(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0003872135.tif 000009
（Ｒはヒドロキシル基、アミノ基を表す。）で示される化合物又はその塩を、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物の培養物、その菌体、または処理菌体に接触せしめることを特徴とする、一般式（ＩＩ）
【化２】
0003872135.tif 000010
（Ｒは前記に同じ。）、又は一般式（ＩＶ）
【化３】
0003872135.tif 000011
（Ｒは前記に同じ。）で示される光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体又はその塩の製造方法。
【請求項２】
一般式（Ｉ）
【化４】
0003872135.tif 000012
（Ｒはヒドロキシル基、アミノ基を表す。）で示される化合物又はその塩を、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物の培養物、その菌体、または処理菌体に接触せしめ、未反応である一般式（ＩＩ）
【化５】
0003872135.tif 000013
（Ｒは前記に同じ。）の化合物又はその塩を反応系から分離することによる（Ｓ）−γ−ブチロラクトン誘導体又はその塩の製造方法。
【請求項３】
一般式（Ｉ）
【化６】
0003872135.tif 000014
（Ｒはヒドロキシル基、アミノ基を表す。）で示される化合物又はその塩を、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物の培養物、その菌体、または処理菌体に接触せしめ、一般式（ＩＩＩ）
【化７】
0003872135.tif 000015
（Ｒは前記に同じ。）の化合物又はその塩を得、これを一般式（ＩＶ）
【化８】
0003872135.tif 000016
（Ｒは前記に同じ。）の化合物又はその塩に変換することによる、（Ｒ）−γ−ブチロラクトン誘導体又はその塩の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬品中間体、また、アミノ酸であるホモセリンの誘導体として有用な光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体の新規な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体の製造方法としては、例えば、光学活性なα−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの製法において、キニーネ、ブルシンを分割剤とする光学分割法［Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２６７５（１９２１）］、アルカロイドとのラセミ混合物を作り、分別結晶により分割する方法［Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１５７６（１９４８），Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２４９７（１９５１）］、光学活性なリンゴ酸を原料とする方法［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１０４０（１９８８）］等が知られている。さらに光学活性なα−アミノ−γ−ブチロラクトンの製造方法としては、アミノ基にアシル基を導入して、生物的に加水分解している方法［Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２１２（１９５３）］、メチオニンを原料とする方法［Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２２６（１９８９）］、アスパラギン酸を原料とする方法［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４７６３（１９９０）］等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、光学分割法はキニーネ、ブルシン等の高価な分割剤を必要とするものであり、また、分割後のγ−ブチロラクトン誘導体の回収も容易ではない等の欠点を有している。分別結晶法は、操作的に煩雑であり、工業的には適当ではない。また、光学活性なリンゴ酸を原料とする方法では、途中ジボランによる還元工程が含まれており、工業的に製造することは困難である。
光学活性なα−アミノ−γ−ブチロラクトンの製造方法におけるような生物的加水分解法は、アミノ基にあらかじめアシル基を導入する必要がある。また、メチオニンを原料とした場合、メチルメルカプト酢酸が副生するため、悪臭の問題がある。アスパラギン酸を原料とする方法には、ジボランによる還元工程が含まれており、工業的に製造することは困難である。
このように、現在、光学活性なγ−ブチロラクトンを簡便に、かつ、工業的に製造する方法はまだ知られていない。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、一般式（Ｉ）
【化９】
0003872135.tif 000002
