(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ基を有する化合物を結合した担体のアミノ基を化学反応によりグアニジル基に変えたことを特徴とする炭水化物用分離剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炭水化物用分離剤の製造方法に関する。さらに詳細には、再現性よく製造でき、寿命が長く、保持容量が大きい炭水化物用分離剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、高速液体クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣともいう）は糖類の分離に広く利用されてきた。糖類は通常生体内で混合物として存在する。糖類の分離には、ホウ酸塩緩衝液を用いるアニオン交換カラムおよびアセトニトリル水溶液を用いるプロピルアミン結合シリカゲルカラムが一般に使用されてきた。
アニオン交換樹脂を用いる単糖類およびオリゴ糖類のイオン交換液体クロマトグラフィーは分析時間が長いという欠点を有する。他方アミン相カラムによる液体クロマトグラフィーは分析時間が短い。しかしながら、アミン相カラムは、例えばリボース、マンノースおよび多くの２−デオキシ糖のような、ある種の糖では回収率が低いという欠点を有する。これは、これらの糖が固定相のアミノ基と反応してＮ−グリコシドを生成し、あるいはアマドリ転移体を生成するためである。アミドカラムは、炭水化物の分析時間が短く、回収率も優れているが、クロマトグラフィーを行う際アノマーの分離を避けるために８０℃近辺の高温で操作する必要がある。
【０００３】
本発明者らは、主としてアルギニンからなる、自然に存在する強塩基性プロテインであるプロタミンが、シリカゲルと容易に結合することを見いだした。この特性を利用して、シリカゲルにプロタミンを塗布して高速液体クロマトグラフィー用充填剤として用いると、糖の分離が早く、回収率が優れていることを見いだした。しかしながら、このカラムは寿命が短いという欠点があった。また再現性よく製造できないという欠点があった。
本発明者らは、さらにプロタミンが共有結合した有機ポリマーを開発し、これを炭水化物の分離に適用した。この有機ポリマーを使用したカラムは、製造容易であり、かつ種々の炭水化物に対する分離性も優れていた。この分離能は従来使用されてきたアミン相カラムと同程度であった。このカラムは、アミン相カラムに比してアルドースの回収率が高く、プロタミンを塗布したカラムに比べて寿命も長かった。
しかしながら、このカラムは保持容量が少なく、溶離液組成として高濃度のアセトニトリルを使用しなければならないという欠点があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、アミン相カラムに比して糖の回収率が高く、保持容量が大きく、プロタミンのような天然高分子を固定化した分離剤に比して、品質、特性の安定した、保持容量の大きい、さらに寿命の長い炭水化物用分離剤の製造方法の提供を目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、アミノ基を有する化合物を結合した担体のアミノ基を化学反応によりグアニジル基に変えたことを特徴とする炭水化物用分離剤の製造方法を提供する。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明で使用される担体に結合するアミノ基を有する化合物としては、アルキルアミン、アルキルジアミン、アルキルポリアミン、ω−アミノカルボン酸が例示される。これらの類似物としては、アルキル基の中間部が炭素原子の代わりに、Ｎ、ＳまたはＯで結合されたものであってもよい。上記化合物の炭素原子数は、１〜２２、好ましく２〜１２、さらに好ましくは３〜８である。少なくとも一端にアミノ基を有する化合物がより好ましく使用される。
これらの化合物をより具体的に例示すると次のとおりである。
プロピルアミノシラン、ブチルアミン、ヘキシルアミン、オクチルアミン、デシルアミン、ヘキサメチレンジアミン、２−メチル−１，５−ペンタンジアミン、β−アラニン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン等。
【０００７】
