(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程からなる等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法。
（ａ）両端に陰極および陽極の電極を設けた等電点電気泳動用ゲル上においてpIマーカーにより作成されるpH勾配を視認できるようにし、この視認可能pH勾配に基づいて所定位置に孔部を形成する工程、
（ｂ）前記孔部にタンパク質を捕捉するための緩衝液で平衡化したイオン交換体を充填する工程、
（ｃ）溶出しようとするタンパク質を含む試料を前記吸着体内にまたは吸着体に当接させる工程、
（ｄ）前記ゲルに電場をかけ、前記イオン交換体のｐＨ値を前記孔部の位置に対応するゲル上のｐＨ勾配に応じたｐＨ値となして試料中のタンパク質を溶出させるとともにこのタンパク質を前記イオン交換体に吸着させる工程、
（ｅ）回収予定のタンパク質に適応するpH値を有するようになっている前記イオン交換体に、このイオン交換体のpH値とほぼ同じpＨ値の緩衝液を加えて攪拌後、濾過してタンパク質を溶出し、この溶出液は脱塩濃縮してタンパク質を回収する工程。
【請求項２】
請求項１記載の等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法において、前記等電点電気泳動用ゲルは、両性担体を添加したものであることを特徴とする等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法において、タンパク質を含む前記試料は、電気泳動によりゲル上に精製された単一のタンパク質を含むバンドの切片であることを特徴とする等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法。
【請求項４】
請求項１ないし３いずれか記載の等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法において、前記孔部は、長方形とし、泳動方向の辺長さを前記ゲルの泳動方向長さの1/10未満に設定してゲルにおいてpH勾配の適正な作製を可能なようにしたことを特徴とする等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、等電点電気泳動によるｐＨ勾配を利用したｐＨ制御下にタンパク質、特にｐＨ環境により機能に影響を受けやすい酵素類をｐＨ安定領域に保ちつつ溶出回収する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
液体中に存在するタンパク質などの分子に電圧を加えると、分子の性質や形状に応じて＋または−の電荷をもち、＋の電荷を有する分子は陰極方向に、また−の電極を有する分子は陽極方向に移動する現象がある。  この現象がいわゆる電気泳動であり、試料は緩衝液を含んだアクリルアミドゲルやアガロースゲル等の支持体に保持され、分子が電界の作用を受ける中で分離される。すなわち、試料中の成分の移動度の相違に基づき所要の分離がなされる。このような目的に供するため従来種々の装置類が提案されている。
例えば、図７は、タンパク質の溶出に用いられる従来の電気泳動溶出装置の構成を示す模式図である。
図において、１は緩衝液で満たされる泳動槽で、陰極２ａを有する陰極槽２と陽極３ａを有する陽極槽３とからなっている。前記陰極槽２と陽極槽３との間には複数の連通管４、４、４が架設されていて、これら連通管４、４、４により前記陰極槽２と陽極槽３との間に流路が形成されている。
【０００３】
そして、前記連通管４内に試料をセットして陰極２ａおよび陽極３ａ間に通電して試料から目的のタンパク質を溶出することになる。  すなわち、図７において、５は連通管４内に設置された載置網６に係止した試料としてのタンパク質を含むゲルであり、７は試料としてのゲル５から緩衝液中に溶出され連通管４内を移動するタンパク質を捕捉採取するために連通管４の陽極槽３側の開口端に張設されたセロファン膜等の導電膜である。  なお、図において、矢符は電流を示している。
