(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体の免疫応答を生じさせることにおける予防的又は治療的使用のための、医薬として許容される賦形剤及び有効に免疫化する量の変異体単純ヘルペスウィルスを含むワクチンであって、
該変異体単純ヘルペスウィルスが、ウィルスDNAを含みかつパッケージング配列も欠如しないが、ｇＨ遺伝子が削除され又は不活性化されているゲノムを含み、
ここで前記変異体ウィルスが、
前記ｇＨ遺伝子を発現する組換え補足性宿主細胞内で、感染性の新しいウィルス粒子の生産を引きおこすことができるが、
前記変異体ウィルスを前記組換え補足性宿主細胞以外の宿主細胞に感染させた場合には、感染性の新しいウィルス粒子の生産を引きおこすことができないことを特徴とするワクチン。
【請求項２】
前記変異体ウィルスのゲノムが、該変異体ウィルスに対して外来性の病原体からの免疫原性タンパク質のための遺伝子材料を含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ｇＨタンパク質が、複製後のイベントに関連することを特徴とする請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ｇＨタンパク質が、ウィルスアセンブリーのために必要されないが、アセンブルしたウィルスが新しい細胞に感染することができるために必要であることを特徴とする請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項５】
前記医薬として許容される賦形剤及び有効に免疫化する量の前記変異体単純ヘルペスウィルスから本質的になる請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項６】
約５×104〜約５×107pfuの前記変異体ウィルスを含む投与量を含む請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項７】
約５×104〜約５×106pfuの前記変異体ウィルスを含む投与量を含む請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項８】
約５×104〜約５×105pfuの前記変異体ウィルスを含む投与量を含む請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項９】
請求項１に記載のワクチンを製造する方法であって、
ａ）組換え補足性宿主細胞中で変異体単純ヘルペスウィルスを増殖させ、
ここで、該変異体単純ヘルペスウィルスは、ｇＨ遺伝子が削除され又は不活性化されているゲノムを含み、及び前記組換え補足性宿主細胞は前記ｇＨ遺伝子を発現し；そして
ｂ）得られたウィルスを、有効に免疫化する量で、医薬として許容される賦形剤と混合すること
を含む方法。
【請求項１０】
前記ｇＨタンパク質が、複製後のイベントに関連することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｇＨタンパク質が、ウィルスアセンブリーのために要求されないが、アセンブルしたウィルスが新しい細胞に感染することができるために必要であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記有効に免疫化する量が、約５×104〜約５×107pfuの前記変異体ウィルスを含む投与量であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記有効に免疫化する量が、約５×104〜約５×106pfuの前記変異体ウィルスを含む投与量であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記有効に免疫化する量が、約５×104〜約５×105pfuの前記変異体ウィルスを含む投与量であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
被検体の免疫応答を生じさせることにおける予防的又は治療的使用のための、医薬として許容される賦形剤及び有効に免疫化する量の感染性ウィルスを含むワクチンであって、
該ワクチン中の感染性ウィルスが、ｇＨ遺伝子が削除され又は不活性化されているゲノムを含む変異体単純ヘルペスウィルスから本質的になり、
ここで前記変異体ウィルスが、
前記ｇＨ遺伝子を発現する組換え補足性宿主細胞内で、感染性の新しいウィルス粒子の生産を引きおこすことができるが、
前記変異体ウィルスを前記組換え補足性宿主細胞以外の宿主細胞に感染させた場合には、感染性の新しいウィルス粒子の生産を引きおこすことができないことを特徴とするワクチン。
【請求項１６】
被検体の免疫応答を生じさせることにおける予防的又は治療的使用のための、感染性ウィルスを含む医薬であって、該医薬中の感染性ウィルスは、有効に免疫化する量の、ｇＨ遺伝子中に不活性化変異を有する変異体単純ヘルペスウィルスからなり、ここで前記ｇＨ遺伝子は新しいウィルス粒子の生産のために本質的であり、
ここで前記変異体単純ヘルペスウィルスは、
前記ｇＨ遺伝子を発現する組換え補足性宿主細胞中で感染性の新しいウィルス粒子の生産を引きおこすことができるが、
前記変異体ウィルスが前記組換え補足性宿主細胞以外の宿主細胞に感染した場合には感染性の新しいウィルス粒子の生産を引きおこすことができないことを特徴とする医薬。
【請求項１７】
前記感染性の変異体単純ヘルペスウィルス及び医薬として許容される担体から本質的になる請求項１６に記載の医薬であって、前記医薬が、単純ヘルペスウィルスへの感染又はその感染の結果に対して、該医薬で免疫化された被検体を保護することができることを特徴とする医薬。
【発明の詳細な説明】
本発明は、ウィルス  ワクチンに関する。特に、それはワクチンとしての使用のための遺伝的に構築された変異ウィルス；その変異ウィルスを含んで成るワクチン；組換え細胞；及びワクチンの製造方法に関する。