本発明で使用されるアミノ基を有する化合物を固定化する担体としては、無機系担体としてシリカ、シリカゲル、多孔性アルミナ、有機系担体としてポリスチレンゲル、ポリスチレン水酸基ゲル、メタアクリレートゲル、エチレングリコール、デンプン、ビニルアルコール等が例示される。これらの担体は、あらかじめアミノ基を有する化合物を固定化したものであってもよく、市販品として容易に入手できる。それらを次に例示する。
シリカゲルとして、“Spherisorb  Si”(フェーズ・セパレーション社製）、“ＹＭＣ GEL Silicagel 60”（山村化学社製）、多孔性アルミナとして、“Aumina Alox 60”(ナーゲル社製）、“LiChrosorb Alox T"（メルク社製）、シリカゲル担体にアミノ基を有する化合物を固定化したものとして、“マイクロボンダスフェアーＮＨ2”（ウォーターズ社製）、“ＹＭＣーＧＥＬ  ＮＨ2”（山村化学社製）、“Zorbax ＮＨ2"(Du Pont社製）、シリカゲル担体にアミノ／シアノ基を有する化合物を固定したものとして、“Partisil 5 PAC"（ワットマン社製）、シリカゲル担体にヒドロキシル基を有する化合物を固定化したものとして、“LiChrosorb DIOL”（メルク社製）、シリカゲル担体にポリアミンを有する化合物を固定化したものとして、“ＹＭＣ−GEL PA"(山村化学社製)等の無機系担体が例示される。
有機系担体としては、ポリスチレンゲルとして、“日立ゲル 3010,3011,3019”（日立社製）、“MCI GEL GHP 20P”（三菱化学社製）、“Shodex polymer pak D"(昭和電工社製)、 “TSK gel LS 110,111"（東ソー社製）、メタアクリレートゲルとして、“Shodex RS pak DE 613"(昭和電工社製）、“TSK GEL LS 120,130,140" (東ソー社製）、エチレングリコールとして、“TSK GEL LS 160”(東ソー社製）、デンプンとして、“TSK GEL LS170”(東ソー社製)、ビニルアルコール系として、“Asahipak GS 220 ■ 620”(旭化成社製）、その他の有機系ポーラスポリマーとして、“MCI GEL LQA 32S”(三菱化学社製、-(CH2)6NH2)等が例示される。これらの担体は、分離剤の用途に応じ適宜選択使用できる。
【０００８】
本発明のグアニジル基含有化合物を担体に固定化した分離剤の製造法の一例を次に説明する。
有機系担体、例えばポリビニルアルコールを担体とする場合の分離剤の製造法は次のとおりである。ポリビニルアルコールにポリアミンを結合した担体に、イソチオ尿素硫酸塩を加えてアミノ基をグアニジル基に変え、ついで硫酸根を水酸化ナトリウム水溶液で除くことにより、グアニジル含有化合物を担体に固定化した分離剤を得ることができる。
無機系担体、例えばシリカゲルを担体とする場合の分離剤の製造法は次のとおりである。シリカゲルを担体とした場合には、まずシリカゲルにプロピルアミノ基を結合させる。ついでＯ−メチルイソ尿素亜硫酸塩水溶液中にプロピルアミノ基を結合したシリカゲル担体を加えてアミノ基をグアニジル基に変え、引き続き亜硫酸根を水酸化ナトリウム水溶液で除くことにより、グアニジル基含有化合物を担体に固定化した分離剤を得ることができる。
【０００９】
従来担体として、多糖類から作られるセルロース、アガロース、セファデックス等、石油化学製品で球状、細管状や網状にしたポリビニルアルコール、ポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン等に代表される柔らかな有機高分子系、およびシリカ、アルミナ、チタニア等に代表される無機高分子系のものが使用されてきた。これらの担体はそのまま吸着濾過剤として、あるいは液体クロマトグラフィー用充填剤として使われている。また、これら担体の表面を天然高分子の蛋白質、多糖類、あるいは合成高分子のシリコーンゴム、カーボワックス、ポリシロキサン等で表面処理して担体の特性を変え、適用範囲を広げる試みもなされてきた。
これらの担体の特性を高めるために、表面を低分子化合物で化学処理する方法も、分離剤として、例えばクロマトグラフィー用充填剤用として広く採用されてきた。すなわち、天然高分子で表面処理する場合には、天然高分子がたとえ安定に供給されたとしても、その品質、純度が一定でないため、再現性のある充填剤を得ることが難しい。しかし、低分子化合物を用いて、化学反応により担体の表面処理を行う場合には、品質管理が容易であり、品質、特性の安定した製品を市場に供給することができる。
【００１０】
