(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）に属する菌株を栄養培地で培養し、培養物中にpH 1.5で安定な耐酸性カタラーゼを産生せしめ、これを採取することを特徴とするpH 1.5で安定な耐酸性カタラーゼの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、耐酸性カタラーゼの製造法に関する。より詳細には、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）に属する菌株を栄養培地で培養し、培養物中に耐酸性カタラーゼを産生せしめ、これを採取する耐酸性カタラーゼの製造方法に関する。
【０００２】
本発明の耐酸性カタラーゼは、強酸性pHの環境下での安定性が極めて良いため、食品加工、臨床検査等に使用される他、特に半導体排水の処理等に好適に使用されうる。
【０００３】
【従来の技術】
従来、微生物由来のカタラーゼとして、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、フミコーラ（Humicola）等の黴の産生するカタラーゼ（特公平5-153975号、特開平2-76579号、特開平6-506347号）、サッカロマイセス（Sacchromyces）、ハンセヌラ（Hansenula）等の酵母の産生するカタラーゼ（特開昭60-83579号、特開昭63-3788号）及びバチルス・アルカロファシエンス（Bacillus alkalofaciense）等の細菌の産生するカタラーゼ（特公昭49-4956号）等が知られている。
【０００４】
一方、豚及び牛の肝臓等に由来する動物性カタラーゼも知られいる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記した微生物及び動物由来のカタラーゼは、何れも強酸性pHの環境下での安定性が悪く、半導体排水の処理等に使用するには不利であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者は、従来のカタラーゼに比較して強酸性pHの環境下での安定性の良い耐酸性カタラーゼを求め、新たな給源を探索したところ、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）が目的とする耐酸性カタラーゼを著量生産し、これを採取すると共に、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）が耐酸性カタラーゼを生産することは初めての知見であることによって本発明を完成した。
【０００７】
本発明に使用する微生物としてはアスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）に属する菌株であれば何れも使用できる。より具体的に示すと、例えば公的機関に寄託され何人も入手可能な菌株としては、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）IFO 5864、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）HUT 2024、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）IAM 2017等が挙げられる。
【０００８】
アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）に属する菌株を用いて耐酸性カタラーゼを製造するための菌の培養法としては、液体培養法、固体培養法のいずれでも良いが、より好ましくは液体培養法が利用できる。
【０００９】
液体培養法としては、例えば以下のようにして行うことができる。
【００１０】
使用できる培地としては、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）に属する菌株が生育可能な培地であれば如何なるものでも良い。例えばグルコース、シュクロース、グリセリン、デキストリン、糖蜜・有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、或いは、グリシン、ペプトン、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
【００１１】
培地のpHは、例えば約３〜９、好ましくは約5.5〜6.9程度に調整し、培養温度は通常約10〜50℃、好ましくは約25〜30℃程度で、１〜20日間、好ましくは６〜12日間程度好気的条件下で培養する。例えば振盪培養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００１２】
また、通常の小麦フスマ等を栄養培地とする固体培養法により約25〜37℃程度で、３〜12日間培養することもできる。
【００１３】
得られた培養物より菌体を除去した培養ろ液、培養物又は固体培養抽出液から耐酸性カタラーゼを通常の手段で単離し耐酸性カタラーゼを得ることができる。
【００１４】
例えば培養ろ液から、耐酸性カタラーゼを単離精製するには、硫安塩析、アルコール沈降、イオン交換樹脂を用いるクロマトグラフィー、ゲルろ過法、ヒドロキシルアパタイト吸着樹脂を用いるクロマトグラフィー等を用い常法により処理して、精製耐酸性カタラーゼを得ることができる。
【００１５】
本発明の耐酸性カタラーゼは、従来のカタラーゼとほぼ同様の酵素的性質を持ちながら強酸性pHの環境下での安定性が極めて良いことに特長がある。
いくつかの酵素的性質を以下に示す。
熱安定性 ：pH4.0で１時間保持した後の残存活性は、60℃で94％以上、70℃  で70%以上である。
至適pH   ：pH６に至適を持ち、pH２〜10でもpH６における活性の60％以上の活性を示す。
