(57)【要約】【課題】低コストで、総個体数の上昇が抑制され、リバウンドのリスクが抑制された、侵略的外来種等の有害な生物個体群を根絶する方法を提供すること。【解決手段】雌特異的不妊化遺伝子を多重に保持する雄または超雄個体を、野生個体群中に放出し、当該雄個体と当該野生個体群中の雌個体とを交配させ、野生個体群中に、雌特異的不妊化遺伝子を保持する子孫個体を生じさせることにより、当該野生個体群サイズを縮小する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体を、野生個体群中に放出し、当該雄個体と当該野生個体群中の雌個体とを交配させ、野生個体群中に、雌特異的不妊化遺伝子を保持する子孫個体を生じさせることを含む、当該野生個体群サイズの縮小方法。
【請求項２】
雌特異的不妊化遺伝子が、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
放出する雄個体が、2以上の雌特異的不妊化遺伝子を保持する、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
放出する雄個体が、雌特異的不妊化遺伝子のホモ接合体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
【請求項５】
放出する雄個体が、超雄である、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を複数回繰り返す、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
野生個体群中に、稔性雌個体が存在しなくなるまで、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を繰り返す、請求項6記載の方法。
【請求項８】
放出する雄個体が、識別可能となるように標識されている、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
野生個体群の一部を捕獲し、捕獲した個体が放出した雄個体である場合には、当該野生個体群中に再放出することを更に含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
野生個体群の生物種が魚類である、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
野生個体群が外来種である、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する子孫個体の製造方法：
（I）雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する生殖原細胞又は始原生殖細胞を、宿主不妊雌個体の生殖腺へ取り込まれるように当該宿主不妊雌個体内へ移植することにより、当該生殖原細胞又は始原生殖細胞から雌特異的不妊化遺伝子を保持する卵を発生させること、
（II）当該卵と、雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子とを交配させることにより、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する子孫個体を生じさせること。
【請求項１３】
雌特異的不妊化遺伝子が、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体である、請求項12記載の製造方法。
【請求項１４】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子が、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体の精子である、請求項12又は13記載の製造方法。
【請求項１５】
雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する生殖原細胞又は始原生殖細胞が、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体に由来する生殖原細胞又は始原生殖細胞である、請求項12〜14のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１６】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子が、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体の精子である、請求項15記載の製造方法。
【請求項１７】
宿主不妊雌個体が、不妊三倍体、不妊雑種二倍体又は不妊雌異質三倍体である、請求項12〜16のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項１８】
宿主不妊雌個体が、全雌生産により生産された個体である、請求項12〜17のいずれか1項に記載の製造方法。
【請求項１９】
子孫個体が雄である、請求項12〜18のいずれか1項記載の製造方法。
【請求項２０】
子孫個体が超雄である、請求項19記載の製造方法。
【請求項２１】
請求項19又は20記載の方法により製造された、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体を放出する、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、侵略的外来種等の生物個体群のサイズを縮小し、ひいては根絶する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
琵琶湖等の大型湖沼において、ブルーギル、オオクチバス等の魚食性の侵略的外来魚の大繁殖による固有生態系の破壊、希少種の絶滅危惧、内水面漁業の壊滅的衰退が大きな社会問題となっている。これまでに国、自治体、漁協、市民活動等、様々な組織による莫大な予算と精力的な駆除努力により一定の減少傾向は見られるものの、未だホンモロコ、エビ類等主要漁獲対象魚種においては資源回復の兆候はなく、また絶滅危惧種は依然絶滅の危機に直面している。現在の懸命な駆除努力下においても在来魚の資源量には回復傾向が全くみられず、将来において平衡状態は高位安定となることが懸念される。従来の対処手法は、1）侵入防除、2）調査、捕獲、採取、毒物等による物理的駆除、3）昆虫等限られた種における不妊化個体の大量放出等で、それらが効果的に機能した事例はいくつか知られているが、駆除できていない事例も数多く存在する。現在大きな問題になっている外来魚の問題では、根本的に侵略的外来種の根絶あるいは量的制御を可能とする概念および手法が見当たらないのが現状である。固有生態系を回復させ、内水面漁業を外来魚が侵入する以前の状態に回復させるには新たな抜本的対策が必要である。
【０００３】
非特許文献1には、放射線処理により不妊化した雄の昆虫を放出することにより、特定の害虫を根絶する方法が開示されている。日本においても、沖縄群島のウリミバエに対してこの方法が適用され、根絶に成功している。しかしながら、この方法では、野生個体群の個体数を超えるほどの多数の不妊個体を要するため、大規模な飼育施設を必要とし、高コストである。また、生存サイクルの短い生物（例えば、ウリミバエは1年程度である。）を根絶する場合には、短いサイクルで、大量の不妊個体を放出し続けることにより、全個体群に対する不妊個体の割合を一定以上の水準に維持しなければならない。また、不妊個体の大量放出により、一時的に総個体数が大幅に上昇するため、有害な生物を駆除対象とする場合には、生態系が破壊され、かえって被害が拡大してしまうおそれがある。更に、駆除効果を放出個体のみに依存しているため、不妊個体の放出を止めたり緩めたりすると、残った個体の子孫が直ちに増殖し個体数が瞬く間に回復してしまう、いわゆるリバウンドのリスクを伴う。
【０００４】
非特許文献2には、自然界には存在しない性染色体（トロイ染色体）と性の組み合わせ個体を放流し、個体群における性の割合を偏らせることにより、外来魚を根絶させる手法が提案されており、特に2つのY染色体をもつ超雄（YY雄）とその雌への性転換個体（YY雌）の放出（次世代以降でYY雄を量産するため、YY雄放流より効果が高い）が前述の不妊雄を放流する方法よりも効果的とされた。しかし、この方法においても、YY雄放流ではかなりの数の放流個体を必要とし（YY雄では、野生個体群の個体数の20％以上）、大規模な飼育施設を必要として、高コストである。一方比較的放流量が少なくてすむYY雌放流でも野生個体群の個体数の8％以上を必要とすること、また性転換にもコストがかかる。また、これらの方法においても、一時的に総個体数が大幅に上昇したり、YY雌放流の場合は放流個体が卵を産むため、YY雄放流より根絶時間は短い分、その期間中の総個体数は高位で推移する（非特許文献3）など、問題点が多く、有害な生物を駆除対象とする場合には、かえって被害が拡大してしまう可能性がある。また、駆除を放流個体（YY雄放流）あるいは次の2世代のみ（YY雌放流）に依存しているため、放流をやめれば、不妊雄と同様、リバウンドのリスクを伴う。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Knipling, E. F. (1955) Possibilities of insect control or eradication through the use of sexual sterile males. J. Econ. Entomol. 48: 459-462.
