(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ネコヘルペスウイルス−１（ＦＨＶ−１）に対して特異的に反応する抗体において、ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列が、それぞれ配列表：配列番号１中のアミノ酸順位２０番〜１４３番および配列番号２中のアミノ酸順位２１番〜１２７番に記載するアミノ酸配列であり、該ＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列中にそれぞれ下記の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、かつ、該抗体の定常領域のアミノ酸配列がネコ抗体由来のアミノ酸配列であることを特徴とする、遺伝子組換え技術により調製された組換え抗体。
ＶＨ；
CDR1：LeuSerThrSerGlyMetGlyAlaGly
CDR2：HisIleTrpTrpAspAspValLysArgTyrAsnProAlaLeuLysSer
CDR3：SerGlnIleTyrPheAspTyrAspGlyAlaTrpPheProPhe
ＶＬ；
CDR1：ArgAlaSerGlnSerIleSerAsnAsnLeuHis
CDR2：AlaSerGlnSerIleSerGly
CDR3：GlnGlnSerAsnSerTrpProHisThr
【請求項２】
該抗体のＨ鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列表：配列番号３に記載のアミノ酸配列、およびＬ鎖定常領域のアミノ酸配列が、配列表：配列番号４に記載のアミノ酸配列または配列表：配列番号５に記載のアミノ酸配列である請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ネコヘルペスウイルス−１（ＦＨＶ−１）に対して特異的に反応するネコキメラ抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子断片であって、配列表：配列番号１中のアミノ酸順位２０〜１４３番に記載するアミノ酸配列をコードする遺伝子断片の下流(3'側)に、ネコ抗体Ｈ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片を結合させたことを特徴とする組換え遺伝子断片。
【請求項４】
該ネコ抗体Ｈ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片が、配列表：配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列である請求項３の組換え遺伝子断片。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ネコヘルペスウイルス−１（ＦＨＶ−１）感染症の診断、治療及び予防に期待できる新規なネコモノクローナル抗体に関する。さらに詳細にはマウス型抗ＦＨＶ−１中和モノクローナル抗体の定常領域をネコ抗体定常領域に変換したネコ型抗ＦＨＶ−１組換え抗体及び該抗体をコードする遺伝子断片に関する。
【０００２】
【発明の背景】
ネコはペットとして昔から人間に愛着のある動物であるが、近年の欧米では、「伴侶、仲間、相棒としての動物」（Companion species）と称され、人間社会の一員としての地位を獲得しつつある。もう一方では、医学、薬学、畜産学、獣医学から心理学にいたる実験動物としての貢献度は従来から大きなものであったが、近年では医薬品の効果検定や安全性試験にＳＰＦ猫（SPF Cat）などの呼称のもとで更に貢献度が高まっている。いずれの場合にも当然の事として、これらのネコの疾病、特に伝染病に関するより確実な知識がますます必要となり、その診断、治療、予防のための方法確立が要求されている。
【０００３】
