(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）部分と連結したシュードモナス  アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）外毒素（ＰＥ）部分を含むキメラ蛋白質であって、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）部分が、（ａ）モルモット（guinea-pig）のミエリン塩基性蛋白質のアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ又はその抗−ＭＢＰ特異Ｔ細胞を標的とする抗原部分；（ｂ）ヒトミエリン塩基性蛋白質のアミノ酸配列Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ又はその抗−ＭＢＰ特異Ｔ細胞を標的とする抗原部分；及び（ｃ）ヒトミエリン塩基性蛋白質のアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ又はその抗−ＭＢＰ特異Ｔ細胞を標的とする抗原部分からなる群から選ばれるものであり、上記ＭＢＰアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の各々と、上記ＰＥ部分とは、１〜３回繰り返されるペンタペプチドによって連結されているキメラ蛋白質及びその塩。
【請求項２】
ＰＥ部分が、５７、２４６、２４７及び２４９のアミノ酸位置の１又は２以上において突然変異したＰＥを含む請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
ＰＥ部分が、外毒素のドメインII及びIIIを含む請求項１記載の蛋白質。
【請求項４】
ペンタペプチドが、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒからなる請求項１〜３のいずれかに記載の蛋白質。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
【請求項６】
請求項５記載のＤＮＡ配列と機能的に連結したプロモーターを含むプラスミド。
【請求項７】
請求項６記載のプラスミドを含み、請求項１ないし４のいずれかに記載の蛋白質を発現することができる発現ベクター。
【請求項８】
請求項１ないし４のいずれかに記載のキメラ蛋白質と、不活性担体とを含む、自己免疫疾患治療のための医薬組成物。
【請求項９】
多発性硬化症治療のための請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
更にリソソーム影響物質を含む請求項８又は９記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の属する技術分野
この発明は、自己免疫疾患、特に、多発性硬化症の標的免疫療法に有用な抗原−毒素キメラ蛋白質に関する。
発明の技術背景
選択的免疫抑制剤の開発は、自己免疫疾患の治療における重要な目標の１つである。関係している特異的な抗原の正体が分からなかったので、これまでの治療は、炎症の伝達物質の活動を抗炎症剤によって妨げると共に、急速に分裂する細胞を細胞障害剤によって非特異的に殺すことに向けられていた。
最近になって、免疫応答についての我々の理解が増したこと、遺伝子工学の進歩、そして、自己免疫疾患についての改善されたモデルのお陰で、免疫応答障害の治療のための特異的かつ選択的な薬が開発された。
よく研究された動物モデルの実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis）（ＥＡＥ）が、ミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）又はその免疫原決定基を、適当な条件下で注入したときに、多くの哺乳類の動物種において誘発されることは知られている。ＭＢＰは中枢神経系（ＣＮＳ）ミエリン蛋白質の主要成分である。ＭＢＰがＴ細胞の集団を刺激して、Ｔ細胞を中枢神経系に移動させ、多発性硬化症に特有の血管周囲カフィング病変と髄鞘脱落をもたらす応答を引き起こすということが提案されている。このモデルは、（ＭＢＰ−特異−ヘルパーＴ細胞をマウスに注入することによっても誘発することができる。
ＥＡＥモデルを防止する様々な試みが為されてきた。ＭＢＰ−１ａ複合体に特異的なモノクローナル抗体は、Ｈ−２SマウスにおいてＥＡＥを防止すると報告されている（1-2）。
多発性硬化症（ＭＳ）を治療する他の試みとしては、合成Ｔ細胞受容体ペプチド（3）、ＭＢＰの変性ペプチド（4）、コーポリマー−１−アミノ酸の合成ランダムコーポリマー（US Patent 3,849,550）、並びに、種々のインターフェロン（5）の投与がある。
自己免疫疾患の治療についての他の試みは、遺伝子融合技術によって製造されたキメラ細胞障害性分子の使用に関するものである。これらの分子は、シュードモナス外毒素（Pseudomonas exotoxin）（ＰＥ）のような毒素の部分を、その非特異的な細胞結合性を除去しつつ、利用するものである。特異性は、切断された、ないしは修飾された毒素分子に、毒素部分を認識要素と融合することによって与えられ、その認識要素が、キメラ蛋白質を特異的な受容体を発現している選択された標的細胞に導く。
有効なキメラ細胞毒素は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ６、ＴＧＦα、抗ＴａｃまたはＣＤ４をコードするｃＤＮＡをＰＥと融合することによって構築されてきた（6-11）。
キメラ蛋白質の１つであるＩＬ２−ＰＥ４０は、ＩＬ２受容体を発現している活性化されたＴ細胞を標的とし、選択的に除去するようにデザインされていた。ＩＬ２−ＰＥ４０は、活性化されたＴ細胞が重要な役割を果たしている免疫応答障害の多くのモデルにおいて、ＩＬ２受容体標的治療の為の、選択的免疫抑制剤として有効であることが見出された（12-19）。
高度に精製された調製物（20）を用いて、ＩＬ２−ＰＥ４０は、（a）ラットにおけるアジュバント誘発関節炎を遅らせ、緩和する（21）、（b）マウスにおける血管形成された心臓同種移植片の生存期間を著しく長くする（22）、（c）ラットにおける実験的自己免疫ブドウ膜網膜症（uveoretinitis）（ＥＡＵ）の発生と症状の重さを低減する（23）、（d）マウスにおけるＴ細胞リンパ種の成長を抑制する（24）、（e）ラットにおける角膜同所移植における臨床的拒絶反応評点と累積拒絶反応率を著しく下げる（25）、及び、（f）ラットとマウスにおけるＥＡＥ特有の特徴を妨げる（26-27）ことが示された。
