(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基をセリン残基に置換した変異アルカリセルラーゼを含有する粉末洗浄剤組成物。
【請求項２】
更に、配列番号１の１０位のロイシン、１６位のイソロイシン、２２位のセリン、３３位のアスパラギン、３９位のフェニルアラニン、７６位のイソロイシン、１０９位のメチオニン、２６３位のフェニルアラニン、３０８位のスレオニン、４６２位のアスパラギン、４６６位のリジン、４６８位のバリン、５５２位のイソロイシン、５６４位のイソロイシン、及び６０８位のセリンからなる群から選ばれる少なくとも一つを他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼである請求項１記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項３】
変異アルカリセルラーゼが、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）、及びＳｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒからなる群から選ばれる２重置換体である請求項１記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項４】
更に、（ｂ）界面活性剤及び（ｃ）ビルダーを含有する請求項１〜３のいずれか１項記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項５】
（ａ）成分が、２０℃、１分後のセルラーゼ放出率が５０％以上の酵素造粒物である請求項１〜４のいずれか１項記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項６】
（ｂ）成分及び（ｃ）成分が、（ｂ）成分及び（ｃ）成分を含有し、２０℃、１分後の（ｂ）成分放出率が６０％以上の粒子である請求項４又は５記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項７】
酵素造粒物が、（ａ）成分を平均粒径２００〜１２００μｍの水溶性粒子からなる核物質及び融点３５〜７０℃の水溶性有機バインダーと共に造粒して得られるものであり、その平均粒径が核物質の平均粒径の１〜２倍である請求項５又は６記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項８】
酵素造粒物が、（ａ）成分、水不溶性物質４５質量％以上、及び水溶性バインダー５〜４０質量％を含有し、かつ内部よりも表面近傍に水溶性バインダーが多く存在する構造を有するものである請求項５又は６記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項９】
（ｂ）成分及び（ｃ）成分を含有する粒子が、（ｂ）成分及び（ｃ）成分の少なくとも一部を混合した後に乾燥して得られ、粒子内に気孔を有するものである請求項６〜８のいずれか１項記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項１０】
（ａ）成分、（ｂ）成分及び（ｃ）成分が洗浄剤粒子を形成する請求項４記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項１１】
洗浄剤粒子が、（ａ）成分、（ｂ）成分及び（ｃ）成分の少なくとも一部を混合した後、乾燥工程を経て得られるものである請求項１０記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項１２】
洗浄剤粒子が、（ｂ）成分及び（ｃ）成分の少なくとも一部を混合した後に乾燥し、これに（ａ）成分を含有する液体を添加して（ａ）成分を担持させる工程を経て得られるものである請求項１０記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項１３】
洗浄剤粒子が、（ｂ）成分として陰イオン界面活性剤を含有し、該陰イオン界面活性剤の液体酸前駆体と、該陰イオン界面活性剤を中和するのに必要な量以上の粒子状固体水溶性アルカリ無機物質を混合して中和する工程、及びこれに（ａ）成分を含有する液体を添加し（ａ）成分を担持させる工程を経て得られるものである請求項１０記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項１４】
平均粒子径が１５０〜１０００μｍである請求項４〜１２のいずれか１項記載の粉末洗浄剤組成物。
【請求項１５】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基をセリン残基に置換した変異アルカリセルラーゼの造粒物であって、２０℃、１分後のセルラーゼ放出率が５０％以上である酵素造粒物。
【請求項１６】
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基をセリン残基に置換した変異アルカリセルラーゼ、（ｂ）界面活性剤、及び（ｃ）ビルダーを含有する洗浄剤粒子 。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異アルカリセルラーゼを含有する粉末洗浄剤組成物、該酵素造粒物及び該酵素を含有する洗浄剤粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
襟袖等の皮脂汚れ及び下着の黄ばみ等の親油的な汚れ、食べこぼし汚れのひどい場合は、通常の洗濯では充分に汚れが取れなかったり、染みのまま残ったりする。このため、従来から洗剤組成物の通常使用濃度よりも高濃度な水溶液に衣料を浸漬することや、温水による洗濯が行われている。
【０００３】
特に、顕著な汚れに対して行われる、通常使用濃度より高濃度な温水への浸漬洗浄においては、被洗浄物から離脱した汚れの一部が再び被洗浄物に沈着して洗浄効率を下げるという問題がある。この再沈着を防止するために、カルボキシメチルセルロース等のセルロース系の再汚染防止剤や、ポリエチレングリコール等のノニオン性高分子再汚染防止剤の配合検討が行われているが、十分な効果が得られていない。
【０００４】
また、特開平７−２１６０８４号公報にはアミノ酸ポリマー、特開平６−３３００８４号公報にはα−スルホ脂肪酸誘導体、特表平１０−５０５８７４号公報にはエチレン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタメチレンリン酸のようなアミノ酢酸の誘導体やアクリル酸又はメタクリル酸のホモポリマー等が再汚染防止剤として開示されているが、十分な効果が得られていない。
【０００５】
一方、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ等の酵素を洗浄補助剤として洗浄剤に配合することは古くから実施されており、中でもセルラーゼは、木綿単繊維の非晶質領域に作用し、単繊維内の皮脂汚れを効果的に除去し、洗浄力を向上させることが見いだされている。しかしながら、アルカリ性の衣料用洗剤液中で作用できるアルカリセルラーゼであっても、従来知られているもののほとんどは耐熱性が低く、且つ衣料用洗剤に酵素を高配合しようとする場合には、酵素培養の特異臭が問題となっていた。
【０００６】
従って、襟・袖口等の皮脂由来の汚れ、染み汚れに対して優れた洗浄力を持つ洗浄剤組成物、より具体的には高濃度な浸漬洗浄や、温水による洗濯に適した洗浄剤組成物が望まれていた。
【０００７】
本発明は、再汚染防止効果に優れ、洗浄効率の高い洗浄剤組成物、特に顕著な汚れに対して行われる、通常使用濃度より高濃度な洗浄、温水洗浄、浸漬洗浄、或いはこれらの組み合わせ洗浄に適する粉末洗浄剤組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、酵素を配合した洗浄剤組成物について検討した結果、特定の変異セルラーゼが高温で安定であると共に高活性であり、これを配合した組成物が、高濃度な洗浄や温水洗浄、浸漬洗浄等に適し、且つ特異臭が殆どない粉末洗浄剤組成物となり得ることを見出した。
【０００９】
すなわち本発明は、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼについて、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換した変異アルカリセルラーゼを含有する粉末洗浄剤組成物を提供するものである。
【００１０】
また本発明は、上記（ａ）の変異アルカリセルラーゼの造粒物であって、２０℃、１分後のセルラーゼ放出率が５０％以上である酵素造粒物を提供するものである。
【００１１】
