(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）を培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分として含むことを特徴とする肝庇護剤。
【請求項２】
該クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）が受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９４のクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株（Clostridium butyricum NIP1020）または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９５のクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株（Clostridium butyricum NIP1021）である、請求の範囲第１項に記載の肝庇護剤。
【請求項３】
該クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）が受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９４のクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株（Clostridium butyricum NIP1020）である、請求の範囲第２項に記載の肝庇護剤。
【請求項４】
脂肪肝、アルコール性肝疾患または中毒性肝障害を予防または治療することを目的として使用される、請求の範囲第１から３項のいずれかに記載の肝庇護剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、肝障害に対して予防および治療効果を有するクロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、当該クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）を培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分とする肝庇護剤、および上記培養液等からなる食品及び飼料に関するものである。詳しくは、本発明は、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対して予防および治療効果を有するクロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、当該クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）を培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分とする、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害の治療及び予防を目的とした肝庇護剤、および上記培養液等からなる食品及び飼料に関するものである。
背景技術
酪酸菌と呼ばれるクロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）は、腸内細菌の一つであり、他の腸内細菌と同様に体内から糞便中に生きたまま出てくる菌である。また、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）（以下、同様につき、括弧内を省略する）は、酪酸発酵により糖質から多量の酪酸を生成するために工業的酪酸の製造においても利用された有用な菌であり、その培養液中に抗腐敗菌有効因子を産生することが知られているため、従来、整腸効果を有する生菌剤として腹部症状の改善を目的とした医薬品あるいは飼料成分などにおいて広く利用されている。加えて、近年、このクロストリジウム・ブチリカムのある菌株には抗腫瘍作用があることが見出だされており、抗腫瘍免疫賦活剤としての利用も提唱されている（特開平０６−２９２５９７号）。
一方、肝臓は、腹腔上部右寄りで横隔膜の直下にある暗褐色の臓器であり、消化管に付属する人体中で最大の腺で体重の約1/45の重量を占める。また、肝臓は、脂質等の代謝、解毒、胆汁の排泄、各種栄養素の貯蔵、造血や血液凝固および循環血液量の調節など、多くの機能を有するため、肝臓に障害が起こると上記したような様々な機能が低下し、最悪の場合には生命の維持が困難に陥るほどの重要な臓器である。一般的に指摘される肝障害の原因としては、ウィルスによる感染、毒物または薬剤による中毒、飲酒や飽食、栄養障害及び循環障害からストレスのような比較的身近な原因まで種々のものが挙げられる。上記原因に加えて、近年では、家畜動物の生産性を上げるために使用される抗生物質や補栄養もまた肝障害を惹起する。このような障害を受けた肝臓は、肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着（脂肪化）、鬱血及び胆汁鬱滞、さらには肝細胞の風船様変化、肝細胞の破壊や壊死等の症状が観察され、倦怠・疲労感あるいは成長期における発育不良、さらには抵抗力の低下による日和見感染の原因となる上、上記したような症状が進むと、脂肪肝、肝炎そして肝硬変、さらには肝癌などの深刻な肝疾患へと移行し、最終的には死に至る可能性も多々ある。しかしながら、このような重大な障害が生じているにもかかわらず、肝臓は大きな予備力を有しているため、肝臓に多少障害が生じても上記したような症状は表に出にくく、痛みなどの症状が現れる時にはすでに病状がかなり進行していることが多く、早期の発見が見過ごされることも多い。
このような肝障害の治療方法は、肝障害を引き起こした原因によって異なり、例えば、アルコール性肝疾患の場合にはアルコール摂取の中止等原因の解消、過栄養に基づく脂肪肝の場合には脂肪摂取量の低減や肥満の解消、ウィルス性肝炎の場合には抗ウィルス剤の投与などが挙げられるが、最適な治療方法はいまだ確立されておらず、特に、原疾患に対する治療薬の投与による肝障害や進行した肝障害の場合には特に治療を施す必要があるが、公知の肝障害に対する治療薬は、急激な作用が生じたり、大量あるいは長期間投与においては副作用があることという欠点がある。このような安全性上の理由により、公知の治療薬を肝臓の庇護を目的として使用する予防薬や日常的な健康維持のための健康食品として利用することは当然のことながら問題がある。
