(57)【要約】【課題】付着依存性細胞の大量培養に応用可能な細胞接着性を有する担体を提供すること。【解決手段】支持体と塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基を８０質量％以上含むポリアミノ酸とを有し、前記支持体に対する前記ポリアミノ酸の結合密度が１μｇ／ｍ2〜１０,０００μｇ／ｍ2であることを特徴とする細胞培養用の担体。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と
塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基を８０質量％以上含むポリアミノ酸とを有し、
前記支持体に対する前記ポリアミノ酸の結合密度が１μｇ／ｍ2〜１０,０００μｇ／ｍ2であることを特徴とする
細胞培養用の担体。
【請求項２】
前記支持体の表面に前記ポリアミノ酸の末端が共有結合している、請求項１に記載の担体。
【請求項３】
前記α−アミノ酸残基がα−Ｌｙｓ残基である、請求項１又は２に記載の担体。
【請求項４】
前記支持体の表面の求核性官能基を開始末端としてアミノ酸モノマーを重合して得た、請求項１〜３いずれか１つに記載の担体。
【請求項５】
前記求核性官能基が、アミノ基、水酸基又はチオール基であり、
前記アミノ酸モノマーが、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物、又はアミノ酸カーバメート化合物である、請求項４に記載の担体。
【請求項６】
前記支持体が粒子である、請求項１〜５いずれか１つに記載の担体。
【請求項７】
前記粒子が多孔質である、請求項６に記載の担体。
【請求項８】
前記粒子の体積平均粒径が１０〜１０００μｍである、請求項６又は７に記載の担体。
【請求項９】
比重が０．９〜１．２である、請求項１〜８いずれか１つに記載の担体。
【請求項１０】
マイクロキャリアである、請求項１〜９いずれか１つに記載の担体。
【請求項１１】
収容部を用意し、前記収容部に、接着依存性細胞、培養液、及び、請求項１〜１０いずれか１つに記載の担体を導入する導入工程と、
前記細胞が接着した担体を浮遊させながら、担体の表面に接着した前記細胞を増殖させる増殖工程と、を含むことを特徴とする
細胞培養方法。
【請求項１２】
前記導入工程と前記増殖工程との間に、さらに前記細胞と前記担体とを接触させ、前記担体の表面に前記細胞を接着させる接着工程を含む、請求項１１に記載の細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は担体及び細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、分化した細胞と異なり、分裂して、自己再生するか、又は表現型及び機能の異なる娘細胞に分化する能力をもつ。有用な細胞を増殖させ患者に移植する治療は、昨今の医学の進歩の著しい再生医療や癌免疫療法で期待されている治療方法である。幹細胞を応用した医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法等の分野において、細胞や組織、微生物等を人工的な環境下で効率良く大量に培養することが求められている。大量培養が可能な細胞培養の手法として、粒子などの担体の表面に細胞を付着させ、該細胞を生育させるマイクロキャリア培養法が知られている。マイクロキャリア培養法とは、培養容器内に、細胞、培養液、及び細胞の接着足場となるマイクロキャリアを導入し、培養液を間欠的に撹拌し、マイクロキャリアの表面に細胞を接着させて増殖させる方法である。マイクロキャリアは、接着依存性の細胞、例えば幹細胞を培養するに当たって足場（担体）として使用する微粒子であり、従来種々の材質のマイクロキャリアが用いられてきた（特許文献１〜４）。
【０００３】
しかし、従来のマイクロキャリアを使用した接着依存性細胞の培養では、充分に満足しうる増殖率が得られているとは云い難かった。また、幹細胞の能力を保持したまま培養できているかなどの十分な評価も行われてない。さらに、細胞の接着に有効な細胞外マトリックス成分を含むマトリックスでコートしたマイクロキャリアなども知られているが、増殖した細胞の人体への移植などに際し、動物由来のタンパクを細胞足場材として用いることは動物由来感染症の発症のリスクの点から好ましくない。したがって、化学合成した非動物由来の細胞培養用担体が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許４５９３５８１号公報
【特許文献２】特開２００４−２５４５１９号公報
【特許文献３】特開２００４−２３６５５３号公報
【特許文献４】特表２０１１−５２９７０１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、付着依存性細胞の大量培養に応用可能な細胞接着性を有する担体を提供することである。また、本発明が解決しようとするもう１つの課題は、該担体を用いて細胞を増殖し、かつ培養した細胞を高収率で回収することを可能とする細胞培養方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、下記の手段により解決された。
【０００７】
＜１＞  支持体と塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基を８０質量％以上含むポリアミノ酸とを有し、前記支持体に対する前記ポリアミノ酸の結合密度が１μｇ／ｍ2〜１０,０００μｇ／ｍ2であることを特徴とする細胞培養用の担体。
＜２＞  前記支持体の表面に前記ポリアミノ酸の末端が共有結合している、＜１＞に記載の担体。
＜３＞  前記α−アミノ酸残基がα−Ｌｙｓ残基である、＜１＞又は＜２＞に記載の担体。
＜４＞  前記支持体の表面の求核性官能基を開始末端としてアミノ酸モノマーを重合して得た、＜１＞〜＜３＞いずれか１つに記載の担体。
＜５＞  前記求核性官能基が、アミノ基、水酸基又はチオール基であり、前記アミノ酸モノマーが、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物、又はアミノ酸カーバメート化合物である、＜４＞に記載の担体。
＜６＞  前記支持体が粒子である、＜１＞〜＜５＞いずれか１つに記載の担体。
＜７＞  前記粒子が多孔質である、＜６＞に記載の担体。
＜８＞  前記粒子の体積平均粒径が１０〜１０００μｍである、＜６＞又は＜７＞に記載の担体。
＜９＞  比重が０．９〜１．２である、＜１＞〜＜８＞いずれか１つに記載の担体。
＜１０＞  マイクロキャリアである、＜１＞〜＜９＞いずれか１つに記載の担体。
＜１１＞  収容部を用意し、前記収容部に、接着依存性細胞、培養液、及び、＜１＞〜＜１０＞いずれか１つに記載の担体を導入する導入工程と、前記細胞が接着した担体を浮遊させながら、担体の表面に接着した前記細胞を増殖させる増殖工程と、を含むことを特徴とする細胞培養方法。
＜１２＞  前記導入工程と前記増殖工程との間に、さらに前記細胞と前記担体とを接触させ、前記担体の表面に前記細胞を接着させる接着工程を含む、＜１１＞に記載の細胞培養方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、付着依存性細胞の大量培養に応用可能な細胞接着性を有する担体を提供することができた。また、本発明により、該担体を用いて細胞を増殖し、かつ培養した細胞を高収率で回収することを可能とする細胞培養方法を提供することができた。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】静置培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の実施例１の粒子上での細胞増殖を示す写真である。
【図２】静置培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の実施例１の粒子上での細胞増殖を示すグラフである。
【図３】浮遊培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の実施例２の粒子上での細胞増殖を示す写真である。
【図４】浮遊培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の実施例２の粒子上での細胞増殖を示すグラフである。
【図５】浮遊培養条件下、実施例２の粒子上で増殖させたヒト間葉系幹細胞株の細胞表面マーカーの発現を示す図である。
【図６】浮遊培養条件下、実施例２の粒子上で増殖させたヒト間葉系幹細胞株の細胞分化能を示す図である。
【図７】静置培養条件下における初代培養ヒト間葉系幹細胞の実施例１の粒子上での細胞増殖を示す写真である。
【図８】静置培養条件下における初代培養ヒト間葉系幹細胞の実施例１の粒子上での細胞増殖を示すグラフである。
【図９】静置培養条件下における初代培養ヒト間葉系幹細胞の実施例２の粒子上での細胞増殖を示す写真である。
【図１０】浮遊培養条件下における初代培養ヒト間葉系幹細胞の実施例１の粒子上での細胞増殖を示す写真である。
【図１１】浮遊培養条件下における初代培養ヒト間葉系幹細胞の実施例１の粒子上での細胞増殖を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
＜細胞培養用の担体＞
