(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
0003868494.tif 000023
または配列：
0003868494.tif 000024
を含む単離されたペプチドであって、配列番号４に記載のアミノ酸配列をもつ哺乳動物オピオイド受容体と結合し、かつμ、δまたはκ−オピオイド受容体に結合しない、前記ペプチド。
【請求項２】
ペプチドがヘプタデカペプチドである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
放射性同位体で放射性標識された、請求項１または２記載のペプチド。
【請求項４】
ヨウ素の放射性同位体で放射性標識された、請求項３記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号３でコードされるか、あるいは配列番号４に記載のアミノ酸配列をもつ受容体と特異的に結合し、かつμ、δまたはκ−オピオイド受容体に結合しない、請求項１−４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
哺乳動物オピオイド受容体と１００ｎＭ以下のＫｉで結合する、請求項１−５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
薬剤的に有効量のペプチドを動物に投与することを含む、動物においてオピオイドの生理学的作用に拮抗するための方法に用いる、請求項１−６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドが動物においてモルフィン誘導性の痛覚脱失作用に拮抗するために投与される、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
オピオイドがモルフィンである、請求項７記載のペプチド。
【請求項１０】
前記方法が、さらに、第２の抗オピオイド薬を動物に投与することを含み、該第２抗オピオイド薬と抗オピオイドペプチドを、合わせてオピオイドの生理学的作用に拮抗するのに十分な量で投与する、請求項７，８または９に記載のペプチド。
【請求項１１】
請求項１−６のいずれかに記載のペプチドと薬剤用キャリヤーを含む、薬剤組成物。
【請求項１２】
診断剤および／または療法剤である、請求項１１記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
動物に診断的または療法的に有効な量の薬剤組成物を投与する工程を含む、動物における運動性疾患を診断または治療する方法に用いる、請求項１１または１２に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
請求項１−６のいずれかに記載のペプチドの類似体または模倣体を製造する工程を含む、オピオイド受容体リガンドを設計する方法。
【請求項１５】
哺乳動物受容体を発現する細胞において該受容体との結合能につき化合物をスクリーニングする方法であって、
(ａ)真核細胞または原核細胞の培養物を、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有する哺乳動物受容体を発現することのできる組換え発現構築体で形質転換し、その際、形質転換した細胞培養物の細胞が該受容体を発現し；
(ｂ)形質転換した細胞培養物を、種々の量の前記化合物と競合して請求項１４記載の検出可能な標識ペプチドを結合する量につきアッセイし；そして
(ｃ)該化合物の存在下で検出可能な標識ペプチドの結合を阻害する程度を計算することにより、化合物が該オピオイド受容体に競合結合するか否かを判定する、工程を含む方法。
【請求項１６】
追加工程：
(ｄ)該化合物の結合能を、哺乳動物オピオイド受容体に結合することが知られている他の化合物の結合能と比較し、その際、他の化合物が天然または合成オピオイド受容体アゴニストおよびアンタゴニストを含む、
を含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
請求項１−８のいずれかに記載のペプチドと、動物に順に、あるいは同時に投与するための第２抗オピオイド薬とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
本発明は、少なくとも一部は国立衛生研究所補助金ＲＯ１  ＭＨ４８９９１のもとで政府の援助によりなされた。政府は本発明に一定の権利をもちうる。
発明の背景
発明の分野
本発明は、哺乳動物種由来の受容体、およびそれらの受容体に特異的なリガンドであって、オピオイド作用に拮抗する活性をもつものに関する。詳細には、本発明は新規な哺乳動物受容体に特異的な内因性ペプチドリガンドの単離、その抗オピオイド特性の認識、およびモルフィンなどのオピオイドの生理学的作用を逆転させるためにそのリガンドを使用することに関する。本発明はまた、この内因性哺乳動物受容体リガンドの類似体、誘導体およびペプチド模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）、ならびにそれらをオピエートアンタゴニストとして使用することに関する。具体的には、哺乳動物視床下部由来の内因性オピオイド受容体リガンド、それらの合成品および類似体、ならびにそれらのリガンドを製造および使用する方法が提供される。
発明の背景
アヘンおよびモルフィンなどのオピエートの使用（および乱用）は太古から知られている（Brownstein,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5391-5393に概説）。１９世紀以来、モルフィンの鎮痛作用をもつが嗜癖効力をもたない化合物を見出すために、化学的解明がなされ、多数のモルフィン類似体が合成された。これらの試みはこれまでは成功していない。
モルフィンおよびモルフィン様化合物の鎮痛性および嗜癖性を裏付ける生物学的根拠は、エンケファリンと呼ばれる内因性のモルフィン様化合物の発見により初めて明らかになった（概説に関してはDiChara & North,1992,Trends in Pharmacol.Sci.13:185-193参照）。この内因性オピオイド発見に伴って、関連はあるが別個であり、それぞれがオピエートアゴニストおよびアンタゴニストに対し独自の薬理学的反応プロフィルを示す一群のオピエート受容体につき生化学的証拠が得られた（概説に関してはNcKnight & Rees,1991,Neurotransmissions 7:1-6参照）。現在までに、薬理学的プロフィルおよび解剖学的分布により異なる４種類のオピエート受容体が報告されている。これらはμ、δ、κおよびσ受容体からなる（σ受容体は、あるいオピオイドアゴニスト類との交差反応性を示す非オピオイド受容体であることが判明した）。
このように哺乳動物オピオイド受容体は当技術分野で既知であり、これらのタンパク質のうちあるものは生化学的に単離され、それらに対応する遺伝子が遺伝子工学的手段で最近クローン化された。
Kieffer et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:12048-12052に、発現クローン化によりマウスδ−オピオイド受容体のｃＤＮＡコピーを単離することが示されている。
Evans et al.,1992,Science 258:1952-1955にも、発現クローン化によりマウスδ−オピオイド受容体のｃＤＮＡコピーを単離することが示されている。
Chen et al.,1993,Molec.Pharmacol.44:8-12には、ラットμ−オピオイド受容体のｃＤＮＡコピーを単離することが示されている。
Yasuda et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6736-6740には、マウスκ−およびδ−オピオイド受容体それぞれのｃＤＮＡコピーを単離することが示されている。
Bzdega et al.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:9305-9309に、マウスδ−オピオイド受容体を単離し、染色体上の位置を決定することが示されている。
本発明者らは、本出願人による出願中の米国特許出願第08/149,093号（1993年に11月8日出願）に開示した新規な哺乳動物受容体遺伝子をクローン化し、発現させ、機能解明した。その全体が参考として本明細書に含まれるものとする。そこに具体的に開示されるのは、新規な哺乳動物受容体遺伝子のコード核酸、この受容体遺伝子を含む組換え発現構築体、そのような構築体を含み、新規な遺伝子を発現する細胞、そのような核酸を調製および使用する方法、ならびにオピオイドを検出し、新規な薬物をスクリーニングするための構築体および細胞である。当該受容体タンパク質の遺伝子核酸配列および推定アミノ酸配列も、この先行出願に開示されている。
この受容体遺伝子はメタドンを高い親和性で結合するので、これまで上記明細書においてＭＳＯＲ（メタドン特異性オピオイド受容体）遺伝子と呼ばれている。このような高い親和性がメタドンに対する特異性を形成するが、この用語はメタドンのみがこの受容体に結合することを意味するのではない。事実、本明細書に示すように本発明の内因性リガンドはこの同じ受容体に著しく高い親和性で結合する（ピコモルまたはナノモル量で脳室内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ、ｉｃｖ）投与した場合に生理的反応を生じる）。内因性リガンドが見出され、本出願人による出願中の米国特許出願第08/514,451号（1995年8月11日出願）に開示されているので、ＭＳＯＲという名称はもはや必要ない。このリガンドは、開示された最初と最後のアミノ酸にちなんでオルファニン（ｏｒｐｈａｎｉｎ）ＦＱ（ＯＦＱ）と呼ばれる（Ｆはフェニルアラニン、Ｑはグルタミン）。したがって上記の受容体は今後、オルファニンＦＱ受容体（ＯＦＱＲ）と呼ばれるであろう。これは抗オピオイド受容体（ＡＯＲ）である。
哺乳動物のオピオイド受容体または抗オピオイド受容体への結合により活性（鎮痛作用など）を及ぼす新規な向精神薬を開発する試みにとってきわめて有利なのは、そのような受容体に結合する内因性リガンドを確認することである。特定のこのようなオピオイドリガンドが先行技術において単離された。これにはエンドルフィンおよびエンケファリンを含むペプチドが含まれる（Jaffe and Martin,1990,“オピオイド系鎮痛薬およびアンタゴニスト”、Goodman and Gilman編、The Pharmacological Basis of Therapeutics,第7版(パーガモン・プレス社、ニューヨーク)、21章、p.491-531）。
オピエートは有効な療法薬であるが、それらを臨床的に用いるには多くの問題があるため、それらの療法指数はかなり低い。そのような問題には、昏迷、呼吸不全、または望ましくない深刻な痛覚脱失（ａｎａｌｇｅｓｉａ）（および虫垂炎などの急性の外科的緊急疾患の隠蔽症状）が含まれる。モルフィンその他のオピエートに対する身体依存性も発現する可能性があり、これを医師が診断するのは困難である。このような状況でオピエートの生理学的作用（望ましくない痛覚脱失または無呼吸）を軽減するために、または嗜癖を立証する禁断症状を促進するために、アンタゴニストを投与してオピエートの作用を逆転させるのが臨床的に有用であることが認識された。
オピオイドアンタゴニストは重要であるにもかかわらず、この群に属する他の薬物の開発は緩慢にしか進んでいない。このようなアンタゴニストのうち最もよく知られているのはナロキソン、すなわちオキシモルフィンに類似し、μ、δ、κおよびσ−オピオイド受容体における競合性アンタゴニストである有機合成分子である。ナルトレキソンはもうひとつの比較的純粋なアンタゴニストであると考えられるが、経口有効性がより高く、かつ作用持続性がより長い。これらの薬物はオピオイド受容体と相互作用し、それに競合的に結合してアンタゴニスト作用を及ぼすと考えられる。それらは無呼吸や昏迷などのオピエート中毒の徴候を逆転させ、薬物依存者の不安、悪寒、腹部けいれん、頻脈、流涙および発汗を特色とする禁断症状を刺激することもできる。このような薬物が臨床的に求められているので、さらに他のオピオイドアンタゴニストの探索が続けられている。内因性アンタゴニストが、それらに予想される効力のため、また耐容性や嗜癖を発現する身体内生理学的経路に関してそれらが提供する貴重な情報のため、特に追求されている。これらの利点にもかかわらず、このような内因性抗オピオイドは長年、研究者に見出されなかった。
発明の概要
本発明は、抗オピオイド性生物学的系がオピオイド受容体へのオピオイドの結合により仲介される作用に生理的に対抗または拮抗するという知見を利用する。ＯＦＱ抗オピオイド受容体は、本出願人の米国特許出願第08/149,093号に開示されている受容体（ＭＳＯＲ）と同一である。本発明のリガンドは、本出願人の米国特許出願第08/514,451号に開示されているリガンドである。本願の処置方法は、この受容体は本発明のリガンドに結合した場合にオピオイドの生理的作用に拮抗するという本発明者らの認識により可能になった。
本発明は、配列番号：５および６として定めるアミノ酸配列をもち、新規な哺乳動物抗オピオイド受容体タンパク質に対するリガンドである、容易に製造できる小型のペプチドを提供する。本発明のペプチドの特色は、配列番号：５および６として定めるアミノ酸配列もしくはそのサブ配列をもつこと、この配列もしくはそのサブ配列のアミノ酸配列変異体であること、ならびにそれらの類似体および誘導体であって、哺乳動物オピオイド受容体タンパク質に対する配列番号：５および６として定めるアミノ酸配列をもつリガンドの類似体および誘導体であることである。
本発明方法は、動物（たとえばげっ歯類またはヒト）においてオピオイド（たとえばモルフィンまたはヘロイン）の生理学的作用（痛覚脱失または体温異常降下（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ））に拮抗する。本方法は、薬剤学的に有効な量の、配列番号：３に示したＤＮＡ分子によりコードされる受容体に高特異性で結合するペプチドを動物に投与することを含む。このペプチドは好ましくはアミノ末端ＦＧＧＦモチーフをもつヘプタデカペプチドであり、かつこのペプチドはμ、δまたはκ−オピオイド受容体に高特異性で結合することはない。これは、外因性オピオイドまたはストレス誘導性痛覚脱失が存在しない状態での疼痛刺激に対する動物のベースライン感受性以上に侵害受容感受性（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）を高めることなく、オピオイドの生理学的作用（痛覚脱失または体温異常降下）に拮抗する。ストレス誘導性痛覚脱失は、ストレスの多い環境刺激に反応して痛覚を低下させるための正常な生理学的メカニズムであり、内因性オピオイドが仲介すると考えられる。
