(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３に示される塩基配列からなるＲＮＡ分子を有効成分として含有してなる、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との間の結合の阻害剤。
【請求項２】
配列番号：２７に示される塩基配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ分子を有効成分として含有してなる、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との間の結合の阻害剤。
【請求項３】
配列番号：２７に示される塩基配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ分子を有効成分として含有してなる神経細胞死抑制剤。
【請求項４】
配列番号：２７に示される塩基配列からなる２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ分子を有効成分として含有してなる、プレセニリン−２ ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生を抑制するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害しうる阻害剤、神経細胞死を抑制することができる神経細胞死抑制剤、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損型スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物、該疾患の治療又は予防方法及び該阻害剤の使用に関する。
背景技術
神経変性疾患の１つであるアルツハイマー病（ＡＤ）は、９０％を超えるＡＤ患者の疾患が孤発性アルツハイマー病（ｓＡＤ）に分類される。ｓＡＤ患者の大脳皮質及び海馬ＣＡ１領域のそれぞれのアポトーシス性錐体細胞に、プレセニリン−２遺伝子のバリアントがコードする異常タンパク質（ＰＳ２Ｖ）が存在することが知られている［サトウ（Ｓａｔｏ，Ｎ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１０８−２１１４（２００１）］。
ＰＳ２Ｖは、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ培養細胞において低酸素刺激により誘導され、酸化ストレス及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞での新たなタンパク質合成に依存することが示されている［サトウ（Ｓａｔｏ，Ｎ．）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７２，２４９８−２５０５（１９９９）］。
前記ＰＳ２Ｖにより、小胞体（ＥＲ）ストレス応答性分子シャペロンであるグルコース調節タンパク質（ＧＲＰ７８）が減少し、ＰＳ２Ｖ発現細胞においてβ−アミロイドタンパク質の産生が増加することが知られている［サトウ（Ｓａｔｏ，Ｎ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１０８−２１１４（２００１）］。
しかしながら、ＰＳ２ＶがｓＡＤにおけるニューロン死の重要な因子の１つである可能性は示唆されているものの、ＰＳ２Ｖの生成、疾患発症におけるメカニズムの詳細が十分に知られていないのが現状である。また、前記ＰＳ２Ｖの生成に起因する疾患の有効な治療法が求められているのが現状である。
発明の開示
本発明は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害しうる阻害剤を提供することを目的とする。また、本発明は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害し、プレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制し、それにより神経細胞死を抑制することができる神経細胞死抑制剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、細胞死、特に、神経細胞死を抑制すること、細胞への導入効率に優れること、生体内における安定性に優れること及びプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害、神経変性疾患等の治療又は予防の少なくとも１つを達成することが可能な、医薬組成物を提供することを目的とする。また、本発明は、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害、神経変性疾患等の治療又は予防を、より効率よく、持続的に行なうことが可能な、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は、
〔１〕  ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害する化合物を有効成分として含有してなる、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との間の結合の阻害剤、
〔２〕  該化合物が、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＲＮＡ分子、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＤＮＡ分子、
（Ｃ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、
（Ｄ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、及び
（Ｅ）前記（Ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
からなる群より選択された１種である、前記〔１〕記載の阻害剤、
〔３〕  該化合物が、
（ａ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＲＮＡ分子、
（ｂ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＤＮＡ分子、
（ｃ）前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、
（ｄ）前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、及び
（ｅ）前記（ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
からなる群より選択された１種である、前記〔２〕記載の阻害剤、
〔４〕  該化合物が、配列番号：２７に示される塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ分子である、前記〔１〕又は〔２〕記載の阻害剤、
〔５〕  ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害する化合物を有効成分として含有した、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との間の結合の阻害剤を有効成分として含有してなる神経細胞死抑制剤、
〔６〕  該化合物が、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＲＮＡ分子、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＤＮＡ分子、
（Ｃ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、
（Ｄ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、及び
（Ｅ）前記（Ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
からなる群より選択された１種である、前記〔５〕記載の神経細胞死抑制剤、
〔７〕  該化合物が、
（ａ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＲＮＡ分子、
（ｂ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＤＮＡ分子、
（ｃ）前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、
（ｄ）前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、及び
（ｅ）前記（ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
からなる群より選択された１種である、前記〔６〕記載の神経細胞死抑制剤、
〔８〕  該化合物が、配列番号：２７に示される塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ分子である、前記〔５〕又は〔６〕記載の神経細胞死抑制剤、
〔９〕  ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害する化合物を有効成分として含有した、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との間の結合の阻害剤、又は
該阻害剤を有効成分として含有した神経細胞死抑制剤
を有効成分として含有してなる医薬組成物、
〔１０〕  該化合物が、
（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＲＮＡ分子、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＤＮＡ分子、
（Ｃ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、
（Ｄ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、及び
（Ｅ）前記（Ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
からなる群より選択された１種である、前記〔９〕記載の医薬組成物、
〔１１〕  該化合物が、
（ａ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＲＮＡ分子、
（ｂ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＤＮＡ分子
（ｃ）前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、
（ｄ）前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、及び
（ｅ）前記（ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
からなる群より選択された１種である、前記〔１０〕記載の医薬組成物、
〔１２〕  該化合物が、配列番号：２７に示される塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ分子である、前記〔９〕又は〔１０〕記載の医薬組成物、
〔１３〕  スプライシング異常を抑制する作用を有する、前記〔９〕〜〔１２〕いずれか１項に記載の医薬組成物、
〔１４〕  プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生を抑制する作用を有する、前記〔９〕〜〔１３〕いずれか１項に記載の医薬組成物、
〔１５〕  プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する脳障害又は神経変性疾患を治療又は予防しうる、前記〔９〕〜〔１４〕いずれか１項に記載の医薬組成物、
〔１６〕  該脳障害が、虚血性脳疾患又は脳神経変性疾患である、前記〔１５〕記載の医薬組成物、
〔１７〕  該脳障害が、脳血管性痴呆、パーキンソン症候群及びアルツハイマー病からなる群より選ばれた疾患である、前記〔１６〕記載の医薬組成物、
〔１８〕  該神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症である、前記〔１５〕記載の医薬組成物、
〔１９〕  プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に投与し、それにより、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物の製造のための、前記〔１〕〜４いずれか１項に記載の阻害剤若しくは前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の神経細胞死抑制剤の使用、並びに
〔２０〕  プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に、前記〔１〕〜〔４〕いずれか１項に記載の阻害剤若しくは前記〔５〕〜〔８〕いずれか１項に記載の神経細胞死抑制剤を治療上有効量投与することを特徴とする、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の阻害剤は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との間の結合を阻害する化合物を有効成分として含有することに１つの特徴がある。本発明の阻害剤は、前記化合物を含有しているため、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡとの間の結合を阻害することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の阻害剤によれば、前記プレセニリン−２  ｍＲＮＡのスプライシング異常、特にプレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制することができるという優れた効果を発揮する。さらに、本発明の阻害剤は、プレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制できるため、さらに神経細胞死を抑制することができるという優れた効果を発揮する。
プレセニリン−２遺伝子は、アルツハイマー病における原因遺伝子の１つとして考えられている遺伝子である。前記プレセニリン−２遺伝子にコードされるタンパク質は、小胞体ゴルジ体に存在する膜タンパク質であって、アミロイド代謝又は沈着に関係するタンパク質である。前記プレセニリン−２遺伝子は、１２のエキソンから構成され、このうち、１０のエキソンがタンパク質をコードする［例えば、レビ−ラハド（Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ）ら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３４，１９８−２０４，（１９９６）；レビ−ラハドら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，９７３−９７７（１９９５）；ロゲフ（Ｒｏｇａｅｖ）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，７７５−７７８（１９９５）等を参照のこと］。
なお、本明細書において、「プレセニリン−２遺伝子」とは、プレセニリン−２タンパク質をコードするｍＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）のいずれをも含むことを意味する。なお、プレセニリン−２遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列は、例えば、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）のアクセッション番号：ＸＭ００２１２７、ＸＭ００２１２８、ＸＰ００２１２７等に記載されている。
本発明で用いられる「ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との間の結合を阻害する化合物」は、例えば、特定部位において、該結合を特異的に拮抗し、それにより、該結合を完全に阻害する化合物、又は、特定部位において、該結合を特異的に拮抗し、それにより、該結合の結合強度を減少させる化合物のいずれでもよい。
前記「特定部位」としては、具体的には、例えば、▲１▼配列番号：１に示される塩基配列からなる領域、▲２▼配列番号：２に示される塩基配列からなる領域、▲３▼配列番号：１に示される塩基配列と配列番号：２に示される塩基配列とを含有した領域；▲４▼前記▲１▼〜▲３▼それぞれに対応するＤＮＡ上における連続した配列からなる領域等が挙げられる。
また、本発明においては、前記「特定部位」には、（ｉ）ＨＭＧ−Ｉタンパク質のアミノ酸配列において、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との間の結合に関与する連続した配列からなる領域；（ｉｉ）ＨＭＧ−Ｉタンパク質中に存在するアミノ酸残基であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との間の結合に関与する複数のアミノ酸残基から形成される空間的な領域をも含まれる。
前記「結合に関与するアミノ酸残基」としては、例えば、他のアミノ酸残基に置換された場合、得られたタンパク質のプレセニリン−２遺伝子への結合能を消失させる残基等が挙げられる。
前記配列番号：１に示される塩基配列及び配列番号：２に示される塩基配列は、プレセニリン−２遺伝子のｍＲＮＡに存在する配列であり、ＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合に重要であることが、本発明者らにより見出された塩基配列であり、本発明は、かかる本発明者らの知見に基づく。
本発明においては、前記配列番号：１又は２は、前記配列番号：１又は２において、少なくとも１残基の変異を有する配列であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合能を呈する配列及びそれに対応するＤＮＡ配列であってもよく、前記配列番号：１若しくは配列番号：２の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合能を呈する配列であってもよい。
前記化合物は、低分子化合物であっても、高分子化合物であってもよい。前記化合物としては、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ等の核酸；有機合成化合物等が挙げられる。前記核酸は、１本鎖でも２本鎖であってもよく、直鎖状であっても環状であってもよい。
前記化合物としては、例えば、ＨＭＧ−Ｉタンパク質中に存在するアミノ酸配列であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との結合に関与するアミノ酸配列からなる領域をブロックする化合物（例えば、核酸、核酸アナログ等）；ＨＭＧ−Ｉタンパク質中に存在するアミノ酸残基であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子との結合に関与する複数のアミノ酸残基から形成される空間的な領域をブロックする化合物（例えば、該空間的な領域に適合する有機合成化合物等）；プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５中に存在する塩基配列からなる領域であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子とが会合する領域をブロックする化合物（例えば、核酸、核酸アナログ等）等が挙げられる。
