(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料中に内在する非環状アデニンヌクレオチド類及び非環状グアニンヌクレオチド類を除去し、環状ヌクレオチド類であるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰをそれぞれ０．１ａｍｏｌ及び０．５ａｍｏｌで高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法であって、試料中のＧＭＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰを、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナーゼを含むクリーニング１反応液を用いて分解し、次いで、試料中のＧＤＰを、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−１リン酸を含むクリーニング２反応液を用いてＧＴＰに変換し、反応液中に残存するＧＴＰをカラム吸着処理した後、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを選択的に溶出させることを特徴とするｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法。
【請求項２】
クリーニング１反応液を用いての分解反応を、塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液中で行うことを特徴とする請求項１記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法。
【請求項３】
クリーニング２反応液を用いてのＧＴＰへの変換反応を、トリス塩酸緩衝液中で行うことを特徴とする請求項１又は２記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法。
【請求項４】
カラム吸着処理に弱アニオン性イオン交換カートリッジを用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法。
【請求項５】
選択的に溶出されたｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ含有画分を、遠心濃縮することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法。
【請求項６】
生物学的試料に、ホスホジエステラーゼ阻害剤の存在下に前処理を施すことを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の調製する方法により得られるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ含有試料を、環状ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用いて、それぞれＡＭＰ及びＧＭＰに変換するＳｔｅｐ１、Ｓｔｅｐ１で生成するＡＭＰ及びＧＭＰをそれぞれＡＤＰ及びＧＤＰに変換するＳｔｅｐ２、Ｓｔｅｐ２で生成するＡＤＰ及びＧＤＰをそれぞれＡＴＰ及びＧＴＰに変換するＳｔｅｐ３、Ｓｔｅｐ３の酵素増幅法により生成する各ピルビン酸を２−ヒドロキシニコチンアルデヒドに変換するＳｔｅｐ４、Ｓｔｅｐ４で生成する２−ヒドロキシニコチンアルデヒドの蛍光強度を測定することを特徴とする同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法。
【請求項８】
Ｓｔｅｐ１でそれぞれカルモジュリン及び３，５−サイクリックヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用い、Ｓｔｅｐ２でミオキナーゼ又はグアニル酸キナーゼを用い、Ｓｔｅｐ３でそれぞれホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼを用い、Ｓｔｅｐ４でそれぞれ乳酸脱水素酵素を用いることを特徴とする請求項７記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法。
【請求項９】
失活させた環状ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用いて測定した蛍光強度をバックグラウンドとすることを特徴とする請求項７又は８記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法に用いることができ、前記クリーニング１反応液及びクリーニング２反応液調製用試薬、並びに前記Ｓｔｅｐ１〜４の各反応液調製用試薬を含有することを特徴とする同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定用キット。
【請求項１１】
アピラーゼ、アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナーゼ、並びに塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング１反応液調製用試薬と、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−１リン酸を含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング２反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、カルモジュリン及び３，５−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ１反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ、クレアチン−１リン酸、ミオキナーゼ及びクレアチンキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ及びグアニル酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ２反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、フルクトース、ホスホエノールピルビン酸、ジチオスレイトール、ヘキソキナーゼ及びピルビン酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、コハク酸、ホスホエノールピルビン酸、ジチオスレイトール、補酵素Ａ、ピルビン酸キナーゼ及びコハク酸チオキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ３反応液調製用試薬と、ＮＡＤＨ及び乳酸脱水素酵素を含むイミダゾール緩衝液からなるＳｔｅｐ４反応液調製用試薬とを含有することを特徴とする請求項１０記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定用キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的試料中に内在する非環状アデニンヌクレオチド類及び非環状グアニンヌクレオチド類を除去し、環状ヌクレオチド類であるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを同時に分離する方法や、該分離方法により分離された同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法や、該測定方法に用いる同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
細胞内ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰは、いずれも細胞内シグナリングの起点となる物質であり、細胞内二次メッセンジャーといわれている。また、心筋細胞などではｃＡＭＰのシグナリング経路とｃＧＭＰのシグナリング経路が、陰陽の関係にあると考えられている。従って、両環状ヌクレオチドによって調節を受ける細胞機能発現や遺伝子発現を研究する際には、細胞レベルでこれらの量的変化を高感度にかつ正確に比較検討する必要がある。
【０００３】
従来、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰの定量には、これらに特異的な抗体を用いた高感度なラジオイムノアッセイ法やエンザイムイムノアッセイ法が開発されてきたが、被爆の可能性や検量線が対数的で微細な変化をとらえるのが困難であり、また同時に測定することができないといった問題を抱えてきた。また、精度が悪く、かつ多大な時間を要する等の欠点があった。最近、酵素増幅法を用いた高感度蛍光測定法が開発され、ｃＡＭＰの定量法については杉山ら（Anal. Biochem., 218, 20-25, 1994）が、ｃＧＭＰの定量法については瀬谷ら（Anal. Biochem., 272, 243-249, 1999）が既に報告している。これらの方法では検量線が直線的に得られるため、微細な変化をとらえることができる。しかし、細胞内ｃＡＭＰやｃＧＭＰは、ホスホジエステラーゼで迅速に分解されるため、基底状態ではそれぞれ平均５０ｆｍｏｌ／ｍｇ、５ｆｍｏｌ／ｍｇとごく微量しか存在しない。従って、前処理や測定手法が異なると、夾雑物などによる影響も異なるため、ｃＡＭＰやｃＧＭＰの微細な変化を同時にかつ正確にとらえ、比較検討するには困難が生じていた。
【０００４】
また、内因性の非環状アデニンヌクレオチド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ量またはアデニル酸シクラーゼ活性を、放射性試薬を使用することなく迅速に測定する方法として、特開２０００−２６２２９６号公報には、内因性アデニル酸シクラーゼによって生成されるｃＡＭＰと、ＡＴＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰおよびこれらの混合物からなる群から選択される内因性の非環状アデニンヌクレオチド類を含む生物学的試料中のｃＡＭＰ量またはアデニル酸シクラーゼ活性を測定するため、(１)上記試料中のｃＡＭＰ以外の内因性非環状アデニンヌクレオチドおよびグルコース-６-リン酸を酵素的に除去するためにアピラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびアルカリフォスファターゼの有効量を混合し、(２)ｃＡＭＰをＡＭＰに酵素的に変換し、(３)放射性物質を用いることなくＡＭＰの量を測定する方法が記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
細胞機能発現や遺伝子発現に関与する細胞内シグナリング物質であるｃＡＭＰやｃＧＭＰは、細胞内に極微量しか存在しないので、これまではラジオイムノアッセイ法とかエンザイムイムノアッセイ法で測定されていたが、検量線が対数的であり微細な変化を正確に捉えることが難しく、また、同一試料中のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの両者を同時に測定できないという問題があった。本発明の課題は、細胞や組織等の生物学的試料における同一試料中のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ量を同時に高感度で定量できる測定方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討し、同一試料中のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ量を同時に高感度で定量する方法として、酵素蛍光法に注目したが、この酵素蛍光法の適用における最大の問題は、試料中に混在するｃＡＭＰやｃＧＭＰ以外の非環状アデニン及びグアニンヌクレオチド類等の測定妨害物質の効率的除去の点にあり、この問題は酵素反応と弱アニオン性イオン交換カートリッジを組み合わせることにより解決することができ、ｃＡＭＰとｃＧＭＰを同時に精製できることを見い出した。また、ｃＡＭＰとｃＧＭＰを同時に定量するために、それぞれ酵素増幅法で増幅された結果生成するピルビン酸量を同時に蛍光定量することにより、ｃＡＭＰは１ｆｍｏｌ、ｃＧＭＰは５ｆｍｏｌから直線的に検量線を引くことができ、ｃＡＭＰは０．１×１０18ｍｏｌ（０．１ａｍｏｌ）、ｃＧＭＰは０．５×１０18ｍｏｌ（０．５ａｍｏｌ）という高感度で正確に定量することができることを見い出した。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００７】
