(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用の腫瘍抗原をコードする核酸配列の免疫学的に有効な量を活性成分として含む、第一の哺乳動物種の被験個体において、自己腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するための医薬組成物であって、
治療用の腫瘍抗原が、自己腫瘍抗原の相同体である哺乳動物の腫瘍抗原であり、
治療用の腫瘍抗原が、第一の哺乳動物種とは異種の関係にあり、
治療用の腫瘍抗原をコードする核酸配列が、第一の哺乳動物種個体における治療用の腫瘍抗原の発現を促進するプロモーターの制御下で治療用の腫瘍抗原をコードする核酸配列を含む非ウイルスプラスミドベクターである、
医薬組成物。
【請求項２】
第一の哺乳動物種がヒトであって、治療用の腫瘍抗原が非ヒト抗原である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
治療用の腫瘍抗原をコードする核酸配列が、リポソームキャリアーに接合する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
治療用の腫瘍抗原をコードする核酸配列が、金コロイド粒子をコートする、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
腫瘍抗原が、ｇｐ７５、ｇｐ１００、悪性メラノーマに対するｍａｒｔ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｍｕｃ−１、前立腺特異的膜抗原，前立腺特異的抗原及び前立腺酸ホスファターゼからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本出願は、分化抗原に対する免疫応答を刺激するための方法及び組成物に関する。
分化抗原は、自己及び同じ由来の幾つかの異質遺伝子型（allogeneic）腫瘍に共通する組織特異的抗原であり、分化の同じ段階において、正常組織該当物上にある。分化抗原は、メラノーマ（melanoma），白血病，リンパ腫，結腸直腸癌，乳癌，前立腺癌，卵巣癌，膵臓癌及び肺癌を含む、様々な腫瘍型によって発現されることが示されている。例えば、メラノーマ細胞によって発現される分化抗原には、Melan−A/MART-1，Pmel17，チロシナーゼ（tyrosinase）及びgp75が含まれる。リンパ腫及び白血病によって発現される分化抗原には、CD19及びCD20/CD20 Bリンパ球分化マーカーが含まれる。結腸直腸癌，乳癌，膵臓癌，前立腺癌，卵巣癌及び肺癌によって発現される分化抗原の例としては、ムチンポリペプチドmuc−1である。乳癌によって発現される分化抗原はher2/neuである。her2/neu分化抗原はまた卵巣癌によっても発現される。前立腺癌によって発現される分化抗原には、前立腺特異的抗原，前立腺酸ホスファターゼ及び前立腺特異的膜抗原が含まれる。
メラノサイト（melanocyte）の分化抗原は、メラノーマを有するヒトの自己抗体及びT細胞に認識され、自己抗原に関連することが示されている（Wangら，J．EXP．Med．183: 799-804（1996）；Vijayasaradhiら，J．Exp．Med．171: 1375-1380（1990））。残念ながらほとんどの場合、個体の免疫系がこれらの抗原に寛容となってしまい、有効な免疫応答を備えていない。それゆえ腫瘍が分化抗原を発現することを特徴とする癌の治療にとって、イン・ビボで（in vivo）、分化抗原に対する免疫応答を刺激する方法をもつことが望まれる。このような方法を提供することが本願発明の目的である。
本願発明の要約
自己の分化抗原に対する免疫系の寛容を克服することができ、治療用の分化抗原の投与によって免疫応答を刺激できることが見出された。治療用の分化抗原を、治療を受ける個体内の標的となる分化抗原（即ち、免疫応答が望まれる分化抗原）に関連して、3つの方法のうちの1つにおいて、改変させる。第一に、治療用分化抗原が、治療を施す個体とは異なる種の細胞で発現されるという条件下では、治療用の分化抗原は、標的となる分化抗原と同系（syngeneic）であってもよい。例えば、昆虫細胞や他の非ヒトの宿主細胞で発現されたヒトの分化抗原を、ヒトである被験者の分化抗原に対する免疫応答を刺激するために用いることができる。第二に、治療用の分化抗原は、例えばグリコシル化変異体などの、同系の分化抗原の変異体であってもよい。第三に、治療用の分化抗原は、治療を施す個体とは異なる種由来の同じ型の（野生型または変異型）分化抗原であってもよい。例えば、マウスの分化抗原を、ヒト被験者内の対応する分化抗原に対する免疫応答を刺激するために用いることができる。本願発明に従って改変された抗原の投与は、治療される個体内の癌によって発現される固有の抗原に対する有効な免疫性を示す。
