(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポックスウイルスゲノムの非必須領域に外来ＤＮＡを含有する組換えポックスウイルスであって、前記ＤＮＡは、アミノ酸715-772が欠失されたgB、またはアミノ酸715-772が欠失され、切断部位がArgThrLysArgSerThrからArgThrIleArgSerThrに修飾されたgBであるＨＣＭＶタンパク質を、単独でまたはHCMV ｇＨ、ｇＬ、pp150、pp65、ＩＥ１、2-32位のアミノ酸が欠失されたＩＥ１、292-319位のアミノ酸が欠失されたＩＥ１、またはＩＥ１エクソン４セグメントの少なくとも１つと共に、コードすることを特徴とする組換えポックスウイルス。
【請求項２】
修飾組換えウイルスであって、ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることにより該ウイルスのビルレンスが弱毒化されていることを特徴とする請求項１の組換えポックスウイルス。
【請求項３】
トリポックスウイルスであることを特徴とする請求項１の組換えポックスウイルス。
【請求項４】
ポックスウイルスがワクシニアウイルスであることを特徴とする請求項１の組換えポックスウイルス。
【請求項５】
ワクシニアウイルスであり、少なくとも１つのオープンリーディングフレームを欠失させることにより遺伝子機能が不活化されていることを特徴とする請求項２の組換えポックスウイルス。
【請求項６】
欠失された遺伝子機能が、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌオープンリーディングフレームまたは宿主域領域を含むことを特徴とする請求項５の組換えポックスウイルス。
【請求項７】
少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、
該追加のオープンリーディングフレームが、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、およびＩ４Ｌから成る群より選ばれることを特徴とする請求項６の組換えポックスウイルス。
【請求項８】
少なくとも１つの追加のオープンリーディングフレームが欠失されており、
該追加のオープンリーディングフレームが、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、およびリボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットから成る群より選ばれることを特徴とする請求項６の組換えポックスウイルス。
【請求項９】
Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌがウイルスから欠失されていることを特徴とする請求項７の組換えポックスウイルス。
【請求項１０】
チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集素遺伝子、宿主域領域およびリボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットがウイルスから欠失されていることを特徴とする請求項８の組換えポックスウイルス。
【請求項１１】
ＮＹＶＡＣ組換えウイルスであることを特徴とする請求項９の組換えポックスウイルス。
【請求項１２】
ＮＹＶＡＣ組換えポックスであることを特徴とする請求項10の組換えポックスウイルス。
【請求項１３】
修飾組換えトリポックスウイルスであって、修飾により宿主内におけるビルレンスが弱毒化されていることを特徴とする請求項２の組換えポックスウイルス。
【請求項１４】
ウイルスがカナリアポックスウイルスであることを特徴とする請求項13の組換えポックスウイルス。
【請求項１５】
カナリアポックスウイルスが、Rentschlerワクチン株の１つであって、ニワトリ胚繊維芽細胞による200回以上の継代培養により弱毒化され、そのマスター種株が寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供された後、そのプラーククローンが５回の追加の継代培養により増殖されたものであることを特徴とする請求項１４の組換えポックスウイルス。
【請求項１６】
ＡＬＶＡＣ組換えウイルスであることを特徴とする請求項15の組換えポックスウイルス。
【請求項１７】
前記ＤＮＡが、アミノ酸715-772が欠失され、切断部位がArgThrLysSerThrからArgIleArgSerThrに修飾されたHCMV gBタンパク質を、HCMV pp65またはIE1の少なくとも１つと共にコードすることを特徴とする請求項３の組換えポックスウイルス。
【請求項１８】
前記ＤＮＡが、アミノ酸715-772が欠失され、切断部位がArgThrLysArgSerThrからArgThrIleArgSerThrに修飾されたHCMV gBタンパク質を、HCMV pp65またはIE1の少なくとも１つと共にコードすることを特徴とする請求項４の組換えポックスウイルス。
【請求項１９】
ｖＰ1128またはｖＰ1145であることを特徴とする請求項４の組換えポックスウイルス。
【請求項２０】
請求項１、２、３、４、11、13、14、15または16のいずれかに記載の組換えポックスウイルスを適当な担体と混合して含むことを特徴とする免疫応答を誘起するための組成物。
【請求項２１】
インビトロ培養される細胞内で遺伝子産生物を発現させる方法であって、該細胞に請求項１、２、３、４、11、13、14、15または16のいずれかに記載の組換えポックスウイルスを導入することを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
この出願は、1995年６月６日に出願された米国特許出願08/471,014号の一部係属出願であり、該08/471,014号出願は、1993年８月13日に出願され今では米国特許第5,494,807号となっている米国特許出願第08/105,483号の一部係属出願であり、該08/105,483号出願は、1992年３月６日に出願された米国特許出願第07/847,951号の一部係属出願であり、該07/847,951号出願は、1991年６月11日に出願された米国特許出願第07/713,967号の一部係属出願であり、該07/713,967号出願は、1991年３月７日に出願された米国特許出願第07/666,056号の一部係属出願であり；1993年３月24日に出願された米国特許第08/036,217号は、米国特許出願第07/666,056号の一部係属出願であり、1994年11月15日に米国特許第5,364,773号として発行されている。この出願は、さらに、1993年９月21日に出願され現在は米国特許第5,482,713号となっている米国特許出願第08/124,668号の一部係属出願であり、該08/124,668号出願は、1990年４月４日に出願され現在は米国第5,338,683号となっている米国特許出願第07/502,834号の分割出願であり；第07/502,834号出願は、1989年８月16日に出願された米国特許出願第07/349,488号出願の一部係属出願であり、該07/394,488号出願は、1989年８月17日に出願された米国特許第07/339,004号の一部係属出願であり；さらに、1987年８月27日に出願された米国特許出願第07/090,209号の一部係属出願であり、該07/090,209号出願は、1984年７月19日に出願され現在では米国特許第4,722,848号となっている米国特許出願第06/622,135号の分割出願であり、該06/622,135号出願は、1982年12月８日に出願され現在では米国特許第4,603,112号となっている米国特許出願第06/446,824号の一部係属出願であり、該06/446,824号出願は、1981年12月24日に出願され現在では米国特許第06/334,456号の一部係属出願であった。これらの出願および特許を参考のために本出願に引用する。
発明の分野
本発明は、変性（修飾）ポックスウイルスならびにその製造および使用方法に関し；例えば、ワクシニアウイルスまたはトリ（鳥類）ポックス（例えば、カナリアポックスまたは家禽ポックス）、例えば変性組換えポックスウイルス−サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、例えば、弱毒化組換え体のようなヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ  ＣＭＶまたはＨＣＭＶ組換え体に関するものである。さらに詳細には、本発明は、外来遺伝子を挿入し発現させて、ＣＭＶまたはＨＣＭＶウイルスに対して免疫応答を誘起するための安全な免疫化媒体として用いられる改良ベクターに関する。すなわち、本発明はＣＭＶまたはＨＣＭＶの遺伝子産生物を発現する組換えポックスウイルス、および、宿主またはインビトロ（例えば、半ビボモダリティ）投与されたＣＭＶまたはＨＣＭＶ感染に対して免疫応答を誘起する免疫原性組成物に関し、さらには、該ポックスウイルスの発現産生物であって、それ自身が免疫応答を誘起、例えば抗体を産生するのに有用な生成物に関し、ここで、該抗体は、血清反応陽性または血清反応陰性の個体におけるＣＭＶまたはＨＣＭＶ感染に対して有用であり、また、該発現産生物またはそれから誘起される抗体は、状況に応じて動物またはヒトまたは培養細胞から単離されることにより、ウイルスもしくは感染細胞またはその他の系における抗原または生成物の発現の検出用の診断キット、試験または分析法を構築するのに有用なものである。そのような単離された発現産生物は、各種の系、宿主、血清もしくはサンプルにおける抗体の検出、または抗体の産生に特に有用である。本発明のポックスウイルス組換え体は好ましくは、ＣＭＶまたはＨＣＭＶのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、pp65およびＩＥＩのいずれかまたは全てのコードするＤＮＡを含有し、一部切除された（truncated）ＩＥＩを発現する組換え体も含む。そして、該組換えポックスウイルスＤＮＡは、ＣＭＶもしくはＨＣＭＶまたはそれらの抗原の存否を検出するためのＣＭＶもしくはＨＣＭＶ用プロープまたはＰＣＲプライマー調製に有用である。
本出願においては、幾つかの刊行物を参照している。これらの参考文献は、本明細書の末尾の特許請求の範囲の前にまとめて引用しているか、あるいは、刊行物について言及している個所においてそれぞれの刊行物を引用しており、それらの内容を本明細書中に包含させることとする。
発明の背景
外来遺伝子を挿入し発現させるためにはワクシニアウイルス、および最近は、その他のポックスウイルスが用いられている。生きた感染性ポックスウイルス内に外来遺伝子を挿入する基本的な手法は、ドナープラスミド内の外来遺伝子をはさむ（フランキングする）ポックスＤＮＡ配列と、レスキューウイルスであるポックスウイルス内に存在する相同配列との間で組換えを起こすことである（Piccini他、1987）。
詳述すれば、組換えポックスウイルスは、当該技術分野で既知であり、また、米国特許第4,769,330号、第4,772,848号、第4,603,112号、第5,100,587号および第5,179,993号に記載のワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルスのようなポックスウイルスの合成組換体を創製する方法（これらの特許の開示を参考のために本明細書に引用しておく。）に類似の２つの工程で構築される。
第１の工程として、当該ウイルスに挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列、特に、非ポックス源からのオープンリーディングフレームが、ポックスウイルスＤＮＡの一部に相同的なＤＮＡが予め挿入されている大腸菌プラスミド構造体に導入される。これとは別に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列をプロモータに連結しておく。プラスミド構造体におけるプロモータと遺伝子の連結体の位置は、可欠（nonessential）遺伝子座を含有するポックスＤＮＡの領域をはさむＤＮＡ配列に相同的なＤＮＡにより、該プロモーター遺伝子連結体の両端がはさまれているようにしておく。このようにして得られたプラスミド構造体は、次いで、大腸菌内で培養、増幅され（Clewell、1972）、単離される（Clewell他、1969；Maniatis他、1982）。
第２の工程として、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離後のプラスミドは、ポックスウイルスとともに、培養細胞、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞に形質転換（トランスフェクション）される。プラスミド内の相同的ポックスＤＮＡと、ウイスルゲノムとの間の組換えにより、ポックスウイルスのゲノムの可欠領域に外来ＤＮＡ配列が存在する変性ポックスウイルスが得られる。「外来（foreign）」ＤＮＡ配列という語は、外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源からのＤＮＡであって、該外因性ＤＮＡが導入されているゲノムによって通常は産生されない遺伝子産生物をコードするＤＮＡを指称する。
遺伝子組換えは、一般に、２つのＤＮＡ鎖間の相同的ＤＮＡ部分の交換である。ウイルスによっては、ＤＮＡの代わりにＲＮＡとなることもある。核酸の相同的部分とは、同じ配列の核酸塩基を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の一部分である。
遺伝子組換えは、本来、感染宿主細胞内で新しいウイルスゲノムが複製または産生される間に起こり得るものである。すなわち、２種もしくはそれ以上の異なるウイルスまたはその他の遺伝子構造体が共感染した（co-infected）宿主細胞内で起こるウイルス複製サイクル中に、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えが起こり得る。第１のゲノム由来のＤＮＡの一部が交換させられて、この第１のウイルスゲノムに相同的なＤＮＡを有する第２の共感染性ウイルスのゲノムの一部を構成する。
しかしながら、組換えは、完全に相同的でない異なるゲノムにおけるＤＮＡ部分間でも起こり得る。第１のゲノム由来のそのようなＤＮＡの一部分が別のゲノムの一部分に相同的であるが、その第１のＤＮＡ部分に、例えば、遺伝子マーカーや抗原決定基をコードする遺伝子が挿入されて存在しているような場合には、組換えが起こり、その組換え産生物は組換えウイルスゲノム内のそのような遺伝子マーカーや遺伝子の存在により検出され得るようになる。最近は、組換えワクシニアウイルスを調製するためにその他の戦略も報告されている。
変性された感染性ウイルスにより、挿入されたＤＮＡ遺伝子配列の発現を成功させるためには２つの条件が要求される。第１に、ウイルスの可欠領域に挿入を行い、変性ウイルスの生存性が維持されるようにしなければならない。挿入ＤＮＡの発現に関する第２の条件は、該挿入ＤＮＡに対して至適な関係でプロモータが存在しているということである。プロモータの位置は、発現されるべきＤＮＡ配列の上流にあるようにしなければならない。
ワクシニアウイルスは天然痘に対する免疫処置に使用されて成功をおさめ、1980年には世界的に天然痘を撲滅させた。その歴史の過程でワクシニアの多くの菌株が出現した。これらの異なる菌株は、種々の免疫原性を示し、また、程度の差はあるが、いろいろな合併症に関連する可能性があるとされ、その最も深刻なものはワクチン接種後の脳炎と全身性ワクシニアである（Behbehani、1993）。
天然痘の撲滅に伴い、ワクシニアの新しい役割、すなわち、外来遺伝子を発現させるための遺伝子工学用ベクターとして役割が重要となった。きわめて多くの異種抗原をコードする遺伝子がワクシニア内で発現され、その結果、対応する病原体による攻撃（チャレンジ）に対する防御免疫をもたらしたことも多い（Tartaglia他による総説、1990a）。
ワクシニアウイルスの遺伝学的経歴は、発現される外来免疫原の防御効能に影響を与えることが示されている。例えば、ワクシニアウイルスのWyethワクチン株内でエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）gp340が発現されても、ＥＢＶウイルスで引き起こされるリンパ腫に対してタマリンを防御しなかったが、ワクシニアウイルスのＷＲ研究室株内で同じ遺伝子を発現させると防御効果があった（Morgan他、1988）。
ワクシニアウイルスに基づき組換えワクチンを得ようとする場合には効力と安全性との間に精密なバランスをとることがきわめて重要である。組換えウイルスが与える免疫原は、ワクチン投与された動物内で防御能のある免疫応答を誘起するが、実質的に病原性が無いものでなければならない。したがって、ベクター株を弱毒化することが、現在の技術状況では最も望ましいであろう。
多くのワクシニア遺伝子が、組織培養におけるウイルスの成長に可欠であることが確認されており、それらを欠失させ不活化することにより、いろいろな動物系におけるビルレンス（毒性）が減少される。
ワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子についてはマッピングが行われ（Hruby他、1982）、また、配列決定も行われている（Hruby他、1993；Wier他、1993）。チミジキナーゼ遺伝子が不活化または完全欠失しても、広範な組織培養中でワクシニアウイルスの増殖は妨げられない。また、ＴＫ-ワクシニアウイルスは各種の投与法により各種の宿主における接種部位においてインビボ複製する能力を有する。
単純ヘルペスウイルス２型については、ＴＫ-ウイルスをモルモットに膣内投与すると、ＴＫ+ウイルスの投与の場合よりも脊髄中のウイルス力価がかなり低くなることが示された（Stanberry他、1985）。ヘルペスウイルスではインビトロでのＴＫ活性は、代謝の活発な細胞中ではウイルスの増殖に重要でないが、静止細胞中ではウイルス増殖に必須であることが示された（Jamieson他、1974）。
マウスに脳内投与および腹膜内投与することによりＴＫ-ワクシニアが弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。神経毒性のあるＷＲ実験室株およびWyethワクチン株の双方について弱毒化が認められた。皮膚内投与されたマウスにおいては、ＴＫ-組換えワクシニアが、親株のＴＫ+ワクシニアウイルスと同等の抗ワクシニア中和抗体を産生したが、これは、この試験系では、ＴＫ機能の喪失がワクシニアウイルスベクターの免疫原性を有意に減少させないことを示唆している。ＴＫ-およびＴＫ+の組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）をマウスに鼻内接種すると、他の部位（脳を含む）へのウイルスの伝播が有意に減少したことが見出された（Taylor他、1991a）。
ヌクレオチドの代謝に関連する別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）内でコードされているリボヌクレオチドレダクターゼの活性が、その大サブユニットをコードしている遺伝子を欠失させることにより喪失しても、インビトロの分裂細胞中でのウイルス増殖やＤＮＡ合成は影響されないが、無血清細胞でのウイルスの増殖能力は極めて損なわれることが示された（Goldstein他、1988）。眼部の急性ＨＳＶ感染および三叉神経ガングリオンにおける再活性性潜伏感染に関するマウスモデルを用いた場合、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットを欠失したＨＳＶについては、野生型ＨＳＶに比べてビルレンスが減少することが示された（Jacobson他、1989）。
ワクシニアウイルスにおいては、リボヌクレオチドレダクターゼの小サブユニット（Slabaugh他、1988）および大サブユニット（Schmidtt他、1988）のいずれも同定されている。ワクシニアウイルスのＷＲ株においてリボヌクレオチドレダクターゼを挿入不活化すると、マウスの頭蓋内接種により測定され得るようなウイルスの弱毒化がもたらされる（Ghild他、1990）。
ワクシニアウイルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子についてはマッピングおよび配列決定が行われている（Shida、1986）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は、組織培養中の増殖にとって可欠なものである（Ichihashi他、1971）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活化すると、頭蓋内投与されたウサギにおいては神経毒性化が減少し、また、皮膚内投与部位におけるウサギの損傷は小さくなっていた（Shida他、1988）。ＨＡの遺伝子座を利用して、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Shida他、1987）、Lister株の誘導体（Shida他、1988）およびCopenhagen株（Guo他、1989）に外来遺伝子を挿入している。外来遺伝子を発現する組換えＨＡ-ワクシニアウイルスは、免疫原性があり（Guo他、1989；Itamura他、1990；Shida他、1988；Shida他、1987）、また、関連する病原体によるチャレンジに対して防御効果を有する（Guo他、1989；Shida他、1987）ことが示された。
牛痘ウイルス（Brighton赤色株）は、鶏卵の漿尿膜上に赤色（出血性）痘瘡を生じさせる。牛痘ゲノム内で自然欠失すると白色痘瘡を生じる変異体となる（Pichup他、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた38ｋＤａのタンパク質によることがマッピングされている（Pickup他、1986）。この遺伝子は、セリンプロテアーゼインヒビターと相同性を有し、牛痘ウイルスに対する宿主の炎症応答を阻害し（Palumbo他、1989）、また、血液凝固のインヒビターである。
このｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのＷＲ株中に存在する（Kotwal他、1989b）。外来遺伝子を挿入することによりｕ領域が不活化されているＷＲワクシニアウイルス組換え体が接種されたマウスは、ｕ遺伝子がインタクトのままである類似の組換えワクシニアウイルスが接種されたマウスよりも、該外来遺伝子に対して高い抗体レベルを産生する（Zhou他、1990）。このｕ領域は、ワクシニアウイルスのCopenhagen株内で欠陥性非機能形態として存在する（Goeberu他による報告（1990a,b）においてＢ13およびＢ14と称されているオープンリーディングフレーム）。
感染細胞内において牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）として局在化している（Kato他、1959）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播に際して牛痘ウイルスビリオンを防御することにあると考えられている（Bergoin他、1971）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は160ｋＤａのタンパク質をコードしており、これがＡＴＩ封入体のマトリックスを形成する（Funahashi他、1988；Patel他、1987）。ワクシニアウイルスは、そのゲノムに相同領域を含有するが、一般にＡＴＩを産生しない。ワクシニアのＷＲ株においては、ゲノムのＡＴＩ領域は94ｋＤａのタンパク質として翻訳される（Patel他、1988）。ワクシニアウイルスのCopenhagen株においてはＡＴＩ領域に相応するＤＮＡ配列の大部分は欠失されており、該領域の残存する３′末端はＡＴＩ領域の上流にある配列と融合して、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）Ａ26Ｌを形成する（Goeberu他、1990a,b）。ワクシニアウイルスの左末端近傍については、各種の自然欠失（Altenburger他、1989；Drillien他、1981；Lai他、1989；Moss他、1981；Paez他、1985；Panicali他、1981）や人為的欠失が報告されている。10kbが自然欠失したワクシニアウイルスのＷＲ株（Moss他、1981；Panicali他、1981）は、マウスに頭蓋内接種することにより弱毒化されることが示された（Buller他、1985）。後に、この欠失部は17ヶのＯＲＦを含む可能性が示された（Kotwal他、1988b）。該欠失部内にある特別の遺伝子としては、ビロカインＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質（Goebel他による1990a,bの報告でＣ３Ｌと称されたもの）が挙げられる。Ｎ１Ｌを挿入不活化すると、通常のマウスおよびヌードマウスのいずれについても、頭蓋内接種によりビルレンスが減少する（Kotwa他、1989a）。上記の35ｋＤａタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地にＮ１Ｌと同様に分泌される。このタンパク質は、補体コントロールタンパク質群、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４bp）に相同性である（Kotwal他、1988a）。細胞性Ｃ４bpと同様に、ワクシニアの35ｋＤａタンパク質は補体の第４成分と結合し、古典的補体カスケードを阻害する（Kotwal他、1990）。このように、ワクシニアの35ｋＤａタンパク質は、該ウイルスが宿主の防御機構を回避するのを助けることに関与しているものと考えられる。
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主域遺伝子として同定された２つの遺伝子、Ｋ１Ｌ（Gillard他、1986）およびＣ７Ｌ（Perkus他、1990）を含む。これらの遺伝子の双方が欠失すると、各種のヒト細胞系でワクシニアウイルスの増殖能が減少する（Perkus他、1990）。
この他に、本来的に宿主が制限されているポックスウイルスであるトリポックスウイルスを使用する２つのワクチンベクター系がある。すなわち、家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ：fowlpoxvirus）およびカナリアポックスウイルス（canarypoxvirus）の両者に工夫を施して外来遺伝子産生物を発現させてきた。家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルス科のトリポックス（Avipox）属の基本ウイルスである。このウイルスは、家禽類に経済的に重要な疾病を引き起こすが、1920年代から弱毒化生ワクチンを使用することにより良好な対策が講じられてきた。トリポックスウイルスの複製は鳥類に限られ（Matthews他、1982）、ヒトを含む非鳥類においてトリポックスウイルスの感染が起こったという文献の報告は存しない。このように宿主が制限されているので、他の種にウイルスが伝染することに対する本質的な安全性が確保され、トリポックスウイルス由来のワクチンベクターは魅力ある手段として動物やヒトへ応用される。
ＦＰＶは、家禽類病原体由来の抗原を発現する優れたベクターとして使用されてきた。ビルレントトリインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質がＦＰＶ組換え体で発現された（Taylor他、1988a）。この組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種すると、同種または異種のビルレントインフルエンザウイルスのいずれのチャレンジに対しても防御能のある免疫応答が誘起された（Taylor他、1988a）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパクを発現するＦＰＶ組換え体も開発された（Taylor他、1990；Edbauer他、1990）。
宿主制限によりＦＰＶおよびＣＰＶの複製はトリ系に限られているにも拘わらず、これらのウイルスから誘導された組換え体は、非トリ源細胞において外来遺伝子を発現することが見出された。さらに、そのような組換え体ウイルスは、該外来遺伝子産生物に対する免疫応答を引き起こし、場合によっては、相応する病原体によるチャレンジに対する防御能を有することが示された（Tartaglia他、1993a,b；Taylor他、1992；1991b；1988b）。
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、ベータヘルペスウイルス亜科（ヘルペスウイルス科）の一種である。ＨＣＭＶはヒトに偏在しており、通常は軽症または不顕性の急性感染の後、保続または潜在化する。しかしながら、ＨＣＭＶは、子宮内感染した幼児においては発病および死亡の主要な原因となっている（Stagno他、1983）。ＨＣＭＶは、臓器移植（Glenn他、1981）および免疫無防備状態の宿主（Weller他、1971）における最も一般的な感染合併症である。エイズ患者においては、ＣＭＶ網膜炎が失明の主因となっている（Roarty他、1993；Gallant他、1992；Gross他1990）。冠状動脈休止症におけるＨＣＭＶの役割の可能性の１つが最近検討された（Speir他、1994）。ＨＣＭＶのTowne株を生きたままで弱毒化したものは、血清陰性の腎臓移植受領者を防御しＨＣＭＶ感染による重い臨床症状を引き起こさないようにし（Plotkin他、1976、1984および1989）、また、当初血清陰性の健康な個体を防御して、ＨＣＭＶ野性株を皮下チャレンジされた後に感染および臨床症状を引き起こさない（Plotkin他、1989）ことが示された。ヒトにおけるヘルペスウイルス感染の特徴として潜伏中に再活性化現象があり、また、ＨＣＭＶの菌株の中にはインビトロで細胞を悪性に形質転換する能力を有するものがあるため、ＨＣＭＶの生ワクチンを使用することが従来より関心を持たれている。これらの理由から、ヒトの免疫には組換えによるサブユニットＣＭＶワクチンの方が好ましいであろう。
個々のＨＣＭＶタンパク質の防御免疫における役割は不明である。ＨＣＭＶエンベロープに関連する３種類の免疫学的に異なる糖タンパク質、すなわち、ｇＣＩ（gp55およびgp93-130）、ｇＣＩＩ（gp47-52）およびｇＣＩＩＩ（gp85-p145）について検討されている（Gretch他、1988b）。これらの糖タンパク群のそれぞれに特異的な抗体を用いるとインビトロでＨＣＭＶが中和されることが示された（Pachl他、1989；Rasmussen他、1989；Kari他、1986）。
ｇＣＩをコードする遺伝子はＨＳＶ−ＩのｇＢと相同性である（Crange他、1986）。ＨＣＭＶｇＢは、見かけの分子量130〜140ｋＤａのグリコシル化された非切断前駆体として合成され、これは細胞のプロテイナーゼにより処理されてＮ末端側の90〜110ｋＤａの生成物とＣ末端側の55〜58ｋＤａの生成物になるが、これらの生成物はジスルフィド結合されたコンプレックスとして結合状態を保持する（BrittおよびAuger、1986；BrittおよびVugler、1989；Reis他、1993）。ＨＣＭＶ感染細胞のライゼートまたはＨＣＭＶビリオンで免疫化（免疫感作）したマウスからＨＣＭＶを中和し得るモノクローナル抗体が得られたが、該モノクローナル抗体は、前記Ｃ末端側55〜58ｋＤａフラグメントと専ら反応性を有していた（Britt、1984；Kari他、1986；Pereira他、1984；Rasmussen他、1988）。しかしながら、生化学的に生成したgp93で免疫化すると、gp93特異的な中和ｍＡｂｓ（モノクローナル抗体）が得られた（Kari他、1990）。
ＨＣＭＶ−ｇＢはヒト中で防御免疫を誘発するように機能するものと考えられる：精製したｇＢタンパク質で免疫化すると中和抗体が誘発され（Goenczoel他、1990）、また、ヒト抗ｇＢモノクローナル抗体は当該ウイルスを中和する（Masuho他、1987）。自然感染の後、ＨＣＭＢ−ｇＢに特異的な中和抗体が認められる。ヒト血清からｇＢ特異性抗体を吸収してしまうと、ＨＣＭＶ中和性抗体の力価は有意に減少する（55〜88％、Goenczoel他、1991；０〜98％（メジアン48％）、Marshall他、1992）。さらに、生来的に血清陽性のヒトにおいてはｇＢタンパク質によりヘルパーＴ細胞が活性化されるという証拠があり（Liu他、1991）、また、幾つかの研究においてはヒト中にｇＢ特異的なＣＴＬが検出されている（Borysiewicz他、1988；Liu他、1991；Riddell他、1991）。
ｇＣＩＩ糖タンパク質は、ＵＳ６遺伝子群にある単一または複数の遺伝子によってコードされている（ＵＳ６からＵＳ11、Gretch他、1988a）。これらの糖タンパク質は、回復期の大人由来の血清中にあるヒト抗ＨＣＭＶ抗体により認識される。しかしながら、永続性感染を有する生来感染幼児由来の血清はｇＣＩＩ糖タンパク質と反応せず（KariおよびGehrz、1990）、このことは、ｇＣＩＩはＨＣＭＶに対するヒトの防御免疫応答に重要であろうということを示唆している。
ｇＣＩＩＩコンプレックスのgp86成分は、ＨＳＶ−１のｇＨに相同性の遺伝子によりコードされている（Crange他、1988、Pachl他、1989）。ＨＣＭＶのｇＨタンパク質は、ヒトにおける中和性免疫応答を誘発する能力がある（ＨＣＭＶ感染した個体の10％に検知可能なレベルの循環性ｇＰ特異的抗体が認められ（Rasmussen他、1991）、同様のことが実験動物についても見られる（Babooniann他、1989；Crange他、1988；Ehrlich他、1988；Rasmussen他、1984））。マウスｇＨ−特異性モノクローナル抗体は、補体に依存してウイルス感染を中和し（Bfboonian他、1989；Crange他、1988；Rasmussen他、1984）、そしてウイルスの蔓延を抑制し（Pachl他、1989）、これらのことから、ｇＨはウイルスの付着、浸透および／または拡散に関与したものと思われる。
ｇＨはＨＣＭＶ感染細胞の表面に見出されるが（Crange他、1988）、各種の組換え系で発現させると内形質細網に限定される（Spaete他、1991）。ＨＣＭＶのＵＬ115遺伝子産生物（糖タンパク質ｇＬ）を共発現（同時発現）させると、これら２種類のタンパク質の安定したコンプレックスが生成し、そして、ｇＨが細胞表面に輸送される（Spaete他、1993；Kaye他、1992）。
ＨＣＭＶは多くのマトリックス外皮リンタンパク質を合成する。リンタンパク質pp150は、きわめて免疫原性が高く、見かけ上、他のＨＣＭＶ構造タンパク質のいずれよりも高い（Jshn他、1987）。第２のマトリックスリンタンパク質pp65は、ヒトにおいて各種の体液性応答を誘発する（Jahn他、1987；Plachter他、1990）。このタンパク質は、リンパ球増殖、ＩＬ−２およびインターフェロンの産生、抗体のＢ細胞刺激およびナチュラルキラー細胞活性を刺激することができる（Forman他、1985）。該タンパク質は、さらに、ＨＣＭＶ−特異的でＨＬＡ−限定性の細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬs）に対する標的抗原としても機能する（Pande他、1991；Gilbert他、1993）。
ＨＣＭＶに対する防御免疫応答を誘発させるには追加の構造タンパク質を必要とするものと思われる。主キャプシドタンパク質（ＵＬ86）は自然感染中に特異抗体を誘発するものとして知られ、また、ＣＭＶ群に共通の抗原と考えられている（Spaete他、1996）。外皮リンタンパク質pp28（ＵＬ99）もまた、自然感染中に持続性の抗体応答を誘発するものとして知られている。さらに、このタンパク質はＣＴＬ標的抗原の１種であると考えられている（Charpentier他、1986）。上部外皮リンタンパク質のようには特徴が明らかにされてはいないが、既知の外皮タンパク質の１種として更に検討が必要である。
組換えサブユニットワクチンには、以上の構造タンパク質に加えて、幾つかの非構造タンパク質を含ませることも考えられる。マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）pp89（HCMV IE 1の機能的ホモログ）を発現する組換えワクシニアウイルスでマウスを免疫すると、ＭＣＭＶのチャレンジによる防御免疫を媒介するＣＤ８+Ｔ細胞応答が誘発される（Jonjic他、1988）。ヒトＣＭＶ主要即時初期タンパク質（IE 1）は、ＨＣＭＶ血清陽性個体から単離されたＣＴＬsに対する標的であることが示されている（Borysiewicz他、1988）。IE 1は、発現される初期のウイルスタンパク質の１種であり、他のＣＭＶ遺伝子の発現を誘発し潜伏感染細胞内でウイルス寿命を開始させるのに必要であるから（BlantonおよびTevethia、1981；CameronおよびPreston、1981；DeMarchi他、1980；McDonoughおよびSpector、1983；Wathen他、1981）、IE 1に対するＣＴＬ応答は、ＨＣＭＶ感染を制御しおよび／または除去するのに重要であると考えられる。最近、Gilberらが提示した（1993）ＨＣＭＶによって展開される機序によれば、ウイルスにコードされている他のタンパク質がクラスＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と共同して、ＩＥ誘導性ペプチドの出現を選択的に妨げるということである。
組換えサブユニットＨＣＭＶワクチンには、その他の非構造タンパク質を含ませることも考えられる。即時初期タンパク質ＩＥ２（ＵＬ122）および調節タンパク質ＵＬ69は、ヒトＴ細胞エピトープを含有することが知られている（Beninga他、1995）。
ＨＣＭＶサブユニットワクチンを開発する１つの手法は、生のウイルスベクターを使用して関連するＨＣＭＶ遺伝子産生物を発現させることである。
かくして、ＣＭＶまたはＨＣＭＶの組換えポックスウイルス、ならびにそれから得られる組成物および生成物、特にＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ由来のＣＭＶまたはＨＣＭＶ組換え体ならびにそれから得られる組成物および生成物、特に、ＨＣＭＶのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、pp65およびＩＥ１のいずれかまたは全てをコードするＤＮＡを含有するような組換え体（一部切除されまたは変性されたＩＥ１および／またはｇＢを発現する組換体を含む）ならびに、それから得られる組成物および生成物が提供されれば、現在の技術を前進させるきわめて望ましいものとなるであろう。
発明の目的および概要
したがって、本発明の目的は、安全性が向上した変性（修飾）組換えウイルスを提供すること、およびそのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンと比較して安全性のレベルが増大した組換えポックスウイルス抗原ワクチンまたは免疫組成物を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、ベクターが宿主内で弱毒化された毒性（ビルレンス）を有するように変性（修飾）された、宿主中で遺伝子産生物を発現する変性（修飾）ベクターを提供することにある。
本発明の別の目的は、安全性の目的は、安全性のレベルが増大した変性（修飾）組換えウイルスまたは変性（修飾）ベクターを用いて、生体内（インビトロ）で培養された細胞中で遺伝子産生物を発現する方法を提供することにある。
本発明のこれらの目的およびその他の目的ならびに効果は、以下の記述から一層明らかになるであろう。
一つの態様として、本発明は、変性組換えウイルスであって、該ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されていることによりビルレンスが弱毒化され安全性が高められた組換えウイルスに関する。その遺伝子機能は、可欠的なものであるか、またはビルレンスに関連しているものである。ウイルスとしてはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えば家禽ポックスウイルスまたはカナリアウイルスである。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、ＨＣＭＶ由来の抗原またはエピトープ、例えば、ＨＣＭＢのｇＢ、ｇＨ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、pp65、ＩＥ１（変性または一部切除されたＩＥ１および／またはｇＢを含む）のいずれかまたは全てをコードする外来ＤＮＡ配列を含むことができる。
他の態様として、本発明は、接種された宿主動物内に免疫応答を誘起する抗原性、免疫原性、ないしはワクチン組成物または治療用組成物に関し、該ワクチンは、担体と変性組換えウイルスとを含み、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている可欠遺伝子機能が２活化されていることによりビルレンスが弱毒化され安全性が向上している。本発明に従うこの組成物に用いられるウイルスはポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えば、家禽ポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、ＨＣＭＶ由来の抗原またはエピトープ、例えば、ＨＣＭＢのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、pp65、ＩＥ１（変性または一部切除されたＩＥ１および／またはｇＢを含む）のいずれかまたは全てをコードする外来ＤＮＡ配列を含むことができる。
さらに別の態様として、本発明は、変性組換えウイルスを含有する免疫原性組成物に関し、該変性組換えウイルスは、ウイルスにコードされている可欠遺伝子機能が不活化されていることによりビルレンスが弱毒化され安全性が高められている。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、抗原性タンパク質［例えば、ＨＣＭＢのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、ＩＥ１（変性または一部切除されたＩＥ１および／またはｇＢを含む）のいずれかまたは全てのようなＨＣＭＶ由来のもの］をコードする外来ＤＮＡ配列を含み、該組成物は、宿主に投与されると、該抗原に特異的な免疫応答を誘起する能力を有する。
別の態様として、本発明は、インビトロ培養される細胞に、ビルレンスが弱毒化され安全性が高められた変性組換えウイルスを導入することにより該細胞内で遺伝子産生物を発現させる方法に関する。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、抗原性タンパク質、例えば、ＨＣＭＶのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、ＩＥ１（変性または一部切除されたＩＥ１および／またはｇＢを含む）のいずれかまたは全てのようなＨＣＭＶ由来のタンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を含むことができる。その後、該細胞は、個体に直接再注入されるか、または、再注入のために特定の反応性を増幅するのに使用する（半ビボ治療）ことができる。
別の態様として、本発明は、インビトロ培養される細胞に、ビルレンスが弱毒化され安全性が高められた変性組換えウイルスを導入することにより該細胞内で遺伝子産生物を発現させる方法に関する。この変性組換えウイルスは、そのウイルスゲノムの可欠領域に、抗原性タンパク質、例えば、ＨＣＭＶのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、ＩＥ１（変性または一部切除されたＩＥ１および／またはｇＢを含む）のいずれかまたは全てのようなＨＣＭＶ由来のタンパク質をコードする外来ＤＮＡ配列を含むことができる。得られた遺伝子産生物は、ヒトまた動物に投与されて免疫応答を刺激することができる。産生された抗体は、各個体内でＨＣＭＶの予防および治療に有用であり、また、ヒトもしくは動物由来の抗体または単離されたインビトロ発現産生物は、診断キット、分析または試験に用いられて、血清のようなサンプル中のＨＣＭＶもしくはＨＣＭＶ由来の抗原またはそれらに対する抗体の有無（したがって、該ウイルスもしくは該産生物、または該ウイルスもしくは抗原に対する免疫応答の有無）を測定するのに用いることができる。