すなわち本発明は、（１）生物学的試料中に内在する非環状アデニンヌクレオチド類及び非環状グアニンヌクレオチド類を除去し、環状ヌクレオチド類であるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰをそれぞれ０．１ａｍｏｌ及び０．５ａｍｏｌで高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法であって、試料中のＧＭＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰを、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナーゼを含むクリーニング１反応液を用いて分解し、次いで、試料中のＧＤＰを、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−１リン酸を含むクリーニング２反応液を用いてＧＴＰに変換し、反応液中に残存するＧＴＰをカラム吸着処理した後、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを選択的に溶出させることを特徴とするｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法や、（２）クリーニング１反応液を用いての分解反応を、塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液中で行うことを特徴とする上記（１）記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法や、（３）クリーニング２反応液を用いてのＧＴＰへの変換反応を、トリス塩酸緩衝液中で行うことを特徴とする上記（１）又は（２）記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法や、（４）カラム吸着処理に弱アニオン性イオン交換カートリッジを用いることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれか記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法や、（５）選択的に溶出されたｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ含有画分を、遠心濃縮することを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法や、（６）生物学的試料に、ホスホジエステラーゼ阻害剤の存在下に前処理を施すことを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれか記載のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを高感度で測定し得るサンプルを同時に調製する方法に関する。
【０００８】
また本発明は、（７）上記（１）〜（６）のいずれか記載の調製する方法により得られるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ含有試料を、環状ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用いて、それぞれＡＭＰ及びＧＭＰに変換するＳｔｅｐ１、Ｓｔｅｐ１で生成するＡＭＰ及びＧＭＰをそれぞれＡＤＰ及びＧＤＰに変換するＳｔｅｐ２、Ｓｔｅｐ２で生成するＡＤＰ及びＧＤＰをそれぞれＡＴＰ及びＧＴＰに変換するＳｔｅｐ３、Ｓｔｅｐ３の酵素増幅法により生成する各ピルビン酸を２−ヒドロキシニコチンアルデヒドに変換するＳｔｅｐ４、Ｓｔｅｐ４で生成する２−ヒドロキシニコチンアルデヒドの蛍光強度を測定することを特徴とする同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法や、（８）Ｓｔｅｐ１でそれぞれカルモジュリン及び３，５−サイクリックヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用い、Ｓｔｅｐ２でミオキナーゼ又はグアニル酸キナーゼを用い、Ｓｔｅｐ３でそれぞれホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼを用い、Ｓｔｅｐ４でそれぞれ乳酸脱水素酵素を用いることを特徴とする上記（７）記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法や、（９）失活させた環状ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用いて測定した蛍光強度をバックグラウンドとすることを特徴とする上記（７）又は（８）記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法に関する。
【０００９】