ＩＬ２−ＰＥ４０のようなサイトカイン−毒素キメラ蛋白質は有効で選択的な免疫抑制剤であることが示されてきたが、その効果は、特定の抗原活性化細胞に限定されず、ＩＬ２受容体を持っている全ての細胞に関与する（12）。
ＥＡＥ又はＭＳを治療する為に採用され又は提案されている多くの戦略とは違って、病原性の細胞のみを標的とし、その他の免疫応答は完全に有効なままに残しておく特異的な取り組み方の必要性が残されている。
切断ないしは突然変異された全長ＰＥ遺伝子をコードするｃＤＮＡと融合された脳発生ＭＢＰ部分をコードするオリゴヌクレオチドは、スタインバーガー等（Steinberger I., et al）によって開示された（神経免疫学に関する第３回国際会議（Third International Conference on Neuro-immunology）、エルサレム、イスラエル（１９９１年）、免疫毒素に関する第３回国際シンポジウム  エルサレム（Third International Symposium on Immunotoxins Jerusalem）（１９９２年））。そのＤＮＡはE. coli中で発現され、得られたキメラ蛋白質は、非標的細胞には何の影響も与えずに、αＭＢＰＴ細胞を効果的に殺した。
発明の簡単な要約
本発明の１つの目的は、自己免疫疾患の治療に有用なキメラ蛋白質を提供することである。
本発明の更なる目的は、多発性硬化症のような自己免疫疾患の治療方法を提供することである。
本発明は、ＭＳ患者からの末梢血細胞と同様に、αＭＢＰ特異Ｔ細胞を標的とし特異的に殺す、有効で選択的な新規な物質であるところの、毒素部分と連結したミエリン塩基性蛋白質部分を含むキメラ分子の構築、特徴付け、及び精製に関するものである。
本発明の１つの側面によれば、（a）ＭＢＰ；（b）モルモット（guinea-pig）ミエリン塩基性蛋白質の６９−８８アミノ酸又はその抗原部分；（c）ヒトミエリン塩基性蛋白質の８４−１０２アミノ酸又はその抗原部分；（d）ヒトミエリン塩基性蛋白質の１４３−１６８アミノ酸又はその抗原部分；及び（e）（a）、（b）、（c）又は（d）のアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸が欠失、付加、置換もしくは突然変異したアミノ酸配列であって、その変化した配列が元のアミノ酸配列と少なくとも７５％のホモロジーを保っているアミノ酸配列を含む群から選ばれるミエリン塩基性蛋白質（ＭＢＰ）部分と連結したシュードモナス  アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）外毒素（ＰＥ）部分を含むキメラ蛋白質が提供される。
シュードモナス外毒素を分析したところ、それが、ドメインＩ（ａ及びｂ）、ドメインII及びIIIと呼ばれる幾つかの機能的に異なるドメインから構成されていることが分かった。好ましくは、シュードモナス毒素部分は、外毒素の全長を含むか、又は、当該外毒素の突然変異された、もしくは切断された（truncated）誘導体である。外毒素は、外毒素のドメインII又はIIIから誘導することができる。或いは、シュードモナス毒素部分は、例えば、５７番目、２４６番目、２４７番目及び２４９番目の１もしくは２以上の位置で突然変異されたシュードモナス外毒素から誘導することができる。そのような突然変異ＰＥはＰＥ６６4Gluと呼ばれる。
他の実施例においては、本発明は、必要に応じて突然変異ないしは切断されたシュードモナス外毒素部分と連結した全長のミエリン塩基性蛋白質を含むキメラ蛋白質に関する。
本発明のいずれの実施例においても、ミエリン塩基性蛋白質部分と毒素部分とは、直接的もしくは間接的に連結することができる。もしも２つの分子が間接的に連結する場合には、リンカー配列によって結合するのが好ましい。ここで使用されているように、「リンカー配列」という用語は、１ないし３回繰り返される１ないし５個のアミノ酸を含む全てのアミノ酸配列を指すものであり、即ち、リンカーは、３回繰り返されるペンタペプチドから成る最大１５個のアミノ酸残基を含むものである。好ましくは、リンカー配列はｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒを含むペンタペプチドである。
本発明の更に他の側面は、本発明の分子をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドと、その分子を発現することができる発現ベクターに関するものである。適したプラスミドは、本発明の分子をコードするＤＮＡ配列と機能的に連結したプロモーターも使用できるが、好ましくは、バクテリオファージＴ７プロモーターが使用される。「機能的に連結」とは、ここでは、プロモーター配列と、そのプロモーターの支配下にある発現されるべき配列とが、そのプロモーターによって発現の誘発が許されるように互いに空間的に位置していることを意味する。即ち、プロモーターと発現すべき配列とはスペーサー配列によって隔てられていても良い。どのような適当な発現ベクターを使用しても良いが、好ましくは、使用されるベクターはE. coliである。
本発明の範囲には、説明されるキメラ蛋白質の塩も含まれる。「塩」という用語は、蛋白質分子のアミノ基の酸付加塩（acid addition salts）と同様に、カルボキシ基の塩も含む、カルボキシ基の塩は、当該技術分野で知られている方法によって形成されることができ、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、その他のような無機塩のみならず、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ピペリジン、プロカイン、その他のような有機塩基との塩も含むものである。酸付加塩は、例えば、例えば塩酸、硫酸のような無機酸との塩や、酢酸又はシュウ酸のような有機酸との塩も含むものである。
本発明は更に、上に定義したようなキメラ蛋白質の少なくとも１つを、医薬的に許容できる不活性の担体と共に含む医薬組成物に関するものである。好ましくは、上記医薬組成物は、塩化アンモニウム、モネンジン、その他のようなリソソーム影響物質（lysosomotrophic agent）を更に含むのが好ましい。
本発明の蛋白質は、当該技術分野で蛋白質の投与方法として知られている方法によって、例えば、経口、静脈内、関節内、皮下、筋内、腹腔内、鼻腔内、硬膜下腔内、皮内、経皮、吸入によって、その他、経腸ルートを含めて、如何なるルートによっても投与することができる。
本発明のキメラ蛋白質は、当業者には良く知られている方法、例えば、化学合成法又は生物工学的（遺伝子的）方法によって、つくることができる。後者の方法に依る場合には、キメラ蛋白質をコードするＤＮＡの構築物がプラスミドに挿入される。適当なベクターが選択され、上記のようなプラスミドによって形質転換される。そのベクターは次いで刺激され、所望のキメラ蛋白質を産生する。
