(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも1個のＤ−チロシンまたはチラミン、アミノ末端およびＤ−リシンから形成されたカルボキシ末端を含み、上記Ｄ−チロシンまたはチラミンと上記カルボキシ末端との間に隣接するＬ−アミノ酸を全く含まない非代謝性ペプチドであって、
式（１）：
ABG-[CL]-Gly-[(D)-AA]n-(D)-Tyr-(D)-Lys-OH
（式中、nは整数で、ｎ＝０又は２〜４０であり、ＡＡはアミノ酸を表し、ＤはＤ−アミノ酸を示し、ＣＬは架橋剤であり、ＡＢＧは抗体結合基である。）
で表されるペプチドと、
（ｂ）アミノポリカルボキシレート付加ペプチドを形成するために、上記Ｄ−リシンのε−アミノ基を介して、イソチオウレア結合により上記ペプチドに結合したアミノポリカルボキシレートと、
（ｃ）前記アミノポリカルボキシレート付加ペプチドに結合しており、且つ抗体結合官能基を有する部分と
を含む抗体の放射性ヨウ素化に有用なアミノポリカルボキシレート付加ペプチド。
【請求項２】
上記Ｄ−チロシン残基またはチラミン残基に共有結合した放射性ヨウ素原子をさらに含む請求項１に記載のアミノポリカルボキシレート付加ペプチド。
【請求項３】
前記官能基が抗体のスルフヒドリル残基と結合して共有結合を形成することができることを特徴とする請求項１に記載のアミノポリカルボキシレート付加ペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドがアミノ酸を５〜４０個含むことを特徴とする請求項１に記載のアミノポリカルボキシレート付加ペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドがアミノ酸を５〜４０個含むことを特徴とする請求項２に記載の放射性ヨウ素化アミノポリカルボキシレート付加ペプチド。
【請求項６】
前記アミノポリカルボキシレートがニトリロ三酢酸、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＴＴＨＡならびにニトリロ三酢酸、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡおよびＴＴＨＡのイソチオシアナトベンジル誘導体から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のアミノポリカルボキシレート付加ペプチド。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は放射免疫検出および放射免疫療法に使用される試薬の調製に関し、詳細には、in vivoでの安定性が増大し、腫瘍部位での保持力が増強した放射性ヨウ素標識複合体の調製に関する。
発明の背景
放射性ヨウ素化したモノクローナル抗体は、GoldenbergがAmer.J.Med.94:297-312(1993)にまとめたように、癌の診断および治療に重要である。この用途のために、放射性ヨウ素をモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体に化学的に導入する多数の方法が、ここ３０年にわたって開発されてきた。ヨウ素は、タンパクの放射性ヨウ素化に使用される化学は比較的やさしく、放射性ヨウ素は有用な物理的崩壊特性を有し、且つヨウ素の同位元素は市販されているため、放射標識として好ましい。
最も有用なヨウ素同位元素は、Pentlow et al.,Journal of Nuclear Medicin,37:1557-62(1996)に記載されている、抗体の放射標識に使用されてきたヨウ素−１２４、およびMartin et al.,Cancer Investigation,14:560-71(1996)に記載されている、手術中のプローブとして使用して検出に使用されてきたヨウ素−１２５である。これらのヨウ素同位元素の使用に関連した１つの心配は、放射性ヨウ素化した抗体の循環期間が長く、そのため、バックグラウンド放射線が高くなることである。バックグラウンドが高い問題は、標準放射性イオン処理方法を使用するとき、標的細胞から放射性ヨウ素が喪失することによっていっそうひどくなる。デリバーされるヨウ素の標的と非標的との比率が低いのは、バックグラウンドが高い問題と放射性ヨウ素が喪失する問題に起因する。したがって、当技術分野における第一の目的は、標的と非標的との比率を改善することである。
ヨウ素−１２５は、Aronsson et al.,Nuclear Medicine and Biology,20:133-44(1993)が記載している通り、カスケードオージェ電子を放出するため、治療用に提案された。明らかに、長命［t 1/2、６０日］の低エネルギー放射核種を最適条件で使用するためには、細胞内標的保持を達成することが必要であり、これは従来の放射性ヨウ素化法では不可能である。癌細胞を標的とする抗体にヨウ素を結合させるために、様々な化学が開発されてきた。この化学は、Wilbur,Bioconjugate Chemstry 3:433-70(1992)が検討を加えている。最も一般的な結合方法では、抗体上の官能基と反応する親電子放射性ヨウ素種を原位置で調製した。親電子ヨウ素を発生させるためにクロラミンＴやヨードジェンなどの試薬が使用された。通常、タンパク上のチロシン基がヨウ素化部位である。しかし、過酷なオキシダントや還元剤が存在すると、抗体の構造的損傷を招く恐れがある。このため、代替法では小さい有機分子をヨウ素化し、純粋なヨウ素化種を抗体に結合させる。Ｎ−スクシンイミジル ３−（３−ヨード−４−ヒドロキシフェニル）プロピオネート（Bolton-Hunter試薬）が後者のカテゴリーの１例である。Wilbur(同上)により、上記方法および他の方法が検討されている。
前述の放射性ヨウ素化図式を使用することに伴う欠点は、in vivoでの脱ヨウ素化現象である。in vivoでの抗体内在化およびリソソームプロセッシングの結果として、標識タンパクは小さいペプチドに分解され、その放射性ヨウ素はヨードチロシンの形で、あるいは低分子量ペプチドフラグメントに結合したヨウ素として、細胞から放出される。この研究結果は、Geisseler et al;,Cancer Reserch 52:2907-1915(1992)およびAxworthy et al.,J.Nucl.Med.30:793(1989)が報告している。このようにin vivoで標的細胞から放射性ヨウ素が除去されることは、放射線診断および放射線療法におけるヨウ素同位元素の使用に重大な関係がある。in vivoで脱ヨウ素化が起こると、診断および治療法に関する腫瘍と非腫瘍との間の区別および腫瘍細胞上での同位元素の長期間保持がひどく損なわれる。このことは、放射免疫療法研究に広く使用されるヨウ素１３１の半減期が１３１日であることを考えれば、容易に理解できる。この同位元素で放射性ヨウ素化された抗体が代謝され、その後、試薬の注射後２４〜１２０時間以内に標的細胞から同位元素が除去されると、長い半減期という治療に有利なこの同位元素の長所が失われる。すなわち、上述した従来の放射性ヨウ素化化学の欠点のため、この同位元素の有用な半減期が、長期殺腫瘍作用に活用されない。
従来の化学のこの欠点とは対照的に、in vivoでヨウ素が分子状のヨウ素の形で細胞から放出される際のデイオジナーゼの作用は、放射性同元素蓄積の標的と非標的との比率を最適化する問題に対してさほど重要ではない。Wilburt et al.,Journal of Nuclear Medicine,30:216-26(1989)により検討されているように、当業者は、in vivoでデイオジナーゼの作用によって「脱ヨウ素化しないヨウ素化タンパクを調製しようとした。しかし、この試みは、細胞の放射性ヨウ素保持改善を示すことができなかった。この失敗の原因は、期待に反して、もとのままのヨードチロシンの代謝消失のほうが、チロシンが脱ヨウ素化されて放射性ヨウ素が遊離することよりも、同位元素の消失に関して問題であったことである。
