(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）又は（b）の単離されたポリペプチド：
（a）配列番号：３に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチド、又は
（b）（a）のポリペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列を持ち、かつ心臓筋細胞肥大性活性、及び／又は神経栄養活性を持つポリペプチド。
【請求項２】
以下の（a）又は（b）の単離されたポリペプチド：
（a）配列番号：８に示されるアミノ酸配列を持つポリペプチド、又は
（b）（b）のポリペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは挿入されたアミノ酸配列を持ち、かつ心臓筋細胞肥大性活性、及び／又は神経栄養活性を持つポリペプチド。
【請求項３】
還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量約２１−２３ｋＤを有する請求項１又は２のポリペプチド。
【請求項４】
請求項１又は２のポリペプチドに結合することのできる単離された抗体。
【請求項５】
請求項４の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系列。
【請求項６】
請求項４の抗体を請求項１又は２のポリペプチドを含有することが推測される試料または細胞と接触させ、結合が起きたか否かを検出することを含む、前記ポリペプチドの検出法。
【請求項７】
請求項４の抗体を結合したカラムに請求項１又は２のポリペプチドの混合物を通過させ、前記ポリペプチドを含む分画を回収することを含む、前記ポリペプチドの精製方法。
【請求項８】
請求項１又は２のポリペプチドをコードする単離された核酸分子。
【請求項９】
以下のヌクレオチド配列を持つ核酸分子：
（a）配列番号：１に示すヌクレオチド配列を持つ核酸、又は
（b）（a）の核酸配列を持つ核酸にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ該核酸がコードするポリペプチドが心臓筋細胞肥大性活性、及び／又は神経栄養活性を持つ核酸。
【請求項１０】
以下のヌクレオチド配列を持つ核酸分子：
（a）配列番号：６に示すヌクレオチド配列を持つ核酸、又は
（b）（a）の核酸配列を持つ核酸にストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ該核酸がコードするポリペプチドが心臓筋細胞肥大性活性、及び／又は神経栄養活性を持つ核酸。
【請求項１１】
さらに核酸分子に作動可能に結合するプロモーターを含む請求項８の核酸分子。
【請求項１２】
標識されたものである請求項８の核酸分子。
【請求項１３】
請求項８の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
そのベクターで形質転換した宿主細胞が認識する制御配列に作動可能に結合している請求項８の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１５】
請求項８の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５の宿主細胞を培養することを含む請求項１又は２のポリペプチドをコードする核酸分子を前記ポリペプチドの生産のために使用する方法。
【請求項１７】
請求項１又は２のポリペプチドを宿主細胞から回収する請求項１６の方法。
【請求項１８】
請求項１又は２のポリペプチドを宿主細胞培養培地から回収する請求項１６の方法。
【請求項１９】
宿主細胞に請求項９又は１０の核酸分子を含む発現ベクターを遺伝子移入する請求項１６の方法。
【請求項２０】
請求項８ないし１０の核酸分子を被験試料核酸とハイブリダイズさせ、ＣＨＦ核酸の存在を決定することを含む被験試料中におけるＣＨＦ核酸分子の存在を決定する方法。
【請求項２１】
請求項８の核酸分子を用いて被験試料中で核酸ポリメラーゼ連鎖反応をプライミングすることを含む核酸被験試料の増幅法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
この発明は心不全の処置における心機能調節および神経学的疾患の処置における神経機能調節のための心臓肥大因子（カルジオトリフィンとも呼ばれる）に関する。
発明の背景
心不全は約３００万人の米国人が罹患し、毎年約４０万人に発症している。最近ではこれが米国における主な入院診断の一つである。急性心筋梗塞を含む急性心臓病の管理における最近の進歩は結局慢性心臓病に進行する患者人口の拡大を招いている。
心不全の最近の療法は一次的にはアンギオテンシン転換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と利尿剤の使用を指向している。ＡＣＥ阻害剤は心不全における生存を延長する一方、最終段階心不全に向けた進行を遅らせ、ＡＣＥ阻害剤を投与されている患者の多数が機能的に第ＩＩＩ級心不全を持っている。さらに、ＡＣＥ阻害剤は心不全患者の６０％以上では症状緩和ができず、心不全による死亡の約１５〜２０％しか減少しないことが確実と思われる。心移植はドナー心臓の入手可能性により限定される。さらに、ジゴキシンを除いて、筋変力作用陽性剤の長期的投与には、たとえば不整脈惹起、突然死、その他の有害副作用のような生存に関わる副作用を伴わない有用な薬剤はない。これら現用療法の欠陥は別の治療的手法に対する必要性を示唆する。
広範なデータは心不全初期における病理学的心筋肥大は心室の拡張、壁張力／ストレスの増加、心筋細胞の長さ対幅の増加、および随伴する心臓の性能および機能の減弱に特徴付けられて、有害であり得ることを示唆する。研究によれば、生理学的または代償性肥大の活性化は心不全には有益であり得る。実際、ＡＣＥ阻害剤の効果は心臓の負荷を除くことを意図するのみでなく、心筋層内の局所的レニン−アンギオテンシン系に関連すると予想される病理学的肥大性反応を阻止することも意図されている。
分子生物学的水準では心臓は筋細胞および周囲の非筋細胞と呼ばれる支持細胞の合胞体として機能する。非筋細胞は本質的に線維芽細胞／間葉細胞であるが、それらは内皮細胞および平滑筋細胞も包含する。実際、筋細胞は成人心筋層量の殆どを構成するが、心臓中に存在する細胞数全体の約３０％であるに過ぎない。生体内で心筋細胞と近接した関係の故に、非筋細胞は筋細胞成長および／または発育に影響を与えることができる。この相互作用は細胞−細胞接触を通じて直接にまたはパラクリン因子の生産を経て間接に介在しうる。このような生体内での関係は、非筋細胞数とそれによって相互作用している細胞外マトリックスとの双方が心筋層肥大においておよび損傷および梗塞に反応して増加するので重要である。これらの変化は異常な心筋層機能に関連している。
心臓の筋細胞は出生直後から分割不能である。それ以上の成長は各細胞の肥大を通じて起きる。筋細胞肥大の細胞培養モデルが開発されて心臓筋細胞肥大の機序に対する理解を深めた。Ｓｉｍｐｓｏｎなど、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、５１巻：７８７〜８０１頁（１９８２年）；Ｃｈｉｅｎなど、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、５巻：３０３７〜３０４６頁（１９９１年）。培養心臓筋細胞の研究は殆どが非筋細胞の夾雑を最小化するように設計されている。例えば、ＳｉｍｐｓｏｎとＳａｖｉｏｎ、Ｃｉｒｃ．ＣＲｅｓ．、５０巻：１０１〜１１６頁（１９８２年）；Ｌｉｂｂｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、１６巻：８０３〜８１１頁（１９８４年）；Ｉｗａｋｉなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１３８０９〜１３８１７頁（１９９０年）参照。
Ｓｈｕｂａｉｔａなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５巻：２０５５５〜２０５６２頁（１９９０年）は肥大反応を活性化できる、たとえばエンドセリン−１のような、ペプチド由来成長因子を確認するための培養モデルの有用性を記載した。Ｌｏｎｇなど、Ｃｅｌｌ・Ｒｅｇｕｒａｔｉｏｎ、２巻：１０８１〜１０９５頁（１９９１年）は心臓筋細胞の培養中での成長に関する心臓非筋細胞の影響を研究した。筋細胞肥大性成長は非筋細胞数を漸増した高密度培養においておよび非筋細胞数を漸増した共培養において促進された。筋細胞の寸法に及ぼす非筋細胞のこの効果は非筋細胞培養物により調整された血漿不含培地によって再現できた。この培養物中の主な筋細胞成長促進活性はヘパリン結合性であった。この成長因子の諸性質を心筋層に存在することが知られている線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、およびトランスフォーミング成長因子−べータ１（ＴＧＦ−β１）を包含する種々の成長因子と比較した。Ｌｏｎｇなどの成長因子は他の公知成長因子よりも大きく、およびＰＤＧＦを除くこれら成長因子全部のものとは異なるヘパリン−セファロース溶離特性を持つことが見出された。さらに、これはＰＤＧＦ特異性抗体によっては中和されなかった。著者はこれが心臓筋肉細胞の成長および発達に重要なパラクリン関係を規定することを提唱した。
欝血性心不全のような心不全治療改善への要求があるのみでなく、神経学的疾患に有効な処置を提供することにも要求がある。インスリン様成長因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３、−４、−５、および毛様体神経栄養因子のような神経栄養因子がニューロンの生存を強化する、例えば筋萎縮性軸索硬化症、アルツハイマー病、発作、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、および末梢性神経障害のような神経変性病のようなものの処置のための潜在的方法として提唱されている。これらの目的に別の療法を加えて提供することは望ましいものである。
それ故、本発明の目的の一つは欝血性心不全のような心不全の予防および／または処置、殊に生理学的な型の肥大の促進または病理学的な型の肥大の阻止、および末梢性神経障害のような神経学的疾患の予防および／または処置のための改善された療法を提供することである。
このような療法で使用するための心臓肥大因子ポリペプチドおよびそれに対する拮抗剤の新規な群を確認することが別の目的の一つである。
このようなポリペプチドをコードする核酸を提供し、この核酸を組換え細胞培養物中でポリペプチドを生産するために使用することがさらに別の目的である。
さらに別の目的はそれらのアミノ酸配列変異体および共有結合誘導体を含む、このようなポリペプチドの誘導体および修飾型を提供することである。
別の目的の一つはこのようなポリペプチドに対する抗体を作成するための抗原を製造し、ならびにそれらと結合することのできる抗体を得ることである。
例えば発現クローニングおよびそのポリペプチドの精製において、発現クローニングから分離されたクローンの評価において、およびそのようなポリペプチドに対する拮抗剤の確認において、使用できる新規肥大性検定法を提供することがさらに別の目的である。
本発明のこれらおよびその他の目的は本明細書の全体を考慮すれば当業者には明白である。
発明の要約
本明細書に開示する心臓肥大因子（ＣＨＦ）の発現クローニングおよび蛋白質精製を可能にする試験管内新生児ラット心臓肥大性検定法を開発した。毎週１０００個の試料処理能力を持ち、試料必要量が１００μＬまたはそれ以下と小さいこの検定法は今までに公表されている方法を使用しては不可能だったと思われる発現クローニングと蛋白質精製とを可能にした。それ故、態様の一つでは本発明は：（イ）インスリン、トランスフェリン、およびアプロチニンを含むダルベッコの修正イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）／Ｆ−１２培地のｍＬ当り約７．５×１０4細胞密度の筋細胞懸濁液を９６ウェルプレートにプレーティング（植え付ける）すること；
（ロ）細胞を培養すること；
（ハ）被験試料（ＣＨＦを含むと推測されるような）を培養した細胞に添加すること；
（ニ）細胞を被験試料とともに培養すること；および
（ホ）被験試料が肥大性活性を持つかどうか決定すること
を含む被験試料を肥大性活性について検定する方法を提供する。
この検定法とは別に、本発明は、ラットＣＨＦポリペプチドを除く、分離したＣＨＦポリペプチドを提供する。このＣＨＦポリペプチドは好ましくは実質的に均一であって、グリコシル化体でも非グリコシル化体であってもよく、天然配列ポリペプチド、ポリペプチド断片、変異体ポリペプチド、およびキメラ体ポリペプチドから構成される群から選択しうる。これに加えて、ＣＨＦポリペプチドは哺乳類から分離されたポリペプチド、組換え手法で作ったポリペプチド、および合成的手法で作ったポリペプチドから構成される群から選択しうる。さらにこのＣＨＦポリペプチドはヒトのものであるポリペプチドおよびヒト中で非免疫原性であるポリペプチドから構成される群から選択しうる。
別の側面では、分離されたＣＨＦポリペプチドは図１に示す翻訳ＣＨＦ配列と少なくとも７５％のアミノ酸配列同一性を共有する。別の側面では、このポリペプチドは成熟ヒトＣＨＦであって図５に示す翻訳ＣＨＦ配列を持つ。
さらに別の側面では、本発明は中程度にストリンジェントな条件下に図１に提供する核酸配列とハイブリッド形成をする配列を持つ核酸がコードする分離されたポリペプチドを提供する。好ましくはこのポリペプチドは生物学的に活性である。
その他の側面では、本発明は異種ポリペプチドに融合したＣＨＦからなるキメラ体を提供する。
さらに別の側面では、本発明は生物学的に活性なＣＨＦと医薬的に許容しうる担体とを含むか、または免疫原性ポリペプチドに融合した生物学的に活性なＣＨＦを含む組成物を提供する。
その他の側面では、本発明はＣＨＦに結合することのできる分離された抗体、およびこの抗体をＣＨＦを含有することが推測される試料または細胞と接触させることおよびもし結合が起きたらＥＬＩＳＡのようなもので検出することを含む試験管内または生体内でＣＨＦを検出する方法を提供する。
さらに別の側面では、本発明は抗体を結合したカラムにＣＨＦの混合物を通過させ、ＣＨＦを含む画分を回収することを含むＣＨＦの精製法を提供する。
他の側面では、本発明はＣＨＦをコードする分離された核酸分子、この核酸分子を含むベクター、好ましくはこのベクターで形質転換された宿主細胞が認識する制御配列に作動可能に結合する核酸分子を含む発現ベクター、哺乳類および細菌の宿主細胞を含むこの核酸分子を含む宿主細胞、およびこの核酸分子を含む宿主細胞を培養することによってＣＨＦを生産するためにＣＨＦをコードする核酸分子を使用する方法を包含する。好ましくは、宿主細胞に遺伝子移入してＣＨＦ核酸を発現させてＣＨＦを宿主細胞培養物から回収するか、もしも分泌されていれば、培養培地から回収する。
さらに別の側面では、本発明は図１または図５に示す読み取り枠の核酸配列を含む分離された核酸分子を提供する。本発明はラットＣＨＦを除外した分離された核酸分子であって、
（イ）図１または図５に示すＣＨＦ遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡクローン；
（ロ）（イ）のクローンとストリンジェントな条件下にハイブリッド形成をすることのできるＤＮＡ配列；および
（ハ）天然ＣＨＦポリペプチドの生物学的性質を持つポリペプチドをコードする（イ）または（ロ）のＤＮＡ配列のうちのいずれかの遺伝子変異体
から構成される群から選択したものも提供する。
本発明は図１または図５に提供するＤＮＡ配列に中程度にストリンジェントな条件下にハイブリッド形成することのできる配列を持つ分離されたＤＮＡ分子であって、ラットＣＨＦを除く生物学的に活性なＣＨＦポリペプチドをコードするものも提供する。
さらに別の側面ではＣＨＦ核酸分子を被験試料と接触させることおよびハイブリッド形成が起きたかどうか決定することを含むか、またはＣＨＦ核酸分子を被験試料核酸にハイブリッド形成することおよびＣＨＦ核酸の存在を決定することを含む、被験試料中のＣＨＦ核酸分子の存在を決定する方法を提供する。
さらに別の側面では、本発明はＣＨＦ核酸分子と被験試料との核酸ポリメラーゼ連鎖反応をプライムすることを含む核酸被験試料を増幅する方法を提供する。
さらに別の側面では、本発明はＣＨＦ拮抗剤および前記肥大性検定法における被験試料として細胞上清液を使用することおよびこの検定法が示すＣＨＦの肥大性活性に拮抗する分子を検索することを含むその拮抗剤の確認法を提供する。
さらに別の側面では、本発明はこのような処置を要する哺乳類に治療的有効量の、ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤を医薬的に許容される担体中に含む、医薬的組成物を投与することを含む心不全、筋変力疾患または不整脈疾患に罹患しているかその危険を持つ哺乳類を処置する方法を提供する。
本発明はまたこのような処置を必要とする哺乳類に医薬的に許容される担体中のＣＨＦを含む治療的有効量の医薬組成物を投与することを含む神経学的疾患に罹患しているか、その危険を持つ哺乳類を処置する方法を提供する。
付加的な態様において、本発明は標識ＣＨＦ、好ましくは放射能標識ＣＨＦ、を細胞受容体検定法中で使用すること、細胞にＣＨＦを結合させること、または標識ＣＨＦを使用して受容体を含む細胞を濃縮すること、を含むＣＨＦに対する受容体を確認する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａおよび１ＢはマウスＣＨＦ・ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（センスおよびアンチセンス鎖）（配列番号：１および２）および演繹されたアミノ酸配列（配列番号３）を描写する。２７位にある下線の相補ヌクレオチドは全長クローンを得るために使用したもう一つのマウスＣＨＦクローンの開始点を示す。
図２はマウスＣＨＦクローン（ｃｈｆ．７８１）の翻訳アミノ酸配列（配列番号３）とヒト毛様体神経栄養因子（ｈｕｍｃｎｔｆ）のアミノ酸配列（配列番号４）を並列比較して配列同一性の程度を示す。
図３は新生児心臓肥大検定法によるフェニルエフリン（標準曲線）および２９３細胞遺伝子移入に対する心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）放出のグラフを示す。
図４はＣＮＴＦ標準（円）、ＣＨＦ・ＤＮＡ遺伝子移入２９３細胞からの培地（三角）、および対照ＤＮＡ遺伝子移入２９３細胞からの培地（四角）を使用する毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）標準（ｎｇ／ｍＬ）または遺伝子移入２９３細胞調整培地（検定容積の逆数）の関数として毛様体神経節ニューロンの生存（細胞数で測定）のグラフを示す。
図５Ａおよび５ＢはヒトＣＨＦ・ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（センスおよびアンチセンス鎖）（配列番号６および７）および演繹したアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
図６はヒトＣＨＦクローンの翻訳されたアミノ酸配列（ｈｕｍｃｔ１）（配列番号８）をマウスＣＨＦクローンの翻訳されたアミノ酸配列（ｃｈｆ．７８１）（配列番号３）と並列して配列同一性の程度を示す。
好適な態様の詳細な記載
Ｉ．定義
一般に、下記の語句は発明の詳細な説明、実施例および請求項で使用するときには指摘する定義を持つ。
「ＣＨＦ」（または「心臓肥大性因子」または「カルジオトロフィン」または「カルジオトロフィン−１」）は本明細書では図１のポリペプチド配列または図５に示すヒトの均等物を含む天然起源ポリペプチドの生物学的性質（下記）の少なくとも一つを有するポリペプチド配列であると定義する。これにはラットのＣＨＦ同族体、すなわちラット種からのＣＨＦは包含しない。この定義は本明細書記載のマウス胚様体のような天然ＣＨＦ源からまたは、ラットを除き、ヒトを含む別の動物種のような別の源から分離したポリペプチドのみならず、組換え法または合成法で製造したポリペプチドにも及ぶ。これにはその機能的誘導体、アレル、アイソフォーム、および同族体を含む変異体型も包含する。
「ＣＨＦ断片」は天然起源成熟全長ＣＨＦ配列の一部であって、アミノ酸残基または炭水化物ユニット１個またはそれ以上を欠失させたものである。除去するアミノ酸残基はポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端または中間を含むいかなる場所にあってもよい。断片はＣＨＦと共通の生物学的性質の少なくとも１種を共有する。典型的には、ＣＨＦ断片はアミノ酸残基少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、または４０個の、マウス胚様体から分離されたＣＨＦまたはヒトＣＨＦを含む、哺乳類から分離されたＣＨＦの配列と同一の逐次的配列を持つ。
本明細書で定義する「ＣＨＦ変異体」または「ＣＨＦ配列変異体」は組換え細胞培養物からまたは図１に記載する演繹された配列を持つマウス胚様体から得たＣＨＦ、または図５に記載するヒト均等物と１００％以下の配列同一性を持つ以下に定義する生物学的に活性なＣＨＦを意味する。通常、生物学的に活性なＣＨＦ変異体はマウス胚様体から分離したＣＨＦまたは成熟ヒトＣＨＦ（図１および図５参照）のアミノ酸配列との間に少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは約８５％、もっと好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を持つ。
「キメラＣＨＦ」は全長ＣＨＦまたはその断片１個またはそれ以上が第２の蛋白質またはその断片１個またはそれ以上に融合または結合したものを含むポリペプチドである。このキメラは生物学的性質の少なくとも１つをＣＨＦと共有する。第二の蛋白質は典型的にはサイトカイン、成長因子、または成長ホルモンのようなホルモン、ＩＧＦ−Ｉ、またはたとえばＣＮＴＦ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、その他のような神経栄養因子である。
「分離されたＣＨＦ」、「高度に精製されたＣＨＦ」および「実質的に均質なＣＨＦ」は互換的に使用され、ＣＨＦ源から精製したか、組換えまたは合成的方法で製造したＣＨＦであって、（１）スピニングカップ配列決定装置または商業的入手可能な最高のアミノ酸配列決定装置またはこの出願の出願日において公表されている方法により修飾したものを使用して、Ｎ−末端または中間のアミノ酸配列のアミノ酸残基少なくとも１５および好ましくは２０アミノ酸残基を得るため、または（２）クーマジーブルーまたは好ましくは銀染色を使用する非還元または還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで、夾雑ペプチドまたは蛋白質が不含となっているＣＨＦを意味する。ここでは、均質性は他の源泉蛋白質の約５％より少ない夾雑を意味する。
「生物学的性質」は「ＣＨＦ」または「分離されたＣＨＦ」いずれかと関連して使用する時は、心筋層肥大、筋変力作用、抗不整脈、または神経栄養活性を持つか、または直接または間接にＣＨＦ（天然または変性の立体配座に関わらず）またはその断片に起因しまたはそれが機能する生体内効果器または抗原機能または活性を持つことを意味する。この効果器機能には受容体結合および担体結合活性、ＣＨＦの作動または拮抗、特に複製、ＤＮＡ制御機能、他種成長因子の生物学的活性の調節、受容体活性化、不活化、アップ−およびダウンレギュレーション、細胞成長または分化、その他の増殖シグナルの伝達を包含する。しかしながら、効果器機能には天然ＣＨＦに対して作成される抗体と交差反応することのできるエピトープまたは抗原部位の保有は含まない。
「抗原機能」は図１に示す配列を持つか、図５に示す配列を持つヒトの相同体を含む他種哺乳類天然ＣＨＦである、天然ＣＨＦに対して作成される抗体と交差反応することのできるエピトープまたは抗原部位の保有を意味する。ＣＨＦポリペプチドの主な抗原機能はマウス胚様体から分離したＣＨＦまたはそのヒト相同体に対して作成した抗体に少なくとも約１０6Ｌ／モルの親和性をもって結合することである。通常、このポリペプチドは親和性少なくとも約１０7Ｌ／モルで結合する。最も好ましくは、抗原的に活性なＣＨＦポリペプチドは前記効果器機能の一つを持つＣＨＦに対して作成された抗体に結合するポリペプチドである。「生物学的活性」を定義するために使用する抗体はフロインドの完全アジュバント中の組換え細胞培養または胚様体から分離したＣＨＦを製剤化し、この製剤を皮下注射し、抗ＣＨＦ抗体の力価が安定するまでこの製剤を腹腔内注射して免疫反応をブースト（追加免疫）して作成したウサギのポリクローナル抗体である。
「生物学的に活性」は「ＣＨＦ」または「分離したＣＨＦ」に関連して使用する時は、ＣＨＦポリペプチドが肥大性、筋変力作用、抗不整脈、または神経栄養活性を示すか、またはマウス胚様体から分離したかまたは本明細書記載の組換え細胞培養により製造したＣＨＦの効果器機能を共有するもの、およびそれに加えて抗原機能を持ちうる（必須ではない）ことを意味する。本明細書のＣＨＦまたはＣＨＦポリペプチドの主な効果器機能は、たとえば、特異なプレーティング培地および密度を使用し、好ましくはクリスタルバイオレット染色を読取るために使用する本明細書記載の心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）放出により、または筋細胞肥大検定により測定される心臓の成長または肥大活性に影響を与えることである。ＣＨＦ（またはＣＨＦ拮抗剤）の所期の機能は生理学的肥大型（有益）を増加させ、病理学的肥大を減少させることである。これに加え、本明細書のＣＨＦは、より正常な電気生理学的表現型を促進することによって、抗不整脈機能を発揮することが期待される。本明細書ＣＨＦまたはＣＨＦポリペプチドの他の主な効果器機能はＣＮＴＦ活性に関する検定でのニワトリ毛様体神経節ニューロンの増殖刺激である。
抗原的に活性のＣＨＦはＣＨＦの抗原的機能を有し、およびそれに加えて効果器機能を持っていてもよい（必須ではない）ポリペプチドとして定義する。
好適な態様において、抗原的に活性なＣＨＦはＣＨＦに結合することのできる抗体に少なくとも約１０6Ｌ／モルの親和性で結合するポリペプチドである。通常、このポリペプチドは少なくとも約１０7Ｌ／モルの親和性で結合する。ＣＨＦに結合することのできる分離された抗体はそれが存在しうる天然環境の成分に確認され、分離された抗体である。最も好ましくは、抗原的に活性なＣＨＦは天然の立体配座においてＣＨＦに結合することのできる抗体に結合するポリペプチドである。天然立体配座におけるＣＨＦは天然に発見されるＣＨＦであって、例えば非還元的、非変性的サイジングゲル上での移動によって測定するとＣＨＦの三次元的構造を実質的に修飾するカオトロープ剤、熱またはその他の処理によって変性されていないものである。この測定で使用する抗体はフロイントの完全アジュバント中の非−ウサギ種からの天然ＣＨＦを製剤化し、この製剤を皮下注射し、抗−ＣＨＦ抗体力価が安定化するまでこの製剤を腹腔内注射することにより免疫反応をブーストして作成したウサギのポリクローナル抗体である。
ＣＨＦ配列に関する「アミノ酸配列同一性百分率」はここでは、各配列を並列比較し、配列同一性百分率を最大にするために必要なら間隔を導入し、配列同一性の部分として如何なる保存的置換をも考慮せずに、図１に記載する演繹アミノ酸配列を持つマウス胚様体から分離したＣＨＦ配列中または図５に記載する演繹ヒトＣＨＦアミノ酸配列中の残基と同一な、候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義する。ＣＨＦ配列へのＮ−末端、Ｃ−末端または中間での延長、欠失、または挿入は配列同一性または相同性に影響を与えないものと解釈すべきである。かくして、同一配列を持つと考えられる生物学的に活性なＣＨＦポリペプチドの例にはプレプロ−ＣＨＦ、プロ−ＣＨＦおよび成熟ＣＨＦを包含する。
「ＣＨＦの微量配列決定」は適当な標準的操作法のいずれによってもその操作法が十分に敏感であれば達成しうる。この方法の一つにおいて、ＳＤＳゲルまたは最終的なＨＰＬＣ段階から得られる高度に精製したポリペプチドは１２０Ａフェニルヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析装置を装着した４７０Ａ型Ａｐｐｌｉｅｄ・Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の気相配列決定装置を使用する直接的自動エドマン分解（フェニルイソチオシアネート）法によって配列決定される。これに加えて化学的（たとえば、ＣＮＢｒ、ヒドロキシルアミン、または２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸）または酵素的（たとえば、トリプシン、クロストリパイン、またはスタフィロコッカスのプロテアーゼ）な消化およびそれに続く断片の精製（たとえば、ＨＰＬＣ）によって得られるＣＨＦ断片は同様にして配列決定しうる。ＰＴＨアミノ酸はＣｈｒｏｍＰｅｒｆｅｃｔ（商品名）データシステム（Ｊｕｓｔｉｃｅ・Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社、パロアルト、ＣＡ）を使用して分析される。配列の解釈はＶＡＸ１１／７８５Ｄｉｇｉｔａｌ・Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社の電算機上でＨｅｎｚｅｌなど、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、４０４巻：４１〜５２頁（１９８７年）に記載のようにして実行される。要すればＨＰＬＣ画分を５〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（ＰｒｏＢｌｏｔｔ、ＡＩＢ、フォスター市、ＣＡ）上に電気転写し、クーマジーブリリアントブルーで染色しうる。Ｍａｔｓｕｒｄｉａｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２巻：１００３５〜１００３８頁（１９８７年）。この染色で確認される特定の蛋白質をブロットから切り出し、前記気相配列決定機によりＮ−末端配列決定を行う。中間の蛋白質配列については、ＨＰＬＣ画分を真空下に乾燥し（ＳｐｅｅｄＶａｃ）、適当な緩衝液に再懸濁し、シアノーゲンブロミド、Ｌｙｓ特異的な酵素Ｌｙｓ−Ｃ（Ｗａｋｏ・Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、リッチモンド、ＶＡ）またはＡｓｐ−Ｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ・Ｍａｎｎｈｅｉｍ、インディアナポリス、ＩＮ）で消化する。消化後、得られたペプチドを混合物としてまたはＣ４カラム上で０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中プロパノール勾配で溶離するＨＰＬＣ分割の後に気相配列決定する。
「分離されたＣＨＦ核酸」は逐次的ヌクレオチド塩基１６個またはそれ以上、好ましくは２０個またはそれ以上を含むＲＮＡまたはＤＮＡであって、生物学的に活性なＣＨＦまたはその断片をコードするものであって、このＲＮＡまたはＤＮＡに相補的であるか、このＲＮＡまたはＤＮＡにハイブリッド形成し、中程度にストリンジェントな条件下に安定して結合するものである。このＲＮＡまたはＤＮＡは通常は天然起源中では共存する汚染源核酸少なくとも一種を含有せず、好ましくは他のいかなる哺乳類ＲＮＡまたはＤＮＡも実質的に含まない。「通常は天然起源中では共存する汚染源核酸少なくとも一種を含有せず」という用語はその核酸が起源または天然細胞内に存在するが、異なる染色体部位にあるか、またはそうでなければ起源細胞内に正常には存在しない核酸配列に結合している場合をも包含する。分離されたＣＨＦ核酸の例はマウスＣＨＦまたはヒトＣＨＦとは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％、および最も好ましくは９５％の配列同一性を共有し、生物学的に活性なＣＨＦをコードするＲＮＡまたはＤＮＡである。
「制御配列」は発現に関する時には、特定の宿主生物中でコード配列に作動可能に結合する、配列の発現に必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物について適切である制御配列は、例えばプロモーター、要すればオペレーター配列、リボソーム結合部位、およびおそらくまだ不十分にしか理解されていない他の配列を含む。真核生物細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが知られている。
「作動可能に結合」は核酸に関して言及する時にはその核酸が他の核酸配列と機能的な関係に位置することを意味する。例えば、もしそのポリペプチドの分泌に関与するプレ蛋白質として発現されるなら、プレ配列または分泌リーダーのためのＤＮＡがポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に結合しており、もしそれが配列の転写に影響を与えるならプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作動可能に結合しており；または、もし翻訳を促進するように配置されているなら、リボソーム結合部位はコード配列に作動可能に結合している。一般的に、「作動可能に結合」は結合されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接し、かつ読み枠内にある。しかしながら、エンハンサーは近接していなくてもよい。結合は好都合な制限部位での連結によって達成される。そのような部位が存在しなければ、常法に従って合成的オリゴヌクレオチド・アダプターまたはリンカーを使用する。
「外来性」は要素について言及する時には、その細胞にとって外来であるか、または細胞にとって相同的ではあるが宿主細胞核酸内では通常は存在しない位置にある核酸配列を意味する。
「細胞」、「細胞系列」および「細胞培養物」はここでは互換的に使用され、この記載はその細胞または細胞系列の全プロゲニー（子孫）を包含する。そこで、例えば「形質転換体」および「形質転換された細胞」のような用語は初代の対象細胞および継代数にかかわらずそれから誘導した培養物を包含する。全プロゲニーは意識的あるいは不作為的な突然変異に起因して、ＤＮＡ含量について正確に同一でなくてもよいことも理解されている。最初に形質転換した細胞で検定したものと同じ機能または生物学的活性を持つ突然変異プロゲニーは包含される。別の意味を意図する場合には、その前後の文章で明らかとなろう。
