(57)【要約】【課題】水素分子の細胞内伝達機構の制御機序を明らかにし、水素分子を含む細胞内シグナル伝達を制御し得る薬剤の提供。【解決手段】水素分子を有効成分として含む、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内シグナル伝達を制御する、細胞内シグナル伝達制御剤。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素分子を有効成分として含む、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内シグナル伝達を制御する、細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項２】
水素分子を有効成分として含む、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御する、請求項１記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項３】
生体内で脂質メディエイターが発生しない健常状態の被験体に対しては細胞内カルシウムシグナル伝達を制御せず、生体内で脂質メディエイターが発生する状態の被験体に対して細胞内カルシウムシグナル伝達を制御する、請求項１又は２に記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項４】
脂質メディエイターが、酸化リン脂質である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項５】
脂質メディエイターが、酸化OxPAPC（1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン）である、請求項４記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項６】
生体に投与したときに、生体内の水素濃度を２マイクロモル以上に上昇させる濃度で水素分子を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項７】
水素ガスを0.5〜1.5％含む、請求項６記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項８】
酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御し、転写因子NFATの活性を低下させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項９】
酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御し、転写因子ERG-1の活性を低下させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞内シグナル伝達制御剤。
【請求項１０】
請求項８に記載の細胞内シグナル伝達制御剤を含む医薬組成物であって、転写因子NFATの活性を低下させることにより、免疫抑制効果、炎症抑制効果、骨粗鬆症抑制効果、糖尿病改善効果、がん抑制効果、高血圧改善効果、ED（勃起障害）改善効果及び美白効果からなる群から選択されるいずれかの効果を発揮する、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞内シグナル伝達制御剤を含む医薬組成物であって、転写因子ERG-1の活性を低下させることにより、心肥大の抑制効果、線維化の抑制効果及びがんの抑制効果からなる群から選択されるいずれかの効果を発揮する、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞内カルシウムシグナル伝達を制御する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の医薬品は、一方向に作用する。例えば、インスリンは血糖値を下げる働きがあり、高血糖値の場合でも低血糖値の場合でも血糖値を下げる。高血糖値の場合は薬効となるが、低血糖値の場合は重篤な副作用となる。
【０００３】
副作用がない医薬品は病態にのみ効果を発揮し、正常値に戻ると効能を発揮しないものが理想的であるが、そのような医薬品はない。
【０００４】
しいていえば、フィードバック機構が存在し、一連の反応系の代謝産物が上流の反応を阻害するというものである。この場合でも、上流の反応系を阻害することで副作用が生じる可能性がある。
【０００５】
水素分子は抗酸化作用、抗炎症作用、抗アレルギー作用とエネルギー代謝促進作用によって、様々な疾患の予防と治療に利用され得ることが示唆されている（特許文献１〜３を参照）。水素分子の効果は多様であり、従来の概念では理解しえない。また、水素濃度が低濃度であっても（吸引水素ガス濃度が１−４％、又は0.8mMの水素水の飲用）効果を発揮することから、水素分子が直接活性酸素を消去するというメカニズムだけでは説明しえない。また、細胞内伝達を制御し、遺伝子発現の制御をすることもわかってきたが、その分子機構は明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO2007/021034号
