(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）骨髄液試料を、赤血球溶解剤と混合して前記試料中の赤血球を溶解するとともに、白血球系細胞及び赤芽球系細胞を染色に好適な状態にし、少なくとも脂質粒子、白血球系細胞及び赤芽球系細胞の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素で染色し、
（２）得られた試料を、フローサイトメータに導入して、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、
（３）散乱光と蛍光との強度差を用いて、脂質粒子、骨髄有核細胞、赤芽球系細胞及び白血球系細胞をそれぞれ分類するとともに、骨髄有核細胞、赤芽球系細胞及び白血球系細胞をそれぞれ計数し、
（４）骨髄有核細胞数と赤芽球系細胞数又は白血球系細胞数とから、骨髄有核細胞と赤芽球系細胞又は白血球系細胞数との比を算出し、
（５）赤芽球系細胞数と白血球系細胞数とから、白血球系細胞と赤芽球系細胞との比を算出することからなる骨髄有核細胞の分類計数方法。
【請求項２】
さらに、（６）散乱光と蛍光との強度差を用いて、赤芽球系細胞を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数し、
（７）赤芽球系細胞数と、成熟度ごとの赤芽球系細胞数とから、全赤芽球系細胞に対する各成熟度の赤芽球の割合を算出することからなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、（８）白血球系細胞数から、リンパ球数と単球数を引算することにより、骨髄系細胞数を算出し、
（９）骨髄系細胞数と赤芽球系細胞数とから、骨髄系細胞と赤芽球系細胞との比を算出することからなる請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
赤血球溶解剤が、浸透圧１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下のｐＨ２．０〜５．０の水溶液である請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
蛍光色素が、
−式（１）
【化１】
0003929283.tif 000039
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素原子、水酸基で置換されていてもよいアルキル基又はアルキニル基；Ｙ及びＺはヘテロ原子又は低級アルキル基を有する炭素原子；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
−式（２）
【化２】
0003929283.tif 000040
（式中、Ｒ3は水素原子又はアルキル基；Ｒ4およびＲ5は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ6は水素原子、アシル基又はアルキル基；Ｚはヘテロ原子又は低級アルキル基を有する炭素原子；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
−式（３）
【化３】
0003929283.tif 000041
（式中、Ｒ7は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ8はアルキル基、Ｒ9は水素原子又はジメチルアミノ基；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
−式（４）
【化４】
0003929283.tif 000042
（式中、Ｒ10は水素原子又はアルキル基；Ｒ11はジメチルアミノ基；Ｒ12は水素原子又はアミノ基；Ｒ13は水素原子、アルキル基又はアミノ基；Ｒ14は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｘ-はアニオン；Ｙはヘテロ原子である。）の化合物
−式（５）
【化５】
0003929283.tif 000043
（式中、Ｒ15は水素原子又は水酸基；Ｒ16は水素原子又はスルホン基；Ｒ17は水素原子又はスルホン基；Ｙ+はカチオンである。）の化合物
−NK-2825：
【化６】
0003929283.tif 000044
−NK-1836：
【化７】
0003929283.tif 000045
−NK-1954：
【化８】
0003929283.tif 000046
−オキサジン（Oxazine）750：
【化９】
0003929283.tif 000047
−クリプトシアニン（Cryptocyanine）
【化１０】
0003929283.tif 000048
−NK-376：
【化１１】
0003929283.tif 000049
−NK-382：
【化１２】
0003929283.tif 000050
−NK-2711：
【化１３】
0003929283.tif 000051
−NK-138：
【化１４】
0003929283.tif 000052
−オキサジン720：
【化１５】
0003929283.tif 000053
−LDS730：
【化１６】
0003929283.tif 000054
−LD700：
【化１７】
0003929283.tif 000055
−ナイルブルー（Nile Blue）A：
【化１８】