本発明の細胞培養用の担体は、支持体と塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基を８０質量％以上含むポリアミノ酸とを有し、前記支持体に対する前記ポリアミノ酸の結合密度が１μｇ／ｍ2〜１０,０００μｇ／ｍ2であることを特徴とする。
担体としては、マイクロキャリアが好ましい。ここでいう「マイクロキャリア」とは、粒子の表面に細胞を付着させ、生育させる方法に使用される基材をいう。
【００１１】
（支持体）
本発明における支持体の形状は特に限定されるものではなく、粒子状、プレート状、繊維状、ロッド状、チップ状等のいずれでもよいが、好ましくは粒子状である。また、支持体は、多孔質でも非多孔質でもよいが、好ましくは多孔質である。
また、支持体の材質としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどを含む多糖類などの天然物質、ガラス、改質ガラス、セラミック等の無機物、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等の合成ポリマーのいずれか、又は、その組み合わせが挙げられる。中でも、多孔質化による浮遊性を確保できることや、靱性に優れ培養中の破損を低減できることから、多糖類、合成ポリマーが好ましく、合成ポリマーがより好ましい。
【００１２】
本発明で用いる材質としては、細胞培養分野で汎用されているスチレン系ポリマーが好ましく、機械的強度に優れることから、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体がより好ましい。
【００１３】
スチレン−ジビニルベンゼン共重合体としては、ポリマーを含む支持体表面に求核性を有する官能基で修飾しうるものが好ましい。具体的には、ジビニルベンゼン系モノマーに由来する構造単位（Ａ）：１０〜３０質量％及びスチレン系モノマーに由来する構造単位（Ｂ）：７０〜９０質量％を有し、且つ前記スチレン系モノマーに由来する構造単位（Ｂ）のうち３０〜７０質量％が、３員環又は４員環の環状エーテル基を有するスチレン系モノマーに由来する構造単位（ｂ−１）である共重合体が好ましい。
【００１４】
構造単位（Ａ）は、ジビニルベンゼン系モノマーに由来するものであればよいが、担体の機械的強度、特に耐圧力性能の観点から、下記式（１）で表されるものが好ましい。
【００１５】
【化１】
2016171794.tif 000002
【００１６】
〔式（１）中、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示し、
Ｒ3は、炭素数１〜１０の有機基を示し、
環Ｑは、ベンゼン環又はナフタレン環を示し、
ｐは、０〜４の整数を示す。〕
【００１７】
式（１）中、Ｒ1及びＲ2で示されるアルキル基の炭素数としては、１又は２が好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ1及びＲ2としては、水素原子が好ましい。
【００１８】
Ｒ3で示される有機基の炭素数は、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１又は２である。
また、上記有機基としては、アルキル基が好ましい。当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。
【００１９】
環Ｑとしては、担体の機械的強度の観点から、ベンゼン環が好ましい。
ｐは０〜４の整数を示すが、０又は１が好ましい。なお、ｐが２〜４の整数の場合、ｐ個のＲ3は同一であっても異なっていてもよい。
【００２０】
上記式（１）で表される構造単位としては、式（２）で表されるものが特に好ましい。
【００２１】
【化２】
2016171794.tif 000003
【００２２】
〔式（２）中、各記号は前記と同義であり、Ｒ3は、炭素数１〜１０の有機基を示し、ｐは、０〜４の整数を示す。〕
【００２３】
構造単位（Ａ）を誘導するモノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタレン等が挙げられる。これらは１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、重合反応の反応性の観点から、ジビニルベンゼンが特に好ましい。
【００２４】
構造単位（Ａ）の含有量は、ポリマー全量中、１０〜３０質量％であるが、機械的強度の観点及び脆性を抑える観点から、１２．５〜２７．５質量％が好ましく、１５〜２５質量％が特に好ましい。
なお、本明細書におけるポリマー中の各構造単位の含有量は、13Ｃ−ＮＭＲ等により測定可能である。
【００２５】
（構造単位（Ｂ））
スチレン系モノマーに由来する構造単位（Ｂ）は、その構造単位（Ｂ）全量中に、３員環又は４員環の環状エーテル基を有するスチレン系モノマーに由来する構造単位（ｂ−１）を３０〜７０質量％含有するものである。なお、本明細書において、「スチレン系モノマー」とは、ジビニルベンゼン系モノマー以外のスチレン系モノマーのことをいうものとする。
上記構造単位（ｂ−１）を誘導する３員環又は４員環の環状エーテル基を有するスチレン系モノマーとしては、下記式（３）で表される環状エーテル基を有するものが好ましく、下記式（４）で表されるものがより好ましい。
【００２６】
【化３】
2016171794.tif 000004
【００２７】
〔式（３）中、Ｒ4は、置換又は非置換の炭素数１又は２のアルカンジイル基を示す。〕
【００２８】
【化４】
2016171794.tif 000005
【００２９】
〔式（４）中、
Ｒ5は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示し、
Ｒ6は、炭素数２又は３のアルカンジイル基を示し、
Ｒ7は、炭素数１〜１０のアルキル基を示し、
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜６の整数を示し、
ｑは、０〜４の整数を示し、
Ｒ4は前記と同義であり、置換又は非置換の炭素数１又は２のアルカンジイル基を示す。〕
【００３０】
式（３）及び（４）中、Ｒ4で示されるアルカンジイル基としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基が挙げられるが、反応性の観点から、メタン−１，１−ジイル基が好ましい。なお、アルカンジイル基が有していてもよい置換基としては、メチル基、エチル基等が挙げられる。
【００３１】
式（４）中、Ｒ5は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示す。Ｒ5で示されるアルキル基の炭素数としては、１又は２が好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基等が挙げられる。
これらの中でも、Ｒ5としては、重合反応の反応性の観点から、水素原子が好ましい。
【００３２】
また、Ｒ6で示されるアルカンジイル基としては、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられるが、エタン−１，２−ジイル基が好ましい。
【００３３】
また、Ｒ7で示されるアルキル基の炭素数は、担体の疎水性を抑える観点から、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１又は２である。
また、上記アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、例えば、上記Ｒ5で示されるアルキル基と同様のものが挙げられる。
【００３４】
ｍ及びｎは、それぞれ独立して、０〜６の整数を示すが、ｍとしては０〜３の整数が好ましい。また、ｎとしては、０〜３の整数が好ましく、０又は１がより好ましい。なお、ｎが２〜６の整数の場合、ｎ個のＲ6は同一であっても異なっていてもよい。
また、ｑは、０〜４の整数を示すが、担体の疎水性を抑える観点から、０又は１が好ましい。なお、ｑが２〜４の整数の場合、ｑ個のＲ7は同一であっても異なっていてもよい。
【００３５】
３員環又は４員環の環状エーテル基を有するスチレン系モノマーとしては、例えば、ビニルベンジルグリシジルエーテル、イソプロペニルベンジルグリシジルエーテル、ビニルフェニルブチルグリシジルエーテル、ビニルベンジルオキシエチルグリシジルエーテル等が挙げられる。これらは１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。これらの中でも、ビニルベンジルグリシジルエーテルが好ましい。
【００３６】
構造単位（ｂ−１）の含有量は、スチレン系モノマーに由来する構造単位（Ｂ）の全質量中、３０〜７０質量％であるが、３５〜６５質量％が好ましく、４０〜６０質量％がより好ましい。上記の数値の範囲内であると、後述の反応に十分な量の官能基を支持体に導入できるために好ましい。
【００３７】
また、本発明で用いる支持体に含まれるポリマーとしては、スチレン系モノマーに由来する構造単位として、上記構造単位（ｂ−１）に加えて、下記式（５）で表される構造単位（ｂ−２）をさらに含むものが好ましい。
【００３８】
【化５】
2016171794.tif 000006
【００３９】
〔式（５）中、
Ｒ8は、水素原子又は炭素数１〜４のアルキル基を示し、
Ｒ9は、炭素数１〜１０の有機基を示し、
ｔは、０〜５の整数を示す。〕
【００４０】