【特許文献２】国際公開第WO2008/026785号
【特許文献３】特開2009-114084号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
水素分子が様々な疾患の予防と治療に利用され得ることは、示唆されていたが、その分子機構は明らかになっていなかった。
【０００８】
本発明は、水素分子の細胞内伝達機構の制御機序を明らかにし、水素分子を含む細胞内シグナル伝達を制御し得る薬剤の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、低濃度の水素分子の細胞内伝達機構の制御機序の解明をすべく鋭意検討を行った。
【００１０】
重要な問題としては、病的な時、又は何らかのストレスがかかったときにだけ水素は作用するというものであり、この機構の解明も必要であった。病的な状態又はストレスのあるときにだけ作用するというのは、新しい概念であり、副作用の無い医薬品となる。
【００１１】
本発明者は、リン脂質を酸化させて脂質メディエイターを作製する際に、水素ガスを混入させたところ、脂質メディエイターを量的又は質的に制御していることを見出した。
【００１２】
すなわち、リン脂質を３日間空気酸化し、脂質メディエイターを作製した。その際に様々な濃度の水素ガスを混入させた。空気酸化したリン脂質をモノサイト由来の培養細胞に加えて、細胞内カルシウムの増加を蛍光色素によってモニターした。すると、水素が存在しない空気酸化によって生じた脂質メディエイターでは、細胞内カルシウム濃度を増加させた。一方、水素ガスが１％程度でも含む空気でリン脂質を処理すると細胞内カルシウムの増加は抑制された。この結果から、水素ガスは１％程度の低濃度でも脂質メディエイターの生成に影響を及ぼすことが明らかとなった。水素存在化でリン脂質を空気酸化させた時の変化をマススペクトルで網羅的に解析すると、増加した分子種と減少した分子種があり、水素濃度が1.3％以上で顕著であった。また、水素ガスが存在する空気と存在しない空気で処理したリン脂質をモノサイト系の培養細胞に作用させ、遺伝子発現の変化をマイクロアレイにより網羅的に解析すると、NFAT（nuclear factor of activated T-cell）シグナル系、ERG-1（early response gene-1）の転写因子に制御されていることが明らかとなった。
【００１３】
通常であれば脂質メディエイターの増加に伴い増加していく細胞内のカルシウムが、水素の存在により抑制された。細胞内カルシウムは様々なシグナル伝達に関与する物質であり、カルシウムの増加が抑制されることは、細胞内シグナル伝達の活性に影響を与えていることを示している。
【００１４】
さらに、脂質メディエイターの増加に伴うカルシウムの増加によって、転写因子NFAT(nuclear factor of activated T-cell)と転写因子ERG-１(early response gene-1)が不活化されることを見出した。NFATとERG-1は様々な疾患の治療のための標的遺伝子として注目されている転写因子である。
【００１５】
この水素による脂質メディエイターへ作用することによる、細胞内カルシウムシグナル伝達機構とその下流のNFATとERG-1の転写抑制は、フリーラジカル連鎖反応に起因するものであるので、フリーラジカル連鎖反応が生じないときは作用しないのが特徴であることを見出した。
【００１６】
これらの知見より、本発明者は水素分子を酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内シグナル伝達を制御することを特徴とする本発明を完成させるに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  水素分子を有効成分として含む、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内シグナル伝達を制御する、細胞内シグナル伝達制御剤。
[２]  水素分子を有効成分として含む、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御する、[１]の細胞内シグナル伝達制御剤。
[３]  生体内で脂質メディエイターが発生しない健常状態の被験体に対しては細胞内カルシウムシグナル伝達を制御せず、生体内で脂質メディエイターが発生する状態の被験体に対して細胞内カルシウムシグナル伝達を制御する、[１]又は[２]の細胞内シグナル伝達制御剤。
[４]  脂質メディエイターが、酸化リン脂質である、[１]〜[３]のいずれかの細胞内シグナル伝達制御剤。
[５]  脂質メディエイターが、酸化OxPAPC（1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン）である、[４]の細胞内シグナル伝達制御剤。
[６]  生体に投与したときに、生体内の水素濃度を２マイクロモル以上に上昇させる濃度で水素分子を含む、[１]〜[５]のいずれかの細胞内シグナル伝達制御剤。
[７]  水素ガスを0.5〜1.5％含む、[６]の細胞内シグナル伝達制御剤。
