(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み合わされて接触活性を有する構造を生じるＶH及びＶLポリペプチド鎖をコードする、接触活性免疫グロブリンをコードする核酸を生産する方法であって、以下の工程、
（1）以下の工程（i）及び（ii）により、少なくとも103個の異なるＶH及びＶLをコードするＤＮＡを含有するＶH及びＶLコード遺伝子ライブラリーを別個に合成する工程、
（i）ＶH及びＶLコード遺伝子のレパートリーの鎖を分離する工程であって、前記各レパートリーが、二本鎖の核酸からなり、それぞれの鎖が、相補鎖にアニール化されたＶH及びＶLコード鎖を含有する工程であって、前記レパートリーが、触媒活性免疫グロブリンを誘導する抗原による免疫によって得られたものである工程、
（ii）前記分離された鎖を、第１及び第２のＶHポリヌクレオチド合成プライマーと、第１及び第２のＶLポリヌクレオチド合成プライマーとにより、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件の下で処理する工程であって、前記第１のＶHポリヌクレオチド合成プライマーのそれぞれが、前記ＶHコード鎖間において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、また、前記第２のＶHポリヌクレオチド合成プライマーが、前記相補鎖において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、前記第１のＶLポリヌクレオチド合成プライマーのそれぞれが、前記ＶLコード鎖間において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、また、前記第２のＶLポリヌクレオチド合成プライマーが、前記相補鎖において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、
前記プライマーが、前記ＶH及びＶLコード遺伝子レパートリーから、複数のＶH及びＶLコードＤＮＡの増幅をプライムすることができ、かつ前記処理によって、前記遺伝子ライブラリーを調製する工程、
（2）（i）前記ＶHコード遺伝子ライブラリーに由来する前記ＶHコード遺伝子と、前記ＶLコード遺伝子ライブラリーに由来する前記ＶLコード遺伝子とを、同一の発現ベクター中に、又は異なる発現ベクター中に結合して、該ＶHコード遺伝子及び前記ＶLコード遺伝子が、同一又は異なる発現ベクターに存在する発現ベクターを調製する工程、及び
（ii）前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換して、前記ＶHコード遺伝子及び前記ＶLコード遺伝子の共発現により、ＶH及びＶL鎖を有する免疫グロブリンを産生する工程、及び、
（3）前記触媒活性を有する、前記抗原に対するＶH及びＶL含有免疫グロブリンについて、前記ライブラリーをスクリーニングする工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記第１のＶHポリヌクレオチド合成プライマーが、免疫グロブリンＪH又はフレームワーク領域のヌクレオチド配列とハイブリダイズする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のＶHポリヌクレオチド合成プライマーが、ＶH免疫グロブリン遺伝子のフレームワーク、リーダー又はプロモーター領域にハイブリダイズする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
組み合わされて触媒活性を有する構造を生じるＶH及びＶLポリペプチド鎖をコードする、触媒活性免疫グロブリン核酸を産生する方法であって、以下の工程、
（1）以下の工程（i）及び（ii）により、少なくとも103個の異なるＶH及びＶLコードＤＮＡを含むＶH及びＶLコード遺伝子ライブラリーを別個に合成する工程、
（i）ＶH及びＶLコード遺伝子のレパートリーの鎖を分離する工程であって、前記各レパートリーが、二本鎖の核酸からなり、それぞれの鎖が、相補鎖にアニール化されたＶH及びＶLコード鎖を含有する工程であって、前記レパートリーが、触媒活性免疫グロブリンを誘導する抗原による免疫によって得られたものである工程、
（ii）前記分離された鎖を、第１及び第２のＶHポリヌクレオチド合成プライマーと、第１及び第２のＶLポリヌクレオチド合成プライマーとにより、ポリメラーゼ連鎖反応増幅に適した条件の下で処理する工程であって、前記第１のＶHポリヌクレオチド合成プライマーのそれぞれが、前記ＶHコード鎖間において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、また、前記第２のＶHポリヌクレオチド合成プライマーが、前記相補鎖において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、前記第１のＶLポリヌクレオチド合成プライマーのそれぞれが、前記ＶLコード鎖間において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、また、前記第２のＶLポリヌクレオチド合成プライマーが、前記相補鎖において保存された配列にハイブリダイズすることができる核酸配列を有し、
前記プライマーが、前記ＶH及びＶLコード遺伝子レパートリーから、複数のＶH及びＶLコードＤＮＡの増幅をプライムすることができ、かつ前記処理によって、前記遺伝子ライブラリーを調製する工程、
（2）前記ＶHコード遺伝子ライブラリーに由来する前記ＶHコード遺伝子と、前記ＶLコード遺伝子ライブラリーに由来する前記ＶLコード遺伝子とを、同一の発現ベクター中に、又は異なる発現ベクター中に結合して、該ＶHコード遺伝子及び前記ＶLコード遺伝子が、同一又は異なる発現ベクターに存在する発現ベクターを調製する工程であって、これによって、複数の異なるＶH及びＶL発現ベクターを形成する工程、及び
（3）前記発現ベクターと和合性の宿主細胞の集団を、複数の前記異なるＶH及びＶL発現ベクターで形質転換して、メンバーが前記ＶH及びＶL発現ベクターを含有する形質転換された宿主細胞集団を産生する工程、
（4）形質転換された集団を、ＶH及びＶLポリペプチド鎖の共発現する条件下で培養する工程、
（5）触媒活性を有する、前記抗原に対するＶH及びＶL含有免疫グロブリンの形質転換体による発現について、前記形質転換集団のメンバーを分析する工程、及び
（6）前記集団から、工程（5）で特定された形質転換体を分離して、もって、組み合わされて触媒活性を有する構造を生じるＶH及びＶLポリペプチド鎖をコードする、触媒活性免疫グロブリンコード核酸を産生する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記合成が、複数の異なる第１のポリヌクレオチド合成プライマーを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記発現ベクター分子が、線状ＤＮＡ発現ベクター分子である請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記発現ベクターが、ラムダZap II ＶH分子である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド合成プライマーが、予め選択された制限エンドヌクレアーゼ認識部位をコードする請求項２又は３に記載の方法。
【請求項９】
触媒活性を有するＶH及びＶL含有免疫グロブリンを産生する方法であって、以下の工程、
（1）請求項１に記載された方法によってＶH及びＶLポリペプチド鎖をコードする免疫グロブリンコード核酸遺伝子を単離した後に、該遺伝子を、適当な発現ベクターに、発現のために作動し得るように結合する工程、
（2）前記発現ベクターに和合性の宿主細胞を形質転換して、形質転換体を産生する工程、
（3）前記形質転換体を、核酸によってコードされる触媒作用性免疫グロブリン発現する条件の下で培養し、もって、前記触媒活性を有する前記免疫グロブリンを培地において産生させる工程、そして
（4）前記免疫グロブリンを、前記培地から分離する工程、
を含有することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
（関連分野）
本発明は所定の活性を有するレセプターをコードする遺伝子を単離する方法に関する。
（関連技術）
リガンドとレセプターの間の結合現象は生物系において多くの重要な役割を果している。このような現象の例にはオキシヘモグロビンを形成するデオキシヘモグロビンに対する酸素分子の結合およびたんぱく質とトリプシンのようなプロテアーゼのように基質とこれに作用する酵素の結合がある。さらに生物学的結合現象の例には抗体に対する抗原の結合およびいわゆるＣＲ１レセプターに対する補体要素Ｃ３の結合が含まれる。
また多くの薬剤や他の治療剤も結合現象に依存すると考えられる。たとえばモルヒネのような麻酔剤は脳の特定のレセプターに結合すると報告されている。麻酔剤アゴニストおよびアンタゴニストはそれらの結合部位をモルヒネのような薬剤と競合すると報告されている。
モルヒネやその誘導体などの人工の薬剤のようなリガンドやエンドルフィンおよびホルモンのような天然に生物系に存在するリガンドは生物系に天然に存在するレセプターと結合する。よってこれらは本明細書において一緒に扱かわれている。このような結合はたんぱく質がトリプシンやパパインのような酵素によって加水分解され、また脂肪がグリセリンと３つのカルボン酸に切断されるように特にアミドおよびエステル結合の加水分解を含む生物の多くの現象を導き得る。さらにこのような結合はたんぱく質および脂肪の形成におけるアミドおよびエステル結合形成を導くのと同様に、炭素−炭素結合および炭素−窒素結合の形成を導き得る。
脊椎動物における代表的レセプター生成系は免疫系である。哺乳類の免疫系は抗体の形でおそらく１．０×１０7以上のレセプター特異性を生成し得ることからもっとも多様な生物学的系の１つである。事実多くの現代的生物学的および医学的研究はこのレパートリーの開発を目差している。この十年間広範な免疫学的レパートリーの出力を利用する能力が劇的に増加した。コラー（kohler）およびミルスタイン（Milstein）によるハイブリドーマ法の開発はモノクローナル抗体すなわち免疫応答の間に誘導される抗体のレパートリーから単一の特異性をもつ抗体組成物を生産し得る。
不幸にもモノクローナル抗体を生成する現在の方法は特定の免疫原によって誘導される全ての抗体応答を有効に探索し得ない。個々の動物では、たとえばジニトロフェノールのような小さくて比較的堅い免疫原に対して特異的な抗体を生成し得る少なくとも５〜１０，０００種のＢ細胞クローンが存在する。さらに抗体の多様性の生成の際の体細胞変異過程のため、基本的に無限の特異的抗体分子が生成し得る。種々の抗体のこの巾広い潜在能力とは対照的に、一般に現在のハイブリドーマ法は融合当り数百個の各モノクローナル抗体しか生成しない。
ハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体生産の別の難点にはハイブリドーマ培養物の遺伝的不安定性および低い生産性がある。後者２つの問題を克服する１つの方法は目的とする特定のハイブリドーマ由来の免疫グロブリン産生遺伝子を原核性発現系にクローン化することである。たとえばロビンソン（Robinson）等、ＰＣＴ  ＷＯ８９／００９９；ウインター（Winter）等、ヨーロッパ特許出願第０２３９４００号；リーディング（Reading），Ｕ．Ｓ．特許第４，７１４，６８１号；およびキャビリー（Cabilly）等、ヨーロッパ特許出願第０１２５０２３号参照。
脊椎動物の免疫学的レパートリーには触媒活性を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子が含まれることが最近分った。トラモンタノ（Tramontano）等、Sci．２３４，１５６６−１５７０（１９８６）；ポラック（Pollack）等、Sci．，２３４，１５７０−１５７３（１９８６）；ジャンダ（Janda）等、Sci．，２４１，１１８８−１１９１（１９８８）；およびジャンダ（Janda）等、Sci．，２４４，４３７−４４０（１９８９）。化学反応を触媒し得る、すなわち酵素のような作用をし得る抗体分子の存在またはこれらを作るレパートリーを誘導する能力はほぼ２０年前Ｗ．Ｐ．ジェンクスによってすでに推測されていた（化学および酵素学における触媒作用、マグローヒル版、Ｎ．Ｙ．（１９６９））。
初期に免疫学的レパートリーからの触媒性抗体の単離に失敗した理由およびそれらの実際の発見から今日まで多くのものを単離することに失敗したことは望ましい活性に関するレパートリーの大部分をスクリーニングできないことにあると考えられている。別の理由は触媒作用とは反対に本質的に中和過程に参加するよう設計された高アフィニティー抗体の生産を指向するハイブリドーマ法のような現在使屠可能なスクリーニング技術の傾向にあると考えられている。
（本発明の簡単な説明）
本発明は所定の活性を有するレセプターをこれまで以上に広い保存的レセプターコード遺伝子レパートリーからスクリーニングする新しい方法を提供し、それにより先に述べたハイブリドーマ法の欠点を克服し得る。
１つの態様においては保存的レセプターコード遺伝子レパートリーの実質的部分を含む保存的レセプターコード遺伝子ライブラリーを合成する。好ましい態様においては保存的レセプターコード遺伝子ライブラリーは少なくとも約１０3種、好ましくは少なくとも約１０4種、そしてより好ましくは少なくとも約１０5種のレセプターコード遺伝子を含んでいる。
この遺伝子ライブラリーは出発物質に依存して２つの方法のいずれかにより合成し得る。
出発物質が多量のレセプターコード遺伝子であるときそのレパートリーに対し２つの別個のプライマー伸長反応を行った。第１のプライマー伸長反応はそのレパートリー内に保存されるヌクレオチド配列（多くの遺伝子に共有されている）にハイブリダイズすることにより第１反応を開始し得る第１ポリヌクレオチド合成プライマーを使用する。第１プライマー伸長は種々の保存的レセプターコードホモログや相補体（レパートリー中の遺伝子に相補的な核酸鎖）を生成する。
テンプレートとして相補体を用いた第２プライマー伸長反応は多くの異なる保存性レセプターコードＤＮＡホモログを生産する。第２プライマー伸長反応は多くの相補体に保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることにより第２反応を開始し得る第２ポリヌクレオチド合成プライマーを使用する。
出発物質が保存的レセプターコード遺伝子の多くの相補体である場合、そのレパートリーについて上述した第２プライマー伸長反応を行う。もちろんもし保存的レセプターコード遺伝子およびそれらの相補体のレパートリーが存在するなら両方法を組合せることができる。
保存的レセプターコードＤＮＡホモログ、すなわち所定のリガンドを結合し得るレセプターをコードする遺伝子がそのライブラリーから分離し単離遺伝子となる。一般にこれはそのライブラリーの種々の保存的レセプターコードＤＮＡホモログを発現するため発現ベクターに機能的に結合させることにより行なわれる。このようにして作ったレセプター発現ベクターを適合宿主細胞すなわち発現するようベクターに機能的に結合した遺伝子を発現し得る細胞に導入する。そのトランスホーマントをレセプターコードＤＮＡホモログをコードするレセプターを発現する条件下で培養する。このトランスホーマントをクローン化し、そのクローンを所定のリガンドを結合するレセプターの発現についてスクリーニングする。レセプターに対するリガンドの結合を検出するのに適した方法ならどれでも使用し得る。望ましい活性を発現するトランスホーマントはその集団から分離されその単離遺伝子を生産する。
別の態様において本発明は少なくとも約１０3、好ましくは少なくとも約１０4、より好ましくは少なくとも１０5の保存的レセプターコードＤＮＡホモログの単離混合物を含む遺伝子ライブラリーに関する。その多くは保存的抗原決定基を共有している。そのホモログはその生物学的活性を維持する水やリン酸緩衝液などのようなインビトロの取扱いに適した培地中に存在することが好ましい。
本発明は本方法で生産され、ここで述べているように好ましくはモノマーかダイマーの所定の活性、好ましくは触媒活性を有するレセプターにも関する。
（図式の簡単な説明）
図は本公開の一部を構成している。
第１図は基本的構造を示す免疫グロブリン分子の模式図である。重鎖の円形領域は可変領域（ＶH）を表わしており、その領域の生物学的活性（リガンド結合）部分を含むポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする遺伝子は本発明の方法で生産される。配列Ｌ０３，Ｌ３５，Ｌ４７およびＬ４８はどの既存のサブグループにも分類し得なかった。
第２Ａ図  ヒトＩgＧ（ＩgＧ１サブクラス）のＨ鎖の模式図。番号付けは左のＮ端から右のＣ端の方向である。各々約６０個のアミノ酸残基にまたがる鎖内ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）を含む４個のドメインの存在に注意せよ。記号ＣＨ０は炭水化物を意味している。重（Ｈ）鎖のＶ領域（ＶH）は３つの超可変ＣＤＲをもつ点でＶLに似ている。
第２Ｂ図  ヒトＫ鎖の模式図（パネル１）。番号付けは左のＮ端から右のＣ端への方向である。ＶLおよびＣLドメイン中ほぼ同数のアミノ酸残基にまたがる鎖内ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）に注意せよ。パネル２はＶLドメイン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）の位置を示している。ＣＤＲの外側のセグメントはフレームワークセグメント（ＦＲ）である。
第３図  ホスホリルコリンに特異的な１９個のマウスモノクローナル抗体のＶH領域のアミノ酸配列。ＨＰとはそのたんぱく質がハイブリドーマの産物であることを表わしている。その他はミエローマたんぱく質である（ギアハート（Gearhart）等、Nature，２９１，２９，１９８１より）。
第４図  ＦＩＴＣで免疫化したマウスの脾臓由来のｍＲＮＡのＰＣＲ増巾の結果を示している。レーンＲ１７〜Ｒ２４はユニークな５′プライマー（２〜９、第１表）および３′プライマー（１２、第１表）を用いた増巾反応に対応しており、Ｒ１６はイノシンを含む５′プライマー（１０、第１表）および３′プライマー（１２、第１表）を用いたＰＣＲ反応を示している。ＺおよびＲ９は増巾のコントロールである。コントロールＺはプラスミド（ＰＬＲ２）由来のＶHの増巾を示しまたＲ９はプライマー１１および１３（第１表）を用いた脾臓のｍＲＮＡの不変領域の増巾を示している。
第５図  ヌクレオチド配列はラムダＺＡＰ中のＰＣＲ増巾したＶH領域のｃＤＮＡライブラリー由来のクローンのものである。Ｎ末端の１１０塩基をリストした。下線のヌクレオチドはcDR1（相補的決定領域）を示している。
第６図  ラムダＺapIIＶH（パネルＡ）およびラムダＺapＶL（パネルＢ）発現ベクターを作製するためにラムダＺＡＰに挿入した合成ＤＮＡ挿入物の配列。ＶHおよびＶLコードＤＮＡホモログを発現するためにこのベクターに必要とされるものにはシャインダルガルノリボゾーム結合部位、モウバ（Mouva）等（J．Biol．Chem．,２５５，２７，１９８０）によって報告されている細胞周辺腔に発現たんぱく質を送り出すのに必要なリーダー配列および発現ベクターにＶHおよびＶLホモログを結合するのに用いる種々の制限酵素部位が含まれる。またＶH発現ベクター配列には可変領域重鎖（ＶHバックボーン）に典型的に見られるアミノ酸をコードする短かい核酸配列を含む。このＶHバックボーンはＸhoＩおよびＳpeＩに機能的に結合するＶHＤＮＡホモログと同様に直ぐ上流に正しい読み枠で存在する。ＶLＤＮＡホモログはＮcoＩおよびＳpeＩ制限酵素部位のところでＶL配列（パネルＢ）と機能的に結合しており、したがってＶHバックボーン領域はＶLＤＮＡホモログがＶLベクターに機能的に結合したとき欠失する。
第７図  細菌発現ベクターラムダＺapIIＶH（ＶH発現ベクター）の主要な特徴が示されている。第６図からの合成ＤＮＡ配列がラムダＺａｐII由来のＴ3ポリメラーゼプロモーターとともに上に示してある。ラムダＺapII中の挿入物の方向が示されている。ＶHＤＮＡホモログはＸhoＩおよびＳpeＩ制限部位に挿入され、転写により、クローニング部位の丁度３′側に位置するデカペプチドのエピトープ（ｔａｇ）を生成する。
第８図  細菌発現ベクターラムダＺapIIＶL（ＶL発現ベクター）の主要な特徴が示されている。第６図に示した配列はラムダＺapIIのＴ3ポリメラーゼプロモーターと一緒に上に示してある。ラムダＺap中の挿入物の方向が示してある。ＶLＤＮＡホモログはショート（short）等（Nucleic Acids Res．１６，７５８３−７６００，１９８８）によって報告されているインビボ切除操作によって作製されたファージミドに挿入される。ＶLＤＮＡホモログはこのファージミドのＮcoＩおよびＳpeＩクローニング部位に挿入する。
第９図  修正した細菌発現ベクターラムダＺapIIＶLII。このベクターは以下の合成ＤＮＡ配列：
0003992290.tif 000002
を予め制限酵素ＳacＩおよびＸhoＩで消化したラムダＺapIIに挿入する。この配列にはシャインタルガルノ配列（リボゾーム結合部位）、発現プラスミドを細胞周辺腔に送るリーダー配列およびこのベクターに提供されるＳacＩおよびＸbaＩ制限酵素部位にＶLＤＮＡホモログを機能的に結合させる適当な核酸配列が含まれる。
第１０図  ラムダＺapIIに挿入してラムダＶLII発現ベクターを作る合成ＤＮＡセグメントの配列。種々の特徴および制限エンドヌクレアーゼ認識部位が示してある。
第１１図  ＶHおよびＶLを発現するためのベクターが別々におよび合せて示してある。これらのベクターの種々の基本的要素が示してある。軽鎖ベクターあるいはＶL発現ベクターはＶH発現ベクターと合せて発現のために同じプロモーターと機能的に結合する両ＶHおよびＶLを含む組合せベクターを作製し得る。
第１２図  ＶHおよびＶLＤＮＡホモログを含む大腸菌から免疫沈殿した標識たんぱく質が示されている。レーン１にはＶHまたはＶLＤＮＡホモログを含まない大腸菌から免疫沈殿したバックグランドたんぱく質が示されている。レーン２にはＶHＤＮＡホモログのみを含む大腸菌から免疫沈殿したＶHたんぱく質が含まれている。レーン３および４ではＶHおよびＶLの両方のDNAホモログを含む大腸菌から免疫沈殿したＶHたんぱく質とＶLたんぱく質の共泳動の様子が示されている。レーン５にはＶHおよびＶLＤＮＡホモログから発現されるＶHたんぱく質とＶLたんぱく質の存在が２つの区別可能なたんぱく質種により示されている。レーン５にはマウス腹水中に存在する抗大腸菌抗体により免疫沈殿するバックグランドたんぱく質が含まれる。
第１３図  カルボキシアミド基質（式２）を加水分解する抗体を誘導する遷移状態アナログ（式１）。グルタリルスペーサーおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドリンカー付加物を含む式１の化合物はたんぱく質キャリヤーＫＬＨおよびＢＳＡにハプテンを結合させるのに用いられる形状である。一方式３の化合物はインヒビターである。ホスホナミデートの機能はアミド結合の加水分解の遷移状態の立体−電子的構造の模倣である。
第１４図  ＮＰＮで免疫化したマウスの脾臓mＲＮＡからのＦdおよびカッパ領域のＰＣＲ増巾を示している。増巾は軽鎖配列（第２表）または重鎖配列（第１表）の増巾に特異的なプライマーとｍＲＮＡの逆転写で得られるＲＮＡcＤＮＡハイブリッドを用い例１８で述べる方法で行った。レーンＦ１−Ｆ８は８個の５′プライマー（プライマー２−９、第１表）の１つおよびユニークな３′プライマー（プライマー１５、第２表）を用いた重鎖増巾反応の産物を示している。５′プライマー（プライマー３−６、および１２、第２表）および適当な３′プライマー（プライマー１３、第２表）を用いた軽鎖（ｋ）の増巾はレーンＦ９〜Ｆ１３に示してある。全てのレーンに見られる７００ｂｐのバンドはＦｄおよびｋ領域の増巾がうまく行ったことを示している。
第１５図  抗原結合に関するファージライブラリのスクリーニングが例１８Ｃに従って示されている。Ｆab（フィルターＡ，Ｂ），重鎖（フィルターＥ，Ｆ）および軽鎖（フィルターＧ，Ｈ）発現ライブラリーの二回のプラークリフトをプレート当り約３０，０００プラークの密度でＮＰＮと結合した125Ｉ標識ＢＳＡに対しスクリーニングした。フィルターＣおよびＤはテキスト中で議論しているように一次フィルターＡ（矢印）由来のコアのあるポジティブ体の２度にわたる二次スクリーニングを示している。
スクリーニングには標準的プラークリフト法を使用した。プラークで感染したＸＬ１ブルー細胞を１５０mmプレート上、３７℃で４時間インキュベートし、１０mＭイソプロピルチオガラクトシドに浸したニトロセルロースフィルターを重ねることによりたんぱく質の発現を誘導した後このプレートを２５℃で８時間インキュベートした。同じ条件を用いた２回目のインキュベーションの際に２枚のフィルターを得た。それからこれらのフィルターをＰＢＳ中１％のＢＳＡ溶液中１時間でブロックし、その後１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中ＮＰＮに結合した125Ｉ標識ＢＳＡ溶液（２×１０6cpm ml-1；ＢＳＡ濃度０．１Ｍ；ＢＳＡ分子当り約１５個のＮＰＮ）と２５℃で１時間振とうしながらインキュベーションした。バックグランドはストックの放射能標識ＢＳＡ溶液を１００，０００ｇ１５分間の予備遠心および挿入物のないファージを感染させた細菌を含むプレート由来のプラークリフトとこの溶液をプレインキュベーションすることにより減少した。標識後フィルターは一晩のオートラジオグラフの現像前にＰＢＳ／０．０５％トゥイーン２０でくり返し洗浄した。