薬剤学的に有効なペプチド量とは、オピエートの作用を自覚的または他覚的に軽減するのに十分な量である。たとえば、疼痛刺激に対するオピオイド誘導性痛覚脱失の程度を逆転させるのに十分な量、またはオピエート誘導性体温異常降下状態にある動物の体温を高めるのに十分な量である。上記のある態様では、この量はピコモルまたはナノモルのｉｃｖ投与量である。たとえばマウスにおいて薬剤学的に有効な量は、２μｌのベヒクル中５０ピコモルないし１０ナノモルのｉｃｖ投与量である。本発明は、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）またはくも膜下（ｉｔ）を含めた多数の経路で投与できる。このペプチドの抗オピオイド効力は著しいので、比較的少量のペプチドを静脈内投与することすら可能である。ヒトには脳室内投与せず、くも膜下投与量は容量２μｌ中１〜１０ナノモルであると考えられる。
さらに他の態様においては、ペプチドは本発明のペプチドの類似体、誘導体または模倣体である。類似体は、本発明のペプチドと同じ抗オピオイド活性をもつペプチドであるが、一次アミノ酸配列が異なる。一次アミノ酸配列の変更は、本明細書に記載される、当技術分野で既知の方法により行うことができる。ペプチドの模倣体は、動物において配列番号：３によりコードされる受容体に特異的に結合してオピオイドの生理学的作用に拮抗する分子、すなわちペプチドまたは他の生物薬剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（たとえば有機合成された化合物）である。
本発明の他の態様においては、本方法は第２の抗オピオイドアンタゴニストを動物に投与することを含み、その際、第２抗オピオイドアンタゴニストと抗オピオイドペプチドを、合わせてオピオイドの生理学的作用に拮抗するのに十分な量で投与する。第１および第２アンタゴニストは順に投与してもよく、混合物として同時に投与してもよい。たとえば本発明の抗オピオイドペプチドをベヒクル（たとえば等張食塩水）中でナロキソン（薬剤学的に有効な１ｍｇ／ｋｇ（動物の体重）の量）と混合して投与することができる。あるいは本発明の抗オピオイドペプチドを他の抗オピオイドペプチド（たとえば本発明のペプチドの類似体、または抗オピオイド活性をもつ他の内因性もしくは合成ペプチド）と組み合わせて投与することができる。
本発明のペプチドには、線状および環状ペプチド、ならびに合成によるそれらの類似体および変異体が含まれる。そのような変異体の特定の態様には、ペプチド中の１またはそれ以上の位置のアミノ酸残基が、本発明の親ペプチドの対応する位置のアミノ酸配列中にみられるものと異なるアミノ酸残基（非典型的アミノ酸残基も含む）で置換された置換変異体が含まれる。本発明のペプチド変異体の他の特定の態様には付加変異体が含まれ、それらの変異体ペプチドは本発明の親ペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシル末端領域または両方に共有結合した最高で合計約１０個の追加アミノ酸を含むことができる。そのような追加アミノ酸には非典型的アミノ酸が含まれてもよい。アミノ酸置換ペプチドおよび付加変異体ペプチドの線状または環状態様も、本発明のペプチドとして提供できる。さらに本発明のペプチドは、他の機能性ターゲティング剤、例えば免疫グロブリンフラグメントとの融合タンパク質として提供することもできる。本発明のペプチドの誘導体には、アミノ末端およびカルボキシル末端、ならびにアミノ酸側鎖基、たとえばアミン、カルボン酸、アルキルおよびフェニル基の修飾も含まれる。
第１観点において本発明は、次式のペプチドを提供する：
(Xaa)n-Phe-Gly-Gly-Phe-(A1)-(A2)-(A3)-(A4)-(A5)-(A6)-(A7)-(A8)-(A9)-(A10)-(A11)-(A12)-Gln-(Xaa)m
式中：Ａ1はＴｈｒ、ＬｅｕまたはＭｅｔであり；Ａ2はＧｌｙ、ＡｒｇまたはＴｈｒであり；Ａ3はＡｌａ、ＡｒｇまたはＳｅｒであり；Ａ4はＡｒｇ、Ｉｌｅ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり；Ａ5はＬｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅであり；Ａ6はＳｅｒ、ＰｒｏまたはＬｙｓであり；Ａ7はＡｌａ、Ｌｙｓ、ＧｌｎまたはＶａｌであり；Ａ8はＡｒｇ、Ｌｅｕ、ＴｈｒまたはＶａｌであり；Ａ9はＬｙｓ、ＰｒｏまたはＴｈｒであり；Ａ10はＴｙｒ、ＬｅｕまたはＴｒｐであり；Ａ11はＡｌａ、ＡｓｐまたはＶａｌであり；Ａ12はＡｓｎまたはＴｈｒであり；（Ｘaa）は任意のアミノ酸であり；ｎおよびｍは整数であり、ｎ＋ｍは８２を越えず、好ましくは２０を越えず、さらには１０を越えず；これらのアミノ酸はそれぞれ別個にＤまたはＬ立体化学的配置である。このペプチドは、配列番号：３で示されるアミノ酸配列をもつ哺乳動物オピオイド受容体に特異的に結合する。好ましい態様においては、上記ペプチドは次式の配列をもつ：
0003868494.tif 000002
他の好ましい態様においては、上記ペプチドは次式の配列をもつ：
0003868494.tif 000003
本発明のペプチドを産生する細胞または組織から常法により精製した天然態様のペプチド、およびそれらの合成態様も、本発明の範囲に含まれる。
他の態様においては、ペプチドは下記一般式：
(Xaa)n-Phe-Gly-Gly-Phe-(A1)-(A2)-(A3)-(A4)-(A5)-(A6)-(A7)-(A8)-(A9)-(A10)-(A11)-(A12)-Gln-(Xaa)m
のものであって、前記のアミノ酸置換基を有し、かつこれらのペプチドが放射性同位体との連結またはそれへの結合により放射性標識されたものである。好ましい態様においては、このペプチドは次式の配列：
0003868494.tif 000004
をもち、かつ放射性標識はヨウ素の放射性同位体である。他の好ましい態様においては、このペプチドは放射性標識結合部分に共有結合しており、放射性標識がヨウ素、ガリウム、テクネチウム、レニウムまたは他の有用な放射性同位体である。
本発明は、本発明のペプチドの薬剤組成物をも提供する。第１態様においては、本発明のペプチドは許容しうるキャリヤーもしくは希釈剤を含む薬剤組成物として、または無菌の水もしくは等張食塩水など、注入もしくは吸入の可能なベヒクルに懸濁した、予め定めた量のペプチドを含むバイアル剤などの剤形として提供される。他の剤形には錠剤またはカプセル剤が含まれ、これらは特に合成模倣体の経口投与用として、より好適である。
第２観点においては、それらの薬剤組成物は検出可能な標識態様で提供され、インビボおよびインビトロで、正常および病的いずれのペプチドリガンド受容体結合部位をも診断同定するのに有用である。このような態様においては、本発明のペプチドはたとえば、特に受容体結合に必須でないチロシン残基を介してペプチドに結合したＩ−１２３、Ｉ−１２５またはＩ−１３１などの放射性同位体で直接に標識されている。他の放射性同位体、たとえばＩｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８およびＴｃ−９９ｍを、当技術分野で周知の方法でそれらのペプチドに結合させることもできる。そのような態様においては、薬剤組成物を適切な比放射能に放射能標識し、診断に有効でありかつ無毒性である用量で動物（好ましくはヒト）に投与する。投与の方法や経路は常法に基づいて、臨床的に適切な形で当業者が選択できる。あるいは、これらの放射性標識リガンドを用いて、そのリガンドの受容体が存在する特定の脳領域を確認することができる。
図面の説明
図１は、本発明の哺乳動物抗オピオイド受容体のヌクレオチド配列（配列番号：３）およびアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。
図２は、本発明の新規な哺乳動物ＯＦＱＲタンパク質（ＬＣ１３２と表示）およびラットμ−オピオイド受容体、ならびにマウスδ−およびκ−オピオイド受容体タンパク質の配列比較を示す。
図３は、脳切片と本発明の哺乳動物ＯＦＱＲに特異的な核酸ハイブリダイゼーションプローブとのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。
図４は、ＣＯＳ−７細胞（パネルＡ）への、および本発明の新規な哺乳動物ＯＦＱＲを発現するＣＯＳ−７細胞（パネルＢ）への3Ｈ−メタドン結合のアフィニティー結合実験結果を示す。
図５は、本発明のＯＦＱＲを異種発現するＣＨＯ細胞において、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）刺激によるｃＡＭＰ蓄積が、ブタ視床下部から酢酸抽出したペプチド画分により阻害される程度を示す。図中、Ａ280は２８０ｎｍにおける吸収を示し、斜線を施した棒は形質転換していないＣＨＯ細胞を用いて得た結果を示し、白い棒はＯＦＱＲ形質転換したＣＨＯ細胞を用いて得た結果を表す。
図６は、本発明のＯＦＱＲを異種発現するＣＨＯ細胞において、フォルスコリン刺激ｃＡＭＰ蓄積が、ブタ視床下部から酢酸抽出した逆相ＨＰＬＣペプチド画分により阻害される程度を示す。図中、Ａ214は２１４ｎｍにおける吸収を示し、斜線を施した棒はＯＦＱＲ形質転換したＣＨＯ細胞を表す。
図７は、オルファニンＦＱ（ＯＦＱ）とオピオイド受容体結合性ペプチドのアミノ酸配列の比較である。これらのペプチド間で共有される等しいアミノ酸残基を太字で示す。
図８は、ＯＦＱＲ形質転換ＣＨＯ細胞において、フォルスコリン刺激によるｃＡＭＰ蓄積が、以下のペプチドにより阻害される程度を示すグラフである：オルファニンＦＱ（黒丸）；Ｙ１４−オルファニンＦＱ（黒四角）；一ヨウ化Ｙ１４−オルファニンＦＱ（白丸）；およびＬｅｕ−エンケファリン（白四角）。オルファニンＦＱ処理した非形質転換ＣＨＯ細胞は黒三角として示される。
図９は、ＯＦＱＲ形質転換ＣＨＯ細胞から摘出した膜への（125Ｉ）−標識Ｙ１４−オルファニンＦＱの結合グラフである。差込み図はこれらの結果のスキャッチャード分析である。
図１０は、種々の濃度のオルファニンＦＱペプチドで処理したマウスの水平活動（パネルＡ）と垂直活動（パネルＢ）に及ぼす影響を示す。
図１１は、オルファニンＦＱペプチドがマウスの侵害受容性に及ぼす影響をホットプレート試験法で測定したものを示す。
図１２は、種々のｉｃｖ量のオルファニンＦＱペプチドがマウスの侵害受容性に及ぼす影響を尾フリック（ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ）試験法で測定したものを示す。
図１３Ａは、ＯＦＱがストレス誘導性痛覚脱失に及ぼす抗オピオイド作用を示す棒グラフであり、モルフィン痛覚脱失を受けていない動物において、食塩水、ナロキソンおよびＯＦＱを投与したのちの尾引抜き（ｔａｉｌ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）潜伏時間の平均を示す。
図１３Ｂは、もだえ（ｗｒｉｔｈｉｎｇ）試験結果を示す棒グラフであり、ＯＦＱによりモルフィン痛覚脱失が排除されたことを証明する。
図１４は、動物において種々の量のＯＦＱを投与した動物の尾引抜き潜伏時間を比較することにより、モルフィン痛覚脱失が逆転したことを証明するグラフである。
図１５は、時間に対する中心体温のグラフであり、モルフィン性体温異常降下がＯＦＱにより減退することを証明する。
図１６は、モルフィン依存性マウスにおいてＯＦＱにより促進された禁断性跳躍のグラフであり、マウスにおいて禁断徴候が促進されたことを証明する。
図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃは、ＯＦＱがμ、δおよびκ−オピオイド受容体に高特異性で結合しないことを示す一連のグラフである。
好ましい態様の詳細な記述
本発明は、動物においてオピオイドの生理学的作用に拮抗する方法である。本明細書において用いる“オピエート”および“オピオイド”という用語は、Goodman and Gilman、The Pharmacological Basis of Therapeutics,第7版(以下“Goodman and Gilman”）、p.492の定義に従って用いられる。“オピエート”は、アヘンから誘導された薬物、たとえばモルフィン、コデイン、およびモルフィンの多数の半合成類似体を表すために用いられる。“オピオイド”は、モルフィン様作用をもつ天然および合成の薬物または生体物質すべてを総称する。したがって“オピオイド”は、プロポキシフェンなどの合成モルフィン様化合物、ならびにエンケファリン、エンドルフィンおよびダイノルフィンを含めた内因性オピオイドペプチドを包含する。
“抗オピオイド”という用語は、オピオイドの生理学的作用に拮抗するペプチドその他の化合物を意味する。“拮抗する”とは、生理学的作用の生化学的または薬理学的除去または軽減を意味する。本発明のペプチドは、オピオイド受容体とは別個に存在すると考えられる抗オピオイド受容体に特異的に結合し、オピオイド受容体が仲介する作用の生理学的拮抗を仲介する。
“高い特異性”（選択性）とは、受容体に高い親和性で結合することを意味し、本明細書においては約１００ｎＭ以下のＫiまたはＩＣ50で結合することと定義する。特異的結合性が特に高い、より具体的な態様においては、ＫiまたはＩＣ50が１０〜１００ｎＭ、特に０．１〜１０ｎＭ、殊に０．１ｎＭ以下である。結合選択性を測定する方法は周知であり、たとえばGoldstein,TIPS Reviews,p.456-459,1987(Vol.8)に記載されており、これを参考として引用する。Ｋiという表示は当技術分野で知られるように用いられ、これはJ.Neurochem.64:18-23(1995)に定義される。これを参考として引用する。特にこの引用文献の表１を参照されたい。
この引用文献に記載されるように、Ｋi値は高親和性部位に関するＩＣ50値に基づいて、Cheng and Prusoff,Biochem.Pharmacol.22:3099-3108(1973)の方程式により計算される：Ｋi＝ＩＣ50／（１＋［Ｌ］／ＫD）；式中のＩＣ50は標識リガンド（Ｌ）の結合を５０％阻害する非標識リガンド濃度であり、［Ｌ］はアッセイに供給したリガンドの総濃度であり、ＫDは解離定数と定義される。ＩＣ50は実施例１２に記載した方法で測定できる。解離定数ＫDはGoodman and Gilman, p.41に定義され、これを参考として引用する。アゴニスト−受容体複合体に関する解離定数の測定法は当技術分野で周知であり、たとえばMunson,Principles of Pharmacology(Chapman & Hall),1995,1章に記載され、これを参考として引用する。特許にその１７〜１８頁に親和定数の測定法が述べられ、これは当技術分野で周知の方法である。それは慣用されるスキャッチャード分析法から判定でき、その際スキャッチャード線の傾斜が−１／ＫDである。あるいはＫDは反応速度実験から判定され、その際ＫD＝ｋ1／ｋ2であり、ここでｋ1は解離速度定数、ｋ2は会合速度定数である。
