(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
前もっての凍結乾燥を受けていない治療上有効な量の抗体と、約ｐＨ４．８から約ｐＨ５．５の酢酸塩バッファーと、ポリソルベートと、非還元糖を含有し、緊張化量の塩を含まない安定な水性医薬製剤。
【請求項２】
等張である請求項１記載の製剤。
【請求項３】
約２−８℃の温度で少なくとも１年間安定である請求項１に記載の製剤。
【請求項４】
製剤の凍結と解凍の後に安定である請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
約３０℃で少なくとも１ヶ月間安定である請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
非還元糖がトレハロースである請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
非還元糖がスクロースである請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
抗体が抗体断片である請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
抗体断片がＦ（ａｂ’）2である請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
抗体がＣＤ１８に結合する請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
約２−８℃の温度で少なくとも２年間安定である請求項１に記載の製剤。
【請求項１２】
製剤中の抗体濃度が約０．１ないし約５０ｍｇ／ｍＬである請求項１に記載の製剤。
【請求項１３】
抗体がＣＤ２０に結合する請求項１に記載の製剤。
【請求項１４】
酢酸塩が約５−３０ｍＭの量で存在する請求項１３に記載の製剤。
【請求項１５】
酢酸塩が１０−３０ｍＭの量で存在する請求項１４に記載の製剤。
【請求項１６】
防腐剤を更に含有する請求項１３に記載の製剤。
【請求項１７】
防腐剤がベンジルアルコールである請求項１６に記載の製剤。
【請求項１８】
抗体が約３０−５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する請求項１３に記載の製剤。
【請求項１９】
バッファーが約ｐＨ４．８から約５．５の１０−３０ｍＭの酢酸塩、非還元糖が約２−１０％ｗ／ｖの量のトレハロースであり、ポリソルベートが約０．０１−０．１ｖ／ｖ％の量であり、製剤が防腐剤としてベンジルアルコールを含有し、製剤が約２−８℃の温度で少なくとも２年間安定である請求項１８に記載の製剤。
【請求項２０】
前もっての凍結乾燥を受けていない治療上有効な量の抗体と、約ｐＨ４．８から約５．５の酢酸塩バッファーと、ポリソルベートと、非還元糖を含有し、緊張化量の塩を含有しない安定な水性医薬製剤を収容する容器を具備してなるキット。
【請求項２１】
前もっての凍結乾燥を受けていない治療上有効な量の抗体と、約ｐＨ４．８から約５．５の酢酸塩バッファーと、ポリソルベートと、非還元糖を組合わせることにより、水性医薬製剤において抗体を安定化させる方法であって、製剤が緊張化量の塩を含まない方法。
【請求項２２】
酢酸塩バッファーが約１０−３０ｍＭの濃度であって、トレハロースが少なくとも１３４ｍＭの濃度である、請求項６に記載の製剤。
【請求項２３】
抗体がＣＤ１８又はＣＤ２０に結合する請求項２２に記載の製剤。
【請求項２４】
ＣＤ１８結合抗体がＦ（ａｂ’）2断片である請求項２３に記載の製剤。
【請求項２５】
請求項２３に記載の製剤を収容する容器を具備してなるキット。
【請求項２６】
酢酸塩バッファーがｐＨ５．０である請求項１に記載の製剤。
【請求項２７】
抗体がＣＤ２０に結合する請求項２６に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
この発明は抗体を含有する安定な水性医薬製剤に関するものである。
関連した開示の説明
過去１０年において、生物工学における進歩は組換えＤＮＡ技術を使用して医薬用途の様々なタンパク質を作り出すことを可能にした。タンパク質は伝統的な有機及び無機薬剤よりも大きく、より複雑であるため（すなわち、複雑な三次元構造に加えて複数の官能基を持つ）、そのようなタンパク質の製剤には特別な問題があった。タンパク質が生物活性を保ったままにするには、製剤は、タンパク質の複数の官能基を分解から保護すると同時に、タンパク質のアミノ酸の少なくともコア配列の高次構造上の完全性を無傷に保たなければならない。タンパク質の分解経路は、化学的不安定性（すなわち、新しい化学的実体を生じる結合形成又は開裂によるタンパク質の修飾に関わる任意の工程）又は物理的不安定性（すなわち、タンパク質のより高次の構造における変化）に関与し得る。化学的不安定性は、脱アミド、ラセミ化、加水分解、酸化、ベータ位脱離又はジスルフィド交換から生じ得る。物理的不安定性は、例えば変性、凝集、沈殿又は吸着から生じ得る。三つの最も一般的なタンパク質劣化経路はタンパク質凝集、脱アミド及び酸化である。Clelandら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 10（4）:307-377（1993）。
製薬用途に使用されるタンパク質に含まれるのは抗体である。治療に対して有用な抗体の例はＣＤ１８抗原に結合する抗体である。ＣＤ１８は、特に炎症の部位での、血管内皮への輸送と接着を媒介する白血球に制限された３つのヘテロダイマー膜インテグリンの共通のβサブユニットである（レビューには、Hynes, R.O.Cell, 69:11-25（1992）; Stoolman, Cell, 56:907-910（1989）; Jutilaら, Transplantation 48（5）:727-731（1989）; Springer,T.A., Nature 346:425-434（1990）;及びAlbeldaとBuck, FASEB J. 4:2868-2880（1990）を参照されたい）。ＣＤ１８及びＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ-１とも呼ばれる）を含むヘテロダイマーは、主に好中球、単球、及び血管内皮上のＩＣＡＭ-１との正常なその相互作用が接着と脈管構造に沿う細胞の「ローリング」を媒介する幾つかの白血球に見出される。虚血及び心拍出量の減少を同時に伴う重症の出血性外傷においては、（放出されたサイトカインに反応しての）早期（３０分以内）の好中球活性化とＭＡＣ-１のアップレギュレーションが好中球の「固着性」を増大させる。これは、究極的には更なる組織損傷と血管透過性の増大に至るプロテアーゼとスーパーオキシドの血管外遊走と放出に先行する（Hernandezら, Am.J.Physiol., 253（3 Pt2）:H699-H703（1987））。蘇生に続く再灌流は浮腫と壊死を悪化させ、多臓器障害及び死亡に至る。部分的に重症の虚血ウサギ耳外傷モデルにおけるＣＤ１８に対するモノクローナル抗体での早期の治療は再付着に続く組織壊死を軽減した（Vedderら, J.Clin.Invest. 81:939-944（1988））。ヒト化抗体は、〜２時間の間血液量の２／３を欠乏させて作り出した心拍出量が減少したアカゲザルにおいて多臓器損傷と死亡を低減する上で有効性を示した（Mileskiら, Surgery, 108（2）:206-212（1990））。これらは出血性ショックの急性治療用の抗ＣＤ１８抗体の治療的潜在性に対する点を研究している。
抗体がターゲッティングする興味ある他の抗原は、「Ｂｐ３５」としてもまた知られているＣＤ２０抗原である。ＣＤ２０は初期プレＢ細胞発生の間に発現され、形質細胞の分化まで残るヒトＢ細胞マーカーである。ＣＤ２０分子は細胞サイクルの開始と分化に必要とされる活性化過程の工程を調節し、通常は腫瘍性Ｂ細胞に非常に高いレベルで発現される。従って、ＣＤ２０表面抗原はＢ細胞リンパ腫を治療するための標的とされ得る。１９９８年４月７日に発行された米国特許第５７３６１３７号はＣＤ２０抗原を結合させるキメラ抗体「Ｃ２Ｂ８」とＢ細胞リンパ腫の治療へのその用途を記述している。
抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ２０抗体のような治療用途に好適な抗体を含有する安定な水性医薬製剤が当該分野で必要とされている。
発明の概要
従って、本発明は、前もっての凍結乾燥を受けていない治療上有効量の抗体、約４．５ないし約６．０の範囲のｐＨを維持するバッファー、界面活性剤及びポリオールを含有する安定な水性医薬製剤を提供する。好ましくは、製剤は少なくとも１年間、約２−８℃の温度で安定であり、及び／又は少なくとも１ヶ月間約３０℃の温度で安定であり、及び／又は製剤の凍結及び解凍に続いて安定である。
本発明はまた前もっての凍結乾燥を受けていない治療上有効量の抗体、約４．５ないし約６．０の範囲のｐＨを維持するバッファー、界面活性剤及びポリオールを含有する安定な水性医薬製剤を保持する容器を具備してなる製造品に関する。
なお更なる側面では、本発明は、前もっての凍結乾燥を受けていない治療上有効量の抗体、約４．５ないし約６．０の範囲のｐＨを維持するバッファー、界面活性剤及びポリオールを組合わせることにより、水性医薬製剤中において抗体を安定化する方法に関する。
更に他の側面では、本発明は、ここで開示した水性医薬製剤の治療上有効料を哺乳動物に投与することを含んでなる哺乳動物の治療方法に関し、ここで哺乳動物は製剤中の抗体での治療を必要とする疾患を持っている。抗体がＣＤ１８を結合させる場合、治療される疾患の例には出血性ショック、熱性外傷（例えば火傷から生じるもの）、発作（虚血及び出血性発作を含む）及び心筋梗塞が含まれる。抗ＩＬ８抗体に対しては、治療される疾患には、成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、血管量減少性ショック、潰瘍性大腸炎、及び関節リウマチのような炎症性疾患が含まれる。抗体がＣＤ２０を結合する場合、治療される疾患にはＢ細胞リンパ腫が含まれる。
本発明のこれらの側面及び他の側面は当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
図１Ａ及び１Ｂは、ｒｈｕＭＡｂのＣＤ１８重鎖（図１Ａ；配列番号：１）と軽鎖（図１Ｂ；配列番号：２）のアミノ酸配列を示す。図１Ａ中のイタリックの配列（配列番号：３）はロイシンジッパーの配列である。
図２Ａ及び２Ｂは、ｒｈｕＭＡｂのＣＤ１８重鎖（図２Ａ）と軽鎖（図２Ｂ）のハイドロフレックスプロットである。６のアミノ酸のウィンドウで平均化されたカイト-ドゥーリトル（Kyte-Doolittle）疎水性計算をタンパク質配列について行った。可動性の値は各残基の疎水性の生成物とその側鎖容量（また６つの残基のウィンドウに対して平均化）から推定した。可動性領域のＡｓｎ-Ｇｌｙ及びＡｓｎ-Ｓｅｒモチーフはより強固な構造におけるものよりも脱アミドしやすい。ＣＤＲもまた知られている。重鎖メチオニンと重鎖Ａｓｎ８４の殆どはＣＤＲの近くにある。
図３Ａと３Ｂは、３４０−３６０ｎｍ（図３Ａ）の範囲の平均吸光度により測定した指定の温度での５週間の貯蔵後の異なったｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８製剤における光散乱への貯蔵温度の影響、又はＡ２５２に対するＡ２７８の比（図３Ｂ）を示している。製剤Ｆ３中のｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８は不溶性の凝集物を形成する傾向にある。
図４は、３２０ｎｍでのビヒクルの吸光度に対して修正された２７８ｎｍでの吸光度により測定したｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８製剤のタンパク質濃度に対する貯蔵温度の影響を示す。
図５Ａと５Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により検定されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８製剤Ｆ２（図５Ａ）と製剤Ｆ５（図５Ｂ）の安定性に対する貯蔵温度の影響を示す。ｐＨ５（図５Ａ）に比較してｐＨ６（図５Ｂ）でより明白になったより小さいＭＷ種（矢印を参照）が現れた。
図６Ａと６Ｂは、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の安定性に対する貯蔵時間と温度の影響を示すもので、ＳＥＣにより検定した全ての製剤に対してピーク面積合計（図６Ａ）及び主ピーク％（図６Ｂ）を示している。ピーク面積合計において有意な変化は見られなかった。Ｆ１とＦ５は最も低い主ピーク％を維持した。
図７はｐＨ５でトレハースと共に酢酸塩中で処方されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８（Ｆ２）のＳＥＣからの主ピーク面積％のアレニウスプロットである。活性化エネルギー＝１９±６ｋｃａｌ／モル。
図８は疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により検定した異なるｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８製剤の４０℃での５週間の貯蔵の影響を示す。１７．５分での早期の溶出ピークと主ピークの先端の肩部は−７０℃の対照と比較して増大した。Ｆ２は両方の成分において最も少ない増加を示した（図９参照）。
図９はＨＩＣにより検定された製剤Ｆ２に対する異なった温度での５週間の貯蔵の影響を示す。−７０℃の対照と比較して、前の主ピークが明らかになった。
図１０は回収されたピーク面積合計を示すＨＩＣにより検定されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の安定性（５週間のデータ）に対する貯蔵温度の影響を示す。面積の減少の傾向は、より低く始まったＦ５を除いて、全ての製剤において貯蔵温度が増大すると認められた。
図１１は逆相疎水性液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）により検定された製剤Ｆ２に対する異なった温度での５週間の貯蔵の影響を示す。小さい部分的に分解した前の主ピーク成分（矢印を参照）は温度が高くなると増加し、その僅かに早い溶出している隣接部は変わらないままであった。
図１２は主ピークのパーセントを示すＲＰ-ＨＰＬＣにより検定されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の安定性に対する５週間の貯蔵の影響を示す。Ｆ２とＦ３は４０℃で５週間後の最も高い主ピーク％を示した。
図１３は、製剤Ｆ２に対するＲＰ-ＨＰＬＣ主ピーク％に基づくアレニウスプロットである。活性化エナルギー（〜２０ｋｃａｌ／モル）だけを、５℃でのκが非常に小さいため、これらのデータから近似した。ＳＥＣとイオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ）検定で得られたものと同様のようであった。
図１４Ａと１４Ｂは、ｐＨ５の製剤Ｆ２（図１４Ａ）とｐＨ６のＦ５（図１４Ｂ）について、ＩＥＸにより検定したｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の安定性に対する貯蔵温度の影響を示す。２つの前の主ピークは時間と温度の増加と共に増加し、ｐＨ６でより明白であった。２２分から２８分の隆起はカラムの洗浄による不純物による人為的結果である。
図１５は、ｐＨ５（Ｆ２）のトレハロースと共に酢酸塩中で処方したｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８のＩＥＸからの主ピーク面積％のアレニウスプロットである。活性化エネルギー＝２０±１０ｋｃａｌ／モル。
図１６は、メチオニン残基の位置を含むｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の３次元構造を示す。Ｍｅｔ６５とＭｅｔ８３は露出する一方、他のものは構造内に埋設されており、酸化を受けにくいと予想される。
図１７は、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８製剤の蛍光分光分析を示す。様々な製剤の発光スペクトルを、２８０ｎｍの励起波長を使用して、ＳＬＭ８０００蛍光メーターで得た。５００μＬの試料を石英キュベットに配し、２２℃で２ｎｍのバンド幅でスペクトルを得た。濃縮原液を０．１ｍｇ／ｍＬまで希釈して異なったｐＨで試料を調製し、２５℃で２４時間後に分析を実施した。抗体はｐＨ３以上で高次構造的に安定である。
図１８Ａと１８Ｂは、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の安定性に対するｐＨとタンパク質濃度の影響を示す。３ないし６のｐＨ範囲で０．５ないし２５ｍｇ／ｍＬの濃度範囲の製剤を２ヶ月間４０℃と−７０℃で安定に配された。分析をＩＥＸ（図１８Ａ）とＳＥＣ（図１８Ｂ）により実施した。ｐＨ５は、タンパク質の濃度に拘わらず、好適なｐＨであることが分かった。
図１９Ａ、１９Ｂ及び１９Ｃは、様々な温度でのＳＥＣ（図１９Ａ）、ＩＥＸ（図１９Ｂ）及びＭＡＣ-１結合（図１９Ｃ）によるｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の分解の動力学を示す。１０ｍＭの酢酸ナトリウム、８％のトレハロース、０．０１％のトゥイーン２０TM、ｐH５に入れた二つ組の試料を３ｃｃのガラスバイアルに調製し、示された温度で安定性のために配した。図１９Ｃでは、比活性は全Ｆ（ａｂ’）2ＥＬＩＳＡに対するＭＡＣ-１の結合の比であった。試料は４３週まで５℃と１５℃で安定であり、３０℃で１ヶ月まで安定である。示した時点で分析を実施した。
図２０は以下の実施例のｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８を生産するために使用したプラスミドｐＳ１１３０の構造を示す。
図２１Ａと２１ＢはｐＳ１１３０発現カセットの全長核酸配列（配列番号：９）とコード化アミノ酸配列（それぞれ配列番号：１０及び１１）を示す。
図２２は４９Ａ５生産株化細胞の誘導を示す。
図２３はｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８に対する発酵過程の概略図である。
図２４Ａと２４Ｂは、４０℃で保存したｐＨ５、６．５又は７．５での４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２５ｍＭのヒスチジン、０．０２％のポリソルベート製剤の凝集（図２４Ａ）及び酸化（図２４Ｂ）の速度に対するｐＨの影響を示す。
図２５は凍結-解凍で誘発されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０多用量製剤の凝集に対するトレハロースの過剰モル比の影響を示す。各製剤は４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２０ｍＭの酢酸塩、０ないし１０００：１のモル比のトレハロース、０．９％のべンジルアルコール及び０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０からなる。製剤１−４中のトレハロースの量は次の通りである：１＝０モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（０ｍＭのトレハロース）；２＝２５０モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（６７ｍＭのトレハロース）；３＝５００モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（１３４ｍＭのトレハロース）；及び４＝１０００モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（２６７ｍＭのトレハロース）。