また、本発明においては、前記配列番号：１に示される塩基配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列を介して、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子とが結合することを阻害しうる化合物も本発明の範囲に含まれる。
なお、本明細書において、「配列同一性」とは、配列番号：１又は２に示される塩基配列からなる核酸分子と比較対象の核酸分子との間の対応残基の同一性をいう。前記「配列同一性」には、２’−Ｏ−メチル誘導体、脱アミノ誘導体（例えば、イノシン等）、アデノシン誘導体（例えば、イソペンテニルアデニン、トレオニノカルボニルアデニン等）、含硫誘導体（４−チオウリジン、２−チオピリミジン誘導体）等の修飾塩基等を介して、配列番号：１又は２に示される塩基配列の残基に類似する場合をも含むことを意図する。前記「配列同一性」は、比較対象の塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの塩基配列を比較することにより決定されうる。配列同一性の数値（パーセンテージ）は、両方の配列に存在する同一の核酸塩基を決定して、適合部位の数を決定し、ついで、比較対象の配列領域内の塩基の総数で、前記適合部位の数を割、得られた数値に１００をかけることにより、算出されうる。最適なアラインメント及びホモロジーを得るためのアルゴリズムとしては、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らの局所ホモロジーアルゴリズム［Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ．，２，４８２（１９８１）］、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）らのホモロジーアラインメントアルゴリズム［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，４８，４４３（１９７０）］、パールソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）らの相同性検索法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，２４４４（１９８８）］等が挙げられる。より具体的には、ダイナミックプログラミング法、ギャップペナルティ法、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｇｏｏｄ−Ｋａｎｅｈｉｓａアルゴリズム、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等が挙げられる。
前記化合物としては、具体的には、（Ａ）配列番号：１に示される塩基配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＲＮＡ分子が挙げられる。前記（Ａ）のＲＮＡ分子によれば、前記（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかの領域をブロックすることができる。
前記（Ａ）のＲＮＡ分子としては、具体的には、例えば、（ａ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＲＮＡ分子等が挙げられる。
また、配列番号：１に示される塩基配列を含有した核酸、配列番号：２に示される塩基配列を含有した核酸、及び配列番号：１に示される塩基配列と配列番号：２に示される塩基配列とを含有した核酸からなる群より選ばれた１種とＨＭＧ−Ｉとの間の結合親和性の点において、同等の結合親和性を呈するものであれば、前記（Ａ）のＲＮＡ分子から得られる核酸誘導体も本発明の範囲に含まれる。
すなわち、本発明においては、前記配列番号：１又は２は、前記配列番号：１又は２において、少なくとも１残基の変異を有する配列であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合能を呈する配列及びそれに対応するＤＮＡ配列であってもよく、前記配列番号：１又は２は、前記配列番号：１若しくは配列番号：２の塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％以上の配列同一性を有する配列であって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合能を呈する配列及びそれに対応するＤＮＡ配列であってもよく、かかる配列を有する核酸も本発明の範囲に含まれる。
前記結合親和性は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合を、サウスウエスタン解析、ゲルシフトアッセイ、共鳴プラズモン相互作用解析等の、タンパク質−核酸間相互作用の解析に使用される慣用の手法により評価されうる。
具体的には、核酸及び核酸誘導体としては、例えば、
（Ｂ）配列番号：１に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列及び／又は配列番号：２に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するＤＮＡ分子、
（Ｃ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子、
（Ｄ）前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子、
（Ｅ）前記（Ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子、
等が挙げられる。
前記（Ｂ）のＤＮＡ分子によれば、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５中における領域であって、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子とが会合する領域をブロックすることが期待される。ここで、前記（Ｂ）において、「配列番号：１に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列」又は「配列番号：２に示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列」とは、配列番号：１又は配列番号：２に示される配列の逆転写産物の相補鎖を意味する。前記（Ｂ）のＤＮＡ分子としては、具体的には、例えば、（ｂ）配列番号：３、４、５、６若しくは７のいずれかに示される塩基配列に対応するＤＮＡ配列（ｕがｔに変換されたもの）を含有し、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合しうるＤＮＡ分子が挙げられる。
前記（Ｃ）において、前記（Ａ）のＲＮＡ分子に相補的な分子（アンチセンス分子）によれば、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５中における領域であって、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子とが会合する領域をブロックすることが期待される。一方、前記（Ｂ）のＤＮＡ分子に相補的なアンチセンス分子によれば、前記（ｉ）又は（ｉｉ）の領域をブロックすることが期待される。前記（Ｃ）に示されるアンチセンス分子としては、前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかに相補的なアンチセンス分子が挙げられる。
前記（Ｄ）において、アナログ分子としては、前記（Ａ）のＲＮＡ分子又は（Ｂ）のＤＮＡ分子において、リン酸ジエステル結合における酸素原子がイオウ原子で置換されたチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）、又は、リン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換されたオリゴヌクレオチド等の生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変されたオリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、前記アナログ分子は、いわゆるペプチド核酸といわれる核酸であってもよい。前記アナログ分子としては、具体的には、配列番号：２７に示される塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ、該配列番号：２７に示される塩基配列を有する４−チオウリジン含有ＲＮＡ、該配列番号：２７に示される塩基配列を有する２−チオピリミジン含有ＲＮＡ等が挙げられる。これらのアナログ分子は、例えば、生体内における安定性に優れる点が特に有利である。
前記（Ｄ）において、前記（Ａ）のＲＮＡ分子のアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子によれば、前記（ｉ）又は（ｉｉ）の領域をブロックすることが期待される。また、前記（Ｂ）のＤＮＡ分子のアナログであって、かつＨＭＧ−Ｉタンパク質と結合するアナログ分子によれば、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５中における領域であって、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２遺伝子とが会合する領域をブロックすることが期待される。前記（Ｄ）に示されるアナログ分子としては、具体的には、例えば、前記（ａ）のＲＮＡ分子又は（ｂ）のＤＮＡ分子のいずれかのアナログであって、かつＨＭＧ−１タンパク質と結合するアナログ分子が挙げられる。
前記（Ｅ）において、アナログ分子としては、前記（Ｃ）のアンチセンス分子において、リン酸ジエステル結合における酸素原子がイオウ原子で置換されたチオリン酸ジエステル結合を有するオリゴヌクレオチド（Ｓ−オリゴ）；リン酸ジエステル結合を電荷をもたないメチルホスフェート基で置換されたオリゴヌクレオチド等の生体内でオリゴヌクレオチドが分解を受けにくくするために改変したオリゴヌクレオチド等が挙げられる。また、前記アナログ分子の場合、いわゆるペプチド核酸といわれる核酸であってもよい。具体的には、（ｅ）前記（ｃ）のアンチセンス分子のアナログ分子が挙げられる。
本発明の阻害剤に用いられる化合物は、核酸又は核酸誘導体を用いる場合、慣用の遺伝子組換え技術、核酸合成法、部位特異的変異導入法により得られうる。例えば、核酸又は核酸誘導体は、遺伝子工学で一般的に用いられる核酸合成法に従い、例えば、ＤＮＡ合成装置を用いて直接合成してもよく、これらの核酸又は核酸誘導体（特に、変異体）を含む核酸又はその一部を合成した後、ＰＣＲ法又はクローニングベクター等を用いて核酸を増幅してもよい。さらに、ＤＮＡ分子の場合、これらの方法により得られたＤＮＡ分子を、制限酵素等により切断し、ついで、ＤＮＡリガーゼ等を用いて適切なベクター等に連結し、得られた組換えベクターを適切な宿主に導入して、得られた形質転換体から核酸を製造してもよい。また、さらに細胞内でより安定な核酸誘導体を得るために、前記核酸の塩基、糖、リン酸部分を化学修飾を施してもよい。
前記部位特異的変異導入法としては、例えば、ギャップド・デュプレックス（ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）法［例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２，９４４１−９４５６（１９８４）等を参照のこと］、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）法［例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８−４９２（１９８５）等を参照のこと］、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記核酸合成法としては、リン酸トリエステル法、ホスホルアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法等が挙げられる。
本発明の阻害剤の薬理評価は、例えば、被検物質（薬理評価対象物）の存在下において、前記（Ａ）の核酸、より具体的には、配列番号：４に示される塩基配列を有する核酸とＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合を検出すること又は該結合の結合強度（例えば、結合親和性等）を測定することにより行なわれうる。
すなわち、被検物質の存在下に、前記（Ａ）の核酸、より具体的には、配列番号：４に示される塩基配列を有する核酸とＨＭＧ−Ｉタンパク質とを接触させる工程を行ない、Ｉ）被検物質の存在下において、該核酸と該ＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合が検出されない場合、又はＩＩ）被検物質の存在下における該核酸と該ＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合の結合強度ａが、被検物質の非存在下における該核酸と該ＨＭＧ−Ｉタンパク質との結合の結合強度ｂよりも小さい場合、該被検物質が、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５とＨＭＧ−Ｉタンパク質との間の結合に対する阻害剤であることの指標となる。また、前記被検物質について、結合親和性を調べる。前記結合及び結合強度（例えば、結合親和性等）は、例えば、前記サウスウエスタン解析、ゲルシフトアッセイ、共鳴プラズモン相互作用解析等の、タンパク質−核酸間相互作用の解析に使用される慣用の手法により評価できる。
具体的には、前記結合及び結合強度（例えば、結合親和性等）は、被検物質の存在下において、例えば、適切な支持体上に前記（Ａ）の核酸、より具体的には、配列番号：４に示される塩基配列を有する核酸又はＨＭＧ−Ｉタンパク質を固定化されたマトリックスを用い、該マトリックスに固定した物質に対応する物質を接触させ、質量の変化、蛍光の変化等を指標として、例えば、前記共鳴プラズモン相互作用解析等により測定することができる。
なお、前記ＨＭＧ−Ｉタンパク質は、例えば、適切な細胞を、通常の酸素条件下に培養し、ついで、低酸素条件下に培養し、それにより細胞内で発現させうる。
通常の酸素条件としては、用いる細胞に応じて適宜設定できるが、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の場合、５％ＣＯ２下、３７℃での培養等の条件等が挙げられる。低酸素条件としては、例えば、低酸素圧（８ｔｏｒｒ）の条件が挙げられる。具体的には、例えば、低酸素圧（８ｔｏｒｒ）の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバーを備えたインキュベーターを用い、３７℃で低酸素条件下に２１時間、培養物を維持することにより、細胞に低酸素刺激を与えることができる。
前記細胞としては、例えば、神経細胞、グリア細胞、星状細胞等の中枢神経系細胞、繊維芽細胞等が挙げられ、より具体的には、例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１１）等が挙げられる。
また、必要により、慣用のタンパク質精製手法〔塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー等〕により精製してもよい。
本発明の阻害剤においては、有効成分が核酸又は核酸誘導体である場合、使用目的に応じて、核酸又は核酸誘導体を、適宜、細胞への導入に適したベクターリポソーム、金属粒子、正電荷ポリマー等に保持せしめてもよい。
前記ベクターとしては、例えば、無毒化したヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、無毒化したレトロウイルスベクター等が挙げられる。
前記リポソームとしては、ＨＶＪ−リポソーム、正電荷リポソーム等が挙げられる。
本発明の阻害剤における有効成分量は、使用目的等に応じて、結合阻害作用を発揮する範囲で適宜設定されうる。例えば、有効成分が、０．０１〜１００ｍｇ好ましくは、３〜１００ｍｇであることが望ましい。
本発明の阻害剤は、プレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制し、それにより、神経細胞死を抑制することができるため、該阻害剤により、神経細胞死抑制剤が提供されうる。かかる神経細胞死抑制剤も本発明の範囲に含まれる。
本発明の神経細胞死抑制剤は、前記阻害剤を有効成分として含有することを１つの大きな特徴とする。したがって、神経細胞死を抑制することができるという優れた効果を発揮する。
本発明の神経細胞死抑制剤における有効成分の含有量は、投与対象の個体の体重、年齢、投与目的により適宜設定することができる。
また、本発明の神経細胞死抑制剤においては、投与量は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択される。前記投与量は、例えば、ＲＮＡ分子を含有する場合、例えば、有効成分が、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは、３〜１００ｍｇであることが望ましい。
本発明の神経細胞死抑制剤の投与方法としては、直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法等が挙げられる。
前記ｉｎ  ｖｉｖｏ法により投与する場合、投与形態は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択され、例えば、静脈注射、鼻粘膜吸入等が挙げられる。
例えば、核酸又は核酸誘導体を含有した阻害剤を有効成分として神経細胞死抑制剤を血液内投与する場合、一般には１日あたり、有効成分量として、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは３〜１００ｍｇであることが望ましい。
また、本発明の神経細胞死抑制剤には、神経細胞等への導入を容易にしうる物質、通常の薬理学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等を含有してもよい。