オピオイドの生理学的作用には、オピオイドを動物に投与したのちみられる生化学的変化および／または臨床的な徴候や症状のうち１またはそれ以上が含まれ、これにはGoodman and Gilman,p.497-504に挙げられる作用が含まれる（これらに限定されない）。このような作用には細胞性ｃＡＭＰ蓄積の阻害、痛覚脱失、嗜眠、気分の変化（多幸症を含む）、瞳孔反応、呼吸低下、吐き気、末梢血管拡張、体温異常降下、および胃腸運動性低下のうち１またはそれ以上が含まれる。本発明は、本発明のペプチドリガンドのアミノ酸配列を利用してＯＦＱ受容体リガンド、ならびにその類似体、誘導体および模倣体を設計する方法をも提供する。本発明の範囲には、本発明方法により製造されるこのような類似体、誘導体および模倣体も含まれる。
第２観点において本発明は、配列番号：４として示すアミノ酸配列をもつ新規な哺乳動物オピオイド特異性受容体タンパク質をコードする核酸、この新規な哺乳動物オピオイド特異性受容体を形質転換細胞の培養に際して発現しうる組換え真核発現構築体、および本発明の受容体を合成する形質転換真核細胞の培養物を提供する。本発明は、配列番号：４として示すアミノ酸配列をもつ受容体タンパク質の均質な組成物、ならびに本発明の受容体タンパク質に対する抗体およびエピトープをも提供する。これらの受容体タンパク質を解明する方法、およびこれらの受容体に関連する薬理学的用途をもつ薬剤の開発にこれらのタンパク質を使用する方法も、本発明により提供される。
本発明のこの観点においては、哺乳動物ＯＦＱ受容体をコードする核酸配列をもつ核酸が提供される。好ましい態様においては、核酸は図１に記載し、配列番号：３として示した、１１０１ヌクレオチドのコーディング鎖、１８１ヌクレオチドの５′側非翻訳配列、および１７０ヌクレオチドの３′側非翻訳配列を含む１４５２ヌクレオチドのｃＤＮＡを含む。本発明のこの態様には、開示したこの配列およびこの配列の対立遺伝子変異体が、天然産物またはインビトロで化学的もしくは遺伝的に修飾された生成物のいずれかであっても包含される。
図１に記載し、配列番号：４として示した推定アミノ酸配列をもつ対応する受容体タンパク質も本発明の１観点である。本発明の具体的態様は、４７ｋＤ哺乳動物ＯＦＱ受容体タンパク質およびその誘導体の均質な組成物である。この大きさは翻訳後修飾を行う前のタンパク質の大きさであると解される。この４７ｋＤ受容体タンパク質の配列を図１に記載し、配列番号：４として示す。
本発明は、本明細書に示す、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから単離された配列より誘導される核酸配列およびアミノ酸配列両方のプローブ、およびそれから得られる配列情報を用いて合成により製造されたプローブを共に提供する。詳細には、本発明のこの観点を具体化するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを用いてニックトランスレーション、ランダムプライマー処理したオリゴヌクレオチド、またはインビトロ増幅プローブ、ならびに本発明のｃＤＮＡまたはゲノムクローン態様の核酸配列情報を利用して化学的に合成したオリゴヌクレオチドその他の合成プローブが本発明に包含されるが、これらに限定されない。
本発明は、本発明の受容体タンパク質態様のｃＤＮＡ態様を含むヌクレオチド配列情報を利用して製造された合成ペプチドをも包含する。本発明は、受容体特異性抗体の産生のための抗原として使用できる、あるいはアゴニスト、アンタゴニストまたは薬物の結合のための受容体分子の競合体として有用な、あるいはそれらのＯＦＱ受容体分子へのアゴニストもしくはアンタゴニストまたはそれらの類似体の結合の阻害薬の製造に使用する、天然または合成ペプチドを包含する。本発明の特に好ましい態様は、本発明のペプチドリガンド態様と相互作用して、受容体タンパク質へのペプチドリガンドの結合を増強または阻害するペプチドである。
本発明は、本発明の哺乳動物オピオイド受容体分子に対する抗体およびエピトープをも提供し、これにはそのような抗体の抗血清ならびにポリクローナルおよびモノクローナル態様、ならびにそのようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系が含まれる。
本発明は、本発明の哺乳動物ＯＦＱ受容体をコードする核酸を含む組換え発現構築体を提供する。この構築体は、この構築体で形質転換された細胞の培養物中において、コードするＯＦＱを発現することができる。このような構築体の好ましい態様は、図１（配列番号：３）に記載したＯＦＱ受容体ｃＤＮＡを含み、その構築体は、その構築体で形質転換された細胞において、構築体がコードするＯＦＱ受容体を発現することができる。
本発明は、本発明の組換え発現構築体で形質転換された細胞の培養物であって、それぞれ形質転換用構築体によりコードされる哺乳動物ＯＦＱ受容体を発現することができ、かつ実際に発現する培養物；ならびに本発明の組換え発現構築体で形質転換した原核細胞または真核細胞の培養物それぞれに由来する、本発明のＯＦＱ受容体タンパク質を含む原核細胞膜または真核細胞膜のタンパク質調製物をも提供する。
本発明は、新規なアゴニストおよびアンタゴニスト化合物のインビトロスクリーニングに用いるための方法であって、本発明の哺乳動物ＯＦＱ受容体分子の生化学的活性を阻害、増強または調節する効力につき化合物をスクリーニングする方法をも提供する。好ましい態様においては、本発明の組換え発現構築体で形質転換した細胞をそれらの化合物と接触させ、そして化合物の結合能、ならびにその化合物が他の既知のアゴニストおよびアンタゴニストの結合に及ぼす作用をアッセイする。他の好ましい態様には、それらの作用の定量的分析が含まれる。本発明は具体的には、哺乳動物ＯＦＱ受容体を発現する細胞において、被験化合物と本発明のペプチドリガンドとの間の競合アッセイ法を用いて、この受容体への化合物の結合能をスクリーニングする方法を提供する。本方法は、以下の工程を含む：
(ａ)真核細胞または原核細胞の培養物を、配列番号：４で示されるアミノ酸配列を有する哺乳動物ＯＦＱ受容体を発現しうる組換え発現構築体で形質転換し、その際、形質転換した細胞培養物の細胞が該受容体を発現し；
(ｂ)形質転換した細胞培養物を、種々の量の前記化合物と競合して請求項１記載の検出可能な標識ペプチドを結合する量につきアッセイし；そして
(ｃ)該化合物の存在下で検出可能な標識ペプチドの結合を阻害する程度を計算することにより、化合物が該受容体に競合結合するか否かを判定する。
本方法の他の態様においては、以下の追加工程が含まれる：
(ｄ)該化合物の結合能を、哺乳動物オピオイド受容体に結合することが知られている他の化合物の結合能と比較し、その際、他の化合物が天然または合成オピオイド受容体アゴニストおよびアンタゴニストを含む。
本発明は、天然または薬物としての形態の、本発明の哺乳動物ＯＦＱ受容体の既知または未知の類似体、アゴニストまたはアンタゴニストを検出するのにも有用である。好ましい態様においては、それらの類似体、アゴニストまたはアンタゴニストは血液、唾液、精液、脳脊髄液、血漿、リンパ球その他の体液中において検出できる。特に好ましい態様においては、本発明のペプチドリガンドはＯＦＱ受容体への新規リガンドの結合を定量評価する競合結合アッセイ法に用いられる。
本発明の特に好ましい態様は、特定の好ましい態様に関する下記の詳細な記述および請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書中で用いる“新規な哺乳動物ＯＦＱ受容体”および“ＯＦＱＲ”という用語は、本質的に図１（配列番号：３）に記載した核酸によりコードされるタンパク質からなり、かつそれと実質的に同じ生物学的活性をもつタンパク質を意味する。この定義は、開示したＯＦＱＲ配列中の天然の対立遺伝子変異体を包含するものとする。本発明により提供されるクローン化核酸は、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ネコおよびヒトを含めた任意の種に由来するＯＦＱＲタンパク質をコードすることができるが、好ましくは本発明により提供される核酸は哺乳動物、最も好ましくはラットおよびヒト由来のＯＦＱＲ受容体をコードする。
本発明の核酸は、本質的に図１（配列番号：３）に記載したＯＦＱＲ受容体のヌクレオチド配列または核酸ハイブリダイゼーションに有効なその任意の部分からなるＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸ハイブリダイゼーションプローブを含む。そのような核酸ハイブリダイゼーションプローブの混合物も本発明の範囲に含まれる。本発明により提供される核酸プローブは、当技術分野で周知の技術により細胞および組織におけるＯＦＱ受容体遺伝子発現を検出するのに有用である。これには逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応生成物ＤＮＡへのノーザンブロットハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびサザンハイブリダイゼーションが含まれるが、これらに限定されない。本発明により提供されるプローブは、それに由来するオリゴヌクレオチドプローブも含めて、特定の遺伝子障害に付随する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）をスクリーニングするための、哺乳動物（好ましくはヒト）ゲノムＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションにも有用である。
本発明は、本発明のＯＦＱ受容体に特異的に結合する単離および精製した天然の内因性哺乳動物ペプチドリガンドを提供する。本発明の目的に関して、このペプチドは本発明のＯＦＱ受容体に特異的に結合する任意の生物学的活性分子であることは理解されるであろう。本発明のペプチドには、本明細書の記載に従って単離した天然ペプチドリガンドの合成形態、ならびにＯＦＱＲに特異的に結合する、このペプチドの類似体、誘導体および変異体が含まれる。このような類似体には、アミノ酸が他のアミノ酸で保存的に置換され、かつペプチドリガンドの特異的結合性を除去しない、置換変異体が含まれる。具体的には、置換されるアミノ酸がＬｅｕ14であり、この残基がチロシンで置換される置換変異体が提供される。
本発明の各ペプチドリガンドは、アミノ酸配列からなる。本発明において用いるアミノ酸という用語は、天然および他のすべてのＬ−およびＤ−アミノ酸を含むものとする。
一般に、本明細書に記載するペプチドは非修飾ペプチドと本質的に同じ活性をもち、かつ所望により他の望ましい特性をもつ化合物を製造するための多様な化学的方法で修飾しうることは、当業者に自明であろう。たとえば本発明のペプチドのカルボン酸基は、カルボキシル末端であっても側鎖であっても、薬剤学的に許容しうるカチオンの塩の形で提供するか、またはエステル化してＣ1〜Ｃ16エステルを形成するか、または式ＮＲ1Ｒ2（式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立してＨもしくはＣ1〜Ｃ16アルキルであるか、または結合して複素環、たとえば５員もしくは６員環を形成する）のアミドに変換することができる。ペプチドのアミノ基は、アミノ末端であっても側鎖であっても、薬剤学的に許容しうる酸付加塩、たとえばＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩、酢酸塩、安息香酸塩、トルエンスルホン酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、もしくは他の有機塩の形であってもよく、または修飾されてＣ1〜Ｃ16アルキルアミノもしくはジアルキルアミノになるか、またはさらにアミドに変換されていてもよい。
上記ペプチドの側鎖のヒドロキシル基は、常法によりＣ1〜Ｃ16アルコキシまたはＣ1〜Ｃ16エステルに変換することができる。ペプチド側鎖のフェニル環およびフェノール環は、１もしくはそれ以上のハロゲン原子、たとえばフッ素、塩素、臭素またはヨウ素で、あるいはＣ1〜Ｃ16アルキル、Ｃ1〜Ｃ16アルコキシ、カルボン酸もしくはそのエステル、またはそれらのカルボン酸のアミドで置換されていてもよい。ペプチド側鎖のメチレン基は、延長されて同族のＣ2〜Ｃ4アルキレンになっていてもよい。チオール基は多数の周知の保護基のいずれか、たとえばアセトアミド基で保護されていてもよい。構造に結合性および／または安定性を高める配座束縛を選択付与するために本発明のペプチドに環状構造を導入する方法も、当業者に自明であろう。たとえばカルボキシル末端またはアミノ末端システイン残基をペプチドに付与すると、酸化された場合にそのペプチドはジスルフィド結合を含み、これにより環状ペプチドが生成する。他のペプチド環化方法には、チオエーテル、ならびにカルボキシル末端とアミノ末端とのアミドおよびエステルの形成が含まれる。
本明細書に開示するペプチドの抗オピオイド活性は前記アミノ酸配列そのものにあるのではなく、前記ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列に固有のエピトープにあることは、当業者に自明であろう。したがって、アミノ酸配列そのものを再構成する必要なしに、エピトープを再構成することによりこれらのペプチドのいずれかの抗オピオイド活性を再構成しうることも、当業者に自明であろう。これは、ペプチドを直接に合成することにより（これによりＤＮＡ配列を用いる必要性が避けられる）、またはエピトープをコードするが、遺伝子コードの重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）のため本明細書に開示する配列と異なる核酸配列を設計することにより達成できる。同様にＯＦＱＲのＮＤＡ配列を変更し、なおかつ機能性ＯＦＱＲタンパク質を産生させることもできる。
したがって、遺伝子コードの縮重により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を維持した状態でＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を著しく変更することができるので、本発明の範囲はさらに拡大する。遺伝子コード、および個々のアミノ酸に対するヌクレオチドコドンの変更を第１および２に示す。遺伝子コードの縮重に基づいて、標準的なＤＮＡ突然変異形成法またはＤＮＡ結合法により、本明細書に開示したＤＮＡ配列から変異体ＤＮＡ分子を誘導することができる。
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“Stop(och)”はオーカー終止トリプレット、“Stop(amb)”はアンバーを表す。
ＡＴＧは最も一般的な開始コドンである。ＧＴＧはバリンをコードするが、ｍＲＮＡ鎖の開始にはメチオニンをコードすることもできる。
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さらに、標準的な突然変異形成法を用いて、本明細書に開示したＤＮＡ分子がコードするペプチドと異なるアミノ酸配列のペプチドを調製することができる。ただしこのようなペプチドは本明細書に開示したＤＮＡ分子がコードするペプチドの本質的特性、すなわちＯＦＱＲに結合することによりオピオイド作用に拮抗する効力は保持する。この特性はｃＡＭＰ蓄積に関して本明細書に記載したアッセイ法で容易に測定できる。抗オピオイド作用の保持に関するスクリーニングも、後記実施例８〜１１の方法を用いて直ちに達成される。変異体ペプチドには、微小な欠失・付加・置換を含めたアミノ酸配列変異をもつものが含まれる。