0003929283.tif 000056
−ブリリアントグリーン（Brilliant Green）：
【化１９】
0003929283.tif 000057
−アイオダイドグリーン（Iodide green）：
【化２０】
0003929283.tif 000058
−マラカイトグリーン（Malachite green）：
【化２１】
0003929283.tif 000059
からなる群から選択される１種以上の色素である請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
赤血球溶解剤が、界面活性剤を含み、界面活性剤が、
−式（A）
【化２２】
0003929283.tif 000060
（式中、Ｒ20、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8アラルキル基；Ｒ23はＣ8-18アルキル基、Ｃ8-18アルケニル基又はＣ6-18アラルキル基；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
−式（B）
【化２３】
0003929283.tif 000061
（式中、Ｒ24はＣ8-18アルキル基；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
−式（C）
【化２４】
0003929283.tif 000062
（式中、Ｒ25及びＲ26は、同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8アラルキル基；Ｒ27はＣ8-18アルキル基、Ｃ8-18アルケニル基又はＣ6-18アラルキル基；ｎは１又は２である。）の化合物
−式（D）
Ｒ28−Ｒ29−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−H （D）
（式中、Ｒ28はＣ9-25アルキル基、Ｃ9-25アルケニル基又はＣ9-25アルキニル基；Ｒ29は
【化２５】
0003929283.tif 000063
または−ＣＯＯ−；ｎは１０〜４０である。）の化合物
−MEGA-8：
【化２６】
0003929283.tif 000064
−シュクロースモノカプレート：
【化２７】
0003929283.tif 000065
−デオキシ-BIGCHAP：
【化２８】
0003929283.tif 000066
−ｎ−オクチル−β−D−チオグルコシド：
【化２９】
0003929283.tif 000067
−ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド：
【化３０】
0003929283.tif 000068
−ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド：
【化３１】
0003929283.tif 000069
−ｎ−オクチル−β−Ｄ−オキシグルコシド：
【化３２】
0003929283.tif 000070
−CHAPS：
【化３３】
0003929283.tif 000071
−CHAPSO：
【化３４】
0003929283.tif 000072
からなる群から選択される１種以上の界面活性剤である請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
界面活性剤濃度が、１０〜１００００ｍｇ／ｌである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
測定する散乱光が、前方高角散乱光及び側方散乱光からなる群から選択される１種以上である請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は骨髄有核細胞の分類計数に関し、より詳細には、フローサイトメトリを利用した骨髄有核細胞の分類計数に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
臨床検査の分野において、骨髄有核細胞の分類計数を行うことは、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な骨髄では白血球系細胞、赤芽球系細胞などの有核細胞が一定の比率で存在するが、ある種の疾患が原因となり、有核細胞数、赤芽球系細胞数、白血球系細胞数が変化し、結果として白血球系細胞と赤芽球系細胞の比率が変動することがある。例えば、有核細胞数が増加する疾患として、各種急性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）などが挙げられ、有核細胞数が減少する疾患として、再生不良性貧血や低形成性白血病などが挙げられる。また、白血球系細胞数が増加する疾患として、各種白血病や悪性リンパ腫の白血化などが挙げられ、赤芽球系細胞数が低下するものとしては、赤芽球癆などが挙げられる。さらに、貧血の場合には、赤芽球系細胞が増加する。このように骨髄有核細胞や骨髄中の白血球系細胞、赤芽球系細胞を分類計数し、細胞比を求めることは、疾患同定、造血器細胞産生能などを調べる上で極めて有用である。
【０００３】
従来、骨髄に含まれる各種の成分の分類計数を行うには、骨髄の塗抹標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら分類計数するのが一般的であった。
【０００４】
