(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ、または９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ、または９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有することを特徴とするタンパク質の塩。
【請求項３】
形質転換した微生物またはストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養することにより請求項１記載のタンパク質を生成し、これを採取することを特徴とする新規タンパク質の製造法。
【請求項４】
形質転換した微生物またはストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養することにより請求項２記載のタンパク質の塩を生成し、これを採取することを特徴とする新規タンパク質の塩の製造法。
【請求項５】
請求項１に記載のタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項６】
配列表の配列番号１で表される塩基配列からなることを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡ。
【請求項７】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ、または９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有することを特徴とするタンパク質のＮ末端に、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列と同じ、または９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするシグナルペプチドが結合していることを特徴とするタンパク質。
【請求項８】
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ、または９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有することを特徴とするタンパク質のＮ末端に、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列と同じ、もしくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とするシグナルペプチドが結合していることを特徴とするタンパク質の塩。
【請求項９】
形質転換した微生物あるいはストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養することにより請求項７に記載のタンパク質を生成し、これを採取することを特徴とする新規なタンパク質の製造法。
【請求項１０】
形質転換した微生物あるいはストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養することにより請求項８に記載のタンパク質の塩を生成し、これを採取することを特徴とする新規なタンパク質の塩の製造法。
【請求項１１】
シグナルペプチドが、形質転換した微生物またはストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養することにより生成され、これを採取したものであることを特徴とする、請求項７に記載のタンパク質の製造法。
【請求項１２】
シグナルペプチドが、形質転換した微生物またはストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養することにより生成され、これを採取したものであることを特徴とする、請求項８に記載のタンパク質の塩の製造法。
【請求項１３】
請求項７〜１１のいずれかに記載のタンパク質をコードすることを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【請求項１４】
配列表の配列番号３で表される塩基配列を含むことを特徴とする請求項１３に記載のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)由来のスーパー抗原性を有する新規タンパク質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般抗原は、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ；以下，ＡＰＣと呼ぶ）内でプロセッシングを受けペプチド断片に分解された後、主要組織適合抗原複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ；以下、ＭＨＣと略す）クラスII分子と複合体を形成して細胞表面に提示される。このときＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｅｒ；以下、ＴＣＲと略す）は超可変部の相補性決定領域を用いてＭＨＣクラスII分子−ペプチド複合体を認識するため、活性化されるＴ細胞は限定される。一方、スーパー抗原はＡＰＣによるプロセッシングを受けずにＭＨＣクラスII分子とＴＣＲのβ鎖可変領域部分（以下、Ｖβと呼ぶ）の外側に結合する。すなわちスーパー抗原はＶβの中でも多様性に乏しい部分を認識するため、特定のＶβを持つＴ細胞をその特異性に関係なく大量に活性化させる。Ｔ細胞の過剰な活性化に伴い、単球、マクロファージの活性化、サイトカインの大量放出が起こり、血圧低下、発熱などの症状が引き起こされると考えられている。
【０００３】
スーパー抗原は細菌性、ウイルス性、植物性の３系統に分類できるが、中でも細菌性スーパー抗原はヒトの感染症と深く関連している。細菌性スーパー抗原として、黄色ブドウ球菌が産生する腸管毒素Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ；以下順に、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ、ＳＥＤ、ＳＥＥと呼ぶ）や、トキシックショックシンドロームトキシン−１（ｔｏｘｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍ  ｔｏｘｉｎ−１；以下、ＴＳＳＴ−１と略す）、Ａ群溶血性連鎖球菌が産生する外毒素Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ  ｅｘｏｔｏｘｉｎ  Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ；以下順に、ＳＰＥＡ、ＳＰＥＣ、ＳＰＥＦ、ＳＰＥＧ、ＳＰＥＨと呼ぶ）、エルシニア菌が産生する外毒素（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ；以下、ＹＰＭと略す）が同定されている。
【０００４】