[８]  酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御し、転写因子NFATの活性を低下させる、[１]〜[７]のいずれかの細胞内シグナル伝達制御剤。
[９]  酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御し、転写因子ERG-1の活性を低下させる、[１]〜[７]のいずれかの細胞内シグナル伝達制御剤。
[１０]  [８]の細胞内シグナル伝達制御剤を含む医薬組成物であって、転写因子NFATの活性を低下させることにより、免疫抑制効果、炎症抑制効果、骨粗鬆症抑制効果、糖尿病改善効果、がん抑制効果、高血圧改善効果、ED（勃起障害）改善効果及び美白効果からなる群から選択されるいずれかの効果を発揮する、医薬組成物。
[１１]  [９]の細胞内シグナル伝達制御剤を含む医薬組成物であって、転写因子ERG-1の活性を低下させることにより、心肥大の抑制効果、線維化の抑制効果及びがんの抑制効果からなる群から選択されるいずれかの効果を発揮する、医薬組成物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の水素分子を有効成分として含む細胞内シグナル伝達制御剤は、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内シグナル伝達を制御することができる。細胞内シグナル伝達を制御する結果、NFATやERG-1等の転写因子の活性を低下させる。その結果、炎症性ホルモンの合成を抑制する。本発明の水素分子を有効成分として含む細胞内シグナル伝達制御剤は酸化ストレスに起因してNFATやERG-1等の転写因子の活性が亢進した結果、炎症性ホルモンの過剰合成を原因とする疾患の治療に用いることができる。
【００１９】
被験体の酸化ストレスが過剰であり、フリーラジカル連鎖反応が生じているときに本発明の水素分子を有効成分として含む細胞内シグナル伝達制御剤は作用し、被験体においてフリーラジカル連鎖反応が生じていないときは作用しない。このため、本発明の水素分子を有効成分として含む細胞内シグナル伝達制御剤は副作用が生じることなく安全に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】水素ガスの経時的なPBS中及びリノレン酸中の溶解濃度を示す図である。
【図１−２】水素ガスの経時的なPBS中及びオクタン酸中の溶解濃度を示す図である。
【図１−３】水素ガスの経時的なPBS中、リノレン酸中及びオクタン酸中の溶解濃度をグラフに示した図である。
【図１−４】H2のLiperfluoの反応に対し影響しないことを示す図である。
【図２−１Ａ】０〜75％濃度水素ガスによる過酸化脂質化の抑制効果を示す図であり、フローサイトメトリーにより測定したLiperfluorの蛍光強度を示す図である。図の最上列のパネルが0、2.5、10、75％水素ガスの結果をまとめて示した図であり、その下の４列のパネルは、それぞれ0、2.5、10及び75％水素ガスの結果を別々に示した図である。
【図２−１Ｂ】０〜10％の低濃度水素ガスによる過酸化脂質化の抑制効果を示す図であり、フローサイトメトリーにより測定したLiperfluorの蛍光強度を示す図である。図の最上列のパネルが0、0.6、1.25、2.5、10％水素ガスの結果をまとめて示した図であり、その下の５列のパネルは、それぞれ0、0.6、1.25、2.5及び10％水素ガスの結果を別々に示した図である。
【図２−２】水素ガスによる過酸化脂質化の抑制効果をグラフで示す図である。
【図２−３】低濃度水素ガスによる過酸化脂質化の抑制効果をグラフで示す図である。
【図３−１】水素ガスによる膜損傷の軽減効果を示す図である。
【図３−２】水素ガスの酸化還元酵素活性に対する影響がないことを示す図である。
【図４−１】水素水を飲ませることによって、血管の酸化LDLが減少することを蛍光抗体法により示した図である。
【図４−２】水素水を飲ませることによって、血管の酸化LDLが減少することを蛍光抗体法の計量結果により示した図である。
【図４−３】水素を発生するMgH2を飲ませることによって、血液中のLPC(リゾホスファチジルコリン：lysophosphatidylcholine)が減少することを示す図である。
【図４−４】OxPAPCの空気酸化を示す図である。
【図４−５】水素分子によるPAPCの空気酸化の抑制効果を示す図である。
【図４−６】ATPを加えたときのTHP-1細胞におけるCa2+濃度の上昇を示す図である。酸化したPAPCではそれ以前にもシグナルが見られる（図４−６a）が、水素存在下でPAPCを酸化させた場合はシグナルが消失する（図４−６b）ことを示す代表的な結果である。
【図４−７】空気酸化の日数とCa2+シグナルの関係を示す図である。
【図４−８】水素濃度とCa2+シグナル強度の関係を示す図である。
【図４−９】水素分子による脂質メディエイター生成の調節を示す図である。
【図５−１】水素分子により発現が影響を受ける遺伝子の分析結果を示す図である（その１）。
【図５−２】水素分子により発現が影響を受ける遺伝子の分析結果を示す図である（その２、その１の続き）。