（Ｒはヒドロキシル基、アミノ基を表す。）で示される化合物、又はその塩の不斉加水分解につき、鋭意研究を行った結果、特定の微生物を用いることにより効率よく、一般式（Ｉ）の化合物のＲ体のみを選択的に加水分解を行い、一般式（ＩＩ）
【０００５】
【化１０】
0003872135.tif 000003
（Ｒは前記に同じ。）で示されるＳ体の未加水分解物を反応系から分離することにより、又、一般式（ＩＩＩ）
【０００６】
【化１１】
0003872135.tif 000004
（Ｒは前記に同じ。）で示されるＲ体の加水分解物はラクトン化を行うことにより、一般式（Ｉ）の化合物から効率よく、一般式（ＩＩ）および（ＩＶ）
【０００７】
【化１２】
0003872135.tif 000005
（Ｒは前記に同じ。）で示される光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体を取得し得ることを見い出した。
【０００８】
本発明は、かかる知見に基づいてなされたものである。すなわち、本発明は、（１）一般式（Ｉ）（Ｒはヒドロキシル基、アミノ基を表す。）で示される化合物又はその塩を、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物の培養物、その菌体、または処理菌体に接触せしめることを特徴とする、一般式（ＩＩ）（Ｒは前記に同じ。）、又は一般式（ＩＶ）で示される光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体又はその塩の製造方法、
（２）一般式（Ｉ）（Ｒは前記に同じ。）で示される化合物又はその塩を、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物の培養物、その菌体、または処理菌体に接触せしめ、未反応である一般式（ＩＩ）（Ｒは前記に同じ。）の化合物又はその塩を反応系から分離することによる（Ｓ）−γ−ブチロラクトン誘導体又はその塩の製造方法、及び
（３）一般式（Ｉ）（Ｒは前記に同じ。）で示される化合物又はその塩を、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物の培養物、その菌体、または処理菌体に接触せしめ、一般式（ＩＩＩ）（Ｒは前記に同じ。）の化合物又はその塩を得、これを一般式（ＩＶ）（Ｒは前記に同じ。）の化合物又はその塩に変換することによる、（Ｒ）−γ−ブチロラクトン誘導体又はその塩の製造方法を提供する。
本発明は、短い反応処理工程で光学純度の極めて高いγ−ブチロラクトン誘導体又はその塩を得ることができることなど多くの長所を有する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明は以下の反応式で表すことができる。
【化１３】
0003872135.tif 000006
（＊は光学活性炭素を示す。）
【００１０】
すなわち、本発明に従えば、一般式（Ｉ）の化合物又はその塩を、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属からなる群より選ばれた属に属する微生物の培養物、その菌体、または処理菌体に接触せしめ、一般式（ＩＩ）で示されるＳ体の未加水分解物又はその塩を反応系から分離することにより、また、得られた一般式（ＩＩＩ）で示される加水分解物又はその塩は次にラクトン化を行うことにより一般式（ＩＶ）又はその塩に変換することにより、効率的な光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体又はその塩の製造法が提供されるのである。
【００１１】
以下に本発明をより詳細に説明する。
本発明においては、一般式（Ｉ）の化合物をＲ体選択的に不斉加水分解する微生物として、フサリウム属、シリンドロカルポン属、ジベレラ属に属する不斉加水分解機能を有する微生物が、工業的に一般式（ＩＩ）の化合物、または一般式（ＩＩＩ）の化合物を経て一般式（ＩＶ）の化合物を製造するための微生物として用いられる。上記各属に属する微生物において、Ｒ体選択的不斉加水分解能の特に優れたものが見い出される。なかでも、フサリウム属としては、フサリウム・オキシスポルム（ＩＦＯ５９４２）、フサリウム・セミテクタム（ＩＦＯ３０２００）等が、シリンドロカルポン属としては、シリンドロカルポン・トンキネンス（ＩＦＯ３０５６１）、シリンドロカルポン・スクレロチゲナム（ＩＦＯ３１８５５）等が、ジベレラ属としては、ジベレラ・フジクロイ（ＩＦＯ６３４９）、ジベレラ・フジクロイ（ＩＦＯ６６０３）等が好ましい。
【００１２】
本発明方法において、微生物を培養する場合の各種条件は、使用する菌株により異なるが、培地に関しては、炭素源として、グルコース、シユクロースなどの糖類、エタノール、グリセロールなどのアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸およびそのエステル類、菜種油、大豆油などの油類などが挙げられ、窒素源として、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ペプトン、カザミノ酸、コーンステイープリカー、ふすま、酵母エキスなどが挙げられ、無機塩類として、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなどが挙げられ、他の栄養源として、麦芽エキス、肉エキスなどを含有する培地を用いる。その他、当該分野で一般的に使用されるものを適宜選択して用いることができ、例えば、ビタミン、ミネラルなどを任意に加えることもできる。