放射性ヨウ素が容認できないほど速く複合体から放出されるのを克服する一法は、ヨウ素を非代謝性炭水化物に付け、結果として得られたものを抗体に結合させる方法である。腫瘍細胞内での抗体異化作用後、放射性ヨウ素は炭水化物にしっかりと付いたままであり、したがって細胞内部に捕らえられる。これらの炭水化物標識は、「残留化標識」とも呼ばれ、Strobel et al.,Arch.Biochem.Biophys 240:635-45(1985)およびAli et al.,Cancer Research(suppl)50:783s-88s(1990)により例示されている。しかし、これらの方法は、モノクローナル抗体（Mab）の標識に応用するとき、下記の欠点の一者または両者が問題となる。（１）非常に低い放射標識率（３〜６％）および（２）凝集の形成（２０％まで）。複合体収率が低いと、十分な放射性標識を抗体に組み込むために、大量の放射性ヨウ素を扱うことが必要になる。この方法を使用すると、放射線安全性の懸念が発生し、併せて使用できない放射能の大部分が廃棄される。結果として、この方法で達成される比活性は悪くなる。さらに、凝集体が形成されると、腫瘍の取り込みが低減して肝取り込みが増強し、その結果、放射標識法の効果が損なわれる可能性がある。炭水化物試薬を使用したときに、低放射標識率と凝集形成という対をなす問題を制限するように改善がなされなければ、放射免疫検出および放射免疫療法に残留化標識を使用する利点は十分に理解されない。斬新な基質および方法論を使用してこのような問題と取り組むことは、本発明のもう１つの態様である。
この問題に取り組む周知の一法は、二官能価アミノポリカルボキシレートリガンド、たとえば、二官能価ＥＤＴＡや二官能価ＤＰＴＡを使用して、放射性金属イオン、たとえばインジウム−１１１やイットリウムの同位元素で、抗体を標識する方法である。このような放射標識複合体は、Stein et al.,Cancer Research 55:3132-39(1995)によるin vivo動物実験で例証された通り、放射金属の細胞内長期保持を示す。すなわち、アミノポリカルボキシレートにキレート化した放射金属イオンは、in vivoでも、残留化標識として機能する。それ故、残留化の問題は一般にこの標識を使用する技術にも当てはまる。
従来技術では、非代謝性糖を使用し、これにヨウ素化可能基を付けることによって、残留化ヨウ素標識の問題点を扱ってきた。チラミンなどのようなヨウ素化可能基は炭水化物に還元的に結合し、それ故、チラミンと糖との間に代謝可能なペプチド結合は全くない。従来技術法では、２つの主要な問題に遭遇する。その問題は抗体結合工程にある。Strobel et al.(上記参照)の方法では、ラクトースから誘導した炭水化物−付加物を使用し、先ず、このような付加物のガラクトース部分をガラクトースオキシダーゼで酸化することによって、タンパクおよび抗体を炭水化物−付加物に結合させる。Stein et al.Cancer Research,55:3132-3139(1995)に記載の通り、全体の収率は通常低い（３〜６％）。さらに、ラクトースはガラクトースオキシダーゼにとって効率の悪い基質である。同酵素で酸化される能力について多数のガラクトース含有炭水化物誘導体を試験するに当たり、Avigad et al.(J.Biol.Chem 237:2736-2743,(1962))は、ガラクトースオキシダーゼに対するラクトースのアフィニティは、Ｄ−ガラクトースの半分未満であり、ガラクトースと比較して５０倍遅く酸化されることを決定した。従って、この高率の悪い工程により、抗体への放射性同位元素組込みが全体として低減する。
抗体への結合に関与する別の方法は、炭水化物が酵素によって選択的に誘導される能力などのような（たとえば、ガラクトース部分を含むガラクトースオキシダーゼ酸化などのような）特定の特性を使用しないが、ヨウ素化炭水化物も抗体も結合するには、塩化シアヌルヨウ素を架橋剤として使用する。この方法には、抗体凝集体が発生するという重大な問題がある。
塩化シアヌルを使用して複合体が形成されてきたが、不運にも、この試薬には反応性塩素が３個あるため、結果として凝集体が形成される。凝集形成に関与する別の因子は、特に、還元的アミノ化によってタンパクに結合する炭水化物残留化剤を使用した場合、残留化剤および／またはカップリング試薬に結合できる複数のアミノ残基が抗体に存在することである。このような多重結合は凝集形成を引起こし、結果として、調製された複合体混合物の放射標識の非活性が低くなる。したがって、凝集形成を引起こさないカップリング剤が必要である。
発明の概要
本発明は、人為的Ｄ−アミノ酸成分から成るヨウ素化可能ペプチドの調製方法および組成物を提供することによって、上で確認された問題を解決する。この複合体の放射ヨウ素化バージョンを使用して、抗体を標識し、残留化標識を作る。
本発明は、ヨウ素化可能基を非代謝性ペプチド結合によってアミノポリカルボキシレート単位に付けることを特徴とする、二官能価ヨウ素化可能アミノポリカルボキシレート付加物のデザインにも関する。付加物を放射性ヨウ素化し、Ｍａｂまたはそのフラグメントに結合させ、それによって、残留化標識を生物特異的Ｍａｂに導入する。
さらに、本発明は、炭水化物を主成分とする試薬を使用して、モノクローナル抗体の放射性ヨウ素化率を改善するための斬新な方法論のデザインにも関する。
本発明はさらに、（凝集が最小限の）残留化標識抗体複合体の質を改善し、その結果、in vivoで標識の（特に肝臓での）非標的蓄積を減少させる、炭水化物を主成分とする試薬のデザインにも関する。
本発明は、このような残留化放射性ヨウ素標識を、モノクローナル抗体、フラグメントおよびその構造物などのようなタンパクを含め、標的ベクターに迅速に付けることにも関する。
１つの実施態様では、in vivoで放射能が残留するように、非代謝性ペプチドおよび放射性ヨウ素化ペプチドを使用して抗体を標識する。これらの特別にデザインされた親水性ペプチドの分子量は、好ましくは５００より大きい（すなわち、アミノ酸残基５個以上）。さらに好ましくは、ペプチドの分子量は１０００〜４０００である（アミノ酸残基１０〜４０個）が、４０個より多いアミノ酸が条件に合う場合もある。本願明細書で使用する親水性ペプチドは、ペプチドが、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニンなどのように帯電しているか、セリンやトレオニンなどのように極性である、極性アミノ酸単位を含有することを意味する。この残基由来の複数の親水性酸基およびその非代謝性ペプチド結合が存在すると、リソソームによる抗体異化作用後、放射性標識の残留化が可能になる。このような状況で最も好ましいのは、アスパラギン酸のような酸性アミノ酸残基である。
Ｄ−アミノ酸は、ペプチドが抗体に付着する部位と、チロシンまたはチラミンに結合している放射性ヨウ素との間のペプチドを構成する。詳細には、この領域内で、隣接する２個のアミノ酸がＬ−アミノ酸であることはない。この状況で、グリシンはＬ−アミノ酸である。このような方法でＤ−アミノ酸を使用すると、放射性ヨウ素を抗体に結合するペプチド結合は、リソソーム内で加水分解され得ない。
第２の実施態様では、ペプチド部分の、別個に保護された２個のアミノ基と、人為的Ｄ−アミノ酸単位から成るペプチド単位を先ず合成することによって、ヨウ素化可能基を含有する二官能価アミノポリカルボキシレート系を調製する。アミノポリカルボキシレート単位を加え、次いでタンパク架橋剤を加えることによるアミノ基の逐次合成で、二官能価アミノカルボキシレートの合成が完了する。このペプチドは人為的Ｄ−チロシン単位を１個以上含む。このペプチドのアミノ酸単位は、非代謝性アミド結合によって付加される。抗体結合基は、アミノ残基（ＭＡｂの酸化された炭水化物部位特異的付着の場合）、イミデートまたはイソチオシアネート（タンパクのリシン基に付着可能）、マレイミド、ブロモアセトアミド残基またはヨードアセトアミド残基（Ｍａｂのチオールに特異的）等々であってもよい。ペプチド中のアミノ酸単位の数は２〜１０個、好ましくは３個であり、そのうち少なくとも１個はＤ−チロシンである。最後のＤ−チロシン単位の次の、抗体結合架橋剤の導入に使用されるアミノ酸は、天然のＬ−アミノ酸であってもよい。アミノポリカルボキシレート単位は、数あるアミノポリカルボキシレートおよび容易に考えられるそれらの誘導体の中で、イミノ二酢酸、ニトリロ三酢酸、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカンＮ，Ｎ'，Ｎ"，Ｎ"'−四酢酸）またはそれらの様々な主鎖置換バージョン、たとえば、イソチオシアナトベンジル−ＥＤＴＡ／ＤＴＰＡ／ＴＴＨＡ／ＤＯＴＡであってもよい。