「プラスミド」は自律的に複製し、独立の複製開始点を有する環状ＤＮＡ分子であって、ここでは小文字「ｐ」を先行し、および／または大文字および／または数字を続けて命名する。ここでは出発プラスミドは商業的に入手可能か、限定なく公共的に入手可能であるか、またはこれらの入手可能なプラスミドから公表された操作に従って構築できる。これに加えて、他の均等なプラスミドが当分野では公知であって、当業者には明白であろう。
「制限酵素消化」はＤＮＡについて言及する時には、ＤＮＡ内部のホスホジエステル結合のＤＮＡ配列中のある位置または部位のみに作用する酵素による触媒的切断を意味する。このような酵素は「制限エンドヌクレアーゼ」と呼称される。各制限エンドヌクレアーゼは二重鎖の対称を示す「制限部位」と呼ばれる特定のＤＮＡ配列を認識する。本明細書で使用する種々の制限酵素は商業的に入手可能であって、酵素供給者が確立したそれらの反応条件、補助因子、およびその他の要件を使用する。制限酵素は通常、最初に各制限酵素を得た微生物を表す大文字に続いて他の字からなる略号、次に特定の酵素を示す数字によって命名する。一般に、プラスミドまたはＤＮＡ断片約１μｇを酵素約１〜２単位とともに緩衝液約２０μＬ中で使用する。特定の制限酵素に対する適当な緩衝液および基質量は製造者が指定している。３７℃で約１時間のインキュベーションを通常用いるが、供給者の指示書に従って変化させうる。インキュベーションの後に、フェノールおよびクロロホルムで抽出して蛋白質またはポリペプチドを除去し、消化した核酸をエタノールでの沈殿によって水性画分から回収する。制限酵素による消化に続いて、末端５’−ホスフェートの細菌アルカリホスファターゼ加水分解をしてＤＮＡ断片の制限分解末端２個が「環化」または制限部位での他種ＤＮＡ断片の挿入を妨げる閉鎖環形成を防止する。別段の言及がない限り、プラスミドの消化の後で５’−末端脱燐酸化は行わない。Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｍａｎｎｕａｌ）（ニューヨーク、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年）の１．５６〜１．６１章に記載のように脱燐酸化の操作および試薬は常法のものである。
制限消化からの特定ＤＮＡ断片の「回収」または「分離」は消化物のポリアクリルアミドまたはアガロースゲル上での電気泳動による分離、既知分子量のマーカーＤＮＡ断片と易動度を比較する所望断片の確認、所望の断片を含むゲル部位の取り出し、およびＤＮＡからゲルを分離することを意味する。この操作は一般に公知である。例えばＬａｗｎなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、９巻：６１０３〜６１１４頁（１９８１年）およびＧｏｅｄｄｅｌなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁（１９８０年）参照。
「サザン分析」または「サザンブロッティング」は公知の標識オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片へのハイブリッド形成によって確認するＤＮＡまたはＤＮＡ含有組成物制限エンドヌクレアーゼ消化物中のＤＮＡ配列存在確認法の一つである。サザン分析は典型的にはＤＮＡ消化物のアガロースゲルでの電気泳動的分離、電気泳動的分離後のＤＮＡの変性、および前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの９．３７〜９．５２章に記載のような放射能標識、ビオチン化、または酵素標識プローブでの分析のためにするニトロセルロース、ナイロンまたはその他の適当な膜担体へのＤＮＡの転写を含む。
「ノーザン分析」または「ノーザンブロッティング」は、たとえばオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、ｃＤＮＡまたはその断片、またはＲＮＡ断片のような、既知プローブにハイブリッド形成するＲＮＡ配列を確認するために使用する方法である。このプローブは33Ｐのような放射性同位元素、またはビオチン化、または酵素により標識する。分析すべきＲＮＡは通常アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動的に分離し、ニトロセルロース、ナイロンまたはその他の適当な膜に移し、前記Ｓambrookらの７．３９〜７．５２章に記載のような当分野でよく公知の標準的技術を使用してプローブでハイブリッド形成する。
「連結」は核酸断片２個の間にホスホジエステル結合を形成する工程である。断片２個の連結のためには、両断片の末端を互いに適合させなければならない。ある場合には、両末端をエンドヌクレアーゼ消化後に直接的に適合させる。しかしながら、まず最初にエンドヌクレアーゼ消化後に共通に生成する互い違い切断末端を平滑末端に転換して、それらを連結に適合させる必要もありうる。両末端を平滑にするためには、ＤＮＡを適当な緩衝液中、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断片またはＴ４・ＤＮＡポリメラーゼ約１０単位と共にデオキシリボヌクレオチド三燐酸４種の存在下に１５℃で少なくとも１５分間処理する。このＤＮＡを次にフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製する。相互に連結すべきＤＮＡ断片のおよそ等モル量を溶液中に入れる。溶液にもまたＡＴＰ、連結緩衝液、およびＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼをＤＮＡ０．５μｇ当り約１０単位含有させる。もしそのＤＮＡを連結してベクターとするならば、そのベクターをまず適当な制限エンドヌクレアーゼで消化してリネアライズ（線状化）する。線状化した断片を次に細菌アルカリホスファターゼまたは子ウシ小腸ホスファターゼで処理して連結段階での自己連結を防止する。
細胞からのＤＮＡの「調製」は宿主細胞の培養物からプラスミドＤＮＡを分離することを意味する。ＤＮＡ調製のために通常に使用する方法は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１．２５〜１．３３章に記載のようなプラスミドの大量−および少量生産法である。ＤＮＡの調製後、たとえば前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１．４０章に記載のような当分野でよく公知の方法により精製できる。
「オリゴヌクレオチド」は、たとえば１９８８年５月４日に発行された欧州特許２６６０３２またはＦｒｏｅｈｌｅｒなど、、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、１４巻：５３９９〜５４０７頁（１９８６年）に記載のデオキシヌクレオシドＨ−ホスフォネート中間体を経由するような固相技術を使用する、たとえばホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホロアミダイト化学のような公知法により化学的に合成した短い、単鎖または二重鎖のポリデオキシヌクレオチドである。さらに別の方法は次に記載するポリメラーゼ連鎖反応およびその他の自動プライマー法および固体支持体上のオリゴヌクレオチド合成を包含する。これらの方法は全てＥｎｇｅｌｓなど、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８巻：７１６〜７３４頁（１９８９年）に記載がある。これらの方法はその遺伝子の全核酸配列が既知であるか、またはコード鎖に相補的な核酸の配列が入手できれば使用される。そうでなければ、もし標的アミノ酸配列が公知であれば、各アミノ酸残基に対する公知で好適なコード残基を使用して可能性のある核酸配列を推測しうる。オリゴヌクレオチドは次にポリアクリルアミドゲルで精製される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の微量な断片を１９８７年７月２８日に発行された米国特許第４６８３１９５号に記載のようにして増幅する操作または技術を示す。一般に、所望の領域の両末端からの配列またはそれを越える配列情報がオリゴヌクレオチドプライマーを設計するのに必要であり、これらのプライマーは増幅すべき鋳型の反対側の鎖に対して配列が同一であるかまたは類似する。両プライマーの５’−末端ヌクレオチドは増幅される物質の末端と一致しうる。ＰＣＲを使用すれば特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定ＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列その他を増幅できる。一般的に、Ｍｕｌｌｉｓなど、Ｃｏｌｄ・Ｓｐｒｉｎｇ・Ｈａｒｂｏｒ・Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．、５１巻：２６３頁（１９８７年）；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ技術（ＰＣＲ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ出版社、ＮＹ、１９８９年）参照。ここで使用するＰＣＲは核酸被験試料の増幅のための核酸ポリメラーゼ反応法の一つであって、プライマーとして既知の核酸および核酸ポリメラーゼを増幅のためまたは核酸の特定の切片を発生するための使用を含むものであるが、しかし唯一の例ではないものであると考えられる。
「ストリンジェント条件」は（１）例えば０．０１５Ｍ−ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ−クエン酸ナトリウム／０．１％ＮａＤｏｄＳＯ4（ＳＤＳ）を５０℃で使用するような低イオン強度および高温度を洗浄のために採用するか、または（２）ハイブリッド形成の間に、例えば０．１％ウシ血清アルブミン含有５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ−ＮａＣｌを含有するｐＨ６．５の５０ｍＭ−燐酸ナトリウム緩衝液、７５ｍＭ−クエン酸ナトリウムを４２℃で使用する、ホルムアミドのような変性剤を採用するものである。他例の一つは５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ−ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ−クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍＬ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸の４２℃での使用と０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で４２℃での洗浄の使用である。
「中程度にストリンジェント条件」は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されており、前記のストリンジェント条件よりもストリンジェントの弱い洗浄溶液およびハイブリッド形成条件（たとえば温度、イオン強度、およびＳＤＳ％）の使用を包含する。中程度にストリンジェント条件の一例は、たとえば、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、１５ｍＭ−クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭ−燐酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０ｍｇ／ｍＬ切断変性鮭精子ＤＮＡからなる溶液中で３７℃で一夜インキュベーションし、続いてフィルターを１×ＳＳＣ中で約３７〜５０℃で洗浄するような条件である。熟練した当業者はプローブ長などのような因子に応じて必要となる温度、イオン強度、その他を調節する方法を認識するものである。
「抗体」（Ａｂｓ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同一の構造的特徴を持つ糖蛋白質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体および抗原特異性を持たない抗体その他の抗体様分子も含む。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低濃度で、また、骨髄腫によって高濃度で生産される。
「天然の抗体および免疫グロブリン」は通常約１５００００ダルトンのヘテロ四量体の糖蛋白質であって、同一の軽鎖（Ｌ）２個および重鎖（Ｈ）２個から構成されている。各軽鎖は重鎖に共有ジスルフィド結合１個によって結合するが、種々の免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間ではジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖および軽鎖は規則的間隔のある鎖内ジスルフィド橋複数を持つ。各重鎖は一端では可変ドメイン（ＶH）とそれに続く多数の定常ドメインを持つ。各軽鎖は一端に可変ドメイン（ＶL）と他端に定常ドメインを持つ；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインに並び、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインに並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の中間面（インターフェイス）を形成していると信じられている（Ｃｌｏｔｈｉａなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８６巻：６５１〜６６３頁［１９８５年］；ＮｏｖｏｔｎｙとＨａｂｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：４５９２〜４５９６頁［１９８５年］）。
用語「可変」は抗体間で可変ドメインのある部分の配列が顕著に相違し、特定の抗体のその特定の抗原に対する結合と特異性とに利用される事実を示す。しかしながら、この可変性は抗体の可変ドメイン全体に均等に分布しているのではない。これは軽鎖および重鎖双方の可変ドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれるセグメント３個に集中している。可変ドメインの中でより高度に保存された部分は枠組領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖と軽鎖の可変ドメインは各々ＦＲ領域４個を含み、主としてβ−シート立体構造をとっており、ＣＤＲ３個を結合して、場合によりβ−シート構造の一部を形成してβ−シート構造を結合するループを形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により近接して維持され、他鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位形成に寄与する（Ｋａｂａｔなど、「免疫学的に重要な蛋白質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ・ｏｆ・Ｐｒｏｔｅｉｎｓ・ｏｆ・Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ・Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ・ｏｆ・Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、ＭＤ［１９９１年］参照）。定常ドメインは直接的には抗体を抗原に結合することには関与しないが、しかし、たとえば抗体依存性細胞障害性への抗体の関与のような、種々の効果器機能を示す。
抗体のパパイン消化は、各々単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる同一の抗原結合断片２個および容易に結晶化する性能を反映する名称で呼ばれる残りの「Ｆｃ」断片を産生する。ペプシン処理では抗原結合部位２個を持ち、まだ抗原と交差結合することのできるＦ（ａｂ’）2断片を与える。
「Ｆｖ」は完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は重鎖１個および軽鎖１個の可変ドメインの強固な非共有結合的な会合により構成される二量体から構成される。各可変ドメインのＣＤＲ３個が相互に作用して抗原結合部位をＶH−ＶL二量体の表面に決定するのはこの立体配置である。結局、ＣＤＲ６個が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、結合部位全体よりも親和性は低いが、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲ３個のみを含むＦｖの半分）でさえ抗原を認識し、結合する性能を持つ。
Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に抗体のヒンジ領域からのシステイン１個またはそれ以上を含む少数の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは相違する。本明細書でＦａｂ’−ＳＨは定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を示す記号である。Ｆ（ａｂ’）2抗体断片は最初は相互の間にヒンジシステインを持つ一対のＦａｂ’断片として製造された。抗体断片のその他の化学的結合も知られている。
いずれかの種の脊椎動物から得た抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」はそれらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる明瞭に区別される２種のタイプのいずれか一方に分類される。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して免疫グロブリンは数種に分類できる。免疫グロブリンには主な５種類：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあって、これらの中でいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）：たとえば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２、に分類される。免疫グロブリンの種類に対応する重鎖定常ドメインは各々α、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。免疫グロブリンの各クラスのサブユニット構造および３次元的立体構造はよく知られている。
用語「抗体」は最広義に使用し、単一のモノクローナル抗体（作動性および拮抗性抗体を含む）およびポリエピトープ特異性を持つ抗体組成物も包含する。
用語「モノクローナル抗体」はここでは実質的に均質な抗体の集団、すなわち微量に含まれる可能性のありうる天然起源突然変異を例外としてその集団を構成する各抗体が同一であるもの、から得た抗体を示す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位を指向する。さらにその上に、典型的には種々の決定基（エピトープ）を指向する種々の抗体を含有する通常の（ポリクローナル）抗体製品とは対照的に、モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンを夾雑物として含まない点が有利である。
ここに、モノクローナル抗体は、起源の種または免疫グロブリンのクラス、またはサブクラス分類、ならびに抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ）に関わらず、それらが所望の生物学的活性を示す範囲内において、定常ドメイン（たとえば、「ヒト化」抗体）を持つ抗ＣＨＦ抗体の可変ドメイン（超可変ドメインを含む）をスプライスすること、または重鎖を持つ軽鎖、または他種からの鎖を持つ１種の鎖、または異種蛋白質との融合、によって製造されたハイブリッドおよび組換え抗体を含む。［たとえばＣａｂｉｌｌｙなど、米国特許第４８１６５６７；ＭａｇｅとＬａｍｏｙｉ、「モノクローナル抗体生産技術および応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ａｎｄ・Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」中、７９〜９７頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｋｋｅｒ社、ニューヨーク、１９８７年）参照］。
そこで、修飾語「モノクローナル」は実質的に均質な抗体集団から得た抗体の性質を示すものであり、その抗体の生産に特定の方法を必要とすると解釈すべきものではない。例えば、本発明で使用するモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがＮａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）に最初に記載したハイブリドーマ法によっても、または組換えＤＮＡ法（前記Ｃａｂｉｌｌｙなど）によっても生産しうる。
本明細書のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するかまたは特定の抗体分類またはサブ分類に属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、一方、鎖の残りの部分は他の種に由来するかまたは他の抗体分類またはサブ分類に属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である抗体、ならびにそのような抗体の断片であって、所期の生物学的活性を持つもの（Ｃａｂｉｌｌｙなど、前出；Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁［１９８４年］）である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を特に包含する。
非ヒト（たとえばマウス）抗体の「ヒト化」型は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（たとえばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、その他抗体の抗原結合サブ配列のような）である。殆どの部分でヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相同性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所期の特異性、親和性および性能を持つ、たとえばマウス、ラット、またはウサギのような非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基に置換されているものである。ある例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組残基を対応する非ヒト残基に置換する。さらにその上、ヒト化抗体はレシピエントの抗体にも導入されたＣＤＲまたは枠組配列にも存在しない残基を含みうる。これらの修正は抗体の性能を調整して最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は実質的に少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメイン全てを含むものであって、そこにおいてはＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒトの免疫グロブリンのコンセンサス配列である。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのもの、の少なくとも一部分を含む。さらに詳細な事項はＪｏｎｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照。
「ヒトに非免疫原的」は、医薬的に許容しうる担体中の医薬的有効量のそのポリペプチドをヒトの適当な組織と接触した時に、適当な潜在期間（たとえば８から１４日）の後にそのポリペプチドの第二の投与に際して、そのポリペプチドに対する過敏性または耐性が証明されないことを意味する。
「神経学的疾患」は末梢性ニューロンおよび中枢神経系からのニューロンの双方を含むニューロンの疾患を示す。このような疾患の例は、たとえば末梢性神経障害（運動および感覚）、筋萎縮性軸索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、ハンチントン病、てんかん、のような神経変性疾患のすべて、およびたとえば糖尿病性網膜炎、網膜ジストロフィー、および乳児期悪性大理石骨病、セロイド−脂褐素沈着症、または胆汁欝滞に起因する網膜変性、または光変性、外傷、軸索切断、神経毒性−興奮性変性または虚血性ニューロン変性に起因する網膜変性のような網膜に関する眼科学的疾患を含む。
「末梢性神経障害」は末梢神経系に影響する疾患を示し、最も多くは運動、感覚運動、または自律神経機能不全の一つまたは組合せとして現れる。末梢性神経障害により現れる広範な形態学的変化は同様に広範な原因数に独特に由来する。例えば、末梢性神経障害は遺伝的に獲得し、全身病から由来し、または毒薬により導入できる。これに限定するものではないが、例としては四跂感覚運動神経障害または、たとえば胃腸管運動性低下または膀胱アトニーのような自律神経障害を包含する。全身性疾患に起因する神経障害の例にはポリオ後症候群を含み、遺伝的神経障害の例はシャルコット−マリー−トゥース病、レフスム病、無β−リポ蛋白血症、タンジェ病、クラッベ病、異染色性白質萎縮症、ファブリー病、およびデジェリン−ソッタ症候群を含み；および毒薬に起因する神経障害の例はビンクリスチンのような化学療法剤による処置に起因するものを包含する。
「心不全」とは心臓が代謝している組織の要求に必要な速度で血液を送らない心機能の異常性を示す。心不全は、たとえば欝血性心不全、心筋梗塞、および頻脈性不整脈のような広範な病的状態を包含する。
「処置」は治療的処置および予防的または防止的手段の両方を示す。処置を要するものは既にその病気を持つものならびにその病気になる傾向があるかまたはその病気を予防すべきものを包含する。
治療の目的である「哺乳類」は哺乳類に分類される動物全てを示し、ヒトまたは、たとえばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、その他のような家畜および農場の動物、および動物園、スポーツ、ペットの動物を包含する。好ましくは、本明細書の哺乳類はヒトである。
ここで使用する「ＡＣＥ阻害剤」はアンギオテンシンＩからアンギオテンシンＩＩへの転換を妨げるアンギオテンシン転換酵素阻害性薬剤を示す。ＡＣＥ阻害剤は全身性の血管抵抗を低下させ、循環の欝血を軽減するので欝血性心不全に有効でありうる。ＡＣＥ阻害剤はこれらに限定するものではないが、商品名アクプリル（キナプリル）、アルテース（ラミプリル）、カポテン（カプトプリル）、ロンテシン（ベナゼプリル）、モノプリル（フォシノプリル）、プリニビル（リシノプリル）、バソテック（エナラプリル）およびゼストリル（リシノプリル）を包含する。ＡＣＥ阻害剤の一例は商標カポテンの下に販売されている。一般名でカプトプリルと呼ばれるこのＡＣＥ阻害剤は、化学的には１−［（２Ｓ）−３−メルカプト−２−メチルプロピオニル］−Ｌ−プロリンと命名されている。
ＩＩ．本発明の実施態様
１．ＣＨＦポリペプチド
この発明の好適なポリペプチドは筋細胞肥大性およびＣＮＴＦ検定法でニワトリ毛様体ニューロンの発育を促進する生物学的性質を持つ実質的に均質なＣＨＦポリペプチドである。さらに好適なＣＨＦは肥大性、抗不整脈、筋変力作用および神経学的活性を持つ分離された哺乳類蛋白質である。この発明の最も好適なポリペプチドは肥大性、抗不整脈、筋変力作用、および神経学的活性を持つマウスおよびヒトのＣＨＦであってそれらの断片も包含する。要すれば、これらマウスおよびヒトＣＨＦはグリコシル化を欠く。
この発明の別の好適ポリペプチドは生物学的に活性なＣＨＦ変異体であって、図１のマウスＣＨＦとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％（すなわち、各々７０〜１００％、７５％〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％および９５〜１００％配列同一性）のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を持つ。それとは別に、好適な生物学的に活性なＣＨＦ変異体は図５のヒトＣＨＦとの間に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％（すなわち、各々７０〜１００％、７５％〜１００％、８０〜１００％、８５〜１００％、９０〜１００％および９５〜１００％配列同一性）のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を持つ。
マウス胚様体からクローニングしたＣＨＦは次の性質を持つ。
（１）還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定すると分子量約２１〜２３ｋＤを持つ。
（２）ＣＮＴＦニワトリ毛様体ニューロン検定および筋細胞肥大性およびＡＮＰ放出肥大性検定において陽性の活性を示す。
さらに好適なＣＨＦポリペプチドはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡがコードするもので、図１に記載したマウスＣＨＦのアミノ酸配列または図５に記載したヒトＣＨＦのアミノ酸配列を持つものである。
この発明のその他の好適な天然起源の生物学的に活性なＣＨＦポリペプチドはプレプロ−ＣＨＦ、プロ−ＣＨＦ、プレ−ＣＨＦ、成熟ＣＨＦ、およびそのグリコシル化変異体を包含する。
さらに別の好適なこの発明のポリペプチドにはＣＨＦ配列変異体およびキメラＣＨＦを包含する。通常は、好適なＣＨＦ配列変異体は生物学的に活性なＣＨＦ変異体であって、ヒトまたはマウスのＣＨＦと少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにもっと好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を示すアミノ酸配列を持つ。好適なＣＨＦ変異体の例はＣ−末端ドメインでのＣＨＦ変異体であって、塩基性または二塩基性アミノ酸残基（たとえば、ＲまたはＫ）の１個またはそれ以上が非塩基性アミノ酸残基（たとえば親水性、中性、酸性、芳香性、ｇｌｙ、ｐｒｏその他）で置換されたものである。
他の例示的好適ＣＨＦ配列変異体の一つは「ドメインキメラ」であって、Ｎ−末端残基がおよそ図２に示すように並んでいるヒトのＣＮＴＦ残基の全部ではないが、１個またはそれ以上で置換されているものである。この態様では、ＣＨＦキメラは図２に示す並列に対応する位置においてＣＨＦ配列にヒトＣＮＴＦ配列からの個々の残基または残基のブロックが付加するか、置換している。例えば、ＣＨＦの対応するセグメントに相同的でないＣＮＴＦのセグメント１個またはそれ以上が置換することができる。この「ＣＨＦ−ＣＮＴＦドメインキメラ」には肥大性／抗不整脈／筋変力作用／神経栄養的を混合した生物学的活性を持つことが意図されている。
この発明のその他の好適なポリペプチドにはマウス胚様体から分離したＣＨＦの配列または対応するヒトＣＨＦの配列と同一な少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、または４０アミノ酸残基、好ましくは約１０〜１５０残基の逐次的配列を持つＣＨＦ断片を包含する。他の好適なＣＨＦ断片は精製ＣＨＦの化学的または酵素的な加水分解または消化の結果として生産されたものを包含する。
本発明の別の側面の一つはＣＨＦ分子の精製法であって、精製すべきＣＨＦ分子を含有するＣＨＦ源と固定化した受容体または抗体ポリペプチドとを精製すべきＣＨＦ分子が固定化した受容体または抗体ポリペプチドに選択的に吸着する条件下に接触させ、固定化担体を洗浄して非吸着物質を除き、および精製すべき分子を吸着している固定化した受容体または抗体ポリペプチドから溶離緩衝液で溶離することを含む。ＣＨＦを含有する源は胚様体細胞懸濁液でありうる。
あるいは、ＣＨＦを含有する源は組換え細胞培養物であって、この場合、培養培地または細胞分解物のいずれかの中のＣＨＦ濃度は一般に原形質またはその他天然源中におけるよりも高濃度である。この場合、前記の免疫親和性法は、使用はできるが、普通は必要ではなく、この分野で公知のさらに慣例的な蛋白質精製法を採用しうる。略述すれば、実質的に均質なＣＨＦを提供するための好適な精製法は：粒状破砕物を、例えば遠心分離または限外濾過などで除去し；要すれば蛋白質プールを商業的に入手できる蛋白質濃縮濾過装置で濃縮し；およびその後に夾雑している可溶性蛋白質およびポリペプチドからＣＨＦを適当な精製手段の例である次の操作法：免疫親和性またはイオン交換カラム上の分画；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；たとえばＤＥＡＥのようなシリカまたはカチオン交換樹脂上のクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈降；ＴｏｙｏｐｅａｒｌおよびＭＯＮＯ−ＱまたはＭＯＮＯ−Ｓクロマトグラフィー；例えばセファデックスＧ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧのような夾雑物質を除去するためのＣＨＦを結合するカラムおよびプロテインＡセファロースカラム上のクロマトグラフィー、で精製することからなる。天然および組換えＣＨＦ双方のための好適な精製方式はＢｕｔｙｌ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに続いて、ＭＯＮ−Ｑカラムおよび逆相Ｃ４カラムを以下に記載のように使用する。
他の好適な態様において、この発明はＣＨＦに結合することのできる分離された抗体を提供する。好適な分離された抗ＣＨＦ抗体はモノクローナルである（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５〜４９７頁［１９７５年］；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、「生化学および分子生物学における実験技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ｉｎ・Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ・ａｎｄ・Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ・Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｂｕｒｄｏｎら編、１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ・Ｓｃｉｅｎｃｅ・Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム［１９８５年］；およびＨｕｓｅなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻：１２７５〜１２８１頁［１９８９年］）。分離された好適な抗ＣＨＦ抗体は少なくとも約１０6Ｌ／モルの親和性でＣＨＦに結合するものである。より好ましくは、この抗体は少なくとも約１０7Ｌ／モルの親和性でＣＨＦに結合するものである。最も好ましくは、この抗体は前記効果器機能の一つを持つＣＨＦに対して作成される。
