(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリー電気泳動により光学異性体を光学分割する方法において、キャピラリーとして、その内部に、多糖あるいはその誘導体を担体に担持させた充填剤を充填したものを用いることを特徴とする新規な光学異性体の光学分割方法であり、
前記多糖あるいはその誘導体が、セルロース、アミロースあるいはそのエステル誘導体又はカルバメート誘導体であることを特徴とする光学分割方法。
【請求項２】
充填剤が、水溶性又は非水溶性の多糖あるいはその誘導体を担体に物理的あるいは化学結合によって担持させた充填剤であることを特徴とする請求項１記載の光学分割方法。
【請求項３】
担体がシリカゲルである請求項１又は２記載の光学分割方法。
【請求項４】
キャピラリー電気泳動が、溶融シリカ製キャピラリー内に上記充填剤を充填したキャピラリーエレクトロクロマトグラフィーであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の光学分割方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は光学異性体の光学分割方法に関し、詳しくは、キャピラリー電気泳動法による光学異性体の光学分割方法に関するものであり、特に医薬品、食品、農薬、香料の分析において、高感度、微量、迅速分析を可能とする優れた光学異性体分析技術を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
多くの有機化合物には光学異性体が存在する。こういった光学異性体の物理的、化学的性質、例えば沸点、融点、溶解度といった物性は全く同一であるが、これら光学異性体間で生理活性にしばしば差があることが広く知られている。従って、特に医薬品の分野においては、光学異性体でその薬効、毒性の点で顕著な差が見られる場合もある。
【０００３】
このため、厚生省は1985年度版医薬品製造指針において、「当該薬物がラセミ体である場合には、それぞれの異性体について、吸収、分布、代謝、排泄動態を検討しておくことが望ましい。」と記載している。
【０００４】
このような社会的な要請のもと、光学異性体の片方のみを製造する手段が広く検討されているが、これと同時に光学異性体を分析する技術も進歩した。先に述べたように光学異性体の物理的、化学的性質、例えば沸点、融点、溶解度といった物性は全く同一であるために、通常の分離手段では分析が行えない。
【０００５】
そこでより広範種類の光学異性体の分離、分析手段として高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による光学分割法が進展した。ここで用いているＨＰＬＣ用カラムの固定相としては、不斉識別剤そのもの、あるいは不斉識別剤を適当な担体上に担持させたキラル固定相が使用されており、不斉識別剤としては例えば、光学活性ポリメタクリル酸トリフェニルメチル（特開昭５７−１５０４３２号公報参照）、セルロース、アミロース誘導体(Y.Okamoto,M.Kawashima and K.Hatada,J.Am,Chem.Soc.,106,5337,1984) 、オボムコイド（特開昭６３−３０７８２９号）等が開発されている。これらＨＰＬＣ用キラル固定相の中でも、セルロース、アミロース誘導体をシリカゲル上に担持させた光学分割用カラムは、極めて幅広い化合物に対し、高い不斉識別能を有することが知られている。
【０００６】
しかしながらこれらＨＰＬＣ法を上述した微量分析である代謝研究等の分野で用いるには、分離の際にある程度の量（約0.1 μｇ以上）の試料が必要であること、分離に時間がかかること、移動相として用いる溶剤量が多いこと、さらに単位メートル当たりの理論段数が不十分であること等の欠点を持っていた。
【０００７】
上述の欠点を解決するために、近年ＨＰＬＣ法とは分離手法の異なるキャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）による光学分割技術の研究が進められている。キャピラリー電気泳動法とは、キャピラリーと呼ばれる細管を用い、両端に電圧を印加することで、電荷、サイズなどの違いにより試料を分離する技術である。従来ＣＥ法を用いた光学分割法は泳動液中にシクロデキストリンやその誘導体を添加して行うＣＺＥ（キャピラリーゾーン電気泳動）法、ＭＥＫＣ（ミセル動電クロマト）法が良く知られている(Journal of Chromatography A, 659, (1994)449) 。またシクロデキストリン以外にもヘパリン(Anal,Chem., 88(1984), 3064)、硫酸化多糖類であるガラクトサミン、グルクロン酸、フコース（特開平９−１４３２０２号）、デキストラン等(Journal of Chromatography A, 735, (1996)345) さらに抗生物質であるバンコマイシン、テイコプラミンを泳動液に添加した例(Chirality, 8, 88-107(1996))が報告されている。
【０００８】
上記手法は、いずれも泳動液中に高価な不斉識別試薬を添加する手法である。このため水溶性でなければ、優秀な不斉識別能力を有する不斉識別剤であってもＣＥ法に適用することは出来ない。また不斉識別剤それ自体にＵＶ吸収がある場合には分析感度が低下し、ＣＥ法の特徴である高感度分析が達成できない場合がある。さらにＨＰＬＣ法で十分に得られた不斉識別に関する知見が全く活かされないという欠点があった。
【０００９】