【非特許文献２】JB Gutierrez and JL Teem (2006) A model describing the effect of sex-reversed YY fish in an established wild population: the use of a Trojan Y chromosome to cause extinction of an introduced exotic species. Journal of Theoretical Biology, 241(22):333-341
【非特許文献３】箱山洋、平成20年度外来魚抑制管理技術開発事業報告書  外来魚と在来魚の共存条件、個体数推定および駆除法の数理的解析1-10
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、低コストで、総個体数の上昇が抑制され、リバウンドのリスクが抑制された、侵略的外来種等の有害な生物個体群を根絶する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討の結果、雌を特異的に不妊化させる遺伝子（例えば、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体）を有する雄個体を放出個体として用いることにより、これらの問題を解決し得ることを見出した。即ち、物理的駆除圧等で個体群の増殖が制御されている環境下で、雌特異的不妊化遺伝子を有する雄個体を野生個体群中に一定量以上放出し続けると、交配の結果、雌特異的不妊化遺伝子を有する子孫個体の割合が増える。子孫個体群のうち、雌特異的不妊化遺伝子をホモ型に有する雌は不妊であり、次世代を残すことができない。一方、雌特異的不妊化遺伝子を有する雄子孫個体は、妊性なので、さらに野生個体群中の雌と交配することにより、雌特異的不妊化遺伝子を有する次世代を残し続ける。雌で不妊化遺伝子がホモ化すると、子孫を残せないことによりその不妊化遺伝子は集団中から失われることになるが、雄においては妊性のため遺伝子が子孫に引き継がれ、失われることがない。つまり雌の不妊化を個体の駆除と同義とみなせば、個体の駆除に比して遺伝子のロスは最小限であり、放流による集団への遺伝子の供給がこの遺伝子の逸失分を上回ることにより、集団中の不妊化遺伝子の占有率を上昇させ続けることが可能である。その結果、比較的少数の放出を続けることにより、不妊化遺伝子の占有率は上がり続け、不妊の雌個体の割合が増加する結果、集団の繁殖力が次第に削がれていき、最終的にこの生物個体群が縮小・根絶される。搭載する遺伝子を多重化する（各遺伝子は異なる連鎖群に属する＝異なる染色体上に座するものとする）ことにより、出現する不妊化雌の割合を増大させることが可能である。さらにこの雌特異的不妊化遺伝子を搭載する雄個体を超雄（YY雄）化することにより、YY雄放流による駆除効果との相乗効果で根絶力はさらに増強される。また駆除効果は放出個体のみならず、過去の放出によって広まった遺伝子を引き継いだすべての個体が駆除効果を発揮するため、一端不妊化遺伝子占有率が上がって繁殖力を削いでしまえば、たとえ放流を止めても個体数が直ちに回復することはなく、リバウンドのリスクを回避できる。また不妊化遺伝子占有率が十分に上がらない時に予期せぬ自然環境の変化により個体群の大きさが拡大したとしても、一度上がった不妊化遺伝子占有率は個体群の大きさに影響されず変化しないので、不妊化雄やYY個体の放流と異なり、過去の放流がこれによって無駄になることはなく、少量ずつの放流による事業展開に適している。
【０００８】
発明者らは、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：
【０００９】
［1］雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体を、野生個体群中に放出し、当該雄個体と当該野生個体群中の雌個体とを交配させ、野生個体群中に、雌特異的不妊化遺伝子を保持する子孫個体を生じさせることを含む、当該野生個体群サイズの縮小方法。
［2］雌特異的不妊化遺伝子が、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体である、［1］記載の方法。
［3］放出する雄個体が、2以上の雌特異的不妊化遺伝子を保持する、［1］又は［2］記載の方法。
［4］放出する雄個体が、雌特異的不妊化遺伝子のホモ接合体である、［1］〜［3］のいずれか記載の方法。
［5］放出する雄個体が、超雄である、［1］〜［4］のいずれか記載の方法。
［6］雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を複数回繰り返す、［1］〜［5］のいずれか記載の方法。
［7］野生個体群中に、稔性雌個体が存在しなくなるまで、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を繰り返す、［6］記載の方法。
［8］放出する雄個体が、識別可能となるように標識されている、［1］〜［7］のいずれか記載の方法。
［9］野生個体群の一部を捕獲し、捕獲した個体が放出した雄個体である場合には、当該野生個体群中に再放出することを更に含む、［1］〜［8］のいずれか記載の方法。
［10］野生個体群の生物種が魚類である、［1］〜［9］のいずれか記載の方法。
［11］野生個体群が外来種である、［1］〜［10］のいずれか記載の方法。
［12］以下の工程を含む、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する子孫個体の製造方法：
（I）雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する生殖原細胞又は始原生殖細胞を、宿主不妊雌個体の生殖腺へ取り込まれるように当該宿主不妊雌個体内へ移植することにより、当該生殖原細胞又は始原生殖細胞から雌特異的不妊化遺伝子を保持する卵を発生させること、
（II）当該卵と、雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子とを交配させることにより、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する子孫個体を生じさせること。
［13］雌特異的不妊化遺伝子が、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体である、［12］記載の製造方法。
［14］雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子が、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体の精子である、［12］又は［13］記載の製造方法。
［15］雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する生殖原細胞又は始原生殖細胞が、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体に由来する生殖原細胞又は始原生殖細胞である、［12］〜［14］のいずれか記載の製造方法。
［16］雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子が、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体の精子である、［15］記載の製造方法。
［17］宿主不妊雌個体が、不妊三倍体、不妊雑種二倍体又は不妊雌異質三倍体である、［12］〜［16］のいずれか記載の製造方法。
［18］宿主不妊雌個体が、全雌生産により生産された個体である、［12］〜［17］のいずれかに記載の製造方法。
［19］子孫個体が雄である、［12］〜［18］のいずれか記載の製造方法。
［20］子孫個体が超雄である、［19］記載の製造方法。
［21］［19］又は［20］記載の方法により製造された、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体を放出する、［1］記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明においては、雌特異的不妊化遺伝子を有する雄個体を野生個体群中に放出し、野生群中の雌個体と交配することによって、雌特異的不妊化遺伝子を有する子孫個体のうち、雌が不妊となる一方で、雄は妊性を維持するので、雌特異的不妊化遺伝子を有する更なる次世代子孫を生じることとなる。自然交配を通じて、野生個体群中に、雌特異的不妊化遺伝子を浸透させるので、比較的少ない放出個体数によって、外来生物等を根絶することが可能である。その結果、放出個体を生産するコストを抑制することができる。また、放出による総個体数の増加を最小限に抑制することができるので、生態系への影響が少なく、有害生物への適用も可能である。また、環境変動等による急激な繁殖力の増加や、根絶後の再侵入への対応も容易であり、駆除が進み、生息密度が極端に下がり、さらなる個体群の縮小に必要な物理的駆除率を維持できなくなった局面でも駆除効果を維持することができる。更に、雌特異的不妊化遺伝子を有する雄子孫個体は、妊性であり、雌特異的不妊化遺伝子を有する次世代を残し続けるので、過去の放出による効果が持続し、リバウンドのリスクが回避されている。また、異なる連鎖群に属する（＝異なる染色体上に座する）雌特異的不妊化遺伝子を多重化搭載することにより、駆除効果を増強することが可能である。更に、雌特異的不妊化遺伝子を有する雄個体を超雄（YY雄）化することにより、超雄放流との併用が可能であり、特に、生息密度が減少し、物理的駆除力が落ちる段階では、放流個体の相対的割合が増すのでYY放流の効果が発揮されやすく、大きな駆除力を発揮し、根絶時間の短縮を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】YY雄個体の放流による、ブルーギル駆除のシミュレーションを示す。
