(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１級水酸基が硫酸エステル化された糖を構成糖として有する硫酸化多糖に、下記式（Ｉ）
0003929486.tif 000005
式中、Ｒ1は同一又は異なり水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ2は低級アルキル基を示し、Ｒ3は同一又は異なり低級アルキル基、アリール基又はハロゲン原子を示す、
で表されるシリル化剤を反応させることにより、第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化することを特徴とする脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項２】
硫酸化多糖が、Ｎ−置換グリコサミン、Ｄ−ガラクトース−６硫酸及びＬ−ガラクトース−６硫酸から成る群より選択される少なくとも１種を構成糖として有するものである請求の範囲第１項記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項３】
硫酸化多糖が、Ｎ−硫酸化グリコサミン又はＮ−アセチル化グリコサミンを構成糖として有するものである請求の範囲第１項記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項４】
硫酸化多糖が、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、フノラン又はポルフィランである請求の範囲第１項記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項５】
硫酸化多糖が、Ｎ−置換グリコサミンを構成糖として有するものである請求の範囲第１項記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項６】
硫酸化多糖が、Ｎ−硫酸化グリコサミンを構成糖として有するものである請求の範囲第５項記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項７】
硫酸化多糖が、ヘパリン又はヘパラン硫酸である請求の範囲第６項記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項８】
硫酸化多糖を有機溶媒可溶性塩とし、反応を有機溶媒中で行う請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項９】
硫酸化多糖の有機溶媒可溶性塩が、硫酸化多糖の有機塩基塩である請求の範囲第８項記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項１０】
脱硫酸化反応後、更にシリル化された水酸基のシリル基を除去する請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載の脱硫酸化多糖の製造法。
【請求項１１】
下記の特性：
（１）酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した不飽和二糖組成のうち、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（U,6,N）Ｓ含量が１０〜４０％、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（U,N）Ｓ含量が３０〜６０％、
（２）Ｎ−置換硫酸基を含む二糖含量が７５〜９５％、及び
（３）重量平均分子量が４，０００〜３０，０００ダルトン、を有することを特徴とする、第１級水酸基に結合している硫酸基が選択的に除去された脱硫酸化ヘパリン。
【請求項１２】
脱硫酸化ヘパリンが請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法によって得られるものである請求の範囲第１１項記載の脱硫酸化されたヘパリン。
【請求項１３】
請求の範囲第１１項または第１２項に記載の脱硫酸化ヘパリンを有効成分として含有することを特徴とする塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤。
【請求項１４】
請求の範囲第１１項または第１２項に記載の脱硫酸化ヘパリン及び塩基性繊維芽細胞増殖因子を含有することを特徴とする塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進された組成物。
【請求項１５】
