(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４（CTLA-4）に対するモノクローナル抗体により認識され、かつ配列番号４または配列番号８に示されたアミノ酸配列を含むペプチドからなることを特徴とする、Ｔ細胞増殖刺激活性を有する免疫制御分子。
【請求項２】
当該ペプチドが配列表の配列番号４に示されたアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の免疫制御分子。
【請求項３】
当該ペプチドが配列表の配列番号８に示されたアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項１に記載の免疫制御分子。
【請求項４】
当該ペプチドがキャリヤーに固定または蛋白質に組み込まれることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の免疫制御分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｔ細胞活性化に関与した第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子間の相互作用を制御する免疫制御分子及びその製造方法に関するものであり、当該分子を利用して免疫系を制御することができる。さらに詳細には、本発明は、補助刺激シグナルの伝達に関与した分子間の結合を阻止し、かつ当該分子の立体構造を認識するモノクロナール抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーより得られる、目的蛋白分子の三次構造を模倣したペプチド配列をもつ免疫制御分子及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
免疫反応はＴ細胞の活性化から始まる。生体内に入り込んだ抗原はマクロファージやB細胞のような抗原提示細胞（以下、ＡＰＣと称することもある）に取り込まれる。次に、抗原断片を取り込んだ抗原提示細胞は細胞膜面上に主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）のクラスＩもしくはクラスIIと抗原（Ａｇ）との複合体を提示する。そしてこのMHC/Ag複合体は、Ｔ細胞上のＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）／CD3複合体により認識され第一シグナルをＴ細胞内に送る。第二シグナルは補助刺激シグナル（costimulatory signal）とも呼ばれ、Ｔ細胞、ＡＰＣ双方の細胞膜上に発現する接着分子間の相互作用によりＴ細胞内に送られる。Ｔ細胞の活性化には第一と第二の両方のシグナルが必要であり、第二シグナルである補助刺激シグナルを阻害するとＴリンパ球が不活性化され、免疫学的不応答（アナジー）に陥ることが分かっている。この補助刺激シグナルは、ＡＰＣ上に発現するCD80（別名B7-1、B7/BB1）及びCD86（別名B7-2、B70）、そのカウンターレセプターであるＴ細胞上に発現するCD28及び細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原（CTLA-4）の相互作用により主に伝達されると考えられている（Lenschow, D. J., et al., Annu. Rev. Immunol. 14, 233-258, 1996）。
【０００３】
CD28分子はＴ細胞上に発現される糖蛋白分子であり、ＴＣＲからの刺激によるＴ細胞の増殖及びさまざまなサイトカイン産生を増強する補助刺激レセプターとして機能していることが明らかにされている。CTLA-4分子はCD28と構造的、機能的に非常に類似している分子として知られている。CTLA-4ノックアウトマウスでは、脾臓やリンパ節のＴ細胞が増え、心筋、甲状腺、膵臓などの多くの臓器にＴ細胞浸潤が起こり、自己免疫病により死亡することより、CTLA-4がＴ細胞応答のネガティブレギュレーターであることが示唆されている。CD28、CTLA-4のリガンドとして、1990年にLinsleyら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5031-5035(1990)）によりCD80分子が、続いて1993年にAzumaら（Nature, 366, 76-79）によりCD86分子が同定された。CD80は膜貫通型糖タンパク質で細胞内領域は短く、シグナル伝達部を有しており、Ｉgスーパーファミリーに分類されている。CD86はCD80同様、Ｉgスーパーファミリーに分類される膜貫通型タンパク質であるが、CD80と異なり、細胞内領域に3つの潜在的なプロテインキナーゼＣ依存性のリン酸化領域を持つことから、シグナル伝達機能を有することが示唆されている。CD80、CD86ともＴ細胞の増殖、細胞障害活性、胸腺内におけるＴ細胞分化に関与している。CD28分子あるいはCTLA-4分子はCD80分子あるいはCD86分子にそれぞれ結合できる能力を有しており、これらの分子の発現時期や相互作用によって、Ｔ細胞の活性化または抑制、ひいては免疫系全体が影響を受けると考えられている。
【０００４】
このようにCD28分子、CTLA-4分子、CD80分子及びCD86分子はＴ細胞の抗原応答やＢ細胞の相互作用など様々な免疫機能発現に極めて重要な役割を果たしており、MHC/Ag複合体とTCR/CD3複合体による第一のシグナルに続く補助刺激シグナルの主たる部分を担っている。従って、この補助刺激シグナルを制御することによって免疫系全体を制御することができると思われる。このような試みとしてCD28分子やCTLA-4分子に対する抗体を用いる試みがあり、抗CD3抗体で予め刺激しているＴ細胞に抗CD28抗体の存在下で抗CTLA-4抗体あるいは抗B7抗体を作用させることにより抗CD28抗体のＴ細胞活性化効果をさらに３倍弱増強している（Matthew F., et al., J. Exp. Med. 182, 459-465, 1995）。
【０００５】
生体内の情報伝達は、補助刺激シグナルの例で述べたように、細胞表面上に発現しているレセプター分子と、これに対応するリガンド分子との結合により送られるシグナルによって行われる。レセプターとリガンドはお互いに相補的な関係にあり、２つの分子の結合はお互い形の合う者同士でおこる。しかし、リガンド分子において結合に最も重要な部位は限られており、その相互作用部位の構造を明らかにすることでレセプターとリガンドの結合をブロックしたり促進したりすることができる。従来、あるレセプター−リガンド系でどちらか一方の相互作用部位を明らかにしようとする場合、そのタンパク質の全アミノ酸配列にわたって適当な長さのペプチドを合成し、その結合活性もしくは結合阻害活性により相互作用部位を明らかにするペプチドスキャンニング方法がとられていた。あるいは、部位特異的突然変異誘発法（site-directed mutagenesis）による結合部位への関与を１つ1つのアミノ酸置換により調べる方法か、フォトアフィニティー法によりタンパク質同士の結合アミノ酸を特定化する方法が使われてきた。最近では、ファージランダムペプチドライブラリーを用いたスクリーニング法が行われるようになってきた。これはScottら（Science, 249, 386-390, 1990）によって開発された方法で、ファージの構成タンパク質であるpIIIタンパクをコードする遺伝子（geneIII）にランダムなペプチド分子をコードする遺伝子を挿入することにより、ランダムなペプチド分子を含んだ形のpIIIタンパクをfd-tetファージ（繊維状一本鎖DNAのファージ）上に発現させ、ファージランダムペプチドライブラリーを作り、パンニングなどで結合ファージをスクリーニングし、そのpIII遺伝子のシークエンスを行って、相互作用部位を決定する方法である。この方法を用いると、数億種類にも及ぶペプチドの集合体を化学反応で合成するよりも容易に得られ、さらに必要に応じてその増幅が可能である。
