(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、または濃度範囲0.0001〜0.2％のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のデオキシコール酸、および濃度範囲0.005〜0.1％のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはそれらの塩から選ばれる物質の１種または２種以上を用いることを特徴とする感作金属コロイド試薬溶液の安定化方法。
【請求項２】
濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンの１種または２種以上と、濃度範囲0.0001〜0.2％のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のデオキシコール酸および濃度範囲0.005〜0.1％のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはそれらの塩の１種または２種以上とを組み合わせて用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
金属コロイドが金コロイドである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
金属コロイドの感作が抗体による感作である請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
抗体がヒトヘモグロビンに対する抗体である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、または濃度範囲0.0001〜0.2％のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のデオキシコール酸、および濃度範囲0.005〜0.1％のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはそれらの塩から選ばれる物質の１種または２種以上を含有することを特徴とする安定な感作金属コロイド試薬含有溶液。
【請求項７】
濃度範囲が0.018〜4.5mMの範囲の、カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンの１種または２種以上と、濃度範囲0.0001〜0.2％のデキストラン硫酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のコール酸、濃度範囲0.0001〜0.5％のデオキシコール酸、および濃度範囲0.005〜0.1％のキサンツレン酸から選ばれる酸もしくはその塩の１種または２種以上とを含有することを特徴とする請求項６に記載の溶液。
【請求項８】
金属コロイドが金コロイドである請求項６または７に記載の溶液。
【請求項９】
金属コロイドの感作が抗体による感作である請求項６、７または８に記載の溶液。
【請求項１０】
抗体がヒトヘモグロビンに対する抗体である請求項９に記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は感作金属コロイド試薬の溶液中での安定化に関するものである。特に、主として臨床検査の分野で、抗原抗体反応を利用した免疫学的測定に用いられる感作金属コロイド試薬の溶液中での安定化法とその含有組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定において金属コロイドが広く用いられている。例えば、抗体を感作した金属コロイドを抗原と反応させて、抗原・抗体−金属コロイド複合体を形成させ、この複合体を抗体が固定化された判定紙（膜）上で泳動させると、固定化された抗体に複合体が捕捉され、その結果、金属コロイドによる着色が生じる。この着色を判定することにより抗原の有無を調べるイムノクロマト法がある。また、溶液中で抗体感作金コロイドと抗原を反応させると、金コロイドが凝集することによって、色調が変化する。この色調を吸光度変化として捉え測定することにより抗原の有無または量を調べるという凝集比色法がある。これらの測定方法においては、測定対象に特異的に結合する物質が金属コロイドに感作された感作金属コロイドが利用され、金属コロイドとしては金コロイドが用いられる場合が多い。
【０００３】
金属コロイドを感作処理後に懸濁させる溶液の組成について、多くの報告がある。特開平９−５３２７の０.０５％ポリエチレングリコール（分子量約２００００）／ＰＢＳ溶液（実施例１）、特開平２−１４１６６５の０.０５Ｍリン酸ナトリウム−０.１５Ｍ食塩−０.０５％カーボワックス２０Ｍ（ｐＨ７.２）（実施例３、ｐ４）、特開平８−２７８３０５の１０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.１）、０.３Ｍ  Ｄ−マンニトール、０.０５％ポリエチレングリコール（分子量２００００）、０.１％牛血清アルブミン(ＢＳＡ)（実施例：金コロイド標識抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体の調製、ｐ３右カラム、４１−４７行）、特公平７−４６１０７の２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８.２）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＢＳＡ（実施例５、ｐ１０右カラム、４２−４３行）、特開平７−３１８５６０の０.１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７.