(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）分離されたヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子を、推定上のＩｇＥ含有組成物に、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体が形成されるのに適した条件下で接触させるステップであって、前記ＩｇＥがイヌＩｇＥ、ネコＩｇＥ及びウマＩｇＥのうちのいずれかから選択されるものである、ステップと、
（ｂ）前記ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体を検出することによりＩｇＥの存在を判定するステップであって、前記ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体の存在はＩｇＥの存在の指標となるものである、ステップと
を含む、ＩｇＥを検出する方法。
【請求項２】
（ａ）組換え細胞を、イヌ、ネコ、又はウマから得られた推定上のＩｇＥ含有組成物に、組換え細胞：ＩｇＥ複合体が形成されるのに適した条件下で接触させるステップであって、前記組換え細胞が、ヒトＦｃεＲ分子を発現する組換え細胞からなるステップと、
（ｂ）前記組換え細胞：ＩｇＥ複合体を検出することによりＩｇＥの存在を判定するステップであって、前記組換え細胞：ＩｇＥ複合体の存在はＩｇＥの存在の指標となるものである、ステップと
を含む、ＩｇＥを検出する方法。
【請求項３】
ＦｃεＲ分子が、ＩｇＥに結合するＦｃεＲアルファ鎖の少なくとも一部分を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子と、イヌ、ネコ又はウマ由来のＩｇＥを検出する手段とを含む、請求項１に記載の方法を実施するためのキットであって、前記手段が、ＦｃεＲ分子、ＩｇＥ分子、又は、前記ＦｃεＲ分子に結合させた検出可能なマーカ、の何れかに結合する化合物を含む、キット。
【請求項５】
ＦｃεＲ分子が、ＩｇＥに結合するＦｃεＲアルファ鎖の少なくとも一部分を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
（ｉ）（ａ）のステップを行う前に前記ＦｃεＲ分子を基質に結合させてＦｃεＲ分子で被膜された基質を形成するステップ、及び、
（ii）（ａ）のステップを行う前に前記推定上のＩｇＥ含有組成物を基質に結合させて推定上のＩｇＥ含有組成物で被膜された基質を形成するステップ、のうちのいずれかから選択されるステップをさらに含み、前記基質が、被膜されていない基質、ＦｃεＲ分子で被膜された基質、抗原で被膜された基質、及び、抗ＩｇＥ抗体で被膜された基質、のうちのいずれかから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原がアレルゲン及び寄生生物抗原のうちのいずれかから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出手段が、アレルゲン及び寄生生物抗原のうちのいずれかから選択される抗原をさらに含み、前記抗原が、イヌ、ネコ及びウマのうちのいずれかから選択される動物においてＩｇＥ抗体の産生を誘起するものである、請求項４に記載のキット。
【請求項９】
前記検出手段が、ＩｇＥに選択的に結合する抗体を含む、請求項４に記載のキット。
【請求項１０】
前記検出手段が前記ＦｃεＲ分子を検出する、請求項４に記載のキット。
【請求項１１】
前記アレルゲンが、真菌、高木、雑草、低木、稲科植物、小麦、トウモロコシ、ダイズ、米、卵、牛乳、チーズ、ウシ、家禽、ブタ、ヒツジ、酵母、蚤、ハエ、蚊、ダニ、ユスリカ、ヌカカ（原語：ｂｉｔｉｎｇ  ｇｎａｔ）、シラミ、蜂、黄蜂、アリ、ナンキンムシ及びマダニのうちのいずれかから選択される物質を由来とする、請求項７に記載のキット。
【請求項１２】
前記蚤アレルゲンが蚤唾液生成物及びノミ唾液タンパク質から成る群より選択される、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記寄生生物抗原がイヌ糸状虫抗原である、請求項８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はイプシロン免疫グロブリン（ＩｇＥ）を検出するための新規な方法に関するものである。本発明には、さらにＩｇＥを検出するための新規なキットと、その検出用試薬を作成する方法とが含まれる。
発明の背景
疾患の診断と治療効果の判断は医療において重要な手段である。特に動物におけるＩｇＥ産生の検出は疾患の指標にすることができるものである。このような疾患には、例えば、アレルギー、アトピー性疾患、高ＩｇＥ症候群、内部寄生生物感染及びＢ細胞の異常増殖がある。加えて、治療後の動物のＩｇＥ産生を検出すれば、例えばＩｇＥの産生を妨げることを意図した治療法を用いた場合など、その治療の効果の指標となる。
本発明の発見までは、非ヒト動物から得た試料中のＩｇＥの検出には、ＩｇＥを検出するための適した試薬がないという障害があった。様々な化合物がＩｇＥ含有組成物中のＩｇＥを検出しようと用いられてきた。具体的には、イプシロンイディオタイプ抗体に選択的に結合する抗体（即ち抗ＩｇＥ抗体）を用いてＩｇＥが検出されている。しかしながらこれらの抗ＩｇＥ抗体は、例えばガンマイソタイプ抗体など、その他の抗体イディオタイプと交差反応することがある。本発明の発見には、推定上のＩｇＥ含有組成物中でＩｇＥの存在を検出するためにＦｃイプシロンレセプタ（ＦｃεＲ）分子を利用することが含まれる。ＩｇＥを検出する際にはＦｃεＲ分子は例えば抗ＩｇＥ抗体に比べて有利である。それはなぜなら、ＦｃεＲ分子は、抗ＩｇＥ結合抗体と比べて、ＩｇＥに結合するときの結合特異性がより高く（即ちイディオタイプとの交差反応性が低く）、また感受性（即ち親和性）もより高いからである。
1993, Annals of Allergy 71:481-484のローウェンタール氏らによれば、イヌ血清は皮膚反応性をヒトに移行させることがあるという。ローウェンタール氏らによる、ヒトＦｃεＲがイヌＩｇＥに結合するという教示が正しい可能性はあるが、ローウェンタール氏らは皮膚反応性の移行に関与している特定の細胞たんぱくを規定したデータを提供していない。従って、当業者であれば、ローウェンタール氏らが教示するような皮膚反応性の移行は多様な別々の分子の間の相互作用によるものであり、ローウェンタール氏らが導き出した結論は単にある一つの解釈に過ぎないと結論付けるであろう。さらに、ローウェンタール氏らはイヌＩｇＥを検出するために、精製されたヒトＦｃεＲを用いることを教示していない。ヒトＦｃεＲのサブユニットは１９８８年という早い段階で知られているが、イヌ、ネコ又はウマＩｇＥを検出するために用いられたことはない。実際、レーダー氏らに与えられた１９９０年１０月９日発行の米国特許第４，９６２，０３５号はヒトＦｃεＲを開示してはいるが、このようなヒトＦｃεＲを用いてヒト又は非ヒトＩｇＥを検出することは開示していない。精製されたヒトＦｃεＲを用いれば、例えば、さらに他の分子も細胞膜上に存在するがためにＦｃεＲ保有細胞が非特異的な結合を見せるなど、細胞に結合したままのＦｃεＲの利用によりもたらされる面倒が軽減される。精製されたヒトＦｃεＲは非ヒトＩｇＥを検出するということは予見されたことではない。なぜならＦｃεＲとＩｇＥとの間の種間結合は予測不可能だからである。例えば、ヒトＦｃεＲはラットＩｇＥに結合するが、ラットＦｃεＲはヒトＩｇＥに結合しない。
高親和性のＦｃεＲは、アルファ、ベータ及びガンマという三つのたんぱく質の鎖から成っている。研究者はこれまで、アルファ鎖（Kochan et al., Nucleic Acids Res. 16:3584, 1988;Shimizu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1907-1911, 1988及びPang et al., J. Immunol. 151:6166-6174, 1993）、ベータ鎖（Kuster et al., J. Biol. Chem. 267:12782-12787, 1992）、及びガンマ鎖（Kuster et al., J. Biol. Chem. 265:6448-6452, 1990）について核酸配列を開示してきた。
このように、非ヒトＩｇＥを特異的に検出する方法及びキットが当業において求められている。
発明の概要
本発明はＩｇＥを検出する検出方法及びキットを含む。本発明のある一つの実施例は、（ａ）分離されたヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子を推定上のＩｇＥ含有組成物に、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体が形成されるのに適した条件下で接触させるステップであって、前記ＩｇＥがイヌＩｇＥ、ネコＩｇＥ及びウマＩｇＥのうちのいずれかから選択されるものである、ステップと、（ｂ）ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体を検出することによりＩｇＥの存在を判定するステップであって、前記ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体の存在はＩｇＥの存在の指標となるものである、ステップとを含む、ＩｇＥを検出する方法である。好適なＦｃεＲ分子はそのＦｃεＲ分子の炭化水素基がビオチンに結合したものである。
本発明のもう一つの実施例は、（ａ）組換え細胞を推定上のＩｇＥ含有組成物に、組換え細胞：ＩｇＥ複合体の形成にとって適した条件下で接触させるステップであって、前記組換え細胞には、ヒトＦｃεＲ分子を発現する組換え細胞と、イヌＩｇＥ、ネコＩｇＥ及びウマＩｇＥを含むＩｇＥに選択的に結合する抗体を発現する組換え細胞と、が含まれる、ステップと、（ｂ）組換え細胞：ＩｇＥ複合体を検出することによりＩｇＥの存在を判定するステップであって、前記組換え細胞：ＩｇＥ複合体の存在はＩｇＥの存在の指標となるものである、ステップと、を含む、ＩｇＥを検出する方法である。好適な組換え細胞にはＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞がある。
本発明の別の実施例は、（ａ）蚤アレルゲンを基質上に固定するステップと、（ｂ）前記蚤アレルゲンを、推定上のＩｇＥ含有組成物に、前記基質に結合した抗原：ＩｇＥ複合体が形成されるのに適した条件下で接触させるステップと、（ｃ）抗原ＩｇＥ複合体が前記基質に結合した状態が維持される条件下で前記基質から結合しない物質を取り除くステップと、（ｃ）前記抗原：ＩｇＥ複合体をＦｃεＲ分子に接触させることにより、前記抗原ＩｇＥ：複合体の存在を検出するステップと、を含む蚤アレルギー性皮膚炎を検出する方法である。好ましくは蚤アレルゲンは蚤唾液抗原であるとよく、より好ましくは蚤唾液生成物及び／又は蚤唾液たんぱくであるとよい。
本発明には、さらに本発明の方法を実施するためのキットが含まれる。ある一つの実施例は、ヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子と、イヌＩｇＥ、ネコＩｇＥ、及びウマＩｇＥを含むＩｇＥを検出する手段とを含む、ＩｇＥを検出するためのキットである。もう一つの実施例は合衆国のあらゆる地域に共通したアレルゲンと、ヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子とを含む一般的アレルゲンキットである。もう一つの実施例は、ヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子及び蚤アレルゲンを含む、蚤アレルギー性皮膚炎を検出するためのキットである。
本発明の別の実施例は、Ｆｃεアルファ鎖たんぱくの炭化水素基がビオチンに結合した、分離されたヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）アルファ鎖たんぱく質である。好適なＦｃεＲアルファ鎖たんぱく質はＰｈＦｃεＲα172−ＢＩＯＴを含む。
【図面の簡単な説明】