さらに本発明は、（１０）上記（７）〜（９）のいずれか記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法に用いることができ、前記クリーニング１反応液及びクリーニング２反応液調製用試薬、並びに前記Ｓｔｅｐ１〜４の各反応液調製用試薬を含有することを特徴とする同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定用キットや、（１１）アピラーゼ、アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナーゼ、並びに塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング１反応液調製用試薬と、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−１リン酸を含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング２反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、カルモジュリン及び３，５−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ１反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ、クレアチン−１リン酸、ミオキナーゼ及びクレアチンキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ及びグアニル酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ２反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、フルクトース、ホスホエノールピルビン酸、ジチオスレイトール、ヘキソキナーゼ及びピルビン酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、コハク酸、ホスホエノールピルビン酸、ジチオスレイトール、補酵素Ａ、ピルビン酸キナーゼ及びコハク酸チオキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ３反応液調製用試薬と、ＮＡＤＨ及び乳酸脱水素酵素を含むイミダゾール緩衝液からなるＳｔｅｐ４反応液調製用試薬とを含有することを特徴とする上記（１０）記載の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定用キットに関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの同時分離方法としては、各種動物細胞や生体組織等の生物学的試料中に内在するＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ等の非環状アデニンヌクレオチド類やＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰ等の非環状グアニンヌクレオチド類を除去し、環状ヌクレオチド類であるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを同一試料から同時に分離する方法であって、試料中のＧＭＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ等をアピラーゼ、アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナーゼを含むクリーニング１反応液を用いて分解し、次いで、試料中のＧＤＰをクレアチンキナーゼ及びクレアチン−１リン酸を含むクリーニング２反応液を用いてＧＴＰに変換し、生成したＧＴＰを含め反応液中に残存するＧＴＰをカラム吸着処理した後、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを選択的に溶出させるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの同時分離方法であれば特に制限されるものではない。
【００１１】
上記生物学的試料としては細胞や生体組織等を例示することができ、これら生物学的試料に、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ペントキシフィリン、テオフィリン等のキサンチン誘導体、フェノチアジン、ビンポセチン、シロスタミド、ミルリノン、トレキンシン、インドリダン、クアジノン、ロリプラム、ザプリナスト、ジピリダモール、パパベリンなどのホスホジエステラーゼ阻害剤の存在下にあらかじめ前処理を施すことが好ましく、かかる前処理としてはｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの分解を防ぐ上記ホスホジエステラーゼ阻害剤又はトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を含む生理溶液中でのインキュベーションを挙げることができる。また上記生理溶液としては、体液と等張の塩類混合液で、血漿に極く近い、イオン、浸透圧、ｐＨが調整された、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、炭酸水素ナトリウムの混合液であるリンガー（リンゲル）液、該リンガーにブドウ糖等が添加されたタイロード液等を用いることができる。さらに、生体試料中のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ含量を亢進させる目的で、一酸化窒素（ＮＯ）ドナー、例えば、三硝酸グリセリン（ＧＴＮ）、四硝酸ペンタエリトリチル（ＰＥＴＮ）、一硝酸−５−イソソルビトール（ＩＳＭＮ）、二硝酸イソソルビトール（ＩＳＤＮ）、六硝酸マンニトール、六硝酸イノシトール、硝酸プロパチル、硝酸トロール、ニコランジル等の有機硝酸エステル、亜硝酸イソアミル、チオ亜硝酸エステル、チオ硝酸エステル等の有機亜硝酸エステル、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミン（ＳＮＡＰ）等のＳ−ニトロソチオール、ニトロソタンパク質、一酸化窒素放出性フロキサン誘導体、メソカルブ、モルシドミン等の一酸化窒素放出性シドノニミン誘導体、鉄−ニトロシル化合物、ニトロプルシッド−ナトリウム等のニトロシル錯体化合物で処理したり、カテコールアミンの一種で交感神経刺激剤としての作用が確立しているイソプロテレノールで処理することもできる。
【００１２】