ウィルス  ワクチンは従来、２種の性質のものである。第１の性質は適切な化学物質、たとえばβ−プロピオラクトンによる処理により殺害されたウィルス調製物である“殺害された”ワクチンである。第２のタイプは、ウィルスゲノムの特定の遺伝子操作により又はより通常にはいくつかのタイプの組織培養システムへの通過により、宿主に対してより低い病原性にされたウィルスである生存“弱毒”ワクチンである。これらの２種のタイプのワクチンはそれぞれ、それら自体の欠点を有する。殺害されたワクチンは宿主において複製しないので、それらは注射により投与されるべきであり、そして従って、不適切な種類の免疫応答を生成することができる。たとえば、ポリオウィルスの殺害された調製物であるSalkワクチンは免疫グロブリン（Ig）Ｇ抗体応答を生成するが、しかし一次感染の天然部位である腸においてIgAの生成を刺激しない。従って、このワクチンは、ポリオの神経学的合併症から個人を保護することができるが、一次感染を阻止せず、そしてその結果、“集団免疫”を付与しない。さらに、殺害されたウィルスは、宿主細胞の内部に侵入せず、そして複製しない。従って、複製の間に生成される非構造タンパク質に対するいづれかの有益な免疫学的応答は利用できない。それらはまた、ウィルス抗原に対して向けられた細胞毒性Ｔ細胞の生成を刺激することができない。“死んだ”抗原は、抗原を示す細胞により取られ、そしてＴ細胞に向けられる。しかしながら、この表示は、MHCクラスII分子を通して生じ、そしてＴヘルパー細胞の刺激を導びく。次に、Ｔヘルパー細胞は、Ｂ細胞の抗原に対しての特異的抗体の生成を助ける。細胞毒性Ｔ細胞の生成を刺激するためには、ウィルス抗原は、感染された細胞の内部の特定の通路を通して進行し、そしてMHCクラスＩ分子上で分裂されたペプチドフラグメントとして示される。この変性路は、感染された細胞の内部で合成されるタンパク質のために最っとも効果的に作用すると思われ、そして従って、宿主細胞に侵入し、そして免疫原性ウィルスタンパク質を発現するウィルスのみが、ウィルス特異的細胞毒性Ｔ細胞を生成することができる。従って、殺害されたワクチンは、ウィルス感染に対する細胞免疫性の良好でないインデューサーである。この観点から、生存弱毒ワクチンはより満足のいくものである。
今日まで、生存弱毒ウィルスは、非必須遺伝子の欠失又は１又は複数の必須遺伝子の部分的な損傷（この場合、損傷は、遺伝子はまだ機能的であるが、しかしそんなに効果的には作用しないようなものである）により製造されて来た。しかしながら、生存弱毒ウィルスはしばしば、宿主に対して有害な効果を有することができる残留病原性を保持する。さらに、その弱毒化が、特異的欠失により引き起こされないならば、よりビルレントの形への復帰の可能性が保持される。それにもかかわらず、あるウィルスタンパク質生成は、宿主において存在する事実は、それらがしばしば、そのようなウィルスタンパク質を生成しない殺害されたワクチンよりも、しばしばより効果的であることを意味する。
生存弱毒ウィルス、並びにそれら自体の能力でワクチンとして使用されることはまた、他の遺伝子の“ワクチンベクター”、換言すれば保護が必要とされる二次ウィルス（又は他の病原体）からの遺伝子のキャリヤーとしても使用され得る。典型的には、ポックスウィルス科のメンバー、たとえばワクシニアウィルスがワクチンベクターとして使用される。ウィルスがワクチンベクターとして使用される場合、それは病原性効果を引き起こさないことが重要である。換言すれば、それは、単純なウィルス  ワクチンが弱毒化されるのと同じ手段で弱毒化される必要がある。従って、上記と同じ欠点が、この場合に存在する。
ウィルスゲノムからの遺伝子を欠失せしめ、そしてその欠失された遺伝子の生成物をウィルスに供給する、いわゆる“相補的”細胞を供給することが可能であることが見出された。これは、一定のウィルス、たとえばアデノウィルス、ヘルペスウィルスおよびレトロウィルスのために達成されて来た。アデノウィルスのためには、ヒト細胞系がアデノウィルスタイプ５DNAのフラグメントにより形質転換された（Graham, Smiley, Russell & Nairn, J. Gen. Viral., 36, 59〜72, 1977）。その細胞系は一定のウィルス遺伝子を発現し、そしてそれが欠失され又は不活性化されたそれらの遺伝子を有するウィルス変異体の増殖を支持することが見出された（Harrison, Graham & Williams, Virology 77, 319〜329, 1977）。ウィルスはこの細胞系（前記“相補的細胞系”）上で良く増殖し、そして標準のウィルス粒子を生成したが、それは正常なヒト細胞上ではまったく増殖しなかった。SV40ウィルスゲノム（パポーバウィルス）のＴ−抗原コード領域を発現する細胞はまた、この領域において特異的に欠失されたウィルスの複製を支持することができることが示された（Gluzman, Cell, 23, 182〜195, 1981）。ヘルペス単純ウィルスのためには、gB糖タンパク質（Caiなど, J. Virol. 62, 714〜721, 1987），gD糖タンパク質（Ligas and Johnson, J. Virol. 62, 1486, 1988）及び即時初期タンパク質ICP4（Delucaなど.,J. Virol.,56, 558, 1985）を発現する細胞系が、生成され、そしてそれらは、その対応する遺伝子の特異的に不活性化されたコピーを有するウィルスの複製を支持できることが示された。
本発明は、ワクチンとしての使用のための変異ウィルスを供給し、ここで感染ウィルスの生成のために不可欠であるタンパク質をコードするウィルス遺伝子は欠失され、又は不活性化されており；そして前記ウィルスは、前記欠失され又は不活性化されたウィルス遺伝子によりコードされる必須タンパク質を前記細胞が発現するのを可能にする非相同ヌクレオチド配列を有する細胞において増殖され得る。
本発明はまた、上記のようなウィルス、及び１又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントを含んで成るワクチンを供給する。そのウィルスゲノムは、それ自体、免疫原を供給することができ、又はそれは免疫原性タンパク質を発現する非相同遺伝子挿入体を含むことができる。