従って、本発明の課題は、従来のＣＥ法の欠点を改良し、高感度、微量、かつ迅速な分析を可能とした光学異性体の光学分割方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、特定の充填剤を充填したキャピラリーを用いたキャピラリー電気泳動法により上記課題が解決できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、キャピラリー電気泳動により光学異性体を光学分割する方法において、キャピラリーとして、その内部に、多糖あるいはその誘導体を担体に担持させた充填剤を充填したものを用いることを特徴とする新規な光学異性体の光学分割方法を提供するものである。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１３】
本発明においては、キャピラリー電気泳動のキャピラリーとしてその内部に、多糖あるいはその誘導体を担体に担持させた充填剤を充填したものを用いる。ここで用いられる多糖とは、合成多糖、天然多糖及び天然物変成多糖のいずれかを問わず、光学活性であればいかなるものでもよいが、特に結合様式の規則性の高いものが望ましい。例示すればβ−１，４−グルカン（セルロース）、α−１，４−グルカン（アミロース、アミロペクチン）、α−１，６−グルカン（デキストラン）、β−１，６−グルカン（プスツラン）、β−１，３−グルカン（例えばカードラン、シゾフィラン等）、α−１，３−グルカン、β−１，２−グルカン（Crown Gall多糖）、β−１，４−ガラクタン、β−１，４−マンナン、α−１，６−マンナン、β−１，２−フラクタン（イヌリン）、β−２，６−フラクタン（レバン）、β−１，４−キシラン、β−１，３−キシラン、β−１，４−キトサン、α−１，４−Ｎ−アセチルキトサン（キチン）、プルラン、アガロース、アルギン酸等であり、アミロースを含有する澱粉も含まれる。これらの中では、高純度の多糖を容易に入手できるセルロース、アミロース、β−１，４−キシラン、β−１，４−キトサン、キチン、β−１，４−マンナン、イヌリン、カードラン等が好ましく、特にセルロース、アミロースが好ましい。
【００１４】
これら多糖の数平均重合度（１分子中に含まれるピラノースあるいはフラノース環の平均数）は６以上、好ましくは10以上であり、特に上限はないが、500 以下であることが取り扱いの容易さの点で望ましい。
【００１５】
これら多糖の誘導体としては、脂肪族エステル、芳香族エステル、脂肪族あるいは芳香族エーテル、硝酸エステル、脂肪族あるいは芳香族カルバメート等の誘導体が挙げられ、特にはエステル誘導体、カルバメート誘導体が好ましい。
【００１６】
また上記多糖あるいはその誘導体を担持させる担体としては、多孔質有機担体または多孔質無機担体が挙げられ、好ましくは多孔質無機担体である。
多孔質有機担体として適当なものは、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート等からなる高分子物質であり、多孔質無機担体として適当なものは、シリカ、アルミナ、マグネシア、ガラス、カオリン、酸化チタン、ケイ酸塩、ヒドロキシアパタイトなどである。特に好ましい担体はシリカゲルであり、シリカゲルの粒径は0.1 μｍから10mm、好ましくは１μｍ〜300 μｍであり、平均孔径は10Å（オングストローム）から100 μｍ、好ましくは50Å〜50000 Åである。シリカゲルの表面は残存シラノールの影響を排除するために表面処理が施されていることが望ましいが、全く表面処理が施されていなくても問題ない。
本発明において、多糖あるいはその誘導体を担体に担持する方法は特に限定されず、物理的あるいは化学結合によって担持させることができる。
【００１７】
本発明において、上記多糖あるいはその誘導体を担体に担持させた充填剤をキャピラリーに充填する方法としては、通常のＨＰＬＣ用送液ポンプを使用し、スラリー法によって充填する方法が挙げられる。
【００１８】
本発明のキャピラリー電気泳動に使用するキャピラリーは通常のキャピラリー電気泳動に使用されるものであれば、特に限定されない。キャピラリーの内径は１〜1000μｍが好ましく、10〜200 μｍが更に好ましい。またキャピラリーの長さはいかなる長さでも良いが、20〜100 cmのものが好ましく用いられる。
【００１９】
キャピラリーの材質は電気泳動分析の使用に供されるものであれば、特に限定されないが、ガラスないしはシリカを含む材質が望ましく、現在電気泳動で多用されている溶融シリカ製のキャピラリーが最も好ましい。
【００２０】
本発明のキャピラリー電気泳動に用いられる泳動液は通常のキャピラリー電気泳動に使用される泳動液であればよく、例えば、リン酸１水素２ナトリウム水溶液／アセトニトリル混合溶液、リン酸緩衝液／アセトニトリル混合溶液等が挙げられる。
【００２１】
本発明の方法においては、まず、多糖あるいはその誘導体を担体に担持させた充填剤を内部に充填したキャピラリーに光学分割しようとする光学異性体混合物を注入する。光学異性体混合物の注入方法は、キャピラリー電気泳動において通常使用される方法であればいずれでもよく、例えば重力、電気、加圧、減圧注入法等が挙げられる。次にキャピラリーに高電圧を印加して電気泳動を行い、光学異性体混合物を光学分割する。分割後の光学異性体の検出はキャピラリー電気泳動法で通常使用されている装置を用いて行なうことができ、例えばＵＶ吸収、蛍光、レーザー等を用いた検出法が挙げられる。
【００２２】
本発明におけるキャピラリー電気泳動は、キャピラリー内に充填された、多糖あるいはその誘導体を担体に担持させた充填剤が分離媒体として作用するので、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィーの分野に属するものである。
【００２３】
本発明においては、キャピラリー内に、多糖あるいはその誘導体を担体に担持させた充填剤を充填したキャピラリーを用い、電気泳動法によって光学分割を行うことにより、不斉識別剤の水溶性、非水溶性を問わずＣＥ法に適用可能となった。また不斉識別剤を泳動液に添加しないため、ＵＶ吸収を妨げることなく高感度分析が実施可能である。さらに分離モードが比較的ＨＰＬＣ法に近いため、優れた不斉識別剤であるＨＰＬＣ用多糖誘導体系キラル固定相の知見を活かし易いという利点がある。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を更に詳細に記載するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２５】
