(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかのアミノ酸配列を有し、顆粒球コロニー刺激因子との結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(1)  配列番号２に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２６〜８３７で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、および
(2)  配列番号２に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２６〜６２６で表されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列。
但し、配列番号２に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２６〜６２６または２６から８３７で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを除く。
【請求項２】
以下のいずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、顆粒球コロニー刺激因子との結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(1)  配列番号１に記載の塩基配列におけるヌクレオチド番号２５５〜２６９０で表される塩基配列、および
(2)  配列番号１に記載の塩基配列におけるヌクレオチド番号２５５〜２０５７で表される塩基配列。
但し、配列番号２に記載のアミノ酸配列におけるアミノ酸番号２６〜６２６または２６から８３７で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを除く。
【請求項３】
請求項１または２のいずれかに記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクターを含有する形質転換体。
【請求項６】
請求項５に記載の形質転換体を培地に培養し、得られた培養物から顆粒球コロニー刺激因子と結合し得る生成物を回収することからなる顆粒球コロニー刺激因子レセプターの製造方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法で製造された顆粒球コロニー刺激因子レセプター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子レセプターをコードするＤＮＡに関し、さらに詳しくは、顆粒球コロニー刺激因子(以下、Ｇ−ＣＳＦと称する)と特異的に結合し得るレセプターペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該ベクターを含有する形質転換体、並びに該形質転換体を培養することにより、該レセプターを製造する方法に関するものである。さらにまた本発明は、このようにして製造された組換えＧ−ＣＳＦレセプターに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血液細胞の増殖と分化はコロニー刺激因子(ＣＳＦ)と称するホルモン様の増殖および分化因子によって制御されている[メトカルフ(Ｍetcalf,Ｄ.)、ネイチャー(Ｎature)、３３９、２７〜３０(１９８９)]。ＣＳＦは、その作用する状況または段階に応じて顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、顆粒球−マクロファージのコロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ)、マクロファージのコロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ)およびインターロイキン３(ＩＬ−３)に大別される。それらの内、Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を担っており、血液中の好中球濃度の制御、並びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分かっている[ナガタ(Ｎagata,Ｓ.)、ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・ファルマコロジー(Ｈandbook of Ｅxperimental Ｐharmacology)、「ペプチド・グロウス・ファクター・アンド・デア・レセプターズ(Ｐeptide Ｇrowth Ｆactors and Ｔheir Ｒeceptors)」、スポーン(Ｓporn,Ｍ.Ｂ.)およびロバーツ(Ｒoberts,Ａ.Ｂ.)編、スプリンガー−バーラグ、ハイデルベルク(Ｓpringer−Ｖerlag，Ｈeidelberg)、Ｖol.９５／Ｉ、６９９〜７２２頁(１９９０)；ニコラ(Ｎicola,Ｎ.Ａ.)、Ａnnu.Ｒev.Ｂiochem.、５８、４５〜７７(１９８９)]。即ち、Ｇ−ＣＳＦは好中球の前駆細胞に存在するレセプター(Ｇ−ＣＳＦレセプター)を介して該細胞に作用し、その増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を与える[ニコラ(Ｎicola,Ｎ.Ａ.)およびメトカルフ(Ｍetcalf,Ｄ.)、プロシィーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ(Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ)、８１、３７６５〜３７６９(１９８４)]。
【０００３】
Ｇ−ＣＳＦにはその他、様々な作用があり、例えば、組換えＤＮＡ技術で得られたＧ−ＣＳＦを用いたインビボの動物実験により、該Ｇ−ＣＳＦが好中球の調節因子であることが示唆された(ツチヤら、ＥＭＢＯ Ｊ．６、６１１−６１６(１９８７)；ニコラら、Ａnnu.Ｒev.Ｂiochem．５８、４５−７７(１９８９))。
また、がん患者へのＧ−ＣＳＦ投与が化学療法および骨髄移植療法に有利であることを示す臨床報告もある(モースチンら、Ｔrends Ｐharmacol.Ｓci．１０、１５４−１５９(１９８９))。その一方で骨髄性白血病細胞などのがん細胞の増殖がＧ−ＣＳＦによって刺激される場合のあることも知られている。
【０００４】
このように、Ｇ−ＣＳＦは臨床上極めて重要な生理活性物質であるにもかかわらず、作用機構には不明な点が残されており、より有効な治療および診断を達成する上で、作用機構の解明が待たれている。そのためには細胞表面に存在するヒトＧ−ＣＳＦレセプターを生化学的に特性化し、該レセプターとＧ−ＣＳＦとの相互作用を研究する必要がある。
【０００５】
ところで、Ｇ−ＣＳＦの作用する細胞は好中球の前駆体および成熟した好中球、および種々の骨髄性白血病細胞に限定されている（ニコラおよびメトカーフ、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８１、３７６５−３７６９(１９８４)、ベグレーら、Ｌeukemia １、１−８(１９８７)、パークら、Ｂlood ７４、５６−６５(１９８９)）。ヒトＧ−ＣＳＦは１７４アミノ酸、ネズミＧ−ＣＳＦは１７８アミノ酸からなるポリペプチドであり、ヒトＧ−ＣＳＦとネズミＧ−ＣＳＦの相同性はアミノ酸配列レベルで７２.６％と高く、種特異性は殆んど認められないことも明らかである（ニコラら、Ｎature ３１４、６２５−６２８(１９８５)）。他方、Ｇ−ＣＳＦレセプターは非血液細胞、例えばヒト内皮細胞（ブッソリノら、Ｎature ３３７、４７１−４７３(１９８９)）および胎盤（ウズマキら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８６、９３２３−９３２６(１９８９)）にも存在していることが最近、報告され、Ｇ−ＣＳＦの作用は一層興味深いものがある。
【０００６】
以上のように、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦレセプターとの相互作用の解明は学問的な見地からも価値があるが、臨床面においても、造血性疾患または他の疾患の予防および治療におけるＧ−ＣＳＦの投与方法の確立、ひいてはより正確で有効な処置を達成するために重要である。他方、レセプター自身の用途として、可溶化型Ｇ−ＣＳＦレセプターが、ある種のＧ−ＣＳＦ依存性ヒト白血病細胞（サントリら、Ｊ.Ｉmmunol １３９、３３４８−３３５４(１９８７)）の増殖阻害に臨床上有用である可能性も存在する。さらに、骨髄性白血病細胞などのがん細胞がＧ−ＣＳＦにより増殖する可能性もあり、該細胞におけるＧ−ＣＳＦレセプターの発現を検討し、Ｇ−ＣＳＦの臨床応用をより有効に行うことができる。このように、研究および実用化の両面でＧ−ＣＳＦレセプターには様々な有用性が指摘されており、Ｇ−ＣＳＦレセプター遺伝子およびそのタンパク質の安定的な供給が望まれる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
近年、多くの生理活性物質の製造に遺伝子工学の技術が利用されている。遺伝子工学による物質生産においては、通常、目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングを行い、該ＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、得られた組換えＤＮＡを用いて微生物や動物細胞等を形質転換し、目的物質を発現させる。
Ｇ−ＣＳＦレセプターを遺伝子工学の技術により生産するには、まず目的物質であるＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡのクローニングを行う必要があるが、Ｇ−ＣＳＦレセプターは細胞表面における存在が極めて少数(細胞あたり、数百〜２０００個)であるためにそのｃＤＮＡのクローニングが容易でなかった。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ヒトＧ−ＣＳＦとネズミＧ−ＣＳＦとのアミノ酸レベルでの相同性が７２．６％と高く、種特異性は殆んど認められないことから、それぞれのＧ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦレセプターとの間に交差反応が予測される、ということに着目し、まず、研究ならびに診断分析に適用し得るＧ−ＣＳＦレセプターを得ることを目的として、ネズミ（マウス）骨髄性白血病ＮＦＳ−６０細胞から、そのレセプターを可溶化し、分子量１００,０００から１３０,０００のタンパク質として精製した。精製方法としては、例えば、細胞膜懸濁液をＣＨＡＰＳ{３−[(３−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−１−プロパンスルホン酸}で抽出した後、その抽出液をＧ−ＣＳＦアフィニティークロマト(組換えヒトＧ−ＣＳＦをゲル樹脂に結合したアフィニティークロマト)で処理し、次いでゲル濾過で精製することができる。
【０００９】
一方、ＮＦＳ−６０細胞から得たｍＲＮＡを逆転写し、ネズミのＧ−ＣＳＦレセプターをコードするｃＤＮＡ(以下、Ｇ−ＣＳＦレセプターｃＤＮＡという）を単離、クローニングすることに初めて成功した。次いで、このｃＤＮＡの塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。ネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡの塩基配列および推定のアミノ酸配列を第１図に示す。
【００１０】