ＣＨＦに結合することのできる分離された抗体は、要すれば第２のポリペプチドに融合しうるし、またその抗体またはその融合物は固定化したＣＨＦポリペプチドについて前記した源からＣＨＦを分離し、精製するために使用しうる。この発明態様のさらに好適な側面では、本発明は抗体をＣＨＦを含有すると推測される試料、好ましくは血清試料、と接触させること、および結合が起きたかどうかを検出することからなる試験管内または生体内でＣＨＦを検出する方法を提供する。
本発明はさらにＣＨＦまたはその断片をコードする分離された核酸分子であって、その核酸分子が検出可能な構造で標識されていても無標識でもよいもの、およびＣＨＦをコードする配列を持つ核酸分子に相補的な、またはストリンジェント条件または中程度にストリンジェントな条件下にハイブリッド形成する配列を持つ核酸分子を提供する。好適なＣＨＦ核酸は生物学的に活性なＣＨＦをコードするＲＮＡまたはＤＮＡであって、マウスまたはヒトのＣＨＦとの間に少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは９５％の配列同一性を持つ。
さらに好適な分離された核酸分子は（イ）哺乳類ＣＨＦ遺伝子のコード領域に基づくＤＮＡ（たとえば、図１または図５に提供するヌクレオチド配列またはその断片からなるＤＮＡ）；（ロ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下に（イ）のＤＮＡにハイブリッド形成することのできるＤＮＡ；および（ハ）遺伝子コードの縮重性の結果として（イ）または（ロ）に規定するＤＮＡに対して縮重関係にあるＤＮＡ；から選択した生物学的に活性なＣＨＦをコードするＤＮＡ配列である。ここに記載する新ＣＨＦはそのＤＮＡが図１または図５のＤＮＡ（またはその断片）と低ストリンジェント度ないし中程度にストリンジェントな条件下にハイブリッド形成しうる、適切な配列同一性を持つ一群のリガンドの一員でありうることが意図されている。そこで、この発明の別の側面は低度ないし中程度にストリンジェントな条件下にＣＨＦポリペプチドをコードするＤＮＡにハイブリッド形成するＤＮＡを包含する。
好ましくは、この核酸分子はＣＨＦをコードするｃＤＮＡであり、さらに、ベクターで形質転換した宿主が認識する制御配列にこのｃＤＮＡが作動可能に結合しているものである複製可能なベクターを包含する。この側面は、さらにこのベクターで形質転換した宿主細胞および、ＣＨＦをコードするｃＤＮＡを形質転換宿主細胞の培養物中に発現させることおよび宿主細胞培養物からＣＨＦを回収することを含む、ＣＨＦ製造のためのｃＤＮＡの使用法も包含する。この様式で製造したＣＨＦは好ましくは実質的に均一なマウスまたはヒトＣＨＦである。
本発明はさらに、哺乳類に治療的有効量のＣＨＦを投与することを含む、心不全、不整脈、筋変力性、または神経学的疾患を持つ哺乳類を処置する好適な方法を包含する。要すれば、このＣＨＦは、欝血性心不全の場合にはたとえばカプトプリルのようなＡＣＥ阻害剤と、または、その他の型の心不全または心臓疾患の場合にはその他の心筋栄養、抗不整脈、または筋変力剤と、または神経学的疾患の場合には、たとえば、ＩＧＦ−Ｉ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＢＮＤＦ、ＮＴ−４、ＮＴ−５などのような神経栄養性分子と、組合せて投与される。
２．天然配列ＣＨＦおよび変異体の調製
以下の議論は殆どＣＨＦ核酸を含むベクターで形質転換した細胞を培養して、細胞培養物からこのポリペプチドを回収することによるＣＨＦの生産に関する。さらに、１９９１年５月１６日に発行されたＷＯ９１／０６６６７に提供されるようにこの発明のＣＨＦが相同的組換えにより生産しうることも概観する。略述すれば、この方法は内在性ＣＨＦ遺伝子を含む初代哺乳類細胞（たとえば、もし所期のＣＨＦがヒトのものであればヒトの細胞）を増幅可能な遺伝子（たとえばジヒドロ葉酸還元酵素［ＤＨＦＲ］または下記のその他のもの）およびＣＨＦ遺伝子の増幅を提供するためのＣＨＦ遺伝子のコード領域の座におけるＤＮＡ配列と相同的な少なくとも１５０ｂｐの長さのフランキング領域少なくとも１個を含む構築物（すなわちベクター）で形質転換することを包含する。この増幅可能な遺伝子はＣＨＦ遺伝子の発現を妨害しない部位になければならない。この形質転換は構築物が相同的に初代細胞のゲノムに組込まれて増幅可能領域が決定するように実行される。
構築物を含有する初代細胞を次に構築物中に存在する増幅可能遺伝子または他のマーカーによって選択する。マーカー遺伝子の存在により宿主ゲノム中への構築物組込と存在を確認する。第二宿主で選択するので、初代細胞をこれ以上に選択することは不要である。所望なら、相同的組換えの存在をＰＣＲを利用して得た増幅ＤＮＡ配列を配列決定するか、または正確な相同的組込体からのＤＮＡが存在し、このような断片を含有する細胞のみを展開する時には、適当な長さのＰＣＲ断片を測定することにより決定することができる。また、所望ならば、選択した細胞を、この時点で細胞に適当な増幅剤（増幅遺伝子がＤＨＦＲであればメトトレキセートのようなもの）でストレスをかけることにより標的遺伝子の多重コピーが得われる様に増幅してもよい。しかしながら、下記の第二の形質転換後まで増幅段階を行わないのが好ましい。
選択段階後、全増幅可能領域を含むのに十分な大きさがあるゲノムＤＮＡ部分を選択した初代細胞から分離する。第二の哺乳類発現宿主細胞を次にこれらゲノムＤＮＡ部分で形質転換し、クローニングし、および増幅可能な領域を含むクローンを選択する。初代細胞の中で増幅してなければ、増幅可能領域を次に増幅剤によって増幅する。最後に、ＣＨＦを含む増幅可能領域の多重コピーを含有する第二の発現宿主細胞を成育させて遺伝子を発現させ、蛋白を調製する。
Ａ．ＣＨＦをコードするＤＮＡの分離
ＣＨＦをコードするＤＮＡはＣＨＦｍＲＮＡを有し、それを検出可能な濃度で発現すると信じられる組織から製造したｃＤＮＡライブラリーから調製しうる。このｍＲＮＡは、例えば、７日間分化した胚様体から適切に調製する。ＣＨＦ遺伝子はゲノムライブラリーから、または完全なヌクレオチドまたはアミノ酸配列が既知であると仮定して前記の試験管内オリゴヌクレオチド合成によって得ることができる。
目的遺伝子またはそれがコードする蛋白質を確認するように設計したプローブでライブラリーを検索する。ｃＤＮＡ発現ライブラリーについて適切なプローブは、たとえば：ＣＨＦを認識して特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；同一または相違する種からのＣＨＦｃＤＮＡの既知のまたは推測上の部分をコードする長さの約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド；および／または同一または類似の遺伝子をコードする相補的または相同的ｃＤＮＡまたはその断片など、を包含する。ゲノムＤＮＡライブラリーを検索するのに適当なプローブは、これに限定するものではないが、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、または同一または類似の遺伝子をコードするその断片、および／または相同的ゲノムＤＮＡまたはその断片、を包含する。選択したプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの検索は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１０〜１２章に記載のような標準的操作を使用して実施しうる。
ＣＨＦをコードする遺伝子を分離するための別法の一つは前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１４章に記載のようなＰＣＲ法を使用することである。この方法はＣＨＦにハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択方針を次に記載する。
この発明を実施する好適な方法は様々な組織、好ましくは哺乳類の分化した胚様体および胎盤、心臓、および脳細胞系列の組織、からのｃＤＮＡライブラリーを検索するために注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用するものである。さらに好ましくは、ヒト胚様体、胎盤、心臓および脳のｃＤＮＡライブラリーをオリゴヌクレオチドプローブで検索する。
プローブとして選択するオリゴヌクレオチド配列は十分な長さを持ち、十分に明確であって、偽陽性を最小にするものであるべきである。実際のヌクレオチド配列は通常保存性または高度に相同性のヌクレオチド配列に基づく。オリゴヌクレオチドは１個所またはそれ以上の個所で縮重していてもよい。優先的コドンの使用が知られていない種からのライブラリーを検索する場合には、縮重オリゴヌクレオチドの使用は殊に重要なものでありうる。
このオリゴヌクレオチドは検索すべきライブラリー中のＤＮＡにハイブリッド形成した際に検出できるように標識しなければならない。標識の好適な方法は当分野でよく知られているポリヌクレオチドキナーゼで32Ｐ−標識ＡＴＰを使用してオリゴヌクレオチドを放射能標識するものである。しかしながら、オリゴヌクレオチドを標識するにはこれに限定するものではないがビオチン化または酵素標識を包含する他の方法も使用しうる。
殊に興味深いものは全長ポリペプチドをコードするＣＨＦ核酸である。好適な数種の態様において、この核酸配列は天然のＣＨＦシグナル配列を包含する。全蛋白質コード配列を持つ核酸は選択したｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを、最初は本明細書に記載する演繹されたアミノ酸配列を使用して検索し、また、要すれば前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの７．７９章に記載のような通常のプライマー延長法を使用して前駆体を検出し、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの中間体をプロセッシングすることによって得られる。
Ｂ．天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体
天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体は適切なヌクレオチド変化を天然ＣＨＦのＤＮＡに導入するか、または所期ＣＨＦポリペプチドの試験管内合成によって調製される。このような変異体には、例えばマウスＣＨＦについて図１に、またヒトＣＨＦについて図５に示したアミノ酸配列内の残基からの欠失、挿入または置換を包含する。欠失、挿入および置換の組合せはいずれも所望の性質を有する最終構築物に到達するために行う。この発明の範囲からはＣＨＦのラット同族体であるＣＨＦ変異体またはポリペプチド配列が除外される。アミノ酸変化は、たとえばグリコシル化部位の位置数を変更するような、天然ＣＨＦの翻訳後過程も変更しうる。
天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体の設計では、突然変異部位および突然変異の性質は修正すべきＣＨＦの性質に依存する。例えばＣＨＦ拮抗剤または超作動剤の候補は最初はＣＨＦおよび成長ホルモン（ＧＨ）／サイトカイン受容体ファミリーの一員、特にＣＮＴＦおよび白血病阻害因子（ＬＩＦ）に結合する他のリガンド中の同一または高度に保存性である部位に配置することによって選択する。この突然変異のための部位は個々にまたは一連のものとして修飾できる。たとえば（１）最初に保存性アミノ酸を選択し、次に達成した結果に依存してさらに選択を進めて置換すること、（２）標的残基を除去すること、（３）同一または異なる分類の残基を存在する部位の隣に挿入すること、または１〜３の組合せ。
突然変異誘発のための好適な位置である天然ＣＨＦポリペプチドのある残基または領域を確認するための有用な方法の一つは「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれ、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年）が記載している。ここで一残基または標的残基群を確認し（たとえば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕのような荷電残基）、中性またはマイナス荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）で置換して細胞の中または外側の周囲の水性環境とアミノ酸との相互作用に影響を与える。置換に対して機能的な感受性を示したドメインを次にその置換部位でまたはそれに向けてさらにまたは別の変異を導入することによって改良する。そこで、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定する一方、突然変異の性質そのものは予備的に決める必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の様式を最適化するために、アラニン走査またはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは標的領域で行い、生成したＣＨＦ変異体を所期活性の最適な組合せについて検索する。
アミノ酸配列変異体の構築での主たる基本的変化には：突然変異部位の位置と突然変異の性質との２種がある。図１または図５の配列からの変異体があり、これらは天然に存在するアレル（これは天然のＣＨＦＤＮＡを操作する必要がない）か、あるいは天然に存在しないアレルまたは変異体に到達するためにこのＤＮＡを突然変異することによって製造した予定した突然変異体である。一般に、選択した突然変異の位置と性質は修飾すべきＣＨＦの性質に依存する。
アミノ酸配列欠失は一般に約１から３０残基にわたり、より好ましくは約１から１０残基であり、通常隣接するものである。隣接する欠失は通常は偶数の残基について行われるが、単数または奇数の欠失もこの範囲内である。ＣＨＦの活性を修飾するための欠失はＣＨＦとヒトＣＨＦアミノ酸配列に対する配列同一性の殆どを共有するＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーに結合するその他のリガンドとの間で相同性の低い領域に導入しうる。ＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーに結合する他のリガンドの受容体結合部位の一つと実質的相同性領域内のＣＨＦからの欠失はＣＨＦの生物学的活性をより顕著に修飾する可能性があるらしく思われる。逐次的欠失の数は影響されるドメイン、たとえばベータプリーツシートまたはアルファ螺旋などＣＨＦ三次構造を保存するように選択する。
アミノ酸配列挿入は長さ１残基から１００残基またはそれ以上を含むポリペプチドの範囲にわたるアミノ−および／またはカルボキシル−末端融合、ならびに単数または複数アミノ酸残基の配列内部挿入を含む。配列内部挿入（すなわち、成熟ＣＨＦ配列内部への挿入）は一般に約１から１０残基、より好ましくは１から５、最も好ましくは１から３残基にわたりうる。挿入は好ましくは残基偶数について行うが、しかしこれは必須ではない。末端挿入の例はＮ−末端メチオニル残基を持つ成熟ＣＨＦ、組換え細胞培養での成熟ＣＨＦ直接生産の人工生成物、および組換え宿主から成熟ＣＨＦの分泌を促進するための異種Ｎ−末端シグナル配列の成熟ＣＨＦ分子のＮ−末端への融合を包含する。このようなシグナル配列は一般に意図する宿主細胞種から得られ、それ故、それに同種的である。適当な配列には大腸菌ではＳＴＩＩまたはｌＰＰ、酵母についてはアルファ因子、および哺乳類細胞についてはヘルペスｇＤのようなウイルスシグナルを包含する。
天然ＣＨＦ分子のその他の挿入変異体にはたとえばβ−ラクタマーゼのような細菌ポリペプチドなど免疫原ポリペプチドまたは大腸菌ｔｒｐ座がコードする酵素または酵母蛋白質の、天然ＣＨＦのＮ−またはＣ−末端への融合、および１９８９年４月６日発行のＷＯ８９／０２９２２に記載のような、たとえば免疫グロブリン定常領域（またはその他免疫グロブリン領域）、アルブミン、またはフェリチンのような半減期の長い蛋白質とのＣ−末端融合を包含する。
変異体の第３群はアミノ酸置換変異体である。この変異体は天然ＣＨＦ分子のアミノ酸残基少なくとも１個が除去され、その場所に異なる残基を挿入したものである。置換的突然変異誘発のために最大の興味がある部位は天然ＣＨＦの活性部位として知られる部位および既知の同族体中に見られるアミノ酸が側鎖の嵩高さ、電荷、または親水性の面で実質的に異なるが、しかし種々の動物ＣＨＦ種内の選択した部位において高度な配列同一性がある部位か、あるいはＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーおよび新規ＣＨＦに結合する既知リガンドに見られるアミノ酸が嵩高さ、電荷、または親水性の面で実質的に異なるが、しかし種々の動物リガンド同族体（たとえば、全動物ＣＮＴＦ分子間）の選択した部位において高度な配列同一性があるものである。この解析は心臓肥大、抗不整脈、筋変力作用、および神経栄養因子の活性の分化に関与する残基を目立たせ、これらの部位における変異体は活性に影響を与えるものとなろう。
興味あるその他の部位は種々の種から得られるＣＨＦの特定の残基において全動物種のＣＨＦおよび他のＧＨ／サイトカイン受容体ファミリー分子に結合するリガンドの間で同一のものであって、これらの酵素に共通の生物学的活性を達成するための重要性をこの一致の程度が示唆する。これらの部位、特に少なくとも３個の同様に保存された部位の配列内にあるもの、は比較的保存性のある様式で置換される。このような保存性のある置換は好適な置換との表題の下に表１に列記する。もしそのような置換が生物学的活性の変化を招くなら、さらに表１の例示的置換に割付けたもの、またはアミノ酸のクラスに関連して以下に記載するような実質的な変化を導入して生成物を検索する。
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天然ＣＨＦの機能または免疫学的同一性における実質的な修飾は（イ）置換の領域内においてポリペプチド骨格の構造、例えばシートまたはラセン立体配座、（ロ）標的部位における分子の電荷または親水性、または（ハ）側鎖の嵩高さの維持に及ぼす効果において顕著に異なる置換を選択することにより達成される。天然起源の残基はその側鎖に共通な性質に基づいて数群に分類される：
（１）親水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ、
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ、
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ、
（５）鎖の向きに影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および
（６）芳香性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
非保存置換はこれら分類の構成員一つを他のものに交換する必要がある。このような置換残基も保存置換部位または、より好ましくは残余の（非保存）部位に導入しうる。
本発明の一態様において、分子中に存在するプロテアーゼ切断部位を不活性化するのが好ましい。これらの部位はコードされたアミノ酸配列を観察することによって特定でき、トリプシンの場合は、たとえばアルギニルまたはリジニル残基に変換する。プロテアーゼ切断部位が決まったら、標的残基を他の残基、好ましくはたとえばグルタミンのような塩基性残基またはセリンのような親水性残基に置換することによって；またはその残基を欠失することによって；またはその残基の直後にプロリル残基を挿入することによって；これらを蛋白分解的切断に対して不活性化する。
別の態様では開始シグナル配列のメチオニル残基以外のいずれかのメチオニル残基またはそれらメチオニル残基から約３残基Ｎ−またはＣ−末端側に存在するいずれかの残基を他の残基に（好ましくは表１に従って）置換するかまたは除去する。あるいは、その部位に隣接して約１〜３残基を挿入する。
天然ＣＨＦの固有の立体配座の維持に関与しないどのシステイン残基も一般にはセリンに置換して分子の酸化に対する安定性を改善し、また異常な交差結合を防止する。
天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は当業界で公知の様々な方法によって製造される。これらの方法は、これに限定するものではないが、天然源からの分離（天然起源アミノ酸配列変異体の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位指向）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、および以前に調製した変異体または天然ＣＨＦの非変異体版のカセット突然変異誘発を包含する。
オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発は天然ＣＨＦＤＮＡの置換、欠失および挿入変異体の調製には好適な方法である。この技術はＡｄｅｌｍａｎなど、ＤＮＡ、２巻：１８３頁（１９８３年）に記載のように当分野でよく公知である。略述すれば、ＣＨＦの無変化または天然ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージの単鎖型であるＤＮＡ鋳型に所期の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリッド形成することによって、天然ＣＨＦＤＮＡを変更する。ハイブリッド形成後、ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドプライマーを挿入し、天然ＣＨＦＤＮＡに選択した変化をコードする鋳型の第２相補鎖全体を合成する。
一般に、長さ少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを使用する。最適なオリゴヌクレオチドは突然変異をコードするヌクレオチドの両側に鋳型に全く相補的な１２から１５ヌクレオチドを持つ。これはオリゴヌクレオチドが単鎖ＤＮＡ鋳型分子に正しくハイブリッド形成することを保証する。このオリゴヌクレオチドはＣｒｅａなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５巻：５７６５頁（１９７８年）が記載するような当業界で公知の技術を使用して容易に合成される。
このＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクター（商業的に入手可能なＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９が適当である）か、またはＶｉｅｒａなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３巻：３頁（１９８７年）が記載する単鎖ファージ複製開始点を含むベクターかから誘導したベクターによって作成できる。そこで、突然変異すべきＤＮＡをこれらベクターに挿入して単鎖鋳型を作成しうる。単鎖鋳型の調製法は前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの４．２１〜４．４１章に記載がある。
あるいは、単鎖ＤＮＡ鋳型は２重鎖プラスミド（またはその他の）ＤＮＡを標準的技術を使用して変性することによって作成できる。
天然ＤＮＡ配列の変更（例えば、アミノ酸配列変異体を作成するため）には、オリゴヌクレオチドを単鎖鋳型に適当な条件下にハイブリッド形成する。次に、通常はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノフ断片であるＤＮＡ重合酵素を添加し、オリゴヌクレオチドを合成用プライマーとして使用して鋳型の相補鎖を合成する。こうして、ＤＮＡ鎖の一つが天然ＣＨＦの突然変異型をコードし、他の鎖（元来の鋳型）が天然の変更のないＣＨＦ配列をコードするように形成したヘテロ二重ラセン分子を形成する。このヘテロ二重ラセン分子を次に通常はたとえば大腸菌ＪＭ１０１のような原核生物である適当な宿主細胞に形質転換する。細胞が成長した後、それらをアガロース板に置き、32Ｐで放射能標識したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して検索して突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを検出する。突然変異した領域を取り、一般に適当な宿主の形質転換に典型的に採用する型の発現ベクターである、適当なベクターに入れて蛋白質を生産する。
直前に記載した方法はプラスミドの両鎖が突然変異を含むものであるホモ二重ラセン分子が形成されるようにも修正しうる。この修正法は以下の通りである：
単鎖オリゴヌクレオチドをアニールして前記のような単鎖鋳型とする。デオキシリボヌクレオチド３種、すなわちデオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物をｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修正チオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社から入手できる）と混合する。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一なＤＮＡ鎖が作成される。これに加えて、このＤＮＡの新鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、制限エンドヌクレアーゼ消化から保護する。
この二重鎖ヘテロ二重ラセンの鋳型鎖を適当な制限酵素でニックした後に鋳型鎖をＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼで消化して、突然変異誘発すべき部位を含む領域をパストできる。この反応を次に停止して部分的に単鎖である分子を残す。次にＤＮＡポリメラーゼをデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート４種全部、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下に使用して完全な二重鎖ＤＮＡホモ二重ラセンを形成する。このホモ二重ラセン分子で次に前記大腸菌ＪＭ１０１のような適当な宿主細胞を形質転換する。
置換するアミノ酸１個またはそれ以上を持つ天然ＣＨＦのＤＮＡでコードした突然変異体は数種の方法の一つで作成する。もしアミノ酸がポリペプチド鎖内で互いに近接して存在するなら、それらは所期のアミノ酸置換全部をコードするオリゴヌクレオチド１個を使用して同時に突然変異しうる。しかしながら、もしもアミノ酸が互いにある距離をおいて位置する（約１０アミノ酸またはそれ以上離れている）なら、所期の変化全部をコードする単一なオリゴヌクレオチドを作成するのはより困難である。その代わりに、別の二法の一つを採用しうる。
第一の方法では置換すべきアミノ酸のための別のオリゴヌクレオチドを作成する。これらオリゴヌクレオチドを次に同時に単鎖鋳型ＤＮＡにアニールすれば、鋳型から合成された第二の鎖は所期のアミノ酸置換全部をコードする。
もう一つの方法は所期の突然変異体を生産するために二回またはそれ以上の突然変異誘発を含む。第一回は単一突然変異体について記載したものである：野生型ＤＮＡを鋳型に使用し、第一の所期アミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールして、ヘテロ二重ラセンＤＮＡ分子を作成する。突然変異誘発の第二回では第一回の突然変異誘発で製造した突然変異体ＤＮＡを鋳型として使用する。こうして、この鋳型は既に突然変異１個またはそれ以上を含有する。次に、付加的な所期アミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニールし、得られる第１および第二回突然変異誘発の双方をコードするＤＮＡの鎖を得る。得られたこのＤＮＡを第三回の突然変異誘発では鋳型とし、さらに反復して使用できる。
ＰＣＲ突然変異誘発も天然ＣＨＦのアミノ酸変異体を作るために適当である。下記の議論はＤＮＡについて行うが、この技術はＲＮＡへも応用できると理解される。ＰＣＲ技術は一般に次の操作を示す（前記Ｅｒｌｉｃｈ、Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉによる章、６１〜７０頁参照）：ＰＣＲで微量の鋳型ＤＮＡを使用する時には、鋳型ＤＮＡの対応する領域とは配列がすこし異なるプライマーを使用して鋳型とはプライマーが鋳型とは異なる位置のみで配列が異なっている鋳型とは異なる比較的多量の特定のＤＮＡ断片を生産する。プラスミドＤＮＡへの突然変異の導入には、プライマーの一つを突然変異の位置を重複するように、また突然変異を含有するように設計する；他のプライマーの配列はプラスミドの対立鎖配列の延長と同一でなければならないが、しかしこの配列はプラスミドＤＮＡに沿うどの場所に配置することもできる。しかしながら、最後にプライマーによって結合されたＤＮＡの全増幅領域を容易に配列決定できるように第二のプライマーの配列が第一のものから２００ヌクレオチド以内に配置することが望ましい。前記のようなプライマー対を使用するＰＣＲ増幅はプライマーが特定する突然変異の位置および、鋳型コピーはいくらか誤差を伴うので可能性としては他の位置でも、相違するＤＮＡ断片の集団を与える。
もし鋳型対生成物物質の比率が極端に低ければ、大多数の生成物ＤＮＡ断片は所期の突然変異を含有している。この生成物質を使用してプラスミド内の対応する領域を置換し、これを標準的ＤＮＡ技術を使用するＰＣＲの鋳型として役立てる。離れた位置での突然変異は第二突然変異プライマーを使用するか、または異なる突然変異プライマーでの第２ＰＣＲを行い、得られるＰＣＥ断片２種をベクターに三（またはそれ以上）部分ライゲーションゲーションで同時に結合することによって導入する。
ＰＣＲ突然変異誘発の特定の実施例では、鋳型プラスミドＤＮＡ（１μｇ）を増幅すべき領域外のプラスミドＤＮＡ内に独特な認識部位を持つ制限エンドヌクレアーゼで消化することによってリネアライズする。この物質の１００ｎｇをデオキシヌクレオチドトリ燐酸４種を含むＰＣＲ緩衝液を含むＰＣＲ混合物に添加し、ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）キット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社、ノーウォーク、ＣＴおよびエマリービル、ＣＡから入手）に入れて、各オリゴヌクレオチドプライマー２５ｐｍｏｌに加えて最終容積５０μＬとした。反応混合物に３５μＬの鉱物油を重積した。反応混合物を１００℃で５分間変性し、氷上に暫時置き、次にＴｈｅｒｍｕｓ・ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／ｍＬ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社）を油層の下に添加した。次に反応混合物を次のように設定したＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ・Ｃｅｔｕｓ社から購入）に注入した：
５５℃２分間、
７２℃３０秒間、
次に下記を１９サイクル：
９４℃３０秒間、
５５℃３０秒間、および
７２℃３０秒間。
プログラムの最後に反応バイアルをサーマルサイクラーから取り出し、水層を新しいバイアルに移し、フェノール／クロロホルム（５０：５０容）で抽出し、エタノール沈降し、ＤＮＡを標準的操作によって回収する。続いて、この物質をベクターに挿入するための適当な処理を行う。
変異体を調製するもう一つの方法はカセット突然変異誘発であってＷｅｌｌｓなど、Ｇｅｎｅ、３４巻、３１５頁（１９８５年）に記載の技術に基づく。出発物質はプラスミド（またはその他のベクター）であって、突然変異すべき天然ＣＨＦＤＮＡを含有する。突然変異すべき天然ＣＨＦＤＮＡ中のコドンを確認する。確認された突然変異部位の各末端には独特の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。そのような制限部位が存在しなければ、前記オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を使用して、それらを天然ＣＨＦＤＮＡ中の適当な位置に導入しうる。制限部位をプラスミドに導入した後、そのプラスミドをこれらの部位で切断してリネアライズする。制限部位の間のＤＮＡの配列をコードするが、所期の突然変異を含有する二重鎖オリゴヌクレオチドを標準的操作を使用して合成する。この鎖２個を別々に合成し、次に標準的技術を使用してハイブリダイズする。この二重鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼称する。このカセットはプラスミドに直接連結できるようにリネアライズしたプラスミドの両端と適合する３’および５’末端を持つように設計される。このプラスミドはここで天然ＣＨＦから突然変異したＣＨＦＤＮＡ配列を含有する。
Ｃ．複製可能なベクターへの核酸の挿入
ＣＨＦをコードする核酸（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を複製可能なベクターに挿入してさらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現を行う。多数のベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は１）増幅またはＤＮＡ発現に使用するかどうか、２）そのベクターに挿入すべき核酸の大きさ、および３）そのベクターで軽質転換すべき宿主細胞、に依存する。各ベクターはその機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）および適合する宿主細胞に応じて様々な成分を含有する。このベクター成分は一般にこれに限定するわけではないが次の１個またはそれ以上を含有する：シグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子１個またはそれ以上、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
