(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体の表面を化学修飾し、カルボキシル基を有する状態で、多価カルボン酸の無水物による化学修飾を施した基体。
【請求項２】
前記基体が、シリコン、ガラス又は金属である請求項１記載の化学修飾を施した基体。
【請求項３】
前記金属が、金、銀、銅、アルミニウム又はタングステンである請求項２記載の化学修飾を施した基体。
【請求項４】
前記基体が、表面にダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボンまたはグラファイトからなる表面処理層が形成された請求項１乃至３に記載の化学修飾を施した基体。
【請求項５】
前記基体が、表面に炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウムまたは炭化モリブデンからなる表面処理層が形成された請求項１乃至３に記載の化学修飾を施した基体。
【請求項６】
前記表面処理層の厚みが、１ｎｍ〜１０００ｎｍである請求項４または５に記載の化学修飾を施した基体。
【請求項７】
前記基体が表面にアミノ基を有することを特徴とする請求項１乃至６記載の化学修飾を施した基体
【請求項８】
基体表面にアミド結合を介して末端にカルボキシル基を有する炭化水素基を結合し、該カルボキシル基を多価カルボン酸の無水物を主成分とした液で浸漬処理する方法で化学修飾を施した基体の製造方法。
【請求項９】
基体表面にアミド結合を介して末端にカルボキシル基を有する炭化水素基を結合させるに当たり、基体表面を塩素化し、ついでアミノ化して得られる第１級アミノ基と多価カルボン酸の無水物とを反応させてアミド結合することを特徴とする請求項８記載の化学修飾を施した基体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、分子生物学分野、生化学関連分野において有用な、核酸又は蛋白を固定化可能な化学修飾を施した基体に関するものである。
背景技術
遺伝子解析は分子生物学、生化学の分野で有用であり、近年では病気の発見等医療分野でも利用されている。
遺伝子解析において、近年ＤＮＡチップが開発され解析速度が著しく速くなった。しかし従来のＤＮＡチップはスライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布し、その後にＤＮＡを固定する方法である。また、フォトリソグラフ等の半導体技術を用いてガラス基板上にオリゴヌクレオチドを合成する方法が用いられている。
しかし、スライドガラス或いはシリコン基板表面にポリリジン等の高分子を塗布してＤＮＡを固定する方法では、ＤＮＡの固定化状態が不安定であり、ハイブリッド形成工程や洗浄工程において、ＤＮＡが剥離するといった問題が生じる。また、半導体技術を用いたＤＮＡチップは、製造工程の煩雑さから非常に高価であるという問題がある。
このような問題点を解決するためには、基体の表面にＤＮＡを高密度で且つ強固に固定化する必要がある。
また、従来、基体の表面を化学修飾した基体が知られている。しかし、カルボン酸等にＤＮＡを結合させるには、カルボン酸の活性化が必要となるため、基板の化学修飾だけでは不十分である。更に、カルボキシル基を導入する方法として酸クロリドを含んだ溶液で処理することが知られているが、酸クロリドは製造が困難なため、安定供給、価格あるいは純度の点で問題がある。
本発明は、ＤＮＡの解明やＤＮＡ保存を効率的に行うことができ、分子生物学分野、生化学分野等において有用で安価なな化学修飾を施した基体及びその製造方法を提供することを目的とするものである。また、本発明は、ＤＮＡ或いは蛋白を安定に固定化するための基体を提供することを目的とするものである。
発明の開示
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討の結果、基体の表面を化学修飾してカルボキシル基を導入する方法として多価カルボン酸の無水物を含んだ処理液で処理することにより、安価な方法となることを見出した。特性的にも、従来の酸クロリドを使った方法と同程度カルボキシル基を導入できることを見出した。
請求項１は、基体上の表面を多価カルボン酸の無水物による化学修飾を施した基体。基体が、シリコン、ガラス又は金属であり、基体の表面に、ダイヤモンド、ダイヤモンドライクカーボン、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウムまたは炭化モリブデンからなる表面処理層が有ることを特徴とする。該金属が金、銀、銅、アルミニウム、タングステンであっても良い。
前記表面処理層の厚みが、１ｎｍ〜１０００ｎｍであることを特徴とする。
また、基体表面にアミノ基を有することを特徴とする。
請求項８は基体表面にアミド結合を介して末端にカルボキシル基を有する炭化水素基を結合し、該カルボキシル基を多価カルボン酸の無水物を主成分とした液で処理する方法で化学修飾した基体の製造方法である。
この多価カルボン酸の無水物を主成分とした液で処理する方法が浸漬による方法であることを特徴とする基体の製造方法である。
基体表面にアミド結合を介して末端にカルボキシル基を有する炭化水素基を結合させるに当たり、基体表面を塩素化し、ついでアミノ化して得られる第１級アミノ基と多価カルボン酸の無水物とを反応させてアミド結合することを特徴とするの基体の製造方法である。
発明を実施するための最良の形態
本発明の基体は、基体の表面に特定の化学修飾を施したことを特徴とするものである。本発明における化学修飾とは、末端に少なくとも２つ以上のカルボキシル基が結合した炭化水素を、基体の表面にアミド結合を介して固定化することをいう。このような化学修飾を施した基体を更に活性エステル化することによって、ＤＮＡ等或いは蛋白を基体の表面に固定しやすくなる。
蟻酸、酢酸  炭化水素基は、炭素数０〜１２、中でも０〜６のものが好ましい。
例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などのジカルボン酸、あるいはトリメリット酸等の多価カルボン酸等があげられ、１種以上の酸無水物の形で用いることができる。中でもコハク酸が好ましい。
