(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有し、２価の鉄イオンまたは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化する、バチルス属微生物由来のペクチン酸リアーゼ。
（１）基質特異性  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチ ン、プロトペクチンに作用する。
（２）最適反応pH pH１０〜１０．５（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩 衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（３）最適反応温度  ６０〜６５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム 緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）分子量  ３３．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
【請求項２】
下記の理化学的性質を有し、マンガンイオンで活性を発現する、バチルス属微生物由来のペクチン酸リアーゼ。
（１）基質特異性  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチ ン、プロトペクチンに作用する。
（２）最適反応pH pH１０〜１０．５（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩 衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（３）最適反応温度  ６０〜６５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム 緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）分子量  ３３．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
【請求項３】
下記の理化学的性質を有し、２価の鉄イオンまたは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化する、バチルス属微生物由来のペクチン酸リアーゼ。
（１）基質特異性  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチ ン、プロトペクチンに作用する。
（２）最適反応pH pH１０．５付近及びpH８付近（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナ トリウム緩衝液及びトリス−塩酸緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（３）最適反応温度  ５５〜６０℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム 緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）分子量  ３２．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
【請求項４】
下記の理化学的性質を有し、マンガンイオンで活性を発現する、バチルス属微生物由来のペクチン酸リアーゼ。
（１）基質特異性  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチ ン、プロトペクチンに作用する。
（２）最適反応pH pH１０．５付近及びpH８付近（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナ トリウム緩衝液及びトリス−塩酸緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（３）最適反応温度  ５５〜６０℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム 緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）分子量  ３２．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
【請求項５】
下記の理化学的性質を有し、２価の鉄イオンもしくは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化する、またはマンガンイオンで活性を発現する、バチルス属微生物由来のペクチン酸リアーゼ。
（１）作用  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα    −１，４結合を切断すると共に、非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し、不    飽和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチ    ン、プロトペクチンに作用する。
（３）最適反応pH  pH１０〜１０．５（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩    衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH  pH４〜１１．５（５℃、２４時間処理）
（５）最適反応温度  ６０〜６５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム    緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性  約６０℃（pH７．５、５mM塩化カルシウムまたは塩化マンガンを含む５    ０mMトリス−塩酸緩衝液中、１５分間処理）