図２６は、４週間まで４０℃で保存されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０の多用量製剤の透明度に対するトレハロース又は塩化ナトリウムの過剰モル比の影響を示す。製剤の組成は、４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２０ｍＭの酢酸塩、０ないし１０００：１のモル比のトレハロース又は塩化ナトリウム、０．９％のベンジルアルコール及び０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０である。ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０製剤に対する塩化ナトリウムの５００：１及び１０００：１のモル比の透明度は、これらの製剤の物理的外観のために４０℃で４週間後は測定されなかった。５００：１比の製剤は非常に乳白色であるが、１０００：１の比の製剤は、乳白流体に覆われた不透明な薄いゲル層からなる二相に分離した。塩化ナトリウムのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０製剤に対する１０００：１モル比のＯ.Ｄ.は４０℃で２週間後に２．７２であった。
図２７はＳＥＣ ＨＰＬＣにより分析された４０℃で貯蔵されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０多用量製剤の安定性に対するトレハロースの過剰モル比の影響を示す。製剤の組成は、４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２０ｍＭの酢酸塩、０−２６７ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール及び０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０である。製剤１−４中のトレハロースの量は次の通りである：１＝０モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（０ｍＭのトレハロース）；２＝２５０モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（６７ｍＭのトレハロース）；３＝５００モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（１３４ｍＭのトレハロース）；及び４＝１０００モルのトレハロース：１モルのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０（２６７ｍＭのトレハロース）。各時点でのパーセントモノマーはＴ＝０でのパーセントモノマーに対して正規化された。
図２８はＳＥＣ ＨＰＬＣにより測定された２年までの間、２−８℃で保存されたプロトタイプ液体ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０多用量製剤の安定性プロフィールを示す。製剤は、４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール及び０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０である。各時点でのパーセントモノマーはＴ＝０でのパーセントモノマーに対して正規化された。２年間２−８℃で保存された製剤の生物活性はＣＤＣ検定により測定して、参照対照に対して９９．２％であった。
好適な実施態様の詳細な説明
I.  定義
「医薬製剤」なる用語は、活性成分の生物活性を明解に効果的であるものとするような形態であり、製剤が投与される患者に対して毒性がある更なる成分を含まない製剤を指す。
「製薬的に許容可能な」賦形剤（媒体、添加剤）は、用いられる活性成分の効果的な用量を提供するために被検動物に合理的に投与することができるものである。
「安定な」製剤は、その中のタンパク質が貯蔵時においてその物理的安定性及び／又は科学的安定性及び／又は生物学的安定性を本質的に保持するものである。タンパク質の安定性を測定する様々な分析方法が当該分野において利用でき、例えば、Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee編, Marcel Dekker,Inc., New York, New York,Pubs.（1991）及びJones, A. Adv.Drug Delivery Rev. 10:29-90（1993）において概説されている。安定性は選択された時間の間、選択された温度で測定することができる。好ましくは、製剤は、少なくとも１ヶ月の間、室温（〜３０℃）又は４０℃で安定であり、及び／又は約２−８℃で少なくとも１年、好ましくは少なくとも２年の間、安定である。更に、製剤は、好ましくは製剤の（例えば−７０℃での）凍結及び解凍の後、安定である。
タンパク質は、色及び／又は透明性の視覚検査時に、又は紫外線散乱又はサイズ排除クロマトグラフィーにより測定したときに、凝集、沈殿及び／又は変性の兆候がないならば、医薬製剤中で「その物理的安定性を保持している」。
タンパク質は、ある時間での化学的安定性が、タンパク質が以下に定義されるようなその生物活性をなおも保持していると考えられるようなものであれば、医薬製剤中で「その化学的安定性を保持している」。化学的安定性は、タンパク質の化学的に変化した形態を検出し定量することにより検定することができる。化学的変化は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び／又はマトリックス補助レーザ脱着イオン化／フライト時間質量分析（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ＭＳ）を使用して評価することができるサイズ修飾（例えばクリッピング）を含みうる。化学的変化の他のタイプは、例えばイオン交換クロマトグラフィーにより評価することができる電荷の変化（例えば脱アミドの結果生じる）を含む。
抗体は、ある時間における抗体の生物活性が、例えば抗原結合検定により測定して、医薬製剤が調製された時に示された生物活性の約１０％以内（検定誤差範囲内）であれば、医薬製剤中において「その生物活性を保持している」。抗体に対する他の「生物活性」検定法は以下に詳細に説明する。
「等張」とは、対象の製剤がヒトの血液と本質的に同じ浸透圧を有していることを意味する。等張製剤は一般に約２５０ないし３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有している。等張性は例えば蒸気圧又は氷凍結型の浸透圧計を使用して測定することができる。
「ポリオール」は複数のヒドロキシル基を有する物質であり、糖（還元及び非還元糖）、糖アルコール及び糖酸を含む。ここで好適なポリオールは、約６００ｋＤ未満（例えば約１２０ないし約４００ｋＤの範囲）である分子量を有する。「還元糖」は、金属イオンを低減することができるかタンパク質中のリジンと他のアミノ基と共有的に反応できるヘミアセタール基を含むものであり、「非還元糖」は、還元糖のこれらの性質を有さないものである。還元糖の例はフルクトース、マンノース、マルトース、ラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、ラムノース、ガラクトース及びグルコースである。非還元糖は、スクロース、トレハロース、ソルボース、メレジトース及びラフィノースを含む。マンニトール、キシリトール、エリスリトール、スレイトール、ソルビトール及びグリセロールが糖アルコールの例である。糖酸については、Ｌ-グルコン酸とその金属塩が含まれる。製剤が凍結解凍上安定であることが望まれる場合は、ポリオールは、好ましくは、それが製剤中の抗体を不安定化させるような凍結温度（例えば−２０℃）で結晶化しないものである。スクロース及びトレハロースのような非還元糖がここで好適なポリオールであり、トレハロースが優れた溶液安定性を有しているため、スクロースよりも好ましい。
ここで使用する場合、「バッファー」は、酸塩基共役成分の作用によりｐＨの変化に抗する緩衝溶液を指す。本発明のバッファーは、約４．５ないし約６．０の範囲；好ましくは約４．８ないし約５．５の範囲；最も好ましくは約５．０のｐＨを有している。ｐＨをこの範囲に調節するバッファーの例には、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸バッファーが含まれる。凍結解凍上安定な製剤が望まれる場合は、バッファーは好ましくはリン酸塩ではない。
薬理学的な意味で、本発明において、抗体の「治療上有効な量」とは、治療に抗体が有効である疾患の予防又は治療に有効な量を指す。「疾患」とは抗体での治療による利益がある任意の症状である。これは、哺乳類の問題の疾患の素因になる病理的状態を含む慢性及び急性疾患又は疾病を含む。
「防腐剤」は、製剤中での細菌の活動を本質的に低減するために製剤中に含めることができる化合物であり、例えば多用途製剤の製造を容易にする。可能な防腐剤の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物）、及びベンゼトニウムクロリドが含まれる。防腐剤の他のタイプには、フェノール、ブチル及びベンジルアルコールのような芳香族アルコール、メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３-ペンタノール、及びｍ-クレゾールが含まれる。最も好適な防腐剤はベンジルアルコールである。
ここで使用する場合、「炎症性疾患」なる用語は、例えば白血球の流入及び／又は好中球走化作用により引き起こされる、炎症を生じる病理的状態を指す。炎症は、病原生物及びウィルスでの感染及び心筋梗塞又は脳卒中に続く外傷又は再灌流のような非伝染性手段、外来性抗原に対する免疫応答及び自己免疫応答により生じうる。炎症性疾患の例には、乾癬及び皮膚炎のような炎症性皮膚病；炎症性腸疾患関連応答（クローン病及び潰瘍性大腸炎など）；虚血性再潅流；成人呼吸困難症候群；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；血管炎、シェーゲン症候群、関節リウマチのような自己免疫疾患；白血球血管外遊出に関連する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害；敗血症又は外傷に続いて起こる多発性臓器傷害症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；抗原抗体複合体媒介性疾患；血液量減少性ショック；糸球体腎炎；多発性硬化症；Ｉ型真性糖尿病；急性及び遅発型過敏；移植片対宿主病；移植拒絶反応；再灌流損傷；内毒性ショック；白血球疾患及び転移による疾病状態；喘息；肺性酸素毒性；胸膜炎、肺胞炎、血管炎、肺炎、慢性気管支炎、及び嚢胞性線維症を含む肺の炎症等々が含まれる。
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に（全長モノクローナル抗体を含む）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物活性を示す限りは抗体断片を包含する。
「抗体断片」は全長抗体の一部、一般にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2及びＦｖ断片；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から生じた多重特異性抗体が含まれる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対応する。更に、異なる決定基（エピトープ）に対応する異なる抗体を典型的には含む通常の（ポリクローナル）抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、Kohlerらによって最初にNature 256:495（1975）に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照）によって作ることができる。「モノクローナル抗体」は例えばClacksonら, Nature 352:624-628（1991）及びMarksら, J.Mol.Biol. 222:581-597（1991）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
ここでもモノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から由来するか特定の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同である一方、鎖の残りが他の種から由来するか他の抗体のクラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一もしくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、それが所望の生物活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む（米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81:6851-6855（1984））。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性孔を生じる抗体アミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）及び８９-９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, ５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.（1991））及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；ChothiaとLesk J.Mol.Biol. 196:901-917（1987））を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。以下の実施例のＨ５２抗体のＣＤＲ及びＦＲ残基は、EigenbrotらProteins: Structure, Function and Genetics 18:49-62（1994）において同定された。
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含むキメラ抗体である。大抵は、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のようなヒト以外の種（ドナー抗体）の高頻度可変領域由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見いだされない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体の挙動を更に洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１個、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全て又は実質的に全ての高頻度可変領域は非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て又は実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンのものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常部（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常部の一部を少なくとも含むであろう。更になる詳細については、Jonesら, Nature 321:522-525（1986）; Riechmannら, Nature 332:323-329（1988）;及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol. 2:593-596（1992）を参照されたい。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶH及びＶLドメインを含に、ここでこれらドメインはポリペプチド単鎖中に存在する。一般にＦｖポリペプチドは、ｓＦｖをして抗原結合に対する所望の構造を形成せしめるポリペプチドリンカーをＶHドメインとＶLドメイン間に更に含む。ｓＦｖのレビューについては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol-113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁（1994）を参照されたい。
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖（ＶH−ＶL）内で軽鎖可変ドメイン（ＶL）に重鎖可変ドメイン（ＶH）が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448（1993）に更に詳細に記載されている。
本出願において使用する場合、「線状抗体」なる表現は、Zapataら, ProteinEng. 8（10）:1057-1062（1995）に記載された抗体を指す。簡単に言えば、これらの抗体は一対の抗原結合部位を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶH-ＣH１-ＶH-ＣH１）を含む。
製剤化される抗体は好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均質である（すなわち、汚染タンパク質等を含まない）。「本質的に純粋な」抗体とは、組成物の全重量に対して、少なくとも約９０重量％の抗体、好ましくは少なくとも約９５重量％の抗体を含有する組成物を意味する。「本質的に均質な」抗体とは、組成物の全重量に対して少なくと約９９重量％の抗体を含有する組成物を意味する。
「治療」は、治療的処置及び予防的又は防護的処置の両方を意味する。治療を必要とする対象には、既に障害を受けているもの並びに障害を予防されるべきものが含まれる。
治療の対象となる「哺乳動物」とは、ヒト、イヌ，ウマ，ネコ，ウシのような家庭及び農場の家畜、動物園の動物、スポーツ用の動物、又はペット動物を含む、哺乳類として分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
II.  発明の実施の形態
本発明は抗体を含有する安定な水性製剤に関する。製剤中の抗体は、抗体を産生するために当該分野で利用できる技術を使用して調製され、その方法の例を以下のセクションにおいて更に詳細に説明する。
抗体は対象の抗原に対して向けられる。好ましくは、抗原は、生物学的に重要なポリペプチドであり、障害を被っている哺乳動物への抗体の投与によりその哺乳動物に治療的利益をもたらすことができる。しかし、非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍随伴糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号を参照）もまた考えられる。