（ｉ）シグナル配列成分
この発明のＣＨＦは直接的に製造されうるのみでなく、異種ポリペプチド、好ましくは成熟蛋白質またはポリペプチドのＮ−末端において特異的な切断部位を持つシグナル配列またはその他ポリペプチドであるもの、との融合物としても製造しうる。一般に、このシグナル配列はベクターの成分でありうるが、ベクターに挿入されたＣＨＦＤＮＡの一部でもありうる。選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものであるべきである。天然ＣＨＦシグナル配列を認識も処理もしない原核生物宿主細胞については、シグナル配列は原核生物シグナル配列、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーから構成される群から選択したもの、によって置換される。酵母分泌については、天然シグナル配列は、たとえば酵母インベルターゼリーダー、酵母アルファ因子リーダー（サッカロミセスおよびクライベロマイセスα−因子リーダを含む；後者は１９９１年４月２３日発行の米国特許第５０１０１８２に記載されている）、酵母酸性ホスファターゼリーダー、マウス唾液腺アミラーゼリーダー、カルボキシペプチダーゼリーダー、酵母ＢＡＲ１リーダー、Ｈｕｍｉｃｏｌａ・ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行の欧州特許３６２１７９）、または１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルでありうる。哺乳類細胞発現においては天然ヒトシグナル配列（すなわち、生体内で正常にはヒト細胞からの天然ＣＨＦの分泌を指向するＣＨＦプレ配列）が満足すべきものであるが、たとえば他種動物ＣＨＦからのシグナル配列、他のＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーの構成員に結合するリガンドからの配列、および同一または関連種の分泌ポリペプチドからのシグナル配列、ならびに、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＤシグナルなどのウイルス分泌リーダーのような他の哺乳類シグナル配列も適当でありうる。
このような前駆体領域のためのＤＮＡは読み取り枠内で成熟ＣＨＦをコードするＤＮＡに連結させる。
（ｉｉ）複製開始点成分
発現およびクローニングベクターは双方とも選択した宿主細胞１種またはそれ以上においてベクターに複製を可能にする核酸配列を含有する。一般にクローニングベクターにおいてはこの配列はベクターに宿主の染色体ＤＮＡとは独立な複製を可能にするが、複製開始および自律的複製配列を包含する。そのような配列は様々な細菌、酵母およびウイルスについてよく公知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製開始点は殆どのグラム陰性細菌に対して適切であり、２μプラスミドの開始点は酵母に対して適切であり、また種々のウイルスの開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は哺乳類細胞中のクローニングベクター用に有用である。一般に、複製開始点成分は哺乳類の発現ベクターには不要である（ＳＶ４０の開始点が典型的に使用されうるが、この理由は早期プロモーターを含有することのみによる）。
殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクター、すなわち、それらは少なくとも１群の生物内で複製できるが、発現用に他生物への遺伝子移入もできる。例えば、大腸菌内である種のベクターをクローニングすると、同じベクターを、宿主細胞の染色体から独立して複製することができないにもかかわらず、発現のために酵母または哺乳類の細胞に遺伝子移入できる。
ＤＮＡは宿主ゲノムに挿入することによっても増幅しうる。これは、例えばバチルスのゲノムＤＮＡに見られる配列に相補的なＤＮＡ配列をベクターに導入することによって、宿主としてバチルス属菌を使用して容易に達成される。このベクターによるバシラス菌の遺伝子移入はゲノムとの相同的な組換えおよびＣＨＦＤＮＡの挿入を招く。しかしながら、ＣＨＦをコードするゲノムＤＮＡの回収には、ＣＨＦＤＮＡを切断するに要する制限酵素消化が必要なので、外因的に複製したベクターのそれよりも複雑である。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現およびクローニングベクターは選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むべきである。この遺伝子は選択培養培地内に生育する形質転換宿主細胞の生存または生育に必要な蛋白質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞はこの培養培地内では生存しない。典型的な選択遺伝子は（イ）たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートまたはテトラサイクリンなどの抗生物質またはその他毒物に対する耐性を与える、（ロ）栄養要求性欠如を与える、または（ハ）たとえば、バシラス菌に対するＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子など、複合培地から得られない限界的栄養を供給する、蛋白質をコードする。
選択様式の一例は宿主細胞の生長を休止する薬剤を使用する。これらの細胞は異種遺伝子で成功裏に形質転換されれば薬剤耐性を与える蛋白質を生産するので選択状況下で生存する。そのような主たる選択の例では薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎなど、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１巻：３２７頁［１９８２年］）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２頁［１９８０年］）、またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５巻：４１０〜４１３頁［１９８５年］）を使用する。これら３例は真核生物制御下に細菌遺伝子を採用し、適当な薬剤、各々Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を与える。
哺乳類細胞に対する適当な選択可能マーカーの別の例は、たとえばＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼのようなＣＨＦ核酸を摂取する能力のある細胞の確認を可能にするものである。哺乳類細胞形質転換体をマーカーを摂取することにより形質転換体のみが独特に生存に適応する選択圧下に置く。選択圧は培地中の選択剤の濃度を十分に変化させて、そこで選択遺伝子とＣＨＦをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導くような条件にして形質転換体を培養することによって与える。増幅は生育に必須な蛋白質の生産用に要求の大きい遺伝子が組換え細胞の逐次的世代の染色体の中で直列に反復することによる過程である。増幅されたＤＮＡからのＣＨＦ合成量は増加する。遺伝子増幅のその他の例はメタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなどを包含する。
例えば、ＣＨＦＲ選択遺伝子で形質転換した細胞はまず形質転換体全部をＤＨＦＲの競合的拮抗剤であるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地内で培養して確認する。野生型ＤＨＦＲを採用する時は適当な宿主細胞はＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁（１９８０年）に記載されたように調製され、培養されたＤＨＦＲ活性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系列である。次に濃度を変えてメトトレキセートを形質転換した細胞と接触させる。これでＤＨＦＲ遺伝子の多重コピーの合成および、同時にＣＨＦをコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他種ＤＮＡの多重コピーを招来する。この増幅技術はたとえばＡＴＣＣ・ＣＣＬ６１・ＣＨＯ−Ｋ１のようなそうでなければ適当な宿主について例えば、もしＭｔｘに高度に耐性のある突然変異ＤＨＦＲ遺伝子が採用されれば（欧州特許第１１７０６０）内在性ＤＨＦＲが存在しても使用できる。
あるいは、ＣＨＦ、野生型ＤＨＦＲ蛋白質、および、たとえばアミノグリコシド・３−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）のようなもう一つの選択マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換したか共形質転換した宿主細胞（殊に内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、たとえばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８などアミノグリコシド抗生物質のような選択マーカー用選択剤を含有する培地内での細胞生育により選択できる。米国特許第４９６５１９９参照。
酵母中で使用するために適当な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８２巻：３９頁［１９７９年］；Ｋｉｎｇｓｍａｎなど、Ｇｅｎｅ、７巻：１４１頁［１９７９年］；またはＴｓｃｈｅｍｐｅｒなど、Ｇｅｎｅ、１０巻：１５７頁［１９８０年］）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えばＡＴＣＣ４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５巻：１２頁［１９７７年］）トリプトファン中で生長する能力を欠いている酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐ１損傷の存在はトリプトファン不在下での生育による形質転換の検出に対して有効な環境を提供する。同様にＬｅｕ２−欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）はＬｅｕ２遺伝子を持つ既知のプラスミドによって補充される。
これに加えて、１．６μｍ環状プラスミドｐＫＤ１から誘導されるベクターはクライベロマイセス酵母の形質転換に使用できる。Ｂｉａｎｃｈｉなど、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１２巻：１８５頁（１９８７年）。最近、ウシ組換えキモシンの大量生産用発現系がＫ．ｌａｃｔｉｓについて報告された。Ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅｒｇ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８巻：１３５頁（１９９０年）。クライベロマイセス工業株による成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多重コピー発現ベターも開示されている。Ｆｌｅｅｒなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：９６８〜９７５頁（１９９１年）。
（ｉｖ）プロモーター成分
発現およびクローニングベクターは通常宿主生物により認識され、ＣＨＦ核酸に作動可能に結合するプロモーターを含有する。プロモーターは構造遺伝子の出発コドンから上流（５’）（一般に約１００から１０００ｂｐ以内）に位置する非翻訳配列であって、たとえばＣＨＦ核酸配列のような作動可能に結合している特定の核酸配列の転写と翻訳を制御する。そのようなプロモーターは典型的には誘導可能および構成的の２種に分類される。誘導プロモーターはそれが制御するＤＮＡからの転写レベルの向上をある種の培養条件、たとえば栄養の存在または不在または温度変化など、に反応して開始するプロモーターである。現在、様々な潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。
これらのプロモーターは、源泉ＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを取り、分離したプロモーター配列をベクターに挿入することによりＣＨＦをコードするＤＮＡに作動可能に結合させる。天然ＣＨＦプロモーター配列および異種プロモーター多数の双方ともＣＨＦＤＮＡの増幅および／または発現を指向して使用しうる。しかしながら、一般に天然ＣＨＦプロモーターと比較して組換え的に製造したＣＨＦのより大きい転写とより高い収率を与えるので、異種プロモーターが好適である。
原核生物宿主に使用する適当なプロモーターにはβ−ラクタマーゼおよび乳糖プロモーター系（Ｃｈａｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７５巻：６１５［１９７８年］；およびＧｏｅｄｄｅｌなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：５４４頁［１９７９年］）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、８巻：４０５７頁［１９８０年］および欧州特許３６７７６）、および、ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター（ｄｅＢｏｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻：２１〜２５頁［１９８３年］）を包含する。しかしながら、他の既知細菌プロモーターも適当である。それらヌクレオチド配列は公表され、リンカーまたはアダプターを使用して必要な制限部位を供給して、熟練した研究者がそれらをＣＨＦをコードするＤＮＡに作動可能に連結することを可能にしている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔなど、Ｃｅｌｌ、２０巻：２６９頁［１９８０年］）。細菌系での使用のためのプロモーターもＣＨＦをコードするＤＮＡに作動可能に結合するシャイン−ダルガルノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
真核生物に対するプロモーターは公知である。真核生物遺伝子はほとんど全てが転写が開始する部位から約２５から３０塩基上流に位置するＡＴが豊富な領域を持つ。多数の遺伝子の転写開始点から７０から８０塩基上流に見られるもう一つの配列はＣＸＣＡＡＴ領域であって、ここにＸは如何なるヌクレオチドでもありうる。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列が存在し、これはコード配列の３’末端へのポリＡテイル付加のシグナルでありうる。これら配列は全てが真核生物発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主での使用のために適当なプロモーター配列の例には３−ホスホグリセレートキナーゼ用プロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５巻：２０７３頁［１９８０年］）またはその他の、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、焦性ブドウ酸脱カルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような解糖酵素（Ｈｅｓｓなど、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ・Ｒｅｇ．、７巻：１４９頁［１９６８年］；およびＨｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１７巻：４９００頁［１９７８年］）を包含する。
生長条件により制御される転写に付加的な利点を持つ誘導プロモーターであるその他の酵母プロモーターはアルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝関連分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−燐酸脱水素酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用を司る酵素プロモーター領域である。酵母発現で使用するために適当なベクターおよびプロモーターはさらにＨｉｔｚｍａｎなど、欧州特許７３６５７に記載がある。酵母のエンハンサーも酵母プロモーターと共に用いるのが有利である。
哺乳類宿主細胞のベクターからのＣＨＦ転写は、宿主細胞系に適合するプロモーターである限り、たとえばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日発行の英国特許第２２１１５０４）、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシパピローマウイルス、トリザルコーマウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはサルウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、たとえばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターなどから、熱ショックプロモーターから、および正常にはＣＨＦ配列に関連するプロモーターから、得られたプロモーターによって制御される。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターはＳＶ４０の制限断片として容易に得られ、これにはＳＶ４００ウイルス複製開始点も含む。Ｆｉｅｒｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２７３巻：１１３頁（１９７８年）；ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０９巻：１４２２〜１４２７頁（１９８０年）；Ｐａｖｌａｋｉｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：７３９８〜７４０２頁（１９８１年）。ヒトのサイトメガロウイルス即時型プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として容易に取得できる。Ｇｒｅｅｎａｗａｙなど、Ｇｅｎｅ、１８巻：３５５〜３６０頁（１９８０年）。ウシのパピローマウイルスをベクターとして使用する哺乳類宿主中での発現ＤＮＡ系は米国特許第４４１９４４６に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１９７８に記載がある。サル細胞内での免疫インターフェロンをコードするｃＤＮＡの発現についてはＧｒａｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９５巻：５０３〜５０８頁（１９８２年）；単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーター制御下におけるマウス細胞内でのヒトのβ−インターフェロンｃＤＮＡ発現についてはＲｅｙｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）；マウスおよびウサギ細胞培養中でのヒトのインターフェロン−β１遺伝子の発現についてはＣａｎａａｎｉとＢｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：５１６６〜５１７０頁（１９８２年）；およびプロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長末端反復を使用するＣＶ−１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニースハムスター卵巣細胞、ヒラ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞内での細菌ＣＡＴ配列の発現についてはＧｏｒｍａｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９巻：６７７７〜６７８１頁（１９８２年）を参照。
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
高等真核生物によるこの発明のＣＨＦをコードするＤＮＡの転写は、しばしばベクターにエンハンサーを挿入することによって増大する。エンハンサーは転写を増大すべきプロモーターに作用する通常は約１０から３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは相対的に方向および位置に依存せず、転写ユニットの５’（Ｌａｉｍｉｎｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８巻：９９３頁［１９８１年］）および３’（Ｌｕｓｋｙなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、３巻：１１０８頁［１９８３年］）、イントロンの中（Ｂａｎｅｒｊｉなど、Ｃｅｌｌ、３３巻：７２９頁［１９８３年］）、ならびにコード配列自体の内部（Ｏｓｂｏｒｎｅなど、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏ．、４巻：１２９３頁［１９８４年］）に見出されている。哺乳類遺伝子には多数のエンハンサー配列が今では公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、通常真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。この例には複製開始点後期側ＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製開始点後期側ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを包含する。真核生物プロモーターの活性化用エンハンサーエレメントに関してはＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照。エンハンサーはベクターにＣＨＦコード配列の５’または３’位でスプライスしうるが、好ましくはプロモーターから５’の部位に位置させる。
（ｖｉ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、カビ、昆虫、植物、動物、ヒト、その他の多細胞生物からの有核細胞）中で使用する発現ベクターは転写の終結とｍＲＮＡ安定化に必要な配列も包含する。このような配列は通常真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの非翻訳領域の５’、時には３’から入手できる。これらの領域はＣＨＦをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分内のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを包含する。
（ｖｉｉ）ベクターの構築および分析
前記の成分１個またはそれ以上を含む適当なベクターの構築には標準的な連結技術を採用する。必要なプラスミドを作成するように、分離したプラスミドまたはＤＮＡ断片を切断し、仕立て、および所期の型に再連結する。
構築したプラスミド中の正確な配列を確認する分析のために、連結混合物を用いて大腸菌Ｋ１２の２９４株（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、適当ならば成功した形質転換体をアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって選択する。形質転換体からのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化によって分析するか、および／またはＭｅｓｓｉｎｇなど、Ｎｕｃｌｅｉｃ・Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、９巻：３０９頁（１９８１年）の方法またはＭａｘａｍなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５巻：４９９頁（１９８０年）の方法によって配列決定する。
（ｖｉｉｉ）一時的発現ベクター
ＣＨＦをコードするＤＮＡの哺乳類細胞で一時的発現を提供する発現ベクターはこの発明の実施において殊に有用である。一般に、一時的発現ではその宿主細胞が発現ベクターのコピー多数を蓄積するように宿主細胞中で効果的に複製でき、次に、その発現ベクターがコードする所期ポリペプチドを高濃度で合成することのできる発現ベクターを使用する。前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１６．１７〜１６．２２。適当な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一時的発現系は、クローニングしたＤＮＡがコードするポリペプチドの好都合な陽性確認法ならびにそのようなポリペプチドの所期の生物学的または生理学的性質についての迅速な検索法を与える。こうして、一時的発現系は生物学的に活性な天然ＣＨＦの同族体および変異体の確認の目的のために、本発明には殊に有用である。
（ｉｘ）脊椎動物細胞ベクターの適例
組換え脊椎動物細胞培養中でＣＨＦの合成への適応に適するその他の方法、ベクター、および宿主細胞についてはＧｅｔｈｉｎｇなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９３巻：６２０〜６２５頁（１９８１年）；Ｍａｎｔｅｉなど、Ｎａｔｕｒｅ、２８１巻：４０〜４６頁（１９７９年）；欧州特許１１７０６０；および欧州特許１１７０５８に記載がある。ＣＨＦの哺乳類細胞培養生産のために殊に有用なプラスミドはｐＲＫ５（欧州特許３０７２４７）またはｐＳＶＩ６Ｂ（１９９１年６月１３日発行のＷＯ９１／０８２９１）である。ｐＲＫ５の誘導体ｐＲＫ５Ｂ（Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：１２７８〜１２８０［１９９１年］）はこのような発現に殊に適当である。
Ｄ．宿主細胞の選択および形質転換
ここで、ベクターのクローニングまたは発現のために適当な宿主細胞は前記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的のために適当な原核生物はたとえばグラム陰性またはグラム陽性生物のようなユーバクテリア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア、クレブシェラ、プロテウスなどエシェリチア属、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ・ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍなどサルモネラ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ・ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのようなセラチア属およびシゲラ属のような腸内細菌科ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（たとえば１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６７１０に開示のＢ．Ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ・４１Ｐ）のようなバチルス属、緑膿菌のようなシュードモナス属、およびストレプトマイセス属を包含する。好適な大腸菌クローニング宿主の一つは大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、大腸菌ＤＨ５α、および大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）も適当である。これらの例は例示であって、限定的なものではない。Ｗ３１１０株は組換えＤＮＡ生成物発酵用の普通の宿主株なので、殊に好適な宿主または親宿主である。宿主細胞は蛋白質分解酵素の分泌が最低であるのが好ましい。例えば、Ｗ３１１０株を修正して宿主内在性の蛋白質をコードするする遺伝子について遺伝子的突然変異を行いうるが、そのような宿主の例は完全遺伝子型ｔｏｎＡΔを持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・１Ａ２株、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔ・ｐｔｒ３を持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・９Ｅ４株、完全遺伝子型ｔｏｎＡΔ・ｐｔｒ３・ｐｈｏＡΔＥ１５・Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９・ΔｄｅｇＰ・ΔｏｍｐＴ・ｋａｎrを持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・２７Ｃ７株（ＡＴＣＣ５５２４４）、完全遺伝子型ｔｏｎＡ・ｐｔｒ３・ｐｈｏＡΔＥ１５・Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９・ΔｄｅｇＰ・ΔｏｍｐＴ・Δｒｂｓ７・ｉｌｖＧ・ｋａｎrを持つＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・３７Ｄ６株、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失突然変異３７Ｄ６株であるＥ．ｃｏｌｉＷ３１１０・４０Ｂ４株、および１９９０年８月７日に発行された米国特許第４９４６７８３に開示の周縁プロテアーゼ突然変異体を持つＥ．ｃｏｌｉ株を包含する。これとは別に、試験管内クローニング法、たとえばＰＣＲまたはその他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
原核生物に加えて糸状菌または酵母のような真核生物微生物もＣＨＦをコードするベクター用の適当なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ・ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはパン酵母は下等真核生物宿主微生物の中で最も普通に使用される。しかしながら、他の属、種、および株の多数が同様に利用でき、本発明に有用であり、たとえばＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ・ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈとＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ、２９０巻：１４０頁［１９８１年］；１９８５年５月２日発行の欧州特許１３９３８３）；クライベロミセス属宿主（米国特許第４９４３５２９；Ｆｌｅｅｒなど、前出）たとえばＫ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔなど、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、７３７頁［１９８３年］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６９０６；Ｖａｎ・ｄｅｎ・Ｂｅｒｇなど、前出）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓおよびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（欧州特許第４０２２２６）；Ｐｉｃｈｉａ・ｐａｓｔｏｒｉｓ（欧州特許１８３０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａなど、Ｊ．Ｂａｓｉｃ・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２８巻：２６５〜２７８頁［１９８８年］）；カンジダ属；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ・ｒｅｅｓｉａ（欧州特許２４４２３４）：Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ・ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６巻：５２５９〜５２６３頁［１９７９年］）；シュワニオミセス属たとえばＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ・ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日発行の欧州特許３９４５３８）；および糸状菌たとえばノイロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５７）、およびアスペルギルス属宿主たとえばＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅなど、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１２巻：２８４〜２８９頁［１９８３年］；Ｔｉｌｂｕｒｎなど、Ｇｅｎｅ、２６巻：２０５〜２２１頁［１９８３年］；Ｙｅｌｔｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：１４７０〜１４７４頁［１９８４年］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙとＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ・Ｊ．、４巻：４７５〜４７９頁［１９８５年］）を包含する。
