(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのメソ位にボロン酸基Ｂ(ＯＨ)2が存在するポルフィリン環が、金属に配位してサンドイッチ構造の２量体を形成しているか、または、メソ位−メソ位連結して２量体を形成している、２量体化ポルフィリン誘導体から成り、ルイス糖を認識してこれに結合することを特徴とするルイス糖の認識剤。
【請求項２】
下記の式（１）で表わされるサンドイッチ構造の２量体化ポルフィリン誘導体から成ることを特徴とする請求項１のルイス糖の認識剤。
【化１】
0003884621.tif 000009
〔式（１）中、Ｍ1は遷移金属から選ばれ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、▲１▼Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3が式（２）で表わされ、且つ、Ｒ4が式（３）で表わされるか、▲２▼Ｒ1＝Ｒ3が式（２）で表わされ、且つ、Ｒ2＝Ｒ4が式（３）で表わされるか、▲３▼Ｒ1＝Ｒ2が式（２）で表され、且つ、Ｒ3＝Ｒ4が式（３）で表わされるか、または▲４▼Ｒ11＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4が式（２）で表わされる。〕
【化２】
0003884621.tif 000010
【化３】
0003884621.tif 000011
【請求項３】
下記の式（４）または（５）で表わされるメソ位−メソ位連結型２量体化ポルフィリン誘導体から成ることを特徴とする請求項１のルイス糖の認識剤。
【化４】
0003884621.tif 000012
【化５】
0003884621.tif 000013
〔式（４）および（５）中、M2はＨ2または遷移金属であり、また、式（５）中、Ｘは、アルキル基、ビニル基、アセチレン基または芳香族基から選ばれる。〕
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、重要な生理活性オリゴ糖であるルイス糖を認識（識別）してこれに結合することによって、ルイス糖の検出や分離などに用いることのできるルイス糖の認識剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞と細胞が出会うところには、細胞表面に存在する糖鎖が関与するといわれ、この糖鎖の主要な構成成分が、ルイス糖をはじめとするオリゴ糖である。このルイス糖は、血液型（ルイス式血液型）の抗原を定める他、腫瘍関連糖鎖抗原と成るなど、重要な生命現象ないしは生理活性と関与していることが明らかにされつつある。
【０００３】
例えば、ガン細胞においては、血管内皮細胞上のＥ−セレクチンなどの細胞接着分子と強く相互作用する「シアリルルイスＸ（ＳＬｅｘ）」や「シアリルルイスａ（ＳＬｅａ）」と呼ばれるルイス糖から成る糖鎖が多く発現していることが知られている。したがって、血流中のある一定量以上のＳＬｅｘやＳＬｅａなどを検出することができれば、臨床的な検査でガンの転移が認められないような段階でもガン細胞を早期に発見して治療や予防に資することができる。
【０００４】
現在、血液中のガン細胞を検出するために用いられているのはＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）やモノクローナル抗体を標識に用いた方法である。これらの方法により高感度にガン細胞を検出できるようになってきているが、例えばＰＣＲの場合、操作の各ステップには異なった温度・処理時間が必要であり、さらにターゲットＤＮＡの鎖長・塩基配列によっても影響を受けるという欠点がある。最近ではＰＣＲも自動化されてきているが、それでも検出に要する時間は最低でも３〜４時間はかかる。
【０００５】
そこで、生理活性オリゴ糖であるルイス糖を選択的に認識してこれに結合することのできる化学物質から成る認識剤（人工レセプター）の開発が望まれる。このような人工レセプターは、対象とするルイス糖に直接的に相互作用することにより、簡便且つ効果的なルイス糖の検出システムを構築し得るとともに、更には、それらのルイス糖を分離したりすることにも利用できるものと期待される。