【図２】雌特異的不妊化遺伝子1つをホモ型に搭載した雄の放流による、ブルーギル駆除のシミュレーションを示す。
【図３】雌特異的不妊化遺伝子2つをホモ型に搭載した雄の放流による、ブルーギル駆除のシミュレーションを示す。
【図４】雌特異的不妊化遺伝子2つをホモ型に搭載したYY雄個体の放流による、ブルーギル駆除のシミュレーションを示す。
【図５】雌特異的不妊化遺伝子のホモ接合体であるYY雄個体を放流し、放流した個体を駆除対象からなるべく外した場合（標識した個体の駆除率は半分に設定）の、ブルーギル駆除のシミュレーションを示す。
【図６】ブルーギルfoxl2の推定ゲノム構造を示す。
【図７】ブルーギルfoxl2の推定ゲノム構造、ORFヌクレオチド配列、及びそれにコードされる推定アミノ酸配列を示す。
【図８】ブルーギルfoxl2に対するガイドRNA（crRNA）のデザインを示す。
【図９】遺伝子編集によるブルーギルfoxl2遺伝子への変異の導入を確認した結果を示す。PAM配列の3〜4残基上流での切断により、上下流6〜13残基が欠損している。
【図１０】遺伝子編集によるブルーギルfoxl2遺伝子への変異の導入により、FoxL2タンパク質のアミノ酸配列が改変されたことを確認した結果を示す。
【図１１】3個の雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載したXY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（リッカー型密度効果）。
【図１２】3個の雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載したXY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（ベバートン・ホルト型密度効果）。
【図１３】3個の雌特異的不妊化遺伝子をヘテロ型で搭載したYY雌を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（リッカー型密度効果）。
【図１４】3個の雌特異的不妊化遺伝子をヘテロ型で搭載したYY雌を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（ベバートン・ホルト型密度効果）。
【図１５】YY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（リッカー型密度効果）。
【図１６】YY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（ベバートン・ホルト型密度効果）。
【図１７】1個の雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載したYY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（リッカー型密度効果）。
【図１８】1個の雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載したYY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（ベバートン・ホルト型密度効果）。
【図１９】3個の雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載したYY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（リッカー型密度効果）。
【図２０】3個の雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載したYY雄を放流し、物理的駆除を併用したモデルにおける相対的資源量の推移を示す（ベバートン・ホルト型密度効果）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体を、野生個体群中に放出し、当該雄個体と当該野生個体群中の雌個体とを交配させ、野生個体群中に、雌特異的不妊化遺伝子を保持する子孫個体を生じさせることを含む、当該野生個体群サイズの縮小方法及び当該野生個体群の増殖抑制方法を提供する。野生個体群の増殖抑制には、野生個体群サイズの縮小のみならず、野生個体群サイズの増大速度を緩やかにすることも包含される。
【００１３】
本発明の方法を適用可能な個体の生物種は、有性生殖をする生物であれば特に限定されず、例えば有性生殖をする植物、動物等が包含される。有性生殖をする植物としては、コケ植物、シダ植物、種子植物等が挙げられるが、これらに限定されない。有性生殖をする動物としては、魚類、節足動物（昆虫類、甲殻類、クモ類等）、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類（ヒトを除く）等を挙げることができるが、これらに限定されない。対象とする有性生殖する野生個体群の生物種は、好ましくは、動物であり、より好ましくは、魚類である。
【００１４】
尚、雌雄同体の植物では、雌特異的不妊化遺伝子は雌性生殖器特異的不稔化遺伝子として定義され、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体に代えて、雌性生殖器特異的不稔化遺伝子を保持する個体が放出され、雌性生殖器特異的不稔化遺伝子を保持した花粉が拡散し、野生個体群中の別の個体に受粉し、野生個体群中に雌性生殖器特異的不稔化遺伝子を保持する子孫個体が生じる。このような態様も、本発明の範囲内である。
【００１５】
一態様において、本発明の方法を適用可能な野生個体群は外来種である。外来種とは、もともとその地域にいなかったが、人間の活動によって他の地域から入ってきた生物をいう。当該外来種は、好ましくは、侵略的外来種である。侵略的外来種とは、地域の自然環境に大きな影響を与え、生物多様性を脅かすおそれのある外来種をいう。侵略的外来種の魚類としては、日本におけるブルーギル、オオクチバス、コクチバス、カダヤシ、ソウギョ、タイリクバラタナゴ、チャネルキャットフィッシュ、ケツギョ等；五大湖のハクレン等のコイ科魚類；オーストラリアのコイ；ヨーロッパ、韓国におけるブルーギル等を挙げることができるが、これらに限定されない。侵略的外来種の節足動物としては、日本におけるウリミバエ、アルゼンチンアリ、カンシャコバネオナガカメムシ等の昆虫、セアカゴケグモ等のクモ類、アメリカザリガニ等の甲殻類等を挙げることができるが、これらに限定されない。侵略的外来種の哺乳類としては、日本におけるアライグマ、ヌートリア、ノネコ、マングース等を挙げることができるが、これらに限定されない。侵略的外来種の鳥類としては、日本におけるガビチョウ、ソウシチョウ等を挙げることができるが、これらに限定されない。侵略的外来種の爬虫類としては、日本におけるカミツキガメ、グリーンアノール等を挙げることができるが、これらに限定されない。侵略的外来種の両生類としては、ウシガエル、オオヒキガエル等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の方法は、系内への個体の流入や、系外への個体の流出が制限された、閉鎖系（例えば、池、湖、沼、離島等）内に生息する野生個体群に適用するのが効果的であるが、開放系に生息する野生個体群へも適用可能である。
【００１７】
本発明において、雌特異的不妊化遺伝子とは、当該遺伝子をホモ接合性又はヘテロ接合性で保持した場合、雌個体のみを特異的に不妊化あるいは繁殖力を減少させ、且つ雄個体の妊性を損なわない遺伝子を意味する。雌特異的不妊化遺伝子としては、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体を挙げることができる。本目的に沿う雌特異的成熟遺伝子としては、卵の支持細胞などの体細胞側で発現し、卵の成熟誘導等の雌の生殖生理に寄与し、卵原細胞や卵細胞など生殖細胞側で発現しない遺伝子が好ましい。候補遺伝子としては、例えば、濾胞刺激ホルモン（FSH）のβサブユニット遺伝子、黄体形成ホルモン（LH）のβサブユニット遺伝子、濾胞刺激ホルモンレセプター（FSH-R）遺伝子、FoxL2遺伝子、卵黄タンパク前駆体ビテロジェニン遺伝子（Vg）、卵膜を構成するタンパク質として知られる、卵膜前駆タンパク質コリオジェニン遺伝子(Chg)やZPタンパク質遺伝子等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体とは、雌特異的成熟遺伝子が本来有する正常な機能が十分に発揮できない変異体をいい、例えば、雌特異的成熟遺伝子を全く発現しない変異体、または雌特異的成熟遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度にその発現量が低下した変異体、あるいは雌特異的成熟遺伝子産物の機能が完全に喪失した変異体、または雌特異的成熟遺伝子が本来有する正常な機能が発揮できない程度に雌特異的成熟遺伝子産物の機能が低下した変異体が挙げられる。本発明においては、好ましくは、雌特異的成熟遺伝子が全く発現しない変異体、又は雌特異的不妊化遺伝子産物の機能が完全に喪失した変異体が用いられる。通常、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体の雌ヘテロ接合体は、正常な対立遺伝子の機能により稔性を維持するが、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体の雌ホモ接合体は不稔化される。