ＣＨＦ生産用に適当な宿主細胞は多細胞生物に由来する。そのような宿主細胞には複雑な処理ができ、グリコシル化活性がある。原理的には、脊椎動物または無脊椎動物のいずれからであっても、高等真核生物細胞培養は使用可能である。無脊椎生物細胞の例には植物および昆虫細胞を包含する。たとえばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ・ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ・ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ・ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ・ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ミバエ）およびＢｏｍｂｙｘ・ｍｏｒｉのようなバキュロウイルス科の株と変種および対応する複製できる昆虫宿主細胞が確認されている。たとえばＬｕｃｋｏｗなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：４７〜５５頁（１９８８年）；Ｍｉｌｌｅｒなど、「遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ・Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．など編、８巻：（Ｐｌｅｎｕｍ・Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社、１９８６年）、２７７〜２７９頁；およびＭｅａｄａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１５巻：５９２〜５９４頁（１９８５年）参照。遺伝子移入用にたとえば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ・ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ・ＮＰＶのＬ−１変異体およびＢｏｍｂｙｘ・ｍｏｒｉ・ＮＰＶのＢｍ−５株などの種々のウイルス株が公共的に入手可能で、これらウイルスは、殊にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ・ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の遺伝子移入用に本発明用ウイルスとして使用しうる。
綿、トウモロコシ、馬鈴薯、大豆、ペチュニア、トマト、および煙草の植物細胞培養は宿主として使用できる。典型的には、予めＣＨＦＤＮＡを含ませるように処理した細菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株とインキュベーションすることによって植物細胞に遺伝子移入する。植物細胞培養物のＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとのインキュベーションの間に、ＣＨＦをコードするＤＮＡは植物細胞宿主に移行して遺伝子移入し、適当な条件下でＣＨＦＤＮＡを発現する。これに加え、たとえばノパリン合成酵素プロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列のような植物細胞に適合する制御およびシグナル配列も入手可能である。Ｄｅｐｉｃｋｅｒなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．、１巻：５６１頁（１９８２年）。これに加え、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流から分離したＤＮＡセグメントは組換えＤＮＡ含有植物組織中の植物発現遺伝子の転写水準を活性化または向上することができる。１９８９年７月２１日発行の欧州特許３２１１９６。
しかしながら、最も注目を引くのは脊椎動物細胞であって、培養中での脊椎動物細胞の増殖（組織培養）は近年では日常的操作になっている（「組織培養（Ｔｉｓｓｕｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、ＫｒｕｓｅとＰａｔｔｅｒｓｏｎ編［１９７３年］）。有用な哺乳類宿主細胞系列の例はＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞系列（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓系列（２９３または懸濁培養での生育用にサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍなど、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁［１９７７年］）；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂとＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁［１９８０年］）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁［１９８０年］）；サル腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１５７８）；ヒト頚部癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ・ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ・Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳癌細胞（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ・ＣＲＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒなど、Ａｎｎａｌｓ・ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁［１９８２年］）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌系列（Ｈｅｐ・Ｇ２）である。
宿主細胞にこの発明の前記発現またはクローニングベクターを遺伝子移入して好適に形質転換し、プロモーターを誘発するために適当なように修正した通常の栄養培地中で培養し、形質転換体を選択し、または所期配列をコードする遺伝子を増幅する。
遺伝子移入は宿主細胞が発現ベクターを取り込むことであって、いずれかのコード配列が実際に発現するかどうかには関わらない。当業者には、たとえばＣａＰＯ4および電気穿孔法など、多数の遺伝子移入法が公知である。遺伝子移入の成功は一般に宿主細胞でこのベクターが作動した兆候が起きた時に認識される。
形質転換は生物体へのＤＮＡの導入であって、そのＤＮＡが染色体外要素としてまたは染色体への挿入によって複製可能であることを意味する。使用する宿主に応じ、形質転換はその細胞に適する標準的技術を使用して行う。実質的細胞壁障壁を持つ原核生物その他の細胞には前記Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１．８２章に記載の塩化カルシウムを採用するカルシウム処理または電気穿孔法が一般的に使用される。ある種の植物細胞の形質転換用にはＳｈａｗなど、Ｇｅｎｅ、２３巻：３１５頁（１９８３年）および１９８９年６月２９日発行のＷＯ８９／０５８５９に記載のようにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ・ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染が使用される。これに加え、１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５８に記載のように植物は超音波処理を使用して遺伝子移入しうる。
このような細胞壁を持たない哺乳類細胞ではＧｒａｈａｍとｖａｎ・ｄｅｒ・Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２巻：４５６〜４５７頁（１９７８年）の燐酸カルシウム沈降法が好適である。哺乳類細胞宿主系形質転換の一般的側面はＡｘｅｌが１９８３年８月１６日発行の米国特許第４３９９２１６に記載している。酵母への形質転換は典型的にはＶａｎ・Ｓｏｌｉｎｇｅｎなど、Ｊ．Ｂａｃｋ．、１３０巻：９４６頁（１９７７年）およびＨｓｉａｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７６巻：３８２９頁（１９７９年）の方法に従って実施される。しかしながらＤＮＡを細胞に導入するその他の方法、たとえば核微注入法、電気穿孔法、無傷細胞との細菌原形質融合、ポリブレン、ポリオルニチンなどポリカチオン、などのようなものも使用しうる。哺乳類細胞を形質転換するための種々の技術についてはＫｅｏｗｎなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８５巻：５２７〜５３７頁（１９９０年）およびＭａｎｓｏｕｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３６巻：３４８〜３５２頁（１９８８年）を参照。
Ｅ．宿主細胞の培養
この発明のＣＨＦポリペプチドを生産するために使用する原核生物細胞は一般的にＳａｍｂｒｏｏｋなど、前出、が記載のような適当な培地中で培養する。
この発明のＣＨＦを生産するために使用する哺乳類宿主細胞は種々の培地中で培養しうる。たとえばＨａｍのＦ−１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（［ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコの修正イーグル培地（［Ｄ−ＭＥＭ］、Ｓｉｇｍａ）、およびＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ）のような商業的に入手可能な培地は宿主細胞を培養するために適当である。これに加え、例えばＨａｍとＷａｌｌａｃｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、５８巻：４４頁（１９７７年）；ＢａｒｎｅｓとＳａｔｏ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０２巻：２５５頁（１９８０年）；米国特許第４７６７７０４；４６５７８６６；４９２７７６２；５１２２４６９；または４５６０６５５；米国再発行特許第３０９８５；ＷＯ９０／０３４３０；またはＷＯ８７／００１９５に記載された培地のいずれかも宿主細胞用の培養培地として使用しうる。これら培地はいずれも必要に応じてホルモンおよび／またはその他の成長因子（たとえばインスリン、トランスフェリン、アプロチニン、および／または内皮成長因子［ＥＧＦ］のような）、塩（たとえば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、および燐酸塩のような）、緩衝液（ＨＥＰＥＳのような）、ヌクレオシド（たとえばアデノシンおよびチミジンのような）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬剤のような）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、およびブドー糖または均等なエネルギー源を添加しうる。その他の必要な添加物も当業者公知の適当な濃度で含有しうる。たとえば温度、ｐＨ、その他のような培養条件は発現用に選択した宿主細胞について前に使用されたもので、通常の当業者には明白である。
一般に、哺乳類細胞培養物の試験管内生産性を最大にするための原理、実験計画および実用技術は「哺乳類細胞バイオテクノロジー：実用的手法（Ｍａｍｍａｌｉａｎ・Ｃｅｌｌ・Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ・Ｐｒａｃｔｉｃａｌ・Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編、（ＩＲＬ・Ｐｒｅｓｓ社、１９９１年）に見出すことができる。
本開示に示す宿主細胞は試験管内培養中ならびに宿主動物内の細胞も含む。
Ｆ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅および／または発現は、例えば本明細書が提供する配列に基づいて常用のサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量するノーザンブロット（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻；５２０１〜５２０５頁［１９８０年］）、ドットブロット（ＤＮＡ分析）、または適当に標識したプローブを使用する原位置ハイブリッド形成、などによって試料中で直接に測定しうる。種々の標識、最も通常には放射性同位元素、殊に32Ｐ、を採用しうる。しかしながら、たとえばポリヌクレオチドへの導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを使用するようなその他の技術も採用しうる。次にビオチンはアビジンまたは抗体への結合部位として役立ち、たとえばこれを放射性核種、螢光基、酵素、その他のような広範な標識でラベルしうる。これとは別にＤＮＡ二重ラセン、ＲＮＡ二重ラセンおよびＤＮＡ−ＲＮＡ二重ラセンまたはＤＮＡ−蛋白質二重ラセンを含む特定の二重ラセンを認識できる抗体を採用しうる。次に抗体を標識し、表面に二重ラセンが形成すればその二重ラセンに結合する抗体の存在が検出できるようにして、二重ラセンが表面に結合するところでの検定を実施する。
遺伝子発現は、これとは別に、たとえば組織切片の免疫組織化学的染色および遺伝子生産物発現を直接的に定量するための細胞培養物または体液の検定のような免疫学的方法により測定しうる。免疫組織化学的染色技術では、典型的には脱水および固定により細胞試料を作成し、続いて結合する遺伝子生産物に特異的な標識抗体と反応させる。通常この標識は、たとえば酵素標識、螢光標識、化学発光標識、その他のように可視的に検出可能なものである。本発明での使用に適当な、殊に高感度の染色技術はＨｓｕなど、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、７５巻：７３４〜７３８頁（１９８０年）に記載されている。
免疫組織化学染色および／または試料液の検定用に有用な抗体はモノクローナルかポリクローナルかであって、哺乳類体内で産生しうる。抗体は天然ＣＨＦポリペプチドに対してまたは本明細書第４章記載のＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して好都合に作成しうる。
Ｇ．ＣＨＦポリペプチドの精製
ＣＨＦは好ましくは培養培地から分泌ポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナルなしに直接生産した時には宿主細胞溶菌液からも回収しうる。
ヒト起源以外の組換え細胞内でＣＨＦを産生する時には、ＣＨＦはヒト起源蛋白質またはポリペプチドを全く含まない。しかしながら、ＣＨＦに関して実質的に均質な製品を得るための細胞蛋白質またはポリペプチドからＣＨＦを精製することが必要である。第一段階で、宿主細胞または溶菌断片のいずれもの粒状破砕物を、例えば遠心分離または限外濾過などにより除去し；要すれば蛋白質を商業的に入手可能な蛋白質濃縮濾過で蛋白質を濃縮し；続いて、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換カラム分画（たとえば、ＤＡＥＡまたはカルボキシメチルまたはスルホプロピル基を含むマトリックス上の）、ブルーセファロース、ＣＭブルー−セファロース、ＭＯＮＯ−Ｑ、ＭＯＮＯ−Ｓ、レンチルレクチン−セファロース、ＷＧＡ−セファロース、コンＡ−セファロース、Ｅｔｈｅｒ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｂｕｔｙｌ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｐｈｅｎｙｌ・ＴｏｙｏｐｅａｒｌまたはプロテインＡセファロース上のクロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィー、シリカクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、逆相ＨＰＬＣ（たとえば脂肪族基付加シリカゲル）、たとえばセファデックス分子篩またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用するゲル濾過、ＣＨＦを選択的に結合するカラム上のクロマトグラフィー、およびエタノールまたは硫酸アンモニウム沈降から選択した工程１回またはそれ以上によってＣＨＦをその他不純物から分離する。前記工程のいずれにもプロテアーゼ阻害剤を添加してプロテイン分解を防止しうる。適当なプロテアーゼ阻害剤の例にはフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、リューコペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩−ベスタチン、キモスタチン、およびベンズアミジンを包含する。
好適な精製方式は関連クローンを遺伝子移入した細胞の培養培地を１．５Ｍ−ＮａＣｌに調整し、Ｂｕｔｙｌ・Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商品名）カラムに装填することを含む。このカラムをＮａＣｌ含有トリス［ヒドロキシメチルアミノ］メタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐＨ７．５で洗浄し、活性を１０ｍＭ−Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商品名）３〜１０界面活性剤を含むＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶離する。活性の極大を１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に調整してＭＯＮＯ−Ｑ迅速フローカラムに入れる。このカラムをＮａＣｌおよびオクチルグルコシドを含むＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄する。活性は流過した画分中に見られる。活性物質は次に０．１％ＴＦＡ、１０％アセトニトリル中の逆相Ｃ４カラムに入れ、０．１％ＴＦＡから８０％までの勾配で溶離する。活性はゲル濾過カラム上で約１５〜３０ｋＤａに分画される。分割と回収にはグアニジン−ＨＣｌのようなカオトロープ剤が必要であると予期される。
残基が欠失、挿入、または置換したＣＨＦ変異体は天然ＣＨＦと同様な方式でその変異によって起きる実質的な変化を配慮して回収される。例えばＣＨＦと、たとえば細菌またはウイルスの抗原など、その他のプロテインまたはポリペプチドとの融合物の製造は精製を促進する；この抗原に対する抗体を含む免疫親和性カラムを融合ポリペプチドを吸着するために使用できる。たとえばウサギのポリクローナル抗−ＣＨＦカラムのような免疫親和性カラムをそれに残りの免疫エピトープ少なくとも１個に結合することによってＣＨＦ変異体を吸着するために採用できる。前記定義のプロテアーゼ阻害剤も精製の間のプロテイン分解を防止するために有用でありうるし、また、抗生物質も偶発的な夾雑物の生育を防止するために添加しうる。熟練した当業者は天然ＣＨＦに対して適当な精製法は、組換え細胞培養中での生産に際してＣＨＦまたはその変異体の性質における変化に起因する修正が必要でありうることを認識するものである。
Ｈ．ＣＨＦポリペプチドの共有結合修飾体
ＣＨＦポリペプチドの共有結合修飾体はこの発明の範囲に含まれる。天然ＣＨＦと天然ＣＨＦのアミノ酸配列変異体との双方とも共有結合的に修飾しうる。この発明の範囲内にある共有結合的修飾の一型は変異体ＣＨＦ断片の製品である。４０アミノ酸残基までの変異体ＣＨＦ断片は化学合成または全長または変異体ＣＨＦポリペプチドの酵素的または化学的切断によって好都合に産生できる。ＣＨＦまたはその断片の他の型の共有結合的修飾は分子にＣＨＦまたはその断片の標的アミノ酸残基を選択した側鎖またはＮ−またはＣ−末端残基と反応することのできる有機誘導化試薬と反応させることにより導入される。
システイニル残基は最も普通には、たとえばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドのような、α−ハロ酢酸（および対応するアミン）と反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイニル残基はブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジサルファイド、メチル・２−ピリジルジサルファイド、ｐ−クロロマーキュリベンゾエート、２−クロロマーキュリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても、誘導体化される。
ヒスチジル残基はｐＨ５．５〜７．０でピロ炭酸ジエチルとの反応で誘導体化される。この試薬は相対的にヒスチジル側鎖に特異的である。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応は好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍ−ナトリウムカコジレート中で行う。
リジニルおよびアミノ末端残基はコハク酸またはその他カルボン酸の無水物と反応する。これら試薬での誘導体化にはリジニル残基の荷電を逆転する効果がある。α−アミノ−含有残基用のその他の適当な試薬は、たとえばメチルピコリンイミデートのようなイミドエステル、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、水素化クロロボロン、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオンおよびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ−触媒反応を包含する。
アルギニル残基は常用の試薬１種または数種との反応で修飾され、その中にはフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫaが高いため、反応をアルカリ性条件中で行うことが必要である。さらに、これら試薬はリジン基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基とも反応しうる。
チロジル残基の特異的修飾はチロジル残基にスペクトル標識を導入する特異的な関心から芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって行われうる。最も通常には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用してＯ−アセチルチロジル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成する。チロジル残基を125Ｉまたは131Ｉを使用して放射能免疫検定用の標識蛋白質を製造するためにヨード化するが、前記クロラミンＴ法が適当である。
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）はカルボジイミド（Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。ここに、ＲおよびＲ’はたとえば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのように異なるアルキル基である。さらにその上、アスパルチルおよびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
双官能性試薬での誘導体化は抗−ＣＨＦ抗体を精製するための方法またはその逆の方法で使用するために、ＣＨＦを水不溶性支持マトリックスまたは表面に交差結合するために有用である。通常使用する交差結合剤には、たとえば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（サクシンイミジルプロピオネート）のようなジサクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二官能性マレイミド、などを包含する。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートのような誘導化試薬は光活性化可能な中間体を与え、それは光の存在下に交差結合を形成することができる。その他に、反応性の非水溶性マトリックス、たとえばシアノーゲンブロミド活性化炭水化物および米国特許第３９６９２８７；３６９１０１６；４１９５１２８；４２４７６４２；４２２９５３７；および４３３０４４０に記載の反応性基質は蛋白質固定化に利用される。
グルタミニルおよびアスパラギニル残基はしばしば脱アミノ化されておのおの対応するグルタミルおよびアスパルチル残基となる。これらの残基は中性または塩基性条件下に脱アミノ化される。これら残基の脱アミド化型はこの発明の範囲内に含まれる。
その他の修飾はプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基にあるヒドロキシル基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖にあるα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、「蛋白質：構造および分子の性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ・ａｎｄ・Ｍｅｏｌｅｕｌａｒ・Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、サンフランシスコ、７９〜８６頁［１９８３年］）、Ｎ−末端アミンのアセチル化およびＣ−末端カルボキシル基のアミド化を包含する。
この発明の範囲内に含まれるＣＨＦポリペプチドのもう一つの型の共有結合的修飾にはこのポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。ここに、変更は天然ＣＨＦに見られる炭水化物基１個またはそれ以上を除去し、および／または天然ＣＨＦには存在しないグリコシル化部位１個またはそれ以上を追加することを意味する。
ポリペプチドのグリコシル化は典型的にはＮ−結合かまたはＯ−結合である。Ｎ−結合は炭水化物基がアスパラギン残基の側鎖に付加することを示す。トリペプチド配列：アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここにＸはプロリン以外のアミノ酸である）はアスパラギン側鎖への炭水化物基の酵素的付加のための認識配列である。そこで、これらトリペプチド配列のいずれかのポリペプチドにおける存在はグリコシル化の可能性ある部位を構成する。Ｏ−結合グリコシル化は、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの一つが、最も普通にはセリンまたはスレオニンであるヒドロキシアミノ酸に結合することを示すけれども５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用しうる。
ＣＨＦポリペプチドへのグリコシル化部位の結合は、前記のトリペプチド配列（Ｎ−結合グリコシル化部位のための）１個またはそれ以上を含むようにアミノ酸配列を変更することによって好都合に達成される。この変更は天然ＣＨＦ配列にセリンまたはスレオニン残基１個またはそれ以上の付加または置換（Ｏ−グリコシル化部位への）することによっても行いうる。容易にするには天然ＣＨＦアミノ酸配列を好ましくはＤＮＡ水準で、殊に天然ＣＨＦポリペプチドをコードするＤＮＡを所期アミノ酸に翻訳されるコドンを作成するように予め選択した塩基で突然変異することによって変更する。ＤＮＡ突然変異は２Ｂ項に前記した方法を用いて行いうる。
ＣＨＦポリペプチド上の炭水化物基の数を増加する別の方法の一つはグリコシドの化学的または酵素的なポリペプチドへの結合である。これらの操作はＮ−またはＯ−結合グリコシル化について、グリコシル化性能を持つ宿主細胞内でポリペプチドの生産を要しない点で有利である。使用する結合様式に依存して、糖は（イ）アルギニンおよびヒスチジン、（ロ）遊離カルボキシル基、（ハ）システインにあるような遊離スルフヒドリル基、（ニ）セリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンにあるような遊離ヒドロキシル基、（ホ）フェニルアラニン、チロジンまたはトリプトファンにあるような芳香族基、または（ヘ）グルタミンのアミド基、に付加しうる。これらの方法は１９８７年９月１１日発行ＷＯ８７／０５３３０およびＡｐｌｉｎとＷｒｉｓｔｏｎ、ＣＲＣ・Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５９〜３０６頁（１９８１年）に記載がある。
ＣＨＦポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は化学的または酵素的に達成しうる。化学的脱グリコシル化にはトリフルオロメタンスルホン酸化合物または均等な化合物とポリペプチドとの接触を要する。この処理では結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の殆どまたは全ての糖を切断するが、ポリペプチドは無傷のままに残す。化学的脱グリコシル化はＨａｋｉｍｕｄｄｉｎなど、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２５９巻：５２頁（１９８７年）およびＥｄｇｅなど、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８巻：１３１頁（１９８１年）に記載がある。ポリペプチド上の炭水化物基の酵素的切断はＴｈｏｔａｋｕｒａなど、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８巻：３５０頁（１９８７年）に記載のように種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼの使用により達成できる。
可能性あるグリコシル化部位でのグリコシル化はＤｕｓｋｉｎなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７巻：３１０５頁（１９８２年）に記載のようにツニカマイシン化合物の使用で防止しうる。ツニカマイシンは蛋白質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻害する。
ＣＨＦの共有結合修飾の他の型は、米国特許第４６４０８３５；４４９６６８９；４３０１１４４；４６７０４１７；４７９１１９２または４１７９３３７にある様式で、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンなど、種々の非蛋白質ポリマーへのＣＨＦポリペプチドの結合を含む。
ＣＨＦはまた、例えばコアセルベーション技術または界面重合（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンミクロカプセルおよびポリ［メチルメタクリレート］マイクロカプセル）により、コロイド性薬剤送達系中（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中に製造したマイクロカプセル中に捕捉しうる。このような技術は「レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ・Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ・Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ．編、（１９８０年）に開示されている。
ＣＨＦ製剤はまた放射性ヨード、酵素、フルオロフォア、スピン標識、その他で標識した時にはＣＨＦのための検定（たとえば放射免疫検定、酵素結合免疫検定、または放射能受容体検定における標準品として使用するためにＣＨＦを標識することによって）における標準品としての抗体の作成において、親和性精製技術において、および競合型受容体結合検定において有用である。
変異体ＣＨＦの性質を予測するのは困難なことが多いので、最適変異体を選択するためには得られる変異体の検索は意義があるものである。心臓肥大、抗不整脈、筋変力作用、または神経栄養性の強化、ＣＨＦ拮抗作用の存在、発現水準の向上、酸化安定性、高濃度分泌性能、その他を検索できる。例えば、所与抗体への親和性のようなＣＨＦ分子の免疫学的性質の変化、たとえばは競合型免疫検定法により測定される。変異体はその肥大性、抗不整脈性、筋変力性、および神経栄養性の活性が同じ検定で天然ＣＨＦで観察される対応する活性（例えば、下記実施例中に記載する肥大および神経栄養性の検定を使用して）と比較することによって低下または強化における変化を検定する。たとえば酸化還元性または熱安定性、親水性、プロテイン分解の受け易さ、またはキャリアーとのまたは多重体への会合性向のような、蛋白質またはポリペプチドの性質の潜在的修飾の他のものは当分野でよく公知の方法によって検定される。
Ｉ．ＣＨＦ拮抗剤
ＣＨＦへの拮抗剤はＣＨＦのための予測される受容体ファミリー（ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、およびオンコスタチンＭ受容体サブファミリーを包含するＧＨ／サイトカイン受容体ファミリー）を使用することによって製造できる。即ち、受容体をファミリーから発現用にクローニングし；次に受容体の可溶性型を、細胞外ドメインを確認し膜貫通ドメインから切断することによって製造できる。可溶性型受容体を次に拮抗剤として使用するか、または受容体を使用してＣＨＦ活性に拮抗する小さい分子を検索できる。
これとは別に、図１に示すマウス配列または図５に示すヒト配列を使用して、拮抗剤として作用する天然ＣＨＦの変異体を製造する。ＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーはリガンド上に結合部位２個を持つことが知られているのでＣＨＦの受容体結合部位は結合性研究で決定でき、また、分子が拮抗剤として作用するようにそれらの一つを標準技術（欠失またはラジカル置換）で除去することができる。本明細書記載の拮抗作用は肥大性および神経栄養性を含む数種の方法によって決定できる。
Ｊ．肥大性検定
肥大性活性を検定するためには、好ましくは縮小検定を使用する。この検定法では使用する培地は細胞を血清不含の低密度プレーティングで生存させる。この培地に直接プレーティングすると、少数細胞が除けるように洗浄段階を省略できる。プレーティング密度は重要である：少数細胞の多くとその生存率が減少し；多数細胞の多くおよび筋細胞が自己誘導肥大を開始する。
これに含まれる段階は：
