(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
大豆モラセス出発材料からイソフラボンを分離する方法であって、
（ａ）大豆モラセス出発材料を、摂氏７０度から摂氏９０度の範囲の一定の温度まで加熱する段階と、
（ｂ）段階（ａ）の加熱した出発材料を、回収対象の前記イソフラボンを通過させる排除限界を有する限外ろ過膜を通過させて、透過液及び保持液を得る段階と、
（ｃ）透過液から前記イソフラボンを回収する段階と
を含む方法。
【請求項２】
前記限外ろ過膜は、ポリスルホン製である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大豆モラセス出発材料は、摂氏８０度に加熱されて、ポリスルホン製の前記限外ろ過膜を通過させられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｃ）の透過液からイソフラボンを回収する段階は、
（ｃ１）吸着性樹脂で透過液を処理する段階と、
（ｃ２）段階（ｃ１）の樹脂を水中で洗浄する段階と、
（ｃ３）段階（ｃ２）の洗浄した樹脂から吸着されたイソフラボンを水アルコール溶媒で溶出する段階と
を含む請求項１，２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記段階（ａ）における前記大豆モラセス出発材料は、摂氏８５度の開始高温に加熱され、
前記回収する段階（ｃ）は、
（ｃ１′）段階（ｂ）の限外ろ過透過液を、常に攪拌しながら、摂氏８５度の前記開始高温から摂氏２２度の低温まで徐々に冷却する段階と、
（ｃ２′）冷却した段階（ｃ１′）の透過液を、段階（ｃ２′）で作成されるイソフラボン沈殿物が形成されるに十分な時間、９００ｘｇで遠心分離する段階と、
（ｃ３′）上清を廃棄する段階と、
（ｃ４′）沈殿物を水で希釈する段階と、
（ｃ５′）残っている上清を排除するために、段階（ｃ４′）の希釈した沈殿を９００ｘｇで再度遠心分離する段階と、
（ｃ６′）再度遠心分離した段階（ｃ５′）の沈殿を乾燥させる段階と
を含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記回収する段階（ｃ）は、前記透過液を冷却してゲニスチンの結晶化を促進し、前記冷却した透過液を遠心分離またはろ過することによりゲニスチンを分離することにより行なわれる請求項１，２又は３に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｂ）の膜に作用する保持液の背圧を、前記限外ろ過の継続中に前記透過液の流量を調節するために、調節することを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脱脂大豆フレークの水アルコール溶媒抽出物を処理することによる高イソフラボンプロセスストリームの製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イソフラボンは、植物フラボノイドのある独特な種類で、植物界でも限られた分布を示し、物理的特徴については無色透明の結晶性ケトン類となる。これらのイソフラボンの食事からの最も一般的かつ重要な摂取源は、大豆であり、大豆には以下の１２種類のイソフラボン異性体が含有される。すなわち、ゲニステイン、ゲニスチン、６”−Ｏ−マロニルゲニスチン、６”−Ｏ−アセチルゲニスチン；ダイドゼイン、ダイドジン、６”−Ｏ−マロニルダイドジン、６”−Ｏ−アセチルゲニスチン；グリシテイン、グリシチン、６”−Ｏ−マロニル、６”−Ｏ−アセチル（Ｋｕｄｏｕ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５５，２２２７−２２３３）。大豆イソフラボンの９７から９８パーセントは、グリコシル化された形態である。
【０００３】
米国の市場で入手できる大豆食品の数が限定されているために、伝統的に、食事性イソフラボンの量を増加させるために大豆食品を使用することには制限があった。
【０００４】
