(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中の標的物質の分析に用いる生物学的チップであって、
（１）少なくとも１つの平坦表面を有し、その平坦表面上に相互に分離した、開口部が０．０５μｍ〜５ｍｍであり、深さが０．０５μｍ〜５ｍｍである複数の凹部を設けたプレート状又はフィルム状の不溶性支持体、及び
（２）前記不溶性支持体の前記凹部内に挿入して非共有結合的に保持され、前記標的物質と特異的に結合することのできるパートナー物質を表面に結合して有する、粒径が０．１μｍ〜１ｍｍである不溶性粒子
を含むことを特徴とする、前記生物学的チップ。
【請求項２】
請求項１に記載の生物学的チップを用いる、被検試料中の標的物質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規の生物学的チップ及び分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シリコン、ガラス、又は各種プラスチック等の種々の不溶性支持体プレートの表面に、少量の試薬を固定化する方法が多数知られている。それらの方法によって、互いに分離した異なる反応性（官能基）を有する試薬スポットを、支持体表面上に得ることができる。例えば、多種類のＤＮＡ断片や抗体などを有する試薬スポットを、特に微細化し且つ大量に固定化したものは、いわゆるアレイ（ａｒｒａｙ）と呼ばれ、近年、医学や遺伝子工学の分野等において注目されている技術である。
【０００３】
例えば、不溶性支持体プレート上に多種類のＤＮＡオリゴヌクレオチド鎖を整列させて多数のドット状に集積したものとして、ＤＮＡチップが実用化されている。ＤＮＡチップは、通常、約１ｃｍ角のチップ上に１０００以上のＤＮＡ断片（ＤＮＡプローブ）を整列させて載せたものである。このＤＮＡチップ上に、例えば、蛍光標識した被検出ＤＮＡ断片を含む試料を流すと、ＤＮＡチップ上のプローブと相補的な配列を有する被検出ＤＮＡ断片はそのプローブと結合し、結合した部分だけを蛍光により識別することができるので、試料中のＤＮＡ断片の配列を解析することができる。当初、この方法は、ヒトゲノム解析での応用が主であったが、現在では、例えば、医薬品の開発、農産物の管理、環境分析、又は臨床における遺伝子検査、特にガン、感染症、若しくは遺伝子疾患などの早期診断等への応用も検討されている。
【０００４】
ＤＮＡチップの製造法は多数報告されている。例えば、光反応とフォトリソグラフィー技術とを応用して、支持体上でオリゴヌクレオチドを固相合成する方法が知られている。この方法では、多数の所定位置に所望の配列を有する複数種のオリゴヌクレオチドを１つずつ、あるいは、同時に形成させることができる。紫外線（ＵＶ）とフォトマスクとにより所定の位置に反応活性な水酸基を生成させ、この水酸基に、５’の位置を光分解性保護基で保護された所定のフォスフォアミダイトを反応させて１つのヌクレオチドを結合させる。反応活性な水酸基を生成させる位置、及びフォスフォアミダイトの種類を適宜選択しながら、この反応を繰り返し、順次、ヌクレオチドを結合させて、オリゴヌクレオチドを形成させる。この方法を用いると、１チップ上に数万種類のプローブが結合したチップが作成可能である。
【０００５】
あるいは、ＤＮＡチップの別の製造方法としては、予め合成したオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡを共有結合又は非共有結合で支持体上に固定化する方法もある。例えば、ポリ−Ｌ−リジンを被覆したスライドガラス上に静電的に吸着させる方法、あるいは、基板上に生成させた官能基（例えば、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、又は−ＣＨＯ等）と特定の結合試薬とにより、オリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡを共有結合させる方法である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来法には種々の欠点がある。例えば、光反応とフォトリソグラフィー技術とを応用する前記方法では、１．２８ｃｍ2の面積に約１０万個のオリゴヌクレオチドを固定したアレイ（チップ）を形成することができるが、３０ｍｅｒを越える長鎖オリゴヌクレオチドを得るのが困難である。この方法で得られたチップでは、プローブとしての塩基数が不充分なので、目的とする標的物質だけでなく、それ以外の物質とも結合してしまう可能性があり、従って、正確な分析を行なうことができず、精度の面で改良の必要性がある。
また、この方法では、フォトリソグラフィーの設備が高価なため、目的のオリゴヌクレオチドを多岐にわたって少量を作成する場合、例えば、特定のＤＮＡプローブのみを支持体上に固定したい場合や必要とされるＤＮＡプローブの数が少なくてよい場合には、逆に、使い勝手の自由度が制限される欠点があった。
【０００７】
また、予め合成したオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡを支持体に固定化する前記方法では、長鎖のオリゴヌクレオチドの固定化が容易なため、目的に応じて使い勝手の自由度の高いチップを製造することができるが、予め多数のＤＮＡ鎖を別途合成して準備しておく必要がある。
