(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロチップをなす基体上で流体として又は流体を伴って流動する物質の運動を制御する方法であって、
前記基体に少なくとも第１、第２、第３及び第４の溜め部と、これらの溜め部を互いに流体連通させるマイクロチャンネルシステムとを設けると共に、このマイクロチャンネルシステムは、第１、第２、第３及び第４の溜め部からそれぞれ延出する第１、第２、第３及び第４のチャンネルと、これらのチャンネルのうち少なくとも二つのチャンネルが交わる所定の交点とを含むように構成する接続段階と、
第１、第２及び第３の溜め部のうち、前記所定の交点に交わる前記チャンネルを有する一つの所定の溜め部には第１の物質を、前記所定の交点に交わるチャンネルを有する一つの他の溜め部には第２の物質をそれぞれ配置した状態で、これらの第１の物質と第２の物質とにそれぞれ電場強度に応じた流速及び流れパターンが与えられるように、選択された電圧を少なくとも第１、第２及び第３の溜め部に同時に印加すると共に、第４の溜め部における電圧を制御することにより、前記所定の溜め部からそれに対応する前記チャンネルを経た所定量の第１の物質と前記他の溜め部からそれに対応する前記チャンネルを経た所定量の第２の物質とを前記所定の交点へ向わせる電圧制御段階とを含む方法。
【請求項２】
請求項１の方法において、前記電圧制御段階が、第１の溜め部と第２の溜め部との間に電位差を形成する方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法において、前記電圧制御段階が、前記所定の交点にある第１又は第２の物質を前記所定の交点から、その物質の起点である前記溜め部とは異なる他の少なくとも一つの前記溜め部へ流す方法。
【請求項４】
請求項３記載の方法において、前記電圧制御段階が、前記所定の交点にある第１又は第２の物質のうちの一方の物質を前記所定の交点から流すに先立って、第１、第２、及び第３の溜め部のうちの少なくとも一つから前記所定の交点へ他方の前記物質を流す方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記所定の交点にある第１又は第２の物質を前記所定の交点から流すことが、その物質の起点である前記溜め部とは異なる他の少なくとも二つの前記溜め部へ向わせる方法。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記所定の交点にある第１又は第２の物質を前記所定の交点から流すことが、その物質の起点である前記溜め部とは異なる他の少なくとも三つの前記溜め部へ向わせる方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記所定の交点は、第５チャンネルで接続された第１交点と第２交点とを含み、第１交点には第１溜め部からの第１チャンネル及び第３溜め部からの第３チャンネルが流体連通し、且つ第２交点には第２溜め部からの第２チャンネル及び第４溜め部からの４チャンネルが流体連通する方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記電圧制御段階が、第１溜め部にある前記物質を第１溜め部から第２溜め部へ向って第５チャンネルを通じて移動させる方法。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、第１の物質を第１溜め部に、第２の物質を第３溜め部にそれぞれ配置すると共に、前記電圧制御段階が、第１溜め部にある第１の物質を第１溜め部から第２溜め部へ向って第５チャンネルを通じて移動させ、且つ第３溜め部にある第２の物質を第３溜め部から第５チャンネルへ移動させる方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記電圧制御段階が、前記選択された電圧を少なくとも第１、第２及び第３の溜め部に同時に印加すると共に、第４の溜め部に電圧を印加することにより、第１溜め部にある第１の物質を第１溜め部から第２溜め部へ向って移動させ、且つ第３及び第４チャンネルから第５チャンネルへ移動させる方法。
【請求項１１】
請求項７記載の方法において、前記電圧制御段階が、第５チャンネルにある物質を第５チャンネルから第３と第４とのチャンネルのうちの少なくとも一方のチャンネルへ移動させる方法。
【請求項１２】
請求項７記載の方法において、前記電圧制御段階が、第５チャンネルにある物質を第５チャンネルから第１と第２と第３と第４とのチャンネルのうちの少なくとも二つのチャンネルへ移動させる方法。
【請求項１３】
請求項７記載の方法において、前記電圧制御段階が、第５チャンネルにある物質を第５チャンネルから第１、第２及び第３チャンネルへ移動させる方法。
【請求項１４】
請求項７記載の方法において、前記マイクロチャネルシステムにおける前記物質の流れを検出する検出段階を更に含む方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記検出段階が、前記マイクロチャネルシステムにおける前記物質の前記光学的な検出又は蛍光検出を含む方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法において、前記検出段階が、ＣＣＤ、カメラ、レーザーのうちの少なくとも一つを用いて実行される方法。
【請求項１７】
請求項７記載の方法において、第３と第４とのチャンネルのうちの少なくとも一方のチャンネルにおける前記物質の流れを検出する検出段階を更に含む方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記検出段階が、第３と第４とのチャンネルのうちの少なくとも一方のチャンネルにおける前記物質の流れを検出する検出段階を更に含む方法。
【請求項１９】
請求項１８記載の方法において、前記検出段階が、ＣＣＤ、カメラ、レーザーのうちの少なくとも一つを用いて実行される方法。
【請求項２０】
請求項１記載の方法において、前記接続段階が、前記マイクロチャンネルシステムの一部を構成するチャンネルを有する第５の溜め部を更に設けることを含み、この第５の溜め部は第１、第２、第３、及び第４の溜め部に前記マイクロチャンネルシステムを通じて流体連通する方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記接続段階が、前記マイクロチャンネルシステムの一部を構成するチャンネルを有する第６の溜め部を更に設けることを含み、この第６の溜め部は第１、第２、第３、及び第４の溜め部に前記マイクロチャンネルシステムを通じて流体連通する方法。
【請求項２２】
請求項１記載の方法において、第１及び第２の物質に加えて更に第３の物質を用い、これら第１、第２及び第３の物質をそれそれぞれ第１、第２及び第３の溜め部に配置すると共に、第２溜め部に配置された第２の物質は第１のバッファであり、第３溜め部に配置された第３の物質は第２のバッファである方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、第１バッファと第２バッファとが同一の物質である方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、第１バッファは第２バッファとは異なる物質である方法。
【請求項２５】
請求項１記載の方法において、前記電圧制御段階が、選択された電圧を第４溜め部に印加することを含む方法。
【請求項２６】
請求項２５記載の方法において、前記電圧制御段階が、第１溜め部と第２溜め部との問の電位差と、第３溜め部又は第４溜め部と第１溜め部との間の電位差とを形成する方法。
【請求項２７】
請求項１１記載の方法において、前記電圧制御段階が、第４溜め部を接地させることを含む方法。
【請求項２８】
請求項１記載の方法において、前記接続段階が、少なくとも二つの前記チャンネルに流体連通する更なる交点を形成することを含む方法。
【請求項２９】
請求項１記載の方法において、前記接続段階が、前記所定の交点を第１、第２、第３及び第４の溜め部からそれぞれ延出する前記チャンネルの交差として形成する方法。
【請求項３０】
請求項１記載の方法において、第１の物質と第２の物質とが前記所定の交点で混合される方法。
【請求項３１】
請求項１記載の方法において、前記電圧制御段階が、第１、第２及び第３の溜め部のうちの少なくとも一つの溜め部に印加すべき前記選択された電圧を変化させる方法。
【請求項３２】
流体として又は流体を伴って流動する物質の運動を制御する装置であって、
マイクロチップをなす基体を備え、この基体には、少なくとも第１、第２、第３及び第４の溜め部と、これらの溜め部を互いに流体連通させるマイクロチャンネルシステムとが設けられ、そのマイクロチャンネルシステムは、第１、第２、第３及び第４の溜め部からそれぞれ延出する第１、第２、第３及び第４のチャンネルと、これらのチャンネルのうちの少なくとも二つのチャンネルが交わる所定の交点とを含み、
前記装置は更に、
第１、第２及び第３の溜め部のうち、前記所定の交点に交わるチャンネルを有する一つの所定の溜め部には第１の物質を、前記所定の交点に交わるチャンネルを有する一つの他の溜め部には第２の物質をそれぞれ配置した状態で、これらの第１の物質と第２の物質とにそれぞれ電場強度に応じた流速及び流れパターンが与えられるように、選択された電圧を少なくとも第１、第２及び第３の溜め部に同時に印加すると共に、第４の溜め部における電圧を制御することにより、前記所定の溜め部からそれに対応する前記チャンネルを経た所定量の第１の物質と前記他の溜め部からそれに対応する前記チャンネルを経た所定量の第２の物質とを前記所定の交点へ向わせる電圧制御手段とを備える装置。
【請求項３３】
請求項３２記載の装置において、前記所定の交点は、第５チャンネルで接続された第１交点と第２交点とを含み、第１交点には第１溜め部からの第１チャンネル及び第３溜め部からの第３チャンネルが流体連通し、且つ第２交点には第２溜め部からの第２チャンネル及び第４溜め部からの４チャンネルが流体連通する装置。
【請求項３４】
請求項３２記載の装置において、前記基体は、前記マイクロチャンネルシステムの一部を構成するチャンネルを有する第５の溜め部を更に含み、この第５の溜め部は、第１、第２、第３、及び第４の溜め部へ前記マイクロチャンネルシステムを通じて流体連通する装置。
【請求項３５】
請求項３４記載の装置において、前記基体は、前記マイクロチャンネルシステムの一部を構成するチャンネルを有する第６の溜め部を更に含み、この第６の溜め部は、第１、第２、第３、及び第４の溜め部へ前記マイクロチャンネルシステムを通じて流体連通する装置。
【発明の詳細な説明】
本発明は、米国エネルギ省によりマルチンマリエッタエネルギシステムに与えられた契約DE-AC05-84OR21400による政府援助でなされたもので、政府は本発明に一定の権利を有する。
発明分野
概して本発明は、化学分析、化学検知及び合成用のミニチュア計測に関し、特にミクロ機械加工チャンネルにおける電気的に制御された流体制御に関する。これらの操作は、毛細管電気泳動、液体クロマトグラフィ、流れ注入分析及び化学反応並びに分析用の電気的に制御された流体制御等の各種の用途で用いられる。
発明の背景
実験室における分析は厄介な方法である。化学的及び生化学的情報は、高価な装置、特殊な実験室及び高度に訓練された人を必要とする。このために、実験室の試験は、化学情報の獲得が有用な極くわずかな状況下でしか行われない。研究及び臨床状況における試験の大部分は、粗野な人的方法で行われる。それらの状況は、高い労務費、試薬の浪費、長い所要時間、比較的不正確かつ悪い再現性を特徴とする。生物学及び医療実験室で広く用いられる電気泳動のような技術の実施はこの３０年間それ程変わっていない。
典型的な実験室的方法で行われる操作には、標本調製、化学・生化学変換、サンプル分別、信号検出及びデータ処理などがある。これらの仕事を行うために、しばしば液体が測定され、容量測定精度で分与され、共に混合され、変換及び分別を行う異なった物理的又は化学的環境にさらされる。研究、診断又は開発状況では、一度に数ミクロリットルから数リットルの範囲の液体を用いてこれらの操作が肉眼規模で行われる。個々の操作は、操作の各段階につきしばしば異なった特殊な装置及び器具を用いて連続的行われる。実験室の多重処理段階を要する操作結果は複雑さ、困難及び費用に帰着する。
多くの作業者は、統合的実験システムを設けることによってこれらの問題を解決せんと試みてきた。従来のロボット式装置が改変されてピペット操作、標本処理、溶液混合、分別及び検出操作などを行うようにされてきた。しかし、これらの装置は非常に複雑かつ高価で、その操作には非常な訓練を要するので、用途は僅かな研究開発プログラムに限られてきた。血液レベルのグリコース、電解質及びガスの臨床化学試験のような少数の用途に対して迅速かつ安価に行うための自動臨床診断システムは首尾よく行われてきた。不幸にしてその複雑さ、大規模、大経費のためにこの様な装置は少数の診断環境で適用されるに過ぎない。
実験室用途で広く用いられる統合システムの利点を利用する要望で、この様なシステムをミニチュア化することが提案されてきた。１９８０年代には、バイオセンサが要望を満たすことを期待してその概念の探究にかなりの研究開発努力がなされた。その様な装置は、化学信号をコンピュータ及びその他の処理装置によって解明できる電気信号に変換する、電気化学及び光学のような新しい検出方法と結合される選択的な化学システム又は生物分子を用いている。不幸にして、バイオセンサは商業的に期待外れであった。１９３３年には、米国で一億ドル未満の所得に相当する２０品目未満の製品が入手できるに過ぎなかった。多くの観測者は、この失敗は技術的なものではなくむしろ主として市場の潜在能力に対する誤解を反映するものと見ている。事実、新薬の大量審査、高度な平行遺伝工学研究及び試験、高価な試薬消費及び廃棄物発生を最小化するための顕微化学及び臨床又は診療室診断のような多くの状況でミニチュア統合実験システムにより多大な利益を得ている。
１９９０年代の初期には、従来技術のミニチュア版を作る可能性が論議された。Andreas Manzは、初めてこの考えを科学出版物に示した。彼は、これらを「ミニチュア統合分析システム」、すなわち、「μ−ＴＡＳ」と称し、化学又は生化学サンプルを処理するのに要する各種の要素の顕微鏡版を単一装置に統合し、それによって自動化実験を達成できることを予言した。その時以来ミニチュア成分、特に、分子分離方法及び微小バルブが出現した。しかし、これらのシステムを完全に統合されたシステムに結合することはまだ成功していない。その第１の理由は、極端に狭いチャンネルにおいて微小な流体容量を正確に操作することが技術的に困難であることが判明したことによる。
ミニチュア化の可能な顕著な分野は毛細管電気泳動である。毛細管電気泳動は、溶液中の荷電分子標本を分離する一般的技術になっている。同技術は、熱対流によるバンド拡大効果を減少させ、したがって分解能を向上させるために小毛細管内で行われる。小管は、サンプルを分離毛細管内に注入するためにナノリットル程度の微小容量の物質を扱わなければならないことを意味する。