図１は、イヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図２は、植物アレルゲン特異的イヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図３は、ヒト又はイヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図４は、蚤アレルゲン特異的イヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図５は、蚤アレルゲン特異的及びイヌ糸状虫抗原特異的イヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図６は、蚤唾液特異的イヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図７は、イヌ糸状虫抗原特異的ネコＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図８は、イヌ糸状虫抗原特異的ネコＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図９は、抗原特異的ウマＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのビオチニル化アルファ鎖を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図１０は、イヌ糸状虫に感染したイヌから採取した血清中のイヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのアルファ鎖を発現する好塩基球性白血病細胞を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
図１１は、蚤唾液に感作したイヌから採取した血清中のイヌＩｇＥ抗体を検出するためにヒトＦｃεＲのアルファ鎖を発現する好塩基球性白血病細胞を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、精製された高親和性のヒトＦｃイプシロンレセプタ（即ちＦｃεＲＩ：ここではＦｃεＲと呼ぶこととする）を、特定の非ヒト（即ちイヌ、ネコ又はウマ）イプシロン免疫グロブリン（ここではＩｇＥ又はＩｇＥ抗体と呼ぶこととする）を基にした検出（例えば診断的、スクリーニング）方法及びキットに用いることができるという発見に関するものである。非ヒトＩｇＥを検出することにヒトＦｃεＲを利用することは、イヌ、ネコ及びウマの免疫系はヒトの免疫系から、そして相互の間でも異なる（即ち免疫系にとって重要な分子は多くの場合、種に特異的である）ために、予見されたことはない。
本発明のある一つの実施例は、ある分離されたヒトＦｃεＲ分子を用いて非ヒトＩｇＥを検出する方法である。ここで「ある」（原語："a"）物質又は「ある」（原語："an"）物質という術語は一つ又はそれ以上のその物質を言うことに留意されたい。例えば、あるたんぱく質とは一つ又はそれ以上のたんぱく質又は少なくとも一つのたんぱく質を言うものである。従って、「ある」（原語："a"）（又は「ある」（原語："an"））、「一つの又はそれ以上の」及び「少なくとも一つの」という術語はここでは互換可能に用いられている場合がある。さらに、「含む（原語：comprising）」、「含む（原語：including）」、及び「有する（原語：having）」という術語も互換可能に用いられている場合があることに留意されたい。さらに、「含む（原語：comprising）」、「含む（原語：including）」、及び「有する（原語：having）」という術語も互換可能に用いられている場合があることに留意されたい。さらに、「のうちのいずれかから選択される」化合物とは、その後に続く化合物のうち、その二つ又はそれ以上の混合物（即ち組合せ）も含めた、一つ又はそれ以上を言うものである。
本発明によれば、分離された、又は生物学的に純粋な、ＦｃεＲ分子とは、その天然ミリューから取り出された分子である。従って、「分離された」及び「生物学的に純粋な」とは、必ずしもその分子が精製された程度を反映するものではない。本発明に基づく分離されたヒトＦｃεＲ分子はその天然源（例えばヒトマスト細胞から）得られても、組換えＤＮＡ技術を用いて作成されても、又は化学合成により作成されてもよい。
本発明のＦｃεＲ分子（ここではＦｃεＲ又はＦｃεＲたんぱく質とも呼ばれる）は全長たんぱく質でも、全長たんぱく質の一部分でも、又はこのようなたんぱく質のいかなる相同体でもよい。ここで用いられる場合のたんぱく質はポリペプチドでも又はペプチドでもよい。本発明のＦｃεＲ分子には、完全なＦｃεＲ（即ちアルファ、ベータ及びガンマといったＦｃεＲ鎖）、アルファＦｃεＲ鎖（ここではＦｃεＲα鎖とも呼ばれる）、又はその一部分を含めることができる。好ましくは、ＦｃεＲ分子は、ＩｇＥに結合する、即ちＩｇＥ恒常領域と免疫複合体を形成することのできる、ＦｃεＲαの少なくとも一部分が含まれているとよい。好ましくは、本発明のＦｃεＲ分子は、約
0003993245.tif 000002
より好ましくは約
0003993245.tif 000003
そしてさらに好ましくは約
0003993245.tif 000004
の親和性をもってＩｇＥに結合するとよい。
本発明による分離されたＦｃεＲ分子は、相同体も含め、そのＦｃεＲ分子がＩｇＥと免疫複合体を形成できる能力により簡単に同定することができる。ＦｃεＲ相同体の例には、アミノ酸が削除（例えばそのたんぱく質の切断形、例えばペプチドなど）、挿入、反転、置換及び／又は誘導（例えばグリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイレーション、プレニレーション、パルミトイレーション、アミド化及び／又はグリセロホスファチジルイノシトールの付加など）された結果、その相同体に、ＩｇＥと免疫複合体を形成することのできるエピトープが少なくとも一つ含まれることとなったようなＦｃεＲたんぱく質がある。
ＦｃεＲ相同体は、天然の対立遺伝子変異や、又は自然突然変異の結果生じたものでもよい。さらに本発明のＦｃεＲ相同体は、当該たんぱく質に直接改良を加えたり、あるいは、例えば無作為又はターゲットを定めた突然変異誘発を起こす伝統的な又は組換えＤＮＡ技術を用いて当該たんぱく質をコードする遺伝子に改変を加えることを含め、しかしこれらに限らず、当業において公知の技術を用いて作成してもよい。
本発明によれば、本発明のヒトＦｃεＲα鎖は、ここで配列同定番号第１番として表される全長ＦｃεＲα鎖たんぱく質をコードするｃＤＮＡのコドン鎖の核酸配列の少なくとも一部分によりコードされるものであり、前記一部分は、少なくとも、ＦｃεＲα鎖たんぱく質のＩｇＥ結合部位をコードするものである。配列同定番号第１番を有するコドン鎖と、それに相補の非コドン鎖（その核酸配列は当業者には容易に判断が可能であり、ここでは配列同定番号第３番として示すこととする）との両方を含む二本鎖の核酸分子を、ここではＦｃεＲ核酸分子ｎｈＦｃεＲα1198と呼ぶこととする。配列同定番号第１番を翻訳すると、核酸分子ｎｈＦｃεＲα1198は、開始（スタート）コドンが配列同定番号第１番のヌクレオチド１０７番からヌクレオチド１０９番にあり、終止（ストップ）コドンが配列同定番号第１番のヌクレオチド８７８番からヌクレオチド８８０番にある開放読み取り枠を想定したときに、配列同定番号第２番で表される、ここではＰｈＦｃεＲα257と呼ばれる、約２５７個のアミノ酸から成る全長ＦｃεＲα鎖たんぱく質をコードしていることが分かる。ストップコドンを含めた、ＰｈＦｃεＲα257をコードするコドン領域は、その核酸配列がここでは配列同定番号第４番で表されるコドン鎖を有する核酸分子ｎｈＦｃεＲα774で表される。配列同定番号第４番の相補体はここでは配列同定番号第５番で表される。配列同定番号第１番は、約２５個のアミノ酸から成るシグナルペプチドや、ここではそのアミノ酸配列を配列同定番号第６番で表すこととする、ここでＰｈＦｃεＲα232と示される、約２３２個のアミノ酸から成る成熟たんぱく質をコードしている。この見かけの成熟たんぱく質をコードする核酸分子はｎｈＦｃεＲα699と呼ばれ、そのコドン鎖の核酸配列はここでは配列同定番号第７番で示されている。配列同定番号第１番はさらに、配列同定番号第２番のアミノ酸２０５番からアミノ酸２５７番までに基として延びる疎水性の膜貫通ドメイン及び細胞質の尾をコードしている。これらの核酸配列及びアミノ酸配列を知ることで、当業者であれば、各々の核酸分子及びたんぱく質に改良を加えて、例えば、可溶性のより高いＦｃεＲα鎖たんぱく質を開発したり、及び／又は、ＩｇＥを検出可能な切断形のたんぱく質（例えばペプチド）、例えばＰｈＦｃεＲα197及びＰｈＦｃεＲα172など、を開発したりすることが可能となる。好適なＦｃεＲ分子にはＰｈＦｃεＲα257、ＰｈＦｃεＲα197、ＰｈＦｃεＲα232及びＰｈＦｃεＲα172が含まれる。ＦｃεＲ分子をコードするのに好適な核酸分子には、ｎｈＦｃεＲα774、ｎｈＦｃεＲα1198、ｎｈＦｃεＲα612、ｎｈＦｃεＲα591、ｎｈＦｃεＲα699及び／又はｎｈＦｃεＲα516が含まれる。
本発明に基づく分離されたＦｃεＲ分子たんぱく質は、このたんぱく質を発現することのできる細胞をこのたんぱく質産生にとって効果的な条件下で培養し、このたんぱく質を回収することにより、生成が可能である。培養に好適な細胞は、このたんぱく質を発現することのできる組換え細胞であるが、この組換え細胞は、ホスト細胞を、本発明による一つ又はそれ以上の核酸分子で形質転換させることにより作成されるものである。ある一つの細胞へのある核酸分子の形質転換は、この細胞に核酸分子を挿入できれば、いかなる方法によっても達成することができる。形質転換技術には、トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着法、及びプロトプラスト融合法があるが、これらに限定されるものではない。組換え細胞は無細胞のままでも、又は、組織、臓器又は多細胞の有機体に成長させてもよい。本発明による形質転換させた核酸分子は染色体外のままでも、又は、形質転換させた（即ち組換え）細胞の染色体の一つ又はそれ以上の部位に、それらの発現能力が維持されるような態様で組み込まれてもよい。細胞を形質転換するのに適切かつ好適な核酸分子は、適切かつ好適なＦｃεＲ核酸分子自体についてここに開示した通りである。本発明の組換え細胞に含めるのに特に好適な核酸分子には、ｎｈＦｃεＲα774、ｎｈＦｃεＲα1198、ｎｈＦｃεＲα612、ｎｈＦｃεＲα591、ｎｈＦｃεＲα699及び／又はｎｈＦｃεＲα516が含まれる。
形質転換するのに適したホスト細胞には、本発明の核酸分子で形質転換することの可能なあらゆる細胞が含まれる。ホスト細胞は未形質転換のままの細胞でも、又は、少なくとも一つの核酸分子で既に形質転換された細胞でもよい。本発明の細胞は、本発明のＦｃεＲ分子たんぱく質を内生（即ち天然で）産生できるものでも、又は、本発明による少なくとも一つの核酸分子で形質転換させた後にこのようなたんぱく質を産生可能になったものでもよい。本発明のホスト細胞は本発明の少なくとも一つのたんぱく質を産生できればいかなる細胞でもよいが、バクテリア、真菌（酵母を含む）、寄生生物（プロトゾア及び外部寄生生物を含む）、昆虫、その他の動物及び植物の細胞が、これに含まれる。
好ましくは、組換え細胞を本発明の組換え分子でトランスフェクトするとよいが、この分子には、形質転換させようとする細胞においてその核酸分子の発現を効果的に制御することのできる転写制御配列のうちの少なくとも一つに有効に連結させた、少なくとも一つの前述の核酸分子を含めることができ、その例をここで開示する。特に好適な組換え分子にはｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612がある。ＦｃεＲ分子核酸分子含有組換え分子の作成に関する詳細をここで開示する。本発明において特に好適な組換え分子には、Trichoplusia ni−ｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612がある。
本発明のＦｃεＲ分子には、ＩｇＥに結合するＦｃεＲ分子の一部分と第二分子とを含むキメラ分子を含めることができるが、ただしこの第二分子とは、この第二分子があることで、このキメラ分子が基質に結合するときに、基質に結合していないＦｃεＲ分子と基本的に同じ態様でこのＦｃεＲ部分がＩｇＥに結合するよう、結合を行うことが可能となるものである。適した第二分子の一例には、免疫グロブリン分子の一部分がある。