（イ）９６ウェルのプレートに、少なくともインスリン、トランスフェリン、およびアプロチニンを添加したＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地中の筋細胞懸濁液を、細胞密度約７．５×１０4細胞／ｍＬでプレーティングする；
（ロ）細胞を培養する；
（ハ）検定すべき物質（ＣＨＦを含むと推測されるような）を添加する；
（ニ）細胞を物質とともに培養する；および
（ホ）肥大性を測定する。
この培地には別の要素、たとえば細胞の長期生存を確保するＥＧＦのようなものを添加できるが、しかしそのような添加は必須ではない。Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地はＧｉｂｃｏ・ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入手でき、下記培地の一つからなる：
0003906314.tif 000003
0003906314.tif 000004
0003906314.tif 000005
好適な肥大性検定法は次の通り：
（イ）ウシ血清を含む培地、好ましくは４％ウシ胎児血清添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地を、好ましくはウェルをこの培地と約８時間３７℃でインキュベーションした、９６−ウェル組織培養プレートにプレコートする；
（ロ）培地を除く；
（ハ）７.５×１０4細胞／ｍＬのインスリン、トランスフェリン、およびアプロチニン添加Ｄ−ＭＥＭ−／Ｆ−１２培地の筋細胞懸濁液を内側の６０ウェルにプレーティングする；
（ニ）筋細胞を少なくとも２４時間培養する；
（ホ）被験物質を添加する；
（ヘ）細胞を被験物質とともに培養する（好ましくは約２４〜７２時間、より好ましくは約４８時間）；次いで
（ト）肥大を、好ましくはクリスタルバイオレット染色で、測定する。
好ましくは段階（ハ）で使用する培地は血清不含であって、ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）およびグルタミンを含有する。最も好ましくは、この培地はＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２を１００ｍＬ、トランスフェリン１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）、インスリン２０μＬ（５ｍｇ／ｍＬ）、アプロチニン５０μＬ（２ｍｇ／ｍＬ）、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを１ｍＬ（ＪＲＨ・Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ・Ｎｏ．５９６０２−７７Ｐ）、Ｌ−グルタミン１ｍＬ（２００ｍＭ）を含有する。
試料必要量が１００μＬまたはそれ以下と小さく、１週間１０００試料の検定性能が発現クローニングおよび蛋白質精製を可能にするが、これは現在までの方法を使用しては実現不能であろう。
肥大性用の検定法の別の一つは心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）放出をラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ融合蛋白質への125Ｉ-ラットＡＮＰの結合に対する競合を測定する検定法によって測定することを含む。使用に適するこの方法はＣｈａｍｏｗなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：９８８５〜９８９１頁（１９９０年）が記載したＣＤ４−ＩｇＧ融合蛋白質を使用してｇｐ１２０を測定するために使用した方法と類似している。
Ｋ．神経栄養性検定
ここではＬｅｕｎｇ、Ｎｅｕｒｏｎ、８巻：１０４５〜１０５３頁（１９９２年）に記載された毛様体神経節神経栄養性活性用検定法が適当である。略述すれば、毛様体神経節をＥ７−Ｅ８ニワトリ胚から切り出し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ１５４００−１３）中で解離し、３７℃で１５分間燐酸塩緩衝食塩水で１０倍に希釈する。神経節をトリプシンがなくなるまで成育培地（１０％ウシ胎児血漿、１．５ｍＭ−グルタミン、ペニシリン１００μｇ／ｍＬおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ添加高グルコースＤ−ＭＥＭ）で３回洗浄し、次に成育培地１ｍＬ中で緩やかにかきまぜて単一細胞懸濁液とする。成育培地５ｍＬ中のこの細胞混合物を１００ｍｍ組織培養皿に入れ、４時間３７℃の孵卵器中でインキュベーションしてニューロンを濃縮する。この時間の間に非ニューロン性細胞は優先的に皿に付着し、インキュベーションの終期にはニューロンは浮遊して緩やかに洗浄できる。濃縮したニューロンを次に予めコラーゲンで被覆した９６−ウェルのプレートに入れてプレーティングする。各ウェルに細胞１０００〜２０００個をプレーティングして、試験すべきＣＨＦ希釈物とともに最終容積を１００から２５０μＬとする。３７℃で２〜４日インキュベーションした後に、生存細胞を生体色素メタロチオネイン（ＭＴＴ）を用いて染色して生体細胞数を評価する。ウェルに５分の１容のＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ・Ｍ２１２８）５ｍｇ／ｍＬを添加する。３７℃で２〜４時間インキュベーション後、生存細胞（濃紫色沈殿物で満たされたもの）を倍率１００×の位相顕微鏡によって計数する。
３．ＣＨＦの使用および治療的組成物および投与
ＣＨＦには生体内で、心不全、不整脈または筋変力疾患および／または末梢性神経障害およびその他の運動ニューロンまたはＣＮＴＦが活性なニューロンに関連する神経学的疾患を持つ哺乳類（動物またはヒト）の処置のための薬剤として用途があると信じられる。
例えば、ＣＨＦは、ＡＣＥ阻害剤が採用できないか、または有効でない症例で鬱血性心不全の処置に有用でありうる。場合によってはＣＨＦをＡＣＥ阻害剤を含む他剤と組合せるか、協同して鬱血性心不全を治療するために投与する。
投与すべきＡＣＥ阻害剤の有効量は、もし採用するなら、医師または獣医師の裁量による。薬剤の投与および調節は鬱血性心不全の最適管理を達成するように行われ、および理想的には利尿剤またはジギタリスの使用および低血圧および腎障害のような状態を考慮に入れる。用量はさらに使用する阻害剤の型および処置すべき特定患者のような因子に依存する。典型的には採用する量はＡＣＥ阻害剤がＣＨＦなしに投与される時に使用される用量と同じ用量とする。
そこで、例えばエナラプリルの試験用量を５ｍｇとし、患者が許容するなら、次にこれを１日１回用量１０〜２０ｍｇに上げる。他の例として、カプトプリルはヒトの患者に最初は試験用量６．２５ｍｇを経口投与し、次にこの用量を患者が許容するなら、２５ｍｇ１日２回（ＢＩＤ）または１日３回（ＴＩＤ）まで、後に５０ｍｇＢＩＤまたはＴＩＤまで増量しうる。許容水準は血圧の低下が低血圧の徴候を伴うかどうかを決定して評価する。もし処方するなら、用量は１００ｍｇＢＩＤまたはＴＩＤまで増加しうる。カプトプリルは活性成分としてヒドロクロロサイアザイドと組合せてカプトプリルが腸に達するまで保護する腸溶または遅延放出被覆を持つｐＨ安定化コアとして製剤化される。カプトプリルは錠剤またはカプセル剤として投与用に入手できる。カプトプリルその他のＡＣＥ阻害剤に関する用量、投与、処方、および配合禁忌についての議論は「医師卓上便覧（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ・Ｄｅｓｋ・Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）」、Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ・Ｄａｔａ・Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ社、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪ．２３１４−２３２０頁（１９９４年）に見出すことができる。
ＣＨＦはまた天然または腫瘍壊死因子誘導死に対して膠突起神経膠細胞を保護する試験管内での膠突起神経膠細胞の発生、成熟および生存の点で、星状神経膠細胞の生存および分化および２型星状神経膠細胞誘導の点で、およびラット中枢神経系（ＣＮＳ）の小神経膠細胞による低親和性神経成長因子およびＣＤ−４の組換え生産の刺激の点で潜在的に有用である。
ＣＨＦはまた脱神経した骨格筋に栄養効果を与える点で潜在的に有用である。これに加え、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、および毛様体神経栄養因子に対する低親和性受容体を遺伝子移入した造血細胞の増殖反応および結合性を持つこと、インターロイキン−６受容体に結合することによって肝実質細胞中のフィブリノーゲン遺伝子発現を制御すること、マウス胚癌細胞に栄養作用を持つこと、内因性熱発物質になること、およびヒトのＩＭＲ３２神経芽細胞腫に有糸分裂促進剤効果を持つことが期待される。
これに加え、ＣＨＦは培養ラット交感神経ニューロンの神経成長因子への反応を強化すること、発育中のラットにおいて運動ニューロンとその標的筋肉を維持すること、生体内で運動神経ニューロンの発芽を誘導すること、試験管内で新生児ラットの皮質脊髄ニューロンの生存を促進すること、生体内で成熟ラットの黒質ドパミン作動性ニューロンの変性を防止すること、海馬錐体ニューロンの興奮毒性損傷に対する感受性の閾値を変化すること、成熟ラットＣＮＳでニューロンの変性を防止し、低親和性ＮＧＦ受容体の生産を促進すること、および胎児ラット海馬培養物中のニューロン生存を強化することが期待される。
これらの活性はＣＨＦによる末梢神経障害（運動および感覚）、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、発作、ハンチントン病、および、例えば網膜に関する眼科疾患を含む全神経変性疾患の治療に翻訳される。
ＣＨＦは、たとえば、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、およびＮＴ−％のような神経栄養因子とともに神経学的疾患の付随的治療としても有用でありうる。
ＣＨＦをコードする核酸は組織特異的型分類の診断剤として有用でありうる。例えば、切片上ハイブリッド形成、ノーザンおよびサザンブロティング、およびＰＣＲ分析のような操作はＣＨＦをコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡが評価すべき細胞型内に存在するかどうかを決定するために使用できる。
分離したＣＨＦポリペプチドは未知量のＣＨＦを含む試料に対する標準または対照として定量的診断検定法で使用しうる。
心不全および神経学的疾患の処置のためのＣＨＦ治療剤は貯蔵のためには所期純度を持つＣＨＦを、要すれば生理学的に許容される担体、添加剤、または安定化剤（前記レミントンの薬剤科学）と混合して、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形に製造される。許容される担体、添加剤または安定化剤は採用する用量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であって、燐酸塩、クエン酸、その他の有機酸のような緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量ポリペプチド（約１０残基以下）；血漿アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、その他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；および／またはトゥイーン、プルロン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を包含する。
生体内投与に使用するＣＨＦは無菌でなければならない。これは凍結乾燥および再構築の前または後に無菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。通常ではＣＨＦは凍結乾燥型または溶液中に貯蔵する。
治療用ＣＨＦ組成物は一般に無菌アクセスポートを持つ容器、例えば皮下注射針によって穴あけできる蓋を持つ静脈注射溶液バッグまたはバイアルに入れる。
ＣＨＦまたはＣＨＦ抗体投与経路はたとえば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病巣内経路など、または下記の持続放出系による注射または点滴など、既知の方法に従うものである。ＣＨＦは点滴するかまとめた注射で連続的に投与される。ＣＨＦ抗体は同様に投与するか、または血流またはリンパに投与する。
持続放出製剤の適例はこの蛋白質を含む固体親水性ポリマーの半透明マトリックスであって、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルに成形したものを包含する。持続放出マトリックスの例にはポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、Ｌａｎｇｅｒなど、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｓｔｅｒ．Ｒｅｓ．、１５巻：１６７〜２７７頁［１９８１年］およびＬａｎｇｅｒなど、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．、１２巻、９８〜１０５頁［１９８２年］に記載のあるポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９、欧州特許５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎなど、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２巻：５４７〜５５６頁［１９８３年］）、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒなど、前出）、分解性乳酸−グリコール酸共重合体、たとえばルプロンデポ（商品名）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロライドの注射用微小球）など、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許１３３９８８）を包含する。
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日以上にわたる分子の放出を可能にするが、ある種のヒトロゲルは蛋白質をもっと短期間放出する。カプセル化された時、蛋白質は体内に長期間残存し、３７℃で湿気に接触する結果として変性または凝集して生物学的活性損失および免疫原性の変化が起こりうる。合理的な方策は関与する機序に依存した蛋白質安定化について工夫できる。例えば、もし凝集機序が分子間チオ−ジスルフィド交換によるＳ−Ｓ結合形成にあることが発見されれば、安定化はスルフヒドリル残基修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含湿量制御、適当な添加剤の使用、および特定ポリマーマトリックス組成物の開発により達成される。
持続放出ＣＨＦ組成物はリポソーム捕捉ＣＨＦも包含する。ＣＨＦを含有するリポソームはそれ自体公知の方法：ＤＥ３２１８１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２巻：３６８８〜３６９２頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：４０３０〜４０３４頁（１９８０年）；欧州特許５２３２２；欧州特許３６６７６；欧州特許８８０４６；欧州特許１４３９４９；欧州特許１４２６４１；日本特許出願８３−１１８００８；米国特許第４４８５０４５および４５４４５４５；および欧州特許１０２３２４；で製造する。正常にはリポソームは小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型でリピド含量はコレステロール約３０モル％より大であって、選択する比率は最適ＣＨＦ療法に適合させる。
治療に採用すべきＣＨＦの有効量は、例えば治療対象、投与経路、および患者の条件などに依存する。それ故、治療者にとって薬剤を力価検定して、最適な治療効果を得るに必要なように投与経路を修正することが必要となる。典型的な日用量は前記因子に依存して１日当り約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ患者体重またはそれ以上までの範囲にわたり、好ましくは約１０μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。典型的には臨床医は用量が心臓または神経不全の治療に所望の効果を達成するまでＣＨＦを投与する。例えば、この量は心室収縮力を増大し、末梢性血管抵抗を減弱し、心不全患者における同様に重大な状態を軽快または処置する。この療法の進捗は通常の検定法で容易に監視される。
４．ＣＨＦ抗体の製造
（ｉ）出発物質および製法
免疫グロブリン（Ｉｇ）およびそのある種の変異体は公知であり、多くは組換え細胞培養によって調製されてきた。例えば、米国特許第４７４５０５５；欧州特許２５６６５４；欧州特許１２０６９４；欧州特許１２５０２３；欧州特許２５５６９４；欧州特許２６６６６３；ＷＯ８８／０３５５９；Ｆａｕｌｋｎｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９８巻：２８６頁（１９８２年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．、１２３巻：７９３頁（１９７９年）；Ｋｏｅｈｌｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７巻：２１９７頁（１９８０年）；Ｒａｓｏなど、Ｃａｎｃｅｒ・Ｒｅｓ．、４１巻：２０７３頁（１９８１年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２巻：２３９頁（１９８４年）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：１２０２頁（１９８５年）；およびＭｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻：６８５１頁（１９８４年）；を参照。再結合免疫グロブリン鎖も公知である。例えば米国特許第４４４４８７８；ＷＯ８８／０３５６５；および欧州特許６８７６３および記載の文献参照。本発明のキメラにおける免疫グロブリン部分はＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、またはＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭ、から得られうるが、好ましくはＩｇＧ−１、またはＩｇＧ−３から得られる。
（ｉｉ）ポリクローナル抗体
ＣＨＦポリペプチドまたはＣＨＦ断片へのポリクローナル抗体は一般にＣＨＦまたはＣＨＦ断片およびアジュバントの皮下（ｓｃ）または腹腔内への多回注射によって動物中に作成する。ＣＨＦまたは標的アミノ酸配列を含む断片を免疫すべき種に免疫原性である蛋白質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤などに双官能または誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホサクシンイミドエステル（システイン残基経由の複合）、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（リジン残基経由）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、またはＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここにＲおよびＲ1は異なるアルキル基である）などを使用して複合させることは有用でありうる。
ＣＨＦポリペプチドまたはＣＨＦ断片、免疫原性複合体、または誘導体に対して動物を免疫するには、ペプチドまたは複合体（各々ウサギまたはマウス）１ｍｇまたは１μｇをフロインドの完全アジュバント３容と混合し、その溶液を多部位に皮内注射する。１月後、初回量の１／５から１／１０量のフロインド完全アジュバント中のペプチドまたは複合体を多部位に皮下注射して動物をブースト（追加免疫）する。７から１４日後、動物から採血し、血清をＣＨＦまたはＣＨＦ断片抗体力価について検定する。動物を力価が安定するまでブーストする。好ましくは、同じＣＨＦまたはＣＨＦ断片の複合体であるが異なる蛋白質におよび／または異なる交差結合試薬により複合した複合体で動物をブーストする。複合体は融合蛋白質として組換え細胞培養物中でも製造できる。明礬のような凝集剤も免疫反応を強化するために適切に使用される。
（ｉｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に均質な抗体の集団、すなわち集団を構成する個々の抗体が微量に存在するかも知れない天然起源の突然変異を除いて一致しているもの、から得られる。そこで、修飾語「モノクローナル」は異なる抗体の混合物ではないという抗体の性質を示す。
例えば、本発明のＣＨＦモノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）が最初に記載したハイブリドーマ法を使用するか、組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙなど、前出）により製造しうる。
ハイブリドーマ法では、マウスまたはハムスターのようなその他の適当な宿主動物を前記のように免疫して免疫に使用したＣＳＦまたはＣＳＦ断片に特異的に結合する抗体を製造するか、製造することができるリンパ球を作成する。あるいは、リンパ球は試験管内で免疫しうる。次にポリエチレングリコールのような適当な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、「モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ・ａｎｄ・Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、５９〜１０３頁［Ａｃａｄｅｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）］。
こうして製造したハイブリドーマ細胞を好ましくは非融合親骨髄腫細胞の成長または生存を阻止する物質１種またはそれ以上を含有する適当な培養培地中に接種し、成育させる。例えば、もし親骨髄腫細胞がヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠失するなら、典型的にはハイブリドーマ用の培養培地にはＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を阻害する物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを添加する（ＨＡＴ培地）。
好適な骨髄腫細胞は効率的に融合し、選択した抗体産生細胞の安定な高水準の抗体産生を維持し、およびＨＡＴ培地のような培地に感受性のあるものである。これらの中で、好適な骨髄腫細胞系列は、たとえばＳａｌｋ・Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ・Ｃｅｌｌ・Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ・Ｃｅｎｔｅｒ、サンジエゴ、カリホルニア州、米国、から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されるもの、およびＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ロックビル、メリーランド州、米国から入手可能なＳＰ−２細胞のようなマウス骨髄腫系列である。
ハイブリドーマ細胞を成育させる培養培地はＣＨＦに対するモノクローナル抗体の生産について検定する。好ましくはハイブリドーマ細胞によって生産されるモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降反応または、たとえばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）のような試験管内結合検定法により決定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎとＰｏｌｌａｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析などによって決定できる。
ハイブリドーマ細胞が所望の特異性、親和性および／または活性を持つ抗体を生産することを確認した後、クローンを制限希釈法によりサブクローニングして標準法によって成長させる（Ｇｏｄｉｎｇ、前出）。この目的に適当な培養培地には、例えばＤ−ＭＥＭまたはＲＭＰＩ−１６４０培地を包含する。これに加えて、ハイブリドーマ細胞は動物中で生体内腹水腫瘍としても成長させうる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を培養培地、腹水液、または血清から常法による免疫グロブリン精製操作、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーのような操作、により適切に分離する。
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは常法操作（たとえば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）を使用して容易に分離し、配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞はこのＤＮＡの好適な源として役立つ。一旦分離すれば、このＤＮＡを発現ベクター中に入れ、次にこれを、たとえば普通は免疫グロブリン蛋白質を生産しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞など宿主細胞に遺伝子移入して組換え宿主細胞内にモノクローナル抗体を合成させる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する綜説文献にはＳｋｅｒｒａなど、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２５６〜２６２頁（１９９３年）およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０巻：１５１〜１８８頁（１９９２年）を包含する。
ＤＮＡは、例えば相同的なマウス配列の代わりにヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を置換するか（Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻：６８５１頁［１９８４年］）、または免疫グロブリンのコード配列に非−免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列全部または一部を共有結合的に結合することによって修飾しうる。このような様式で、本発明の抗−ＣＨＦモノクローナル抗体の結合特異性を持つ「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を製造する。
典型的にはそのような非免疫グロブリンポリペプチドを本発明抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、またはそれらを本発明抗体の抗原結合部位の一つの可変ドメインの代わりに置換してＣＨＦに特異性を持つ抗原結合部位１個および異なる抗原に対する特異性を持つ別の抗原結合部位を含有するキメラ二価抗体を作成する。
キメラまたはハイブリッド抗体または試験管内で交差結合剤が関与するものを含む合成蛋白質化学の既知方法を使用しても製造しうる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成してイムノトキシンを構築しうる。この目的の適当な試薬の例にはイミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートを包含する。
診断的応用のためには、本発明の抗体を典型的には検出可能な基で標識する。この検出可能な基は直接的または間接的に検出可能なシグナルを作ることのできるものであることができる。例えば、検出可能な基は3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、または125Ｉのような放射性同位元素；たとえばフルオレッセインイソチオシアネート、ロダミン、またはルシフェリンのような螢光または化学発光化合物；たとえば125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、3Ｈなどの放射性同位元素標識；たとえばアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼのような酵素でありうる。
Ｈｕｎｔｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、１４４巻：９４５頁（１９６２年）；Ｄａｖｉｄなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：１０１４頁（１９７４年）；Ｐａｉｎなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、４０巻：２１９頁（１９８１年）；およびＮｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ・Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０巻：４０７頁（１９８２年）に記載された方法を包含する検出可能な基に対する抗体を別々に複合するための当分野の公知方法を採用しうる。
本発明の抗体は、たとえば競合的結合検定法、直接的または間接的なサンドウィッチ検定法および免疫沈降検定法のような、いずれの公知検定法にも採用しうる。Ｚｏｌａ、「モノクローナル抗体：技術便覧（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ・Ｍａｎｕａｌ・ｏｆ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ・Ｐｒｅｓｓ社、１９８７年）。
競合的結合検定法は被験試料被分析物（ＣＨＦ）と競合して所定量の抗体と結合する標識標準（ＣＨＦまたはその免疫学的に反応性の部分でありうる）の性能に依存する。被験試料中のＣＨＦの量は抗体に結合することになる標準品の量に逆比例する。結合してくる標準品の量を迅速に決定するためには、一般に、抗体に結合する標準品および被分析物を結合せずに残っている標準品と被分析物から分離しうるように、抗体を競合の前または後に固定化する。
サンドウィッチ検定法は検出すべき蛋白質（ＣＨＦ）の異なる免疫原部分またはエピトープに結合することのできる抗体２個の使用を含む。サンドウィッチ検定法では、被験試料被分析物を固体担体上に固定化された第一の抗体に結合し、その後に、第二の抗体を被分析物に結合して不溶性の三成分複合体を形成する。ＤａｖｉｄとＧｒｅｅｎｅ、米国特許第４３７６１１０。第二抗体自体を検出可能な基で標識する（直接サンドウィッチ検定）か、または検出可能な基で標識した抗免疫グロブリン抗体を使用して測定（間接サンドウィッチ検定）しうる。例えば、サンドウィッチ検定法の一型はＥＬＩＳＡ検定法であって、ここでは検出可能な基は酵素（たとえば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）である。
（ｉｖ）ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野でよく公知である。一般に、ヒト化抗体は非ヒト起源から導入されたアミノ酸残基１個またはそれ以上を持つ。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は本質的にＷｉｎｔｅｒおよびその協力者の方法（Ｊｏｎｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁［１９８６年］；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁［１９８８年］；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁［１９８８年］）に従って、囓歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒトの抗体の対応する配列に置換することによって実行できる。それ故に、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（Ｃａｂｉｌｌｙなど、前出）、そこでは実質的に無傷のヒト可変ドメインより小さいものが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている。実際的に、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であって、そこではＣＤＲ残基のいくつかおよびおそらくＦＲ残基のいくつかが囓歯類抗体中の類似部位からの残基によって置換されている。
ヒト化抗体を作成するために使用すべきヒト可変ドメインの選択は軽鎖および重鎖の双方とも抗原性を削減するためには非常に重要である。いわゆる「最適」法に従って、囓歯類抗体の可変ドメインの配列を公知ヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して検索する。囓歯類のものに最近似のヒト配列を次にヒト化抗体用のヒトのフレームワーク（ＦＲ）として許容する（Ｓｉｍｓなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２２９６頁［１９９３年］；ＣｌｏｔｈｉａとＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１頁［１９８７年］）。別法の一つは軽鎖または重鎖にある特定のサブグループに属するヒト抗体全部のコンセンサス配列から誘導した特殊なフレームワークを使用する。同じフレームワークを数種の異なるヒト化抗体に使用しうる（Ｃａｒｔｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁［１９９２年］；Ｐｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁［１９９３年］）。
