(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリケーションキトサンを含むイムノアジュバント。
【請求項２】
発色団を更に含む請求項１に記載のイムノアジュバント。
【請求項３】
前記発色団が、インドシアニングリーン、ＤＨＥ、ｍ−ＴＨＰＰ、ＡｌＰｃＳ4、ＺｎＥＴ２およびＢｃｈｌａから成る群より選択される請求項２に記載のイムノアジュバント。
【請求項４】
前記発色団がインドシアニングリーンである請求項２に記載のイムノアジュバント。
【請求項５】
前記イムノアジュバントが溶液を更に含む請求項２に記載のイムノアジュバント。
【請求項６】
前記溶液が、０．２５重量％の前記発色団および０．５重量％の前記グリケーションキトサンを含む請求項５に記載のイムノアジュバント。
【請求項７】
前記イムノアジュバントが、前記グリケーションキトサンに対して共役した腫瘍特異的抗体を更に含む請求項１に記載のイムノアジュバント。
【請求項８】
前記イムノアジュバントが、前記グリケーションキトサンに対して共役した腫瘍特異的抗原を更に含む請求項１に記載のイムノアジュバント。
【請求項９】
前記グリケーションキトサンが、カルボニルまたはカルボキシル反応性基を含む請求項１に記載のイムノアジュバント。
【請求項１０】
グリケーションキトサンからなるイムノアジュバント。
【請求項１１】
脱アセチル化キチン（キトサン）の直鎖状ホモポリマーを含むキトサン由来生体材料であって、該脱アセチル化キチンが、他の場合には遊離の多数のアミノ基を、還元性単糖またはオリゴ糖のカルボニル基に結合させて有し、グリケーションキトサンを形成している上記キトサン由来生体材料。
【請求項１２】
前記グリケーションキトサンがシッフ塩基の形である請求項１１に記載のキトサン由来生体材料。
【請求項１３】
前記グリケーションキトサンがアマドリ産物の形である請求項１１に記載のキトサン由来生体材料。
【請求項１４】
前記グリケーションキトサンが還元シッフ塩基の形である請求項１１に記載のキトサン由来生体材料。
【請求項１５】
前記単糖がガラクトースである請求項１１に記載のキトサン由来生体材料。
【請求項１６】
前記グリケーションキトサンが、カルボニルまたはカルボキシル反応性基を含む請求項１１に記載のキトサン由来生体材料。
【請求項１７】
請求項１−１０のいずれか１項のイミュノアジュバント、および発色団を含む、新生物を治療するための治療用組成物。
【請求項１８】
請求項１−１０のいずれか１項のイミュノアジュバント、および発色団を含む、タンデムな光力学的及び免疫学的な治療のための新生物を調製するための治療用組成物。
【請求項１９】
イミュノアジュバント及び発色団が腫瘍特異的抗原に共役している、請求項１７又は１８の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
１．  技術分野：
本発明は、概して、新生物（neoplasm）を治療する方法に関する。更に詳しくは、本発明は、光力学療法および腫瘍免疫療法を組合わせて、新生物細胞破壊を引き起こし且つ残留する新生物細胞に対する自己免疫防御系を刺激する。
２．  背景：
新生物は、細胞増殖によって正常組織よりも速やかに増殖する異常組織である。それは、その増殖を起こした刺激が消散した後でも増殖し続ける。新生物は、構造的組織化および正常組織との機能的協調について部分的または完全な欠如を示し、そして通常、良性かまたは悪性でありうる独特な塊を形成する。
癌は、様々な種類の悪性腫瘍全部を示すのにしばしば用いられる一般名であり、その大部分が、周囲の組織に侵入し、いくつかの部位に転移することがあり、そして除去を試みた後に再発し且つ適切に治療しなければ患者を死亡させる可能性がある。癌は、どんな年齢でもどの臓器のどの組織でも発生しうる。
いったん癌が疑われる診断がなされると、治療の決定が最も重要となる。全ての癌に応用できる一つの治療法はないが、臨床的に明らかであろうと鏡検であろうと、成功した療法を一次腫瘍およびその転移に集中させる必要がある。
慣用的な治療
歴史的に、手術または放射線などの局所および局部療法は、癌治療において、全身療法、例えば、薬物と一緒に用いられてきた。
手術は、最も古い有効な種類の癌療法である。１９８８年には、約１，５００，０００人が癌を発症し、その内の約５１５，０００人は皮膚かまたは頸部の癌であった。約９８５，０００人は他の全身性の種類であり、６４％は、推定治癒率６２％の手術可能な病変であった。初期に検出された場合に手術だけで確実に影響を受けることができる癌としては、頸部癌、乳癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌、咽頭癌、子宮内膜癌、卵巣癌、口腔癌、腎臓癌、精巣癌（非セミノーム）および肺癌（非小細胞）がある。しかしながら、治療成功百分率は、癌の部位間で大きく異なることに留意する必要がある。
放射線は、ホジキン病、結節型および散在性非ホジキンリンパ種、頭部および頸部の偏平上皮癌、縦隔生殖細胞腫、セミノーム（seminoma）、前立腺癌、初期乳癌、初期の非小細胞肺癌並びに髄芽細胞腫の治癒において重要な役割を果たす。放射線は、骨転移がある場合の前立腺癌および乳癌において、多発性骨髄腫、進行期の肺および食道咽頭癌、胃癌、および肉腫において、並びに脳転移において一時的緩和療法として用いることができる。放射線だけで治癒することができる癌としては、ホジキン病、初期の非ホジキンリンパ腫、精巣（セミノーム）癌、前立腺癌、咽頭癌、頸部癌、並びにより小さい範囲までの鼻咽頭癌、鼻洞癌、乳癌、食道癌および肺癌がある。
抗腫瘍性薬は、腫瘍細胞の細胞分裂（有糸分裂）、発生、成熟または拡散を妨げるものである。理想的抗腫瘍性薬は、正常細胞に対する悪影響または毒性を伴うことなく癌細胞を破壊するであろうが、このような薬物は存在しない。しかしながら、多数の薬物の狭い治療指数にもかかわらず、治療および治癒さえもが、若干の患者で可能である。ある時期の絨毛癌、ホジキン病、散在性大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫および白血病は、精巣癌（非セミノーム）および肺癌（小細胞）と同様、抗腫瘍薬に対して感受性であることが判った。抗腫瘍性薬の一般的な種類としては、アルキル化剤、抗代謝剤、植物アルカロイド、抗生物質、ニトロソ尿素、無機イオン、酵素およびホルミンがある。
