(57)【要約】【課題】幹細胞溶液の準備方法を提供すること。【解決手段】当該方法は、（１）血液試料と２価カチオンキレート剤との混合液を２〜１２℃の雰囲気下で３〜７２時間静置することによって、当該混合液を２層または２層以上（すなわち、混合液が２つまたは２つ以上の分離層を形成させる）に分ける（そのうち一つの分離層の液体は例えば血小板と幹細胞とを含む）工程と、（２）混合液から当該液体を収集または取得する工程と、（３）当該液体に含む複数の顆粒（前述した血小板と幹細胞とを含む）を容器の底部に沈積するまで遠心分離する遠心分離工程と、（４）当該顆粒を緩衝液その他適切な液体に再び懸濁させる工程と、を備える。【選択図】図１
2016171793.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞溶液の準備方法であって、
血液試料と２価カチオンキレート剤との混合液を２〜１２℃の雰囲気下で３〜７２時間静置することによって、前記混合液に複数の分離層を形成させ、前記分離層のうち一つの分離層の液体に複数の体性幹細胞と、複数の血小板を形成するステップと、
前記液体を取得するステップと、
前記液体を取得した後、前記液体を遠心分離させ、体性幹細胞と、血小板とを含めた複数の顆粒を前記液体に集合させるステップと、を含むことを特徴とする、
幹細胞溶液の準備方法。
【請求項２】
前記液体を遠心分離した後、全部または一部分の前記液体を取り除き、集合された前記顆粒を残した上、前記顆粒を再び懸濁させることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２価カチオンキレート剤はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞の大きさは、０．１〜６ミリメートルであり、かつＣＤ３４９（＋）感細胞と、Ｌｇｒ５（＋）感細胞と、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記液体は、前記２価カチオンキレート剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞溶液は、歯の治療または骨移植術に適用できることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
溶液であって、
前記溶液は大きさが２ミリメートル以上〜６ミリメートル以下のＬｇｒ５（＋）体性幹細胞を含む、
歯の治療に用いることができることを特徴とする、溶液。
【請求項８】
溶液であって、
前記溶液は大きさが２ミリメートル以上〜６ミリメートル以下のＣＤ３４９（＋）体性幹細胞を含む、
歯の治療に用いることができることを特徴とする、溶液。
【請求項９】
前記白血球の大きさが２ミクロン以上２０ミクロン以下の細胞に占める百分比は２％以下であることを特徴とする、請求項７記載の溶液。
【請求項１０】
塩類を含むことを特徴とする、請求項７記載の溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞を含む溶液の準備方法に関し、特に一種の（体性）幹細胞を含む溶液の準備方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は自己複製（ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ）の能力を有しているため、より多くの幹細胞を形成して、かつほとんどの種の特異性細胞（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）に変えることができる。幹細胞は今後の生物医学のもっとも重要な分野の一つであり、さらに近年はその関連産業もすばやく成長を見せており、人が幹細胞の医療応用に対するニーズを浮彫りされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の主な目的は、歯の治療または骨移植術（ｂｏｎｅ  ｇｒａｆｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に適用できる幹細胞溶液の準備又は製造の方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
前述した目的を達成するため、本発明より幹細胞溶液の準備又は製造の方法を提供する。
当該方法は、（１）血液試料と２価カチオンキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩[Ｋ２  ＥＤＴＡ]またはエチレンジアミン四酢酸三カリウム塩[Ｋ３  ＥＤＴＡ]）と均一に混合して形成する混合液を温度２〜１２℃（好ましくは２〜７℃または約４℃とする）の環境にて３〜７２時間、３〜６時間、６〜７２時間、６〜４８時間、１６〜７２時間、１６〜４８時間、３６〜６０時間または４８〜７２時間静置し、混合液を２層または２層以上に分離させ、すなわち、第１混合液に２つまたはそれ以上の分離層を形成し（例えば、上部分離層と下部分離層とを含む）、そのうち一つの分離層（例えば、上部分離層または最上層の分離層）の第１液体（例えば、上清液）に複数の血小板（大きさは例えば、６ミクロン[μｍ]以下である）及び複数の体性幹細胞とを含み、それらの体性幹細胞は、ＣＤ３４９（＋）（多能型）体性幹細胞と、Ｌｇｒ５（＋））（多能型）体性幹細胞）と、を含む取得ステップと、（２）当該混合液から第１液体を収集または取得するステップと、（３）当該第１液体を収集または取得した後、当該第１液体に前述した血小板と幹細胞とを含む複数の顆粒を集合させる、遠心分離ステップと、を含む。
当該方法はさらに、第１液体を遠心分離した後、一部分の第１液体を取り除き、集合した顆粒を残りの第１液体を残して置き、引き続き、幹細胞溶液の準備又は製造するため、当該顆粒を残りの第１液体に再び懸濁させる方向を含む。または、当該方法はさらに、第１液体を遠心分離した後、実質上の全部または一部分の第１液体を取り除き、集合した顆粒を残りの第１液体を残して置き、引き続き、幹細胞溶液の準備又は製造するため、当該顆粒を残りの第２液体に再び懸濁させる。当該第２液体はまたは塩溶液、例えば（ダルベッコ）リン酸緩衝生理食塩水[（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ]を含めても良い。または、当該第２液体は、カルシウムを有しないイオン（Ｃａ２＋）溶液例えば、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）いずれか他の２価イオンを含有しなくても良い。カルシウムを有しないイオン溶液は例えば、生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）、すなわち、０．９％の塩溶液であっても良い。あるいは、第２液体は前述した塩溶液及び一部分の第１溶液を含めても良い。それらの顆粒を再び第２液体に懸濁させた後、第２液体はそれらの顆粒を含むと共に、それらの顆粒と一体に混合される。前述した幹細胞溶液は、歯の治療または骨移植術に適用できる。
【０００５】
前述した目的を達成するため、本発明は幹細胞溶液（または幹細胞混合液）の準備又は製造の方法を提供する。
当該溶液は歯の治療または骨移植術に適用できる。当該方法は、（１）血液試料と２価カチオンキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩[Ｋ２  ＥＤＴＡ]またはエチレンジアミン四酢酸三カリウム塩[Ｋ３  ＥＤＴＡ]）を温度２〜１２℃（好ましくは２〜７℃または約４℃）の環境にて所定時間（例えば３〜７２時間、好ましくは３〜６時間、６〜７２時間、６〜４８時間、１６〜７２時間、１６〜４８時間、３６〜６０時間または４８〜７２時間とする）を培養または育成し、血液試料を２層または２層以上に分離させ、すなわち、血液試料に２つまたはそれ以上の分離層を形成（例えば、上部分離層と下部分離層とを含む）させるステップと、（２）そのうち一つの分離層（例えば上部分離層）を収集または取得し、当該分離層は複数の血小板（大きさは、６μｍ以下）と、複数の体性幹細胞（例えば、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞とＬｇｒ５（＋））体性幹細胞）と、を含む）とを有し、当該分離層を容器（例えば、試験管）に入れるステップと、（３）容器の当該分離層に懸濁していた粒（前述した体性幹細胞と血小板とを含む）多種顆を容器の底部に沈積させる遠心分離ステップと、（４）容器の底部に沈積されたそれらの顆粒を再び所定の液体溶液に懸濁させて、当該幹細胞溶液を準備又は製造するステップと、を含む。
当該液体または溶液は、例えば（ダルベッコ）リン酸緩衝生理食塩水を含めても良い。または、当該液体または溶液は、カルシウムを有しないイオン（Ｃａ２＋）の溶液例えば、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）いずれか他の２価イオンを含有しなくても良い。カルシウムを有しないイオン溶液は例えば、生理食塩水、すなわち、０．９％の塩溶液であっても良い。あるいは、当該液体または溶液は前述した塩溶液及び一部分の当該分離層を含めても良い。もしくは、当該液体または溶液は一部分の当該分離層であっても良い。それらの顆粒を再び当該液体または溶液に懸濁させた後、当該液体または溶液はそれらの顆粒を含むと共に、それらの顆粒と一体に混合される。
【０００６】
前述した２種の方法のうち、体性幹細胞のサイズ（例えば大きさ）は１μｍ〜６μｍ、好ましくは１または２μｍ以上から６μｍ以下とする。体性幹細胞は、大きさが２μｍ以上から６μｍ以下のＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞（つまり、類卵割球幹細胞）を含めても良い。ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞もＣＤ９（＋）であり、かつ大きさが２μｍ以上から６μｍ以下である。Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞はＯｃｔ４（＋）とＮａｎｏｇ（＋）、およびＣＤ１３３（―）、ＣＤ６６ｅ（―）、Ｓｏｘ２（―）、ＣＤ４（―）、ＣＤ８（―）、ＣＤ９（―）、ＣＤ１０（―）、ＣＤ１１（―）、ＣＤ１６（―）、ＣＤ１７（―）、ＣＤ１８（―）、ＣＤ１９（―）、ＣＤ２０（―）、ＣＤ２１（―）、ＣＤ３１（―）、ＣＤ４２（―）、ＣＤ６３（―）、ＣＤ３４（―）、Ｌｉｎ（―）、ＣＤ３８（―）、ＣＤ９０（―）、ＣＤ４５（―）とＣＤ３４９（―）でもある。Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞の大きさが２μｍ以上から６μｍ以下であっても良い。
幹細胞溶液のうち、Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞は大きさが２μｍ以上から６μｍ以下の細胞に占める百分比は４％または５％以上（好ましくは４．５％〜１０％とする）であり、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞が２μｍ以上から６μｍ以下の細胞に占める百分比は４％または５％以上であり（好ましくは４．５％〜１０％とする）、白血球は大きさが２μｍ以上から２０μｍ以下の細胞に占める百分比は２％以下であり（好ましくは１％、０．５％または０．１％以下とする）、赤血球は大きさが２μｍ以上から１０μｍ以下の細胞に占める百分比は３％以下（好ましくは２％、１％または０．５％以下とする）である。このほか、幹細胞溶液のうち、１％以下の細胞からＣＤ１３３が表現される。前述した血液試料は、個体（ヒトまたは動物）の末梢血から採取され、複数の細胞を含める。