【０００６】
ファージランダムペプチドライブラリーを利用して、ターゲット分子上の相互作用部位を同定することが試みられている。一般的には、レセプターあるいはリガンドを直接プレート上に固相化してパンニング法によりファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングする方法がとられている。しかし、相当数の目的分子に結合するファージクローンが得られ、その大多数は機能のない単なる結合ファージクローンであり、その中からレセプター−リガンドの相互作用を制御するようなペプチド配列を持ったファージを得ることは非常に効率が悪く、困難であった。また、抗原指向性がはっきりしている抗体を用いてファージライブラリーをスクリーニングする場合には、比較的効率よく結合ペプチドが得られている。例えば、抗p53モノクローナル抗体を用いてp53分子上のエピトープの決定を行っている例では、種々の長さのランダムペプチドライブラリーを用いているが、抗p53モノクローナル抗体によって得られたものは、全てp53上のアミノ酸配列にホモロジーの高いものであり、その結果からエピトープを同定している（Stephen, C. W., et al., J. Mol. Biol., 248, 58-78, 1995）。また、抗bFGF抗体を用いて６個のアミノ酸配列をもったファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングしたところbFGFのアミノ酸配列に類似のペプチド配列が得られ、そのアミノ酸配列を８個に拡張して合成したペプチドがbFGFとそのレセプターFGFR-1との結合を阻害したとの報告がある（Yayon, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10643-10647, 1993）。また、アセチルコリンレセプターに対してコンフォメーショナルなエピトープを認識する抗体に結合するモチーフを６個のアミノ酸をもつファージランダムペプチドライブラリーを用いてスクリーニングしたところ、アセチルコリンレセプターとはホモロジーがないが、この抗体と結合するペプチド配列が得られている。しかしながら、アセチルコリンと結合するかどうかは何ら言及されていない（Balass, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10638-10642, 1993）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前述の補助刺激シグナルに関係している分子をターゲットにして免疫反応を制御しようとする試みとして、B7分子やCTLA-4分子に対する抗体が用いられているが、その抗体の効果はＴ細胞活性化を３倍弱増強するにとどまっており、十分に高いとは言いがたい。また、彼らの実験では、具体的な抗原を用いておらず、in vivoの免疫反応において効果があるとの確証は得られていない。抗体以外のものとして、特に、医薬品として望ましいと考えられる小分子をこのような補助刺激シグナルに関与した分子をターゲットにしてデザインする試みはまだ報告されていない。
【０００８】
一方、小分子をデザインするための情報として、ターゲット分子の相互作用部位解析を行い、その相互作用部位のアミノ酸配列を元にペプチドを合成し、小分子をデザインするという方法がとられてきた。しかし、従来の蛋白分子同士の相互作用部位の解析法により相互作用部位のアミノ酸配列を明らかにし、そのアミノ酸一次配列をもとにオリゴペプチドを作製しても、ターゲット分子の機能を代替するような小分子の設計は困難であった。すなわち、重要な機能を有する蛋白分子の相互作用部位は三次構造によって規定されており、たとえ三次構造上相互作用に関与する部位が集積されていたとしても、一次配列上では相互作用部位が散在しているため、相互作用部位のアミノ酸一次配列をもとにオリゴペプチドを作製しても、相互作用部位の三次構造を再構成することは技術的に困難であり、機能小分子の設計は困難であった。
【０００９】
ファージランダムペプチドライブラリーを用いた検索でも、レセプターあるいはリガンドを直接固相化してパンニング法によりスクリーニングすると、レセプター−リガンドの相互作用を制御するような特別のペプチド配列を持ったファージを得ることは非常に効率が悪く、困難であった。さらに、抗体のような比較的、抗原指向性がはっきりしているタンパク分子を使ったスクリーニングでも、抗体が結合するターゲット分子のアミノ酸の一次配列あるいは、それとホモロジーの高いモチーフを同定することに使われてきており、ホモロジーがない場合は単に抗体と結合するだけのペプチド配列を示す場合がほとんどであった。すなわち、抗体の結合するターゲット分子の三次構造をアミノ酸の一時配列に依存せずに模倣する分子が得られたとの報告は未だされていない。ましてやＡＰＣ上に発現するCD80及びCD86と、そのカウンターレセプターであるＴ細胞上に発現するCD28及びCTLA-4をターゲットにして、免疫系を制御するような小分子を得たとの報告もない。さらに、ターゲット分子のアミノ酸の一次配列に依存せずにそのような小分子を作製する試みがなされたという報告もない。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、Ｔ細胞活性化に関与したMHC/Ag複合体とTCR/CD3複合体による第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子間の相互作用を制御する免疫制御分子及びその製造方法を提供するものであり、当該分子を利用して免疫系を制御することができる。さらに詳細には、本発明は、補助刺激シグナルに関与した分子間の結合を阻止し、かつ当該分子の立体構造を認識するモノクロナール抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーより得られる、目的蛋白分子の三次構造を模倣したペプチド配列をもつ免疫制御分子及びその製造方法を提供する。
【００１１】