第１６図  競合的阻害で示されるように抗原結合の特異性は例１８Ｃで示される。ポジティブプラークからのプラークリフトにインヒビターＮＰＮの濃度を漸次上げながら125Ｉ−ＢＳＡ−ＮＰＮを作用させた。
この実験で第１５図に見られるようなＮＰＮ結合に関連する多くのファージを細菌グランド上に直接スポットした（スポット当り約１００個）。それからこのプレートにＩＰＴＧ浸漬フィルターを重ね、２５℃で１９時間インキュベートした。標識溶液中に種々の濃度のＮＰＮを含めること以外は第１５図について先に述べた方法と同様に125Ｉ−ＢＳＡ−ＮＰＮ中でのインキュベーション前にＰＳＢ中１％ＢＳＡ中でフィルターをブロックした。他の条件および操作は第１５図と同様である。中程度のアフィニティーをもつファージの結果は図に２つづつ示してある。同様の結果が有効インヒビター濃度範囲にいくらか差がある他の４つのファージについても得られている。
第１７図  例１８Ｄに従がい抗原結合たんぱく質の特性が示されている。濃縮し部分的に精製したＮＰＮ結合クローンの細菌上清をゲル濾過で分離し各フラクションからの一部を、ＢＳＡ−ＮＰＮでコートしたマイクロプレートに入れた。アルカリホスファターゼに結合した抗デカペプチド（−−−）または抗カッパ鎖（―）抗体のいずれかを添加後発色させた。矢印は既知のＦabフラグメントの溶出位置を示している。この結果は抗原結合が重鎖および軽鎖の両方を含む５０ｋＤたんぱく質の性質であることを示している。
２個のＮＰＮポジティブクローンの単一プラーク（第１５図）をピックアップし重鎖および軽鎖挿入物を含むプラスミドを切り出した（１９）。Ｌ培地５００ml培養物に切り出したプラスミドを含む飽和培養物３mlを接種し、３７℃で４時間インキュベートした。最終濃度が１mＭとなるようにＩＰＴＧを添加したんぱく質の誘導を行ない、その培養物を２５℃で１０時間インキュベートした。細胞上清２００mlを２mlにまで濃縮し、ＴＳＫ  Ｇ４０００カラムにかけた。溶出フラクションの５０μｌをELISAで検定した。
ＥＬＩＳＡ分析ではマイクロプレートをＢＳＡ−ＮＰＮ１μｇ／mlでコーティングし、５０μｌのサンプルを５０μｌのPBS−−トゥイーン２０（０．０５％）−ＢＳＡ（０．１％）と混ぜたものを添加した後このプレートを２５℃で２時間インキュベートする。ＰＢＳ−トゥイーン２０−ＢＳＡで洗浄後、適当な濃度のアルカリホスファターゼと結合したウサギ抗デカペプチド抗体（２０）およびヤギ抗マウスカッパ軽鎖（サウザンバイオテク）溶液５０μｌを加え、２５℃で２時間インキュベートした。さらに洗浄後、５０μｌのＰ−ニトロフェニルホスフェート（５０mＭ MgCl2を含む０．１Ｍトリス（pＨ９．５）中１mg／ml）を加え、そのプレートを１５〜３０分間インキュベートしてから４０５nmのＯＤを測定する。
第１８図  選択可能なＶH発現ベクターを作るためにラムダＺapIIＶHに挿入し（パネルＡ）また選択可能なＶL発現ベクターを作るために例１７に従ってラムダＺapIIＶLに挿入する（パネルＢ）合成ＤＮＡ挿入物の配列。
第１９図
（Ａ）選択可能なＶL発現ベクターの主要な特徴をパネルＡに示す。第１８図Ａの合成ＤＮＡ配列の特徴をラムダＺapIIのＴ3ポリメラーゼプロモーターと一緒に上に示した。ラムダＺapII中の挿入物の方向も示してある。ＶHＤＮＡホモログはＸhoＩおよびＳpeＩ制限酵素部位に挿入してある。ＶHＤＮＡホモログはＸhoＩおよびＳpeＩ部位に挿入してあり、その転写はクローニング部位の丁度３′側に位置するデカペプチドエピトープ（ｔａｇ）を生成する。
（Ｂ）細菌発現ベクターラムダＺapIIＶH（ＶH発現ベクター）の主要な特徴を示す。第６図の合成ＤＮＡ配列はラムダＺapIIのＴ3ポリメラーゼプロモーターと一緒に上に示してある。ラムダＺapII中の挿入物の方向も示してある。ＶHＤＮＡホモログはＸhoＩおよびＳpeＩ制限酵素部位に挿入されている。ＶHＤＮＡはＸhoＩおよびＳpeＩ部位に挿入されており、その転写はクローニング部位の丁度３′側に位置するデカペプチドエピトープ（ｔａｇ）を生成する。
第２０図  ＶHおよびＶLの発現を組合せたベクターの１つを示している。これらのベクターの種々の基本的要素が示されている。選択マーカー（ＳupＦ）も示されている。
（本発明の詳細な説明）
Ａ．定義
ヌクレオチド：  糖（ペントース）、リン酸および窒素複素環塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡの単量体ユニット。塩基は糖にグリコシド結合で結合しておりこの塩基と糖の組合せ物はヌクレオシドと呼ばれる。ヌクレオシドがペントースの３′または５′位にリン酸基を含んでいるときこれをヌクレオチドと呼ぶ。
塩基対（ｂp）：  二本鎖ＤＮＡ分子中のアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の対。ＲＮＡではチミンの代りにウラシルが用いられている。
核酸：  一本鎖または二本鎖のヌクレオチドのポリマー。
遺伝子：  そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペプチドをコードしている核酸。
相補的塩基：  ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖構造をとる時に通常対を作るヌクレオチド。
相補的ヌクレオチド配列：  一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡに相補的で最終的に水素結合で特異的にこれにハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌクレオチド配列。
保存的：  所定の配列の相補体に非ランダム的にハイブリダイズする場合そのヌクレオチド配列は所定の配列に対し保存的である。
ハイブリダイゼーション：  相補的塩基対間に水素結合ができる二重鎖またはヘテロ二重鎖を形成する実質的に相補的なヌクレオチド配列の対合。それは競合的に阻害され得る２つの相補的ポリヌクレオチド間の特異的、すなわち非ランダムの相互作用である。
ヌクレオチドアナログ：  構造的にＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃ，またはＵと異なるが核酸分子中で正しいヌクレオチドと置き換われるほど類似しているプリンまたはピリミジンヌクレオチド。
ＤＮＡホモログ：  所定の保存的ヌクレオチド配列および所定のリガンドを結合し得るレセプターをコードする配列を有する核酸。
抗体：  本明細書で使用している種々の文法型の“抗体”という言葉は免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子を意味する。代表的抗体分子には本来の免疫グロブリン分子、実質的免疫グロブリン分子およびＦab、Ｆab′、Ｆ（ab′）2およびＦ（ｖ）として知られている領域を含む免疫グロブリン分子の一部分が含まれる。
抗体結合部位：  抗体結合部位とは抗原と特異的に結合（免疫反応）する重鎖および軽鎖の可変および超可変領域を含む抗体分子の構造領域である。種々の文法型の免疫反応という語句は抗原決定基含有分子と抗体分子またはその一部分のような抗体結合部位を含む分子との間の特異的結合を意味する。
モノクローナル抗体：  種々の文法型で用いられるモノクローナル抗体という語句は特定の抗原と免疫反応し得る抗体結合部位を唯一種しか持たない抗体分子群を意味する。したがってモノクローナル抗体は一般にそれが免疫反応を起こす抗原に対する唯一の結合アフィニティーを示す。それゆえモノクローナル抗体には種々の抗原に各々免疫特異性を示す複数の抗体結合部位をもつ抗体分子、たとえば二特異的モノクローナル抗体も含まれる。
Ｂ．方  法
本発明は保存的遺伝子のレパートリーから所定の活性、好ましくは触媒活性を有するレセプターをコードする遺伝子を単離する方法に関する。このレセプターとしてはポリペプチドでも、トランスファＲＮＡ、酵素活性を示すＲＮＡなどのＲＮＡでもよい。このレセプターは酵素、抗体分子またはその免疫学的に活性な部分、細胞レセプター、もしくは保存的遺伝子、すなわち長さが少なくとも１０ヌクレオチドの保存的ヌクレオチド配列を含む遺伝子群の１つによってコードされる細胞粘着たんぱく質などのポリペプチドであることが好ましい。
代表的保存的遺伝子群には免疫グロブリン、クラスＩまたはIIの主要組織適合性複合体抗原、リンパ球レセプター、インテグリンなどをコードするものがある。
いくつかの方法を用いて保存的遺伝子のレパートリーに属する遺伝子を同定し得る。たとえば単離した遺伝子を低ストリンジェンシー条件下ハイブリダイゼーションプローブとして用いるサウザン（Southern）,J．Mol．Biol．９８，５０３（１９８５））の方法によりゲノムＤＮＡ中に存在する保存的遺伝子のレパートリーの他のメンバーを検出することができる。もしハイブリダイゼーションプローブとして用いた遺伝子が多重制限エンドヌクレアーゼフラグメントにハイブリダイズしたなら、その遺伝子は保存的遺伝子のレパートリーの１員である。
（免疫グロブリン）
免疫グロブリンまたは抗体分子はＩgＤ，ＩgＧ，ＩgＡ，ＩgＭおよびＩgＥなどいくつかの型の分子を含む非常に大きな分子群である。一般に抗体分子は２本の重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）からなり各鎖には可変（Ｖ）および不変（Ｃ）領域が存在する。免疫グロブリンのくつかの領域には免疫グロブリンのレパートリーを単離するのに有効な保存的配列が含まれている。代表的保存的配列を示すアミノ酸および核酸配列データは免疫グロブリン分子に関してカバット（Kabat）等によって編集されている（“免疫学的に興味のあるたんぱく質の配列”National Institute of Health，ベセスダ，ＭＤ，１９８７）。
Ｈ鎖のＣ領域は特定の免疫グロブリン型を決定する。それゆえ、Ｈ鎖のＣ領域から、ここで定義されているような保存的配列を選択すれば選択したＣ領域の免疫グロブリン型のメンバーを有する免疫グロブリン遺伝子のレパートリーが調製される。
一般にＨまたはＬ鎖のＶ領域には４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が含まれ、各々は保存配列を含む比較的低い可変性を含んでいる。ＶH鎖のＦＲ１およびＦＲ４（Ｊ領域）フレームワーク領域由来の保存的配列の使用は好ましい代表的態様であり、例で取り上げている。一般にフレームワーク領域はいくつかまたは全ての免疫グロブリン型に保存されており、したがってここに含まれる保存的配列はいくつかの免疫グロブリン型を有するレパートリーの調製には特に適している。
（主要組織適合性複合体）
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）はクラスＩ、クラスIIまたはクラスIIIＭＨＣ分子と呼ばれる数クラスの分子を含む広いたんぱく質群をコードする大きな遺伝子座である。ポール（Paul）等、基礎免疫学、レーベンプレス版、ＮＹ，pp．３０３−３７８（１９８４）。
クラスＩＭＨＣ分子はその抗原が重鎖と非ＭＨＣコード軽鎖からなる保存的群を示す移植抗原の多型グループである。その重鎖にはＮ，Ｃ１，Ｃ２、メンブレンおよび細胞質領域と呼ばれるいくつかの領域が含まれる。本発明に有用な保存的配列は主にＮ，Ｃ１およびＣ２領域に見られ、カバット（Kabat）等（上述）の報告では“不変残基”の連続的配列と呼ばれている。
クラスIIＭＨＣ分子にはアルファおよびベータ鎖からなり、免疫応答に関与する多型的抗原の保存的群が含まれる。各々アルファおよびベータ鎖をコードする遺伝子にはＭＨＣクラスIIアルファまたはベータ鎖のレパートリーを生産するのに適している保存的配列が含まれている。代表的保存的ヌクレオチド配列にはＡ１領域のアミノ酸残基２６〜３０、Ａ２領域の残基１６１−１７０およびメンブレン領域の残基１９５〜２０６、アルファ鎖の全てをコードするものが含まれる。また保存的配列は、各々アミノ酸残基４１〜４５、１５０〜１６２および２００〜２０９をコードするヌクレオチド配列であるベータ鎖のＢ１，Ｂ２およびメンブレン領域中に存在する。
（リンパ球レセプターおよび細胞表面抗原）
リンパ球にはＴ細胞レセプター、Ｔhy-１抗原およびモノクローナル抗体ＯＫＴ４（leu３）、ＯＫＵＴ５／８（leu２）、ＯＫＵＴ３、ＯＫＵＴ１（leu１）、ＯＫＴ１１（leu５）、ＯＫＴ６およびＯＫＴ９によって限定される抗原を含む多くのＴ細胞表面抗原を含む細胞表面上の何種類かのたんぱく質群が含まれる。ポール（Paul）、上述、pp．４５８−４７９。
Ｔ細胞レセプターとはＴ細胞表面に存在する一群の抗原結合分子に対して用いられる語句である。一群としてのＴ細胞レセプターはその多様性において免疫グロブリンと同様の多型的結合特異性を示す。成熟Ｔ細胞レセプターはアルファおよびベータ鎖からなりその各々は可変（Ｖ）および不変（Ｃ）領域を有している。Ｔ細胞レセプターが遺伝子組織および機能においてもつ免疫グロブリンに対する類似性は、Ｔ細胞レセプターが保存的配列の領域を含んでいることを示している。ライ（Lai）等、Nature、３３１,５４３−５４６（１９８８）。
代表的保存的配列にはアルファ鎖のアミノ酸残基８４〜９０、ベータ鎖のアミノ酸残基１０７〜１１５およびガンマ鎖のアミノ酸残基９１〜９５および１１１〜１１６をコードする配列が含まれる。カバット（Kabat）等、上述、p．２７９。
（インテグリンおよび粘着）
細胞粘着に関する粘着性たんぱく質はインテグリンと呼ばれる大きな関連たんぱく質群のメンバーである。インテグリンはべータおよびアルファサブユニットからなるヘテロダイマーである。インテグリン群のメンバーには細胞表面糖たんぱく質血小板レセプターＧｐIIｂ−IIIａ、ビトロネクチンレセプター（ＶnＲ）、フィブロネクチンレセプター（ＦnＲ）および白血球粘着レセプターＬＦＡ−１，Ｍac−１、Ｍo−１および６０．３が含まれる。ローサチ（Roushahti）等、Science，２３８，４９１−４９７（１９８７）。核酸およびたんぱく質配列データはこれらの群のメンバー中、特にＧｐIIｂ−IIIａＶnＲおよびＦnＲのベータ鎖、およびＶnＲ，Ｍac−１，ＬＦＡ−１，ＦnrおよびＧｐIIｂ−IIIａのアルファサブユニットに保存的配列領域が存在することを示している。スズキ（Suzuki）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，８３．８６１４−８６１８，１９８６；ギンスバーグ（Ginsberg）等、J．Biol．Chem．２６２，５４３７−５４４０，１９８７。
以下の議論は本発明の方法が免疫グロブリン遺伝子レパートリーから保存的レセプターコード遺伝子を単離するのに使用し得ることを示している。この議論は制限するものでなく機能的に関連するレセプターをコードする保存的遺伝子群から１つの遺伝子を単離するのに使用し得る原則の応用を示すものである。
一般にこの方法は以下の要素を合せ持っている。
1．  免疫学的レパートリーの実質的部分を含む核酸の単離。
2．  免疫グロブリンＶHおよび、またはＶL領域遺伝子を含むポルヌクレオチドセグメントをクローニングするためのポリヌクレオチドプライマーの調製。
3．  レパートリーからの複数の異なるＶHおよびＶL遺伝子を含む遺伝子ライブラリーの調製。
4．  別個でも同じ細胞中でもよいし、かつ同じ発現ベクターでも異なるベクターによってもよい、原核または真核性の適当な宿主におけるＶHおよび、またはＶLポリペプチドの発現。
5．  所定の活性に関する発現ポリペプチドのスクリーニングおよびスクリーニング過程で同定されるＶHおよび、またはＶLコード遺伝子の分離。
本発明によって生産されるレセプターは競合的に阻害され得ることで示されている抗原、酵素基質などに特異的な結合部位をもつ構造を有している。ある態様において、本発明のレセプターは所定の抗原に特異的に結合しその抗原と単離される複合体の結合部位の間に十分強い結合をもつ複合体を形成する抗原結合部位を形成するリガンド結合ポリペプチドである。レセプターが抗原結合ポリペプチドであるときそのアフィニティーは一般に１０5Ｍ-1以上であり、通常は１０6以上であり好ましくは１０8Ｍ-1以上である。
別の態様において本発明のレセプターは基質と結合し、その基質から産物を形成する。触媒性レセプターのリガンド結合部位のトポロジーが所定の活性に関しその基質へのアフィニティー（会合定数、pＫa）よりもより重要であるだろうが一方本触媒性レセプターは所定の基質に対し一般に１０3Ｍ-1以上、通常１０5または１０6Ｍ-1以上で好ましくは１０7Ｍ-1以上の会合定数を有している。
本発明によって産生されるレセプターはヘテロ二量体であり、それゆえ通常各ポリペプチド単独、すなわちモノマーのアフィニティーまたは会合定数とは異なり好ましくは高くなる所定の基質に対する結合アフィニティーまたは会合定数を有する構造を共に有している２つの異なるポリペプチド鎖から成っていることが好ましい。異なるポリペプチド鎖の１つまたは両方は免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域に由来する。典型的に軽鎖（ＶL）および重鎖（ＶH）の可変領域からなるポリペプチドは所定のリガンドの結合に一緒に使用される。
本発明によって産生されるレセプターは単量体同様多量体でも、ホモ体でもヘテロ体でも活性であるがヘテロ二量体が好ましい。たとえば、本発明で産生されるＶHおよびＶLリガンド結合ポリペプチドはうまくヘテロ二量体を形成しヘテロ二量体の活性を調節し得るし、またはヘテロ二量体にユニークな活性を生成し得る。個々のリガンド結合ポリペプチドはＶHおよびＶLと呼びまたヘテロ二量体はＦｖと呼ぶ。
しかし、ＶH結合ポリペプチドはＶHに加えて実質的に全ての、または一部の重鎖不変領域を含んでいる。ＶL結合ポリペプチドはＶLに加えて、実質的に全ての、または一部の軽鎖不変領域を含んでいる。重鎖不変領域の一部を含むＶH結合ポリペプチドと実質的に全ての軽鎖不変領域を含むＶL結合ポリペプチドからなるヘテロ二量体はＦabフラグメントと呼ばれる。Ｆabの生産はＦｖと比較されるようにＦab中に含まれる付加的不変領域配列がＶHおよびＶLの相互作用を安定化し得ることからある状況では有利となり得る。このような安定化はＦabに抗原に対するより高いアフィニティーを提供し得る。さらにＦabは当分野でより一般的に使用されており、従ってＦabを特異的に認識するのに使用可能な市販の抗体もある。
個々のＶHおよびＶLポリペプチドは一般に約１２０アミノ酸残基よりも小さく、一方一般に６０アミノ酸残基以上で、通常には約１００アミノ酸残基以上である。ＶHは約１１０〜約１２５アミノ酸残基長であることが好ましく一方ＶLは約９５〜約115アミノ酸残基長であることが好ましい。
アミノ酸残基配列は関連する特定のイデォオタイプにより巾広く変化する。通常、約６０〜７５アミノ酸残基で隔てられジスルフィド結合で結合している少なくとも２つのシステインが存在する。本発明で産生されるポリペプチドは通常免疫グロブリンの重鎖および、または軽鎖の可変領域のイディオタイプの実質的コピーであるがある状況ではポリペプチドは望ましい活性に改善するためアミノ酸残基配列にランダム突然変異を含んでいる。
ある状況ではＶHおよびＶLポリペプチドに共有結合による架橋を提供することが望ましく、このことはカルボキシル末端にシステイン残基を提供することで行なわれる。このポリペプチドは通常免疫グロブリン不変領域を含まないように調製するが、DNA合成プライマーの有利な選択に基づき少量のＪ領域が含まれることがある。通常Ｄ領域がＶHの転写物に含まれる。
別の状況ではＶLおよびＶHを結合するペプチドリンカーを提供し、ＶHおよびＶLからなる一本鎖抗原結合たんぱく質を形成することが望ましい。この一本鎖抗原結合たんぱく質は単一たんぱく質鎖として合成される。このような一本鎖抗原結合たんぱく質はバード（Bird）等（Science，２４２，４２３−４２６（1988））によって報告されている。適当なペプチドリンカー領域の設計はロバート・ランドナー（Robert Landner）により米国特許第4,704,692号に報告されている。
このようなペプチドリンカーは発現ベクターに含まれる核酸配列の一部として設計し得る。このペプチドリンカーをコードする核酸配列はＶHおよびＶLＤＮＡホモログの間にあり、発現ベクターにＶHおよびＶLＤＮＡホモログを機能的に結合させるのには制限エンドヌクレアーゼ部位が使用される。
またこのようなペプチドリンカーは種々の遺伝子ライブラリーを調製するのに用いるポリヌクレオチドプライマーの一部である核酸配列にコードし得る。このペプチドリンカーをコードする核酸配列は遺伝子ライブラリーを作るのに使用するいくつかのポリヌクレオチドプライマーに付随する核酸配列に由来するペプチドリンカーをコードする核酸配列またはプライマーの１つに結合する核酸から作り得る。
一般にＶHおよびＶLポリペプチドのＣ端領域はＮ端よりも配列の多様性が大きく、また本戦術に基づき、天然のＶHおよびＶL鎖を変化させるよう修正できる。また、合成ポリヌクレオチドを用い超可変領域の１つ以上のアミノ酸を変化させ得る。
1．レパートリーの単離
免疫学的遺伝子レパートリーの実質的部分を含む核酸の組成物を調製するためＶHおよび、またはＶLポリペプチドをコードする遺伝子源が必要である。その遺伝子源は異種の抗体産生細胞群、すなわちリンパ球（Ｂ細胞）、好ましくは脊椎動物の循環器系または脾臓に存在するような転位Ｂ細胞群であることが好ましい（転位Ｂ細胞とは免疫グロブリン遺伝子の転座すなわち転位が起った細胞でこれは隣接して存在する免疫グロブリン遺伝子Ｖ，ＤおよびＪ領域転写物を含むｍＲＮＡの存在で証明される）。
ある場合に核酸源として種々の年令、健康および免疫応答の脊椎動物由来の細胞（ソース細胞）を使用することによるなど所定の活性についてそのレパートリーをふり分けることが望ましい。たとえば転位Ｂ細胞採集前に健康な動物を反復し免疫化すると高アフィニティーのリガンド結合ポリペプチドを産生する遺伝物質に富んだレパートリーが得られる。逆に、その免疫系が最近チャレンジを受けていない健康な動物由来の転位Ｂ細胞の採集は高アフィニティＶHおよび、またはＶLポリペプチドの産生にバイアスがかかっていないレパートリーが生成する。
核酸を得るための細胞集団の遺伝的異種性が大きければ大きいほど本発明の方法に従がうスクリーニングに使用し得る免疫学的レパートリーの多様性も大きくなることに注意しなければならない。したがって種々の個体からの細胞、特に免疫学的に有意な年令差のある細胞および種々の株、種族または種由来の細胞をうまく組合せてそのレパートリー異種性を高めることができる。
このように好ましい態様においてソース細胞は脊椎動物、好ましくはそれに対する活性が求められている抗原性リガンドすなわち所定の抗原で免疫化または部分的に免疫化した哺乳類から得られる。免疫化は従来のように行った。動物中の抗体濃度は目的とするレパートリーの豊富さに従がう望ましい免疫化段階を測定することによりモニターし得る。一般的に部分的免疫化を行った動物は１回の免疫化のみが行なわれ、その細胞を応答が検出された直後に採集する。十分に免疫化した動物は最高値を示し、このことは宿主動物に通常２〜３週間間隔で１回以上の注射をくり返すことで得られる。通常、最後の注射後３〜５日目にその脾臓を取り出し、その約９０パーセントが転位Ｂ細胞である脾細胞の遺伝的レパートリーを標準法で単離する。Current Protocols in Molecular Biology、オースベル（Ausubel）等、編、ジョンウィリー・アンド・サン社版、ＮＹ，ＶHおよびＶLポリペプチドをコードする核酸はＩgＡ，ＩgＤ、ＩgＥ、ＩgＧまたはＩgＭ、最も好ましくはＩgＭおよびＩgＧ産生細胞から誘導し得る。免疫グロブリン可変遺伝子を多様性集団としてクローニングし得るゲノムＤＮＡのフラグメントの調製法はよく知られている。たとえば、ハーマン（Herrmann）等、Methods in Enzymol．１５２，１８０−１８３（１９８７）；フリッシャウフ（Frischauf）Methids in Enzymol．１５２，１８３−１９０（１９８７）、フリッシャウフ（Frischauf），Mothods in Enzymol．１５２，１９０−１９９（１９８７）、およびジレラ（Dilella）等、Methods in Enzymol．１５２，１９９−２１２（１９８７）参照。（ここで引用している参考文献中の事項は参考として提示されている）。
望ましい遺伝子レパートリーは可変領域の転写物を示すメッセンジャーＲＮＡまたは可変領域を発現する遺伝子を含むゲノムから単離し得る。他の非転位Ｂリンパ球由来のゲノムＤＮＡを用いる際の困難はイントロンで分離されている可変領域コード配列を並置することにある。適正なエクソンを含むＤＮＡフラグメントを単離し、イントロンを切除し、さらにエクソンを正しい順序で正しい方向にスプライスしなければならない。多くの場合このことは困難であり、その結果転位Ｂ細胞を用いる別の方法はＣ，ＤおよびＪ免疫グロブリン遺伝子領域が隣り合うよう転位するような方法であり、この方法によりその配列は全可変領域に関して連続的となる（イントロンなし）。