【０００７】
前述した目的を達成するため、本発明は歯の治療または骨移植術に適用できる幹細胞溶液を提供する。
当該幹細胞溶液は大きさが２μｍ以上から６μｍ以下ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞（すＳＢ−１細胞）と、大きさが２μｍ以上から６μｍ以下Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞（ＳＢ−２細胞）および大きさが２μｍ以上から６μｍ以下ＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞（類卵割球幹細胞）と、を含む。幹細胞溶液は塩類、（例えば塩化ナトリウム）または塩溶液を含めても良い。塩溶液は（ダルベッコ）リン酸緩衝生理食塩水またはカルシウムを有しないイオン（Ｃａ２＋）溶液であっても良い。カルシウムを有しないイオン溶液は例えば、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）いずれか他の２価イオンを含有しなくても良い。カルシウムを有しないイオン溶液は例えば、生理食塩水、すなわち、０．９％の塩溶液であっても良い。
幹細胞溶液のうち、Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞の大きさが２μｍ以上から６μｍ以下の細胞に占める百分比は４％または５％以上であり（好ましくは４．５％〜１０％とする）、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞が２μｍ以上から６μｍ以下の細胞に占める百分比は４％または５％以上であり（好ましくは４．５％〜１０％とする）、ＣＤ６６ｅ（＋）は大きさ２μｍ以上から６μｍ以下の細胞に占める百分比は６％以下（好ましくは５％または４．５％以下とする）であり、白血球は大きさ２μｍ以上から２０μｍ以下の細胞に占める百分比は２％以下であり（好ましくは１％、０．５％または０．１％以下とする）、赤血球は大きさ２μｍ以上から１０μｍ以下の細胞に占める百分比は３％以下（好ましくは２％、１％または０．５％以下とする）である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の一実施例による幹細胞溶液の準備又は製造の方法に関わるフロー図（その１）である。
【図２】本発明の一実施例による幹細胞溶液の準備又は製造の方法に関わるフロー図（その２）である。
【図３】フコイダン補助剤の内容／成分情報を示す。
【図４】６名のヒト被験者にフコイダン補助剤を経口に服用させる前と服用させた後の幹細胞データである。
【図５Ａ】ヒト被験者が顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＧＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）の注射治療前の流動細胞計測データ（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｄａｔａ）である。
【図５Ｂ】ヒト被験者が顆粒球コロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，ＧＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）の注射治療後の流動細胞計測データ（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｄａｔａ）である。
【図６Ａ】前方散乱係数（ｆｏｒｗａｒｄｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＦＳＣ）対側方散乱係数（ｓｉｄｅｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＳＳＣ）のフローサイトメトリーのドットプロット（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｄｏｔｐｌｏｔ）である。
【図６Ｂ】フローサイトメトリー解析（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓ）によって、得られた蛍光ヒストグラムである。
【図６Ｃ】前方散乱係数対側方散乱係数のフローサイトメトリーのドットプロットである（その１）。
【図７Ａ】前方散乱係数対側方散乱係数のフローサイトメトリーのドットプロットである（その２）。
【図７Ｂ】フローサイトメトリー解析によって、得られた蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｃ】フローサイトメトリー解析によって、得られた蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｄ】フローサイトメトリー解析によって、得られた蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｅ】フローサイトメトリー解析によって、得られた蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｆ】フローサイトメトリー解析によって、得られた蛍光ヒストグラムである。
【図７Ｇ】フローサイトメトリー解析によって、得られた蛍光ヒストグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下に実施例と、付属図面と、特許請求の範囲について、詳しく説明することによって、本発明の構成品、ステップ、特徴、効果と優位性を明確化する。
【００１０】
図面には本発明を説明する目的の実施例を開示しているが、すべての実施例の説明ではなく、そのほか、または他の実施例に代替えすることができる。内容の重複を避けて、より効率的な説明を図るため、明らかなもの及び必要でない細部説明を省略する。それに対して、詳細説明の代りに実施例を説明する。同じ素子番号が異なる図面に示される場合は、同じまたは類似する構成品あるいはステップを示されている。
以下の説明を添付図面と合わせて参照することによって、本発明の態様をより詳しく理解できる。ただし、当該添付図面はあくまでも説明を目的としており、これに制限されるべきでない。
【実施例】
【００１１】
まず、本発明の用語の定義とその記述を説明し、引き続き本発明の実施例を詳しく説明する。
【００１２】
＜細胞の大きさ（Ｚ）の定義＞
【００１３】
本発明において、以下の段落に触れる大きさ（Ｚ）は、細胞（例えば、（体性）幹細胞または生体細胞）の大きさを指す。大きさ（Ｚ）は例えば（ただし、限定ではない）、（１）細胞生物学分野で細胞の大きさまたは長さを代表する従来の定義と、（２）細胞の直径（特に細胞の形状が実質上球体のとき）と、（３）細胞長軸の長さ（特に細胞の形状が実質上楕円体のとき）と、（４）細胞の幅（細胞の形状が立方体に近いとき）と、（５）細胞の長さ（細胞の形状が直方体に近いとき）または（６）細胞の最大断面または横方向の大きさを記述または定義に関わる。
光学顕微鏡または電子顕微鏡（例えば、走査型電子顕微鏡）から得られた細胞画像、またはフローサイトメーター（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）より獲得されたデータ（例えば、二次元の点、プロファイルまたは密度図）は、大きさ（ｚ）（直径、長さ、幅或いは最大の横断面または横方向の大きさのいずれか）の判定・測定に利用することができる。光学顕微鏡または電子顕微鏡から獲得された細胞映像は、例えば細胞の二次元の断面図または立体構造のいずれでも良い。一例として、光学顕微鏡または電子顕微鏡（例えば、走査型電子顕微鏡）を用いて、まず二次元の断面画像を得てから、係る二次元の断面画像における細胞最大の横断面または横方向の大きさを測定することを用いて、細胞の大きさ（Ｚ）が得られる。
【００１４】
＜幹細胞の定義＞
【００１５】
体性幹細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）ともいう。骨髄、脂肪または末梢血等の器官あるいは組織で見つかり、かつすべての幹細胞と同様な基本特徴を有する。体性幹細胞は、特殊化していない細胞（ｕｎｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ）または未分化細胞（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ）であり、しかも分化または特殊化可能な細胞種をいう。
”体性幹細胞”という用語は、本発明において、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）に属しないかまたは含まない。言い換えれば本発明において、体性幹細胞は胚胎または胚胎組織から由来または取得したものではない。
【００１６】
体性幹細胞は、全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）や前駆幹細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）などのさまざまな種類が数多くある。前駆幹細胞は、特異的な幹細胞または単能性幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）ともいう。類卵割球幹細胞（ｂｌａｓｔｏｍｅｒｅ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＢＬＳＣ）は、全能性幹細胞または多功能幹細胞に属する。類卵割球幹細胞（ｅｒｙ  ｓｍａｌｌ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−ｌｉｋｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＶＳＥＬ）は、多能性幹細胞に属する。ＳＢ−１細胞と、ＳＢ−２細胞は、全能性幹細胞または多能性幹細胞に属する。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）、造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＨＳＣ）、多能性成体前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ，ＭＡＰＣ）、骨髄由来多能性細胞（ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＢＭＳＣ）、多能性成体幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ＭＡＳＣ）などは、いずれも多分化能幹細胞に属する。