本発明はまた、ワクチンの調製に使用するために、上記のような弱毒化されたウィルスによりトランスフェクトされた相補的細胞を供給する。
本発明はまた、疾病の治療又は予防処置のためのワクチンの調製に上記のようなウィルスの使用を含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、感染ウィルスの生成のために必須であるタンパク質をコードする欠失され、又は不活性化されたウィルス遺伝子を有するウィルスにより感染された細胞を培養し、そしてここで前記宿主細胞は前記ウィルス遺伝子を含んで成る非相同ヌクレオチド配列を有し、そして前記遺伝子によりコードされる必須タンパク質を発現することができる；このようにして生成されたウィルスを収穫し；そしてそれをワクチンに使用することを含んで成るワクチンの製造のための方法を提供する。
ウィルスはヘルペス単純ウィルス（HSV）に由来し、ここでたとえば糖タンパク質Ｈ（gH）をコードする遺伝子は不活性化され又は欠失されている。変異ウィルスはまた、病原体に由来する免疫原をコードする非相同配列を含んで成る。宿主細胞は適切には、HSV糖タンパク質Ｈをコードする遺伝子を含む組換え真核細胞系であろう。もう１つの例として、ウィルスはオルトポックスウィルス、たとえばワクシニアウィルスに由来し、ここで前記ウィルスは病原体に由来する免疫原をコードする非相同配列を含んで成る。
本発明は、殺害されたワクチンの効能及び安全性と弱毒化されたワクチンによるウィルスタンパク質のインビボ生成により誘発された特別の免疫学的応答とを組合す独得の手段を示す。好ましい態様においては、それは２種の特徴を含む。第１に、選択された遺伝子は、通常特定の欠失を創造することによってウィルスゲノム内で不活性化される。この遺伝子は感染性ウィルスの生成において包含されるが、しかし好ましくはウィルスゲノムの複製を妨害しない。従って、感染された細胞は複製された遺伝子材料からよりウィルス性のタンパク質を生成することができ、そして多くの場合、新規ウィルス粒子が生成されるが、しかしこれらは感染性ではない。これは、ウィルス感染が接種の部位から広がらないことを意味する。
本発明の第２の特徴は、欠失された遺伝子の生成によりウィルスを供給する細胞であり、従って組織培養におけるウィルスの増殖を可能にする。従って、ウィルスは、それが適切な宿主細胞において増殖される場合、必須タンパク質をコードする遺伝子を欠くけれども、それは増幅し、そして元のウィルスとは区別できない外観である完全なウィルス粒子を生成するであろう。この変異ウィルス調製物は、不完全なゲノムを有し、そして正常な宿主においては感染性ウィルスを生成しないような態様で不活性的であり、そしてその結果、宿主において体液性応答を直接的に生成するために必要とされる量で安全に投与され得る。従って、変異ウィルス又は、保護されるべき宿主の細胞のために感染性である必要はなく、そして従来の殺害された又は弱毒化されたウィルス  ワクチンと同じ手段で単に操用する。しかしながら、好ましくは、免疫化ウィルスは、それが細胞に結合し、それに侵入し、そしてウィルス複製サイクルを開始せしめるような態様でそれ自体まだ感染性であり、そして従って、保護されるべき種の宿主細胞内で感染を開始せしめることができ、そしてその中であるウィルス抗原を生成することができる。従って、宿主免疫システムの細胞武装を刺激する追加の機会が存在する。
欠失された又は不活性化された遺伝子は、免疫原性応答を生成するためにインビボで、できるだけ多くのウィルスタンパク質を供給するために、好ましくはウィルスサイクルにおいて、できるだけ遅く関与する遺伝子である。たとえば、その遺伝子は、たとえばHSVのgH糖タンパク質のパッケージング又はある他の後一複製出来事に関与する遺伝子であり得る。しかしながら、選択された遺伝子は、ウィルスゲノム複製に関与する遺伝子であり、そしてインビボで発現されるタンパク質の範囲は、その遺伝子が通常発現される段階に依存するであろう。ヒトサイトメガロウィルス（HCMV）の場合、選択された遺伝子は、ウィルスゲノム複製（及び実際、そのために必須である）の前に生成される即時初期遺伝はひじょうに免疫原性であるので、インビボでのウィルスゲノム複製を効果的に妨げる遺伝子（即時初期遺伝子以外の）であり得る。
本発明は、１又は複数の必須遺伝子が同定され、そしてウィルスゲノムから欠失され又はそのゲノム内で不活性化され得るいづれかのウィルスに適用され得る。DNAウィルス、たとえばアデノ、ヘルペス、パボバ、パピロマ及びパルボウィルスのためには、これは、（ｉ）特定のDNA変化を創造するために選択された必須遺伝子のクローンされたDNAコピーのヒイビトロ操作；（ii）組換え及びマーカーレスキューの標準方法を通してウィルスゲノム中への変更された態様の再導入により直接的に達成され得る。しかしながら、本発明はまた、RNAウィルスにも適用できる。RNAウィルスゲノムの相補的DNAコピーの、標準遺伝子技法によるインビトロでの操作、そして次にインビトロ転写によるRNAに転換を可能にする技法が現在利用できる。次に、その得られるRNAはウィルスゲノム中に再導入され得る。その技法は、陽性及び陰性標準RNAウィルス、たとえばポリオウィルス（Racaniello and Baltimore Science, 214, 916〜919, 1981）及びインフルエンザウィルス（Lutyesなど.,Cell, 59, 1107〜1113, 1989）のゲノムに特定の変化を創造するために使用されて来た。
理論的には、必須タンパク質をコードするいづれかの遺伝子が弱毒化されたウィルスの創造へのこのアプローチのための可能性ある標的であるはずである。しかしながら、実際、その遺伝子の選択は、多くの考慮により推進されるであろう。
