(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水又は緩衝液中に、１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの組織トロンボプラスチン及び１〜２０ｍＭのカルシウムイオン形成化合物を含有してなる血液凝固時間測定用溶液試薬において、更にグルコース、フルクトース、リボース、マンノース、キシロース、ショ糖、トレハロース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、マルチトール、パラチノース、キシロビオース、トリマルトース、グルコシルスクロース、オリゴキシロース、エチレングリコール、グリセロール、及びソルビトールからなる群より選ばれる少なくとも１種からなる糖類および／または多価アルコールを１０〜３０重量％含有してなることを特徴とする血液凝固時間測定用溶液試薬。
【請求項２】
前記糖類および／または多価アルコールが１分子中にエカトリアル位のＯＨ基を３個以上有する糖類および／または１分子中にＯＨ基を３個以上有する多価アルコールである請求項１に記載の血液凝固時間測定用溶液試薬。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の血液凝固時間測定用溶液試薬に凍結乾燥保護剤を添加し、凍結乾燥することを特徴とする血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物の製造方法。
【請求項４】
請求項３に記載の血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物の製造方法で製造される、“水又は緩衝液中に、１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの組織トロンボプラスチン及び１〜２０ｍＭのカルシウムイオン形成化合物を含有してなる血液凝固時間測定用溶液試薬であって、更にグルコース、フルクトース、リボース、マンノース、キシロース、ショ糖、トレハロース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、マルチトール、パラチノース、キシロビオース、トリマルトース、グルコシルスクロース、オリゴキシロース、エチレングリコール、グリセロール、及びソルビトールからなる群より選ばれる少なくとも１種からなる糖類および／または多価アルコールを１０〜３０重量％含有してなる血液凝固時間測定用溶液試薬”用の乾燥組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は臨床検査に使用される血液凝固時間測定用溶液試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液凝固能は様々な疾患、抗凝固剤、あるいは外傷などにより大きく影響される。そのため、患者の病態について詳しい情報を得るために血液凝固能が測定される。たとえばビタミンＫは肝臓で合成されるため、肝臓に疾患を持つ場合には、ビタミンＫの作用によって活性化される血液凝固第ＩＩ、第ＶＩＩ、第ＩＸ、第Ｘ因子の活性が低下する。そのため血液凝固能の測定を行い、これらの血液凝固因子の活性を調べ、その結果から肝臓の障害を知ることができる。また、外科手術時には血液凝固能を一定の範囲にまで低下させるためにヘパリン等の薬剤を投与するが、この時もヘパリン等の投与量をコントロールするために血液凝固能が測定されている。
【０００３】
人や動物の血液凝固能を測定する方法として様々な方法が用いられている。例えば、血液凝固時間の測定、抗原抗体反応を利用した各血液凝固因子の定量などがある。この中で血液凝固時間の測定はその簡便さから広く普及している。
【０００４】
血液凝固時間は血液凝固反応を開始してから、血液が凝固し該反応が終了するまでの時間である。血液凝固反応は、血液凝固因子の関与する反応が何段にもわたり順次に起きるカスケード反応であるため、ある血液凝固因子の濃度が低いとその血液凝固因子が関与する反応は遅く進行し、それに伴い得られる血液凝固時間は正常の場合よりも延長する。従って、血液凝固時間を測定し正常人の血液凝固時間と比較することにより血液中の血液凝固因子濃度の異常を知ることができる。例えば、ある血液凝固反応の引き金となる物質あるいは触媒等を、測定したい血漿試料あるいは全血試料（以下、これらを単に血液試料と呼ぶ。）と反応させ、その血液凝固時間を測定すれば、血液凝固反応に関与するある特定の凝固因子の不足の有無等を知ることができる。この測定原理を用いた血液凝固時間の検査項目として、外因系凝固経路の正常・異常を検査するプロトロンビン時間（ＰＴ）、内因系凝固経路の正常・異常を検査する活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）などが挙げられる。
【０００５】
ところで、従来用いられてきたこれらの血液凝固時間の測定方法は、主に溶液試薬を用いた測定方法であり、該方法は現在も広く使用されている。この方法は、まず凍結乾燥試薬に蒸留水等を加えて再生することで溶液試薬を調製し、血液試料に該溶液試薬を接触させて反応させ、反応液の濁度変化あるいは粘度変化が生じるまでの時間を測定して血液凝固時間を測定する方法である。
【０００６】