例えば、分子ＡとＢの結合を阻害し分子Ａの立体構造を認識する抗Ａモノクローナル抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーからこの抗体に結合するファージクローンを単離する場合、用いた抗Ａ抗体は分子Ａ上の結合部位の三次構造の「鋳型」、すなわち分子Ｂ上の結合部位の役割を果たすため、分子Ａの結合部位の三次構造と類似している構造をファージ表面に提示したクローンに結合する。従来の分子Ｂをそのままスクリーニングに使用する方法では、分子Ｂ上に数多くのファージ結合可能部位があり、Ａ−Ｂ分子間の相互作用に関係ない部分に結合するファージクローンも同時に得られることになってしまい、スクリーニング効率を非常に悪くしていた。一方、Ａ−Ｂ分子間の相互作用に関係している部分の立体構造を認識する抗Ａモノクローナル抗体を使うことにより、相互作用に関係している分子Ｂ上の部分の立体構造のみを抽出することになり、ターゲット領域を単一化することができ、その点でファージスクリーニングの効率を飛躍的に上げることができる。この立体構造を保持するためにペプチド単独の状態にせずに、ファージ上に表現されたままで、分子Ｂとの結合活性によりスクリーニングすれば、最終的に分子Ａと非常に構造の良く似た立体構造を持つペプチド配列を有するファージを選択することができる。このペプチド配列は分子Ａと非常に構造がよく似ていることから、さらに、バイオアッセイ等により選択すれば、その分子Ａのアゴニストやアンタゴニストとしての活性を明らかにすることができる。また、このようにして選択されたペプチド配列をもつファージクローンの中には、その立体構造が非常に分子Ａと似ている構造をしていることから、分子Ａのアゴニスト・アンタゴニスト的な活性ではなく、分子Ａとは異なるが分子Ａファミリーに属し、同様の立体構造を持った分子Ｃのアゴニスト・アンタゴニストとしても働くものが得られる。
【００１２】
このような方法を用いることにより、補助刺激シグナルに関与したCD80及びCD86とCD28及びCTLA-4、さらにこれらの分子と立体構造が非常に類似しているが、未だ明らかになっていない分子をターゲットにした免疫系を制御するような小分子をアミノ酸一次配列に依存せずに作製することが可能になり、本発明の一つであるＴ細胞の活性化を促進するペプチド配列を得るに至った。
【００１３】
【発明の構成】
本発明の免疫制御分子とは、第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子をターゲットにした小分子である。ここでいう補助刺激シグナルに関与した分子とは、ＡＰＣ上に発現するCD80及びCD86と、そのカウンターレセプターであるＴ細胞上に発現するCD28及びCTLA-4、あるいは、未だ知られていないが、これらの分子と非常に立体構造がよく似ている分子である。本発明の免疫制御分子は、第一シグナルに続く補助刺激シグナルに関与した分子間の結合を阻止し、かつその分子の立体構造を認識するモノクロナール抗体を用いて、１０8種類以上の少なくとも８個以上の長さを持ったランダムなペプチド配列を提示するファージランダムペプチドライブラリーを、そのペプチド配列がファージに表現された状態でスクリーニングすることによって得ることができる。
【００１４】
本発明の免疫制御分子は、補助刺激シグナルに関与し、かつＴ細胞上に発現するCTLA-4に対する抗体と結合するものであり、さらに、そのアミノ酸配列としての特徴は、２つのCys残基を持ち、該Cys残基を介して分子内Ｓ−Ｓ結合をしており、これら２つのCys残基の間に少なくとも６個のアミノ酸配列を含む全体では少なくとも８個のペプチド配列からなる分子である。また、当該分子はCTLA-4分子のアミノ酸配列とはホモロジーがほとんど無いという特徴がある。
そのような分子としては、配列表配列番号４に記載したＦ２または配列表配列番号８に記載したＦ６が挙げられる。
この小分子は、ファージクローンより得たＦ２及びＦ６のペプチド配列情報に基づきその立体構造を保持した状態であれば、何らかのキャリヤー上か、あるいは蛋白質に組み込まれた形態であるか、またはペプチド合成によりペプチド単独の形態でも使用可能である。さらに、Ｆ２またはＦ６をリード化合物として、Ｆ２またはＦ６の立体構造が保持された範囲で当該ペプチド配列を欠失、置換、付加または修飾させてもよい。
【００１５】
本発明で用いるモノクローナル抗体は、補助刺激シグナルに関与した分子間を阻害する能力のある抗体であればどのような動物種の抗体でもよく、抗体のサブクラスやアイソタイプには限定されないが、コンフォメーショナルエピトープを認識する抗体が望ましい。本発明ではＴ細胞上に発現するCTLA-4に対する抗CTLA-4抗体として、UC10-4F10-11モノクローナル抗体（ファーミンジェン社製）を使用しているが、これだけに限定されるものではない。例えば、抗CD28抗体など、CTLA-4及びCD80またはCD86との結合、あるいはCD28及びCD80またはCD86との結合を阻害することができ、かつコンフォメーショナルエピトープを認識するモノクローナル抗体であれば使用することができる。コンフォメーショナルエピトープを認識する抗体とは、エピトープの立体構造を認識する抗体、すなわち、その抗体の抗原結合領域がカウンターパートの立体構造を再現しているような抗体をいう。具体的には免疫沈降反応など抗原がネイティブな状態であれば結合できるが、抗原が変性状態にある場合に結合できない抗体のことであり、還元下の状態でウエスタンブロッティング法により抗原と結合できない抗体、またはエピトープの構成アミノ酸配列をもとに合成されたリニアなペプチドに結合できないような抗体のことを指す。
【００１６】
本発明で用いるファージランダムペプチドライブラリーは、ファージ表面にランダム配列を持つペプチドが提示されているものならば、いかなる種類のファージベクターも使用可能である。挿入されるランダムなペプチド配列の長さは、8個以上のアミノ酸のランダム配列が挿入されたものを用いるのが望ましく、特に好ましくは15個以上のアミノ酸のランダム配列が挿入されたものである。さらに、ランダムなペプチド配列はファージの表面に提示されていれば、いかなるファージの構成タンパク質に挿入されていても良いが、ｐIIIタンパクに挿入されたものが望ましい。ｐIIIタンパクのＮ末端から４番目のAlaと５番目のGlyとの間（配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列において、それぞれ２２番目と２３番目に相当する）に15個以上のアミノ酸のランダム配列が挿入されているものならばペプチドモチーフの両端に延びるアミノ酸配列がモチーフの三次構造に及ぼす影響を最小限におさえることができる。
【００１７】
本発明は、前述の抗CTLA-4抗体を用いて、ファージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより始まる。スクリーニング方法としては抗体をプレート上に固定化して使用する一般的なパンニング方法や、抗体を固定化したアフィニティーカラム法などを使用することができる。また、パンニング→ファージ回収→ファージ増殖→パンニングの工程を３回以上繰り返すことによって、目的のファージクローンを濃縮することができる。このようなスクリーニング法によって、抗CTLA-4抗体に結合するペプチド配列を持ったファージクローンを得ることができる。通常このようにして得られたファージクローンは、抗体との結合力の差や保持されているペプチド配列の種類によっていくつかのクローン集団に分類することができる。ファージクローンのシークエンスはジデオキシ法などの常法により簡単に行うことができる。
【００１８】