アミノ酸配列変異を導入する部位は予め定めるが、突然変異そのものを予め定める必要はない。たとえば特定の部位における突然変異の実施を最適なものにするために、標的とするコドンまたは領域でランダム突然変異を行い、発現したタンパク質変異体を目的活性の最適な組合わせにつきスクリーニングする。前記の既知配列をもつＤＮＡ中の予め定めた部位に置換突然変異を形成する方法は周知である。
機能性ペプチドを維持するために、好ましいペプチド変異体は天然ＤＮＡ配列がコードするペプチドと少数のアミノ酸が異なるにすぎない。好ましくはこのような変異体は残基１個のアミノ酸置換体であろう。置換変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１個の残基が除去されて、その代わりに異なる残基が挿入されたものである。このような置換体は、そのタンパク質の特性をわずかに調節したい場合には下記の表３に従って調製される。表３には、タンパク質中の元のアミノ酸と置換でき、かつ保存的置換と考えられるアミノ酸を示す。上記のように、これらのペプチド変異体はすべて、それらがオピエート作用に拮抗する効力を保持することを確認するために試験される。
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生物学的活性の実質的変更は、表２のものより保存度の低い置換を選択することにより、すなわち下記条件の維持に対して及ぼす作用がより著しく異なる残基を選択することにより行うことができる：（ａ）置換領域のポリペプチド主鎖の構造、たとえばシートまたはらせん配座、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩。
ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）および生物模倣体（ｏｒｇａｎｏｍｉｍｅｔｉｃ）も本発明の範囲に含まれることをここに明記する。これは、そのようなペプチド模倣体および生物模倣体の化学的成分の３次元配置が前記ペプチド主鎖および成分アミノ酸側鎖の３次元配置を模倣し、その結果実質的な生物学的活性をもつ本発明のペプチドのペプチド模倣体および生物模倣体が得られるものである。コンピューターモデリング用として、ファルマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）は生物学的活性に対する構造要件の理想的な３次元定義である。ペプチド模倣体および生物模倣体は、現在のコンピューターモデリングソフトウェアを用いてそれぞれのファルマコフォアに適合するように設計することができる（計算機援用設計）。ファルマコフォアの比活性間の重複度はやはり測定しなければならない。このような方法で調製した、また本発明のペプチドリガンドを用いて開発した、ＯＦＱ受容体に特異的に結合する模倣体が本発明の範囲に含まれることは理解されるであろう。
本発明により提供されるペプチドは、当技術分野で既知の多数の手動または自動合成法のいずれかにより化学的に合成できる。自動ペプチド合成装置用として利用できる自動合成経路も、本発明の範囲に含まれるものとする。天然ペプチド、または酵素もしくは化学的手段で分解したタンパク質変性物混合物から精製したペプチドを本明細書に開示した方法または当技術分野で周知の他の方法により化学的に誘導体にすることも本発明の範囲に含まれ、分子工学的または遺伝子工学的手段で調製したペプチドも同様である。好ましくは固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）を０．２５ミリモル規模で、アプライド・バイオシステムズ社、モデル４３１Ａペプチド合成装置を用いて、また９−フルオレニルメチルカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ末端保護を用い、ジシクロヘキシルカルボジイミド／ヒドロキシベンゾトリアゾールもしくは２−（１Ｈ−ベンゾ−トリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ）と結合させ、そしてカルボキシ末端酸用としてｐ−ヒドロキシメチルフェノキシメチルポリスチレン（ＨＭＰ）もしくはサスリン（Ｓａｓｒｉｎ、商標）樹脂、またはカルボキシ末端アミド用としてリンク（Ｒｉｎｋ）アミド樹脂を用いて、実施する。
Ｆｍｏｃ誘導体アミノ酸は、適切な前駆体アミノ酸からトリチル化およびトリフルオロ酢酸中でのトリフェニルメタノール処理、次いでＦｍｏｃ誘導体化により製造される（Atherton et al.,1989,Solid Phase Peptide Sythesis,IRLプレス社、オックスフォードの記載に従う）。
サスリン樹脂結合したペプチドを、ジクロロメタン中の１％ＴＦＡ溶液で開裂させて、保護されたペプチドを得る。適宜、アミノ酸側鎖を保護した発生期（ｎａｓｃｅｎｔ）ペプチドにおいてジフェニルホスホリルアジドを用いて、保護されたペプチド前駆体をアミノ末端遊離アミンとカルボキシ末端遊離酸との反応によりアミノ末端とカルボキシ末端との間で環化する。
ＨＭＰまたはリンクアミド樹脂に結合した生成物を常法により開裂させ、保護された側鎖を含む環化ペプチドを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含みかつ所望により水、チオアニソールおよびエタンジチオールをも含有する溶液（比率１００：５：５：２．５）を用いて室温で０．５〜３時間、脱保護する。
ウォーターズ社デルタ−パック（Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ）Ｃ１８カラムおよびアセトニトリルで調整した水中の０．１％ＴＦＡで濃度勾配溶離する調製用高圧液体クロマトグラフィーにより、粗製ペプチドを精製する。カラムの溶離後、溶出画分からアセトニトリルを蒸発させ、次いで凍結乾燥させる。こうして調製および精製した各生成物の同一性を、高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢＭＳ）または電子スプレー質量分析法（ＥＳＭＳ）により確認する。
本発明のＯＦＱ受容体タンパク質などのタンパク質をクローン化遺伝子から遺伝子工学的手段で製造することは、当技術分野で周知である。したがって以下の考察はこの分野の概観としてのものであり、技術水準を完全に反映することを意図したものではない。
オピオイド受容体をコードするＤＮＡは、以下に示すように本明細書の開示内容を考慮して、適切な細胞または細胞系の培養物からｍＲＮＡの逆転写体をスクリーニングすることにより、適切な細胞からのゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、またはこれらの方法の組合わせにより得られる。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、本明細書に開示した受容体（ＯＦＱＲ）から得られる配列情報により形成されたオリゴヌクレオチドプローブを用いて行うことができる。後記の実施例に詳述するように、プローブを任意の検出可能な基で標識して、通常のハイブリダイゼーションアッセイに用いることができる。別法ではポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、本明細書に提示したＯＦＱＲから得られる核酸配列情報に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、アミノ酸トランスポーター由来の核酸配列を得ることができる。米国特許第4,683,195号（マリスら）および第4,683,202号（マリスら）参照。
ＯＦＱＲタンパク質は、ＯＦＱ受容体ｃＤＮＡのコード核酸を含む組換え発現構築体で形質転換した宿主細胞内において合成することができる。本発明の目的に関して、組換え発現構築体は、好適な宿主内でオピオイド受容体を発現しうる好適な制御配列にオピオイド受容体をコードする核酸が作動的に結合した、複製可能なＤＮＡ構築体である。制御配列には一般に、転写プロモーター、転写を制御するオペレーター配列（任意）、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終止を制御する配列が含まれる。Sambrook et al.,1990,Molecular Cloning：A Laboratory Manual（コールド・スプリング・ハーバー・プレス社、ニューヨーク）参照。
本発明の実施に有用なベクターには、プラスミド、ウイルス（ファージを含む）、レトロウイルスおよび統合可能なＤＮＡフラグメント（すなわち相同組換えにより宿主ゲノムに結合しうるフラグメント）が含まれる。好ましいベクターはＲｃＲＶＳ（インビトローゲン社、カリフォルニア州サンディエゴ）である。
多細胞生物由来の細胞培養物は組換えオピオイド受容体タンパク質合成に望ましい宿主である。形質転換した宿主細胞は、組換えＤＮＡ技術で調製された、アミノ酸トランスポータータンパク質をコードする核酸を含む組換え発現構築体で形質転換またはトランスフェクションした細胞である。形質転換した宿主細胞は、ＯＦＱＲタンパク質を発現することができる。本発明のＯＦＱ受容体は発現した場合、一般に宿主細胞膜中に位置する。Sambrook et al. （前掲）参照。原則として、脊椎動物または無脊椎動物培養物のいずれに由来するものであっても、高等真核細胞培養物はいずれも有用である。しかし実施例に示すように、哺乳動物細胞が好ましい。細胞培養によるそれらの細胞の増殖はルーティンになっている。Tissue Culture、アカデミック・プレス社、Kruse & Ptterson編(1973)参照。有用な宿主細胞系は、ヒトの２９３細胞、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞系、チャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、マウスのＬｔｋ細胞系、ならびにＷＩ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＣＦおよびＭＤＣＫ細胞系である。ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７およびＬｔｋ細胞が好ましい。
本発明の組換え発現構築体は、普通はＯＦＱ受容体を発現しない細胞を形質転換して、その後この受容体を発現させるのに有用である。このような細胞は、受容体結合活性アッセイに有用な細胞膜調製物を調製するための中間材料として有用であり、この調製物は本発明に従って製造した薬物または新規ペプチドをスクリーニングするのに有用である。したがって本発明の組換え発現構築体は、潜在的に有用なペプチドおよび他の薬物を、従来の動物スクリーニングプロトコールより有利な低価格でスクリーニングするための試薬を得る方法を提供する。最終的なインビボ活性および毒性アッセイの必要性が完全に排除されるわけではないが、本発明の構築体および培養物は、毎年、合成され、天然源から発見または抽出される莫大な数の潜在的に有用な向精神薬の重要な第１スクリーニング工程を提供する。
本発明の組換え発現構築体は、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、精液、またはこれらの化合物の他の潜在的供給源中に見出される、抗オピオイドアゴニスト（たとえばＯＦＱ）およびアンタゴニストに対する他の新規な内因性受容体を検出、単離、解明および同定するのに有用である。
本発明は本発明の核酸をそれがコードする受容体タンパク質を含む細胞膜の調製に用いるのに有用であり、また本明細書中でオルファニンＦＱ（ＯＦＱ）と呼ぶ内因性の受容体結合性リガンドとしての新規ペプチドの単離、解明および同定に本発明のこの観点が有用であることが証明されたので、現在用いられている技術を利用して療法に有効な新規薬物を合理的に設計できる（Walters,“計算機援用薬物設計”、Klegerman & Groves編、1993,Pharmaceutical Biotechnology、インターファーマ・プレス社、イリノイ州バッファロー・グローブ、p.165-174）。
本発明は、本明細書の提示に従って真核細胞を形質転換することにより製造される新規な哺乳動物受容体タンパク質の均質な組成物を提供する。このような均質な組成物は、この均質な組成物中のタンパク質の少なくとも９０％を占めるＯＦＱＲタンパク質を含むものとする。本発明は、本明細書の記載に従って組換え発現構築体で形質転換した結果としてＯＦＱＲタンパク質を発現する細胞からの膜調製物をも提供する。
本発明に従ってクローン化遺伝子から調製した哺乳動物受容体タンパク質は、オピオイド系と平行して、またその系に対する機能性拮抗作用により作動する、抗オピオイド系の類似体をスクリーニングするのに使用できる。これらの受容体タンパク質はまた、オピオイド結合のアゴニストもしくはアンタゴニストを見出すために、または当該溶液（たとえば血漿、脳脊髄液または血清）中に存在するアゴニストもしくはアンタゴニストの量を測定するために、有用である。たとえば本発明の組換え発現構築体で宿主細胞を形質転換し、これらの宿主細胞内で哺乳動物ＯＦＱＲを発現させ、その細胞または膜を用いて、抗オピオイド受容体結合活性に対する作用につき化合物をスクリーニングすることができる。普通はＯＦＱＲを発現しない宿主細胞を選択することにより、トランスポーターを含む純粋な調製物を得ることができる。
本発明は、天然リガンドおよびその合成態様を含めた、それらのＯＦＱＲタンパク質に対するリガンドをも提供する。他の代替リガンド、ならびにＯＦＱペプチドリガンド結合の他のアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法も、本発明により提供される。このような方法には、本発明のペプチドリガンドに検出可能な標識を付与し、種々の量の推定リガンド被験化合物と競合結合する条件下でインキュベートする、競合結合アッセイ法が含まれる。標識リガンド結合の阻害の程度は、ＯＦＱＲに対する新規リガンドの結合の程度および親和性を解明するのに有用である。好ましくは、このような競合実験に用いる本発明のペプチドリガンドは、放射性同位体、たとえばＩ−１２３、Ｉ−１２５およびＩ−１３１で標識される。
本発明は、本発明により提供されるオピオイド受容体タンパク質またはそのエピトープに対して免疫反応性である抗体をも提供する。本発明により提供される抗体は、当技術分野で周知の方法により形成することができる。
本発明は、本発明のＯＦＱ受容体に由来するエピトープまたはそのフラグメントと免疫反応性であるモノクローナル抗体をも提供する。それらの抗体は当業者に周知の方法および技術で形成することができる。本発明により提供されるモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞系により産生される。これらの細胞系も本発明により提供され、当技術分野で周知の方法により形成することができる。