したがって、上記したような背景を踏まえるに、高い肝障害治療及び予防効果さらには安全性を有する肝庇護剤の開発、さらには、このような肝庇護剤による肝障害の治療や予防方法の開発、さらには肝障害に対する治療及び予防効果を有する物質の食品あるいは飼料への利用が達成されれば、それにより得られる利益は計り知れないものである。
本発明は、上記諸事情を鑑みて成されたものであり、重篤な副作用を生じることなく、肝障害を有効に予防および治療する効果を有する安全性の高い肝庇護剤を得ることを目的とする。
本発明の他の目的は、重篤な副作用を生じることなく、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を有効に予防および治療する効果を有する安全性の高い肝庇護剤を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、重篤な副作用を生じることなく、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を有効に予防および治療する方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対する有効な予防及び治療する効果を有しかつ不快感を伴わずに容易に食せる食品または飼料を提供することにある。
発明の開示
上記諸目的は、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum；以下、単に「クロストリジウム・ブチリカム」と称する）を培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分として含むことを特徴とする肝庇護剤により達成される。なお、本明細書において、「肝庇護剤」という表現は、「肝障害に対して予防および／または治療効果を有する製剤」という意味で使用される。
本発明は、該クロストリジウム・ブチリカムが受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９４のクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株または受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９５のクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株である、前記肝庇護剤である。
本発明はまた、該クロストリジウム・ブチリカムが受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９４のクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株である、前記肝庇護剤である。
本発明はさらに、脂肪肝、アルコール性肝疾患または中毒性肝障害を予防および／または治療することを目的として使用される、前記肝庇護剤である。なお、本明細書において、「中毒性肝障害」という表現は、「医薬品、毒物及び化学性物質などによって引き起こされる肝障害」という意味で使用される。
上記諸目的はまた、前記したいずれかの肝庇護剤を肝障害を有する患者に投与することからなる、肝障害の治療または予防方法により達成される。
上記諸目的はさらに、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を１０-6〜１重量％混入した脂肪肝、アルコール性肝疾患または中毒性肝障害を予防または治療することを目的として使用される食品または飼料により達成される。
本発明のクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物（以下、単に「クロストリジウム・ブチリカムの培養物」または「培養物」とも称する）は、強力な肝障害改善作用および肝保護作用を有し、かつ哺乳動物に対して高い安全性を有するため、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を治療および／または予防するのに非常に有用である。
また、本発明の肝庇護剤は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を有効成分として含んでいるため、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対して強力な治療及び予防作用を有し、かつ哺乳動物に対して高い安全性を有する製剤である。
さらに、本発明の食品および飼料は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物からなり、高い安全性が確保されており、さらに食品または飼料中に混入されているため、安全でかつ有効な肝障害改善作用および肝保護作用を有しかつ容易に食することが可能な食品および飼料である。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、上記諸問題を解決するために、広く微生物の性質及び生産を鋭意検討した結果、肝疾患に見られる肝腫大、脂肪の沈着、炎症あるいは胆汁鬱滞などの肝障害を動物で引き起こす条件を見いだし、さらに、それらの動物モデルにクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を摂取せしめることにより肝障害が予防ならびに治療できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の肝庇護剤は、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分として含むことを特徴とするものである。
