(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖重合度が２〜３０の整数で還元性末端基がアルドースより構成されており、かつ該還元性末端基のアノマー位を酸化して得られたカルボン酸塩とハロゲン化物である疎水性基導入剤とを反応させることにより、該還元性末端基のアノマー位に疎水性基をエステル結合で導入したオリゴ糖脂質であって、該疎水性基が炭素数１２〜２２のアルキル基、炭素数１２〜２２の１〜４の不飽和結合を有するアルケニル基、炭素数１２〜２２のアルキル基を１，２位または１，３位に有するグリセリル基、及びステリル基からなる群から選ばれるものである、オリゴ糖脂質。
【請求項２】
請求項１記載のオリゴ糖脂質からなるリン脂質小胞体用安定化剤。
【請求項３】
請求項１記載のオリゴ糖脂質からなるＯ／Ｗエマルジョン用安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、公知の界面活性剤からなるリン脂質小胞体（以下、小胞体という）、油滴あるいはミセルの膜表面にオリゴ糖鎖を安定に導入することができる、簡便に合成でき、構造明確なオリゴ糖脂質に係るものである。即ち、本発明は、リン脂質等の界面活性剤からなる小胞体、あるいは、Ｏ／Ｗ型エマルジョンである油滴およびミセルの分散安定化を図るオリゴ糖脂質に関するものである。
【０００２】
即ち、本発明のオリゴ糖鎖で修飾した小胞体やＯ／Ｗ型エマルジョンの油滴およびミセルは分散安定性に優れ、小胞体どうしの融合も防止できるので、粒径の安定したＯ／Ｗ型エマルジョンタイプの化粧品等が調製できる。
また、該小胞体は内水相にアドリアマイシンやプロスタグランジンなどの生理活性物質を内包させたドラッグデリバリーシステムや徐放性材料として用いることができ、さらに、小胞体に精製ヘモグロビンを内包させて人工赤血球とすることもできる。同様に、Ｏ／Ｗ型エマルジョンの油滴およびミセルの油相にトコフェロール等の親油性生理活性物質を含有させることもできる。
【０００３】
【従来の技術】
小胞体およびＯ／Ｗ型エマルジョンの油滴あるいはミセルは、その凝集や融合、崩壊あるいは前記現象に伴う形態の変化や内包物の漏出などの不安定性をもつことが常態であり、かかる不安定性解決の手段として数多くの提案が行われている。
まず、不飽和リン脂質の集合体の重合による安定化が試みられているが（例えば、総説：Ｈ．Ｒｉｎｇｓｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｎｇｌ．，２７，１１３（１９８８））、その膜重合により、本来の脂質が有していた特性、例えば、ゲルー液晶相転移現象、相分離や膜の流動性などが失われ、これに係わる機能の損失発生があるうえ、重合体の生体内での代謝機構も明らかではない。
【０００４】
次に、カルボキシメチルキチンによる小胞体の表面被覆（Ｈ．Ｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，８５５，２４３（１９８６））や、アミロペクチンやプルラン等の多糖類にコレステロールなどの疎水性基を結合させた化合物で小胞体表面を被覆することにより小胞体構造を安定化する技術（特開平３ー２９２３０１号公報）が開示されている。また、リン脂質小胞体等のマイクロカプセルの被覆剤としてヒアルロン酸等の多糖類に脂肪酸を導入した誘導体（特開平３ー４７８０１号公報）やカチオン性リポソーム形成用配合剤としてのグルコサミン誘導体（特開平３ー２１８３８９号公報）が開示されているが、これらの発明は、何れも小胞体の膜流動性を大きく変えることはないものの該小胞体の凝集を誘起し易い欠点がある。
【０００５】
なお、コレステロールやホスファチジルエタノールアミンの親水部にポリエチレングリコールを結合させた両親媒性分子を小胞体に導入すると小胞体の凝集が抑制され、小胞体の血中滞留時間が延長できることが報告されている（Ｔ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０６６，２９（１９９１））。また、免疫分析試薬用リポソームとしてポリオキシエチレン系界面活性剤等をリン脂質に含有させて安定化を図る技術（特開平３ー６１８５９号公報）が開示されているが、代謝など生体内での挙動が懸念されている。