本発明の神経細胞死抑制剤の薬理評価は、前記阻害剤における薬理評価と共に以下に示す手法により行ないうる。すなわち、被検物質（神経細胞死抑制剤の候補）を導入したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔被検細胞〕と導入していないＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔対照細胞〕とについて、それぞれ低酸素条件〔低酸素圧（８ｔｏｒｒ）の条件等〕下、ツニカマイシン等により引き起こされる神経細胞死を調べることにより薬理評価が行なわれうる。ここで、被検細胞における神経細胞死が、対照細胞における神経細胞死よりも抑制される場合、前記被検物質が、神経細胞死抑制剤であることの指標となる。また、ＨＭＧ−Ｉを一過性発現し、かつ被検物質（神経細胞死抑制剤の候補）を導入したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔被検細胞〕と、ＨＭＧ−Ｉを一過性発現するＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔対照細胞〕とについて、ツニカマイシン等により引き起こされる神経細胞死を調べることにより薬理評価が行なわれうる。ここで、被検細胞における神経細胞死が、対照細胞における神経細胞死よりも抑制される場合、前記被検物質が、神経細胞死抑制剤であることの指標となる。
かかる神経細胞死の抑制について、ＭＴＴ法［モッスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ，Ｔ．）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−５９（１９８５）］により確認してもよく、慣用の３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＳアッセイという）を行なって、細胞の生存率を測定し、被検細胞と対照細胞とを比較することにより確認してもよい。
前記低酸素条件として、具体的には、例えば、低酸素圧（８ｔｏｒｒ）の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバーを備えたインキュベーターを用い、３７℃で低酸素下に２１時間、培養物を曝露することにより、細胞に低酸素刺激を与える条件が挙げられる。
本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、神経細胞死を抑制することができ、プレセニリン−２  ｍＲＮＡのスプライシング異常、特にプレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制することができるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤により、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防に有用な医薬組成物が提供されうる。かかる医薬組成物も本発明に含まれる。また、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防用の医薬組成物の製造に使用されうる。
本発明の医薬組成物は、前記阻害剤又は前記神経細胞死抑制剤を有効成分として含有することに１つの特徴がある。本発明の医薬組成物は、スプライシング異常を抑制する作用、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生を抑制する作用等を有する。したがって、本発明の医薬組成物は、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防への応用が期待される。
本発明の医薬組成物の適用対象となる疾患としては、例えば、脳組織におけるプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する脳障害、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する神経変性疾患等が挙げられる。
前記脳障害としては、虚血性脳疾患、脳神経変性疾患等が挙げられる。より具体的には、脳血管性痴呆、パーキンソン症候群、アルツハイマー病等が挙げられる。
前記神経変性疾患としては、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。
本発明の医薬組成物の投与量は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択される。前記投与量は、例えば、ＲＮＡ分子を含有する場合、有効成分量として、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは３〜１００ｍｇであることが望ましい。
本発明の医薬組成物は、有効成分が、患部の細胞又は目的とする組織の細胞内に取り込まれるような剤形であればよく、単独で、もしくは、慣用の担体と混合して、非経口投与、局所投与で投与される。
投与形態は、投与目的（例えば、疾患の種類）、投与対象の個体の年齢及び体重、有効成分の種類等により適宜選択され、例えば、静脈注射及び鼻粘膜吸入等が挙げられる。
医薬組成物が、例えば、核酸又は核酸誘導体を含有するものであり、血液内投与する場合、一般には１日あたり、有効成分量として、３〜１００ｍｇを１日１回から数回投与することができる。
また、本発明の医薬組成物は、疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易くするために、徐放性の製剤（ミニペレット製剤等）を調製し患部近くに埋め込むことも可能であり、あるいはオスモチックポンプ等を用いて患部に連続的に徐々に投与することもできる。
本発明の医薬組成物は、必要に応じ、疾患部位への導入を容易にしうる物質、各種の担体、助剤、安定剤、潤滑剤、その他一般に使用される添加剤、例えば乳糖、クエン酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、落下生油、オリーブ油、カカオバター、エチレングリコール等をさらに含有してもよい。
本発明の医薬組成物の薬理評価は、前記阻害剤及び神経細胞死と同様の評価方法により行なわれうる。また、対象となる疾患に応じて、慣用の薬理評価を行なうこともできる。
本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、神経細胞死を抑制することができ、プレセニリン−２  ｍＲＮＡのスプライシング異常、特にプレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制することができるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤により、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、例えば、脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防方法が提供されうる。かかる治療又は予防方法も本発明の範囲に含まれる。
本発明の治療又は予防方法は、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、例えば、脳障害の個体又は神経変性疾患の個体に、治療上有効量の本発明の阻害剤又は本発明の神経細胞死抑制剤を投与することを１つの特徴とする。本発明の治療又は予防方法によれば、前記阻害剤又は神経細胞死抑制剤を投与するため、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防が期待される。
また、本発明の治療又は予防方法によれば、前記阻害剤又は神経細胞死抑制剤を投与するため、神経細胞死の抑制作用を、より効率よく、より持続的に発揮させることができるという優れた効果を発揮する。したがって、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の治療又は予防を、より効率よく、より持続的に行なうことができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の治療又は予防方法によれば、前記阻害剤又は神経細胞死抑制剤を投与するため、ＨＭＧ−ＩがＤＮＡ結合部位においてＤＮＡと結合することにより発揮されるＨＭＧ−Ｉ本来の機能を損なうことなく、ＲＮＡ結合部位を阻害するという優れた効果を発揮する。したがって、本発明の治療又は予防方法によれば、ＨＭＧ−ＩとＤＮＡとの結合に基づく本来の機能を損失させることによる影響を生じないという優れた効果を発揮する。
「治療上有効量」とは、神経細胞死を抑制することができ、プレセニリン−２  ｍＲＮＡのスプライシング異常、特にプレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制することができる量を意味する。
個体への阻害剤又は神経細胞死抑制剤の投与は、例えば、静脈注射及び鼻粘膜吸入等により、１日あたり、阻害剤又は神経細胞死抑制剤の有効成分量として、３〜１００ｍｇを１日１回から数回投与することにより行なわれうる。
本発明の治療又は予防方法の効果は、対象となる疾患の病理学的特徴等の発現の抑制を指標として評価されうる。例えば、脳虚血のモデルとして、特に限定されないが、先天的にＷｉｌｌｉｓ動脈輪の形成が不完全な動物の両側総頸動脈を一過性に閉塞して、ついで再開通させることにより得られる遅発性神経細胞死のモデル動物；中大脳動脈を永久又は一過性に閉塞して得られる局所脳虚血モデル動物等を用い、該モデルに前記阻害剤又は神経抑制剤を投与し、症状の改善等を調べることにより、本発明の治療又は予防方法の効果を評価することができる。さらに、マウスに対して、長期的にアルミニウムや鉄等を負荷して得られる化学的低酸素モデル動物；加齢により生じる微小管梗塞低酸素を反映する老齢マウス等のモデル動物に、前記阻害剤又は神経抑制剤を投与し、症状の改善等を調べることにより、本発明の治療又は予防方法の効果を評価することもできる。
また、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤は、神経細胞死を抑制することができ、プレセニリン−２  ｍＲＮＡのスプライシング異常、特にプレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制することができるため、本発明の阻害剤及び神経細胞死抑制剤により、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に投与し、それにより、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物を製造することができる。しらがって、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患の個体に投与し、それにより、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患を治療又は予防するための医薬組成物を製造するための、本発明の阻害剤又は神経細胞死抑制剤の使用も本発明に含まれる。
実験例１  細胞培養、低酸素刺激及び一過性トランスフェクション
サトウらの文献［サトウ（Ｓａｔｏ  Ｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１０８−２１１４，（２００１）］に従い、以下のように、細胞培養及び低酸素刺激を行なった。
ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有したαＭＥＭ〔ギブコ  ビー・アール・エル（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）社製〕中において、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。前記細胞が１７６．６ｃｍ２培養皿にてコンフルエントに達したとき、培養物中の血清含有α−ＭＥＭを、無血清αＭＥＭと交換した。培地交換後の培養物を、さらに４時間培養した。
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞については、それぞれ１０％ウシ胎仔血清を含有したダルベッコ最小必須培地〔ギブコ  ビー・アール・エル社製〕中において、５％  ＣＯ２、３７℃で培養した。前記細胞のそれぞれが１７６．６ｃｍ２培養皿にてコンフルエントに達したとき、培養物中の血清含有ダルベッコ最小必須培地を、無血清ダルベッコ最小必須培地と交換した。培地交換後の培養物を、さらに４時間培養した。
低酸素刺激を与える場合、低酸素圧（８ｔｏｒｒ）の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバーを備えたインキュベーターを用い、得られた培養物を３７℃で低酸素下に２１時間曝露した。
種々の構築物の一過性トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（ＬｅｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥＴＭ  ２０００）〔ギブコ  ビー・アール・エル社製〕を用いて行なった。
また、オリゴＲＮＡの一過性トランスフェクションを、オリゴフェクタミン（ＯｌｉｇｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ）〔ギブコ  ビー・アール・エル社製〕を用いて行なった。
実験例２  全ＲＮＡの調製及びＲＴ−ＰＣＲ
サトウらの文献［サトウ（Ｓａｔｏ  Ｎ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７２，２４９８−２５０５，（１９９９）］に従い、以下のように、種々のストレス下の神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びＨｅＬａ細胞それぞれ由来の全ＲＮＡの調製、並びにＲＴ−ＰＣＲを行なった。
ＲＮｅａｓｙトータルＲＮＡキット〔キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を用い、製造者の説明書に従い、酸素正常状態、低酸素曝露又はＨＭＧ−Ｉの過剰発現時におけるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のそれぞれから全ＲＮＡを抽出、精製した。
ついで、得られた全ＲＮＡと、マウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕とを用いて、４２℃で１時間逆転写反応を行なった。ついで、得られた反応物を鋳型として、ネスティッドＰＣＲを行なった。ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃３０秒−６０℃３０秒−７２℃１分（最終サイクルにおいては２分）を１サイクルとした３０サイクルである。１次ＰＣＲには、プライマーｐｓ２５１〔５’−ａｔｔｃａｇａｃｃｔｃｔｃｔｇｃｇｇｃｃ−３’（配列番号：９）〕とプライマーｐｓ２３１〔５’−ａａｇｃｇｇｇａｇｃｃａａａｇｔｃｔｇｇ−３’（配列番号：１０）〕とを用いた。２次ＰＣＲには、プライマーｐｓ２５２〔５’−ｇｔｔｃｇｔｇｇｔｇｃｔｔｃｃａｇａｇｇ−３’（配列番号：１１）〕とプライマーｐｓ２３３〔５’−ｇｇａｃｃａｃｔｃｔｇｇｇａｇｇｔａｃａ−３’（配列番号：１２）〕とを用いた。
得られた産物を、５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。
実験例３  核抽出液の調製
核抽出液を、シュレイバー（Ｓｈｒｅｉｂｅｒ）らの方法の改良方法［ヨネダ（Ｙｏｎｅｄａ，Ｙ．）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，９０，５１９−５３３（１９９９）］に従い、以下のように調製した。
なお、使用した緩衝液及びその他の溶液は、いずれも、使用前に、その都度、孔径２２０ｎｍのＳｔｅｒｉｔｏｐ〔ミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）社製〕により濾過して滅菌した。
各細胞構造物のホモジナイズについては、特に断りのないかぎり、１０ｍＭ  ＫＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと５ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）と１ｍＭ（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）とを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）５０容量〔３１５μｌ／プレート〕中２℃で行なった。
ついで、得られたホモジネートに１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を添加して終濃度を０．６％とした。得られた混合物を１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。ついで、得られたペレットを、４００ｍＭ  ＫＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと１ｍＭ  ＤＴＴと１ｍＭ  ＰＭＳＦとを含有した２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０容量〔０．１ｍｌ〕中に懸濁し、３０分間、氷冷した。氷冷後の懸濁物を、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清を、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイ、ゲルシフトアッセイ及びスーパーシフトアッセイのための核抽出液として用いた。なお、前記核抽出液は、使用まで、−８０℃で保存した。
実験例４  サイトゾルフラクション及び核フラクションの調製
核フラクションを、マナベ（Ｍａｎａｂｅ）らの文献［マナベ（Ｍａｎａｂｅ）ら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１００，４５３−４６３，（２０００）］に従い、以下のように調製した。
１０ｍＭ  ＫＣｌと１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと５ｍＭ  ＤＴＴと１ｍＭ  ＰＭＳＦとを含有した１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）〔３１５μｌ／プレート〕中２℃で脳構造物をホモジナイズした。得られたホモジネートに、１０％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０を添加して終濃度を０．６％に調製した。得られた混合物を、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、ペレット〔核フラクション（ＮＰ−４０不溶性）〕と上清〔サイトゾルフラクション（ＮＰ−４０可溶性）〕とを得た。また、前記ペレットを、１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡとＰＭＳＦとを含有した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）〔５０μｌ〕中に懸濁し、核フラクション（ＮＰ−４０不溶性）とした。
実験例５  ＤＮＡ構築物の調製
第２３図に示す各オリゴヌクレオチドを慣用の方法により合成した。２４マー又は６０マーの塩基長を有する２種の相補的なオリゴヌクレオチドを用いてアニーリングを行ない、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１（配列番号：１３〜２３）の各二本鎖ＤＮＡ断片を得た。なお、図中、各オリゴヌクレオチドにおいて、ＰＳ２のエキソン５の各断片を下線を付し、太字で示す。
