(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製コンドロイチナーゼが、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）ＮＣＴＣ４６３６由来の次の特性を有する精製コンドロイチナーゼＡＢＣであり、溶液状態としたときｐＨ５〜９を示すよう調整されているとともに、比活性が３００Ｕ／ｍｇ以上の精製コンドロイチナーゼと、精製コンドロイチナーゼに対して少なくとも０．００１倍重量の血清アルブミンまたはゼラチンとを含有することにより容器への吸着性を低下させ、溶液としたときの不溶物の生成が防止されたコンドロイチナーゼ組成物。
（ｉ）分子量が、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による測定（還元および非還元のいずれにおいても）およびゲル濾過法による測定において約１００，０００である。
（ｉｉ）  等電点がｐＨ約８．２および約８．５である。
（ｉｉｉ）至適ｐＨは８．０〜８．２（基質：コンドロイチン硫酸Ｃ、緩衝液：トリス−塩酸緩衝液）、至適温度は３７℃である。
（ｉｖ）Ｚｎ2+、Ｎｉ2+、Ｆｅ3+、およびＣｕ2+によって活性が阻害される。
（ｖ）Ｎ末端アミノ酸がアラニンであり、Ｃ末端アミノ酸がプロリンである。
（ｖｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単一のバンドを示し、高速液体クロマトグラフィー（ゲル濾過およびカチオン交換）においても単一のピークを示す。
（ｖｉｉ）エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下である。
（ｖｉｉｉ）結晶化し得る。
【請求項２】
溶液または乾燥物である請求項１に記載のコンドロイチナーゼ組成物。
【請求項３】
１〜１００ｍＭの生理学上許容される緩衝剤を含むことにより、溶液状態としたときｐＨ５〜９を示すよう調整されている請求項１または２のいずれかに記載のコンドロイチナーゼ組成物。
【請求項４】
緩衝剤が、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、りん酸、りん酸二水素カリウム、りん酸水素二カリウム、りん酸二水素ナトリウム、りん酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノールアミン、アルギニン、エチレンジアミンからなる群から選択された成分を含有する緩衝剤である請求項３に記載のコンドロイチナーゼ組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のコンドロイチナーゼ組成物を含有する注射用製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、コンドロイチナーゼ組成物および該組成物を含有する注射用製剤に関する。
本発明のコンドロイチナーゼ組成物は、安定性が高く、溶液状態で不溶物を生成せず、容器への吸着が防止され、注射用製剤に有用に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチナーゼＡＢＣ(Chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、ムコ多糖を不飽和糖を含む二糖に分解する酵素で、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸の分解に対しては弱く触媒する酵素である。
本酵素は、動物組織からムコ多糖類を除去したり、組織中のムコ多糖を同定するための研究用試薬として、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)等の細菌の産生する酵素商品が市販されている。
【０００３】
一方、ヒトの腰痛の病因として区分される椎間板ヘルニア症の治療に、植物パパイヤ由来の蛋白分解酵素キモパパインや、バクテリア由来の膠質分解酵素コラゲナ−ゼ等を、該ヘルニア症患者の椎間板腔に注入し、ヘルニアを溶解する椎間板溶解療法（ＩＤ療法）が開発され、欧米に於いては、キモパパインが医薬品（商品名、キモダイアクチン）として市販されている。
然るに、上記蛋白分解酵素を用いるＩＤ療法は、脊椎・椎間板のヘルニア部分のみならず、周辺の構造組織の蛋白部分をも分解し、神経麻痺や、アレルギー発現等、副作用を生じやすい欠点を有する。
