(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽い高カリウム血症を引き起こすのに十分な量で、薬学的に受容可能なインスリン、薬学的に受容可能なグルコース、および薬学的に受容可能なカリウムイオンまたはその薬学的に受容可能な塩の有効量の混合物を含有する、リンパ球増殖を増加させるための薬学的組成物であって、該組成物において、該インスリンの量は、３．５Ｕと１６８Ｕとの間であり、該グルコースの量は、２８０ｇと１４００ｇとの間であり、該カリウムイオンまたはその薬学的に受容可能な塩の量は、８０ｍＥｑ／Ｌを超えない濃度で、９８ｍＥｑと４９０ｍＥｑとの間であり、そして該軽い高カリウム血症は、カリウムレベルが、６．５ｍＥｑ／Ｌ血清であるものとして定義される、薬学的組成物。
【請求項２】
甲状腺製剤、ピロカルピンを含むコリン作動性薬剤、および炭酸水素塩からなる群より選択される１つ以上のさらなる物質を含有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
局所的処方物または坐薬の形態の、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
癌を処置するために使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
軽い高カリウム血症を引き起こすのに十分な量で、薬学的に受容可能なインスリン、薬学的に受容可能なグルコース、および薬学的に受容可能なカリウムイオンまたはその薬学的に受容可能な塩の有効量の混合物を含有する、リンパ球増殖を増加させるための薬学的キットであって、該キットにおいて、該インスリンの量は、３．５Ｕと１６８Ｕとの間であり、該グルコースの量は、２８０ｇと１４００ｇとの間であり、該カリウムイオンまたはその薬学的に受容可能な塩の量は、８０ｍＥｑ／Ｌを超えない濃度で、９８ｍＥｑと４９０ｍＥｑとの間であり、そして該軽い高カリウム血症は、カリウムレベルが、６．５ｍＥｑ／Ｌ血清であるものとして定義される、キット。
【請求項６】
甲状腺製剤、ピロカルピンを含むコリン作動性薬剤、および炭酸水素塩からなる群より選択される１つ以上のさらなる物質を含有する、請求項５に記載の薬学的キット。
【請求項７】
局所的処方物または坐薬の形態の、請求項５または６に記載の薬学的キット。
【請求項８】
癌を処置するために使用される、請求項５〜７のいずれか１項に記載の薬学的キット。
【請求項９】
ヒトを除く哺乳動物においてリンパ球増殖を増加させるための方法であって、該方法が、軽い高カリウム血症を引き起こすのに十分な量で、薬学的に受容可能なインスリン、薬学的に受容可能なグルコース、および薬学的に受容可能なカリウムイオンまたはその薬学的に受容可能な塩の有効量の混合物を該ヒトを除く哺乳動物に投与する工程を包含し、該方法において、該インスリンの量は、３．５Ｕと１６８Ｕとの間であり、該グルコースの量は、２８０ｇと１４００ｇとの間であり、該カリウムイオンまたはその薬学的に受容可能な塩の量は、８０ｍＥｑ／Ｌを超えない濃度で、９８ｍＥｑと４９０ｍＥｑとの間であり、そして該軽い高カリウム血症は、カリウムレベルが、６．５ｍＥｑ／Ｌ血清であるものとして定義される、方法。
【請求項１０】
甲状腺製剤、ピロカルピンを含むコリン作動性薬剤、および炭酸水素塩からなる群より選択される１つ以上のさらなる物質を投与する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合物が局所的処方物または坐薬の形態である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
癌を処置するために使用される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫増強治療と、それに対して有用な組成物の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
Jennerが200年以上前に患者の天然痘に対する予防接種に成功して以来、医師は他の病気に対処するために免疫性を増強する方法を探求してきた。種々の形態の免疫感作が、灰白髄炎、ジフテリア、百日咳、腸チフス、おたふくかぜ、および風疹などの、数多くの病気から重篤な結果または死さえも除去されてきた。
【０００３】
免疫の増強は、癌、免疫不全症候群、ある種の局所および全身感染、ハンセン病、結核、帯状疱疹、いぼ、ヘルペス、マラリア、歯肉炎、アテローム性動脈硬化症などと診断された患者の治療における望ましい目標である。
【０００４】
約100年前William Coleyは、癌に対して免疫系の援助を得ようと試みた。彼は生菌を感染させることにより癌患者を治療することに、いくらかの成功を納めた。しかし、感染が患者に重大な問題を生じさせたので、彼は死菌に基づいたワクチンの開発に方向転換した(Old, L.J. (1988),「腫瘍壊死因子」Scientific  American  258:59-60)。これらの調製物はColey毒素と呼ばれた。彼は限られた成功のみを納めた。まもなく放射線および化学療法が、彼の選択した治療法としての毒素に取って変わった。
【０００５】
しかし、研究者らは免疫増強が腫瘍を破壊する可能性に興味をそそぎ続けた。Lewis  ThomasおよびMacfarlane  Burnetは、Theory  of  Immune  Surveillanceにおいて、身体が日常的に変異に対処しなければならず、それゆえそのような不良細胞に一定の監視を行っていると示唆したとき、その動向が促進された。ヒトの腫瘍が宿主に免疫原性であり、そしてそれゆえ、不十分ではあるが、免疫応答を引き起こすという認識が、研究者らに癌の免疫療法は可能であるとの希望を生じさせた(Patillo, R. (1974),「栄養芽細胞癌」Hormones  and  Cancer, (K.W. McKerns編), Academic  Press, New  York, p. 384；Prehn, R.T. (1976),「腫瘍は宿主の免疫応答のゆえに増殖するか?」Transplantation  Reviews  28:34-42；Ellenhorn, J.D.ら(1988),「抗CD3のインビボ投与は悪性進行性腫瘍増殖を妨げる」Science  242:569-571)。
【０００６】
めったにないが明らかにしばしば感染の後に自然に生じる腫瘍の退縮は、なおさらに奨励をもたらした。免疫系の精巧な特異性、すなわち感染に対して抵抗性を与え移植物を破壊するその能力は、増強された免疫が理想的な癌の治療であろうと期待させた。しかし、多くの試みがなされたが限られた成果のみであった。
【０００７】
免疫調節の理解における最初の解明は、David  Talmage、Niels  Jerne、およびMacfarlane  Burnetによって展開されたクローン選択説(Clonal  Selection  Theory)によってもたらされ、抗原とリンパ球レセプターが適合するとき、リンパ球は活性化と増殖について「選択」されると提案されている。しかし、クローン選択説の概念が免疫調節の理解に極めて大きく貢献したにもかかわらず、免疫増強法の発見はほとんど進展しなかった。臨床医学者はシクロスポリンまたはグルココルチコイドのような薬剤によって免疫反応を減少させ得たが、それを増強することはできなかった。
【０００８】
第２の重要な手がかりは、リンホカインおよびサイトカインの群の発見から生じた。免疫細胞によって主として放出される抗原非特異的調節タンパク質(これに限定されない)が、免疫応答の大きさを制御することが示された。抗原結合のみがクローンに拡張する細胞を選択し得るが、その細胞は１つまたはそれより多くのこれらのタンパク質からの刺激も受けた場合のみ増殖し得る。インターフェロン、あるいはインターロイキン-1または-2のようなこれらの物質のいくつかは、免疫細胞を直接的に刺激する。他のタンパク質は骨髄を刺激して、より多くの白血球を生産させる(Golde, D.W.ら(1988),「血液細胞の増殖を刺激するホルモン」Scientific  American  259:62-71)。
【０００９】
いくつかの物質はマクロファージおよび多形核白血球に対する化学的誘引物質として作用し、内皮細胞上にレセプターを誘導し、その結果循環白血球がそれらに付着し(Bevilacquam  M.J.ら(1989),「内皮白血球接着分子１：補体調節タンパク質およびレクチンに関連する好中球についての誘導レセプター」Science  243:1160)、そして内皮細胞を分離させ、その結果白血球が血管区画を離れて創傷に入り得る。いくつかの物質は強力な脈管形成因子であり、傷害を受けた組織における血管の置換を刺激する。いくつかの物質は食細胞を固定化し、創傷からの遊走を抑制する。他の物質はマクロファージを活性化して、破片および病原体を食作用させ、そしてより多くの因子(例えば、カケクチンおよびインターロイキン1)を生産させる。繊維芽細胞は刺激を受け、フィブリン障壁を形成して病原体を局部的領域へ限定する。１種のサイトカインであるカケクチン(腫瘍壊死因子-α)は、Coleyが証明した効果を担う物質のようである(Old,L.J. (1988),「腫瘍壊死因子」Scientific  American  258:59-60)。
【００１０】
これらの物質の援助を得て、免疫を増強し腫瘍に対する攻撃を引き起こす多大な努力がはらわれている。いくつかの成功が達成されている。白血球から主に生産されるインターフェロン-αは、低度の非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、慢性骨髄性白血病、カポジ肉腫、および特に毛様細胞白血病の治療において効果的である。完全には理解されていない理由により、一部の患者には効果がほとんどなく、上記以外の腫瘍には効果がないようである(Oppenheim  J.J.ら(1987), Basic  and  Clinical  Immunology,第６版, (D.P. Stitesら,編), Appleton  and  Lange, Los  Altos,CA, p. 94)。
【００１１】
カケクチンを使用して腫瘍を破壊する炎症を引き起こす努力は、不本意にも一貫しない結果および危険な毒性をもたらした(Old, L.J. (1988年,４月),「腫瘍壊死因子」Scientific  American  258:59-60)。
【００１２】