得られた二本鎖ＤＮＡ断片を、それぞれ、ｐｃＤＮＡ３（＋）ベクターに組み込み、ＤＮＡ構築物を得た。ＤＮＡシークエンサー３７３Ａ型〔アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）社製〕を用いて、前記二本鎖ＤＮＡ断片のそれぞれについて、配列解析を行なった。
実験例６  ｐｒｅ−ｍＲＮＡプローブの調製
実験例５で得られたＤＮＡ構築物を、ＥｃｏＲＩを用いて直鎖状にし、それにより鋳型ＤＮＡを得た。ついで、前記鋳型ＤＮＡを、［α−３５Ｓ］標識ＵＴＰ（６２．５μＣｉ）又は［α−３２Ｐ］標識ＵＴＰ（５０μＣｉ）と０．２５ｍＭ  ＵＴＰと０．５ｍＭ  ＡＴＰと０．５ｍＭ  ＣＴＰと０．５ｍＭ  ＧＴＰとＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ用緩衝液と２０ＵのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕と４０単位のＲＮアーゼインヒビター（東洋紡社製）とを含有した転写用緩衝液中３７℃で１時間インキュベートすることにより、インビトロ転写を行ない、ｐｒｅ−ｍＲＮＡプローブ（ＲＮＡプローブＮｏ１〜１１）を得た。
実験例７  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイ
タンパク質量５μｇ相当量の核抽出液を、１０μｇのｔＲＮＡと各３５Ｓ−標識ＲＮＡプローブ（１μｇ）とともに、インキュベーション緩衝液〔６０ｍＭ  ＫＣｌと４ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと１ｍＭ  ＤＴＴと１０％グリセロールと１ｍＭ  ＰＭＳＦとを含有した１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）〕中２５℃で３０分間インキュベートした（全容量２５μｌ）。
ついで、得られた反応物に、ＵＶ照射器（２５４ｎｍ、６０Ｗ）下、１５分間室温で紫外線（ＵＶ）照射した。その後、ＵＶ照射後の反応物に１０μｇのＲＮアーゼＡを添加し、２５℃で３０分間インキュベーションして、前記反応物中のプローブを消化した。
得られた産物を、１０％  グリセロールと２％  ＳＤＳと０．０１％  ブロモフェノールブルーと５％  ２−メルカプトエタノールとを含有した１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．８）と体積比１：４で混合して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理を行なった。ＳＤＳ処理した溶液を、０．１％のＳＤＳを含有する１０〜２０％グラジェントポリアクリルアミドゲル又は１５％ポリアクリルアミドゲル上、１５ｍＡ／プレートの一定電流で２時間、室温での電気泳動に供した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、イメージングプレートに曝した。
実験例８  ノーザンブロットアッセイ
ノーザンブロットアッセイを、前記サトウらの文献［サトウ（Ｓａｔｏ  Ｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１０８−２１１４，（２００１）］に記載の方法に従って、下記のように行なった。すなわち、全ＲＮＡの２０μｇ相当量を、ホルムアルデヒド−ホルムアミドゲルを用いて電気泳動し、得られたゲルをナイロンフィルターにプロットした。ついで、前記ナイロンフィルターに転写されたＲＮＡと標識ヒトＨＭＧ−Ｉ  ｃＤＮＡとをハイブリダイズさせた。なお、前記標識ヒトＨＭＧ−Ｉ  ｃＤＮＡを、Ｒａｎｄｏｍ−Ｌａｂｅｌｉｎｇキット（宝酒造社製）を用いて標識して作製した。
実験例９  イムノブロットアッセイ
イムノブロットアッセイを、前記マナベ（Ｍａｎａｂｅ）らの文献［マナベ（Ｍａｎａｂｅ）ら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１００，４５３−４６３，（２０００）］の記載に従って、下記のように行なった。すなわち、核抽出液、全ライセート、サイトゾルフラクション及び核フラクションについて、タンパク質量を測定した。ついで、核抽出液、全ライセート、サイトゾルフラクション及び核フラクションの各アリコートと、緩衝液〔１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％  グリセロール、２％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．０１％  ブロモフェノールブルー、５％  メルカプトエタノール、（ｐＨ６．８）〕とを体積比１：４で混合した。得られた混合液を１００℃で１０分間煮沸した。一定量の各アリコート（核抽出液においては２５μｇタンパク質相当量、全ライセートとサイトゾルフラクションと核フラクションとにおいては５０μｇタンパク質相当量）を、０．１％  ＳＤＳを含有した１５％  ポリアクリルアミドゲル上、１５ｍＡ／プレートの一定電流で２時間、室温で電気泳動した。電気泳動後のゲルを、１００％  メタノールにより活性化させたポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜にブロットした。ブロット後のＰＶＤＦ膜を、５％  スキムミルクを含有した０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳでブロックした。ついで、ＰＶＤＦ膜を、１％スキムミルクを含有した０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳに希釈した抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体と反応させた。アルカリホスファターゼ結合抗ヤギイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体と反応させた。免疫反応性を、１００ｍＭ  ＮａＣｌと５ｍＭ  ＭｇＣｌ２と６６．７％  ４−ニトロブルーテトラゾリウムクロリド（ＮＴＢ）と３３．３％  Ｘ−ホスフェート／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）とを含有した１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．５）中で可視化した。
実験例１０  免疫沈降
免疫沈降を、前記サトウらの文献［サトウ（Ｓａｔｏ  Ｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１０８−２１１４，（２００１）］に記載の条件に従って、下記のように行なった。
酸素正常状態のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液又は低酸素曝露したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液を、抗ＨＭＧ−Ｉ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）とともに４℃で８時間インキュベートした。得られた産物をプロテイン−Ｇアガロース〔ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕と混合し、４℃で１時間維持した。得られた混合物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた沈殿物をＰＢＳに懸濁した。さらに、得られた懸濁物を、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた沈殿物を、Ｍｉｌｉ−Ｑ水に懸濁した。この懸濁液を、ＳＤＳ処理し、得られた溶液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。得られたゲルについて、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰに対する抗体を用い、イムノブロットアッセイを行なった。
また、前記抗ＨＭＧ−Ｉ抗体の代わりに、抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）を用いて免疫沈降を行ない、前記Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰに対する抗体の代わりに、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙに対する抗体〔抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体；サンタクルツバイオテクノロジー社製〕を用いてイムノブロットアッセイを行なった。
実験例１１  免疫細胞化学
免疫細胞化学的検査をＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞で行なった。すなわち、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態に維持するか、あるいは、該細胞を低酸素条件下に２１時間曝露した。ついで、得られた細胞を、４％パラホルムアルデヒド中に室温で２時間固定し、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中で少なくとも５分間透過させた。固定及び透過させた細胞をＰＢＳで３回洗浄した。洗浄細胞を、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体及び抗ＳＣ３５抗体〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製〕と４℃で１２時間免疫反応させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗ヤギＩｇＧ抗体及びＣｙ３結合抗マウスＩｇＧ抗体とともに室温で２時間インキュベートした。免疫反応性タンパク質を、コンピューターに接続した顕微鏡下で４８８ｎｍ励起フィルターを用いて観察した。
実験例１２  免疫組織化学
免疫組織化学法を、前記サトウらの文献［サトウ（Ｓａｔｏ  Ｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１０８−２１１４，（２００１）］に記載の改良イムノペルオキシダーゼ法を用いて行なった。すなわち、対照又はｓＡＤの脳切片を室温で２時間固定し、ついで、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ免疫組織化学の処理を行なった。抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体又は抗ＳＳＭＡＧ抗体を１：１０００の希釈律で使用した。ビオチニル化抗ヤギ抗体又はビオチニル化抗ウサギＩｇＧ〔ベクタスタチンエライト（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ）社製〕を二次抗体として使用した。免疫反応性を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）中０．０５％ＤＡＢ及び０．０１％過酸化水素で可視化した。
実験例１３  スーパーシフトアッセイ
５μｇタンパク質相当量の核抽出液を、１μｇの抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）又は０．５〜２．０μｇの抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）とともに４℃で８時間インキュベートし、前処理を行なった。得られた前処理産物を、インキュベーション緩衝液〔組成：６０ｍＭ  ＫＣｌと４ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと１ｍＭ  ＤＴＴと１０％グリセロールと１ｍＭ  ＰＭＳＦとを含有した１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）〕中２μｇ若しくは１０μｇのｔＲＮＡとともにインキュベートした。ついで、３２Ｐ標識ＲＮＡプローブ〔１μｇ、第４図に示されるＮｏ．５プローブ〕を添加して、２５℃で３０分間インキュベーションした（全容量５０μｌ）。
得られた反応物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓと０．３８Ｍグリシンと２ｍＭ  ＥＤＴＡとを含有した緩衝液（ｐＨ８．５）中、４％ポリアクリルアミドゲル上、１１Ｖ／ｃｍの一定電圧で１．５時間、４℃で電気泳動することにより、結合プローブと遊離プローブとを分離した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、ついでＸ線フィルムに曝した。
実施例１  孤発性アルツハイマー病患者脳及び培養細胞中におけるＰＳ２Ｖの発現
（１）孤発性アルツハイマー病患者の脳におけるＰＳ２Ｖの発現
孤発性アルツハイマー病（ｓＡＤ）脳由来の全ＲＮＡ又は年齢がマッチした対照脳由来の全ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲでアッセイした。
ｓＡＤ脳及び対照脳のそれぞれから、アンウォー（Ａｎｗａｒ  Ｒ．）ら［アンウォー（Ａｎｗａｒ  Ｒ．）ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，６６，１７７４−１７７７（１９９６）］記載の方法に従い、ｍＲＮＡを単離した。
ついで、得られたｍＲＮＡと、マウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕とを用いて、逆転写反応を行なった。ＰＣＲにおけるサーマルプロファイルは、変性：９５℃、２分／９５℃、３０秒、アニーリング：６０℃、３０秒、伸長：７２℃、１分を１サイクルとする３０サイクルである。また、１次プライマーとして、前記プライマーｐｓ２５１とｐｓ２３１とを用い、２次プライマーとして、プライマーｐｓ２５２とｐｓ２３３とを用いた。
得られた反応物を５％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した。増幅産物を臭化エチジウム染色により可視化した。その結果を第１図に示す。
第１図の左パネルのレーン１と、サトウ（Ｓａｔｏ）らの文献［サトウ（Ｓａｔｏ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７２，２４９８−２５０５（１９９９）］とに示されるように、対照脳においては、全長ＰＳ２が主要なＲＴ−ＰＣＲ産物として検出されることがわかる。一方、第１図の左パネルのレーン２に示されるように、ｓＡＤ脳においては、全長ＰＳ２に加え、より短鎖の産物が検出されることがわかる。ダイレクトシークエンシングの結果、前記短鎖の産物は、ＰＳ２遺伝子のエキソン５が欠失したバリアント（以下、ＰＳ２Ｖという）であることが示される。
（２）培養細胞におけるＰＳ２Ｖの発現
ｓＡＤのモデルのように、培養細胞において、ＰＳ２Ｖの生成を効率よく再現するために、前記と同様の実験によりあらゆる種類のストレス下における種々の細胞株由来の全ＲＮＡについて、ＰＳ２Ｖの発現を測定した。その結果を第１図の右パネルに示す。
第１図の右パネルのレーン１〜３に示されるように、酸素正常状態に曝露した種々の細胞株、すなわちＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において、全長ＰＳ２のみが検出されることがわかる。また、第１図の右パネルのレーン４及び５に示されるように、同様の結果が低酸素条件に曝露したＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において見られる。
しかしながら、低酸素条件に曝露したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔第１図、右パネルのレーン６；サトウ（Ｓａｔｏ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７２，２４９８−２５０５（１９９９）〕並びにｓＡＤ脳においては、ＰＳ２と、ダイレクトシークエンシングによりＰＳ２Ｖであることが確認された短鎖の産物とが検出されることがわかる。
一方、検出可能なＰＳ２Ｖは、他のストレスであるツニカマイシン（第１図、右パネルのレーン７）、β−アミロイド（第１図、右パネルのレーン８）及び過酸化水素［サトウ（Ｓａｔｏ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７２，２４９８−２５０５（１９９９）］においては観察されなかった。
ついで、ＰＳ２Ｖタンパク質に対する抗体（抗ＳＳＭＡＧ抗体）を用いて、免疫組織化学的染色法により、ＰＳ２Ｖの局在を調べた。結果を第２図に示す。
第２図及びサトウらの文献［サトウ（Ｓａｔｏ  Ｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，２１０８−２１１４，（２００１）］に示されるように、ＰＳ２Ｖに対する免疫反応性が、ｓＡＤ脳組織の海馬ＣＡ１領域の錐体細胞層及び側頭皮質の錐体細胞層に観察される。したがって、ｓＡＤ脳組織の海馬ＣＡ１領域の錐体細胞層及び側頭皮質の錐体細胞層において、ＰＳ２Ｖが局在することがわかる。
実施例２  低酸素曝露細胞におけるＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合因子の検出
低酸素曝露細胞におけるＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合因子を検出するため、第４図に示す種々の３５Ｓ−標識ｐｒｅ−ｍＲＮＡプローブ（ＲＮＡプローブ）を調製した。第３図に示されるストラテジーにより、第４図に示す種々のプローブを用いる独自のｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイを構築した。結果を第５図に示す。
その結果、Ｎｏ．０の３５Ｓ−標識プローブを用いたｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイにより、第５図、レーン１に示されるように、酸素正常状態の神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においては、黒矢印で示した分子量（約２０ｋＤａ）の位置にシグナルが検出されず、低酸素条件に２１時間曝露した神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においては、第５図、レーン２に示されるように、黒矢印で示した分子量（約２０ｋＤａ）の位置にシグナルが検出された。したがって、低酸素曝露神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液において、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合活性を呈する因子が存在することがわかる。ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイに使用する前における核抽出液の加熱により、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合活性がほぼ完全に消失するため、この結合活性がタンパク質由来であり、核酸、脂質等の他の因子由来ではないという可能性が高い。