ネコのウイルス性疾患は多く、なかでもＦＨＶ−１に起因した上部気道性疾患は急性で致死率が高い。両疾病に対する特効的な治療薬はなく、抗生物質、サルファ剤等の二次細菌感染予防の対症療法しかなく、現在の治療法には問題を残している。
【０００４】
従来よりウイルス感染症の治療薬として高度免疫血清や血清由来の免疫グロブリンが使用され有効な実績を残してきた。しかし、現在では、動物愛護思想の高まりと共に、ネコ血清原料の入手が困難になりこの治療法は使いたくとも使用できない状況になっている。従って、従来の高度免疫血清に代わってＦＨＶ−１を中和できるモノクローナル抗体があればＦＨＶ−１感染症の治療に大きく貢献することが可能である。
【０００５】
【従来技術】
ＦＨＶ−１に対する中和モノクローナル抗体がいくつか確立されているが、確立されているモノクローナル抗体は、全てマウスハイブリドーマ由来の抗体である。これらの抗体を治療薬としてネコに投与した場合、異種蛋白であるため血中に存在している補体あるいはFcレセプターを持つ免疫担当細胞との結合力は同種（ネコ）のそれよりも弱く、抗体＋補体による細胞障害や抗体依存・細胞媒介性細胞障害を誘起しにくいと考えられる。ＦＨＶ−１の感染防御及びウイルスの中和には抗体単独による作用に加えて、これら２つの免疫反応も重要であることが知られている（Horimoto T. et al. Jpn.J.Vet.Sci. 51, p1025, 1989）。従って、従来のマウス抗体では効果的な治療効果を誘導できない可能性がある。
【０００６】
さらに、異種タンパクとして認識されたマウス抗体はアナフィラキシーショックや血清病などの副作用を起こしたり、半減期が短縮し治療効果が薄れる可能性がある。従って投与する抗体は、従来のマウスモノクローナル抗体では決して満足のいくものではなく、ネコ型のモノクローナル抗体でなければならなかった。
【０００７】
【発明の目的】
このような状況にあって、本発明者らは、ＦＨＶ−１ウイルス株を中和するマウスモノクローナル抗体ＪＨ２を確立し、この抗体の可変領域（Ｖ領域）をコードする遺伝子の核酸配列を同定し、さらに該抗体のＦＨＶ−１中和に深く係わるＶ領域中の特異的アミノ酸配をも見いだした。次に本マウス型モノクローナル抗体をネコ型化するために、抗ＦＨＶ−１中和抗体をコードする抗体Ｖ領域遺伝子を、先に本発明者らが見いだしたネコ抗体の定常領域をコードする遺伝子断片と連結させることにより、ＦＨＶ−１中和活性を有する抗ＦＨＶ−１キメラ抗体発現ベクターを構築し、これを発現させ、抗ＦＨＶ−１キメラ抗体を得ることに成功するに至った。すなわち、本発明は、遺伝子工学的手法を用いてマウス型抗体の定常領域をネコ抗体の定常領域と置き換えた、これまでに報告のない抗ＦＨＶ−１ネコ型キメラ抗体、およびこの調製に有用な該抗体をコードする遺伝子断片を提供することを目的とする。かくして、ＦＨＶ−１感染症に対して有効かつ副作用のない、診断薬・治療薬・予防薬への抗ＦＨＶ−１抗体の応用が可能となる。
【０００８】
【発明の構成及び効果】
本発明者らは、まずＦＨＶ−１-Ｋ１ウイルス粒子で免疫されたマウスのリンパ球とマウスミエローマ細胞を常法にしたがい細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清中のウイルス中和能を指標にクローニングを行った結果、ＦＨＶ−１の中和活性において極めて優れたモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞ＪＨ２を確立することに成功した。
【０００９】
一般に、抗体の抗原にたいする特異性は抗体可変（Ｖ）領域のアミノ酸によって規定されていることが知られている。そこで、ＪＨ２のＶ領域がいかなるアミノ酸で構成されているか調べた。アミノ酸配列は、該抗体のＶ領域をコードする遺伝子をクローニングし、その核酸塩基配列を調べることにより決定した。
【００１０】
