(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（I）：
0003929490.tif 000017
（式中、R1およびR2は独立して水素、所望により置換されたアルキル、アラルキル、アルカリール、所望により置換されたアリール、および所望により置換されたヘテロアリールであり；
式中、R3は水素、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、およびアルコキシであり；
式中、Xは窒素または酸素であり；
式中、R4は水素、所望により置換されたアルキル、アラルキル、アルカリール、所望により置換されたアリール、および所望により置換されたヘテロアリールであり；
式中、R5は水素、フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）、tert-ブトキシカルボニル（BOC）、およびカルボベンゾキシ（CBZ）、カルバモイル、所望により置換されたアルキル、アミド、所望により置換されたアリール、および所望により置換されたヘテロアリールであり）
である、O-マロニルチロシル化合物。
【請求項２】
R1およびR2が独立して、tert-ブチル、n-ブチル、または水素である、請求項1に記載の式（I）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項３】
R3が水素またはフッ素である、請求項1に記載の式（I）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項４】
R4が、水素、メチル、tert-ブチル、またはベンジルである、請求項1に記載の式（I）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項５】
R5が、フルオレニルメトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、またはカルボベンゾキシである、請求項1に記載の式（I）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項６】
シグナル伝達経路に影響を及ぼすのに有効な量の請求項1に記載の式（I）の少なくとも1種の化合物と好適な担体とを含む、細胞のシグナル伝達経路に影響を及ぼすための組成物。
【請求項７】
患者における疾患の処置または防止のための、治療的に有効量の請求項7に記載の組成物、またはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項８】
式（II）：
0003929490.tif 000018
（式中、R6およびR7は独立して水素、所望により置換されたアルキル、所望により置換されたアリール、アルカリール、およびエチレンチオアルキルであり；
式中、R8は水素、ハロゲン、アルコキシ、ハロアルコキシ、ニトロ、アミド、および置換アミノ基であり；
式中、X2は窒素または酸素であり；
式中、R9は水素、所望により置換されたアルキル、アラルキル、アルカリール、所望により置換されたアリール、および所望により置換されたヘテロアリールであり；
式中、R10は水素、フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）、tert-ブトキシカルボニル（BOC）、およびカルボベンゾキシ（CBZ）、カルバモイル、所望により置換されたアルキル、アミド、所望により置換されたアリール、および所望により置換されたヘテロアリールである）
である、O-マロニルチロシル化合物。
【請求項９】
R8が、フッ素、臭素または塩素から成る群から選択されるハロゲンである、請求項８に記載の式（II）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項１０】
R6およびR7が独立して水素である、請求項８に記載の式（II）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項１１】
R6およびR7が独立して、tert-ブチルまたはn-ブチルであり；R8が水素であり；R9が水素であり；そしてR10がフルオレニルメトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、またはカルボベンゾキシである、請求項８に記載の式（II）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項１２】
R6およびR7が独立して、tert-ブチル、n-ブチル、またはアルキルであり；R8がフッ素であり；R9が水素であり；そしてR10がフルオレニルメトキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニル、またはカルボベンゾキシである、請求項８に記載の式（II）のO-マロニルチロシル化合物。
【請求項１３】
式（III）：
0003929490.tif 000019
（式中、R11は、水素、アセチル、アルカノイル、所望により置換されたアルキル、所望により置換されたアリール、アラルキル、アルカリール、またはポリエチレンオキシであり；
式中、R12およびR16は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから成る群から選択されるアミノ酸の残基であり；
式中、R13およびR14は独立して、水素、所望により置換されたアルキルおよびエチレンチオアルキルであり；
式中、R15は水素、ハロゲン、アルコキシ、ハロアルコキシ、アミド、および置換アミノ基であり；
式中、R17はヒドロキシ、NH2、O-アルキル、O-アリール、O-アラルキル、O-アルカリール、N-ポリエチレンオキシであり；そして
式中、n1およびn2は同一でも異なっていてもよく、ゼロまたは1〜10であるが、n1およびn2は同時にゼロではない）
である、O-マロニルチロシル化合物含有ペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の式（III）および好適な担体を含む疾患の処置または防止用の組成物。
【請求項１５】
患者における癌、糖尿病または免疫機能不全を処置または防止するための、治療的に有効量の請求項１４の組成物、またはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患が癌である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
化学療法剤をさらに含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
照射処置と組み合わせて投与する、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ペプチドが式D-X-V-P-M-Lのペプチドであり、式中Xが式（III）のO-マロニルチロシル化合物の残基である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項２０】
ペプチドが式Q-X-E-E-I-Pのペプチドであり、式中Xが式（III）のO-マロニルチロシル化合物の残基である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項２１】
ペプチドが式N-X-V-N-I-Eのペプチドであり、式中Xが式（III）のO-マロニルチロシル化合物の残基である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項２２】
ペプチドが式L-N-X-I-D-L-D-L-Vのペプチドであり、式中Xが式（III）のO-マロニルチロシル化合物の残基である、請求項１３に記載のペプチド。
【請求項２３】
請求項１３に記載の少なくとも1種のペプチドと好適な担体とを含む、P1-3キナーゼC末端p85 SH2ドメインとリガンドとの結合相互作用を阻害するための組成物。
【請求項２４】
請求項１３に記載の少なくとも1種のペプチドと好適な担体とを含む、Src SH2ドメインとリガンドとの結合相互作用を阻害するための組成物。
【請求項２５】
請求項１３に記載の少なくとも1種のペプチドと好適な担体とを含む、Grb2 SH2ドメインとリガンドとの結合相互作用を阻害するための組成物。
【請求項２６】
請求項１３に記載の少なくとも1種のペプチドと好適な担体とを含む、N末端SH-PTP2 SH2ドメインとリガンドとの結合相互作用を阻害するための組成物。
【請求項２７】
P1-3キナーゼC末端p85 SH2ドメイン結合相互作用の阻害が望ましい患者における疾患を処置または防止するための、治療的に有効量の請求項２３に記載の組成物またはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項２８】
Src SH2ドメイン結合相互作用の阻害が望ましい患者における疾患を処置または防止するため、治療的に有効量の請求項２４に記載の組成物またはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項２９】
Grb2 SH2ドメイン結合相互作用の阻害が望ましい患者における疾患を処置または防止するための、治療的に有効量の請求項２５に記載の組成物またはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項３０】
N末端SH-PTP2 SH2ドメイン結合相互作用の阻害が望ましい患者における疾患を処置または防止するための、治療的に有効量の請求項２６に記載の組成物またはその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、リン不含有Ｏ−マロニルチロシル化合物、その誘導体、Ｏ−マロニルチロシル化合物含有ペプチド、上記ペプチドを含む医薬組成物、および薬学的活性剤としてのそれらの使用に関する。本発明はまた、受容体ドメインの結合相互作用に対する、並びにタンパク質−チロシンホスファターゼに対する阻害効力を示すＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドを提供する。
発明の背景
異常な細胞シグナル伝達は、免疫機能不全、癌および糖尿病を含む多様な疾患進行の原因になったりそれらを強めたりし得る。この理由のため、細胞シグナル経路は、新規な治療剤の開発のための標的となっている（Brugge,J.S.,Science 260:918-919（1993）;Brunton,V.G.およびWorkman,P.;Cancer Chemother Pharmacal 32:1-19（1993））。最も熱烈に研究された細胞シグナル経路の領域の一つは、ホスホチロシル依存性経路の領域である。ホスホチロシル依存性経路で特に重要なのは、ホスホチロシル（ｐＴｙｒ）残基の戦略的役割であり、これは下流のシグナル過程を活性化および不活性化することができる分子スイッチとしての役割を果たすようである（Panayotou,G.およびWaterfield,M.D.,Bioessays 15:171-177（1993））。インスリン受容体を含む成長因子受容体の細胞外ドメインへのリガンドの結合は、それらの細胞内タンパク質−チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）ドメインを生じさせ、チロシンの基質リン酸化およびさらなるシグナル伝達が生じる（Brunton,V.G.およびWorkman,P.;Cancer Chemother Pharmacal 32:1-19（1993））。
特に、ｐＴｙｒ−依存性機構によるシグナル伝達は、複合３成分の相互作用に依存する。これには、多くの場合は成長ホルモンの細胞表面受容体への結合のような外的刺激に対する応答において、ｐＴｙｒ残基を生成するＰＴＫが含まれる。第２のシグナル成分は、タンパク質−チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）であると仮定されており、これはｐＴｙｒホスファターゼを除去し、シグナル伝達全体において正または負の役割のいずれかを果たすかもしれない。三成分の第３の足は、タンパク質構造内に含まれるｐＴｙｒ残基への二次的シグナルタンパク質のＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン仲介結合であると仮定される。ＰＴＫｓの作用は、ｐＴｙｒホスフェートエステルを加水分解し（Walton,K.M.:Dixon,J.E.,Ann.Rev.Biochem.62:101-120（1993））、ＰＴＫ仲介シグナルの阻害調節剤として作用することが概念的に予測される、タンパク質−チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）によって平衡化される。ＰＴＰｓが複数の系において正のシグナル因子でもあるかもしれないことが以前に示唆されている（Tan,Y.H.,Science 262:376-377（1993））。例えば、ＰＴＰα、ＣＤ４５およびｐ８０ｃｄｃ２５は各々、おそらく阻害性ｐＴｙｒ残基を脱リン酸化することによって、ＰＴＫｓ、ｐ６０srcおよびｐ５６lcksおよびセリン−トレオニンキナーゼｐ３４ｃｄｃ２（Morla,A.O.,et al.,Cell 58:193-203（1989））を活性化することができるＰＴＰｓである。ＰＴＰｓはまた、インターロイキン−４（ＩＬ−４）などのある種のサイトカインの分裂促進作用（Miresluis,A.R.;Thorpe,R.,J.Biol.Chem.266:18113-18118（1991））、およびある種のインターフェロン（Igarashi,K.,et al.,Mol.Cell.Biol.13:3984-3989（1993））に必要であるようである。ＰＴＰｓはまた、細胞外リガンド−結合ドメインへのインスリンの結合後の自己リン酸化によって活性化され、ＰＴＰｓによるこれらの活性化ｐＴｙｒ残基の加水分解が糖尿病状態を潜在的に悪化させている、インスリン受容体ＰＴＫによって例示されるように、疾患進行に直接的に寄与している場合がある（Sale,G.J.,Advances in Protein Phosphatases 6:159-186（1991））。