【図５−３】水素分子により発現が影響を受ける遺伝子の分析結果を示す図である（その３、その２の続き）。
【図５−４】水素分子により発現が影響を受ける遺伝子の分析結果を示す図である（その４、その３の続き）。
【図６−１】水素分子により発現が影響を受ける遺伝子の発現量をRT-PCR法で測定した結果を示す図である。図６−１a、b、c、d、eは、それぞれ、TNF-α、IL-8、EGR-1、VLDLR及びATP2B4の結果を示す。
【図６−２】水素分子により発現が影響を受ける遺伝子間の関連を示す図である。
【図６−３】水素分子存在下でのモノサイト細胞におけるTNF-αの発現を示す図である。
【図６−４】水素分子存在下でのヒト上皮細胞（HAEC:human epidermic cell）におけるIL-8の発現を示す図である。
【図６−５】酸化OxPAPCによって、NFATが核に移行したことを示す図である。
【図７】実施例の結果から得られた知見をまとめた図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２２】
本発明は、水素分子（H2）を有効成分として含む、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御する、細胞内シグナル伝達制御剤である。
【００２３】
水素分子は、脂質メディエイターへ作用して、多様な機能を発揮する。脂質メディエイターとは、リン脂質が酸化することにより生じる物質、すなわち酸化リン脂質であり、多様な細胞内カルシウム伝達系に作用する。脂質はエネルギー源、生体膜の構成成分として、細胞の固有機能を果たすために必須の役割を果たしているが、生体膜に外界から刺激が加わる（リン脂質が酸化する）と、脂質メディエイターというホルモン様分子が産生される。脂質メディエイターは、生体防御、神経伝達など様々な機能を営んでいる。脂質メディエイターは、構造の違いによって分類され、それぞれの特異的受容体を介して生理作用を発揮し、炎症、免疫、血圧調節、脳神経機能、癌、妊娠と出産、など様々な生体機能や病態に深く関わっている。このような理由から、脂質メディエイターは創薬研究のターゲットとして大いに注目され、解熱鎮痛薬や抗アレルギー薬として医療の現場で用いられてきた。本発明は、水素分子が脂質メディエイターを標的として作用することを見出しなされた。酸化され脂質メディエイターとなるリン脂質として、例えば、PAPC（1-palmitoyl-2-arachidonyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine：1-パルミトイル-2-アラキドノイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン）が挙げられ、PAPCにおいては、アラキドン酸基が酸化され、酸化PAPC（OxPAPC）となる。脂質メディエイターは、炎症誘導作用を有する。すなわち、OHラジカル等の活性酸素が発生すると、フリーラジカル連鎖反応が生じ、脂質メディエイターが発生する。脂質メディエイターが発生するとカルシウムシグナルが細胞に伝達され、細胞内で転写因子であるNFAT(Nuclear factor of activated T-cell)及びERG-1(Early response protein 1)を活性化し、TNF-α、IL-8等の炎症性ホルモンが合成され、炎症を引き起こす。
【００２４】
すなわち、水素分子は酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内カルシウムシグナル伝達を制御し、転写因子NFAT又はERG-1の活性を低下させる。
【００２５】
酸化LDLとリゾホスファチジルコリン（酸化リン脂質の１種）は、脂質メディエイターとして機能することが広く知られている。これらの減少も水素の投与によってみられることから、酸化LDLとリゾホスファチジルコリンを含めた酸化リン脂質も水素が作用する分子に含まれる。
【００２６】
水素分子は、フリーラジカル連鎖反応を停止させることにより、脂質メディエイターを量的又は質的に変化させる。すなわち、水素分子により脂質メディエイターは合成されなくなるか、あるいは別種のメディエイターが生成する。この結果、カルシウムシグナルが作動しなくなるので、炎症性ホルモンが合成されなくなる。この際、水素分子は水素ガスとして１％程度、例えば、0.5〜２％、好ましくは0.5〜1.5％、さらに好ましくは１％存在すれば、細胞におけるフリーラジカル連鎖反応を停止させることができる。この濃度の水素ガスは、生体内の水素濃度を２μM以上に上昇させる濃度である。水素分子が脂質メディエイターに作用し、カルシウム伝達を制御する機構を図７に示す。
【００２７】
ここで、もともとOHラジカルが過剰に無いときには、水素分子の効果は生じない。つまり、健常時でストレスがないときには、水素の効果は発揮しないので、副作用は生じない。水素分子は、生体内で脂質メディエイターが発生しない健常状態の被験体に対しては細胞内カルシウムシグナル伝達を制御せず、生体内で脂質メディエイターが発生する状態の被験体に対して細胞内カルシウムシグナル伝達を制御することができる。