その結果、図２及び図３に示されるアミノ酸配列を有していることが分かった。一般に、抗体のＨ鎖遺伝子領域には約200個のＶＨ、数10個のＤ、４つのＪＨ遺伝子が存在する。一方Ｌ(κ)鎖遺伝子領域には約200のＶκ、４つのＪκ遺伝子がある。Ｂ細胞の分化にともない、これらのＶ(Ｄ)Ｊの各断片のうちから1つを選んで再構成が起こり可変領域全体のアミノ酸をコードする遺伝子となることが知られている。さらに、Ｎ配列の付加、Somatic Mutationにより、抗体可変領域の多様性は莫大な数となる。本発明により明らかにされたＪＨ２の可変領域遺伝子はこの中から選択された唯一のものである。図中のＣＤＲは、抗原と結合する上で重要な領域である。ＪＨ２の場合も、これら６つのＣＤＲ領域のアミノ酸がＦＨＶと結合し、中和反応を引き起こしているものと考えられる。中でもＨ鎖ＣＤＲ３に見られるAsp Gly Ala Trp Phe Pro PheはＪＨ２特有のアミノ酸配列であることが他の抗体可変領域との相同性比較により明かとなった。
【００１１】
従って、Ｈ鎖ＣＤＲ３を中心に他のＨ，Ｌ鎖のＣＤＲ領域のアミノ酸がＦＨＶ−１との結合および中和反応と密接に関連する部位と考えられ、これはＪＨ２抗体の可変領域遺伝子を単離することにより初めて明かとなった。さらに、ＪＨ２のＶ領域の核酸塩基配列、アミノ酸配列が明らかになったことにより、この配列を基にさらに抗原結合活性を向上させたり、Ｖ領域そのものをネコ型化を可能にするものである。そして、この様なアミノ酸配列を持つ抗体もしくはペプチドはＦＨＶ−１感染症の治療、診断、予防に用いることが出来ると推察される。
【００１２】
すなわち、本発明に従い提供される、ＦＨＶ−１に対して中和活性を有する抗体のＶ領域をコードする遺伝子断片とは、下記の特徴を有する遺伝子断片を言う。
【００１３】
ネコヘルペスウイルス−１（ＦＨＶ−１）に対して特異的に反応する抗体ＶＨまたはその一部をコードする遺伝子断片とは、該抗体のＣＤＲ３をコードする核酸配列部分が、下記のアミノ酸配列をコードする核酸配列であることを特徴とする抗体ＶＨ遺伝子断片である。
Asp Gly Ala Trp Phe Pro Phe
【００１４】
このような配列をコードする核酸配列を有する好ましいＶＨ遺伝子断片とは、該抗体のＣＤＲ１〜３をコードする核酸配列部分が、それぞれ下記のアミノ酸配列をコードする核酸配列である遺伝子断片が挙げられる。
CDR1：LeuSerThrSerGlyMetGlyAlaGly
CDR2：HisIleTrpTrpAspAspValLysArgTyrAsnProAlaLeuLysSer
CDR3：SerGlnIleTyrPheAspTyrAspGlyAlaTrpPheProPhe
【００１５】
さらに、上記ＶＨ遺伝子断片の好ましい配列の一例としては、配列表：配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられる。その具体的核酸配列とは、例えば、配列表：配列番号１に記載の核酸配列が挙げられる。
【００１６】
一方、ネコヘルペスウイルス−１（ＦＨＶ−１）に対して特異的に反応する抗体ＶＬまたはその一部をコードする遺伝子断片とは、該抗体のＣＤＲ１〜３をコードする核酸配列部分が、それぞれ下記のアミノ酸配列をコードする核酸配列である遺伝子断片が挙げられる。
CDR1：ArgAlaSerGlnSerIleSerAsnAsnLeuHis
CDR2：AlaSerGlnSerIleSerGly
CDR3：GlnGlnSerAsnSerTrpProHisThr
【００１７】
さらに、上記ＶＬ遺伝子断片の好ましい配列の一例としては、配列表：配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列が挙げられる。その具体的核酸配列とは、例えば、配列表：配列番号２に記載の核酸配列が挙げられる。
【００１８】