請求の範囲第１１項または第１２項に記載の脱硫酸化ヘパリンを有効成分として含有することを特徴とする創傷治療、潰瘍治療、骨粗鬆症治療または骨折治療のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、硫酸化多糖の第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸した脱硫酸化多糖の製造法及びこの製造法により得られた脱硫酸化されたヘパリンに関する。
背景技術
生物活性を有する硫酸化多糖を提供するために、硫酸化多糖の様々な脱硫酸化方法が研究されている。硫酸化多糖の脱硫酸化方法としては、塩化水素／メタノール中で酸触媒により脱硫酸化する方法が知られている（Kantor T.G. and Schubert M., J. Amer. Chem. Soc. Vol.79, p.152 (1957)）。しかし、この方法では特定の硫酸基のみを脱硫酸化することはできず、またグリコシド結合のメタノリシスによる糖鎖の切断が起こるため低分子量化し、もとの鎖長を有する反応生成物の収量は低下する。
収量よく脱硫酸化を行う方法として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はピリジン等の非プロトン性溶媒中（Usov A. et a1. Carbohydr. Res., Vol. 18, p.336 (1971)）又は少量の水又はメタノールを含むＤＭＳＯ中（Nagasawa K. et a1. Carbohydr. Res., Vol. 58, p. 47 (1977), Nagasawa K. et al. J. Biochem., Vol. 86, p. 1323 (1979)）で行うソルボリシスがある。ソルボリシスの反応機構は、非プロトン性の溶媒中で三酸化硫黄とアミンの複合体を用いて行う硫酸化反応の逆反応であることが知られている。この反応は、反応条件をコントロールすることによりＮ−硫酸基の選択的脱硫酸方法として用いることができる。しかし、第１級又は第２級水酸基に結合しているＯ−硫酸基を脱離させることはできなかった。さらに、この方法をオリゴ糖又は多糖に適用した場合、ＤＭＳＯ等の溶媒を反応後に除去する操作が煩雑であること、完全に脱硫酸化するには反応温度を上昇させる必要があり、このような反応条件ではグリコシド結合の切断が起こること、などの問題点があった。
他方、糖類の第１級水酸基に結合した硫酸基を特異的に脱硫酸化する方法として、Ｎ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＴＳＡ）を用いる方法がある（Matsuo, M. et al., Carbohydr. Res., Vol. 241, pp. 209-215 (1993)）。この方法をヘパリンに適用した場合、グルコサミンの６位の硫酸基は比較的特異的に除去される。しかし、酵素消化法によってその微細構造を調べた結果では、第１級水酸基に結合した硫酸基が脱離すると同時に少量のＮ−硫酸基の離脱が起こることが分かった。このため、より選択性の高い第１級水酸基結合硫酸基の除去法が求められていた。
第１級水酸基に結合している硫酸基の特異的脱離法の開発は、ヒトに対し好ましい生物活性を有する医薬品の創造を目的とした硫酸化多糖を提供するために非常に重要である。例えば、硫酸化多糖であるデキストラン硫酸、キシラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリンなどは、脂質代謝改善剤、抗血栓剤として使用されているが、人工的に硫酸基を導入したものは、導入した硫酸基の位置が特定できず、多量に硫酸基を導入するに従い組織からの出血傾向が強まる副作用が生ずることも知られている。また、天然由来の硫酸化多糖は、起源の違いにより硫酸基の位置、量がそれぞれ異なり、各硫酸化多糖の生理活性も微妙に異なる。
いろいろな生理活性蛋白質との特異的な結合能をもつヘパリンの脱硫酸化はとりわけ重要と考えられる。例えば、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）と相互作用し、その安定化と細胞増殖に対する活性を促進するヘパリンの構造は、Ｎ−硫酸基とイズロン酸の２位硫酸基を豊富に含んでおり、６位硫酸基を必要としない（Ishihara, M. et al., Glycobiology,Vol. 4, pp.451-458 (1994)）。一方、酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）やＦＧＦ−４（カポシ肉腫ＦＧＦ）との活性促進には豊富な６位硫酸基も必要である（Ishihara, M., Glycobiology, Vol. 4, pp. 817-824 (1994)）。従って、ヘパリンからグルコサミンの第１級水酸基（６位水酸基）の硫酸基を除去することにより得られた選択的６位脱硫酸化ヘパリンは、脱硫酸化を行う前のヘパリンと比べて抗凝固活性は低下するが、特異的にｂＦＧＦ活性を促進する効果を維持し、且つ、他の多くの生体内生理活性分子との相互作用から生じる望ましくない生理活性を低く抑える効果が期待できる。
繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と多糖類を使用した組成物としては、例えば、ＵＳＰ５２８８７０４号（特開平６−８０５８３号）に記載された、ＦＧＦと、抗ウィルス活性を有する硫酸化多糖及び賦形剤から成る医薬組成物、ＥＰ公開５０９５１７号に記載された、ＦＧＦと、Ｌ−イズロン酸２硫酸及びＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミンから成り、かつ８−１８糖で構成されるＦＧＦと結合性を有するオリゴ糖の少なくとも１種を含有する組成物、及び特開平２−４０３９９号に記載された、ＦＧＦムテインとグリコサミノグリカンとの複合体或いはこれらを配合した組成物が提案されている。このうち、ＵＳＰ５２８８７０４号に記載の医薬組成物において使用されている硫酸化多糖としては、脱硫酸化されたものは記載されておらず、医薬組成物は抗ウィルス活性の共働作用による増強を目的としている。また、ＥＰ公開５０９５１７号に記載された組成物は、脱硫酸化されていない特定のオリゴ糖を使用しており、特開平２−４０３９９号に記載された組成物は、天然のグリコサミノグリカンを使用しており、脱硫酸化処理が施されたものではない。
本発明者は、硫酸化多糖の第１級の水酸基に結合している硫酸基のみを脱硫酸化することにより、出血作用などの副作用が少なく、かつその硫酸化多糖本来の生物活性をより特異的に発現させることを目的として、位置選択性が高く、グリコシド結合の切断、Ｎ−硫酸基の脱離等の副反応のない脱硫酸化法を鋭意検討し、本発明に到達した。
発明の開示
本発明は、第１級水酸基が硫酸エステル化された糖を構成糖として含有する硫酸化多糖に、下記式（Ｉ）
0003929486.tif 000002
式中、Ｒ1は同一又は異なり水素原子又はハロゲン原子を示し、Ｒ2は低級アルキル基を示し、Ｒ3は同一又は異なり低級アルキル基、アリール基又はハロゲン原子を示す、
で表されるシリル化剤を反応させることにより、第１級水酸基に結合している硫酸基を選択的に脱硫酸化することを特徴とする脱硫酸化多糖の製造法である。
上記方法において、硫酸化多糖を有機塩基塩などの有機溶媒可溶性塩とし、反応を有機溶媒中で行うことが好ましい。
また、脱硫酸化反応後、更にシリル化された水酸基のシリル基を除去する処理を行うことが好ましい。
本発明は、また、下記の特性：
（１）酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いる測定によって測定した不飽和二糖組成のうち、第２図に示すΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（U,6,N）Ｓ含量が１０〜４０％、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（U,N）Ｓ含量が３０〜６０％、
（２）Ｎ−置換硫酸基を含む二糖含量が７５〜９５％、
（３）重量平均分子量（Ｍｗ）が４，０００〜３０，０００ダルトン、
（４）抗トロンビン活性が２０Ｕ／ｍｇ〜１５０Ｕ／ｍｇ、及び
（５）塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性促進効果が脱硫酸化を行なっていないヘパリンに対して８０％以上を維持する
を有することを特徴とする選択的に脱硫酸化されたヘパリンを提供する。
本発明は、更に、上記の製造法によりヘパリンを脱硫酸化して得られた脱硫酸化ヘパリンであって、前記（１）〜（５）の特性を有することを特徴とする選択的に脱硫酸化されたヘパリンを提供する。
本発明は、更に、上記脱硫酸化ヘパリンを有効成分として含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤、並びに上記脱硫酸化ヘパリン及び塩基性繊維芽細胞増殖因子を含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進された組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＭＴＳＴＦＡ量変化に伴うメチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸の脱硫酸化率を示したグラフである。
第２図は、グリコサミノグリカンを酵素消化することによって生成する各種不飽和二糖異性体の構造と略称の関係を示すものである。図中、Ａｃはアセチル基を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明の製造法によれば、硫酸化多糖の第１級水酸基（構成糖単位が五炭糖（ペントース）又は六炭糖類（ヘキソース）からなる場合は、それぞれ５位又は６位の水酸基を表す）に結合している硫酸基の完全な脱硫酸化を、又は反応条件を制御することによって部分的な脱硫酸化を、位置選択的に行うことができる。