近年、コンドロイチナーゼＡＢＣまたはコンドロイチナーゼＡＣを椎間板腔に直接投与して椎間板ヘルニアを治療する試みが行なわれており椎間板ヘルニアの治療薬としての用途が期待されている〔米国特許 4696816号明細書、 Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990) 〕
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
コンドロイチナ−ゼは溶液状態でガラス容器やプラスチック容器に吸着して溶液中の酵素活性が減少し、品質管理において重大な問題であった。特に低濃度溶液ではその影響が大きい。また、本酵素は不安定であって、水溶液の保存、凍結あるいは凍結乾燥の操作中および凍結乾燥後の保存において、とりわけ凍結乾燥を行う際の乾燥操作において容易に活性が減じ、また凍結乾燥品を再溶解した際に濁りを認める等の問題点を有し、医療用等に用いる上ではなはだ不都合であることを見いだした。
本発明は、このような欠点を改善することを目的としてなされたものである。すなわち、本発明の課題は、安定性が高く、溶液状態で不溶物を生成せず、容器への吸着が防止され得る精製コンドロイチナーゼ組成物を提供することにある。
さらに、本発明の課題は、このような組成物を含有する注射用製剤を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
かかる事実に鑑み、本発明者らは、コンドロイチナ−ゼの容器への吸着を防止し、さらに保存時の安定性を向上させることについて研究を重ねたところ、コンドロイチナ−ゼにある種の成分を添加すると、容器への吸着が防止できること、さらに保存時の安定性が向上すること、乾燥物を再溶解した際に濁り生じないことを見出し本発明に到達した。
すなわち、本発明は、比活性が300U/mg 以上の精製コンドロイチナーゼと血清アルブミンまたはゼラチンとよりなるコンドロイチナ−ゼ組成物を提供するものである。
また、該組成物の好ましい態様として、溶液状態としたときｐＨ５〜９を示すように調整されているコンドロイチナ−ゼ組成物を提供するものである。
さらに本発明は上記コンドロイチナ−ゼ組成物を含有する注射用製剤を提供するものである。
【０００６】
以下本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明において、コンドロイチナーゼとは、コンドロイチン硫酸リアーゼを意味し、具体的にはコンドロイチナーゼＡＢＣ〔EC 4.2.2.4〕またはコンドロイチナーゼＡＣ〔EC 4.2.2.5〕が包含されるが、コンドロイチナーゼＡＢＣが好ましく、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)由来の酵素がより好ましい。
また、比活性が300U/mg 以上の精製コンドロイチナーゼとは、比活性が300U（ユニット；単位）/mg 蛋白以上であり、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下であるコンドロイチナーゼをいい、とりわけ比活性が300U/mg 以上であり、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下であるコンドロイチナーゼＡＢＣが好ましい。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは後述の参考例および特願平４−１９２８８２号の特許出願明細書に記載の方法で得ることができる新規な酵素である。参考例の方法で得られるコンドロイチナーゼＡＢＣは次の特性を有する。
(i)   分子量が、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)による測定（還元および非還元のいずれにおいても）およびゲル濾過法による測定において約100,000 である。
(ii)  等電点が約pH 8.2および約pH 8.5である。
(iii) 至適pHは 8.0〜8.2(基質：コンドロイチン硫酸Ｃ，緩衝液：トリス−塩酸緩衝液) 、至適温度は37℃である。
(iv)  Zn2+、Ni2+、Fe3+、およびCu2+によって活性が阻害される。
(v)   Ｎ末端アミノ酸がアラニンであり、Ｃ末端アミノ酸がプロリンである。