【００１９】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する個体は、例えば、ゲノム編集技術を用いて作成することが可能である。例えば、目的とする生物種の受精卵に、標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）のゲノム配列を特異的に切断するように設計された人工ヌクレアーゼであるZinc Finger Nucleases（ZFNs）やTranscription Activator-Like Effector Nucleases（TALENs）を注入するか、受精卵に、標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）のゲノム配列に相補的な合成RNA及びCas-9ヌクレアーゼを注入することにより（CRISPR/Casシステム）、当該受精卵における標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）のゲノムを特異的に破壊し、標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）の機能的欠失変異体をゲノム上にコードする受精卵を得る。得られた受精卵を孵化させることにより、標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）の機能的欠失変異体をゲノム上にコードする個体を得ることが出来る。得られた受精卵が、標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）の機能的欠失変異体のヘテロ接合体の場合には、ヘテロ接合体同士を交配することにより、ホモ接合性の個体を得ることが出来る。作出した機能的欠失変異をもった個体は、雌でホモ接合体でない限り後代を得ることができ、後代においてヘテロ接合性の雌とヘテロまたはホモ接合性の雄との交配により、ホモ接合性の雄個体を得ることができる。このゲノム編集技術を用いることによって、戻し交配操作を要することなく、標的遺伝子を破壊、もしくは導入したホモ接合体の個体を直接得ることも可能である。また、ゲノム編集技術は、魚類、哺乳類、昆虫、植物を含む、幅広い生物種に適用可能である（Joung and Sander, Nat Rev Mol Cell Biol, 2012; Barrangou, Nat Biotechnol, 2012）。重要なことには、このようなゲノム編集技術によって得られた遺伝子の欠失変異は、遺伝子組み換えには当たらず、環境中への放出が許容される。技術的には、レポーター遺伝子をノックインすることによっても同様の遺伝子の機能的欠失変異体をえられるが、この場合はゲノム編集による欠失変異と異なり、外来遺伝子がゲノム中に挿入された遺伝子組み換え体にあたるため、一般的には、環境中への放出が規制されている。実際に、ゲノム編集技術を用いて、FSHRを欠損させたメダカを作成したことが報告されている（Endocrinology 155: 3136-3145, 2014）。
【００２０】
本発明においては、好ましくは、異なる染色体上に座した2種以上の雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体が用いられる。また同一の染色体上に座している場合でも、遺伝子地図上の位置が遠く、容易に組み換えが起こるほどの距離を有していれば、多重化の意味はある。複数の雌特異的不妊化遺伝子を多重搭載することの意義は、野生個体群中に放出した際に、1つの雌特異的不妊化遺伝子のみを保持する雄個体を用いた場合よりも、駆除効果が増大する点にある。ヘテロ接合性の雌とホモ接合性の雄とを交配する場合、雌特異的不妊化遺伝子が1遺伝子のみでは子孫雌の50％しか不妊化できないが、2遺伝子なら75％、3遺伝子なら87.5％、4遺伝子なら93.75％を不妊化できる。2種以上の雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体は、それぞれの雌特異的不妊化遺伝子を保持する個体を交配することによって作出することもできるが、例えば、上記ゲノム編集技術において、受精卵に2種以上の標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）のゲノム配列をそれぞれ特異的に切断するように設計されたZFNsやTALENsを導入するか、受精卵に、2種以上の標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）のゲノム配列にそれぞれ相補的な合成RNAs及びCas-9ヌクレアーゼを導入することにより、直接作成することも可能である。或いは、ゲノム編集技術によって、まず1種類の雌特異的不妊化遺伝子を保持する個体を得て、その個体から1種類の雌特異的不妊化遺伝子を保持する受精卵を作成し、この受精卵に、更にゲノム編集技術を適用し、別の標的遺伝子（例、雌特異的成熟遺伝子）のゲノムを特異的に破壊することによっても、2種以上の雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体を得ることが出来る。導入する雌特異的不妊化遺伝子の数は、根絶を目的に不妊化力を高める観点からは多ければ多いほどよい。例えば、2種以上、3種以上、4種以上の雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体を用いる。生息密度が極端に低下したときの物理的駆除圧が低下したときにもさらに個体数を減少させ続ける目的で不妊化力を高めるためには、YYとの併用をしない場合を仮定すると、繁殖力の旺盛な対象種に対しては1〜2種の雌特異的不妊化遺伝子の搭載では不妊化力が低く、なるべく多く搭載する必要があり、好ましくは4種以上が想定される。導入する、雌特異的不妊化遺伝子の数の上限値は、理論的には、特に制限されず、根絶を目的に不妊化力を高める観点からは多ければ多いほどよいが、実質染色体の種類の数、さらには候補遺伝子の数に影響される。通常は、10種以下、5種以下程度である。
【００２１】
放出する雄個体に搭載する雌特異的不妊化遺伝子の数は、野生個体群中の雌個体との交配の結果、当該野生個体群サイズの縮小を可能にする限り特に限定されないが、増殖力の旺盛な侵略性の強い魚類の場合、雌特異的不妊化遺伝子1個のみの搭載では、ある程度の野生個体群サイズの増殖スピードの低減は見込めても、根絶までは難しい。なぜなら、ヘテロ接合性雌とホモ接合性雄との最高のペアリングを想定した場合においても、1遺伝子では雌の産む子孫の雌の50％しか不妊化することができない。ブルーギルの場合、物理的親魚駆除率が50％の場合でも増殖抑制は難しいことが実験的に確かめられており、1年で産卵して死亡する1年魚ではなく、生き残った親魚が翌年以降も産卵する魚種の場合を想定すると、親魚の不妊化率50％は親魚の駆除率50％に満たないため、個体数が減って併用している物理的駆除圧が減少していくと、これとの合計の駆除圧が低下し、個体の増殖を制御できなくなって平衡状態へと移行することが予想されるからである。2種の雌特異的不妊化遺伝子を使用した場合は、ヘテロ接合性雌とホモ接合性雄とのペアリングを想定した場合、雌の産む子孫のメスの75％を不妊化することができるが、親魚の駆除率に換算すると60％程度が予想され、個体群サイズの縮小ができるかできないかのレベルとなる。しかし、個体数が極端に減少した最終局面においては物理駆除圧は全く望めず、かかっていた密度効果の解除により増殖力が増す可能性を考えると、実際には低位で平衡状態になり、根絶できない可能性がある。よって対象種の繁殖率にもよるが、魚類一般を対象として個体群サイズを縮小する場合には、超雄個体への搭載により雌を減らす手法と併用しない限りは、少なくとも3種以上の雌特異的不妊化遺伝子の搭載が好ましく、より好ましくは4種以上の雌特異的不妊化遺伝子を搭載させる。
【００２２】
本発明の方法において、野生個体群中に放出される雄個体は、雌特異的不妊化遺伝子のホモ接合体であっても、ヘテロ接合体であってもよいが、好ましくは、ホモ接合体である。ヘテロ接合体放出の場合、放出を続けても最高で雌特異的不妊化遺伝子占有率は50％であり、これ以上には上がらないため、ホモ化して不妊になる雌の出現率は低く、高い効果は望めない。しかし遺伝子の種類によっては不妊化には及ばないものの、ヘテロ接合で繁殖力に負の影響が出る可能性も考えられ、その場合はヘテロ接合体でも効果が望める。一方、ホモ接合体放流を考えた場合、放流を続けると最高で不妊化遺伝子占有率は100％に向かって漸近するため、ホモ化して不妊になる雌の出現率が高く、高い効果が望める。雄個体が、2種以上の雌特異的不妊化遺伝子を保持する場合、好ましくは、少なくとも1つの雌特異的不妊化遺伝子についてホモ接合体であり、より好ましくは、全ての雌特異的不妊化遺伝子についてホモ接合体である。
【００２３】