式（５）中、Ｒ8で示されるアルキル基の炭素数としては、１又は２が好ましい。また、当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ8としては、水素原子が好ましい。
【００４１】
Ｒ9で示される有機基の炭素数は、担体の疎水性を抑える観点から、好ましくは１〜６であり、より好ましくは１〜３であり、さらに好ましくは１又は２である。
また、上記有機基としては、アルキル基が好ましい。当該アルキル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００４２】
また、ｔは、０〜５の整数を示すが、担体の疎水性を抑える観点から、０〜３が好ましく、０又は１がより好ましい。なお、ｔが２〜５の整数の場合、ｔ個のＲ9は同一であっても異なっていてもよい。
【００４３】
構造単位（ｂ−２）を誘導するスチレン系モノマーとしては、例えば、スチレン、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２，４，６−トリメチルスチレン、４−エチルスチレン、４−イソプロピルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン等が挙げられる。これらは１種を単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００４４】
構造単位（ｂ−２）の含有量としては、粒子形状の保持の観点から、スチレン系モノマーに由来する構造単位（Ｂ）の全質量中、３０〜７０質量％が好ましく、３５〜６５質量％がより好ましく、４０〜６０質量％が特に好ましい。
構造単位（ｂ−１）と構造単位（ｂ−２）との含有量の比率〔（ｂ−１）：（ｂ−２）〕としては、反応性官能基の導入量と粒子形状の保持の観点から、質量比で、３０：７０〜７０：３０が好ましく、３５：６５〜６５：３５がより好ましく、４０：６０〜６０：４０が特に好ましい。
【００４５】
構造単位（Ｂ）の含有量は、ポリマー全量中、７０〜９０質量％であるが、機械的強度の観点及び脆性を抑える観点から、７２．５〜８７．５質量％が好ましく、７５〜８５質量％が特に好ましい。上記の数値の範囲内であると、脆性を抑制でき、かつ、機械的強度が向上する。
【００４６】
また、構造単位（Ａ）及び（Ｂ）の合計含有量としては、担体に含まれるポリマー中、８０〜１００質量％が好ましく、９０〜１００質量％がより好ましく、９５〜１００質量％がさらに好ましい。
【００４７】
また、本発明の支持体は、ヒドロキシ基を含む基を表面に有していてもよい。例えば、ポリアミノ酸の固定後に残存した構造単位（ｂ−１）の３員環又は４員環の環状エーテル基を開環させることで得ることができる。斯様な支持体とすることにより、支持体の親水化による水媒体への分散性が改善され、また、固定したポリアミノ酸の支持体表面への非特異的吸着が抑制される。ヒドロキシ基を含む基としては、構造単位（ｂ−１）の３員環又は４員環の環状エーテル基が開環したものが好ましく、１，２−ジヒドロキシエチル基が特に好ましい。
【００４８】
支持体は、比重の制御、培養液の循環を促進させることから、多孔質粒子であることが好ましい。多孔質粒子の体積平均細孔径としては、粒子の表面積の増大による官能基の導入効率の観点から、１〜１０００ｎｍが好ましく、１０〜８００ｎｍがより好ましく、１００〜５００ｎｍがさらに好ましい。
【００４９】
本発明で用いる支持体の比表面積としては、０．０５〜５００ｍ2／ｇが好ましく、０．１〜２５０ｍ2／ｇがより好ましく、１０〜２００ｍ2／ｇがさらに好ましく、５０〜１５０ｍ2／ｇがさらに好ましく、７０〜１００ｍ2／ｇが特に好ましい。
【００５０】
また、本発明で用いる支持体が粒子の場合、その体積平均粒径としては、細胞の増殖効率の観点から、培地（培養液）に湿潤した状態で、１０〜１０００μｍが好ましく、５０〜５００μｍがより好ましく、１００〜３００μｍが特に好ましい。また、体積平均粒径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
【００５１】
上記体積平均細孔径、比表面積、体積平均粒径は、後述する実施例に記載の方法で測定した値をいう。変動係数は、例えば、フロー式粒子像分析装置等により測定すればよい。
【００５２】
本発明で用いる支持体は、例えば、上記のポリマーを誘導する各モノマーを使用し、常法に従い水系媒体中で懸濁重合することで得ることができる。
懸濁重合は、ラジカル重合開始剤を用いて行うのが好ましく、ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル等のアゾ系開始剤が挙げられる。重合開始剤の使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して０．０１〜１０質量部程度である。
【００５３】
また、多孔質粒子として支持体を得る観点から、懸濁重合は多孔化剤存在下で行うのが好ましい。多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロヘキサン、シクロペンタン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、テトラクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、ヘキサノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類が挙げられる。多孔化剤の使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して７０〜３５０質量部程度である。
【００５４】
また、懸濁重合は、水系媒体中で行うのが好ましい。また、上記水系媒体は、水溶性高分子、無機塩等の分散安定剤；アニオン性界面活性剤、ノニオン界面活性剤、両性界面活性剤等の界面活性剤；無機系重合禁止剤、有機系重合禁止剤等の重合禁止剤が添加されていてもよい。水系媒体の使用量は、モノマー総量１００質量部に対して、６００〜６０００質量部が好ましい。
【００５５】
重合反応の温度は、１０時間半減期温度＋２０℃を中心に、上下２０℃以内が好ましく、より好ましくは上下１５℃以内である。また重合時間は通常５分〜４８時間、好ましくは１０分〜２４時間である。
【００５６】
（塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基を８０質量％以上含むポリアミノ酸）
次に、塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基を８０質量％以上含むポリアミノ酸について説明する。本明細書中において、α−アミノ酸とはカルボキシ基が結合している炭素（α炭素）にアミノ基も結合しているアミノ酸をいう。なお、α−アミノ酸の立体配置は、Ｌ体であってもＤ体であってもよい。
【００５７】
塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基の塩基性基としては、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾイル基、インドリル基及び４級アンモニウム基よりなる群から選択された少なくとも１つであることが好ましく、ｐＫａの観点から、アミノ基がより好ましい。
【００５８】
また、本発明の担体は、支持体の表面にポリアミノ酸の末端が共有結合しているものが好ましく、支持体の表面にポリアミノ酸のポリマーブラシが形成されているのがより好ましい。また、結合は、非多点結合であるのが好ましい。
このような構成とすることで、細胞を剥離する際に粒子の表面を修飾したポリマーの脱落がなく、細胞の接着性を維持することができる。
【００５９】
このような担体は、例えば、支持体の表面の求核性官能基を開始末端としてアミノ酸モノマーを重合して得ることができる。また、ポリアミノ酸の重合後に支持体表面に化学的に結合させてもよい。
前記求核性官能基としては、アミノ基、水酸基、チオール基が挙げられ、中でもアミノ基が好ましい。求核性官能基の導入は、支持体を構成するモノマーとして、求核性官能基を有するモノマーを使用してもよいが、支持体を作製した後に導入してもよい。たとえば、得られた支持体が有する３員環又は４員環の環状エーテル基を１官能又は２官能以上の求核性試薬と反応させることにより求核性官能基を導入してもよい。
【００６０】
求核性試薬としては、アンモニア水、エチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、４−ビス（３−アミノプロピル）ピペラジン、ｏ−キシレンジアミン、ｍ−キシレンジアミン、ｐ−キシレンジアミン、ビス（２−アミノエトキシ）ジエチルシラン、ビス（３−アミノプロピル）アミン、ビス（２−アミノエチル）アミン、１，３−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、１，４−ビス（アミノメチル）シクロヘキサン、エチレングリコールビス（３−アミノプロピル）エーテル、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、ビス（アミノメチル）ノルボルナン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、トリメチレンビス（４−アミノベンゾアート）、４，４'−メチレンビス（シクロヘキシルアミン）、シスタミン、トリス（２−アミノエチル）アミン、ＤＬ−ジチオトレイロール、ジチオエリトリトール、１，２−エタンジチオール、１，３−プロパンジチオール、１，２−ブタンジチオール、２−アミノエタノール、２−メルカプトエタノールなどが挙げられる。
