(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１−ａ）または（１−ｂ）で示されるアミジン誘導体。
0003919227.tif 000011
Ｒ1、Ｒ2は各々独立して炭素数１０〜１８のアルキル基である。
【請求項２】
前記一般式（１−ｂ）中、Ｒ2が炭素数１０のアルキル基である請求項１に記載のアミジン誘導体。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のアミジン誘導体を構成成分とするリポソーム。
【請求項４】
内部に診断および／または治療するための薬物を封入してなる請求項３に記載のリポソーム。
【請求項５】
外径が０．０２〜２５０μｍの大きさである請求項３または請求項４に記載のリポソーム。
【請求項６】
前記診断および／または治療するための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子またはその類縁体である請求項４または請求項５に記載のリポソーム。
【発明の詳細な説明】
「技術分野」
本発明は、新規なアミジン誘導体及びそれを構成成分とする薬物担体に関するものである。
「背景技術」
近年、リポソーム、エマルジョン、リピッドマイクロスフェアなどの閉鎖小包を薬物担体としてドラッグデリバリーシステム（以下、ＤＤＳと称す）に応用しようとする研究が盛んに行われている。これら閉鎖小包は一般的にリン脂質あるいはその誘導体、またはステロールやリン脂質以外の脂質等を基本膜構成成分として調製される、しかしながら、これら基本構成成分のみでは、閉鎖小包同士の凝集、体内における滞留性の低下などの実際に応用していくうえでの様々な面での困難を克服することはできなかった。さらに、実際にＤＤＳ製剤として目的の部位に薬物を到達させることは非常に困難であった。
そこで、薬物封入率の向上および閉鎖小包の細胞接着性の向上を目的として、ステアリルアミン等のカチオン化脂質を少量配合することにより、閉鎖小包体の表面を生理的ｐＨ範囲でカチオン化する試みも行われている。特にＤＮＡを含むカチオン性のリポソームはＤＮＡの細胞中への移動、すなわち、トランスフェクションを促進することが知られているが、さらに導入効率、発現率、安全性の高いものが切望されている。しかし、カチオン化脂質として選択できる脂質は限られており、安全性が高く、高機能を発現する薬物担体用カチオン化脂質の開発が強く望まれている。現在のところ、そのようなカチオン化脂質としては、米国特許第４８９７３５５号、米国特許第５３３４７６１号、日本特許公報特開平２−２９２２４６号、日本特許公報特開平４−１０８３９１号が報告されているが十分な効果は得られていない。
従って、効率良くかつ安全にＤＮＡを細胞中へ導入でき、またＤＮＡの細胞中への移動以外の目的、例えば血管内皮損傷部位、腎炎、腎ガン、肺炎、肺ガン、肝炎、肝ガン、膵ガン、リンパ腫などの患部に確実に、効率良くかつ安全に薬物のターゲッティングが行えＤＤＳ療法に有効な薬物担体の開発が強く望まれている。
「発明の開示」
従って本発明の目的は、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体を細胞へ効率良くしかも安全にトランスフェクションを行える薬物担体、およびそれを形成しうるカチオン化脂質を提供することである。また本発明の目的は薬物、ペプチドおよびタンパク質を目的の部位に効果的に送達する薬物担体、およびそれを形成しうるカチオン化脂質および薬物担体を提供することである。
上記目的は以下の本発明により達成される。
（１）  本発明は下記一般式（１−ａ）または（１−ｂ）で示されるアミジン誘導体及びその塩である。
0003919227.tif 000002
Ｒ1、Ｒ2は各々独立して炭素数１０〜１８のアルキル基である。
（２）  本発明は前記一般式（１−ｂ）中、Ｒ2が炭素数１０のアルキル基を示す上記（１）に記載のアミジン誘導体である。
（３）  本発明は上記（１）または上記（２）に記載のアミジン誘導体を構成成分とするリポソームである。
（４）  本発明は内部に診断および／または治療するための薬物を封入してなる上記（３）に記載のリポソームである。
（５）  本発明は外径が０．０２〜２５０μｍの大きさである上記（３）または（４）に記載のリポソームである。
（６）  本発明は前記診断および／または治療するための薬物が、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子またはその類縁体である上記（４または（５）に記載のリポソームである。
本発明の化合物は、いずれも新規化合物であり、その合成経路の例を下記に示す。但し、本発明はこれらに限定されるものでない。
