(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗不安作用及び非鎮静作用又はほんの僅かの鎮静作用を有する化合物の同定方法に於て、
（ｉ）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターで化合物の親和性及び（又は）有効性を測定し、
（ii）工程（ｉ）で測定された親和性及び（又は）有効性を異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで同一化合物の親和性及び（又は）有効性と比較し、次いで
（iii）α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで選択的ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストである化合物を選ぶ
工程から成ることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
（ｉ）クローン化されたα2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターへの及び異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプへのテスト化合物の親和性を測定し、
（ii）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターに対して選択的親和性を有する化合物を選び、
（iii）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターで選択された化合物の有効性を測定し、次いで
（iv）クローン化ＧＡＢＡAレセプターで選択的アゴニストである化合物を選ぶ、
請求の範囲１記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターへの及び異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプへのテスト化合物の親和性を測定し、
（ii）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターに対して親和性を有する化合物を選び、
（iii）クローン化ＧＡＢＡAレセプターで選択された化合物の有効性を測定し、
（iv）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターで選択的アゴニストである化合物を選ぶ、
請求の範囲１記載の方法。
【請求項４】
ＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対するテスト化合物の親和性を、放射能標識された非選択性、高親和性ベンゾジアゼピンレセプターリガンド、たとえばトリチウム同位体放射能標識されたフルマゼニルTM又はフルニトラゼパムTMと置き換えられるテスト化合物の親和性を測定することによって決定する、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対するテスト化合物の有効性を、ＧＡＢＡの存在及び不在下にレセプターに対する化合物の親和性を測定し、ＧＡＢＡ-比率を算出して決定する、請求の範囲１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対するテスト化合物の有効性を、パッチクランプ法を用いてクロライド流量を測定して決定する、請求の範囲１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターと異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプが選択的不安作用を伝達しないことで知られているサブタイプである、請求の範囲１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターと異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプがα1,α3又はα5ＧＡＢＡAレセプターサブユニットを含有する、請求の範囲１記載の方法。
【請求項９】
クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターと異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプが、サブユニット組合せα1β3γ2又はα3β2γ2を含有する、請求の範囲１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、選択的抗不安特性を有するベンゾジアゼピンレセプターリガンド、すなわち非鎮静抗不安薬の同定に、α2，β3及びγ2サブユニットから成るクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプを使用することに関する。
従来技術
重要な抑制性中枢伝達性のγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）に対するレセプターは２つの主要な種類、ＧＡＢＡAレセプター及びＧＡＢＡBレセプターに分類される。
