(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬上許容されるキャリア又は希釈物と一緒に、粘膜アジュバントと共に免疫上有効量のヘリコバクター抗原を含んでいる、哺乳動物宿主における先在ヘリコバクター感染の、上記感染宿主での粘膜免疫反応の発生による根絶又は抑制用のワクチン組成物。
【請求項２】
抗生物質を更に含んでいる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
粘膜アジュバントがコレラ毒素又は大腸菌熱不安定毒素である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
ヘリコバクター抗原がＨ．ピロリ抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
ヘリコバクター抗原がＨ．フェリス抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
ヘリコバクター抗原がヘリコバクター細胞の超音波分解産物からなる、請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
ヘリコバクター抗原がＨ．ピロリ細胞の超音波分解産物からなる、請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
ヘリコバクター抗原が、Ｈ．ピロリウレアーゼ、Ｈ．ピロリ細胞毒素、Ｈ．ピロリ細胞毒素関連免疫優性抗原およびＨ．ピロリ熱ショックタンパク質からなる群より選ばれる、請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
経口剤形である、請求項１に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）感染に関連した胃十二指腸疾患の治療に関し、特にそれはＨ．ピロリ関連胃十二指腸疾患用の治療として能動免疫の用途に関する。
発明の背景
ヘリコバクター・ピロリ細菌は主要な胃十二指腸病原体として現在よく知られており、世界人口の５０％以上はこの生物に感染して、様々な程度の胃炎を起こしている。症状はかなりの割合の感染者ではっきりしないが、相当数のＨ．ピロリ感染者で明白な疾患が起きることがある。十二指腸潰瘍の大部分（９５％）はＨ．ピロリ感染と関連している；該生物が潰瘍治癒時に根絶されているならば潰瘍は再発しないが、それとは対照的にその生物に感染している者における１年目の再発率は８０％であることを示す治療研究により、原因的役割が示されている。更に、胃潰瘍の８０％以内はＨ．ピロリ関連であると考えられている（Blaser， 1992）。
長期Ｈ．ピロリ感染の有害結果の証拠が現在増加している。中国、コロンビア及び日本のような国々においてその細菌は人生の非常に早期に侵入し、これらの人々において胃炎は３０〜４０年間の継続的感染後に重度の胃萎縮が現れるまでゆっくり進行する。胃萎縮は胃癌の前兆病変であるとしてよく知られているが、萎縮した胃で発生する現実の癌は食事を含めた無数の他のファクターに依存している。しかしながら、現在までのすべての証拠は、萎縮が生じる前に早い年齢でＨ．ピロリ感染をなくすことができたならば、癌が発生しないことを示唆している（Parsonnetら，1991）。
新たな抗Ｈ．ピロリ療法の大規模評価に使用できるＨ．ピロリ感染の実験動物モデルはいない。しかしながら、新規抗菌治療法の能力のスクリーニングで極度に有用とわかった胃ヘリコバクター感染のヘリコバクター・フェリス（Helicobacter felis）マウスモデルが開発された。Ｈ．フェリスはＨ．ピロリと緊密に関連した螺旋形細菌である。この細菌はヒトの場合におけるＨ．ピロリと非常によく似てマウスの胃でコロニー形成し、即ち主な生態学的適所は胃粘膜であり、コロニー形成の部位は洞部で優性である。無菌マウスにおいて、Ｈ．フェリス感染は多形核白血球浸潤を伴う慢性炎症のあるヒトＨ．ピロリ感染と非常に似ている胃炎を誘導する。各生物による感染は各々Ｈ．ピロリ及びＨ．フェリスに対して類似した免疫応答を誘導する（Leeら，1990）。
Ｈ．フェリスマウスモデルはヒトにおいて抗Ｈ．ピロリ剤の効力をかなりうまく予測することがわかった。これによると、エリトロマイシンのような高いインビトロ活性の薬剤による単剤療法はマウスでＨ．フェリスに対して有意のインビボ効果を示さず、同様にエリトロマイシンはインビトロで高い抗菌効果にもかかわらずヒトで抗Ｈ．ピロリ効果を有しない。逆に、ビスマス化合物、メトロニダゾールとテトラサイクリン又はアモキシシリンの三剤療法ではＨ．フェリス感染マウスで非常に高い根絶率を示す（Dick-Hegedus及びLee，1991）。このような三剤療法は最も成功したヒト抗Ｈ．ピロリ法であり、現在抗Ｈ．ピロリ療法で最初の選択肢として推奨されている。しかしながら、定着したヘリコバクター感染は治療が難しく、現行化学療法は効力、毒性、薬物耐性及び再感染の問題のため最適には至っていない（O′Connor，1992）。