pH安定性 ：グリシン−塩酸バッファー（pH1.5）において、30℃、２時間処  理でも50％以上の残存活性を示す。
【００１６】
尚、本発明において耐酸性カタラーゼ活性の測定方法は、以下に示す通りである。
【００１７】
過酸化水素基質〔50mMリン酸塩緩衝液（pH７）200mlに31％過酸化水素242μlを加えたもの〕を平底試験管に５ml入れ、30℃の恒温水槽で20分間保温しておき、これに酵素試料１ml加え、よく振りまぜ、直ちに30℃の恒温水槽に入れ、正確に５分間反応させ、反応後に１N硫酸溶液２mlを加え、よく振りまぜ反応を止め、これにヨウ化カリウム溶液（10％）を１ml、モリブデン酸アンモニウム溶液（１％）を１滴及び指示薬としてデンプン試薬（0.5％）を５滴加え、この溶液を攪拌しながら、1/200 Nチオ硫酸ナトリウム溶液（定量用）で滴定し、ブランクは試料の代わりにリン酸塩緩衝液１mlを添加し、以下の計算方法でカタラーゼ活性を求めた。
1/200 Nチオ硫酸ナトリウム１ml＝2.5μM H2O2
カタラーゼ活性（U/ml）＝Ｘ×ｎ
ｎ：希釈倍数
Ｘ：標準曲線のグラフよりｙ＝（Ｔ0−ＴS）×24.5／Ｔ0×2.5×ｆ
のｘ軸の値Ｘを求める。
ｆ＝1/200 Nチオ硫酸ナトリウムのファクター
Ｔ0＝ブランクの滴定値（ml）
ＴS＝サンプルの滴定値（ml）
24.5／Ｔ0＝初発基質濃度による活性測定変化に対する補正値
【００１８】
以下実施例をあげて、本発明をより具体的に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
実施例１
グルコース10.2％（W/V）、コーン・スティープ・リカー2.75％（W/V）、グリシン0.5％（W/V）、NaNO3 1.5％（W/V）、Ca(NO3)2 0.5％（W/V）、KH2PO4 0.1％（W/V）、MgSO4・７H2O 0.05％（W/V）、FeCl3 0.01％（W/V）、pH6.9よりなる培地100mlを500ml容の坂口フラスコに仕込み、121℃で30分間殺菌した。
【００２０】
他方、ポテトデキストロース寒天培地で30℃，３日間予め培養しておいたアスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）IFO 5864の菌体を前記培地に無菌的に接種し、30℃で６日間振盪攪拌培養した。培養ろ液の耐酸性カタラーゼ活性は240 U/mlであった。
【００２１】
実施例２
グルコース10.2％（W/V）、コーン・スティープ・リカー2.75％（W/V）、グリシン0.5％（W/V）、NaNO3 1.5％（W/V）、Ca(NO3)2 0.5％（W/V）、KH2PO4 0.1％（W/V）、MgSO4・７H2O 0.05％（W/V）、FeCl3 0.01％（W/V）、pH6.9よりなる培地100mlを500ml容の坂口フラスコに仕込み、121℃で30分間殺菌した。
【００２２】
他方、ポテトデキストロース寒天培地で30℃，３日間予め培養しておいたアスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）IAM 2017の菌体を前記培地に無菌的に接種し、30℃で６日間振盪攪拌培養した。培養ろ液の耐酸性カタラーゼ活性は365 U/mlであった。
【００２３】
実施例３
実施例１で得られた培養物を東洋ろ紙 No.２を用いてろ過、及び8000rpm，10分間の遠心分離を行い上清を得、これを限外ろ過して濃縮し、酢酸でpHを4.0に調整後、0.2M酢酸バッファー（pH4.0）で平衡化させたアンバーライト（Amberlite）CG-50（ローム・アンド・ハース社製品）に吸着後、0.2M酢酸ナトリウム溶液にて（流速0.3ml/min）酵素を溶出した。次いでこの溶出画分を５Ｍ EDTA・2Naを含む0.1Mリン酸カリウムバッファー（pH6.0）で平衡化したDEAE-SepharoseCL-6B（ファルマー社製品）に供し、同バッファーで洗浄して、DEAE-Sepharose未吸着画分を集め、脱塩濃縮した。得られた精製耐酸性カタラーゼの比活性は2,200U/A280タンパク質であった。また、実施例２で得られた培養物からも同様にして比活性820U/A280タンパク質の耐酸性カタラーゼを濃縮精製することができた。
【００２４】
実施例４
実施例１及び実施例２に準じて調製した本発明の耐酸性カタラーゼ及び市販品のアスペルギルス・ニガー（Asperugillus niger）由来のカタラーゼ（カタラーゼＬＣ「アマノ」天野製薬社製）の各々について、それらの酵素濃度が100U/mlになるように50mMグリシン−塩酸バッファー（pH1.5）で希釈し、30℃で１時間及び２時間インキュベートした後の各残存活性を測定した。
【００２５】
その結果は、図１に示される通りである。即ち、本発明の何れのカタラーゼも、pH1.5で１時間保持した後では、60％以上の残存活性を有しており、且つ又２時間保持した後でも50％以上の残存活性を有しているに対し、市販品のアスペルギルス・ニガー（Asperugillus niger）由来のカタラーゼＬＣ「アマノ」（天野製薬社製）は、pH1.5で１時間保持した後では、５％以下の残存活性を示し、且つ又２時間保持した後では、1.3％の残存活性を示すにすぎない。
【００２６】
【発明の効果】
本発明によって、耐酸性カタラーゼを新たにアスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）菌株から得ることができ、半導体排水処理等の工業分野にそれを好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の耐酸性カタラーゼと市販のアスペルギルス・ニガー（Asperugillus niger）由来カタラーゼとについて、pH1.5の耐酸性環境下における１時間及び２時間経過後の残存活性を比較した図である。
【図１】
0004025392.tif 000002