第３の実施態様では、チラミン基および抗体結合基をアミノポリカルボキシレートに付けることによって、二官能価ヨウ素化可能アミノポリカルボキシレートを誘導する。この構造にプロテアーゼ感受性結合は全く含まれない。あるいは、抗体結合単位で主鎖が置換されたアミノポリカルボキシレートを、相応する二無水物に変換し、これをＤ−チロシンと反応させるとＤ−チロシン残基を２個含むものが得られる。プロテアーゼは二官能価アミノポリカルボキシレートとＤ−チロシンとの間のアミド結合を認識しないため、残留化ヨウ素標識の異なるバージョンが構成される。
これらの系全部の中で１つの重要な特徴は、ヨウ素化Ｄ−チロシン部分がデイオジナーゼに抵抗性になることである。この可能性については、Dumas et al.,Biochem.Biophys.Acta 293:36-47(1973)に記載されている。
第４の実施態様では、ガラクトース単位を含み、且つガラクトースオキシダーゼで容易に酸化され得る二糖を使用して、炭水化物を主成分とする残留化標識をデザインする。メリビオースから誘導された製剤が、この実施態様の例である。既に抗体結合基を含む、炭水化物を主成分とする残留化標識が調製される別の例が提供されている。これに関するさらに別の態様では、ヨウ素化され誘導された炭水化物との反応にヒドラジド付加抗体を使用する。
第５の実施態様では、放射性ヨウ素化炭水化物を、抗体結合部分を有するように既に誘導されている塩化シアヌル誘導体と反応させる。
本発明の方法は、残留化ヨウ素標識による抗体標識の効率を高める。本方法は、凝集物含有率が低い、より質の高い安定な放射性ヨウ素複合体製剤も提供する。下記の詳細な説明から、他の目的および利点が明らかになるであろう。
詳細な説明
本発明は、炭水化物を主成分とする従来技術で報告された標識効率が低い問題や凝集形成の問題を、２通りの一般的方法で解決する。第１の方法では、ガラクトース含有炭水化物−チラミン（またはD−チロシン）付加物をガラクトースオキシダーゼで酸化することが可能な新しい方法を提供する。本発明は、付加物中の炭水化物としてメリビオースを使用することによって達成される。メリビオースのガラクトースオキシダーゼに対するアフィニティは、ガラクトースの５倍であり、ラクトースのガラクトースオキシダーゼに対するアフィニティに比べて１０倍も高い。さらに、ガラクトースに匹敵する速度でメリビオースを酸化させる。その結果、本発明のこの方法は、酸化工程で得られる総合的工程収率を高める。本発明の放射性ヨウ素化および酸化（ガラクトースオキシダーゼを使用した酸化）ジメリビトールチラミンを使用した抗体の放射性ヨウ素化では、１８．７〜２０．７％（実施例９を参照されたい）という総合的組込みが達成された。この組込みは、放射ヨウ素化して酸化したジラクチトールチラミンを使用した同抗体の放射性ヨウ素化で確認された収率より５〜１０倍高い。この点に関する本発明の利点は、ガラクトースオキシダーゼで容易に酸化される基質（ジメリビトールチラミン）を利用することにある。さらに、これに関する発明ではヒドラジド付加抗体を使用し、結果として、タンパクに付加された炭水化物の還元的カップリングの工程で収率が向上した。
本発明が、上述した従来技術の問題を解決する第２の方法は、塩化シアヌル介在タンパク−炭水化物カップリングによって調製したヨウ素化抗体複合体の質を改良することである。これは、（１）もっと多数のタンパク第一級アミン残基の代わりに、１個または限られた数のより反応性のヒドラジド残基を、カップリング試薬と優先的に反応する抗体に導入することによる方法、および（２）二塩化シアヌル誘導体を使用して抗体を残留化標識にカップリングする方法の、２通りの方法で行われる。本発明で使用される、非水条件で調製される、一置換塩化シアヌルはマレイミドのようなチオール反応性を有し、チオール化抗体にカップリングさせるのに使用される。この塩化シアヌルの第２の塩素は、フェノール系ヒドロキシル基、たとえば、チラミン残基由来のものと反応させるのに使用され、チオール化抗体のチオール基は次の工程でマレイミド基と反応する。第３の塩素は非反応性であり、要因ではない。したがって、凝集形成が最小限に抑えられ、調製された複合体の比活性が改善される。
本発明の１つの態様によれば、ヨウ素の放射性同位元素を非代謝様式で基質に付ける。次いで、ヨウ素は抗体異化後にリソソームの酸性環境内に捕らえられる。その結果、標的細胞、たとえば腫瘍細胞内に放射性ヨウ素が長期保持されると、標的器官線量測定が容易になり、標的と非標的の区別が増強される。腫瘍を標的とする場合、この増強によって、さらに有効な放射線診断および放射線療法が可能になる。
本発明の別の態様は、新クラスのペプチドを主成分とする残留化標識である。この残留化標識を使用すると、炭水化物を主成分とするヨウ素標識の使用中に遭遇する問題に対処できる。
ペプチドを主成分とする残留化標識は、他の人為的アミノ酸に結合している１個以上の人為的Ｄ−チロシン単位から成るペプチドを含む。このペプチドは好ましくは、親水性を高めるためにＤ−アスパラギン酸単位やＤ−グルタミン酸単位などの親水性アミノ酸を含み、アミノ酸残基が少なくとも５個のサイズのものである。このペプチドのアミノ末端残基は、Ｌ−アミノ酸であれば、チロシンに直接付いていないという条件でＬ−アミノ酸であってもＤ−アミノ酸であってもよく、また、後で抗体に付けるためにタンパク結合架橋剤に付いていてもよい。いったん放射性ヨウ素化して抗体にカップリングした後は、ヨウ素化ペプチド単位を、関連抗体の結合およびプロセッシングによって細胞表面に付けた後、細胞リソソーム内に残留化させる。非代謝性アミド結合と、帯電したアスパラギン酸残基やグルタミン酸残基などのような親水性アミノ酸残基とが存在し、且つサイズがアミノ酸４個より大きいと、このような残留が可能になる。これに関して、ペプチドにアスパラギン酸残基を使用することが最も好ましい。
ペプチドカルボキシ末端にＤ−リシンを使用することによって、複合体の構造を変えることができる。こうすると、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはトリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）などのようなアミノポリカルボキシレートを付けるためにε−アミン基が提供される。この実施態様では、指定された位置にアミノポリカルボキシレートと架橋剤を付けるために、カルボキシル末端のε−アミンおよびアミン末端のアミンを別個に保護する。本発明のこの変形では、場合に応じて、ペプチド中のＤ−アスパラギン酸が他のアミノ酸で置換される。さらに別の変形では、チラミンなどのような放射性ヨウ素化可能基ならびに抗体結合部分を含むアミノポリカルボキシレート系を合理的にデザインする。
本発明の生成物は、抗体を内在化して処理した後で高い安定性を与える構造面と関係がある。腫瘍中の放射性ヨウ素の保持を低減させるのは、この抗体プロセッシングであり、抗体内在化によって悪化する。我々の発明は、アミノポリカルボキシレートおよびヨウ素化可能物にも付着する非代謝性ペプチド鋳型をデザインすることにより、この問題点に対処する。ＤＴＰＡなどのような極性基をＤ−リシンに付け、次ぎにはこれを、タンパク部分結合部位にカップリングさせたＤ−チロシンに付けることによって、本発明は、抗体プロセッシング後、抗プロテアーゼペプチド結合の存在、親水性およびサイズによってアミノポリカルボキシレート−Ｄ−リシン［Ｉ−１２５］−Ｄ−チロシンタンパク全体を確実にリソソーム内に捕える。これは、リソソームから容易に脱出し、腫瘍部位での放射能維持を低減させる従来の放射性ヨウ素化抗体の異化生成物であるヨードチロシンとは著しく異なる。