ＧＡＢＡAレセプターは、リガンド関門イオンチャンネルファミリーのメンバーであり、哺乳類脳中でもっとも豊富な抑制性レセプターである。各ＧＡＢＡAレセプター複合体（complex）は神経細胞膜を通過するクロライド流量を支配するクロライドイオンチャンネルを、小さい変調分子（modulatory molecule）、たとえばベンゾジアゼピン類、バルビツール酸塩類、ピクロトキシン類及び特定のステロイド類に対する多種多様の認識部位と共に有する。ＧＡＢＡはそのレセプターと相互に作用する場合、イオンチャンネルは開放され、クロライド流入量は増加し、そしてその細胞は興奮刺激にあまり応答しなくなる。このＧＡＢＡで誘発されたイオン流動を、種々の剤（ベンゾジアゼピンレセプター又は認識部位と相互に作用する剤も含めて）によって調節することができる。
ＧＡＢＡAレセプター複合体、たとえばベンゾジアゼピンレセプター上の変調部位に結合するか又はこれと相互に作用し、ＧＡＢＡの作用にレセプターの正の変調効果を及ぼす剤は、ベンゾジアゼピンレセプターアゴニスト又は半アゴニストと呼ばれる。アゴニストは一般に筋弛緩作用、睡眠作用、鎮静作用、抗不安作用及び（又は）抗けいれん作用を生じる。
ＧＡＢＡの作用に負の変調効果を及ぼすベンゾジアゼピンレセプターリガンドは逆アゴニストと呼ばれる。一方、内在性活性のないベンゾジアゼピンレセプターリガンドはアンタゴニストと呼ばれる。
ベンゾジアゼピンレセプターに対して親和性を有する、種々の一連の化合物に属する多数の化合物は、この３０年間合成されている。特に、強い抗不安活性を有し、かつ鎮静剤作用のないベンゾジアゼピンレセプターモデュレーターを開発するのにいくつかのグループに目が向けられている。しかし、ベンゾジアゼピンレセプター部位は種々の障害及び疾病を治療するために、依然としてＣＮＳと相互作用する極めて興味のある生物学的部位としてみなされるので、このレセプター部位で作用する、ほとんどすべての以前に合成された化合物は、その容認されていない副作用のゆえに、臨床上の開発でうまくいっていない。
ＧＡＢＡAレセプターは、α，β及びγ／δたん白質サブユニットの組合せを含有する高分子へテロペンタメリック（heteropentameric）集合体を構造上構成する。この様なＧＡＢＡAレセプターのいくつかのサブユニット（α1-6，β1-3，δ及びγ1-3）は、最近の分子生物学の技術を用いて特徴づけられている。個々の哺乳類ＧＡＢＡAレセプターサブユニットの数を考慮すれば、理論上存在しうる種々のサブユニット変更を有するペンタメリックサブタイプの数は、圧倒的である。したがって天然のＧＡＢＡレセプターのサブユニット補体を正確に示すこと及びその生理学的役割を決定することは重要な挑戦である。
特異的ＧＡＢＡAレセプターサブタイプは、ベンゾジアゼピンの抗不安作用を伝達するのに関与すると信じられている。しかし不安障害の病態生理学に係る特異的サブタイプ及び（又は）サブユニットは、現在知られていない。
ラットでの解剖／挙動研究から、ベンゾジアゼピンMidazolamTMの抗葛藤作用が、基底外側の扁桃核で伝達されることが示される（European Journal of Pharmacology, 1982 82 115-116及びNeuroscience Letters, 1985 53 285-288）。上述した様に、６つのαサブユニットが存在し、ベンゾジアゼピンはα-サブユニットに結合するか又はαサブユニットとβサブユニットの間の境界面で結合すると信じられている。α1サブユニットはラット脳全体にほぼ均一に分布し、ベンゾジアゼピンレセプターリガンドの鎮静作用に係ると信じられている。α4及びα6サブユニットに対するベンゾジアゼピンの親和性は低く、したがってベンゾジアゼピンがこれらのサブユニットを介してその作用を伝達するとはとても考えられない。
その場のハイブリット形式（hybridization）を伴う解剖学的研究から、α1，α2，α3，α4及びα5サブユニットは基底外側扁桃様核中に存在し、α2は最も豊富なα-サブユニットであることが示される（The Journal of Neuroscience, 1992 12(3)1040-1062）。
更に、β3サブユニットは基底外側扁桃様核中で最も豊富なβサブユニットであり、β3-サブユニットは主にα2サブユニットとの組合せで発現されるらしいことが示される（The Journal of Neuroscience, 1992 12(3)1040-1062, and Biochem. J. 1995 310 1-9）。同様に基底外側扁桃様核中で最も豊富なγサブユニットはγ2サブユニットである。
これらの知見によればα2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプがベンゾジアゼピンの抗不安作用の単独伝達物質であると提案されている。
強い抗不安特性を有しかつクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプに低い鎮静作用を及ぼす新規ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストの親和性及び有効性を測定することによって、本発明者は、この新規ベンゾジアゼピンレセプターリガンドがα2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対する完全アゴニストであり、そしてα1β2γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対する半アゴニストであることを見い出した。
これらの知見に基づき、抗不安作用（anxiolytic potential）を有する化合物の新規同定方法が開発された。