【０００６】
これまでにも糖類の認識剤ないしはレセプターとして幾つかの化合物が案出されているが、それらの多くは単糖類または二糖類を対象とするものであり、オリゴ糖、特にルイス糖を選択的に認識しこれと親和性を有するように設計されたものは見当らない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、重要な生理活性オリゴ糖であるルイス糖の認識剤として機能し、その検出（分析）や分離などに用いることのできる新規な化合物を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ボロン酸基を有する特定構造のポルフィリン誘導体がルイス糖と高い親和性を示すことを見出し、本発明を導き出した。
【０００９】
かくして、本発明は、少なくとも２つのメソ位にボロン酸基Ｂ(ＯＨ)2が存在するポルフィリン環が、金属に配位してサンドイッチ構造の２量体を形成しているか、または、メソ位−メソ位連結して２量体を形成している、２量体化ポルフィリン誘導体から成り、ルイス糖を認識してこれに結合することを特徴とする生理活性オリゴ糖の認識剤を提供するものである。
特に好ましい態様に従えば、本発明のルイス糖の認識剤は、下記の式（１）で表わされるサンドイッチ構造の２量体化ポルフィリン誘導体から成る。
【００１０】
【化６】
0003884621.tif 000002
【００１１】
式（１）中、Ｍ1は遷移金属から選ばれ（例えば、セリウム）、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、▲１▼Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3が式（２）で表わされ、且つ、Ｒ4が式（３）で表わされるか、▲２▼Ｒ1＝Ｒ3が式（２）で表わされ、且つ、Ｒ2＝Ｒ4が式（３）で表わされるか、Ｒ1＝Ｒ2が式（２）で表され、且つ、Ｒ3＝Ｒ4が式（４）で表されるか、または▲４▼Ｒ11＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4が式（２）で表わされる。
【００１２】
【化７】
0003884621.tif 000003
【００１３】
【化８】
0003884621.tif 000004
【００１４】
別の特に好ましい態様に従えば、本発明のルイス糖の認識剤は、下記の式（４）または（５）で表わされるメソ位−メソ位連結型２量体化ポルフィリン誘導体から成る。
【００１５】
【化９】
0003884621.tif 000005
【００１６】
【化１０】
0003884621.tif 000006
【００１７】
式（４）および（５）中、M2はＨ2あるいは遷移金属であり（例えば、亜鉛）、また、式（５）中、Ｘは、アルキル基、ビニル基、アセチレン基または芳香族基から選ばれる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明が対象とするルイス糖とは、よく知られているように、ルイス式血液型抗原決定基またはこれとよく似た構造の糖鎖を構成する糖であって、ガラクトース、グルコサミン誘導体およびフコースを含む３〜４個の単糖単位から成る一群のオリゴ糖であり、具体的には、ルイスａ（Ｌｅａ）、ルイスｂ（Ｌｅｂ）、ルイスｘ（Ｌｅｘ）、およびルイスｙ（Ｌｅｙ）、ならびに、これらにシアル酸またはスルホン酸が結合したもの〔例えば、シアリルルイスａ（ＳＬｅａ）、シアリルルイスｘ（ＳＬｅｘ）、スルホルイスａ（Sulpho Ｌｅａ）、スルホルイスｘ（Sulpho Ｌｅｘ）〕を指称する。図１は、ルイス糖の化学構造を例示するものである。図１に示されるように、ルイス糖は、近接する２個の水酸基（水酸基対：図１中、破線で囲んだもの）を２対以上有している。
【００１９】
ボロン酸基Ｂ(ＯＨ)2が、２個の水酸基（ＯＨ）と共有結合することは知られている。本発明のルイス糖認識剤を構成するポルフィリン誘導体は、ポルフィリン環の４つのメソ位のうちの少なくとも２つのメソ位にボロン酸基が存在し、且つ、そのように少なくとも２つのボロン酸基を有するポルフィリン環が２量体化し、したがって、少なくとも４つのボロン酸基を有する。
【００２０】
