(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
【化１】
0003872105.tif 000013
（式中、
Ａ21位のXaaは、Lys、ArgおよびCys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸である；
Ｂ1、Ｂ2、Ｂ3、Ｂ26、Ｂ27、Ｂ28およびＢ29位のXaaは、それぞれ独立して、Cys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸であるか、または欠失している；
Ｂ30位のXaaは、Cys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸、CysもしくはArgを含まないジペプチド、CysもしくはArgを含まないトリペプチド、CysもしくはArgを含まないテトラペプチドであるか、または欠失している；そして、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸のアミノ基には、負に荷電しうる基を任意に含有する、ＣＨ3（ＣＨ2）nＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯ−（式中、ｎは9〜15の整数である）、ＣＨ3（ＣＨ2）rＣＯ−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2）2ＣＯ−（式中、ｒは9〜15の整数である）及びＣＨ3（ＣＨ2）sＣＯ−ＮＨＣＨ（（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ）ＣＯ−（式中、ｓは9〜15の整数である）から成る群から選択される炭素数１２〜４０の親油性基Ｗが結合しているか、あるいは、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基には、負に荷電しうる基を任意に含有する、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2）4ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）mＣＨ3（式中、ｍは８〜１８の整数である）、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2）4ＮＨ−ＣＯＣＨ（（ＣＨ2）2ＣＯＯＨ）ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）pＣＨ3（式中、ｐは10〜16の整数である）及び−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2）4ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）qＣＨ3（式中、ｑは10〜16の整数である）から成る群から選択される炭素数１２〜４０の親油性基Ｚが結合しており（ただし、Ｂ1、Ｂ2およびＢ3位のアミノ酸が1以上欠失している場合には、Ｎ末端アミノ酸の番号は、常に番号７が割り当てられるCysB7から数えて算出し）、そして
（ａ）Ｂ1−Ｂ2−Ｂ3がPhe−Val−Asn、そしてＡ21がAsn、そしてＢ26−Ｂ27−Ｂ28−Ｂ29−Ｂ30がTyr−Thr−Pro−Lys−ThrまたはTyr−Thr−Pro−Lys−Alaの場合には、前記ＷまたはＺは、負に荷電しうる基を常に含有し、そして
（ｂ）Ｂ29および／又はＢ30が欠失しており、そして前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に存在しており、そしてＢ1、Ｂ2およびＢ3のいずれもが欠失していない場合には、Ｂ1−Ｂ2はPhe−Valと異なるか、あるいは、Ｂ26−Ｂ27−Ｂ28はTyr−Thr−Proと異なるか、あるいはＢ1−Ｂ2およびＢ26−Ｂ27−Ｂ28は共に前記配列と異なり、そして
（ｃ）Ｂ29および／又はＢ30が欠失しており、そして前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に存在しており、そしてＢ1、Ｂ2およびＢ3の1つが欠失している場合には、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸はValと異なるか、あるいは、配列Ｂ26−Ｂ27−Ｂ28はTyr−Thr−Proと異なるか、あるいは、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸および配列Ｂ26−Ｂ27−Ｂ28は共に、それぞれ、ValおよびTyr−Thr−Proと異なる）
で表されるインスリン誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のインスリン誘導体であって、前記親油性基ＷがＢ鎖中のＮ末端アミノ酸のアミノ基に結合しているインスリン誘導体。
【請求項３】
請求項１に記載のインスリン誘導体であって、前記親油性基ＺがＢ鎖中のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基に結合しているインスリン誘導体。
【請求項４】
前記請求項のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ａ21位のXaaが、Ala、Asn、Gln、Glu、GlyおよびSerよりなる群から選ばれるアミノ酸を示すインスリン誘導体。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ1位のXaaがPheを示すかまたは欠失しているインスリン誘導体。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ2位のXaaがAlaまたはValを示すインスリン誘導体。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ3位のXaaが、Asn、Gln、GluおｙびThrよりなる群から選ばれるアミノ酸を示すインスリン誘導体。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ26位のXaaがTyrを示すインスリン誘導体。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ27位のXaaがThrを示すインスリン誘導体。
【請求項１０】
請求項１〜３項のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ28位のXaaがProを示すインスリン誘導体。
【請求項１１】
請求項１〜３項のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ29位のXaaがLysまたはThrを示すインスリン誘導体。
【請求項１２】
請求項１〜３項のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ30位のXaaがThrまたはε−アシル化Lysを示すインスリン誘導体。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ30位のXaaが欠失しているインスリン誘導体。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ28位のXaaがLysを示し、前記Ｂ29位のXaaがProを示すインスリン誘導体。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｂ28位のXaaがProを示し、前記Ｂ29位のXaaがThrを示すインスリン誘導体。
【請求項１６】
請求項２に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｗがアミド結合を介してＮ末端アミノ酸のアミノ基に結合しているインスリン誘導体。
【請求項１７】
請求項16に記載のインスリン誘導体であって、前記ＷがＣＨ3（ＣＨ2）nＣＨ（ＣＯＯＨ）ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）2ＣＯ−であり、ｎが9〜15の整数であるインスリン誘導体。
【請求項１８】
請求項３に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｚがアミド結合を介してＣ末端アミノ酸のカルボキシル基に結合しているインスリン誘導体。
【請求項１９】
請求項18に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｚが−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ2）4ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ2）mＣＨ3であり、ｍが８〜１８の整数であるインスリン誘導体。
【請求項２０】
請求項19に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｚが結合している親インスリンがThrB29ヒトインスソンであるインスリン誘導体。
【請求項２１】
請求項19に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｚが結合している親インスリンがデス（Ｂ28−Ｂ30）ヒトインスリンであるインスリン誘導体。
【請求項２２】
請求項19に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｚが結合している親インスリンがデス（Ｂ27−Ｂ30）ヒトインスリンであるインスリン誘導体。
【請求項２３】
請求項19に記載のインスリン誘導体であって、前記Ｚが結合している親インスリンがデス（Ｂ26−Ｂ30）ヒトインスリンであるインスリン誘導体。
【請求項２４】
請求項１に記載のインスリン誘導体であって、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸がε−アシル化Lysであり、Ｃ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸がGlyであるインスリン誘導体。
【請求項２５】
糖尿病の治療を要する患者における糖尿病の治療のための薬学的組成物であって、請求項1に記載のインスリン誘導体の治療的有効量と薬学的に許容される担体とを含んでなる薬学的組成物。
【請求項２６】
糖尿病の治療を要する患者における糖尿病の治療のための薬学的組成物であって、作用発現が迅速なインスリンまたはインスリン類縁体と混合された請求項１に記載のインスリン誘導体の治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを含んでなる薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、持続性作用特性を有する可溶性の新規ヒトインスリン誘導体、そのような誘導体の製造法、それを含有する薬学的組成物、およびそのようなインスリン誘導体の糖尿病治療における用途に関する。
発明の背景
基本的な必要性を満たす１回または２回の持続性インスリンの注射と、食事に伴って必要となる迅速作用性インスリンの補充的な適用量注射からなる投与計画の下、多数の糖尿病患者が、１日に複数回のインスリン投与による治療を受けている。
持続性インスリン組成物は当該分野でよく知られている。例えば、持続性インスリン組成物の１つの主要タイプとしては、インスリン結晶または無晶性インスリンの注射可能な水性懸濁剤などが挙げられる。これらの組成物で典型的に使用されるインスリン化合物は、プロタミンインスリン、亜鉛インスリンまたはプロタミン亜鉛インスリンである。
インスリン懸濁剤の使用には、欠点が伴う。例えば、正確な投与を保証するためには、一定容量の懸濁液をバイアルから取り出したり、カートリッジから発射する前に、インスリン粒子を穏やかな攪拌により均一に懸濁しなければならない。また、インスリンの保存では、塊の形成や凝固を避けるため、インスリン溶液の場合よりも狭い温度範囲内に維持しなければならない。