さらに、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、網膜幹細胞（ｒｅｔｉｎａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、嗅球幹細胞（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｂｕｌｂｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、表皮幹細胞（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、筋肉幹細胞（ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、腸管幹細胞（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、膵臓幹細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、心臓幹細胞（ｈｅａｒｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、肝臓幹細胞（ｌｉｖｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、腎臓幹細胞（ｋｉｄｎｅｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、μ皮幹細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、脂肪または脂肪由来幹細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｏｒ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、骨髄から単離した成人の多系統誘導性細胞（ｍａｒｒｏｗ−ｉｓｏｌａｔｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ（ＭＩＡＭＩ）ｃｅｌｌ）、前間葉系幹細胞（ｐｒｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，ｐｒｅ−ＭＳＣ）、間葉系前駆細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）、造血前駆細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ，ＨＰＣ）、多能性前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ，ＭＰＰ）、系統限定前駆細胞（ｌｉｎｅａｇｅ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ，ＬＲＰ）、通常骨髄前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ，ＣＭＰ）や通常リンパ球系前駆細胞（ｃｏｍｍｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ，ＣＬＰ）などは、いずれも前駆幹細胞に属する。
【００１７】
以降の段落において、細胞（表面）マーカーの後ろに付けた符号「＋」とは、（例えば幹細胞には）この細胞（表面）マーカーを表現することができることを指す。つまり、フローサイトメーターは（特定マーカー用）抗原によって、幹細胞の表面に存在する細胞（表面）マーカーを検出することができる。
細胞（表面）マーカーの後ろに付けた符号「−」とは、（例えば幹細胞には）当該種の細胞（表面）マーカーを表現することができない。つまり、この種の細胞（表面）マーカーは幹細胞の表面に存在しておらず、かつフローサイトメーターがある種の（特定マーカー用）抗体によって、この種の幹細胞表面の（表面）マーカーを検出することもできない。
よって、プラス符号「＋」は細胞（例えば、幹細胞）にとって、細胞（表面）マーカーを表現し、マイナス符号「−」は細胞（例えば、幹細胞）にとって、細胞（表面）マーカーを表現しない。
【００１８】
ＳＢ−１細胞は細胞核を有する多機能または多能性幹細胞であり、かつＣＤ３４９（＋）細胞である。ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞（すなわちＳＢ−１細胞）は、ＣＤ９（＋）、Ｏｃｔ４（＋）とＮａｎｏｇ（＋）、およびＣＤ１３３（μ）、ＣＤ９０（μ）、ＣＤ３４（μ）とＳｏｘ２（μ）であることが分かる。一例として、ＣＤ３４９（＋）体性幹細胞の大きさ（前述細胞の大きさ（Ｚ）の定義を参照する）は、４マイクロメータ、５マイクロメータまたは６マイクロメータ以下または等しい。
一例として、０．１〜６マイクロメータ、０．５〜６マイクロメータ、１〜６マイクロメータ、０．１〜５マイクロメータ、０．５〜５マイクロメータ、１〜５マイクロメータ、０．１〜４マイクロメータ、０．５〜４マイクロメータまたは１〜４マイクロメータのいずれかの範囲であっても良い。好ましくは、ＳＢ−１細胞の大きさ２ミクロン以上から６ミクロン以下とする。ＳＢ−１細胞は細胞（表面）マーカーＣＤ３４９を表現できるため、ＣＤ３４９（＋）によって、その特徴を記述することができる。
【００１９】
ＳＢ−２細胞は細胞核を有する多機能または多能性幹細胞であり、かつＬｇｒ５（＋）細胞である。Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞（すなわちＳＢ−２細胞）はＯｃｔ４（＋）とＮａｎｏｇ（＋）、およびＣＤ１３３（μ）、ＣＤ６６ｅ（μ）、Ｓｏｘ２（μ）、ＣＤ４（μ）、ＣＤ８（μ）、ＣＤ９（μ）、ＣＤ１０（μ）、ＣＤ１１（μ）、ＣＤ１６（μ）、ＣＤ１７（μ）、ＣＤ１８（μ）、ＣＤ１９（μ）、ＣＤ２０（μ）、ＣＤ２１（μ）、ＣＤ３１（μ）、ＣＤ４２（μ）、ＣＤ６３（μ）、ＣＤ３４（μ）、Ｌｉｎ（μ）、ＣＤ３８（μ）、ＣＤ９０（μ）、ＣＤ４５（μ）とＣＤ３４９（μ）であることが分かる。一例として、Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞の大きさ（前述細胞の大きさ（Ｚ）の定義を参照する）は、４マイクロメータ、５マイクロメータまたは６マイクロメータ以下または等しい。
一例として、０．１〜６マイクロメータ、０．５〜６マイクロメータ、１〜６マイクロメータ、０．１〜５マイクロメータ、０．５〜５マイクロメータ、１〜５マイクロメータ、０．１〜４マイクロメータ、０．５〜４マイクロメータまたは１〜４マイクロメータのいずれかの範囲であっても良い。好ましくは、ＳＢ−２細胞の大きさ２ミクロン以上から６ミクロン以下とする。ＳＢ−２細胞は細胞（表面）マーカーＬｇｒ５を表現できるため、Ｌｇｒ５（＋）によって、その特徴を記述することができる。本案において、ＳＢ細胞はＣＤ３４９（＋）体性幹細胞（すなわちＳＢ−１細胞）と、Ｌｇｒ５（＋）体性幹細胞（すなわちＳＢ−２細胞）と、を含む。
【００２０】
卵割球様幹細胞（ＢＬＳＣ）は、細胞核を含む多能性幹細胞であると共に、ＣＤ６６ｅ（＋）細胞である。
一例として、ＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞（すなわち、卵割球様幹細胞）の大きさ（前述細胞の大きさ（Ｚ）の定義を参照する）は、４マイクロメータ、５マイクロメータまたは６マイクロメータ以下または等しい。一例として、０．１〜６マイクロメータ、０．５〜６マイクロメータ、１〜６マイクロメータ、０．１〜５マイクロメータ、０．５〜５マイクロメータ、１〜５マイクロメータ、０．１〜４マイクロメータ、０．５〜４マイクロメータまたは１〜４マイクロメータのいずれかの範囲であっても良い。好ましくは、類卵割球幹細胞の大きさ２ミクロン以上から６ミクロン以下とする。類卵割球幹細胞は細胞（表面）マーカーＣＤ６６ｅを表現できるため、ＣＤ６６ｅ（＋）によって、その特徴を記述することができる。
【００２１】
超小型胚様幹細胞（ＶＳＥＬ）は、細胞核を含む多能性幹細胞であると共にＣＤ１３３（＋）と、ＣＤ３４（＋）体性幹細胞であっても良い。超小型胚様幹細胞ＣＤ１３３（＋）に属する体性幹細胞と、ＣＤ３４（＋）体性幹細胞は、ＣＤ４５（μ）と、Ｌｉｎ（μ）であることが分かる。
一例として、ＣＤ１３３（＋）体性幹細胞の大きさ（前述細胞の大きさ（Ｚ）の定義を参照する）は、４マイクロメータ、５マイクロメータまたは６マイクロメータ以下または等しい。一例として、０．１〜６マイクロメータ、０．５〜６マイクロメータ、１〜６マイクロメータ、０．１〜５マイクロメータ、０．５〜５マイクロメータ、１〜５マイクロメータ、０．１〜４マイクロメータ、０．５〜４マイクロメータまたは１〜４マイクロメータのいずれかの範囲であっても良い。好ましくは、ＣＤ１３３（＋）体性幹細胞と、ＣＤ３４（＋）体性幹細胞の大きさが２ミクロン以上から６ミクロン以下とする。ＣＤ１３３（＋）、ＣＤ４５（−）、Ｌｉｎ（−）多能性幹細胞の例として、この種の超小型胚様幹細胞には、ＣＤ１３３の細胞（表面）マーカーを表現することができるが、ただし、ＣＤ４５とＬｉｎとの２種の細胞（表面）マーカーを表現することができない。さらに、超小型胚様幹細胞はＣＤ１３３（＋）、ＣＤ４５（−）とＬｉｎ（−）によって、その特徴を記述することができる。ＣＤ１３３（＋）、ＣＤ４５（−）、Ｌｉｎ（−）体性幹細胞の例として、この種の超小型胚様幹細胞には、ＣＤ３４の細胞（表面）マーカーを表現することができるが、ただし、ＣＤ４５とＬｉｎとの２種の細胞（表面）マーカーを表現することができない。さらに、超小型胚様幹細胞はＣＤ１３３（＋）、ＣＤ４５（−）とＬｉｎ（−）によって、その特徴を記述することができる。
【００２２】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は細胞核を含む多能性幹細胞であり、かつＣＤ１３（＋）体性幹細胞、ＣＤ２９（＋）体性幹細胞、ＣＤ４４（＋）体性幹細胞、ＣＤ７３（＋）体性幹細胞、ＣＤ９０（＋）体性幹細胞またはＣＤ１０５（＋）体性幹細胞であっても良い。間葉系幹細胞は、ＣＤ１３（＋）体性幹細胞、ＣＤ２９（＋）体性幹細胞、ＣＤ４４（＋）体性幹細胞、ＣＤ７３（＋）体性幹細胞、ＣＤ９０（＋）体性幹細胞、またはＣＤ１０５（＋）体性幹細胞であっても良い。間葉系幹細胞は、以下ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０とＣＤ１０５に示す一種または複数種の細胞（表面）マーカーを表現することができる。従って、間葉系幹細胞はＣＤ１３（＋）、ＣＤ２９（＋）、ＣＤ４４（＋）、ＣＤ７３（＋）、Ｃ９０（＋）とＣＤ１０５（＋）のいずれかの一種または複数種の特徴を有しても良い。間葉系幹細胞は、各種のそれぞれ異なる細胞群体を有しているため、様々な大きさと形状を有している。
一例として、ある種の間葉系幹細胞の大きさ（前述細胞の大きさ（Ｚ）の定義を参照する）は、４マイクロメータ、５マイクロメータまたは６マイクロメータより小さいかまたは等しい。一例として、０．１〜６マイクロメータ、０．５〜６マイクロメータ、１〜６マイクロメータ、０．１〜５マイクロメータ、０．５〜５マイクロメータ、１〜５マイクロメータ、０．１〜４マイクロメータ、０．５〜４マイクロメータまたは１〜４マイクロメータのいずれかの範囲であっても良い。さらに、その他タイプの間葉系幹細胞の大きさ（前述細胞の大きさ（Ｚ）の定義を参照する）は、６マイクロメータ、７マイクロメータまたは１０マイクロメータ以上である。
【００２３】
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、細胞核を有する多能性幹細である。造血幹細胞は、ＣＤ３４（＋）、ｃＫｉｔ（μ）、  ＣＤ３８（μ）、Ｌｉｎ（μ）細胞と、ＣＤ１５０（＋）、ＣＤ２４４（μ）、ＣＤ４８（μ）細胞と、を含む。造血幹細胞は（例えばＣＤ３４（＋）、ｃＫｉｔ（−）、ＣＤ３８（−）、Ｌｉｎ（−）体性幹細胞と、ＣＤ１５０（＋）、ＣＤ２４４（−）、ＣＤ４８（−）体性幹細胞の大きさ（寸法の記述は前述大きさ（Ｚ）の定義を参照する）は、４マイクロメータ、５マイクロメータまたは６マイクロメータより小さいかまたは等しい。