ｍＲＮＡを用いる場合、細胞をＲＮase阻害条件下で溶解する。１つの態様における第１ステップはオリゴｄＴセルロースカラムへのハイブリダイゼーションによる全細胞ｍＲＮＡの単離である。重鎖および、または軽鎖ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの存在は、適当な遺伝子の一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより検定し得る。ＶHおよびＶLの不変領域をコードする配列をポリヌクレオチドプローブとして用いると便利であり、その配列は使用可能なものから得ることができる。たとえばアーリー（Early）およびブード（Hood），Genetic Engineering，セットロ（Setlow）およびホレンダー（Hollaender）編、第３巻、プレナムパブリッシングコーポレーション，ＮＹ，（１９８１），pp．１５７−１８８、およびカバット（Kabat）等、“免疫学的に興味のある配列”、National Institute of Health，ベセスダ、ＭＤ（１９８７）参照。好ましい態様においてまず細胞性ｍＲＮＡについてＶHおよびＶLコードｍＲＮＡを濃縮する。一般に濃縮は全ｍＲＮＡ調製物またはその部分精製ｍＲＮＡを本発明のポリヌクレオチド合成プライマーを用いたプライマー伸長反応にかけることにより行なわれる。
2．ポリヌクレオチドプライマーの調製
プライマー、プローブおよびプライマー伸長により合成される核酸フラグメントまたはセグントに関し本明細書で用いている“ポリヌクレオチド”という言葉は２つ以上、好ましくは３つ以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからなる分子を意味する。その正確な大きさは多くの因子に依存しまたその事自体が使用する条件に依存する。
本明細書で用いている“プライマー”という語は核酸の制限消化物から精製される場合も合成的に作られる場合もある核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチドおよび重合に必要なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの試薬の存在下および適当な温度およびpＨに置かれたときに合成の開始点として働き得るポリヌクレオチドを意味する。効率が最高となるためにはこのプライマーは一本鎖であることが好ましいが二本鎖でもよい。もし二本鎖ならプライマーをまず伸長反応に使うまえに鎖を解離しておく。このプライマーはポリデオキシリボヌクレオチドであることが望ましい。プライマーは重合用の試薬の存在下伸長反応物の合成を開始するのに十分な長さ長さをもっていなければならない。プライマーの正しい長さは温度およびプライマーの起源などを含む多くの因子に依存する。たとえば標的配列の複雑性に依存して通常ポリヌクレオチドプライマーは１５〜２５以上のヌクレオチドを含むがより少ないヌクレオチドからなることもある。一般に短かいプライマー分子はテンプレートと十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。
ここで使用されるプライマーは合成もしくは増巾される各特異的配列をもつ鎖に“実質的に”相補的となるよう選択される。このことはそのプライマーが各々のテンプレート鎖に非ランダムにハイブリダイズするのに十分な相補性を有していなければならない。それゆえ、このプライマー配列はテンプレートの配列を正確に反映しているものではない。たとえば非相補的ヌクレオチドフラグメントも、そのプライマー配列の別の部分がその鎖に実質的に相補的であるならそのプライマーの５′末端に結合し得る。
一般にこのような非相補的フラグメントはエンドヌクレアーゼ制限部位をコードしている。別にもしプライマー配列が合成または増巾される鎖の配列と実質的に相補的でそれと非ランダム的にハイブリダイズし、それによりポリヌクレオチド合成条件下伸長産物を形成するなら非相補的塩基またはより長い配列はそのプライマー中に点在し得る。
ポリヌクレオチドプライマーはたとえばホスホトリエステルまたはホスホジエステル法など適当な方法で調製し得る（ナラング（Narang）等、Meth．Enzymol．６８，９０（１９７９）；米国特許第4,356,270号およびブラウン（Brown）等、Meth．Enzymol．６８，１０９（１９７９））。
プライマーのヌクレオチド配列の選択は目的とするレセプターをコードする領域からの核酸における距離、使用する第２プライマーに対する核酸上のハイブリダイゼーション部位、それがハイブリダイズするレパートリー中の遺伝子の数などの因子に依存する。
たとえばプライマー伸長によりＶHコードＤＮＡホモログを作るため、プライマーのヌクレオチド配列は機能性（結合し得る）ポリペプチドが得られるようにＶHコード領域に実質的に隣接する部位で多数の免疫グロブリン重鎖遺伝子とハイブリダイズするように選択する。多種類のＶHコード核酸配列とハイブリダイズするにはプライマーは種々の鎖内に保存されているヌクレオチド配列に実質的に相補的でなければならない。このような部位には不変領域、可変領域フレームワーク領域、好ましくは第３フレームワーク領域、リーダー領域、プロモーター領域、Ｊ領域などに含まれるヌクレオチド配列がある。
モシＶHコードおよびＶLコードＤＮＡホモログをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）増巾で生成する場合、増巾する核酸の各コード鎖用に２つのプライマーが用いられる。第１プライマーはナンセンス（マイナスまたは相補）鎖の一部であり、レパートリー内のＶH（プラス）鎖に保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ＶHコードＤＮＡホモログを生成するためには第１プライマーを選んで免疫グロブリン遺伝子のＪ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域またはＣＨ３領域内に保存される領域にハイブリダイズ（すなわち相補的である）させる。ＶLコードＤＮＡホモログを生成するためには第１プライマーを選んで免疫グロブリン軽鎖遺伝子のＪ領域または不変領域内に保存される領域にハイブリダイズ（すなわち相補的）させる。第２プライマーはコード（プラス）鎖の一部でありマイナス鎖に保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ＶHコードDNAホモログを生成するためには第２プライマーを選んでリーダ領域または最初のフレームワーク領域をコードする領域内のようなＶHコード免疫グロブリン遺伝子の５′端に保存されるヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。ＶHおよびＶLコードＤＮＡホモログ両方の増巾には第２プライマーの保存的５′側ヌクレオチド配列はロー（Loh）等により報告されている方法により（Sci．243，２１７−２２０（１９８９））外から付加した配列に相補的であることに注意せよ。第１および第２プライマーのいずれかまたは両方はエンドヌクレアーゼ制限部位を示すヌクレオチド配列を含み得る。この部位は増巾される免疫グロブリン遺伝子とは異なり得て一般にそのプライマーの５′末端またはその近傍にある。
また本発明のプライマーはＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーターまたはその相補配列を含む。たとえばクリーグ（Krieg）等、Nucleic Acids Res．１２，７０５７−７０（１９８４）；スタジア（Studier）等、J．Mol．Biol．１８９，１１３−１３０（１９８６）；およびモレキュラークローニング；ラボラトリーマニュアル、第２編、マニアチス（Maniatis）等編、コールドスプリングハーバー、ＮＹ（１９８９）参照。
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むプライマーを用いるときそのプライマーは増巾するポリヌクレオチド鎖にハイブリダイズし、かつＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの第２のポリヌクレオチド鎖は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメントなどの誘導試剤を用いて完全なものとなる。ＲＮＡポリヌクレオチドとDNAポリヌクレオチドの間を往復することにより出発ポリヌクレオチドが増巾する。
またプライマーにテンプレート配列またはＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼの複製開始部位を含めることもある。典型的ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼにはリザルディ（Lizardi）等により報告されているＱβレプリカーゼが含まれる（Biotechnology，６，1197−１２０２（１９８８））。
ＲＮＡ指向ＲＮＡポリメラーゼはテンプレート配列または複製開始部位を含む少ないテンプレートＲＮＡ鎖から大量のＲＮＡ鎖を生成する。一般にこれらのポリメラーゼはクレマー（Kramer）等（J．Mol．Biol．８９，７１９．７３６（１９７４））により報告されているようにテンプレート鎖を１００万倍に増巾する。
3．遺伝子ライブラリーの調製
単離したレパートリー内に含まれるＶHおよび、またはＶL遺伝子をクローニングすなわち実質的に再生するのに用いる戦術は当分野でよく知られているようにレパートリーを作り上げている核酸のタイプ、複雑性および純度に依存する。他の因子にはその遺伝子が増巾および、または変異を受けるかどうかが含まれる。
１つの戦術においてその目的はｍＲＮＡおよび、またはゲノムＤＮＡのセンス鎖などポリヌクレオチドコード鎖からなるレパートリーからＶHおよびＶLコード遺伝子をクローン化することである。もしそのレパートリーが二本鎖ゲノムＤＮＡの形体であるならば通常まず一般的には融解により１本鎖に変性される。そのレパートリーを所定のヌクレオチド配列を有する第１ポリヌクレオチド合成プライマーで処理することにより第１プライマー伸長反応を行う。この第１プライマーはレパートリー内に保存されている長さ少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドのヌクレオチドにハイブリダイズすることにより第１プライマー伸長反応を開始し得る。この第１プライマーは核酸のコードまたはセンス鎖にハイブリダイズすることからしばしばセンスプライマーと呼ばれる。さらに第２プライマーは核酸の非コードまたはアンチセンス鎖、すなわちコード鎖に相補的な鎖にハイブリダイスすることから“アンチセンス鎖”と呼ばれる。
第１プライマー伸長は好ましくは所定量のレパートリーの核酸を好ましくは所定量の第１プライマーと混合し第１プライマー伸長反応混合物を作ることにより行う。この混合物をポリヌクレオチド合成条件下に第１プライマー伸長反応産物が形成するのに十分な一般的には所定の時間維持することにより多種多様なＶHコードＤＮＡホモログ相補体が生成する。それからこの相補体を所定のヌクレオチド配列をもつ第２ポリヌクレオチド合成プライマーで処理することにより第２プライマー伸長反応を行う。この第２プライマーはたとえば第１プライマー伸長反応によって生産されたものなどの多様なＶHコード遺伝子相補体に保存される好ましくは長さ少なくとも約１０ヌクレオチド、より好ましくは長さ少なくとも約２０ヌクレオチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることにより第２反応を開始し得る。このことは好ましくは所定量の相補的核酸と好ましくは所定量の第２プライマーを混合し第２プライマー伸長反応混合物を作ることにより行う。この混合物を第１プライマー伸長反応産物の形成に十分な一般的には所定の時間ポリヌクレオチド合成条件に維持することで多種のＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログを含む遺伝子ライブラリーを作る。
多数の第１および、または多数の第２プライマーを各増巾で使用し得るし、また第１および第２プライマーの個々のペアも使用し得る。どちらの場合でも第１および第２プライマーの同じまたは異なる組合せ物を使用した増巾産物を合せて遺伝子ライブラリーの多様性を増加し得る。
別の戦術ではその目的はｍＲＮＡを逆転写反応にかけることにより生産されるポリヌクレオチドまたはゲノム二本鎖のアンチセンス鎖などのレパートリーのポリヌクレオチド相補体を提供することによりそのレパートリーからＶH−および、またはＶLコード遺伝子をクローン化することである。これらの相補体を生成する方法はよく知られている。この相補体に対し上述の第２プライマー伸長反応、すなわち多種のＶHコード遺伝子相補体に保存されているヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド合成プライマーを用いたプライマー伸長反応と同じプライマー伸長反応を行う。
このプライマー伸長反応はいくつかの適当な方法で行なわれる。一般に好ましくはpＨ７〜９、もっとも好ましくは約８の緩衝液中で行う。モル数で過剰のプライマー（ゲノム核酸については通常約１０6：１プライマー：テンプレート）をテンプレート鎖を含むバッファに添加する。この過程を効率よく行うためには大モル過剰のプライマーを用いるのが好ましい。
またデオキシリボヌクレオチド三リン酸ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを適当量このプライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応混合物に入れ、９０℃〜１００℃で約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間加熱する。加熱後この溶液を室温まで冷却する。このことでプライマーのハイブリダイゼーショが起こる。冷却した混合物にプライマー伸長反応を誘導または触媒する適当な試薬を入れ、この分野でよく知られている条件下で反応を進行させる。この合成反応は室温から誘導試薬がもはや有効に機能しなくなる温度までの範囲で進行する。したがってたとえばＤＮＡポリメラーゼを誘導試薬として用いると一般にその温度はせいぜい約４０℃である。
誘導試薬としてはプライマー伸長産物の合成を遂行するよう機能するならどのような化合物でもシステムでもよく、これには酵素も含まれる。本目的のための酵素には、たとえば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、その他使用可能なＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素および熱的に安定な酵素も含む、各核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物を形成するようにヌクレオチドを正しく結合していく酵素が含まれる。一般にこの合成は各プライマーの３′端から開始しテンプレート鎖に沿って合成が止まるまで５′方向に進行していき、種々の長さの分子を生成する。しかしながら上述と同様のプロセスを用いながらその５′端から合成を開始し、上述の方向に進行する誘導試薬もある。
またこの誘導試薬はＲＮＡプライマー伸長産物の合成を遂行する化合物またはシステムでもよく、これには酵素が含まれる。好ましい態様においてその誘導試薬にはＴ４ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼがある。これらのポリメラーゼは相補的なＲＮＡポリヌクレオチドを生成する。チャンバリン（Chamberlin）等（The Enzyme，P．ボイアー（Boyer），pp．８７−１０８、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９８２））によて報告されているようにＲＮＡポリメラーゼは高ターンオーバー速度で出発ポリヌクレオチドを増巾する。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのもう１つの利点はｃＤＮＡの１部を１つ以上の変異原オリゴヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置換し、この部分的にミスマッチしたテンプレートを直接転写することによりポリヌクレオチド合成に変異を導入し得ることである（ジョイス（Joyce）等、Nucleic Acids Research，１７，７１１−７２２（１９８９）。転写に基づく増巾システムはギンゲラス（Gingeras）等（PCRプロトコール、方法と応用へのガイド、pp．２４５−２５２、アカデミックプレス、サンディエゴ、ＣＡ（１９９０））によって報告されている。
もし誘導試薬がＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼで、それゆえ、リボヌクレオチド三リン酸を含んでいるなら、十分な量のＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰおよびＵＴＰをプライマー伸長反応混合物に添加し、この溶液を上述のように処理する。
新しく合成された鎖およびその相補鎖は二本鎖を形成しこのプロセスの次のステップに使用し得る。
先に議論した第１および、または第２プライマー伸長反応をうまく使用しレセプターの中にレセプターの免疫学的検出および、または単離に有用な所定のエピトープを組込むことができる。このことは第１および、または第２ポリヌクレオチド合成プライマーまたは発現ベクターを用い所定のアミノ酸残基配列をレセプターのアミノ酸残基配列の中に組込むことによって行う。
レパートリー内の多種多様なＶHおよびＶLコード遺伝子に対しＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログを作った後一般的にはそのホモログを増巾する。ＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログは自己複製ベクターへの組込みなどの従来技術で増巾し得るがまず、それらのＤＮＡホモログをベクターに挿入する前にこれらをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）にかけ増巾した方が好ましい。事実好ましい戦術では遺伝子ライブラリーの作製に用いた第１および、または第２プライマー伸長反応はポリメラーゼチェーンリアクションの第１および第２プライマー伸長反応である。
一般的にＰＣＲはポリヌクレオチド合成と形成された二本鎖の変性を含むサイクルを回す、すなわち１つの混合物内で上述の第１および第２プライマー伸長反応を同時に行うことにより行う。ＤＮＡホモログを増巾する方法およびシステムはムリス（Mullis）等（米国特許第4,683,195号および第4,683,202号）により報告されている。
好ましい態様においては増巾反応に第１および第２プライマー１対が使用される。各々種々のプライマー対を用いた種々の増巾に由来する増巾反応産物を合せる。
しかし、本発明は共増巾（２対のプライマーの使用）および多重増巾（約８、９または１０対までのプライマーの使用）によるＤＮＡホモログ産物にも関する。
一般にＰＣＲ増加で得たＶHおよびＶLコードＤＮＡホモログは二本鎖であり、かつ各末端近傍にエンドヌクレアーゼ制限部位のヌクレオチド配列を有している。それらの末端近傍に制限部位をもつＶHおよびＶLコードＤＮＡホモログの１つ以上のエンドヌクレアーゼによる消化で所定の特異性を有する粘着末端をもつホモログができる。
好ましい態様においてはこのＰＣＲ工程はライブラリーのＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログを増巾するだけでなくライブラリーに変異を誘導しより異質性の高いライブラリーを提供する。まずＰＣＲは当分野でよく知られている多くの因子により本質的に変異原的性質を有することに注意しなければならない。第２に上述のＵ．Ｓ．特許第4,683,195号で報告されているような変化を誘導する変異に加えて、他の変異を誘導するＰＣＲも使用し得る。たとえば、ＰＣＲ反応混合物、すなわち第１および第２プライマー伸長反応混合物を合せたものは伸長反応産物に取り込まれる１つ以上のヌクレオチドの量を変えて調製する。このような条件ではＰＣＲ反応は特定の塩基の涸渇の結果伸長産物内にヌクレオチド置換を起こす。同様にＸ回のサイクルを行うのに十分な量でほぼ等モル量のヌクレオチドで最初のＰＣＲ反応混合物を作りついでたとえば２ＸのようなＸ過剰で反応サイクルをまわす。別に、通常増巾されるレパートリーの核酸中には見られないイノシンなどのヌクレオチド誘導体を反応混合物中に入れることによりＰＣＲ反応中に変異を誘導し得る。つづくインビボ増巾の際、このヌクレオチド誘導体は置換ヌクレオチドに置き換えられ点突然変異が誘導される。
4．ＶHまたはＶLＤＮＡホモログの発現
上述の方法で作られたライブラリー中のＶHおよび、またはＶLＤＮＡホモログは増巾および、または発現のためベクターに機能的に結合する。
本明細書で用いられているように“ベクター”とは機能的に結合するもう１つの核酸を別の遺伝的環境から転移し得る核酸分子である。１つの好ましいベクターはエピソーム、すなわち染色体外複製可能な核酸分子である。好ましいベクターは自己複製およびそれが結合している核酸の発現が可能なものである。機能的に結合する遺伝子の発現を行ない得るベクターを“発現ベクター”と呼ぶ。ＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログを機能的に結合するベクターの選択は当分野ではよく知られているように望ましい機能性、たとえば複製またはたんぱく質発現およびトランスホームされる宿主細胞に依存するがこれらは組換えＤＮＡ分子の構築技術に本質的な制限となる。
好ましい態様において使用するベクターは原核性レプリコン、すなわち自己複製および細菌宿主細胞などトランスホームされた原核性宿主細胞中で染色体外でその組換えＤＮＡ分子を維持する能力を有するＤＮＡ配列が含まれる。このようなレプリコンは当分野でよく知られている。さらに原核性レプリコンを含むこれらの態様は、その発現が薬剤耐性のような選択的利点をトランスホームした宿主細菌に付与する遺伝子も含んでいる。典型的細菌薬剤耐性遺伝子はアンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
原核性レプリコンを含むベクターにはトランスホームを受けた大腸菌など細菌宿主細胞中でＶHおよび、またはＶLコードホモログを発現（転写および翻訳）し得る原核性プロモーターも含んでいる。プロモーターとはＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にし転写を開始させるＤＮＡ配列で形成される発現コントロール要素である。細菌宿主に適合するプロモーター配列は一般に本発明のＤＮＡセグメントを挿入するのに便利な制限部位を含むプラスミドベクター中に提供される。これらのベクタープラスミドにはバイオラドラボラトリー（リッチモンド，ＣＡ）から市販されているｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９およびファルマシア（ピスカタウェイ，ＮＪ）から市販されているpPLおよびｐＫＫ２２３がある。
真核細胞に適合する発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合するものも使用し得る。真核細胞発現ベクターもこの分野ではよく知られており、いくつかの業者から市販されている。一般にこのようなベクターは目的とするＤＮＡホモログの挿入用に便利な制限部位を含んでいる。このようなベクターにはｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（ファルマシア）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ2d（インターナショナルバイオテクノロジー）およびｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ，No．３１２５５）がある。
好ましい態様において使用される真核細胞発現ベクターには真核細胞中で有効な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーが含まれている。好ましい薬剤耐性マーカーは発現によってネオマイシン耐性となる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｅｏ）遺伝子である。サウザーン（Southern）等，J．Mol．Appl．Genet．１，３２７−３４１（１９８２）。
本発明はＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログの遺伝子の発現用のレトロウイルス発現ベクターの使用にも関する。本明細書で用いられているように“レトロウイルス発現ベクター”とはレトロウイルスゲノムのロングターミナルリピート（ＬＴＲ）領域由来のプロモーター配列を含むＤＮＡ分子を意味する。
好ましい態様において一般に発現ベクターは真核細胞中好ましくは複製不能なレトロウイルス発現ベクターである。レトロウイルスベクターの構築および使用法はソルジ（Sorge）等（Mol．Cel．Biol．，４，１７３０−１７３７（１９８４））により報告されている。
相補的な粘着末端を介してＤＮＡをベクターに機能的に結合する多くの方法が開発されてきている。たとえば相補的粘着末端を先に議論したように適当に設計したポリヌクレオチド合成プライマーを用いてプライマー伸長反応の際にＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログに作ることができる。そのベクターおよび必要ならばＤＮＡホモログを制限酵素で切断しＤＮＡホモログの末端に相補的な末端を作る。このベクターおよびＤＮＡホモログの相補的粘着末端を機能的に結合させ１つの二本鎖ＤＮＡ分子とする。