本願発明のもう1つの側面は、本願発明の方法を実施するのに有用な特定の組成物及び細胞系である。特に、本願発明は、例えば昆虫細胞系などの、ヒト分化抗原を発現する非ヒト細胞系及びこのような細胞系を生成するのに有用な発現ベクターを含む。
【図面の簡単な説明】
Fig.1は、Sf9昆虫細胞で発現したヒトgp75で免疫したマウスを用いた腫瘍防御実験の結果をまとめたものである。
Fig.2は、異種（xenogeneic）のヒトgp75をコードするDNAをもつ遺伝子銃（gun）で免疫されたマウスを用いた腫瘍防御の結果をまとめたものである。
発明の詳細な説明
本願発明は、被験個体内の標的となる分化抗原を発現する組織に対する免疫応答を刺激する方法を提供する。被験個体はヒトであることが望ましいが、本願発明は動物種、好ましくは哺乳動物または鳥類などの獣医学に関する適用にも供される。
本出願の明細書及び請求の範囲に用いられているように、「免疫応答」という語は、細胞性及び体液性の免疫応答を含んでいる。免疫応答は、標的となる分化抗原を発現する腫瘍の成長に対して免疫防御を十分に提供することが望ましい。「刺激する」という語は、新しい免疫応答の最初の刺激もしくは既に存在する免疫応答の増大という意味に当てられている。
本願発明によれば、免疫応答を刺激するのに有効な量で、標的となる分化抗原と同じ型の治療用の分化抗原を投与することによって、被験個体を治療する。従って、例えば、標的となる分化抗原がメラノーマ細胞及びメラノサイトに見出されるgp75抗原である場合は、治療用の抗原もまたgp75抗原である。しかしながら、被験個体と同じ種の細胞で発現される同系の分化抗原の投与が、免疫応答を刺激するのに有効でないことが実験的に見出されている（実施例1及び2参照）。ゆえに、本願発明の方法において有効なものとするために、治療用の分化抗原を、標的となる分化抗原に関連させて改変させなければならない。
本願発明の1つの態様においては、治療用の分化抗原及び標的は両方とも、同じ種由来である。治療用の分化抗原は、第一の種と異なるもう一つの種の細胞での発現によって産生される。本願発明のもう一つの態様おいては、治療用の分化抗原は、同系の分化抗原からの変異体である。本願発明のさらにもう一つの態様においては、異種の分化抗原である。これらの態様について順にそれぞれ、以下に論じる。
治療用の分化抗原の投与は、幾つかの経路で行うことができる。第一に、治療用の分化抗原を、免疫応答の強度を増すために、明ばん，QS21，TITERMAXまたはその誘導体，不完全または完全フロイント（Freund's）及び関連アジュバンドなどの1以上のアジュバンド、及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子，flt−3リガンド，インターロイキン−2及びインターロイキン−12などのサイトカインを含んでいてもよいワクチン組成物の一部として投与してもよい。ワクチン組成物は、溶液状や懸濁液状の治療用の分化抗原の形であってもよく、治療用の分化抗原はリポソーム（liposome）などの脂質（lipid）キャリアーに導入されてもよい。このような組成物は一般に皮下，皮内または筋肉内などの経路で投与される。発現された治療用の分化抗原を含むワクチン組成物は、被験個体内の標的となる分化抗原に対する免疫応答を刺激するのに有効な量で投与される。投与すべき好ましい量は、標的となる個体の種及び特定の抗原に依存するが、用量を増加させて与えて、抗体形成またはT細胞応答の程度をELISAまたは同様な試験によって測定するという、事前のルーチンな試験を通して決定することができる。T細胞の応答はまた、細胞毒性，サイトカイン放出アッセイ及び増殖アッセイなどの細胞免疫アッセイによっても測定される。
同系の変異体、または異種の変異体の治療用の分化抗原はまた、抗原をコードするDNAを、抗原を自ら発現している被験者に導入するというDNA免疫化技術を用いる本願発明に従って導入されてもよい。