いくつかの成功にもかかわらず、上の治療は望まれる程度まで有効ではなく、より有効な療法のための研究が続けられている。
最近の進歩
医学界で研究されたより最近の腫瘍学的治療方式の内の二つは、光力学療法および腫瘍免疫療法である。
Ｉ．  光力学的療法
光感受性化合物が、光に対して暴露された場合に光化学反応を示すことは長年の間知られてきた。光力学療法（ＰＤＴ）は、このような光感受性化合物およびレーザーを用いて腫瘍壊死を引き起こす。ＰＤＴによる中実腫瘍の治療は、通常、腫瘍限局性光感受性化合物の全身投与および引き続くレーザーによるそれらの活性化を行う。適当な波長の光を吸収すると、増感剤は安定な原子構造から励起状態へと変換される。細胞障害性および結果として起こる腫瘍破壊は、処置された組織内の増感剤と分子酸素との間の相互作用によって媒介されて、細胞障害性一重項酸素を生じる。
光供給および容量パメローターを含めた、ＰＤＴ、生物医学的レーザーおよび光感受性化合物に関する二つの充分な一般の参考文献は、両方とも本明細書中に援用される、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・リミテッド（John Wiley and Sons Ltd.），チチェスター，英国によって１９８９年に公表されたPhotosensitizing Compounds:Their Chemistry,Biology and Clinical Use，ISBN 0 471 92308 7、およびエルセビア・サイエンス・パブリッシャーズ（Elsevier Science Publishers）B.V.，アムステルダム，オランダによって公表されたPhotodynamic Therapy and Biomedical Lasers:Proceedings of the International Conference on Photodynamic Therapy and Medical Laser Applications，ミラノ，1992年６月24〜27日，ISBM 0 444 81430 2である。
ＰＤＴに関する米国特許としては、リービ（Levy）らの米国特許第5,095,030号および第5,283,225号；パンディー（Pandey）らの第5,314,905号；アリソン（Allison）らの第5,214,036号；およびコペセク（Kopecek）らの第5,258,453号があり、いずれも本明細書中に援用される。リービの特許は、受容体特異的リガンド、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの免疫特異的部分などの腫瘍特異的抗体に結合した６７０〜７８０ｎｍの波長によって影響を受ける光増感剤の使用を開示している。パンディーの特許は、標準的な光力学療法で用いるためのピロフェオホルバイド（Pyropheophorbide）化合物に関する。パンディーはまた、その組成物とリガンドおよび抗体との結合を開示している。アリソンの特許は、緑色ポルフィリンを脂質複合体に結合させて、標的の腫瘍細胞に対するポルフィリン化合物の特異性を増加させるという点で、リービの特許と似ている。コペセクの特許もまた、癌組織を治療するための組成物開示している。これらの組成物は、コポリマー性担体に結合した２種類の薬物、すなわち、抗癌薬および光活性化薬から成る。それらの組成物は、飲作用によって標的細胞に入る。抗癌薬は、標的細胞に侵入した後に作用する。一定時間後、光源を用いて光増感置換基を活性化させる。
ＩＩ．  腫瘍免疫療法
免疫系の主な機能は、「自己」の概念を引出し且つ「非自己」であるものを排除することである。微生物は、毎日出会う主要な非自己実体であるが、免疫系は、更に、新生物および移植片を排除するように働く。本明細書中に援用されるラーウェイ（Rahway），N.J.のメルク・リサーチ・ラボラトリーズ（Merck Research Laboratories），ISBN 0911910-16-6および0076-6526によって1992年に公表されたThe Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第16版の第18および103章を参照されたい。
免疫系にはいくつか異なった種類がある。非特異的、すなわち先天性の免疫は、以前の感染またはワクチン接種によって免疫化（感作またはアレルギー化）されなかった種によって示される本来備わっている抵抗性を意味する。その主な細胞成分は食細胞系であり、その機能は、侵入した微生物を取込み且つ消化することである。食細胞としては、血液中の好中球および単球並びに組織中のマクロファージがある。補体タンパク質は、非特異的免疫の主な可溶性成分である。インターフェロンなどの急性期反応体およびサイトカインもまた、先天性免疫の一部分である。
特異的免疫は、それを刺激した抗原決定基（感染性物質または他のもの）に対して単独で向けられる変更された反応性が存在する免疫状態である。それは、時々、獲得免疫と称される。それは、自然に獲得した（容易に判るまたは判らない）感染または故意のワクチン接種の結果として活性であり且つ特異的でありうるし、またはそれは、他人または動物からの抗体の転移から獲得される受身でありうる。特異的免疫は、学習、適応性および記憶の特徴がある。細胞成分はリンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）であり、そして免疫グロブリンは可溶性成分である。
寄生したまたは外来細胞を認識し且つ破壊する場合のＴ細胞およびＢ細胞の作用を、細胞性免疫と称する。細胞性免疫と対比して、体液性免疫は、複合体認識過程後にＢ細胞によって産生された循環性抗体に関係している。