また本発明は、上記（ａ）の変異アルカリセルラーゼ、（ｂ）界面活性剤、及び（ｃ）ビルダーを含有する洗浄剤粒子を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（ａ）成分の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼを変異の対象となるセルラーゼ（以下、「親アルカリセルラーゼ」ともいう）とし、当該配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換してなるものであり、これらは野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１３】
親アルカリセルラーゼである「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ」としてはＥｇｌ−２３７［バチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７８７５）由来、Hakamadaら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2281-2289, 2000］が挙げられる。また、「配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上の相同性を示すアルカリセルラーゼ」としては、配列番号１に示すアミノ酸配列と好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上の相同性を示すアルカリセルラーゼが挙げられ、例えば、バチルス  エスピー  １１３９株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−１１３９）（Fukumori ら，J. Gen, Microbiol, 132, 2329-2335）（相同性９１．４％）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−６４株由来のアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−６４）（Sumitomo ら，Biosci. Biotechnol. Biochem., 56, 872-877, 1992）（相同性９１．９％）、バチルス  エスピー  ＫＳＭ−Ｎ１３１株由来のセルラーゼ（Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂ）（特願２０００−４７２３７号）（相同性９５．０％）が挙げられる。
尚、アミノ酸配列の相同性はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮのマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム（ソフトウェア開発）を用いて計算することができる。
【００１４】
そして、本発明の変異アルカリセルラーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するセルラーゼを親アルカリセルラーゼとする場合には、２４２位のグルタミン残基を他のアミノ酸に置換したものであり、配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼ（配列番号１で示されるアルカリセルラーゼを除く）を親アルカリセルラーゼとする場合には、配列番号１の２４２位に相当する位置のグルタミン残基を他のアミノ酸に置換したものである。斯かる他のアミノ酸残基としては、セリン残基が好ましい。
【００１５】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アルカリセルラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。セルラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各セルラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である（図１）。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のセルラーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１６】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼ（Ｅｇｌ−２３７）の２４２位に相当する位置を、前述したＥｇｌ−１１３９、Ｅｇｌ−６４、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂについて示せば、Ｅｇｌ−１１３９では２４２位、Ｅｇｌ−６４では２４２位、Ｅｇｌ−Ｎ１３１ｂでは２２８位である。
【００１７】
また、本発明の変異アルカリセルラーゼは、その酵素活性及び酵素特性が変化しない限り、配列番号１の２４２位又はこれに相当する位置のグルタミン残基以外に、例えば配列番号１の１０位のロイシン、１６位のイソロイシン、２２位のセリン、３３位のアスパラギン、３９位のフェニルアラニン、７６位のイソロイシン、１０９位のメチオニン、２６３位のフェニルアラニン、３０８位のスレオニン、４６２位のアスパラギン、４６６位のリジン、４６８位のバリン、５５２位のイソロイシン、５６４位のイソロイシン、６０８位のセリン等が他のアミノ酸残基に同時に置換していてもよい。
【００１８】
配列番号１に示すアルカリセルラーゼにおいて、２個所以上の変異が同時になされた場合の好ましい具体例を以下に示す。尚、以下の表記ではアミノ酸を３文字表記とし、「＋」は一ヶ所の置換に対し付加された置換を表し、「／」については表記したいずれのアミノ酸を使用しても良いことを示している。
例えば、２重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｐｈｅ２６３（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｐｒｏ／Ｖａｌ）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００１９】
３重置換体の例としては、Ｌｅｕ１０（Ｇｌｎ／Ａｌａ／Ｐｒｏ／Ｍｅｔ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ７６（Ｈｉｓ／Ｍｅｔ／Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ａｌａ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６（Ｌｅｕ／Ａｌａ／Ｓｅｒ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００２０】
４重置換体の例としては、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｍｅｔ１０９（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ／Ｓｅｒ／Ｖａｌ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｉｌｅ５６４（Ｖａｌ／Ｔｈｒ／Ｌｅｕ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒが特に好ましい。
【００２１】
５重置換体の例としては、Ｉｌｅ１６（Ａｓｎ／Ａｒｇ）＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｔｈｒ３０８（Ａｌａ／Ｓｅｒ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ）＋Ｉｌｅ５５２Ｍｅｔ＋Ｓｅｒ６０８（Ｉｌｅ／Ａｒｇ）等が好ましく、Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ＋Ｉｌｅ１６Ａｓｎ＋Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ＋Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ＋Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕが特に好ましい。
また、更にそれ以上の多重置換、例えば６〜１７置換体でもよい。
【００２２】
本発明の変異アルカリセルラーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。