一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動血球分類計数装置が提供されている。
しかし、これらの装置は、骨髄液に含まれる脂質粒子が測定の障害となったり、血球細胞が凝集しやすいなどの問題があり、骨髄有核細胞を正確に分類計数することはできなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、（１）骨髄液試料を、赤血球溶解剤と混合して前記試料中の赤血球を溶解するとともに、白血球系細胞及び赤芽球系細胞を染色に好適な状態にし、少なくとも白血球系細胞及び赤芽球系細胞の間に蛍光強度の差異を生じる蛍光色素で染色し、
（２）得られた試料を、フローサイトメータに導入して、少なくとも１つの散乱光と、少なくとも１つの蛍光を測定し、
（３）散乱光と蛍光との強度差を用いて、骨髄有核細胞、赤芽球系細胞及び白血球系細胞を、それぞれ分類計数し、
（４）骨髄有核細胞数と赤芽球系細胞数又は白血球系細胞数とから、骨髄有核細胞と赤芽球系細胞又は白血球系細胞数との比を算出し、
（５）赤芽球系細胞数と白血球系細胞数とから、白血球系細胞と赤芽球系細胞との比を算出することからなる骨髄有核細胞の分類計数方法が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明における骨髄液試料は、骨髄穿刺液などの白血球系細胞及び赤芽球系細胞を含む試料を意味する。本発明では、骨髄液試料の前処理は特に必要としないが、骨片、血球細胞凝集などの存在により、白血球系細胞及び赤芽球系細胞の測定に障害が発生するようであれば、必要に応じて、フィルタレーションを行ってもよい。また、緩衝剤、キレート剤、抗凝固剤等を含む水溶液で希釈してもよい。ここで使用することができる緩衝剤としては、後述するような緩衝剤を使用することができる。また、キレート剤としては、ＥＤＴＡ塩等を使用することができる。抗凝固剤としては、特に限定されないが、例えば、ヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩等を使用することができる。水溶液で希釈する場合の希釈倍率は、５〜１００倍程度（容量）が適当であり、好ましくは１０〜５０倍程度である。
【０００７】
本発明では、工程（１）において、骨髄液試料に赤血球溶解剤を混合する。これによって、骨髄液試料中に含有される赤血球を、後述する各種細胞成分の測定の障害とならない程度に溶解するとともに、白血球系細胞、赤芽球系細胞及び／又は脂質粒子を染色に好適な状態にすることができる。ここで、染色に好適な状態とは、各細胞膜にはダメージとならない程度の損傷を与えるが、実質的に生きた細胞と同様の機能、形状等を維持しうる状態を意味する。また、赤芽球系細胞の細胞膜も赤血球と同様に細孔を生じ、溶血するが、赤芽球系細胞の細胞核の状態は、ほぼ生きた細胞と同様に保たれる。白血球系細胞の細胞膜への傷害は明確ではないが、光学的顕微鏡による観察では、生きた細胞と顕著な差は認められず、実質的に生きた細胞と同様に保つことができる。
【０００８】
赤血球溶解剤は、このような作用を示すものであれば、その組成は特に限定されない。赤血球は、若干の個体差があるが、通常１５０ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧で細胞膜に細孔を生じ、細胞内部のヘモグロビンを流出し、光学的に透明となる（溶血する）。光学的に透明となった赤血球は、後述する各種細胞成分測定の障害とはならなくなる。赤血球の溶血は浸透圧の低いほど、ｐＨの低いほど速やかに進行する。したがって、本発明における赤血球溶解剤では、個体差を考慮して、１００ｍＯｓｍ／ｋｇ以下の浸透圧であることが好ましく、３０〜１００ｍＯｓｍ／ｋｇ程度がより好ましい。また、ｐＨが低すぎる場合、赤血球のみならず、白血球系細胞及び赤芽球系細胞にも過度の障害を与えることとなり、後述する両者の間の蛍光強度の差異が得にくくなるため、酸性側、特に２．０〜５．０程度のｐＨが適当であり、より好ましくは２．５〜４．５程度である。
【０００９】
このような浸透圧及びｐＨを実現するために、赤血球溶解剤は、例えば、電解質、糖類、緩衝剤等を含有する水溶液であることが好ましく、さらに、分子内に少なくとも１つの芳香環を有する有機酸又はその塩を含有している場合には、より効果的に（短時間に）赤血球を溶血ことができるため好ましい。また、赤血球溶解剤は、界面活性剤を含むことが好ましい。電解質としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等が挙げられる。糖質としては、単糖類、多糖類、オリゴ糖糖が挙げられ、具体的には、グルコース、ラクトース、スクロース糖が挙げられる。緩衝剤としては、設定するｐＨ±２．０の付近にｐＫａを有する緩衝剤が挙げられ、具体的には、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、ジグリコール酸、マロン酸等が挙げられる。有機酸又はその塩としては、例えばサリチル酸、フタル酸等又はこれらのアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等が挙げられる。これらは、緩衝剤としても作用する。
これらの濃度は、例えば、０．１〜１００ｍＭ程度が適当であり、１〜３０ｍＭ程度が好ましい。
【００１０】