【００６１】
求核性官能基の導入方法として、例えば、水、リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、炭酸バッファー等の水系バッファー中で、３員環又は４員環の環状エーテル基を有する支持体と前記求核性試薬とを接触させる方法が挙げられる。また、上記の求核置換反応を促進するため、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸三ナトリウム等の塩を共存させてもよい。
【００６２】
求核性官能基導入反応の反応温度は特に限定されないが、４〜１５０℃が好ましく、３０〜１３０℃がより好ましく、６０〜８０℃が特に好ましい。また、反応時間は特に限定されないが、０．５〜４８時間が好ましく、１〜２４時間がより好ましく、２〜６時間が特に好ましい。残余の３員環又は４員環の環状エーテル基は、後の副反応を抑制するため例えば硫酸などの酸処理により開環させてもよい。硫酸で処理した後には、トリエチルアミンなどの塩基性化合物により中和することが好ましい。
【００６３】
求核性官能基を重合開始点として反応させるアミノ酸モノマーとしては、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物、又はアミノ酸カーバメート化合物等のアミノ酸誘導体が挙げられる。これら化合物中に含まれるアミノ酸構造が塩基性基を側鎖部に有するものを、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物又はアミノ酸カーバメート化合物の全量に対し、８０質量％以上使用することで、所望のポリアミノ酸を導入できる。
Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物、アミノ酸カーバメート化合物の中では、ポリアミノ酸の分子量の制御が容易であることから、アミノ酸カーバメート化合物がより好ましい。
Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物、又は、アミノ酸カーバメート化合物としては、下記式（６）、式（７）の化合物が挙げられる。式（７）の化合物としては、式（７−２）の化合物が好ましい。
【００６４】
【化６】
2016171794.tif 000007
【００６５】
〔式中、
Ｒ10は、炭素数１以上の２価の有機基を示し、
Ｒ11は、水素原子または炭素数１以上の有機基を示し、
Ｒ13は、炭素数１以上の有機基を示し、
Ｙは、電子吸引性基を示し、
ｋは、０〜５の整数を示す。〕
【００６６】
より具体的には、下記反応式で表されるように、式（６）で表されるようなＮ−カルボキシアミノ酸無水物を用いた反応と、式（７）で表されるようなアミノ酸カーバメート化合物を用いた反応により成し得る。
【００６７】
【化７】
2016171794.tif 000008
【００６８】
【化８】
2016171794.tif 000009
【００６９】
〔式中、
Ｒ12は、炭素数１以上の有機基を示し、
Ｘ2は、求核性官能基を示し、
Ｘ3は、求核性官能基由来の２価の基を示し、
ｒは、アミノ酸の繰り返し単位数を示し、例えば、２以上である。
なお、その他の記号は前記と同義である。〕
【００７０】
本発明においては、式（６）、式（７）におけるＲ10及びＲ11中に塩基性基やそれを保護した基を含むものを、Ｎ−カルボキシアミノ酸無水物又はアミノ酸カーバメート化合物の全量に対し、８０質量％以上使用することで、所望のポリアミノ酸を導入できる。
Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12としては、例えば、アミノブチル、アミノプロピル、グアニジノプロピル、メチルイミダゾイル、メチルインドリルのようなアミノ基、グアニジノ基、イミダゾイル基、インドリル基などの塩基性基を保護基で保護した基を有するものが好ましい。
ここで示したように、アミノ酸が水酸基やチオール基、あるいは複数個のカルボキシ基あるいはアミノ基を有するときは、反応に関与するもの以外を保護することが好ましい。保護方法としては、特に限定されないが、アミノ基の場合は、カルボベンジルオキシ基（Ｚ基）、ｔ‐ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、アセチル基などで置換する方法、グアニジノ基の場合は、ｐ−トルエンスルホニル基などで置換する方法、イミダゾイル基の場合は、ベンジルオキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基、２，４−ジニトロフェニル基、トリチル基などで置換する方法、インドリル基の場合は、ホルミル基などで置換する方法が例示される。複数のアミノ基を有するアミノ酸のアミノ基保護無しに、本発明の方法でポリアミノ酸を製造した場合、デンドロン構造あるいはハイパーブランチ構造のポリアミノ酸でグラフトすることも可能である。
【００７１】
本発明に用いられるアミノ酸又はアミノ酸誘導体は、塩基性基やそれを保護した基を側鎖部に有するものが８０質量％以上含まれていれば、天然及び非天然のアミノ酸類いずれに由来するものでもよい。例えば、リジン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファンなどの天然アミノ酸及びその活性水素置換アミノ酸；前述の天然アミノ酸のＤ−異性体である非天然アミノ酸などが挙げられる。これらのアミノ酸の中でも特に好適に用いられるのは、重合する際に使用する溶剤に良好な溶解性を示すモノマーを与えるアミノ酸である。
【００７２】
有機溶媒としては、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド系溶媒；ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド系溶媒；２−ブタノン、メチルエチルケトン、アセトンなどのケトン系溶媒；酢酸エチル、酢酸ブチルなどのエステル系溶媒；アセトニトリルなどのニトリル系溶媒；クロロホルム、ジクロロメタンなどのハロゲン系溶媒；テトラヒドロフラン、シクロペンタンモノメチルエーテルなどのエーテル系溶媒；メタノール、エタノール、ブタノールなどのアルコール系溶媒などが挙げられる。
【００７３】
なお、反応は、脱水剤の存在下で行ってもよい。脱水剤としては、モレキュラーシーブ４Ａ、モレキュラーシーブ３Ａ、又はモレキュラーシーブ５Ａなどの合成ゼオライト、無水硫酸ナトリウム、無水硫酸マグネシウム又は無水硫酸カルシウムなどを挙げることができる。反応は、通常、大気下で実施可能であるが、アルゴン、窒素などの不活性気体雰囲気下で実施するのが望ましい。なお、この反応は、常圧、減圧、加圧のいずれの状態でも実施可能である。また、反応温度としては、通常、−７０℃〜１２０℃、好ましくは−１０〜１００℃の範囲から選択するのがよい。反応時間としては、通常、０．１〜１００時間を要する。
【００７４】
前記アミノ酸カーバメート化合物のＲ13は、炭素数１以上の有機基を示すが、置換基を有していてもよい１価の炭化水素基が好ましい。置換基を有していてもよい１価の炭化水素基としては、置換基を有してもよいアルキル基、置換基を有してもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよいアルケニル基、置換基を有していてもよいシクロアルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基が挙げられる。
【００７５】
これらの炭化水素基に置換し得る基としては、ニトロ基；塩素原子、フッ素原子などのハロゲン原子；パーフルオロアルキル基（ここで、アルキル基としては、炭素数１〜８の直鎖状、分枝状、環状の飽和及び不飽和アルキル基などが挙げられる。）、パークロロアルキル基（ここで、アルキル基としては、パーフルオロアルキル基と同じものが挙げられる。）等のハロゲン化アルキル基；エステル基；アセチル基、ベンゾイル基などの炭素数２〜１５のアシル基；シアノ基等が挙げられ、ニトロ基、ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基（ここで、アルキル基としては、パーフルオロアルキル基と同じものが挙げられる。）が好ましい。
【００７６】
上記「置換基を有していてもよいアルキル基」において、「アルキル基」としては、炭素数１〜２０のアルキル基が挙げられるが、炭素数１〜１０のアルキル基が特に好ましい。当該アルキル基としては、直鎖状、分岐状アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デカニル基等が挙げられる。
【００７７】
上記「置換基を有していてもよいシクロアルキル基」において、「シクロアルキル基」としては、炭素数３〜２０のシクロアルキル基が挙げられるが、炭素数３〜１０のシクロアルキル基が特に好ましい。具体的には、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基が挙げられる。
上記「置換基を有していてもよいアルケニル基」において、「アルケニル基」としては、炭素数２〜１８のアルケニル基が挙げられるが、炭素数２〜１０のアルケニル基が特に好ましい。具体的には、ビニル基、プロペニル基、３−ブテニル等が挙げられる。
【００７８】