発明の要旨
本発明の目的は、クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターへのテスト物質の親和性及び（又は）有効性を測定し、次いで選択的抗不安作用を伝達しないことが知られている他のＧＡＢＡAレセプターサブタイプへのテスト化合物の親和性及び（又は）有効性と比較することによって、選択的抗不安特性を有するベンゾジアゼピンレセプターリガンド（すなわち非-鎮静剤）を同定する方法を提供することである。本発明は選択的抗不安活性を有する化合物に関する化学情報をスクリーニングするのに及び選択的抗不安活性を有する薬剤を製造するのに重要な手段を提供する。
したがって、その第一の観点によれば、本発明は、抗不安作用及び非鎮静作用又はほんの僅かの鎮静作用を有する化合物の同定方法を提供する。
その方法は
（ｉ）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターで化合物の親和性及び（又は）有効性を測定し、
（ii）工程（ｉ）で測定された親和性及び（又は）有効性を異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで同一化合物の親和性及び（又は）有効性を比較し、次いで
（iii）α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで選択的ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストである化合物を選ぶ、
工程から成る。
もう一つの観点によれば、本発明は、本発明の方法によって得られた抗不安作用を有する化合物を提供する。
第三の観点によれば、本発明はα2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで選択的ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストである化合物を提供する。
別の観点によれば、本発明は本発明の化合物を薬剤として使用すること及びこれらの化合物を含有する薬学的調製物に関する。
最後に、本発明はα2β3γ2ＧＡＢＡレセプター選択的ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストである化合物の治療上有効な量を不安に悩む患者に投与してこの患者を治療する方法に関する。
発明の詳細な説明
本発明は、抗不安活性及び非鎮静又はほんの僅かの鎮静作用を有するベンゾジアゼピンレセプターリガンドとしての作用（potential）を有する化合物の同定を提供する。
本発明の方法は、クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターへの結合に対する化合物（テスト化合物）の親和性及び（又は）有効性を測定し、この様に測定された親和性及び（又は）有効性と、別のクローン化ＧＡＢＡAレセプタータイプへの結合に対する同一化合物の親和性及び（又は）有効性を比較することから成る。この方法で、α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで選択的ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストである化合物を同定することができる。
これから明らかなように、ＧＡＢＡAレセプターへの選択的親和性は、このレセプターへのある化合物の親和性が他のＧＡＢＡAレセプターへのこの化合物の親和性よりも高いことを意味する。
更に、これから明らかなように、ＧＡＢＡAレセプターの選択的アゴニストはＧＡＢＡAレセプターの正のモデュレーターである。このレセプターは他のＧＡＢＡAレセプターに対するよりもこのレセプターに対する方がはるかに高い有効性を有する。
好ましい実施態様で、本発明の方法は、
（ｉ）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターへの及び異なるクローン化ＧＡＢＡレセプターサブタイプへのテスト化合物の親和性を測定し、
（ii）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターに対して選択的親和性を有する化合物を選び、
（iii）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターで選択された化合物の有効性を測定し、次いで
（iv）クローンＧＡＢＡA化レセプターで選択的アゴニストである化合物を選ぶことから成る。
他の好ましい実施態様で、本発明の方法は、
（ｉ）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターへの及び異なるクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプへのテスト化合物の親和性を測定し、
（ii）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターに対して親和性を有する化合物を選び、
（iii）クローン化ＧＡＢＡAレセプターで選択された化合物の有効性を測定し、
（iv）クローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターで選択的アゴニストである化合物を選ぶ、