次に、これらの分類されたクローンの中から、Ｔ細胞制御活性があるペプチド配列を選択するために、in vitroあるいはin vivoのアッセイ系よって更なるスクリーニングをする必要がある。例えば、抗CTLA-4抗体によって選ばれたファージクローンは、CTLA-4分子と同様の働きをすることが期待されているので、CTLA-4分子のカウンターレセプターであるCD80あるいはCD86と結合するかどうか調べることができるアッセイ系により選別することができる。また、補助刺激シグナルが関与する分子が相互作用した結果を実際の免疫反応によって調べることが可能なバイオアッセイ系によりファージを選択することもできる。この場合のバイオアッセイ系とは、Ｔ細胞の活性化の程度がわかる方法であれば、どのような方法でも良く、Ｔ細胞活性化の結果、産生されるサイトカインの量を調べる方法なども適用可能である。抗原により一回感作された動物のＴ細胞や抗原提示細胞をin vitroでペプチド配列を持つファージクローン単独であるいは、抗原及びペプチド配列を持つファージクローンと共に刺激し、Ｔ細胞の活性化の程度を3Ｈチミジンの取り込み度合いで調べる方法が望ましい。分類されたファージクローンを、このような実際の免疫反応を反映したアッセイ系に供することにより、結果として現在知られていないメカニズムにより、Ｔ細胞を制御するようなペプチド配列を持ったファージクローンが得られる可能性がある。そのような望ましい例として、Ｆ６のアミノ酸からなるペプチド配列（配列表配列番号８）が示される。このＦ６配列を持ったファージは、未だ知られていないが、おそらくCD80あるいはCD86と良く似た他の免疫関連因子と相互作用していると思われる。このようなペプチド配列をスクリーニングするためには、ペプチドがファージ上に表現されたままでアッセイに供することが望ましい。立体構造が重要であるようなペプチド配列の場合、ファージ上からペプチド状態にすると、その立体構造が保持できない場合が多い。しかし、ファージクローンより得たペプチド配列情報に基づきその立体構造を保持した状態でペプチドを合成することができるならば、前述のスクリーニング系にペプチド単独で供することも可能である。
【００１９】
このような方法により、CD80あるいはCD86分子に結合し、さらにＴ細胞を活性化するペプチド配列を持ったファージクローンを得ることができる。その好ましい配列はＦ２（配列表配列番号４）である。また、CD80やCD86分子とは結合しないが、Ｔ細胞を活性化するペプチド配列を持ったファージクローンも得ることができる。その望ましい配列はＦ６（配列表配列番号８）である。
【００２０】
本発明の免疫制御分子は、補助刺激シグナルに関与した分子の発現状態により、Ｔ細胞に対して正の制御または負の制御を行うことができる。例えばCD28が主として作用している状態では、その免疫制御分子は免疫反応抑制因子として働くことができ、一方、CTLA-4が主として作用している状態では、免疫反応活性化因子として働くことができる。例えば、本発明のＦ２またはＦ６に代表される免疫制御分子は、Ｔ細胞の抗原特異的な活性化を著しく（５〜１０倍）促進することが可能である。
また、その免疫制御分子による制御活性は、抗原の種類に依存するものではなく、当該分子と同時に免疫反応の場に存在する抗原に対する免疫反応を制御することができる抗原特異的なものである。さらに、その制御活性を発揮するためには、抗原と同一分子上に存在してもよいが、抗原と個別に使用されてもよい。
【００２１】
【発明の効果】
本発明の補助刺激シグナルに関与した分子間の相互作用を制御する免疫制御分子は、結果として免疫反応を制御することができることから、免疫反応が係わる疾病には全て応用可能である。最も望ましい使用法としては、ワクチンあるいは、ガンの抗原特異的な免疫療法における免疫反応増強剤やアレルギー反応における免疫抑制剤としての使用などが挙げられる。
また本発明は、補助刺激シグナルに関与した分子以外に、一般的なレセプター分子とそれに相互作用するリガンド分子あるいは、酵素分子と基質蛋白質等の生体高分子間の相互作用を制御する小分子を設計するための新しい方法としても提供する。生体高分子間の結合を制御する小分子を、アミノ酸一次配列に依存せずに直接分子設計する事ができる本発明は、レセプターとリガンドのアゴニストやアンタゴニストを分子デザインする上で有用な方法となる。この方法はすべての生体高分子に適用できるので、この新技術で明らかにされるペプチドモチーフの数々は、今後の新規医薬品の開発に絶大な波及効果をもつと考えられる。しかも、波及効果は単に医薬品開発に留まらず、選択的接着技術を必要とする医療材料、DDS等の機能性材料分野の開拓、さらに分子間の特異的結合を利用する応用技術一般へ影響を及ぼすと考えられる。
以下に本発明を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
【００２２】
【実施例】
《実施例１：ファージランダムペプチドライブラリー》
Smithら（G.P.Smith,Science,Vol.249, p386-390(1990)）により報告されたファージランダムペプチドライブラリーは、産生されるファージの先端にあるｐIIIタンパク分子をコードする遺伝子（geneIII）内に目的に応じた長さのペプチド配列に相当するランダムな遺伝子を挿入したものであり、pIIIタンパクは感染能力を保持したままでそのペプチド分子を含んだ形で発現するように設計されたものである。配列表配列番号１にｐIIIタンパクのアミノ酸の１次配列を示した。この１次配列の２２番目のAlaと２３番目のGlyの間にランダムなアミノ酸配列に対応する遺伝子を挿入することで、このペプチドはpIIIタンパクと融合した形で発現する。この方法を用いると、数億種類にも及ぶペプチドの集合体を化学反応で合成するよりも容易に得られ、さらに必要に応じてその増幅が可能である。今回のスクリーニングに用いたファージランダムペプチドライブラリーはNishi,Sayaら（T.Nishi 実験医学、Vol.11p95-100(1993)）により作製されたもので、これはSmithらによって報告された方法により作製されたものである。このファージランダムペプチドライブラリーは、その先端にあるpIIIタンパク分子をコードする遺伝子（geneIII）内の、配列表の配列番号１の２２番目のAlaと２３番目のGlyの間に15残基のランダムなアミノ酸配列に対応する遺伝子が挿入されて、pIIIタンパクとこの15残基のアミノ酸が融合した形で発現するように設計されたものである。この15残基のランダムなペプチド分子をファージのpIIIタンパク内に発現するファージ（fd-tet）を今回のスクリーニングに用いた。
【００２３】
《実施例２：スクリーニングに用いる抗体の活性》
本発明の目的は、CD80とCTLA-4あるいはこれらの分子と関連する分子と相互作用して、免疫調節作用を示すペプチド配列をもつファージクローンを得ることである。そこで実施例１に示したファージランダムペプチドライブラリーのスクリーニングを、抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体（ファーミンジェンより購入：UC10-4F10-11）を用いて、この抗体に特異的に結合するファージクローンの単離を行った。この抗体に特異的に結合するファージのｐIIIに含まれる15残基のモチーフは、CTLA-4分子の抗体に認識される部分と同様な構造を持っていると考えられる。この部分はリガンドへの相互作用部位であるのでファージより得られたモチーフもCD80分子またはCD86分子を認識し、CTLA-4分子とCD80分子またはCD86分子との相互作用に影響を与えるか、あるいはCD80分子またはCD86分子に何らかのシグナルを伝える可能性がある。