腫瘍免疫学に関して、腫瘍免疫におけるリンパ様細胞の重要性が繰り返し示されてきた。腫瘍に対する細胞性宿主応答には、免疫学的監視の概念が含まれ、それによって、細胞性免疫に関係した細胞機序は、腫瘍結合抗原（正常細胞上ではっきりしない腫瘍細胞と結合した抗原）を認識後に、新しく形質転換された腫瘍細胞を破壊する。これは、非同一ドナーからの移植組織の拒絶の過程に似ている。ヒトの場合、腫瘍小節の増殖は、患者の末梢血リンパ球の懸濁液および腫瘍細胞の懸濁液を混合することによってin vivoで阻害され、腫瘍に対する細胞性反応が示唆された。in vitro研究は、ある種の新生物を有する患者からのリンパ様細胞が、培養中の該当するヒト腫瘍細胞に対して細胞障害性を示すことを示した。これらの細胞障害性細胞は、概して、Ｔ細胞であり、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、肉腫、並びに結腸癌、乳癌、頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、精巣癌、鼻咽頭癌および腎臓癌で見出された。マクロファージもまた、腫瘍結合抗原、リンホカインまたはインターフェロンの存在下の場合、腫瘍に対する細胞性宿主応答に関与しうる。
in vitroで腫瘍細胞と反応する体液性抗体は、化学的発癌物質またはウイルスによってもたらされた種々の動物腫瘍に反応して産生された。in vitroでのハイブリドーマ技術は、種々の動物およびヒト新生物に対して向けられる単クローン性抗腫瘍抗体の検出および産生を可能にする。しかしながら、in vivoでの腫瘍増殖に対する抗体仲介防御は、ある種の動物白血病およびリンパ腫においてのみ実証できた。対照的に、in vivoでのリンパ球細胞仲介防御は、広範な種の動物腫瘍系において生じる。
癌に対する免疫療法は、幅広い対象、すなわち、生物学的療法の一部分としてまたは生体応答変更因子の投与について最もよく考えられる。これらの剤は、様々な機序（１）エフェクター細胞の数を増加させるかまたは１種類若しくはそれ以上の可溶性メディエイタを生産することによって宿主の抗腫瘍応答を刺激すること；（２）エフェクターまたはメディエイタとして役立つこと；（３）宿主サプレッサー機序を低下させること；（４）腫瘍細胞を、それらの免疫原性を増加させるようにまたは免疫学的過程によってそれらが損傷されうるように変更すること；または（５）細胞障害物質または放射線療法に対する宿主の寛容性を向上させることの内の一つまたはそれ以上によって作用する。したがって、細胞性腫瘍免疫療法の中心は、インターロイキン−２に対する暴露によるin vitro拡大後の患者リンパ球の再注入であった。一つの変法としては、in vivoで腫瘍に浸潤したリンパ球、いわゆる腫瘍浸潤性リンパ球の集団の単離および拡大がある。もう一つは、インターフェロンの同時使用であり、それは、組織適合性抗原および腫瘍結合抗原の腫瘍細胞上での発現を促進し、それによって、注入されたエフェクター細胞による腫瘍細胞の致死を増加させると考えられる。
また一方で、体液性療法は、宿主自身の免疫系の活発な刺激とは対照的に、受動免疫療法の形としての抗腫瘍抗体の使用に長い間集中してきた。もう一つの変法は、単クローン性抗腫瘍抗体と、リシンおよびジフテリアなどの毒素と、または放射性同位体との結合であり、それゆえ、それら抗体は、これら毒性物質を腫瘍細胞に対して特異的に供給するであろう。照射、ノイラミニダーゼ処置、ハプテン結合またはハイブリダイゼーション後に、宿主自身の腫瘍細胞を用いる活発な免疫化もまた試みられた。臨床的改善は、そのように治療された患者の少数で見られた。他からの腫瘍細胞は、それらの照射後に、緩解後の急性リンパ芽球性白血病および急性骨髄芽球性白血病においてアジュバントと一緒に用いられた。緩解の延長または向上した再誘導率は、いくつかの系列で報告されたが、大部分においてではなかった。インターフェロン、腫瘍壊死因子およびリンホトキシンもまた、免疫学的に仲介された機序に影響を与えるのに用いられた。細胞性および体液性両方の機序を用いる最近のアプローチは、一つの抗体を、細胞障害性エフェクター細胞と反応する第二抗体に対して結合した腫瘍細胞と反応させ、腫瘍に対して後者をより特異的に集中させることを含む「異種交差結合抗体」の開発である。ＰＤＴ処置されたネズミ腫瘍への宿主免疫細胞浸潤が報告された。
併用されるＰＤＴおよび免疫療法
ＰＤＴと免疫療法とを組合わせる可能性は、クロベリク（Krobelik）、クロスル（Krosl）、ダウアティー（Dougherty）およびチャプリン（Chaplin）によって調べられた。Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers，上記，518〜520頁を参照されたい。その研究において、彼等は、ＰＤＴに対する免疫反応の拡大および処置された腫瘍の更に広がった破壊へのその方向の可能性を研究した。偏平上皮癌ＳＣＣＶＩＩである腫瘍を、雌Ｃ３Ｈマウスで増殖させた。免疫活性化剤ＳＰＧ（マクロファージおよびリンパ球を、サイトカインからの刺激および他の免疫シグナルに対してより一層反応性になるように刺激する高分子量Ｂ−グルカン）を、ＰＤＴの前日に終了するかまたはＰＤＴの直後に開始して、７日用量で筋肉内投与した。フォトフリン基剤ＰＤＴを用い、フォトフリンは光処置の２４時間前に静脈内投与された。ＳＰＧ免疫療法は、ＰＤＴの直接的致死作用を促進することが判った。しかしながら、間接的致死作用（現場に残された腫瘍細胞の生存の減少として判る）は、ＳＰＧを与えられなかった動物の腫瘍においてより一層顕著であった。ＰＤＴの前後に行われた場合のＳＰＧ免疫療法の有効性の違いは、光供給の時点またはその直後に免疫活性がピークに達する場合に最大相互作用が達成されることを示唆した。ＰＤＴ後に開始する（および５〜７日後に最適免疫活性化に達する）ＳＰＧでのそれは、有益な反応には明らかに遅過ぎる。
もう一つの研究において、低酸素条件下で細胞障害性である生体反応性薬物の作用を増強するためのＰＤＴの使用が研究された。Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers，上記，698〜701頁を参照されたい。このような薬物の抗腫瘍活性は、腫瘍低酸素状態を増加する処置とそれらを組合わせて用いた場合に、in vivoで増強されうることが判った。
目的
本発明の目的は、光力学的および免疫学的療法を組合わせることによって、即時に腫瘍細胞破壊を引き起こすと同時に、残留するまたは転移腫瘍細胞の増殖に対して自己免疫防御系を刺激するような方法で新生物の処置を改善することである。
発明の概要