６）、０.３％ＢＳＡ、０.２５％ポリエチレングリコール（６０００）、４％シュークロース、０.１％アジ化ナトリウム（実施例、ｐ７右カラム、１１−１５行）、特開平６−９４７１８の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６.４）、１％ＢＳＡ、０.０５％アジ化ナトリウム（実施例１、ｐ５左カラム、９−１３行）、等がある。また、Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ.  Ｒｅｓ.  Ｃｏｍｍｕｎ.  Ｖｏｌ.１２１、Ｎｏ.１（１９８４）ｐ２８４−２８９のｐ２８５では、感作金コロイドをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）／１％ＢＳＡ／０.０２％アジ化ナトリウム溶液中に懸濁したものは、４℃保存で４週間は反応性の低下がなかったと記載されている。
【０００４】
また、金コロイド免疫測定時にナトリウム、カリウム、リチウム、マグネシウムの各塩を反応液中に存在させる方法が開示されている（特開平９−５３２６）が、これらの塩の添加は感作金コロイド試薬の安定化を目的とするものではなく、免疫反応の判定を容易にするためのものである。さらに、感作する前の金属コロイドの凝集防止方法（特開平９−７０５２７）として、無機イオンを含まず、かつ有機系である緩衝剤（例としてトリスヒドロキシメチルアミノメタン、Ｎ−トリスヒドロキシメチル−２−アミノメタンスルホン酸等）を組成成分として用いる方法が開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように感作処理後の金属コロイドを懸濁させる溶液には、緩衝剤、ＢＳＡ、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウムの使用は一般的である。しかしながら、これら物質が添加された感作金属コロイド試薬溶液では経時的に反応性の低下が生じるので、臨床検査用試薬として、長期使用に耐えられる安定な試薬とすることが望まれる。よって、本発明の目的は、溶液中での感作金属コロイド試薬を安定化する方法、長期保存可能な感作金属コロイド試薬溶液を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明はカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸から選ばれる酸またはその塩の１種または２種以上を組成成分として用いることを特徴とする、感作金属コロイド試薬溶液を安定化する方法および安定な感作金属コロイド試薬含有組成物を提供するものである。
また、本発明はカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンの１種または２種以上と、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸から選ばれる酸またはその塩の１種または２種以上とを組み合わせて、組成成分として用いることを特徴とする、感作金属コロイド試薬溶液をさらに安定化する方法およびさらに安定な感作金属コロイド試薬含有組成物を提供するものである。
本発明によれば、感作金属コロイド試薬溶液の反応性を長期に維持することができ、公知の方法に従ってヘモグロビンの測定試薬として好適に使用される。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明における金属コロイドとしては、金、銀、セレン等のコロイドがあるが、金コロイドが一般的に利用され易く、好ましい。
金属コロイドを感作するものとしては、抗体や抗原の他に、測定対象に特異的に結合するものであれば利用可能である。
本発明で安定化剤として用いられるカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオンは、通常塩の形で用いられ、それらの塩としては、溶液中でそれらのイオンを形成する塩であればいずれも利用できる。例えばカルシウムイオンには塩化カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム等の塩、マグネシウムイオンには塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム等の塩、バリウムイオンには塩化バリウム、フッ化バリウム等の塩が含まれる。これらの金属イオンは０.０１８−４.５ｍＭの濃度範囲、好ましくは１ｍＭ付近の濃度で配合される。それらを塩の濃度で示せば、例えばカルシウムイオンとしての塩化カルシウムの濃度は０.０００２−０.０５％（０.０１８−４.５ｍＭ）の範囲で、０.０１％（０.９ｍＭ）付近が好ましい。
他の安定化剤であるデキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸およびキサンツレン酸は遊離酸としてまたはそれらの塩として用いられ、例えばデキストラン硫酸はナトリウム、カリウム等のアルカリ金属塩等が利用でき、その用量は０.０００１−０.２％の濃度範囲である。コール酸およびデオキシコール酸はそのものまたはナトリウム塩等のアルカリ金属塩等が利用でき、その用量は０.０００１−０.５％の範囲である。またキサンツレン酸も、そのものまたはアルカリ金属塩として利用でき、その用量は０.００５−０.１％の範囲である。
本発明における感作金属コロイド試薬液には、従来用いられている緩衝剤、糖および糖アルコール、アルブミン、ポリエチレングリコール、塩化ナトリウム、防腐剤、その他の物質が適宜含まれる。
【０００８】