１．遺伝子は好ましくは、感染において後期で必要とされる遺伝子であるべきである。従って、弱毒化されたウィルスの複製は初期相においては妨害されない。これは、ほとんどの及び可能性あるすべての他のウィルス抗原が感染された細胞に生成され、そして宿主細胞MHCクラスＩ分子と共に宿主免疫システムに表わされるであろうことを意味する。そのような表示は、細胞毒性Ｔ細胞の生成を通してウィルス感染に対しての細胞免疫性の進行を導く。細胞毒性Ｔ細胞は、それらの抗原を認識することができ、そして従って、ウィルス感染された細胞を殺害することができる。欠失された遺伝子は、ウィルスアセンブリーのためにはまったく必要とされないが、しかし新規細胞を感染せしめることができる前記アセンブリーされたウィルスのためには必要である遺伝子表わすことが可能である。そのようなタンパク質の例はHSV gHタンパク質である。このタンパク質の不在下で、HSVビリオンはまだ生成されるが、しかしそれらは非感染性である。
２．理想的には、選択された遺伝子の生成物は、真核細胞に対して単独では毒性であるべきでなく、その結果、相補的細胞が比較的容易に生成され得。しかしながら、それは絶対的な必要条件ではない。なぜならば、前記遺伝子は、その発現が必要とされる場合のみスイッチ−オンされるように、相補的細胞における誘発性プロモーターの制御下に配置され得るからである。
標的遺伝子に創造される変異の性質はまた、選択の出来事でもある。非機能的な遺伝子生成物を生成するいづれかの変化は、野性型の構造体への転換の危険性が最少化される限り、満足のいくものである。そのような変化は、外部配列による標的の妨害及び特異的欠失の創造を包含する。しかしながら、治療剤及び／又は予防剤として使用されるべきワクチンのための最っとも満足のいく手段は、相補的細胞中に導入されるべき全体の配列を包含する欠失が行なわれる場合の手段であろう。そのアプローチは、相補的細胞におけるウィルスと細胞DNAとの間の組換えを通して野性型ウィルスを生成する危険性を最少にする。
特異的に不活性化されたウィルス及び相補的細胞の組合せのいくつかの例が存在するが（初期の論議を参照のこと）、今日まで、それらは、トランスジェニック動物を生成するために安全なベクターを製造するために、前記ウィルスに対する基本的な研究のために又はレトロウィルスの場合におけるように使用されて来た。それらは、ワクチン生成のために使用されておらず、そして出願者の知識の限り、この種の使用の提案はこれまで示差されていない。
野生型ウィルスに対する安全なワクチンを生成するためにそのような不活性化されたウィルス／相補的細胞の組合せの他に、本発明はまた、外来性病原体に対するワクチンとして使用のための安全なウィルスベクターを生成するために前記同じシステムの使用を論じる。
そのようなベクターの例は、HSVに基づくベクターである。HSVゲノムは、相当の追加の遺伝子情報を収容するために十分に大きく、そして外来性遺伝子材料を担持し、そして発現する組換えHSVウィルスのいくつかの例が記載されている（たとえばLigas and Johnson, J. Virol. 1988, op. cit.）。従って、上記のような必須ウィルス遺伝子における欠失を有し、そしてまた、定義された外来性遺伝子を担持し、そして発現するウィルスが、外来性タンパク質に対する免疫応答を生成するためにワクチン化のための安全ベクターとして使用され得る。
HSVの特定の特徴は、それが感染された個人のニューロンにおいて潜伏性になり、そして時々、再活性化し、局部的な損傷を導びくことである。従って、必須ウィルス遺伝子における欠失を有し、そして外来性遺伝子を発現するHSVは、処理された個人におけるニューロンの潜伏的感染を故意に生成するために使用され得る。そのような潜伏的な感染の再活化は、ウィルスベクターは十分に複製できないので損傷の生成を導びかないが、しかしウィルス複製サイクルの初期部分の開始をもたらすであろう。この時間の間、外来性抗原の発現が生じ、免疫応答の生成も導く。欠失されたHSV遺伝子がウィルスアセンブリーのためには必要とされないが、しかしアセンブリーされたビリオンの感染性のためにのみ必要とされるタンパク質を特定する状況においては、そのような外来性抗原はそのアセンブリーされたウィルス粒子中に組込まれ、その免疫原性効果の増強を導びかれる。ウィルス粒子における外来性遺伝子のこの発現及びそのタンパク質の組込みはまた、変異ウィルスがその相補的宿主にまず生成される段階で生じ、この場合、変異ウィルスは、ワクチンとして使用される場合、処理される種に対する外来性タンパク質をすぐに付与するであろう。
他の例においては、ワクシニアウィルス、たとえばポックスウィルスが種々の病原体からの遺伝子担持し、そして発現し、そしてこれらは、動物実験システムに使用される場合、効果的なワクチンを形成することが示された。ヒトへの使用のための可能性はばく大であるが、しかし天然痘に対するワクチンとしての広範囲の使用に関連する既知の副作用のために、ヒトへの大規模での非変成ワクシニアウィルスの使用には不適切である。非必須遺伝子、たとえばワクシニア増殖因子遺伝子を欠失することによってワクシニアウィルスを弱毒化する試みが行なわれて来た（Buller,Chakrabarti, Cooper, Twardzik & Moss, J. Virology 62, 866〜874, 1988）。しかしながら、そのような弱毒化されたウィルスは、減じられたレベルでではあるが、インビボでまた複製することができる。必須遺伝子における欠失を有するワクシニアウィルスは、まだ生成されてないが、しかし増殖のためのその相補的細胞を伴って、上記のような必須遺伝子の欠失されたそのようなウィルスはこのワクチンベクターの安全な変種を提供する。
非相同タンパク質に対しての免疫化のためのこの一般的な手段の追加の利点は、従来の生存ウィルスベクターによれば、ほとんど不可能であるが、同じウィルスベクターによる多様な効果的なワクチン投与を行なうことが可能であることである。標準の生存ウィルスワクチンは、感染の多くのサイクルを通して宿主動物において複製するその能力にその効能のためには依存するので、その有用性は、そのウィルスに対する免疫性を有する個人においてきびしく削減されるであろう。従って、同じウィルスによる第２挑戦は、同じタンパク質に対しての追加免疫化を提供しても、又は異なったタンパク質に対しての新規応答を提供しても、たぶん効果的ではない。しかしながら、必須遺伝子の欠失を有するウィルスベクターを用いれば、多様な複製サイクルが所望されず又は必要とされない場合、効果的な免疫化を導びく出来事は、免疫化のすぐ後で生じるであろう。変異ウィルスの用量は比較的多量であり（なぜならば、それは完全に安全であるはずであるからである）、そして従って、それらの初期出来事は、宿主免疫応答により阻止されそうもなく、そしてそれは時々、完全に変動性化される必要があろう。