【０００６】
また、本発明者らは、既に、オリゴ糖脂肪酸エステルを小胞体二分子膜中に導入して、極めて有効に小胞体分散の安定化を図り得ること、ならびに、オリゴ糖の糖鎖が長くなるほど優れた効果を示すことを開示した（特開平１ー２９４７０１号公報）。しかし、該オリゴ糖脂肪酸エステルは小胞体の安定性に多くの解決をもたらすものではあるが、反応基（水酸基）を多数有するオリゴ糖への長鎖脂肪酸の導入は非選択的に行われ、導入数や導入部位も様々である。そのために、該オリゴ糖脂肪酸エステルの分離および精製が複雑なうえに収率も低く、これを導入した小胞体自体の凝集抑制効果、融合抑制効果ならびに小胞体膜表面に固定される度合いが、該オリゴ糖の異性体によって異なることなどが問題となる。さらにその異性体の構造と効果との関連も不明である。
【０００７】
さらに、本発明者らは、オリゴ糖の還元性末端基のアノマー位に疎水性基をエーテル結合およびアミド結合により効率良く導入したオリゴサッカライド誘導体により、小胞体を優れて安定化し得ることを開示した（特願平４ー１２６７１６号発明、特願平４ー１４８９２２号発明、特願平４ー１９１３６４号発明、特願平４ー２０６１３６号発明）。しかし、その製造法は反応性基（水酸基）に保護基を導入、あるいは、還元性末端基を酸化開環後、脱水閉環したのちに疎水性基を結合させる方法で製造工程が煩雑となり収率も低い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、前記諸問題の解決のために、オリゴ糖脂質の特定基に疎水基を簡易に、かつ、高収率に導入した構造の明確なオリゴ糖脂質の開発を技術的課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、前記する課題を解決するために、糖重合度が２〜３０の整数で還元性末端基がアルドースより構成されており、かつ、還元性末端基のアノマー位に疎水性基をエステル結合で導入したオリゴ糖脂質を提供し、さらには、該オリゴ糖脂質をリン脂質小胞体用安定化剤とすることに関するものである。
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のオリゴ糖脂質は、親疎水バランスを調整する必要のある化合物であるため、本発明に使用するオリゴ糖は、糖単位数が２〜３０の整数で示されるオリゴ糖であり、かつ、還元性末端基がアルドースで構成されるオリゴ糖が好ましい。
【００１１】
糖単位数が２〜３０の整数で示されるオリゴ糖の重合度別、種類別の分取は、保温したゲル濾過カラムを用いることにより、このものを純度高く得ることができる。また、その検出には示差屈折計を使用する。分取したオリゴ糖の定性および純度の確認は、シリカゲル薄層板を用いて混合溶媒（１−ブタノール／ピリジン／水）で多重展開して硫酸発色させるか、あるいは、アミノ基を有する固定相、混合溶媒（アセトニトリル／水）の移動相を用いた液体クロマトグラフィーや、もしくは、オクタデシル基を有する固定相、純水の移動相を用いた液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。なお、本発明に使用するオリゴ糖は、構造が明確であれば市販の純品を用いてもよい。
【００１２】
本発明のオリゴ糖脂質は、親疎水バランスの調整を重視する必要から、ここに使用する疎水性基は、例えばアルキル鎖の場合は、炭素数を１２〜２２とし、かつ、不飽和結合を持つ場合には、不飽和の数を１〜４とするのが好ましい。また、オリゴ糖鎖の還元性末端基のアノマー位を酸化して得られたカルボン酸塩と疎水性基をエステル結合させるため、本発明に使用する疎水性基導入剤はハロゲンを有する。
【００１３】
ハロゲンを持つ疎水性基導入剤を例示すれば、そのアルキル炭素数が１２〜２２個の第一および第二ハロゲン化アルキルがある。即ち、疎水性基を持つハロゲンとしては、例えば、塩素、臭素、ヨウ素などが挙げられる。ハロゲンを有する長鎖アルキルには、直鎖第一ハロゲン化アルキルとして、ラウリルクロライド、セチルブロマイド、ステアリルブロマイド、ベヘニルヨーダイド等が挙げられる。その他、１−クロロ−１−ドデセン、オレイルブロマイド、リノレニルヨーダイド等の直鎖第一不飽和ハロゲン化アルキル、分岐第一飽和ハロゲン化アルキル、分岐第一不飽和ハロゲン化アルキル、第二飽和ハロゲン化アルキル、あるいは、第二不飽和ハロゲン化アルキルも使用できる。