定義
以下の説明で、多数の用語を頻繁に使用する。本発明を理解しやすくするために、ここに定義を示す。
リン酸緩衝液。本願明細書で使用する「リン酸緩衝液」は、ｐＨを６．０〜７．５に調節した０．１Ｍリン酸ナトリウム水溶液を指す。
抗体。本願明細書で使用する「抗体」は、ネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体などのようなモノクローナル抗体、ならびにその抗原結合フラグメントを含む。このようなフラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ'）2などがあり、もとの抗体のＦｃフラフメントが欠如している。このようなフラグメントとしては、軽鎖可変領域から成る孤立フラグメント、軽鎖と重鎖の可変領域から成る「Ｆｖ」フラグメント、（ｓＦｖ'）2フラグメント（たとえば、Tai et al.,Cancer Research supplement,55:5983-5989,1995を参照されたい）、および軽鎖可変領域と重鎖可変領域がペプチドリンカーで接続されているリコンビナント１本鎖ポリペプチド分子などがある。
放射性ヨウ素−抗体複合体。本願明細書で使用する放射性ヨウ素−抗体複合体は、残留化標識を少なくとも１個と抗体を含む分子である。放射性ヨウ素−抗体複合体は、抗体の免疫反応性を保持する。すなわち、抗体部分は、残留化標識との複合体形成前と比較して、複合体形成後に概ね同じか僅かに低下しただけの抗原結合能力を有する。
残留化標識。「残留化標識」は、タンパクに共有結合的に付けた放射標識であり、キャリヤータンパクの分解後、リソソーム内または他の細胞下成分内に捕らわれたままであるようにデザインされている。一般に、残留化標識は、自らはリソソーム内で容易に分解されない分子から合成される。一般にこのようなトレーサーは放射性炭水化物またはＤＴＰＡなどのようなアミノポリカルボキシレートの金属キレートであった。
任意の非代謝性炭化水素が本発明に適している。ジメリビトールチラミン（ＤＭＴ）やメリビトールチラミン（ＭＴ）はこのカテゴリーの例である。二官能価ＤＴＰＡ（またはＥＤＴＡ）は、単独でまたはＤ−チロシン付加基質として、アミノポリカルボキシレートのカテゴリーのよい例である。
凝集体。本願明細書で使用する「凝集体」は、所望の抗体に加えて余分なポリペプチドを少なくとも１個含む分子複合体である。所望の抗体に加えて余分なポリペプチドを直接または間接的にポリペプチドにカップリングさせる。余分なポリペプチドは、直接または間接的に共有的手段で抗体にカップリングさせる。凝集体の例は抗体のダイマー、トリマーおよび他のマルチマーである。残留化標識による抗体の過剰な標識によって抗体結合活性が損なわれる場合、抗体当たり１個より多い残留化標識を含む高分子複合体は凝集体であると考えられる。しかし、調製された抗体複合体の比放射能を高める手段として、複数の残留化標識による抗体の標識が望ましい場合が多い。
本発明の５つの実施態様を以下の図式Ｉ〜VIIに示し、順次説明する。
図式Ｉ
ＡＢＧ−[ＣＬ]−ＡＡ−[(Ｄ)−ＡＡ]m−[(Ｄ)−Tyr]n−(Ｄ)-Lys−ＯＨ
式中、ｍは各々整数で、ｍ＋ｎ＝４〜４０であり、ＡＡはアミノ酸を表し、ＤはＤ−アミノ酸を示し、ＣＬは架橋剤であり、ＡＢＧは抗体結合基である。１個以上のＤ−チロシン残基、１個以上の親水性アミノ酸、たとえばＤ−アスパラギン酸および他のアミノ酸を含有するペプチドのデザインは、樹脂を使用して遂行する。Ｆｍｏｃ保護した第１アミノ酸（場合に応じて、Ｄ−リシンと表示されている）は、そのカルボキシ末端によってクロロトリチル−クロリド樹脂製の樹脂支持体に固定する。アミノ酸を逐次加えることによってペプチドを合成し、各アミンをＦｍｏｃ基で保護し、カルボン酸を活性化する。各アミド結合の形成後、Ｆｍｏｃ基をはずす。Ｆｍｏｃ基をはずすと、次のカルボキシ活性化したＦｍｏｃ保護Ｄ−アミノ酸にカップリングすることができる。それ故、ペプチドの組立は簡単な手順である。最後のペプチドを固体支持体から遊離させた後、アミン末端を適当なヘテロ二官能価架橋剤またはホモ二官能価架橋剤に付ける。こうした架橋剤の多くは市販されている。ペプチドの親水性を高めるために、１種以上の親水性アミノ酸、たとえばアスパラギン酸を導入する。このようにして形成されたアミノ酸は最小限のサイズのアミノ酸５個である。本発明に従って作られた代謝的に安定なＤ−チロシン含有親水性ペプチドは残留化ヨウ素標識として有用である。
図式II
0003992745.tif 000002
上記テーマの変形は、そのカルボキシ末端にＤ−リシンを含有し、このリシンのε−アミノ基をアミノポリカルボキシレート、たとえば、ＥＤＴＡやＤＴＰＡ等々に付けるペプチドを調製することである。図式IIに示した一般構造で、ｍは０、１、または２の値を有する整数である。ペプチド部分で、文字ＤはＤアミノ酸を示し、ＡＡはアミノ酸を表し、ｎは２〜４０の整数である。ここではグリシンとして表してあるアミン末端を、抗体結合基ＡＢＧで終わる架橋剤ＣＬに付ける。後者は任意のタンパク結合基、たとえば、マレイミド、ハロアセトアミド、イソチオシアネート、スクシンイミドエステル、イミデートエステル等々であってもよい。アミノポリカルボキシレートの置換基Ｒは水素か、ペプチド部分が付着可能な４−イソチオシアナトベンジルなどの基である。ＤＴＰＡの付着様式は、たとえば、Ｄ−リシンのε−アミンとＤＴＰＡ二無水物との反応による（上記構造に示した）アミド結合によるか、イソチオシアナトベンジルＤＴＰＡ（Ｒに付着したペプチドを含む）へのイソチオウレア結合による。Franano et al.,Nucl.Med.Biol.21:1023-34(1994)等の研究から、ＤＴＰＡとリシンのε−アミンとの間のアミド結合またはイソチオウレア結合はリソソーム内で不活性（非代謝性）であることが判っている。金属キレート化剤としてのアミノポリカルボキシレート、たとえば、ＤＴＰＡにより、インジウムまたはイットリウムで放射性金属処理した抗体は残留化されることも判っている。Stein et al.（上記参照）等によって証明されているこの現象は、金属キレートの親水性ならびにその電荷および分子量に起因し、これらは全てリソソーム区画内での残留化に寄与する。この発明では、残留化ヨウ素標識を製造する一法として、ヨウ素化可能で且つ非代謝性のペプチド鋳型に基づいたアミノポリカルボキシレートを使用する。この目的のために、Ｄ−チロシンを付けることによってアミノ末端に、アミノポリカルボキシレートにカップリングされるＤ−リシンを合成すると、総合的に不活性な付加物が生じ、これをヨウ素化して、架橋剤により上記ペプチドのアミン末端で抗体に付けたとき、結果として残留化放射性ヨウ素となる。放射性ヨウ素化してリンパ腫抗体ＬＬ２にカップリングしたとき、その生成物は、in vitroでのリンパ腫細胞系への保持に関して、インジウム１１１で標識した同抗体に似ており、従来通りに放射性ヨウ素化した同抗体と比較して保持力が増強している（実施例５を参照されたい）。
このカテゴリーのペプチドは、マニュアル操作で、または自動ペプチドシンセサイザーを使用して、固体支持体上で容易に合成することができる。アミノ酸単位の数は２〜４０であってもよいが、但しＤＴＰＡ固定アミノ酸はＤ−リシンかＤ−アルギニンかＤ−オルニチンであり、且つこのアミノ酸はＤ−チロシンに直接付いている。ペプチドが複数のＤ−チロシン（これは比活性を高めるのに有用である）を含むとき、各チロシンはＤ−アミノ酸に付いている。ペプチドのアミン末端はグリシンであっても、Ｌアミノ酸またはＤアミノ酸であってもよく、抗体にカップリングする場合、架橋剤に付いている。
図式III
0003992745.tif 000003