さて、マウス型抗体ＪＨ２をＦＨＶ−１感染症の治療用として直接ネコに投与することは、有効性の減弱、副作用、半減期の短縮などの点から困難と考えられる。これは抗体そのものがネコにとって異種蛋白であるマウス由来のものであるため、ネコの補体やＦｃレセプターを有する免疫担当細胞と結合できない可能性があり、その結果ＡＤＣＣやＣＤＣを誘導しにくいことが予想される。前述のようにＦＨＶ感染症においては、これらの作用がウイルス中和に大きく寄与していることを考えると抗体はネコのＦｃ領域をもつ必要がある
【００１９】
さらに、生体内において異種蛋白として免疫原性を惹起すれば、生体より速やかにクリアランスされるため半減期が短縮されたり、血清病などの副作用を引き起こすかも知れない。抗体分子としての免疫原生もＦｃ領域に集約されているといわれており、このことからもＦｃ領域は同種蛋白であるネコの抗体分子のアミノ酸配列であることが好ましい。
そこで本発明者らは、ＪＨ２の抗体定常領域を、ネコのそれと遺伝子工学的手法を用いて置き換えることにより、ネコ型ＪＨ２を作製することに成功した。
【００２０】
このようなネコ型抗体は、本発明により提供される上記抗ＦＨＶ−１抗体のＶＨをコードする遺伝子およびＶＬ遺伝子の下流(3'側)に、ネコ抗体定常領域遺伝子；ＣＨ遺伝子およびＣＬ遺伝子を接続することにより該ネコ型抗体すなわち、ネコ型キメラ抗体をコードする抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の構造遺伝子が構築され、これを適当な動物細胞等で発現されることにより目的の抗ＦＨＶ−１キメラ抗体が調製される。
【００２１】
このようなネコ抗体定常領域をコードする遺伝子は、本発明者らが先に見いだしている（特開平3-123488、特開平3-201986および特開平3-72873）。このようなネコ抗体定常領域をコードする遺伝子の核酸配列としては、ＣＨをコードする遺伝子断片として、配列表：配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片が挙げられる。その具体的な核酸配列としては、配列表：配列番号３に記載の核酸配列が挙げられる。また、このようなＣＨ遺伝子は、Escherichia coli CCG-CB25G；微工研菌寄第11166号（FERM P-11166）として本出願人により寄託されている。また、Ｃκをコードする遺伝子として、配列表：配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片が挙げられる。その具体的な核酸配列としては、配列表：配列番号４に記載の核酸配列が挙げられる。また、このようなＣκ遺伝子は、Escherichia coli FCK-CEK8A；微工研菌寄第10985号（FERM P-10985）として本出願人により寄託されている。さらに、Ｃλをコードする遺伝子として、配列表：配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片が挙げられる。その具体的な核酸配列としては、配列表：配列番号５に記載の核酸配列が挙げられる。また、このようなＣλ遺伝子は、Escherichia coli FCL-T162；微工研菌寄第10942号（FERM P-10942）として本出願人により寄託されている。
【００２２】
本発明のＦＨＶ−１に対して中和活性を有する抗体のＶ領域をコードする遺伝子断片は、上記のようなＶ領域がマウス由来、Ｃ領域がネコ由来の配列からなるキメラ抗体の他に、Ｖ領域のフレーム（ＦＲ）領域についてもマウス以外の抗体（本発明の場合にはネコ抗体）由来の配列に組換えられた改変抗体の調製にも用いることができる。ネコ抗体の一般的なＶ領域ＦＲ領域のアミノ酸配列に関しては、未だその全配列に関しては報告されていない。しなしながら、その配列の一部については、既に報告されており（KEHO J.M. et al. Proc. N.A.S. 69, p2052, 1972）、これらおよび、本発明者らが先に見いだしたネコ抗体の定常領域のアミノ酸配列等から適当なプライマーを調製することにより、ネコ抗体Ｖ領域をコードする遺伝子をクローニングし、該ＦＲ領域のアミノ酸配列を見いだすことも可能であろう。改変抗体の基本的調製法に関しては、公知の技術（例えば、特開昭62-296890号）に従い調製される。この場合に用いられる、本発明の遺伝子断片とは、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖をコードする一部の遺伝子として、少なくとも下記のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む遺伝子断片を言う。