異なった種の細胞で発現される同系の抗原
本願発明によれば、標的となる分化抗原に対する免疫応答を、異なった種の細胞で発現される同系の分化抗原の投与によって刺激することができる。一般に、治療を受ける被験者はヒトまたは他の哺乳類である。従って、昆虫細胞は同系の分化抗原の発現にとって好ましい型の細胞である。適した昆虫細胞系には、Sf9細胞及びシュナイダー（Schneider）2 Drosophila細胞が含まれる。治療用の分化抗原はまた、バクテリア，酵母またはCOSやチャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物細胞系でも発現できる。哺乳類の被験者に対して、昆虫，酵母またはバクテリアなどの、治療を受ける被験者と進化論的に離れている宿主細胞は、被験者と同一の様式で発現されるタンパク質を産生することはないと考えられるので、好ましいといえる。
選択された系において分化抗原の発現を提供するために、分化抗原や免疫学的に有効な発現産物を提供するのに十分な程度の分化抗原の一部をコードするDNAを、適当な発現ベクターに挿入する。宿主細胞に編入された遺伝子物を発現するために供される既知のベクター系は多数あり、昆虫細胞と共に使用されるバキュロウイルスベクター，バクテリア及び酵母の発現ベクター、もしくは哺乳動物細胞と共に使用されるプラスミドベクター（psvk3など）が含まれる。これらの系の使用は当分野ではよく知られている。
同系の分化抗原でのヒトの治療のために、標的とすべきヒト分化抗原をコードするcDNAが役立つに違いない。cDNAをmRNAの逆転写によって生成し、標的とする分化抗原をコードする特定のcDNAを、分化抗原のタンパク質の配列に由来するプローブを用いるヒトcDNAライブラリーから同定できる。多種のヒト分化抗原のcDNA配列がこれらの方法により引き出され、当分野で知られている。例えばヒトgp75（チロシナーゼ関連タンパク質−1としても知られている）の配列が、Vijayasaradhi，S．，Bouchard，B．，Houghton，A．N，“メラノーマの抗原gp75は、マウスb（brown）座遺伝子産物のヒト相同体である。”，J． Exp．Med．171: 1375-1380（1990）；Bouchardら，J．Exp．Med．169: 2029-2042（1989）から知られている。既知のcDNA配列をもつ他のヒト分化抗原には、gp100（チロシナーゼ関連タンパク質−2としても知られている）（Kawakamiら，Proc．Nat'l．Acad．Sci．（USA）91: 6458-6462（1994）；Ademaら，J．Biol．Chem．269: 20126-20133（1994））、及び悪性メラノーマに対するmart−1/melan−a；非ホジキン（Hodgkin's）リンパ腫に対するCD19及びCD20；乳癌に対するher−2/neu（Kingら，Science 229: 874-976（1985））；胸，結腸直腸，肺，膵の腫瘍に対するmuc−1（Spicerら，J．Biol．Chem．266: 15099-15109（1991））前立腺癌に対する前立腺特異的膜抗原，前立腺特異的抗原及び前立腺酸ホスファターゼ（Israeliら，Cancer Res．54: 6344-6347（1994）；Monneら，Cancer Res．54: 6344-6437（1994）；Vihkoら，FEBS Lett．236: 275-281（1988））がある。
異なった種の細胞で発現された治療用の分化抗原を、免疫応答を誘導するのに十分な量、被験個体に投与する。投与される組成物は、治療用の分化抗原を発現する細胞の溶解産物であってもよく、治療用の分化抗原の精製または部分精製調製物であってもよい。
同系分化抗原の変異体
本願発明の第二の態様において、標的となる腫瘍によって発現される型の同系の分化抗原の変異体が、腫瘍に対して向けられる免疫応答を刺激するために用いられた。従って、例えば腫瘍がgp75を発現するヒト腫瘍である場合は、ヒトgp75の変異体が、治療用の分化抗原として使用される。
全ての変異体が本願発明の方法で有用な抗原を生産するわけではないことは、当業者に認識されている。例えば、重要なエピトープを失った、大規模な欠失体は、作用を示すことが期待できず、本願の明細書及び請求の範囲で用いられている意味での治療用の分化抗原であるとは考えられない。しかしながら、より広い変異、特に発現された分化抗原の三次及び／または四次構造を変化させるほどの変異は、本願発明の範囲に含まれる。