現在の注入技術は、サンプルを容器から連続分離管内へ注入する電気移動及びサイフォン移動を含む。両サンプリング技術に対して分析毛細管の入力端は、バッファレザーバ（リザーバ）、すなわち、緩衝溜め（貯蔵容器）からサンプル保持溜めへ移されなければならない。従って、機械的操作が必要とされる。サイフォン移動注入の場合サンプル溜めは、一定時間に亘って毛細管の出口端を保持する緩衝溜め上方に上昇される。
電気泳動注入は、毛細管の入口端をサンプルレザーバ内におくと同時に、所定の持続時間に亘って適切に分極された電位を毛細管を横切って加えることにより行われる。より高い電気泳動性を有する不釣合に大量の標本が管内へ移動するので、これはサンプリングバイアスをもたらす可能性がある。両技術において注入持続時間後は、毛細管がサンプルレザーバから除去されて入口バッファレザーバ内へ再配置される。
改良された電気泳動分析及び注入安定性をもたらす方法及び装置に対しては継続的必要性がある。
発明の概要
本発明は、電子制御下においてマイクロチップ上で行われる複雑な生化学及び化学手順を可能にする、マイクロチップ実験装置、すなわち、実験装置を提供する。同マイクロチップ実験装置は、マイクロチップ上の相互接続されかつ統合されたチャンネル系を通して物質を運ぶ、物質処理装置を含む。物質の移動は、統合されたチャンネル内に生成される電場を制御することによって正確に方向付けられる。この様な物質の正確な移動制御は、所望の生化学及び化学手順を行うのに要する正確な混合、分離及び反応を可能にする。
本発明のマイクロチップ実験装置は、正確かつ再現可能な方法で化学物質を分析し、合成する。同装置は、化学分析又は合成で用いられる化学物質を貯蔵する複数のレザーバを接続する統合されたチャンネルを有する本体を含む。一面において、同時に少なくとも５つのレザーバが制御された電位を有し、チャンネルを通してレザーバの少なくとも１つからの物質が少なくとも１つの他のレザーバへ運ばれるようにされる。チャンネルを通した物質の運搬は、選択された一以上の化学又は物理的環境へ物質をさらすことになり、それによって化学物質の分析又は合成に帰着する。
同様にマイクロチップ実験装置は、３つ以上のチャンネルを接続する統合されたチャンネルの１以上の交点を含むのが望ましい。同実験装置は、チャンネル内に生成される電場を制御し、レザーバ内のどの物質が交点を通して運ばれるかを制御させるにようにする。一実施態様においてマイクロチップ実験装置は、混合又は希釈器として作動し、混合すべき物質が取出される２つのレザーバの各電位より低い電位を交点内に生成することによって、交点において物質を結合させる。その代わりに実験装置は、分与器として作動することが可能で、交点を通して正確に制御された量の物質が動電学的に注入される。
少なくとも５つのレザーバの各々において同時に電位を作用させることによって、マイクロチップ実験装置は、化学分析又は合成のすべてを行う完全なシステムとして作動できる。５つ以上のレザーバは、分析すべきサンプル（「アナライト」）の動電学的分離を可能にし、その後試薬レザーバからの試薬と混合される。その代わりに、初めにアナライト及び溶剤の化学反応を行い、次いで反応の結果得られる物質を動電学的に分離することができる。このようなものとして、５以上のレザーバを用いることで、事実上あらゆる化学分析又は合成を行うことができる、統合された実験装置が提供される。
本発明のさらに他の面においてマイクロチップ実験装置は、少なくとも６つのレザーバを相互接続するチャンネルによって形成される２重交点を含む。第１交点は、正確な大きさにされたアナライトプラグ、すなわち、アナライト栓を、廃棄物レザーバに向けて分離チャンネル内に注入するのに用いられる。第２交点の電位は、アナライトプラグの大きさをさらに制御するように選択することができる。さらに、電位は、第１交点からの選択された量の物質が第２交点を通して第４交点に向けて運ばれた後、第５および第６レザーバからの物質が第２交点を通して第１交点および第４交点にに向けてを運ばれるように制御することができる。このような制御は、第１交点を通して第２アナライトプラグが注入可能にされると同時に、アナライトプラグを分離チャンネルの下方に押し下げるのに用いることができる。
他の面においてマイクロチップ実験装置は、少なくとも４つのレザーバを結ぶ統合されたチャンネルによって形成される交点を通して物質の流れを制御するためのマイクロチップ流れ制御装置として作動する。マイクロチップ流れ制御装置は、制御された電位を少なくとも３つのレザーバに同時に加え、交点を通して第１レザーバから第２レザーバへ運ばれる物質の量が交点を通る第３レザーバからの物質の移動のみによって選択的に制御されるようにする。第１レザーバから運ばれる材料を選択的に制御するために、第３レザーバを通して移動される物質は、第１レザーバからの物質と同一の第２レザーバに向けられるのが望ましい。このようなものとして、マイクロチップ流れ制御装置は、交点を通して運ばれる物質の量を選択的に制御するバルブ又はゲートとして作動する。同様にマイクロチップ流れ制御装置は、第１物質の選択された量が交点を通過した後、第１物質が交点を通して第２レザーバに向けて移動するのを防止する、分与器として作動するように構成することもできる。その代わりに、マイクロチップ流れ制御装置は、交点から第２レザーバに向けて第１および第２物質を同時に運ぶように、交点内の第１および第２物質を混合する希釈器として作動するように構成することができる。
本発明の他の目的、利点及び顕著な特徴は、付図と共に本発明の望ましい実施態様を開示する詳細な説明から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の望ましい実施態様を示す構成図である。
図２は、図示のチャンネルの拡大した垂直断面図である。
図３は、本発明の第２の望ましい実施態様によるマイクロチップの上面構成図である。
図４は、図３の交点区域の拡大図である。
図５は、図３０の実施態様の交点を通って移動するアナライトプラグのＣＣＤ像である。
図６は、本発明の第３の望ましい実施態様によるマイクロチップの上面構成図である。
図７は、「ローダミンＢに対するサンプル装荷モード」（陰影区域）のＣＣＤ像である。
図８ａは、アナライト注入に先立つ図６のマイクロチップの交点区域の構成図である。
図８ｂは、押込めモードにおけるサンプル装荷後図８ａと同一区域をとったＣＣＤ蛍光像である。
図８ｃ図は、浮動モードでサンプル装荷後図８ａと同一区域をとった顕微鏡写真である。
図９は、押込め及び浮動注入につき時間に対してプロットされた注入量に対する統合された蛍光信号を示す。
図１０は、本発明の第４の望ましい実施態様によるマイクロチップの上面構成図である。
図１１は、図１０の交点区域の拡大図である。
図１２は、本発明の第５の望ましい実施態様によるマイクロチップ実験装置の上面構成図である。
図１３ａは、図１２のマイクロチップ実験装置の交点区域のＣＣＤカメラでとった上面構成図である。
図１３ｂは、押込めモードにおけるサンプル装荷後図１３ａと同一区域をとったＣＣＤ蛍光像である。
図１３ｃ−１３ｅは、ランモードに切替えた後それぞれ１、２及び３秒においてチャンネル交点から遠ざかるアナライトプラグを順番に示す、図１３ａと同一区域をとったＣＣＤ蛍光像である。
図１４は、２秒間注入されたジダンシル・リシンに対する２つの注入曲線を示す（γは０．９７及び９．７と等しい）。
図１５は、ローダミンＢ（保持小）及びスルフォンローダミン（保持大）に対する注入点からａ）３．３ｃｍ、ｂ）９．９ｃｍ及び１６．５ｃｍでとられた電子写真である。
図１６は、図１５の電子写真から発生される効率データのプロットで、ローダミンＢ（正方形・プラス）、スルフォンローダミン（正方形・プラス）及び各アナライトに対して最高直線適合度（実線）を有するスルフォンローダミン（正方形・点）に対するチャンネル長さとプレートナンバの変化を示す。
図１７ａは、１．５ｋＶ／ｃｍの分離場強度及び０．９ｍｍの分離長さを有する、ローダミンＢ及びフルオレスセインの電子写真を示す。
図１７ｂは、１．５ｋＶ／ｃｍの分離場強度及び１．６ｍｍの分離長さを有する、ローダミンＢ及びフルオレスセインの電子写真を示す。
図１７ｃは、１．５ｋＶ／ｃｍの分離場強度及び１．６ｍｍの分離長さを有する、ローダミンＢ及びフルオレスセインの電子写真を示す。
図１８は、分離長さ１．６ｍｍ（円）及び１１．１ｍｍ（正方形）におけるローダミンＢ及び分離長さ１．６ｍｍ（ダイア）及び１１．１ｍｍ（三角）におけるフルオレスセインに対する電場強度の関数として、分離長さ単位時間当りのプレートナンバの変化を示すグラフである。
図１９は、図１２の装置を用いて電子クロマトグラフィにより分析されたクマリンのクロマトグラフを示す。
図２０は、図１２の装置を用いたミセルの動電学的毛細管クロマトグラフに起因するクマリンのクロマトグラフを示す。
図２１ａ及び２１ｂは、図１２の装置を用いて３つの金属イオン分離を示す。
図２２は、試薬リザーバ及び反応チャンネルを付加的に含む、図３の実施態様によるマイクロチップの上面構成図である。
図２３は、印加される電圧を示す、図２０の実施態様の構成図である。
図２４は、図２２の実施態様を用いて生成される２つ電子写真を示す。
図２５は、本発明の望ましい第６実施態様によるマイクロチップ実験装置の構成図である。
図２６は、図２５の装置を用いてアルギニン及びグリシンに対する注入量再現性を示す。
図２７は、図２５の装置を用いて３つの電気泳動分離のオーバーレイを示す。
図２８は、図２５の装置を用いて注入された量のプロットに対する反応時間を示す。
図２９は、図２５の装置を用いて生成される制限断片の電子写真を示す。
図３０は、本発明の望ましい第７実施態様によるマイクロチップ実験装置の構成図である。
図３１は、図２１の装置の構成図で、所望の流体操作を行うた電圧の順次印加を示す。
図３２は、図２３の流れ操作を行うために加えられる異なった電圧を示すグラフである。
発明の詳細な説明
化学薬品を分析又は合成する、統合された微小実験装置は、流体及び流体を帯びた物質を操作し、所望の変換又は分離を行う選択された化学的又は物理的環境に同流体をさらす正確な方法を必要とする。適切な時間内で化学変換を生成するアナライトの濃度、分子検出の特質、拡散時間及び顕微鏡規模での装置を造る製造方法を前提とすると、統合されたミニチュア微小実験装置は、直径が１乃至１００ミクロン程度の寸法を有するチャンネルになりやすい。この状況下において、動電学的ポンプ作用は、顕微製造、すなわち、ミクロ製造される実験装置内の物質を運ぶのに多面的に用いられかつ有効であることが立証されている。
本発明は、分離において動電学的ポンプ作用を用いるためのみならず、化学変換又はサンプル分離のような他の重要なサンプル処理段階を達成する流体処理を行うために必要な用具を提供する。マイクロチップ構造体内のチャンネルによって接続される複数のポート、すなわち、出入口において同時に電圧を制御することによって、高精度で流体を測定かつ分与し、試薬を混合し、反応成分を培養し、成分を物理的又は生化学的分離位置に向けさせ、成分を検出システムにかけることが可能である。これらの可能性を単一マイクロチップ上で結合させることによって、化学薬品を分析するか若しくは合成する完全な統合されかつ自動化されらたミニチュア自動実験装置を造ることができる。
このような統合されたマイクロ実験装置は、幾つかの成分要素から構成することができる。構成要素は、液体分散システム、液体混合システム、分子分離システム、検出器照準等を含むことができる。例えば、本明細書に記載の通り、ＤＮＡ分子において制限内ヌクレアーゼ位置を確認する比較的完全なシステムを構成することができる。この単一の顕微製造された装置は、このように単一システム内に、ピペット用具、培養器、ゲル電気泳動システム及びデータ取得システムを用いて技術者によって伝統的に行われる諸機能を含んでいる。このシステムにおいては、ＤＮＡは酵素と混合され、混合物は培養され、反応混合物の選択された量が分離チャンネル内へ分与される。
図１は、完全な化学分析又は合成を行うように構成されたマイクロチップ実験装置１０の一例を示す。実験装置１０は、以下に詳述するように、下層又は基部材（図１には図示せず）内へミクロ機械加工されたチャンネルシステムによって相互に接続された６つのレザーバ、すなわち、貯蔵槽１２、１４、１６、１８、２０及び２２を含む。各レザーバ１２−２２は、チャンネルシステム２４の対応するチャンネル２６、２８、３０、３２、３４、３６及び３８と流体連通している。第１レザーバ１２からの第１チャンネル２６は、第１交点３８において第２レザーバ１４からの第２チャンネル２８と接続される。同様に、第３レザーバ１６からの第３チャンネル３０は、第２交点４０において第４チャンネル３２と接続される。第１交点３８は、反応室又はチャンネル４２により第２交点と接続される。第５レザーバ２０からの第５チャンネル３４は、同様に第２交点４０と接続され、第２交点４０がチャンネル３０、３２、３４及び４２の４路交点になるようにされる。第５チャンネル３４は、同様に第３交点４４において第６レザーバ２２からの第６チャンネル３６と交差する。
レザーバに貯蔵された物質は、所望の分析又は合成を行うためにチャンネルシステム２４を通して動電学的に運ばれるのが望ましい。このような動電学的運搬を提供するために実験装置１０は、接地を含む選択可能な電圧レベルを加えることができる電圧制御器４６を含むのが望ましい。このような電圧制御器は、選択可能な電圧レベルを得るために多重電圧デバイダ及び多重リレーを用いて実施することができる。電圧制御器は、レザーバ内の物質に所望の電圧を加えるために電圧ラインＶ１−Ｖ６により６つのレザーバ１２−２２の各々に位置する電極と接続される。電圧制御器は、同様に各交点における電圧を検知するために、それぞれ第１、第２及び第３交点３８、４０、４４と接続されたセンサチャンネルＳ１、Ｓ２及びＳ３を含むのが望ましい。
上記のミニチュア平坦液相分離装置上で動電学的運搬を用いることは、サンプル操作及び液体クロマトグラフに対するポンプ作用機構として実行可能な研究手段である。同様に本発明は、制御されかつ再現可能な様式で各種の流体を混合するために電気浸透流を用いることをも要する。適切な物質製の管内に適切な流体が対応して置かれる場合、管表面における官能基はイオン化可能である。水酸産基で終結する配管物質の場合には、陽子が表面に残りかつ水溶剤に入るであろう。このような条件下では、表面は正味負の電荷を持つと共に溶剤は、大抵表面において帯電された２重層の形で、過剰な正の電荷を持つであろう。管を横切って電場を加えることで、溶液中の過剰な陽イオンは陰極、すなわち、負の電極に引き寄せられるであろう。管を通したこれらの陽電荷の移動は、溶剤を共に引き寄せるであろう。定常状態速度は、式１で与えられる。
ｖ＝εζＥ／４πη                                （１）
ここでｖは溶剤速度、εは流体の誘電率、ζは表面のゼータ定数、Ｅは電場強度、πは溶剤粘性である。式１から、流体流速が電場強度を通して制御可能であることは明らかである。従って、電気浸透はプログラム可能なポンプ作用機構として用いることができる。