【００２４】
まず、スクリーニングに用いたこの抗体の特異性を見るために、以下の操作を行った。この操作で用いたCTLA-4-Ｉg及びCD80-Igキメラ分子は、Linsleyら（J.Exp.Med.Vol. 174, p561-569(1991)）の方法に従って作製したCTLA-4-Ｉg及びCD80-Igのキメラ遺伝子断片をpCDM8に組み込んだ発現プラスミド（上出（北大免疫研）より恵与）を、それぞれDEAE-dextran 法を用いてCOS7細胞に遺伝子導入後、培養72時間後の上清よりプロテインAセファロース（ファルマシア社）を用いて精製したものを使用した。
【００２５】
まず96ウエルのＥＩＡプレート（住友ベークライト）に0.02％NaN3を含む50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl（TBS）で希釈したCTLA-4-Ｉg（200ng/ml）を１ウエルあたり50μl分注し、37℃で１時間反応後、0.5％Tween20を含む50mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl（TBST）で洗浄した。各ウエルに１％牛血清アルブミン（BSA）を250μl分注し、37℃で１時間反応させマスキングを行った。各ウエルをTBSTで洗浄後、TBSで種々の濃度に希釈した抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体を１ウエルあたり100μl分注し、37℃で１時間反応後、TBSTで洗浄した。その後TBSで200ng/mlに希釈したビオチン標識したマウスCD80-Igを１ウエルあたり50μl分注し、37℃で１時間反応後、TBSTで洗浄した。最後にTBSで100倍に希釈したアルカリフォスタファーゼ標識ストレプトアビジン（Leinco Technologies Ltd.)を室温で１時間反応、TBSTで洗浄後、基質であるｐ-ニトロフェニルリン酸ナトリウム六水和物（和光純薬）を加え405nmにおける吸光度を測定した。陰性対照として抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体の代わりにこの抗体と同じアイソタイプであるハムスター抗体（ハムスター血清の硫酸アンモニウム（33〜５５％）飽和画分をＰＢＳに対して透析したもの）を用いた。その結果、図１に示すように、ここで用いた抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体はCTLA-4-ＩgとCD80-Ｉgの結合を完全に阻害することを確認した。
【００２６】
《実施例３：抗CTLA-4抗体と結合するファージクローンのパンニング》
実施例２に示したCTLA-4-ＩgとCD80-Ｉgの結合を阻害する抗CTLA-4抗体を用いて、以下に示す方法に従って実施例１に述べたファージランダムペプチドライブラリーのパンニングを行った。直径３５ｍｍのプラスチックプレート（岩城ガラス）に抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体を1枚あたり10μg/mlを1mlコートし、ファージランダムペプチドライブラリー（1.2×1012TU）と４℃で16時間反応させた。このプレートをTBSTで洗浄後、結合しなかったファージを取り除き、0.1N HCl-glycine pH 2.2 （１mg/ml BSA,0.1mg/ml フェノールレッド(ギブコ)）を加え、抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体に特異的に結合したファージを溶出し、回収後、pH9.1のTris-HClで中和した。得られたファージを大腸菌K91 kanに感染させ増殖させた後、パンニングに用いる抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体の量を５μg、１μgと減らしながら同じ操作を計3回行い、より強く特異的に抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体と結合するファージの選別を行った。
【００２７】
得られたファージ58個のクローンについてELISA法を用いた１次スクリーニングを行った。Smith等の方法(G.P.Smith, Method in enzymology, Vol.217, p228-257(1993), Academic Press Inc.)に従い精製した各ファージ（4×109 virions / well /40μl）を96ウエルELISAプレート（住友ベークライト）に４℃で１晩でコートしTBSTで洗浄し、0.02％NaN3,１％BSAを含む50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaClを１ウエルあたり100μl加え、室温で２時間ブロックした。このプレートをTBSTで洗浄後、抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体（200ng/ml/well/100μl）を加え室温で１時間反応させた。TBSTで洗浄後、TBSで250倍に希釈したアルカリフォスタファーゼ標識の抗ハムスターＩgG抗体（ザイメット）を室温で１時間反応、洗浄後、基質であるｐ-ニトロフェニルリン酸ナトリウム六水和物（和光純薬）を加え405nmにおける吸光度を測定した。その結果、抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体と反応するファージクローンが21個確認できた（図２）。
【００２８】
《実施例４：パンニングされたファージクローンの挿入ペプチドのアミノ酸配列の決定》
実施例３で得られた21個のファージクローンの挿入ペプチドに対応する核酸塩基配列について、それぞれのファージからDNAをSmithらの方法（G.P.Smith, Method in Enzymology, Vol.217, p228-257(1993); Academic Press Inc.）に従って回収し、配列表の配列番号２に示す合成DNAをプライマーとして、Applied Biosystems社の373A-36S DNA Sequencer を用いて核酸塩基配列の解析を行った。このプライマーは配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列の37番のProから41番のAsnの領域に対応するものである。核酸塩基配列の解析の結果、これらのファージクローンの、配列表の配列番号１に示すｐIIIタンパクの22番目のAlaと23番目のGlyの間に含まれるアミノ酸配列モチーフは、配列番号３から８に示す６種類のアミノ酸配列に分類されることが確認された。これらのアミノ酸配列をCTLA-4のアミノ酸配列と比較したが、ホモロジーは認められなかった。これらのアミノ酸配列のモチーフを表１に示す。これらのアミノ酸配列モチーフを、それぞれＦ１（配列番号３）、Ｆ２（配列番号４）Ｆ３（配列番号５）、Ｆ４（配列番号６）、Ｆ５（配列番号７）及びＦ６（配列番号８）とし、以下の解析を行った。