図面の説明
本発明は、以下の図面と一緒に、以下に述べる好適な実施例の詳細な説明からより良く理解されるであろう。図面において：
図１は、ＢＰＰ１−ＰＥ６６4Glu、ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu及びＭＢＰ−ＰＥ６６4Gluをそれぞれコードする、発現プラスミドｐＩＳ−１、ｐＩＳ−２及びｐＩＳ−３の構築手順である。図１において、ＢはＢａｍ  ＨＩ；ＨはＨｉｎｄ  III；ＮはＮｄｅＩ；ＥはＥｃｏＲＩである；
図２は、発現プラスミドｐＨＬ１５の構築手順であり、図２において、ＢはＢａｍ  ＨＩ；ＮはＮｄｅＩ；ＥはＥｃｏＲＩである；
図３Ａは、ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質を含むバクテリア細胞フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すクーマシーブルー染色ゲルを示す；
図３Ｂは、抗ＰＥ抗体によるイムノブロッティング（immunobloting）とＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質を含むバクテリア細胞フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す；
図４は、αＭＢＰ  Ｔ細胞株Ｄ９に対するキメラ蛋白質ＢＰＰ−ＰＥの細胞障害活性を示す。キメラ蛋白質ＢＰＰ−ＰＥは以下のような種々の濃度で添加された：
１−４＝グアニジン  ヒドロクロリド処理されたＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の不溶性フラクションを、それぞれ、２５０、５００、１０００、１５００ｎｇ（総蛋白質濃度）；
４’＝αＰＥ抗血清の存在下でのＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質（１５００ｎｇ、総蛋白質濃度）；
５−７＝高度に精製されたＩＬ２−ＰＥ４０を、それぞれ、５０、１００、５００ｎｇ。［3Ｈ］−ロイシンの細胞蛋白質（cellular proteins）への取り込みが測定された。結果は、ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質に晒されていない対照細胞に対するパーセンテージで表現されている；
図５は、αＭＢＰ−Ｔ細胞株Ｚｌａに対するＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性を示す。結果は、図４の説明文で記載したように表現されている；
図６は、αＭＢＰ−Ｔ細胞株ｋｌａに対するＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性を示す。結果は、図４の説明文で記載したように表現されている；
図７は、Ｚ８５細胞に対するＭＢＰ−ＰＥ６６4Gluキメラ蛋白質の細胞障害活性を示す。結果は、図４の説明文で記載したように表現されている；
図８は、非標的細胞株Ａ２ｂに対するＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性を示す。ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質は以下のような種々の濃度で添加された：
１−５＝グアニジン  ヒドロクロリド処理されたＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の不溶性フラクションを、それぞれ、２５０、５００、１０００、１５００、２０００ｎｇ（総蛋白質濃度）；
６−８＝高度に精製されたＩＬ２−ＰＥ４０を、それぞれ、５０、１００、５００ｎｇ。［3Ｈ］−ロイシンの細胞蛋白質（cellular proteins）への取り込みが測定された。結果は、ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質に晒されていない対照細胞に対するパーセンテージで表現されている；
図９は、ＰＰＤ−非標的細胞に対するＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性を示す。結果は、図４の説明文で記載したように表現されている：
図１０は、キメラ蛋白質ＢＰＰ２−ＰＥ６６とＢＰＰ１−ＰＥ４０のＰＡＳ標的細胞へのインターナリゼーション（internalization）を示す。ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu又はＢＰＰ１’−ＰＥ４０（１５ｕｇ、グアニジン  ヒドロクロリド処理された不溶性フラクションの総蛋白質濃度）が５時間、細胞に添加された。細胞は洗浄され、溶解されて、試料は、抗ＰＥ抗血清を用いるイムノブロット分析（immunoblot analysis）に供された。
レーン１：それぞれ、ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu又はＢＰＰ１’−ＰＥ４０（３ｕｇ、総蛋白質濃度）；
レーン２：いずれかのキメラ蛋白質ＢＰＰ−ＰＥと共にインキュベートされた溶解された細胞の不溶性フラクション；
レーン３：ＢＰＰ−ＰＥと共にインキュベートされた溶解された細胞の可溶性フラクション；
レーン４、５：それぞれ、洗浄工程１及び４の試料。
図１１は、ＰＡＳ細胞（αＭＢＰ  Ｔ細胞）に対するＢＰＰ１’−ＰＥ４０の細胞障害活性を示す。精製されたＢＰＰ１’−ＰＥ４０（−□−）が、種々の濃度で、ＰＡＳ細胞に、増殖期間の１日目に添加された。結果は図４において説明されたように表現されている；
図１２は、αＭＢＰ  Ｔ細胞に対するＢＰＰ１’−ＰＥ４０の細胞障害活性に及ぼすＮＨ4Ｃｌの影響を示す。ＢＰＰ１’−ＰＥ４０は、５００ｎｇの一定量で添加された。ＢＰＰ１’−ＰＥ４０による蛋白質合成阻害が、ＮＨ4Ｃｌの次第に増加する濃度下において測定された（−○−）。ＮＨ4Ｃｌ単独の効果も、種々の濃度において測定された（−□−）。結果は図４におけると同様に表現されている；
図１３は、ＭＳ患者からのＰＢＬに対するＢＰＰ１’−ＰＥ４０の効果を示す。ＢＰＰ１’−ＰＥ４０は、以下のＭＳ患者から分離されたＰＢＬ細胞に、種々の濃度で添加された：ＭＳＭ１３（−■−）、ＭＳＭ１４（−△−）、ＭＳＭ１６（−●−）及びＭＳＭ１８（−□−）である。蛋白質合成阻害は、図４において説明されたように測定された；
図１４ａ−ｄは、ヒトキメラ蛋白質をコードするプラスミドの図式表現である；そして