図１に示す実験マイクロチップ装置１０は、以下に詳述するように、ＤＮＡ順次配列又は分析、電気クロマトグラフ、ミセラ動電学的毛細管クロマトグラフ（ＭＥＣＣ）、無機イオン分析及び勾配溶出液体クロマトグラフのような、多種類の実験分析又は合成を行うのに用いることができる。第５チャンネル３４は、電気泳動又は電気クロマトグラフ分離に用いられる。従って、ある実施態様においては分離チャンネル又はカラム（柱状体）と呼び得る。反応室４２は、第１および第２レザーバ１２、１４内に貯蔵される任意の２つの化学薬品を混合するのに用いることができる。例えば、第１レザーバ１２からのＤＮＡは、第１交点３８において第２レザーバ１４からの酵素と混合され、混合物は反応室４２で培養され得る。その後培養された混合物は、第２交点４０を通して分離のために分離カラム３４内へ運ぶことができる。第６レザーバ２２は、第３交点４４において分離カラム３４で分離された物質と混合される蛍光ラベル（標識化同位体）を貯蔵するのに用い得る。次いで、第３交点４４及び第５レザーバ２０間で標識化された物質を分析するために、適切な検出器Ｄを用いることができる。第１交点３８及び反応室４２における予備・分離カラム反応並びに第３交点４４におけるポスト・分離カラム反応に備えることにより、実験装置１０は、従来の実験室で通常人手により行われる多くの標準実験室技術を実施するのに用いることができる。さらに、実験装置１０の要素は、より複雑な実験手順を解明するためにより複雑なシステムを構成するのに用いることができる。
実験マイクロチップ装置１０は、下層又は基部材（図１には図示せず）を含む。これは長さが約２インチ幅が約１インチの顕微鏡スライド（Corning, Inc. #2947）でもよい。ガラスが望ましい材料であるが、融解石英、結晶石英、プラスチック及びケイ素（もしその低効率を変えるように表面が十分処理されるなら）のような類似の材料を用いてもよい。マイクロチップ内のチャンネルを通して動電学的に運ばれる物質に比較的高い電場を加えることができるように、硝子又は融解石英のような非伝導材料を用いるのが望ましい。ケイ素のような半導体物質を用いることもできるが、印加される電場は通常最低（現行技術による絶縁層を用いて１ｃｍ当り約３００ボルト未満）に保つことを要する。これは動電学的移動上不十分であろう。
チャンネルパターン２４は、化学的湿式エッチングを伴なう標準写真平板手順を用いて下層の平坦面に形成される。チャンネルパターンは、正の光硬化性樹脂（Shipley 1811）及びｅ・ビームによるクロムマスク（Institute of Advanced Manufacturing Sciences, Incs）を有する下層上に転写してもよい。パターンはＨＦ／ＮＨ4Ｆ溶液を用いて化学的にエッチングしてもよい。
チャンネルパターン形成後、直接結合技術を用いてカバ−プレートが下層に接着され、それによって下層及びカバ−プレート表面は、先ず薄めたＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ2溶液中で加水分解され、次いで合体される。カバ−プレートが下層に適切に接着していることを保証するためにその後組立体は約５００℃で焼鈍される。
カバ−プレートの接着に次いで、レザーバが下層に固定され、カバ−プレート部分は、エポキシ樹脂又はその他の適切な手段により間に挟み込まれる。レザーバは、軸方向両端が開放された円筒形でよい。概して、各レザーバ内にプラチナワイヤ電極を設けることにより電気的接触がなされる。電極は、以下に述べるような方法で、所望の電位を選択された電極に加える電圧制御器４６と接続される。
第１チャンネルの断面は図２に示す。断面は、統合された各チャンネルのものと同一である。下層に非結晶材料（ガラスのような）を用い、チャンネルが化学的に湿式エッチングされる場合には、等方性エッチングが生じる。すなわち、ガラスはあらゆる方向に一様にエッチングされ、結果的に生じるチャンネル形状は台形になる。台形の断面は、光硬化性樹脂の縁における化学的エッチング処理による「アンダ−カット（下すかし）」に起因する。一実施態様においては、チャンネル断面は、深さ５．２μｍ、頂幅５７μｍ、底幅４５μｍの寸法を有する。他の実施態様のチャンネルは、深さｄ＝１０μｍ、上幅ｗ１＝９０μｍ、下幅ｗ２＝７０μｍの寸法を有する。
本発明の重要な面は、チャンネルシステム２４を通して行われる物質の制御された動電学的運搬である。この様な制御された動電学的運搬は、チャンネル２４の１以上の交点を通してレザーバの１つから選択された量の物質を分与するのに用いることができる。その代わりに、既に触れた通り、２つのレザーバからの物質の選択された量を交点に運び、そこで物質を所望の濃度に混合することができる。
ゲート制御分与器
図３に示す実験成分１０Ａは、チャンネル構造体２４Ａを通して物質を運ぶ望ましい方法を実施するのに用いることができる。各番号に続くＡは、Ａを除いた同一番号を持つ図１の類似の要素に相当することを示す。簡単にするために、電極及びチャンネルシステム２４Ａを通して物質の運搬を制御する電圧制御器との接続は、図３には示していない。
図３に示す実験マイクロチップ装置１０Ａは、第１チャンネル２６Ａから交点４０Ａへのアクセス、すなわち、通路を動電学的に開閉することにより、交点４０Ａを通して第１レザーバ１２Ａから第４レザーバ２０Ａに向けて運ばれる物質の量を制御する。こういうものとして、実験マイクロチップ装置１０Ａは、制御された動電学的バルブを本質的に実施している。この様な動電学的バルブは、単一物質の選択された量を分与する分与器として若しくは交点４０Ａにおいて複数の物質の選択された量を混合するミキサとして用いることができる。概して「電気浸透」は、流体物質を運ぶのに用いられ、電気泳動は、イオンを取り巻く流体物質を運ぶことなくイオンを運ぶのに用いられる。従って、ここで用いられるように、「物質」の用語は、流体及びイオンを含むあらゆる形の物質を対象とするように広く用いられる。
実験装置１０Ａは、分離チャンネル３４Ａを通して流体の連続的な一方向性の流れを与える。この注入又は分与機構では、電圧を変えるか若しくは１（又は２）のレザーバから電圧を除去して第４レザーバ２０Ａを接地電位に保つことのみを必要とする。これは、単極電源で注入及び分離を行うことを可能にしている。
交点４０Ａの拡大図は図４に示す。方向を示す矢印は、交点４０Ａにおける流れ側面の時間順序を示す。実線の矢印は、初期の流れパターンを示す。各種のレザーバにおける電圧は、記載した流れパターンを得るために調節される。初期流れパターンは、十分な速度で第２物質を第２レザーバ１６Ａからもたらし、レザーバ１２Ａから交点４０Ａに運ばれた第１物質のすべてが第３レザーバ１８Ａに向けて押し込まれるようにする。概して電位分布は、最高電位が第２レザーバ１６Ａにあり、僅かに低い電位が第１レザーバ１２Ａに、さらに低い電位が第３レザーバ１８Ａにあり、第４レザーバ２０Ａが接地されるように配分される。これらの条件下において第４レザーバ２０Ａに向かう流れは、第２レザーバ１６Ａからの第２物質のみである。
交点４０Ａを通して第１レザーバ１２Ａから物質を分与するためには、第２レザーバ１６Ａの電位を第１レザーバ１２Ａの電位より小さい値に切り替えるか若しくは図４に示す短いダッシュの矢印により示される流れを与えるために、レザーバ１６Ａ、１８Ａの電位を一時的に浮動させることができる。これらの条件下での主な流れは、第１レザーバ１２Ａから下方に分離チャンネル廃棄物レザーバ２０Ａに向かうものとなる。第２及び第３レザーバ１６Ａ、１８Ａからの流れは、小さくていずれかの方向になり得る。この状態は、第１レザーバ１２Ａから交点４０Ａを通して所望の量の物質を分離チャンネル３４Ａ内へ運ぶのに十分な時間保たれる。所望の物質が交点４０Ａを通過するのに十分な時間後、第１レザーバ１２Ａからの付加的物質が交点４０Ａを通して分離チャンネル３４Ａに向けて流れるのを防止するために、電圧分布は元の値に戻るよう切り替えられる。
このようなゲート「制御分与器」の一用途は、分離チャンネル３４Ａにおける電気泳動又はクロマトグラフ分離のために第１レザーバ１２Ａから制御された可変サイズのアナライトプラグを注入することである。この様なシステムでは、第１レザーバ１２Ａは、アナライトを貯蔵し、第２レザーバ１６Ａは、イオンバッファ（緩衝剤）を貯蔵し、第３レザーバ１６Ａは、第１廃棄物レザーバであり、第４レザーバ２０Ａは、第２廃棄物レザーバである。第１レザーバ１２Ａから小さな可変アナライトプラグを注入するために、浮動バッソァ及び第１廃棄物レザーバ１６Ａ、１８Ａは、短時間（約１００ｍｓ）に亘って単に浮動させ、アナライトが分離カラム３４Ａを下方に移動できるようにする。注入プラグを中止するために、バッファレザーバ１６Ａ及び第１廃棄物レザーバ１８Ａの電位が再び加えられる。その代わりに、一連のバルブ作動は、レザーバ１６Ａ及び１８Ａを交点４０Ａの電位にし、その後それらの元の電位に戻すことによって行える。この方法の欠点は、注入されたプラグの構成が電気泳動的な移動性バイアスを持ち、それによってより早い移動混合物がより遅いものより優先的に分離カラム３４Ａ内へ導入されることである。
図５においては、図３の実施態様の交点を通して連続的に移動するアナライトプラグのＣＣＤ像を見ることができる。実験装置１０Ａを通してポンプで注入されるアナライアトは、ローダミンＢ（陰影区域）であり、注入交差、すなわち、注入交点のＣＣＤ像の方位は図３のものと同一である。第１像Ａは、注入に先立って注入交点を通して第１廃棄物レザーバ１８Ａに向けてポンプで押し込まれるアナライトを示す。第２像Ｂは、分離カラム３４Ａ内へ注入されるアナライトプラグを示す。第３像Ｃは、注入プラグが完全に分離カラム３４Ａ内へ完全に導入された後、注入交点から遠ざかって移動するアナライトプラグを示す。パッファ及び第１廃棄物レザーバ１６Ａ、１８Ａにおける電位は、１００ｍｓの間浮動され、同時にサンプルは、分離カラム３４Ａ内へ移動された。さらなるアナライトが、交点４０Ａを通して分離カラム３４Ａ内へ移動するのを防止するために像Ｃの時までに閉じたゲートモードが再開始され、長さ１４２μｍのきれいな注入プラグが分離カラム内へ導入された。以下に述べるように、ゲート制御された注入器は、全プレート高さのより少ない小部分のみに寄与するのみである。注入プラグ長さ（容量）は、注入時間及びカラム内の電場強度の関数である。注入されたプラグの形状は、押し分けて進むバファ流れの方向性のために僅かに斜めにされる。しかし、ピーク区域を積分することによって決められる、所与の注入期間に亘り注入される量の再現性は、一連の１０繰り返し注入に対して１％ＲＳＤである。
図３の実験マイクロチップ装置１０Ａ及び本発明による方法を用いて電気泳動実験が行われた。アナライト蛍光発光を用いてチップ動力学が分析された。チップの指定区域を検査するために電荷転送素子（ＣＣＤ）カメラが用いられ、光電子増倍管（ＰＭＴ）が単一点事象を追跡した。ＣＣＤ（Princeton Instrument, Inc, TE/CCD-512TKM）カメラが立体顕微鏡（Nikon SMZ-U）に取付けられ、３Ｗで作動され、直径約２ｃｍの円形スポットに拡大されたビームを備えたアルゴンネオンレーザ（５．１４５ｎｍ，Coherent Innova 90）で実験装置１０Ａが照明された。収集光学系を有するＰＴＭは、光軸がマイクロチップ面に対して垂直になるようにマイクロチップ下方に配置された。レーザは約２０ｍＷで作動され、ビームは、マイクロチップ面に対して４５°でかつ分離チャンネルに平行になるようにマイクロチップに突き当たるようにされた。レーザビーム及びＰＴＭ観測軸は、１３５°の角度で分離された。点検出機構は、ＰＴＭ（Oriel 77347）の応答を監視する電位計（Keithley 617）を有する、ヘリウム・ネオンレーザ（５４３ｎｍ，PMS Electro-optics LHGP-0051）を用いた。電気泳動用の電圧制御器４６（Spellman CZE 1000R）は、接地に対して０乃至＋４．４ｋＶで作動された。
図３及び４に関して述べたゲート制御された種類の注入器は、従来の電気浸透注入のように、電気泳動移動性に基づくバイアスを示す。それでもなお、この研究方法は、電圧切替え要件及び製造面で簡単であると共に分離チャンネルを通して連続的な一方向性流れを与える。さらに、ゲート制御注入器は、分離チャンネル３４Ａ内へ流入される可変容量の流体を、印加電位により正確に制御される方法でバルブ調節する方法を提供する。
ゲート制御分与器１０Ａの他の用途は、所望の分量の物質を制御された方法で希釈又は混合することである。このような混合機構を実施するためには、第１及び第２レザーバ１２Ａ、１６Ａからの物質を混合するように第１及び第２チャンネル２６Ａ、３０Ａの電位は、混合中交点４０Ａの電位より高く保つ必要がある。このような電位は、交点４０Ａを通して第１及び第２レザーバ１２Ａ、１６Ａからの物質を同時に移動させ、それによって２つの物質を混合させるようにする。第１及び第２レザーバ１２Ａ、１６Ａに加えられる電位は、各物質の選択された濃度を達成するために望まれるように調節することができる。各物質の所望の量を分与した後、第２レザーバ１６Ａの電位は、第１レザーバ１２Ａからのさらなる物質が交点４０Ａを通って第３レザーバ３０Ａに向けて運ばれることを防止するのに十分な方法で増加させることができる。
アナライト注入器
本発明によるマイクロチップアナライト注入器１０Ｂは図６に示す。チャンネルパターン２４Ｂは、既に述べた通り、下層４９内にミクロ機械加工された４つの別個のチャンネル２６Ｂ、３０Ｂ、３２Ｂ及び３４Ｂを有する。各チャンネルは、各チャンネル部分の終端上方に取付けられた付属のレザーバを有し、４つのすべてのチャンネルは、４路交点４０Ｂの形で一端で交差する。各接合部の反対端は、下層４９に取付けられたカバープレート４９′の周辺端をわずかに越えて伸びる終端を与える。図６に示すアナライト注入器１０Ｂは、レザーバ１２Ｂからよりはむしろレザーバ１６Ｂから交点４０Ｂを通して物質のある量が注入され、注入された物質の量が交点のサイズにより制御されるような方法で電位が加えられることを除けば、ゲート制御分与器１０Ａとほぼ同一である。
図６に示す実施態様は、各種の物質操作に用いられる。一用途においては、実験装置は、分離チャンネル３４Ｂで分離するために交点４０Ｂを通してアナアライトレザーバ１６Ｂからアナライトを注入するために用いられる。アナライト注入器１６Ｂは、「装荷（負荷）」モード又は「ラン（走行）」モードのいずれかで作動され得る。レザーバ１６Ｂは、アナライトを供給され、レザーバ１２Ｂは、バッファを供給される。レザーバ１８Ｂは、アナライト廃棄物レザーバとして作動し、レザーバ２０Ｂは、廃棄物レザーバとして作動する。
負荷モードにおいては、少なくとも２種類のアナライト導入が可能である。先ず、「浮動装荷」として知られるものでは、レザーバ１８Ｂが接地され、電位はアライトレザーバ１６Ｂに加えられる。同時に、レザーバ１２Ｂ及び２０Ｂが浮動する。すなわち、それらのレザーバは、電源及び接地のいずれにも結合されない。
第２負荷モードは、「押込められた」装荷モードで、そこでは、以下に詳述するように、注入プラグ形状を制御するために、レザーバ１８Ｂが接地され、電位はレザーバ１２Ｂ、１６Ｂ及び１８Ｂに同時に加えられる。ここで用いられるように、複数のレザーバにおいて電圧を同時に制御することは、化学的に同一に重要な時間期間において各電極が作動中の電源に接続されることを意味する。レザーバを浮動させることは、レザーバの電極を電源から外すことを意味する。すなわち、レザーバの電位が制御されないことを意味する。
ランモードにおいては、電位はバッファレザーバ１２Ｂに加えられ、レザーバ２０Ｂが接地されると共にレザーバ１６Ｂ及び１８Ｂの電位がレザーバ１２Ｂの約半分にされる。走行モード中にバッファレザーバ１２Ｂに加えられ比較的高い電位は、分離カラム３４Ｂ内の廃棄物レザーバ２０Ｂに向けて交点４０Ｂ内のアナライトを移動させるようにする。
