(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織プラスミノーゲン活性化因子と、ニコチン酸アミド又はその誘導体と、クエン酸とを配合した組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物であって、前記誘導体が、N-アルキル置換ニコチン酸アミド（但し、置換アルキル基は、炭素数１〜５個の直鎖又は分岐のアルキル基である）、ニコチン酸アミドの環置換アルキル基を有するニコチン酸アミド（但し、置換アルキル基は、炭素数１〜５個の直鎖又は分岐のアルキル基である）及びイソニコチン酸アミドからなる群から選択されることを特徴とする組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
【請求項２】
組織プラスミノーゲン活性化因子が、改変型組織プラスミノーゲン活性化因子である請求項１に記載の組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
【請求項３】
ニコチン酸アミド又はその誘導体が、0.1〜50%(w/v%)の濃度で配合されている請求項１又は２に記載の組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
【請求項４】
上記クエン酸が、10〜500mMの濃度で含有されている請求項１又は２に記載の組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
【請求項５】
凍結乾燥製剤である請求項１又は２に記載の組織プラスミノーゲン活性化因子医薬組成物。
【請求項６】
組織プラスミノーゲン活性化因子の溶解度を増加させるために、前記組織プラスミノーゲン活性化因子を含有する媒体において、ニコチン酸アミド又はその誘導体と、クエン酸とを配合する組織プラスミノーゲン活性化因子の溶解方法であって、前記誘導体が、N-アルキル置換ニコチン酸アミド（但し、置換アルキル基は、炭素数１〜５個の直鎖又は分岐のアルキル基である）、ニコチン酸アミドの環置換アルキル基を有するニコチン酸アミド（但し、置換アルキル基は、炭素数１〜５個の直鎖又は分岐のアルキル基である）及びイソニコチン酸アミドからなる群から選択されることを特徴とする組織プラスミノーゲン活性化因子の溶解方法。
【請求項７】
上記ニコチン酸アミド又はその誘導体の配合量が、0.1〜50%（w/v%）である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記クエン酸が、10〜500mMの濃度で配合される請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願発明は、組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｔ- ＰＡとも称する）含有医薬組成物に関する。より詳細には、ｔ- ＰＡ又はその改変型組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、改変型ｔ- ＰＡとも称する）及びニコチン酸アミド又はその誘導体を配合したことを特徴とする、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡ含有医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
ｔ- ＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化し、該プラスミンが血栓の蛋白質基質の主成分であるフィブリンを溶解する。心筋梗塞や、脳梗塞の原因となる血栓症に対する血栓溶解療法において、より血栓選択的な血栓溶解剤としてｔ- ＰＡ製剤が開発された。また、天然型ｔ- ＰＡに比較してフィブリン親和性及び血中半減期を高める目的で、種々の改変型ｔ- ＰＡが遺伝子工学的に製造されてきた。その際、原核生物からの改変型ｔ- ＰＡは、天然型ｔ- ＰＡとは対照的に非グリコシル型で生産される。一般的にｔ- ＰＡは水に極めて難溶性の蛋白質であるが、とりわけ当該改変型ｔ- ＰＡは、前述のフィブリン親和性の増加、血中半減期の延長等種々の長所を有するものの、水に対して、天然型ｔ- ＰＡよりも難溶であり、調製時の困難性は、言うに及ばず、水に溶解して投与する注射剤等としての製剤化を極めて困難なものにしている。