ＰＴＰ阻害剤がシグナル伝達経路の研究および治療の介在のために提示する潜在的価値にも係わらず、そのような薬剤の開発は比較的ほとんど報告されていない。バナジウム酸塩、オキソバナジウム錯体（Posner,B.I.,et al.,J.Biol.Chem.269:4596-4604（1994）;Watanabe,H.,et al.,J.Med.Chem.37:876-877（1994））およびガリウムニトレート（Berggren,M.M.,et al.,Cancer Res 53:1862-1866（1993））並びにスラミン（suramin）（Ghosh,J.;Miller,R.A.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,194:36-44（1993））およびメリチン（melittin）（Errasfa,M.;Stern,A.,Eur J.Pharmacal 247:73-80（1993））などの大型の高度に電荷を帯びた分子を含む、幾つかの金属含有ＰＴＰ阻害剤が既知である。これらの物質の全ては、かなり非特異的な様式で作用することが予測される。小型分子の阻害剤の探索により最近、ニトロソアミン含有発酵生成物「デフォスタイン（dephostatin）」（Imoto,M.,et al.,J.Antibiot 46:1342-1346（1993））および不可逆自殺阻害剤、４−ジフルオロメチルフェニルホスフェート（Wange,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.,270:944-948（1995））が生み出されたが、これら後者の化合物は共に非常に毒性の代謝物を生成する可能性がある。
ＰＴＰ阻害剤の設計に対する他の試みは、加水分解不能なホスフェート模倣物によるＰＴＰペプチド基質中のｐＴｙｒ残基の置換に依存する。ホスホン酸は親のホスフェートとイソステリック（isosteric）であるけれども、Ｐ−Ｃ結合切断に対して化学的および酵素的に耐性であるため、それらを多様な生物学的関連分野において価値のあるホスフェート模倣物としている（Blackburn,G.M.,Chem.Ind.（London）134-138（1981）;Engel,R.生体系中のホスホネートの役割における抗代謝物としてのホスホン酸およびホスホネート、R.L.Hilderbrand,編者、1983、CRC Press,Inc:Boca Raton,F1.p.97-138）。ホスホノメチルフェニルアラニン（Ｐｍｐ）はｐＴｙｒのホスホネートに基づく代理であり、ホスフェートエステル酸素がメチレン単位によって置換されている。Ｐｍｐ含有ペプチドは競合的ＰＴＰ阻害剤として作用することが以前に示されている（Chatterjee,S.,et al.,Peptides:Chemistry and Biology,J.E.RivierおよびJ.A.Smith,編者、1992,Escom Science Publishers:Leiden,Netherland,p.553-555;Zhang,Z.Y.,et al.,Biochemistry 33:2285-2290（1994））。ＰｍＰ−保有ペプチドもまた、親和性は減少しているけれども、天然ｐＴｙｒ含有ペプチドと同様にＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインに結合する（Domchec,S.M.,et al.,Biochemistry 31:9865-9870（1992））。アルファメチレンにおいて置換された２個のフッ素を有するＰｍｐ誘導体、ホスホノジフルオロメチルフェニルアラニン（Ｆ2Ｐｍｐ）が以前に開発された（Burke,T.R.,Jr.,et al.,J.Org.Chem.58:1336-1340（1993）;Burke,T.R.,Jr.,et al.,Tetrahedron Lett.34:4125-4128（1993）;Smyth,M.S.,et al.,Tetrahedron Lett.33:4137-4140（1992））。Ｆ2Ｐｍｐ含有ペプチドはそれらのＰｍｐカウンターパートと比較してＰＴＰアッセイにおいて増加した阻害効力を示すことも示されている（Burke,T.R.,Jr.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.204:1148-1153（1994））。しかしながら、Ｆ2Ｐｍｐ成分はＰＴＰ阻害剤の製造のための価値のある新規な成分であるけれども、生理的ｐＨにおけるその二イオン化性は細胞膜の通過に対してそれらを耐性にするので、Ｆ2Ｐｍｐ含有ペプチドは医薬化合物における使用には不適切である。Ｆ2Ｐｍｐ含有ペプチドは細胞膜を通過できないために、冗長なマイクロインジェクション（Xiao,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:21244-21248（1994））または細胞透過可能化（Wange,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.,270:944-948（1995））技術が必要である。ホスフェート（例えば、Srivastva,D.N.;Farquhar,D.,Bioorganic chemistry 12:118-129（1984））およびホスフェート（例えば、Iyer,R.P.,et al.,Tetrahedron Letters 30:7141-7144（1989）;Freeman,S.,et al.,J.Chem.Soc.Chem.Commun.875-877;（1991）;Mitchell,A.G.,et al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I（1992）;Lombaert,S.D.,et al.,J.Med.Chem.37:498-511（1994））のバイオ可逆保護のための方法が報告されており、そのような「プロドラッグ」誘導化は達成することが困難なことが多く、ペプチド合成への応用には容易には適切ではない。従って、ホスファターゼへの不安定性およびホスフェート含有ｐＴｙｒファルマコホア（pharmacophore）の細胞膜を通過する低い浸透性は、ｐＴｙｒに基づく薬剤の治療的または薬理学的有用性に２つの大きな限界をもたらす。従って、固相ペプチド合成を受け得るプロドラッグとして製造でき、適当なペプチドに置換された場合にＰＴＰ阻害効力を維持するｐＴｙｒ模倣体に対する大きな需要が存在する。
ホスフェート機能を模倣するためのマロネートファルマコフォアの使用は、未関連の酵素系において記載されている（Marzabadi,M.R.,et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.2:1435-40（1992）;Corey,S.D.,et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.3:2857-2862（1993）;Miller,M.J.,et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.7:1435-1440（1993）;Sikorski,J.A.,et al.,Phosphorus,Sulfur Silicon Relat.Elem.76:115-118（1993）を参照）。しかし、これらの化合物はｐＴｙｒまたは関連シグナルに向いていなかった。
ＰＴＫ依存性シグナルを調節する一つの方法は、Ｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン結合相互作用の阻害によるものである。小型のｐＴｙｒ含有ペプチドはＳＨ２ドメインに結合して、より大型のｐＴｙｒペプチドまたは天然のタンパク質ｐＴｙｒリガンドに競合することができる。このようなｐＴｙｒペプチドは、それらがＰＴＰｓに対して加水分解的に不安定であり、イオン化されたホスフェート成分の細胞浸透性が悪いために、インビボでのＳＨ２ドメイン阻害剤としての有用性において限定されている。上記したホスホネートに基づくｐＴｙｒ模倣体ＰｍｐおよびＦ2ＰｍｐはＰＴＰ−耐性ＳＨ２ドメイン阻害剤ペプチドの製造のために使用することは成功しているが、細胞浸透の問題はこれらのホスホネートに基づく化合物については未解決のままである。
ＳＨ２ドメインは、多様な重要なシグナル伝達分子に見出される約１００アミノ酸の相同な配列であり、それらはタンパク質−タンパク質会合を促進することによってＰＴＫ仲介細胞シグナルの鍵成分を補助する（Margolis,B.Growth Differ 3:73-80（1993）;Panayotou,G.et al.,Bioessays 15:171-177（1993）;およびPawson,T.,et al.,Curr Biol 3:434-442（1993））。多数の分裂促進シグナルカスケードにおいてＰＴＫにより果たされる中心的役割（Fantl,W.J.,et al.,Ann.Rev.Biochem.,453-481（1993）;Fry,M.J.,et al.,Protein Sci.2:1785-1797（1993））、並びに幾つかの癌および増殖性疾患におけるＰＴＫｓの異常または過剰な発現の関与（Cantley,L.C.,Cell 64:281-302（1991））は、ＳＨ２ドメインの結合を特異的にブロックする阻害剤の開発を、生物学的手段そして有効な治療剤の両方として望ましいものとしている（Burke,T.R.,et al.,Drugs of the Future 17:119-131（1992）;Brugge,J.S.,Science 260:918-919（1993））。ＳＨ２結合ドメインのために、相互作用は結合したタンパク質中のｐＴｙｒ残基の存在に依存することが多い。ＳＨ２ドメインの異なるクラスの中で、二次的リガンドが、ｐＴｙｒ残基に隣接するアミノ酸配列内に、特にはＣ−末端側に向かう残基中に特異的に存在し、それによってＳＨ２ドメインのファミリーは標的タンパク質上の特異的な結合部位を「認識」することができるようになる。これらの標的配列後に形成した小型のｐＴｙｒ保有ペプチドもまた、好適なＳＨ２ドメインに高い親和性と調節選択性とともに結合し、それによって特異的ＳＨ２シグナル経路を競合的に阻害する有効な手段が提供される（Fantl,W.J.,et al.,Cell 69:413-423（1992）;Songyang,Z.,et al.,Cell 72:767-778（1993））。
従って、本発明は、ホスファターゼに対して安定であり、細胞膜を通過することができ、ペプチド合成の応用に好適であり、細胞内への輸送のためにプロドラッグ誘導化を受けることができる新規なＯ−マロニルチロシル化合物およびＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドの製造および使用を提供することによって、従来技術の欠点を解消するものである。本発明はまた、細胞膜を通過する輸送の増加とその後の細胞内への活性ジカルボン酸の一度のエステラーゼが仲介した遊離のために中性のジエステルの形態で保護することができる、Ｏ−マロニルチロシル化合物およびその誘導体を提供する。
本発明はさらに、ペプチドの合成におけるＯ−マロニルチロシル化合物含有化合物の使用、並びに受容体ドメインとｐＴｙｒ含有ペプチドリガンドとの結合相互作用に対する阻害効力を示すＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドを提供するが、それらの利点および使用は本発明の以下の目的および開示から自明となるであろう。
発明の要旨
本発明は、Ｏ−マロニルチロシル化合物およびその誘導体、ペプチド合成におけるＯ−マロニルチロシル化合物の応用、並びにＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドおよびその使用に関する。本発明のＯ−マロニルチロシル化合物、その誘導体、およびＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドは、ホスファターゼに対して安定であり、Ｏ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドのペプチド合成への応用に好適であり、そして細胞内への輸送のためのプロドラッグ誘導化を受けることができる。
特には、本発明は本明細書中では「ＯＭＴ」と命名されるＯ−マロニルチロシル化合物の製造および使用を提供する。本発明はさらに、ペプチド中への取り込みに好適な、カルボン酸ジエステルの形態で保護されたＯＭＴ化合物の設計および製造を提供する。
本発明はさらに、例えば、Ｏ，Ｏ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチル）−Ｎ−ＦｍｏｃＯＭＴおよびモノフルオロ−ＯＭＴなどの、ＯＭＴの誘導体の設計と合成を提供する。
本発明はまた、タンパク質−チロシンホスファターゼ（ＰＴＰｓ）に対する阻害活性を示すＯＭＴ化合物を提供する。
本発明はさらに、タンパク質−チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）、またはホスホチロシル含有リガンドとのＳｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメイン結合相互作用に対する阻害効力を示すＯＭＴ−含有ペプチドを提供する。
特には、本発明は、ホスホチロシル含有ペプチドリガンドとのＰ１−３キナーゼＣ−末端Ｐ８５ＳＨ２ドメイン結合相互作用に対する阻害効力を示すＯＭＴ−含有ペプチドの製造および使用を提供する。
さらに、本発明は、ホスホチロシル含有リガンドとのＳｒｃドメイン結合相互作用に対して向けられたＯＭＴ−含有ペプチドの製造および使用の方法を提供する。
本発明はさらに、ホスホチロシル含有リガンドとのＧｒｂ  ＳＨ２ドメイン結合相互作用に対して向けられたＯＭＴ−含有ペプチドの製造および使用を提供する。
本発明はさらに、ホスホチロシル含有リガンドとのＮ末端ＳＨ−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメイン結合相互作用に対して向けられたＯＭＴ−含有ペプチドの製造および使用の方法を提供する。
本発明はさらに、免疫機能不全、癌、および糖尿病に関連した疾患進行などのような疾患進行を処置または防止するための方法および組成物を提供する。
本発明はまた、治療的に有効量のＯＭＴ含有ペプチドの投与による、免疫機能不全、癌、および糖尿病などの疾患を防止または処置する方法を提供する。
本発明はまた、毒素、細胞毒性薬剤、または照射と組み合わせた治療的に有効量のＯＭＴ含有ペプチドの投与による、癌を防止または処置する方法を提供する。
本発明はまた、本明細書中に記載した方法における使用のための医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１Ａおよび１Ｂ．  図１Ａおよび１Ｂは、Ｐ５６lckＳＨ２ドメインへの（Ａ）アリールホスフェートおよび（Ｂ）アリールマロネートファルマコフォアの構造および相対結合部位を記載する。