しかも、それらのＤＮＡ鎖を固定化するには、支持体表面を加工処理した後に、化学的架橋剤を用いて共有結合させることにより、オリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡを支持体に結合させるため、調製が煩雑で、また、ハイブリダイゼーション能力を損なうことは否定できない。一方、非共有結合で支持体上に直接固定化する方法では、架橋剤等の処理が施されないため、相補的核酸配列と特異的に対を形成しやすいとはいえ、反応段階での洗浄や試薬の添加による溶液の影響は避けられず、充分な固定化が維持できず、固定化したオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡが支持体より剥がれてしまうという問題点がある。すなわち、共有結合であるか非共有結合であるかを問わず、この方法では、反応の感度が低下する欠点があった。
更に、反応スポット（試薬スポット）は、オリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡを含む溶液をインクジェット法や自動マイクロピペッティング装置により形成するため、高度な設備を要し、この点で、光反応とフォトリソグラフィー技術とを応用する前記方法と同様の問題点を有している。
【０００８】
従って、本発明の課題は、従来技術における前記問題点を解消し、プローブを選択する自由度が高く、分析目的に応じたプローブを容易に且つ安価に選択可能であって、しかも、反応の感度を向上させることのできる生物学的チップを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、被検試料中の標的物質の分析に用いる生物学的チップであって、
（１）少なくとも１つの平坦表面を有し、その平坦表面上に相互に分離した、開口部が０．０５μｍ〜５ｍｍであり、深さが０．０５μｍ〜５ｍｍである複数の凹部を設けたプレート状又はフィルム状の不溶性支持体、及び
（２）前記不溶性支持体の前記凹部内に挿入して非共有結合的に保持され、前記標的物質と特異的に結合することのできるパートナー物質を表面に結合して有する、粒径が０．１μｍ〜１ｍｍである不溶性粒子
を含むことを特徴とする、前記生物学的チップによって解決することができる。
また、本発明は、前記の生物学的チップを用いる、被検試料中の標的物質の分析方法に関する。
【００１０】
本明細書における「分析方法」には、標的物質の存在の有無を判定する「検出方法」と、標的物質の量を決定する「測定方法」とが含まれる。
また、本明細書において「標的物質」とは、分析の対象となる物質を意味する。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の生物学的チップの一態様を、図１及び図２に模式的に示す。図１は、本発明の生物学的チップの一態様を模式的に示す斜視図であり、図２は、図１に示す生物学的チップにおける凹部及びその内部に保持されている不溶性粒子の状態を模式的に示す、拡大部分断面図である。
【００１２】
図１及び図２に示すように、本発明の生物学的チップ１は、不溶性支持体プレート２と、この不溶性支持体２の一方の平坦表面２２上に設けられた複数の凹部２１内に挿入されている不溶性粒子３とを含む。
前記不溶性支持体プレート２に設けられた複数の前記凹部２１の各々は、前記不溶性支持体プレート２の前記平坦表面２２上に、縦方向及び横方向に整列した状態で互いに分離して配置されている。また、前記不溶性粒子３の表面には、標的物質と特異的に結合することのできるパートナー物質３１が担持されている。
【００１３】
本発明の生物学的チップにおける不溶性支持体に用いることのできる材料としては、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ又は免疫学的アッセイにおいて一般的に用いられている実質的に水又は有機溶媒に不溶性である有機材料又は無機材料、例えば、シリコン、ガラス、磁性金属若しくは非磁性金属、又はプラスチック等を挙げることができる。特には、シリコン、各種プラスチック類（例えば、ポリカーボネート、ポリスチレン、又はポリプロピレン等）、石英、又はガラス等を用いることが好ましい。
また、前記材料として、多孔性材料を用いることもでき、例えば、紙、ナイロン、又はセルロース若しくはセルロース誘導体（例えば、ニトロセルロース）を挙げることができる。
本発明において、前記の不溶性支持体は、少なくとも１つの平坦表面を有する形状である限り、その形状は特に限定されるものではないが、プレート状又はフィルム状であることが好ましい。
【００１４】
前記不溶性支持体の表面には、互いに分離した複数の凹部が形成されている。前記凹部は、後述する不溶性粒子が充分に安定的に保持されるように形成されている限り、その形状及び大きさは特に限定されるものではない。
例えば、前記凹部の開口部の形状としては、例えば、円形、楕円形、又は多角形を挙げることができる。
更に、前記凹部の縦断面の形状は、例えば、Ｕ字形状、Ｖ字形状（図２参照）、矩形形状、半円形状、又は半楕円形状などであることができる。
前記凹部の開口部が、例えば、円形である場合には、その径は、好ましくは０．０１μｍ〜１ｃｍ、より好ましくは０．０５μｍ〜５ｍｍである。また、前記凹部の開口部が他の形状である場合には、前記の円形開口部と同程度の大きさであることができる。
前記凹部の深さは、好ましくは０．０１μｍ〜１ｃｍ、好ましくは０．０５μｍ〜５ｍｍである。
【００１５】