本発明の方法が適用される硫酸化多糖は、第１級水酸基が硫酸エステル化された糖を構成糖として有する多糖（本発明においては、「多糖」をオリゴ糖及び複合多糖を包含する用語として使用する）であれば特に制限されない。このような硫酸化多糖は天然物から抽出単離されたものであっても、合成されたものであってもよい。このような硫酸化多糖としては、Ｎ−置換グリコサミンを構成糖として有するものが挙げられ、特に従来の脱硫酸化法では脱硫酸化されやすいＮ−硫酸基を有するＮ−硫酸化グリコサミンを構成糖とするものが好ましい。
本発明において使用される硫酸化多糖として、具体的には、第１級水酸基が硫酸エステル化されたＮ−置換グリコサミンを構成糖として有するもの等が挙げられる。Ｎ−置換グリコサミンを構成糖として有するものとしては、Ｎ−硫酸化もしくはＮ−アセチル化されたグルコサミンもしくはガラクトサミンを構成糖として有するグリコサミノグリカン、例えば、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等；Ｄ−ガラクトース−６硫酸を構成糖として有するフノラン；及びＬ−ガラクトース−６硫酸を構成糖として有するポルフィラン等が例示される。
本発明では通常脱硫酸化反応を有機溶媒中で行うので、硫酸化多糖は有機溶媒に可溶性の塩として反応に供される。この様な有機溶媒可溶性塩としては、硫酸化多糖の有機塩基塩が挙げられ、有機塩基としては、ピリジン、ジメチルアニリン、ジエチルアニリン等の芳香族アミン；トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリオクチルアミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−１，８−ナフタレンジアミン等の３級アミン；Ｎ−メチルピリミジン、Ｎ−エチルピリミジン、Ｎ−メチルモルホリン、Ｎ−エチルモルホリン等のＮ−アルキル複素環アミン等が挙げられる。硫酸化多糖の有機塩基塩は、遊離の硫酸化多糖を有機塩基と反応させることによって容易に得ることができる。
脱硫酸化反応は、通常無水の有機溶媒中、硫酸化多糖に前記式（Ｉ）で示されるシリル化剤を作用させることによって達成される。この反応によって、硫酸エステル化された水酸基から硫酸基が脱離するとともに、水酸基のシリル化が起こる。
反応に使用する有機溶媒は、硫酸化多糖の塩の形成に使用した前記の有機塩基（ピリジン等）が好ましいが、有機塩基の代わりに、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，４−ジオキサン等の非プロトン性溶媒を使用してもよい。
シリル化剤である式（Ｉ）で表される化合物において、Ｒ1は同一又は異なり水素原子又はフッ素等のハロゲン原子を示し、Ｒ2はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル等の炭素数１〜６の低級アルキル基を示し、Ｒ3は同一又は異なり前記と同様の低級アルキル基、フェニル等のアリール基又は塩素、フッ素等のハロゲン原子を示す。式（Ｉ）における（Ｒ3）3Ｓｉとしては、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ジメチルイソプロピルシリル、イソプロピルジメチルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリイソプロピルシリル基等が例示される。式（Ｉ）で表されるシリル化剤として最も好ましいものは、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルアセトアミド（ＭＴＭＳＡ）又はＮ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＴＳＴＦＡ）である。
反応は、室温〜１００℃において数分〜数十時間で終了する。室温より低い温度では反応が十分に進行せず、１００℃以上の温度では硫酸化多糖のグリコシド結合が開裂するおそれがある。反応条件、特に反応温度を変化させることによって脱硫酸化の程度を制御することができる。例えば、３０〜１００℃、３０分〜３時間程度、好ましくは６５〜９０℃、３０分〜２時間の反応では、存在する硫酸基の部分的な脱硫酸化を行うことができ、９０〜１００℃、２〜６時間程度の反応ではより完全な脱硫酸化を行うことができる。
シリル化剤の使用量は、硫酸化多糖の全水酸基（非置換及び置換水酸基の全て）１モルに対して３〜１００倍モル程度であり、好ましくは３〜３０倍モル程度である。シリル化剤の使用量を変化させることによっても脱硫酸化の程度を制御することができる。
