(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母由来の三価鉄還元酵素ＦＲＥ１遺伝子と同一のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、その塩基配列中にＡＡＴＡＡＡの配列と共に、当該配列中のどの１塩基を他の塩基で置換した配列（即ち、ＮＡＴＡＡＡ、ＡＮＴＡＡＡ、ＡＡＮＡＡＡ、ＡＡＴＮＡＡ、ＡＡＴＡＮＡ、又は、ＡＡＴＡＡＮ）も含まず、かつ８塩基以上連続したＧ又はＴのみからなる配列を含まないように改変された、三価鉄還元酵素をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
さらにＧ及びＣの含量が全領域にわたって一定で、かつＡＴＴＴＡ配列も含まないように改変された、請求項１に記載のＤＮＡ。
【請求項３】
前記改変が、形質転換される植物のコドン利用率に基づいてなされたものである、請求項１又は２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号１に記載の塩基配列からなる請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載のＤＮＡを用いて植物を形質転換することを特徴とする、三価鉄還元活性を有する形質転換植物の製造方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法により得られた、三価鉄還元活性を有する形質転換植物。
【請求項７】
植物が種子である、請求項６に記載の形質転換植物。
【請求項８】
植物が、請求項６に記載の形質転換植物を少なくとも一方の親とする子孫である、請求項６又は７に記載の形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、有用植物に他の生物の遺伝子を導入して有用植物を形質転換する方法に関し、より詳細には導入される他の生物の遺伝子がコードする蛋白質が有する機能を実質的に変更することなく、当該他の生物の遺伝子の塩基配列中に存在する形質転換される有用植物のｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係する要素の領域を、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係しないような他の塩基配列に改変することを特徴とする有用植物を形質転換する方法、それにより製造され得る形質転換された有用植物、それに使用される塩基配列が改変された核酸、及び、当該核酸の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生物が生育するためには、多くの栄養素が必要である。植物はこれらの生育に必要な栄養素の大半を根から吸収している。栄養素を吸収するのに必要な各種の酵素活性が遺伝的に低いために、土壌中にある栄養素を吸収することができない植物がある。
【０００３】
例えば、鉄はほとんどの生物にとって必要不可欠な元素であり、光合成や呼吸など細胞を機能させるのに関わる多くの酵素に必要である。土壌中の可溶化した鉄としては、主にＦｅ（III）キレート（場合によっては  Ｆｅ（II）キレート）として存在している。一般に植物は、Ｆｅ（III）に比べてＦｅ（II）が優先的に吸収されるが、これは植物の種類による。
植物には二種類の鉄の獲得機構、吸収機構（Ｉ）（図１参照）と吸収機構（II）（図２参照）とがある(Mori, 1994)。
【０００４】
図１に示される吸収機構（Ｉ）は、（１）根圏へのプロトンの放出(Olsen and Brown 1980)、（２）根の細胞膜における三価鉄還元活性の増加(Brown et al. 1961, Chaney et al. 1972) 、（３）還元・キレート性物質の根からの分泌(Hether et al. 1984)、などからなっている。つまり放出したキレート物質によりＦｅ（III）をキレート化し、根のフリースペース中の Ｆｅ（III）−キレートを細胞膜上で三価鉄還元酵素によってＦｅ（II）に還元し、Ｆｅ（II）トランスポーターを通して吸収するという仕組みである。根圏へプロトンを放出し、フリースペースのｐＨを下げることで還元酵素の活性を増加させているとも考えられている。しかし、三価鉄の還元活性は高ｐＨで阻害されるため、高濃度の炭酸陰イオンによる強いｐＨ緩衝作用により石灰クロロシスを起こす(Marschner et al. 1986) という問題が知られている。
【０００５】
また、図２に示される吸収機構（II）は、イネ科植物に特有のもので、（１）ムギネ酸類（phytosiderophore）の合成、（２）根圏へのムギネ酸類の放出、（３）鉄とムギネ酸類との可溶性複合体の形成、（４）植物体によるムギネ酸類−鉄複合体の吸収、とからなっている(Takagi 1976, Takagi et al. 1984)。イネ科植物などにみられるこのような吸収機構（II）による鉄獲得機構は、高ｐＨに阻害されないという長所がある。
【０００６】
一方、真核生物のモデルとして知られる酵母（Saccharomyces cerevisiae）は前記した吸収機構（Ｉ）に類似した鉄吸収を行う。高等植物における遺伝子レベルでの研究は Ｆｅ（II） のトランスポーターが酵母の鉄吸収変異株のコンプリメンテーションによってクローニングされている(Eide et al., 1996)が，まだ細かい鉄吸収のシステムについては調べられていない。
それに対して酵母（Saccharomyces cerevisiae）ではその機構が非常に詳しく調べられている。酵母における鉄吸収は、まず細胞膜表面で三価鉄還元酵素ＦＲＥ１、ＦＲＥ２により三価鉄の二価鉄への還元を行う(Dancis et al., 1990, 1992, Georgatsou and Alexandraki,1994)。還元された二価鉄を細胞内に取り込む手段として高親和性機構（high affinity）と、低親和性機構（low affinity）の２つの吸収機構がある。
【０００７】
高親和性機構による鉄吸収は、マルチ銅酸化酵素（multicopper oxidase）ＦＥＴ３による二価鉄の再酸化(Askwith et al. 1994)を行った後、恐らくは三価鉄のトランスポーターＦＴＲ１(Stearman et al., 1996) で細胞内に取り込まれると考えられている。ここでＦＥＴ３による二価鉄の再酸化には、銅が必要であることが分かっており(Dancis et al., 1994, Klomp et al., 1997)、ＦＥＴ３に銅を供給する経路についても調べられている(Yuan et al., 1995, Lin et al., 1997)。
一方、低親和性機構による鉄吸収は、二価鉄のトランスポーターであるＦＥＴ４(Dix et al., 1994,1997) の働きによるものであると考えられている。
【０００８】
酵母におけるこのような鉄吸収機構を植物に応用することにより、鉄欠乏土壌でも生育できる植物を創製することが可能となる。
本発明者らは、この目的で、Dr. Dancis (NIH) より提供を受けた酵母のＦＲＥ１遺伝子を、タバコへ導入した形質転換されたタバコを創製した（山口, 1995）。  しかし、ＦＲＥ１遺伝子の導入された形質転換タバコでは、その還元活性は野生型に比べ変化がみられなかった。ノーザンハイブリダイゼーションの結果、酵母の遺伝子ＦＲＥ１はタバコではその転写産物が０．９ｋｂと小さなものになっていた。
【０００９】
このような異種生物の遺伝子を高等植物に導入しようとして転写が不完全だった例として、バチルス菌（Bacillus thuringiensis）のデルタ−エンドトキシン（δ-endotoxin（殺虫性のタンパク質））をコードする遺伝子群Ｃｒｙがある。４２以上のＣｒｙ遺伝子が存在し、大別すると４つのクラス(cry I〜cry IV)に分けられる(Whiteley and Schnepf,1986)。この殺虫性タンパク質をコードする遺伝子が高等植物に導入されたが、うまく発現しなかったり、極端に発現量が落ちていたことがわかった。
この原因として、（１）コドン利用率（codon usage）の違い、（２）Ｃｒｙ遺伝子のＡＴ含量が高い、（３）ｍＲＮＡの不安定性、（４）Ｃｒｙ遺伝子の一部がイントロンとしてスプライシングされている、等があげられている。
Ｃｒｙ遺伝子群を高等植物で効率的に発現させるために、植物に合う塩基配列にそれぞれＣｒｙ遺伝子を直し、プライマーを合成してＰＣＲにより完全合成することでタンパクの発現量の高い形質転換植物を作製したここも報告されている(Perlak et al., 1991, Fujimoto et al., 1993, Nayak et al., 1997)。
【００１０】
このように、高等植物に他の生物の遺伝子などを導入して形質転換することは知られているが、その発現は必ずしも十分なものではなかった。その原因として前記したような種々のものが考えられていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、有用な高等植物に他の生物が有している機能を付加するために、当該機能を有する蛋白質をコードする遺伝子を、高等植物に導入して形質転換された高等植物において、当該導入遺伝子が十分に発現するための要因を鋭意研究してきたところ、形質転換される植物のｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係する要素の塩基配列が発現に重要な部分であることを見出した。