ヘルパーＴ細胞により生産されるインターロイキン-2はその腫瘍に対する効果について集中的に研究されている。これらで最も成功した研究において、腫瘍に浸潤していたリンパ球はインビトロでIL-2により活性化される。細胞が十分量まで増殖すると、それらは、追加のIL-2とともに、患者に注射される(Rosenberg, S.A.ら(1986),「腫瘍浸潤リンパ球を使用した癌の養子免疫療法の新しいアプローチ」Science  233:1318-1321；Rosenberg, S.A. (1990),「癌の養子免疫療法」Scientific  American  262:62-69;Geiger, J.D.ら(1993),「自然転移の治療に有効な弱免疫性B16-BL6黒色腫に反応するＴ細胞の生成」J. Immunother. 13:153-165；Chang, A.E.ら(1993),「インビトロで腫瘍に対して２次的に感受性にしたワクチン感作Ｔリンパ球を使用した養子免疫療法に対する臨床的観察」Cancer  Res. 53:1043-1050)。実験は、結腸癌および腎臓癌、ならびに悪性黒色腫の治療に部分的に成功した。約20%の患者が少なくとも何らかの応答を示した。少数は数ヶ月の間徴侯が現れなかった。不幸にも、IL-2は腫瘍の処置において最も有用な量で毒性があることが示された(Oppenheim, J.J.ら(1987), Basic  and  Clinical  Immunology,第６版, (D.P. Stitesら,編), Appleton  and  Lange, Los  Altos,CA, p. 94；Petska,S. (編), (1992年,１月),「免疫療法における現在のアプーチと障害」Pharm. Tech., pp. 26-35)。毒性の影響には、不快、発熱、吐き気または嘔吐、下痢、および貧血が挙げられる。そこで、インビトロまたはインビボで選択されたリンパ球の刺激のための無毒性の方法が必要とされる。
【００１３】
リンパ球が抗原により選択されるとき、最初に検出可能な効果は電気化学的勾配に沿ったカリウムの流出とナトリウムの補償流入である。リンパ球はサイトカインによる刺激に応答し得る前、カリウムの細胞内レベルをエネルギー依存性の作用であるナトリウム/カリウムポンプ(Na+K+  ATPase)によって正常に回復しなければならない。多くの研究者が、Na+K+  ATPaseの遮断が細胞の活性化または増殖を抑制することを示した(例えば, Ward, P.A. (1985)「炎症」Immunology  III, (J.A. Bellanti,編), W.B. Saunders, Co., Philadelphia, PA, p. 212；Handwerger, B.S.およびDouglas, S,D. (1980)「胚子発生の細胞生物学」The  Cell  Biology  of  Inflammation (G. Weissmann,編), Elsevier, New  York/N. Holland Biomedical Press, Amsterdam, p. 654を参照のこと)。腫瘍細胞は、化学療法に耐性になることが報告されており、これはナトリウム-カリウムイオンポンプの刺激がこの薬剤耐性を逆転し得ると示唆している。Lewrence, T.S.およびDavis, M.A. (1990),「ヒト腫瘍細胞におけるドキソルビシンを介した細胞傷害およびDNA鎖破損に対するNa、Kポンプ遮断の影響」Cancer  Chemother. and  Pharmacol. 26:163-167。
【００１４】
他の研究者は正常な細胞内カリウム貯蔵がリンパ球の活性化に必須であることに留意しているが(Owens,T.およびKaplan, J.G. (1981),「活性化されたマウスＴおよびＢリンパ球における１価陽イオン流」Mechanisms  of  Lymphocyte  Activation (Resch, K.およびKirchner, H.編) p. 238-241；Grinstein, S.およびDixon, S.J. (1989),「リンパ球におけるイオン輸送、膜ポテンシャル、および細胞質pH：活性化中の変化」Physiol. Rev. 69:417-481；Calahan, M.D.ら(1991),「Ｔリンパ球の発生、活性化、および病気におけるカリウムチャンネル」Developmental  Biology  of  Membrane  Transport  Systems (Benos, D.J.編), p. 357-394)、カリウムの補充(repletion)を介して免疫を活性化させる最近の努力はない。1940年代にMax  Gerson博士は、種々のカリウム塩の経口投与を含む癌の栄養学的治療を考案した。彼はいくらかの成功を主張したが、ニューヨーク医学会は彼の方法は価値がないと宣言した。Gersonの治療は、彼がJohn  Guntherの若い息子の脳腫瘍を治療したときに、いくらかの名声を獲得した。その少年は死亡した。Gersonの治療は彼の著書A  Cancer  Therapy：Results  of  Fifty  Cases (New  York：Dura  Books, Inc., 1958), p. 237-248)に記載されている。彼は死去したが、患者はメキシコにおいて、彼の治療法の改変型によりいまだに治療を受けている。
【００１５】
不完全なアポトーシスまたは細胞自滅の現象もまた癌の原因に関係付けられている(Edgington, S.M. (1993),「目で死を見る：アポトーシスと癌研究--癌は本当に自滅の合図を示すための細胞の拒絶によって起こるか?」Bio/Tech. 11:787-792；Hardin, J.A.ら(1992),「DNA断片化を受けるリンパ球の表面抗原表現型解析のための簡単な蛍光発光法」J. Immuno. Meth. 154:99-107)。カリウムが、細胞におけるアポトーシスを引き起こす役割を有することが示唆されている(Ojcius, D.M.ら(1991),「イオノフォア-誘導性アポトーシス：DNA断片化およびカルシウム流の役割」Exp. Cell Res. 197:43-49)。
【００１６】
甲状腺抑制剤および甲状腺除去が、すべてのカテゴリー(発癌物質誘導性、移植性、および自然発生)の癌の病原性を増加させることが示されている。統計によって、甲状腺機能低下症の患者に最も一般的であり、そして甲状腺機能亢進症の患者で最も頻度の低い病気について、癌を、甲状腺の機能と逆に関連付けている。１つの研究において、胸部癌を甲状腺機能亢進症の女性と比較したところ、極度の甲状腺機能低下症の女性は９倍、甲状腺摘出した女性は16倍であった。1950年代のはじめ、Alfred  A. Loeser博士は胸部癌患者に甲状腺製剤を投与して良好な結果を得た。他の研究では、実質的に何ら応答がなかった(McGrady,P. (1964), The  Savage  Cell, Basic  Books, Inc., New  York, p. 139)。
【００１７】
インスリンが血清カリウム濃度を低下させることは長年知られていた(Kassirer, Jerome  P.ら(1989), Repairing  Body  Fluids：Principles  and  Practice, p. 47)。そして、インスリンが、他の多くのホルモン、神経伝達物質、およびオータコイドと同様に、免疫応答、特にＴリンパ球の機能の調節に関与することが確立されている(Koffler, Michaelら(1991),「正常および肥満の被験者における同種異系活性化リンパ球に対するインスリンレセプターの調節の免疫生物学的結果」Diabetes, 40:364-370；Coffey, Ronald  G.およびHadden, John  W. (1984),「免疫系細胞の神経液およびホルモンの調節における環状ヌクレオチド」Stress, Immunity  and  Aging (Cooper, E.L.,編) pp. 231  ff.)。
【００１８】
リンパ球がそれらの生活環の後期にインスリンレセプターを示すことが発見されたとき、研究者らはこれらの白血球に対するインビトロでのこのホルモンの効果を研究した。彼らの研究により、インスリンの生理学的濃度が細胞傷害性リンパ球の標的細胞を傷害する能力を増強することが示された。インスリンはコリン作動性薬剤とほとんど同様の免疫増強効果を有し、そして同様の時間および用量依存性で機能すると思われたので、これらは同じレセプターを介して作用すると仮定された。しかし、ムスカリン様アンタゴニストであるアトロピンを使用した研究により、インスリン誘導性のリンパ球介在性細胞傷害(LMC)の増強が、コリン作動性レセプターとは独立していることが確立された(Strom, Terry  B.ら(1975),「リンパ球介在性細胞傷害のインスリン誘導性増強」Science  187:1206-1208)。さらに、コリン作動性薬剤がサイクリックGMPの増加を起こしているにもかかわらず、１人の研究者もインスリンがインスリンレセプターを獲得する前または後において、サイトゾールのサイクリックGMPまたはAMPに対するインスリンの効果を示し得なかった(Ercolani, L.ら(1985),「マイトジェン活性化ヒトＴリンパ球におけるレセプターおよびレセプター後レベルのインスリン誘導性脱感作」Diabetes：34:931-937)。
【００１９】
リンパ球がその膜上のインスリンレセプターの数を調節し得ることが発見された。インスリンによる刺激はレセプターの減少にともなって減退した。さらに、血漿インスリンの濃度とレセプターの極大の提示との間に逆の関係の存在が示された。ユーグリセミッククランプ(euglycemic  clamp)技術を使用した研究により、対応する殺生効果の損失とともにインビボにおける慢性インスリン過剰症が細胞傷害性T-リンパ球上のレセプターの数を、細胞あたり6752から1665に減少させることが示された。さらに、この細胞傷害の欠損は、低インスリン培地に置かれているにもかかわらず、インビトロで数時間継続した(Koffler, Michaelら(1991),「正常および肥満の被験者における同種異系活性化リンパ球に対するインスリンレセプターの調節の免疫生物学的結果」Diabetes, 40:364-370)。
【００２０】
多くの研究者が、腫瘍を有する動物の悪液質に対するインスリンの効果を研究した。一般に、彼らは、インスリンが食欲不振の回復をさせ、そして体重の増加をもたらしたが、生存を長期化せず、または腫瘍に何ら効果を有さないことを見出した(Morrison, S.D. (1982),「インスリンおよびインスリン停止に対する腫瘍保持ラットの食応答および自発性腫瘍流出の悪液質減少に対する寄与」Cancer  Res. 42:3642-3647；Moley, J.F.ら(1985),「ラットにおける癌悪液質のインスリンの逆転」Cancer  Res. 45:4925-4931；Moley, J.F.ら(1983),「外因性インスリン投与の食物摂取、体重変化、および腫瘍倍化時間に対する効果」Surgical  Forum  35:91-93)。Schein, Philip  S.ら(1979),「悪性の悪液質」Cancer  43:2070-2076は、悪性の悪液質を示す患者が、単球上のインスリンレセプターは正常であるが、投与されたインスリンに著しい耐性を示すと報告した。
【００２１】