ネズミＧ−ＣＳＦレセプターｃＤＮＡを含有する発現クローニングベクターでＣＯＳ細胞を形質転換すると、該細胞はＮＦＳ−６０細胞上に存在する天然のネズミＧ−ＣＳＦレセプターと同様の性質を有するレセプターを発現した。ネズミＧ−ＣＳＦレセプターｃＤＮＡの塩基配列に基づいてＧ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列を類推し、他の増殖因子レセプターファミリーのそれと比較した結果、このネズミＧ−ＣＳＦレセプターは、それらと共通する特徴を有することが明らかになった（第７図参照）。また、このようにして得たネズミＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡから調製したプローブは、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターとハイブリダイズした。これはＧ−ＣＳＦレセプターには種特異性がなく、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターはマウスＧ−ＣＳＦレセプターと非常に相似していることを示すものであり、従ってネズミＧ−ＣＳＦレセプターＤＮＡは、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターを製造する為のいわば中間体として極めて有用である。
【００１１】
次に本発明者らはヒトＧ−ＣＳＦレセプターを十分な量、供給することを目的として、ネズミＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡから調製したプローブを用い、ヒト胎盤およびＵ９３７細胞由来の全(total)mＲＮＡから作成したcＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするcＤＮＡをクローニングすることに成功した。
【００１２】
本発明のヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするプラスミドで形質転換されたサルＣＯＳ細胞は天然のヒトＧ−ＣＳＦレセプターと同様のＧ−ＣＳＦとの特異的な結合特性を有するヒトＧ−ＣＳＦレセプターを産生した。
【００１３】
即ち、本発明はＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡを提供するものである。また本発明はＧ−ＣＳＦレセプターをコードしている発現ベクターを提供するものでもある。さらに本発明は、該発現ベクターで培養細胞を形質転換し、形質転換体を培地に培養し、培養物からＧ−ＣＳＦレセプターを回収することからなるＧ−ＣＳＦレセプターの製造方法を提供するものである。
【発明の実施の形態】
【００１４】
本明細書中、Ｇ−ＣＳＦレセプターペプチドなる語句は、成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターのみならず、該レセプター分子の一部であって、Ｇ−ＣＳＦとの特異的結合活性を有するペプチド分子の全てを指すものとする。
【００１５】
本発明により、従来、単離が困難であったヒトＧ−ＣＳＦレセプターを遺伝子組換え法により容易に得ることが可能となったので、そのようにして得られた組換えＧ−ＣＳＦレセプターを用いてＧ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦレセプターの作用機構および臨床(診断および治療)適用のための研究、並びに実用化を推進することができる。また、Ｇ−ＣＳＦを白血病などの癌患者に臨床応用する際に、当該癌細胞がＧ−ＣＳＦレセプターを発現しているか否かを、Ｇ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡをプローブとして用いて容易に検討することができる。従って、そのようなcＤＮＡはＧ−ＣＳＦの有効な臨床応用に役立つと考えられる。さらに、可溶化型Ｇ−ＣＳＦを遺伝子組換え法により大量に生産し、その三次構造を解析する、等により、Ｇ−ＣＳＦレセプターに、効率よく結合するタンパク質や化合物を開発することも可能である。
【００１６】
ネズミＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡのクローニングは、次記の方法により行われた。即ち、Ｇ−ＣＳＦレセプターの発現率が高いマウス骨髄性白血病細胞ＮＦＳ−６０からＧ−ＣＳＦレセプターを精製し、その分子量が１００,０００−１３０,０００ダルトンであることを確認した。さらに、該細胞から、グアニジンチオイソシアネート／ＣsＣl法で全ＲＮＡを調製し、poly(Ａ)ＲＮＡを選択した。次いで、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成し、哺乳類発現ベクターＣＤＭ８（シード、Ｎature ３２９、８４０−８４２(１９８７)）をベクターとするｃＤＮＡライブラリーを構築した(６０−８０クローンの８８４プール)。各プールからプラスミドＤＮＡを調製してＣＯＳ−７細胞に導入し、放射性ヨウ素でラベルしたＧ−ＣＳＦを用いて結合活性を示す２つのプールＩ６２およびＪ１７を選択した。これらのプールから、Ｇ−ＣＳＦとの結合活性が高い２個の独立のクローン、プラスミドｐＩ６２およびｐＪ１７を同定した。これらのプラスミドで形質転換されたＣＯＳ細胞は、Ｇ−ＣＳＦと結合活性を有するレセプターを発現した。
【００１７】
次いで、プラスミドｐＪ１７およびｐＩ６２の塩基配列を決定した結果、これらはいずれもネズミＧ−ＣＳＦレセプターの完全なコーディング領域を含有しているが、poly（Ａ）配列もpoly（Ａ）付加シグナルも含有していないことが分かった。そこで、ｐＪ１７の２.５kb ＨindIII−ＸbaＩをプローブとするコロニーハイブリザイゼーションによって、上記ｃＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングし、陽性クローンの１つ（ｐＦ１）を選択した。これは６０３bpの３'非コーディング領域と、２個の重複するpoly（Ａ）付加シグナルを含有していた。これら３個のクローン化ｃＤＮＡ（ｐＩ６２、ｐＪ１７およびｐＦ１）の塩基配列およびそれより類推されるアミノ酸配列を図１−３、および配列表の配列番号１、２に示す。また、その模式図および制限酵素切断点地図、並びにハイドロパシープロットを第２図に示す。
【００１８】
本発明によりクローニングされたネズミＧ−ＣＳＦレセプターｃＤＮＡは以下の特徴を有する。
ヌクレオチド１８０−１８２の開始コドンＡＴＧとヌクレオチド２６９１−２６９３の終止コドンＴＡＧとの間に長いオープン・リーディング・フレーム（２,５１１ヌクレオチド）を有する。その５'上流側には３個の開始コドンとなり得るコドンが、７３、１０５および１２６位に存在しているが、いずれの下流にも短いオープン・リーディング・フレームしか存在しない。プラスミドｐＩ６２をＨindIII消化してｃＤＮＡからこれらＡＴＧコドンを欠失させてもＣＯＳ細胞内での組換えＧ−ＣＳＦレセプターの発現は増減しないということが分かった。
【００１９】
さらに、ロング・オープン・リーディング・フレームのＮ−末端配列には疎水性アミノ酸からなる配列が存在し、これはシグナル配列と思われる。そして、代表的なシグナルペプチド開裂部位の配列との比較によりＮ−末端２５アミノ酸がシグナル配列と類推された。
【００２０】
以上から、成熟ネズミＧ−ＣＳＦレセプターは、８１２アミノ酸から成り、理論分子量９０,８１４であると結論された。この値は125Ｉヨウ素放射Ｇ−ＣＳＦとの結合実験の値(実施例２(２)参照、図７）や精製ネズミＧ−ＣＳＦレセプターの分子量(９５,０００−１２５,０００)と比較して５,０００−３５,０００ダルトン少ない。この差異はおそらくＧ−ＣＳＦレセプターの細胞外領域に認められる１１個の推定Ｎ−グリコシル化部位(Ａsn−Ｘ−Ｔhr／Ｓer)の幾つかに糖鎖が結合していることによるものであろう(図１−３)。
成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列のヒドロパシープロット(図４、Ｂ)(カイトおよびドゥーライト、Ｊ.Ｍol.Ｂiol．１５７、１０５−１３２(１９８２))によると、Ｌeu−６０２からＣys−６２５に至る２４個のアミノ酸は非荷電アミノ酸であり、３個の塩基性アミノ酸がこれに続く。これらの特徴は多くの膜タンパク質における膜貫通領域に認められる特徴と一致している。
【００２１】
このように、成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターは６０１アミノ酸の細胞外ドメイン、２４アミノ酸の膜貫通領域（単一のトランスメンブラン領域）、および１８７アミノ酸の細胞質ドメインからなる。細胞外ドメインのＮＨ２末端３７３個のアミノ酸はシステイン残基に富んでおり（１７／３７３アミノ酸）、これは多くのレセプターのリガンド結合領域に共通する性質である（マクドナルトら、ＢritishＭedical Ｂulltein ４５５、５４−５６９(１９８９)）。エリスロポエチンレセプター（ドアンドレらＣell ５７、２７７−２８５(１９８９)）と同様、Ｇ−ＣＳＦレセプターもプロリンに富み(８０残基、９.９％)、また、ネズミＧ−ＣＳＦレセプターはトリプトファン残基をかなり高含有率で含有する(２６残基、３.２％)。
【００２２】
以上から明らかな様に、本発明により決定されたネズミＧ−ＣＳＦレセプターは、増殖および分化因子のレセプターに共通する特徴である、Ｎ末端のシグナル配列、単一のトランスメンブラン領域、Ｎ末端部分における細胞外ドメイン、Ｃ末端部分における細胞内ドメインから成る。
さらに、ネズミＧ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列と他の増殖因子のレセプターのアミノ酸配列とを比較して以下の結果を得た（図９−１１）。比較に用いたのは、成長ホルモン、プロラクチン、エリスロポエチン、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−３、ＧＭ−ＧＳＦのレセプターであって、これらはすべて増殖因子レセプター群に属する。図９に示されているように増殖因子レセプター群で共通に見い出されるシステインとトリプトファン残基はＧ−ＣＳＦレセプターにおいても保存されており、“ＷＳＸＷＳ”モチーフ（ギアリング、ＥＭＢＯ Ｊ．８３、６６７−３６７６(１９８９)、イトウら、Ｓcience ２４７、３２４−３２６(１９９０)）もアミノ酸残基２９４−２９８に認められ、該Ｇ−ＣＳＦが同群に属することを示唆している。このＧ−ＣＳＦレセプターと他の血液細胞増殖因子レセプター群の比較により、Ｇ−ＣＳＦとＩＬ−６の相同性は４４.６％であるが、そのレセプター間の相同性はＧ−ＣＳＦレセプターとプロラクチンレセプターとの相同性に比較して低い。また、図１０に示されているようにＧ−ＣＳＦレセプターの細胞外領域のアミノ酸配列（３７６−６０１）とニワトリコンタクチン（ランシト、Ｊ.Ｃell.Ｂiol．１０７、１５６１−１５７３(１９８８)）の細胞外領域の一部とに有意な相同性が認められる。コンタクチンは神経細胞表面糖タンパク質（１３０kＤ）であって神経系の細胞間情報伝達に関連しているとされている。コンタクチンのアミノ酸残基７３７−８１８は細胞、ヘパリンおよびＤＮＡとの結合に関連するフィブロネクチンIII型セグメントと相同性を保持しており、この領域は細胞同士の付着に重要な役割を担っていると思われる。骨髄では常に顆粒球が形成されており、好中球の前駆細胞と骨髄質細胞との直接相互作用の存在が示されている（ロバートら、Ｎature ３３２、３７６−３７８(１９８８)）。上記のネズミＧ−ＣＳＦレセプターとコンタクチンの細胞外領域の類似性はこの領域が好中球の前駆細胞と骨髄質細胞との相互作用に関与していることを示唆するものである。
【００２３】
Ｇ−ＣＳＦの細胞質ドメインは、他の増殖因子レセプターと同様、セリン（１２.８％）およびプロリン（１２.３％）に富む。そして、Ｇ−ＣＳＦレセプターのトランスメンブランおよび細胞質領域の配列はＩＬ−４レセプターと有意に類似する。
【００２４】