本発明のリガンドは、適切なキャリヤーまたは希釈剤との薬剤組成物として構成した場合、診断薬および療法薬として有用である。診断態様においては、検出可能な標識ペプチドリガンドを、インビボでＯＦＱ受容体のリガンド結合に関連する疾患または病的状態の診断法に用いる。本発明には療法も包含され、これは前記ペプチドの薬剤組成物をインビボで療法に有効な量で用いることにより得られる。
本発明のペプチドの薬剤学的に許容しうる組成物の調製は、当業者に周知の方法で達成できる。無菌食塩水、血漿など、慣用される任意のキャリヤーを、本発明により提供されるペプチドと共に使用できる。投与経路には経口、脳室内（ｉｃｖ）、くも膜下（ｉｔ）、静脈内（ｉｖ）、非経口、直腸内、局所、眼内、結膜下、鼻内、耳内および経皮経路が含まれるが、これらに限定されない。本発明のペプチドは、静脈注射に好都合な任意の媒質、たとえば食塩水または血漿媒質中で静脈内投与することができる。このような媒質は一般的な佐剤、たとえば浸透圧調節のための薬剤学的に許容しうる塩類、緩衝剤、防腐剤などを含有してもよい。好ましい媒質には、生理食塩水および血漿が含まれる。
薬剤を含む本発明の態様は、当業者に既知である慣用される薬剤学的に許容しうるキャリヤー、佐剤および対向イオンを用いて調製できる。これらの薬剤は、好ましくは単位用量の固体、半固体および液状の剤形、たとえば錠剤、丸剤、散剤、液剤または懸濁液剤、ならびに注射用および注入用の液剤、たとえば単位用量バイアル剤である。単位用量容器内に含まれる有効量の範囲としては、約１００μｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）が考慮される。
本発明は、溶液中の被分析体の量を測定する方法をも提供し、その際、被分析体は血液、血清、血漿または脳脊髄液などの生体試料中にある本発明の内因性ペプチドリガンドである。この方法においては、本発明のＯＦＱオピオイド受容体を異種発現する細胞または膜を含む第１混合物、標準量の検出可能な標識態様の本発明ペプチドリガンドを含む第２混合物、および診断上重要な組織試料または体液を含む第３混合物を用意する。第１、第２および第３混合物を接触させ、ペプチドリガンドとＯＦＱ受容体との結合が起きるのに十分な時間、この反応混合物をインキュベートすることにより、これらの混合物から特異的結合反応混合物を調製する。結合反応の程度は、ＯＦＱ受容体に結合した本発明の検出可能な標識ペプチドリガンドの量を計算し、用意した第３混合物の組織試料または体液の存在下でのＯＦＱ受容体へのペプチドリガンドの結合量を、用意した第３混合物の組織試料または体液の不在下で見られた結合量と比較することにより判定される。
これらの例全体において、注射をくも膜下または脳室内に行うことがある。脳室内注射法によれば、少量の薬物を外科的介入なしに直接に脊髄に適用することができる。マウスを、すべての注射の前にハロタンに短時間暴露する。
くも膜下注射は１０μｌのルーアー注射器（ハミルトン社、ネバダ州リノ）にはめ込んだ使い捨て３０ｇ、1/2インチの注射針を用いて行う。人工脳脊髄液中の薬物を投与し、注射量は２〜５μｌである。マウスを平たい面に乗せ、頭をタオルに入れて掌の踵をかるくかぶせ、背部下方の皮膚が伸びるのに十分な力で母指で食指を腸骨稜にかるく押し付ける。この組織のＬ５棘突起のすぐ内側に、針が棘突起と横突起の間の溝に進入するように挿入する。この部位が脊椎に最も接近でき、脊髄損傷（馬尾内へ）の可能性が最も少ない。次いで針の角度を約３０°から１５°に小さくしながら、椎間腔へ慎重に針を前進させる。針の先端約０．５ｃｍが脊柱内にあるように挿入する。これはマウスの尾のフリックにより確実に示される。
ヒトの場合、脊椎注射針を用いる一般的な腰椎穿刺により硬膜上腔またはくも膜下腔に到達できる。
ｉｃｖ注射のためには、２６ｇ、1/2インチの注射針を、覆われていない針３ｍｍがマウスの頭蓋に進入するように、ポリエチレンチューブ片にはめ込む（このスリーブにより、針の深さが確実に側脳室の深さとほぼ同じになる）。マウスをハロタンで短時間麻酔する。針を４５°の角度にもち、ブレグマの中心線に対し１〜２ｍｍ外側に挿入する。この縫合部位では針が容易に頭蓋穿刺するので、正確に配置するために切開する必要がない。針の先端を尾の方へ向けると、３ｍｍの深さで薬物を側脳室内へ直接に装入することができる。
以下の実施例は本発明の具体的態様およびその種々の用途を示す。それらは説明のために提示したにすぎず、本発明の限定と解すべきではない。
実施例１：縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いるラット脳由来のｃＤＮＡのランダムＰＣＲ増幅による哺乳動物オピオイド受容体プローブの単離
新規な哺乳動物Ｇタンパク質と結合した受容体をクローン化するために、哺乳動物（ラット）脳の種々の領域由来のＲＮＡから調製したｃＤＮＡを、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）に基づくランダムクローニング実験の鋳型として用いた。マウスδ−オピオイド受容体（Kieffer et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:12048-12052; Evans et al., 1992, Science 258:1952-1955）由来の縮重オリゴヌクレオチドプライマー対を用いてＰＣＲを行った。この実験で得られたＰＣＲ産物をヌクレオチド配列決定により性状決定し、ラット脳ｃＤＮＡライブラリーからの全長ｃＤＮＡ単離に用いた。
本願と同一出願人による同時継続中の米国特許出願番号08/149,093（参照としてこれを援用する）に記載の方法で以下のプライマーを用いてＰＣＲ増幅実験を行った：
プライマーIII（センス）：
0003868494.tif 000008
及び
プライマーVII（アンチセンス）
0003868494.tif 000009
ＰＣＲ反応の増幅産物を１．０％アガロースゲルで分離（Sambrook et al., 前出参照）し、４００塩基対（ｂｐ）から７５０ｂｐの大きさの断片をプラスミドベクターpBluescript(Stratagene, La Jolla, CA)にサブクローニングした。慣用法（Sambrook et al., 前出参照）により、サブクローニングした各断片を含む多数の細菌コロニーを用いてニトロセルロースフィルター上で細菌コロニーリフトを作製した。このようなフィルターを、1 x 106cpm/mL濃度で、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下［３５％ホルムアミド、5X標準クエン酸塩（SSC;ここで1X SSCは0.15M NaCl/0.015Mクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、5X Denhard's solution（ここで1X Denhard's solutionは牛血清アルブミン、フィコール及びポリビニルピロリドンを各0.02g/mL）］、３７℃で一晩、全長マウスδ−オピオイド受容体ｃＤＮＡを含む［32Ｐ］−ｄＣＴＰ−標識した放射性核酸プローブとハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、フィルターを2X SSC/0.1%ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液中、５５℃で洗浄し、タングステン含浸増強スクリーン（DuPont-NEN, Wilmington, DE）を用いて，−７０℃で２日間Ｘ線フィルム（XAR-5, Estman-Kodak, Rochester, NY）に暴露した。ハイブリダイズするクローンからのプラスミドＤＮＡを精製し、SequenaseTM(U.S. Biochemical Corp., Cleaveland, OH)を用いるジデオキシヌクレオチド鎖末端法（Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA74:5463-5467）によって挿入ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定した。
実施例２：新規な哺乳動物オピオイド受容体ｃＤＮＡの単離
ＰＣＲ産物の１つ（ＬＣ１３２という）を単離してこの方法で配列決定したところ、マウスδ−オピオイド受容体配列（Evans et al., 前出、及びKieffer et al., 前出）と高度の相同性をもつことが判明した。このＰＣＲ断片に対応する全長ｃＤＮＡクローンを、本願と同一出願人による同時継続中の米国特許出願番号08/149,093に記載するようにして、オリゴ（ｄＴ）−プライム化ラット脳ｃＤＮＡを含むクローニングベクターλｇｔ１１中に調製したｃＤＮＡライブラリーから単離した。
文献（Sambrook前出、参照）記載の方法で実質的に行ったヌクレオチド配列分析の結果、図１に示す配列（配列番号：３）が明らかとなった。この遺伝子の推定のタンパク質産物も図１に示す（配列番号：４）。この配列は翻訳後修飾を受ける前には、予測分子量４７キロダルトンで、３６７アミノ酸のタンパク質をコードする１１０１ヌクレオチドのオープンリーディングフレームをもつことがわかった。提案された開始コドンのすぐ５’側にある配列には、上記オープンリーディングフレームと読み枠が合ったいくつかの翻訳終止コドンが含まれており、これが翻訳開始部位であることを支持している。予測された膜貫通ドメイン［Eisenberg et al., (1984, J. Molec. Biol. 179:125-142)のアルゴリズムを用いて決定］を箱で囲んで示し、ローマ数字（Ｉ−VII）で同定し、Ｎ−結合グリコシル化部位として可能性のある３つの部位をタンパク質のアミノ末端部分に黒三角で示した。予測される細胞質ループ中に見られるタンパク質リン酸化部位として可能性のある部分を星印で示した。さらに、既知のオピオイド受容体に保存されているシステイン残基対が予測された１番目及び２番目の細胞外ループに見られた。この分析に基づいて、このクローン化した核酸を、μ、δやκ受容体のようなオピオイド受容体に関連する新規な哺乳動物受容体であると決定した。
この新規な受容体の予測されるアミノ酸配列、ラットμ−オピオイド受容体（Chen et al., 前出）、マウスδ−オピオイド受容体（Evans et al., 前出及びKieffer et al., 前出）及びマウスκ−オピオイド受容体（Yasuda et al., 前出）を並べたものを図２に示す。上部に付けた線部分はこの遺伝子のタンパク質産物中の予測される膜貫通領域Ｉ−VIIを示す。４つの哺乳動物オピオイド受容体全てに共通に見られるアミノ酸残基を太字で示す。
全体として、上記新規な哺乳動物受容体は、その他の哺乳動物オピオイド受容体と全体で４７％の相同性を有し、予測される膜貫通ドメインのみを考えると６７％に上昇する。各膜貫通ドメイン（ＴＭＩ−ＴＭVII）につき個々に、膜貫通ドメイン全体の平均（ＴＭａｖｇ）として、及び全体としての各タンパク質に対するアミノ酸配列の相同性の平均度（ａｖｇ／ａｌｌ）として比較した。全体で、３６７残基のうち１４５がその他の哺乳動物オピオイド受容体と共通であり、ここに開示する新規哺乳動物受容体がオピオイド受容体と関連するという結論を確認した。しかしながら、驚くべきことにこの受容体が抗オピオイド作用を仲介することを本発明者らは発見した。
実施例３：新規哺乳動物オピオイド受容体の組換え発現構築体の構築、ＤＮＡ形質転換及び機能的発現
実施例２に記載する新規哺乳動物オピオイド受容体の生化学的特徴付けを行い、これが新規オピオイド受容体をコードすることを確認するために、ｃＤＮＡを哺乳動物発現構築体にクローン化し、ＣＯＳ−７細胞（一過性発現アッセイ用）及びマウスＬｔｋ-細胞（安定発現アッセイ用）に形質転換して得られる組換え発現構築体を得て、細胞表面の細胞膜中で受容体タンパク質を発現した細胞膜（ＣＯＳ−７）又はセルライン（Ｌｔｋ-）を作製した。このような細胞から単離した細胞及び膜を用いて米国特許出願番号149,093に記載の生化学的特徴付け実験に用いた。
受容体ｃＤＮＡインサートの全コーティング領域をＲｃＲＳＶベクター（Invitrogen, San Diego, SA）中に慣用法（Sambrook et al., 前出参照）によってサブクローニングした。このような組換え発現構築体をカルシウム−リン酸沈殿法（Chen & Okayama, 1987, Molec. Cell Biol. 7:2745-2752）によってＣＯＳ−７細胞中に導入し、形質転換細胞に２４−９６時間で受容体を発現させ、受容体を含む膜を単離した。タンパク質濃度は下記の結合研究のそれぞれにつき、15-80μｇ／サンプルに調整した。
これらの組換え発現構築体をカルシウム−リン酸沈殿法によりＬｔｋ1細胞中にも導入し、ベクターＲｃＲＳＶが細菌ネオマイシン耐性遺伝子の機能的コピーをもっているので、哺乳動物ネオマイシン類似体であるＧ４１８（Grand Island Biological Co., Long Island, NY）中での増殖により安定に形質転換されたクローンを選択した。次にノーザンブロット（Sambrook et al., 前出）で測定した個々のネオマイシン耐性形質転換クローンのｍＲＮＡ発現レベルに基づいて、膜結合研究のための安定セルラインを選択した。細胞膜を調製し、上述のＣＯＳ−７細胞形質転換体に用いた。
一過性及び安定性形質転換体の両方からの膜上で、種々のオピオイド受容体アゴニスト及びアンタゴニストを用いて特異的結合アッセイを行った。リガンド結合実験は実質的にBunzow et al.(1988, Nature 336:783-787)及び米国特許出願08/149,093に記載の方法で行った。結合実験では、増加する量の膜タンパク質（15-80μｇ）を試験すべき放射性標識オピオイド受容体アゴニスト又はアンタゴニストと共に、全用量１ｍｌ中、２２℃で１２０分インキュベートした。しかし、この実験では以下の化合物については特異的結合が見られなかった（その既知の受容体結合特異性を括弧内に記す）：［3Ｈ］-Try-DAla-Gly-Met-Phe-Gly-ol（ＤＡＭＧＯ；μ−オピオイド受容体アゴニスト）、［3Ｈ］-c[D-ペニシラミン2、D-ペニシラミン5]エンケファリン（ＤＰＤＰＥ：δアゴニスト）、［3Ｈ］-U-69,593（κアゴニスト）、［3Ｈ］-ジプレノルフィン（μアゴニスト）、［3Ｈ］-ブレマコジン（κアゴニスト）、［3Ｈ］-ジヒドロモルフィン（μアゴニスト）、［3Ｈ］-エチルケトシクラゾシン（κアゴニスト）又は［125Ｉ］-β-エンドルフィン。［3Ｈ］-ナラキソン（μアンタゴニスト）を用いると低レベルの特異的結合が見られたが、形質転換しないＣＯＳ−７及びＬｔｋ-細胞でも低レベルの内因性の特異的［3Ｈ］-ナラキソン結合を示したという事実により、この結果の重要性はあまりない。
しかしながら、驚くべきことに、［3Ｈ］-メタドンを用いると特異的結合が観察された。メタドン結合データのスキャッチャード分析の結果を図４に示す。