このようなポルフィリン誘導体は、上述したようなルイス糖に対してきわめて高い親和性を有し、水性溶液（水溶液）中でポルフィリン誘導体：ルイス糖＝１：２以上の割合でルイス糖と結合することが見出されている。そして、この結合に際して、オリゴ糖の濃度と結合量の関係はシグモイド型（Ｓ字形）の曲線になり、ポルフィリン誘導体とルイス糖の結合には「正のアロステリック」効果が存在することが示されている。
【００２１】
これは、ルイス糖の１分子が、その水酸基（水酸基対）を介してポルフィリン誘導体のボロン酸基の一部と結合すると、２量体を形成しているポルフィリン環間の回転の自由度が抑制されて、ポルフィリン環に存在する残りのボロン酸基が、第２のルイス糖分子の水酸基（水酸基対）と結合し易いような位置に整列するためと考えられる。図２は、このように本発明に従う２量体化ポルフィリン誘導体に複数のルイス糖が結合し、その結合に協同現象が見られることを模式的に示すものである。かくして、本発明で用いられる２量体化ポルフィリン構造から成るポルフィリン誘導体は、ある一定量以上のルイス糖を高感度に検出することができるので、例えば、血流中で閾値以上のガン関連糖鎖を検出するのに有用である。
【００２２】
本発明に従うルイス糖認識剤として用いられるポルフィリン誘導体の基本構造を構成するポルフィリン環は、下記の一般式（６）で表わすことができる。
【００２３】
【化１１】
0003884621.tif 000007
【００２４】
本発明のポルフィリン誘導体においては、ポルフィリン環の４つのメソ位のうち少なくとも２つのメソ位にボロン酸基が存在する。すなわち、式（６）において、Ａ1、Ａ2、Ａ3およびＡ4のうちの少なくとも２つにボロン酸基Ｂ(ＯＨ)2が存在する。ボロン酸基は、一般に芳香族ボロン酸として結合されている。したがって、Ａ1〜Ａ4のうちの少なくとも２つが、フェニルボロン酸、ナフタレンボロン酸、アントラセンボロン酸、チオフェンボロン酸などの芳香族ボロン酸であり、特に好ましいのはフェニルボロン酸である。ボロン酸基が存在しないメソ位については、Ａ1〜Ａ4は省略されることになる。
【００２５】
また、式（６）においては、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3またはＸ4としては、アルキル基、ビニル基、アセチレン基、芳香族置換基（フェニル基、フェニルアミノ基、フェニルアンモニウム基、フェニルアセチレン基、チオフェニル基、ピリジル基など）などが可能であり、これらにエステル基、アミド基、エーテル基などが含まれていてもよく、また、発色性や蛍光性の官能基または原子団が含まれていてもよい。Ｘ1〜Ｘ4は、その全てまたは一部が省略されていてもよい。
【００２６】
本発明に従ってルイス糖の認識剤として用いられるポルフィリン誘導体は、以上のような少なくとも２つのボロン酸基を有するポルフィリン環が２量体化したものである。この２量体化ポルフィリン誘導体には、２つの態様があり、その一つは、前述の式（１）で表わされるように、２つのポルフィリン環が金属（Ｍ1）に配位して、該金属イオンを挟持するサンドイッチ構造をとるものであり、もう一つは、前述の式（４）または（５）で表わされるように、２つのポルフィリン環がメソ位−メソ位連結しているものである。
【００２７】
このような２量体化ポルフィリン誘導体がルイス糖に結合するに際しては、式（１）で表わされるようなポルフィリン誘導体（以下、ダブルデッカー型ポルフィリン誘導体またはポルフィリン錯体と称することがある）においては金属（Ｍ1）を介して、また、式（４）または（５）で表わされるようなポルフィリン誘導体においてはメソ位−メソ位連結部位を介して、既述したように、ポルフィリン環が回転することにより複数のルイス糖が結合し易いような協同効果（アロステリック効果）が生じるものと考えられる。
【００２８】