約30年前、Oscar  Neufeld博士は、癌の悪液質と糖尿病の衰弱との間に類似性を見出して、７人の患者(肺癌患者３人、食道癌２人、および肝癌と胃癌１人ずつ)へのインスリン投与を決定した。彼の目的は患者の食欲を刺激することにあった。１人(胃癌患者)以外のすべてで、食欲が回復した；そしてそのすべてが体重を増加し良好に感じた；何人かは多幸症の感覚を経験した。徐々に増加したインスリンの用量は一般に良好に寛容された。(McGrady, P. (1964), The  Savage  Cell, Basic  Books, Inc., New  York, p. 139)。
【００２２】
1958年に、何人かの英国、カナダ、およびアメリカの科学者が、インスリンにはマウスおよびラットの移植腫瘍に対する治療効果が認められないが、毒性用量のインスリンおよびグルカゴンの組み合わせはこれらの癌の多くを緩慢にした。グルカゴン単独でもこれらの癌を停止した(McGrady, P. (1964), The  Savage  Cell, Basic  Books, Inc., New  York, p. 139)。
【００２３】
サイクリックGMPの増加は、休止リンパ球のリンパ球形態変化および増殖を制御する初期のシグナルとして作用すると考えられる。アセチルコリンおよびピロカルピンなどのムスカリン様コリン作動性薬剤は、ヒトリンパ球におけるサイクリックGMPの細胞内レベルを上昇させることが知られている。コリン作動性薬剤はまた、感受性化細胞におけるリンパ球介在性細胞傷害(LMC)を増強する。Strom, T.B.ら(1977),「リンパ球の活性化および機能における環状ヌクレオチドの役割」Progress  in  Clinical  Immunology (Schwartz, R.S.,編) p. 115-153。アセチルコリンおよびアゴニストは、β-グルクロニダーゼの免疫学的分泌を刺激し、好中球における食作用を増強する。Ignarro, L.J.およびCech, S.Y. (1976),「ヒト好中球におけるグアノシン3',5'-一リン酸およびアデノシン3',5'-一リン酸(39232)によるリソソーム酵素分泌および食作用の２方向性調節」Proc. Nat. Acad. Sci. 151:448-452。コリン作動性効果が造血幹細胞に及ぼされることもまた示されている(Unanue, E.R.およびSchreiner, G.F. (1975),「Ｂリンパ球における免疫グロブリンの調節およびその免疫刺激に対する関連性」Immune  Regulation (Rosenthal, A.S.,編) 271)。
【００２４】
免疫応答の増強のための無毒性治療が求められたが、現在までに有効な治療は得られていない。
【００２５】
発明の要旨
本発明は、ヒトを含む哺乳類におけるカリウムの細胞内貯蔵および蓄積のための組成物、およびいくつかの化合物を含有する該組成物を使用する方法を提供する。本発明の方法は、哺乳類のリンパ球、好ましくは抗原により既に選択されたリンパ球の細胞内カリウム含有量を増加させるために提供され、有効量のインスリンまたはインスリン産生化合物、グルコースおよびその薬学的に受容可能な等価物、ならびにカリウムを該哺乳類へ投与する工程を包含する。甲状腺ホルモンの単独または薬学的組み合わせ、炭酸水素塩およびその薬学的塩、ならびにアセチルコリン、ピロカルピン、およびカルバコールのようなコリン作動性薬剤も投与し得る。
【００２６】
当該分野において公知のインスリン産生薬物としては、体内でインスリンを生産させるスルホニルウレア、アセトヘキサミド、クロルプロパミド、グリピジド、およびグリブリドが挙げられる。グルコースの薬学的に受容可能な代替物としては、グルコースポリマーが挙げられる。用語「カリウム」は、カリウムの薬学的に受容可能な塩を包含する。用語「甲状腺製剤」は、T3およびT4を含む甲状腺ホルモンならびにその薬学的に受容可能な組み合わせを包含する。
【００２７】
本明細書に記載される化合物によって治療され得る病理学的状態は、癌、免疫不全症侯群、癌化学療法薬剤耐性、およびハンセン病、結核、マラリアの徴候のような免疫不全の効果、カポジ肉腫、気管支感染のようなエイズの合併症などを包含する。本明細書で例示するように、本発明の治療は、イヌの被験体で期待された寿命予想を上回る寿命の有意な延長をもたらした。未刺激リンパ球のS-期集団の５パーセント以上の増加が見られ、同様に266パーセントのアメリカヤマゴボウ分裂促進因子への末梢リンパ球の増殖応答性の増大がみられた。口腔黒色腫を有する１匹の被験体は完全に治癒し、そして腫瘍の実質的な衰退が他の被験体において見られた。
【００２８】
カリウムはほとんどの体組織の主要な細胞内陽イオンである。カリウムは、細胞内張性の維持、神経インパルスの伝達、心筋、骨格筋、および平滑筋の収縮、細胞増殖、ならびに正常な腎臓機能の維持を包含する多くの必須な生理学的過程に関与する。記載された治療手順は細胞内カリウムの貯蔵を包含する。
【００２９】
種々の成長因子および内分泌ホルモンの共同作用によって生じる免疫抑制は、身体が感染に対処するときに誘導されることを模倣して、人為的にホルモン混合を改変して回復され得る。このホルモン治療は、非活性化免疫細胞内へカリウムを押し入れることを目的とする。カリウムは、細胞を増殖および活性化に必要な酵素反応に関連させ得る。グルコースもまた、過剰のナトリウムを排出してカリウムに置き換えるために必要なエネルギーを免疫細胞に供給するために投与される。
【００３０】
本発明の好ましい免疫増強治療は、インスリンおよび好ましくは甲状腺ホルモンの投与、およびグルコースおよびカリウムの注入を必要とする。ピロカルピンのようなコリン作動性薬剤もまた、細胞によるカリウムの取り込みならびに免疫細胞の活性化および増殖を刺激するために、好適に投与される。炭酸水素塩は、細胞内へカリウムを押し入れるためにさらなる援助が必要または所望される場合に使用され得る。
【００３１】
インスリンは細胞にグルコースを取り込ませ、カリウムを細胞内に押し入れさせる。甲状腺製剤およびコリン作動性薬剤はこの効果を増加させる。甲状腺ホルモンは、ATPaseを刺激し、そしてまた、細胞外カリウムと細胞内ナトリウムとの交換を容易にする。炭酸水素塩、アルドステロン、およびデスオキシコルチコステロンは、カリウムに対する同様な効果を有し、そして患者が注入されたカリウムを所望のレベルに保持しなかった場合に使用され得る。
【００３２】
本発明はまた、静脈内注入のためのグルコース、カリウム、およびインスリンの混合物を含有する薬学的組成物を提供する。この混合物は、再水和のための粉末形態で、または水和形態で供給され得る。これらの組成物は、追加のインスリンおよび甲状腺製剤で補充され得る。コリン作動性薬剤は好ましくは別々に摂取され得る。インスリンおよびコリン作動性薬剤は皮下に投与され得る。甲状腺製剤およびコリン作動性薬剤は経口形態で摂取され得る。
【００３３】
本発明はさらに、インスリン、グルコース、およびカリウム、ならびに任意の甲状腺製剤、コリン作動性薬剤、および炭酸水素塩を、本発明の治療法を有効にする自己投与に適切な用量で供給する薬学的キットを提供する。
【００３４】
本発明のバイオセラピーの局所適用のための方法および組成物もまた提供される。
【００３５】
細胞内カリウムの増加は、免疫系の増強、特にリンパ球増殖を増加させることにより生じる。それはまた、癌細胞のアポトーシスの刺激にも有用である。さらにそれは、薬剤耐性になった腫瘍細胞の再感受性化に有用である。この方法は、腫瘍および外来微生物のような疾患状態に対処するための、および養子免疫治療前にチャレンジされたリンパ球の集団を増加させるための、増加した数のリンパ球を供給するために、インビボで有用である。本明細書に記載された生物活性薬剤はまた、養子免疫治療のためのインビトロ細胞培養の培地に使用され得る。
【００３６】
好ましい実施態様の詳細な説明
好ましくは抗原により予め選択されたリンパ球の細胞内カリウム含有量を増加させる工程を包含する、哺乳類における免疫応答の増強または強化のための方法が提供される。これは、該哺乳類に対して効果的な量の薬学的に受容可能なインスリンホルモン、ならびにカリウムおよびグルコースを、免疫応答が強化されるよう細胞内カリウムを増加させるに十分な期間投与することにより、好ましい実施態様において達成される。甲状腺製剤およびコリン作動性薬剤も投与され得る。
【００３７】
リンパ球の細胞内カリウム含有量の増加は、指示色素PBFI(カタログ番号  p-1265)(ベンゾフラン  150フタレート(benzofuran  150  phthalate)、Molecular  Probes, Inc.社製)を用いた試験などの当該分野に公知の方法により直接測定し得る(Kasner, S.E.およびGanz, M.B. (1992),「メサンギウム細胞における細胞内カリウムの調節：色素PBFIを使用した蛍光分析」Amer. J. Physiol. 3:462-467を参照)。この増加は好ましくは、細胞内カリウムレベルを細胞が維持し得る最高値に至らせる。本発明のバイオセラピーの適用に先立ち免疫抑制された患者において、これらのレベルは最高値より有意に少ない。
【００３８】
それぞれの物質の有効量は一般的に以下に示す推奨用量内である；しかし、用量は、当該分野に公知の方法で、所望の目的を達成するために本明細書の教示に従って調整し得る。
【００３９】
免疫応答の増強(「免疫増強」)は、当該分野において周知のように、外来抗原に対する生物の応答能力を増加させることを意味する。すなわち、外来抗原を攻撃するように感作された細胞が、数、活性、および外来抗原を発見して攻撃する能力を増大させられることである。免疫応答の強度は以下を包含する標準的な試験によって測定される：当該分野に公知の手段による末梢血リンパ球の直接的測定；ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性アッセイ(例えば、Provinciali, M.ら(1992),「蛍光色素カルボキシフルオレセインジアセテート(CFDA)の標的細胞保持による細胞傷害アッセイの最適化および従来の51Cr放出アッセイとの比較」J. Immunol. Meth. 155:19-24を参照)、細胞増殖アッセイ(例えば、Vollenweider, I.およびGroseurth, P.J. (1992),「リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞の細胞増殖を測定するために使用する４種のDNA染色蛍光色素の比較」J. Immunol. Meth. 149:133-135を参照)、免疫細胞およびサブセットのイムノアッセイ(例えば、Loeffler,D.A.ら(1992),「Hoechst  33342標識およびイムノフェノタイピングの同時使用による腫瘍-および前新形成-浸潤リンパ球の分布解析」Cytom. 13:169-174；Rivoltini, L.ら(1992),「腫瘍表現型の特徴付けを用いた、リンパ球浸潤小児腫瘍の表現型および機能的解析」Can. Immunol. Immunother. 34:241-251を参照)；または細胞を介した免疫性皮膚試験(例えば、Chang, A.E.ら(1993),「インビトロで腫瘍に対して２次的に感受性にしたワクチン感作Ｔリンパ球を使用した養子免疫療法に対する臨床的観察」Cancer  Res. 53:1043-1050を参照)。上記試験により測定された免疫応答の強度の統計的に有意な増加はいずれも、本明細書で使用される「増強された免疫応答」「免疫増強」または「免疫強化」とみなされる。