【００２９】
【表１】
0004025400.tif 000002
【００３０】
《実施例５：各モチーフと抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体との結合特異性》
実施例４に示したそれぞれのモチーフが、特異的に抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体に結合するかどうかについての検討を行った。特異性の検討は実施例３に示したELISA法により行った。陰性コントロールとして抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体と同じアイソタイプである抗マウスCD28抗体（ファーミンジェン、San Diego）およびハムスターＩgGを用いた。検出抗体には抗ハムスターＩgG抗体を用いた。その結果、Ｆ２配列を発現するファージとＦ６配列を発現するファージがより強く抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体と反応し、Ｆ１配列、Ｆ４配列及びＦ５配列を発現する各ファージは弱く反応することがわかった。また、Ｆ３配列を発現するファージはさらに弱く反応した（図３）。なお、このＦ２配列を発現するファージを産生する大腸菌がEscherichia coli F2［FERM BP-6009］として、また、Ｆ６配列を発現するファージを産生する大腸菌がEscherichia coli Ｆ６［FERM BP-6010］として、1997年４月14日（原寄託日；1997年７月４日にそれぞれ微工研菌寄第P-16192号及び第P-16193号よりブダペスト条約に基づく寄託へ移管）に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に出願人により寄託されている。
【００３１】
《実施例６：各々のファージのT細胞増殖刺激活性》
実施例５に示したように、今回得られた６種類の配列を発現するファージは、抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体と結合活性を有することから、これらの配列を発現するファージは、アミノ酸配列は類似していないが、CTLA-4分子のホモローグとして、CTLA-4分子と同様の働きをすることが期待される。そこで、まずＴ細胞増殖に及ぼすこれらのファージの影響をマウスを用いて検討した。
実験にはBalb/cマウス（６週令）を用い（１群４匹）、ファージはSmithらの方法（G.P.Smith, Method in Enzymology, Vol.217, p228-257(1993); Academic Press Inc.)に従って精製した。ファージの量は、プロテインアッセイキット（バイオラド）を用いて牛血清アルブミンをスタンダードとして測定し、タンパク濃度で表した。
【００３２】
まず、Balb/cマウスに対する抗原刺激として、pIIIタンパクを発現していないファージ本体（W.T.)を10μg(200μl/PBS)腹腔内投与した。投与４週間後各マウスより常法に従って脾臓細胞を摘出し、この脾臓細胞を96ウエルカルチャープレートに１ウエルあたり1.5×105cells分注し、精製したW.T.のファージおよびＦ１〜Ｆ６の配列を発現するファージを最終濃度0.015から５μg/mlになるように加え、計200μl（10％FCSを含むRPMI 1640培地）とし、各サンプルについて３検体ずつ用意した。これらの試料を30分間氷上でインキュベート後、３日間37℃、５％CO2の条件で培養を行った。培養終了18時間前に[3H]チミジン（0.5μCi／well）でパルスラベルを行い、セルハーベスターで細胞を回収し、[3H]チミジンの取り込み量を液体シンチレーションカウンターで測定した。その結果、図４に示すようにＴ細胞の増殖は、Ｆ１、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５配列を発現するファージを加えた群は、W.T.ファージを加えた群と同程度の活性しか認められなかったが、Ｆ２およびＦ６配列を発現するファージを加えた群は、W.T.ファージを加えた群と比べて５倍から１０倍のＴ細胞の著明な増殖が認められた。以上のことからＦ２及びＦ６配列を発現するファージにはＴ細胞の抗原特異的な増殖刺激活性があることが示された。
【００３３】
《実施例７：Ｆ２及びＦ６配列を有するファージのマウスCD80への結合活性》
実施例６でＴ細胞増殖刺激活性を示した、Ｆ２及びＦ６配列を発現するファージのCTLA-4のレセプターであるマウスCD80に対する結合活性を調べた。
結合活性の評価はELISA法を用いた。Ｆ２およびＦ６配列を発現するファージ（4×109 virions/well/40μl）を96ウエルELISAプレート（住友ベークライト）に４℃で１晩でコートし、１％BSAを含む50mMTris-HCl,pH7.5,150mMNaCl（TBS）で室温で２時間ブロックした。このプレートをTBSTで洗浄後、PBSで希釈したマウスCD80-Igを200ngから1000ng/35μl加え、室温で１時間反応させた。TBSTで洗浄後、TBSで100倍に希釈したアルカリフォスタファーゼ標識の抗ヒトIgG抗体（ザイメット）を室温で１時間反応、洗浄後、基質であるｐ-ニトロフェニルリン酸ナトリウム六水和物を加え405nmにおける吸光度を測定した。その結果、Ｆ２配列を発現するファージのみがマウスCD80-Ｉgに濃度依存的に結合することが確認された（図５）。
【００３４】
次にこのＦ２ファージのCD80-Igへの結合の特異性をみるために、Ｆ２配列を発現するファージをコートしたプレートに対してマウスCD80-Ｉg,マウスCTLA-4-Ｉg,ヒトＩgＧとの反応を、本実施例に述べた方法に従ってELISA法により検討を行った。その結果、Ｆ２配列を発現するファージはマウスCD80-Ｉgのみ特異的に反応する事が確認できた（図６）。
【００３５】
《実施例８：Ｆ２配列を発現するファージのヒトCD80-Igとの結合性》
実施例７ではＦ２ファージがマウスCD80-Igと特異的に結合する事を示したが、次に、このＦ２配列を発現するファージがヒトCD80-Igと特異的に結合するかどうかを、実施例７、図５に示した方法に従って検討した。ヒトCD80-Ｉgの調製にあたっては、Linsleyらの方法（J.Exp.Med. Vol.173, p721-730 (1991)）に従って、ヒトCD80の細胞外ドメインとヒトＩg Ｃγ１領域との融合遺伝子を構築した。この融合遺伝子断片がpCDM8に組み込まれた発現プラスミドを、DEAE-デキストラン法を用いてCOS7細胞に遺伝子導入後、培養72時間後の上清よりプロテインＡセファロース（ファルマシア社）を用いてヒトCD80-Ｉgを精製した。調製されたヒトCD80-Ｉgを用い、Ｆ２配列を発現するファージのヒトCD80-Ｉgへの結合活性を、マウスCTLA-4-Ｉg及びヒトＩgＧを陰性対照として調べたところ、図７に示すように、Ｆ２配列を発現するファージはマウスCD80-Ｉgと同様にヒトCD80-Ｉgと特異的に結合する事が確認された。この結果は、Ｆ２配列を発現するファージは、ヒトの免疫系にも作用しうることを示している。
【００３６】