本発明において使用されるクロストリジウム・ブチリカムとしては、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０１９株、ＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２２、およびクロストリジウム・ブチリカム  ＡＴＣＣ  ８６０株など、すべてのクロストリジウム・ブチリカムが使用できるが、これらのうち、好ましくは、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株（以下、単に「ＮＩＰ１０２０株」と称することもある）、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株（以下、単に「ＮＩＰ１０２１株」と称することもある）及びクロストリジウム・ブチリカム  ＡＴＣＣ１９３９８株（以下、単に「ＡＴＣＣ株」と称することもある）が使用される。なお、上記クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株は、特公昭３７−８３００号に記載されたクロストリジウム・ブチリカム  ミヤイリ株と同等であり、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９５号で、平成９年１月２３日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている菌株である。
また、本発明において好ましく使用されるクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株の菌学的性質を示す。
（ａ）形態
１）  細胞の形および大きさ：  直線状または曲線状で両端が鈍円の桿菌である。大きさは、０．６〜１．２μｍ×５〜１０μｍである。芽胞は、末端が丸い卵円形の亜端在性(subterminal)である。
２）  運動性の有無：  有り
３）  胞子の有無：  有り
（ｂ）培養的性質
１）  １％スターチ添加肉汁寒天平板培養：  コロニーは円形から不規則形で白っぽいクリーム色でかつ凸状に隆起している。コロニーの大きさは、３７℃で２日間培養した際、直径約２〜４ｍｍである。
２）  １％スターチ添加肉汁液体培養：  酸及びガスを酸性
３）  １％スターチ添加肉汁ゼラチン寒天平板培養：  ゼラチンの液化なし
４）  リトマス・ミルク：  酸性、ガス、凝固
（ｃ）生理学的性質
１）  グラム染色性：  ＋
２）  硝酸塩の還元：  −
３）  インドールの生成：  −
４）  デンプンの加水分解：  ＋
５）  カタラーゼ：  −
６）  酸素に対する態度：  嫌気性
７）  生育の範囲：  ｐＨ；５．０〜８．０
温度；２０〜４２℃
８）  下記糖類からの酸の生成の有無
セロビオース；      ＋
Ｄ−フラクトース；  ＋
Ｄ−ガラクトース；  ＋
ラクトース；        ＋
マルトース；        ＋
Ｄ−マンノース；    ＋
メリビオース；      ＋
ラフィノース；      ＋
ラムノース；        −
サリシン；          ＋
Ｄ−ソルビトール；  −
シュークロース；    ＋
トレハロース；      ＋
Ｄ−キシロース；    ＋
（ｄ）  その他の生理学的性質
１）  溶血性：  −
２）  レシチナーゼ：  −
３）  発酵産物：  酪酸、酢酸
本菌を、バージーズ  マニュアル  オブ  システマティック  バクテリオロジー第９版(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 9th)を参考に分類したところ、クロストリジウム・ブチリカムに帰属することが分かった。このクロストリジウム・ブチリカムについて、下記実施例において記載されるように、肝障害の予防及び治療効果を調べたところ、公知の菌株（クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカム  ＡＴＣＣ  １９３９８株）に比べて有意に高い肝障害の予防効果を有することが分かった。これにより、上記菌株を新規な微生物であると考え、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株と命名し、平成９年１月２３日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−５７９４号である。
なお、クロストリジウム・ブチリカムは、生菌剤、飼料添加物、さらには、食品として広く市販されており、人や家畜などの哺乳動物に長期間にわたって投与しても全く副作用を認めず、高い安全性が保証されている。
本発明において、クロストリジウム・ブチリカムの培養物、即ち、「クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液、該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣及び該残渣の乾燥物」は、既知の微生物の培養方法、例えば、特願平０８−２５２０８８号に開示された方法により得られる。その一実施態様を下記に示す：クロストリジウム・ブチリカムを１．０（ｗ／ｖ）％  ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％  酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％  コーンスターチ及び０．２（ｗ／ｖ）％  沈降炭酸カルシウムからなる培地に１０5〜１０6個／ｍｌになるように接種し、３７℃にて４８時間静置培養することにより、「クロストリジウム・ブチリカムの培養液」を得る。次に、得られた培養液を遠心分離（２，０００〜６，０００ｇ×１０〜３０分）して、「培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣」を分離し、この残渣を、０〜８０℃、好ましくは１０〜２０℃で、１〜２４時間、好ましくは５〜１８時間風乾等による乾燥処理または０〜８０℃、好ましくは１０〜２０℃、０．０５〜５００Ｔｏｒｒ、好ましくは１〜１００Ｔｏｒｒで、１〜２４時間、好ましくは２〜１５時間減圧乾燥処理することなどにより「残渣の乾燥物」を得る。
本発明のクロストリジウム・ブチリカムの培養に使用する培地は、使用する菌株の種類等によっても異なるが、使用するクロストリジウム・ブチリカムが資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びビタミン類などのその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。