図１５ａ−ｃは、ヒトＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質：a）ＢＰＰ84-102−ＰＥ６６4Glu；b）ＢＰＰ143-168−ＰＥ６６4Glu；c）ＢＰＰ84-102−ＰＥ４０を発現しているE. coli細胞フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を示す。
好適な実施例の詳細な説明
Ａ．ＢＰＰ−ＰＥ／ＭＢＰ−ＰＥ融合遺伝子の構築
５つのペプチド−毒素キメラ蛋白質が構築された。３つは、モルモット（guinea-pig）のミエリン塩基性蛋白質（29a）の１９個のアミノ酸（アミノ酸６９−８８）をコードするＢＰＰ配列を含んでいた。各々が、このモルモットの配列を含む、３つのオリゴヌクレオチドが合成され（オリゴ１、１’及び２、表Ｉ）、切断された形態のＰＥ（ＰＥ４０）又は突然変異された全長ＰＥ配列（ＰＥ６６4Glu）をコードするＤＮＡフラグメントの５’末端に、各々融合された。ＢＰＰ１−ＰＥ６６4Glu及びＢＰＰ１’−ＰＥ４０の場合、２アミノ酸Ｍｅｔ−Ｖａｌをコードする配列が、また、ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Gluの場合にはＭｅｔ−Ａｌａをコードする配列が、ＢＰＰをコードする配列の前に存在した。
ＢＰＰ／ＭＢＰをコードする配列は、突然変異されたＰＥ配列（キメラ蛋白質ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu）に直接、又は、ＢＰＰ配列とＰＥ６６4Glu（表Ｉ、オリゴ１キメラ蛋白質ＢＰＰ１--ＰＥ６６4Glu）もしくはＰＥ４０（表Ｉオリゴ１’、キメラ蛋白質ＢＰＰ１’−ＰＥ４０）との間に挿入された、５アミノ酸（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｓｅｒ）のリンカー配列を介して、融合された。
第４のプラスミド、ｐＩＳ−３、においては、ラットのＭＢＰ配列（30）が、ＰＥ６６4Glu配列（図１）に直接連結された。一方、第５番目のｐＳＭ−８４６６においては、ヒトＭＢＰのアミノ酸８４−１０２をコードする配列がＰＥ６６4Glu配列に直接連結された。
プラスミドとその内容のまとめ（構築（プラスミド名））：
１．ＢＰＰ１−ＰＥ６６4Glu（ｐＩＳ−１）−モルモット（guinea pig）ＭＢＰの６９−８８と突然変異ＰＥ、リンカーあり
２．ＢＰＰ１’−ＰＥ４０（ｐＨＬ１５）−モルモットＭＢＰの６９−８８と切断ＰＥ、リンカーあり
３．ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu（ｐＩＳ−２）−モルモットＭＢＰの６９−８８と突然変異ＰＥ、リンカーなし
４．ＭＢＰ−ＰＥ６６4Glu（ｐＩＳ  ３）−ラットＭＢＰと突然変異ＰＥ、リンカーなし
５．ＢＰＰ８４−ＰＥ６６4Glu（ｐＳＭ−８４６６）−ヒトＭＢＰの８４−１０２と突然変異ＰＥ、リンカーなし
0003906447.tif 000002
Ａ．１：プラスミドｐｌＳ−１、ｐｌＳ−２及びｐＳＭ−８４６６
バクテリオファージＴ７プロモーター下でキメラ蛋白質を発現するプラスミドが、図１及び図２に示すように構築された。ＢＰＰ１−ＰＥ６６4Glu、ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu及びＢＰＰ８４−ＰＥ６６4Gluを、それぞれコードするプラスミドｐｌＳ−１、ｐｌＳ−２及びｐＳＭ−８４６６が、ＮｄｅｌとＨｉｎｄIIIでカットされたｐＨＬ８２３（28）から構築された。最大のベクターフラグメント（４．４Ｋｂ）が異なる３つの合成オリゴヌクレオチド（オリゴ１、２又は３、表Ｉ及び図１）の各々に連結された。得られたプラスミドは、大きさと、ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞中におけるコードされたキメラ蛋白質の発現が調べられた。Ｇ章を参照。
Ａ．２：ＢＰＰ１’−ＰＥ４０をコードするプラスミドｐＨＬ１５
プラスミドｐＨＬ１５が、ＮｄｅｌでカットされたｐＨＬ９０６（29b）から構築された。最大のベクターフラグメント（４ｋｂ）が合成オリゴヌクレオチド（オリゴ１’、表Ｉ及び図２）に連結された。プラスミドｐＨＬ１５は上に述べたように調べられた。
Ａ．３：ＭＢＰ−ＰＥ６６４ＧｌｕをコードするプラスミドｐｌＳ−３
プラスミドｐｌＳ−３が、ラットＭＢＰの全体に対応する４００ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＮｄｅｌとＨｉｎｄ  IIIでカットされたｐＨＬ８２３の最大フラグメント（４．４Ｋｂ）に融合することによって構築された（図１）。ＰＣＲフラグメントは、ＩＳ１及びＩＳ２プライマー（表Ｉ）及び、エル  フッド、カリフォルニア技術研究所、アメリカ（L. Hood, California Inst. of Tech, USA）から親切にも提供されたプラスミドｐＭＢＰ−１を用いて合成された。ＰＣＲ産物は、ＮｄｅｌとＨｉｎｄ  IIIでカットされ、同じ酵素でカットされたｐＨＬ８２３に連結された。プラスミドｐＭＢＰ−１は、ラットＭＢＰのフルサイズｃＤＮＡを含んでいる。
構築されたキメラ遺伝子の配列はＤＮＡ配列分析によって確認された（データは示していない）。
Ｂ．蛋白質の発現
融合遺伝子をコードするプラスミドは、熱ショック法（32）を用いてE.coli株ＢＬ−２１  ＤＥ３に形質転換された。形質転換されたE.coliのコロニーは培養され、アンピシリン（１００（ｇ／ｍｌ）寒天プレートから選択された。選択されたコロニーは、アンピシリン（５０（ｇ／ｍｌ）含有ＳＬＢ培地中で、ＯＤ650が０．５になるまで、更に培養された。次いで、イソ−プロピル（Ｄ−ガラクトシド（iso-propyl-(-D-galactoside）（ＩＰＴＧ）（最終濃度１ｍＭ）を用いて９０分間、インダクションが行われた。
発現した細胞のペレットは、ＴＥバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｓｉ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁され、音波処理（６回の３０秒バースト、１００Ｗ）され、１０，０００ｘｇで１５分、遠心分離された。上澄み（可溶性フラクション）が取り除かれ、分析のために保管された。ペレットは、４ｖｏｌ（ｖ／ｗ）の抽出バッファー（７Ｍ  Ｇｕ−ＨＣＩ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中で変性され、音波処理（６回の３０秒バースト、１００Ｗ）された。懸濁液は４℃で１時間、攪拌された。懸濁液は１２，０００ｇで１５分間遠心分離されて澄まされ、ペレットは捨てられた。澄んだ上澄みは、次に、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で４倍に希釈され、ＰＢＳに対して透析された。透析された物質は１２，０００ｇで１０分間遠心分離された。