ローダミンＢ及びスルフォローダミン１０１（Exciton Chemical Co., Inc.）を、ＣＣＤ像に対しては６０μＭでかつ点検出に対しては６μＭでアナライトととして用いて診断実験が行われた。ホウ砂バッファ（５０ｍＭ，ｐＨ９．２）は、実験中は移動性の相であった。空間的に適切に定められた小量（約１００ｐＬ）かつ小長手範囲（約１００μｍ）の注入、これらの種類の分析を行う場合注入が有利である。
アナライトは、前面エレクトロフェログラムとして注入交点内へ装荷され、最も遅いアナライト成分の前面が一度注入交差、すなわち、交点４０Ｂを通過すると、アナライト分析の準備は整う。図７において、ＣＣＤ像（その領域は破線方形）は、アナライト５４（陰影区域）の流れパターン及び注入交点４０Ｂの区域を通してバッファ（白い区域）を示す。
アナライトの流れを押込むことにより、アナライトプラグの容量は時間を通して安定する。わずかに非対称なプラグ形状は、バッファ、アナライト及び廃棄物レザーバに１．０ｋＶが加えられる、アナライト廃棄物レザーバが接地される場合に、バッファチャンネル２６Ｂ（４７０Ｖ／ｃｍ）及び分離チャンネル３４Ｂ（１００Ｖ／ｃｍ）における電場強度の差に起因する。しかし、異なった電場強度は、注入されるアナライアトプラグの安定性には影響を与えない。理想的には、アナライトプラグが分離チャンネル３４Ｂ内へ注入される場合、注入交差、すなわち、交点４０Ｂ内のアナライトのみが分離チャンネル内へ移動するであろう。
注入交差における注入プラグの量は、約１２０ｐＬで、プラグ長さは、１３０μｍである。アナライトチャンネル３０Ｂ及びアナライト廃棄物チャンネル３２Ｂ内のアナライト５４の部分は、分離チャンネル３４Ｂ内へ引き込まれる。分離（ラン）モードへのスイッチに続いて、注入プラグの量は約２５０ｐＬで、プラグ長さは、２０８μｍである。これらの寸法は、スイッチが分離モードにされる直後にとれた一連のＣＣＤ像から推定される。
装荷の２つのモードが、分離チャンネル３４Ｂ内への導入に対して試験された。アナライトは、アナライトレザーバ１６Ｂ内に置かれ、両注入機構においてレザーバ１８Ｂ、すなわち、廃棄物レザーバの方向で運ばれた。２種類の注入につきＣＣＤ像は図８ａ−８ｃに示す。図８ａは、チャンネル端部に加えて交点４０Ｂを示す。
図８ｂのＣＣＤ像は、走行モードに切り替えられる直前の押込まれたモードにおける装荷に関するものである。押込みモードにおいては、アナライト（黒の背景に対して白で示す）は、レザーバ１６Ｂからレザーバ１８Ｂへ（左から右へ）電気泳動的かつ電気浸透的にポンプで送り込まれ、バッファレザーバ１２Ｂ（頂部）及び廃棄物レザーバ２０Ｂ（底部）からのブッファは、レザーバ１８Ｂ（右）に向けて進む。レザーバ１２Ｂ、１６Ｂ、１８Ｂ及び２０Ｂに加えられる電圧は、それぞれ４００、２７０、６９０及び２０Ｖ／ｃｍの対応チャンネルの電場強度に相当する電源出力のそれぞれ９０、９０、０及び１００％であった。廃棄物レザーバ２０Ｂに加えられる電圧は、アナライトレザーバ１８Ｂに加えられるものより高いが、アナライアトチャンネル３０Ｂと比較した分離チャンネル４３Ｂの追加的長さが、追加的電気抵抗を与え、従って、アナライトバッファ１６Ｂから交点への流れが優勢になる。その結果として、交点４０Ｂのアナライトは台形の形状を有し、この物質運搬パターンによりチャンネル３２Ｂで空間的に制限される。
図８ｃは、浮動モード装荷を示す。アナライトは、押込まれた注入を除けば、レザーバ１２Ｂ及び１８Ｂには電位が加えられないので、レザーバ１６Ｂから１８Ｂへポンプ移送される。チャンネル部分２６Ｂ及び３４Ｂにおいて移動性相（バッファ）の流れを制御しないことにより、アナライトは、対流及び拡散を通してこれらのチャンネル内へ自由に拡大し、それによって拡大された注入プラグに帰着する。
押込み及び浮動注入を比較すると、押込まれた注入は３領域において優れている、すなわち、注入量の一時的安定性、注入された量の精度及びプラグ長さ。大きく異なった２以上のアナラアイトが分析される場合、一時的安定性を有する注入では、同一量の早く及び遅く移動するアナライトが分離カラム、すなわち、チャンネル３４Ｂ内へ導入されることが保証される。注入量の高度な再現性は、定量分析を行う能力を助長する。より小さなプラグ長さは、より高い分離効率を導き、その結果として、処与の計器に対してより大きな成分容量及びより早い分離へ導く。
各モードの一時安定性を決めるために、アナライトが注入交点４０Ｂに達する直前に、一連のＣＣＤ蛍光像が１．５ｂ秒間隔で集められた。注入されたアナライトの推定量は、交点４０Ｂ及びチャンネル２６Ｂ並びに３４Ｂにおける蛍光発光を積分することにより決定された。この蛍光は時間に対して図９でプロットされている。
押込み注入に対して、注入された量は数秒間で安定し、１％の相対標準偏差（ＲＳＤ）の安定度を示し、これは照明レーザの安定度と比較できる。浮動注入に対しては、分離チャンネル３４Ｂ内へ注入されるアナライトの量は、チャンネル２６Ｂ及び３４Ｂ内へのアナライトの分散的流のために、時間と共に増大する。３０秒注入に対して注入プラグの量は、約９０ｐＬで、押込み注入の約３００ｐＬに対して安定しかつ浮動注入に対しは時間と共に増大する。
交点４０Ｂから０．９ｃｍの点において分離チャンネルを監視することにより、分離チャンネル３４Ｂ内への導入に次いで、バンド断面区域を積分することによって押込み注入モードに対する再現性が試験された。持続時間４０秒で６つの注入に対し、押込み注入に対する再現性は、０．７％ＲＳＤである。この測定された安定性の多くは、光学測定システムからのものである。押込み注入は、注入された量の一時的安定度のためにより高い再現性を有する。電気的に制御された電圧切替えで、ＲＳＤは両機構に対して改良が期待される。
注入プラグ幅及び、究極的に、アナライト間の分解能は、アナアライトの流れパターン及び交点４０Ｂの寸法の双方に依存する。このカラムに対し、チャンネル頂部における幅は９０μｍであるが、１０μｍのチャンネル幅が可能で、これは押込み注入で、９０ｐＬから１ｐＬへの注入プラグ量の減少につながるであろう。
「押込み」及び「浮動」注入機構につき既に述べたように、分離チャンネルにおける流れを逆にすることには望ましくない状況が存在する。この様な場合の例としては、先のプラグが完全に溶出される前に新しいサンプルプラグを注入すること若しくは試薬が継続的に分離カラムの端内へ注入されているときにポスト・カラム反応装置を用いることであろう。後者の場合において、概して試薬を分離チャンネル内へ逆流させることは望ましくないであろう。
代替アナライト注入器
図１０は、代わりの注入装置１０Ｃを示す。同装置は、それぞれ異なった６つのレザーバ１２Ｃ、１６Ｃ、１８Ｃ、２０Ｃ、６０及び６２と接続された６つの異なったポート、すなわち、チャンネル２６Ｃ、３０Ｃ、３２Ｃ、３４Ｃ、５６及び５８を有する。各要素の後の文字Ｃは、図１の対応する番号を持つ要素と類似していることを示す。マイクロチップ実験装置１０Ｃは、注入交差、すなわち、交点４０Ｃを備える点で、前述の実験装置１０、１０Ａ及び１０Ｂと類似している。図１０の実施態様では、分離チャンネルにおいて流れを逆転させる問題を克服するために、第２交点６４及び２つの追加レザーバ６０並びに６２が設けられる。
先の実施態様と同様に、アナラアイト注入装置１０Ｃは、電気泳動又はクロマトグラフによるか若しくは他の処理要素内へ物質を分与することによってアナライト分離を実施するのに用いることができる。実験装置１０Ｃにおいて、レザーバ１２Ｃは分離バッファを含み、レザーバ１６Ｃはアナライトを含み、レザーバ１８Ｃ及び２０Ｃは廃棄物レザーバである。交点４０Ｃは、図６の実施態様におけるように、押込みモードで作動されるのが望ましい。レザーバ６０及び６２と流体連通する下方交点６４は、追加の流れを与えるために用いられ、連続したバッファ流が下方の廃棄物レザーバに向けられるようにし、必要な場合には、上方の注入交点４０Ｃに向けられるようにする。レザーバ６０及び付属のチャンネル５６は必要ではないが、プラグが下方交点６４を通るときバンド拡大を低減させることにより性能が改善される。多くの場合、レザーバ６０からの流れは、レザーバ６２からのものと対称である。
図１１は、２つの交点４０Ｃ及び６４の拡大図である。異なった種類の矢印は、アナライトプラグを分離チャンネル内へ注入するときにおける各場合につき流れの方向を示す。実線の矢印は、初期の流れパターンを示し、そこではアナライトが動電学的に上方交点４０Ｃ内へポンプ送入され、レザーバ１２Ｃ、６０及び６２からの物質流によりこの同一交点に向けて「押込まれる」。注入交点４０Ｃからの流出は、アナアライト廃棄物レザーバ１８Ｃに向けてなされる。同様にアナライトは、レザーバ１６Ｃからアナライト廃棄物レザーバ１８Ｃへ流れる。これらの条件下において、レザーバ６０（及び６２）からの流れは、同様に廃棄物レザーバ２０Ｃに向けて分離チャンネル３４Ｃを下方に進む。このような流れパターンは、６つのすべてのレザーバにおいて電位を同時に制御することによって作られる。
アナライトプラグは、短いダッシュの矢印により示す流れの断面形へ切り替えることによって、注入交点４０Ｃを通して分離チャンネル３４Ｃ内へ注入される。バッファは、レザーバ１２Ｃから注入交点４０Ｃへ下方に流れると共にレザーバ１６Ｃ、１８Ｃ及び２０Ｃに向けて流れる。既に述べたように、この流れの形でアナライトプラグは廃棄物レザーバ２０Ｃに向けて分離チャンネル３４Ｃ内へ押込まれる。この流れの形は、十分な時間に亘って保持され、アナライトが下方交点６４を通過するようにされる。レザーバ６０及び６２から分離チャンネル３４Ｃ内へのバッファの流れは、歪みを最小にするために短い矢印で示すように低くなければならない。
上下交点４０Ｃ及び６４間の距離は、それぞれプラグ歪み及び２つの流れ状態間の切替えタイミングの臨界性を最小にするために、できるだけ小さくしなければならない。適切な流れ制御のための電位調節を助長するために、電位を検知する電極を下方交点及びチャンネル５６並びに５８に配置してもよい。下方交点６４における正確な流れ制御は、望ましくないバンド拡大を防止するために必要である。
サンプルプラグが下方交点を通過後、長いダッシュの矢印で示すように、元の流れの断面形を与えるために電位は初期状態に切り替えられる。この流れパターンは、バッファを分離チャンネル３４Ｃ内へ流すと同時に、次のアナライトプラグが上方交点４０Ｃのプラグ形成領域へ運ばれることを可能にする。この注入機構は、迅速な連続注入を可能にすると共に遅く移動するサンプル又はもつれたポリマ溶液のように上方交点４０Ｃにおいて均一なサンプルを得るのに長時間を要するようなものにとって非常に重要である。この押込み注入の実施で、図２２に関して以下にのべるように、ポスト・カラム反応にとって必要とされるように、分離チャンネルを通して一方向性流れが維持される。
ヘビ状チャンネル
本発明の他の実施態様は、図１２に示す改変されたアナライト注入器装置１０Ｄである。図１２に示す実験装置１０Ｄは、分離チャンネル３４Ｄがヘビ状路に続くことを除けば、図６に示す実験装置１０Ｂとほぼ同一である。分離チャンネル３４Ｄのヘビ状路は、ヘビ状路を実施するために要する下層４９Ｄの面積を実質的に増大させることなく、分離チャンネルの長さを大きく増大させることができる。分離チャンネル３４Ｄの長さを増大させることは、アナライト要素を区別する装置１０Ｄの能力を増大させる。特に好ましい一実施態様においては、レザーバ１６Ｄから１８Ｄまでのびる囲まれたチャンネルの長さ（カバ−プレート４９Ｄ′によって覆われた）は１９ｍｍで、チャンネル部２６Ｄの長さは６．４ｍｍで、チャンネル３４Ｄの長さは１７１ｍｍである。分離カラムとして役立つチャンネル３４Ｄの各巻きの巻き半径は０．１６ｍｍである。
改変されたアナライト注入器装置１０Ｄを用いて分離を行うために、既に述べた装荷方法の一つを用いて、先ずアナライトが注入交点４０Ｄ内へ装荷される。マイクロチップ実験装置１０の交点４０Ｄ内へアナライトが装荷された後、作動電圧が人手により装荷モードから走行（分離）モードに切替えられる。図１３ａ−１３ｅは、以下の条件を用いて行われるローダミンＢ（小保持）及びスルフォローダミン（大保持）の分離を例示する。
Ｅinj＝４００Ｖ／ｃｍ
Ｅrun＝１５０Ｖ／ｃｍ
バッファ＝５０ｍＭ（ｐＨ９．２のホウ砂）
ＣＣＤ像は、１秒間隔で分離工程を示す。図１３ａは、チップ像断面の構成を示し、図１３ｂ−１３ｅは、分離段階を示す。
図１３ｂは、押込み注入を示し、レザーバ１２Ｄ、１６Ｄ及び２０Ｄには同一電圧が加えられ、レザーバ１８Ｄは接地された。図１３ｃ−１３ｅは、走行モードに切り替えられた後、それぞれ１秒、２秒及び３秒において、交点から遠ざかるプラグを示す。図１３ｃにおいて注入プラグは、９０°転向付近を移動中で、プラグの内側の進行が外側より遅いことによりバンド歪みが見られる。図１３ｄにおいてアナライトは、平行四辺形に歪んだ明瞭なバンドに分離した。図１３ｅにおいてバンドは、半径方向の拡散、すなわち、効率損失への付加的寄与により十分に分離され、より長方形（すなわち、平行四辺形の崩壊）に近づいた。
スイッチが負荷モードから走行モードに切替えられるとき、後追いを避けるため、注入プラグがアナライト流からはっきり分かれることが望ましい。これは、交点４０Ｄの電位をレザーバ１２Ｄより低くかつレザーバ１６Ｄ、１８Ｄ及び２０Ｄより高く保つことにより、移動性相、すなわち、バッファをチャンネル２６Ｄからチャンネル３０Ｄ、３２Ｄ及び３４Ｄ内へ同時にポンプ送入することにより達成される。
代表的な実験において交点４０Ｄは、走行モード中レザーバ１２Ｄの電位の６６％に保たれた。これは、分離チャンネル３４Ｄの電場強度を大幅に下げることなく、注入交点４０Ｄから遠ざかってチャンネル３０Ｄ及び３２Ｄを下方に移動するアナライトの十分な流れを提供する。代わりのチャンネル設計で、レザーバ１２Ｄに加えられる電位のより大きな部分を分離チャンネル３４Ｄを横切って下降するようにし、それによって効率を改良することができるであろう。
この３路の流れは、チャンネル３０Ｄ及び３２Ｄ（それぞれ左及び右）内のアナライトが時間と共に交点からさらに遠ざかるとき、１３ｃ−１３ｅに示されている。３路の流れは、分離チャンネル３４Ｄ内へのアナライトの流出を最小にする、適切に定められた再現可能な注入を可能にする。
検出器
これらの統合された化学分析又は合成用のマイクロシステムをもくろむ大抵の用途において、従来の実験測定工程と類似した１以上の点においてチャンネルに存在する物質を計量することが必要となろう。計量に用いられる技術には、光学濃度、屈折率変化、蛍光発光、化学ルミネセンス、各種の方式のラマン分光学（スペクトル）、電気伝導度測定、電気化学的電流測定、音響波伝播測定等がある。
光学濃度測定は、電磁スペクトルのＵＶ（紫外線）部分における現象の一般性のために従来の実験分析システムで一般的に用いられる。光学濃度は、光力が計量すべき既知の長さの物質を通過するとき衝突する光力の減衰を測定することによって決められる。光音響及び光熱技術を含むレーザ技術による代りの方法も可能である。この様な測定値は、ここで述べたマイクロチップ技術で用いることが可能で、ミクロ製造装置に対する光学波基準を潜在的に統合する付加的利点もある。周波数変換要素の有無にかかわらずＬＥＤ（発光ダイオード）及びダイオードレーザのような固体光源を用いることは、システムサイズの縮小にとって魅力的であろう。固体光源及び検出器技術をチップ上に統合することは、現在は不可能に見えるがいつか興味あるものとなろう。