さらに別の態様として、本発明は変性組換えウイルスに関し、該組換えウイルスは、ウイルスにコードされている可欠遺伝子機能が不活化されていることによりビルレンスが弱毒化されており、さらに、ウイルスゲノムの可欠領域に外来源のＤＮＡを含有している。このＤＮＡは、ＨＣＭＶのｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、pp65、ＩＥ１（変性または一部切除されたＩＥ１および／またはｇＢを含む）のようなＨＣＭＶをコードすることができるものである。さらに詳述すれば、遺伝子機能は、ビルレンス因子をコードするオープンリーディングフレームを欠失させることにより、または、自然の宿主制限ウイルスを利用することによって不活化されている。本発明に用いるウイルスは、ポックスウイルスが有利であり、特にワクシニアウイルスまたはトリポックスウイルス、例えば家禽ポックスウイルスまたはカナリアポックスウイルスである。オープンリーディングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ、Ａ26Ｌ、Ａ56Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ、および14Ｌ（Goebel他による1990a,bの報告における名称による）から成る群、ならびにそれらの組合せにより選択されるのが好ましい。ここで、オープンリーディングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体、血球凝集遺伝子、宿主域遺伝子領域もしくはリボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニット、またはそれらの組合せから成る。ワクシニアウイルスの好適な変性Copenhagen株は、ＮＹＶＡＣとして同定されたものであり（Tartaglia他、1992）、または、Ｊ２Ｒ、Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ、Ａ26Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ11およびＩ４Ｌまたはチミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、血球凝集遺伝子、宿主域領域、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットが欠失されたワクシニアウイルスである（米国特許第5,364,773号も参照されたい）。他の好適なポックスウイルスは、ＡＬＶＡＣであり、カナリアポックスウイルス（Rentschlerワクチン株）が、例えば、ニワトリ胚繊維芽細胞による200回以上の継代培養により弱毒化され、そのマスター種株が寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供された後、５回の追加の継代培養によりプラーククローンが増幅されたものである。
本発明は、さらに別の態様として、本発明による組換えポックスウイルスの発現産生物およびその使用、例えば、治療、予防、診断または試験に用いられる抗原性組成物ないしはワクチン組成物を調製することに関する。
これらの態様およびその他の態様は、以下の詳細な説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
以下、添付図面に沿って本発明を詳細に説明するが、この説明は本発明を例示するためのものであり、本発明はそれらの特定の態様に限定されるものではない。
図１は、チミジンキナーゼ遺伝子を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ410を形成するためのプラスミドｐＳＤ460を構築する方法を図示する。
図２は、出血性領域を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ553を形成するためのプラスミドｐＳＤ486を構築する方法を図示する。
図３は、ＡＴＩ領域を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ618を形成するためのプラスミドｐＭＰ494Δを構築する方法を図示する。
図４は、血球凝集遺伝子を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ723を形成するためのプラスミドｐＳＤ467を構築する方法を図示する。
図５は、遺伝子群［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ804を形成するためのプラスミドｐＭＰＣＫ１Δを構築する方法を図示する。
図６は、リボヌクレオチドレダクターゼの大サブユニットを欠失させ組換えワクシニアウイルスｖＰ866（ＮＹＶＡＣ）を形成するためのプラスミドｐＳＤ548を構築する方法を図示する。
図７は、ＴＫ欠失遺伝子座に狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を挿入し組換えワクシニアウイルスｖＰ879を形成するためのプラスミドｐＲＷ842を構築する方法を図示する。
図８は、Ｃ５  ＯＲＦ［SEQ ID NO:27（配列識別番号27）］（このＣ５  ＯＲＦは1537位で開始し1857位で終結する）を含有するカナリアポックスＤＮＡの3209塩基対フラグメントのＤＮＡ配列を示す。
図９Ａおよび図９Ｂは、組換えカナリアポックスウイルスｖＣＰ65（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）を構築する方法を図示する。
図10は、ＮＹＶＡＣを形成するために欠失させるＯＲＦｓ（オープンリーディングフレーム）を図示する。
図11Ａから図11Ｄは、予め同一のワクチンを接種するかまたはワクチンを変えて免疫化したボランティアにおけるウサギ中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、IU／ml）、ＨＤＣおよびｖＣＰ65（105.5ＴＣＩＤ50）のブースター効果を示すグラフである。（なお、ワクチン接種は、０日、28日および180日目に行い、抗体力価の測定は０日、７日、28日、35日、56日、173日、187日および208日目に行った。）
図12は、ＨＣＭＶｇＢ（Towne株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:37）を示す。
図13Ａおよび図13Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＢおよびＮＹＶＡＣ配列（ＴＫ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:38）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＢの５′末端は3447位にあり；ＣＭＶｇＢをコードする配列は3324位から606位までである。）
図14Ａから図14Ｃは、Ｃ３  ＯＲＦを含有するカナリアポックスＤＮＡの7351塩基対フラグメントのＤＮＡ配列（SEQ ID NO:39）を示す。（Ｃ３  ＯＲＦは1458位から開始され、2897位で終結する。）
図15Ａから図15Ｃは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＢおよびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ３遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:40）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＢの５′末端は4425位にあり；ＣＭＶｇＢをコードする配列は4301位から1581位までである。）
図16Ａおよび図16Ｃは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＢおよびＮＹＶＡＣ配列（ＡＴＩ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:41）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＢの５′末端は3348位にあり；ＣＭＶｇＢをコードする配列は3224位から504位までである）。
図17は、トランスメンブレン領域が欠失されたＨＣＭＶｇＢ（Towne株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:42）を示す。
図18Ａおよび図18Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＢ（そのトランスメンブレン領域を欠損している）およびＮＹＶＡＣ配列（ＡＴＩ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:43）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＢの５′末端は3173位にあり；ＣＭＶｇＢをコードする配列は3050位から504位までである。）
図19は、トランスメンブレン領域が欠失され且つ切断部位が変性（修正）されたＨＣＭＶｇＢ（Towne株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:44）を示す。
図20Ａおよび図20Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＢ（トランスメンブレン領域が欠失され且つ切断部位が変性されている）およびＮＹＶＡＣ配列（ＡＴＩ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:45）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＢの５′末端は3173位にあり；ＣＭＶｇＢをコードする配列は3050位から504位までである。）
図21は、ＨＣＭＶｇＨ（Towne株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:46）を示す。
図22Ａおよび図22Ｂは、42ＫをプロモータとするＨＣＭＶｇＨとＮＹＶＡＣ配列（Ｉ４Ｌ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:47）を示す。（42ＫをプロモータとするＣＭＶｇＨの５′末端は641位にあり；ＣＭＶｇＨをコードする配列は708位から2933位までである。）
図23Ａおよび図23Ｂは、42ＫをプロモータとするＣＭＶｇＨとＡＬＶＡＣ配列（Ｃ５遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:48）を示す。（42ＫをプロモータとするＣＭＶｇＨの５′末端は1664位にあり；ＣＭＶｇＨをコードする配列は1730位から3955位までである。）
図24は、42ＫをプロモータとするＣＭＶｇＨおよびＷＲフランキング配列のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:49）を示す。（42ＫをプロモータとするＣＭＶｇＨの５′末端は2457位にあり；ＣＭＶｇＨをコードする配列は2391位から166位までである。）
図25は、ＨＣＭＶ  ＩＥ１（ＡＤ169株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:50）を示す。
図26は、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１およびＷＲフランキング配列のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:51）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１の５′末端は1796位にあり；ＣＭＶＩＥ１をコードする配列は1673位から201位までである。）
図27Ａおよび図27Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１およびＮＹＶＡＣ配列（ＡＴＩ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:52）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１の５′末端は2030位にあり；ＣＭＶＩＥ１をコードする配列は1906位から434位までである。）
図28は、292〜319位のアミノ酸を欠くＨＣＭＶＩＥ１（ＡＤ169株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:53）を示す。
図29Ａおよび図29Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１（292〜319位のアミノ酸を欠如している）およびＮＹＶＡＣ配列（ＡＴＩ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:54）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１の５′末端は1940位にあり；ＣＭＶＩＥ１をコードする配列は1816位から434位までである。）
図30は、ＨＣＭＶＩＥ１（ＡＤ169株）のエクソン４セグメントのＤＮＡ配列（SEQ ID NO:55）を示す。
図31は、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１  エクソン４セグメントおよびＡＬＶＡＣ配列（Ｉ４Ｌ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:56）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＩＥ１  エクソン４の５′末端は630位にあり；ＣＭＶＩＥ１  エクソン４をコードする配列は754位から1971位までである。）
図32Ａおよび図32Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１  エクソン４セグメントおよびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ５遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:57）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＩＥ１  エクソン４は1647位にあり；ＣＭＶＩＥ１  エクソン４をコードする配列は1771位から2988位までである。）
図33は、２〜32位のアミノ酸を欠如するＨＣＭＶＩＥ１（ＡＤ169株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:58）を示す。
図34は、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１（２〜32位のアミノ酸を欠く）およびＮＹＶＡＣ配列（Ｉ４Ｌ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:59）を示す。（Ｈ６をプロモータとし２〜32位のアミノ酸を欠くＩＥ１の５′末端は630位にあり；２〜32位のアミノ酸を欠くＣＭＶＩＥ１をコードする配列は754位から2133位までである。）
図35Ａおよび図35Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ１（２〜32位のアミノ酸を欠く）およびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ５遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:60）を示す。（Ｈ６をプロモータとし２〜32位のアミノ酸を欠くＩＥ１の５′末端は1647位にあり；２〜32位のアミノ酸を欠くＣＭＶＩＥ１をコードする配列は1771位から3150位までである。）
図36は、ＨＣＭＶ  pp65（Towne株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:61）を示す。
図37は、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶpp65およびＮＹＶＡＣ配列（ＨＡ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:62）を示す。（Ｈ６をプロモータとするpp65の５′末端は476位にあり；ＣＭＶpp65をコードする配列は660位から2282位までである。）
図38Ａおよび図38Ｂは、Ｃ６  ＯＲＦを含有するカナリアポックスＤＮＡの3706塩基対フラグメントのＤＮＡ配列（SEQ ID NO:63）を示す。（Ｃ６  ＯＲＦは377位から開始され2254位で終結する。）
図39Ａおよび図39Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶpp65およびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ６遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:64）を示す。（Ｈ６をプロモータとするpp65の５′末端は496位にあり；ＣＭＶpp65をコードする配列は620位から2302位までである。）
図40は、Ｈ６をプロモータとするＣＭＶpp65およびＷＲフランキング配列のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:65）を示す。（Ｈ６をプロモータとするpp65の５′末端は168位にあり；ＣＭＶpp65をコードする配列は292位から1974位までである。）
図41は、ＨＣＭＶpp150（Towne株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:66）を示す。
図42Ａおよび図42Ｂは、42ＫをプロモータとするＣＭＶpp150およびＮＹＶＡＣ配列（ＡＴＩ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:67）を示す。（42Ｋをプロモータとするpp150の５′末端は3645位にあり；ＣＭＶpp150をコードする配列は3580位から443位までである。）
図43Ａおよび図43Ｂは、42ＫをプロモータとするＣＭＶpp150およびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ６遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:68）を示す。（42Ｋをプロモータとするpp150の５′末端は3714位にあり；ＣＭＶpp150をコードする配列は3649位から512位までである。）
図44Ａおよび図44Ｂは、42ＫをプロモータとするＣＭＶpp150およびＷＲフランキング配列のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:69）を示す。（Ｈ６をプロモータとするpp150の５′末端は3377位にあり；ＣＭＶpp150をコードする配列は3312位から175位までである。）
図45Ａおよび図45Ｂは、42ＫをプロモータとするＨＣＭＶｇＨおよびＨ６をプロモータとするＨＣＭＶＩＥ  エクソン４およびＮＹＶＡＣ配列（Ｉ４Ｌ遺伝視座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:70）を示す。（42ＫをプロモータとするＣＭＶｇＨの５′末端は2935位にあり；ＣＭＶｇＨをコードする配列は2869位から644位までであり；Ｈ６をプロモータとするＣＭＶＩＥ  エクソン４の５′末端は2946位にあり；ＣＭＶＩＥ  エクソン４をコードする配列は3070位から4287位までである。）
図46Ａから図46Ｃは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶpp65および42ＫをプロモータとするＨＣＭＶpp150およびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ６遺伝視座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:71）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶpp65の５′末端は496位にあり；ＣＭＶpp65をコードする配列は620位から2302位までであり；42ＫをプロモータとするＣＭＶpp150の５′末端は5554位にあり；ＣＭＶpp150をコードする配列は5489位から2352位までである。
図47は、ＨＣＭＶｇＬ（Towne株）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:72）を示す。
図48Ａおよび図48Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＬおよびＮＹＶＡＣ配列（ＴＫ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:73）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＢの５′末端は3447位にあり；ＣＭＶｇＢをコードする配列は3324位から606位までであり；Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＬの５′末端は3500位にあり；ＣＭＶｇＬをコードする配列は3624位から4460位までである。）
図49は、ＡＬＶＡＣ−ＩＥ１（ｖＣＰ256）によるＨＣＭＶＩＥ１  ＣＴＬの刺激の結果を示す。（パーセント細胞毒性；無地棒グラフ＝ＷＲ、黒地（右下がり縞）棒グラフ＝ＷＲＩＥ１、（右上がり縞）棒グラフ＝非同原）。
図50は、ＡＬＶＡＣ−pp65（ｖＣＰ260）によるＨＣＭＶ  pp65−ＣＴＬの刺激の結果を示す。（インビトロでヒトＣＴＬを刺激し、図49に用いたのと同様の方法によりＨＣＭＶ  pp65−ＣＴＬを分析したもの。パーセント細胞毒性；無地棒グラフ＝ＷＲ、黒地（右下がり縞）棒グラフ＝ＷＲ−pp65、（右上がり縞）棒グラフ＝非同原）。
図51は、ＡＬＶＡＣ−ＩＥ１（ｖＣＰ256）によるＨＣＭＶ  ＩＥ１  ＣＴＬの刺激の結果を示す。（図49に用いたのと同様の方法による。但し、再刺激のために６日間インキュベートした後、抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８モノクローナル抗体に結合された免疫磁性ビートを用いてキラー単核細胞をインキュベートした。パーセント細胞毒性；無地棒グラフ＝ＷＲ、黒地（右下がり縞）棒グラフ＝ＷＲ−ＩＥ１、（右上がり縞）棒グラフ＝ＨＬＡミスマッチ）。
図52Ａから図52Ｄは、ＣＯＰＡＫ組換え体によるVero細胞およびHeLa細胞におけるＣＭＶ  ｇＢの発現を示す。（35Ｓメチオニンで放射標識した感染細胞由来の細胞および培地画分をモルモット抗ＣＭＶｇＢ抗体で免疫沈降したもの；ｖＰ993（ＣＯＰＡＫ親株）（レーン１）、全ｇＢを発現するｖＰ1126（レーン２）、トランスメンブレン部位の無いｇＢを発現するｖＰ1128（レーン３）、およびトランスメンブレン部位が無く且つ切断部位が変性されたｇＢを発現するｖＰ1145（レーン４）のそれぞれによる感染由来のVero培地（Ａ）、HeLa培地（Ｂ），Vero細胞（Ｃ）、およびHeLa細胞（Ｄ）画分を示している。右端のレーンは分子量マーカーを示す。
図53Ａおよび図53Ｂは、Vero細部およびHeLa細胞のワクシニア感染を、ワクシニア初期タンパク質Ｅ３Ｌの発現によって検出したものである。（35Ｓメチオニンで放射標識した感染細胞由来の細胞画分をウサギ抗ｐ25（Ｅ３Ｌ）抗体で免疫沈降させた；ｖＰ993（レーン１）、ｖＰ1126（レーン２）、ｖＰ1128（レーン３）、およびｖＰ1145（レーン４）による感染由来のVero細胞（Ａ）およびHeLa細胞（Ｂ）画分を示す；右端のレーンは分子量マーカーである。）
図54は、Vero細胞、HeLa細胞およびＭＲＣ−５細胞によるＣＭＢ  ｇＢの産生を比較して示すものである。ｖＰ1145（レーン１、２、３）またはｖＰ993（レーン４、５、６）を感染させた後、ＭＲＣ−５細胞（レーン１、４）、Vero細胞（レーン２、５）またはHeLa細胞（レーン３、６）由来の培地にＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を行った；ＣＭＢ  ｇＢの検出にはモノクローナル抗体ＣＨ380を用いた；レーンＭには分子量マーカーを示す。）
図55は、幾つかのモノクローナル抗体およびモルモット抗ｇＢ抗体によるＣＭＶの免疫沈降を示す。（ｖＰ993（レーン１）、ｖＰ1126（レーン２）、ｖＰ1128（レーン３）、およびｖＰ1145（レーン４）を感染させたVero細胞由来の放射標識した培地画分を、モルモット抗ＣＭＶ  ｇＢ抗体またはモノクローナル抗体13−127、13−128、ＣＨ380、ＨＣＭＶ34、もしくはＨＣＭＶ37で免疫沈降させた；左端のレーンは分子量マーカーを示す。）
図56は、ＣＭＶ  ｇＢイムノアフィニティクロマトグラフィカラムからの画分および層（ベッド）物質のウエスタンブロット分析を示す。（溶出したｇＢ（レーン５）、フロースルー物質（レーン６）、カラムに適用した（かけた）粗製ｇＢ（レーン７）を表すカラム19画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびモノクローナル抗体ＣＨ380を用いるウエスタンブロットにより分析した；カラム19からの層物質（レーン２）、カラム11からの層物質（レーン３）およびカラム７で精製したｇＢ（レーン４）についても分析を行った；分子量マーカーはレーン１に示されている。）
図57は、イムノアフィニティクロマトグラフィカラムから溶出したＣＭＢ  ｇＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（カラム８から溶出した画分8.16から8.22までを10％ゲル上で還元条件下に電気泳動によって分離し、銀染色した。）
図58は、イムノアフィニティにより精製したＣＭＶ  ｇＢの５つのバッチについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すものである。（バッチ１から５までのサンプル（レーン１〜５）を10％ゲル上で還元条件下に電気泳動により分離し、クーマーシーブルーで染色した；レーンＭは分子量マーカーを含む。）
図59および図59Ａは、イムノアフィニティで精製したＣＭＶ  ｇＢの特性を示す。（図58Ａおよび図58Ｂに示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析したバッチ５にデンシトメーターを走査して、各バンドを同定した（レーン７のラベル１〜８）。図59Ａは、レーン７のデンシトメーター記録を示す。）
図60Ａおよび図60Ｂは、イムノアフィニティ精製したＣＭＶ  ｇＢのイムノブロット分析を示す。（精製したＨＩＶ env（レーン１）、アフィニティ精製したＣＭＶ  ｇＢ（レーン２）、粗製ＣＭＶ  ｇＢ（レーンＢ３）、またはモノクローナル抗体ＣＨ380（レーンＡ３）を10％ゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロースペーパーに転写し、そして、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ａ）またはモノクローナル抗体ＣＨ380（Ｂ）を用いてマウスＩｇＧのＨおよびＬ鎖またはＣＭＶｇＢの存在を探査した；レーン４には分子量マーカーを示す。）
図61Ａおよび図61Ｂは、アフィニティ精製したｇＢの免疫沈降／イムノブロット分析を示す。（イムノアフィニティで精製したｇＢ（Ａ）または粗製ｇＢ（Ｂ）を、モノクローナル抗体ＣＨ380（レーン１）、13−127（レーン３）、ＨＣＭＶ37（レーン４）またはＨＣＭＶ34（レーン５）で免疫沈降させた；それらの免疫沈降物を10％ゲル上で還元条件下に電気泳動により分離し、ニトロセルロースに転写し、モルモット抗ＣＭＶ  ｇＢ抗体を用いてｇＢの存在を探査した；右端のレーンは分子量マーカーである。
図62Ａおよび図62Ｂは、アフィニティ精製したＣＭＶ  ｇＢのイムノブロット分析を示す。（Vero細胞リゼイト（レーンＡ３、Ｂ２）、ＣＥＦリゼイト（レーンＡ２）、ワクシニア感染Vero細胞（レーンＢ３）、粗製ＣＭＶ  ｇＢ（レーン４）、アフィニティ精製したＣＭＶ  ｇＢ（レーン５）または精製ＨＩＶ env(レーン６）を10％ゲル上で還元条件下に電気泳動により分離し、ニトロセルロースに転写して、ウサギ抗Vero細胞抗体を用いてVero細胞タンパク質の存在（Ａ）、またはウサギ抗ワクシニア抗体を用いてワクシニアタンパク質の存在（Ｂ）を探査した；分子量マーカーはレーン１に示す。）
図63Ａから図63Ｃは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶpp65および42ＫをプロモータとするＨＣＭＶpp150およびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ６遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:188）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶpp65の５′末端は496位にある。ＣＭＶpp65をコードする配列は620位から2302位までである。42ＫをプロモータとするＣＭＶpp150は2341位にある。ＣＭＶpp150をコードする配列は2406位から5543位までである。）
図64Ａおよび図64Ｂは、Ｃ７  ＯＲＦ（tk）を含有するカナリアポックスＤＮＡの5798bpフラグメントのＤＮＡ配列（SEQ ID NO:189）を示す。（Ｃ８  ＯＲＦは4412位で開始され4951位で終結する。）
図65Ａおよび図65Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＬおよびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ７遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＬの５′末端は2136位にある。ＣＭＶｇＬをコードする配列は2260位から3093位までである。）
図66Ａおよび図66Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＬおよびＨ６をプロモータとするＨＣＭＶ  ＩＥ１−エクソン４遺伝子およびＡＬＶＡＣ配列（Ｃ７遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:190）を示す。Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＬの５′末端は3476位である。ＣＭＶｇＬをコードする領域は3600位から4433位までである。Ｈ６をプロモータとするＩＥ１−エクソン４の５′末端は3469位にある。ＣＭＶ  ＩＥ１−エクソン４をコードする領域は3345位から2128位までである。）
図67は、トランスメンブレン領域および細胞質尾部を欠失したＨＣＭＶｇＨのＤＮＡ配列（SEQ ID NO:191）を示す。
図68Ａおよび図68Ｂは、Ｈ６をプロモータとするＨＣＭＶｇＬ遺伝子および42Ｋをプロモータとする端部切断ＨＣＭＶｇＨ遺伝子およびＮＹＶＡＣ配列（ＡＴＩ遺伝子座をはさむ）のＤＮＡ配列（SEQ ID NO:191）を示す。（Ｈ６をプロモータとするＣＭＶｇＬ遺伝子の５′末端は2669位にある。ＣＭＶｇＬをコードする領域は2793位から3626位までである。42ＫをプロモータとするＣＭＶｇＨ遺伝子の５′末端は2650位にある。一部切除されたＣＭＶｇＨをコードする配列は2584位から434位までである。）
発明の詳細な説明
新しいワクシニアワクチン株を開発するために、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ866）、すなわち、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン（Copenhagen）株を、既知または予想される毒性（ビルレンス）因子をコード化するゲノムの６つの可欠領域を欠失させることにより変性した。配列の欠失については以下詳細に記載されている（米国特許第5,364,773号を参照）。ワクシニアの制限断片（フラグメント）、オープンリーディングフレームおよびヌクレオチド位置の呼称は全て、Goebel等、1990a,bに報告されている用語法に基づいている。
また、挿入する外来遺伝子を受容できるように欠失させる遺伝子座を工夫した。
ＮＹＶＡＣ中で欠失された領域を以下に列記する。欠失された領域の略称、およびオープンリーディングフレームの呼称（Goebel等、1990a,b）並びに特定の欠失を含有するワクシニア組換え体の呼称（ｖＰ）も併せて記している：
(1)チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ410；
(2)出血性領域（ｕ；Ｂ13Ｒ＋Ｂ14Ｒ）ｖＰ553；
(3)Ａ型封入体領域（ＡＴＩ；Ａ26Ｌ）ｖＰ618；
(4)血球凝集素遺伝子（ＨＡ；Ａ56Ｒ）ｖＰ723；
(5)宿主域遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ804；および
(6)リボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニット（Ｉ４Ｌ）ｖＰ866（ＮＹＶＡＣ）。
ＮＹＶＡＣは、ビルレンスおよび宿主域に関連する遺伝子産生物を含む遺伝子産生物をコードする18のオープンリーディングフレームを欠失させることにより遺伝子工学的手法で得られたワクシニアウイルス株である（Tartaglia他、1992；Goebel他、1990a,b）。宿主域遺伝子を欠失すると、特定の種（例えば、ブタやヒト）由来の組織培養細胞内における該ウイルスの複製能力が減少する（Tartaglia他、1992；Perkus他、1990）。複製能力が減少することの他に、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されたことは以下のような多くの特徴によって示される；(a)ウサギの皮膚に硬結や潰瘍形成がなくなること、(b)投与部位からの迅速なクリアランス、(c)新生マウスに頭蓋内投与した場合、ＷＹＥＴＨのような他のワクシニア株に比べて無病毒性が大きくなること、(d)免疫無防備状態の動物に腹膜腔内投与した場合に、死亡、二次障害または播種性感染が起こらなくなること（Tartaglia他、1992）。ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化する特徴を示すにも拘わらず、ＮＹＶＡＣに基づく組換え体は、狂犬病のチャレンジからマウス（Tartaglia他、1992）、日本脳炎ウイルスおよび擬似狂犬病ウイルスのチャレンジからブタ（Brockmeier他、1993；Konishi他、1992）、ならびにウマインフルエンザウイルスのチャレンジからウマ（Taylor他、1993）をそれぞれ防御するのに効果的である。
ＮＹＶＡＣは高度に弱毒化されるが、このことは以下のような多くの特徴からも判る：i)新生マウスに脳内接種するとビルレンスが減少すること、ii)遺伝学的に（nu+/nu+）または化学的（シクロホスホアミド）に免疫無防備状態マウスにおける無毒性、iii)免疫無防備状態マウスにおいて、播種性感染が起こらなくなること、iv)ウサギ皮膚の硬結や潰瘍形成がなくなること、v)接種部位からの迅速なクリアランス、vi)多くの組織培養細胞系（ヒト由来のものを含む）において複製能が激減すること。これにも拘わらず、ＮＹＶＡＣに基づくベクターは、外来性免疫原に対して優れた応答を誘起し防御免疫を提供する。
生のベクターとしてトリポックスウイルス由来の組換体を用いることによっても組換えサブユニットワクチンが得られる。該ウイルスは本来的にその複製能が鳥類に限られている。ＴＲＯＶＡＣとは、弱毒化家禽ポックスであって、１日齢のヒナへのワクチン接種がライセンスされている家禽ポックスウイルスＦＰ−１ワクチン株からプラークを単離して得られたものである。
ＡＬＶＡＣは、弱毒化カナリアポックスを基礎とするベクターであり、ライセンスされているカナリアポックスワクチンＫａｎａｐｏｘ（Tartaglia他、1992）からプラークをクローニングして得られたものである。ＡＬＶＡＣの一般的性質には、Ｋａｎａｐｏｘの一般的性質と同じものがある。外来性免疫原を発現するＡＬＶＡＣ系組換えウイルスは、ワクチンベクターとしても有効であることが示されている（Tartaglia他、1993a,b）。例えば、狂犬病ウイルスの糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣ組換え体で免疫化されたマウスは、狂犬病ウイルスの致死量チャレンジから防御され（Tartaglia他、1992）、このことはワクチンベクターとしてのＡＬＶＡＣの可能性を示唆している。ＡＬＶＡＣ由来の組換え体は、さらに、イヌジステンパーウイルスがチャレンジされたイヌ（Taylor他、1992）、狂犬病ウイルスがチャレンジされたイヌ（Perkus他、1994）、ネコ白血病ウイルスがチャレンジされたネコ（Tartaglia他、1993b）、ウマインフルエンザウイルスがチャレンジされたウマ（Taylor他、1993）においても有効であることが証明されている。
このトリポックスベクターは、その複製がトリ類に限定されている。ヒトの培養細胞においては、ウイルスのＤＮＡ合成に先行してウイルス複製サイクルの初期にカナリアポックスウイルスの複製は中断してしまう。しかしながら、外来性免疫原を発現するように工夫すれば、哺乳動物細胞中でインビトロで真正な発現とプロセシングが認められ、多くの哺乳動物種に接種すると該外来性免疫原に対する抗体および細胞性免疫応答を誘発し、同種の病原体のチャレンジに対する防御を与える（Taylor他、1992；Taylor他、1993）。カナリアポックス／狂犬病糖タンパク質組換え体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ65）に関するヨーロッパおよび米国における最近の第一相臨床試験によれば、この試験ワクチンは、充分に受け入れられるものであり、防御レベルの狂犬病ウイルス中和抗体を誘起することが示された（Cadoz他、1992；Fries他、1992）。事実、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与されたボランティアの反応原性は極めて少なく、そして105.5ＴＣＩＤ50の用量でＡＬＶＡＣ−ＲＧが２回投与されたワクチン被接種者の全てにおいて狂犬病中和抗体の発現が認められた。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ被接種者由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は、精製狂犬病ウイルスで刺激すると有意レベルのリンパ球増殖を示した（Fries他、1992）。
ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質gp160を発現するＡＬＶＡＣ組換え体（ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ；ｖＣＰ125）を用いて第一相ヒト臨床試験を行い、組換えgp160を用いてプライム（一次免疫）／ブースト（追加免疫）プロトコールが実施された。ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶを投与したボランティアの反応原性はきわめて少なく、このワクチンは初回投与でＨＩＶ−１のエンベロープに特異的な体液性免疫応答および細胞性免疫応答の両方を誘発した。
最近の研究によれば、プライム／ブーストプロトコールを採用し、外来遺伝子産生物を発現するポックスウイルスによる免疫の後に、該遺伝子産生物を精製したサブユニット製剤を用いてブースト（追加免疫）を行うと、それらの単独を用いて誘発される応答に比べて免疫応答が増大することが示されている。ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質を発現するワクシニア組換え体で免疫化され且つ精製されたＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質サブユニット製剤がブースト（追加免疫）されたヒトボランティアにおいては、該ワクシニア組換え体または精製されたエンベロープ糖タンパク質のみで免疫化した個体よりもＨＩＶ−１中和抗体力価の発現が高い（Graham他、1993；Cooney他、1993）。ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ−１  env組換え体（ｖＣＰ125）を２回注射して免疫されたヒトにおいては、ＨＩＶ特異的抗体が出現されなかった。ワクシニアウイルス組み換え体由来の精製rgp160でブーストすると検出可能なＨＩＶ−１中和抗体が生じた。さらに、rgp160をブーストすることにより、rgp160に対して特異的なＴリンパ球細胞増殖が明らかに大きくなった。このワクチン接種法によれば、エンベロープ特異的細胞障害性リンパ球活性も検出された（Pialoux他、1995）。サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）のエンベロープ糖タンパク質を発現するワクシニアウイルスで免疫化し且つバキュロウイルス由来のＳＩＶエンベロープ糖タンパク質でブーストされたアカゲザルはＳＩＶチャレンジから防御された（Hu他、1991；1992）。同様にして、精製したＨＣＭＶｇＢタンパク質を用いて、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ｇＢ組換え体によるプライム／ブーストプロトコールを実施することもできる。
また、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは、以下の点において、あらゆるポックスウイルスの中でも独特であると考えられている。すなわち、米国公衆衛生局のＮＩＨ（Institute of Health）の組換えＤＮＡ勧告委員会（Recombinant DNA Advisory Committee）は、ウイルスやベクターのような遺伝子材料の物理的封じ込めに関するガイドライン、すなわち、特定のウイルスやベクターの病原性に基づくそれらのウイルスやベクターの利用における安全な取扱に関するガイドラインを出しているが、この物理的封じ込めのレベルをＢＳＬ２からＢＳＬ１に下げることを認めた。ここで、他のいずれのポックスウイルスもＢＳＬ１の物理的封じ込めレベルを満足していない。ワクシニアウイルスのCopenhagen株（最も一般的な天然痘ワクチンである）ですら、これよりも高い物理的封じ込みレベル、すなわち、ＢＳＬ２を有する。このように、当該分野においては、ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは他のポックスウイルスよりも病原性が低いことが認められている。
ＣＭＶは、エイズ患者、骨髄被移植者および新生物疾患（腫瘍性疾患）の免疫抑制治療を受けている患者の発病や死亡の原因となることが多い。ＣＭＶ感染に対する有効で広く許容された薬剤的治療法はない。１つの方法は、ドナーＣＭＶ特異的ＣＴＬの半ビボ刺激を行い、骨髄被移植者においてＣＭＶ感染により頻発する致命的な肺炎を治療し制御することであろう。事実、ＣＭＶ  ＣＴＬクローンの養子移入によるヒトにおけるＣＭＶ感染の治療および制御は成功をおさめている（Riddell他、1992）。しかしながら、この例においては、該治療プロトコールに用いたＣＭＶ特異的ＣＴＬクローンを刺激し維持するためにＣＭＶが用いられた。ＣＴＬクローンを半ビボ刺激する目的でＣＭＶを使用することは幾つかの欠点があり、その最も明らかなものは、免疫抑制されている患者に別のＣＭＶを導入する可能性があるということである。抗原特異的な細胞性免疫エフェクター活性を刺激するのに安全で容認できる手段を与えるような免疫治療剤を利用しなければならないということが、養子免疫治療における大きな短所である。タンパク質サブユニットは、安全とは考えられるが、よく知られているようにＣＴＬの刺激能が低い。ペプチドは、一般に安全且つＣＴＬ応答を刺激するのも効果的であるが、ＣＴＬ応答を刺激する能力がきわめて限定的である。すなわち、ペプチドは、一般に、単一のタンパク質に含有されている多くの可能なＣＴＬエピトープのうちの１つのＣＴＬエピトープに対するＣＴＬ応答を誘発することしかできない。さらに、ペプチドは、個体群の限定された一部のＣＴＬ応答しか刺激しないのが一般的であり、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の特定のアレルを発現するような個体に限られる。組換えウイルスベクターは、全抗原を発現することができ、個体群の単一部分に対する単一のエピトープに限られないので、ＣＴＬ活性の優れた誘発剤と考えられる。しかしながら、これらのウイルスベクターの多く（例えば、アデノウイルス）は、複製能があり、この種のプロトコールに使用するのに安全とは限られない。本明細書に含まれるデータによって示されるように、ＡＬＶＡＣ組換え体は、哺乳動物細胞内では複製せず、しかも抗原特異的ＣＴＬ応答を刺激する能力は有するので、ウイルス特異的ＣＴＬクローンを半ビボ刺激して免疫治療に適用するための唯一の安全で効果的な方法を提供する。