治療用の分化抗原の変異体の好ましい型は、グリコシル化変異体である。いずれの与えられた膜タンパク質においても、一般的に1つもしくは多数のグリコシル化部位があり、その各部位はそれぞれ、タンパク質の輸送及び分解に対するその効果において重要性が異なる。例えば、マウスgp75の場合は、6個のN−グリコシル化部位があり、その1つはプロテアーゼ消化に強い抵抗性を示し、他の2つは、タンパク質の小胞体からの運び出しをさせるのに重要である。これらの部位（Asn96，Asn104，Asn181，Asn304，Asn350，Asn385）で改変されるグリコシル化変異体は、部位直接の変異を用いて調製される。これらの変異は、通常非免疫原性である同系のタンパク質を、免疫性をもつ改変された抗原に変換させる。
アミノ酸350番目のアスパラギンをこの部位でのグリコシル化を失わせるように改変した、同系のグリコシル化gp75変異体での遺伝子免疫が、細胞内のgp75の早期にプロセスされた型に対する自己抗体の産生を刺激することを見出した。これらの自己抗体は成熟型のgp75を認識しなかった。我々はこれらと同様な抗体を、この改変されたタンパク質を発現する細胞で免疫することによって、即ち、同じ効果をもつ改変されたタンパク質での免疫によって産生した。
異種の分化抗原
本願発明によれば、標的となる分化抗原に対する免疫応答を、同じ型の異種の分化抗原の投与によって刺激することができる。従って、例えばgp75を発現する腫瘍に対する免疫応答を、自己抗原に対する寛容を壊す異なった種由来のgp75での免疫化によって、刺激することができる。ヒトの治療にとって、好ましい異種抗原はげっ歯類の抗原であるが、イヌ，ネコ，ウシやヒツジなどの他の哺乳類、または鳥類，魚類，両生類，爬虫類，昆虫または他のより遠縁の種からも得ることができる。
異種の分化抗原を、起源となる生体から由来する、精製した分化抗原として投与してもよい。またタンパク質を、この目的のために細胞溶解物からカラムクロマトグラフィーを用いて精製することができる。またタンパク質を、この目的のために望む産物を発現するバクテリア，酵母クローン，哺乳動物及び昆虫細胞系などの組換え原体からも精製することができる。多くの非ヒト原体からの多くの分化抗原の核酸配列は既知であり、マウスチロシナーゼ（gp75）（Yamamotoら，Japanese J．Genetics 64: 121-135（1989））；マウスgp100（Bailinら，J．Invest．Dermatol．106: 24-27（1996））；及びラット前立腺特異的膜抗原（Bzdegaら，J．Neurochem．69: 2270-2277（1997））が含まれる。
異種抗原はまた、分化抗原をコードするDNAでの被験者の遺伝子免疫化を介して間接的に投与されてもよい。分化抗原をコードするcDNAを、哺乳動物細胞での核酸ポリマーの発現に有効なプロモーターと結合する。これは、核酸ポリマーを制限的エンドヌクレアーゼでの消化及びSV40プロモーター，サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターやラウスザルコーマ（Rous sarcoma）ウイルス（RSV）プロモーターなどのプロモーターを含むプラスミドへのクローニングによって行われる。そして生じた構成体を遺伝子免疫のためのワクチンとして使用する。また核酸ポリマーを、哺乳動物細胞に形質導入されることが知られているプラスミド及びウイルスベクターにクローンすることができる。これらのベクターには、レトロウイルスベクター，アデノウイルスベクター，ワクシニアウイルスベクター，ポックスウイルスベクター及びアデノウイルス関連ベクターが含まれる。
プロモーター，抗原−コーディング（coding）領域及び細胞ソーティング（sorting）領域を含む核酸構築体を直接投与することもできるし、投与前にリポソームに包埋したり、金コロイド粒子をコートすることもできる。DNAワクチンをリポソームに包埋する技術は、Murray編集“Gene Transfer and Expression Protocols”Humana Pres，Clifton，NJ（1991）などから、当分野においては既知である。同様に、裸のDNAに金粒子をコートする技術も、Yangの“Gene transfer into mammalian somatic cells in vivo”，Crit．Rev．Biotech．12: 335-356（1992）中に教授されており、ウイルスベクターを用いるタンパク質発現の技術はAdolph，K.編集“Viral Genome Methods”CRC Press，Florida（1996）中に見出すことができる。
