(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球細胞を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン１５の存在下に培養する第１期培養工程、固相化した抗ＣＤ３抗体の非存在下かつインターロイキン１５の存在下に培養する第２期培養工程の各工程を含むことを特徴とするリンパ球細胞の製造方法。
【請求項２】
リンパ球細胞を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン１５の存在下に培養する第１期培養工程、固相化した抗ＣＤ３抗体の非存在下かつインターロイキン１５の存在下に培養する第２期培養工程の各工程を含み、リンパ球の増殖が抑制される前に前記第１期培養工程から前記第２期培養工程へ移行することを特徴とするリンパ球細胞の製造方法。
【請求項３】
リンパ球細胞を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン１５の存在下に培養する第１期培養工程、固相化した抗ＣＤ３抗体の非存在下かつインターロイキン１５の存在下に培養する第２期培養工程の各工程を含み、前記抗ＣＤ３抗体は１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で固定化に用いられ、前記インターロイキン１５は培養中１〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられることを特徴とするリンパ球細胞の製造方法。
【請求項４】
リンパ球細胞を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン１５の存在下に２〜２０日間培養する第１期培養工程、固相化した抗ＣＤ３抗体の非存在下かつインターロイキン１５の存在下に培養する第２期培養工程の各工程を含み、前記第２期培養工程では細胞数が１〜１０×１０５個／ｍｌを維持するように培養することを特徴とするリンパ球細胞の製造方法。
【請求項５】
リンパ球細胞を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン１５の存在下に２〜２０日間培養する第１期培養工程、固相化した抗ＣＤ３抗体の非存在下かつインターロイキン１５の存在下に培養する第２期培養工程の各工程を含み、前記抗ＣＤ３抗体は１〜１０μｇ／ｍｌの濃度で固定化に用いられ、前記インターロイキン１５は培養中１〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で用いられ、かつ、前記第２期培養工程では細胞数が１〜１０×１０５個／ｍｌを維持するように培養することを特徴とするリンパ球細胞の製造方法。
【請求項６】
前記リンパ球細胞の数が、培養開始時に１×１０６〜５０×１０６である請求項１〜５のいずれかに記載のリンパ球細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法によりリンパ球を得る工程と、前記工程で得られたリンパ球を製剤化する工程とを有することを特徴とするリンパ球を含有してなる免疫治療剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、腫瘍細胞に細胞毒性（cytotoxicity）を有するリンパ球細胞亜集団、特にＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞及び／又はガンマー・デルタＴ細胞を、選択的に増殖し製造する方法並びに養子免疫療法に有用な免疫治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
過去、癌治療を目的として、様々な免疫療法が試みられてきた。代表的な方法として、一つは、癌細胞に対する担癌患者自身の宿主免疫反応を高めることを期待して、特異的又は非特異的な免疫活性化物質が投与された。ある種、例えばインターフェロン、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）等のサイトカイン類、ＰＳＫ、ＯＫ−４３２、レンチナン等の免疫賦活物質の実験では癌治療に応用できる可能性が示唆されたが、目的の腫瘍抗原に対する免疫反応が強く誘導できないこと、基本的に低下している癌患者の免疫能を期待ほど高めることが出来ないこと、さらに投与された物質そのものの副作用が問題になったこと等の理由で、未だに確かな成功をみた例はない。