また、長鎖アルキル基を２本以上有するハロゲン化物の疎水性基、例えば、グリセロール骨格の１，２位および１，３位に長鎖アルキル基を有するハロゲン化物の疎水性基導入剤も有効である。
さらに、ステロール類、例えばコレステリルブロマイド等の物質もハロゲンを有する疎水性基導入剤の範囲に含まれる。
【００１４】
疎水性基の糖鎖末端アノマー位へのエステル結合による導入は以下のようにして行う。
即ち、オリゴ糖の還元性末端を次亜ヨウ素酸あるいは臭素水を用いて酸化しアノマー位をカルボン酸塩として開環したのち、陽イオン交換カラムによってカルボン酸とする。
次いで、テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムハイドロオキサイド等の１０％メタノール溶液または１０％水溶液で中和し、カルボン酸の４級アンモニウム塩を得る。あるいは、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムまたは水酸化リチウム等の０．５Ｎ水溶液で中和してアルカリ金属塩とする。または、アンモニア塩基性ＡｇＮＯ3 水溶液を用いてカルボン酸銀塩とする。これらをジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドあるいはホルムアミドで溶解したのち、疎水性ハロゲン化物を混合して均一な溶液となし、２０〜９０℃、好ましくは４０〜７０℃の温度で反応させ、目的のオリゴ糖脂質溶液を得る。ここに得たオリゴ糖脂質の精製は、アセトン等の貧溶媒等により沈澱させ、沈澱物を水または水ーメタノールあるいは水ーエタノールに溶解して逆相シリカゲルカラムにかけることにより行う。
【００１５】
前記の方法にて得られたエステル結合によるオリゴ糖脂質の構造確認は、 1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲにて行う。また純度確認は、赤外分光光度計（以下、ＩＲという）およびシリカゲルをベースとした薄層クロマトグラフィー、または、逆相系あるいは順相系シリカゲルカラムを適用し検出器に示差屈折検出器を用いた高速液体クロマトグラフィーにて行う。
【００１６】
また、本発明のオリゴ糖脂質を修飾した小胞体の安定性の確認は以下の如くして行うことができる。
リン脂質単独、または、リン脂質に膜安定剤（コレステロール、コレスタノール等のステロール類）、あるいは、リン脂質に負電荷脂質（ステアリン酸、ジアシルフォスファチジン酸等）等を添加して成る混合脂質に、本発明のオリゴ糖脂質を小胞体用安定化剤として０．０１〜５０モル％、好ましくは０．０５〜２０モル％添加して水和物を作成する。該水和物を超音波攪拌器、マイクロフルイダイザーあるいはエクストルーダー等の公知の方法により５０〜２００ｎｍの小胞体分散液を調製する。ここに得た小胞体分散液の粒径は、粒径分布測定装置、または、ネガティブ染色した透過型電子顕微鏡により行うことができる。
【００１７】
前記小胞体の分散液をゲル濾過したのち、あるいは、超遠心分離機により小胞体に導入されなかったオリゴ糖脂質を上澄として系外に除去したのち、それぞれ、各フラクションの糖をフェノール−硫酸法を用いて定量することにより、オリゴ糖脂質の小胞体への導入率を決定することができる。本発明のオリゴ糖脂質は添加量の７０％以上が小胞体に導入される。
小胞体の分散安定性は、遊離のオリゴ糖脂質を除いた分散液について、室温放置で５００〜８００ｎｍの吸光度（濁度）の経時変化を紫外可視分光光度計で測定することにより評価確認することができる。
【００１８】
その他、小胞体の分散安定性の評価の方法として、小胞体の分散液につき、コーンプレート型回転粘度計による粘度測定をする方法、あるいは、電子顕微鏡などによる検鏡法等がある。
【００１９】
次いで、本発明のオリゴ糖脂質を修飾したＯ／Ｗ型エマルジョンとして油滴を例示して、その安定性の確認を説明する。