本発明のＦｃεＲ分子は、ここでＦｃεＲ製剤と呼ばれる製剤中に封入することができる。例えば、ＦｃεＲを、ＦｃεＲが可溶化された緩衝液、及び／又は、担体と配合することができる。適した緩衝剤及び担体は当業者に公知である。適した緩衝剤の例には、ＦｃεＲがＩｇＥに選択的に結合する働きを行えるあらゆる緩衝液が含まれるが、例えば、しかしこれらに限らず、リン酸緩衝生理食塩水、水、生理食塩水、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドリキシエチルピペラジン−Ｎ‘−２−エタンスルホン酸緩衝生理食塩水）、ＴＥＳ緩衝液（トリス−ＥＤＴＡ緩衝生理食塩水）、トリス緩衝液、及びＴＡＥ緩衝液（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）がある。担体の例には、ポリマーマトリックス、トキソイド、及び例えばウシ血清アルブミンなどの血清アルブミンがあるが、これらに限定されるものではない。担体をＦｃεＲと混合しても、又は、ＦｃεＲがＩｇＥに選択的に結合できる能力に大きく干渉しないような態様でＦｃεＲに結合（即ち付着）させてもよい。
本発明のＦｃεＲは、ＦｃεＲを発現する細胞表面に結合させてもよい。好適なＦｃεＲ保有細胞には、本発明のヒトＦｃεＲα鎖をコードする核酸分子を発現する組換え細胞がある。本発明においてより好適な組換え細胞は、以下のたんぱく質、即ちＰｈＦｃεＲα257及びＰｈＦｃεＲα232、のうちの少なくとも一方をコードする核酸分子を発現するものである。さらにより好適な組換え細胞は、ｎｈＦｃεＲα612、ｎｈＦｃεＲα591、ｎｈＦｃεＲα699及び／又はｎｈＦｃεＲα516を含む核酸分子を発現するものであるが、配列同定番号第１番又は配列同定番号第４番を含む核酸配列を含む核酸分子か、又は、配列同定番号第１番又は配列同定番号第４番を含む核酸分子の対立遺伝子変異体を含む核酸分子、を発現する組換え細胞がさらにより好ましい。さらにより好適な組換え細胞はＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞である。
加えて、本発明のＦｃεＲ製剤にはＦｃεＲだけでなく、ＩｇＥを検出するのに有用な一つ又はそれ以上の別の抗原又は抗体を含めることができる。ここで用いられる場合の抗原とは、ある抗体が選択的に結合することのできるあらゆる分子を言う。ここで用いられる場合の、第一の分子の第二の分子への特異的結合とは、この第一の分子が、この第一の分子が第三の分子に結合する際の能力に比して第二の分子に優先的に結合（例えば高親和性の高結合力を有して）できることを言う。第一の分子は必ずしも第二の分子の天然のリガンドでなくともよい。このような抗体の例には、ＩｇＥ重鎖の恒常領域に選択的結合する抗体（即ち抗ＩｇＥイソタイプ抗体）又は特異抗原特異性を有するＩｇＥに選択的に結合する抗体（即ち抗ＩｇＥイディオタイプ抗体）があるが、これらに限られることはない。このような抗原の例には、ＩｇＥの産生を誘起することの知られたあらゆる抗原が含まれる。好適な抗原にはアレルゲン及び寄生生物抗原がある。本発明のアレルゲンは、好ましくは、真菌、高木、雑草、低木、稲科植物、コムギ、トウモロコシ、ダイズ、米、卵、牛乳、チーズ、ウシ（原語：bovines）（又はウシ（原語：cattle））、家禽、ブタ、ヒツジ、酵母、蚤、ハエ、蚊、ユスリカ、ヌカカ、ブヨ、シラミ、蜂、黄蜂、アリ、ナンキンムシ及びマダニを由来とするものであるとよい。適した蚤アレルゲンには、蚤、特に蚤の唾液抗原を由来とするアレルゲンがある。好適な蚤アレルゲンには、蚤唾液抗原がある。好適な蚤唾液抗原には、例えば１９９６年４月１８日公開のフランク氏らによるＰＣＴ特許公報ＷＯ９６／１１２７１号（この公報全文を参考文献としてここに編入することとする）などがあるが、蚤唾液生成物及び蚤唾液たんぱくが特に好適である。本発明によれば、蚤唾液たんぱくには、組換えＤＮＡ法により作成されたたんぱく質や、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９６／１１２７１号に開示のその他の方法により分離されたたんぱく質が含まれる。
好適な一般的アレルゲンには、稲科植物、ヒロハノウシノケグサ，カーリードック（原語：Curly Dock），オオバコ、メキシカンファイアブッシュ（原語：Mexican Firebush），シロザ，アカザ、ブタクサ、セージ、ニレ、オナモミ、ネグンドカエデ，クルミ、ポプラ、トネリコ、カバ、セイヨウスギ、オーク、クワ、ゴキブリ、ヒョウヒダニ，アルテルナリア属、アスペルギルス属、クラドスポリウム属、フザリウム属、ヘルミントスポリウム属、ケカビ属、ペニシリウム属、Pullularia，クモノスカビ属及び／又はTricophytonを由来とするものが含まれる。より好適な一般的アレルゲンには、ヒメモロコシ，ナガハグサ，ヒロハノウシノケグサ，カモガヤ，多年生ライグラス，コヌカグサ，オオアワガエリ，ギョウギシバ，チャヒキ，カーリードック（原語：Curly Dock），ヘラオオバコ，メキシカンファイアブッシュ（原語：Mexican Firebush），シロザ，ラフピッグウィードショートラグウィード（原語：Rough Pigweed Short Ragweed），ウォームウッドセージ（原語：Wormwood Sage），アメリカニレ，コモンコックルバー（原語：Common Cocklebur），ネグンドカエデ，クログルミ，イースタンコットンウッド（原語：Eastern Cottonwood），グリーンアッシュ（原語：Green Ash），フロリダカンバ，エンピツビャクシン，アカガシワ，アカミグワ，ゴキブリ、Dermataphagoides farinae, Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Cladosporium herbarum, Fusarium vasinfectum, Helminthosporium sativum, Mucor recemosus, Penicillium notatum, Pullularia pullulans, Rhizopus nigricans及び／又はTricophyton種を由来とするものが含まれる。好適な熱帯性アレルゲンには、ギョウギシバ，ミノボロ，一年生イチゴツナギ，カモガヤ，多年生ライグラス，オオアワガエリ，ヒロハノウシノケグサ，コモンコックルバー（原語：Common Cocklebur），イエロードック（原語：Yellow Dock），ヒメスイバ，ヘラオオバコ，シロザ，ラフピッグウィード（原語：Rough Pigweed），ロシアンシストル（原語：Russian Thistle），ショートラグウィード（原語：Short Ragweed），エンピツビャクシン，ネコ上皮，アリゾナサイプレス（原語：Arizona Cypress），ラクウショウ，ヤシ科フェニックス属，シマナンヨウスギ，ユーカリ樹，マンゴ，アカシア，グラーマグラス，イラクサ，ウェスタンコットンウッド（原語：Western Cottonwood），塩生草類，Dermataphagoides pteronyssinus, Aureobasidium pullans, Penecillium notatum, Penicillium chrysogenum, Drechslera sorokiniana, Fusarium roseum, Cladosporium sphaerospermum, Aspergillus fumigatus, Alernaria tenuis Dermataphagoides farinae及びStemphyllium sarciniformを由来とするものが含まれる。好適な砂漠アレルゲンには、バヒアグラス，コスズメノチャヒキ，ヒメモロコシ，コヌカグサ，フォールスラグウィード（原語：False Ragweed），ケアレスウィード（原語：CarelessWeed），グリースウッド、ラフマーシュエルダー（原語；Rough Marsh Elder），コキア，トールラグウィード（原語：Tall Ragweed），ウェスタンラグウィード（原語：Western Ragweed），スレンダーラグウィード（原語：Slender Ragweed），コモンセージ（原語：Common Sage），プレーリーセージ（原語：Prairie Sage），マグワートセージ（原語：Mugwort Sage）及びシャドスケールを由来とするものが含まれる。好適な寄生生物抗原には、蠕虫抗原、特に、例えば（グリーブ氏らによる１９９６年９月１８日出願の米国特許出願第０８／７１５，６２８号���説かれた）Ｄｉ３３などのイヌ糸状虫抗原が含まれるが、これに限られるものではない。「由来とする」という術語は、このような植物又は生物の天然アレルゲン（即ちこのような植物又は生物から直接分離されるアレルゲン）や、あるアレルゲンに対して免疫反応を誘起することのできるエピトープを少なくとも一つ持ったこのような植物又は生物の非天然アレルゲン（例えば組換えＤＮＡ技術又は化学合成により作成されるものなど）を言う。
本発明には、さらに、ＩｇＥを検出するためのヒトＦｃεＲミメトープ及びその利用が含まれる。本発明によれば、「ミメトープ」とは、あるＦｃεＲ分子がＩｇＥに結合するその能力を模倣することのできるあらゆる化合物を言う。ミメトープは、分解への感受性を減じるよう改良されていながら、ＩｇＥ結合活性は保ったままのペプチドでもよい。ミメトープのその他の例には、炭化水素を基にした化合物、脂質を基にした化合物、核酸を基にした化合物、天然有機化合物、合成有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／又は触媒抗体、あるいはこれらのフラグメント、が含まれるが、これらに限られるものではない。ミメトープは、例えばＩｇＥに結合することのできる化合物を探して合成化合物のライブラリをスクリーニングすることで得ることができる。またミメトープを、例えば合理的なドラッグデザインにより得てもよい。合理的なドラッグデザインの手法においては、本発明に基づくある化合物の三次元構造を、例えば核磁気共鳴法（ＮＭＲ）又はｘ線クリスタログラフィにより分析することができる。こうしてこの三次元構造を用い、例えばコンピュータモデリングを行えば、ミメトープと考えられる物質の構造を予測することができる。こうして予測されたミメトープの構造を、例えば化学合成、組換えＤＮＡ技術や、又はミメトープを天然源から分離するなどして、作成することが可能である。ＦｃεＲミメトープの具体的な例には、抗イディオタイプ抗体、Selex技術を用いて生成されるオリゴヌクレオチド、ペプチドライブラリを無作為にスクリーニングして同定されるペプチド、及び、ファージ表示技術を用いて同定されるたんぱく質がある。
本発明の一実施例は、（ａ）分離されたヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子を推定上のＩｇＥ含有組成物に、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体が形成されるのに適した条件下で接触させるステップと、（ｂ）前記ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体を検出することによりＩｇＥのレベルを判定するステップと、を含む、非ヒトＩｇＥを検出する方法である。このようなＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体の存在は、その動物がＩｇＥを産生していることの指標となるものである。ヒトＦｃεＲ分子を用いて検出を行うのに好適な非ヒトＩｇＥには、イヌＩｇＥ、ネコＩｇＥ及びウマＩｇＥがある。本方法にはさらに、ＦｃεＲ分子と複合体を形成したＩｇＥが非耐熱性であるかどうかを判定するステップを含めてもよい。ＩｇＥの非耐熱性を判定する方法は実施例の項に開示されている。好ましくは、ＩｇＥは約５６℃で約４時間インキュベートされた時に非耐熱性であるとよい。理論に縛られる訳ではないが、非耐熱性の型のＩｇＥは特定のアレルゲンに結合し、耐熱成型のＩｇＥはその他のタイプのアレルゲンに結合すると出願人は考える。従って、耐熱性のＩｇＥに比較して非耐熱性のＩｇＥを検出する方法を用いれば、アレルゲンの感受性を判別することができる。例えば、特定の蚤アレルゲン及びイヌ糸状虫アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体は非耐熱性であるが、特定の植物アレルゲンに結合するＩｇＥ抗体は耐熱性であると出願人は考える。従って、耐熱性のＩｇＥが存在することは、動物が特定の植物アレルゲンに感受性があるが特定の蚤又はイヌ糸状虫アレルゲンには感受性がないということを示しているかも知れない。さらに、ヒトＦｃεＲを用いた非耐熱性ＩｇＥ及び耐熱性ＩｇＥの同定は、公知のＩｇＥに類似の構造を持っている又は持っていないかも知れない別々のＩｇＥの小集団が存在することを示唆するものであると出願人は考える。このように、本発明のＦｃεＲ分子は、ＦｃεＲ分子が結合した分子でありながら、公知のＩｇＥとは同一ではない分子を検出する上で有用かも知れない。