（７）分子量  ３３．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
（８）等電点  pH１０．５以上（等電点電気泳動法）
（９）阻害剤  エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤によって阻害される    。
【請求項６】
下記の理化学的性質を有し、２価の鉄イオンもしくは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化する、またはマンガンイオンで活性を発現する、バチルス属微生物由来のペクチン酸リアーゼ。
（１）作用  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα    −１，４結合を切断すると共に、非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合付与し、不飽    和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性  ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチ    ン、プロトペクチンに作用する。
（３）最適反応pH  pH１０．５付近及びpH８付近（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナ    トリウム緩衝液及びトリス−塩酸緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH  pH４〜１２（５℃、２４時間処理）
（５）最適反応温度  ５５〜６０℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム    緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性  約５５℃（pH７．５、５mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩    衝液中、１５分間処理）、約６０℃（pH７．５、５mM塩化マンガンを含む５０mMトリ    ス−塩酸緩衝液中、１５分間処理）
（７）分子量  ３２．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
（８）等電点  pH１０．５以上（等電点電気泳動法）
（９）阻害剤  エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤によって阻害される    。
【請求項７】
（ａ）配列番号１もしくは配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるペクチン酸リアーゼまたは（ｂ）配列番号１もしくは配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、２価の鉄イオンもしくは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化する、またはマンガンイオンで活性を発現する、ペクチン酸リアーゼ。
【請求項８】
バチルス  スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ７（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９８５）またはバチルス  スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１０３（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９８８）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、洗浄剤、繊維処理剤、食品加工剤として有用なペクチン酸リアーゼ及びこれを産生する微生物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ペクチン酸リアーゼ（ＥＣ４．２．２．２）は、１９６２年、バチルス  ポリミキサ（Bacillus polymyxa）及びエルビニア  カルトボラ（Erwinia cartovora）の培養液中に初めて見出された酵素であり、ペクチン酸に対しβ−脱離反応により、α−１，４結合を切断し、非還元末端にＣ４〜Ｃ５不飽和結合を形成し、最適反応pHが８以上であり、活性の発現にカルシウムイオンを必要としている（Starr & Moran., Science, 135, 920-921, 1962）。またカルシウムイオン以外にストロンチウムイオンによっても活性を発現するものも知られている（Chesson & Codner, J. Appl. Bacteriol., 44, 347-364, 1978）。
【０００３】
しかしながら、衣服や装置の洗浄、繊維処理、食品加工等で用いる水には、カルシウムイオン以外に鉄イオン等多くのイオンが存在している。このためカルシウムイオンと他のイオンが併存しても酵素活性が安定したペクチン酸リアーゼが求められていた。また木綿繊維の精練や洗浄には不溶性のペロトペクチンの除去が必要であり、かかるプロトペクチンに対して高アルカリ性で作用できるＡ−タイプのプロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼが求められていた。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、バチルス属に属する微生物から、カルシウムイオン以外のイオンで処理しても活性が安定しており、さらに驚くべきことに２価の鉄イオンまたは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化するペクチン酸リアーゼの単離に成功し、本発明を完成した。
【０００５】