界面活性剤は、難溶性の色素の可溶化、赤血球ゴーストの凝集防止、血小板凝集防止、赤血球ゴースト収縮、赤血球溶血促進等を行うことができるものであればよく、例えば、以下の界面活性剤を単独又は２種以上で使用することが好ましい。
【００１１】
−式（A）
【化３５】
0003929283.tif 000002
（式中、Ｒ20、Ｒ21及びＲ22は、同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8アラルキル基；Ｒ23はＣ8-18アルキル基、Ｃ8-18アルケニル基又はＣ6-18アラルキル基；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
【００１２】
−式（B）
【化３６】
0003929283.tif 000003
（式中、Ｒ24はＣ8-18アルキル基；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
【００１３】
−式（C）
【化３７】
0003929283.tif 000004
（式中、Ｒ25及びＲ26は、同一又は異なって、水素原子、Ｃ1-8アルキル基又はＣ6-8アラルキル基；Ｒ27はＣ8-18アルキル基、Ｃ8-18アルケニル基又はＣ6-18アラルキル基；ｎは１又は２である。）の化合物
【００１４】
−式（D）
Ｒ28−Ｒ29−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−H        （D）
（式中、Ｒ28はＣ9-25アルキル基、Ｃ9-25アルケニル基又はＣ9-25アルキニル基；Ｒ29は
【化３８】
0003929283.tif 000005
または−ＣＯＯ−；ｎは１０〜４０である。）の化合物
【００１５】
−MEGA-8：
【化３９】
0003929283.tif 000006
【００１６】
−シュクロースモノカプレート：
【化４０】
0003929283.tif 000007
【００１７】
−デオキシ-BIGCHAP：
【化４１】
0003929283.tif 000008
【００１８】
−ｎ−オクチル−β−D−チオグルコシド：
【化４２】
0003929283.tif 000009
【００１９】
−ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド：
【化４３】
0003929283.tif 000010
【００２０】
−ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド：
【化４４】
0003929283.tif 000011
【００２１】
−ｎ−オクチル−β−Ｄ−オキシグルコシド：
【化４５】
0003929283.tif 000012
【００２２】
−CHAPS：
【化４６】
0003929283.tif 000013
【００２３】
−CHAPSO：
【化４７】
0003929283.tif 000014
【００２４】
式中、Ｃ1-8のアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔ−ペンチル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル等が挙げられる。好ましくは、Ｃ1-3のアルキル基である。Ｃ6-8のアラルキル基としては、ベンジル、フェネチル等が挙げられる。
【００２５】
Ｃ8-18のアルキル基としては、オクチル、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。好ましくはデシル、ドデシル、テトラデシルなどのＣ10-18の直鎖のアルキル基である。Ｃ8-18のアルケニル基としては、オクテニル、デセニル、ドデセニル、テトラデセニル等が挙げられる。Ｃ6-18のアラルキル基としては、フェニルプロピレン、フェニルブテン、ナフチルメチレン、ナフチルエチレン、ナフチルプロピレン、ビフェニルメチレン、ビフェニルエチレン等が挙げられる。
【００２６】
また、Ｃ9-25のアルキル基としては、上記アルキル基の他、イコシル、ヘンイコシル、トコシル、トリコシル等が挙げられる。Ｃ9-25のアルケニル基としては、上記アルケニル基の他、イコセニル、ヘンイコセニル等が挙げられる。Ｃ9-25のアルキニル基としては、上記アルキニル基の他、イコシニル、ヘンイコシニル等が挙げられる。
上記に記載した界面活性剤のうち、ＭＥＧＡ−８からＣＨＡＰＳＯまでは株式会社同仁化学研究所より購入することができる。
【００２７】
界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類、併用する赤血球溶解剤の成分及び濃度等により適宜調整することができる。通常、界面活性剤の濃度が高すぎる場合、赤血球のみならず、白血球系細胞及び赤芽球系細胞にも過度の傷害を与え、特に赤芽球系細胞の形状を変化させ、後述する赤芽球系細胞と脂質粒子と白血球系細胞との蛍光強度の差異を小さくする問題がある。したがって、例えば、１０〜１００００ｍｇ／ｌ程度が好ましく、１００〜５０００ｍｇ／ｌ程度であることがより好ましく、１０００〜３０００ｍｇ／ｌがさらに好ましい。なお、この濃度は赤血球溶解剤における界面活性剤の濃度である。
骨髄液試料と、赤血球溶解剤との混合は、１５〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で、３〜１２０秒間、好ましくは５〜４０秒間行うことが適当である。