【０００３】
ところで、最近の急性心筋梗塞の治療で基本になっている考えは、冠動脈の閉塞が生じた場合、可及的速やかに血流を回復し、心臓の受ける障害を最小限に抑えることである。この考えに沿えば、高濃度且つ短時間で安全に投与できる薬剤が好ましい。従って、種々の長所を有する改変型ｔ- ＰＡの適用において早期の冠動脈再開通及び梗塞領域の拡大防止を期待する場合には、ｔ- ＰＡ高濃度製剤の単回急速投与が好適である。そのため、ｔ- ＰＡ、特に非グリコシル化ｔ- ＰＡは前述のごとく水に対して難溶性且つ蛋白構造的に不安定であるにも拘らず、臨床的使用においては水溶性の高められたより高濃度且つ蛋白構造的に安定なｔ- ＰＡ製剤の開発が望まれている。
また、ｔ- ＰＡは一般に熱に不安定であり、改変型ｔ- ＰＡもまた例外ではない。このような物質を医薬品として開発するためには安定化の技術が不可欠である。
【０００４】
ｔ- ＰＡを可溶化させるための従来の技術としては、アルギニン塩酸塩又はその塩を添加し、中性〜弱アルカリ性においてｔ- ＰＡを溶解安定化する技術が公知である（特公平6-72105 号及び特公平6-99324 号公報）。しかしながら、この技術の欠点は、中性〜弱アルカリ性条件下では、高濃度ｔ- ＰＡの蛋白構造的な安定性が低下することにある。更に、溶解性においても非グリコシル化ｔ- ＰＡ及び改変型非グリコシル化ｔ- ＰＡにおいては、その溶解特性が天然型ｔ- ＰＡと異なり、自己会合したｔ- ＰＡを当該方法により再溶解させることは困難であった。
また、溶液の液性をｐＨ２〜５に調整して、ｔ- ＰＡを可溶化する方法が知られている（特公昭63-38327号及び特公平3-69332 号公報）が、凍結乾燥状態及び溶液状態において速やかに分解し、失活するため、製剤化にはなお克服すべき問題を伴っていた。
【０００５】
一方で、ｔ- ＰＡを安定化させるための従来の技術として、アルブミンを添加する方法（特公平3-29390 号公報）、アルブミン分解物を添加する方法（特開平1-221325号公報）及び酸処理ゼラチンを添加する方法（特公平5-27607 号公報）が知られている。しかしながら、これらの方法では、高濃度ｔ- ＰＡにおける効果が不充分であり、特にアルブミン添加によりクエン酸緩衝液中のｔ- ＰＡの溶解性が低下することが確認されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本願発明の課題は、溶解性及び安定性の低いｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡ組成物の溶解性を増加させる方法を提供すること、並びに該ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡを臨床使用に適した濃度の溶液で含有し且つ製剤学的に充分に安定化されたｔ- ＰＡ医薬品製剤を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、先ずｔ- ＰＡ及び改変型ｔ- ＰＡの溶解性について、驚くべきことに、ニコチン酸アミド又はその誘導体を含有する製剤組成において著しく溶解度が向上することを見出した。一方、凍結乾燥状態及び液状においても、ニコチン酸アミドを含有する製剤によってｔ- ＰＡの安定性が大幅に向上することを発見し、これら知見に基づき、ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡの溶解性を増加させるための新規な溶解方法、及び該ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡと、ニコチン酸アミドもしくはその誘導体とを含有するｔ- ＰＡ組成物を提供する本願発明を完成させるに至った。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、詳細に説明する。
本願発明で使用されるｔ- ＰＡとしては、ヒト由来の天然型ｔ- ＰＡだけでなく、遺伝子工学的手法により得られたグリコシル化、非グリコシル化ｔ- ＰＡ等各種のｔ- ＰＡを使用することができる。