【００２８】
水素分子を有効成分として含む細胞内カルシウムシグナル伝達制御剤は、酸化ストレスに起因するNFAT活性の亢進或いはERG-1活性の亢進に起因して起こる炎症性ホルモンの過剰合成を原因とする疾患の治療に用いることができる。
【００２９】
NFATの活性低下によって、免疫抑制効果（いわゆるシクロスポリンなどの免疫抑制剤に代わる効果）、炎症抑制効果（ステロイドに代わる効果）、骨粗鬆症抑制効果、糖尿病改善効果及びがん抑制効果が期待できる。また、ERG-1の不活化によって、心肥大の抑制、線維化の抑制、がんの抑制効果が期待できる。水素分子を有効成分として含む細胞内カルシウムシグナル伝達制御剤は、これらの効果を発揮する医薬組成物として用いることができる。また、NFATを不活化することによって、COX-2（遺伝子名PTGS２）が低下する。COX-2はレニン分泌を刺激するので、レニン酵素タンパク質の遺伝子の活性が強いと高血圧になりやすくなる。COX-2を抑制することで、高血圧を予防することができる。さらに、NFATを不活化することによって、エンドセリン（遺伝子名END1）が低下する。エンドセリン（ET)は肺高血圧、心不全、腎不全といった病態との関連が指摘されている。エンドセリンは、一過性の血管拡張作用と、それに引き続く持続的な血管収縮作用を有するので、エンドセリンの分泌を抑制することで、ED(勃起障害）や高血圧の予防となる。エンドセリン受容拮抗薬である「bosentan」は肺動脈性肺高血圧症の治療薬として使用されている。エンドセリンは、メラノサイト(メラニン色素合成細胞)に作用し、メラノサイトの成長に不可欠である。紫外線に当たって皮膚にエンドセリンが大量に産生されると、肌が黒くなり、さらに高じると、メラノーマ(悪性黒色腫)ができる。エンドセリンの分泌を抑制することで美白効果が生じる。さらに、NFATを不活化することによって、MCP-1（遺伝子名CCL）が低下する。MCP-1(CCL2)は、破骨細胞に作用して、歯周病や骨粗鬆症の原因となるのでMCP-1を抑制することで、骨粗鬆症を予防する。すなわち、本発明の水素分子を有効成分として含む細胞内カルシウムシグナル伝達制御剤は、NFATの活性を低下させることにより、高血圧、ED(勃起不全）の治療、改善に効果を発揮し、さらに、美白効果も発揮し得る。
【００３０】
本発明の水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤は、液体であっても気体であってもよい。
【００３１】
水素分子を含む液体は、水溶液からなることを特徴とする。本発明において、水素を含む液体を水素水と呼ぶことがある。この水溶液を形成する媒体としては、純水、イオン交換水、蒸留水、生理食塩水等を使用し得る。さらに、前記媒体として純水、イオン交換水あるいは蒸留水を使用し、一般的な水性飲料品、例えば、ミネラルウォーター、ジュース、コーヒー、お茶等に添加して飲用するようにしてもよい。ここで、飲料品は、飲料用の健康食品、特定保健用食品、栄養機能食品等を含む。ここで、特定保健用食品とは、食生活において特定の保健の目的で摂取をし、その摂取により当該保健の目的が期待できる旨の表示をする食品をいう。
【００３２】
水素分子は飽和状態であっても水又は水溶液中にある程度の時間溶けていることができる。このような水素分子が飽和状態の水又は水溶液は、加圧下において水素ガスを水又は水溶液に溶解させた後に圧力を取り除くことにより簡単に製造し得る。例えば、水溶液を0.4MPa以上の水素ガス圧下に数時間、好ましくは１〜３時間おけばよい。あるいは大量に水素水を製造する装置で短時間で製造してもよい。水溶液形態の水素水は、飲用として用いることもでき、生理食塩水の形で静注用として用いることもできる。この場合、投与はカテーテルを用いた投与や注射による投与が可能である。注入後は生体内に摂取された水素は生体にほとんど吸収され、血液を介して全身に行き渡り、効果を発揮し、その後呼気と一緒に排出される。
【００３３】
水素１気圧、室温条件で水素は水１L当たり約17.5mL溶存し得る（約1.6ppm、約0.8 mM）。本発明の水素分子を含む液体組成物は、水溶液１L当たり、10ｍL以上、好ましくは15mL以上、特に好ましくは17.5mL以上の水素分子を含む。また、本発明の水素分子を含む液体組成物は、１ppm以上、好ましくは1.5ppm以上の水素分子を含む。また、本発明の水素分子を含む液体組成物は、0.1mM以上、好ましくは0.4mM以上、さらに好ましくは0.6mM、特に好ましくは0.8mM以上の水素分子を含む。
【００３４】
また、本発明の水素分子を含む液体組成物は、酸素分子を含んでいてもよい。水溶液中に水素分子と酸素分子とが共存することとなるが、水素分子と酸素分子とが混合状態であっても、ただちに反応することはなく、両者とも安定に共存し得る。
【００３５】
本発明の液体組成物は、好ましくはアルミニウム等の水素を透過できない素材でできた容器中に保存するのが好ましい。また、低温である程、より多くの水素が溶存するので、低温で保存するのが好ましい。
【００３６】