最初はプロタミンは非免疫原性だと考えられていたが、現在ではプロタミンはヒトで免疫原性となる場合があり、医学的目的にそれを使用すると抗体が産生されうることが判明している（Samuelら，Studies on the immunogenicity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol. 33, pp. 252-260（1978））。
また、プロタミン−インスリン複合体自体が免疫原性であるという証拠も見出されている（Kurtzら，Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins. Diabetologica 25, pp. 322-324（1983））。したがって、患者によっては、プロタミンを含有する持続性インスリン組成物の使用を避けなければならない。
もう１つのタイプの持続性インスリン組成物は、生理的ｐＨ未満のｐＨ値を有する溶液であるが、その溶液を注入するとｐＨ値の上昇によりインスリンが該溶液から析出してしまう。１つの欠点は、インスリンの固体粒子が局所刺激物として作用し、注射部位組織の炎症を引き起こすことである。
WO91/12817（Novo Nordisk A/S）は、コバルト（III）のインスリン複合体よりなる持続性可溶性インスリン組成物を開示している。これらの複合体の持続性は中間的であるにすぎず、バイオアベイラビリティーが減少する。
ヒトインスリンは、３つの一級アミノ基、すなわち、Ａ鎖およびＢ鎖のＮ末端基およびLysB29のε−アミノ基を有する。これらの基の１以上が置換されているいくつかのインスリン誘導体が、先行技術において公知である。例えば、米国特許第3,528,960号（Eli Lilly）は、インスリン分子の１、２または３つの一級アミノ基がカルボキシアロイル基を有するＮ−カルボキシアロイルインスリンに関する。特異的にNεB29−置換されたインスリンは開示されていない。
英国特許第1.492.997号（Nat. Res. Dev. Corp.）によれば、NεB29にカルバミル置換を有するインスリンは、改善された血糖低下作用特性を有することが判明している。
日本国特許出願公開第1−254699号（Kodama Co., Ltd.）は、PheB1のアミノ基またはLysB29のε−アミノ基またはこれらの両方に脂肪酸が結合したインスリンを開示している。その誘導体化の目的は、薬理学的に許容される安定なインスリン製剤を得ることだと記載されている。
ヌクレオチドトリプレットに必ずしもコードされない少なくとも５つの炭素原子を有するアミノ酸をＢ30位に有するインスリンが、日本国特許出願公開第57−067548号（Shionogi）に記載されている。このインスリン類縁体は、糖尿病の治療において、特に、ウシまたはブタインスリン抗体産生によりインスリン抵抗性の患者において有用だと主張されている。
米国特許第5,359,030号（Ekwuribe, Protein Delivery, Inc.）には、経口または非経口投与用の共役安定化ポリペプチド組成物が記載されており、これは、直鎖状ポリアルキレン部分および親油性部分を含むポリマーと共有結合しているポリペプチドよりなり、該ポリペプチドのインビボでの酵素分解抵抗性が向上するようそれらの部分が互いに関連して配置されている。
EP 511600 A2は、例えば、式：[タンパク質][Ｚ]n〔式中、[タンパク質]は、アミノ基の代わりに、水素原子の１つを除くことによりアミノ基からそれぞれ誘導されるｎ個のアミノ残基を有するタンパク質を示し、[Ｚ]は、式−CO−W−COOH（Ｗは、ある種のヘテロ原子を含有していてもよい２価の長鎖炭化水素基であり、ｎは[Ｚ]と[タンパク質]との間のアミド結合数の平均を示す）で表される残基である〕で表されるタンパク質誘導体に関する。該発明のタンパク質誘導体は、元のタンパク質と比較して非常に延長された血清半減期を有し、抗原性を示さないと記載されている。また、インスリンが、該発明の誘導体を製造しうる起源タンパク質の１つであるとは記載されているが、EP511600には、具体的なインスリン誘導体は開示されていないし、好ましい[Ｚ]も、有用なインスリン誘導体を得るために[Ｚ]を導入すべき好ましい位置も何ら示されていない。
本明細書中、インスリンなる語を総称的または一般的な意味で用いる場合はいつでも、天然のインスリンおよびインスリン類縁体およびそれらの誘導体の全てを包含する意である。本明細書中で使用する「インスリン誘導体」は、CysA7とCysB7との間、およびCysA20とCysB19との間にジスルフィド架橋を、また、CysA6とCysA11との間に内部ジスルフィド架橋を含みインスリン活性を有する、ヒトインスリンと類似した分子構造を有するポリペプチドを意味する。
しかしながら、注射後に溶液中に残存し炎症性および免疫原性が最小のインスリンを含有する、注射可能な溶液の持続性インスリン組成物が依然として必要とされている。
本発明の１つの目的は、生理的ｐＨ値で可溶性であり、持続性作用特性を有するヒトインスリン誘導体を提供することである。
本発明のもう１つの目的は、本発明のヒトインスリン誘導体を含んでなる薬学的組成物を提供することである。
さらに、本発明のヒトインスリン誘導体の製造法を提供することも本発明の目的である。
発明の概要
驚くべきことに、Ｂ鎖のＮ−末端アミノ酸のアミノ基に炭素数12〜40の親油性置換基が結合しているか、あるいはＢ鎖のＣ−末端アミノ酸のカルボン酸基に炭素数12〜40の親油性置換基が結合している、ある種のインスリン誘導体が、持続性作用特性を有し生理的ｐＨ値で可溶性であることが判明した。
したがって、本発明は、その最も広い態様において、以下の配列を有するインスリン誘導体に関する：
0003872105.tif 000002
（式中、
A21位のXaaは、Lys、ArgおよびCys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸である；
B1、B2、B3、B26、B27、B28およびB29位のXaaは、それぞれ独立して、Cys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸であるか、または欠失している；
B30位のXaaは、Cys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸、CysもしくはArgを含まないジペプチド、CysもしくはArgを含まないトリペプチド、CysもしくはArgを含まないテトラペプチドであるか、または欠失している；そして、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸のアミノ基には、負に荷電しうる基を任意に含有する炭素数１２〜４０の親油性基Ｗが結合しているか、あるいは、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基には、負に荷電しうる基を任意に含有する炭素数１２〜４０の親油性基Ｚが結合しており（ただし、B1、B2およびB3位のアミノ酸が１以上欠失している場合には、Ｎ末端アミノ酸の番号は、常に番号７が割り当てられるCysB7から数えて算出し）、そして
（ａ）B1−B2−B3がPhe−Val−Asn、そしてA21がAsn、そしてB26−B27−B28−B29−B30がTyr−Thr−Pro−Lys−ThrまたはTyr−Thr−Pro−Lys−Alaの場合には、前記ＷまたはＺは、負に荷電しうる基を常に含有し、そして
（ｂ）B29およびB30が欠失しており、そして前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に存在しており、そしてB1、B2およびB3のいずれもが、欠失していない場合には、B1−B2はPhe−Valと異なるか、あるいは、B26−B27−B28はTyr−Thr−Proと異なるか、あるいは、B1−B2およびB26−B27−B28は共に前記配列と異なり、そして
（ｃ）B29およびB30が欠失しており、そして前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に存在しており、そしてB1、B2およびB3の１つが欠失している場合には、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸はValと異なるか、あるいは、配列B26−B27−B28はTyr−Thr−Proと異なるか、あるいは、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸および配列B26−B27−B28は共に、それぞれ、ValおよびTyr−Thr−Proと異なる）。
好ましい態様では、本発明は、以下の配列を有するインスリン誘導体に関する：
0003872105.tif 000003
（式中、
A21位のXaaは、Lys、ArgおよびCys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸である；
B1、B2、B3、B26、B27、B28、B29位およびB30位のXaaは、それぞれ独立して、Cys以外のいずれかのコード可能なアミノ酸であるか、または欠失している；そして、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸のアミノ基には、負に荷電しうる基を任意に含有する炭素数１２〜４０の親油性基Ｗが結合しているか、あるいは、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基には、負に荷電しうる基を任意に含有する炭素数１２〜４０の親油性基Ｚが結合しており（ただし、B1、B2およびB3位のアミノ酸が１以上欠失している場合には、Ｎ末端アミノ酸の番号は、常に番号７が割り当てられるCysB7から数えて算出し）、そして
（ａ）B1−B2−B3がPhe−Val−Asn、そしてA21がAsn、そしてB26−B27−B28−B29−B30がTyr−Thr−Pro−Lys−ThrまたはTyr−Thr−Pro−Lys−Alaの場合には、前記ＷまたはＺは、負に荷電しうる基を常に含有し、そして
（ｂ）B29およびB30が欠失しており、そして前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に存在しており、そしてB1、B2およびB3のいずれもが欠失していない場合には、B1−B2はPhe−Valと異なるか、あるいは、B26−B27−B28はTyr−Thr−Proと異なるか、あるいは、B1−B2およびB26−B27−B28は共に前記配列と異なり、そして
（ｃ）B29およびB30が欠失しており、そして前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に存在しており、そしてB1、B2およびB3の１つが欠失している場合には、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸はValと異なるか、あるいは、配列B26−B27−B28はTyr−Thr−Proと異なるか、あるいは、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸および配列B26−B27−B28は共に、それぞれ、ValおよびTyr−Thr−Proと異なる）。
親油性基Ｗが、Ｂ鎖のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基に結合している場合、該α−アミノ基とＷとの結合は、好ましくは、アミド結合であり、このアミド結合では、Ｂ鎖のＮ末端アミノ基がそのアミン部分を構成し、Ｗに含有される基がそのカルボキシル部分を構成している。