本発明は、ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp150、pp65およびＩＥ１（その一部が切除されたものを含む）をコードするＨＣＭＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびワクシニア（ＷＲ株）組換え体に関し、その詳細は後の実施例で述べる。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ核ベクターの弱毒化プロフィルおよびそれらが体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘発する能力を有することから明らかなように（Tartaglia他、1993a,b；Taylor他、1992；Konishi他、1992）、それらの組換えウイルスは、既述のワクシニア系組換えウイルスよりも顕著な利点を有している。
本発明の組換えウイルスまたはその発現産生物、組成物、例えば、免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物は、非経口経路（皮内、筋肉または皮下）で投与することができる。そのような投与により全身性免疫応答が可能となる。
さらに概説すれば、本発明に従う抗原性、免疫原性もしくはワクチン組成物または治療組成物（本発明のポックスウイルス組換え体を含有する組成物）は、製薬技術分野における当業者に周知の標準的な方法に従って調製することができる。それらの組成物は、患者の年齢、性別、体重、および症状、ならびに投与経路を考慮しながら、適当な投与量で医学的分野の当業者に周知の方法に従って投与することができる。該組成物は、単独投与することもできるが、さらに、本発明の組成物、または他の免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物と同時に、または、それらとともに特定の順序で逐次的に、血清（反応）陽性の個体に投与することもできる。また、該組成物は、単独投与することもできるが、本発明の組成物、または他の免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物または治療組成物と同時に、またはそれらとともに特定の順序で逐次的に、血清（反応）陰性の個体に投与することもできる。他の組成物とは、ＨＣＭＶ由来の精製抗原または組換えポックスウイルスもしくは他のベクター系によって発現されたそのような抗原由来のものが挙げられる。他の組成物としては、また、他のＨＣＭＶ抗原を発現する組換えポックスウイルスまたは生体応答調節剤が挙げられる。これらの場合においても、患者の年齢、性別、体重および症状ならびに投与経路などの因子を考慮する。
本発明の組成物は、例えば、腔部（例えば、口、鼻、肛門、膣など）投与用の液状製剤、例えば、サスペンション、シロップまたはエリキジールなど；さらには、非経口、皮下、皮内、筋肉内または静脈内投与（例えば、静注）用製剤、例えば、無菌のサスペンションまたはエマルションの形態をとる。それらの組成物においては、組換えポックスウイルスに、適当なキャリア、稀釈剤、または賦形剤、例えば無菌水、生理食塩水、ブドウ糖などを混合させてもよい。
さらに、本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を直接使用して、血清陰性（血清反応陰性）もしくは血清陽性（血清反応陽性）のヒトまたは動物における免疫応答を刺激することもできる。すなわち、上述の組成物における本発明の組換えウイルスの代わりにまたはそれとともに、該発現産生物を使用して本発明に従う組成物とすることもできる。
また、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれに由来する発現産生物は、ヒトおよび動物における免疫または抗体応答を刺激し、したがって該産生物は抗原となる。これらの抗体または抗原から、当該技術分野で周知の手法により、モノクローナル抗体を調製することができ、そして、周知の抗体結合分析系、診断キットまたはテスト系においてこれらのモノクローナル抗体または抗原を使用して、特定のＨＣＭＶ抗原の有無、したがって、（ＨＣＭＶまたはその他の系において）該ウイルスまた抗原の発現の有無を測定したり、または、該ウイルスまたは抗原に対する免疫応答が刺激されたか否かを判定することができる。これらのモノクローナル抗体または抗原は、免疫吸着クロマトグラフィーに使用されて、ＨＣＭＶまたは本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を回収したり単離することもできる。
さらに、詳述すれば、本発明に従う組換え体および組成物は、以下のような多くの用途を有する：
(i)血清反応陰性の個体における免疫応答の誘発（ワクチン接種またはワクチン接種の一部として）；
(ii)血清反応陽性の個体の治療；および
(iii)ウイルス感染のリスクを伴わないインビトロでのＨＣＭＶタンパク質の調製。
本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物は、直接使用されて、血清反応陰性もしくは血清反応陽性のヒトまたは動物における免疫応答を刺激することができる。すなわち、本発明の組換えポックスウイルスに代えてまたはそれとともに、該発現産生物を使用して本発明の組成物を調製することもできる。
さらに、本発明の組換えポックスウイルスおよびそれに由来する発現産生物は、ヒトおよび動物における免疫または抗体応答を刺激する。これらの抗体から、当該分野で周知の手法によりモノクローナル抗体を調製することができ、そして、これらのモノクローナル抗体または本発明に従うポックスウイルスの発現産生物もしくは組成物を周知の抗体結合分析系、診断キットまたはテスト系に使用して、特定のＨＣＭＶ抗原または抗体の有無、したがって、該ウイルスの有無を測定したり、あるいは、該ウイルスまたは抗原に対する免疫応答が刺激されたか否かを判定することができる。これらのモノクローナル抗体を免疫吸着クロマトグラフィーに使用して、ＨＣＭＶまたは本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を回収、単離または検出することもできる。モノクローナル抗体を製造する方法およびモノクローナル抗体の使用方法、ならびにＨＣＭＶ抗原（本発明のポックスウイルスの発現産生物および組成物）の使用法などは当該技術分野における当業者には周知である。それらは、診断法、キット、テスト系または分析系などに使用されるとともに、免疫吸着クロマトグラフィーまたは免疫沈降法による物質回収に使用され得る。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞により産生される免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定基に反応し、通常の血清由来の抗体よりも高い特異性を与える。さらに、多数のモノクローナル抗体にスクリーニングを行うことにより、所望の特異性、アビディディ（抗原結合力）およびイソタイプを有する個々の抗体を選択することができる。ハイブリドーマ細胞系は、化学的に同一の抗体の恒常的且つ安価な供給源となり、そして、そのような抗体の調製は容易に標準化できる。モノクローナル抗体を産生する方法は当該技術分野における当業者には周知であり、例えば、Koprowski他による米国特許第4,196,265号1983年３月８日発行）を参考に引用しておく。
モノクローナル抗体の用途も既知である。そのような用途の一つは診断法に利用するものであり、例えば1983年３月８日付でDavid,G.およびGreene,H．に付与された米国特許第4,376,110号を引用しておく。モノクローナル抗体は、免疫吸着クロマトグラフィーにより物質を回収するのにも利用されており、例えば、Milstein,C．による「Scientific American 243：66，70（1980）」を引用しておく。
さらに、本発明に従う組換えポックスウイルスおよびその発現産生物は、インビトロまたは半ビボ（後に患者に再注入）で細胞の応答を刺激するのに使用することができる。患者の血清反応が陰性の場合、再注入により、免疫応答、例えば能動免疫のような免疫または抗原応答を刺激する。血清反応陽性の患者においては、再注入が、ＨＣＭＶに対する免疫系を刺激または増強する。
従って、本発明の組換えポックスウイルスは以下のような幾つかの用途を有する：血清反応陰性の患者に投与されるような抗原性、免疫性またはワクシン組成物における使用。ＨＣＭＶに対する免疫系を刺激または増強して治療が必要な血清反応陽性なヒト用組成物への使用。インビトロで抗原性を産生させ、これをさらに、抗原性、免疫性もしくはワクチン組成物または治療組成物に使用すること。以下の用途に使用され得るような抗体（直接投与するか、または本発明の組換えポックスウイルスの発現産生物を投与することによる）または該発現産物または抗原を産生させること：すなわち、診断系、テスト系またはキットに使用して、血清のようなサンプル中における抗原の有無を確認、例えば、血清のようなサンプル中のＨＴＬＶの有無を確認したり、あるいは、該ウイルスまたは特定の抗原に対する免疫応答が誘起されたか否かを判定したり、さらには、免疫吸着クロマトグラフィー、免疫沈降またはこれらに類似する手法に使用すること。
さらに、本発明の組換えポックスウイルスは、ハイブリダイゼーションし得るＤＮＡの存否を検出したり、ＤＮＡを増幅して、例えば、サンプル中のＨＣＭＶを検出し、またはＨＣＭＶのＤＮＡを増幅するのに使用することができるプローブまたはＰＣＲプライマー用のＤＮＡを調製するのにも有用である。
本発明の実施態様としてはその他の用途もある。
本発明およびその効果をさらに明らかにするため以下に実施例を示す。
実施例
ＤＮＡクローニングおよび合成  標準的な方法（Maniatis他、1982；Perkus他、1985；Piccini他、1987）によりプラスミドを構築し、スクリーニングし培養した。制限エンドヌクレアーゼは、米国メリーランド州Gaithersburgのベセスダーリサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）、米国マサチューセッツ州Beverlyのニューイングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）、および米国インディアナ州Indianapolisのベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）から入手した。大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片は、Boehringer Mannheim Biochemicalsから入手した。ＢＡＬ−３１エクソヌクレアーゼおよびファージＴ４のＤＮＡリガーゼはNew England Biolabsから入手した。各試薬は供給業者の指示に従って使用した。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、既述のように（Perkus他、1989）Biosearch 8750またはApplied Biosystems 380B ＤＮＡ合成装置を用いて調製した。ＤＮＡ配列決定は、既述の手法に従い（Guo他、1989）シークエナーゼ（Sequenase）を用いて（Tabor他、1987）ジデオキシ−チェインターミネーション法により（Sanger他、1977）行った。配列確認のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（Engelke他、1988）は、自動式Perkin Elmer Cetus ＤＮＡ熱サイクル装置（ＤＮＡ Thermal Cycler）によりカスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびGeneAmp ＤＮＡ増幅試薬キット（米国コネチカット州Norwalkのパーキン・エルマー・シータス（Perkin Elmer Cetus）社製）を用いて実施した。プラスミドからの過剰ＤＮＡ配列の欠失は、制限エンドヌクレアーゼ分解、その後、ＢＡＬ−３１エクソヌクレアーゼによる制限分解および合成オリゴヌクレオチドによる突然変異法（Mandecki,1986）により行った。
細胞、ウイルスおよびトランスフェクション  ワクシニアウイルスのコペンハーゲン（Copenhagen）株の起源および培養条件は既に明らかにされている（Guo他、1989）。組換えによる組換えウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイトウハイブリダイゼーションおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を利用するスクリーニングについては既に明らかにされている（Piccini他、1987）。
ワクシニアウイルスのCopenhagen株およびＮＹＶＡＣの起源および培養条件は既に明らかにされている（Guo他、1989；Tartaglia他、1992）。組換えによる組換えウイルスの調製、ニトロセルロースフィルターを用いるインサイトウハイブリダイゼーション、およびβ−ガラクトシダーゼを利用するスクリーニングについては既に明らかにされている（Panicali他、1982；Perkus他、1989）。
カナリアポックスウイルスの親株（Rentschler株）はカナリアのワクシニア菌株である。このワクチン株は、野生型の単離物から入手され、ニワトリ胚繊維芽細胞を用いる200回以上の継代培養により弱毒化されたものである。そのマスターウイルス種株は寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供され、そのプラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増幅され、その後、このストックウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に使用されてきた。このプラーク精製カナリアポックス単離物がＡＬＶＡＣと命名されている。
ＦＰ−１と命名された家禽ポックスウイルス（ＦＰＶ）株については既に明らかにされている（Taylor他、1988a）。これは、日齢のヒナのワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン株である。親ウイルス株Duvetteは、フランスにおいてニワトリヒナから家禽ポックス疥癬として入手された。このウイルスが胚鶏卵での約50回の連続的な継代培養の後、ニワトリ胚繊維芽細胞における25回の継代培養により弱毒化された。該ウイルスは４回の連続的なプラーク精製に供された。プラークの１つが単離され、初代ＣＥＦ細胞中で増幅され、ＴＲＯＶＡＣと命名されたストックウイルスが樹立された。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣ各ウイルスベクターおよびそれらの誘導体の増殖については既に記述されている（Piccini他、1987；Taylor他、1988a,b）。増殖にベロ（Vero）細胞やニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）を使用することも既に明らかにされている（Taylor他、1988a,b）。
ＮＹＶＡＣおよび特に実施例１から６に関しては、米国特許第5,364,773号を参照しており、本明細書に引用しておく。
実施例１−チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）を欠失させたプラスミドｐＳＤ４６０の構築
図１に関連して、プラスミドｐＳＤ４０６は、ｐＵＣ８にクローニングしたワクシニアＨｉｎｄIII Ｊ（位置83359〜88377）（83359〜88377位）を含有する。ｐＳＤ４０６をＨｉｎｄIIIとＰｖｕIIで切断し、ＨｉｎｄIIIの左側の1.7kbのフラグメントを、ＨｉｎｄIII／ＳｍａIで切断したｐＵＣ８にクローニングしてｐＳＤ４４７を調製した。ｐＳＤ４４７は、Ｊ２Ｒの全遺伝子を含有する（位置83855〜84385）。開始コドンはＮｌａIII部位内に含まれており、また、終止コドンはＳｓｐI部位内に含まれている。転写の方向は図１内の矢印で示す。
左側のフランキングアームを得るために、ｐＳＤ４４７から0.8kbのＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩフラグメントを分離し、次いでＮｌａIIIで分解して0.5kbのＨｉｎｄIII／ＮｌａIIIフラグメントを分離した。以下の配列を有するアニーニングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４（ＳＥＱＩＤ  NO:1／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:2）を0.5kbのＨｉｎｄIII／ＮｌａIIIフラグメントと連結（ライゲート）し、ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ１８ベクタープラスミドに導入して、プラスミドｐＳＤ４４９を得た。
0003940959.tif 000002
ワクシニアの右側のフランキングアームおよびｐＵＣベクター配列を含有する制限酵素フラグメントを得るために、ワクシニア配列内でＳｓｐＩ（部分的）を用い、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIIIを用いてｐＳＤ４４７を切断して、2.9kbのベクターフラグメントを分離した。このベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４５／ＭＰＳＹＮ４６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:3／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:4）と連結して、ｐＳＤ４５９を得た。
0003940959.tif 000003
左側フランキングアームと右側フランキングアームを結合させて１つのプラスミドとするために、ｐＳＤ４４９から0.5kbのＨｉｎｄIII／ＳｍａＩフラグメントを分離し、これを、ＨｉｎｄIII／ＳｍａＩで切断されたｐＳＤ４５９ベクタープラスミドに連結してｐＳＤ４６０を調製した。このｐＳＤ４６０をドナープラスミドとして用い、野性型親ワクシニアウイルスCopenhagen株ＶＣ−２との組換えを実施した。鋳型としてＭＰＳＹＮ４５（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:3）およびプライマーとして相補的な20マー（20mer）オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:5）（５′TTAGTTAATTAGGCGGCCGC３′）を用いるプライマー延長法により32Ｐがラベルされたプローブを合成した。組換えウイルスｖＰ４１０の同定はプラークハイブリダイゼーションにより行った。
実施例２−出血性領域（Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）を欠失させたプラスミドｐＳＤ４８６の構築
図２において、プラスミドｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇ（位置160,774〜173,351）を含有する。ｐＳＤ４２２は、右側に隣接するワクシニアＳａｌＩフラグメントＳａｌＩ  Ｇ（位置173,351〜182,746）（ｐＵＣ８にクローニングされている）を含有している。出血性領域ｕ、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置172,549〜173,552）が欠失されたプラスミドを構築するため、左側フランキングアーム源としてｐＳＤ４１９を用い、また、右側フランキングアーム源としてｐＳＤ４２２を用いた。ｕ領域の転写方向は図２の矢印で示す。
ｐＳＤ４１９から非所望配列を除去するために、ＮｃｏＩ／ＳｍａＩを用いてｐＳＤ４１９を分解し、次いで大腸菌のクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ＮｃｏＩ部位（位置172,253）の左側の配列を除去してプラスミドｐＳＤ４７６を得た。Ｂ１４Ｒの終結コドンにおけるＨｐａＩを用いるｐＳＤ４２２の分解およびＮｒｕＩによる分解によりワクシニアの右側フランキングアーム0.3kbを得た。この0.3kbのフラグメントを単離、ｐＳＤ４７６から単離された3.4kbのＨｉｎｃIIベクターフラグメントに連結して、プラスミドｐＳＤ４７７を得た。ｐＳＤ４７７におけるワクシニアｕ領域の部分欠失位置は三角形で示している。ｐＳＤ４７７における残りのＢ１３Ｒコード配列を除去するため、ＣｌａＩ／ＨｐａＩを用いる酵素分解を行い、得られたベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ22mer／ＳＤ20mer（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:6／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:7）に連結して、ｐＳＤ４７９を調製した。
0003940959.tif 000004
ｐＳＤ４７９は、開始コドン（下線）を含有し、その後にＢａｍＨＩ部位がある。ｕプロモーターの制御下にＢ１３−Ｂ１４（ｕ）欠失位置に大腸菌ベーターガラクトシダーゼを入れるために、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＤ４７９のＢａｍＨＩ部位に挿入して、ｐＳＤ４７９ＢＧを調製した。このｐＳＤ４７９ＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ４１０との組換えを実施した。組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３を、発色性基質Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして分離した。ｖＰ５３３においては、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域が欠失され、ベーターガラクトシダーゼによって置換されている。
ｖＰ５３３からベーターガラクトシダーゼを取り除くために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠失結合部に開始コドンを有しないｐＳＤ４７７の誘導体であるプラスミドｐＳＤ４８６を用いた。先ず、上述のｐＳＤ４７７由来のＣｌａＩ／ＨｐａＩベクターフラグメントを、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＳＤ42mer／ＳＤ40mer（ＳＥＱＩＤ  NO:8／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:9）に連結して、プラスミドｐＳＤ４７８を調製した。
0003940959.tif 000005
次に、ｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩ部位を破壊するため、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４７８を酵素分解し、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）を行うことにより、ｐＳＤ４７８Ｅ-を得た。このｐＳＤ４７８Ｅ-をＢａｍＨＩおよびＨｐａＩを用いて分解し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:10／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:11）に連結して、プラスミドｐＳＤ４８６を調製した。
0003940959.tif 000006
ｐＳＤ４８６をドナープラスミドとして用い、組換えワクシニアウイルスｖＰ５３３との組換えを行ってｖＰ５５３を得た。このｖＰ５５３は、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
実施例３−ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）を欠失させたプラスミドｐＭＰ４９４Δの構築
図３において、ｐＳＤ４１４は、ｐＵＣ８にクローニングされたＳａｌＩ  Ｂを含有する。Ａ２６Ｌ領域の左側の非所望ＤＮＡ配列を取り除くために、ｐＳＤ４１４を、ワクシニア配列内でＸｂａＩを用いて切断し、またｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIIIを用いる切断を行い、次に、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結を行うことにより、プラスミドｐＳＤ４８３を得た。Ａ２６Ｌ領域の右側の非所望ワクシニアＤＮＡ配列を除去するために、ＥｃｏＲＩを用いてｐＳＤ４８３を切断し（位置140,665およびｐＵＣ／ワクシニア結合部）、連結処理（ライゲーション）を行ってプラスミドｐＳＤ４８４を形成した。Ａ２６Ｌコード領域を取り除くため、ＮｄｅＩ（部分的）を用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し上流を切断し（位置139,004）且つＨｐａＩを用いてＡ２６ＬのＯＲＦの少し下流を切断（位置137,889）した。5.2kbのベクターフラグメントを単離し、これを以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:12／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:13）と連結して、Ａ２６Ｌの上流領域を再構成し、下記の配列に示すようなＢａｌII、ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩの制限部位を含有する短いポリリンカー領域とＡ２６ＬのＯＲＦを置換した。
0003940959.tif 000007
得られたプラスミドをｐＳＤ４８５と命名した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域におけるＢａｌII部位およびＥｃｏＲＩ部位は唯一のものではないので、ＢｇｌIIを用いる分解（位置140,136）およびｐＵＣ／ワクシニア結合部におけるＥｃｏＲＩによる分解を行い、その後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結（ライゲーション）により、プラスミド４８３（上述）から非所望のＢａｌII部位およびＥｃｏＲＩ部位を除去した。得られたプラスミドをｐＳＤ４８９と命名した。ｐＳＤ４８９由来でＡ２６ＬのＯＲＦを含有する1.8kbのＣｌａＩ（位置137,198）／ＥｃｏＲＩ（位置139,048）フラグメントを対応する0.7kbでポリリンカーを含有するｐＳＤ４８５由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントと置換することによりｐＳＤ４９２を得た。このｐＳＤ４９２のポリリンカー領域におけるＢｇｌII部位およびＥｃｏＲＩ部位は唯一のものである。
ｐＳＤ４９２のＢｇｌII部位に、１１ｋＤａのワクシニアプロモーター（Bertholet他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.3kbのＢｇｌIIカセットを挿入して、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４９３ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ５５３との組換えを行った。Ａ２６Ｌ欠失領域にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ５８１が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色のプラークとして単離された。
ワクシニア組換えウイルスｖＰ５８１からベーターガラクトシダーゼを欠失させるプラスミドを調製するために、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:14）を用いる突然変異法（Mandeck、1986）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー領域を欠失させた。
0003940959.tif 000008
得られたプラスミドｐＭＰ４９４Δにおいては、位置［137,889〜138,937］をカバーし、Ａ２６ＬのＯＲＦ全体を含むワクシニアＤＮＡが欠失されている。このｐＭＰ４９４Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ５８１との間の組換えにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ６１８が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
実施例４−血球凝集素遺伝子（Ａ５６Ｒ）を欠失させたプラスミドｐＳＤ４６７の構築
図４において、ワクシニアＳａｌＩ  Ｇ制限酵素フラグメント（位置160,744〜173,351）は、ＨｉｎｄIII Ａ／Ｂ結合部（位置162,539）を包含している。ｐＳＤ４１９は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＳａｌＩ  Ｇを含有する。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向は図４における矢印で示されている。ＨｉｎｄIII Ｂ由来のワクシニア配列の除去には、ワクシニア配列内およびｐＵＣ／ワクシニア結合部においてＨｉｎｄIIIを用いるｐＳＤ４１９の酵素分解を行い、その後、連結処理（ライゲーション）した。得られたプラスミドｐＳＤ４５６は、左側が0.4kbのワクシニア配列および右側が0.4kbのワクシニア配列で挟まれたＨＡ遺伝子（Ａ５６Ｒ）を含有する。Ａ５６Ｒをコードする配列を除去するために、Ａ５６Ｒコード配列の上流をＲｓａＩ（部分的；位置161,090）により、また、該遺伝子の末端近傍をＥａｇ１（位置162,054）によりｐＳＤ４５６を切断した。ｐＳＤ４５６から3.6kbのＲｓａＩ／ＥａｇＩベクターフラグメントを単離し、以下の配列を有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９（ＳＥＱＩＤ  NO:15）、ＭＰＳＹＮ６２（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:16）、ＭＰＳＹＮ６０（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:17）およびＭＰＳＹＮ６１（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:18）に連結（ライゲート）して、Ａ５６ＲのＯＲＦの上流のＤＮＡ配列を再構成し、Ａ５６ＲのＯＲＦを下記に示すようなポリリンカー領域と置換した。
0003940959.tif 000009
得られたプラスミドがｐＳＤ４６６である。このｐＳＤ４４６におけるワクシニア欠失は位置［161,185〜162,053］を包含する。ｐＳＤ４６６における欠失部位は図４では三角形で示されている。
ｐＳＤ４６６のＢｇｌII部位に、１１ｋＤａのワクシニアプロモーター（Bertholet他、1985；Guo他、1989）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＢｇｌII／ＢａｍＨＩ（部分的）カセットを挿入して、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形成した。このプラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧを用いて、レスキューウイルスｖＰ６１８との組換えを行った。Ａ５６Ｒ欠失部位にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７０８が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
ドナープラスミドｐＳＤ４６７を用い、ｖＰ７０８からベーターガラクトシダーゼ配列を除去した。ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同じであるが、但し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩを用いるｐＳＤ４６６の分解、それに続く大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化および連結処理（ライゲーション）によりｐＵＣ／ワクシニア結合部からＥｃｏＲＩ部位、ＳｍａＩ部位およびＢａｍＨＩ部位が取り除かれている。ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間に組換えを行うことにより組み換えワクシニア欠失変異体ｖＰ７２３が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
実施例５−オープンリーディングフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を欠失させたプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δの構築
図５に関し、次のワクシニアクローンを利用してｐＭＰＣＳＫ１Δを構築した。ｐＳＤ４２０は、ＳａｌＩ  ＨでｐＵＣ８にクローニングされたものである。ｐＳＤ４３５は、ＫｐｎＩ  ＦでｐＵＣ１８にクローニングされたものである。ＳｐｈＩでｐＳＤ４３５を切断してｐＳＤ４５１を形成した。このｐＳＤ４５１においては、ＨｉｎｄIII ＭにおけるＳｐｈＩ部位（位置27,416）の左側のＤＮＡ配列が除去されている（Perkus他、1990）。ｐＳＤ４０９は、ＨｉｎｄIII ＭでｐＵＣ８にクローニングされたものである。
ワクシニアから［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］遺伝子群を除去する基質を得るために、先ず、以下のように、ワクシニアのＭ２Ｌ欠失座に大腸菌ベーターガラクトシダーゼを挿入した。ｐＳＤ４０９においてＢｇｌII部位を取り除くために、ＢｇｌIIを用いてワクシニア配列（位置28,212）およびＢａｍＨＩを用いてｐＵＣ／ワクシニア結合部において該プラスミドを切断し、次いで連結処理（ライゲーショん）を行い、プラスミドｐＭＰ４０９Ｂを形成した。唯一のＳｐｈＩ部位（位置27,416）においてｐＭＰ４０９Ｂを切断した。以下の配列の合成オリゴヌクレオチドを用いる突然変異法（Guo他、1990；Mandecki，1986）によりＭ２Ｌをコードする配列を除去した。
0003940959.tif 000010
得られたプラスミドｐＭＰ４０９Ｄは、上記のようにＭ２Ｌ欠失座に挿入された唯一のＢｇｌII部位を含有する。ＢｇｌIIで切断されたｐＭＰ４０９Ｄに、１１ｋＤａのプロモーター（Bertholet他、1985）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＢａｍＨＩ（部分的）／ＢｇｌIIカセットを挿入した。得られたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ（Guo他、1990）をドナープラスミドとして用い、レスキューワクシニアウイルスｖＰ７２３との組換えを行った。Ｍ２Ｌ欠失座に挿入されたベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ７８４が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］が欠失されたプラスミドを、ＳｍａＩ、ＨｉｎｄIIIで切断され、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片で平滑末端化されたｐＵＣ８に組み込んだ。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｃ配列から成る左側のフランキングアームを得るために、ｐＳＤ４２０をＸｂａＩ（位置18,628）で分解した後、大腸菌ポリメラーゼのクレノウ断片を用いる平滑末端化およびＢｇｌII（位置19,706）を用いる分解を行った。ワクシニアＨｉｎｄIII Ｋ配列から成る右側のフランキングアームを選るには、ｐＳＤ４５１をＢｇｌII（位置29,062）およびＥｃｏＲＩ（位置29,778）で分解した。得られたプラスミドｐＭＰ５８１ＣＫは、ＨｉｎｄIII ＣのＢｇｌII部位（位置19,706）とＨｉｎｄIII ＫのＢｇｌII部位との間のワクシニア配列が欠失されている。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫにおけるワクシニア配列の欠失部位は図５に三角形で示している。
ワクシニア欠失部の過剰なＤＮＡを除去するため、プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫをワクシニア配列内のＮｃｏＩ部位（位置18,811；19,625）において切断し、Ｂａｌ−３１エクソヌクレアーゼを用いて処理し、さらに、以下の配列を有する合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:20）を用いる突然変異法（Mandecki，1986）に供した。
0003940959.tif 000011
得られたプラスミドｐＭＰＣＳＫ１Δは、12のワクシニアリーデンフレーム［Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ］を包含する18,805〜29,108位置のワクシニア配列が欠失されている。ｐＭＰＣＳＫ１Δとベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニアウイルスｖＰ７８４との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８０４が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
実施例６−リボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットを欠失させたプラスミドｐＳＤ５４８の構築
図６において、プラスミドｐＳＤ４０５は、ｐＵＣ８にクローニングされたワクシニアＨｉｎｄIII Ｉ（位置63,875〜70,367）を含有する。このｐＳＤ４０５をワクシニア配列内でＥｃｏＲＩにより、また、ｐＵＣ／ワクシニア結合部においてはＳｍａＩにより消化分解し、連結処理（ライゲーション）することによりプラスミドｐＳＤ５１８を形成した。ｐＳＤ５４８の構築に用いたワクシニア制限フラグメントは、全て、このｐＳＤ５１８由来のものである。
ワクシニアのＩ４Ｌ遺伝子は、67,371〜65,059の位置に延在している。Ｉ４Ｌの転写方向は、図６において矢印で示されている。Ｉ４Ｌのコード配列の一部が欠失したベクタープラスミドを得るために、ｐＳＤ５１８をＢａｍＨＩ（位置65,381）およびＨｐａＩ（位置67,001）を用いて分解し、且つ、大腸菌のクレノウ断片を用いて平滑末端化した。この4.8kbのベクターフラグメントを、ワクシニアの１１ｋＤａのプロモーター（Bertholet他、1985；Perkus他、1990）の制御下に大腸菌ベーターガラクトシダーゼ遺伝子（Shapira他、1983）を含有する3.2kbのＳｍａＩカセットに連結して、プラスミドｐＳＤ５２４ＫＢＧを得た。このｐＳＤ５２４ＫＢＧをドナープラスミドとして、ワクシニアウイルスｖＰ８０４との組換えを行った。Ｉ４Ｌ遺伝子の部分欠失位置にベーターガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５が、Ｘ−ｇａｌの存在下に青色プラークとして単離された。
ベーターガラクトシダーゼおよび残存するＩ４ＬのＯＲＦをｖＰ８５５から欠失させるために、欠失プラスミド５４８を構築した。以下に詳述し且つ図６に示すように、左側および右側のワクシニアフランキングアームをそれぞれ別個にｐＵＣ８に組み込んだ。
左側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ａ１／５１８Ａ２（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:21／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:22）に連結して、プラスミドｐＳＤ５３１を形成した。
0003940959.tif 000012
ＲｓａＩ（部分的）およびＢａｍＨＩでｐＳＤ５３１を切断し、2.7kbのベクターフラグメントを単離した。ＢｇｌII（位置64,459）でｐＳＤ５１８を切断して0.5kbのフラグメントを単離した。これらの２つのフラグメントを互いに連結して、Ｉ４Ｌのコード配列の左側の完全なワクシニアフランキングアームを含有するｐＳＤ５３７を形成した。
右側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構築するため、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでｐＵＣ８を切断し、以下に示す配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１／５１８Ｂ２（ＳＥＱＩＤ  NO:23／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:24）に連結して、プラスミドｐＳＤ５３２を形成した。
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このｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分的）／ＥｃｏＲＩで切断して2.7kbのベクターフラグメントを単離した。ｐＳＤ５１８を、ワクシニア配列内をＲｓａＩ（位置67,436）により、また、ワクシニア／ｐＵＣ結合部をＥｃｏＲＩによって切断して0.6kbのフラグメントを単離した。Ｉ４Ｌをコードする配列の右側の完全なフランキングアームを含有するｐＳＤ５３８を調製した。
右側のワクシニアフランキングアームは、ｐＳＤ５３８から0.6kbのＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラグメントとして単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIで切断されたｐＳＤ５３７内に連結した。得られたプラスミドｐＳＤ５３９においては、Ｉ４ＬのＯＲＦ（位置65,047〜67,836）がポリリンカー領域によって置換されており、該領域は左側を0.6kbのワクシニアＤＮＡにより、また右側を0.6kbのワクシニアＤＮＡにより挟まれており（フランキングされており）、これらは全てｐＵＣバックグランド内にある。ワクシニア配列内の欠失部は、図６において三角形で示している。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘導部分のベーターガラクトシダーゼが、組換えワクシニアウイルスｖＰ８５５内のベーターガラクトシダーゼと組換えを行う可能性を回避するため、ｐＳＤ５３９からワクシニアＩ４Ｌ欠失カセットを取り除いてｐＲＣ１１とした。このｐＲＣ１１は、すべてのベーターガラクトシダーゼが除去され、ポリリンカー領域で置換されたｐＵＣ誘導体である（Cokins他、1990）。ｐＳＤをＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断して1.2kbのフラグメントを単離した。このフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩで切断したｐＲＣ１１（2.35kb）に連結して、ｐＳＤ５４８を形成した。ｐＳＤ５４８とベーターガラクトシダーゼ含有ワクシニア組換え体ｖＰ８５５との間に組換えを行わせることにより、ワクシニア欠失変異体ｖＰ８６６が得られ、Ｘ−ｇａｌの存在下に明瞭なプラークとして単離された。