Asp Gly Ala Trp Phe Pro Phe
【００２３】
また、好ましくは、該改変抗体Ｖ領域のＣＤＲをコードする核酸部分として、ＶＨ鎖、ＶＬ鎖それぞれ下記のアミノ酸をコードする核酸配列が用いられる。
ＶＨ鎖；
CDR1：LeuSerThrSerGlyMetGlyAlaGly
CDR2：HisIleTrpTrpAspAspValLysArgTyrAsnProAlaLeuLysSer
CDR3：SerGlnIleTyrPheAspTyrAspGlyAlaTrpPheProPhe
ＶＬ鎖；
CDR1：ArgAlaSerGlnSerIleSerAsnAsnLeuHis
CDR2：AlaSerGlnSerIleSerGly
CDR3：GlnGlnSerAsnSerTrpProHisThr
【００２４】
さらに、本発明者らによれば、上記の様な改変抗体の調製の際には、従来の技術に従い、Ｖ領域のＣＤＲ部分をマウス由来の配列にするよりも、ＣＤＲに隣接するＶ領域のＦＲ領域の一部についてもＣＤＲと同様のマウス由来の配列にすることで、本来のマウスモノクローナル抗体の持つ特異性に優れた抗体を調製できることがあることをこれまでに見いだしている。すなわち、ＶＨ鎖については図２に記載されているアミノ酸配列を、ＶＬ鎖については図３に記載されているアミノ酸配列を参考にすることにより、Ｖ領域のＦＲ領域についてもその一部をマウス由来の配列にすることで、ＣＤＲのみをマウス由来の配列にした改変抗体より更に優れた改変抗体を調製できる可能性がある。
【００２５】
上記のごとく、本発明の抗ＦＨＶ−１抗体の可変領域をコードする遺伝子を用いて、キメラ抗体用または改変抗体用のＶ領域構造遺伝子を構築し、本発明者らが先に見いだしたネコ抗体定常領域をコードする遺伝子と連結させることにより、ネコ型抗ＦＨＶ−１組換え抗体、いわゆるキメラ抗体をコードする構造遺伝子が調製される。この遺伝子を適当なプロモーター遺伝子の下流に連結させ公知の技術に従い動物細胞等で発現させることにより得られる本発明の組換え抗体は、マウス型抗体のＪＨ２と同じ優れた中和活性を保持していた。さらにＦＨＶ感染ネコへ投与した場合においては、顕著な副作用を呈することなく病状を緩和させた。E.A.Emini等はチンパンジーのＨＩＶ感染におけるモノクローナル抗体の感染防御効果を検討した。その結果、ヒト型のキメラ抗体はＨＩＶ感染を防御出来た（E.A.Emini et al. Nature,355,p728,1992）が、オリジナルのマウス型抗体は防御出来なかった（E.A.Emini et al. J.Virol.,64,p3674,1990）。これは、Ｆｃ領域依存性のADCCあるいはCDC活性を誘導できなかった点、及び消失半減期が短かったことによるものと考えられる。
今回見いだされたＦＨＶ感染ネコにおけるＦＨ２抗体の有効性も前例同様マウス型の抗体では効果が弱いと考えられ、ネコ型化することによってはじめて認められるものと推察される。
以上のことから本抗ＦＨＶ−１キメラ抗体ＦＨ２はＦＨＶ−１感染症の治療・予防において、実質的な治療薬となり得るものである。
以下、本発明を実施例に沿って更に詳細に説明する。
【００２６】
【実施例】