本願発明で使用される改変型ｔ- ＰＡは、ｔ- ＰＡをポイントミューテーション法などにより改良し、あるいはｔ- ＰＡの有する生物学的活性等を高めるために改変されたｔ- ＰＡであり、本願発明の溶解性増加効果及び安定化効果を達成するものであればいずれの改変型ｔ- ＰＡであってもよい。例えば、このような改変型ｔ- ＰＡとしては、特開昭61-243024 号、特開昭62-24 号、特開昭63-133988 号、特表昭63-501335 号、特表平2-504102号及び特表平3-500843号等公報に示された改変型ｔ- ＰＡ等が好適に挙げられる。
【０００９】
具体的には、本願発明で使用される改変型ｔ- ＰＡとしては、例えば、以下の改変ｔ- ＰＡを挙げることができる。
（1)  ｔ- ＰＡの２４５位のＶａｌがＭｅｔに置換された変異ｔ- ＰＡ、
（2)  ｔ- ＰＡの８４位のＣｙｓがＳｅｒに置換された変異ｔ- ＰＡ、
（3)  ｔ- ＰＡのＦ領域及びＧ領域の一部が欠失し、１１７位のＡｓｎがＧｌｕに置換された変異ｔ- ＰＡ、
（4)  ｔ- ＰＡのＫ１領域が欠落し、２７５位のＡｒｇがＧｌｕに置換された変異ｔ- ＰＡ、及び
（5)  ｔ- ＰＡのＦ領域、Ｇ領域及びＫ１領域が欠落した変異ｔ- ＰＡ。
ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡは、本願発明の医薬組成物の重量に基づいて、例えば、0.005 〜１重量％、好ましくは、0.01〜0.5 重量％、特に好ましくは、0.1 〜0.2 重量％の量で配合することが適当である。
【００１０】
なお、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡの安全性については、これまでの臨床的な使用実績により問題はない。
本願発明で使用されるニコチン酸アミドは、水溶性ビタミンＢ2 複合体の一因子であって、一般成人一日当り１０〜２０ｍｇ以上の摂取が必要とされている。ニコチン酸アミドは、日本薬局方に収載されており、臨床的にはニコチン酸欠乏症の予防及び治療に用いられる。ニコチン酸アミドの毒性に関しては、致死量はマウスに対して２〜３ｇ／ｋｇ、ヒトには１日５００ｍｇを連日非経口投与しても毒性は認められず、大量投与することができることが報告されている。
ｔ- ＰＡそのものの安全性はこれまでの臨床的な使用実績により問題はなく、従って、ニコチン酸アミドを含有した該製剤組成は極めて安全性の高いｔ- ＰＡ製剤であると考えられる。また、これまで知られているニコチン酸アミドの薬理作用は殆どはニコチン酸と同等であるが、ニコチン酸のように血管透過性を亢進させることはない。従って、これまで知られているニコチン酸アミドの薬理作用においては、ニコチン酸アミドの血液系に及ぼす影響は殆どなく、ｔ- ＰＡの薬理作用に対して相互作用を及ぼすことのない理想的な医薬品添加剤であると考えられる。
【００１１】
本願発明に用いられるニコチン酸アミドは、その誘導体であってもよく、例えばＮ- メチルニコチン酸アミドや、Ｎ, Ｎ−ジエチルニコチン酸アミド等のN-アルキル置換ニコチン酸アミド（例えば、置換アルキル基は、炭素数１〜５個、好ましくは、１〜３個の直鎖又は分岐アルキル基を好適に挙げることができる）や、１- メチルニコチン酸アミド等の環置換アルキル基を有するニコチン酸アミドの誘導体（アルキル基としては、例えば、炭素数１〜５個、好ましくは、１〜３個の直鎖又は分岐アルキル基を好適に挙げることができる）、イソニコチン酸アミドなどを用いることができる。なお、日本薬局方に収載されているニコチン酸アミドが最適な態様である。
ニコチン酸アミド又はその誘導体は、本願発明の医薬組成物に基づいて、通常、0.1 〜50％（ｗ／ｖ％、以下の％表示も同様である）、好ましくは0.3 〜５％、実用上更に好ましくは、１〜３％が適当である。この範囲内で、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡの溶解性を増加させることができる。
【００１２】
本願発明の医薬組成物には、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡ及びニコチン酸アミド又はその誘導体とともに、必要に応じて、更に、塩化ナトリウムや、塩化カリウム等の等張化剤や、マンニトールや、アルブミンなどの賦形剤、安定化剤、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０（商品名））などの非イオン性界面活性剤などの、医薬品製剤化において通常使用される添加剤を随時配合することができる。