既に感染した患者の能動免疫は、臨床上明白なヒト感染疾患にとり効能があるとは証明されていない（Burke，1992）。Ｈ．ピロリ感染が長期間続くとしても、感染個体の生涯にわたるのではないならば、血清中に高レベルの循環ＩｇＧ抗体及び胃粘膜で局所特異的ＩｇＡ抗体の証明を含めた活発な免疫応答の存在にもかかわらず、能動免疫は治療上有効ではないらしいと考えられた（Goodwin，1993）。実際に、（Ｈ．フェリスマウスモデルで経口免疫プロトコールの評価に基づき）経口予防接種がヒトでＨ．ピロリ感染の予防に実行可能なアプローチかもしれない、と提案しているCzinnら（1993）では、感染が定着すると、抗体だけでなく抗生物質も根絶上非常に有効というわけではないことを示唆している。
Vargaら（1992）は、患者由来の生物から作られて患者に非経口注入されたＨ．ピロリワクチンがアレルギー反応を起こし、その生物を根絶しえないことを報告した。
意外にも、胃ヘリコバクター感染に対して能動免疫の治療能力が実際にあることが、初めて発見された。更に、適切な粘膜アジュバントと一緒のＨ．ピロリ抗原の経口投与はアレルギー又は過敏症状を起こさないで、胃粘膜から感染生物を抑制又は根絶することが発見された。
発明の要旨
本発明の一面によれば、場合により粘膜アジュバントと一緒に免疫上有効量の１種以上のヘリコバクター抗原の感染宿主への経口投与からなる、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染の治療方法が提供される。
もう１つの面において、場合により粘膜アジュバントと一緒に免疫上有効量の１種以上のヘリコバクター抗原を含んだ、哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染の治療用のワクチン組成物が提供される。
更にもう１つの面において、本発明は哺乳動物宿主におけるヘリコバクター感染の治療に関する、場合により粘膜アジュバントと一緒に免疫上有効量の１種以上のヘリコバクター抗原を含んだワクチン組成物の用法を提供する。
この明細書及び後記の請求の範囲をとおして、文脈上それ以外を要求しないかぎり、“含む”という用語、あるいは“含む”又は“含んでいる”のようなバリエーションは、規定された整数又は整数のグループの含有を意味して、いかなる他の整数又は整数のグループも排除する、というわけではないと理解される。
本明細書で“免疫上有効量”という用語の使用は、１回か又は何回かに分けた個別感染宿主へのその量の投与がヘリコバクター感染の治療に有効であることを意味する。この量は治療される個体の健康及び身体条件、治療される個体の分類学的グループ、抗体を合成する個体免疫系の能力、望まれる保護の度合、ワクチンの処方、医療状況の評価及び他の関連ファクターに応じて変わる。その量は比較的広範囲にわたり、ルーチン試験で決定できると考えられる。
発明の具体的な説明
本発明に従い用いられるヘリコバクター抗原はＨ．フェリス抗原、又は更に好ましくはＨ．ピロリ抗原である。本発明の特に好ましい面において、粘膜アジュバントと一緒にＨ．ピロリ抗原を含んだワクチン組成物は、ヒト患者でＨ．ピロリ感染の治療に用いられる。
好ましくは、ヘリコバクター抗原は細菌超音波分解産物、特にＨ．ピロリ超音波分解産物である。更に好ましくは、本発明に従い用いられるヘリコバクター抗原はＨ．ピロリの不活化全細菌細胞である。
一方、本発明に従い用いられるヘリコバクター抗原は、１種以上の個別抗原、特に１種以上のＨ．ピロリ抗原、例えば国際特許公開第ＷＯ９３／１８１５０号明細書で例示されるようなＨ．ピロリウレアーゼ、Ｈ．ピロリ細胞毒素（ＣＴ）、細胞毒素関連免疫優性（ＣＡＩ）抗原又は熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）であってもよい。