上記「置換基を有していてもよいシクロアルケニル基」において、「シクロアルケニル基」としては、炭素数５〜１８のシクロアルケニル基が挙げられるが、炭素数５〜１０シクロアルケニル基が特に好ましい。具体的には、シクロヘキセニル、シクロオクテニル、シクロドデセニル等が挙げられる。
上記「置換基を有していてもよいアリール基」において、「アリール基」としては、炭素数６〜１４のアリール基が挙げられ、炭素数６〜１０のアリール基が特に好ましい。具体的には、フェニル、トリル、ナフチル等が挙げられる。
【００７９】
上記「置換基を有していてもよいアラルキル基」において、「アラルキル基」としては、炭素数７〜１３のアラルキル基が挙げられるが、炭素数７〜９のアラルキル基が特に好ましい。具体的には、ベンジル、フェネチル、ナフチルメチル、ナフチルエチル等が挙げられる。
【００８０】
前記炭化水素基としては、置換基を有してもよいアリール基が好適に用いられる。具体的には、ジフェニルカーボネート、ビス（４−ニトロフェニル）カーボネート、ビス（２−ニトロフェニル）カーボネート、ビス（２，４−ジニトロフェニル）カーボネート、ビス（２，４，６−トリニトロフェニル）カーボネート、ビス（ペンタフルオロフェニル）カーボネート、ビス（４−クロロフェニル）カーボネート、ビス（２，４−ジクロロフェニル）カーボネート、ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）カーボネート等を用いて形成された炭化水素基が好ましく、中でもジフェニルカーボネートが特に好ましく用いられる。なお、上述した炭酸ジエステルは、公知の方法により製造でき、市販のものを使用できる。
【００８１】
最後に、脱保護する際には、例えばＺ基保護ポリ−Ｌ−リジンで修飾された支持体と、臭化水素（３０％酢酸溶液）と、トリフルオロ酢酸とを容器に添加し、２時間、１５０ｒｐｍの条件で振盪するなど、使用した保護基の種類に応じて脱保護すればよい。
【００８２】
なお、ポリアミノ酸を重合した後に、下記の開環付加反応により支持体に結合させてもよい。開環付加反応は、例えば、塩基性水溶液中で行うことができる。塩基性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液等が挙げられるが、その他、アミン等の塩基性有機化合物であっても構わない。
開環反応の反応温度は、通常４〜９０℃であり、１０℃〜８０℃が好ましく、２０〜７０℃が特に好ましい。
【００８３】
本発明の担体としては、式（８）で表されるものであることが好ましい。
【００８４】
【化９】
2016171794.tif 000010
【００８５】
〔式（８）中、
Ｒ14は、支持体（例えば粒子など）に結合した炭素数１〜１０のアルカンジイル基を示し、
Ｒ15は、一つ以上のエーテル基、一つ以上のヒドロキシ基あるいは一つ以上のアミノ基、またはその組合せのいずれかを有する炭素数３〜３０（好ましくは炭素数３〜２１、より好ましくは炭素数３〜１２、特に好ましくは炭素数３〜９）の有機基を示し、
Ｒ16は、水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、
Ｒ17およびＲ18は、それぞれ独立して、炭素数１〜８のアルカンジイル基を示し、
Ｘ4は、それぞれ独立して、−ＮＨ2、−Ｎ+Ｈ3Ｚ、−ＮＨＲ19、−Ｎ+Ｈ2Ｒ19Ｚ、−ＮＲ20Ｒ21、−Ｎ+Ｒ22Ｒ23Ｒ24のいずれかを示し、
ｒは、アミノ酸の繰り返し単位数を示し、例えば、２以上であり、
Ｙは、ＮＨ2、又はＮ+Ｈ3Ｚを示す。
ただし、Ｒ19〜Ｒ24は、それぞれ独立して、炭素数１〜３のアルキル基を示し、Ｚは、任意の陰イオンを示す。〕
【００８６】
Ｒ14で示されるアルカンジイル基としては、例えば、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，１−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，１−ジイル基、ペンタン−１，２−ジイル基、ペンタン−１，３−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，１−ジイル基、ヘキサン−１，２−ジイル基、ヘキサン−１，３−ジイル基、ヘキサン−１，４−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基、ノナン−１，９−ジイル基、デカン−１，１０−ジイル基等が挙げられる。Ｒ17、Ｒ18も、これらと同様のものが挙げられる。
Ｒ16で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
Ｒ19〜Ｒ24で示されるアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基等が挙げられる。
【００８７】
本発明において、上記ポリアミノ酸は、塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基を８０質量％以上含むポリアミノ酸であり、塩基性基を側鎖に有するα−アミノ酸残基の含有量としては、９０質量％以上が好ましく、９５質量％がより好ましい。
側鎖にアミノ基を有するα−アミノ酸残基を形成するアミノ酸としては、リジン、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミンが挙げられ、中でも、リジン、オルニチンが好ましく、リジンが特に好ましい。アミノ酸は上述したように、保護基を導入したアミノ酸誘導体として使用することが好ましい。
【００８８】
ポリアミノ酸の重量平均分子量としては、２００〜１，０００，０００の範囲が好ましく、５００〜１００，０００の範囲がより好ましく、１，０００〜２０，０００の範囲がさらに好ましい。
【００８９】
（ポリアミノ酸の結合密度）
本発明において、支持体に対するポリアミノ酸の結合密度は、１μｇ／ｍ2〜１０,０００μｇ／ｍ2である。結合密度としては、５０μｇ／ｍ2〜５,０００μｇ／ｍ2が好ましく、５００μｇ／ｍ2〜２，０００μｇ／ｍ2がより好ましい。特に、５００μｇ／ｍ2以上とすることで、本発明の所望の効果が向上する。
ポリアミノ酸の結合密度は、ポリアミノ酸の結合量と支持体の比表面積から算出できる。
【００９０】
（ポリアミノ酸の結合量）
本発明において、支持体に対するポリアミノ酸の結合量は、１ｍｇ／ｇ〜１０００ｍｇ／ｇが好ましく、１０ｍｇ／ｇ〜７５０ｍｇ／ｇがより好ましく、３０ｍｇ／ｇ〜５００ｍｇ／ｇがさらに好ましく、５０ｍｇ／ｇ〜３００ｍｇ／ｇが特に好ましい。このような範囲とすることで、本発明の所望の効果が向上する。
ポリアミノ酸の結合量は、後述する実施例に記載の方法に従い測定すればよい。
【００９１】
本発明の担体は、浮遊培養に用いるという観点から、比重が１に近いことが好ましく、より好ましくは比重０．９〜１．２、特に好ましくは約１．０である。比重が培養液（培地）のそれより高いとマイクロキャリアは沈降する傾向が高くなり、浮遊培養のためには強く撹拌する必要がある。一方、比重が培地のそれよりも小さいと培地からマイクロキャリアが浮上する傾向が高くなり、やはり強く撹拌する必要がある。従って、マイクロキャリアの比重は培地のそれ（約１）と同等であることが好ましい。このように粒状支持体マイクロキャリア全体の比重を調整するために、担体粒子重合時のポロジェンの選択、架橋によるゲルネットワークの形成、及び粒子状支持体の内部に独立した空気孔を設ける等により、適した比重を得ることが可能である。
【００９２】
担体の体積平均粒径の好ましい範囲は、支持体において述べた通りである。
【００９３】
＜細胞培養方法＞
本発明の細胞培養方法は、収容部を用意し、前記収容部に、接着依存性細胞、培養液、及び、本発明の担体を導入する導入工程と、前記細胞が接着した担体を浮遊させながら、担体の表面に接着した前記細胞を増殖させる増殖工程と、を含むことを特徴とする。好ましくは、前記導入工程と前記増殖工程との間に、さらに前記細胞と前記担体とを接触させ、前記担体の表面に前記細胞を接着させる接着工程を含む。
以下、本発明の細胞培養方法について説明する。
【００９４】
細胞は、血清培地、または無血清培地いずれに懸濁され、培養されてもよい。
【００９５】
培地としては、細胞培養のための全ての公知培地を使用することができる。具体的には、ＨａｍＦ１０培地、ＨａｍＦ１２培地、ダルベッコ改変ＭＥＭ（ＤＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）−１６４０培地、ＭＥＭ−α培地、ＣＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ）−ＣＨＯ培地などのケミカリー・ディファインド培地、およびこれらの混合培地が挙げられる。動物細胞培養培地として用いる場合には、グルタミン０．５〜５ｍＭ、抗生物質（ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、Ｇ４１８（０．３ｍｇ／ｍＬ））などを添加してもよい。
【００９６】
前述の無血清培地は、未知組成のタンパク質、水解物および成分を含まないという点で無タンパク質であってもよい。無血清培地には、すべての成分が既知の化学構造をもつ化学的に規定された培地を含めることができる。
【００９７】
本発明は、幹細胞を安定に長期間、インビトロ培養において培養するための方法を提供する。この方法を用いて、細胞を各継代間で連続拡張させることができ、拡張したヒト幹細胞集団の多分化能性は少なくとも５継代を超えて、通常は１０継代を超えて維持される。