例えば、本発明による培地中で使用される炭素源の例として、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。炭素源としては、必ずしも糖に制限されないが、菌体の増殖を考慮すると、使用する細菌が利用可能な糖または糖を含むものが好ましく使用される。使用できる炭素源の具体例としては、資化性を考慮して、セロビオース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、サリシン、スターチ、シュクロース、トレハロース、キシロース、デキストリン、および糖蜜等が挙げられる。これらの炭素源のうち、スターチ、グルコース、フルクトース、シュクロース及び糖蜜が好ましく使用される。上記した炭素源を、使用するクロストリジウム・ブチリカムを考慮して、１種または２種以上選択して使用してもよい。この際、炭素源の添加濃度は、使用するクロストリジウム・ブチリカムや炭素源の種類および使用する培地の炭素源以外の培地組成等によっても異なるが、通常、０．５〜５（ｗ／ｖ）％、好ましくは、２〜４（ｗ／ｖ）％である。
また、窒素源およびビタミン類としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、味液等の大豆及び小麦の加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素化合物および硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩が挙げられる。これらの窒素源のうち、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー及び味液が好ましく使用される。上記した窒素源及びビタミン類を、使用するクロストリジウム・ブチリカムの生育を向上させるために、１種または２種以上選択して使用してもよい。この際、上記窒素源の添加濃度は、使用する菌株や窒素源の種類および使用する培地の窒素源以外の培地組成等によっても異なるが、窒素源を多く含むペプトンを使用する際には、通常、０．５〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜３（ｗ／ｖ）％であり、窒素源及びビタミン類を多く含む味液やコーンスティープリカーを使用する際には、通常、０．５〜５（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜４（ｗ／ｖ）％であり、さらに、ビタミン類を多く含む酵母エキスあるいは肉エキスを使用する際には、通常、０．５〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜３（ｗ／ｖ）％である。
さらに、無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、モリブデン、ストロンチウム、ホウ素、銅、鉄、スズ及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。また、培地中に、必要に応じて、消泡剤、植物油、界面活性剤、血液及び血液成分、ビタミン類、抗生物質などの薬剤、植物または動物ホルモンなどの生理活性物質等を適宜添加してもよい。
本発明において行われる培養の条件は、本発明に使用するクロストリジウム・ブチリカムの生育の範囲（ｐＨや温度等）等の生理学的性質によって異なるが、クロストリジウム・ブチリカムは偏性嫌気性であるため、通気しない、または窒素若しくは炭酸ガスを通気しながら、または培地中に還元剤を加えることにより酸化還元電位を下げるなどによって嫌気的条件下培養されることが必要である。その際の培養条件は、使用される菌株の生育の範囲、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖できる条件であれば特に制限されない。具体的には、培養温度は、２０〜４２℃、好ましくは３５〜４０℃である。
また、本発明において、クロストリジウム・ブチリカムの培養は、培養中に産生される酸をアルカリで中和することにより増殖が促進されるため、予め培地に炭酸カルシウムを添加することが好ましい。この際、炭酸カルシウムの添加量は、０．１〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．２〜２．５（ｗ／ｖ）％である。または、上記中和工程を、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム及び炭酸カリウム等のアルカリ水溶液によって培地のｐＨを設定ｐＨの範囲内に抑えながら行うことも好ましい。なお、アルカリ水溶液を使用する場合には、「設定ｐＨ」とは、培養期間中に予め設定されている培地のｐＨを意味し、「設定ｐＨの範囲」とは、培養期間中に許容されるｐＨの範囲であり、一般的には、設定ｐＨ±許容差で表わす。本発明によると、設定ｐＨは、通常、５．０〜７．５、好ましくは５．５〜６．５の範囲内で設定され、設定ｐＨの範囲は、設定ｐＨ±０．５、望ましくは設定ｐＨ±０．２である。
なお、本発明において、培養を行う間の培地のｐＨは、菌の接種時では中性付近、より好ましくは６．５〜７．５とする。なお、アルカリ水溶液を使用する場合には、酸素が混入しないように緩やかに攪拌しながら設定ｐＨの範囲内に入るよう維持することが好ましい。このように菌の接種時および菌の増殖時のｐＨを制御することによって、菌密度を飛躍的に増大させることができる。
本発明による培養において、クロストリジウム・ブチリカムの初期培養濃度は、クロストリジウム・ブチリカムが生育できる範囲であれば特に制限されず、通常、クロストリジウム・ブチリカムの培養で行われるものと同様である。具体的には、通常、１０4〜１０7個／ｍｌ、好ましくは１０5〜１０6個／ｍｌである。
このようにして得られたクロストリジウム・ブチリカムの培養物、特にクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株の培養物は、アルコール摂取、有機溶剤、薬剤、ウィルス、ストレス、栄養不足または栄養過多などのによる肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着（脂肪化）、鬱血及び胆汁鬱滞、さらには肝細胞の風船様変化、肝細胞の破壊や壊死等の肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対して優れた予防及び治療効果を有する。