【０００４】
陰極２ａと陽極３ａ間に電圧をかけるとゲル５からタンパク質８が溶出されて連通管４内を陽極方向に移動し、前記セロファン膜７に当接して移動が遮断されその近傍に濃縮される。  試料中のタンパク質は溶出されて移動するうちに、緩衝液中に拡散・希釈されるから高塩濃度溶液等を使用して回収する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、酵素などの機能を有するタンパク質は周囲のｐＨ環境によって影響を受ける。  すなわち、酵素は機能を発現できる至適ｐＨ領域を持ち、至適ｐＨ領域外では機能を発現できない。また、ｐＨ安定性も酵素の持つ特徴のひとつであって、酵素がその機能を維持できるｐＨ領域も各酵素に固有のものである。
ｐＨ安定領域からはずれたｐＨ環境に酵素を晒すと酵素はその機能を失うこともある。
したがって、酵素の機能を失わずにこれを回収するには、回収の際のｐＨを酵素のｐＨ安定領域内に維持する必要がある。しかしながら、上述の従来技術にあっては、泳動槽を満たす緩衝液のｐＨを自由に設定できないため、泳動用の緩衝液のｐＨ（pH8.0-pH9.0）条件下で不安定な酵素はその活性を維持した状態での回収することが困難であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本願発明は、
（ａ）両端に陰極および陽極の電極を設けた等電点電気泳動用ゲル上においてpIマーカーにより作成されるpH勾配を視認できるようにし、この視認可能pH勾配に基づいて所定位置に孔部を形成する工程、
（ｂ）前記孔部にタンパク質を捕捉するための緩衝液で平衡化したイオン交換体を充填する工程、
（ｃ）溶出しようとするタンパク質を含む試料を前記吸着体内にまたは吸着体に当接させる工程、
（ｄ）前記ゲルに電場をかけ、前記イオン交換体のｐＨ値を前記孔部の位置に対応するゲル上のｐＨ勾配に応じたｐＨ値となして試料中のタンパク質を溶出させるとともにこのタンパク質を前記イオン交換体に吸着させる工程、
（ｅ）回収予定のタンパク質に適応するpH値を有するイオン交換体に前記タンパク質に適合するpHの緩衝液を加えて攪拌後、濾過してタンパク質を溶出し、この溶出液は脱塩濃縮してタンパク質を回収する工程。
以上の工程からなる等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法を提供して上記従来の課題を解決しようとするものである。
【０００７】
上記において、前記等電点電気泳動用ゲルは、両性担体を添加したもので構成することがある。
【０００８】
また、上記いずれかの等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法において、タンパク質を含む前記試料は、電気泳動によりゲル上に精製された単一のタンパク質を含むバンドの切片で構成することがある。
【０００９】
さらに、上記いずれかの等電点電気泳動法によるタンパク質溶出方法において、前記孔部は、長方形とし、泳動方向の辺長さを前記ゲルの泳動方向長さの1/10未満に設定してゲルにおいてpH勾配の適正な作製を可能なように構成することがある。
【００１０】
【発明の実施形態】
本願発明の要旨は、ｐＨ環境による影響を受けやすい酵素などの機能をもつタンパク質を回収時のｐＨ環境を該酵素のｐＨ安定領域に制御保持して酵素の機能を損なうことなく回収する点にあり、前記ｐＨの制御は等電点電気泳動によって形成されるｐＨ勾配を利用してなされる。
【００１１】
まず、タンパク質を含む試料を電気泳動用のゲルに添加し、図１に概略構成を示す電気泳動装置により電気泳動して単一のタンパク質を含むバンドに精製する。
図１において、１１は、ゲル１２の支持板で電圧印加時の冷却手段を兼ねている。１３、１３は、ゲル１２の両端に設置された濾紙で電気的インターフェースとしての電極液を含浸させてある。１４、１４は、前記濾紙１３、１３と電極を結ぶ導電線である。  なお、矢符は電流方向を示している。