【００２８】
骨髄液試料を、蛍光色素で染色する。この際、少なくとも脂質粒子、白血球系細胞及び赤芽球系細胞の間に蛍光強度の差異を生じさせる蛍光色素を用いることが必要である。このような蛍光色素としては、例えば、以下の群から選択することができる。
【００２９】
−式（１）
【化４８】
0003929283.tif 000015
（式中、Ｒ1及びＲ2は水素原子、水酸基で置換されていてもよいアルキル基又はアルキニル；Ｙ及びＺはヘテロ原子又は低級アルキル基を有する炭素原子；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
【００３０】
−式（２）
【化４９】
0003929283.tif 000016
（式中、Ｒ3は水素原子又はアルキル基；Ｒ4およびＲ5は水素原子、低級アルキル基又は低級アルコキシ基；Ｒ6は水素原子、アシル基又はアルキル基；Ｚはヘテロ原子又は低級アルキル基を有する炭素原子；ｎは０、１又は２；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
【００３１】
−式（３）
【化５０】
0003929283.tif 000017
（式中、Ｒ7は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｒ8はアルキル基、Ｒ9は水素原子又はジメチルアミノ基；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである。）の化合物
【００３２】
−式（４）
【化５１】
0003929283.tif 000018
（式中、Ｒ10は水素原子又はアルキル基；Ｒ11はジメチルアミノ基；Ｒ12は水素原子又はアミノ基；Ｒ13は水素原子、アルキル基又はアミノ基；Ｒ14は水素原子又はジメチルアミノ基；Ｘ-はアニオン；Ｙはヘテロ原子である。）の化合物
【００３３】
−式（５）
【化５２】
0003929283.tif 000019
（式中、Ｒ15は水素原子又は水酸基；Ｒ16は水素原子又はスルホン基；Ｒ17は水素原子又はスルホン基；Ｙ+はカチオンである。）の化合物
【００３４】
−NK-2825：
【化５３】
0003929283.tif 000020
【００３５】
−NK-1836：
【化５４】
0003929283.tif 000021
【００３６】
−NK-1954：
【化５５】
0003929283.tif 000022
【００３７】
−オキサジン750：
【化５６】
0003929283.tif 000023
【００３８】
−クリプトシアニン
【化５７】
0003929283.tif 000024
【００３９】
−NK-376：
【化５８】
0003929283.tif 000025
【００４０】
−NK-382：
【化５９】
0003929283.tif 000026
【００４１】
−NK-2711：
【化６０】
0003929283.tif 000027
【００４２】
−NK-138：
【化６１】
0003929283.tif 000028
【００４３】
−オキサジン720：
【化６２】
0003929283.tif 000029
【００４４】
−LDS730：
【化６３】
0003929283.tif 000030
【００４５】
−LD700：
【化６４】
0003929283.tif 000031
【００４６】
−ナイルブルーA：
【化６５】
0003929283.tif 000032
【００４７】
−ブリリアントグリーン：
【化６６】
0003929283.tif 000033
【００４８】
−アイオダイドグリーン：
【化６７】
0003929283.tif 000034
【００４９】
−マラカイトグリーン：
【化６８】
0003929283.tif 000035
【００５０】
式中、ヘテロ環の窒素原子又は炭素原子に結合するアルキル基は、炭素数１〜２０、好ましくは、１〜１０、より好ましくは１〜６の直鎖又は分岐のアルキル基であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が挙げられる。
【００５１】
低級アルキル基とは炭素数１〜８の直鎖又は分岐アルキル基であり、例えば、メチル、エチル等が挙げられる。低級アルコキシル基とは炭素数１〜８の直鎖又は分岐アルコキシル基であり、例えば、メトキシ、エトキシ等が挙げられる。アシル基としては炭素数１〜３のもの、例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニルが挙げられる。アニオンとしては、Ｆ-、Ｃｌ-、Ｂｒ-、Ｉ-などのハロゲンイオン及びＣＦ3ＳＯ3-、ＢＦ4-、ＣｌＯ4-等が挙げられる。ヘテロ原子とは、窒素原子、硫黄原子、酸素原子が挙げられる。カチオンとしては、Ｎａ+、Ｋ+、Ｌｉ+等が挙げられる。
【００５２】
上記に記載した色素のうちＮＫシリーズは、日本感光色素研究所（株）より、ＬＤＳ７３０、ＬＤ７００はＥｘｃｉｔｏｎ社より、その他のものは市販品を購入することができる。
【００５３】
蛍光色素は、赤血球溶解剤に溶解して、これらを骨髄液試料に混合すると同時に作用（混合）させてもよいし、赤血球の溶解等の工程を経た後、適当な溶媒（水、低級アルコール、エチレングリコール、ＤＭＳＯ等）に溶解して作用させてもよい。