前記不溶性支持体における前記凹部の配置は、標識に由来する信号を検出する際に、各凹部の位置が確認可能である配置である限り、特に限定されるものではなく、例えば、分析目的に応じて、あるいは、標識に由来する信号を検出するのに用いる分析装置に応じて、適宜決定することができる。凹部の位置の確認が容易である点で、前記凹部は整列して配置されていることが好ましい。また、図１に示すように、前記凹部の複数個を、所定の間隔をあけて線状に一列に配置し、更に、そのような列を相互に平行に複数列配置することがより好ましい。このように前記凹部を配置すると、標識に由来する信号の検出工程を自動化することが容易である。
前記不溶性支持体の表面に設ける前記凹部の間隔は、標識に由来する信号を検出する際に、隣接する凹部の影響を受けない程度に分離している限り、特に限定されるものではなく、例えば、隣接する各凹部の縁部間の最短距離は、好ましくは０．０１μｍ〜１ｃｍ、好ましくは０．０５μｍ〜５ｍｍである。
また、前記不溶性支持体における前記凹部の数も、特に限定されるものではなく、不溶性支持体の大きさにも依存するが、例えば、数個〜数万個（一般には数十〜１乃至２万個）の凹部を形成することができる。
【００１６】
前記不溶性支持体上の平坦表面における前記凹部の形成手段としては、公知の技術を適宜利用することができ、その一例としては、エッチング法を挙げることができる。前記エッチング法では、例えば、表面を酸化処理したシリコン基材上に、ネガ型フォトレジスト膜をコーティングした後に、所望形状のフォトマスク［例えば、凹部の開口部の形状に相当するドット（黒い点）を複数設けたフォトマスク］を用いて露光する。続いて、露光しなかった部分のレジストを現像処理により除去した後に、レジストの除去により露出した部分の酸化膜を除去する。次に、前記露光処理において露光した部分に残留するレジストを除去すると、シリコン基板上には、酸化膜で覆われた部分と、酸化膜が除去され、シリコン表面が露出した部分とが現われる。これらの内、酸化膜で覆われていないシリコン部分をエッチング処理し、最後に、残りの酸化膜を除去することにより、シリコン基材表面に凹部を形成することができる。
あるいは、同じようにエッチング法で鋳型を作成し、その鋳型を用いて不溶性支持体を調製することもできる。
【００１７】
このようにして調製した凹部を有する不溶性支持体は、そのまま、本発明の生物学的チップに適用することができるし、必要に応じて、不溶性支持体表面全体又はその一部を親水処理又は疎水処理して用いることもできる。あるいは、金属を蒸着させてから用いることもできる。例えば、シリコン基材表面に凹部を形成させた後に、前記凹部の内部に酸化膜を形成させると、凹部の内壁の親水性を高めることができ、溶液の保持性を向上させることができるので好ましい。
【００１８】
前記不溶性支持体の一方の平坦表面に形成された前記凹部に保持させる不溶性粒子は、本発明による生物学的チップの使用条件下において実質的に水又は有機溶媒に不溶性の粒子であれば、その材質は特に限定されない。このような材料としては、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ又は免疫学的アッセイにおいて一般的に用いられている実質的に不溶性である有機材料又は無機材料、例えば、シリコン、ガラス、磁性金属若しくは非磁性金属、又はプラスチック等を挙げることができる。特には、ガラス又はラテックス（例えば、ポリスチレン）が好ましく、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ又は免疫学的アッセイにおいて一般的に用いられているラテックス粒子を、前記不溶性粒子として好適に用いることができる。
前記不溶性粒子は一般に球状であり、その粒径は特に限定されるものではなく、例えば、０．０１μｍ〜１ｃｍ、好ましくは０．０５μｍ〜５ｍｍ、より好ましくは０．１μｍ〜１ｍｍである。
【００１９】
本発明の生物学的チップにおいて、前記不溶性粒子には、その表面に、標的物質と特異的に結合することのできるパートナー物質を結合して用いる。本発明において、「標的物質」と「パートナー物質」との組み合わせとしては、特異的な結合を示す限り、特に限定されるものではなく、例えば、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）とそれに相補的な核酸との組み合わせ、抗原と抗体（又は抗体フラグメント）との組み合わせ、受容体とそのリガンド（例えば、ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質、又はレクチン）との組み合わせ、酵素とそのリガンド（例えば、酵素の基質アナログ、補酵素、調節因子、又は阻害剤）との組み合わせ、酵素アナログとその酵素アナログの元となる酵素の基質との組み合わせ、又はレクチンと糖との組み合わせを挙げることができる。なお、「酵素アナログ」とは、元の酵素に対する基質との特異的な親和性は高いものの、触媒活性を示さないものを意味する。また、前記の各組み合わせにおける各化合物は、それぞれ、いずれか一方が「標的物質」となり、他方が「パートナー物質」となることができる。例えば、「抗原と抗体との組み合わせ」では、抗原が「標的物質」となる場合には、抗体が「パートナー物質」となることができ、逆に、抗体が「標的物質」となる場合には、抗原が「パートナー物質」となることができる。
【００２０】