組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６由来のＤＮＡの分析は、制限酵素分解、次にアガロースゲル上の電気泳動法により行った。制限パターンは予測どおりであった。鋳型としてｖＰ８６６および上で詳述した６つの欠失遺伝子座を挟むプライマーを用いるポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）（Engelke他、1988）により予測された大きさのＤＮＡフラグメントが得られた。ＰＣＲで得られたフラグメントの欠失接合領域近傍の配列分析により、接合が期待どおりであることが確認された。上述したような６つの欠失部を有するように工夫した組換えワクシニアウイルスｖＰ８６６をワクシニアウイルス株「ＮＹＶＡＣ」と命名した。
実施例７−ＮＹＶＡＣへの狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子の挿入
ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b）の制御下に狂犬病（ウイルス）糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子をＴＫ欠失プラスミドｐＳＤ５１３に挿入した。ｐＳＤ５１３は、ポリリンカーが存在している点を除いては、ｐＳＤ４６０（図１）と同一である。
図７に示すように、ｐＳＤ４６０をＳｍａＩで切断し、以下の配列を有するアニーリングされた合成オリゴヌクレオチドＶＱ１Ａ／ＶＱ１Ｂ（ＳＥＱ  ＩＤNO:25／ＳＥＱ  ＩＤ  NO:26）に連結することにより該ポリリンカーを挿入することにより、ベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成した。
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このｐＳＤ５１３をＳｍａＩで切断し、ワクシニアＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b）の制御下に狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする遺伝子を含有し、ＳｍａＩ末端から成る1.8kbのカセットに連結した。得られたプラスミドをｐＲＷ８４２と命名した。このｐＲＷ８４２をドナープラスミドとして用い、ＮＹＶＡＣレスキューウイルス（ｖＰ８６６）と組換えを行った。狂犬病糖タンパク質Ｇをコードする配列に対する32Ｐラベル化プローブを用いるプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスｖＰ８７９を同定した。
本発明の変性組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとして幾つかの利点を有する。すなわち、ベクターのビルレンスが弱毒化されているので、ワクチン接種による被接種者が無制御（ランナウェー）感染する可能性が減少し、さらに、感染者から非感染者への伝染や環境の汚染も少なくするという利点を有する。
さらに、本発明の変性組換えウイルスは、インビトロ培養される細胞内で遺伝子産生物を発現させるのに用いることもでき、このためには、該細胞内で遺伝子産生物をコードし発現する外来遺伝子を有する本発明の変性組換えウイルスを該細胞に導入すればよい。
実施例８−狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣ組換え体の構築
この実施例は、カナリアポックスウイルスベクターＡＬＶＡＣおよびカナリアポックス−狂犬病ウイルス組換え体ＡＬＶＡＣ−Ｒ（ｖＣＰ６５）の調製ならびにその安全性と効力について記述するものである。
細胞およびウイルス  親カナリアポックスウイルス（Rentschler株）はカナリア用ワクチン株の１つである。このワクチン株は野性型の単離物から入手され、にわとり胚繊維芽細胞による200回以上の連続的な継代培養により弱毒化されたものである。マスターウイルス種株は、寒天培地下の４回の連続的なプラーク精製に供され、さらに、プラーククローンの１つが５回の追加の継代培養により増殖された後、該保存ウイルスが親ウイルスとしてインビトロ組換え試験に用いられた。プラーク精製されたカナリアポックス単離物は、ＡＬＶＡＣと命名されている。
カナリアポックス挿入ベクターの構築  880bpのカナリアポックスＰｖｕIIフラグメントを、ＰＵＣ９のＰｖｕII部位間にクローニングしてｐＲＷ764.5を調製した。このフラグメントの配列は、図８（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:27）において1372〜2251位置に示されている。Ｃ５として指称されているオープンリーディングフレームの範囲を確認した。このオープンリーディングフレームは、該フラグメント内の位置１６６（166位）で開始され且つ位置４８７（487位）で終結されていることが明らかにされた。オープンリーディングフレームを阻害することなくＣ５の欠失を行った。位置１６７から位置４５５までの塩基を、配列（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:28）GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTと置換した。この置換配列は、ＨｉｎｄIII、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ挿入部位と、それに後続しワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される翻訳停止シグナルおよび転写終結シグナルを含有している（Yuen他、1987）。Ｃ５オープンリーディングフレームの欠失は以下のように行った。プラスミドｐＲＷ764.5をＲｓａＩで部分的に切断して線状の生成物を単離した。このＲｓａＩ線状フラグメントをＢｇｌIIで再切断し、かくして、位置１５６から位置４６２までのＲｓａＩからＢｇｌIIまでが欠失したｐＲＷ764.5フラグメントを単離し、以下の合成オリゴヌクレオチド用ベクターとして使用した。
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オリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６をアニーリングし、上述のｐＲＷ764.5 ＲｓａＩおよびＢｇｌIIベクターに挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３１と命名した。
狂犬病Ｇ遺伝子を含有する挿入ベクターの構築  以下にｐＲＷ８３８の構築について説明する。ＡからＥのオリゴヌクレオチド（狂犬病ウイルスＧのＨ６プロモーターの開始コドンと重なっている）をｐＵＣ９にクローニングしてｐＲＷ７３７とした。オリゴヌクレオチドＡ〜ＥはＨ６プロモーターを含有し、ＮｒｕＩで始まり、狂犬病ウイルスＧのＨｉｎｄIIIに到り、その後にＢｇｌIIがある。オリゴヌクレオチドＡ〜Ｅ（（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:31）〜（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:35））の配列は以下のとおりである。
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また、アニーリングされたオリゴヌクレオチドＡ〜Ｅを図解すると次のようになる。
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オリゴヌクレオチドＡ〜Ｅをキナーゼ処理し、アニーリングし（95℃で５分間、その後、室温に冷却）、ｐＵＣ９のＰｒｕII部位間に挿入した。得られたプラスミドｐＲＷ７３７をＨｉｎｄIIIおよびＢｇｌIIで切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲＯ（Kieny他、1984）のＨｉｎｄIII−ＢｇｌIIの1.6kbpフラグメント用ベクターとして使用してｐＲＷ７３９を調製した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯＨｉｎｄIII部位は、狂犬病Ｇの翻訳開始コドンの86bp下流にある。また、ｐｔｇ１５５ＰＲＯにおいて、ＢｇｌIIは狂犬病Ｇ翻訳停止コドンの下流にある。ｐＲＷ７３９をＮｒｕＩ用いて部分切断し、さらにＢｇｌIIを用いて完全切断し、かくして、既知のＨ６プロモーター（Taylor他、1988a,b；Guo他、1989；Perkus他、1989）の３′末端から狂犬病Ｇの全遺伝子までを含有する1.7kbpのＮｒｕＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐＲＷ８２４のＮｒｕＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に挿入した。得られたプラスミドをｐＲＷ８３２と命名する。ｐＲＷ８２４に挿入することにより、ＮｒｕＩのＨ６プロモーターの５′が付加された。ＳｍａＩの前のＢａｍＨＩのｐＲＷ８２４の配列は、GGATCCCCGGG（ＳＥＱ  ＩＤ  NO:36）である。ｐＲＷ８２４は、ワクシニアウイルスのＨ６プロモーターに非関連遺伝子が正確に結合されたプラスミドである。ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩを用いる分解によりこの非関連遺伝子を切除した。このｐＲＷ８３２のＳｍａＩの1.8kbpフラグメント（Ｈ６をプロモーターとする狂犬病Ｇを含有している）をｐＲＷ８３１のＳｍａＩに挿入して、プラスミドｐＲＷ８３８を調製した。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧの調製  既知のリン酸カルシウム沈降法を用いて（Panicali他、1982；Piccini他、1987）、ＡＬＶＡＣ感染初代ＣＥＦ細胞にｐＲＷ８３８をトランスフェクトさせた。特定の狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションにより陽性クローンを選択し、純粋な集団が得られるまで６回の連続的なプラーク精製に供した。次に、代表プラークを増殖して、得られたＡＬＶＡＣ組換え体をＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）と命名した（図９Ａおよび図９Ｂ参照）。配列分析により、狂犬病Ｇ遺伝子がＡＬＶＡＣゲノム内に正しく挿入され、その後の変異が生じていないことを確認した。
免疫蛍光  成熟狂犬病ウイルス粒子が形成される最終段階においては、糖タンパク質成分はゴルジ体から形質膜に移送され、そこで、細胞膜質および細胞膜の外表面にあるタンパク質本体にカルボキシ末端を延ばしながら蓄積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が正しく存在していることを確認するために、ＡＬＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ＲＧで感染された初代ＣＥＦ細胞上で免疫蛍光測定法を実施した。この免疫蛍光法は、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、狂犬病Ｇのモノクローナル抗体を用いて行った。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ細胞においては強い表面蛍光が検出されたが、親のＡＬＶＡＣには蛍光は認められなかった。
免疫沈降  初代ＣＥＦ細胞、ベロ（Vero）細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）、およびＭＲＣ−５細胞（正常なヒト胎児肺臓由来の繊維芽細胞類似の細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171）から予め形成した単層に、既知の手法（Taylor他、1990）に従い、放射ラベルした35Ｓ−メチオニンの存在下に、１０ｐｆｕ／細胞で、親ウイルスＡＬＶＡＣおよび組換えウイルスＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。免疫沈降反応は、狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いて行った。組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧの場合は、分子量がおよそ67kDaの狂犬病特異的糖タンパク質が効率的に発現していることが検出された。非感染細胞または親ウイルスであるＡＬＶＡＣが感染された細胞においては、狂犬病特異的生成物の検出は認められなかった。
連続継代培養実験  ＡＬＶＡＣを広範囲の非トリ種に適用した研究では、感染の増幅や明白な病気は認められていない（Taylou他、1991b）。しかしながら、親ウイルスおよび組換えウイルスのいずれも非トリ細胞では増殖できないことを確認するため、連続的な継代培養実験を行った。
以下の細胞基質に２種類のウイルス、すなわち、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種して10代の連続的な盲検（ブラインド）継代培養を行った。
(1)11日齢の白色レグホーン胚由来の初代ニワトリ繊維芽（ＣＥＦ）細胞；
(2)ベロ（Vero）細胞−アフリカミドリザルの腎臓細胞由来の無限増殖性細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81）；および
(3)ＭＲＣ−５細胞−ヒト胎児の胚組織由来の二倍体細胞系（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171）。
各細胞につき３ヶの60mm培養皿を用い各皿に２×106ヶの細胞が含有されるようにして、0.1pfu／細胞のm.o.i.で最初の接種を行った。培養皿の１つは、ＤＮＡ複製の阻害剤であるシトシンアラビノシド（Ara Ｃ）40μg/mlの存在下に接種を行った。37℃で１時間の吸着期間の後、接種物を除去し、単層を洗浄して非吸着ウイルスを取り除いた。この時点で、培地の置換を行い、２つの培養皿（サンプルｔ０およびサンプルｔ７）には５mlのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳを入れ、また、第３番目の培養皿（サンプルｔ７Ａ）には40μg/mlのAra Ｃを含有する５mlのＥＭＥＭ＋２％ＮＢＣＳを入れた。サンプルｔ０は−70℃で凍結して残存する導入ウイルスの指標とした。サンプルｔ７およびサンプルｔ７Ａは37℃で７日間培養し、その後、内容物をハーベストし、間接音波処理により細胞を破砕した。
各細胞基質のサンプルｔ７の１mlを同じ細胞基質の３つの培養皿に稀釈せずに接種し（サンプルｔ０、ｔ７およびｔ７Ａとする）、さらに、初代ＣＥＦ細胞の１つの培養皿に接種した。サンプルｔ０、サンプルｔ７およびサンプルｔ７Ａは継代用に処理した。ＣＥＦ細胞への追加接種は、非トリ細胞中に存在し得るようなウイルスに対する高感度検出用の増殖工程に供した。
この操作を繰り返して、10代の連続ブラインド継代培養（ＣＥＦおよびＭＲＣ−５）または８代の連続ブラインド継代培養を行った。サンプルを凍結し、３回解凍して初代ＣＥＦ単層上で滴定を行うことにより分析した。
次に、寒天培地下にＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を測定した。実験結果をまとめて図１および図２に示す。
この結果から、親のＡＬＶＡＣおよび組換え体のＡＬＶＡＣ−ＲＧの両方とも、ＣＥＦ単層上で複製を持続する能力を有し力価の損失はないことが示されている。ベロ（Vero）細胞においては、ＡＬＶＡＣについては第２代後、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧについては第１代後にウイルスのレベルは検出レベル以下に低下した。ＭＲＣ−５においても同様の結果が示され、第１代後にはウイルスが検出されなかった。図１および図２には第４代までの結果しか示していないが継代培養を第９代（Vero）および第10代（ＭＲＣ−５）まで行ったところ、これらの非トリ細胞においてはいずれのウイルスも検知可能となるように成長適応化していなかった。
第１代においては、ＭＲＣ−５細胞およびVero細胞のｔ７サンプルには比較的高レベルのウイルスが存在した。しかしながら、このレベルは、ｔ０サンプルおよびウイルスの複製が起こり得ないようにシトシンアラビノシドの存在下に接種を行ったｔ７Ａサンプルにおいて見られるレベルに等しかった。このことは、非トリ細胞において７日目に認められたウイルスレベルは、残存ウイルスを表し新たに複製されたウイルスではないことを示している。
分析をさらに高感度にするため、各細胞基質から７日目にハーベストしたものの一部を、許容ＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰＥ）が認められた時にハーベストするか、またはＣＰＥが示されない場合は７日目にハーベストした。この実験結果を図３に示す。許容細胞基質による増殖後においも、ＭＲＣ−５細胞およびVero細胞においては、更に２代の継代でウイルスが検出されるでけであった。これらの結果から、採用した条件下では、Vero細胞またはＭＲＣ−５細胞においてはいずれのウイルスも増殖できるように適応化できないことが明らかである。
アカゲザルへの接種  ＨＩＶに関して血清反応陽性の４匹のアカゲザルに先ずＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した（表４）。100日後、該動物に再接種してブースター効果を調べ、さらに、追加の７匹のアカゲザルにいろいろな投与量で接種を行った。適当な間隔で血液を抜き出し、56℃において30分間の加熱不活性化後、迅速蛍光フォーカス阻止（Rapid Fluorescent Focus Inhibition：ＲＦＦＩ）分析法（Smith他、1973）により狂犬病ウイルス抗体の存在を血清分析した。
チンパンジーへの接種  オトナのオスのチンパンジー２匹（体重範囲50〜65kg）に、ｖＣＰ６５を１×107pfuで筋肉内また皮下接種した。該動物の反応を観察し、また、規則的な間隔で採血を行いＲＦＦＩテスト（Smith他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体の存在を分析した。最初の接種から13週間後、同じ投与量で該動物に再接種した。
マウスへの接種  グループ分けしたマウスに、異なるバッチ由来のｖＣＰ６５をいろいろな希釈度で50〜100μｌ接種した。マウスへの接種は肉趾に接種した。14日目に、狂犬病ウイルスのビルレント性ＣＶＳ株を15〜43マウスＬＤ50で頭蓋内接種することによりマウスのチャレンジを行った。マウスの生存率を監視し、接種から28日目における50％防御投与量（ＰＤ50）を求めた。
イヌおよびネコへの接種  10匹のビーグル犬（５ヶ月齢）および10匹のネコ（４ヶ月齢）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.7または7.7log10ＴＣＩＤ50で皮下接種した。４匹のイヌおよび４匹のネコには接種を行わなかった。接種後14日および28日後にそれらの動物の採血を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病ウイルス抗体を分析した。6.7log10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧが投与された動物については、接種後29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルスチャレンジ株の3.7log10（マウスＬＤ50）（ビーグル犬）または4.3log10（マウスＬＤ50）（ネコ）を用いてチャレンジを行った。
リスザルへの接種  各グループに４匹のリスザル（Saimiri Sciureus）から成る３グループのリスザルに、３種類のウイルスの１つ、すなわち、(a)ＡＬＶＡＣ（カナリアポックス親ウイルス）、(b)ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組換体、または(c)ｖＣＰ３７（ネコ白血病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質を発現するカナリアポックス組換え体）を接種した。接種はケタミン麻酔下に実施した。各動物は以下を同時に投与された：(1)乱刺を行わずに右目の表面に滴注された20μｌ、(2)口中に数滴として100μｌ、(3)右腕の外表面の毛をそった皮膚内の２つの注射部位にそれぞれ100μｌ；および(4)右大腿の前部筋肉に100μｌ。
４匹のサルに各ウイルスを接種し、２匹についてはlog10pfuとして全量5.0とし、また、他の２匹についてはlog10pfuとして7.0とした。規則的な間隔で該動物の採血を行い、血清を分析してＲＦＦＩテスト（Smith他、1973）により抗狂犬病ウイルス抗体を調べた。接種に対する該動物の反応を毎日観察した。最初の接種から６ヶ月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与された４匹のリスザル、ｖＣＰ３７が当初投与された２匹のリスザルに加えて非投与のリスザル１匹に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを6.5log10pfuで皮下接種した。血清を分析して、ＲＦＦＩテスト（Smith他、1973）により狂犬病ウイルス中和抗体の存在を調べた。
ヒト細胞系へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種  当該ウイルスが複製しない非トリ細胞内で外来遺伝子が効率的に発現されるか否かを判定するため、５種類の細胞系、すなわち、１種類のトリ系および４種類の非トリ系について分析を行い、ウイルス収量、外来狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的ＤＮＡ蓄積を調べた。接種した細胞は次のとおりである。
(a)Vero細胞。アフリカミドリザル腎臓細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ81。
(b)ＭＲＣ−５細胞。ヒト胎児肺細胞。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171。
(c)ＷＩＳＨ細胞。ヒト羊膜由来。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ25。
(d)Detroit-532細胞。ヒト包皮由来。ダウン症候群。ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。
(e)初代ＣＥＦ細胞。
11日齢白色レグホーン胚由来のニワトリ胚繊維芽細胞を陽性対象として用いた。接種は全て、下記のように予め調製した２×106細胞から成る単層に実施した。
Ａ．ＤＮＡ分析法。
各細胞系について３ヶの培養皿を用い、被試験ウイルスを５pfu／細胞で接種し、さらに、各細胞系について１ヶの培養皿を追加し非接種用とした。培養皿の１つについては、40μg/mlのシトシスアラビノシド（Ａｒａ  Ｃ）の存在下に培養を行った。37℃において60分間の吸着期間の後、接種物を除き、単層を２回洗浄して非吸着ウイルスを除去した。次いで、培地（Ａｒａ  Ｃを含有するもの、または含有しないもの）の交換を行った。培養皿の１つ（Ａｒａ  Ｃを含有しないもの）からは、時間ゼロにおけるサンプルとして細胞をハーベストした。残りの皿は、37℃で72時間保持した後、細胞をハーベストしてＤＮＡ蓄積の分析に用いた。２×106細胞から成る各サンプルを40ｍＭのＥＤＴＡを含有する0.5mlのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に再懸濁して37℃で５分間保温した。42℃で予め加温し120ｍＭのＥＤＴＡを含有する等体積の1.5％アガロースを細胞懸濁液に添加してゆっくり混合した。該懸濁液をアガロースプラグモールドに移し、少なくとも15分間放置して硬化させた。次いで、アガロースプラグを取り除き、該プラグを覆うような体積の溶解緩衝液（１％のサルコシル、100μg/mlのプロティナーゼＫ10ｍＭのトリスＨＣｌ  ｐＨ7.5、200mlのＥＤＴＡ）内で50℃において12〜16時間インキュベートした。次に、該溶解緩衝液を5.0mlの無菌0.5×ＴＢＥ（44.5mlのトリス−ボロン酸、44.5ｍＭのボロン酸、0.5ｍＭのＥＤＴＡ）と置換して、ＴＢＥ緩衝液を３回変えながら４℃において６時間平衡化した。パルス電場式電気泳動装置を用いて細胞ＲＮＡおよびＤＮＡからプラグ内にあるウイルスＤＮＡを分別した。電気泳動は、ランプ50〜90秒とし0.5×ＴＢＥ内で15℃において、180Ｖで20時間実施した。ラムダＤＮＡを分子量標準としてＤＮＡを走行させた。電気泳動後、エチジウムブロミドで染色することによりウイルスＤＮＡのバンドを可視化した。次にＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮＡから調製した放射ラベル化プローブを用いて分析した。
Ｂ．ウイルス収量の推定
培養皿への接種は上記と同じように行った。但し、感染多重度は0.1pfu／細胞とした。感染72時間後、凍結および解凍サイクルを３回連続的に実施することにより細胞を溶解した。ＣＥＦ単層上でプラーク滴定を行うことによりウイルス収量を調べた。
Ｃ．狂犬病Ｇ遺伝子の発現の分析
組換えウイルスまたは親ウイルスを10pfu／細胞の多重度で培養皿に接種するとともに、追加の皿を非感染ウイルス対照用とした。１時間の吸着期間の後、培地を除去し、無メチオニン培地と置換した。30分後、この培地を、25μCi/mlの35Ｓ−メチオニンを含有する無メチオニン培地と置換した。感染細胞を一晩かけて（約16時間）ラベル化し、次に、Ａ緩衝液を添加することにより溶解した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用い既知の手法に従い（Taylor他、1990）、免疫沈降を実施した。
結果：ウイルス収量の推定
細胞当たり0.1pfuで接種した72時間後に行ったウイルス収量を求める滴定分析の結果を表５に示す。この結果が示すように、トリ細胞においては強い感染が生じ得るが、４種類の非トリ細胞系においてはこの方法ではウイルス収量の増加を検知することはできない。
ウイルスＤＮＡの蓄積の分析  ＤＮＡ複製の前または後に非トリ細胞におけるウイルス複製の阻害が生じたか否かということを判定するために、細胞リゼイト（溶菌液）からのＤＮＡを電気泳動法により分画し、ニトロセルロースに移し、ウイルス特異的ＤＮＡを探査した。非感染ＣＥＦ細胞、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染細胞、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞および接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞（40μg/mlのシトシンアラビノシド存在下）由来のＤＮＡはいずれもある程度のバックグランド活性を示したが、これは、おそらく、放射ラベル化ＡＬＶＡＣ  ＤＮＡプローブの調製に際して混入したＣＥＦ細胞ＤＮＡに因るものと思われる。しかしながら、接種72時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞は、約350kbpの領域にＡＬＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡの蓄積を表す強いバンドを示した。ＤＮＡ合成阻害剤であるシトシンアラビノシドの存在下に培養物をインキュベートしてもそのようなバンドは検出されなかった。
Vero細胞で得られた相応するサンプルについては、時間ゼロにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染Vero細胞において約350kbpにおいて非常に弱いバンドが示された。このレベルは残存ウイルスを表すものであった。接種72時間後にはバンド強さが増加されており、このことは、Vero細胞においてはある程度のレベルのウイルス特異的ＤＮＡ複製が起こったが、ウイルス子孫の増加を生じさせはしなかったということを示唆している。ＭＲＣ−５細胞で得られた相応するサンプルにおいては、これらの条件下でウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は検出されなかった。この実験を広げ、追加のヒト細胞系、すなわちＷＩＳＨ細胞およびDetroit-532細胞についても実施した。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞を陽性対照とした。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種されたＷＩＳＨ細胞およびDetroit細胞のいずれにおいてもウイルス特異的ＤＮＡ蓄積は検出されなかった。なお、この方法の検出限界は完全には確認されておらず、ウイルスＤＮＡ蓄積は起こっているのかも知れないが、該方法の感度よりも低いレベルであろう。3Ｈ−チミジンを導入することによりウイルスＤＮＡ複製が測定されるようにした他の実験は、Vero細胞およびＭＲＣ−５細胞に関して得られた上記の結果を支持している。
狂犬病遺伝子の発現分析  ウイルス遺伝子、特に挿入された外来遺伝子の発現が、ウイルスＤＮＡ複製の非存在下においてもヒト細胞系で起こっているか否かを判定するために、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたトリ系細胞および非トリ系細胞由来の35Ｓ−メチオニンラベル化リゼイトについて免疫沈降実験を実施した。狂犬病Ｇ特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降実験の結果、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを感染させたＣＥＦ、Vero、ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨおよびDetroitの各細胞において67ｋＤａの糖タンパク質から成る特異的免疫沈降が認められた。非感染細胞および親ウイルスを感染させた細胞のリゼイトのいずれにおいても、そのような特異的狂犬病遺伝子産物は検出されなかった。
この実験結果が示唆することは、分析したヒト細胞系においては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換え体はＨ６初期／後期ワクシニアウイルスプロモータの転写制限下に感染を開始し外来遺伝子産物を発現させることはできるが、ＤＮＡ複製を介する複製は進行せず、また、検知され得るようなウイルス子孫は産生しなかったということである。Vero細胞においては、ある程度のレベルのＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ複製は認められたが、この方法ではウイルス子孫は検出されなかった。これらの結果から、分析したヒト細胞系においてはウイルス複製の阻止はＤＮＡ複製の開始前に起こるが、Vero細胞においてはウイルスＤＮＡ複製の開始後に該阻止が起こるのであろう。
ＡＬＶＡＣ−ＲＧ内で発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性を有するか否かを判定するために、多くの動物種に該組換え体を接種してテストした。現行の狂犬病ワクチンの効力はマウスモデル系で評価されている。そこで、ＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いて同様のテストを行った。感染力価が6.7から8.4（log10（ＴＣＩＤ50/ml））の範囲にある９種類のウイルス調製物（種ウイルスを10回組織培養による継代培養して得られたワクチンバッチ(J)を含む）を連続的に稀釈し、50〜100μｌの稀釈液を４週齢から６週齢のマウスの肉趾に接種した。14日後に、マウスＬＤ50（対照用マウスグループにおける致死滴定量から求めた）が15から43の狂犬病ウイルスＣＶＳ株300μｌを頭蓋内投与してマウスをチャレンジした。ＰＤ50（50％防御投与量）として表す効力をチャレンジから14日目に計算した。実験結果を表６に示す。この結果から、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは狂犬病ウイルスのチャレンジに対して恒常的にマウスを防御することができ、ＰＤ50値は、3.33から4.56の範囲にあり平均値3.73（ＳＴＤ0.48）であることが示されている。追加実験として、6.0log10ＴＣＩＤのＡＬＶＡＣ−ＲＧを含有するウイルス50μｌまたは等体積の非感染細胞懸濁液をオスのマウスに頭蓋内接種した。接種から１日、３日および６日目にマウスを殺し、その脳を取り出し、固定化し薄片に切断した。組織病理学検査によれば、マウス内にＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は認められなかった。
イヌおよびネコに対するＡＬＶＡＣ−ＲＧの安全性および効力を評価するため、14ヶ月齢および５ヶ月齢のビーグル犬、ならびに14ヶ月齢および４ヶ月齢のネコから成るグループの分析を行った。該イヌおよびネコのそれぞれについて４匹にはワクチン接種を行わなかった。該動物の５匹には6.7log10ＴＣＩＤ50で皮下投与した。動物の採血を行い、抗狂犬病抗体の分析を行った。非投与または6.7log10ＴＣＩＤのＡＬＶＡＣ−ＲＧを投与した動物に対しては、接種から29日目に、ＮＹＧＳ狂犬病ウイルスチャレンジ株の3.7log10（マウスＬＤ50）（ビーグル犬、側部筋に）または4.3log10（マウスＬＤ50）（ネコ、頚部に）を用いてチャレンジを行った。実験結果を表７に示す。
ネコおよびイヌのいずれにおいて且ついずれの接種ウイルス投与量においても接種に対する副作用は認められなかった。6.7log10ＴＣＩＤ50で免疫された５匹のイヌのうち４匹は、ワクチン接種14日目に抗体力価を示し、29日目には全てのイヌが抗体力価を有した。全てのイヌが、４匹の対照用イヌの３匹を殺したようなチャレンジに対して防御された。ネコの場合、6.7log10ＴＣＩＤ50で投与された５匹のネコのうち、３匹が14日目に特異的抗体力価を有し、そして、29日目には全てが陽性となったが、平均抗体力価は低く2.9ＩＵであった。対照用ネコの全てを殺したようなチャレンジに対して、５匹のネコのうち３匹が生存した。7.7log10ＴＣＩＤ50で免疫したネコは全て14日目に抗体力価を示し、29日目には幾何平均力価は8.1国際単位（ＩＵ）であった。
ＡＬＶＡＣ、ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび非関連カナリアポックスウイルス組換え体の接種に対するリスザル（Saimiri Sciureus）の免疫応答を試験した。幾つかのグループに分けたリスザルに上述したように接種を行い、血清を分析して狂犬病特異的抗体の有無を調べた。皮内投与に対する軽い典型的な皮膚反応を除いては、いずれのサルにおいても副作用は認められなかった。投与から２日目および４日目だけは、皮内接種後の皮膚損傷部から少量の残留ウイルスを単離した。７日目以降は全て陰性であった。筋注に対する局部反応は認められなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧが接種された４匹のサルは全て、ＲＦＦＩテスト測定すると、抗狂犬病血清中和抗体を産生してた。最初の接種から約６ヶ月後、全てのサルおよび追加の非接種サル１匹に、左側大腿部の外表面に6.5log10ＴＣＩＤ50のＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下経路で再接種した。血清を分析して抗狂犬病抗体の存在を調べた。結果を表８に示す。
狂犬病ウイルス未感染の５匹のサルのうち４匹は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種７日後に血清学的応答を示した。接種11日後には５匹のサル全てが検出可能な抗体を有した。予め狂犬病糖タンパク質に感染された４匹のサルについては、ワクチン接種から３日から７日の間に血清中和力価に有意の増加が認められた。この結果から、リスザルにＡＬＶＡＣ−ＲＧをワクチン接種すると副作用は生じず、一次中和抗体応答が誘起され得ることが示された。ＡＬＶＡＣに、または非関連外来遺伝子を発現するカナリアポックス組換え体に予め感染していても、再ワクチン接種に際して、抗狂犬病免疫の誘発を妨げない。
ＨＩＶ−２に関して血清反応陽性のアカゲザルにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ接種に対する免疫応答を調べた。該動物に上述のように接種を行い、ＲＦＦＩテストにより抗狂犬病血清中和抗体の有無を分析した。表９に結果を示すように、皮下接種されたＨＩＶ−２陽性アカゲザルは、１回の接種から11日目までに抗狂犬病抗体を産生した。最初の接種から約３ヶ月後に与えたブースター接種後に既往応答が検出された。該組換え体が経口投与された動物には何らかの応答も検出されなかった。更に、一連の６匹のアカゲザルに投与量を減少させながらＡＬＶＡＣ−ＲＧを筋肉内または皮下投与した。接種された６匹のうち５匹がワクチン接種から14日目までに応答を示したが抗体力価に有意の差は無かった。
以前にＨＩＶ感染した２匹のチンパンジーに7.0log10pfuのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下または筋肉内接種した。該接種から３ヶ月後に両チンパンジーに同じ方法で再ワクチン接種した。結果を表10に示す。
筋肉内または皮下接種のいずれにおいても接種に対する副作用は見られなかった。いずれのチンパンジーも初回接種から14日目までに応答し、そして、再接種後に応答の強い増強が検出された。
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実施例９−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリアポックス（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５）を用いるヒトの免疫化
実施例９および図９Ａおよび図９Ｂで記述したようにＡＬＢＡＣ−ＲＧ（ｖＣｐ６５）を調製した。スケールアップおよびワクチン生産のため、ＳＰＦ卵由来の初代ＣＥＦにおいてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ）を増殖させた。細胞を0.1の多重度で感染させ、37℃において３日間インキュベートした。
該感染細胞から成る無血清培地中で超音波破砕することによりワクチンウイルスの懸濁液を得た。次に、細胞破片を遠心分離とろ過により取り除いた。得られた清澄な懸濁液に凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を加え、単一投与用バイアル内に分散させ、凍結乾燥した。凍結乾燥の前に、無血清培地および凍結乾燥剤の混合物に入れたウイルス懸濁液を連続的に10倍稀釈することにより力価が徐々に低下した３種類のバッチを調製した。
細胞基質、培地およびウイルス種株ならびに最終生成物には品質管理試験を行った。望ましくない特徴は見出されなかった。
前臨床データ  インビトロ試験によれば、ＶＥＲＯ細胞またはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の増殖を支持せず、８回の連続継代培養（ＶＥＲＯの場合）および10回の連続継代培養（ＭＲＣの場合）によって、これらの非トリ細胞系において当該ウイルスが検出され得るように増殖適応化されないことが示された。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）が感染または接種されたヒト細胞系（ＭＲＣ−５、ＷＩＳＨ、Detroit-532、ＨＥＬ、ＨＮＫまたはＥＢＶ形質転換リンパ芽球細胞）の分析では、ウイルス特異的ＤＮＡの蓄積は認められず、これらの細胞においてはＤＮＡ合成の前に複製の阻害が起こることが示唆された。しかしながら、重要なことには、試験された全ての細胞系において狂犬病ウイルス糖タンパク質の発現から、カナリアポックス複製サイクルにおける不稔過程はウイルスＤＮＡ複製に先行して起こることが示唆された。
一連の動物実験においてＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の安全性と効力が明らかにされた。多数の動物種、例えばカナリア、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、実験用げっ歯類（マウスの乳獣および成獣）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、リスザル、アカゲザルおよびチンパンジーに、105から108pfuの投与量範囲で接種が行われた。各種の投与経路を検討し、最も一般的には皮下、筋肉内および皮下投与であったが、経口（サル類およびマウス）や頭蓋内投与（マウス）も採用した。
カナリアにおいては、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）は、乱刺部位に「癒着」損傷を引き起こしたが、疾病や死亡の徴候はなかった。ウサギへの皮内接種は典型的なポックスウイルス接種反応を示したが、この反応が拡がることはなく、７日から10日で治癒した。いずれの動物においてもカナリアポックスに因る副作用は無かった。げっ歯類、イヌ、ネコおよび霊長動物にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ）を接種した後、迅速蛍光フォーカス阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）によって測定すると、抗狂犬病抗体が産生していることにより免疫原性があることが明らかにされた。また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫したマウス、イヌ、およびネコに狂犬病ウイルスをチャレンジすることにより防御機能が発現することも明らかにされた。
ボランティア  狂犬病免疫化の前略のない年齢20〜45才の25人の健康な成人を登録した。病歴調査、身体検査および血液の化学分析を行うことにより、これらのボランティアの健康状態を調べた。妊娠、アレルギー症、あらゆる種類の免疫低下症、慢性的な衰弱症、がん、過去３ヶ月以内の免疫グロブリンの投与、およびヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）またはＢ型肝炎表面抗原に対する血清反応陽性を有する者は排除した。
試験計画  標準的なヒトジプロイド細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）（フランスLyonのPasteur Merieux Serum & Vaccine製）または対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）のいずれかが投与されるようにボランティアを無作為に振り分けた。
この試験は投与量（用量）漸増試験とした。３つのバッチ由来の試験対象ワクチンＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）を３グループのボランティア（グループＡ，ＢおよびＣ）に２週間間隔で逐次的に使用した。それらの３つのバッチの濃度は、それぞれ、１回の投与当たり、103.5、104.5および105.5ＴＣＩＤ50（Tissue Culture Infectious Dose：50％組織培養感染量）とした。
各ボランティアには、２週間間隔で三角筋域に同一のワクチンを２回皮下投与（注射）した。最初の投与時にはボランティアには投与ワクチンの種類を知らせないが、研究者には分かるようにした。
第２回目の投与時に即時過敏症を可及的に少なくするため、実験対象ワクチンの中間用量が投与されるように割り当てられたグループＢのボランティアには、１時間前に低用量を投与し、また、高用量グループ（グループＣ）のボランティアには１時間間隔で低用量および中間用量を逐次投与した。
６ヶ月後、最も高用量のＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者（グループＣ）およびＨＤＣワクチンの被投与者に第３回目のワクチン投与を行った。次に、該被投与者を無作為に分けて以前と同一のワクチンまたは別のもう一方のワクチンを投与した。このようにして、以下の免疫化スケジュールに対応する４つのグループを構成した：１．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＨＤＣ；２．ＨＤＣ、ＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）；３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）。