図式IIIに示した反応系で、置換基アミノポリカルボキシレート、たとえばＤＴＰＡを使用して放射性ヨウ素を抗体にカップリングする。主鎖が置換されたＤＴＰＡ、たとえば、４−ニトロベンジルＤＴＰＡ（図式IIIの左の構造、式中ｎ＝０、１、２）が合成の論理的出発点である。二無水物をニトロベンジルＤＴＰＡから調製し、ＤＭＳＯ中またはＤＭＦ中の塩基性非水条件下で、Ｄ−チロシンで開く。この構造中のニトロベンジル基は、触媒的水素化とチオホスゲンとの反応の、２工程処理でイソチオシアナトベンジル基に変換される（生成物構造は示さず）。この基質を最初に放射ヨウ素化し、次いでｐＨ８〜９で抗体にカップリングする。二官能価ＤＴＰＡは出発物質のよい例であるが、本法は二官能価ＥＤＴＡまたは二官能価ＴＴＨＡを出発物質として使用する場合にも適用できる。
図式IV
0003992745.tif 000004
別の方法では、チラミンおよび抗体結合部分がアミノポリカルボキシレート構造単位の一部を構成する。これを、表示した反応図式の二官能価構造Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−Ｎ'−［２−（ｐ−ヒドロキシ−フェニル）エチル］−２−［ｐ−イソチオシアナトベンジル］エチレンジアミンＡおよびＢで図解する。簡単に記述すると、この合成は、最初に、たとえば、還元剤としてボランを使用して、カルボキシル基をアルコールに還元し、続いてジアルキル化し、ＤＭＳＯに溶解した塩化オキザリルを用いてスローン（Sloan）酸化によってアルコール基をアルデヒドに酸化した後、チラミンに還元的カップリングし、最後にニトロベンジル基をイソチオシアナトベンジル基に変換することによって、４−ニトロフェニルアラニンを合成する。これらの残基を先ず放射性ヨウ素化し、次いで抗体リシン基またはチオール化抗体にカップリングさせる。調製した複合体に塩基性アミノ基およびカルボン酸基が存在すると、酸性リソソーム環境内への残留化を助ける。
図式Ｖ
0003992745.tif 000005
図式Ｖに示した反応系では、２通りの例示的方法の１つで、１個以上のチオール基を抗体、たとえばモノクローナル抗体（Ｍａｂ）に導入する。第１の方法では、ジスルフィド結合還元剤、たとえばジチオトレイトール（ＤＴＴ）で、重鎖ジスルフィド結合を部分的にまたは完全に切断する。あるいは、リンカーを用いて、１個以上のチオール基
0003992745.tif 000006
を導入する。保護した第三級チオール、たとえばスクシンイミジル２−[Ｎ−(３'−メチル−３'−チオアセチル)ブタミジル]アセテート（１）が好ましく、次に、GoyindanらがBioconjugate Chemistry,7:290-297,1966に記載している通りに、そのチオエステルをヒドロキシルアミンで切断する。
結果として生じたチオール化抗体を、マレイミド／ヒドラジド複合体、たとえば、４−[４'−(Ｎ−マレイミジル)−フェニル]ブチリルヒドラジド（ＭＰＢＨ、２）や４−(Ｎ−マレイミジルメチル)−シクロヘキサン−１−カルボキシヒドラジド（Ｍ2Ｃ2Ｈ５、３）を使用して、ヒドラジドに連結する。
0003992745.tif 000007
最後に、ヒドラジドを、放射性ヨウ素化した炭水化物、たとえばガラクト−スオキシダーゼとの酵素反応で酸化されているジメリビトールチラミン（ＤＭＴ、４）にカップリングする。
0003992745.tif 000008
場合に応じて、還元的アミノ化反応によって放射性ヨウ素化ＤＭＴ−Ｍａｂ−複合体を形成することにより、この酸化した炭水化物をさらに安定化させる。
本発明の１つの利点は、簡単な第一級アミン、たとえば、リシン等から形成された酸化した炭水化物のシッフ（Shiff）塩基付加物とは著しく異なり、本発明のヒドラゾン複合体は、安定化にイミン（ヒドラゾン）官能基の還元を必要としない。ヒドラゾンは生理条件下での加水分解に抵抗性であるが、Schiff塩基はるかに加水分解されやすい。
図式VI
0003992745.tif 000009
図式VIに示す反応手順では、酸化した炭水化物、たとえば、ＤＭＴは、マレイミド／ヒドラジド複合体、たとえば、ＭＰＢＨ（２）またはＭ2Ｃ2Ｈ（３）とカップリングしてマレイミドジメリビトールチラミンが生じる。あるいは、先ず２−アミノエチルカルバメートを酸化したジメリビトールチラミンまたは酸化したメリビトールチラミンに還元的にカップリングし、続いて残りの第一級アミノ基を保護解除し、さらにマレイミドに変換することによって、マレイミド基を導入する。この反応の前または後に、チラミン残基をヨウ素化する。上述の２通りの方法の１法で１個以上のチオール基を抗体に導入する。最後に、マレイミドを抗体にカップリングして安定な放射性ヨウ素ＤＭＴ−抗体複合体を形成する。
過ヨウ素酸塩、たとえば、過ヨウ素酸ナトリウムまたは過ヨウ素酸カリウムで酸化すると、炭水化物上にアルデヒド官能基が生成するが、隣接する炭素原子に付いた２個以上のケト基またはヒドロキシル基を含む化合物は、この２個の炭素の間で切れる傾向がある。過ヨウ素酸塩酸化は広範な異性化および炭水化物の分解までも引起こす可能性がある。このため、炭水化物は、他の構造変化を引起こさずに、アルデヒド官能基１個を炭水化物に導入することができるガラクトースオキシダーゼなどのような酵素で酸化することが好ましい。
図式VII
0003992745.tif 000010
図式VIIの反応手順は、二塩化シアヌルの塩素の置換による、置換塩化シアヌル（ＣＣ）で放射標識したチラミン炭水化物、たとえばＤＭＴ（４）またはＭＴのカップリングを示す。塩化シアヌルの第１の塩素は非常に反応性であり、一置換ＣＣの第２の塩素はさほど反応性ではないが、残りの二塩素置換ＣＣの塩素は比較的非反応性である。１つの好適な実施態様では、非水条件で等モル量のＣＣとマレイミド含有アミン、たとえば、一置換ＣＣ類縁体（下記の、ＣＣ類縁体５）から一置換ＣＣを調製する。
0003992745.tif 000011
上記一置換ＣＣから、塩素１個のみが放射性ヨウ素化炭水化物、たとえば、Ｉ−125−ＤＭＴとの反応に容易に使用される。さらに、チオール反応性であるマレイミド基は、その後、チオール化抗体にカップリングすることができる。マレイミドに対するチオールの反応性が高いため、抗体アミンとＤＭＴ−誘導ＣＣとの長い反応に起因する低収率および凝集の問題が回避される。
ヨウ素１２５（Ｉ−１２５）放射性同位元素は、図式Ｉ〜VIIに示した実施態様のよい例であり、本発明の方法は任意のヨウ素同位元素に適用できる。I−１２３は腫瘍造影に使用するのに特に好ましく、ヨウ素−１３１（I-１３１）は腫瘍治療に特に好ましく、Ｉ−１２５はたとえば、手術中、血管内または内視鏡的手技用の腫瘍マージンの短距離検出に好ましい。
本発明のペプチドまたは炭水化物への放射性ヨウ素の組込みは、親電子置換反応によって行われる。この反応は速く、放射性ヨウ素の希釈溶液中でカップリングすることができる。親電子放射性ヨウ素化試薬を作るために、反応は一般にヨウ素イオンの酸化を必要とする。ハライドイオンを酸化する方法は当技術分野で周知であり、Wilburが記述している（上記参照）。本発明はヨウ化ナトリウム／ヨードジェンの組合せの例であるが、方法はこの試薬組合せに限定されない。
置換二塩化シアヌルの反応は、中性のｐＨで実施することが好ましい。中性のｐＨはｐＨ４．５〜ｐＨ９．５と定義される。本発明にはｐＨ６〜ｐＨ８の中性のｐＨが特に好ましい。
多くの異なる種類のマレイミド−ヒドラジドは知られているか、当業者が作ることができ、本発明に適している。特に好ましいのは、上記２種のマレイミド−ヒドラジド（２）および（３）である。他のマレイミド−ヒドラジドはマレイミド Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルから合成することができる。この目的に有用な代表的なマレイミドエステルは、３−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、β−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−(Ｎ−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−(Ｎ−マレイミドメチル−シクロヘキサン−１−カルボン酸３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルおよびβ−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