油脂、例えば大豆油等のトリグリセリド（油脂／オリゴ糖脂質モル比＝０．１〜１００、好ましくは１〜１０）、水系媒質、例えば、水、リン酸緩衝液（ｐＨ５〜９）、生理食塩水、Ｋｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒｓ液などを加えたのち、振盪あるいはミキサーで攪拌する。
斯くして調製したＯ／Ｗ型オリゴ糖脂質修飾マイクロスフェアは、親水性エマルジョンである。
さらに、超音波処理またはマイクロフルイダイザー等の高圧ホモジナイザーを用いて乳化処理を行うことで、粒径の小さな油滴小球を含有する親水性エマルジョンが得られる。また、該調製法の条件により数μｍ〜数十ｎｍの範囲で油滴小球を調製することができる。これらの粒径は室温または５℃で数カ月間保存後も変化なく安定である。
【００２０】
【作用】
本発明のオリゴ糖脂質は、極めて簡易な方法により高収率をもって得られる構造が明確な化合物であり、両親媒性分子と親和性が非常に良いため、両親媒性分子を包含して形成する集合体（小胞体、油滴、ミセル等）の修飾剤として好適である。さらに、前記集合体に導入したオリゴ糖脂質は、糖構造を水相に露出した状態を保持することができる。
【００２１】
本発明の集合体修飾剤としてのオリゴ糖脂質は、例えば、小胞体の分散安定化剤や内包物の漏出抑制剤としての用途のほか、蛋白等の溶質に対する分散安定化、親細胞化、特定抗体に対する認識ラベル化、生体内での貪食抑制等利用目的に応じての使い分けが可能である。
【００２２】
小胞体の内水相に機能性分子を包含したキャリアーを生体投与した場合、該小胞体は細網内皮系や貪食細胞への取込みにより短時間で血中より除外されることが通常ではあるが、本発明のオリゴ糖脂質による小胞体の表面修飾により、該小胞体の血中滞留時間を制御することができる。
さらに、オリゴ糖鎖、ならびに、疎水性基ともに代謝可能な構造をエステル結合させた本発明のオリゴ糖脂質は、生体内代謝において障害を生じないものと期待することができる。
【００２３】
【実施例】
以下に実施例をもってさらに詳細に説明する。
実施例１．
ヨウ素１．８３ｇを２０％ヨウ化カリウム水溶液５０ｍｌに溶解し、これに、マルトペンタオース５．０ｇを純水５ｍｌに溶解させた水溶液を添加後、暗所室温にて１０％テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムハイドロオキサイド（（ｎ−Ｂｕ） 4ＮＯＨ）水溶液をヨウ素の色が消えるまで滴下しながら３時間攪拌反応した。反応物をアセトンおよびエタノールで洗浄し、遊離の塩を除去した。これにより、オリゴ糖の還元性末端基のアノマー位がカルボン酸（ｎ−Ｂｕ） 4Ｎ+ 塩となって開環しているオリゴ糖誘導体を４．５１ｇ得た。収率は６８．９％であった。反応の確認はＩＲスペクトル（ＫＢｒ）において、カルボン酸イオンに基づく１６２０ｃｍ-1付近にピークが出現することにより確認した。
【００２４】
得られたオリゴ糖のアンモニウム塩０．５ｇを、蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下、ＤＭＦという）４０ｍｌに溶解し、２倍モルのステアリルブロマイド３０７ｍｇと混合し、５０℃にて４０時間攪拌した。このものを濃縮後アセトン中にて再沈澱させることにより、本発明のオリゴ糖脂質のマルトペンタオースモノステアリルエステル（以下、ＭＰＭＳという）の粗標品を得た。即ち、これはマルトペンタオースにステアリルブロマイドを用いてエステル結合によりエステル基を導入したものである。
ここに得たＭＰＭＳをメタノールに溶解し、液体クロマトグラフィーを用いて、固定相にカプセルパックＣ１８カラム（商品名、株式会社資生堂製）（オクタデシル修飾シリカゲルカラムであればよい）および移動相にメタノール／純水（９５／５）混合溶媒を使用して未反応物を除去した結果、精製ＭＰＭＳを０．３７ｇを得、前記アンモニウム塩に対しその収率は７６．０％であった。
【００２５】