好ましい態様においては多様なライブラリーのＶHおよびＶLコードＤＮＡホモログをインビトロでランダムに結合し、個々のベクターからポリシストロニックな発現を可能にする。すなわち二本鎖ＤＮＡ発現ベクターの多様性集団ができる。そこでは単一のプロモーターのコントロール下各ベクターは１つのＶHコードＤＮＡホモログおよび１つのＶLコードＤＮＡホモログを発現するがその集団の多様性は異なるＶHおよびＶLコードＤＮＡホモログの組合せによる。インビトロでのランダムな組合せは両方に共通な各々の制限部位の位置により互いに区別可能な２つの発現ベクターを用いて行ない得る。そのベクターは本明細書に述べられてるようなラムダＺap由来のベクターのように線状二本鎖DNAであることが好ましい。第１のベクターではその部位はプロモーターとポリリンカーの間、すなわちポリリンカーの５′側（発現の方向で上流）であるがプロモーターの３′側（発現の方向で下流）に位置する。第２ベクターではポリリンカーはプロモーターと制限部位の間にあり、すなわち制限部位はポリリンカーの３′側にあり、かつそのポリリンカーはプロモーターの３′側にある。
好ましい態様では各々のベクターはリボゾーム結合配列およびリーダー配列を有しており、その配列はプロモーターおよびポリリンカーの間に位置するがもし制限部位がプロモーターとポリリンカーの間にあるならそれは共有される制限部位の下流（３′側）に位置する。またベクターは停止コドンをポリリンカーの下流で、もし制限部位がポリリンカーの下流にあるときは共有される制限部位の上流に含むことが好ましい。第１および、または第２のベクターはペプチドtagをコードするヌクレオチド配列を含み得る。一般にこのtag配列はポリリンカーの下流でもし停止コドンがあるならその上流に位置する。好ましい態様ではベクターはそのベクターの一部分、すなわち特定のラムダアームの存在を選択し得る選択可能マーカーを含んでいる。典型的選択マーカーは当分野でよく知られている。このようなマーカーの例には抗生物質耐性遺伝子、遺伝的選択マーカー、マンバーサプレッションなどの変異サプレッサーなどがある。一般に選択可能マーカーはプロモーターの上流および、または第２の制限部位の下流に位置する。好ましい態様においては１つの選択可能マーカーはＶHコードDNAホモログを含む第１ベクターのプロモーターの上流に位置する。第２の選択可能マーカーはＶLコードＤＮＡホモログを含むベクターの第２制限部位の下流に位置する。ＶHコードベクターおよびＶLコードベクターが第１制限部位を介してランダムに結合するとき両ＶHおよびＶLおよび両選択可能マーカーを含むベクターが選択されるならばこの第２選択可能マーカーは第１マーカーと同じものでも異なるものでもよい。
一般にポリリンカーは１つ以上、好ましくは少なくとも２つの制限部位を含んでいる。そしてそれら各々はそのベクターにユニークなものでかつ別のベクターに共有されていないことが好ましい。すなわちそれが第１ベクターにあるなら、第２ベクターにない方がよい。ポリリンカー制限部位は、リーダー、tagまたは停止コドン配列が存在するのと同じ読み枠でベクター中にＶHまたはＶLコードＤＮＡホモログをライゲーションし得るよう配向させる。
ランダムな組合せは一般的にはポリリンカー内の制限部位で第１ベクターにＶHコードＤＮＡホモログをライゲーションすることにより行う。同様にＶLコードDNAホモログは第２ベクターにライゲーションされ、それにより２つの多様性発現ベクター集団ができる。どちらのタイプのＤＮＡホモログ、すなわちＶHまたはＶLがどちらのベクターにライゲーションしても問題ないが、たとえば全てのＶHコードＤＮＡホモログが第１または第２ベクターのいずれかとライゲーションし、かつ全てのＶLコードＤＮＡホモログが第１または第２ベクターのいずれかとライゲーションすることが望ましい。それから両集団のメンバーを共有される制限部位を一般的には同じ酵素で両集団を消化することにより切断する。生成した産物はメンバーの粘着末端が他のメンバーの粘着末端と相補的であるような制限フラグメントの２つの多様性集団である。この２つの集団の制限フラグメントを互いにランダムにライゲーションする。すなわちランダムな集団間ライゲーションを行ない同じ読み枠に存在しかつ第２のベクターのプロモーターのコントロール下のＶHコードおよびＶLコードＤＮＡホモログを各々有するベクターの多様性集団を作る。もちろん２つの集団からのメンバーのライゲーションで再生する共有される制限部位での切断と再ライゲーションにより組換えが可能である。
生成した構築物を適当な宿主に導入し別々にまたは組合せてＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログを増巾および、または発現させる。同じもしくは別々のベクターで同じ生物内で共発現させたとき、機能性ＦVが生成する。ＶHおよびＶLポリペプチドを別の生物中で発現させる場合は各ポリペプチドを単離し適当な媒体中で合せることによりＦVが形成される。ＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログ含有構築物を導入した細胞宿主は本明細書で“トランスホームされたもの”または“トランスホーマント”と呼ぶ。
この宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよい。細菌細胞は好ましい原核性宿主細胞であり一般にベセスダリサーチラボラトリーズ社（ベセスダ、ＭＤ）から市販されてる大腸菌ＤＨ５株などの大腸菌が用いられる。好ましい真核性宿主細胞にはイーストおよび哺乳類細胞が含まれ、マウス、ラット、モンキーまたはヒトの細胞系列など脊椎動物細胞が好ましい。
本発明の組換えＤＮＡ分子による適当な宿主細胞のトランスホーメーションは一般的に使用されるベクターのタイプに依存した方法で行う。原核性宿主細胞のトランスホーメーションに関してはたとえばコーエン（Cohen）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，６９，２１１０（１９７２）；およびマニアチス（Maniatis）等、Molecular Cloning，ラボラトリーマニュアル、コールドスプリングハーバー，ＮＹ（１９８２）参照。ｒＤＮＡを含むレトロウイルスベクターによる脊椎動物のトランスホーメーションに関してはソルジ（Sorge）等、Mol．Cell．Biol．４，１７３０−1737（１９８４）、グラハム（Graham）等、Virol．５２，４５６（１９７３）：およびウィグラー（Wigler）等、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，７６，１３７３−１３７６（１９７９）参照。
5．ＶHおよび、またはＶLポリペプチドの発現に関するスクリーニング
うまくトランスホームした細胞,すなわちベクターに機能的に結合したＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログを含む細胞はリガンドへのレセプターの結合またはそのレセプター好ましくは活性部位をコードするポリヌクレオチドの存在を検出する適当な従来技術により同定し得る。好ましいスクリーニング法には直接的にしろ間接的にしろ検出可能なシグナルがレセプターとリガンドの結合により生成する方法である。このようなシグナルにはたとえば複合体の生成、触媒反応産物の形成、エネルギーの放出または取込みなどが含まれる。たとえば問題のｒＤＮＡでトランスホーメーションした細胞をクローン化し、モノクローナルコロニーを調製し得る。コロニーから細胞を収穫し、溶解後、それらのＤＮＡについてサウザーン（Southern）（J．Mol．Biol．９８，５０３（１９７５））またはベレント（Berent）等（Biotech．３，２０８（１９８５）の方法に従がいｒＤＮＡの存在を試験する。
ＶHおよびＶLコードＤＮＡホモログの存在を直接検定するのに加えてトランスホーメーションは特にＶHおよび、またはＶLポリペプチドが所定のエピトープを含む場合など従来の免疫学的方法により確認される。たとえばトランスホームした細胞サンプルいついて所定のエピトープに対する抗体を用い、そのエピトープの存在を検定する。
6．ＶHおよび、またはＶLコード遺伝子ライブラリー
本発明は好ましくはここで述べられているプライマー伸長反応またはプライマー伸長反応の組合せで生成され、少なくとも約１０3、好ましくは少なくとも１０4、そしてより好ましくは約１０5の異なるＶHおよび、またはＶLコードＤＮＡホモログを含む遺伝子ライブラリーに関する。このホモログはたとえばプライマー伸長反応試薬および、または基質、ゲノムＤＮＡセグメントなどの物質を実質的に含まないことが好ましい。
好ましい態様においてライブラリー中に存在するホモログの実質的部分はベクターに機能的に結合しており、好ましくは発現のために発現ベクターに機能的に結合している。
このホモログは水や緩衝剤を含む水などインビトロでの取扱いに適した媒体中に存在することが好ましい。この媒体はホモログの生物学的活性の維持に適合しているべきである。さらに、このホモログは合理的頻度でホモログに適合する宿主細胞にトランスホーメーションすることが十分可能な濃度で存在するべきである。
さらにこのホモログはこれでトランスホームした適合する宿主細胞中に存在することが好ましい。
Ｄ．発現ベクター
本発明はとりわけ本発明の方法を行うのに有用な種々の発現ベクターに関する。各々の発現ベクターはラムダＺapの新しい誘導体である。
1．ラムダＺapII
ラムダＺapIIは例６に述べられてるようにベクターラムダＺapのラムダＳ遺伝子をラムダｇt１０ベクター由来のラムダＳ遺伝子に置き換えることにより調製する。
2．ラムダＺapIIＶH
ラムダＺapIIＶHは第６Ａ図に示した合成ＤＮＡ配列を上述のラムダＺapIIベクターに挿入することにより調製する。この挿入ヌクレオチド配列は都合よくリボゾーム結合部位（シャインダルガルノ配列）を提供しｍＲＮＡのたんぱく質への翻訳を可能にし、かつリーダー配列を提供し翻訳されたたんぱく質を細胞周辺腔に効率的に誘導する。ラムダＺａｐIIＶHの調製は例９でより詳細に述べており、またその特徴を第６Ａ図および第７図に示した。
3．ラムダＺapIIＶL
ラムダＺapＶLは例１２で述べているようにラムダＺapIIに第６Ｂ図で示した合成ＤＮＡ配列を挿入することにより調製する。ラムダＺapIIＶLの重要な特徴は第８図に示した。
4．ラムダＺapIIＶLII
ラムダＺapIIＶLIIは例１１に述べているようにラムダＺapIIに第１０図に示した合成ＤＮＡ配列を挿入することにより調製する。
上述のベクターは大腸菌宿主に適合する。すなわちこれらは発現のために機能的に結合された遺伝子によりコードされるたんぱく質を細胞周辺腔へ分泌するように発現し得る。
例
以下の例は本発明の範囲を説明するものであり、これを制限するものではない。
1．ポリヌクレオチド選択
免疫グロブリンたんぱく質ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は非常に可変性が高い。しかしＶHドメインに隣接する非常に保存的配列をもつ領域がいくつかある。たとえば実質的に保存されるヌクレオチド配列、すなわち同じプライマー配列にハイブリダイズする配列を含む。それゆえ、保存的配列にハイブリダイズし、ベクターに合成されたＤＮＡフラグメントを機能的に結合するのに適した制限部位を生成するＤＮＡホモログ中に組込むポリヌクレオチド合成（増巾）プライマーを構築した。特定するとそのＤＮＡホモログはラムダＺapIIベクター（ストラタジーンクローニングシステム、ラジョラ、ＣＡ）のＸhoＩおよびＥcoＲＩ部位に挿入した。ＶHドメインの増巾には３′プライマー（第１表のプライマー１２）をＪH領域のｍＲＮＡに相補的となるように設計した。全ての場合、５′プライマー（第１表、プライマー１〜１０）は保存的Ｎ末端領域中の第１鎖ｃＤＮＡアンチセンス鎖）に相補的となるように選んだ。最初の増巾は５つの部位で縮退している３２個のプライマー（第１、プライマー１）の混合物で行う。ハイブリドーマｍＲＭＡは混合プライマーで増巾し得たが脾臓からのｍＲＮＡを増巾する最初の試みは種々の結果を生じた。それゆえ、混合５′プライマーを用いた増巾以外にいくつかの方法を比較した。
最初の方法は混合プライマープールの個々のメンバーに対応する多重ユニークプライマー（そのうちの８個は第１表に示した）を構築することであった。第１表のプライマー２〜９は５個の縮退位置の３つに２つの可能なヌクレオチドを組込むことにより構築した。
第２の方法はタカハシ（Takahashi）等（Proc．Natl．Acad．Sic．（ＵＳＡ）８２、１９３１−１９３５（１９８５））およびオーツカ（Ohtsuka）等（J．Biol．Chem．２６０，２６０５〜２６０８（１９８５））の研究に基づき可変部位の４つにイノシンを含むプライマー（プライマー１０、第１表）を構築するものである。このプライマーはマーチン（Martin）等、Nuc．Acids．Res．13，８９２７（１９８５）により議論されているように縮退しておらず、かつ同時に非保存的部位でのミスマッチのネガティブ効果を最小限にする利点を有している。しかしイノシンヌクレオチドの存在がクローン化したＶH領域中に望ましくない配列を組み入れるかどうかは分っていない。それゆえイノシンは制限部位の切断後増巾されたフラグメントに残っている１つの部位には含まれていない。
さらにユニークな３′プライマーを含むＶH増巾プライマーはガンマ１重鎖ｍＲＮＡの第１不変領域ドメインの一部に相補的となるように設計した（プライマー１５および１６、第１表）。これらのプライマーは重鎖のＶHおよび第１不変領域ドメインのアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡホモログを生成する。これらのＤＮＡホモログはＦVではなくＦabフラグメントを作るのに用いられる。
本発明はＩgＭ、ＩgＥおよびＩgＡなど免疫グロブリン重鎖の別のクラスの同じ領域にハイブリダイズするよう設計されたユニークな３′プライマーにも関する。また、特定のクラスのCH1不変領域の特定の領域にハイブリダイズし、かつ別のクラスの重鎖または軽鎖不変領域を有するＶHドメインを発現し得る発現ベクターにこのプライマーを用いて増巾したＶHドメインを転移するのに適したオーバー３′プライマーにも関する。
脾臓またはハイブリドーマmＲＮＡから不変領域ＩgＧ内の保存性の高い領域にハイブリダイズする一組のプライマーを増巾するコントロールとして重鎖遺伝子を構築した。その５′プライマー（プライマー１１、第１表）はＣH2領域中のcＤＮＡに相補的であり、一方３′プライマー（プライマー１３、第１表）はＣH3領域中のmＲＮＡに相補的である。これらのプライマーおよびテンプレートの間にミスマッチはないと考えている。
ＶLＣＤＲをコードするヌクレオチド配列は可変性が高い。しかし、ＪL、ＶLフレームワーク領域およびＶLリーダー／プロモーターを含むＶLＣＤＲドメインに隣接する保存的配列の領域がいくつかある。それゆえ、この保存的配列にハイブリダイズしかつ、ＮcoＩおよびＳpeＩで切断したpBluescript SK-ベクターへの増巾したフラグメントのクローニングを可能にする制限部位を組込む増巾プライマーを構築した。ＶLＣＤＲドメインの増巾のためにＪL領域内のmＲＮＡに相補的であるような３′プライマー（プライマー１４、第１表）を設計した。５′プライマーは保存的Ｎ末端領域中の第１鎖cＤＮＡに相補的となるように選択した。
ＶLＣＤＲドメインの増巾用の２番目の増巾用プライマーセットである５′プライマー（プライマー１〜８、第２表）は保存的Ｎ末端領域中の第１鎖cＤＮＡに相補的となるように設計した。またこれらのプライマーはＳacＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入しＶLＤＮＡホモログのＶLII発現ベクターへのクローニングを可能にする。３′ＶL増巾プライマー（プライマー９、第２表）はＪL領域中のmＲＮＡに相補的であり、かつＶLＤＮＡホモログをＶLII発現ベクターに挿入するときに必要なＸbaＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するよう設計した（第ａ図）。
さらに３′ＶL増巾プライマーをカッパまたはラムダmＲＮＡいずれかの不変領域にハイブリダイズするよう設計した（プライマー１０および１１、第２表）。これらのプライマーはカッパまたはラムダ鎖の不変領域アミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡホモログの生成を可能にする。これらのプライマーはＦVよりむしろＦabフラグメントの生成を可能にする。
Ｆabを構築するためのカッパ軽鎖配列の増巾に使用するプライマーを第２表に示す。これらのプライマーを用いた増巾は５個の別々の反応で行なった。それぞれの反応には５′プライマー１つ（プライマー３〜６および１２）および３′プライマー１つ（プライマー１３）が含まれている。残りの３′プライマー（プライマー９）はＦVフラグメントを構築するのに用いた。５′プライマーはＳacＩ制限部位を含んでおり、また３′プライマーはXbaI制限部位を含んでいる。
Ｆab構築のための重鎖Ｆdフラグメント増巾に用いるプライマーを第１表に示す。増巾は８個の別々の反応で行った。各々の反応は５′プライマー１つ（プライマー２〜９）および３′プライマー１つ（プライマー１５）を含む。単一反応の増巾で使用する５′プライマーは縮退プライマー（プライマー１）または４つの縮退部位にイノシンを組込んだプライマー（プライマー１０、第１表、プライマー１７および１８、第２表）である。残りの３′プライマー（プライマー１４、第２表）はＦVフラグメントの樺築に使用した。５′プライマーの多くはＸhoＩ部位を有し、また３′プライマーはＳpeＩ制限部位を有する。
ヒト重鎖可変領域を増巾するように設計されたＶH増巾プライマーを第２表に示す。５′重鎖プライマーの１つは縮退ヌクレオチド部位にイノシン残基を含み、単一プライマーの多くの可変領域配列へのハイブリダイズを可能にしている。種々のIgG mRNAの不変領域にハイブリダイズするように設計されたプライマーも第２表に示す。
ラムダおよびカッパ両アイソタイプのヒト軽鎖可変領域にハイブリダイズするように設計されたＶL増巾プライマーも第２表に示した。
ここで用いられかつ第１〜４表に示された全てのプライマーおよび合成ポリヌクレオチドはリサーチジェネティクス社（ハンツビル、アラバマ）から購入するかまたはアプライドバイオシステムスＤＮＡ合成機モデル３８１Ａを業者の説明書に従がい用いて合成した。
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2．ＦＩＴＣ結合タンパク質に富むＶH暗号レパートリーの生産
螢光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）をレセプター結合のためのリガンドとして選択した。抗ＦＩＴＣレセプターについて暗号化する遺伝子に関して、免疫遺伝子レパートリー、即ちＶH暗号遺伝子レパートリー及びＶL暗号遺伝子レパートリーを免疫化により富化することを更に決めた。これは、Antibodies A Laboratory Manual、ハーロウ（Harlow）及びロウ（Lowe）編集、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ＮＹ（1988年）に記載された技術を用いてＦＩＴＣをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に連鎖することにより行なった。簡単に言えば、キーホールリンペットヘモシアニン１０．０mg及びＦＩＴＣ０．５mgを、０．１Ｍの炭酸ナトリウム、pH９．６を含む緩衝液１mlに添加し、４℃で１８〜２４時間攪拌した。未結合ＦＩＴＣをセファデックス（Sephadex）Ｇ−２５によるゲル濾過により除去した。
ＫＬＨ−ＦＩＴＣ複合体は、複合体１００μｇをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）２５０μｌに添加することによりマウスに注射するために調製した。等容量の完全フロイントアジュバントを添加し、全溶液を５分間乳化した。１２９ＧIX+マウスにエマルション３００μｌを注射した。注射は２１ゲージ針を用いて幾つかの部位で皮下で施した。ＫＬＨ−ＦＩＴＣによる第二の免疫化を２週間後に行なった。この注射液は、以下のようにして調製した。ＫＬＨ−ＦＩＴＣ５０μｇをＰＢＳ２５０μｌ中で希釈し、等容量の明ばんをＫＬＨ−ＦＩＴＣ溶液に添加した。マウスに２３ゲージ針を用いて溶液５００μｌを腹腔内に注射した。１ケ月後、マウスにＰＢＳ中で２００μｌに希釈されたＫＬＨ−ＦＩＴＣ複合体５０μｌの最後の注射を施した。この注射は３０ゲージ針を用いて尾部側脈中に静脈内に施した。この最後の注射の５日後に、マウスを犠牲にし、全細胞ＲＮＡをそれらの脾臓から分離した。
ホスホネートエステルに免疫特異的な抗体を生産するハイブリドーマＰＣＰ８Ｄ１１を、ペニシリン及びストレプトマイシンを補給した１０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地（ギブコ・ラボラトリィズ（Gibco Laboratories）、グランドアイランド、ＮＹ）中で培養した。約５×１０8個のハイブリドーマ細胞を回収し、リン酸塩緩衝食塩水中で２回洗浄した。全細胞ＲＮＡをこれらの分離ハイブリドーマ細胞から調製した。
3．ＶH暗号遺伝子レパートリーの調製
全細胞ＲＮＡを、製造業者の指示及びストラタゲン・クローニング・システムズ（Stratagene Cloning Systems）（ラ・ジョラ（La Jolla）、ＣＡ）により製造されたＲＮＡ分離キットを用いて、クロムシジンスキィ（Chomczynski）らにより記載されたＲＮＡ調製方法（Anal．Biochem．１６２巻、１５６〜１５９頁（１９８７年）を参照のこと）を用いて実施例２に記載されたＫＬＨ−FITCで免疫化された一匹のマウスの脾臓から調製した。簡単に言えば、免疫化されたマウスから脾臓を除去した直後に、組織をガラスホモジナイザーを用いて４．０Ｍのグアニンイソチオシアネート、０．２５Ｍのクエン酸ナトリウム、pH７．０、及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを含む変性溶液１０ml中で均一にした。pH４．０の２Ｍの濃度の酢酸ナトリウム１mlを、均一にした脾臓と混合した。また、予めＨ2Ｏで飽和されたフェノール１mlを、均一にした脾臓を含む変性溶液に添加した。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１ｖ／ｖ）混合物２mlをこの均一液に添加した。均一液を１０秒間激しく混合し、氷の上に１５分間保った。その後、均一液を厚肉の５０mlのポリプロピレン遠心分離管（フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニィ（Fisher Scientific Company）、ピッツバーグ、ＰＡ）に移した。その溶液を４℃で１０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上部のRNAを含む水層を新しい５０mlのポリプロピレン遠心分離管に移し、等容量のイソプロピルアルコールと混合した。この溶液を少なくとも１時間−２０℃に保ってＲＮＡを沈殿させた。沈殿したRNAを含む溶液を４℃で１０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。ペレット化した全細胞RNAを集め、上記の変性溶液３mlに溶解した。イソプロピルアルコール３mlを再懸濁した全細胞ＲＮＡに添加し、激しく混合した。この溶液を−２０℃で少なくとも１時間保ってＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＲＮＡを含む溶液を４℃で１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレット化したＲＮＡを７５％のエタノールを含む溶液で１回洗浄した。ペレット化したＲＮＡを減圧下で１５分間乾燥し、ついでジメチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理した水（ＤＥＰＥ−Ｈ2Ｏ）中で再懸濁した。
長いポリＡ道を含む配列に関して富化されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、Molecular Cloning A Laboratory Manual、マニアチアス（Maniatias）ら、編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、（１９８２年）に記載された方法を用いて全細胞ＲＮＡから調製した。簡単に言えば、上記のように調製された１個の免疫化マウス脾臓から分離された全ＲＮＡの半分をDEPC−Ｈ2Ｏ１ml中に再懸濁し、６５℃で５分間保った。１００mＭのトリス−ＨＣｌ、１Ｍの塩化ナトリウム、２．０mＭの二ナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、pH７．５、及び０．２％のナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）からなる２Ｘの多い塩添加緩衝液１mlを再懸濁したＲＮＡに添加し、混合物を室温に冷却させた。その後、混合物を、オリゴｄＴを０．１Ｍの水酸化ナトリウム及び５mＭのＥＤＴＡを含む溶液で洗浄しついでカラムをＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏで平衡にすることにより前もって調製されたオリゴ−ｄＴ（コラボレイティブ・リサーチ（Collaborative Research）型２または型３）カラムに適用した。溶出液を無菌ポリプロピレン管に集め、溶出液を６５℃で５分間加熱した後に同カラムに再度適用した。その後、オリゴｄＴカラムを、５０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、５００mＭの塩化ナトリウム、１mＭのＥＤＴＡ、pH７．５及び０．１％のＳＤＳからなる多い塩添加緩衝液２mlで洗浄した。その後、オリゴｄＴカラムを、５０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１００mＭの塩化ナトリウム、１mＭのＥＤＴＡ及び０．１％のＳＤＳからなる１Ｘの培地塩緩衝液２mlで洗浄した。メッセンジャーＲＮＡを、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１mＭのＥＤＴＡ、pH７．５及び０．０５％のSDSからなる緩衝液１mlでオリゴｄＴカラムから溶出させた。この溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、その後１００％のクロロホルムで１回抽出することによりメッセンジャーＲＮＡを精製した。メッセンジャーＲＮＡをエタノール沈殿により濃縮し、ＤＥＰＣ−Ｈ2Ｏ中で再懸濁した。