上記クリーニング１反応液を用いての分解反応は、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ、アデノシンデアミナーゼに加えて塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で行うことが好ましく、かかる酵素による分解反応後に、例えば９０℃１０分間の加熱により酵素類を失活させることが好ましい。また、上記クリーニング２反応液を用いてのＧＤＰのＧＴＰへの変換は、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−１リン酸を含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で行うことが好ましく、かかる酵素による変換反応後に加熱により酵素類を失活させることが好ましい。クリーニング１反応液により試料中のＧＭＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ等を分解した後、クリーニング２反応液を用いて試料中のＧＤＰをＧＴＰに変換し（化１参照）、生成したＧＴＰを含め反応液中に残存するＧＴＰはカラム吸着処理により除去されるが、かかるカラム吸着処理としてはＧＴＰを選択的に吸着し、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを溶出しうる処理であれば特に制限されず、例えばＳＥＰ−ＰＡＫ ＮＨ2カートリッジ等の弱アニオン性イオン交換カートリッジを用いる処理を挙げることができる。このように、選択的に溶出されたｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ含有画分は、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰが分解されない温度、例えば６０℃で遠心濃縮することが好ましい。
【００１３】
【化１】
0003992467.tif 000002
【００１４】
上記本発明のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの同時分離方法により得られるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを含有するサンプル中のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰは、本発明の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法により、ｃＡＭＰは０．１×１０18ｍｏｌ（０．１ａｍｏｌ）、ｃＧＭＰは０．５×１０18ｍｏｌ（０．５ａｍｏｌ）という高感度で正確に定量することができる。かかる本発明の測定方法としては、同一サンプル中に含まれるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを、３，５−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ等の環状ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用いて、それぞれＡＭＰ及びＧＭＰに変換するＳｔｅｐ１（化２参照）と、Ｓｔｅｐ１で生成するＡＭＰ及びＧＭＰをそれぞれＡＤＰ及びＧＤＰに変換するＳｔｅｐ２（化３参照）と、Ｓｔｅｐ２で生成するＡＤＰ及びＧＤＰをそれぞれＡＴＰ及びＧＴＰに変換するＳｔｅｐ３（酵素増幅反応；化４参照）と、Ｓｔｅｐ３の酵素増幅法により生成する各ピルビン酸を２−ヒドロキシニコチンアルデヒドに変換するＳｔｅｐ４（化５参照）と、Ｓｔｅｐ４で生成する２−ヒドロキシニコチンアルデヒドの蛍光強度を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、蛍光強度を励起波長（ｅｍ）３７０ｎｍ、蛍光波長（ｅｘ）４６０ｎｍで測定して蛍光定量することにより、ｃＡＭＰは１ｆｍｏｌ、ｃＧＭＰは５ｆｍｏｌから直線的に検量線を引くことができる。
【００１５】
【化２】
0003992467.tif 000003
【００１６】
【化３】
0003992467.tif 000004
【００１７】
【化４】
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【００１８】
【化５】
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【００１９】
また、上記Ｓｔｅｐ１でｃＡＭＰ測定及びｃＧＭＰ測定の場合とも、カルモジュリン及び３，５−サイクリックヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼ、好ましくはさらに塩化マグネシウム、塩化カルシウム等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Ｓｔｅｐ２のｃＡＭＰ測定の場合に、ミオキナーゼ好ましくはさらに塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ、クレアチン−１リン酸、クレアチンキナーゼ等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Ｓｔｅｐ２のｃＧＭＰ測定の場合に、グアニル酸キナーゼ好ましくはさらに塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Ｓｔｅｐ３のｃＡＭＰ測定の場合に、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ好ましくはさらに塩化マグネシウム、フルクトース、ジチオスレイトール、ヘキソキナーゼ等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Ｓｔｅｐ３のｃＧＭＰ測定の場合に、ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼ好ましくはさらに塩化マグネシウム、コハク酸、ジチオスレイトール、補酵素Ａ、コハク酸チオキナーゼ等を含むトリス塩酸緩衝液を用い、Ｓｔｅｐ４でｃＡＭＰ測定及びｃＧＭＰ測定の場合とも、乳酸脱水素酵素好ましくはさらにＮＡＤＨ等を含むイミダゾール緩衝液を用いることが望ましい。
