(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌を培養して得られるβ−グルカンを含む培養物と、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体とを有効成分として含有することを特徴とする皮膚用保湿剤。
【請求項２】
前記β―グルカンはβ−１，３−１，６−グルカンである、請求項１に記載の皮膚用保湿剤。
【請求項３】
固形分中に、前記培養物をβ−グルカン換算で１〜４０質量％含有し、かつ前記乳酸菌の加熱処理菌体を４〜９５質量％含有する、請求項１又は２に記載の皮膚用保湿剤。
【請求項４】
前記培養物は、アウレオバシジウム プルランス M-1（Aureobasidium pullulans M-1）（FERM P-19213）を培養して得られる培養物である、請求項１〜３のいずれか一つに記載の皮膚用保湿剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、β−グルカン、特にβ−１，３−１，６−グルカンを含む素材と乳酸菌の加熱処理菌体とを有効成分として含有する皮膚用保湿剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
皮膚は、表皮、真皮、皮下組織の３層からなり、表皮は更に角質層、顆粒層、有棘層、基底層の４層からなっている。そして、基底層で生まれた皮膚細胞は、徐々に皮膚の表面へ移行し、最終的にアカとなってはがれ落ちる。また、排泄された汗や皮脂が皮膚の表面で皮脂膜を作り、皮膚を紫外線等の対外刺激からガードするバリアの役目を果たしている。
【０００３】
健康な肌はしっとりと潤った状態となっているが、これは、皮脂膜と角質層が一体となって対外刺激から肌を守り、角質層の水分を維持しているためである。
【０００４】
しかし、湿度・気温の低下、紫外線、冷暖房による影響、新陳代謝機能の低下等の様々な原因により、皮膚細胞の生まれ変わりのリズムが狂ったり、十分な皮脂膜が形成されないと、肌に必要な水分が保てなくなり、カサついたり、肌荒れが起こるようになる。
【０００５】
そのため、皮膚表面の水分を調節して肌の乾燥を防ぐために様々な保湿剤が提案されている。従来、保湿成分としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、その他の多価アルコールをはじめ、油脂成分、アミノ酸、蛋白質、多糖類、ムコ多糖類等が利用されているが、中でもβ−グルカンを使用したものとして、例えば、下記特許文献１には、結合様式β−１，３−１，６−グルカンを含有する化粧品等の添加剤が開示されている。そして、β−１，３−１，６−グルカンを水溶液にして、そのまま皮膚や毛髪に塗布すると、従来の化粧料、整髪料、軟膏添加材に比べて皮膚や毛髪面の皮膜形成性、保湿性が優れていることが記載されている。
【０００６】
また、下記特許文献２には、微生物により生産される少なくとも１種の細胞外ホモ多糖、又は該細胞外ホモ多糖と少なくとも１種のアミノ酸とを含むことを特徴とする入浴剤が開示されている。そして、前記細胞外ホモ多糖の構成糖がβ−Ｄ-グルコースであること、前記β−Ｄ-グルコースが、オーレオバシジウム属に属する微生物により生産されるβ−１，３−１，６−グルカンであることが記載されている。
【０００７】
また、下記特許文献３には、β−１，３−１，６−グルカン及びリンゴ抽出物を含有する組成物からなる皮膚塗布剤が開示されている。
【０００８】
【特許文献１】
特開昭６２−２０５００８号公報
【特許文献２】
特開平１０−３１０５１５号公報
【特許文献３】
特開２００２−３３５９２６号公報
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、化学合成の保湿成分は特に安全性の点で不安があるため、その使用は好ましいものとは言えない。また、天然物由来の保湿成分は、保湿効果の持続性や使用感等の点で十分満足できるものではなかった。
【００１０】
例えば、上記特許文献１、２に記載されているように、β−１，３−１，６−グルカンを単独で用いた場合、一時的な保湿効果は得られるものの、その効果は長続きしなかった。
【００１１】
また、上記特許文献３に記載されているように、β−１，３−１，６−グルカンと馬油を併用した場合は、べたつきを生じたり油っぽくなるなど、使用感があまりよくなかった。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、保湿効果の持続性や使用感に優れ、かつ安全性の高い皮膚用保湿剤を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するため、本発明の皮膚用保湿剤は、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌を培養して得られるβ−グルカンを含む培養物と、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体とを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１４】