本発明に従いルイス糖の認識剤として用いられるポルフィリン誘導体は、天然のポルフィリン化合物または合成によるポルフィリン化合物から、既知の反応を工夫することにより調製することができる。図３は、式（１）で表わされるようなポルフィリン誘導体（ダブルデッカー型ポルフィリン錯体）の典型例の合成スキームを示すものである（後述の実施例参照）。また、式（４）で表わされるようなメソ位−メソ位連結型のポルフィリン二量体は、例えば、次のようにして合成することができる：５，１５−ジアリルポルフィリンの金属錯体（例えば、亜鉛ン（II）錯体）をクロロホルムに溶解し、ＡｇＰＦ6のアセトニトリル溶液を加え、窒素気流下、遮光し室温で攪拌する。蒸留水を加え、有機相を抽出した後、溶媒を減圧留去する。得られた固体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーおよびゲルカラムクロマトグラフィーにより精製することによって目的物が得られる。
【００２９】
以上のようにして得られるポルフィリン誘導体がルイス糖に対してきわめて高い親和性を有し、ルイス糖を認識してこれと結合することは、例えば、ＣＤ（円二色性）スペクトルの測定によって確認されている。かくして、上述したような二量体化ポルフィリン誘導体から成る本発明のルイス糖認識剤は、ガンの転移や免疫など各種の生理活性において重要な役割を果たしているルイス糖に結合し、例えば、特定のルイス糖（糖鎖）を多く発現した細胞を染色して（ポルフィリン固有の赤色系の呈色または蛍光に基づく。あるいは、ポルフィリン誘導体に色素や蛍光性官能基を導入してそのシグナルを変えたり高めてもよい）、それらのルイス糖の検出に供することができる。更に、上述したようなポルフィリン誘導体から成る本発明のルイス糖認識剤は、ルイス糖に結合してそれを分離するためのアフィニティクロマトグラフィの材料として用いることもできる。
【００３０】
【実施例】
以下に本発明の特徴を更に明らかにするため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制限されるものではない。
実施例１：ポルフィリン誘導体の合成
図３に示す反応スキームに従って、本発明のルイス酸認識剤として機能するダブルデッカー型ポルフィリン誘導体を合成した。
（１）４−メトキシフェニルジピロメタンの合成（工程ｉ）：
窒素気流下、300 ml三口フラスコにｐ−アニスアルデヒド10 mmol（82 mmol）にピロール230 ml（3.3mol、40 eq）およびＴＦＡ0.9 ml（8.2 mmol、0.1 eq）を加えた。反応溶液を室温で２時間攪拌した。ＴＬＣ（クロロホルム：ヘキサン＝１：１）によって原料（Ｒｆ＝0.5）のスポットの消失およびジピロメタン由来のスポットの生成を確認した。反応溶液にジクロロメタンを加え、0.1Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、蒸留水で有機相を洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過後、ろ液から溶媒を減圧留去し、ポンプで減圧乾燥し、オレンジ色のオイル状液体を得た。
【００３１】
（２）５，１５−ビス（４−メトキシフェニル）−１０，２０−ジ（４−ピリジル）ポルフィリンの合成（工程ii）：
還流冷却器を取り付けた500 ml三口フラスコに、工程ｉで得たｐ−メトキシフェニルジピロメタンを10 g（40 mmol）、ピリジン−４−アルデヒド7.7 ml（80 mmol、2.0 eq）、プロピオン酸230 mlを加え、100℃まで加熱してからピロール2.9 ml（41 mmol、4.5 eq）を加え、４時間還流した。その後、溶媒を減圧留去した。続いてカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム）にて精製した。同定は1Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析（ＭＡＬＤＩＴＯＦ  ＭＳ）によって行った。収量1.5 g、収率5.6 %。
1Ｈ−ＮＭＲ（250 MHz、CDCl3、27℃）（ppm）：-2.80(s, 2H), 4.10(s, 6H), 7.32(d, 4H, J=8.4Hz), 8.13(d, 4H, J=8.4Hz), 8.18(d, 4H, J=5.8Hz), 8.81(d, 4H, J=5.8Hz), 8.93(d, 4H, J=5.8Hz), 9.05(d, 4H, J=5.6Hz) ; MALDITOF MS (CHCA) m/z 877.2 (M+ + H = 677.9)
【００３２】