【００４０】
増強された免疫応答はまた、発熱および炎症のような身体的症状発現、全身および局所感染の治癒、および疾患の徴候の減少、すなわち腫瘍サイズの減少、ハンセン病、結核、マラリア、ナフトール(naphthous)潰瘍、疱疹性および乳頭腫性いぼ、歯肉炎、アテローム性動脈硬化症、AIDSの合併症(例えばカポジ肉腫、気管支感染症)などの徴候の軽減によっても示される。このような身体的症状発現もまた、本明細書で使用される「増強された免疫応答」、「免疫増強」または「免疫強化」を定義する。
【００４１】
本明細書中で用いられる用語「哺乳類」はヒト、およびウシ、ブタ、ヤギ、有袋動物、野生の有蹄動物、イヌ、ウマ、ネコ、クジラ、イルカ、動物園動物およびその他の哺乳類を含む食料源として使用される動物、および、非食用動物を包含する。
【００４２】
本発明の方法および組成物による治療を受ける被験体または患者の哺乳類は、好ましくは、腫瘍、ハンセン病、結核などをわずらう哺乳類のように、免疫系が不活発化、抑制、または低下しているものである。免疫抑制または弱い免疫系の徴候は、創傷、慢性感染症、疾患状態が治癒しないこと、およびS-期のＴ細胞数が少ない、またはリコール(recall)抗原を用いた皮膚試験の応答が低いことを示すアッセイ結果を包含する。
【００４３】
本発明の実施において哺乳類に投与される物質は、薬学的に受容可能な形態であるべきである。すなわち、適切な純度、投与形態、化学的塩、または化学的アナログは当該分野において公知のように使用され得る。投与は、当該分野において公知である都合の良い任意の経路、静脈内、筋肉内、病変内、経口、直腸、膣、局所など、により行い、投与された物質が所望の血中レベルになるようにした。このような薬学的に受容可能な形態および投与様式は当該分野において周知である。それぞれの物質の用量は以下に記載の効果を生じるに十分高くあるべきではあるが、動物の死亡または恒久的な障害を生じさせるほど高くあるべきではない。
【００４４】
ほとんどの場合で、治療のコースは数日から１週間または10日間であり、必要に応じて繰り返される。そして患者の反応をモニターし、用量を要求に応じて調整すべきである。リンパ球の増殖が必要である場合は、現存するリンパ球の単純な活性化よりも約21日までの治療期間を必要とし得る。
【００４５】
グルコースはエネルギー源およびカリウムイオンの細胞内輸送の援助として働く。グルコースは、正常血中グルコースレベルから上記のような高い血中グルコースレベルを維持するに十分高いが、重度の高血糖症または糖尿病性昏睡を生じさせるほどの高さではない用量で投与される。
【００４６】
グルコースの注入は液体または溶質の過負荷を生じ得、血清電解質の希釈、水分過剰、うっ血状態、または肺水腫を引き起こす。静脈内投与期間中の流体バランス、電解質濃度、および酸塩基バランスをモニターするために臨床評価および検査室測定の実施は不可欠である。高血糖症および糖尿は投与速度または代謝不全の作用であり得る。これらの状態を最小限にするために、低速での注入を使用すべきであり、そして血中および尿中のグルコース濃度をモニターすべきである。浸出を予防するためには慎重な投与を用いるべきである。注入中に血栓が生じた場合は、注入を停止してカテーテルを取り除くべきである。糖尿を起こさずにデキストロースを注入し得る最高速度は0.5gm/kg/時間である。0.8gm/kg/時間において、95%の注入されたグルコースが保持される。非経口投与されたグルコースは二酸化炭素と水に酸化されて、3.4cal/gmのd-グルコース一水化物を生じる。薬学的に受容可能なグルコースの濃度は、当該分野において公知である。５%デキストロース溶液が等張である(５%デキストロースは50gm/L、170cal/Lまたは253mOsm/Lである)。
【００４７】
本発明の好ましい実施態様において、腎臓、肝臓の機能、および血糖レベルが正常な場合は、治療は５%グルコース(デキストロース)で開始する。注入速度は100mL/時間未満に維持する。好ましくは、グルコースの投与は約4g/kg体重/日と約20g/kg体重/日との間の量とし、より好ましくは、約12g/kg体重/日と約16g/kg体重/日との間である。
【００４８】
カリウムは主要な細胞内陽イオンである。低カリウム血症は、腎排出の増加、GI管を通じての損失の増加、および不十分な摂取から起こり得る。体内総カリウム貯蔵の98%は細胞内である。1mEq/L血清のカリウムの減少は、総体内カリウム貯蔵からの100〜200mEqに相当する。低カリウム血症の徴候は虚弱、疲労、多飲症、心房および心室の早期拍動、およびQT間隔の延長である。正常にはカリウム摂取の80〜90%が尿中に排出され、残りは大便中および少量は発汗により排出される。カリウムを決して希釈されない状態でも高カリウム血症の状態にも投与すべきでない。
【００４９】
カリウムは薬学的に受容可能な塩、例えば塩化塩または酢酸塩の形態で、総体内補充(すなわち、穏やかな高カリウム血症)を達成するのに十分高いが、心臓抑制、不整脈、または心臓停止を起こすほどは高くない用量、好ましくは、１日当たり体重75kg当たり約100mEqと約500mEqとの間の量で、より好ましくは、１日当たり体重75kg当たり約200mEqと約400mEqとの間の量で投与される。カリウムは好ましくは塩化塩の形態で投与される。カリウムの至適投与は８時間にわたる約２リットルの液体の投与を必要とし、そしてカリウムレベルは血液または尿中で測定されるので静脈内投与が好ましい。通常の添加物の希釈液は40mEq/L  IV液体であり、最大でも80mEq/Lである。ECGおよび電解質を個々の投与の間モニターすべきである。血清カリウムが2.5mEq/Lより多い場合、最大注入速度は約10mEq/時間であるべきである。最大濃度は約40mEq/L、24時間の最大用量は約200mEqであるべきである。血清カリウムが約2mEq/L未満の場合、最大注入速度は約40mEq/L；最大濃度は約80mEq/L；24時間の最大用量は約400mEqであるべきである。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様において、30mEq/Lの塩化カリウムが100mL/時間未満の速度で注入される。カリウムおよびグルコースレベルを最初は注入速度を調節するために30分毎にモニターし、その後は１日に２回測定する。カリウムおよびナトリウム、および時には尿酸を、治療前および治療中少なくとも２回、24時間採取尿中で測定する。
【００５１】
インスリンは、グルコースの適切な利用に要求される主要なホルモンである。任意の薬学的に受容可能な形態の、インスリンまたは上述のインスリン同等物を使用し得る。レギュラーインスリン(regular  insulin)は作用の迅速な開始および短い持続時間のために好まれている。高カリウム血症において、インスリンとグルコースとの混合物(３グラムのデキストロース当たり１単位のインスリン)によりカリウムイオンの細胞外空間から細胞内への移動および血清カリウムレベルの低下が生じることが知られている。インスリンは、食前および就寝時の血中グルコースレベルを上記の添加グルコース存在下で約80〜140mg/dLに維持するに十分高いが、低血糖反応または非可逆的インスリンショックを生じるほど高くはない用量、好ましくは、約0.05U/kg体重/日と約2.4U/kg体重/日との間のレギュラーインスリンの皮下量、より好ましくは、約0.25U/kg体重/日と約1.5U/kg体重/日との間の皮下量で投与される。インスリンは好ましくは、迅速な(1/2〜１時間)作用開始をするレギュラーインスリンの形態で投与され、好ましくは血中グルコースレベルについて血中でモニターされる。本明細書の好ましい実施態様において、インスリンの投与は、カリウム注入の約30分後に0.5U/kg/時間または50mL/時間(溶液１L当たり10U)の用量で開始され、そしてグルコースは上記のように開始される。
【００５２】
甲状腺製剤は、T4レベルを穏やかな甲状腺機能亢進症まで上昇させるに十分高い用量、例えば15μg/dL(200nmol/L)であるが代謝亢進状態、すなわち毒性を引きおこすほど高くはない用量、好ましくは約0.3μg/kg体重/日と約４μg/kg体重/日との間の量、より好ましくは約１μg/kg体重/日と約３μg/kg体重/日との間の量で投与される。経口甲状腺製剤(T4)の通常維持量は0.2mg/日未満である。非経口用量は経口用量の２分の１である。合成甲状腺製剤誘導体はレボチロキシン(levothyroxine)(T4)、リオチロニン(liothyronine)(T3)、およびリオトリックス(Thyrolar、Rorer-Rhone  Poulenc  Pharmaceuticals, Fort  Washington, PA、の商標)と呼ばれるT4とT3との４対１混合物を包含する。甲状腺ホルモンの正確な作用メカニズムは良くは理解されていないが、効果の大部分はDNA転写およびタンパク質合成の制御により発揮されると考えられている。
【００５３】
カリウムの細胞内取り込みは、甲状腺ホルモン誘導により、Na+/K+  ATPaseの新たな生合成を伴って上昇する。甲状腺ホルモンの主要な生理的効果は、酸素消費、呼吸速度、体温、心拍出量、心拍数、血液量、脂肪、タンパク質、および炭水化物の代謝速度、酵素活性、ならびに成長および活動量の増加を伴う体組織の代謝速度の増加である。甲状腺ホルモンは組織の分化および増殖にもまた関与する。甲状腺ホルモンは基礎代謝速度を上昇させること知られている。効果は徐々に現れ持続する。効果の開始は48時間以内に始まり、そして８〜10日間で最大に達する。
【００５４】
甲状腺製剤は好ましくは、レボチロキシン(T4)の形態で経口錠剤または注射剤として投与され、T3およびT4のレベルに関して血中において測定される。データはT4が選択されるホルモンであることを示唆する；T3はより迅速な作用開始を有するが、T4中毒の前に甲状腺中毒性レベルを生じ得る。迅速な作用開始のためには、T3(リオチロニン(liothryonine)、例えばCytomel(Smith, Kline  &  French  Laboratories, Philadelphia, PAの商標)として入手し得る)またはT4とT3との混合物の調製品(Thyrolar (Rorer-Rhone  Poulenc  Pharmaceuticals, Fort  Washington, PAの商標)として入手し得る)が使用されるべきである。T3およびT4は無菌溶液での再構成用に入手し得る。T4は例えば、Synthroid (Boots-Flint, Inc., Lincolnshire, ILの商標)として入手し得る。
【００５５】
甲状腺製剤は身体に効果が現れるまで48時間またはそれ以上かかるので、治療開始に少なくとも48時間先だっての甲状腺製剤による前処理が推奨される。好ましい方法は、下記に議論されるようなカリウム、インスリン、およびグルコース注入の48時間前にリオチロニン(Cytomel)を用いての甲状腺ホルモンの開始である。その後リオトリックス(liotrix)１日当たり0.5グレーン(grain)(25μg  T4および6.25μg  T3に相当)を経口で投与する。