上記の方法により分離されたメッセンジャーＲＮＡは複数の異なるＶH暗号ポリヌクレオチド、即ち、約１０4より大きい異なるＶH暗号遺伝子を含む。
4．単一のＶH暗号ポリヌクレオチドの調製
単一のＶHに関して暗号化するポリヌクレオチドを、全細胞ＲＮＡを実施例２で調製されたモノクローナルハイブリドーマ細胞から抽出した以外は、実施例３に従って分離した。この様にして分離されたポリヌクレオチドは単一ＶHに関して暗号化する。
5．ＤＮＡ同族体調製
ＰＣＲ増幅に関する調製に際し、上記の実施例に従って調製されたｍＲＮＡをプライマー延長反応によるｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。典型的な５０μｌの転写反応中に、水中の脾臓またはハイブリドーマｍＲＮＡ５〜１０μｇを、まず３′ＶHプライマー（プライマー１２、表１）５００ng（５０．０ｐモル）で６５℃で５分間ハイブリッドを形成した。続いて、混合物を１．５mＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、４０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH８．０、８mＭのMgCl2、５０mＭのNaCl、及び２mＭのスペルミジンに調節した。モロニー−マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ストラタゲン・クローニング・システムズ）、２６単位を添加し、溶液を３７℃で１時間保った。
ＰＣＲ増幅を、逆転写反応の生産物（ｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド約５μｇ）、３′ＶHプライマー（表１のプライマー１２）３００ng、夫々の５′ＶHプライマー（表１のプライマー２〜１０）３００ng、２００mＭのｄＮＴＰの混合物、５０mＭのKCl、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH８．３、１５mＭのMgCl2、０．１％のゼラチン及びＴaqＤＮＡポリメラーゼ２単位を含む１００μｌの反応中で行なった。反応混合物を鉱油でオーバーレイし、４０サイクルの増幅にかけた。夫々の増幅サイクルは、９２℃で１分間の変性、５２℃で２分間のアニーリング、ついで７２℃で１．５分間のプライマー延長（伸長）によるポリヌクレオチド合成を伴なっていた。増幅したＶH暗号ＤＮＡ同族体を含む試料を、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈殿させ、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、（pH、７．５）及び１mＭのＥＤＴＡ中で−７０℃で貯蔵した。
特異な５′プライマー（２〜９、表１）を使用して、有効なＶH暗号ＤＮＡ同族体合成及び脾臓ｍＲＮＡからの増幅を第３図中、レーンＲ１７〜Ｒ２４で示されるように行なった。増幅したcDNA（ＶH暗号ＤＮＡ同族体）が予想されるサイズ（３６０bp）の主用バンドとして見られる。夫々の反応中の増幅したＶH暗号ポリヌクレオチドフラグメントの強さは明らかに類似し、これらのプライマーの全てが増幅を開始するのにほぼ同等に有効であることを示す。これらのプライマーによる増幅の収率及び品質は再現性があった。
また、イノシンを含むプライマーは脾臓ｍＲＮＡから増幅したＶH暗号ＤＮＡ同族体を再現性よく合成し、その他の増幅したｃＤＮＡ（第４図、レーンＲ１６）の強さと類似する強さの予想されるサイズのフラグメントの生産をもたらした。この結果は、イノシンの存在がまた有効なＤＮＡ同族体合成及び増幅を可能にすることを示した。このようなプライマーが複数のＶH暗号DNA同族体を生じるのに如何に有効であるかを明らかに示す。一定の領域のプライマー（プライマー１１及び１３、表１）から得られた増幅生産物は一層強く、増幅がおそらく鋳型とプライマー（第４図、レーンＲ９）との間の高度の相同性のために一層有効であったことを示す。これらの結果に基いて、ＶH暗号遺伝子ライブラリーを８つの増幅の生産物からつくり、夫々異なる５′プライマーを用いて行なった。夫々のプライマー延長反応からの生産物の等しい部分を混合し、その後、混合生産物を使用してＶH暗号ＤＮＡ同族体を含むベクターのライブラリーをつくった。
ＶLのＤＮＡ同族体を、上記のように調製した精製ｍＲＮＡから調製した。ＰＣＲ増幅に関する調製に際し、上記の実施例に従って調製したｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。典型的な５０μｌの転写反応に於いて、まず水中の脾臓またはハイブリドーマｍＲＮＡ５〜１０μｇを６５℃で５分間３′ＶLプライマー（プライマー１４、表１）３００ng（５０．０ｐモル）でアニーリングした。続いて、混合物を１．５mＭのｄＡＴＰ、dCTP、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、４０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH８．０mＭのMgCl2、５０mＭのNaCl、及び２mＭのスペルミジンに調節した。マロニー−マウス白血病ウイルス逆転写酵素（ストラタゲン・クローニング・システムズ）、２６単位を添加し、溶液を３７℃で１時間保った。ＰＣＲの増幅を、上記のようにして生産したｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド約５μｇ、３′ＶLプライマー（表１のプライマー１４）３００ng、５′ＶLプライマー（表１のプライマー１５）３００ng、２００mＭのｄＮＴＰの混合物、５０mＭのＫＣｌ、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH８．３、１５mＭのMgCl2、０．１％のゼラチン及び２単位のＴaqＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌの反応中で行なった。反応混合物を鉱油でオーバーレイし、４０サイクルの増幅にかけた。夫々の増幅サイクルは９２℃で１分間の変性、５２℃で２分間のアニーリング及び７２℃で１．５分間の伸長を伴なっていた。増幅試料をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈殿させ、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び１mＭのＥＤＴＡ中で−７０℃で貯蔵した。
6．ベクター中へのＤＮＡ同族体の挿入
ＶH配列に富むライブラリーをクローニングするための調製に際し、ＰＣＲ増幅生産物（２．５mg／３０μlの１５０mＭのNaCl、８mＭのトリス−ＨＣｌ（pH７．５）、６mＭのMgSO4、１mＭのＤＴＴ、２００mg／mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、３７℃、を制限酵素Ｘho（１２５単位）及びＥcoＲＩ（１０Ｕ）で消化し１％のアガロースゲルで精製した。増幅反応の生産物の混合物を要するクローニング実験に於いて、等容量（５０μｌ、１〜１０μｇの濃度）の夫々の反応混合物を増幅の後で制限消化の前に組合せた。消化したＰＣＲ増幅脾臓ｍＲＮＡのゲル電気泳動後に、約３５０bpsのＤＮＡフラグメントを含むゲルの領域を切除し、透析膜に電気溶出し、エタノールで沈殿させ、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び１mＭのＥＤＴＡ中で１０ng／μｌの最終濃度に再懸濁した。その後、等モル量のインサートを、ＥcoＲＩ及びＸhoＩにより前もって切断されたラムダＺＡＰTMIIベクター（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）１μｇに５℃で一夜でつないだ。連鎖混合物の一部（１μｌ）を、ギガパック・ゴールド（Gigapack Gold）包装抽出物（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）を用いて室温で２時間包装し、包装物質をＸＬ１−ブルー宿主細胞に塗布した。そのライブラリーは３０％未満の非組換えバックグラウンドを含む２×１０7個のＶH同族体からなることを測定した。
上で使用したベクター、即ちラムダＺaPIIは、もとのラムダＺapの全ての特性を保持し６個の特異なクローニング部位、融合タンパク質形質発現、及びインサートをファージミド（ブルースクリプトＳＫ−）の形態で迅速に切除する能力を含むがＳＡＭ１００突然変異を欠如し、ＸＬl−ブルーを含む多くのノン−サップ（Non-Sup）Ｆ株上での増殖を可能にするもとのラムダＺapの誘導体（ＡＴＣＣ＃４０，２９８）である。ラムダＺapIIは、ショート（Short）ら著、Nucleic Acids Res．，１６巻、７５８３〜７６００頁、１９８８年に記載されたように、ラムダＺapを制限酵素ＮcoＩで消化することにより生産された４２５４塩基対（bp）ＤＮＡフラグメント中に含まれるラムダＳ遺伝子を置換することによりつくった。この４２５４bpＤＮＡフラグメントを、ベクターを制限酵素ＮcoＩで消化した後、ラムダgt１０（ＡＴＣＣ＃４０，１７９）から分離されたラムダＳ遺伝子を含む４２５４bpＤＮＡフラグメントで置換した。ラムダgt１０から分離された４２５４bpＤＮＡフラグメントを、Current Protocols in Molecular Bioloy，アウスベル（Ausubel）ら、編集、ジョン・ウィリィ・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ＮＹ、１９８７年に記載されたこのような操作のための標準プロトコル及びＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いてもとのラムダＺapベクターにつないだ。
ＶL配列に富むライブラリーをクローン化する調製に際し、ＰＣＲ増幅生産物２μｇ（２．５mg／３０μｌの１５０mＭのNaCl、８mＭのトリス−ＨＣｌ（pH７．５）、６mＭのMgSO4、１mＭのＤＴＴ、２００mg／mlのＢＳＡ、３７℃）を制限酵素ＮcoＩ（３０単位）及びＳpeＩ（４５単位）で消化した。消化した増幅生産物を、Molecular Clonig A Laboratory Manual，マニアチスら編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、（１９８２年）に記載された通常の電気溶出技術を用いて１％のアガロースゲルで精製した。簡単に言えば、消化したＰＣＲ増幅生産物のゲル電気溶出の後に、適当なサイズのＶL暗号ＤＮＡフラグメントを含むゲルの領域を切除し、透析膜に電気溶出し、エタノールで沈殿させ、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び／mＭのＥＤＴＡを含む溶液中で１０ng／mlの最終濃度で再懸濁した。
複素の異なるＶL暗号ＤＮＡ同族体に相当する等モル量のDNAを、ＮcoＩ及びＳpeＩで前もって切断されたｐブルースクリプトＳＫ−ファージミドベクターにつないた。連鎖混合物の一部を、製造業者の指示を用いてエピクイアン・コリ（Epicuian Coli）XL1−ブルーコンピテント細胞（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）に形質転換した。形質転換体ライブラリーは３％未満の非組換えバックグラウンドを含む１．２×１０3個のコロニー形成単位／μｇのＶL同族体からなることを測定した。
7．ＶH暗号ｃＤＮＡライブラリーからプラスミドの配列の決定
ラムダＺapIIファージクローンを分析するために、製造業者の指示（ストラタゲン・クローニング・システム、ラ・ジョラ、CA）に従ってクローンをラムダＺapからプラスミドに切除した。簡単に言えば、ファージプラークを寒天プレートからコアを形成し、５０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１００mＭのNaCl、１０mＭのMgSO4、及び０．０１％のゼラチンを含む緩衝液５００μl及びクロロホルム２０μｌを含む無菌ミクロフュージ（microfuge）管に移した。
切除のため、ファージ原液２００μｌ、ＸＬ１−ブルー細胞（Ａ600＝１．００）２００μｌ及びＲ４０８ヘルパーファージ（１×１０llpfu／ml）１μｌを３７℃で１５分間保温した。切除したプラスミドをＸＬ１−ブルー細胞に感染させ、アンピシリンを含むＬＢプレートに塗布した。二本鎖ＤＮＡを、ホルメス（Holmes）らにより記載された方法（Anal．Biochem．１１４巻、１９３頁（１９８１年）を参照のこと）に従ってファージミドを含む細胞から調製した。まずクローンをＰvuIIまたはＢglＩのいずれかによる制限消化によりＤＮＡインサートに関してスクリーニングし、想像上のＶHインサートを含むクローンをサンガー（Sanger）らにより記載された一般方法（Proc．Natl．Acad．Sci，USA，７５巻、５４６３〜５４６７頁、（１９７７年）を参照のこと）及びストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡからのＡＭＶ逆転写酵素35Ｓ−ｄＡＴＰ配列動決定キットに於ける製造業者の指示に於いて与えられたこの方法の特別の改良に従って逆転写酵素を用いて配列を決定した。
8．クローン化したＶHレパートリーの特性決定
Ｘho１及びＥcoＲＩで消化されラムダＺＡＰにクローン化された増幅生産物は、９．０×１０5pfuを有するｄＤＮＡライブラリーをもたらした。ライブラリーがＶH暗号ＤＮＡ同族体の種々の集団からなることを確かめるために、ライブラリーから任意に選ばれた１８のクローンのＮ−末端１２０塩基を切除し配列を決定した（第５図を参照のこと）。クローンがＶH遺伝子源のものであるかどうかを決定するため、クローン化した配列を既知のＶH配列及びＶL配列と比較した。クローンは既知のＨ鎖源の配列と８０〜９０％の相同性を示し、Sequence of Proteins of Immunological Interest、カボット（kabot）ら、第４編、U．S．Dept．of Health and Human Sciences、（1987年）に於いて入手し得る配列と比較する時にＬ鎖源の配列と殆ど相同性を示さなかった。これは、ライブラリーがＬ鎖配列の如きその他の配列に優先して所望のＶH配列に関して富化されることを示した。
集団の多様性を、配列決定クローンを予め特定したサブグループ（第５図）に分類することにより評価した。マウスＶH配列を１１のサブグループ（第５図）に分類した。マウスＶH配列を、Sequence of Proteins of Immunological Interestカボットら、第４編、U．S．Dept．of Health and Human Sciences、（1987年）；ディルドロップ（Dildrop）著、Immunology Today、５巻８４頁（１９８４年）；及びブロデュアー（Brodeur）ら著、Eur．J．Immunol．，１４巻、９２２頁、（１９８４年）に記載されたフレームワークアミノ酸配列に基く１１のサブグループ〔Ｉ（Ａ、Ｂ）、II（Ａ、Ｂ、Ｃ）、III（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）、Ｖ（Ａ、Ｂ）〕に分類する。配列決定したクローンの分類は、ｃＤＮＡライブラリーが少なくとも７つの異なるサブグループのＶH配列を含むことを示した。更に、配列決定したクローン間の相同性の対状の（pairwise）比較は、二つの配列が全ての部分で同一ではないことを示し、配列分析により特性決定が可能である程度に集団が異なることを示唆した。
クローン（Ｌ３６〜５０、第５図）のうちの６個はサブクラスIIIＢに属し、非常に類似するヌクレオチド配列を有していた。これは刺激した脾臓中の一つまたは幾つかの関連する可変遺伝子から誘導されるｍＲＮＡの優勢を反映し得るが、そのデータは増幅法に於けるバイアスの可能性を除外することを許さない。
9．ＶH形質発現ベクター構成
ベクター系を選択するのに使用した主な基準は、直接スクリーニングし得る最大数のＦabフラグメントを生じることの必要性であった。バクテリオファージラムダを三つの理由で形質発現ベクターとして選択した。第一に、ファージＤＮＡの試験管内パッケージングはＤＮＡを宿主細胞に再導入する最も有効な方法である。第二に、タンパク質形質発現を単一ファージプラークのレベルで検出することが可能である。最後に、ファージライブラリーのスクリーニングは典型的に非特異的な結合による難点を殆ど伴なわない。別のプラスミドクローニングベクターは、それらが同定された後に、クローンの分析にのみ有利である。この利点はラムダＺapの使用のために本系に於いて失なわれず、それによりＨ鎖、Ｌ鎖、またはＦab形質発現インサートを含むプラスミドが切除されることを可能にする。
大腸菌宿主細胞中で複数のＶH暗号ＤＮＡ同族体を形質発現するために、ＶH暗号ＤＮＡ同族体を適当な読取り枠中に入れ、シャイン（Shine）らにより記載されたリボソーム結合部位（Nature、２５４巻、３４頁、１９７５年を参照のこと）を与え、形質発現タンパク質をペリプラズム間隙に送るリーダー配列を与え、既知のエピトープ（エピトープtag）に関して暗号化するポリヌクレオチド配列を与え、且つまたＶH暗号ＤＮＡ同族体とエピトープtagに関して暗号化するポリヌクレオチドとの間のスペーサータンパク質に関して暗号化するポリヌクレオチドを与えるベクターをつくった。上記のポリヌクレオチド及び特徴の全てを含む合成ＤＮＡ配列を、互いにハイブリッドを形成し第６図に示された二本鎖合成ＤＮＡ配列を形成する２０〜４０の塩基の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することによりつくった。個々の一本鎖ポリヌクレオチド（Ｎ1〜Ｎ12）を表３に示す。
ポリヌクレオチド２、３、９−４′、１１、１０−５′、６、７及び８を、夫々のポリヌクレオチド（０．１μｇ／μｌ）１μｌ及び２０単位のＴ4ポリヌクレオチドキナーゼを７０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．６、１０mＭのMgCl2、５mＭのＤＴＴ、１０mＭの２ＭＥ、５００μｇ／mlのＢＳＡを含む溶液に添加することによりキナーゼ処理した。その溶液を３７℃で３０分間保ち、溶液を６５℃で１０分間保つことにより反応を停止した。二つの末端ポリヌクレオチド、即ちポリヌクレオチドＮ１及びポリヌクレオチドＮ１２  ２０ngを、２０．０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．４、２．０mＭのMgCl2及び５０．０mＭのNaClを含む１／１０容量の溶液と共に、上記のキナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液を７０℃で５分間加熱し、５００mlの水のビーカー中で室温約２５℃に１．５時間にわたって冷却した。この期間中に全ての１０のポリヌクレオチドはアニールして第６Ａ図に示された二本鎖合成ＤＮＡインサートを形成した。個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合で連鎖し、上記の反応液４０μｌを５０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、７mＭのMgCl2、１mＭのＤＴＴ、１mＭのアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）及び１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に添加することにより合成ＤＮＡインサートを安定化した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つことによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活した。末端ポリヌクレオチドを、上記の反応液５２μｌ、１０mＭのＡＴＰを含む溶液４μｌ及び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することによりキナーゼ処理した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つことによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活した。完全合成ＤＮＡインサートを、制限酵素ＮotＩ及びＸhoＩで前もって消化したラムダＺapIIベクターに直接つないだ。連鎖混合物を、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡから入手し得るギガパックIIゴールドパッキング抽出物を用いて製造業者の指示に従って包装した。包装した連鎖混合物をｘＬ１ブルー細胞（ストラタゲン・クローニング・システムズ、サンジエゴ、ＣＡ）に塗布した。個々のラムダＺapIIプラークをコア形成し、インサートを製造業者、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡにより与えられた生体内切除プロトコルに従って切除した。この生体内切除プロトコルはクローン化したインサートをラムダＺapIIベクターからプラスミドベクターへと移動させ、容易な摸作及び配列の決定を可能にする。上記のクローニング工程の正確度を、サンガーら著、Proc．Natl．Acad．Sci USA、７４巻、５４６３〜５４６７頁、（１９７７年）に記載されたサンガージデオキシド法を用い、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡからのＡＭＶ逆転写酵素35Ｓ−ATP配列決定キットに於ける製造業者の指示を用いてインサートを配列決定することにより確認した。得られたＶH形質発現ベクターの配列を第６Ａ図及び第７図に示す。
0003992290.tif 000009
10．ＶL形質発現ベクター構成
大腸菌宿主細胞中で複数のＶL暗号ポリヌクレオチドを形質発現するために、ＶL暗号ポリヌクレオチドを適当な読取り枠に入れ、シャインらにより記載されたようなリボソーム結合部位（Nature、２５４巻、３４頁（１９７５年）に参照のこと）を与え、形質発現タンパク質をぺリプラズム間隙に送るリーダー配列を与え、且つまたＶLポリヌクレオチドとエピトープtagに関して暗号化するポリヌクレオチドとの間のスペーサータンパク質に関して暗号化するポリヌクレオチドを与えるベクターをつくった。上記のポリヌクレオチド及び特徴の全てを含む合成ＤＮＡ配列を、互いにハイブリッドを形成し第６Ｂ図に示された二本鎖合成DNA配列を形成する２０〜４０の塩基の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することによりつくった。個々の一本鎖ポリヌクレオチド（Ｎ1〜Ｎ8）を表３に示す。