図２Ａおよび２Ｂ．  図２Ａおよび２Ｂは、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）触媒部位内に結合したＨＣＦ2ＰＯ（Ｏ−）2（図２Ａ）およびＣＨ2（ＣＯ2−）2（図２Ｂ）のエネルギー最小構造を記載する。
図３．  図３は、基質として32Ｐ−標識無傷インスリン受容体を使用した、ＰＴＰ  １Ｂ触媒インスリン受容体脱リン酸化に対する、ＯＭＴ−ペプチドＡｃ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｌｅｕ−アミドの影響を記載する。
図４．  図４は、基質として32Ｐ−標識無傷インスリン受容体を使用した、ＰＴＰ  １Ｂ触媒インスリン受容体脱リン酸化に対する、ＦＯＭＴ−ペプチドＡｃ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−〔Ｌ−ＦＯＭＴ〕−Ｌｅｕ−アミドの影響を記載する。
発明の詳細な説明
本発明は一般的には、新規なＯ−マロニルチロシル化合物、新規なＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチド、上記ペプチドを含む医薬組成物、および薬学的活性剤としてのそれらの使用を提供する。
さらに詳細には、本発明は、ホスファターゼに対して安定であり、細胞膜を通過することができる、新規なＯ−マロニルチロシル化合物およびその誘導体の製造および使用を提供する。本発明はまた、新規なＯ−マロニルチロシル化合物およびその誘導体が細胞内への輸送のためのプロドラッグ誘導化を受けることができることを提供する。本明細書中での誘導化とは、Ｏ−マロニルチロシル化合物のジエステルへの誘導化、即ちその化合物を細胞浸透可能な形態へ転換することを意味する。
本発明は、式（Ｉ）のＯ−マロニルチロシル化合物に関する：
0003929490.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2は独立して水素、アルキル、アラルキル、アルカリール、アリール、およびヘテロアリールであり；
式中、Ｒ3は水素、ハロゲン、アミノ、ヒドロキシ、およびアルコキシであり；
式中、Ｘは窒素または酸素であり；
式中、Ｒ4は水素、アルキル、アラルキル、アルカリール、所望により置換されたアリール、およびヘテロアリールであり；
式中、Ｒ5は水素、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、tert−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、およびカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）、カルバモイル、アルキル、アミド、アリール、およびヘテロアリールである；但し、置換され得る式（Ｉ）の置換基は所望により置換されている）。
式（Ｉ）の好ましいＲ1およびＲ2置換基は、例えば、tert−ブチル、フェニル、およびベンジルであり得る。
式（Ｉ）の好ましいＲ4置換基は、例えば、tert−ブチル、ベンジル、およびペンタフルオロフェニルであり得る。
式Ｉ中に存在するアルキルは、Ｃ1-20アルキルであるアルキルであり得る。
式Ｉにハロゲンが存在する場合、ハロゲンは塩素、臭素、またはフッ素であればよく、好ましいハロゲンはフッ素である。
置換アルキルが式Ｉ中に存在する場合、好適な置換基の例は、ヒドロキシ、ハロゲン、アルコキシ、ハロアルコキシ、およびアルコキシアルキルであり；そして式中、本明細書中のアルキル基並びにアルカリールおよびアラルキル基のアルキル基は、最大１０までの炭素原子を有する、直鎖また分枝鎖、または環式である。
置換ヘテロアリール基が式Ｉ中に存在する場合、好適な置換基の例は、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはハロアルキル基であり；そして式中、本明細書中のアルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アルコキシ、およびハロアルコキシ基は、１０未満の炭素原子、好ましくは５未満の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖であり、これら全ての基の中のハロ置換基は、モノ置換から完全なポリ置換までの、同一または異なる、１またはそれ以上のハロゲン原子から成る。
本発明はさらに、ペプチドの合成における使用のための式（ＩＩ）の化合物の応用に関する：
0003929490.tif 000003
（式中、Ｒ6およびＲ7は独立して水素、アルキル、アリール、アルカリール、およびエチレンチオアルキルであり；
式中、Ｒ8は水素、ハロゲン、アルコキシ、ハロアルコキシ、ニトロ、アミド、および置換アミノ基であり；
式中、Ｘ2は窒素または酸素であり；
式中、Ｒ9は水素、アルキル、アラルキル、アルカリール、所望により置換されたアリール、およびヘテロアリールであり；
式中、Ｒ10は水素、フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、tert−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、およびカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）、カルバモイル、アルキル、アミド、アリール、およびヘテロアリールである；但し、置換され得る式（ＩＩ）の置換基は所望により置換されている）。
式（ＩＩ）の好ましいＲ9置換基は、例えば、tert−ブチル、ベンジル、およびペンタフルオロフェニルであり得る。
式ＩＩ中に存在するアルキルは、Ｃ1-20アルキルおよびＣ1-6アルキルであるアルキルであり得る。式ＩＩ中に存在するアリールは、Ｃ6-10アリールであるアリールであり得る。
置換アルキルが式ＩＩ中に存在する場合、好適な置換基の例は、ヒドロキシ、ハロゲン、アルコキシ、ハロアルコキシ、およびアルコキシアルキルであり；そして式中、本明細書中のアルキル基並びにアルカリールおよびアラルキル基のアルキル基は、最大１０までの炭素原子を有する、直鎖また分枝鎖、または環式である。
置換ヘテロアリール基が式ＩＩ中に存在する場合、好適な置換基の例は、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはハロアルキル基であり；そして式中、本明細書中のアルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アルコキシ、およびハロアルコキシ基は、１０未満の炭素原子、好ましくは５未満の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖であり、これら全ての基の中のハロ置換基は、モノ置換から完全なポリ置換までの、同一または異なる、１またはそれ以上のハロゲン原子から成る。
本発明はさらに、式（ＩＩＩ）のペプチドに関する：
0003929490.tif 000004
（式中、Ｒ11は、水素、アセチル、アルカノイル、アルキル、アリール、アラルキル、アルカリール、またはポリエチレンオキシであり；
式中、Ｒ12およびＲ16は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンから成る群から選択されるアミノ酸の残基、またはその誘導体、並びに、式ＩＩのＯ−マロニルチロシル化合物から誘導された単位の残基であり；
式中、Ｒ13およびＲ14は独立して、水素、アルキルおよびエチレンチオアルキルであり；
式中、Ｒ15は水素、ハロゲン、アルコキシ、ハロアルコキシ、ニトロ、アミド、および置換アミノ基であり；
式中、Ｒ17はヒドロキシ、ＮＨ2、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリール、Ｏ−アラルキル、Ｏ−アルカリール、Ｎ−ポリエチレンオキシであり；そして
式中、ｎ1およびｎ2は同一でも異なっていてもよく、ゼロまたは１〜１０であるが、ｎ1およびｎ2は同時にゼロではない；
但し、置換され得る式（ＩＩＩ）の置換基は所望により置換されている）。
式ＩＩＩに存在するアルキルはＣ1-20アルキルであるアルキルであり得る。
式ＩＩＩに存在するアリールはＣ6-10アリールであるアリールであり得る。
置換アルキルが式ＩＩＩ中に存在する場合、好適な置換基の例は、ヒドロキシ、ハロゲン、アルコキシ、ハロアルコキシ、およびアルコキシアルキルであり；そして式中、本明細書中のアルキル基並びにアルカリールおよびアラルキル基のアルキル基は、最大１０までの炭素原子を有する、直鎖また分枝鎖、または環式である。
置換ヘテロアリール基が式ＩＩＩ中に存在する場合、好適な置換基の例は、ハロゲン、ニトロ、シアノ、またはハロアルキル基であり；そして式中、本明細書中のアルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アルコキシ、およびハロアルコキシ基は、１０未満の炭素原子、好ましくは５未満の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖であり、これら全ての基の中のハロ置換基は、モノ置換から完全なポリ置換までの、同一または異なる、１またはそれ以上のハロゲン原子から成る。
式ＩＩＩのＲ12およびＲ16は独立して、アミノ酸またはその誘導体であり、アミノ酸の１以上はアスパラギン酸および／またはグルタミン酸であり、アスパラギン酸および／またはグルタミン酸成分の好ましい側鎖は独立して、ｎ−ブチルエステル、ｎ−アルキル、またはアリールである。
式ＩＩＩのＲ12およびＲ16が独立してペプチドである場合、アミノ酸配列は直鎖でも分枝鎖でもよく、任意の数のアミノ酸、通常は約３〜３０アミノ酸から成り、好ましい長さは５〜１０アミノ酸である。ペプチドのアミノ酸配列はペプチドの特定の用途に依存する。例えば、受容体結合の阻害剤としての用途のためのペプチドの設計は、特定の受容体ドメインのアミノ酸配列に向けられ、受容体の間で大きく変化するであろう。
本発明で有用な式ＩＩＩのペプチドの具体的ではあるが非限定的な例には以下のものが含まれる：
（１）Ｐ１−３キナーゼＣ−末端ｐ８５  ＳＨ２ドメインとホスホチロシル含有ペプチドリガンドとの結合の阻害に向けられた、ペプチドＤ−Ｘ−Ｖ−Ｐ−Ｍ−Ｌ（配列番号１）、式中Ｘは式ＩＩの化合物の残基である。
（２）Ｓｒｃ  ＳＨ２ドメインとホスホチロシル含有ペプチドリガンドとの結合の阻害に向けられた、ペプチドＱ−Ｘ−Ｅ−Ｅ−Ｉ−Ｐ（配列番号２）、式中Ｘは式ＩＩの化合物の残基である。
（３）Ｇｒｂ２  ＳＨ２ドメインとホスホチロシル含有ペプチドリガンドとの結合の阻害に向けられた、ペプチドＮ−Ｘ−Ｖ−Ｎ−Ｉ−Ｅ（配列番号３）、式中Ｘは式ＩＩの化合物の残基である。そして、
（４）Ｎ末端ＳＨ−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメインとホスホチロシル含有ペプチドリガンドとの結合の阻害に向けられた、ペプチドＬ−Ｎ−Ｘ−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｖ（配列番号４）、式中Ｘは式ＩＩの化合物の残基である。
本発明のＯ−マロニルチロシル化合物およびＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドは、遊離、即ち未保護の形態、または保護された形態で存在することができる。本明細書中の保護された形態とは、１以上の反応性基、例えばＮ−末端アミノ基または−ＯＨ基が保護基によって覆われている化合物のことを意味する。好適な保護基は、Ｎ−、カルボキシ−、およびＯ−保護基などのようなペプチド化学の技術分野で既知の任意のものである。本発明のＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドの好ましい形態は、カルボキシル基が中性状態で存在し、細胞膜の通過を可能とする、ジエステル形態である。カルボン酸ジエステル形態、アルキルまたは好適なプロドラッグエステルは、「プロドラッグ」、即ち、医薬として有用である保護された形態の化合物であると考えることができる。
本発明のペプチドは、それらが遊離または保護された形態であっても、塩としてまたは錯体として存在することができる。酸付加塩は、例えば、有機酸、ポリマー酸、および無機酸によって形成することができる。そのような酸付加塩の形態には中でも、塩酸塩および酢酸塩が含まれる。錯体は本明細書中では、Ｃａ−およびＺｎ−塩などの無機塩または水酸化物などの無機物質の添加により、および／またはポリマー有機物質の添加により形成される、既知のタイプの化合物として定義される。
本発明はさらに、疾患を防止または処置するための方法および組成物を提供する。疾患の具体的な非限定的例としては、免疫機能不全、癌、および糖尿病が挙げられる。より具体的には、本発明は、免疫機能不全、癌、または糖尿病に関連した疾患進行を処置または防止するために、受容体ドメインとホスホチロシル含有リガンドとの結合相互作用を阻害するための本発明の化合物および組成物を使用することを提供する。本発明はまた、上記を含む医薬組成物を提供する。
さらに具体的には、本発明は、例えば、ＳＨ２ドメインとホスホチロシル含有リガンドとの結合相互作用に対する阻害効力を示す、治療的に有効量のＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドを投与することによる、糖尿病の処置方法を提供する。
本発明はさらに、治療的に有効量のＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドを投与することによる疾患を防止または処置する方法を提供する。
本発明はまた、化学療法剤、毒素、または照射と組み合わせた治療的に有効量のＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドを投与することによる疾患を防止または処置するための方法を提供する。化学療法剤の例は当業者に既知であり、ブレオマイシン、マイトマイシン、シクロホスホミド、ドキソルビシン、パクリタクセル（paclitaxel）、およびシスプラチンが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の一つの態様においては、Ｏ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドは薬学的に許容できる担体中で投与される。薬学的に許容できる担体には、滅菌溶液、錠剤、被覆錠剤およびカプセル剤などの任意の標準的な薬学的担体が含まれる。そのような担体には典型的には、デンプン、ミルク、糖、ある種の粘土、ゼラチン、ステンス酸（stensic acid）、タルク、野菜脂肪または油、ゴム、グリコール、または他の既知の賦形剤などの賦形剤が含まれる。そのような担体はまた、香料または着色添加物および他の成分を含んでもよい。