したがって、本発明は、導入された遺伝子が形質転換された高等植物中で高効率で発現するための方法、当該形質転換された高等植物、及び、そのための遺伝子の改変方法を提供するものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、有用植物に他の遺伝子を導入して有用植物を形質転換する方法において、導入される他の遺伝子がコードする蛋白質が有する機能を実質的に変更することなく、当該他の遺伝子の塩基配列中に存在する形質転換される有用植物のｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係する要素の領域を、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係しないような他の塩基配列に改変することを特徴とする有用植物を形質転換する方法に関する。前記したｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係する要素の領域の塩基配列としては、ＡＡＴＡＡＡ様の塩基配列が好ましく、また、当該ｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係する要素の領域が、ＧＴ−リッチな塩基配列の下流側に存在している領域であることが好ましい。さらに、当該領域の塩基配列の改変は、形質転換される有用植物のコドン利用率に基づいて行われることが好ましい。
【００１３】
本発明の方法においては、導入される遺伝子の塩基のＧ及びＴが豊富な領域が少ないこと、導入される遺伝子の全領域にわたって塩基のＧ及びＣの含有量の差が少ないこと、ＡＴＴＴＡ配列を有さないこと、及び／又は、導入される遺伝子の開始コドンの上流に、コザック配列（Ｋｏｚａｋ配列）を有することが好ましい。
【００１４】
また、本発明は、本発明の方法により製造され得る形質転換された有用植物に関する。本発明の形質転換された有用植物は、生体であっても、種子であってもよくその形態については制限はない。
さらに、本発明は、前記の形質転換する方法で使用され得る塩基配列が改変された塩基配列を有する核酸、特にＤＮＡに関する。
【００１５】
本発明の核酸の塩基配列は、形質転換された有用植物において高効率で発現できるように改変されたものであり、例えば、当該有用植物のｍＲＮＡのポリ（Ａ）付加に関係する要素であり、当該ポリ（Ａ）付加に関係する要素の部分を他の塩基配列で置換されていることを特徴とするものであり、さらには、導入される遺伝子の塩基のＧ及びＴが豊富な領域が少ないこと、導入される遺伝子の全領域にわたって塩基のＧ及びＣの含有量の差が少ないこと、ＡＴＴＴＡ配列を有さないこと、及び／又は、導入される遺伝子の開始コドンの上流に、コザック配列（Ｋｏｚａｋ配列）を有することが好ましい。
【００１６】
また、本発明は前記した核酸類を、数個のフラグメントに分割して、これらのフラクメントを結合させることを特徴とする前記の核酸類を製造する方法に関する。
【００１７】
本発明の形質転換される有用植物としては、食品、医薬品などの産業上利用される植物であれば制限はないが、穀物、野菜、果実種、タバコなどの高等植物が好ましい。
また、本発明の導入される他の遺伝子としては、植物に対して有用なものであり、植物自体及びヒトに対して害を及ぼさないものであれば、特に制限はない。植物に対して直接的に有益なものであってもよいが、除草剤などの薬物に対する耐性を持たせるための遺伝子などであってもよいが、細菌、酵母などの生物由来の酵素などが好ましい。例えば、鉄の吸収に関与する酵母の三価鉄還元酵素ＦＲＥ１などが好ましい。
【００１８】
本発明者らは、形質転換された植物において、導入された遺伝子の発現を左右する要因として、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）の付加を決定づけている塩基配列があることを見出した。さらに、このポリ（Ａ）の付加を決定づけている塩基配列の上流にＧＴ−リッチな塩基配列が必要であることを見出した。つまり、ＧＴ−リッチな塩基配列があると、植物ではポリ（Ａ）の付加が決定され、その後でてくるポリ（Ａ）シグナル、例えば、ＡＡＴＡＡＡ様の塩基配列の１０〜３０ｂ後ろの箇所でｍＲＮＡを切断し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの働きでポリ（Ａ）が付加するのである。したがって、導入される遺伝子がこのような塩基配列を有している場合には、形質転換された植物においては、全長のｍＲＮＡは発現することができず、ＡＡＴＡＡＡ様の塩基配列を有するポリ（Ａ）シグナルの１０〜３０ｂ後ろでｍＲＮＡが切断されることになる。
【００１９】
したがって、本発明は導入される遺伝子中に存在する植物におけるポリ（Ａ）シグナル、例えば、ＡＡＴＡＡＡ様の塩基配列、好ましくはＧＴ−リッチな塩基配列を他の塩基配列に改変することを特徴とするものである。
【００２０】
改変のための塩基配列の設計方法としては、まず、導入される遺伝子がコードしているアミノ酸配列を変更しないようにコドンを選定する。アミノ酸配列は、その蛋白質が有する機能に実質的な影響を及ぼさないのであれば、これを変更することもできるが、アミノ酸配列は変更しないようにおこなうのが好ましい。
アミノ酸をコードするコドンが複数存在する場合には、形質転換される植物のコドンの利用率を考慮して、当該植物の利用率が高いコドンを選定することが好ましい。
【００２１】
また、ポリ（Ａ）シグナルの塩基配列の改変のみならず、ＧＴ−リッチな塩基配列を除くことも好ましい。特に、高度にＧＴ−リッチな塩基配列が存在している場合には、その下流側に出現するポリ（Ａ）シグナル様の塩基配列の領域でｍＲＮＡが切断される可能性が高いので、このような領域のＧＴ含有量を減少させる改変が重要である。
【００２２】
さらに、本発明の方法によれば、前記の改変に加えて導入される遺伝子の全領域にわたって塩基のＧ及びＣの含有量の差が少なくなるように改変するのが好ましい。また、ｍＲＮＡの不安定化配列として知られている、ＡＴＴＴＡ配列を有さないこと、及び／又は、導入される遺伝子の開始コドンの上流に、真核生物でｍＲＮＡが効率よく翻訳されるための配列として知られているコザック配列（Ｋｏｚａｋ配列）を有することが好ましい。
即ち、本発明の方法は、前記した塩基配列の改変に、さらに通常の改変方法を組み合わせて塩基配列を改変することも包含するものである。
【００２３】
塩基配列を代える方法としては、とくに制限はなく公知の各種の方法で行うことができる。例えば、ポイントミューテーションや制限酵素により切断して改変することなどの任意の方法で行うことができる。
また、改変すべき塩基が多数になる場合や、導入する遺伝子自体が短い場合には、合成法により製造することもできる。後により具体的に説明するように、遺伝子が長い場合であっても、これらをいくつかのフラグメントに分割して、ＰＣＲ法により製造された各フラグメントを、制限酵素を用いて結合させることにより、改変された塩基配列を有する遺伝子を製造することもできる。
【００２４】
さらに、本発明の方法をより具体的に説明するが、本発明の方法が以下の説明で使用されるものに限定されるものでなく、以下の説明に基づいて広範囲な応用ができることは当業者には明らかである。
【００２５】
本発明者らは、まず、タバコに導入した酵母のＦＲＥ１のｍＲＮＡの長さが短くなっている（約０．９ｋｂ）ことから、この原因を考察した。酵母の３価鉄還元酵素遺伝子ＦＲＥ１をタバコに導入した場合の転写産物が不完全な長さであった原因として、
（１）ｍＲＮＡの一部がイントロンとして切り出されている。
（２）転写領域（coding region）の途中で転写が終わっている。
という２つの可能性が考えられた。さらなる解析を行うためＲＴ−ＰＣＲを行い、ＦＲＥ１を遺伝子導入した形質転換タバコでは転写領域（coding region）の途中でポリ（Ａ）の付加が起こっていることが判明した。
【００２６】
実際にいままで酵母の遺伝子を高等植物に導入し発現が確認されている例としてインベルターゼ (Hincha, 1996) などがある。今回、ＦＲＥ１遺伝子の導入により同じ真核生物の遺伝子であっても完全長のｍＲＮＡが合成されない場合があるという新規な知見を得ることができた。
ＦＲＥ１を導入した形質転換タバコで完全長のｍＲＮＡができない理由は、ＦＲＥ１の転写領域（coding region）の途中でポリ（Ａ）が付加しているためであった。
【００２７】
ポリ（Ａ）が付加する位置（poly(A) site）は一ヶ所ではなく、それぞれのポリ（Ａ）サイトの上流には確かに塩基配列がＡＡＵＡＡＡ様のポリ（Ａ）シグナルと推定される領域（putative poly(A) signal）が存在した。しかし、ＡＡＵＡＡＡ様の配列というのは、ＦＲＥ１の５’側にいくつか存在するが、これらの場所ではポリ（Ａ）の付加は起こっていないことがわかった。
植物においてポリ（Ａ）の付加を決定づけているのは、ポリ（Ａ）シグナルのさらに上流に存在する、ＧＵ−リッチな配列の方ではないかと考えられた。つまりＧＵ−リッチな配列があると植物ではポリ（Ａ）の付加が決定され、その後でてくるＡＡＵＡＡＡ様の配列の１０〜３０ｂ後ろの「ＰｙＡ」でｍＲＮＡを切断し、ポリ（Ａ）ポリメラーゼの働きでポリ（Ａ）が付加するのだろう。
結局、酵母ではポリ（Ａ）の付加に無関係であったＧＵ−リッチな配列が植物では、ポリ（Ａ）の付加を決定していることが、ＦＲＥ１を導入した形質転換タバコで完全長のｍＲＮＡができない原因であると考えられた。
【００２８】