（１）抗ＦＨＶ−１中和モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ＦＨＶ−１感染ＦＬ細胞(ネコ肺細胞)の培養上清を硫酸アンモニウムで沈降させ、透析後、リン酸緩衝液に再懸濁させBALB/cマウスの腹腔内にフロイントの完全アジュバントとともに免疫した。２週間後、マウスのリンパ球とマウスミエローマ細胞(P3U1)をポリエチレングリコール法で細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清中のウイルス中和能を指標にクローニングを行い４種類のＦＨＶ−１中和モノクローナル抗体産生細胞を確立した。下記の表１は各モノクローナル抗体が10TCID50のＦＨＶ−１を中和するのに必要な抗体の最小有効濃度を示している。これらのモノクローナル抗体のうちＪＨ２抗体は最も強力にＦＨＶ−１−Ｋ１株を中和した。
【００２７】
【表１】
0003919830.tif 000002
【００２８】
（２）抗ＦＨＶ−１抗体(ＪＨ２)可変領域遺伝子の単離
1〜0.5×107の細胞（ハイブリドーマ）から全ＲＮＡを抽出し、Oligo dTカラム(Stratagene社製、Poly(A) Quik mRNA Purification Kit)によってｍＲＮＡを精製した。逆転写酵素(タカラ社；以下特別にことわりのないかぎり遺伝子操作用の試薬はタカラ社製のものを用いた)により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。
5'側のプライマーとしては抗体のリーダー領域(MHL34,MKL104)の、3'側にはＪ領域(MHJ3,MKJ124)の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド合成した。下記にその塩基配列を示す。
ＶＨ鎖増幅用プライマー
MHL341：TCTAGAAGCTTGCCGCCACCATGGGCAGACTTACATTCTCATT
MHJ3  ：GAAGATCTGGATCCACTCACCTGCAGAGACAGTGA
Ｖκ鎖増幅用プライマー
MKL104：GGAATTCAAGCTTGCCGCCACCATGGT(T/A)T(C/T)CTCACCTCAG
MKJ124：CTAGATCTGGATCCACTTACGTTT(T/G)ATTTCCA(A/G)CTT
【００２９】
ｃＤＮＡ 20ngに50pmoleのプライマーをそれぞれ添加した。94℃１分、55℃１分、72℃１分で30サイクルＰＣＲ(Polymerase Chain Reaction)を行い、プライマーによって挟まれた可変領域遺伝子（ＶＨ、Ｖκ）を増殖した。図１は増幅された遺伝子断片のアガロース電気泳動パターンである。遺伝子の大きさはＶＨ（Ｈ鎖）約400bp、Ｖκ（Ｌ鎖）約400bpであり期待されたバンドの大きさとほぼ一致した。
【００３０】
（３）塩基配列の決定
１で増幅された各遺伝子断片の塩基配列をジデオキシ法により決定した。ＶＨおよびＶκ遺伝子断片をpUC18にそれぞれクローン化し、ジデオキシ法(USB社製、Sequenase ver.2)により塩基配列を決定した。
【００３１】
図２は、ＪＨ２抗体のＶＨ遺伝子の塩基およびそれによってコードされるアミノ酸配列を示したものである。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をとりドメイン構造を形成するCysは保存されていたことからこの遺伝子が発現型の遺伝子であることが示された。また、ＪＨ３で再配列していることが解った。次に、この遺伝子のコードするアミノ酸配列のホモロジー検索を行なった。検索用ソフトウエアはGENETYX-CD（ソフトウエア社）を用い、Gene Bankのデータベースを検索した。その結果、ＶＨIII／J606ファミリーに属する抗体１から５が相同性の高いＶＨとして検索された（図４）。図４中の*は、他のＶＨと相同性のあるアミノ酸を示し、それ以外の領域は、ＪＨ２のみに認められたアミノ酸配列である。特に下線で示された部分はこれまでに報告のない新規なアミノ酸配列で、ＪＨ２抗体に特徴的な領域である。
【００３２】