本発明の水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤が気体状の形態である場合、気体中の水素ガス濃度は、上記のように、生体内の水素濃度を２μM以上に上昇させる濃度であり、具体的には、0.5〜２％、好ましくは0.5〜1.5％、さらに好ましくは１％である。本発明の水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤は、さらに酸素ガス及び／又は他の不活性ガスを含んでいてもよい。酸素ガスを含む場合、水素ガスと酸素ガスの混合ガスからなる。酸素ガスは呼吸のために消費される。不活性ガスとしては、窒素ガス、ヘリウムガス、アルゴンガス等を使用し得るが、安価な窒素ガスが望ましい。この不活性ガスの含有量は、多すぎない範囲で当業者が任意に設定できるが、呼吸用の酸素ガス濃度を考慮すると80％（v/v）以下が好ましい。さらに、本発明の水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤は、水素ガスと空気の混合ガスであってもよい。このような混合ガスは、空気に水素ガスを適宜混合することにより簡単に製造し得る。
【００３７】
本発明は、水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤を有効成分として含む、医薬組成物も包含する。この場合、水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤は液体状であっても、気体状であってもよい。これらの組成物は、上記の酸化ストレスに起因するNFAT活性の亢進或いはERG-1活性の亢進に起因して起こる炎症性ホルモンの過剰合成を原因とする疾患の治療に用いることができる。
【００３８】
投与は、液体状の水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤の場合、経口投与、静脈注射等により行うことができる。また、気体状の水素分子を含む細胞内シグナル伝達制御剤の場合は、吸引により投与すればよい。
【実施例】
【００３９】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００４０】
実施例１  水、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸における水素の相対的溶解度と滞在時間の検討
PBS（リン酸緩衝生理食塩水）と飽和脂肪酸（オクタン酸：Octanoic acid）又は、PBSと不飽和脂肪酸(リノレン酸：Linolenic acid)を密閉容器で混合し、水素ガスをバブリングして水素を溶かした後に、空気に触れさせ、各時間後に水素含量をガスクロマトグラフィーで測定した。
【００４１】
図１−１〜図１−３に結果を示す。図１−１は、経時的な水素ガスのPBS中及びリノレン酸中の溶解濃度を示し、図１−２は、経時的な水素ガスのPBS中及びオクタン酸中の溶解濃度を示す。図１−３は結果をグラフに示したものである。図１−１〜１−３の結果は、H2は水よりも脂肪酸に多く溶けること、及び不飽和脂肪酸におけるH2の滞在時間が飽和脂肪酸の場合より長いことを示す。
【００４２】
不飽和脂肪酸は、フリーラジカル連鎖反応が生じるときの最初の標的であるので、H2は低濃度で生物膜におけるフリーラジカル連鎖反応を効率的に抑制し得ることが示唆された。
フリーラジカル連鎖反応は過酸化物の生成を促進する。
【００４３】
H2は脂質過酸化物を検出するための蛍光色素であるLiperfluo（N-(4-Diphenylphosphinophenyl)-N'-(3,6,9,12-tetraoxatridecyl)perylene-3,4,9,10-tetracarboxydiimide）の反応を妨げなかった（図１−４）。
【００４４】
実施例２  水素ガスによる過酸化脂質化の抑制
ヒトモノサイト系の培養細胞(THP-1)にフリーラジカル誘発剤(AAPH (2,2'-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride)又はTBHP(tert-Butyl hydroperoxide))を加え、様々の濃度の水素ガス(0％〜75％)の存在下で培養し、その後にフローサイトメトリーによりLiperfluorで過酸化脂質を定量した。図２−１Ａ、２−１Ｂ、２−２及び２−３に結果を示す。図２−１Ａ及び２−１Ｂはフローサイトメトリーにより測定したLiperfluorの蛍光強度を示し、図２−２及び２−３は、その結果を定量化した結果を示す。図に示すように、水素ガス濃度が0.6％でも、過酸化脂質化は抑制された。過酸化脂質は、フリーラジカル連鎖反応によって生じるので、0.6％程度の水素濃度でもフリーラジカル連鎖反応を抑制することがわかった。
【００４５】
実施例３  水素ガスによる膜損傷の軽減
THP-1細胞に上記のフリーラジカル誘発剤を加え、様々の濃度の水素ガス(0％〜75％)の存在下で培養し、細胞液に流出したLDHの活性を測定した。
【００４６】
図３−１に示すように、細胞質に存在する酵素であるLDHの漏出量から判断すると、水素ガスはフリーラジカル誘発剤（AAPH又はTBHP）により誘発された膜の損傷を軽減させた。また、図３−２に示すように、AlamarBlueアッセイの結果から判断すると、水素ガスは酸化還元酵素活性をわずかに抑制しただけであり、このことは水素ガスの主標的が膜であることを示す。