本化合物の投与は周知の方法のいずれによっても行うことができ、これには経口、静脈内、筋肉内、皮下投与が含まれるが、これらに限定されない。好ましい投与方法は静脈内である。
本発明の方法の実施において、組成物中に取り込まれるＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドの量は広範に変化させることができる。正確な量を決定する方法は、処置される対象、特定の薬学的担体、使用される投与経路、化合物が投与される頻度、並びに組成物が化学療法剤および／または照射治療と一緒に投与されるか否かに依存する。
本発明は、同様の応用を有する化合物中に現在存在している問題を示さない新規なＯ−マロニルチロシル化合物およびＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドを提供する。
ホスフェート含有ｐＴｙｒファルマコフォア（pharmacophore）は、本発明の実施により解消されたｐＴｙｒに基づく薬剤の治療的および薬学的有用性に対する２つの重要な制限である、ホスファターゼに対する不安定性並びに低い細胞膜浸透性を証明する。
以前に、ＰＴＰ阻害剤がＰＴＰ−基質ペプチドにおけるｐＴｙｒ残基の置換のために設計された。これは、ペプチド基質を修飾してそれらがＰＴＰによる化学的変換を受けることができないようにすることによって達成された。ＰＴＰ−基質ペプチド中のｐＴｙｒ残基を、加水分解不能なｐＴｙｒ模倣体、Ｐｍｐ２で置換すると（Burke,T.R.,Jr.et al.,Synthesis 11:1019-1020（1991））、競合的ＰＴＰ阻害剤であるペプチドが得られる（Chatterjee,S.,et al.,Peptides:Chemistry and Biology,J.E.RivierおよびJ.A.Smith,編者、1992,Escom Science Publishers:Leiden,Netherlands.p.553-555;Zhang,Z.Y.,et al.,Biochemistry 33:2285-2290（1994））。Ｐｍｐは、チロシル４’−エステル酸素の代わりに置換されたメチレンを有している点でｐＴｙｒとは相違する。一つのそのようなヘキサマー阻害剤ペプチドにおけるＰｍｐ残基をＦ2Ｐｍｐ3で置換すると（Burke,T.R.,Jr.,et al.,J.Org.Chem.58:1336-1340（1993）;Burke,T.R.,Jr.,Tetrahedron Lett.34:4125-4128（1993）;Smyth,M.S.およびBurke,T.R.,Jr.,Tetrahedron Lett.35 551-554（1994））、阻害効力が１０００倍増加することが以前に示された（ＩＣ50＝１００ｎＭ、ＰＴＰ１Ｂに対して）（Burke,T.R.,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.204:129-134（1994））。ジフルオロホスホネート成分が生理的ｐＨでジイオン化されているので（Smyth,M.S.,ey al.,Tetrahedron Lett.33:4137-4140（1992））、細胞膜を渡る輸送は危うくなり、Ｆ2Ｐｍｐ含有ペプチドの細胞研究は膜浸透化（Wange,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.270:944-948（1995））またはマイクロインジェクション（Xiao,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:21244-21248（1994））技術に頼られた。プロドラッグ保護基がホスフェート（Srivastva,D.N.およびFarquhar,D.,Bioorganic Chemistry 12:118-129（1984）;McGuigan,C.,et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.2:701-704（1992）;Perigaud,C.,et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.3:2521-2526（1993）;Farquhar,D.,et al.,J.Med.Chem.38:488-495（1995））およびホスホネート（Freeman,S.,et al.,J.Chem.Soc.Chem.Commun.875-877（1991）;Lombaert,S.D.,et al.,J.Med.Chem.37:498-511（1994））について開発されている一方、これらの保護基はＦ2Ｐｍｐ含有ペプチドには未だ広げられておらず、合成の挑戦が存在する。
本発明は、加水分解不能な非リンに基づくＯ−マロニルチロシル化合物の設計および合成を提供することによって従来技術のフッ素含有ペプチドの欠点を解消するものである。例えば、Ｐｍｐ２およびそのモノフルオロ（ＦＰｍｐ３）およびジフルオロ（Ｆ2Ｐｍｐ４）アナログは、好適なペプチドに置換された場合にＳＨ２ドメイン結合効力を保持することが示されているが、ホスファターゼによって加水分解されない（Domchek,S.M.,et al.,Biochemistry 31:9865-9870（1992）;Burke,T.R.,Jr.,et al.,Biochemistry 33:6490-6494（1994）を参照）。ホスホネート基は生理的ｐＨでイオン化されるので（Smyth,M.S.,et al.,Tetrahedron Lett.33:4137-4140（1992）,これらのペプチドは制限された細胞膜の浸透性を示す。Ｆ2Ｐｍｐ含有ペプチドは細胞に基づく系において成功的に使用されているが、浸透可能にされた細胞（Wange,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.270:944-948（1995））またはマイクロインジェクション技術（Xiao,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:21244-21248（1994））をこれらの研究のために使用した場合のみである。従って、加水分解不能であり、細胞膜を浸透することができる合成ペプチドに対する要求が存在する。
文献には、ホスフェート（Srivastva,D.N.およびFarquhar,D.,Bioorganic Chemistry 12:118-129（1984））およびホスホネート（Iyer,R.P.,et al,.Tetrahedron Letters 30:7141-7144（1989）;Freeman,S.,et al.,J.Chem.Soc.Chem.Commun.875-877（1991）;Mitche11,A.G.,et al.,J.Chem.Soc.Perkin Trans.I（1992）;Lombaert,S.D.,et al.,J.Med.Chem.37:498-511（1994））のバイオ可逆保護の複数の例が含まれるが、そのような「プロドラッグ」誘導化は達成することが困難なことが多く、ペプチド合成には容易には応用できず、Ｆ2Ｐｍｐ種には未だ拡張されていない。マロネート成分はＥＰＳＰ（５−エノールピルボイル−シキメート−３−ホスフェート）合成阻害剤中でのホスフェート構造を模倣し得るというSikorski,et al.,の先の知見に基づいて（Miller,M.J.,et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.4:2605-2608（1994）を参照）、化合物Ｌ−Ｏ−マロニルチロシン（Ｌ−ＯＭＴ）を本発明の方法により設計し合成した。Ｌ−ＯＭＴは、Ｌ−ＯＭＴがプロドラッグ誘導化を受けることができる点でｐＴｙｒを置換するのに使用した従来の化合物を改良するものである。Ｌ−ＯＭＴはｐＴｙｒ残基のホスフェート基をマロネートジカルボン酸構造で置換することによって設計した。前記したように、Ｆ2Ｐｍｐのような先のホスフェートに基づくアナログを上回るＬ−ＯＭＴの利点は、ＯＭＴのカルボン酸ジエステルとしての製造がプロドラッグ保護の一つの有効な手段を与えるということである。ＯＭＴのマロニル構造は、ホスフェート基の代わりに２個のカルボン酸を含み、そしてこのようにして、それは細胞膜を渡る輸送のためにジエステルとして容易に保護することができる。細胞内で、エステルのエステラーゼ仲介切断は、活性ジ酸形態を放出する。
0003929490.tif 000005
本発明はさらに、固相合成によるペプチド中への取り込みのために好適に保護された、上記の式５および６を有するＯＭＴのアナログを提供する。本発明は、実施例６に記載するように、Ｏ，Ｏ−ビス（tert−ブチル）−Ｎ−ＦｍｏｃＯＭＴ式５を使用するペプチド合成が、樹脂からの酸触媒切断中にtert−ブチル基の見せ掛けの除去を生じさせることを実証し、マロネートカルボキシルが遊離の生物学的に活性の酸の形態で存在しているＯＭＴ−ペプチドを提供する。あるいは、tert−ブチルエステルの代わりにｎ−ブチルまたはアルキルエステル（式６の化合物）を使用する固相ペプチド合成は、マロネートジエステル保護を保持する最終ペプチドを生じさせた。このジエステル形態は、ＯＭＴの「プロドラッグ」とみなすことができ、カルボキシル基は中性の形態で存在しており、細胞膜の通過が可能となる。生物学的に活性な遊離酸の形態の遊離が、次いで、細胞内でのエステル官能性のエステラーゼ仲介加水分解によって生じうる。
本発明はまた、本明細書中ではモノフルオロ−ＯＭＴ（ＦＯＭＴ）と命名するＯＭＴのアナログを提供し、その合成は実施例７に記載される。本発明はさらに、ＳＨ２ドメイン阻害ペプチドの合成におけるＬ−ＯＭＴの新規の使用を記載する。本発明のＯＭＴ含有ＳＨ２ドメイン阻害ペプチドを設計し合成する方法は最初に、ＳＨ２結合相互作用においてｐＴｙｒの模倣体として作用し得るホスファターゼ耐性アミノ酸アナログの試験を包含した。最初の試験は、チロシンホスフェートの細胞ＰＴＰｓに対する加水分解的不安定性の知識に基づいていた（Walton,K.M.,et al.,Ann.Rev.Biochem.62:101-120（1993）を参照）。Ｐｍｐは、ホスフェートエステル酸素がメチレンによって置き換えられている、ｐＴｙｒのホスホネートホモログである。固相合成によるペプチドへの取り込みに好適なＰｍｐの保護された形態が開発された（Burke,T.R.,et al.Synthesis 11:1019-1020（1991）;Shoelson,S.E.,et al.,Tetrahedron Lett.32:6061-6064（1991）を参照）。この試薬により製造したマウスポリオーマｍＴ抗原のＴｙｒ−３１５の周辺の配列に対応するＰｍｐ含有ペプチドのＳＨ２阻害効力が次いで試験された。効力の２倍の損失が、対応するｐＴｙｒ含有ペプチド（ＩＤ50＝３．６μＭ）と比較してＰｍｐの保護された形態（ＩＤ50＝７．２μＭ）について観測された（Domchek,S.M.,et al.,Biochemistry 31:9865-9870（1992）を参照）。この測定に基づいて、メチレン架橋の上に１個のフッ素（ＦＰｍｐ）または２個のフッ素（Ｆ2Ｐｍｐ）のいずれかを有するＰｍｐの新規なアナログを設計した（Burke,T.R.,et al.,J.Org.Chem.58:1336-1340（1993）;Burke,T.R.,et al.,Tetrahedron Lett.34:4125-4128（1993）;Otaka,A.,et al.,Tetrahedron Lett.34:7039-7042（1993）;およびSmyth,M.S.,et al.,Tetrahedron Lett.35:551-554（1994）を参照）。フッ素化されたＰｍｐｓの阻害効力は親Ｐｍｐと比較して増強された（Burke,T.R.,et al.,Biochemistry 33:6490-6494（1994）を参照）。Ｆ2Ｐｍｐ含有ペプチドを無傷の細胞で研究した（Xiao,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:21244-21248（1994）;Wange,R.L.,et al.,J.Biol.Chem.,270:944-948（1995）を参照）。フッ素化したＰｍｐ含有ペプチドは細胞膜を通過する能力を有していないために、それらを細胞に導入するためには人工手段が必要とされた。細胞浸透性のこの欠如は再度、薬学的手段および治療剤としてのホスホネートに基づくＳＨ２ドメイン阻害剤の大きな限界を強調する。本発明の実施は、ホスホネートまたはホスフェート部分の代わりにマロネート基を使用する、本明細書中ではＯ−マロニルチロシル（ＯＭＴ）と命名される、ｐＴｙｒの非リンに基づく模倣体を提供することによって、フッ素化したＰｍｐｓを改良するものである。
本発明はさらに、受容体ドメインとホスホチロシル含有リガンドとの結合相互作用に対するＰＴＰまたはＳＨ２阻害効力を示すＯＭＴ−含有ペプチドの製造および使用を提供する。ＰＴＰまたはＳＨ２ドメイン阻害効力を示すペプチドの具体的な例としては、Ｐ１−３キナーゼＣ−末端ｐ８５  ＳＨ２ドメイン、Ｓｒｃ  ＳＨ２ドメイン、Ｇｒｂ  ＳＨ２ドメイン、およびＮ−末端ＳＨ−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメインに対する阻害効力を示すＯＭＴ−含有ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