好ましい態様において、本発明の方法において、野生個体群中に放出する雄個体は、超雄である。超雄とは、性染色体として2つのY染色体のみを有する雄個体（即ち、YY雄）を意味する。雌特異的不妊化遺伝子を保持する通常の雄個体（即ちXY雄）を用いた場合よりも、雌特異的不妊化遺伝子を保持する超雄個体を用いた場合の方が、個体群における雄の割合が増加する効果が加わることにより、駆除効果の増強が期待できる。例えば、魚類の場合、超雄YY個体は、雌性ホルモン（エストロゲン）を雄の幼生（XY）に投与し、雌化させたXY個体を得て、このXY雌に産卵させることにより、Y卵を得て、これと、通常雄の作るY精子との受精により作出することができる。また、通常雄の始原生殖細胞や精原細胞を3倍体化等により不妊化した雌稚魚に移植する仮腹技術を用いてY卵を得て、これと、通常雄の作るY精子との受精により作出することもができる。また、YY雄が作出さられば、この精原細胞を借り腹親に移植することで、全Y卵をつくることができ、これとYY雄の作る全Y精子との交配で、全YY雄生産をすることができる。雌特異的不妊化遺伝子を保持するYY雄は、上述のゲノム編集により作成した雌特異的不妊化遺伝子を保持する個体に、これらの超雄YY個体作成方法を適用することにより作出することができる。産出した雌特異的不妊化遺伝子を保持するYY雄は、遺伝子検査と後代検定で選別することが出来る。
【００２４】
放出用の雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体（好ましくは、超雄個体）は、動物であれば、技術的には交配によって得た個体を選別することで得ることはできるが、大量放出が必要である動物種、たとえば魚類であれば、それは手間やコストなどから実用性が低い。実用化の観点からは、選別作業を省くため、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体（好ましくは、超雄個体）のみを生産する（即ち、全ホモ雄生産もしくは全ホモ超雄生産）必要があるが、これは借腹技術を用いることにより達成することができる。一方繁殖力がそれほど高くない哺乳類等であれば、交配後の出生個体の選別によるか、人工受精卵の着床前遺伝子診断で雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体（好ましくは、超雄個体）の選別が可能であり、いまだ技術開発されていない仮腹技術の必要性は高くない。また、植物であればカルス培養を用いて大量に増殖させることが出来る。魚類等を想定した借腹技術においては、宿主不妊雌個体として、移入する生殖細胞と同種の魚類の不妊三倍体雌や、近縁種の異種交雑による不妊雑種二倍体雌又は不妊異質三倍体雌を利用する。不妊異質三倍体に関しては、同種のゲノム2つに異種ゲノム1つから構成されるAAB型の異質三倍体でも、すべて異なる3種のゲノムから構成されるABC型の完全異質三倍体（三基異質三倍体）でもよい。
移入する生殖細胞と同種の魚類の不妊三倍体は、受精卵に高圧処理や温度処理等の物理的刺激を与えて、第二成熟分裂で第二極体として捨て去られる1組の染色体を細胞内にとどめる方法（第二極体放出阻止）により作成することが出来るが、同種の染色体の減数分裂が強行され異数性の卵を産む可能性を回避することや、移植する生殖細胞側のホルモンとレセプター間の協調性の不具合が起こるのを防ぐため等から完全異質三倍体（三基異質三倍体）がより望ましい。不妊全雌雑種二倍体は、ホルモン関係の異常ではなく、単純に減数分裂阻害が原因で不妊となる生存性雑種の組み合わせを用いて、通常の異種交配で作出できる。なお、雌雄の区別ができない稚魚のうちに借り腹操作をしなければならないことから本操作の効率を考えると、不妊三倍体、不妊雑種2倍体、不妊異質三倍体などこれらの借腹親候補は、すべて雌であることがのぞましい。そのためには、雌の稚魚に雄性ホルモンあるいは雌性ホルモン合成阻害剤や抗エストロゲン作用剤を経口投与することにより、Y染色体を持たないが精子を形成する能力がある機能的性転換雄＝偽雄（XX雄）を作出し、この精子を使うことが望ましい。またこれらの雑種や3倍体を利用する方法の他、ゲノム編集技術で、生殖細胞側でのみ発現する生殖関連遺伝子を欠損させた二倍体雌を借腹親に用いることもできる。これらの借腹親の作出技術に関しては、例えば以下の文献を参照のこと。
・Dawley RM, Graham JH, Schultz RJ. 1985. Triploid progeny of pumpkinseed × green sunfish hybrids. J Hered 76:251-257. 
・Dawley, R. M. 1987. Hybridization and polyploidy in a community of three sunfish species (Pices: Centrarchidae). Copeia: 326-335.
・Production of Amphidiploid Medaka Oryzias 2 latipes sinensis - 2 curvinotus by Gynogenesis with Retention of the Second Polar Body J. Kurita et al. 1993 Nippon Suisan Gakkaishi, 59(2) 323
・メダカ完全異質三倍体の作成 栗田潤  他  1992、日本水産学会誌  58巻12号2311 〜 2314
・Cytogenetic Studies on Diploid and Triploid Oogenesis in Interspecific Hybrid Fish Between Oryzias latipes and O. curvinotus J.Kurita et al. 1995 The Journal of Experimental Zoology, 273, 234-241
・Andrew R. Westmaas, Polyploidy Induction in Bluegill Sunfish (Lepomis Macrochirus) Using Cold and Pressure Shocks. Michigan State University. Department of Fisheries and Wildlife, 1992
【００２５】
例えば、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体を増殖させる場合、雌特異的不妊化遺伝子を保持する生殖原細胞又は始原生殖細胞（好ましくは、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する生殖原細胞又は始原生殖細胞）を、上述の宿主不妊雌個体へ移植する。生殖原細胞としては、精原細胞、卵原細胞等を挙げることが出来る。雌特異的不妊化遺伝子を保持する生殖原細胞又は始原生殖細胞（好ましくは、雌特異的不妊化遺伝子のホモ接合体）は、好ましくは、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体（好ましくは、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体）に由来する生殖原細胞又は始原生殖細胞である。雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体に由来する精原細胞は、当業者に周知の方法により当該雄個体から精原細胞を単離することにより、得ることが出来る。雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体に由来する卵原細胞は、雌性ホルモン（エストロゲン）を当該雄個体の幼生に投与し、雌化させた個体を得て、この雌化個体から当業者に周知の方法により卵原細胞を単離すること、あるいは雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の精原細胞を宿主不妊雌個体に移植してつくられる卵原細胞を単離することにより、得ることが出来る。雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体に由来する始原生殖細胞は、当該雄個体の初期発生胚から始原生殖細胞を単離することにより、得ることができる。移植した生殖原細胞又は始原生殖細胞は宿主生殖腺に取り込まれ、減数分裂し、雌特異的不妊化遺伝子を保持する卵（X又はY）へと発生する。この卵と、雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子（X又はY）とを交配することにより、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する子孫個体が生じる。必要に応じて雄個体を選別することにより、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体（XY又はYY）を得ることが出来る。放出個体を選別するのは非効率的であるので、効率よく全雄（XY）個体を生産するには、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雌の卵原細胞を仮腹親に移植し、生じる全X卵を、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄YY雄の全Y精子と受精すればよい。
【００２６】
雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体を増殖させる場合、雌特異的不妊化遺伝子を保持する超雄個体（好ましくは、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体）に由来する生殖原細胞又は始原生殖細胞（YY）を、上述の宿主不妊雌個体へ移植する。移植した生殖原細胞又は始原生殖細胞は宿主生殖腺に取り込まれ、減数分裂し、雌特異的不妊化遺伝子を保持する卵（Y）のみが生じる（即ち、全Y卵）。この卵と、性染色体がYである、雌特異的不妊化遺伝子を保持する精子とを交配することにより、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する子孫超雄個体（YY）のみが生じる。当該精子は、好ましくは、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体の精子である。