本発明によれば、β−グルカンを含有する素材と、乳酸菌の加熱処理菌体とを含むので、これらの成分の相乗効果により、保湿効果の持続性や使用感に優れた皮膚用保湿剤を提供できる。また、上記各成分は飲食品等に利用されている天然物由来の成分であるため安全性も高い。更にまた、エンテロコッカス・フェカリスは、ラクトバチルスやビフィズス菌等の他の乳酸菌に比べて、菌体の大きさが小さいため、添加質量当たりの菌体数が多くなり、効率よく保湿効果を高めることができる。
【００１５】
本発明においては、前記β―グルカンはβ−１，３−１，６−グルカンであることが好ましい。この態様によれば、保湿効果だけでなく、アトピー性皮膚炎等のアレルギー症状の低減効果も期待できる。
【００１６】
また、固形分中に、前記培養物をβ−グルカン換算で１〜４０質量％含有し、かつ前記乳酸菌の加熱処理菌体を４〜９５質量％含有することが好ましい。この態様によれば、より保湿効果の持続性に優れた皮膚用保湿剤を得ることができる。
【００１８】
更にまた、前記培養物は、アウレオバシジウム プルランス M-1（Aureobasidium pullulans M-1）（FERM P-19213）を培養して得られる培養物であることが好ましい。この態様によれば、β−１，３−１，６−グルカンをより簡単に調製することができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明においてβ−グルカンとは、グルコースから構成される多糖類のうち、グルコースがβ型の構造で結合したものをいい、β−１，３−グルカン、β−１，６−グルカン、β−１，３−１，６−グルカン等が例示できる。好ましくはβ−１，３−１，６−グルカンが例示でき、特に好ましくはグルコースがβ−１，３結合した主鎖からβ−１，６結合でグルコースが分岐した構造を有するグルカンが例示できる。β−１，３−１，６−グルカンは、抗アレルギー作用、抗炎症作用等の様々な生理活性を有していることが知られており、保湿効果以外にも、例えば、アトピー性皮膚炎等のアレルギー症状の低減効果も期待できる。
【００２２】
本発明において、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌としては、例えば、特開昭５７−１４９３０１号公報、特公平５−４０６３号公報、特開２００２−３３５９２６号公報等に記載された菌株を用いることができるが、アウレオバシジウム プルランス M-1（Aureobasidium pullulans M-1、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター寄託番号FERM P-19213）が好ましく用いられる。これらのアウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌の細胞壁や該菌を培養して得られる培養物には、β−１，３−１，６−グルカンを主成分とするβ−グルカンが含まれている。
【００２３】
アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌からβ−１，３−１，６−グルカンを主成分とするβ−グルカンを調製する方法は、公知の方法（特開昭５７−１４９３０１号公報等参照）に準じて行うことができる。すなわち、炭素源（ショ糖）０．５〜１．０質量％、Ｎ源０．１質量％、その他の微量物質（例えば、ビタミン類、無機質）を加えた培地（ｐＨ５．２〜６．０）に菌を接種し、温度２０〜３０℃で２〜３日間通気培養、好ましくは通気撹拌培養すればよい。β−１，３−１，６−グルカンが生成されるにしたがって培養液の粘度が上昇し、粘性の高いジェル状になる。このようにして得られる培養液には、通常、０．６〜１．８質量％の固形分が含まれており、該固形分中にはβ−１，３−１，６−グルカンが５〜８０質量％含まれている。
【００２４】
本発明においては、上記培養液中に含まれるβ−グルカンを、エタノール沈殿等の公知の方法により精製してもよいが、培養液をそのまま用いるほうが好ましい。上記培養液には、β−グルカンだけでなく、例えば、β−グルカンの吸収を助ける成分であるリン、カリウム、マグネシウム、ビタミンＣ、オレイン酸、リノール酸等の他の有用成分も含まれており、β−グルカンの有する他の生理活性効果も期待できる。
【００２５】
