(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（７）の特性を有する新規α−１,２−マンノシダーゼ。
（１）作用
（ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシド結合を特異的に分解する。
（ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する。
（２）基質特異性
α−マンナン、α−１,２−マンノビオース、非還元末端にα−１,２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用するが、α−１，３−マンノビオース、α−１，６−マンノビオースには作用しない。
（３）最適温度：３５℃〜４５℃
（４）最適pH：５〜７
（５）安定温度：４０℃
（６）安定ｐＨ：５〜１２
（７）分子量：４００,０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
【請求項２】
α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス属由来のものである請求項１記載のα−１,２−マンノシダーゼ。
【請求項３】
α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イリノイセンシス由来のものである請求項１又は２記載のα−１,２−マンノシダーゼ。
【請求項４】
α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株由来のものである請求項１、２又は３記載のα−１,２−マンノシダーゼ。
【請求項５】
酵素反応によりマンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖質を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル糖化合物を製造する方法において、酵素として、請求項１、２、３又は４記載のα−１,２−マンノシダーゼを用いることを特徴とするα−マンノシル糖化合物の製造方法。
【請求項６】
α−マンノシル糖化合物がマンノオリゴ糖である請求項５記載のα−マンノシル糖化合物の製造方法。
【請求項７】
パエニバチルス属由来の細菌を培養し、その培養物から請求項１、２、３又は４記載のα−１,２−マンノシダーゼを採取することを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のα−１,２−マンノシダーゼの製造方法。
【請求項８】
パエニバチルス属由来の細菌がパエニバチルス・イリノイセンシスである請求項７記載のα−１,２−マンノシダーゼの製造方法。
【請求項９】
請求項１、２、３又は４記載のα−１,２−マンノシダーゼ生産能を有するパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規α−１,２−マンノシダーゼ及び該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
糖鎖は生体内で、細胞膜や細胞小器官の膜、タンパク質の表面等に分布し、細胞同士や細胞とタンパク質、タンパク質同士等、互いの認識に役立っており、これにより、酵素や細胞の作用対象が決定されたり、タンパク質が目的の部位まで正確に運ばれたりする等、生体反応に重要な役割を果たしている。
糖鎖構造中には、α−マンノシド結合したマンノオリゴ糖部分が多く存在し、特に糖タンパク質に結合しているハイマンノース型糖鎖で見られるような糖鎖の先端部分に位置している場合が多い。
【０００３】
このようなことから、マンノオリゴ糖部分は糖鎖の認識に直接関与していると考えられており、これらの研究を行う際の研究用試薬として安価なマンノオリゴ糖が求められている。また、研究用試薬としての糖鎖の合成を考えた場合、化学的合成法では長い糖鎖でトータル収率が極めて低くなってしまうという問題点があるが、酵素合成法でマンノオリゴ糖部分を組み合わせるという手法も一法であると考えられ、この場合も、マンノオリゴ糖が必要とされる。
【０００４】
マンノオリゴ糖などのマンノシル糖化合物は、天然物からの抽出によって得られるが、その量は極微量であるので、化学合成により合成することが考えられている。
しかしながら、化学合成による方法は、行程が複雑であり、トータル収率が極めて低くなってしまうという問題がある。
これに対して、酵素合成法によれば、マンノースを含む糖類からマンノオリゴ糖などのマンノシル糖化合物を有利に製造できる。このため酵素として、α−マンノシダーゼ等が開発されている。
【０００５】
α−マンノシダーゼとしては、例えばタチナタマメあるいはアーモンドなどの植物由来のもの等を用いるものが挙げられる（特開平５−４９４９２）。
前述した高マンノース型糖鎖に関しては、先端部にα−１，２−マンノオリゴ糖が存在しているので、α−１，２−マンノシダーゼが重要になるが、上記の酵素は、特にこのような立体特異的なものを意図しているわけではない。