精製ＭＰＭＳは、ＩＲ測定の結果、アルキル鎖に基づくピークが２８００〜２９５０ｃｍ-1付近に確認され、さらに、エステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に基づくピークが１７４０ｃｍ-1付近に確認された。また、 1Ｈ−ＮＭＲ測定より、エステル結合に基づくα位およびβ位のメチレンプロトンのピークがそれぞれ４．０４および１．５８ｐｐｍに認められた。従って、該ＭＰＭＳは、マルトペンタオースの還元末端基のアノマー位にステアリル基がエステル結合により導入された、構造の明確なオリゴ糖脂質とすることができる。
【００２６】
ＭＰＭＳの小胞体安定化の評価は以下の如くに行った。
ＭＰＭＳ３ｍｇとリン脂質としてジパルミトイルホスファチジルコリン（以下、ＤＰＰＣという）１００ｍｇをメタノールに溶解して混合したのち、ロータリーエバポレーターにてナシ型フラスコの内壁に薄膜を形成させた。１０ｍｌの純水と数個のガラスビーズを添加し、ボルテックスにて５０℃の加温下に攪拌して白濁液を得た。この白濁液をエクストルーダーで処理したが、処理に際してのポリカーボネート製フイルターの孔径を０．４μｍ、０．２μｍ、０．１μｍ、０．０５μｍと順次変化させながら、各５回通過させることにより、白色透明なＤＰＰＣ小胞体分散液を得た。ここに得た小胞体の粒径を、粒径分布測定装置およびネガティブ染色した透過型電子顕微鏡で測定した結果、その平均粒径は各５６±１１ｎｍおよび５３±９ｎｍであった。
【００２７】
前記小胞体の分散安定性は、２５℃、３日間放置で５００ｎｍの吸光度（濁度）の変化を紫外可視分光光度計（ＭＰＳ−２０００、株式会社島津製作所製）で測定して評価した。
未修飾ＤＰＰＣ小胞体では、調製直後の試料を室温に放置すると、溶液の濁度は直ちに上昇をはとじめ該小胞体の凝集が生起した。また、シュガーエステル修飾小胞体では、濁度上昇は未修飾系のそれを１００％とした場合の７０％程度に達し、凝集は十分に抑制されなかった。
一方、ＭＰＭＳを導入して修飾した系では、調製静置直後に未修飾系の７％程度の濁度上昇を認めたに過ぎず、経時的な上昇も殆どなく凝集が抑制された。
従って、本発明のＭＰＭＳの小胞体に対する分散安定性の賦与の効果は極めて大なるものであった。
【００２８】
実施例２．
ヨウ素５．２０ｇを４０℃加熱メタノール溶液５０ｍｌに溶解し、これに、マルトペンタオース５．０ｇを水５ｍｌに溶解させた水溶液を添加し、４０℃にて６０分攪拌した。次いで、４％ＫＯＨ／メタノール溶液を添加し、ヨウ素の色が消えるまで滴下した。これによりオリゴ糖のアノマー位はカルボン酸カリウム塩となり開環し沈澱物質となった。次いで、該沈澱物質をろ過してエタノールおよびアセトンで洗浄した。
洗浄終了後、沈澱物質を水に溶解し、さらに、この水溶液を陽イオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ−ＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ+ 型）（オルガノ株式会社製）を用いてカルボン酸を有するオリゴ糖とし、遊離の塩は電気透析型脱塩装置（旭化成株式会社製）にて除去した。
【００２９】
前記カルボン酸を有するオリゴ糖に蒸留水中にて１０％テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムハイドロオキサイド−メタノール溶液３．１ｍｌを滴下し、水溶液のｐＨを７．５としたのち、凍結乾燥を行い、エタノールおよびアセトンで遊離の塩を洗浄し、乾燥後カルボン酸アンモニウム塩４．３ｇを得た。反応はＩＲスペクトル（ＫＢｒ）において、１６２０ｃｍ-1付近にカルボン酸イオンに基づくピークが出現することにより確認した。
【００３０】
得られたオリゴ糖脂質のアンモニウム塩０．５ｇを、蒸留したＤＭＦ４０ｍｌに溶解し、２倍モルのセチルヨーダイド３２４ｍｇと混合し、７０℃にて１２時間攪拌し反応させた。さらに、該反応液を濃縮後、アセトン中にて再沈澱させることによりマルトペンタオースモノセチルエステル（以下、ＭＰＭＣという）の粗標品を得た。
ここに得たＭＰＭＣをメタノールに溶解させ、液体クロマトグラフィーを用いて、固定相にリクロプレップＲＰ−１８カラム（商品名、メルク社製）（オクタデシル修飾シリカゲルカラムであればよい）および移動相にメタノール／純水（９５／５）混合溶媒を使用して未反応物を除去した結果、精製ＭＰＭＣを０．３９ｇを得、前記オリゴ糖脂質のアンモニウム塩に対しその収率は７９．３％であった。
