(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面プラズモン共鳴スペクトルによるプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法であって、リガンドにABO式血液型エピトープ部分を用いることを特徴とするプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項２】
表面プラズモン共鳴スペクトルによるプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法であって、リガンドに大腸由来のムチンを用いることを特徴とするプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法。
【請求項３】
大腸由来のムチンが粗精製ムチンである請求項２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
プロバイオティクス乳酸菌がLactobacillus属またはBifidobacterium属である請求項１〜３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
Lactobacillus属がL. acidophilus、L. casei、L. rhamnosus、およびL. bulgaricusからなる群より選ばれる請求項４記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新機能をもったプロバイオティクス乳酸菌の新規なスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト大腸ムチン(human colon mucin：ＨＣＭ)を構成する糖鎖の化学構造が、ABO式血液型により異なることが報告（例えば、非特許文献１参照。）された。この科学的事実は、血液型が異なれば各人の消化管ムチンの糖鎖構造も異なり、そこに付着増殖するプロバイオティック乳酸菌の種類が異なることを強く示唆している。
【０００３】
プロバイオティック乳酸菌として、ヒトを対象に用いられているLactobacillus属の代表的菌種は、L. acidophilus、L. casei、L. rhamnosus、およびL. bulgaricusである。ヒト・動物の糞便から分離されたL. acidophilusグループ乳酸菌は、Bifidobacteriumグループと同様に宿主の腸管内に生息して腸内フローラを改善し整腸作用などの働きをすると考えられている。
【０００４】
L. acidophilusグループ乳酸菌は、ＤＮＡ−ＤＮＡホモロジーおよび細胞壁組成分析の結果、L. acidophilus（A-1）、L. crispatus（A-2）、L. amylovorus（A-3）、L. gallinarum（A-4）、L. gasseri（B-1）、およびL. johnsonii（B-2）の６菌種に分類（例えば、非特許文献２参照。）されている。
【０００５】
これらの乳酸菌がヒトに初期感染し腸管へ定着（colonization）するためには、腸上皮細胞表面に接着することが不可欠である。高橋らは、腸管に強く接着するL. acidophilusグループ乳酸菌株をスクーリニングするために大腸ムチン（ＲＣＭ）をコートしたポリスチレンビーズを開発し、L. acidophilusグループ乳酸菌株をスクーリニングした結果、ＲＣＭに強く結合した株由来の表層タンパク（ＳＬＰ）は、ヒト大腸粘液層にも結合したことを報告している（例えば、非特許文献３参照。）。
【０００６】
一方、表面プラズモン共鳴(SPR)現象を利用したバイオセンサー（BIACORE）が開発され、生化学、分子生物学の分野に急速に普及してきた。
【０００７】
【非特許文献１】
天野純子、生化学, 社団法人日本生化学会, 1999年, 第71巻, p.274-277
【非特許文献２】
Fujisawa, T. 外, Int. J. Syst. Bacteriol., 1992年, 第42巻, p.487-491
【非特許文献３】
Takahashi, N. 外, Biosci. Biotech. Biochem., 1996年, 第60巻, 第9号, p.1434-1438
【非特許文献４】
稲川淳一：実験医学別冊 クローズアップ実験法 総集編, 2002年3月1日発行, p.143-150