本発明のグアニジル基を担体に固定化した分離剤は、プロタミンのような天然高分子を固定化した分離剤に比して、品質、特性の安定した製品を市場に供給することができる。さらに、用途に応じて適宜担体を選択することにより、酸や塩基にも耐える製品とすることができ、広い用途に適応した分離剤を提供できることとなる。とりわけ生化学の分野での応用が広く期待できる。
【００１１】
以下本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
製造例１ ポリビニルアルコール系グアニジノカラムの製造
Asahipak NH2P-50(長さ１５０ｍｍ、内径４．６ｍｍ）にＳ−メチルイソチオ尿素硫酸塩水溶液（１６．４ｇ／リットル）を８０℃で３リットル流した。その後、５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１００ミリリットルで洗浄し、硫酸イオンを除いた。さらに、洗浄液が中性になるまで水洗し、分析用カラムとした。
【００１２】
製造例２  グアニジル基結合シリカゲルカラムの製造
アミノプロピルシリカゲル１０ｇをＯ−メチルイソチオ尿素硫酸塩２．８ｇを溶かした水１００ミリリットルに加え、８０℃で２日間加熱した。濾紙で濾過した後、１ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液１リットルで洗浄し、亜流酸イオンを除いた。さらに、濾液が中性になるまで水洗した後、アセトンで過剰の水を除き、風乾した。
合成したグアニジル基結合シリカゲルを通常通りにカラムに充填し、ＨＰＬＣ用充填カラムとした。
【００１３】
実施例１
製造例１で得られた長さ１５ｃｍ、内径４．６ｍｍのポリビニルアルコール系グアニジノカラムに、８０％アセトニトリル水溶液を溶離液として、流速１ミリリットル／分で送液し、示差屈折計検出器でモニターし、各種糖の保持比および回収率を求めた。その結果を表１に示した。
表１において、水酸型とは、グアニジル基結合シリカゲルを合成した段階のものである。リン酸型とは、水酸型カラムにリン酸水溶液を流して得られたものである。
【００１４】
比較例１
アミノ基をグアニジル基に置換する以前のポリビニルアルコール系アミノカラムを使用し、実施例１と同一条件で各種糖の保持比および回収率を求めた。その結果を表１に示した。
【００１５】
0003895814.tif 000002
【００１６】
0003895814.tif 000003
【００１７】
表１から明らかなように、アミノカラムは糖の回収率が低く、糖の分離分析には適していない。例えば、フラクトースの回収率を１００％とするとグルコースの回収率は８４％、キシロースの回収率は４２％、マンノース、ガラクトース、リボース、アラビノースの回収率は１０〜２０％であった。２−デオキシグルコースと２−デオキシリボースは吸着されて回収できなかった。これに対しグアニジノカラムの場合には、グルコース、マンノース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、リボースおよび２−デオキシグルコースの回収率はほぼ１００％であった。さらにアミノカラムに比して保持容量が大きく、例えばグルコースで２倍、フラクトース、キシロース、リボースで３倍であり、糖の分離分析に適したカラムであった。
表１に見られるように、グアニジル基の対イオンが水酸型、リン酸型であるかにより、糖の保持比、回収率が異なっている。本発明においては、分離目的に応じてイオン型、例えば、酢酸型、リン酸型、硫酸型、ホウ酸型等のいずれかに変えて、保持比、回収率を適宜の範囲とすることができる。
さらにグアニジノカラムとプロタミンカラムでの糖の保持比を比較した。プロタミンカラムでは、保持時間を長くするために、濃度８７．５％のアセトニトリル水溶液を使用する必要があった。これに対しグアニジノカラムでは濃度８０．０％のアセトニトリル水溶液を使用した。プロタミンカラムの場合、高濃度のアセトニトリル水溶液を使用しているにも拘わらず、グルコースおよびキシロースの保持比は、グアニジノカラムのそれぞれ約１／３の３．６と２．１であった。
【００１８】
【発明の効果】
本発明によれば、品質が安定であり、かつ寿命の長い炭水化物の分離用に適した分離剤が提供される。さらに本発明によれば、炭水化物の回収率が高く、保持容量の高い分離剤が提供される。
さらに本発明によれば、プロタミン結合カラムのような強大な蛋白質を使用するものではないため、合成反応の制御が容易であり、保持容量の均一な、再現性よく、品質管理の保証された分離剤が提供される。