場合により、好ましくは感染宿主にヘリコバクター抗原と共に投与される１つの粘膜アジュバントはコレラ毒素である。ヘリコバクター抗原と共に投与されるもう１つの好ましい粘膜アジュバントは、大腸菌熱不安定毒素（大腸菌ＨＬＴ）である。本発明に従い用いられるコレラ毒素及び大腸菌ＨＬＴ以外の粘膜アジュバントには、コレラ毒素の無毒性誘導体、例えばＢサブユニット（ＣＴＢ）、化学的修正コレラ毒素又はコレラ毒素アミノ酸配列の修正により作られる関連タンパク質がある。粘膜アジュバント又はデリバリー性質を有するこれら分子の各々は、ヘリコバクター抗原に加えられるか、又はそれと複合化される。粘膜アジュバント又はデリバリー活性を有する他の化合物、例えば胆汁；ＤＥＡＥ-デキストラン及びポリオルニチンのようなポリカチオン；ナトリウムドデシルベンゼンサルフェートのような界面活性剤；脂質複合化物質；ストレプトマイシンのような抗生物質；ビタミンＡ；粘膜表面の構造的又は機能的完全性を変える他の化合物も用いてよい。他の粘膜活性化合物にはＭＤＰのような微生物構造の誘導体、アクリジン及びシメチジンがある。
ヘリコバクター抗原はＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）、ＣＴＢ含有ＩＳＣＯＭＳ、リポソームで本発明に従いデリバリーされるか、あるいはＭ細胞による吸着に適したサイズの微小球を形成するためにアクリレート又はポリ（ＤＬ-ラクチド-コグリコシド）のような化合物に封入される。一方、ミクロ又はナノ粒子は特異的腸レセプターを有するビタミンＢ１２のような分子に共有結合させてもよい。抗原は油性エマルジョン中に配合して、経口デリバリーしてもよい。アジュバントの広範囲だが網羅的でないリストはCox及びCoulter，1992でみられる。
他のアジュバントと、慣用的な製薬上許容されるキャリア、賦形剤、緩衝剤又は希釈物も本発明の治療ワクチン組成物に含有させてよい。ワクチン組成物は、例えばヘリコバクター抗原及び粘膜アジュバントと一緒に炭酸水素ナトリウム緩衝剤を含有した腸溶性ゼラチンカプセルで処方される。
通常、本発明によるワクチン組成物は、１種以上の慣用的な製薬上許容されるキャリア及び／又は希釈物と一緒に、免疫上有効量のヘリコバクター抗原と場合により粘膜アジュバントを含んでいる。本明細書で用いられる“製薬上許容されるキャリア及び／又は希釈物”には、あらゆる溶媒、分散媒体、水性溶液、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等がある。医薬活性物質に関してこのような媒体及び剤の使用は当業界で周知であり、Remington′s Phamaceutical Sciences，18th Edition，1990，Mack Publishing Company，Pennsylvania，U．S．A．で例示されている。
本発明の医薬組成物は例えば不活性希釈物又は同化性食用キャリアと共に哺乳動物宿主に直接経口投与され、硬質又は軟質殻ゼラチンカプセルに封入され、錠剤に圧縮され、あるいは飲食の固体又は液体食と直接配合される。経口治療投与の場合、活性化合物は賦形剤と配合して、摂取性の錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハース等の形態で用いられる。組成物及び製剤中の活性成分の率は勿論様々であり、適切な投与量が免疫上有効として得られるような率である。
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等のような固体経口投薬単位は以下も含有してよい：トラガカントガム、アラビアガム、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤；リン酸二カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；スクロース、ラクトース又はサッカリンのような甘味剤、あるいはペパーミント、冬緑油又はチェリーフレーバーのような香味剤が添加できる。単位剤形がカプセルであるとき、それは上記タイプの物質に加えて液体キャリアを含有していてもよい。様々な他の物質もコーティングとして、又は剤形の物理的形態を変えるために存在してよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセルはシェラック、糖又は双方でコートされる。シロップ又はエリキシルは活性成分、甘味剤としてスクロース、保存剤としてメチル及びプロピルパラベン、色素と、チェリー又はオレンジフレーバーのような香味剤を含有してもよい。勿論、単位剤形を製造する上で用いられるいかなる物質も薬学上純粋で、用いられる量で実質上無毒性であるべきである。
本発明のワクチン組成物は、当業者により容易に決定される量で経口投与される。このため、成人の場合、適切な投与量は１０μｇ〜１０ｇ、例えば５０μｇ〜３ｇの範囲である。同様の投与量範囲が子供に適用される。
上記のように、適切な粘膜アジュバントはコレラ毒素である。用いられる粘膜アジュバントの量は、用いられる粘膜アジュバントのタイプに依存している。例えば、粘膜アジュバントがコレラ毒素であるとき、それは適切には１０ng〜５０μｇ、例えば０．１〜１０μｇの量で用いられる。粘膜アジュバントが大腸菌熱不安定毒素であるとき、適切な量は１μｇ〜１mg、例えば５〜５０μｇである。