得られた上澄み（不溶性フラクション、グアニジン  ヒドロクロリド処理）は、大部分の実験において、キメラ蛋白質源として使用された。
Ｃ．ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の特性と細胞下局在
新しく発現したキメラ蛋白質がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって特性付けられた。これらの蛋白質は、ＢＰＰ１’−ＰＥ４０、ＢＰＰ１−ＰＥ６６4Glu／ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu／ＢＰＰ８４−ＰＥ６６4Gluの期待される分子量に、それぞれ対応する、約４２．９Ｋｄ及び６８．３−６８．９Ｋｄの見掛けの分子量で移動した（図３Ａ）。ＭＢＰ−ＰＥ６６4Gluの分子量は８０Ｋｄであった。イムノブロットは、キメラ蛋白質がポリクローナル抗−ＰＥ抗血清と反応することを示した（図３Ｂ）。
細胞からの抽出物は、下記の表IIに示すように、ＡＤＰ−リボシル化活性（31）を示した。発現したキメラ蛋白質の細胞下局在（subcellular localization）を特定するために、細胞分画が行われた。各々のサブフラクションは、延長因子２に富んだ小麦胚抽出物（wheat germ extracts）を用いて、そのＡＤＰ−リボシル化活性がテストされた。酵素活性によれば、３つの異なるキメラ蛋白質（ＢＰＰ１−ＰＥ６６4Glu、ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu及びＢＰＰ１’−ＰＥ４０）は、発現しており、異なるサブフラクション中に同様に分布している。
全活性の約６０−７０％が可溶性フラクション中に見出され、３０−４０％だけが不溶性フラクション中に見出された。しかしながら、不溶性フラクションは、可溶性フラクションに対して計算されるものよりも、７から１６倍も高い値（比活性）を示し、最も蛋白質に富んだフラクションであることが分かった（表II）。従って、ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質は、不溶性フラクションから精製された（下記参照）。ペリプラズム（periplasm）フラクション、ないしは培養培地中には、基本レベルのＢＰＰ−ＰＥ蛋白質しか見出されなかったのは注目に値する。
0003906447.tif 000003
Ｄ．ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性
異なるＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性が、ＭＢＰ−特異脳炎誘発性Ｔ細胞株について、テストされた。細胞株（（ＭＢＰ−特異Ｔ細胞株：Ｚｌａ、Ｄ９、ＰＡＳ、Ｋｌａと対照細胞株：Ａ２ｂ、ＰＰＤ、発明者から入手可能）は、３日間の特異抗原刺激と、それとは別の５−７日間の増殖期とを交互に受けながら、培地中に維持された。ＭＢＰ特異脳炎誘発性ＭＢＰ−Ｔ株細胞（３ｘ１０５細胞／ｍｌ）の刺激は、１５μｇ／ｍｌのモルモットＭＢＰの存在下で、２ないし３日間、１５ｘ１０6細胞／ｍｌの同系の照射された胸腺細胞を抗原提示細胞（ＡＰＣ）として、１％の同系ラット血清、２ｍＭ−Ｌグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５ｘ１０-5Ｍ  β−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌ  ペニシリン、及び、１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補った、ＲＰＭＩ−１６４０中で行われた。活性化されたリンパ芽球は、胸腺細胞及び残渣から、フィコールパック（Ficoll paque）勾配（ファルマシア（Pharmacia））で遠心分離によって、分離された。リンパ芽球は、境界領域（interface）に見出された。リンパ芽球は、次いで、抗原とラット血清を除き、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１０％ＣｏｎＡ活性化脾臓細胞上澄み（ＴＧＣＦを含むならし培地）又は２５単位／ｍｌのヒトｒＩＬ２を付加した同じ培地中に、広げられた。
試験は、０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中に希釈された、種々のキメラ蛋白質の不溶性フラクションを用いて行われた。それらは、次いで、種々の濃度で、９６ウエルプレート中の（ＭＢＰ−Ｔ細胞（２−４ｘ１０4細胞／ウエル）に、増殖期の３日目（ｄ３）に、３回、添加された。細胞は、５％ＣＯ2空気中、３７℃で、１８−２４時間培養され、２μｃｉの［３Ｈ］−ロイシン又は１μｃｉの［３Ｈ］−チミジンを添加して、更に１２−１６時間培養された。細胞は、次いで、取り出され、集められて、放射能が測定された。ＨＵＴ１０２対照細胞について試験を行うに際しては、放射性物質が、細胞を取り出すわずか４時間前に添加された。蛋白質合成阻害のパーセンテージは、いかなるキメラ蛋白質にも晒されていない対照細胞から計算された。
図４−６に示すように、特異αＭＢＰ  Ｔ細胞株（それぞれ、Ｄ９、Ｚｌａ及びＫｌａ）は、試験された最も高い濃度において、６０−７０％の蛋白質合成の阻害を示し、これらＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性に感受性があった。蛋白質の合成阻害は濃度に依存した。
キメラ蛋白質ＢＰＰ１−ＰＥ６６4Gluは、他の２つのキメラ（ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu及びＢＰＰ１’−ＰＥ４０）とは違って、Ｄ９標的細胞に対して細胞障害性ではなかった（図４）。ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害効果がＤＮＡ合成に関してテストされたところ、キメラ蛋白質は不可逆的に蛋白質の合成を阻害し、細胞を死に至らしめ、同様の結果が観察された（結果は示していない）。発現細胞の不溶性フラクションがこれらの実験の殆どにおいて用いられたので、我々は、キメラ蛋白質の毒素部分、（ＰＥ４０）、だけを発現している細胞の不溶性フラクションを対照として使用して、不溶性フラクション調製物に関する非特異的活性をテストした。