【００２０】
また、本発明の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法において、上記３，５−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ等の環状ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼに代えて、加熱等により失活させた環状ヌクレオチド選択性ホスホジエステラーゼを用いて測定した蛍光強度をバックグラウンドとして検量線を作成することにより、より一層正確に同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを測定することができる。
【００２１】
本発明の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定用キットとしては、上記本発明の同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定方法に用いることができ、前記クリーニング１反応液及びクリーニング２反応液調製用試薬、並びに前記Ｓｔｅｐ１〜４の各反応液調製用試薬を含有するものであればどのようなものでもよく、例えば、アピラーゼ、アルカリホスファターゼ及びアデノシンデアミナーゼ、並びに塩化マグネシウムを含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング１反応液調製用試薬と、クレアチンキナーゼ及びクレアチン−１リン酸を含むトリス塩酸緩衝液からなるクリーニング２反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、カルモジュリン及び３，５−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ１反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ、クレアチン−１リン酸、ミオキナーゼ及びクレアチンキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、塩化カリウム、ＡＴＰ及びグアニル酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ２反応液調製用試薬と、塩化マグネシウム、フルクトース、ホスホエノールピルビン酸、ジチオスレイトール、ヘキソキナーゼ及びピルビン酸キナーゼを含むトリス塩酸緩衝液、並びに、塩化マグネシウム、コハク酸、ホスホエノールピルビン酸、ジチオスレイトール、補酵素Ａ、ピルビン酸キナーゼ及びコハク酸チオキナーゼを含むトリス塩酸緩衝液からなるＳｔｅｐ３反応液調製用試薬と、ＮＡＤＨ及び乳酸脱水素酵素を含むイミダゾール緩衝液からなるＳｔｅｐ４反応液調製用試薬とを含有する、同一サンプルにおけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの測定用キットを具体的に挙げることができる。
【００２２】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１（本発明のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰの同時測定）
１−１  非環状アデニン及びグアニンヌクレオチドの除去
各種濃度のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰに、濃度５〜１０ｎｍｏｌのそれぞれＡＭＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰからなる非環状アデニンヌクレオチド類、及びそれぞれＧＭＰ、ＧＤＰ、ＧＴＰからなる非環状グアニンヌクレオチド類を含む試料を作製し、本発明のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの検出限界を調べてみた。まず各試料を、２０ｍＭのトリス緩衝液（１０μｌ）に溶かした後、１０μｌのクリーニング１反応液（２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｍＭの塩化マグネシウム、４Ｕ／ｍｌのアピラーゼ、４０Ｕ／ｍｌのアルカリホスファターゼ、２０Ｕ／ｍｌのアデノシンデアミナーゼ）を加え、３０℃で３時間インキュベーションすることによりＧＭＰ、ＡＭＰ、ＡＤＰ及びＡＴＰを分解させ、反応終了後９０℃で１０分間加熱して酵素類を失活させた。加熱した各反応溶液に１０μｌのクリーニング２反応液（２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのクレアチンリン酸、８０Ｕ／ｍｌのクレアチンキナーゼ）を加え、３０℃で１時間インキュベーションすることによりＧＤＰをＧＴＰに誘導させ、反応終了後、９０℃で５分間加熱して失活させた。
【００２３】
上記前処理及びクリーニング反応を行った各試料に純水を加えて総量５００μｌとし、ＳＥＰ−ＰＡＫ  ＮＨ2カートリッジカラム（０．５ｇ；ウォーターズ製）に吸着させ、０．５ｍｌの純水で洗浄した後、３ｍｌの純水でｃＡＭＰ及びｃＧＭＰを濃縮用チューブに溶出させた。溶出したｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ画分を減圧濃縮装置（大洋化学工業社製）を用いてそれぞれ６０℃にて減圧濃縮し、測定に使用するまで−８０℃で保存した。
【００２４】
２−２  ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの同時酵素蛍光測定
（ステップ１）