【００５６】
甲状腺製剤治療の禁忌は以下を包含するべきである。長期のT4使用は骨密度の減少に関連付けられている。毒性の徴候は以下を包含する：動悸、心頻拍、狭心症、心臓停止；CNS振せん、頭痛、神経質、不眠；GI-下痢および嘔吐。慢性的過剰投与はうっ血性心不全(CHF)および狭心症を生じさせ得る。
【００５７】
リンパ球におけるカリウム輸送メカニズムは体液および浸透圧刺激により調節される。細胞内カルシウムの高レベルでの維持は、免疫リンパ球を包含する多くの細胞タイプにとって至適細胞機能に不可欠である。グルコース、インスリン、および甲状腺ホルモンに加え、コリン作動性レセプターによる膜脱分極および電気化学的制御は、細胞内カリウムのホメオスタシスの達成に貢献することが判明している。ピロカルピンは良好に寛容され得る短期作用性(開始15〜30分；持続４〜８時間)副交感神経作動薬である。より高濃度でより長い作用持続が得られる。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様において、コリン作動性薬剤、好ましくはピロカルピンを投与し、細胞によるカリウムの取り込みをさらに刺激し、免疫細胞の増殖を刺激する。若干のより長い作用のために、またはピロカルピンに対する耐性が現れた場合(数カ月から数年)、カルバコールを代わりに使用し得る。より強力により長く作用するコリン作動性薬剤はアセチルコリンエステラーゼインヒビターを包含する。別の選択肢には、サクシニルコリン(脱分極性コリン作動性薬剤の１種)が挙げられる。その血液循環におけるより長期間の残存、より持続する効果、および免疫細胞に対する若干のより大きな影響(impact)の理由から、ピロカルピンは選択されるべきコリン作動性薬剤である。
【００５９】
コリン作動性薬剤は好ましくは、皮下または病変内に、カリウムポンプを刺激するに十分高いが、腹腔痙攣、筋肉衰弱、失禁、徐脈、下痢、または気管支痙攣のような望まれない副作用を引き起こすほどは高くない用量で投与される。コリン作動性薬剤の投与は、１日当たり約30μgおよび450μgの間の量(70kgの患者に基づいた場合)で投与される。好ましくは、ピロカルピンは、１日３回約35μgおよび約120μgの間(１日当たり約1.5μg/kg〜約5.1μg/kg)の量で投与される。好ましくは、用量を徐々に増加して約５日間で最高用量とし、毒性の徴候が生じれば減少する。急性毒性の場合にはアトロピンを皮下投与する。
【００６０】
血中カリウムレベルが正常範囲に維持され、過剰のカリウムを処理する身体能力が限界を超えない間は、甲状腺製剤およびインスリンはカリウムイオンをリンパ球内に押し込むために作用し、任意の過剰カリウムは排出され得る。連続的カリウム注入を伴ったECGによる連続的モニターは、最高用量のカリウムを投与することを可能にし得、心臓に対する有害な影響が観察された場合には、投与を停止するか、または解毒剤を投与した。高カリウム血症の解毒剤は、インスリンとグルコース、甲状腺製剤と炭酸水素塩、およびアルドステロンとデスオキシコルチコステロンを包含し、これらすべてはカリウムを細胞内へ押し込むことそして血流から押し出すことにより作用する。細胞がカリウム取り込み能の限界に達していない間は、これらの解毒剤は有効であり、血中カリウムレベルを低下させるさらなる効果が観察されなくなるまで投与され得る。アルドステロンとデスオキシコルチコステロンもまたカリウム排泄を刺激し本目的に使用され得る。
【００６１】
甲状腺製剤、インスリン、グルコースおよびカリウムを用いた治療は、好ましくは都合の良いように１日１回または１日数回の原則による用量で、上記試験のいずれかによって測定した場合に所望のレベルの免疫強化または免疫増強に達するまで継続する。好ましくは、治療は病気の身体的症状発現が実質的に軽減するかまたは見られなくなるまで継続される。腫瘍治療のための本発明の１実施態様において、治療は５日間行われ、腫瘍の有意な衰退が起こるまで１〜10日の間隔で繰り返される。「有意な衰退」は腫瘍の大きさの約50%の減少を意味する。
【００６２】
好ましくは患者の、甲状腺製剤、インスリン、グルコース、およびカリウムの血中レベルを治療コースの間、少なくとも毎日モニターし、それに従って各物質の用量を調製する。
【００６３】
甲状腺製剤(T4)血中レベル(ラジオイムノアッセイで測定)は、少なくとも約10μg  free/dL〜約18μg  free/dL血清、好ましくは少なくとも約12μg  free/dL〜約15μg  free/dLの血清レベルに維持される。穏やかな甲状腺亢進症の血中レベル、すなわち約11μg  free/dL〜約14μg  free/dLが好ましい。血清T4レベルはT3以外のすべての甲状腺製剤薬物の効果を試験するために使用し得る。甲状腺ホルモン抑制(THS)の抑制試験を、T3およびT4を測定するために当該分野において公知であるように使用し得る。甲状腺製剤レベルがこの数字を下回る場合、所望のレベルに達するまで用量レベルを当該分野において公知のように増加する。甲状腺製剤レベルが至適値を超えて上昇する場合、用量を減少させる。身体的反応もまたモニターし、頭痛、過敏症、神経質、発汗、心頻拍、またはその他の既に記載したような毒性の徴候が甲状腺製剤レベルに対する反応として生じた場合、過剰用量の処置を当該分野に公知のように、例えば甲状腺製剤投与の停止を実施する。
【００６４】
インスリンの血中レベルは好ましくは正常より上のレベル、例えば少なくとも約20mIU/Lに維持される。インスリンレベルがこの数字を下回る場合、所望のレベルに達するまで用量レベルを当該分野において公知のように増加させる。インスリンよりむしろグルコースが血中においてモニターされ得る。好ましくは血中グルコースレベルは少なくとも約575mg/L、そして好ましくは少なくとも約950mg/Lのレベルに維持される。インスリンレベルが至適値を上回る場合、またはグルコースレベルが至適値を下回る場合、グルコースを所望のレベルに達するまで投与する。身体的反応もまたモニターし、低血糖症がインスリンレベルに対する反応として生じた場合、インスリン用量の減少よりも、グルコースを、例えば50%またはそれ以上の濃度のグルコース溶液を経口または舌下投与するのが好ましい。市販のグルコース溶液、グルカゴンおよびIVデキストロースがインスリンに対する有用な解毒剤である。インスリン誘導性低血糖症には、グルコースを以下に従って投与し得る：10〜25gmグルコースおよび必要に応じて繰り返し(成人)；250〜500mg/kg/用量(小児)；５kgの幼児に対しては５〜10mLの25%デキストロース溶液。
【００６５】
インスリンの減少は、カリウムが細胞に分配されていないことの指標となるカリウムの尿中への排泄を生じさせる。グルコースを、正常または高い正常レベルの維持に要求される最小値に加え、カリウム取り込みをさらに容易にし、適切なポンピングのための細胞内エネルギーを供給するために投与する。不用意なインスリンの過剰用量は不可逆的なインスリンショックを引き起こし得る。インスリンに対するアレルギー反応はまれであり、紅斑、腫脹、または掻痒症を包含する。このような反応は通常数日から数週の内に消散する。急性の低血糖症において、インスリン注射部位の切除が、悪化状態の回復に使用され得る。
【００６６】
血中カリウムレベルは好ましくは少なくとも約5.0mEq/Lに維持される。カリウムレベルがこの数字を下回る場合、所望のレベルに達するまで用量レベルを当該分野において公知のように増加させる。カリウム排泄のレベルが一定、および血中カリウムレベルがさらに上昇しなくなるまで、カリウムを投与することが好ましい。これは典型的には約３〜５日の内に起こる。カリウムレベルが至適レベルを上回る場合、投与を停止する。穏やかな高カリウム血症(6.5mEq/L血清)から中程度の(8mEq/L血清)は無症侯性であり得、血清カリウム濃度の上昇および特徴的なECG変化により症状発現し得る。筋肉衰弱、弛緩性四肢麻痺、および呼吸麻痺が8mEq/Lより高い血清濃度で起こり得る。カリウム中毒は以下の徴候および症状を包含する：弛緩性麻痺；筋肉または呼吸麻痺；精神錯乱を伴う衰弱；精神錯乱；低ナトリウム血症；不整脈；心ブロックおよびP-波消失のようなECG異常；２相性カーブの発達を伴うQRS棘波群の拡がりおよび低速化ならびに心臓停止、悪心および嘔吐、腹痛、下痢。カリウムの高血漿濃度は心臓抑制、不整脈、または心臓停止による死亡を起こし得る。カリウムは血漿および尿において、継続的または断続的なECGによってモニターされるべきある。カリウムはいかなる腎臓機能障害または副腎機能不全と共には使用されるべきではなない。潜在的に致命的な高カリウム血症は無症候性であり得、低カリウム血症を模し得る。IV投与は、血清電解質濃度の希釈をもたらす液体または溶質の過負荷を引き起こし得、うっ血状態または肺水種を過水和(overhydrate)し得る。カリウム毒性を伴うECG変化は以下を包含する：T-波の高さの進行性増加および尖鋭化；R-波の低下；P-波の振幅減少および最終的な消失；PR間隔およびQRS棘波群の延長；QRS間隔の短縮および死亡を伴う心室細動。
【００６７】
高カリウム血症およびECG変化がカリウムの過剰用量に対する反応として生じる場合、グルコースおよびインスリンを投与する。炭酸水素塩およびグルコン酸カルシウムまたは塩化カルシウムもまた投与され得る。推奨されるカリウム過剰用量治療は以下の通りである。カリウム注入の停止およびレギュラーインスリン１単位当たり３gmのデキストロースの注入の開始(300〜500mL/時間、10〜20単位のインスリン/Lを含む10%デキストロース)；炭酸水素ナトリウムの投与、50〜100mEq  IV(カリウムのさらなる細胞内貯蔵への移行)、およびグルコン酸カルシウムまたは塩化カルシウム(10%)、10〜100mL、のECG変化を逆転させるための投与。
【００６８】
薬学的に受容可能な形態の炭酸水素塩もまたカリウムの細胞内取り込みを増強するために投与され得る。好ましくは、炭酸水素塩は薬学的に受容可能な塩の形態で、静脈内注入、または注射、経口、または当該分野において公知の他の方法により投与される。炭酸水素塩はカリウムを細胞内に押し込むに十分高いが、毒性を生じるほど高くはない用量、好ましくは約1.0mEq/kg体重/日と約6.0mEq/kg体重/日との間の量で、より好ましくは約2.0mEq/kg体重/日と約5.0mEq/kg体重/日との間の量で投与される。血液ガスをモニターし、必要がある場合には治療を中断する。
【００６９】
アルドステロンおよび/またはそのアナログ、デスオキシコルチコステロンもまた薬学的に受容可能な形態で投与し得る。アルドステロンはカリウムの取り込みのさらなる増強に機能する。これらの物質はカリウムを細胞内へ押し込み、またその排泄も刺激する。アルドステロンは正常にはカリウムレベルの上昇に応答して体内において生産される。血清カリウムレベルを低下させるに十分高いが、低カリウム血症を生じさせるほどは高くない用量、好ましくは体重１kg当たり約0.6μgと約20μgとの間の量で、より好ましくは１日当たり体重１kg当たり約２μgと約３μgとの間の量で投与される。デスオキシコルチコステロンは、好ましくは酢酸デスオキシコルチコステロンの形態で投与される。