例えば、本発明の生物学的チップを核酸ハイブリダイゼーションアッセイに適用する場合には、前記パートナー物質として、標的物質である核酸（例えば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド）と相補的に結合することのできるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを用いることができる。本明細書においては、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」には、２’−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。なお、ＰＮＡとは、ＤＮＡのホスホジエステル結合をペプチド結合に変換した人工核酸である。
前記不溶性粒子に結合されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの鎖長は、分析目的に応じて適宜選択することができ、例えば、捕捉しようとするＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＰＮＡの相補的配列の鎖長に基づいて決定することができる。
【００２１】
前記パートナー物質として用いるオリゴヌクレオチドの合成は、自動合成装置を用いて一般的に行なうことができる。また、必要に応じて、自動合成装置を用いて、末端アミノ基又は他の基が修飾されたオリゴヌクレオチドを製造することもできる。あるいは、自動合成装置を用いて未修飾オリゴヌクレオチドを予め合成しておき、必要に応じて、前記の未修飾オリゴヌクレオチドを修飾することもできる。オリゴヌクレオチドを修飾する方法は周知であり、例えば、アミン類やフルオレセイン等を付加することができる。このように修飾されたオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドと比べて、不溶性粒子に対する親和性が大きい。
また、パートナー物質として用いるポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）の合成は、通常の遺伝子工学的手法、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて行なうことができる。
【００２２】
また、本発明の生物学的チップを免疫学的アッセイに適用する場合には、前記パートナー物質として、標的物質と特異的に結合する抗原（ハプテンを含む）又は抗体を用いることができる。この場合に、前記標的物質としては、被検試料中に一般的に含まれている成分で、しかも、免疫学的に検出することのできる物質であれば、特に制限されない。一例を挙げれば、各種タンパク質、多糖類、脂質、菌体、又は各種環境物質等を挙げることができる。より詳細には、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、又はＩｇＡ）、感染症関連マーカー（例えば、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓ抗体、ＨＩＶ−１抗体、ＨＩＶ−２抗体、ＨＴＬＶ−１抗体、又はトレポネーマ抗体）、腫瘍関連抗原（例えば、ＡＦＰ、ＣＲＰ、又はＣＥＡ）、凝固線溶マーカー（例えば、プラスミノーゲン、アンチトロンビン−III、Ｄ−ダイマー、ＴＡＴ、又はＰＰＩ）、抗てんかん薬（例えば、ホルモン）、各種薬剤（例えば、ジゴキシン）、菌体（例えば、Ｏ−１５７又はサルモネラ）若しくはそれらの菌体内毒素若しくは菌体外毒素、微生物類、酵素類、残留農薬、又は環境ホルモン等を挙げることができる。前記パートナー物質として用いる抗体としては、周知の方法で得られるポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれをも使用することができる。更に、前記抗体は、タンパク質［例えば、酵素（例えば、ペプシン又はパパイン）］処理したもの［例えば、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、又はＦｖ）］でも構わない。
【００２３】
前記不溶性粒子は、前記の標的物質と特異的に結合するパートナー物質を結合させて用いる。前記不溶性粒子と前記パートナー物質とを結合する手段としては、当業者において周知の結合方法を使用することができ、例えば、非共有結合（いわゆる物理吸着）による結合方法又は共有結合（いわゆる化学結合）による結合方法を使用することができる。
例えば、非共有結合による結合方法を用いる場合には、パートナー物質と不溶性粒子とを含む溶液を、両者が結合するのに充分な時間、撹拌混合した後に、前記不溶性粒子を、例えば、遠心分離又は濾過により分離することにより、パートナー物質を結合した不溶性粒子を得ることができる。得られたパートナー物質結合不溶性粒子は、使用するまでの間、パートナー物質の安定性を維持することができる緩衝液又は溶媒中で保存することができる。
【００２４】
一方、共有結合（化学結合）により結合させる場合には、官能基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、又は水酸基）を有する不溶性粒子に、パートナー物質を結合することができる。このような不溶性粒子としては、その表面にカルボキシル基又は第一級アミノ基をもつ不溶性粒子はそのまま使用することができる。また、その表面に前記官能基をもたない不溶性粒子の場合には、その不溶性粒子表面に前記官能基を公知の方法により付加することにより、使用可能である。
【００２５】
前記官能基を有する不溶性粒子へのオリゴヌクレオチドの化学的結合方法としては、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端を不溶性粒子の官能基に共有結合で結合させるマレイミド法又はカルボジイミド法が知られている。