ことから成る。ＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対するテスト化合物の親和性は、放射能標識された非選択性、高親和性ベンゾジアゼピンレセプターリガンド、たとえばトリチウム同位体放射能標識されたフルマゼニルTM又はフルニトラゼパムTMと置き換えられるテスト化合物の親和性を測定することによって決定される。
あるいはＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対するテスト化合物の有効性はＧＡＢＡの存在及び不在下にレセプターに対する化合物の親和性を測定し、ＧＡＢＡ-割合を算出して決定される。
もう１つの好ましい実施態様で、ＧＡＢＡAレセプターサブに対するテスト化合物の有効性は、パッチクランプ法を用いるクロライド流量の測定によって決定される。
他の好ましい実施態様で、本発明の方法で使用される、別のクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプ――これはクローン化α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターではない――は、選択的抗不安作用を伝達しないことで知られているサブタイプである。更に好ましいこの別のクローン化ＧＡＢＡAレセプターは、α1又はα3，α5ＧＡＢＡAレセプターサブユニットを含有する。最も好ましい実施態様で、この別のクローン化ＧＡＢＡAレセプターサブタイプはサブユニット組合せα1β3γ2又はα3β2γ2を含有する。
本発明の特別の実施態様で、クローン化ラット又はヒトＧＡＢＡレセプターサブユニットを発現する安定なＣＨＯ（Chinese hamster ovary）細胞を、α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプへのテスト化合物の親和性に関してこの化合物を検査するのに使用する。このレセプターサブタイプへのこの化合物の親和性を、選択的抗不安作用を伝達しないと信じられているＧＡＢＡAレセプタータイプ、たとえばα1レセプターサブユニットを有するＧＡＢＡAレセプターサブタイプへの化合物の親和性と比較する。クローン化レセプターに対するテスト化合物の親和性は、非選択性放射能標識されたベンゾジアゼピンレセプターリガンド、たとえばトリチウム同位体放射能標識されたフルマゼニルTM又はフルニトラゼパムTMと置き換えられる化合物の能力を測定することによって決定される。結合の阻害は、クローン化ＧＡＢＡAレセプタータイプを発現する細胞の膜調製物を用いて、通常の試験管内結合アッセイによって測定される。
テスト化合物の有効性、すなわちこの化合物がベンゾジアゼピンレセプターでアゴニスト、逆アゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかは、使用されるレセプターサブタイプ夫々に関してこの化合物のＧＡＢＡ-比率を算出して決定することもできる。ＧＡＢＡ-比率は、ＧＡＢＡの存在下に測定されたテスト化合物の親和性とＧＡＢＡの不存在下に測定された化合物の親和性の比率である。完全アゴニストであるベンゾジアゼピンレセプターリガンドは、一般に１．８−３のＧＡＢＡ比率を有し、半アゴニストは１．０−１．８の比率を有し、アンタゴニストは約１の比率を有する。ところが逆アゴニストは約０．５−１のＧＡＢＡ比率を有する。したがってＧＡＢＡ-比率の計算は、テスト化合物の有効性の目安を提供する。
化合物の有効性も、パッチクランプ法を用いて電気生理学的実験で測定することもできる。
本発明の方法によれば、ＧＡＢＡAレセプターサブユニットを発現するすべての細胞を使用することができる。好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞、又は他のげっし類線維芽細胞系、たとえばＢＨＫ（baby kiney hamster cells）及びマウスLtK-細胞、昆虫細胞、たとえばＳｆ-９、及びＨＥＫ２９３又はＨｅＬａ細胞である。この細胞によって発現されるＧＡＢＡAサブユニットは動物（ラット又はウシ）又はヒトに由来する。
他の観点によれば、本発明は本発明の方法によって得られた抗不安作用を有する化合物を提供する。
第三の観点によれば、本発明はα2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで選択的ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストである化合物を提供する。
別の観点によれば、本発明は本発明の化合物を薬剤として使用すること及びこれらの化合物を含有する薬学的調製物に関する。
最後に、本発明はα2β3γ2ＧＡＢＡレセプターで選択的ベンゾジアゼピンレセプターアゴニストである化合物の治療上有効な量を不安に悩む患者に投与してこの患者を治療する方法に関する。
例
本発明を次の例によって詳述するが、本発明はこれによって限定されない。
種々のＧＡＢＡAレセプターサブタイプに対する５-アセチル-１-（３-（３-ピリジル）フエニル）ベンズイミダゾール  Ｏ-エチルオキシムの親和性を、昆虫の細胞中で発現された組換えＧＡＢＡAレセプターによって調べる。ＧＡＢＡの不存在及び存在下での化合物の親和性の比率（ＧＡＢＡ比率）はクローン化レセプターのサブユニット組合せに依存する。化合物は、α2β3γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで完全アゴニストに対するＧＡＢＡ比率及びα1β2γ2ＧＡＢＡAレセプターサブタイプで半アゴニストに対するＧＡＢＡ比率を有する。