（３）ビス[５．１５−ビス（４−メトキシフェニル）−１０，２０−ジ（４−ピリジル）ポルフィリナート]セリウム（IV）の合成（工程iii）：
脱気窒素置換した100 ml三口フラスコに、工程iiで得た化合物を100 mg（0.15 mmol）、１，２，４−トリクロロベンゼン45 mlを加え、室温で攪拌した。そして、ｎ−ブチルリチウム（1.54Ｎヘキサン溶液）3.8 ml（5.9 mmol、40 eq）を攪拌している溶液に滴下した。泡がでなくなったのを確認した後Ｃｅ(ａｃａｃ)3・３Ｈ2Ｏ 0.37 g（0.75 mmol、5 eq）を加え、６時間還流した。反応終了後、室温まで放冷し、溶媒を減圧留去した。残渣をジクロロメタンに溶解させ、不溶物をろ別した。ろ液から溶媒を減圧留去した後、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、クロロホルム：アセトン＝５０：１）によって精製し、黒色固体を得た。同定は1Ｈ−ＮＭＲ、ＦＡＢ  ＨＲＭＳおよび吸収スペクトルによって行った。収量30 mg、収率27 %。
1Ｈ−ＮＭＲ（600 MHz, CD2Cl2, -40 ℃）（ppm）：4.13(s, 12H, -OCH3), 6.44(d, 4H, J=3.9Hz, exo o-H in -C6H4-OCH3), 6.49(m, 4H, exo o-H in -C6H4N), 6.89(d, 4H, J=3.9Hz, exo m-H in -C6H4-OCH3), 7.73(m, 4H, endo m-H, in -C6H4-OCH3), 8.20-8.43(m, 16H, pyrrole- H), 8.57(m, exo m-H in -C6H4N), 9.43-9.46(m, 8H, endo m-H in -C6H4N and endo o-H in -C6H4-OCH3), 9.52(m, 4H, endo o-H in -C6H4N) ; FAB HRMS (NBA) m/z 1489.3997 (M+ + H = 1489.3993) ; UV-Vis (CH2Cl2) Imax / nm (log e) 325.5 (4.60), 398.0 (5.21), 542.0 (3.95)。
【００３３】
（４）ダブルデッカー型ポルフィリン誘導体（７）の合成（工程iv）：
ｐ−メチルフェニルボロン酸を常法、すなわちＮＢＳを用いるラジカルブロモ化法に従いブロモ化することにより、ｐ−ブロモメチルフェニルボロン酸の保護体を合成した。一方、窒素気流下、工程iiiで得た化合物30 mg（0.020 mmol）に乾燥ＤＭＦ10 mlを加え溶解させた。これに前記のｐ−ブロモメチルフェニルボロン酸の保護体102.7 mg（0.403 mmol, 20 eq）を加え、55℃で加熱、攪拌を行った。反応追跡をＴＬＣ（シリカゲル：ｎ−ブタノール：水：酢酸＝４：１：１）によって行った。反応が進行しなくなったのを確認した後、溶媒を減圧留去した。エーテルおよびアセトンで洗浄を行った後、メタノール／エーテルによって再沈殿操作を行った。茶紫色の粉末を得た。化合物の同定は1Ｈ−ＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトルおよび元素分析によって行った。
融点＞300℃（分解）、収量27 mg（収率54 %）。ＩＲ（ＫＢｒ）：1340.0 cm-1 (B-O)。1Ｈ−ＮＭＲ（600 MHz, メタノール・Ｄ4, -40℃；室温下でピーク広がる）、ｄ（ppm）：1.70-1.72(m, 8H, 1,3-propane diol), 3.63(t, 16H, J=6.09 Hz, 1,3-propane diol), 4.11(s, 12H, -OCH3), 6.16(br, s, 8H, benzyl proton), 6.48(br, s, 4H, m-exo-H in C6H4OMe), 6.97(br, s, 4H, o-exo-H in C6H4OMe), 7.29(br, s, 4H, o-endo-H in C6H4OMe), 7.82(br, s, 4H, m-exo-H in pyridinium group), 7,89(br, s, 8H, Ar-H), 8.05(br, s, 8H, Ar-H), 8.42(br, s, 8H, β-pyrrole), 8.68(br, s, 8H, β-pyrrole), 9.11(br,s, 4H, m-endo-H in C6H4OMe), 9.48(br, s, 4H, o-exo-H in pyridinium group), 9.89(br, s, 4H, m-endo-H in pyridinium group), 10.01(br, s, 4H, o-endo-H in pyridinium group)。