一例として、０．１〜６マイクロメータ、０．５〜６マイクロメータ、１〜６マイクロメータ、０．１〜５マイクロメータ、０．５〜５マイクロメータ、１〜５マイクロメータ、０．１〜４マイクロメータ、０．５〜４マイクロメータまたは１〜４マイクロメータのいずれかの範囲であっても良い。ＣＤ３４（＋）、ｃＫｉｔ（μ）、  ＣＤ３８（μ）、  Ｌｉｎ（μ）体性幹細胞の例として、この種の造血幹細胞には、ＣＤ３４の細胞（表面）マーカーを表現することができるが、ただし、ｃＫｉｔ、ＣＤ３８、Ｌｉｎと３種の細胞（表面）マーカーを表現することができない。よって、この種の造血幹細胞はＣＤ３４（＋）、ｃＫｉｔ（μ）、ＣＤ３８（μ）と、Ｌｉｎ（μ）によって、その特徴を記述することができる。ＣＤ１５０（＋）、ＣＤ２４４（μ）、ＣＤ４８（μ）体性幹細胞の例として、この種の造血幹細胞には、ＣＤ１５０の細胞（表面）マーカーを表現することができるが、ただし、ＣＤ２４４とＣＤ４８の細胞（表面）マーカーを表現することができない。よって、この種の造血幹細胞はＣＤ１５０（＋）、ＣＤ２４４（μ）と、ＣＤ４８（μ）によって、その特徴を記述することができる。
【００２４】
＜行為または方法（Ｘ）に関する説明＞
【００２５】
以下にて、行為または方法（Ｘ）の範例を挙げる。これらの行為または方法は個体（例えば、ヒトの体または非ヒトの体）の体内のある種または特定の数種の幹細胞の数を増やせることが認められている。非ヒトの体は例えば、動物であっても良い。
【００２６】
行為または方法（Ｘ）は、下記の項目を含む。
【００２７】
１．薬物の服用、例えば合成薬物または自然抽出物を含む薬物。
【００２８】
２．薬草または漢方薬の服用、例えば冬虫夏草、朝鮮人参、枸杞、霊芝、ベニクスノキタケ及び／またはアガリクス茸などである。
【００２９】
３．栄養品または栄養補助食品（ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）の服用、係る栄養錠剤または粉末には、以下に示すビタミン（例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＢグループ、ビタミンＢ１２、ビタミンＤ、ビタミンＤ３、ビタミンＥなど）、大量または微量な鉱物質（例えばカルシウム、ナトリウム、カリウム、フッ素、臭素、クロミウム、ヨウ素、珪素、セレニウム、ベリリウム、コバルト、バナジウム、ニッケルなど）、多糖（ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、高分子量フコース含有の糖蛋白質（ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｆｕｃｏｓｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、藻類（クロレラ、藍藻、褐藻など）、フコース（ｆｕｃｏｓｅ）、褐藻の特殊成分−フコイダン（ｆｕｃｏｉｄａｎ）、小分子オリゴフコイダン（ｏｌｉｇｏ  ｆｕｃｏｉｄａｎ）、藻類、褐藻オリゴを含める褐藻（例えば、沖縄県に生息する褐藻）、もずく（Ｍｏｚｕｋｕ）、クロレラ、藍藻、褐藻（もずく、昆布（ｋｅｌｐ）、若布（ｕｎｄａｒｉａ  ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、ヒジキ（ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｆｕｓｉｆｏｒｍｅ）など）、植物化学物質（ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）（例えば、イソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅｓ）、植物エストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）など）、リコペン（ｌｙｃｏｐｅｎｅ）、没食子酸エピガロカテキン（ｅｐｉｇａｌｌｏｃａｔｅｃｈｉｎ  ｇａｌｌａｔｅ，  ＥＧＣＧ）、緑茶エッセンス（ｇｒｅｅｎ  ｔｅａ  ｅｓｓｅｎｃｅ）、糖鎖栄養素（ｇｌｕｃｏｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）（例えば、ガラクトース（Ｇａｌａｃｔｏｓｅ）、キシロース（Ｘｙｌｏｓｅ）、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（Ｍａｎｎｏｓｅ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、アセチルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、アセチルノイラミン酸（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）など）、魚油、チャンチン、植物、葉っぱ、果実、野菜、魚、海藻、または藻類の栄養素いずれかの一種または複数種の物質或いは成分が含まれている。
【００３０】
４．精進食飲食の励行。
【００３１】
５．健康食品または有機食品の摂取。
【００３２】
６．代替（非伝統的な）薬品の服用
【００３３】
７．代替療法または代替治療（例えば、ゲルソン治療（Ｇｅｒｓｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）、ブルース癌症療法（ｔｈｅ  Ｂｒｅｕｓｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｕｒｅ）など）の受け入れ。
【００３４】
８．鍼治療の受け入れ。
【００３５】
９．マッサージ（例えば、足裏マッサージ）の受け入れ。
【００３６】
１０．運動する（例えば、歩行、ジョギング、ダンス、体操、ヨガー、有酸素運動及び／または太極拳など）。
【００３７】
１１．睡眠（その目的は睡眠品質の評価）を取る。
【００３８】
１２．瞑想する。
【００３９】
１３．個人、保健専門家または医師が設計した健康改善計画または疾病治療計画の進行。
【００４０】
１４．体内器官を改善できる栄養補助食品の服用、例えば、前立腺の健康状態を改善できるリコペンの服用。
【００４１】
１５．怪我の治療、治療手術による創傷治療または疾病の治療をするために、リハビリテーション計画の進行。
【００４２】
１６．薬用酒の飲用（薬用酒は一種または複数種の薬材を酒に所定の期間を漬けて作られる）、例えば、朝鮮人参薬用酒（朝鮮人参薬用酒は朝鮮人参を高アルコール濃度の米酒に１か月漬けて作られる）。
【００４３】
１７．政府部門または機関（例えば、米国食品医薬品局）が認可された特定の疾患治療（例えば、癌症、皮膚病、腎臓病など）一種又は多種薬物の服用。
【００４４】
１８．政府部門が認可された特定の疾患治療（例えば、癌症、皮膚病、腎臓病など）一種又は多種方法の受け入れ。
【００４５】
１９．祈祷または神様への礼拝などの宗教活動の取り組みや参与。
【００４６】
２０．太陽光（または日光）の直接または間接照射を受け、照射を受ける時間は例えば、（１）日出前１０分間から日出後５０分間まで（この時間帯に大量な赤外線を有する）の朝時間帯、（２）午前１１時３０分（１１：３０ＡＭ）から午後１２時３０分（１２：３０ＰＭ）まで（この時間帯に大量な紫外線を有する）の昼時間帯、または（３）日没前５０分間から日没後１０分間まで（この時間帯に大量な赤外線を有する）の午後の時間帯。
【００４７】
２１．蛍光灯または発光ダイオード（ＬＥＤ）から出射される光源の照射を受ける。可視光のフルスペクトル（ｓｐｅｃｔｒｕｍ）、赤外線のフルスペクトル、赤光のフルスペクトル、緑光のフルスペクトル、青光のフルスペクトル、紫外線のフルスペクトルまたは前述一種以上が混合された光線のフルスペクトルを含む蛍光灯または発光ダイオードの出射光源の照射。
【００４８】
２２．病気の後、けがの後または手術後に体の治癒力に用いる方法または治療（例えば、高濃度酸素治療）など、体の治癒力改善の計画、治療、方法、機器及び／またはシステムの進行、受け入れ。
【００４９】
２３．例えば、ブラックコーヒーの摂取。
【００５０】
２４．例えば、緑茶、紅茶またはジャスミン茶など、お茶の摂取。
【００５１】
２５．赤ワインの摂取。
【００５２】
２６．メラトニン（ｍｅｌａｔｏｎｉｎ）の服用。
【００５３】
２７．音楽の鑑賞、例えばモーツァルトの交響曲または交響曲或ベートーヴェン交響曲。
【００５４】
２８．フコイダンまたは小分子フコイダンを含む物質の注射を受ける、例えば、フコイダンまたは小分子フコイダンを含む栄養品または健康補助食品。
【００５５】
２９．ホルモン補助剤の服用または注射。
【００５６】
３０．顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ）の注射を受ける。係る因子はサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）またはホルモン（糖蛋白質）であり、骨髄を刺激して果粒球白血球（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ）と幹細胞を生成し、これを血液に放出する。
【００５７】
３１．顆粒球コロニー刺激因子の注射治療を受ける。
【００５８】
３２．（１）各種のアミノ酸（例えば、アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、ヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）、リシン（Ｌｙｓｉｎｅ）、アスパラギン酸（Ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、セリン（Ｓｅｒｉｎｅ）、トレオニン（またはスレオニン、Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、アスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）、システイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、セレノシスチン（Ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ）、トリプトファン（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、アラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）、バリン（Ｖａｌｉｎｅ）、イソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、メチオニン（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）など）、（２）均衡アミノ酸（ｂａｌａｎｃｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）、または（３）９種の体に必要なアミノ酸（ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファンと、バリン）などの栄養補助食品、栄養製品、栄養エキス、栄養飲料、栄養補充剤または栄養食品の摂取。
例として、（ａ）小豆、緑豆または黒豆を含む発酵製品、（ｂ）一種または複数種の果物（甜菜（ｓｕｇａｒ  ｂｅｅｔ）、リンゴ、グアバ、キーウィフルーツ、ぶどう、パイナップル、ドラゴンフルーツ、青パパイヤ、トマト、アボカドなど）を含む発酵物の液体、飲料またドリンクや（ｃ）一種または複数種の薬材を酒に所定の期間を漬けて作られた薬用酒、例えば、朝鮮人参を高アルコール濃度の米酒に１か月漬けて作られる朝鮮人参薬用酒などが挙げられる。