必須遺伝子を欠いている及び場合によって、免疫原性病原タンパク質のための遺伝子を含む変異ウィルスについてこれまで言及されて来たが、その変異体は、１つ以上の必須遺伝子を欠き、そして／又は１つ以上の免疫原性病原タンパク質遺伝子を含むことができる。従って、変異ウィルスは、上記態様でワクチンとして作用するHIV gp 120のための遺伝子、及びまた、ワクチン投与された宿主内で発現され、そして宿主においてＴ−細胞応答を刺激するためにMHC-1と共に、宿主細胞の表面で表わされるHIV gagタンパク質のための遺伝子を含むことができる。
本発明をより明日に理解するために、さらに例が例示されるが、それらは本発明を限定するものではない。
図１は、プラスミドpGH1の生成を例示する。
図２は、プラスミドpGH2の生成を例示する。
図３ａは、プラスミドpSP64Taを生成するために使用される相補的オリゴヌクレオチドの対を示す。
図３ａは、プラスミドpSP64TAの生成を示す。
図４ａは、プラスミドpCMVIEPを生成するために使用される２つのオリゴヌクレオチドを示す。
図４ｂは、プラスミドpCMVIEPを例示する。
図５は、プラスミドpCMVlacZを例示する。
図６は、プラスミドpGH3を例示する。
図７は、プラスミドpGH-120の構成のための手段を例示する。
糖タンパク質Ｈを欠失されたヘルペス単純ウィルス（gH-HSV）
ヘルペス単純ウィルス（HSV）は、ヒトにおいて広範囲の病原性症状、たとえば再発性顔面及び生殖器損傷及びまれであるが、致命的な脳炎を引き起こす大きなDNAウィルスである。このウィルスによる感染は、薬物アシクロバー（Acyclovir）を用いての化学療法によりある程度まで制御され得るが、しかし今までのところは、一次感染を妨ぐために利用できるワクチンは存在しない。HSVに対する予防接種の困難性は、そのウィルスは一般的に細胞から細胞への直接的な移行により身体内で広がることである。従って、体液性免疫は、循環抗体が細胞外ウィルスのみを中和できるので、効果的でありそうもない。ウィルス感染の制御のための一層の重要性は、細胞免疫であり、そしてその結果、体液性免疫及び細胞免疫の両者を生成でき、しかもまた完全であるワクチンが相当な利点を有する。
HSVゲノム内での不活性化のための適切な標的遺伝子は、糖タンパク質Ｈ遺伝子（gH）である。そのgHタンパク質は、ウィルスエンベロープの表面上に存在する糖タンパク質である。このタンパク質は、感染された細胞中へのウィルスの侵入の間の膜融合の工程に関与されると思われる。これは、この遺伝子の欠失を有する感温性ウィルス変異体が、許容できない温度で、ウィルス感染された細胞から抽出されない理由からである。（Desaiなど.,J. Gen. Virol. 69, 1147〜1156, 1988）。そのタンパク質は感染の後期で発現され、そしてその結果、その不在下で、相当量のウィルスタンパク質合成がなお存在し得る。
すべての遺伝子操作工程は、“Molecular Cloning”, A Laboratury Manual, Sambrook, Fritsch and Maniatis版, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989に記載される標準方法に従って行なわれる。
Ａ．HSV gH遺伝子を発現する細胞系の生成
gH遺伝子は、ヌクレオチド46382と43868との間のHSVタイプ１ゲノムのユニークな長さの領域（ＵL）に存在する（McGeochなど, J. Gen. Virol. 69, 1531〜1574, 1988）。この遺伝子のクローンされたコピーは、プラスミドpAF2内で利用できる。このプラスミドは、プラスミドpTZgHから完全なgHコード配列を包含するBgl II−Xho Ｉを切り出し、そしてそれをプラスミドpSP64TのBgl II部位中に記載のようにしてクローニングすることによって生成された（Gompels and Minson, J. Virol.,63, 4744〜1755, 1989）。次に、糖タンパク質Ｄ（gD）遺伝子のためのプロモーター配列を含むHind IIIフラグメント（gD遺伝子の開始に関して、ヌクレオチド−395から＋11に延びる）が、プラスミドpSVD4（Everett, Nucl.Acids Res.,11,6647〜6667, 1983）から切断され、そしてpAF2のユニークHind III部位中にクローン化され、プロモーター配列がgH遺伝子の発現を駆動する正しい配向に存在するようなpGH1（図１）が生成される。従って、このプラスミドは、HSVタイプ１gD遺伝子プロモーターの制御下で完全なgHコード配列を含む。次に、このプラスミドは精製され、そして次に、標準リン酸カルシウム同時沈殿技法（Graham and Van der Eb, Virology52, 456〜467, 1973）を用いて、プラスミドpNEO（Pharmacia LKB Biotechnology Inc.）によりVero細胞中に同時トランスフェクトされた。次に、耐ネオマイシン性を得たVero細胞が薬物G418へのその細胞の通過により選択され、そしてそれらの細胞のコロニーが制御希釈法によりクローン化される。次に、それらの耐ネオマイシン性細胞が組織培養中で増幅され、そして次に、サンプルがHSVタイプ２ウィルスにより感染される。HSVタイプ２ウィルスによる感染は、相補的細胞ゲノムに存在するタイプ１gDプロモーターからの転写の誘発及びその結果、相補的細胞におけるタイプ１gHタンパク質の生成を刺激する効果を有する。次に、感染された細胞の溶融物が、タイプ１gHタンパク質を特異的に認識することが知られているポリクローナル抗血清を用いて、ウェスターンブロットによりpHタンパク質の発現についてスクリーンされる（Desaiなど.,1988 op cit.）。次に、必要とされるタンパク質を発現する細胞が保持され、そして凍結貯蔵物が調製される。この材料は、gH+相補的細胞系を表わす。