遺伝子免疫において、ワクチン組成物は、好ましくは、注射、もしくは粒子衝撃（particle bombardment）により送られるガスによって、皮内，皮下または筋肉内に投与され、宿主生体内の免疫応答を刺激するのに有効な量が送達される。この組成物は、リポソームの形質移入，粒子衝撃または（共生培養（co-cultivation）技術を含む）ウイルス感染を用いて、半ビボで（ex vivo）血液のまたは骨髄由来の細胞（APCsを含む）に投与されてもよい。そして処理された細胞を、免疫すべき被験者にもどす。必要とされる物質量は各個体の免疫原性に依存し、事前に予測できないと考えられているが、どの被験個体に対しても適した量を決定する方法が直接的である。具体的には、約0.1μgから始まる、一連の増大する大きさの用量を投与し、ELISAを用いて抗体滴定を測定したり、クロム放出アッセイを用いてCTLを検出したり、またはサイトカイン放出アッセイを用いてTH（ヘルパーT細胞）応答を検出したりすることによって、生じる免疫応答を観察する。
本願発明を、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに詳述する。
実施例1
C57BL/6マウスを、a）同系のgp75+B16メラノーマ細胞（非変異b座（locus）タンパク質；b）IL−2，GM−CSF及びIFN−γを発現する、同系のB16細胞；c）同系のgp75-B16メラノーマ変異体，B78H.1及びマウスb対立遺伝子を発現するcDNAで形質導入された、同系の線維芽細胞；d）キャリアタンパク質に接合したgp75の親水性ペプチド；及びe）同系のメラノーマ細胞から精製された、全長型gp75糖タンパク質で免疫した。細胞，精製した糖タンパク質またはペプチドをフロイントアジュバント，バクテリアの細胞壁骨格の混合物及びエンドトキシン誘導体（DETOX），及びサポニン構成物（QS21）を含むアジュバントと組合せた。免疫化は、腹腔内，皮下及び皮内の経路で試験された。免疫化の後、マウスをgp75に対する抗体について、ELISA，免疫沈降及びウェスタンブロットによって評価し、B16に対する細胞毒性Tリンパ球（CTL）については、51Cr放出細胞媒介の細胞毒性アッセイを用いて評価した。Table 1にまとめたように、いずれの免疫化方法においても実施後、gp75に対する抗体またはCTLは検出されず、C57BL/6はgp75糖タンパク質に寛容のままであることが支持された。
実施例2
実施例1に示したように、細胞結合型または精製型のgp75タンパク質で免疫した同系のC57BL/6は、gp75に対する自己抗体を産生しなかった。我々は次に、粒子衝撃によって同系のC57BL/6マウスの真皮に送達したcDNAにコードされるgp75が、自己抗体応答を誘導するかどうかを評価した。
C57BL/6マウスを、1週間に一度で5週間、CMVプロモーターの制御下で同系のgp75を全長コードするcDNAで遺伝子免疫した。そしてこれらのマウスからの血清を、材料及び方法で記載したように、gp75に対する自己抗体について免疫沈降によって評価した。抗体が検出されたマウスはなく（0/28）、C57BL/6マウスが同系のタンパク質に対して寛容であることが示された。
実施例3
げっ歯類のgp75を全長コードするバキュロウイルスベクターを、Dr．Charles Tackney（Iclone，New York，NY）と共同で、標準的な技術を用いて構築し、分離した（Summers & Smith，“バキュロウイルスベクター及び昆虫細胞培養に関する方法のためのマニュアル”，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No 1555（1987）；Lucklow & Summers，Biotechnology 6: 47-55（1988））。要約すれば、げっ歯類のgp75をコードするpHOMERB2の1.8kbのEcoRIフラグメントを、ストラテジーン（Stratagene）社製のｐBbacに関連したバキュロウイルス発現ベクターにサブクローン（subclone）し、発現ベクターをバキュロウイルスに導入した。Spodoptera frugiperda Sf9昆虫細胞をこのウイルス体及び野生型のAutographa californica nuclear polyhedrosis virus（AcNPV）と共感染させ、マウスgp75を発現する組換えAcNPVを相同組換えにより産生した。プラーク精製後、Sf9細胞を組換えウイルスに感染させ、高レベルのgp75を発現するクローンを、gp75に対する抗体でのスクリーニングにより同定した。これらの細胞系を免疫化研究に使用した。