【００７０】
上で開示した、インスリン、カリウムおよびグルコースの混合物、ならびに好ましい実施態様における、甲状腺製剤、および/またはコリン作動性薬剤を含有する薬学的組成物もまた、IV、経口投与、注射、または他の当該分野で公知の形態での投与に適切な形態で本発明により提供される。
【００７１】
本発明の１つの実施態様において、インスリン、カリウム、およびグルコースの混合物が、静脈内注入に適切な様に提供される。この混合物は標準的な薬学的に受容可能な投与濃度の約3.5Uと約168Uとの間のインスリン、約98mEqと約490mEqとの間のカリウム、および約280gと約1400gとの間のグルコースを含有する(甲状腺製剤が存在する場合にはそれは、約70gと約420gとの間を含有し、ピロカルピンまたは他のコリン作動性薬剤が存在する場合には約105μgと約360μgとの間を含有する)、すべては当該分野に公知の薬学的に受容可能なキャリアー中にある。前述の量は70kgの患者に適切であり、患者の体重に従い当該分野において公知のように調節し得る。混合物は、約200mL/時間と約800mL/時間との間の速度で、約６〜約24時間の期間の間注入される。注入は毎日、好ましくは３〜10日間繰り返され、その後約７〜10日間休止し、カリウム補充が完了し免疫増強が生じるまで必要に応じ繰り返される。混合物中の各成分の相対量は、種々の成分の血中濃度の測定値および上記の身体的症状発現の発生に従って、治療の期間中に調整され得る。
【００７２】
静脈内組成物はまた、毎日の再構成のための乾燥粉末形態で提供され得、好ましくは約14gと約28gとの間のグルコース、約98mEqと約500mEqとの間のカリウム、約3Uと約170Uとの間のインスリン、約80μgと約240μgとの間の甲状腺製剤(リオトリックス)、ならびに約50mEqと約80mEqとの間の炭酸水素塩を含有する。組成物は、体重に基づく用量および本明細書中の教示に従う適切な用量を調整後投与される。
【００７３】
本発明のさらなる実施態様において、70kgの患者による毎日の間隔での自己投与に適切な多様な用量のインスリン、グルコース、およびカリウムを、５日間の最大用量が、インスリンについて約17.5Uと約840Uとの間；グルコースについて約1400gと約5600gとの間；およびカリウムについて約490mEqと2520mEqとの間となるような量で含有する薬学的キットが提供される。当業者によって認識される様に、用量は患者の体重に基づいて調整され得る。
【００７４】
自己投与に適切な甲状腺製剤が、このようなキットにおいて、約350μgと1.05mgとの間の５日間の最大用量を提供する量で、必要に応じて提供される。ピロカルピンまたは他のコリン作動性薬剤もまた、１日当たり３回約10μgと１日当たり３回約40μgとの間の最大用量を提供する量で提供され得る。自己投与に適切な炭酸水素塩もまた、約70gと約140gの間の５日間の最大用量を提供する量で提供され得る。上述の様に、用量は70kgの患者のために示されており、適切に調整され得る。
【００７５】
前記薬学的キットの上記成分は、医学の訓練を受けていない患者による自己投与に適切ないずれの形態、例えば、経口錠剤または液体状形態、あるいは注射剤形態であり得る。好ましくは、経口形態が可能な全ての成分はその形態で提供される。好ましい実施態様において、自己注射剤形態で容易に得られるインスリン以外、すべての成分は経口形態で提供される。
【００７６】
キットは任意に、血中グルコースモニターおよびインスリン誘導性低血糖症の補正に使用する追加のグルコースを含有する。キットはまたアトロピンをピロカルピンの毒性の補正に適切な用量で含有し得る。
【００７７】
本発明のバイオセラピーは、養子免疫療法のための培養用のリンパ球を取り出す前に使用され、選択されたリンパ球の最初の数を増加させ得る。
【００７８】
この方法はまた、養子免疫療法のための選択されたリンパ球のインビトロでの培養用の培地の生産に適応され得る。ワクチンで感作したリンパ節からの細胞の拡張のためのインビトロ培養培地は、グルコース、カリウム、インスリン、炭酸水素塩、および任意にピロカルピンを、注入細胞の効率および免疫学的応答性を増加させるために補充される。本発明の１つの実施態様において、約50mg/mLのグルコース、約0.08mEq/mLのカリウム、約0.02mEq/mLの炭酸水素塩、約10〜100U/mLのインスリン、約１μg/mLのリオチロニン、および約10mg/mLのピロカルピンが、リンパ球培養培地に添加される。
【００７９】
本発明のバイオセラピーはまた、上で記載した成分を含有するスキンクリームまたは処方物において局所的に適用し得る。局所処方は、外皮から生じた表面の病気および障害の治療に有用である。このような目的のための処方物は、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、または坐薬であり得、皮膚や、鼻道を含む粘膜への適用に適切な形態で混合され得る。皮膚への局所適用のための水中油型(oil  in  water)クリームの典型的な処方物は以下を含有する：水相：塩化カリウム、約10〜20mEq；グルコース、約５〜10g；リオチロニン、約50〜100μg；レギュラーインスリン、約200〜500U；炭酸水素ナトリウム、約１〜２g；ピロカルピン、約1.5〜５mg；架橋したアクリル酸コポリマー(Carpobol  940、B.F. Goodrich, Inc., Cleveland, OHの登録商標)、約100〜250mg；ヒドロキシメチルグリシン酸ナトリウム(Suttocide  A、GAF  Chemicals  Corp., Chatham, NJの登録商標)、約300〜500mg；脱イオン水、十分量、油相：ステアリン酸、約２〜４g；グリセリンモノステアレート、約１〜３g；プロピオン酸ミリスチル、約１〜５mL；プロピレングリコール、約３〜７mL；ラウレス(laureth)-4、約0.5〜４mL；鉱油、約0.5〜７mL。Carpobol  940を水相に溶解して粘性溶液とし、これに水溶性成分が添加される。その後各相を65〜70℃に加熱し、そして油相をゆっくりと撹拌しながら水相に添加する。この混合物を良く混合し、そして冷却させる。過剰の有機塩、すなわちトリエタノールアミンを添加して、ゼラチン化を完了させる。このような局所調製物は、医師により指示されるように患部の上および周囲に塗布され、３週間毎日繰り返される。
【００８０】
本発明は本明細書中で開示された方法および組成物にあるが、いかなる理論にも限定されず、臨床的に同等な免疫増強または免疫強化治療を生じさせるために、用量の調整、ならびに組成物および方法の改変の補助となる以下の理論的考察が示される。
【００８１】
免疫に影響する５つの相互に関係する因子がある:
1)レセプターが抗原チャレンジ(antigenic  challenge)に適合したリンパ球の活性化および増殖のためのクローン選択。
【００８２】
2)免疫調節性のサイトカインおよびリンホカインが、抗原チャレンジの間に損傷細胞、および免疫および炎症細胞により放出される。これらの成長因子は本明細書で提供されるモデルにおいて攻撃的因子(AF)として共に分類される。これら因子はなんらかの方法で炎症または免疫応答に貢献する。いくつかの因子はマクロファージおよび多形核白血球に対して走化性である。他の因子は内皮細胞上にレセプターが、循環白血球をそれらへ接着し得るように誘導する；または内皮細胞に分離を起こさせ、その結果白血球が血管区画を出て傷害に入り得る。さらに他の因子はマクロファージの挙動を改変して免疫を増強する。多くのサイトカインおよびリンホカインはオートクリンまたはパラクリンとして作用し、選択されたリンパ球の栄養物の取り込みおよび活性化を刺激する。他の因子は血管形成またはフィブリン障壁(barricade)の敷設を誘導する。インターフェロンおよびインターロイキンのような他の因子は主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)の発現を増強する。
【００８３】
いくつかのAFは真性のホルモンとして作用し、遠隔の組織に影響する。コロニー刺激因子は骨髄を刺激してより多くの白血球を産生させる。インターロイキン-1は急性期タンパク質の上昇、血漿金属の循環レベルの変化、骨および軟骨吸収、筋肉のタンパク質分解およびコラーゲンの産生を生じさせる。さらに、タンパク質は視床下部に運ばれそこでレセプターに結合する。その結果体温の上昇およびACTH分泌の増強を生じる。AFは視床下部に傷害または抗原チャレンジを知らせるメッセンジャー分子として機能する。
【００８４】
要約すると、攻撃的因子は:
(a)局所的:
i)白血球を引きつけて刺激し、活性化および増殖させる。
【００８５】
ii)フィブリン障壁産生を刺激する。
【００８６】
iii)局所細胞の免疫原性を増強する。
【００８７】
(b)遠隔的:
i)末梢組織においてタンパク質分解および脂肪分解を刺激することにより白血球のために資源を動員する。
【００８８】
ii)視床下部を刺激して体温の上昇および免疫を援助する内分泌混合物を生じさせる。
【００８９】
3)本明細書で示すモデルにおいて共に再生因子(RF)として分類されるタンパク質のセットは第３の調節因子である。これらの因子は損傷組織の再構成を担う種々の細胞によって分泌される。RFは繊維芽細胞および上皮細胞のような細胞を刺激して、アミノ酸、グルコース、および脂肪酸を取り込ませることにより治癒を促進する。このグループは、上皮成長因子、繊維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子-αおよび-β、ソマトメジンおよびその他の因子を包含する。１つの重要な認識において、RFはAFの効果とは逆の効果を有する、なぜなら、RFは炎症および免疫反応を抑制するからである。TGF-βはシクロスポリンよりも1,000倍強力な免疫抑制剤である。このモデルにおいて、これらの成長因子はまた、局所組織の免疫原性をMHCの発現を阻害することにより減少させることが提案されている。
【００９０】
AFがそうであるように、RFは真性のホルモンであり、脂肪細胞(adipocyte)および筋芽細胞のような遠隔組織に影響し、末梢組織に異化効果を生じさせる。RFもまた身体が傷害の治癒を処理中であることを視床下部に知らせるためのメッセージとして視床下部に移動すると言われている。
【００９１】
要約すると、再生因子は:
(a)局所的:
(i)組織再構成に関与する細胞を刺激し、活性化および増殖させる。
【００９２】
(ii)白血球を不活化する。
【００９３】
(iii)MHCの発現を阻害することにより免疫原性を減少させる。
【００９４】
(b)遠隔的:
(i)末梢組織においてタンパク質分解および脂肪分解を刺激することにより傷害の治癒のために資源を動員する。
【００９５】
(ii)視床下部を刺激して治癒を援助する内分泌混合物を誘導する。