抗原がポリペプチドである場合、それは、膜貫通型分子（例えばレセプター）又は成長因子のようなリガンドであってもよい。抗原の例としては、レニンのような分子、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α１-抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；ＶＩＩＩＣ因子，ＩＸ因子，組織因子及びフォンビルブラント因子のような血液凝固因子；プロテインＣのような抗血液凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；ウロキナーゼ又はヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ-ＰＡ）のようなプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベジン；トロンビン；造血増殖因子；α及びβ腫瘍壊死因子；エンケファリナーゼ；ランテス（ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secreted））；ヒトマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ-１α）；ヒト血清アルブミンのような血清アルブミン；ミュラー阻止物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；βラクタマーゼのような微生物タンパク質；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；ＣＴＬＡ-４のようなキラーＴリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン-３、-４、-５、又は-６（ＮＴ-３、ＮＴ-４、ＮＴ-５、又はＮＴ-６）のような神経栄養因子、又はＮＧＦ-βのような神経成長因子；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦのような線維芽細胞成長因子；上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ-β１、ＴＧＦ-β２、ＴＧＦ-β３、ＴＧＦ-β４又はＴＧＦ-β５を含むＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ、及びＩＩ（ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ）；デス（１−３）-ＩＧＦ-Ｉ（脳ＩＧＦ-Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０のようなＣＤタンパク質；エリスロポエチン；オステオインダクティブ因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロンα、β及びγのようなインターフェロン；例えばＭ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ及びＧ-ＣＳＦのようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ-１ないしＩＬ-１０のようなインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えばエイズエンベロープのタンパク質のようなウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレッシン；調節タンパク質；ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ（細胞接着分子）、ＶＬＡ（最晩期抗原）-４及びＶＣＡＭ（血管細胞接着分子）のようなインテグリン；ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプターのような腫瘍随伴抗原；及び上記に列挙したポリペプチドの任意のものの断片が含まれる。
本発明に含まれる抗体に対する好適な分子標的には、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３４のようなＣＤタンパク質；ＥＧＦレセプター、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３又はＨＥＲ４レセプターのようなＥｒｂＢレセプターファミリーのメンバー；ＬＦＡ-１、Ｍａｃ-１、ｐ１５０、９５、ＶＬＡ-４、ＩＣＡＭ-１、ＶＣＡＭ及びそのα又はβサブユニットの何れかを含むαｖ／β３インテグリンのような細胞接着分子（例えば抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８又は抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ＶＥＧＦのような成長因子；ＩＬ８のようなインターロイキン；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３レセプター；肥満（ＯＢ）レセプター；ｍｐｌレセプター；ＣＴＬＡ-４；プロテインＣ等々が含まれる。
ここで好適な抗体は、ヒトＣＤ１８に結合し、好ましくはその細胞表面でＣＤ１８サブユニットを発現して内皮に結合する細胞（例えば好中球）の能力を（部分的又は完全に）遮断するものである。抗ＣＤ１８抗体の例には、ＭＨＭ２３（Hildrethら, Eur.J.Immunol. 13:202-208（1983））;Ｍ１８／２（ＩｇＧ2a; Sanches-Madridら, J.Exp.Med. 158:586（1983））；Ｈ５２（アメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ＡＴＣＣ）寄託ＨＢ１０１６０）；Ｍａｓ１９１ｃ及びＩＯＴ１８（Vermot Desrochesら, Scand.J.Immunol. 33:277-286（1991））；及びＮＡ-８（ＷＯ９４／１２２１４）が含まれる。好適な抗体は、ＭＨＭ２３かＨ５２が結合するＣＤ１８エピトープに結合するものである。ある実施態様においては、抗体は、ＣＤ１１ｂに付随するＣＤ１８の細胞外ドメイン内の領域に結合し得、抗体はまたα鎖及びβ鎖を解離し得る（例えば抗体は、ＭＨＭ２３抗体の場合のようにＣＤ１１ｂとＣＤ１８複合体を解離し得る）。
ここに開示したようにして処方し得る抗体を生産する技術を以下に詳細に説明する。
Ａ．  抗体の調製
（ｉ）  抗原の調製
場合によっては他の分子に抱合されていてもよい可溶性抗原又はその断片を、抗体を産生するための免疫原として使用することができる。例えばレセプターのような膜貫通型分子では、これらの断片（例えばレセプターの細胞外ドメイン）を免疫原として使用することができる。あるいは、膜貫通型分子を発現する細胞を免疫原として使用することができる。このような細胞は天然源（例えばガン株化細胞）から引き出すことができ、あるいは膜貫通型分子を発現する組換え技術により形質転換した細胞であってもよい。抗体を調製するために有用な他の抗原及びその型は当業者には明らかであろう。
（ｉｉ）  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下（ｓｃ）又は腹腔内（ｉｐ）注射することにより、動物に産生される。免疫化されている種において免疫原性であるタンパク質、例えばスカシガイヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する抱合）、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する抱合）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ2、又はＲ1Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、ＲとＲ1は異なったアルキル基である）を使用して、関連抗原を抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ（それぞれウサギ又はマウスの場合）を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤を介してコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
（iii）  モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495（1975）により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターもしくはマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁（Academic Press, 1986））。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう（ＨＡＴ培地）。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001（1984）; Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、（Marcel Dekker, Inc., New York, 1987））。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁（Academic Press, 1986））。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフイー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組換え生産は以下に更に詳細に説明する。
更なる実施態様において、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554（1990）に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628（1991）及びMarksら, J.Mol.Biol., 222:581-597（1991）は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は鎖シャッフィングによる高親和性（ｎＭ範囲）のヒト抗体の生産（Marksら, Bio/Technology, 10:779-783（1992））、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え（Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266（1993））を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード化配列を、相同的マウス配列の代わりに置換することにより（米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851（1984））、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることにより、修飾することができる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常部を置換し、又は抗体の１個の抗原結合部位の定常部を置換して、抗原に対する特異性を有する１個の抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位を含むキメラ二価抗体を作り出す。
（ｉｖ）  ヒト化およびヒト抗体
ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された一又は複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは典型的には「移入」可変ドメインから取られている。ヒト化は、本質的にはウィンターと共同研究者の方法（Jonesら, Nature, 321:522-525（1986）; Riechmannら, Nature, 332:323-327（1988）; Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536（1988））に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の対応配列を置換することにより、実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質上小さい部分が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、幾つかのＣＤＲ残基及びことによると幾つかのＦＲ残基が、齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
ヒト化抗体の作成に使用される軽鎖と重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法によれば、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる（Simsら, J.Immunol., 151:2296（1993）; Chothiaら, J.Mol.Biol., 196:901（1987））。もう一つの方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用するものである。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Carterら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89:4285（1992）; Prestaら, J.Immunol., 151:2623（1993））。
更に、抗体は、抗原に対する高親和性及び他の望ましい生物学的性質を保持したままヒト化することが重要である。この目的を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及び様々な概念的ヒト化生成物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて分析する工程によって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般に利用でき、当業者には良く知られている。選ばれた候補免疫グロブリン配列の可能な三次元コンホメーション構造を例示し表示するコンピュータープログラムが利用できる。これらの表示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合させる能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにしてレシピエント及び移入配列からのＦＲ残基を選択し、結びつけることができ、所望の抗体の特性、例えば標的抗原に対する親和性の増加が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合への影響に関与する。
別法として、免疫時に内因性免疫グロブリンの産生なしにヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪH）遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすということが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスでのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551（1993）;Jakobovitsら, Nature 362:255-258（1993）; Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33（1993）；及びDuchosalら, Nature 355:258（1992）を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレーライブラリから取り出すこともできる（Hoogenboomら; J.Mol.Biol., 227:381（1991）; Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597（1991）; Vaughanら, Nature Biotech 14:309（1996））。
（ｖ）  抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導される（例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117（1992）及びBrennanら, Science, 229:81（1985）を参照されたい）。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリから分離することができる。別法として、Ｆａｂ’-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ（ａｂ’）2断片を形成することができる（Carterら, Bio/Technology 10:163-167（1992））。以下の実施例に記載されているような他の実施態様では、Ｆ（ａｂ’）2分子の組立を促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用してＦ（ａｂ’）2が形成される。他のアプローチ法では、Ｆ（ａ2ｂ’）断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）である。ＷＯ９３／１６１８５を参照されたい。
（vi）  多重特異性抗体
多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対する結合特異性を有し、ここでエピトープは通常は異なる抗原からのものである。このような分子は通常は二つの異なったエピトープを結合させるのみであるが（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体のような更なる特異性を持つ抗体もここで使用される場合この表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、一方の腕が腫瘍細胞抗原に向けられ他方の腕が細胞毒性トリガー分子に向けられたもの、例えば抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５HER2／ＦｃγＲIII（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５HER2、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎臓細胞ガン腫、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ-３、抗ＣＤ３／Ｌ-Ｄ１（抗大腸ガン腫）、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸塩結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗全ガン腫随伴抗原（ＡＭＯＣ-３１）／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する一つの腕と毒素に結合する一つの腕を持つＢｓＡｂ、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ-１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロンα（ＩＦＮ-α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド；（マイトマイシンホスフェートのマイトマイシンアルコールへの転換を触媒する）抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼのような酵素活性化プロドラッグを転換するためのＢｓＡｂ；抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）のような線維素溶解剤として使用することができるＢｓＡｂ；抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃレセプター（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII又はＦｃγＲIII）のような細胞表面レセプターへ免疫複合体をターゲティングするためのＢｓＡｂ；抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶのような感染性疾患の治療に使用されるＢｓＡｂ；抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５HER2／抗ハプテンのようなインビトロ又はインビボでの腫瘍検出のためのＢｓＡｂ；ワクチンアジュバントとしてのＢｓＡｂ；及び抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗βガラクトシダーゼのような診断ツールとしてのＢｓＡｂが含まれる。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）2二重特異性抗体）として調製することができる。