上記培養液をそのまま用いる場合は、培養液を必要に応じて適宜濃縮した後、加熱又は加圧加熱殺菌して用いてもよく、遠心分離等により菌体を分離除去した後殺菌して用いてもよい。本発明においては、固形分中にβ−１，３−１，６−グルカンを好ましくは１質量％以上、より好ましくは５質量％以上含む培養液が用いられる。なお、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌の培養物は、増粘安定剤等の食品添加物として使用されているものであり、安全性は高い。
【００２８】
なお、上記アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌の培養物に含まれるβ−１，３−１，６−グルカンの定量は、特公平３−４８２０１号公報に記載された方法に準じて行うことができる。すなわち、培養終了後、培養液を殺菌して、遠心分離して菌体を除去した溶液に、クロロホルム／ブタノール混合液を１０％加えて振とう（Sevage法）した後、遠心処理してクロロホルムと不溶物を除去する。この操作を２回繰り返した後、エタノール沈殿により、沈殿物を回収して蒸留水に溶解し、酵素処理により、プルランを分解し、蒸留水中で透析を行い、透析液をエタノール沈殿して、沈殿物（β−１，３−１，６−グルカン）を回収して収量を求めればよい。
【００２９】
また、本発明において、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体とは、該乳酸菌を加熱処理して得られる死菌体である。この乳酸菌の加熱処理菌体は、例えば、該乳酸菌を、ロゴサ培地にて３０〜４５℃、１２〜７２時間培養し、遠心分離等の適当な手段で菌体を分離、回収して水洗、濃縮し、８０〜１１５℃、３０分〜３秒間加熱処理した後、噴霧乾燥、凍結乾燥等の適当な手段によって乾燥することにより得ることができる。
本発明においては、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis、例えば、ATCC 19433、ATCC 14508、ATCC 123655、IFO 16803等）が好ましく用いられる。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）は、ラクトバチルスやビフィズス菌等の他の乳酸菌に比べて、菌体の大きさが小さいため、添加質量当たりの菌体数が多くなり、効率よく保湿効果を高めることができる。また、この乳酸菌は、耐塩性が高く、高濃度で培養が可能であるため、低コストで高い収量が得られる。
【００３３】
本発明の皮膚用保湿剤は、例えば、菌体を除去せずに、あるいは菌体を除去した後殺菌したアウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌の培養液に、上記乳酸菌の加熱処理菌体粉末を混合して、均一に分散させることにより得ることができる。なお、必要に応じて上記成分以外に、グリセリン、ヒアルロン酸、トレハロース、リポソーム等を含むことができる。
【００３４】
本発明の皮膚用保湿剤は、固形分中に、上記培養物をβ−グルカン（好ましくはβ−１，３−１，６−グルカン）換算で１〜４０質量％含有し、かつ上記乳酸菌の加熱処理菌体を４〜９５質量％含有することが好ましく、上記培養物をβ−グルカン換算で２〜４０質量％含有し、かつ上記乳酸菌の加熱処理菌体を１０〜９５質量％含有することがより好ましく、上記培養物をβ−グルカン換算で３〜４０質量％含有し、かつ上記乳酸菌の加熱処理菌体を３０〜９５質量％含有することが特に好ましい。アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌を培養して得られるβ−グルカンを含む培養物の配合量が少なすぎると十分な保湿効果が得られず、多すぎると製品の流動性（のびやすさ）が低下し、使用感が低下する。また、乳酸菌の加熱処理菌体の配合量が少なすぎると十分な保湿効果の持続性が得られず、多すぎると製品中での分散性が低下し、均一な製品を得ることができない。
【００３５】
なお、上記β−グルカンを含有する素材と、上記乳酸菌の加熱処理菌体とを併用することにより、保湿効果の持続性が向上する理由は明確には分からないが、例えば、乳酸菌の加熱処理菌体が担体となって、β−グルカンや水分を保持していることが考えられる。
【００３６】
本発明の皮膚用保湿剤は、そのまま化粧水や化粧液として用いてもよく、各種皮膚用化粧品（例えば、乳液、クリーム、パック等）に配合して用いてもよい。該皮膚用保湿剤の皮膚用化粧品への配合量は、０．５〜５０質量％が好ましく、５〜２０質量％がより好ましい。
【００３７】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。なお、以下の説明において、特に断りのない限り、「％」は「質量％」を表す。
【００３８】
実施例
（１）アウレオバシジウムの培養