すなわち、クローニングされた親アルカリセルラーゼ（例えば配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ）をコードする遺伝子に対して置換（以下、「変異」ともいう）を施し、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養し、培養物から採取することにより得られる。
【００２３】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばバチルス  エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７の染色体より、ショットガン法やＰＣＲ法により取得できる。
【００２４】
親アルカリセルラーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えばのSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット(Takara製)等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２５】
得られた変異遺伝子を用いた本発明変異アルカリセルラーゼの生産は、宿主菌体内で複製維持が可能であり、該酵素を安定に発現させることができ、該遺伝子を安定に保持できるベクターに当該遺伝子を組込み、得られた組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換することにより行えばよい。
【００２６】
斯かるベクターとしては大腸菌を宿主とする場合、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社）等が挙げられ、枯草菌を宿主にする場合、ｐＵＢ１１０、ｐＨＳＰ６４（Sumitomoら、Biosci. Biotechnol,Biocem., 59, 2172-2175, 1995）あるいはｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられる。
【００２７】
宿主菌を形質転換するにはプロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等を用いて行うことができる。宿主菌としては特に制限されないがバチルス属（枯草菌）等のグラム陽性菌、大腸菌等のグラム陰性菌、ストレプトマイセス属等の放線菌、サッカロマイセス属等の酵母あるいはアスペルギルス属等のカビが挙げられる。
【００２８】
得られた形質転換体は、資化しうる炭素源、窒素源、金属塩、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。かくして得られた培養液から、一般的な方法によって酵素の分取や精製を行い、限外ろ過濃縮、凍結乾燥、噴霧乾燥、結晶化等により必要な酵素形態を得ることができる。
【００２９】
斯くして得られた本発明の変異アルカリセルラーゼは、優れた耐熱性を有するとともに、洗浄力にも優れ、更に高い比活性を有する。
【００３０】
（ａ）成分の含有量は、粉末洗浄剤組成物中では、０．０００１〜５質量％であるのが好ましく、０．０００５〜２．５質量％がより好ましく、０．００１〜２質量％が更に好ましい。また、酵素造粒物として用いる場合の造粒物中での（ａ）成分の含有量は、０．０１〜５０質量％であるのが好ましく、０．０５〜２５質量％がより好ましく、０．１〜２０質量％が更に好ましい。
【００３１】
また、２０℃の０．９質量％ＮａＣｌ水溶液１００ｍＬのスターラー１００ｍｉｎ-1の撹拌下、酵素造粒物１００ｍｇを添加し、１分後に放出されたセルラーゼ量を完全溶解時のセルラーゼ量で除した放出率は、洗浄性能の点で５０％以上であるのが好ましく、更に６０％以上、更に７０％以上、特に８０％以上であるのが好ましい。
【００３２】
本発明の粉末洗浄剤組成物は、上記（ａ）成分の他に、（ｂ）界面活性剤及び（ｃ）ビルダーを含有するのが好ましい。
（ｂ）成分の界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤及び陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることができるが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
【００３３】
陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８〜２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エステル塩、パラフィンスルホン酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、α−スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０〜１４、より好ましくは１２〜１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩が好ましい。これらの塩の対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００３４】
非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８〜２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８〜２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４〜２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５〜１５．０、好ましくは１１．０〜１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
【００３５】
（ｂ）成分の界面活性剤の合計量は、洗浄力及び溶解性の点から、粉末洗浄剤組成物中１０〜６０質量％であるのが好ましく、１５〜５０質量％がより好ましく、２０〜４５質量％が更に好ましい。
陰イオン性界面活性剤は、粉末洗浄剤組成物中１〜６０質量％であるのが好ましく、１〜５０質量％がより好ましく、３〜４０質量％が特に好ましい。
非イオン性界面活性剤は、粉末洗浄剤組成物中０．５〜４５質量％であるのが好ましく、１〜３５質量％がより好ましく、３〜２５質量％が特に好ましい。
陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤は、単独で用いることもできるが、好ましくは混合して用いるのが良い。また、両性界面活性剤や陽イオン性界面活性剤を目的に合わせ併用することもできる。
【００３６】
（ｃ）成分のビルダーとしては、そのもの自身では洗浄力がないか、又はあってもそれ程著しくないが、粉末洗浄剤組成物に配合されると著しく洗剤性能を向上させ、特に洗浄剤の主要成分である界面活性剤の洗浄能力を向上させるものが挙げられ、作用として、多価金属陽イオンの捕捉作用、汚れ分散作用及びアルカリ緩衝作用の少なくとも１つの作用を有するものである。
斯かるビルダーとしては、例えば水溶性無機化合物、水不溶性無機化合物、有機化合物等が挙げられる。
【００３７】
水溶性無機化合物としては、リン酸塩（トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、メタリン酸塩、リン酸三ナトリウム等）、ケイ酸塩、炭酸塩、硫酸塩等が挙げられる。中でも３つの作用を全て有する点でリン酸塩が好ましい。
【００３８】
水不溶性無機化合物としては、アルミノケイ酸塩（Ａ型ゼオライト、Ｐ型ゼオライト、Ｘ型ゼオライト、非晶質アルミノケイ酸塩等）、結晶性ケイ酸塩等が挙げられる。中でも粒子径３μｍ以下（より好ましくは１μｍ以下）のＡ型ゼオライトが好ましい。
【００３９】
有機化合物としては、カルボン酸塩（アミノカルボン酸塩、ヒドロキシアミノカルボン酸塩、ヒドロキシカルボン酸塩、シクロカルボン酸塩、マレイン酸誘導体、シュウ酸塩等）、有機カルボン酸（塩）ポリマー（アクリル酸重合体及び共重合体、多価カルボン酸重合体及び共重合体、グリオキシル酸重合体、多糖類及びこれらの塩等）等が挙げられる。中でも有機カルボン酸（塩）ポリマーが好ましい。
【００４０】
前記ビルダーの塩において、対イオンとしては、アルカリ金属塩、アミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。
【００４１】