二重特異性抗体を作成する方法は当分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な組換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの該鎖は異なる特異性を持っている（Millsteinら, Nature, 305:537-539（1983））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ（四部雑種）は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第ＷＯ９３／０８８２９号及びTrauneckerら、EMBO J., 10:3655-3659（1991）に開示されている。
異なったアプローチ法によると、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗原-抗体結合部位）を、免疫グロブリン不変ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常部との融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、そして、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、作成に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率を提供する態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又は、その比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様において、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖、及び他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。二重特異性分子の半分しか免疫グロブリン軽鎖がないことで容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、ＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作製する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210（1986）を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣH３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（アラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート抗体」もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞を標的とするため（米国特許第４６７６９８０号）、及びＨＩＶ感染の治療のために提案された（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、及びＥＰ０３０８９）。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81（1985）は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’-チオールに再転換し、他のＦａｂ’-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ’-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら, J.Exp.Med., 175:217-225（1992）は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）2分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する。様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148（5）:1547-1553（1992）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448（1993）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶL）に重鎖可変ドメイン（ＶH）を結合してなる。従って、一つの断片のＶH及びＶLドメインは他の断片の相補的ＶL及びＶHドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368（1994）を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。TuttらJ.Immunol. 147:60（1991）。
（vii）  エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、鎖間ジスルヒド結合の形成を許容する。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caronら, J.Exp.Med. 176:1191-1195（1992）及びShopes,B. J.Immunol. 148:2918-2922（1992）を参照されたい。増強された抗腫瘍活性を持つホモダイマー抗体は、Wolffら, Cancer Research 53:2560-2565（1993）に記載されたようにしてヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することができる。別法として、二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有する抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti-cancer Drug Design 3:219-230（1989）を参照のこと。
（viii）  抗体-サルベージレセプター結合エピトープ融合
本発明のある実施態様においては、例えば腫瘍浸透性を増大させるために無傷の抗体よりも抗体断片を使用することが望ましい。この場合、その血清半減期を増大させるために抗体断片を改変することが望ましい。これは、例えば、抗体断片にサルベージレセプター結合エピトープを導入することにより（例えば、抗体断片中の適当な領域の突然変異により、あるいはついで抗体断片の何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプチド合成により、融合されるペプチドタグ内にエピトープを導入することにより）、達成できる。
サルベージレセプター結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二つのループからの一又は複数のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に移される領域を構成する。更により好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二つのループの３又はそれ以上の残基が移される。なお更に好ましくは、エピトープはＦｃ領域（例えばＩｇＧの）のＣＨ２ドメインから取上げられ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又はＶH領域、あるいは一以上のそのような領域に移される。別法として、エピトープをＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取上げ、抗体断片のＣL領域又はＶL領域、又は両方に移す。
一つの最も好適な実施態様においては、サルベージレセプター結合エピトープは、配列（５’ないし３’）：ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号：４）を含み、場合によっては、ＨＱＳＬＧＴＱ（配列番号：５）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号：６）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号：７）、又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号：８）からなる群から選択された配列を更に含み、特にここで、抗体断片はＦａｂ又はＦ（ａｂ’）2である。他のより好適な実施態様では、サルベージレセプター結合エピトープは、配列（５’ないし３’）：ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号：６）、ＨＱＮＩＳＤＧＫ（配列番号：７）、又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号：８）及び配列：ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号：４）を含むポリペプチドである。
（ｉｘ）  抗体の他の共有結合修飾
抗体の共有結合修飾は本発明の範囲内に含まれる。それらは、化学合成により、又は適用可能ならば抗体の酵素的もしくは化学的開裂により製造し得る。他のタイプの抗体の共有結合修飾は、抗体の標的とするアミノ酸残基を、選択した側鎖又はＮもしくはＣ末端残基と反応できる有機の誘導体化剤と反応させることにより、分子中に導入される。共有結合修飾の例は、特にここに出典を明示して取り込む米国特許第５５３４６１５号に記載されている。抗体の共有結合修飾の好適なタイプは、米国特許第４６４０８３５号；同４４９６６８９号；同４３０１１４４号；同４６７０４１７号；同４７９１１９２号又は同４１７９３３７号に記載されたようにして、様々な非タンパク様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの１つに抗体を結合させることからなる。
（ｘ）  生物活性な抗体の選択
上述のようにして生産された抗体を一又は複数の「生物活性」検定にかけて、治療上の見込みの観点から有利な性質を持つ抗体を選択する。
抗体が産生される抗原を結合させる能力について抗体をスクリーニングする。抗ＣＤ１８抗体の場合は、以下の実施例に示すように、抗体の抗原結合特性は「ＭＡＣ-１捕獲検定」において評価することができる。簡単に言えば、該検定は、対象の抗ＣＤ１８抗体とは異なったＭＡＣ-１の部位に結合する抗ＣＤ１８抗体をＥＬＩＳＡプレートに最初に塗布し、続いて洗浄、試験試料の添加、洗浄、ヤギＨＲＰ標識抗ヒトＦ（ａｂ’）2抗体の添加及びＯＰＤ基質の比色検出を行うことを含む。抗体の全量を、ポリクローナル抗Ｆ（ａｂ’）2抗体をＥＬＩＳＡプレートに最初に塗布し、続いて試験及びＨＲＰ-抗Ｆ（ａｂ’）2の添加及びＨＲＰ基質の比色検出、ＯＰＤを行うことにより測定できる。比活性は全Ｆ（ａｂ’）2ＥＬＩＳＡ値に対するＭＡＣ-１結合の比である。
他の実施態様において、抗体の親和性は、例えば飽和結合；ＥＬＩＳＡ；及び／又は競合検定（例えばＲＩＡ’ｓ）により測定することができる。
また、抗体を、例えば治療薬としてのその有効性を評価するために他の生物活性検定にかけてもよい。このような検定は当該分野において知られており、標的抗原と抗体の意図した用途に依存する。
抗体がＣＤ１８を結合させる場合、生物活性検定の例には、スライド接着検定、ファゴサイトーシス検定、好中球結合検定及び脱顆粒検定が含まれる。
スライド接着検定は、様々な濃度の抗ＣＤ１８抗体と共にヘパリン処理血液をプレインキュベートし、ついで一定分量をチャンバー式ガラススライド上に配することを含む。スライドを３７℃でインキュベートして細胞を接着させ、非接着細胞を穏やかに洗い流し、接着細胞を染色し、接着細胞の顕微鏡場当り平均数を３０場に対して決定する。
ファゴサイトーシス検定に対しては、ヘパリン処理した全血を得て、赤血球を溶解する。ついで該血球を、オプソニン化ＢＯＤＩＰＹ標識黄色ブドウ球菌粒子と共に３７℃で３０分インキュベートする。ついで細胞をＦＡＣＳにより分析し、好中球ゲートの蛍光強度をファゴサイトーシスの度合を示すものとして測定する。
好中球への抗ＣＤ１８抗体の結合を測定するために、全血を様々な濃度の抗ＣＤ１８抗体と共にインキュベートする。ついで細胞をＦＩＴＣ抱合ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）2抗体で染色し、赤血球を溶解し、白血球をＦＡＣＳで分析する。好中球ゲートにおける傾向強度は抗ＣＤ１８抗体結合の度合いに比例する。
脱顆粒検定に対しては、好中球を全血から分離し、抗ＣＤ１８抗体と共にインキュベートする。ついで細胞をオプソニン化ザイモサン粒子で、刺激し、室温に放置する。細胞の上清をついで収集して、脱顆粒を特異的ＥＬＩＳＡ（ミエロペルオキシダーゼ又はラクトフェリンに対する）か、酵素検定（エラスターゼに対する）により評価する。
他の抗体に対しては、生物活性検定の例には、腫瘍細胞成長阻害検定（例えばＷＯ８９／０６６９２に記載されているようなもの）；抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）及び補体媒介障害活性（ＣＤＣ）検定（米国特許第５５００３６２号）；及びアゴニスト活性又は造血検定（ＷＯ９５／２７０６２参照）が含まれる。
対象の抗原上の特定のエピトープに結合する抗体（例えば実施例のヒト化Ｈ５２抗体のＣＤ１８への結合を阻害するもの）をスクリーニングするには、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow及びDavid Lane編（1988）に記載されているもののような常套的な交差ブロック検定を実施することができる。別法として、例えば、Champeら, J.Biol.Chem.270:1388-1394（1995）に記載されているようなエピトープマッピングを実施して、抗体が対象のエピトープを結合させるかどうかを決定することができる。
Ｂ．  ベクター、宿主細胞及び組換え方法
抗体の組換え生産に対しては、それをコードしている核酸を分離し、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入する。モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは直ぐに分離され、通常の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）配列決定される。多くのベクターが利用できる。限定されるものではないが、ベクター成分には一般に次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列（例えば、ここに出典明示により取込まれる米国特許第５５３４６１５号に記載されているようなもの）。
ここでのベクター中でのクローニング又はＤＮＡの発現に適した宿主細胞は、上記の原核生物、酵母、又は高等真核細胞である。この目的に対して好適な原核生物は、エシェリキア、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウイニア、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばサルモネラ・チフィムリウム、セラチア、例えばセラチア・マルセスセンス、及びシゲラ、並びにバシラス、例えばバシラス・サチリス及びバシラス・リチエニホルミス（例えば１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リチエニホルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えばシュードモナス・エールギノーサ、及びストレプトマイセスのような腸内細菌のごときグラム陰性とグラム陽性のような真性細菌を含む。１つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）も適している。これらの例は、限定的でなく、例示的である。
原核生物に加えて、糸状菌や酵母のような真核性微生物が抗体コードベクターの好適なクローニング又は発現宿主である。一般のパン酵母であるサッカロミセス・セレビシエは下等真核宿主微生物の中で最もよく利用される。しかし、多くの他の属、種、及び株も一般に利用でき、ここで有用であり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ；例えばクルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・フラジリス（ＡＴＣＣ１２４２４）、クルイベロミセス・ブルガリクス（ＡＴＣＣ１６０４５）、クルイベロミセス・ビッケラミー（ＡＴＣＣ２４１７８）、クルイベロミセス・ワルティー（ＡＴＣＣ５６５００）、クルイベロミセス・ドロソフィラルム（ＡＴＣＣ３６９０６）、クルイベロミセス・サーモトレランス及びクルイベロミセス・マルキシアナスのようなクルイベロミセス宿主；ヤロービア（ＥＰ４０２２２６）；ピチア・パストリス（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ；トリコデルマ・リーシア（ＥＰ２４４２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；シュバニオマイセス・オクシデンタリスのようなシュバニオマイセス；及び例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウムのような糸状菌、及びアスペルギルス・ニジュランス及びアスペルギルス・ニガーのようなアスペルギルス宿主である。