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ヒトの血液型に適合した腸管付着性の極めて高い腸管系乳酸菌、とくにL. acidophilusグループ乳酸菌をスクリーニングするシステムを構築することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、このバイオセンサー(BIACORE 1000)を用いて、わが国に最も多いＡ型血液型健常人のヒト腸管ムチンへ付着するL. acidophilusグループ乳酸菌のスクリーニング方法を確立した。
【００１０】
すなわち、本発明は、
（１）  表面プラズモン共鳴スペクトルによるプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法であって、リガンドにABO式血液型エピトープ部分を用いることを特徴とするプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法、
（２）  表面プラズモン共鳴スペクトルによるプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法であって、リガンドに大腸由来のムチンを用いることを特徴とするプロバイオティクス乳酸菌のスクリーニング方法、
（３）  大腸由来のムチンが粗精製ムチンである（２）のスクリーニング方法、
（４）  プロバイオティクス乳酸菌がLactobacillus属またはBifidobacterium属である（１）〜（３）のスクリーニング方法、
（５）  Lactobacillus属がL. acidophilus、L. casei、L. rhamnosus、およびL. bulgaricusからなる群より選ばれる（４）のスクリーニング方法、
からなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
BIOCOREは、ファルマシアバイオテク社により開発・実用化された表面プラズモン共鳴センサーである。その原理と概要は以下の通りである。
その基本構造は、光源とプリズム、検出系とマイクロ流路系からなっている（図３）。カセット式のセンサーチップ表面にリガンドを固定化し、そこにアナライト（測定対象）をインジェクトする。両者に親和性があれば、その結合量が光学的に検出される（図４）。その検出原理の概要をのべると、センサーチップのガラス面側プリズムを介して偏光を入射させると、反射光の一部に反射光強度が低下した部分が観察される。この反射光内にある暗線角度は、金薄膜の極近傍の質量変化（屈折率変化）に依存する。すなわち、チップ上に固相化しているリガンドにアナライトが結合した場合に生じる質量変化が暗線の角度変化として検出される。この暗線の角度量をRU（レゾナンスユニット）と定義し、時間（秒）に対するRU値としてグラフ化（センサーグラム）し、リアルタイムでモニターしている。センサーチップはガラス板に金を蒸着し、さらにカルボキシルメチルデキストラン（CM-デキストラン）を結合させてある（CMチップ）。
【００１２】
〈材料および方法〉
１  供試乳酸菌
ヒト乳児、幼児、成人および老人糞便より単離したL. acidophilus（A-1）６菌株、L. crispatus（A-2）３菌株、L. amylovorus（A-3）３菌株、L. gasseri（B-1）７菌株、およびjohnsonii（B-2）２菌株の計２１菌株を用いた。各菌種の同定は、DNA-DNAハイブリダイゼーション法により実施した。
【００１３】
２  血液型糖鎖（3糖）ビオチニル化ポリマー（BP-）プローブ
実験には、２種類のヒトＡＢＯ式血液型基質のエピトープ部分構造である３糖糖鎖（Ａ型［GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal-］およびＢ型［Galα1-3(Fucα1-2)Gal-］）BP-Probe（生化学工業製）を用いた。また、非特異的吸着をみるためのコントロールとして、BP化糖鎖プローブのスペーサー部位が共通である、α-L-Rhamnose BP-プローブを使用した。このBP-プローブの構造を図１に、糖鎖の化学構造を図２に示した。
【００１４】
３  ヒト大腸ムチンの調製
ヒトＡ型腸管（直腸）は東北大学大学院医学研究科より、標本採取試料として分譲された。粘液ムチン層は、直腸正常部位から表層掻き取り法で採取した。ムチン層は、Folchの溶媒およびジエチルエーテルにより脱脂後、4 M 塩酸グアニジンに溶解させた。ゲルろ過精製を行い、粗精製のヒトＡ型腸管ムチン(human colon mucin：ＨＣＭ)として、試験に供した。これらの試料採取に関しては、医学研究科の倫理委員会を経て実施し、また患者の同意を得ている。