【００９８】
好ましい態様において、培養の後、培養物中の少なくとも６０％以上の幹細胞が幹細胞特有のマーカー発現を維持するなど、幹細胞の性質を維持している。あるいは、これは少なくとも７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上のいずれかであってもよい。
【００９９】
（導入工程）
本発明の細胞培養方法は、収容部を用意し、前記収容部に、接着依存性細胞、培養液、及び、本発明の担体を導入する導入工程を含む。
【０１００】
本発明において、培養に供せられる接着依存性細胞とは、足場依存性細胞や基質依存性細胞ともいい、細胞が増殖する際に付着すべき足場が必要な細胞の総称であり、上記担体（例えばマイクロキャリア）を足場として培養可能な細胞であれば特に限定されるものではない。接着依存性細胞の具体例としては、例えば間葉系幹細胞、骨髄幹細胞、各種組織の幹細胞、前駆細胞、芽細胞などが挙げられる。また、株化細胞であっても初代培養細胞であっても構わない。
【０１０１】
本発明における収容部として適切な容器としては、後述する浮遊培養が可能なものであれば限定されないが、スピナーが含まれる。スピナーは、調節型又は非調節型バイオリアクターであり、これらは種々の撹拌メカニズム、たとえばガラスボール撹拌機、インペラー撹拌機、及び他の適切な撹拌機を用いて撹拌することができる。スピナーの培養体積は一般に２０ｍＬ〜５００ｍＬである。
【０１０２】
（接着工程）
本発明の細胞培養方法は、好ましくは、前記導入工程と前記増殖工程との間に、さらに前記細胞と前記担体とを接触させ、前記担体の表面に前記細胞を接着させる接着工程を含む。
【０１０３】
細胞はどのような濃度で播種してもよい。典型的に、細胞は、担体（例えばマイクロキャリア）の約１０，０００細胞／ｃｍ2〜約５００，０００細胞／ｃｍ2で播種される。例えば、細胞は、担体の約５０，０００細胞／ｃｍ2〜約１５０，０００細胞／ｃｍ2で播種してもよい。しかしながら、それより高いまたは低い濃度でも使用することができる。インキュベーション時間および温度、ＣＯ2とＯ2レベル、増殖培地などの条件は、培養されている細胞の性質に合わせて、適宜変更することができる。
【０１０４】
（増殖工程）
本発明の細胞培養方法は、前記細胞が接着した担体を浮遊させながら、担体の表面に接着した前記細胞を増殖させる増殖工程を含む。
【０１０５】
例えば、前記細胞は、トリプシン処理等の酵素処理によって担体（例えばマイクロキャリア）から離脱されて他の担体（例えばマイクロキャリア）へ移植される。このプロセスを少なくとも１回以上反復することにより、前記細胞を希望する任意世代数まで連続的に増大させることを可能にする。
【０１０６】
（分化工程）
本発明の細胞培養方法はさらに、培養の後に得られる幹細胞の分化を誘導する工程を含むことができる。これは、幹細胞の分化を誘導する条件下に担体と幹細胞の複合体を置くことにより達成できる。あるいは、本発明の細胞培養方法は、スピン培養の後に、幹細胞を担体から分離し、そして分離した幹細胞を担体の無い培養において、幹細胞の分化を誘導する条件下で培養する分化工程を含むことができる。
【０１０７】
また、本発明の担体（例えばマイクロキャリア）と共に細胞がインキュベーションされる培地に、１種類以上の増殖因子または他の因子を加えてもよい。それらの因子は、細胞の増殖、接着、自己再生、分化などを促進させ得る。培地に加えてもまたは含ませてもよい因子の例としては、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポイエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、アクチビンＡなどのアクチビン、造血成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）、インターフェロン、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）などの線維芽細胞増殖因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ペプチド性細胞増殖因子、ヘパリン結合成長因子（ＨＢＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、トランスフォーミング増殖因子-β１（ＴＧＦβ１）などのトランスフォーミング増殖因子、およびコロニー刺激因子などが挙げられる。
【０１０８】
培養された細胞は、（ｉ）治験研究に使用するため、（ｉｉ）治療目的のため、（ｉｉｉ）薬物の研究および毒性スクリーニングのためなどを含むどのような適切な目的に使用してもよい。
【実施例】
【０１０９】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【０１１０】
実施例における各分析条件を以下に示す。
（体積平均粒径）
粒子の体積平均粒径は、濃度が１０質量％となるように粒子を純水中に懸濁させ、この懸濁液を用いてレーザー回折散乱式粒度分布測定装置（ベックマン・コールター社製  ＬＳ１３３２０）にて測定した。
【０１１１】
（体積平均細孔径及び比表面積）
粒子の体積平均細孔径及び比表面積は、粒子を４０℃で２４時間真空乾燥させた乾燥粒子について、水銀ポロシメーター（島津製作所社製  オートポアＩＶ９５２０）を用いて、細孔径の測定範囲を１０〜５０００ｎｍとして測定した。
【０１１２】
（ポリリジン結合量）
粒子に結合したリガンドであるポリリジンの結合量は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬を用いた試薬セットで定量した。具体的には、固形分換算で４ｍｇの粒子をテストチューブに採取し、これをＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔで定量した。反応は、３７℃で３０分間、転倒混和することによって行った。検量線は、重量平均分子量３万のα−ポリＬリジンを用いて作成した。
【０１１３】
〔実施例１〕
３６０．５９ｇの純水に、ポリビニルアルコール（日本合成化学社製、ＧＨ−２３）２．１７ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．０３６ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液（α）を調製した。さらに重合当日、そのうち１０ｇを別に抜き取った。
次に、４−ビニルベンジルグリシジルエーテル（東レファインケミカル社製）４．９３ｇ、スチレン（日本オキシラン社製）４．９３ｇ、及びジビニルベンゼン（新日鉄住金化学社製）２．４６ｇをジイソブチルケトン（和光純薬社製）２４．７４ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。なお、各モノマーの全質量を１００質量部としたときの、各モノマーの部数は、４−ビニルベンジルグリシジルエーテル４０質量部、スチレン４０質量部、ジビニルベンゼン２０質量部である。
次いで、水溶液（α）のほぼ全量を５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、撹拌翼、及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、３８０ｒｐｍで撹拌を開始した。２０分後に、上記有機モノマー溶液全量をフラスコ内に加え、更に２０分間撹拌した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、内温が７０℃に到達したところで、滴下ロートを用いて２，２'−アゾジイソブチロニトリル（開始剤）１．５１ｇをフラスコに投入し、抜き取っておいた水溶液（α）のうち５ｇでロートに残留した開始剤を洗い入れ、５時間撹拌を行った。その後さらに、滴下ロートを用いて２，２'−アゾジイソブチロニトリル１．５１ｇをフラスコに投入し、２時間撹拌を行った。
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液をヌッチェでろ過し、純水とイソプロパノールで洗浄した。洗浄した粒子をイソプロパノールに分散して１８０μｍの金属メッシュにかけることで大粒子を除き、続いて９０μｍの金属メッシュにかけることで小粒子を除いた。分散液をヌッチェでろ過し、４０℃で８時間真空乾燥することで多孔質粒子（１−１）（粒子乾燥質量８．３ｇ）を得た。得られた多孔質粒子（１−１）の体積平均粒径は１４５μｍ、体積平均細孔径は１７１ｎｍ、比表面積は９３ｍ2／ｇであった。
【０１１４】
多孔質粒子（１−１）４．００ｇ、２５％アンモニア水（和光純薬社製）２９．１２ｇ、純水８．００ｇをポリプロピレン容器に添加した。ポリプロピレン容器をインキュベーターシェーカーに入れ、７０℃、４時間、１５０ｒｐｍの条件で振盪した。かかる反応液をろ過し、純水で洗浄した。洗浄した粒子全量と、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸４０．００ｇを別のポリプロピレン容器に添加し、インキュベーターシェーカーに入れ、７０℃、２時間、１５０ｒｐｍの条件で振盪した。続いて、かかる分散液をろ過し、残渣として得られた粒子全量、純水３６ｇ、及びトリエチルアミン（和光純薬社製）４ｇを別のポリプロピレン容器に添加してローターに設置し、３０分、４０ｒｐｍの条件で撹拌した。分散液をろ過し、さらに、純水、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液、エタノールで洗浄ろ過を行った。回収した粒子を４０℃で８時間真空乾燥することで、表面がアミノ化された多孔質粒子（１−２）を得た。