腫瘍細胞表面マーカーに特異的な任意の抗体が本発明に有用である。この抗体は、目標に向かう抗体が腫瘍造影または腫瘍治療用の放射性ヨウ素をデリバーすることが可能な、特定の細胞型に対するアフィニティを有することが好ましい。特に好ましいのは、Stein et al.,Cancer Res,50:1330-36(1990)に記載されている内在化パンカルシノーマ抗体、たとえばＲＳ７、Pawlak-Byczkowska et al.,Cancer Res.49:4568-77(1989)記載されている内在化リンパ腫抗体、たとえば、ＬＬ２およびHansen et al.,Cancer 71:3478-85(1933)に記載されている抗癌胚抗原抗体、たとえばImmu-14である。上記３つの参考文献は全て、本願明細書の一部として援用する。抗体および抗体フラグメントのキメラバージョン、ヒト化バージョンおよびヒトバージョンも好ましい。
本方法は、スルフヒドリル含有一価抗体フラグメント、たとえば、Fab−SHまたはFab'−SHは、適当な従来のジスルフィド還元剤、たとえば、システイン、ジチオトレイトール、２−メルカプトエタノール、ジチオナイト等々を用いた二価Ｆ（ａｂ）2フラグメントまたはＦ（ａｂ'）2フラグメントの還元的切断によって生じるため、これらをカップリングするのに特に適している。還元は、都合よくは不活性ガス雰囲気下、たとえば、クエン酸緩衝液中、酢酸緩衝液中またはリン酸緩衝液中で、ｐH５．５〜９．５、好ましくは６．０〜６．８、さらに好ましくは６．１〜６．４で行うことが好ましい。還元は高いｐHでより速いが、再酸化も速い。還元は適度に速いが、チオール還元剤との混合ジスルフィドの形成を含め、酸化は無視できる、最適ｐHを選択する。免疫グロブリンタンパク内の重鎖／重鎖ジスルフィド結合と競争して軽鎖／重鎖ジスルフィド結合を還元する、過度に強力な還元剤を避けるように注意しなければならない。このようなジスルフィド還元にはシステインが好ましいが、システインと同様の酸化能を有する他のチオール類を使用することも可能である。ジスルフィド還元剤とタンバクの比率は鎖間ジスルフィド結合安定性の関数であるが、個々のケース毎に最適化しなければならない。Ｆ（ａｂ'）2抗体フラグメントの切断は、１０〜２０mMのシステインおよび約１０mg/mlのタンパク濃度で有利に行われる。
二価抗体フラグメントの切断は、たとえば、サイズ排除ＨＰＬＣでモニタリングして、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ'フラグメントを適正限度まで産生するが、軽鎖−重鎖切断を最少限に抑えるように条件を調整することができる。サイジングゲルカラムからの溶出液を直接使用してもよく、あるいは、Ｆａｂ−ＳＨ溶液またはＦａｂ'−ＳＨ溶液を、数日〜数週間、都合よくは不活性ガス雰囲気下、たとえば、窒素またはアルゴン雰囲気下、好ましくはｐＨ３．５〜５．５、さらに好ましくはｐＨ４．５〜５．０で、たとえば冷蔵庫内で、低温で保存してもよい。
図式１、２および３のカップリング反応に適した時間、温度、イオン強度、ｐＨ等々の最適反応条件は、最少限の実験で決定することができる。事実、本発明の１つの主な利点は、マレイミドおよび二塩化シアヌルとのカップリング反応を、容易に且つ中性のｐＨで行うことができる。反応温度およびイオン強度は、同様に重要ではない。考えるべき重要なことは、使用した特異的抗体を変性させない極端でない反応条件を選択することである。
例示的実施例に言及することにより、以下に本発明をさらに説明する。
実施例
実施例１．（ＢＯＣ）Gly−D−Tyr−（Ｏ−ｔ but）−D−Lys−OHの調製
Fmoc−Ｄ−リシン（Aloc）［０．３２５g、０．７２mmol］を無水ジクロロメタン（CH2Cl2）５mlに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）０．５５mlと混合する。この溶液を、２０mlバイアル内の２−クロロトリチルクロリド樹脂０．５gに加え、内容を勢いよく１８時間振塗する。混合するためか、あるいはカラムから溶液を排水し、且つ樹脂をカラム上に残しておくために、スラリーに窒素を通して泡立てるのに使用することができる、フリットおよび三方コック栓を取付けたカラムアセンブリに、赤みを帯びたスラリーを入れる。溶液を排水し、３×４０mlのCH2Cl2：MeOH：ＤＩＥＡ（１７：２：１）、３×４０mlのCH2Cl2、２×４０mlのＤＭＦ、２×４０mlのCH2Cl2および２×４０mlのMeOHで樹脂を洗浄する。樹脂を窒素流下で乾燥させる。１：１（ｖ／ｖ）CH2Cl2−DMF中の５％ ピペリジン ４０mlを１０分間加え、溶液を排水することによってＦｍｏｃ基を切断し、CH2Cl2−DMF中の２０％ピペリジンで１５分間切断を続ける。これに続いて、ＤＭＦ ４０ml、イソプロパノール（ＩＰＡ）４０ml、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）４０ml、ＩＰＡ ４０mlおよびＮＭＰ ４×４０mlで洗浄サイクルを行う。続いて樹脂を活性化Ｆｍｏｃ−Ｄ−チロシン（Ｏ−ｔ but）１．８mmolと４０分間反応させる。活性化は、Fmoc−D−チロシン（Ｏ−ｔ but）０．８２７ｇ（１．８mmol）、ＮＭＰ ４ml中のＨＯＢＴ ０．２６９gを使用し、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）の透明な溶液０．３１mlに加え、室温に２０分間保つことによって行われる。この期間の後、ＤＩＥＡ ３．６mmol（０．６２ml）を加え、反応を２５分間続ける。洗浄手順、その後のＦｍｏｃ切断および次の洗浄手順は、上述の通りである。活性化ＢＯＣ−グリシン（Ｂｏｃ−グリシン０．３７６ｇすなわち３mmolから誘導される）を使用した第２回カップリングを同様の方式で行う。CH2Cl2（４０ml）：ＡｃＯＨ（２ml）とＥＤＴＡ（５ml)の混合物に溶解した、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）０．１５４７ｇの溶液を使用し、続いてトリブチルチンヒドリド ５mlを加えて、Aloc基をはずす。通常の洗浄手順の後、酢酸−トリフルオロエタノール−CH2Cl2（１：１：８ ｖ／ｖ）１０mlでペプチドを樹脂から切断する。切断されたペプチドの溶液を、標題の化合物０．２５ｇまで（ゴム状生成物）濃縮する。この生成物は、保持時間７．１０分で、ピーク１つを示し、分析用逆相ＨＰＬＣ電気スプレー質量スペクトルで、ｍ／ｅ ５２３でＭ＋Ｈピークを示し（陽イオンモード）、ｍ／ｅ ５２１でＭ−Ｈを示す（陰イオンモード）。
実施例２．Gly−D−Tyr−D−Lys（ＩＴＣ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）-ＯＨの調製
工程１の生成物０．０５３ｇ（０．１mmol）を水−ジオキサン中のＩＴＣ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ（含有率８０％のＤＴＰＡ ８１mｇ、２０％過剰）と混合し、ｐＨを８．５に調整する。この溶液を３７℃で２．５時間インキュベートする。さらにＩＴＣ−ＤＴＰＡ（４１mg）を加え、ｐHを８．５６に調整する。この溶液を同じ温度で２時間インキュベートする。逆相カラムで水（０．１％ＴＦＡ）／９０％アセトニトリル−水（０．１％ＴＦＡ）の勾配溶離を使用した分離用HPLC精製により、（ＢＯＣ）Gly−D−Tyr−（Ｏ−ｔ but）−D−Lys（ＩＴＣ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）-ＯＨが無色の固体として３０ｍｇ得られる。分析用逆相ＨＰＬＣは保持時間７．５４分で、ピーク１つを示す。質量スペクトル分析では、ｍ／ｅ １０６３でＭ＋Ｈピークを示し（陽イオンモード）、ｍ／ｅ １０６１でＭ−Ｈピークを示す（陰イオンモード）。次いで、この物質をＴＦＡ／CH2Cl2／アニソールの混合物で１時間処理し、ＢＯＣ−およびTyr−（Ｏ−ｔ but）保護基を切り取る。反応混合物をエチルエーテルに加えることによって、標題の化合物を沈澱させる。HPLC保持時間は５．３１分であった。質量スペクトル分析では、９０７でＡＮ Ｍ＋Ｈピークを示し、９０６でＡＮ Ｍ−Ｈピークを示した。