かくして、硫酸化多糖の第１級水酸基に結合している硫酸基が部分的に又は完全に除去された脱硫酸化多糖を得ることができる。なお、脱硫酸化反応後、未反応のシリル化剤を非反応性とするため、また脱硫酸化多糖の水酸基に結合したシリル基を除去するためには、例えば反応液に水を加え及び／又は反応液を水に対して透析することにより目的を達成することができる。さらに、必要に応じて常法に従ってシリル基の除去反応を行うこともできる。この反応は、例えば上記の処理を行った溶液を、ｐＨ９〜９．５程度のアルカリ条件下又は加熱条件下に置くことによって行われる。
脱硫酸化多糖にアニオン性の官能基が存在する場合、それに対する対イオンを溶液中に存在させて塩を形成させることができる。例えば、シリル基除去反応後の脱硫酸化多糖の水溶液に水酸化アルカリ金属（水酸化ナトリウム等）を添加し、必要に応じて透析した後、凍結乾燥等の非加熱条件下における脱水工程に付すことによって、脱硫酸化多糖のアルカリ金属塩を得ることができる。具体的には、これらに残存する硫酸基をＮａ塩とするために、水酸化ナトリウムを加えてｐＨ９前後に調整し、透析した後、凍結乾燥して脱硫酸化多糖のナトリウム塩を得ることができる。
本発明の製造法により得られる選択的に脱硫酸化された脱硫酸化多糖の中で、特にヘパリンが好ましく、この選択的に脱硫酸化されたヘパリンは、下記の特性を有するものである。
（１）酵素分解および高速液体クロマトグラフィーを用いる測定によって測定した不飽和二糖組成のうち、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（U,6,N）Ｓ含量が１０〜４０％、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（U,N）Ｓ含量が３０〜６０％であり、
（２）Ｎ−置換硫酸基を含む二糖含量が７５〜９５％であり、
（３）重量平均分子量Ｍｗが４，０００〜３０，０００ダルトンであり、
（４）抗トロンビン活性が、２０Ｕ／ｍｇ〜１５０Ｕ／ｍｇの値を示し、
（５）塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性促進効果が、脱硫酸化を行なっていないヘパリンに対して、その８０％以上を維持するものである。
ここで、（１）のΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（U,6,N）Ｓ含量とは、後述する試験法「酵素消化による二糖分析」によって得られる値であり、ヘパリンをヘパリン分解酵素で分解した結果生ずる各種の不飽和二糖（第２図参照）のうち、ウロン酸の２位、グルコサミンのアミノ基及び６位が硫酸化されたものの含量を意味し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（U,N）Ｓ含量とは、同様にウロン酸の２位及びグルコサミンのアミノ基が硫酸化されたものの含量を意味する。好ましくは、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（U,6,N）Ｓ含量が１０〜２０％であり、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（U,N）Ｓ含量が５０〜６０％である。
（２）のＮ−置換硫酸基を含む二糖含量は、脱硫酸化を行なったヘパリン中の全構成糖単位に対するＮ−置換硫酸基を含む二糖の含量（モル％）である。
（３）の重量平均分子量は、高速ゲルろ過クロマトグラフィーにより、コンドロイチン硫酸の分子量標準品を対照にして求めた重量平均分子量（Ｍｗ）の値であり、好ましくは１０，０００〜２０，０００ダルトンである。
なお、ゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した場合、脱硫酸化される前のヘパリンの重量平均分子量は、通常、４，０００〜３０，０００ダルトンの範囲であるが、本発明の方法で脱硫酸化されたヘパリンの重量平均分子量には殆ど変化がない。
尚、実施例において脱硫酸化前後の分子量は以下の条件で測定した。
ゲルろ過（ＧＰＣ）ＨＰＬＣ
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  G-4000＋G-3000＋G-2500（東ソー(株)製）
溶媒  ：０．２Ｍ  ＮａＣｌ，１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：示差屈折計（ＲＩ）、紫外吸収（ＵＶ２３０ｎｍ）
注入量：５μｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）
（４）の抗トロンビン活性は、後記実施例記載の方法で測定した値である。脱硫酸されていないヘパリンの抗トロンビン活性を、該方法によって測定した場合、その値は１，２００Ｕ／ｍｇ〜１，６００Ｕ／ｍｇを示すが、本発明の脱硫酸化ヘパリンの抗トロンビン活性は２０Ｕ／ｍｇ〜１５０Ｕ／ｍｇ、好ましくは３０Ｕ／ｍｇ〜１００Ｕ／ｍｇの範囲であり、出血作用が低減されている。