すなわち本発明は、２価の鉄イオンまたは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化する、バチルス属微生物由来のペクチン酸リアーゼを提供するものである。
本発明はまたかかるペクチン酸リアーゼを産生するバチルス属に属する微生物を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
一般にペクチン酸リアーゼはカルシウムイオンで活性を発現するが、本発明のペクチン酸リアーゼは、水に一般に含まれるカルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、２価の鉄イオン、１価の銅イオン、アルミニウムイオン等で処理しても活性が安定であり、さらに２価の鉄イオンまたは２価のパラジウムイオンで処理すると活性化する。ここでイオンで処理して活性が安定または活性化するとは、そのイオンを含有する溶液（緩衝液等）に酵素を添加して特定条件で保持した後の、特定濃度のカルシウムイオン含有溶液中での酵素活性が、該イオンを含有しない溶液で保持した後の酵素活性と比較して、それぞれほとんど差がない場合または高くなる場合をいう。
【０００７】
本発明のペクチン酸リアーゼは、またカルシウムイオン、ストロンチウムイオン以外にマンガンイオンでも活性を発現する。マンガンイオンは洗浄剤中で界面活性剤に作用しないため洗浄力を低下させることがなく、また安価であるため洗浄剤に配合することが可能であり、かかるマンガンイオンで活性を発現する本発明のペクチン酸リアーゼは洗浄剤配合成分として極めて優れたものである。
【０００８】
本発明のペクチン酸リアーゼの例としては、次の酵素学的性質を有するものが挙げられる。
【０００９】
（１）作用              ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に、非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し、不飽和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性        ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチン、プロトペクチンに作用する。
（３）最適反応pH        pH１０〜１０．５（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH            pH４〜１１．５（５℃、２４時間処理）
（５）最適反応温度      ６０〜６５℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性            約６０℃（pH７．５、５mM塩化カルシウムまたは塩化マンガンを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、１５分間処理）
（７）分子量            ３３．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
（８）等電点            pH１０．５以上（等電点電気泳動法）
（９）阻害剤            エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤によって阻害される。
（以下上記性質を有するペクチン酸リアーゼを「Ｐ７酵素」という。）
【００１０】
あるいは次の酵素学的性質を有するものも挙げられる。
【００１１】
（１）作用              ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応によってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に、非還元末端のＣ４〜Ｃ５位に二重結合を付与し、不飽和ジガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニドを生成する。
（２）基質特異性        ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）、酸可溶性ペクチン酸、ペクチン、プロトペクチンに作用する。
（３）最適反応pH        pH１０．５付近及びpH８付近（３０℃、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液及びトリス−塩酸緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（４）安定pH            pH４〜１２（５℃、２４時間処理）
（５）最適反応温度      ５５〜６０℃（pH１０．５、５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中、ペクチン酸を基質とした場合）
（６）耐熱性            約５５℃（pH７．５、５mM塩化カルシウムを含む５０                        mMトリス−塩酸緩衝液中、１５分間処理）、約６０℃（pH７．５、５mM塩化マンガンを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液中、１５分間処理）
（７）分子量            ３２．０±１．０kDa （ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）
（８）等電点            pH１０．５以上（等電点電気泳動法）
（９）阻害剤            エチレンジアミンテトラアセテート等のキレート剤によって阻害される。
（以下上記性質を有するペクチン酸リアーゼを「Ｐ１０３酵素」という。）
【００１２】
本発明ペクチン酸リアーゼは、例えばバチルス属に属するその生産菌を培養した後培養物から採取することにより製造される。ペクチン酸リアーゼ生産菌としては、例えば表１及び表２に示す菌学的性質を有するバチルス  スピーシーズＫＳＭ−Ｐ７株あるいはバチルス  スピーシーズＫＳＭ−Ｐ１０３株が挙げられる。