本願発明の医薬組成物は、固形組成物や、水性組成物として、更には、例えば、用時調製注射剤としてｔ- ＰＡ含有凍結乾燥バイアルと、ニコチン酸アミド又はその誘導体とを含有する溶解液バイアルの組み合せのようなｔ- ＰＡ並びにニコチン酸アミド又はその誘導体が別個に包装された形態として使用してもよい。
【００１３】
本願発明の医薬組成物は、各種の方法によって製造することができる。例えば、本願発明の医薬組成物は、適当な媒体中において、ｔ- ＰＡ又は改変型ｔ- ＰＡにニコチン酸アミド又はその誘導体を添加することによって製造することができる。このような媒体としては、好適には、各種の緩衝液を使用することができる。このような緩衝液としては、例えば、トリス塩酸や、リン酸、炭酸、ホウ酸、クエン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸、アミノ酸などを含有する緩衝液を用いることができる。
本願発明の医薬組成物においては、特に、媒体として、クエン酸を含有するクエン酸緩衝液が、相乗的にニコチン酸アミド又はその誘導体の可溶化効果を改善することができるので好適である。
【００１４】
本願発明の医薬組成物において、クエン酸緩衝液を配合する場合には、好ましくは、クエン酸（クエン酸又はクエン酸塩としてのクエン酸の全量）の含有量（濃度）は、10〜500 mM、実際上、特に好ましくは、10〜50mMが好適である。
本願発明における医薬組成物において、通常、ｐＨ４〜6.5 、好ましくはｐＨ５〜６が適当である。特に、ｐＨ５〜６においては、ｔ- ＰＡ及び改変型ｔ- ＰＡの安定性が向上し、加熱やエージング(aging) によるアミノ酸レベルでの修飾を受けにくいことが判明している。
本願発明の製剤組成物は、具体的には、クロマトグラフィーで溶出したｔ- ＰＡ含有画分を、ニコチン酸アミド又はその誘導体を含んだ、例えば、クエン酸緩衝液で置換する方法や、ｔ- ＰＡ含有画分を水に対して透析し、ｔ- ＰＡの沈殿を生ぜしめた後、これをニコチン酸アミド又はその誘導体を含んだ、例えばクエン酸緩衝液で再溶解する方法などを採用することができる。いずれの方法においても、最終的にニコチン酸アミド又はその誘導体、及び必要により添加されるその他のクエン酸緩衝液等の製剤用基剤を配合し、これを、無菌的に所望のｔ- ＰＡ濃度に調製した液剤とするか、あるいはこの液体の凍結乾燥品を製造することも可能である。特に、本願発明によれば、ｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡを臨床使用するのに適した濃度で含有し、且つ製剤学的に十分に安定したｔ- ＰＡ凍結乾燥製剤が容易に得られる。
【００１５】
このような凍結乾燥製剤を製造する場合には、上記のｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡ含有溶液は、次いで、常法により凍結乾燥する。例えば、当該溶液を濾過滅菌等により滅菌し、次いで、アンプル又はバイアルのような無菌ガラス容器に所望の容量で分注する。これらを、例えば、−50〜−10℃の温度で冷凍し、冷凍溶液は、真空乾燥を開始するまで適当な温度（例えば、−50℃）で保持される。
冷凍溶液の真空乾燥は、適宜に実施でき、例えば、通常、0.01〜0.1 トールで実質的に全ての冷凍液の除去が達成されるまで充分な時間、部分的真空又は完全真空下に乾燥させる。真空乾燥を行なう温度は、通常、溶液が実質的に又は完全に凍結した形態で維持されるように、処理の開始時点で、通常、−40〜０℃である。処理が進行し、水分が除去されるにつれて、温度は室温に達するまで次第に上昇することがある。最後の痕跡量の水分をできるだけ除去するために、処理の終了時点において室温又はそのすぐ上の温度で約0.01トールの実質的真空下に真空乾燥を行なうことが好ましい。得られるｔ- ＰＡ凍結乾燥製剤の水分含有量（含湿度）は、好ましくは2.5 ％以下である。真空乾燥が完了したならば、凍結乾燥させたｔ- ＰＡ製剤を含有する無菌のガラス容器を減圧状態のままあるいは窒素ガス充填の後に密封する。
【００１６】
本願発明によって、高濃度でｔ- ＰＡもしくは改変型ｔ- ＰＡを含有する凍結乾燥医薬製剤を好適に得ることができる。投与用のｔ- ＰＡ含有溶液を調製するには、本願発明のｔ- ＰＡ凍結乾燥医薬製剤を中性又は酸性のｐＨを有する水で再構成する。ｔ- ＰＡ凍結乾燥医薬製剤が得られる水溶液が実質的に等張である場合には、再構成用の水は、実質的に等張であることが好ましい。