コンドロイチナーゼＡＢＣの末端は、次のアミノ酸残基よりなる。
Ｎ末端アミノ酸：アラニン          Ｃ末端アミノ酸：プロリン
(vi)  SDS-PAGEにより単一のバンドを示し、高速液体クロマトグラフィー (ゲル濾過およびカチオン交換) においても単一のピークを示す。
(vii) エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下である。
(viii)結晶化し得る。
(ix)  比活性が300U/mg 以上である。
【０００７】
本発明の組成物を製造する際には、以下に説明する添加成分を含有し、ｐＨを調整した水溶液を用意し、これに例えば比活性300U/mg 以上の精製コンドロイチナーゼを混和して10U/mL以上、好ましくは40〜400U/mL 含有する水性溶液とし、必要に応じて除菌濾過を行い、溶液状の組成物とするか、あるいはこの溶液状の組成物を凍結乾燥法等の非加熱条件での乾燥処理に付して乾燥物状の組成物（好ましくは凍結乾燥物）とすることができる。さらに、溶液状の組成物を例えば
− 80 〜−20℃で凍結させてもよい。
【０００８】
本発明の組成物において、精製コンドロイチナ−ゼに配合される必須の添加成分は、血清アルブミンまたはゼラチンのような蛋白質であり、これらを併用してもよい。
血清アルブミンとしてはヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの哺乳動物の血清アルブミンが例示される。特にヒトに投与する注射用製剤として使用する場合には非経口投与に使用可能なヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が好ましい。例えば、健常人血漿を原料としてコーン（Cohn）のエタノール分画法によって分画精製されたものが用いられる。特に好ましくは血清アルブミンを加熱処理（好ましくは60℃、10時間程度）して肝炎ウィルス等の不活化処理を行ったものが使用される。なお、ＨＳＡには安定化剤としてＮ−アセチルトリプトファンナトリウムまたは／およびカプリル酸ナトリウムが添加されていても差し支えない。
ゼラチンとしてはウシ、ブタなどの動物由来のものが例示される。なお、ここでゼラチンとは動物の皮、骨等から得たコラーゲンを適当な前処理により可溶化して得られるもので、鉱酸（pH１〜３程度の塩酸、硫酸、亜硫酸、りん酸等）で処理した等電点7.0 〜9.0 の酸処理ゼラチン（Ａ型）および石灰等のアルカリで処理した等電点4.5 〜5.0 のアルカリ処理ゼラチン（Ｂ型）が例示される。本発明に用いるゼラチンとしては、酸処理ゼラチンが好ましい。
【０００９】
また、本発明の組成物は溶液状態で通常ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８を示すように調整する。このために該ｐＨ領域に維持可能な緩衝剤を通常含有する。緩衝剤としては生理学上許容されるものであればよく、特に限定されないが、塩酸、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、りん酸、りん酸二水素カリウム、りん酸水素二カリウム、りん酸二水素ナトリウム、りん酸水素二ナトリウム、アミノ酢酸、安息香酸ナトリウム、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸、酢酸ナトリウム、酒石酸、酒石酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、エタノ−ルアミン、アルギニンまたはエチレンジアミンの一種以上を含有する緩衝剤が例示される。特にりん酸塩緩衝液（剤）が好ましい。なお、ｐＨ５より低い場合および９より高い場合にはコンドロイチナーゼが失活したり、溶液状態で不溶物が生成することがある。
【００１０】
前記した添加成分の添加量は、蛋白質についてはコンドロイチナーゼの蛋白質の 0.001倍重量以上で効果が認められるが、好ましくは0.01〜 100倍重量、特に好ましくは0.05〜10倍重量の割合で配合される。なお、 100倍重量以上であっても本発明の効果を達成することはできるが、単位重量あたりの酵素活性が低くなる。組成物中の緩衝剤の濃度は１〜100mM 、好ましくは10〜50mMである。