このα−１，２−マンノシダーゼについては、微生物由来のものとして、アスペルギルス属に属する糸状菌由来のもの（特開昭５７−５４５８８）、バチルス属に属する細菌由来のもの（特開平５−６４５８６）、担子菌由来のもの（Journal of Biotechnology７７（２０００）ｐ．２５５−２６３）等が開発されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
上記した従来のα−１，２−マンノシダーゼは、いずれもα−１，２−マンノシダーゼ活性が低く、また、培養法、精製法が煩雑なものが多く、工業的に安価に生産することは困難であるという問題がある。
更に、前記したバチルス属に属する細菌由来の酵素は、縮合によるオリゴ糖生成率が低いという問題点がある。
【０００７】
従って、本発明の目的は、α−１，２−マンノシダーゼを菌体外に生産する新規菌株と、この菌株を用いてα−１，２−マンノシダーゼを工業的に有利に製造する方法、及び製造した酵素を用いてマンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物を多量生産させる方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記のような状況に鑑み、マンノシダーゼを生産する微生物を土壌から検索したところ、新たに、これまで全く知られていなかった新規なマンノシダーゼを生産する微生物を発見し、その生理化学的性質からパエニバチルス・イリノイセンシス（Paenibacillus illinoisensis）と同定され、本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、次の通りのものである。
１．下記の特性を有する新規α−１，２−マンノシダーゼ。
（１）作用
（ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシド結合を特異的に分解する。
（ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する。
（２）基質特異性
α−マンナン、α−１,２−マンノビオース、非還元末端にα−１,２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用するが、α−１，３−マンノビオース、α−１，６−マンノビオースには実質的に作用しない。
（３）最適温度：３５℃〜４５℃
（４）最適pH：５〜７
（５）安定温度：４０℃
（６）安定pH：５〜１２
（７）分子量：約４００,０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
２．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス属由来のものである上記１記載のα−１,２−マンノシダーゼ。
３．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イリノイセンシス由来のものである上記１又は２記載のα−１,２−マンノシダーゼ。
４．α−１,２−マンノシダーゼがパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株由来のものである上記１、２又は３記載のα−１,２−マンノシダーゼ。
５．酵素反応によりマンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を製造する方法において、酵素として、上記１、２、３又は４記載のα−１,２−マンノシダーゼを用いることを特徴とするα−マンノシル糖化合物の製造方法。
６．α−マンノシル糖化合物がマンノオリゴ糖である上記５記載のα−マンノシル糖化合物の製造方法。
７．パエニバチルス属由来の細菌を培養し、その培養物からα−１,２−マンノシダーゼを採取することを特徴とするα−１,２−マンノシダーゼの製造方法。
８．パエニバチルス属由来の細菌がパエニバチルス・イリノイセンシスである上記７記載のα−１,２−マンノシダーゼの製造方法。
９．α−１,２−マンノシダーゼ生産能を有するパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株。
【００１０】
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、（ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシド結合を特異的に分解する特性、及び（ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する特性を有するので、この特性を利用することにより、マンノオリゴ糖のα−マンノシル糖化合物を製造することができる。
【００１１】
本酵素の作用条件（ｐＨ５．０〜７．０、反応温度４０℃：実施例２〜４参照）は、マンノースイソメラーゼの作用条件（ｐＨ５．０〜９．０、温度４０℃）とほぼ一致しているので、マンノースイソメラーゼを併用することにより、フルクトースからα−マンノシル糖化合物の製造が可能である。
そして、本酵素は活性が高く、例えば、従来知られているバチルス属のα−１,２−マンノシダーゼに比べて、縮合によるオリゴ糖生成率が顕著に優れている。
また、本酵素は、発色物質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに対して作用するので、活性測定等が容易である点においても、特徴的である。