培養は好気的に行ない、通常、培養時間、１〜７日程度、培地のｐＨ、３〜９、培養温度、１０〜５０℃で行なう。
【００１３】
本発明方法において、使用する微生物は、液体培地に菌株を培養して得られた培養物、培養液から分離した菌体、あるいは菌体または培養物を処理して得られる乾燥菌体、もしくは固定化菌体などのいずれの形態のものも用いることができ、遺伝子組換えによる微生物を用いることも可能である。また、遺伝子組換え及び変異処理により微生物の酵素活性を上昇させることも可能である。遺伝子組換えは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  ｅｄ．；Ｊ．Ｓｈａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載の方法などに従って行うことができる。変異処理による育種法としては、突然変異を誘発せしめる方法が挙げられ、例えば紫外線、γ−線、Ｘ線などの物理的変異原を利用するもの、亜硝酸ナトリウム、アルキル化剤、ヒドロキシルアミン、ニトロソウレア、ニトロソグアニジンなどの化学的変異誘起物質を利用するものなどが挙げられる。
操作は回分式、半回分式、または、連続式のいずれでも行なうことができる。使用するγ−ブチロラクトンの濃度は、通常、１０〜５００ｇ／ｌである。反応温度は、通常、１０〜５０℃であるが、より好ましくは２０〜３０℃である。反応時間は、回分式の場合、通常、数時間から１日間である。反応系のｐＨは、通常、３〜９程度であるがより好ましくは６〜８である。
微生物による一般式（Ｉ）の選択的不斉加水分解の結果、一般式（ＩＩＩ）の化合物が生成し、反応液のｐＨが低下するとともに、反応速度も低下する。反応速度を大きくするため、反応液のｐＨを各微生物のラクトン加水分解酵素の至適ｐＨに保持することが好ましい。その際、ｐＨを保持するための無機塩として、アルカリ金属またはアルカリ土類金属の水酸化物または炭酸塩のほか、アンモニア水などが用いられる。
【００１４】
反応終了後、加水分解をうけていない反応液中の一般式（ＩＩ）の化合物を有機溶媒による抽出などの操作により分離する。有機溶媒としては、塩化エチレン、クロロホルム、トリクロロエタンのようなハロゲン系炭化水素、ベンゼン、トルエンのような芳香族系炭化水素、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテルのようなエーテル類の他、酢酸エチル等が用いられ、より好ましくは、酢酸エチルである。
また抽出以外の分離方法としては、カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。逆相カラムを用い、溶離液としては、水、メタノールまたはエタノールのようなアルコール類、またはそれらの混合物で一般式（ＩＩ）の化合物と一般式（ＩＩＩ）の化合物を分離することも可能である。
反応液中に残存している一般式（ＩＩＩ）の化合物は、そのまま酸性にすることにより、一般式（ＩＶ）の化合物に変換することができる。酸としては、塩酸、硫酸等が用いられ、より好ましくは硫酸である。ｐＨや反応温度、反応時間は、一般式（ＩＩＩ）の化合物が閉環し、一般式（ＩＶ）の化合物に変換することができる条件でよいが、より好ましくは、ｐＨは１以上の強酸性、反応温度は８０〜１３０℃、反応時間は１〜６時間である。
【００１５】
生成した一般式（ＩＶ）の化合物は有機溶媒を用いて抽出することにより回収する。ここで用いられる有機溶媒は、先に一般式（ＩＩ）の化合物の抽出に用いた溶媒と同様に、塩化エチレン、クロロホルム、トリクロロエタンのようなハロゲン系炭化水素、ベンゼン、トルエンのような芳香族系炭化水素、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテルのようなエーテル類の他、酢酸エチル等が用いられ、より好ましくは、酢酸エチルである。また、カラムクロマトグラフィーでの回収も可能である。
一方、反応液中に残存している一般式（ＩＩＩ）の化合物は、アルカリ金属の水酸化物または炭酸塩等で処理後、反応液を減圧留去し、乾固物を溶媒で再結晶することにより、カルボン酸のアルカリ金属塩とし単離することもできる。用いられるアルカリ金属の水酸化物または炭酸塩としては、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等があり、好ましくは、水酸化ナトリウムである。また、再結晶溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、クロロホルム等が用いられ、好ましくは、メタノールである。
このように、本発明は医薬品中間体やアミノ酸誘導体として有用な光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体の簡便で、効率的な製造方法を提供するものである。
【００１６】
【実施例】
以下に、実施例を掲げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１〜６】