【００１５】
４  L. acidophilusグループ乳酸菌と、血液型糖鎖およびヒト腸管粗精製ムチンの相互作用解析
L. acidophilusグループ乳酸菌と、血液型糖鎖およびヒト腸管粗精製ムチンの相互作用解析は表面プラズモン共鳴解析装置（BIACORE 1000；Pharmacia Biotech）により実施した。センサーグラム（結合性・解離性曲線）における相互作用強度はレゾナンスユニット（RU）値で表した。再生溶液は、0.75〜3Mグアニジン塩酸塩を用いた。本装置の原理およびセンサーグラムの解釈方法は、図３および図４に示した。
【００１６】
４-１  アナライト菌体の培養と調製
各菌株は、ＭＲＳ培地（Difco Laboratories）に継代培養後、37℃で12時間培養した。培養液（500μl）より集菌した菌体は、ランニングバッファーHBS-EP buffer（0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005% Surfactant P20を含む）で洗浄した後、同バッファー（500μl）に懸濁してアナライト菌体とした。
【００１７】
４-２  血液型糖鎖に対する相互作用解析
ストレプトアビジン(ＳＡ)を予め固定化したタイプのセンサーチップＳＡ上の各フローセルに、ビオチン化した３種類のリガンド、すなわち、Ａ型血液型糖鎖BPプローブ、Ｂ型血液型糖鎖BPプローブ、およびα-L-Rhamnose BP-プローブを、それぞれビオチンを介してアビジンに結合させ固定化した。ついで、４-１で調製した各アナライト菌体をBIACORE 1000にインジェクトし、継時的に結合糖鎖と菌体との相互作用を解析した。
【００１８】
４-３  Ａ型ヒト腸管ムチンに対する相互作用解析
カルボキシルメチルデキストランが導入してあるタイプのセンサーチップＣＭ５を用いた。３で調製した粗精製のヒトＨＣＭ（リガンドのこと）を、アミンカップリング法により、センサーチップ上の各フローセルに固定化した。リガンド未結合の残存活性基のブロッキングには、エタノールアミンを用いた。ついで、４-１で調製した各アナライト菌体をBIACORE 1000 にインジェクトし、継時的にヒト大腸ムチンと菌体との相互作用を解析した。
【００１９】
〈結果および考察〉
１  血液型糖鎖プローブに対するBIACORE 1000による相互作用解析
BIACORE 1000による、２１菌株とリガンドとの結合（アフィニティー）をセンサーグラム（反応曲線）で調べた。その結果、３菌株は、BP糖鎖プローブへの結合が認められた。残りの１８菌株は、明瞭な結合は認められないか、認められても極めて弱いものであった。
BP糖鎖プローブへの結合が認められた L. crispatus JCM8778株のセンサーグラムを図５Ａおよび図５Ｂに示した。このJCM8778株は、Ｂ型糖鎖であるB-trisaccharide BP-Probe（200RU値）に対する結合（図５Ｂ）と比較して、Ａ型糖鎖であるA-trisaccharide BP-Probe（350RU値）に対して、より強い結合性を示した（図５Ａ）。一方、BP-Probeとは糖鎖エピトープ部位のみで異なる比較対照のα-L-Rhamnnose BP-Probe に対しては全く結合しなかった（図５Ｃ）。この結果、JCM8778株の両糖鎖 BP-Probe への結合は、糖鎖 BP-Probe のスペーサー部位、あるいはセンサーチップＳＡ表面への非特異的な結合ではなく、糖鎖エピトープへの特異的結合であることが明らかとなった。すなわち、JCM8778株は、血液型糖鎖を特異的に認識して結合する乳酸菌の一つであるとことが示された。
【００２０】
２  Ａ型ヒト腸管ムチンに対する相互作用解析
以上の結果は、L. acidophilus乳酸菌の、人工的な糖鎖プローブに対する、BIACORE 1000による結合性試験であった。そこで、より実際の腸管環境を反映すると考えられる、ヒト腸管より調製したＡ型ヒト腸管粗精製ムチンに対しての、JCM8778株の結合性を調べた。その結果、Ａ型糖鎖 BP-プローブの場合に比べて結合は弱かったが、明らかにヒトＡ型大腸ムチンに対する結合が認められた。この実験結果より、JCM8778株はヒト腸管に強く付着している可能性の高いことが示唆された。Ａ型糖鎖 BP-プローブの場合に比べて結合は弱かったことは、Ａ型ヒト大腸ムチン中には種々のタンパク質および糖鎖部位が多量に含まれており、結合に関与するＡ型糖鎖の量が希釈されていたことも原因の一つとして考えられた。