さらに本発明の組成物には等張化剤、賦形剤、保存剤あるいは無痛化剤などの医薬品製剤に通常含まれる添加剤を含んでいてもよい。例えば賦形剤は、注射剤に通常使用されるものであれば特に限定されないが、クレアチニン、乳糖、マンニトール、精製白糖、キシロース等が好ましい。
【００１１】
本発明の組成物は、主にコンドロイチナーゼを有効成分とする注射用製剤またはその原料として使用される。溶液状の組成物をアンプル、バイアル等の容器に充填し、そのまま流通させ、あるいは保存し、注射剤として投与に供することができ、また、適当な容器中で乾燥または凍結させた組成物を流通、保存し、投与時に注射用蒸留水、生理食塩水等で溶解し、または融解させて投与に供することができる。このような注射剤は、コンドロイチナーゼを有効成分とする椎間板ヘルニア治療剤として使用することができる。この治療剤を、ヘルニア症患者の椎間板腔に注入し、ヘルニアを溶解して治療する椎間板溶解療法に用いることができる。使用量は、症状、年令等によって異なり、一概には特定できたないが、コンドロイチナーゼＡＢＣの場合、通常１回10〜100U程度を注入する。
なお、本発明におけるコンドロイチナーゼＡＢＣの力価はコンドロイチン硫酸を基質にして、37℃で反応させた時に生成する紫外部に顕著な吸収を有する不飽和二糖類を吸光光度法で測定することにより求めた。
なおまた、コンドロイチナ−ゼＡＢＣの１単位(U) は、１分間に不飽和二糖を１マイクロモル遊離させる酵素量である。
【００１２】
【実施例】
以下実施例および参考例によって本発明を具体的に説明する。
実施例１
ガラスおよびプラスチック容器への吸着防止効果（溶液）：
参考例とほぼ同様の方法で製造したコンドロイチナ−ゼＡＢＣ（比活性 300U/mg）５単位（U)を含む溶液に表１および２に示すとおりゼラチン（酸処理ゼラチン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を酵素蛋白量の 0.001〜 100倍量添加し、さらに50mMりん酸カリウム塩緩衝液でｐＨを7.0 に調整し、溶液状のコンドロイチナ−ゼＡＢＣ組成物を得た。この溶液をガラス製およびプラスチック（ポリプロピレン）製バイアル瓶に入れ、４℃、24時間保存後の溶液中の酵素活性を測定して容器への吸着防止効果を調べた。ガラス製バイアル瓶での結果を表１に、プラスチック製バイアル瓶での結果を表２に示す。なお、結果は保存前の溶液中の活性に対する保存後の活性の百分率で表した。
【００１３】
【表１】
0003895782.tif 000002
【００１４】
【表２】
0003895782.tif 000003
【００１５】
実施例２
再溶解時の不溶物生成防止効果および活性保存効果（凍結乾燥物）：
参考例で得たコンドロイチナ−ゼＡＢＣ（比活性380U/mg)５０単位を含む溶液に表３および４に示すような物質を酵素蛋白量の 0.001〜10倍量添加し、さらにりん酸ナトリウム塩緩衝液でｐＨを 6.5 (20mM) に調整した。この溶液に賦形剤としてクレアチニン(10mg/ml) を加え、バイアル瓶に入れ、凍結乾燥して乾燥物状のコンドロイチナーゼＡＢＣ組成物を得た。この組成物を、バイアル瓶中、40℃で１ケ月保存し、保存後の組成物の性状を観察したが、着色および崩れ等の異常はなかった。また、注射用蒸留水を加えて、再溶解時の性状を観察し、さらに活性を測定して添加剤の活性保存効果を調べた。その結果を表３および表４に示す。なお、表３は再溶解した際の不溶物の生成の有無を肉眼的に観察した結果であり、表４の結果は保存前の活性に対する保存後の活性の百分率で表した。
また、上記と同様の方法でクレアチニンを添加しない組成物（コンドロイチナーゼＡＢＣ（比活性380U/mg)50単位；ＨＳＡ，酵素蛋白質の0.05倍量）も調製し、同様に保存後の性状および活性を測定したが、溶状は無色澄明で、活性の残存率は80％であった。
【００１６】
【表３】
0003895782.tif 000004
【００１７】
【表４】
0003895782.tif 000005
【００１８】
以上の実施例の実験結果から、ゼラチン，ＨＳＡ，ＢＳＡを精製コンドロイチナーゼに配合し、溶液状態でほぼ中性付近になるようにすると、精製コンドロイチナーゼの容器への吸着を防止し、溶解後無色澄明な状態となり、さらに保存後の活性を低下させることなく維持することができる。