上記減圧濃縮した各試料のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ画分を、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）４０μｌに溶かし、１０×７５ｍｍガラスチューブに８μｌずつ４本に分けてｃＧＭＰアッセイ用とし、残りの８μｌに２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて１０倍希釈した溶液から２μｌずつ４本に分けｃＡＭＰアッセイ用とした。ｃＧＭＰアッセイ用チューブ２本と、ｃＡＭＰアッセイ用チューブ２本にそれぞれＳｔｅｐ１（ＰＤＥ＋）反応液［２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭの塩化マグネシウム、０．１ｍＭの塩化カルシウム、３００Ｕ／ｍｌのカルモジュリン、０．１Ｕ／ｍｌの環状ヌクレオチド選択性ジホスホエステラーゼ］５μｌを加えて３０℃で１時間インキュベーションし、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰからＡＭＰ、ＧＭＰへと誘導した。また、残りのｃＧＭＰアッセイ用チューブ２本と、ｃＡＭＰアッセイ用チューブ２本にＳｔｅｐ１（ＰＤＥ−）反応液［Ｓｔｅｐ１（ＰＤＥ＋）反応液を９０℃１５分加熱し、生体由来ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰがＡＭＰ、ＧＭＰに変換されないので、バックグラウンドとして用いた。］５μｌを加えて上記と同様にインキュベーションした。
【００２５】
（ステップ２）
インキュベーション後、各ｃＡＭＰアッセイ用チューブ中の環状ヌクレオチド由来ＡＭＰをＳｔｅｐ２（ｃＡＭＰ）反応液［２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化カリウム、１０ｎＭのＡＴＰ、０．１ｍＭのクレアチン−１リン酸、１２０Ｕ／ｍｌのミオキナーゼ、４０Ｕ／ｍｌのクレアチンキナーゼ］中で、一方、各ｃＧＭＰアッセイ用チューブ中の環状ヌクレオチド由来ＧＭＰをＳｔｅｐ２（ｃＧＭＰ）反応液［２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭの塩化マグネシウム、１００ｍＭの塩化カリウム、５０μＭのＡＴＰ、１Ｕ／ｍｌのグアニル酸キナーゼ］中で、３０℃，１時間反応させてＡＤＰやＧＤＰを導き、反応後、各チューブを９０℃で５分間加熱して酵素を失活させた。
【００２６】
（ステップ３）
上記得られた環状ヌクレオチド由来ＡＤＰ、ＧＤＰを、酵素増幅反応システムにより２時間の増幅反応処理し、ＡＤＰは最大約５００００倍、ＧＤＰは約１００００倍に増幅した。各ｃＡＭＰアッセイ用チューブには、Ｓｔｅｐ３（ｃＡＭＰ）反応液［２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭの塩化マグネシウム、８ｍＭのフルクトース、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．５ｍＭのジチオスレイトール、３０．８Ｕ／ｍｌのヘキソキナーゼ、７０Ｕ／ｍｌのピルビン酸キナーゼ］２５μｌを加え、各ｃＧＭＰアッセイ用チューブには、Ｓｔｅｐ３（ｃＧＭＰ）反応液［２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、５ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭのコハク酸、１ｍＭのホスホエノールピルビン酸、０．５ｍＭのジチオスレイトール、０．５ｍＭの補酵素Ａ、８０U／ｍｌのピルビン酸キナーゼ、２Ｕ／ｍｌのコハク酸チオキナーゼ］２５μｌを加え、３０℃で２時間インキュベーションした後、各チューブに０．５ＭのＥＤＴＡ水溶液１０μｌを加えて反応を停止させた。
【００２７】
（ステップ４）
Ｓｔｅｐ３の酵素増幅反応が終了した各チューブにＳｔｅｐ４反応液（１００ｍＭのイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．０）、５ｍＭのＮＡＤＨ、４Ｕ／ｍｌの乳酸脱水素酵素）１０μｌを加え、常温下に１０分間放置し反応させた。次に２ＮのＨＣｌ水溶液１０μｌを加えて常温下に１０分静置し、未反応ＮＡＤＨを分解した後、６ＮのＮａＯＨ水溶液１０μｌを加え、６０℃で１０分間反応させた（この反応でＮＡＤ+が２−ヒドロキシニコチンアルデヒドに分解される。）。室温静置２０分後に２−ヒドロキシニコチンアルデヒドの蛍光強度を蛍光分光光度計（日本分光社製）を用いてｅｍ：３７０ｎｍ、ｅｘ：４６０ｎｍで測定した。その結果、蛍光定量の検出限界は約５０ｐｍｏｌであることがわかった。従って、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰの測定感度はそれぞれ１及び５ｆｍｏｌとなり、１００ｆｍｏｌまで直線検量線を作ることができることが明らかとなり、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ以外のアデニンおよびグアニンヌクレオチドによる影響はいずれも１０ｎｍｏｌまで受けないことが確認された。また、この方法の開発により、測定時間は従来の２分の１（約７時間）に短縮された。以上のことから、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ同時測定法は高感度かつ簡便であることから、ｃＡＭＰとｃＧＭＰ量の同時比較が必要な細胞を含む幅広い生体試料への適用が期待できる。
【００２８】
実施例２（ラット大動脈平滑筋細胞内ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ量の測定）
上記実施例１の方法を用いて細胞内又は組織内のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ量の測定が可能かどうかを、ラット大動脈平滑筋細胞内におけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ量の測定を行うことにより調べてみた。３５ｍｍディッシュ中でセミコンフルエントに達したラット大動脈平滑筋細胞を０．２ｍＭのＩＢＭＸ（ホスホジエステラーゼ阻害薬）含有又は非含有のタイロード液に置き換えて１５分間インキュベートし、その後、かかる細胞溶液に１００μＭのＳＮＡＰ（Ｓ−ニトロソ  Ｎ−アセチルペニシラミン、ＮＯドナー）又は１０μＭのイソプロテレノール（ＩＳＰ）を加えて更にインキュベーションし、５分後に１０％のトリクロロ酢酸水溶液を加えて反応を終了させた。得られた細胞溶液に氷冷した１０％のトリクロロ酢酸水溶液５００μｌを加え、氷冷下に３０分静置した。得られた上澄み液に５倍量の水飽和エーテルを加えて洗浄し、トリクロロ酢酸を取り除く操作を４回繰り返し行った。洗浄した上澄み液を６０℃で遠心濃縮し、測定に使用するまで−８０℃で保存した。