これらのビルダーは、単独で又は２種以上を併用することができるが、水溶性無機化合物を含有するのが好ましく、水溶性無機化合物及び有機化合物を併用するのがより好ましく、水溶性無機化合物、有機化合物及び水不溶性無機化合物を併用するのが更に好ましい。
【００４２】
（ｃ）成分のビルダーの合計量は、洗浄性能の点から、粉末洗浄剤組成物中２０〜８０質量％であるのが好ましく、３０〜７０質量％がより好ましく、３５〜６０質量％が更に好ましい。
また、水溶性無機化合物ビルダーは、粉末洗浄剤組成物中１０〜５０質量％であるのが好ましく、１５〜４５質量％がより好ましく、２０〜４０質量％が更に好ましい。
水不溶性無機化合物ビルダーは、粉末洗浄剤組成物中５〜５０質量％であるのが好ましく、１０〜４５質量％がより好ましく、１５〜４０質量％が更に好ましい。
有機化合物ビルダーは、粉末洗浄剤組成物中０．１〜２０質量％であるが好ましく、０．３〜１５質量％がより好ましく、０．５〜１０質量％が更に好ましい。
【００４３】
本発明の粉末洗浄剤組成物には、上記（ａ）〜（ｃ）成分の他に、漂白剤（過炭酸塩、過ホウ酸塩、漂白活性化剤等）、再汚染防止剤（カルボキシメチルセルロース等）、柔軟化剤（ジアルキル型第四級アンモニウム塩、粘土鉱物等）、還元剤（亜硫酸塩等）、蛍光増白剤（ビフェニル型、アミノスチルベン型等）、泡コントロール剤（シリコーン等）、香料、その他の酵素（プロテアーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、リパーゼ等）等の添加剤を含有させることができる。これらは、別の粒子として粉末洗浄剤組成物に配合しても良い。
【００４４】
上記成分を含有する本発明の粉末洗浄剤組成物は、（ａ）成分からなる酵素造粒物（以下、「粒子（Ｉ）」ともいう）と洗剤ベースとなる（ｂ）及び（ｃ）成分を含有する粒子（以下、「粒子（ＩＩ）」ともいう）を含有する組成物、又は一つの粒子中に（ａ）〜（ｃ）成分を含有する洗浄剤粒子であるのが好ましい。
【００４５】
（ａ）成分からなる酵素造粒物は、洗浄効率の点から、２０℃、１分後のセルラーゼの放出率が５０％以上、好ましくは６０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上の粒子（粒子（Ｉ））であるのが好ましい。
ここで、セルラーゼ放出率とは、１００ｍＬ溶ビーカー（内径５０ｍｍ）に２０℃の０．９質量％ＮａＣｌ水溶液１００ｍＬを入れ、攪拌子（長さ３５ｍｍ、直径８ｍｍ）の回転数１００ｍｉｎ-1にて攪拌下、粒子１００ｍｇを添加し、１分後に放出されたセルラーゼ活性量を完全溶解時のセルラーゼ活性量で除し、得られた値に１００をかけたものをいう。尚、セルラーゼ活性量は公知の方法（特開平１０−３１３８５９号公報）により測定すればよい。
【００４６】
当該酵素造粒物は、非分級性の点から、ＪＩＳ  Ｋ  ３３６２：１９９８により規定された方法で測定する見掛け密度が、５００〜１６００ｇ／Ｌであるのが好ましく、より好ましくは６００〜１５００ｇ／Ｌ、特に好ましくは７００〜１４００ｇ／Ｌである。
また、高速溶解性、低発塵性、非分級性の点から、ＪＩＳ  Ｚ  ８８０１の標準篩を用いて５分間振動させた後、篩目のサイズによる重量分率から求める平均粒径が、１５０〜１２００μｍであるのが好ましく、より好ましくは１５０〜１０００μｍ、特に好ましくは２００〜９００μｍである。
加えて、発塵性、溶解性の点から、１２５〜７１０μｍの粒子が酵素造粒物全体の８０質量％以上であるのが好ましく、９０質量％以上がより好ましい。
【００４７】
酵素造粒物中のセルラーゼの含有量は、造粒性や溶解性及び洗浄性能の点から、０．０２〜２０質量％であるのが好ましく、０．０５〜１５質量％がより好ましく、０．１〜１０質量％が更に好ましい。
【００４８】
本発明の酵素造粒物は、以下に示す（Ｉ−１）及び／又は（Ｉ−２）の造粒物であるのが好ましく、高速溶解性及び低発塵性の点で（Ｉ−２）の造粒物であるのがより好ましい。
【００４９】
（Ｉ−１）の造粒物は、セルラーゼを平均粒径２００〜１２００μｍの水溶性粒子からなる核物質及び融点３５〜７０℃の水溶性有機バインダーと共に造粒し、得られた造粒物の平均粒径が核物質の平均粒径の１〜２倍である造粒物である。
【００５０】
核物質としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、芒硝、炭酸ナトリウム、砂糖等の水溶性粒子が挙げられ、中でも塩化ナトリウムが好ましい。核物質の平均粒径は、溶解性、及び目的とする最終の酵素粒子を洗剤粒子と混合した時の外観の美麗さ、非分級性の観点から、２００〜１２００μｍが好ましく、２５０〜１０００μｍがより好ましい。なお、平均粒径は、ＪＩＳ  Ｚ  ８８０１の標準篩を用いて５分間振動させた後、篩目のサイズによる重量分率から求めることができる。
核物質の含有量は、造粒性や溶解性の観点から、（Ｉ−１）の造粒物中３０〜８０質量％であるのが好ましく、４０〜７０質量％がより好ましい。
【００５１】
水溶性有機バインダーとしては、ポリエチレングリコール、非イオン界面活性剤（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレン・アルキルエーテル等）等が挙げられ、中でもポリエチレングリコールが好ましい。生産性の点で、水溶性有機バインダーの量は、核物質１００重量部に対して５〜６０重量部であるのが好ましい。
【００５２】
水溶性有機バインダーの融点は、３５〜７０℃であることが好ましく、４０〜７０℃がより好ましく、４５〜６８℃が更に好ましい。該融点は、ＪＩＳ  Ｋ００６４：１９９２に規定された目視による方法により測定することができる。
セルラーゼを核物質及び水溶性有機バインダーと共に造粒して（Ｉ−１）の造粒物を製造する方法は、公知の方法を用いればよく、例えば特開昭６２−２５７９９０号公報に記載の造粒法が好ましい。
【００５３】
以上のようにして得られた造粒物（Ｉ−１）の平均粒径は、溶解性及び非分級性の観点から、核物質の平均粒径の１〜２倍が好ましく、１．０５〜１．５倍がより好ましい。
【００５４】
（Ｉ−２）の造粒物は、セルラーゼ、水不溶性物質４５質量％以上、及び水溶性バインダー５〜４０質量％を含有し、かつ内部よりも表面近傍に水溶性バインダーが多く存在する構造を有する造粒物である。
【００５５】
水不溶性物質としては、セルロースパウダー等の有機物質、ゼオライト、タルク、クレー、アルミナ、カオリン、チタニア、炭酸カルシウム、硫酸バリウム等の無機物質が挙げられ、熱に対する安定性の点で、無機物質が好ましく、中でも分散性の点でゼオライトやカオリンが特に好ましい。水不溶性物質は、均一性の点で、一次粒子の平均粒径が２０μｍ以下であるのが好ましく、１０μｍ以下がより好ましく、０．１〜５μｍが特に好ましい。
（Ｉ−２）の造粒物中の水不溶性物質の含有量は、酵素の速やかな溶出を促す点で、４５質量％以上であるのが好ましく、５０質量％以上がより好ましい。
一方、溶け残り防止の点からは、９０質量％以下であるのが好ましく、８０質量％以下がより好ましく、７０質量％以下が特に好ましい。
【００５６】
水溶性バインダーとしては、ポリエチレングリコール及びその誘導体、ポリビニルアルコール及びその誘導体、水溶性セルロース誘導体、カルボン酸系ポリマー、澱粉、糖類等が挙げられる。誘導体としては、エーテル化合物等が挙げられる。中でも、生産性、高速溶解性の点で、カルボン酸系ポリマー及び糖類が好ましく、アクリル酸−マレイン酸コポリマーの塩、ポリアクリル酸塩がより好ましい。塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩が好ましい。該水溶性バインダーを配合することは、粒子強度の向上及び粒子の速やかな崩壊の点で好ましい。
（Ｉ−２）の造粒物中の水溶性バインダーの含有量は、低発塵性の点で５質量％以上であるのが好ましく、１０質量％以上がより好ましく、１５質量％以上が更に好ましい。また、高速溶解性の点からは、４０質量％以下であるのが好ましく、３５質量％以下がより好ましく、３０質量％以下が更に好ましい。
【００５７】
（Ｉ−２）の造粒物は、粒子内部よりも表面近傍に水溶性バインダーが多く存在する構造を有するものであり、例えば、前記セルラーゼ、水不溶性物質、及び水溶性バインダーを混合して、好ましくは水分量３０〜６０質量％のスラリーにした後、該スラリーを噴霧乾燥することで得られる。噴霧乾燥時の熱風の温度は、酵素の安定性及び生産性の点で１４０〜２１０℃が好ましい。その他の噴霧乾燥の条件については、特に限定はない。
【００５８】
なお、セルラーゼ造粒物における水溶性バインダーの偏在性の確認は、例えば、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴ−ＩＲ）や光音響分光法（ＰＡＳ）を併用する方法（ＦＴ−ＩＲ／ＰＡＳ）を用いて行うことができる。これらは、Applied Spectroscopy vol.47、1311-1316(1993)に記載のとおり、粒子の表面から深さ方向における物質の分布状態を解析する方法であり、それにより水溶性成分の偏在性を確認することができる。