屈折率検出器は、現象の一般性のために流れ化学分析システムの計量に広く用いられてきたが、光学濃度より感度が低かった。レーザに基づく屈折率検出器の実施は、ある状況においては十分な感度を与えかつ簡便さの利点がある。蛍光発光（又は蛍光発光検出）は、極端に高感度な検出方法で、一般的に生物物質の分析に用いられる。検出に対するこの研究方法は、当技術の感度及び操作及び分析できる小容量（ピコリットル範囲の容量が可能）のために、ミニチュア化学分析及び合成装置に多大の関連性がある。例えば、濃度１ｎＭのアナライトの１００ｐＬサンプルは、処理及び検出すべきアナライト分子は６０，０００に過ぎない。蛍光検出による溶液中の単一分子の検出を示す幾つかの例は文献に記載されている。レーザ源は、超高感度測定用の励起源としてしばしば用いられるが、希ガス放出ランプ及びＬＥＤのような従来の光源も同様に用いられる。蛍光発光は、光電子増倍管、ホトダイオード又は他の光センサで検出できる。アナライトの空間分散の像を造るためにＣＣＤ（電荷転送素子）検出器のようなアレー検出器も用い得る。
ラマンスペクトルは、マイクロチップ装置のための検出方法として用いることができる。分子振動情報が得られる利点はあるが、感度が比較的に低い欠点がある。面増強ラマンスペクトル（ＳＲＥＳ）効果を通して感度は増大されたが、これも研究レベルにおいてのみである。電気的及び電気化学的な検出方法は、ミクロ製造された構造体上への統合化が容易なこと及び潜在的に得られる高感度のために、マイクロチップ装置上での実施に対し特に興味がある。電気的計量への最も一般的な研究方法は、伝導度測定、すなわち、イオンサンプルの伝導度測定である。イオン化されたアナライトの存在は、それに対応して流体の伝導度を増大させることが可能で、従って、計量を可能にする。電流測定は、処与の電位において、電極における分子の酸化又は還元に起因する電流を、電極を通して測定することを意味する。電極の電位を制御することによりある感度選択性は得られるが、それは最低のものである。電流測定検出は、一般的溶媒を用いて可能な限られた電位内で酸化又は還元できる分子が限定されるので、伝導度測定より一般的ではない。１ｎＭ範囲の感度が、小容量（１０ｎＬ）で報告されている。この技術の他の利点は、測定される電子の数が（電流を通して）存在する分子の数と等しいことである。これらの検出方法のいずれかで必要とされる電極は、写真平板パターン化及び金属堆積工程を通してミクロ製造された装置上に含めることができる。同様に電極は、化学ルミネセンス検出工程にも用い得る。すなわち、酸化・還元処理を介して励起状態の分子が発生され、その後そのエネルギがアナライト分子に移転され、次いで検出される光子を放出する。
物質の定量化のために同様に音響測定も用い得るが、現在まで広く用いられていない。主としてガス相検出に用いられてきた一方法は、表面音響波（ＳＡＷ）の減衰又は位相偏移である。ＳＷＡの伝播下における下層の表面に対する物質の吸着は、伝播特性に影響を与えて濃度決定を可能にする。ＳＡＷ装置の表面に置かれる選択的な溶剤がしばしば用いられる。同様な技術は本明細書に記載した装置において有用である得る。
本発明のマイクロチップ実験装置の混合能力は、１以上の試薬の追加を含む検出工程に適している。誘導反応は、生化学分析では一般的に用いられる。例えば、アミノ酸、ペプチッド及び蛋白質は、容易に検出可能な蛍光分子を生成するために、一般的にダンシル化（dansylating）試薬又はオルトフタルデアルデヒドで識別される。その代わりに、識別用分子として酵素を用いることが可能で、酵素増強された検出機構を与えるために下層を含めて試薬を加えることができる。すなわち、酵素は、検出可能な生成物を生成する。光学濃度又は蛍光発光のいずれかにより検出度を向上させるために、このような研究方法が従来の実験手順で用いられてきた多くの例がある。統合された混合方法から利益が得られる検出方法の第３の例は、化学ルミネセンス検出である。このような種類の検出シナリオでは、検出可能な光子を放出する励起された状態の分子を生成するために、試薬及び触媒が適切な目標分子と混合される。
アナライト堆積
マイクロチップ実験装置の１０Ｄの感度を向上させるために、分離に先立ってアナライト予備濃縮を行うことができる。濃度強化は、マイクロチップ技術により目標とされる２つの領域、すなわち、環境サンプル及び生物物質を分析する場合特に価値のある手段である。アナライトの堆積は、電気泳動分析と一体化するために好都合な技術である。アナライト堆積を用いるためにアナライトは、分離バッファより低い伝導度を有するブッファ内に用意される。伝導度の差が、アナライトプラグの初め又は終りにおいてアナライト内のイオンを堆積させ、それによってさらに容易に検出される濃縮されたアナライトプラグ部分に帰着する。より洗練された予備濃縮技術には、２つ及び３つのバッファシステム、すなわち、一時的な等速伝達予備濃縮を含む。関連する溶液数が多い程注入技術の実施が困難になることは明らかであろう。予備濃縮段階は、マイクロチップ上で実施するのによく適している。電気浸透的に駆動される流れは、バルブ及びポンプを用いることなく、分離及びサンプルバッファが制御され得るようにさせる。チャンネル間の静止容量接続部分を少なくするように構成することは容易に実現可能で、これにより精度、速度及び再現性を高めることができる。
再び図１２を参照すると、アナライトの予備濃縮は、アナライトを堆積させるために、改変されたゲート制御注入を用いて分離チャンネル３４Ｄの頂部で行われる。先ず、電気浸透流を用いてアナライトプラグが分離チャンネル３４Ｄ上に導入される。次いでアナライトプラグには、バッファレザーバ１６Ｄからのより多くの分離バッファが続くようにする。この時点でアナライトは、アナライトと分離バッファとの境界に堆積する。アナライトバッファプラグの境界近くに堆積する陰イオンとなるダンシル化アミノ酸が、アナライトとして用いられた。分離効率及び検出限度の双方に対する堆積の影響と共にアナライト堆積の実施につき記載された。
マイクロチップ実験装置の１０Ｄによるゲート制御された注入を用いるために、アナライトは頂部レザーバ１２Ｄに貯蔵され、バッファは左レザーバ１６Ｄに貯蔵される。アナライト堆積に用いられるゲート制御注入は、流動するバッファのイオン強度より弱い強度を持つアナライトにつき行われる。バッファは、電気浸透によりバッファレザーバ１６Ｄからアナライト廃棄物及び廃棄物レザーバ１８Ｄ、２０Ｄの双方に向けて運ばれる。このバッファの流れは、アナライトが分離チャンネル３４Ｄ内へ流出するのを妨げる。代表的実施態様以内で、バッファ、アナライト、アナライト廃棄物及び廃棄物レザーバにおける電位は、それぞれ１、０．９、０．７及び０である。マイクロチップに加えられる１ｋＶに対し、分離中のバッファ、アナライト、アナライト廃棄物及び分離チャンネル内の電場強度は、それぞれ、１７０、１３０、１８０及び１２０Ｖ／ｃｍである。
アナライトを分離チャンネル３４Ｄに注入するために、わずかな時間（０．１−１０ｓ）に亘ってバッファレザーバ１６Ｄにおける電位は浮動（高電圧スイッチの解放）するようにされる。マイクロチップに加えられる１ｋＶに対し、注入中のバッファ、サンプル、サンプル廃棄物及び分離チャンネル内の電場強度は、それぞれ、０、２４０、１２０及び１１０Ｖ／ｃｍである。アナライトプラグを外すためにバッファレザーバ１６Ｄにおける電位が再び加えられる（高電圧スイッチ閉鎖）。アナライトプラグの量は、注入時間、電場及び電気泳動的移動性の関数である。
分離バッファ及びアナライトの組成は、全く異なり得るが、ゲート制御注入では、アナライト及びバッファの双方の流れの完全性は、堆積作動を行うために分離チャンネル３４Ｄ内では交互に維持され得る。アナライト堆積は、アナライトに対する分離バッファの相対的伝導度γに依存する。例えば、５ｍＭの分離バッファ及び０．５１６ｍＭのサンプル（０．０１６ｍＭダンシル・リシン）では、γは、９．７に等しい。図１４は、２ｓに亘り注入されたジダンシル・リシンに対する２つの注入断面形を示し、γは０．９７及び９．７に等しい。γ＝０．９７（分離及びサンプルバッファは共に５ｍＭ）を有する注入断面形は、堆積を示さない。γ＝９．７を有する第２断面形は、γ＝０．９７を有する注入に対して相対的ピーク高さ３．５の適度な強化を示す。ジダンシル・リシンは陰イオンであり、従って、サンプルバッファプラグの後方境界において堆積する。アナライト濃度を増大させることに加えて、プラグの空間範囲は制限される。γ＝９．７を有する断面形は、半分の高さで０．４１５の幅を有し、一方γ＝０．９７を有する注入断面形は、半分の高さで１．８８５の幅を有する。注入（注入フィールド強度）中の分離チャンネル３４Ｄ内の電場強度は、分離（分離フィールド強度）中の分離チャンネル内の電場の９５％である。これらの断面形は、分離フィールド強度が加えられると同時に測定される。２ｓの注入時間に対し、γ＝０．９７に対し１．９５の注入プラグ幅が期待される。
堆積による濃度の強化は、幾つかのサンプルプラグ長さ及び分離バッファとアナライトとの相対的伝導度につき評価された。堆積による強化は、増大する相対的伝導度γと共に増大する。表１には、０．９７乃至９７０のγに対する強化が列挙されている。γ＝９７０のとき強化は最大であるが、相対的伝導度が大きすぎる場合、濃度境界において生じる電気浸透圧力により分離効率は悪くなる。堆積強化及び分離効率間の兼ね合いをとらなければならず、γ＝１０が最適であることが分かっている。γ＝９７及びγ＝９７０で堆積された注入を用いて行われた分離に対し、ジダンシル・リシン及びダンシル・リシンは効率の損失より分解されなかった。また、マイクロチップ上の注入工程はコンピュータで制御され、かつカラムはバイアルからバイアルへ物理的に運ばれないので、堆積された注入の再現性は、６回の繰返し分析につきピーク領域に対し２．１％ｒｓｄ（百分率相対標準偏差）である。比較のため、堆積されなかったゲート制御注入は、６回の繰返し分析につきピーク領域に対し１．４％ｒｓｄを有し、押込み注入は６回の繰返し分析につきピーク領域に対し０．７５％ｒｓｄを有する。これらは、大規模な、市場向きの、自動化された電気泳動計器に対して報告された数値に十分対応する。しかし、マイクロチップ上でなされる注入は、容量が約１００倍も小さく、例えば、マイクロチップ上で１００ｐＬに対して市場用計器上で１０ｎＬ
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異なった伝導度のバッファ流は、マイクロチップ上で正確に組合せることができる。追加のバッファレザーバを有するマイクロチップを造ることによって、より手の込んだ堆積機構を用いることが可能であるが、ここに記載するのは簡単な堆積方法である。さらに、サンプル堆積を強化し、最終的には、ここに示したものを越て検出限度を下げるために、先頭及び後続の電解質バッファを用いることができる。場増強アナライト注入並びにアナライト及びバッファイオンの移動性のよりよい適合により、さらに大きな強化が無機（元素の）陽イオンに対して期待されることに言及しておく。
サンプル堆積が用いられるかどうかにかかわらず、ローダミンＢ及びスルフォローダミンから成るアナライトの電気泳動的分離を達成するために、図１２のマイクロチップ実験装置１０Ｄを用いることができる。図１５は、ローダミンＢ（小保持）及びスルフォローダミン（大保持）に対する注入点からａ）３．３ｃｍ、ｂ）９．９ｃｍ及びｃ）１６．５ｃｍにおける電気泳動図である。これらは、以下の条件を用いてとられ、注入は押込み型であった。
Ｅinj＝５００Ｖ／ｃｍ
Ｅrun＝１７０Ｖ／ｃｍ
バッファ＝５０ｍＭｐ（ｐＨ９．２におけるホウ砂）
従来の方法で電気泳動図を得るために、分離チャンネル３４Ｄの軸下方の異なった位置において、ヘリウム・ネオンレーザ（グリーンライン）による単一点検出が用いられた。
分離装置の効用の重要な尺度は、以下の式で与えられるように、単位時間当り発生されるプレーと数である。
Ｎ／ｔ＝Ｌ／（Ｈｔ）
ここで、Ｎは理論的プレート数、ｔは分離時間、Ｌは分離カラムの長さ、Ｈは理論的プレートと同等な高さである。プレート高さＨは、以下の式で表される。
Ｈ＝Ａ＋Ｂ／ｕ
ここで、Ａは注入プラグ長さ及び検出器路の長さからの寄与の和、Ｂは２Ｄｍ（ここでＤｍはバッファ内のアナライトに対する拡散係数）、ｕはアナライトの線速度である。
上の式を組合せてｕ＝μＥ（ここでμはアナライトの有効電気泳動的移動性、Ｅは電場強度であり、単位時間当りのプレートは、電場強度の関数として表すことができる。
Ｎ／ｔ＝（μＥ）2／（ＡμＥ＋Ｂ）
低い電場強度においては、軸方向拡散がバンド分散の優勢な形である場合、ＡμＥ項はＢに関して小さく、その結果として毎秒当りのプレート数は、電場強度の平方で増大する。
電場強度が増大するにつれて、プレート高さは定数に近づき、ＡμＥに関してＢが小さいので、毎秒当りのプレート数は電場強度と共に直線的に増大する。従って、Ａをできるだけ小さくするのが有利であり、これは押込み注入機構の利点である。
等間隔の１０位置において、ローダミンＢ及びスルフォローダミンの電気泳動的分離効率が監視され、各々が別個の実験として行われた。注入点から１６．５ｃｍにおけるローダミンＢ及びスルフォローダミンの効率は、それぞれ３８，１００及び２９，０００プレートである。この大きさの効率は、多くの分離用途に対して十分である。データの直線性は、チャンネルの長さに沿ったチャンネルの均一性及び特性に関する情報を提供する。チャンネルの欠陥、例えば、大きなピットが存在するなら、効率の急激な低下が結果的に生じる。しかし、なにも検出されなかった。効率データは、図１６（図１６に対する条件は図１５に対するものと同一であった）にプロットされている。
図６のマイクロチップアナライト注入器１０Ｂを用いて、同様な分離実験が行われた。直線分離チャンネル３４Ｂのために、アナライト注入器１０Ｂは、図１２に示す代替アナライト注入器１０Ｄのヘビ状分離チャンネル３４Ｄを用いて達成されるものより迅速な分離を可能にしている。さらに、用いた電場強度はより高く（バッファ及び分離チャンネル２６Ｂ、３４Ｂに対してそれぞれ４７０Ｖ／ｃｍ及び１００Ｖ／ｃｍ）、さらに分離速度が増大した。
本発明の平坦なマイクロチップ実験装置１０Ｂの特別な一利点は、レーザ誘導の蛍光発光で検出点が分離カラムに沿った任意の位置に設定できることである。電気泳動図は、注入交点４０Ｂからの分離長さが０．９ｍｍ、１．６ｍｍ及び１１．１ｍｍにおいて検出されている。０．０６乃至１．５ｋＶ／ｃｍの範囲の電場強度に亘って１．６ｍｍ及び１１．１ｍｍの分離長さが用いられ、分離はこの範囲に亘り基線分解能を持った。１．５ｋＶ／ｃｍの電場強度においてアナライト、ローダミンＢ及びフルオレスセインは、図１７ａに示す通り０．９ｍｍの分離長さに対して１５０ｍｓ未満で分解され、図１７ｂに示す通り１．６ｍｍの分離長さに対して２６０ｍｓ未満で分解され、図１７ｃに示す通り１１．１ｍｍの分離長さに対して１．６ｍｓ未満で分解される。
チャンネルの台形形状のために、電位がサンプル装荷モードから分離モードへ切り替えられるとき、上方の隅では正確にサンプルプラグを切り離すことを困難にしている。従って、注入プラグは、それと関連するわずかな尾を有し、この効果が多分別個のピークにおいて観察される引きずりを説明している。
