(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記理化学的性質を有するキトビオース生産酵素。
1) 作用及び基質特異性：キトサン及び／又はキトサンオリゴマーに作用し、キトビオース単位で加水分解する。
2) 至適pH：4.5付近
3) 至適温度：50℃付近
4) 熱安定性：pH 6.0において、30分間の処理で40℃付近まで安定で、3時間の処理で30℃付近まで安定である。
5) pH安定性：30℃、3時間の処理でpH 6.0〜10.0で安定であり、24時間の処理でpH 6.0〜8.5で安定である。
6) 分子量：約60,000ダルトン（ゲル濾過法）。
【請求項２】
請求項１記載の酵素が、Gongronella属に属する微生物に由来するものであるキト
ビオース生産酵素。
【請求項３】
キトサン及び／又はキトサンオリゴマーに、請求項１又は２のいずれか１項に記載の酵素を接触させ、キトビオースを採取するキトビオースの製造方法。
【請求項４】
キトビオース生産酵素を産生するGongronella butleri C6-2 (FERM P−18452)。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は均一成分より成る低分子量キトサンオリゴマーを効率よく製造する方法に関する。キトサンオリゴマー混合物は、キトサンを微生物由来の加水分解酵素、又はγ―線等で処理することにより生産される。本物質は人体に対しては無害な物質であるがバクテリアに対する抗菌活性、昆虫類の孵化阻害作用等の生理作用、及び金属イオン等に対するキレート作用等が期待される有用な物質である。
【０００２】
【従来の技術】
キトサンを加水分解してキトサンオリゴマーを生産する酵素（キトサナーゼ）としては、Myxobacter属、Bacillus属、Streptomyces属、Penicillium属等の微生物が生産する酵素が公知である〔Hedge,A. et.al. J. Bacteriol.,120, 844 (1974)、Tzume,M. et.al. Agric.Biol.Chem.,51,1189(1987)、Tominaga,Y. et.al. Biochem.Biophys.Acta, 410, 145 (1975)、等参照〕。これらのキトサナーゼは何れも、反応初期にキトサン及びキトサン誘導体から２〜６糖を生成するが、反応が進行すると最終的に２〜３糖混合物を与えるendo型酵素であり、反応終了液から目的のオリゴ糖を取得するには分子篩、クロマト分離等の煩雑な操作が必要であった。
またγ―線照射処理によるキトサンオリゴマーの製造は、高分子量オリゴマーの混合物が得られるため、キトビオース等低分子量オリゴマーを均一成分として製造するのは困難であった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、キトサン及び／又はキトサンオリゴマーを酵素的に加水分解し、キトビオースのみを選択的に生産する酵素及び本酵素を用いたキトビオースの製造法に関する。
【０００４】
【課題を解決する為の手段】
本発明者らはこれらの課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、多数のキトサン加水分解微生物の中から、キトサン及び／又はキトサンオリゴマーをキトビオースのみに変換する微生物を見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は、キトサン、キトサンオリゴマーに作用してキトビオース単位で加水分解するキトビオース生産酵素である。詳しくは、下記理化学的性質を有するキトビオース生産酵素である。
1)    作用及び基質特異性：キトサン及び／又はキトサンオリゴマーに作用し、キトビオース単位で加水分解する。
2)    至適pH：4.5付近
3)    至適温度：50℃付近
4)    熱安定性：pH 6.0において、30分間の処理で40℃付近まで安定で、3時間の処理で30℃付近まで安定である。
5)    pH安定性：30℃、3時間の処理でpH 6.0〜10.0で安定であり、24時間の処理でpH 6.0〜8.5で安定である。
6)    分子量：約60,000ダルトン（ゲル濾過法）。
また、本酵素は、Gongronella属に属する微生物にその存在が見いだされる。さらには、本酵素を、キトサン及び／又はキトサンオリゴマーに接触させることにより、キトビオースを製造することができる。
【０００５】
本発明において、キトビオース単位で加水分解するキトビオース生産酵素として、Exo-型キトサン加水分解酵素であるexo-chitobiohydrolaseは、1984年にDavis等[Davis, B. et.al. Chitin, Chitosan, and Related Enzymes p161〜179, 1984. Academic Press]がその存在を推定していたが、現在までに発見されたとの報告は無かった。本発明者らが発見したキトビオース生産酵素（exo-chitobiohydrolase）は初めての実例である。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、キトビオース生産酵素とは、キトサン及び／又はキトサンオリゴマーに作用し、キトビオース単位で加水分解する酵素をいう（以下、exo-chitobiohydrolase）。exo-chitobiohydrolase生産能を有する微生物は、土壌より分離された。分離された微生物、C6-2株は、FERM P−18452として、産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、寄託されており、本菌の菌学的性質は表１の通りである。