親油性基Ｚが、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基に結合している場合、該カルボキシル基とＺとの結合は、好ましくは、アミド結合であり、このアミド結合では、該Ｃ末端カルボキシル基がそのカルボキシル部分を構成し、Ｚに含有されるアミノ基がそのアミン部分を構成している。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、親油性基ＷがＢ鎖のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基に結合している前記のインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、親油性基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基に結合している前記のインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、A21位のアミノ酸が、Ala、Asn、Gln、Glu、GlyおよびSerよりなる群から選ばれるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B1位のアミノ酸がPheであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B1位のアミノ酸が欠失しているインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B2位のアミノ酸が、AlaおよびValよりなる群から選ばれるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B3位のアミノ酸が、Asn、Gln、GluおよびThrよりなる群から選ばれるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B26位のアミノ酸がTyrであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B27位のアミノ酸がThrであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B28位のアミノ酸がProであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B29位のアミノ酸がLysまたはThrであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B28位のアミノ酸がLysであり、B29位のアミノ酸がProであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B30位のアミノ酸がThrまたはε−アシル化Lysであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２の30位のXaaがジペプチドThr−Lysを示すインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２の30位のXaaがジペプチドGly−Lysを示すインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２の30位のXaaがトリペプチドGlu−Ser−Lysを示すインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２の30位のXaaがトリペプチドThr−Gly−Lysを示すインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２の30位のXaaがテトラペプチドThr−Gly−Gly−Lysを示すインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２の30位のXaaがテトラペプチドThr−Glu−Gly−Lysを示すインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、配列番号２の30位のXaaがテトラペプチドGly−Asp−Thr−Lysを示すインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸がε−アシル化Lysであり、Ｃ末端アミノ酸に隣接するアミノ酸がGlyであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、親インスリンがデス（B30）インスリンであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、親インスリンがデス（B30）ヒトインスリンであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、親インスリンがデス（B28−B30）インスリンであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、親インスリンがデス（B27−B30）インスリンであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、親インスリンがデス（B26−B30）インスリンであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、B28位のアミノ酸がProであり、B29位のアミノ酸がThrであるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＷがＢ鎖のＮ末端α−アミノ基に結合しており、Ｗが一般式CH3（CH2）nCH（COOH）NH−CO（CH2）2CO−（式中、ｎは9〜15の整数である）の基であるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＷがＢ鎖のＮ末端α−アミノ基に結合しており、Ｗが一般式CH3（CH2）rCO−NHCH（COOH）（CH2）2CO−（式中、ｒは9〜15の整数である）の基であるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＷがＢ鎖のＮ末端α−アミノ基に結合しており、Ｗが一般式CH3（CH2）sCO−NHCH）（CH2）2COOH）CO−（式中、ｓは9〜15の整数である）の基であるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に結合しており、Ｚが一般式−NHCH（COOH）（CH2）4NH−CO（CH2）mCH3（式中、ｍは８〜１８の整数である）の基である、すなわち、ＺがNε−アシル化リシン残基であるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に結合しており、Ｚが一般式−NHCH（COOH）（CH2）4NH−COCH（（CH2）2COOH）NH−CO（CH2）pCH3（式中、ｐは10〜16の整数である）の基であるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に結合しており、Ｚが一般式−NHCH（COOH）（CH2）4NH−CO（CH2）2CH（COOH）NH−CO（CH2）qCH3（式中、ｑは10〜16の整数である）の基であるインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、部分的にまたは完全に水素化されているシクロペンタノフェナントレン骨格を含む前記の基Ｚを有するインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、アシル化アミノ酸、特にアシル化リシンである前記の基Ｚを有するインスリン誘導体に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に結合しているThrB29ヒトインスリンに関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に結合しているデス（B28−B30）ヒトインスリンに関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に結合しているデス（B27−B30）ヒトインスリンに関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、前記の基ＺがＢ鎖のＣ末端アミノ酸に結合しているデス（B26−B30）ヒトインスリンに関する。
もう１つの実施態様では、本発明は、糖尿病治療薬の製造のための、本発明のインスリン誘導体の使用に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、本発明のインスリン誘導体の治療的有効量と薬学的に許容される担体とを含んでなる、糖尿病の治療を要する患者における糖尿病の治療のための薬学的組成物に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、作用発現が迅速なインスリンまたはインスリン類縁体と混合された本発明のインスリン誘導体の治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを含んでなる、糖尿病の治療を要する患者における糖尿病の治療のための薬学的組成物に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、生理的ｐＨ値で可溶性である本発明のインスリン誘導体を含んでなる薬学的組成物に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、約6.5〜8.5の間のｐＨ値で可溶性である本発明のインスリン誘導体を含んでなる薬学的組成物に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、本発明のインスリン誘導体を含んでなる持続性薬学的組成物に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、約120nmol／ml〜約1200nmol／ml、好ましくは、約600nmol／mlの、本発明によるインスリン誘導体を含有する溶液である薬学的組成物に関する。
もう１つの好ましい実施態様では、本発明は、糖尿病の治療を要する患者における糖尿病の治療方法であって、本発明のインスリン誘導体の有効量と薬学的に許容される担体とを該患者に投与することを含んでなる方法に関する。
もう１つの実施態様では、本発明は、糖尿病の治療を要する患者における糖尿病の治療方法であって、作用発現が迅速なインスリンまたはインスリン類縁体と混合された本発明のインスリン誘導体の治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを該患者に投与することを含んでなる方法に関する。
本発明の好ましいインスリン誘導体としては、例えば、以下のものが挙げられる：
（NεB30−テトラデカノイル）ThrB29，LysB30ヒトインスリン、
（NεB28−テトラデカノイル）LysB28デス（B29,B30）ヒトインスリン、
（NεB27−テトラデカノイル）LysB27デス（B28−B30）ヒトインスリン、
（NεB26−テトラデカノイル）LysB26デス（B27−B30）ヒトインスリン、
（NεB32−テトラデカノイル）GluB30，SerB31，LysB32ヒトインスリン、
（NεB29−アセチル，NεB32−テトラデカノイル）GluB30，SerB31，LysB32ヒトインスリン。
【図面の簡単な説明】
以下、添付図面に関して本発明をさらに説明する。
図１は、プラスミドpKV153、pKV159、pJB173、pJB174およびpJB175の構築を示す。
図２aは、図２bへ続く図であり、pMT742、907位〜1500位の配列、および実施例１のPCR1A、PCR1BおよびPCR1Cで使用するオリゴヌクレオチド#94、#593、#2371および#3075を示す。該138アミノ酸配列は、MFアルファプレプロ−リーダー（アミノ酸番号1−85）およびアミノ酸配列B（1−29）AlaAlaLysA（1−21）［式中、A（1−21）はヒトインスリンのＡ鎖であり、B（1−29）は、Thr（B30）を欠くヒトインスリンのＢ鎖である］を有するインスリン前駆体（アミノ酸番号86−138）に相当するものであり、コーディング配列の下に示している。
発明の詳細な説明
用語
本明細書中で用いるアミノ酸残基の３文字コードおよび１文字コードは、J. Biol. Chem. 243, p.3558（1968）に記載されているものである。