例えば、下記一般式２で表わされる化合物のＺの部位を、Ｚがハロゲンのときはチオ尿素を導入することにより、またＺが-ＣＮのときはこれをアミジノ基に変換することによって製造することができる。
0003919227.tif 000003
式２中、Ａは芳香環であり、Ｒ1、Ｒ2は同一または異なって炭素数１０〜２５のアルキル基またはアルケニル基である。Ｘ、Ｙは同一または異なって-Ｏ-または-Ｓ-または-ＣＯＯ-または-ＯＣＯ-または-ＣＯＮＨ-または-ＮＨＣＯ-であり、ｎは０または１〜６までの自然数を示す。Ｚは、ハロゲンまたは-ＣＮである。
このように製造されるアミジン誘導体は、自体公知の分離、精製手段（例えば、クロマトグラフィー、再結晶）などにより単離採取することができる。
本発明の担体は、粒径が０．０２〜２５０μｍ、とりわけ０．０５〜０．４μｍの大きさが好ましい。
また、構造としては様々な形態が考えられ、限定する必要はないが、特にその内部に薬物を高濃度封入することのできる潜在的機能を有する、巨大分子、微集合体、微粒子、微小球、ナノ小球、リポソームおよびエマルジョンのうちより少なくとも一つ以上からなることが最も望ましい。
本発明において、薬物担体の構成成分としては、上記の形態を形成できるものであれば特にその配合に限定する必要はないが、その安全性や、生体内において安定性を考慮すると、リン脂質あるいはその誘導体、リン脂質以外の脂質あるいはその誘導体、または安定化剤、酸化防止剤、その他の表面修飾剤の配合が望ましい。
リン脂質としては、ホスファチジルコリン（＝レシチン）、ホスファジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、カルジオリビン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらを常法にしたがって水素添加したもの等を挙げることができる。
安定化剤としては、膜流動性を低下させるコレステロールなどのステロール、あるいはグリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。
酸化防止剤としては、トコフェロール同族体すなわちビタミンＥなどが挙げられる。トコフェロールには、α、β、γ、δの４個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。
その他の表面修飾剤としては、親水性高分子やグルクロン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。
前記親水性高分子としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、プルラン、フィコール、ポリビニルアルコール、スチレン−無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル−無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロペクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ペクチン、カラギーナンなどが挙げられる。その中でもポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果が顕著である。
また前記親水性高分子は、長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはグリセリン脂肪酸エステル等の疎水性化合物と結合させた誘導体を用いることによって、疎水性化合物部位を薬物担体（例えばリポソーム）の膜へ安定に挿入することができる。そのことにより、薬物担体表面に親水性高分子を存在させることができる。本発明において具体的に用いることができる親水性高分子誘導体としては、ポリエチレングリコール−フォスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
本発明において、薬物担体に封入する薬剤としては、診断および／または治療の目的に応じて薬学的に許容し得る薬理的活性物質、生理的活性物質または診断用物質を用いることができる。
封入する薬剤の性質としては、基本的にはどの物質においても問題ないが、担体の表面が陽電荷を持つ特徴から、電気的に中性あるいはアニオン性である物質の方が高封入率が期待できる。