本発明により、前述のおよび他の目的および利点は、発色団およびイムノアジュバントを新生物中に導入することによって達成される。次に、腫瘍細胞破壊をもたらし且つ細胞性および体液性免疫応答を刺激するのに充分な放射照度でその新生物をレーザー処置する。
本発明の一つの態様により、悪性腫瘍などの新生物に、発色団およびイムノアジュバントを含有する溶液を注射する。次に、発色団の波長に対して相補的な波長の放射線を発する低エネルギーレーザーを、その新生物に対して、腫瘍細胞破壊をもたらし且つ腫瘍細胞増殖に対する自己免疫防御系を刺激する程度までその新生物の温度を上昇させるのに充分な時間集中させる。多数の代わりの発色団およびイムノアジュバントを、放射照度パラメーターと一緒に提供する。
本発明のもう一つの態様により、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）およびグリケーション（glycated）キトサンの溶液を、キトサンに対して０．１〜２％のＩＧＣの濃度で調製する。その溶液を、新生物中に７０〜４００μｌの投与量で注射する。次に、出力約５ワットで且つ正常な細胞組織をほとんど破壊することなく容易に透過できる放射線の波長を有するレーザーを用いて、その新生物をレーザー処置する。照射は１〜１０分間続けるが、それは、腫瘍細胞破壊をもたらし且つ細胞性および体液性免疫応答を刺激する程度まで新生物の温度を上昇させるのに充分である。
本発明は、他の慣用的なおよび慣用的でない治療方式にまさるいくつかの利点を有する。増感剤および免疫刺激アジュバントの組合わせがその鍵である。最も重要な利点は、組合わせの急性および慢性腫瘍破壊である。急性腫瘍減少は、腫瘍組織の光気化、光除去または熱致死によって大規模且つ一定規模に直接の部分で引き起こされて、腫瘍量（burden）を減少させ、したがって増幅の根拠を減少させるので、自己防御系は一層弱い敵と戦うことができる。光熱破壊が起こる場合、断片化された組織および細胞分子は、キトサンなどの免疫増強材料の存在下において宿主内にまき散らされる。事実上、その場でワクチンが形成される。次に、この材料混合物は宿主内で循環し、そして免疫監視系によって検出される。引続き、ＮＫ細胞および補充されたキラーＴ細胞を包含する細胞性免疫の即時動員が起こる。これらの細胞は、類似した抗原または化学物質の部位に移動する。やがて、細胞性免疫は、細胞障害性抗体の産生と共に体液性免疫に移行する。これらの抗体は、身体のあちこちに自由に循環し、そしてそれらがコードされた細胞および材料に付着する。この付着が補体因子の存在下で起こる場合、その結果が細胞死である。これら二つの免疫作用方式の持続時間枠は、細胞性応答では０〜２週間であり、体液性戦闘部隊は約３０日目に成熟し、そして宿主の寿命まで長期間存続する必要がある。
用いられた放射線の波長は正常な細胞組織によって容易に吸収されないので、付帯損傷は許容しうる程度まで減少する。特に、レーザー出力をある種の損傷閾値に基づいて注意深く選択する場合、そのレーザーは、皮膚などのレーザービームの経路にある組織をほどんど損傷しないであろう。この特性は、非侵襲性処置を可能にする。患部組織が体内の深いところにある場合でも、内視鏡および光ファイバーは治療部位に容易に到達することができる。
相補的吸収波長の発色団は、レーザー処置を極めて選択的にする。発色団注射部分だけが顕著な組織損傷を受ける。発色団の濃度、発色団およびイムノアジュバントの投与量並びに投与のタイミングは、もたらされる光熱作用の時間的および空間的調節を考慮している。最適投与は、発色団の物理的および化学的特性を考慮することによっておよび光熱相互作用に対する組織応答を考慮することによって達成することができる。等しく重要なのは、経時的分子分解並びに循環および排出系による分子の移動などの、レーザー刺激が全くない場合の発色団とその宿主組織との自然の反応である。本発明の好ましい発色団ＩＣＧは、無毒性であり、そして肝臓および腎臓によって短時間で容易に排出されうる。
要するに、完全な癌撲滅による長期生存は、本発明によって達成されうる。それは、光熱相互作用による減少した腫瘍量と、キトサンまたは他のイムノモジュレーターの存在による促進された免疫系応答との組合わせの結果である。
また、本発明の他の目的および利点は、次の詳細な説明から当業者に容易に明らかになるであろうが、そこでは、単に、本発明を実施するのに考えられる最善の態様の例として、本発明の好ましい実施態様だけが示され且つ記載されている。理解されるように、本発明は、本発明から全く逸脱することなく、種々の明らかな点で変更可能である。したがって、その説明は、事実上、例示するものとしてみなされるべきであり、制限するものとしてみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の方法で一次腫瘍を処置されたあるネズミ対象の腫瘍量を経時的に示したネズミ乳房腫瘍の実験に関するチャートである。
図２は、第二の被処置ネズミ対象についての図１と同様のチャートである。
図３は、図１のネズミ対象での未処置二次腫瘍の経時的腫瘍量を示すチャートである。
図４は、図２のネズミ対象での未処置二次腫瘍の経時的腫瘍量を示すチャートである。
図５は、他の被処置ネズミ対象３匹についての経時的腫瘍量を示すチャートである。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は、発色団およびイムノアジュバント（イムノモジュレーターまたは免疫増強物質とも称される）両方を新生物中に導入することによって光力学的および免疫学的療法を組合わせる。腫瘍細胞破壊を引き起こすのに充分なレーザー放射照度の適用で、このように放出された腫瘍抗原に対する細胞性および体液性免疫応答は、該イムノアジュバント成分によって刺激（増強）される。
発色団およびイムノアジュバントは、好ましくは、腫瘍塊の中心に注射するために溶液中に混合される。しかしながら、発色団およびイムノアジュバントを腫瘍部位に限局化するのに他の方法も充分でありうるということは理解されるはずである。一つのこのような代わりの供給手段は、腫瘍部位への供給を促進するような、組織特異的抗体または組織特異的抗原に対する発色団若しくはイムノアジュバントまたは両方の共役である。発色団およびイムノアジュバントを腫瘍部位に限局化するいずれか一つの方法または種々の方法の組合わせは、その供給機序が新生物中に充分な濃度の成分を確保する限りにおいて許容しうる。