【０００３】
他は、免疫細胞を体外に分離して刺激し免疫能を高め再び生体内に移入する方法で、免疫反応の低下している癌宿主の免疫反応に関わり無く直接的又は間接的に癌細胞を障害することが予想され、臨床試験が試みられ、ある程度の効果が確認された。このような治療に用いられる免疫的に活性のある細胞としては、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、腫瘍内浸潤リンパ球（ＴＩＬ）細胞などが代表としてあげられる。
【０００４】
特開昭６２−１１６５１８号公報には、細胞セパレータを用いて患者の血液を４時間以内に１０〜２０リットル処理して、１回あたり約５×１０５〜５×１０１０個の単核球を集め、フィコール・ハイパックでリンパ球を分離し、ＩＬ−２で刺激してＬＡＫ細胞を得、最後に大量のＩＬ−２と共にＬＡＫ細胞を患者に投与することが記載されている。その結果、一部の患者又は一部の癌種において、転移の部分的退縮等の効果が確認されている。しかし一方で、投与患者の大多数に発熱、悪寒、吐き気、嘔吐、呼吸困難、倦怠、紅班または皮膚発疹等のような比較的重篤な副作用も報告された。これらの方法の一つの大きな欠点は、治療に使用する細胞を大量に必要とすること、刺激後のリンパ球と同時に刺激物質を大量に投与することによる重篤な副作用が発現することであった。
【０００５】
また特開平３−８００７６号公報では、少量のリンパ球を培養器に固相化した抗ＣＤ３抗体で刺激することにより、さらに抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２で刺激することにより、細胞数が出発したときの約１００〜１００００倍に増殖することが報告されている。また、これらのリンパ球と腫瘍を増大させる宿主の免疫を抑制するための薬剤を同時に投与した臨床試験を行っており、リンパ球を投与した患者の全てで腫瘍が５０％以上縮小したことを報告している。しかしながら、この方法もリンパ球と同時に免疫を抑制する薬剤及び／又はＩＬ−２を投与しているため、前記の方法と同様、副作用が発現することが類推される。
【０００６】
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、Ｔ細胞増殖因子として発見された新しいサイトカインであり（ＷＯ９５／２７７２２号明細書）、Ｔ細胞、ＮＫ細胞を活性化することが知られている。しかし、ＩＬ−２とは異なり、リンパ球系の細胞からは産生されず、むしろ単球内皮細胞、平滑筋細胞等の非リンパ球系の細胞から産生されることを特徴とする。また、Ｔ細胞以外の例えば血管内皮細胞などにも結合能を有する。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５受容体α鎖と共にＩＬ−２受容体β及びγ鎖を介して情報伝達することもわかっている。しかしながら、ＩＬ−１５のリンパ球に対する作用効果のＩＬ−２との差異は明確になっていない。
【０００７】
これに関連し、マウスに予めＩＬ−２又はＩＬ−１５をその腹腔内に投与し、続いて１２５Ｉ標識牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を静脈内に投与すると、ＩＬ−２投与群で肺組織内の放射活性がＩＬ−１５の６倍に有意に上昇し、さらに、肺重量も有意に増加したことが報告され、これは、ＩＬ−２投与により血管漏出症候群（Vascular Leak Syndrome：ＶＬＳ）及び肺浮腫が惹起されたことによることが確認されている（William Munger et al., Cellular Immunology,165巻、289〜293頁、1995年）。従って、ＩＬ−２は、ＩＬ−１５より毒性が６倍高く、これは、ヒトの臨床試験で確認されている副作用の問題と関連があると思われる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
請求項１及び２記載の発明は、毒性の低いＩＬ−１５を用いて、腫瘍細胞に対して細胞毒性を有するリンパ球を大量に増殖するリンパ球細胞の製造法を提供するものである。
また、請求項３記載の発明は、癌、感染症等の治療に用いられる養子免疫療法に好適な免疫治療剤を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リンパ球細胞を、抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン１５の存在下に培養することを特徴とするリンパ球細胞の製造法に関する。