この効果は、特にゼラチン、ＨＳＡ，ＢＳＡを精製コンドロイチナーゼ酵素蛋白量の0.05〜10倍量使用したときに顕著にあらわれる。また、この際、参考例に示されるような高度に精製され、比活性が高いコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、これをゼラチン，ＨＳＡ，ＢＳＡとともにpH５〜９、好ましくは６〜８のりん酸ナトリウム塩緩衝液に溶解し（りん酸ナトリウム塩緩衝液濃度として10〜50mM) 、凍結乾燥して得られ、溶解状態にしたときに前記ｐＨの範囲になるコンドロイチナーゼ組成物を用いることが望ましい。
【００１９】
【参考例】
次に、本発明に使用する精製コンドロイチナーゼＡＢＣの製造法の一例について参考例を挙げて具体的に説明する。
プロテウス・ブルガリス（NCTC 4636, ATCC 6896, IFO 3988) を従来知られている通常の方法(J.Biol.Chem.,243 (7), 1523-1535(1968)）で培養して湿菌体を得た。この湿菌体200gに５mMりん酸緩衝液 (pH6.5 〜7.0)600ml を加えて懸濁させ、 Dino-Millにより菌体を破砕し遠心分離して、酵素抽出液を得た（工程1)。
この菌体抽出液から核酸を除くために硫酸プロタミンを用いた。上記酵素抽出液に最終濃度 0.5％となるように５％硫酸プロタミン溶液を加え、４℃で約30分間撹拌し、生じた沈澱を遠心分離によって除去し、上澄液を得た（工程2)。
得られた上澄液に約５倍量の水を加えカラムクロマトグラフィーで精製した。すなわち、ＣＭセファロースを充填したカラムに５mMりん酸緩衝液(pH6.5〜7.0)を流して平衡状態とした後、上記上澄液を流し吸着させた。その後カラムを同じ緩衝液で洗浄し次いで 0.020〜 0.025M 食塩を含んだ同じ緩衝液で洗浄し、次に0.1Mの食塩を含んだ上記緩衝液で溶出し、酵素活性を有する画分を得た（工程3)。
この酵素活性画分に約５倍量の水を加え、予め５mMりん酸緩衝液(pH6.5〜7.0)で平衡化したＳ−セファロースカラムに吸着させた。その後、カラムを上記緩衝液で洗浄し、次いで 0.020〜0.025M食塩を含む上記緩衝液で洗浄し、次に 0.025〜約0.35Ｍの食塩を含む上記緩衝液で濃度勾配法により溶出した。
溶出したコンドロイチナーゼＡＢＣは単一バンド(SDS-PAGE)を示し、かつ核酸(DNA) 、プロテアーゼ等が除去されており、比活性は380U/mg であって、従来のコンドロイチナーゼＡＢＣにくらべて比活性は約３倍程度以上高く、高純度の酵素となった。
この酵素溶液（りん酸緩衝液（pH7.0)) に15％となるようにポリエチレングリコール (分子量 4,000) を添加し、室温で約１週間放置したところ、針状結晶状で白色乃至無色の結晶性コンドロイチナーゼＡＢＣが生成した。
上記各工程におけるコンドロイチナーゼＡＢＣの精製度を示すと表５に示すとおりとなる。
【００２０】
【表５】
0003895782.tif 000006
【００２１】
また、各工程におけるエンドトキシンの含量および、プロテアーゼ残存量を表６に示す。
【表６】
0003895782.tif 000007
*   コンドロイチナーゼＡＢＣ 100単位(U) 当りのエンドトキシン含量；トキシカラーシステム (生化学工業（株）製) を用いて測定。EUはエンドトキシン単位(Endotoxin Unit)を示す。
**  FITC−カゼインを基質として測定
【００２２】
工程４により得られた酵素溶液中のエンドトキシン含量は、上記のように 5.0pg/100U 程度の極微量で実質的に含有されておらず、また核酸（ＤＮＡ）についてスレッシュホールド法〔ＤＮＡ測定装置：スレッシュホールド（モレキュラーデバイス社製）〕で測定したが、ＤＮＡは検出されなかった（検出限界以下）。
【００２３】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明では精製コンドロイチナ−ゼ、特に、比活性が300U/mg 以上であるような高度に精製されたコンドロイチナ−ゼＡＢＣを用い、これに血清アルブミンまたはゼラチンという特定の蛋白質を添加し、さらに溶液状態でのｐＨを通常ｐＨ５〜９の範囲に調整したコンドロイチナーゼ組成物とすることにより、コンドロイチナーゼのガラス製、プラスチック製等の容器への吸着が防止され、さらに安定性を向上させることができる。また、乾燥物状の上記組成物を再溶解する際に不溶物の生成を防止することもできる。