図１８では、１．６ｍｍ及び１１．１ｍｍの分離長さに対する毎秒当りのプレート数が、電場強度に対してプロットされている。毎秒当りのプレート数は、プレート高さが定数に近づくので、急速に電場強度の一次関数になる。図１８中のしるしは、１．６ｍｍ及び１１．１ｍｍの分離長さにおける２つのアナライトにつき集められた実験データを表す。各ラインは、上記の式を用いて計算され、係数は実験的に決められる。１１．１ｍｍの分離長さにおけるローダミンＢに対する実験データと計算された数との間にはわずかなずれが見られる。これは主に実験誤差に起因する。
電気クロマトグラフ
一般的な分析に対する電気泳動上の問題は、変化していない標本を分離できないことである。特定サンプル中のすべての中性標本の電気泳動的な移動性は零であり、従って、同一移動時間を有する。図１２に示すマイクロチップアナライト注入器１０Ｄは、非イオンアナライトを分離するために電気式クロマトグラフを行うのに用いることができる。このような電気式クロマトグラフを行うために、分離チャンネル３４Ｄの表面は、チャンネルを囲むために下層にカバープレートを接着した後、逆相被覆を分離チャンネルの壁に化学的に接着することにより用意された。分離チャンネルは、１Ｍ苛性ソーダで処理し、その後水ですすがれた。分離チャンネルは、約５０ｋＰａのゲージ圧力のヘリウムで清浄にすると共に１２５℃で２４時間乾燥された。クロロジメチルオクタアルデシルシラン（ＯＤＳ，Ａｌｄｒｉｃｈ）の２５％（ｗ／ｗ）トルエン溶液が、約９０ｋＰａの過剰圧力で分離チャンネル内へ装荷された。ＯＤＳ／トルエン混合物は、１２５℃で１８時間の反応期間に亘って連続的にカラム内へポンプ送入された。チャンネルは、トルエンですすがれ、次いで未反応のＯＤＳを除去するためにアセトニトリルで処理される。実験装置１０Ｄは、クマリン４４０（Ｃ４４０）、クマリン４５０（Ｃ４５０）及びクマリン４６０（Ｃ４６０，Exciton Chemical Co., Inc.）から成るアナライトにつき、分離の直接蛍光測定に対し１０μＭで、空白時間の間接蛍光測定に対し１μＭで、電気式クロマトグラフを行うために用いられた。２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを有するホウ砂バッファ（１０ｍＭ，ｐＨ９．２）がバッファであった。
アナライト注入器１０Ｄは、押込みアナライト装荷モード及び図６に関して既にのべた分離（走行）モード下で作動された。アナライトは、アナライトレザーバ１６Ｄからアナライト廃棄物レザーバ１８Ｄまで進む前方クロマトグラムを介して注入交差内へ装荷され、最も遅いアナライトの前面が一度注入交点４０Ｄを通過すると、サンプル分析の準備が整う。分離モードに切り替えるために、加えられた電位は、例えば、人手でスイッチを倒すことにより再構成される。加えられた電位を切り替えた後、分離のための主流路はバッファレザーバ１２Ｄから廃棄物レザーバ２０Ｄまでになる。小アナライトプラグを分離チャンネル３４Ｄ内へ注入し、過剰のアナライトが分離チャンネル内へ流出するのを避けるために、アナライト及びアナライト廃棄物レザーバ１６Ｄ、１８Ｄは、バッファレザーバ１２Ｄに加えられた電位の５７％に保たれる。サンプルを装荷しかつ注入するこの方法は、時間に依存せず、バイアスはかけられず、再現性がある。
図１９は、線速度０．６５ｍｍ／ｓに対するクマロンのクロマトグラムを示す。Ｃ４４０に対し、１２０／ｓに相当する１１，７００プレートが観測された。最も保持量の多い成分Ｃ４６０は、Ｃ４４０に対するものよりほぼ一桁低い程度の大きさ，すなわち、１，２９０の効率を有する。クロマトグラムの波状バックグラウンドは、ガラス下層からのバックグラウンド蛍光に起因し、レーザの電力不安定性を示す。しかし、これは分離又は検出の品質を損なわなかった。これらの結果は、プレート数に関して従来の実験高性能ＬＣ（ＨＰＬＣ）技術に十分匹敵し、速度においてはＨＰＬＣを「１０」だけ凌駕する。この効果は、高速度分離による単一層静的又は動的作用の過負荷に起因する可能性がある。
ミセル動電学的毛細管クロマトグラフ
図１９に関して既に述べた電気式クロマトグラフ実験では、サンプル成分は、チャンネル壁を覆う静止相と成分との相互分離作用によって分離された。中性アナライトを分離する他の方法は、ミセル動電学的毛細管クロマトグラフ（ＭＥＣＣ）である。ＭＥＣＣは、電気泳動の一操作モードであり、そこでは、バッファ内にミセルを形成するために、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような表面活性剤が十分な濃度でバッファに加えられる。典型的な実験配置においてミセルは、周りのバッファ溶液より遥かに遅く陽極に向けて移動する。ミセルとそれを取り囲むバッファ溶液との間の溶質の分離は、液体クロマトグラフの分離と類似の分離機構を与える。
図１２のマイクロチップ実験装置１０Ｄは、中性染料クマリン４４０（Ｃ４４０）、クマリン４５０（Ｃ４５０）及びクマリン４６０（Ｃ４６０，Exciton Chemical Co., Inc.）から成るアナライトにつき用いられた。各染料の個々の貯蔵液は、メタノール内で用意され、その後使用前に分析バッファ内へ希釈された。各染料の濃度は、別段の指示がない限り約５０μＭであって、ＭＥＣＣバッファは、１０ｍＭホウ砂（ｐＨ９．１）、５０ｍＭＳＤＳ及び１０％（ｖ／ｖ）メタノールから構成された。メタノールは、水成バッファシステム内でクマリン染料を可溶化させるのを助けると共に染料のある部分をミセル内へ分離させる。これらの染料の化学的、物理的及び毒物学的特性が十分に調査されていないので、クマリン染料の取扱いには適切な注意を払わなければならない。
マイクロチップ実験装置１０Ｄは、既に述べたように「押込まれた注入」モードで作動された。レザーバに加えられた電圧は、装荷モード又は「ラン（走行）」（分離）モードのいずれかに設定された。装荷モードにおいては、アナライトレザーバ１６Ｄ内の溶液の前方クロマトグラムが、電気浸透的に交点通ってアナライト廃棄物レザーバ１８Ｄ内へポンプ送入される。バッファ及び廃棄物レザーバに加えられる電圧は、側部から交点内へ、次いでアナライト廃棄物レザーバ１８Ｄ内への弱い流れを起こさせる。チップは、最も遅く移動するアナライトの成分が交点４０Ｄを通過してしまうまでこのモードを保つ。この時点で、交点のアナライトプラグは、動電学的バイアスなしにアナライト溶液を代表する。
注入モードは、チップを走行モードに切り替えることによりなされる。これによりレザーバに加えられる電圧は、バッファが、バッファレザーバ１２Ｄから交点４０Ｄを通って分離チャンネル３４Ｄ内へ、廃棄物レザーバ２０Ｄに向けて流れるようにされる。交点４０Ｄ内にあったアナライトプラグは、分離チャンネル３４Ｄ内へ一掃される。比例的により低い電圧が、アナライト及びアナライト廃棄物レザーバ１６Ｄ、１８Ｄへ加えられ、バッファレザーバ１２Ｄからこれらのチャンネル内へのバッファの弱い流れを起こさせる。これらの流れで、サンプルプラグがアナライト流からきれいに取り去られかつ分析中に過剰アナライト分離チャンネル内へ漏れ込まないことが保証される。
Ｃ４４０、Ｃ４５０及びＣ４６０の混合物のＭＥＣＣ分析結果は、図２０に示す。各ピークは、各染料の個々の分析によって確認された。第１ピーク４４０の移動時間安定性は、変化するメタノール濃度と共に、この染料がかなりな範囲まではミセル内へ分離しないことを強く示している。従って、それは移動時間ｔ0を有する電気浸透流標識（マーカ）と考えられた。最後のピークＣ４６０は、ミセル移動時間ｔｍに対する標識と想定された。図２０のデータからこれらの数値ｔ0及びｔｍを用いて、計算された溶出範囲ｔ0／ｔｍは０．４３である。これは、同様なバッファシステムに対する文献数値ｔ0／ｔｍ＝０．４と十分合致し、我々の想定を支持するものである。これらの結果は、毛細管で行われる従来のＭＥＣＣに十分匹敵すると共に効率は保持比と共に保持されるので上記の電気クロマトグラフに優る幾つかの利点もある。中性標本を分離するこの研究方法のさらなる利点は、壁の表面を改変する必要がなくかつ実験中静止相が連続的に新たにされることである。
無機イオン分析
図６の実験装置１０Ｂ又は図１２の実験装置１０Ｄのいずれかで行い得る他の実験分析は、無機イオン分析である。図６の実験装置１０Ｂを用いて、電気泳動で分離されてＶＵレーザで誘導される蛍光で検出される、８−ヒドロキシキノリン−５−スルフォン酸（ＨＱＳ）で複合化された金属イオンについて無機イオン分析が行われた。ＨＱＳは、金属イオンを光学的に決定するためにリガンドとして広く用いられてきた。水成媒体内におけるＨＱＳの光学的特性及び可溶性は、最近イオンクロマトグラフ及び毛細管電気泳動によって分離される金属イオンの検出に用いられてきた。複合ＨＳＱは蛍光を発しないので、大きなバックグラウンド信号に寄与することなく分離中複合化平衡を維持するために、過剰のリガンドがバッファに加えられる。これは、分離効率及びサンプルの検出可能性の双方に利益をもたらす。実験に用いられた複合体は、硫酸亜鉛、硝酸カドミウム及び硝酸アルミニウムである。バッファは、８−ヒドロキシキノリン−５−スルフォン酸（図５を除くすべての実験に対して２０ｍＭ、Sigma ChemicalCo.）を有するリン酸ナトリウ（６０ｍＭ，ｐＨ６．９）である。２０ｍＭまでのＨＱＳを溶解するためには、少なくと５０ｍＭのリン酸ナトリウを必要とする。用いられた下層４９Ｂは、ガラス下層より大きな可視性を与える、溶融石英である。
図６に関して既に述べた通り、アナライトを注入交点４０Ｂへ運ぶために、浮動又は押込みアナライト装荷が用いられる。浮動サンプル装荷では、注入されるプラグは電気泳動バイアスを持たないが、サンプルの容量はサンプル装荷時間の関数である。サンプル装荷時間は、用いられる場強度に逆比例するので、高注入場強度に対しては、低注入場強度に対するものよりも短い注入時間が用いられる。例えば、６３０Ｖ／ｃｍ（図３ａ）の注入場強度に対しては、注入時間は１２ｓ、５２０Ｖ／ｃｍ（図３ｂ）の注入場強度に対しては、注入時間は１４．５ｓである。電気泳動流の抑制の有無にかかわらず、押込み及び浮動サンプル装荷の双方を用いることができる。
図２１ａ及び２１ｂは、８−ヒドロキシキノリン−５−スルフォン酸で複合化された３つの金属イオンの分離を示す。３つの錯体すべてが正味の負電荷を持つ。ポリアクリルアミドの共有結合によりチャンネル壁に対する電気浸透流が最小にされるので、接地に関する負の電位は、サンプル装荷及び分離中錯体を操作するために用いられる。図２１ａ及び２１ｂにおいて分離チャンネル場強度は、それぞれ８７０及び７２０Ｖ／ｃｍで、分離長さは１６．５ｍｍである。注入プラグの容量は１２０ｐＬで、これはそれぞれ図４ａのＺｎ、Ｃｄ及びＡｌに対して注入される１６、７、及び１９ｆｍｏｌに相当する。図４ｂにおいては、Ｚｎ、Ｃｄ及びＡｌの０．４８、０．２３及び０．５９ｆｍｏｌが、それぞれ分離カラムに注入される。ピーク領域（６回の繰返し分析）により測定される、注入された容量の平均再現可能性は１．６％ｒｓｄ（百分率相対平均偏差）である。錯体を励起させるのに用いたレーザの安定性は、約１％ｒｓｄである。検出限界は、有用な分析が行い得る範囲内に有る。
ポスト分離チャンネル反応器
代わりのマイクロチップ実験装置１０Ｅは、図２２に示す。５−ポートパターンのチャンネルが下層４９Ｅ上に配置され、既に述べた通りカバープレート４９Ｅ′で覆われる。マイクロチップ実験装置１０Ｅの実施態様は、標準写真平板、湿式化学エッチング及び接着技術を用いて製造された。フォトマスクは、クロム（５０ｎｍ）をガラススライド上にスパッタにより付着させ、ＣＡＤ／ＣＡＭレーザアブレーションシステム（Resinetics, Inc.）を介してチャンネルデザインをクロムフィルム内へ溶発させることによって製造された。その後チャンネルデザインは、陽性の熱硬化性樹脂を用いて下層に移転された。チャンネルは、希釈されたＨｆ／Ｎｈ4Ｆ浴中で下層内へ食刻される。分離チャンネル３４Ｅを形成するために、直接接着技術を用いてカバープレートが食刻されたチャンネルを覆って下層に接着される。表面は希釈されたＮＨ4ＯＨ／Ｈ2Ｏ2溶液中で加水分解され、消イオンされ濾過されたＨ2ですすがれ、接合された後５００℃で焼鈍された。円筒形のガラスレザーバは、ＲＴＶシリコーン（General Electric製）を用いて下層上に固定される。プラチナ電極は、電圧制御器４６Ｅ（Spellman CZE1000R）からレザーバ内の溶液まで電気接触を与える。
一実施態様においてチャンネル２６Ｅは、第１レザーバ１２Ｅから交点４９Ｅまで長さは２．７ｍｍである。一方チャンネル３０Ｅは７．０ｍｍで、第３チャンネル３２Ｅは６．７ｍｍである。混合Ｔ字管４４Ｅで分離チャンネル３４Ｅに接続する、試薬チャンネル３６Ｅを有する試薬レザーバ２２Ｅを追加したことにより、分離チャンネル３４Ｅは、長さがわずか７．０ｍｍに改変される。従って、分離チャンネル３４Ｅの長さは、交点４０Ｅから混合Ｔ字管４４Ｅまでになる。混合Ｔ字管４４Ｅ廃棄物レザーバ２０Ｅまで伸びるチャンネル５６は、反応カラム又はチャンネルで、例示の実施態様では同チャンネルの長さは、１０．８ｍｍである。試薬チャンネル３６Ｅの長さは、１１．６ｍｍである。
代表的な例において図２２の実施態様は、アナライトを分離するために用いられた。その分離は、励起用にアルゴンイオンレーザ（３５１．１ｍｍ、５０ｍＷ、Coherent Innova 90）を用いて蛍光発光を介してマイクロチップ上で監視される。蛍光信号は、点検出のための光電子増倍管（PMT, Oriel 77340）及びマイクロチップ９０の一区域の像を作るための電荷転送素子（ＣＣＤ、Princeton Instruments, Inc. TE/CCD-512TKM）で集められた。装置を試験するために用いられた錯体は、ローダミインＢ（Exciton Chemical Co., Inc.）、アルギニン、グリシン、トレオニン及びオルトフタルジアルデヒド（Sigma Chemical Co.）であった。２％（ｖ／ｖ）メタノール及び０．５％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールと共にホウ砂バッファ（２０ｍＭ、ｐＨ９．２）がバッファとしてすべての試験に用いられた。アミノ酸、ＯＰＡ及びローダミン溶液の濃度は、それぞれ２ｍＭ、３．７ｎＭ及び５０μＭであった。幾つかの走行条件が用いられた。
図２３の構成図は、１ｋＶが全システム加えられる場合の一例を示す。この電圧構成では、分離チャンネル３４Ｅ（Ｅsep）及び反応チャンネル３６Ｅ（Ｅrea）の電場強度は、それぞれ２００および４２５Ｖ／ｃｍである。これは、混合Ｔ字管４４Ｅにおいて分離路の１部分と試薬路の１．１２５部分とを組合わせることを可能にする。ポスト・カラム反応の有無にかかわらず、このようなアナライト導入システムは、多重分析のための非常に迅速な周期時間を可能にする。
図２４の電気泳動図Ａ、Ｂは、２対のアミノ酸の分離を示す。分離カラム（Ｅsep）及び反応カラム（Ｅrea）のそれぞれの電場強度８００Ｖ／ｃｍ及び１，７００Ｖ／ｃｍに対応する合計印加電圧が４ｋＶであることを除けば、電圧構成は、図２３のものと同一である。アルギニン、グリシン及びトレオニンに対してそれぞれ推定された３８４、２４５及び２２５μｍの注入プラグの長さに対応する試験のための注入時間は１００ｍｓであった。１０２、６５及び６０ｐＬの注入容量は、それぞれアルギニン、グリシン及びトレオニンに対して注入された２００、１３０及び１２０ｆｍｏｌに対応する。検出点は混合Ｔ字管から６．５ｍｍ下流で、これは分離及び反応に対し１３．５ｍｍの合計カラム長さを与える。