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物から由来のものである。非脊椎動物細胞の例には植物及び昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体及びスポドプテラ・フルジペルダ（毛虫）、アエデス・エジプテイ（蚊）、アエデス・アルボピクタス（蚊）、ドロソフィラ・メラノガスター（ミバエ）、及びボンビクス・モリのような宿主由来の対応する許容される昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株が、公に入手でき、例えばオートグラファ・カルフォルニカ（Ａutographa Ｃalifornica）ＮＰＶのＬ−１変異株、ボンビクス・モリ（Ｂombyx mori）ＮＰＶのＢｍ-５株が挙げられ、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、スポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトの植物細胞培養も宿主として使用できる。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養（組織培養）した細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株（２９３又は懸濁培養で生長するようにサブクローン化された２９３細胞，Grahamら,J.Gen Vitrol.,36:59（1977））；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Urlaubら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216（1980））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251（1980））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７）；ヒト頚管腫瘍細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）；バッファローラット腎細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈep Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Matherら,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68（1982））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞（Ｈep Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の本発明の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
この発明の抗体を製造するのに用いる宿主細胞は、様々な培地中で培養し得る。ＨａｍのＦ１０（シグマ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）（シグマ））、ＲＰＭＩ-１６４０（シグマ）、及びダルベッコの改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、シグマ）等の商業的に入手し得る培地が、該宿主細胞を培養するのに適している。また、例えば、ＨamおよびＷallace, Ｍethods in Ｅnzymology, ５８：４４（１９７９）；ＢarnesおよびＳato, Ａnal. Ｂiochem., １０２：２５５（１９８０）；米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第５，１２２，４６９号、または４，５６０，６５５号；再発行米国特許第３０，９８５号；国際公開９０／０３４３０または同８７／００１９５号に記載されたいずれの培地も、該宿主細胞用の培地として使用し得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、アプロチニン、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）等の）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等の）、緩衝液（ＨＥＰＥＳ等の）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジン等の）、抗生物質（ゲンタマイシン等の）、微量元素（最終濃度がマイクロモルの範囲で通常存在する無機化合物）、およびグルコースまたは等価なエネルギー源を補い得る。いずれの他の必要な添加物も、当業者に知られているであろう適当な濃度で含めてもよい。温度、pＨ等の培養条件は、発現用に選択された宿主細胞について以前に用いられた条件であり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を使用する場合、抗体は、細胞膜周辺腔において細胞内に生産することができ、又は培地に直接分泌させることができる。抗体が細胞内に生産されるときは、第一工程として、粒状細片を、例えば遠心分離又は限外濾過により、宿主細胞であれ溶解細胞であれ除去する。抗体が培地に分泌される場合は、そのような発現系からの上清を、商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン又はミリポアペリコン限外濾過ユニットを使用して一般に最初に濃縮される。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼインヒビターを、タンパク分解を阻害するために先の工程の何れかで含めてもよく、また抗生物質を外来性汚染物の成長を防ぐために含めてもよい。
細胞から調製された抗体組成物は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラｆヒーが好適な精製法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡはヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために使用することができる（Lindmarkら, J.Immol.Meth.62:1-13（1983））。プロテインＧが全てのマウスのアイソタイプ及びヒトγ３に対して推奨される（Gussら, EMBO J. 5:1567-1575（1986））。アフィニティーリガンドが結合されるマトリックスは最も頻繁にはアガロースであるが、他のマトリックスも利用することができる。制御多孔質ガラスやポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのように機械的に安定なマトリックスを使用すれば、アガロースの場合よりも速い流速と短い処理時間が可能になる。抗体がＣH３ドメインを含む場合は、ベイカーボンド（Bakerbond）ＡＢＸTM樹脂（J. T. Baker, ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（SEPHAROSETM）によるクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿のような他のタンパク質精製技術も、回収しようとする抗体によっては利用できる。
Ｃ．  製剤の調製
上述の対象の抗体の調製後に、それを含有する医薬製剤を調製する。処方される抗体は前もっての凍結乾燥を受けておらず、ここにおける対象の製剤は水性製剤である。好ましくは、製剤中の抗体は、Ｆ（ａｂ’）2のような抗体断片であり、その場合、全長抗体の場合には起こらない問題（例えば抗体のＦａｂへのクリッピング）を考える必要がある。製剤中に存在する抗体の治療上有効な量は、例えば望ましい用量及び投与形態を考慮に入れて決定される。約０．１ｍｇ／ｍＬないし約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍＬないし約２５ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２ｍｇ／ｍＬないし約１０ｍｇ／ｍＬが製剤中の例示的な抗体濃度である。
水性製剤はｐＨ緩衝溶液に抗体を含有させることで調製される。この発明のバッファーは、約４．５ないし約６．０の範囲、好ましくは約４．８ないし約５．５の範囲、最も好ましくは約５．０のｐＨを有する。この範囲にｐＨを調節するバッファーの例としては、酢酸塩（例えば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えばコハク酸ナトリウム）、グルコン酸、ヒスチジン、クエン酸塩及び他の有機酸緩衝液が含まれる。バッファー濃度は、例えばバッファーと製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭないし約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭないし約３０ｍＭとすることができる。好適なバッファーは酢酸ナトリウム（約１０ｍＭ）、ｐＨ５．０である。
ポリオールは、緊張化剤（tonicifier）として作用し、抗体を安定化させうるが、製剤中に含められる。好適な実施態様では、製剤は、塩化ナトリウムのような緊張化量の塩を含まないが、これは、抗体を沈殿させ、及び／又は低ｐHで酸化を生じるからである。好適な実施態様では、ポリオールは、スクロース又はトレハロースのような非還元糖である。ポリオールは、製剤の所望の等張性に対して変化しうる量が製剤に添加される。好ましくは、水性製剤は等張性であり、その場合、製剤中のポリオールの好適な濃度は、例えば約１％ないし約１５％ｗ／ｖ、好ましくは約２％ないし約１０％ｗ／ｖである。しかし、高張又は低張製剤もまた適している。添加されるポリオールの量は、ポリオールの分子量に対してまた変わりうる。例えば、二糖類（例えばトレハロース）に比較して、少ない量の単糖類（例えばマンニトール）を添加することができる。
界面活性剤もまた抗体製剤に添加される。例示的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０、８０等々）又はポロキサマー（例えばポロキサマー１８８）のような非イオン性界面活性剤が含まれる。添加される界面活性剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減し、及び／又は製剤中の粒子の形成を最小化し、及び／又は吸着を低減するような量である。例えば、界面活性剤は製剤中に、約０．００１％ないし約０．５％、好ましくは約０．００５％ないし約０．２％、最も好ましくは約０．０１％ないし約０．１％の量で存在しうる。
一実施態様において、製剤は上述の薬剤（すなわち、抗体、バッファー、ポリオール及び界面活性剤）を含み、一又は複数の防腐剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、ｍ-クレゾール、クロロブタノール及びベンゼトニウムクロリドを本質的に含まない。他の実施態様において、防腐剤が製剤に含まれていてもよく、特にその場合、製剤は多用量製剤である。防腐剤の濃度は約０．１％ないし約２％、最も好ましくは約０．５％ないし約１％の範囲でありうる。一又は複数の他の製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16版, Osol,A.編（1980）に記載されているようなものを、それらが製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさない限りは、製剤中に含めることができる。許容可能な担体、賦形剤又は安定剤は、その用量ではレシピエントに無毒性であり、更なる緩衝剤；共溶媒；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；ＥＤＴＡのようなキレート化剤；金属錯体（例えばＺｎ-タンパク質複合体）；ポリエステルのような生分解性ポリマー；及び／又はナトリウムのような塩形成対イオンが含まれる。
ここにおける製剤はまた、治療されている特定の兆候に対して必要な一を越えるタンパク質、好ましくは他のタンパク質に悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものを含んでいてもよい。例えば、抗体が抗ＣＤ１８である場合は、抗接着抗体、例えば抗ＩＣＡＭ-１又は抗ＣＤ１１ａ抗体を単一の製剤中に抗ＣＤ１８抗体と共に提供することが望ましい。このようなタンパク質は好適には意図した目的に対して有効である量で組合わせて存在する。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、製剤の調製前又はそれに続いて、無菌濾過膜を通過させる濾過により容易になされる。
Ｄ．  製剤の投与
製剤は、抗体での治療を必要としている哺乳動物、好ましくはヒトに、機知の方法、例えばボーラスとしてもしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、大脳内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により、投与される。好適な実施態様では、製剤は静脈内投与により哺乳動物に投与される。このような目的には、製剤は、例えばシリンジを使用して、又はＩＶラインを介して注入される。
抗体の好適な用量（「治療上有効な量」）は、例えば、治療される状態、状態の重病度及び過程、抗体が予防目的で投与されるか治療目的で投与されるかどうか、過去の治療法、患者の臨床経過及び抗体に対する反応、使用する抗体の種類、及び担当する医師の裁量に依存するであろう。抗体は好適には患者に一度にあるいは一連の治療にわたって投与され、診断の開始から任意の時に患者に投与することができる。抗体は、単独の治療薬として、あるいは問題の症状を治療するのに有用な他の薬物又は治療法と併用して投与することができる。
一般的な提案として、投与される抗体の治療上有効な量は、１回の投与であろうと複数回の投与であろうと、患者の体重当り約０．１ないし約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、使用される抗体の典型的な範囲は、例えば約０．３ないし約２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．３ないし約１５ｍｇ／ｋｇで毎日投与される。しかし、他の投与計画も有用であろう。この治療の進捗は通常の技術により容易にモニターされる。
抗ＣＤ１８抗体の場合には、抗体の治療上有効な量を、出血性ショックのような炎症性疾患、熱性損傷（例えば火傷から生じるもの）、発作（虚血及び出血性発作を含むもの）、及び心筋梗塞を治療するために投与することができる。抗体が抗ＩＬ８抗体である場合は疾患は成人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）、血管量減少性ショック、潰瘍性大腸炎、及び関節リウマチのような炎症性疾患でありうる。
Ｅ．  製造品
本発明の他の実施態様において、本発明の水性製剤を収容する容器を具備汁製造品が提供され、場合によってその使用のための指示を提供する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル及びシリンジが含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。例示的な容器は３−２０ｃｃのガラス製バイアルである。容器は製剤を収容し、容器上又は容器に伴うラベルは使用上の指示が示されている。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用指示書を伴うパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
本発明は次の実施例を参照すれば更に十分に理解されるであろう。しかし、これら実施例は、発明の範囲を制限するものとみなしてはいけない。全ての文献と特許は出典を明示してここに取込む。
実施例１
この実施例は抗体、組換えヒト化抗ＣＤ１８抗体（ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８）を含有する水性製剤を記述する。図１Ａ（重鎖；配列番号：１）と図１Ｂ（軽鎖；配列番号：２）に示されたアミノ酸配列を有するｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８を、マウスモノクローナル抗体ｒｈｕＭＡｂ Ｈ５２のヒト化（Hildrethら, J.Immunology 134:3272-3280（1985））により創製した。
ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８は以下に記載するようにして組換え的に生産された。プラスミドｐＳ１１３０が、大腸菌においてロイシンジッパードメインを持つｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８前駆体分子の生産を行うために作成された。該前駆体はプロテアーゼペプシンにより精製過程の間に開裂されてｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８を生じる。ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８は、ジスルフィド結合により結合した二つの異なったペプチド（軽鎖及び重鎖）からなるＦ（ａｂ’）2分子である。酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー二量体化ドメインのＦａｂ’のＣ末端への融合がＦｃ領域を置換し、大腸菌における効果的なＦ（ａｂ’）2の生産が可能になる。ＧＣＮ４ロイシンジッパードメインが相互作用をして、二つの未変性鎖間ジスルフィド結合が生じ得るように二つの重鎖のヒンジ領域システイン残基を一緒に保持する安定なダイマー構造（平行なコイル化コイル）を形成する。この結果、ジスルフィド結合により共有結合的に結合したＦ（ａｂ’）2が形成される。ロイシンジッパードメインは後で、ヒンジの二つのロイシン残基間を均一に切断するプロテアーゼペプシンを使用して精製過程の間にｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８前駆体から取除かれる。この結果、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８のＦ（ａｂ’）2分子が形成される。
プラスミドｐＳ１１３０（図２０）はＥｃｏＲＩ制限部位内に挿入された２１４３ｂｐの発現カセット（図２１Ａ及び２１Ｂ）を伴う特徴が既知のプラスミドｐＢＲ３２２に基づいている。プラスミドｐＳ１１３０はテトラサイクリンとβラクタム抗生物質の双方に対して耐性である。発現カセットは直列に結合した各遺伝子の単一コピーを含む。単一のジシストロン性ＲＮＡ内への各遺伝子の転写は大腸菌ｐｈｏＡプロモータ（Changら, Gene 44:121-125（1986））により方向付けられ、ファージラムダｔ0ターミネーターで終了する（ScholtissekとGrosse Nucleic Acdis Research 15:3185（1987））。各鎖に対する翻訳開始シグナルは大腸菌ＳＴII（熱安定エンテロトキシン）（Pickenら, Infection and Immunity 42:269-275（1983））シャイン-ダルガルノ配列により提供される。各鎖の翻訳は、細胞膜を横切って細胞膜周辺膣内へのペプチドの転座を方向付ける２３の残基ＳＴIIシグナルペプチドで始まる。ＳＴIIシグナルペプチドをついで大腸菌リーダーペプチダーゼにより除去する。軽鎖及び重鎖を細胞膜周辺膣内への分泌後にその天然の高次構造に折り畳み、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８前駆体、共有的結合Ｆ（ａｂ’）2内に会合させる。ロイシンジッパードメインを精製過程（以下を参照）の間に前駆体から切断してｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８を得る。ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の生産に用いられた株化細胞は、図２２に示されるように、大腸菌株化細胞Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）由来の４９Ａ５である。発酵手順は図２３に示されるようにして起こる。ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８前駆体の生産は、典型的には接種３０−６０時間後に、培地のリン酸塩がなくなったときに生じる。