アウレオバシジウム プルランス M-1（Aureobasidium pullulans M-1）（FERM P-19213）の前培養液を、ショ糖１％、アスコルビン酸０．２％、米糠０．２％を含む液体培地（ｐＨ５．３）に適量接種して、２５℃、２日間、通気撹拌培養を行った。培養終了後、この培養液を１２１℃、１５分間殺菌した。この培養液は固形分１質量％であり、該固形分中に３５質量％のβ−１，３−１，６−グルカンを含んでいた。
【００３９】
（２）エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の培養
エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis、IFO 16803）を、ロゴサ培地で３７℃、２４時間培養した前培養液を、酵母エキス４％、ポリペプトン３％、乳糖１０％を含む液体培地に適量接種し、ｐＨスタットを用いてｐＨ６．８〜７．０に苛性ソーダ水溶液で調整しながら３７℃、２２〜２４時間中和培養を行った。
【００４０】
培養終了後、連続遠心機で菌体を分離、回収した後、水を加えて元の液量まで希釈して再度連続遠心機で菌体を分離、回収した。この操作を合計４回繰り返して菌体を洗浄した。次いで、洗浄した菌体を適量の水に懸濁し、１００℃、３０分間殺菌した後、スプレードライヤーを用いて菌体を乾燥して加熱処理菌体粉末を調製した。
【００４１】
（３）保湿効果の確認
上記（１）で得られたアウレオバシジウム培養培養液及び上記（２）で得られたエンテロコッカス・フェカリスの加熱処理菌体粉末を用いて、下記に示す被験サンプルを調製し、５名の女性ボランティア（２０代２名、３０代、４０代、５０代各１名）による保湿効果の確認試験を行った。
【００４２】
・被験サンプル
１：アウレオバシジウム培養液のみ
２：エンテロコッカス・フェカリス加熱処理菌体１％水懸濁液
３：エンテロコッカス・フェカリス加熱処理菌体１％含有アウレオバシジウム培養液
４：水（対照）
各被験者は、測定部位（前腕内側屈曲部より５ｃｍ下の幅３ｃｍ×長さ１０ｃｍの範囲）を石鹸で洗浄した後、温度１８〜２０℃、湿度５０〜５５％に調整された恒温恒湿条件下の室内で２０分間安静にしてもらった。そして、上記測定部位を４つに区分けし、各区に上記被験サンプル１〜４をそれぞれ１０μｌ塗布した後、表皮角質層水分量（皮表コンダクタンスμＳ）を、高周波インピーダンス法を応用した表皮角質層水分量測定装置「ＳＫＩＮＣＯＮ−２００」（商品名、アイ・ビイ・エス株式会社製）を用いて各区を経時的に測定した。なお、表皮角質層水分量の測定は、被験サンプル塗布５分前（−５分）、塗布直後（０分）、塗布後１０、２０、３０、６０分に行った。その結果を図１〜５に示す。なお、図１〜５において、１〜４はそれぞれ被験サンプル１〜４に対応する。
【００４３】
図１〜５から、被験サンプル３を塗布した場合、被験サンプル１、２に比べて、塗布後時間が経過しても、表皮角質層水分量が高く維持されており、保湿効果が持続していることが分かる。また、被験者に使用感をアンケートしたところ、べたつきや油っぽさもなく、使用感もよいとのことであった。
【００４４】
【発明の効果】
以上説明したように本発明によれば、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する菌を培養して得られるβ−グルカンを含む培養物と、乳酸菌エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）の加熱処理菌体とを有効成分として含有させることにより、保湿効果の持続性や使用感に優れ、かつ安全性の高い皮膚用保湿剤を提供することができる。
【００４５】
この皮膚用保湿剤は、そのまま化粧水や化粧液として用いることもでき、各種皮膚用化粧品に配合して用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  被験者１（２０代女性）における表皮角質層水分量（皮表コンダクタンスμＳ）の経時的変化を測定した結果を示す図である。
【図２】  被験者２（２０代女性）における表皮角質層水分量（皮表コンダクタンスμＳ）の経時的変化を測定した結果を示す図である。
【図３】  被験者３（３０代女性）における表皮角質層水分量（皮表コンダクタンスμＳ）の経時的変化を測定した結果を示す図である。
【図４】  被験者４（４０代女性）における表皮角質層水分量（皮表コンダクタンスμＳ）の経時的変化を測定した結果を示す図である。
【図５】  被験者５（５０代女性）における表皮角質層水分量（皮表コンダクタンスμＳ）の経時的変化を測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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