ここで用いられる場合のイヌとは、家イヌ、野生のイヌ、及び、動物園のイヌを含めたあらゆるイヌ科の仲間を言う。イヌの例には、家イヌ、野生のイヌ、キツネ、オオカミ、ジャッカル及びコヨーテが含まれるが、これらに限らない。ここで用いられる場合のネコとは、家ネコ、野生のネコ、及び、動物園のネコを含めたあらゆるネコ科の仲間を言う。ネコの例には、家ネコ、ライオン、トラ、ヒョウ、パンサー、クーガー、ボブキャット、オオヤマネコ、ジャガー、チータ、及びサーバルが含まれるが、これらに限らない。ここで用いられる場合のウマとは、ウマ、ロバ、ラバ及びシマウマを含めたあらゆるウマ科の仲間を言う。
ここで用いられる場合の「接触させる」という術語は、この場合は推定上のＩｇＥ含有組成物をヒトＦｃεＲ分子に配合又は混合することを言う。ＦｃεＲとＩｇＥとの間の複合体の形成とは、測定（即ち検出）の可能な安定した複合体を形成すべくＦｃεＲがＩｇＥに選択的に結合することができることを言う。ここで用いられる場合のＩｇＥに選択的に結合するという術語は、本発明のＦｃεＲがその他の抗体イソタイプには大きく結合することができない状態でＩｇＥに優先的に結合することができることを言う。ＦｃεＲとＩｇＥとの間の結合は、複合体の形成にとって適した条件下で行われるが、このような条件（例えば適した濃度、緩衝剤、温度、反応時間）や、このような条件を最適化する方法は当業者に公知であり、その例はここで開示されている。複合体形成条件の例はさらに、例えばSambrook et al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989に開示されており、このSambrook et alの文献全体を参考文献としてここに編入することとする。
ここで用いられる場合の「複合体の形成を検出する」という術語は、何らかの複合体が形成されていないか判断する、即ち複合体の存在（即ち存在）について検定することを言う。複合体が形成されていれば、形成された複合体の量を調べてもよいが、必ずしも調べなくともよい。ＦｃεＲと組成物中の何らかのＩｇＥとの間の複合体の形成、又は選択的結合は当業において標準的な様々な方法（例えば上述のSambrook et alを参照されたい）を用いて測定（即ち検出、判定）が可能であるが、その例はここに開示されている。
ある一つの実施例では、本方法の推定上のＩｇＥ含有組成物には動物から採った生体試料が含まれる。適した生体試料には体液組成物又は細胞組成物があるが、これらに限定されるものではない。体液とは、動物から採取（即ち得る）することの可能なあらゆる流体を言い、その例には、血液、血清、血漿、尿、涙液、房水、中枢神経系流液（ＣＮＦ）、唾液、リンパ液、鼻分泌液、乳汁、及び糞尿が含まれるが、これらに限らない。本発明のこのような組成物を予処理して、非ＩｇＥイソタイプの免疫グロブリン、及び／又は、体液中に存在するその他のたんぱく質、例えばアルブミンなど、の少なくともいくつかを除去してもよいが、必ずしも除去しなくともよい。このような除去には、体液を、例えばプロテインＧなどの物質に接触させてＩｇＧ抗体を取り除くこと、及び／又は、体液を例えばコンカナバリンＡなどに暴露することで体液のその他の成分からＩｇＥ抗体を親和性精製すること、が含まれるが、これらに限定されるものではない。別の実施例では、組成物には、採集された体液であって、その体液中に含まれた免疫グロブリンを濃縮するように予処理されたものがある。例えば、体液中に含まれた免疫グロブリンは硫酸アンモニウムを用いることでその他のたんぱく質から沈降させることができる。本方法において好適な組成物は血清である。
別の実施例では、本方法の組成物にはＩｇＥ産生細胞がある。このような細胞は、ＩｇＥを細胞表面に結合させていたり、及び／又は、ＩｇＥを分泌していることがある。このような細胞の例には、好塩基球及び骨髄腫細胞がある。ＩｇＥは細胞表面の細胞膜に直接結合していたり、細胞表面に結合した分子（例えば抗原）に結合していたりする場合がある。
複合体の検出は以下の検定法のうちの一つ又はそれ以上の利用を含め、しかし、これらに限らず、様々な方法で行うことができる。即ち、酵素結合免疫検定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光免疫検定法、化学発光検定法、ラテラルフロー検定法、凝集反応検定法、微粒子を基にした検定法（例えば磁気粒子又は例えばラテックス又はポリスチレン・ビードなどの樹脂性ポリマーなど、しかしこれらに限らず、微粒子を用いる）、免疫沈降検定法、BioCoreTM検定法（金コロイドを用いる）及び免疫ブロット検定法（例えばウェスタンブロット）である。このような検定法は当業者に公知である。検定法を用いれば、それらがどのように用いられるかに応じて定性的又は定量的結果を出すことができる。検定の中には、例えば凝集反応法、微粒子分離法、及び免疫沈降法など、検出可能マーカーを必要とせずに視覚的（例えば肉眼で、又はデンシトメータ又は分光光度計などの機械を用いて）に観察が可能なものもある。他の検定法では、検出可能マーカーを、ＦｃεＲに、又はＦｃεＲに選択的に結合する試薬に、あるいは検出しようとするＩｇＥに結合させる（以下に詳述する）と、複合体の形成を検出する上で便利である。検出可能マーカーの例には、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、色素産生標識又はリガンドがあるが、これらに限られるものではない。リガンドとは、別の分子に選択的に結合する分子を言う。好適な検出可能マーカーには、フルオレセイン、放射性同位体、ホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ）、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）及びビオチン関連化合物又はアビジン関連化合物（例えばストレプトアビジン又はImmunoPure▲Ｒ▼NeutrAvidin）があるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ビオチンをＦｃεＲのα鎖に結合するとよい。好ましくは、ＦｃεＲα鎖の炭化水素基をビオチンに結合するとよい。ビオチンに結合される好適なＦｃεＲ分子はＰｈＦｃεＲα172−ＢＩＯＴ（その作成法を実施例の項で説明する）を含むものである。
ある一つの実施例では、複合体は、検出可能マーカーに結合したＦｃεＲ分子に推定上のＩｇＥ含有組成物を接触させることにより、検出される。ＦｃεＲ分子に結合させるのに適した検出可能マーカーには、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、又は色素産生標識があるが、これらに限定されるものではない。検出可能マーカーをＦｃεＲ分子又は試薬に結合させるときには、ＦｃεＲ又は試薬が、検出しようとするＩｇＥに結合する能力を遮断しないような態様で行われる。好ましくは、ＦｃεＲの炭化水素基をビオチンに結合させるとよい。
別の実施例では、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体は、推定上のＩｇＥ含有組成物をＦｃεＲ分子に接触させ、その後この複合体を指示分子に接触させることにより検出される。本発明において適した指示分子には、ＦｃεＲ分子又はＩｇＥ抗体のいずれかに結合することのできる分子がある。従って、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体のどの部分を検出しようとするかに応じて、指示分子には、例えばＦｃεＲ分子、抗原、抗体及びレクチンを含めることができる。判別可能なように標識される化合物で好適なものには、例えば抗ＩｇＥ抗体及び抗ＦｃεＲ抗体が含まれる。好適なレクチンには、高マンノース基に結合するようなレクチンが含まれる。より好適なレクチンは、昆虫細胞で産生される、本発明のＦｃεＲ分子上に存在する高マンノース基に結合するものである。指示分子それ自体を本発明の検出可能マーカーに結合させてもよい。例えば、抗体をビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はフルオレセインに結合させてもよい。
ある好適な実施例では、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体は、この複合体を、本発明のＦｃεＲ分子に選択的に結合する試薬に接触させることにより、検出される。このような試薬の例には、ＦｃεＲ分子に選択的に結合する抗体（ここでは抗ＦｃεＲ抗体と呼ぶこととする）、又は、ＦｃεＲ分子に結合させた検出可能マーカーに選択的に結合する化合物、があるが、これらに限らない。ビオチンに結合させたＦｃεＲ分子は、好ましくは、ストレプタビジンを用いて検出されるとよく、より好ましくはImmunoPure▲Ｒ▼NeutrAvidin（イリノイ州ロックフォード、ピアス社から入手可能）を用いて検出されるとよい。
別の好適な実施例では、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体は、この複合体を、ＩｇＥ抗体に選択的に結合する試薬（ここでは抗ＩｇＥ試薬と呼ぶこととする）に接触させることにより、検出される。このような抗ＩｇＥ試薬の例には、抗イソタイプ抗体である第二抗体（例えばＩｇＥの恒常領域に選択的に結合する抗体）、抗体結合バクテリア表面たんぱく（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ）、抗体結合細胞（例えばＢ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、多形核白血球細胞、単核細胞又はマクロファージ細胞）、抗体結合真核細胞表面たんぱく（例えばＦｃレセプタ）、及び抗体結合補体たんぱく、があるが、これらに限られるものではない。好適な抗ＩｇＥ試薬には、Ｄ９、及びＣＭＩ抗体＃９、ＣＭＩ抗体＃１９、ＣＭＩ抗体＃５９並びにＣＭＩ抗体＃７１（カリフォルニア州ウェストサクラメント、カスタム・モノクローナル・インターナショナル社から入手可能）が含まれるが、これらに限られるものではない。特に、ここで用いられる場合において、抗ＩｇＥ抗体には、完全な抗体だけでなく、ＩｇＥ重鎖恒常領域に選択的に結合することのできる、あらゆるそのサブユニット又は部分が含まれる。例えば、抗ＩｇＥ試薬の一部には、Janeway et al. Immunobiology, the Immune System in Health and Disease, Garland Publishing, Inc., NY, 1996（この文献全体を参考文献としてここに編入することとする）に詳細に説明されているＦａｂフラグメント又はＦ（ａｂ‘）2フラグメントを含めることができる。
ある一つの実施例では、複合体を溶液中で形成かつ検出してよい。別の実施例では、複合体の形成は、その複合体の一つ又はそれ以上の構成員を基質上に固定（例えば被膜）した状態で行わせてもよい。固定技術は当業者には公知である。適した基質材料には、樹脂、ガラス、ゲル、セルロイド、紙、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、ナイロン、ニトロセルロース、及び、例えばラテックス、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロース及び磁気樹脂などの微粒子材料が含まれるが、これらに限定されるものではない。基質材料にとって適した形状には、ウェル（例えばマイクロタイタ皿のウェル）、プレート、ディップスティック、ビード、ラテラルフロー装置、メンブラン、フィルタ、試験管、ディッシュ、セルロイド型マトリックス、磁気粒子、及びその他の微粒子が含まれるが、これらに限定されるものではない。特に好適な基質にはＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、ラジオイムノアッセイ・プレート、アガロース・ビード、樹脂・ビード、ラテックス・ビード、免疫ブロットメンブラン及び免疫ブロットペーパが含まれる。ある実施例では、微粒子などの基質に検出可能マーカーを含めることができる。