【００５９】
酵素造粒物は、洗浄性能及び経済性の点で洗浄剤組成物中０．０１〜１０質量％であるのが好ましく、０．０５〜８質量％がより好ましく、０．１〜５質量％が更に好ましい。
【００６０】
（ｂ）及び（ｃ）成分から構成される粒子（ＩＩ）は、洗浄効率の点から、（ｂ）成分及び（ｃ）成分を含有し、２０℃、１分後の（ｂ）成分の放出率が６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上の粒子であるのが好ましい。
ここで、界面活性剤放出率は、ＪＩＳ  Ｋ  ３３６２：１９９８記載の界面活性剤定量法に基づいて測定することができる。
【００６１】
粒子（ＩＩ）は、流動性及び非ケーキング性の点で、表面被覆剤により表面改質を行うことが好ましく、当該表面被覆剤は粒子（ＩＩ）中、１〜３０質量％であるのが好ましく、２〜１５質量％がより好ましく、５〜１０質量％が更に好ましい。
表面被覆剤としては、例えば、アルミノケイ酸塩、ケイ酸カルシウム、二酸化ケイ素、ベントナイト、タルク、クレイ、非晶質シリカ誘導体、結晶性シリケート化合物等のシリケート化合物、金属石鹸、粉末の界面活性剤等の微粉体、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアクリル酸ソーダ、アクリル酸とマレイン酸のコポリマー又はその塩等のポリカルボン酸塩等の水溶性ポリマー；脂肪酸が挙げられる。中でも水不溶性無機物が好ましく、特に結晶性アルミノケイ酸塩、非晶質アルミノケイ酸塩、結晶性シリケート化合物が好ましい。
【００６２】
粒子（ＩＩ）は、（ｂ）成分、（ｃ）成分の少なくとも一部を混合した後乾燥する工程を経て得る粒子（ＩＩ−１）の製法、（ｂ）成分として陰イオン界面活性剤を含有し、該陰イオン界面活性剤の液体酸前駆体と、該陰イオン界面活性剤を中和するのに必要な量以上の粒子状固体水溶性アルカリ無機物質を混合して中和する工程を経て得る粒子（ＩＩ−２）の製法等によって得ることができる。中でも粒子（ＩＩ−１）の製法が洗浄性能、溶解性の点で好ましい。
【００６３】
すなわち粒子（ＩＩ−１）は、（ｂ）成分、（ｃ）成分の少なくとも一部をスラリーとして混合し、噴霧乾燥によって粒子を得ることができる。場合によっては、（ｂ）成分、（ｃ）成分の残部を後添加しても良いし、より高い見掛け密度を求めるのであれば、（ｂ）成分、（ｃ）成分の残部を後添加して造粒することができる。溶解性の点で、噴霧乾燥粒子構造を潰さずに粒子内部に気孔を維持することが好ましい。この点で（ｂ）成分を含有する液状物を、噴霧乾燥粒子内部に気孔を維持したまま吸収担持させる方法がより好ましい。
【００６４】
粒子（ＩＩ−２）は、（ｂ）成分として陰イオン界面活性剤を含有し、該陰イオン界面活性剤を中和するのに必要な量以上の粒子状固体水溶性アルカリ無機物質に、該陰イオン界面活性剤の液体酸前駆体を添加することにより、該液体酸前駆体を中和し、これを造粒して粒子を得ることができる。
【００６５】
粒子（ＩＩ）の見掛け密度は、好ましくは５００〜１２００ｇ／Ｌ、より好ましくは６００〜１０００ｇ／Ｌ、特に好ましくは６５０〜８５０ｇ／Ｌである。また、経済効率の観点から、見掛け密度は５００ｇ／Ｌ以上が好ましく、溶解性の観点から１２００ｇ／Ｌ以下が好ましい。
【００６６】
粒子（ＩＩ）の平均粒径は、好ましくは１５０〜８００μｍ、より好ましくは２５０〜７５０μｍ、特に好ましくは３００〜７００μｍである。また、ペースト化防止の観点からは１５０μｍ以上が好ましく、溶解性の観点からは８００μｍ以下が好ましい。
【００６７】
粒子（ＩＩ）の水分値としては、品質の観点から１０質量％以下であるのが好ましく、５質量％以下がより好ましい。
【００６８】
（ａ）〜（ｃ）成分を含有する洗浄剤粒子は、以下のように製造することができる。
すなわち、製法Ａ：（ａ）成分及び、（ｂ）成分、（ｃ）成分の少なくとも一部を混合した後乾燥する工程を経て得る方法、製法Ｂ：（ｂ）成分、（ｃ）成分の少なくとも一部を混合した後に乾燥し、これに（ａ）成分を含有する液体を添加し（ａ）成分を担持させる工程を経て得る方法、製法Ｃ：（ｂ）成分として陰イオン界面活性剤を含有し、該陰イオン界面活性剤の液体酸前駆体と、該陰イオン界面活性剤を中和するのに必要な量以上の粒子状固体水溶性アルカリ無機物質を混合して中和する工程、及びこれに（ａ）成分を含有する液体を添加し（ａ）成分を担持させる工程を経て得る方法、等によって得ることができる。中でも製法Ｂが洗浄性能、溶解性及び酵素の安定性の点で好ましい。
【００６９】
製法Ａによれば、（ａ）成分及び、（ｂ）成分、（ｃ）成分の少なくとも一部をスラリーとして混合し、噴霧乾燥によって洗浄剤粒子を得ることができる。場合によっては、（ｂ）成分、（ｃ）成分の残部を後添加してもよいし、より高い見掛け密度を求めるのであれば、（ｂ）成分、（ｃ）成分の残部を後添加して造粒することができる。溶解性の点で、噴霧乾燥粒子構造を潰さずに粒子内部に気孔を維持することが好ましい。この点で（ｂ）成分を含有する液状物を、噴霧乾燥粒子内部に気孔を維持したまま吸収担持させる方法がより好ましい。
【００７０】
製法Ｂによれば、（ｂ）成分、（ｃ）成分の少なくとも一部をスラリーとして混合した後に噴霧乾燥し、これに（ａ）成分を含有する液体を添加し（ａ）成分を担持させて洗浄剤粒子を得ることができる。場合によっては、（ｂ）成分、（ｃ）成分の残部を後添加しても良いし、より高い見掛け密度を求めるのであれば、（ｂ）成分、（ｃ）成分の残部を後添加して造粒することができる。溶解性の点で、噴霧乾燥粒子構造を潰さずに粒子内部に気孔を維持することが好ましい。この点で（ｂ）成分を含有する液状物を、噴霧乾燥粒子内部に気孔を維持したまま吸収担持させる方法がより好ましい。
【００７１】
製法Ｃによれば、（ｂ）成分として陰イオン界面活性剤を含有し、該陰イオン界面活性剤を中和するのに必要な量以上の粒子状固体水溶性アルカリ無機物質に、該陰イオン界面活性剤の液体酸前駆体を添加することにより、該液体酸前駆体を中和し、これを造粒する過程で（ａ）成分を含有する液体を添加し（ａ）成分を担持させる方法がより好ましい。
【００７２】
また、当該洗浄剤粒子は、流動性及び非ケーキング性の点で、表面被覆剤により表面改質を行うことが好ましい。表面被覆剤は洗浄剤粒子中１〜３０質量％であるのが好ましく、２〜１５質量％がより好ましく、５〜１０質量％が更に好ましい。表面被覆剤としては、上記粒子（ＩＩ）について挙げたものと同様のものが使用できる。
【００７３】
斯くして得られる本発明の粉末洗浄剤組成物は、溶解性の点から、ＪＩＳ  Ｚ８８０１の標準篩を用いて５分間振動させた後、篩目のサイズによる質量分率から求める洗浄剤組成物の平均粒径は１５０〜１０００μｍであるのが好ましく、より好ましくは１５０〜８００μｍ、更に好ましくは１８０〜６００μｍである。
【００７４】
また、ＪＩＳ  Ｋ  ３３６２：１９９８により規定された方法で測定する見掛け密度は、溶解性の点から、１６００ｇ／Ｌ以下であるのが好ましく、１３００ｇ／Ｌ以下がより好ましく、１０００ｇ／Ｌ以下が更に好ましい。また、利便性や廃棄物（例えば箱等）低減の点からは、見掛け密度は３００ｇ／Ｌ以上であるのが好ましく、６００ｇ／Ｌ以上がより好ましく、７００ｇ／Ｌ以上が更に好ましい。
【００７５】
本発明の洗浄剤組成物は、利便性の点から、圧縮して錠剤形態にしてもよいし、１回の使用量を水溶性或いは水不溶性の容器に収納してもよい。
【００７６】
【実施例】
製造例１
（１）アルカリセルラーゼ遺伝子の変異体作製
鋳型ＤＮＡとして大腸菌−枯草菌のシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ中に組換えられたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ−Ｓ２３７株由来のアルカリセルラーゼ遺伝子を用いた。
【００７７】
部位特異的変位Ｌｅｕ１０Ｇｌｎ、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕを導入するための変異導入用プライマーＬｅｕ１０Ｇｌｎ（配列番号２）、Ｉｌｅ１６Ａｓｎ（配列番号３）、Ｓｅｒ２２Ｐｒｏ（配列番号４）、Ｉｌｅ７６Ｈｉｓ（配列番号５）、Ｇｌｎ２４２Ｓｅｒ（配列番号６）、Ｌｙｓ４６６Ｌｅｕ（配列番号７）を用い、アルカリセルラーゼ遺伝子内に存在する適当な対向プライマーを構築して鋳型ＤＮＡと共に変異導入を行った。
【００７８】