緩衝剤としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス塩酸緩衝液、２−[４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジニル]エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル)−２−アミノエタンスルフォン酸（ＢＥＳ）、２−モルフォリノエタンスルフォン酸（ＭＥＳ）、３−[Ｎ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル)アミノ]−２−ヒドロキシプロパンスルフォン酸（ＤＩＰＳＯ）、２−ヒドロキシ−Ｎ−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰＳＯ）等のグッド緩衝液が挙げられ、ｐＨは５−９が好ましく、濃度は１−１００ｍＭが好ましい。糖および糖アルコールとしては、グルコ−ス、マンノース、サッカロース、ラクトース、マルトース、マンニトール、ソルビトール等が挙げられ、濃度としては０.０１−１０％が好ましい。アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく、濃度としては０.００１−１％が好ましい。防腐剤としてはアジ化ナトリウムが好ましく、濃度としては０.０１−０.５％が好ましい。その他の添加物質として、ツィーン２０、ポリエチレングリコール（分子量１、０００−５００、０００）、ポリエチレングリコールラウリルエーテル、５−ブロモサルチル酸、サリチル酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベンゼンスルホン酸ナトリウム、フェノール、チモール等が挙げられる。
【０００９】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１
ヒトヘモグロビンを緩衝液Ａ（０.０５％ＢＳＡ、０.１％アスパラギン、０.９％塩化ナトリウム、１.８％ポリエチレングリコール、０.０５％アジ化ナトリウムを含む３０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液ｐＨ５.７）に溶解して、ヘモグロビン濃度０、５０、１００および２００ｎｇ／ｍｌの溶液を調製し、小分け分注し−４０℃の冷凍庫に凍結保存したものを融解し、検体として使用する。
抗ヘモグロビン抗体を感作した金コロイド試薬（メイチェック  ヘモプレート（オート）（日本商事（株）製）の金コロイド試薬凍結乾燥品（６０ｍｌ用）を０.２％ＢＳＡ、６％マンニトール、０.１％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液Ｂ(１５ｍｌ)で溶解する（金コロイド液）。各種の安定化剤（後記表１および表２を参照）を蒸留水に溶解し、試料溶液とする。ただし、酸の物質については水酸化ナトリウム溶液を添加し中性に調整する。前記、金コロイド液と試料溶液を１：１に混合し、金コロイド試薬溶液とする。
金コロイド試薬溶液の反応性は金コロイド凝集比色法により以下のように測定する。マイクロプレートに検体(２５μｌ)、緩衝液Ａ(５０μｌ)、金コロイド試薬溶液(１００μｌ)を添加後、マイクロプレートを撹拌し、撹拌後約３０秒後とその６分後の吸光度（主波長５４０ｎｍ、副波長７００ｎｍ）をプレートリーダーを用いて測定する。初期吸光度と６分後の吸光度の差（変化）を検体（ヘモグロビン）に対する金コロイド試薬溶液の反応性の指標とする。金コロイド試薬溶液の調製当日と３７℃にて３日保存後に検体を測定し、調製当日の金コロイド試薬溶液の反応性を１００％として、３７℃にて３日保存後の残存反応率（％）を求める。その結果を表１に示す。
【００１０】
【表１】
0003993670.tif 000002
【００１１】
表１の安定化剤の濃度は金コロイド試薬溶液中の濃度である。対照（蒸留水添加）に比べ、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、フッ化バリウム、デキストラン硫酸カリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、キサンツレン酸の添加で、金コロイド試薬溶液の反応の低下が抑制され、金コロイド試薬溶液の安定化効果が認められる。
【００１２】
実施例２
実施例１と同様の方法で、金コロイド試薬溶液の調製当日と３７℃にて３、６日保存後に検体を測定し、安定化剤の単独および組み合わせの添加による金コロイド試薬溶液の安定化効果について検討する。その結果を表２に示す。
【００１３】
【表２】
0003993670.tif 000003
【００１４】
表２の試験結果から明らかなように、塩化バリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、デキストラン硫酸カリウム、コール酸ナトリウム、キサンツレン酸各単独とそれらの組み合わせの添加それぞれに金コロイド試薬溶液の安定化効果が認められる。
【００１５】
【発明の効果】
感作金属コロイド試薬溶液の反応性の低下をカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよびバリウムイオンから選ばれる金属イオン、デキストラン硫酸、コール酸、デオキシコール酸、キサンツレン酸から選ばれる酸またはその塩の１種または２種以上を用いることにより抑制することができ、感作金属コロイド試薬の安定化が図れる。従って、本発明によれば、より長期にわたり感作金属コロイド試薬溶液の安定化が可能となり、感作金属コロイド試薬溶液を用いた抗原抗体反応等の測定を行う臨床検査分野において、使用期間の延長や測定精度の向上に寄与することができる。