イソフラボンであるゲニスチンは、１９３１年にＷａｌｚにより大豆食品より始めて単離され（Ｊｕｓｔｕｓ  Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ  ４８９，１１８）、後に１９４１年にＷａｌｔｅｒにより確認された（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６３，３２７３）。これまでに特許で記載されたものには、高イソフラボン大豆たんぱく製品の製造について（ＷＯ  ９５／１０５１２；ＷＯ９５／１０５２９；  ＷＯ  ９５／１０５３０）、マロン酸ゲニスチンおよびマロン酸ダイドジン（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，１４１，７４６）、イソフラボンを含有する医薬品型成分（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  ５，４２４，３３１；４，８８３，７８８）、テンペーからのイソフラボンの単離および修飾（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔｓ  ４，３９０，５５９；４，３６６，２４８；４，３６６，０８２；４，２６４，５０９；４，２３２，１２２；４，１５７，９８４）がある。しかし、本発明は、脱脂大豆フレークのエタノール抽出物から得られる、広範な大豆イソフラボンまたは高度に精製されたゲニスチンを含有する高イソフラボン製品の製造に関する。
【０００５】
冠心臓疾患（ＣＨＤ）は、特に米国および他の先進国において、死因のトップであることより、総およびＬＤＬコレステロールの値が高いことは人の健康に悪影響を及ぼす重要なリスク・ファクターである。人において、平均摂取値として１日あたり４７グラムの大豆たんぱく質をとった場合、大豆たんぱく製品が、血清中総コレステロール値を平均で約９．３％、低密度リポプロテイン（ＬＤＬ）コレステロール値を平均で１２．９％低下させるようである（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＥＪＭ，３３３；２７６−２８２，１９９５）。
【０００６】
イソフラボン（フィトエストロゲン）は、大豆たんぱく製品中のある化合物の種類で、動物において少なくともこのコレステロール低下作用の一部を担うことが示されている（Ｓｅｔｃｈｅｌｌ，ｉｎ  ＭｃＬａｃｈｌａｎ  ＪＡ，ｅｄ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ＩＩ：６９−８５，１９８５）。更に、霊長類での研究から、大豆イソフラボンが、大豆たんぱく質の血中コレステロール低下作用の約６０から７０％までを担っている可能性を示唆している（Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：Ｓｕｐｐｌ：Ｉ−２３５．（ａｂｓｔｒａｃｔ），１９９４；  Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．，１２５：Ｓｕｐｐｌ  ３Ｓ：８０３Ｓ−８０４Ｓ．（ａｂｓｔｒａｃｔ），１９９５；Ａｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９１：９２５．（ａｂｓｔｒａｃｔ），１９９５）。
【０００７】
また、イソフラボンが、ある種のガンの予防において作用を有することが示唆されている。イソフラボンを多く含む食事を摂取する日本人女性では、乳ガンの発生率が非常に低いようである（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５：７５７Ｓ−７７０Ｓ，１９９５）。大豆製品はまた、ラットの乳ガンモデルにおいて、乳房腫の形成を減少させ、または乳房腫の進行を防止することが示されている（Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３４７：２３９−２５３；  Ｈａｗｒｙｌｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２１：１６９３−１６９８，１９９１）。ゲニステインは、プロテイン・チロシン・キナーゼを阻害し（Ａｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：５５９２−５５９５，１９８７）、血管形成を阻害し（Ｆｏｔｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２６９０−２６９４，１９９３）、数種類の悪性細胞株において分化を誘導すること（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５：７８４Ｓ−７８９Ｓ，１９９５）が示されており、これらはいずれもガンの出現において重要なリスク・ファクターとなる可能性がある。