本発明に至る研究において、コレラ毒素又は大腸菌ＨＬＴアジュバントと全細胞Ｈ．フェリス又はＨ．ピロリ超音波分解産物の経口投与によるＨ．フェリスに既に感染したマウスの能動免疫では、胃粘膜からＨ．フェリスを浄化する。したがって、Ｈ．ピロリ抗原と共に粘膜アジュバントの経口投与による感染ヒトの能動免疫は胃粘膜からＨ．ピロリを浄化すると考えられる。抗Ｈ．ピロリ剤を用いたこのモデルでの前記研究に基づき、これはＨ．ピロリワクチンでの能動免疫の治療能力の最初の証拠であると考えられ、ヒトＨ．ピロリ関連胃十二指腸疾患の治療用ワクチン組成物は、場合により及び好ましくは粘膜アジュバントと組み合わされたヘリコバクター抗原の製剤であることを示している。
感染を根絶又は抑制するヘリコバクター抗原の経口ワクチン組成物によるヒトのヘリコバクター・ピロリ感染の有効な治療が、胃炎の抑制又は消失、消化性潰瘍再発の防止と、消化性潰瘍及び胃癌を含めたヘリコバクター・ピロリ感染の有害後遺症の減少により有意の治療効果を示すことは、当業者にとり明らかであろう。
本発明は下記の非制限例で更に説明されている。
例１
オーストラリア、ニューサウスウェールズ大学畜産学部の雌性ＳＰＦマウス１６０匹を１０９〜１０10生ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ培養４９１７９）の２日離した４回の経口投与で感染させた。
細菌を、アンホテリシンＢ〔フンギゾン（Fungizone）、スクイブ（Squibb）、プリンストン、ＮＪ、ＵＳＡ〕２．５mg／ｌ、トリメトプリム〔シグマ（Sigma）、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ〕１０mg／ｌを含有した３．８％w/v血液寒天ベースNo．２〔オキソイド（Oxoid）、ベーシングストーク、ＵＫ〕と７％v/v全ウマ血（オキソイド）とが入ったプラスチック製ペトリ皿で増殖させた。プレートを微好気性湿気雰囲気（オキソイド、ＢＲ５６）中３７℃で４８時間インキュベートした。
超音波分解産物を上記のような生物の増殖、その後０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中での該生物の回収により得た。細胞を洗浄し、遠心により回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮ＰＢＳに再懸濁した。次いで細胞はＢ-３０ブランソン（Branson）細胞破壊機を用いて細胞懸濁液ml当たり１分間の割合で超音波処理した（５０％能力サイクル）。超音波分解産物を−２０℃で貯蔵した。
Ｈ．フェリスの最終感染用量の投与後２８、４２、４４及び４７日目に、２０匹のマウスに、コレラ毒素（シグマＣ３０１２）１０μｇ及びタンパク質１mg（バイオラッドＤＣタンパク質アッセイ）含有Ｈ．フェリスの超音波分解産物を含む懸濁液０．２mlを経口投与した。
洞部粘膜のサンプルを前記のように迅速な微量滴定ウレアーゼ試験で感染について調べた（Leeら，1990）。この試験はＨ．フェリス胃感染を高度に予想しうるとして有効であった。マウス４０匹の群（ワクチン接種２０匹及びコントロール２０匹）をワクチンの最終投与後１週間、１月間、２月間及び３月間の間隔で安楽死させた。
結果は表１で示されている。
これらの結果はヘリコバクター抗原及び粘膜アジュバントからなる経口ワクチンでのＨ．フェリス感染マウスの治療が有意の割合のマウスで感染治癒させることを示している。この効果は治療中止後１週間で明らかであり、少くとも３月間にわたり続き、マウスがそれらの感染から治癒したことを証明している。
0003919812.tif 000002
例２
オーストラリア、ニューサウスウェールズ大学畜産学部の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス１００匹を１０８生ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ培養４９１７９）の２日離した３回の、即ち１、３及び５日目の経口投与で感染させた。
細菌を、アンホテリシンＢ（フンギゾン、スクイブ、プリンストン、ＮＪ、ＵＳＡ）２．５mg／ｌ、トリメトプリム（シグマ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）１０mg／ｌを含有した３．８％w/v血液寒天ベースNo．２（オキソイド、ベーシングストーク、ＵＫ）と７％v/v全ウマ血（オキソイド）とが入ったプラスチック製ペトリ皿で増殖させた。プレートを微好気性湿気雰囲気（オキソイド、ＢＲ５６）中３７℃で４８時間インキュベートした。