図１１に示すように、Ｇ−ＣＳＦレセプターのトランスメンブラン領域および細胞質領域の最初の４６アミノ酸はネズミＩＬ−４の対応する領域と相同である（５０.０％）。さらに、Ｇ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸残基６７２−８０８はＩＬ−４レセプターのアミノ酸残基５５７−６９４と有意な類似性を持つ（４５.４％）。このことは、Ｇ−ＣＳＦによる細胞への情報伝達とＩＬ−４による情報伝達が同様の機構で起こっていることを示唆するものである。
【００２５】
本発明においては、ネズミ白血病細胞ＮＦＳ−６０細胞から得たｍＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡを得たが、このｃＤＮＡは同一動物の他の細胞（例えば、ＷＥＨＩ−３ＢＤ＋細胞やマウス骨髄細胞）のｍＲＮＡからも得ることができる（図８参照）。また、それは他の動物種（例えばヒト）のゲノムとも相同である。
【００２６】
Ｇ−ＣＳＦレセプターの３.７kb ｍＲＮＡはＮＦＳ−６０細胞のみならずＷＥＨＩ−３ＢＤ＋にも検出された（同図）。このことはＧ−ＣＳＦによるＮＦＳ−６０細胞の増殖とＷＥＨＩ−３ＢＤ＋細胞の分化が同一Ｇ−ＣＳＦレセプターに関連していることを示唆するものである。ＮＦＳ−６０およびＷＥＨＩ−３ＢＤ＋細胞に対するＧ−ＣＳＦ作用が増殖と分化という異なる結果をもたらすのは、レセプターより下流のシグナル伝達機構が異なることに起因すると思われる。例えば、骨髄細胞の分化に関与すると思われるc−mybおよびevi−１部位がＮＦＳ−６０細胞内では再編成されているが、ＷＥＨＩ−３ＢＤ＋細胞内では再編成されていないという相違点が報告されている（モリシタら、Ｃell ５４、８３１−８４０(１９８９)）。
【００２７】
本発明のネズミＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡは図１−３に記載の塩基配列に従って得ることができる。これは、受託番号、微工研菌寄第１１３５３号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１１３５３）の下で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され（寄託日：平成２年３月９日）、その後ブダペスト条約の下で国際寄託に移管されたＥscherichia coli．pＩ６２から常法通り単離することができる（国際寄託における受託番号：微工研条寄第３３１２号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３１２；移管日：平成３年３月１６日）。あるいは化学合成することも可能であり、さらには該配列に基づいて、通常、約３０ヌクレオチドのプローブを合成し、これをゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリザイゼーションプローブとして用いることにより、得ることもできる。そのようなライブラリーは、上記のごとく、Ｇ−ＣＳＦレセプターを発現する任意の種、例えばヒト、マウス、ラット、その他の動物から調製することができる。プローブとして用いるＤＮＡの合成およびハイブリザイゼーション法は当業者に既知である。ゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーの調製も当業者既知である。
【００２８】
また本発明のヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするcＤＮＡのクローニングは、次記の方法により行われた。即ち、Ｇ−ＣＳＦレセプターの発現率が高いヒト胎盤およびＵ９３７細胞(human histiocytic lymphoma，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３)から全ＲＮＡを調製し、poly(Ａ)ＲＮＡを選択した。次いで、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いて２本鎖cＤＮＡを合成し、哺乳類発現ベクターpＥＦ−ＢＯＳ(図２１参照)を用いてcＤＮＡライブラリーを構築した。一方、前述のネズミＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡからハイブリダイゼーションプローブを調製し、該プローブを用いるコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションによって上記cＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンを選択した。
【００２９】
Ｕ９３７細胞から調製したcＤＮＡライブラーから５個の陽性クローンが単離された(pＨＱ１〜pＨＱ５)。他方、ヒト胎盤から調製したcＤＮＡライブラリーから１００個以上の陽性クローンが得られ、その内６個の陽性クローンを単離してＥcoＲＩ消化し、得られたＥcoＲＩ断片をpＢluescript ＳＫ(＋)でサブクローニングした。次いで、単離したcＤＮＡを制限酵素マッピングおよびＤＮＡ配列決定により分析した。その結果、クローンは以下の３クラスに分類されることが分かった。胎盤およびＵ９３７細胞から得られたcＤＮＡの大部分がクラス１に属していた。
【００３０】
クラス１：プラスミドpＨＱ３(Ｕ９３７細胞)およびpＨＧ１２(胎盤)
このクラスのクローンは８３６アミノ酸のタンパク質をコードする大きいオープン・リーディング・フレームを有する。その塩基配列および推定のアミノ酸配列を図１３、１４および配列番号３、４に示す。推定のアミノ酸配列のヒドロパシー分析により、このクラスのcＤＮＡによってコードされているＧ−ＣＳＦレセプターは、Ｎ末端から２３アミノ酸残基のシグナル配列、６０４残基の細胞外ドメイン、２６残基からなる膜貫通領域(トランスメンブラン・ドメイン)、および１８３残基の細胞質ドメインを含有することが示された。プラスミドpＨＱ３(pＨＧ１２と同一)の制限酵素切断点は図１６に記載されている。
【００３１】
このプラスミドにコードされているヒトＧ−ＣＳＦレセプター(８１３アミノ酸)の推定の分子量は従来のヒトＧ−ＣＳＦレセプターの分子量と３０,０００〜６０,０００ダルトン相違している。これは細胞外領域に存在する９個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位がグリコシル化されていることによるものと考えられる。
【００３２】
本発明によりクローニングされたヒトＧ−ＣＳＦレセプターとネズミＧ−ＣＳＦレセプターとの相同性はヌクレオチド配列レベルで７２％、アミノ酸配列レベルで６２.５％であり、アミノ酸配列における相同性は分子の全領域を通して均一であった。このヒトＧ−ＣＳＦレセプターの細胞外ドメインには１７個のシステイン残基があり、その１４個はヒトおよびネズミで保存されている。さらに該細胞外ドメインには、サイトカインレセプターに共通する保存的な“ＷＳＸＷＳ"モチーフも存在しており、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターがサイトカインレセプター群に属することが示された。
【００３３】
クラス２：プラスミドpＨＱ２(Ｕ９３７細胞)
プラスミドpＨＱ２の塩基配列は、pＨＱ３の配列から、ヌクレオチド番号２,０３４−２,１２１の８８ヌクレオチドが欠失していることを除いてpＨＱ３のそれと同一である。この８８ヌクレオチド領域には膜貫通領域が含まれている。該プラスミドの欠失開始部位から下流のヌクレオチド配列を図１５Ａに示す。クラス２のクローンの塩基配列および推定のアミノ酸配列を配列番号５、６に示す。
【００３４】
図から明らかに、pＨＱ２においては、欠失部位から下流の１５０アミノ酸をコードする翻訳リーディングフレームの配列がpＨＱ３の配列と異なっており、分泌、可溶化型のＧ−ＣＳＦレセプターをコードしていると考えられる。このレセプターは７４８アミノ酸からなり、分子量の計算値は８２,７０７である。
【００３５】
クラス３：プラスミドpＨＧ１１およびpＨＧ５(胎盤)
これらのプラスミドはpＨＱ３の配列において、ヌクレオチド番号２,２１０位に８１bpの挿入を含有するものである。挿入位置はＧ−ＣＳＦレセプターの細胞質ドメインであり翻訳オープンリーディングフレームは変化していない。挿入部分のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を図１５Ｂに示す。また、クラス３のクローンの塩基配列および推定のアミノ酸配列を配列番号７、８に示す。プラスミドpＨＱ２によってコードされているレセプターのアミノ酸数はクラス１のＧ−ＣＳＦレセプターよりも２７個多く、分子量は２,９５７大きい。この挿入部を有するcＤＮＡの制限地図を図１６に示す。
【００３６】
上記３種のヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡのＧ−ＣＳＦとの結合活性を調べたところ、クラス１のプラスミドpＨＱ３で形質転換されたサルＣＯＳ細胞はネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと高い親和性を有していた(結合における解離定数は５５０pＭであり、レセプター数は３.４×１０4個／細胞)。この結合における親和性は、ＣＯＳ細胞によって発現されたネズミＧ−ＣＳＦレセプターに対するネズミＧ−ＣＳＦの結合における親和性とほぼ同一であった。天然にＵ９３７細胞表面に存在するレセプターに対するヒトＧ−ＣＳＦの結合親和性は解離定数４２４pＭである[パーク(Ｐark,Ｌ.Ｓ.)、ワルドロン(Ｗaldron,Ｐ.Ｅ.)、フレンド(Ｆriend,Ｄ.)、サッセンフェルド(Ｓassenfeld,Ｈ.Ｍ.)、プライス(Ｐrice,Ｖ.)、アンダーソン(Ａnderson,Ｄ.)、コスマン(Ｃosman,Ｄ.)、アンドリュー(Ａndrews,Ｒ.Ｇ.)、バーンステイン（Ｂernstein,Ｉ.Ｄ.)およびアーダル(Ｕrdal,Ｄ.Ｌ.)、ブラッド(Ｂlood)、７４、５６〜６５(１９８９)]ことから、pＨＱ３によってコードされているポリペプチドはＧ−ＣＳＦと十分に高い親和性を有するレセプターである。
【００３７】
他方、クラス２のpＨＱ２によりコードされたポリペプチドは一部を欠失していることから、pＨＱ２ｃＤＮＡで形質転換されたＣＯＳ細胞とネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとの結合は極めて低レベルであった。解離定数は４４０pＭであって結合部位は６×１０３／細胞であった。このことからも膜貫通領域を欠くpＨＱ２によりコードされているレセプターは細胞から分泌された可溶化型であると考えられる。
【００３８】
クラス３のcＤＮＡの結合特性を調べるために、pＨＱ３cＤＮＡの５'側の配列とpＨＧ１１の３'側の配列とを哺乳類発現ベクターpＥＦ−ＢＯＳに挿入して発現プラスミドpＱＷ１１を構築した。このプラスミドを用いてＣＯＳ細胞を形質転換し、得られた形質転換体とネズミ125−Ｇ−ＣＳＦとの結合分析を行った結果、細胞質ドメインにおける２７アミノ酸挿入体は、Ｇ−ＣＳＦとの結合活性に殆んど影響していないことが分かった。
【００３９】
本発明のヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡの塩基配列は図１３、１４および配列番号３、５、７に記載されている。このＤＮＡは、受託番号、微工研菌寄第１１５６６号、第１１５６７号および第１１５６８号の下で通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され(寄託日：平成２年６月２８日)、その後ブダペスト条約の下、平成３年３月１６日付けで国際寄託に移管されたＥscherichia coli．pＨＱ２、Ｅscherichia coli．pＨＱ３およびＥscherichia coli．pＨＧ１１から常法通り単離することができる。これらの国際寄託における受託番号および移管日は下記の通りである。Ｅscherichia coli．pＨＱ２；受託番号：微工研条寄第３３１３号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３１３）；Ｅscherichia coli．pＨＱ３：微工研条寄第３３１４号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３１４）；Ｅscherichia coli．pＨＧ１１：微工研条寄第３３１５号（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３３１５）。