【００２７】
或いは、全Y卵に高圧処理や温度処理等の物理的刺激を与えて第二極体放出阻止型、或いは第一分裂阻止型の雌個体を発生させることによっても、雌特異的不妊化遺伝子を保持する子孫超雄個体（YY）（雌特異的不妊化遺伝子のホモ接合性超雄個体）を得ることができる。
【００２８】
上に記した雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する全雄（XY）あるいは雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する全超雄（YY）増産には雄親として超雄（YY）が必要であるが、YY雄自体の生残性に問題があり、使用できない可能性も考えられる。その場合放流には全XY雄生産が必要となるが、YY雄を用いずに全XY雄を生産するには以下の方法が可能である。
【００２９】
生残性に問題がある場合でもYY胚は孵化ステージ程度には発生することが予想される。そこで、性転換した偽雌XYの卵、あるいは雄の精原細胞移植をおこなった借り腹雌の産む卵（X卵とY卵の混合）と通常XY雄の精子（X精子とY精子の混合）との交配で得られた受精卵の孵化稚魚もしくは胚（YY個体が含まれると考えられる）から始原生殖細胞を借り腹親に移植する。移植された生殖原細胞がYY細胞であれば、この借り腹親は全Y卵を産むので、これと偽雄（XX雄）のつくる全X精子との交配で、全雄（XY雄）生産が可能となる。借り腹親の持つ生殖細胞がYYであるか否かは後代検定で確認可能である。
【００３０】
なお、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄の放流は、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持するXX雌との混合で行っても、雌個体が不妊のため、繁殖による個体数の増加の懸念はないので、大きな問題はないとも考えられる。その場合、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雌の卵原細胞を移植した借り腹雌親と、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する通常XY雄との交配を行い、生じる雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持するXX雌（不妊）と雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持するXY雄を選別せずに放流してよい。あるいは、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持するXY雄の精原細胞を移植した借り腹雌親と、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する通常XY雄との交配を行い、生じた子供から、生き残った雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持するXX雌（不妊）と雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持するXY雄を選別せずに放流してもよい。同時に生じるYY個体は生存性がない場合は放流前に死滅するか、生残性が悪い場合は放流後に死滅する。
【００３１】
本発明は、上述のような雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する子孫個体（好ましくは雄個体、より好ましくは超雄個体）の製造方法をも提供する。本発明の製造方法において移植に使用する生殖原細胞（例、精原細胞、卵原細胞）及び始原生殖細胞は、雌雄個体から採取後、移植時までに適切な凍結保存液中で凍結保存させておいてもよい。
【００３２】
この借腹技術は、雌特異的不妊化遺伝子として、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体を用いる場合に、特に有効である。移入する、精原細胞が雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体をホモ接合性で保持することにより、機能的な雌特異的成熟遺伝子を発現できず、自身は成熟卵を作ることができないが、借り腹技術によりこの生殖細胞を移植すれば、卵の支持細胞は宿主側から提供され、機能的な雌特異的成熟遺伝子を発現するので、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異をホモ接合性で保持する卵を成熟させることが可能だからである。
【００３３】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する個体間の自然交配のみでは、雌特異的不妊化遺伝子（雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異体）をホモ接合性で保持する雌が不妊となってしまうため、通常の交配で雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性で保持する雄個体を大量に調達することが困難である。雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異のヘテロ接合体雌個体と、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異を保持する雄個体とを交配し、得られた子孫個体の中から、雌特異的成熟遺伝子の機能的欠失変異をホモ接合性で保持する雄個体を選別することにより、一定数を確保することはできるが、選別のためのゲノタイピングを要し、放出に供すことのできないヘテロ個体を大量に飼育する必要があるので、無駄が多く、高コストである。特に、湖等の広大な自然生態系内の特定の生物種等を駆除しようとする場合には、大量の雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体を調達する必要があるため、コストは膨大であり、非現実的である。これに対して、上述の借腹技術を用いると、ゲノム編集技術により雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体を少数得ることが出来れば、これをベースに、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体を、ゲノタイピングを要することなく、大量に、且つ低コストで得ることが可能であり、広大な自然生態系内の外来種等を駆除するのに必要な数の雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雄個体の調達を実現可能にする。特に、本発明の製造方法において、生殖原細胞又は始原生殖細胞、及び精子を供給する雄個体として雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体を用いると、放出に有用な雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体のみが生じるので、ゲノタイプを要せず、放出に供することのできない個体の維持に必要なコストを削減することができ、得られた雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する超雄個体を、更なる子孫個体の製造に転用することが出来る。借腹技術の詳細については、例えば以下の文献を参照のこと。
・T. Okutsu, S. Shikina, M. Kanno, Y. Takeuchi, G. Yoshizaki. 2007. Production of trout offspring from triploid salmon parents. Science  317, 1517.
【００３４】
上述のようにして得られた雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体を、野生個体群中に放出する。放出された雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体は、野生個体群中の雌個体と自然交配し、野生個体群中に雌特異的不妊化遺伝子を保持する子孫個体（ヘテロ接合体）が生じる。更に、放出された雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体がこのヘテロ接合体と交配し、或いは、ヘテロ接合体同士が交配することにより、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性で保持する子孫個体が生じる。子孫個体群のうち、雌特異的不妊化遺伝子をホモ接合性に保持する雌は不妊であり、次世代を残すことができないので、これを産卵メス個体の駆除とみなすことができる。雌の駆除と引き換えに不妊化遺伝子も子孫に伝達されることなく集団中から失われる。一方、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄は、妊性なので、さらに野生個体群中の雌との交配により、雌特異的不妊化遺伝子を次世代に伝達するベクターとなることにより、雌特異的不妊化遺伝子は失わることなく集団中に存続し続ける。雌雄ともに同数駆除しても、雌だけ半分駆除しても駆除効果は変わらないと考えられるので、個体の駆除に比べて雌特異的不妊化遺伝子のロスは最小限に抑えられ、雌の不妊化に伴う遺伝子の損失は最低限の雄の放流によって十分に賄えきれる。つまり、雌特異的不妊化遺伝子をホモ型に保持する雄を放流を続ける限り、雌特異的不妊化遺伝子が野生個体群中に浸透していき、不妊化遺伝子の占有率は上がり続けることにより、産卵可能な雌の割合が減少していき、子孫個体を残すことが出来なくなる結果、野生個体群のサイズが縮小し、最終的には、野生個体群から稔性雌個体が排除され、当該野生個体群が根絶する。