ＩｇＥを検出するのに好適な方法は免疫吸着検定法である。本発明の免疫吸着検定法は捕獲分子及び指示分子を含む。本発明の捕獲分子は、ＩｇＥが基質上に固定されるような態様で捕獲分子に結合する。従って、捕獲分子は、好ましくは、この捕獲分子を推定上のＩｇＥ含有組成物に暴露する前に予め本発明の基質に固定しておくとよい。本発明の指示分子は、捕獲分子に結合したＩｇＥの存在を検出するものである。従って、指示分子は、好ましくは、捕獲分子を推定上のＩｇＥ含有組成物に暴露する前に捕獲分子と同じ基質には固定されていないとよい。
好適な免疫吸着検定法は、（ａ）ＦｃεＲ分子を推定上のＩｇＥ含有組成物に接触させる前に、ＦｃεＲ分子を基質に結合させ、ＦｃεＲ分子で被膜された基質を形成するステップ、又は（ｂ）ＦｃεＲ分子を推定上のＩｇＥ含有組成物に接触させる前に、推定上のＩｇＥ組成物を基質に結合させて、推定上のＩｇＥ含有組成物で被膜された基質を形成するステップ、のいずれかを含む。好ましくは、この基質は、被膜されていない基質、ＦｃεＲ分子で被膜された基質、抗原で被膜された基質又は抗ＩｇＥ抗体で被膜された基質、のいずれかを含むとよい。
本発明による捕獲分子及び指示分子の両方がＩｇＥに結合可能である。好ましくは、捕獲分子が指示分子とは異なるＩｇＥ領域に結合するとよく、これにより、捕獲分子と指示分子とを同時にＩｇＥに結合させることが可能となる。試薬を捕獲分子として利用するか、又は指示分子として利用するかは、その分子をＩｇＥ分子に暴露するときにその分子を基質上に固定しておくかによる。例えば、本発明のＦｃεＲ分子は、このＦｃεＲ分子を基質に結合させる場合には捕獲分子として用いられる。その代わりに、このＦｃεＲ分子を基質に結合させない場合には、ＦｃεＲ分子は指示分子として用いられることとなる。捕獲分子または指示分子として利用するのに適した分子には、本発明のＦｃεＲ分子、本発明の抗原試薬又はＩｇＥ抗体試薬があるが、これらに限らない。
本発明の免疫吸着検定法にはさらに、指示分子の存在を検出できる、一つ又はそれ以上の層及び／又は種類の第二分子又はその他の結合分子を含めてもよい。例えば、指示分子に選択的に結合する無標識の（即ち検出可能マーカーに結合させていない）第二抗体を、この第二抗体に選択的に結合する標識付（即ち検出可能マーカーに結合させた）第三抗体に結合させてもよい。適した第二抗体、第三抗体及びその他の第二又は第三分子は当業者には選択可能である。本発明において好適な第二分子には、抗原、抗ＩｇＥイディオタイプ抗体及び抗ＩｇＥイソタイプがある。好適な第三分子は、第二分子の性質に応じて当業者であれば選択可能である。同じ戦略がその次の層にも当てはまる。
ある一つの実施例では、所望の抗原が、例えばマイクロタイタ皿のウェル又はディップスティックなどの基質上に固定されることにより、捕獲分子として用いられる。好適な抗原にはここに開示したものが含まれる。動物から採取した生体試料をこの基質に施し、抗原：ＩｇＥ複合体が基質に結合した状態（即ち試料中のＩｇＥが、基質上に固定された抗原に結合する）で形成されるのに適した（即ち充分な）条件下でインキュベートする。結合しなかった余分な物質（即ち生体試料を由来とする物質で抗原に結合しなかったもの）があれば、抗原：ＩｇＥ複合体が基質に結合された状態が維持されるような条件下で基質から取り除かれる。好適な条件はここで実施例の項に開示してあるが、上述したSambrook et alに概ね説かれている。指示分子は、抗原に結合したＩｇＥに選択的に結合することができ、この指示分子を検出可能マーカー（好ましくは酵素標識、比色標識、蛍光標識、放射性同位体、又は、ビオチン又はアビジン系などのリガンド）に結合させておくことができ、基質に加えてインキュベートすることで、この指示分子と抗原：ＩｇＥ複合体との間の複合体を形成させる。過剰な指示分子を取り除き、必要に応じて現像主薬を加え、基質を検出装置にかけて分析する。この実施例のために好適な指示分子はＦｃεＲ分子であるが、好ましくはビオチン、蛍光標識又は酵素標識に結合されたものであるとよい。
ある一つの実施例では、ＦｃεＲ分子が、例えばマイクロタイタ皿のウェル又はディップスティックなどの基質上に固定されることにより、捕獲分子として用いられる。動物から採取した生体試料をこの基質に施し、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体が基質に結合した状態で形成されるのに適した条件下でインキュベートする。結合しなかった余分な物質があれば、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体が基質に結合された状態が維持されるような条件下で基質から取り除かれる。このＦｃεＲに結合したＩｇＥに選択的に結合することができる指示分子を基質に加え、インキュベートすることで、この指示分子と、ＦｃεＲ分子：ＩｇＥ複合体との間の複合体を形成させる。好ましくは、この指示分子を検出可能マーカー（好ましくは酵素標識、比色標識、蛍光標識、放射性同位体、又はビオチン又はアビジン系のリガンド）に結合させておくとよい。過剰な指示分子を取り除き、必要に応じて現像主薬を加え、基質を検出装置にかけて分析する。この実施例のために好適な指示分子は、生体試料中のＩｇＥ又は抗ＩｇＥイソタイプ又はイディオタイプ抗体に結合することとなる抗原であるとよいが、いずれの場合もフルオレセイン又はビオチンに結合させておくことが好ましい。
ある一つの実施例では、抗ＩｇＥ抗体（例えばイソタイプ又はイディオタイプ特異抗体）が、例えばマイクロタイタ皿のウェル又はディップスティックなどの基質上に固定されることにより、捕獲分子として用いられる。動物から採取した生体試料をこの基質に施し、抗ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体が基質に結合した状態で形成されるのに適した条件下でインキュベートする。結合しなかった余分な物質があれば、抗ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体が基質に結合された状態が維持されるような条件下で基質から取り除かれる。ＦｃεＲ分子を基質に加え、インキュベートすることで、このＦｃεＲ分子と、抗ＩｇＥ抗体：ＩｇＥ複合体との間の複合体を形成させる。好ましくは、このＦｃεＲ分子を検出可能マーカー（好ましくはビオチン、酵素標識又は蛍光標識）に結合させておくとよい。過剰なＦｃεＲ分子を取り除き、必要に応じて現像主薬を加え、基質を検出装置にかけて分析する。
一実施例では、本発明の免疫吸着検定法は捕獲分子を利用しない。この実施例では、動物から採取した生体試料を基質、例えばマイクロタイタ皿のウェル又はディップスティックなどに施し、ＩｇＥが基質に結合するのに適した条件下でインキュベートする。体液中に存在する何らかのＩｇＥが基質上に固定される。結合しなかった余分な物質があれば、ＩｇＥが基質に結合された状態が維持されるような条件下で基質から取り除かれる。ＦｃεＲ分子を基質に加え、インキュベートすることで、このＦｃεＲ分子とＩｇＥとの間の複合体を形成させる。好ましくは、このＦｃεＲ分子を検出可能マーカー（好ましくはビオチン、酵素標識又は蛍光標識）に結合させておくとよい。過剰なＦｃεＲ分子を取り除き、必要に応じて現像主薬を加え、基質を検出装置にかけて分析する。
ＩｇＥを検出するもう一つの好適な方法はラテラルフロー検定法であるが、その例はPronovost氏らによる１９９５年６月１３日発行の米国特許第５，４２４，１９３号、Imrich氏らによる１９９５年５月１６日発行の米国特許第５，４１５，９９４号、Miller氏らによる１９９４年１２月２２日公開のＷＯ９４／２９６９６号、及びPawlak氏らによる１９９４年１月２０日公開のＷＯ９４／０１７７５号に開示されており、これらの各特許公報の全文を参考文献としてここに編入しておく。ある一つの実施例では、生体試料をラテラルフロー装置に配するが、このラテラルフロー装置には以下の構成要素が含まれる。即ち（ａ）流路を規定する支持構造、（ｂ）抗原に結合させたビードを含む標識試薬、この標識試薬は支持構造の標識域内に含浸されている、及び（ｃ）ＩｇＥ結合組成物を含む捕獲試薬、である。好適な抗原にはここに開示されたものが含まれる。捕獲試薬は、標識試薬が標識域から捕獲域に流れ込めるような態様で、標識域に流体的に接続する、標識試薬の下流にあたる捕獲域内に配置される。支持構造は、標識域から捕獲域へというビードの流れを妨げない材料を含む。支持構造として用いるのに好適な材料にはイオン（即ち陰イオン又は陽イオン）材料が含まれる。このような材料の例には、ニトロセルロース（ＮＣ）、ＰＶＤＦ、カルボキシメチルセルロース（ＣＭ）があるが、これらに限定されるものではない。支持構造は左右の流路を規定すると共に複数の域、即ち標識域及び捕獲域、に分割される。この装置には、さらに、流路に沿って配された試料受容域を含めることができ、より好ましくはこの試料受容域は標識試薬の上流に来るとよい。支持構造内の流路は、捕獲域の下流、好ましくは流路の終点になる支持構造部分を、標識域及び捕獲域から余分な液体を吸収することのできる吸収剤に接触させることにより、形成される。
この実施例では、生体試料は、支持構造の一部を含む試料受容域に施される。標識域が試料を試料受容域から受け取ると、この試料は流路により下流に向けられる。標識域はＩｇＥに結合する標識試薬を含む。好適な標識試薬は、例えばラテックス・ビードなどの樹脂性ビードの基質に、直接又はリンカーを介して結合された抗原である。基質にはさらに検出可能マーカー、好ましくは比色マーカーが含まれる。典型的には、標識試薬は乾燥又は凍結乾燥により支持構造に含浸される。試料構造はさらに標識域の下流にある捕獲域を含む。この捕獲域が標識試薬を標識域から受け取ると、この試薬は流路により下流に向けられる。捕獲域は捕獲試薬、この場合には上に開示したようにＦｃεＲ分子を含有し、このＦｃεＲ分子により、抗原と複合体を形成したＩｇＥが捕獲域に固定される。捕獲試薬は、好ましくは乾燥又は凍結乾燥により支持構造に固定されているとよい。標識試薬は捕獲域内に蓄積するが、この蓄積を、視覚又は光学的検出装置により評価する。
別の実施例では、ＩｇＥを検出するのに用いるラテラルフロー装置は、（ａ）流路を規定する支持構造、（ｂ）上述したようなＦｃεＲ分子を含む標識試薬、ただしこの標識試薬は支持構造の標識域内に含浸されている、及び（ｃ）抗原を含む捕獲試薬、ただしこの捕獲試薬は、標識試薬が標識域から捕獲域に流れ込めるような態様で、標識域に流体的に接続する、標識試薬の下流にあたる捕獲域内に配置される、を含む。この装置は好ましくは、流路に沿って、好ましくは標識試薬の上流に試料受容域をさらに含むとよい。またこの装置がさらに、流路の終点に配置された吸収剤を含むことが好ましい。
本発明の一実施例は阻害検定法であり、この方法では、推定上のＩｇＥ含有組成物中のＩｇＥの存在は、このような組成物を、本発明のＦｃεＲ分子と、このＦｃεＲ分子に結合することが公知の分離されたＩｇＥとに、加えることにより判定される。推定上のＩｇＥ含有組成物中のＩｇＥの存在を示す、公知のＩｇＥへのＦｃεＲ分子の結合がないこと。
本発明はさらに、開示された検出方法のそれぞれに基づいてＩｇＥを検出するためのキットが含まれる。一実施例は、ヒトＦｃεレセプタ（ＦｃεＲ）分子と、イヌＩｇＥ、ネコＩｇＥ及び／又はウマＩｇＥを含むＩｇＥを検出する手段とを含む、ＩｇＥを検出するためのキットである。適したかつ好適なＦｃεＲ分子はここに開示されている。適した検出方法には、ＦｃεＲ分子又はＩｇＥのいずれかに結合する、ここで開示された化合物が含まれる。本発明において好適なキットには、ここで開示された抗原の一つ又はそれ以上を含む検出手段と、ここで開示されたＩｇＥに選択的に結合することのできる抗体と、及び／又は、ＦｃεＲ分子に結合された検出可能マーカーに結合可能な化合物（例えば、検出可能マーカーがビオチンである場合はアビジン、ストレプトアビジン及びImmunoPure▲Ｒ▼NeutrAvidin）とがさらに含まれる。このような抗原は、好ましくは、イヌ、ネコ及び／又はウマを含む動物中でＩｇＥ抗体の産生を誘起するものであるとよい。