例えば、マレイミド法では、まず、オリゴヌクレオチドの５’末端とマレイミド化合物とを反応させ、オリゴヌクレオチドの５’末端にマレイミド基を導入する。好適なマレイミド化合物としては、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート等を挙げることができる。前記反応とは別に、アミノ基を有する不溶性粒子とスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートとを反応させた後に、ヒドロキシラミンを用いて脱アセチル化を行なうことにより、前記不溶性粒子にＳＨ基を付与する。こうして付与した不溶性粒子上のＳＨ基と、５’末端にマレイミド基を導入して調製した前記オリゴヌクレオチドの５’末端に導入したマレイミド基とを反応させることにより、オリゴヌクレオチドを結合させた不溶性粒子を調製することができる。
【００２６】
一方、カルボジイミド法により支持体にオリゴヌクレオチドを結合させるには、予めカルボキシル基を結合させた担体を用いることが好ましい。まず、アミノ基を有するカルボジイミドとカルボキシル基を有する不溶性粒子支持体とを反応させる。カルボジイミド化合物としては、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等を挙げることができる。スルホ−ＮＨＳと反応させることにより活性化したＥＤＣは、その表面にカルボキシル基を含む不溶性粒子と反応することができる。次いで、これをアミノ基を有するオリゴヌクレオチドの５’末端と反応させると、オリゴヌクレオチドを結合させた不溶性粒子を調製することができる。
【００２７】
前記官能基を有する不溶性粒子へのオリゴヌクレオチドの結合方法としては、前記のマレイミド法及びカルボジイミド法の他にも、多くの結合方法、例えば、ビオチン−アビジン系を用いる方法も使用することができる。
また、オリゴヌクレオチド以外のパートナー物質、すなわち、ポリオリゴヌクレオチド、抗原（ハプテンを含む）、又は抗体（抗体フラグメントを含む）等についても、前記のオリゴヌクレオチドの場合と同様の方法で、あるいは、別の公知方法により、不溶性粒子に結合させることができる。前記パートナー物質は、必要に応じて、リンカー物質を結合してから、不溶性粒子へ化学結合することもできる。
【００２８】
本発明の生物学的チップにおいては、１個の不溶性粒子に対して同一種のパートナー物質を結合させることもできるし、あるいは、１個の不溶性粒子に対して複数種のパートナー物質を結合させることもできるが、通常、１個の不溶性粒子に対して同一種のパートナー物質のみを結合させ、使用するパートナー物質毎に、各パートナー物質を結合させた不溶性粒子をそれぞれ作製することが好ましい。
【００２９】
本発明の生物学的チップでは、前記のようにして調製した、標的物質と特異的に結合するパートナー物質を結合した不溶性粒子を、それ単独で、あるいは、適当な緩衝液と共に、不溶性支持体表面上の複数の凹部に挿入させ、保持させる。本明細書において前記「保持」には、不溶性粒子全体が凹部内部に完全に収納され、粒子の一部が凹部の開口部から突出していない状態に限定されるものではなく、不溶性粒子の一部が凹部の開口部から突出している状態も含まれる。
【００３０】
不溶性粒子を凹部に挿入させる方法としては、任意の手段を用いることができる。例えば、不溶性粒子としてラテックス粒子を用いる場合には、光ピンセットを用いることが好ましく、不溶性粒子としてガラス粒子を用いる場合には、マイクロマニュピレーターを用いることが好ましい。あるいは、重力法で凹部に粒子を入れることもできる。
【００３１】
このようにして凹部に挿入した不溶性粒子は、特別な処理を施すことなく、好ましくは適当な緩衝液と共に、不溶性支持体の凹部内部に保持させておくことが可能である。また、必要により、例えば、水溶性高分子溶液で被覆することにより、不溶性粒子を前記凹部内部に固定することもできる。
【００３２】
本発明の生物学的チップにおいては、凹部１個当たりに保持される不溶性粒子の数は特に限定されるものではない。しかし、定量法に利用する場合には、凹部１個当たりに保持される不溶性粒子数をそれぞれ同一とすることが好ましい。本発明の生物学的チップでは、凹部及び不溶性粒子の大きさを適宜調製することができるので、凹部１個に不溶性粒子１個を容易に挿入することができる。
また、凹部１個当たりに複数個の不溶性粒子を挿入する場合には、それらの不溶性粒子上に担持されているパートナー物質が同一の単独種であることもできるし、あるいは、複数種であることもできるが、通常、同一の単独種であることが好ましい。
【００３３】
こうして得られた本発明の生物学的チップは、本発明による分析方法に使用することができる。本発明による分析方法によれば、被検試料中に存在するおそれのある標的物質に応じて、前記不溶性粒子に結合させるパートナー物質を適宜選択することにより、前記標的物質を分析（例えば、測定又は検出）することができる。
本発明の分析方法を適用することのできる前記被検試料は、標的物質を含有する可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、例えば、動物（特にはヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、又は髄液）若しくは排泄物（例えば、尿、糞便、又は膿）、臓器、組織、若しくは細胞、又は非生物学的試料、例えば、水（例えば、上水、下水、河川水、湖水、又は海水）、土壌、若しくは汚泥などを挙げることができる。