【００２１】
〈結論〉
表面プラズモン共鳴スペクトルを利用したバイオセンサーBIACOREは生体分子の相互作用をリアルタイムに測定することにより、それぞれの相互作用を単なる強さ（アフィニティー）の解析から、速さ（カイネティックス）まで解析できる特徴をもっている。また、Ｂ/Ｆ分離の必要な他の分析では困難な、非常に弱い結合（低アフィニティー、ＫD値10-3 M程度）の解析を行うことができる（例えば、非特許文献４参照。）。
Ａ型糖鎖 BP-Probeを結合させたセンサーチップを用いて、マススクリーニングを行い、さらにヒトＡ型大腸ムチンを結合させたセンサーチップを用いてスクリーニングすることにより、ヒト腸管付着性の高い有用プロバイオティック乳酸菌を提供することができた。本スクリーニングの対象となる乳酸菌を表１に示した。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
この表面プラズモン共鳴スペクトルを利用したBIACOREによる、乳酸菌の、両センサーチップに対する付着性を検証することにより、血液型糖鎖認識性L. acidophilusグループ乳酸菌のスクリーニングに極めて有効ではないかと考えられる。付着性を示すものはRU値が上昇し、付着性を示さないものはRU値の上昇が全く見られないといったBIACOREによる結合性の評価法は、明確そのものであり、さらにセンサーグラムの形状より供試菌株がどの様な結合性を有するかについても有用な知見が得られる。
また、他の O(H)型糖鎖 BP-ProbeおよびB、O型ヒト大腸ムチンを用いたBIACORE解析を拡大することで、ヒトの全血液型に対応したヒト腸管付着性乳酸菌の新規スクリーニング法を確立することができる。当該方法によってABO血液型別に腸管付着性の高い乳酸菌をスクリーニングすることができ、当該乳酸菌を用いて個人レベルに対応したオーダーメードの血液型別機能性ヨーグルトを作製することができる。
【００２４】
【発明の効果】
本発明により、表面プラズモン共鳴スペクトルを利用したBIACOREによる、新機能をもったプロバイオティクス乳酸菌株の、新規なスクリーニング方法が提供された。本発明により得られた乳酸菌株は、ABO血液型別に腸管付着性の高い乳酸菌であり、当該乳酸菌を用いて個人レベルに対応したオーダーメードの血液型別機能性ヨーグルトをはじめ、新しいプロバイオティクス食品、あるいは消化器プロバイオティクス、例えば感染症（歯周病、虫歯、慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌、腸管出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群、脳症、食中毒、偽膜性大腸炎）、アレルギー疾患（食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、気管支喘息）、炎症性腸疾患（Crohn 病、潰瘍性大腸炎）などの疾患の予防又は治療用食品の提供を可能とする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ヒトＡＢＯ式血液型のＡ型とＢ型のエピトープ部位を有するＢＰプローブ糖鎖プローブの化学構造を示す。
【図２】  図２−ＡはＡ型糖鎖ＢＰプローブの糖鎖部位、図２−ＢはＢ型糖鎖ＢＰプローブの糖鎖部位を示す。
【図３】  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用したBIACORE 1000測定法の原理とレゾナンスユニットの定義する。
【図４】   BIACORE 1000解析で得られるセンサーグラムにおける結合・解離・再生のサイクルを示す。
【図５】  図５−ＡはＡ型糖鎖ＢＰプローブへの結合を示したL. crispatus JCM8778株のBIACOREセンサーグラムを示し、図５−ＢはＡ型糖鎖ＢＰプローブへの結合を示した同株のBIACOREセンサーグラム示し、そして図５−Ｃは対照を示す。
【図６】  図６−ＡはセンサーチップＣＭへの、Ａ型血液型ヒト大腸粗精製ムチンの固定化センサーグラムを示し、図６−Ｂは同ムチンへの結合性を示したL. crispatus JCM8778株のBIACOREセンサーグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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