本発明のキットの好適な実施例は、例えばここで開示されたもののような蚤アレルゲンを含む蚤アレルゲンキットである。蚤アレルゲンキットで用いるのに特に好適な蚤アレルゲンには、蚤唾液生成物及び蚤唾液たんぱく質がある。
本発明において別の好適なキットは、合衆国のあらゆる地域に共通のアレルゲンと、本発明のヒトＦｃεＲ分子とを含む一般的アレルゲンキットである。ここで用いられる場合の「一般的アレルゲン」キットとは、（即ち、基本的には合衆国の特定の地域に限られるのではなく）概ね合衆国全体を通じて見られるアレルゲンを含むキットを言う。一般的アレルゲンキットは、一個のキットを用いれば、合衆国の大部分の地理的位置にある動物を調べることができるため、地域アレルゲンキットに比べて有利である。本発明の一般的アレルゲンキットで用いるのに適したかつ好適な一般的アレルゲンには、ここで開示されたような一般的アレルゲンがある。
本発明のもう一つの好適なキットは、牛肉、鶏肉、豚肉、例えばタラ、ハリバ又は及びマグロなどの魚肉の混合物、卵、牛乳、ビール酵母、全粒小麦、トウモロコシ、ダイズ、チーズ及び米を含む食物アレルゲンと、本発明のヒトＦｃεＲ分子とを含む食物アレルゲンキットである。好ましくは、牛肉、鶏肉、豚肉、魚肉、トウモロコシ及び米は調理されたものであるとよい。
本発明の好適なキットには、アレルゲンが基質に固定されたものが含まれる。キットが二つ又はそれ以上の抗原を含む場合、このキットには、それぞれが一つの抗原を含む一つ又はそれ以上の組成物を含めることができる。従って、各抗原を別々に調べることが可能である。キットにはさらに、ＩｇＥのための二つ又はそれ以上の診断試薬、別の分離されたＩｇＥ抗原、及び／又は、ここで開示されたような抗体を含めてもよい。特に好適なのは、ラテラルフロー検定フォーマットで用いられるキットである。ラテラルフロー検定キットに、一つ又はそれ以上のラテラルフロー検定装置を含めることができることは本発明の範囲内である。複数のラテラルフロー装置をそれぞれの端部に相互に取り付けることで扇のような構造を形成してもよい。
具体的には、本発明の方法及びキットは、ＩｇＥのレベルが変化することに関連した、動物の異常な状態を診断するのに有用である。診断するのに特に好適な状態には、アレルギー、寄生生物感染及び新形成がある。例えば、本発明の方法及びキットは、このような方法又はキットが蚤唾液抗原の利用を含む場合、蚤アレルギー性皮膚炎（ＦＡＤ）を検出するのに特に便利である。ＦＡＤは蚤に噛まれることに対する過敏反応であると定義されている。好ましくは、推定上のＩｇＥ含有組成物は、ＦＡＤを有すると疑われる動物から得られるとよい。好適な動物にはここで開示されたものがあるが、イヌ及びネコがより好ましい。加えて、本発明の方法及びキットは、このような方法又はキットに、例えばＤｉ３３などの蠕虫抗原の利用が含まれる場合、蠕虫感染、特にイヌ糸状虫感染を検出するのに特に有用である。好ましくは、推定上のＩｇＥ含有組成物は、蠕虫感染の疑われる動物から得られるとよい。好適な動物にはここで開示されたものがあるが、イヌ及びネコがより好ましい。
以下の実施例は実例を挙げることを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を限定すべく意図されてはいない。
実施例
実施例１．
本実施例では、ヒトＦｃεレセプタのα鎖の切断部分を発現する組換えバキュロウィルスの構築を説明する。
バキュロウィルス多面体転写制御配列に有効に連結させた、ＦｃεＲα鎖の細胞外ドメインをコードする核酸分子を含む組換え分子ｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612を以下の方法で作成した。ヒトＦｃεレセプタの全長アルファ鎖（α鎖）をコードするｃＤＮＡクローンをJean-Pierre Kinet博士（マサチューセッツ州ケンブリッジ、ハーバード大学）から得た。このｃＤＮＡクローンは、ここでｎｈＦｃεＲα1198と呼ばれる約１１９８個のヌクレオチドのインサートを含んでいた。ｎｈＦｃεＲα1198のコドン鎖の核酸配列をここでは配列同定番号第１番で示す。配列同定番号第１番を翻訳すると、核酸分子ｎｈＦｃεＲα1198は、開始コドンが配列同定番号第１番のヌクレオチド１０７番からヌクレオチド１０９番にあり、終了コドンが配列同定番号第１番のヌクレオチド８７８番からヌクレオチド８８０番にある開放読み取り枠を想定すると、配列同定番号第２番のアミノ酸配列を有する、ここではＰｈＦｃεＲα257と呼ばれる、約２５７個のアミノ酸から成る全長ヒトＦｃεレセプタα鎖たんぱく質をコードしていることが分かる。配列同定番号第１番の相補体はここでは配列同定番号第３番で表される。ここでＰｈＦｃεＲα232と示される提案される成熟たんぱく質（即ちシグナル配列が切り取られたＦｃεＲα鎖）は、ここで配列同定番号第６番で表される約２３２個のアミノ酸を含んでいる。ＰｈＦｃεＲα232をコードする核酸分子はここではｎｈＦｃεＲα699と示され、そのコドン鎖は配列同定番号第７番で表される。
ＦｃεＲα鎖の細胞外ドメインの分泌型を作成するために、ｎｈＦｃεＲα1198によりコードされる疎水性膜貫通ドメイン及びＦｃεＲα鎖の細胞質側の尾を以下のように取り除いた。約６１２個のヌクレオチドから成る、ＦｃεＲα鎖細胞外ドメイン核酸分子含有フラグメントを、ｎｈＦｃεＲα1198から、核酸配列５‘ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＣＣＡＴＧＧ３’（配列同定番号第８番と示す）を有する、BamHI部位を含む前方プライマＥＪＨ０４０と、核酸配列５‘ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＴＡＣＡＧ３’（ここでは配列同定番号第９番と示す）を有する、EcoRI部位を含む後方プライマＩｇＥアンチセンスとを用いてＰＣＲ増幅した。その結果のＰＣＲ産物をBamHI及びEcoRIで切断してｎｈＦｃεＲα612を作成した。核酸分子ｎｈＦｃεＲα612は、ヒトＦｃεＲα鎖の細胞外ドメインをコードする、配列同定番号第１番のヌクレオチド１０７番からヌクレオチド６９７番までに延びる約５９１個のヌクレオチド断片を含んでいたが、この断片はここでは核酸分子ｎｈＦｃεＲα591と示され、そのコドン鎖は配列同定番号第１０番の核酸配列を有するものである。配列同定番号第１０番を翻訳すると、核酸分子ｎｈＦｃεＲα612は、配列同定番号第１１番のアミノ酸配列を有する、ここではＰｈＦｃεＲα197と呼ばれる、約１９７個のアミノ酸から成るＦｃεＲたんぱく質をコードしていることが分かる。核酸分子ｎｈＦｃεＲα612は、配列同定番号第１３番のアミノ酸配列を有する、ここではＰｈＦｃεＲα172と示される、リーダー配列を持たない分泌可能型のヒトＦｃεＲα鎖をコードしている。ＰｈＦｃεＲα172のためのコドン領域はｎｈＦｃεＲα516と示され、そのコドン鎖は配列同定番号第１２番で示される核酸配列を有する。配列同定番号第１２番の相補体はここでは配列同定番号第１４番で表される。
ＰｈＦｃεＲα197の産生を命令できるバキュロウィルス組換え分子を作成するために、核酸分子ｎｈＦｃεＲα612をｐＶＬ１３９２バキュロウィルスシャトルプラスミド（カリフォルニア州サンディエゴ、ファーミンジェン社から入手可能）の非反復BamHI及びEcoRI部位にサブクローンして、ここでｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612と呼ばれる組換え分子を作成した。その結果得られた組換え分子ｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612は制限マッピングにより、インサートの方向が正しいかを確認された。
実施例２．
本実施例ではＰｈＦｃεＲα172たんぱく質の作成を説明する。
組換え分子ｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612を直線バキュロゴールドバキュロウィルスＤＮＡ（ファーミンジェン社から入手可能）に同時トランスフェクトさせ、以下の方法を用いてTrichoplusia ni細胞（カリフォルニア州サンディエゴ、インビトロジェン社から入手可能：High FiveTM細胞）に入れた。約１．５リットルの無血清ex-Cell Medium（インビトロジェン社から入手可能）の培養液に媒質１ｍｌ当り約１×１０6の細胞を接種した。Trichoplusia ni細胞に、組換え分子ｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612を、１細胞当り約２から約５粒子形成単位（ｐｆｕ）の感染多重度（ＭＯＩ）になるように感染させて組換え細胞Trichoplusia ni−ｐＶＬ−ｎｈＦｃεＲα612を作成した。この感染を制御された温度２７℃で４８時間進行させて組換えたんぱく質ＰｈＦｃεＲα172を生成した。感染後、遠心分離により細胞を媒質から分離し、媒質を−７０℃で凍結させた。
直前に説明した培養媒質から、セファロース４Ｂに結合させた骨髄腫細胞株Ｕ２６６ＤＩ（アメリカン・ティシュー・タイプ・カタログＴＩＢ１９６番）の産生したＩｇＥ抗体を用いたアフィニティー・クロマトグラフィーにより、ＰｈＦｃεＲα172を精製した。このアフィニティーで精製されたＰｈＦｃεＲα172のアミノ酸組成及びＮ末端アミノ酸配列を当業において標準的な方法を用いて調べた。その結果から、ＰｈＦｃεＲα172はTrichoplusia ni細胞により正しく加工されていることが判明した。
実施例３．
本実施例では、組換えヒトＦｃεＲアルファ鎖たんぱく質のビオチニル化を説明する。
実施例２で上述したように調製され、アフィニティ精製された組換えたんぱく質ＰｈＦｃεＲα172を以下のようにビオチニル化した。約４４０マイクログラム（μｇ）のＰｈＦｃεＲα172を、約２００マイクロリットル（μｌ）の０．１ＭのＮａＩＯ4を含有する約１．５ミリリットル（ｍｌ）の酢酸緩衝液（０．１ＭのＮａＡｃ、ｐＨ５．５）中に希釈した。この混合液を約２０分間、氷上でインキュベートし、約２μｌのグリセロールをインキュベート後に加えた。次にこの混合液を、３ｍｌのSlide-A-Lyzerカセット（イリノイ州ロックフォード、ピアス社から入手可能）に入れた約２リットルの酢酸緩衝液で２回、それぞれ約２時間の間、透析した。約３．７２μｇのビオチン-LC-ヒドラジド（ピアス社から入手可能）を約２００μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、このカセットに注入した。次にこのカセットを室温で約２時間震盪させた。インキュベート後、組換えたんぱく質及びビオチンを含むこの混合液を３回、初回は約１８時間、次の二回は約２時間、それぞれ５℃で、リン酸緩衝生理食塩水で透析した。ビオチニル化したこのたんぱく質を透析液から回収したが、これをここではＰｈＦｃεＲα172-BIOTと呼ぶこととする。
実施例４．
本実施例では、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いた固相ＥＬＩＳＡでのイヌＩｇＥの検出を説明する。