【００１３】
【表１】

0004025421.tif 000002
【００１４】
【表２】

0004025421.tif 000003
0004025421.tif 000004
【００１５】
以上の菌学的性質について「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」（Williams & Wilkins社、1984年）の記載に準じ検討したところ、Ｐ７株、Ｐ１０３株は双方ともバチルス属に属する菌株であるが、微酸性領域からアルカリ性領域まで生育が可能であり、またこのpH範囲での生育度も良好であることから、従来のバチルス属細菌には該当しない新規な微生物である。そこで本発明菌株であるＰ７株、Ｐ１０３株を工業技術院生命工学研究所にバチルス  スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ７（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８５）、バチルス  スピーシーズ（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１０３（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５９８８）として寄託した。
【００１６】
ＫＳＭ−Ｐ７株、ＫＳＭ−Ｐ１０３株等のペクチン酸リアーゼ生産菌及びこれらの高生産変異株を用いて本発明ペクチン酸リアーゼを生産するには、当該菌株が資化しうる炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すれば良い。
【００１７】
かくして得られた培養液中からのペクチン酸リアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて行うことができる。精製された酵素液は、そのまま或いは公知の方法により精製、結晶化することもできる。また、洗剤用組成物として用いる場合には、培養液を遠心分離後、濃縮、透析した後、噴霧乾燥し、公知の方法により造粒物とすることもできる。
【００１８】
本発明のペクチン酸リアーゼのアミノ酸配列は、例えばＫＳＭ−Ｐ７株またはＫＳＭ−Ｐ１０３株の培養液から染色体ＤＮＡを調製し、例えばＰＣＲ法によりクローニングして得られたペクチン酸リアーゼ遺伝子の塩基配列から決定することができる。
【００１９】
Ｐ７酵素は配列番号１で表わされるアミノ酸配列を有し、Ｐ１０３酵素は配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有する。本発明のペクチン酸リアーゼは、配列番号１または配列番号２で表わされるアミノ酸配列を有するものであるが、２価の鉄イオン、２価のパラジウムイオンで処理すると活性化すれば、該アミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたものでもよい。
【００２０】
配列番号２中、アミノ酸番号９４〜２２８の間で、他の酵素との相同性を検討すると、図５に示すように、アスペルギルス  ニデュランス（Aspergillus nidulans）に由来するペクチン酸リアーゼＰｅｌＡ（Meng-Chen Ho, et al.,Curr.Genet., 27, 142-149, 1995）が最も相同性が高いが、４３．９％の相同性があるにすぎない。従って、本発明酵素のアミノ酸配列のアミノ酸番号９４から２２８の間で適切にアライメントした時、これら以上の相同性がある酵素は、本発明に含まれる。すなわち、本発明酵素のアミノ酸配列の相同性は、配列番号２におけるアミノ酸番号９４〜２２８に対して４５％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。
【００２１】
また、配列番号２中、アミノ酸配列１〜３０２の間で、他の酵素との相同性を検討すると、グロメレラ  シングラタ（Glomerella cingulata）（GenBank 登録No. GCU32942）に由来するペクチン酸リアーゼが最も相同性が高いが、アミノ酸番号１４〜２８７間において３９．９％の相同性があるにすぎない。従って、本発明酵素のアミノ酸配列のアミノ酸番号１４から２８７の間で適切にアライメントした時、これら以上の相同性がある酵素は、本発明に含まれる。すなわち、本発明酵素のアミノ酸配列の相同性は、配列番号２におけるアミノ酸番号１４〜２８７に対して、４０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。
【００２２】
かくして得られる本発明のペクチン酸リアーゼの一例であるBacillus sp. ＫＳＭ−Ｐ７株及びＫＳＭ−Ｐ１０３株由来のペクチン酸リアーゼを電気泳動的に均一に精製した酵素標品は、以下に示すような理化学的性質を有する。なお、酵素活性は次のように測定した。
【００２３】
〔標準酵素活性測定法〕
試験管に０．２mlの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．１mlの４mM塩化カルシウム溶液、０．２mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Lot 14482、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）及び１．４mlの脱イオン水を加え、３０℃で５分間恒温した後、０．１mlの酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を添加し反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２mlの５０mM塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和ポリガラクツロニド量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００（Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838-845, 1966）を用いて求めた。なお、盲検は酵素液を加えずに処理した反応液に２mlの５０mM塩酸を加え、その後に０．１mlの酵素液を添加したものを用いた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和ポリガラクツロニドを生成する量とした。