副作用の観察  すべての被験者を投与１時間後に観察し、さらに次の５日間にわたり毎日検査した。次の３週間、局部反応および全身反応について尋ね、１週間に２度、電話により質問した。
実験室における分析  登録前、ならびに各投与後２日目、４日目および６日目に血液標本を採取した。実施した分析には、血球数、肝臓酵素およびクレアチンキナーゼの分析を含む。
抗体分析  最初の投与の７日前ならびに実験開始から７日、28日、35日、56日、173日、187日および208日目に抗体分析を行った。
中和抗体のレベルの測定には、迅速蛍光フォーカス阻害テスト（ＲＦＩＩＴ）（Smith他、1973）を採用した。カナリアポックス抗体は、直接ＥＬＩＳＡにより測定した。これには、抗原、すなわち、0.1％Triton×100で破砕した精製カナリアポックスウイルスの懸濁液をマイクロプレートに被覆した。血清の固定化稀釈液を室温下で２時間反応させ、ペルオキダーゼでラベルした抗ヒトＩｇＧヤギ抗体を用いて反応性抗体を出現させた。結果を490mmにおける光学密度として表した。
分析  25名を被験者として登録し試験を行った。男性が10名、女性が15名であり、平均年齢は31.9才（21才〜48才）であった。３名を除く全てが、以前に種痘のワクチン接種を受けていた。残りの３名の被験者は瘢痕およびワクチン接種の前歴がなかった。３名の被験者に試験対象ワクチンの低用量のそれぞれ（103.5および104.5ＴＣＩＤ50）を投与し、９名の被験者には105.5ＴＣＩＤ50を投与し、さらに10名の被験者にＨＤＣワクチンを投与した。
安全性（表11）  初回免疫に際して、投与から24時間以内に37.7℃より高い熱を示したのは、ＨＤＣを投与された者の１名（37.8℃）および105.5ＴＣＩＤ50のｖＣＰ６５を投与された者の１名（38℃）であった。ワクチン接種によるその他の全身性反応はいずれの被投与者にも見られなかった。
皮下接種によるＨＤＣワクチンの被投与者の9/10に、また、103.5、104.5および105.5ＴＣＩＤ50のｖＣＰ６５被投与者には、それぞれ0/3、1/3および9/9に局部的反応が見られた。
痛覚が最も一般的な症状であったが、常に軽いものであった。他の局所的症状として発赤および硬結があったが、これらも軽く且つ一過性のものであった。すべての症状は一般に24時間以内におさまり、72時間以上持続することはなかった。
血球数、肝臓酵素またはクレアチンキナーゼの値に有意の変化はなかった。
免疫応答：狂犬病に対する中和抗体（表12）  最初の投与から28日後、ＨＤＣ被投与者のすべてが（感染）防御力価
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を有していた。これに対して、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の被投与者においては、この防御力価に達したのは、グループＡおよびＢ（103.5および104.5ＴＣＩＤ50）の被投与者にはなく、またグループでは2/9のみであった。
56日目（すなわち、２回目接種（二次接種）から28日目）に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ワクチン被投与者においては、グループＡでは0/3、グループＢでは2/3およびグループＣでは9/9が防御力価を取得し、また、ＨＤＣ被投与者においては10名の全てにおいて、この防御力価が持続されていた。
56日目における幾何平均力価は、グループＡ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣにおいて、それぞれ、0.05、0.47、4.4および11.5IU/mlであった。
180日目には、すべての被験者において狂犬病抗体力価はかなり低下したが、ＨＣＤ被投与者のうち5/10、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）被投与者のうち5/9においては、最低防御力価0.5IU/ml以上に持続されていた。ＨＣＤグループおよびグループＣにおける幾何平均力価は、それぞれ、0.51および0.45IU/mlであった。
カナリアポックスウイルスに対する抗体（表13）  高力価被験者にカナリアとの接触の前歴が無いにも拘わらず、0.22から1.23O.D.の広範囲にわたる前免疫（pre-immune）力価が認められた。前免疫力価とその後の第２回目の投与による力価との差の２倍以上増加した場合に血清変換（seroconversion）が起こったと定義すれば、グループＢの被験者の1/3、グループＣの被験者の9/9に血清変換が起こったが、グループＡまたはＨＤＣの被験者には血清変換はなかった。
ブースター投与  ６ヶ月後のブースター投与（追加接種）時にはワクチンは充分に許容できるものとなった。ＨＤＣブースター被投与者の2/9、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター被投与者の1/10に発熱が見られた。局部反応は、ＨＤＣブースター被投与者の5/9、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースター被投与者の6/10に認めれた。
観察結果  図11Ａ〜図11Ｄは、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴによる。単位IU/ml）を示すグラフであり、ボランティアに対するＨＤＣまたはｖＣＰ６５（105.5ＴＣＩＤ）のブースター効果を示している（該ボランティアには以前に同一のワクチンまたはもう一方のワクチンを接種）。ワクチン接種は０日、28日および180日目に実施した。抗体力価の測定は、０日、７日、28日、35日、56日、173日、187日および208日目に行った。
図11Ａ〜図11Ｂに示すように、ブースター投与するとどの免疫スケジュールでも全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇をもたらした。しかしながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）ブースターは、全体的に、ＨＤＣブースターよりも低い免疫応答を誘発しており、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）の順序から成るグループは、他の３つのグループよりも実質的に力価が低くなっていた。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）をブースター投与すると、以前にＨＤＣワクチンが投与された被験者の3/5に、また、以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）で免疫化された被験者の全てに、カナリアポックス抗体力価の上昇をもたらした。
一般的に、ｖＣＰ６５の投与による局所的副作用からウイルスの局所的複製が起こっていることは示されなかった。特に、ワクチン接種後に見られるような皮膚障害はなかった。このように見かけ上はウイルスの複製が無いにも拘わらず、該投与により、カナリアポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の双方に対する有意量の抗体がボランティアに産生された。
狂犬病中和抗体の分析は、迅速蛍光フォーカス阻害テスト（ＲＦＦＩＴ）により実施したが、この方法は、マウスにおける血清中和テストと優れた相関性を有することで知られている。105.5ＴＣＩＤ50の被投与者９名のうち５名は、初回投与後の応答レベルが低かった。最も用量（投与量）の高い被投与者全員、また、中間用量の被投与者も３名のうち２名において、２回目の投与後に防御力価を有する狂犬病抗体が得られた。この試験においては、両ワクチンとも、生ワクチンについては、一般的に推奨されているが不活性ＨＤＣワクチンには勧められていない皮下投与により接種した。この投与経路を選択したのは、投入部位（注射部位）を入念に調べることができる点において最良であるからであるが、このために、ＨＤＣ被投与者における抗体の出現が遅くなったことも考えられる：事実、ＨＤＣ被投与者のいずれも７日目には抗体上昇を示さず、一方、ＨＤＣワクチン筋肉内投与する多くの試験においては、被験者の大部分に抗体上昇が認められている（Klietmann他、国際赤十字（ジュネーブ）、1981；Kuwert他、国際赤十字（ジュネーブ）、1981）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下投与に限定されるものではない。
被験ワクチンにおける狂犬病中和抗体のＧＭＴ（幾何平均力価：geometric mean fiters）は、ＨＤＣ対照ワクチンよりも低かったが、防御に必要な最低力価を充分に上まわるものであった。３種類の投与量を採用した本試験において得られた明瞭な用量依存性応答が示すように、投与量が高い程、強い応答を誘発する。当業者であれば本明細書の開示から、所与の患者に至適な投与量を選択できることは明らかであろう。
本実施例の他の重要な結果は、抗体応答を増強（ブースト）する能力である。免疫スケジュールの如何に拘わらず６ヶ月目の投与後には全ての被験者に狂犬病抗体力価の上昇が見られており、このことは、カナリアポックスウイルスまたは狂犬病糖タンパク質により誘発された既存の免疫は、当該組換えワクチンまたは従来からのＨＤＣ狂犬病ワクチンによるブースター（追加接種）に対する阻害作用を有しないということを示している。このことは、ワクシニア組換え体をヒトに用いた場合、既存の免疫によって免疫応答が阻害されるという従来の知見（Cooney他；Etinger他）とは対照的である。
かくして、本実施例が明示するように、非複製性ポックスウイルスはヒトにおいて免疫化ベクターとして機能することができ、その際、複製性の作用物質が免疫応答に与えるような全ての利点を有しながら、完全に許容性のウイルスが引き起こすような安全上の問題はない。そして、本実施例および他の実施例の教示から、狂犬病ウイルスまたはその他のコードもしくは発現産物を含有する組換え体を投与または免疫接種するに際して、至適な投与量（用量）または投与方式や投与経路を選択することは、インビトロ発現法とともに当業者には明らかであろう。
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実施例10−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株とのＬＤ50の比較
マウス  異系交配したオスのスイス・ウェブスター（Swiss Webster）マウスをTaconic Farms（米国ニューヨーク州Germantown）から購入し、３週齢（「標準」マウス）になって使用に供されるまで、マウス飼料と水を任意に（adlibitum）に与えて飼育した。異系交配したオスとメスのスイス・ウェブスター新生マウスはTaconic Faumsによって実施された計画妊娠に従って入手した。新生マウスは全て出産から２日以内に引き渡されたものである。
ウイルス  ＡＬＶＡＣは、カナリアポックスウイルスの集団をプラーク精製し、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）内で調製されたものである。ショ糖密度勾配遠心により精製した後、ＣＥＦ細胞内のＡＬＶＡＣのプラーク形成単位を測定した。ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株はＷＲの大プラーク表現型を選択することによって得られたものである（Panicali他、1981）。ワクシニアウイルスのWyethワクチン株（New York State Board of Health）はPharmaceuticals Calf Lymph Type vaccine Dryvaxから管理番号302001Bとして入手したものである。ワクシニアウイルスのCopenhagen株ＶＣ−２はフランスのInstitute Merieuxから入手した。ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株はCopenhagen株ＶＣ−２から誘導されたものである。Wyeth株をのぞき、これらの株は全て、アフリカミドリザルの腎臓由来のVero細胞で培養し、ショ糖密度勾配遠心法により精製し、そしてVero細胞上のプラーク形成単位を測定した。Wyeth株はＣＥＦ細胞内で増殖し、ＣＥＦ細胞内のプラーク形成単位を測定した。
接種  各グループ10匹から成る標準マウスにウイルス稀釈液の１つの0.05mlを頭蓋内（ic）接種した。ウイルス稀釈液は保存ウイルス液を連続的に10倍稀釈することによって調製した。場合によっては、保存ウイルス液を稀釈せずに接種した。
各グループ10匹から成る新生マウス（１日齢または２日齢）にも標準マウスと同様にic接種した。但し、接種量は0.03mlとして使用した。
すべてのマウスについて、毎日、接種から14日間（新生マウスの場合）または21日間（標準マウスの場合）にわたって死亡率を観察した。接種の翌朝に死亡したマウスは、外傷による死亡の可能性があるので排除した。
被験個体数の50％を死亡させるのに要する致死量（ＬＤ50）は、ReedおよびMuenchの比例法（ReedおよびMuench，1938）に従って求めた。
若い異系交配標準マウスにおけるic投与によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニアウイルス株とのＬＤ50の比較  若い標準マウスにおいては、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣのビルレンス（毒力）は、試験した他のワクシニアウイルス株よりも数桁低かった（表14）。ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、Wyeth株よりも3,000倍以上平常マウスにおけるビルレンスが低く；親株であるＶＣ−２株よりも12,500倍以上ビルレンスが低く；そして、ＷＲ（Ｌ）変異株よりも63,000,000倍以上ビルレンスが低いことが見出された。これらの結果から、ＮＹＶＡＣは他のワクシニアウイルスよりも高度に弱毒化されており、また、ＡＬＶＡＣは頭蓋内投与された場合、若いマウスには一般に非ビルレンス性であると考えられる。但し、両者ともきわめて高投与量の場合（ＡＬＶＡＣを3.85×108PFU、ＮＹＶＡＣを３×108PFU）、未だ不明の機序により、この投与経路によりマウスの死亡をもたらすことがある。
異系交配新生マウスにおけるic投与によるＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣと各種のワクシニア株とのＬＤ50の比較  新生マウスにおける５種類のポックスウイルス株の相対的ビルレンスを頭蓋内（ic）チャレンジモデル系における滴定によって調べた（表15）。ＬＤ50の値が示したところによれば、ＡＬＶＡＣは、ワクシニアウイルスのWyeth株よりも100,000倍以上ビルレンスが低く；ワクシニアウイルスのCopenhagenＶＣ−２株よりも200,000倍以上ビルレンスが低く；そして、ワクシニアウイルスのＷＲ（Ｌ）変異株よりも25,000,000倍以上ビルレンスが低い。但し、試験した最高投与量（6.3×107PFU）においては、100％死亡率となった。6.3×106PFUでは33.3％の死亡率が認められた。最高投与量グループ（約6.3ＬＤ50）の平均生存時間（ＭＳＴ）が6.7±1.5日であることから、死因は（未だはっきりしないが）おそらく毒性または外傷性によるものではないであろう。チャレンジ投与量５ＬＤ50におけるＷＲ（Ｌ）と比較すると、ＡＬＶＡＣがチャレンジされたマウスのＭＳＴは有意に長いものであった（Ｐ＝0.001）。
ＮＹＶＡＣと比較すると、Wyethは15,000倍以上ビルレンスが高く；ＶＣ−２は35,000倍以上ビルレンスが高く；そして、ＷＲ（Ｌ）は3,000,000倍以上ビルレンスが高いことが見出された。ＡＬＶＡＣの場合と同様に、ＮＹＶＡＣの投与量が高くなる（6×108PFUおよび6×107PFU）と、100％死亡率となった。しかしながら、そのような最高用量（380ＬＤ50に相応）でチャレンジされたマウスのＭＳＴは僅か２日（２日目に９匹死亡、４日目に１匹死亡）であった。これに対して、最高用量（500ＬＤ50に等しい）のＷＲ（Ｌ）でチャレンジされたマウスは全て４日目まで生存した。
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実施例11．−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡ−ＲＧ（ｖＰ８７９）の評価
免疫沈降  トリ細胞または非トリ細胞から成り予め形成した単層に、親ウイルスであるＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）ウイルスまたはＮＹＶＡ−ＲＧ（ｖＰ８７９）ウイルスを10pfu／細胞接種した。この接種は２％の透析したウシ胎児血清を添加した無メチオニンＥＭＥＭ内に実施した。１時間インキュベートした後、接種物を除き、培地を20μCi/mlの35Ｓ−メチオニンを含有するＥＭＥＭ（無メチオニン）と置換した。一晩、約16時間インキュベートした後、緩衝液Ａ（１％のNonidet P-40、10mMトリス（ｐＨ7.4）、150mMのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、0.01％のアジ化ナトリウム、アプロチニン500単位／ml、および0.02％のフェニル・メチル・スルホニル・フルオリド）を添加して細胞を溶解した。免疫沈降には、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体24-3F10（入手先：米国ニューヨーク州AlbanyのGriffith Laboratories，New York State Department of HealthのC．Trinarchi博士）およびラットの抗マウスコンジュゲート（入手先：Boehringer Mannheim Corporation,カタログ番号605-500）を使用した。支持マトリックスとしてプロテインＡセファロースＣＬ−４８（入手先：米国ニュージャージー州PiscatawayのPharmacia LKB Biotechnology社）を用いた。10％ポリアクリルアミドゲル上で免疫沈降物を分画した（Dreyfuss他、1984）。ゲルを固定化し、蛍光写真に供するため１ＭのＮａ−サリシレートで１時間処理し、KodakのＸＡＲ−２フィルムに露光して免疫沈降したタンパク質種を現像した。
動物源  ニュージーランド（New zealand）白色ウサギをHare-Marland（米国ニュージャージー州Hewitt）から入手した。３週齢のオスの異系交配スイス・ウェブスター（Swiss Webster）マウス、計画妊娠しているメスの異系交配スイス・ウェブスターマウス、および４週齢のスイス・ウェブスターヌードマウス（ｎｕ+ｎｕ+）をTaconic Farms社（米国ニューヨーク州Germantown）から入手した。これらの動物は全てＮＩＨのガイドラインに従って飼育した。動物のプロトコールは全てＩＡＣＵＣによって承認されたものである。必要と考えられた場合には、明らかに致命的な疾病を有しているマウスは安楽死させた。
ウサギにおける障害評価  ２匹のウサギのそれぞれに、104、105、106、107もしくは108pfuの各被験ウイルスを含有するＰＢＳまたはＰＢＳ単独0.1mlを複数部位に皮内接種した。４日目から障害が消散するまでウサギを毎日観察した。硬結および潰瘍形成を測定し記録した。
接種部位からのウイルス回収  １匹のウサギに、106、107もしくは108pfuの各試験ウイルスを含有するＰＢＳまたはＰＢＳのみの0.1mlを複数の部位に皮内接種した。11日目に、ウサギを安楽死させ、各接種部位から採取した皮膚のバイオプシー標本を機械的破砕および間接音波処理により無菌的に調製してウイルスを回収した。ＣＥＦ単層上のプラーク滴定により感染ウイルスを分析した。
マウス内のビルレンス  各グループ10匹から成るマウス、または５匹から成るヌードマウスに、0.5mlの無菌ＰＢＳに溶かしたウイルスの数倍稀釈液の１つをip接種した。実施例11も参照。
シクロホスホアミド（ＣＹ）処理  −２日目に４mg（0.02ml）のＣＹ（ＳＩＧＭＡ製）をマウスにip注入した後、０日目にウイルス注入を行った。ウイルス注入後、次のようにマウスにＣＹをip注入した：１日目に４mg；４日、７日および11日目に２mg；14日、18日、21日、25日および28日目に３mg。Coulter計数装置を用い11日目に白血球を計数することにより免疫抑制を間接観察した。平均白血球数は、非処理マウス（ｎ＝４）については13,500白血球／μｌ、また、ＣＹ処理した対照マウスについては4,220白血球／μｌであった。
ＬＤ50の計算  ReedおよびMuenchによる比例法（ReedおよびMuench，1938）により、50％死亡率をもたらすのに要する致死量（ＬＤ50）を求めた。
マウス内のＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ４週齢から６週齢のマウスの肉趾に、ＶＶ−ＲＧ（Kieny他、1984）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（Taylor他、1991b）、またはＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかの一定範囲稀釈液（50％組織培養感染料（ＴＣＩＤ50）として2.8〜8.0）の50〜100μｌを接種した。各グループは８匹のマウスから構成した。ワクチン接種後14日目において、狂犬病ウイルスＣＶＳ株（0.03ml）の15ＬＤ50を頭蓋内接種することによりマウスへのチャレンジを行った。28日目に生存マウスを数え、50％防御投与量（ＰＤ50）を求めた。
ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導  ワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株は、Copenhagenワクチン株をプラーククローニングして得られたＶＣ−２から調製されたものである。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを調製するためには、本明細書において既述したような一連の操作を行って、18ヶのワクシニアのＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）（ビルレンスに関連する多数のウイルスの機能を含む）を正確に欠失させた。これらの欠失を行うに当たっては、非所望の新規なオープンリーディングフレームが出現しないように設計した。図10は、ＮＹＶＡＣを調製するのに欠失させたＯＲＦを図示する。図10の上部には、ワクシニアウイルスゲノム（ＶＣ−２プラーク単離物、Cophenhagen株）のＨｉｎｄIII制限マップを示す。ＮＹＶＡＣを調製するのに逐次欠失させたＶＣ−２の６つの領域を拡げて示している。これらの欠失については本明細書において既述した（実施例１から実施例６）。そのような欠失位置の下に、該位置から欠失させたＯＲＦを、その遺伝子産物の機能ないしはホモロジーおよび分子量とともに掲記している。
ヒト組織細胞系におけるＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの複製試験  ヒト由来の細胞におけるワクシニアウイルスのＮＹＶＡＣ株（ｖＰ８６６）の複製レベルを調べるため、液体培養条件下、導入多重度0.1pfu／細胞で６種類の細胞系を接種し、72時間インキュベートした。親株のCophenhagenクローン（ＶＣ−２）の接種も併せて行った。初代ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）（10〜11日齢のＳＰＦ源の胚卵。米国コネチカット州StorrsのSpafas社製）使用して全てのウイルスに対する許容細胞基質とした。２つの基準、すなわち、産生的なウイルス複製が生じているかということ、および、外来抗原が発現しているかということに基づいて培養物の分析を行った。ヒト由来のいろいろな細胞におけるＮＹＶＡＣの複製能を表16に示す。ＶＣ−２およびＮＹＶＡＣのいずれもＣＥＦ細胞内で複製する能力を有するが、ＮＹＶＡＣの方が幾分収量（産生量）が低い。ＶＣ−２も、ＥＢＶ形質転換リンパ球芽細胞系ＪＴ−１（エプステインバーウイルスで形質転換されたヒトリンパ球芽細胞系。Rickinso他（1984）を参照）を除き、試験した６種類のヒト由来細胞系で産生的複製能力を有している。これに対して、ＮＹＶＡＣは、試験したヒト由来細胞系のいずれにおいてもその複製能力が高度に減弱されている。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ171、ヒト胎児肺由来）、ＤＥＴＲＯＩＴ５３２（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ54。ヒト包皮、ダウン症候群）、ＨＥＬ２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ137、ヒト胎児肺細胞）、およびＨＮＫ（ヒト新生児腎臓細胞。米国メリーランド州WakersvilleのWhittiker Bioproducts社製、カタログ＃70-151）から、残存ウイルスレベルを超える感染ウイルスの僅かな増加が見られている。これらの細胞系における複製は、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞または親株のＶＣ−２から得られたウイルス収量（産生量）に比較すると有意に減少していた（表16）。注目すべきことには、ＮＹＶＡＣおよびＶＣ−２のいずれについても、24時間におけるウイルス収量は72時間の収量に等しい。したがって、該ヒト由来細胞系培養物を更に48時間（ウイルス生成サイクルの２回分）培養させると、相対的なウイルス収量を上昇させたかも知れない。
上記のヒト由来細胞系においては、ウイルス収量が低かったことに一致して、ＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２においてもＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡの複製は、検出可能ではあったが、そのレベルは低かった。ＮＹＶＡＣを感染させたＭＲＣ−５およびＤＥＴＲＯＩＴ５３２細胞系におけるＤＮＡ複製レベルは、ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞で見出されたレベルと比較すると、ウイルス収量において近似していた。その他のヒト由来細胞のいずれにおいてもＮＹＶＡＣ特異的ウイルスＤＮＡ複製は見出されなかった。
トリポックスウイルスであるＡＬＶＡＣを用いても同様の実験を行った。このウイルス複製の結果も表16に示す。いずれのヒト細胞系においても子孫ウイルス（子ウイルス）は検出されず、カナリアポックスウイルスの宿主域によりトリ種に制限されていることに相反しない。さらに、いずれのヒト由来細胞系においてもＡＬＶＡＣ特異的なＤＮＡ蓄積は検出されなかったという事実も、それらのヒト由来細胞のおいてＡＬＶＡＣの産生的複製が起こらないということに矛盾していない。
ヒト細胞におけるＮＹＶＡ−ＲＧ（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質の発現  産生的ウイルス複製が実質的に起こらない場合においても外来遺伝子の効率的な発現が得られるかということを判定するために、上記と同じ細胞系に、35Ｓ−メチオニンの存在下に、狂犬病ウイルス糖タンパク質発現性のＮＹＶＡＣ組換え体（ｖＰ８７９、実施例７）を接種した。該狂犬病糖タンパク質に特異的なモノクローナル抗体を用い、放射ラベルした培養リゼイトから狂犬病糖タンパク質を免疫沈降させた。６７ｋＤａのタンパク質の免疫沈降物が得られたが、これは狂犬病糖タンパク質が完全にグリコシレートされた形態に一致する。非感染細胞リゼイトまたは親のＮＹＶＡＣが感染した細胞リゼイトにおいて血清学的に交差性の生成物は検出されなかった。分析した他の細胞においても同様の結果が得られた。
ウサギ皮膚への接種  ワクシニアウイルス株の病原性の尺度として、皮内（id）接種後のウサギの皮膚障害およびその特徴が利用されている（Buller他、1988；Child他、1990；Fenner他、1958；Flexner他、1987；GhendonおよびChernos1964）。そこで、ワクシニア株ＷＲ（ＣＶ−１細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ70をプラーク精製したＡＴＣＣ＃ＶＲ119として、これらからＬ変異体として単離、選択されたプラークから成るＡＴＣＣ＃ＶＲ2035。Panicali他（1981）参照）、ＷＹＥＴＨ（ＡＴＣＣ＃ＶＲ325。米国ペンシルバニア州MariettaのWyeth Laboratories社からＤＲＹＶＡＣとして市販）、COPENHAGEN（ＶＣ−２）およびＮＹＶＡＣを２匹のウサギ（Ａ０６９およびＡ１２８）にid接種した場合の障害の特徴を調べた。これらの２匹のウサギはウイルスに対する全体的な感度が異なっており、ウサギＡ１２８の方がウサギＡ０６９よりも応答性が低かった。ウサギＡ１２８においては障害は比較的軽くて、接種後27日目までに消散した。ウサギＡ０６９においては、障害程度は強く（特にＷＲ接種部位）、49日経過後ようやく消散した。また、障害の強さは、リンパ液排出網状組織に対する接種部位の相対的な位置に依存していた。特に脊椎上に位置する部位の障害が強く、脾腹にある障害が消散するのに長い時間を要した。４日目から最後の障害が消えるまで全ての障害を毎日調べ、障害の最大サイズの平均値および消散までの日を求めた（表17）。対照であるＰＢＳの注入部位には局部反応は見られなかった。ＷＲ、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨワクシニアウイルス株の注入部位には潰瘍性障害が見られた。重要なことは、ＮＹＶＡＣの接種部位には硬結または潰瘍性障害が観察されなかったということである。
接種部位における感染性ウイルスの残存  接種部位における各ウイルスの相対的な残存性を調べるため、106、107、または108pfuのＶＣ−２、ＷＲ、ＷＹＥＴＨまたはＮＹＶＡＣを含有する0.1mlのＰＢＳをウサギの複数部位に皮内接種した。各ウイルスについて、107pfuを脊椎上に投与し、その両側に106および108を投与した。接種部位を11日間にわたって毎日観察した。ＷＲが最も強い反応を示し、次いで、ＶＣ−２およびＷＹＥＴＨとなった（表18）。潰瘍が最初に見出されたのは、ＷＲおよびＷＹＥＴＨについては９日目、ＶＣ−２については10日目であった。ＮＹＶＡＣまたは対照用ＰＢＳが接種された部位は硬結または潰瘍形成を示さなかった。接種後11日前に、接種部位から皮膚サンプルを切除し、機械的に破砕し、ＣＥＦ細胞上でウイルスを滴定した。結果を表18に示す。いずれの場合においても、この時点では投与量よりも多量のウイルスは回収されなかった。ワクシニア株ＷＲの回収量は、ウイルス投与量とは無関係に約106pfuであった。ワクシニア株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収量は投与量と関係なく103から104であった。ＮＹＶＡＣを接種した部位からは感染性ウイルスは回収されなかった。
遺伝的または化学的に免疫不全性のマウスへの接種  ヌードマウスに高投与量のＮＹＶＡＣ（５×108pfu）またはＡＬＶＡＣ（109pfu）を腹腔内投与したが、10日間の観察期間を通じ、死亡、障害および明らかな疾病を引き起こすことはなかった。これに対して、ＷＲ（103から104pfu）、ＷＹＥＴＨ（５×107または108pfu）またはＶＣ−２（104から109pfu）を接種されたマウスは、先ず趾部に、次いで尾部にポックスウイルスに典型的な播種性障害を示し、その後、幾つかのマウスにおいては睾丸炎が見られた。ＷＲまたはＷＹＥＴＨを感染させたマウスは播種性障害が出現すると、一般的に、最終的には死亡したが、ＶＣ−２を感染させたマウスは多くの場合、最終的には回復した。ＬＤ50計算値を表19に示す。
さらに詳述すると、ＶＣ−２を接種されたマウスは先ず趾部に、そして、それより１〜２日後には尾部に障害（赤色丘疹）を示す。これらの障害は、高投与量（109、108、107および106pfu）を投与されたマウスについては接種後から11〜13日目、105pfuを投与されたマウスにおいては接種後16日目、また、104pfuを投与されたマウスにおいては接種後21日目に出現した。103および104を投与されたマウスにおいては100日間の観察期間中障害は見出されなかった。109および108pfuを投与されたマウスにおいては接種後23日目に、また、他のグループのマウス（107から104pfu）においては、それより約７日後に睾丸炎が認められた。睾丸炎は109および108投与グループにおいて特に強く、次第に後退してはゆくが、100日間の観察期間の終わりまで認められた。数匹のマウスの皮膚には、接種後30〜35日目に幾つかのポックス性の障害が認められた。これらのポックス障害の多くは、一般に接種後60〜90日目に治癒した。109pfuを接種されたグループのマウスのうち１匹のみが死亡し（接種後34日）、また、108pfuを投与されたグループのマウスの１匹が死亡（接種後94日）した。ＶＣ−２が接種されたマウスにその他の死亡は見られなかった。
104pfuのＷＲワクシア株を接種されたマウスは、接種後17日目にポックス性障害を示し始めた。これらの障害は、ＶＣ−２接種マウスに見られた障害と同じであった（趾部、尾部の腫脹）。103pfuのＷＲ株を接種されたマウスでは接種後34日目まで障害は出現しなかった。睾丸炎が認められたのは高用量のＷＲ（104pfu）が接種されたマウスのみであった。観察期間の後期に口の周りに障害が現れマウスは食餌を止めた。104pfuのＷＲを接種したマウスは全て、接種後21日から31日目に死亡するか、必要に応じて安楽死させた。103pfuのＷＲを投与した５匹のうち４匹は、接種後35日から57日目に死亡するか、必要と考えられた場合は安楽死させた。低投与量のＷＲ（１から100pfu）が接種されたマウスには死亡は認められなかった。
高投与量（５×107および５×108pfu）のワクシニアＷＹＥＴＨ株を投与したマウスは、趾部および尾部に障害を示し、睾丸炎が発生し、そして死亡した。５×106pfuまたはそれ以下のＷＹＥＴＨを投与したマウスは疾病や障害の症状を示さなかった。
表19に示すように、ＣＹ処理されたマウスは、ポックスウイルスのビルレンスを分析するのにヌードマウスの場合よりも高感度のモデル系を与える。ＷＲ、ＷＹＥＴＨ、およびＶＣ−２に関するＬＤ50値は、このモデル系においてはヌードマウスモデルの場合よりも有意に低くなっていた。さらに、ＷＹＥＴＨ、ＷＲおよびＶＣ−Ｒワクシニアウイルスをマウスに投与した場合、以下に記すように、各ウイルスをさらに高い用量で投与することにより障害が出現し、この結果、障害の形成がさらに迅速になっている。ヌードマウスにおいて見られたように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを注入されたＣＹ処理マウスは障害を示さなかった。しかしながら、ヌードマウスの場合とは異なり、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを用いてチャレンジされたＣＹ処理マウスにおいては、投与量とは無関係に、死亡が見られたものもあった。このような不規則な発病が死因と関係しているかも知れない。
ＷＹＥＴＨが投与されたマウスはいずれの投与量においても（9.5×104から9.5×108pfu）、接種後７日目から15日目の間に尾部および／または趾部にポックス性障害を示した。さらに、尾部および趾部は腫脹した。尾部での障害の出現は、ポックス性障害の典型的なものであり、丘疹の形成、潰瘍形成、そして最後には痂皮の形成を伴う。ＶＣ−２が投与されたマウスも、すべての投与量において（1.65×105から1.65×109pfu）、ＷＹＥＴＨ投与マウスの場合に類似した尾部および／または趾部にポックス性障害を示した。これより低用量のＷＲウイルスを投与したマウスには障害は見られなかったが、これらのグループで死亡は生じた。
ＮＹＶＡＣ−ＲＧの効力試験  ワクシニアウイルスのCOPENHAGEN株を弱毒化すすることにより、それから得られるＮＹＶＡＣ株のベクターとしての有用性を実質的に変化させていないことを明らかにするため、比較効力試験を行った。該ウイルスを弱毒化するのに行われた一連の遺伝子操作中の該ベクターの免疫原性能を調べるため、リポーター外来抗原として狂犬病ウイルスの糖タンパク質を利用した。該狂犬病糖タンパク質を発現するベクターの感染防御効力の評価は狂犬病に関する標準的なＮＩＨマウス効力試験によった（Seligmann、1973）。表20に示しているように、高度に弱毒化したＮＹＶＡＣベクターについて得られるＰＤ50値は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病遺伝子を含有するCOPENHAGEN由来組換え体を用いて得られた値（Kieny他、1984）と同じであり、また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（トリ種に複製が制限されているカナリアポックス由来ベクター）について得られたＰＤ50に近似している。
考察  よく知られたビルレンス遺伝子が欠失され且つ限定されたインビトロ増殖特性を有するＮＹＶＡＣを動物モデル系で分析して、その弱毒化特性を調べた。これらの試験に当たって、神経毒性のあるワクシニアウイルスの実験室株、ＷＲ、２種類のワクシニアウイルスワクチン株、ＷＹＥＴＨ（New York City Board of Health）およびCOPENHAGEN株、さらには、カナリアポックスウイルス株であるＡＬＶＡＣとの比較を行った（実施例11も参照）。さらに、これらのウイルスについてマウスチャレンジモデルおよびウサギ皮膚モデルにおける相対的な病原性能が調べられた。すなわち、ＷＲが最もビルレンスの高い株であり、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（ＶＣ−２）は弱毒化ワクチン株として既に利用されているような特徴を有し、そして、ＡＬＶＡＣは複製がトリ種に制限されるようなポックスウイルスの１例であることが理解された。これらのインビボ分析は、ワクシニアウイルス株ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN（ＶＣ−２）に比べるとＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有するものであることを明示している（実施例14〜20）。重要なことは、ＮＹＶＡＣにおけるＬＤ50値は、トリ宿主制限トリポックスウイルスであるＡＬＶＡＣにおいて見出された値に匹敵したということである。ＮＹＶＡＣに因る死亡は、ＡＬＶＡＣと同様に、きわめて高用量のウイルスが頭蓋投与された場合のみ見出された（実施例11、表14、15、19）。この死亡が多量のタンパク質を接種した非特異性に因るものであるか否かは未だ明らかでない。免疫無防備状態マウスモデル（ヌードマウスおよびＣＹ処理マウス）における分析からも、ＷＲ、ＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGEN株に比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特徴を有することが明らかにされた。重要なことは、ＮＹＶＡＣ接種動物またはＡＬＶＡＣ接種モデルにおいては、観察期間を通して、ワクシニア感染の播種やワクシニア性疾病の形跡が見出されなかったということである。ＮＹＶＡＣにおいて複数のビルレンス関連遺伝子を欠失させると、病原性に関する相乗効果が示された。ＮＹＶＡＣの接種特性を知る別の手段としてウサギ皮膚への皮内投与を行った（表17および18）。非トリ種において複製能力を有しないウイルスであるＡＬＶＡＣに関する結果を考察すると、接種部位における複製能力のみが反応性に相関しているのではない。ＡＬＶＡＣの皮内接種は投与量に依存して硬結域をもたらしたからである。すなわち、ウイルスの複製能力以外の因子が障害の形成に寄与しているものと推測される。ＮＹＶＡＣにおいてビルレンスに関連する特定の遺伝子を欠失させると障害の発生が防止される。
さらに、本実施例および既述の実施例（実施例９を含む）の結果から、ＷＲ、ならびに既に利用されているワクシニアウイルスワクチン株であるＷＹＥＴＨおよびCOPENHAGENに比べてＮＹＶＡＣが高度に弱毒化された特性を有することが明らかである。事実、試験した動物モデル系におけるＮＹＶＡＣの病原性プロフィルは、トリ種においてのみ産生的複製を行うことで知られたポックスウイルスであるＡＬＶＡＣのプロフィルに類似していた。ＮＹＶＡＣの産生的複製能がヒト（表16）およびその他の動物（マウス、ブタ、イヌおよびウマを含む）由来の細胞において見かけ上制限されていることが重要な障壁となって、ワクチン接種されたヒトの中で播種する可能性の低いベクターを提供できることに加えて、ワクチン非接種者または一般的な環境への伝染を制限したり防止することになる。
重要なことは、ＮＹＶＡＣ系ワクチンが効力を有することが示されたことである。各種の病原体由来の外来遺伝子産物を発現するＮＹＶＡＣ組換え体は、霊長類を含む幾つかの動物種において該外来遺伝子産物に対する免疫応答を引き起こした。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣを基礎とする組換え体は致死的な狂犬病ウイルスのチャレンジに対してマウスを防御する能力を有した。該ＮＹＶＡＣ由来狂犬病糖タンパク質組換え体の効力は、ｔｋ遺伝子座に狂犬病糖タンパク質を含有するCOPENHAGEN由来組み換え体のＰＤ50に匹敵するものであった（表20）。また、ＮＹＶＡＣを基礎とする組換え体は、ウサギにおいて麻疹ウイルス中和抗体を誘起し、ブタにおける擬狂犬病ウイルスおよび日本脳炎ウイルスのチャレンジに対して防御機能を有した。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ株は、ヒト、動物、医学および獣医学の分野での利用において安全であるという利点を有する（Tartaglia他、1992）。さらに、一般の実験的発現ベクター系としてＮＹＶＡＣを使用すれば、ワクシニアウイルスに関連する生物学的危険性（ハザード）が激減する。
本実施例およびその他の実施例（実施例10を含む）の結果が示すように、次のような基準によりＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されたものであることを明らかにした：ａ）接種部位に硬結または潰瘍化が検出されないこと（ウサギ皮膚）；ｂ）皮内接種部位から感染ウイルスが迅速に存在しなくなること（ウサギ皮膚）；ｃ）睾丸炎症がないこと（ヌードマウス）；ｄ）ビルレンスが激減していること（３週齢マウスおよび新生マウスの両方における頭蓋内チャレンジ）；ｅ）免疫不全被験体において病原性が激減しており播種しないこと（ヌードおよびシクロホスホアミド処理マウス）；およびｆ）各種のヒト組織培養細胞において複製能が著しく減少していること。そして、高度に弱毒化されているのにも拘わらず、ＮＹＶＡＣは、ベクターとして、外来抗原に対する強力な免疫応答を保有している。
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実施例12−ポックスウイルスベクターへのＨＣＭＶのクローニング
ワクシニアドナープラスミドへのＨＣＭＶｇＢ遺伝子のクローニングＨＣＭＶ  ＤＮＡ（Towne株）のＨｉｎｄIIIフラグメントの4800bpＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントを、プラスミドｐＩＢＩ２４（米国コネチカット州HavenのInternational Biotechnologies社製）の2800bpＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメント内にクローニングした。オリゴヌクレオチド
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を用いるインビトロ変異法（Kunkel、1985）により、該ｇＢ遺伝子を変性してワクシニアＨ６プロモータの制御下に発現され得るようにした（Taylor他、1988a,b；Perkus他、1989）。この変性ｇＢを含有するプラスミドを２４ＣＭＶｇＢ（５＋３）とした。ＣＭＶｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列は図12に示す（SEQ ID NO:37）。
プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ（Ｋ１Ｌ宿主域遺伝子の上流にワクシニア配列に対するポリリンカー領域を含有する）を上記ポリリンカー内でＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩを用いて分解（酵素分解）し、さらに、以下に示すアニーリングされたオリゴヌクレオチドＳＰＨＰＲＨＡ  ＡからＤに連結（ライゲート）して、ＨｉｎｄIII部位、Ｈ６プロモータ（−124〜−１）（Perkusu他、1988）およびポリリンカー領域を含有するＳＰ１３１を調製した。