図３は、ＪＨ２抗体のＶκ遺伝子の塩基およびそれによってコードされるアミノ酸配列を示したものである。Ｌ鎖と同様にＯＲＦをとりドメイン構造を形成するCysは保存されていたことからこの遺伝子が発現型の遺伝子であることが示された。また、Ｊκ１で再配列していることが解った。図５は、ホモロジー検索の結果を示している。ＪＨ２のＶκの場合も他のＶκと相同性が認められた。
【００３３】
すなわち、ＶＨ鎖における下線部で示された部分がＪＨ２抗体特異的な部分であり、抗原結合活性を規定する重要なアミノ酸配列であると推察された。
【００３４】
（４）抗ＦＨＶ−１キメラ抗体遺伝子の作製
ＰＣＲにより増幅された可変領域遺伝子をそれぞれ、ネコ抗体γ鎖定常領域遺伝子CB25γ(特開平3-201986)あるいはκ鎖定領域CEK(特開平3-123488)と連結した。発現用のプロモーターにはニワトリのβ-アクチンのプロモーター（特願平1-309785）を、セレクションマーカーにはneo（Southern P.J. J.Mol.Appl.Genet.,1,327,1982）あるいはdhfr遺伝子(Stark,G.R. and Wahl,G.M.,Annu.Rev.Biochem.,53,p447,1984)を用いた。図６および図７は、作製されたキメラ抗体Ｈ鎖およびＬ鎖発現ベクターの制限酵素地図である。
【００３５】
（５）安定形質転換体の作製
図６及び図７に示したキメラ抗体遺伝子Ｈ鎖、Ｌ(κ)鎖それぞれ10μgをPvuＩで切断し2x106のマウスミエローマ細胞P3-X63-Ag8-6.5.3.（ATCC・CRL1580）にlipofectin（BRL社製）を用いてco-transfectionし0.25x10-7M メトトレキセート(MTX)を含む5%FCS/RPMI1640選択培地で培養し薬剤耐性株（形質転換体）を選別した。培養上清中に発現されるネコＩｇＧを指標にキメラ抗体産性細胞を限界希釈法によってクローン化し発現細胞ＦＨ２を確立し、以下の性状解析を行った。
【００３６】
（６）抗ネコ抗体との反応
ＦＨ２(キメラ抗体発現細胞)およびＪＨ２(マウスモノクローナル抗体発現細胞)の培養上清を抗ネコ抗体（E.Y.LABS.INC）固相化マイクロタイタープレートに加え、室温で１時間反応させた。プレートを洗浄後、ＨＲＰ-抗ネコ抗体（E.Y.LABS.INC）を室温で１時間反応させた。再びプレートを洗浄後、ＴＭＢＺで発色させ吸光度450nmを測定し抗ネコ抗体との反応性を調べた（図８）。ＦＨ２の培養上清は濃度依存的に抗ネコ抗体と反応したが、マウス抗体を発現しているＪＨ２の培養上清は抗ネコ抗体と反応しなかった。このことからＦＨ２細胞の発現しているキメラ抗体はネコ抗体であることがわかった。
【００３７】
（７）キメラ抗体のSDS-PAGEによる同定
培養上清よりキメラ抗体をProteinA（Bio Rad社製、MAPS-II）で精製した。精製キメラ抗体を12.5%SDS-PAGEにかけ、ネコＩｇＧ標品（ポリクローナル抗体）と比較した。分子量はBio Rad社製のプレステインドマーカーにより求めた。図９に示されるように、キメラ抗体は還元状態下ではＨ鎖５万、Ｌ鎖2.5万で非還元状態では約15万のところにバンドを検出したことから、Ｈ２Ｌ２の２量体を形成し、ネコの生体内に存在しているＩｇＧと同じ形をとっていることがわかった。
【００３８】
（８）ＦＨＶ−１ウイルス粒子との反応
次にキメラ抗体の抗原結合活性を調べた。培養上清（ＦＨ２及びＪＨ２）をＦＨＶ−１-Ｋ１（硫安沈澱粗精製品）固相化マイクロタイタープレートに加えた。プレートを洗浄後、ＨＲＰ-抗ネコ抗体あるいはＨＲＰ-抗マウス抗体を反応させた。ＴＭＢＺで発色させ、ＦＨＶ−１ウイルス粒子との反応性を調べた。ＦＨ２抗体はマウス抗体ＪＨ２と同様にＦＨＶ−１-Ｋ１と特異的に反応した。しかしながら、他のウイルスに特異的な組換えキメラ抗体（同じネコ定常領域と異なるマウス可変領域を持っている抗体）は反応しなかった（図１０）。
【００３９】
（９）ＦＨＶ−１ウイルス中和試験
さらにキメラ抗体のＦＨＶ−１中和活性を調べた。培養上清（ＦＨ２及びＪＨ２）をＦＨＶ−１ウイルス100TCID50と４℃で６時間反応させた。ＣＲＦＫ細胞を0.25×105個加えて３７℃で２日培養した。ＣＰＥ(Cell Rounding）を観察し、最低有効中和濃度を求めた。