【表１】
0004000250.tif 000002
【０００７】
上記菌学的性質をDictionary of the Fungi 8th Ed.(Howksworth et al.,1995)により判断すると、C6-2株(FERM)はGongronella butleriであり、交配型が＋であると同定される。
【０００８】
Exo-chitobiohydrolaseの生産は、exo-chitobiohydrolase生産能を有する微生物を、キトサンを0.1〜5質量％含む培地で１〜１０日間、１０〜４５℃、好気的に培養して行われる。炭素源は、グルコース、フラクトース、グリセロール等、窒素源は、酵母エキス、ポリペプトン、硫酸アンモニウム等、無機イオンは、MgSO4、FeSO4、K2HPO4等が例示できる。必要に応じてビタミン、アミノ酸、核酸等の要求因子を必要量添加すれば良い。
【０００９】
培養の対象となる微生物、培養条件、培地組成等により異なるが、exo-chitobiohydrolaseの大半は培養液中に分泌生産され、一部が細胞側に残存する。培養液中に分泌生産された酵素の取得は、硫酸アンモニウムによる分画、DEAE―セファデクス等のイオン交換クロマトグラフィー、セファデクス等の分子篩、その他、蛋白質の分離精製に通常用いられる手法を用いて行うことができる。
【００１０】
本発明において、キトサン又はキトサンオリゴマーの加水分解は、キトサンを有機酸又は鉱酸で可溶化した後、水酸化ナトリウム溶液等によりpH4〜9に調整するか、又はキトサンオリゴマーを適当なpHの緩衝液に溶解し、これに酵素又は微生物を添加して実施される。
【００１１】
反応液中のキトサン又はキトサンオリゴマー濃度は、0.1〜5質量％、好ましくは0.5〜2質量％の範囲、反応pHは3.5〜7.0、好ましくは4.0〜6.0の範囲であり、添加する酵素濃度は、使用する酵素の純度等により異なるが、キトサン又はキトサンオリゴマーに対して、0.01〜5質量％、好ましくは0.1〜1.0質量％の範囲であり、微生物の培養上清をそのまま使用しても良い。また、本酵素によるキトサン又はキトサンオリゴマーの加水分解速度を加速する目的で、エンドタイプのキトサン加水分解酵素と組み合わせて使用することもできる。
【００１２】
微生物細胞を用いる加水分解は、exo-chitobiohydrolase生産微生物の培養液に対して、前記方法で可溶化したキトサン又はキトサンオリゴマー溶液をキトサン濃度が0.1〜5質量％と成るように添加して行われる。
反応液中に生産されたキトビオースは、濾過、遠心分離等の手法により、不溶物を除去した後、膜分離、イオン交換樹脂、活性炭への吸着/脱離等により精製、採取することができる。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
＜実施例１＞  exo-chitobiohydrolase活性を有する微生物の単離方法
下記(1)の組成からなる寒天培地上に生育する微生物を土壌より分離した。単離した微生物を１０ｍｌの液体培地〔下記(1)の培地から寒天を除いたもの〕を含む試験管（25×200mm、120℃、10分加圧殺菌）で37℃、48時間振とう培養した。培養終了後、16,500g、15分、３℃の遠心により培養上清を得た。該培養上清を粗酵素液とし、下記の反応に供した。
【００１４】
（１）培地組成
キトサン（キトサン10B、カトキチ社製）  0.5%
酵母エキス                             0.1%
ポリペプトン                           0.2%
K2HPO4                                  0.1%
MgSO4・7H2O                            0.05%
寒天                                   1.5%
【００１５】
（２）活性測定法
0.15％キトサン水溶液  1.0ml、0.2M酢酸ナトリウム（pH4.5）0.4ml、培養上清 0.1mlを混合後、４０℃、60分間反応させた。反応終了後、フェリシアン化カリウム試薬２ｍｌを加え、１００℃、１５分加熱発色させ、水中冷却後、420nm吸光度により定量した。
上記キトサン水溶液は、キトサン３００ｍｇを３Ｍ 酢酸１０ｍｌ中でゲル化させ、１４０ｍｌ脱塩水を加え、ポリトロンホモジナイザーを用いて十分に分散、溶解させ、４Ｎ NaOHでpH 4.5に調整後、全体を２００ｍｌとしたものを使用した。
【００１６】
フェリシアン化カリウム試薬は、炭酸ナトリウム５３ｇを７００ｍｌの脱塩水に溶解後、フェリシアン化カリウム０．５ｇを溶解し、１０００ｍｌとしたものを使用した。溶液は褐色瓶に入れ、暗所に保存した。
その結果、６２株の微生物に活性が認められた。
【００１７】
（３）反応生成物の解析
活性が認められた６２株の微生物が生成するキトオリゴ糖の解析を下記の方法に従い薄層クロマトグラフィーを用いて行った。
キトサン５００ｍｇを１Ｍ  酢酸１０ｍｌでゲル化、脱塩水７０ｍｌを加え分散、溶解させた。４Ｎ NaOHでpH4.5に調整後、全容を１００ｍｌ(薄層用基質溶液)とした。培養上清０．２ｍｌと薄層用基質溶液０．２ｍｌの混合液を４０℃、５時間反応後、１００℃、５分間加熱して酵素を失活させ試料とした。