一般的には、本発明のＳＨ２阻害ペプチドは、固相ペプチド技術および保護されたアナログ（Ｌ）−Ｎα−ｆｍｏｃ−Ｏ’−［（Ｏ”，Ｏ”−（tertブチル）マロニル］チロシンを使用して４個のＳＨ２ドメイン阻害ペプチドの各々にＯＭＴを取り込むことによって製造した（Ye,B.およびBurke,T.R.,Jr.,Tetrahedron Lett.（in review）を参照）。ＯＭＴ−残基は、細胞膜を渡る輸送およびその後の細胞内への一度の活性カルボン酸のエステラーゼ仲介遊離のために中性ジエステル形態で潜在的に保護することができる。実施例８は、以下のＳＨ２ドメインに対する４個のＯＭＴ−含有ペプチドの製造および合成を記載する；ＰＩ−３キナーゼＣ−末端ｐ８５  ＳＨ２ドメイン（Ａｃ−Ｄ−［Ｌ−ＯＭＴ］−Ｖ−Ｐ−Ｍ−Ｌ−アミド；ＩＣ50＝１４．２μＭ（配列番号１））；Ｓｒｃ  ＳＨ２ドメイン（Ａｃ−Ｑ−［Ｌ−ＯＭＴ］−Ｘ−Ｅ−Ｅ−Ｉ−Ｐ−アミド；ＩＣ50＞２００μＭ（配列番号２））；Ｇｒｂ２  ＳＨ２ドメイン（Ａｃ−Ｎ−［Ｌ−ＯＭＴ］−Ｖ−Ｎ−Ｉ−Ｅ−アミド；ＩＣ50＞６００μＭ（配列番号３））およびＮ−末端ＳＨ−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメイン（Ａｃ−Ｌ−Ｎ−［Ｌ−ＯＭＴ］−Ｉ−Ｄ−Ｌ−Ｄ−Ｌ−Ｖ−アミド；ＩＣ50＝２２．０μＭ（配列番号４））。ＳＨ２ドメイン結合分析を４個のペプチドの各々について行い、上記のＩＣ50値を得た。ＩＣ50値は、ＳＨ２ドメイン間の選択性の有意な程度を示し、ＯＭＴ含有ペプチドは、ｐ８５およびＳＨ−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメインに対しては合理的な親和性を有しているが、ＳｒｃおよびＧｒｂ  ＳＨ２ドメインに対しては有していない。ＳＨ２−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメインのＩＣ50値は、対応するＦ2Ｐｍｐ含有ペプチドについて以前に観測されたものと等しい。
表１は、ｐＴｙｒまたはＬ−Ｆ2ＰｍｐのいずれかがＯＭＴ成分の代わりに代替されて以外は、上記に示した４個のＯＭＴ含有ペプチドと同一であるペプチドの阻害率を記載する。値は、ＯＭＴ−ペプチド番号７および８が各々ＳｒｃまたはＧｒｂ２結合分析において本質的に不活性であることを実証する。あるいは、６についての穏やかな親和力が、ｐ８５ＳＨ２ドメインに対して示されるが（ＩＣ50＝１４．２μＭ）、効力は、対応するｐＴｙｒ−ペプチド（ＩＣ50＝０．１５μＭ）またはＬ−Ｆ2Ｐｍｐ−ペプチド（ＩＣ50＝０．１７μＭ）と比較して、有意に減少している（Burke,T.R.,Jr.,et al.,Biochemistry 33:6490-6494（1994）を参照）。
表１はまた、ＳＨ２−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメインに対するＯＭＴ−ペプチド番号９の効力を示す。絶対値の阻害（ＩＣ50＝２２μＭ）は、ｐ８５指向Ｌ−ＯＭＴペプチド番号６について見られたものと同一のオーダーであり、この最後の例ではＬ−ＯＭＴペプチドはｐＴｙｒまたはＦ2Ｐｍｐペプチドのいずれかと比較して２００倍の効力の損失を受けた。一方、ＳＨ−ＰＴＰ２：ペプチド番号９は、対応するＬ−Ｆ2Ｐｍｐペプチド（ＩＣ50＝２３μＭ）と比較して効力の損失を示さない（Xiao,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:21244-21248（1994）を参照）。Ｌ−Ｆ2Ｐｍｐペプチドがラット１線維芽細胞においてＳＨ−ＰＴＰ２仲介分裂促進シグナルをブロックする能力が以前に実証されているので（Xiao,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:21244-21248（1994）を参照）、これは重要であるが、Ｌ−ＯＭＴペプチド番号９もまた細胞分析において測定可能な効果を誘発するのに十分な効力を有しているかもしれないことが示唆される。
本発明のＯＭＴ残基のＳＨ２ドメインの相互作用を、分子モデル研究を使用して天然のｐＴｙｒファルマコフォアのものと比較した（実施例２および図１Ａおよび１Ｂを参照）。ホスフェートおよびマロネートの構造は化学的に大きく相違し、マロネート基はホスフェーとより約１８％大きい容積を占めるけれども（図１Ａおよび図１Ｂを参照）、それらのＳＨ２ドメインとの相互作用はかなり類似しており、両方の構造はほぼ同一のＳＨ２ドメイン形状を維持しながら達成することができ、ＯＭＴはｐＴｙｒ残基と同様の様式でＳＨ２ドメインに結合することができることが示される。
異なるＳＨ２ドメインに対して向けられたＯＭＴペプチドの結合効力において観測された相違は、ＯＭＴ残基が各々のＳＨ２ドメインのｐＴｙｒポケットにおいて異なって結合していることを示しているのかもしれない。効力の相違もまたペプチドリガンドの結合の全体の様式におけるより大きな相違を反映しているのかもしれない。例えば、ＳｒｃファミリーのＳＨ２ドメインへのｐＴｙｒペプチドの結合は、ＳＨ２ドメインとｐＴｙｒとの間の明白な「二股の」相互作用と、ｐＴｙｒ残基に対してＣ末端の第２の疎水ポケットに位置した３残基を使用することが示されている。全体のペプチド−ＳＨ２ドメイン相互作用に対するｐＴｙｒ結合の高い寄与は、ｐＴｙｒ模倣体によって生じる効力の何らかの損失を増幅していることが予測できた。あるいは、ＳＨ−ＰＴＰ２のようなＳＨ２ドメインはより拡大した領域に渡って分布したペプチド−ＳＨ２ドメイン結合相互作用を示すように思われる。ペプチドリガンドの全結合に対するｐＴｙｒ結合の寄与はあまり重要ではないかもしれないので、ｐＴｙｒ結合部位での親和性の損失はより耐えられるかもしれず、効力のより高い保持はｐＴｙｒ模倣体を使用するペプチドについて観察されるかもしれない。
特異性はＳＨ２ドメイン阻害剤の開発において望ましい属性である。ＳＨ２ドメインに応じて、ｐＴｙｒ模倣体Ｆ2Ｐｍｐ３を有するペプチドは、親のｐＴｙｒ保有ペプチドと比較して増強または減少した効力を示すことができることが以前に報告されている（Burke,T.R.,Jr.,et al.,Biochemistry 33:6490-6494（1994）を参照）。これは、選択性の測定がｐＴｙｒ部位における結合の相違によって達成されることを示している。
ＳＨ２ドメイン阻害剤の第２の望ましい特徴は生物学的利用能である。細胞膜を通過する本発明のジエステル保護されたＯ−マロニルチロシル化合物含有ペプチドのプロドラッグ輸送は、細胞浸透可能な阻害剤の開発に大きく貢献するであろう。
実施例
本書中の実施例は本発明の実施の多様な態様を例示することを意味するものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定することは意図しない。
実施例１
ペプチド合成
チロシンホスフェート模倣アミノ酸Ｘ＝Ｌ−ＯＭＴを、Ｆｍｏｃ化学による固相合成を使用して、ＥＧＦＲセグメント、Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−Ｘ−Ｌ中に取り込んだ。アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌ−ＯＭＴ（tert−ブチル）2−ＯＨを公開された方法により合成した（Ye,B.およびBurke,T.R.,Jr.,Tetrahedron Lett.（in review））。ペプチドを、ＰＡＬ樹脂（Albericio,F.,et al.,J.Org.Chem.55:3730-3743（1990））、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢＴ結合試薬、およびＦｍｏｃ脱保護用の２０％ピペリジン／ＤＭＦを使用して製造した。樹脂に結合した保護されたペプチドを１０％の１−アセチルイミダゾール／ＤＭＦによりアセチル化した。ペプチドＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｅ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｌ−アミドを、樹脂からの同時切断、並びにエタンジチオール、ｍ−クレゾール、チオアニソールおよび水を各々５％（Ｖ／Ｖ）含有するＴＦＡによる脱保護によって一工程で得た。ペプチドを以下の条件下で逆相ＨＰＬＣによって精製した：ＶｙｄａｃＣ18カラム（１０×２５０ｍｍ）；溶媒勾配：Ａ：Ｈ2Ｏ中０．０５％ＴＦＡ、Ｂ：Ｈ2Ｏ中９０％アセトニトリル中０．５％ＴＦＡ、勾配（Ｂ％）：１０−５５％３０分：流速：２．５ｍＬ／分；ＵＶ検出器：２２０ｎｍ；保持時間：１４．５分。ＦＡＢＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＋８６８．３（計算値８６８．３）。アミノ酸分析：Ａｓｐ（１．９８）、Ｇｌｕ（１．００），Ａｌａ（１．０１），Ｌｅｕ（１．０２）；ＯＭＴはこの分析では測定できなかった。
実施例２
分子モデリング
ＰＴＰ１Ｂ酵素の触媒部位内に複合したジフルオロメチルホスホネート基〔ＨＣＦ2ＰＯ（Ｏ−）2〕およびマロネート基〔ＣＨ2（ＣＯ2−）2〕の構造（各々、図２Ａおよび２Ｂ）をＧＡＵＳＳＩＡＮ９２（ＧＡＵＳＳＩＡＮ９２、Gaussian Inc.,Carnegie Office Park,Building 6,Pittsburgh,PA 15106）を使用するＣＯＮＶＥＸメインフレームコンピューター上に設定した３−２１Ｇベーシスを使用する最初（ab initio）法によって最小化した。結合部位の形状およびホスホネートの結合様式は、ＰＴＰ１Ｂ触媒部位内に結合したジフルオロホスホネート含有阻害剤のＸ線結晶グラフィックデータから得た。ジフルオロメチルホスホネート−酵素複合体の最小化の間に、結合部位の形状をＸ線構造に対して固定し、形状パラメーターおよびホスホネートの位置を最適化した。図２Ａおよび２Ｂは、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）触媒部位内に結合したＨＣＦ2ＰＯ（Ｏ−）2（図２Ａ）およびＣＨ2（ＣＯ2−）2（図２Ｂ）のエネルギー最小構造を記載する。ホスホネートの最小化形状を図２Ａに示す。マロネート構造を有するＰＴＰ１Ｂの複合体を最小化する際に、マロネートの形状パラメーターおよび位置を最適化したのみならず、最初の５０時間のＣＰＵ時間の間の結合部位内の酵素構造の形状もまた最適化した。最小化したマロネート複合体を図２Ｂに示す。結合の全体の形状はＰＴＰ−１Ｂに複合化したアリールジフルオロホスホネート阻害剤のＸ線構造に基づいた。
実施例３
組織培養細胞株
ヒトインスリン受容体を過剰発現する以下の細胞株のいずれかを、組み換えＰＴＰ１Ｂによるインスリン受容体脱リン酸化の分析のために使用することができる：
（１）Ｌ６：ラット骨格筋ミオブラスト（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１４５８の下ＡＴＣＣから得ることができる）；および
（２）ＨＥＰＧ２：ヒト肝細胞性癌腫（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８０６５の下ＡＴＣＣから得ることができる）
細胞を１０％牛胎児血清を含有するＦ−１２培地中で維持し、集密になるまで培養した。
実施例４
部分精製したヒトインスリン受容体の調製
ヒトインスリン受容体を過剰発現する培養細胞からの膜を、本質的にLiotta et al.（Liotta,A.S.,et al.,J.Biol.Chem.269:22996-23001（1994））に記載されるようにして、単離してＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で可溶化した。簡単に述べると、細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２５Ｍのスクロース、５ｍＭのＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．２ｍＭのフェニルメチルスルホニフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する等張性ホモジネーション緩衝液中で皿から剥がし、３００×ｇで１０分間遠心することによってペレットにした。細胞ペレットをホモジネーション緩衝液に再懸濁し（４３×１０6細胞／ｍｌ）、ポリトロンホモジナイザー（Brinkman）を使用して、各回１５秒間で７の設定で２回ホモジナイズした。ホモジネートを４℃で２０分間１２，０００×ｇで遠心し、核酸、破片およびミトコンドリアを含むペレットを廃棄した。上清を４℃で６０分間１００，０００×ｇで遠心し、得られた粗製膜ペレットを洗浄し−７０℃で凍結した。必要時に、膜ペレットを、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２５Ｍのスクロース、２０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、０．２ｍＭのＰＭＳＦ、および１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ｗ／ｖ）を含有する可溶化緩衝液中に再懸濁した（３〜５ｍｇタンパク質／ｍＬ可溶化緩衝液）。時々攪拌しながら氷上で３０分間インキュベーションした後、混合物を４℃で６０分間１００，０００×ｇで遠心し、不溶性物質を廃棄した。可溶化した膜から精製したインスリン受容体が、Brillon et al.（Brillon,D.J.,et al.,Endocrinology 123:1837-1847（1988））の方法に従って、小麦胚アグルチン（ＷＧＡ）（Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CAから入手）カラムを通過させた後に得られた。精製した受容体を含有するＷＧＡ溶出物を１００μｌのアリコートに分割し、−７０℃で保存した。
実施例５
組み換えＰＴＰ１Ｂによるインスリン受容体脱リン酸化の分析
ＷＧＡ精製ヒトインスリン受容体を以前に記載されているように〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰで自己リン酸化し（Liotta A.S.,et al.,J.Biol.Chem.269:22996-23001（1994））、この32Ｐ−標識インスリン受容体を、本質的にBurke et al.により記載された方法（Burke,T.R.JR.,Biochem.Biophys.Res.Commun.204:129-134（1994））に従って、ＰＴＰ−１Ｂ活性の分析用の基質として使用した。簡単に言うと、32Ｐ−標識した自己リン酸化したインスリン受容体（１０μｇ／ｍｌ）を、指示した濃度の各種ペプチドの不在または存在下において、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１００μｌの反応液中で２２℃で０．５μｇ／ｍｌの組み換えＰＴＰ１Ｂとともにインキュベートした。分析は、１容量の２倍濃度のLaemmliサンプル緩衝液（３６）を含むチューブに反応混合物のアリコートを移すことによって様々な間隔で停止させた；サンプルを９５℃で５分間加熱し、還元条件下で７．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。９５ｋＤａのインスリン受容体β−サブユニット中に残存する32Ｐを、固定かつ乾燥したゲルのBetagenカウンティングによって定量した。
実施例６
モノフルオロ−ＯＭＴの調製