更に、本酵素は、パエニバチルス・イリノイセンシスに属する細菌を液体培養することによって培地中に生産出来るので、タチナタマメ等から抽出したり、アスペリギルス属の糸状菌を培養して製造される公知の酵素に比べて培養・精製が容易で、大量生産に適している。
【００１２】
従って、以上の本発明の酵素の特性を利用することにより、マンノース（フルクトース）やα−１，２−マンノシド結合を有する糖類などから、マンノオリゴ糖、α−マンノシル糖化合物などを自由に、効率よく製造することができるので、本酵素は、糖タンパクや糖脂質などの複合糖質（特に、高マンノース型）の研究やその薬理研究などに資することができ、マンノオリゴ糖の工業生産を可能とする点で、非常に価値がある。
なお、パエニバチルス属の微生物が、α−１，２−マンノシダーゼを生産することについては未だ知られておらず、本発明のものが最初である点でも、技術的な価値が高い。
【００１３】
以下、本発明を更に説明する。
１．  菌株
本発明に使用するパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株は、本発明者らによって土壌中より発見された菌種であり、産業総合研究所生命工学工業技術研究所に、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２５６として寄託されている。
【００１４】
パエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株は、以下の菌学的諸性質を有する。
細胞の形及び大きさ：０．５×１．８〜２．４μｍのかん菌
運動性：＋
グラム染色性：＋
胞子形成：＋
酸素に対する態度：好気性
生育最適温度：３０℃
また、１６SrRNA配列の分析を行い、既知配列との相同性を検索した結果、パエニバチルス・イリノイセンシスの１６SrRNA配列と平均９８．５％の確率で一致していた。これらのことから、本菌はパエニバチルス・イリノイセンシスと判定した。
【００１５】
２．  マンノシダーゼの産出
マンノシダーゼは、上記の菌株から生産されるものが好ましいが、パエニバチルス属に属する微生物から生産されるものであれば何れでもよく、例えば、パエニバチルス・アルギノリティクス、パエニバチルス・アミノリティクス、パエニバチルス・マセランス、パエニバチルス・ポリミキサ等が挙げられる。
また、これらの組換え酵素も利用できる。分泌の場所は特に制限されず、菌体内、菌体外の何れでもよい。
【００１６】
この酵素は、以下のような、通常の培養手段により産出される。
フルクトース、グルコース、マンノース、ガラクトース、異性化糖、蔗糖、マルトース、キシロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、マンナンなど種々な糖、糖アルコール及びデキストリンなどを炭素源とし、それに微生物の増殖に必要な窒素化合物（酵母エキス、魚肉エキス、ペプトン、アミノ酸、などの有機窒素源、あるいは硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源）、ミネラルを加えた培地で、２０〜３５℃、好ましくは３０℃前後で好気条件下において、１〜５日、好ましくは１〜３日培養する。
分泌の場所が菌体内の場合、培養後、濾過又は遠心分離により菌体を回収し、そのまま使用するか、又は超音波若しくは自己消化法等により該酵素を抽出し使用する。又、分泌の場所が菌体外の場合、培養後、濾過又は遠心分離により菌体を除去し、濾過又は上清をそのまま使用できるので、有利である。抽出された酵素は、必要により、硫酸アンモニウム、アセトン、メタノール、エタノール等で沈澱し、精製濃縮し、又は乾燥保存する。
【００１７】
また、上記の菌体、菌体処理物、濾液または上清からα−１，２−マンノシダーゼをさらに精製することも可能であり、その方法としては、例えば、硫安による塩析、エタノール、アセトン等による溶媒沈澱法、限外濾過法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂等による一般的な酵素精製方法が採用される。
例えば、パエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３菌株を、酵母マンナンを主要な炭素源とし、酵母エキスを添加した培地中、好気的な条件下で培養した培養液から菌体を分離除去し、ついでDEAE−トヨパール６５０Ｓ（商品名：東ソー株式会社製）によるイオン交換クロマトグラフィー及びトヨパールＨＷ−５５Ｆ（商品名：東ソー株式会社製）によるゲル濾過クロマトグラフィーの各段階を経て精製し、電気泳動的にほば均一な精製酵素標品を得ることが出来る。
【００１８】
本発明におけるα−１，２−マンノシダーゼ活性の測定法及び活性表示法は以下のとおりである。
酵母マンナンを基質として反応を行い、遊離するマンノースを測定することによって行った。すなわち、酵母マンナン（終濃度０．１％）と酵素液を含む反応液（０．６Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）中、４０℃で３０分間、反応を行い、反応後、マンノースを標準として還元糖をネルソン・ソモジ法によって測定した。酵素活性の単位は、上記反応において１秒間に１モルのマンノースを遊離する酵素量を１カタール（以下k a t）とした。