【００２９】
上記測定試料を実施例１記載の方法と同様に試料における非環状アデニン及びグアニンヌクレオチドの除去し、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの同時酵素蛍光測定を行った。なお、試料における非環状アデニン及びグアニンヌクレオチドの除去する際、同時に検量線作成用のｃＡＭＰスタンダード溶液（０、５０、１００ｆｍｏｌのｃＡＭＰ溶液）又はｃＧＭＰスタンダード溶液（０、５０、１００ｆｍｏｌのｃＧＭＰ溶液）も並行して反応を行い、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの同時酵素蛍光測定を行った。検量線を図１に、酵素蛍光測定の結果を図２に示す。なお、３５ｍｍディッシュ中の培養平滑筋細胞に含まれるタンパク量は平均８３．５±７．５μｇ／ディッシュであった。これらのことから、ＩＢＭＸ（イソブチルメチルキサンチン）を存在せしめることによりｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ量の増加が認められた。また、イソプロテレノールを含有したものは細胞内ｃＡＭＰ量を著しく上昇させたが、ｃＧＭＰ量を変化させなかった。一方、ＳＮＡＰ（ＮＯドナー）は細胞内ｃＧＭＰ量を著しく上昇させたが、ｃＡＭＰ量には影響しなかった。以上のことから、本発明のｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ同時測定法は高感度かつ簡便に細胞内ｃＡＭＰとｃＧＭＰ量を同時測定できることがわかった。
【００３０】
実施例３（ラット心筋組織内ｃＧＭＰ量の測定）
次に  まず、ラット大動脈平滑筋細胞内におけるｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ量の測定を行った。エーテル麻酔したラットから心臓を摘出し、左心房、左心室乳頭筋標本を作製し、マグヌス装置に装着した後、心房筋には０．５ｇの、心室筋には１ｇの張力をかけ、１Ｈｚ閾値の１．５〜２倍の電圧をかけて等尺性収縮を測定した。１時間かけて安定化させ、その間１５分ごとにタイロード液で洗浄した。洗浄後、１００μＭのＳＮＡＰ（ＮＯドナー）存在下又は非存在下で９０秒間インキュベーションし、その後標本を迅速に液体窒素で凍結して−８０℃で保存した。
【００３１】
上記凍結粉状の組織に１０倍量の氷冷した１０％のトリクロロ酢酸水溶液を加えてホモジナイズし、４℃で２０００ｇ×１５分間遠心した。遠心後、上澄み液を採取し、残渣に再度、同量の１０％のトリクロロ酢酸水溶液を加えて強く撹拌洗浄して４℃で２０００ｇ×１５分間遠心し上澄み液を採取した。得られた上澄み液を２ｍｌの水飽和エーテルで４回洗浄した後（洗浄のたびにエーテルを除く）、洗浄した上澄み液を６０℃で遠心濃縮し、測定に使用するまで−８０℃で保存した。その後、試験例１記載の方法と同様に試料における非環状アデニン及びグアニンヌクレオチドの除去し、ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰの同時酵素蛍光測定を行い、ｃＧＭＰの量を測定した。その結果、ペーシング下でのラット心筋標本中ｃＧＭＰ量は左心房が２９±２２．５、左心室が１８．９±１３．０ｆｍｏｌ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであったが、ＳＮＡＰ（ＮＯドナー）存在下ではそれぞれ、１８９．３±３４．４、１２４．８±２３．５ｆｍｏｌ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎに上昇することがわかった。
【００３２】
実施例４（ガスクロマトグラフィー質量分析によるピルビン酸の超高感度測定）
実施例１記載のＳｔｅｐ３で得られた反応液をシリカゲルカートリッジに吸着させ、クロロホルム−メタノール−酢酸（１：１：０．０４）混合液でピルビン酸を選択的に溶出し、反応液中に存在する妨害物質、ホスホエノールピルビン酸やコハク酸を取り除いた。溶出されたピルビン酸をガスクロマトグラフィー質量分析計（日本電子社製）で定量した。この結果、ガスクロマトグラフィー質量分析計を用いることにより５ｆｍｏｌの感度で測定できることがわかった。以上のことより、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰの測定感度はそれぞれ０．１及び０．５ａｍｏｌとなる。従って、単一細胞内ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰを介するシグナリングの動態を調べることができると考えられる。
【００３３】
【発明の効果】
本発明によると、細胞や組織等の生物学的試料における同一試料中のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ量を同時に高感度で定量することができ、本発明の測定方法によると、脳や心臓などの細胞内のｃＡＭＰやｃＧＭＰを介したシグナリングによる細胞機能発現、遺伝子発現研究におけるｃＡＭＰやｃＧＭＰ動態を知ることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ標準物質を用いた場合の蛍光強度変化（ｎ＝５）を示す図である。
【図２】ラット大動脈平滑筋細胞内ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ両の各種薬物による変化を示す図である。
【図１】
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【図２】
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