モノフルオロ−ＯＭＴ（ＦＯＭＴ）（式番号１３）、ＯＭＴの誘導体、を式番号１１から調製したが、エレクトロフィリック（electrophilic）フッ素化によって式番号１２を得て、これを次いで脱メチルすることによって、式番号１３を得た。
0003929490.tif 000006
実施例７
Ｏ，Ｏ−ビス（tert−ブチル）−Ｎ−Ｆｍｏｃ  ＯＭＴ（式番号５）の合成を以前に報告された合成法を使用する下記の反応図に記載する。ロジウムジアセテートの存在下におけるジアゾジ−tertブチルマロネート（式番号１０）による既知化合物（式番号９）の反応から出発して、式番号１１の保護されたＯＭＴ誘導体を得た。メチルエステルの加水分解によって所望の式５を得た。
0003929490.tif 000007
式番号６のｎ−ブチルまたはアルキルジエステルは、対応するジアゾジ−（ｎ−ブチル）マロネート（またはジアルキルエステル）およびＮα−ｆｍｏｃチロシネートtert−ブチルエステルを使用して、後にＴＰＡによる処理を行うことによって上記のように調製することができる。あるいは、化合物１１を酸（トリフルオロ酢酸）で処理してtert−ブチル基を加水分解して、次いで所望のエステル基で再エステル化することができる。ＬｉＯＨによるＯＭｅエステルの選択的加水分解は次いで、式番号６の最終生成物を与えるであろう。
実施例８
ＳＨ２ドメイン阻害ペプチドの調製
Ｌ−Ｏ−マロニルチロシル（Ｌ−ＯＭＴ４）、リン不含有ｐＴｙｒ模倣体を、固相ペプチド技術および保護されたアナログ（Ｌ）−Ｎα−ｆｍｏｃ−Ｏ’−〔（Ｏ”，Ｏ”−tert−ブチル）マロニル〕チロシンを使用して、ＳＨ２ドメイン阻害ペプチド中に取り込んだ（Ye,B.E.およびBurke,T.R.,Jr.,Tetrahedron Lett.（in review））。
これらのペプチドの配列は、所望のＳＨ２ドメイン構築物に対して高い親和性を示すことが以前に示されているｐＴｙｒおよびＦ2Ｐｍｐ含有ペプチドと同一である（Burke,T.R.,Jr.,et al.,Biochemistry 33:6490-6494（1994）;およびSmyth,M.S.,et al.,Tetrahedron Lett.33:4137-4140（1992）を参照）。
Ａ．Ｐ１−３キナーゼＣ−末端ｐ８５ＳＨ２ドメインに対するペプチドＡｃ−Ａｓｐ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−アミド（配列番号１）の調製
ＳＨ２ドメインに対する阻害効力を示すＯＭＴ−含有ペプチドを、ＰＩ３キナーゼｐ８５Ｃ末端ＳＨ２ドメインの阻害のためにＰＤＧＦ受容体のＴｙｒ７５１から誘導し（Piccione,E.,et al.,Biochemistry 32:3197-3202（1993）を参照）、ジ−tert−ブチル保護したＦｍｏｃ−ＯＭＴを使用する固相ペプチド技術によってｐＴｙｒ模倣体Ｌ−Ｏ−マロニルチロシン（Ｌ−ＯＭＴ）をペプチドＡｃ−Ａｓｐ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−アミド中に導入することによって合成した。
競合分析を行って、高い親和性のホスホペプチドリガンドに対するペプチドの相対ＳＨ２ドメイン親和性を、実施例９に記載するようにして測定した。表１はｐ１−３キナーゼＣ−末端ｐ８５ＳＨ２ドメイン構築物に対するペプチドＡｃ−Ａｓｐ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕一Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−アミド（ペプチド番号６）の阻害率を記載する。表１にはまた、Ｌ−ＯＭＴ成分の代わりに置換したｐＴｙｒまたはＬ−Ｆ2Ｐｍｐのいずれかを有する同一ペプチドの阻害率も示される。
Ｂ．Ｓｒｃ  ＳＨ２ドメインに対するペプチドＡｃ−Ｇｌｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−アミド（配列番号２）の調製
ペプチドＡｃ−Ｇｌｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−アミドをＳｒｃ  ＳＨ２ドメインの阻害のためにハムスターポリオーマウイルスミドルＴ抗原のＴｙｒ３２４から誘導した（Payne,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4902-4906（1993）;およびSongyang,Z.,et al.,Cell72:767-778（1993）を参照）。競合分析を行って、高い親和性のホスホペプチドリガンドに対するペプチドの相対ＳＨ２ドメイン親和性を、実施例９に記載するようにして測定した。表１はＳｒｃ  ＳＨ２ドメイン構築物に対するペプチドＡｃ−Ｇｌｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−アミド（ペプチド番号７）の阻害率を記載する。表１にはまた、Ｌ−ＯＭＴ成分の代わりに置換したｐＴｙｒまたはＬ−Ｆ2Ｐｍｐのいずれかを有する同一ペプチドの阻害率も示される。
Ｃ．Ｇｒｂ２  ＳＨ２ドメインに対するペプチドＡｃ−Ａｓｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−アミド（配列番号３）の調製
ペプチドＡｃ−Ａｓｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−アミドをＧｒｂ２  ＳＨ２ドメインの阻害のためにＩＲＳ−１のＴｙｒ８９５から誘導した（Sun,S.J.,et al.,Mol.Cell.Biol.13:7428-7428（1993）を参照）。競合分析を行って、高い親和性のホスホペプチドリガンドに対するペプチドの相対ＳＨ２ドメイン親和性を、実施例９に記載するようにして測定した。表１はＧｒｂ２  ＳＨ２ドメイン構築物に対するペプチドＡｃ−Ａｓｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−アミド（ペプチド番号８）の阻害率を記載する。表１にはまた、Ｌ−ＯＭＴ成分の代わりに置換したｐＴｙｒまたはＬ−Ｆ2Ｐｍｐのいずれかを有する同一ペプチドの阻害率も示される。
Ｄ．ＳＨ−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメインに対するペプチドＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−アミド（配列番号４）の調製
ペプチドＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−アミドをＳＨ−ＰＴＰ２（Ｓｙｐとしても既知）Ｎ−末端ＳＨ２ドメインの阻害のためにＩＲＳ−１のＴｙｒ１１７２から誘導した（Sun,S.J.,et al.,Mo1.Cell.Biol.13:7428-7428（1993）を参照）。競合分析を行って、高い親和性のホスホペプチドリガンドに対するペプチドの相対ＳＨ２ドメイン親和性を、実施例９に記載するようにして測定した。表１はＳＨ−ＰＴＰ２  ＳＨ２ドメイン構築物に対するペプチドＡｃ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｉｌｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−アミド（ペプチド番号９）の阻害率を記載する。表１にはまた、Ｌ−ＯＭＴ成分の代わりに置換したｐＴｙｒまたはＬ−Ｆ2Ｐｍｐのいずれかを有する同一ペプチドの阻害率も示される。
0003929490.tif 000008
ａ  指示した場所以外は、阻害率は以前に報告されている（Burke,et al.,Biochemistry 33:6490-6494（1994）を参照）。
ｂ  以前に報告されている（Xiao,S.,et al.,J.Biol.Chem.269:21244-21248（1994）を参照）。
実施例９
ＳＨ２ドメイン結合分析
ＳＨ２ドメイン競合分析の詳細は、Piccione,E.,et al.,Biochemistry 32:3197-3202（1993）に記載されている。簡単に言うと、４個の異なる分析を使用して、高い親和性ホスホペプチドリガンドに対するｐＴｙｒアナログの相対ＳＨ２ドメイン親和性を測定した。各分析において、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）／ＳＨ２ドメイン融合タンパク質を適当な高親和性〔125Ｉ〕ボルトン・ハンター放射標識ホスホペプチドと対にし、様々な濃度の未標識ペプチドを競合物質として添加した。ＰＩ  ３−キナーゼｐ８５のＣ−末端ＳＨ２ドメインをＩＲＳ−１ｐＹ６２８、ＧＮＧＤｐＹＭＰＭＳＰＫ（配列番号５）（Piccione,E.,et al.,Biochemistry 32:3197-3202（1993）を参照）と対にし、Ｓｒｃ  ＳＨ２ドメインをｈｍＴｐＹ３２４  ＫＥＰＱｐＹＥＥＩＰＩＹＬ（配列番号６）（Payne,G.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4902-4906（1993）を参照）と対にし、ＰＬＣγ−Ｃ  ＳＨ２ドメインをＰＤＧＦｐＹ１０２１、ＤＮＤｐＹＩＩＰＬＰＤＰＫ（配列番号７）（Piccione,E.,et al.,Biochemistry 32:3197-3202（1993）を参照）と対にし、そしてＬｃｋ  ＳＨ２ドメインをＳｒｃ  ＳＨ２ドメインについて行った分析と同様にｈｍＴｐＹ３２４配列と対にした。下線は、〔125Ｉ〕ボルトン・ハンター修飾リジンの位置を示す。ＧＳＴ／ＳＨ２ドメイン融合タンパク質（０．１−１．０μＭ、ブラッドフォード分析で測定）、３５ｆｍｏｌのＨＰＬＣ精製〔125Ｉ〕ボルトン・ハンター処理ホスホペプチド（６７ｎＣｉ）、および各種濃度のｐＴｙｒアナログを、全量２００μｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のウシ血清アルブミン、１０ｍＭのジチオトレイトール（ｐＨ７．４）中で混合し、ボルテックスした。グルタチオン−アガロース（１：４水性スラリーの２５μｌ、Molecular Probes）を添加し、サンプルを常に混合しながら２２℃で一晩インキュベートした。１２，０００ｇで５分間遠心した後、上清溶液を吸引によって除去し、未洗浄のペレットに付随する〔125Ｉ〕放射活性をγ−カウンターで測定した。
実施例１０
分子モデリング研究
本発明のＯＭＴ残基のＳＨ２ドメイン相互作用を天然のｐＴｙｒファルマコフォアのものとを比較するために、分子モデリング研究を、ｐ５６lckＳＨ２ドメインに結合した高親和性ｐＴｙｒペプチドの以前に報告されたＸ線構造を使用して行った。図１Ａおよび１Ｂは、Ｐ５６lckＳＨ２ドメインに対する（Ａ）アリールホスフェートおよび（Ｂ）アリールマロネートファルマコフォアの構造および相対結合部位を記載する。このＳＨ２ドメイン内のｐＴｙｒフェニルホスフェートファルマコフォアの複合化を図１Ａに示す。対応するＯＭＴファルマコフォアの結合を図１Ｂに示す。ホスフェートおよびマロネート酸素原子には影が付けられている。図１Ａの構造は、ＳＨ２ドメイン内のｐＴｙｒフェニルホスフェートファルマコフォアの複合化を示し、結合した高親和性ｐＴｙｒペプチドの以前に報告されたＸ線構造から誘導された一方（Eck,M.J.,et al.Nature 362:87-91（1993）を参照）、対応するＯＭＴファルマコフォアの結合を示す、図１Ｂの構造は本明細書中に記載したような分子モデリングによって得た。ホスフェートおよびマロネートの構造は化学的に大きく異なるけれども、マロネート基はホスフェートよりも約１８％大きい容積を占め、それらのＳＨ２ドメインとの相互作用はかなり類似しており、両方の構造はほぼ同一のＳＨ２ドメイン形状を維持しながら達成することができる。
実施例１１
ペプチドＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−ＯＭＴ−Ｌ−アミド（配列番号８）の調製およびＰＴＢ−１Ｂに対する試験
ペプチドＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−ＯＭＴ−Ｌ−アミド（配列番号８）を、ジ−tert−ブチル保護Ｆｍｏｃ−ＯＭＴ２を使用する固相ペプチド技術によって調製した。
ペプチドＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−ＯＭＴ−Ｌ−アミド（配列番号８）を次いでリン酸化したインスリン受容体のＰＴＢ−１Ｂ脱リン酸化に対する阻害効力について試験した。簡単に言うと、このアッセイは以下のようにして行った：32Ｐ標識自己リン酸化インスリン受容体を、各種の濃度でＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−ＯＭＴ−Ｌ−アミド（配列番号８）の不在または存在下において、組み換えＰＴＰ−１Ｂとともにインキュベートした。アッセイは異なる間隔で停止し、還元条件下で７．５％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動によって試験した。９５ｋＤａインスリン受容体β−サブユニット中に残存する32Ｐを、固定し乾燥したゲルのBetagenカウンティングによって定量した。同一条件下で、Ｆ2Ｐｍｐ含有ペプチドおよびＰｍｐ含有ペプチドは、各々１００ｎＭおよび２００μＭの阻害率を示した（Burke,et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.204:129-134（1994）を参照）。ペプチドＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−ＯＭＴ−Ｌ−アミド（配列番号８）は約１０μＭの阻害率を示した。
32Ｐ−標識無傷インスリン受容体を基質として使用するＰＴＰ１Ｂ触媒インスリン受容体脱リン酸化に対するＯＭＴペプチドＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−〔Ｌ−ＯＭＴ〕−Ｌ−アミド（配列番号８）の作用を図３に示す。
同様の実験のセットを、ペプチドＡｃ−Ｄ−Ａ−Ｄ−Ｅ−〔Ｌ−ＦＭＯＴ〕−Ｌ−アミド（配列番号８）を使用して行った。図４にグラフにより示されるように、１μＭのＩＣ50値が得られた。
引用文献
1.  Albericio,F.,Kneib-Cordonier,N.,Bianacalana,S.,Gera,L.,Masada,R.I.,Hudson D.およびBarany,G.（1990）,J.Org.Chem.55,3730-3743.