【００９６】
4)視床下部-脳下垂体-内分泌系が第４の因子である。かなり長い間ある種のホルモンが免疫に強力に影響することが知られているが、これは免疫調節の包括的なモデルには組み込まれなかった。内分泌ホルモンは明らかに総体的調節系の一部である。事実、神経-内分泌系は免疫調節の全く異なる次元を構成する。
【００９７】
5)中枢神経系が第５の因子である。視床下部が内分泌系を広く制御するだけでなく、CNSも免疫反応に活発に参加する。例えば、全身感染の間、CNSは末梢組織の神経終末からのノルエピネフリンの放出を生じさせる。この結果、筋肉および脂肪細胞が血清グルコースおよび電解質について免疫細胞と競合することを防ぐ。中枢神経系はまた炎症損傷部位または治癒中の傷害へのコリン作動性およびアドレナリン作動性薬物の放出を引き起こす。リンパ器官もまた支配され、従ってこれら神経ホルモンによる調節を受ける。
【００９８】
奇妙なことに、炎症、感染、または傷害治癒において、内分泌性混合物は常に異化的および免疫抑制的である。それぞれの状態において、栄養物が末梢組織から剥奪され免疫反応または治癒のいずれかに関与する分裂中の細胞に迅速に供給されなければならないので、このことは重要である。また、栄養物は主要なチャレンジに特異的に関与する細胞以外の免疫細胞に転用されてはならない。
【００９９】
視床下部によって誘導される内分泌性混合物は、RFおよびAFと協働的に作用してそれらの因子の効果を増大させる。従って、内分泌ホルモンもRFまたはAFのレベルも、生体にダメージを与えるほど高くある必要はない。治癒、炎症、または免疫に実際に関与する細胞は、ホルモン環境の異化的および免疫抑制的効果を克服し得る。なぜなら、それらの細胞はAFまたはRFによる直接的な刺激を受けているからである。免疫応答の場合において、抗原によって選択されたリンパ球クローンが、最高レベルの内分泌性ホルモン(コルチゾールのような)以外はいずれもがそれらに影響し得る、それらのサイクルにおける点を超えているが、この免疫抑制的内分泌性環境が有効であるときの後に抗原により選択される他の細胞は、活性化し得ない。これは、現存する感染が第２の抗原チャレンジに対して不十分な応答を身体に生じさせる、抗原性競合の現象を生じさせる。
【０１００】
身体は、必須の物質を供給しないまたはすることにより免疫および炎症細胞の活性化を調節する。必須の物質は：アミノ酸、脂肪酸、グルコースおよび電解質である。調節はイオン流を制御して実施する。リンパ球が抗原により選択される場合、最初に検出される効果は、電気化学的勾配に沿ったカリウムの流出とナトリウムの補償流入である。このナトリウムの流入は脂肪酸、アミノ酸、およびグルコースを運び入れる。次いでリンパ球がサイトカインによる刺激に応答し得る前に、リンパ球はエネルギー依存性作用であるナトリウム/カリウムポンプ(Na+K+  ATPase)を用いてカリウムの細胞内レベルを正常に回復しなければならない。多くの研究者が、Na+K+  ATPaseのブロックが細胞の活性化または増殖を妨げることを示している(例えば、Harold, F.M. (1986),The  Vital  Force, A  Study  of  Bioenergetics, W.H. Freeman  and  Co., New  York, p.332；Handwerger, B.S.およびDouglas, S.D. (1980),「胚子発生の細胞生物学」The  Cell  Biology  of  Inflammation, (G. Weissmann,編), Elsevier, New  York/North  Holland  Biomedical  Press, Amsterdam, p. 654；Segel, G.B.およびLichtman, M.A. (1976),「フィトヘマグルチニンで処理したヒト血液リンパ球におけるカリウム輸送」J. Clin. Investigation  58:1358-1369；Quastel, M.R.およびKaplan, J.G. (1970),「PHAで処理したリンパ球におけるカリウム取り込みの初期刺激」Expl. Cell  Res. 63:230-233参照)。
【０１０１】
それゆえ、抗原の選択によって既に課せられた調節、およびサイトカインによる刺激または調節的阻害に加えて、身体はさらにグルコース制御ホルモン(glucoregulatory  hormone)によって免疫を調節し得る。白血球にグルコースを供給しないことによって、身体は細胞に細胞内カリウムレベルの回復に必要なエネルギーを供給しない。グルコース制御ホルモンは、コルチゾール、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン、および甲状腺製剤を異なる組み合わせで包含する。感染中に生じるホルモンのプロフィールは傷害の治癒中に生じるそれとは異なる。感染中身体は、成長ホルモン、コルチゾール、チロキシン、アルドステロン、インスリン、およびグルカゴンの分泌の増加を生じさせる。傷害が治癒されている場合、肝臓はレセプター部位についてインスリンと競合すると考えられているソマトメジンの高レベルを生じる。インスリンは正常またはそれ以下に低下し、従って抗原によってチャレンジされた場合に必要な刺激をリンパ球から剥奪する。グルカゴンのレベルは低下し、そしてチロキシンおよびアルドステロンは徐々に減少する。
【０１０２】
悪性細胞が一般的にそれほど抗原性ではなくヒトにおいて効果的な免疫応答を誘発しない理由は、以前に知られていなかった。免疫および炎症細胞が腫瘍に侵入し、そして調節性サイトカインを放出することが知られている。しかし、侵入した白血球は組織を損傷しないだけでなく、時には腫瘍の増殖に貢献しているかにさえ見える。免疫系を刺激して悪性細胞を攻撃させる企ては大部分失敗に終わるかまたは受容され得ない毒性を生じさせている。
【０１０３】
本モデルにおいては、腫瘍に適用した場合、視床下部に到達したRFが治癒中の傷害を信号で知らせるので、身体は免疫反応を腫瘍に拘束する。腫瘍細胞は、治癒中の傷害の分裂細胞と同様の方法で成長因子を放出する。これらの成長因子は腫瘍細胞にオートクリンおよびパラクリンの刺激を与え、アミノ酸、脂肪酸、グルコース、および電解質を取り込ませる。しかし同時に、これらの成長因子は、直接的または腫瘍細胞のMHC産生を減少させて、免疫細胞に対して抑制的効果をおよぼす。さらにこれらの同じ成長因子は、視床下部において治癒中の傷害からであるかの様に相互作用する。このことは視床下部に「治癒」、すなわち腫瘍増殖および悪液質、を援助する内分泌性混合物の合成の信号を送らせ、したがってさらに免疫およびMHC発現を抑制する。
【０１０４】
腫瘍は、大きければ大きいほど、より多くの成長因子を放出する。視床下部に到達する
RFが多ければ多いほど、身体はより懸命に「治癒中の傷害」を支持しようとする。視床下部により誘導された内分泌性混合物は、腫瘍から放出されたRFと共同して作用する。
総合してこれらは以下を生じさせる:
1)末梢組織からの脂肪およびタンパク質の消失(すなわち、悪液質)。
2)腫瘍の迅速な増殖(傷害)。
3)腫瘍に到達する白血球の不活化(細胞のカリウム消失およびナトリウムへの置換の促進により)。
4)MHC発現の抑制による腫瘍組織における免疫原性の減少。
【０１０５】
本明細書で開示された治療システムは、傷害治癒中に生じるホルモン混合物よりも感染中に生じるそれを身体に供給する様に設計されている。本発明のバイオセラピーは、身体は免疫をイオンの流れを制御することによって調節するという考えに基づいている。神経内分泌系を通じて、脳は全身の免疫を、細胞をナトリウムで満たさせ、細胞にカリウムレベルの正常値への回復に必要なエネルギーを供給しないことにより、ダウンレギュレーションする。従ってナトリウムの汲み出しおよびカリウムの汲み入れをし得ないリンパ球および単球は、抗原またはサイトカインの刺激のいずれからも回復し得ない。なぜなら、それら両方はカリウムの流出およびナトリウムの流入を生じさせるからである。細胞は完全な活性化および増殖に移行し得ない。免疫細胞へカリウムを押し込み(炭酸水素塩およびインスリンによって)、Na+K+  ATPaseへの刺激(インスリン、甲状腺製剤、コリン作動性薬剤によって)、およびポンピングにエネルギー(グルコース)を提供することによって、免疫抑制は克服される。これは病原体または腫瘍に対する効果的な攻撃へと導く。
【０１０６】
食細胞およびリンパ球のいずれもが、コリン作動性薬剤と傷害または炎症損傷において接触すると考え得る理由がある(Ignarro, L.J. (1975),「リソソーム酵素放出のプロスタグランジン、自律神経ホルモン、および環状ヌクレオチドによる調節」Lysosomes  in  Biology  and  Pathology, (Dingle, J.T.およびDean, R.T.,編) p. 517)。胸腺、脾臓、リンパ節、およびその他の末梢リンパ系器官もまた、コリン作動性およびアドレナリン作動性神経線維の両方によって神経支配されることが知られている。従って、自律神経系はリンパ系器官に内在するＴ細胞と接触し、おそらく機能を制御している(Hadden, J.W. (1987),「胸腺依存性免疫系の神経内分泌性調節」Annals  of  the  N.Y. Acad. Of  Sciences  496:39-48)。アセチルコリンとその認識部位との分子反応が、哺乳類の神経筋接合部においてイオンコンダクタンスの迅速な増加を生じさせることもまた確立されている(Tiedt, T.N.ら(1979),「アセチルコリンレセプターのイオンチャンネルに対するピペロカインの電圧および時間依存性作用」Molec. Pharmacology  16:909-921)。コリン作動性薬剤が、免疫の調節に関与し、必要な刺激および抗原選択、サイトカイン刺激、およびインスリンにより生じる同様なイオン流を提供することが本明細書において開示される。インスリン、コリン作動性薬剤、および甲状腺製剤は共同的に作用して、細胞を刺激し、イオンの完全性を回復し、免疫および炎症細胞を活性化および増殖のサイクルに移行させる。こうして、インスリン、甲状腺製剤、グルコース、および塩化カリウム(カリウムの細胞内への移行を補助する炭酸水素塩)とともにコリン作動性薬剤を投与すればリンパ球を刺激して腫瘍を攻撃および破壊する。
【０１０７】
甲状腺製剤は緩慢に作用するので、患者に残りの治療に先立って２〜３日前に甲状腺製剤による前治療を施せば、Na+K+  ATPaseを刺激するに十分な安定した血中甲状腺製剤レベルに到達する時間を与え得る。
【０１０８】
適切な栄養の欠乏は免疫応答を阻害し得るので治療に先立って患者を栄養において正常に高めておくことが所望される。癌患者は多くの場合悪液質であるので、従って患者は栄養の補充を受けて本発明の治療に対するより敏速な応答を成し遂げ得る。
【０１０９】
実施例
実施例１．"マーチョ"(Macho)