ポリヌクレオチドＮ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ６、Ｎ７及びＮ８を、夫々のポリヌクレオチド１μｌ及び２０単位のＴ4ポリヌクレオチドキナーゼを７０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．６、１０mＭのMgCl2、５mＭのＤＴＴ、１０mＭの２ＭＥ、５００μｇ／mlのＢＳＡを含む溶液に添加することによりキナーゼ処理した。その溶液を３７℃で３０分間保ち、溶液を６５℃で１０分間保つことにより反応を停止した。二つの末端ポリヌクレオチド、即ちポリヌクレオチドＮ１及びポリヌクレオチドＮ５  ２０ngを、２０．０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．４、２．０mＭのMgCl2及び５０．０mＭのNaClを含む１／１０容量の溶液と共に、上記のキナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液を７０℃で５分間加熱し、５００mlの水のビーカー中で室温約２５℃に１．５時間にわたって冷却した。この期間中に全てのポリヌクレオチドはアニールして二本鎖合成ＤＮＡインサートを形成した。個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合で連鎖し、上記の反応液４０μｌを５０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、７mＭのMgCl2、１mＭのＤＴＴ、１mＭのＡＴＰ及び１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に添加することにより合成ＤＮＡインサートを安定化した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つことによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活した。末端ポリヌクレオチドを、上記の反応液５２μｌ、１０mＭのＡＴＰを含む溶液４μｌ及び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することによりキナーゼ処理した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つことによりポリヌクレオチドキナーゼを失活した。完全合成ＤＮＡインサートを、制限酵素ＮotＩ及びＸhoＩで前もって消化したラムダＺapIIベクターに直接つないだ。連鎖混合物を、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡから入手し得るギガパックIIゴールドパッキング抽出物を用いて製造業者の指示に従って包装した。包装した連鎖混合物をＸＬ１ブルー細胞（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）に塗布した。個々のラムダＺapIIプラークをコア形成し、インサートを製造業者、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ・ＣＡにより与えられショートら著Nucleic Acids Res．１６巻、７５８３〜７６００頁１９８８年に記載された生体内切除プロトコルに従って切除した。この生体内切除プロトコルはクローン化したインサートをラムダＺapIIベクターからプラスミドベクターへと移動させ、容易な操作及び配列の決定を可能にし、またＶL形質発現ベクターのファージミド変種を生産する。上記のクローニング工程の正確度を、サンガーら著、Proc．Natl．Acad．Sci USA、７４巻、５４６３〜５４６７頁、（１９７７年）に記載されたサンガージデオキシド法を用い、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡからのＡＭＶ逆転写酵素35Ｓ−ｄＡＴＰ配列決定キットに於ける製造業者の指示を用いてインサートを配列決定することにより確認した。得られたＶL形質発現ベクターの配列を第６図及び第８図に示す。
ＶLライブラリーをつくるのに使用したＶL形質発現ベクターは、ＶL形質発現ベクターのＤＮＡが決定されることを可能にするために生産されたファージミドであった。上で詳述されたように、ファージミドをラムダＺapＶL形質発現ベクター（第８図）からの生体内切除法により生産した。このベクターのファージミド変種を使用した。何となれば、ＮcoＩ制限酵素部位はこの変種中で特異であり、こうしてＶLＤＮＡ同族体を形質発現ベクターに操作上連鎖するのに使用し得たからである。
11．ＶLII−形質発現ベクター構成
大腸菌宿主細胞中で複数のＶL暗号ＤＮＡ同族体を形質発現するために、ＶL暗号ＤＮＡ同族体を適当な読取り枠中に入れ、シャインらにより記載されたようなリボソーム結合部位（Nature、２５４巻、３４頁、１９７５年を参照のこと）を与え、ライ（Lei）ら（J．Bac．，１６９巻、４３７９頁（１９８７年））及びベター（Better）ら（Science、２４０巻、１０４１頁（１９８８頁））により大腸菌中でＦabフラグメントをうまく分泌するのに従来使用されていたＰelＢ遺伝子リーダー配列を与え、且つまたクローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリヌクレオチドを与えるベクターをつくった。上記のポリヌクレオチド及び特徴の全てを含む合成ＤＮＡ配列を、互いにハイブリッドを形成し、第１０図に示された二本鎖合成ＤＮＡ配列を形成する２０〜６０の塩基の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することによりつくった。二本鎖合成ＤＮＡ配列内の夫々個々の一本鎖ポリヌクレオチド（０１〜０８）の配列を表４に示す。
ポリヌクレオチド０２、０３、０４、０５、０６及び０７を、夫々のポリヌクレオチド（０．１μｇ／μｌ）１μｌ及び２０単位のＴ4ポリヌクレオチドキナーゼを７０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．６、１０mＭの塩化マグネシウム（MgCl2）、５mＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０mＭの２−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、５００μｇ／mlのウシ血清アルブミンを含む溶液に添加することによりキナーゼ処理した。その溶液を３７℃で３０分間保ち、溶液を６５℃で１０分間保つことにより反応を停止した。二つの末端ポリヌクレオチド、０１及び０８の夫々２０ngを、２０．０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．４、２．０mＭのMgCl2及び１５．０mＭの塩化ナトリウム（NaCl）を含む１／１０容量の溶液と共に、上記のキナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液を７０℃で５分間加熱し、５００mlの水のビーカー中で室温約２５℃に１．５時間にわたって冷却した。この期間中に全ての８のポリヌクレオチドはアニールして第９図に示された二本鎖合成ＤＮＡインサートを形成した。個々のポリヌクレオチドを互いに共有結合で連鎖し、上記の反応液４０μｌを５０mＭのトリス−１０ＨＣｌ、pH７．５、７mＭのMgCl2、１mＭのＤＴＴ、１mＭのＡＴＰ及び１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含む溶液に添加することにより合成ＤＮＡインサートを安定化した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つことによりＴ４ＤＮＡリガーゼを失活した。末端ポリヌクレオチドを、上記の反応液５２μｌ、１０mＭのＡＴＰを含む溶液４μｌ及び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを混合することによりキナーゼ処理した。この溶液を３７℃で３０分間保ち、その後、溶液を６５℃で１０分間保つことによりＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活した。完全合成ＤＮＡインサートを、制限酵素ＮotＩ及びＸhoＩで前もって消化したラムダＺapIIベクターに直接つないだ。連鎖混合物を、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡから入手し得るギガパックIIゴールドパッキング抽出物を用いて製造業者の指示に従って包装した。包装した連鎖混合物をＸＬ１ブルー細胞（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）に塗布した。個々のラムダＺapIIプラークをコア形成し、インサートを製造業者、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡにより与えられた生体内切除プロトコルに従って切除した。この生体内切除プロトコルはクローン化したインサートをラムダＺapIIベクターからプラスミドベクターへと移動させ、容易な操作及び配列の決定を可能にする。上記のクローニング工程の正確度を、ストラタゲンクローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡからのＡＭＶ逆転写酵素35Ｓ−ｄＡＴＰ配列決定キットに於ける製造業者の指示を用いてインサートを配列決定することにより確認した。得られたＶLII形質発現ベクターの配列を第９図及び第１１図に示す。
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12．ＶH＋ＶLライブラリー構成
ＶH配列に富む形質発現ライブラリーを調製するために、ＶH配列に富むＤＮＡ同族体を、５′プライマーの同じ組を使用するが３′プライマーとしてプライマー１２Ａ（表１）を用いて実施例６に従って調製した。その後、これらの同族体を制限酵素XhoI及びＳpeＩで消化し、Molecular Cloning Laboratory Manual、マニアチスら編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、（１９８２年）に記載された通常の電気溶出技術を用いて１％のアガロースゲルで精製した。その後、これらの調製したＶHDNA同族体を、ＸhoＩ及びＳpeＩで前もって消化されたＶH形質発現ベクターに直接挿入した。
ＶHＤＮＡ同族体を含む連鎖混合物を、ギガパック・ゴールドIIパッキング抽出物（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）を使用して製造業者の仕様書に従って包装した。その後、形質発現ライブラリーをＸＬ−１ブルー細胞に塗布されるように準備した。
ＶL配列に富むライブラリーを調製するために、ＶL配列に富むＰＣＲ増幅生産物を実施例６に従って調製した。これらのＶLＤＮＡ同族体を制限酵素ＮcoＩ及びＳpeＩで消化した。消化したＶLＤＮＡ同族体を、Molecular Cloning A Laboratory Manual、マニアチスら編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２年）に記載された通常の電気溶出技術を用いて１％のアガロースゲルで精製した。調製したＶLＤＮＡ同族体を、制限酵素ＮcoＩ及びＳpeＩで前もって消化されたＶL形質発現ベクターに直接挿入した。ＶLＤＮＡ同族体を含む連鎖混合物を、製造業者（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）の指示を用いてＸＬ−１ブルーコンピテント細胞に形質転換した。
13．ＶL形質発現ベクター中へのＶL暗号ＤＮＡ同族体の挿入
ＶL配列に富むライブラリーをクローン化するための調製に於いて、ＰＣＲ増幅生産物（２．５μｇ／３０μｌの１５０mＭのNaCl、８mＭのトリス−ＨＣｌ（pH７．５）、６mＭのMgSO4、１mＭのＤＴＴ、２００μｇ／mlのＢＳＡ、３７℃を、制限酵素ＳacＩ（１２５単位）及びＸbaＩ（１２５単位）で消化し、１％のアガロースゲルで精製した。増幅反応の生産物の混合物を必要とするクローニング実験に於いて、等容量（５０μｌ、１〜１０μｇ濃度）の夫々の反応混合物を増幅の後で制限消化の前に組合せた。消化したＰＣＲ増幅脾臓ｍＲＮＡのゲル電気泳動の後に、約３５０bpのＤＮＡフラグメントを含むゲルの領域を切除し、透析膜に電気溶出し、エタノールで沈殿させ、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び１mＭのＥＤＴＡを含むＴＥ溶液中で５０ng／μｌの最終濃度に再懸濁した。
ＶL形質発現ＤＮＡベクターを、このＤＮＡ１００μｇを夫々２５０単位の制限エンドヌクレアーゼＳacＩ及びＸbaＩ（両方ともボーリンガー・マンハイム（Boehringer Mannheim）、インジアナポリス、ＩＮから入手した）並びに製造業者により推奨された緩衝液を含む溶液に添加することによりクローン化のために調製した。この溶液を３７℃で１．５時間保った。その溶液を６５℃で１５分間保って制限エンドヌクレアーゼを失活した。溶液を３０℃に冷却し、製造業者の仕様書に従って熱死滅性（heat-killable）（ＨＫ）ホスファターゼ（エピセンター（Epicenter）、マジソン、ＷＩ）２５単位及びCaCl2をそれに添加した。この溶液を３０℃で１時間保った。その溶液をフェノールとクロロホルムの混合物で抽出し、続いてエタノールで沈殿させることにより精製した。今ここに、ＶLII形質発現ベクターが、上記の実施例で調製したＶLＤＮＡ同族体への連鎖のために準備された。
ＶL配列に富むＤＮＡ同族体を、表２に示された３′Ｌ鎖プライマー及び５′Ｌ鎖プライマーを使用して実施例５に従って調製した。個々の増幅反応を、３′Ｌ鎖プライマーと組合せて夫々の５′Ｌ鎖プライマーを使用して行なった。これらの別個のＶL同族体を含む反応混合物を混合し、実施例６に従って制限エンドヌクレアーゼＳacＩ及びＸhaＩで消化した。ＶL同族体を、Molecular Cloning A Laboratory Manual、マニアチスら、編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、（１９８２年）に記載された通常の電気溶出技術を用いて１％のアガロースゲルで精製した。その後、これらの調製したＶLＤＮＡ同族体を、３モルのＶLＤＮＡ同族体インサートを各モルのＶLII形質発現ベクターと５℃で一夜つなぐことにより、上で調製されたＳac１−Ｘba開裂ＶLII形質発現ベクターに直接挿入した。ＤＮＡをギガパックIIボールド（ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡ）で包装した後、３×１０5のプラーク形成単位を得、５０％が組換体であった。
14．同一の形質発現ベクターに於けるＶHＤＮＡ同族体及びＶLＤＮＡ同族体の無秩序の組合せ
実施例１３で調製したＶLII形質発現ライブラリーを増幅し、ＶLII形質発現ライブラリーファージＤＮＡ５００μｇをMolecular Cloning:A Laboratory MauaL：、マニアチスら、編集コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２年）に記載された操作を用いて増幅ファージ原液から調製した。このＶLII形質発現ファージＤＮＡ５０μｇを、エンドヌクレアーゼ製造業者により供給された緩衝液２００μｌ中に１００単位のＭＬuＩ制限エンドヌクレアーゼ（ボーリンガー・マンハイム、インジアナポリス、ＩＮ）を含む溶液中で３７℃で１．５時間保った。その後、溶液をフェノールとクロロホルムの混合物で抽出した。その後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ水１００μｌ中で再懸濁した。この溶液を、製造業者により規定された成分を含む緩衝液の最終容量２００μｌ中の１００単位の制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩ（ボーリンガー・マンハイム、インジアナポリス、ＩＮ）と混合した。この溶液を３７℃で１．５時間保ち、その後、溶液をフェノールとクロロホルムの混合物で抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＤＮＡをＴＥ中で再懸濁した。
実施例１２で調製したＶH形質発現ライブラリーを増幅し、ＶH形質発現ライブラリーファージＤＮＡ５００μｇを上で詳述した方法を使用して調製した。ＶH形質発現ライブラリーファージＤＮＡ５０μｇを、エンドヌクレアーゼ製造業者により供給された穣衝液２００μｌ中に１００単位のＨindIII制限エンドヌクレアーゼ（ボーリンガー・マンハイム・インジアナポリス、ＩＮ）を含む溶液中で３７℃で１．５時間保った。その後、その溶液を、０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、pH７．５で飽和されたフェノールとクロロホルムの混合物で抽出した。その後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ水１００μｌ中で再懸濁した。この溶液を、製造業者により規定された成分を含む緩衝液の最終容量２００μｌ中の１００単位の制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩ（ボーリンガー・マンハイム・インジアナポリス、ＩＮ）と混合した。この溶液を３７℃で１．５時間保ち、その後、溶液をフェノールとクロロホルムの混合物で抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ＤＮＡをＴＥ中で再懸濁した。
制限消化したＶH形質発現ライブラリー及びＶLII形質発現ライブラリーを一緒につないだ。連鎖反応は、ストラタゲン・クローニング・システムズ（ラ・ジヨラ、カリフォルニア）から購入した連鎖キット中に供給された試薬を使用する１０μｌの反応液中にＶH１μｇ及びＶLIIファージライブラリー１μｇからなっていた。４℃で１６時間の連鎖後に、つながれたファージＤＮＡ１μｌをギガパック・ゴールドII包装抽出物で包装し、製造業者の指示に従って調製されたＸＬ１−ブルー細胞に塗布した。得られた３×１０6のクローンの一部を使用して組合せの有効性を測定した。得られたＶH及びＶL形質発現ベクターを第１１図に示す。
ＶH及びＶLの両方を含むクローンを、ショートら著、Nucleic Acid Research、１６巻、７５８３〜７６００頁（１９８８年）に記載された試験管内切除プロトコルを用いてファージからｐブルースクリプトに切除した。切除のために選ばれたクローンはデカペプチドtagを形質発現し、２mＭのＩＰＴＧの存在下にＸ−galを開裂せず、こうして白色のままであった。これらの特徴を備えたクローンはライブラリーの３０％に相当した。切除のために選ばれたクローンの５０％は制限分析により測定されるようにＶH及びＶLを含んでいた。ＶHライブラリー中のクローンの約３０％はデカペプチドtagを形質発現しＶLIIライブラリーのクローンの５０％はＶL配列を含んでいたので、組合せライブラリー中のクローンの１５％以下はＶHクローン及びＶLクローンの両方を含むことが予想された。得られた実際の数はライブラリーの１５％であり、組合せの方法が非常に有効であることを示した。
15．ＶH抗原結合タンパク質のためのＤＮＡ同族体の分離
ＶH抗原結合タンパク質に関して暗号化するＤＮＡ同族体を含む個々のクローンを分離するために、実施例１１に従って調製したＶH形質発現ライブラリーの力価を測定した。このライブラリー滴定を、当業者に公知の方法を用いて行なった。簡単に言えば、ライブラリーの連続希釈液を１００mＭのNaCl、５０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び１０mＭのMgSO4を含む緩衝液中でつくった。夫々の希釈液１０μｌを指数的に増殖する大腸菌細胞200μｌに添加し、３７℃で１５分間保ってファージを細菌細胞に吸収された。上部の寒天３mlは５ｇ／ｌのNaCl、２ｇ／ｌのMgSO4、５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのＮＺアミン（カゼイン加水分解産物）及び０．７％の融解した５０℃のアガロースからなっていた。ファージ、細菌及び上部の寒天を混合し、その後、予め温めた細菌寒天プレート（５ｇ／ｌのNaCl、２ｇ／ｌのMgSO4、５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのＮＺアミン（カゼイン加水分解産物）及び１５ｇ／ｌのジフコ寒天）の表面に均等に分布させた。プレートを３７℃で１２〜２４時間保ち、その期間中にラムダプラークが細菌ローン上で発生した。ラムダプラークを計数してもとのライブラリー中の１ml当りのプラーク形成単位の合計数を測定した。
その後、滴定した形質発現ライブラリーを、複製フィルターがライブラリーからつくれるようにプレートアウト（plate out）した。複製フィルターは、関係する抗原結合タンパク質を形質発現しているライブラリー中の個々のクローンをその後に分離するのに使用される。簡単に言えば、１５０ｍｍのプレート当り20,000のプラークを生じる容量の滴定したライブラリーを、指数的に増殖する大腸菌細胞６００μｌに添加し、３７℃で１５分間保ってファージを細菌細胞に吸収させた。その後、上部の寒天７．５mlを、細菌細胞及び吸収ファージを含む溶液に添加し、全混合物を予め温めた細菌寒天プレートの表面に均等に分布させた。この方法を、ライブラリーサイズに少なくとも等しい合計数のプラークをプレートアウトするのに充分な数のプレートに関して繰返した。その後、これらのプレートを３７℃で５時間保った。その後、プレートを、１０mＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含む溶液で前処理されたニトロセルロースフィルターでオーバーレイし、３７℃で４時間保った。プレートに対するニトロセルロースフィルターの配向を、フィルターを通って数ケ所で細菌プレートに至る防水インク中に浸漬されたニードルで穴をあけることによりマークした。ニトロセルロースフィルターをピンセットで取り出し、２０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１５０mＭのNaCl及び０．０５％モノラウレート（トゥイーン−２０）を含むＴＢＳＴ溶液中で１回洗浄した。また、１０mＭのＩＰＴＧを含む溶液中で浸軟された第二ニトロセルロースフィルターを細菌プレートに再度適用して二重フィルターをつくった。フィルターをＴＢＳＴの新しい溶液中で１５分間更に洗浄した。その後、フィルターを、２０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５、１５０mＭのNaCl及び１％のＢＳＡからなるブロッキング溶液中に入れ、室温で１時間攪拌した。ニトロセルロースフィルターを、一次抗体の１：５００希釈液を含む新しいブロッキング溶液に移し、室温で少なくとも１時間にわたって穏かに攪拌した。フィルターを一次抗体を含む溶液中で攪拌した後、フィルターをTBST中で毎回５分間で３〜５回洗浄して残留の未結合一次抗体を除去した。フィルターを新しいブロッキング溶液及びアルカリホスファターゼ接合二次抗体の１：５００〜１：１０００希釈液を含む溶液に移した。フィルターを、その溶液中で室温で少なくとも１時間にわたって穏かに攪拌した。フィルターをＴＢＳＴの溶液中で毎回少なくとも５分間で３〜５回洗浄して残留の未結合二次抗体を除去した。フィルターを、２０mＭのトリス−ＨＣｌ、pＨ７．５及び１５０mＭのNaClを含む溶液中で１回洗浄した。フィルターをこの溶液から取り出し、過剰の水分を濾紙でそれらから吸い取った。フィルターを、１００mＭのトリス−ＨＣｌ、pH９．５、１００mＭのNaCl、５mＭのMgCl2、０．３mg／mlのニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及び０．１５mg／mlの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート（ＢＣＩＰ）を含む溶液中に室温で少なくとも３０分間入れることにより発色させた。残留発色溶液を、２０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５及び１５０mＭのNaClを含む溶液でフィルターからすすいだ。その後、フィルターを２０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH２．９及び１mＭのＥＤＴＡからなるストップ溶液中に入れた。強い紫色の発色が陽性の結果を示す。フィルターを使用して所望のタンパク質を生産したファージプラークを配置する。そのファージプラークを分離し、その後、更に分析するために増殖させる。
一次抗体及び二次抗体の幾つかの異なる組合せを使用した。第一の組合せは、ＶH抗原結合タンパク質が翻訳の解読をＶH抗原タンパク質に共有結合で付着されるデカペプチドエピトープを含むようにさせるのに適当な読取り枠で形質発現される場合にのみ形質発現されるデカペプチドに対して免疫特異的な一次抗体を使用した。このデカペプチドエピトープ及びこのデカペプチドエピトープに対し免疫特異的な抗体は、グリーン（Green）ら著、Cell２８巻、１７７頁（１９８２年）及びニーマン（Niemann）ら著、Proc．Nat．Acad．Sci．U．S．A．８０巻、４９４９頁（１９８３年）に記載されていた。認識されたデカペプチドの配列を第１１図に示す。デカペプチドに対し免疫特異的であるモノクローナル抗体の機能上の均等物はグリーンらの方法及びニーマンらの方法に従って調製し得る。この一次抗体と共に使用した二次抗体は、ヤギ抗マウスＩgＧ（フィッシャー・サイエンティフック（Fisher Scientific）であった。この抗体はマウスＩgＧの一定の領域に対して免疫特異的であり、Ｈ鎖の可変領域の部分を認識しなかった。一次抗体及び二次抗体のこの特別な組合せは、上記のプロトコルに従って使用された場合に、クローンの２５％〜３０％がデカペプチドを形質発現していることを測定し、それ故これらのクローンはまたＶH抗原結合タンパク質を形質発現していることが推定された。
別の組合せに於いて、抗デカペプチドマウスモノクローナル抗体を一次抗体として使用し、ストラタゲン・クローニング・システムズ、ラ・ジョラ、ＣＡからピコブルー免疫スクリーニングキットの部分として市販されるアフィニティー精製ヤギ抗マウスIgを二次抗体として使用した。この組合せは多数の偽陽性クローンを生じた。何となれば、二次抗体がまたＨ鎖のＶHと免疫反応したからである。それ故、この抗体はＶHタンパク質を形質発現する全てのクローンと反応し、一次抗体と二次抗体のこの組合せは適当な読取り枠中のＶHポリヌクレオチドを含むクローンを特異的に検出せず、こうしてデカペプチドの形質発現を可能にする。