ＤＮＡ配列では、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、そしてＴはチミンである。
以下の頭文字を使用する：
ジメチルスルホキシドにはDMSO、
ジメチルホルムアミドにはDMF、
tert−ブトキシカルボニルにはBoc、
１−メチル−２−ピロリドンにはNMP、
トリフルオロ酢酸にはTFA、
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルにはX−Osu、
アシル基にはＸ、
逆相高速液体クロマトグラフィーにはRP−HPLC。
親油性インスリン誘導体の製造
本発明のインスリン誘導体は、例えば以下に記載のとおりに製造することができる。
１．例えばトレオニン（ヒトインスリン）またはアラニン（ブタインスリン）の遺伝暗号によりコードされうるB30位のアミノ酸残基で特徴づけられるインスリン誘導体
１．１  ヒトインスリンを出発原料とする、Ｎ末端アミノ基に親油性基Ｗが結合することにより修飾されたインスリン
ヒトインスリンをBoc試薬（例、ジ−tert−ブチルジカーボナート）で処理して、（A1,B29）−ジBocヒトインスリン、すなわち、Ａ鎖のＮ末端およびLysB29のε−アミノ基がBoc基で保護されているヒトインスリンを得る。必要なら、例えばHPLCにより精製し、その後、生成物を式W−Osu（式中、Ｗは、Ｂ鎖のＮ末端α−アミノ基に導入しようとする前記アシル基である）で表されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることにより、PheB1のα−アミノ基にアシル基を導入する。最終工程で、TFAを使用してBoc基を除去し、得られたNαB1−Wヒトインスリンを単離する。
２．B30位にアミノ酸残基を有さないインスリン誘導体、すなわちデス（B30）インスリン
２．１  ヒトインスリンまたはブタインスリンから出発する場合
ヒトインスリンおよびブタインスリンは共に、アンモニウム緩衝液中カルボキシペプチダーゼＡで処理すると、デス（B30）インスリンを与える。必要なら、精製した後、デス（B30）インスリンをBoc試薬（例、ジ−tert−ブチルジカーボナート）で処理して、（A1,B29）−ジBocデス（B30）インスリンを得る。必要なら、例えばHPLCにより精製し、その後、生成物を式W−Osu（式中、Ｗは、導入しようとするアシル基である）で表されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによりB1位のアミノ酸のα−アミノ基にアシル基を導入する。最終工程で、TFAを使用してBoc基を除去し、得られた（NαB1−W）デス（B30）インスリンを単離する。
２．２  一本鎖ヒトインスリン前駆体から出発する場合
一本鎖ヒトインスリン前駆体は、アルギニン残基を介してB1に結合するエクステンション（Ext）によりB1位で延長しており、また、B26、B27、B28またはB30位のＣ末端リシンからA1への架橋を有するものであり、該前駆体は出発物質として使用することができる。好ましくは、該架橋は、式Yn−Arg（式中、Ｙはシステイン、リシンおよびアルギニン以外のコード可能なアミノ酸であり、ｎはゼロまたは１〜35の整数である）で表されるペプチドである。ｎが１を上回る場合、Ｙは異なるアミノ酸を示すものであってもよい。B26、B27、B28またはB30位のLysからA1へ至る架橋の好ましい具体例は、AlaAlaArg、SerArg、SerAspAspAlaArgおよびArg（欧州特許第163529号）である。一般式Ext−Arg−B（1−Q）−Yn−Arg−A（1−21）（式中、Ｑは26、27、28または30である）で表されるそのような前駆体をリシルエンドペプチダーゼ、例えばアクロモバクター・リティクス（Achromobacter lyticus）プロテアーゼで処理すると、Ext−Arg−B（1−Q）Yn−Arg−A（1−21）インスリンが得られる。この中間体を一般式X−Osu（式中、Ｘはアシル基である）で表されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでアシル化すると、LysBQのε−アミノ基に、そしてＡ鎖およびＢ鎖のＮ末端アミノ基にアシル基Ｘが導入され、（NεBQ−X）X−Ext−Arg−B（1−Q）X−Yn−Arg−A（1−21）インスリンが得られる。この中間体を、水と適当な有機溶媒（例、DMF、DMSO、低級アルコールなど）との混合物中でトリプシン処理すると、所望の誘導体であるＺ−ヒトインスリン（式中、ＺはLysεBQ−X）が得られる。
薬学的組成物
本発明のヒトインスリン誘導体を含有する薬学的組成物は、そのような治療を要する患者に非経口的に投与してもよい。非経口投与は、シリンジ（ペン様シリンジも可）を用いて皮下、筋内または静脈内注射することにより行ってもよい。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて行うこともできる。さらに別の選択肢として、鼻スプレー形態でヒトインスリン誘導体を投与するために、組成物は、散剤または液剤とすることもできる。
本発明の化合物を含有する薬学的組成物は、例えばレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ（Remington's Pharmaceutical Sciences）、1985に記載されている通常の技術により製造してもよい。
例えば、本発明の注射可能なヒトインスリン組成物は、成分を適宜溶解し混合して所望の最終産物を得ることを含む、医薬産業の通常の技術により製造することができる。
例えば、１つの方法では、該ヒトインスリン誘導体を、製造する組成物の最終容量よりいくらか少ない一定量の水に溶解する。必要に応じて等張化剤、防腐剤および緩衝液を加え、さらに必要なら酸（例、塩酸）または塩基（例、水性水酸化ナトリウム）を用いて該溶液のｐＨ値を調整する。最終的に、該溶液の容量を水で調整して、該成分の希望の濃度とする。
等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、グリセロールなどが挙げられる。
防腐剤としては、例えば、フェノール、ｍ−クレーゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
適当な緩衝剤としては、例えば、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
本発明の個々のインスリンの好ましい薬学的組成物は、溶液六量体複合体である。典型的には、該六量体複合体は、１六量体あたり、２以上の亜鉛イオン、および３分子以上のフェノール性化合物（例、フェノールまたはメタクレーゾールまたはそれらの混合物）により安定化される。
特定の実施態様では、２つの異なるインスリン（一方は持続性作用特性を有するもの、もう一方は作用発現が迅速なもの）を含有する可溶性六量体複合体形態の組成物を提供する。典型的には、該六量体複合体は、１六量体あたり、２以上の亜鉛イオン、および３分子以上のフェノール性化合物（例、フェノールまたはメタクレーゾールまたはそれらの混合物）により安定化される。該複合体は、個々のインスリンの六量体の混合物、および混合六量体であり、その２つの異なるインスリンの比率は１：５〜５：１である。
本発明のインスリン誘導体の経鼻投与用組成物は、例えば、欧州特許第272097号（Novo Nordisk A/S）に記載されているとおりに製造してもよい。
本発明のインスリン組成物は、糖尿病の治療で使用することができる。どのような患者であれ、最適な投与レベルは、用いる具体的なヒトインスリン誘導体の効力、患者の年齢、体重、身体機能および食事などの種々の要因、他の薬物との可能な組み合わせ、および糖尿病症状の重症度に依存する。本発明のヒトインスリン誘導体の１日投与量は、公知インスリン組成物の場合と同様に、個々の各患者について当業者により決定されることが推奨される。
本発明のヒトインスリン誘導体は、適宜、他の型のインスリン、例えば、作用発現がより迅速なヒトインスリンまたはブタインスリンまたはインスリン類縁体との混合物として使用してもよい。そのようなインスリン類縁体の具体例は、例えばEP214826（Novo Nordisk A/S）、EP375437（Novo Nordisk A/S）およびEP383472（Eli Lilly＆Co.）の公開番号を有する欧州特許出願に記載されている。
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、保護範囲を限定するものではない。以上の説明および以下の実施例に開示の特徴は、独立して、また、それらのいずれかの組み合わせとして、本発明の種々の態様の認識に重要と考えられる。
実施例
プラスミドおよびＤＮＡ材料
すべての発現プラスミドはcPOTタイプのものである。そのようなプラスミドは欧州特許出願第171142号に記載されており、プラスミドの選択および安定化のためのシゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）トリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子（POT）を含有することにより特徴づけられる。POT遺伝子を含有するプラスミドは、寄託されている大腸菌（E. coli）株（ATCC39685）から入手可能である。該プラスミドは、さらに、エス・セレビシエ（S.cerevisiae）トリオースホスファートイソメラーゼプロモーターおよびターミネータ−（PTPおよびTTPI）を含有する。それらは、MFαプレプロリーダー／産物のコーディング領域を含むEcoRI−XbaI制限部位で区切られる領域を除き、pMT742（Egel−Mitani，Mら，Gene 73（1988）113−120）（図１参照）と同一である。pMT742自体のEcoRI／XbaI断片は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の接合因子（MF）アルファプレプロ−リーダー配列に続いて、B29とA1とを接続するAla−Ala−Lys架橋を有するインスリン前駆体MI3（すなわち、B（1−29）−Ala−Ala−Lys−A（1−21））（図２参照）をコードする。
ホスホルアミダイト化学法および商業的に入手可能な試薬を用いて、自動ＤＮＡ合成装置（Applied Biosystems model 380A）上で合成ＤＮＡ断片を合成した（Beaucage, S.L.およびCaruthers, M.H., Tetrahedron Letters 22（1981）1859-1869）。
他のすべての方法および材料においては、一般的な最新技術の知見を用いた（例えばSambrook, J., Fritsch, E.F.およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989を参照されたし）。
分析
製造したインスリン前駆体の分子量は、Bio−Ion20装置（Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Sweden）を用いるプラズマ脱離質量分析（PDMS）またはAPI IIIバイオモレキュラー・マス・アナライザー（Perkin Elmer Sciex Instruments, Thornhill, Canada）を用いるエレクトロスプレー質量分析（ESMS）のいずれかによる質量分析（MS）により測定した。
ヒトインスリンに対するインスリン誘導体の親油性k'relを、LiChrosorb▲Ｒ▼RP18（５μm，250×４mm）HPLCカラム上、Ａ）10％アセトニトリルを含有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液，pH7.3およびＢ）水中の50％アセトニトリルの混合物を用いて40℃で無勾配溶出することにより測定した。該溶出は、溶出液の214nmでの吸収によりモニターした。空隙時間tOは、0.1mM硝酸ナトリウムを注入することにより確認した。ヒトインスリンの保持時間tヒトは、Ａ溶液とＢ溶液との比率を変化させることにより、少なくとも2tOに調整した。k'relは、（t誘導体−t0）／（tヒト−t0）と定義される。