封入する治療するための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねないがぎり特に限定されるものではない。具体的には、核酸、ポリヌクレオチド、遺伝子およびその類縁体、抗炎症剤、ステロイド剤、抗癌剤、酵素剤、抗生物質、抗酸化剤、脂質取り込み阻害剤、ホルモン剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、アンジオテンシン受容体拮抗剤、平滑筋細胞の増殖・遊走阻害剤、血小板凝集阻害剤、ケミカルメデイエーターの遊離阻害剤、血管内皮細胞の増殖促進または抑制剤、アルドース還元酵素阻害剤、メサンギウム細胞増殖阻害剤、リポキシゲナーゼ阻害剤、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗ウイルス剤、ラジカルスカベンチャー、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。
また、封入する診断するための薬剤の種類としては、薬物担体の形成を損ねないがぎり特に限定されるものではない。具体的には、Ｘ線造影剤、放射性同位元素標識核医学診断薬、核磁気共鳴診断用診断薬等が挙げられる
本発明の薬物担体は常法によって容易に得ることができるが、その一例を以下に示す。フラスコ内にアミジン誘導体およびリン脂質等の他の担体構成成分を、クロロホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、当該フラスコ内に薬物を加え、激しく攪拌することにより、リポソーム分散液を得る。得られたリポソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし封入されなかった薬物を除去することにより、薬物担体を分散液として得ることができる。また、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる。
「発明を実施するための最良の形態」
次に実施例、試験例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例、試験例に限定されるべきものではない。
（実施例１）  ３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジンの合成
３，５−ジヒドロキシベンゾニトリル０．５０ｇ、１−ブロモペンタデカン２．７０ｇ、炭酸カリウム２．５６ｇ及びアセトン３０ｍｌを混合し、一夜加熱還流した後、水を加え塩化メチレンで抽出し、水洗した後無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。溶媒を留去して、無色の結晶として３，５−ジペンタデシロキシベンゾニトリル０．３３ｇを得た。これをメタノール２０ｍｌとベンゼン３５ｍｌの混合溶媒に溶解し、氷冷下１時間塩化水素ガスを導入した。減圧下溶媒を留去し得られた結晶をクロロホルムとヘキサンで再結晶して３，５−ジペンタデシロキシ−α-メトキシ-α-イミノトルエン塩酸塩０．２８ｇを得た。これをクロロホルム１０ｍ１に溶解し、氷冷下４０分間アンモニアガスを導入した後、４．５時間加熱還流した。減圧下溶媒を留去し得られた固体からクロロホルム不溶物を除去して、無色の結晶として３，５−ジペンタデシロキシベンズアミジン０．２０ｇを得た。このものの機器分析データは下記式３の構造を支持する。
1Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤＣｌ3）  δ（ｐｐｍ）：６．９２（ｓ，２Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），３，９９（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），１．７７−１．２２（ｍ，５２Ｈ），０．８８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）
融点１４９〜１５０℃
0003919227.tif 000004
（実施例２）３，５−ジヘキサデシロキシベンズアミジンの合成
１−ブロモペンタデカンに代えて１−ブロモヘキサデカンを用いる以外は実施例１の方法に準じて、下記式４にその構造を示し、下記の性質を示す目的化合物を製造した。
1Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤＣｌ3）  δ（ｐｐｍ）：６．９３（ｓ，２Ｈ），６．６４（ｓ，１Ｈ），３．９８（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．７８−１．７０（ｍ，４Ｈ），１．４７−１．１５（ｍ，５２Ｈ），０．８８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）
融点１０９〜１１０℃
0003919227.tif 000005
（実施例３）  ３，５−ジオクタデシロキシベンズアミジンの合成