色素の濃度は使用する色素の種類により異なるが、一般に０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｌ、より好ましくは０．３〜３．０ｍｇ／ｌである。なお、この濃度は骨髄液試料と、赤血球溶解剤及び蛍光色素とを混合した状態での濃度である。
【００５４】
これにより、白血球系細胞は強く染色され、強い蛍光を発する。赤芽球系細胞は弱く染色され、弱い蛍光を発する。また、脂質粒子も弱く染色され、弱い蛍光を発する。白血球系細胞と赤芽球系細胞との蛍光強度に差異が生じる作用機序は明確ではないが、おそらく赤芽球系細胞の核（ＤＮＡ）が凝縮しているために、色素の細胞核への取り込みが阻害されるからであると考えられる。
【００５５】
工程（２）において、得られた試料をフローサイトメータに導入して、少なくとも１つの散乱光と少なくとも１つの蛍光を測定する。フローサイトメータは市販のいずれのものでも使用することができる。
本発明でいう散乱光は、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光をさし、前方低角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、側方散乱光（受光角度は９０度付近）等をいい、好ましくは、側方散乱光が選ばれ、この散乱光は細胞の核形態などのような内部情報を反映する。
【００５６】
蛍光とは、前述の細胞成分を染色した色素から発せられるもので、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するものである。
【００５７】
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンイオンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べ非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができる。
【００５８】
工程（３）において、測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて、脂質粒子、骨髄有核細胞、赤芽球系細胞及び白血球系細胞を、それぞれ分類計数する。
【００５９】
「測定した散乱光と蛍光の強度差を用いて骨髄有核細胞を分類計数する」には、まず、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に側方散乱光をとってスキャッタグラムを描く。この場合、図１に示すように、骨髄有核細胞、脂質粒子及びゴースト化した細胞の各細胞が、集団（クラスター）を形成して分布する。次いで、適当な解析ソフトを用いて、各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。これにより、骨髄有核細胞の数を計数することができる。同様に、脂質粒子、赤芽球系細胞及び白血球系細胞を分類計数することができる。
【００６０】
なお、脂質粒子の影響がほとんどない場合は、例えば、Ｘ軸に蛍光、Ｙ軸に前方散乱光をとってスキャッタグラムを描くと、図３に示すように赤芽球系細胞、白血球系細胞及びゴースト化した細胞の各細胞が、集団（クラスター）を形成して分布する。次いで、この集団を、適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。これにより、赤芽球系細胞の数を計数することができる。同様にして、白血球系細胞の数も計算できる。
【００６１】
これにより、骨髄有核細胞数と赤芽球系細胞数又は白血球系細胞数とから、骨髄有核細胞と赤芽球系細胞又は白血球系細胞数との比を算出することができる。また、赤芽球系細胞数と白血球系細胞数とから、白血球系細胞と赤芽球系細胞との比を算出することができる。
【００６２】
また、本発明においては、工程（１）〜（３）に続いて、散乱光と蛍光との強度差を用いて、赤芽球系細胞を成熟度ごとに少なくとも２つに分類計数することができる。赤芽球系細胞を成熟度ごとに分類計数するには、実質的に上記と同様にスキャッタグラムを描き、赤芽球系細胞の成熟度ごとの集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞数を解析する。
これにより、赤芽球系細胞数と、成熟度ごとの赤芽球系細胞数とから、全赤芽球系細胞に対する各成熟度の赤芽球の割合を算出することができる。
【００６３】
さらに、本発明においては、工程（１）〜（３）に続いて、白血球系細胞数から、リンパ球数と単球数を引算することにより、骨髄系細胞数を算出することができる。骨髄系細胞数を求めるために、例えば、同一の試料を他の血球計数器で測定し、リンパ球数と単球数を求め、白血球細胞数からリンパ球数と単球数を引くことにより、骨髄系細胞数が算出される。これにより、算出した骨髄系細胞と赤芽球系細胞との比（M／E比）を算出することができる。
【００６４】
白血球系細胞と赤芽球系細胞との比は、通常２：１〜５：１であり、骨髄系細胞と赤芽球系細胞との比は、１．５：１〜３．３：１である。白血病などの疾患により、これらの比率は変化する。また、これらの比率は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）や骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の診断に有用である。したがって、経日的に測定することにより、各種白血病の病態把握、治療モニタリングなどが可能である。