一次抗体が螢光性イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に接合される場合に、一次抗体と二次抗体の幾つかの組合せが使用され、こうして抗体の免疫特異性は重要ではなかった。何となれば、抗体が予め選択された抗原（ＦＩＴＣ）に接合され、形質発現ライブラリー中のクローンにより生産されるＶH抗原結合タンパク質により結合されるべきものはその抗原であるからである。この一次抗体が有効に結合された後、それはＦＩＴＣ接合マウスモノクローナル抗体ｐ２  ５７６４（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−９５０５）である。この一次抗体と使用される二次抗体は、Antibodies A Lahoratory Manual、ハーロウ（Harlow）及びロウ（Lowe）、編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、（１９８８年）に記載された方法を用いてアルカリホスファターゼに接合されたヤギ抗マウスＩg6（フィッシャー・サイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）である。ＶH形質発現ライブラリー中の特別なクローンが一次抗体に共有結合でカップリングされたＦＩＦＣを結合するＶH結合タンパク質を形質発現する場合、二次抗体が特異的に結合し、発色される場合アルカリホスファターゼは明瞭な紫色を生じさせる。
その型の抗体の第二の組合せは、ＦＩＴＣ接合ウサギ抗ヒトＩgＧ（フィッシャー・サイエンティフィック、ピッツバーグ、ＰＡ）である一次抗体を使用する。この一次抗体と共に使用される二次抗体は、Antibodies A Laboratory Manual、ハーロウ及びレーン、編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ、（1988年）に記載された方法を用いてアルカリホスファターゼに接合されたヤギ抗ウサギＩgＧである。ＶH形質発現ライブラリー中の特別なクローンが一次抗体に接合されたＦＩＴＣを結合するＶH結合タンパク質を形質発現する場合、二次抗体は特異的に結合し、発色される場合アルカリホスファターゼは明瞭な紫色を生じさせる。
その他の一次抗体は、ＦＩＴＣと125Ｉの両方に接合されたマウスモノクローナル抗体ｐ２  ５７６４（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−9505）であった。その抗体は形質発現されたいずれかのＶH抗原結合タンパク質により結合される。その場合、抗体はまた125Ｉでラベルされるので、アルカリホスファターゼに接合される二次抗体を使用する代わりにフィルターのオートラジオグラムがつくられる。オートラジオグラムのこの直接の生産が関係のあるＶH抗原結合タンパク質を形質発現するライブラリー中のクローンの分離を可能にする。
16．抗原結合ＦVを形成するＶH及びＶLのためのＤＮＡ同族体の分離
抗原結合ＦVを形成するＶH及びＶLに関して暗号化するDNA同族体を含む個々のクローンを分離するため、ＶH及びＶL形質発現ライブラリーを実施例１５に従って滴定した。その後、滴定した形質発現ライブラリーを、実施例１５に記載された方法を用いてＶHで形質発現されたデカペプチドtagの存在に関してスクリーニングした。その後、ＤＮＡをデカペプチドtagを形質発現するクローンから調製した。このＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＰvuIIで消化して、これらのクローンがまたＶLＤＮＡ同族体を含むか否かを測定した。ＰvuII制限エンドヌクレアーゼフラグメントの一層遅い移行は、特別なクローンがＶHDNA同族体及びＶLＤＮＡ同族体の両方を含むことを示した。
ＶHＤＮＡ同族体及びＶLＤＮＡ同族体の両方を含むクローンを分析して、これらのクローンがＶHＤＮＡ同族体及びＶLＤＮＡ同族体から組立てＦVタンパク質分子を生産するか否かを測定した。
ＶH及びＶLの両方を含むクローン中に生産されたＦVタンパク質フラグメントを、クローン中に形質発現された放射能でラベルしたタンパク質の免疫沈殿により視覚化した。１００μｇ／μｌのアンピシリンを含むＬＢブロース（５ｇ／ｌの酵母エキス、１０ｇ／ｌのトリプトン及び１０ｇ／ｌのNaCl、pH７．０）の培養液に、ＶH及びＶLを含むプラスミドを含む大腸菌を接種した。培養液を、５５０nmで測定される光学密度が０．５になるまで振とうしながら３７℃に保ち、その後、培養液を３，０００ｇで１０分間遠心分離し、メチオニンまたはシステインを含まずアミノ酸で補給されたＭ９培地５０ml（６ｇ／ｌのNa2HPO4、３ｇ／ｌのKH2PO4、０．５ｇ／ｌのNaCl、１ｇ／ｌのNH4Cl、２ｇ／ｌのグルコース、２mＭのMgSO4及び０．１mＭのCaCl2）中に再懸濁した。この溶液を３７℃で５分間保ち、その後HSO4-としての35Ｓ（ニュー・イングランド・ヌクレアー（New England Nuclear）、ボストン、ＭＡ）０．５ｍCiを添加し、その溶液を３７℃で更に２時間保った。その後、溶液を３０００×ｇで遠心分離し、上澄液を廃棄した。得られた細菌細胞ペレットを凍結し、融解し、その後４０mＭのトリス、pH８．０、１００mＭの蔗糖及び１mＭのEDTAを含む溶液中で再懸澄した。その溶液を１００００×ｇで１０分間遠心分離し、得られたペレットを廃棄した。上澄液を抗デカペプチドモノクローナル抗体１０μｌと混合し、氷上で３０〜９０分間保った。セファローズビーズ（ファーマシア（Pharmacia）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ＮＪ）に結合されたプロテインＧ４０μｌその溶液に添加し、添加溶液を氷上で３０分間保って免疫沈殿物を生成させた。溶液を１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、得られたペレットを１００mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．５を含む溶液１mlに再懸濁し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離した。この操作を２回繰返した。得られた免疫沈殿ペレットを、製造業者の指示に従ってファストゲル・ホモジナウス（Phast Gel Homogenous）２０ゲル（ファーマシア、ピスカタウェイ、ＮＪ）に装填した。ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムを露出するのに使用した。
得られたオートラジオグラムを第１２図に示す。組立てＦV分子の存在は、免疫沈殿させられたＶLの存在によりわかる。何となれば、それは沈殿する抗体により認識されるＶHデカペプチドtagに付着されたからである。
17．選択性ＶH及びＶL形質発現の構成
Ａ．変異体Ｓ遺伝子形質発現プラスミドの構成
バクテリアファージラムダＳ遺伝子は、リーダー（Reader）ら著、Virology、４３巻、６０７〜６２２頁（１９７１年）に記載されるように溶菌に直接関与されると示されていた。Ｓ遺伝子は、ガレット（Garrett）ら著、J．Virology、４４巻、８８６〜８９２頁（１９８２年）に記載されているようにそれがペプチドグリカンを分解する場合に細胞の周辺質中へのＲ遺伝子生産物の放出を可能にする細胞質膜中の致命的な出来事に対して応答性である１０７アミノ酸ポリペプチドを暗号化する。優性Ｓ遺伝子変異体（Ｓ100ＳＡＭ５）は、正常なＳタンパク質膜チャンネルの形成を妨害し、こうして細胞溶解を防止すると示された突然変異である。ラアブ（Raab）ら著、J．Mol．Biol．１９９巻、９５〜１０５頁（１９８８年）を参照のこと。この変異体Ｓ遺伝子は優性である。何となれば、それが形質発現される場合に、野生型Ｓタンパク質の存在下であっても、それは細菌細胞の溶解を防止するからである。また、Ｓ100ＳＡＭ５優性突然変異はアンバー変異を含み、それ故、変異体Ｓタンパク質が生産されるために細菌細胞中のサプレッサーｔＲＮＡの形質発現を必要とする。更に、このアンバー変異は溶解しないで変異体Ｓ遺伝子構成物を含む細菌の増殖を可能にする。何となれば、このアンバー抑制ｔＲＮＡなしでは、機能性Ｓ遺伝子タンパク質が生産されないからである。
ラムダＺap Ｓam５からの優性Ｓ遺伝子を、ポリメラーゼ鎖反応を使用して分離した。簡単に言えば、ラムダＺap Ｓam５DNAを、Molecular Clonig：A Laboratory Manual、マニアチスら、編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２年）に記載された方法を用いて分離した。ラムダＺap Ｓam５ＤＮＡ ０．１μｇを、プライマーＲＧ１５（表５）１５０ng及びプライマー  ＲＧ１６（表５）１５０ng、夫々０．２５mＭのｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＡＴＰ（ｄＮＴＰｓ）、５０mＭのＫＣｌ、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH８．３、１．５mＭのMgCl2、及び０．１５％の無菌ゼラチンを含む緩衝液と混合した。得られた溶液を９１℃に５分間加熱し、その後５４℃の水浴中に５分間入れた。０．５μｌのＴaqポリメラーゼ（パーキン・エルマー−セタス（Perkin Elmer-Cetus）、ノーウォーク、ＣＴ）を添加し、その溶液を鉱油の層でオーバーレイした。
その後、その溶液をＤＮＴサーマル・サイクラー（Thermal Cycler）（パーキン・エルマー−セタス、ノーウォーク、ＣＴ）に入れ、下記の温度及び時間条件に暴露した。（１）プライマー延長を可能にするために７２℃で２分間、（２）二重らせんDNAを熱変性するために９１℃で１分間、及び（３）一本鎖の核酸をハブリッド形成させるために５４℃で２分間。同溶液を、製造業者の指示に従って合計３０のサイクルのために工程（１）、（２）及び（３）の更なるサイクルに暴露した。その後、サイクルした溶液を７２℃で１０分間保ち、その後使用するまで４℃で貯蔵した。
上記のポリメラーゼ鎖反応により生産された変異体Ｓ遺伝子ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＨindIII及びＢglIIで消化した。簡単に言えば、上で生産されたポリメラーゼ鎖反応生成物の半分をフェノール抽出、その後のエタノールによる沈殿により精製した。その後、ＤＮＡを、１００mＭのNaCl、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．７、１９mＭのMgCl2、１mＭのＤＴＴ、１００μｇ／mlのＢＳＡ、２０単位のＨindIII及び１０単位のＢglIIを含む溶液と混合した。この溶液を３７℃で１時間保った。この制限エンドヌクレアーゼ消化の効率を、Current Protocols in Molecular Biology、アウスベルら、編集、ジョン・ウィリィ・アンド・サンズ（John Wiley and Sons）、ＮＹ（１９８７年）に記載された方法に従ってゲル電気泳動により測定した。
ポリメラーゼ鎖反応生成物の半分を制限エンドヌクレアーゼＳau３Ａ及びＢglIIで消化した。簡単に言えば、ＤＮＡを、１００mＭのNaCl、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．７、１０mＭのMgCl2、１mＭのＤＴＴ、１００μｇ／mlのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０単位のＳau３Ａ、及び１０単位のＢglII（ストラタゲン、ラ・ジヨラ、ＣＡ）を含む緩衝液と混合した。この溶液を３７℃で１時間保った。この制限エンドヌクレシス消化の効率をゲル電気泳動により測定した。
得られた優占種、約５００塩基対バンドを分離し、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、マニアチズら、編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２年）に記載された操作に従ってアガロースゲルで精製した。ＤＮＡを、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、マニアチスら、編集、コールド・スプリング・ハーバー、ＮＹ（１９８２年）に記載された方法に従って電気溶出によりアガロース薄片から精製した。電気溶出したＤＮＡをフェノール抽出、その後のエタノールによる沈殿により精製した。
変異体Ｓ遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼＨindIII及びＢamHIで前もって消化されたｐブルースクリプトＫＳ＋（ストラタゲン）に挿入した。簡単に言えば、ｐブルースクリプトＫＳ＋を、100mＭのNaCl、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH７．７、１０mＭのMgCl2、１mＭのＤＴＴ、１００μｇ／mlのＢＳＡ、４０単位のＢamＨＩ及び４０単位のＨindIII（ストラタゲン）を含む緩衝液と混合した。この溶液を３７℃で１時間保った。ｐブルースクリプトＫＳ＋を含む溶液を、その後、トリス−ＨＣｌ、pH８．０を０．１Ｍの最終濃度まで添加することによりpH８．０に調節した。子ウシの腸アルカリホスファターゼ（ストラタゲン）５単位を、この溶液に添加し、その溶液を３７℃で３０分間保った。その後、子ウシの腸アルカリホスファターゼを、その溶液を６５℃で１０分間保つことにより失活した。その後、ｐブルースクリプトＫＳ＋を、フェノール抽出、その後のエタノールによる沈殿により精製した。その後、制限エンドヌクレアーゼで清浄したｐブルースクリプトKS＋を、１０mＭのトリス−ＨＣｌ、pH８．０及び１mＭのＥＤＴＡを含む溶液中で再懸濁した。
変異体Ｓ遺伝子を、ＨindIII及びＢamＨＩ制限エンドヌクレアーゼによる消化により上で調製されたｐブルースクリプトベクターに挿入（連鎖）した。簡単に言えば、ＨindIII及びＢamＨＩで前もって切断されたｐブルースクリプトベクター１μｌを、上で調製された変異体Ｓ遺伝子インサート１μｌ、０．６６Ｍのトリス−ＨＣｌ、pH７．６、５０mＭのMgCl2、５０mＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む緩衝液１μｌ並びに１０mＭのＡＴＰ及び０．５μｌ（４単位）のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ストラタゲン）を含む溶液１μｌと混合した。この溶液を３７℃で１時間保った。
その連鎖混合物を、製造業者の指示に従ってＸＬ１ブルー細胞（ストラタゲン）中で形質転換した。
上記のクローニング工程の正確度をＤＮＡ配列決定により確かめた。
Ｂ．選択性ＶH形質発現ベクター構成
ＶH暗号ＤＮＡ同族体を含まない形質発現ベクターに対して選択する能力を付加するために、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を実施例９で調製されたＶH形質発現ベクターに挿入した。選択性ＶH形質発現ベクターを、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子及びデカペプチドtagに関して暗号化するＤＮＡ配列を含む合成ＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼＸhoＩ及びＥcoＲＩで前もって開裂された実施例９で調製したＶH形質発現ベクターに挿入することにより調製した。
サプレッサー遺伝子及びデカペプチドtagに関して暗号化するポリヌクレオチド配列を含む合成ＤＮＡ配列を、互いにハイブリッドを形成し第１８Ａ図に示された二本鎖合成ＤＮＡ配列を形成する２０〜４０の塩基の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することによりつくった。個々の一本鎖ポリヌクレオチドを表５に示す。
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ポリヌクレオチド９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、ＡＢ２３及び９７１を、７０mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．６）、１０mＭ MgCl2、５mＭ  ＤＴＴ、１０mＭ２ＭＥ、及び１mlあたり５００μｇのＢＳＡを含有する溶液に各ポリヌクレオチド（０．１μｇ／μｌ）１．０μｌ及びＴ4ポリヌクレオチドキナーゼ２０単位を加えることによりキナーゼ化した（were kinased）。溶液を３７℃で３０分保持し、ついで６５℃で１０分保つことにより反応を停止させた。
得られた（the required）ポリヌクレオチドをアニール化して図１８Ａに示す合成ＤＮＡ配列を形成させた。手短かに述べると（Briefly）、以下のポリヌクレオチドの溶液を１／１０容量の２０．０mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．４）、２０mＭ MgCl2及び５０．０mＭ NaClを含有する溶液と混合した：ポリヌクレオチド９２６、９２７、９２８、９２９、９３０及び９３１を２．５μｇ／ml含有する別個の溶液５μｌ；キナーゼ化されていないポリヌクレオチドＡＢ２４及びキナーゼ化されたポリヌクレオチドＡＢ２３を２．０μｇ／ml含有する別個の溶液４μｌ；キナーゼ化されたポリヌクレオチド９７１及びキナーゼ化されていないポリヌクレオチド９７０を１．０μｇ／ml含有する別個の溶液２μｌ。
この溶液を７０℃に５分加熱し、水の入った５００mlビーカー中で１．５時間保持して４０℃に冷却した。この時間中に１０のポリヌクレオチドはすべてアニール化し図１８Ａに示す二本鎖合成ＤＮＡ挿入物を形成した。上記反応物（４６．６μｌ）のすべてを、５０mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．５）、７mＭ MgCl2、１mＭ ＤＤＴ、１mＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び１０単位のT4ＤＮＡリガーゼを含有する溶液と混合して連結反応混合物を形成させることによって個々のポリヌクレオチドをお互いに共有結合させて合成ＤＮＡ挿入物を安定化させた。この混合物を３７℃で１時間保ち、ついで溶液を６５℃で１５分保持することによりT4ＤＮＡリガーゼを失活させた。上記連結反応混合物反応物のすべてと１０mＭ  ＡＴＰ及び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する溶液６μｌとを混合して目的ポリヌクレオチドをキナーゼ化した。この溶液を３７℃で３０分保持し、ついで溶液を６５℃で１０分保持してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。かくして、予め制限エンドヌクレアーゼＸhoＩ及びEcoRIで消化したＶH−発現ベクター（図７）に連結するための完全合成ＤＮＡ挿入物（図１８Ａ）が調製された。
ＶH−発現ベクター（図７）は製造者のすすめに従って制限エンドヌクレアーゼＸhoＩ及びＥcoＲＩで消化した。手短に述べると、５０μｇのＶH−発現ベクター（３８．５μｌ）、２２５単位のＸhoＩ（Stratagene）及び１５０単位のＥcoＲＩ（Stratagene）を、５５０mＭトリス−塩酸（pH７．７）、１０mＭ MgCl2、５０mＭ NaCl及び１００μｇ／mlＢＳＡよりなる一般的な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液と混合して消化混合物を形成した。消化混合物を３７℃で２時間維持した。
ついで１．０mＭトリス−ＨＣｌ溶液（pH８．０）の添加によって消化混合物をpH８．０に調製し、最終濃度０．１Ｍとした。この溶液に２．５単位の子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Stratagene）を加え、得られた溶液を３７℃で３０分維持した。この溶液を６５℃で１０分維持して子牛腸アルカリ性フォスファターゼを失活させた。ついでＶH−発現ベクターＤＮＡをフェノール抽出によって精製し、ついでエタノール沈殿させた。ついで制限エンドヌクレアーゼで切断したＶH−発現ベクターＤＮＡを１０mＭトリス−ＨＣｌ（pH８．０）及び１mＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液５０μｌに再懸濁した。
上記で調製した合成ＤＮＡ挿入物を制限エンドヌクレアーゼで切断したＶH−発現ベクターに挿入した。手短に述べると、ＸhoＩ及びＥcoＲＩで切断したＶH−発現ベクター１μｇ、合成ＤＮＡ挿入物（０．５μｇ）２μｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Stratagene）０．５μｌ（４単位）を６６mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．６）、５．０mＭ MgCl2、５．０mＭ  ＤＴＴ及び１．０mＭ  ＡＴＰを含有する溶液と混合して連結混合物を生成させた。連結混合物を３７℃で２時間維持した。ついで連結混合物を製造者の指示に従ってStratageneから入手し得るギカパックIIゴールドパッキングエキストラクト（Gigapack II Gold packing extract）を用いてパッケージした（was packaged）。ついでパッケージした連結混合物をＸＬＩブルーセル（ＸＬＩ blue cells）（Stratagene）上に置いた。
個々のラムダファージプラークを、合成ＤＮＡ挿入物中に含まれたポリヌクレオチド（polynucleotides）とハイブリッドした個々のプラーク（Plaques）をCurreut Protocols in Molecular Biology（分子生物学における最近のプロトコル）、Ausubolら編、ジョシンウィリーアンドサンズ、ニューヨーク（１９８７）に記述された方法に従って選択することによって、ＤＮＡ配列決定のために、選択した。選択し得るＶH−発現ベクターを図１９Ａに示す。
Ｃ．撰択し得るＶL−発現ベクターの構築
ＶLをコード化するＤＮＡを含有しない発現ベクターに相同体を選択する能力を付加するために、実施例１１で調製したＶL−発現ベクター中にサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を挿入した。制限エンドヌクレアーゼＳacＩ及びＸbaＩで予め切断した、実施例１１で調製したＶL−発現ベクター中にサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含有する合成ＤＮＡ配列を挿入することにより選択し得るＶL−発現ベクターを調製した。
サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含有する合成ＤＮＡ配列は、互いにハイブリットして図１８Ｂに示す二本鎖合成ＤＮＡ配列を形成する、２０−４０塩基の一本鎖ポリヌクレオチド断片を設計することによって構築した。個々の一本鎖ポリヌクレオチドを表５に示す。
ポリヌクレオチド９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９７２及び９７５を、各ポリヌクレオチド（０．１μｇ／μｌ）１．０μｌ及び２０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを７０mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．６）、１０mＭ MgCl2、５mＭ  ＤＴＴ、１０mＭ２ＭＥ、１００μｇ／mlＢＳＡを含有する溶液に加えることによってキナーゼ化した。この溶液を３７℃で３０分維持し、ついで溶液を６５℃で１０分維持することにより反応を停止させた。
得られたポリヌクレオチドをアニール化して図１８Ｂに示す合成ＤＮＡ配列を形成させた。手短かに述べると、以下のポリヌクレオチド溶液を２０．０mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．４）、２．０mＭ MgCl2及び５０．０mＭ NaClを含有する１／１０容積の溶液と混合した：キナーゼ化したポリヌクレオチド９２６、２２７、９２８、９２９、９３０及び９３１を２．５μｇ／ml含有する別個の溶液５μｌ；キナーゼ化されていないポリヌクレオチド９７４及び９７３を２．０μｇ／ml含有する別個の溶液２μｌ；キナーゼ化されたポリヌクレオチド９７２及び９７５を２．０μｇ／ml含有する別個の溶液２μｌ。
この溶液を７０℃で５分加熱し、ついで水の入った５００mlビーカー中で１．５時間保持して４０℃に冷却した。この時間内に１０のポリヌクレオチドはすべてアニール化して図１８Ｂに示す二本鎖合成ＤＮＡ挿入物を形成した。上記反応物（４２．２μｌ）のすべてを、５０mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．５）、７mＭ MgCl2、１mＭ  ＤＤＴ、１mＭアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び１０単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを含有する溶液と混合して連結反応混合物を形成させることによって個々のポリヌクレオチドをお互いに共有結合させて合成ＤＮＡ挿入物を安定化させた。この混合物を３７℃で１時間保ち、ついで溶液で６５℃で１５分維持してＴ４ＤＮＡリガーゼを失活させた。上記連結反応混合物反応物のすべてと１０mＭ  ＡＴＰ及び５単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する溶液６μｌとを混合して目的ポリヌクレオチドをキナーゼ化した。この溶液を３７℃で３０分保持し、ついで溶液を６５℃で１０分保持してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。かくして予め制限エンドヌクレアーゼＳacＩ及びＸbaＩで消化したＶL−発現ベクター（図９）に連結するための完全合成ＤＮＡ挿入物（図１８Ｂ）が用意された。