【００５９】
[実施例]
図１の、幹細胞溶液の準備又は製造の方法に関わる６つのステップＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５とＳ６とを参照する。図１に示されるステップＳ１からＳ６を順に追って、進行または実施することによって、幹細胞溶液を準備、獲得または製造することができる。図１を参照する。
ステップ１２において、被治療者（すなわち、個体）の末梢血から血液試料を取り出し、採取、獲得または抽出して、一つ又は多数の２価カチオンキレート剤を含む第１容器（例えば、一つの保存バッグ、一つまたは多数の注射器、一つまたは多数の採血管）に入れた後、血液試料と２価カチオンキレート剤を均一に混合させ、第１容器に血液試料と２価カチオンキレート剤の第１混合液を形成する。本案において、被治療者の末梢血は非胚性組織である。２価カチオンキレート剤は抗凝固剤（ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ）である。
本案において、２価カチオンキレート剤は、例えばＫ２  ＥＤＴＡ抗凝固剤またはＫ３  ＥＤＴＡ抗凝固剤、あるいはクエン酸ナトリウム（ｃｉｔｒａｔｅ）などのエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ，  ＥＤＴＡ）である。各第１容器には７０ミニグラム（ｍｉｌｌｉｇｒａｍ，  ｍｇ）以上の２価カチオンキレート剤、例えば、９０〜９００ミニグラムの２価カチオンキレート剤を含む、１２０〜４５０ミニグラムの２価カチオンキレート剤または１５０〜４００ミニグラムの２価カチオンキレート剤を含む。被治療者は例えばヒト（例えば子供、青少年、成年男子、成年女子または老人）または動物（例えば哺乳動物）であっても良い。係る動物は、霊長類動物（例えば、猿またはゴリラ）、犬、げっ歯動物（例えば、ねずみまたはテンジクネズミ）、ねこ、馬、牛、羊、豚、にわとり、鴨、鵞鳥、鳥または象を含む。
【００６０】
血液試料には大きさ６ミクロン以下または等しい小細胞と、大きさは６ミクロン以上大きい細胞を含む細胞がたくさん含まれている。小さい細胞は、血小板（その大きさは６ミクロン以下）と、小体性感細胞（その大きさは６ミクロン以下または等しい、好ましくは１または２ミクロン以上６ミクロン以下または等しいとする）と、を含む。
例えば、小体性感細胞は、一種または多種の特定体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）、類卵割球幹細胞（すなわちＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）、超小型胚様幹細胞（すなわちＣＤ１３３（＋）体性幹細胞とＣＤ３４（＋）体性幹細胞）と、を含む。大きい細胞は例えば、大きさは６ミクロン以上大体性感細胞および赤血球と、白血球等の細胞系譜（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｅｌｌ）と、を含む。血液試料の量（体積）は、２０、３０または４５ミリリットル以上または等しい、例えば、２０〜２５０ミリリットル、６０〜５００ミリリットル、８０〜２５０ミリリットルまたは１００〜２００ミリリットル。第１混合液を獲得または形成するため、１ミリリットルの血液試料には１．５ミニグラムまたは以上（好ましくは１．６〜２．０ミニグラムとする）の２価カチオンキレート剤（例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｋ３  ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウム）を混合しても良い。
前述した一種または多種の特定体性幹細胞（以下、「特定体性幹細胞」という。）は例えば、前述「幹細胞定義」した一種又は多種の幹細胞かまたはこれを含む。また、特定体性幹細胞は例えば、大きさ１μｍ〜６μｍ（好ましくは、１μｍ〜６μｍまたは１μｍ以上６μｍ以下とする）の体性幹細胞、例えば、ＳＢ−１細胞、ＳＢ−２細胞、類卵割球幹細胞、超小型胚様幹細胞、間葉系幹細胞および／または造血幹細胞を含むことができる。もしくは、特定体性幹細胞は大きが６μｍ以下（好ましくは、２μｍ以上から６μｍ以下とする）の体性幹細胞、例えばＣＤ３４９（＋）体性幹細胞（すなわちＳＢ−１細胞）及び／またはＬｇｒ５（＋）体性幹細胞（すなわちＳＢ−２細胞）及び／またはＣＤ６６（＋）体性幹細胞（すなわち類卵割球幹細胞）を含むことができる。
【００６１】
ステップＳ２において、第１混合液を温度２〜１２℃（好ましくは２〜７℃または約４℃とする）の設備に（所定）時間例えば、３〜７２時間、好ましくは３〜６時間、６〜７２時間、６〜４８時間、１６〜７２時間、１６〜４８時間、３６〜６０時間または４８〜７２時間静置する。前述設備は例えば、冷蔵庫または物品を低温に維持できる装置である。
前述の（所定）時間静置した第１混合液のうち、特定体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）は２価カチオンキレート剤（例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡ、Ｋ３  ＥＤＴＡまたはクエン酸ナトリウム）によって活性化される。言い換えれば、特定体性幹細胞の細胞周期はＧ０期から（またはに進行という）Ｇ１期に活性化される。）係る活性化作用は、２価カチオンキレート剤（例えば、Ｋ２  ＥＤＴＡまたはＫ３  ＥＤＴＡ）によるｐ５３機能の抑制能力（キレートＺｎ２＋）による）と関係あり、ｐ５３の抑制機能によって、特定体性幹細胞をＧ０静止期から細胞周期Ｇ１に進行される。Ｐ５３タンパク質はＺｎ２＋を取り入れなければ機能タンパク質を適切に折り畳むことはできない。よって、２価カチオンキレート剤によってＺｎ２＋をキレートすることは、特定体性幹細胞活性化のキーステップである。このほか、２価カチオンキレート剤は、他の２価イオン（例えば、Ｃａ２＋）のキレートによって、Ｇ０期の特定体性幹細胞を活性化させることもできる。
【００６２】
第１混合液を前述温度、かつ前述の（所定）時間を維持された後、第１混合液が重力により、２層または以上に分ける。すなわち、第１混合液に２つまたは以上の分離層が形成（例えば、上部分離層と下部分離層）される。これらの分離層の一つは、例えば上部分離層または最上層の分離層は、上清液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ  ｌｉｑｕｉｄ）であり、かつ血小板（大きさは６ミクロン以下）と、血清（ｓｅｒｕｍ）と、小体性感細胞と、３つの部分に分けられる。そのうち、小体性感細胞は特定体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）、類卵割球幹細胞（すなわちＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）、超小型胚様幹細胞（すなわちＣＤ１３３（＋）体性幹細胞とＣＤ３４（＋）体性幹細胞）と、を含む。
上清液の量（体積）は例えば、６ミリリットル〜１２０ミリリットル、２０ミリリットル〜２５０ミリリットル、４０ミリリットル〜１２５ミリリットルまたは５０ミリリットル〜１００ミリリットルである。前述分離層のうち、上清液は２価カチオンキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）及び／または成長因子を含めても良い。これらの分離層のもう一つの層は例えば、下部分離層に第１混合液の大多数または非常に高い百分比の大きい細胞（赤血球と白血球等の系譜細胞および大体性感細胞を含む）を含む。例えば、当該もう一つの分離層に第１混合液の９５％、９８％、９９％または以上の大きい細胞を含む。よって、上清液は大概大きい細胞（例えば、赤血球と白血球）を含まないか、または第１混合液のうち、０．５％、１％、２％または５％以下の大きい細胞を含む。
例えば、上清液は第１混合液に１％または２％以下の赤血球と、第１混合液に１％または２％以下の白血球を含む。第１混合液は少なくとも９８％または９９％の赤血球と、第１混合液に少なくとも９８％または９９％の白血球は前述もう一つの分離層（例えば下部分離層）に集合される。上清液の量（体積）を血液試料の量（体積）に割り計算して、得られた比は１／３〜１／２である。上清液の量（体積）を第１混合液の量（体積）に割り計算して、得られた比は１／３〜１／２である。以上をまとめると、ステップ１２とステップ２１によれば、被治療者由来の血液試料と２価カチオンキレート剤を前述温度で前述の（所定）時間を培養または育成し、血液試料を２層またはそれ以上に分ける。すなわち血液試料に２つまたはそれ以上の分離層を形成（それらの分離層は上清液を含む）される。
【００６３】
ステップＳ３において、ほとんどの部分またはほぼすべての上清液を第２容器（例えば、一つの保存バッグ、一つのバイアルまたは一つの注射器）に集合または移す。第２容器の上清液（以下、「第２混合液」という）に小さい細胞、例えば血小板と小体性感細胞を含む。そのうち、小体性感細胞は特定体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）、類卵割球幹細胞（すなわちＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）、超小型胚様幹細胞（すなわちＣＤ１３３（＋）体性幹細胞とＣＤ３４（＋）体性幹細胞）と、を含む。
大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の体性幹細胞が第２混合液における数量は、１０００万個または３０００万個以上または等しい、好ましくは２５００万〜３００００万個、３０００万〜５００００万個または１０００万〜５００００万個である。第２混合液は２価カチオンキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）及び／または成長因子を含めても良い。細胞混合液において、大きい細胞の数量がすべての粒子または細胞の数量に占める百分比は５％、１％、または０．５％（好ましくは０．１％または０．０１％以下）以下、小さい細胞の数量がすべての粒子または細胞の数量に占める百分比は９５％、９９％または９９．５％（好ましくは９９．９％または９９．９９％以上）以上である。
【００６４】
図６Ａと図６Ｂの資料に基づき、１ミリリットルの細胞混合液の赤血球数を算出できる。図６Ａはフローサイトメーターを用いて、１０マイクロリットル（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ，  μｌ）の細胞混合液を分析して得られた。赤血球はすなわちＣＤ２３５ａ（＋）細胞であり、図６ＡのゾーンＲ３に分布されている。ゾーンＲ３の細胞合計数は２５０００である。
図６Ｂは、ゾーンＲ３に関連するすべての細胞のＣＤ２３５ａ蛍光強度分布を示す。図６Ｂにおいて、蛍光直方図が垂線２ａ（すなわち参考線）によって、低い蛍光強度ゾーンＶ３−Ｌと、高い蛍光強度ゾーンＶ３−Ｒに分けられている。図６ＢのゾーンＶ３−Ｒは細胞がＣＤ２３５ａ染色に対して陽性を示す、すなわち赤血球である。図６ＢのゾーンＶ３−Ｌは細胞がＣＤ２３５ａ染色に対して陰性を示す。
図６Ｂの結果から、ゾーンＲ３の赤血球数がゾーンＲ３の細胞総数に占める百分比は０．１％を示す。ゾーンＲ３の細胞総数（すなわち２５０００）をゾーンＲ３の赤血球数がゾーンＲ３の細胞総数に占める百分比（すなわち０．１％）を乗じた場合は、１０マイクロリットル第２混合液の赤血球数（２５）を算出できる。その後、１０マイクロリットルの細胞混合液の赤血球数を用いて、１ミリリットルの第２混合液の赤血球数を計算し、算出した数量は２５００である。