下記の表２にその結果をまとめた。その結果、ＦＨ２抗体はＦＨＶ−１を１．９５ug/mlで中和することが確認された。
【００４０】
【表２】
0003919830.tif 000003
【００４１】
（１０）ＦＨＶ強制感染ネコにおけるＦＨ２の有効性
104TCID50のＦＨＶ−１−Ｋ１株を1.5-3.0Kgのネコに経鼻より強制感染させた。２日目にＦＨ２を30-10mg/Kgで頸静脈より静脈内投与した。体重、体温、食餌量、飲水量及び元気などの一般臨床症状、さらに、流涙、結膜炎、鼻漏、くしゃみおよび咳などの呼吸器病変を経時的に観察し、無症状０点、軽度の症状を１点、中度２点、重度３点としてスコア化した（図１１）。その結果、10及び30mg/kg投与群で病状が緩和され、ＦＨ２のＦＨＶ感染症に対するin vivoでの有用性が示された。また、ＦＨ２投与後に発熱、下痢、嘔吐その他のショック様症状などの副作用は観察されなかった。以上のこのことより、ＦＨ２抗体はＦＨＶ−１感染症に対して有効かつ副作用のない診断薬、治療薬・予防薬への応用を可能にするものである。
【００４２】
【配列表】
0003919830.tif 000004
0003919830.tif 000005
【００４３】
0003919830.tif 000006
0003919830.tif 000007
【００４４】
0003919830.tif 000008
0003919830.tif 000009
0003919830.tif 000010
【００４５】
0003919830.tif 000011
0003919830.tif 000012
【００４６】
0003919830.tif 000013
0003919830.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲによって増幅された抗ＦＨＶ−１抗体ＪＨ２のＶＨ、Ｖκ遺伝子のアガロースゲル電気泳動結果を示す模式図である。
【図２】実施例（３）で得たＶＨ遺伝子の塩基配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図３】実施例（４）で得たＶκ遺伝子の塩基配列及びそれによってコードされるアミノ酸配列を示す。
【図４】ＪＨ２と他の抗体のＶＨ領域のアミノ酸レベルでの相同性比較を行った結果を示す。
【図５】ＪＨ２と他の抗体のＶκ領域のアミノ酸レベルでの相同性比較を行った結果を示す。
【図６】抗ＦＨＶ−１キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターの制限酵素地図を示す。
【図７】抗ＦＨＶ−１キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの制限酵素地図を示す。
【図８】抗ネコ抗体に対する本発明のキメラ抗体の反応性を示したものである。
【図９】本発明のキメラ抗体のSDS-PAGEの泳動結果を示す模式図である。
【図１０】ＦＨＶ−１に対する本発明のキメラ抗体の結合性を示したものである。
【図１１】    ＦＨＶ−１Ｋ１株を強制感染させたネコに対する本発明のキメラ抗体の有効性を示したものである。
【図１】
0003919830.tif 000015
【図２】
0003919830.tif 000016
【図３】
0003919830.tif 000017
【図４】
0003919830.tif 000018
【図５】
0003919830.tif 000019
【図６】
0003919830.tif 000020
【図７】
0003919830.tif 000021
【図８】
0003919830.tif 000022
【図９】
0003919830.tif 000023
【図１０】
0003919830.tif 000024
【図１１】
0003919830.tif 000025