18Δ152-TdT、およびpUC18Δ161-TdT（図１参照）をそれぞれ別個に、ヘルパープラスミドpUBS520とともに各種の大腸菌株に形質転換した。ヘルパープラスミドpUBS520（Brinkmannら, 1989, Gene 85: 109-114）は、lacリプレッサーをコードするlacIq遺伝子および大腸菌中の稀なtRNAARG（コドンAGAとAGGを認識する）をコードするdnaY遺伝子を保有する（Garciaら, 1986, Cell 45: 453-459）。選択マーカーとしては、トランスポゾンTN903由来のカナマイシン耐性遺伝子を使用した。
【００２８】
実施例２
発現プラスミドpUC18Δ138-TdT、pUC18Δ152-TdT、およびpUC18Δ161-TdTの各種大腸菌発現株への形質転換
Hanahanの方法（J. Mol. Biol. 1993, vol. 166: 557）に従って各種大腸菌株のコンピテント細胞を調製した。この方法で調製した200μlの細胞を、20ngの単離した発現プラスミドpUC18Δ138-TdT、pUC18Δ152-TdTおよびpUC18Δ161-TdT、ならびに40ngのヘルパープラスミドDNAと混合した。氷上で30分インキュベートした後、それらに熱ショック（42℃で90秒）を与えた。続いて、細胞を１mlのLB培地に移し、表現型発現のためLB培地中37℃で１時間インキュベートした。この形質転換混合物のアリコートを、選択マーカーとしてアンピシリンとカナマイシンを含むLBプレートに接種し、37℃で15時間インキュベートした。好ましい菌株としては、大腸菌K12株C600、DH3α、LE392、JM83、JM105、NM522、M15、RR1Δ15、UT5600、TG1、A1200、または大腸菌B株BL21、HB101があり、大腸菌UT5600が特に好ましいものである。
【００２９】
実施例３
大腸菌でのトランケート型TdT遺伝子の発現
トランケート型TdTペプチドをコードする遺伝子を発現させるために、プラスミド含有クローンを3mlのLBampkan培地に接種し、振とうしながら37℃でインキュベートした。光学密度0.5（550nmで測定、OD550）において0.5mMのIPTGを用いて細胞を誘導し、振とうしながら37℃で4時間インキュベートした。続いて、個々の発現クローンの光学密度を測定して、mlあたり5.0のOD550に相当するアリコートを取り出し、細胞を遠心分離した（10分、6000rpm、4℃）。細胞ペレットを400μlのTEバッファー（50mM Tris/50mM EDTA, pH8.0）に再懸濁し、超音波で細胞を破砕し、可溶性タンパク質画分を遠心分離（10分、13800rpm、4℃）により不溶性タンパク質画分から分離した。SDSおよび2-メルカプトエタノールを含むアプリケーションバッファーを全ての画分に添加し、タンパク質を煮沸（100℃で5分）して変性させた。次いで、10μlアリコートを分析用SDSゲル（10％）により分析した（Laemmli U.K. 1970 Nature 227: 555-557）。
【００３０】
SDSゲルを評価したところ、トランケート型TdT断片の明らかな過剰発現が存在することがわかった。過剰発現された追加のバンドは、約45 kDa（Δ138-TdT）または44 kDa（Δ152-TdT）または43 kDa（Δ161-TdT）に認められ、これらは、誘導しなかった対照クローン、あるいは誘導したがプラスミドを含有しない対照クローンには見られなかった。この発現戦略を使用したときは、高い増殖温度でさえも、可溶性タンパク質画分中に全てのTdT断片が検出されたが、同レベルでの対応するバンドは不溶性タンパク質画分中には検出されなかった。
【００３１】
実施例４
ターミナルトランスフェラーゼ活性の測定
ターミナルトランスフェラーゼ活性を測定するために様々な試験を行った。
１．非放射能試験（試験Ａ）
非放射能試験系を用いて、精製中の画分のターミナルトランスフェラーゼ活性を検出した。そのためにDIG Oligo 3’末端標識付けキット（Roche Diagnostics GmbH、カタログ番号1 362 372）を使用した。インキュベーション時間を30分に延長した。
【００３２】
２．放射能試験系
Ａ．Zn/Mg系での試験（試験Ｂ）
亜鉛およびマグネシウムイオンを含む放射能試験系によりプール画分のターミナルトランスフェラーゼ活性を測定した。ターミナルトランスフェラーゼ活性に関する試験は、試験容量60μl（40mMカコジル酸カリウム, pH6.8, 0.33mM ZnSO4, 10mM MgCl2, 1mM dATP, 0.1ABポリd(pT)6, 12.5pM [3H]-dATP）で実施した。ターミナルトランスフェラーゼ（10μl）を適当な希釈率で添加した。37℃で30分インキュベートした後、10% TCA溶液（1000μl）を加えて反応を停止させた。生成された放射能標識産物をニトロセルロースフィルター上に沈澱させてから洗浄した。放射能の取込み率をシンチレーションカウンターで測定し、サンプルのターミナルトランスフェラーゼ活性を算出した。これに関連して、１酵素単位は、37℃で60分以内に酸不溶性産物に1.0nMのdAMPを取り込ませるターミナルトランスフェラーゼの量として定義した。