抗体を抗原への高親和性その他の好ましい生物学的性質を保持したままヒト化することはさらに重要である。この目的を達するため、好適な方法に従えば、ヒト化抗体は親配列およびヒト化配列の三次元モデルを使用する親配列および種々の概念的なヒト化生成物の分析の過程により製造される。三次元免疫グロブリンモデルは普通に入手可能で、当業者は精通している。選択した免疫グロブリン配列候補の推測上の三次元立体配座構造を描写し、表示するコンピュータープログラムが入手できる。これらの画像を検討すると免疫グロブリン配列候補の官能性における残基の推測上の役割、すなわち抗原に結合する免疫グロブリン候補の性能に影響を与える残基の解析、を分析できる。こうして、ＦＲ残基をコンセンサスおよび輸入配列から選択して結合して標的抗原への親和性向上のような抗体の所期特性に到達するようにする。一般に、ＣＤＲ残基は直接的におよび最も実質的に抗原結合に与える影響に関与している。
（ｖ）ヒトの抗体
ヒトのモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成できる。ヒトのモノクローナル抗体生産のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系列は、例えばＫｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒなど、「モノクローナル抗体製造技術および応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ・Ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ・Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ・ａｎｄ・Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ・Ｄｅｃｋｅｒ社、ニューヨーク、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６〜９５頁（１９９１年）に記載がある。
今日では免疫によって内因性免疫グロブリン生産なしにヒト抗体の全レパートリーを作成することのできるトランスジェニック動物（たとえば、マウス）も生産できる。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の同型接合欠失が内在性抗体生産の完全阻害を招くことが報告されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配置をそのような生殖系列突然変異マウスに移転すると抗原チャレンジに際してヒト抗体を生産を招くであろう。たとえばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎなど、Ｙｅａｒ・ｉｎ・Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９９３年）参照。
これとは別に、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ・ｄｉｓｐｌａｙ）技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙなど、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５３頁［１９９０年］）もヒト抗体および抗体断片を試験管内で非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖ）遺伝子レパートリーから産生するため使用できる。この技術に従えば、抗体のＶドメイン遺伝子を、たとえばＭ１３またはｆｄのような繊維状バクテリオファージの主または微量コート蛋白質いずれかの遺伝子にフレーム内クローニングして、ファージ粒子表面上の機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的性質に基づく選択はこれらの性質を示す抗体をコードする遺伝子の選択を招来する。こうしてファージはＢ−細胞の性質をいくつか模倣することになる。ファージのディスプレーは種々の様式で行われる；これに関する綜説については、たとえばＪｏｈｎｓｏｎ・Ｋｅｖｉｎ・Ｓ．とＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ・Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ・Ｏｐｉｎｉｏｎ・ｉｎ・Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ・Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻：５６４〜５７１頁（１９９３年）を参照。Ｖ遺伝子セグメントの起源数種をファージディスプレーに使用できる。Ｃｌａｃｋｓｏｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）は免疫マウスの脾臓から誘導したＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーから得た抗オキサゾロン抗体の多数のアレイを分離した。非免疫ヒトドナーからＶ遺伝子レパートリーを構築でき、そして抗原（自己抗原を含む）のアレイ多数に対する抗体を本質的には、Ｍａｒｋｓなど、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）またはＧｒｉｆｆｉｔｈなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１２巻：７２５〜７３４頁（１９９３年）が記載した技術に従って分離できる。
天然の免疫反応においては抗体遺伝子は高率で突然変異を蓄積する（体細胞高突然変異）。導入される変化のいくつかは高親和性を与え、高親和性表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞は次の抗原チャレンジまでの間に優先的に複製され、分化する。この天然の過程を「連鎖シャッフリング」（Ｍａｒｋｓなど、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：７７９〜７８３頁［１９９２年］）として知られる技術を採用して模倣できる。この方法ではファージディスプレーによって得られる［プライマリー］なヒト抗体の親和性を重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を非免疫ドナーから得たＶドメイン遺伝子の天然起源変異体（レパートリー）のレパートリーと逐次交換することによって改善できる。この技術でｎＭ範囲の親和性を持つ抗体または抗体断片を産生できる。非常に大きいファージ抗体レパートリーを作成する方策がＷａｔｅｒｈｏｕｓｅなど、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ・Ｒｅｓ．、２１巻：２２６５〜２２６６頁（１９９３年）に記載されている。
ヒトの抗体が囓歯類の抗体と類似の親和性および特異性を持っている時は、遺伝子シャッフリングを囓歯類抗体からヒト抗体を誘導するためにも使用できる。「エピトープインプリント法（ｅｐｉｔｏｐｅ・ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ）」とも呼ばれるこの方法に従えば、ファージディスプレー技術によって得た囓歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子レパートリーと交換して囓歯類−ヒトキメラを作成する。抗原についての選択で機能的抗原結合部位、すなわち結合相手選択を支配（ｉｍｐｒｉｎｔ）するエピトープ、を復元できるヒト可変が分離される。この過程を反復して残りの囓歯類ドメイン置換すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日発行のＰＣＴ・ＷＯ９３／０６２１３）。従来のＣＤＲ移植による囓歯類抗体のヒト化とは相違して、この技術は囓歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基を持たない完全なヒト抗体を提供する。
（ｖｉ）双特異性抗体
双特性抗体は好ましくはヒトのまたはヒト化モノクローナル抗体であって、抗原少なくとも２種に対する結合特性を持つ。本件の場合、結合特異性の一つはＣＨＦに対するもので、他の一つは他のいずれかの抗原、好ましくはＧＨ／サイトカイン受容体ファミリー構成員に結合する他のリガンド、に対する。例えば、ＣＨＦおよび神経栄養因子または異なる二型のＣＨＦポリペプチドに特異的に結合する双特異性抗体は本発明の範囲内にある。
双特異性抗体の製法は当業界では公知である。伝統的に、双特異性抗体の組換え製造は重鎖２種が異なる特異性を持つ免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア２種の共発現に基づいている（ＭｉｌｓｔｅｉｎとＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７〜５３９頁［１９８３年］）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな分類の故に、これらハイブリドーマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）は異なる抗体分子１０種の混合物を生産する可能性があり、その中で１種のみが正しい双特異性構造を持つ。通常親和性クロマトグラフィー工程で行う正しい分子の精製はかなり面倒で、生成物の収率が低い。同様な操作法が１９９３年５月１３日発行のＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒなど、ＥＭＢＯ・Ｊ．、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。
別の好ましい手法に従えば、所期の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を持つ抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合する。この融合は、好ましくは少なくともヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域を包含する免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。軽鎖結合に必要な部位を含む重鎖第一定常領域（ＣＨ１）を融合物の一つに存在させることは好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物および、所望ならば、免疫グロブリン軽鎖、をコードするＤＮＡを別の発現ベクターに挿入して適当な宿主生物中に共遺伝子移入する。これで構築で使用するポリペプチド３種の不均等な比率が最適収率を与える態様においてポリペプチド断片３種の相互比率を調製するために大きな柔軟性が提供される。しかしながら、ポリペプチド少なくとも２種の等比率産生が高収率を与える時または比率が別段の意味を持たない時には発現ベクターの一つへのポリペプチド鎖２種または全３種のコード配列を挿入することも可能である。この手法の好適な態様では、双特異性抗体は一方のアームに第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖および別のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造は双特異性分子の半分だけにある免疫グロブリン軽鎖の存在が迅速な分離方法を提供するので、所期の双特異性化合物を望まない免疫グロブリン鎖結合物から分離し易くすることが見出されている。
双特異性抗体作製についてさらに詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈなど、Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１２１巻：２１０頁（１９８６年）参照。
（ｖｉｉ）ヘテロ複合抗体
ヘテロ複合抗体も本発明の範囲内にある。ヘテロ複合抗体は共有結合的に結合した抗体２個から構成される。このような抗体は、例えば望まない細胞を免疫系細胞のターゲットにするため（米国特許第４６７６９８０）およびＨＩＶ感染症の処置のために（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；および欧州特許０３０８９）提案されている。ヘテロ複合抗体は好都合な交差結合法を使用して製造される。適当な交差結合剤は当業界でよく知られており、米国特許第４６７６９８０に多数の交差結合技術とともに開示されている。
５．ＣＨＦ抗体の使用
ＣＨＦ抗体はＣＨＦに対する診断検定、たとえば特定の細胞、組織または血清中での生産など、において有用である。抗体は前記ＣＨＦにおけると同じ様式で標識し、および／または不溶解性マトリックス上に固定化する。受容体結合検定法の一態様において、ＣＨＦ全部または選択したＣＨＦ複数に結合する抗体組成物を不溶性マトリックスに固定化し、被験試料を固定化抗体組成物に接触させてＣＨＦ全部を吸着し、次に固定化したＣＨＦを予め決めたＣＨＦに対して特異的であるように個々に別個の螢光団その他のような独特の標識によって認識される各ＣＨＦに特異的な抗体複数と接触させる。各独特の標識の存在および／または量を決定することのよって、各ＣＨＦの相対的比率および量を決定できる。
本発明の抗体は患者を受動的に免疫するためにも有用である。
ＣＨＦ抗体は組換え細胞培養物または天然起源からＣＨＦを親和性精製するためにも有用である。ラットＣＨＦと検出可能に交差反応しないＣＨＦ抗体はＣＨＦをこの蛋白質不含まで精製できる。
ＣＨＦおよびその抗体を診断的に検定する適当な方法それ自体はよく公知である。下記実施例に記載する候補ＣＨＦを試験してそれが肥大性、抗不整脈、筋変力作用または神経栄養活性を持つかどうかを見るための生物検定法に加えて、競合的、サンドウィッチおよび立体的阻害免疫検定技術も有用である。競合的およびサンドウィッチ法は相分離工程を方法の肝要な部分として採用し、一方では立体的阻害検定は単一反応混合物中で行う。検定すべき物質の分子量によってはある種の方法が好ましいが、基本的には同じ操作を使用してＣＨＦおよびＣＨＦ結合性物質を検定する。それ故、抗原か抗体かの状態にかかわりなく、ここに試験すべき物質を被分析物と称し、被分析物に結合する蛋白質は、それらが抗体、細胞表面受容体または抗原のいずれでも結合相手と名付ける。
ＣＨＦまたはその抗体のに対する分析法は全て次の試薬１種またはそれ以上を使用する：標識被分析物類似体、固定化被分析物類似体、標識結合相手、固定化結合相手、および立体的複合体。標識した試薬は「トレーサー」とも呼ばれる。
使用する標識（これはプローブとして使用するためのＣＨＦ核酸を標識するためにも有用である）は被分析物およびその結合相手との結合を妨害せずに検出を可能とする機能である。免疫検定で使用するための標識多数が公知で、その例には直接検出できる、たとえばフルオロクローム、化学発光、および放射能標識のようなもの、ならびに、たとえば検出のためには反応するか誘導されなければならない酵素のようなものを包含する。このような標識の例には放射性同位体元素32Ｐ、14Ｃ、125Ｉ、3Ｈ、131Ｉ；希土類キレートまたはフルオレッセインとその誘導体のような螢光団；ロダミンとその誘導体；ダンシル；ウンベリフェロン；たとえばホタルおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６）；ルシフェリン；２，３−ジヒドロフタラジンジオン；マレエート脱水素酵素；ウレアーゼ；セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のようなペルオキシダーゼ；アルカリホスファターゼ；β−ガラクトシダーゼ；グルコアミラーゼ；リゾチーム；たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素のようなサッカライドオキシダーゼ；色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する、たとえばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼまたはマイクロペロキシダーゼのような、酵素と共にウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼのようなヘテロ環オキシダーゼ；ビオチン／アビジン；スピン標識；バクテリオファージ標識；安定な遊離ラジカル；その他を包含する。
当業者は本発明に採用されうる適当な他の標識を知ることとなろう。ＣＨＦ、その抗体または断片の結合は、当業者に普通に知られている標準的技術を使用して達成される。例えば、ジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビスイミデート、ビスジアゾ化ベンジジン、その他の結合試薬は前記の螢光、化学発光および酵素標識でポリペプチドに目印を付けるために使用しうる。例えば米国特許第３９４０４５７（螢光分析）および第３６４５０９０（酵素）；Ｈｕｎｔｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、１４４巻：９４５頁（１９６２年）；Ｄａｖｉｄなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３巻：１０１４〜１０２１頁（１９７４年）；Ｐａｉｎなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４０巻：２１９〜２３０頁（１９８１年）；Ｎｙｇｒｅｎ、Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ・Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．、３０巻：４０７〜４１２頁（１９８２年）；Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎなど、「酵素免疫検定での使用のための酵素−抗体複合の製造法（Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｆｏｒ・ｔｈｅ・Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ・ｏｆ・Ｅｎｚｙｍｅ−ａｎｔｉｂｏｄｙ・Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ・ｆｏｒ・Ｕｓｅ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｅ・Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」、Ｊ．Ｊ．ＬａｎｇｏｎｅとＨ．ｖａｎ・Ｖｕｎａｋｉｓ編「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ・ｉｎ・Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、７３巻中、１４７〜１６６頁（Ａｃａｄｍｉｃ・Ｐｒｅｓｓ社、ニューヨーク、ＮＹ、１９８１年）；Ｋｅｎｎｅｄｙなど、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、７０巻：１〜３１頁（１９７６年）；およびＳｃｈｕｒｓなど、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、８１巻：１〜４０頁（１９７０年）を参照。最後の文献に記載の結合技術はグルタルアルデヒド法、過ヨード酸法、ジマレイミド法、およびｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル法である。
本発明の実施においては、酵素標識は好適な態様である。全ての着想可能な検定法での標識として使用するためにある一つの酵素が理想的であることはない。その代わり、特定の検定系にはどの酵素が適するかを決定しなければならない。酵素選択に重要な判断基準は純粋な酵素のターンオーバー数（単位時間毎に酵素当り生成物に転換される基質分子の数）、酵素製品の純度、生成物検出感度、酵素反応検出の容易さと速度、試験液中妨害因子および酵素様活性の不在、酵素およびその複合の安定性、酵素とその複合体の入手可能性および経費、その他である。本発明の検定法における好適な標識として使用される酵素に包含されるものの中には、アルカリホスファターゼ、ＨＲＰ、ベーターガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、マレエート脱水素酵素、およびグルコース−６−ホスフェート脱水素酵素がある。ウレアーゼがさらに好適な酵素標識の中にあるのは、殊に容易にその活性が裸眼で見える発色団ｐＨ指示薬の故である。
ある種の検定法には試薬の固定化が必要である。固定化は結合相手を溶液内に遊離して溶存している被分析物から分離することを意図する。この便利さは結合相手または被分析物類似体のどちらかを検定操作の前に水不溶性のマトリックスまたは表面に吸着することにより（Ｂｅｎｎｉｃｈなど、米国特許第３７２０７６０）、共有結合することにより（例えば、グルタルアルデヒド交差結合を使用して）、または相手または類似体を後に、たとえば免疫沈降することによって不溶化することにより達成される。
別の検定法で競合的またはサンドウィッチ検定と呼ばれるものはよく確立されて商業的診断企業では広く使用されている。
競合的検定はトレーサー類似体が共通の結合相手にある限定された数の結合部位で被験試料被分析物と競合する性能に依存する。結合相手は一般に競合前または後に不溶化され次にその結合相手に結合したトレーサーと被分析物を非結合トレーサーおよび被分析物から分離する。この分離はデカンテーションにより（結合相手を予め不溶化した時）、または遠心分離により（結合相手を競合反応後に沈降した時）達成する。被験試料被分析物の量はマーカー物質の量により測定した結合トレーサーの量に対して逆比例する。被分析物既知量での用量−作用曲線を作製して試験結果と比較して被験試料内に存在する被分析物の量を定量的に決定する。マーカーとして検出可能な酵素を使用する時、これら検定法はＥＬＩＳＡ系と呼ばれる。
「均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」検定と呼ばれる別種の競合的検定法は相分離を要しない。ここでは、酵素と被分析物との複合体を形成し、抗被分析物が被分析物に結合すると、抗被分析物の存在が酵素活性が変わるように使用する。この場合、ＣＨＦまたはその免疫学的に活性な断片を有機的双官能的架橋でペルオキシデースのような酵素に複合する。抗ＣＨＦの結合が標識の酵素活性を阻害または強化するようにして複合物を抗ＣＨＦと共に使用するように選択する。この方法自体はＥＭＩＴの名で広く実用されている。
立体的複合体は均質検定の立体障害法で使用する。この複合体はハプテンに対する抗体が抗被分析物と同時には複合体と結合することができないようにして、低分子量ハプテンを小さい被分析物と共有結合的に結合することによって合成する。この検定操作では被験試料中に存在する被分析物は抗被分析物と結合し、その際、抗ハプテンを複合体に結合して、たとえばハプテンが螢光物質である時には螢光の変化など、複合体ハプテンの性質を変化させる。
サンドウィッチ検定はＣＨＦまたはＣＨＦ抗体の測定では、殊に有用である。逐次的なサンドウィッチ検定法において、固定化した結合相手を使用して被験試料被分析物を吸着し、被験試料を洗浄により除去し、結合した被分析物を使用して標識した合相手を吸着し、および結合した物質を次に残余のトレーサーから分離する。結合したトレーサー量は被験試料被分析物に直接的に比例する。「同時的」サンドウィッチ検定では、被験試料は標識した結合相手を添加する前には分離しない。抗ＣＨＦモノクローナル抗体を抗体の一つとして、およびポリクローナル抗ＣＨＦ抗体を他方として使用する逐次的サンドウィッチ検定はＣＨＦ活性について試験するために有用である。
以上は単なる例示的なＣＨＦおよび抗体の診断的検定法である。これらの被分析物の測定について現在または今後開発される他の方法は前記生物検定法を含めて本範囲内に包含する。
次の実施例は例示のために記載するものであって、限定のためではない。明細書中の引用文献は全て参考のために明示的に引用したものである。
実施例Ｉ
ＣＨＦの確認および試験管内活性
Ａ．発現クローニングした物質のための検定
肥大性について使用する検定法は、一般的には次の通りに記載される新生児ラット心臓肥大性の試験管内検定法である。：
１．筋細胞懸濁液の調製
筋細胞懸濁液の製造はＣｈｉｅｎなど、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７５巻：１７７０〜１７８０頁（１９８５年）およびＩｗａｋｉなど、前出に略記された方法に基づく。生後１〜２日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット仔心臓から得た心室を取り、三分割した。細断した心室を一連のコラゲナーゼ処理により消化した。得られた単一細胞懸濁液を非連続的Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上で精製して９５％純度の筋細胞懸濁液を得た。
２．筋細胞のプレーティングおよび培養
発表されている筋細胞のプレーティングと培養方法２種は次の通り：（１）Ｌｏｎｇなど（前出）は細胞懸濁液をＭＥＭ／５％ウシ血清中で３０分間、前プレーティングした。次に、付着しなかった筋細胞を、インスリン、トランスフェリン、ＢｒｄＵ、およびウシ血清アルブミン添加血清不含ＭＥＭ中、３５ｍｍ組織培養皿にｍＬ当り７．５×１０4細胞の密度でプレーティングした。（２）Ｉｗａｋｉなど（前出）はＤ−ＭＥＭ／１９９／５％ウマ血清／５％ウシ胎児血清中の細胞懸濁液を１０ｃｍ組織培養皿にｍＬ当り３×１０5細胞でプレーティングした。２４時間培養後、細胞を洗浄して血清不含Ｄ−ＭＥＭ／１９９中でインキュベーションした。
この発明では、小型検定での試験性能を増大するためにこれらの細胞をプレーティングし、培養するため異なるプロトコールを開発した。９６ウェル組織培養プレートをＤ−ＭＥＭ／Ｆ１２／４％ウシ胎児血清と３７℃で８時間プレコートする。この培地を去り、細胞懸濁液を内側のウェル６０個中にインスリン、トランスフェリン、およびアプロチニン添加Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２の１ｍＬ当り７．５×１０4細胞でプレーティングする。この培地は典型的にはペニシリン／ストレプトマイシンのような抗生物質およびグルタミンを含有させる。この培地はこれら細胞を血清不含のこの低プレーティング密度で生存させる。細胞を２４時間培養した後に、試験物質を直接ウェルに添加する。
３．肥大性の読取り
アルファアドレナリン作動剤またはエンドテリンで刺激後、培養物中の新生児ラットの心筋層細胞は生体内での欝血性心不全で見られる細胞サイズが増大することおよび個々の収縮蛋白質集合体が増加して組織化された収縮単位を形成することを含む心筋層細胞肥大性の特徴のいくつかを示す。Ｃｈｉｅｎなど、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、前出。これらの変化は逆位相顕微鏡で目視でき、肥大性の程度を任意尺度７から０で記録した。７は完全に肥大した細胞で、３は刺激されていない細胞である。この３および７の段階はＳｉｍｐｓｏｎなど、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ・Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１巻：７８７〜８０１頁（１９８２年）の図２、ＡおよびＢに各々見られる。９６ウェル培養物の顕微鏡読取を促進し、永続的記録を作成するために、筋細胞を固定し、適当な試験時間後にクリスタルバイオレットのメタノール溶液で染色した。クリスタルバイオレットは培養細胞の蛋白質染色に普通に使用される。
これに加えて９６ウェルプレートから適量を取り、ＡＮＦまたはＡＮＰの放出のような反応の蛋白質マーカー発現を監視した。
Ｂ．発現クローニング
ポリ（Ａ）+ＲＮＡを７日マウス肺様体から分離した（ＡｖｉｖとＬｅｄｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９巻：１４０８〜１４１２頁［１９７２年］；Ｃａｔｈａｌａなど、ＤＮＡ、２巻：３２９〜３３５頁［１９８３年］）。胚葉体は多能胚幹細胞（ＥＳ）の分化により形成される（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎなど、Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．、８７巻：２７〜４５頁［１９８５年］）。この胚幹細胞系列ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ・ＣＲＬ１９３４）をＬＩＦ（Ｗｉｌｌｉａｍｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３６巻：６８４〜６８７頁［１９８８年］）を含む培地中では非分化状態に維持する。この培地はＤ−ＭＥＭ（高グルコース）、１％グルタミン、０．１ｍＭ−２−メルカプトエタノール、ペニシリン−ストレプトマイシン、１５％熱不活化ウシ胎児血清および１５ｎｇ／ｍＬマウスＬＩＦを含有していた。これらの細胞をＬＩＦ不含で２０％熱不活化ウシ胎児血清を含有する同じ培地中の懸濁培養液中に入れると（０日）、それらは凝集し、胚様体と呼ばれる多細胞構造に分化した。培養８日目までに搏動する原基心臓様構造を構造の一部に形成する。分化しつつあるＥＳ細胞を血清不含培地（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、１％グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシン、０．０３％ウシ血清アルブミン添加）に変えて２４時間蓄積させることによってこの胚様体をＣＨＦ活性の産生について評価した。検定の前に調整した培地を３−Ｋ限外濾過膜（Ａｍｉｃｏｎ）で１０倍濃縮し、検定培地に対して透析した。３日目から開始して２４時間調整した培地は肥大性スコア４．５〜５．５を示し、６日目から開始すると５．５〜７．５を示した。
プラスミド発現ベクターｐＲＫ５Ｂ（Ｈｏｌｍｅｓなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３巻：１２７８〜１２８０頁［１９９１年］）のｃＤＮＡライブラリーをベクタープライミング手法（Ｓｔｒａｔｈｄｅｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３５６巻：７６３〜７６７頁［１９９２年］）に従って作製した。ベクターｐＲＫ５ＢをＮｏｔＩ部位でリネアライズし、アルカリホスファターゼで処理し、配列：
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ（配列番号５）
を持つ単鎖オリゴヌクレオチドｏｃｄｌ．１．３に連結した。連結生成物を次にＢｓｔＸＩで切断し、４７００ｂｐのベクター断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。ベクターはオリゴｄＡクロマトグラフィーでさらに精製した。
発現ライブラリーはポリ（Ａ）+ＲＮＡ１μｇ、ベクタープライマー５μｇ、およびＡｍｅｒｓｈａｍ社の試薬を使用して構築した。第一および第二鎖合成およびＴ４−ＤＮＡポリメラーゼ充填反応後、ゲル電気泳動によって５００ｂｐより大きい挿入について物質をサイジングし、リンカーを付加しない平滑末端連結法により環化した。連結物を使用して大腸菌ＤＨ５αを電気穿孔法により形質転換した。ポリ（Ａ）+ＲＮＡ１μｇから二重鎖ｃＤＮＡ４９９ｎｇを作成した。ｃＤＮＡ１７ｎｇを連結し、３．３んｇを形質転換して７８００００クローンを得たが、その８３％が平均サイズ１４７０ｂｐを持つ挿入物を持っていた。
７５〜１５０００クローンのプールからＤＮＡを分離し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ・ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ・ＢＲＬ社）によって、ヒト胎児腎臓２９３細胞に遺伝子移入した。ＤＮＡ２μｇを使用して６ウェル皿の〜２０００００細胞に遺伝子移入した。細胞を血清不含検定培地２ｍＬ中で４日間インキュベーションした。この培地は１００ｍＬのＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２、トランスフェリン１００μＬ（１０ｍｇ／ｍＬ）１００μＬ、インスリン（５ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ、アプロチニン（２ｍｇ／ｍＬ）５０μＬ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ＪＲＨ・Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ・Ｎｏ．５９６０２−７７Ｐ）１ｍＬ、およびＬ−グルタミン（２００ｍＭ）１ｍＬから構成されていた。遺伝子移入および発現の効率はアルカリホスファターゼの分泌型を発現するプラスミドのＤＮＡ０．２μｇを加えて観察した（Ｔａｔｅなど、ＦＡＳＥＢ・Ｊ．、４巻：２２７〜２３１頁［１９９０年］）。
各遺伝子移入プールからの調整培養培地１００μＬを最終容積２００μＬ中で肥大性について検定した。あるプールでは調整培地を検定前にＣｅｎｔｒｉｃｏｎ・３・ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ（商品名：Ａｍｉｃｏｎ社）で４〜５倍濃縮した。１００００〜１５０００クローンの１９プール、１０００〜５８００クローンの３５９プール、および７５〜７００クローンの７２３プールを遺伝子移入し、肥大性活性を検定した。これらの１１７２プールの中で２個が陽性であった。プール４３７（１８７クローンのプール）およびプール７８１（７００クローンのプール）はスコア４を与えた。プール４３７からの純粋クローン（ｐｃｈｆ．４３７．４８と命名）を徐々に減数する陽性プールのクローンを単一クローンが得られるまで反復する再遺伝子移入によって分離した。プール７８１からの純粋クローン（ｐｃｈｆ．７８１と命名）はクローンｐｃｈｆ．４３７．４８からの挿入物へのコロニーハイブリッド形成法によって分離した。
クローンｐｃｈｆ．７８１の挿入物の配列は図１（配列番号１、２、および３：それぞれヌクレオチド鎖２個およびアミノ酸配列）に示す。クローンｐｃｈｆ．４３７．４８の挿入物の配列は塩基２７（下線部分）から開始するクローン７８１に一致する。