【０１１５】
窒素雰囲気下、多孔質粒子（１−２）４．００ｇ、Ｎα−フェノキシカルボニル−Ｎε−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジン３．８０ｇ、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（和光純薬社製）２０７．２９ｇを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、撹拌翼、及び冷却管を装着して、オイルバスにセットし、１００℃、４時間、１５０ｒｐｍの条件で反応させた。冷却後、かかる分散液を桐山漏斗でろ過し、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、イソプロパノールで洗浄ろ過を行った。回収した粒子を４０℃で８時間真空乾燥することで、表面がＺ基保護ポリ−Ｌ−リジンで修飾された粒子を得た。
上記Ｚ基保護ポリ−Ｌ−リジンで修飾された粒子全量、臭化水素（３０％酢酸溶液）（東京化成社製）１４．２１ｇ、及びトリフルオロ酢酸（和光純薬社製）３０．２４ｇをポリプロピレン容器に添加し、２時間、１５０ｒｐｍの条件でローターにて振盪した。かかる分散液を桐山漏斗でろ過し、純水、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄ろ過を行った。その後、残渣として得られた粒子全量を１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液中に一晩浸漬した後、純水、イソプロパノールで洗浄ろ過を行った。回収した粒子を４０℃で８時間真空乾燥することで、表面がポリ−Ｌ−リジンで修飾された多孔質粒子（１−３）を得た。導入されたポリ−Ｌ−リジン量は９６．０ｍｇ／ｇ−ｂｅａｄｓであった。
【０１１６】
〔実施例２〕
３６０．８９ｇの純水に、ポリビニルアルコール（日本合成化学社製、ＧＨ−２３）２．１７ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム（花王社製  エマール１０Ｇ）０．０３６ｇを添加し、一晩撹拌して水溶液（β）を調製した。さらに重合当日、そのうち１０ｇを別に抜き取った。
次に、４−ビニルベンジルグリシジルエーテル（東レファインケミカル社製）４．１９ｇ、スチレン（日本オキシラン社製）４．１９ｇ、及びジビニルベンゼン（新日鉄住金化学社製）２．１０ｇをジイソブチルケトン（和光純薬社製）２６．３１ｇに溶解させ、有機モノマー溶液を調製した。なお、各モノマーの全質量を１００質量部としたときの、各モノマーの部数は、４−ビニルベンジルグリシジルエーテル４０質量部、スチレン４０質量部、ジビニルベンゼン２０質量部である。
次いで、水溶液（β）のほぼ全量を５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、撹拌翼、及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下、２８０ｒｐｍで撹拌を開始した。２０分後に、上記有機モノマー溶液全量をフラスコ内に加え、更に２０分間撹拌した。続いて、セパラブルフラスコを温水バスにより加温し、内温が７０℃に到達したところで、滴下ロートを用いて２，２'−アゾジイソブチロニトリル（開始剤）（和光純薬社製）１．２３ｇをフラスコに投入し、５時間撹拌を行った。その後さらに、滴下ロートを用いて２，２'−アゾジイソブチロニトリル１．２３ｇをフラスコに投入し、２時間撹拌を行った。
次いで、反応液を冷却したのち、かかる反応液をヌッチェでろ過し、純水とイソプロパノールで洗浄した。洗浄した粒子をイソプロパノールに分散して１２５μｍの金属メッシュにかけることで小粒子を除いた。分散液をヌッチェでろ過し、４０℃で８時間真空乾燥することで多孔質粒子（２−１）（粒子乾燥質量８．８ｇ）を得た。得られた多孔質粒子（２−１）の体積平均粒径は２６９μｍ、体積平均細孔径は４４５ｎｍ、比表面積は９６ｍ2／ｇであった。
【０１１７】
多孔質粒子（２−１）４．００ｇ、２５％アンモニア水（和光純薬社製）２９．１２ｇ、純水８．００ｇをポリプロピレン容器に添加した。ポリプロピレン容器をインキュベーターシェーカーに入れ、７０℃、４時間、１５０ｒｐｍの条件で振盪した。かかる反応液をろ過し、純水で洗浄した。洗浄した粒子全量と、０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸４０．００ｇを別のポリプロピレン容器に添加し、インキュベーターシェーカーに入れ、７０℃、２時間、１５０ｒｐｍの条件で振盪した。続いて、かかる分散液をろ過し、残渣として得られた粒子全量、純水３６ｇ、及びトリエチルアミン（和光純薬社製）４ｇを別のポリプロピレン容器に添加してローターに設置し、３０分、４０ｒｐｍの条件で撹拌した。分散液をろ過し、さらに、純水、５０ｖ／ｖ％エタノール水溶液、エタノールで洗浄ろ過を行った。回収した粒子を４０℃で８時間真空乾燥することで、表面がアミノ化された多孔質粒子（２−２）を得た。
【０１１８】
多孔質粒子（１−２）を多孔質粒子（２−２）に変更する以外は実施例１と同様の手順にて、表面がＺ基保護ポリ−Ｌ−リジンで修飾された粒子を得、さらに表面がポリ−Ｌ−リジンで修飾された多孔質粒子を得た。この多孔質粒子を多孔質粒子（２−３）とする。導入されたポリ−Ｌ−リジン量は１３３ｍｇ／ｇ−ｂｅａｄｓであった。
【０１１９】
〔比較例１〕
窒素雰囲気下、ｎ−ブチルアミン１１ｍｇ（０．１５ｍｍｏｌ）、Ｎα−フェノキシカルボニル−Ｎε−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジン３．００ｇ（７．４９ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（和光純薬社製）１５ｇを、５００ｍＬセパラブルフラスコ内に投入し、温度計、撹拌翼、及び冷却管を装着して、オイルバスにセットし、１００℃、４時間、１３０ｒｐｍの条件で反応させた。冷却後、反応液をジエチルエーテル１Ｌ中に加えて沈殿させ、生じた固体を桐山漏斗でろ別した。回収した固体を４０℃で８時間真空乾燥することで、Ｚ基保護ポリ−Ｌ−リジンを得た。
上記Ｚ基保護ポリ−Ｌ−リジン全量、臭化水素（３０％酢酸溶液）（東京化成社製）２．１０ｇ、及びトリフルオロ酢酸（和光純薬社製）４．２０ｇをガラス容器に入れ、スターラーで２時間撹拌後、冷却した後、反応液をジエチルエーテル１Ｌ中に加えて沈殿させ、生じた固体を桐山漏斗でろ別した。回収した固体を４０℃で８時間真空乾燥することで、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩（Ａ）（以下、単に重合体（Ａ）ともいう）を得た。この反応混合物を、ＮＭＲ定量することにより、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩が得られていることを確認した。ＧＰＣによる平均分子量測定の結果は、Ｍｎ５，４００、Ｍｗ７，４００であった。
【０１２０】
多孔質粒子（１−１）１．００ｇ、重合体（Ａ）０．０７８ｇ、トリエチルアミン（和光純薬社製）０．０７６ｇ及び純水１５．００ｇをポリプロピレン容器に添加した。ポリプロピレン容器をインキュベーターシェーカーに入れ、６０℃、８時間、１５０ｒｐｍの条件で振盪した。かかる反応液を桐山漏斗でろ過し、純水、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。その後、粒子を１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液中に一晩浸漬した後、純水、イソプロパノールで洗浄した。回収した粒子を４０℃で８時間真空乾燥することで、表面がα−ポリ−Ｌ−リジンで修飾された多孔質粒子（１'−Ａ）を得た。導入されたα−ポリ−Ｌ−リジン量は２３．７ｍｇ／ｇ−ｂｅａｄｓであった。
【０１２１】
〔比較例２〕
ｎ−ブチルアミン量を２２ｍｇに変更した以外は比較例１と同様の操作を行い、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩（Ｂ）（以下、単に重合体（Ｂ）ともいう）を得た。この反応混合物を、ＮＭＲ定量することにより、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩が得られていることを確認した。ＧＰＣによる平均分子量測定の結果は、Ｍｎ２，４００、Ｍｗ４，４００であった。
さらに、重合体（Ａ）を重合体（Ｂ）に変更した以外は比較例１と同様の操作を行い、表面がα−ポリ−Ｌ−リジンで修飾された多孔質粒子（１'−Ｂ）を得た。導入されたα−ポリ−Ｌ−リジン量は１２．３ｍｇ／ｇ−ｂｅａｄｓであった。
【０１２２】
〔比較例３〕
ｎ−ブチルアミン量を３３ｍｇに変更した以外は比較例１と同様の操作を行い、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩（Ｃ）（以下、単に重合体（Ｃ）ともいう）を得た。この反応混合物を、ＮＭＲ定量することにより、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素塩が得られていることを確認した。ＧＰＣによる平均分子量測定の結果は、Ｍｎ１，４００、Ｍｗ２，８００であった。