【００３１】
精製ＭＰＭＣは、ＩＲ測定の結果、アルキル鎖に基づくピークが２８００〜２９５０ｃｍ-1付近に確認され、さらに、エステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に基づくピークが１７４０ｃｍ-1付近に確認された。また、 1Ｈ−ＮＭＲ測定より、エステル結合に基づくα位およびβ位のメチレンプロトンのピークがそれぞれ４．０４および１．５８ｐｐｍに認められた。従って、該ＭＰＭＣは、マルトペンタオースの還元末端基のアノマー位にセチル基がエステル結合により導入された、構造の明確なオリゴ糖脂質とすることができる。
【００３２】
本発明のオリゴ糖脂質を含む混合脂質粉末（モル比：ＤＰＰＣ／コレステロール／パルミチン酸／ＭＰＭＣ＝７／７／２／１）２ｇに５（６）−カルボキシフルオレセイン（以下、ＣＦという）４０ｍＭ水溶液（ｐＨ７．４）４０ｍｌを添加し、４℃にて２４時間攪拌する。得られた白濁液をエクストルージョン法により孔径０．２μｍのポリカーボネート製フィルターを５回通過させ、平均粒径２１７±３９ｎｍのＣＦ内包小胞体分散液を得た。５０ｍＭのヘペス緩衝溶液を展開溶媒としてゲルろ過し、未内包ＣＦおよび未導入ＭＰＭＣを除去した。さらに、遠心分離（５０，０００×ｇ、６０分）し、脂質濃度を５ｗｔ％のＣＦ内包小胞体層を得た。
【００３３】
前記小胞体層部２ｍｌに、ヒト血液を遠心分離（１９００×ｇ）することにより得たヒト血漿２ｍｌを添加し、３７℃にて静置し、ＣＦの漏出率および濁度を測定した。
その結果、未修飾系では１９．９％のＣＦが漏出したのに対し、ＭＰＭＣ修飾系はＣＦ漏出率が４．３％に抑制され、血漿中で小胞体の極めて大きな安定化効果が認められた。
【００３４】
実施例３．
ジ−Ｎ−アセチルキトビオースから誘導されるラクトン（以下、キトビオースラクトンという）１００．０ｍｇを水溶液中にて０．１Ｎアンモニア塩基性ＡｇＮＯ3 水溶液２．４ｍｌと混合し、キトビオース酸銀塩を得た。
該生成物と２倍モルのオレイルヨーダイドとをジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯいう）中にて８０℃、７５時間攪拌することにより、ジ−Ｎ−アセチルキトビオースモノオレイルエステル（以下、ＤＡＣＭＯという）を得た。これを濃縮したのち、アセトン中にて沈澱させ、実施例１と同様に、液体クロマトグラフィーを用い未反応物を除去して精製ＤＡＣＭＯを１１１ｍｇ得た。この時の総収率は６８％であった。
【００３５】
前記精製ＤＡＣＭＯにつきＩＲ測定を行った結果、２７００〜３０００ｃｍ-1付近にアルキル鎖に基づくピークが確認でき、７００ｃｍ-1付近にオレイル基のＣＨ−面外変角振動に基づくピークが認められた。また、エステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に基づくピークが１７３５ｃｍ-1付近に認められ、さらに、 1Ｈ−ＮＭＲから、エステル結合に基づくα位およびβ位のメチレンプロトンのピークがそれぞれ４．０５および１．５９ｐｐｍに確認できた。従って、ここに得たＤＡＣＭＯはキトビオースの還元性末端基のアノマー位にオレイル基がエステル結合により導入されたものとすることができた。
【００３６】
次いで、ＤＡＣＭＯを含む混合脂質粉末（モル比：ＤＰＰＣ／コレステロール／ジステアリルホスファチジン酸／ＤＡＣＭＯ＝１０／９／０．９／５）２５０ｍｇをジオキサン／メタノール／純水の混合溶媒からの凍結乾燥により得た。この凍結乾燥標品に生理食塩水を５ｍｌ添加後、１２時間攪拌して得た白濁液をヒスコトロン（株式会社日音医理科器械製作所製）にて室温下、３０分間の粉砕処理を行った。このものを、孔径１．０μｍ、０．４μｍ、０．２μｍの滅菌フィルターを順次通過させることにより白色透明なＤＡＣＭＯ修飾小胞体分散液（平均粒径２００ｎｍ）を得た。この分散液に５ｍＭの塩化カルシウム（カルシウムイオンとして）を添加後、分散液の粘度を回転粘度計（ビスメトロン  ＶＳ−ＡＫ）により測定（１．２ｓｅｃ-1）したところ、５ｃｐであって、小胞体の安定度は極めて高いものと評価した。
【００３７】