また本発明は、リンパ球細胞を、固相化した抗ＣＤ３抗体及びインターロイキン１５の存在下に培養する第１期培養工程、固相化した抗ＣＤ３抗体の非存在下かつインターロイキン１５の存在下に培養する第２期培養工程の各工程を含むことを特徴とするリンパ球細胞の製造法に関する。
さらに本発明は、前記の製造法により得られたリンパ球細胞を含有してなる免疫治療剤に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるリンパ球細胞としては、末梢血リンパ球、上皮性リンパ球、腫瘍内浸潤リンパ球、癌性腹水胸水浸潤リンパ球など生体に存在するあらゆるリンパ球が挙げられ、特に制限はされないが、末梢血リンパ球、特に採血直後の新鮮末梢血リンパ球が、採血患者への身体的負担、リンパ球分離の簡便さ、分離後のリンパ球の生存率の良さ等の点で好ましい。細胞の数としては、１×１０6〜５０×１０6個程度であるのが好ましく、血液量では１０〜２０mlであるのが、量的に問題なく培養でき、また採血時の患者への負担も軽いので好ましい。
【００１１】
上記リンパ球細胞は、抗ＣＤ３抗体の存在下に培養する。
ここでＣＤ３とは、Ｔリンパ球の細胞表面に存在し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と共に標的抗原を認識する際に重要な分子である。ＣＤ３分子を介して刺激情報が細胞内に伝達されることにより、Ｔ細胞は増殖を開始する。同様な現象が、ＣＤ３分子に対する特異的抗体（抗ＣＤ３抗体）の刺激により起こる。
リンパ球細胞の刺激に用いる抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を用いて動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、コスト等に優れた市販品を用いることもできる。
【００１２】
抗ＣＤ３抗体は固相化して用いるのが、増殖の効果が高いので好ましい。固相化には、抗ＣＤ３抗体を滅菌したリン酸緩衝液で１〜１０μg/mlの濃度に希釈して用いるのが好ましい。抗体を固相化する器具としては、ポリスチレン等のプラスチック製の減菌済み細胞培養フラスコ等が好ましく、その大きさは適宜選択できる。固相化方法としては、前記抗ＣＤ３抗体の希釈液を固相化する器具に加え、２〜２４時間、４〜３７℃で静置する方法が好ましい。固相化後、使用時まで冷蔵庫（４℃）で保存することが好ましい。使用時には、液を除去し、好ましくは常温の、リン酸緩衝液等で洗浄する。
【００１３】
また、本発明では培養にインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を用いる。ＩＬ−１５は、培養中１〜１０００ｎg/mlの濃度となるように用いるのが好ましい。ＩＬ−１５は市販されているものを用いることができる。ＩＬ−１５は、水、生理食塩液、リン酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる細胞培養液等に溶解して使用することができる。一度溶解したものは、活性の低下を防ぐため、冷蔵保存することが好ましい。
【００１４】
リンパ球細胞の培養は、ＩＬ−１５を含む培養液にリンパ球細胞を浮遊させ、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器に入れ培養を開始するのが好ましい。培養液としては、リンパ球の培養に適したものであれば特に制限されず、血清等の生物由来の培養液、平衡塩類溶液にアミノ酸、ビタミン、核酸塩基などを加え、さらに必要に応じてウシ胎児血清やウシ血清アルブミンを加えた合成培地などが使用でき、ＲＰＭＩ−１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等が好ましいものとして挙げられ、ＲＰＭＩ−１６４０が特に好ましいものとして挙げられる。培養液は、正常ヒト血清を添加したものが増殖効果に優れ好ましい。
【００１５】
これらの培地は市販品を用いることができる。培養は、一般的な細胞培養の方法に従うことができる。例えば、ＣＯ２インキュベータ内で行うことができる。ＣＯ2濃度は１〜１０％、特に５％が好ましく、温度は、３０〜４０℃、特に３７℃が好ましい。この培養は、日数に特に制限はないが、抗ＣＤ３抗体の刺激情報が細胞に伝達されることが前提となるため、２〜２０日行うことが好ましく、３〜７日行うことが好ましい。この培養の期間内には、顕微鏡下で細胞の状態を観察し、適宜細胞数を計測しながら、培養液を適宜添加するのが好ましい。この培養では、通常、培養開始１〜２日目には目立った細胞の増殖はないが、３日目頃から細胞増殖が観察され、順調に増殖し出すと培養液がオレンジ色から黄色に変化するようになる。培養液の添加量は、添加前の培養中の液の液量に対して０．１〜５倍程度が好ましい。その添加割合は、培養液の劣化及びＩＬ−１５活性の低下を防ぐために、１〜７日に１回行うことが好ましい。