三価鉄還元酵素ＦＲＥ１のＧＴ−リッチであると思われる配列を図４に示す。図４の四角で囲った領域がＧＴ−リッチであると考えられる領域である。
従って、タバコで三価鉄還元酵素ＦＲＥ１を発現させるためには、ＦＲＥ１遺伝子のＧＴ−リッチな配列を除けばいいと考えられる。しかし、現在までのところ植物のポリ（Ａ）付加を決定づける配列についてはコンセンサスがＧＵ−リッチというぐらいで、配列がはっきりと特定されているわけではない。はっきりとしたコンセンサスがわからない以上、その配列を変えるだけでは完全長のｍＲＮＡを得られない可能性がある。植物において完全長のｍＲＮＡが合成されるように、ＦＲＥ１のアミノ酸配列を変えずに、形質転換される植物のコドン利用率（codon usage）にあわせた塩基配列を設計することにした。
【００２９】
そこで、本発明者らは、タバコで酵母の三価鉄還元酵素を発現させるために、ＦＲＥ１のアミノ酸配列を変えずにタバコのコドン利用率（codon usage）にあった塩基配列に設計し直した。塩基配列の設計に当たって次ぎの点を考慮した。
【００３０】
（１）  ＧＴ−リッチな領域除いた。
（２）  ポリ（Ａ）シグナルとされる塩基配列ＡＡＴＡＡＡおよびそれに似た塩基配列を除いた。
（３）  塩基配列を確認しやすいように、約４００ｂｐごとに制限酵素部位をつくり、５つのセグメントに分けた（４１７〜４３６ｂｐ）。
（４）  ｍＲＮＡの不安定化配列といわれる塩基配列ＡＴＴＴＡ配列（Ohme-        Takagi, 1993）をなくした。
（５）  全領域にわたって塩基Ｇ及びＣの含量に差がないようにコドンの位置を入れ換えた。
（６）  Ｋｏｚａｋ配列と呼ばれる真核生物で、ｍＲＮＡが効率よく翻訳されるための配列（Kozak, 1989）を開始コドンの前に付けた。
【００３１】
このようにして設計された酵母の三価鉄還元酵素ＦＲＥ１の遺伝子の改変された塩基配列を、配列表の配列番号１に示す。また、配列番号２にそのアミノ酸配列を示す。
設計された遺伝子の名前は、再構築ＦＲＥ１（以下、reconstructed ＦＲＥ１の略で「ｒｅｆｒｅ１」という。）とした。
【００３２】
本発明のｒｅｆｒｅ１は、図５に示す５個のセグメント（Ａ〜Ｅ）に分けて合成された。
セグメントＡは、４３４ｂｐまでのもので、１塩基目からＥｃｏＲＩ、７塩基目からＸｂａＩ、４２９塩基目からＢａｍＨＩの制限酵素サイトを持つように設計された。セグメントＢは、４２９〜８４５ｂｐまでのもので、４２９塩基目からＢａｍＨＩ、８４０塩基目からＭｒｏＩの制限酵素サイトを持つように設計された。セグメントＣは、８４０〜１２７５ｂｐまでのもので、８４０塩基目からＭｒｏＩ、１２７０塩基目からＳａｌＩの制限酵素サイトを持つように設計された。セグメントＤは、１２７０〜１６９６ｂｐまでのもので、１２７０塩基目からＳａｌＩ、１６９１塩基目からＰｓｔＩの制限酵素サイトを持つように設計された。セグメントＥは、１６９１〜２０９２ｂｐまでのもので、１６９１塩基目からＰｓｔＩ、２０８１塩基目からＳａｃＩ、２０８７塩基目からＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトを持つように設計された。
【００３３】
４１７〜４３６ｂｐの各セグメントＡ〜Ｅは、それぞれ７７〜８３ｍｅｒのプライマー６本を用いて合成した。使用したＡ−１〜Ｅ−６までの３０本のプライマーを図６に示す。また、これらの塩基配列を配列表の配列番号５〜３４に示す。
各セグメントのプライマーのうちの−１、−２、−３はセンス鎖であり、プライマー−４、−５、−６はアンチセンス鎖である。各セグメントのプライマー−３と−４が、３’末端に１２か１３ｂｐの相補鎖、プライマー−１と−２、−２と−３、−４と−５、−５と−６がそれぞれ３’末端に１２か１３ｂのオーバーラップをもつようにプライマーを設定した。また、プライマー−１と−６は５’末端の１塩基目から制限酵素部位をもつように設定した。
これらのプライマーと、設計された塩基配列との関係を図７に示す。
各セグメントＡ〜Ｅは、前記した塩基配列に従って合成されたプライマーを用いてＰＣＲ法により（図５参照）製造された。
【００３４】
３段階目のＰＣＲの反応液を０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、予想される長さ（４１７〜４３６ｂｐ）のバンドを切り出して精製し、プラスミド  ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（ＴａＫａＲａ製）へクローニングした。得られたクローンの塩基配列を確認し、蛍光  ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＤＳＱ−１０００Ｌ（島津製）を利用して正しい塩基配列をもつものを選抜した。
それぞれの正しい配列をもつセグメントを得た後、制限酵素部位を利用して図８に示す方法によりｒｅｆｒｅ１の全長を作成した。
セグメントＢ及びＥは、インサートの向きが全長の作成ために必要であった。他のセグメントについてはインサートの向きに関係なく正しい塩基配列を含んでいるものを使用した。
【００３５】
得られたｒｅｆｒｅ１の全塩基配列を図９示す。ｒｅｆｒｅ１の配列の特徴としては、
（１）  元のＦＲＥ１と７５．３％のホモロジーがある。
（アミノ酸配列は１００％）
（２）  ８塩基以上連続したＧ又はＴのみの配列を含まない。
（３）  ＡＡＴＡＡＡという配列だけでなく、この中のどの１塩基を他の塩基で置換した配列も含まない。
（４）  ＡＴＴＴＡ  配列を含まない。
（５）  全領域にわたってＧＣ含量に差がない。
等があげられる。
元のＦＲＥ１と比べて、ｒｅｆｒｅ１では連続したＧ及びＴのみの配列が減っていることを図１０に示す。これは、ＦＲＥ１およびｒｅｆｒｅ１の配列中の連続した８塩基のＧＴ含量を％で表したものである。図１０に示したように、ｒｅｆｒｅ１では、ＧＴの含有量が元のＦＲＥ１に比べて均一化されていることがわかる。
【００３６】
このようにして合成した遺伝子ｒｅｆｒｅ１をタバコ（Nicotiana Tabacum L.var. SR1）へ導入した。形質転換の結果カナマイシンに耐性な植物が６８個体再生した。再生してきた植物に目的遺伝子であるｒｅｆｒｅ１が導入されていることと、そのコピー数を確認するためにゲノミック・サザン・ハイブリダイゼーションを行った。その結果形質転換体で１から数コピーの個体においてｒｅｆｒｅ１遺伝子の存在が確認された。
【００３７】
植物細胞への遺伝子導入から植物体を再生させるまでの方法は、通常の方法により行うことができる。例えば、「ラボマニュアル植物遺伝子の機能解析」（丸善）（参考文献（４））に記載の方法に準じて行うことができる。
より具体的には、前記の方法でｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクターにクローニングしたｒｅｆｒｅ１の制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩとのフラグメントを、バイナリーベクター  ｐＢＩ１２１（ＴＯＹＯＢＯ製）のβ−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅの  ＯＲＦと定法により交換し、バイナリーベクターｐＲＦ１を作成した。バイナリベクターｐＲＦ１  の構造を図１１に示す。
【００３８】
得られたバイナリーベクターｐＲＦ１を大腸菌に入れ、この大腸菌とヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（helper plasmid pRK2013）をもつ大腸菌とを、３７℃で１晩振盪培養した。一方、アグロバクテリウムツメファシエンスＣ５８（Agrobacterium tumefaciens C58）を、適切な抗生物質を含むＬＢ液体培地１ｍＬ中で２６℃で２晩振盪培養した。これらを、それぞれ１００μＬをとり抗生物質を含まないＬＢプレート上に混合し、２６℃で２晩培養した後、白金スパチュラでプレートをかきとり選択プレート（100μg/μL rifampicin (Rf) と25μg/μL kanamycin (Km) を含むＬＢプレート）にて、２６℃で２晩培養してシングルコロニーを形成させた。
シングルコロニーを４ｍＬのＬＢ（Ｋｍ，Ｒｆ）液体培地中、２６℃で２晩振盪培養し、アルカリ−ＳＤＳ法（ａｌｋａｌｉｎｅ−ＳＤＳ法）で、プラスミドを抽出し制限酵素による切断パターンをみることで、ｐＲＦ１の存在を確認した。
【００３９】
形質転換される植物は次のようにして用意された。
野生型のタバコの８ｃｍほどの若い葉を２〜３枚切り取り、滅菌液（次亜塩素酸１０％、Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％）で満たしたシャーレに入れ、１５分間攪拌しながら滅菌した。その後、滅菌水で３回ゆすいだ後、葉を８ｍｍ  角にメスで切った。シャーレに集めておいた葉片に、ＬＢ（Ｋｍ，Ｒｆ）液体培地中、２６℃で二晩培養したバイナリーベクターｐＲＦ１をもつアグロバクテリウムツメファシエンスＣ５８（Agrobacterium tumefaciens C58）の培養液を３ｍＬを加えた。１分後パスツールピペットですばやく液を取り除き、さらにオートクレーブ滅菌した濾紙上で余分な液を取り除いた。
葉片を、ＭＳ培地にベンジルアデニン及びナフタレン酢酸を加えた培地上に置き、２５℃で明るい条件で３日間培養した。その後、葉片を前記のＭＳ培地にさらにクラフォラン（CLAFORAN）を加えた培地に移し１週間培養した後、前記のクラフォランを加えた培地にさらにカナマイシンを加えたＭＳ培地に移し、２週間ごとに植え継いだ。カルスが誘導され、シュート（ｓｈｏｏｔ）が形成されたらメスで当該シュート（ｓｈｏｏｔ）を切り取り、ＭＳ培地にカナマイシンを加えた培地に移した。