（５）の塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性促進効果とは、後述の試験法「ｂＦＧＦとａＦＧＦ活性促進効果の測定」によって細胞増殖を測定したときの、脱硫酸化剤処理前のヘパリンによるｂＦＧＦ活性維持効果に対し、本発明の脱硫酸化ヘパリンのｂＦＧＦ活性維持効果を百分率で表わしたものであり、本発明の脱硫酸化ヘパリンは、脱硫酸化を行っていないヘパリンが有する活性促進効果を、脱硫酸化後においても、８０％〜ほぼ１００％を維持しているものである。
本発明の製造法により得られる選択的に脱硫酸化されたヘパリンは、これを有効成分として含有する塩基性繊維芽細胞増殖因子活性促進剤を提供すると共に、塩基性繊維芽細胞増殖因子と混合することにより、塩基性繊維芽細胞増殖因子の細胞増殖に対する活性が促進された組成物を提供することができる。
本発明の脱硫酸化されたヘパリンは、生体内外に投与することにより、ｂＦＧＦの活性を安定化し、例えば、床ずれ等の創傷治癒の治療又は予防に有用である。糖尿病患者はヘパラン硫酸或いはヘパリンが少なくなっている可能性があり、創傷治癒に用いられるｂＦＧＦはヘパラン硫酸またはヘパリンがないと活性を十分に発現しないと考えられるので、本発明の上記組成物は特に糖尿病患者の床ずれの治療及び予防に有用である。また、内因性のｂＦＧＦが十分に産出されている患者及び投与部位を治療する場合、必ずしも外部からｂＦＧＦを投与する必要はなく、本発明の脱硫酸化ヘパリンのみでも十分に目的を達成できるので、上記ｂＦＧＦ活性促進剤を創傷治癒等の目的に使用することができる。本発明のｂＦＧＦ活性促進剤又は上記の組成物を生体内外に投与する際の剤型及び投与経路としては、それらをそのまま、又は他の薬理学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤等と共に医薬組成物（例えば、注射剤、錠剤、カプセル剤、液剤、軟膏等）として、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、犬、ネコ等）に対し、非経口的又は経口的に安全に投与することができる。
また、本発明のｂＦＧＦ活性促進剤及び上記組成物は、出血作用等の副作用が低減されており、医薬品としての安全性が高い。
実施例
以下、実施例及び試験例により本発明を更に詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものではない。
硫酸化多糖の同定は以下の方法に基づいて行った。
試験法
１）酵素消化による二糖分析
グリコサミノグリカンの脱硫酸化後の硫酸基の位置の分析は、次のようにして行うことができる。すなわち、脱硫酸化反応の処理前後のグリコサミノグリカンを酵素で消化し、生成した不飽和二糖を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。（新生化学実験講座３，糖質II(1991) p49〜62に記載の「２・８グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組合せた構造解析」参照）。
ヘパリン分解酵素による消化
新生化学実験講座３、糖質II p 54-59（東京化学同人刊、1991）の方法により、ヘパリン０．１mgを２mM酢酸カルシウムを含む２０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２２０μｌに溶解して、２０mUのヘパリナーゼ、２０mUのヘパリチナーゼＩ及びIIを加えて、３７℃で２時間反応させた。なお、脱硫酸化処理によってアミノ基に結合した硫酸基が脱離した場合、このような脱硫酸化ヘパリンにはヘパリン分解酵素類が作用しなくなるので、酵素反応に先立って予めアミノ基をアセチル化する必要がある。Ｎ−アセチル化は炭酸ナトリウムまたはダウエックス（Dowex-1 (HCO3)型）イオン交換樹脂を含む水溶液中、無水酢酸によって定量的に進行する（「糖鎖工学」、（株）産業調査会、バイオテクノロジー情報センター発行、324頁参照）。
ＨＰＬＣによる分析
ヘパリン分解酵素消化を行った後の溶液５０μｌを、ＨＰＬＣ（医理化、モデル 852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（Dionex社、CarboPac PA-1 カラム４．０mm×２５０mm）を使用し、２３２nmでの吸光度を測定した。流速１ml／分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（５０mM→２．５Ｍ）を用いる方法に準拠した（Kariya, et al. Comp. Biochem. Physiol. Vol. 103B, pp. 473-479(1992)）。