ＶL−発現ベクター（図９）は製造者のすすめに従って制限エンドヌクレアーゼＳacＩ及びＸbaＩで消化した。手短かに述べると５．０μｇのＶL−発現ベクター（３０．５μｌ）、５０単位のＳacＩ（Stratagene）及び５０単位のＸbaＩ（Stratagene）を、１０mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．７）、１０mＭMg MgCl2、１００mＭ NaCl及び１００μｇ／mlＢＳＡよりなる一般的な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液と混合して消化混合物を形成した。消化混合物を３７℃で２時間維持した。
ついで１．０mＭトリス−ＨＣｌ溶液（pH８．０）の添加によって消化混合物をpH８．０に調整し、最終濃度０．１Ｍとした。この溶液に２．５単位の子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Stratagene）を加え、得られた溶液を３７℃で３０分維持した。この溶液を６５℃で１０分維持して子牛腸アルカリ性フォスファターゼを失活させた。ついでＶL−発現ベクターＤＮＡをフェノール抽出によって精製し、ついでエタノール沈殿させた。ついで制限エンドヌクレアーゼで切断したＶL−発現ベクターＤＮＡを１０mＭトリス−ＨＣｌ（pH８．０）及び１mＭ  ＥＤＴＡを含有する溶液５０μｌに再懸濁した。
上記で調製した合成ＤＮＡ挿入物を制限エンドヌクレアーゼで切断したＶL−発現ベクターに挿入した。手短かに述べると、ＳacＩ及ＸbaＩで切断したＶH−発現ベクター１μｇ、合成DNA挿入物（０．５μｇ）２μｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（Stratagene）０．５μｌ（４単位）を６６mＭトリス−ＨＣｌ（pH７．６）、５．０mＭ MgCl2、５．０mＭ  ＤＴＴ及び１．０mＭ  ＡＴＰを含有する溶液と混合して連結混合物を生成させたた。連結混合物を３７℃で２時間維持した。ついで連結混合物を製造者の指示に従ってStratageneから入手し得るギガパックIIゴールドパッキングエキストラクトを用いてパッケージした。ついでパッケージした連結混合物をＸＬＩブルーセル（Stratagene）上に置いた。
個々のラムダファージプラークを、合成ＤＮＡ挿入物中に含まれたポリヌクレオチド（polynucleotides）とハイブリッドしたプラーク（plaques）をMolecular Cloning：A Laboratory Manual（分子クローニング：実験室指針）、Maniatisら編、Cold Spring Harbor、ニューヨーク（１９８９）に記述された方法に従ってスクリーニングすることによって、ＤＮＡ配列決定のために、選択した。選択し得るＶL−発現ベクターを図１９Ｂに示す。
Ｄ．選択し得るＶL−及びＶH−発現ベクターの構築
実施例１７Ｂで調製したＶH−発現ベクターをそれがＸhoＩまたはＳpeＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含まないように修飾する。このベクターの修飾は１セットのポリヌクレオチド及び実施例１７Ｂに記述した方法と同様な方法を用いて達成する。
実施例１７Ｃで調製したＶL−発現ベクターをそれがＳacＩまたはＸbaＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有しなくなるように修飾する、このＶL−発現ベクターの修飾は１セットのポリヌクレオチド及び実施例１７Ｃに記述した方法と同様な当業界で周知の方法を用いて達成する。修飾したＶL−発現ベクターと修飾したＶH−発現ベクターを組み合わせて選択し得るＶL及びＶH−発現ベクターを生成させる。手短かに述べると、修飾したＶH−発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩ及びＨindIIIで酵素製造業者によって推奨された条件を用いて消化し、他方修飾したＶL−発現ベクターを制限エンドヌクレアーゼＥcoＲＩ及びＭluＩで消化する。制限エンドヌクレアーゼで切断したＶH及びＶL−発現ベクターを標準的技術を用いて連結して図２０に示す選択し得るＶH−及びＶL−発現ベクターを形成させた。
ＶH−及びＶL−発現ベクター（vector）は２つのサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含有しており、１つはＶHＤＮＡ相同体で代替されており、他はＶLＤＮＡ相同体で代替されている。従って、ベクターがＶHとＶLＤＮＡ相同体の両方を含有する場合には、そのベクターはＶH及びＶL含有ベクター（vector）が適当な選択条件下にファージプラークを生じさせることを可能にするサプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含有していない。
Ｅ．ＤＮＡ相同体の選択し得るＤＮＡ発現ベクターへの挿入
実施例５で調製したＶH及び／またはＶLをコードするＤＮＡ相同体を提供された制限エンドヌクレアーゼ部位を用いてＶH及びＶL発現ベクター、ＶH発現ベクターまたはＶL発現ベクターに挿入する。ＶH−コードＤＮＡ相同体は代表的には提供されたＸhoＩ及びＳpeＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（図２０）中に標準的手法を用いて挿入する。ＶL−コードＤＮＡ相同体は代表的には提供された制限エンドヌクレアーゼ部位（図２０）に挿入する。従って、選ばれた特定の発現ベクターによって、ここに記述した方法はＶH−コードＤＮＡ相同体単独、ＶL−コードＤＮＡ相同体単独、またはＶHびＶLＤＮＡ相同体を含有する発現ベクターを生成させる。
ＶH−コードＤＮＡ相同体をまず発現ベクターに挿入し、ついでＶLＤＮＡ相同体を挿入することができる。別法として、ＶL−コード相同体をまず挿入し、ついでＶH−コード相同体を挿入できる。いずれの挿入順序もＶH−コードＤＮＡ相同体のライブラリーとＶL−コードＤＮＡ相同体のライブラリーのランダム組換えを可能にする。ＶH相同体をＶH＋ＶL発現ベクターに挿入した後、この発現ベクターを増殖させてより多くのＶH含有発現ベクターを生成させることができる。ついでＶL−コードＤＮＡ相同体をＶH及びＶL発現ベクターに挿入できる。これらの手順のいずれも大きな組合せライブラリーの生産を可能にする。
Ｆ．ＶH及び／またはＶLＤＮＡ相同体含有ファージの選択
最終ライブラリー中に存在する、ＶH及び／またはＶLＤＮＡ相同体を含有しない発現ベクターの数を減ずるために強力な選択系を用いる。この選択系は優性ラムダＳ遺伝子突然変異をＶH及び／またはＶL発現ベクター中に存在するサプレッサーｔＲＮＡと組み合わせる。発現ベクター中にサプレッサーｔＲＮＡが存在すると、突然変異ラムダＳタンパク質が生産されて感染菌体（infected cell）の溶菌（lysis）を防止し、それによってファージプラークの生成を防止する。ＤＮＡ相同体がサプレッサーtRNAに代替すると、発現ベクターはファージプラークを生成させ得る。ＶH及び／またはＶLを検出するには、ＶH及び／またはＶL発現ベクターはファージプラークを生産しなければならない。なぜなら、プラークの生産がない場合には、免疫学的または結合アッセイを用いて検出するに十分な発現されたＶH及びＶLがないからである。従って、ＶH及び／またはＶLを含有しないファージは検出されない。この選択を達成するのに、実施例１７Ａで生産した変異体Ｓ遺伝子プラスミドを含有する適当な宿主細菌菌体を目的とする発現ベクターライブラリーで感染させる。サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を有しない発現ベクター、すなわちＤＮＡ相同体を含有する発現ベクターがファージプラークを生産する。
18．ファージにおける免疫グロブリンレパートリーの大きな組合せのライブラリーの生成（generation）
ＶH、ＶL、ＦV及びＦab配列の発現に適したベクターを図７及び９に図示する。前述の如く、これらのベクターはラムダＺapを、多重クローニング部位に合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより修飾することによって構築した。ベクターはクローニング部位及び発現部位の側面に位置するＮotＩ及びＥcoＲＩ制限部位に関し反対称となるように設計した。下記に示すごとく、バクテリオファージのような線状ベクター中の制限部位の配置における反対称はＬ鎖を発現するライブラリーをＨ鎖を発現するライブラリーと結合して組合せのＦab発現ライブラリーを構築するのを可能にする系の本質的特徴である。ラムダＺapIIＶLII（図９）はＬ鎖断片のためのクローニングベクターとして役立つよう設計されており、ラムダＺapIIＶH（図７）はライブラリー構築の初期工程におけるＨ鎖配列のためのクローニングベクターとして役立つよう設計されている。これらのベクターは、各末端に移入された特定の制限部位を有する、ＰＣＲ増幅の生産物を効率的にクローン化するよう設計されている。
Ａ．抗体断片のＰＣＲ増幅
増幅された生産物の末端に制限部位を移入するオリゴヌクレオチドを有する脾臓細胞から単離されたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅をＦd及びカッパ鎖配列を含むＨ鎖配列をクローン化し、発現するのに用いることができる。これらの増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーを表１及び２に示す。これらのプライマーはＶH配列の増幅のために実施例５で成功裏に用いられたプライマーと類似である（analogous）。Ｈ鎖増幅のための５′プライマーのセットはＶHを増幅するのに以前に用いたものと同じであり、Ｌ鎖増幅のための５′−プライマーは同様な原則に基づいて選ばれた；Sastryら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，８Ｇ：５７２８（１９８９）及びOrlandiら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，８Ｇ：３８３３（１９８９）。Ｈ（ＩｇＧ１）及びＬ（ｋ）鎖配列の独特の３′プライマーはＨ−Ｌ鎖ジスルフィド結合の生成に関与するシステインを含むように選んだ。この段階ではラムダＬ鎖を増幅するプライマーは構築されていなかった。なぜならラムダＬ鎖はネズミの抗体の小さな分画しか構成しないからである。さらに、Ｊ（結合（joining））領域（アミノ酸１２８）におけるｍＲＮＡに相補的な３′プライマーと加工されたタンパク質の保存されたＮ−末端領域にある１次鎖ｃＤＮＡ（firsts strand ｃＤＮＡ）に相補的な独特な５′プライマー（５′primers）の１セットを用いてＦV断片を構築した。制限エンドヌクレアーゼ認識配列をプライマーに入れて、発現のために設定された読取り枠において増幅された断片をラムダファージベクター中にクローニングするための準備をする（allow for）。
Ｂ．ライブラリーの構築
組合せライブラリーの構築は２工程で行った。最初の工程では、別々のＨ及びＬ鎖ライブラリーをそれぞれラムダＺaPIIＶH及びラムダＺａｐIIＶLII中に構築した。第２の工程で、これら２つのライブラリーを各ベクター中に存在する反対称ＥapＲＩ部位で結合させた（were combined）。これによりＨ及びＬ鎖を共に発現し得るクローンのライブラリーが得られる。現実の組合せはランダムであり、親動物中のＢ細胞集団中に存在する組合せを反映する必要はない。キーホールリンプレットヘモシアニン（ＫＬＨ）と複合化させた式Ｉ（図１３）のｐ−ニトロフェニルホスホンアミデート（ＮＰＮ）抗原１で予め免疫化した１２９Ｇix＋マウスの脾臓から単離したｍＲＮＡのＰＣＲ増幅によって得られたＤＮＡから、ラムダＺapIIＶH発現ベクターを用いてＨ鎖配列のライブラリーを作出した。ＮＰＮ−ＫＬＨ複合体はジメチルホルムアミド中式１（図１３）のＮＰＮ２．５mgを含有する２５０μｌの溶液と０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．２）中にＫＬＨ２mgを含有する７５０μｌの溶液とを混合して調製した。すなわち２つの溶液を、回転する攪拌棒による攪拌下のＫＬＨ溶液にＮＰＮ溶液を徐々に添加することによって混合した。ついで混合物を同じ攪拌下に４℃で１時間維持して複合化を進行させた。複合化NPN−ＫＬＨを非複合化ＮＰＮ及びＫＬＨからセファデックスＧ−２５を用いるゲル濾過によって単離した。単離したＮＰＮ−KLH複合体を実施例２に記述した如きマウスの免疫化に用いた。
上述の免疫化で得られた脾臓ｍＲＮＡを単離し、ラムダＺapIIＶH発現ベクターを用いてＶHの遺伝子配列の１次ライブラリー（primary library）を作出するのに用いた。１次ライブラリーは１．３×１０6のpfuを含んでおり、Ｆd配列を発現するクローンのパーセンテージを決定するデカペプチド標識の発現についてスクリーニングした。このペプチドの配列はＦd（またはＶH）断片のベクターへのクローニングに続く発現のためのフレーム中にのみ存在する。ライブラリー中のクローンの少なくとも８０％がデカペプチド標識の免疫検出に基づくＦd断片を発現する。
Ｈ鎖と同様にしてＬ鎖ライブラリーを構築した。このＬ鎖ライブラリーは２．５×１０6のメンバーを含有することが判明した。抗カッパ鎖抗体を用いるプラーク配列決定はライブラリーの６０％が発現されるＬ鎖挿入物を含むことを示した。この比較的小さな、挿入物のパーセンテージはＳacＩ及びＸbaＩでの切断後のベクターの不完全な脱リン酸化に由来すると考えられる。
一旦得た後、この２個のライブラリーはＥcoＲＩ部位でそれらを交叉させることにより組合わせライブラリーを構築するのに用いられた。この交叉を達成するため、ＤＮＡははじめに各々のライブラリーから精製された。Ｌ−鎖ライブラリーはＭluＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断され、得られる５′末端は脱リン酸され、生成物はＥcoＲＩで消化された。この工程はベクターの左アーム（arm）を数個の断片に切断したが、Ｌ−鎖配列を含む右アームはそのまま残存した。
同様に、重い鎖ライブラリーのＤＮＡはＨindIIIで切断され、脱リン酸化され、及びＥcoＲＩにより切断され、右アームを破壊したがＨ−鎖配列を含む左アームはそのまま残存した。このようにして調製されたＤＮＡは次いで結合され、（Combined）、連結（ligate）された。連結後、Ｌ−鎖を含むクローンの右アームとＨ−鎖を含むクローンの左アームとの組合わせから得られたクローンのみが生存可能なファージを再構築した。連結及びパッケージングの後、２．５×１０7のクローンが得られた。これはＮＰＮに対するアフィニティーを有するクローンを同定するためにスクリーンされた、組合せＦab発現ライブラリーである。
Ｌ−及びＨ−鎖断片を共に発現（co-express）するファージクローンの頻度を決定するために、Ｌ−鎖の重複リフト（lift）、Ｈ−鎖及び組合せライブラリーは、Ｌ−及びＨ−鎖発現のために上述のようにスクリーンされた。約５００の組換えファージのこの研究において、約６０％がＬ−及びＨ−鎖蛋白質を共に発現した。
Ｃ．抗原結合
すべての３種のライブラリー、Ｌ−鎖、Ｈ−鎖及びＦabは、それらが、ＮＰＮと結合する抗体断片を発現する組換えファージを含むかどうか決定するためにスクリーンされた。代表的な工程においては、３０，０００ファージがプレートされ（plated）、ニトロセルロースとの重複リフトが125Ｉ標識ＢＳＡに連結された（coupled）ＮＰＮへの結合についてスクリーンされた（第１５図）。Ｌ−鎖ライブラリーからの８０，０００組換えファージ及びＨ−鎖ライブラリーからの同数の重複スクリーンは、抗原に結合するいずれのクローンも同定しなかった。これと対照的に、Ｆab発現ライブラリーからの同様の数のクローンのスクリーンは、ＮＰＮに結合した多くのファージプラークを同定した（第１５図）。この観測は、多くのＨ−鎖がＬ−鎖と組み合わされて抗原に結合する条件下では同じＨ−鎖又はＬ−鎖のみが得られないことを示唆する。したがって、ＮＰＮの場合、多くのＨ−及びＬ−鎖が特別なＬ−及びＨ−鎖に各々結合されたとき、多くのＨ−及びＬ−鎖は抗原に単に結合するものと信じられている。
数多くのクローンをスクリーンする能力を測定するために、及び組合せライブラリーにおける抗原結合クローンの頻度についてより定量的な予測を得るために、百万のファージプラークがスクリーンされ及び抗原に結合した約１００のクローンが同定された。ＮＰＮに結合すると信じられている６クローンについて、正の及び約２０サランディング（surrounding）バクテリオファージプラークを含むプレートの領域が「コア」され、リプレートされ（replated）、及び重複リフトともにスクリーンされた（第１５図）。予測されたとおり、２０個のファージのうち約１個が特異的に抗原に結合した。負と信じられていた、プレートされたファージの領域の「コア」はリプレートの際に正を与えなかった。
抗原−抗体相互作用の特異性を決定するために、第１６図に示されるように、抗原結合は遊離の標識しない抗原との競合に付された。競合研究は個々のクローンが抗原アフィニティーに基づいて識別できたことを示した。結合の抑制を競合させるために要求される遊離の抗原の濃度は１０−１００×１０9Ｍの間で変動し、このことは発現Ｆab断片がナノ（nano）モル範囲内で結合定数を有することを示唆している。
Ｄ．クローンの組成及びそれらの発現生成物
実施例１８Ｃで述べたようなＮＰＮを結合することができる蛋白生成物の特性化（characterization）の調製において、Ｈ−及びＬ−鎖遺伝子を含むプラスミドがＭ１３mp８ヘルパーファージを用いておおよそ「コアされた」（Cored）バクテリオファージプラークから削り取られた。削り取られたプラスミドのマッピングはＨ−及びＬ−鎖配列の挿入と一致する制限パターンを立証した。クローンの１つの蛋白生成物はエライザ（ＥＬＩＳＡ）及びウェスタンブロッティングにより分析され、ＮＰＮ結合蛋白質の組成を確立した。ＬＰＴＧ誘導（induction）に引き続く細菌の上清は濃縮され、ゲルロ過に付された。分子量範囲４０〜６０ｋＤの分画がプールされ（pooled）、濃縮され及び更にゲルロ過分離に付された。第１７図に示されるように、溶離分画のエライザ分析は、ＮＰＮ結合が分子量５０ｋＤの蛋白質と結合しており、それはＨ−及びＬ−鎖を含むことが免疫検出により示されることを立証した。非還元性条件下濃縮細菌の上澄調製物のウェスタンブロット（図示されない）はアンチ−デカペプチド抗体とともに展開された。これは、５０ｋＤの分子量の蛋白質バンドを示した。これらの結果は、Ｈ−及びＬ−鎖が共有結合しているＦab断片のファンクション（function）であるＮＰＮ結合と一致している。
Ｅ．生体内のレパートリーの性質対ファージ組合せライブラリーの性質の比較
この実施例においては、わずかに限定された数のプライマーがＥd配列のＰＣＲ増幅のために用いられるので、比較的制限されたライブラリーが調製された。このライブラリーはカッパ／ガンマ１配列を発現するクローンのみを含むことが予測されている。しかし、抗体クラスはサブクラスを増幅するために追加的プライマーを加えることができるので、これは本質的な方法の制限とはならない。この制限にもかかわらず、我々は数多くの抗原結合クローンを単離することができる。
この研究から生じる中心的な問題は、上記のように調製されたファージライブラリーを生体内の抗体レパートリーと、大きさ、多様性の特徴及びアクセスのし易さの諸点においていかにして比較するかということである。
哺乳類の抗体のレパートリーの大きさを判断することは困難であるが、抗原特異性とは異なる１０6〜１０8程度の数値がしばしば引用される。幾分が控えめに後述されるように、この大きさかまたはこれより大きいファージライブラリーを現行の方法の改良によって容易に構築することができる。事実、初期の組合せライブラリーが一旦構築された後、Ｈ−及びＬ−鎖は組み換えられ、例外的に大きい数のライブラリーを得ることができる。
原理上、ナイーブな（naive）（非免疫の）生体内のレパートリー及びこれに対応するファージライブラリーはＨ−及びＬ−鎖のランダムな組合せを含むという点で同様であると予測される。しかし、異なるファクターが生体内レパートリー及びファージライブラリーにより発現される多様性を制限する役割を果たすであろう。例えば、耐性（tolerance）のような生理的な変化（modification）が生体内レパートリーからのある種の抗原特異性の発現を制限するであろうがこれらの特異性はまだファージライブラリーにおいて現われるかもしれない。一方、クローニング工程におけるバイアス（bias）が制限をファージライブラリーの多様化に導くかもしれない。例えば、刺激されたＢ−細胞により発現される配列のためのｍＲＮＡの表現（representation）は、高レベルの発現のために、刺激されない細胞のそれらに優先するものと予測し得る。異なるソース（source）組織（例えば、末梢血液、骨髄又は局所のリンパ節）及びＰＣＲプライマー（例えば、異なる抗原クラスを増幅すると予測されるもの）は、異なる多様性特性を有するライブラリーをもたらすかもしれない。
生体内のレパートリーとファージライブラリー間の別の相違は、前者がＨ−及びＬ−鎖の結合後の体腔（somatic）変異によるアフィニティー成熟を利用できるのに対して、後者は成熟したＨ−及びＬ−鎖をランダムに結合することである。特定の生体内レパートリーに由来する十分に大きいファージライブラリーであれば、元の成熟したＨ−及びＬ−鎖が組み換えられるであろう。この新しい技術の潜在的な利益の一つは単一の高度に多様な属に通有な（generic）ファージライブラリーが生じることにより免疫の必要性を回避することであるため、体腔（somatic）変異及びクローン選択の欠損を補填するための配列を至適化する方法を有することは有用であろう。本発明の方法においては３種の方法が容易に適用し得る。第１に、飽和突然変異生成（saturation mutagenesis）がＣＤＲ's上で行なわれるかもしれず、及び得られたＦabsは増加した機能のために分析され得る。第２に、抗原を結合するクローンのＨ−又はＬ−鎖が、組合せライブラリーを構築するのに用いたのと同様の操作により、全体のＬ−又はＨ−鎖ライブラリーと組み換えられ得る。第３に、上述の２種の手順の反復サイクルは、イムノグロブリンのアフィニティー又は触媒特性をさらに至適化するために行い得る。後の２種の操作がＢ−細胞クローン選択において許容されないことは、ここに述べられる方法が実際に至適な配列を同定する能力を増加するかもしれないことを示唆していることは留意されるべきである。
アクセスは、生体内抗原レパートリーとファージライブラリーとを比較するのが興味深い第３の領域である。実際上、ファージライブラリーはかなりアクセスし易い。スクリーニング方法は、人間がプレート１個当たり少なくとも５０，０００のクローンを調べ１日当たり１０6の抗体を容易に検査し得ることを可能にする。このファクターのみで、ハイブリドーマ技術をここに記載される方法に代えることは勇気づけられるべきである。最も強力なスクリーニング方法は、選択可能なマーカーを、栄養要求性細菌株の複製に必要とされる脱離基や触媒によって不活性化され易い毒性置換基のような抗原へ導入することによって達成されるかもしれない、選択を利用する。生体内抗原レパートリーは結合アフィニティーに基づく選択である免疫を通してのみアクセスされるという事実に関連する、更なる有利性も存在する。このファージライブラリーは同様に制限されない。例えば、触媒特性とともに抗体を同定する唯一の一般的な方法は抗体の遷移状態類似体へのアフィニティーに基づく前選択（pre-selection）による。このような制限は、触媒反応が原理上直接的に分析し得る生体外ライブラリーに適用されない。数多くの抗体を機能のために直接的に分析する能力は機構がよく解明されていないかまたは遷移状態類似体の合成が困難である、触媒の選択を可能にするかもしれない。触媒反応の分析は、合成類似体に悪化させる（pejorative to）反応機構のためのスクリーニング操作のバイアス（bias）を直接除去する。したがって、一定の化学変換の多重反応経路を同時に解明することが可能となる。
ここに開始された方法は、多くの重要な点においてそのままの（全体の）抗体と明らかに異なるＦab断片の生成を記載している。疑いなく、一価のＦab抗原バインダー（binder）を有することにおいて、アフィニティーの損失があるが、これは適切なきつい（tight）バインダー（binder）の選択によって補填きる。診断法やバイオセンサー等の多くの用途においては、一価のＦab断片を有することが好ましいかもしれない。Ｆc効果器（effector）機能が要求される用途においては、Ｈ−鎖遺伝子を拡張し及び哺乳細胞内でグリコシル化された（glycosylated）抗体全体を発現する技術は既に存在する。
ここに提示された考えは、抗体の同定及び評価における重要な点（bottle neck）である。単一の特異性（mono-specificity）を有しつつ、従来可能であったより、少なくとも３倍多いクローンを構築しスクリーンすることが可能になった。この方法の潜在的な用途は基礎研究及び応用科学に及ぶ。
上記の記述は本発明の例として意図されたものであり、本発明を制限するものではない。本発明の真の精神及び範囲から逸脱せずに多くの変更及び改良ができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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