《実施例９：鶏卵リゾチーム免疫マウスに対するＦ２及びＦ６配列を発現するファージのＴ細胞増殖刺激活性》
実施例６でＦ２及びＦ６配列を発現する各ファージがＴ細胞増殖刺激活性を有することを示した。実施例６では、最初の抗原刺激としてファージタンパクを用い、in vitroの２次刺激ではこのファージタンパクにＦ２あるいはＦ６配列が発現したものを用いた。つまり実施例６では、抗原としてファージタンパク質を用い、２次刺激の際に、この抗原とＦ２あるいはＦ６配列が同じ粒子上に存在する状態で行われた。そこで、今回認められたＦ２あるいはＦ６配列を発現するファージのＴ細胞増殖刺激活性を、最初の抗原刺激として、ファージとは全く異なる抗原（鶏卵リゾチーム）を用い、２次刺激として、鶏卵リゾチームとＦ２あるいはＦ６配列を発現するファージ粒子を個別に加える系で実施例６と同様の検討を行った。
【００３７】
まずBalb/cマウスに対して鶏卵リゾチームを10μg（100μl/フロイント不完全アジュバント(FIA)）皮下注射した。投与４週間後各マウスより常法に従って脾臓細胞と所属リンパ節を摘出した。本実施例ではこの脾臓細胞を調製後96ウエルカルチャープレートに１ウエルあたり1.5×105cellsに分注し、各サンプルに鶏卵リゾチームを３μg/mlで添加し、Ｆ２及びＦ６配列を発現するファージを添加する時期を（各ファージの添加量は1μg/ml）、鶏卵リゾチーム添加と同時、１日後、２日後の３通りに設定した。陰性対照として、W.T.ファージを添加した。培養以降の測定は実施例６に従った。その結果、図８に示すように、最初の抗原刺激はファージ由来の抗原でなくても（この場合は鶏卵リゾチーム）、Ｆ２及びＦ６配列を発現するファージは、T細胞の抗原特異的な増殖刺激活性を示した。しかもこの活性は、抗原と同一分子上になくても作用し、抗原と同時に添加する方が効果が高いことが示された。
【００３８】
《実施例１０：Ｔ細胞増殖刺激活性におけるＦ２及びＦ６配列を発現する各ファージのレセプター特異性》
Ｆ２及びＦ６配列を発現する各ファージは、実施例５に示すように、抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体と反応し、そのうちＦ２配列を発現するファージは、実施例７に示すようにマウスCD80-Ｉgと特異的に結合する。そこで実施例９に示されたＦ２及びＦ６配列を発現する各ファージのＴ細胞増殖刺激活性が、これらのレセプター−リガンドを介した反応によるものかを確認するために、実施例９で述べたＦ２及びＦ６配列を発現する各ファージのＴ細胞増殖刺激活性に対するCD80-Ｉg及びCD86-Ｉgの影響を測定した。
【００３９】
Balb/cマウスに対して鶏卵リゾチームを50μg(100μl/PBS)腹腔内投与し、投与４週間後各マウスより常法に従って脾臓細胞を摘出した。本実施例では、この脾臓細胞を96ウエルカルチャープレートに1.5×105cellsに分注し、各サンプルに鶏卵リゾチーム３μg/mlとＦ２あるいはＦ６配列を発現しているファージ（１μg/ml）とCD80-ＩgまたはCD86-Ｉg、または陰性対照としてヒト-Ｉgを０から１μg/mlで添加し、実施例６で述べた方法に従ってＴ細胞増殖刺激活性を調べた。その結果、図９に示すようにＦ２配列を発現するファージは、CD80-Ｉg存在下では著しくＴ細胞増殖刺激活性が阻害され、CD86-Ｉg存在下では、CD80-Ｉgの場合の40％程度の阻害が認められた。Makらの報告によると、CTLA-4遺伝子をノックアウトしたマウスではＴ細胞の過剰な活性化がおこり、生後３〜４週間で死亡することから（Science Vol.270, p985 (1995)）、CTLA-4分子がＴ細胞の活性化を抑制する機能を有していることが示唆されている。Makらの報告に従えば、今回得られた結果は、Ｆ２配列を発現するファージがCD80またはCD86とCTLA-4の相互作用に影響した結果、Ｔ細胞増殖を誘導したことを示唆している。このように、Ｆ２配列を発現するファージが、CTLA-4分子のＴ細胞の活性化に対する負の作用を阻害した可能性や、CD80またはCD86と結合することでＡＰＣを介してＴ細胞の活性化に対して正のシグナルを与えた、などの可能性が考えられる。
【００４０】
一方、同様の実験をＦ６配列を発現するファージで行ったところ、図１０に示すようにCD80-ＩgあるいはCD86-Ｉgを添加しても全くＴ細胞増殖刺激活性が阻害されず、Ｆ６配列を発現するファージはこれらのレセプター−リガンドとは別の分子を介してＴ細胞増殖刺激活性を示しているものと思われる。これは、今回のように抗リガンド抗体を用いてファージランダムペプチドライブラリーのスクリーニングを行うことで、目的のリガンドと似た未知のリガンド或いはレセプター様の分子と相互作用するファージが得られることを示しており、未知のリガンド或いはレセプターのスクリーニングに有効であることを示している。
【００４１】
《実施例１１：Ｂ型肝炎表面抗原（HBsAg）免疫マウスに対するＦ２またはＦ６配列を発現するファージの抗HBsAg抗体産生増強活性》
実施例９において、Ｆ２またはＦ６配列を発現するファージが、鶏卵リゾチーム免疫マウスに対してＴ細胞増強刺激活性を有することが示され、Ｆ２またはＦ６配列を発現するファージが外来抗原に対しても免疫系の細胞を活性化することが明らかになった。そこで、次にこの免疫系の細胞の活性化がワクチン抗原を免疫した際にも認められるかどうかをHBsAgを用いて検討を行った。
まず、Balb/cマウス（４匹／１群）に対して、酵母産生組換えHBsAg（yHBsAg；(財)化学及血清療法研究所）を10μg（100μl/PBS）のみ、またはyHBsAgとともにＦ２またはＦ６配列を発現するファージ（10μg/100μl）を腹腔内投与した。さらに初回免疫より15日後に、同じ組み合わせのサンプルを腹腔内投与した。初回免疫より３週間後各マウスより採血を行い、血清をPBSで50倍、200倍、800倍希釈した後、抗HBsAg抗体価をオーサブEIAキット（アボット社）を用いて測定した。
抗体価の定量は、キットに添付された陽性コントロールをスタンダードとして用いて行った。その結果、図１１に示すように、HBsAgのみを免疫した群が示した抗HBsAg抗体価を１とした場合、Ｆ２またはＦ６配列を発現するファージと共にyHBsAgを免疫した群は、３週間後の血中の抗HBsAg抗体価はそれぞれ17.9，11.9であり、有意に高かった。この結果より、Ｆ２またはＦ６配列を発現するファージがアジュバント活性を有することが明らかとなった。
【００４２】
《実施例１２：Ｆ２及びＦ６配列を発現するpIIIタンパクのマウスCD80への結合活性》
実施例７ではＦ２及びＦ６配列を有するファージのマウスCD80への結合活性について述べた。ファージ本体の構成タンパクは主に、pIIIタンパク及びpVIIIタンパクであり、コピー数で言えばpVIIIタンパクがpIIIタンパクの数百倍であることが知られている（Kremser A.,et al., Biochemistry, Vol.33,p13954-13958(1994)）。本発明においては、ランダムなペプチド配列をpIIIタンパク上に発現させていることから、pVIIIタンパクの本活性に対する影響を見るために、ファージ本体よりＦ２及びＦ６配列を発現するpIIIタンパクを単離し、マウスCD80への結合活性を調べた。