二枚のイムロンIIマイクロタイタ・プレート（ヴァージニア州アレクサンドリア、ダイナテック社から入手可能）のウェルに、図１に示すような約１００μｌ／ウェルの様々な濃度の精製されたイヌＩｇＥの二部にした試料で被膜を施した。このイヌＩｇＥは、例えばヘテロハイブリドーマ２．３９（Gebhard et al., Immunology 85:429-434, 1995に説かれている）などのイヌＩｇＥ産生ハイブリドーマから得て、ＣＢＣ緩衝液（１５ｍＭのＮａ2ＣＯ3及び３４．８ｍＭのＮａＨＣＯ3、ｐＨ９．６）中に希釈した。被膜されたプレートを４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、このイヌＩｇＥ含有溶液を各プレートから取り出し、プレートをブロットして乾燥させた。次にこれらプレートを、０．２５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＢ）溶液約２００μｌ／ウェルを用いて遮断した。その後これらのプレートを自動洗浄器（ダイナテック社から入手可能）を用いて０．０５％のトウィーン−２０ＰＢＳ溶液（ＰＢＳＴ）で４回、洗浄した。０．０５％のトウィーン−２０の加わったＰＢＳＢ（ＰＢＳＢＴ）中４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（約１４５μｇ／ｍｌ：実施例３で説明したもの）の１：４０００希釈液が約１００μｌ／ウェルになるようにした実験試料を、イヌＩｇＥで被膜した一方のプレートの各ウェルに加えた。約１００μｌのビオチニル化抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体Ｄ９（ウィスコンシン州マディソン、ウィスコンシン大学のDeBoer博士から進呈いただいた）から成る対照試料は、イヌＩｇＥで被膜した他方のプレートの各ウェルに加えられた。これらのプレートを１時間、室温でインキュベートした後、ＰＢＳＴで４回、洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた約１００μｌの約０．２５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（メリーランド州ガイザーズバーグ、カークガード・アンド・ペリー・ラボラトリーズ（ＫＰＬ）社から入手可能；ＰＢＳＴで希釈）を、実験又は対照試料を容れた各ウェルに加えた。次にこれらのプレートを１時間、室温でインキュベートし、ＰＢＳＴで４回、洗浄した。予め室温まで暖められた約１００μｌのＴＭＢ基質（ＫＰＬ社から入手可能）を加えた。さらにこれらプレートを１０分間、室温でインキュベートした後、約１００μｌ／ウェルの停止液（ＫＰＬ社から入手可能）を加えた。停止液を加えてから１０分以内に４５０ｎｍでのウェルの光学密度をSpectramax Microtiter Plate（モラキュラー・デバイセズ社から入手可能）で読んだ。
図１に示されたその結果から、固相検定法では、ヒトＦｃεＲのアルファ鎖は、イヌＩｇＥ（Ｄ９：開環）に特異的に結合する対照抗体と同様な態様でイヌＩｇＥ（閉環）の存在を検出するものであることが分かる。
実施例５．
本実施例では、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いた植物アレルゲン特異イヌＩｇＥの検出を説明する。
イムロンIIマイクロタイタ・プレート（ダイナテック社から入手可能）の複数のウェルに、双方ともＣＢＣ緩衝液中に希釈した、１μｇ／ｍｌのナガハグサアレルゲンを約１００μｌ／ウェルになるように、又は、１μｇ／ｍｌのグリーンアッシュ（原語：Green Ash）アレルゲンを約１００μｌ／ウェルになるようにして（両方ともニューカロライナ州ルノアール、グリアー社から入手可能）、いずれかで被膜を施した。このプレートを４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。次に、二つの別々のプールのイヌ血清をこの抗原で被膜されたウェルに加えた。最初のプールは、アレルゲン反応性であると報告された８匹のイヌから分離された血清から成っていた。二番目のプールは、アレルゲン非反応性であると報告された８匹のイヌから分離された血清から成っていた。各プールの血清を１：１０又は１：１００にＰＢＳＴで希釈した。約１００μｌの各濃度の各希釈血清試料をウェルに加え、１時間、室温でインキュベートした。次にこのプレートを４回、ＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳＢＴ中に含まれた、４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（実施例３で説明したもの）の１：４０００希釈液を約１００μｌ／ウェルになるように、抗原で被膜したウェルに加えた。このプレートを１時間、室温でインキュベートした。次にこのプレートを４回、ＰＢＳＴで洗浄した。ＰＢＳＴ中に含まれた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ピアス社から入手可能）に結合させた約０．２５μｇ／ｍｌのニュートラビジンを約１００μｌ／ウェルになるように加えた。このプレートを１時間、室温でインキュベートした。次にこのプレートを洗浄し、プレートに結合したニュートラビジンの存在を実施例４で説明した方法を用いて検出した。
図２に示された結果から、ヒトＦｃεＲのアルファ鎖は、一般の雑草アレルゲン又は一般の高木アレルゲンに特異的に結合するイヌＩｇＥ抗体の存在を検出するものであることが分かる。加えて、イヌＩｇＥ抗体の検出は線量依存的である。
実施例６．
本実施例では、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いた総イヌＩｇＥの検出を説明する。
イムロンIIマイクロタイタ・プレート（ダイナテック社から入手可能）の複数のウェルに、ＣＢＣ緩衝液中に希釈した約１００μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌのＣＭＩ抗イヌＩｇＥ抗体＃６（カリフォルニア州ウェストサクラメント、カスタム・モノクローナルズ・インターナショナル社から入手可能）で被膜を施した。このプレートを４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。次に、多様な源から採取した血清試料の１：６０のＰＢＳＢＴ希釈液を約１００μｌ／ウェル、抗ＩｇＥ抗体で被膜された複数のウェルに加えた。試料には、（１）蚤唾液に対してアレルギーを持つことが判明しているイヌの血清、（２）D.immitisに感染しているイヌの血清、（３）及び（４）イヌアレルギー校正物質として規定されたイヌ血清のプール（アリゾナ州タンパ、バイオプロダクツＤＶＭ社から入手可能）、（５）ナガハグサアレルゲンへの結合の低い抗体を含んだイヌ血清のプール、（６）ナガハグサアレルゲンへの結合の高いイヌ血清のプール、（７）蚤唾液に対してアレルギーを持つことの判明しているイヌから得たイヌ血清のプール、この試料は加熱により不活化されている（５６℃で４時間）、（８）蚤唾液に対してアレルギーを持つことの判明しているイヌから得たイヌ血清のプール、又は（９）バリア施設で育てられたイヌから得たイヌ血清のプール（即ち陰性対照）、が含まれていた。さらに、実施例４で説明したイヌヘテロハイブリドーマを由来とするＩｇＥから成る一組の陽性対照試料をプレートに加えることで、標準曲線を作成した。このプレートを１時間、室温でインキュベートした後、ＰＢＳＴで４回、洗浄した。イヌＩｇＥの存在を、双方ともにＰＢＳＢＴ中に含有させた、４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（実施例３で説明したもの）による約１００μｌ／ウェルの１：４０００希釈液か、又は、約１μｇ／ｍｌのＣＭＩ抗イヌＩｇＥ抗体＃１９（カスタム・モノクローナルズ・インターナショナル社から入手可能）の約１００μ／ウェル、のいずれかを用いて検出した。プレートを１時間、室温でインキュベートした。次にこのプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた約０．２５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンに接触させ、再び洗浄し、プレートに結合したストレプトアビジンの存在を実施例４で説明した方法を用いて検出した。対照試料について得られた光学密度の読み取り値を用いて標準曲線を作成し、この曲線を用いてテスト試料を容れたウェルに結合した総ＩｇＥを判定した。
図３に示されたその結果から、多様なイヌ血清から得られたイヌＩｇＥが、イヌＩｇＥに特異的に結合する抗体を用いるのと同様な態様でヒトＦｃεＲのアルファ鎖を用いて検出されることが分かる。加熱処理された試料（試料７）中に検出可能な量のＩｇＥが存在しないことは、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTにより検出される抗体がＩｇＥであることを示すものである。加えて、この結果から、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTはアレルゲンナガハグサ、試料５及び６）や、寄生生物抗原（D.immitis、試料２）に結合するＩｇＥを検出するための有効な試薬であることが分かる。
実施例７．
本実施例では、蚤唾液に対してアレルギーを持つことの判明しているイヌから分離されたイヌ血清中のイヌＩｇＥを、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いて検出することを説明する。
イムロンIIマイクロタイタ・プレートの複数のウェルに、ＣＢＣ緩衝液中に希釈した約１００μｌ／ウェルの様々な濃度の蚤唾液組換えたんぱく質ｆｓｐＮ（上述したＰＣＴ特許公報ＷＯ９６／１１２７１号に説かれたもの、濃度を図４に示す）で被膜を施した。このプレートを４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。蚤唾液に特異的に結合するＩｇＥを産生することが判明している、イヌから分離された血清のプールの、ＰＢＳＢＴ中１：１０の希釈液が約１μｌ／ウェル。いくつかのウェルには、バックグラウンドの結合レベルが判定できるようにイヌ血清を容れなかった。このプレートを１時間、室温でインキュベートした後、ＰＢＳＴで４回、洗浄した。ＰＢＳＢＴ中に含有させた、４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（実施例３で説明したもの）による１：４０００希釈液を約１００μｌ／ウェルになるように加えた。プレートを１時間、室温でインキュベートした。次にこのプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた約０．２５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンに接触させ、再び洗浄し、プレートに結合したストレプトアビジンの存在を実施例４で説明した方法を用いて検出した。
図４に示されたその結果から、蚤唾液抗原に特異的に結合するイヌＩｇＥが、ヒトＦｃεＲのアルファ鎖を用いて検出されることが分かる。
実施例８．
本実施例では、蚤唾液に対してアレルギーを持つことが判明しているイヌ、イヌ糸状虫に感染したイヌ、及び特定病原体除去（ＳＰＦ）イヌ、から分離したイヌ血清中の総イヌＩｇＥをＰｈＦｃεＲα−ＢＩＯＴを用いて検出することを説明する。
イムロンIIマイクロタイタ・プレートの複数のウェルに、ＣＢＣ緩衝液中、約１μｇ／ｍｌのＣＭＩ抗イヌＩｇＥ抗体＃６（カスタム・モノクローナルズ・インターナショナル社から入手可能）で約１００μｌ／ウェルになるように被膜を施した。このプレートを４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。ＰＢＳＢＴ中にＩｇＥを含有した流体の別々の試料を、約１００μｌ／ウェルになるように、抗イヌＩｇＥ抗体で被膜された複数のウェルに加えた。試料には、（１）実施例４で説明したヘテロハイブリドーマから精製された１００μｇ／ｍｌのイヌＩｇＥ、（２）蚤唾液に対してアレルギーを持つことが判明しているイヌから採取された血清のプールの１：１０希釈液、（３）（２）と同じ血清プールだが加熱して不活化させた１：１０の希釈液、（４）臨床上蚤アレルギー性皮膚炎のあることが判明しているイヌから採取された血清の１：１０希釈液（イヌＣＰＯ２）、（５）加熱して不活化させたＣＰＯ２血清の１：１０希釈液、（６）イヌ糸状虫に感染したイヌから採取した血清の１：１０希釈液（イヌ４１７）、（７）加熱して不活化させた４１７血清の１：１０希釈液、（８）イヌ糸状虫に感染したイヌから採取した血清のプールの１：１０希釈液、（９）（８）と同じ血清プールであるが加熱して不活化させた１：１０希釈液、及び（１０）バリア施設で育てられたイヌから採取された血清のプール、が含まれていた。各試料はＰＢＳＢＴで希釈された。このプレートを１時間、室温でインキュベートした後、ＰＢＳＴで４回、洗浄した。ＰＢＳＢＴ中４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（実施例３で説明したもの）による１：４０００希釈液を約１００μｌ／ウェルになるように加えた。プレートを１時間、室温でインキュベートした。次にこのプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた約０．２５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンに接触させ、再び洗浄し、プレートに結合したストレプトアビジンの存在を実施例４で説明した方法を用いて検出した。