１−ブロモペンタデカンに代えて１−ブロモオクタデカンを用いる以外は実施例１の方法に準じて、下記式５にその構造を示し、下記の性質を示す目的化合物を製造した。
1Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤＣｌ3）  δ（ｐｐｍ）：６．９１（ｓ，２Ｈ），６．６５（ｓ，１Ｈ），３．９９（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．８０−１．７０（ｍ，４Ｈ），１．４７−１．１８（ｍ，６０Ｈ），０．８８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）
融点１４６〜１４８℃
（実施例４）  ３，５−ジデシロキシベンズアミジンの合成
１−ブロモペンタデカンに代えて１−ブロモデカンを用いる以外は実施例１の方法に準じて、下記式６にその構造を示し、下記の性質を示す目的化合物を製造した。
1Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤＣｌ3）  δ（ｐｐｍ）：６．９６（ｓ，２Ｈ），６．５８（ｓ，１Ｈ），３．９６（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），１．７７−１．６６（ｍ，４Ｈ），１．４４−１．１９（ｍ，２８Ｈ），０．８８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）
融点１２７〜１２８℃
0003919227.tif 000006
（実施例５）  ３，４−ジデシロキシベンズアミジンの合成
３，５−ジヒドロキシベンゾニトリルに代えて３，４−ジヒドロキシベンゾニトリルを１−ブロモペンタデカンに代えて１−ブロモデカンを用いる以外は実施例１の方法に準じて、下記式７にその構造を示し、下記の性質を示す目的化合物を製造した。
1Ｈ−ｎｍｒ（ＣＤＣｌ3−ＣＤ3ＯＤ）  δ（ｐｐｍ）：７．４３−７．２８（ｍ，２Ｈ），７．０１−６．９５（ｍ，１Ｈ），４．１２−４．０１（ｍ，４Ｈ），１．９１−１．７８（ｍ，４Ｈ），１．５４−１．１２（ｍ，２８Ｈ），０．９４−０．８４（ｍ，６Ｈ）
0003919227.tif 000007
（実施例６）
実施例１〜５で合成したアミジン誘導体を膜構成成分として含有するリポソームを下記の通りに調製した。
アミジン誘導体を３μＭ、ジパルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を２１μＭ、コレステロールを６μＭを、容量１０ｍＩのナス型フラスコに秤りとり、１ｍｌのクロロホルムにて完全に溶解する。エバポレータによりクロロホルムを減圧留去しフラスコ内壁に脂質薄膜を形成する。次いで０．５μＭのカルセインを含む１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１ｍｌをフラスコに加え、激しく振とう攪拌することにより、カルセイン封入リポソーム（ＭＬＶ）分散液を得た。
（試験例１）  カルセインの封入率の測定
カルセインのリポソームへの封入率は、次のように求めた。５０倍に希釈したリポソーム懸濁液４０μｌを２．０ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に添加し、蛍光強度を測定する（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５３０ｎｍ）。この時の蛍光強度をＦｔとする。つぎに１０ｍＭＣｏＣｌ2水溶液を２０μｌ添加しリポソームに封入されなかったカルセインを消光させ、リポソームの内部に封入されたカルセインの蛍光を測定する。この時の蛍光強度をＦｉｎとする。さらに２０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を２０μｌ添加することにより、リポソームを破壊し、すべてのカルセインをＣｏ2+と結合させ消光させる。この時の蛍光強度を、Ｆｑとする。リポソームの保持効率は以下の式にて求めた。
保持効率（％）＝（Ｆｉｎ−Ｆｑ×ｒ）／（Ｆｔ−Ｆｑ×ｒ）×１００
式中のｒは、リポソーム懸濁液および薬物の添加に伴う反応液の体積変化を補正した値で本試験例では、ｒ＝（２．０＋０．０４＋０．０２＋０．０２）／２．０＝１．０４である。結果を表１に示す。
0003919227.tif 000008
（実施例７）
実施例１〜５で合成したアミジン誘導体を膜構成成分として含有するＤＮＡ封入リポソームを下記の通りに調製した。