即ち、鋳型ＤＮＡプラスミド０．５μＬ(１０ｎｇ)、変異導入用プライマー２０μＬ（１μＭ）、対向プライマー２０μＬ（１μＭ）、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ｍＭデオキシヌクレオチド３リン酸(ｄＮＴＰ)混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラーゼ０．５μＬ(２．５ｕｎｉｔｓ、タカラ製)及び脱イオン水３９．５μＬを混合した後、ｇｅｎｅ ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（アマシャムファルマシア製）でＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃２分間の熱変性後、９４℃１分間、５６℃１分間、７２℃３０秒間（３０サイクル）及び７２℃１分間で行った。得られたＰＣＲ産物をＧＦＸ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｇｅｌ  ｂａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア製）で精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ(１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行ない精製（５０μＬ）した。リン酸化されたＰＣＲ産物２５μＬに、鋳型プラスミドを２μＬ(２０ｎｇ)、１０倍濃度のＰＣＲ用緩衝液１０μＬ、１０ ｍＭ ｄＮＴＰ混液８μＬ、ＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡポリメラー１μＬ (５ｕｎｉｔｓ)及び脱イオン水５４μＬを混合した後、ＰＣＲを行った。反応条件は、９４℃、２分間の熱変性後、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃６分間（３０サイクル）及び７２℃１２分間で行った。
得られたＰＣＲ産物を精製後（４３．５μＬ）、５．５μＬの１０倍濃度のリン酸化用緩衝液及びポリヌクレオチドキナーゼ１μＬ (１０ｕｎｉｔｓ)を加え、３７℃で１時間リン酸化反応を行った後、エタノール沈澱（１０μＬ）した。回収された１０μＬのＤＮＡ溶液をｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（タカラ製）を用いて１６℃、１８時間ライゲーション反応を行い、自己閉環した後、再度エタノール沈殿して、ＤＮＡ混液を回収した。
【００７９】
（２）形質転換法
（１）で得られたＤＮＡ混液５μＬを用いてChangらの方法（Chang and Cohen,Mol.Gen.Gent.,168,111-115,1979）によりＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓＩＳＷ１２１４株に導入して形質転換体を取得した。即ち、宿主菌Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＳＷ１２１４株を５０ ｍＬのＬＢ培地中で３７℃で、約２時間振とう培養後 (６００ｎｍにおける吸光度が０．４)、室温で遠心分離 (７０００ｍｉｎ-1、１５分間)により菌体を集め、５ｍＬのＳＭＭＰ[０．５Ｍ シュークロース、２０ｍＭ マレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ３（ディフコ製）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液 (３０ｍｇ／ｍＬ)を加え、３７℃で１時間保温した。保温終了後、室温で遠心分離 (２８００ｍｉｎ-1、１５分間)によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に１０μＬのプラスミド溶液と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、シグマ製）を加え、緩やかに攪拌後、室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離 (２８００ｍｉｎ-1、１５分間)によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を３７℃で９０分間振盪 (１２０ｍｉｎ-1)した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、シグマ製）を含むＤＭ３再生寒天培地[０．８％（ｗ／ｖ） 寒天（和光純薬製）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（ディフコ製）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（シグマ製）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（メルク製）及びアミノ酸混液(ロイシン、メチオニン１０μg／ｍＬ)]上に塗布し、３０℃で７２時間培養して形質転換体を得た。ＤＭ３再生寒天平板培地上で、ハローを形成した形質転換体をテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ）を含んだポリペプトン培地で、３０℃で１５時間振とう培養を行い、集菌後、ｍｉｃｒｏ  ｐｒｅｐ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（アマシャムファルマシア製）によりプラスミドを回収、精製した。
【００８０】
（３）塩基配列の決定
（２）で取得したプラスミド中に挿入されたセルラーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、３７７ＤＮＡシークエンサー（アプライド  バイオシステム製）を用いて行なった。
【００８１】
製造例２  酵素造粒物の製造
（１）酵素造粒物−１の製造
配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ（４００００Ｕ／ｇ）２質量％、核物質（平均粒径２５０μｍの塩化ナトリウム）４５質量％、バインダー（ポリエチレングリコール６０００）１５質量％、酸化チタン５質量％、塩化カルシウム１質量％、芒硝３２質量％を造粒し、平均粒径３５０μｍの造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８３０ｇ／Ｌであった。
【００８２】
（２）酵素造粒物−２の製造
配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ（４００００Ｕ／ｇ）２質量部、水不溶性物質（ゼオライト）６５質量部、水溶性バインダー（ポリアクリル酸／マルチット＝１／１）２５質量部、芒硝４質量部である水分量５５質量％のスラリーを調整した。次にこれを噴霧乾燥により水分量４質量％の平均粒径２５０μｍの造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８１０ｇ／Ｌであった。また、表面近傍に水溶性バインダーが多く存在していた。
【００８３】
（３）酵素造粒物−３の製造
酵素造粒物−１に用いたセルラーゼを、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼに置き換えた以外は同様にして造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８３０ｇ／Ｌであった。
【００８４】
（４）酵素造粒物−４の製造
酵素造粒物−２に用いたセルラーゼを、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼに置き換えた以外は同様にして造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８１０ｇ／Ｌであった。また、表面近傍に水溶性バインダーが多く存在していた。
【００８５】
（５）酵素造粒物−５の製造
酵素造粒物−１に用いたセルラーゼを、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼに置き換えた以外は同様にして酵素造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８２０ｇ／Ｌであった。
【００８６】
（６）酵素造粒物−６の製造
酵素造粒物−２に用いたセルラーゼを、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼに置き換えた以外は同様にして酵素造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８００ｇ／Ｌであった。また、表面近傍に水溶性バインダーが多く存在していた。