【００１６】
本発明においては、上述の培養を第１期培養工程とし、固相化した抗ＣＤ３抗体の非存在下かつＩＬ−１５の存在下に培養する第２期培養工程を設けることが、リンパ球を大量に増殖・維持できるので好ましい。抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器で長期間培養を行うと、リンパ球の増殖が抑制されることがある。
第２期培養に用いる培養容器としては、細胞培養用のプラスチック製フラスコ、ＣＯ2ガス透過性のガス・パーミアブル・バッグ等を使用することができるが 、この工程ではリンパ球が急速に大量に増殖してくるため、２〜４日毎に培養器の数を増やしていくことが好ましい。細胞数の目安としては、５×１０5〜１０×１０5個／mlになるように培養液の追加又は培養器の数の増加を行っていくことが好ましい。
【００１７】
本発明の製造法によれば、主に、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマー・デルタＴ細胞及び／又はＣＤ１６＋ＮＫ細胞が増殖してくる。さらに、これらの細胞の少なくとも一つは、腫瘍細胞に対して細胞障害性（cytotoxicity）を示す。つまり、新しいサイトカインであるＩＬ−１５の刺激により、少量のリンパ球から標的細胞を障害する活性を有するリンパ球集団が効率的かつ大量に誘導できる。
【００１８】
ここでＣＤ４＋Ｔ細胞は、従来ヘルパー／インデューサーＴ細胞と言われ、標的となる細胞の組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と抗原分子を認識する細胞である。また、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、従来キラー／サプレッサーＴ細胞と言われ、標的となる細胞の組織適合性抗原（ＭＨＣ）クラスＩ分子と抗原分子を認識して攻撃する細胞である。また、ＣＤ１６＋ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞は、表面抗原にＣＤ１６分子を発現している細胞で、標的細胞の組織適合性抗原に拘束される事無く標的細胞を攻撃する能力を有する細胞である。また、ガンマー・デルタＴ細胞は、少なくともＣＤ３＋ＣＤ１６−の表面抗原を有し、Ｔ細胞受容体ガンマー・デルタ鎖を発現している細胞である。
【００１９】
さらに、本発明の製造法により得られるリンパ球細胞は、ＩＬ−２受容体及びＩＬ−１２受容体を高発現している。リンパ球などの細胞が、サイトカインなどの細胞刺激物質の刺激情報を受けて細胞内に情報を伝達するには、それぞれの物質に特異的な受容体で情報を受け取る必要がある。つまり、細胞表面に受容体が存在すれば、その受容体に特異的に結合する物質の刺激を受け取ることが出来る。本発明により培養したリンパ球が、ＩＬ−２受容体及びＩＬ−１２受容体を高発現しているということは、本リンパ球がＩＬ−１５の刺激以外に少なくともＩＬ−２及びＩＬ−１２に刺激を受け取り活性化されることを示しており、ＩＬ−１５とこれらのサイトカインとの相加または相乗効果も期待される。さらに、ＩＬ−２受容体の一部を共有するＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９等によっても同様の結果が得られる可能性を示している。従って、本発明により製造したリンパ球細胞は癌、各種感染症等の治療に有用な養子免疫療法に用いる免疫治療剤の有効成分とすることができる。また、研究用試薬として、種々の研究用途に用いることができる。
【００２０】
免疫治療剤とする場合、その投与量は、１回あたりの細胞の量で１０6〜１０12個の細胞が好ましい。投与形態としては、注射剤、点滴剤等の液体が好ましく 、前記細胞をヒト血清アルブミンを０．０１〜５％となるように添加した生理食塩液に分散した注射剤又は点滴剤がより好ましい。投与方法としては、静脈への点滴又は静脈、動脈、局所等への注射が好ましい。投与する液量は、投与方法、投与する場所等に異なるが、５０〜５００ccとするのが好ましく、この液量に前記の量の細胞が含まれるようにするのが好ましい。投与頻度は１回／日〜１回／月とするのが好ましく、投与回数は少なくとも１回、好ましくは５回以上である。