以下に、上記方法についてＰＴ測定用凍結乾燥試薬を用いた例を具体的に説明する。ＰＴ測定用凍結乾燥試薬は主成分として組織トロンボプラスチン、カルシウム塩を含むもので、一般に市販されている。この凍結乾燥試薬を用いた測定は、まず上記の該凍結乾燥試薬を水溶液にしたＰＴ測定用溶液試薬を調製して加温後、これを同じく予備加温しておいた血液試料に添加して添加直後から反応系の濁度変化あるいは粘度変化を測定する（フィブリンの析出により凝固し始めると、反応系の濁度および粘度が変化する）ことにより行われている。そして、ある一定の濁度あるいは粘度変化が生じた点を血液凝固反応の終点とし、血液試料を添加してから該終点までの時間を血液凝固時間として求めている。この血液凝固時間はＰＴ反応経路（外因系凝固経路）に関与する凝固因子の活性に応じて変化し、活性が低いほど延長する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、上記のようなＰＴ測定用溶液試薬のような組織トロンボプラスチン、カルシウム塩を含む溶液試薬を静置しておくと数時間で沈殿が生じてくる。そして、沈殿物を再懸濁することなしに該溶液試薬を用いて血液凝固時間の測定を行った場合には、血液凝固時間は本来得られるべき値よりも沈殿の程度に対応して延長することがわかった。すなわち、従来用いられてきた溶液試薬は静置保存するだけで試薬の性能は劣化し、長期保存ができないという欠点があることが明らかとなった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記のように、血液凝固時間測定用溶液試薬における沈殿の生成と性能の悪化には明らかな相関が見られたことから、本発明者等は、まず溶液試薬の懸濁状態を安定化させることに着目し、溶液試薬の懸濁状態の安定化方法について鋭意研究を行った。その結果、組織トロンボプラスチン、カルシウム塩を含む溶液試薬に糖類および／または多価アルコールを特定量含有させることにより試薬の懸濁状態を安定化できることを見出した。そして、そのことにより溶液試薬の性能も長期間安定することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、水又は緩衝液中に、１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの組織トロンボプラスチン及び１〜２０ｍＭのカルシウムイオン形成化合物を含有してなる血液凝固時間測定用溶液試薬において、更にグルコース、フルクトース、リボース、マンノース、キシロース、ショ糖、トレハロース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、マルチトール、パラチノース、キシロビオース、トリマルトース、グルコシルスクロース、オリゴキシロース、エチレングリコール、グリセロール、及びソルビトールからなる群より選ばれる少なくとも１種からなる糖類および／または多価アルコールを１０〜３０重量％含有してなることを特徴とする血液凝固時間測定用溶液試薬である。該血液凝固時間測定用溶液試薬においては、前記糖類および／または多価アルコールが１分子中にエカトリアル位のＯＨ基を３個以上有する糖類および／または１分子中にＯＨ基を３個以上有する多価アルコールであることが好ましい。
【００１０】
さらに、別の発明は、上記本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬に凍結乾燥保護剤を添加し、凍結乾燥することを特徴とする血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物の製造方法によって製造される、“水又は緩衝液中に、１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの組織トロンボプラスチン及び１〜２０ｍＭのカルシウムイオン形成化合物を含有してなる血液凝固時間測定用溶液試薬であって、更にグルコース、フルクトース、リボース、マンノース、キシロース、ショ糖、トレハロース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、マルチトール、パラチノース、キシロビオース、トリマルトース、グルコシルスクロース、オリゴキシロース、エチレングリコール、グリセロール、及びソルビトールからなる群より選ばれる少なくとも１種からなる糖類および／または多価アルコールを１０〜３０重量％含有してなる血液凝固時間測定用溶液試薬”用の乾燥組成物である。
【００１１】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬では、1)糖類および／または多価アルコールを含むことによりその粘度が上昇し、試薬中の組織トロンボプラスチン同士の衝突が抑制される、或いは2)糖類および多価アルコールの有する適度な界面活性作用により組織トロンボプラスチンの疎水性領域同士の親和力に基づく凝集が抑制される等して、結果として沈殿物となる組織トロンボプラスチン凝集物の生成が抑制されるもの思われる。そして、糖類および多価アルコールは血液凝固反応阻害しないため、本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬は長期間保存後測定しても信頼性の高い測定結果を与えることができる（保存安定性が高くなる）と考えられる。