0003940959.tif 000040
24ＣＭＶｇＢ（５＋３）の2900bpＥｃｏＲＶ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ＳＰ１３１の3100bpＥｃｏＲＶ−ＢｇｌIIフラグメント内にクローニングした。このクローニング工程により、当該ｇＢ遺伝子がＨ６プロモータの制御下に置かれるようになる。得られたプラスミドをＳＰ１３１ＣＭＶｇＢと命名した。
プラスミドｐＳＤ２２−Ｈは、ｐＵＣ８のＢａｍＨＩ部位に連結されたワクシニアウイルスＷＲ株のＨｉｎｄIII Ｆ領域由来の2.9kbＢｇｌIIフラグメントを含有する。ｐＳＤ２２−Ｈにおける唯一のＢａｍＨＩ部位は、外来遺伝子に対する挿入遺伝子座として使用する可欠部位である（PanicaliおよびPaoletti、1982）。プラスミドｐＭＰ２２ＢＨＰは、ｐＳＤ２２−Ｈの誘導体であり、上記の唯一のＢａｍＨＩ部位が、延長したポリリンカー領域を加えることにより外来ＤＮＡを挿入できるようになっている。プラスミドｐＭＰ２２ＢＨＰをＨｉｎｄIIIで分解し、ＳＰ１３１ＣＭＶｇＢ（Ｈ６をプロモータとするｇＢ遺伝子を含有する）由来の2.9kbＨｉｎｄIIIフラグメントに連結して、プラスミドＳＡｇ２２ＣＭＶｇＢを調製した。ＳＡｇ２２ＣＭＶｇＢ内のポリリンカー領域を変性するために、該プラスミドをＢａｍＨＩで分解した後、ＨｉｎｄIIIで部分分解し精製した。ＩＢＩ２４由来の50bpＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIポリリンカーに連結することによってプラスミド２２ＣＭＶｇＢを得た。
ＮＹＶＡＣドナープラスミドｐＳＤ５４２へのＨＣＭＶｇＢ遺伝子のクローニング  プラスミドｐＳＤ５１３（Tartaglia他、1992）からプラスミドｐＳＤ５４２（ＮＹＶＡＣ  ＴＫ遺伝子座ドナープラスミド）を誘導した。このため、ｐＳＤ５１３内のポリリンカー領域をＰｓＴＩ／ＢａｍＨＩを用いて切断し、次に、アニーリングされた合成オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000041
に連結することによりプラスミドｐＳＤ５４２を得た。
２２ＣＭＶｇＢを、ＢａｍＨＩおよびＮｓｉＩで分解してＨ６プロモータおよびｇＢ遺伝子の一部を含有するフラグメントを調製し、また、ＮｓｉＩおよびＰｓｔＩで分解してｇＢ遺伝子の残りを含有するフラグメントを調製した。これらの２種類のフラグメントをｐＳＤ５４２（予め、そのポリリンカー内でＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで分解して、ＮＹＶＡＣドナープラスミド５４２ＣＭＶｇＢを形成したもの）に連結した。５４２ＣＭＶｇＢに含有されているＣＭＶｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列およびその端部をはさむ配列（フランキング配列）は図13Ａおよび図13Ｂに示す（SEQ ID NO:38）。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドＣＰ３ＬＶＱＨ６へのＨＣＭＶｇＢ遺伝子のクローニング  8.5kbのカナリアポックスＢｇｌIIフラグメントをｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクター（米国カリフォルニア州La JollaのStratagene社製）のＢａｍＨＩ部位にクローニングしてｐＷＷ５を調製した。ヌクレオチド配列分析によれば、Ｃ３と指称されているリーディングフレームは、図14Ａ〜図14Ｃに示す配列（SEQ ID NO:39）において、1458位から開始され2897位で終結していた。Ｃ３遺伝子座に外来遺伝子を挿入するとともにＣ３のオープンリーディングフレームを完全に切除したドナープラスミドを構築するために、ＰＣＲプライマーを用いてＣ３に対する５′側配列および３′側配列を増幅した。５′側配列用のプライマーとして、
0003940959.tif 000042
を用いた。また、３′側配列用のプライマーとして、
0003940959.tif 000043
を用いた。これらのプライマーは、ワクシニアの転写および翻訳停止シグナルが隣接しているような多重クローニング部位を含むように設計した。さらに、左側アームおよび右側アームの５′末端および３′末端に適当な制限酵素部位がある（左側アームについてはＡｓｐ７１８およびＥｃｏＲＩ、右側アームについてはＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩ）ようにし、これによりＡｓｐ７１８／ＳａｃＩ分解ｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクターにそれらの２種のアームを連結させることができた。得られたプラスミドをｐＣ３１と命名した。
プラスミドｐＷＷ５をＮｓｉＩおよびＳｓｐＩで分解することにより、Ｃ３遺伝子座のすぐ上流に908bpのカナリアポックスＤＮＡフラグメントを得た。ＰＣＲ法により（Engelke他、1988）、鋳型としてプラスミドｐＷＷ５およびオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000044
を用いて、カナリアポックスＤＮＡの604bpフラグメントを得た。該604bpのフラグメントをＡｓｐ７１８およびＸｈｏＩ（それらの制限部位は、それぞれ、オリゴヌクレオチドＣＰ１６およびＣＰ１７の５′末端に存在）で分解し、次に、Ａｓｐ７１８／ＸｈｏＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２５（米国コネチカット州New HavenのInternational Biotechnologies社製）にクローニングして、プラスミドＳＰＣ３ＬＡを調製した。このＳＰＣ３ＬＡをＩＢＩ２５内でＥｃｏＲＶにより分解、また、カナリアポックスＤＮＡ内でＮｓｉＩにより分解し、これを908bpのＮｓｉＩ−ＳｓｐＩフラグメントに連結することによりＳＰＣＰＬＡＸを調製した。ＳＰＣＰＬＡＸは、Ｃ３遺伝子座の上流にカナリアポックスＤＮＡの1444bpを含有する。
プラスミドｐＸＸ４（これは、ｐＢＳ−ＳＫのＰｓｔＩ部位にクローニングされたカナリアポックスＤＮＡの6.5kbＮｓｉＩフラグメントを含有する）から、カナリアポックスＤＮＡの2178bpＢｇｌII−ＳｔｙＩフラグメントを分離した。プラスミドのｐＸＸ４を鋳型とし、さらに、オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000045
を用いて、ＰＣＲ法（Engelke他、1988）によりカナリアポックスＤＮＡの279bpフラグメントを分離した。この279bpのフラグメントをＸｈｏＩおよびＳａｃＩ（これらの制限酵素部位は、それぞれ、オリゴヌクレオチドＣＰ１９およびＣＰ２０の５′末端に存在する）で分解し、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ分解されアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２５中にクローニングして、プラスミドＳＰＣ３ＲＡを得た。
該ポリリンカーに唯一の制限酵素を追加するために、ｐＣ３Ｉをポリリンカー領域内でＥｃｏＲＩによって分解し、アルカリホスファターゼで処理し、さらに、キナーゼ処理され且つアニーリングされたオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000046
ＥｃｏＲＩ粘着端、ＸｈｏＩ部位、ＢａｍＨＩ部位、およびＣｌａＩに結合し得る粘着端を含有する）に連結した。ＳＰＣＰ３Ｓを、Ｃ３遺伝子座の下流のカナリアポックス配列内でＳｔｙＩおよびＳａｃＩを用いて分解し（ｐＢＳ−ＳＫ）、ＳＰＣ３ＲＡ由来の261bpＢｇｌII−ＳａｃＩフラグメントおよびｐＸＸ４由来の2178bpＢｇｌII−ＳｔｙＩフラグメントに連結して（Ｃ３遺伝子座の下流に2572bpのカナリアポックスＤＮＡを含有する）プラスミドＣＰＲＡＬを調製した。Ｃ３遺伝子座の上流のカナリアポックス配列内においてＡｓｐ７１８（ｐＢＳ−ＳＫ中）およびＡｃｃＩを用いてＳＰＣＰ３Ｓを分解し、ＳＰＣＰＬＡＸ由来の1436bpＡｓｐ７１８−ＡｃｃＩフラグメントに連結して、（Ｃ３遺伝子座の上流に1457bpのカナリアポックスＤＮＡを含有する）プラスミドＣＰＬＡＬを調製した。Ｃ３遺伝子座の下流のカナリアポックス配列内でＳｔｙＩおよびＳａｃＩ（ｐＢＳ−ＳＫ中）を用いてＣＰＬＡＬを分解し、次に、ＣＰＲＡＬ由来の2438bpＳｔｙＩ−ＳａｃＩフラグメントに連結してプラスミドＣＰ３Ｌを調製した。かくして、このプラスミドＣＰ３Ｌは、Ｃ３遺伝子座の上流に1457bpのカナリアポックスＤＮＡ、６ヶのリーディングフレーム内に停止コドン、初期転写終結シグナル、ポリリンカー領域、初期転写終結シグナル、６ヶのリーディングフレーム内に停止コドン、および、Ｃ３遺伝子座の下流に2572bpのカナリアポックスＤＮＡを含有する。
ＰＣＲ法により（Engelke他、1988）、鋳型としてｐＲＷ８３８（Ｈ６プロモータに連結した狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子（Kieny他、1984）を含有するプラスミド）を用い、さらにオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000047
を用いて、初期／後期Ｈ６ワクシニアプロモータ（Taylor他、1988a,b；Perkus他、1989）を生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いて（それらの制限酵素部位は、それぞれ、ＣＰ２１およびＣＰ２２の５′末端にある）分解し、ＣＰ３Ｌに連結し、さらに、ポリリンカー内でＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで分解し、プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌを得た。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌをポリリンカー内でＸｈｏＩにより、また、Ｈ６プロモータ内でＮｒｕＩによって分解し、そして、２２ＣＭＶｇＢ（Ｈ６プロモータおよびｇＢ遺伝子の一部、ならびにＸｈｏＩおよびＨｉｎｄIII分解によりｐＩＢＩ２４から誘導されたポリリンカーを含有する）由来のＮｒｕＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結して、ＡＬＶＡＣドナープラスミドＣＰ３ＬＣＭＶｇＢを調製した。プラスミドＣＰ３ＬＣＭＶｇＢにおけるＣＭＶｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列および付加されているフランキング配列は図15Ａ〜図15Ｃに示している（SEQ ID NO:40）。
トランスメンブレン領域が欠失されたＨＣＭＶｇＢ遺伝子のＮＹＶＡＣドナープラスミドｐＳＤ５５３へのクローニング  プラスミドｐＳＤ５５３は、ＣＯＰＡＫ系列に属するワクシニア欠失／挿入プラスミドの１つである。このプラスミドは、Copenhagenワクシニアのフランキングアーム内に、ワクシニアＫ１Ｌ宿主域遺伝子（Gillard他、1986；Perkus他、1990）を含有し、ＡＴＩ領域（オープンリーディングフレームＡ２５Ｌ、Ａ２６Ｌ；Goebel他、1990a,b）を置換している。ｐＳＤ５５３は以下のように構築した。
左側および右側のワクシニアフランキングアームは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により鋳型としてｐＳＤ４１４（ワクシニアＳａｌＩ  ＢをｐＵＣ８にクローニングしたものの１種（Goebel他、1990a,b））を用いて調製した。左側アームの合成にはプライマーとして、合成デオキシオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000048
用いた。右側アームは、プライマーとして合成デオキシオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000049
を用いて合成した。左側アームおよび右側アームを含有するこれらの２種類のＰＣＲ由来ＤＮＡフラグメントを一緒にして更なるＰＣＲ反応を行った。得られた生成物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで切断して、0.9kbのフラグメントを分離した。この0.9kbフラグメントをｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII断片に連結して、プラスミドｐＳＤ５４１を得た。ワクシニアＡＴＩ欠失座にあるポリリンカー領域を以下のように伸長した。ｐＳＤ５４１をＢｇｌII／ＸｈｏＩで切断し、アニーリングされた相補的合成オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000050
に連結してプラスミドｐＳＤ５５２を調製した。プラスミドｐＳＤ５４２から１kbのＢｇｌII（部分分解）／ＨｐａＩフラグメントとしてＫ１Ｌ宿主域遺伝子（Perkus他、1990）を単離した。ｐＳＤ５５２をＢｇｌII／ＨｐａＩで切断し、上記Ｋ１Ｌ含有フラグメントに連結して、ｐＳＤ５５３を調製した。
ＳＰ１３１ＣＭＶｇＢ（Ｈ６プロモータの制御下にあるＨＣＭＶｇＢ遺伝子を含有する）由来のＨｉｎｄIIIフラグメントをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で切れ目充填（フィリング）し、プラスミドｐＳＤ５５３（ＳｍａＩで分解されアルカリホスファターゼ処理されたもの）に連結した。得られたＮＹＶＡＣドナープラスミド（Ｈ６をプロモータとするｇＢはＫ１Ｌと同じ方向にある）を５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢと命名した。このプラスミド５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢにおけるＣＭＶｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列と付加されているフランキングＤＮＡ配列は図16Ａおよび図16Ｂに示す（SEQ ID NO:41）。
トランスメンブレン領域が欠失されたＣＭＶｇＢの配列は図17に示されている（SEQ ID NO:42）。トランスメンブレン領域をコードするヌクレオチドは以下のように欠失させた。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000051
をキナーゼ処理し、アニーリングし、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングしてプラスミドＳＰＣＭＶｇＢ２を調製した。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000052
を用いプラスミドＳＰ１３１ＣＭＶｇＢを鋳型とするＰＣＲを行い、0.7kbフラグメントを調製した。このフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで分解し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４中にクローニングしてプラスミドＳＰＣＭＶｇＢ１を調製した。このＳＰＣＭＶｇＢ１由来の0.7kbＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＮｃｏＩ分解されホスファターゼ処理されたＳＰＣＭＶｇＢ２に連結してプラスミドＳＰＣＭＶｇＢを調製した。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000053
を用いる突然変異法（Mandecki、1986）により、ＳＰＣＭＶｇＢ３内の唯一のＮｃｏＩ部位を欠失させてプラスミドＳＰＣＭＶｇＢ４を調製した。ＳＰＣＭＶｇＢ４由来の0.7kbＰｓｔＩフラグメントを５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢ由来の6.6kbＰｓｔＩフラグメントに連結して、ＮＹＶＡＣドナープラスミド５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢＴＭ-を調製した。このプラスミドは、Ｈ６プロモータの制御下にあり、そのトランスメンブレン領域が欠失された（アミノ酸715〜772位；Spaete他、1988）ｇＢ遺伝子を含有する。プラスミド５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢＴＭ-におけるトランスメンブレンが欠失されたＣＭＶｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列と追加のフランキングＤＮＡ配列は図18Ａおよび図18Ｂに示す（SEQ ID NO:43）。
トランスメンブレン領域が欠失され切断部位が変更されたＨＣＭＶｇＢ遺伝子のＮＹＶＡＣドナープラスミドｐＳＤ５５３へのクローニング
トランスメンブレン領域が欠失され変更（変性）された切断部位を含有するＣＭＶｇＢの配列は図19に示す（SEQ ID NO:44）。切断部位の変性は以下のように行った。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000054
をキナーゼ処理し、アニーリングし、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングして、プラスミドＢｓｔＩＢＩを調製した。５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢＴＭ-由来の1.4kbＢｓｔＥII／ＳｐＨＩフラグメントを、ＢｓｔＥII／ＳｐＨＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＢｓｔＩＢＩにクローニングして、ＳＰＣＭＶｇＢ５を調製した。
オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000055
を用いてプラスミド５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢＴＭ-のＰＣＲを行い、0.7kbフラグメントおよび0.8kbフラグメントを得た。これら２種類のフラグメントを組み合わせて、オリゴヌクレオチドＳＰｇＢ１０＋ＳＰｇＢ１２のＰＣＲを実施して、1.2kbのフラグメントを得た。この1.2kbフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで分解し、0.5kbのフラグメントを分離し、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングして、プラスミドＳＰＣＭＶｇＢ６を調製した。このＳＰＣＭＶｇＢ６由来の0.5kbＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントを用いて、ＳＰＣＭＶｇＢ５中の対応するフラグメントと置換して、プラスミドＳＰＣＭＶｇＢ７を調製した。このＳＰＣＭＶｇＢ７由来の1.4kbＢｓｔＥII／ＳｐＨＩフラグメントを用いて、５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢ中の対応するフラグメントと置換して、ＮＹＶＡＣドナープラスミド５５３Ｈ６ｇＢＣ-ＴＭ-を調製した。このプラスミドは、Ｈ６プロモータの制御下にあり、トランスメンブレン領域が欠失された（アミノ酸715〜772位）ｇＢ遺伝子を含有し且つ切断部位が変性（ＲＴＫＲ*ＳＴがＲＴＩＲＳＴに変性。ここで星印は切断が通常起こる個所を示すが（Spaete他、1988）、Ｓコドンが変性されてＢｇｌII制限酵素部位を形成した。）されている。プラスミド５５３Ｈ６ｇＢＣ-ＴＭ-における切断部位が変性され且つトランスメンブレンが欠失されたＣＭＶｇＢのＤＮＡ配列および追加のフランキングＤＮＡ配列は図20Ａおよび図20Ｂに示されている。（SEQ ID NO:45）
実施例13−ＨＣＭＶｇＢを含有する組換えポックスウイルスの構築
レスキューウイルスを感染させた組織培養細胞に組換えドナープラスミドをトランスフェクションし、ニトロセルロースフィルタ上のインサイチュハイブリダイゼーションにより組換え体を同定することは既に明らかにされている（Guo他、1989；PanicaliおよびPaoletti、1982；Piccini他、1987；Perkus他、1993）。かくして、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）感染Vero細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ＃８１）に、プラスミド５４２ＣＭＶｇＢをトランスフェクションして、組換え体ｖＰ１００１（ＮＹＶＡＣ−ｇＢ）を調製した。また、ＡＬＶＡＣ感染初代ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞にプラスミドＣＰ３ＬＣＭＶｇＢをトランスフェクションして組換え体ｖＣＰ１３９（ＡＬＶＡＣ−ｇＢ）を調製した。さらに、ＮＹＶＡＣ感染Vero細胞に、プラスミド５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢ、５５３Ｈ６ＣＭＶｇＢＴＭ-および５５３Ｈ６ｇＢＣ-ＴＭ-をトランスフェクションして、それぞれ、組換え体ｖＰ１１２６、ｖＰ１１２８およびｖＰ１１４５を調製した。ＷＲ  Ｌ変異体ワクシニアウイルス（Panicali他、1981）が感染したVero細胞に、プラスミド２２ＣＭＶｇＢをトランスフェクションして、組換え体ｖＰ９９２を調製した。
実施例14−ポックスウイルス組換え体によって発現されたＣＨＭＶｇＢの免疫沈降
ｇＢ特異的モルモットポリクローナル血清（Goenczoel他、1990）を用い、既知の方法（Taylor他、1990）により免疫沈降分析を行った。ｇＢ特異的なバンドの見かけの分子量は以前に報告された結果（BrittおよびAuger、1986；BrittおよびVugler、1989；Reis他、1993）と一致した。ｖＰ９９２、ｖＰ１００１、ｖＣＰ１３９、ｖＰ１１２６、ｖＰ１１２８およびｖＰ１１４５由来の細胞内画分は、見かけの分子量130〜140ｋＤａの主要バンドを含有したが、これはグリコシル化された未切断ｇＢ前駆体であろう。また、細胞画分には約110ｋＤａおよび55ｋＤａにおいて弱いバンドも見られたが、これらはＮ−末端およびＣ末端のプロセシングされたフラグメントである。ｖＰ１１２８およびｖＰ１１４５が感染した細胞由来の細胞内画分は、未切断前駆体ならびにＮ−末端およびＣ末端のプロセシングされたフラグメントを含有していた。
実施例15−ＡＬＶＡＣ−ｇＢおよびＮＹＶＡＣ−ｇＢを接種した実験動物の体液性応答
ＣＢＡマウスにｖＰ１００１（ＮＹＶＡＣ−ｇＢ）を単一回接種して免疫化（免疫感作）した後、被接種マウスの血清中の中和抗体力価を分析した（Goenczoel他、1986）。免疫化から14〜21日後（幾何平均力価は１：16）および28〜60日後（幾何平均力価は１：26）マウスの血清中のＨＣＭＶ中和性抗体を検出した（表２）。ＣＢＡマウスにｖＣＰ１３９（ＡＬＶＡＣ−ｇＢ）を単一回免疫化した場合に産生されたＨＣＭＶ中和性抗体力価は、１：64gmt（幾何平均）（免疫後14〜21日）および１：111gmt（免疫後28〜60日）であった。このように、ＨＣＭＶｇＢを発現するＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ組換え体でマウスを免疫化すると、ＨＣＭＶの感染を中和することのできる抗体が誘起される。
ヒトのボランティアにおいてＡＬＶＡＣ−ｇＢ（ｖＣＰ１３９）の安全性および免疫原性を評価した。該組換え体を106.3ＴＣＩＤ50で２回接種した後でも、顕著な作用は認められなかった。
0003940959.tif 000056
免疫化は、組換えウイルスを２〜４×108ＰＦＵでi.p.投与することにより行った。
次に、モルモットにＡＬＶＡＣ−ｇＢを２回（０日および28日）接種、免疫化し、血清を分析してＨＣＭＶ中和抗体の存在を調べた。34日目（gmt=60）、42日目（gmt=60）および56日目（gmt=60）において血清中のＨＣＭＶ中和抗体の検出を行った（表22）。このように、ＡＬＶＡＣ−ｇＢでモルモットを免疫化すると、ＨＣＭＶの感染を中和し得る抗体が誘発された。
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０日目および28日目に106.3ＴＣＩＤ50でモルモットに筋肉内接種した。
実施例16−ポックスウイルスベクターへのＨＣＭＶｇＨのクローニング
ＮＹＶＡＣドナープラスミドｐＳＤ５５０へのＨＣＭＶｇＨ遺伝子のクローニング  ＰＣＲ法によりオリゴヌクレオチド
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を用いてゲノムＤＮＡ（Towne株）からＨＣＭＶｇＨ遺伝子を単離した。得られた2.3kbフラグメントをＰｓｔＩ（制限部位はＳＰｇＨ１の５′末端にある）およびＨｉｎｄIII（制限部位はＳＰｇＨ２の５′末端にある）を用いて分解し、ＰｓｔＩ／ＨｉｎｄIII分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングしてプラスミドＳｐｇＨ１を調製した。ＣＭＶｇＨの配列は図21に示す（SEQ ID NO:46）。
以下に示すように、該ｇＨ遺伝子の３′末端を変性させて、ワクシニアウイルス初期転写終結シグナル（YuenおよびMoss、1987）および唯一のＸｈｏＩ制限（酵素）部位を含有するようにした。すなわち、ＳＰｇＨ１を、ｇＨの３′末端内でＳｐＨＩを用い、また、ＩＢＩ２４内でＨｉｎｄIIIを用いて分解し、得られるｇＨ含有フラグメントを精製し、そして、キナーゼ処理され且つアニーリングされたオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000059
に連結してプラスミドＳＰｇＨ２を調製した。
キナーゼ処理され且つアニーリングされたオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000060
を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４に連結してプラスミドＳＰｇＨ３を調製した。このプラスミドは、唯一のＸｈｏＩ部位、エントモポックス４２ＫプロモータおよびＨＣＭＶｇＨの最初の４個のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有する（オリゴヌクレオチドＳＰｇＨ１３（SEQ ID NO:116）およびＳＰｇＨ１４（SEQ ID NO:117）において斜線を引いているコドンはアミノ酸配列を変更することなくＳｍａＩ部位を形成するように変性されたものである）。プラスミドＳＰｇＨ１を鋳型とするＰＣＲ法においてオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000061
を用いて0.4kbのフラグメントを得た。このフラグメントをＳｍａＩおよびＰｓｔＩで分解し、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＳＰｇＨ３にクローニングして、プラスミドＳＰｇＨ５（唯一のＸｈｏＩ部位、４２ＫプロモータおよびＨＣＭｇＨ遺伝子の５′側15％を含有する）を調製した。このＳＰｇＨ５由来の0.4kbＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラグメントを、ＳＰｇＨ５由来の4.7kbＥｃｏＲＩ／ＢｇｌIIフラグメントに連結して、プラスミドＳＰｇＨ６（４２Ｋをプロモータとし、ＸｈｏＩ部位にはさまれているｇＨ遺伝子を含有する）を調製した。
プラスミドｐＳＤ５４８（Tartaglia他、1992）からプラスミドｐＳＤ５５０（Ｉ４Ｌ遺伝視座ドナープラスミド）を誘導した。すなわち、ｐＳＤ５４８内のポリリンカー領域をＢｇｌIIおよびＳｍａＩで切断し、アニーリングされた合成オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000062
に連結することにより変性して、プラスミドｐＳＤ５５０を得た。ＳＰｇＨ６由来の2.3kbＸｈｏＩフラグメントを、ＸｈｏＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたｐＳＤ５５０にクローニングして、ＮＹＶＡＣドナープラスミドＩ４Ｌ４２ＫｇＨを調製した。このプラスミド中でｇＨの方向は置換されたＩ４Ｌ遺伝子と同じ方向にある。プラスミドＩ４Ｌ４２ＫｇＨにおけるＣＭＶｇＨのＤＮＡ配列および付加されているフランキングＤＮＡ配列は図22Ａおよび図22Ｂに示している（SEQ ID NO:47）。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドＮＶＱＣ５ＬＳＰへのＨＣＭＶｇＨ遺伝子のクローニング  以下のようにして、Ｃ５上流に1535bp、ＫｐｎＩ／ＳｍａＩ／ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ部位を含有するポリリンカーおよび404bpのカナリアポックスＤＮＡ（31塩基対のＣ５をコードする配列および373bpの下流配列）を含有するＣ５挿入ベクターを誘導した。コスミドベクター（KnaufおよびNester、1982）にカナリアポックスＤＮＡのゲノムライブラリーを構築した。この際、プロービングにｐＲＷ764.5（ＰＵＣ９系プラスミドであり、図９（SEQ ID NO:27）におけるＣ５のＯＲＦヌクレオチド1372〜2252位を含む880bpカナリアポックスＰｖｕIIフラグメントを含有する）および29kbのインサート（ｐＨＣＯＳ１）を含有するクローンを用いた。ｐＨＣＯＳ１からＣ５領域を含有する3.3kbのＣｌａＩフラグメントを分離、同定した。Ｃ５のオープンリーディングフレームは、図８に示す配列（SEQ ID NO:27）において1537位で開始し、1857位で終結している。
Ｃ５挿入ベクターの構築には、２つの工程を実施した。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000063
ならびに精製されたゲノムカナリアポックスＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲ増幅法により1535bpの上流配列を調製した。このフラグメントをＥｃｏＲＩで分解（オリゴＣ５Ａ内で）し、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ分解されたｐＵＣ８にクローニングしてＣ５ＬＡＢを調製した。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000064
を用いるＰＣＲ増幅法により、404bpのアームを調製した。このフラグメントをＰｓｔＩで分解（オリゴＣ５ＤＡ内で）し、ＳｍａＩ／ＰｓｔＩ分解されたＣ５ＬＡＢにクローニングして、ｐＣ５Ｌを調製した。
このｐＣ５ＬをＡｓｐ７１８およびＮｏｔＩで分解（ポリリンカー内）し、アルカリホスファターゼで処理し、さらに、キナーゼ処理され且つアニーリングされたオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000065
（不能化したＡｓｐ７１８部位、６ヶのリーディングフレームの翻訳停止コドン、ワクシニア初期転写終結シグナル（YuenおよびMoss、1987）、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＣｌａＩおよびＳｍａＩ制限部位、ワクシニア初期転写終結シグナル、６ヶのリーディングフレームの翻訳停止コドン、ならびに不能化したＮｏｔＩ部位を含有する）に連結して、プラスミドＣ５ＬＳＰを調製した。Ｃ５ＬＳＰのポリリンカー領域をさらに変性するため、ＢａｍＨＩで分解し、アニーリングされたオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000066
に連結して、プラスミドＶＱＣ５ＬＳＰを調製した。このＶＱＣ５ＬＳＰをＥｃｏＲＩで分解し、アルカリホスファターゼ処理し、キナーゼ処理され且つアニーリングされたオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000067
に連結し、さらにＮｏｔＩで分解した。この線状プラスミドを精製し、自己連結させてプラスミドＮＶＱＣ５ＬＳＰを調製した。ＳＰｇＨ６由来の2.3kbのＸｈｏＩフラグメントを、ＸｈｏＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＮＶＱＣ５ＬＳＰにクローニングしてＡＬＶＡＣドナープラスミドＮＶＱＣ５Ｌ４２ＫｇＨを得たが、該プラスミド内ではｇＨの方向は欠失されたＣ５遺伝子と同じ方向にある。プラスミドＮＶＱＣ５Ｌ４２ＫｇＨにおけるＣＭＶｇＨのＤＮＡ配列および追加のフランキングＤＮＡ配列は図23Ａおよび図23Ｂに示す（SEQ ID NO:47）。
ワクシニアドナープラスミドｐＳＤ１５７Ｋ１ＬＩＮＳへのＨＣＭＶｇＨ遺伝子のクローニング  プラスミドｐＨＫ（これは、ｐＢＲ３２２にクローニングされたＷＲワクシニアＨｉｎｄIIIＫフラグメントを含有する）をＨｉｎｄIII／ＢｈｌIIで分解し、1.2kbフラグメントを単離し、これをＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII分解されたｐＢＳ−ＳＫ+にクローニングして、プラスミドｐＢＳ−ＨＫＡＲＭを得た。このｐＢＳ−ＨＫＡＲＭをポリリンカー内でＡｓｐ７１８を用いて分解し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑末端化し、そして、ｐＢＳ／ワクシニア接合部においてＨｉｎｄIIIで分解した。得られた4.1kbのベクターフラグメントをｐＨＭ−１（ｐＨＭ−１は、ｐＢＲ３２２にクローニングしたＷＲワクシニアウイルスＨｉｎｄIIIＭフラグメントを含有する）由来の2.0kbＮｒｕＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結してプラスミドｐＭＰＷＲＭＫを得た。このｐＭＰＷＲＭＫをＨｐａＩで切断し、アニーリングされた合成オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000068
に連結した。得られたプラスミドがｐＳＤ１５７Ｋ１ＬＮＳである。ｐＳＤ１５７Ｋ１ＬＮＳをそのポリリンカー領域内でＸｈｏＩで分解し、アルカリホスファターゼで処理し、さらに、ＳＰｇＨ６由来の2.3kbのＸｈｏＩフラグメントに連結してプラスミドＭＰ８０４−４２ＫｇＨ（同じ方向にあるＨＣＭＶｇＨ遺伝子およびＫ１Ｌ遺伝子を含有）を形成した。プラスミドＭＰ８０４−４２ＫｇＨにおけるＣＭＶｇＨのＤＮＡ配列および付加されているフランキングＤＮＡ配列は図24に示す（SEQ ID NO:49）。
実施例17−ＨＣＭＶｇＨを含有する組換えポックスウイルス組換え体の構築
ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞にプラスミドＩ４Ｌ４２ＫｇＨをトランスフェクションして組換え体ｖＰ１１７３（ＨＣＭＶｇＨを含有）を調製した。同じプラスミドをｖＰ１００１感染Vero細胞にトランスフェクションして組換え体ｖＰ１１８３（ＨＣＭＶｇＢおよびｇＨを含有）を調製した。
プラスミドＮＶＱＣ５Ｌ４２ＫｇＨをＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞にトランスフェクションして、組換え体ｖＣＰ２３６（ＨＣＭＶｇＨを含有）を調製した。同じプラスミドをｖＣＰ１３９感染ＣＥＦ細胞にトランスフェクションして組換え体ｖＣＰ２３３（ＨＣＭＶｇＢおよびｇＨを含有）を調製した。ワクシニアウイルスｖＰ１１７０（これは、欠失されたＫ１Ｌ遺伝子の場所にエントモポックスウイルス４２Ｋプロモータの転写制御下にＥｃｏｇｐｔを含有する）を用いて、プラスミドＭＰ８０４−４２ＫｇＨでトランスフェクションされたVero細胞を感作して組換え体ｖＰ１２０５Ｂを調製した。
実施例18−ポックスウイルス組換え体によって発現されるＨＣＭＶｇＨの免疫沈降
ＨＣＭＶｇＨに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて実施した免疫沈降により、組換え体ｖＰ１１７３、ｖＰ１１８３、ｖＰ１２０５Ｂ、ｖＣＰ２３３およびｖＣＰ２３６によって８６ＫＤａのｇＨタンパク質（Pachl他、1989）が発現されていることが示された。また、ｇＢ特異的モルモットポリクローナル血清を用いる免疫沈降により、組換え体ｖＰ１１８３およびｖＣＰ２３３が正確に発現されていることが示された。
ＨＣＭＶの７２ＫＤａ即時初期１タンパク質（ＩＥ１）は、ヒトにおけるＣＤ8+細胞障害性Ｔ細胞の標的であり（Borysiewicz他、1988）、ＣＤ4+Ｔ細胞によって認識される（Alp他、1991）。１人についてＩＥ１上の増殖性でＭＨＣ−クラスＩ−制限性の細胞障害性決定基を調べたところ、エクソン４をコードする領域の空間的に離されたセグメントから成ることが見出された（Alp他、1991）。ＩＥ１タンパク質は、それ自身のプロモータ由来の発現を高めるように調節し（CherringtonおよびMocarski、1989）、さらには、ＨＩＶ  ＬＴＲ由来の発現（BiegalkeおよびGeballe、1991；Ghazal他、1991）および細胞性遺伝子ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｆｏｓおよびｈｓｐ７０に対するプロモータの発現（Hagemeiser他、1992；SantomennaおよびColberg-Poley、1990；Colberg-Paley他、1992）に同様の機能を発揮することが示されている。Lafeminaら（1989）は、安定な細胞系内で発現されたＩＥ１タンパク質は分裂中期の染色体に優先的に結合すると報告し、潜伏期にＨＣＭＶのＤＮＡをプラスミド状態で保持するのに該タンパク質が関与している可能性があることを提示した。
以下の実施例19〜30においては、ＩＦ１全遺伝子、２〜32位のアミノ酸が欠失されたＩＥ１、292〜319のアミノ酸が欠失されたＩＥ１、またはＩＥ１のエクソン４セグメントを発現するポックスウイルス組換え体の構築について示している。これらの検討を行った目的は、核へ転移することができず、したがって、転移活性物質として機能する可能性を減少させながら、ＣＤ8+細胞障害性Ｔ細胞により認識され得る能力は維持しているような形態のＩＥ１遺伝子産生物を開発することにある。実施例45により、全長遺伝子産生物とは異なり、変性された形態のＩＥ１タンパク質（２〜32位のアミノ酸が欠失したもの）を発現するＡＬＶＡＣ組換え体は、感染細胞の核および細胞質の双方において見出され、ＨＣＭＶ血清反応陽性個体由来の細胞障害性エフェクター細胞を再刺激できることが示されている。
実施例19−ポックスウイルスベクターへのＨＣＭＶ  ＩＥ１全遺伝子のクローニング
ワクシニアドナープラスミドｐＳＤ２２−ＨへのＨＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子のクローニング  プラスミドｐＪＤ０８３を鋳型とし（Akrigg他、1985）、オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000069
を用いるＰＣＲ法により、1.5kbフラグメントとして全ＨＣＭＶ  ＩＥ１遺伝子を得た。プラスミドｐＳＤ４８６Ｈ６３４０（これは、Ｈ６プロモータに正確に結合した非関連遺伝子を含有する）を（該Ｈ６プロモータ内で）ＮｒｕＩで分解し、さらに（該非関連遺伝子の３′末端において）ＢａｍＨＩで分解し、ＢａｍＨＩ分解された1.5kbのＰＣＲフラグメント（オリゴヌクレオチドＩＥ３の５′末端にＢａｍＨＩがある）に連結してプラスミドｐＳＤ４８６Ｈ６ＨＣＭＶＩＥ１を調製した。
このｐＳＤ４８６Ｈ６ＨＣＭＶＩＥ１から、ＢａｍＨＩによる分解の後、部分的ＢａｌII分解を行うことにより1.6kbのフラグメントとしてＨ６をプロモータとするＩＥ１遺伝子が得られ、ＢａｍＨＩ分解ｐＳＤ２２−Ｈに連結してプラスミドｐＳＤ２２−ＨＣＭＶＩＥ１を調製した。プラスミドｐＳＤ２２−ＨＣＭＶＩＥ１におけるＣＭＶ  ＩＥ１のＤＮＡ配列と追加のフランキングＤＮＡ配列は図26に示している（SEQ ID NO:51）
ワクシニアドナープラスミドｐＳＤ５５４へのＨＣＭＶＩＥ１遺伝子のクローニング  プラスミドｐＳＤ４８６Ｈ６ＨＣＭＶＩＥ１を鋳型とするＰＣＲ法においてオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000070
を用いて、181bpフラグメントを調製した。このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで分解し、ＥｃｏＲＵ／ＸｂａＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングして、プラスミドＳＰＩＥ１（Ｈ６プロモータの一部およびＩＥ１遺伝子の最初の135bpを含有する）を調製した。プラスミドｐＳＤ４８６Ｈ６ＨＣＭＶＩＥ１を鋳型とするＰＣＲ法にオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000071
を用いて506bpのフラグメントを調製した。このフラグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングしてプラスミドＳＰＩＥ２（ＩＥ１遺伝子の３′末端、ワクシニア初期転写終結シグナルおよびＸｈｏＩ部位を含有する）を調製した。ＳＰＩＥ１を、ＩＥ１遺伝子の挿入フラグメントの３′末端においてＨｉｎｄIIで分解し、ＩＢＩ２４ポリリンカー内でＨｉｎｄIIIで分解し、アルカリホスファターゼ処理し、さらに、ｐＳＤ４８６Ｈ６ＨＣＭＶＩＥ１由来の903bpＨｉｎｄII−ＢｇｌIIフラグメントおよびＳＰＩＥ２由来の464bpＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIフラグメントに連結してプラスミドＳＰＩＥ３（Ｈ６プロモータの一部に結合した全ＩＥ１遺伝子を含有する）を調製した。
プラスミドｐＳＤ５５３をＮｒｕＩで切断し、（翻訳開始コドンに対して−２６に位置するＮｒｕＩ部位の上流に合成Ｈ６プロモータ（Perkus他、1989）を含有する）ＳｍａＩ／ＮｒｕＩフラグメントに連結した。得られたプラスミドｐＭＰ５５３Ｈ５をＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩで分解し、アニーリングされたオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000072
に連結した。得られたプラスミドは、開始コドンに対して−１位のヌクレオチドを通る全Ｈ６プロモータ領域、それに後続するポリリンカー領域を含有する。このｐＳＤ５５４をＮｒｕＩおよびＸｈｏＩで分解し、ＳＰＩＥ３由来の1.5kbのＮｒｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントに連結してプラスミドＣＯＰＡＫＨ６ＩＥを調製した。プラスミドＣＯＰＡＫＨ６ＩＥにおけるＣＭＶ  ＩＥ１のＤＮＡ配列およびフランキングＤＮＡ配列は図27Ａおよび図27Ｂに示す（SEQ ID NO:52）。
実施例20−全ＨＣＭＶＩＥ１遺伝子を含有する組換えポックスウイルスの構築
ＷＲ  Ｌ変異体を感染させたVero細胞にプラスミドｐＳＤ２２−ＨＣＭＶＩＥ１をトランスフェクションして組換え体ｖＰ８９３を調製した。また、ＮＹＶＡＣ感染Vero細胞にプラスミドＣＯＰＡＫＨ６ＩＥをトランスフェクションして組換え体ｖＰ１１６１を調製した。
実施例21−ポックスウイルス組換え体による全ＩＥ１遺伝子の発現
ＨＣＭＶＩＥ１に特異的なモノクローナル抗体を用いた免疫沈降試験により、ｖＰ８９３およびｖＰ１１６１による７２ｋＤａのＩＥ１タンパク質（BlantonおよびTevethia、1981；CameronおよびPreston、1981）の発現が確認された。免疫蛍光試験（Taylor他、1990）の記載に従って実施）によれば、該ＩＥ１遺伝子産生物が核に局在化していることが示された。
実施例22−ワクシニアドナープラスミドｐＳＤ５５４へのＨＣＭＶＩＥ１遺伝子（292〜319位アミノ酸を欠失）のクローニング