シュート（ｓｈｏｏｔ）から根が出たものをバーミキュライトに植えかえ、ハイポネックス（ハイポネックス  ジャパン）を与えて育て形質転換された植物を得た。
【００４０】
形質転換の結果、カナマイシンに耐性をもつ形質転換された植物を６８個体得ることができた。これらの植物のうちの生育した例を図１２、及び、開花しているものを図１３に写真として示す。
そのうちの５個体についてゲノミックサザン・ハイブリダイゼーションを行った。その結果を図１４に示す。
ゲノミックサザン・ハイブリダイゼーションは、形質転換されたタバコからのゲノムＤＮＡの抽出は「植物細胞工学シリーズ２  植物のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤社）（参考文献（２））に従って行い、得られたゲノムＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩをもちいて消化し、ｒｅｆｒｅ１の全長断片を鋳型として作成したプローブ（ただし［α−32Ｐ］−ｄＡＴＰを用いた）を用いて行った。
【００４１】
図１４に示されゲノミックサザン・ハイブリダイゼーションでは制限酵素処理の時点でＤＮＡ量を揃えたが、制限酵素処理後エタノール沈殿を行ったために泳動量にばらつきがみられる。従ってここで検出されたバンドの濃さは必ずしも導入された遺伝子のコピー数を反映しているわけではない。
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化ではすべての個体で予想される、３．２ｋｂｐの大きさにバンドが観察された。しかし、Ｎｏ．１２の個体からは３．２ｋｂｐよりもわずかに小さいバンドも検出された。この結果によれば、Ｎｏ．１とＮｏ．１１には１コピー、Ｎｏ．２には３コピーか４コピー、Ｎｏ．９には４コピーの、ｒｅｆｒｅ１が存在していると考えられる。
なお、Ｎｏ．１２のＨｉｎｄＩＩＩによる消化はゲルへのロードミスのためバンドが検出されなかった。
【００４２】
前記のゲノミックサザン・ハイブリダイゼーション解析の結果から、ここで選んだ５個体については、ｒｅｆｒｅ１遺伝子が導入されていることがわかった。
制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切り出すと、プロモーターからターミネータまでが切り出されるので、導入したｒｅｆｒｅ１遺伝子はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でｍＲＮＡへと転写されることになる。Ｎｏ．１２のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの両者での消化において、３．２ｋｂｐよりもわずかに小さいバンドも検出されたのは、おそらく導入されたコンストラクトのうちの一つが植物ゲノムに組み込まれる前に途中で切れてしまい、植物ゲノムのＥｃｏＲＩかＨｉｎｄＩＩＩ部位の近くに入ったのだろうと考えられる。
【００４３】
次に、前記のゲノミックサザン・ハイブリダイゼーションでｒｅｆｒｅ１遺伝子の導入が確認された形質転換されたタバコのＮｏ．１とＮｏ．２について、全長のｍＲＮＡができていることをノーザン解析により確認した。
この解析における、ブロッティングの方法は定法、例えば、「クローニングとシークエンス」（農村文化社）（参考文献（１））に従って行い、ハイブリダイゼーションの方法は前記のサザン解析の場合と同様に行った。
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図１５に示す。図１５では、野生型（Ｗ．Ｔ．）のレーンにはバンドは検出されなかった。Ｎｏ．１とＮｏ．２のレーンには、２．５ｋｂの大きさにメジャーなバンドが検出され、それより小さな位置にいくつかのバンドが検出された。
【００４４】
ノーザン解析により、本発明のｒｅｆｒｅ１の導入により完全長のｍＲＮＡができたかどうかを確認することができた。この解析は、本来は最も発現していて欲しい根からの全ＲＮＡを抽出するべきことになるのではあるが、この試験では根を切断してしまうと次世代の植物を得ることができなくなってしまうので、葉からの抽出によって行った。プロモーターにＣａＭＶ３５Ｓを用いたことから植物体全体でｒｅｆｒｅ１遺伝子が発現していることから、葉からの全ＲＮＡを抽出した前記の解析によっても、植物体の中なら葉でも根でも同じ様に転写が行われ、ｐｏｌｙ（Ａ）の付加位置も変わらないことも確認できた。
【００４５】
ノーザンハイブリダイゼーションの結果から、ｒｅｆｒｅ１を導入したタバコでは２．５ｋｂの転写産物が確認されたので、ｐｏｌｙ（Ａ）の付加は、ＮＯＳのターミネーターによって起こっていると考えられる。ｒｅｆｒｅ１を導入したタバコでは完全長のｍＲＮＡができていることがわかった。
図１５にみられる、２．５ｋｂよりも小さなバンドは、泳動後に撮影した写真と比較するとちょうどｒＲＮＡの位置に検出されていた。ｒＲＮＡへのプローブの非特異的な吸着かとも考えられたが、野生型のＲＮＡにはハイブリダイズしていないことから、ｒｅｆｒｅ１の転写産物にハイブリダイズしていることは間違いない。ｒｅｆｒｅ１でも全長よりも短いｍＲＮＡがわずかながらできているという可能性はある。しかし完全にｒＲＮＡと同じ大きさに検出されたことから考えると、ＲＮＡの泳動時に、ｒｅｆｒｅ１のｍＲＮＡが大量に存在するｒＲＮＡに引きずられたのではないかと考えられる。ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡだけを精製してノーザンハイブリダイゼーションを行うことで、この理由は明らかにすることができるが、図１５からも明なように大部分が完全長のｍＲＮＡであったのでその理由を追求する必要はなかった。
【００４６】
また、このノーザンハイブリダイゼーションのために、サザンハイブリダイゼーションの結果、１コピーであったＮｏ．１の形質転換体と、３又は４コピーであったＮｏ．２の形質転換体のＲＮＡを泳動したが、ｒｅｆｒｅ１遺伝子のコピー数に従って、Ｎｏ．２の方がバンドが明らかに濃いことがわかった。
【００４７】
さらに、得られた形質転換されたタバコ（カナマイシンで選抜）６８個体のうち、６個体について根における恒常的な三価鉄還元活性を確認した。
還元活性の確認には、Ｆｅ（II）の強力なキレーターである、バソフェナンソロリン  ジスルホン酸（bathophenanthroline disulfonic acid（ＢＰＤＳ））が Ｆｅ（II）と複合体を形成することで赤色を呈することを利用した。形質転換体と野生型のタバコのバーミキュライトを除いた後、根をＢＰＤＳを含有するゲルに寝かせアルミホイルで遮光して２７℃で２４時間静置した。形質転換体の根圏での発色から三価鉄の還元が確認された。
還元酵素活性の確認の写真を図１６及び図１７に写真で示す。図１６及び１７の写真は、カラー写真の白黒コピーであるために、ＢＰＤＳとの複合体による赤色が必ずしも明確ではないが、写真右側の形質転換体のほうが赤色に発色していることが黒く示されている。
【００４８】
このように、根での三価鉄還元酵素活性の確認に用いた６個体（kanamycin 選抜）はすべて三価鉄還元活性が検出された。形質転換されたタバコと野生型のタバコでの差を明確にするために還元酵素による反応時間を24時間と長く設定したが、１時間ぐらいからその違いは確認された。実験に用いた形質転換体６個体すべてについて言えることだが、活性試験用のゲルにおくと野生型に比べて葉が萎れてしまうという傾向があった。これは、導入したｒｅｆｒｅ１遺伝子の葉での発現が、何らかのメカニズムで関与しているのではないかと推測される。このためあまり活性試験は行わなかったが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御の下でｒｅｆｒｅ１遺伝子が葉においても転写・翻訳され発現していることはまちがいない。
【００４９】
このように、本発明者らは、酵母の三価鉄還元酵素ＦＲＥ１を高等植物であるタバコで発現することができる新規なタバコを創製した。
異種生物の遺伝子の転写産物が完全長でないということが起こる原因として、ｍＲＮＡの一部がイントロンとしてスプライシングされている可能性と、転写領域（coding region）の途中でポリ（Ａ）が付加しているという２つの可能性が考えられる。
本発明は、異種生物の遺伝子を高等植物に導入して、完全長の転写産物が得られるための塩基配列の設計方法を提供するものである。本発明の方法は、転写領域（coding region）の途中で、ポリ（Ａ）の付加を避けるために、８塩基以上連続した  Ｇ又はＴのみの配列を含まず、ＡＡＴＡＡＡという配列だけでなく、この中のどの１塩基を他の塩基で置換した配列（即ち、ＮＡＴＡＡＡ、ＡＮＴＡＡＡ、ＡＡＮＡＡＡ、ＡＡＴＮＡＡ、ＡＡＴＡＮＡ、又は、ＡＡＴＡＡＮ）も含まないように設計する必要があることが判明した。
また、Ｇ及びＣの含量が全領域にわたって一定になるように設計することも重要であることがわかった。
【００５０】
さらに、前記の発明の具体的な説明においては、プロモーターとしてＣａＭＶ３５Ｓを用いたので形質転換されたタバコでは、植物体全体で三価鉄還元酵素が発現した。このように、プロモーターとの組合せにより、局所的に発現している遺伝子を植物全体で発現させることもできるようになる。また、反対に植物全体で発現している遺伝子を局所的に発現させることも、適当なプロモーターとの組合せにおいて可能となる。