【００１９】
本発明の新規α−１，２−マンノシダーゼの理化学的性質を以下に示す。
（１）作用
（ａ）α−１，２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１，２−マンノシド結合を特異的に分解する。
（ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合又は転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する。
（２）基質特異性
α−マンナン、α−１，２−マンノビオース、非還元末端にα−１，２−マンノシド結合を有するオリゴ糖、ｐ−ニトロフェニル−α−D−マンノシドには作用するが、α−１，２−マンノビオース、α−１，６−マンノビオースには実質的に作用しない（実施例３参照）。
（３）最適温度：３５℃〜４５℃
本酵素について、２０〜６０℃の温度で、終濃度６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０分間反応させて相対活性を調べたところ、最適温度は、図１に示すように３５℃〜４５℃であった。
（４）最適ｐＨ：５〜７
本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソン（Britton-Robinson）の広域緩衝液を用いて４０℃、３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、最適ｐＨは、図２に示すように５〜７であった。
（５）安定温度：４０℃以下
本酵素について、６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）中、０〜６０℃の範囲で１０分間処理した後、４０℃、３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、安定温度は、図１に示すように４０℃以下であった。
（６）安定ｐＨ：５〜１２
本酵素について、終濃度２０ｍＭのブリトン・ロビンソン（Britton-Robinson）の広域緩衝液を用いて、４℃、２４時間の処理を行った後、６０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で、４０℃、３０分間の酵素反応によって相対活性を調べたところ、安定ｐＨは、図２に示すように５〜１２であった。
（７）分子量：約４００，０００（ゲル濾過ＨＰＬＣ）
【００２０】
３．  α−マンノシル糖化合物の製造
本発明のα−１，２−マンノシダーゼは、（ａ）α−１,２−マンノシド結合を含むα−マンナンまたはオリゴ糖の非還元末端位のα−１,２−マンノシド結合を特異的に分解する特性、及び（ｂ）マンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させてα−マンノシル糖化合物を生成する特性を有する。
また、本酵素は、前述した、従来のバチルス属由来のもの（特開平５−６５４８６）とは違い、ｐ−ニトロフェニル−α−D−マンノシドに作用する基質特異性を有する。
上記のよう本酵素の特性を利用すれば、マンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物を製造することが出来るので、以下説明する。
【００２１】
１）  縮合反応によるマンノオリゴ糖の製造
本酵素の縮合反応性を利用することにより、マンノースを脱水縮合させてマンノオリゴ糖を製造することができる。例えば、マンノオリゴ糖としては、Ｍａｎ１−２Ｍａｎ、Ｍａｎ１−３Ｍａｎ、Ｍａｎ１−６Ｍａｎなどを製造することが出来る。
マンノオリゴ糖の製造方法としては、例えば、以下のようにして行うのがよい。
高濃度のマンノースを含む溶液に、パエニバチルス・イリノイセンシス由来のα−１，２−マンノシダーゼを添加し、その反応液を室温乃至８０℃、好ましくは４０℃でインキュベーションし、ＨＰＬＣにて反応の進行を観察し、マンノオリゴ糖の含量が高まった時点で反応を停止したのち、活性炭クロマトグラフィー等の精製手段を用いることにより、目的物を得ることが出来る。
【００２２】
２）  転移反応によるα−マンノシル糖化合物の製造
本酵素の転移反応性を利用することにより、マンノース供与体とマンノース受容体からα−マンノシル糖化合物を製造することができる。
マンノース供与体としては、例えばｐ−ニトロフェニル−α−マンノシド、メチル−α−マンノシド、フェニル−α−マンノシド等が挙げられる。
一方、マンノース受容体としては、マンノース、マンノビオース、ラミナリビオース等が挙げられる。
本転移反応は、通常の反応条件下で行うことができる。
基質溶液としては、受容体と供与体とを含有する水溶液又はジメチルスルホキシドなどの有機溶剤液が用いられる。その場合、受容体と供与体のモル比は１：５０〜５０：１が好ましく、基質濃度は５〜５０重量％が好ましい。
本反応は、受容体と供与体とを含有する基質溶液に、本酵素を作用させることにより行うが、反応時のｐＨと温度は、通常、ｐＨ４〜８、温度２０〜７０℃が適当である。