本発明の肝庇護剤は、前記クロストリジウム・ブチリカムの培養物そのままの形態でまたは前記クロストリジウム・ブチリカムの培養物に製薬上許容される担体を配合して経口投与用または非経口投与用組成物として患者（家畜、家禽やヒト等の哺乳動物、および魚を含む）に投与できる。本剤を経口投与用とする場合には、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成若しくは天然ガム、及び結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、カルボシキメチルセルーロースやメチルセルーロース等のセルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、及びポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、炭酸水素ナトリウム及びアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、および炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、及びリン酸ナトリウム等の充填剤または希釈剤などと適宜混合して、錠剤、散剤（粉末）、丸剤、および顆粒剤などの固型形態にすることができる。または、経口投与用の肝庇護剤は、カプセル剤の形態を有していてもよく、この際、カプセルとしては、硬質あるいは軟質のゼラチンカプセルが用いられる。これらの固型製剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート、及びメタアクリレートコポリマー等の被覆用基剤を用いて腸溶性被覆を施してもよい。さらに、本発明のクロストリジウム・ブチリカムの培養物を、精製水等の一般的に用いられる不活性希釈剤またはトリカプリン、トリアセチン等のグリセリンエステル類またはエタノール等のアルコール類に懸濁して、必要に応じて、この溶液に浸潤剤、乳化剤、分散助剤若しくは界面活性剤、甘味料、フレーバー若しくは芳香物質などを適宜添加することにより、シロップ剤やエリキシル剤等の液状製剤とすることもできる。
また、本発明の肝庇護剤を非経口投与用とする場合には、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理的食塩水、リンガー溶液やロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび慣用される防腐剤、安定剤及び界面活性剤等と適当に組み合わせた滅菌された水溶液若しくは非水溶液、懸濁液、リポソーム、またはエマルジョンとして、液状製剤化できる。この際、液状製剤は、生理学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨを有することが好ましい。また、本発明の肝庇護剤を、公知の方法を用いて、軟膏、ローションまたはクリーム等の経皮用製剤として形成してもよい。
また、本発明の肝庇護剤は、例えば、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸等からなる中性付近、あるいはｐＨ３〜７の緩衝液を用い、必要に応じて防腐剤、安定剤、浸透圧調節剤等を加えて点眼剤の形態にしてもよい。
さらに、本発明の肝庇護剤は、ペレットによる埋め込み、またはゼラチンソフトカプセル等の坐薬用基剤を用いた坐薬として投与されることも可能である。
上述したうち、好ましい投与形態や投与経路などは、担当の医師によって選択される。
本発明の肝庇護剤中に含まれるクロストリジウム・ブチリカムの培養物の濃度は、投与時の形態、病気の種類や重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、一般的には、原料の全重量に対して、菌体の重量が０．１〜５０重量％、好ましくは１〜１０重量％となる範囲である。特に、本発明の製剤が経口投与される場合には、原料の全重量に対して、菌体の重量が０．１〜５０重量％、より好ましくは１〜１０重量％となる範囲であり、非経口投与される場合には、原料の全容量に対して、菌体の重量が０．１〜５０重量％、より好ましくは１〜１０重量％となる範囲であることが好ましい。この際、クロストリジウム・ブチリカムの培養物の濃度が前記上限値を超えると、均質な投与量が得られず好ましくない。これに対して、クロストリジウム・ブチリカムの培養物の濃度が前記下限値未満であると、本発明によって得られるべき病態改善効果が十分に期待できずやはり好ましくない。
本発明の肝庇護剤の投与量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって異なり、正確な量は医師が決定するものである。具体的には、本発明の肝庇護剤を経口投与する場合には、クロストリジウム・ブチリカムの培養液を培養物として使用する際には、通常、０．０１〜１０ｍｌ／ｋｇ体重／回、より好ましくは０．１〜２ｍｌ／ｋｇ体重／回の投与量の範囲で、また、この培養液を遠心分離して得た菌体、抽出物、精製物質またはその乾燥物を培養物として使用する際には、通常、０．０１ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重／回、より好ましくは１ｍｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重／回の投与量の範囲で、それぞれ、１日に１〜６回、より好ましくは１〜３回に分けて投与されるのが望ましい。この際、１日当たりの投与量が多い場合には、１回に複数個の錠剤等の製剤に分けて投与してもよい。また、本発明の肝庇護剤を非経口投与する場合には、菌体重量の換算して、通常、０．０１ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重／回、より好ましくは１ｍｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重／回の投与量の範囲で、１日に１〜６回、好ましくは１〜３回に分けて投与されるのが望ましい。
本発明の他の特徴の一つは、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を１０-6〜１重量％、好ましくは１０-6〜０．１重量％混入した食品または飼料である。本発明では、上記混入は、予め所定量の培養物を混入した食品、飲水若しくは飼料の形態であっても、または摂取時に所定量の培養物を混入した食品、飲水若しくは飼料の形態であってもよい。