また、第５図のレーン３〜１２に示されるように、低酸素条件に曝露されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液中に見出されたＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合活性を呈する因子は、ＰＳ２エキソン５の３’部位に結合することがわかる。
さらに、低酸素条件に曝露されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液中に見出された前記因子とＮｏ．０プローブとの結合に対する非標識のＮｏ．１〜５の各プローブの影響を、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイにより調べた。結果を第６図に示す。
第６図に示されるように、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液中に見出された前記因子とＮｏ．０プローブとの結合は、Ｎｏ．５の３５Ｓ−非標識プローブの添加により阻害されるが、他の非標識プローブ（Ｎｏ．１〜４）では阻害されないことがわかる。
さらに、刺激後の異なる時点で得た核抽出液におけるＮｏ．５プローブに対する結合活性の誘導における酸素正常状態及び低酸素の影響を調べた。その結果、酸素正常状態曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においては、使用した条件下のＮｏ．５プローブについて顕著な結合活性は認められなかった。しかしながら、刺激後１６〜２１時間の間の核抽出液では低酸素による結合活性の増強が認められ、少なくとも２４時間持続することが示された。
本実施例における全ての実験は、別の細胞培養物を用いて、少なくとも４回繰り返され、同様の結果が得られた。したがって、低酸素により誘導される結合活性は、Ｎｏ．５プローブに特異的であることが示唆される。
実施例３  ヒトＰＳ２エキソン５結合タンパク質の精製及び同定
実施例２におけるＮｏ．５プローブへの結合活性を有する因子を精製するため、被検フラクションを、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合性反応物に加え、Ｎｏ．５のプローブに対する結合活性の増加を測定することによりアッセイした。
精製手順の概略を第７図に示す。第７図に示された（Ｉ）〜（Ｖ）の各フラクションを、銀染色（第８図）及びＲＮＡ結合アッセイ（第９図）によりアッセイした。
実施例１と同様に低酸素条件に曝露したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液（第９図、レーン１）を、６０％飽和硫酸アンモニウムで分画し、上清として、Ｎｏ．５  ＲＮＡプローブへの結合活性を有するフラクション〔フラクション（ＩＩ）、第７図（ＩＩ）〕を得た。なお、前記フラクション（ＩＩ）の銀染色の結果を第８図、レーン２に示し、ＲＮＡ結合アッセイの結果を第９図、レーン２に示す。
前記フラクション（ＩＩ）を、それぞれ５Ｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中、４℃で４時間、２回透析し、それにより、硫酸アンモニウムを除去した。得られた透析物を、ＤＥＡＥカラム〔ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕による陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、その後、カラムを１０ｍｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄した。ついで、１Ｍ  ＮａＣｌを含有した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１０ｍｌを用いて溶出を行ない、Ｎｏ．５  ＲＮＡプローブへの強い結合活性を有するフラクション〔フラクション（ＩＩＩ）、第７図（ＩＩＩ）〕を得た。なお、前記フラクション（ＩＩＩ）について、銀染色の結果を第８図、レーン３に示し、ＲＮＡ結合アッセイの結果を第９図、レーン３に示す。
前記フラクション（ＩＩＩ）を、５Ｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して、４℃で４時間、２回透析した。ついで、得られた透析物を、５’−アミノ−２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（５’−ａｕｃｕｕｃｕｕｇｇｕｇｇｕｇｃｕｃｕａｃａａｇｕａｃｃｇｃｕｇｃｕａｃａａｇｇｕｇａｇｇｃｃｃｕ−３’配列番号：２４）結合ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ〔ファルマシアバイオテク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）社製〕アフィニティーカラムに供した。前記アフィニティーカラムを、前記インキュベーション緩衝液１０ｍｌで洗浄し、１Ｍ  ＮａＣｌを含有したインキュベーション緩衝液１５ｍｌを用いて溶出して、Ｎｏ．５  ＲＮＡプローブへの結合活性を有するフラクション〔フラクション（ＩＶ）、第７図（ＩＶ）〕を得た（第９図、レーン４）。フラクション（ＩＶ）について、銀染色の結果を第８図、レーン４に示し、ＲＮＡ結合アッセイの結果を第９図、レーン４に示す。
銀染色の結果より、第８図、レーン４に示すように、完全には精製されていないことがわかった。
ついで、前記フラクション（ＩＶ）を、５ＬのＭｉｌｉ−Ｑ水に対して、４℃で４時間、２回透析した。得られた透析物を完全に凍結乾燥した後、０．１％ＴＦＡを含有したＭｉｌｉ−Ｑ水に再溶解した。
得られた溶液を、Ｗａｔｅｒｓ  ５Ｃ１８−ＭＳ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムを用いた逆相クロマトグラフィーに供した。すなわち、０．１％ＴＦＡを含有したＭｉｌｉ−Ｑ水でカラムを洗浄した。その後、０〜１００％のリニアグラジェントアセトニトリルの０．１％  ＴＦＡ含有Ｍｉｌｉ−Ｑ水溶液２５ｍｌ、続いて０．１％  ＴＦＡ含有１００％アセトニトリル５ｍｌを用いて溶出を行なった。
その結果、２０〜２５％アセトニトリルで溶出された単一ピークのフラクション〔フラクション（Ｖ）、第７図（Ｖ）〕を得た。かかるフラクションは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色により、第８図、レーン５に示されるように、黒矢印で示した分子量の位置において単一のバンドを示した。しかしながら、最終フラクションの結合活性は、先のステップ〔第７図（ＩＶ）〕のものと比較して劇的に低下した。結合反応溶液におけるアセトニトリルの最終濃度を３０％とすることにより、もとのフラクション中のプローブＮｏ．５に対する結合活性がほぼ完全に消失したため、最終フラクションの結合活性の減少は、逆相クロマトグラフィー用溶離緩衝液に含まれるアセトニトリルに依存することがわかる。
得られたフラクションを、０．１％  ＳＤＳを含有した１２％ポリアクリルアミドゲルで、１５ｍＡ／プレートの一定電流にて２時間、室温で電気泳動して分離した。その後、分離されたタンパク質バンドを含むゲル断片を切り出し、トリプシンを用いてゲル内消化を行なった。溶出したペプチド断片を、ＴＳＫゲルＯＤＳ−８０Ｔｓ  ＱＡカラム（２．０ｍｍ×２５０ｍｍ、東ソー社製）を用いたＨＰＬＣにより分離した。ついで、分離されたペプチド断片を、自動タンパク質シークエンサー（ＨＰ  Ｇ１００５Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）により解析した。得られたペプチド配列情報をデータベースの検索に使用した。
最終フラクション中の単一バンドについてペプチド配列解析を行ない、１７個のアミノ酸配列を得た。得られたペプチド配列を、配列データベースの既知のタンパク質と比較した結果、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液中のＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合性タンパク質は、ＨＭＧ−Ｉに完全にマッチした（ジーンバンクアクセッション番号Ｐ１７０９６）。
実施例４  ＨＭＧ−Ｉの結合活性の評価
実施例３の結果に基づき、ＨＭＧ−Ｉが、実際に結合活性を有する物質であることを確認するため、ＨＭＧ−Ｉタンパク質に対する抗体と、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液又は酸素正常状態のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液とを用いて、実験例１３に従い、下記のように、スーパーシフトアッセイを行なった。
すなわち、５μｇタンパク質相当量の核抽出液を、０．５〜２．０μｇの抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体〔サンタクルツバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社製〕とともに、４℃で８時間インキュベートし、前処理を行なった。前処理した核抽出液を、インキュベーション緩衝液中１０μｇのｔＲＮＡとともにインキュベートし、ついで、得られた産物に、全容量５０μｌの３２Ｐ標識ＲＮＡプローブ〔１μｇ、第４図に示されるＮｏ．５プローブ〕を添加して、２５℃で３０分間インキュベーションした。結合プローブと遊離プローブとを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓと０．３８Ｍグリシンと２ｍＭ  ＥＤＴＡとを含有した緩衝液（ｐＨ８．５）中、４％ポリアクリルアミドゲル上、１１Ｖ／ｃｍの一定電圧で１．５時間、４℃で電気泳動することにより分離した。ゲルを固定し、乾燥した。ついで、乾燥ゲルを、Ｘ線フィルムに曝して、オートラジオグラフィーを行なった。
その結果、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液を用いた場合、第１０図、右パネルのレーン１及び２に示すように、酸素正常状態のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液を用いた場合よりも強い結合活性が見られた。また、この結合活性の増加は、第１０図、右パネルのレーン３〜５に示すように、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体での前処理により、抗体濃度依存的にスーパーシフトされることがわかる。しかしながら、第１０図、左パネルに示すように、対照実験としての酸素正常状態のＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液では、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体の添加による顕著な効果は観察されなかった。
これらの結果により、プローブＮｏ．５に対する結合活性を有する低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来物質は、ＨＭＧ−Ｉであることが示される。
また、ＨＭＧ−Ｉタンパク質の低酸素曝露細胞におけるプローブＮｏ．５に対する結合活性は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイではＵＶ照射に依存しないことが示される。
実施例５  ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合部位の決定
本発明者らは、第４図のプローブＮｏ．５のＰＳ２エキソン５の３’末端における２回繰り返した類似配列（反復配列）に着目し、ＨＭＧ−Ｉタンパク質がこれらの反復配列に結合することを予想した。そこで、プローブＮｏ．５の誘導体として、第１１図に示した６種のＲＮＡプローブ（プローブＮｏ．６〜１１）を調製し、得られたプローブを用いて、前記実験例７に従い、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合アッセイを行なった。その結果を第１２図に示す。なお、前記反復配列は、第１１図のプローブＮｏ．５中における下線部の配列であり、それぞれ配列番号：１及び２に示される。
第１２図のレーン１に示すように、プローブＮｏ．５に対する結合活性は、酸素正常状態曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液において検出できなかった。一方、プローブＮｏ．５に対する結合活性は、第５図及び第６図と同様、第１２図のレーン２に示すように、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液を用いることにより、黒矢印で示した分子量の位置において強く増加することがわかる。
しかしながら、低酸素曝露によるこの結合活性の増大は、第１２図のレーン３に示すように、配列番号：１及び２の配列を欠いたプローブ（第１１図のプローブＮｏ．６）を使用することにより消失した。一方、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液において、配列番号：１及び２のそれぞれを直接結合させた配列を含むプローブＮｏ．７（第１１図）を使用することにより、結合が強く上昇した（第１２図、レーン４）。また、配列番号：１及び２の配列において、それぞれのＣをＡに置換された配列を含むプローブＮｏ．８（第１１図）を用いた場合、第１２図のレーン５に示すように、ほとんどの部分で完全に結合活性が消失した。さらに、配列番号：１又は２のいずれか一方を結合アッセイに使用し、結合活性を観察すると（第１２図、レーン６及び８）、両配列を有するプローブＮｏ．１０に対する結合活性が最も強かった（第１２図、レーン７）。これらの結果は、配列番号：１又は２のいずれか又は両方が、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対するＨＭＧ−Ｉタンパク質の結合活性に必要であることを意味する。
第１２図は、配列番号：１又は２のいずれか又は両方が、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対するＨＭＧ−Ｉの結合活性に必要であることを示す。前記配列番号：１及び配列番号：２の配列をデータベースの他の遺伝子と比較するために相同性を調べたところ、前記配列番号：１及び２は、これまでのところ、ＰＳ２のエキソン５に特有の配列であることが示される。
以上の結果は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質が一本鎖ＲＮＡに結合することを示し、ＨＭＧ−Ｉタンパク質が、ｇｃｕｃｕａｃａａｇ（配列番号：１）及び／又はｇｃｕｇｃｕａｃａａｇ（配列番号：２）を含有した配列からなる部位を認識し、結合することを示す。
実施例６  ＨＭＧ−Ｉ  ｍＲＮＡ及び免疫反応性ＨＭＧ−Ｉタンパク質の発現に対する低酸素の影響
結合活性の増加がＨＭＧ−Ｉの発現の増加に依存するか否かを調べるため、ＨＭＧ−ＩのｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルについて、酸素正常状態の場合と低酸素曝露した場合とを比較した。
第１３図の上部左パネルに示されるように、ノーザンブロット解析により、ＨＭＧ−ＩのｍＲＮＡレベルは、神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞においてＰＳ２Ｖを発現する条件である低酸素曝露により劇的に増加することがわかる。しかしながら、ＰＳ２Ｖを誘導しない低酸素曝露ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を用いた場合（第１３図、上部中央パネル）又はＰＳ２Ｖを誘導しないツニカマイシン処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いた場合（第１３図、上部中央パネル）では、ストレス下での顕著な増加は見られないことがわかる。
その結果、第１４図、左パネルにおける上側の矢印に示されるように、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用いたイムノブロット解析により、免疫反応性ＨＭＧ−Ｉタンパク質は、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞核抽出液において、酸素正常状態条件下の細胞の場合よりも多く発現することがわかる。しかしながら、第１４図の左パネルにおける下側の矢印に示されるように、免疫反応性ＨＭＧＹタンパク質は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液において低酸素ストレスによる影響を受けないことがわかる。第１４図の右パネルに示されるように、低酸素曝露ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞では、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体による顕著な免疫反応性が見られないことがわかる。
低酸素曝露ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及びツニカマイシン処理ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いる実験により示された結果は、低酸素により初期事象としてＨＭＧ−Ｉ／Ｙ  ｍＲＮＡの定常状態の細胞レベルが増加し、それに伴ってＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質が増加するという先の報告［ジー（Ｊｉ，Ｙ．Ｓ．）ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，８３，２９５−３０４，（１９９８）］と矛盾する。この明白な矛盾は、各細胞株の相違を反映しているのかもしれない。
実施例７  ＨＭＧ−Ｉタンパク質の細胞レベルでの局在
細胞下の局在を調べるため、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞培養物を低酸素条件に２１時間曝露し、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体と抗ＳＣ３５抗体とを用いて免疫蛍光顕微鏡によりＨＭＧ−Ｉタンパク質を検出した。なお、前記抗ＳＣ３５抗体は、スプライシングの必須因子であるＳＣ３５タンパク質に対する抗体である。本実施例においては、前記抗ＳＣ３５抗体を、スプライシング因子存在点であるスペックルのマーカーとして使用して、免疫細胞化学的検査を行なった。
免疫細胞化学的検査を行なった結果、酸素正常状態下の細胞では、第１５図の酸素正常状態の図に示されるように、ＨＭＧ−Ｉタンパク質は、主に核に局在し、弱く、散在的な免疫反応が、核スペックルのみに存在する免疫反応性ＳＣ３５タンパク質と共−局在することなく細胞質において得られることがわかる。