本発明化合物の持続性の基準として、ブタでの消失速度を調べ、T50%を求めた。T50%は、外部γ−カウンターで測定した場合、A14 Tyr（125Ｉ）標識類縁体の50％が注射部位から消失する時間である（Ribel, U.ら，The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man. In: M. serrano-RiosおよびP.J. Lefebre（編）: Diabetes 1985; Proceedings of the 12th Congress of the International Diabetes Federation, Madrid, Spain, 1985（Excerpta Medica, Amsterdam,（1986）891-96））。
実施例１
エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）MFアルファプレプロ−リーダーを用いる酵母株yKV153からのGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−29）−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の合成。
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003872105.tif 000004
ジーン・アンプ（Gene Amp）PCR試薬キット（Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, CT, USA）を製造業者の指示に従い使用して、以下の２つのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った（図２参照）。
PCR1A：
0.2μlのpMT742プラスミド鋳型
4.0μlのオリゴヌクレオチド#593（100pmol）
4.0μlのオリゴヌクレオチド#94（100pmol）
10.0μlの10×PCR緩衝液
10.0μlの2.5mM d NTP
0.5μlのTaqポリメラーゼ酵素
71.3μlの水
PCR1B：
0.2μlのpMT742プラスミド鋳型
4.0μlのオリゴヌクレオチド#3075（100pmol）
4.0μlのオリゴヌクレオチド#2371（100pmol）
10.0μlの10×PCR緩衝液
10.0μlの2.5mM d NTP
0.5μlのTaqポリメラーゼ酵素
71.3μlの水
どちらの場合も、「94℃で１分間45℃で１分間および72℃で１分間」を２サイクル、ついで「94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で１分間」のを１１サイクル行った。
20μlの各PCR混合物を２％アガロースゲル上にローディングし、標準的な方法（Sambrookら，Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989）を用いて電気泳動に付した。生じたＤＮＡ断片（PCR1Aから452bpおよびPCRB1から170bp）を該アガロースゲルから切り出し、ジーン・クリーン（Gene Clean）キット（Bio101 Inc., PO BOX 2284, La Jolla, CA, USA）を製造業者の指示に従い使用して単離した。精製されたＤＮＡ断片を100μlの水に溶解した。
以下のPCRを行った。
PCR1C：
PCR1AからのＤＮＡ断片1.0μl
PCR1BからのＤＮＡ断片1.0μl
10.0μlの10×PCR緩衝液
10.0μlの2.5mM d NTP
0.5μlのTaqポリメラーゼ酵素
69.5μlの水
「94℃で１分間、45℃で１分間および72℃で１分間」を２サイクル行った。
ついで、４μlのオリゴヌクレオチド#94（100pmol）および4.0μlのオリゴヌクレオチド#2371（100pmol）を加え、「94℃で１分間、55℃で１分間および72℃で１分間」を15サイクル行った。
該PCR混合物を１％アガロースゲル上にローディングし、記載されているとおりにジーン・クリーン・キットを用いて、生じた594bp断片を精製した。精製されたPCR ＤＮＡ断片を20μlの水および制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解し、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびXbaI（New England Biolabs, Inc. MA, USA）で切断した。得られた550bpのEcoRI／XbaI制限断片をアガロースゲル上で移動させ、ジーン・クリーン・キットを用いて単離し精製した。
２つの独立した制限エンドヌクレアーゼ消化において、プラスミドpMT742を、ｉ）制限エンドヌクレアーゼApaIおよびXbaIおよびii）制限エンドヌクレアーゼApaIおよびEcoRIで切断した。これらの消化物から、8.6kbのApaI／XbaI制限断片および2.1kbのApaI／EcoRI制限断片を単離した。
その３つの断片（すなわち、PCR1Cからの550bp EcoRI／XbaI制限断片およびpMT742からの8.6kb ApaI／XbaI制限断片および2.1kb ApaI／EcoRI制限断片）を、T4 ＤＮＡリガーゼおよび標準的な条件（Sambrookら，Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989）を用いて連結した（図１参照）。該連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Apr-）中に形質転換し、ついでアンピシリン耐性に関して選択した。得られた大腸菌コロニーから、標準的なＤＮＡミニプレップ法（Sambrookら，Molecular cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989）を用いてプラスミドを単離し、適当な制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、EcoRI、ApaIおよびXbaI）で確認した。ＤＮＡ配列決定分析（U.S. Biochemical CorpからのSequenaseキットを製造業者の推奨に従い使用することによる）により、pKV153と称される選択されたプラスミドは、MFアルファプレプロ−リーダー／Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−29）−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体をコードする正確な配列を含有することが示された。
公開第214826号の欧州特許出願に記載のとおり、pKV153をエス・セレビシエ（S. cerevisiae）株MT663中に形質転換し、グルコース上での増殖に関して選択した。
得られた酵母株をyKV153と称することにし、該酵母株がGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−29）−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体を培地中に産生することをHPLCおよび質量分析により確認した。
実施例２
LysB30（Nε−テトラデカノイル）ThrB29ヒトインスリンの合成
２a．エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）MFアルファプレプロ−リーダーを用いる酵母株yKV159からのGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−28）−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003872105.tif 000005
前記のとおりジーン・アンプ（Gene Amp）PCR試薬キットを用いて、以下のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。
PCR2：
0.2μlのpKV153プラスミド鋳型（実施例１から）
4.0μlのオリゴヌクレオチド#3881（100pmol）
4.0μlのオリゴヌクレオチド#2371（100pmol）
10.0μlの10×PCR緩衝液
10.0μlの2.5mM d NTP
0.5μlのTaqポリメラーゼ酵素
71.3μlの水
「94℃で１分間、45℃で１分間および72℃で１分間」を２サイクル、ついで「94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で１分間」を11サイクル行った。
該PCR混合物を２％アガロースゲル上にローディングし、記載されているとおりにジーン・クリーン・キットを用いて、生じた174bp断片を精製した。精製されたPCR ＤＮＡ断片を20μlの水および制限エンドヌクレアーゼ緩衝液に溶解し、制限エンドヌクレアーゼHindIIIおよびXbaIで切断した。得られた153bpのHindIII／XbaI制限断片をアガロースゲル上で移動させ、ジーン・クリーン・キットを用いて単離し精製した。
２つの独立した制限エンドヌクレアーゼ消化において、pMT742を制限エンドヌクレアーゼApaIおよびXbaIで切断し、一方、pKV153（実施例１から）を制限エンドヌクレアーゼApaIおよびEcoRIで切断した。この消化物から、8.6kbのApaI／XbaI制限断片をpMT742から、そして2.1kbのApaI／EcoRI制限断片をpKV153から単離した。
その３つの断片（すなわち、PCR2からの550bp EcoRI／XbaI制限断片およびpMT742からの8.6kb ApaI／XbaI制限断片およびpKV153からの2.1kb ApaI／EcoRI制限断片）を、前記のとおり、T4 ＤＮＡリガーゼを用いて連結した（図１参照）。該連結混合物をコンピテント大腸菌（E. coli）細胞（Apr-）中に形質転換し、ついでアンピシリン耐性に関して選択した。前記のとおり、得られた大腸菌コロニーからプラスミドを単離し、適当な制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、HindIII、ApaIおよびXbaI）について確認した。
pKV159と称される選択されたプラスミドは、ＤＮＡ配列決定分析により、MFアルファプレプロ−リーダー／Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−28）−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体をコードする正確な配列を含有することが示された。
前記のとおり、pKV159をエス・セレビシエ（S. cerevisiae）株MT663中に形質転換し、グルコース上での増殖に関して選択した。
得られた酵母株をyKV159と称することにし、該酵母株がGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−28）−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体を培地中に産生することをHPLCおよび質量分析により確認した。
２b．Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−28）−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の単離
yKV159株を72時間発酵させ、５リットルのブロスを集めた。酵母細胞を遠心分離により除き、硫酸を用いてpH値を3.0に調整し、300mlのStreamline▲Ｒ▼SRイオン交換体を充填したPharmacia Strealine▲Ｒ▼50カラム上で該インスリン前駆体を濃縮した。25mMクエン酸緩衝液，pH値3.6，で洗浄した後、該前駆体を0.5M NH3により溶出し、300〜600mlの画分を集めた。pH値を2.5に調整し、孔径100Åの15μ球状C18シリカおよび緩衝液として0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4を用い23〜33％アセトニトリルの勾配を用いるRP−HPLCにより該前駆体を精製した。該前駆体は、約27〜28％アセトニトリルで溶出した。該前駆体の中央の主ピークを含有するプールを、0.5M酢酸中Sephadex▲Ｒ▼ G−50F上でゲル濾過により脱塩し、該前駆体を凍結乾燥により単離した。収量：486mg。