製造例１
〔セルロース  トリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）をシリカゲル上に担持させた充填剤を充填したキャピラリーの作製法〕
▲１▼  シリカゲル表面処理
多孔質シリカゲル（ダイソー（株）製、粒径；５μｍ、細孔径；1000Å）を特開平７−３０９７８４号、同８−５９７０２号公報記載の方法により表面処理を行った。
即ち、多孔質シリカゲル20ｇを十分に脱水乾燥した後、窒素雰囲気下、トルエン還流中で、２−フェニルエチルジメチルクロロシラン10mlと20時間反応させた。グラスフィルターで濾取し、トルエン、塩化メチレンで洗浄した後、乾燥して、シリカゲルの表面処理を行った。
【００２６】
▲２▼  セルロース  トリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）の合成
窒素雰囲気下、セルロース（メルク社、ミクロクリスタリンアビセル）10ｇを乾燥ピリジン100ml中、３，５−ジメチルフェニルイソシアネート42ｇと100℃、48時間加熱攪拌を行った後、メタノール２リットル中に注ぎ込んだ。析出した固体をグラスフィルターで濾取し、メタノールにて数回の洗浄後、真空乾燥（80℃、５時間）を行った。
【００２７】
▲３▼  セルロース  トリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）のシリカゲルへの担持
上記▲２▼で得たセルロース誘導体2.5 ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）20mlに溶解し、このポリマードープを均一に▲１▼のシリカゲルに塗布した。塗布後、十分にセルロース誘導体がシリカゲル細孔にしみ込むのを待って、ＴＨＦを除去した。得られたセルロース誘導体担持シリカゲルをメタノールで洗浄後、真空乾燥（80℃／２時間）を行った。
【００２８】
▲４▼  セルロース誘導体担持シリカゲルのキャピラリーへの充填
▲３▼で得たシリカゲルに担持したにセルロース誘導体からなる充填剤を２−プロパノールに分散後、アセトニトリルを加圧溶媒としてＨＰＬＣ送液ポンプを用い、溶融シリカキャピラリー（全長33cm、内径100 μｍ、有効長23cm）に加圧（420 bar)充填した。
【００２９】
実施例１〜８
製造例１で得られたセルロース誘導体をシリカゲル上に担持させた充填剤を充填したキャピラリー（長さ33cm、有効長23cm、内径100 μｍ）を用い、Hewlett-Packerd 社製ＨＰ3Dキャピラリー電気泳動システムを使用して、下記に示す８種類のラセミ化合物を下記泳動条件で光学分割した。結果を表１に示す。
【００３０】
【化１】
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【００３１】
＜泳動条件＞
泳動液：10mMリン酸１水素２ナトリウム水溶液／アセトニトリル混合溶液あるいは50mMリン酸緩衝液／アセトニトリル混合溶液
印加電圧：25kV
泳動液中に流れた電流：10〜30μＡ
試料注入法：電気的注入法
試料濃度：各試料 0.1mg／１ml（泳動液）
【００３２】
【表１】
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【００３３】
注）
*1 泳動液
Ａ： 10mM Na2HPO4 水溶液／アセトニトリル＝50／50（容量比）
Ｂ： 10mM Na2HPO4 水溶液／アセトニトリル＝30／70（容量比）
Ｃ： 50mM リン酸緩衝液（pH＝4)／アセトニトリル＝30／70（容量比）
*2 理論段数計算式
理論段数＝ 5.54 ×（ｔR／Ｗ1/2)2 
ここで、ｔRは試料の移動時間、Ｗ1/2 はピーク半値幅を示す。
【００３４】
また図１〜８に実施例１〜８の光学分割によって得られたクロマトグラムをそれぞれ示す。
【００３５】
上記の実施例１〜８の結果、８種のラセミ体サンプル中、５種が完全分割〜ほぼ完全分割し、残り３種が部分分割であったことから、本ＣＥ法の光学分割に対する有効性が示された。またＨＰＬＣ法の分析時間が15分〜30分程度かかるのに対し、本ＣＥ法では５分〜10分以内に分析が終了し分析時間の迅速さが示された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  実施例１の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図２】  実施例２の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図３】  実施例３の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図４】  実施例４の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図５】  実施例５の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図６】  実施例６の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図７】  実施例７の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図８】  実施例８の光学分割結果を示すクロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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