また、１分子中に存在するエカトリアル位のＯＨ基の数の多い糖類や１分子中のＯＨ基の数の多い多価アルコールは、上記粘度上昇効果や界面活性効果が高いため、このような物質を添加した場合には上記の効果が特に高いものと思われる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明で用いる組織トロンボプラスチンとは、牛脳、兎脳等からアセトン等により抽出された外因系凝固経路に関与する血液凝固因子であり、血液試料の凝固反応の触媒となる成分である。組織トロンボプラスチンは複数の蛋白質と脂質成分の混合物であり、溶液状試薬中では懸濁状態で存在する。本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬中の組織トロンボプラスチンの含有量（濃度）は特に限定されず、一般に１０μｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で使用されるが、血液凝固反応の進行がより安定する点から１〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度が好適である。
【００１３】
本発明で用いるカルシウムイオン形成化合物は血液凝固反応に必須のカルシウムイオンの供給源であり、例えば塩化カルシウムや乳酸カルシウム等のカルシウム塩が挙げられる。本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬中のカルシウムイオン形成化合物の濃度は特に限定されないが、一般には約１〜２０ｍＭ程度である。該濃度は、血液凝固反応の進行がより安定するという理由で、約４〜１５ｍＭの濃度が特に好適である。
【００１４】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬に含まれる前記糖類および／または多価アルコールのうち、糖類としては、グルコース、フルクトース、リボース、マンノース、キシロース、ショ糖、トレハロース、セロビオース、マルトース、イソマルトース、マルチトール、パラチノース、キシロビオース、トリマルトース、グルコシルスクロース、およびオリゴキシロースが使用される。
【００１５】
その中でも本発明の効果の高さの点から、一分子中にエカトリアル位のＯＨ基を３個以上有する糖類が好適に使用できる。
【００１６】
尚、本発明でいうエカトリアル位のＯＨ基とは、環状の糖分子面に対してほぼ並行な方向に配置されたＯＨ基を指す。又、糖類は、一般に複数の構造異性体の混合物として存在し、該構造異性体は相互に変換し得るため、同じ糖であっても形成される構造異性体によってエカトリアル位のＯＨ基の数は異なる場合がある。従って、この様な場合における糖類の１分子中に存在するエカトリアル位のＯＨ基の数は、当該糖類について取りうる全ての構造異性体の存在比を考慮した平均の個数を求め、該平均の個数を以て一分子中のエカトリアル位のＯＨ基の数とする。即ち、糖類が構造異性体を有する場合には、各構造異性体のそれぞれのエカトリアル位ＯＨ基の数と存在率の積の総和を求め、該総和を以て１分子中のエカトリアル位のＯＨ基の数とする。
【００１７】
例えば、糖類がグルコースである場合、α型構造異性体及びβ型構造異性体の存在率並びにエカトリアル位のＯＨ基の数は、それぞれ４０％及び６０％、並びに４個及び５個であるため、グルコース一のエカトリアル位ＯＨ基の数は、４×０．４  ＋  ５×０．６  ＝４．６となる。
【００１８】
一分子中のエカトリアル位のＯＨ基の数が３以上の糖類としては、グルコースの他にマンノース、ショ糖、トレハロース、オリゴキシロースが挙げられる。
【００１９】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬に含まれる前記糖類および／または多価アルコールのうち、多価アルコールとしては、エチレングリコール、グリセロール、ソルビトールが用いられるが、その効果の高さの点から、１分子中のＯＨ基の数が３以上である多価アルコールを使用するのが好適である。そのような多価アルコールを例示するとグリセロール、ソルビトール等が挙げられる。
【００２０】
糖類および多価アルコールは、１種類を単独で使用しても良く、又、複数のものを混合して使用しても良い。
【００２１】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬中に含まれる前記の糖類および／または多価アルコールの濃度範囲は１０〜３０重量％である。
【００２２】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬は、水又は緩衝液中に前記の組織トロンボプラスチン、カルシウムイオン形成化合物、並びに糖類および／または多価アルコールを含有してなるが、このとき使用する水又は緩衝液は特に限定されない。上記水としては蒸留水又はイオン交換水を使用するのが好ましく、緩衝液を使用する場合には、これら水に緩衝剤を添加すればよい。このとき使用できる緩衝剤としては２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（HEPES）、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸（EPPS）等のＧｏｏｄ’ｓ緩衝剤類、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどが例として挙げられる。該緩衝剤の濃度は、血液試料と混合したときに十分にｐＨを保つことができる濃度で、かつ血液凝固反応を著しく阻害しない濃度であれば特に限定されないが、一般的には１〜５０ｍＭの範囲で使用するのが好適である。
【００２３】