スーパー抗原が関与している疾患としては、ＴＳＳＴ−１に起因する毒素性ショック症候群（ｔｏｘｉｃ  ｓｈｏｃｋ  ｓｙｎｄｒｏｍ；以下，ＴＳＳと略す）や新生児ＴＳＳ様発疹症（Ｎｅｏｎａｔａｌ  ＴＳＳ−ｌｉｋｅ  ｅｘａｎｔｈｅｍａｔｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ；以下、ＮＴＥＤと略す）、ＹＰＭが原因の全身エルシニア菌感染症などがある。さらに、猩紅熱や劇症型Ａ群連鎖球菌感染症、急性全身性血管炎である川崎病にも、スーパー抗原の関与が示唆されているが、原因毒素は未だ明確になっていない。また、劇症型Ａ群連鎖球菌感染症と類似の症例においてＣ群連鎖球菌であるストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)が検出されたという報告もあるが、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)はウシの乳房炎の原因菌としてしばしば検出されるもののヒトからの採取例が少ないため、これまで臨床的にあまり着目されていなかった。よって、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)が産生する新たなスーパー抗原（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ  ｍｉｔｏｇｅｎ；以下、ＳＤＭと略す）の同定は、未知のスーパー抗原が関与している可能性がある疾患の発症機序を解明し、予防、あるいは治療法を確立するために必要であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規なスーパー抗原を提供することを目的としている。より詳細には、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)由来の、スーパー抗原性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、および該タンパク質の精製法の提供を目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するために下記の構成を有する。
（１）配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同じ、もしくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有することを特徴とするタンパク質またはその塩。
（２）（１）記載のタンパク質Ｎ末端に、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列と同じ、もしくは９０％以上の同一性を有するシグナルペプチドが結合していることを特徴とするタンパク質またはその塩。
【０００７】
（３）（１）もしくは（２）記載のタンパク質または（２）記載のシグナルペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡを含有するＤＮＡ。
【０００８】
（５）形質転換した微生物を培養することにより生成し、これを採取することを特徴とする（１）もしくは（３）記載のタンパク質もしくははその塩または（２）記載のシグナルペプチドもしくはその塩の製造法。
（６）ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を培養し、培養培地から（１）もしくは（３）記載のタンパク質もしくはその塩または（２）記載のシグナルペプチドもしくはその塩を採取することを特徴とする該タンパク質もしくはその塩または該シグナルペプチドもしくはその塩の製造法
【０００９】
【発明実施の形態】
本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列は、同定されたＳＤＭのものである。本発明の配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質は、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)に由来するタンパク質であってもよく、組み換えタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
【００１０】
本発明による新規タンパク質には、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質またはその塩も含まれる。本発明の配列番号２と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質またはその塩などが好ましい（以下、配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質を、本発明によるタンパク質または本発明による新規タンパク質あるいは新規タンパク質と称することがある）。実質的に同質の性質としては、例えばヒト末梢血リンパ球に対するマイトジェン活性やＶβの選択性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が定性的に同質であることを示す。従って、ヒト末梢血リンパ球に対するマイトジェン活性やＶβの選択性が同等であることが好ましいが、これらの性質の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１１】
本発明によるシグナルペプチドには、配列表の配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むペプチド、およびその塩が含まれ、配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。より具体的には、配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、シグナルペプチドとしての機能を発揮できるペプチドであれば特に限定されず、分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
【００１２】
また、本発明のタンパク質としては、例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含有し、かつスーパー抗原としての機能を有するタンパク質のＮ末端に、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有するシグナルペプチドが結合したタンパク質なども挙げられる。例えば、配列番号４で表されるシグナルペプチドを有するタンパク質は、本発明のタンパク質を製造するための中間体として有用である。
【００１３】
また、本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質としては、糖鎖が結合した複合タンパク質なども含まれる。
【００１４】