【００２４】
〔還元糖の定量による酵素活性測定法（ＤＮＳ法）〕
試験管に０．１mlの０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）、０．１mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロン酸水溶液（ＩＣＮ社製：Lot 14482、水酸化ナトリウム溶液にてpH６．８に調整したもの）、０．０５mlの４mM塩化カルシウム溶液、０．７mlの脱イオン水及び０．１mlの酵素液（希釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液、pH７．５により行った）を添加し３０℃で反応を開始した。１５分間恒温した後１mlのＤＮＳ溶液（０．５％ジニトロサリチル酸、３０％ロッシェル塩、０．１６％水酸化ナトリウムから成る水溶液）を加え反応を停止した。これを沸水浴中で５分間加熱した後、氷水中で冷却し４mlの脱イオン水を加え十分攪拌し、遠心分離（３０００×ｇ，５分）した上清の５３５nmにおける吸光度を測定した。なお、盲検は酵素液を加えずに処理した反応液に１mlのＤＮＳ溶液を加え、その後に０．１mlの酵素液を添加したものを同様に処理し、用いた。酵素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol のガラクツロン酸相当の還元糖を生成する量とした。
【００２５】
〔Bacillus sp. ＫＳＭ−Ｐ７株のペクチン酸リアーゼの特性〕
（１）最適反応pH
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９．５）、またはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．０〜１１．０）を用いて３０℃で最適反応pHを調べたところ、Ｐ７酵素はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応速度が高く、pH１０．０〜１１．０の範囲内においても最高活性の７０％以上の相対活性を示した。さらにトリス−塩酸緩衝液中においてpH７．５で一つの活性ピークを示したがその活性は最高活性の約５０％であった（図１）。
【００２６】
（２）pH安定性
５０mM各種緩衝液（酢酸緩衝液、pH４．０〜６．０；リン酸緩衝液、pH６．０〜８．０；トリス−塩酸緩衝液、pH７．０〜９．０；ホウ酸緩衝液、pH９．０〜１１．０；塩化カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、pH１１．５〜１３．０）中にＰ７酵素を添加し５℃、２４時間恒温した後、２倍希釈した酵素液を用い標準酵素活性測定法にて残存活性を調べた。その結果、Ｐ７酵素は、pH４．０〜１２．０の範囲で極めて安定であった。さらにＰ７酵素はリン酸緩衝液中で恒温しただけで処理前の活性に比べて２０〜３０％の活性化が起こることが判明した。なお、本酵素の安定性にはカルシウムイオン、マンガンイオンは全く関係のないことも判った。
【００２７】
（３）最適反応温度
５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中にて２０℃〜７５℃の各温度で酵素反応を行い最適反応温度を調べた。その結果、Ｐ７酵素は、試験温度範囲において作用し、その最適反応温度は６０〜６５℃であった。
【００２８】
（４）耐熱性
５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）に５mMの塩化カルシウムまたは塩化マンガンを添加した系及び無添加系を用意し、Ｐ７酵素を加えて３０℃〜８０℃の各温度で１５分間放置した。その後氷水中で急冷し、１０倍に希釈した酵素液を用い標準酵素活性測定法にて残存活性を調べた。その結果、Ｐ７酵素は５５℃まで安定であった。さらにカルシウムイオン、マンガンイオンには安定化効果が認められ６０℃まで安定であった。このようにカルシウムイオン、マンガンイオンによる耐熱性の向上に関しては従来のペクチン酸リアーゼでは全く知られていない事象である。
【００２９】
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド電気泳動法（１５％ゲル）により、Ｐ７酵素の分子量は約３３±１kDa と見積られた。なお、標準タンパク質としてバイオラッド社製のSDS-PAGE Molecular Weight Standards, Low Rangeを用いた。
【００３０】
（６）等電点
pH８〜１０．５のアンフォライン（ファルマライト、ファルマシア社製）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用いた等電点電気泳動法で測定した結果、Ｐ７酵素の等電点はpH１０．５以上であった。
【００３１】
（７）アミノ末端配列
Ｐ７酵素をPro Sorbフィルター（パーキンエルマー社製）にブロッティングし、プロテインシークエンサー（６７４型、アプライドバイオシステム社製）を用いてアミノ末端配列を２０番目のアミノ酸まで決定した結果、ＡＮＦＮＱＱＧＦＳＴＬＮＧＧＴＴＧＧＥＧであった。
【００３２】
（８）基質特異性