一般に、血液凝固反応の進行を円滑に行わせるためには上記水又は緩衝液はｐＨが約６〜９の緩衝液であることが望ましく、そのためには蒸留水やイオン交換水等の水に上記緩衝剤およびｐＨ調節剤を添加してｐＨが約６〜９となるように調製すればよい。このとき使用できるｐＨ調節剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ性化合物または塩酸、硫酸、リン酸等の酸性化合物等が挙げられる。これらｐＨ調節剤の添加量は、緩衝剤の濃度、種類、所望するｐＨ等に応じて適宜決定すればよい。
【００２４】
さらに、本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬には、血液凝固反応の速度を制御するための無機塩を添加することができる。該無機塩として塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、チオシアン酸ナトリウムなどのナトリウム塩、塩化カリウムなどのカリウム塩が例として挙げられる。該無機塩の濃度は特に限定されないが、一般に１０〜５００ｍＭの範囲にて使用される。
【００２５】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬を調製する方法については特に限定されず公知の方法を用いることができる。一般的には、緩衝液に所定量のカルシウムイオン形成化合物並びに糖類および／または多価アルコールを添加した後、マグネチックスターラ等で撹拌することで溶解させ、次に３７℃で加温しながら該溶解液に組織トロンボプラスチンを添加し、その後１時間程撹拌して調製する方法、市販のカルシウムイオン形成化合物が含有されている組織トロンボプラスチン凍結乾燥品に所定量の糖類および／または多価アルコールが含有されている水溶液を添加し混合する方法、並びに後述する本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物に蒸留水やイオン交換水を加え撹拌する方法等が挙げられる。
【００２６】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬は、これに凍結乾燥保護剤等を添加し、凍結乾燥することにより血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物とすることで乾燥状態で保存することができる。この時使用できる凍結乾燥保護剤としてはウシ血清アルブミン、グリシン、グリシルグリシン等のアミノ酸類が例として挙げられる。該凍結乾燥保護剤の使用量は特に限定されないが、一般に蒸留水等で溶解し本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬としたときの濃度で約０．１〜１０重量％の範囲となる量であるのが好適である。
【００２７】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物を調製する方法については特に限定されず、例えば、本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬に上記凍結乾燥保護剤を添加したものをバイアルびんに分注し、凍結後に凍結乾燥を行うことで調製できる。
【００２８】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬を用いて血液凝固時間を測定する方法は、用いる試薬が本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬である点を除いて従来の血液凝固時間測定用溶液試薬を用いた測定法方と変わる所は特にない。
【００２９】
又、本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物を用いて血液凝固時間を測定する場合には、該乾燥組成物に所定量の蒸留水等を加えて懸濁状態の溶液試薬液とし、該溶液試薬液を用いて従来の血液凝固時間測定用溶液試薬を用いたときと同様にして測定すればよい。例えば、試験管中で３７℃に加温された所定量の測定用血液試料に予め３７℃に加温された所定量の本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬を加え混合し、反応系の粘度あるいは濁度の変化をモニターし、濁度あるいは粘度がある一定量変化するまでの時間を計ることにより測定される。
【００３０】
このような血液凝固時間測定ができる測定装置としては市販のＫＣ−１０Ａ（アメルング社）、ＣＡ−５０００（東亜医用電子株式会社）等が挙げられる。
【００３１】
【実施例】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、本発明は該実施例に限定されるものではない。
【００３２】
実施例１〜６
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬を用いて保存安定性試験を行った。
【００３３】
まず、本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬を表１及び表２に示す組成で各々１０ｍｌずつ調製した。
【００３４】
【表１】
0003992792.tif 000002
【００３５】
【表２】
0003992792.tif 000003
【００３６】
尚、試薬の調製は、実施例１〜６すべてにおいて緩衝液３０ｍＭＨＥＰＥＳ（同仁化学製）に上記各構成成分を添加・混合した後、ｐＨを７．３５に調整する方法で行った。