本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質の塩としては、生理学的に許容される酸（例えば、無機酸、有機酸）や塩基（例えば、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、好ましくは生理学的に許容される酸付加塩が用いられる。このような塩としては、例えば、無機酸との塩、あるいは有機酸との塩などが用いられる。無機酸としては例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などを用いることができ、また有機酸としては例えば、酢酸、蟻酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、しゅう酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などを用いることができる。
【００１５】
本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質は、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)から製造することもできるし、本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。
【００１６】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号１で表されるＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。厳しい条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭであり 、温度が６０〜６５℃である条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合がさらに好ましい。配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成できるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列と９０％以上さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１７】
本発明のシグナルペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号３で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号３で表されるＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成する塩基配列を有し、本発明のシグナルペプチドと実質的に同質の性質を有するシグナルペプチドをコードするＤＮＡであればいずれのものでもよい。配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡと厳しい条件下でハイブリッドを形成できるＤＮＡとしては、例えば、配列番号３で表される塩基配列と９０％以上さらに好ましくは約９５％以上の同一性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００１８】
本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤＮＡとしては、前述した本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチド、または本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードし、スーパー抗原性を有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細菌由来のｃＤＮＡ、前記した細菌由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。また、５’末端側の翻訳終止コドンの塩基としては、ＴＡＡ、ＴＧＡ、ＴＡＧのいずれでもよい。
【００１９】
本発明は、前記タンパク質、前記シグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを有し当該タンパク質を発現しうるプラスミドおよびこのプラスミドを有する宿主細胞を提供する。宿主細胞としては、例えば大腸菌、枯草菌、肺炎双球菌、連鎖球菌などの原核細胞宿主、酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｈｅｌａ細胞、３Ｔ３細胞、３Ｔ６細胞、Ｌｔｋ−細胞などの真核細胞宿主など、遺伝子組換え技術分野において通常用いられるすべての宿主細胞を用いることができる。本発明のプラスミドとしては、用いる宿主に対応して適切なプラスミドであればいかなるものでもよい。プラスミドとしては、例えば、通常の発現用プラスミド／ウイルスベクターを用いればよく、原核細胞宿主を用いる場合には、例えば、ＥＴ−３ａ−ｄ、ｐＥＴ−５ａ−ｃ、ｐＥＴ−９ａ−ｄ、ｐＥＴ−１１ａ−ｄ、ｐＥＴ−１２ａ−ｃなどのベクターを用いることができる。本発明は、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または上記宿主細胞を培養することを特徴とする前記タンパク質、前記シグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質またはそれらの塩の製造法を提供する。本発明のタンパク質またはシグナルペプチドまたは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質を発現しうるストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または宿主細胞は、細胞の性質に応じて通常の方法で培養することができる。培養培地はストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)または宿主細胞の培養に適した培地であれば限定されない。培養培地から該タンパク質を得るためには、イオン交換クロマトグラフィーと硫安分画を必要回繰り返し、必要に応じてヒドロキシアパタイトカラム、ゲル濾過などを行うことにより単離精製することができる。
【００２０】
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するにためには、培養後、公知の方法で菌体または細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などを用いることができる。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を得る。上記の方法で得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。分離、精製法としては、塩析や溶媒沈殿法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外濾過法、ゲル濾過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。タンパク質が遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。なお、組み替え体が産生するタンパク質を精製前または精製後に適当なタンパク修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００２１】