【００５１】
また、三価鉄を還元して吸収する機構はイネ科を除く単子葉と双子葉植物の鉄獲得機構に特徴的だが、イネ科でも鉄が十分に存在する状態では三価鉄を二価鉄に還元して吸収しているのではないかと考えられている。鉄欠乏の根で特異的に働くプロモーターに、本発明の三価鉄還元酵素遺伝子ｒｅｆｒｅ１をつなぐことにより、鉄欠乏条件下で鉄の吸収機構（Ｉ）と吸収機構（II）とを機能させることのできる新規なイネ科植物の創製も考えられる。
【００５２】
以下に、本発明の参考文献を掲載する。
（１） クローニングとシークエンス (1989) 農村文化社
（２）植物のPCR実験プロトコール (1995) 秀潤社
（３）バイオ実験  イラストレイテッド・遺伝子解析の基礎 (1995) 秀潤社
（４）ラボマニュアル植物遺伝子の機能解析 (1992) 丸善
（５）アスキウイズら、セル、７６巻、４０３−４１０頁  （１９９４年）（Askwith, C., et al.,Cell, 76:403-410（1994））
（６）ブラウンら、ソイル  サイエンス、９１巻、１２７−１３２頁（１９６１）
（Brown, J.C., et al., Soil Sci., 91: 127-132 (1961)）
【００５３】
（７）チャネイら、プラントフィジオロジー、５０巻、２０８−２１３頁（１  ９７２年）（Chaney, R.L., et al., Plant Physiol. 50: 208-213 (1972)）
（８）ダンシスら、モレキュラーセルバイオロジー、１０巻、２２９４−２３０１頁（１９９０年）（Dancis, A., et al., Mol. Cell. Biol. 10: 2294-23    01 (1990)）
【００５４】
（９）ダンシスら、プロシーディングナショナルアカデミックサイエンス  ＵＳＡ、８９巻、３８６９−３８７３頁（１９９２年）（Dancis, A., et al.,     Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3869-3873 (1992)）
（１０）ディックスら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、２６９巻、    ２６０９２−２６０９９頁（１９９４年）（Dix, D.R., et al., J. Biol.     Chem. 269: 26092-26099 (1994)）
【００５５】
（１１）ディックスら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、２７２巻、    １１７７０−１１７７７頁（１９９７年）（Dix, D., et al., J. Biol.     Chem. 272: 11770-11777 (1997)）
（１２）エイデら、プロシーディングナショナルアカデミックサイエンス  ＵＳＡ、９３巻、５６２４−５６２８頁（１９９６年）（Eide, D., et al.,     Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5624-5628 (1996)）
（１３）フジモトら、バイオ／テクノロジー、１１巻、１１５１−１１５５頁  （１９９３年）（Fujimoto, H., et al., Bio/Technology 11: 1151-1155       (1993)）
【００５６】
（１４）ガリーら、プラントセル、９巻、６６７−６７３頁（１９９７年）（Gallie, D.R., et al., Plant Cell 9: 667-673 (1997)）
（１５）ジョーガトソら、モレキュラーセルバイオロジー、１４巻、３０６５−３０７３頁（１９９４年）（Georgatsou, E. et al., Mol. Cell. Biol.     14:  3065-3073 (1994)）
（１６）グオら、バイオケミカルサイエンス、２１巻、４７７−４８１頁（１９９６年）（Guo, Z. et al., Biochem. Sci. 21: 477-481 (1996)）
【００５７】
（１７）ハセットら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、２７０巻、１２８−１３４頁（１９９５年）（Hassett, R. et al., J. Biol. Chem.     270: 128-134 (1995)）
（１８）ヘザーら、ジャーナルオブプラントニュートリアス、７巻、６６７−６７６頁（１９８４年）（Hether, N.H., et al., J. Plant Nutr. 7: 667-67    6 (1984)）
（１９）ハインカら、ジャーナルオブプラントフィジオロジー、１４７巻、６０４−６１０頁（１９９６年）（Hincha, D.K., et al., J. Plant Physiol.     147: 604-610 (1996)）
【００５８】
（２０）コザック、ジャーナルオブセルバイオロジー、１０８巻、２２９−２４１頁（１９８９年）（Kozak, M., J. Cell. Biol. 108: 229-241 (1989)）
（２１）リンら、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー、２７２巻、９２１５−９２２０頁（１９９７年）（Lin, S.J., et al., J. Biol. Chem. 27    2: 9215-9220 (1997)）
（２２）マーシェナーら、ジャーナルオブプラントニュートリアス、９巻、６９５−７１３頁（１９８６年）（Marschner, H., et al.,J. Plant Nutr. 9:     695-713 (1986)）
（２３）メウエスら、ネイチャー、３８７巻、７−８頁（１９９７年）（Mewes, H.W., et al., Nature 387: 7-8 (1997)）
【００５９】
（２４）モリら、「根圏における微量金属栄養素の生化学」、第２２５−２４９頁（１９９４年）（Mori, S. (1994) Biochemistry of metal micronutrien    ts in the rizosphere.(Eds. Manthey, J.A., Crowley, D.E., Luster, D.G.,    Lewis Publishers) pp.225-249）
（２５）ナイトーら、プラントモレキュラーバイオロジー、１１巻、１０９−１２４頁（１９８８年）（Naito, S., et al., Plant mol.Biol. 11:109-124     (1988)）
【００６０】
（２６）ナカニシら、プラントセルフィジオロジー、３４巻、４０１−４１０頁（１９９３年）（Nakanishi, H., et al., Plant Cell Physiol. 34: 401-4    10 (1993)）
（２７）ナヤックら、プロシーディングナショナルアカデミックサイエンス  ＵＳＡ、９４巻、２１１１−２１１６頁（１９９７年）（Nayak, P., et al.,     Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 2111-2116 (1997)）
【００６１】
（２８）オーメ−タカギら、プロシーディングナショナルアカデミックサイエンス  ＵＳＡ、９０巻、１１８１１−１１８１５頁（１９９３年）（Ohme- Ta    kagi, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11811-11815 (1993)）
（２９）オクムラら、ジャーナルオブプラントニュートリアス、１５巻、２１５７−２１７２頁（１９９２年）（Okumura, N., et al., J. Plant Nutr.     15: 2157-2172 (1992)）
（３０）オクムラら、プラントモレキュラーバイオロジー、２５巻、７０５−７１９頁（１９９４年）（Okumura, N., et Al., Plant Mol. Biol. 25: 705-    719 (1994)）
【００６２】
（３１）オルセンら、ジャーナルオブプラントニュートリアス、２巻、６２９−６６０頁（１９８０年）（Olsen, R.A. et al., J. Plant Nutr. 2: 629-66    0 (1980)）
（３２）パーラックら、プロシーディングナショナルアカデミックサイエンス  ＵＳＡ、８８巻、３３２４−３３２８頁（１９９１年）（Perlak, F.J., et     al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328 (1991)）
（３３）スティアマンら、サイエンス、２７１巻、１５５２−１５５７頁（１９９６年）（Stearman, R., et al., Science 271: 1552-1557 (1996)）
【００６３】
（３４）タカギ、ソイルサイエンスプラントニュートリアス、２２巻、４２３−４３３頁（１９７６年）（Takagi, S., Soil Sci. Plant Nutr. 22: 423-43    3 (1976)）
（３５）タカギら、ジャーナルオブプラントニュートリアス、７巻、６２９−  ６６０頁（１９８４年）（Takagi, S., et al., J. Plant Nutr. 7: 469-47    7 (1984)）