ゲニステインおよびグリシテイン（Ｂｉｏｃｈａｎｉｎ  Ａ）はまた、試験管内で、アンドロジェン依存性および非依存性の前立腺ガン細胞の生長を阻害するようである（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂａｒｎｅｓ，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２２：３３５−３４５，１９９３）。ゲニステインは、抗酸化剤として作用する可能性がある（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｔｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０：１−１２，１９９３）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このように、本発明の目的は、イソフラボンを栄養補助剤またはもっと伝統的な形態の食品の材料として摂取する簡便な方法を提供することである。
【０００９】
人の疾病予防において、イソフラボン、そして特にゲニステイン、のおそらくはプラスの作用を鑑み、本発明の目的は、ゲニステインのグリコン形などの精製された形態のゲニスチンを、後に追加的な精製段階としての再結晶処理を実施または実施しないで、単離することである。
【００１０】
他の目的は、人の食事補強のためのイソフラボン製品を与えるためまたは、食品または食品材料を補強するための、全ての種類の大豆イソフラボンを多量に含有する製品を生み出すことである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明のある側面に一致し、選択されたイソフラボンは、水溶液中のイソフラボンの溶解性の差異に基づいて抽出される。アルコールは、脱脂大豆フレークの抽出物から蒸発により除去される。次に、可溶性イソフラボンを他の可溶性物質および不溶性の材料から分離するために、残留した水溶液を高温にて限外ろ過（ＵＦ）にかける。可溶性イソフラボンを含有するＵＦ透過液は、二つのうちのいずれかの方法で処理される。１）広範囲のイソフラボン異性体を回収すると同時に可溶性糖類と塩類を除去するために、透過液を吸着性樹脂で処理する、または２）ゲニスチンの結晶化を促進するために、透過液を冷却する。次いで遠心分離またはろ過により、高度に精製されたゲニスチンを単離する。このゲニスチンは、水アルコール溶媒からのさらなる再結晶によりさらに精製することもできる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明は、水溶液中のイソフラボンの溶解度の差異に基づく方法を使用する。ゲニスチンは、イソフラボン・グリコシド類の中で最も水に溶解しにくく、冷水には不溶で、熱水に僅かに溶解するのみである（図１）。
【００１３】
さらに詳細には、ゲニスチンの溶解度は、摂氏４度から摂氏５０度まで温度が上昇しても殆ど変化せず、摂氏７０度から摂氏９０度に温度が上昇すると急速に溶解度が増大することを図１は示している。したがって、ゲニスチンを回収するための製造プロセスの場合、回収処理は、目盛りの最も高温側で実施すべきである。
【００１４】
ゲニスチン以外のイソフラボングリコシドは全て、水への溶解度が高く、他の可溶性成分とともに限外ろ過を容易に透過する。限外ろ過に先立ち水溶液の温度を上昇させることにより、ゲニスチンおよび他のすべてのイソフラボンを不溶性成分から分離することができる。限外ろ過透過液中のイソフラボンは、溶液を樹脂で処理し、樹脂を水で洗浄して可溶性糖類を除去し、エタノールと水の混合液でイソフラボンを溶出することにより、回収できる。
【００１５】
発明によるプロセスのための出発材料は、ヘキサン脱脂大豆フレークの水エタノール溶媒抽出物から得られる。脱脂大豆フレークを、水エタノール溶媒（容積で約６０〜８０％エタノール）を用いて、およそ摂氏４４度から摂氏６３度または華氏１２０から１５０度の範囲の温度で抽出する。次に、エタノールを除去するために、この水エタノール溶媒抽出物を減圧蒸留で処理する。アルコールを除去した抽出物は、「大豆モラセス」または「大豆可溶物」として知られている。
【００１６】