超音波分解産物を上記のような生物の増殖、その後０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中での該生物の回収により得た。細胞を洗浄し、遠心により回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮ＰＢＳに再懸濁した。次いで細胞はＢ-３０ブランソン細胞破壊機を用いて細胞懸濁液ml当たり１分間の割合で超音波処理した（５０％能力サイクル）。超音波分解産物を−２０℃で貯蔵した。
Ｈ．フェリスの最終感染用量の投与後２１、３５、３７及び４０日目に、２０匹のマウスに、コレラ毒素（シグマＣ３０１２）１０μｇ含有溶液０．２mlを各々経口投与し、２０匹のマウスに、コレラ毒素１０μｇ及びタンパク質１mg（バイオラッドＤＣタンパク質アッセイ）含有Ｈ．フェリスの超音波分解産物を含む懸濁液０．２mlを各々経口投与し、２０匹のマウスに、タンパク質１mg含有Ｈ．フェリスの超音波分解産物を含む懸濁液０．２mlを各々経口投与し、２０匹のマウスに、コレラ毒素１０μｇ及びタンパク質１mg含有Ｈ．ピロリ（株９２１０２３）の超音波分解産物を含む懸濁液０．２mlを各々経口投与し、２０匹のマウスには経口ワクチン接種しなかった。
最終免疫投与後１週間目に、すべてのマウスを安楽死させた。洞部粘膜のサンプルを前記のように迅速な微量滴定ウレアーゼ試験で感染について調べた（Leeら，1990）。この試験はＨ．フェリス胃感染を高度に予想しうるとして有効であった。
結果は表２で示されている。
これらの結果は粘膜アジュバントと共にＨ．フェリス又はＨ．ピロリに由来するヘリコバクター抗原の経口投与が有意の割合のＨ．フェリス感染マウスを治癒させることを示している。
0003919812.tif 000003
例３
オーストラリア、ニューサウスウェールズ大学畜産学部の雌性ＳＰＦマウス１００匹を１０９〜１０10生ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ培養４９１７９）の２日離した４回の経口投与で感染させた。雌性ＳＰＦマウス２０匹は陰性コントロールとして未感染のままにした。
細菌を、アンホテリシンＢ（フンギゾン、スクイブ、プリンストン、ＮＪ、ＵＳＡ）２．５mg／ｌ、トリメトプリム（シグマ、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）１０mg／ｌを含有した３．８％w/v血液寒天ベースNo．２（オキソイド、べーシングストーク、ＵＫ）と７％v/v全ウマ血（オキソイド）とが入ったプラスチック製ペトリ皿で増殖させた。プレートを微好気性湿気雰囲気（オキソイド、ＢＲ５６）中３７℃で４８時間インキュベートした。
超音波分解産物を上記のような生物の増殖、その後０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中での該生物の回収により得た。細胞を洗浄し、遠心により回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、新鮮ＰＢＳに再懸濁した。次いで細胞はＢ-３０ブランソン細胞破壊機を用いて細胞懸濁液ml当たり１分間の割合で超音波処理した（５０％能力サイクル）。超音波分解産物を−２０℃で貯蔵した。
Ｈ．フェリスの最終感染投与後６〜９週間日に出発して、２０匹のマウスに、大腸菌熱不安定毒素（ＨＬＴ）（シグマＥ８０１５）２５μｇ含有溶液０．２mlを各々経口投与し、２０匹のマウスに、ＨＬＴ２５μｇ及びタンパク質１mg（バイオラッドＤＣタンパク質アッセイ）含有Ｈ．ピロリの超音波分解産物を含む懸濁液０．２mlを各々経口投与し、２０匹のマウスに、タンパク質１mg含有Ｈ．ピロリの超音波分解産物を含む懸濁液０．２mlを各々経口投与し、４０匹のマウスには経口ワクチン接種しなかった。
各群は初回投与後１５、１７及び２０日目に更に３回の投与をうけた。
最終免疫投与後４週間日に、すべてのマウスを安楽死させた。洞部粘膜のサンプルを前記のように迅速な微量滴定ウレアーゼ試験で感染について調べた（Leeら，1990）。この試験はＨ．フェリス胃感染を高度に予想しうるとして有効であった。
結果は表３で示されている。
それらは粘膜アジュバント大腸菌熱不安定毒素と共にＨ．ピロリに由来するヘリコバクター抗原の経口投与が有意の割合のＨ．フェリス感染マウスを治癒させることを示している。
0003919812.tif 000004
参考文献
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