大腸菌細胞ペーストからのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８前駆体の精製は、次のようにした。抗ＣＤ１８前駆体抗体を含む凍結細胞ペレットを、３０−４０℃に加熱した約３容量の抽出バッファー（１２０ｍＭのＭＥＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６）に溶解させた。これにより、約５．４と６．５の間のｐＨを持つ懸濁液が得られた。この懸濁液を、熱交換器で２０℃以下に保たれた５５００ないし６５００ｐｓｉのゴーリン（Gaulin）ホモジェナイザーに２回通した。５％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ｗ／ｖ）、ｐＨ６を、０．２％ＰＥＩの最終濃度になるまでホモジェネートに添加した。混合物を２−８℃で約１時間インキュベートした。約１容量の抽出バッファー（１２０ｍＭのＭＥＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６）を、１５２８０ｇでの遠心分離により固体が除かれる前に添加した。透明な上清を、冷水の添加により３メガオーム未満の伝導率に馴化した。馴化した上清を、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０、クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化したカチオン交換カラム（ＡＢＸカラム；Mallinckrodt Baker, Inc., NJ, USA）に負荷した。カチオン交換抗ＣＤ１８前駆体抗体プールを、約２ｇ／Ｌの濃度になるまで、５０ｍＭのＭＥＳ、３６ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で希釈した。ついで、プールを２Ｍのクエン酸を加えてｐＨ４に調節し、前もって５０ｍＭのＭＥＳ、３６ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ４．０で平衡化した固定化ペプシンを含むカラム（ペプシン-ＣＰＧ）に流通させた。ペプシン（シグマ、ＭＯ、ＵＳＡ）は、バイオプロセス社，NJ, USAからの調整穴あきガラス（ＣＰＧ）に科学的に結合した；ＣＰＧはＮａＩＯ４で活性化され、続いてＮａＢＨ３ＣＮを使用してＣＰＧとペプシンの間のシッフ塩基形成が還元された。この手順により、無傷のＦ（ａｂ’）2を残しながらヒンジ領域からジッパーを除いた。ペプシン-ＣＰＧカラムからの溶出液をアニオン交換サルトバインド（Sartobind）Ｑフィルター（Sartorius, Goettingen, West Germany）を通してライン上で直接濾過した。産生された抗ＣＤ１８Ｆ（ａｂ’）2抗体はフィルターを通過して流れる一方、ペプシンと他の負に荷電した不純物はフィルターに強く結合する。プールを希釈して水の添加によりおよそ７メガオームの伝導率にし、ついで、２５ｍＭのＭＥＳ、６０ｍＭの酢酸、ｐＨ４．０で平衡化したカチオン交換カラム（ＳＰセファロースＨＰ）に適用し、２５ｍＮのＭＥＳ、ｐＨ５．６中の７５−１１０ｍＭの酢酸塩の線形勾配で溶出させた。ＳＰセファロースカラムからのプールした画分を、プール１リットル当り０．２６リットルの比で３．０Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０を添加して希釈し、０．６２５Ｍの硫酸アンモニウム、２５ｎＭのＭＥＳ、ｐＨ６．０で前もって平衡にした疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム（フェニルセファロースＦＦ-低置換）を通過させた。負荷後に、平衡化に使用した同じバッファーでカラムを洗浄し、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８を、０．３７５Ｍの硫酸アンモニウム、２５ｍＮのＮＥＳ、ｐＨ６．０に溶出させた。
この結果、以下に記載されるような製剤化のための精製ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８が得られた。５つの水性製剤を、例えば出血性ショックに使用される臨床的製剤の選択のために評価した。製剤は以下の表１に示したようなものであった。
0003919235.tif 000002
二つのｐＨ，ｐＨ５（酢酸ナトリウム）とｐＨ６（ヒスチジン）を比較した。各ｐＨにおいて、塩化ナトリウムとトレハロースを緊張化剤として比較した。ｐＨ６．０のマンニトールを伴うヒスチジン製剤をまた評価した。界面活性剤（例えば０．０１％のトゥイーン２０TM）の存在が、振盪機誘発凝集に対する安定化のために、また１ｍｇ／ｍＬ以下のタンパク質濃度で容器への吸着を防止するために必要であることが分かった。安定性検定は、トレハロース製剤が他のものよりも一般に優れ、ｐＨ５が、低減したクリッピングのためにｐＨ６製剤よりも僅かに高い化学的安定性を示すことを示した。５、３０、及び４０℃での２週間及び５週間の保存後の動力学的データをアレニウス解析及び有効期間予想に対して使用した。カチオン交換ＨＰＬＣを使用して、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８に対する好適な製剤は１０ｍＭ酢酸ナトリウム、８％トレハロースｗ／ｖ、０．０１％トゥイーン２０TM、ｐＨ５．０であり、予想有効期間は５℃で２５−７５ヶ月（９５％信頼区間）であった。
抗体製剤の設計においては、製剤化する抗体の構造的性質を分析することが有用であるが、これは必要ではない。ＲｈｕＭＡｂ ＣＤ１８は、二つの分子内ジスルフィドによりそれぞれ構造的に安定化され、分子間ジスルフィド（図１６の底部のバレルとして示す）により一緒に保持された軽鎖（図１６の分子の左側）と重鎖（図１６の分子の右側）のβシートからなる。可変セグメント内のＣＤＲ（相補的決定領域）は分子の頂部に配向している。ＣＤＲの内部及びＣＤＲに近接して位置しているのは複数のメチオニンであり、その一つのみ（Ｍｅｔ６５）が完全に露出している。Ｍｅｔ６５は抗ＣＤ１８内に埋設されているが、これは、如何なる理論にも制約されるものではないが、近接メチオニンの金属誘発酸化を促進する（Liら, Biochem. 34（17）:5762-5772（1995））ヒスチジン残基の近くにある。ＣＤＲでの酸化の受け易さをここで評価した。低いｐＨでの酸化を最小化するために、緊張化剤として、塩よりもむしろ糖を使用することが望ましいことが見出された。
この分子における潜在的脱アミド又は異性体化部位、すなわち親水性で可撓性領域であるＡｓｘ-Ｇｌｙ又はＡｓｘ-Ｓｅｒ（ＡｓｘはＡｓｐ又はＡｓｎを示す）の評価において（Clarkeら, Stability of Protein Pharmaceuticals, Part A. Chemical and Physical Pathways of Protein Degration, T.J.Ahem及びM.C.Manning編, 1992, Plenum Press: New York.P.2-29; 及びKossiakoff, Science, 240:191-94（1988））、６つが露出しており、かなり可撓性の領域であることが見出された（図２Ａ及び２Ｂ）。如何なる理論にも制約されるものではないが、重鎖モチーフＭＮ84Ｓ、ＫＮ55Ｇ、及び軽鎖モチーフＧＮ158Ｓ、ＱＤ167Ｓ、ＫＤ170Ｓは最も反応性であることが予想される；Ａｓｎ８４での反応性は、それがＣＤＲのものに近いので抗体の結合活性に影響を及ぼす可能性が高い。Ａｓｎ１０３は分解（脱アミド経由）の主要経路であることが分かった。
材料と方法
次の方法において使用した材料は次の通りであった：氷酢酸９９．９％（ＭＷ６０．０５）；濃ＮａＯＨ１８．９４Ｎ（５０％ｗ／ｗ；ＭＷ４０．０）；濃ＨＣｌ３７．８％（１２．４４Ｎ；ＭＷ３６．４６）；ヒスチジン（ＭＷ１５５．１６）；ＮａＣｌ（ＭＷ５８．４４ｇ）；医薬品等級トレハロース二無水物（ＭＷ３４２．３１）；Ｄ-マンニトール（ＭＷ１８２．１７）；低パーオキシドトゥイーン２０TM；ｒｈｕＭＡｂ抗ＣＤ１８（ＭＯＰＳ、酢酸ナトリウム、ｐＨ６．９中に〜１．３ｍｇ／ｍＬ）。
バッファーの調製と製剤のセットアップ：２リットルの次の原液バッファーを透析と製剤のために調製した：
０．２Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５：２２．７ｍＬ酢酸、１７ｍＬの５０％ＮａＯＨをミリＱ水で２Ｌにする。最終ｐＨ４．９８。溶液を２Ｌのナルジェン（Nalgene）ボトル中に殺菌濾過し５℃で保存。
２Ｍのヒスチジン、ｐＨ６：６２．０６ｇのヒスチジン、２０ｍＬの濃ＨＣｌをメスフラスコ中で２Ｌにする。最終ｐＨ５．９２。溶液を２Ｌのナルジェンボトル中に殺菌濾過し５℃で保存。
２ＭのＮａＣｌ：１１６．８８ｇのＮａＣｌをミリＱ水で１Ｌにする。溶液を１Ｌのナルジェンボトル中に殺菌濾過し５℃で保存。
１８％のマンニトール：１８０ｇのマンニトールをミリＱ水で１Ｌにする。溶液を１Ｌのナルジェンボトル中に殺菌濾過し５℃で保存。
２０％のトレハロース：４００ｇのトレハロースをミリＱ水で２Ｌにする。最終ｐＨは６．４であった。溶液を２Ｌのナルジェンボトル中に殺菌濾過し５℃で保存
１０％（ｖ／ｖ）トゥイーン２０TM：１０ｍＬの濃トゥイーン２０TMを注意深く除去し、１００ｍＬのメスフラスコに添加し、ミリＱ水で希釈し、溶解するまで攪拌した。暗所で２８℃で保存した。
製剤：以下の表２は出発タンパク質バルクを本研究のために透析したバッファーの調製を示している。およそ４０ｍＬのバルクｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８（〜１．３ｍｇ／ｍｌタンパク質濃度）を表２に示されるようにして調製した溶液に対して透析した（５℃で４時間の間２Ｌ及び一晩かけて〜２Ｌ）。透析液を０．２μＭのナルジェンセルロース酢酸塩フィルターユニットで濾過し、UV及びHPLC分析に対するブランクとして使用するために無菌条件下で貯蔵した。
0003919235.tif 000003
残りの透析バッファーの幾つかを使用して、表３に示されるように、トゥイーン２０TMを添加することにより製剤ビヒクルを調製した。
0003919235.tif 000004
以下の表４は、透析したタンパク質溶液の最終の外観、ｐH、及びタンパク質濃度を示す。
0003919235.tif 000005
表５に示すように、これらのタンパク質溶液を、逆相透析バッファーを使用して、最終〜１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度まで希釈し、トゥイーン２０TMを最終０．０１％（ｖ／ｖ）になるまで添加した。
0003919235.tif 000006
殺菌フード中で酢酸セルロース膜を伴う１５０ｍＬのナルジェンフィルターユニットを使用して製剤を殺菌濾過した。殺菌製剤したｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８溶液を３ｃｃバイアル当り０．６ｍＬで充填し、標識し、指定温度で保存した。ビヒクル溶液を濾過し、同じように濾過した。以下の表６Ａ（抗体製剤）と６Ｂ（ビヒクル対照）はこれらの製剤に対する安定性を示している。ここで提供したデータは５週間までの保存のものである。
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0003919235.tif 000008
２週と５週の時点で、各製剤及び保存温度からの２つのバイアルを−７０℃で凍結させた。５週の時点で、凍結試料を解凍し、バッチを、充填後直ぐに（ｔ＝０週）−７０℃で凍結された対照試料と共に分析した。
ＵＶスペクトル分析：試料を、底が隆起し側部が黒い２ｍｍ幅、１ｃｍ経路長細胞のHellma中で希釈せずに測定した。およそ３００μＬの試料を測定に使用した。機器をミリＱ水で空にした。試料を、２ｎｍのバンド幅と１秒の積分でＨＰ-８４５２Ａ分光光度計を使用して２００ないし４００ｎｍでスキャニングした。
タンパク質濃度を、１．４５ｍＬ／ｍｇ／ｃｍの吸光係数を使用して３２０ｎｍでの吸光度で修正した２７８ｎｍの吸光度から決定した。
ｐＨ：オリオン７２０ＡｐＨ計を、マイクロエレクトロード社のＭＩ-４１０マイクロｐＨ電極と共に使用した。電極をｐＨ４及び７の標準バッファーで較正し、１０−１５試料毎に再チェックし、必要に応じて再較正した。機器を較正し、試料を室温（〜２３℃）で測定した。
ＲＰ-ＨＰＬＣ：Ａバッファーとして０．１％のＴＦＡと、Ｂバッファーとしてアセトニトリルに入った０．０８％のＴＦＡを用い７．５ｘ７５ｍｍのＴＳＫフェニル-５ＰＷカラムを使用してＲＰ-ＨＰＬＣを実施した。カラムの前に０．５μＭのインラインフィルターを使用した。カラムを１０％のＢバッファーで平衡にし、５５℃で操作した。２０μＬの注入を行い、以下の表７に従って溶出させた。
0003919235.tif 000009
１秒当り１ポイント、２１４ｎｍで収集したデータを分析に使用した。
ＳＥＣ検定：用いた移動相は２００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０であった。操作は、０．５ｍＬ／分の流量で４０μＬの注入を雰囲気温度で行って、４０分続いた。主カラムの前にインラインフィルターとＴＳＫガードカラムを備えたＴＳＫ Ｇ３００ ０ＳＷＸＬの３０ｃｍｘ７．８ｍｍカラムを使用した。検出を２１４ｎｍで行った。
イオン交換ＨＰＬＣ検定（ＩＥＸ）：５０μＬの注入を用いてＩＥＸを操作した。移動相は、Ａに対してｐＨ６．０に、Ｂに対してｐＨ６．０に調節された各３３ｍＭのＭＥＳ／ＨＥＰＥＳ／ＰＩＰＥＳ；Ｃ＝ミリＱ水であった。表８に示す勾配を使用した。
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該方法では、０．５μＭのインラインフィルターをカラム前に備えた５０ｘ４．６ｍｍのベイカーボンド（BakerBond）カルボキシ-サルフォン（ＣＳｘ）カチオン交換カラムを４０℃で操作して使用した。高いバッファーバックグラウンドのために、２８０ｎｍで得たデータで分析を実施した。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）：ＨＩＣを、０．５μＭんおインラインフィルターをカラム前に備えた４．６ｘ５０ｍｍのベイカーボンドブチルＮＰＲカラムで実施した。操作バッファーは、Ａバッファーとして２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７に入れた２Ｍの硫酸アンモニウム、Ｂバッファーとして２０ｍＭのトリス、ｐＨ７であった。カラムを１ｍＬ／分の１０％バッファーＢで５０℃で平衡にし、１０μＬの注入をした。表９に示す勾配を溶出のために使用した。
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１秒当り１ポイント、２１４ｎｍでデータを収集した。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ：予め作られた１０及び１４％のグリシンＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル（Novex、San Diego, CA）をそれぞれ還元及び非還元試料の分析に使用した。１０μＬの２Ｘトリス-グリシン試料バッファー（Novex）で希釈した１０μＬの１ｍｇ／ｍＬ試料を、９５℃に２分加熱し、同様に高ＭＷ範囲及び低ＭＷ範囲（バイオラド）マーカーを同じバッファー中で１：２０に希釈した。カレイドスコープＭＷマーカーを、また希釈しないで９５℃に加熱した。試料が冷却されたとき、１０μＬをゲルに負荷した。ＭＷマーカー溶液の負荷は５μＬであった。ゲル装置（Novex）に１Xのゲル負荷バッファー（Media Services）を充填し、ゲルを１２５ｍＶの一定電圧と可変電圧で２時間の間操作した。ゲルを一晩かけてノベックスクーマシーブルー染料で染色した。次の日に、ゲルを水で２時間洗浄し、ついで半時間ゲル乾燥溶液（Gel Drying Solution）（１Ｘ）（Novex）に浸漬した。ついで、ゲルをノベックスセロファン系で空気乾燥させた。
ゲル等電フォーカシング電気泳動：ファーマシア３．５ないし９．５ＰＡＧプレートゲルを使用してＩＥＦを行った。ファーマシアのリン酸及び水酸化ナトリウム操作バッファーを使用した。試料を、３０μＬの１５％グリセロールに１０μＬの試料を混合することにより調製した。ファーマシアの広範囲及び高範囲ＩＥＦ標準、並びにサーバ（Serva）プロテインテストミックス９をｐｌマーカーとして操作した。ファーマシア標準は１５％グリセロールと標準（ミリＱ水で再構成）を１：１で混合することにより調製した。サーバプロテインミックスは指示に従って再構成し、１５％グリセロールで１０倍に希釈した。一つのゲルでは、抗ＨＥＲ２ＭＡｂバルク（ｐｌ＝８．８−９．０計算値）を対照としてまた操作した。ＨＥＲ２試料（５ｍｇ／ｍＬ）を１５％グリセロールで４０Ｘに希釈した。ゲルに、陽極（酸側）から１／３ゲル幅にある紙パッチに吸着された２０μＬの各試料を負荷した。４００Ｖに設定した一定電圧で３０分間１０℃で操作し、その後に試料を負荷した紙を除き、ゲルを１１５００Ｖで１．５時間以上の間操作した。ゲルをスルホサリチル酸で３０分間ＴＣＡに固定し、水で１０分間（第２ゲルに対して）又はＩＥＦ脱染剤で（第３のゲルに対して）洗浄し、ＴＣＡを洗い流さないで、ノベックスの指示書に指示されているようにして（第１のゲルに対して）染色した。最初の二つのゲルはノベックスの指示に従ってノベックスコロイド状クーマシーで染色した。最後のゲルは〜６０℃まで予め加熱した標準ＩＥＦクーマシー染料で染色し、次いで一晩かけて〜６０℃まで予め加熱していたＩＥＦ脱染剤で脱染した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルに対して上述したような方法でゲルを空気乾燥させた。
凍結／解凍安定性：試験されている製剤における凍結／解凍サイクルによりｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８が分解しないことを証明するために、各製剤の４つのバイアルを凍結及び解凍の３回のサイクルにかけた。各製剤のバイアルのうち二つは−７０℃と２−８℃の間のサイクルにかけ、２つは−２０℃と２−８℃の間のサイクルにかけた。各製剤の２つのバイアルは対照として２−８℃に保持した。各サイクルの間、バイアル中に可視できる液体が残らなくなるまで、少なくとも２時間の間フリーザー内に残ったままにした。ついで、それらを固体が残らなくなるまで少なくとも２時間２−８℃にした。酢酸塩／トレハロースの一つのバイアルであるｐＨ５の製剤（Ｆ２）は最初のサイクルでは−２０℃では凍結しなかったが、−７０℃のフリーザー内の棚に置いたとき直ぐに凍結した。