（３６）ホワイトレーら、アヌアルレビューマイクロバイオロジー、４０巻、５４９−５７６頁（１９８６年）（Whiteley, H.R., et al., Annu. Rev. Mic    robiol. 40: 549-576 (1986)）
【００６４】
（３７）ウーら、プラントジャーナル、８巻、３２３−３２９頁（１９９５年）（Wu, L., et al., Plant J. 8:323-329 (1995)）
（３８）ヤーンら、プロシーディングナショナルアカデミックサイエンス  ＵＳＡ、９２巻、２６３２−２６３６頁（１９９５年）（Yuan, D.S., et al.,     Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92: 2632-2636 (1995)）
【００６５】
【実施例】
つぎに実施例により、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６６】
以下の実施例においては、基本的な遺伝子操作は「クローニングとシークエンス」（農村文化社）に従い、遺伝子の塩基配列の解析には DNASIS (Hitachi製) を使用した。
実施例１（ＦＲＥ１を導入した形質転換タバコからの全ＲＮＡの抽出）
ＦＲＥ１を導入した形質転換タバコからの全ＲＮＡの抽出は（Ｎａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８８）に従って行った。
ＦＲＥ１を導入した形質転換タバコの葉２ｇを乳鉢に入れ、液体窒素を加えて完全にすりつぶした。破砕物に３倍量の抽出用緩衝液と等量のフェノール／クロロホルム（１：１）を加え懸濁し、８０００ｒｐｍで１５分遠心した後、水層を別のチューブに移し、さらに２回フェノール／クロロホルム抽出をし、その後クロロホルム抽出を１回行った。−８０℃で３０分間エタノール沈殿し、８０００ｒｐｍ、４℃で３０分遠心し沈殿を７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥した。沈殿を１ｍＬのＤＥＰＣ水に溶かし、１３５００ｒｐｍで３分遠心して上清を新しいチューブに移し、１／４ｖｏｌ．の１０Ｍ  ＬｉＣｌを加えて氷上で２時間静置した。１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心し、沈殿を７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥したものをＤＥＰＣ水５０μＬに溶かした。
【００６７】
試薬      抽出用緩衝液
1 M Tris・HCl pH9.0
1% SDS
（使用前に６mLに対して120μLのβ-メルカプトエタノールを加える。）
【００６８】
実施例２  （ポリ（Ａ）＋ＲＮＡの精製とｃＤＮＡの合成）
実施例１で得た禅ＲＮＡの１００μｇから、ダイナビーズオリゴ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｏｌｉｇｏ）（ｄＴ）２５（ＤＹＮＡＬ製）を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。このポリ（Ａ）＋  ＲＮＡを下記のハイブリッドプライマーを用いて、３７℃で１時間  Ｍ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｍ−ＭＬＶ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）（ＴＯＹＯＢＯ製）により逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。
ハイブリッドプライマー（ｄＴ17アダプタープライマー)
５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
【００６９】
実施例３  （ＲＴ−ＰＣＲと塩基配列の確認）
実施例２で得られたｃＤＮＡを鋳型としてハイブリッドプライマーに特異的なプライマーと、ＦＲＥ１の５’プライマーで、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応産物を０．８％  アガロースで電気泳動し、得られたバンドをｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（ＴａＫａＲａ製）へクローニングした。コロニーをＬＢ培地で１晩振盪培養し、アルカリ−ＳＤＳ法でプラスミドを抽出し、制限酵素処理によりインサートが入っていることが確認された７つのクローンの塩基配列をブカベストＤＮＡポリメラーゼ（Bca BEST DNA polymerase）を用いて決定した。（「バイオ実験  イラストレイテッド・遺伝子解析の基礎」）（秀潤社）。
ハイブリッドプライマーに特異的なプライマー
５’−ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧ−３’
ＦＲＥ１の５’プライマー
５’−ＡＣＡＣＴＴＡＴＴＡＧＣＡＣＴＴＣＡＴＧＴＡＴＴ−３’
【００７０】
ＰＣＲの反応条件
（１）９５℃    ５分
（２）９５℃  ４０秒
（３）５５℃  ３０秒
（４）７２℃    １分
（５）７２℃  １０分
（６）  ４℃
で、（２）、（３）、及び、（４）を４０回繰り返した。
【００７１】
この結果、ＦＲＥ１を導入した形質転換タバコでは、ＦＲＥ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡには、図３に示すような位置でポリ（Ａ）が付加していた。
ポリ（Ａ）の付加位置は一様ではなく、いくつかの長さのｍＲＮＡが存在した。ポリ（Ａ）サイト（poly(A) site）の上流のポリ（Ａ）シグナル（poly(A) signal）として認識されていると思われる配列を推定されるポリ（Ａ）シグナル（  putative poly(A) signal）として示した。
【００７２】
実施例４  （ＰＣＲ法による各セグメントの製造）
各セグメントは、図５に示される、ＰＣＲ法により製造した。タックポリメラーゼ（Taq polymerase）はスーパータック（super Taq）（サワディー製）を使用した。
ＰＣＲ反応液の組成は、次のとおりである。
第１段階のＰＣＲ反応液
１０ｘ緩衝液                  １０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物        １０μＬ
２０μＭ  プライマー（−３）    ５μＬ
２０μＭ  プライマー（−４）    ５μＬ
蒸留水    で  全量を      ９９．５μＬ
第２段階のＰＣＲ反応液
第１段階のＰＣＲ反応混合物      １μＬ
１０ｘ緩衝液                  １０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物        １０μＬ
２０μＭ  プライマー（−２）    ５μＬ
２０μＭ  プライマー（−５）    ５μＬ
蒸留水    で  全量を      ９９．５μＬ
第３段階のＰＣＲ反応液
第２段階のＰＣＲ反応混合物      １μＬ
１０ｘ緩衝液                  １０μＬ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ混合物        １０μＬ
２０μＭ  プライマー（−１）    ５μＬ
２０μＭ  プライマー（−６）    ５μＬ
蒸留水    で  全量を      ９９．５μＬ
【００７３】
ＰＣＲの反応条件
（１）９５℃    ５分
（２）タック０．５μＬ添加
（３）９５℃  ４０秒
（４）４５℃    １分
（５）７２℃    １分
（６）９４℃  ４０秒
（７）６０℃  ３０秒
（８）７２℃    １分
（９）７２℃  １０分
（１０）４℃
で、（３）、（４）、及び、（５）を５回、（６）、（７）、及び、（８）を２０回繰り返した。
【００７４】
実施例５  （クローニングと塩基配列の確認）
実施例４の第３段階目のＰＣＲの反応液を、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後、予想される長さ（４１７〜４３６ｂｐ）のバンドを切り出して精製し、プラスミドｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（ＴａＫａＲａ製）へクローニングした。得られたクローンの塩基配列を確認し、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  蛍光  ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  ＤＳＱ−１０００Ｌを利用して正しい塩基配列をもつものを選抜した。
それぞれの正しい配列をもつセグメントを得た後、制限酵素部位を利用して図８のようにｒｅｆｒｅ１の全長を作成した。セグメントＢ、Ｅは、インサートの向きが全長の作成ために必要であった。他のセグメントについてはインサートの向きに関係なく正しい塩基配列を含んでいるものを使用した。
合成したｒｅｆｒｅ１の全塩基配列を、配列表の配列番号１及び図９に示す。
【００７５】
実施例６  （ｒｅｆｒｅ１のタバコへの導入）
実施例５により合成した遺伝子ｒｅｆｒｅ１を、タバコ（Nicotiana Tabacum L. var. SR1）へ導入した。形質転換の結果、カナマイシンに耐性な植物が６８個体再生した。再生してきた植物に目的遺伝子であるｒｅｆｒｅ１が導入されていることと、そのコピー数を確認するためにゲノミック・サザン・ハイブリダイゼーションを行った。その結果、１コピーから数コピーのｒｅｆｒｅ１遺伝子の存在が確認された。