２c．Ala−Thr−Arg−B（1−28）−Thr−Lys,Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
前記のとおり得た一本鎖前駆体486mgを0.05Mグルタミン酸緩衝液（pH9.0）30mlに溶解し、固定化エイ・リティクス（A. lyticus）プロテアーゼゲル３mlを加えた（PCT／DK94／00347、第45頁参照）。30℃で５時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除き、エタノール10ml、クエン酸三ナトリウム二水和物845mgおよび塩化亜鉛78mgを加えることにより二本鎖の伸長（extended）インスリンを結晶化した。pH値を6.1に調整し４℃で一晩保存した後、該結晶を遠心分離により集め、イソプロパノールで２回洗浄し、真空中で乾燥した。収量：450mg。
２d．NαA-5,NαB-3,NεB30−トリス（テトラデカノイル）Ala−Thr−Arg−B（1−28）−Thr−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
前記のとおり得た二本鎖の伸長インスリン450mgを、DMSO 3.15mlとNMP中の２Mジイソプロピルエチルアミン0.69mlとの混合物に溶解した。該溶液を15℃に冷却し、DMSO／NMP（１：１, v/v）中の0.3Mテトラデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.69mlを加えた。15℃で２時間後、エタノール／水（60：40, v/v）中の0.01Mグリシン緩衝液112mlを加えることにより該反応を停止し、pH値を10.0に調整した。該トリアシル化中間体は単離しなかった。
２e．LysB30（Nε−テトラデカノイル）ThrB29ヒトインスリンの合成
前工程からの溶液に、固定化トリプシンゲル５mlを加えた（PCT／DK94／00347、第46頁参照）。15℃で16時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除き、pH値を9.0に調整し、該溶液をQAE−Sephadex▲Ｒ▼ A−25の2.5×25cmカラムにかけた。NH3でpH9.0に調整したエタノール／水（60：40, v/v）中の0.12M NH4Cl緩衝液を用いて17.3ml／時の速度で無勾配溶出を行った。表題化合物は650ml後にカラムから出現し、650〜754mlのプールを集めた。最後に、該緩衝液をSephadex▲Ｒ▼ G−50Fine上のゲル濾過により0.01M NH4HCO3に変え、生成物を凍結乾燥により乾燥状態で単離した。収量：91mg。
表題化合物の分子量、MSによる測定値：6020±6，理論値：6018。
Ｂ鎖の分子量、MSによる測定値：3642±5，理論値：3640。
V8プロテアーゼで消化されたＢ鎖のＣ末端断片の分子量、MSによる測定値：1326±2、理論値：1326。
相対親油性、k'rel＝113。
ブタに皮下注射した後の消失半減期、Ｔ50%：20.3±5.2時間（ｎ＝６）
実施例３
LysB28（Nε−テトラデカノイル）デス（B29−B30）ヒトインスリンの合成
３a．エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）MFアルファプレプロ−リーダーを用いる酵母株yJB173からのGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003872105.tif 000006
オリゴヌクレオチド#3881をオリゴヌクレオチド#627で置換することにより実施例２に記載したのと同様にして、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）をコードするＤＮＡを構築した。
得られたプラスミドをpJB173と称することにし、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）を発現する酵母株をyJB173と称することにした。
３b．Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の単離
yJB173株を72時間発酵させ、4.8リットルのブロスを集めた。酵母細胞を遠心分離により除き、硫酸を用いてpH値を3.0に調整した。伝導率は7.8mS／cmであった。Streamline▲Ｒ▼SPイオン交換体300mlを充填したPharmacia Sreamline▲Ｒ▼50カラム上で該インスリン前駆体を濃縮した。25mMクエン酸緩衝液，pH値3.6で洗浄した後、該前駆体を0.5M NH3により溶出し、300〜600mlの画分を集めた。遊離アンモニアを真空中室温で蒸発させ、得られた280mlの溶液のpH値を塩酸で9.0に調整した。
３c．Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
前記のとおり得た一本鎖前駆体118mgを含有する溶液280mlに、固定化エイ・リティクス（A. lyticus）プロテアーゼゲル３mlを加えた（PCT／DK94／00347、第45頁参照）。30℃で24時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除いた。pH値を3.5に調整し、該溶液をMilipore▲Ｒ▼0.45μフィルターで濾過した。孔径100Åの15μ球状C18シリカを充填した２×20cmカラムおよび緩衝液として0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4（pH3.5）を用い23〜33％アセトニトリルの勾配を用いるRP−HPLCを速度４ml／分でカラム温度40℃で２回行うことにより、その二本鎖の伸長インスリンを精製した。その二本鎖の伸長インスリンは、約30〜31％アセトニトリルで溶出した。合わせたプール70mlから該アセトニトリルを真空中で蒸発させることにより除き、0.5M酢酸中Sephadex G−25の５×47cmカラムを用いるゲル濾過により脱塩した。その二本鎖の伸長インスリンを凍結乾燥により単離した。収量：110mg。
３d．NαA-5,NαB-3,NεB28−トリス（テトラデカノイル）Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
前記のとおり得た二本鎖の伸長インスリン110mgを、DMSO 0.84mlとNMP中の２Mジイソプロピルエチルアミン0.275mlとの混合物に溶解した。該溶液を15℃に冷却し、DMSO／NMP（１：１, v/v）中の0.3Mテトラデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.185mlを加えた。15℃で２時間後、エタノール／水（60：40, v/v）中の0.01Mグリシン緩衝液32.5mlを加えることにより該反応を停止し、pH値を10.0に調整した。該トリアシル化中間体は単離しなかった。
３e．LysB28（Nε−テトラデカノイル）デス（B29−B30）ヒトインスリンの合成
前工程から得られた溶液に、固定化トリプシンゲル1.5mlを加えた（PCT／DK94／00347、第46頁参照）。15℃で18時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除き、pH値を9.0に調整し、該溶液をQAE−Sephadex▲Ｒ▼A−25の1.5×21cmカラムにかけた。NH3でpH9.0に調整したエタノール／水（60：40, v/v）中の0.12M NH4Cl緩衝液を用いて10ml／時の速度で無勾配溶出を行った。表題化合物は250〜390ml後にカラムから出現し、330mlでピークに達した。最後に、該緩衝液をSephadex▲Ｒ▼G−50Fineを用いるゲル濾過により0.01M NH4HCO3に変え、生成物を凍結乾燥により乾燥状態で単離した。収量：47mg。
表題化合物の分子量、MSによる測定値：5820±2，理論値：5819。
Ｂ鎖の分子量、MSによる測定値：3444±4，理論値：3442。
V8プロテアーゼで消化されたＢ鎖のＣ末端断片の分子量、MSによる測定値：1128±2、理論値：1128。
相対親油性、k'rel＝121。
ブタに皮下注射した後の消失半減期、Ｔ50%：19.6±3.6時間（ｎ＝４）
実施例４
LysB27（Nε−テトラデカノイル）デス（B28−B30）ヒトインスリンの合成
４a．エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）MFアルファプレプロ−リーダーを用いる酵母株yJB174からのGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−26）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003872105.tif 000007
オリゴヌクレオチド#3881をオリゴヌクレオチド#628で置換することにより実施例２に記載したのと同様にして、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−26）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）をコードするＤＮＡを構築した。
得られたプラスミドをpJB174と称することにし、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−26）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）を発現する酵母株をyJB174と称することにした。
４b．Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−26）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の単離
yJB174株を72時間発酵させ、3.5リットルのブロスを集めた。酵母細胞を遠心分離により除き、硫酸を用いてpH値を3.0に調整し、塩濃度を減少させるために該溶液を水で８リットルにまで希釈した。得られた伝導率は7.9mS／cmであった。Streamline▲Ｒ▼SPイオン交換体300mlを充填したPharmacia Streamline▲Ｒ▼50カラム上で該インスリン前駆体を濃縮した。25mMクエン酸緩衝液，pH値3.6で洗浄した後、該前駆体を0.5M NH3により溶出し、300〜600mlの画分を集めた。遊離アンモニアを真空中室温で蒸発させ、得られた280mlの溶液のpH値を塩酸で9.0に調整した。
４c．Ala−Thr−Arg−B（1−26）−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
前記のとおり得た一本鎖前駆体の溶液280mlへ、固定化エイ・リティクス（A. lyticus）プロテアーゼゲル３mlを加えた（PCT／DK94／00347、第45頁参照）。30℃で13時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除いた。pH値を2.5に調整し、該溶液をMilipore▲Ｒ▼0.45μフィルターで濾過した。孔径100Åの15μ球状C18シリカを充填した２×20cmカラムおよび緩衝液として0．2M Na2SO4、0.04M H3PO4（pH2.5）を用い24〜33％アセトニトリルの勾配を用いるRP−HPLCを４回行うことにより、その二本鎖の伸長インスリンを精製した。その二本鎖の伸長インスリンは、約30〜31％アセトニトリルで溶出した。合わせたプールから該アセトニトリルを真空中で蒸発させることにより除き、0.5M酢酸中Sephadex G−25の５×47cmカラムを用いるゲル濾過により脱塩した。その二本鎖の伸長インスリンを凍結乾燥により単離した。収量：69mg。