しかしながら、ＳＣ３５が共−局在する核スペックルにおいて、より強い免疫反応性が得られ、細胞質の免疫反応性は、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において、酸素正常状態の細胞よりも低下した。したがって、ＨＭＧ−Ｉタンパク質がＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において低酸素刺激により誘導されるだけでなく、細胞質から核に蓄積され、ＨＭＧ−Ｉの発現とＰＳ２Ｖの誘導との間に相関関係があると考えられる。
実施例８  イン・ビボにおけるＰＳ２遺伝子のエキソン５スキッピングへのＨＭＧ−Ｉ及びＨＭＧＹの一過性トランスフェクションの効果
前記サトウ（Ｓａｔｏ）らの文献［サトウ（Ｓａｔｏ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７２，２４９８−２５０５（１９９９）］に記載の方法に従い、孤発性アルツハイマー病の脳及び低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のそれぞれから、エキソン５を欠損した選択的スプライシング型のＰＳ２遺伝子を得た。
ＰＳ２遺伝子のエキソン５欠損を伴う選択的スプライシングがＨＭＧ−Ｉ／Ｙにより起こるか否かを調べるため、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ培養細胞及びＨＥＫ−２９３Ｔ培養細胞におけるＰＳ２Ｖの誘導に対するＨＭＧ−Ｉの一過性発現の効果を調べた。イムノブロット解析の結果を第１６図に示し、ＲＴ−ＰＣＲの結果を第１７図に示す。
第１６図に示すように、ＨＭＧ−ＩトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液及びＨＭＧ−ＩトランスフェクトＨＥＫ−２９３Ｔ細胞由来の核抽出液のそれぞれにおいて、これらのｍｏｃｋトランスフェクト細胞由来の核抽出液よりも、より強い免疫反応性ＨＭＧ−Ｉタンパク質の発現が見出された。さらに、第１７図のレーン１に示すように、ｍｏｃｋトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて、全長ＰＳ２遺伝子が対応する分子量の位置において主要転写産物（第１７図中、ＰＳ２）として検出されることがわかる。対照的に、ＨＭＧ−Ｉトランスフェクト細胞由来の全ＲＮＡを用いた場合、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、第１７図のレーン２及びレーン３に示されるように、全長ＰＳ２である主転写産物（第１７図中、ＰＳ２）だけでなく、ＨＭＧ−Ｉ量依存的に、より短鎖のＲＴ−ＰＣＲ産物（第１７図中、ＰＳ２Ｖ）も検出されることがわかる。
異常ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ダイレクトシークエンス解析により、エキソン５を欠くＰＳ２のオルタナティブスプライシング産物であることが示される。それに対し、第１７図のレーン４及びレーン５に示すように、ＨＭＧ−Ｙの一過性トランスフェクションにより、ＰＳ２Ｖの弱い誘導が、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞において見られるが、ＨＭＧＹタンパク質は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来核抽出液において低酸素により誘導されない。さらに、第１７図に示すように、ＰＳ２Ｖが低酸素により誘導されない細胞株（第２図）であるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞において、ＨＭＧ−Ｉの過剰発現によりＰＳ２Ｖが検出される。
スプライシングの必須因子の１つであるＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰは、通常、５’スプライシング部位に結合することが知られている。したがって、ＨＭＧ−Ｉは、Ｕ１ｓｎＲＮＰのｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合を阻害しうることが予想される。そこで、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液におけるＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰのｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合活性に対するＨＭＧ−Ｉの効果を調べた。
Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰに対する抗体〔抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）〕を用い、実験例１３に従い、下記のように、スーパーシフトアッセイを行なった。
すなわち、５μｇタンパク質相当量の核抽出液を、１μｇの抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体（サンタクルツバイオテクノロジー社製）とともに４℃で８時間インキュベートし、前処理を行なった。得られた前処理産物を、インキュベーション緩衝液〔組成：６０ｍＭ  ＫＣｌと４ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと１ｍＭ  ＤＴＴと１０％グリセロールと１ｍＭ  ＰＭＳＦとを含有した１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．９）〕中２μｇのｔＲＮＡとともにインキュベートした。ついで、３２Ｐ標識ＲＮＡプローブ〔１μｇ、第４図に示されるＮｏ．５プローブ〕を添加して、２５℃で３０分間インキュベーションした（全容量５０μｌ）。得られた反応物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓと０．３８Ｍグリシンと２ｍＭ  ＥＤＴＡとを含有した緩衝液（ｐＨ８．５）中、４％ポリアクリルアミドゲル上、１１Ｖ／ｃｍの一定電圧で１．５時間、４℃で電気泳動することにより、結合プローブと遊離プローブとを分離した。電気泳動後のゲルを固定し、乾燥し、ついでＸ線フィルムに曝した。その結果を第１８図に示す。
第１８図の左パネルに示すように、ＭｏｃｋトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液におけるプローブＮｏ．１２に対する結合活性は、抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体による前処理によって抗体濃度依存的にスーパーシフトすることがわかる。また、第１８図の左パネルのレーン１、右パネルのレーン１に示すように、ＨＭＧ−ＩトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液では、Ｍｏｃｋトランスフェクト細胞由来の核抽出液よりも強い結合活性が見られる。
しかしながら、これらの結合活性は、第１８図、レーン２〜４、右パネルに示されるように、ＨＭＧ−ＩトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞核抽出液では、抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体の添加による影響を受けないことがわかる。すなわち、これらの結果により、ＨＭＧ−Ｉは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対するＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰの結合活性を阻害することが示される。
さらに、ＨＭＧ−Ｉによるｐｒｅ−ｍＲＮＡに対するＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰの結合活性の阻害を調べた結果を第１９図に示す。
第１９図に示されるように、ＨＭＧ−Ｉは、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においては、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰと直接結合するが、酸素正常状態曝露細胞由来の核抽出液においては、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰと結合しないことがわかる。
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞でのＨＭＧ−Ｉ一過性トランスフェクションは、ＰＳ２Ｖの発現を誘導した（第１７図）。さらに、低酸素曝露によりＰＳ２Ｖが発現されない細胞株であるＨＥＫ−２９３Ｔ細胞（第２図）でのＨＭＧ−Ｉの過剰発現により、検出可能なＰＳ２Ｖが観察された（第１７図）。したがって、ＰＳ２Ｖは、細胞でＨＭＧ−Ｉ過剰発現させるだけで誘導されるといえる。低酸素刺激よりもＨＭＧ−Ｉ発現の増加がＰＳ２Ｖの誘導に必要であることが示唆される。
Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰは、スプライシングの必須因子であり、５’スプライシング部位を認識し、該５’スプライシング部位に結合する。Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ認識配列及びＨＭＧ−Ｉ認識配列は、Ｎｏ．５プローブ上で互いに近接している。Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰのＰＳ２ｍＲＮＡへの結合活性は、ＨＭＧ−ＩトランスフェクトＳＫ−Ｎ−ＳＨ由来の核抽出液においてインビトロで阻害された（第１８図）。
さらに、ＨＭＧ−Ｉタンパク質は、低酸素曝露ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液においてＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰと結合した（第１９図）。本実施例で観察されたＨＭＧ−Ｉと及びＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰの会合は、ＳＦ２／ＡＳＦとＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰとの結合を阻害した後、その結果としてＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰのｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合活性を抑制すると思われる。
また、ＨＭＧ−Ｉが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ又は第２０図に示すような他のスプライシング因子へのＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰの結合を阻害することによって、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰのＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに対する作用を抑制する可能性が示される。
実施例９  ｓＡＤ脳におけるＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質の発現
本当にＨＭＧ−Ｉタンパク質が、ＰＳ２のエキソン５を欠く選択的スプライシングを誘導するならば、対照脳よりもｓＡＤ脳においてより強いＨＭＧ−Ｉの発現が観察されるはずであることが考えられる。そこで、イムノブロットアッセイにより、対照脳におけるＨＭＧ−Ｉの発現レベルをｓＡＤ脳における場合と比較した。その結果を第２１図に示す。
第２１図の左パネル及び右パネルに示すように、ＨＭＧ−Ｉタンパク質及びＹタンパク質はともに、年齢がマッチした対照と比べると増加しており、３名の異なるｓＡＤ患者の海馬由来の全ライセート及び核フラクションにおいて発現することがわかる。しかしながら、第２１図の中央図に示されるように、海馬のサイトゾルフラクションでは、ｓＡＤ患者と対照との間に顕著な差はみられないことがわかる。
海馬のＨＭＧ−Ｉ／Ｙ発現領域を特定するため、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用いて免疫組織化学解析を行なった。その結果を第２２図に示す。第２２図に示すように、ｓＡＤ脳の海馬ＣＡ１領域の錐体細胞層において、対照よりも強い免疫反応性の発現が認められる。
免疫組織化学的解析において、免疫反応性ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質は、対照脳の海馬由来の核フラクションにおいて検出されたが（第２１図）、対照脳の海馬ＣＡ１領域ではＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質は、ほとんど検出されなかった（第２２図）。これは、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙが対照の海馬の多孔層から分子層にわたって発現したためであり、ｓＡＤ脳との比較において違いはなかった。
ｓＡＤの海馬核フラクションでは、ＨＭＧ−Ｉタンパク質及びＹタンパク質の両方について対照よりも強い発現が観察されたが、サイトゾルフラクションでは観察されなかった（第２１図）。また、免疫組織学的検査により、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質は、ｓＡＤ脳の海馬ＣＡ１領域の錐体細胞において検出された（第２２図）。これらの結果は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質が、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡに結合し、ｓＡＤの脳及び細胞株においてＰＳ遺伝子のエキソン５を欠くスプライシングバリアントを実際に誘導する可能性を示す。
実施例１０
前記サトウらの文献に従い、神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の全ＲＮＡの調製及びＲＴ−ＰＣＲを行ない、配列番号：２７に示される塩基配列を有する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡによるプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生抑制効果について、以下のように検討した。
神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を１０％ウシ胎仔血清を含有したダルベッコ最小必須培地〔ギブコ  ビー・アール・エル社製〕８ｍｌに播種し、各０、１０、１５μｇの２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）（それぞれ、０μｌ、２０μｌ、４５μｌ）を、オリゴフェクタミンを用いてトランスフェクションした。オリゴフェクタミンのみ（それぞれ、０μｌ、２０μｌ、４５μｌ）を用いた場合には、顕著な変化は認められなかった。
前記細胞を５％ＣＯ２、３７℃条件下にて１６時間培養した。培養１２時間後に培地を交換した。その後、得られた細胞を低酸素チャンバー（酸素圧８ｔｏｒｒ）中において、さらに２１時間培養した。
ついで、前記と同様に、ＲＮｅａｓｙトータルＲＮＡキット〔キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社製〕を用い、全ＲＮＡを抽出、精製した。
得られた全ＲＮＡと、マウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製〕とを用いて、４２℃で１時間逆転写反応を行なった。得られた反応物を鋳型として、１次ＰＣＲを行ない、さらに得られたＰＣＲ産物を鋳型として２次ＰＣＲを行なった。
ＰＣＲのサーマルプロファイルは、９５℃３０秒−６０℃３０秒−７２℃１分（最終サイクルにおいては７２℃２分）を１サイクルとした３０サイクルである。１次ＰＣＲには、プライマーｐｓ２５１（配列番号：９）とプライマーｐｓ２３１（配列番号：１０）とを用いた。２次ＰＣＲには、プライマーｐｓ２５２（配列番号：１１）とプライマーｐｓ２３３（配列番号：１２）とを用いた。
得られた産物を、５％ポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥ）を用いて電気泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。
なお、対照として、２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡを導入しない神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来のＲＮＡを用いた。結果を第２４図に示す。
第２４図に示されるように、２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡを導入ない場合に比べ、導入した場合、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアント（図中、ＰＳ２Ｖ）の産生が抑制されることがわかった。
実施例１１
イン・ビトロで、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡへの低酸素誘導されたＨＭＧ−Ｉの結合における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）の影響を調べた。
正常酸素条件又は低酸素条件で、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を５％ＣＯ２、３７℃条件下にて、２１時間培養した。得られた細胞から、核抽出液を調製した。その後、得られた核抽出液と、３２Ｐ標識ＲＮＡプローブＮｏ．５と、各種使用量の２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（レーン３、０．５μｇ  レーン４、５μｇ  レーン５、５０μｇ  レーン６、５００μｇ）とを、２５℃で３０分間インキュベーションした。結合プローブと遊離プローブとを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓと０．３８Ｍグリシンと２ｍＭ  ＥＤＴＡとを含有した緩衝液（ｐＨ８．５）中、４％ポリアクリルアミドゲル上、１１Ｖ／ｃｍの一定電圧で１．５時間、４℃で電気泳動することにより分離した。その後、電気泳動後のゲルを固定し、乾燥した。ついで、乾燥ゲルを、Ｘ線フィルムに曝して、オートラジオグラフィーを行なった。結果を第２５図に示す。