【００３４】
本発明による分析方法は、
（１）標的物質を含有する可能性のある被検試料と、凹部内の不溶性支持体上のパートナー物質とを接触させる工程、及び
（２）前記パートナー物質と前記標的物質との複合体を検出又は測定する工程
を含む。前記被検試料と凹部内の不溶性支持体上のパートナー物質との接触は、例えば、標的物質を含有する可能性のある被検試料を、前記凹部内に添加することにより行なうことができる。
【００３５】
本発明による分析方法においては、前記のパートナー物質と標的物質との複合体を検出又は測定する手段として公知の検出手段又は測定手段を使用することができる。
例えば、本発明による分析方法における第１の態様は、
（１）被検試料中に存在する可能性のある標的物質に標識を導入する工程、
（２）得られた被検試料を、本発明による生物学的チップにおける凹部内に添加し、前記凹部内の不溶性支持体上のパートナー物質と、前記被検試料とを接触させる工程、及び
（３）前記パートナー物質と前記標的物質との複合体に含まれる前記標識に由来する信号を検出又は測定する工程
を含む。
【００３６】
また、本発明による分析方法における第２の態様は、
（１）標的物質を含有する可能性のある被検試料を、本発明による生物学的チップにおける凹部内に添加し、前記凹部内の不溶性支持体上の第１のパートナー物質と、前記被検試料とを接触させる工程、
（２）前記標的物質と特異的に反応することができ、しかも、標識された別の第２のパートナー物質を、前記凹部内に更に添加する工程、及び
（３）前記の不溶性支持体上の第１のパートナー物質と、前記標的物質と、前記の標識された第２のパートナー物質との複合体に含まれる前記標識に由来する信号を検出又は測定する工程
を含む。前記の不溶性支持体上の第１のパートナー物質、及び前記の標識された第２のパートナー物質は、標的物質とそれぞれ異なる位置で結合することが必要である。
【００３７】
更に、本発明による分析方法における第３の態様は、
（１）標的物質を含有する可能性のある被検試料を、本発明による生物学的チップにおける凹部内に添加し、前記凹部内の不溶性支持体上のパートナー物質と、前記被検試料とを接触させる工程、
（２）ＤＮＡ合成酵素と、少なくとも１種類が標識されている４種のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰとを、前記凹部内に更に添加する工程、及び
（３）前記の不溶性支持体上のパートナー物質と、前記標的物質との複合体に導入された前記標識ｄＮＴＰに由来する信号を検出又は測定する工程
を含む。
前記第３の態様は、標的物質が核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチド核酸等）であり、パートナー物質として、前記核酸と相補的に結合可能な核酸を用いる場合に適用することができる。
【００３８】
本発明による分析方法において、標的物質が核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はペプチド核酸等）であり、パートナー物質として、前記核酸と相補的に結合可能な核酸を用いる場合には、例えば、本発明の分析方法における前記の第１の態様により前記標的物質を分析することができる。
すなわち、本発明による生物学的チップにおける不溶性支持体の凹部に、予め標的物質である核酸を標識化しておいた被検試料を添加し、不溶性支持体上のパートナー物質と、前記被検試料とを好適な時間及び条件下で接触させると、被検試料中に標的物質が存在した場合には、前記パートナー物質と標的物質との複合体が、不溶性粒子上に形成される。標的物質である核酸が、不溶性粒子に結合されたパートナー物質である核酸とハイブリダイズするので、その存在の有無又は存在量を、核酸ハイブリダイゼーションアッセイに用いられる周知の方法により検出又は測定することができる。
【００３９】
例えば、被検試料を前記凹部に添加する前に、予め、ニックトランスレーションによって標的物質である核酸に、標識されたヌクレオチドを付加しておくと、パートナー物質と標的物質との反応後、前記標識を直接、あるいはその標識に特異的な反応を発現させるための更なる試薬類の追加によって、ハイブリダイズの結果を反映するシグナルを検出又は測定することができる。
また、予めＰＣＲ法等で標的核酸を増幅させておくこともできる。更に、この際、標識となる物質をプライマーに付加しておけば、後の検出が容易となるとともに、検出の感度も高くなるので都合がよい。
【００４０】
また、この場合、すなわち、標的物質が核酸であり、パートナー物質として、前記核酸と相補的に結合可能な核酸を用いる場合には、本発明の分析方法における前記の第３の態様によっても前記標的物質を分析することができる。
すなわち、本発明による生物学的チップにおける不溶性支持体の凹部に被検試料を添加し、不溶性支持体上のパートナー物質と、前記被検試料とを好適な時間及び条件下で接触させると、被検試料中に標的物質が存在した場合には、前記パートナー物質と標的物質との複合体が、不溶性粒子上に形成される。このパートナー物質と標的物質との複合体中に、二重鎖を形成していない一重鎖部分が存在する場合には、次に、ＤＮＡ合成酵素と、少なくとも１種類が標識されている４種のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰとを添加すると、その一重鎖部分を鋳型として、ＤＮＡが合成されると同時に、前記複合体に標識が導入される。前記ＤＮＡ合成終了後、前記標識を直接、あるいはその標識に特異的な反応を発現させるための更なる試薬類の追加によって、そのシグナルを検出又は測定することができる。