一方、ＤＡＣＭＯを含まない混合脂質粉末（モル比：ＤＰＰＣ／コレステロール／ジステアリルホスファチジン酸＝１０／９／０．９）から小胞体分散液を同様に調製してカルシウムイオンを添加すると、小胞体表面は負電荷を帯びているため小胞体は直ちに凝集し、粘度は１１ｃｐまで上昇した。
【００３８】
実施例４．
セロトリオース７．０ｇから実施例１と同様の手法により、アンモニウム塩を調製し、蒸留したＤＭＦに溶解させ、予めクロロホルムに溶解した２倍モルのコレステリルブロマイドとにより、これもまた実施例１の方法でセロトリオースモノコレステリルエステル（以下、Ｓ−Ｃｈｏｌ．という）を合成し、さらに、実施例１と同様の手順に従い精製して、精製Ｓ−Ｃｈｏｌ．を９．９ｇ得たが、原料糖、即ち、セロトリオースの使用モル数に対する生成糖脂質、即ち、Ｓ−Ｃｈｏｌ．中の糖のモル数を比較すると、その収率は８０％であった。このもののＩＲスペクトルでは、１７４０ｃｍ-1付近にエステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に基づくピークが認められ、エステル化反応が進行したことを確認した。
【００３９】
前記の精製Ｓ−Ｃｈｏｌ．を含む混合脂質粉末（モル比：水素添加大豆レシチン／コレステロール／ステアリン酸／Ｓ−Ｃｈｏｌ．＝７／４／２／３）１０．０ｇを生理食塩水に分散させ、４℃で２４時間攪拌した。これをマイクロフルイダイザーを使用して２５００ｐｓｉ、１５分、４℃の条件で処理し、平均粒径３５０±９５ｎｍのＳ−Ｃｈｏｌ．修飾小胞体分散液を得、さらに、遠心分離（１０００００×ｇ、３０分）して下層に小胞体層を得た。デキストランによる凝集作用を見るために、前記小胞体層に、デキストラン（分子量、４００００）を添加し、８００ｎｍにおける濁度測定を行った。
その結果、未修飾小胞体では、その１ｗｔ％の水和物でも濁度が上昇し凝集が認められたが、Ｓ−Ｃｈｏｌ．修飾小胞体では濁度の上昇が殆どなく、デキストランの凝集作用に対するＳ−Ｃｈｏｌ．の抑制効果を確認することができた。
【００４０】
実施例５．
ＭＰＭＳを含んだ混合脂質粉末（モル比：ＤＰＰＣ／コレステロール／パルミチン酸／ＭＰＭＳ＝７／７／２／０．５）１０．０ｇを、精製したストローマ除去ヘモグロビン溶液（４０ｗｔ％、２００ｍｌ〔ｐＨ７．４、ＮａＣｌ１００ｍＭ、ピリドキサール−５, −ホスフェート１９．２ｍＭ〕）に分散させ、４℃で２時間攪拌したうえ、マイクロフルイダイザーにより平均粒径３００±９９ｎｍの小胞体分散液を得た。さらに、粒径エクストルージョン法により孔径０．２μｍのフィルターを通過させ、生理食塩水を溶媒としてゲルろ過により外水相ヘモグロビンと未導入ＭＰＭＳとを除去し、平均粒径２１５±５８ｎｍのヘモグロビン内包小胞体の分散液を得た。
【００４１】
前記ヘモグロビン内包小胞体分散液を脂質濃度５ｗｔ％、ヘモグロビン濃度１０ｗｔ％、ｐＨ７．４に調整後、２０００ｍｇ／ｋｇを一群のラットに尾静脈内投与した。経時的に採血したのち、遠心分離により赤血球とヘモグロビン内包小胞体とを分離して、ヘモグロビン内包小胞体の血中からの消失量の経時変化を観察した。その結果、本発明のオリゴ糖脂質であるＭＰＭＳで小胞体を修飾した系と未修飾系での血中半減期の平均は、それぞれ３９時間と２３時間であり、ＭＰＭＳの小胞体修飾が有効であったことが認められた。
【００４２】
実施例６．
２５ｇのコーンスターチをプルラナーゼ処理したのち、１８ｇの９５℃加熱溶解分画を得た。ここに得た分画物を、液体クロマトグラフィーを用いて、６０℃に保温した条件で固定相にオクタデシル修飾シリカゲルカラム（ＯＤＳ−ＡＱ、ＹＭＣ社製）及び移動相に純水を使用し、糖単位数２５のマルトエイコサペンタオース６５０ｍｇを得た。
【００４３】
前記マルトエイコサペンタオース５００ｍｇを熱水に溶解したのち、６０℃保温下で０．５Ｎ水酸化ナトリウムを１．０ｍｌ加え、直ちに液温を４０℃に冷却した。ここで、ヨウ化カリウム１７５ｍｇおよびヨウ素３７ｍｇをそれぞれ加えて溶解し、密閉遮光下で４０℃、１８時間攪拌反応した。反応後、熱エタノール、アセトン洗浄し、脱塩処理した沈澱物を得た。これを熱水に溶解後、５℃に冷却して生じた沈澱物を採り、希薄塩酸で洗浄することにより糖末端のカルボン酸カリウム塩を遊離のカルボン酸とした。このものを凍結乾燥し４５０ｍｇの白色粉末を得た。