ＰＥ４０の不溶性フラクションは、標的（図４）及び非標的細胞に対して、細胞障害効果を持っていなかった。ＭＢＰ−ＰＥ６６4Gluの不溶性（ins.）フラクションは、Ｚ８５細胞に対して細胞障害性であった。テストされた最も高い濃度（２，０００ｎｇ）において、５８％の蛋白質合成阻害が観察された（図７）。
インターロイキン２受容体分子（ＩＬ２Ｒ）の新規の発現が、抗原によって誘発されたＴ細胞株の活性化プロセス中に現れたので、我々は、異なる抗原特異Ｔ細胞株に対するＩｌ２−ＰＥキメラ蛋白質の細胞障害活性を、正の対照として、テストした。高度に精製されたＩＬ２--ＰＥ６６4Gluは、テストされた種々のαＭＢＰ  Ｔ細胞株において、４０−７５％の蛋白質合成阻害をもたらした（図４−６）。
Ｅ．ＢＰＰ／ＭＢＰ−ＰＥキメラ蛋白質の活性の特異性
ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質が、αＭＢＰ  Ｔ細胞株に対して、細胞障害効果を持っていることを示した後で、我々は、キメラ蛋白質に対する応答の特異性を評価した。図４に示されているように、ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質のαＭＢＰ  Ｔ細胞株Ｄ９に対する細胞障害効果は、過剰のポリクローナルαＰＥによって完全にブロックされ、その作用の特異性を示した。
ＢＰＰ−ＰＥ蛋白質の効果は、非標的細胞株Ａ２ｂ又はＰＰＤについてもテストされた。マイコバクテリア抗原に対して特異的なＡ２ｂ細胞株は、ラット軟骨に対しても交差反応し、アジュバント関節炎を仲介するのに関与している。ＰＰＤ細胞株は、ヒト型結核菌のピュリファイド  プロテイン  デリバティブ（Purified Protein Derivative）に特異的である。双方のＴ細胞が、αＭＢＰ  Ｔ細胞と同じ条件の培地中に維持された。
図８及び図９に示すように、Ａ２ｂ又はＰＰＤ対照細胞株は、ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の作用の影響を受けず、その効果は高度に特異的な応答であることを示した。ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の活性は、他の非標的細胞−ＨＵＴ１０２細胞、高い親和性形態及び低い親和性形態のＩＬ２Ｒを発現している、ヒトＨＴＬＶ−Ｉ  Ｔ細胞白血病細胞株についてもテストされた。この細胞は、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭ１６４０中に維持された。ＨＵＴ１０２は、ティー．エー。ワルドマン（T.A. Waldmann）（国立癌研究所（National Cancer Institutes）から頂いた。ＢＰＰ−ＰＥキメラによる細胞障害効果は観察されなかった。
Ｆ．キメラ蛋白質の標的細胞へのインターナリゼーション
標的細胞へのＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質のインターナリゼーションを確認する別の試みとして、我々は、イムノブロット分析によって、培養後の、細胞中での、当該蛋白質の存在を追跡した。
キメラ蛋白質の標的細胞へのインターナリゼーションは、キメラ蛋白質ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu及びＢＰＰ１’−ＰＥ４０（５μｇ、不溶性フラクションの総蛋白質濃度、グアニジン  ヒドロクロリド−処理）を、αＭＢＰ  Ｔ細胞（ＰＡＳ細胞）又はＡ２ｂ非標的細胞と共に、５時間培養することによってテストされた。培養の終わりに、細胞は、各々の洗浄工程から試料を採取しながら、ハンクス平衡ソディウムサリン（Hanks Balanced Sodium Saline）（ＨＢＳＳ）緩衝液によって４回洗浄された。細胞は、次いで、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＮＰ４０、１％  デオキシコール酸、０．１％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）で溶解され、室温で１５分、インキュベートされた。細胞溶解産物は、９０００ｇで１０分遠心分離され、ペレット（Ｔｒｓｉ−ＨＣＩ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＴＥ緩衝液中に溶解）と溶解した細胞の上澄みフラクションが、分析のために保管された。増殖培地、洗浄工程、及び溶解細胞からの試料は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析に供された。電気泳動した試料は、ゲルからニトロセルロースに移され、αＰＥ抗血清を用いてイムノブロットされた。Ａ２ｂ細胞に関してインターナリゼーションが試験される時には、試料のイムノブロットはスロット−ブロット（slot-blot）分析によって行われた。
標準の試験条件の後、ＢＰＰ２−ＰＥ６６4Glu及びＢＰＰ１’−ＰＥ４０は、標的細胞の溶解産物中に検出することができた（図１０）。これらのキメラ蛋白質は、最後の洗浄工程（細胞溶解前、洗浄ＩＶ、図１０）からの試料はいかなる免疫反応性のある物質も示さなかったので、細胞関連のものである。同一試験条件の下で、非標的細胞Ａ２ｂ中には、インターナリゼーションしたキメラ蛋白質は検出されなかった（図１０）。予想されたように、この場合には、キメラ蛋白質は、増殖培地と最初の洗浄試料においてのみ、検出された。
Ｇ．ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質の産生と精製
ＭＢＰ／ＢＰＰ−ＰＥキメラ蛋白質は、原核生物系で発現される。E. coli中での発現は、多くの異質の真核生物蛋白質に関して観察されるように、非−生（non-native）かつ非−活性コンフォーメーション中に組み換え蛋白質を含む、不溶性の封入体（inclusion bodies）を形成することとなる。融合蛋白質を得る他の方法は異なり、その構成部分の性質に依存する。
キメラ蛋白質が、E. coli株ＢＬ２１（λＤＥ３）中で発現された。細菌細胞は、ＳＬＢ／Ａｍｐ（５０（ｇ／ｍｌ）（１Ｌ中のＳＬＢ−５ｇ  ＮａＣｌ、１６ｇ  トリプトファン、１０ｇ  酵母抽出物）培地中、３７℃で、ＯＤ600が１．５−２．０になるまで、増殖された。ＩＰＴＧ（１ｍＭ、９０分、３７℃）で誘発すると、キメラ蛋白質の発現が起こった。培地は２７００ｒｐｍで１５分間、遠心分離された。細胞のペレットは、−７０℃で凍結された。凍結したE. coli細胞は、解凍され、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２ｍｇ／ｍｌ  リゾチーム）（１０ｍｌ／ｇ細胞）中に懸濁された。