前述の結果から分かるように、１ミリリットルの第２混合液の赤血球数が１０５または１０４であることが分かる。好ましくは、１ミリリットルの細胞混合液の赤血球数が１０３以下であることが分かる。このほか、細胞混合液において、赤血球の大きさが２ミクロン以上１０ミクロン以下の細胞に占める百分比は３％以下、好ましくは２％、１％または０．５％以下が良い。
【００６５】
図６Ｃのフローサイトメーター資料に基づき、１ミリリットルの細胞混合液の白血球数を算出できる。図６Ｃのフローサイトメーター資料は、フローサイトメーターを用いて、５０マイクロリットルの細胞混合液を分析して得られたものである。
図６Ｃにおいて、ゾーンＲ１は、白血球分析するために設けられた通門（ｇａｔｉｎｇ）である。５０マイクロリットルの細胞混合液に含む白血球数は、図６Ｃのフローサイトメーター資料より獲得し、算出した数は３０である。その後、５０マイクロリットルの細胞混合液の白血球数を用いて、１ミリリットルの細胞混合液の白血球数を計算し、算出した数量は６００である。前述の結果から分かるように、１ミリリットルの細胞混合液の赤血球数が１０４または１０３以下であることが分かる。好ましくは、１ミリリットルの細胞混合液の白血球数は１０２以下が良い。このほか、細胞混合液において、白血球の大きさが２ミクロン以上２０ミクロン以下の細胞に占める百分比は２％以下、好ましくは１％、０．５％または０．１％以下が良い。
【００６６】
図７Ａの、前方散乱係数（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＦＳＣ）対側方散乱係数（ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ，ＳＳＣ）のフローサイトメトリーのドットプロット（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｄｏｔ  ｐｌｏｔ）を参照する。図７Ａのドットプロットは、フローサイトメトリーを用いて、５．６マイクロリットルの細胞混合液を分析して得られたものである。図７Ａにおいて、大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞がゾーンＲ５に分布されている。言い換えれば、ゾーンＲ５すべての細胞の大きさは、２ミクロン以上から６ミクロン以下である。
図７Ｂは、ゾーンＲ５に関連するすべての細胞のＣＤ６１蛍光強度分布を示す。図７Ｂにおいて、蛍光直方図が垂線（すなわち参考線）によって、低い蛍光強度ゾーンＶ１−Ｌと、高い蛍光強度ゾーンＶ１−Ｒに分けられている。図７ＢのゾーンＶ１−Ｒは細胞がＣＤ６１染色に対して陽性を示す、すなわち血小板である。図７ＢのゾーンＶ１−Ｌは細胞がＣＤ６１染色に対して陰性を示す。
図７Ｂの結果から、ゾーンＲ５の血小数がゾーンＲ５の細胞総数に占める百分比は８０．５％を示す。よって、細胞混合液において、血小板の大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は７５％または８０％以上、好ましくは７５％〜８５％が良い。
【００６７】
図７Ｃと７Ａは、ゾーンＲ５に関連するすべての細胞のＣＤ１３３蛍光強度分布を示す。図７Ｃにおいて、蛍光直方図が垂線（すなわち参考線）によって、低い蛍光強度ゾーンＶ３−Ｌと、高い蛍光強度ゾーンＶ３−Ｒに分けられている。図７ＣのゾーンＶ３−Ｒは細胞がＣＤ１３３染色に対して陽性を示す、すなわち超小型胚様幹細胞である。図７ＣのゾーンＶ３−Ｌは細胞がＣＤ１３３染色に対して陰性を示す。
図７Ｃの結果から、ゾーンＲ５のＣＤ１３３（＋）細胞数がゾーンＲ５の細胞総数に占める百分比は０．３％を示す。前述から分かるように、細胞混合液のうち、１％以下の細胞がＣＤ１３３を表現される。
図７Ｄと７Ａは、ゾーンＲ５に関連するすべての細胞のＣＤ３４蛍光強度分布を示す。図７Ｄにおいて、蛍光直方図が垂線（すなわち参考線）によって、低い蛍光強度ゾーンＶ１−Ｌと、高い蛍光強度ゾーンＶ１−Ｒに分けられている。図７ＤのゾーンＶ１−Ｒは細胞がＣＤ１３３染色に対して陽性を示す、すなわち超小型胚様幹細胞である。図７ＤのゾーンＶ１−Ｒは細胞がＣＤ３４染色に対して陰性を示す。
図７Ｄの結果から、ゾーンＲ５のＣＤ３４（＋）細胞数がゾーンＲ５の細胞総数に占める百分比は０．４％を示す。このほか、細胞混合液において、ＣＤ１３３（＋）細胞とＣＤ３４（＋）細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は２％以下、好ましくは１％、または０．５％以下が良い。
【００６８】
図７Ｅと７Ａは、ゾーンＲ５に関連するすべての細胞のＣＤ６６ｅ蛍光強度分布を示す。図７Ｅにおいて、蛍光直方図が垂線（すなわち参考線）によって、低い蛍光強度ゾーンＶ２−Ｌと、高い蛍光強度ゾーンＶ２−Ｒに分けられている。図７ＥのゾーンＶ２−Ｒは細胞がＣＤ６６ｅ染色に対して陽性を示す、すなわち類卵割球幹細胞である。図７ＥのゾーンＶ２−Ｒは細胞がＣＤ６６ｅ染色に対して陰性を示す。
図７Ｅの結果から、ゾーンＲ５のＣＤ６６ｅ（＋）細胞数がゾーンＲ５の細胞総数に占める百分比は４％を示す。このほか、細胞混合液において、ＣＤ６６ｅ（＋）細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は６％以下、好ましくは５％、または４．５％以下が良い。
【００６９】
図７Ｆと７Ａは、ゾーンＲ５に関連するすべての細胞のＣＤ３４９蛍光強度分布を示す。図７Ｃにおいて、蛍光直方図が垂線（すなわち参考線）によって、低い蛍光強度ゾーンＶ３−Ｌと、高い蛍光強度ゾーンＶ３−Ｒに分けられている。図７ＦのゾーンＶ３−Ｒは細胞がＣＤ３４９染色に対して陽性を示す、すなわちＳＢ−１細胞である。図７ＦのゾーンＶ３−Ｌは細胞がＣＤ３４９染色に対して陰性を示す。
図７Ｃの結果から、ゾーンＲ５のＣＤ３４９（＋）細胞数がゾーンＲ５の細胞総数に占める百分比は５．６％を示す。このほか、細胞混合液において、ＣＤ３４９（＋）細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は４％または５％以上、好ましくは４．５％〜１０％。
【００７０】
図７Ｇと７Ａは、ゾーンＲ５に関連するすべての細胞のＬｇｒ５蛍光強度分布を示す。図７Ｅにおいて、蛍光直方図が垂線（すなわち参考線）によって、低い蛍光強度ゾーンＶ２−Ｌと、高い蛍光強度ゾーンＶ２−Ｒに分けられている。図７ＧのゾーンＶ２−Ｒは細胞がＬｇｒ５染色に対して陽性を示す、すなわちＳＢ−２細胞である。図７ＧのゾーンＶ２−Ｌは細胞がＬｇｒ５染色に対して陰性を示す。
図７Ｇの結果から、ゾーンＲ５のＬｇｒ５（＋）細胞数がゾーンＲ５の細胞総数に占める百分比は５．４％を示す。このほか、細胞混合液において、Ｌｇｒ５（＋）細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は４％または５％以上、好ましくは、Ｌｇｒ５（＋）細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は４％または５％以上、好ましくは４．５％〜１０％が良い。
【００７１】
ステップＳ４において、細胞混合液（すなわち、第２容器にある上清液）を適切な回転速度（例えば、毎分の回転数（ｒｐｍ）を１，２００回転に等しいかまたはより速いから３，０００回転に等しいかまたはより遅いに回転させる。好ましくは、１，４００回転に等しいかまたはより速いから２，０００回転に等しいかまたはより遅い）で、適切な時間（例えば、１０分に等しいかまたはより長いから、２５分に等しいかまたはより短い、好ましくは、１５分に等しいかまたはより長いから、２０分に等しいかまたはより短い）を遠心分離させ、細胞混合液に懸濁された複数の顆粒を第２容器の底部に沈積または集合させる。
言い換えれば、遠心分離した後の細胞混合液は、遠心された液体（以下「遠心液体」という）と、それらの顆粒の２つの主な部分をまとめることができる。そのうち、遠心液体は第２容器に収められ、それらの顆粒は第２容器の底部、遠心液体と、遠心液体の底部に集合または沈積される。それらの顆粒は、前述した小さい細胞、例えば血小板と小体性感細胞を含む。そのうち、小体性感細胞は特定体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）、類卵割球幹細胞（すなわちＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）、超小型胚様幹細胞（すなわちＣＤ１３３（＋）体性幹細胞とＣＤ３４（＋）体性幹細胞）と、を含む。
【００７２】
このほか、図６Ａ〜図６Ｃと図７Ａ〜図７Ｇの結果から、以下の数値を算出、仮定、推測することができる。
それらの顆粒のうち、ＳＢ−１細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は４％または５％（好ましくは４．５％〜１０％）以上、ＳＢ−２細胞は大きさ２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は４％または５％（好ましくは４．５％〜１０％とする）以上、類卵割球幹細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は６％（好ましくは５％または４．５％以下とする）以下、超小型胚様幹細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は２％（好ましくは１％または０．５％以下とする）以下、血小板は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は７５％または８０％（好ましくは７５％〜８５％とする）以上、白血球は大きさが２ミクロン以上２０ミクロン以下の細胞に占める百分比は２％（好ましくは１％、０．５％または０．１％以下とする）以下、赤血球は大きさが２ミクロン以上１０ミクロン以下の細胞に占める百分比は３％（好ましくは２％、１％または０．５％以下とする）以下とする。このほか、それらの顆粒のうち、１％以下の細胞以下の細胞からＣＤ１３３が表現される。
【００７３】
ステップＳ５において、すべてのまたは最上部にある遠心液体を第２容器から取り除く。ただし、第２容器の底部、遠心液体の中及び遠心液体の底部に残されたそれらの顆粒は、なお第２容器に、または第２容器に残された遠心液体の底部に集合または沈積させる。引き続き、Ｓ６に進み、適量の緩衝液または液体を第２容器に加えた後に、第２容器に残されたそれらの顆粒を再び液体溶液（例えば、当該緩衝液または液体そのものあるいはそれを含む）に懸濁させ、幹細胞溶液（または幹細胞混合液を言う）を形成させる。幹細胞溶液にそれらの顆粒、例えば、血小板と小体性感細胞を含む。そのうち、小体性感細胞は特定体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）、類卵割球幹細胞（すなわちＣＤ６６ｅ（＋）体性幹細胞）、超小型胚様幹細胞（すなわちＣＤ１３３（＋）体性幹細胞とＣＤ３４（＋）体性幹細胞）と、を含む。一部の場合（例えば、ステップＳ５は最上部の遠心液体を取り除く）において、前述した液体溶液は底部の遠心液体（すなわち、第２容器に残され遠心液体）を含めても良い。