【００４７】
本実施例の結果は、水素ガスは、連鎖反応の引金となる・ＯＨだけではなく、脂質ラジカル（Ｌ・）、アルコキシラジカル（ＬＯ・）、ペルオキシラジカル（ＬＯＯ・）等の中間体ラジカルと反応してフリーラジカル連鎖反応を停止させることを示す。
【００４８】
実施例４  水素ガスにより脂質メディエイターへの作用による細胞内カルシウムシグナル伝達
本発明者は、先にapoE(-/-)マウスにおいて、水素水を飲むことにより動脈硬化を抑制し得ることを示した（Ohsawa I, Nishimaki K, Yamagata K, Ishikawa M, Ohta S. Consumption of hydrogen water prevents atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice.Biochem Biophys Res Commun. 2008 Dec 26;377(4):1195-8. doi:10.1016/j.bbrc.2008.10.156.）。水素水の長期に及ぶ飲用はapoE(-/-)マウスと同様なC57BL/6.KOR/StmSlc-Apoeshl（ApoE欠損自然発症高脂血症マウス；B6.SHLマウス）において、血管の酸化LDL(ox-LDL)を減少させた。すなわち、水素水の飲用によりin vivoでリン脂質の酸化が抑制された(図４−１及び４−２)。図４−１は、緑色は抗酸化LDL抗体で染色した酸化LDLを示し、青は核を染色するDAPI染色で細胞を染色したものである。水素水を飲用することによって、緑色が減少することから、水素水を飲用することによって動脈に取り込まれた酸化LDLを減少させることを示し、図４−２は、その定量結果である。さらに、同実験マウスにMgH2 0.9mg/kg体重（0.001g/ml脱水グリセロール）、Mg(OH)2（MgH2を投与した際に発生する量：0.0022g/ml 80%脱水グリセロール）を強制経口投与にて行った。Shamは、対照のグリセロール液を投与、０dayは採血１日前にMg(OH)2を投与した結果を示す。マウス血清は、投与終了後の翌週に心採血により調製した。血清中のリゾフォスファチジルコリンをAZWELL LPC Assay Kitにより測定をおこなった。この結果、血液中のリゾホスファチジルコリン（酸化リン脂質の１種）も水素水を体内で発生させることにより減少した(図４−３)。
【００４９】
いままでの実施例では、培養細胞を用い、水素ガスの濃度を調節することによって、リン脂質の酸化による効果を示したが、ここでは個体（マウス）に対し、日常生活で摂取しやすい水素水やMgH2によっても、リン脂質の酸化を抑制することを示した。したがって、本発明は、培養細胞に限定されるものではないことを示した。
【００５０】
リン脂質過酸化物は、酵素的に又は化学的に加水分解され、種々のシグナル伝達を調節するメディエイターを生成する。酸化リン脂質メディエイターの生成に対する水素ガスの影響を確認するため精製PAPC（1-palmitoyl-2-arachidonyl-sn-glycero-3-phosphorylcholine）を空気酸化させ、Liperfluoで過酸化脂質を定量した。結果を図４−４に示す。図４−４に示すように、PAPCは空気酸化で過酸化脂質ができることがわかった。次いで、水素ガス1.3％存在下で。PAPCを空気酸化し、PAPCの量をマススペクトルで定量した。結果を図４−５に示す。図４−５に示すように、水素は1.3％でも、PAPCの空気酸化を抑制することがわかった。
【００５１】
さらに、PAPCを空気酸化させ、ヒトモノサイト系の培養細胞(THP-1)に作用させ、カルシウム感受性蛍光色素であるFluo4-AMを用いて、細胞内カルシウム(Ca2+)の濃度をモニターした。陽性コントロールとして、ATPを加えて、Ca2+濃度が上昇することを確認した（図４−６）。図４−７に空気酸化のタイムコースとCa2+シグナルの関係を示す。Ca2+シグナルは、４日で最大値を示した。この結果は、途中経過の３日後にCa2+を測定するのが至適であることを示す。
【００５２】
次に様々な水素濃度（0、0.15、0.3、1.25、5及び80％）の下でPAPCを３日間空気酸化し、THP-1に作用させ、Ca2+の上昇した細胞の数の比率を示した。結果を図４−８に示す。図４−８に示すように、PAPCを空気酸化するときに、水素が1.25％以上存在するとCa2+シグナルが低下することがわかった。
【００５３】
水素ガスにより調節されるメディエイターを同定するために、水素ガスの存在下で空気酸化したPAPC（図４−８に結果を示す実験で用いたPAPC)をマススペクトルにかけて、網羅的に解析した。結果を図４−９に示す。図４−９中、各バンドは分子量の異なる酸化PAPCを示し、赤色は水素によって増加したもの、緑は減少したものを示す。0.3％と1.3％の境でパターンが変動していることがわかる。水素によって増加するもの、減少するものがあるので、水素によって、リガンド（agonist）が減少したためにCa2+シグナリングが低下したのか、あるいは類似のリガンド（antagonist）によって、agonistの作用を抑制しCa2+シグナリングを低下させたのかは、不明である。いずれにしろ、低い水素ガス濃度で、酸化メディエイターが生成し、その結果シグナル伝達が調節された。