次にこの抽出物を適当な範囲内の温度（摂氏約６５から９５度）に調整し、好ましくは分子量１００００を排除限界とする（ＭＷＣＯ）膜を使用して、限外ろ過処理する。しかし、所望のイソフラボンのろ過を可能とするどんな膜でも使用できることから、本プロセスは排除限界（ＭＷＣＯ）分子量１００００の膜に限定されるものではない。本発明による方法に適当な最小の排除限界の膜は、分子量５３０を透過させるものでなくてはならず、適切に不溶性成分を保持し、イソフラボンを通過させるものである。
【００１７】
二種類の主要なイソフラボン、ダイドジンおよびゲニスチンの、限外ろ過透過液中の濃度に対する温度の影響を図２に示す。温度が低いと、限外ろ過透過液中のゲニスチン濃度が低下する。ダイドジン濃度は、温度による影響をずっと受けにくい。限外ろ過透過液中のイソフラボンを最適な濃度にするために、摂氏６５度を超える温度で限外ろ過を行う必要がある。
【００１８】
例えば、図２は、限外ろ過処理する水溶液透過液中のダイドジンとゲニスチンの濃度の間の差を示す。摂氏２４度で限外ろ過を行うと、ダイドジン濃度が高く、ゲニスチン濃度が低くなる。したがって、ダイドジンを回収し、ゲニスチンを排除する製造プロセスの場合、透過液中のゲニスチンの量に基づいて抽出温度は選択できるであろうが、おそらく、回収は摂氏２４度の比較的低温で実施する必要がある。一方、ダイドジンとゲニスチンの両方を回収するための製造プロセスの場合、おそらく約摂氏７８度の交差点で操作するのが良いであろう。ゲニスチンについては、回収はより高い温度でおこなう必要がある。
【００１９】
製造プロセスの一例を説明するフロー・ダイアグラムを図３に示す。
【００２０】
さらに詳細には、２０において、好ましい出発材料が２２で限外ろ過処理される大豆モラセスであることを、図３は示している。２４で、限外ろ過の保持液はさらに加工、リサイクルされ、または別のプロセスで使用される。
【００２１】
バッチ型のプロセスを採用する場合、限外ろ過保持成分２４の容積は、限外ろ過プロセス中にもとのアルコール除去抽出物の容積の約三分の一から三分の二に減少する、または別の表現をすれば、固形分１２から１５％にまで減少する。限外ろ過保持液は、保持液の容積の約１から３倍の水でダイヤフィルターすることもできるが、その場合、この水は透過液中のイソフラボン回収率をより高くするために、事前に摂氏６５から９５度の温度範囲内に調整したものである。
【００２２】
透過液をダイヤフィルターする場合もしない場合も、２６の限外ろ過透過液には、多様なイソフラボンが含有されており、これを適当な温度に調節する（摂氏４５から９５度）。次いで、これを２８において、バッチまたはクロマトグラフィー・カラム型のプロセスのいずれかで、吸着性樹脂で処理し、この後３０において樹脂を洗浄する。次に、イソフラボンを３２で水アルコール溶媒（容積比で２０から１００％、摂氏２５から８５度）で、グラジエントまたは一定濃度プロセスのいずれかで、溶出する。結果として得られた成分を、好ましくは蒸発で乾燥させ（図３には示していない）、固体換算にて約３０％のイソフラボンを含有する産物を製造する。３２で使用するアルコールは、エタノール、メタノール、またはイソプロパノールでよい。樹脂は、これに限定されるものではないが、エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン、スチレン−ジビニルベンゼン、またはポリチレン・ポリマーでよく、イオン系または非イオン系のいずれでもよい。
【００２３】
代替的または追加的に、透過液をダイヤフィルターした場合もしない場合も、３４でのゲニスチンの結晶化を促進するために、限外ろ過透過液２６を適切な温度に調節する（摂氏約４から４５度）。高度に精製されたゲニスチン結晶を、この後３６において低速遠心分離またはろ過により取り除き、最終的に冷水で洗浄する（図３には示していない）。最終産物は、乾燥時の測定で、純度７０から９０％のゲニスチンである。ゲニスチン結晶は、水エタノール溶媒、メタノール、イソプロパノールなどの水アルコール溶媒を使用してさらに精製することができる。
【実施例】
【００２４】
実施例１
大豆可溶物の限外ろ過