２）ゲルろ過
硫酸化多糖の３％溶液１０μｌをＨＰＬＣによるゲルろ過で分析した。カラムはＴＳＫgel-（G4000+G3000+G2500）PWXL（東ソー、7.8mm×30cm）を用い、溶離液に０．２Ｍ塩化ナトリウムを使用して、１．０ml／分の流速で展開した。硫酸化多糖の検出には示差屈折計（島津，AID-2A）を用いた。
３）ｂＦＧＦとａＦＧＦ活性促進効果の測定
１０％の牛血清を含んだＤＭＥＭ培地（Life Technologies社製）で継代維持されたＡ３１細胞（BALB/c 3T3）を、１μｌ／mlのテストサンプルを含む１００μｌのＩＴＳ+（Collaborative Research社製）、２０mMＮａＣｌＯ3、２ng／mlヒト組換ｂＦＧＦ（ｈｒｂＦＧＦ）（生化学工業(株)製）或いは５ng/mlヒト組換ｂＦＧＦ（ｈｒｂＦＧＦ）（生化学工業(株)製）を含んだＳＯ42-フリーＤＭＥＭと共に９６−マルチウェルカルチャープレートにプレートした。３日間の培養後、２０μｌのセルタイター９６ＡＱノンラジオアクティブ細胞増殖アッセイ溶液（生化学工業(株)製）を各ウェルに添加し、３７℃で２時間培養後、ＯＤ490を測定することにより、それぞれのウェルの細胞増殖を定量した。表２において、ｂＦＧＦとａＦＧＦのそれぞれにおいて、１μｌ／mlの脱硫酸化していないヘパリンを加えた時の細胞増殖を１００とし、加えない時を０とした。
４）抗トロンビン活性の測定
１５０mM食塩、１０mM塩化カルシウム及び０．１％牛血清アルブミンを含む２０mMトリス緩衝液（ｐＨ７．４）３５０μｌと牛アンチトロンビンIII溶液（１Ｕ／ml同緩衝液）１００μｌ並びにヘパリン試料の倍数希釈水溶液１００μｌの３液を冷却した状態で混合し、３７℃で２分間保温した。この溶液に牛トロンビン溶液（５０mU／ml蒸留水）５０μｌを加え、３７℃で５分間保温後、基質溶液（Boc-Val-Pro-Arg-MCA、７０μＭ水溶液）１００μｌを加えて撹拌し、３７℃で３分間インキュベートし、３０％酢酸３００μｌを加えて反応を停止した。反応液の蛍光強度を励起波長３５０nm、蛍光波長４４４nmにて測定した。上記反応液組成の試料の代わりに蒸留水を用いて測定したブランク１と、基質と緩衝液のみの反応混液のプランク２を同様に処理し、蛍光度を求めた。
トロンビン活性阻害率を次式から求め、試料濃度に対するそれぞれの阻害率を片対数グラフにプロットし、５０％阻害率（ＩＣ50）を求めた。その結果を表２に示す。
トロンビン活性阻害率（％）＝１００−（ΔＦｓ／ΔＦｂ）ｘ１００
ただし、ΔＦｓ：試料の蛍光強度−ブランク１の蛍光強度
ΔＦｂ：ブランク２の蛍光強度−ブランク１の蛍光強度
試験例
メチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸アンモニウム塩約２mg／３mlの水溶液に、アンバーライトIR-120(H+)型樹脂５mlを加えて、遊離の硫酸エステル型に変換させた。樹脂を除去した後、ピリジン２mlを加え、ピリジニウム塩を形成させた。残余のピリジンを減圧下で留去し、残渣を凍結乾燥することにより、乾燥メチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム塩を調製した。この試料を各０．２mgづつ小分けし、これに乾燥ピリジン約０．０５mlと内部標準としてメチル−α−グルコシドを加えて、メチル−α−ガラクトピラノシド−６硫酸ピリジニウム塩の全水酸基モル量（[-OH]＋[-O-SO3-]）に対するＭＴＳＴＦＡのモル量が０〜２０倍量までの異なる反応系を用意した。各系にＭＴＳＴＦＡを加えた後、８０℃で約２時間加熱反応させた。完全にＯ−トリメチルシリル化してガスクロマトグラフィー分析を行うために、トリメチルシリルイミダゾールを反応液に加えて、８０℃で２０分間加熱した。各系の反応混合物中のトリメチルシリル化メチル−α−ガラクトピラノシドを直接ガスクロマトグラフィ−で測定することにより、脱硫酸量を算出して第１図に示した。第１図から、硫酸化単糖の場合は、上記反応条件においてＭＴＳＴＦＡを糖の全水酸基モル量に対し、約１３倍モル量以上使用すれば、第１級水酸基の硫酸エステルをほぼ完全に脱硫酸化できることが分かる。
実施例
ヘパリンのナトリウム塩（重量平均分子量：１２，２００ダルトン）２００mgをアンバーライトIR-120（H+型）カラム（１×10cm）にかけ、溶出液に過剰のピリジンを加えてpH８に中和し、凍結乾燥してヘパリンのピリジニウム塩を調製した。このヘパリンのピリジニウム塩を脱水したピリジン２０mlに溶解して反応試料とした。ヘパリンの糖骨格の２０倍モル量（約４ml）のＭＴＳＴＦＡを加え、６５、７５、８５、９０及び９５℃で２時間攪拌した。反応終了後、２０mlの水を加えて未反応のＭＴＳＴＦＡを加水非反応性とすることにより反応を停止させ、ミリポア限外ろ過膜を用いて透析してトリメチルシリル化したヘパリンの脱硫酸化処理物溶液を得た。