第２５図のレーン１及びレーン２に示されるように、配列番号：３に示される配列を有するＲＮＡプローブＮｏ．５へのＨＭＧ−Ｉ結合は、酸素正常条件で培養したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に比べ、低酸素条件下で培養したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の核抽出液において増加した。これらの結合の増加は、前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの添加により、用量依存的に阻害されたため、前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡが、ＨＭＧ−ＩとＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ上の標的部位との低酸素誘導された結合活性を阻害することがわかった。
実施例１２
３２Ｐ標識した２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）をオリゴフェクタミンを用いて、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に導入した。ついで、全溶解物、核画分、及びサイトゾル画分のそれぞれを抽出した。その後、全溶解物、核画分、及びサイトゾル画分のそれぞれにおける放射活性を測定することにより、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞中における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）の安定性と、該ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞への２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの導入効率とを調べた。結果を第２６図のパネルＡに示す。
第２６図のパネルＡのａに示されるように、前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡは、消失することなく、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に導入され、用量依存的に核に送達されることがわかった。また、第２６図のパネルＡのｂに示されるように、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞への前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの導入効率は、２０μｇ／１０ｃｍディッシュの２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡを用いた場合、割合が最も高くなった。
しかしながら、第２６図のパネルＡから、取り込み量は、約１５μｇ／１０ｃｍディッシュの２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡであると推定されるため、以後の細胞導入の際の最高用量を１５μｇ／１０ｃｍディッシュに設定した。
さらに、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞への２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの導入後４８時間の時点において、核における導入された２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの安定性を調べた。その結果を、第２６図のパネルＢに示す。
第２６図のパネルＢに示すように、導入後、４８時間後においても、２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡは、オリジナルフラクション中に存在していた分子量にほぼ同等であること、すなわち、該２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡは、４８時間後も核内に入り、分解されずに安定であることがわかった。
実施例１３
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液中のＨＭＧ−ＩのＤＮＡ結合における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）の作用を調べた。
最初に、イン・ビトロＤＮＡ選別アッセイにより、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフの塩基配列を決定した。イン・ビトロＤＮＡ選別アッセイ手順は、以下のとおりである。５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：６７）と、５’−ＧＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号：６８）とをプライマーとして用い、〔９４℃１分−５３℃１分−７２℃１分〕を１サイクルとした７サイクルのＰＣＲにより、３１ヌクレオチドのランダムな配列（１６クローンのダイレクトシークエンスにより、２０．７％  Ａ、２２．７％  Ｃ、３１．５％  Ｔ、２５．１％  Ｇ）を含む合成ＤＮＡ［５’−ＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡ（Ｎ３１）ＴＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＣ−３’］を増幅した。
得られた産物を、インキュベーション緩衝液〔６０ｍＭ  ＫＣｌと４ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭ  ＥＤＴＡと１ｍＭ  ＥＧＴＡと１ｍＭ  ＤＴＴと１０％グリセロールと１ｍＭ  ＰＭＳＦとを含有した１２ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）〕中、大腸菌発現組換えＨＭＧ−Ｉ（ｒＨＭＧ−Ｉと表記する）とともに２５℃で３０分間インキュベートした。
得られた反応溶液について、ＨＭＧ−Ｉに対する抗体を用いた免疫沈降を行ない、免疫沈降した産物を鋳型とし、５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡ−３’（配列番号：６７）と、５’−ＧＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号：６８）とをプライマーとして用い、〔９４℃１分−５３℃１分−７２℃１分〕を１サイクルとした７サイクルのＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクター（プロメガ社製）にクローン化し、ダイレクトシークエンスで解析した。
その結果、第２７図の最上段に示されるコンセンサス配列が、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフであることが示唆された。
ついで、前記ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含む３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブ〔ｇｃｇＧ（Ａ）ＧＴ（Ａ）Ａ（Ｔ）ＡＴＴＴｃｇｃ（配列番号：６６）〕とＨＭＧ−Ｉとの結合における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）の作用を調べた。
核抽出液のタンパク質含有量を測定した後、前記インキュベーション緩衝液に、５μｇ  タンパク質相当量の抽出液と、１μｇ  ポリｄＩｄＣと、各濃度の２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）とを添加し、ついで、１μｇの３２Ｐ標識ＤＮＡプローブ〔ｇｃｇＧ（Ａ）ＧＴ（Ａ）Ａ（Ｔ）ＡＴＴＴｃｇｃ（配列番号：６６）〕を添加し、全５０μｌとし、さらに、２５℃で３０分間インキュベートした。
その後、５０ｍＭ  トリスと０．３８Ｍ  グリシンと２ｍＭ  ＥＤＴＡとを含む緩衝液中、１１Ｖ／ｃｍ  定常電圧、４℃、１．５時間での４％  ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、結合プローブと、遊離プローブとを分離した。泳動後のゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーにより解析した。
その結果、第２８図のパネルＡ及びパネルＢのそれぞれのレーン１及びレーン２に示されるように、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞におけるＨＭＧ−Ｉの過剰発現により、前記ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含む３２Ｐ−標識ＤＮＡプローブとＨＭＧ−Ｉとの結合は、劇的に上昇した。
しかしながら、第２８図のパネルＡ及びパネルＢのそれぞれのレーン３及び４に示されるように、前記ＤＮＡプローブへのＨＭＧ−Ｉの結合活性の上昇に関して、前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡによる顕著な影響は観察されなかった。
したがって、前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの阻害作用は、ＲＮＡへのＨＭＧ−Ｉの結合に特異的であるが、ＤＮＡへのＨＭＧ−Ｉの結合には特異的でないことが示された。
実施例１４
２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）を導入したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔被検細胞〕と導入していないＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔対照細胞〕とを、それぞれ低酸素圧（８ｔｏｒｒ）の加湿雰囲気下に維持した低酸素チャンバーを備えたインキュベーターを用い、３７℃で低酸素条件下又は正常酸素条件下、２１時間培養し、ついで、２μＭ  ツニカマイシンの存在又は非存在下、１０時間培養した。
その後、プロメガ社製商品名：Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６Ｒ  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙを用い、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムアッセイ（ＭＴＳアッセイという）を行なうことにより、細胞の生存率を解析した。
その結果、第２９図のパネルＡのレーン４〜７に示されるように、低酸素刺激とツニカマイシンとにより誘導された細胞死は、前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの導入により、用量依存的に、和らげられることがわかった。
また、ＨＭＧ−Ｉを一過性発現し、かつ２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡ（配列番号：２７）が導入されたＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞〔被検細胞〕と、ＨＭＧ−Ｉを一過性発現するＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞とを、それぞれ、２μＭ  ツニカマイシンの存在又は非存在下、１０時間培養した。
その後、ＭＴＳアッセイを前記と同様に行なうことにより、細胞の生存率を解析した。
その結果、第２９図のパネルＢのレーン４〜７に示されるように、ＨＭＧ−Ｉの一過性発現とツニカマイシンとにより誘導された細胞死は、前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの導入により、用量依存的に、顕著に、和らげられることがわかった。
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、結合領域の配列を示す。
配列番号：２は、結合領域の配列を示す。
配列番号：３は、ＲＮＡプローブＮｏ．５の配列を示す。
配列番号：４は、ＲＮＡプローブＮｏ．７の配列を示す。
配列番号：５は、ＲＮＡプローブＮｏ．９の配列を示す。
配列番号：６は、ＲＮＡプローブＮｏ．１０の配列を示す。
配列番号：７は、ＲＮＡプローブＮｏ．１１の配列を示す。
配列番号：８は、ＲＮＡプローブＮｏ．８の配列を示す。
配列番号：９は、プライマーｐｓ２５１の配列を示す。
配列番号：１０は、プライマーｐｓ２３１の配列を示す。
配列番号：１１は、プライマーｐｓ２５２の配列を示す。
配列番号：１２は、プライマーｐｓ２３３の配列を示す。
配列番号：１３は、ＤＮＡプローブＮｏ．１の配列を示す。
配列番号：１４は、ＤＮＡプローブＮｏ．２の配列を示す。
配列番号：１５は、ＤＮＡプローブＮｏ．３の配列を示す。
配列番号：１６は、ＤＮＡプローブＮｏ．４の配列を示す。
配列番号：１７は、ＤＮＡプローブＮｏ．５の配列を示す。
配列番号：１８は、ＤＮＡプローブＮｏ．６の配列を示す。
配列番号：１９は、ＤＮＡプローブＮｏ．７の配列を示す。
配列番号：２０は、ＤＮＡプローブＮｏ．８の配列を示す。
配列番号：２１は、ＤＮＡプローブＮｏ．９の配列を示す。
配列番号：２２は、ＤＮＡプローブＮｏ．１０の配列を示す。
配列番号：２３は、ＤＮＡプローブＮｏ．１１の配列を示す。
配列番号：２４は、アフィニティーカラムのリガンドとして用いた５’−アミノ−２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの配列を示す。
配列番号：２５は、ＲＮＡプローブＮｏ．６の配列を示す。
配列番号：２６は、ＲＮＡプローブＮｏ．１２の配列を示す。
配列番号：２７は、配列番号：２４中に存在するＨＭＧ−Ｉタンパク質結合領域の配列に対応する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの配列を示す。
配列番号：２８は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：２９は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３０は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３１は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３２は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３３は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３４は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３５は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３６は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３７は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３８は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：３９は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４０は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４１は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４２は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４３は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４４は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４５は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４６は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４７は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４８は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：４９は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５０は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５１は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５２は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５３は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５４は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５５は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５６は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５７は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５８は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：５９は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：６０は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：６１は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：６２は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：６３は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：６４は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：６５は、イン・ビトロＤＮＡ選別アッセイに用いられた合成ＤＮＡの配列を示す。ｎは、Ｇ又はＡ又はＴ又はＣを示す。
配列番号：６６は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフを含有した合成ＤＮＡの配列を示す。
配列番号：６７は、イン・ビトロＤＮＡ選別アッセイに用いられたプライマーの配列を示す。
配列番号：６８は、イン・ビトロＤＮＡ選別アッセイに用いられたプライマーの配列を示す。
産業上の利用可能性