ステンレス・スチールの蒸気過熱した浸漬コイルを使用して、大豆可溶物（１５．２６ｋｇ）を摂氏約８０度の一定の温度に加熱した。次いで、パラスタルティック・ポンプを使用して、大豆可溶物をモデル９２−ＨＦＸ−１３１−ＵＹＵらせん状のポリスルホン製、公称分子量排除限界１００００の限外ろ過膜（Ｋｏｃｈ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＩＬ）を通過させた。透過流速が７０ｍＬ／分になるように、膜の出口側の背圧を手動式クランプで調節した。透過液が９．４ｋｇ、残存する保持液が４．８ｋｇになるまで、限外ろ過を続けた。様々な画分のイソフラボンのプロファイルを以下に示す。
0003919871.tif 000002
【００２５】
実施例２
限外ろ過保持液のダイヤフィルトレーション
限外ろ過保持液（開始温度は摂氏８０度）を、４．８ｋｇの水道水（摂氏２５度）を、透過速度または製造されている透過液流量に相当する供給速度で保持液に供給したこと除いて、実施例１に記載されると同様に限外ろ過処理した。この後、保持液を最終重量が１．９３ｋｇになるまでさらに限外ろ過した。様々な画分のイソフラボンのプロファイルを以下に示す。
0003919871.tif 000003
【００２６】
実施例３
樹脂へのイソフラボンの吸着と回収
ガラス製の液体クロマトグラフィー・カラム（内径２．５４センチメートル）を、７０％エタノール中、Ｄｏｗ  ＸＵＳ  ４０３２３  ジビニルベンゼン、エチルビニルベンゼン共重合体樹脂で泥状に充填する。樹脂は、別の５００ｍＬの７０％エタノール、ついで重量比０．１％のＮａＯＨ（５００ｍＬ）、および水（５００ｍＬ）で洗浄した。ついで、樹脂をサイズにより分離するために、当初充填した容積の約１．５倍まで樹脂のベッド容積が拡張するまで、樹脂を水でバックフラッシュした。最終的な充填容積は１００ｍＬであった。できたばかりの限外ろ過透過液（２０００ｍＬまたはカラム容積の２０倍）を開始温度摂氏６０度で、カラム容積の６倍／時間または１０ｍＬ／分の速度で樹脂床に供給した。樹脂を５００ｍＬの水で速度１０ｍＬ／分で洗浄し、残存する糖類や他の不純物を除去した。ついで、速度１０ｍＬ／分の２０から９５％エタノール（合計５００ｍＬ）の直線グラジエントでイソフラボンを樹脂から溶出させた。次に、アルコール性イソフラボン含有画分全体を、真空乾燥し、以下のプロファイルを有する産物を得た。
0003919871.tif 000004
【００２７】
実施例４
限外ろ過透過液からのゲニスチンの沈殿
７．６９ｋｇの限外ろ過透過液（開始温度は摂氏８５度）を、常時撹拌しながら１６時間かけて徐々に室温（摂氏２２度）まで冷却した。冷めた透過液を、９００ｘｇで１０分間遠心分離し、ゲニスチン沈殿物を得た。上清は廃棄した。白色の塊を水（１００ｍＬ）で希釈し、９００ｘｇで１０分間再度遠心分離して残っている上清を完全に排除した。白色の沈殿は、ついで真空乾燥して、１．０２ｇの乾燥粉末を得た。乾燥粉末のイソフラボン組成は、以下のとおりであった。
0003919871.tif 000005
【００２８】
実施例５
限外ろ過透過液の沈殿物からのゲニスチンの再結晶
沈殿が溶解するまで還流しながら、８０％エタノール（５０ｍＬ）を、１ｇの透過液沈殿物に徐々に加えた。ついで、溶液をＷｈａｔｍａｎ  ４２濾紙でろ過し、徐々に冷却し（摂氏２２度）、細かな黄白色の結晶を得た。結晶は、９００ｘｇで１０分間遠心分離して回収した。上清は、廃棄した。次に、結晶を５０ｍＬの水（摂氏４度）に混合し、再度遠心分離して残っている上清を完全に排除した。ついで水を廃棄し、結晶を真空乾燥して、以下のイソフラボンプロファイルの産物を得た。
0003919871.tif 000006
【００２９】
当業者には、本発明を修飾する方法が容易に認識されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲と精神に包含される全ての同等な構成を網羅するために作成されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  温度に対する水へのゲニスチンの溶解度を示すグラフである。
【図２】  温度に対するUF透過液中のイソフラボンの濃度を示すグラフである。
【図３】  発明の製品の製造を示すプロセスの流れ図である。
【符号の説明】
２０  大豆モラセス
２１  保持液
２２  限外ろ過
２６  透過液
３４  冷却して結晶化
３６  結晶を遠心分離またはろ過
２８  吸着性樹脂
３０  樹脂を水洗
３２  水アルコール溶媒で産物を溶出
【図１】
0003919871.tif 000007
【図２】
0003919871.tif 000008
【図３】
0003919871.tif 000009