Ｂ．中断されたgH遺伝子によるHSVタイプ１ウィルスの生成
HSVフランキング配列と共にgHのコード配列を含む6432塩基対のBgl IIフラグメントを、プラスミドpUG102（Gompels and Minson, Virology 153, 230〜247, 1986）から切り出し、そしてプラスミドpAT153（Twigg and Sherrat, Nature, 283, 216, 1986）中にクローンし、pGH2（図２）を生成する。このプラスミドを、２つの位置（McGeochなど, 1988, op cit.の番号付けスケムに従ってヌクレオチド44955〜46065）でのgHコード配列内のみを切断するPvu IIにより消化し、２つのフラグメントの大きい方を精製する。次に、サイトメガロウィルス（CMV）からの即時初期遺伝子プロモーターの下流のＥ．コリからの完全なβ−ガラクトシダーゼ遺伝子から或るDNAのフラグメントを、次の方法により調製する。すべての対の相補的オリゴヌクレオチド（図３ａに示される）の初めをアニールし、そしてBal II−消化されたホスファターゼ処理されたpSP64T（Krieg and Melton, Nucl. Acids Res. 12, 7057〜7071, 1984）により連結し、図3bに示されるようなプラスミドpSP64Taを生成する。付加されたリンカーはまた、開始コドン及びＥ．コリのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の３つのコドンを含む。次に、CMVの即時初期遺伝子プロモーターの“コア領域”を、それぞれ−302〜−288及び−13〜−36の配列（Akriggなど.,Virus Research, 2, 107〜121, 1985により記載されるようなCMV即時初期遺伝子の開始から番号付けされた）に対応する、図4aに示される２つのオリゴヌクレオチドを用いて、ポリメラーゼ鎖反応技法（PCR-Molecular Cloning, Sambrookなど.,op cit.）によりプラスミドpUG-H1（Gompels and Minson, 1989, op cit.）から増幅する。これらのオリゴヌクレオチドはまた、それらの５′端で、制限酵素Hind IIIの、ための部位及びプロモーターの上流のオリゴヌクレオチドアニーリングの場合、追加のSma Ｉ部位を含む。次に、PCR−増幅された生成物DNAをHind IIIにより消化し、そしてHind III−消化されたpSP64Ta中にクローン化し、プラスミドpCMVIEP（図4b）を生成する。最後に、コード配列の最５′端のみを欠くＥ．コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の完全なコピーを含むDNAフラグメントを、BamHIによるプラスミドpSC8（Chakrabartiなど.,Mol. Cell. Biol.,5, 3403〜3409, 1985）の消化により単離し、そしてpCMVIEPのユニークBgl II部位中にクローン化し、pCMVlacZ（図５）を生成する。次に、CMV IEプロモーターの制御下でのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むDNAのフラグメントを、Sma IによるpCMVlacZの消化により単離し、そして上記pGH2の精製されたPvu IIフラグメントにより連結し、官能的β−ガラクトシダーゼ遺伝子（図６）により中断されるgH遺伝子のコピーから成るpGH3を生成する。次の段階は、HSVゲノムにおける野生型gH遺伝子をこの中断された型と置換することであり、そしてこれはHSV DNAとプラスミドpGH3との間の組換え、続いて、官能的β−ガラクトシダーゼ遺伝子を得たそれらのウィルスの選択により行なわれる。従って、プラスミドpGH3 DNAを、標準のリン酸カルシウム沈殿技法（Graham and Van der Eb, 1973, op cit.）により、精製されたHSVビリオン（Killington and Powell, “Techniques in Virology : A Practical Approach”（B. W. J. Mahy版）207〜236ページ、IRL Press Oxford（1985））から単離された精製HSV DNAと共にgH遺伝子（セクションＡに記載されるgH+相補的細胞系）を発現する細胞中に同時トランスフェクトする。次に、このトランスフェクション実験から生成された子孫HSVウィルスを、酵素β−ガ��クトシダーゼにより青色物質に転換される色原体基質である５−ブロモ−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−gal）の存在下で、寒天層を用いて、標準プラークアッセイによりgH+相補的細胞の単層上にプレートする。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含み、そして発現するウィルスゲノムによる感染に起因するプラークは、青色に見えるであろう。従って、これらのウィルスゲノムは、gH遺伝子の中断された型を担持すべきである。ウィルスを、プレートの適切な部分からの寒天の突き刺しによりそのらのプラークから回収し、そしてウィルス貯蔵物をgH+相補的細胞系におけるウィルスの増殖に通して調製する。それらのウィルスは、gH遺伝子の非官能型を担持するので、gH遺伝子の内因性官能コピーを含まず、そして発現しない細胞上にプラークを形成できるべきでなく、そしてこれを確かめるために、ウィルスのサンプルを、gH相補的細胞と比較して、野生型Vero細胞単層上にプラークを形成するその能力についてアッセイする。最後に、ウィルスDNAをそれらの貯蔵物から調製し、そしてサザンブロットによりgH遺伝子のまわりの予測されるDNA構造について調べる。正しい遺伝子構造の確認の後、gH遺伝子を次ぐウィルスの多量の貯蔵物を、gH+相補的細胞系（感染の多重度＝0.01）の大規模培養物中へのウィルスのサンプルの接種により調製し、そして３日後、感染された細胞を収穫する。感染された細胞を、細胞関連ウィルスを放すために高波処理により破壊し、そして高波処理された全混合物を、ウィルスマスター貯蔵物として−70℃で貯蔵する。次に、ウィルス貯蔵物の力価を、gH+相補的細胞系に対するプラークアッセイにより確立する。次に、このウィルス貯蔵物のサンプルを用いて、作業用貯蔵物を調製し、そしてそれらの作業用貯蔵物を用いて、下記のようにして実験用動物を感染せしめる。