292〜319位アミノ酸を欠失したＣＭＶＩＥ１のＤＮＡ配列は図28に示す（SEQ ID NO:53）。この欠失は以下のように行った。ＳｐｅＩでプラスミドＳＰＩＥ３を分解し、4239bpのフラグメントを単離した（これは、292〜319位のアミノ酸をコードする868〜958位のヌクレオチドを欠失する）。該フラグメントを自己連結させてプラスミドＳＰＩＥ４とした。このＳＰＩＥ４由来の1.4kbのＮｒｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ分解されたｐＳＤ５５４に連結してプラスミドＣＯＰＡＫＨ６ＩＥＮ-を調製した。プラスミドＣＯＰＡＫＨ６ＩＥＮ-において292〜319位アミノ酸を欠失するＣＭＶＩＥ１のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図29Ａおよび図29Ｂに示している（SEQ ID NO:54）。
実施例23−292〜319位のアミノ酸が欠失したＨＣＭＶＩＥ１遺伝子を含有する組換えポックスウイルスの構築
ＮＹＶＡＣ感染Vero細胞にプラスミドＣＯＰＡＫＨ６ＩＥＮ-をトランスフェクションして組換え体ｖＰ１１６０を調製した。
実施例24−292〜319位のアミノ酸が欠失したＨＣＭＶＩＥ１遺伝子の発現
免疫沈降分析により、ｖＰ１１６０が感染した細胞での６９ｋＤａタンパク質の発現は292〜319位のアミノ酸を欠失したものであることが確認された。免疫蛍光試験により、この遺伝子の産生物は核に局在化していることが示された。
実施例25−ポックスウイルスへのＨＣＭＶＩＥ１のエクソン４セグメントのクローニング
ＮＹＶＡＣドナープラスミドＳＰＩ４ＬＨ６へのＨＣＭＶＩＥ１のエクソン４セグメントのクローニング  ＨＣＭＶＩＥ１のエクソン４セグメントのＤＮＡ配列を図30に示す（SEQ ID NO:55）。該遺伝子セグメントは以下のようにして得た。すなわち、プラスミドｐＳＤ４８６Ｈ６ＨＣＭＶＩＥ１に対するＰＣＲ法においてオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000073
を用いて0.5kbのフラグメントで分解し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングして、プラスミドＳＰＩＥ５を調製した。プラスミドＳＰＩＥ３をＥｃｏＲＩおよびＮｃｏＩで分解して3.6kbのフラグメントを精製し、ＳＰＩＥ５由来の0.47kbＥｃｏＲＩ−ＮｃｏＩフラグメントに連結してプラスミドＳＰＩＥ６（これは、Ｈ６プロモータの一部に結合したＩＥ１のエクソン４セグメントを含有する）を調製した。
鋳型としてＰＲＷ８２３（非関連遺伝子に結合したＨ６プロモータを含有するプラスミド）を用い、さらに、オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000074
を用いて初期／後期Ｈ６ワクシニアウイルスプロモータ（Guo他、1989；Perkusu他、1989）を得た。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで分解（制限部位は、それぞれ、ＣＰ３０およびＣＰ３１の５′末端にある）し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ分解されたＣ５ＬＳＰに連結してプラスミドＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰを調製した。このプラスミドを鋳型として用い、オリゴヌクレオチドＣＰ３１および
0003940959.tif 000075
を用いるＰＣＲ法を実施した。得られたＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで分解（制限部位は、それぞれ、ＲＵＢ１およびＣＰ３１の５′末端にある）し、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ分解されたｐＳＤ５５０に連結してプラスミドＳＰＩ４ＬＨ６を調製した。ＳＰＩＥ６から単離した1.3kbのＮｒｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＳＰＩ４ＬＨ６にクローニングして、プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥ−Ｅｘ４（この中では、Ｈ６をプロモータとするＩＥ１のエクソン４遺伝子は、置換されたＩ４Ｌ遺伝子と同じ方向にある）を調製した。プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥ−Ｅｘ４におけるＨＣＭＶＩＥ１のエクソン４セグメントのＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図21に示している（SEQ ID NO:54）。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰへのＨＣＭＶＩＥ１のエクソン４フラグメントのクローニング  プラスミドＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰをＥｃｏＲＩで分解し、アルカリホスファターゼ処理し、キナーゼ処理され且つアニーリングされたオリゴヌクレオチドＣＰ２９に連結し、さらに、ＮｏｔＩで分解した。直鎖状にした該プラスミドを精製し、自己連結させてプラスミドＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰを調製した。ＳＰＩＥ６由来の1.3kbＮｒｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントをＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰにクローニングしてプラスミドＮＶＱＨ６ＩＥ−Ｅｘ４（このプラスミド中では、Ｈ６をプロモータとするＩＥ１のエクソン４遺伝子は、置換されたＣ５遺伝子と同じ方向にある）を調製した。プラスミドＮＶＱＨ６ＩＥ−Ｅｘ４におけるＨＣＭＶＩＥ１のエクソン４セグメントのＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図32Ａおよび図32Ｂに示している（SEQ ID NO:57）。
実施例26−ＩＥ１エクソン４セグメントを含有する組換えポックスウイルスの構築
ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞に、プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥ−Ｅｘ４をトランスフェクションして組換え体ｖＰ１１８６を調製した。また、ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞に、プラスミドＮＶＱＨ６ＩＥ−Ｅｘ４をトランスフェクションして組換え体ｖＣＰ２４４を調製した。
実施例27−ポックスウイルス組換え体によるＨＣＭＶＩＥ１のエクソン４セグメントの発現
免疫蛍光分析によれば、組換え体ｖＰ１１８６およびｖＣＰ２４４によって発現されたＩＥ−エクソン４タンパク質は細胞質に局在化していることが示された。ＩＥ−エクソン４に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降実験により、ｖＣＰ２４４が感染した細胞内でエクソン４セグメントの大きさに正確に一致する６０ｋＤａのタンパク質の発現が確認された。バクテリアのエクソン４融合タンパク質に対するポリクローナルウサギ血清を用いる免疫沈降反応により、ｖＰ１１８６およびＶＣＰ２４４が感染した細胞内で６０ｋＤａのタンパク質が発現されていることが示された。
実施例28−ポックスウイルスベクターへの（２〜32位のアミノ酸を欠失する）ＨＣＭＶＩＥ１遺伝子のクローニング
ＮＹＶＡＣドナープラスミドＳＰＩ４ＬＨ６への（２〜32位アミノ酸を欠失する）ＨＣＭＶＩＥ１遺伝子のクローニング  ２〜32位のアミノ酸を欠失するＨＣＭＶＩＥ１のＤＮＡ配列は図33に示す（SEQ ID NO:58）。このセグメントは以下のように調製した。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000076
をキナーゼ処理し、アニーリングし、さらに、ＳＰＩＥ３由来のアルカリホスファターゼ処理された4.2kbフラグメントに連結してプラスミドＳＰＩＥ８を調製した。このＳＰＩＥ０（Ｈ６プロモータの一部および２〜32位アミノ酸を欠失するＩＥ１を含有する）由来の1.4kbのＮｒｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＳＰＩ４ＬＨ６に連結して、プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥｄ３２を調製した。プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥｄ３２における２〜32位アミノ酸欠失ＨＣＭＶＩＥ１のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図34に示している（SEQ ID NO:59）。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰへの（２〜32位のアミノ酸が欠失した）ＨＣＭＶＩＥ１遺伝子のクローニング  ＳＰＩＥ８由来の1.4kbのＮｒｕＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰにクローニングして、プラスミドＮＶＱＨ６ＩＥｄ３２を調製した。プラスミドＮＶＱＨ６ＩＥｄ３２における２〜32位アミノ酸欠失ＨＣＭＶＩＥ１のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図35Ａおよび図35Ｂに示している（SEQ ID NO:60）。
実施例29−２〜32位のアミノ酸が欠失されたＩＥ１遺伝子を含有するポックスウイルス組換え体の構築
ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞に、プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥｄ３２をトランスフェクションして組換え体ｖＰ１２０１を調製した。また、ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞にＮＶＱＨ６ＩＥｄ３２をトランスフェクションして組換え体ｖＣＰ２５６を調製した。
実施例30−ポックスウイルス組換え体による２〜32位アミノ酸欠失ＩＥ１の発現
免疫蛍光実験によれば、組換え体ｖＰ１２０１およびｖＣＰ２５６による２〜32位アミノ酸欠失ＩＥ１タンパク質は核および細胞質の両方に存在していることが示された。バクテリアのエクソン４に対するポリクローナルウサギ血清を用いる免疫沈降法は、ｖＰ１２０１が感染した細胞に、予測サイズに一致する６８ｋＤａのタンパク質が発現していることを示した。
実施例31−ポックスウイルスベクターへのＨＣＭＶ  ｐｐ６５遺伝子のクローニング
ＮＹＶＡＣドナープラスミドへのＨＣＭＶ  ｐｐ６５遺伝子のクローニング
ｐＳＤ４５６は、ＨＡ遺伝子（Ａ５６Ｒ、Goebel他、1990a,b）およびその周りの領域を含有するコペンハーゲン（Copenhagen）ワクシニアＤＮＡのサブクローンである。このｐＳＤ４５６を鋳型としＰＣＲ法により、Ａ５６Ｒ  ＯＲＦをはさむ（フランキングする）左側および右側のワクシニアアームを合成した。左側アームの合成にはオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000077
を用いた。右側アームは、オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000078
を用いて合成した。これらの左側アームおよび右側アームの精製ＰＣＲフラグメントを更なるＰＣＲ反応によって結合した。得られた生成物をＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで分解した。得られた0.9kbのフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII分解されたｐＵＣ８にクローニングしてプラスミドｐＳＤ５４４を得た。
このｐＳＤ５４４を、ポリリンカー内でＸｈｏＩ分解し、クレノウ断片を用いてフィリングを行い、さらにアルカリホスファターゼ処理した。プラスミドＳＰ１２６（ＳＰ１３１と等価）をＨｉｎｄIIIで分解し、クレノウ処理し、さらにＳｍａＩで分解してＨ６プロモータを単離した。このＨ６プロモータフラグメントをｐＳＤ５４４に連結してＳＰＨＡ−Ｈ６を調製した。
鋳型としてＨＣＭＶゲノムＤＮＡ（Towne株）を用い、さらにオリゴヌクレオチド
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を用いて、ＨＣＭＶ  ｐｐ６５遺伝子をＰＣＲ増幅した。ＣＭＶｐｐ６５のＤＮＡ配列は図36に示す（SEQ ID NO:61）。1.6kbの生成物をＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩで分解（制限部位は、それぞれ、オリゴヌクレオチドｐｐ６５１およびｐｐ６５１Ｒの５′末端に存在する）し、ＮｒｕＩ／ＢａｍＨＩ分解されたＳＰＨＡ−Ｈ６にクローニングしてプラスミドＣＭＶ65.1を調製した。このプラスミドはＨ６プロモータに結合したｐｐ６５遺伝子を含有していたが、該ｐｐ６５遺伝子の最初の３０ｂｐを欠失していた。
ｐｐ６５の最初の３０ｂＰを含有するプラスミドを得るために、オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000080
を用いてゲノムＤＮＡのＰＣＲ反応を行った。得られた１ｋｂフラグメントをＢａｍＨＩで分解（ＢａｍＨＩ部位は、両オリゴヌクレオチドの５′末端に存在する）し、ＢａｍＨＩ分解されたＩＢＩ２４にクローニングしてプラスミドpp65.7を調製した。このプラスミドpp65.7を用いてオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000081
によるＰＣＲ法を実施して0.5kbのフラグメントを得た。このフラグメントをＮｒｕＩおよびＢｓｔＸＩで分解（制限部位は、それぞれ、オリゴヌクレオチドpp651Ｂおよびpp65ＢｓｔＸＩの５′末端にある）し、ＣＭＶ65.1の4.8kbのＮｒｕＩ／ＢｓｔＸＩフラグメントに連結してプラスミドｐＣＭＶ65.2を調製した。このプラスミドは、Ｈ６プロモータに正確に連結され置換されたＨＡ遺伝子と同じ方向に配向されている全pp65遺伝子を含有する。プラスミドｐＣＭＶ65.2におけるＣＭＶpp65のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図37に示す（SEQ ID NO:62）。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドｐＭＰＣ６１６Ｅ６ＶＱへのＨＣＭＶ  pp65遺伝子のクローニング  図38Ａおよび図38Ｂ（SEQ ID NO:63）は、カナリアポックスＤＮＡの3.7kbフラグメントの配列である。該配列を分析することにより、Ｃ６Ｌと指称されるリーディングフレームが377位で開始し2254位で終結していることが示された。Ｃ６の上流の370bp、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有するポリリンカー、ならびに下流配列の1156bpを含有するＣ６挿入ベクターを以下のようにして誘導した。0.4bpの上流配列の調製は、精製したゲノムカナリアポックスＤＮＡ由来のコスミドクローンのＰＣＲ増幅法によりオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000082
を用いて行った。1.2kbの下流アームは上記と同じ鋳型を用いるＰＣＲ増幅法によりオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000083
を使用して調製した。これらのフラグメントを融合するため、ゲル精製した0.4kbフラグメントおよび1.2kbフラグメントを鋳型としてプライマーＣ６Ａ１ＳＧ（SEQ ID NO:159）およびＣ６Ｄ１ＳＧ（SEQ ID NO:162）を用いる第３のＰＣＲ法を実施した。得られる1.6kbのフラグメントをアガロースゲルから分離し、ＳａｃＩおよびＫｐｎＩで分解し、同じ酵素で分解されたｐＢＳに連結して、Ｃ６挿入プラスミドｐＣ６Ｌを調製した。
非関連遺伝子に結合したＨ６プロモータを含有するＨｐａＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ＳｍａＩ−ＸｈｏＩ分解されたｐＣ６ＬにクローニングすることによりプラスミドｐＭＰＣ６１６Ｅ６ＶＱを誘導した。このｐＭＰＣ６１６Ｅ６ＶＱＱをＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩで分解し、４ｋｂのベクターフラグメント（ＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩ）と0.6kbのＣ６フランキングアームフラグメント（ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ）を単離した。これらの２種類のフラグメントを、ｐＣＭＶ65.2（p65遺伝子に結合したＨ６プロモータの一部分を含有する）由来の1.7kbＮｒｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに連結して、プラスミドＣＭＶ６５Ｃ6.1、すなわち、Ｃ６フランキングアーム、Ｈ６プロモータおよびpp65遺伝子を含有するが0.6kbのＣ６フランキングアームを欠失したプラスミドを調製した。ＣＭＶ６５Ｃ6.1をＢａｍＨＩで分解し、アルカリホスファターゼ処理し、さらに、0.6kbのＣ６フランキングアームに連結して、プラスミドＣＭＶ６５Ｃ6.2、すなわち、Ｈ６−pp65インサートの両側にＣ６フランキングアームが存在しているプラスミドを調製した。プラスミドＣＭＶ６５Ｃ6.2におけるＣＭＶpp65のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は、図39Ａおよび39Ｂに示す（SEQ ID NO:64）。
ワクシニアドナープラスミドｐＳＤ１５７Ｋ１ＬＩＮＳへのＨＣＭＶｐｐ６５遺伝子のクローニング  プラスミドｐＣＭＶ65.2をＫｐｎＩ分解し、ヤエナリヌクレアーゼ処理し、さらにＢａｍＨＩで分解して、Ｈ６−pp65を含有する1.7kbフラグメントを調製した。ＰＳＤ１５７Ｋ１ＬＩＮＳをＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで分解し、上記1.7kbフラグメントに連結して、プラスミドＣＭＶ65．ＷＲを調製した。プラスミドＣＭＶ65．ＷＲにおけるＣＭＶpp65のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図40に示す（SEQ ID NO:65）。
実施例32−ＨＣＭＶpp65を含有する組換えポックスウイルスの構築
プラスミドｐＣＭ65.2を、ＮＹＶＡＣ感染Vero細胞にトランスフェクションして組換え体ｖＰ１１８４（ＨＣＭＶpp65を含有する）を調製し、ｖＰ１００１感染Vero細胞にトランスフェクションして組換え体ｖＰ１１９６（ＨＣＭＶｇＢおよびpp65を含有する）を調製し、また、ｖＰ１１８３感染Vero細胞にトランスフェクションして組換え体ｖＰ１２１０（ＨＣＭＶｇＢ、ｇＨおよびpp65を含有する）を調製した。
ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞にプラスミドＣＭＶ６５Ｃ6.2をトランスフェクションして組換え体ｖＣＰ２６０（ＨＣＭＶpp65を含有する）を調製した。
ｖＰ１１７０感染Vero細胞にプラスミドＣＭＶ65．ＷＲをトランスフェクションして組換え体ｖＰ１２１４（ＷＲ−pp65）を調製した。
実施例33−ポックスウイルス組換え体によるＨＣＭＶpp65の発現
ＨＣＭＶpp65に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降実験の結果、組換え体ｖＰ１１８４、ｖＰ１２１４、ｖＣＰ２６０、ｖＰ１１９６およびｖＰ１２１０による６５ｋＤａのタンパク質（Pande他、1991）の発現が確認された。さらに、ｇＢ特異的なモルモットポリクローナル血清を用いる免疫沈降実験の結果、組換え体ｖＰ１１９６およびｖＰ１２１０によりｇＢが正しく発現されていることが明らかにされ、また、ｇＨ特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降実験によれば組換え体ｖＰ１２１０によりｇＨが正しく発現されていることが明らかにされた。
実施例34−ポックスウイルスベクターへのＨＣＭＶ  pp150遺伝子のクローニング ＮＹＶＡＣドナープラスミドｐＳＤ５４１へのpp150遺伝子のクローニング
ＣＭＶpp150のＤＮＡ配列を図41に示す（SEQ ID NO:66）。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000084
を用いてTowneゲノムＤＮＡのＰＣＲを行って、pp150の５′末端から２ｋｂフラグメントを調製した。このフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングしてプラスミドpp150.5を調製した。オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000085
を用いてTowne ＤＮＡのＰＣＲを実施して、該遺伝子の３′末端を含む1.8kbフラグメントを調製した。このフラグメントをＢａｍＨＩで分解して、ＢａｍＨＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＰＵＣ８にクローニングしてpp150.3を得た。
オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000086
を用いてプラスミドpp150.5を鋳型とするＰＣＲを行い、259bpのフラグメントを調製した。このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで分解して、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングしてプラスミド150.5MPを調製した。このプラスミドはＮｈｅＩ部位、65bpのエントモポックスウイルス４２Ｋプロモータ、およびpp150遺伝子の５′末端から１〜170位の塩基を含有する。オリゴヌクレオチドＳＰ１５０−３の配列において下線を施した塩基（該プロモータの−53位）はこのクローンにおいては欠失している。
オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000087
を用いてプラスミドpp150.3を鋳型とするＰＣＲを行い、907bpのフラグメントを調製した。このフラグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ２４にクローニングしてプラスミド150.3MPを得た。このプラスミドは、pp150の2273〜3141位のヌクレオチド、それに後続するワクシニア初期転写終結シグナル（Ｔ5ＡＴＴ）（YuenおよびMoss、1987）およびＮｈｅＩ部位を含有する。このクローンにおけるpp150のヌクレオチド2748位（図41；SEQ ID NO:48）は、Ａでありpp150.3におけるようにＣでないが、この変化はサイレントである。
プラスミドpp150.3をＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、3451bpのフラグメントを単離した。プラスミド150.3MPをＳｎａＢＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、873bpのフラグメントを単離した。これらの２種類のフラグメントを連結することによりプラスミド150.3MC、すなわち、pp150の1473〜3141位ヌクレオチド、それに後続するＴ5ＡＴＴおよびＮｈｅＩ部位を含有するプラスミドを得た。
プラスミド150.5MPをＳａｃＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、3056bpのフラグメントを単離した。プラスミドpp150.5をＳａｃＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、1816bpのフラグメントを単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミド150.5MC（ＮｈｅＩ部位、65bpの４２Ｋプロモータおよびpp150の１〜1981位ヌクレオチドを含有する）を得た。
プラスミド150.5MCをＨｐａＩおよびＨｉｎｄIIIで分解して4634bpのフラグメントを単離した。プラスミド150.3MCをＨｐａＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、1412pbのフラグメントを単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミド150.1を得たが、このプラスミドはＮｈｅＩ部位、65bpの４２Ｋプロモータ、pp150の１〜3141位ヌクレオチドおよびＮｈｅＩ部位を含有する。
プラスミドｐＳＤ5411は、Ａ２５ＬおよびＡ２６ＬのＯＲＦ（Goebel他、1990a,b）を包含するワクシニアウイルス配列が欠失した挿入プラスミドである。欠失接合部は、ＸｈｏＩ、ＳｍａＩおよびＢｇｌII制限部位を含有するポリリンカー領域から成り、その両側が停止コドンおよび初期ワクシニア転写終結シグナル（YuenおよびMoss、1987）ではさまれている。ｐＳＤ５４１の構造は、クローニングしたワクシニアＳａｌＩ  Ｅプラスミドを鋳型とするポリメラーゼ連鎖反応により行った。プライマーとして合成オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000088
を用いて左側のワクシニアアームを調製し、また、合成オリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000089
を用いて右側のワクシニアアームを調製した。該左側アームおよび右側アームから成るＰＣＲ生成物を結合させて、ＰＣＲ増幅に供した。そのＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIで分解して、アガロースゲル上で電気泳動させた。0.8kbのフラグメントを単離し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで切断されたｐＵＣ８に連結して、プラスミドｐＳＤ５４１を得た。
ｐＳＤ５４１をそのポリリンカー内でＳｍａＩで分解し、アルカリホスファターゼ処理した。プラスミド150.1をＮｈｅＩで分解し、クレノウ断片で処理して3224bpのフラグメント（42K-pp150を含有）を単離した。これらの２種類のフラグメントを連結してプラスミド150.7を得た。プラスミド150.7におけるＣＭＶpp150のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列は図42Ａおよび図42Ｂに示している（SEQ ID NO:68）。
ＡＬＶＡＣドナープラスミドへのpp150遺伝子のクローニング  プラスミドＰＭＭ117は、ポリリンカー領域が変性されたｐＣ６Ｌの誘導体である。ＰＭＭ117をそのポリリンカー内でＥｃｏＲＩで分解し、クレノウでフィリングを行い、さらに、アルカリホスファターゼで処理した。プラスミド150.1をＮｈｅＩで分解し、クレノウ処理して、3224bpのフラグメント（42K-pp150を含有）を単離した。このようにして得られた２種類のフラグメントを連結してプラスミド150.69を調製した。プラスミド150.6におけるＣＭＶpp150のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列を図43Ａおよび図43Ｂに示す（SEQ ID NO:68）。
ワクシニアドナープラスミドｐＳＤ１５７Ｋ１ＬＩＮＳへのpp150遺伝子のクローニング  プラスミドｐＳＤ１５７Ｋ１ＬＩＮＳをそのポリリンカー内でＳｍａＩで分解し、アルカリホスファターゼ処理した。プラスミド150.1をＮｈｅＩで分解し、クレノウで処理して、3224bpのフラグメント（42K-pp150を含有する）を単離した。これらの２種類のフラグメントを連結してプラスミド150.4を調製した。プラスミド150.4におけるＣＭＶpp150のＤＮＡ配列とフランキングＤＮＡ配列を図44Ａおよび図44Ｂに示す（SEQ ID NO:69）。
実施例35−ＨＣＭＶpp150を含有する組換えポックスウイルスの構築
ｖＰ１１７０感染ＣＥＦ細胞にプラスミド150.4をトランスフェクションして組換え体ｖＰ１２３８（ＷＲ−pp150）を調製した。
ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞にプラスミド150.7をトランスフェクションして組換え体ｖＰ１２４７（ＮＹＶＡＣ−pp150）を調製した。
ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞にプラスミド150.6をトランスフェクションして組換え体ｖＣＰ２８４（ＡＬＶＡＣ−pp150）を調製した。
実施例36−ポックスウイルス組換え体によるＨＣＭＶpp150の発現
ＨＣＭＶpp150に特異的なモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットにより（HalowおよびLane、1988）、ｖＰ1238感染細胞内に150ｋＤａのタンパク質が発現され、ＨＣＭＶ感染細胞内に存在するタンパク質と共に移動したことが示された。pp150に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降により、ｖＰ1247およびｖＣＰ284感染細胞内に150ｋＤａのタンパク質の発現が認められた。
実施例37−ＨＣＭＶｇＨおよびＩＥ１エクソン４遺伝子を含有するＮＹＶＡＣドナープラスミドの構築
プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥ−Ｅｘ４をＢａｍＨＩで直鎖状にし、クレノウでフィリングし、さらにアルカリホスファターゼで処理して4.9kbのフラグメントを得た。プラスミドｇＨ６−３をＸｈｏＩで分解し、クレノウでフィリングして、2.3kbのフラグメント（42K-gHを含有）を単離した。これらの２種類のフラグメントを連結してプラスミドＩ４Ｌ４２ＫｇＨＨ６ＩＥ−Ｅｘ４を調製した。プラスミドＩ４Ｌ４２ＫｇＨＨ６ＩＥ−Ｅｘ４におけるＣＭＶｇＨのＤＮＡ配列と負荷されているフランキング配列は図45Ａおよび図45Ｂに示す（SEQ ID NO:70）。
実施例38−ＨＣＭＶｇＢ＋ｇＨ＋pp65＋ＩＥ−エクソン４、ＨＣＭＶｇＢ＋ｇＨ＋pp65＋pp150、またはＨＣＭＶｇＢ＋ｇＨ＋pp65＋ＩＥ−エクソン４およびpp150を含有するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
ｖＰ1196感染Vero細胞にプラスミドＩ４Ｌ４２ＫｇＨＨ６ＩＥ−Ｅｘ４をトランスフェクションして、組換え体ｖＰ1216（ＨＣＭＶｇＢ、ｇＨ、pp65、ＩＥ−エクソン４を含有）を調製した。ｖＰ1216感染ＣＥＦ細胞にプラスミド150.7をトランスフェクションして組換え体ｖＰ1251（ＨＣＭＶｇＢ、ｇＨ、ＩＥ−エクソン４、pp65、pp150を含有）を調製した。ｖＰ1210感染Vero細胞にプラスミド150.7をトランスフェクションして組換え体ｖＰ1262（ＨＣＭＶｇＢ、ｇＨ、pp65、pp150を含有）を調製した。
実施例39−ｖＰ1216、ｖＰ1251、ｖＰ1262におけるＨＣＭＶ遺伝子の発現
ｇＢ、ｇＨ、pp65およびＩＥ−エクソン４に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降により、組換え体ｖＰ1216によるそれら４種類の遺伝子の正確な発現が確認された。ｇＢ、ｇＨ、pp65およびＩＥ−エクソン４に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降により、組換え体ｖＰ1251によってそれら４種類の遺伝子が正確に発現されていることが確認された。ｇＢ、ｇＨおよびpp65に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降により、組換え体1262によるそれら３種類の遺伝子の正確な発現が確認された。pp150に特異的なモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロットにより、組換え体ｖＰ1251およびｖＰ1262による該遺伝子の正確な発現が確認された。
実施例40−ＨＣＭＶのpp65およびpp150遺伝子を含有するドナープラスミドの構築  プラスミドＣＭＶ６５Ｃ6.2をＥｃｏＲＩで直鎖状化し、クレノウでフィリングを行い、さらにアルカリホスファターゼで処理して6.3kbのフラグメントを調製した。プラスミド150.1をＮｈｅＩで分解し、クレノウでフィリングを行って、3.2kbのフラグメント（42K-pp150を含有）を調製した。これらの２種類のフラグメントを連結してプラスミド150.8を得た。プラスミド150.8におけるＣＭＶpp65とpp150のＤＮＡ配列と付加されているフランキング配列は図46Ａ〜46Ｃに示す（SEQ ID NO:71）。
実施例41−ＨＣＭＶｇＢ、ｇＨ、pp65およびpp150を含有するＡＬＶＡＣ組換え体の構築
ｖＰＣ233感染ＣＥＦ細胞にプラスミド150.8をトランスフェクションして、ＡＬＶＡＣ−ｇＢ、ｇＨ、pp150組換え体（ｖＣＰ280）を調製した。
実施例42−ｖＣＰ280におけるＨＣＭＶ遺伝子の発現
ｇＢ、ｇＨおよびpp65に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降により、組換え体ｖＣＰ280によるそれら３種類の遺伝子の正確な発現が確認された。
実施例43−ｇＢおよびｇＬを含有するＮＹＶＡＣドナープラスミドを得るためのポックスウイルスへのＨＣＭＶｇのクローニング
Towne ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000090
を用いて853bpのフラグメントを調製した。このフラグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ24にクローニングしてプラスミドＵＬ115.1を調製した。ＣＭＶｇＬの配列は図47に示す（SEQ ID NO:72）。
プラスミドＵＬ115.1を鋳型とするＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000091
を用いて498bpのフラグメントを調製した。このフラグメントＨｉｎｄIIIおよびＸｂａＩで分解し、ＨｉｎｄIII／ＸｂａＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ24にクローニングしてプラスミド115.2を調製した。
プラスミドＵＬ115.1を鋳型とするＰＣＲにおいてオリゴヌクレオチド
0003940959.tif 000092
を用いて450bpのフラグメントを調製した。このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで分解し、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ分解され且つアルカリホスファターゼ処理されたＩＢＩ24にクローニングしてプラスミドＵＬ115.3を調製した。
プラスミド115.3をＨｉｎｄIIIおよびＳａｃＩで分解し、3226bPのフラグメントを単離した。プラスミドＵＬ115.2をＨｉｎｄIIIおよびＳａｃＩで分解し、469bpのフラグメントを単離した。これらの２種類のフラグメントを連結してプラスミドＵＬ115.4を得た。
プラスミド115.4をＮｒｕＩおよびＢｇｌIIで分解し、865bpのフラグメントを得た。プラスミドＩ４ＬＨ６をＮｒｕＩおよびＢｇｌIIで分解し、3683bpのフラグメントを単離した。これらの２種類のフラグメントを連結してプラスミドＩ４ＬＨ６ｇＬを得た。
Ｉ４ＬＨ６ｇＬ内のＨ６プロモータの１塩基欠失を矯正するために、該プラスミドをＥｃｏＲＶで分解し、アルカリホスファターゼで処理して、3805bpのフラグメントを単離した。また、プラスミドＩ４ＬＨ６をＥｃｏＲＩで分解して736bpのフラグメントを単離した。これらの２種類のフラグメントを連結してプラスミドＩ４ＬＨ６ＣｇＬを得た。
プラスミド５４２ＣＭＶｇＢをＢａｍＨＩを用いて直鎖状化し、アルカリホスファターゼで処理した。プラスミドＩ４ＬＨ６ＣｇＬをＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで分解し、968bpのフラグメント（Ｈ６をプロモータとするｇＬ遺伝子を含有する）を単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミド５４２ＣＭＶｇＢｇＬを調製した。プラスミド５４２ＣＭＶｇＢｇＬにおけるＣＭＶｇＬおよびＣＭＶｇＢのＤＮＡ配列と付加されているフランキングＤＮＡ配列は図48Ａおよび図48Ｂに示している（SEQ ID NO:73）。
実施例44−ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp65、pp150、ＩＥ１−エクソン４、またはｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp65、pp150を含有するＮＹＶＡＣ組換え体の構築
ｖＰ１２５１感染ＣＥＦ細胞にプラスミド５４２ＣＭＶｇＢｇＬをトランスフェクションして、ＮＹＶＡＣ  ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp65、pp150、ＩＥ１−エクソン４組換え体（ＮＹＶＡＣ−ＣＭＶ６：ｖＰ1302およびｖＰ1302Ｂ）を調製した。
ｖＰ1262感染細胞にプラスミド５４２ＣＭＶｇＢｇＬをトランスフェクションしてＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ1312（ＮＹＶＡＣ−ＣＭＶ５）を調製した。
実施例45−ＨＣＭＶタンパク質に対するヒト細胞傷害性Ｔリンパ球応答
免疫系の抗原特異性セグメントから成るリンパ球は、抗体（Ｂリンパ球）を産生することにより、あるいは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔリンパ球）になることにより抗原と機能的に反応し得る。ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球により認識されることが知られているＨＣＭＶタンパク質を発現するＡＬＶＡＣ組換え体は、ヒトの細胞性免疫応答を再刺激することができ、その際、古典的なＣＴＬｓの特徴が発揮される。
ＣＴＬ標的用に既にＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系（ＬＢＣＬ）が樹立された13名について、スクリーニングを行いＨＣＭＶのｇＢ、ＩＥ１およびpp65に対するＣＴＬ応答を調べた。これらの血液提供ボランティアのうちＨＣＭＶの明確な臨床経歴を有するのは１名のみであったが、ＨＣＭＶ中和性抗体を含有する血清によれば７名がＨＣＭＶ血清陽性であることが判明した。
ＡＬＶＡＣ−ＩＥ１（ｖＣＰ２５６）によるＨＣＭＶ  ＩＥ１  ＣＴＬｓの刺激：各ボランティアドナーから静脈穿刺により全血液を採取してヘパリン添加したVacutainer管に入れた。残りの血液構成分から単核細胞画分をLeucoprep勾配遠心により分離し、Stim培地（５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、10-4Ｍの２−メルトカプトエタノール、100IU/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを含有するＭＥＭ）中で遠心することにより数回洗い、トリパンブルーを用いて生存細胞を計数し、Stim培地内に５×106細胞／mlの濃度で再懸濁した（キラー細胞）。該単核細胞の一部を、２％ＦＢＳを含有するＭＥＭ中に107細胞／mlの濃度で再懸濁し、ＨＣＭＶのＩＥ１を発現する組換えＡＬＶＡＣを37℃において１時間にわたり感染多重度25で感染させた。インキュベーション後、充分量のStim培地を添加して該感染細胞を稀釈して５×105細胞／mlとした（刺激細胞）。等体積のキラー細胞と刺激細胞とを、直立で25cm2の組織培養フラスコまたは24個のウエルから成る組織培養プレートのウエルに添加して、37℃において６日間、５％ＣＯ2／95％空気下にインキュベートした。標的細胞の調製は、刺激細胞の感染の場合と同様に、ＨＣＭＶのＩＥ１を発現する組換えＷＲワクシニアウイルス（ｖＰ893）でＬＢＣＬｓを感染させることにより行った。但し、標的細胞は、20％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ1640培地中４×105細胞／mlにおいて一晩インキュベートした。インキュベーション後、単核細胞および標的細胞をAssay培地（10％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、５×10-5Ｍの２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ1640培地）中の遠心により洗浄した。標的細胞をＮａ251ＣｒＯ4中で１時間インキュベートし、Assay培地中の遠心により洗浄し、Assay培地中で105細胞／mlの濃度に再懸濁して、使用に供するまで氷上に保持した。遠心後、単核細胞をAssay培地中で２×106細胞／mlに稀釈した。10分の１mlの単核細胞および0.1mlの51Ｃｒをラベルした感染標的細胞を、96−ウエル丸底組織培養プレートのウエルに添加した。この体積と細胞密度により、エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）は20：１となった。該組織培養プレートを250gで２分間遠心し、次に、５％ＣＯ2／95％空気中で37℃において４〜５時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウエルからSkatronフィルターガーゼを用いて0.1mlの上澄み液を集め、放出された放射能を計数した。細胞毒性（パーセント）は以下のように計算した：
（実験による51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出）／（最大51Ｃｒ放出−自発的51Ｃｒ放出）×100。
最大放出は標的細胞に５％のドデシル硫酸ナトリウムを添加することにより測定し、また、自発的放出はエフェクター細胞の不存在下に標的細胞をインキュベーションすることにより測定した。いずれの実験においても、標的細胞からの51Ｃｒの自発的放出が最大の51Ｃｒ放出の20％を超えることはなかった。
単一のＨＣＭＶタンパク質を発現するＡＬＶＡＣ組換え体によるインビトロ刺激後、７名の血清陽性ボランティアドナーのうちの４名由来の単核細胞はＨＣＭＶのＩＥ１を発現する同原性（自己由来）標的を溶解し（図49）、また、７名の血清陽性ドナーのうちの６名由来の単核細胞はＨＣＭＶのpp65を発現する同原性標的を溶解した（図50）。ＨＣＭＶ血清陽性ドナー由来の再刺激単核細胞が、ＨＣＭＶのｇＢを発現する同原性標的を溶解することはなかった。
ＨＣＭＶ血清陰性のボランティアドナー由来の単核細胞をＨＣＭＶ血清陽性ドナーの単核細胞と同様に再刺激したが、ＨＣＭＶのＩＥ１またはＨＣＭＶのpp65を発現する同原性標的細胞を溶解しなかった（それぞれ、図49および図50参照）。
１例を除くすべての場合において、細胞障害性エフェクター細胞は、適当なＨＣＭＶを発現する同原性標的細胞のみを溶解し、非同原性標的細胞は溶解しなかった。唯一の例外であるドナー７Ｃ由来の単核細胞は、ＡＬＶＡＣpp65（ｖＣＰ６５０）による再刺激後、ＨＣＭＶpp65を発現する非同原性標的細胞を溶解することができた。しかしながら、後に、ドナー７Ｃおよび非同原性標的細胞系のドナーは、ヒト主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のＨＬＡ−Ｂ７を共有していることが明らかにされた。
ＡＬＶＡＣ−ＩＥ１（ｖＣＰ256）によるＨＣＭＶ  ＩＥ１  ＣＴＬｓの刺激：インビトロでヒトＣＴＬｓを刺激し、図49と同様の方法を用いてＨＣＭＶ  ＩＥ１  ＣＴＬｓを分析した。但し、再刺激のための６日間のインキュベーションの後、抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８モノクローナル抗体に結合した免疫磁性ビードを用いてキラー単核細胞をインキュベートした。インキュベーション後、マグネットによりビード、すなわちＣＤ３＋、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を除去した。磁性ビートに付着している細胞を解離し、洗浄して、細胞障害性分析に使用した。