本発明のタンパク質は、公知の合成法に従っても製造することができる。タンパク質の合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法を用いることができ、本発明のタンパク質を構成しうる部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の１〜５に記載された方法が挙げられる。
１．Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  およびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
２．ＳｃｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
３．泉屋信夫他，ペプチド合成の基礎と実験  丸善（株）  （１９７５年）
４．矢島冶明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学IV、２０５、（１９７７年）
５．矢島冶明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて、本発明のタンパク質、本発明のシグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質またはそれらの塩を精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドもしくはタンパク質が遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２２】
本発明に係るタンパク質、本発明に係るシグナルペプチドもしくは本発明のタンパク質のＮ末端に本発明のシグナルペプチドが結合したタンパク質、またはそれらをコードするＤＮＡは、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドが関与している疾患の診断に用いることができる。その診断方法としては例えば酵素免疫測定法があり、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドを用いて該タンパク質もしくは該ペプチドに対する抗体価を測定することができるし、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドを動物に免疫して得られた抗体を用いて、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドの濃度を測定することもできる。さらに、該タンパク質もしくは該シグナルペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドが関与している疾患の治療や治療法の開発に用いることができる。治療としては例えば、該タンパク質を失活させたり該タンパク質による免疫系の活性化を抑制するための医薬品や、該タンパク質もしくは該シグナルペプチドを吸着除去できるカラム、または該タンパク質に対する抗体を用いて、該タンパク質が関与している疾患に対する治療を行うことができるし、感染症患者において分離された感染菌のＤＮＡを解析することでも該タンパク質を産生する菌を判別することができるため、感染症疾患の治療につなげることもできる。
【００２３】
【実施例】
実施例１：新規タンパク質の精製
透析により高分子成分を除去したＤｉｆｃｏ社製Ｂｒａｉｎ−Ｈｅａｒｔ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ液体培地でストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)を３７℃、５％二酸化炭素インキュベーター中で終夜静置培養した。遠心分離およびフィルターろ過により菌体を除去した培養液を水で５倍に希釈後、リン酸添加によりｐＨ４．５に調製した。この培養上清にあらかじめクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡化したアマシャムファルマシア社製ＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５を添加することにより培養上清中から活性タンパク質をゲルに吸着させた。このＳＰ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５をカラムに充填しクエン酸−リン酸緩衝液で洗浄後、１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出させた。得られた溶出液に７５％飽和硫酸アンモニウム溶液を添加して沈殿させた後蒸留水に溶解し、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）に対して透析を行った。これをあらかじめ２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で平衡化したＴｏｓｏｈ製ＳＰ−５ＰＷ陽イオン交換カラムに添加し、０．４Ｍまでの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配により溶出した。溶出液の各分画の活性は、ヒト末梢血単核球（以下、ＰＢＭＣと呼ぶ）に対するマイトジェン活性により測定した。すなわち、常法によりＰＢＭＣを調整しこれに各分画液を希釈して添加後、実施例２に記載の方法でマイトジェン活性の測定を行った。活性分画を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で平衡化したヒドロキシアパタイトカラムにかけ、０．２Ｍまでのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）の直線的勾配により溶出した。得られた活性分画をアマシャムファルマシア社製Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｇ７５ゲル濾過カラムにより展開した。得られた活性タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で３３ｋＤａの分子量であった（図１）。本法により１０Ｌの培養から５０μｇ程度の新規タンパク質が精製できた。
【００２４】
実施例２：新規タンパク質の活性およびその作用機序
（１）Ｔ細胞活性化能
ヒツジ赤血球とのロゼット形成法によってヒト末梢血リンパ球をＴ細胞分画と非Ｔ細胞分画に分け、（ａ）Ｔ細胞分画単独、（ｂ）非Ｔ細胞分画単独、（ｃ）Ｔ細胞分画と非Ｔ細胞分画を１対１の割合で混合したもの、の３種類の細胞懸濁液を用意した。各細胞懸濁液を細胞数が１×１０５／ｗｅｌｌとなるよう９６穴のマイクロプレートに添加し、これにＳＤＭを１ｐｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの各濃度で添加して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。
【００２５】