【００４０】
本発明者らはまた、これらのヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡから調製したプローブを用い、ノーザンハイブリダイゼーションにより、種々のヒト組織細胞をＧ−ＣＳＦレセプターＲＮＡの存在に関して分析した。Ｕ９３７細胞、胎盤およびＫＧ−１細胞が３.７kbの単一バンドを与え、中でも、胎盤がＧ−ＣＳＦレセプターのmＲＮＡを大量に発現していることが確認された。
【００４１】
さらに、ＰＣＲ法により、細胞により発現されるレセプターの種類を検討し、クラス１Ｇ−ＣＳＦレセプターは、Ｕ９３７および胎盤細胞の両者、クラス２の可溶化型レセプターはＵ９３７細胞、挿入体を有するクラス３レセプターは胎盤細胞により発現されることを確認した。
【００４２】
また、サザーンハイブリダイゼーションにより、Ｇ−ＣＳＦレセプターをコードする遺伝子の数を検討した結果、ヒトハプロイドゲノムあたり、単一の遺伝子が存在することを見いだした。
【００４３】
本発明により、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列が明らかになったので、このＤＮＡを用いて適当な宿主系で機能する発現ベクターを構築し、その発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養することにより、組換えヒトＧ−ＣＳＦレセプターを製造することができる。このようにして得られた組換えヒトＧ−ＣＳＦレセプターは、白血病の診断やヒトＧ−ＣＳＦの作用機構の解明等、様々な目的に有用である。
【００４４】
本発明のＧ−ＣＳＦレセプターをコードするcＤＮＡのヌクレオチド配列はマウスについては図１−３および配列番号１、ヒトについては図１３−１５および配列番号３、５、７に記載されているが、当業者ならば、これらのＤＮＡから、ヌクレオチドの挿入、置換または欠失により、容易に同様の活性を有する誘導体を導くことができるということを理解するであろう。従って、そのようにして導かれるＤＮＡも本発明の範囲に包含されるものである。
【００４５】
本発明の目的を達成するために用いるＧ−ＣＳＦと結合するポリペプチドは、必ずしも成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターであることを必要としない。むしろ、Ｇ−ＣＳＦとの結合活性を有する断片であることが好ましい場合もある。同様に、成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡの全配列および、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡとの結合活性を有する、成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターの一部をコードするＤＮＡ断片もまた有用である。
【００４６】
従って本発明は、Ｇ−ＣＳＦと結合し得るレセプターペプチド、並びに該ペプチドをコードするＤＮＡを提供するものである。
【００４７】
このように、本発明のＧ−ＣＳＦレセプターペプチドをコードするＤＮＡは、成熟Ｇ−ＣＳＦレセプター、並びに該成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターのＧ−ＣＳＦとの結合活性を有するペプチド断片をコードするＤＮＡを包含する。
【００４８】
本発明のＤＮＡを用いて他の動物種のＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡを得、Ｇ−ＣＳＦレセプターの発現ベクターを構築し、適当な培養細胞に導入して、Ｇ−ＣＳＦレセプターを発現させることができる。
【００４９】
本発明のＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターは種々の方法で構築することができるので、当業者は適宜選択すればよい。Ｇ−ＣＳＦレセプター遺伝子の発現に適したベクターは、Ｇ−ＣＳＦレセプターＤＮＡ配列の挿入部位の直ぐ上流に転写開始のためのプロモーターを有するものが好ましい。適当なプロモーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機能特性に応じて選択することができる。例えば、マウスメタロチオナインプロモーターおよびＳＶ−４０スモールＴプロモーターを、それぞれ、ネズミおよびサル細胞に用いることができる。細菌プロモーターを、細菌内でＧ−ＣＳＦを発現させるのに用いることもできる。Ｇ−ＣＳＦレセプター配列の挿入部位下流にpoly−Ａシグナルがあることが望ましい。ベクター中には薬物耐性マーカーのような選択可能マーカーが存在することが望ましい。特に望ましいマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を挙げることができる。
【００５０】
発現ベクターはＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入することにより構築することができる。適当なベクターは、プロモーター、polyＡシグナル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野で既知のものから選択する。本発明のcＤＮＡを挿入し、培養細胞に導入してこのcＤＮＡを発現する目的に用いることができるＤＮＡベクターとして、例えばpＳＶ２、ウシパピローマウィルスＤＮＡを挙げることができる。
【００５１】
本発明のＧ−ＣＳＦレセプターの発現に用い得る培養細胞は複製可能で図１−３もしくは図１３−１５に記載のＤＮＡを発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような原核性微生物、Ｓ.セレビシエのような真核性微生物、さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはトリ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステムの選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それらの内から本発明のＧ−ＣＳＦレセプターをコードするcＤＮＡの発現に適した系を任意に選択することができる。
【００５２】
以下に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。
【実施例】
実施例１  ネズミＧ−ＣＳＦレセプターＤＮＡのクローニング
１）細胞
ネズミ骨髄性白血病細胞ＮＦＳ−６０（ワインシュタインら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８３、５０１０−５０１４(１９８６)；セント・ジュード・チャイルドレンズ・リサーチ・ホスピタルのＪ.Ｉhle氏から寄贈）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および１０〜２０単位／mlの組換えマウスＩＬ−３を加えたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
ＣＯＳ−７細胞は常法通り１０％ＦＣＳ含有ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。
【００５３】
２）組換えＧ−ＣＳＦなどの増殖、分化因子
ヒトＧ−ＣＳＦｃＤＮＡ（ツチヤら、１９８７、前掲）を担持するウシパピローマウイルス発現ベクター（フクナガら、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ８１、５０８６−５０９０(１９８４)）で形質転換したマウスＣ１２７Ｉ細胞の培養液より、ヒト組換えＧ−ＣＳＦを精製した。
マウスＧ−ＣＳＦを、同様の発現システムを用い、均一タンパク質として精製した。チャイニーズハムスターの卵巣細胞によって産生されたヒト組換えＧ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦは中外製薬（日本）から得た。
Ｅ.coliによって産生されるヒト組換えＧ−ＣＳＦはアマーシャム(Ａmersham)から購入した。
マウス組換えＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦはミヤジマおよびアライ氏（ＤＮＡＸインスティチュート）から得た。
マウス組換えＩＬ−６およびマウス組換えＬＩＦは、それぞれ、ヒラノ氏（大阪大学）およびニコラ氏（ウオルター・エリザ・ホール・インスティチュート）から得た。
ラットプロラクチンはケミコンインターナショナル、インコーポレーテッドから購入した。
放射性ヨウ素でラベルしたネズミ組換えＧ−ＣＳＦは、改良ＩＯＤＯ−ＧＥＮ法（フレイカーおよびスペック、Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun．８０、８４９−８５７(１９７８)）により作成した［比活性：６−８×１０4cpm／ngタンパク質(１,２００〜１,６００cpm／fmole)］。
【００５４】
３）ＣＤＭ８ｃＤＮＡライブラリー
対数増殖期のＮＦＳ−６０細胞からグアニジンイソチオシアネート／ＣｓＣ１法で全ＲＮＡを調製し、オリゴ（ｄＴ）ーセルロースカラムクロマトグラフィーでpoly（Ａ）ＲＮＡを選択した。逆転写酵素（生化学工業から購入）とアマーシャム社のキットを用い、文献記載(ナガタら、Ｎature ３１９、４１５−４１８(１９８６))に従って２本鎖ｃＤＮＡを合成した。
【００５５】
得られた平滑末端ｃＤＮＡにＢstＸＩアダプターを付加し、１％アガロースゲルで電気泳動した。１.８kb以上のｃＤＮＡをゲルから回収し、ＢstＸＩー消化哺乳類発現ベクターＣＤＭ８（シード、１９８７、前掲）に結合（ライゲーション）させ、得られたＤＮＡでＥ.coli ＭＣ１０６１／ｐ３細胞を形質転換した（電気穿孔法、ダウエルら、Ｎucleic Ａcids Ｒes．１６、６１２７−６１４５(１９８８)）。
【００５６】
４）ＤＮＡの調製
６×１０4個の細菌コロニーを２４ウエルのマイクロタイタープレートに、ウエルあたり６０〜８０コロニーの密度でプレートした。コロニーの各プールごとにグリセリン培養を調製した。各グリセリン培養の一部をＬＢブロスに接種し、煮沸法（ボイリング法）で各プールからプラスミドＤＮＡを調製し（マニアティスら、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌaboratory Ｍanual １９８２）、フェノール抽出およびエタノール沈澱に付した。
【００５７】
５）ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクション
６ウエルのマイクロタイタープレートでＣＯＳ−７細胞の単層培養を得、この細胞を改良ＤＥＡＥデキストラン法(ソンパイラックおよびダンナ、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７８７、５７５−７５７８(１９８１))により上記４）で調製したプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクションした。
即ち、約５０％の全面成長した細胞を血清不含ＤＭＥＭで３回洗浄し、３７℃で８時間、５０mＭ Ｔris−ＨＣl(pＨ７.３）、０.３mg／ml ＤＥＡＥ−デキストランおよびプラスミドＤＮＡ１μgを含有するＤＭＥＭ０.６ml中でインキュベートした。２０％グリセリン含有Ｔris−ＨＣl緩衝化食塩水を用い、室温で２分間グリセリンショックに付した後、細胞をＤＭＥＭで２回洗浄し、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中でインキュベートした。