2.  Barford,D.,Flint,A.J.およびTonks,N.K.（1994）Science 263,1397-1404.
3.  Berggren,M.M.,;Burns,L.A.;Abraham,R.T.;Powis,G.抗腫瘍剤硝酸ガリウムによるタンパク質チロシンホスファターゼの阻害、Cancer Res 1993,53,1862-1866.
4.  Blackburn,G.M.,生物学的ホスフェートのアナログとしてのホスホネート、Chem.Ind.（London）1981,134-138.
5.  Brillon,D.J.,Henry,R.r.,Klein,H.H.,Olefsky,J.M.およびFreideberg,g.R.（1988）.
6.  Brugge,J.S.,治療的薬物設計のための新規な細胞内標的、Science 1993,260:918-919.
7.  Brunton,V.G.;Workman,P.;抗腫瘍薬物開発のための細胞シグナル標的、Cancer Chemother Pharmacal 1993,32,1-19.
8.  Burke,T.R.,Jr.タンパク質−チロシンキナーゼ阻害剤、Drugs of the Future 1992,17,119-131.
9.  Burke,T.R.,Jr.:Kole,H.K.;Roller,P.P.ホスホチロシル模倣体Ｆ２Ｐｍｐを含有するヘキサマーペプチドによるインスリン受容体脱リン酸化の潜在的阻害、Biochem.Biophys.Res.Commun.1994,204,129-134.
10.  Burke,T.R.,Jr.;Lim,B.B.ペプチド合成における使用のために好適に保護されたホスホノアルキルフェニルアラニン化合物、米国特許５，２００，５４６号、１９９３年４月１６日（１９９１年９月３０日出願）、1993,
11.  Burke,T.R.,Jr.;Nomizu,M.:Otaka,A.;Smyth,M.S.;Roller,P.P.;Case,R.D.;Wolf,G.;Shoelson,S.E.ホスファチジルイノシトール３−キナーゼｐ８５ＳＨ２ドメイン結合の環状ペプチド阻害剤、Biochem.Biophys.Res.Commun.1994,201,1148-1153.
12.  Burke,T.R.,Jr.;Russ,P.:Lim,B.（1991）Synthesis 11,1019-1020
13.  Burke,T.R.,Jr.;Russ,P.:Lim,B.４−［ビス（tert−ブチル）ホスホノメチル］−Ｎ−Ｆｍｏｃ−ＤＬ−フェニルアラニン；ペプチド合成のために潜在的に好適なＯ−ホスホチロシンの加水分解安定アナログの製造、Synthesis 1991,11,1019-1020.
14.  Burke,T.R.,Jr.,;Smyth,M.;Nomizu,M.;Otaka,A.;Roller,P.P.Ｏ−ホスホチロシンンの加水分解安定アナログを含有するペプチドの固相合成のために好適に保護されたフルオロ−およびヒドロキシ−４−ホスホノメチル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンの製造、J.Org.Chem.1993,58,1336-1340.
15.  Burke,T.R.,Jr.,;Smyth,M.;Nomizu,M.;Otaka,A.;Roller,P.O.（1993）J.Org.Chem.58,1336-1340.
16.  Burke,T.R.,Jr.,;Smyth,M.S.;Otaka,A.;Nomizu,M.;Roller,P.P.;Wolf,G.;Case,R.;Shoelson,S.E.ホスファターゼ耐性ＳＨ２ドメイン阻害剤の製造のための加水分解不能なホスホチロシル模倣体、Biochemistry 1994,33,6490-6494.
17.  この研究の予備的開示が存在する：Burke,T.R.,Jr.,Ye.,B.,Akamatsu,M.,Yan,X.,Kole,H.K.,Wolf,G.,Shoelson,S.E.およびRoller,P.O.209th国立アメリカ化学学会、アナハイム、ＣＡ（1995）MEDI 14
18.  Burke,T.R.:Kole,H.K.;Roller,P.O.（1994）Biochem.Biophys.Res.Commun.204,129-134.
19.  Burke,T.R.,;Smyth,M.S.;Otaka,A.;Roller,P.O.（1993）Tetrahedron Lett.34:4125-4128.
20.  Burke,T.R.;Smyth,M.S.;Otaka,A.;Roller,P.P.加水分解不能なホスホチロシルペプチドアナログの固相合成のために好適に保護された４−ホスホノ（ジフルオロメチル）−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンおよびＮ−ＢｏｃおよびＮ−Ｆｍｏｃ誘導体の合成、Tetrahedron Lett. 1993,34,4125-4128.
21.  Cantley,L.C.,;Auger,K.R.;Carpenter,C.;Duckworth,B.;Granziani,A.:Kapeller,R.;Soltoff,S.癌遺伝子およびシグナル伝達、Cell 1991,64,281-302.
22.  Chatterjee,S.;Goldstein,B.J.,Csermerly,P.;Shoelson,S.E.タンパク質−チロシンホスファターゼのホスホペプチド基質およびホスホペプチド阻害剤:in Peptides:Chemistry and Biology,J.E.RivierおよびJ.A.Smith,編者、1992,Escom Science Publishers:Leiden,Netherlabd,p.553-555.
23.  Corey,S.D.;Pansegrau,P.D.;Walker,M.C;Sikorski.J.A.ＥＰＳＰシンターゼ阻害剤設計ＩＩＩ、３−ホスフェート模倣体としてマロネートエーテルを取り込むＥＰＳＰの新規５−オキサミン酸アナログの合成および評価、Bioorg.Med.Chem.Lett.1993,3,2857-2862.
24.  Diamond,R.H.,Cressman,D.E.,Lax,T.M.,Abraham,C.S.およびTaub,R.（1994）Mol.Cell.Biol.14,3752-3762.
25.  Domchec,S.M.,;Auger,K.R.;Chatterjee,S.;Burke,T.R.;Shoelson,S.E.加水分解不能なホスホノペプチドによるＳＨ２ドメイン／ホスホタンパク質会合の阻害、Biochemistry 1992,31,9865-9870.
26.  Engel,R.生体系中のホスホネートの役割における、抗代謝物としてのホスホン酸およびホスホネート、R.L.Hilderbrand編者、1983,CRC Press,Inc:Boca Raton,F1.p.97-138.
27.  Errasfa,M.;Stern,A.メリチンおよびＣａ2+イオノフォアＡ２３１８７によるＨＥＲ１４細胞におけるタンパク質チロシンホスファターゼ活性の阻害、Eru J.Pharmacal 1993,247:73-80.
28.  Fantl,.J.;Escobedo,J.A.;Martin,G.A.;Turck,C.W.;Delrosario,M.:Mccormick,F.;Williams,L.T.成長因子受容体上の別個のホスホチロシンが異なるシグナル経路を仲介する特異的分子に結合する、Cell 1992,69,413-423;
29.  Fantl,W.J.;Johnson,D.E.;Williams,L.T.受容体チロシンキナーゼによるシグナル、Annu.Rev.Biochem.,1993,453-481.
30.  Farquhar,D.,Chen,R.およびKhan,S.（1995）J.Med.Chem.38,488-495.
31.  Freeman,S.,Irwin,W.J.,Mitchell,A.G.,Nicholls,D.およびThomson,W.（1991）J.Chem.Soc.Chem.Commun.875-877.
32.  Freeman,S.;Irwin,W.J.;Mitchell,A.G.;Nicholls,D.;Thomson,W.ホスホ基のためのバイオ可逆保護：ジ（４−アセトキシベンジル）メチルホスホネートのカルボキシエステラーゼによる化学安定性およびバイオ活性化、J.Chem.Soc.Chem.Commun.1991,875-877.
33.  Fry,M.J.;Panayotou,G.;Booker,G.W.;Waterfield,M.D.タンパク質−チロシンキナーゼ受容体シグナル複合体への新規な洞察、Protein Sci.1993,2,1785-1797.
34.  GAUSSIAN 92,Gaussian,Inc.,Carnegie Office Park, Building 6,Pittsburgh,PA 15106.
35.  Ghosh,J.;Miller,R.A.スラミン、実験的化学療法薬はインビトロでＴ細胞ＣＤ４５−タンパク質チロシンホスファターゼを不可逆的にブロックする、Biochem Biophys Res Commun 1993,194,36-44.
36.  Igarashi,K.,David,M.,Larner,A.C.およびFinbloom,D.S.（1993）Mol.Cell.Biol.13,3984-3989.
37.  Igarashi,K.;David,M.;Larner,A.C.;Finbloom,D.S.ガンマインターフェロンによる転写因子のインビトロ活性化は膜関連チロシンキナーゼを必要とし、バナジウム酸塩によって模倣される、Mol.Cell.Biol.1993,13,3984-3989.
38.  Imoto,M.;Kekeya,H.;Sawa,T.;Hayashi,C.;Hamada,M.;Takeuchi,T.;Umezawa,K.デフォスタチン、Streptomycesによって産生される新規タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤  .1.タキソノミー、単離、および同定、J.Antibiot 1993,46,1342-1346.
39.  Iyer,R.P.;Phillips,L.R.;Biddle,J.A.;Thakker,D.R.;Egan,W.;Aoki,S.;Mitsuya,H.抗ウイルス性ホスホノギ酸三ナトリウム（Foscarnetナトリウム）の有効プロドラッグとしてのアシルオキシアルキルアシルホスホネートの合成、Tetrahedron Letters 1989,30,7141-7144.
40.  Koretzky,G.A.（1993）FASEB J.7,420-426.
41.  Koretzky,G.A.免疫系におけるシグナル伝達におけるＣＤ４５チロシンホスファターゼの役割、FASEB J.1993,7,420-426.
42.  Kusari,J.,Kenner,K.A.,Suh,K.I.,Hill,D.E.およびHenry,R.R.（1994）J.Clin.Invest.93,1156-1162.
43.  Liotta,A.S.,Kole,H.K.,Fales,H.M.,Roth,J.およびBernier,M.（1994）J.Biol.Chem.269,22996-23001.
44.  Lombaert,S.D.,Erion,M.D.,Tan,J.,Blanchard,L.,El-Chehabi,L.,Ghari,R.D.,Sakane,Y.,Berry,C.およびTrapani,A.J.（1994）J.Med.Chem.37,498-511.
45.  Lombaert,S.D.;Erion,M.D.,Tan,J.;Blanchard,L.;El-Chehabi,L.;Ghari,R.D.;Sakane,Y.;Berry,C.;Trapani,A.J.Ｎ−ホスホノメチルジペプチドおよびそれらのホスホネートプロドラッグ、中性エンドペプチダーゼ（NEP,EC 3.4.24.11）の新規生成、J.Med.Chem.1994,37,498-511.
46.  Margolis,B.ＳＨ２ドメインを有するタンパク質−チロシンキナーゼシグナル経路におけるトランスデューサー、Cell.Growth Differ.1992,3,73-80.
47.  Marzabadi,M.R.;Font,J.L.;Gruys,K.J.;Pansegrau,P.D.;Sikorski,J.A.シキメート−３−ホスフェートおよびグリホスフェートを有する３成分複合体に基づく新規ＥＰＳＰ合成阻害剤の設計および合成、Bioorg.Med.Chem.Lett.1992,2,1435-40.
48.  McGuigan,C.,Pathirana,R.N.,Mahmood,N.およびHay,A.J.（1992）Bioorg.Med.Chem.Lett.2,701-704.
49.  Miller,M.J.;Anderson,K.S.;Braccolino,D.S.;Cleary,D.G.;Gruys,K.J.;Han,C.Y.;Lin,K.C.;Pansegrau,P.D.;Ream,J.E.;Sikorski,R.D.S.J.A.ＥＰＳＰシンターゼ阻害剤設計ＩＩ、シキメート−３−ホスフェート部位でのリガンド結合のための３−ホスフェート基の重要性および新規３−ホスフェート模倣体としての３−マロネートエーテルの同定、Bioorg.Med.Chem.Lett.1993,7,1435-1440.
50.  リード文献としては以下を参照：Miller,M.J.,Braccolino,D.S.,Cleary,D.G.,Ream,J.E.,Walker,M.C.およびSikorski,J.A.（1994）Bioorg.Med.Chem.Lett.4,2605-2608.
51.  Miresluis,A.R.;Thorpe,R.,（1991）J.Biol.Chem.266,18113-18118.
52.  Miresluis,A.R.;Thorpe,R.インターロイキン−４増殖シグナル伝達はチロシン特異的ホスファターゼの活性化および８０ｋＤａタンパク質の脱リン酸化を包含する、J.Biol.Chem 1991,266,18113-18118.
53.  Mitchell,A.G.,Thomson,W.;Nicholls,D.;Irwin,W.J.;Freeman,S.ホスホ基のバイオ可逆保護：メチルホスホネートおよびホスホノアセテートのジ（４−アシルオキシベンジル）およびモノ（４−ジアシルオキシベンジル）ホスホエステルのバイオ活性化、J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 1992
54.  Morla,A.O.,Beach,G.;およびWang,J.Y.J.（1989）Cell 58,193-203.
55.  Morla,A.O.;Beach,G.;Wang,J.Y.J.ｃｄｃ２の可逆チロシンリン酸化：脱リン酸化は模倣体へのエントリーの間に活性化を伴う、Cell 1989,58,193-203.
56.  Nomizu,M.;Otaka,A.;Burke,T.R.;Roller,P.P.タンパク質チロシンキナーゼ／ｓｈ２相互作用の阻害剤としての環状ペプチドを含有するホスホノメチル−フェニルアラニンおよびホスホチロシンの合成、Tetrahedron 1994,50,2691-2702.