アミノ酸とＯＰＡとの反応速度は適度に早かったが、これらの実験の時間尺度上では十分早くはなかった。バンド歪みの増加が観測される。その理由は、誘導された錯体の移動性が純粋なアミノ酸と異なるからである。反応が完了するまで、未反応及び反応したアミノ酸の各区域は異なった速度で移動し、アナライト区域の拡大を生じさせるであろう。図２４で立証されるように、グリシンは誘導及び無誘導アミノ酸間で電気泳動的移動性上最大の食違いを有する。過度のバンド拡大は、保有時間の関数ではなかったことを確認するためにトレオニンも同様に試験された。トレオニンは、グリシンより僅かに長い保有時間を有するが、拡大はグリシン程広大ではなかった。
分離及び反応の両カラムにおいてマイクロチップの効率を試験するために、蛍光発光レーザ染料、ローダミンＢがプローブとして用いられた。注入交差から６ｍｍ及び８ｍｍの距離又は混合Ｔ字管からにおいて１ｍｍ上流及び１ｍｍ下流におい点検出機構を用いて、半分の高さにおいてピーク幅から計算した効率測定が行われた。
試薬及び分離カラムの電場強度はほぼ同一で、反応カラムの電場強度は、分離カラムの２倍であった。印加電圧のこの構成は、誘導試薬及び分離カラムからの流れの容量比が約１：１であることを可能にした。電場強度が増大するにつれて、混合Ｔ字管における乱流の程度が増大した。分離距離６ｍｍ（混合Ｔ字管から１ｍｍ上流）においてプレート高さは、期待の通りアナライトの線形速度とは逆に変化した。分離距離８ｍｍ（混合Ｔ字管から１ｍｍ上流）においてプレート高さデータは、期待の通りアナライトの線形速度とは逆に減少した。分離距離８ｍｍ（混合Ｔ字管から１ｍｍ下流）においてプレート高さデータは、１４０Ｖ／ｃｍから１４００Ｖ／ｃｍに減少した。この作用は異常で、同一容量の２つの流れが集中する場合に見られるバンド拡大現象を示す。混合Ｔ字管の形状は、このバンド歪みを最小にするために最適化されていなかった。８４０Ｖ／ｃｍを越える分離場強度では、システムは安定して再びプレート高さは線速度の増加と共に減少する。Ｅsep＝１４００Ｖ／ｃｍに対しては、８ｍｍ及び６ｍｍの分離長さにおいてプレート高さの比は１．２２であり、これは分離効率上では受け入れられないものではない。
混合Ｔ字管においてＯＰＡと混合させるために、分離チャンネルを通して下方にグリシンを連続的にポンプ送入することによって、ＯＰＡのアミノ酸との反応から発生された蛍光信号の強度が試験された。ＯＰＡ・アミノ酸反応からの蛍光信号は、生成物が混合Ｔ字管から下流に移動するときＣＣＤを用いて集められた。再び、ＯＰＡとグリシンの流れとの相対的容量比は、１．１２５であった。ＯＰＡは、アミノ酸との反応で４ｓの典型的なハーフタイムを持つ。アナライト分子の観測ウインド内の平均滞留時間は、反応カラム（Ｅrea）内の電場強度２４０、４８０、９６０及び１９２０Ｖ／ｃｍに対し、それぞれ４．６８、２．３４、１．１７及び０．８５ｓであった。蛍光の相対的強度は、定性的この反応の４ｓハーフタイムに対応する。反応チャンネルにおいて場強度が増大するにつれて、蛍光強度の傾斜及び最大値はさらに下流に転移する。これは、グリシン及びＯＰＡがより高い場強度と共により急速に混合Ｔ字管から一掃されるからである。理想的には、生成物から観測された蛍光は、分離流れ及び誘導試薬の混合に続いて反応の段階関数を持つことであろう。しかし、反応の動力学及び拡散によって抑制される有限な混合速度がその発生を妨げる。
ポスト分離チャンネル反応器を用いる分離は、図３に関して既に述べた通り、アナライト、バッファ及び試薬の流れを隔離しておくためにゲート制御注入機構を用いた。ポスト分離チャンネル反応に対してマイクロチップは、連続的アナライト装荷・分離モードで作動された。それによってアナライトは、アナライトレザーバ１２Ｅから注入交点４０Ｅを通してアナライト廃棄物レザーバ１８Ｅに向けて連続的にポンプ送入された。バッファは、アナライト流を偏向させてアナライトが分離チャンネルを下方に移動するのを防止するために、バッファレザーバ１６Ｅからアナライト廃棄物及び廃棄物レザーバ１８Ｅ、２９Ｅに向けて同時にポンプ送入された。アナライトの小アリコートを注入するために、バッファ及びアナライト廃棄物レザーバ１６Ｅ、１８Ｅは、アナライトがアナライト注入プラグとして分離チャンネルを下方に移動させるために、短い時間（約１００ｍｓ）に亘り単に浮動された。注入プラグを外すために、バッファ及びアナライト廃棄物レザーバ１６Ｅ、１８Ｅの電位が再び加えられた。
ミクロ機械加工されたポストカラム反応器の利用は、過剰チャンネル配管の容量、特に分離及び試薬チャンネル３４Ｅ、３６Ｅ間をミニチュア化することによって、分析的手段としてのポスト分離チャンネル反応器の電力を改良することができる。このマイクロチップデザイン（図２２）は、分離チャンネル３４Ｅ（７ｍｍ）及び試薬チャンネル３６Ｅ（１０．８ｍｍ）適切な長さで製造され、これはこの開示にとって非常に満足すべきものであった。より長い分離チャンネルは、図１２に関して既に述べた通り、より困難な分離を行うためにヘビ状路を用いて類似サイズのマイクロチップ上に製造することができる。ポスト混合Ｔ字管の歪みを減少させるために、ヘビ状チャンネル３４Ｅ及び反応チャンネル５６間のチャンネル寸法比は、分離チャンネル３４Ｅの電場強度が大きく、すなわち、狭いチャンネルになりかつ反応チャンネル５６では小さく、すなわち、広いチャンネルになるように最小化すべきである。
毛細管分離システムに対しては、小さな検出容量は、情報を引き出すために用い得る検出機構の数を制限する可能性がある。毛細管電気泳動にとって蛍光検出は、依然として最も感度の高い検出技術の一つである。本来蛍光アナライトを持たないシステム内へ蛍光検出を組み入れる場合、アナライトの誘導は、分離の前又は後のいずれかで行わなければならない。蛍光「タグ」が短命か若しくは分離が予備分離誘導により妨げられる場合、誘導試薬のポストカラム追加が選択方法になる。毛細管電気泳動に対しては各種のポスト分離反応器が示されてきた。しかし、バンド歪みを最小にするために極端に低容量の接続でポスト分離反応器を造る技能は困難であった。本発明は、一体構造で個々のチャンネル機能間で極端に低容量の交換を可能にする、統合されたポスト分離反応チャンネル５６を備えた電気泳動分離のためのマイクロチップ装置を製造する研究方法をとっている。
予備分離チャンネル反応システム
図２２に示すポスト分離チャンネル反応器デザインの代わりに、図２５に示すマイクロチップ実験装置１０Ｆは、予備分離チャンネル反応器を含む。図２５に示す予備分離チャンネル反応器デザインは、図１に示すものと類似している。ただし、第１及び第２チャンネル２６Ｆ、２８Ｆは、図１のＹデザインよりはむしろ反応室４２Ｆを有する「ゴール・ポスト」デザインを形成する点で異なる。反応室４２Ｆは、反応室により低い電場強度を与え、従って試薬により長い滞留時間を与えるために、分離チャンネル３４Ｆより広くなるように設計された。反応室４２Ｆは、半分の深さで幅が９６μｍで、深さが６．２μｍである。分離チャンネル３４Ｆは、半分の深さで幅が３１μｍで、深さが６．２μｍである。
マイクロチップ実験装置１０Ｆは、反応生成物の電気泳動分析を備えたオンライン予備分離チャンネル反応を行うために用いられる。ここでは、反応器は、図３に関して既に述べたゲート制御分与器を用いて周期的に分離チャンネル３４Ｆ内へ導入される小アリコートで連続作動される。マイクロチップの操作は３要素から成る。すなわち、オルトフタルジアルデヒド（ＯＰＡ）を有するアミノ酸の誘導、分離カラムへのサンプル注入及び反応器流出成分の分離・検出である。実験に用いた錯体は、アルギニン（０．４８ｍＭ）、グリシン（０．５８ｍＭ）及びＯＰＡ（５．１ｍＭ、Sigma Chemical CO.）である。すべてのレザーバ内のブッファは、２％（ｖ／ｖ）メントール及び０．５％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭホウ砂である。２−メルカプトエタノールは、誘導反応に対する還元剤としてバッファに加えられる。
反応を行うためにレザーバ１２Ｆ、１４Ｆ、１６Ｆ、１８Ｆ及び２０Ｆは、制御された電圧．５ＨＶ、．５ＨＶ、ＨＶ、．２ＨＶ及び接地をそれぞれ同時に与えられた。この構成は、ゲート制御注入機構を用いるとき生成物が分離チャンネル内へ大幅に流出することなく、反応室４２Ｆ（１．０ｋＶに対し２５Ｖ／ｃｍ、マイクロチップ印加）を横切って最低の電位降下を可能にすると共に分離チャンネル３４Ｆ（１．０ｋＶに対し３００Ｖ／ｃｍ、マイクロチップ印加）を横切って最高の電位降下を可能にした。各レザーバに加えられた電位を設定するのに用いられた電圧分割器の合計抵抗は、１０ＭΩ区分で１００ＭΩであった。第１レザーバ１２Ｆからのアナライト及び第２レザーバ１４Ｆからの試薬は、１：１．１０６の容量比で反応室４２Ｆ内へ電気浸透的にポンプ送入される。従って、アナライト及び試薬レザーバ１２Ｆ、１４Ｆからの溶液は、約ファクタ２で希釈される。バッファは、バッファレザーバ１６Ｆからアナライト廃棄物及び廃棄物レザーバ１８Ｆ、２０Ｆに向けて同時にポンプ送入された。このバッファ流は、新たに形成される生成物が分離チャンネル３４Ｆ内へ流出するのを防止する。
図３に関して既に述べたゲート制御注入機構を用いて反応室４２Ｆからの流れを分離チャンネル３４Ｆ内へ注入するのが望ましい。バッファレザーバ１６Ｆの電位は、短時間（０．１−１．０ｓ）に亘り単に浮動されてサンプルは分離チャンネル３４Ｆ内へ移動する。注入プラグを除くためにバッファレザーバ１６Ｆの電位は再印加される。注入プラグの長さは、注入時間及び電場強度双方の関数である。この電位印加構成で、ＯＰＡとアミノ酸との反応で、分析すべき新たな生成物が連続的に発生する。
多くの毛細管電気泳動実験の重大な欠陥で、注入の再現性は不調であった。マイクロチップ注入はコンピュータ制御されかつ注入工程は単一の高電圧スイッチの開閉を要するので、注入は正確に時間通り行い得る。図２６は、アルギン及びグリシンの双方に対する注入容量（ピークの積分区域に対する百分率相対標準偏差％ｒｓｄ）の再現性を示す。ここで、電場強度は、それぞれ０．６及び１．２ｋＶ／ｃｍで、注入時間は０．１乃至１．０ｓである。０．３ｓを越える注入時間に対しては、百分率相対標準偏差は１．８％未満であった。これは商業的に自動化された毛細管電気泳動計器について報告されている数値に匹敵する。しかし、マイクロチップでなされる注入は容量的に約１００倍も小さく、例えば、マイクロチップ上で１００ｐＬに対し商業計器上では１０ｎＬである。この変動の一部は、約０．６％のレーザの安定性若しくは注入時間０．３ｓに起因し、誤差は注入される錯体及び注入場強度には依存しないと思われる。
図２７は、アルギン及びグリシンの３つの電気泳動分離のオーバレイを示し、オン・チップＯＰＡ予備カラム誘導後、１．８ｋＶ／ｃｍの分離場強度及び１０ｍｍの分離長さで行われた。分離場強度は、分離中の分離チャンネル３４Ｆ内の電場強度である。反応室４２Ｆ内の強度は、１５０Ｖ／ｃｍで在る。アナライトの反応時間は移動性と逆比例し、例えば、アルギン及びグリシンの反応時間はそれぞれ４．１ｓ及び８．９ｓである。注入されたプラグの容量はそれぞれ１５０ｐＬ及び７１ｐＬであり、これは分離チャンネル３４Ｆに注入されるアミノ酸の３５及び２０ｆｍｏｌに相当する。ゲート制御注入器は迅速な連続注入を可能にする。この特殊な場合において、４ｓ毎に分析を行うことができるであろう。錯体について観測される電気泳動的移動性は、分離場強度と共に線形速度の変動への線形適合により決められる。傾斜は、アルギン及びグリシンに対してそれぞれ２９．１及び１３．３ｍｍ2／（ｋＶ−ａｓ）であった。速度対場強度の直線性で示されるように、ジュール熱の証拠は観察されなかった。線形適合で、分離場強度０．２−２．０ｋＶ／ｃｍについて、０．９９９及び０．９９６の相関係数がアルギン及びグリシンに対してそれぞれ生成された。
マイクロチップ実験装置１０Ｆに増大する電位を加えると、反応室４２Ｆ及び分離チャンネル３４Ｆの場強度が増加する。これは、反応室内の反応体の滞留時間の短縮及び生成物の分析時間の短縮につながる。マイクロチップに加えられる電位を変えることにより、反応動力学が研究できる。発生される生成物の量的変化に対する反応時間が図２８にプロットされている。応答は、ピークの積分される区域で、検出器観測ウインド内の滞留時間及び生成物の光電ブリーチにつき修正される。図２８のアルギン及びグリシンに対するデータ間の偏差は、主に注入容量の差、すなわち、アミノ酸の異なった電気泳動的移動性に起因する。ＯＰＡの１０倍の過剰量は、擬似の第１級反応条件を得るために用いられた。データと適合するラインの傾斜は、誘導反応速度に対応する。アルギン及びグリシンに対する傾斜は、それぞれ０．１３ｓ-1および０．１１ｓ-1で、反応のハーフタイム５．１および６．２ｓにそれぞれ対応する。これらの反応のハーフタイムは、先にアラニンについて報告された４ｓと比較できる。アルギン及びグリシンについては先に報告されたものは発見されていない。
これらの結果は、統合された顕微製造装置の潜在力を示す。図２８のデータは、５以内の１００ｎＬ程度の試薬を約５分でコンピュータ制御下で処理することにより生成できる。これらの結果は、化学反応に対する自動化、速度及び容量の点で先例がない。
ＤＮＡ分析
有用な生物分析手順を明示するために、図２９に示す統合された生物学的反応器・電気泳動マイクロチップ装置１０Ｇを用いて、制限温浸及び電気泳動的サイジング実験が順次行われる。マイクロチップ実験装置１０Ｇは、実験装置１０Ｇの分離チャンネル３４Ｇがヘビ状路に続くことを除けば、図２５の実験装置と同一である。エピゾームｐＢＲ３２２の順序及び酵素ＨｉｎｆＩの識別順序は知られている。温浸後、断片分布の決定は、分離チャンネル３４Ｇのふるいかけ媒体における電気泳動を用いて温浸生成物を分離することにより行われる。これらの実験に対してヒドロキシエチルセルローズがふるいかけ媒体として用いられる。分離チャンネル３４Ｇの下流の固定点において、挿入される染料、チアゾールオレンジ２量体（ＴＯＴＯ−１）と共にオン・チップレーザ誘導蛍光を蛍光担体として用いて、移動する断片が尋問される。
図２９に示す反応室４２Ｇ及び分離チャンネル３４Ｇは、それぞれ長さが１ｍｍ及び６７ｍｍで、幅が半分の深さで６０μｍ及び１２μｍである。さらにチャンネル壁は、電気浸透流及び吸着を最小にするためにポリアミドで被覆される。単一点検出レーザ誘導蛍光検出を用いて電気泳動図が発生される。アルゴンイオンレーザ（１０ｍＷ）が、レンズ（１００ｍｍ焦点距離）を用いてチップ上のスポットに収斂される。蛍光信号は、２１倍対物レンズ（Ｎ．Ａ．＝０．４２）を用いて集められる。レンズには空間フィルタ（０．６ｍｍ径ピンホール）及びスペクトルフィルタ（５６０ｎｍバンドパス、４０ｎｍバンド幅）が続き、光電子増倍管（ＰＭＴ）を用いて測定される。データ取得及び電圧切替え装置がコンピュータ制御される。反応バッファは、１０ｍＭトリスアセテート、１０ｍＭマグネシウマセテート及び５０ｍＭ酢酸カリウムである。反応バッファは、図２９に示す、ＤＮＡ、酵素及び廃棄物１レザーバ１２Ｇ、１４Ｇ、１８Ｇ内に配置される。分離ブッファは、０．２ｍＭＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）ヒドロキシエチルセルローズを有する、９ｍＭトリス・ホウ酸塩である。分離バッファは、バッファ及び廃棄物２レザーバ１６Ｆ、２０Ｆ内に配置される。エピゾームｐＢＲ３２２及び酵素ＨｉｎｆＩの濃度は、それぞれ１２５ｎｇ／μｌ及び４ｕｎｉｔｓ／μｌである。温浸及び分離は、室温（２０℃）で行われる。