【００３３】
この試験は、天然および組換えターミナルトランスフェラーゼの活性をルーチンに測定するために使用されている試験である。
【００３４】
Ｂ．Co系での試験（試験Ｃ）
ターミナルトランスフェラーゼ活性はコバルトイオンを含有する試験系でも測定された。この試験は、試験容量120μl（200mMカコジル酸カリウム, pH7.2, 1mM CoCl2, 1mM dTTP, 0.1ABポリd(pT)6, 37.5pM [3H]-dTTP）で実施した。ターミナルトランスフェラーゼ（10μl）を適当な希釈率で添加した。37℃で30分インキュベートした後、10% TCA溶液（1000μl）を加えて反応を停止させた。生成された放射能標識産物をニトロセルロースフィルター上に沈澱させてから洗浄した。放射能の取込み率をシンチレーションカウンターで測定し、サンプルのターミナルトランスフェラーゼ活性を算出した。これに関連して、１酵素単位は、プライマーとしてd(pT)6を使用して、37℃で60分以内に酸不溶性産物に1.0nMのdTMPまたはdATPを取り込ませるターミナルトランスフェラーゼの量として定義した。
【００３５】
混入活性に関する試験
混入している外来活性の存在についての試験は、10mM Tris/HCl, pH7.5, 10mM MgCl2, 1mM DTEからなる溶液中で実施した。
【００３６】
適当な各酵素画分のサンプルを対応する核酸とともにインキュベートした。いわゆるニッキング活性は、プラスミドpBR322（1μg）とともに37℃で2〜16時間インキュベートして検出した。非特異的ヌクレアーゼは、λDNA／EcoRI，HindIII（1μg）とともに37℃で2〜16時間インキュベートして検出した。
【００３７】
エキソヌクレアーゼ混入に関する試験の場合は、サンプルを4μgの[3H]-標識DNAとともに37℃で4時間インキュベートし、その後放出された[3H]-標識ヌクレオチドを測定した。
【００３８】
実施例５
ターミナルトランスフェラーゼの精製
ターミナルトランスフェラーゼ遺伝子を過剰発現した大腸菌K12 UT5600細胞（上記参照）を、組換えターミナルトランスフェラーゼを精製するための出発原料として使用した。
【００３９】
TdTの精製は4℃で行った。細胞溶解および一連のクロマトグラフィー工程による核酸の分離後に精製を実施した。この精製法は混入している酵素活性が取り除かれた組換えTdTをもたらす。
【００４０】
使用する溶液：
バッファーA：50mM Tris/HCl, pH7.6, 0.5M NaCl, 50mM LiCl
バッファーB：50mM KPO4, pH6.0, 5% グリセロール
バッファーC：50mM Tris/HCl, pH7.6, 0.5M NaCl, 5% グリセロール
バッファーD：20mM KPO4, pH7.0, 1.3M 硫酸アンモニウム, 5% グリセロール
保存バッファー：60mM KPO4, pH7.2, 150mM KCl, 1mM 2-メルカプトエタノール,                0.5% Triton X-100, 50% グリセロール
【００４１】
細胞溶解：
約1100gの大腸菌K12 UT5600細胞を4000mlのバッファーAと混合して解凍し、懸濁させた。この懸濁液に20mlの0.1M PMSF溶液（Roche Diagnostics GmbH、カタログ番号2 36 608）を添加した。次いで細胞を冷却（温度＜10℃）しながら高圧分散（Gaulin Lab-60）により溶解した。これにより、40〜50％の典型的な溶解度の細胞懸濁液が得られた。
【００４２】
核酸の沈澱：
続いて、Polymin沈澱により核酸を取り除いた。100mlの10% Polymin-P溶液を滴下して添加した。沈澱が不十分な場合には、さらに滴下による添加を行った。4℃で30分インキュベートしてから遠心分離（30分、5000rpm、4℃）を行った。
【００４３】
クロマトグラフィー精製：
Poros HS 50カラムでのクロマトグラフィー：
透析した遠心分離上清を、バッファーB＋0.2M NaClで平衡化したPoros HS 50カラム（9cm×20cm、PerSeptiv）にアプライし、約10LのバッファーB＋0.2M NaClで洗浄した。酵素の溶出は、バッファーB＋200mM NaClおよびバッファーB＋1M NaClの直線勾配を用いて全量8Lで行った。流量を100ml/分、画分サイズを100mlとした。ターミナルトランスフェラーゼは300mM〜700mMのNaCl濃度で溶出した。
【００４４】
Ni-キレートカラムでのアフィニティークロマトグラフィー：