本発明の阻害剤によれば、ＨＭＧ−Ｉタンパク質とプレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５との結合を阻害することができ、それにより、スプライシング異常に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患を治療及び／又は予防することが可能になるという優れた効果を奏する。また、本発明の神経細胞死抑制剤によれば、プレセニリン−２エキソン５欠損型スプライシング異常を抑制し、それにより神経細胞死を抑制することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明の医薬組成物によれば、神経細胞死を抑制することでき、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防を行なうことができるという優れた効果を奏する。また、本発明の治療又は予防方法によれば、プレセニリン−２  ｍＲＮＡエキソン５欠損スプライシングバリアントの産生に起因する疾患、特に脳障害又は神経変性疾患の治療又は予防を、より効率よく、持続的に行なうことができるという優れた効果を奏する。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、ｓＡＤの脳及び培養細胞株におけるＰＳ２Ｖの発現を示す図である。左パネルは、代表的なｓＡＤ脳又は年齢がマッチした対照脳由来の増幅産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した結果である。右パネルは、正常酸素状態、低酸素曝露、ツニカマイシン（ＴＭ）、β−アミロイドの各ストレス下の種々の細胞由来の全ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供し、得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した結果である。図中、黒矢印は、ＰＳ２（上部）及びＰＳ２Ｖ（下部）に対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第２図は、ｓＡＤ脳及び対照脳のそれぞれにおけるＰＳ２Ｖの免疫組織化学検出を行なった結果を示す図である。厚さ１０μｍの対照及びｓＡＤの脳切片を作製し、続いて抗ＳＳＭＡＧ抗体を用いるＰＳ２Ｖの免疫組織化学的検出をおこなった。これらの結果は、少なくとも３種の異なる対照及びＡＤの脳を解析し、同様の結果を得たものである。
第３図は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法の概略を示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を、酸素正常状態又は低酸素刺激の２１時間後に回収した後、核抽出液を調製し、続いてＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ断片の各プローブと結合反応させる。反応液に紫外（ＵＶ）光を照射した後、ＲＮアーゼＡを用いてプローブを消化し、続いてＳＤＳ処理を行なう。ＳＤＳ処理した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイにより分離した後、Ｂａｓ用イメージングプレートを用いて結合陽性バンドを検出する。
第４図は、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡプローブの概略図である。図中、結合実験法のためのＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ断片の６種のプローブを概略的に示す。枠で囲んだ領域及び下線部は、それぞれエキソン及びイントロンを表す。全てのプローブは、インビトロ転写により標識される。
第５図は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法の結果を示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収した。各放射性標識プローブを用いるｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法により、回収した細胞由来の核抽出液を解析した。次いで、濃度勾配（１０〜２０％）ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｂａｓ用イメージングプレートに曝した。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第６図は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法の結果を示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収した。核抽出液を各３５Ｓ−非標識コールドプローブとともに結合条件下で前インキュベートした。前インキュベートした反応液を用いるｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法を、各３５Ｓ−標識ホットプローブの添加により開始し、次いで、１５％ポリアクリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｂａｓ用イメージングプレートに曝した。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第７図は、低酸素ストレス下のヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞核抽出液由来のＮｏ．５プローブ結合活性を有するフラクションの精製プロフィールを示す。精製方法はイタリック体で示す。個々のフラクションをローマ数字で示す。
第８図は、第７図に示される各精製段階におけるタンパク質（２５μｌ／フラクション）を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色により解析した結果を示す図である。図中、Ｍは、分子量（ｋＤａ）マーカーを示す。
第９図は、３５Ｓ−標識Ｎｏ．５プローブと各精製段階におけるフラクション（１５μｌ／フラクション）との結合活性を示す図である。
第１０図は、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体を用いたスーパーシフトアッセイの結果を示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態（左図）又は低酸素（右図）の刺激の２１時間後に回収した。放射能標識したＮｏ．５プローブと反応させる前に、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体の存在下又は非存在下で、通常のバッファー中で核抽出液をインキュベートした。次いで、試料をゲル遅延電気泳動及びオートラジオグラフィーに供した。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得た。
第１１図は、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡの７種類の構造を示す図である。図中、エキソンを大文字で示し、イントロンを小文字で示す。２個の類似配列を太字で示し、下線を付す。
第１２図は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質のＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡにおける結合部位を調べた結果を示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収する。各放射能標識プローブを用いるｐｒｅ−ｍＲＮＡ結合実験法により、回収した細胞由来の核抽出液を解析する。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、Ｂａｓ用イメージングプレートに曝す。図中、黒矢印は、対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第１３図は、培養細胞におけるＨＭＧ−Ｉ  ｍＲＮＡ（図中、ＨＭＧＩ  ｍＲＮＡ）及び該ｍＲＮＡに対応するタンパク質の発現に対する種々のストレスの影響をノーザンブロット解析により調べた結果を示す図である。左パネル及び中央パネルは、酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、曝露の２１時間後に回収した細胞株について解析した結果を示す。右パネルは、ツニカマイシン処理し、２４時間後に回収したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞について解析した結果を示す。全ＲＮＡをホルムアルデヒド−ホルムアミドゲル電気泳動し、放射能標識したＨＭＧ−Ｉ  ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロットアッセイに供す。図中、分子量点を黒矢印で示す。
第１４図は、培養細胞におけるＨＭＧ−Ｉ  ｍＲＮＡ及び該ｍＲＮＡに対応するタンパク質の発現に対する種々のストレスの影響をウエスタンブロット解析により調べた結果を示す図である。各細胞株を、酸素正常状態又は低酸素に曝露した後、刺激の２１時間後に回収する。得られた核抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体を用いてイムノブロットアッセイに供す。図中、黒矢印は、ＨＭＧ−Ｉ（上部、図中、「ＨＭＧＩ」）及びＨＭＧ−Ｙ（下部、図中、「ＨＭＧＹ」）タンパク質の対応する分子量点を示す。
第１５図は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞における免疫反応性ＨＭＧ−Ｉタンパク質の細胞下局在に対する低酸素の影響を示す図である。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を酸素正常状態又は低酸素に２１時間曝露する。細胞を、一次免疫反応のために抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ（図中、「ＨＭＧＩ／Ｙ」）抗体及び抗ＳＣ３５抗体で免疫染色した後、ＦＩＴＣ結合二次抗体及びＣｙ３結合二次抗体で染色する。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第１６図は、培養細胞におけるＰＳ２遺伝子のエキソン５スキッピングに対するＨＭＧ−Ｉ又はＨＭＧ−Ｙの一過性発現の効果を調べた結果を示す図である。各細胞株にｍｏｃｋ又はＨＭＧ−Ｉのトランスフェクションを行った後、トランスフェクションの２４時間後に回収した。核抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＨＭＧ−Ｉ／Ｙに対する抗体を用いてイムノブロットアッセイに供した。黒矢印は、ＨＭＧ−Ｉタンパク質（図中、「ＨＭＧＩ」）の対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第１７図は、培養細胞におけるＰＳ２遺伝子のエキソン５スキッピングに対するＨＭＧ−Ｉ又はＨＭＧ−Ｙの一過性発現の効果を調べた結果を示す図である。各細胞株に、異なる量のｍｏｃｋ、ＨＭＧ−Ｉ（図中、「ＨＭＧＩ」）又はＨＭＧ−Ｙ（図中、「ＨＭＧＹ」）のトランスフェクションを行った後、トランスフェクションの２４時間後に回収した。回収した細胞由来の全ＲＮＡを、文献［サトウ（Ｓａｔｏ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，７２，２４９８−２５０５（１９９９）］の方法によりＲＴ−ＰＣＲに供した。増幅産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。黒矢印は、ＰＳ２（上部）及びＰＳ２Ｖ（下部）の対応する分子量点を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第１８図は、Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰのＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡへの結合に対するＨＭＧ−Ｉ（図中、「ＨＭＧＩ」）の効果を調べた結果を示す図である。回収した細胞由来の核抽出液を、上部パネルに示したＮｏ．１２のプローブ（３２Ｐ標識）と反応させる前に、ＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体の存在下又は非存在下で、通常のバッファー中でインキュベートした。次いで、試料をゲル遅延電気泳動及びオートラジオグラフィーに供した。図中、黒矢印は、遊離、結合及びスーパーシフトしたプローブを示す。また、図中Ａｂは、抗Ｕ１  ｓｎＲＮＰ抗体を示す。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも４回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第１９図は、ＨＭＧ−Ｉ／ＹとＵ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰとの相互作用を示す図である。上部パネルは、抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体を用いてイムノプロットアッセイを行なった結果を示す。酸素正常状態又は低酸素に曝露したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を刺激の２４時間後に回収した後、核抽出液を調製した。核抽出液を抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体（図中、「抗ＨＭＧＩ／Ｙ抗体」）により免疫沈降させた後、抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体を用いてイムノブロットアッセイを行なった。下部パネルは、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用いてイムノブロットアッセイを行なった結果を示す。核抽出液を抗Ｕ１（７０Ｋ）ｓｎＲＮＰ抗体により免疫沈降させた後、抗ＨＭＧ−Ｉ／Ｙ抗体を用いてイムノブロットアッセイを行なった。これらの実験は、別個の細胞培養物を用いて少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得たものである。
第２０図は、ＰＳ２  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ上の異常スプライシング機構の仮説の概略図である。
第２１図は、ｓＡＤ脳におけるＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質の発現をウエスタンブロット解析により調べた結果を示す図である。全ライセート、サイトゾルフラクション及び核フラクションを、３例の異なるｓＡＤ脳及び年齢がマッチした対照の海馬から調製した。これらのフラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及びＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質に対する抗体を用いるイムノブロットアッセイに供した。黒矢印は、ＨＭＧ−Ｉ（上部、図中、「ＨＭＧＩ」）及びＨＭＧ−Ｙ（下部、図中、「ＨＭＧＹ」）タンパク質の対応する分子量点を示す。
第２２図は、ｓＡＤ脳におけるＨＭＧ−Ｉ／Ｙタンパク質の発現を免疫組織化学により調べた結果を示す図である。少なくとも３種の異なる対照及びＡＤの脳を解析し、常に同様の結果を得たものである。厚さ１０μｍの対照及びｓＡＤの脳切片を作製し、続いて免疫反応性ＨＭＧ−Ｉ／Ｙの免疫組織化学的検出をおこなった。少なくとも３種の異なる対照及びＡＤの脳を解析し、常に同様の結果を得たものである。
第２３図は、合成された各オリゴヌクレオチドを示す図である。慣用の方法によりした。２４マー又は６０マーの塩基長を有する２種の相補的なオリゴヌクレオチドを用いてアニーリングを行ない、Ｎｏ．１〜Ｎｏ．１１の各二本鎖ＤＮＡを得た。なお、図中、各オリゴヌクレオチドにおいて、ＰＳ２のエキソン５の各断片を下線を付し、太字で示す。
第２４図は、２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡによるプレセニリン−２遺伝子エキソン５欠損スプライシングバリアントの産生抑制効果を調べた結果を示す図である。
第２５図は、イン・ビトロでの低酸素誘導ＨＭＧ−Ｉ結合における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの影響を調べた結果を示す図である。図中、レーン１の「Ｎ」は、正常酸素条件、レーン２の「Ｈ」は、低酸素条件を示す。また、２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの使用量は、レーン３については、０．５μｇ、レーン４については、５μｇ、レーン５については、５０μｇ、レーン６については、５００μｇである。
第２６図は、細胞内における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの取り込み、安定性及び導入効率を調べた結果を示す図である。パネルＡにおいて、パネルａは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の各画分における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの取り込み量を示し、パネルｂは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞への前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの導入効率を示す。パネルＢは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞への前記２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの導入後、４８時間の時点での２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの安定性を調べた結果を示す。
第２７図は、ＨＭＧ−ＩのＤＮＡ認識モチーフを決定するための合成ＤＮＡの配列を示す図である。最上段は、ＨＭＧ−Ｉ認識モチーフのコンセンサス配列を示す。
第２８図は、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞由来の核抽出液中のＨＭＧ−ＩのＤＮＡ結合における２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの作用を調べた結果を示す図である。パネルＡは、ゲルシフトアッセイの結果を示し、パネルＢは、パネルＡを数値化したデータを示す。
第２９図は、細胞死に対する２’−Ｏ−メチルオリゴＲＮＡの作用を調べた結果を示す。パネルＡは、低酸素条件とツニカマイシンとにより誘導された細胞死について調べた結果、パネルＢは、ＨＭＧ−Ｉの一過性発現とツニカマイシンとにより誘導された細胞死について調べた結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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