次にトリメチルシリル基を加水分解除去するため、透析内液を１００℃で３０分から１時間（溶液が透明になるまで）加熱沸騰させた。水酸化ナトリウムを加えてｐＨ９〜９．５に調整した後、透析した。透析内液を凍結乾燥して、ヘパリンの脱硫酸化処理物１３０mg相当のナトリウム塩を得た。
比較例
対照実験として、実施例に準じ、ＭＴＳＴＦＡの代わりにＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）アセトアミド（ＢＴＳＡ）を用いて９０℃で反応させた。
ヘパリンの上記シリル化剤処理前後の酵素消化による二糖分析値を表１に示す。
上記のヘパリンの各脱硫酸化処理物を炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ６．５）中、４℃において無水酢酸とメタノールを用いて２時間反応させ、アセチル化した。この試料を上記試験法記載の分析方法に従ってヘパリン分解酵素を用いて分解し、生成した不飽和二糖の各種異性体（第２図）をＨＰＬＣで分画し、その組成比を分析した結果を表１に示す。
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表１は、ＢＴＳＡ及びＭＴＳＴＦＡのいずれの処理によっても、６位硫酸基の脱離によってヘパリンの主構成成分二糖由来のΔＤｉＨＳ−Ｔｒｉ（U,6,N）が著しく低下し、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（U,N）Sが増加したことを示している。しかし、ＢＴＳＡ処理では、さらにＮ−硫酸基の脱離が生じたため、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（U,N）SとΔＤｉＨＳ−Ｔｒｉ（U,6,N）Ｓとの合計量の減少とΔＤｉＨＳ−ＵＳの増加を引き起こした。すなわち、ＭＴＳＴＦＡ処理ではヘパリンの第１級水酸基の硫酸基をＢＴＳＡ処理と同程度除去することが可能であり、さらにＢＴＳＡ処理によりＮ−硫酸基の減少を抑制して６位硫酸基に、より選択的に作用したことが分かる。
さらに、ＭＴＳＴＦＡ処理前後のヘパリンについて、ゲルろ過により分子量の変化を調べた結果、分子量の変化は殆んど認められなかった。
以上のことから、ＭＴＳＴＦＡによる脱硫酸化反応は、第１級水酸基に結合している硫酸基に特異的に働き、他の位置の硫酸基及びグリコシド結合には影響を与えないことが明らかである。
また、ＭＴＳＴＦＡを用いて、６位硫酸基を６５℃、７５℃、８５℃、９０℃及び９５℃で、２時間の反応により段階的に脱硫酸化した…（中略）…活性促進効果を調べた。その結果を表２に示す。
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表２に示したように、トロンビン阻害活性は、６５℃での部分的６位脱硫酸化で急激な減少を示すのに対し、ｂＦＧＦ活性促進効果は９０℃での脱硫酸化まで維持されている。一方、ａＦＧＦ活性促進効果は６位硫酸基の脱硫酸化と共にゆるやかな減少を示した。特に、８５〜９０℃の反応温度で６位硫酸基の脱硫酸化を行なうことにより、抗凝固活性やａＦＧＦＧ活性促進効果等を抑えた特異的なｂＦＧＦ活性促進効果を維持する選択的６位脱硫酸化ヘパリンが得られた。
尚、重量平均分子量４，０００〜３０，０００の範囲のヘパリンを前記と同様に、本発明の方法で脱硫酸化した場合、表１と同様に６位が特異的に脱硫酸化され、生物学的活性も表２と同様の傾向を示し、脱硫酸化処理前後での分子量の変化もほとんどない。
産業上の利用可能性
本発明によれば、硫酸化多糖の糖骨格に結合している性質の異なる硫酸基を、第１級水酸基の硫酸基と第２級水酸基の硫酸基及びＮ−硫酸基との違いを認識して、第１級水酸基の硫酸基のみを特異的に脱硫酸化することにより、従来知られていない位置特定硫酸エステルを有する硫酸化多糖を製造することができる。
特に、ヘパリンを本発明方法によって脱硫酸化して得られる脱硫酸化処理物はヘパリンの非特異的な蛋白質への結合が抑制され、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）との相互作用による特異的生理活性を示すヘパリンである。更に、ｂＦＧＦとの併用、或いは単独で、出血傾向等の副作用が少ない医薬、例えば、創傷、火傷、皮膚潰瘍治療薬、骨粗しょう症治療薬、骨折治療薬、消化器潰瘍治療薬、心筋梗塞予後改善薬等幅広い医薬品への応用が可能である。
また、本発明の脱硫酸化法は、ｂＦＧＦ以外の他の生理活性分子に対しても、幅広い応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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