ポリガラクツロン酸の代りにエステル化度の異なるペクチンを基質とした場合の反応速度を標準酵素活性測定法を用いて調べた。Ｐ７酵素は、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社製、Lot 14482）に対し最も反応性が高く、この反応速度を１００％とした時、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を用いた場合その相対反応速度は６２％であった。エステル化度が３１％、６３％、９３％と高くなるにつれて相対反応速度は５７％、２３％、５％と減少していくが、分解作用を示した。
またWardとFogarty の方法（J. Gen. Microbiol., 73, 439-446, 1972）に従い調製した酸可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、Ｐ７酵素はペクチン酸に対する反応速度の約１．４倍の反応速度で分解した。
次に基質として品質管理用作業手袋（４０スムス晒指付き・綿、中田久吉商店製）を細かく裁断（１〜２mm四方）した木綿繊維片１０mg〔１％（ｗ／ｖ）〕を０．４mM塩化カルシウムを含む５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．５）中に懸濁しＰ７酵素を添加した後、３０℃、６０分間反応させた。反応液を遠心分離し上澄液中に遊離したペクチンをカルバゾール硫酸法により定量した（Sakai, T., Methods Enzymol., 161, 335-350, 1988）。その結果、０．１ＵのＰ７酵素を用いた場合１０mgの木綿繊維あたりガラクツロン酸として１０〜１５μｇのペクチン遊離量が認められた。このことは、Ｐ７酵素が木綿繊維表面のプロトペクチンに対して作用していることを示唆し、さらに上澄液中の２３５nmにおける吸光度の上昇が認められたことから、Ｐ７酵素はＡタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有していることが判った。
またペクチン酸を基質にした時の反応液を経時的に分取し、薄層クロマトグラフィーにより反応生成物を展開した〔展開液、ｎ−ブタノール／酢酸／脱イオン水、５／２／３（ｖ／ｖ）〕。風乾後、アニスアルデヒド硫酸試薬により生成物を検出した結果、不飽和ジガラクツロニドを主成分とし不飽和モノガラクツロニドから不飽和テトラガラクツロニドが検出されたこのことからＰ７酵素はペクチン酸をエンド型で分解していることが示唆された。
【００３３】
（９）金属イオンの影響
Ｐ７酵素を５mMのＥＧＴＡ〔エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）四酢酸〕を含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）中にて３０℃、３０分間処理した後、１００倍に希釈した酵素液を用い０．２mMの各種金属塩を添加した系にて酵素反応を行った。その結果、Ｐ７酵素はカルシウムイオンの他にストロンチウム、マンガンの各イオンを添加した場合に活性が発現された。カルシウムイオン添加時の反応速度を１００とした場合、ストロンチウムイオンでは８８％、マンガンイオンでは６６％の相対反応速度を示し、他には鉛イオンで４０％の相対反応速度を示した（表１）。マンガンイオンによる活性発現はその濃度に依存し０．４mM以上添加した場合、カルシウムイオン添加による反応速度を大幅に超える傾向を示した（図２）。なお図２はカルシウムイオン０．２mMの場合に対する活性を相対活性（％）とした。
【００３４】
【表３】
0004025421.tif 000005
【００３５】
次に各種金属塩５mMを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）中にＰ７酵素を添加し３０℃、１５分間恒温した後、１００倍に希釈した酵素液を用い標準酵素活性測定法にて残存活性を測定した（表２）。その結果、本酵素は３価の鉄イオンを除く殆どの金属イオンに対し非常に安定であるとともに２価の鉄イオンあるいは２価のパラジウムイオンによって無添加処理に比べ１５０％、１２７％とそれぞれ活性化されることが明らかとなった。
【００３６】
【表４】
0004025421.tif 000006
【００３７】
（１０）各種化合物の影響
Ｐ７酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響を調べた。初めに各化合物を反応液に加えて酵素反応を行い、ＤＮＳ法により活性測定したところ、１０mM  ＥＤＴＡ、１０mM  ＥＧＴＡにより完全に反応は阻害された。このことはＰ７酵素がカルシウム、ストロンチウム、マンガン等の金属イオンを反応に必要としていることからも明らかである。また、２，３ブタンジオン（５mM）により約５０％、Ｎ−ブロモスクシイミド（０．１mM）により約２５％、２−ヒドロキシ５−ニトロベンジルブロミド（５mM）によって約１７％それぞれ活性が阻害された。
【００３８】
次に各化合物を含む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）にＰ７酵素を添加し３０℃、１５分間恒温した後、１００倍に希釈した酵素液を用い標準活性測定法にて残存活性を測定した。その結果、Ｐ７酵素は多くの化合物に対して安定であったが、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド（５mM）により処理した場合約９５％、Ｎ−ブロモスクシイミドで約６０％（０．１mM）、１００％（１mM）とそれぞれ著しく阻害された。この方法でのキレート剤による阻害は完全に回復した。
【００３９】
〔Bacillus sp. ＫＳＭ−Ｐ１０３株のペクチン酸リアーゼの特性〕
（１）最適反応pH
Ｐ７酵素と同様にして最適反応pHを調べたところ、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５中で最も反応速度が高く、pH１０．０〜１１．０の範囲内において最高活性の６０％以上の相対活性を示した。さらにトリス−塩酸緩衝液中においてもpH８．０で一つの活性ピークを示し、その活性は最高活性の８５％であった。またpH７．５〜８．５の範囲で７５％以上の相対活性を示した（図３）。Ｐ７酵素に比べトリス−塩酸緩衝液中における反応速度が高いこともＰ１０３酵素の特徴である。