【００５８】
６）Ｇ−ＣＳＦレセプターを発現しているＣＯＳ−７細胞（形質転換体）のスクリーニング
トランスフェクションから７２時間後、ＣＯＳ−７細胞を、１０％ＦＣＳおよび２０mＭ ＨＥＰＥＳ含有ＤＭＥＭ（ｐＨ７.３）（結合培地）で洗浄し、結合培地０.６ml中の125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦ（１.７×１０5cpm(２００ｐＭ)）と共に３７℃で２時間インキュベートした。結合しなかった放射活性Ｇ−ＣＳＦを除去し、細胞を０.７mＭ ＣaＣl２と０.５mＭ ＭgＣl２を補充したりん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で３回、ＰＢＳで1回洗浄した。次いで、細胞をトリプシン処理して回収し、細胞と結合した放射活性をＡＵＴＯ−ＧＡＭＭＡ ５０００ ＭＩＮＡＸＩ ガンマカウンター(Ｐackard)で計数した。125ＩでラベルしたＧ−ＣＳＦとＣＤＭ８ベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞とのバックグラウンド結合は３０８±３８(ＳＤ)cpmであった。一方、cＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡのプールで形質転換したＣＯＳ細胞のうち、２つのプール(Ｉ６２とＪ１７)のプラスミドＤＮＡを導入したＣＯＳ細胞が125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと有意な結合を示した（それぞれ５００cpm、９１２cpm）。
【００５９】
各陽性プール(Ｉ６２とＪ１７)から得た１４４の独立のクローンを２４ウエルのマイクロタイタープレート(６プレート)で培養し、１２×１２クローンを用いてsib選択に付した(マニアティスら、前述、１９８２)。プラスミドのミニプレパレーション、およびＣＯＳ−７細胞のトランスフェクションの後、125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとの結合反応を行い、各陽性プールから単一のクローンを選択した。
【００６０】
すなわち、プールＩ６２およびＪ１７の細菌クローンを各１２クローンの１２サブグループに分けた。幾つかのサブグループはＣＯＳ細胞への125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの結合反応が３７１０および４０１０cpmであった。そして各陽性サブグループの単一のクローンを分析して２個の独立のクローンpＩ６２およびpＪ１７を同定した。pＩ６２およびpＪ１７のプラスミドＤＮＡでＣＯＳ−７細胞をトランスフェクトしたときの125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦ結合値はそれぞれ３０３００cpmおよび３１６００cpmであった。次いで、プラスミドpＪ１７およびpＩ６２の塩基配列を決定したところ、これらはいずれもＧ−ＣＳＦレセプターの完全なコーディング領域を含有しているが、poly(Ａ)配列もpoly(Ａ)付加シグナルも含有していないことが分かった。そこで、ｐＪ１７の２.５kb ＨindIII−ＸbaＩをプローブとするコロニーハイブリザイゼーションによって、上記cＤＮＡライブラリーを再度スクリーニングし、陽性クローンの１つ(pＦ１)を選択した。これは６０３bpの３'非コーディング領域を含み、その領域には、２個の重複するpoly（Ａ）付加シグナルが存在していた。これら３個のクローン化cＤＮＡ(pＩ６２、pＪ１７およびpＦ１)の塩基配列およびそれより類推されるアミノ酸配列を図１−３に示す。また、その模式図および制限酵素切断点地図、並びにハイドロパシープロットを図４に示す。
【００６１】
実施例２  クローニングしたネズミＧ−ＣＳＦレセプターＤＮＡの特性化
１）クローン化Ｇ−ＣＳＦレセプターの結合活性
125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとＣＯＳ細胞およびＮＦＳ−６０細胞との結合を調べた。
１５cmのプレート上で培養したＣＯＳ細胞を、２０μgのpＩ６２またはpＪ１７でトランスフェクションした。グリセリンショック後、１２時間後に６ウエルのマイクロタイタープレートに分割して入れ、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中、６０時間培養した。細胞を結合培地で洗浄し、種々の量の125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦ(１０pＭ−１.２nＭの範囲)と一緒に４℃で４時間インキュベートした。125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと細胞の非特異結合を測定するために大過剰の非標識Ｇ−ＣＳＦ(８００nＭ)の存在下で結合反応を行い、全結合活性から非特異的に結合した放射活性を差し引くことにより特異的結合活性を求めた。
【００６２】
一方、５.２×１０6個のＮＦＳ−６０細胞を、種々の濃度の125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦを含有する１０％ＦＣＳと２０mＭ  ＨＥＰＥＳ(pＨ７.３)からなるＲＰＭＩ−１６４０培地０.３ml中で４℃で４時間インキュベートすることにより、該細胞とＧ−ＣＳＦとを結合させた。図５に結果を示す。Ａは125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとＣＯＳ細胞との飽和結合を示す。上記のごとく、プラスミドｐＪ１７で１×１０6ＣＯＳ細胞をトランスフェクションした後、種々の量の125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの存在下、過剰量の非標識Ｇ−ＣＳＦの存在下または非存在下でインキュベートした。白丸は全結合、白三角は非特異結合、黒丸は特異結合を表し、特異結合は全結合と非特異結合の差として求めた値である。ＢはＣＯＳ細胞へのＧ−ＣＳＦ結合データのスキャッチャードプロットを示すグラフである。Ｃは125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦのＮＦＳ−６０細胞への飽和結合を示すグラフであって、白丸は全結合、白三角は非特異結合、黒丸は特異結合を表し、特異結合は全結合と非特異結合の差として求めた値である。ＤはＮＦＳ−６０細胞へのＧ−ＣＳＦ結合データのスキャッチャードプロットを示すグラフである。該グラフから、ＣＯＳ細胞で発現されたＧ−ＣＳＦレセプターの平衡解離定数は２９０ｐＭであって、細胞あたり３.０×１０4個のレセプターが存在することが分かる。ＣＯＳ細胞のトランスフェクション効率を１０−２０％とする(ソンパイラックおよびドナ、Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７８、７５７５−７５７８(１９８１))と、トランスフェクション陽性のＣＯＳ細胞は組換えＧ−ＣＳＦレセプターを１.５〜３.０×１０5個／細胞の頻度で発現していると予測される。ＮＦＳ−６０細胞上の固有のＧ−ＣＳＦレセプターの平衡解離定数は１８０ｐＭ（図５Ｄ）であるので、これらの結果はプラスミドｐＪ１７にコードされているｃＤＮＡがネズミＧ−ＣＳＦに高い親和性を有するレセプターを発現するのに充分であることを示唆している。
【００６３】
次いで、ＣＯＳ細胞で発現された組換えＧ−ＣＳＦレセプターのＧ−ＣＳＦとの結合特異性を調べた。上記と同様にＧ−ＣＳＦレセプターのｃＤＮＡ（ｐＪ１７）でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞を１μgの非標識ネズミＧ−ＣＳＦ、ヒトＧ−ＣＳＦ、ネズミＧＭ−ＣＳＦ、ネズミＩＬ−６、ネズミＬＩＦ、ラットプロラクチンまたはヒトＭ−ＣＳＦの存在下または非存在下で２ngの125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと一緒にインキュベートした。ヒトＧ−ＣＳＦとしては、ネズミＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターの卵巣細胞または大腸菌によって産生された組換えヒトＧ−ＣＳＦを用いた。各実験でＣＯＳ細胞と結合した125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦの放射活性を競合物質不在の場合の値に対する％で表した。結果を図６に示す。
【００６４】
ヒトＧ−ＣＳＦはネズミＧ−ＣＳＦとネズミＷＥＨＩ−３Ｂ Ｄ＋細胞との結合に競合する（ニコラら、１９８５、前掲）。哺乳類細胞または大腸菌のいずれかによって産生された非標識組換えヒトＧ−ＣＳＦは、標識したネズミＧ−ＣＳＦと、プラスミドｐＪ１７でトランスフェクションされたＣＯＳ細胞の結合反応において充分競合した（図６）。これに対し、非標識組換えネズミＧＭ−ＣＳＦ、ネズミＩＬ−３、ネズミＩＬ−６、ネズミ白血病阻害因子(ＬＩＦ)、ラットプロラクチンまたはヒトＭ−ＣＳＦによっては125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦのＣＯＳ細胞への結合は全く、阻害されなかった。
【００６５】
２）クロスリンキング反応
Ｇ−ＣＳＦ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとＣＯＳ細胞によって発現されたレセプターとのクロスリンキング反応を以下のようにして行った。
上記のごとく、プラスミドｐＩ６２でトランスフェクションした８×１０5のＣＯＳ細胞（３.５cmプレート）を１.２ｎＭの125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと一緒に、１.５μＭの非標識Ｇ−ＣＳＦの存在または非存在下、結合培地０.６ml中、４℃で２.５時間インキュベートした。セルリフターを用いてプレートから細胞をかきとり、ＰＢＳ１mlで３回洗浄した。クロスリンキング反応は、１５０μＭスベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）および１５０μＭ酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）を含有するＰＢＳ１ml中で２０分間、氷上で行った。１ＭＴris−ＨＣl(pＨ７.４）５０μｌを加えて反応を止め、遠心して細胞を収集し、プロテアーゼインヒビター混合物(２mＭ ＥＤＴＡ、２mＭ(ｐ−アミノフェニル)メタンスルホニルフルオリド塩酸塩、２mＭ Ｏ−フェナンスロリン、０.１mＭロイペプチン、１μg／mlペプスタチンＡおよび１００単位／mlアプロチニン）を含有する１％Ｔriton Ｘ−１００  １５μlで細胞を溶解した。遠心して上清を得、この澄明なライゼート（１０μl）をＳＤＳの存在下４〜２０％ポリアクリルアミドゲルグラディエント電気泳動にかけて分析した（レムリ、Ｎature ２２７、６８０−６８５(１９７０))。強化スクリーンを用い、−８０℃で２日間Ｘ−線フィルムに感光した。サイズマーカーとして１４Ｃラベル分子量標準（レインボウマーカー、アマーシャム）を並行して電気泳動させた。
【００６６】
結果を図７に示す。レーン２は過剰量の非標識ネズミＧ−ＣＳＦの存在下、レーン３および４は非存在下のクロスリンキング反応の結果を表す。ただし、レーン３ではＤＳＳおよびＤＳＴを含まない反応の結果である。レーン５はネズミＮＦＳ−６０細胞（３×１０6細胞／レーン）を同様に125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと一緒に、過剰量の非標識Ｇ−ＣＳＦの存在下、レーン６は非存在下でインキュベートし、ＤＳＳおよびＤＳＴによりクロスリンキングさせた実験の結果を表す。レーン１および７はそれぞれサイズマーカーとして用いた１４Ｃラベル分子量標準（レインボウマーカー、アマーシャム）である。タンパク質標準の分子量をkＤで示す。