この培養上清を希釈し、上清中に含まれるインターロイキン２（以下、ＩＬ−２と略す）の量を、ＩＬ−２に依存して増殖するＣＴＬＬ−２細胞を用いたバイオアッセイにより測定した。（ｃ）のサンプルでＩＬ−２の産生が認められた（表１）ことから、ＳＤＭにはマイトジェン活性があることが示された。さらに、Ｔ細胞単独（（ｂ）のサンプル）ではＩＬ−２が産生されず、Ｔ細胞と非Ｔ細胞が共存している場合にのみ、ＩＬ−２の産生が起こった。ＳＤＭによるＴ細胞活性化にはＴ細胞以外の細胞も必要であることが示された。
【００２６】
【表１】
0004000845.tif 000002
【００２７】
（表１）Ｔ細胞／非Ｔ細胞分画混合懸濁液へのＳＤＭ刺激によるＩＬ−２産生性（Ｕ／ｍｌ）
（２）Ｔ細胞活性化能のＭＨＣクラスII依存性
マウス繊維芽細胞であるＬ細胞にＭＨＣクラスIIの亜型であるヒト白血球抗原−ＤＲ（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ＤＲ；以下、ヒトＨＬＡ−ＤＲと呼ぶ）を形質転換した細胞（以下、８１２４細胞と呼ぶ）に対し、マイトマイシンＣ処理およびＸ線照射を行い、増殖能を失わせた。この細胞と実施例２（１）の方法で分画したＴ細胞をそれぞれ１×１０５／ｗｅｌｌ、５×１０５／ｗｅｌｌになるよう４８穴のマイクロプレートに混合して播種した。これに１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＭを添加し、２日間培養した後、上清を採取してＩＬ−２濃度を測定した。この実験を、ＨＬＡ−ＤＲで形質転換していないＬ細胞についても行った。８１２４細胞とＴ細胞が共存する場合にのみＩＬ−２産生が認められたことから、ＳＤＭはＭＨＣクラスII依存性にＴ細胞を活性化することが示された。
【００２８】
（３）Ｔ細胞活性化におけるプロセッシング依存性
８１２４細胞を１％パラホルムアルデヒドで３７℃、５分間の処理を行うことで固定化し、細胞の抗原プロセッシング能を失わせた。この細胞および実施例２（１）の方法で分画したＴ細胞をそれぞれ１×１０５／ｗｅｌｌ、５×１０５／ｗｅｌｌになるよう４８穴のマイクロプレートに混合して播種した。１０ｎｇ／ｍｌのＳＤＭを添加し、２日間培養した後、上清を採取してＩＬ−２濃度を測定した。この実験を、パラホルムアルデヒド処理をしていない８１２４細胞についても行った。
【００２９】
プロセッシング能のない細胞でもＩＬ−２産生が認められたことから、ＳＤＭによるＴ細胞活性化にはプロセッシング過程は不必要であることが確認できた。
【００３１】
以上、実施例２（１）〜（３）で述べたように、ＳＤＭはＴ細胞の活性化能を有すること、またその活性化能は、ＭＨＣクラスII依存性であり、プロセッシング非依存性であり、ＴＣＲのＶβ１、またはＶβ８に特異的であることが確認できた。これらのことより、ＳＤＭはスーパー抗原であることが明らかとなった。
【００３２】
実施例３：新規タンパク質のアミノ酸配列および新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列の解析
図２は本発明の新規タンパク質のアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡの塩基配列とを対応させたものである。図２においてアミノ酸配列については１〜２６がシグナルペプチドであり、塩基配列については１〜３が開始コドン、７１５〜７１７が終止コドンである。
【００３３】
（１）新規タンパク質のアミノ酸配列解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にＰＶＤＦにブロッティングし目的タンパク質のみのバンドとしたサンプルについて、ヒューレットパッカー社製Ｇ１００５Ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて末端から３６アミノ酸残基分のアミノ酸配列を同定した。
【００３４】
（２）新規タンパク質をコードするＤＮＡ配列の解析
以下のＰＣＲではＳｉｇｍａ社製ＡｃｃＴａｑ  ＬＡを用いた。得られたアミノ酸配列の内部に２カ所のプライマーを設定し、ＰＣＲによりＤＮＡ断片を得、これをクローニングして両プライマー間の内部の塩基配列情報を得た。さらにこの塩基配列部分に相当するセンス側（以下、ｐｒｉｍｅｒ１と称す）、アンチセンス側（以下、ｐｒｉｍｅｒ２と称す）のプライマーを設計した。
【００３５】
また、ストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)のゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、ｐＵＣ１８のＢａｍＨＩサイトへｌｉｇａｔｉｏｎした。これをテンプレートし、ｐｒｉｍｅｒ１、ｐｒｉｍｅｒ２とｐＵＣ１８上のマルチクローニングサイトの両外側に設定されたプライマー（以下それぞれ，ｐｒｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ４と称す）を使ってｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ４、ｐｒｉｍｅｒ２とｐｒｉｍｅｒ３、ｐｒｉｍｅｒ２とｐｒｉｍｅｒ４の４通りの組み合わせでＰＣＲを行った。得られた断片について、一部はクローニング後、残りの部分はｐｒｉｍｅｒ１とｐｒｉｍｅｒ２を用いた直接シーケンシングによって塩基配列情報を得た。
【００３６】
最終的な配列を確認するために、得られた塩基配列情報を元にして配列の両末端部分に近い部位にプライマーを設定し、それらを用いてＰＣＲで増幅した。得られた断片について、シーケンス用試薬としてＡＢＩのＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ、解析システムとしてＡＢＩの３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒを使用し、直接シーケンシングによって配列を同定した。
【００３７】
【発明の効果】
本発明により、Ｃ群溶血性連鎖球菌であるストレプトコッカス  ディスガラクティアエ(Streptococcus dysgalactiae)由来のスーパー抗原性を有する新規タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは該タンパク質の精製法を提供することができる。製造された新規タンパク質は、該タンパク質のかかわる疾病のメカニズム研究、該タンパク質を用いる疾病の診断および診断キット、該タンパク質のかかわる疾病の治療、治療法の開発ならびに治療薬の開発に役立てることができる。
【００３８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２】本発明の新規タンパク質の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３】ＳＤＭ刺激に対する各Ｖβ領域の増幅度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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