【００４０】
（２）pH安定性
Ｐ７酵素と同様にしてＰ１０３酵素のpH安定性を調べた結果、pH４．０〜１２．０の範囲で極めて安定であった。さらに驚くことにＰ１０３酵素はリン酸緩衝液中で恒温しただけで処理前の活性に比べて４０〜５０％の活性化が起こることが判明した。なお、本酵素の安定性にはカルシウムイオン、マンガンイオンは全く関係のないことも判った。
【００４１】
（３）最適反応温度
Ｐ７酵素と同様にＰ１０３酵素の最適反応温度を調べた結果、５５〜６０℃であった。
【００４２】
（４）耐熱性
Ｐ７酵素と同様にＰ１０３酵素の耐熱性を調べた結果、５０℃まで安定であった。カルシウムイオンを添加した系においては若干耐熱性の向上が認められ、５５℃まで安定であった。さらに、マンガンイオンには安定化効果が認められ６０℃まで安定であった。このようにカルシウムイオン、マンガンイオンによる耐熱性の向上に関しては従来のペクチン酸リアーゼでは全く知られていない事象である。
【００４３】
（５）分子量
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド電気泳動法（１５％ゲル）で測定した結果、Ｐ１０３酵素の分子量は約３２±１kDa と見積られた。
【００４４】
（６）等電点
Ｐ７酵素の場合と同様に測定した結果、Ｐ１０３酵素の等電点はpH１０．５以上であった。
【００４５】
（７）アミノ末端配列
Ｐ７酵素の場合と同様に配列した結果、Ｐ１０３酵素のアミノ末端配列は、ＡＮＦＮＱＱＧＦＳＴＬＮＧＧＴＴＧＧＥＧであった。
【００４６】
（８）基質特異性
Ｐ１０３酵素はＰ７酵素と同様に、ポリガラクツロン酸（ＩＣＮ社製、Lot 14482）に対し最も反応性が高く、同じポリガラクツロン酸（シグマ社製、Lot 122H3780）を用いた場合その相対反応速度は７９％であった。エステル化度が３１％、６３％、９３％と高くなるにつれて相対反応速度は５７％、１７％、４％と減少していくが、分解作用を示した。
また可溶性ペクチン酸を基質として用いた場合、Ｐ１０３酵素はペクチン酸に対する反応速度の約１．４倍の反応速度で分解した。
次に、０．１ＵのＰ１０３酵素を用いた場合１０mgの木綿繊維（裁断した品質管理用作業手袋）あたりガラクツロン酸として１５〜２０μｇのペクチン遊離量が認められた。さらに上澄液中の２３５nmにおける吸光度の上昇が認められたことから、Ｐ１０３酵素はＡタイプに属するプロトペクチナーゼ活性を有していることが判った。
またペクチン酸を基質にした反応生成物はＰ７酵素と同様であり、Ｐ１０３酵素はペクチン酸をエンド型で分解していることが示唆された。
【００４７】
（９）金属イオンの影響
Ｐ７酵素と同様に金属イオンの影響を調べた結果、Ｐ１０３酵素はカルシウムイオンの他にストロンチウム、マンガンの各イオンを添加した場合に活性が発現された。カルシウムイオン添加時の反応速度を１００とした場合、ストロンチウムイオンでは１１５％、マンガンイオンでは７８％の相対反応速度を示し、他には鉛イオンで４４％の相対反応速度を示した（表１）。マンガンイオンによる活性発現はその濃度に依存し０．４mM以上添加した場合、カルシウムイオン添加による反応速度を大幅に超える傾向を示した（図４）。
【００４８】
Ｐ７酵素と同様にＰ１０３酵素の各金属塩における安定性を調べた結果、本酵素は３価の鉄イオンを除く殆どの金属イオンに対し非常に安定であるとともに２価の鉄イオンあるいは２価のパラジウムイオンによって無添加処理に比べ１９６％、１２０％とそれぞれ活性化されることが明らかとなった（表２）。
【００４９】
（１０）各種化合物の影響
Ｐ１０３酵素の活性に及ぼす各種化合物の影響をＰ７酵素と同様に調べたところ、１０mM  ＥＤＴＡ、１０mM  ＥＧＴＡにより反応は完全に阻害された。このことはＰ１０３酵素がカルシウム、ストロンチウム、マンガン等の金属イオンを反応に必要としていることからも明らかである。また、２，３−ブタンジオン（５mM）により約４０％、Ｎ−ブロモスクシイミド（０．１mM）により約１７％それぞれ活性が阻害された。
【００５０】
Ｐ７酵素と同様にＰ１０３酵素の各化合物に対する安定性を調べた。その結果、Ｐ１０３酵素は多くの化合物に対して安定であったが、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド（５mM）により処理した場合約８７％、Ｎ−ブロモスクシイミドで約６０％（０．１mM）、１００％（１mM）とそれぞれ著しく阻害された。この方法でのキレート剤により阻害は完全に回復した。
【００５１】
このように本発明のＰ７及びＰ１０３ペクチン酸リアーゼは、プロトペクチナーゼ活性を有するＡタイプの酵素であり、その最適反応pHはpH１０．０〜１０．５にあり、反応にカルシウムイオンのみならずストロンチウムイオン、マンガンイオン等も必要とし活性を発現することができる。また２価の鉄イオン、２価のパラジウムイオンにて処理を行うことで活性化する酵素である。これらの性質を有する本発明酵素は、以上の点で従来より知られているErwinia属、Bacillus属、Pseudomonas属、Streptomyces属、Fusarium属、Aspergillus属、Amycolata属等の生産するペクチン酸リアーゼと大きく異なっている。
【００５２】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を説明する。
【００５３】
実施例１    ペクチン酸リアーゼ生産菌のスクリーニング
日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは当研究室保存菌株をポリガラクツロン酸を含有する寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養を行った。菌が生育した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶液（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を流し込み１０分間静置した。コロニーの周辺に溶解斑を形成した菌を選抜してペクチン酸リアーゼ生産菌として保存し、粗酵素を調製し種々の評価に供した。その結果、アルカリペクチン酸リアーゼ生産菌としてバチルス