【００６７】
ＮＦＳ−６０細胞上のＧ−ＣＳＦレセプターと標識化ネズミＧ−ＣＳＦ（分子量２５,０００）とのクロスリンキング反応で見掛けの分子量１２５,０００−１５５,０００（レーン６）が得られ、これはＮＦＳ−６０上のネズミＧ−ＣＳＦレセプターの分子量が１００,０００−１３０,０００であることを示唆している。同様に、ネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとＣＯＳ細胞上で発現したレセプターとのクロスリンキング反応で分子量１２０,０００−１５０,０００（レーン４）に主バンドを得、これはＮＦＳ−６０細胞に検出した値とやや異なっている。これらのバンドはクロスリンキング反応を非標識Ｇ−ＣＳＦの存在下（レーン２および５）、または結合試薬が存在しないとき（レーン３）には認められなかった。ＣＯＳ細胞とＮＦＳ−６０細胞の分子量に僅かな相違はこれらの細胞系でのレセプターのグリコシル化が相違することで説明することができる。
【００６８】
３）ハイブリダイゼーション
コロニーハイブリダイゼーションとノーザンハイブリダイゼーションを文献記載の方法(マニアティス、Ｃold Ｓpring Ｈarbor、Ｎew Ｙork：Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory(１９８２))に従って行った。プローブとして、クローンｐＪ１７の２.５kb ＨindIII−ＸbaＩ断片をランダムプライマーラベリング法（ファインバーグおよびボーゲルシュタイン、Ａnal.Ｂiochem．１３、２６−１３(１９８３)）により32Ｐで標識したものを用いた。ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図８に示す。
【００６９】
ネズミの種々の組織から調製した全ＲＮＡまたはpoly(Ａ)ＲＮＡを用いた。それらは、Ｌ９２９(レーン１)、ＮＦＳ−６０(レーン２および３)、ＦＤＣ−Ｐ１(レーン４)、ＷＨＥＩ−３ＢＤ＋(レーン５)またはマウス組織、脳(レーン６)、肺(レーン７)、脾臓(レーン８)、骨髄(レーン９）、肝臓(レーン１０)、および腎臓(レーン１１)である。全ＲＮＡ３０μg(レーン１、および３〜１１)またはpoly(Ａ)ＲＮＡ２μg(レーン２)を６.６％ホルムアルデヒド含有１.３％アガロースゲル電気泳動にかけ、上記の文献記載の方法に従い、ノーザンハイブリザイゼーションで分析した。
【００７０】
実施例３  クローニングしたネズミＧ−ＣＳＦレセプターＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされているポリペプチドのアミノ酸配列
１）ヌクレオチド配列決定
ＤＮＡ配列決定はＴ７−ＤＮＡポリメラーゼ(ファルマシア)およびα−35Ｓ dＡＴＰαＳ(アマーシャム)を用いるジデオキシヌクレオチド鎖決定法で行った。結果を図１−３および図４に示す。
図１−３はネズミＧ−ＣＳＦレセプターｃＤＮＡ（ｐＩ６２、ｐＪ１７およびｐＦ１）のヌクレオチド配列およびそれより類推されるアミノ酸配列を示す。各ラインの上下の数字はそれぞれ、ヌクレオチド位置およびアミノ酸位置を表し、アミノ酸は成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターのＣys−１から始まっている。アミノ酸配列でシグナル配列および膜貫通領域には下線を引いた。２つのオーバーラップしたpoly(Ａ)付加シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）にも下線を引いて示した。潜在的なＮ−グリコシル化部位（Ａsn−Ｘ−Ｓer／Ｔhr）(細胞外領域の11および細胞質領域の２）は箱で囲まれている。
【００７１】
図４はネズミＧ−ＣＳＦレセプターｃＤＮＡであって、Ａは３つの独立したｃＤＮＡ（ｐＩ６２，ｐＪ１７，ｐＦ１）の模式図および制限地図である。長方形で囲んだ部分はオープンリーディングフレームである。点描および塗り潰した部分はそれぞれ、シグナル配列および膜貫通領域を表す。制限酵素切断部位も示されている。ＢはネズミＧ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列のヒドロパシープロットであって、これは１０残基のウインドウを用いるカイトおよびドゥーライトの方法(１９８２)によって得られた。図の下の番号は前駆体タンパク質のアミノ酸残基の位置を表す。
【００７２】
２）Ｇ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列と他の成長因子レセプターアミノ酸配列との比較（図９−１０）。
図９にＧ−ＣＳＦレセプターとプロラクチンおよび成長ホルモンレセプターを並列に示す。ネズミＧ−ＣＳＦレセプターの９６−３１７アミノ酸配列とラットプロラクチンおよびヒト成長ホルモンレセプターとを比較し、幾つかのギャップ（−）を導入して得られる最大ホモロジーを示す。２配列における同一残基は実線で囲み、好ましい（favored)置換と見なされる残基は破線で囲まれている。好ましいアミノ酸置換は以下のグループのいずれか1つに属する対のアミノ酸間における置換と定義される：Ｓ，Ｔ，Ｐ，ＡおよびＧ；Ｎ，Ｄ，ＥおよびＱ；Ｈ，ＲおよびＫ；Ｍ，Ｉ，ＬおよびＶ；Ｆ，ＹおよびＷ。増殖因子レセプター類（ファミリー）の９メンバー（Ｇ−ＣＳＦ、プロラクチン、成長ホルモン、エレイスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２β、ＩＬ−３、ＩＬ−４およびＩＬ−６）の間で保存されているアミノ酸は、各ラインの下に括弧を付けて、また括弧なしに記載されている。括弧のない残基は８以上のメンバーに保存されていたが、括弧をした残基はファミリーの５〜７メンバーに保存されていた。
【００７３】
図１０は図９と同様に、ネズミＧ−ＣＳＦレセプターの３７６−６０１アミノ酸配列とニワトリコンタクチンのアミノ酸配列とを並行に示した図である。
図１１はネズミＧ−ＣＳＦレセプターの６０２ー８０８アミノ酸配列を上記のようにネズミＩＬ−４レセプターと並列に記載した図である。
図１２はネズミＧ−ＣＳＦレセプターの模式図であって、箱で囲んだ範囲は成熟Ｇ−ＣＳＦレセプターを表す。"ＴＭ"はトランスメンブラン領域、領域"Ａ"は他の成長因子レセプター（プロラクチンおよび成長ホルモンレセプター）と同様のドメイン（２２２アミノ酸）を表し、"ＷＳＸＷＳ"モチーフが見られる。ネズミＧ−ＣＳＦレセプターの領域"Ｂ"(２２６アミノ酸)とニワトリコンタクチンとは類似する。領域"Ｃ"(２１１アミノ酸)はトランスメンブランドメイン（下線）およびＧ−ＣＳＦレセプターの細胞質ドメインを含み、ネズミＩＬ−４レセプターの２個の領域と類似している。
【００７４】
実施例４  ヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡのクローニング
（１）ヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡクローンの単離
Ｕ９３７細胞からpoly(Ａ)ＲＮＡを調製し、逆転写酵素(生化学工業から購入)とアマーシャム社のcＤＮＡ合成キットを用い、文献記載(ナガタら、Ｎature、３１９、４１５〜４１８(１９８６))の方法に従って２本鎖cＤＮＡを合成した。得られた平滑末端cＤＮＡにＢstＸ１アダプターを付加し、１％アガロースゲルで電気永動した。２.５kb以上のcＤＮＡをゲルから回収し、哺乳類発現ベクターpＥＦ−ＢＯＳ(図２１)に結合させ、得られたＤＮＡでＥ.coli ＤＨ１細胞を電気穿孔法(ダウエルら、Ｎucleic Ａcids Ｒes.、１６、６１２７−６１４５(１９８８))を用いて形質転換した。
次いで、得られたライブラリーの合計３.４×１０4個のクローンをコロニーハイブリダイゼーションでスクリーニングした。
【００７５】
ハイブリダイゼーションプローブはネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡの２.５kbＨindIII−ＸbaＩ断片をランダムオリゴヌクレオチドプライマー標識法[サンブルック(Ｓambrook,Ｊ.)、フリッツ(Ｆritsch,Ｅ.Ｆ.)およびマニアティス(Ｍaniatis,Ｔ.)、モレキュラー・クローニング(Ｍolecular Ｃloning)(１９８９)：ア・ラボラトリー・マニュアル(Ａ Ｌaboratory Ｍanual)、第２版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(Ｃold Ｓpring Ｈarbor，Ｎew Ｙork)：コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory)]により32Ｐでラベルしたものを用いた。ここで用いたプローブはネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡ(pＩ６２)である。そのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を添付の図１−３に示す。なお、この図１−３においてシグナル配列および膜貫通領域には下線が付されている。また、潜在的なＮ−グリフシル部位は四角で囲まれている。
【００７６】
ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション温度を２８℃に下げ、フィルターを３７℃において１５０mＭ ＮaＣl／１５mＭ クエン酸ナトリウム、pＨ７.０／０.１％ＮaＤodＳo４で洗浄する他は文献[フクナガ(Ｆukunaga,Ｒ.)、マツヤマ(Ｍatsuyama,Ｍ.)、オカムラ(Ｏkamura,Ｈ.)、ナガタ(Ｎagata,Ｋ.)、ナガタ(Ｎagata,Ｓ.)およびソカワ(Ｓokawa,Ｙ.)、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Ｎucl.Ａcids Ｒes.)、１４、４４２１〜４４３６(１９８６)]に従って行った。即ち、コロニーのレプリカフィルターを作製し、各ニトロセルロースフィルターと９５℃で５分間加熱後急冷したプローブとを２８℃で１２時間ハイブリダイゼーションさせた。次いで、上記記載の方法でフィルターを洗浄後、オートラジオグラフィーにより目的のクローンを探索した。
【００７７】
他方、λgt１１を用いて構築されたヒト胎盤cＤＮＡライブラリーをクローンティック(Ｃlonetech)社より購入し、ネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡを用いるプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
即ち、約１.５×１０6個のクローンのファージＤＮＡをベントンおよびディビスによって記載された方法(Ｂenton,Ｗ.Ｄ．＆ Ｄavis,Ｒ.Ｗ.，Ｓcience，１９６，１８０−１８２(１９７７))によってニトロセルロースフィルターに移した後、プラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。用いたプローブＤＮＡおよびハイブリダイゼーション条件は、上記に記載したＵ９８３ cＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いたプローブおよび条件と同一である。
【００７８】
Ｕ９３７細胞から調製したcＤＮＡライブラリーから５個の陽性クローンを単離した(pＨＱ１〜pＨＱ５)。
他方、ヒト胎盤cＤＮＡライブラリー(１.５×１０6個)とネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡとのプラークハイブリダイゼーションにおいて１００個以上の陽性シグナルを示すクローンが得られ、その６個の陽性クローン(λＨＧ４、５、１１、１２、１４および１８)のＥcoＲＩ断片をpＢluescript ＳＫ(＋)ベクターにサブクローンし、pＨＧ４、５、１１、１２、１４あるいは１８と命名した。
【００７９】