適当な発色団の選択は、主として、放射線の許容しうるレーザー波長との協調が問題である。用いられる放射線の波長は、当然ながら、発色団の光特性（すなわち、吸収ピーク）に対して相補的でなければならない。他の発色団選択基準としては、熱エネルギーを生じる能力、一重項酸素および他の活性分子を発生する能力、またはシスプラチニン（cis-platinin）のようにそれらだけで毒性である能力がある。本発明において、放射線の好ましい波長は、８０８±１０ｎｍである。所望の発色団は、組織が比較的透明である赤および近赤外スペクトル部分で強い吸収がある。この波長のもう一つの利点は、ＵＶ励起増感剤が出会う潜在的突然変異原作用が避けられることである。それにもかかわらず、１５０〜２００ｎｍの波長は、個々の場合に有効であることを示しうる。好ましい発色団はインドシアニングリーンである。他の発色団を用いてよいが、しかしながら、それらの選択は、光感作効率および光細胞障害性が依存する所望の光物理的および光化学的特性に基づく。代わりの発色団の例としては、それらに限定されるものではないが、ＤＨＥ（ポリヘマトポルフィリンエステル／エーテル）、ｍ−ＴＨＰＰ（テトラ（メタ−ヒドロキシフェニル）ポルフィリン）、ＡｌＰｃＳ4（テトラスルホン酸フタロシアニンアルミニウム）、ＺｎＥＴ２（亜鉛アセチオ−プルプリン）およびＢｃｈｌａ（バクテリオクロロフィルａ）がある。
好ましいイムノアジュバントはキトサンである。キトサンは、通常、カニ、イセエビおよび小エビなどのいくかの甲殻類の殻から単離される化合物であるキチンの誘導体である。キチンは、β１→４グリコシド結合によって結合したＮ−アセチルグルコサミン単位から成る直鎖状ホモポリマーである。キチン、キトサン（部分脱アセチル化キチン）およびそれらの誘導体は、多数の様々な且つ発展する産業および医学的用途をもたらした興味深い化学的および生物学的特性が与えられている。第一および第二アルコール基並びにキトサン中の第一アミノ基の存在は、主として、それらの可溶化を達成するように且つ具体的な用途に特殊な性質を与えるように設計された化学修飾のための多数の方法を容易にする。それらの生分解性および毒性の欠如は、それらの分解産物を、生きている組織の複合糖質成分の生合成に用いることができるので、それらを「生物学的に親しく」させる。キトサンおよびその誘導体は、特に、包帯および縫合糸、熱傷包帯剤、代用皮膚、人工骨および義歯、食品包装、薬物封入、化粧品、金属キレート化および関連の抗酸化作用、廃水処理、ホメオスタシス、抗凝固物質（硫酸化後）、並びに色素ドーピングに用いられてきた。
キチンおよびキトサンの可溶化は、オリゴ糖に対する部分加水分解によって達成されうる。キトサンについては、有機および無機両方の種々の酸での処理が、遊離アミノ基のプロトン化による水溶性キトソニウム塩の形成をもたらす。アミノ基の更に別の修飾としては、カルボキシメチル、グリセリル、Ｎ−ヒドロキシブチルおよびその他などの化学基の導入がある。キトサンの遊離アミノ基のグリケーション、すなわち、非酵素的グリコシル化、引続きの還元による安定化は、本発明において用いられるキトサンゲルおよび溶液の新規製造方法を与える。
本発明において用いるためのグリケーションキトサンの製造用プロトコルは次の通りである。還元性単糖（例えば、グルコース、ガラクトース、リボース）３グラムまたは等量の還元性オリゴ糖を、エレンマイヤーフラスコ中で静かに電磁撹拌されている蒸留水１００ｍｌ中に溶解させる。キトサン１グラムを加える。懸濁液が均一になった時点で、トルエン０．２５ｍｌを加え、そしてフラスコをアルミニウムホイルで密封する。電磁撹拌は室温で２４時間続ける。撹拌後、その溶液を、通風装置を備えたヒュームフード中に置き、そこで、０．１Ｍ水酸化ナトリウム５ｍｌ中の水素化ホウ素ナトリウム１．３２７ｇを加えて、シッフ塩基およびアマドリ産物を還元する。次に、その溶液をホイルで大まかに覆い、室温で１０分間および氷浴中で５０分間撹拌する。この撹拌工程後、フラスコを氷浴から取出し、そしてその溶液を、更に電磁撹拌しながら、氷酢酸（約１．９ｍｌ）の滴加によってｐＨ５．５まで酸性にして、過剰の水素化ホウ素を分解する。次に、その溶液を、５本のガラス（コレクス（Corex））遠心管中において１５，０００ｒｐｍ（ソーバル（Sorval），ローターＳＳ−３４において４℃で）で１５分間遠心分離する。その上澄みを傾瀉し、そしてペレットの上にある透明なゲル層をスチールスパチュラで静かに掻取る。２本の遠心管からの上澄みを用いて、それらのペレットを２本の管中で再懸濁させ且つ再度遠心分離する。また上澄みを傾瀉し、そしてゲルを上のように集める。合わせたペレットを、１本の管の上澄み中に再懸濁させ後に３回遠心分離する。上澄みを傾瀉後、そのゲルを再度集める。次に、プールされたゲルを、プールされた上澄み中に分散させて均一懸濁液を得、それを３個の透析バッグ（スペクトラポア（Spectrapor），平面幅２５ｍｍ，分画分子量１２，０００〜１４，０００）に入れる。その懸濁液を、蒸留水３．５ガロンに対して４℃で一晩中透析する。次に、バッグを新しい蒸留水中に入れ、そして透析を更に７時間続ける。透析後、透析物をバッグから取出し、そしてそれを、ワーリング（Waring）ブレンダー中において高速で３バースト（各１０秒間）まで均一にする。得られた粘稠溶液を凍結貯蔵する。本発明での使用前に、その凍結材料を水浴中において３７℃で融解させた後、ワーリングブレンダー中で混合して均一配合物にする。
好ましい実施態様においては、ＩＣＧ粉末をグリケーションキトサン標品と混合して、グリケーションキトサン標品に対して０．１％〜２％のＩＣＧの濃度（０．１〜２グラム／１００ｍｌ）の溶液を生じる。その溶液を使用するまで温めておく。有効量の溶液は７０〜２０００μｌである。
グリケーションキトサンが好ましいが、他の免疫増強物質を、細菌細胞壁若しくは遊離したタンパク質、弱毒化された生菌、各種油、修飾キトサン、または宿主とは無関係であるが無毒性であるキトサン様材料などの免疫活性剤の広範な群より選択しうる。