振盪機実験：各製剤の一つと同一に構成されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８バルクのバイアルを、グラス-コル（Glas-Col）９９ＡＳ６００１２シェイカー上のラックに水平に配した。シェイカーアームを半径〜３０ｃｍに調節し速度を７０ｒｐｍに設定した。試料を室温で２４時間軸方向に振とうした。各製剤の第２のバイアル及びバルクはシェイカーの近くに対照として室温に維持した。ついで試料をＩＥＸ、ＭＡＣ-１捕獲検定、及びＵＶスペクトル分析により分析した。
ＭＡＣ-１捕獲（レセプターＥＬＩＳＡ）及び全Ｆ（ａｂ’）2ＥＬＩＳＡ：ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８をＭＡＣ-１のＣＤ１８鎖に向ける。これにより、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の抗原結合特性を「ＭＡＣ-１捕獲検定」により評価することができる。該検定は、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８とは異なるＭＡＣ-１の部位（ＭＨＭ２３ＭＡｂ;Hildrethら, Eur.J.Immunol.13:202-208（1983））に結合するマウス抗ＣＤ１８抗体で最初に９６ウェルのマイクロタイタープレートをコーティングして可溶性ＭＡＣ-１の組換え調製物を捕獲し、ついでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、未知の試料を添加し、ＰＢＳで洗浄し、ヤギＨＲＰ標識抗ヒトＦ（ａｂ’）2抗体を添加し、ＯＰＤ基質の比色を検出することを含む。抗体の全量は、先ずＥＬＩＳＡプレートにポリクローナル抗Ｆ（ａｂ’）2抗体をコーティングし、続いて試料及びＨＲＰヤギＦ（ａｂ’）2を添加しＨＲＰ基質ＯＰＤの比色を検出することにより測定する。両方の場合における検定希釈剤は０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％のポリソルベート２０、１ｍＭのＣａＣｌ2、１ｍＭのＭｇＣｌ2であった。比活性は全Ｆ（ａｂ’）2ＥＬＩＳＡ値に対するＭＡＣ-１結合の比として測定した。
試料を、マイクロタイタープレートと多チャンネルピペットを使用するマイクロニクス管に２００００、４００００及び８００００倍の最終希釈度まで、得られた検定希釈剤で連続的に前もって希釈した。希釈されたｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８のバルクの試料を対照として各検定プレート上に含めた。これらのバルク対照を１回余分に２Ｘ希釈するようにして最終の４００００、８００００及び１６００００倍まで希釈した。同じ希釈度を両検定に使用した。５週間の分析に対して解凍されたのと同じ日に試料を希釈し、次の日の検定に提出する前にマイクロニクス管中で凍結させた。これらの検定における検定希釈剤で希釈したｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の凍結／解凍安定性を証明した。
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動力学パラメータ、アレニウス計算、及び統計：主ピーク％損失対時間を一次速度動力学に一致させた。様々な温度で観察された速度定数（ｋ）は以下に示されるようなアレニウスの式に一致させた：
ｌｎ  ｋ＝−ΔＥ／ＲＴ＋Ｃ
ここで、Ｅは活性化エネルギー（ｃａｌ／モル）、Ｒは普遍気体定数（１．９８７ｃａｌ／モル／Ｋ）、Ｔは絶対温度（ケルビン）及びＣは定数である。ｌｎ ｋ対１／Ｔのプロットの傾斜から、ΔＥを計算した。ｌｎ ｋに対する標準誤差（ＳＥ）は式[（１／ｋ）2＋（ＳＥ）2]0.5を使用して計算した。より低い温度におけるｌｎ ｋに対する大きなＳＥ値の理由は、式の分母にあるｋの小さい数値にある。アレニウスフィット（９５％信頼区間）から外挿したｋの値を、
ｔ90（週）＝ｌｎ ０．９／ｋ
に従って、５℃での有効期間を予想するために使用した。ここで、ｋは週-1で表された。信頼区間はプログラムＳＩＧＭＡＰＬＯＴTMを用いて決定した。
結果と検討
凍結／解凍安定性：以下の表１１は凍結／解凍実験における試料の分析からのデータの要約を示す。異なった温度群の間には有意な差異はみられなかった。第１回目のサイクルでＦ２の一つのバイアルが−２０℃で凍結しなかったという観察は、ジャケット付ステンレススチールストレージタンク中でのバルクの凍結は問題があるかもしれないという課題を提起した。これらのタンク中の溶液の最も冷たい部分は約−２０℃にしか至らず、よって完全には凍結していないかもしれない。これを製剤ビヒクルを使用して試験した。タンクは６時間の冷却内で凍結固化することが観察され、バルク保存に問題はないことが予想された。
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ＵＶスペクトル分析：試料のスペクトル分析を実施して、タンパク質濃度を測定し、並びに３４０ないし３６０ｎｍの範囲の平均吸光度の増加により、あるいは２７８ｎｍの最大吸光度と２５２ｎｍの最小値の比の減少により示される光散乱を測定した。図３Ａと３ＢはＵＶデータの要約を示している。製剤Ｆ３の４０℃試料は非常に曇っており、白色の凝縮した粒子を含んでいる。これらの試料は１４０００ＲＰＭで５分間微量遠心管を通され、散乱がなおかなり高い後に再計測された。全ての他の試料は透明であり無色であるようであった（Ａ340-360＜０．０２、Ａ278／Ａ252＞２．４）。Ａ２７８／Ａ２５０の変化は３４０ないし３６０ｎｍの平均吸光度よりもより感度の高い散乱の指標であった。これは、後者は保存温度に関連する蛍光は見られなかったが（図３Ａ）、前者は４０℃試料に対して明確な増加を示した（図３Ｂ）からである。ｐＨ５製剤はあらゆる場合においてｐＨ６製剤より４０℃でより少ないＡ２７８／Ａ２５２比の変化を示した。ｐＨ５の製剤のタンパク質濃度はｐＨ６の製剤よりも２−３％だけ大きかった（図４）。
ｐＨ：Ｆ４を除く全ての製剤ビヒクルは、−７０℃の対照と比較してｐＨの僅かな増加（４０℃で〜０．１単位）を示した（以下の表１２参照）。ｐＨ５の製剤は両方ともビヒクル試料よりも活性試料でより大きなｐＨの増加を示した。ｐＨ６の製剤の何れも活性及びビヒクル試料の間のこの差を示した。実は、Ｆ３及びＦ５ビヒクルに見られたｐＨ増加は活性な試料は見られなかった。Ｆ４のｐＨはより高い保存温度で僅かに減少した。ｐＨ５の試料でのｐＨの増加はストッパーを通しての拡散による酢酸濃度の損失により説明され、５℃では有意であるとは予想されなかった。
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ｐＨ５製剤はビヒクルと活性な試料に対してより高い保存温度でのｐＨの少しの増加を示した。製剤Ｆ３とＦ５は保存温度が高くなるのに伴ってビヒクルのｐＨの増大を示したが、活性なし量はこの増加を示さなかった。製剤はｐＨの僅かな減少を示した。
ＳＥＣ：図５Ａと５Ｂは製剤Ｆ２（図５Ａ）とＦ５（図５Ｂ）に対するクロマトグラムを示す。ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の主ピークは１８．６分で溶出したが、これは〜７００００Ｄの見かけＭＷに対応する。主ピークの後に溶出した二つの主な不純物ピークがあり、２０．９分のものはｊ巻と保存温度の増加と共にかなり増加した。２０．９分のピークの増加は、Ｆ２（図５Ａ）と比較して、Ｆ５（図５Ｂ）においてさらにより明白であり、如何なる理論にも制約されるものではないが、最も可能性が高いのはＦ５のｐＨがより高いためであろう。図６Ａと６Ｂは５、３０及び４０℃で０、２及び５週間の保存後の全ての製剤の全ピーク面積と主ピーク％のグラフを示す。製剤Ｆ３とＦ４に対する全ピーク面積は他の３つの製剤よりも有意により低かった。
より低いｐＨ製剤が最も高い安定性を示したので、ＳＥＣクロマトグラムの主ピーク％からの速度データを算出し、アレニウスプロットに一致させた。Ｆ２に対するデータは図７に示す。このプロットは、５℃での速度定数が大きな標準誤差を有していたので、二つのみの有用な点を含んでいた。これらのデータから得られた活性化エネルギー（１９±６ｋｃａｌ／モル）は５℃のデータなしでもＩＥＸデータ（図１５参照）からさん呈したものと非常に類似していた。曲線一致に対しての９５％信頼区間により、５℃で６ないし６０年の有効期間を予想した。
ＨＩＣ：この検定を５５℃よりもむしろ５０℃のカラム温度で実施し、不幸にも分解能の喪失を犠牲にして、タンパク質回収を改善した（〜３０％から略９０％）。安定性試料のＨＩＣ分析は、主ピークの先端の肩部の乏しい分解能のピークの増加を示し、全ての製剤に対して保存時間と温度の増加と共に、１７．５分のピークの増加を示した（図８）。予備的な評価ではペプチドマッピングにより現れた酸化種にどのピークも一対応しないけれども、肩部は、タンパク質の酸化形と一致する位置にあった。Ｆ２はこの先端のピークで最も少ない増加を示した（図９）。回収（全領域）の減少傾向が保存温度の増加と共に見られ、全ての製剤が４０℃で同じ全面積をしましている（図１０）。製剤Ｆ２とＦ５は、出発の−７０℃の試料に対して５及び３０℃の全領域の変化は最も少なかった。この方法は、１７．５'の分解ピークと主ピークの間の分解能が精確な定量には低すぎるので、安定性を示すものではなく、該方法からの回収は乏しい。
ＲＰ-ＨＰＬＣ：ＲＰ-ＨＰＬＣにより観察された唯一の変化は、約２５分で溶出するピークの増加であり、保存温度の増加に伴い、主ピーク面積が対応して減少している（図１１及び１２）。この変化の大きさはＳＥＣに見られたより低いＭＷ種のものと類似していた。このピークの相対位置とその面積に基づいて、それは低ＭＷ種に対応する。製剤Ｆ２は、温度の増加と共に、主ピーク面積％の最も少ない変化を示した。ＤＴＴで還元した試料もまたＲＰ-ＨＰＬＣで実施し、酸化型が抗体の分離した小さいサブユニットの一つから溶解したかもしれない機会を増加させる。この方法では保存試料と−７０℃対照試料の間に差異は見られなかった。
製剤Ｆ２に対するＲＰ-ＨＰＬＣ動力学データのアレニウスプロットは、ＳＥＣ及びＩＥＸの結果（１９−２０ｋｃａｌ／モル）に対して同様な活性化エネルギー（２１±１ｋｃａｌ／モル）を与えた（図１３）。曲線一致に対して９５％の信頼区間により示される有効期間は５℃で４ないし１５０年である。
ＩＥＸ：この検定により、１８．４及び２６．６分の保持時間での早期の溶出ピークは保存温度の増加と共に増大した。Ｆ２とＦ５をそれぞれ表す図１４ＡとＢに示されるように、Ｆ２と比較して、Ｆ５にこれらのピークのより明白な増加があった。また、１９．５分のピークはより高い温度でより広くなった。ｐＨ１１に試料をさらしたときに見られたクロマトグラフィー変化に基づいて（以下を参照）、この方法は脱アミド及び／又はジスルフィドスクランブリングのような変化を即座に検出すべきであり、その両方がアルカリ性ｐＨで誘発しうる。
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製剤Ｆ１及びＦ２は他の瀬尾剤よりも明らかによく、主な分解過程は塩で触媒されていることを意味している。主ピーク面積％に基づくアレニウスプロットは、Ｆ２に対して１９．８±９．９ｋｃａｌ/モルの活性化エネルギーと、５℃で５０±２５ヶ月のｔ90（９５％信頼区間）を予想した（図１５）。
レセプター結合活性：以下の表１４は５週間の保存後の各温度及び製剤に対する比活性を示す。比活性は、ＭＡＣ-１捕獲検定濃度を全Ｆ（ａｂ）2ＥＬＩＳＡ濃度で割ることにより算定した。示した標準誤差はｎ＝２に対するものであり、各３回の希釈で２つのバイアルに対する二つの異なった検定からの全増殖誤差を説明する。より高い保存温度でより低い比活性になるという全ての製剤に対して明快な傾向があった（４０℃で〜１０−１５％の損失）；全ての製剤は−７０℃に対して４０℃でおよそ同じ程度の損失を示した。異なった製剤に対する４０℃データの一方向ＡＮＯＶＡ分析のｐ値は０．９８であり、４０℃平均は９５％の信頼度内で有意に互いに異なるとは考えられないであろう。４０℃データ対３０℃データの非対ｔテストは、差異が有意であり（ｐ＝０．０４４）、より低い温度がこの方法によりなお一層有意に異なる（ｐ＜０．０２）ことを示している。
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ＩＥＦ：異なった温度での５週間の保存の影響を製剤Ｆ２及びＦ５に対して等電フォーカシング電気泳動法（ＩＥＦ）により検定された。主バンドは〜８．８のｐｌを有するように見えた。ｐｌが〜８．７５（二番目に強いバンド）、〜８．６、及び〜８．４で３つの主成分がまた見られ、これは、特にｐＨ６で、保存と共に僅かに増加する。３０及び４０℃の試料はおよそ等しい強さを有しており、この点において製剤間に識別できる差異はなかった。少なくとも二つのより酸性のバンド（ｐｌが〜８．６と〜８．４）があり、二つの最も塩基性のバンドより少なくとも４倍低い強さを有していた。これらのバンドは保存と共に強さが変化することはなかった。
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ：ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８製剤Ｆ２及びＦ５（５週）の安定性に対する保存温度の影響をＳＤＳ-ＰＡＧＥ（還元及び非還元条件下）により検定した。ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８は非還元ゲル上で〜１２０ｋＤのＭＷで現れた。出発バルクには、ロイシンジッパーの様々な部分がなお付着したｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８を表す主バンドよりもより大きい分子量の幾つかの小さいバンドが存在した。この不純物の数パーセントはこのバルク調製物中に存在していることが知られている。主バンドよりも低いＭＷの幾つかのバンドがあったが、これらのバンドの一つのみが何れの製剤のおいても、あるいは温度と共に、変化するように見えた。約４５ｋＤのバンドは温度と共に増加し、ｐＨ５製剤においてよりもｐＨ６製剤において僅かにより強いものであるようであった。この観測はＳＥＣデータと一致していた。非還元ゲルでの〜４５ｋＤバンドの丁度上のバンドは還元ゲルに見られるバンドと見かけ分子量で対応し、非還元汚染タンパク質を表している。全ての種は、ジチオスレイトールでの還元時には軽鎖と重鎖に対応する２つのバンドに変換され、如何なるタンパク分解性開裂も存在しないことを示唆している。ＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ ＭＳ（Yates, J.Methods Enzymol., 271:351-377（1996））はＦａｂ’のサイズであった断片の形成を確認した。
製剤ｐＨ及びタンパク質濃度：ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の高次構造に対するｐＨの影響を蛍光分光分析法（図１７）を使用して調査した。タンパク質はｐＨ３以下で三次構造を失うように思われたが、ｐＨ３ないし８の範囲で変わらなかった。
上記の観察に基づき、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の安定性に対するｐＨとタンパク質濃度の影響をついで中央複合設計制御を使用して調査した。１０ｍＭの酢酸ナトリウム、８％のトレハロース、次の条件の一つを含む０．０５％のトゥイーン２０TMを含む製剤を調製した：０．５ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ４．５）、５ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ３、４．５、６）、１０ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ４．５）、２５ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ４．５）。試料を４０℃と−７０℃にして、ＩＥＸ（図１８Ａ）及びＳＥＣ（図１８Ｂ）により、２ヵ月後に分析した。再び、ｐＨ５が、タンパク質の濃度に拘わらず、タンパク質に対して最も安定した条件であることが分かった。
ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８製剤の長期間安定性：Ｆ２製剤の長期間安定性を調べるために、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、８％のトレハロース、０．０１％のトゥイーン２０TM、ｐＨ５中に入れた二組の試料を３ｃｃのガラス製バイアル中に調製し、示した温度で安定的に配した。ＳＥＣ（図１９Ａ）及びＭＡＣ-１結合（図１９Ｃ）による分析は、５℃で４３週までサイズ分布、凝集状態、又はタンパク質の生物活性に変化が無いことを示しており；３０℃で〜１ｍｏまでの安定性が示されている。ＩＥＸはペプチドマッピング／ＭＳにより脱アミドであることが特定された酸性ピーク（４３週後に〜１％）の形成を示している。
結論
予備的なデータによれば、精製したｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８における主反応が出発材料のおよそ半分のＭＷの種への開裂であり、この反応、並びにＩＥＸでの酸性ピークの発生とＨＩＣ及びＲＰ-ＨＰＬＣでの早期の溶出ピークが、ｐＨ５（ｐＨ６との比較）で、またトレハロース中（塩又はマンニトールとの比較）で全て最小化されることが示唆された。より小さいＭＷ種はタンパク分解性開裂及び／又はジスルフィドスクランブリングの何れかにより形成され得、その両方がより高いｐＨで増強され得る。対照及び分解試料の還元により、Ｆａｂへの開裂か、重鎖と軽鎖の間の混合ジスルフィド形成と一致して、軽鎖及び重鎖のみが得られた。
ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８は塩製剤において安定性が最も劣るように思われた；ｐＨ５で（トリマーに等価な）より大きな凝集物が現れ、ｐＨ６で沈殿が４０℃で見られた。如何なる理論に制約されるものではないが、一つの可能な説明は、糖及びマンニトールがそうするように、ＮａＣｌが水素結合を提供せず、潜在的により高い温度でこの抗体の自己会合を防止しうることである。
主要な検定（ＩＥＸ、ＳＥＣ、及びＵＶ）からの上記の予備データに基づいて、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ１８の好適な水性製剤は、１０ｍＭの酢酸塩、８％ｗ／ｖのトレハロース、０．０１％のトゥイーン２０TM、ｐＨ５．０である。一次速度定数（ＩＥＸデータ）にアレニウスフイットから予想される有効期間は５℃で１．７ないし４年である（９５％の信頼区間）。この製剤は、０．５７３ｍＬの氷酢酸、０．４０３ｍＬの濃ＮａＯＨ、８０ｇのトレハロース、１ｍＬの１０％トゥイーン２０TM溶液を混合し、ミリＱ水で１Ｌまでにする（２ＬスケールでｐＨ５．０±０．１）ことにより調製することができる。この製剤の伝導率は、ＣＤＣ３１４プローブを伴うレイディオメーター・コペンハーゲンＣＤＭ-８３を使用して５０２±１０％であることが分かり、密度は１．０１７ｇ／ｍＬであった。
実施例２
この実施例は組換えヒト化抗ＣＤ２０抗体、ｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０を含有する安定な水性多用量製剤の生産を記述している。１ヶ月間４０℃で保存した酢酸塩（ｐＨ５）製剤が、ヒスチジンで処方した試料（ｐＨ５又は６）よりもより高い安定性を立証した。より高い温度での保存後のヒスチジン製剤は非常に乳白色になり色が黄色になった。１０−３０ｍＭの酢酸塩の緩衝能はｐＨを５．０に維持するのに十分であった。凍結又は熱誘発凝集に対して抗体を安定化させるために必要な緊張性改変剤の有効量を、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）又はトレハロースを使用して比較した。トレハロースは、凍結誘発凝集から、特に