図５に示されたその結果から、蚤唾液に対してアレルギーのイヌから得たイヌＩｇＥと、イヌ糸状虫に感染したイヌから得たイヌＩｇＥはヒトＦｃεＲのアルファ鎖を用いて検出されることが分かる。加えて、加熱により不活化された血清試料中に比色シグナルがないことから、抗ＩｇＥ抗体に結合すると共に、ＦｃεＲアルファ鎖により検出される抗体はイプシロンイソタイプ抗体であり、その他のイソタイプではないことが分かる。
実施例９．
本実施例では、蚤唾液に特異的に結合するＩｇＥをＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いて検出することを説明する。
イムロンIIマイクロタイタ・プレートの複数のウェルに、ＣＢＣ緩衝液中、上述のＰＣＴ特許公報ＷＯ９６／１１２７１号に説かれた方法を用いて採集された蚤唾液約０．１μｇ／ｍｌを約１００μｌ／ウェルになるように被膜を施した。このプレートをインキュベートし、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。次に実施例８で説明したＩｇＥ含有試料をこの蚤唾液で被膜したプレートに施した。その後このプレートを実施例８で説明した方法を用いて処理した。
図６に示されたその結果から、血清中に含まれた、蚤唾液に特異的に結合するイヌＩｇＥはヒトＦｃεＲのアルファ鎖を用いて検出されることが分かる。加えて、加熱により不活化された血清試料中に比色シグナルがないことから、蚤唾液たんぱくに結合すると共に、ＦｃεＲアルファ鎖により検出される抗体はイプシロンイソタイプ抗体であることが分かる。
実施例１０．
本実施例ではネコＩｇＥをＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いて検出することを説明する。
イムロンIIマイクロタイタ・プレートの複数のウェルに、双方ともにＣＢＣ緩衝液中に含有させた、約１０μｇ／ｍｌのＤｉ３３たんぱく（上述した米国特許出願０８／７１５，６２８号に説明されている）か、又は１０μｇ／ｍｌのイヌ糸状虫の粗ホモジネートで、約１００μｌ／ウェルになるように被膜を施した。イヌ糸状虫の粗ホモジネートとは、ＰＢＳ虫に均質化した成虫イヌ糸状虫の清澄させた上清である。このプレートを４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。次に、２匹のイヌ糸状虫に感染したネコから採った血清試料を、Ｄｉ３３で被膜されたウェルと、イヌ糸状虫抗原で被膜されたウェルとに加えた。イヌ糸状虫に感染したネコ＃ＡＸＨ３又はネコ＃ＭＧＣ２の血清のＰＢＳＢＴによる１：１０希釈液を約１００μｌ／ウェルになるようにプレートに加えた。ネコ＃ＡＸＨ３及びネコ＃ＭＧＣ２の感染前採血の血清から成る陰性対照試料も、ＰＢＳＢＴ中１：１０の希釈度でプレートに加えた。イヌ糸状虫に感染したイヌから得た血清のプールから成る陽性対照試料も、ＰＢＳＢＴ中１：１０の希釈度でプレートに加えた。プレートを１時間、室温でインキュベートした後、ＰＢＳＴで４回、洗浄した。４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（実施例３で説明したもの）をＰＢＳＢＴで１：４０００に希釈して約１００μｌ／ウェルになるように加えた。プレートを１時間、室温でインキュベートした。その後このプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた約０．５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンの１：４０００希釈液に接触させ、再び洗浄し、プレートに結合したストレプトアビジンの存在を実施例４で説明した方法を用いて検出した。
図７に示された結果から、イヌ糸状虫の粗ホモジネート又はＤｉ３３たんぱくに特異的に結合するネコＩｇＥはヒトＦｃεＲのアルファ鎖を用いて検出されることが分かる。
実施例１１．
本実施例では、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いたネコＩｇＥの検出を説明する。
イムロンIIマイクロタイタ・プレートの複数のウェルに、実施例１０で説明したようなＤｉ３３のＣＢＣ緩衝液溶液で被膜を施した。このプレートを４℃で一晩インキュベートした。このプレートを、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。次に、２匹のイヌ糸状虫に感染したネコから採った血清試料を、Ｄｉ３３で被膜されたウェルに加えた。イヌ糸状虫に感染したネコ＃ＭＧＣ２の血清及びイヌ糸状虫に感染したネコの血清のプール、並びにこれらの血清をそれぞれ加熱して不活化した試料、のＰＢＳＢＴによる１：１０希釈液を約１００μｌ／ウェルになるようにプレートに加えた。イヌ糸状虫に感染したイヌから得た血清のプールから成る陽性対照試料も、ＰＢＳＢＴ中１：１０の希釈度でプレートに加えた。プレートを１時間、室温でインキュベートした後、ＰＢＳＴで４回、洗浄した。４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（実施例３で説明したもの）をＰＢＳＢＴで１：４０００に希釈して約１００μｌ／ウェルになるように加えた。プレートを１時間、室温でインキュベートした。その後このプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンに接触させ、再び洗浄し、プレートに結合したストレプトアビジンの存在を実施例４で説明した方法を用いて検出した。
図８に示された結果から、イヌ糸状虫抗原Ｄｉ３３に特異的に結合する、イヌ糸状虫感染ネコのネコＩｇＥが、ヒトＦｃεＲのアルファ鎖を用いて検出されることが分かる。加えて、加熱により不活化させた血清試料中に比色シグナルが存在しないことから、Ｄｉ３３たんぱく質に結合すると共にＦｃεＲアルファ鎖により検出される抗体はイプシロンイソタイプ抗体であることが分かる。
実施例１２．
本実施例では、ＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いた固相ＥＬＩＳＡにおけるウマＩｇＥの検出を説明する。
特定のアレルゲンに対してアレルギーを持つことが判明しているウマから採ったウマ血清と、同じアレルゲンに対してアレルギーを持たないことが判明しているウマから採ったウマ血清とを、以下のようにＰｈＦｃεＲα172-BIOTを用いてＩｇＥの存在について検定した。CanitecTMアレルゲン特異ＩｇＥキット（バイオプロダクツＤＶＭ社から入手可能）のNorth Atlantic/Ohio Valley Regional Panelプレートを、実施例４で説明したように遮断し、洗浄した。この二つのウマ血清の約１：１０希釈液の二つの試料をＰＢＳＢＴを用いて調製した。この二つの試料を先の遮断されたプレートに加え、プレートを１時間、室温でインキュベートした。このプレートを実施例４で説明したように洗浄した。４０μｇ／ｍｌのＰｈＦｃεＲα172-BIOT（実施例３で説明したもの）をＰＢＳＢＴ中で１：４０００にした希釈液を約１００μｌ／ウェルになるように各ウェルに加えた。その後にプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた約０．５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン溶液に接触させ、再び洗浄し、プレートに結合したストレプトアビジンの存在を実施例４で説明した方法を用いて検出した。
実施例９に示された結果から、特定のアレルゲンに対してアレルギーを持つことの判明しているウマから採ったウマＩｇＥは特定の植物に特異的に結合し、ダニアレルゲンがヒトＦｃεＲのアルファ鎖を用いて検出されることが分かる。
実施例１３．
本実施例では、ヒトＦｃεＲアルファ鎖をトランスフェクトさせた好塩基球を用いた固相ＥＬＩＳＡにおけるイヌＩｇＥの検出を説明する。
ヒトＦｃεＲアルファ鎖をコードする核酸分子でトランスフェクトしたラット好塩基球性白血病（ＲＢＬ）細胞（ここではＲＢＬ−ｎＦｃεＲ細胞と呼ぶこととする；Miller et al., Science 244:334-337, 1989に説かれている）を用いてイヌＩｇＥを以下のように検出した。１０％の仔ウシ血清を含有するアールの改良イーグル培地（ＥＭＥＭ−ＦＢＳ）に含有させた約４×１０4のＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞を９６ウェルの底の平らな組織培養プレートの各ウェルに加えた。このＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞を一晩かけて３７℃でインキュベートした。インキュベート後、このプレートをＰＢＳＴで４回、洗浄した。次に細胞を約２分、１ウェル当り約２００μｌの無水アルコールを用いて室温で固定した。その後プレートをＰＢＳＴで８回洗浄して残ったアルコールを取り除いた。
ＥＭＥＭ−ＦＢＳによる系列希釈液（濃度は図１０に示す）をイヌ糸状虫に感染したイヌから採った血清のプールを用いて調製した。ＥＭＥＭ−ＦＢＳによる系列希釈液（濃度は図１１に示す）を、蚤唾液に感作したイヌから採った血清のプールを用いて調製した。両方の血清プールを約４時間５６℃で加熱して不活化した別の試料も調製した。加熱処置した試料は上述のように希釈された。
各血清試料の各希釈液を約１００μｌ、固定されたＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞を含んだ別々のウェルに加え、このプレートを３７℃で約１時間インキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。１００μｌのＥＭＥＭ−ＦＢＳ中、約５μｇのマウスＩｇＧモノクローナル抗体抗イヌＩｇＥ抗体（即ちカスタム・モノクローナル抗体＃７１；カスタム・モノクローナル・インターナショナル社から入手可能）を各ウェルに加えた。プレートを約３０分間、３７℃でインキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回、洗浄した。１００μｌのＥＭＥＭ−ＦＢＳに入れた、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識したロバ抗マウスＩｇＧ（ペンシルバニア州ウェストグローブ、ジャクソン・ラボラトリーズ社から入手可能）を約１００ｎｇ、各ウェルに加え、プレートを約３０分間、室温でインキュベートした。インキュベート後、プレートをＰＢＳＴで４回、洗浄した。ＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞がイヌＩｇＥに結合可能であることを示す、プレートに結合した抗マウスＩｇＧの存在を、実施例４で説明した方法を用いて検出した。
図１０に示されたその結果から、イヌ糸状虫に感染したイヌのイヌＩｇＥ（◆）が、ヒトＦｃεＲのアルファ鎖を発現するＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞を用いて検出されることが分かる。さらに、このような加熱により不活化された血清試料（■）に比色シグナルがないことから見ても、ＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞上のＦｃεＲアルファ鎖により検出される抗体がイプシロンイソタイプ抗体であることが分かる。同様に、図１１に示された結果から、蚤唾液に感作したイヌのイヌＩｇＥ（◆）はヒトＦｃεＲのアルファ鎖を発現するＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞を用いて検出されることが分かる。さらに、このような加熱により不活化された血清試料（■）において比色シグナルがないことから、ＲＢＬ−ｈＦｃεＲ細胞上のＦｃεＲアルファ鎖により検出される抗体がイプシロンイソタイプ抗体であることが分かる。
配列表
本発明の様々な実施例を詳細に述べてきたが、当業者であればこれらの実施例に対する改良及び適応を想到されようことは明白である。しかしながら、このような改良及び適応は、以下の請求の範囲に記載された本発明の範囲内にあることを理解されたく、ここに明示しておく。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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