レーザーパラメーターについてと同様、直径１００〜２０００μｍの光ファイバーによって持続波で発光する固体ダイオードレーザーが好ましいが、同じ波長であってよいしまたは同じとは限らなくてよい個々のレーザーのバンクを含めた他のレーザーを用いてもよい。用いられるレーザー出力は、１〜６０ワットであり、好ましい出力は１〜５ワットである。照射持続時間は１〜６０分間持続する必要があり、３〜６分間が好ましい。レーザー処置される腫瘍塊の温度は、好ましくは、約１４０°Ｆまたは６０°Ｃまで上昇させる必要がある。
最も好ましい実施態様においては、ＩＣＧおよびグリケーションキトサンの溶液を、上記のように、キトサンに対して０．２５〜２％のＩＣＧの濃度で製造する。その溶液を、新生物の中心に７０〜４００μｌの投与量で注射する。次に、その新生物を、出力約５ワットで且つ正常細胞組織をほとんど破壊することなく容易に透過できる放射線の波長を有するレーザーを用いてレーザー処置する。照射は１〜１０分間続けるが、それは、腫瘍細胞破壊をもたらし且つ細胞性および体液性免疫応答を刺激する腫瘍抗原を遊離する程度まで新生物の温度を上昇させるのに充分である。
成分、パラメーターおよび手順を含めた本発明の好ましい実施態様の追加の説明は、ネズミ乳房腫瘍の実験についての次の要約に含まれる。
ネズミ乳房腫瘍実験
Ａ．  材料および方法
１．  レーザー
この実験では、ダイオードレーザーを用いた。インダストリアル・セミコンダクター・レーザー（Industrial Semiconductor Laser）ＩＳＬ５０Ｆ（マクドネル・ダグラス・アエロスペース（McDonnell Douglas Aerospace），セント・ルイス，ＭＯ）は、ダイオードドライバーによって電力供給されるダイオードアレイを用いる。レーザーは、８０８±１０ｎｍの波長の放射線をパルスでかまたは持続モードで発する。利用可能な計算状況出力でのその最大近赤外出力は３５ワットである。レーザーは、標準電力（１１０／１２０ＶＡＣ）で操作される。マイクロプロセッサーは、レーザー作業パラメーターを監視し且つ調整する。レーザーエネルギーは、種々の寸法の光ファイバーによって供給されうる。赤レーザーダイオードは、目標ビームとして６７０ｎｍ光を０．９ｍＷで発する。この実験では、持続波モードを用いた。
実験では、５ワットで３分間〜１５ワットで５分間のいろいろな出力およびレーザー照射持続時間を用いた。出力は、ジュール／ワットメーター（オフィア・オプティクス（Ophir Optics），イスラエル）を用いる操作前、中および後に測定された。２種類の光ファイバー、すなわち、直径６００μｍおよび１２００μｍを用いた。
２．  動物の調製
６〜７週令で体重１００〜１２５グラムのウィスター・ファース（Wistar Furth）雌ラットを実験用に選択した。モデルは、転移性移植可能ラット乳房腫瘍である。腫瘍株はＤＭＢＡ−４であった。腫瘍細胞（約２５，０００個）を、ラットに対して皮膚と筋肉層との間の表面の鼠径部中への注射によって移植した。若干の選択されたラットには、同時腫瘍増殖のために左右両方の鼠径部に腫瘍細胞を注射した。
ラットに、高飽和脂肪食である特別食を与えて、腫瘍の増殖を促した。腫瘍は、通常、腫瘍移植から１０〜１４日以内に約１〜４ｃｍ3まで増殖した。ほとんどの場合、ラット腫瘍が５ｃｍ3を越えて増殖する前にそれらを処置した。
レーザー処置の前に、麻酔を行い（キシラジンおよびケタミン溶液ＩＭ  １００μｌ）、そして腫瘍の上にある体毛を刈込み且つ剃り落とした。その処置後、ラットを別々のケージで維持し、そしてまた同様の高脂肪食を与えた。ラットを毎日観察し、そしてレーザー処置と未処置対照の両方の腫瘍の形態測定を週に２回行った。
３．  増感剤投与
増感剤インドシアニングリーン（ＩＣＧ）（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Co.）セント・ルイス）を、水中ＩＣＧおよびグリケーションキトサン中ＩＣＧの２種類の形で用い、その濃度は水またはキトサンに対して０．５％および１％（ｇ／１００ｍｌ）ＩＣＧであった。キトサン溶液の場合、ＩＣＧ粉末を、上記のように製造され、ゲルを凍結状態（−４℃）から３７℃まで上昇させた後のグリケーションキトサンと一緒にガラスグラインダー中で混合して、均一溶液を得た。つぎに、その増感剤溶液を、レーザー処置の２４時間前かまたはその操作のちょうど１０分前に、標的腫瘍の中心に注射した。投与量は、一つの腫瘍に対して７０μｌ〜４００μｌであった。
両方の鼠径部に一次腫瘍を移植されたラットについては、一方の腫瘍だけにＩＣＧ−キトサン注射を行った。しかしながら、両腫瘍とも、同じレーザーパラメーターを用いて処置された。
４．  レーザー処置
レーザーエネルギーは、直径６００または１２００μｍのファイバーによって処置部位に与えられた。ファイバーの先端は、皮膚から４ｍｍに維持された。ファイバー先端を、腫瘍の側面全体にむらなく且つゆっくりと移動させて、均一なエネルギー分布を確実にした。処置部位表面上に薄水膜（２０℃）を絶えず与えて、表面発熱による皮膚の不必要な損傷を防止した。
二つの同時一次腫瘍を有するラットについては、一方の腫瘍をＩＣＧ−キトサンの助けによってレーザー処置し、そしてもう一方をレーザーだけで処置した。５６匹のラットを、ＩＣＧ−キトサン溶液と一緒に様々なレーザーパラメーターを用いて処置した。１６匹のラットには、１％ＩＣＧ−Ｈ2Ｏ溶液１００〜２００μｌを注射し、そして３〜５分間および３〜１０ワットの様々な放射照度でレーザー処置した。
Ｂ．  結果
１．  生存ラット
全体として、１０５匹の（１０５）ラットを、１９９５年４月１日までの実験で用いた。全ラットに、転移性移植可能ラット乳房腫瘍細胞を、片方の鼠径部かまたは両方に注射した。ラットを、（１）対照、（２）ＩＣＧ−Ｈ2Ｏ溶液と共にレーザー処置、および（３）ＩＣＧ−キトサン溶液と共にレーザー処置の３群に分けた。各グループ別対象の生存ラットを表Ｉにまとめる。
0003929491.tif 000002