植物細胞への遺伝子導入から植物体を再生させるまでの方法は、「ラボマニュアル植物遺伝子の機能解析」（丸善）に従って行われた。
【００７６】
（１）  形質転換用バイナリーベクターｐＲＦ１の作成
ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクターにクローニングしたｒｅｆｒｅ１のＸｂａＩとＳａｃＩフラグメントを、ＴＯＹＯＢＯから市販されているバイナリーベクターｐＢＩ１２１のβ−グルクロニダーゼ（β−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ）のＯＲＦと交換して、バイナリーベクターｐＲＦ１を作成した。バイナリーベクターｐＲＦ１の構造を図１１に示す。
【００７７】
（２）  （バイナリーベクターｐＲＦ１のアグロバクテリウム（Agrobacterium）への導入）
適切な抗生物質を含むＬＢ液体培地１ｍＬ中で、アグロバクテリウムツメファシエンスＣ５８（Agrobacterium tumefaciens Ｃ５８）を２６℃で２晩振盪培養、ｐＲＦ１をもつ大腸菌とヘルパープラスミド（helper plasmid）ｐＲＫ２０１３をもつ大腸菌を３７℃で１晩振盪培養した後、それぞれ１００μＬをとり抗生物質を含まないＬＢプレート上に混合した。２６℃で２晩培養した後、白金耳でプレートをかきとり選択プレート（１００μｇ／μＬリファンピシン（rifampicin）（Ｒｆ）と２５μｇ／μＬカナマイシン（kanamycin）（Ｋｍ）を含むＬＢプレート）に、シングルコロニーを形成させた（２６℃で２晩培養）。
得られたシングルコロニーを４ｍＬのＬＢ（Ｋｍ，Ｒｆ）液体培地中、２６℃で２晩振盪培養し、アルカリーン−ＳＤＳ法でプラスミドを抽出し、制限酵素による切断パターンをみることで、ｐＲＦ１の存在を確認した。
【００７８】
（３）  （アグロバクテリウム（Agrobacterium）のタバコへの感染と植物体の再生）
野生型の８ｃｍほどタバコ（Nicotiana Tabacum L. var. SR1）の若い葉を２〜３枚切り取り、滅菌液（次亜塩素酸１０％，Ｔｗｅｅｎ２０  ０．１％）で満たしたシャーレに入れ、１５分間攪拌しながら滅菌した。その後滅菌水で３回ゆすいだ後、葉を８ｍｍ角にメスで切った。シャーレに集めておいた葉片に、ＬＢ（Ｋｍ，Ｒｆ）液体培地中、２６℃で二晩培養したバイナリーベクターｐＲＦ１をもつアグロバクテリウム（Agrobacterium）の培養液を３ｍＬを加えた。
１分後、パスツールピペットですばやく液を取り除き、さらにオートクレーブ滅菌した濾紙上で余分な液を取り除いた。葉片を下記のＭＳ培地（II）上に置き、２５℃で明条件で３日間培養した。その後葉片をＭＳ培地（III)に移し１週間培養した後、ＭＳ培地（IV）に移し２週間ごとに植え継いだ。カルスが誘導され、シュート（ｓｈｏｏｔ）が形成されたらメスでシュート（ｓｈｏｏｔ）を切り取りＭＳ培地（Ｖ）に移した。シュート（ｓｈｏｏｔ）から根が出たものをバーミキュライトに植えかえ、ハイポネックス（ハイポネックス  ジャパン）を与えて育て再生植物を得た。
【００７９】
前記の実験で使用したタバコ用ＭＳ培地の組成は次のとおりである。
主要な成分（Major elements）(g/L)
ＮＨ4ＮＯ3                １．６５
ＫＮＯ3                   １．９
ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ        ０．４４
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ０．３７
ＫＨ2ＰＯ4                ０．１７
少量の成分（Minor element） (mg/L)
Ｈ3ＢＯ4  ６．２
ＭｎＳＯ4・４Ｈ2Ｏ      ２２．３
ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ        ８．６
ＫＩ                      ０．８３
Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ     ０．２５
ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ        ０．０２５
ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ        ０．０２５
Ｆｅ（III)Ｎａ−ＥＤＴＡ        ０．０４２  ｍｇ／Ｌ
ミオイノシトール            １００  ｍｇ／Ｌ
チアミン                        ５  ｍｇ／Ｌ
ｓｕｃｒｏｓｅ                ３０  ｇ／Ｌ
ゲランガム                      ２  ｇ／Ｌ
【００８０】
ＭＳ培地（Ｉ）は、前記の組成で作り、これに下記の植物ホルモン及び／又は抗生物質を加えて下記の他のＭＳ培地を作った。
0003920453.tif 000002
【００８１】
実施例７  （サザン解析）
（１）  タバコからのゲノムＤＮＡの抽出
タバコからのゲノムＤＮＡの抽出は「植物細胞工学シリーズ・植物のPCR実験プロトコール」（秀潤社）に従った。
乳鉢に、０．１〜０．２ｇの葉を入れ、液体窒素を加えて完全にすりつぶした。破砕物をエッペンドルフチューブに入れ、３００μＬの２％ＣＴＡＢ溶液を加え、混合し、６５℃で３０分間加温した。等量のクロロホルム・イソアミルアルコール（２４：１）を加え５分間混合した。
１２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上層を新しいチューブに移し、クロロホルム・イソアミルアルコール抽出をもう一度繰り返し、上層を新しいチューブに移した。１〜１．５容量の１％ＣＴＡＢ溶液を加え、混合し、室温で１時間静置した後、８０００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清を捨て４００μＬの１ＭＣｓＣｌを加え、６５℃で沈殿が完全に溶けるまで加温した。８００μＬの１００％エタノールを加え、混合し、−２０℃で２０分間静置後、１２０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥したものを３０μＬのＴＥ緩衝液に溶かした。
【００８２】
試薬      ２％  ＣＴＡＢ溶液
１００ｍＭ      トリス−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）
２０ｍＭ      ＥＤＴＡ        （ｐＨ  ８．０）
１．４Ｍ    ＮａＣｌ
２％        ＣＴＡＢ  （cetyltrimethylammonium bromide）
１％  ＣＴＡＢ溶液
５０ｍＭ      トリス−ＨＣｌ  （ｐＨ  ８．０）
２０ｍＭ      ＥＤＴＡ        （ｐＨ  ８．０）
１％        ＣＴＡＢ
【００８３】
（２）  制限酵素によるゲノムＤＮＡの切断と電気泳動
制限酵素処理は、ｐＣａＭＶ３５ＳからｔＮＯＳまでが切断されるＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの両者による消化と、ｐＣａＭＶ３５Ｓの上流で切断されるＨｉｎｄＩＩＩだけでの消化を行った。
ゲノムＤＮＡ１０μｇを、反応液量１００μＬとして終夜で制限酵素処理し、エタノール沈殿して２０μＬのＴＥ緩衝液に溶解した。ｌｏｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μＬを加えて０．８％アガロースゲルで、６０Ｖで５時間、電気泳動した。泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶトランスイルミネーター上でスケールとともに写真を撮影した。
【００８４】
（３）  ブロッティングとハイブリダイゼーション
写真撮影後のゲルを蒸留水で洗浄し、０．２Ｎ  ＨＣｌ中で１０分間振盪した。ブロッティングの方法は「クローニングとシークエンス」（農村文化社）に従った。０．４Ｎ  ＮａＯＨでナイロンメンブレン（Ｎｅｗ  Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーし、２ｘＳＳＰＥで５分洗った後室温で３時間乾燥した。ハイブリダイゼーションの方法は「バイオ実験イラストレイテッド・遺伝子解析の基礎」（秀潤社）を参照した。メンブレンをあらかじめ６５℃に加温しておいた３０ｍＬのハイブリダイゼーションバッファーでプレハイブリダイゼーションを６５℃で１時間行い、ハイブリダイゼーションバッファーを交換（２５ｍＬ）した。プローブを加え、６５℃で１２時間ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンの洗浄はあらかじめ６５℃に加温しておいた洗浄液で６５℃１０分を２回、ｈｉｇｈ  ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ洗浄液で、６５℃１０分を１回行った。メンブレンをサランラップでつつみ、イメージングプレートに２４時間感光させ、イメージアナライザー（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ製）で結果を確認した。
【００８５】