本発明において、培養物の混入量を１０-6〜１重量％としたのは、１０-6重量％未満では培養物による十分な肝障害改善または保護作用が期待できず、また、１重量％を超えると食品等としての味覚、風合い及び食感が損なわれる可能性が高いため、好ましくない。
本発明に係る食品としては、ヨーグルト、チーズ等のの乳製品、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、なると、つみれ等の水産練り製品、でんぶ等の魚介類加工品、ソーセージ、フランクフルト、レバーペースト等の食肉加工品、豆腐、焼き豆腐、生揚げ、油揚げ、がんもどき、おから、凍り豆腐、湯葉等の豆製品、ピューレ等の野菜加工品、マッシュポテト、くず、はるさめ、こんにゃく、しらたき等の芋加工品、もち、白玉、白飯、麩、ビーフン、マカロニ、スパゲッティ、そうめん、そば、うどん、中華めん、食パン、乾パン、アンパン等の穀物の加工品、ジャム等の甘味類、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング等の油脂類、あめ、らくがん、せんべい、あられ、カステラ、ようかん、もなか、まんじゅう、大福もち、だんご、ういろう、チョコレート、ビスケット、クッキー、ドーナツ、ケーキ、パイ、アイスクリーム、プリン、ババロア、ガム等の菓子類、豆腐、ゼリー、コンニャク、寒天またはトコロテン等のゲル状食品、コンブ、ワカメ、ノリ、テングサ等の海草類など、通常食することのできるすべての食品が挙げられる。
また、本発明に係る飼料としては、ブタ、ウシ、ヒツジやヤギ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギやハムスター等のペット、家禽及び魚など、通常、飼育される動物用のエサはすべて含まれる。
以下に、本発明のクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカム  ＡＴＣＣ  １９３９８株に関する毒性試験を行い、その安全性を確認した：クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカム  ＡＴＣＣ  １９３９８株を、１．０（ｗ／ｖ）％  ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％  酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％  コーンスターチ及び０．２（ｗ／ｖ）％  沈降炭酸カルシウムからなる培地に約１０6個／ｍｌになるように接種し、３７℃にて４８時間静置培養し、得られた培養液を遠心分離（４，０００ｇ×２０分）して菌体を分離した後、菌体を乾燥処理（１５℃、２０Ｔｏｒｒで１２時間減圧処理）することにより菌体乾燥末を得る。この菌体乾燥末をマウス用エサ（オリエンタル酵母工業株式会社製、製品名：ＭＦ）（以下、単に「マウス用エサ」と称する）に重量比で１：１０5で混合して、調製飼料を調製した。４週令のｄｄｙ系マウス（オス、１７〜２０ｇ）５匹を１群として予め同一ケージ内で上記マウス用エサを３日間与えて飼育した後、上記で調製した調製飼料をさらに６カ月間与えて飼育した。この際、調製飼料の代わりにマウス用エサ単独を使用する以外は同様にして飼育した「無投与群」を比較対照とした。なお、すべての試験群において、マウスの餌摂取量は３〜８ｇ／日／匹であった。結果を下記表１に示す。
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表１に示されるように、本発明において好ましく使用される３菌株はすべて、マウスの体重及び状態において無投与群と差異は認められず、これより、上記３菌株の安全性が確認された。
次に、本発明を下記実施例をもってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカム  ＡＴＣＣ  １９３９８株を、１．０（ｗ／ｖ）％  ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％  酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％  コーンスターチ及び０．２（ｗ／ｖ）％  沈降炭酸カルシウムからなる培地に約１０6個／ｍｌになるように接種し、３７℃にて４８時間（静置または振盪）培養した。得られた培養液を遠心分離（４，０００ｇ×２０分）して菌体を分離した後、菌体を乾燥処理（１５℃、２０Ｔｏｒｒで１２時間減圧処理）することにより、それぞれの菌体の乾燥末を調製した。
実施例２
下記実験を行い、本発明の菌株（ＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株）のエタノールによる肝障害予防効果を調べた。
水０．６ｍｌをゾンデを用いて日に２回強制的に経口投与すると同時に水を自由摂取させた無処理群（Ｂ群）以外は、すべての群（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ群）に関して、シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ：３匹／群）に、下記処理を３カ月間施して、エタノールによる肝障害動物モデルを作製した：２５（ｗ／ｖ）％エタノール水溶液０．６ｍｌを２０ゾンデを用いて日に２回強制的に経口投与すると同時に、５（ｗ／ｖ）％エタノール水溶液を飲水として自由摂取させた。また、本実験期間中、各ハムスター群に、以下に示されるエサをそれぞれ与えて飼育した。
Ａ群：オリエンタル酵母工業株式会社製、製品名：ＭＦのハムスター用エサ（以下、単に「ハムスター用エサ」と称する）（ネガティブコントロール）；
Ｂ群：ハムスター用エサ（無処理群）；