３３匹の対照ラットでの平均生存時間は、腫瘍移植後３１．５日間であり；水性ＩＣＧのみを注射されたレーザー処置ラットでの平均は２９．０日間であり；全平均生存時間は、ＩＣＧ−キトサン注射レーザー処置ラットで４５．６日間であった。最後の群のラット５６匹の内、６匹は長期生存（対照ラットの少なくとも２倍）に達し、それらを除くと、その群生存率は３２．８日間であった。また一方、６匹のラットは、平均生存日数が１５２．０日となった。３匹のラット，Ｓラット３、Ｓラット４およびＳラット６は、１９９５年４月１日までにそれらがそれぞれ２２０、１９２および１４７日生存した後、報告が書かれた時点でまだ生存していたことに注目することは価値がある。
２．  レーザー処置に対する腫瘍反応
表Ｉは、群２および群３両方の腫瘍ラットがレーザーエネルギーに対して正に反応したことを示す。ほとんど全部の腫瘍が、レーザー処置直後に温度上昇した。ＩＣＧ−Ｈ2ＯまたはＩＣＧ−キトサン溶液を注射された腫瘍は、通常、４０°Ｆまで温度を上昇させ、ＩＣＧ不含腫瘍も温度を上昇させたが、レーザー出力および持続時間に応じて、より低レベルで、通常、体温より高い２０〜３０°Ｆであった。
突然の温度上昇のために、操作中にしばしば内部破裂が起こった。それは、例えば、１０ワットを越える高レーザー出力下で一層明らかであった。高出力は、処置表面上に水滴を絶えず与えたとしても、ほとんどの場合に皮膚損傷を生じた。
高レーザー出力下（１０〜１５Ｗ）での腫瘍細胞破壊は、むしろ表面的であり、より深い所にある腫瘍細胞は、しばしば、レーザー攻撃から生き残った。よりよい結果は、より低いレーザー出力を適用した場合に得られた。６匹の長期生存ラット全部が、５ワット処置によって得られた（３分間暴露時間で４匹および５分間で２匹）。表IIを参照されたい。
0003929491.tif 000003
全体として、４３匹のラットを５ワットのレーザー出力および３〜６分間の照射持続時間で処置し、これは、この群での長期生存率１４％を生じた。これらのパラメーターの下で、６匹の長期生存ラットを含まなければ、平均生存日数は３２．８±６．３日に達した。
レーザー処置直後に、腫瘍は全て、最初に数日中により遅い増殖を示した後、普通の増殖速度に戻った。しばしば、腫瘍は、部分的にかみ切られるかまたはかみ砕かれるであろうが、それが増殖を止めたり遅くしたりすることはないと考えられる。大部分のラットは、表IIで挙げたラットを除いておよそ３０〜３５日で死滅した。約半数の被処置ラットは、後に、大部分が（腋窩部分のリンパ節への転移の）「ハンドバッグ」として二次腫瘍を生じ、一次腫瘍の周りの局所膨脹もリンパ節においてであった。どちらの場合にも、表IIのラットを除いて、二次腫瘍は死滅するまで増殖し続けた。
３．  長期生存ラットの腫瘍発生
表IIの６匹のラット全部を、５ワット出力を用いて持続時間３分間（４匹）かまたは５分間（２匹）で処置した。更に重要なことに、それら全部にＩＣＧ−キトサンゲル溶液を注射した。一次腫瘍を２個移植されたラットについては、二つの腫瘍の内の一方だけにＩＣＧ−キトサン溶液を与え、そしてもう一方は、いずれのＩＣＧ増感剤も用いることなくレーザー処置した。一次腫瘍１個だけのラットには、ＩＣＧ−キトサンを用いた。ＩＣＧ−キトサン溶液は０．５％〜１％であり、その投与量は、腫瘍ごとに７０μｌ〜１５０μｌであった。ＩＣＧ−キトサンは、通常、レーザー処置の２４時間かまたは１０分前に、腫瘍中に直接的に注射された。
他のラット全部と同様に、腫瘍は、処置後に増殖し続け、そして腫瘍の大部分は乳線に沿って腋窩節およびその向かい側の鼠径部節まで転移した。しかしながら、腫瘍の発生は、後期に劇変する。図１および２で示されるのは、レーザーで処置されたＳラット１およびＳラット２の一次腫瘍の増殖チャートであり、その左鼠径部腫瘍にはＩＣＧ−キトサンを注射し、そして右鼠径部腫瘍には注射しなかった。増殖は、腫瘍移植後およそ５０日でピークに達した後、後退し始めた。腫瘍は縮小し続け、そしておよそ９０日でそれらの最小寸法に達した。その後、腫瘍は再び増殖し始め、Ｓラット１がＳラット２よりも攻撃的であった。両方の場合の右鼠径部（ＩＣＧ−キトサン注射せず）でのより大きい量に注目されたい。
Ｓラット１およびＳラット２の二次腫瘍は、腫瘍移植後およそ２０日目に現れ、そして図３および４で示されたように、一次腫瘍と同様のパターン、すなわち、増殖／縮小／増殖を経過した。Ｓラット２の場合、二次腫瘍の再発はほとんど無視できた。
他の３匹のラットの腫瘍増殖を図５で示す。Ｓラット３およびＳラット６は、１個の一次腫瘍だけで開始し、そしてＳラット４は２個で開始した。図５は、はるかに早い応答、すなわち、およそ２０〜２５日に開始する腫瘍減少を示す。更に、ここまでは二次腫瘍は存在せず、そして一次腫瘍は、腫瘍のまさに残りである線維組織の小さい堅い芯だけになった。更に、３匹全部がこの時点（１９９１年４月１日）で生きているので、観察されるであろう。
４．  実験の改善
初期の実験は、主として、レーザーパラメーター並びにＩＣＧ−キトサンの濃度および投与量を含めた作業可能な条件を確立することに集中してきた。最初の少数の群では、長期生存は観察されなかった。in vitroおよびin vivo結果で示唆すれば、作業は３〜５ワットのレーザー出力範囲で続けられてきた。０．５％〜１％のＩＣＧ−キトサン溶液は有効であると考えられる。一定した長期生存率１０％が達成され、そして細菌のラット群の一つでは、２０％比率さえも達成された。
Ｃ．  考察
明らかに、体制化された組織に対する８０８ｎｍダイオードレーザーの光熱作用は、およそ８００ｎｍの吸収ピークと一緒に発色団ＩＣＧを用いる場合に大きく増強することができる。８００ｎｍレーザーエネルギーは、調節された出力範囲内で、細胞構造を概ねそのまま残している正常組織を介して容易に透過できる。
標的組織に対して注射された場合、８０８ｎｍ放射線を強く吸収し且つ励起状態に達するのは、ＩＣＧ分子である。その分子が基底状態に戻る時、貯蔵エネルギーが、周囲組織で吸収されうる熱の形で放出されて、温度を上昇させる。（励起したＩＣＧ分子はまた、本発明者の誘導免疫応答での鍵でありうる他の生化学的反応を引き起こすことができる。）充分な量のＩＣＧ分子が、（通常、組織熱緩和時間より短い）ある時間内に励起する場合、放出された熱は、それが分散されうるよりも早く組織細胞によって吸収されることができる。レーザーに対する暴露が充分に長い場合、蓄積された熱エネルギーは、体制化された組織の光熱破壊を引き起こすことができるレベルまで組織温度を上昇させることがてきる。この破壊は、ある選択されたレーザー出力および照射持続時間で達成されうる。およそ３〜５ワットのレーザー出力は、腫瘍細胞に対して致命的な傷害を引き起こすのに充分であると考えられる。