Ｃ．熱殺害されたウィルスに比較してのgH-HSVの保護効果に対する研究
このウィルスに対する宿主の免疫学的応答を評価するために、下記に記載される実験計画に従って、挑戦的実験をマウスに行なった。
生存gH-ウィルス調製物の保護効果を、次のようにして野生型（WT）ウィルス（株SS16）の不活性化された調製物と比較した。
予防接種のための不活性化された野生型ウィルスの調製：
HSVタイプ１（株SC16）を、Vero細胞の低多重度感染（0.01pfu/細胞）により増殖した。３日後、ウィルスを収穫し、そして細胞質ウィルスをDounce均質化により回収した。核を500xgで15分間の遠心分離により回収し、そしてウィルスを、Beckman Sw27ローターを用いて12Kで60分間の40％スクロースクッションに対する遠心分離により上清液から回収した。バンドを形成したウィルスを希釈し、ペレット化し、そしてスクロースグラジエント遠心分離（Killington and Powell, 1985, op. cit.）により精製した。ウィルスバンドをグラジエントから回収し、そしてウィルスを遠心分離により回収した。ウィルスをリン酸緩衝溶液（PBS）に再懸濁し、子供ハムスターの腎臓（BHK）細胞に対するプラーク力価により感染性についてアッセイし、そして粒子計数を電子顕微鏡により測定した。調製物の粒子：感染性の比は100粒子／pfuであった。ウィルスを2.5×1010pfu/ml PBSに希釈し、そして20℃で60分間のβ−プロピオラクトンにより処理により不活性化した。次に、アリコートを−70℃で貯蔵した。
予防接種のための生存gH-ウィルスの調製：
この材料を野生型ウィルスについて記載されるようにして調製した。但し、ウィルスは、HSVタイプ１gH遺伝子を含み、そして発現するgH+相補的細胞系において増殖し、そしてそれをβ−プロピオラクトンによる処理により不活性化しなかった。この調製物の粒子：感染性の比は150：１であった。この調製物の濃度を2.5×1010pfu/mlに調整し、そしてアリコートを−70℃でPBSに貯蔵した。
予防接種手段：
生後４週目の雌のbalb/cマウス（Tucks U. K. Ltdから購入された）を、リン酸緩衝溶液２μｌ体積中、不活性化されたWTウィルス又は生存gH-ウィルスの種々の用量により、滴下適用及び右耳の針による突き刺しにより次の通りに予防接種した：
グループＡ  対照−ウィルスを含まない
グループＢ  ５×104pfuウィルス  ワクチン
グループＣ  ５×105pfuウィルス  ワクチン
グループＤ  ５×106pfuウィルス  ワクチン
グループＥ  ５×107pfuウィルス  ワクチン
14日後、すべてのマウスを、２×106pfu HSV-１株SC16（野生型ウィルス）による左耳の類似する接種により挑戦せしめた。５日後、マウスを殺し、そして左耳及び左の頸部神経節ｃ II, ｃ III及びｃ IV（組合されている）におけるウィルス感染性についてアッセイした。潜在性研究のために、他の予防接種され、そして挑戦された動物を１ヵ月後に殺し、そしてｃ II, ｃIII及びｃIV神経節を切開することによって潜在性感染について試驗した。これらを培地において５日間インキュベートし、次に均質化し、そして標準のプラークアッセイにより感染性ウィルスの存在についてアッセイした。すべての次の結果はpfu/器官として表わされる。
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（p. f. u＝プラーク形成単位；gH-は欠損gH遺伝子を有するウィルスである）。
これらの結果は、感染の急性相の間、耳及び頸部神経節に存在する挑戦ウィルスWT SC16の力価を示す。従って、低い力価は、gH-ウィルスによる予防接種の良好な有効性を示し、ところが高い力価は良好でない有効性を示す。生存gH-HSVウィルスによる予防接種は等量の不活性化されたWTウィルスよりもより一層有効であることが前記結果から明白である。不活性化された調製物に関しては、５×107pfuの用量が、耳における挑戦ウィルスの複製を妨げるために必要とされ、ところが生存gH-ウィルスの用量は100〜1000倍、低い用量が必要とされる。５×105pfu及びそれ以上での生存gH-ウィルスによる予防接種は、感染の急性相の間、頸部神経節における挑戦ウィルスの複製を阻止でき、そしてさらに、頸部神経節における潜在性感染の確立に対して明白な保護効果を示した。
外来性抗原に対しての免疫化のためのベクターとしてのgH遺伝子を欠くHSV：gH-HSVウィルスのゲノム中へのSIVmac株142のgp120遺伝子の導入
必須遺伝子を欠くウィルスは、上記のように、免疫システムに外来性抗原を運ぶための安全ベクターとして使用され、そして上記gH-HSVウィルスはそのようなベクターの適切な例を提供する。このウィルスを、いづれかの所望する外来性抗原を発現するために使用され得るが、しかし特に好ましい可能性はAIDSウィルスヒト免疫不全ウィルス（HIV）の主な抗原性タンパク質であろう。従って、これらの配列は、組換えウィルスにより、正常細胞（すなわち非相補的細胞）の感染の間、それらの発現を確保する手段でgH-HSVゲノム中に挿入されるであろう。そのようなウィルスによる個人の感染は、再活性化に基づいて時間から時間に、外来性抗原の多量の生成を導びき、そのタンパク質に対する免疫応答の刺激をもたらす潜在性感染を導びくであろう。