ＤＮＡ及び酵素は、適切な電位を加えることによって、各々のレザーバ１２Ｇ、１４Ｇから反応室４２Ｇ内へ電気泳動的に装荷される。ＤＮＡ（１２Ｇ）、酵素（１４Ｇ）、バッファ（１６Ｇ）、廃棄物１（１８Ｇ）及び廃棄物２（２０Ｇ）レザーバの相対電位は、それぞれ１０％、１０％、０．３％及び１００％である。ＤＮＡと酵素との間の電気泳動的移動性の差により、平衡に達するために装荷時間は十分長くされる。同様に、反応室４２Ｇ（０．７ｎＬ）の容量が小さいので、急速な拡散混合が起こる。電気浸透流は線形ポリアクリルアミドの共有不動化により最小化され、従って、陰イオンのみが、用いられた電位分布につれて、ＤＮＡ及び酵素レザーバ１２Ｇ、１４Ｇから反応室４２Ｇ内へ移動する。酵素による温浸に要する陽イオン、例えば、Ｍｇ2を含む反応バッファも、同様に廃棄物１レザーバ１８Ｇ内に配置される。これは、反応室の装荷中ＤＮＡ及び酵素に対する向流として、反応室内へ陽イオンが伝播することを可能にさせる。温浸は、反応室４２Ｇを装荷した後、すべての電位を除去することにより、ＤＮＡが反応室を通過する比較的短い時間のために静的に行われる。
温浸周期の後、バッファ及び廃棄物１レザーバ１６Ｆ、１８Ｆへの電圧を浮動させることにより、分析のため生成物は分離チャンネル３４Ｆ内へ移動される。注入作動は移動性バイアスを有し、そこではより大きな断片を利してより小さい断片が注入される。これらの実験において７５−べース対（ｂｐ）断片の注入プラグ長さは、０．３４ｍｍと推定され、一方１６３２−ｂｐ断片は僅かに０．２２ｍｍとされる。これらのプラグ長さは、それぞれ反応室容量の３４％及び２２％に相当する。注入プラグ長さのプレート高さへの寄与が強大なので、反応室４２Ｆの全内容は現分離条件下では分析できない。
温浸及び分離チャンネル３４Ｆへの注入に続いて、１．０％（ｗ／ｖ）ヒドロキシエチルセルローズをふるいかけ媒体として用いて、断片が分解される。図３０は、酵素ＨｉｎｆＩによる２分間の温浸に続いて、エピゾームｐＢＲ３２２の制限断片の電気泳動図を示す。温浸の後であるが尋問の前に、２重よりされたＤＮＡの効率的なオン・カラム染色を可能にするために、挿入染料ＴＯＴＯ−１（１μＭ）が廃棄物２レザーバ２０Ｇのみに配置され、ＤＮＡへの向流をなして移動する。期待されたように、より大きな断片内にはより多くの挿入場所が存在するので、バンドの相対強度は断片サイズの増加と共に増加する。分解されていない２２０／２２１及び５０７／５１１−ｂｐ断片は、バンド重複のために隣接する単一ピークより高い濃度を有する。移動時間及び注入容量の再現性は、それぞれ５回の繰返し分析に対し、０．５５及び３．１％ｌｓ相対標準偏差（％ｒｓｄ）である。
エピゾームＤＮＡ制限断片分析用マイクロチップ実験装置１０Ｇの上記開示は、より複雑な生化学的手順を自動化及びミニチュア化する可能性を示す。この実験はこれまでに明示されたものの中で、最も高度な統合マイクロチップ化学分析装置を代表するものである。同装置は、試薬をアナライトと混合し、アナライト・試薬混合物を培養し、生成物を識別し、完全なコンピュータ制御下で生成物を分析し、しかも、典型的な小容量実験手順よりも１万倍も少ない物質しか消費しない。
概して本発明は、異なったポート又はレザーバに含まれる異なった流体を混合するのに用いることができる。これは液体クロマトグラフ分離実験用にも用いることが可能である。次いで、ポスト・カラム識別反応が行われ、そこでは処与の容量の異なった化学溶液が主分離チャンネル内へポンプ送入され、他の試薬又は溶液が異なった時間に同溶液流内へ注入若しくはポンプ圧入されて正確な既知の濃度に混合するようにされる。この工程を実施するためには、各種のチャンネルにおいて溶液を正確に制御かつ操作することを要する。
予備・ポスト分離反応器システム
図３１は、図１のものと同一の６・ポートマイクロチップ実験装置を示す。異なったポートに設けられる溶剤レザーバを特徴とする。これらの実験装置は、液体クロマトグラフ分離実験に用い、ポスト・カラム識別反応につなげ得る潜在的可能性を有する。この様な実験においてレザーバ１２及び１４は、液体クロマトグラフ溶剤プログラム式分離で用いられる、水及びアセトニトリルのような溶剤を含むであろう。
チャンネル３４は、廃棄物レザーバ２０及び２つのチャンネル２６及び２８に接続され、チャンネル２６及び２８はアナライト及び溶剤レザーバ１２及び１４を接続する。チャンネル３４は、主分離チャンネルであり、そこでは液体クロマトグラフ実験が行われる。バッファ及びアナライト廃棄物レザーバ１６及び１８を接続するチャンネル３０、３２は、上記の通り、液体クロマトグラフ又は分離チャンネル３４への注入を行うのに用いられる。最後に、分離チャンネル３４に取付けられる、レザーバ２２及びそのチャンネル３６は、分離チャンネルに分離された標本を検出可能にさせる、試薬を追加するのに用いられる。
本工程を実施するために、各種のチャンネル内の溶液を正確に制御かつ操作することを要する。上記実施態様は、レザーバ１２及び４０から非常に少ない容量（約１００ｐｌ）の液体を取出し、それらを正確に分離チャンネル３４内へ注入した。例えば、液体クロマトグラフのための溶剤プログラミング又はポスト・カラム識別反応は、正確かつ既知の濃度で溶液流が混合されることを必要とする。
本発明によると、各種の溶剤を既知の割合で混合することは、式１に示すように最終的に電気浸透による流れを制御する電位を制御することにより行い得る。式１によると、溶剤の線形速度を決めるためには電場強度を知ることが必要である。概して、これらの種類の流体操作では、既知の電位又は電圧が処与のレザーバに加えられる。電場強度は、印加した電圧及びチャンネルの特性から計算することができる。
チャンネルの抵抗は、式２で与えられる。ここでＲは抵抗、κは抵抗率、Ｌはチャンネルの長さ、Ａは断面積である。
Ｒi＝ρiＬi/Ａi                              （２）
流体は通常コンダクタンスによって特徴づけられる。コンダクタンスは、式３に示す通り抵抗の丁度逆である。式３において、Ｋは電気コンダクタンス、ρは電導率、Ａは断面積、Ｌは上記長さである。
Ｋi＝κiＡi／Ｌi                              （３）
オームの法則と式１及び２を用いて処与のチャンネル（i）の電場強度を表すことができる。すなわち、当該チャンネルを横切る電圧の降下をその長さで除したもので表せる。これは電流（Ｉi）と等しく、式４に示す通り、チャンネル（i）に当該チャンネルの低効率を乗じ、断面積で除すことによって求められる。
Ｅi＝Ｖi/Ｌi＝Ｉiρi/Ａi＝Ｉi/κiＡi        （４）
従って、もしチャンネルが寸法的及び電気的の双方で特徴づけられるなら、式５に示す通り、溶剤速度又は当該チャンネルを流れる流速を求めるために、チャンネルを横切る電圧降下又はチャンネルを流れる電流を用いることができる。流体流は表面のゼータ電位に依存し、従って、流体及び表面の化学的構成に依存する。
Ｖi∝Ｉi∝Ｆｌｏｗ                        （５）
明らかに電導率（κ）又は低効率（ρ）は、チャンネル毎に変わり得る溶液の特性に依存するであろう。多くのＣＥ用途において、バッファの特性は、流体の電気的特性を卓越し、従って、コンダクタンスは一定になるであろう。溶剤プログラミングが行われる、液体クロマトグラフの場合には、２つの移動性相の電気的特性は、もしバッファが用いられないなら、著しく異なる可能性がある。溶剤プログラミングが進行中は、混合物のモル部分が変化し続け、混合物の電導率が非線形に変わる可能性があるが、それは純粋な一溶剤のから他のものに単調に変わるであろう。モル部分につれた電導率の実際の変化は、個々のイオンの伝導度に加えて溶剤の解離定数に依存する。
上記の通り、図３１に概略を示す装置は、例えば、検出目的のためにポスト・カラム識別をと共に傾斜溶出液体クロマトグラフを行うのに用いることが可能である。図３１ａ、３１ｂ及び３１ｃは、上記のように、液体クロマトグラフ実験で必要とされることを行うための流体流要件を示す。図中の矢印は、チャンネル内の流れの方向及び相対的大きさを示す。図３１ａでは、アナライトレザーバ１６からのある容量のアナライトが分離交点４０内へ装荷される。押込み注入を実行するために、サンプルをアナライトレザーバ１６から交点を横切ってアナライトは廃棄物レザーバ１８へ運ぶことを要する。さらに、容量を絞るために、分離チャンネル３４及び溶剤レザーバ１２、１４からの物質が、図示の通り交点４０に向けて流れなければならない。第１レザーバ１２からの流れは、第２レザーバ１４からのものより遥かに多い。その理由は、これらが傾斜溶出実験の初期条件だからである。傾斜溶出実験の始めにおいては、レザーバ２２内の試薬が分離チャンネル３４へ入るのを防止するのが望ましい。このような試薬流を防止するために、試薬チャンネル３６へ向けられた廃棄物レザーバ２０からのバッファの小さい流れが望ましく、この流れは可能なか限り零に近付けるべきである。代表的なアナライト容量が注入交点４０に現れた後、分離を進めることができる。走行（分離）モードを示す図３１ｂでは、レザーバ１２及び１４からの溶剤は、交点４０を通過して分離チャンネル３４を下方に流れる。さらに、溶剤はレザーバ４及び５に向けて流れ、分離チャンネル３４内へ純粋なアナライトを注入するようにする。試薬レザーバ２２からの試薬の適切な流れが、同様に分離チャンネルへ方向付けられる。図３１ｂに示す初期条件は、溶剤１の大モル部分及び溶剤２の小モル部分を含む。溶剤レザーバ１２、１４に加えられる電圧は、溶剤１及び２の割合が溶剤１の優勢から殆ど溶剤２になるように、時間の関数として変えられる。これを図３１ｃに示す。印加電圧のこの単調な変化は、傾斜溶出液体クロマトグラフ実験を達成させる。隔離された成分が、試薬追加チャンネル３６を通るるので、この試薬と隔離された物質間に適切な反応が起こり検出可能な標本が形成されるようになる。
図３２は、仮説の傾斜溶出実験のために各種のレザーバに対してどの様に電圧が変えられるを示す。この図に示す電圧は、相対的大きさ示すのみで絶対値ではない。装荷モードの作動においては、静的電圧が各種のレザーバに加えられる。試薬レザーバ２２を除くすべてのレザーバからの溶剤流が、アナライト廃棄物レザーバ１８に向けられる。従って、アナライトレザーバ１８は、最低の電位あり、他のすべてのレザーバはより高い電位にある。試薬レザーバの電位は、試薬レザーバに向けてわずかな流れのみを与えるために、廃棄物レザーバ２０のものより十分低くなければならない。第２溶剤レザーバ１４の電圧は、注入交点４０に向けて正味の流れを与えるために、十分大きくしなければならないが、流れの大きさは低くしなければならない。
図３１ｂに示す走行（開始）モードへ移動するに当たっては、図３２に示すように電位は再調節しなければならない。現在の流れは、溶剤レザーバ１２及び１４からの溶剤が破棄物レザーバ２０に向けて分離チャンネル３４を下方に移動するようになる。アナライト及びアナライト廃棄物レザーバ１６及び１８に向けて注入交点４０から遠ざかるわずかな流れ及び試薬レザーバ２２から分離チャンネル３４内への適切な流れも存在する。現在廃棄物レザーバ２０が最小の電位にありかつ第１溶剤１２が最大の電位にあることが必要である。他のすべての電位は、図３１ｂに示すような流体流の方向及び大きさを与えるように調節される。また、図３２に示すように、溶剤レザーバ１２及び１４に加える電圧は、溶剤１の大モル部分の状態から溶剤２の大モル部分の状態へ単調に変えられる。
溶剤プログラミング走行の終りにおいて、装置は今他のサンプルを装荷するためにスイッチ切替えにより注入状態に戻る準備ができている。図３２に示す電圧変化は、図３１ａ−ｃの各種の流体流を与えるためになにがなされなければならないかを例示するためのみのものである。実際の実験においては、各種の電圧の内相対的大きさが変わるものも多分あるであろう。
本発明を例示するために有利な実施態様が選ばれたが、添付した請求の範囲に定めた本発明の範囲から逸脱することなく各種の改変をなし得ることは当業者に理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（ａ）】
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【図５（ｂ）】
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【図５（ｃ）】
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【図７】
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【図６】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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【図８（ｃ）】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３（ａ）】
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【図１３（ｂ）】
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【図１３（ｃ）】
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【図１３（ｄ）】
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【図１３（ｅ）】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７（ａ）】
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【図１７（ｂ）】
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【図１７（ｃ）】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１（ａ）】
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【図２１（ｂ）】
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【図２４】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１（ａ）】
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【図３１（ｂ）】
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【図３１（ｃ）】
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【図３２】
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