0003920453.tif 000003
【００８６】
（４）  プローブの作成
ｒｅｆｒｅ１の全長断片を鋳型として、ランダムプライマーＤＮＡラベリングキット第２版（Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2.0）（ＴａＫａＲａ製）を用いてプローブを作成（ただし［α−32Ｐ］−ｄＡＴＰを用いた。）し、ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔＴＭ  Ｇ−５０  Ｍｉｃｒｏ  Ｃｏｌｕｍｎｓ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製）により未反応の［α−32Ｐ］−ｄＡＴＰを除去した。
結果を図１４に示す。図１４の左側は、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの両者による消化を行ったものであり、右側は、ＨｉｎｄＩＩＩだけでの消化を行ったものである。図中のＷ．Ｔ．は野生型を示す。
【００８７】
実施例８  （ノーザン解析）
（１）  全ＲＮＡの抽出
実施例１と同様な方法により、ｒｅｆｒｅ１を遺伝子導入した形質転換タバコおよび野生型のタバコの葉から、全ＲＮＡを抽出した。
【００８８】
（２）  ＲＮＡの電気泳動
泳動槽・ゲル受け・コームおよび三角フラスコはあらかじめ  アブソルブ（ａｂＳｏｌｖｅ（ＲＮａｓｅ  阻害剤  ＤＵ  ＰＯＮＴ製））処理をしておいた。２０ｘＭＯＰＳ１０ｍＬ、２．４ｇアガロース、１００ｍＬ滅菌蒸留水を三角フラスコにいれ、電子レンジでアガロースを溶かした。約５０℃まで冷えたところで、ホルムアルデヒド１０ｍＬを加え、滅菌蒸留水で２００ｍＬにしたものを固めてゲルに用いた。泳動槽に、約８００ｍＬの１ｘＭＯＰＳを入れ、１０ｍｇ／ｍＬのエチジウムブロマイド５μＬを加え、泳動緩衝液とした。全ＲＮＡ１０μｇに１６μＬのＲＮＡｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、滅菌蒸留水で２０μＬとし、６５℃で１０分間加温した後氷上で５分間静置したものを泳動した。泳動条件は、６０Ｖで１時間泳動した後、電圧を１２０Ｖにしてさらに２時間泳動した。
【００８９】
0003920453.tif 000004
【００９０】
グリセリン色素液
グリセリン                        ５ｍＬ
ブロモフェノールブルー            １ｍｇ
キシレンシアノール                １ｍｇ
０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）    ０．０２ｍＬ
【００９１】
（３）  ブロッティングとハイブリダイゼーション
泳動終了後、ゲルを  ＵＶ  イルミネーターにのせスケールと共に写真を撮った。ブロッティングの方法は「クローニングとシークエンス」（農村文化社）に従い、２０ｘＳＳＰＥで、ＲＮＡをゲルからナイロンメンブレン（Ｎｅｗ  Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ  Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーした。１２時間後、メンブレンを、２ｘＳＳＰＥで５分間洗い、３時間室温で乾燥した後５分間ＵＶ照射してメンブレンにＲＮＡを固定した。
ハイブリダイゼーションの方法はサザン解析の場合と同様に行った。
結果を図１５に示す。図中のＷ．Ｔ．は野生型を示す。野生型（Ｗ．Ｔ．）のレーンにはバンドは検出されなかった。Ｎｏ．１とＮｏ．２のレーンには２．５ｋｂの大きさにメジャーなバンドが検出され、それより小さな位置にいくつかのバンドが検出された。
【００９２】
実施例９  （三価鉄還元酵素活性の確認）
ｒｅｆｒｅ１を遺伝子導入した形質転換体と野生型のタバコを、バーミキュライトに植え替えハイポネックス（Ｈｙｐｏｎｅｘ）を与えて育て、シュート（ｓｈｏｏｔ）が５ｃｍ〜１０ｃｍ位になったものを用いて三価鉄還元酵素活性を確認した。
三価鉄還元酵素活性の確認には、Ｆｅ（II）の強力なキレーターであるバソフェナンソロリンジスルホン酸（ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  （ＢＰＤＳ））  が、Ｆｅ（II）と複合体を形成することで赤色を呈することを利用した。分析用緩衝液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）にアガロースを０．４％になるように加え、電子レンジで溶解後、ある程度冷えてから１／１００  ｖｏｌ．の５００μＭ  Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡと１／１００ｖｏｌ．の５００μＭＢＰＤＳを加え、攪拌し容器に入れ、固まるまで待った。形質転換体と野生型のタバコのバーミキュライトを除いた後、根をゲルに寝かせアルミホイルで遮光して２７℃で２４時間静置した。
同様の実験を再生植物の種子から発芽させた２世代目の形質転換植物で行った。このときの反応時間は１時間とした。
【００９３】
分析用緩衝液（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）
０．２ｍＭ        ＣａＳＯ4
５．０ｍＭ        ＭＥＳ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ５．５
【００９４】
三価鉄還元酵素活性の確認の写真を図１６及び図１７に、２世代目の三価鉄還元酵素活性の確認の写真を図１８に示した。形質転換体の根圏での発色から三価鉄の還元が確認された。
【００９５】
0003920453.tif 000005
0003920453.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、植物の鉄分の吸収機構（Ｉ）を示すものである。
【図２】図２は、植物の鉄分の吸収機構（II）を示すものである。
【図３】図３は、高等植物におけるポリ（Ａ）付加の位置を示すものである。
【図４】図４は、酵母の遺伝子ＦＲＥ１のＧ及びＴがリッチな配列を示すものである。
【図５】図５は、Ｒｅｆｒｅ１の合成法の概念を示すものである。
【図６】図６は、ｒｅｆｒｅ１の合成に使用した３０本のプライマーの配列を示すものである。
【図７】図７は、ｒｅｆｒｅ１の配列と設定したプライマーとの関係を示すものである。
【図８】図８は、ｒｅｆｒｅ１の全長の作成方法を示すものである。
【図９】図９は、設計したｒｅｆｒｅ１の全配列を示すものである。
【図１０】図１０は、ＦＲＥ１（上段）とｒｅｆｒｅ１のＧ及びＴの含有量を連続する８塩基単位で計算してグラフ化したものである。
【図１１】図１１は、バイナリーベクターｐＲＦ１の構造を示すものである。
【図１２】図１２は、本発明の形質転換された植物の生育を示す写真である。
【図１３】図１３は、本発明の形質転換された植物の開花状況を示す写真である。
【図１４】図１４は、ｒｅｆｒｅ１をプローブとした形質転換体のサザンハイブリダイゼーションの結果を示すものである。左側はＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩの両者による消化の場合であり、右側はＨｉｎｄＩＩＩでの消化によるものである。Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１２は形質転換体であり、Ｗ．Ｔ．は野生型である。
【図１５】図１５は、ｒｅｆｒｅ１をプローブとした形質転換体のノーザンハイブリダイゼーションの結果を示すものである。Ｎｏ．１及びＮｏ．２は形質転換体を示し、Ｗ．Ｔ．は野生型である。
【図１６】図１６は、根における三価鉄還元酵素の活性を、Ｆｅ（II）によるＢＰＤＳ−Ｆｅ（II）複合体の赤い発色を示す写真である。左側は野生型であり、赤い発色はみられないが、右側の形質転換体の根では赤い発色が確認できる。
【図１７】図１７は、別の形質転換体を用いて図１６と同じ実験を繰り返した場合の写真であり、形質転換体（右側）に赤い発色が確認できる。
【図１８】図１８は、形質転換体の種から得られた２世代目を用いた根における三価鉄還元酵素の活性を、ＢＰＤＳ−Ｆｅ（II）複合体の赤い発色により示した写真である。形質転換体の２世代目（左側）にもＢＰＤＳ−Ｆｅ（II）複合体による赤い発色が確認できた。
【図１】
0003920453.tif 000028
【図２】
0003920453.tif 000029
【図３】
0003920453.tif 000030
【図４】
0003920453.tif 000031
【図５】
0003920453.tif 000032
【図６】
0003920453.tif 000033
【図７】
0003920453.tif 000034
【図８】
0003920453.tif 000035
【図９】
0003920453.tif 000036
【図１０】
0003920453.tif 000037
【図１１】
0003920453.tif 000038
【図１２】
0003920453.tif 000039
【図１３】
0003920453.tif 000040
【図１４】
0003920453.tif 000041
【図１５】
0003920453.tif 000042
【図１６】
0003920453.tif 000043
【図１７】
0003920453.tif 000044
【図１８】
0003920453.tif 000045