【００２３】
３）  α−１，２−マンノシダーゼの使用形態
α−１，２−マンノシダーゼとしては、▲１▼菌体を通常の方法で固定化したもの、▲２▼菌体を機械的、酵素的、若しくは、界面活性剤や有機溶剤などで処理したもの、又は、それらを固定化したもの、▲３▼菌体を破砕して破砕残さを除去したもの、又は、それを固定化したもの、▲４▼酵素精製物、又は、それを固定化したもの、▲５▼培養液または菌体を除去した培養上清、又はそれを濃縮、乾燥、及び／あるいは固定化したもの等が挙げられる。
固定化は、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウム、カラギーナン、イオン交換担体、キトサンビーズなどを用いた通常の固定化方法が使用できる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。特別に標記がない場合、百分率はW／V％である。
【００２５】
【実施例１】
（α−１，２−マンノシダーゼの調整）
酵母マンナン０．２％、硫酸第２鉄（７水和）０．００３％、硫酸マグネシウム（７水和）０．０４％、塩化カルシウム（２水和）０．００６％、リン酸水素２カリウム０．６９％、リン酸２水素カリウム０．２３％、硫酸アンモニウム０．０５％、酵母エキス０．１５％を含む液体培地８００ml（ｐＨ７．０）を、３Ｌの坂口フラスコに入れ、１昼夜培養したパエニバチルス・イリノイセンシスNo．１３株を加え、３０℃で２晩培養した。次いで、この培養液を９，000×ｇ、３０分間遠心して菌体を除き、上清を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析を行い、粗酵素液を得た。粗酵素液の活性測定を行ったところ、１９ｍｋａｔ／Ｌであった。
【００２６】
透析後の粗酵素液を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させ、０〜０．８Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。
【００２７】
溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析した後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させ、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１〜０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。
【００２８】
溶出させた活性画分を集めて、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して１晩透析した後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓカラムに吸着させ、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、０．１５〜０．４５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の濃度勾配法により酵素を溶出させた。
【００２９】
溶出させた活性画分を集めて、限外濾過（分画分子量１０，０００）で濃縮した後、１５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたトヨパールＨＷ−５５Ｆカラムに供し、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により酵素を溶出させて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、均一なバンドからなる精製酵素を得た。活性収率は１５％であった。
【００３０】
【実施例２】
培養に用いる菌株を、それぞれ、パエニバチルス・イリノイセンシスＪＣＭ９９０７、パエニバチルス・ポリミキサＪＣＭ２５０７、パエニバチルス・マセランスＪＣＭ２５００とした以外は、実施例１と同様にして、粗酵素液を調製した。  それぞれの粗酵素液に対して活性測定を行ったところ、それぞれ、１６ｍｋａｔ／Ｌ、１２ｍｋａｔ／Ｌ、９ｍｋａｔ／Ｌであった。
【００３１】
【実施例３】
（基質特異性）
各マンノビオース（α−１,２−マンノビオース、α−１,３−マンノビオース、α−１,６−マンノビオース）０．０５％含む３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、実施例１のα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃、９０分間インキュベートした後、以下の分析条件で分析した。
【００３２】
ＨＰＬＣ：ウォーターズ社製
検出器：示差屈折計（日立 Ｄ−２５００ クロマトインテグレーター）
カラム：ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ２０００ＰＷ（東ソー株式会社製）
流速：０．５ｍｌ／分
溶出：水
【００３３】