【００４１】
前記第３の態様で使用する核酸合成酵素は、標的物質とパートナー物質との複合体における鋳型の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、鋳型がＤＮＡである場合には、例えば、クレノウ酵素を使用することができ、鋳型がＲＮＡである場合には、例えば、逆転写酵素を使用することができる。
【００４２】
次に、標的物質が抗原であり、パートナー物質として抗体を用いる場合には、例えば、本発明の分析方法における前記の第２の態様により前記標的物質を分析することができる。
すなわち、本発明による生物学的チップにおける不溶性支持体の凹部に被検試料を添加し、不溶性支持体上のパートナー物質と、被検試料とを好適な時間及び条件下で接触させると、被検試料中に標的物質が存在した場合には、パートナー物質である前記抗体と、標的物質である抗原との複合体が、不溶性粒子上に形成される。次に、不溶性粒子上に捕捉（結合）された前記抗原に対し、標識抗体（すなわち、標的物質である前記抗原に特異的に結合し、しかも、不溶性粒子に結合させた前記抗体とは別のエピトープを認識する抗体を標識化したもの）を添加及び反応させた後、前記標識を直接、あるいはその標識に特異的な反応を発現させるための更なる試薬類の追加によって、そのシグナルを検出又は測定することができる。
また、この場合、すなわち、標的物質が抗原であり、前記パートナー物質として抗体を用いる場合には、本発明の分析方法における第１の態様によっても前記標的物質を分析することができる。
【００４３】
更に、標的物質が抗体であり、パートナー物質として抗原を用いる場合には、標的物質である前記抗体に特異的に結合する抗体を標識化した抗体を、前記標識抗体として使用すること以外は、標的物質が抗原であり、パートナー物質として抗体を用いる場合と同様にして、シグナルを検出又は測定することができる。
また、標的物質が、受容体、受容体のリガンド、酵素、酵素のリガンド、酵素アナログ、酵素アナログの元となる酵素の基質、レクチン、又は糖であり、パートナー物質として、それらに特異的に結合する物質を用いる場合には、前記標的物質に特異的に結合する抗体を標識化したものを、前記標識抗体として使用すること以外は、標的物質が抗原であり、パートナー物質として抗体を用いる場合と同様にして、シグナルを検出又は測定することができる。あるいは、被検試料を不溶性支持体の凹部に添加する前に、予め、標的物質に標識を導入しておくことにより、本発明の分析方法における前記の第１の態様によっても前記標的物質を分析することができる。
【００４４】
前記標識抗体における標識、又は標的物質に予め導入することのできる標識としては、例えば、酵素的に活性な群（例えば、酵素と酵素の基質との組み合わせ、酵素と補欠分子族との組み合わせ、又は酵素と補酵素との組み合わせ）、スピンラベル、蛍光分子（例えば、蛍光発光体、発蛍光団）、発色団及び色原体、発光分子（例えば、発光物質、化学発光物質、及び生体発光物質）、燐光体分子、特異的に結合可能なリガンド（例えば、ビオチン又はアビジン）、電気活性物質、放射性同位元素、着色粒子（着色物質を含む粒子、及び着色物質からなる粒子を含む）若しくは蛍光粒子（蛍光物質を含む粒子、及び蛍光物質からなる粒子を含む）、又はコロイド粒子（例えば、セレンコロイド又は金コロイド）等を挙げることができる。
各標識に由来するシグナルの検出又は測定には、標識由来のシグナルに適した公知の手段により実施することができる。
【００４５】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《オリゴヌクレオチドチップの調製》
本実施例においては、パートナー物質としてオリゴヌクレオチドを用いるオリゴヌクレオチドチップを作製した。
【００４６】
（１）不溶性支持体の調製
半導体熱処理装置［管状電熱炉ＡＲＦ−１１２−１型；（株）アサヒ理化製作所］を用いて、シリコン基板（３ｃｍ×３ｃｍ）の表面を熱酸化処理（熱源＝電熱ヒーター，温度＝１０００℃，時間＝８時間）した。次いで、スピンコーター［１Ｈ−ＤＸII；ミカサ（株）］を用いて、ネガ型フォトレジストＯＭＲ８３（東京応化）を被覆［５００ｒｐｍ（１０秒間）及び４０００ｒｐｍ（２０秒間）］した後に、マスクをかぶせ、マスクアライナー［ＳＵＳＳ  ＭＪＢ３；カール・ズース・ジャパン（株）］で８秒間照射（光源＝水銀ランプ）し、非露光部のレジストを除去した。この露光処理では、一辺が５０μｍである正方形のドット（黒い点）２００個を、所定の間隔（５０μｍ）をあけて線状に一列に配置し、更に、それを平行に２００列配置したマスク（ドットの総数＝４００００個）を使用した。
【００４７】
得られたシリコン基板をフッ酸溶液（フッ化水素：フッ化アンモニウム＝１：１）に浸し、レジストの除去により露出した部分の酸化膜を除去した後に、露光部に残っていた部分のレジストも除去した。続いて、水酸化テトラメトキシアンモニウムでエッチング処理（温度＝８０℃，時間＝１時間）することにより、逆ピラミッド型の凹部を有する不溶性支持体を得た。前記凹部の開口部（正方形状）の一辺の長さは５０μｍであり、凹部の深さは２７μｍであり、一列当たりの凹部数は２００個（総数４００００個）であり、そして、隣接する凹部間の間隔は５０μｍであった。