Ｃ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２０株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｄ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２１株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２１株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｅ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＡＴＣＣ株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＡＴＣＣ株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｆ群：肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸のエタノール溶液（０．１ｍｇ／ｃｃ９９．５％エタノール）をハムスター用エサに１ｋｇ当たり１０ｍｇのウルソデスオキシコール酸が含まれるように吸収させた後風乾させた調製飼料（ウルソデスオキシコール酸投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
３カ月間の処理終了後、各々処理されたマウス群に関して、触診による上腹部の腫れを調べたところ、Ａ群では腫れを確認し、Ｂ群及びＣ群では上腹部の腫れは認められなかったが、Ｄ群、Ｅ群及びＦ群において上腹部にやや腫れを認めた。また、それぞれのマウス群について、肝所見として体重１００ｇ当たりの肝臓の容積（ｍｌ／１００ｇ体重）、辺縁鈍化及び脂肪の沈着を調べた。結果を下記表２に示す。
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表２から明らかなように、本発明のＮＩＰ１０２０株投与群（Ｃ群）、ＮＩＰ１０２１株投与群（Ｄ群）及びＡＴＣＣ株投与群（Ｅ群）はすべてネガティブコントロールであるＡ群に比べて有意に肝腫大及び脂肪の沈着を抑制し、この抑制効果は肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸と同等またはそれ以上であることから、本発明のＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株の培養物は、エタノールによる肝障害（アルコール性肝疾患）を有効に予防することが示された。また、本実施例において使用された菌株のうち、特にＮＩＰ１０２０株投与群（Ｃ群）は無処理群（Ｂ群）とほぼ同等の結果にまで肝腫大、辺縁鈍化及び脂肪の沈着を抑制したことから、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を有効成分として含む配合物はアルコール性肝疾患に有効な予防薬としての可能性を有することが示唆される。
実施例３
下記実験を行い、本発明の菌株（ＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株）の四塩化炭素による肝障害予防効果を調べた。
シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ：４匹／群）にパラフィン油０．２ｍｌ単独を毎週２回の割合で計６カ月間にわたって皮下注射した比較群（Ｈ群）以外は、すべての群（Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬ群）に関して、シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ：４匹／群）に、下記処理を計６カ月間施して、四塩化炭素による肝障害動物モデルを作製した：最初の４カ月間は２．５ｍｇ／０．２ｍｌ、次の１カ月間は３．２ｍｇ／０．２ｍｌ、及び最後の１カ月間は４．０ｍｇ／０．２ｍｌの濃度の四塩化炭素のパラフィン油混合液０．２ｍｌを、毎週２回の割合で計６カ月間にわたって皮下注射した。また、本実験期間中、各ハムスター群に、以下に示されるエサをそれぞれ与えて飼育した。
Ｇ群：ハムスター用エサ（ネガティブコントロール）；
Ｈ群：ハムスター用エサ（比較群）；
Ｉ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２０株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｊ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２１株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２１株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｋ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＡＴＣＣ株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＡＴＣＣ株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｌ群：肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸のエタノール溶液（０．１ｍｇ／ｃｃ９９．５％エタノール）をハムスター用エサに１ｋｇ当たり１０ｍｇのウルソデスオキシコール酸が含まれるように吸収させた後風乾させた調製飼料（ウルソデスオキシコール酸投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
６カ月間の処理終了後、各々処理されたマウス群に関して肝所見（上腹部に腫れ、辺縁鈍化、肝臓の白色化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞及び炎症）を調べたところ、Ｇ群では６カ月後には触診において上腹部に腫れを確認し、さらに、辺縁鈍化、肝臓の白色化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞および炎症を認め、明らかに四塩化炭素による肝障害が起きていることを確認した。また、Ｉ群及びＬ群では、上腹部の腫れ、辺縁鈍化、肝臓の白色化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞および炎症はほとんど認められなかったが、Ｊ群及びＫ群では、上腹部にやや腫れを認め、辺縁鈍化がやや多く認められた。詳細な結果を下記表３に示す。