【００３５】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出個体数は、野生個体群中の雌個体との交配の結果、当該野生個体群細胞の縮小を可能にする限り特に限定されない。1回の放出あたり、放出開始前の野生個体群の個体数は、例えば、1％以上、好ましくは、5％以上である。放出する個体数が少なすぎると雌の不妊化に伴う遺伝子のロス分を賄えきれなくなり、これ以上減らせない平衡状態に移行する。もしくは駆除効果が弱く、野生個体群中に稔性雌個体が存在しなくなるまでに要する期間が長くなる。駆除効果を増強する観点からは、放出する雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の数は多ければ多い程よく、その個体数の上限値はないが、放出する個体数が多すぎると、放出個体に起因する生態的被害や（魚類の場合）漁業被害が生じる。そのため、放出する雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の個体数は、野生個体群の個体数の例えば、20％以下、好ましくは、10％以下である。即ち、放出する雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の個体数は、好ましくは、野生個体群の個体数の1〜20%、より好ましくは5〜10％、更に好ましくは、6〜9％である。なお、放出は繁殖1年後の加入群へ行うことを仮定して算出しているので、コスト等の理由から1年に満たないで放出する場合は残りの間の死亡率を適切に勘案してに放出量を算出する。
【００３６】
雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出は、年間1回のみであってもよいが、駆除効果を増強する観点から、生態系に悪影響がない限りは複数回繰り返しても良い。放出の間隔は、対象生物種の産卵周期の例えば、1/3〜3倍、好ましくは、1/2〜2倍、より好ましくは、産卵周期と同一である。例えば、1年に1回産卵する生物種（例、魚類）を対象とする場合、例えば、2か月〜3年に1回、好ましくは、6ヶ月〜2年に1回、より好ましくは1年に1回、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体を放出する。各放出回において放出する雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の個体数の範囲は、上述の量を放流回数で除した値を基準とするが、生態系に悪影響がない限りはそれを超えてもよい。
【００３７】
駆除効果を増強する観点からは、生態系に悪影響がない限りは放出回数が多いほど好ましい。理論的には、放出回数の上限値はないが、例えば、野生個体群中の稔性雌個体数が、放出開始前と比較して減少したことが確認されるまで、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を繰り返す。減少位で放出を止めることは、標的とする野生個体群数の回復につながるため、避けるべきである。好ましくは、野生個体群中の稔性雌個体数が、確認されなくなるまで、あるいはモニタリングによって集団中の雌特異的不妊化遺伝子の占有率が100％に達したことが確認されるまで、あるいは繁殖期に稚魚の発生が確認されなくなるまで、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を繰り返す。稔性雌個体の存在が確認されなくなった後は、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を停止してもよいし、少数の稔性雌個体が残存するリスクを低減するためや、他からの自然あるいは人為的移入個体の繁殖による増殖を抑制する目的で、一定の回数あるいは他所からの移入のリスクが完全になくなるまで継続して、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出を継続してもよい。
【００３８】
一態様において、本発明の方法において、雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体の放出と、野生個体群の物理的駆除（野生個体群の捕獲及び系外への排除）とを組み合わせてもよい。または、増殖中の個体群の制御においては組み合わせることが必要である。この際、捕獲した個体が、放出した雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体である場合には、当該野生個体群中に再度放出することにより、駆除効果の更なる増強が期待できる。このような再放出を容易にするため、少なくとも放出する雌特異的不妊化遺伝子を保持する雄個体は、識別可能となるように標識することが好ましい。放出する雄個体の標識としては、鰭カット、イラストマー標識等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。野生個体群の物理的駆除は、できるだけ長い期間続ける方が、高い駆除効果が期待できるので、好ましい。例えば、モニタリングによって集団中の雌特異的不妊化遺伝子の占有率がある程度の割合になるまで、例えば、50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上、最も好ましくはモニタリングによって野生個体群が確認できなくなるまで（占有率100％）となるまで、野生個体群の物理的駆除を続ける。特に、雌特異的不妊化遺伝子を保持する個体として、超雄個体を使用しない場合（例えば、XY雄、XY雌、YY雌）には、雌特異的不妊化遺伝子の占有率が100％となる前に、物理的駆除を止めてしまうと、集団の個体数が回復してしまうおそれがあるため、モニタリングによって野生個体群が確認できなくなるまで（占有率100％）野生個体群の物理的駆除を続けることが望ましい。これに対して、雌特異的不妊化遺伝子を保持する超雄個体を用いた場合には、雌特異的不妊化遺伝子の占有率が100％に到達していなくても、集団中の雌特異的不妊化遺伝子の占有率がある程度の割合（例えば、50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上）になった段階で、物理的駆除を止めても、集団の個体数は減少し続け、根絶を達成可能であり得る。
【００３９】
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００４０】
［試験例1］
＜ブルーギルを念頭に想定した架空魚種での簡易シミュレーション＞
シミュレーションの条件は、以下の通りである。
・初期個体数は、0＋魚は10000尾、1＋魚は0＋魚の50％（5000尾）、2＋魚は1＋魚の50％（2500尾）、3＋魚は2＋魚の50％（1250尾）、4＋魚以上は3＋魚の50％（625尾）、と想定、次の年級へ移行する際の死亡率は50％とした。なお年級の基点は繁殖期直前のため、1+魚が2才魚となる。本モデルでは2+魚＝（3歳魚）。
・リッカー型、ベバートン・ホルト型等、密度効果は一切考慮しない。想定した最大値で常に繁殖するものと仮定した。
・増殖防止に必要な親魚駆除率をフィールド試験の文献などから60％と見積もり、その駆除圧で個体群が平衡状態になるよう増殖率を設定した。具体的には繁殖に関与する年級群雌の約16.1倍が翌年の0＋魚の雄雌各資源に移行し、資源全体の年間増殖率は駆除を行わらなければ143.6％に収束する。
・60％を初期親魚駆除率として親魚の物理駆除を開始する。そこから密度に応じ駆除圧が下がるモデルを使用した。
・親魚駆除率は、0.6の（初期個体数/その年の個体数）乗で設定した。
・閉鎖系であり、系外からの野生ブルーギルの移入はない。
・当初資源量の6％の個体を毎年繁殖1年後の加入群に対して放流する。
・雌特異的不妊化遺伝子は、ヘテロ接合体では雌を不妊化しないが、ホモ接合体では雌を不妊化する。
・遺伝子の親魚間で存在比率の差異と各年級群での産卵数の違いは無視し、親魚全体の遺伝子の比率と親魚全体で平均して産卵するとして、次世代の遺伝子の比率を算出している。
・雌雄比は1：1とする。
繁殖可能なXX雌個体がいなくなる時間を根絶時間とした。図1〜5において、縦軸は％、横軸は放流開始からの年数をそれぞれ示す。
【００４１】
（1）当初資源量の6％のYY雄個体を毎年放流した場合、100年経っても根絶できなかった（図1）。
（2）雌特異的不妊化遺伝子1つをホモ接合性に搭載した雄個体を用いた場合、不妊化率は最高の状況でも50％で、増殖防止に必要な親魚の駆除率60％（不妊化率相当で72％程度）に到底満たないため、親魚の駆除率が下がるにしたがい資源量は平衡状態になり根絶には至らなかった。駆除効果はYY雄個体を用いた場合より劣っていた（図2）。
（3）雌特異的不妊化遺伝子2つをホモ接合性に搭載した雄個体を用いた場合、根絶可能（繁殖可能な雌個体根絶まで約75年）であり、その駆除効果はYY雄個体を用いた場合より優れていた（図3）。
（4）雌特異的不妊化遺伝子2つをホモ接合性に搭載したYY雄個体を用いた場合、双方の効果によりさらに強い駆除力が得られた。シミュレーションでは、放流開始から約50年で繁殖可能な雌個体が根絶した（図4）。