57.  Nomizu,M.;Otaka,A.;Smyth,M.S.;Shoelson,S.E.;Case,R.D.;Burke,T.R.,Jr.;Roller,P.P.ペプチド化学における４−ホスホノメチル−フェニルアラニンおよびアナログを含有するＳＨ２結合ペプチドの合成および構造：第３１回日本シンポジウム１９９４の会報、神戸：タンパク質研究協会、大阪、日本
58.  Otaka,A.;Burke,T.R.,Jr.;Smyth,M.S.;Nomizu,M.;Roller,P.P.４−［（ジエチルホスホノ）ジフルオロメチル］−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン残基を含有する保護されたペプチド樹脂用の脱保護および切断方法、Tetrahedron Lett.1993,34,7039-7042.
59.  Otaka,A.;Nomizu,M.;Smyth,M.S.;Case,R.D.;Shoelson,S.E.;Burke,T.R.,Jr.;Roller,P.P.Ｏ−ホスホチロシンの加水分解安定アナログを含有するＳＨ２結合ペプチドの合成および構造活性研究、in Peptides:Chemistry and Biology:第１３回アメリカペプチドシンポジウム１９９３の会報、エドモントン、アルベルタ、カナダ：ESCOM Publishers,Leiden,オランダ.
60.  Panayotou,G.;Waterfield,M.D.受容体チロシンキナーゼによるシグナル複合体の組み立て、Bioessays 1993,15,171-177.
61.  Pawson,T.;Gish,G.D.ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン−構造から機能へ、Cell 1992,71,359-362.
62.  Pawson,T.;Schlessinger,J.ＳＨ２およびＳＨ３ドメイン、Curr Biol 1993,3,434-442.
63.  Perigaud,C.,Gosselin,G.,Lefebvre,I.,Girardet,J.L.,Benzaria,S.,Barber,I.およびImbach,J.L.（1993）Bioorg.Med.Chem.Lett 3,2521-2526.
64.  Piccione,E.;Case,R.D.;Domchec,S.M.;Hu,P.;Chaudhuri,M.;Backer,J.M.;Schlessinger,J.;Shoelson,S.E.直接的ホスホペプチド／ＳＨ２ドメイン結合によって特異的に特定されたホスファチジルイノシトール３−キナーゼｐ８５  ＳＨ２ドメイン、Biochemistry 1993,32,3197-3202.
65.  Posner,B.I.;Faure,R.;Burgess,J.W.;Bevan,A.P.;Lachance,D.;Zhangsun,G.Y.;Fantus,I.G.;Ng,J.B.;Hall,D.A.;Lum,B.S.;Shaver,A.;ペルオキソバナジウム化合物−インスリン模倣体である新規な種類の有効ホスホチロシンホスファターゼ阻害剤、J.Biol.Chem. 1994,269,4596-4604.
66.  Roller,P.P;Otaka.A.;Nomizu,M.;Smyth,M.S.;Barchi,J.J.,Jr;Burke,T.R.,Jr.;Case,R.D.;Wolf,G.;Shoelson,S.E.ｐ８５  ＳＨ２ドメインに結合するホスファターゼ耐性直鎖または環状ペプチドにおけるメチオニンの代替としてのノルロイシン、Bioorg.Med.Chem.Lett.1994,1879-1882.
67.  Sale,G.J.,インスリン受容体ホスホチロシルタンパク質ホスファターゼ並びにインスリン受容体チロシンキナーゼ作用の調節、Advances in Protein Phosphatases 1991,6,159-186.
68.  Shoelson,S.E.;Chatterjee,S.;Chaudhuri,M.;Burke,T.R.Ｎ（α）−ｆｍｏｃ−（Ｏ，Ｏ−ジ−tert−ブチル）ホスホノ−パラ−メチルフェニルアラニンを有する加水分解不能なホスホチロシルペプチドアナログの固相合成、Tetrahedron Lett.1991,32,6061-6064.
69.  Sikorski,J.A.;Miller,M.J.;Braccolino,D.S.;Clearly,D.G.;Corey,S.D.;Font,J.L.;Gruys,K.J.;Han,C.Y.;Lin,K.C.;EPSPシンターゼ、新規−３−ホスフェート模倣体を取り込む二基質阻害剤の設計および合成、Phosphorus,Sulfur Silicon Relat.Elem.1993,76,115-118.
70.  Smyth,M.S.,およびBurke,T.R.,Jr.（1994）Tetrahedron Lett.35,551-554.
71.  Smyth,M.S.,Ford,H.,Jr.,およびBurke,T.R.,Jr.（1992）Tetrahedron Lett.33,4137-4140.
72.  Smyth,M.S.,およびBurke,T.R.,Jr.Ｎ−ＢｏｃおよびＮ−Ｆｍｏｃ保護ジエチル４−ホスホノジフルオロメチル−Ｌ−フェニルアラニンのエナンチオ選択的合成；Ｏ−ホスホチロシンの加水分解不能アナログを含有するペプチドの固相合成のために好適な試薬、Tetrahedron Lett.1994,35,551-554.
73.  Smyth,M.S.,Ford,H.,Jr.,およびBurke,T.R.,Jr.ベンジル酸α、α−ジフルオロホスホン酸の製造のための一般的方法；ホスホチロシンの加水分解不能な模倣体、Tetrahedron Lett.1992,33,4137-4140.
74.  Songyang,Z.;Shoelson,S.E.;Chaudhuri,M.;Gish,G.;Pawson,T.;Haser,W.G.;King,F.;Roberts,T.;Ratnofsky,S;Lechleider,R.J.;Neel,B.G.;Birge,R.B.;Fajardo,J.E.;Chou,M.M.;Hanafusa,H.;Schaffhausen,B.;Cantley,L.C.ＳＨ２ドメインは特異的ホスホペプチド配列を認識する、Cell 1993,72,767-778.
75.  Srivastva,D.N.およびFarquhar,D.（1984）Bioorganic Chemistry 12,118-129.
76.  Srivastva,D.N.およびFarquhar,D.バイオ可逆ホスフェート保護基：アシルオキシメチルホスフェートのモデルの合成および安定性、Bioorganic chemistry 1984,12,118-129.
77.  Tan,Y.H.（1993）Science 262,376-377.
78.  Tan,Y.H.サイトカインシグナルにおけるリン酸化の陰陽、Science 1993,262,376-377.
79.  Walton,K.J.およびDixon,J.E.（1993）J.Biol.Chem.62,101-120.
80.  Walton,K.M.;Dixon,J.E.タンパク質チロシンホスファターゼ、Ann.Rev.Biochem.1993,62,101-120.
81.  Wang,Q.P.,Dechert,U.;Jirik,F.;Withers,S.G.ヒトプラスタチン酸ホスファターゼおよびホスホチロシンホスファターゼの自殺不活性化、Biochem Biophys Res Commun 1994,200,577-583.
82.  Wange,R.L.,Isakov,N.,Burke,T.R.,Jr.,Otaka,A.,Roller,P.O.,Watts,J.D.,Aebersold,R.およびSamelson,L.W.（1995）J.Biol.Chem.270,944-948.
83.  Watanabe,H.;Nakai,M.;Komazawa,K.;Sakurai,H.新規な経口活性インスリン模倣バナジル複合体：ビス（ピロリジン−Ｎ−カルボチオアタオ）−オキソバナジウム（ＩＶ）、J.Med.Chem.1994,37,876-877.
84.  Wiener,J.R.,Hurteau,J.A.,Kerns,B.J.,Whitaker,R.S.,Conaway,M.R.,Berchuck,A.およびBast,R.C.,Jr.（1994）Am.J.Obstet.Gynecol.170,1177-1183.
85.  Wiener,J.R.,Kerns,B.,Harvey.E.L.,Conaway,M.R.,Iglehart,J.D.,Berchuck,A.およびBast,R.C.,（1994）J.Nat.Cancer Inst.86,372-378.
86.  Xiao,S.;Rose,D.W.;Sasaoka,T.;Maegawa,H.;Burke,T.R.;Roller,P.P.;Shoelson,S.E.;Olefsky,J.M.Ｓｙｐ（ＳＨ−ＰＴＰ２）は増殖因子により刺激された分裂促進シグナル伝達の正の仲介物質である、J.Biol.Chem.1994,269,21244-21248.
87.  Ye,B.,Akamatsu,M.,Yan,X.,Wolf,G.,Shoelson,S.E.およびRoller P.O.およびBurke,T.R.,Jr.,（in review）J. Med.Chem.
88.  Ye,B.およびBurke,T.R.,Jr.,（in review）Tetrahedron Lett.
89.  Zanke,B.,Squire,J.,Griesser,H.,Henry,M.,Suzuki,H.,Patterson,B.,Minden,M.およびMak,T.W.（1994）Leukemia 8,236-244.
90.  Zhang,Z.Y.;Maclean,D.;McNamara,D.J.;Sawyer,T.K;Dixon,J.E.タンパク質チロシンホスファターゼ基質特異性−ペプチド基質におけるサイズおよびホスホチロシンの位置の要件、Biochemistry 1994,33,2285-2290.
91,  Zheng,X.M.;Wang,Y.;Pallen,C.J.タンパク質チロシンホスファターゼの過剰発現によるｐｐ６０（ｃ−ｓｒｃ）の細胞形質転換および活性化
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：厚生省長官により代表されるアメリカ合衆国の政府
（ii）発明の名称：Ｏ−マロニルチロシル化合物、Ｏ−マロニルチロシル化合物含有ペプチド、およびそれらの使用
（iii）配列の数：８
（iv）通信先：
（Ａ）宛て名：モルガン＆フィネガン、Ｌ．Ｌ．Ｐ．
（Ｂ）番地：３４５パーク通り
（Ｃ）都市：ニューヨーク
（Ｄ）州：ニューヨーク
（Ｅ）国：ＵＳＡ
（Ｆ）ＺＩＰ：１０１５４
（Ｖ）コンピューター読み取り形式
（Ａ）媒体型：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣコンパチブル
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウエア：ＡＳＣＩＩ
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：付与される予定
（Ｂ）出願日：１９９６年３月２９日
（Ｃ）分類：
（vii）先の出願のデータ：
（Ａ）出願番号：０８／４１４，５２０
（Ｂ）出願日：１９９５年３月３１日
（Ｃ）分類：
（viii）弁護士／代理人情報
（Ａ）氏名：ウイリアムＳ．フェイラー
（Ｂ）登録番号：２６，７２８
（Ｃ）参照／ドケット番号：２０２６−４１８７ＰＣＴ
（ix）電信情報：
（Ａ）電話：（２１２）７５８−４８００
（Ｂ）テレファックス：（２１２）７５１−６８４９
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：式中Ｘａａは式ＩＩのＯ−マロニルチロシル化合物から誘導された単位の残基である。
（xi）配列の記載：配列番号１
0003929490.tif 000009
（２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：式中Ｘａａは式ＩＩのＯ−マロニルチロシル化合物から誘導された単位の残基である。
（xi）配列の記載：配列番号２
0003929490.tif 000010
（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：式中Ｘａａは式ＩＩのＯ−マロニルチロシル化合物から誘導された単位の残基である。
（xi）配列の記載：配列番号３
0003929490.tif 000011
（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：９
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：式中Ｘａａは式ＩＩのＯ−マロニルチロシル化合物から誘導された単位の残基である。
（xi）配列の記載：配列番号４
0003929490.tif 000012
（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１１
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：Ｃ末端Ｌｙｓは［Ｉ125］ボルトン−ハンター修飾リジンである。
（xi）配列の記載：配列番号５
0003929490.tif 000013
（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：Ｎ末端Ｌｙｓは［Ｉ125］ボルトン−ハンター修飾リジンである。
（xi）配列の記載：配列番号６
0003929490.tif 000014
（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：１２
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：Ｃ末端Ｌｙｓは［Ｉ125］ボルトン−ハンター修飾リジンである。
（xi）配列の記載：配列番号７
0003929490.tif 000015
（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：６
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の型：不明
（Ｄ）トポロジー：不明
（ix）特徴
（Ａ）名称／キー：
（Ｂ）位置：
（Ｃ）同定方法：
（Ｄ）他の情報：式中Ｘａａは式ＩＩのＯ−マロニルチロシル化合物から誘導された単位の残基である。
（xi）配列の記載：配列番号８
0003929490.tif 000016
【図１Ａ】
0003929490.tif 000020
【図１Ｂ】
0003929490.tif 000021
【図２Ａ】
0003929490.tif 000022
【図２Ｂ】
0003929490.tif 000023
【図３】
0003929490.tif 000024
【図４】
0003929490.tif 000025