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表３から明らかなように、本発明のＮＩＰ１０２０株投与群（Ｉ群）、ＮＩＰ１０２１株投与群（Ｊ群）及びＡＴＣＣ株投与群（Ｋ群）はすべてネガティブコントロールであるＧ群に比べて有意に肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞及び炎症を抑制し、この抑制効果は、肝腫大がＮＩＰ１０２１株（Ｊ群）及びＡＴＣＣ株（Ｋ群）でやや劣るものの、全般的には、肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸と同等またはそれ以上であることから、本発明のＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株の培養物は、四塩化炭素による肝障害（脂肪肝や中毒性肝障害）を有効に予防することが示された。また、本実施例において使用された菌株のうち、特にＮＩＰ１０２０株投与群（Ｉ群）は、比較群（Ｈ群）やウルソデスオキシコール酸投与群（Ｌ群）とほぼ同等の結果にまで肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞及び炎症を抑制したことから、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を有効成分として含む配合物は脂肪肝や中毒性肝障害に有効な予防薬としての可能性を有することが示唆される。
実施例４
実施例２及び３において特に優れた予防効果が認められたＮＩＰ１０２０株について下記実験を行い、四塩化炭素による肝障害治療効果を調べた。
シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ）に、実施例２と同様の処理を施して、四塩化炭素による肝障害動物モデルを作製した。６カ月間四塩化炭素投与後、腹部に腫れを認めたハムスターを２群（４匹／群）に分け、一方の群はハムスター用エサ単独で１カ月間飼育し（Ｍ群：四塩化炭素投与後の通常飼育群）、他方の群はハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株の乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料で１カ月間飼育した（Ｎ群：四塩化炭素投与後のＮＩＰ株投与群）。
また、上記実験において、四塩化炭素投与期間中ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株の乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料で飼育する以外は同様の実験を繰り返して四塩化炭素処理を６カ月間行ったハムスターを２群（４匹／群）に分け、一方の群はハムスター用エサ単独で飼育した群をＯ群（ＮＩＰ処理四塩化炭素投与後の通常飼育群）とし、他方の群はハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株の乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料で飼育した群をＰ群（ＮＩＰ処理四塩化炭素投与後のＮＩＰ株投与群）とし、それぞれ１カ月間飼育した。
所定期間飼育後、実施例３と同様にして肝臓の様子を観察した。結果を表４に示す。
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表４から明らかなように、Ｍ群では、実施例３におけるＧ群の結果と比較することにより、肝障害の原因たる四塩化炭素の投与を中止した後も肝障害による症状は進行するが、Ｎ群の結果から、四塩化炭素による肝障害が生じた後でも本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を投与すると肝腫大、辺縁鈍化及び胆汁鬱滞の症状の軽減が認められ、高度な肝障害に対してもＮＩＰ１０２０株の培養物の投与が有効であることが示される。さらに、表４、Ｏ群及びＰ群の結果から、四塩化炭素の投与と同時にＮＩＰ１０２０株の培養物を含むエサを与えると、四塩化炭素の投与の中止と同時にＮＩＰ１０２０株の培養物の摂取を中止させても、Ｍ群はもとよりＮ群よりも肝障害はほんど受けず、特に本実験期間中を通して毎日ＮＩＰ１０２０株の培養物を投与された群（Ｐ群）は最も肝障害を受けてないことが分かった。したがって、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物は、四塩化炭素による肝障害（脂肪肝や中毒性肝障害）を有効に治療することから、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を有効成分として含む配合物は脂肪肝や中毒性肝障害に有効な治療薬としての可能性を有することが示唆される。
産業上の利用可能性
上述のように、本発明のクロストリジウム・ブチリカムは、高い肝障害改善作用及び肝保護作用を有する新規な微生物である。したがって、本発明にかかるクロストリジウム・ブチリカム、特にクロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカム  ＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカム  ＡＴＣＣ  １９３９８株の培養物は、肝障害を治療および／または予防する製剤において、さらには、健康食品または飼料において非常に有用である。
また、本発明の肝庇護剤は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を有効成分として含むので、高い肝障害予防作用及び肝障害治療作用さらには哺乳動物に対する高い安全性を有するため、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を治療および／または予防するのに非常に有効に使用できる。
さらに、本発明の食品および飼料は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物からなるため、高い安全性や肝障害改善作用及び肝保護作用は確保されたまま、公知の食品に混入されているため、不快感を伴わずに容易に食することができるという利点を有する。