６歳の雄のロットワイラー犬は摘出生検で免許のある獣医病理学者により血管肉腫であると診断された。腫瘍は10cm×12.5cmと測定された。動物は17ポンドやせて衰弱していた。手術および化学療法が推奨された。この状態での通常の余命(life  expectancy)は６〜12ヶ月であるが、腫瘍のサイズおよび動物の総体的状態から、その余命はわずかに30〜60日であった。被験体の飼い主は本出願に記載の免疫増強のための新たな治療プロトコールに同意した。
【０１１０】
治療開始の前の日に、イヌは0.4mgの経口甲状腺製剤をレボチロキシンで受けた。治療の日(第1日)およびさらに２日間、イヌは、a) 2.8Lのカリウム(30mEq/Lまたは0.25mEq/kg/時間)、b) 0.9mgのレボチロキシン、およびc) 11.4単位(または0.11mL)のレギュラーインスリンを投与された。治療は毎日8時間にわたって実施された。
【０１１１】
第1日目および第2日目には、すべての生命徴候、すなわち体温、血中グルコース、ECG、および呼吸速度は正常であった。第１日目以降、動物は夜には帰宅し、翌日に治療および/または観察のために診療所に戻った。第2日目の初めには、体温は徐々に上昇し始め平均が101.2°Fから第4日目の初めには104°Fになった。治療は第４日目に中断し、３Lの正常生理食塩水の注入に置き換えた。体温が沈静し始めたので治療を第5日目に再開した。
【０１１２】
腫瘍は第２日目に膨張を始め、過敏になり、接触に対し苦痛のある状態となった。第4日目までに腫瘍は平らになっていた。第8日目の吸引生検は第８日目の腫瘍細胞について陰性であり、動物の健康および健全な状態(well-being)は大きく改善された。腫瘍はもはや接触に対し苦痛ではなくなった。イヌは欠乏を補正するために1日２回の甲状腺製剤0.4mgの投与を継続された。第27日目の摘出生検は梗塞壊死性の血管肉腫に一致する任意の切片において腫瘍の証拠がないことを示した。動物の健全な状態は大いに改善した。約５ヶ月後に腫瘍は再発した。治療を施し、腫瘍が後退した結果、イヌははね回るようになり、そして高められた健全な状態を経験した。約３ヶ月後に腫瘍はまた増殖を開始した。イヌの飼い主はさらに治療することを辞退し、約３ヶ月後ペットの安楽死を選択した。イヌの生存期間は11ヶ月であった。
【０１１３】
DNA含量および分布のフローサイトメトリー分析技術(Vollenweider, I.およびGroseurth, P.J. (1992),「リンホカイン活性化キラー(LAK)細胞の細胞増殖測定するための４種のDNA染色蛍光色素の比較」J. Immunol. Meth. 149:133-135)、およびCD4ヘルパーおよびCD8サプレッサー免疫細胞リンパ球に対するモノクローナル抗体(Loeffler,D.A.ら(1992),「Hoechst  33342標識とイムノフェノタイピングを同時に使用する腫瘍-および前新形成-浸潤リンパ球の分布解析」Cytom. 13:169-174；Rivoltini, L.ら(1992),「腫瘍表現型の特徴付けを用いた、小児腫瘍に浸潤するリンパ球の表現型および機能的解析」Can. Immunol. Immunother. 34:241-251)により、３つの治療コースの後にマーチョはその末梢リンパ球の増殖応答性をポークウィードマイトジェン266%およびCD8に対するCD4の比率1.81まで増加していた。
【０１１４】
実施例２．"コディ"(Kody)
14歳のシェトランド犬(表１)は、口腔黒色腫で腹部または胸部には転移性病変が無いと診断された。標準的な血液化学のプロフィールからは、リンパ球および好酸球が正常より低いことが示された。イヌは表２に大要を記載した養生法のプロトコールに従って投薬治療を受けた。治療は5日間であった。2回目の4日間にわたる治療は8週間後に開始した。薬剤に関連した有害な影響は観察されなかった、すなわちECGは正常のままであった。本明細書執筆時治療後11ヶ月時点で、再発の証拠は見られず、そしてリンパ節は正常のままである。
【０１１５】
実施例３．イヌ試験の要約
４〜14歳の表１に詳述した種々の腫瘍タイプを有する8匹のイヌが臨床研究に参加した。すべての動物は中程度の期間の進行した病気を示した。診断は、委員会に承認された獣医病理学者により組織学的および/またはＸ線写真的に確認された。研究は職業的に訓練された獣医により、個人的な実施設定においてで実施された。本発明の組成物のこれら腫瘍の臨床コースを改変する能力は、寿命の延長および病気の無い期間の延長により立証された。余命は研究開始時における最良の臨床判断に基づいていた。何匹かの被験体は早い時期に飼い主により安楽死させられた。
【０１１６】
【表１】
0003884474.tif 000002
【０１１７】
それぞれの動物は完全な身体的、血液学的、ECG的、および放射線医学的検査を研究開始前に受けた。診断および放射線医学的および生検の報告書の検討の後に、動物の臨床研究の予定を立てた。動物のそれぞれの飼い主は臨床プロジェクトの研究的性質を承認する、インフォームドコンセントに署名した。
【０１１８】
臨床プロジェクトに入る少なくとも1週間前に、動物は感作用量の甲状腺ホルモンを投与された。各治療日の朝に動物は、表２に記録された指定の速度および量でカリウムおよびグルコースの注入を開始した。動物はまた甲状腺ホルモンおよびインスリンも投与された。正午および各日の終わりに、動物は2回目および3回目のインスリン投与を受けた；甲状腺ホルモンは帰宅前にまたは自宅で飼い主により投与された。時折、低血糖症のためインスリンの正午の投与を控えた。その他のまれな低血糖症の例では、動物にグルコースシロップを投与した。
【０１１９】
すべての動物は養生法を受けた後に活力および機敏性の改善を経験し、食欲が改善され、飼い主は彼らの動物についてより良い健全な状態を報告した。1匹のイヌもコース中または臨床研究後に任意の心肺の疾患を経験しなかった。8匹中3匹のイヌが通常臨床プロジェクトの初日の後に血液を含む下痢を経験した。
【０１２０】
8匹中6匹の動物が表２に大要を記載した養生法の複数のコースを受け、その平均コース数は３コースであり約3週間の間隔を置いた。1匹以外すべての動物は死亡し、2番目に長く生存したものはその病気の通常の余命がわずか２〜３ヶ月であるにもかかわらず、12ヶ月近く生存した。口腔黒色腫を有するイヌは11ヶ月時点でまだ生存している。6匹の動物は、研究の終了または適切なフォローアップがなされる前に飼い主により安楽死させられた。
【０１２１】
治療コース中の3匹のイヌからのリンパ球のイムノタイピング(Loeffler,D.A.ら(1992),「Hoechst  33342標識とイムノフェノタイピングの同時使用による腫瘍-および前新形成-浸潤リンパ球の分布解析」Cytom. 13:169-174；Rivoltini, L.ら(1992),「腫瘍表現型の特徴付けを用いた、小児腫瘍に浸潤するリンパ球の表現型および機能的解析」Can. Immunol. Immunother. 34:241-251)により、1匹のイヌについてCD4/CD8比の上昇(＞３)インビトロの免疫感作が可能である証拠を示した；未刺激リンパ球S-期集団の＞５%増加を示した。
【０１２２】
結論すると、ほとんどの動物は相当の大きさの固形腫瘍を有し余命が60日未満である広範囲の病気を有していた。治療された動物の４分の１は臨床的予後よりも長い余命を経験し、ほとんどの動物は臨床プロジェクトの期間中およびその後にクオリティオブライフ(quality  of  life)の改善を経験した。ほとんどの動物の絶対的な生存期間は、飼い主がそれらのペットの安楽死を選択したので未知である。
【０１２３】
【表２】
0003884474.tif 000003
【０１２４】
実施例４．ヒトバイオセラピー法
バイオセラピー開始の７日前に、T3およびT4を絶った状態でのインスリンおよびグルコースレベルの試験を含む完全な血液学的検査を得る。甲状腺製剤投与(リオトリックス、10lb当たり22.5mg、１日２回、午前および午後)を開始し、表３のスケジュールに従って毎日調整する。
【０１２５】
バイオセラピー開始の３日前に、当該分野で公知の方法により被験体のインスリン寛容能を決定するためにインスリンチャレンジ試験を実施する。
【０１２６】
バイオセラピーを表３に示すように５日間投与する。水は随意に、食物は正午と夕方に与える。
【０１２７】
【表３】
0003884474.tif 000004
各1日8時間について、総カリウム(K)は70mEqであり、グルコースは70gmであり、炭酸水素塩は21gmである。注入は175mL流量/時間である。
調整:
リオトリックス(甲状腺製剤):200ng/dL以上または以下のT3各10ng/dLについて、それぞれ1.5μg/10lb減少または増加。
【０１２８】
インスリン：50mg/dL以上または以下のグルコース各10mg/dLについて、それぞれ44mU/kg減少または増加。
【０１２９】
ピロカルピン：ピロカルピンは滅菌眼科用溶液として多くの一般名および商品名で入手し得る。15mLサイズで入手し得る10%濃度での開始が推奨される。一時的な刺痛および刺激が注射部位に生じ得る。0.1ccを超える注射量については複数の注射部位を用いる。
【０１３０】
ピロカルピンの用量は表４に示す増加スケジュールによって示されるように特記される。
【０１３１】
【表４】
0003884474.tif 000005
【０１３２】
被験体を表５に示すようにモニターする。
【０１３３】
【表５】
0003884474.tif 000006
【０１３４】
バイオセラピーにおける改変は以下のように行った:
低血糖症が生じる場合、次の用量をプロトコール(上記)に従って調整し、所望の場合は、0.5ccの50%グルコースシロップを投与する。必要があれば50%グルコースシロップのチューブが自宅使用用に提供され得る。
【０１３５】
治療中に下痢を生じ得、標準的な治療薬で制御し得る。重度の下痢の場合は、治療を中止すべきである。過剰なインスリンは低血糖症を生じさせ得、グルコース投与によって処置され得る。炭酸水素塩は頻拍を生じさせ得、生命がおびやかされる場合は投与を中止すべきである。頻拍が、おそらくカリウムのために持続する場合はバイオセラピーを中止する。
【０１３６】
毒性が生じた場合は解毒剤を表６に示すように投与し得る。
【０１３７】
【表６】
0003884474.tif 000007
【０１３８】
前記の明細書および実施例中に引用された参考文献は、本明細書中に参考としてその全体が援用される。
【０１３９】
当業者は、本発明の目標を達成するために、前出の実施例に明記された以外の改変した技術、手順、方法、および試薬が容易に使用または代用され得ることが理解される。すなわちそれは、免疫増強または免疫強化のための組成物および治療法、および腫瘍サイズの減少、ならびにハンセン病、マラリア、ヘルペス、帯状疱疹、結核、ナフトール潰瘍、疱疹性および乳頭腫性いぼ、AIDS、歯肉炎、アテローム性動脈硬化症などの徴候の軽減のような身体的徴候の軽減である。あるいは、機能的に同等の、ホルモン、ビタミン、およびミネラルを包含する薬学的組成物、ならびに方法は、当業者に容易に理解され得、不当に多くの実験を行うことなしに本発明に適用し得る。すべてのそのような代替、改変、および同等物は、本発明の意図および範囲内に包含されると考えられる。