【００８７】
（７）酵素造粒物−７の製造
酵素造粒物−１に用いたセルラーゼを、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、１６位のイソロイシンをアスパラギンに、７６位のイソロイシンをヒスチジンに、２４２位のグルタミンをセリンに、４６６位のリシンをロイシンに置換した変異アルカリセルラーゼに置き換えた以外は同様にして酵素造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８２０ｇ／Ｌであった。
【００８８】
（８）酵素造粒物−８の製造
酵素造粒物−２に用いたセルラーゼを、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの１０位のロイシンをグルタミンに、１６位のイソロイシンをアスパラギンに、７６位のイソロイシンをヒスチジンに、２４２位のグルタミンをセリンに、４６６位のリシンをロイシンに置換した変異アルカリセルラーゼに置き換えた以外は同様にして酵素造粒物を得た。
１２５〜７１０μｍの粒子は９０質量％以上であり、見掛け密度は８２０ｇ／Ｌであった。また、表面近傍に水溶性バインダーが多く存在してした。
【００８９】
製造例３  洗剤ベースの製造
（１）洗剤ベース−１の製造
全洗剤ベース中の質量基準で、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２０質量％、トリポリリン酸ナトリウム１７質量％、炭酸ナトリウム１０質量％、硫酸ナトリウム２２質量％、１号ケイ酸ナトリウム１４質量％、ポリエチレングリコール（ＭＷ＝１３０００）０．３質量％、アクリル酸−マレイン酸コポリマー（ナトリウム塩（７０モル％中和）、モノマー比はアクリル酸／マレイン酸＝３／７（モル比）、平均分子量７００００）０．３質量％、カルボキシメチルセルロース０．２質量％、チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバスペシャリティケミカルス社製）０．０５質量％、チノパールＡＭＳ−ＧＸ（チバスペシャリティケミカルス社製）０．０５質量％、及び亜硫酸ナトリウム０．５質量％から、固形分５０質量％のスラリーを調製し、噴霧乾燥することによって噴霧乾燥粒子を得た。ついで、これを全洗剤ベース中の質量基準で、４Ａ型ゼオライト（東ソー（株）製）１０質量％、及び香料０．３質量％を混合し表面被覆を行い洗剤ベースを得た。洗剤ベースの平均粒径は３００μｍ、見掛け密度は４５０ｇ／Ｌであった。
【００９０】
（２）洗剤ベース−２の製造
固形分４８質量％のスラリーを、熱風温度２５０℃で噴霧乾燥し、ポリアクリル酸ナトリウム（平均分子量１００００）８質量％、炭酸ナトリウム３０質量％、硫酸ナトリウム２０質量％、塩化ナトリウム５質量％、蛍光染料０．５質量％、ゼオライト３５質量％の噴霧乾燥粒子を得た。次に、レディゲミキサー（松阪技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付き）に噴霧乾燥粒子１００質量部投入し、主軸（１５０ｍｉｎ-1）の攪拌下、非イオン界面活性剤１８質量部、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２０質量部、脂肪酸（炭素数１４〜１８）ナトリウム５質量部、ポリエチレングリコール（平均分子量８５００）３質量部、水４質量部の混合液を、３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更に、このミキサーに結晶性シリケート１５質量部、ゼオライト１５質量部、香料０．３質量部を投入し、表面被覆を行い洗剤ベースを得た。得られた洗剤ベースの見掛け密度８２０ｇ／Ｌ、平均粒径３２０μｍであった。
【００９１】
（３）洗剤ベース−３の製造
最終洗剤ベース基準で、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸カリウム（Ｃ１０〜１４）１４質量％、α−オレフィンスルホン酸カリウム（炭素数１４〜１８）１２質量％、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｃ１２〜１４、ＥＯ１２）８質量％、ポリエチレングリコール（平均分子量＝８５００）１質量％、ゼオライト１８質量％、アクリル酸−マレイン酸コポリマー（平均分子量＝７００００  ）０．５質量％、脂肪酸カリウム（パーム核油由来）４質量％、１号ケイ酸塩４質量％、炭酸カリウム８質量％、硫酸ナトリウム２質量％、亜硫酸ナトリウム１質量％、及び蛍光染料０．３質量％からなるスラリー（固形分５０質量％）を調製し、噴霧乾燥して噴霧乾燥組成物を得た。これに最終洗剤ベース基準の重量基準で、炭酸ナトリウム１３質量％をリボンミキサーに投入して混合を行った。得られた混合物を前押し出し式２軸型押し出し造粒機（ペレッターダブル：不二パウダル（株）製）で直径が１０ｍｍの円柱状に押し出し成形して圧密化した。得られたペレット状物を、ゼオライト５質量％とともにフラッシュミル（不二パウダル（株）製）で粉砕造粒して表面被覆を行った。この造粒物から粗大物を取り除いた後、Ｖブレンダーに移し、ゼオライト５質量％を混合し、水分４．２質量％の洗剤ベースを得た。得られた洗剤ベースは、見掛け密度８２０ｇ／Ｌ、平均粒径３９０μｍであった。
【００９２】
実施例１〜１３
表１の組み合わせで、上記の酵素造粒物及び洗剤ベースを混合し粉末洗浄剤組成物を得た。
【００９３】
比較例１〜６
酵素造粒物−１〜４を市販の「セルザイム０．７Ｔ」もしくは、「ケアザイム４５００Ｔ」（ノボザイムズ社製）に置き換えて同活性量になるようにして粉末洗浄剤組成物を得た（表２）。
各洗浄剤組成物について、溶解性、洗浄力、匂い、再汚染防止性の評価を行った。結果を表１及び表２に併せて示す。また、セルラーゼの放出率は、実施例１〜１３は何れも６０％以上であったが、比較例は５０％未満であった。
【００９４】
【表１】
0003872373.tif 000002
【００９５】
【表２】
0003872373.tif 000003
【００９６】
＜溶解性評価＞
１Ｌ容ビーカー（内径１０５ｍｍ）に５℃の硬水（７１．２ｍｇＣａＣＯ3／Ｌ、Ｃａ／Ｍｇのモル比７／３）１Ｌを入れ、攪拌子（長さ３５ｍｍ、直径８ｍｍ）の回転数８００ｍｉｎ-1にて撹拌下、酵素造粒物又は洗浄剤組成物１ｇを投入し、６０秒間攪拌してＪＩＳ  Ｚ  ８８０１規定の標準篩（目開き７４μｍ）を通過させた。この時の篩い上の状態を以下の基準で目視判定した。
【００９７】
評価基準：
○：残留物が全く無い
×：残留物が確認できる
【００９８】
＜洗浄力評価＞
まず、表３に示した成分からなる油脂／カーボン汚れを木綿金布に染着させ、人工汚染布を調製した（６×６cm）。
【００９９】
【表３】
0003872373.tif 000004
【０１００】
次いで、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１６７ｍＬを１Ｌ容ビーカー（内径１０５ｍｍ）に入れ、洗浄剤組成物０．６７ｇを溶解させ、この中に前記人工汚染布５枚を入れ、４０℃で１時間漬け置きした。次いで４０℃の使用水（同上）８３３ｍＬを加え、全量をかき混ぜ式洗浄力試験機（ターゴトメーター）の試料カップに移し、回転速度１００ｍｉｎ-1にて１０分間攪拌した。人工汚染布を流水下で濯いだ後、アイロンプレスし、反射率測定に供した。
汚染前の原布及び洗浄前後の汚染布の５５０ｎｍにおける反射率を自記色彩計（島津製作所製（株）製）にて測定し、次式によって洗浄率（％）を求め、５枚の測定平均値を以下の基準により評価した。
【０１０１】
【数１】
0003872373.tif 000005
【０１０２】
評価基準：
○：洗浄率が７５％以上
×：洗浄率が７５％未満
【０１０３】
＜匂い評価＞
坪量５５０ｇ／ｃｍ2の紙表面をポリエチレンでラミネートし、容器を作成した。接着剤としては、一般に用いられているアクリル系エマルジョンタイプの接着剤を使用した。容器寸法は横１４．８ｃｍ×奥行き８．７ｃｍ×高さ１６ｃｍである。これに、洗剤組成物１５００ｇを充填した。その後、開口部を封緘し、３０℃、８０％ＲＨの恒温恒湿器中に９０日間放置した。試験後、以下の基準により評価した。
【０１０４】
評価基準：
○：酵素の特異臭が殆ど感じられない
×：酵素の特異臭が感じられる
【０１０５】
＜洗浄剤組成物の再汚染防止性＞