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のレベルで（５００：１モル比）製剤を保護することが見出された。溶液の透明度が証拠付けるように、トレハロース製剤（６７−２７０ｍＭ）が４０℃に配した製剤を安定化させる上でＮａＣｌよりも更により効果的であった。これらの結果から、２−８℃で２年間貯蔵の最小保存期間を有する４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２５ｍＭの酢酸塩、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール、０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０を含有する安定なプロトタイプ液体多用量製剤の開発に至った。
材料と方法
ＲｈｕＮＡｂ ＣＤ２０：全ての実験において使用したバルク材料は、５０ｍＭのトリス及び１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．５中に入った２７ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０あるいは２５ｍＭのトリス及び５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０中に入った２．７ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０からなる。バルクを光の無い状態で２−８℃で無菌的に保存した。
バッファー交換：使用前に脱イオン化水で十分にすすいだスペクトラ／プロR７膜（ＭＷＣＯ＝８Ｋｄａ）を使用して２−８℃で透析して、異なった試験バッファー中へのバルクｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０の交換をなした。１容量の抗体を、最小１０容量の適当な試験バッファーに対して透析した。この過程を一日の間に３回から４回繰り返した。４０ｍｇ／ｍＬの最終濃度を得るために、ＹＭ３０膜（ＭＷＣＯ＝３０ｋＤａ）を含むアミコンＵＦ／ＤＦ細胞を使用して抗体を更に濃縮した。２．７ｍｇ／ｍＬ材料という低い出発濃度のために、この材料を最初に〜４０ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、ついで適切な試験バッファーに対して透析した。標的濃度に達し、バッファー交換が完了した後、トレハロース、ベンジルアルコール及びポリソルベート２０を以下の表１５ないし１７に記載された最終濃度になるまで添加した。液体多容量Ｃ２Ｂ８候補製剤は、２５ｍＭの酢酸塩、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール及び０．０２％のポリソルベート２０、ｐＨ５．０に処方した４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０であった。製剤を次いで０．２μの膜で殺菌濾過し、濃度をＵＶ分光光度計スキャンにより測定した。各最終製剤の０．５ｍｌを次に殺菌した３ｃｃのガラス製バイアル中に満たし、表面テフロン加工の灰色のブチルゴム製ストッパーで栓をし、ついでクリンプシールでキャップをした。
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ＳＥＣ ＨＰＬＣ：検定前に製剤バッファーで試料を１０ｍｇ／ｍＬまで希釈した。該方法は、０．２Ｍのリン酸カリウム、０．２５Ｍの塩化カリウム、ｐＨ７からなる移動相を持つＴＳＫ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（トーソーハース）を使用する。アイソクラティックな流量は３０分の全実施時間で０．５ｍＬ／分である。注入されたタンパク質の量は２００μｇであり、２８０ｎｍでのＵＶ吸光を検出モードとして使用した。
ＨＩＣ ＨＰＬＣ：検定前に製剤バッファーで試料を１０ｍｇ／ｍＬまで希釈した。最終の断片の分析前にカルボキシペプチダーゼとパパインで抗体を消化させた。該方法はＴＳＫ-ＧＥＬブチル-ＮＰＲ（４．６ｘ３５ｍｍ）カラムを使用する。検定の間、カラムの温度は３５℃に制御される。抗体断片の溶出は硫酸アンモニウム勾配の変化により誘発される。検定の全実施時間は４０分であり、流量は１ｍｌ／分である。５−１０μｇのタンパク質の負荷を注入し、２１４ｎｍでのＵＶ吸光度により検出をモニターした。
ＵＶ分光光度計スキャン：タンパク質濃度の測定に対して、試料を製剤バッファーで精確に１：１００に希釈した。２８０、３２０及び３５０での吸光度を同じ製剤バッファーをブランクとしてヒューレットパッカード８４５１Ａダイオードアレイ分光光度計で読み取った。タンパク質濃度をＡ２８０からＡ３２０を減算し、１．７の吸光係数で除して算定した。
濁度の評価のために、試料をヒューレットパッカード８４５１Ａダイオードアレイ分光光度計でスキャニングし、３４０−３６０ｎｍの範囲の平均吸光度を測定した。水をブランクとして使用した。
増大した安定性の実験：２−８℃、３０℃、４０℃又は５０℃で温度制御室又はインキュベーター内に真直ぐにバイアルを保存した。有限時間で２ないし３のバイアルを取除き、安定性指示検定（ＳＥＣ ＨＰＬＣ、ＨＩＣ ＨＰＬＣ、タンパク質濃度と濁度を測定するためのＵＶ分光光度計スキャン、並びにｐＨ計測）によりタンパク質の分解をモニターした。加えて、試料を以下に記載されたようにして補体依存性細胞障害性検定にかけて生物活性を評価した。
凍結解凍実験：試料について、−７０℃で最短２時間の凍結に続いて室温での解凍
0003919235.tif 000021
を行った。各サイクルは１回の凍結に続いて１回の解凍を実施することからなる。１回、３回及び５回の連続凍結解凍サイクルの後に製剤当り３つのバイアルを取除き、安定性をＳＥＣ ＨＰＬＣとＵＶ分光光度計スキャンによりモニターし、濁度とタンパク質濃度を測定した。
補体依存性細胞障害性検定（ＣＤＣ）：安定性試料の生物活性を、（ウサギ補体ではなく）ヒト補体を使用したことを除いて、Gazzano Santoroら,J.Immunol.Meth. 202:163-171（1997）に記載されたＣＤＣ検定により測定した。試験試料の生物活性％は、次のようにして決定された：
生物活性％＝[（試料のＣＤＣ検定ｍｇ／ｍＬ／試料のタンパク質濃度）]ｘ100
[（参照のＣＤＣ検定ｍｇ／ｍＬ／参照のタンパク質濃度）]
試験試料と参照対照のタンパク質濃度をＵＶ分光光度計スキャンにより測定した。
結果と検討
ｐＨとバッファー種：ヒスチジン及びトレハロース中で製剤化された４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０のｐＨを７．５から５．０に減少させると、４０℃で２ヶ月貯蔵した後でさえ抗体の酸化を実質的になくした（図２４Ｂ）。凝集速度に減少がまた見られるが、ｐＨ６．５以下の差異は僅かである（図２４Ａ）。更に凝集速度を減少させるにはタンパク質濃度を減少させることが必要である。安定な製剤は酸性範囲のｐＨを必要とするようである。
バッファー種とｐＨの影響、ヒスチジン（５又は６）と酢酸塩（５）の間の差異を明確にするために、２−８℃、４０℃又は５０℃での貯蔵後に多用量製剤を比較した。観察された分解により２−８℃の貯蔵で見られたものを必ずしも予測できなかったので、製剤間の相対的な安定性を素早く測定する方法として試料を５０℃で保存した。
４週（５０℃）及び８週（２−８℃、４０℃）貯蔵した後の製剤の目で見た透明度とＵＶ分光光度計でスキャンして測定した（３４０−３６０ｎｍ）濁度を表１８に示す。両方のヒスチジン製剤は実験した全ての温度で酢酸塩よりもより乳白色であった。５０℃で２週間貯蔵した後では、ｐＨ５のヒスチジンが固体の不透明なゲルを形成する一方、ｐＨ６の同胞製剤は４週までに目で見て曇っており黄色であった。４０℃で保存したヒスチジン製剤も黄色になった。如何なる理論にも制約されるものではないが、色の形成はおそらくはヒスチジンの酸化によるものであり、使用したヒスチジンの濃度が高いため（５０ｍM）本実験でより明らかである。
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安定性をまたＨＩＣ及びＳＥＣ ＨＰＬＣ法によりモニターした。４０℃で８週の貯蔵後に、酢酸塩ｐＨ５製剤は無変化であったが、ヒスチジンｐＨ６製剤は初期時点に対して未酸化Ｆｃが１８パーセント減少した（表１９）。４０℃で貯蔵された全ての製剤においてモノマーパーセントは減少し、ヒスチジンｐＨ６は若干より安定であった。この減少は、空隙容積で溶出する高分子量の凝集物の形成、モノマーピークのラギング肩部及び低分子量種のためである。ゲル化の場合を除いて、タンパク質濃度とｐＨもまた測定されたが、実験の期間中変化はなかった。
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酢酸塩ｐＨ５製剤はほんの僅かより高い凝集速度を持ち、高温での貯蔵時に黄色にならず、実験した全ての条件下で最も透明であったので、これが全ての次の液体Ｃ２Ｂ８多用量製剤スクリーニングに対するバッファー種及び選択ｐＨとして選ばれた。
緩衝種の量：４０ｍｇ／ｍＬのＣ２Ｂ８多用量製剤のｐＨを５．０に維持した酢酸塩の量を測定した。表２０にまとめたものは、酢酸塩バッファー濃度を１０から３０ｍＭへ増大させたときのｐＨに対する影響である。２週と４週では、１５ｍＭ以上の酢酸塩とすることに若干の利点が見られた。但し、長期間の保存ではそうではなかった。２−８℃で一年間貯蔵した後では試験製剤の何れにもｐＨ変化は見られなかった。
１０ないし３０ｍＭの範囲の酢酸塩がｐＨを５．０に維持するために十分である。
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緊張性改変剤：タンパク質の比：トレハロースの添加は、複数回の凍結／解凍サイクルの後でのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０多用量製剤の安定性に有用であった。製剤中のトレハロースの濃度を増加させるにつれて、可溶な凝集物の形成の減少が観察された。５００モルトレハロース：１モルＣ２Ｂ８（１３４ｍＭトレハロース）の比で、形成された凝集物のパーセントは５回の凍結乾燥サイクル後に〜０．５％のみである一方、等張性改変剤を含まない対照製剤は４％の凝集物を形成した。液体Ｃ２Ｂ８製剤中に少なくとも５００倍のモルの過剰のトレハロースを有すると、凍結で誘発された凝集に対して十分な保護を提供した。
より高い温度での貯蔵の間におけるｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０を安定化させるトレハロースの能力を実験し、塩化ナトリウムと比較した。
図２６は４０℃で保存された試験製剤の透明度に対するトレハロース又は塩化ナトリウムの過剰モル比の影響を記述している。塩化ナトリウムは安定性に悪影響を持つ。４０℃での２週間の貯蔵後に、５００：１の比の試料は０．４４のＯ.Ｄ.を有していた。１０００：１のモル比で、塩化ナトリウム含有製剤は、乳白色の流体で上部が覆われた不透明なゲルからなる二相系に分離した。これに対して、４０℃で１ヶ月の貯蔵後でさえ０ないし１０００：１のモル比のトレハロースを含む試料の溶液透明性に変化は殆どなかった。２−８℃の製剤は最初の時点から変わっていなかったが、塩化ナトリウム含有試料はより乳白色であった。
可溶な凝集物形成の最小化に対するトレハロースの効果は、ＳＥＣ ＨＰＬＣにより評価した（図２７）。トレハロースの製剤と緊張性改変剤を含んでいない負の対照の間に差異は観察されなかった。製剤は４０℃での貯蔵時に同じ製品に同じ速度で分解するようであった。ｐＨと濃度もまた実験の間中維持された。
トレハロースの存在は凍結誘発凝集を最小にするために有用であり、液体状態における安定性には不利ではない。候補液体多用量製剤は好ましくは少なくとも５００：１のモル比のＣ２Ｂ８に対するトレハロースを含む。
候補の液体多用量製剤の安定性：上述の実験に基づき、４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２５ｍＭの酢酸塩、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール及び０．０２％のポリソルベートでｐＨ５からなるプロトタイプ液体多用量製剤は２−８℃、３０℃及び４０℃で安定に配された。実験した各温度でのＳＥＣ ＨＰＬＣによる安定性プロフィールを図２８に示す。凝集速度は参照対照（１０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２５ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０７％のポリソルベート８０、ｐＨ６．５）と比較して多用量製剤（４０ｍｇ／ｍＬ）では４０℃で僅かに速いが、２−８℃での２年間の貯蔵時にはモノマーパーセントに減少は見られなかった。２年を経た２−８℃の試料の生物活性はＣＤＣ検定により測定して、参照対照に対して９９．２％であった。
結論
上記のスクリーニング実験は、酢酸塩で緩衝化させ、ｐＨを５に維持し、そして好ましくは抗体１モル当り少なくとも約５００モルのトレハロースを含ませることにより、安定な高濃度のｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０液体多用量製剤が得られることを示している。好適な液体多用量構成は、４０ｍｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂ ＣＤ２０、２５ｍＭの酢酸塩、１５０ｍＭのトレハロース、０．９％のベンジルアルコール及び０．０２％のポリソルベートでｐＨ５からなり、２−８℃で２年の有効期間を有している。
配列リスト
（１）一般情報：
（ｉ）出願人：ジェネンテク・インク
（ｉｉ）発明の名称：抗体製剤
（ｉｉｉ）配列の数：１１
（ｉｖ）通信住所：
（Ａ）あて名：ジェネンテク社
（Ｂ）通り：１ ＤＮＡ ウェイ
（Ｃ）市：サウスサンフランシスコ
（Ｄ）州：カルフォルニア
（Ｅ）国：アメリカ合衆国
（Ｆ）郵便番号：９４０８０
（ｖ）コンピュータ読取り可能形態：
（Ａ）媒体方式：３．５インチ、１．４４Ｍｂフロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣ互換機
（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ウィンパットィン（ジェネンテク）
（ｖｉ）現出願データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先の出願データ
（Ａ）出願番号：０８／８７４８９７
（Ｂ）出願日：１９９７年６月１３日
（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報：
（Ａ）名前：リー,ウェンディ・エム
（Ｂ）登録番号：４０３７８
（Ｃ）整理／ドケット番号：Ｐ１０８９Ｒ１ＰＣＴ
（ｉｘ）遠距離通信情報：
（Ａ）電話：６５０／２２５−１９９４
（Ｂ）テレファックス：６５０／９５２−９８８１
（２）配列番号：１の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：２４１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：１：
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（２）配列番号：２の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：２１４アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：２：
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（２）配列番号：３の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：３６アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：３：
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（２）配列番号：４の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：４：
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（２）配列番号：５の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：５：
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（２）配列番号：６の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：６：
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（２）配列番号：７の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：７：
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（２）配列番号：８の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：８アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：８：
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（２）配列番号：９の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：２１４３塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：９：
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（２）配列番号：１０の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：２３７アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：１０：
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（２）配列番号：１１の情報：
（ｉ）配列の性質：
（Ａ）配列の長さ：３００アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｘｉ）配列：配列番号：１１：
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
0003919235.tif 000050
【図８】
0003919235.tif 000051
【図９】
0003919235.tif 000052
【図１０】
0003919235.tif 000053
【図１１】
0003919235.tif 000054
【図１２】
0003919235.tif 000055
【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
0003919235.tif 000060
【図１７】
0003919235.tif 000061
【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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