【００２１】
【実施例】
（１）抗ＣＤ３抗体固相化培養フラスコの調製
抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３，オルソ  ファーマシューティカル  コーポレイション製）をリン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）で５μg/mlの濃度に希釈し、表面積２５cm2のフラスコに５ml注入した。この溶液をフラスコの底面にまんべんなく広げ、冷蔵庫（４℃）で一晩以上、使用時まで静置した。溶液を注入したフラスコは、使用前に常温のＰＢＳで３回洗浄した。
【００２２】
（２）ＩＬ−１５を含む培養液（培地）の調整
ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ社製）に、１０％（体積／体積）ヒト正常血清（新鮮凍結血漿を３７℃で解凍後、５６℃、３０分間加熱して非働化し、１８０００rpm、６０分、４℃の遠心により沈殿物を除去し、さらに０．２２μｍのフィルターで濾過したもの）、１００U/mlペニシリン（明治製菓株式会社製）、１００γ/mlストレプトマイシン（明治製菓株式会社製）及びＩＬ−１５（イムノテック社製）５０ng/mlを含むように調整した。
【００２３】
（３）リンパ球の培養
ヘパリン処理をした２０mlの注射器を用いて採血したヒト末梢血全血２０mlに生理食塩液２０mlを加え２倍に希釈し、密度勾配遠心分離の媒体であるFicoll-Paque（ファルマシア社製）４mlに希釈血液１０mlを重層して１６００rpm、２５分、２０℃の条件で遠心を行いリンパ球層を回収し、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄した。約２×１０7個のリンパ球が得られた。前記のＩＬ−１５を含む培養液中に細胞密度約２×１０6個／mlで懸濁させ、この細胞懸濁液約５mlを前記抗ＣＤ３抗体固相化培養フラスコ中に加えて培養を開始した。翌日（培養１日目）からＩＬ−１５を含む培養液を１ml添加し、この操作を培養４日目まで繰り返した。培養５日目に抗ＣＤ３抗体を固定化していない７５cm2のフラスコに細胞浮遊液を移し、ＩＬ−１５を含む培養液を約１０ml添加した。これ以後、フラスコ１本当たりの細胞浮遊液の量は約３０mlを目安とし、培養液のオレンジ色から黄色への色の変化、及び細胞数の増加（１〜１０×１０5個／mlを目安）に応じて新しいフラスコに基本的に２分割して本数を増やし、ＩＬ−１５を含む培地を約１０ml添加した。この操作を繰り返し、リンパ球集団を８日間培養した。
【００２４】
（４）培養リンパ球の表現型の測定
上記により得られた培養リンパ球５×１０5個を試験管に分取し、ＲＰＭＩ−１６４０培地を加え１回遠心後上清を除去して、直接染色の場合ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）またはＰＥ（フィコエリスリン）標識モノクローナル抗体１０μｌを、間接染色の場合非標識モノクローナル抗体１μｇをそれぞれ加え良く撹拌した。氷中で３０分間静置の後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回遠心洗浄した。間接染色の場合、次に適当に希釈したＦＩＴＣ標識ヒツジ抗マウス抗体又は抗ラット抗体（カッペル社製）１０μｌを加え氷中で３０分間静置の後、ＲＰＭＩ−１６４０培地で２回遠心洗浄した。最後に０．５mlのＲＰＭＩ−１６４０培地を加え、良く撹拌し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・デッキンソン社）で各抗体に反応した表面抗原を測定した。
【００２５】
測定に用いたモノクローナル抗体は、直接染色には、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＴＣＲ−α／β抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＴＣＲ−γ／δ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４＋ＰＥ標識抗ＣＤ８抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ５６抗体（以上ベクトン・ディッキンソン社製）、間接染色には、ラット抗ＩＬ−２受容体α鎖抗体（抗ＣＤ２５、セロテック社製）、マウス抗ＩＬ−２受容体β鎖抗体（Ｍｉｋ−β１、ニチレイ(株)製）、マウス抗ＩＬ−２受容体γ鎖抗体（ＡＧ１８４、ファーミンジェン社製）及びマウス抗ＩＬ−１２受容体β１抗体（ホフマン・ラ・ロッシュ社製）及びＦＩＴＣ標識抗ラットＩｇＧ又はＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ（以上カッペル社製）を用いた。結果を表１に示す。