タンパク質を含む試料をゲル上の陰極側の近傍適宜箇所に濾紙小片を載置し、この小片に試料溶液を添加する。  次いで、ゲルに電圧をかけて電気泳動を発生させ、タンパク質をそれぞれ単一のバンドに分離する。
【００１２】
次いで、分離した試料をゲルから切片として採取する。  以降の手順を図２の参照下に説明する。  図２は図１に示した電気泳動装置における泳動面の平面図であり、ゲル１２は両性担体を添加した等電点電気泳動用のゲルであり図２（ａ）に示すように両極間に電場をかけることによりゲル上に所定範囲のｐＨ勾配が形成される。  さて、このゲル１２表面において、所要のｐＨに応じた所定位置に図２（ｂ）に示すように長方形の孔部２１を形成する。
なお、孔部２１において、泳動方向（図で水平方向）の長さが過大であるとｐＨ勾配の作製に影響をおよぼすので、前記長さは、好ましくはゲル長さ（泳動方向）の１／１０未満に設定する。
【００１３】
次に、タンパク質の吸着体として緩衝液で平衡化したイオン交換体２２を準備して、  前記孔部２１に充填する。  このイオン交換体２２は、電場をかけた場合にゲル１２上に作製されるｐＨ勾配上において孔部２１の位置に対応するｐＨに制御されることとなる。したがって、緩衝液で平衡処理をなすにあたってはそれに近いｐＨの緩衝液の使用が望ましい。  吸着体としてのイオン交換体としては、イオン交換樹脂、イオン交換セルロース、イオン交換セファロース、イオン交換セファデックス等の周知のものを使用できるが、親水性に優れタンパク質、核酸、多糖類などの吸着に好適なイオン交換セルロース、イオン交換セファロース等の採用が望ましい。
なお、イオン交換体には陰イオン交換体と陽イオン交換体があり、前者は平衡化されたpHより低い値のpI(pH)のタンパク質を吸着する一方、後者は逆に平衡化されたpHより高いpI(pH)のタンパク質を吸着する。  このような観点において、吸着体は、目的物の性質に即して適切なものを選択することになる。
【００１４】
次に、孔部２１に充填したイオン交換体２２内に試料２３を載置添加する（図２（ｃ））。  試料２３の位置は回収に支障がなければイオン交換体２２内部に限定されない。  以上の状態で、ゲル１２に適合する条件で電圧をかけて、タンパク質２４を溶出してイオン交換体２２に吸着させる。吸着したタンパク質は溶液化して脱塩濃縮する等、通常の方法で回収する。
【００１５】
【発明の実施例】
次に、イオン交換体のｐＨ制御の実証試験、タンパク質吸着等の実証試験ならびにこれらに基づく本願発明の１実施例を説明する。
実験１（図３、図４参照）
使用した電気泳動装置：  Multiphor II Electrophoresis System（ファルマシア社商標）
ゲル：  Ampholine PAG Plate pH3.5-9.5（ファルマシア社商標）
イオン交換体：  DEAE Sepharose Fast flow（ファルマシア社商標）
pIマーカー：  Broad pI Kit,pH3.5-9.3 （ファルマシア社商標）
1.  装置の冷却板に絶縁用のケロシンを滴下し、ゲルをサポートフィルムごと設置した。
2.  陰極用濾紙に1Mグリシン溶液、陽極用濾紙に  1Mリン酸溶液をしみこませゲルの両端にセットした。
3.  図３に示すように両極間をほぼゲル１２を6等分する位置の５箇所に長方形の孔部２１（たて7mm ×横1cm）を形成した。
4.  孔部２１にイオン交換体を間隙なく充填した。
このイオン交換体は、10mM酢酸緩衝液pH5.5で平衡化して自然沈降させ、上澄み部分を除いたややゆるめのペースト状に調整した。
5.  ゲル１２上で図示の位置に、ゲルに作製されるpH勾配の視覚的確認のため、pIマーカー２５，２５を濾紙を用いて添加した。
6.  使用したゲル１２に適した条件（1400V, 25mA, 35W）で１時間通電した。
7.  前記の電気泳動後、各孔部２１のイオン交換体を回収しそれらのpH値をpHメーターで測定した。