炭化水素基の末端に結合する活性エステル基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル或いはｐ−ニトロフェノールエステルが好ましい。
このような活性化エステルは、基体にアミド結合を介して炭化水素基の末端に活性エステル基が結合した基を固定化することである。
例えば活性エステル基がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基の場合には、塩素ガス中で基体に紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、ジカルボン酸の無水物を用いてカルボキシル化し、末端のカルボキシル基をカルボジイミド或いはジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと脱水縮合することにより行うことができる。
この方法を採用する場合の脱水縮合について一例を挙げて説明すると、表面を化学修飾し、カルボキシル基を有する状態の固体支持体をカルボジイミドあるいはジシクロヘキシルカルボジイミド、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド或いはｐ−ニトロフェノールを溶解した１，４−ジオキサン溶液中に浸漬させ、洗浄後乾燥する。このようにして、Ｎ−スクシンイミドエステル基やｐ−ニトロフェノールエステル基を末端に有する炭化水素基が結合した基体が得られる。
この方法は、本発明者らがはじめて開発したものである。基体の表面を活性化エステル基で化学修飾した状態の商品とすることにより、ユーザーはそれを用いて容易にＤＮＡを直に基体の表面にアミド結合により固定化することができる。
本発明において上記のような化学修飾を行う基体としては、ダイヤモンド、金、銀、銅、アルミニウム、タングステン、モリブデン等の金属、上記金属とセラミックスとの積層体、あるいはポリカーボネート、フッ素樹脂等のプラスチック等が挙げられる。
その他の材料でも、化学的に安定な材料であれば使用でき、例えば、グラファイト、ダイヤモンドライクカーボンが挙げられる。また、プラスチックと上記金属、セラミックス、ダイヤモンド等との混合体でもよい。更に、スライドグラスあるいはシリコンの上に、ダイヤモンド、ダイヤモンドカーボン、グラファイト、炭化ハフニウム、炭化ニオブ、炭化珪素、炭化タンタル、炭化トリウム、炭化チタン、炭化ウラン、炭化タングステン、炭化ジルコニウムまたは炭化モリブデンなどの表面処理層を形成したものでも良い。この表面処理層の厚みとして、１ｎｍ〜１０００ｎｍが好ましい。
これらのうち、ＤＮＡ等の固体化密度が格段に高いこと、および熱伝導性の点からダイヤモンドあるいはダイヤモンドライクカーボンが好ましい。
ダイヤモンド基板の素材として、合成ダイヤモンド、高圧形成ダイヤモンド、或いは天然のダイヤモンド等のいずれも使用できる。また、それらの構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。マイクロ波プラズマＣＶＤ法、高周波プラズマＣＶＤ法、イオン蒸着法、アーク蒸着法などを用いて製造されたダイヤモンドあるいはダイヤモンドライクカーボンを用いることが好ましい。
本発明の基体の形成方法は公知の方法で行うことができる。例えば、マイクロ波プラズマＣＶＤ法、ＥＣＲＣＶＤ法、ＩＰＣ法、直流スパッタリング法、ＥＣＲスパッタリング法、イオンプレーティング法、アークイオンプレーティング法、ＥＢ蒸着法、抵抗加熱蒸着法などが挙げられる。また、金属粉末やセラミック粉末等に樹脂をバインダーとして混合して結合形成したものが挙げられる。また、金属粉末やセラミック粉末等の原料をプレス成形機を用いて圧粉したものを高温で焼結したものもあげられる。
本発明の基体の基板表面は意図的に粗面化されていることが望ましい。このような粗面化表面は基体の表面積が増えて多量のＤＮＡ等を固定させることに好都合であるからである。基体の形状は平板状、糸状、球状、多角形状、粉末状など特に問わない。
さらに、このダイヤモンド基板は、ダイヤモンドと他の物質との複合体（例えば、２層からなる基板）であってもよい。
実施例
以下実施例により本発明を説明する。
実施例１
塩素ガス中で３ｍｍ角のＣＶＤダイヤモンドに紫外線照射して表面を塩素化し、次いでアンモニアガス中で紫外線照射してアミノ化した後、ジカルボン酸の無水物によりカルボキシル化した。このカルボキシル化は、ピロリドン４２ｍＬに無水コハク酸０．２ｇ溶解し、更に１モルのホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を１ｍＬ添加した処理液に、アミノ化した基体を２０分浸漬し、基体を緩やかに揺らす。そして水洗してカルボキシル化を完了する。
この表面が修飾された基体を、カルボジイミド２．５ｍｇ／ｍｌおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミド１．５ｍｇ／ｍｌを溶解した１，４−ジオキサン溶液（３ｍｍ角ダイヤモンド１枚に対し１００μｌとなる量）中に１５分間浸漬させ、末端カルボキシル基を脱水縮合した。反応終了後水洗し、さらに、１，４−ジオキサン溶液で洗浄後乾燥し、化学修飾された基体を得た。
上記に示す実施例１で作成した基体を用いて、２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを固定した後、相補的な配列を持つ蛍光標識プローブとハイブリッド形成し、蛍光光度計を用いてオリゴヌクレオチド固定化量を見積もった。その結果、実施例１では３ｍｍ角の基板１枚あたり９ｐｍｏｌ、実施例２では１ｍｍ２あたり０．１ｐｍｏｌであり、いずれもオリゴヌクレオチドが高密度に固定していることが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明の化学修飾を施した基体は、化学修飾がされ活性化エステル基を有しているため、ＤＮＡ等核酸を安定して固定化できるので、ＰＣＲを行うにあたり、あるいはＤＮＡアレー基板として用いるにあたり有利である。また、カルボキシル基の導入は、酸クロリドの替わりに多価カルボン酸の無水物を主成分とした液を使って処理するので、安価で安定して固定化できる基体であり、安価な基体の製造方法となる。