得られた洗浄剤０．６７ｇを、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１０００ｍＬに溶解させる。次にこれに社団法人日本油化学会選定のカーボンブラック（旭カーボン（株）製、旭洗浄用カーボンブラックが好適）０．２５ｇを添加し、２６±１．５ＫＨｚの超音波を５分間照射してカーボンブラックを均一に分散させる。次にこれを４０℃にてかき混ぜ式洗浄力試験機（ターゴトメータ：Ｔｅｒｇ−Ｏ−Ｔｏｍｅｔｅｒ）の試料カップに移し、６ｃｍ×６ｃｍの木綿の白布（社団法人日本油化学会選定の標準品、洗濯科学協会が販売する＃２０２３布）５枚を入れて回転速度１００±５ｍｉｎ-1で１０分間撹拌する。次に木綿の白布を取り出し、含水率が２００質量％以下になるように軽く手で絞ってから、４０℃の使用水（ＣａＣｌ2：５５．４２ｍｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ：４３．５１ｍｇ／Ｌ）１０００ｍＬに入れ、かき混ぜ式洗浄力試験機（回転速度１００±５ｍｉｎ-1）を用いて３分間濯ぎ、この濯ぎ操作を計２回行なう。次に風乾後、アイロン仕上げを行って、５５０ｎｍにおける反射率を判定した。
【０１０６】
【数２】
0003872373.tif 000006
【０１０７】
評価基準：
○：再汚染防止率が６５％以上
×：再汚染防止率が６５％未満
【０１０８】
製造例４  洗浄剤粒子の製造
（１）洗浄剤粒子−１の製造
全洗浄剤粒子中の質量基準で、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ０．０１質量％、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２０質量％、トリポリリン酸ナトリウム１７質量％、炭酸ナトリウム１０質量％、硫酸ナトリウム２２質量％、１号ケイ酸ナトリウム１４質量％、ポリエチレングリコール（ＭＷ＝１３０００）０．３質量％、アクリル酸−マレイン酸コポリマー（ナトリウム塩（７０モル％中和）、モノマー比はアクリル酸／マレイン酸＝３／７（モル比）、平均分子量７００００）０．３質量％、カルボキシメチルセルロース０．２質量％、チノパールＣＢＳ−Ｘ（チバスペシャリティケミカルス社製）０．０５質量％、チノパールＡＭＳ−ＧＸ（チバスペシャリティケミカルス社製）０．０５質量％、及び亜硫酸ナトリウム０．５質量％から、固形分５０質量％のスラリーを調製し、噴霧乾燥することによって噴霧乾燥粒子を得た。ついで、これを全洗浄剤粒子中の質量基準で、４Ａ型ゼオライト（東ソー（株）製）１０質量％、及び香料０．３質量％を混合し表面被覆を行い洗浄剤粒子を得た。
洗浄剤粒子の平均粒径は３００μｍ、見掛け密度は４５０ｇ／Ｌであった。洗浄剤粒子１００質量部に対して消泡剤０．４質量部を混合し、洗浄剤組成物を得た。
【０１０９】
（２）洗浄剤粒子−２の製造
固形分４８質量％のスラリーを、熱風温度２００℃で噴霧乾燥し、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ０．０２質量％、ポリアクリル酸ナトリウム（平均分子量１００００）８質量％、炭酸ナトリウム３０質量％、硫酸ナトリウム２０質量％、塩化ナトリウム５質量％、蛍光染料０．５質量％、ゼオライト３５質量％の噴霧乾燥粒子を得た。次に、レディゲミキサー（松阪技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付き）に噴霧乾燥粒子１００質量部投入し、主軸（１５０ｍｉｎ-1）の攪拌下、非イオン界面活性剤１８質量部、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２０質量部、脂肪酸（炭素数１４〜１８）ナトリウム５質量部、ポリエチレングリコール（平均分子量８５００）３質量部、水４質量部の混合液を、３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更に、このミキサーに結晶性シリケート１５質量部とゼオライト１５質量部を投入し、表面被覆を行い洗浄剤粒子を得た。
得られた洗浄剤粒子の見掛け密度８３０ｇ／Ｌ、平均粒径３１０μｍであった。
【０１１０】
（３）洗浄剤粒子−３の製造
固形分４８質量％のスラリーを、熱風温度２００℃で噴霧乾燥し、ポリアクリル酸ナトリウム（平均分子量１００００）８質量％、炭酸ナトリウム３０質量％、硫酸ナトリウム２０質量％、塩化ナトリウム５質量％、蛍光染料０．５質量％、ゼオライト３５質量％の噴霧乾燥粒子を得た。次に、レディゲミキサー（松阪技研（株）製、容量２０Ｌ、ジャケット付き）に噴霧乾燥粒子１００質量部投入し、主軸（１５０ｍｉｎ-1）の攪拌下、非イオン界面活性剤１８質量部、直鎖アルキル（炭素数１０〜１３）ベンゼンスルホン酸ナトリウム２０質量部、脂肪酸（炭素数１４〜１８）ナトリウム５質量部、ポリエチレングリコール（平均分子量８５００）３質量部、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼ０．０２質量部、水４質量部の混合液を、３分間で投入し、その後５分間攪拌を行った。更に、このミキサーに結晶性シリケート１５質量部とゼオライト１５質量部を投入し、表面被覆を行い洗浄剤粒子を得た。
得られた洗浄剤粒子の見掛け密度８２０ｇ／Ｌ、平均粒径３２０μｍであった。
【０１１１】
（４）洗浄剤粒子−４の製造
炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、蛍光染料を、レディゲミキサーＦＫＭ−１３０Ｄ（（株）マツボー製）を用いて攪拌羽根を周速３．４ｍ／ｓ、剪断機周速２７ｍ／ｓで１分間混合した。混合物の平均粒径は９８μｍであった。次に、同条件でミキサーを作動させながら、直鎖アルキル（炭素数１２〜１４）ベンゼンスルホン酸（含水率０．５％）と硫酸の混合物を４分間で加え、更に５分間作動させて中和反応を行った。次いで、同条件でミキサーを作動させながら、非イオン界面活性剤、ゼオライトを洗浄剤粒子中の１５質量％分を加え、２分間作動させて造粒を行った。次に、同条件でミキサーを作動させながら、ゼオライトを洗浄剤粒子中の７質量％分を加え、配列番号１に示すアルカリセルラーゼの２２位のセリンをプロリンに、２４２位のグルタミンをセリンに置換した変異アルカリセルラーゼを４質量％含有する酵素溶液を洗浄剤粒子中の０．５質量％分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１３０００）、アクリル酸マレイン酸コポリマー（ＡＡ／ＭＡコポリマー）４０質量％水溶液を１分間で加え、更に２分間作動させて造粒を行った。続いて残りのゼオライトを加え、更に２分間作動させて表面改質処理を行い、表４に示す洗浄剤粒子を得た。
得られた洗浄剤粒子は、見掛け密度７８０ｇ／Ｌ、平均粒径３６０μｍであった。
【０１１２】
【表４】
0003872373.tif 000007
【０１１３】
（５）比較例
変異アルカリセルラーゼを配合せずに、それ以外は製造例８、９、１１と同様にして洗浄剤粒子を得た。これに同活性量のセルザイム０．７Ｔ、もしくはケアザイム４５００Ｔ（ノボザイムズ社製）粒子を添加して洗浄剤組成物とした。
【０１１４】
実施例１４
実施例１〜１３と同様に、各洗浄剤粒子について、溶解性、洗浄力、匂い、再汚染防止性の評価を行った。
溶解性については、洗浄剤粒子−１〜４は、篩い上のセルラーゼ残留量が何れも比較例の残留量よりも大幅に下回っていた。また、セルラーゼの放出率は、洗浄剤粒子−１〜４は何れも６０％以上であったが、比較例は５０％未満であった。
再汚染防止性、匂いの評価については、洗浄剤粒子−１〜４は何れもセルザイムを用いた比較例よりも明らかに勝っていた。また、洗浄力、再汚染防止性の評価については、洗浄剤粒子−１〜４は何れもケアザイムを用いた比較例よりも明らかに勝っていた。
【０１１５】
【発明の効果】
本発明の粉末洗浄剤組成物は、高濃度な浸漬洗浄や、温水による洗濯にも適し、襟・袖口等の皮脂由来の汚れ、染み汚れに対しても優れた洗浄力を発揮する。また、本発明組成物におけるセルラーゼは高活性であり、従来の洗浄剤に比べて酵素の使用量が少なくて済むため、当該組成物における酵素特有の匂いも低減できる。
【０１１６】
【配列表】
0003872373.tif 000008
0003872373.tif 000009
0003872373.tif 000010
0003872373.tif 000011
0003872373.tif 000012
0003872373.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】配列番号１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するセルラーゼのアミノ酸配列を整列させた図である。
【図１】
0003872373.tif 000014