【００６５】
さらに骨髄有核細胞中の赤芽球系細胞数から、骨髄中のエリスロポエーシスの状態を把握することもできる。
【００６６】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
【００６７】
実施例１
以下の組成の試薬を調製した。
0003929283.tif 000036
まず、上記試薬１．０ｍｌを、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の骨髄液３０μｌに加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、側方散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。
【００６８】
図２にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に側方散乱光強度をとったスキャッタグラムを示す。骨髄有核細胞は、白血球系細胞、赤芽球系細胞StageＩ、赤芽球系細胞StageII、赤芽球系細胞StageIIIの４つの集団を形成する。
【００６９】
上記の骨髄にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球系細胞、赤芽球系細胞を分類し、さらに赤芽球系細胞を前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分類した。また、別途血球計数器より得たリンパ球数と単球数から、骨髄系細胞数を算出し、骨髄系細胞に対する赤芽球系細胞の比を算出し、上記フローサイトメータで得られた結果と比較した。
表１にフローサイトメータと目視の結果を示す。
【００７０】
【表１】
0003929283.tif 000037
表１から、本発明と目視の結果がよく一致していることが判明した。
【００７１】
実施例２
まず、実施例１の試薬１．０ｍｌを脂質粒子をほとんど含まない急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の骨髄液３０μｌに加え、４０℃で５秒間反応させた後、フローサイトメータで、前方低角散乱光、蛍光を測定した。光源は６３３ｎｍの赤色半導体レーザを使用した。蛍光は６６０ｎｍ以上の波長の蛍光を測定した。
【００７２】
図４にＸ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとったスキャッタグラムを示す。骨髄有核細胞は、白血球系細胞、赤芽球系細胞StageI、赤芽球系細胞StageII、赤芽球系細胞StageIIIの４つの集団を形成する。
【００７３】
上記の骨髄にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球系細胞、赤芽球系細胞を分類し、さらに赤芽球系細胞を前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球に分類した。また血球計数器より得たリンパ球数と単球数から、骨髄系細胞数を算出し、骨髄系細胞に対する赤芽球系細胞の比を算出し、上記フローサイトメータで得られた結果と比較した。
表２にフローサイトメータで得られた結果を目視との結果を示す。
【００７４】
【表２】
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【００７５】
表２から、本発明と目視との結果がよく一致していることが判明した。
【００７６】
このように、本発明においては、予期せぬことに、従来不可能であると考えられてきた、脂質粒子と骨髄有核細胞の間に明瞭な散乱光強度と蛍光強度の差異を生じさせ、さらに赤芽球系細胞と白血球系細胞の間の明瞭な蛍光強度の差異を生じさせ、骨髄有核細胞、赤芽球系細胞、白血球系細胞を分類計数でき、加えて赤芽球系細胞を成熟度ごとに分類計数することが可能になった。
【００７７】
また、求めた骨髄有核細胞数、赤芽球系細胞数、白血球系細胞数から、骨髄有核細胞と赤芽球系細胞との比、骨髄有核細胞と白血球系細胞との比、白血球系細胞と赤芽球系細胞との比を求めることができる。加えて、別途血球計数器からリンパ球数、単球数を求めることにより、骨髄系細胞数と赤芽球系細胞との比（Ｍ／Ｅ比）を求めることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の骨髄有核細胞の実施例１の分類計数方法によって分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
【図２】本発明の骨髄有核細胞の実施例１の分類計数方法によって分類計数された各細胞のスキャッタグラムである。
【図３】本発明の骨髄有核細胞の実施例２の分類計数方法によって分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
【図４】本発明の骨髄有核細胞の実施例２の分類計数方法によって分類計数された各細胞のスキャッタグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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