更に高い出力は、ＩＣＧと一緒に、組織に対する急速で且つ一層劇的な熱傷害を引き起こすことができるが、いくか望ましくない結果が生じることがある。高出力照射は、一層速い温度増加を生じ、特に、酸素が空気中で豊富な場合の処置表面上では、しばしば、内部破裂および急速な組織炭化をもたらす。水膜によるかまたはヘリウムガスによる表面冷却法は、炭化を遅らせることができないことがあり、それは、表面組織特性をほぼ透明から８０８ｎｍ波長に対して極めて吸収性に変化させる。８０８ｎｍ放射線は、炭化した組織によって引続き更に吸収されるであろう。これは、レーザーエネルギーの透過を妨げ、目的の悪性組織の表面的で且つ限られた空間的熱破壊を引き起こすと考えられる。
熱衝撃単独では、短期腫瘍増殖を遅らせることはできるが、獲得腫瘍を有する宿主の定められた運命を変更することはできない。表Ｉで示されたように、ＩＣＧ−Ｈ2Ｏ溶液の助けによってレーザーで処置された第二群は、生存率の改善を全く示さなかった。当然ながら、光熱相互作用による腫瘍細胞の破壊は優先的な作用であった。しかしながら、腫瘍の攻撃的性質のために、完全な撲滅は、外科的除去および放射線療法の場合とほぼ同様に、熱破壊単独では希にしか達成されなかった。
結論
したがって、悪性細胞増殖の根本原因を処理するために他の機序を用いる必要があることは明らかである。当然ながら、理想的な機序は自己免疫防御系であり、それは、異常細胞の増殖を妨げることができる。癌が発生するのは、自然の免疫機能が衰弱しているかまたは外来要素侵入に対する反応が不適切な場合である。自然の免疫防御が、内因性または外因性の細胞の制御されない増殖を止めることができない場合、刺激された免疫応答が必要とされる。前述のように、いくつかの化学物質は、自然の防御機序を増強させうることが長い間知られてきたが、しばしば、その増強は、腫瘍増殖の後の一つまたはいくつかの段階である。本明細書中に記載のモデルは、組合わせのＰＤＴおよび免疫療法処置に向けられた。
化学療法および放射線療法などの他の方式は、しばしば、無差別に細胞を死滅させるので、その付帯損傷は、まさに致命的でありうる。また、ＰＤＴは、腫瘍細胞を死滅させるのに、レーザーおよびある種の光増感剤の処置によって生じる熱および／または毒性一重項酸素に頼るが、それもまた、宿主の自己免疫防御系に影響を与える手段ではない。レーザー、発色団およびイムノモジュレーターの組合わせを用いることにより、本発明は、新規の癌治療法を提供する。
宿主の細胞性および体液性免疫応答を刺激する場合の本発明の効果を、図１〜５で示す。増殖チャート（図１および２）は、腫瘍量の変化を示す。腫瘍移植から５０日後（レーザー−ＩＣＧ−キトサン処置から４０日後）に、一次腫瘍はそれらの最大寸法に達した。その後の腫瘍増殖および寸法の減少は、生じた免疫応答によって単に説明できるにすぎないが、それは、自己防御機序だけが、完全に発生した場合に、腫瘍増殖を遅らせ且つ停止すると考えられるし、そして非機能性腫瘍細胞は、マクロファージによって飲込まれると考えられるからである。この興味深い特徴がなければ、表Ｉの実験ラットの最初の２群で実証されたように、３５日または４０日を越えて生存できるラットはいなかった。
ＩＣＧ−キトサンを注射された腫瘍（表IIの６匹のラットの大部分の場合の左鼠径部）は、両方の腫瘍を同じレーザー出力および持続時間で処置したとしても、イムノアジュバントのより直接的衝撃の徴候である一層遅い増殖速度であった。ＩＣＧ−キトサンを注射された腫瘍は、概して、レーザー処置に対してより多く反応した。熱相互作用単独では、ＩＣＧと一緒に、腫瘍量を大規模に効果的に減少させた。キトサンは、明らかに、免疫刺激を増加した。熱および免疫作用の組合わせは、図１および２で示されたように、左鼠径部腫瘍が右のものより少なく増殖した理由に関して説明していると考えられる。
免疫防御系応答の発生および促進は、更に、長期生存ラットの二次腫瘍の発生によって支持される。転移は、通常、一次腫瘍の移植からおよそ１５〜２０日後に半数のラットで起こった。二次腫瘍は、ほとんどの場合、乳線に沿って現れ、そして致死するまで増殖し続けた。しかしながら、図３および４のＳラット１およびＳラット２の転移腫瘍は、ＩＣＧ−キトサン注射もレーザー処置も用いなければ、一次腫瘍の場合（図１および２）と同様の傾向を正確に示した。図５は、３匹のラット（Ｓラット３、Ｓラット４およびＳラット６）の一次腫瘍の増殖を図示し、それらは全て、同じ展開、すなわち、増殖／処置／増殖／減少をたどる。更に、これら３匹のラットは、それらの完全な応答をより早く生じ、その腫瘍増殖は、腫瘍移植からおよそ２０〜２５日後に停止し、しかも二次腫瘍は全く現れなかった。誘導された免疫防御機序のこの早い確定は、これらのラットがまだ生存していて且つ腫瘍再発の徴候がない理由を説明することができる。
結論として、完全な癌撲滅による長期生存は、レーザー−発色団−アジュバントで誘導された免疫応答によって達成されうる。それは、光熱相互作用によって減少した腫瘍量と、キトサンまたは他のイムノモジュレーターを加えることによって増強された免疫系応答の組合わせの結果である。実験結果は絶えず改善されている。最初の少数の群は、長期生存者をもたらさなかったが、ここで、安定した１０％の長期生存率が達成されている。現行の適合されたレーザー出力（５ワット）および照射持続時間（３〜６分間）の範囲内で、長期生存率は最大１４％に達する。
本発明を、ある程度具体的に記載してきたが、本明細書中上記の方法において、本開示の精神および範囲から逸脱することなく多数の変更を行うことができることは明らかである。本発明は、例示のための本明細書中に記載の実施態様に制限されないが、それぞれの要素が与えられる同等物の完全な範囲を含めた一つまたは複数の請求の範囲の範囲によってのみ制限されるということは理解される。
【図１】
0003929491.tif 000004
【図２】
0003929491.tif 000005
【図３】
0003929491.tif 000006
【図４】
0003929491.tif 000007
【図５】
0003929491.tif 000008