【００４８】
次に、得られた前記不溶性支持体を出発材料として、前記フォトレジストＯＭＲ８３の代わりに、ポジ型フォトレジストＯＦＰＲ−８００（東京応化）を用いたことを除いて、前記の熱酸化処理、露光処理、感光レジスト除去処理、フッ酸処理、及び残存レジスト除去処理を繰り返すことにより、凹部内部にのみＳｉＯ2層を形成させた不溶性支持体を得た。
【００４９】
（２）オリゴヌクレオチド結合ラテックス粒子の調製
カルボキシル化ラテックス粒子の懸濁液（２．５％ラテックス，フナコシ，粒径＝１０μｍ）０．１ｍｌと、
塩基配列：５’−tttttttttt tttttttttt cccccccccc cccccccccc−３’
を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴヌクレオチドｔ20ｃ20と称する）［国際試薬（株）］を含有する０．１Ｍイミダゾール緩衝液０．６ｍｌとを混合した後に、０．１Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）０．１ｍｌを添加し、２５℃で２０時間振盪した。続いて、２×ＳＳＣ溶液（０．３Ｍ−ＮａＣｌ及び０．１Ｍクエン酸ナトリウム）で洗浄することにより、前記オリゴヌクレオチドｔ20ｃ20を表面に結合したラテックス粒子（オリゴヌクレオチドｔ20ｃ20結合ラテックス粒子）を得た。
また、コントロールとして、前記オリゴヌクレオチドｔ20ｃ20の代わりに、
塩基配列：５’−tttttttttt tttttttttt gggggggggg gggggggggg−３’
を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴヌクレオチドｔ20ｇ20と称する）を用いたこと以外は前記操作を繰り返すことにより、前記オリゴヌクレオチドｔ20ｇ20を表面に結合したラテックス粒子（オリゴヌクレオチドｔ20ｇ20結合ラテックス粒子）を得た。
【００５０】
（３）オリゴヌクレオチドチップの調製
前項（１）で得られた不溶性支持体の凹部４００００個に、前項（２）で得られたオリゴヌクレオチドｔ20ｃ20結合ラテックス粒子又はオリゴヌクレオチドｔ20ｇ20結合ラテックス粒子のいずれか一方を、各凹部当たり１個ずつ、光ピンセットを用いて挿入させることにより、本発明によるオリゴヌクレオチドチップを得た。
得られたオリゴヌクレオチドチップの走査型電子顕微鏡写真を図３に示す。図３は、前記オリゴヌクレオチドチップの表面の構造を示す図面に代わる走査型電子顕微鏡写真である。
【００５１】
【実施例２】
《被検試料中のオリゴヌクレオチドの測定》
本実施例では、被検試料として、オリゴヌクレオチドｔ20ｇ20の５’末端に、蛍光物質であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を導入した標識オリゴヌクレオチド水溶液（４．６μｇ／ｍｌ）を用いた。
前記実施例１で調製したオリゴヌクレオチドチップにおける不溶性支持体の凹部４００００箇所に、前記の標識オリゴヌクレオチド水溶液２０μｌを添加し、３７℃で１００分間反応させた。反応終了後、２×ＳＳＣ溶液で洗浄し、蛍光測定装置を用いて、各凹部の蛍光量を測定した。
その結果、オリゴヌクレオチドｔ20ｃ20結合ラテックス粒子を挿入した凹部において蛍光を検出することができたのに対して、コントロールであるオリゴヌクレオチドｔ20ｇ20結合ラテックス粒子を挿入した凹部からは蛍光は検出されなかった。従って、本発明の生物学的チップを用いることにより、被検試料中のオリゴヌクレオチドを検出可能であることが確認された。
【００５２】
【発明の効果】
本発明の生物学的チップによれば、フォトリソグラフィー技術を利用する従来法では利用するのが困難であった、数十ｍｅｒを越える長鎖オリゴヌクレオチドであっても、プローブとして容易に取り扱うことができる。また、プローブの数が少ない場合（例えば、特定のプローブを使用する場合）であっても、容易に且つ安価に対応することができる。従って、本発明の生物学的チップによれば、プローブの選択の自由度が高く、分析目的に応じたプローブの選択が可能であるので、被検試料中に含まれる標的物質を容易に判別することができると同時に、反応の精度を向上させることができる。
【００５３】
また、本発明の生物学的チップによれば、予め合成したオリゴヌクレオチド又はｃＤＮＡを支持体に固定化する従来法において必要であった高度な設備を必要としない。また、前記従来法において問題であった、化学的架橋剤によるプローブの反応性の低下や、反応段階での洗浄や試薬の添加によるプローブの脱落（剥がれ）といった現象を回避することができるので、反応の感度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の生物学的チップの一態様を模式的に示す斜視図である。
【図２】図１に示す本発明の生物学的チップにおける凹部及びその内部に保持されている不溶性粒子の状態を模式的に示す、拡大部分断面図である。
【図３】実施例１で調製した本発明によるオリゴヌクレオチドチップの表面の構造を示す図面に代わる走査型電子顕微鏡写真である。
【符号の説明】
１・・・生物学的チップ；２・・・不溶性支持体プレート；２１・・・凹部；２２・・・平坦表面；３・・・不溶性粒子；３１・・・パートナー物質。
【図１】
0003872227.tif 000002
【図２】
0003872227.tif 000003
【図３】
0003872227.tif 000004