その結果、図４に示すように孔部２１に充填したイオン交換体（図中白線囲み部分）のpH値は陰極からの距離に応じて変化し、pIマーカーで示されたpHの値とほぼ一致する。したがって、予めpIマーカーでゲル上の位置ごとのpH値がわかっていれば、孔部２１の形成位置によりイオン交換体のpHの設定すなわちpH制御が可能であることが確認される。
【００１６】
実験２(図５参照)
ゲル、イオン交換体その他の試薬類および装置は前記実験１と同様のものを使用した。
１．  ゲルを設置し孔部２１を形成して、イオン交換体を充填するまでの工程は前記実験１と同様である。
２．  陰極から1.5cmの位置に5mm×5mmの濾紙をセットし、これにpIマーカーを添加した。
３．  また、イオン交換体上に5mm×5mmの濾紙をセットしこれにpIマーカーを添加した。
４．  以上の状態で前記実験１と同様の条件下に、４０分間の電気泳動をなした。
５．  ゲルからイオン交換体を除去し、ゲルをクマシブルーR250染色液で染色した。
以上において、イオン交換体のない位置に添加したpIマーカーでは、含まれている全てのタンパク質のバンドが検出された。  一方、イオン交換体の上に添加したpIマーカーにあっては、イオン交換体に吸着されない孔部の位置より陰極側のタンパク質のバンドは全て検出されたが、イオン交換体に吸着される陽極側のタンパク質はゲル中にバンドが形成されなかった。通常、陰イオン交換体は平衡化されたpHよりpI（等電点）の低いタンパク質を吸着する。  該実験においても、ゲルに作製されるpHによってイオン交換体が平衡化されたpH以下のpIのタンパク質が吸着されることが確認された。
【００１７】
実施例１（図６参照）
１．  部分精製したマンガンペルオキシダーゼアイソザイム４個を含む試料を、等電点電気泳動によって４本のバンドに分離し、これら各バンドをゲルから切り取りゲル切片を得た。
２．  前記実験１，２と同様に装置にゲルを設置してpH5.5-6.0となる位置に４個の孔部を形成しイオン交換体を充填して、これらの各イオン交換体内に前記ゲル切片を添加し前記実験２と同様に電気泳動溶出を実行した。
３．  泳動後、各孔部からイオン交換体を回収した。
４．  回収したイオン交換体に0.5M塩化ナトリウムを含む10mM酢酸緩衝液pH5.5を2ml加え、攪拌後、濾過してタンパク質を溶出した。なお、溶出液は脱塩濃縮して５μlとした。
以上、図６に示すように、回収されたタンパク質の等電点電気泳動結果より、各タンパク質は始めに精製されたのと同じ位置に単一のバンドとなって検出された。
したがって、４つのマンガンペルオキシダーゼアイソザイムはいずれも、ゲル切片から各イオン交換樹脂に溶出吸着されたことが確認できる。したがって、電気泳動試料の前記ゲル切片からタンパク質の溶出、回収が可能であることが確認できた。
【００１８】
【発明の効果】
本願発明は、以上説明したように、等電点電気泳動によって形成されるpH勾配を介してpH制御されたイオン交換体にタンパク質を溶出するようにしたので、タンパク質、特に酵素等の機能や特性を損なうことなくそれらの溶出回収が可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例に係る電気泳動装置の概略構成図である。
【図２】  図１に示す装置における泳動面の平面図である。
【図３】  電気泳動装置のゲル上に形成した孔部を示す平面図である。
【図４】    図３の設定状態で電気泳動をなした後の各孔部におけるイオン交換体の実測pHと陰極からの距離との相関関係を示すゲル平面図である。
【図５】  等電点電気泳動ゲル上でのpIマーカーの電気溶出結果を示す平面図である。
【図６】  第１実施例に係るタンパク質の回収結果を示すゲル平面図である。
【図７】  従来技術の説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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