C57BL/6マウスを、バキュロウイルスベクター内の同系のgp75または野生型のバキュロウイルスのどちらか一方を発現するSf9昆虫細胞（それぞれgp75/Sf9またはwt/Sf9）の溶解物で免疫した。gp75/Sf9溶解物（1または5×106細胞）で免疫したマウスは、gp75に対する自己抗体を、フロイントアジュバントありで（120/120マウス）またはなしで（25/28マウス）発現した。wt/Sf9での免疫化後では、抗体は検出されなかった（46マウスのうち0）。自己抗体は2〜4回の免疫化後に現れ、最後の免疫化後4ヶ月以上持続し、同系のメラノサイト細胞（B16F10及びJBRHメラノーマ）で発現されたgp75と反応した。抗体は、ウサギ抗マウスIgG及びプロテインAとの反応性、及び血清からのIgG分画との抗体反応性の共精製（copurification）に基づいて、IgGクラスであった。
gp75/Sf9とマウスgp75との免疫原性における違いは、8×106のB16メラノーマ細胞がgp75を20μg含むのに対し、1×106のgp75/Sf9細胞では14μgしかないことと比較して、2つの調製物でのgp75量における、単に量的な違いによるものではなかった。また、wt/Sf9溶解物と混合した10μgの精製マウスgp75は自己抗体を誘導しなかった。Sf9細胞がアジュバント効果を与えることは明らかであるけれども（Prehaudら，Virology 173: 390-399（1989）；Ghiasiら，J．Gen．Virology 73: 719-722（1992））、これらの結果は、昆虫細胞で産生されるgp75とマウス細胞で産生されるgp75との他の違い（例えば糖質の構造）が、自己抗体を誘導するのに必要であることを示している。
実施例4
gp75/Sf9溶解物での免疫化と対照的に、gp75．Sf9昆虫細胞で産生された精製gp75（12μg）にフロイントアジュバントを加えたものでの免疫は、68/70kDaの早期にプロセスされた型のgp75を認識する自己抗体を誘導した。この型のgp75は、未成熟の高マンノースN−リンク糖質のみを含有し、その結果としてこのgp75は小胞体またはゴルジ体に位置する。
実施例5
マウスを、gp75+ヒトメラノーマ細胞系SK−MEL−19とフロイントアジュバントで免疫化し、げっ歯類のgp75に対する自己抗体の発現を評価した。全てのマウス（20/20）が自己抗体を発現した。アジュバントなしでは応答はなく（0/5マウス）、gp75に対する抗体は、gp75-ヒトメラノーマSK−MEL−131またはSK−MEL−37にフロイントアジュバントを加えたもので免疫化した12匹のマウスの血清中には検出されなかった。精製ヒトgp75（10μg／用量を5回免疫）をフロイントアジュバントと共に免疫化したマウス5匹のうち3匹は、gp75に対する自己抗体を発現したが、SK−MEL−19溶解物中のgp75量に比べて、使用された精製gp75の量が少ないことによる可能性が高いのだけれども、抗体応答は一般的に弱った。従って、ヒトgp75の投与はC57BL/6マウスにおけるgp75に対する寛容を破壊した。
実施例6
C57BL/6マウス内のB16メラノーマ細胞及び正常メラノサイトは、GP75，ブラウン座の野生型b対立遺伝子を発現する。上記したように、この遺伝子座の産物は、gp75/Sf9細胞で発現されたマウスgp75及びヒトgp75で免疫した同系のマウスからの血清によって認識される。我々は以前、gp75に対するマウスモノクローナル抗体の、B16F10腫瘍を植え付けたマウスへの受身移入は腫瘍の拒絶を導くことを示した（Haraら，Int．J．Cancer 61: 253-260（1995））。観察された自己免疫応答が、腫瘍に対する同様な防御を与えたかどうか決定するため、gp75の免疫認識のイン・ビボの効果を、同系の腫瘍モデルを用いて研究した。