アミジン誘導体を１０μＭ、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）を２０μＭ、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を２０μＭ秤りとり、１ｍｌのクロロホルム溶液Ａとする。
クロロホルム溶液Ａの２０μｌを容量１０ｍｌのナス型フラスコに取りさらに１ｍｌのクロロホルムを加えた。エバポレータによりクロロホルムを減圧留去しフラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。次いで、β-ｇａｌａｃｔｏｓｏｄａｓｅの遺伝子を組み込んだプラスミドｐｃＤＮＡ／Ａｍｐ（Invitrogen社）２０μｇを溶解した水溶液１ｍｌをフラスコ内に加え、激しく振とう攪拌することによりＤＮＡ封入リポソームを得た。
（試験例２）  細胞の調製とトランスフェクション
細胞：大日本製薬株式会社より購入したＣｏｓ−１細胞（ATCC No. CRL-1650）を１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むIscove's modified Dulbecco's medium（ＩＭＤＭ）を用いて５％ＣＯ2，９５％Ｏ2，３７℃のインキュベータ中で継代培養した。
トランスフェクション：１０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ培地（１ｍｌ）を添加した６穴マルチウェルプレートに約２×１０4のＣｏｓ−１細胞を加え細胞培養を行った。約２４時間培養後ＦＣＳを含まない新鮮培地と交換し、０．２μｇのＤＮＡを含むリポソーム懸濁液を加える。１６時間培養後、１０％ＦＣＳ  ＩＭＤＭ培地にて培地交換し、さらに４８時間培養した。その後、細胞をホルムアルデヒドで固定し、β-ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの基質である５−ｂｒｏｍｏ−４ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｘ−ｇａｌ）を加え、β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅを発現した細胞を同定した。発色した細胞の全体に対する割合は、画像処理により測定した。結果を表２に示す。
0003919227.tif 000009
（実施例８）
実施例１で合成したアミジン誘導体を膜構成成分として含有するローダミン標識リポソームを下記の通りに調製した。
大豆レシチン/コレステロール/アミジン誘導体（全脂質量：１２０ｍＭ、７／２／１（モル比））からなる脂質のクロロホルム溶液をナスフラスコに入れ、ロータリーエバポレーターにて減圧乾固した後、一晩室温で真空乾燥することによりフラスコ内壁に脂質薄膜を形成した。次いで、生理食塩水（４ｍｌ）をフラスコに加えて６５℃に加温し、ボルテックスミキサーにて激しく攪拌してリポソーム分散液を得た。
この分散液は、ポリカーボネート膜を通して粒径制御した後、ローダミン標識フォスファチジルエタノールアミン（Avanti社）のエタノール溶液を添加して３７℃で３０分間放置した。次いで、セルロース透析膜を用いて生理食塩水に対して４℃で充分に透析した。
（試験例３）  実験的腎炎動物モデルを用いた集積性試験
ＳＤラット（５週令、雄）を１週間予備飼育した後、抗Ｔｈｙ１．１抗体（ＯＸ７、セロテック社）を尾静脈投与して腎炎を惹起した。抗体投与後３〜４日目の一日蓄積尿中の蛋白量を測定して腎炎発症を確認した。腎炎発症ラットにローダミン標識アミジンリポソーム（全脂質量１０ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）を１ｍｌ／ｋｇ尾静脈投与し、投与後１、６および２４時間後に脱血にて殺した。ヘパリン生食にて全身灌流した後、肝臓、脾臓、および腎臓を摘出し、それぞれの臓器について組織ホモジネートを調製してクロロホルムにてローダミン色素を抽出し、組織中のリポソーム濃度を求めた。結果を表３に示す。
表３に示したように、本発明のアミジン誘導体を膜構成成分として含有するリポソームは腎炎ラットの肝臓、脾臓では速やかに消失するのに対して腎臓には顕著に集積し、その集積性は２４時間以上持続した。
0003919227.tif 000010
（急性毒性）
ＩＣＲ系雄性マウス（５週齢）を用いて経口および静脈内投与により急性毒性試験を行った結果、本発明のアミジン誘導体のＬＤ50はいずれも３２０mg/kg以上であり有効性に比べて高い安全性が確認された。
「産業上の利用分野」
本発明により新規アミジン誘導体が供給される。本発明のアミジン誘導体を構成成分とするリポソームやエマルジョンなど薬物担体は、内部に遺伝物質や薬物を封入し、効率良くかつ安全に当該遺伝物質や薬物を細胞や病患部へ送達させることができる。