細胞懸濁液は、３Ｘ３０秒、パルス音波処理された。破壊された細胞は、３５，０００ｘｇで３０分間、４℃で遠心分離され、不溶性フラクション、即ち、封入体を得た。この封入体は、変性緩衝液（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）（１ｍｌ／ｇ細胞）中に懸濁された。混合物が遠心分離（３５，０００ｇ  １５分間）で集められた。上澄みは、再生緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ  アルギニン、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ）によって、１００倍に希釈され、４℃で４８時間、攪拌された。
希釈された抽出物は、３５，０００ｇ、３０分間、４℃の遠心分離によって澄まされた。再生液の蛋白質はグラム毎に、０．７−０．８ｍｌの（ＢＳＡによって）前処理されたヒドロキシアパタイトに吸着された。吸着剤に結合しなかったフラクションは、０．２５Ｍ  ＮａＣｌと１００ｍＭ  アルギニンが添加され、攪拌容器（ヌクレオポール、メンブラン  カット３０，０００、シグマ（Nucleopore, membrane cut 30,000, Sigma）によって、最終容積が１−２ｍｌになるまで、濃縮された。濃縮されたフラクションは、５０ｍＭ  Ｋ−フォスフェイト（K-phosphate）緩衝液  ｐＨ７．０と０．２５Ｍ  ＮａＣｌで予め平衡しておいた、セファクリル  Ｓ−２００  ＨＲカラム（１Ｘ１２０ｃｍ）に負荷された。
１ｍｌ毎のフラクションが集められ、２８０ｎｍにおける吸収と、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるテストが行われた。ピーク部分のフラクションが集められ、ＰＢＳに対して透析され、精製ＢＰＰ１’−ＰＥ４０４とされた。高度に精製されたＢＰＰ１’−ＰＥ４０は、部分標本として、−２０℃で保存された。
全精製工程は、試料の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、蛋白質測定、ウエスタンブロット分析、及び、ＡＤＰ−リボシル化活性によって、追跡された。
（ＡＤＰ−リボシル化活性によって測定された）全活性に基づけば、出発物質に対して４．５％の収率（表III）が得られた。キメラ蛋白質の比活性によれば、精製度は２０．８倍（表III）であった。
0003906447.tif 000004
高度に精製されたキメラ蛋白質の非特異的毒性がテストされた。これは、キメラ蛋白質の単純に増加する投与量をマウス（ＳＪＬ系）に注入することによって行われた。ＰＥの毒性投与量は２４−４８時間以内に死をもたらしたけれども、動物は少なくとも２週間の間、観察された。５０μｇの投与量では１匹のマウスも死ななかった。１００μｇの投与量では２／３のマウスが死亡した。
上述した精製手順におけるヒドロキシアパタイト工程の後に、（攪拌容器の代わりに）イオン交換カラムを使用すると、最終産物の純度が改善される。ヒドロキシアパタイト支持体に結合しないことが分かったフラクションは、ＴＥ緩衝液（ＴＥ緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で希釈（１：５）され、Ｑ−セファロース（希釈されたＢＰＰ１−ＰＥ４０溶液の２０ｍｇ蛋白質に対して５ｍｌの湿式カラム媒体）に添加され、４℃で３０分間、攪拌された。その材料は、次いで、カラムに詰められ、ＴＥ緩衝液で洗われた。溶出は、ＴＥ緩衝液中の１Ｍ  ＮａＣｌで行われた。この工程は蛋白質試料を濃縮し、濃縮された蛋白質試料は、次いで、セファクリルカラムにかけられた。
Ｈ．精製されたＢＰＰ１’−ＰＥ４０の細胞障害活性
精製ＢＰＰ１’−ＰＥ４０キメラ蛋白質の増加する量が、ＰＡＳ細胞に、増殖期の第１日目（ｄ１）に、添加された。図１１に示すように、高度に精製されたＢＰＰ１’−ＰＥ４０は、その投与量に依存して、蛋白質の合成阻害をもたらした。
Ｉ．リソソーム影響物質による細胞毒性の増強
ＮＨ4Ｃｌは、リソソームのｐＨを増加させて、その酵素の活性を中和するリソソーム影響物質（lysosomotrophic agent）として知られている。ＮＨ4Ｃｌ、モネンジン等のような種々のリソソーム影響物質は、免疫毒素の細胞毒性を増強させる。
標的細胞に対するＢＰＰ１’−ＰＥ４０の細胞毒性に及ぼすＮＨ4Ｃｌの効果を調べた。図１２に見られるように、５ｍＭのＮＨ4Ｃｌは、ＰＡＳ細胞に対するＢＰＰ１’−ＰＥ４０の細胞障害効果を劇的に増加させた。ＮＨ4Ｃｌが存在しない場合には、５００ｎｇのＢＰＰ１’−ＰＥ４０は４％の蛋白質合成阻害をもたらすだけであるが、ＮＨ4Ｃｌの添加は、蛋白質合成阻害を９８％に増加させた（５ｍＭのＮＨ4Ｃｌは、それ自体では、蛋白質の合成を２６％低下させる）。
Ｊ．ＭＳ患者からのＰＢＬに対するＢＰＰ−ＰＥの細胞毒性
ＭＳ患者と、対照となる健康なドナーとから、末梢が集められた。２０ｍｌの末梢血をフィコール−アイソパック（Ficoll-isopaque）（１．０７７）に供することによって、リンパ球が分離された。リンパ球は、ＰＨＡ（５（ｇ／ｍｌ）で７２時間、活性化されるか、又は、２４時間以内の新鮮な状態で使用された。活性化されたリンパ球は、１０％  ＦＣＳと、１０単位／ｍｌ  ｒＩＬ２とを補充されたＲＰＭＩ１６４０に移された。細胞を移した後、直ちに、細胞毒性試験（２ｘ１０4細胞／ウエル）が行われた。新鮮なリンパ球（１０5細胞／ウエル）は、２０％の熱不活性化ＦＣＳと１０単位／ｍｌ  ｒＩＬ２とを補充された、Ｔ細胞株のところで説明したのと同じ培地中に維持された。
細胞は蛋白質阻害試験の為に接種された。試験は次のものについて為された：
１）予備活性化期間のない新鮮な細胞。較正実験が対照となる新鮮な血液試料について為され、試験期間の間、細胞の良い入手性を確かなものとした。接種された細胞の密度、特定の成長因子／サイトカインの添加、等、のようなパラメーターがテストされた；
２）ＰＨＡによる活性化後、２−３日経過した細胞。平行実験として、健康な個人から対照血液試料が採取され、同様のやり方でテストされ、使用されたキメラ蛋白質の特異性が調べられた。
調査は、主として病気が再発したＭＳ患者について為された。１８人のＭＳ患者が調査された。１１人の患者からの新鮮な細胞（如何なる予備活性化もない）が、（精製手順の進展に応じて）種々の精製段階にあるＢＰＰ１’−ＰＥ４０を用いて調べられた。６人の患者（５４％）からの末梢血細胞は、２０％から９２％の範囲で蛋白質の合成を阻害し、ＢＰＰ１’−ＰＥ４０が介在する細胞毒性に感受性を示した。図１３は、少数のＭＳ患者に対するＢＰＰ１’−ＰＥ４０の効果を示す。患者の１人は、当該キメラに対して非常に感受性があった（ＭＳＭ−１８）。１人の患者は、何等の反応も示さなかった（ＭＳＭ−１６）。その他の２人の患者は、ＢＰＰ１’−ＰＥ４０介在細胞毒性に対して、低い、ないしは、中位の感受性を示した（ＭＳＭ−１３、１４）。