スキャッチャード分析実験のためには、形質転換細胞培養液から得た粗原形質膜ホモジネートの０．２５ｍｌアリコートを、上記の条件下に増加する濃度の［3Ｈ］-メタドン（70.3Ci/mmol; 10-3000pM最終濃度）と共に二重試験でインキュベートした。Ｂmaxの推定値はＬＩＧＡＮＤコンピュータープログラムを用いるデータから得た。図４のパネルＡは形質転換しなかったＣＯＳ−７細胞との放射性標識されたメタドン結合の結果を示す；同様の結果がＬｔｋ-細胞膜でも見られた。これらの結果は、これらの細胞膜による内因性のメタドン結合が全くないか、無視しうる量であることを示す。パネルＢはＲｃＲＳＶ−ＬＣ１３２発現構築体で形質転換したＣＯＳ−７細胞を用いた結果を示す。このグラフに示される特異的結合のレベルはメタドンについての約１０-10Ｍの解離定数（ＫD）及びこれらの細胞により発現された新規哺乳動物オピオイド受容体についての約４００−４５０フェムトモル／μｇタンパク質のＢmaxに対応する。
従って、ここに開示する新規哺乳動物オピオイド受容体は、オピエート類似体であるメタドンへの特異的結合を示し、その他の種々の公知のオピオイド受容体アゴニスト及びアンタゴニストへの特異的結合を示さない、というこれまでに知られていない性質を有する。これらの結果は、ここに開示する受容体が完全に新規なものであり、本明細書中でＯＦＱと命名するオピオイド受容体ファミリーのこれまで未知のメンバーであるという結論を支持する。
実施例４：ＯＦＱＲ発現の脳組織分布
ラット脳の種々の領域におけるＯＦＱ受容体遺伝子の発現に対応するｍＲＮＡの分布を、米国特許出願08/149,093に記載の方法で、ラット脳スライスのin situハイブリダイゼーションによって試験した。
これらの試験結果を図３に示す。パネルＡは前頭皮質、視索前領域及び尾状被殻を横切るセクションであり；パネルＢは視床下部、視床及び海馬を横切るセクションであり；パネルＣは脳橋及び小脳を横切るセクションを示す。これらの実験では、視床下部［弓形（Ａｒｃ）、背部（ＰＨ）、外側（ＬＨ）及び腹側正中（ＶＭＨ）視床下部核、パネルＢ］、視床のいくつかの核［副脳室視床核（ＰＶＰ）、パネルＢ］、内側小帯（ＭＨｂ、パネルＢ）、視床下部のＣＡ領域、歯状回（ＤＧ、パネルＢ）、青色斑（locu coeruleus）及びいくつかの皮質領域［内側前視領域（ＭＰＡ）、パネルＡ及び皮質（ＣＸ）、パネルＢ］に高濃度のＯＦＱＲ発現が局在していた。尾部被殻（Ｃｐｕ、パネルＡ）又は小脳（Ｃｂ、パネルＣ）には実際上シグナルが観察されなかった。脳幹（パネルＣ）及び脊髄（示さず）のセクションには強いハイブリダイゼーションが検出された。
これらの結果は、ここで開示するＯＦＱ受容体がラット脳の解剖学的に異なる様々な部位で発現していることを示しており、高度な脳の機能及び運動神経や感覚神経の情報伝達の中枢神経系制御の両方においてこの受容体が重要な役割を果たすことを示している。しかし、この受容体によって媒介される抗オピオイド作用は全く予測できないことであった。
実施例５：ＯＦＱ受容体のための内因性ペプチドリガンドの同定
ＯＦＱ受容体と実施例２に記載のμ−、δ−及びκ−オピオイド受容体との高い配列相同性のために、ここに開示する新規受容体が内因性ペプチドリガンドを特異的に認識して、従来公知のオピオイド受容体と関連して発現された情報伝達系と似た第２の情報伝達系を用いてこのようなリガンドと結合するように応答することが予測された。ＯＦＱＲは実施例４で中枢神経系の細胞と発現することが見いだされていたので、またＯＦＱＲ  ｍＲＮＡが視床下部で高度に発現していたので、ブタ視床下部ホモジェネートの受容体結合活性をスクリーニングした。ＯＦＱＲを異種的に発現する細胞中における、フォルスコリンによって誘導されたサイクリックアデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）蓄積の阻害をアッセイとして用いたが、このアッセイはオピオイド受容体とそのリガンドとの相互作用を特徴付けるために従来用いられていたものである。
ブタ視床下部組織の酢酸抽出物を以下のようにして調製した。新鮮な凍結ブタ視床下部組織４．５ｋｇを０．５Ｍ酢酸／１０ｍＭアスコルビン酸／１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液９Ｌ中で抽出した。抽出物を遠心して不溶性ゴミを除去し、上清をＣ18シリカマトリックスにバッチ法で吸着した。水で洗浄して未結合マトリックスを除去し、次に特異的に結合した物質を８０％メタノール溶液で溶出した。次に合計２Ｌのメタノール溶出液をロータリーエバポレーターで最終容量４４ｍＬに濃縮し、Amicon Centriprep 10カラム（Amicon, Beverl, MA）を用いる限外濾過により分子量１０キロダルトン以下の物質を得た。この物質を１０ｍＭ  ＮＨ4ＣＯＯで平衡化したカチオンＨＰＬＣ交換カラム（Protein Pak SP 8HR, 10x100mm, Waters）に１０回に分けてかけた。カラムを１０％メタノール中のＮＨ4ＣＯＯの直線状グラジエントで，１ｍＬ／分の流速で展開し；１ｍＬの分画８０個を回収した。５個の連続分画のそれぞれの１０％（１００μＬ）を集めて凍結乾燥し、合計１６プールを得た。ＯＦＱオピオイド受容体を異種的に発現する細胞中で各プールの５％をフォルスコリンによって刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害能について二重試験でアッセイした。
ＯＦＱ受容体を異種的に発現する細胞中における、フォルスコリンによって刺激されたｃＡＭＰ蓄積のリガンド結合関連阻害のアッセイは以下のようにして行った。ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）を欠失するＣＨＯ細胞を、カルシウムリン酸共沈殿法（Okayama and Chen, 前出）を用いて実施例３に記載の方法で、発現ベクターｐＲｃＲＳＶ（Invitrogen）中にクローニングしたＯＦＱＲをコードするｃＤＮＡで形質転換した。Ｇ４１８を用いて安定的に形質転換されたクローンを選択し、逆転写−ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＯＦＱ発現をスクリーニングした。ポジティブなＯＦＱＲ発現を示す１つのクローン（ＬＣ−７）をリガンド結合試験に用いた。
ｃＡＭＰレベルを決定するために、受容体で形質転換されたＣＨＯ細胞（すなわちＬＣ−７）又は非形質転換ＣＨＯ／ｄｈｆｒ細胞を２４ウエルの培養プレートに入れて、コンフルエントになるまで増殖した。培地を除去した後、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４、１ｍＭフォルスコリン及び１ｍＭ  Ｒｏ２０−１７２４（Rolipram, RBI）を含む全量０．２ｍＬのＤＭＥＭ中に上記で調製したＨＰＬＣ分画のアリコートを加えたものを各ウエルに入れて、３７℃で１０分細胞をインキュベートした。氷冷エタノール０．５ｍＬを加えて細胞反応を停止し、プレートを８０℃で１２時間又は一晩貯蔵した。凍結プレートを遠心し、上清のアリコートを除去し、９６ウエルプレート上で乾燥してｃＡＭＰ測定を行った。ｃＡＭＰ測定は、市販のキット（Biotrak SPA, Amersham）を用いて実質的に製造者の指示に従って行った。
この実験結果を図５に示す。白い棒はＯＦＱを発現する形質転換ＣＨＯ細胞で得られた結果を、影をつけた棒は非形質転換ＣＨＯ細胞で得られた結果を表す。プール１３と１４（分画６１−７０に対応）は一様に、形質転換対非形質転換細胞でアデニルシクラーゼ阻害活性を示した。分画２に見られたｃＡＭＰの大きな増加は組織から抽出された内因性ｃＡＭＰによるものである。分画６０−６７に検出された生物活性のほとんどが含まれていると思われ、これを逆相ＨＰＬＣによるさらなる精製に用いた。
プールした分画６０−６７で逆相ＨＰＬＣを以下のようにして行った。完全に生物活性な材料をオクチルシリカカラム（Superspher RP Select B, 2x125mm, Merck）に充填し、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリルの直線状グラジエントを用いて０．１２ｍＬ／分の流速で溶出した。このグラジエントから得られる分画のアリコートを上述のようにして試験し、アッセイの結果を図６に示す。ＯＦＱＲで形質転換したＣＨＯ細胞中のフォルスコリン刺激したｃＡＭＰの阻害（影をつけた棒）は、溶出タンパク質の主要ピークでのみ検出された（２１４ｎｍの吸光度（Ａ214）で測定）。
アデニルシクラーゼ阻害活性をもつ単離された物質をマススペクトルで分析し、エドマン分解によって配列決定した。この物質は以下の配列をもつペプチドであることか分かった：
0003868494.tif 000010
（アミノ酸の略号はZubay, Biochemistry 2d ed., 1988, MacMillan Publishing: New York, p.33を参照）。このペプチドの最終収率は視床下部４．５ｋｇから約２００ピコモル（湿潤重量）であった。コンピューターデータベースで検索したところ、このペプチドはユニークな独立体としても、また大きなタンパク質の一部としても、今までに報告されていないものであった。このペプチドを本明細書中でオルファニンＦＱ（ＯＦＱ）と命名する。
この新規ペプチドの一次構造を多数の天然のオピオイドペプチドの一次構造と比較したものを図７に示す。既知のオピオイド受容体リガンドのアミノ末端にあるテトラペプチド配列モチーフＹＧＧＦはＯＦＱに見られるアミノ末端配列ＦＧＧＦと驚くほど似ている。さらに、オルファニンＦＱペプチドに見られる塩基性アミノ酸の２つのクラスターはジノルフィンＡ（Dynorphin A）及びβ−エンドルフィンにあるプラスに荷電した残基の配置に似ている。しかしながら、これらのペプチドのいずれもＯＦＱＲとの結合を示さず、その他のオピオイド受容体リガンドからのオルファニンＦＱペプチドの構造的／機能的なへだたりを示唆している。
単離した物質がこれを単離したプール分画に観察された性質をもっていることを証明するために、演繹した配列をもつ合成ペプチドを作製し、逆相ＨＰＬＣアッセイでの溶出特性及びマススペクトルで決定した分子量をもつ単離ペプチドと同一であることが分かった。さらに、この合成ペプチドはＯＦＱで形質転換され異種的にＯＦＱＲを発現するフォルスコリンで刺激されたＣＨＯ細胞中でのアデニルシクラーゼ産生を阻害し、１．５８ｎＭ（±０．６６６ｎＭ）のＥＣ50をもち、約１００ｎＭ濃度で最大阻害（８０％）を示すことも分かった。この高い能力は、その他のＣＮＳ特異的受容体の天然のリガンドとして同定されているその他の神経ペプチドと比較しうるものである。従って、オルファニンＦＱと命名した単離された配列はＯＦＱＲに対する新規の内在的ペプチドリガンドを表す。
このＯＦＱＲに対する新規のリガンドのリガンド結合をさらに特性付けるために、ペプチド配列中の様々な位置でチロシン置換された一連のペプチド類似体を作製した。次にチロシン置換したペプチド及びモノヨードチロシン置換したペプチドを用いてｃＡＭＰ阻害アッセイを行った。ヨウ素化ペプチドはHunter and Greenwood（1962, Nature 194:495）をクロラミンＴ法を用いて合成した。この研究によって、位置１４にチロシンをもつペプチド類似体（Ｙ−１４：配列番号：６）及びそのモノヨード形（Ｉ−Ｙ１４）は、オルファニンＦＱペプチドとほぼ同じ強度のＯＦＱＲアゴニストであり、それぞれ１ｎＭ及び３ｎＭのＥＣ50をもつことが分かった。
図８は、ＯＦＱＲを異種発現する形質転換ＣＨＯ細胞中におけるオルファニンＦＱ（黒丸）、Ｙ１４オルファニンＦＱ（黒四角）、モノヨードＹ１４オルファニンＦＱ（白四角）及びＬｅｕ−エンケファリン（白丸）のアデニルシクラーゼ阻害活性を比較するものであり；非形質転換ＣＨＯ細胞は対照としてオルファニンＦＱペプチドで処理した（黒三角）。フォルスコリン刺激した非形質転換ＣＨＯ細胞のｃＡＭＰレベルが１００％になるようにデータを正規化した。ｃＡＭＰレベルは全てのインキュベーションにつき三重試験で少なくとも２回測定した。図８は代表的実験の結果を示す。
新規なリガンドに対する受容体結合親和性を定量的にアッセイするためにＹ１４ペプチドを用いた。ＯＦＱＲで形質転換したＣＨＯ細胞（ＬＣ−７）由来の膜を膜タンパク質５５μｇ／アッセイ濃度で用いた。小麦胚芽アグルチニン被覆ＳＡビーズ（Amersham）１ｍｇを含む最終容量０．２ｍＬの結合緩衝液（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．１％牛血清アルブミン、０．０２５％バシトラシン）中の増加する濃度の（125Ｉ）−Ｙ１４−オルファニンＦＱとともに膜をインキュベートした。クロルアミンＴ法を用いて上述のヨウ素化ペプチドを合成した。モノヨード化ペプチドを、合成日に２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅの特異的活性をもつ単一ピークとして得た。９６ウエルプレート（OptiPlate, Caberra Packard）でアッセイを行い、混合物を震盪しながら１時間インキュベートした。TopCountミクロプレートシンチレーションカウンター（Canberra Packard）を用いて結合リガンド関連の放射能活性をシンチレーションプロキシミティ法（例えば、Nelson, 1987, Anal. Biochem. 165:287; Bosworth and Towers, 1989, Nature 341:167）で測定した。加えた放射性リガンドの全量から特異的結合リガンドの量を引くことによって遊離のリガンド濃度を計算した。
実験結果を図９に示す。スキャッチャード分析を挿入図に示す。放射性標識モノヨード−Ｙ１４−オルファニンＦＱペプチドはＯＦＱＦ発現形質転換細胞の膜との飽和可能で置換可能な結合を示し、０．１ｎＭ（８０ピコモル±０．２ナノモル）のＫD（スキャッチャードラインの勾配＝−１／ＫD）及び８００ｆｍｏｌ／ｍｇ膜タンパク質のＢmax（スキャッチャードラインの横座標切片）をもつ。ＫDはMunson, Principles of Pharmacology (Chapman & Hall), 1995, Chapter 1（参照として援用）に記載の方法で測定した。この実験により、新規な内因性リガンドペプチドであるオルファニンＦＱ及びそのＹ１４−チロシンが置換された類似体がＯＦＱＲと高親和性で飽和可能に結合することが示され、さらにこのペプチドがこの受容体に対する天然の内因性リガンドであるという結論を確認した。この実験はまた、Ｙ１４−置換ペプチドをＯＦＱオピオイド受容体レベルの検出及び定量のための放射性リガンドとして用い得ることを示唆する。
実施例６：オルファニンＦＱペプチドの機能的特徴付け
オルファニンＦＱペプチドの生理学的活性を研究するために、ペプチドのin vivo活性を制限しない動物、特にこのような動物の侵害受容（nociception）で試験した。