４d．NαA-5,NαB-3,NεB27−トリス（テトラデカノイル）Ala−Thr−Arg−B（1−26）−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
４eに記載のとおり得た二本鎖の伸長インスリン62mgを、DMSO 0.44mlとNMP中の２Mジイソプロピルエチルアミン0.15mlとの混合物に溶解した。該溶液を15℃に冷却し、DMSO／NMP（１：１, v/v）中の0.3Mテトラデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.096mlを加えた。15℃で２時間後、エタノール／水（60：40, v/v）中の0.01Mグリシン緩衝液17mlを加えることにより該反応を停止し、pH値を10.0に調整した。該トリアシル化中間体は単離しなかった。
４e．LysB27（Nε−テトラデカノイル）デス（B28−B30）ヒトインスリンの合成
前工程から得られた溶液に、固定化トリプシンゲル１mlを加えた（PCT／DK94／00347、第46頁参照）。15℃で26時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除き、pH値を9.0に調整し、該溶液をQAE−Sephadex▲Ｒ▼A−25の1．5×25.5cmカラムにかけた。NH3でpH9.0に調整したエタノール／水（60：40, v/v）中の0.12M NH4Cl緩衝液を用いて17.3ml／時の速度で無勾配溶出を行った。表題化合物は360ml後にカラムから出現し、272〜455mlのプールを集めた。最後に、該緩衝液をSephadex▲Ｒ▼G−50Fine上のゲル濾過により0.01M NH4HCO3に変え、生成物を凍結乾燥により乾燥状態で単離した。収量：38mg。
表題化合物の分子量、MSによる測定値：5720±6，理論値：5718。
Ｂ鎖の分子量、MSによる測定値：3342±4，理論値：3340。
V8プロテアーゼで消化されたＢ鎖のＣ末端断片の分子量、MSによる測定値：1027±2、理論値：1027。
相対親油性、k'rel＝151。
ブタに皮下注射した後の消失半減期、Ｔ50%：15.2±2.2時間（ｎ＝５）
実施例５
LysB26（Nε−テトラデカノイル）デス（B27−B30）ヒトインスリンの合成
５a．エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）MFアルファプレプロ−リーダーを用いる酵母株yJB175からのGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−25）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003872105.tif 000008
オリゴヌクレオチド#3881をオリゴヌクレオチド#629で置換することにより実施例２に記載したのと同様にして、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−25）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）をコードするＤＮＡを構築した。
得られたプラスミドをpJB175と称することにし、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−25）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）を発現する酵母株をyJB175と称することにした。
５b．Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−25）−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の単離
yJB175株を72時間発酵させ、3.7リットルのブロスを集めた。酵母細胞を遠心分離により除き、硫酸を用いてpH値を3.0に調整し、塩濃度を減少させるために該溶液を水で8.5リットルにまで希釈した。得られた伝導率は7.7mS／cmであった。Streamline▲Ｒ▼SPイオン交換体300mlを充填したPharmacia Strealine▲Ｒ▼50カラム上で該インスリン前駆体を濃縮した。25mMクエン酸緩衝液，pH値3.6で洗浄した後、該前駆体を0.5Mアンモニアにより溶出し、300〜600mlの画分を集めた。遊離アンモニアを真空中室温で蒸発させ、得られた270mlの溶液のpH値を塩酸で9.0に調整した。
５c．Ala−Thr−Arg−B（1−25）−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
前記のとおり得た一本鎖前駆体の溶液270mlへ、固定化エイ・リティクス（A. lyticus）プロテアーゼゲル３mlを加えた（PCT／DK94／00347、第45頁参照）。30℃で23時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除いた。pH値を2.5に調整し、該溶液をMilipore▲Ｒ▼0.45μフィルターで濾過した。孔径100Åの15μ球状C18シリカを充填した２×20cmカラムおよび緩衝液として0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4（pH3.5）を用い、24〜33％アセトニトリルの勾配を用いるRP−HPLCを４回行うことにより、その二本鎖の伸長インスリンを精製した。その二本鎖の伸長インスリンは、約29〜31％アセトニトリルで溶出した。合わせたプールから該アセトニトリルを真空中で蒸発させることにより除き、0.5M酢酸中Sephadex▲Ｒ▼ G−25の５×47cmカラムを用いるゲル濾過により脱塩した。その二本鎖の伸長インスリンを凍結乾燥により単離した。収量：81mg。
５d．NαA-5,NαB-3,NεB26−トリス（テトラデカノイル）Ala−Thr−Arg−B（1−25）−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
その二本鎖の伸長インスリン80mgを、DMSO 0.56mlとNMP中の２Mジイソプロピルエチルアミン0.19mlとの混合物に溶解した。該溶液を15℃に冷却し、DMSO／NMP（１：１, v/v）中の0.3Mテトラデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.124mlを加えた。15℃で２時間後、エタノール／水（60：40, v/v）中の0.01Mグリシン緩衝液21.8mlを加えることにより該反応を停止し、pH値を10.0に調整した。該トリアシル化中間体は単離しなかった。
５e．LysB26（Nε−テトラデカノイル）デス（B27−B30）ヒトインスリンの合成
前工程から得られた溶液に、固定化トリプシンゲル１mlを加えた（PCT／DK94／00347、第46頁参照）。15℃で23時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除き、pH値を9.0に調整し、該溶液をQAE−Sephadex▲Ｒ▼A−25の1.5×25.5cmカラムにかけた。アンモニアでpH9.0に調整したエタノール／水（60：40, v/v）中の0.12M NH4Cl緩衝液を用いて19.3ml／時の速度で無勾配溶出を行った。表題化合物は320mlの後のカラムから出現し、320〜535mlの画分を集めた。最後に、該緩衝液をSephadex▲Ｒ▼G−50Fineを用いるゲル濾過により0.01M NH4HCO3に変え、生成物を凍結乾燥により乾燥状態で単離した。収量：25mg。
表題化合物の分子量、MSによる測定値：5555±6，理論値：5555。
Ｂ鎖の分子量、MSによる測定値：3179±4，理論値：3178。
V8プロテアーゼで消化されたＢ鎖のＣ末端断片の分子量、MSによる測定値：864±1、理論値：863.5。
相対親油性、k'rel＝151。
ブタに皮下注射した後の消失半減期、Ｔ50%：14.4±1.5時間（ｎ＝５）
実施例６
（Ｎ−（１−カルボキシトリデシル）−２−アミドスクシニル）−PheαB1デス（B30）ヒトインスリン
A1,B29−ジBoc−デス（B30）ヒトインスリン（200mg, 0.033mmol）をDMF（15ml）に溶解し、トリエチルアミン（20μl）を加えた。Ｎ（１−カルボメトキシトリデシル）−２−アミドコハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（16mg, 0.033mmol）を加え、室温で４時間後、該反応混合物を真空中で蒸発乾固させた。トリフルオロ酢酸（５ml）により30分間室温で処理することにより、Boc基を除去した。トリフルオロ酢酸を真空中で蒸発させることにより除去した。残留物を０℃で0.1N NaOH（20ml）に溶解した。１時間後０℃で該メチルエステルのけん化を完了した。該反応混合物のpH値を酢酸で5.0に調整し、エタノール（５ml）を加えた。生成した沈殿物を遠心分離により単離した。
QAE−Sephadex▲Ｒ▼A25の2.5×27cmカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、表題化合物を該沈殿物から精製した。
アンモニアを用いてpH値を9.8に調整することにより、該沈殿物をエタノール／水（60：40, v/v）（25ml）に溶解し、その溶液をカラムにかけた。合計1000mlの溶離液およびエタノール／水（60：40, v/v）中0.12〜0.18M NH4Clの直線勾配を用いてNH3／NH4Cl緩衝液中pH9.0で溶出を行った。溶出液のUV吸収を280nmでモニターし、10mlの画分を集めた。表題化合物は、画分62〜72のカラムから出現した。２容量の水で該プールを希釈し、pH値を5.0に調整することにより表題化合物を沈殿させた。遠心分離後、該沈殿物を水洗し、２回目の遠心分離の後、生成物を真空中で乾燥した。収量：10mg。
分子量、PDMSによる測定値：6032，理論値：6032。
相対親油性、k'rel＝140。
ブタに皮下注射した後の消失半減期、Ｔ50%：8.65±1.65時間（ｎ＝５）
実施例７
PheαB1−テトラデカノイル−グルタミル−グリシル デス（B30）ヒトインスリン
A1,B29−ジBocデス（B30）ヒトインスリン（200mg, 0.033mmol）をDMF（15ml）に溶解し、トリエチルアミン（100μl）を加えた。ミリストイル−Glu（γ−OtBu）−Gly Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（95mg, 0.17mmol）を加え、室温で４時間後、該反応混合物を真空中で蒸発乾固させた。トリフルオロ酢酸（５ml）により30分間室温で処理することにより、BocおよびtBu基を除去した。トリフルオロ酢酸を真空中で蒸発させることにより除去した。C18シリカカラムを用い、pH７の75mM（NH4）2SO4を含有する50mMトリス／リン酸緩衝液中16〜64％アセトニトリルの直線勾配で溶出するRP−HPLCにより、表題化合物を該沈殿物から精製した。表題化合物は、約50％アセトニトリルでカラムから出現した。アセトニトリルを真空中で蒸発させ、エタノールを20％（v/v）になるまで加えた。pH値を5.0に調整することにより生成物を沈殿させた。遠心分離後、沈殿物を10mM NH4HCO3に溶解し、Sephadex G−25を用いるゲル濾過により脱塩し、凍結乾燥した。収量：97mg。
分子量、PDMSによる測定値：6105，理論値：6104。
実施例８
GlyB28,ThrB29,LysB30（Nε−テトラデカノイル）ヒトインスリンの合成
８a．エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）MFアルファプレプロ−リーダーを用いる酵母株yKV195からのGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003872105.tif 000009