それらの顆粒を再び当該液体または溶液に懸濁させるステップを経た後、当該液体または溶液はそれらの顆粒を含むと共に、それらの顆粒と一体に混合される。前述した緩衝液または液体は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）、例えば（ダルベッコ）リン酸緩衝生理食塩水[（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ]を含めても良い。または、前述した緩衝液または液体は、カルシウムを有しないイオン（Ｃａ２＋）溶液あるいは培養液であるかまたは含めても良い。カルシウムを有しないイオンの溶液または培養液は例えば塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液のほか、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）などいずれか他の２価イオンを含有しなくても良い。
前述した塩化ナトリウムを含む溶液、例えば、生理食塩水（ｎｏｒｍａｌ  ｓａｌｉｎｅ）であっても良い。生理食塩水は一般として、重量／体積百分比０．９％の塩化ナトリウム溶液を言い、約３００ｍＯｓｍ／Ｌまたは１リットルあたりに９．０グラムを含むものを指す。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）は、例えば、塩化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）と、リン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と、リン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である。一部の配合において、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）はリン酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）と、マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ）カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ）とをさらに含んでいる。
【００７４】
もう一つの凡例において、本発明は、第２容器に残されたそれらの顆粒を再び底部の遠心液体（すなわち、第２容器に残された遠心液体）に懸濁させ、それらの顆粒を含む幹細胞溶液（または幹細胞混合液）を形成することができる。この凡例において、ステップＳ６で触れた、適量の緩衝液または液体を第２容器に加わるステップを省略してもよい。
【００７５】
本発明において、幹細胞溶液の濃度は、例えば、１ミリリトル当たりに１０６〜１０７のＳＢ細胞（すなわち、ＳＢ−１細胞と、ＳＢ−２細胞）を含ませることができる。このほか、図６Ａ〜図６Ｃと図７Ａ〜図７Ｇの結果から、以下の数値を算出、仮定、推測することができる。
幹細胞溶液のうち、ＳＢ−１細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は４％または５％（好ましくは４．５％〜１０％）以上、ＳＢ−２細胞は大きさ２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は４％または５％（好ましくは４．５％〜１０％）以上、類卵割球幹細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は６％（好ましくは５％または４．５％以下）以下、超小型胚様幹細胞は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は２％（好ましくは１％または０．５％以下）以下、血小板は大きさが２ミクロン以上６ミクロン以下の細胞に占める百分比は７５％または８０％（好ましくは７５％〜８５％）以上、白血球は大きさが２ミクロン以上２０ミクロン以下の細胞に占める百分比は２％（好ましくは１％、０．５％または０．１％以下）以下、赤血球は大きさが２ミクロン以上１０ミクロン以下の細胞に占める百分比は３％（好ましくは２％、１％または０．５％以下）以下とする。
このほか、幹細胞溶液のうち、１％以下の細胞からＣＤ１３３が表現される。幹細胞溶液のうち、１ミリリットルの白血球数は１０４または１０３以下とし、好ましくは１０２以下とする。幹細胞溶液のうち、１ミリリットルの赤血球数は１０５または１０４以下とし、好ましくは１０３以下とする。一部の場合（例えばステップＳ５は、液体の上部を除去するために遠心分離される。）において、幹細胞溶液は二価カチオンキレート剤（エチレンジアミン四酢酸二カリウム塩及び／または成長因子を含む。
【００７６】
もう一つの実施例において、図２に示すように、本発明は、ステップＳ１を実施または進行させ前に、ステップＳ１１とステップＳ１２を先に実施または進行させることができる。ステップＳ１１において、例えば前述した行為または方法（Ｘ）のいずれかの一つを被治療者に所定の行為または方法を行わせる。例えば、被治療者をステップＳ１１において、フコイダンを含む化合物の幹細胞駆動剤を服用又は摂取させる。係るフコイダンを含む化合物は、例えば褐藻補助剤である。
図３はフコイダン補助剤の内容／成分情報を示す。図３に示すように、一錠のフコイダン補助剤は、８０重量パーセントのもずく粉末（ｍｏｚｕｋｕ  ｐｏｗｄｅｒ）と、１５重量パーセントの結晶セルロース（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）と、３重量パーセントのショ糖脂肪酸エステル（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒｓ）と、２重量パーセントの精細シリカを含む。もずく粉末は例えば、沖縄県周辺海域で生息しているもずく褐藻（一種の海藻）から抽出（または取り出す）するものである。
引き続き、もずく粉末に結晶セルロースと、ショ糖脂肪酸エステルと、精細シリカとを混合すれば、フコイダン補助剤（０．１グラムのフコイダンを含む）の錠剤を獲得するうことができる。ステップＳ１１において、被治療者に２０錠または以上（例えば少なくとも３０錠）のフコイダン補助剤を服用又は摂取させる。つまり、被治療者に２グラムまたは以上（例えば、少なくとも３グラム）のフコイダンを服用又は摂取させる。あるいは、ステップＳ１１において、被治療者に顆粒球コロニー刺激因子（一種の幹細胞駆動剤）を注射させるか、または顆粒球コロニー刺激因子の注射治療を受けさせる。
【００７７】
図１のステップＳ１２において、被治療者に前述行為または方法を行わせたかまたは受け入れさせた（すなわち、ステップＳ１１を行わせる）後、例えば１５〜６０分、２０〜１００分、３０分〜４時間、６０〜９０分、０．５分〜３時間、１〜６時間、１〜１２時間、１２〜３６または３６〜５０時間の所定（予定の）時間待機させる。
ステップＳ１１とステップＳ１２によって、前述した特定の体性幹細胞（例えばＳＢ細胞）を被治療者の骨髄から被治療者の末梢血に流せて、被治療者の末梢血を特定の体性幹細胞をたくさん含ませることができる。ステップＳ１２を実施した後、順を追って、図１に示すステップＳ１からステップＳ６を実施または進行させた後に、前述した幹細胞溶液を獲得する。
【００７８】
図４に示すものは、ある実験において、６名のヒト被験者Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、ＹとＰの幹細胞資料を示す図であり、これらの幹細胞資料は被験者Ｃ、Ｌ、Ｍ、Ｗ、ＹとＰの末梢血から採取したものである。この実験において、被験者Ｃ、Ｌ、Ｍ、ＷとＹにそれぞれ２０錠の図３に記述したフコイダン補助剤を経口に服用させる。言い換えれば、被験者Ｃ、Ｌ、Ｍ、ＷとＹにそれぞれ経口方式により、少なくとも２グラムのフコイダンを服用させる。被験者Ｐは、この実験において対照群（コントロール群）としており、よって、前述のフコイダン補助剤を服用していない。
図４において、０ｈｒは被験者Ｃ、Ｌ、Ｍ、ＷとＹにとって、「フコイダン服用前」を言い、被験者Ｐにとって、「対照試験開始するとき」を言う。１．５ｈｒは被験者Ｃ、Ｌ、Ｍ、ＷとＹにとって、「フコイダン服用後１．５時間」を言い、被験者Ｐにとって「対照試験開始後１．５時間」を言う。２４ｈｒは被験者Ｃ、Ｌ、Ｍ、ＷとＹにとって、「フコイダン服用後２４時間」を言い、被験者Ｐにとって「対照試験開始後２４時間」を言う。図４に示すように、ＣＤ３４９（＋）細胞とＬｇｒ５（＋）細胞（すなわちＳＢ細胞）の数量はフコイダン服用後１．５時間に顕著な増加を示しているのに対して、一方、ＣＤ３４９（＋）細胞とＬｇｒ５（＋）細胞の数量は対照試験開始後１．５時間に顕著な増加は見られない。従って、フコイダンを服用または摂取することによって（例えば、フコイダン補助剤）ＳＢ細胞（例えば、ＣＤ３４９（＋）細胞と、Ｌｇｒ５（＋）細胞）を駆動し、末梢血または血液に流せて、末梢血または血液にＳＢ細胞をたくさん含ませることができる。
【００７９】
図５Ａにおいて、第１血液試料のうち、Ｌｇｒ５（＋）細胞（すなわちＳＢ−２細胞）のフローサイトメーター数値を示す。そのうち、第１血液試料はヒト被験者が錠粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）の注射治療を受ける前の末梢血から採取される。図５Ｂにおいて、第２血液試料のうち、Ｌｇｒ５（＋）細胞のフローサイトメーター数値を示す。そのうち、第２血液試料はヒト被験者が錠粒球コロニー刺激因子の注射治療を受けた後の末梢血から採取される。前述の錠粒球コロニー刺激因子の注射治療は、５日連続して１日体重１キロ当たりに５マイクログラム（すなわち５ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ／ｋｇ／ｄａｙ）分量の錠粒球コロニー刺激因子を注射する。この実験において、ヒト被験者５日に連続して、毎日に１回の分量は５ｍｉｃｒｏｇｒａｍｓ／ｋｇ／ｄａｙの錠粒球コロニー刺激因子を注射する。第２血液試料は、被験者が最後の回に錠粒球コロニー刺激因子を注射後約３．５時間の末梢血から採取される。
図５Ａと図５Ｂの、フローサイトメーターから得られた結果または数値を参照する。図５Ａと図５Ｂにおいて、ゾーンＱ５−ＬＲのうち、黒点はＬｇｒ５（＋）細胞を示す。第１血液試料より得られた図５Ａにおいて、ゾーンＱ５−ＬＲのＬｇｒ５（＋）細胞数量がゾーンＱ５−ＵＬ、Ｑ５−ＵＲ、Ｑ５ＬＬとＱ５ＬＲのすべての粒子または細胞数量に占める百分比は１．６％である。第２血液試料より得られた図５Ｂにおいて、ゾーンＱ５−ＬＲのＬｇｒ５（＋）細胞数量がゾーンＱ５−ＵＬ、Ｑ５−ＵＲ、Ｑ５ＬＬとＱ５ＬＲのすべての粒子または細胞数量に占める百分比は８％である。従って、錠粒球コロニー刺激因子を注射することによって、ＳＢ細胞（特にＬｇｒ５（＋）細胞）を駆動し末梢血または血液に流せて、末梢血または血液にＳＢ細胞をたくさん含ませることができる。
【００８０】
前述した結果または数値から分かるように、ステップＳ１１の行為または方法（例えば、フコイダン補助剤の摂取または錠粒球コロニー刺激因子の注射治療を受ける）は、特定体性幹細胞（例えば、ＳＢ細胞）を被治療者の末梢血に駆動させ、被治療者の末梢血が前述した行為または方法を行わせるかまたは受け入れさせた後のある時点（例えば、１．５時間または１〜６時間）に特定体性幹細胞の数量を増加させることができる。よって、ステップＳ１１とステップＳ１２によって、被治療者の末梢血に特定体性幹細胞、例えば、ＳＢ−１細胞および／またはＳＢ−２細胞をたくさん含ませることができる。
【００８１】