（5）雌特異的不妊化遺伝子2つのホモ接合体であるYY雄個体を放流し、更に、放流魚を標識し、駆除対象から外すことにより、さらに強い駆除効果が得られた。放流魚の駆除率をそれ以外の半分と想定したとき、放流開始から約30年で繁殖可能な雌個体が根絶し、資源量を23.5％にまで減少させることができた（図5）。
【００４２】
本シミュレーションでは、最終段階でも放流魚自身に起因する一定の個体数が保たれているので、物理駆除圧は0になっていない。放流魚がいることで逆に駆除圧を保てている面はある一方で、実際を想定すると、駆除しているのはほとんど放流魚ということになり、コスト的には無駄が多い面がある。最終的にはコストがかさむ物理駆除を放棄したいところであり、そのためには物理駆除が0でもひきつづき個体数を減らしていくために、放流魚においては高い不妊化率を達成できる4遺伝子以上の多重搭載や、YY個体への多重搭載、さらにはその組み合わせが望ましい。
【００４３】
［試験例2］
放出する雄個体が保持する不妊遺伝子の数と、産卵雌子孫の雌の不妊化率との関係を調べた。各雌特異的不妊化遺伝子は異なる連鎖群と仮定した。
【００４４】
【表１】
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【００４５】
不妊化率は、1遺伝子の場合50％、2遺伝子の場合75％、3遺伝子の場合87.5％、4遺伝子の場合93.75％と算出された。従って2以上の雌特異的不妊化遺伝子を用いることにより、雌子孫を効率的に不妊化し得ると考えられた。
【００４６】
［試験例3］
雌特異的不妊化遺伝子により、個体群を根絶するのに必要な不妊化遺伝子の数を検討した。具体的には、親魚駆除率（％）を36〜100％の範囲で段階的に設定し、その親魚駆除率を本シミュレーション上で達成するために必要な不妊化遺伝子の数を検討した。
【００４７】
【表２】
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【００４８】
不妊化率が親魚駆除率より高いのは、雌個体が数年間、再生産を行うためである。すなわち、毎年継続的な60％の親魚駆除を行うということは、親魚の1年目に60％駆除され、生き残った個体が2年目に再度60％駆除され、3年目以降も同様に駆除され続けるということを意味しているからである。仮に1年で産卵して死んでしまう年魚なら、親魚駆除率と不妊化率は一致する。個体数の増加を抑制するのに必要な親魚駆除率を60％と想定すると、本モデルにおいては、個体群増殖抑制には、2以上の雌特異的不妊化遺伝子を必要とすることを示している。一方根絶には親魚の駆除率にして80から90％程度の継続した駆除が必要と考えられていることから、3個から5個の雌特異的不妊化遺伝子を保持した魚を継続的に放流すれば、親魚の密度が低下して物理駆除圧がまったく担保できなくなっても、根絶可能と考えられた。なお放流魚をYY雄にすれば、必要とされる搭載遺伝子数は少なくて済む可能性があり、少なくしなければ、根絶時間を早められると考えられる。
【００４９】
［試験例4］
＜ブルーギルのfoxl2、fshr塩基配列決定、及びfoxl2への変異の導入＞
ブルーギルの全ゲノム配列を決定し、雌成熟関連遺伝子 foxl2、及びfshrの塩基配列を探索した。foxl2の推定ゲノム構造を図6及び7に示す。また、foxl2の推定cDNA配列を配列番号1に、推定アミノ酸配列を配列番号2に、それぞれ示す。ブルーギルfoxl2のORFは、918塩基からなり（終始コドン含む）、イントロンを含まないと推定された。ブルーギルfoxl2ゲノムのヌクレオチド配列は、ヨーロピアンシーバスのfoxl2と高い相同性を有していた。
【００５０】
ブルーギルfshrのゲノム配列は、以下のように決定した。即ち、メダカfshr（NM_001201514）のcDNA配列をブルーギルゲノム配列に対してblast解析に付したところ、一部がsca.212（5Mb）にヒットした。ヒット周辺領域で遺伝子予測（FGENESH：tonguefishモデル）したところ、677アミノ酸（又は707アミノ酸）の蛋白質をコードする推定遺伝子領域が同定された。この677アミノ酸長のアミノ酸配列を、NCBI blastp解析に付したところ、このアミノ酸配列は、魚類fshrのアミノ酸配列と高い相同性を有することが判明した。特にニベ類fshrのアミノ酸配列に対する相同性は90%以上であった。従って、得られた推定遺伝子領域にブルーギルfshrが含まれると考えられた。メダカとブルーギルとの間で、fshr遺伝子構造はよく似ていた。また、メダカとブルーギルとの間で、fshr遺伝子周辺の遺伝子の位置及び向きが保存されていた。
【００５１】
獲得したブルーギルfoxl2及びfshrゲノム配列に基づき、CRISPR/Cas9システムで遺伝子を切断・破壊するための特異的なガイドRNA（crRNA）を設計した。foxl2については3か所、fshrについては2か所に、crRNAを設計した。foxl2に対するcrRNAを図8に示す。
【００５２】
foxl2に対するcrRNAであるfoxl2_g1（配列番号3）（ファスマック）を、Cas9（人工ヌクレアーゼ）のmRNA（addgene（pCS2+hSpCas9）のCas9 RNA又はサーモフィッシャー GeneArt（登録商標）CRISPR nuclease mRNA）とガイドRNAとなるtracrRNA（ファスマック）と共に、ブルーギル受精卵へ顕微注入すると、foxl2ゲノム中に変異が導入された子孫個体が多数得られた。変異導入により生じた停止コドンにより、FOXL2タンパク質のアミノ酸配列の大部分が欠損していることから、得られた変異個体においてはFOXL2タンパク質の機能が重度に阻害されていると想定された（図9及び10）。
【００５３】
［試験例5］
＜根絶シミュレーション（3雌特異的不妊化遺伝子使用まで）＞
（目的及び方法）
雌特異的不妊化遺伝子を有する個体を少量ずつ放流し続け、徐々に集団内の雌特異的不妊化遺伝子の占有率を上げ、繁殖力を低下させる「遺伝子制圧法」の効果を、Ferson らにより報告された米国Hyco 湖におけるブルーギル個体群モデル（リッカー型：R型）及びその改変モデル（ベバートン・ホルト型：B-H型）を用いたシミュレーションにより検証した。放流雄に搭載する雌特異的不妊化遺伝子数を1、2および3にした場合であって、それぞれの雌特異的不妊化遺伝子をXY雄にホモ型、YY雄にホモ型、およびYY雌にヘテロ型で搭載した場合について、検証した。
【００５４】
（結果）
（1）遺伝子制圧シナリオI：XY雄に雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載した場合
1〜3個の雌特異的不妊化遺伝子をホモ型でXY雄に搭載した場合は、物理的駆除併用下で、個体群を根絶可能であった。根絶に要する時間は、2遺伝子、3遺伝子と搭載遺伝子を多重化していくにつれ短くなった。しかしながら、物理的駆除を根絶直前で完全に放棄した場合は、個体数は回復し、放流だけ続けても個体群を根絶させることは出来なかった（図11および12  3個の雌特異的不妊化遺伝子を搭載した場合のみ示す）。
【００５５】
（2）遺伝子制圧シナリオII：YY雌に雌特異的不妊化遺伝子をヘテロ型で搭載した場合
YY雌による効果と、雌特異的不妊化遺伝子の相乗効果により、駆除力が高まった。しかしながら、卵を産む雌を放流することにより、総個体数の減少が遅く、ほぼ雌を根絶した時点でも両モデルとも20％程度の総個体数が維持された。雌の根絶は早いが、生態系回復のために速やかに総個体数を減少させるという目的にはそぐわない。また、雌の根絶直前に放流をやめると個体数が急速に回復した（図13および14  3個の雌特異的不妊化遺伝子を搭載した場合のみ示す）。
【００５６】
（3）遺伝子制圧シナリオIII：YY雄に雌特異的不妊化遺伝子をホモ型で搭載した場合
YY雄単独の場合でも子孫は全て雄となり、雌が生じないため、放流魚が一定割合以上に達すると、根絶直前に物理的駆除を放棄しても、放流のみで個体群を根絶できた（図15および16）。また、YY雄へ雌特異的不妊化遺伝子を搭載して放流した場合、双方の相乗効果により駆除力が高まり、更に不妊化遺伝子の数を1〜3に増加することで、より根絶時間は早まった（図17-20）。
【００５７】
（結論）
YY雄に雌特異的不妊化遺伝子を搭載すれば、根絶直前（物理的駆除は困難な段階）に駆除を中止しても、放流のみで個体群を根絶させることが出来る。その際、雌特異的不妊化遺伝子を3重搭載すると、駆除率は、YY雄の2倍、YY雌と同程度の高い駆除効果を有する。従って、YY雄に雌特異的不妊化遺伝子を多重搭載するのが効果的であることが示された。
【００５８】
［試験例6］
＜根絶シミュレーション（駆除率固定）＞
物理的駆除だけで当所個体数が30％で平衡になると仮定した駆除率（51.4％）条件下での、高生残ベバートン・ホルト型モデルにおいて、放流量を変化させた場合の根絶に要する年数を計算した。
【００５９】
【表３】
2016171797.tif 000004
【００６０】
＊    実際にはスニーカーがいるため、この条件で根絶を達成できる可能性は低い。
＊＊  スニーカーにより卵の2割が受精すると仮定した場合。
※    雌の根絶は、YY雌、並びにYY雌と遺伝子制圧の組み合わせは、YY雄と遺伝子制圧の組み合わせよりも早いが、総個体数がなかなか減らないという問題がある。総個体数の面では、YY雄と遺伝子制圧の組み合わせが優れている。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の方法により、低コストで、環境への影響をできる限り抑制しながら、外来生物等を根絶することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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