【００１７】
【実施例】
以下、本願発明について、調製例や、実施例等を参照しながら、更に詳細に説明するが、本願発明の範囲は、これらの調製例や実施例等によって何ら限定されるものではない。
調製例１（改変型ｔ- ＰＡの調製）
ｔ- ＰＡのＦ領域、Ｇ領域及びＫ１領域が欠失し、２７５位のＡｒｇがＧｌｕに置換された精製改変型ｔ- ＰＡを、Biotechnology Progress, 10(5): 472-479 (1994) に記載されている方法に従い調製した。当該精製改変型ｔ- ＰＡは精製水に対して透析し、遠心処理した後得られた沈澱を−８０℃にて保存した。
調製例２（天然型ｔ- ＰＡの調製）
組換えＣＨＯ細胞に由来する完全分子からなる天然型ｔ- ＰＡ（田辺製薬製「グルトパ」）を準備した。この天然型ｔ- ＰＡは、精製水に対して透析し、遠心処理した後、沈殿を−８０℃で保存した。用時は、約８mg／mlの濃度で所定の濃度のニコチン酸アミド又はその誘導体とともに使用した。
試験例１（溶解性試験１）
調製例１に示した改変型ｔ- ＰＡを約８ｍｇ試験管に取り、以下の表１に示す各組成の緩衝液を添加し、撹拌した後、遠心して得られた上清中のｔ- ＰＡが、プラスミノーゲンを活性化し、生成したプラスミンに特異的な合成基質（Ｓ- ２２８８）の水解活性により、ｔ- ＰＡ活性を測定し、濃度既知のｔ- ＰＡ標準品によりｔ- ＰＡの溶解度を求めた。結果を表１に示す。
【００１８】
【表１】
0004025394.tif 000002
上記表１から、ニコチン酸アミドを含有した医薬組成物において、アルギニン（Ａｒｇ）含有医薬組成物よりも、約５０倍以上可溶化することが分かる。従って、本願発明の医薬組成物により、ニコチン酸アミドが改変型ｔ- ＰＡの溶解度を著しく高める効果を有することが明らかとなった。
同様に、クエン酸緩衝液におけるクエン酸の濃度を40mMとしたことを除いて、上記と同様に溶解性試験１を行ったところ、上記と同様の結果が得られた。
【００１９】
試験例２（溶解性試験２）
上記溶解性試験１において、試料３及び４のニコチン酸アミドの濃度を、以下の表２に示すように変化させたことを除いて、上記溶解性試験１を繰り返すことにより、ｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を表２に示す。
【００２０】
【表２】
0004025394.tif 000003
上記表２の結果から、本願発明の医薬組成物において、ニコチン酸アミド濃度の上昇に伴い、改変型ｔ- ＰＡの溶解度が増大することが明らかとなった。また、この結果から、ニコチン酸アミドを、溶液中に実用上0.3 ％以上の濃度で共存させることにより、臨床的使用を充分満足するｔ- ＰＡの溶解度が達成されることが明らかとなった。
【００２１】
試験例３（溶解性試験）
５％ニコチン酸アミド、１％マンニトール及び0.01％Ｔween８０を含有した緩衝液において、併用する緩衝液の種類を変えることによって、試験例１と同様に、改変型ｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を以下の表３に示す。
【００２２】
【表３】
0004025394.tif 000004
上記表３の結果から、クエン酸緩衝液を使用すると、それ以外の緩衝液を使用する場合に比べて、ｔ- ＰＡの溶解度が大幅に増強されることが明らかである。
【００２３】
試験例４（溶解性試験４）
ｔ- ＰＡ溶解緩衝液（2.5 ％ニコチン酸アミド／１％マンニトール／0.01％Ｔween８０／クエン酸緩衝液、ｐＨ5.6 ）で使用されるクエン酸緩衝液のクエン酸の濃度を変化させて、試験例１と同様にｔ- ＰＡの溶解度を求めた。その結果を以下の表４及び図１に示す。
【００２４】
【表４】
0004025394.tif 000005
この試験例４の結果から、ニコチン酸アミドによるｔ- ＰＡ溶解度の増加効果は、500mM までの濃度のクエン酸イオン源の存在により濃度依存的に高められることが明らかとなった。
【００２５】
試験例５（溶解性試験５）
上記溶解性試験１において、改変型ｔ- ＰＡの代わりに、調製例２の天然型ｔ- ＰＡを使用し、且つ40mMのクエン酸を含有する緩衝液を使用したことを除いて、組み合わせるニコチン酸アミドの濃度を変化させた場合の、天然型ｔ- ＰＡの溶解性を上記と同様にして求めた。その結果を表５に示す。なお、ここで使用した基礎緩衝液の組成は以下の通りである。