マウス（1群5匹）に、gp75/Sf9溶解物（5×106gp75/Sf9細胞）を皮下に、同時に105B16F10メラノーマ細胞を経静脈投与し、腫瘍誘発14日後の肺転移の発生をモニターした。wt/Sf9細胞で免疫したマウス、及び免疫化していないマウスをコントロールとして用いた。結果をFig．1にまとめる。示されるように、gp75/Sf9溶解物で免疫したマウスでは、コントロールに比べて肺転移の形成が十分に防御された。転移が成立するであろう、腫瘍誘発の4日後に、免疫化が行なわれたときにも、著しい防御（肺転移においての53%の減少）が観察された。免疫化していないコントロールに比べて、wt/Sf9溶解物で免疫化したマウスにおいては、あまり防御効果は認められなかった。
wt/Sf9溶解物で免疫化したマウスからの血清の、5匹の免疫化していないマウスへの受身移入によって、同量の正常マウス血清で処理したマウスに比べて肺転移が68%減少し（ｐ＝0.02）、腫瘍防御は少なくとも部分的には液性機構を介しているという結論を支持していた。
ヒトgp75+SK−MEL−19で免疫したマウスにおいても、免疫化されていないマウスに比べて、B16F10メラノーマに対して著しく防御された（コントロールマウスで275±77の肺転移に対して、免疫化マウスで4±7の転移−1群6匹）。gp75以外の他の異種の抗原の認識を、完全には評価できないが、gp75-メラノーマSK−MEL-131での免疫化は、B16F10メラノーマに対する腫瘍防御を誘導しなかった。
gp75/Sf9細胞から精製したgp75を用いて、未成熟な、早期にプロセスされた型のgp75に対して免疫されたマウスは、B16F10転移に対してあまり防御されなかった（5匹の免疫化されていないコントロールマウスで412±94の転移に対して4匹の免疫化されたマウスで366±78の転移）。しかしながら、最終的には、この群の中の1匹が成熟gp75に対する自己抗体を発現し、肺転移に対して防御された（21の転移だけ）。
実施例7
C57BL/6マウスを、遺伝子銃インジェクション（gene gun injection）によって1週間に一度で5週間、CMVプロモーターの制御下で、ヒトgp75を全長コードするcDNAで遺伝子的に免疫した。コントロールとして、マウスに、CMVプロモーターの制御下での同系のマウスgp75を全長，gp75のグリコシル化変異体（gly31）またはヌル（null，無意味な）DNAを注射した。最後の免疫化の4週後に、マウスに、尾血管から2×105B16F10LM3メラノーマ細胞を注射した。処理されたマウスの1群を再度メラノーマ細胞で誘発した。腫瘍誘発の20日後に、マウスを屠殺し、表面転移肺小節（nodule）を数えた。未処理群は10匹，ヌル及びマウスgp75群はそれぞれ9匹，gly31群は8匹、そしてヒトgp75群は19匹であった。CD4，CD8及びNK細胞の意義についてもモノクローナル抗体（CD4に対してラットmAb GK1.5；CD8に対してmAb53.6.7；NK1.1に対してmAbPK1.36）を用いる枯渇によって試験した。CD4 T細胞の必要性も、遺伝子銃（gun）によるヒトgp75遺伝子のイン・ビボの移入後のCD4ノックアウトマウスでの腫瘍拒絶を探索することによって評価した。
Fig．2に示すように、異種のヒトgp75で免疫したマウスが、B16F10LM3メラノーマで誘発されると、肺転移から著しく防御され（平均41±15転移）（ｐ＜0.0001）、コントロールのマウスと比較して肺小節は84％減少した。グリコシル化マウスgp75変異体のイン・ビボの遺伝子移入を受けた同系のマウスは、B16F10LM3腫瘍誘発からあまり防御されず（平均300±12転移）、また粒子衝撃によりコントロールのDNAが送達されたもの（平均292±15転移）や未処理であったもの（平均307±20転移）も同様であった（ｐ＞0.45）。CD8の欠失は腫瘍の拒絶に変化を与えなかったが、（mAbまたはノックアウトによる）CD4+及びNK1.1+の枯渇は、達成される防御レベルを減少させた。従って、後者2つの細胞は、異種のDNAでの遺伝子免疫化を用いて達成される腫瘍からの防御において役割を演じているのかもしれない。
【図１】
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【図２】
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