このＨＣＭＶ血清陽性コホートの細胞障害性応答の表現型の典型として、ＡＬＶＡＣ−ＩＥ１（ｖＣＰ256）で再刺激されたドナー２Ａ由来の単核細胞は、ＣＤ３およびＣＤ８を発現するがＣＤ４を発現しないリンパ球を欠失させたＩＥ１発現性標的を溶解しなかった（図51）。さらに、ＣＤ８を増加させたがＣＤ４は増加させていない再刺激単核細胞は、細胞障害活性を保持していた。
このように、ＨＣＭＶ  ＩＥ１を発現するＡＬＶＡＣ組換え体（ｖＣＰ256）またはＨＣＭＶ  pp65を発現するＡＬＶＡＣ組換え体（ｖＣＰ260）によるインビトロ再刺激によってＨＣＭＶ血清陽性のボランティアドナーから誘導された細胞障害性エフェクター細胞は、抗原特異性でＭＨＣ制限性であり、そしてＣＤ３およびＣＤ８発現性である。これらの特徴は、古典的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬｓ）の特徴と一致している。
これらの結果は、ＨＣＭＶが感染したヒトの細胞の破壊を媒介することのできるヒト細胞障害性Ｔリンパ球を誘発する目的のワクチンとして、ＨＣＭＶタンパク質を発現するＡＬＶＡＣ組換え体が機能し得ることを示すものである。さらに、これらのデータは、これらの組換えウイルスが、免疫治療の目的で半ビボ刺激したり細胞障害性Ｔリンパ球クローンを増幅する（Riddell他、1992）ための試薬として機能し得ることも示している。
前に論じたように、ＨＣＭＶ−ｇＢはヒトにおいて防御免疫を誘発するように機能することができるが、その理由は、1)ヒト血清からｇＢ特異的抗体が吸収されてしまうとＨＣＭＶ中和性抗体の力価が有意に減少すること（Goenczoel他、1991；Marshall他、1992）、および2)血清陽性の個体においてｇＢタンパク質によりヘルパーＴ細胞が活性化されている証拠がある（Liu他、1991）からである。Goenczoelら（1990）は、イムノアフィニティ法で精製したｇＢがヒトのボランティア内で免疫原性を有していたことを報告している。この研究では、該精製ｇＢの単一回投与（注射）により、本来血清陽性の個体に高力価のＨＣＭＶ中和性抗体およびリンパ球増幅を誘起することができた。血清陰性の個体においてはｇＢ製剤を３回投与すると一過性のＨＣＭＶ中和性抗体が誘起され、第４回目の投与により迅速な再誘起が認められ、ＨＣＭＶ中和性抗体力価が上昇した。
これらの研究は、精製ｇＢがサブユニットとして使用できることを示している。さらに、精製ｇＢはＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ−ｇＢ組換え体と組み合わせることにより、プライム／ブーストプロトコールに使用することもできる。最近の研究が示すところによれば、外来遺伝子の産生物を発現するポックスウイルス組換え体で免疫化した後、該遺伝子産生物を精製したものでブースト（追加免疫）を行うプライム／ブーストプロトコールは、それらの生成物のいずれか一方のみによって誘起される応答に比べて高い免疫応答を誘起している。例えば、ＨＩＶ−１のエンベロープ等タンパク質を発現するワクシニア組換え体で免疫化され、さらに、バキュロウイルス組換え体由来の精製されたＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質でブーストされたヒトは、該ワクシニア組換え体または精製エンベロープ糖タンパク質単独で免疫化された個体よりも高いＨＩＶ−１中和性抗体力価を示している（Graham他、1993；Cooney他、1993）。ＡＬＶＡＣ−ＨＩＶ（ｖＣＰ125）の２回投与（注射）で免疫化されたヒトは、ＨＩＶ特異性抗体を産生しなかった。ワクシニアウイルス組換え体由来の精製rgp160でブーストすると、検知可能なＨＩＶ−１中和抗体を生じた。さらに、rgp160を用いるブーストにより、rgp160に対して特異的なリンパＴ細胞の増殖の上昇が明らかに認められた。このワクチン化法によれば、エンベロープ特異的細胞障害性リンパ球活性も検出された（Pialoux他、1995）。サル免疫不全症ウイルス（ＳＩＶ）エンベロープ糖タンパク質を発現するワクシニア組換え体で免疫化され且つバキュロウイルス組換え体由来のＳＩＶエンベロープ糖タンパク質でブーストされたマカークザルは、ＳＩＶのチャレンジから防御されている（Hu他、1991；1992）。
実施例46−ＨＣＭＶ糖タンパク質Ｂの精製
この実施例は、ワクシニア組換え体によって産生されたＣＭＶ糖タンパク質Ｂの精製、およびＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ  ｇＢ（ｖＣＰ139）と組み合わせた場合の実験動物中の免疫原性の試験に関するものである。
ＣＯＰＡＫ組換え体ｖＰ1126、ｖＰ1128、およびｖＰ1145（それぞれ、異なる形態のｇＢを発現する）は、マウス中にＣＭＶ中和性抗体を誘発し（表23）、したがって、免疫原性のある形態でｇＢを発現する。ウイルスと細胞系、そしてＣＭＶのｇＢを精製するための免疫試薬を選定するために、５種類の異なるｇＢ特異的モノクローナル抗体を用いる免疫沈降分析により上記３種類のＣＯＰＡＫ組換え体の比較を行った。その分析結果に基づき、ｖＰ1145感染Vero細胞の培地からｇＢを精製する方法を開発した。ＣＭＶ  ｇＢ特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＣＨ380をプロテインＡ−アガロースに架橋させることにより、イムノアフィニティカラムの層材料（充填材）を調製した。この材料を用いて１段階法によるｇＢの精製を行った。ｇＢのバッチを幾つか製造し、セクションIIIに記述するように純度を調べた。
免疫沈降分析  それぞれ60mmの皿に入れたVero細胞およびHeLa細胞の単層にｖＰ1126、ｖＰ1128、ｖＰ1145、またはｖＰ993（後述）を無血清培地内で５pfu／細胞のmoiで感染させた。感染から24時間後、培地と細胞を別々にハーベストした。下記の試薬を用い、モノクローナル抗体用プロテインＡに対するブリッジとしてラットの抗マウスＩｇＧを用いる免疫沈降（ＩＰ）分析を行った（Taylor他、1990）。
ウイルス：
ｖＰ1126：COPAK-CMV gB(全域）。全長の野性型gB。
ｖＰ1128：COPAK-CMV gB（ＴＭ-）。トランスメンブレン領域を欠失。
ｖＰ1145：COPAK-CMV gB（ＴＭ-，Ｃｌ-）。トランスメンブレン領域を欠失し、切断部位が変性されている。
ｖＰ993：COPAK（対照）。
試薬：
モルモット抗CMV gB：Eva Goenczoel（Wistar研究所）から入手。
モノクローナルCH380：ＰＭｓ＆Ｖ（PereriaおよびHoffman、1986）から入手。
モノクローナル13-127：Advanced Biotechnologies社製。
モノクローナル13-128：Advanced Biotechnologies社製。中和性でコンホメーション依存性。
モノクローナルHCMV-34：Cogent Diagnostics製、中和性。
モノクローナルHCMV-37：Cogent Diagnostics製、中和性。
ウサギ抗−p25（ワクシニアＥ３Ｌ）：米国アリゾナ州Bert Jacobsから入手。
イムノアフィニティクロマトグラフィ層材料の調製  架橋剤ジメチルピメリミデートを用いてプロテインＡ−アガロースに結合させたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）CH380の約2.4mgから成るイムノアフィニティカラム層材料１mlがConnaught Laboratories社（カナダのオンタリオ州Willowdale）のStephem Cockleによって提供された。mAb CH380（PereriaおよびHoffman、1986）は、ＣＭＶウイルスエンベロープ調製物（Goenzoel他、1990）からＣＭＶｇＢを精製するのに以前に使用された。S．Cockleからの材料を予備的な実験に用いて、ｇＢ精製に有用であるかを確認した。ｇＢの生産をスケールアップするため、S．Cockleによるのと同じ方法により、後述するように、追加の層材料を調製した。
モノクローナル抗体CH380の調製  凍結乾燥したモノクローナル抗体CH380（ロットS1705、PMsvから入手）の４バイアルをＰＢＳ（137mMのＮａＣｌ、2.7mMのＫＣｌ、1.5mMのＫＨ2ＰＯ4、8.1mMのＮａ2ＨＰＯ4、ｐＨ7.4）中で再構成（各１ml）し、ＰＢＳ（最終体積3.5ml）に対して一晩透析した。ビシンコニン酸分析（ＢＣＡ分析。試薬は米国イリノイ州RockfordのPierceから入手）によるとタンパク質濃度は4.9mg/mlと測定された。次に、この製剤を等体積のＭＡＰＳ結合緩衝液（Bio-Radのカタログ番号153-6161；milli-Q水中31.4％w/v、ｐＨ９に調整、22mmの膜でろ過したもの）中に稀釈した。粒状物質を取り除くため、ＭＡＰＳ緩衝液に溶かした抗体製剤を16,000×ｇで30分間遠心し、上澄液中のタンパク質濃度を280nmにおける吸光度（ＩｇＧに対する吸光度係数を1.44とする）から計算した。
プロテインＡ−アガロースビードの調製  プロテインＡ−アガロースビード（Bio-Rad社カタログ番号153-613）３mlを、２倍体積のＭＡＰＳ結合緩衝液を用い密閉管中で軽く混合し、1000×ｇで５分間遠心（Beckman社製ＧＰＫＲ遠心機で1400rpm、GH3.7ローター）することにより４回洗浄した。最後の洗浄後、上清を廃棄した。
ビートへのモノクローナル抗体の結合  上記の工程１で得たｍＡｂ抗体の全てを工程２からの洗浄済みビードに添加し、得られた混合物を密閉管中４℃で回転させた。ビードをペレット化し（1000g／５分）、280nmにおけるＯＤを読みとり（上述）上清中のＩｇＧを測定することにより、ビードに結合されたｍＡｂの量を６〜12時間毎に求めた。上清から90％のＩｇＧが欠失するには、４℃において約48時間のインキュベーションが必要であった。
ビードへのモノクローナル抗体の共有架橋  90％の結合が得られた後、ビードを６ml（２倍体積）の50mMのホウ酸塩、３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ９）で４回洗浄した。次に、該ビードを30ml（10倍体積）の50mMのホウ酸塩、３ＭのＮａＣｌ（ｐＨ９）に再懸濁し、ｐＨを９±0.1に調整した。ビードの１サンプル（100μｌ）を抜き出し、後の架橋度の評価に供した。架橋剤ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）は使用直前に調製し、200mMのホウ酸、３ＭのＮａＣｌ、ｐＨ９に溶かして500mMの濃度とした。ビードにＤＭＰを添加して最終濃度20mMとし、それらのビードを密閉管内で室温下に30分間上下を逆にすることにより混合した。別のビードサンプル（100μｌ）を取り出し架橋度の評価に供した。残存する架橋剤をクエンチするため、200mMのエタノールアミン（ｐＨ８）６ml（２倍体積）を用いてビードを２回洗浄し、次に、200mMのエタノールアミン（ｐＨ８）30ml（10倍体積）中で、２時間室温下に混合（上下を逆にする）することによりインキュべートした。最終ビードを６ml（２倍体積）のＰＢＳで４回洗い、0.01％ＮａＮ3を含むＰＢＳ６ml中に保存した。
架橋度を測定するため、ＤＭＰインキュベーションの前後に取り出したゲル状ビードサンプルをペレット化し、上清を棄て、そしてビードを２倍量のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（還元剤を含有）と混合した。これらのサンプルを煮沸し、10％ポリアクリルアミドゲル状で電気泳動法により分離した。クーマーシーブルーで染色した後、ＩｇＧのＨ鎖およびＬ鎖は、「事前」サンプルには検出されたが「事後」サンプルには検出されず、効率的に架橋が生じていることが示された。
ビードによる抗体のインキュベーションの前後のタンパク質濃度に基づき、得られた層材料は、プロテインＡ−アガロースビード１ml当たり約５mgのモノクローナル抗体を含有するものと推定された。
イムノアフィニティカラムクロマトグラフィによるＣＭＶｇＢの精製 カラム緩衝液  ＰＢＳ（173mMのＮａＣｌ、2.7mMのＫＣｌ、1.5mMのＫＨ2ＰＯ4、8.1mMのＮａ2ＨＰＯ4）、ｐＨ１（バッチ１）、ｐＨ7.4（バッチ２〜５）、またはｐＨ6.8（バッチ２〜５）；0.1Ｍグリシン、ｐＨ2.5；１Ｍトリス、ｐＨ8.5。
カラム  カラムの大きさは、体積として0.3〜４mlの範囲で変化させた。新しいカラムを注入したときは、10層体積（bed volume：bv）の0.1Mグリシン（ｐＨ2.5）、次いで10〜20bvのＰＢＳ（ｐＨ７または7.4）を用いてストリッピングを行った。各カラム運転の最後に、少なくとも10bvのＰＢＳ（ｐＨ７）を用いてカラムを洗浄した。各カラム運転の最初にも、少なくとも10bvのＰＢＳ（ｐＨ７）を用いて洗浄を行った。カラムの運転は室温下に行い、使用していないときは、ＰＢＳ＋0.01％ＮａＮ3中４℃で貯蔵した。
粗ｇＢサンプルの調製  ＭＥＭ＋10％ＦＢＳに入れたVero細胞をローラボトル（850cm2）に接種した。感染の２〜12時間前に培地を無血清ＭＥＭに変えた。ｖＰ1145を細胞に感染させ、このときのＭＯＩは５pfu／細胞（体積10ml／無血清ＭＥＭのＲＢ）とした。37℃で60分間ウイルスを吸収させ、その後、各ＲＢに無血清ＭＥＭを添加し、37℃においてインキュベーションを続行した。感染から16〜24時間後、培地をハーベストした。3000rpmで15分間遠心することにより（Beckman製ＧＰＫＲ遠心機、ＧＨ3.7ロータ）培地を清澄化した。上清を回収し、Beckman製ＳＷ28ロータ中で60分間、20,000rpmで遠心することにより更に清澄化した。次に、清澄化した培地を、30,000MWCOを有する以下の限外濾過装置を用い、ＰＢＳ（ｐＨ7.4）に緩衝液を交換する限外濾過により濃縮（10〜40倍）した：Centricell-60（Polysciences製、カタログ番号19182-6）、Centriprep-30（Amicon製、カタログ番号4306）、またはポリスルホン浸水性フィルターユニット（Polysciences製、カタログ番号2250）。以上のようにして得られた材料を後述するようにカラムに適用した。
カラム操作  ストップコックまたはペリスタル型ポンプにより流量を0.03〜0.09ml／分に制御して、上記の粗ｇＢサンプルをカラムに適用（注入）した。サンプルの注入後、10bvのＰＢＳ、ｐＨ７（バッチ１）、または20bvのＰＢＳ、ｐＨ7.4の次に20bvのＰＢＳ、ｐＨ6.8（バッチ２〜５）を用いて、0.2〜0.6ml／分の流量でカラムを洗浄した。10bvの0.1Mグリシン（ｐＨ2.5）を用いて被結合材料を溶出させて、1.0Mトリス（ｐＨ8.5）50μｌを含有する管（バッチ１，３）または100μｌを含有する管（バッチ２，４，５）に、500μｌのフラクション（バッチ１，３）または１mlのフラクション（バッチ２，４，５）を集めた。１つのカラム（＃28）は0.1Ｎのグリシン＋0.1Ｍのトリス（ｐＨ７）を用いて溶出を行った。ＣＭＶ  ｇＢフラクション（画分）の同定は、還元条件下10％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで銀染色（Bio-Rad社製キット、カタログ番号161-0443）によって行った。
溶出ｇＢの処理  ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による同定後、ＣＭＶｇＢ画分をプールし、以下の２つの方法のいずれかによって濃縮した：1)0.1×ＰＢＳに対する透析および真空による10倍濃縮（バッチ１の大部分）、または2)70％硫酸アンモニウムを用いる沈降処理およびＰＢＳへの再懸濁。ｇＢサンプルのタンパク質濃度は、ビシンコニン酸マイクロプレート分析（ＢＣＡ、試薬は米国イリノイ州RockfordのPeirce製）により測定した。ｇＢの５バッチを調製し、幾つかのアリコートにして−70℃に凍結した。
精製ｇＢの評価 スロットブロット  スロットブロット分析を用いて、粗調製物、アフィニティカラム精製のフロースルー画分および溶出画分中のＣＭＶ  ｇＢの相対量を測定した。各テストサンプルについてＰＢＳ中の連続的な２倍稀釈を行い、SchleicherおよびSchell Manifold IIスロットブロット装置を用いてニトロセルロースペーパーにかけた。各テストには、標準として既知のタンパク質濃度（ＢＣＡマイクロプレート分析によって測定）を有する精製ｇＢの連続稀釈サンプルを含ませた。ＣＭＶ  ｇＢの検出には、モノクローナル抗体ＣＨ380（1000倍稀釈）を用い125Ｉヤギ抗マウス抗体（ＮＥＮ製、カタログ番号NEX159、0.1Ci/ml）により行った。オートラジオグラフ上のスロットブロット信号をスキャンニングして、デンシオメトリー（米国ニューヨーク州Huntington StationのＰＤＩ社製、Quantity-Oneデンシオメータプログラム付）によって分析した。各テストサンプルのＣＭＶ  ｇＢの量は、ｇＢの標準曲線と比較した線形回帰分析により求めた。
ウエスタンブロット  テストサンプルは、還元条件下に10％ゲル上に電気泳動法に分離し、そしてニトロセルロースペーパーにブロッティングした（HarlowおよびLane、1988）。以下の試薬を用いてブロットを探査し、ＣＭＶｇＢ、マウスＩｇＧ、ワクシニア、およびVero細胞タンパク質の存在を調べた。
0003940959.tif 000093
免疫沈降／ウエスタンブロット分析  モノクローナル抗体を用いバッチ１のｇＢについてＩＰ（免疫沈降）／ウエスタンブロットを実施した。ラベル化していない粗製ｇＢおよび精製ｇＢおよび精製ｇＢを免疫沈降に供した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルをニトロセルロースにブロッティングし、モルモット抗ＣＭＶｇＢ抗体（Eva Goenczoelから入手）（1000倍稀釈）を用い、125ＩプロテインＡ（ＮＥＮ製、＃NEX-146）（0.1μCi/ml）により、ｇＢ特異的タンパク質を検出した。
ｇＢ生成物の純度分析  各ｇＢバッチのサンプルについて、還元条件下10％ゲル上での電気泳動分離による分析を行った後、クーマーシーブルーによる染色を行った。乾燥後のゲルをスキャンニングしてデンシトメトリー（米国ニューヨーク州Huntington StationのＰＤＩ社製、Quantitiy-Oneデンシトメータプログラム付）によって分析した。
３種類のワクシニアCOPAK組換え体によるＣＭＶｇＢの発現を比較するための免疫沈降分析  ＣＭＶｇＢを産生させイムノアフィニティ精製するのに好適な組換え体、細胞基質および抗体を選択するために、モルモット抗ｇＢ抗体および一連のモノクローナル抗体を用いる免疫沈降分析により、３種類の異なる形態のｇＢを発現するCOPAK組換え体の比較を行った。組換え体ｖＰ1126、ｖｐ1128、およびｖＰ1145は、マウス内にＣＭＶ中和性抗体を誘発し、したがって、免疫原性のある形態のｇＢを発現する（表23）。テストしたＣＭＶ  ｇＢ抗体はすべて同様のＩＰ結果を示した。HeLa細胞およびVero細胞感染由来の培地および細胞画分の両方を用いてモルモット血清について行った代表的な分析を図52Ａ〜図52Ｄに示す。予想されたように、ｖＰ1128およびｖＰ1145感染細胞の細胞および培地画分の両方からＣＭＶ  ｇＢ特異的物質が沈降したが、ｖＰ1126感染細胞に関しては細胞画分のみであった。ｇＢ特異的バンドの見かけの分子量は以前に報告された結果と一致している（BrittおよびAuger、1986；BrittおよびVugler、1989；Reis他、1993）。これらの３種類のＣＭＶｇＢ組換え体の全ての細胞画分は、見かけの分子量130〜140の主要バンドを含有していたが、これはグリコシル化された未切断ｇＢ前駆体の見かけの分子量に一致する。細胞画分にはみかけのＭＷが110kDaおよび55kDaの弱いタンパク種が観察されたが、これは加水分解処理を受けた成熟タンパク種に一致する。Ｎ末端生成物は以前に90〜110kDaであると報告され、また、Ｃ末端生成物は55〜58kDaと報告された（BrittおよびAuger 1986）。HeLa細胞においては見かけの分子量がさらに高いタンパク種（約150kDa）も存在していた（例えば、図52Ｄのレーン４）。このタンパク種も、おそらく、未切断前駆体を示すし、グリコシル化の更に進んだものであろう。培地画分においては、ｖＰ1128およびｖＰ1145感染細胞から３種類ｇＢバンドの沈降が認められ、未切断前駆体ならびに、Ｎ−末端プロセシングされたポリペプチドおよびＣ末端がプロセシングされたポリペプチドを示している。デンシトメトリー分析によれば、HeLa細胞に比べてVero細胞の培地画分からの方がより多くのｇＢ特異性の物質の沈降が認められ、組換え体ｖＰ1145はｖＰ1128よりも多くのｇＢ特異性物質を産生させていた。この相違は、ｖＰ1128の細胞画分よりもｖＰ1145の細胞画分からの方がより多くのワクシニアＥ３Ｌが沈降し、このサンプルにおいては全体のワクシニアの発現量が高くなっていることを示しているという事実から（図53Ａおよび図53Ｂ）説明できる。ｖＰ1145については、細胞画分（HeLa細胞およびVero細胞の両方）からよりも培地画分からの方が多くのｇＢ特異的物質の沈降が見られた（図52ＡおよびＢと図52ＣおよびＤを比較されたい）。
HeLa感染細胞の培地から沈降したサイズの異なる３種類のｇＢは、Vero細胞で産生した３種類と分子量が異なっているようである（図52Ａと図52Ｂを比較）。この相違は、Vero細胞に比べてHeLa細胞におけるグリコシル化の程度が異なることに因るものかも知れないが、この推定は更に検討はしていない。分子量の大きいｇＢ特異的タンパク質が他のヒト細胞系（ＭＲＣ−５）においても産生されるか否かということを明らかにするため、モノクローナル抗体ＣＨ380を用い、ｖＰ1145を感染させたHeLa細胞、ＭＲＣ−５細胞およびVero細胞の培地におけるｇＢタンパク質を比較するウエスタンブロット分析を行った（図54）。その結果、この分析で検出できる２つのｇＢバンド、すなわち、ｇＢ前駆体（約140kDa）およびＣ末端プロセシングフラグメント（55〜58kDa）は、Vero細胞におけるよりもHeLa細胞およびＭＲＣ−５細胞における方がみかけの分子量が大きくなっていた。Ｎ−末端プロセシングフラグメントは、モノクローナル抗体ＣＨ380またはモルモット抗ＣＭＶｇＢ血清のいずれを用いてもウエスタンブロットでは検出できない。
イムノアフィニティ精製用にモノクローナル抗体ＣＨ380を選択した。その理由は、大量を容易に入手でき、また、上記ＩＰ分析において５種類の異なるモノクローナル抗体により検出されたｇＢ特異的タンパク質に違いが認められなかったからである（図55）。ＩＰ分析に基づき、更に、感染細胞の培地から分泌ｇＢを精製するには細胞膜からｇＢを可溶化し、細胞タンパク質からそれを精製する必要がないということを考慮して、ＣＭＶ  ｇＢの精製はｖＰ1145感染Vero細胞の培地画分を用いて開始した。無血清培地において感染を行い、粗製材料中に混入するタンパク質を更に減少させた。
ＣＭＶ  ｇＢの精製  別々に実施した15回のイムノアフィニティクロマトグラフィカラム運転（全量として3.1mgのｇＢを得た）の結果を表24にまとめている。該物質の幾分かを更なる分析に使用し、残りは、精製済み生成物として５つのバッチに分けて（全量2.6mg）プールした（図25）。カラムラン７，８，10および11は同一のカラムにおける連続的な運転である。カラム19Ａ、19Ｂ、19Ｃ、21Ａ、21Ｂおよび21Ｃ由来の層材料をプールしてラン28、29および32用のカラムを調製した（ラン28、29および32から最大量のｇＢが得られた）。表24は各カラムに適用した粗製ｇＢを掲記したものであり、該粗製物が誘導されたｖＰ1145感染Veroローラーボトルの数（ＲＢ当たり１×108細胞）、該粗製物中の全タンパク質およびｇＢ特異的タンパク質の量を示している。８サンプルの分析に基づき、該粗製物中の全タンパク質含有量は1.2〜3.7mg/RBの範囲にあり平均値は2.4mg/RB（106細胞当たり24μｇ）であった。精製ｇＢを標準とするスロットブロット分析により、それらの調製物のうちの７つについて粗製物中に存在するｇＢの量を測定したところ、50〜350μg/RBの範囲にあり、平均値は153μg/RB（1.5μg/106細胞）であった。これらの数値をまとめると、粗製物中のタンパク質は、約６％のｇＢから構成されていたことが示された。ＣＭＶ  ｇＢの収量は、８〜29μg/RBの範囲にあり、平均値は20μg/RB（0.2μg/106細胞）であった（表24）。１mgのＣＭＶ  ｇＢを得るのに、大略50のローラーボトル（１×109細胞）が必要であった。ｇＢ用免疫吸着ゲルの性能は充分に調べていなかった。そこで、カラムラン28，29および32に用いた４mlの層材料を当初，0.6mlのミニカラムに分割し（カラムラン19Ａ、19Ｂ、19Ｃ、21Ａ、21Ｂおよび21Ｃ）、ｇＢを量を変えながら各カラムにかけて（適用して）結合の飽和が生じるかを判定した。不幸なことには、カラムに適用した粗製物中のｇＢの量を過大評価していたため、飽和は見られなかった。結合が最大のもの（カラム19Ｃから）をカラム性能の推定量として用いた（300μg/ml層材料）。ミニカラムから溶出したｇＢの量は、カラムに適用したｇＰタンパク質の８〜25％であった（表24）。したがって、４mlカラムの性能が少なくとも1.2mgであり、適用されたｇＢの25％が回収されるとすれば、1.2mgの精製ｇＢを得るには、4.9mgの粗製ｇＢ（約33のＲＢから）をカラムに適用しなければならないものと推定された。カラム28による結果はこの推定に近い：36のローラーボトルから得られた材料をカラムに適用して、１mgのｇＢが溶出された。
カラムに適用されたが精製物として溶出されなかったｇＢの定量的な説明はできていない。カラムに適用された（かけられた）ｇＢのうちの８〜25％のみが精製ｇＢとして回収されたものであるから、残りは、フロースルー画分、洗浄画分、生成物とともにプールされなかった溶出画分に存在するか、またはカラムに結合しているはずである。フロースルー画分においてはウエスタンブロットによりＣＭＶ  ｇＢを検出することはできた（例えば、図56のレーン６）。しかしながら、スロットブロット分析によりフロースルー画分中のｇＢ量を推定すると、適用したｇＢの20％以上を説明できなかった。洗浄画分は調べていない。最終的なｇＢ生成物として選ばれたプール画分はピーク画分のみであるから、隣接する画分中の痕跡量のｇＢが消失ｇＢとなっているのかも知れない。例えば、図57は、カラム８から溶出された連続的な画分であり、画分8.17〜8.21はｇＢ生成物としてプールされたが、痕跡量が画分8.16および8.22に残存していた。さらに、免疫吸着ゲル中にｇＢが保有されている証拠もある。溶出および洗浄後のカラム11および19Ｃからのゲル材料は、ウエスタンブロットで検出され得るｇＢ特異的物質を含有している（図56のレーン２および３）。カラム上に残存するｇＢの量の定量的分析は行わなかった。
カラムラン７のフロースルー物質をカラム10に適用することにより、フロースルー物質をカラムに再度適用してみた（表24）。カラム10から溶出したｇＢの量（4.5μｇ）は、カラム７から得られたｇＢ量（110μｇ）のわずか４％であった。この結果を評価することはできない。ｇＢ用層材料の性能、ならびにカラムに適用されフロースルー画分に存在するｇＢの量が不明であったからである。収量が悪いので、この方法を再度用いることはなかった。
精製ｇＢの評価  ｇＢを含有する溶出画分をプールした後、精製ｇＢについて以下の評価を行った：1)全タンパク質濃度の測定、2)ｇＢ特異的および非特異的バンドを同定するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、および3)免疫試薬を用いる上記バンドの確認。さらに、精製ｇＢを分析して、デンシトメータの走査による純度、および一連のＣＭＶモノクローナル抗体に対する結合能による自然コンホメーションを調べた。
各カラムから溶出したＣＭＶ  ｇＢ含有画分を先ずＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により分析し、ｇＢ画分の同定を行い各ラン毎にプールした。典型的な溶出プロフィルは図57に示す。溶出ｇＢの一部を分析に使用し、該物質の残りを一緒にして５つのバッチに分けた（表25）。各バッチについて、還元条件下10％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を行い、クーマーシーブルーを用いて染色を行った（図58）。染色ゲルをデンシトメータでスキャンニング（走査）し、各バンドの分子量および相対量を求めた：典型的なスキャンを図59および図59Ａに示し、また、５つのバッチの分析結果を表26にまとめている。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によれば、バッチ１〜５は非常に似ているようである（図58）。みかけの分子量が120〜130および51〜59ｋＤａの２つの主要バンドは、前駆体ｇＢタンパク質およびＣ末端がプロセシングされたフラグメントを表す。これらのバンドが幅広状になっているのは、一般にグリコシル化の強いこの種のタンパク質においていろいろなレベルのグリコシル化が生じているためであろう。これらのバンドがｇＢ特異的であることの確認は、モノクローナル抗体ＣＨ380を用いるウエスタンブロットの結果によって裏付けられた（図60Ｂ）。バッチ２〜５においてダブレットとして現れている（図58）みかけの分子量77〜100ｋＤａのバンドは、ｇＢのＮ−末端プロセシングフラグメントのサイズに一致し、ＩＰ分析によりｖＰ1145感染細胞の培地で同定されたものである（図52Ａおよび52Ｂ）。これらのバンドは、ウエスタンブロット分析（図60Ｂ）または免疫沈降−ウエスタンブロット分析の組合せ（図61Ａおよび図61Ｂ）のいずれによってもｇＢ特異的であると確認できなかったが、モルモット抗ｇＢ血清またはモノクローナル抗体のいずれもウエスタンブロットによりＮ−末端プロセシングフラグメントを検出することができないことから、その可能性は除外されるべきであろう。各バッチには、全タンパク質の６〜15％の程度で、約39〜45ｋＤａの混入（汚染）タンパク質が存在する（図58および表26）。全てのバッチにおいてｇＢタンパク質である可能性のより高い２つのバンド、すなわち、一方は200ｋＤａより大きいバンドおよびもう一方は30〜35ｋＤａのバンドが存在する（図58、59、および59Ａ；表26）。大きいタンパク質（〜200ｋＤａ）がｇＢであるという証拠は、モノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットによって導かれ、これによれば、200ｋＤａよりも大きい分子量を有する２つのタンパク質が検出されている（図60Ｂのレーン２および３）。約30〜35ｋＤａのタンパク質もｇＢ特異的である可能性がある（図58）。vP1145感染細胞の培地のＩＰ分析においては、約35ｋＤａのタンパク質が、３種類のモノクローナル抗体（13-128、ＨＣＭＶ34、およびＨＣＭＶ37）により検出され（図55）、およびモルモット血清により検出されている（図52Ａおよび図52Ｂ）。このサイズのタンパク質はReis他により（1993）ｇＢの分解産物として記述されていた。
ｇＢ調製物の汚染（混入）タンパク質が、細胞基質、ウイルスベクターまたは免疫吸着層材料に由来するものと仮定して、該調製物を調べてマウスＩｇＧ、Vero細胞タンパク質、およびワクシニアタンパク質の存在を確認した。Vero細胞またはマウスＩｇＧ由来のタンパク質はウエスタンブロット分析によっては検出することができなかった（図60Ａおよび図62Ａ）。しかしながら、約35および20ｋＤａの分子量を有するワクシニア特異的タンパク質が痕跡量で検出された（図62Ｂ、レーン５）。
溶出されたｇＢがその自然のコンホメーションを保持していたかということを明らかにするため、３種類の中和性抗体および１種類のコンホメーション依存性抗体を含む一連のモノクローナル抗体を用いて、免疫沈降／ウエスタンブロットを組み合わせた分析を行った。各モノクローナル抗体は、精製されたｇＢ由来の前駆体およびＣ−末端フラグメントを沈降させ、イムノアフィニティカラムから溶出されたｇＢがその自然のコンホメーションを保持していることが示された。
総括すると、バッチ１〜５の溶出ｇＢの分析により、生成物は少なくとも２種類の既知のｇＢ特異的タンパク質、すなわち前駆体ｇＢおよびＣ末端フラグメントを含有し、これらを合せてタンパク質の約50％を占めていることが示されている（図58および表26）。その他の３種類のタンパク種（全タンパク質の約20〜25％をしめる）もｇＢ特異的と考えられ得るが、直接的な証拠は得られていない。
精製されたｇＢの免疫原性  ＣＭＶｇＢの５つのバッチをプールし、最終濃度を測定した。精製ｇＢの幾つかにはアジュバントとしてミョウバンまたはＱＳ21を加え、マウスへの接種に用いた。マウスの血清についてＨＣＭＶ中和性抗体の有無を調べた。表27は、テストした精製ｇＢはいずれの量においても両アジュバントによりＨＣＭＶ中和性抗体を誘発できたことを示している。
精製ｇＢをＡＬＶＡＣ−ｇＢと組み合わせてマウスプライム（初回免疫）／ブースト（追加免疫）プロトコールに用いた。表28が示すように、０日目にＡＬＶＡＣ−ｇＢ（ｖＣＰ139）が投与され且つ29日目に精製ｇＢ（ＱＳ21またはミョウバンをアジュバントとする）でブースとされたマウスは、２回目にＡＬＶＡＣ−ｇＢ（ｖＣＰ1319）が投与されたマウスよりも高レベルのＨＣＭＶ中和性抗体を発現した。
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本明細書に記す結果が示すように、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＨＣＭＶ組え体およびそれらから得られる生成物の性能は、記述したような組成物や用途に利用することができ、例えば、免疫原性、抗原性もしくはワクチン組成物、または、分析、キットもしくは試験用の抗原もしくは抗体の調製に用いられ、また、例えば、ＨＣＭＶの感染を防止することのできるワクチンまたは免疫化（免疫感作）戦略に用いられるのに適しており、さらに、該組換え体のＤＮＡはプローブとして、またはＰＣＲプライマーを調製するのに有用である。
実施例47−ＮＹＶＡＣ−ＣＭ６およびＮＹＶＡＣ−ＣＭＶ５におけるＣＭＶ遺伝子の発現
ｇＢ、ｇＨ、pp65、pp150およびＩＥ１−エクソン４に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降によれば、ＮＹＶＡＣ−ＣＭＶ６によりこれら５種類の遺伝子が正しく発現されていることが示された。ＦＡＣＳｃａｎ分析（Becton-Dickinson社製）によれば、ｖＰ1302Ｂ感染細胞内ではｇＨの表面発現があるが、その親株（ｖＰ1251）が感染した細胞内ではこれがなく、機能性ｇＬ遺伝子産生物はｖＰ1302Ｂ内で発現されることが示された。
ｇＢ、ｇＨ、pp65およびpp150に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降によれば、ＮＹＶＡＣ−ＣＭＶによりこれら４種類の遺伝子が正しく発現されていることが示された。ＦＡＣＳｃａｎ分析によれば、ｖＰ1312感染細胞内でｇＨの発現があるが、その親株（ｖＰ1262）が感染した細胞内ではこれがみられず、機能性ｇＬ遺伝子産生物はｖＰ1312内で発現されることが示された。
実施例48−ＨＣＭＶのpp65およびpp150遺伝子を含有するＡＬＶＡＣドナープラスミドの構築
プラスミドＣＭＶ65Ｃ6.2をＥｃｏＲＩで直鎖状化し、クレノウでフィリングを行い、さらに、アルカリホスファターゼ処理して6.3kbのフラグメントを調製した。プラスミド150.1をＮｈｅＩで分解し、クレノウでフィリングして3.2kbのフラグメント（42K-pp150）を単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミド150.8R1（このプラスミド内では、pp65およびpp150の転写が同じ方向にあり、また、pp150は実施例40のプラスミド150.8と逆になっている）を得た。プラスミド150.8R1におけるＣＭＶpp65およびＣＭＶpp150のＤＮＡ配列と付加されているフランキング配列は図63Ａ〜図63Ｃに示している（SEQ ID NO:177）。
実施例49−ＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ４（ｇＢ、ｇＨ、pp65、pp150）の構築
ｖＣＰ233感染ＣＥＦ細胞にプラスミド150.8R1をトランスフェクションしてＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ４（ｖＰ1360）を調製した。
実施例50−ＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ４内でのＣＭＶ遺伝子発現
ｇＢ、ｇＨ、pp65およびpp150に対して特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降によって、ＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ４（ｖＰ1360）により４種類の遺伝子は全て正しく発現されていることが示された。
実施例51−ＨＣＭＶのｇＬまたはｇＬ＋ＩＥ１−エクソン４を含有するＡＬＶＡＣドナープラスミドの構築
図64Ａおよび64Ｂ（SEQ ID NO:178）は、プラスミドｐＣＰｔｋに含まれるカナリアポックスＤＮＡの3.8kdセグメントの配列である。カナリアポックスチミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ）は、このセグメント内にコードされ、4412位のヌクレオチドから開始され4951位のヌクレオチドで終結している。Ｃ７の上流2085bp、ＳｍａＩ、ＮｒｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩおよびＳｔｕＩ部位を含有するポリリンカー、ならびにＣ７の上流812bpを含有するｔｋ（Ｃ７）挿入ベクターを以下のように調製した。ｐＣＰｔｋ由来の3450bpのＰｓｔＩ／ＮｓｉＩフラグメントを、ｐＢＳ−ＳＫ＋の平滑末端化Ａｓｐ718／ＸｂａＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＥＵ１を得た。ｔｋのＯＲＦを欠失させポリリンカーと置換させるため、オリゴヌクレオチド
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を用いてｐＣＴｔｋ由来の２種類ＰＣＲフラグメントを増幅した。これらのフラグメントを精製し、ＨｉｎｄIII／ＥｃｏＲＩまたはＢｓｔＢＩ／ＥｃｏＲＩで分解し、ＨｉｎｄIII／ＢｓｔＢＩで切断されたｐＦＵ１に連結して、プラスミドｐＣ７を得た。
ｐＣ７内のポリリンカー領域を次のように変性した。ｐＣ７をＥｃｏＲＩおよびＳｔｕＩで分解し、精製し、次に、アニーリングされたオリゴヌクレオチド
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に連結して、プラスミドｐＣ７+を調製した。プラスミドｐＣ７+をＢａｍＨＩで分解し、アルカリホスファターゼで処理した。プラスミドＩ４ＬＨ６ＣｇＬをＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで分解して968bpのフラグメント（Ｈ６をプロモータとするｇＬ遺伝子を含有する）を単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミドＣ７ｇＬ（このプラスミド内では、ｇＬの転写は欠失されたｔｋ遺伝子と同じ方向になる）を調製した。プラスミドＣ７ｇＬにおけるＨＣＭＶのｇＬのＤＮＡ配列と付加されているフランキング配列は図65Ａおよび図65Ｂに示している。
プラスミドＣ７ｇＬをＢａｍＨＩおよびＰｓｐＡＩで分解し、アルカリホスファターゼで処理した。プラスミドＩ４ＬＨ６ＩＥＥＸ４をＢａｍＨＩおよびＰｓｐＡＩで分解し、1363bpのフラグメント（Ｈ６をプロモータとするＩＥ１−エクソン遺伝子を含有する）を単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミドＣ７ｇＬＩＥＳ２を得た。プラスミドＣ７ｇＬＩＥＳ２におけるＨＣＭＶのｇＬおよびＩＥ１−エクソン４のＤＮＡ配列と付加されているフランキング配列は図66Ａおよび66Ｂに示している。
実施例52−ＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ６（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp65、pp150、ＩＥ１−エクソン４）およびＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ６（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp65、pp150）の構築
ｖＰ1360感染細胞にプラスミドＣ７ｇＬＩＥＳ２をトランスフェクションしてＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ６（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp65、pp150、ＩＥ１−エクソン４）を調製した。
ｖＰ1360感染細胞にプラスミドＣ７ｇＬをトランスフェクションしてＡＬＶＡＣ−ＣＭＶ５（ｇＢ、ｇＨ、ｇＬ、pp65、pp150）を調製した。
実施例53−トランスメンブレン領域および細胞質テイルを欠失するＨＣＭＶ  ｇＬおよびｇＨのＮＹＶＡＣドナープラスミドｐＳＤ553へのクローニング
トランスメンブレン領域および細胞質テイル（尾部）を欠失するＨＣＭＶ  ｇＨの配列を図67に示す。プラスミドＳＰｇＨ１にＰＣＲを実施しオリゴヌクレオチド
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を用いて756bpのフラグメントを調製した。このフラグメントをＮｓｉＩおよびＨｉｎｄIIIで分解して275bpのフラグメントを単離した。プラスミドＳＰｇＨ６をＮｓｉＩおよびＨｉｎｄIIIで分解し、4779bpのフラグメントを単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミドＳＰｇＨ７（トランスメンブレン領域および細胞質テイルを欠失し、42ＫをプロモータとするｇＨ遺伝子を含有する）を得た。
ＮＹＶＡＣ挿入プラスミドｐＳＤ553 ＶＣをＢａｍＨＩで分解しアルカリホスファターゼで処理した。プラスミドＩ４ＬＨ６ＣｇＬをＢａｍＨＩおよびＢｇｌIIで分解し、970bpのフラグメント（Ｈ６プロモータとｇＬ遺伝子を含有する）を単離した。これら２種類のフラグメントを連結してプラスミドＣＯＰＡＫｇＬ−24を調製した。
プラスミドｇＨ７をＸｈｏＩおよびＳｃａＩで分解し、2239bpのフラグメント（42Ｋプロモータと端部切除されたｇＨ遺伝子を含有する）を単離した。プラスミドＣＯＰＡＫｇＬ−24をＸｈｏＩで分解し、アルカリホスファターゼで処理し、さらに、前記2239bpフラグメントに連結してプラスミドＣＯＰＡＫＨＬ−15を調製した。プラスミドＣＯＰＡＫＨＬ−15におけるｇＬおよび端部切除ｇＨのＤＮＡ配列と付加されているフランキング配列は図68Ａおよび68Ｂに示している（SEQ ID NO:187）。
実施例54−トランスメンブレン領域および細胞質テイルを欠失するｇＬおよびｇＨを含有するポックスウイルス組換え体の構築
ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞にプラスミドＣＯＰＡＫＨＬ−15をトランスフェクションして組換え体ｖＰ1399を調製した。
実施例55−組換え体ｖＰ1399によるｇＨの発現
ｇＨに特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫沈降によって、約97ｋＤａの分泌ｇＨタンパク質が組換え体ｖＰ1399により発現されていることが示された。
以上のように本発明を好ましい実施態様に沿って詳述したが、請求の範囲に記載の本発明はそのような特定のものに限定されるものではなく、本発明の技術思想または請求の範囲から逸脱しない多くの変更が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図５９Ａ】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６３Ｃ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５Ａ】
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【図６５Ｂ】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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