この実験のために、マウスにペプチドを脳室内（ｉｃｖ）投与及び胞膜内（intrathecally: ｉｔ）投与で投与した。ペプチド投与の直後に、マウスを３匹１群にして透明な箱に入れて行動兆候を記録した。ペプチドの抑制剤、刺激剤及び自律性効果を示す兆候（Irwin, 1968, Psychopharmacologia 13:222の記載する兆候）に特に注目した。オープンフィールド観察実験では、大投与量（例えば１ｎｍｏｌｅ／２μＬ／マウス以上）でペプチドを投与すると、運動活性に深刻な影響が見られ、また筋肉の緊張力の減少、正向反射の減少及び運動失調が観察された。定量的研究によると、０．１−１０ｎｍｏｌｅ／２μＬ／マウス濃度でペプチドをｉｃｖ投与すると、水平運動と垂直運動のいずれにおいても減少を示した。この結果を図１０に示す。水平運動及び垂直運動活性に及ぼす影響をDigiscan Animal Activity Monitors（Omnitech, Columbus, OH）を用いて測定した。水平運動及び垂直運動活性値は、ペプチド投与後の最初の１０分間における水平及び垂直センサーの中断回数を表す。データは平均±標準偏差を示す。
一方、オルファニンＦＱペプチドは図１１に示すホットプレート試験で記録するように、マウスに痛覚脱失作用効果をほとんど示さなかった。６−８匹の雄ＭＯＲＯマウス（体重＝２２ｇ）の群にリン酸緩衝塩液（白丸）又は種々の投与量のオルファニンペプチドを投与した。反応時間はマウスが足をなめるのに要した時間を表す。ホットプレートは５８℃にセットし、６０秒のカットオフ時間を用いた。１０ｎｍｏｌｅ／マウスという高投与量のペプチドをｉｃｖ投与（約０．４５ｎｍｏｌｅ／ｇ）したマウス（星印で示す）を除いて、反応時間に有意な減少はなかった。この観察は運動活性及び筋肉の緊張力の減少とよく関連すると思われた。試験した全ての投与量で、図１２に示すように、全動物が正常なつま先及び尾ピンチ反射を示した。オルファニンＦＱを２．５−１０ｎｍｏｌｅ／４μＬ／動物で胞膜内投与したときには痛覚脱失作用は観察されなかったが、最高投与量では後足麻痺と運動活性の減少が観察された。運動活性及び筋肉緊張力で有意な減少をもたらさない投与量では、このペプチドは全てのマウスに痛覚脱失作用が観察されなかった。これらの結果は、実施例５に記載したような痛覚脱失作用を生じるオピオイド受容体リガンドとの構造的相同性にもかかわらず、オルファニンＦＱペプチドは薬理学的に異なるものであり、はっきりした痛覚脱失作用活性をもたない（実施例６で測定した反応時間に有意な減少が見られなかったことからして）と思われる。
実施例７：ナロキソン及びＯＦＱにより逆転されるストレス誘導の痛覚脱失作用ＯＦＱとオピオイドペプチドとの構造的相同性にもかかわらず、ｉｃｖ注射した動物は、痛みに対する感受性減少として観察される明確な侵害受容又は痛覚脱失を示さない。むしろ、ＯＦＱが尾をたたくアッセイ及びホットプレートアッセイの両方で痛覚過敏、つまり痛みに対して過感受性になったという報告がある（Meunier et al., Nature 377:532-535, 1995）。他の者の予期することとは反対に、本発明者はＯＦＱが痛覚過敏をもたらすのではなく、むしろ痛覚脱失のようなオピエート作用に強力かつ用量依存的に拮抗することを見いだした。ＯＦＱはマウスやヒトなどの動物における内因性又は外因性オピオイドの効果を逆転することができる内因性抗オピオイドペプチドとして作用することが観察された。
ＯＦＱペプチドの抗オピオイド作用は、本実施例で示されており、急性熱痛に対する応答アッセイである尾引っ込め（ＴＷ）試験でＯＦＱの効果を示している。結果を図１３Ａに示す。両性のAwiss-Websterマウス（２０−３５ｇ；Simonsen Inc., Ｎ＝７−８匹／群）に、食塩水（Sal; 10ml/mg）及びナロキソン（NAL, 1mg/kg）の皮下（ｓｃ）注射及びＶｅｈ（人工能脊髄液（ＣＳＦ）２．５μｌ）又は１０ｎｍｏｌｅのＯＦＱをｉｃｖ注射（ハロタン麻酔下で）を行う前と後（１０、２０及び３０分）に尾の遠位末端の半分を４６℃の水につけて、侵害受容感受性を試験した。別の群のマウスは食塩水又はナロキソンのｓｃ注射のみを受けた（図１３Ａでｉｃｖ注射を受けていないのはＮｏｎｅで表す）。
尾の激しい屈曲運動による熱刺激への応答潜伏を、動物の薬剤投与状況を知らされていない経験のある観察者によりほぼ０．１秒まで測定した。試験中、マウスは布／厚紙ホルダー中に軽く拘束した。引っ込め反射又はその他の苦痛を示す兆候がないときには、尾を１５秒のカットオフ潜伏期の後に水から尾を取り出した。正確さを改良するために、２０秒おきに３回の別個のＴＷ潜伏試験を行い、各試験の平均を取った。この試験及び次の試験において、性別による効果や相互作用は有意ではなかったので、両性のデータを集めた。注射後１０、２０及び３０分の繰り返し試験でどの群にも注射後のＴＷ潜伏期には変化がなかったので、これらの時点におけるデータを集めた。平均ＴＷ変化データで行ったＡＮＯＶＡ（変量分析）によると、ｓｃ注射とｉｃｖ注射に有意な主要効果が見られた（それぞれF2,44=9.31，p＜0.05）。計画対比では、Sal/Veh群がその他の全ての群と有意に異なっていることを示した。
ＯＦＱによって引き起こされた痛覚過敏の証拠はなかったが、ベヒクル処理した動物はＯＦＱ処理した動物よりも高いＴＷ潜伏期（つまり痛みに対して感受性が低い）を示した（p＜0.01）（図１３）。ベヒクル処理した動物はストレスにより誘導された痛覚脱失（ＳＩＡ）を示した。ＳＩＡは内因性オピオイドによって媒介されるので、ＳＩＡに及ぼすオピエートアンタゴニストであるナロキソン及びＯＦＱの効果を試験した。ナロキソン及びＯＦＱはいずれも、ベヒクル処理した動物によるＴＷ潜伏における４秒の注射後増加を弱めた（p＜0.05）。ナロキソンとＯＦＱを組み合わせて投与しても追加効果はなかった。ＯＦＱ又はナロキソンで処理したマウスはどの場合も痛覚過敏を示さず、むしろこれらの薬剤の投与は単にＳＩＡを逆転することによる痛覚感受性をベースラインに戻すものであった。痛覚過敏はベヒクル単独の場合よりも尾引っ込めが短くなることで検出されるはずであるが、ＯＦＱではこれは観察されなかった。
実施例８：身もだえ試験におけるＯＦＱによるモルフィン痛覚脱失の逆転
痛覚過敏の観察を最大にするために、腹収縮試験でＯＦＱの効果を測定するための酢酸ＡＣアッセイを行った。この試験は持続性の化学的に誘発された痛み刺激を測定する極めて敏感な試験である。結果を図１３Ｂに示す。
ＡＣアッセイはKosterらが記載する方法を修飾したものである。マウス（Ｎ＝９−１５匹／群）を別々の円筒形プレキシガラス観察箱中に３０分以上順応させた。次に体重を測定し、食塩水（Sal; 10ml/mg）及びナロキソン（NAL, 1mg/kg及び10mg/kg）の皮下（ｓｃ）注射をするか、あるいは注射なし（Ｎｏｎｅ）で処理した。その直後、マウスをハロタンで軽く麻酔し、ベヒクル（ＶＥＨ；人工ＣＳＦを２．５μｌ）又はベヒクル２．５μｌ中のＯＦＱ２．５ｎｍｏｌｅ（ＯＦＱ−２．５）のｉｃｖ注射を行った。Ｓａｌ処理したマウスの別の群はｉｃｖ注射をしなかった（Ｎｏｎｅ）。５〜１０分後に全マウスに０．９％酢酸を腹腔内（ｉｐ）投与し、観察箱に戻した。続く３０分間、腹収縮回数（胴の長さ方向へ伸び及びこれに付随する背部の凹形のアーチ形成）を数えて記録した。薬剤条件を知らない１人の実験者が別々の箱に入った４匹のマウスを同時に観察した。ＡＮＯＶＡによると、有意な群間の差があった。
結果を図１３Ｂに示す。ＶＥＨマウスにおける収縮回数の減少はＳＩＡによるものであり、これがＮＡＬ及びＯＦＱ−２．５で逆転されたと信じられる。ＯＦＱ２．５ｎｍｏｌのｉｃｖ注射は、ＯＦＱ投与後３０分以内にモルフィンの痛覚脱失作用を阻害するために薬理学的に十分な量であった。
実施例９：尾引っ込め潜伏期におけるＯＦＱによるモルフィン痛覚脱失の逆転
ＯＦＱは、オピオイドＳＩＡ基質によって媒介されるモルフィンの痛覚脱失作用を逆転する。本実施例では、ベースライン侵害受容感受性の評価の直後にマウスにモルフィンを投与する。これにより注射３０分後にピークになる顕著な痛覚脱失をもたらし（図１４）、約２時間続いた。しかし、ＯＦＱはこの痛覚脱失を用量依存的に逆転した（２．５−２５ｎｍｏｌｅの用量で）。
両性のSwiss-Websterマウス（Ｎ＝６−１１匹／群）を、４９℃のＴＷ試験（実施例７に記載のもの）上でのベースライン侵害受容感受性を試験し、硫酸モルフィン（ＭＯＲ；５ｍｇ／ｋｇ）をｓｃ注射し、次にモルフィン痛覚脱失の存在を確立するために２０分後に再試験した。痛覚脱失マウス（少なくとも２倍のベースラインのＴＷ潜伏期をもつもの：３匹を除く全マウス）をハロタンで軽く麻酔し、ベヒクル（Ｖｅｈ；人工ＣＳＦを２．５μｌ）又はＯＦＱ（ベヒクル２．５μｌ中の２．５、５、１０又は２５ｎｍｏｌｅ）のｉｃｖ注射を行い、１０、２５、４０及び１００分後にＯＦＱ用量を知らされていない実験者によってＴＷ潜伏期を再試験した．２５ｎｍｏｌｅのＯＦＱはマウスの５０％に顕著なアトニー（無緊張）と弛緩性麻痺をもたらした。しかし、この高いＯＦＱ用量を注射されたマウスに実際には熱刺激に対してより迅速に反応したので、これらの副作用はこのデータと混同してはならない。
図１４は、モルフィン痛覚脱失と４つのＯＦＱ用量によるその用量依存的逆転を示す経時変化データである。印は各時点における４９℃水からの平均（±ＳＥＭ）ＴＷ潜伏期を表す。
線状回帰分析を用いて５ｍｇ／ｋｇのモルフィン痛覚脱失作用を５０％阻害するＯＦＱ用量を計算し、このＥＤ50を２．５μｌ容量では７．５ｎｍｏｌであると決定した。ＥＤ50とは最大効果の５０％応答をもたらすのに必要な用量である。痛覚脱失の有意な阻害はオピエート痛覚脱失の５０％阻害であるだろう。ＥＤ50は有意な阻害を達成するための薬理学的に十分なＯＦＱ量である。
実施例１０：ＯＦＱによるモルフィン体温異常降下の緩和
本実施例では、痛覚脱失以外のオピオイド作用と機能的に拮抗するＯＦＱの能力を示す。ここで研究するモルフィンの非侵害受容作用は、高い用量で齧歯類に体温異常降下を誘発する能力である．ＤＢＡ／２Ｊマウス株は強力な体温異常降下応答を示すことが知られているので、この株を体温異常降下緩和試験に用いた。
食塩水（Ｓａｌ；１０ｍｇ／ｋｇ）又はモルフィン（ＭＯＲ；２０ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ）の全身投与の直前及び３０分後にＤＢＡ／２Ｊマウス（１５−３０ｇ：The Jackson Laboratory; Ｎ＝７−８匹／群）の中心体温を評価した。その直後に、マウスにベヒクル（Ｖｅｈ；人工ＣＳＦを２．５μｌ）又はベヒクル２．５μｌ中の５又は１０ｎｍｏｌｅのＯＦＱ（ＯＦＱ−５及びＯＦＱ−１０）をｉｃｖ注射し、１５、３０及び６０分後に再試験した。
図１５に示すように、ハロタンによる一次的体温異常降下に加えて、ＭＯＲによって体温が６℃低下した。食塩水処理したマウスの体温は、ハロタンによる短時間の体温異常降下以外は約３８℃に保持された。ＯＦＱ自身は体温に影響しなかった。しかしながら、いずれの用量のＯＦＱも、ＭＯＲ注射後６０−９０分における２０ｍｇ／ｋｇのＭＯＲ体温異常降下に逆転した（F4.33=44.94，p＜0.001）。この条件下では、体温異常降下の逆転は少なくとも１℃の温度上昇であるだろう。本実施例で投与されたＯＦＱの用量はこの逆転を達成するために薬理学的に十分な量である。
本実施例で用いた高用量（２０ｍｇ／ｋｇ）のモルフィンはストラウブテイル（Straub tail）をもたらし、これは全てのマウスでオピエートに暴露することに付随する尾の筋肉硬直である。少なくとも５ｎｍｏｌｅのＯＦＱに暴露することにより、大多数の動物においてｉｃｖ注射の１−２分後にストラウブテイルが有効に排除された。１５−３０ｇのラットで５ｎｍｏｌｅのｉｃｖ用量は、大多数の動物においてｉｃｖ注射の１−２分後にストラウブテイルが排除されるための薬理学的に十分な量の１例である。この知見はオピエートメカニズムのＯＦＱの機能的拮抗作用をさらに一般化するものである。
実施例１１：モルフィン依存性マウスにおけるオピエート禁断症状症候群の促進（precipitation）
オピエート耐性、依存性及び禁断症状はオピエート受容体機能における単純な変更によっては説明できない。モルフィン耐性及び中毒は（現在までは）よく定義されていない抗オピオイド活性の作用が関与すると信じられてきた。特に、モルフィン投与は抗オピオイドペプチドの放出を引き起こし、これがモルフィン作用と相互作用し、生理学的恒常性の維持に寄与すると信じられる。抗オピオイドペプチドはこの恒常状態に介入することによって禁断症状症候群を促進させるはずである。本実施例はモルフィン依存性マウスで実際にオピエート禁断症状症候群を引き起こすこと、さらに抗オピオイドとしての役割を支持することを示す。
両性のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１５−２５ｇ；The Jackson Laboratory；Ｎ＝６−１１匹／群）を、除放性製剤を用いてモルフィン依存性にした。この製剤は食塩水溶液中に硫酸モルフィン３５ｍｇ／ｍｌを含み、６：１の軽鉱油；マンニドモノオレエート（Arlacel A, Sigma）混合物と、モルフィン：オイル溶液を１：７の比率で激しく攪拌した。粘度の高い白色エマルジョンを２１ゲージの針を用いて２００ｍｇ／ｋｇモルフィン（８ｍｌ／ｋｇ容量で）をｓｃ投与した。試験時点（注射後５−６時間）でモルフィンはストラウブテイル及び４９℃のＴＷ潜伏期評価でまだ存在していた。マウスに食塩水（Ｓａｌ；１０ｍｇ／ｋｇ）又はＮＡＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）をｓｃ投与し、その直後にベヒクル（Ｖｅｈ；人工ＣＳＦを２．５μｌ）又はＯＦＱ（ベヒクル２．５μｌ中の０．１−１０ｎｍｏｌｅ）をｉｃｖ注射した。使用した全てのＯＦＱ投与量が禁断症状の促進に同じように有効であると思われたので、これらのデータを一緒にした。次に各動物を、卓上３２ｓｍにつり下げた１７ｘ２７ｃｍの個別のプラットフォームに入れた。ジャンプ回数を２０分間記録し、これは震え／”濡れ犬震え（wet-dog shakes）”の頻度であり、下垂の存在を示すものである。５ｎｍｏｌｅ以上のＯＦＱ用量で、ジャンプ行動が妨害された数匹のモルフィン依存性マウスにアトニーをもたらした。
ＯＦＱによって促進した禁断症状ジャンプを図１６に示す。棒は２０分の試験期間の禁断症状ジャンプ回数の平均（±ＳＥＭ）を表す。誤差の棒を越える比率は全試験回数と比較したジャンプ行動を示す動物数を示す。ＯＦＱのｉｃｖ投与によって生じた禁断症状症候群は、全身性ナロキソン（ＮＡＬ）によって生じるものと比較して軽いが、明白に存在する。濡れ犬震えや下垂を含むその他の禁断症状症候群がＯＦＱ処理したマウスで観察されたが、ベヒクルのみを与えたマウスには見られなかった。禁断症状の促進は実施例１１のプロトコルにおける増加する全禁断症状ジャンプとして定義される。
実施例１２：ＯＦＱ受容体アゴニストの親和性の決定
本発明のペプチドはμ、κ又はδ−オピオイド受容体と高特異性で結合しない。本実施例では受容体特異性の欠如と、リガンド−受容体結合の特異性をどのようにして決定したかを示す。ＯＦＱへの受容体結合親和性をアッセイするための競合アンタゴニストとして、［3Ｈ］ジプレノフィンを用いた。ＯＦＱＲで形質転換したＣＨＯ細胞（ＬＣ−７）由来の膜を１００μｇ膜タンパク質／アッセイ濃度で用いた。