オリゴヌクレオチド#3881をオリゴヌクレオチド#4790で置換することにより実施例２に記載したのと同様にして、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）をコードするＤＮＡを構築した。
得られたプラスミドをpKV195と称することにし、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）を発現する酵母株をyKV195と称することにした。
８b．Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Thr−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の単離
yKV195株を72時間発酵させ、4.4リットルのブロスを集めた。酵母細胞を遠心分離により除き、硫酸を用いてpH値を3.0に調整し、水3.6リットルを加えて塩を希釈して伝導率を7.7mS／cmとした。Streamline▲Ｒ▼SPイオン交換体300mlを充填したPharmacia Strealine▲Ｒ▼50カラム上で該インスリン前駆体を濃縮した。25mMクエン酸緩衝液（pH3.6）３リットルで洗浄した後、該前駆体を0.5Mアンモニアを用いて溶出し、300〜600mlの画分を集めた。遊離アンモニアを真空中室温で蒸発させ、得られた280mlの溶液のpH値を塩酸で9.0に調整した。
８c．Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Thr−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
該一本鎖前駆体300mgを含有する溶液280mlへ、固定化エイ・リティクス（A. lyticus）プロテアーゼゲル３mlを加えた（PCT／DK94／00347、第45頁参照）。30℃で17時間穏やかに攪拌した後、ゲルを濾過により除いた。pH値を3.5に調整し、該溶液をMilipore▲Ｒ▼0.45μフィルターで濾過した。孔径120Åの10μ球状C18シリカを充填した２×20cmカラムおよび緩衝液として0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4（pH3.5）を用い23〜33％アセトニトリルの勾配を用いるRP−HPLCを速度４ml／分、カラム温度40℃で３回行うことにより、その二本鎖の伸長インスリンを精製した。その二本鎖の伸長インスリンは、約30〜31％アセトニトリルで溶出した。合わせたプール70mlからアセトニトリルを真空中で蒸発させることにより除き、Sephadex▲Ｒ▼G−25の５×47cmカラムおよび0.5M酢酸を用いるゲル濾過により脱塩した。その二本鎖の伸長インスリンを凍結乾燥により単離した。収量：176mg。
８d．NαA-5,NαB-3,NεB30−トリス（テトラデカノイル）Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Thr−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
その二本鎖の伸長インスリン176mgを、DMSO1.4mlとNMP中の２Mジイソプロピルエチルアミン0.275mlとの混合物に溶解した。該溶液を15℃に冷却し、DMSO／NMP（１：１, v/v）中の0.3Mテトラデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.963mlを加えた。15℃で20時間後、エタノール／水（60：40, v/v）中の0.01Mグリシン緩衝液50mlを加えることにより該反応を停止し、pH値を10.0に調整した。該トリアシル化中間体は単離しなかった。
８e．GlyB28,ThrB29,LysB30（Nε−テトラデカノイル）ヒトインスリンの合成
前工程からの溶液に、固定化トリプシンゲル2.5mlを加えた（PCT／DK94／00347、第46頁参照）。15℃で５時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除き、pH値を9.0に調整し、該溶液をQAE−Sephadex▲Ｒ▼A−25の1.5×26.5cmカラムにかけた。アンモニアでpH9.0に調整したエタノール／水（60：40, v/v）中の0.12M NH4Cl緩衝液を用いて9.3ml／時の速度で無勾配溶出を行った。表題化合物は325〜455ml後にカラムから出現し、380mlでピークに達した。最後に、該緩衝液をSephadex▲Ｒ▼G−50Fineを用いるゲル濾過により0.01M NH4HCO3に変え、生成物を凍結乾燥により乾燥状態で単離した。収量：50mg。
表題化合物の分子量、MSによる測定値：5979±6，理論値：5977。
Ｂ鎖の分子量、MSによる測定値：3600±4，理論値：3600。
V8プロテアーゼで消化されたＢ鎖のＣ末端断片の分子量、MSによる測定値：1286±2、理論値：1286。
相対親油性、k'rel＝103。
ブタに皮下注射した後の消失半減期、Ｔ50%：17±2時間（ｎ＝４）
実施例９
GlyB28,LysB29（Nε−テトラデカノイル）ヒトインスリンの合成
９a．エス・セレビシアエ（S. cerevisiae）MFアルファプレプロ−リーダーを用いる酵母株yKV196からのGlu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の合成
以下のオリゴヌクレオチドを合成した。
0003872105.tif 000010
オリゴヌクレオチド#3881をオリゴヌクレオチド#4791で置換することにより実施例２に記載したのと同様にして、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）をコードするＤＮＡを構築した。
得られたプラスミドをpKV196と称することにし、Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）を発現する酵母株をyKV196と称することにした。
９b．Glu−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Ala−Glu−Pro−Lys−Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Lys−Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリン前駆体の単離
yKV196株を72時間発酵させ、3.6リットルのブロスを集めた。酵母細胞を遠心分離により除き、硫酸を用いてpH値を3.0に調整し、水3.4リットルを加えて塩を希釈して伝導率を7.7mS／cmとした。実施例8bで記載した方法により、該インスリン前駆体を300mlにまで濃縮した。
９c．Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
該一本鎖前駆体390mgを含有する溶液300ml（pH9.0）へ、固定化エイ・リティクス（A. lyticus）プロテアーゼゲル５mlを加えた（PCT／DK94／00347、第45頁参照）。30℃で40時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除いた。pH値を3.5に調整し、該溶液をMilipore▲Ｒ▼0.45μフィルターで濾過した。孔径120Åの10μ球状C18シリカを充填した２×20cmカラムおよび緩衝液として0.2M Na2SO4、0.04M H3PO4（pH3.5）を用い23〜33％アセトニトリルの勾配を用いるRP−HPLCを速度４ml／分、カラム温度40℃で３回行うことにより、その二本鎖の伸長インスリンを精製した。その二本鎖の伸長インスリンは、約29％アセトニトリルで溶出した。合わせたプール60mlからアセトニトリルを真空中で蒸発させることにより除き、Sephadex▲Ｒ▼G−25の５×47cmカラムおよび0.5M酢酸を用いるゲル濾過により脱塩した。その二本鎖の伸長インスリンを凍結乾燥により単離した。収量：154mg。
９d．NαA-5,NαB-3,NεB29−トリス（テトラデカノイル）Ala−Thr−Arg−B（1−27）−Gly−Lys, Ser−Asp−Asp−Ala−Arg−A（1−21）インスリンの合成
その二本鎖の伸長インスリン154mgを、DMSO 1.05mlとNMP中の２Mジイソプロピルエチルアミン0.329mlとの混合物に溶解した。該溶液を15℃に冷却し、DMSO／NMP（１：１, v/v）中の0.3Mテトラデカン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル0.22mlを加えた。15℃で２時間後、エタノール／水（60：40, v/v）中の0.01Mグリシン緩衝液40mlを加えることにより該反応を停止し、pH値を10.0に調整した。該トリアシル化中間体は単離しなかった。
９e．GlyB28,LysB29（Nε−テトラデカノイル）ヒトインスリンの合成
前工程からの溶液に、固定化トリプシンゲル1.5mlを加えた（PCT／DK94／00347、第46頁参照）。15℃で21時間穏やかに攪拌した後、該ゲルを濾過により除き、pH値を9.0に調整し、43mlの溶液中の生成物をQAE−Sephadex▲Ｒ▼A−25の1.5×26.0cmカラムにかけた。アンモニアでpH9.0に調整したエタノール／水（60：40, v/v）中の0.12M NH4Cl緩衝液を用いて9.5ml／時の速度で無勾配溶出を行った。表題化合物は190〜247ml後にカラムから出現し、237mlでピークに達した。最後に、該緩衝液をSephadex▲Ｒ▼G−50Fineを用いるゲル濾過により0.01M NH4HCO3に変え、生成物を凍結乾燥により乾燥状態で単離した。収量：67mg。
表題化合物の分子量、MSによる測定値：5877±2，理論値：5876。
Ｂ鎖の分子量、MSによる測定値：3499±3，理論値：3499。
V8プロテアーゼで消化されたＢ鎖のＣ末端断片の分子量、MSによる測定値：1184±2、理論値：1185。
相対親油性、k'rel＝118.5。
ブタに皮下注射した後の消失半減期、Ｔ50%：25±9時間（ｎ＝４）
配列表
（１）一般情報：
（i）出願人
（A）名称：ノボ・ノルディスク  Ａ／Ｓ
（B）通り：ノボ  アレ
（C）市：デーコー−２８８０  バグスバエルト
（E）国：デンマーク国
（G）電話番号：＋４５  ４４４４８８８８
（H）テレファックス：＋４５  ４４４９０５５５
（I）テレックス：３７１７３
（ii）発明の名称：アシル化インスリン
（iii）配列の数：２
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：ノボ・ノルディスク  Ａ／Ｓ
コーポレイト・パテンツ
（B）通り：ノボ  アレ
（C）市：デーコー−２８８０  バグスバエルト
（E）国：デンマーク国
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：Patent In リリース#1.0、バージョン#1.25
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（vii）先行出願データ：
（A）出願番号：ＤＫ  ０２７６／９５
（B）出願日：１９９５年３月１７日
（viii）アトニー／エージェント情報
（A）氏名：ユルゲンセン，ダン  等
（C）参照／ドケット番号：４３４１−ＷＯ，ＤＪ
（ix）電信情報：
（A）電話：＋４５  ４４４４８８８８
（B）テレファックス：＋４５  ４４４９３２５６
（２）配列認識番号１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：１：
0003872105.tif 000011
（２）配列認識番号：２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：２：
0003872105.tif 000012
【図１】
0003872105.tif 000014
【図２ａ】
0003872105.tif 000015
【図２ｂ】
0003872105.tif 000016