【００１８】
セルロースプレート（アビセルＳＦ）を用い、n-ブタノール/ピリジン/酢酸/水（15：10：3：12）で２回の多重展開を行った。発色はニンヒドリン試薬を用い、噴霧後、１１０℃、１０分間加熱、又は噴霧後一夜放置した。
その結果、６２株中の６１株は２〜４糖のキトオリゴ糖混合物を生成した。しかし、C6-2株はキトビオースのみを生成した。
【００１９】
＜実施例２＞
実施例１と同様の方法で、C6-2株を液体培養に供し、培養上清を調製した。該培養上清を粗酵素液とし、薄層クロマトグラフィーにより酵素反応の経時的解析を行った。その結果、本菌株は反応初期の０.５時間から反応終期の２４時間後においても、キトサンからキトビオースのみを生成した（図１参照）。
【００２０】
＜実施例３＞
実施例１と同様の方法で得た培養上清を、脱イオン水に対して透析し粗酵素を調製した。該粗酵素液 0.1ｍｌ、表２に示した各種オリゴ糖 50ｍＭ溶液を0.1ｍｌ、反応温度40℃、反応時間1又は5時間の生成物を薄層クロマトグラフィーで分析した結果を表２に示した。結果、C6-2株の生産する酵素がキトサンのみならず、キトオリゴ糖をもキトビオース単位で加水分解された。
【００２１】
【表２】
0004000250.tif 000003
【００２２】
＜実施例４＞  exo-chitobiohydrolaseの部分精製
0.02M 酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.5）でCM-Toyopearl 650M (2.0φ×7.5 cm)を緩衝化した後、実施例３で調製した粗酵素液を吸着させた。吸着後、同一緩衝液中のNaCl濃度を0→0.5Mに上昇させるリニアグラジエント法により溶出操作を行った。目的のexo-chitobiohydrolaseは、0.04〜0.08Mの濃度で溶出した。
【００２３】
＜実施例５＞  exo-chitobiohydrolaseの諸性質
以下、実施例４で得られたexo-chitobiohydrolaseを使用し、各種理化学的性質を決定した。
(1)  分子量の測定
exo-chitobiohydrolaseを、100mM食塩を含む20mM酢酸緩衝液pH4.5で平衡化したセファクリルS-200(カラムサイズ2.6×95cm)に供し、分子量を測定した。
exo-chitobiohydrolase及び標準蛋白質の溶出位置は、280nmの吸光度と実施例１記載の活性測定法により行った。標準蛋白質として、パン酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（150,000ダルトン）、ウシ血漿アルブミン（66,000ダルトン）、卵白アルブミン（45,000ダルトン）、及びブタすい臓キモトリプシノーゲン（25,000ダルトン）を用いた。
その結果、exo-chitobiohydrolaseの分子量は60,000ダルトンであった（図２参照）。
【００２４】
(2)  至適温度
温度勾配装置を使用し、20〜70℃の範囲で酵素活性を測定した以外は、実施例1(2)と同様に活性測定を行った。その結果、至適温度は50℃付近であった（図３参照）。
【００２５】
(3)  至適pH
マッキルベイン緩衝液を使用し、pH 2.0〜8.0の間で0.5刻みでpHを調整し、活性測定を実施した。その結果、至適pHは4.5付近であった（図４参照）。
【００２６】
(4)  温度安定性
50 mMの酢酸ナトリウム緩衝液でpH 6.0に調整した酵素液を、温度勾配装置を使用して20〜60℃の種々の温度で30分間及び3時間処理し、活性測定を実施した。
その結果、30分間の処理では40℃付近まで、3時間の処理では30℃付近まで安定であった（図５参照）。
【００２７】
(5)  pH 安定性
酵素液をpH 2.0〜10.0の範囲で0.5刻みの各緩衝液中で、30℃,３時間及び24時間保存した。なお、pH 2.0〜8.0においては、マッキルベイン緩衝液を、pH 8.5〜10.0は0.1M アンモニア−塩化アンモニウム緩衝液を使用した。
保存後、活性測定を行った結果、3時間保存ではpH 6.0〜10.0で、24時間保存ではpH 6.0〜8.5で安定であった（図６参照）。
【００２８】
【発明の効果】
キトサン又はキトサンオリゴマーからキトビオースを製造するに当たり、キトサン、及びキトオリゴ糖からキトビオースのみを生成する酵素を使用することにより、キトビオースの安価で効率的な製造法を提供する。
【００２９】
【図面の簡単な説明】
【図１】酵素反応の経時変化を示した薄層クロマトグラフィーである。
【図２】  exo-chitobiohydrolase及び標準蛋白質の溶出位置を示した図である。
【図３】  exo-chitobiohydrolase活性に及ぼす温度の影響を示した図である。
【図４】  exo-chitobiohydrolase活性に及ぼすpHの影響を示した図である。
【図５】  exo-chitobiohydrolaseの安定性に及ぼす温度の影響を示した図である。
【図６】  exo-chitobiohydrolaseの安定性に及ぼすpHの影響を示した図である。
【図１】
0004000250.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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