１２人の患者からの試料（患者からの試料の一部は、新鮮細胞として、及び、活性化された後の両方でテストされた）が、３日間のＰＨＡによる活性化の後、テストされた。１２の試料のうち６つ（５０％）が、当該キメラに対して感受性を示した。
対照ドナーから採取された細胞は、当該キメラに対して、全く反応しないか、又は、極めて殆ど反応しなかった。他の病気、関連性のない神経性の病気の患者から採取された細胞もテストされたが、ＢＰＰ１’−ＰＥ４０の細胞障害効果に対して、無反応であることが見出された。
Ｋ．ＢＰＰ１’−ＰＥ４０によるＥＡＥの阻害
免疫感作（immunization）と処置の手順：
８−１０週齢の間の１８匹の雌のＳＪＬマウスが、ｐＨ７．４のＰＢＳに可溶化され、かつ、全量が、１００μｌ／マウスとなるようにＣＦＡ（５ｍｇ／ｍｌ Mycobacterium tuberculosum）中に１：１で乳化されたマウス脊髄ホモジネート（０．１ｍｇ／マウス）によって、４つの足の裏に、免疫感作された。更に、百日咳毒素（２００ｎｇ／２００μｌ／マウス）が静脈注射された。４８時間後に、百日咳毒素の再投与、静脈注射（２００ｎｇ／２００μｌ／マウス）によって、追加免疫が為された。
処置は、０．５ｍｌ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中のＢＰＰ１’−ＰＥ４０、５ｕｇ／マウス（２．５μｇ／ｇ動物に基づいている）、又は、０．５ｍｌ  ＰＢＳ単独を、１２時間毎に、腹腔内に注射することからなっていた。処置は、免疫感作の８日後から開始され、１０日間続けられた。ＥＡＥの症状の重さの階級付けは、処置の間毎日と、少なくとも１ヶ月後に行われた。点数付は以下のように１から６の範囲で行われた：
１＝軽い尾の弱り、２＝尾の麻痺、３＝尾の麻痺と後脚の麻痺、４＝後脚の麻痺又は軽い前脚の弱り、５＝四肢麻痺、６＝死。
結果：
ＢＰＰ１’−ＰＥ４０処置されたマウスはＥＡＥを全く発症せず（即ち症状の重さ＝０）、この病気で１匹も死ななかった。対照的に、ＰＢＳ対照群においては、９匹のうち６匹のマウスがＥＡＥを発症し、１４日目が病気のピークとなった。発病した６匹のマウスは、病気の症状の重さと期間とにおいて、異なっていた。１４日目の平均の症状の重さは３であった。更に、対照群の６匹のマウスのうちの１匹がこの病気によって死亡した。
処置された群は、更に４週間追跡されたが、病気の遅れた発症ないしは遅れた再発の徴は全く観察されなかった。
Ｌ．ヒトキメラ蛋白質
ヒトＭＢＰ病原性配列に基づくキメラ蛋白質が更に幾つか構築された。これらのキメラ蛋白質における標的配列は、ヒトＭＢＰの８４−１０２及び１４３−１６８のペプチドに基づいている（表ＩＶｂ）。短いペプチド配列がＤＮＡシンセサイザーによって合成され、通常の方法によって精製された。構築に使用したオリゴの配列は表ＩＶａに示されている。
0003906447.tif 000005
0003906447.tif 000006
新しいキメラ蛋白質が遺伝子融合技術を用いて構築された。この新しいキメラ蛋白質をコードするプラスミドの図式表現を図１４ａ−ｄに示す。標的配列は、修飾ＰＥの全長の５’末端でクローン（ＰＥ６６4Glu）（図１４ａ、ｂ）されるか、ＰＥ−ｃＤＮＡの切断された形態にクローン（ＰＥ４０）（図１４ｃ、ｄ）された。両方の形態のＰＥ−ｃＤＮＡがＩＬ２−毒素キメラ蛋白質を構築するのに使用され、ヒト及びマウス新鮮活性化Ｔ細胞に対して異なる活性を示すことが見出された。オリゴ１−２は、ＢＰＰ143-168−ＰＥ４０を構築するのに使用された；オリゴ３−４は、ＢＰＰ84-102−ＰＥ４０を構築するのに使用された；オリゴ５−６は、ＢＰＰ84-102−ＰＥ６６4Gluを構築するのに使用された；オリゴ７−８は、ＢＰＰ143-168−ＰＥ６６4Gluを構築するのに使用された。
新しいキメラ細胞毒素は、先のＭＢＰ−ＰＥの産生と同様に、E. coli発現系で発現された。発現後、細胞抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１５ａ−ｃ）、抗ＰＥ抗体を用いたウエスタンブロット分析及び発現蛋白質のＡＤＰ−リボシル化活性測定が行なわれた。全ての新しいキメラ蛋白質は良く発現され、発現細胞の不溶性フラクションに主として濃縮された。
これらのヒトキメラ蛋白質は、ＭＳ患者からの末梢血のような標的細胞に対してテストされた。ＢＰＰ84-102−ＰＥ６６4Gluは、２人のＭＳ患者（既に先にテストされたＭＳＭ１６、１８）の細胞に対してテストされ、細胞障害性であることが分かった（表Ｖ）。ヒトの配列に基づく新しいキメラ蛋白質に反応したこれらの患者のうちの１人（ＭＳＭ１６）は、以前、ＢＰＰ１−ＰＥ４０（モルモットに基づく配列）介在細胞毒性に対しては反応しなかった。もう１人のＭＳ患者からの細胞はＢＰＰ84-102−ＰＥ６６4Gluに対して応答しなかった。
0003906447.tif 000007
0003906447.tif 000008
0003906447.tif 000009
0003906447.tif 000010
本発明が上に説明されたものに限られるものではなく、本発明の範囲は以下の請求項によってのみ限定されるものであるということは、当業者には理解されるであろう：
【図１】
0003906447.tif 000011
【図２】
0003906447.tif 000012
【図３Ａ】
0003906447.tif 000013
【図３Ｂ】
0003906447.tif 000014
【図４】
0003906447.tif 000015
【図５】
0003906447.tif 000016
【図６】
0003906447.tif 000017
【図７】
0003906447.tif 000018
【図８】
0003906447.tif 000019
【図９】
0003906447.tif 000020
【図１０】
0003906447.tif 000021
【図１１】
0003906447.tif 000022
【図１２】
0003906447.tif 000023
【図１３】
0003906447.tif 000024
【図１４ａ】
0003906447.tif 000025
【図１４ｂ】
0003906447.tif 000026
【図１４ｃ】
0003906447.tif 000027
【図１４ｄ】
0003906447.tif 000028
【図１５】
0003906447.tif 000029