実施例３．（ＭＣＣ）Gly−D−Tyr−D−Lys（ＩＴＣ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）−ＯＨの調製
実施例２の生成物０．０２５ｇ（０．０１３８mmol）をｐH７．０の０．１Ｍ リン酸ナトリウム ０．５mlに溶解する。これに、市販のスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）０．０３gを加え、ｐHを７．１７に上げる。透き通った溶液を１時間攪拌する。分離用逆相カラムを用いた分離用ＨＰＬＣで実施例１と同じ勾配溶出を使用すると、標題の化合物０．００５４ｇが得られる［ＭＣＣは４−Ｎ−マレイミドメチル）−１−カルボニル部分を表す］。精製された物質の保持時間（分析用逆相カラム）は６．３６分である。電気スプレー質量スペクトル分析では、ｍ／ｅ １１２６でaN Ｍ＋Ｈピークを示し、ｍ／ｅ １１２４でＭ−Ｈピークを示した。
実施例４．実施例３の生成物の放射性ヨウ素化、ＤＴＴ還元モノクローナル抗体ＩｇＧ［ＬＬ２］、およびＤＴＴ還元モノクローナル抗体ＩｇＧ［ＲＳ７］への結合。
実施例３の生成物１０ナノモル（nmol）を、ヨードジェンヨウ素化法によりＩ−１２５−ヨウ化ナトリウムで放射性ヨウ素化する。標識した基質を第２のバイアルに移し、４−ヒドロキシフェニル酢酸６０nmolで処理した後、ジチオトレイトールで予め還元された抗リンパ腫抗体［ＬＬ２］０．６mgと反応させると、抗体の１個以上の鎖間ジスルフィド結合の還元によってチオール基が生じる。反応の１〜２時間後、溶液をナトリウムテトラチオネート中５mMとし、５分間インキュベートして、遠心分離した、０．１Mリン酸ナトリウム ｐH７中SephadexTM５０／８０のサイズ排除ＨＰＬＣカラムで精製した。カラム上に置いた放射能の量を基準にして、抗体結合物質の放射能が３７．４％回収され、これはＨＰＬＣによるサイズ排除クロマトグラフィーで測定したとき、９５％純粋であった。この手順で達成された比活性は０．９４mCi/mgである。
この手順の変形では、クロラミンＴをオキシダントとして１−２分間使用して、実施例３の生成物１０nmolをＩ−１２５ヨウ化ナトリム２．２４mCiで放射性ヨウ素化する。未使用の活性ヨウ素を４−ヒドキシフェニル酢酸で失活させ、ヨウ化カリウムで希釈し、ＤＴＴ−還元ＬＬ２ ０．５mgと１５〜４０分間反応させる。作業およびクロマトグラフィーは上述の通りであった。この総合的収率は４１％〜４３％で、最終的な比活性は１．９８〜２．０９mCi/mgの範囲である。
ヨードジェンをオキシダントとして使用して、実施例３の生成物（１０nmol）を、ＮａＩ（Ｉ−１２５）１．４６mCiで放射性ヨウ素化し、放射性ヨウ素化した物質をＤＴＴ−還元ＲＳ７（０．５ng）に結合させる。最終的比活性１．０mCi/mgで総合的収率（精製後）２９．３％が得られる。精製された物質を分析用ＳＥＣ ＨＰＬＣで分析すると、抗体と結合した放射能は＞９８％を示す。
実施例５．in vitro結合試験
３７℃に維持した無菌インキュベーター内で、実施例４の生成物をRaji細胞（Dulbecoのダブルイーグル培地中１０6細胞／ml）とインキュベートする。２時間後、細胞を遠心分離でペレット化し、上清溶液を捨てる。冷培地で細胞を３回洗浄する。洗浄した細胞を新鮮な溶媒で再懸濁し、インキュベーターに入れる。様々な時点で、既知量の細胞懸濁液を取り、ペレット化して細胞ペレトと結合した放射能を測定する。コントロール（対照）実験では、クロラミンＴ手順で直接標識した同じ抗体（陰性コントロール）またはＩｎ−１１１で標識した（実施例３の生成物をＩｎ−１１１アセテートで標識し、続いてＤＴＴ−還元ＬＬ２にカップリングすることにより陽性コントロールとして）同じ抗体を使用する。実施例４の生成物は、直接放射性ヨウ素化したＬＬ２と比較して、Raji細胞と長く結合していた。この保持は、Ｒａｊｉ細胞上でのＩｎ−１１１の保持と類似している。［保持された％初期結合ｃｐｍ：Ｉ−１２５標識ＬＬ２の場合：９４．７％（２時間）、６３．８％（２６時間）、５１．１％（４８時間）、および３５．４％（１２０時間）、Ｉｎ−１１１標識ＬＬ２の場合：８９．２％（２時間）、６８．１％（２６時間）、４９．８％（４８時間）、および３４．１％（１２０時間）。
同様の様式で、本発明の残留化標識で放射性ヨウ素化したＣａｌｕ 3非小肺腺癌細胞系ＲＳ７（すなわち、放射性ヨウ素化してＤＴＴ−還元ＲＳ７にカップリングした実施例３の生成物）と、従来通りに放射性ヨウ素化したＲＳ７へのin vitro結合を比較した。この実施例のデータから、残留化標識は従来のヨウ素標識と比較して、明らかに長い保持を示すことが判った。
実施例６．図式IV Ｎ，Ｎ−ビス（カルボキシメチル）−Ｎ'−［２−（ｐ−ヒドロキシフェニル）エチル］−２−［ｐ−イソチオシアナトベンジル］−エチレンジアミンＡおよび相応するマレイミドＢの調製
４ニトロフェニルアラニンをＴＨＦ中のボランで還元する。灌流しているアセトニトリル中で２当量のtert−ブチルボロアセテートと無水炭酸ナトリウムと反応させるとジアルキル化した生成物が、フラッシュクロマトグラフィー精製後、収率６７．９％で得られる。この生成物の４００MHzのプロトンＮＭＲスペクトルは、構造割り当てと完全に一致する。中間体（０．１ｇ）は、−７８℃でＤＭＳＯ／塩化オキザリルを使用し、続いてトリエチルアミンで処理すると高収率でアルデヒドに酸化され、精製した生成物をナトリウムシアノボロヒドリドの存在下、メタノール水中でチラミンと反応させる。チラミン付加中間体（総合的収率７０％）は、ｍ／ｅ ５４４でのＭ＋Ｈピーク（電気スプレー質量スペクトル、陽イオンモード）を特徴とする。ニトロ基を触媒的に水素化してアニリン誘導体（生成物は質量スペクトルに特徴がある）とし、後続の２工程反応手順（塩酸を使用したカルボキシル保護基の保護解除、およびその後の３Ｍ塩酸中でのチオホスゲンとの反応を含む）でイソチオシアナト誘導体Ａが生じ、次にこれを２工程（エチレンジアミンとの反応およびその後の、実施例３に記載のＳＭＣＣ処理）でマレイミド誘導体Ｂに変換する。
実施例７．Ｉ−１２５標識ＡまたはＩ−１２５−標識Ｂ（図式４のＡおよびＢ）を使用したリンパ腫抗体（ＬＬ２）の放射性ヨウ素化
Ａ（Ｎａ125Ｉ／ヨ−ドジェン）１０nmを放射性ヨウ素化した後、未反応の放射性ヨウ素を水性フェノール４０nmで失活させ、次にｐH８〜８．２、３７℃でＬＬ２ １．３７ｇと３時間反応させると、３２．８％の組込みが起こる。比活性を高めるために少量の抗体を使用して実験を行う。比活性１．１mCi/mgで２３．７％の組込み、比活性１．４ｍCi/mgで２４．１％の組込みが得られる。凝集含有率も２％と低い。B旦と還元ＬＬ２（実施例４の通りに還元を行う）を使用すると、比活性０．９５mCi/mgで２８．４％の組み込みが得られ、凝集は無視できる。
実施例８．ジメリビトールチラミンの調製