ＤＮＡの塩基配列決定のために、エキソヌクレアーゼIIIおよびmung beanヌクレアーゼ(サンブルックら、前掲)を用いて約３００bpづつ欠失した一連のプラスミドを調製した。そして、配列決定はＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、deaza dＧＴＰおよびα−35ＳdＡＴＰα−Ｓを用い、ジデオキシ鎖ターミネーション法で行なった。
配列決定の結果、Ｕ９３７および胎盤cＤＮＡライブラリーから単離されたcＤＮＡは以下の３クラスに分類されることが分かった。
【００８０】
クラス１:プラスミドpＨＱ３(Ｕ９３７)およびpＨＧ１２(胎盤)
Ｕ９３７および胎盤cＤＮＡライブラリーから単離された大部分のcＤＮＡがこのクラスに属する。これらプラスミドの塩基配列および推定のアミノ酸配列を図１３−１４に示す。また、その制限酵素切断部位を示す地図を図１６に示す。
【００８１】
これらのクラス１のプラスミドは８３６アミノ酸からなるタンパク質をコードする大きいオープンリーディングフレームを有している。推定のアミノ酸配列のヒドロパシー分析の結果、図面から明らかなように、Ｎ−末端２３アミノ酸残基がシグナル配列に相当し、６０４残基の細胞外ドメイン、２６残基の、膜貫通領域、および１８３残基の細胞質ドメインが続く。この細胞外領域には９個の潜在的Ｎ−グリコシル化部位が存在する。
【００８２】
また、このcＤＮＡによってコードされているペプチドの細胞外ドメインには１７個のシステイン残基が存在し、内１４個はヒトおよびネズミで保存されている。また、該ドメインにはサイトカインレセプターで保存されている"ＷＳＸＷＳ"モチーフも存在しており、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターがサイトカインレセプターに属することが示された。
【００８３】
このクラス１のプラスミドでコードされているヒトＧ−ＣＳＦレセプター(８１３アミノ酸)とネズミＧ−ＣＳＦレセプターの相同性はヌクレオチド配列レベルで７２％、アミノ酸配列レベルで６２.５％であった。また、アミノ酸配列における相同性は分子の全領域を通して均一であった。
【００８４】
クラス２：プラスミドpＨＱ２(Ｕ９３７細胞)
プラスミドpＨＱ２の塩基配列は、pＨＱ３の配列から、ヌクレオチド番号２,０３４−２,１２１の８８ヌクレオチドが欠失していることを除いてpＨＱ３のそれと同一である。欠失配列の末端は、図１３−１４記載の配列の黒い矢頭で示されている。
【００８５】
図から明らかなように、この８８ヌクレオチドの欠失領域には膜貫通領域が含まれている。欠失部分から下流のヌクレオチド配列を図１５Ａに示す。
pＨＱ２においては、欠失部位から下流の１５０アミノ酸をコードする翻訳リーディングフレームがこの欠失により変化しており(図１６参照)、分泌、可溶化型のＧ−ＣＳＦレセプターをコードしていると考えられる。この可溶化型レセプターは７４８アミノ酸からなり、分子量計算値は８２,７０７である。
【００８６】
クラス３：プラスミドpＨＧ１１およびpＨＧ５(胎盤)
これらプラスミドのヌクレオチド配列はpＨＱ３のヌクレオチド番号２,２１０位に８１bpＤＮＡ断片が挿入されたものである。挿入位置はＧ−ＣＳＦレセプターの細胞質ドメイン内にあり、図１３−１４において太い矢印で表示した部位である。翻訳オープンリーディングフレームは変化していない。挿入体のヌクレオチド配列および推定の塩基配列を図１５Ｂに示す。従ってプラスミドpＨＱ２にコードされているレセプターは第１クラスのＧ−ＣＳＦレセプターよりもアミノ酸数で２７、分子量で２,９５７大きいことになる。
【００８７】
これら３クラスのプラスミドのヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列は図１３−１５および配列番号３−８に記載されている。図１３−１４において、ＡにおけるpＨＱ２の配列における種々の記号等は以下の意味を有する。アミノ酸配列の番号はアミノ酸Ｇluを番号１とするものである。シグナル配列および膜貫通領域は太い下線、Ｎ−グリコシル化部位(Ａsn−Ｘ−Ｔhr／Ｓer)は四角で示されている。サイトカインレセプターファミリーに保存されている"ＷＳＸＷＳ"モチーフ部分は２重下線で示されている。黒の矢頭はpＨＱ２において欠失されている配列の末端、太い矢印はpＨＧ１１における挿入体の挿入部位を表す。細い矢印は後述のＰＣＲ法に用いたオリゴヌクレオチドプライマー部分を示す。図１５Ａにおいて、△から下流の配列は、pＨＱ２における、pＨＱ３の欠失されたヌクレオチド２,０３４から下流の配列に相当するヌクレオチド配列、および推定のアミノ酸配列を示す。図１５ＢはpＨＧ１１に含有されている、pＨＱ３のアミノ酸６５７位への挿入体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列である。挿入された配列は括弧で囲まれている。
【００８８】
上記３クラスのプラスミドの制限地図は図１６に示されている。図中、四角で囲んだ部分はオープンリーディングフレーム、陰影を付けた部分はシグナル配列、塗りつぶした部分は膜貫通領域を表す。pＨＱ２における斜線部分は他のcＤＮＡのオープンリーディングフレームから変化した部分であって、異なるアミノ酸をコードする配列を表す。pＨＧ１１における斜線部分は２７アミノ酸をコードする挿入体配列部分を表す。
【００８９】
（２）ヒト細胞におけるＧ−ＣＳＦレセプターmＲＮＡの検出
上記cＤＮＡから調製したプライマーを用い、ポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法によってヒトＧ−ＣＳＦレセプターmＲＮＡを検出した。
１本鎖cＤＮＡの合成およびＰＣＲは実質上カワサキ[カワサキ(Ｋawasaki,Ｅ.Ｓ.)、ピーシーアール・プロトコールズ(ＰＣＲ Ｐrotocols)、「ア・ガイド・トゥー・メソッズ・アンド・アプリケーション(Ａ guide to methods and application)」、アイニス(Ｉnnis,Ｍ.Ａ.)、ゲルファンド(Ｇelfand,Ｄ.Ｈ.)、シャインスキー(Ｓhinsky,Ｊ.Ｊ.)およびホワイト(Ｗhite,Ｔ.Ｊ.)ら編、(アカデミック・プレス、サン・ディエゴ、カリフォルニア(Ａcademic Ｐress，Ｓan Ｄiego，ＣＡ))、２１頁〜２７頁(１９９０)]の方法に従って行い、結果を図１９に示した。
【００９０】
即ち、ヒト胎盤またはＵ９３７細胞から得た全ＲＮＡ(レーン２および５)またはpoly(Ａ)ＲＮＡ(レーン２１および４)、あるいはヒト胎盤(レーン３および６)２μgを反応混合物５０μl中、ランダム６量体(ヘキサマー)０.５μgとＡＭＶ逆転写酵素８０単位の存在下、既述(カワサキら、前掲)の如くし、cＤＮＡ合成に付した(カワサキら、前掲)。
反応混合物５μlをとり、下記の順(フォワード)および逆(リバース)プライマー各５０pmolを含有するＰＣＲバッファー１００μlで希釈し、８０℃に予備加熱したＤＮＡサーマルサイクラー(パーキン−エルマー−セタス)中に置いた。
【００９１】
次いで、Ｔagポリメラーゼ２.５単位を加えて反応を開始した。ＰＣＲの条件は以下の通りである。９５℃で１.５分、７０℃で１.５分、７２℃で１.５分、のサイクルを３０回行う。
【００９２】
最後に、生成物(反応混合物の１０％)をＴＢＥバッファー中、１.５％ アガロースゲル電気泳動にかけ臭化エチジウム蛍光で観察した。サイズマーカーとして、ＢamＨＩおよびＭvaＩ消化pＢＲ３２２を同時に電気泳動しＤＮＡ断片のサイズを塩基対で示した。単離したＤＮＡに対応する増幅したＤＮＡ断片(Ａ１、Ａ２、Ｂ１およびＢ２)を矢印で示した。
【００９３】
図１９において、レーン１〜３の試料はヌクレオチド番号１,７９０−１,８１０の順プライマーと２,１７９−２,１５６の逆プライマーの組を用いて増幅したものである。レーン４〜６は、第２のオリゴヌクレオチド(ヌクレオチド番号２,０８６〜２,１０５および２,３２２〜２,３０３)を特異的プライマーとして増幅した試料である。
図から明らかなように、Ｕ９３７および胎盤細胞のいずれもクラスＩＧ−ＣＳＦレセプターを発現し、Ｕ９３７細胞は可溶性Ｇ−ＣＳＦレセプターを発現し、さらに、胎盤細胞は細胞質領域に挿入体を有するＧ−ＣＳＦレセプターを発現することが確認された。
【００９４】
実施例５  クローニングしたヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡによるＣＯＳ細胞の形質転換および形質転換体の結合活性
ネズミ125ＳＦと実施例４で得たcＤＮＡで形質転換されたＣＯＳ細胞との結合を調べた。
ネズミ組換えＧ−ＣＳＦの標識化、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡを含有する発現ベクターによるＣＯＳ細胞の形質転換、および125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦのＣＯＳ細胞への結合アッセイは前述のネズミの実施例で開示した方法に従って行った。
【００９５】
プラスミドpＨＧ１１を用いて、細胞質領域に挿入体を有する完全長さのcＤＮＡを構築した。即ち、プラスミドpＨＧ１１を制限酵素(ＮheＩ、宝酒造より購入)完全消化、ＢstＸＩ(１,４２５)(宝酒造より購入)部分消化した。制限酵素の反応条件は、宝酒造からの酵素に添付されている反応条件に従った。
次いで、１.３８kb BstXI-NheI断片とpＨＱ３の６.９kb BstXI-NheI断片とをＴ４−ＤＮＡリガーゼ(宝酒造より購入)を用いて結合させてpＱＷ１１を構築した。そして、これらのcＤＮＡを含有する発現プラスミド(pＨＱ２、pＨＱ３およびpＱＷ１１)でＣＯＳ細胞を形質転換し、125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦに対する結合を検討した。
【００９６】
即ち、１５cmのプレート上で培養したＣＯＳ細胞と、２０μgのpＨＱ２、pＨＱ３またはpＱＷ１１でトランスフェクションした。グリセリンショク後、１２時間後に６ウエルのマイクロタイタープレートに分割して入れ、１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中、６０時間培養した。細胞を結合培地(１０％ＦＣＳＦおよび２０mＭ ＨＥＰＥＳ(pＨ７.３)含有ＤＭＥＭ)で洗浄し、種々の量の125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦ(１０pＭ〜１.２nＭの範囲)と一緒に４℃で４時間インキュベートした。125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと細胞の非特異的結合を測定するために、大過剰の非標識Ｇ−ＣＳＦ(８００nＭ)の存在下で結合反応を行い、全結合活性から非特異的に結合した放射活性を差し引くことにより特異的結合活性を求めた。図１７Ａは、125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦのＣＯＳ細胞への飽和結合活性、図１７Ｂはそのスキャッチャード解析の結果を示す。この際、ネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡも同様にＣＯＳ細胞へ導入し、Ｇ−ＣＳＦの結合活性を検討した。
【００９７】
図１７において、黒三角はネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡで形質転換されたＣＯＳ細胞を示す。そしてヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡで形質転換されたＣＯＳ細胞の内、pＨＱ３による形質転換体は白丸、pＨＱ２による形質転換体は黒丸、pＱＷ１１による形質転換体は白三角で示されている。