安定に形質転換されたＣＨＯ細胞を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）で３回リンスし、回収してガラス−テフロンホモジェナイザーを用いて同じ緩衝液で４℃でホモジェナイズした。ホモジェネートを４２０００ｇ、４℃で１５分遠心した。ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。プレインキュベーションの後、ホモジェネートを上述のようにして遠心し、ペレットを使用時まで７０℃に貯蔵した。
ペレットを融解し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、ホモジェネートを上述のようにして遠心した。ペレットを結合緩衝液に再懸濁し、タンパク質濃度を、牛血清アルブミンを標準として用いるローリー法で測定した標準曲線によって測定して１００μｇ／μｌに調整した。平衡競合実験では、［3Ｈ］ジプレノフィンを、μ、κ及びδ受容体をそれぞれ発現するＣＨＯ細胞中のμ、κ及びδ受容体を標識するためのアンタゴニスト放射性リガンドとして用い、ＯＦＱを置換体として用いた。さらに、ＤＡＭＧＯ、Ｕ５０４８８Ｈ及びＤＰＤＰＥもこれらのアッセイにおいてμ、κ及びδ受容体を発現するＣＨＯ細胞中で置換体として用いた。
０．３６ｎＭの最終［3Ｈ］ジプレノフィン濃度を用いて、１０マイクロモルのペプチダーゼ阻害剤であるベスタチンの存在下に、全量１ｍｌで２５℃、６０分、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．７）を入れたインキュベーション管中で結合反応を行った。全ての管は膜調製物と［3Ｈ］ジプレノフィンを含んでいた。また興味のあるリガンドを膜／ジプレノフィン調製物にそれぞれ加えた。管の一部のサブセットには興味のあるリガンドとして１０マイクロモルのナロキソンを加えて、非特異的結合を測定した。別の管サブセットには［3Ｈ］ジプレノフィンの存在下にＯＦＱを加えて、ジプレノフィン置換体による各クラスの受容体からのＯＦＱの置換を測定した。興味のあるリガンドとして別の管サブセットにはＤＰＤＰＥを加えて、さらに別の管にはＵ５０４８８Ｈを加えた。各興味のあるリガンドは０から１００マイクロモルの桁までの濃度で存在した。放射性ジプレノフィン置換体の濃度は管のサブセットにより図１７に示す範囲で変更した。
６０分のインキュベーションの最後に、Brandel Cell Harvesterを用いてポリエチルアミン（０．５％）に浸したＧＦ／Ｂフィルターで真空濾過することによりインキュベーションを終わらせた。このセルハーベスターは制御された方法で反応管から内容物を同時に取り出す多数の装置をもっており、各管に対応する内容物をフィルターディスク上にため、氷冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液各２ｍｌで２回洗浄し、内容物を再度対応するフィルターディスク上にためる。フィルターディスクをミニバイアルに入れてEcoLumeシンチレーション液（ICN, Costa Mesa, CA）中で一晩溶出させ、Beckmanシンチレーションカウンターでカウントした。
得られるデータは放射能カウントであり、これは全結合ジプレノフィン放射性リガンドの％に比例した。興味のある結合リガンド％（例えばＯＦＱ）は検出した放射能活性量と逆比例した。図１７に示すように、μ、κ及びδ受容体での全ＯＦＱの％は、広範囲な置換体濃度にわたって安定であった。しかしながら、ＤＡＭＧＯ、ＤＰＤＰＥ及びＵ５０４８８Ｈ（μ、κ及びδ受容体と結合することが知られている）は競合的に置換された。
リガンド置換研究の各サブセットについて、シンチレーションカウンターで得られた結果を、GraphPad Inplot（GraphPad, Inc., SanDiego, CA）ソフトウエアプログラムを備えたＩＢＭコンピューターで分析した。このプログラムはデータに対するロジスティック方程式の非線形回帰当てはめを行うものであり、図１７に示すグラフを得た。
このデータを用いて、プログラムはＩＣ50（［3Ｈ］ジプレノフィンなどの放射性標識されたリガンド結合の５０％を阻害するＯＦＱなどの非標識リガンドの濃度）をさらに計算する。ＩＣ50とＫiとは方程式Ｋi＝ＩＣ50／（１＋［Ｌ］／ＫD）（式中、［Ｌ］は標識リガンドジプレノフィンの濃度であり、ＫDは［3Ｈ］ジプレノフィンの解離定数である）によって関連付けられる。ＩＣ50のデータを以下の表１に示す。
0003868494.tif 000011
データは３回の独立した実験の平均ＳＥ値である。興味のあるリガンドはもしもそれが高親和性で受容体と結合するならば低いＩＣ50（≦１００ｎｍ）をもつ。μ及びδ部位で２０００以上、またκ部位で７５４のＩＣ50をもつＯＦＱを除くと、全ての興味のあるリガンドは、オピオイド受容体のいずれかと高親和性で結合する。これらの値はＯＦＱがμ、κ及びδ受容体と特異的に結合しないことを示す。ここでは、受容体との特異的結合とは、約１００ｎｍ以下のＩＣ50で表される親和性をもつことを意味する。好ましい態様では、親和性は０．１−１０ｎｍであり、好ましくは１ｎｍ以下であり、最も好ましくは０．１ｎｍ以下のである。
実施例１３
本発明のいかなるペプチドの親和性も実施例１２で記載する親和性研究で決定できる。従って、アミノ酸置換をもつＯＦＱ類似体を実施例１２のＯＦＱに代えて用いることができる。ＯＦＱ受容体のペプチド類似体の親和性を決定するために、実施例１２のμ、κ及びδ受容体発現細胞膜に代えてＯＦＱＲで形質転換したＣＨＯ細胞膜を用いた。これによって、ペプチドがＯＦＱＲに特異的に（Ｋi又はＩＣ50≦１００ｎｍ）結合するかどうかを決定する直接スクリーニング法が可能になる。
実施例１４：ＯＦＱ抗オピオイドアンタゴニストを得る方法及びアンタゴニストを使用する方法
ＯＦＱ／ＯＦＱＲ系の拮抗作用は臨床分野で実際的用途をもつ。アンタゴニストは痛覚脱失作用自体をもたないが、モルフィン薬物療法の補助薬として有効であることが期待される。体の恒常的抗オピオイドメカニズムに介入することによって、ＯＦＱＲアンタゴニストはより大きな痛覚脱失作用を達成するためにより低い治療用量を用い得ることが期待される。モルフィン用量が低いことは副作用（呼吸低下又は便秘など）を少なくし、高用量のモルフィンを長期間使用した後に経験する耐性又は中毒の発生を避けるという利点をもっている。ＯＦＱＲアンタゴニストはまた中毒者のオピエート禁断症状の兆候や症状を軽くすることが期待される。このような方法でのアンタゴニストの使用は、ＯＦＱ／ＯＦＱＲ相互作用が抗オピオイド作用を媒介するという本発明者の認識によって可能になったのである。
抗オピオイドアンタゴニストの使用法は当業者には公知でなかったが、オリゴヌクレオチドはＯＦＱ作用に拮抗することが報告されている。Meunier et al., Nature 377:532-535, 1995（参照としてここに援用する）を参照のこと。この報告で記載されているオリゴヌクレオチドはＯＦＱＲの翻訳された領域に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであった。アンチセンスオリゴヌクレオチドｍＡＳ［２５，９］は、マウスＯＲＬ1ｍＲＮＡの翻訳された領域の塩基９−２５と相補的な１７ｍｅｒの３’−ＧＧＡＧＡＡＡＧＧＡＣＧＧＧＧＴＡ−５’であった。対照のミスセンスオリゴヌクレオチドｈＡＳ［２５，９］は、ヒトＯＲＬ1ｍＲＮＡの翻訳された領域の塩基９−２５と相補的な１７ｍｅｒの３’−ＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＣＧＣＧＧＣＡ−５’であった。オリゴヌクレオチドを最終濃度２ｍｇ／ｍｌで滅菌生理食塩水に溶解した。雄のスイスＣＤ１マウス（２０−２５ｇ；Charles River）に溶液１０μＬを４日間毎日、外側脳室に直接注射した。
受容体の発現はアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害された。同様な拮抗作用を与えるために、同様な長さのその他のオリゴヌクレオチドを塩基９−２５にマッピングした（表１の遺伝コードを用いて）。
オピエート禁断症状症候群を治療するために本発明の方法ではその他のアンタゴニストを用いる。ＯＦＱアミノ酸配列と実質的に相同であるが、１以上のアミノ酸置換を行った配列をもつヘプタデカペプチドを合成した。次に合成したヘプタデカペプチド（又はその他のオリゴペプチド）を、ＯＦＱで形質転換したＣＨＯ細胞中でｃＡＭＰ蓄積アッセイを用いてスクリーニングした。ｃＡＭＰ蓄積を阻害しないペプチド（実施例５に記載するアッセイを用いて）をアンタゴニストとして作用する部分的アゴニストとして選択した。この直接アッセイで得られた選択ペプチドを次に動物に投与（実施例１１に記載するように）してオピエート禁断症状の緩和を測定し、これはＯＦＱアンタゴニストを投与していない動物と比較した禁断症状ジャンプの減少で示される。
ここに開示するアッセイでｃＡＭＰ蓄積を阻害しないアゴニスト−アンタゴニストペプチドを見つけるために、合成ペプチドのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングは、Houghten et al., Generation and use of synthetic peptid combinatorial libraries for basic research and drug discovery, Nature 354:84-86（参照としてここに援用する）に記載の方法を用いて行う。可溶性で支持体と結合していないペプチドライブラリーは、Ostresh, "Libraries from libraries: Chemical transformation of combinatorial libraries to extend the range and repertoire of chemical diversity", PNASが報告するように、in vtro及びin vivoで有用である。これらのライブラリーの上手な使用法は受容体活性なオピオイドペプチドの開発で報告されている。Dooley, "An All D-Amino Opioid Peptide with Central Analgesis Activity from a Combinatorial Library", Science 266:2019-2022, 1994（参照としてここに援用する）を参照のこと。
これらの方法で発見されるアンタゴニストを実施例８に記載するように、オピエート禁断症状の兆候を妨害する試験に付す。
これまでの記載は本発明の特定の態様を強調するものであり、付属の請求の範囲に示すように、これと均等な修飾や変更が本発明の精神及び範囲内のものである。
配列表
（２）配列番号：１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３１塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000012
（３）配列番号：２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000013
（４）配列番号：３の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１４５２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ｃＤＮＡ
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名前／キー：５’ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１．．１８１
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名前／キー：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：１８２．．１２８２
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名前／キー：３’ＵＴＲ
（Ｂ）位置：１２８３．．１４５２
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000014
0003868494.tif 000015
（５）配列番号：４の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３６７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：タンパク質
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000016
（６）配列番号：５の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ペプチド
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000017
（７）配列番号：６の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ペプチド
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000018
（８）配列番号：７の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ペプチド
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000019
（９）配列番号：８の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ペプチド
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000020
（１０）配列番号：９の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ペプチド
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000021
（１１）配列番号：１０の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：５アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）分子のタイプ：
（Ａ）特徴：ペプチド
（ｘｉ）配列
0003868494.tif 000022
【図１】
0003868494.tif 000025
【図２】
0003868494.tif 000026
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
0003868494.tif 000029
【図５】
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【図６】
0003868494.tif 000031
【図７】
0003868494.tif 000032
【図１４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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