【００４４】
前記白色粉末４５０ｍｇを９５℃の純水５０ｍｌに溶解し、１０％（Ｗ／Ｖ）のテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムハイドロオキサイド水溶液をｐＨ７．５になるように添加したのち、ロータリーエバポレーターにて乾固し、これを５０ｍｌの５％（Ｗ／Ｖ）リチウムクロライド添加ホルムアミドに溶解した。さらに、２倍モルの１−ブロモ−２，３−Ｏ−オクタデシルプロパン０．１４ｇを加え、７０℃にて４８時間攪拌した。反応収量後、アセトン中で再沈澱させることにより、２本のアルキル基を有した疎水性基を糖還元性末端のアノマー位にエステル結合させた１，２−ジ−Ｏ−オクタデシル−３−α（β）−エイコペンタオニル−rac −グリセリド（以下、ＤＯＤＥＰＧという）の粗標品を得た。
【００４５】
該ＤＯＤＥＰＧ粗標品につき、６０℃に保温した条件で固定相にオクタデシル修飾シリカゲルカラムおよび移動相に純水を用いる液体クロマトグラフィーを使用して、未反応物を除去し、凍結乾燥してその精製物２８０ｍｇを得た。
精製ＤＯＤＥＰＧのＩＲ測定の結果、２８００〜３０００ｃｍ-1付近にアルキル鎖に基づくピークが確認でき、さらに、エステル結合のＣ＝Ｏ伸縮振動に基づくピークが１７４０ｃｍ-1付近に認められた。また、13Ｃ−ＮＭＲから、糖末端アノマー位炭素の化学シフトが原料の９５ｐｐｍより１７０ｐｐｍに移動したので、ジアルキルグリセリドが末端アノマー位に選択的に導入されていたことが確認できた。
【００４６】
前記ＤＯＤＥＰＧ凍結乾燥体２８０ｍｇに、トリオクタノイルグリセリド６８０ｍｇおよび１／３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０ｍｌをそれぞれ加え、マグネチックスターラーにて攪拌後、マイクロフルイダイザー（７０００ｐｓｉ、１０分）にて処理し、油滴小球を含有する水性分散液を調製した。この油滴小球につき走査型電子顕微鏡観察を行ったところ平均粒径９０±４５ｎｍの微小球の形態であることが観察された。また、これらの粒子は室温または５℃で３ケ月間保存しても粒径の変化がなく安定していた。
【００４７】
実施例７．
実施例１で得たＭＰＭＳ０．２ｇに流動バラフィン（シリコールＰ７０：商品名、松村石油株式会社製）２０．０ｇ、および、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン０．５ｇを加え、８０℃に加温溶解し、Ｔ．Ｋ．オートホモミキサー（特殊機化工業株式会社製）により攪拌しながら除々に８０℃の水を加えて転相させ、さらに、ヒスコトロンにより粒径の小さなミセルを有する０／Ｗ型エマルジョンを得た。
前記ＭＰＭＳ添加系０／Ｗ型エマルジョンを、その調製直後および３０℃静置１ケ月後のミセルの粒径につき、光学顕微鏡を用いて観察した結果、それぞれの平均粒径は５．７±２．１μｍおよび５．８±２．３μｍであって、粒径は保持され０／Ｗ型エマルジョンの分離は認められず安定であった。
一方、同時に行ったＭＰＭＳ無添加系０／Ｗ型エマルジョンの観察では、調製直後の平均粒径は６．７±３．８μｍであったが、３０℃１ケ月静置後では分離こそしていなかったものの、平均粒径は２４±１３μｍと明らかに粒径の増大が認められた。
このことから、該ＭＰＭＳは０／Ｗ型エマルジョンにおけるミセル粒径の安定化に寄与することが示された。
【００４８】
【発明の効果】
本発明のオリゴ糖脂質は、これをリン脂質等の界面活性剤からなる小胞体、および、０／Ｗ型エマルジョンである油滴あるいはミセルの修飾剤として使用することにより、前記リン脂質小胞体、および、０／Ｗ型エマルジョン自体の凝集抑制のみならず、該小胞体のイオン溶液中での分散安定化を図ることができ、進んで、生体内での貪食抑制効果を引き出すことができる。
また、０／Ｗ型エマルジョンである油滴あるいはミセルの安定化剤として使用すれば、優れた化粧品、医薬部外品、医薬品等が調製できる。
さらには、従来のオリゴ糖脂肪酸エステルに比較して合成の効率ならびに修飾の効果ともに優れている。
従って、本発明のオリゴ糖脂質は当業界に資するところ極めて大きい。