基礎緩衝液の組成：40mMクエン酸緩衝液／0.01％Tween80 (pH7.2)
この緩衝液を、緩衝液Ａとする。
【００２６】
【表５】
0004025394.tif 000006
【００２７】
上記表５の結果から、天然型ｔ- ＰＡにおいても、ニコチン酸アミドの添加により、ｔ- ＰＡの溶解性が向上したことが分かる。また、全体的に、改変型ｔ- ＰＡに比べて、天然型ｔ- ＰＡの方が、溶解性が優れていることが分かる。
【００２８】
試験例６（凍結乾燥試験１）
溶解性試験例１〜５によって得られた結果に基づき、以下の成分からなる組成物を用いて、改変型ｔ- ＰＡの凍結乾燥製剤を調製した。
凍結保存しておいた改変型ｔ- ＰＡの沈澱を２倍濃度の組成緩衝液で溶解し、ｔ- ＰＡ濃度を３mg／mlになるように調整し、濾過滅菌した後、ガラス製バイアルに分注して、以下の工程で凍結乾燥した。
（1)  常圧で、棚温度−５０℃で２時間、引続き棚温度−２４℃で１時間凍結の後、−５０℃で１５時間予備凍結した。
（2)  0.1 トールの減圧下で棚温度を−５℃まで上昇させ、一次乾燥を行なった。
（3)  一次乾燥後、棚温度を３０℃まで上昇させ、二次乾燥を行なった。
（処方例）
クエン酸緩衝液      100 mM
ニコチン酸アミド    1.25  ％
マンニトール        １％
Ｔｗｅｅｎ８０      0.01  ％
改変型ｔ- ＰＡ      1.5 mg／ml
（ｐＨ5.6 ）
得られた凍結乾燥製剤を注射用水で溶解した。その結果、この凍結乾燥製剤は極めて速やかに注射用水に溶解し、透明な液となった。また、得られた注射剤では、改変型ｔ- ＰＡの活性及び正常な蛋白構造が保持されていた。従って、試験例６から、高濃度の改変型ｔ- ＰＡの凍結乾燥製剤を製造することが可能であることが示された。
また、40mMのクエン酸緩衝液を使用したことを除いて、上記と同様に試験を行ったが、上記と同様の効果が得られた。
【００２９】
試験例７（凍乾標品の安定性試験１）
試験例６で得られた凍結乾燥標品を所定時間６０℃中に放置し、安定性を調べた。安定性については、合成基質（Ｓ- ２２８８）水解活性の減衰及び、陰イオン交換（ＤＥＡＥ）ＨＰＬＣ分析におけるメインピークの残存率で評価を行なった。
合成基質水解活性の測定は、Pharmacopeial Previews, p.1223, Ｎov.-Ｄec., (1990) に基づいて行なった。陰イオン交換ＨＰＬＣによる分析は、陰イオン交換カラム（ＤＥＡＥ- ５ＰＷ：東ソー( 株) ）に対して、２Ｍ尿素を含む10mMトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.0 ）を移動相として用い、本移動相に0.2 Ｍ塩化ナトリウムを含有する溶離液でグラジエント溶出した。
その結果を以下の表６に示す。
【００３０】
【表６】
0004025394.tif 000007
上記表６の結果から分かるように、ニコチン酸アミドは、ｔ- ＰＡの可溶化効果だけではなく、凍結乾燥状態での安定性に対しても有効であり、ニコチン酸アミドを含有した医薬組成物によって、安定性の高い製剤を製造することが可能である。
【００３１】
試験例８（液状製剤の安定性試験１）
改変型ｔ- ＰＡを、ニコチン酸アミドを含んだ緩衝液に溶解した後、４０℃中に放置し、安定性を調べた。
安定性の評価については試験例７と同様に行なった。その結果、以下の表７に示す。
【００３２】
【表７】
0004025394.tif 000008
上記表７の結果から、ニコチン酸アミドを含んだ医薬組成物においては、液状においても、安定的に性状が保持されることが示された。特に、陰イオン交換ＨＰＬＣ分析では、加熱による修飾体の増加が抑制され、メインピークが保持されることが確認された。
この効果は、更に、クエン酸緩衝液を併用した場合でも、同様であった。
【００３３】
【発明の効果】
本願発明によれば、ｔ- ＰＡにニコチン酸アミド又はその誘導体を併用することにより、ｔ- ＰＡの溶解度及び安定性を向上させる。従って、本願発明は、ｔ- ＰＡの臨床上使用し得る、例えば、凍結乾燥製剤等の製剤を提供できるものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｔ- ＰＡの溶解度に対するクエン酸濃度の影響を示す図である。
【図１】
0004025394.tif 000009