メリビオース２．２３ｇ（６．５５mmol）、チラミン０．０８９ｇ（０．６５７mmol）およびｐH９のホウ酸緩衝液５ml中のナトリウムシアノボロヒドリド０．１６９ｇ（２．６３mmol）を６５℃で１８時間使用して、標題の化合物を調製する。この溶液をｐH４．６まで酸性化し、ｐH４．６の０．５Ｍ酢酸アンモニウム中に充填したDowex 50-X2陽イオン交換樹脂の２．５cm（外径）、高さ１０cmのカラムで精製する。同緩衝液で溶離した後、水１Lと１M水酸化アンモニウム１Lの直線勾配で、流速２〜３ml／分で溶離する。各々４mLの分画を回収する。２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度で分画を分析すると、溶離プロフィールが得られた。溶離プロフィールにはピーク１つが含まれる。したがって、溶離液分画６０〜７０をプールし、蒸発させ、凍結乾燥すると標題の生成物および無機塩を含む無色の固体０．９８ｇが得られる。２８０nmにおける吸光度値を使用して水溶液中のジメリビトールチラミンの含有量を測定する。凍結乾燥した物質の電気スプレー質量スペクトルは、ｍ／ｅ ７９０で適正なM+Hピークを示す。
実施例９．Ｉ−１２５−ＤＭＴを使用したＬＬ２の放射性ヨウ素化
１つの実験で、ＤＭＴ １０nmolをＩ−１２５で標識する（ヨードジェン法）。ヨウ素化したＤＭＴを約１０単位のガラクトースオキシダーゼで、３０℃で２．５時間酸化する。酸化した125Ｉ−ＤＭＴを、等モル（１０nmol）のＬＬ２および２０mMナトリウムシアノボロヒドリドと、同じ温度で１８時間反応させる。組込みは１８．７％であり、これは再現性がある（２回目の実験で２０．７％）。
実施例１０．in vitroでの、実施例９の生成物のRaji細胞への結合
直接放射ヨウ素化した（クロラミンＴ法による）抗体をコントロール（対照）として使用して、実施例５の記載と同様に実験を行う。結果から、実施例９の生成物はコントロールと比較して１７０倍の期間にわたってRaji細胞上に保持されることが判明した。
実施例１１．図式Ｉ：チオール化抗体とマレイミド含有ヒドラジドとの反応およびその後の酸化された炭水化物との反応
この図式の第１工程で、ＩｇＧジスルフィド結合をジチオトレイトールで還元する。簡単に記述すると、Pawlak-Byczkowska et al.,Cancer Research 49:4568-77(1989)に記載されている内在化抗リンパ腫抗体ＬＬ２ ０．５５mlを同量のｐH ７．４のリン酸ナトリウム緩衝液、ｐH８．５の０．５Mホウ酸緩衝液０．１１mlおよび水中０．４g/mlのジチオトレイトール６μlと混合する。反応混合物を渦巻き混合し、室温で３０分間インキュベートする。ｐH７．０のリン酸緩衝液中で平衡化したSphadexTM５０／８０樹脂中を、上記還元タンパク溶液を通過させることによって、チオール還元した抗体をサイズ排除クロマトグラフィーで精製する。
この図式の第２工程で、ヒドラジド基をＬＬ２に導入する。ＩｇＧの各ＳＨ基について、ジメチルホルムアミドに溶解した１０当量のヒドラジド−マレイミドM2C2Hを、調製した抗体溶液に加える。インキュベーションを３７℃で２時間続ける。反応を停止するために、モル濃度が５０倍過剰のＮ−エチルマレイミドを加え、インキュベーションを３７℃でさらに３０分間続ける。次いで、処理したＩｇＧをサイズ排除クロマトグラフィーで精製する。
この図式の第３工程で、ＩｇＧをジメリビトール−125/131Ｉ−チラミンと結合させる。最初に、ヨードジェンを使用して、ジメリビトールチラミンを放射性ヨウ化ナトリウムで放射性ヨウ素化する。Strobel et al.,Arch Biochem.Biophys.240:635-45(1985)に記載されている手順の１つで、ヨウ素化したジメリビトールチラミンをガラクトースオキシダーゼで酸化する。処理したＩｇＧを、ｐＨ７．７のリン酸緩衝液中、１：１モル比で、酸化したジメリビトールチラミンのアルデヒド基に結合させる。２時間後、ナトリウムシアノボロヒドリドを最終濃度２０mMまで加え、この反応混合物をさらに１時間インキュベートする。ジメリビトール−125/131Ｉ−チラミンを含む複合体を、ｐＨ７．４のサイズ排除クロマトグラフィーで再度精製する。
実施例１２．図式Ｉ：抗体のチール化および次ぎのマレイミド含有ヒドラジドによるカップリング
この図式の第１工程で、チオール化試薬（１）との反応によって、少なくとも１個のチオール基を抗体に導入する。最終ジメチルホルムアミド濃度５％ ｖ／ｖまで、チオール化試薬をジメチルホルムアミドに溶解する。調製した抗体のチオール含有率をEllmanの分析法で測定する。テール化抗体を、ｐH７．５のリン酸緩衝液中で平衡化し、４〜１０倍過剰のマレイミド−ヒドラジド試薬M2C2Hと反応させる。抗体と試薬ＭＰＢＨとの反応後、複合体をサイズ排除クロマトグラフィーで精製する。上記実施例１１の工程２および工程３に略述した手順に従って、ヒドラジド導入抗体を、酸化したジメリビトール−123Ｉ−チラミンにカップリングさせる。
実施例１３．図式II：マレイミド含有ヒドラジドの、酸化した炭水化物への導入に後続する抗体へのカップリング
この図式で、酸化したジラクチトール−123Ｉ−チラミンを２倍過剰のM2C2Hと、ｐH６〜ｐH７のリン酸緩衝液中で１時間インキュベートする。次いで、上記実施例１または実施例２に記載の通りに調製したチオール化抗体を、インキュベーション混合物に加える。室温でさらに３０分間インキュベートした後、ヨードアセトアミドを加え、さらに３０分間インキュベートして未反応のチオールを失活させる。ナトリウムシアノボロヒドリドを最終濃度１０mMまで加え、１時間インキュベートする。調製抗体を、最終反応混合物からサイズ排除クロマトグラフィーで精製する。
実施例１４．図式III：抗体と残留化標識との二塩化シアヌルカップリング
この図式で、置換二塩化シアヌルを使用して、抗体を残留化標識にカップリングさせる。二塩化シアヌル誘導体をジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドに溶解し、次いでジラクチトール−123Ｉ−チラミンの水溶液に加える。
二塩化シアヌル類縁体とのカップリングの場合、最初に二塩化シアヌル類縁体を残留化標識と３７℃で９０分間インキュベートする。冷却後、リン酸緩衝液中の抗体溶液を加え、混合物を３７℃で３時間インキュベートする。抗体にカップリングするとき、最終反応ｐＨがｐＨ７〜８になるように抗体緩衝液溶液のｐＨを調整する。チオール化抗体とのカップリングの場合には、最終ｐＨはｐＨ６〜７である。抗体を他の反応物からサイズ排除クロマトグラフィーで精製する。
上記実施例の各々に関して、タンパクに組み込まれたＩ−１２３の量および回収されたタンパクの量を測定することによって複合体効率を求める。分析用サイズ排除ＨＰＬＣまたはドデシル硫酸ナトリウムの存在下でポリアミドゲル電気泳動を使用して、調製したＩｇＧの分子サイズ分析を行うことにより、ＩｇＧ凝集の程度を求める。
残留化剤、抗体および他の試薬のモル比を変え、比活性、結合アフィニティおよび各反応条件化で形成された複合体の量を測定することによって、上記反応における残留化剤、抗体および他の試薬の最適量を求める。
実施例１５．Ramosヒト腫瘍異種移植片を担持するヌードマウスにおける、実施例３の生成物から誘導した残留化Ｉ−１２５標識または従来のクロラミンＴ法を使用したＩ−１３１で標識したリンパ腫抗体ＬＬ２の比較用生物分布。
Ramos腫瘍細胞系を使用して、４週令のメスヌードマウスで腫瘍を増殖させた。２週間後、腫瘍のサイズは約０．１〜０．２gに達する。この段階で、マウス５匹の群に、両者とも同じバイアルに入っている、２種のヨウ素標識（Ｉ−１２５残留化標識および従来のＩ−１３１）の各々を約１０μCi投与する。二重標識は抗体線量および腫瘍サイズの変化が存在しないため、二重の標識を使用するとさらに正確に比較できる。標識抗体の投与後１日、３日、５日、７日および１０日に動物を屠殺する。腫瘍を含む様々な器官を切除する。器官と結合した放射能を、ｇ当たりの注射した線量のパーセンタージとして表す（％ ID/g）この実施例から得られたデータから、残留化Ｉ-１２５標識と従来通りに調製した（ＣＴ法）Ｉ−１３１標識に対する残留化Ｉ-１２５標識の長期保持とすぐれた腫瘍：比腫瘍比率の融合が了解される。
前述の説明から、当業者は本発明の本質的な特徴を確認することができ、且つその精神および範囲から逸脱せずに、本発明の様々な変更および修正を行って、本発明を様々な用途および条件に適合させることができる。