まず、Ｆ２及びＦ６配列を有するファージより、pIIIタンパク及びpVIIIタンパクをMortonらの方法（J.Immunol.,Vol.156,p1047-1054(1996)）及びWalunasらの方法（J.Exp.Med., Vol.183, p.2541-2550(1996)）に従って、高速液体クロマトグラフィーカラムを用いて精製した。次にＦ２配列を発現するpIIIタンパク（F2-g3p），Ｆ６配列を発現するpIIIタンパク（F6-g3p）を30ng/40μlで96ウエルELISAプレート（住友ベークライト）に４℃で１晩でコートし、結合活性の評価は実施例７に記載の方法に従って行った。
その結果、図１２に示すようにF2-g3pはマウスCD80へ特異的に結合したが、F6-g3pはマウスCD80に結合しなかった。このことは、実施例７に記載のファージ本体を用いた結果と一致し、さらに、Ｆ２配列のマウスCD80への結合活性は、pVIIIタンパクに全く依存しないことが明らかとなった。
【００４３】
《実施例１３：Ｆ２及びＦ６配列を発現するpIIIタンパクのＴ細胞増殖刺激活性》
実施例６において、Ｆ２及びＦ６配列を有するファージがＴ細胞増殖刺激活性をもつことを示した。そこで、本実施例においては、実施例１２で述べた方法に従って調製したF2-g3p及びF6-g3pのＴ細胞増殖刺激活性について検討した。
実験は、実施例６に記載の方法に従い、摘出した脾臓に対して、精製したF2-g3p及びF6-g3pを１μg/mlで添加し、以降の操作も実施例６に記載の方法に従った。陰性対象として、Ｆ２及びＦ６配列とは異なる配列を発現しているpIIIタンパク（K7-g3p）、及びＦ２及びＦ６配列を有するファージより得られた、pVIIIタンパク（F2-g8p,F6-g8p）を用いた。
その結果、図１３に示すように、F2-g3p及びF6-g3pは共に強いＴ細胞増殖刺激活性を示した。この結果は実施例６で示した結果とも一致し、さらに、Ｔ細胞増殖刺激活性の発現は、pVIIIタンパクには依存しないことが明らかとなった。
【００４４】
《実施例１４：Ｆ６配列を有する合成ペプチドのＴ細胞増殖刺激活性》
実施例１３で、F6-g3pがＴ細胞増殖刺激活性を持つことを示した。pIIIタンパクは配列表の配列番号１に記載のように432アミノ酸残基からなる大きなタンパク質であり、しかもファージ由来のタンパク質である。これまで述べてきたＦ２及びＦ６配列を有する分子の医薬品としての臨床応用を考えた場合、生物活性を示す領域はできるだけ短いことが望ましく、これらの配列を発現させる場合は安全性に優れたものが望ましい。そこで、Ｆ６配列のＣ末端に７個のアミノ酸を付加した２２残基からなる合成ペプチド（s-F6：配列表の配列番号９）を合成し、このペプチドのＴ細胞増殖刺激活性を調べた。
ペプチドの合成はパーセプティブ  バイオシステムズ社のペプチド合成機（モデル９０５０）を使用し、システイン残基の酸化は以下に示す方法で行った。ペプチド合成機により合成されたペプチドを定法により樹脂から切り出し減圧乾燥を行った。得られた乾燥物２mgを１mlの４Ｍ尿素を含む0.5ＭTris-HCl(pH8.6)に溶解させ、時々攪拌しながら室温で２時間放置する。この反応物を逆相HPLCにより、酸化物を精製した。このようにして得られたs-F6のＴ細胞増殖刺激活性を実施例６に記載の方法に従い測定した。摘出した脾臓に対して、s-F6を２μＭ、２０μＭで添加し、陽性対象としてＦ６配列を有するファージ添加群（５μg/ml）を、陰性対象としてPBS添加群を用いた。以降の操作は実施例６に記載の方法に従った。
その結果、図１４に示すように、s-F6は用量依存的にＴ細胞増殖刺激活性を示し、しかもＦ６配列を有するファージよりも強いＴ細胞増殖刺激活性を示した。これらのことから、Ｆ６配列がＴ細胞増殖刺激活性を担っていることがより明らかとなり、小分子であるs-F6の医薬品としての応用の可能性が示唆された。
【００４５】
【配列表】
0004025400.tif 000003
0004025400.tif 000004
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【００４６】
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【００４７】
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【００４８】
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【００４９】
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【００５０】
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【００５１】
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【００５２】
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【００５３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ファージランダムペプチドライブラリーのスクリーニングに用いた抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体の特異性を示したものである。
【図２】  抗CTLA-4抗体と結合するファージクローンのパンニングの結果得られた58個のファージクローンの抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体との反応性を示したものである。
【図３】  ６種類のファージクローンの抗マウスCTLA-4モノクローナル抗体との結合性を示したものである。
【図４】  ６種類のファージクローンのマウスＴ細胞増殖に及ぼす影響を示したものである。
【図５】  ３種類のファージクローンのマウスCD80-Ｉgへの結合能を示したものである。
【図６】  Ｆ２配列を発現するファージクローンのマウスCD80-Ｉg,マウスCTLA-4-Ｉg,ヒトＩgＧへの結合活性を示したものである。
【図７】  Ｆ２配列を発現するファージクローンのヒトCD80-Ｉgへの結合活性を示したものである。
【図８】  鶏卵リゾチーム免疫マウスに対するＦ２,Ｆ６配列を発現するファージクローンのＴ細胞増殖刺激活性を示したものである。
【図９】  Ｆ２配列を発現するファージクローンのＴ細胞増殖刺激活性に対するCD80-Ｉg,CD86-Ｉgの影響を示したものである。
【図１０】  Ｆ６配列を発現するファージクローンのＴ細胞増殖刺激活性に対するCD80-Ｉg,CD86-Ｉgの影響を示したものである。
【図１１】  Ｆ２及びＦ６配列を発現するファージの抗HBsAg抗体産生増強活性を示したものである。
【図１２】  F2-g3pのマウスCD80への特異的結合性を示したものである。
【図１３】  F2-g3p及びF6-g3pのＴ細胞増殖刺激活性を示したものである。
【図１４】  s-F6のＴ細胞増殖刺激活性を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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