さらに、重合体（Ａ）を重合体（Ｃ）に変更した以外は比較例１と同様の操作を行い、表面がα−ポリ−Ｌ−リジンで修飾された多孔質粒子（１'−Ｃ）を得た。導入されたα−ポリ−Ｌ−リジン量は６．０ｍｇ／ｇ−ｂｅａｄｓであった。
【０１２３】
各実施例及び比較例で得た粒子について分析した結果を以下の表１に示す。なお、粒子表面のポリ−Ｌ−リジンの密度は、以下の式により求めた。
〔密度（ｍｇ／ｍ2）〕＝〔ポリ−Ｌ−リジン結合量（ｍｇ／ｇ−ｂｅａｄ）〕／〔比表面積（ｍ2／ｇ−ｂｅａｄ）〕
【０１２４】
【表１】
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【０１２５】
〔株化細胞を用いた評価〕
＜評価１−１：静置培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の粒子上での細胞増殖＞
低接着ディッシュ（ＳＵＭＩＬＯＮ、２４ウェル）に、実施例１の多孔質粒子（１−３）とヒト間葉系幹細胞株を混ぜて播種し培養したところ、ヒト間葉系幹細胞は粒子に接着して増殖を開始した（図１、Ｄａｙ１）。なお、細胞の増殖のモニタリングは、培養中に粒子を少量サンプリングし、ヘキストで染色して粒子上の細胞核を可視化後、蛍光顕微鏡で観察することで行った。
また、３日後には細胞が目に見えて増殖し（図１、Ｄａｙ３）、５日目や７日目では細胞と粒子が互いにくっつきあって混合塊を形成する様子が観察された（図１、Ｄａｙ５及び７）。０〜７日目に細胞数をカウントした結果を図２に示す。この結果より、本発明の担体は顕著な増殖率を示し、細胞培養用の担体として有効に使用できることが確認された。
【０１２６】
また、実施例２の多孔質粒子（２−３）を使用して上記と同様の試験をしたところ、この多孔質粒子（２−３）に関しても、多孔質粒子（１−３）と同様の結果が得られることが確認された。比較例１〜３の粒子についても同様に、ヒト間葉系細胞の接着と増殖は認められた。
【０１２７】
＜評価１−２：浮遊培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の粒子上での細胞増殖＞
実施例２の多孔質粒子（２−３）１ｍＬと培地５０ｍＬをスピナーフラスコに加え、培地５０ｍＬに懸濁したヒト間葉系幹細胞株（１×１０6細胞）を加えて一晩静置し、翌日、粒子を１ｍＬ採取し、粒子に接着した細胞をヘキストで染色後蛍光顕微鏡を用いて観察した。その後４５ｒｐｍでスピン培養を開始し、播種後７日目、１４日目、２１日目に粒子をＰＢＳで洗浄後Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理により細胞を剥離し、新しい粒子に一定量播種し継代培養を続けた。また、播種後１日目、４日目、７日目、８日目、１１日目、１４日目、１５日目、１８日目、２１日目に粒子を１ｍＬずつ回収しておいた。
その結果、継代培養条件下においてもヒト間葉系幹細胞株は粒子上で増殖する様子が観察された（図３）。
また、実施例１、比較例１〜３の粒子を使用して、上記と同様の試験を行った。
【０１２８】
上記試験の結果、実施例１、２の粒子を使用した場合には、長期間浮遊培養することによって、初期に接着した細胞の数が顕著に増大することが確認された。一例として、浮遊培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の実施例２の粒子上での細胞増殖の様子を図３に示す。
一方で、比較例１〜３の粒子については、長期間浮遊培養しても、培養途中での細胞の脱落により、初期に接着した細胞の増殖が認められなかった。
すなわち、ポリ−Ｌ−リジンを多点結合した比較例１〜３の粒子よりも、ベース粒子上の官能基からポリ−Ｌ−リジンをグラフト重合した実施例１、２の粒子の方が、細胞の接着が良好であった。これらの結果は、粒子表面のポリアミノ酸の結合の様式の違いによるものと考えられる。そこで、同じ量のポリ−Ｌ−リジンを固定化した両結合様式の粒子について比較を行ったところ、やはり多点結合したものよりもグラフト重合したものの方が増殖は良好であった。これは、担体表面上のポリ−Ｌ−リジン主鎖がブラシ状に伸びてより濃密であるとき、細胞が足場としてより認識しやすいためと推察される。
【０１２９】
＜評価１−３：浮遊培養条件下におけるヒト間葉系幹細胞株の粒子上での増殖細胞の定量＞
評価１−２で回収しておいた播種後１日目、４日目、７日目、８日目、１１日目、１４日目、１５日目、１８日目、２１日目の粒子について、Ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理により細胞を剥離し、細胞数をカウントした。
その結果、図４のグラフに示すとおり、細胞継代時に若干細胞のロスが見られるものの、培養開始後３週間にわたり細胞が粒子上で継続的に増殖し、３週間で初期播種量の４９０倍にまで増殖させることができた。
【０１３０】
＜評価１−４：浮遊培養条件で増殖させたヒト間葉系幹細胞株の細胞表面マーカーの発現＞
評価１−２において実施例２の多孔質粒子（２−３）上で浮遊培養した細胞について、培養３週間後に細胞をＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理により回収し、各種ヒト間葉系幹細胞表面マーカーの発現を免疫蛍光染色にて観察した。
その結果、粒子上で継代培養したヒト間葉系幹細胞についてもＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５がいずれも陽性であり、一方、造血幹細胞マーカーであるＣＤ３４やリンパ球マーカーのＣＤ４５は陰性であり（図５）、ヒト間葉系幹細胞特異的な細胞表面マーカーの発現を維持していることが確認された。
【０１３１】
＜評価１−５：浮遊培養条件で増殖させたヒト間葉系幹細胞株の細胞分化能＞
評価１−２において実施例２の多孔質粒子（２−３）上で浮遊培養した細胞について、培養３週間後に細胞をＴｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ処理により回収し、ヒト間葉系幹細胞の分化能である骨分化能と脂肪分化能を評価した。骨分化に関しては、Ｌｏｎｚａ社の骨分化誘導培地にて１５日間分化誘導後、細胞をａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色により評価した。また、脂肪分化に関しては、Ｌｏｎｚａ社の脂肪分化誘導培地にて１７日間分化誘導を行った後、細胞をＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ染色により評価した。
その結果、粒子上で浮遊培養したヒト間葉系幹細胞についても、市販の接着細胞培養用のプラスチックディッシュで培養した細胞と同様に、ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色で陽性の骨芽細胞へと分化し、Ｏｉｌ  ｒｅｄ  Ｏで染色される脂肪細胞にも分化する能力を示したことから（図６）、多孔質粒子（２−３）上での培養により細胞は性状を保ったまま培養可能であることが確認された。
【０１３２】
〔初代培養細胞を用いた評価〕
＜評価２−１：静置培養条件下における初代培養ヒト間葉系幹細胞の粒子上での細胞増殖＞
低接着ディッシュ（ＳＵＭＩＬＯＮ、２４ウェル）に、実施例１の多孔質粒子（１−３）と初代培養ヒト間葉系幹細胞を混ぜて播種し培養した。なお、細胞の増殖のモニタリングは、培養中に粒子を少量サンプリングし、ヘキストで染色して粒子上の細胞核を可視化後、蛍光顕微鏡で観察することで行った。
また、３日後には細胞が粒子に接着して増殖し細胞数が大きくなりはじめ、７日目や１６日目では細胞と粒子が互いにくっつきあって混合塊を形成する様子が観察された（図７）。０〜１６日目に細胞数をカウントした結果を図８に示す。この結果より、本発明の担体は顕著な増殖率を示し、細胞培養用の担体として有効に使用できることが確認された。
【０１３３】
また、実施例２の多孔質粒子（２−３）を使用して上記と同様の試験をしたところ、この多孔質粒子（２−３）に関しても、多孔質粒子（１−３）と同様の結果が得られることが確認された（図９）。比較例１〜３の粒子についても初代培養ヒト間葉系幹細胞の接着と増殖は認められた。
【０１３４】
＜評価２−２：浮遊培養条件下における初代培養ヒト間葉系幹細胞の粒子上での細胞増殖及び増殖細胞の定量＞
ヒト間葉系幹細胞株のかわりに初代培養ヒト間葉系幹細胞を、実施例２の多孔質粒子のかわりに実施例１の多孔質粒子を、それぞれ用いて播種後１０日目、２０日目に観察及び細胞数のカウントを行った以外は、評価１−２、評価１−３と同様の評価試験を行った。
その結果、浮遊培養条件下においても初代培養ヒト間葉系幹細胞は実施例１の多孔質粒子（２−３）上で増殖した（図１０、１１）。
【０１３５】
上記試験の結果、本発明の担体を使用して長期間浮遊培養することによって、初代培養ヒト間葉系幹細胞についても、初期に接着した細胞の数が顕著に増大することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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