【００３７】
調製した各血液凝固時間測定用溶液試薬を蓋つき容器中で４℃で静置保存した。試験開始直後から１週間おきに溶液試薬上部の０．３ｍｌをサンプリングし、次のような方法で濁度試験と試薬性能評価試験を行った。
【００３８】
［濁度試験］
沈殿の発生で溶液試薬上部の濁度が減少することを利用し、サンプリングした血液凝固時間測定用溶液試薬０．０５ｍｌと０．３５ｍｌの水とを混合し、該混合液の波長６６０ｎｍでの吸光度を測定する事により行った。
【００３９】
［試薬性能評価試験］
市販のコントロール血漿（Dade社  CITROL-1）０．１ｍｌに対しサンプリングした血液凝固時間測定用溶液試薬０．２ｍｌを加え、その血液凝固時間を測定することで行った。尚、血液凝固時間の測定装置はＫＣ−１０Ａ（アメルング社製）を使用した。測定方法は取り扱い説明書に従い測定した。
【００４０】
９週間の保存安定性試験について、糖類添加の場合の濁度試験の結果を図１、多価アルコ−ル添加の場合の濁度試験の結果を図２に、糖類添加の場合の試薬性能評価の結果を図３に、多価アルコ−ル添加の場合の試薬性能評価の結果を図４に示した。
【００４１】
図１〜４より明らかなように、糖あるいは多価アルコールの種類により若干の濁度の上昇はあるものの、９週間にわたってほぼ同じ血液凝固時間を維持した。本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬は長期間にわたる良好な保存安定性があることが確認された。
【００４２】
又、含有せしめた糖の平均エカトリアル位のＯＨ基の数並びに含有せしめた多価アルコ−ルのＯＨ基の数が大きいほどさらに安定性が増すことも確認できた。
【００４３】
比較例１
リボ−スを添加しない点を除いて実施例１の血液凝固時間測定用溶液試薬と同様な組成の溶液試薬を調製し、実施例１と同様な試験を行った。
【００４４】
比較例１の濁度試験の結果を図５に、試薬性能評価試験の結果を図６に示した。比較例１では１週間目で既に沈殿が生じ懸濁状態を保てず濁度が低下した。また、血液凝固時間も保存日数とともに延長し、試薬性能の大きな劣化がみられた。図１〜４の結果と図５〜６の結果との比較から、実施例１〜６の方が良好な結果であることは明白である。
【００４５】
実施例７：血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物を再生した溶液試薬の保存安定性試験
実施例３の血液凝固時間測定用溶液試薬に最終濃度１％になるように牛血清アルブミン（シグマ社製）を添加・溶解し、これをバイアルびんに１０ｍｌ入れ、−４０℃フリーザーにて１昼夜凍結した後、凍結乾燥を行うことで血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物を作製した。尚、凍結乾燥は真空状態で−４０℃から４０℃に４８時間で段階的に昇温することで行った。
【００４６】
次に、作製した血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物に１０ｍｌの水を加え懸濁状態の試薬液とした。該試薬液に対して実施例３と同様な試験を行った。また、実施例３と同様にして９週間の保存安定性試験を行なった。
【００４７】
濁度試験の結果を図７に、試薬性能評価試験を図８に示した。血液凝固時間測定用溶液試薬用乾燥組成物を再生した試薬液でも長期にわたる懸濁安定性と試薬性能の安定性があることが示された。
【００４８】
【発明の効果】
本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬は、試薬性能の長期安定性に優れている。従来の溶液状試薬は静置保存するだけで試薬性能が徐々に劣化し、再懸濁しても数日しか使用できないという不具合点を有していた。そのため試薬が使われないままに性能劣化し、廃棄されることも少なくなかった。本発明は、このような従来の試薬の不具合点を解消するものであり、臨床検査のコストダウンに大きく貢献することができるという大きな特長を有する。
【００４９】
また、従来は数日ごとに新しい溶液状試薬を調製し使用しなければならなかったため、試薬の調製操作のばらつきが原因で試薬溶液の性能に差が生じ、調製する毎に測定値がばらつくという問題点もあった。本発明の血液凝固時間測定用溶液試薬は、この問題点も解消するものであり、ばらつきの少ない測定を長期間行うことができるという特長を有する。よって臨床検査の正確さという点でも寄与するところは大きい。このように本発明の工業的な価値は非常に大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本図は実施例１〜３の濁度試験の結果を示す図である。
【図２】本図は実施例４〜６の濁度試験の結果を示す図である。
【図３】本図は実施例１〜３の試薬性能評価試験の結果を示す図である。
【図４】本図は実施例４〜６の試薬性能評価試験の結果を示す図である。
【図５】本図は比較例１の濁度試験の結果を示す図である。
【図６】本図は比較例１の試薬性能評価試験の結果を示す図である。
【図７】本図は実施例７の濁度試験の結果を示す図である。
【図８】本図は実施例７の試薬性能評価試験の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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