図１７から、pＨＱ３あるいはpＨＱ１１で形質転換されたサルＣＯＳ細胞はネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦと高い親和性を有し、結合における解離定数は５５０pＭ、レセプター数は３.４×１０4個／細胞であることが分かる。また、pＨＱ２cＤＮＡで形質転換されたＣＯＳ細胞とネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとの結合は、プラスミドpＨＱ２が一部を欠失したペプチドをコードしていることから、極めて低レベルであった(解離定数４４０pＭ、結合部位６×１０３／細胞)。このことは膜貫通領域を欠くpＨＱ２によりコードされたレセプターは細胞から分泌され、培地中に蓄積されている可能性を強く示唆している。
【００９８】
また、プラスミドpＱＷ１１による形質転換体とpＨＱ３による形質転換体がほぼ同等のネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦに対する結合活性を示すことは、細胞質ドメインにおける２７アミノ酸挿入体がＧ−ＣＳＦの結合に殆ど影響していないことを示している。
なお、形質転換体の発現により取得されるヒトＧ−ＣＳＦレセプターの精製については、前述の天然のマウスＧ−ＣＳＦレセプターの精製方法を使用することができる。
【００９９】
実施例６  ヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡおよびmＲＮＡの分析ノーザンハイブリダイゼーションおよびサザーンハイブリダイゼーションにより、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを分析した。
全ＲＮＡは種々の細胞系統および新鮮なヒト臨月胎盤から既述(サンブルック、前掲)のごとくグアニジンイソチオシアネート／ＣsＣl法を用いて調製した。
【０１００】
他方、細胞ＤＮＡはヒトＴリンパ球から、文献(フクナガら、Ｎucleic.ＡcidsＲes.、１４、４４２１−４４３６(１９８６))に記載された方法に従い調製した。
サザーンおよびノーザンブロットハイブリダイゼーションはヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡを含有するプラスミドpＨＱ３のＸhoＩ ＤＮＡフラグメント(３kb)をプローブとして、文献記載の方法(マニアティスら、Ｍolecular Ｃloning、Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory(１９８２))に従って行なった。
【０１０１】
１）Ｇ−ＣＳＦレセプター転写物およびゲノムＤＮＡの分析
種々の細胞からのmＲＮＡをヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡ
をプローブとするノーザンハイブリダイゼーションにより試験した。
結果を図１８に示す。用いた細胞は以下の通りである。ヒトＵ９３７細胞(レーン１および２)、ヒトＫＧ−１(レーン３)、ヒトＨＬ−６０(レーン４)、ヒトＦＬ(レーン６)、ヒトＣＨＵ−２(レーン７)、およびヒト胎盤(レーン５および８)。
Ｕ９３７：human histiocytic lymphoma，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３
ＫＧ−１：human acute myelogenous leukemia，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４６
ＨＬ−６０：human promyelocytec leukemia，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０
ＦＬ：human amnion，ＡＴＣＣ ＣＣＬ６２
また、レーン２〜６および８は全ＲＮＡ(２０μg)、レーン１および７はpoly(Ａ)ＲＮＡ(１μg)を表す。
【０１０２】
図１８Ａは、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡをＤＮＡプローブとし、ハイブリダイゼーション後フィルターをＸ−線フィルムに４０時間、感光させて得た像の模写図である(ただし、レーン８は２時間)。
Ｕ９３７、胎盤およびＫＧ−１から得たＲＮＡでは３.７kbに単一のバンドが観察される。しかも、胎盤由来のＲＮＡに検出されたシグナルはＵ９３７由来ＲＮＡにおけるそれの２０倍以上である。
Ｂは、ブロットを再度、32Ｐ標識ヒト延長因子(エロンゲーションファクター）１αcＤＮＡ［ウエツキ（Ｕetsuki,Ｔ.)、ナイトウ(Ｎaito,Ａ.)、ナガタ(Ｎagata,Ｓ.)およびカジロ(Ｋaziro,Ｙ.)、ジャーナル・オブ・バイシオロジカル・ケミストリー(Ｊ.Ｂiol.Ｃhem.)、２６４、５７９１〜５７９８(１９９０)］によるハイブリダイゼーションに付し、フィルターをＸ線フィルムに１時間感光させて得た像の模写図である。この場合には、どの細胞から調製したＲＮＡも殆んど同様のシグナルが得られた。これらの結果は胎盤がＧ−ＣＳＦレセプターのmＲＮＡを非常に大量に発現していることを示しており、Ｇ−ＣＳＦの胎盤成長促進作用を示唆するものである。
【０１０３】
２）サザーンハイブリダイゼーション
サザーンハイブリダイゼーション法によりヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードする遺伝子の数を検討した。
ヒトゲノムＤＮＡ１０μgをＥcoＲＩ、ＨindIII、ＢamＨＩ、ＢglII、ＸbaＩ、ＰstＩ、ＳacＩおよびＡpaＩで消化し、０.８％アガロースゲル電気泳動にかけた。ＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し、32Ｐ標識ヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡとハイブリダイズした。この際、ＤＮＡサイズマーカーを同時に泳動した。
【０１０４】
結果を図２０に示す。図はＥcoＲＩ(レーン１)、ＨindIII（レーン２)、ＢamＨＩ(レーン３)、ＢglII(レーン４)、ＸbaＩ(レーン５)、ＰstＩ(レーン６)、ＳacＩ(レーン７)およびＡpaＩ(レーン８)の各消化断片に関する分析結果を示すものである。制限酵素ＥcoＲＩ、ＨindIII、ＢglII、およびＸbaＩで消化したＤＮＡには１〜２個のバンドしか認められないが、ＢamＨＩ、ＰstＩ、ＳacＩ、およびＡpaＩで消化したＤＮＡはそれぞれ４〜５個のバンドが認められる。図１６記載のごとく、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡは３ＢamＨＩ、６ＰstＩ、２ＳacＩ、および３ＡpaＩ制限酵素切断部位を有するので、この結果よりヒトハプロイドゲノムあたり１個のＧ−ＣＳＦレセプター遺伝子が存在すると推定される。
【０１０５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はネズミＧ−ＣＳＦレセプターのヌクレオチド配列およびそれより類推されるアミノ酸配列（N末端側）の模式図である。
【図２】  図２はネズミＧ−ＣＳＦレセプターのヌクレオチド配列およびそれより類推されるアミノ酸配列（中間部）の模式図である。
【図３】  図３はネズミＧ−ＣＳＦレセプターのヌクレオチド配列およびそれより類推されるアミノ酸配列（Ｃ末端側）の模式図である。
【図４】  図４はネズミＧ−ＣＳＦレセプターcＤＮＡ(pＩ６２、pＪ１７およびpＦ１)の模式図、制限地図およびヒドロパシープロットを示すグラフ
【図５】  図５は組換えネズミＧ−ＣＳＦを発現するＣＯＳ細胞およびＮＦＳ−６０細胞とネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとの結合を示すグラフであって、Ａはネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦとＣＯＳ細胞との飽和結合、ＢはＣＯＳ細胞へのネズミＧ−ＣＳＦ結合データのスキャッチャードプロットを示すグラフ、Ｃはネズミ125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦのＮＦＳ−６０細胞への飽和結合を示すグラフ、ＤはＮＦＳ−６０細胞へのネズミＧ−ＣＳＦ結合データのスキャッチャードプロットを示すグラフ、
【図６】  図６はＣＯＳ細胞で発現された組換えネズミＧ−ＣＳＦレセプターとネズミＧ−ＣＳＦとの結合特異性を表すグラフ、
【図７】  図７はＣＯＳ細胞およびＮＦ−６０細胞で発現されたネズミＧ−ＣＳＦレセプターのクロスリンキング反応の結果を表すグラフ、
【図８】  図８はネズミＧ−ＣＳＦレセプターmＲＮＡのノーザンハイブリザイゼーション分析の結果を表す写真の模写図、
【図９】  図９はネズミＧ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列と、プロラクチンおよび成長ホルモンレセプターのアミノ酸配列とを並列に示した配列図である。
【図１０】  図１０はネズミＧ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列と、ニワトリコンタクチンのアミノ酸配列とを並列に示した配列図である。
【図１１】  図１１はネズミＧ−ＣＳＦレセプターのアミノ酸配列と、ネズミＩＬ−４レセプターのアミノ酸配列とを並列に示した配列図である。
【図１２】  図１２はネズミＧ−ＣＳＦレセプターの模式図である。
【図１３】  図１３はヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするcＤＮＡ（プラスミドpＨＱ３およびpＨＧ１２）のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列（N−末端側）を表す図である。
【図１４】  図１４はヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするcＤＮＡ（プラスミドpＨＱ３およびpＨＧ１２）のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列（C末端側）を表す図である。
【図１５】  図１５はヒトＧ−ＣＳＦレセプターをコードするcＤＮＡ（プラスミドpＨＱ２およびプラスミドpＨＧ１１）のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列の一部を表す図である。Ａは図１３−１４に記載のpＨＱ２の配列の内、pＨＱ３の配列と異なる配列部分であって、pＨＱ３のヌクレオチド番号２,０３４から下流に相当する配列のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列、ＢはpＨＧ１１の配列の内、図１３−１４に記載のpＨＱ２に挿入されている挿入体のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を表す図である。
【図１６】  図１６は図１３−１５に記載のpＨＱ３およびpＨＧ１２、pＨＱ２、並びにpＨＧ１１の制限酵素地図の模式図である。
【図１７】  図１７はＣＯＳ細胞により発現された組換えヒトＧ−ＣＳＦレセプターのネズミＧ−ＣＳＦとの結合特性を示すグラフであり、Ａは125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦのＣＯＳ細胞への飽和結合を示すグラフ、ＢはＧ−ＣＳＦ結合データのスキャッチャード解析の結果を示すグラフである。
【図１８】  図１８はヒトＧ−ＣＳＦレセプターmＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション分析の結果を示す写真の模写図である。
【図１９】  図１９はヒトＧ−ＣＳＦレセプターmＲＮＡのＰＣＲにおける結果を示す写真の模写図である。
【図２０】  図２０はヒトＧ−ＣＳＦレセプターのサザーンハイブリダイゼーション分析の結果を示す写真の模写図、
【図２１】  図２１は発現ベクターpＥＦ−ＢＯＳの模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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