透明なプール画分をK2HPO4でpH7.5に調整し、1/100のバッファーC＋1Mイミダゾールと混合し、その後、バッファーC＋10mMイミダゾールで平衡化してニッケルをローディングしたキレートSepharose ffカラム（2.6cm×10cm、Pharmacia）にアプライした。次いで、カラムを約800mlのバッファーC＋20mMイミダゾールで洗浄し、その後バッファーC＋30mMイミダゾールで洗浄した。酵素の溶出は、バッファーC＋30mMイミダゾールおよびバッファーC＋1Mイミダゾールの直線勾配を用いて全量600mlで行った。流量を12ml/分、画分サイズを25ml/画分とした。酵素は50mM〜200mMのイミダゾール濃度で溶出した。
【００４５】
活性のある画分をすべてプールした。このプールに固体の硫酸アンモニウムを添加して最終濃度を1.3Mとした。
【００４６】
フェニルSepharose ffでのクロマトグラフィー：
その後、バッファーDで平衡化したフェニルSepharose ffカラム（2.6cm×10cm、Pharmacia）にプール画分をアプライした。このカラムを初めに約400mlのバッファーDで、次に約600mlのバッファーD＋500mM硫酸アンモニウムで洗浄した。この洗浄工程で酵素が溶出された。流量を10ml/分、画分サイズを10mlとした。
【００４７】
活性のある画分をプールし、保存バッファーに対して透析した。純度を調べるために、SDSと2-メルカプトエタノールを含むアプリケーションバッファーを精製したタンパク質に加え、このサンプルを煮沸（100℃で5分）して変性させた。続いて、サンプル（20μl）を分析用SDSゲル(4〜20％)により分析した（Laemmli U.K. 1970 Nature 227: 555-557）。上記精製法により、高純度の分子質量45.3 kDaのターミナルトランスフェラーゼが得られた（図１）。
【００４８】
実施例６
天然および組換えターミナルトランスフェラーゼの活性の比較
テイリング反応における組換えターミナルトランスフェラーゼの性能が向上していたため、これら２種のターミナルトランスフェラーゼの酵素活性は２つの異なる試験系で調べた。そのために、Zn/Mg系（試験Ｂ）およびCo系（試験Ｃ）を採用した。
【００４９】
【表１】
異なる試験系（Zn/Mg系およびCo系）における天然および組換えターミナルトランスフェラーゼの活性
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【００５０】
天然のターミナルトランスフェラーゼはZn/Mg系よりもCo系において３〜４倍程度高い活性を有する。これに対して、組換えターミナルトランスフェラーゼはZn/Mg系よりもCo系において23倍程度高い活性を有する。したがって、天然のターミナルトランスフェラーゼと比較して、組換えターミナルトランスフェラーゼはCo系において酵素活性のより顕著な向上を示す。
【００５１】
この活性の違いは、テイリング反応において組換えターミナルトランスフェラーゼの活性が向上していたことに対する説明となる。
【００５２】
実施例７
ターミナルトランスフェラーゼの機能試験
得られた組換えターミナルトランスフェラーゼを機能試験で検査した。この機能試験はオリゴテイリング反応によるものである。そのために、Dig Oligonucleotide Tailingキット（Roche Diagnostics GmbH, カタログ番号1 417 231）において10単位の組換えTdTと10単位の天然TdTを使用した。テイリング反応の鋳型として30merオリゴヌクレオチド（5’-pTTG GGT AAC GCC AGG GTT TTC CCA GTC ACG OH-3’）を使用した。
【００５３】
テイリング実験の反応産物を6%アガロースゲルで分離して評価した（図２）。組換えTdTからは、より長い（それゆえに、より良好な）テイリング反応産物が得られた。
【００５４】
本発明に従うTdTと既知の製剤との比較
【表２】
異なる試験系での天然および組換えTdT並びに各種製造元のTdT製剤の活性
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【００５５】
参考文献
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【００５６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】精製したターミナルトランスフェラーゼのSDSゲル電気泳動を示した図である。レーン１：分子量マーカー12（Novex Co.）；レーン２：ターミナルトランスフェラーゼ 10単位（Zn/Mg系）
【図２】オリゴテイリング反応のアガロースゲル電気泳動を示した図である。レーン１、４：オリゴヌクレオチド；レーン２：テイリング反応の産物、10単位のTdT、天然型；レーン３：テイリング反応の産物、10単位のTdT、組換え型；LSV：DNA分子量マーカーV（Hae IIIで切断したpBR322 DNA、8〜587 bpの22の断片、Roche Diagnostics GmbH カタログ番号 821 705）
【図１】
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【図２】
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