【００２６】
【表１】
0003951350.tif 000002
【００２７】
表１のデータから示されることは、得られたリンパ球細胞の表現型はほとんどがＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋のＴ細胞であり、Ｔ細胞受容体アルファー・ベータ鎖を有していることである。また、他に、少数のＴ細胞受容体ガンマー・デルタ鎖を有するＴ細胞及びＣＤ１６＋ＮＫ細胞が存在した。また、これらのリンパ球は、ＩＬ−２受容体α鎖、β鎖、γ鎖及びＩＬ−１２受容体を強く発現しており、ＩＬ−１５以外に例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９等のＩＬ−２受容体の一部を共有して情報を伝達するサイトカイン、及びＩＬ−１２等のＩＬ−１２受容体を介して情報を伝達するサイトカイン等の刺激により強く活性化されるであろう事は想像できる。つまり、ＩＬ−１５とこれらサイトカインとの組み合わせによる、リンパ球活性化の相加または相乗効果が期待される。
【００２８】
（５）培養腫瘍細胞に対する障害活性の測定
効果細胞として、培養して得られたリンパ球を、１０％（体積／体積）牛胎児血清（ＦＢＳ）添加ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、同じ培地に浮遊させ、細胞数を数えた後９６穴Ｕ底プレート（ファルコン社製）の最上段に２００μｌづつ播種し、以下２段目以降２倍づつ希釈して希釈段階を作製した。続いて、５１Ｃｒ（ICN社製）を２時間標識した標的細胞（培養癌細胞株Ｋ５６２，Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ細胞）１×１０5個／mlを１００μｌ（１×１０4個）づつ播種してリンパ球と混合し、５％ＣＯ2、３７℃で４時間培養した。培養終了後、上清１００μｌを採取し、ガンマーカウンター（パッカード社製）で遊離した５１Ｃｒの放射活性（ｃｐｍ、試験遊離群）を測定した。細胞障害率（％）は、以下の式で算出した。
【数１】
0003951350.tif 000003
なお、51Ｃｒ標識腫瘍細胞に３％トリトンＸ−１００を加え細胞を溶解したものを最大遊離群、51Ｃｒ標識腫瘍細胞単独を自然遊離群とした。
【００２９】
結果を図１に示す。これらリンパ球は、図１に示したように株化腫瘍細胞を効果的に障害したことから、養子免疫療法に用いるための効果的な細胞群であることが示された。
【００３０】
（６）免疫治療剤の調整及びその使用方法
免疫治療剤
上記の方法で癌患者由来のリンパ球細胞を増殖して製造し、これを市販の分離剤（Lymphoprep,Nycomed社製）を用いて、そのプロトコルに従って分離精製する。得られる細胞２×１０9個を、ヒト血清アルブミン０．１％を含む生理食塩液２００mlに懸濁して、点滴剤形態の免疫治療剤とすることができる。
免疫治療剤の使用方法
上記注射剤の全量を、癌患者に点滴静注する。
この操作を月１回の割合で繰り返すことにより、癌患者の癌を治癒したり、症状の進行の停止又は鈍化を図ることができる。
【００３１】
【発明の効果】
請求項１及び２記載のリンパ球細胞の製造法によれば、養子免疫療法で用いるために十分な数と、腫瘍細胞を障害する活性を有する活性化リンパ球が少量の全血から出発して効率よく得られる。
請求項３記載の免疫治療剤は、腫瘍細胞を障害する活性を有する活性化リンパ球を多く含み、養子免疫療法に有用なものである。さらに、他のサイトカイン等の免疫刺激物質と組み合わせることにより、さらに活性化したリンパ球が効率よく得られるであろう事が示唆される。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製造法により得られたリンパ球（効果細胞）の癌細胞株（標的細胞）に対する細胞障害活性（Cytotoxicity）を示したグラフである。
【図１】
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