グルコース１％、ポリペプトン０. ５％、酵母エキス０. ５％、コーンスティープリカー０. ５％からなる液体培地（ｐＨ６. ５）を試験管に５ｍｌずつ分注し、オートクレーブにて１２１℃で２０分間、加熱滅菌した。各試験管内の培地に、斜面培地から第１表に記載した各種の菌株をそれぞれ、接種し、２８℃で３日間、好気的に振盪培養した。培養後、濾過により菌体を取得し、これらの各菌体にα−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン１％濃度の０. ２Ｍ Tris - HCl 緩衝溶液２ｍｌ（ｐＨ７. ５）ずつを加え、３０℃で２時間振盪した。反応後、濾過により菌体を除去し、ＨＰＬＣ（YMC-Pack ODS-AQ φ６. ０ｘＬ３００ｍｍ、溶離液３％メタノール（０. １％ TFA）、流速０. ８ｍｌ／min 、検出波長２３０ｎｍ、カラム温度３０℃）にて各反応液のα−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの減少量および２、４−ジヒドロキシ−酪酸の生成量を測定した。また生成した（Ｒ）−２、４−ジヒドロキシ−酪酸の光学純度はＨＰＬＣ(MCI GEL  φ4.6 ｘＬ100 ｍｍ、溶離液2mM CuSO4 、流速0.4 ｍｌ／min 、検出波長２５４ｎｍ、カラム温度３０℃）にて測定した。その結果は第１表に示す通りである。
【００１７】
【表１】
0003872135.tif 000007
【００１８】
【実施例７〜１２】
実施例１〜６に準じ、第２表に記載した各菌株の菌体を取得した。これらの各菌体にα−アミノ−γ−ブチロラクトン臭化水素酸塩１％濃度の０. ２Ｍ Tris - HCl 緩衝溶液２ｍｌ（ｐＨ７. ２）ずつを加え、３０℃で２時間振盪した。反応後、濾過により菌体を除去し、ＨＰＬＣ（YMC-Pack ODS-AQ φ６. ０ｘＬ３００ｍｍ、溶離液３％メタノール（０. １％ TFA）、流速０. ８ｍｌ／min 、検出波長２３０ｎｍ、カラム温度３０℃）にて各反応液のα−アミノ−γ−ブチロラクトンの減少量およびホモセリンの生成量を測定した。また生成した（Ｒ）−ホモセリンの光学純度はＨＰＬＣ(MCI GEL  φ4.6 ｘＬ150 ｍｍ、溶離液2mM CuSO4 、流速0.4 ｍｌ／min 、検出波長２５４ｎｍ、カラム温度３０℃）にて測定した。その結果は第２表に示す通りである。
【００１９】
【表２】
0003872135.tif 000008
【００２０】
【実施例１３】
フサリウム・オキシスポルム（IFO 5942）をグルコース１％、ポリペプトン０. ５％、酵母エキス０. ５％、コーンスティープリカー０. ５％からなる液体培地３００ｍｌ（ｐＨ６. ５）が入った５００ｍｌ振盪フラスコを２本用い、２８℃で４日間、好気的に振盪培養した。培養後、濾過により得られた菌体にα−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの１０％水溶液１００ｍｌを加え、攪拌下、アンモニア水の中和により反応液ｐＨを７に保持しながら３０℃で３時間反応した。反応終了後、菌体を濾過により除去し、得られた反応終了液を硫酸アンモニウムで塩析した後、酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで脱水した。硫酸マグネシウムを濾過で除去し、得られた酢酸エチル層を減圧留去後、減圧蒸留（b.p. 98 〜99℃／0.17 Torr ）し、（Ｓ）−α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン２. ９ｇ（収率：２９％、光学純度：９８. ２％ e.e.
[ α] D 25= −69.2゜(C 1.15,CHCl3)）を得た。
【００２１】
【実施例１４】
実施例１３と同様に培養して得られたフサリウム・オキシスポルム（IFO 5942）の菌体にα−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの１０％水溶液１００ｍｌを加え、攪拌下、アンモニア水の中和により反応液ｐＨを７に保持しながら３０℃で１時間反応した。反応終了後、菌体を濾過により除去し、得られた反応終了液を硫酸アンモニウムで塩析した後、酢酸エチルで未反応のα−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンを抽出除去後、得られた水層に硫酸を加えｐＨを１に調整し、５時間煮沸した。冷却後、アンモニア水で中和し、酢酸エチルで抽出した。得られた酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで脱水した。硫酸マグネシウムを濾過で除去し、得られた酢酸エチル層を減圧留去後、減圧蒸留し、（Ｒ）−α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン２. ２ｇ（収率：２２％、光学純度：９３. ５％ e.e.  [α] D 25= ＋65.9゜(C 1.15,CHCl3)）を得た。
【００２２】
【発明の効果】
本発明により、高価な分割剤を必要せず、また簡単な操作で工業的生産に適し、環境上も問題の少ない、そして効率よい方法で、医薬品中間体として有用な、またアミノ酸であるホモセリンの誘導体として有用な光学活性γ−ブチロラクトン誘導体を製造できる。光学活性なγ−ブチロラクトン誘導体を簡便に、かつ、工業的に製造する方法が提供される。