分析結果は、図３〜５に示す。図３はα−１,２−マンノビオース、図４はα−１,３−マンノビオース、図５はα−１,６−マンノビオース、の結果である。この結果によると、図３では、α−１，２−マンノビオースが分解され、マンノースの位置にピークがシフトした。これに対して、図４（α−１,３−マンノビオース）及び図５（α−１,６−マンノビオース）では、ピークに変化はない。  この結果から、本酵素により、α−１，２−マンノビオースのみが分解されたことが分かる。
【００３４】
【実施例４】
（縮合）
６０％（Ｗ／Ｗ）のマンノース溶液にマンノース１ｇ当たり２０ｎｋａｔとなるように、実施例１のα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃、７２時間反応させた。反応後の液をＨＰＬＣで分析した。
分析結果によると、全糖中に占めるマンノオリゴ糖の割合は６．５％であった。
この結果から、本酵素には、マンノースを脱水縮合させて、マンノオリゴ糖を生成する活性があることが分かる。
【００３５】
【比較例１】
（縮合）
実施例４で用いた、実施例１のα−１，２−マンノシダーゼに代えて、Bacillus sp. M−90株由来のα−１．２−マンノシダーゼ（特開平５−６４５８６）を使用した以外は、実施例４と同様にして、マンノースの縮合を行った。
分析結果によると、全糖中に占めるマンノオリゴ糖の割合は２．２％であった。
実施例４と比較例１の分析結果の比較から、マンノースを脱水縮合する活性は、本酵素の方が公知の酵素より高いことが分かる。
【００３６】
【実施例５】
（転移）
供与体としてｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド３０％、受容体としてラミナリビオースの３０％を含有する基質溶液（ｐＨ６）に、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシド１ｇ当たり２０ｎｋａｔとなるように、実施例１のα−１，２−マンノシダーゼを加え、４０℃、７２時間反応させた。反応後の液をＨＰＬＣで分析した。
分析結果によると、全糖中に占める転移生成物の割合は０．９％であった。
この結果から、本酵素には、非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を転移させて、α−マンノシル糖化合物を生成する活性があることが分かる。
【００３７】
【発明の効果】
（１）本発明の酵素は、α−１,２−マンノシド結合の分解反応性やマンノース又は非還元末端にα−マンノシド結合を有する糖類を脱水縮合または転移させて、マンノオリゴ糖等のα−マンノシル糖化合物を生成する性質等を有しているので、マンノオリゴ糖などのα−マンノシル糖化合物が製造し得る。
また、本酵素作用条件とマンノースイソメラーゼの作用条件とがほぼ一致しているので、マンノースイソメラーゼを併用することにより、フルクトースからα−マンノシル糖化合物が製造し得る。
【００３８】
（２）本酵素は活性が高く、例えば、従来知られているバチルス属のα−１,２−マンノシダーゼに比べて、オリゴ糖生成率が数倍高い。
【００３９】
（３）本酵素は、発色物質であるｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノシドに対して作用するので、活性測定等が容易である。
【００４０】
（４）本酵素は、パエニバチルス・イリノイセンシスに属する細菌を液体培養することによって培地中に生産出来るので、タチナタマメ等から抽出したり、アスペルギルス属の糸状菌を培養して製造される公知の酵素に比べて培養・精製が容易で、大量生産に適している。
【００４１】
（５）以上の本発明の酵素の特性を利用することにより、マンノース（フルクトース）やα−１，２−マンノシド結合を有する糖類などから、マンノオリゴ糖、α−マンノシル糖化合物などを自由に、効率よく製造することができるので、本酵素は、糖タンパクや糖脂質などの複合糖質（特に、高マンノース型）の研究やその薬理研究などに資することができる点で、非常に価値がある。
【００４２】
（６）なお、パエニバチルス属の微生物が、α−１，２−マンノシダーゼを生産することについては未だ知られておらず、本発明のものが最初である点でも、技術的な価値が高い。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の酵素の最適温度と安定温度を示す説明図である。
【図２】本発明の酵素の最適ｐＨと安定ｐＨを示す説明図である。
【図３】本発明の酵素によるα−１,２−マンノビオースについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマトグラフィーによる測定曲線図である。
【図４】本発明の酵素によるα−１,３−マンノビオースについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマトグラフィーによる測定曲線図である。
【図５】本発明の酵素によるα−１,６−マンノビオースについての経時的な分解能を示す、高速液体クロマトグラフィーによる測定曲線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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