【００５４】
実施例５  水素ガスにより発現が影響を受ける遺伝子の分析
水素ガス依存性メディエイターにより影響を受ける遺伝子発現を、マイクロアレイを用いて分析した。
【００５５】
水素ガス５％存在下で空気酸化させたOxPAPCと、水素ガスの非存在下で空気酸化させたPAPCをTHP-1細胞に加え、４時間後に細胞からmRNAを採取し、マイクロアレイによって網羅的に遺伝子発現の変化を解析した。
【００５６】
結果を図５に示す。図５に示す遺伝子から、水素ガス非存在下での空気酸化OxPAPCによって上昇し、水素ガス存在下での空気酸化OxPAPCによって、その増加を抑制した遺伝子を選択した。図５中の数字は、OxPAPCによって上昇した倍率と５％H2で処理して条件下で酸化させたOxPAPCによって減少した比率の値である。ここに記載された遺伝子の役割は図５に示した。
【００５７】
転写因子NFATにより転写を受ける遺伝子とMAPKによって発現が調節されるEGR-1を記載した。これらの遺伝子の機能は、すべて細胞内シグナリングに関与する遺伝子であった。
【００５８】
図５に示す遺伝子の発現を確認するために、RT-PCR法で各々の遺伝子発現量を測定した。図６−１に結果を示す。図６−１a、b、c、d及びeは、それぞれ、TNF-α、IL-8、EGR-1,VLDLR、及びATP2B4の結果を示す。遺伝子中、NFAT(Nuclear factor of activated T-cell)は、ATP2B(Plasma membrane calcium-transporting ATPase 2)、WNT11(Wingless-type MMTV integration site family, member 11)、TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α)及びIL-8(Interleukin-8)の８遺伝子の発現を制御し、MAPK(Mitogen-activated Protein Kinase）カスケードはカルシウム依存的にEGR-1(Early response protein 1)の発現を制御した。図６−２に遺伝子間の関連を示す。図６−２は、すべての遺伝子が、脂質メディエイターの増加によって増加するCa2+によって制御されていることを示す。また、遺伝子発現は、NFAT（nuclear factor of activated T-cell）シグナル系、ERG-1（early response gene-1）とFOSの転写因子に制御されていることが明らかとなった。
【００５９】
次いで、遺伝子の発現をELISAによりタンパク質レベルで確認した。結果を図６−３に示す。図６−３はマウスのモノサイト細胞におけるTNF-αの発現を示し、水素ガス存在下で空気酸化させたOxPAPCにより、THP-1細胞におけるTNF-αの発現は下方制御された。また、図６−４はヒト上皮細胞（HAEC:human epidermic cell)におけるIL-8の発現を示す。水素ガス存在下で空気酸化させたOxPAPCにより、HAEC細胞におけるIL-8の発現は下方制御された。図６−３〜６−４の結果は、動物種と細胞種を超えて共通の働きが、水素にあることを示す。
【００６０】
図６−５は、酸化OxPAPCによって、NFATが核に移行したことを示す。左は、核をHoechst33342染色した図、中央は、抗NFAT抗体で染色した図、右はそれらを重ね合わせた図である。図６−５は、OxPAPCで処理したNFATが核へ移行したことを示す。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
水素分子を有効成分として含む、酸化ストレスに起因する脂質メディエイターに作用し細胞内シグナル伝達を制御する、細胞内シグナル伝達制御剤は、酸化ストレスに起因するNFAT活性の亢進或いはERG-1活性の亢進に起因して起こる炎症性ホルモン、エンドセリン、COX-2、MPC-1の過剰合成を原因とする疾患の治療に用いることができる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２−１Ａ】
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【図２−１Ｂ】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図４−７】
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【図４−８】
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【図４−９】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７】
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