一実施例において、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、準備、獲得または製造された幹細胞溶液は、骨移植術（ｂｏｎｅ  ｇｒａｆｔ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に用いることができる。骨移植術は、欠損組織（ｌｏｓｔ  ｔｉｓｓｕｅ）または不十分な組織（ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｉｓｓｕｅ）の再建に用いることができる。
本実施例において、骨移植術は、（骨）移植部材と、前述した幹細胞溶液とを混合して、（骨）移植部材と幹細胞溶液とを含む第２溶液を形成または作り出し、有効量の第２混合液を前述した被治療者（以下「第１個体」という）またはもう一人の被治療者（以下「第２個体」という）に例えば第１または第２個体の歯槽骨（ａｌｖｅｏｌａｒ  ｂｏｎｅ）を投与する。第２個体は例えば、第１個体と同じ生体分類の種（例えば、ヒト）か、または第１個体と異なる生体分類の種である。例えば、第１個体を哺乳動物（例えば、豚）とし、第２個体はヒトであっても良い。前述した、（骨）移植部材は例えば、人工骨（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｅｒｉａｌ）、処理済みの提供材料（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｍａｔｅｒｉａｌ）または第１個体自らの自家骨（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ）である。骨移植術は例えば、歯科インプラント治療（ｄｅｎｔａｌ  ｉｍｐｌａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）など、骨または関節関連治療に用いることができる。
骨移植術が歯科インプラント治療に用いられた場合、骨移植術の実行を完了した後に、歯科インプラント部材（ｄｅｎｔａｌ  ｉｍｐｌａｎｔ）が第１または第２個体の歯槽骨に取り付けられる。第１または第２個体の歯槽骨に入れた第２混合液が骨の成長を刺激し、歯の移植体に稠密、丈夫なベースを築き上げる。
【００８２】
もう一つの実施例において、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、準備、獲得または製造された幹細胞溶液は、歯科インプラント治療に用いることができる。当該歯科インプラント治療は、（１）歯の移植体に対する処理ステップと、（２）処理済みの歯の移植体（雄ねじ（または螺旋状）に多孔性酸化チタン層（ａ  ｐｏｒｏｕｓ  ｔｉｔａｎｉｕｍ−ｏｘｉｄｅ  ｌａｙｅｒ）を有する）を第１または第２個体の歯槽骨にねじ込むステップを有する。
歯の移植体に対する処理ステップは、多孔性酸化チタン層に前述した幹細胞溶液を含ませるステップを含み、その方法として、歯の移植体を幹細胞溶液に浸すかまたは幹細胞溶液を多孔性酸化チタン層に塗布または滴下する。第２個体は例えば、第１個体と同じ生体分類の種（例えば、ヒト）か、または第１個体と異なる生体分類の種である。例えば、第１個体は例えば、哺乳動物（例えば、豚）であり、第２個体はヒトである。多孔性酸化チタン層は、複数のマイクロメータクラスの気孔（ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｐｏｒｅ）、複数のサブミクロンクラスの気孔（ｓｕｂ−ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ  ｐｏｒｅ）と、複数のナノメートルクラスの気孔（ｎａｎｏｍｅｔｅｒ  ｐｏｒｅ）がその中に有しており、そのうち、多孔性酸化チタン層の粗さは、１００ナノメートル（ｎｍ）以上、２００ナノメートルまたは３００ナノメートル。例えば、２００〜７００ナノメートル、あるいは３００〜５００ナノメートルである。歯の移植体を第１または第２個体の歯槽骨にねじ込み、所定期間を経過した後、幹細胞溶液によって、ナノ細孔（ｎａｎｏ−ｈｏｌｅ）と、マイクロ細孔（ｍｉｃｒｏ  ｈｏｌｅ）の多孔性構造を多孔性酸化チタン層と歯槽骨との間の形成を増強する。本実施例において、多孔性酸化チタン層は例えば、歯科移植体の雄ねじのチタン金属表面に形成される。
【００８３】
もう一つの実施例において、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、準備、獲得または製造された幹細胞溶液は、歯科インプラント治療に用いることができる。当該歯科インプラント治療は、（１）歯の移植体に対する処理ステップと、（２）処理済みの歯の移植体を第１または第２個体の歯槽骨にねじ込むステップを含む。
歯の移植体に対する処理ステップは、歯の移植体の雄ねじ（または螺旋状）のチタン金属表面に前述した幹細胞溶液を含ませるステップを含む、その方法として、歯の移植体を幹細胞溶液に浸すかまたは幹細胞溶液を多孔性酸化チタン層に塗布または滴下する。第２個体は例えば、第１個体と同じ生体分類の種（例えば、ヒト）か、または第１個体と異なる生体分類の種である。例えば、第１個体は例えば、哺乳動物（例えば、豚）であり、第２個体はヒトである。チタン金属の表面粗さは５０ナノメートル（ｎｍ）または１００ナノメートル以下、例えば、２０〜８０ナノメートルあるいは３０〜４５ナノメートルとする。
歯の移植体を第１または第２個体の歯槽骨にねじ込み、所定期間を経過した後、幹細胞溶液によって、酸化チタン層と歯槽骨との間にマイクロホール構造が形成される。
【００８４】
もう一つの実施例において、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、準備、獲得または製造された幹細胞溶液は、歯科インプラント治療に用いることができる。当該歯のインプラント治療は、歯の移植体をねじ込み方式により、第１または第２個体の歯槽骨にねじ込みステップを含む。
そのうち、歯の移植体を雄ねじ（または螺旋状）に形成した上、幹細胞溶液を歯の移植体の露出部分（すなわち、歯の移植体の最上部）に塗布または滴下することにより、幹細胞溶液が歯の移植体の多孔性酸化チタン層と、第１または第２個体の歯槽骨との間の表面に流れて、歯の移植体の多孔性酸化チタン層と、第１または第２個体の歯槽骨との間に幹細胞溶液を含ませる。第２個体は例えば、第１個体と同じ生体分類の種（例えば、ヒト）か、または第１個体と異なる生体分類の種である。例えば、第１個体は例えば、哺乳動物（例えば、豚）であり、第２個体はヒトである。多孔性酸化チタン層は、複数のマイクロメータクラスの気孔、複数のサブミクロンクラスの気孔と、複数のナノメートルクラスの気孔がその中に有しており、そのうち、多孔性酸化チタン層の粗さは、１００ナノメートル（ｎｍ）以上、２００ナノメートルまたは３００ナノメートル。例えば、２００〜７００ナノメートル、あるいは３００〜５００ナノメートルである。
幹細胞溶液が多孔性酸化チタン層と歯槽骨との間に所定期間を滞留した後、幹細胞溶液によって、ナノ細孔と、マイクロ細孔の多孔性構造を多孔性酸化チタン層と歯槽骨との間の形成を増強される。本実施例において、多孔性酸化チタン層は例えば、歯科移植体の雄ねじのチタン金属表面に形成される。
【００８５】
もう一つの実施例において、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、準備、獲得または製造された幹細胞溶液は、歯科インプラント治療に用いることができる。当該歯のインプラント治療は、歯の移植体をねじ込み方式により、第１または第２個体の歯槽骨にねじ込みステップを含む。
そのうち、歯の移植体の雄ねじ（または螺旋状）の表面をチタン金属の表面に形成した上、幹細胞溶液を歯の移植体の露出部分（すなわち、歯の移植体の最上部）に塗布または滴下することにより、幹細胞溶液が歯の移植体の雄ねじのチタン金属表面と、第１または第２個体の歯槽骨との間の表面に流れて、チタン金属表面と、第１または第２個体の歯槽骨との間に幹細胞溶液を含ませる。第２個体は例えば、第１個体と同じ生体分類の種（例えば、ヒト）か、または第１個体と異なる生体分類の種である。例えば、第１個体は例えば、哺乳動物（例えば、豚）であり、第２個体はヒトである。チタン金属の表面粗さは５０ナノメートル（ｎｍ）または１００ナノメートル以下、例えば、２０〜８０ナノメートルあるいは３０〜４５ナノメートルとする。
幹細胞溶液をチタン金属の表面と歯槽骨との間に所定期間を経過した後、幹細胞溶液によって、酸化チタン層と歯槽骨との間にマイクロホール構造が形成される。
【００８６】
もう一つの実施例において、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、準備、獲得または製造された幹細胞溶液は、関節、腱、（膝）関節の軟骨、肩部または脊髄の治療に用いることができる。
当該治療は、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、幹細胞溶液を準備、獲得または製造した後に、有効量の細胞溶液を第１または第２個体の関節、腱、（膝）関節の軟骨、肩部、脊髄あるいは筋肉に注射するステップを含む。
第２個体は例えば、第１個体と同じ生体分類の種（例えば、ヒト）か、または第１個体と異なる生体分類の種である。例えば、第１個体は例えば、哺乳動物（例えば、豚）であり、第２個体はヒトである。
【００８７】
もう一つの実施例において、ステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、準備、獲得または製造した幹細胞溶液は例えば、関節炎（例えば骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、リューマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）または強直性脊椎炎（ａｎｋｙｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、腱炎、腱損傷または自己免疫疾患（例えば、リューマチ関節炎、強直性脊椎炎または全身性紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）の治療に用いることができる。
当該治療は、図１に示すステップＳ１からステップＳ６、または図２に示すステップＳ１１、Ｓ１２及びステップＳ１からステップＳ６によって、幹細胞溶液を準備、獲得または製造した後に、有効量の細胞溶液を第１または第２個体の関節、腱、（膝）関節の軟骨、肩部、脊髄あるいは筋肉に注射するステップを含む。
第２個体は例えば、第１個体と同じ生体分類の種（例えば、ヒト）か、または第１個体と異なる生体分類の種である。例えば、第１個体は例えば、哺乳動物（例えば、豚）であり、第２個体はヒトである。
【００８８】
以上、実施例をもって、本発明の特徴を説明した。本実施例は当業者が本発明の内容を理解し、かつこれに基づいて実施を可能にすることを目的としており、本発明の特許請求範囲を制限されるべきでない。よって、本発明で開示された精神に基づいて完成された等効果の修飾または修正は、以下の特許請求の範囲に含む。
【００８９】
以上、本発明の一部の実施例を開示したが、当業者であればこの実施例の説明に基づき、本発明のその他の実施例及び本発明の範疇において思料し、自らの実施例に変化や修飾することが可能である。
【符号の説明】
【００９０】
Ｓ１〜Ｓ６  ステップ
Ｓ１１、Ｓ１２  ステップ
２ａ  垂直線
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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