元素分析（CeC128H123B4Br4N12O20として）、計算値：C, 57.96 ; H, 4.67 ; N, 6.33 %、実測値：C, 57.78 ; H, 4.26 ; N, 6.48 %。
【００３４】
実施例２：ポルフィリン誘導体とルイス糖の結合実験
実施例１で合成されたダブルデッカー型ポルフィリン誘導体〔図３の化合物（７）〕が水溶液中で各種のルイス糖（Lex、Sulpho Lex、SLex、Lea、Sulpho Lea、SLea）を認識し、それらと結合（錯化：コンプレックス形成）することをＣＤスペクトルの測定により確認した。測定条件は、ポルフィリン誘導体（７）の濃度1.0×10-4Ｍ、各ルイス糖の濃度０〜2.1 mM、溶媒組成Ｈ2Ｏ（50 mMのＮａＨＣＯ3−Ｎａ2ＣＯ3緩衝液）／メタノール＝１／１（v/v）、ｐH10.5、測定温度25℃、光路長0.1 cmとした。ＣＤスペクトルの測定結果を図４に示す。なお、以下に示すＣＤスペクトルおよび各ルイス糖の濃度は全て補正後の値である。
【００３５】
図４に示されるように、各ルイス糖の添加に伴い等吸収点を通過する明瞭なＣＤスペクトル強度の変化が観察され、各ルイス糖とポルフィリン誘導体とにより、それぞれ単一の錯化種（コンプレックス）が生成していることが理解される。
さらに、図５には、446 nmにおけるＣＤスペクトル強度を各ルイス糖の濃度に対してプロットした結果を示している。図５から分かるように、滴定線はシグモイド曲線（Ｓ字型曲線）となり、ポルフィリン誘導体（７）がルイス糖を認識しルイス糖と結合する過程には正のアロステリック効果の存在が示唆された。事実、この滴定曲線からヒル（Hill）プロットを作成し、ヒル係数（ｎ）および会合定数（Ｋ）を求めたところ、下記の表１のようになり、ヒル係数はいずれも１より大きく、正のアロステリック効果（協同性）の存在することが確認され、また、会合定数も従来より知られているレセプター化合物と糖との会合定数に比べて非常に大きく、ポルフィリン誘導体（７）がルイス糖に対するレセプターとして優れていることが確認された。
【００３６】
【表１】
0003884621.tif 000008
【００３７】
さらに、よく知られたジョブ（Ｊｏｂ）プロットを用いる連続変化法により、ポルフィリン誘導体（７）とルイス糖との結合における化学量論比を決定した。図６は、１例として、[ポルフィリン誘導体（７）の濃度]＋[SLexの濃度]＝1.0×10−4Ｍとした場合のジョブプロットである。図６に示されるように[ポルフィリン誘導体（７）の濃度]／（[ポルフィリン誘導体の濃度（７）の濃度]＋[SLexの濃度]）＝0.33において446 nmのＣＤスペクトル強度は最大となっており、ポルフィリン誘導体（７）：SLex＝１：２の比で結合していることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ルイス糖の化学構造式を例示する。
【図２】本発明に従いポルフィリン誘導体に複数のルイス糖分子が結合するに際して協同性があることを模式的に示す。
【図３】本発明に用いられるポルフィリン誘導体の代表例の合成スキームを示す。
【図４】ポルフィリン誘導体にルイス糖を添加した際に観察されるＣＤスペクトル強度の変化を示す。
【図５】ポルフィリン誘導体にルイス糖を添加した際に観察されるＣＤスペクトル強度の変化をルイス糖の濃度に対してプロットしたものである。
【図６】ポルフィリン誘導体とルイス糖の結合の化学量論比を決定するために行ったジョブプロットの１例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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