スピーシーズ  ＫＳＭ−Ｐ７株及びＫＳＭ−Ｐ１０３株を得た。
【００５４】
実施例２    ＫＳＭ−Ｐ７株及びＫＳＭ−Ｐ１０３株の培養
上述のスクリーニングにより得られたバチルス  スピーシーズ  ＫＳＭ−Ｐ７株またはバチルス  スピーシーズ  ＫＳＭ−Ｐ１０３株の培養は、坂口フラスコに５０mlの液体培地を加えて３０℃、２日間振盪することにより行った。培地組成は、３％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．５％酵母エキス、１％魚肉エキス、０．１５％リン酸２カリウム、０．００１％塩化カルシウム、０．５％ペクチン、０．５％炭酸ナトリウムとした。
【００５５】
実施例３    ＫＳＭ−Ｐ７株及びＫＳＭ−Ｐ１０３株産生ペクチン酸リアーゼの精製
バチルス  スピーシーズ  ＫＳＭ−Ｐ７株あるいはＰ１０３株の培養液を遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分、４℃）し、その上澄液（９００ml）に硫酸アンモニウムを６５％飽和となるように徐々に添加した。５℃で一昼夜放置した後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分、４℃）を行い沈殿物を回収した。これを少量の基本緩衝液〔１mM塩化カルシウムを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）〕に溶解し、同緩衝液に対して一昼夜透析を行った。得られた透析内液（１０５ml）をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＤＥＡＥ−Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラム（２．５×１６cm）へ添着した。基本緩衝液にて洗浄溶出される画分に活性が認められ、これを集めた。次にこの非吸着画分をあらかじめ基本緩衝液にて平衡化しておいたＣＭ−Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）カラム（２．５×２２cm）へ添着した。約３００mlの基本緩衝液にて洗浄溶出を行った後、０から０．１Ｍの塩化カリウムを含む基本緩衝液（４００mlずつ）を用いた濃度勾配溶出法により、吸着タンパク質を溶出させた。Ｐ７及びＰ１０３ペクチン酸リアーゼは７０〜８０mM付近の塩化カリウム濃度で単一ピークとして溶出され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ並びにＴａｂｅｒ法によるＰＡＧＥにおいても均一なタンパク質として検出された。これらの画分を集め限外濾過（ＹＭ３メンブレン、アミコン社製）にて濃縮し、２０％グリセロール液として−２０℃にて凍結保存した。上記の操作により得られた精製Ｐ７酵素の場合、活性収率は約２５％、精製倍率は約１８０倍であった。一方、精製Ｐ１０３酵素の場合、活性収率は約４２％、精製倍率は約５００倍であった。
【００５６】
実施例４
実施例２で得られたＫＳＭ−Ｐ１０３株の培養液を遠心して菌体を回収し、Saito とMiura の方法（Biochim. Biophys. Acta、72, 619-629, 1963）で染色体ＤＮＡを調製した。次いで実施例３の精製酵素のアミノ末端配列（前記アミノ末端配列の項参照）及びペクチン酸リアーゼ保存領域アミノ酸配列からプライマーを合成し、上記染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲで増幅した。精製後プラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に導入してクローン化した。次にＰＣＲ増幅断片の上流及び下流領域をインバースＰＣＲで増幅した。ダイレクトシークエンスによってこのＤＮＡ断片及び上記プライマーの配列決定を行い、Ｎ−末端アミノ酸配列から終止コドン（ＴＡＡ）の前のアミノ酸までの３０２アミノ酸からなるＰ７酵素のアミノ酸配列を決定した（配列番号１）。同様の方法によりＰ１０３酵素のアミノ酸配列を決定した（配列番号２）。
【００５７】
【発明の効果】
本発明ペクチン酸リアーゼは、カルシウム、ストロンチウムのみならずマンガンイオンによって活性を発現し、さらに２価の鉄イオン、２価のパラジウムイオンで活性化することができ、アルカリ条件下で優れた活性を有し、衣料用、漂白剤用、食器洗浄用さらには植物性繊維の精練等への使用が可能である。
【００５８】
【配列表】
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【００５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐ７酵素のpH活性曲線を、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５における活性に対する相対値で示したものである。
【図２】Ｐ７酵素活性に及ぼす金属イオン濃度の影響を、カルシウムイオン濃度０．２mMにおける活性に対する相対値で示したものである。
【図３】Ｐ１０３酵素のpH活性曲線を、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH１０．５における活性に対する相対値で示したものである。
【図４】Ｐ１０３酵素活性に及ぼす金属イオン濃度の影響を、カルシウムイオン濃度０．２mMにおける活性に対する相対値で示したものである。
【図５】配列番号２中、他の酵素との相同性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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