クローンｐｃｈｆ．７８１の第一読み取り枠（図１の翻訳参照）はアミノ酸（ＭＷ＝２１．５ｋＤａと翻訳される）２０３個の蛋白質をコードする。この蛋白質はシステイン残基１個およびＮ−結合グリコシル化可能部位１個を営むが、親水性Ｎ−末端分泌シグナル配列はない。クローンｐｃｈｆ．７８１の３’−非翻訳領域はｂ１（ｂｐ〜８９５〜１０１５）と称される通常のマウス反復配列を包含する。７日目の胚様体ポリ（Ａ）+ＲＮＡとのクローンｐｃｈｆ．７８１からのプローブとのハイブリッド形成は〜１．４ｋｂの単一バンドを示し、これはｃＤＮＡクローンからの挿入物のサイズが大体同じである。
コードされた配列はＤａｙｈｏｆｆデータベース中の既知蛋白質配列のいずれとも高度（＞３５％アミノ酸同一性）な類似はない。しかしながら、これは、ＣＮＴＦ、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−１１（ＩＬ−１１）、ＬＩＦおよびオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）（Ｂａｚａｎ、Ｎｅｕｒｏｎ、７巻：１９７〜２０８頁［１９９１年］）を含む遠い関連性のある蛋白質のファミリーに対して程度の低い類似性を示す。マウスＣＨＦはマウスＬＩＦにアミノ酸同一性２４％を持ち（ＲｏｓｅとＴｏｄａｒｏ、ＷＯ９３／０５１６９）、ヒトＣＮＴＦにアミノ酸同一性２１％（ＭｃＤｏｎａｌｄなど、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９０巻：７０〜８０頁［１９９１年］）を持つ。マウスＣＨＦとヒトＣＮＴＦとの配列比較については図２参照。ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、およびＯＳＭはＧＨ／サイトカイン受容体ファミリーに属するｇｐ１３０を含む関連受容体シグナル蛋白質を使用する（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏなど、Ｃｅｌｌ、７６巻：２５３〜２６２頁［１９９４年］）。ＣＨＦと同様にＣＮＴＦはＮ−末端分泌シグナル配列を持たない。
Ｃ．クローンの性質および活性
クローンｐｃｈｆ．７８１がＣＨＦをコードすることを証明するために、２９３細胞の遺伝子移入と試験管内ＳＰ６転写／翻訳結合系の使用との双方によって発現研究を行った。ｐｃｈｆ．７８１−遺伝子移入２９３細胞によって産生した蛋白質の32Ｓ−メチオニンおよびシステイン標識（ベクター遺伝子移入細胞と比較）は調整培地は約２１．８ｋＤａの標識蛋白質を含み、細胞抽出物は２２．５ｋＤａの蛋白質を示した。これら遺伝子移入からの調整培地は１：４の希釈率で前記検定法を使用する心臓肥大性についてスコア６を示した。非標識遺伝子移入からの調整培地は１：１希釈率で形態学的スコア５．５〜６．５を示した。
これら検定は心臓肥大性−ＡＮＰ放出の第二測定も陽性であった。図３参照。この検定は125Ｉ−ラットＡＮＰのラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ融合蛋白質への結合についての競合の測定によって行った。この方法はＣＤ４−ＩｇＧ融合蛋白質を使用するｇｐ１２０の測定（Ｃｈａｍｏｗなど、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９巻：９８８５〜９８９１頁［１９９０年］）と類似している。略述すれば、マイクロタイタープレートの各ウェルをラット抗ヒトＩｇＧ抗体（２μｇ／ｍＬ）１００μＬで一夜４℃で被覆した。０．５％ウシ血清アルブミン添加燐酸塩緩衝食塩水で洗浄後、ウェルを３ｎｇ／ｍＬラットＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ１００μＬ（ヒトＡＮＰ受容体Ａ−ＩｇＧ（Ｂｅｎｎｅｔｔなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２３０６０〜２３０６７頁［１９９１年］）と同様な方法で製造し、精製したもの）と２４℃で１時間インキュベーションした。ウェルを洗浄し、ラットＡＮＰ標準品または試料５０μＬとともに２４℃で１時間インキュベーションした。次に125Ｉ−ラットＡＮＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）５０μＬを添加してさらに１時間インキュベーションした。ウェルを洗浄し、計数して結合競合の程度を測定した。試料中のＡＮＰ濃度をラットＡＮＰ標準曲数と比較して決定した。
クローンｐｃｈｆ．７８１のＳＰ６−結合試験管内転写／翻訳（Ｐｒｏｍｅｇａ社からの物質）で行った蛋白質の35Ｓ−メチオニン標識は２２．４ｋＤａの標識蛋白質を示した。この標識翻訳生成物は１：２００の希釈率で心臓肥大性検定で陽性（形態学的スコア５〜６）であった。この２２．４ｋＤａ標識バンドが肥大性活性の原因であることを証明するために、標識翻訳生成物を逆相Ｃ４カラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ・ＲＯ−４−４０００）を１０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ中で平衡させ、アセトニトリル勾配で溶離した。標識蛋白質のピークと肥大性活性のピークとはこのカラムから〜５５％アセトニトリルで同時的に溶離した。
心臓筋細胞肥大性活性は既にラット心線維芽細胞から部分的に精製されて報告されている。Ｌｏｎｇなど、前出。さらに本明細書のＣＨＦの性質を研究するため、ラット心線維芽細胞を培養した。初代培養からの調整培地は本発明の試験管内新生児ラット心臓肥大性検定で心臓肥大性活性を持つ。クローンｐｃｈｆ．７８１のコード領域断片でプローブ（ハイブリッド形成は５〜ＳＳＣ、２０％ホルムアミド、４２℃で最終洗浄は０．２×ＳＳＣ、５０℃）した時、これら培養物から分離したラット線維芽細胞ｍＲＮＡのブロットハイブリッド形成では１．４ｋｂに明瞭なバンドを示した。
Ｄ．因子の精製
クローンｐｃｈｆ．７８１またはヒトのクローンで遺伝子移入した細胞によって調整した培養培地を１．５Ｍ−ＮａＣｌに調節し、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商品名）Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍカラムに入れる。このカラムを１０ｍＭ−ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ−ＮａＣｌで洗浄し、１０ｍＭ−ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ−Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商品名）３−１０で活性を溶離する。活性のピークを１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ８．０に調節し、ＭＯＮＯ−Ｑ・Ｆａｓｔ・Ｆｌｏｗカラムに入れる。このカラムを１０ｍＭ−ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、０．１％オクチルグルコシドで洗浄すると、活性は流過画分に見出される。次に活性物質を０．１％ＴＦＡ、１０％アセトニトリル中の逆相Ｃ４カラムに入れ、０．１％ＴＦＡから８０％までの勾配で溶離する。活性はゲル濾過カラム上で約１５〜３０ｋＤａに分画される。分別と回収のためにはグアニジン−ＨＣｌのようなカオトロープ剤が必要であると予期される。
実施例ＩＩ
生体内肥大活性試験
Ａ．正常ラット
実施例Ｉの精製ＣＨＦがたとえば血圧、心拍数、全身血管抵抗、収縮性、心拍力、集中または遅延肥大、左心室収縮期圧、左心室平均圧、左心室拡張終期圧、心拍出量、拍動係数、組織学的パラメーター、心室サイズ、壁圧、その他のような循環器パラメーターに及ぼす効果を正常ラットで観察するために試験する。
Ｂ．圧過負荷マウスモデル
精製ＣＨＦを肺動脈を狭窄して右心室不全を起こした圧過負荷マウスモデルでも試験する。
Ｃ．ＲＶネズミ機能不全モデル
心室機能不全のレトロウイルスマウスモデルを精製ＣＨＦを試験するために使用でき、ｄＰ／ｄｔ、駆出率および容量を前記肥大性検定法で検定できる。このモデルでは、マウスの肺動脈を狭窄して肺肥大および肺不全を作成する。
Ｄ．トランスジェニックマウスモデル
筋肉アクチンプロモーター−ＩＧＦ−Ｉ融合遺伝子を持つトランスジェニックマウスは筋障害または心不全の兆候なしに心筋および骨格筋の肥大を示す。さらに、ＩＧＦ−Ｉ遺伝子標的マウスは心室筋肉収縮蛋白質遺伝子の顕著な発現低下を含む心臓（ならびに骨格）筋肉発生欠陥を示す。これらモデル２種で精製ＣＨＦを試験する。
この他に壊死を伴わない拡張心筋障害および心機能障害の遺伝子起因モデルをトランスジェニックおよび遺伝子標的マウス（ＭＬＣ−ｒａｓマウス；異型接合ＩＧＦ−Ｉ−欠損マウスの大動脈バンディング）で開発できる。
Ｅ．ラットの心筋梗塞後モデル
ナトリウム利尿ペプチド産生においてヒト欝血性心不全の予報であるラットの心筋梗塞後モデルで精製ＣＨＦを試験する。特定的には雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ・Ｒｉｖｅｒ・Ｂｒｅｅｄｉｎｇ・Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、８週齢）を術前少なくとも１週間装置に順化する。ラットは粒状のラット餌および水を自由摂取させ、明るい温度制御室内で飼育する。
１．冠状動脈結紮
心筋梗塞をＧｒｅｅｎｅｎなど、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９１巻：９２〜９６頁（１９８７年）およびＢｕｔｔｒｉｃｋなど、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６０巻：１１４７３〜１１４７９頁（１９９１年）に記載のようにして左冠状動脈の結紮により発生させる。ラットをペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、気管切開で挿管し、人工呼吸器（Ｈａｒｖａｒｄ・Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、モデル６８３）で通気する。左側開胸後、左冠状動脈の根元から約２ｍｍのところを７−０絹縫合糸で結紮する。シャム動物に縫合糸を冠状動脈の下を通過させ、次に除去する以外は同じ操作を行う。ラットは全て米国心臓協会によって１９８４年１１月１１日に採用された「研究用動物の使用に関する米国心臓協会の立場」に準拠して取扱う。結紮の４から６週後、ラットの心筋梗塞は心不全まで進行する。
臨床的患者では、心筋梗塞または冠状動脈疾患は心不全の最も普通の原因である。このモデルにおける欝血性心不全はヒトの患者多数における欝血性心不全に合理的に類似している。
２．心電図
術後１週間目に、梗塞の進行を記録するために軽度のメトファン麻酔下に心電図を取る。この研究の結紮ラットを前胸部導線を通る病的Ｑ波の深さと持続に従ってサブグループに群分けする。Ｂｕｔｔｒｉｃｋなど、前出；Ｋｌｏｎｅｒなど、Ａｍ．Ｈｅａｒｔ・Ｊ．、５１巻：１００９〜１０１３頁（１９８３年）。これで梗塞寸法の大体の推測値を与え、大小の梗塞の分布がＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤および基剤で処置した結紮ラットの間で相違しないことを保証する。精密な梗塞サイズ測定で確認する。
３．ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の投与
術後４週間目に、ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤（１０μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、１５日間）または食塩水基剤を結紮ラットおよびシャム対照に皮下注射する。処置の間、１週２回体重を測定する。ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤は基剤としての食塩水または水に溶かして投与する。
４．カテーテル装着
ＣＨＦ、ＣＨＦ拮抗剤、または基剤で１３日間処置後、ラットをペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔する。カテーテル（ＰＥ５０と結合したＰＥ１０）にヘパリン−食塩水溶液（５０／Ｕ／ｍＬ）を満たし、右大腿動脈を通して動脈圧および心拍数を測定するために腹部大動脈に入れる。第２のカテーテル（ＰＥ５０）を右頚静脈を通して右心房圧の測定および食塩水注入のために右心房に挿入する。左心室圧および収縮性（ｄＰ／ｄｔ）測定のために、第３カテーテル（ＰＥ５０）を右頚動脈を通して左心室に挿入する。温度希釈法による心排出量測定のために、サーミスターカテーテル（Ｌｙｏｎｓ・Ｍｅｄｉｃａｌ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｌｍａｒ、ＣＡ）を大動脈弓に挿入する。全カテーテルを頚の後ろで皮下を通るステンレス鋼線でまとめて、次に固定する。カテーテル挿入に続いて、ラット全部を個室に入れる。
５．血行力学的測定
カテーテル装着１日後、サーミスターカテーテルをマイクロコンピューター系（Ｌｙｏｎｓ・Ｍｅｄｉａｌ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）で操作して心排出量を測定し、他のカテーテル３個をＧｒａｓｓ・Ｍｏｄｅｌ・７ポリグラフ（Ｇｒａｓｓ・Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、クインシー、ＭＡ）を装着したＣＰ−１０型圧力伝達器（Ｃｅｎｔｕｒｙ・Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、クインシー、ＭＡ）に連結する。平均動脈圧（ＭＡＰ）、心収縮器圧（ＳＡＰ）、心拍数（ＨＲ）、右心房圧（ＲＡＰ）、左心室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、左心室平均圧（ＬＶＭＰ）、左心室拡張後期圧（ＬＶＥＰ）、および左心室最高（ｄＰ／ｄｔ）を意識下の非拘束ラットで測定する。
心排出量の測定には室温で等張食塩水０．１ｍＬを頚静脈カテーテルを通して一時に注入する。温度希釈曲線をＶＲ−１６ｓｉｍｕｌｔｒａｃｅ記録器（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ社、ＮＹ）で監視、心排出量（ＣＯ）計数値をマイクロコンピューターによって得る。拍動容積（ＳＶ）＝ＣＯ／ＨＲ；心指数（ＣＩ）＝ＣＯ／ＢＷ；全身血管抵抗（ＳＶＲ）＝ＭＡＰ／ＣＩ。
これらの血行力学的パラメーターの測定後、血液１ｍＬを動脈カテーテルを通して採取する。血清を分離し、−７０℃で貯蔵してＣＨＦ濃度および所望ならば種々の生化学的パラメーターを測定する。
この実験の最後にラットをペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、ＫＣｌ（１Ｍ）の心房内注射により心臓を拡張期で停止させる。心臓を取出し、心室から心房と大管を切取る。心室を重量測定して１０％緩衝ホルマリン中に固定する。
実験操作は全部研究開始前にＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社の実験動物管理および使用委員会の承認を受ける。
６．梗塞寸法の測定
右心室の壁を左心室から切離す。左心室を頂部から底部に向けて４つに分断する。５μｍ切片を取り、Ｍａｓｓｏｎのトリクローム染剤で染色して装着する。梗塞および非梗塞左心室の心内膜および心外膜の周縁をＤｉｇｉｔａｌ・Ｉｍａｇｅ・Ａｎａｌｙｚｅｒのプラニメーターで測定する。スライス全４個の梗塞した周縁および左心室周縁を心外膜および心内膜表面各々別々に集計し、合計値を各表面について梗塞した周縁の左心室周縁に対する比率として表示する。
これら比率２個を平均して梗塞サイズ百分率として表示する。
７．統計的分析
結果は平均値±標準誤差として表現する。変動の二元および一元分析（ＡＮＯＶＡ）を行って群間でのパラメーターにおける相違を評価する。次に差の有意性をＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法を使用してｐｏｓｔ・ｈｏｃ分析する。
ｐ＜０．０５を有意とする。
８．結果
ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤または基剤で処置する前および後の平均体重は実験群の間で相違するとは期待されない。結紮ラットの梗塞寸法は基剤処置群とＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤処置群との間で異なるとは期待されない。
結紮ラットに対するＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の前記用量における投与は基剤処置シャム対照と結紮ラット対照とで観察されるものよりも心室収縮の増大と末梢血管抵抗の低下によって心臓肥大を改善すると期待される。この期待される結果はＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の投与は欝血性心不全での心機能を改善することを証明する。しかしながら、シャムラットではＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤投与はおそらく動脈圧および末梢血管抵抗をわずかに低下させる以外はこの用量では心機能を有意に変化させるとは期待されない。
本明細書のラットのデータはウマ、ウシ、ヒト、その他の哺乳類に認められた獣医学的および臨床的手法に従って哺乳類の体重について補正すれば外挿しうるものと期待するのは合理的である。標準的実験計画および手法を使用して、獣医または臨床医は処置すべき哺乳類に最高の効果を達成するためにＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の用量、投与の計画および形態を調節することができる。ヒトもこの方式で反応するものと信じられる。
実施例ＩＩＩ
拡張心筋症の臨床処置案
Ａ．処置方針
ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤初期用量１０〜１５０μｇ／ｋｇ／日の患者自己投与を提案する。副作用があれば用量を削減する。再評価時に有益な結果がなくて限定する副作用がなければ、用量を増加する。同時的投薬（たとえばＡＣＥ阻害剤としてのカプトプリルおよび利尿剤）は研究医師の裁量により調節する。最大用量を８週間投与後、ＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤の投与を停止し、類似の無処理期間後（またはプラセボ）に再評価を行う。
Ｂ．編入判断基準
もし次の判断基準に適合すれば患者を考慮の対照とする：
−拡張心筋症（ＤＣＭ）。コントラスト心室造影術または２Ｄ超音波心臓検査術で左心室（ＬＶ）の無動症／運動障害の孤立領域を含まない突発性ＤＣＭ、または虚血性ＤＣＭ。ＬＶ拡張終期ディメンジョン（ＥＤＤ）＞３．２ｃｍ／ｍ2ＢＳＡまたは２Ｄ超音波心臓検査法でＥＤＶ＞８２ｍＬ／ｍ2、超音波心臓検査法でＬＶの部分的短縮＜２８％、または排出率（コントラスト心室造影または放射核種血管造影）＜０．４９を含む収縮期機能障害の証拠。
−兆候。ジゴキシン、利尿剤および血管拡張剤（ＡＣＥ阻害剤）に少なくとも１ケ月安定なニューヨーク心臓協会のＩＩＩ級または最高運動ＶＯ2１６ｍＬ／ｋｇ／分（年齢で調整）。
−現在ＡＣＥ阻害剤治療中。
−左心室容積と重量を推測できる適当な超音波心臓検査の「ウインドウ」。
−投与計画に従ってＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤を自己投与し、信頼性をもって追跡評価のために戻ってくる能力。
−患者およびその初診医師の参加への同意。
−除外判断基準適合の不在。
Ｃ．除外判断基準
次のいずれかの理由があれば患者を考慮の対照から除外する。
−心臓弁疾患に由来する拡張心筋症（手術可否にかかわらない）、特定の処置可能病因（脱離が試みられていないアルコールを含む）、または手術可能な冠状動脈疾患。
−特定の腰痛または閉塞性末梢性血管症による運動制限。
−慢性閉塞性肺疾患。
−糖尿病またはグルコース許容性の障害。
−手根トンネル症候群の症歴、または検査でのティネル徴候陽性の証拠。
−腎臓結石の病歴。
−変形性関節症の徴候。
−侵襲性の血行力学的監視を伴う一連の自転車エルゴメトリー（下記のような）への同意または参加の不能。
−活性な悪性腫瘍。
Ｄ．患者評価
１）主な評価点；ベースライン；ピーク後安定なＣＨＦまたはＣＨＦ拮抗剤用量を８週間継続；投与停止後のアフターイコール期。
−患者は実際の処理開始後２日から３日入院させ、毎日体重および電解質、燐、ＢＵＮ、クレアチニン、およびグルコースを含む試験データを採集することになる。これに続いて臨床検査センターの階でさらに２日か３日毎日観察を受ける。
ｉ．体力測定。
ｉｉ．徴候評価点数（Ｋｅｌｌｙなど、Ａｍｅｒ．Ｈｅａｒｔ・Ｊ．、１１９巻：１１１１頁［１９９０年］）。
ｉｉｉ．臨床検査項目：ＣＢＣ；電解質（Ｍｇ+2およびＣａ+2を含む）；ＢＵＮ：クレアチニン；燐；空腹時グルコースおよび脂質特性（全コレステロール、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、トリグリセリド）；肝機能検査（ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリフォスファターゼ、全ビリルビン）；全蛋白質；アルブミン；尿酸；およびＣＨＦ。
ｉｖ．２Ｄ、Ｍ−モード、およびドップラー超音波心臓検査：乳頭筋の水準における拡張期および収縮期のディメンジョン；先端２室および４室視点からの面積測定で評価した拍出率測定値、Ｓｉｍｐｓｏｎ則の方法による収縮期および拡張期推測容積、および推測上の左心室量；僧帽弁流入特性（ＩＶＲＴ、ピークＥ、ピークＡ、徐脈時間、Ａ波時間）、および肺静脈流動プロファイル（収縮期流動面積、拡張期流動面積、逆時間、および速度）のドップラー評価；を含む。
ｖ．休息および運動時血行力学および経皮挿入した肺動脈および動脈カテーテルでの自転車エルゴメトリーを使用する酸素消費測定。感知した運動水準をＢｏｒｇスケールで記録し、肺動脈の収縮期、拡張期および平均圧ならびに動脈圧および肺毛細管ウエッジ圧を運動負荷の段階毎に、動脈および混合静脈酸素含有量とともに測定して心排出量を算出する。
ｖｉ．脂肪および脂肪のない身体量ならびに骨格筋強度と持久力の評価。
２）中間評価点：毎週
ｉ．体力測定。
ｉｉ．徴候点のスコア。
ｉｉｉ．臨床検査データ：電解質、ＢＵＮ、クレアチニン、燐、空腹時グルコース、ソマトメジン−Ｃ、およびＣＨＦ。
Ｅ．可能性のある利点
１）満足状態感覚の改善。
２）運動許容の増加。
３）筋力および脂肪のない身体量の増加。
４）全身血管抵抗の減少。
５）心臓性能の強化。
６）相補的心筋肥大の強化。
実施例ＩＶ
試験管内神経栄養活性の試験
毛様体神経節神経栄養活性用の検定をＬｅｕｎｇ、Ｎｅｕｒｏｎ、８巻、１０４５〜１０５３頁（１９９２年）にしたがって実行した。略述すれば、Ｅ７−Ｅ８ニワトリ胚から毛様体神経節を切離し、トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ・１５４００−０１３）で分離し、燐酸緩衝食塩水中で３７℃で１５分間１０倍に希釈した。神経節をトリプシン不含になるまで生育培地（１０％ウシ胎児血清、１．５ｍＭ−グルタミン、ペニシリン１００μｇ／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ添加高グルコースＤ−ＭＥＭ）で３回洗浄し、次に生育培地１ｍＬ中で緩やかにかきまぜて単一細胞懸濁液とした。生育培地５ｍＬ中のこの細胞混合物を１００ｍｍ組織培養皿上にプレーティングし、３７℃で４時間組織培養インキュベーターに置いてニューロンを濃縮した。この間に非ニューロン細胞は優先的に皿に付着し、インキュベーション終期にはニューロンは緩やかに洗浄される。
濃縮されたニューロンを次に予めコラーゲンで被覆した９６ウェルプレートにプレーティングした。各ウェルに細胞１０００から２０００個を入れ、実施例Ｉのｐｃｈｆ．７８１−遺伝子移入２９３細胞からの調整培地で希釈して最終容積１００から２５０μＬとした。細胞を対照としての遺伝子移入２９３調整培地とともに、および比較としてのＣＮＴＦ標準とともに入れた。３７℃で２〜４日間のインキュベーション後に、生体色素メタロチオネイン（ＭＴＴ）を使用して生存細胞を染色して生存細胞数を評価した。ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ・Ｍ２１２８）５ｍｇ／ｍＬの５分の１容をウェルに添加した。３７℃で２〜４時間インキュベーション後に、生存細胞（濃紫色沈降物で満ちている）を１００×の位相差顕微鏡で計数した。
この検定結果を図４に示す。ｐｃｈｆ．７８１遺伝子移入（三角）は遺伝子移入２９３調整培地の検定容積の逆数の増加と共にニューロンの生存（細胞数で測定）を増加することを認識できる。これはＣＮＴＦ標準（円）のパターンと類似し、調整培地の検定容積の関数としては生存数の増加を示さない対照遺伝子移入（四角）とは対照的である。これはＣＨＦはＣＮＴＦで観察されるものと同様な効果を持ち、神経栄養剤として有用であることを示す。
実施例Ｖ
ヒトＣＨＦ（ヒトのカルジオトロフィン−１［ＣＴ−１］とも呼ばれる）をコードするｍＲＮＡの源泉をマウスＣＨＦ・ｃＤＮＡクローンからのプローブで成人組織数種からポリ（Ａ）＋ＲＮＡを検索して確認した。心臓、骨格筋、結腸、卵巣、および前立腺は２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、４２℃で１８０ｂｐのマウスＣＨＦプローブ（１９ｂｐ５’の開始ＡＴＧからアミノ酸５０まで）でブロットハイブリッド形成させ、０．２５×ＳＳＣ、５２℃で最終洗浄すると１．８ｋｂバンドを示した。同じプローブおよび条件（最終洗浄５５℃）でヒト心臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を検索することによってヒトのＣＴ−１をコードするクローンを分離した。
クローン１１個を１００万個から選択した。このクローン数種のＥｃｏＲＩ挿入物をプラスミドベクターにサブクローニングし、そのＤＮＡ配列を決定した。
クローンｈ５からのＤＮＡ配列（配列番号６および配列番号７：センスおよびアンチセンス鎖）を図５に示すが、これはコード領域全部を包含する。クローンｈ５（ｐＢＳＳＫ＋．ｈｕ．ＣＴ１．ｈ５）は１９９４年７月２６日にＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＡＴＣＣ第７５８４１として寄託された。ｈ６と命名された他のクローンのＤＮＡ配列はクローンｈ５のものと重複領域内では一致した。クローンｈ６はクローンｈ５の塩基４７から始まり、さらにクローンｈ５の３’に５２１塩基まで伸長する。図６から明らかなように、ヒトＣＴ−１（配列番号８）のコードする蛋白質に配列はマウスＣＨＦ配列（配列番号３）に７９％同一であって、前者を「ｈｕｍｃｔ１」、後者を「ｃｈｆ．７８１」と命名する。
クローンｈ５がコードするヒトＣＴ−１が、生物学的に活性であることを証明するために、ＥｃｏＲＩ断片を哺乳類発現ベクターｐＲＫ５（欧州特許３０７２４７）の独特なＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＲＫ５．ｈｕ．ＣＴ１を得た。このプラスミドをヒト２９３細胞に遺伝子移入し、細胞を血清不含培地に３〜４日間維持した。この培地を次に心臓筋細胞肥大性に対してマウスＣＨＦについて前記したようにして検定した。遺伝子移入した２９３調整培地はこの検定で明らかに活性であった（１：２０希釈で肥大性スコア５．５）。
材料の寄託
次のプラスミドをＡｍｅｒｉｃａｎ・Ｔｙｐｅ・Ｃｕｌｔｕｒｅ・Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１・Ｐａｒｋｌａｗｎ・Ｄｒｉｖｅ・ロックビル、ＭＤ、米国（ＡＴＣＣ）に寄託した。
0003906314.tif 000006
この寄託は特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定およびその下にある諸規則（ブダペスト条約）に従って行われた。これは寄託物の増殖可能培養物の維持を寄託日から３０年間保証する。この寄託物は関連する米国特許の発行または米国または外国特許の公開のいずれか早い方が行われた後には、ＡＴＣＣはブダペスト条約の規定およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社とＡＴＣＣとの契約の下に寄託物培養物の子孫について公共に対する永続的な無限定な入手可能性を保証し、米国特許法１２２条および特許商標庁長官の規則（米国特許庁公報８８６巻６３８項を参照する３７ＣＦＲ１．１４条を含む）に従って米国特許商標庁長官が決定する者に対する寄託物の子孫の入手可能性を保証する。
本出願の譲受者はもし寄託したプラスミドの培養物が適当な条件下に培養した時に死滅するか、紛失するか破壊されたら、通告があればプラスミドを同じプラスミドの別物と迅速に交換することに合意している。寄託プラスミドの入手可能性を各政府がその特許法による権限で与える権利を侵害する本発明の実施を承諾するものと理解してはならない。
前記明細書は当業者に本発明を実施させるに十分であると考えるものである。寄託した態様は本発明のある側面の単なる一例示であり、機能的に均等な構築物はいずれもこの発明の範囲内にあることが意図されているので、本発明は寄託された構築物による範囲に限定されるものではない。本材料を寄託したことは本明細書記載がその最適態様を含む本発明のいずれかの側面を実施するために不適当であるとの告白を構成するものではなく、またそれが提示する特定の例示に請求項の範囲を限定すると理解してはならない。実際、本開示および記載に加えて当業者にとって本発明の種々の修飾は前記記載から明白であり、本発明の種々の修飾は添付する請求項の範囲内に入るものである。
配  列  表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人：
（Ａ）ジェネンテク・インコーポレイテッド
（ii）発明の名称：カルジオトロフィンおよびその使用
（iii）配列の数：８
（iv）連絡先：
（Ａ）宛名：ジェネンテク・インコーポレイテッド
（Ｂ）通り：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバード４６０番
（Ｃ）市：サウス・サン・フランシスコ
（Ｄ）州：カリフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）ＺＩＰ：９４０８０
（ｖ）コンピューター解読書式：
（Ａ）媒体型：５．２５インチ，３６０Ｋbフロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ適合
（Ｃ）オペレーティング・システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：patin(ジェネンテク)
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（vii）優先権主張出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／２３３６０９
（Ｂ）出願日：１９９４年４月２５日
（viii）弁理士／代理人情報
（Ａ）氏名：ハサク，ジャネット・イー
（Ｂ）登録番号：２８，６１６
（Ｃ）参照／整理番号：８９４Ｐ１ＰＣＴ
（ix）電話連絡先情報：
（Ａ）電話番号：４１５／２２５−１８９６
（Ｂ）ファックス番号：４１５／９５２−９８８１
（Ｃ）テレックス：９１０／３７１−７１６８
（２）配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３５２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号１：
0003906314.tif 000007
（２）配列番号２の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１３５２塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号２：
0003906314.tif 000008
（２）配列番号３の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０３アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号３：
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（２）配列番号４の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２００アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号４：
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0003906314.tif 000012
（２）配列番号５の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：５０塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号５：
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（２）配列番号６の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号６：
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（２）配列番号７の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１０１８塩基対
（Ｂ）型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号７：
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（２）配列番号８の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：２０１アミノ酸
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（xi）配列：配列番号８：
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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