ヒトへのこのアプローチを直接的に試驗する研究は現在、可能ではないので、初期段階として、そのアプローチは、Simian AIDSウィルスSIVmac（短尾サルから単離されたSimian免疫不全ウィルス）を用いて、モンキーにおいて試驗され得る。この目的のための適切なSIVウィルスはgp120タンパク質をコードする遺伝子、すなわちこのウィルスのための主要抗原標的の１つである。従って、この遺伝子は、gH-HSVゲノム中に導入され、そしてSIVによる挑単に対してモンキーを保護するワクチンとしてのこのウィルスの効能が評価される。
SIV gp120遺伝子はまずサイトメガロウィルスIEコアプロモーターの次にクローンされ、そして続いて、gp120遺伝子及び上流のCMVプロモーターから成るDNAカセットがプラスミドpGH2中にクローンされる（図２）。次に、その得られるプラスミドが、gH-HSVから精製されたDNAと共にgH+相補的細胞系中に同時トランスフェクトされ、そしてgH-HSVウィルスに存在するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の代わりにgp120遺伝子を得た組換えウィルスが、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の中断のためにスクリーニングにより単離される。
Ａ．HSVゲノム中へのSIV gp120コード配列の組換えのためのプラスミドの構成
この方法のための全体のスケムは図７に示される。Sac Ｉ制限酵素フラグメント（塩基5240−8721に対応する）を、SIVゲノムのクローンされたDNAコピーから切り出し（Chakrabartiなど.,Nature328, 543（1987）），そして特定部位の突然変異誘発による操作のために一本鎖DNAに転換され得るプラスミドpSIV1を生成するために、プラスミドpUC118（Viera and Messing, Methods in Enzymology, 153, 3, 1987）のSac Ｉ部位中にクローンする。次に、そのSIV env遺伝子（6090〜8298に対応する）を含有このDNA領域を特定部位の突然変異誘発により変更し（Brierleyなど.,Cell 57, 537, 1989），合成オリゴヌクレオチド：
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を用いて位置6053〜6058で酵素EcoRVのための制限酵素部位を導入する。
次に、第２のEcoRV部位を、合成オリゴヌクレオチド：
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を用いて、env遺伝子配列のgp120とgp40ドメインとの間の切断部位に対応するSIV env遺伝子内の位置7671〜7676で導入し、プラスミドpSIV2を生成する。次に、SIV env遺伝子のgp120部分に対応するDNAフラグメント（1617個の塩基対）を、EcoRVによるSIV2の消化により調製する。
CMV即時初期遺伝子プロモーターのコア領域を、次の２種の合成オリゴヌクレオチドを用いてPCR技法によりプラスミドpUG-H1（Gompels and Minson, 1989, op cit.）から得る：
上流のプライマー
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下流のプライマー
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次に、この反応の生成物を酵素EcoR Ｉ及びHind IIIにより切断し、DNAフラグメントを得、それを次に、EcoR Ｉ−及びHind III−消化されたプラスミドpUC118中にクローン化し、CMVプロモーター配列のすぐ下流に位置するユニークSma Ｉ部位を有するプラスミドpCMVIE2を生成する。次に、上記のようにして調製されたSIVmacgp120コード配列を含むEcoRVフラグメントを、このSma Ｉ部位中にクローン化し、そしてプロモーターからのコード配列の発現を可能にするために正しく配向されたSIVコード領域を有するプラスミドpSIV3を選択する。次に、このプラスミドをEcoRVにより消化し、CMVプロモーターと共にSIV配列から成るブラント末端化されたDNAフラグメントを生成し、次にこれをPvu II‐消化されたpGH2（図２）中にクローン化し、pGH-120を生成する。
Ｂ．組換えgH-HSVを担持するSIV gp120の構成
DNAを、前記セクションに記載されるようにして構成されたgH-HSVウィルスから精製し、そして精製されたpGH-120 DNAと共にgH+相補的細胞中に同時トランスフェクトする。次に、このトランスフェクション方法から単離された子孫ウィルスを、Ｘ−galの存在下で寒天層を用いて前記のようにして標準プラークアッセイによりgH+相捕的細胞系の単層上にプラークする。親gH-ウィルスは、残留gHコード配列内に位置する官能的β−ガラクトシダーゼ遺伝子を担持し、そしてＸ−galの存在下で、青色プラークを形成するであろう。しかしながら、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の代わりにSIV gp120コード配列を得た組換えウィルスは白色プラークを形成するであろう。ウィルスをそれらの白色プラークから寒天を突き刺すことにより回収し、そしてウィルス貯蔵物をgH+相補的細胞系におけるそのウィルスの増殖を通して調製する。ウィルスDNAをそれらの貯蔵物から調製し、そしてSIVコード配列に由来する適切なプローブを用いて、サザンブロットによりgH遺伝子のまわりの正しいDNA構造体の存在について調べる。最後に、そのウィルスの貯蔵物を、動物における予防接種のために前記のようにして調製する。
弱毒化されたウィルスを含んで成るワクチンを、当業界において知られている標準技法に従って調製し、そして使用することができる。たとえば、ワクチンはまた、１又は複数の賦形剤及び／又はアジュバントを含むことができる。ワクチンにより供給される弱毒化されたウィルスの有効量は、当業界において良く知られている技法に従って決定され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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