(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞における発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトＶＬＤＬレセプター遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクター。
【請求項２】
該ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
アデノウイルスＥ１遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項２記載のベクター。
【請求項４】
アデノウイルスＥ３遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
肝細胞における発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトＶＬＤＬレセプター遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターによる該肝細胞のトランスダクシヨンを通して、その中に導入されたヒトＶＬＤＬレセプター遺伝子を発現する哺乳類の肝細胞。
【請求項６】
製薬学的に受容しうる担体及びウイルスベクターを含んでなり、該ベクターが、肝細胞における発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトＶＬＤＬレセプター遺伝子を含んでなる、製薬学的組成物。
【請求項７】
該ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
アデノウイルスＥ１遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
アデノウイルスＥ３遺伝子の全てまたは一部における欠失をさらに含んでなる、請求項８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
本発明は、国立保険研究所助成番号ＤＫ４２１９３−０５及びＨＤ２９９４６により援助された。米国政府は、本発明における権利を有する。
発明の分野
本発明は、体細胞遺伝子治療の分野及びリポタンパク質の代謝に関する遺伝的疾患の治療に関する。
発明の背景
脂質、特に、コレステロールの代謝は、多数のリポタンパク質及びアポリポタンパク質の相互作用を伴う。超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及びアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の生産における、そしてコレステロールを含む全般的な脂質の代謝における重要な前駆体分子である。ＬＤＬは、ヒト血漿における主要なコレステロール輸送リポタンパク質である。
ＶＬＤＬ／ａｐｏＥレセプターは、心臓、骨格筋、及び脂肪組織［Ｆ．Ｍ．Ｗｉｔｔｍａａｃｋ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１３６（１）：３４０−３４８（１９９５）］において、そして腎臓、胎盤、膵臓、及び脳においてより低いレベルの発現で発現される。このレセプターは、特定の器官によるトリグリセリドに富んだリポタンパク質粒子の取り込みにおいて役割を果たすことが示唆されている。ヒトＶＬＤＬレセプターと考えられるものをコードしているｃＤＮＡが、最近、クローン化された［引用することにより本明細書に取り込まれるＭ．Ｅ．Ｇａｆｖｅｌｓ等、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：５５７−５６９（１９９３）］。ＬＤＬに対するレセプターは、肝臓及び他の器官において細胞表面上の被服小窩に位置する。
図１Ａにおいて描かれるように、正常な健康なヒトにおいて、分子、アポリポタンパク質Ｂ４８（Ａｐｏ−Ｂ４８）、アポリポタンパク質Ｃ−II（Ａｐｏ−Ｃ−II）、及びＡｐｏＥは、腸へ向かう血漿においてキロミクロン粒子を形成し、これは肝臓においてキロミクロン残存（ｒｅｍｎａｎｔ）レセプターと相互作用する。残存レセプターにより取り込まれたキロミクロンの代謝後、肝臓は、Ａｐｏ−Ｅ、Ａｐｏ−Ｃ−II、及びアポリポタンパク質Ｂ１００（Ａｐｏ Ｂ１００）を含む一次リポタンパク質、ＶＬＤＬを生産する。ＶＬＤＬは、Ａｐｏ Ｂ１００を介して肝臓のＬＤＬレセプターに結合するＬＤＬに代謝される。肝臓のＬＤＬレセプターは、レセプター依存性エンドサイトーシスによるＬＤＬの取り込みを促進する。ＬＤＬは、リソソームにおいて分解され、そのコレステロールは、代謝用途のために放出される。
そのようなリポタンパク質及び／またはレセプターの代謝における欠陥は、いくつかの重い代謝異常をもたらす。ヒト疾病の家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、主に、ＬＤＬレセプターをコードしている遺伝子中の一つまたはそれより多い突然変異により引き起こされる。ＦＨは、（１）ＬＤＬの高い濃度、（２）腱及び皮膚（黄色腫）における、そして動脈（アテローム）におけるＬＤＬ由来のコレステロールの沈着、及び（３）遺伝子量効果を有する常染色体優性形質としての遺伝により臨床的に特徴づけられる。ＦＨの個体は、通常、幼年期に、早期冠動脈性心疾患にかかる。ヘテロ接合体は５００人に約１人であり、ＦＨを最も一般的な先天的な代謝の誤りの中に位置づける。ヘテロ接合体は、出生から血漿コレステロールの２倍の上昇（３５０ないし５５０ｍｇ／ｄｌ）を有し、２０歳より後に、腱黄色腫及び冠状動脈アテローム硬化症にかかりやすい。ホモ接合体は、百万人に１人であり、重い高コレステロール血症（６５０ないし１０００ｍｇ／ｄｌ）、生涯の最初の４年以内に現れる皮膚黄色腫、及び幼少期に始まり、２０歳前にしばしば死をもたらす冠動脈性心疾患により特徴づけられる。［Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等、「Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ」、第４８章、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ中、第６版、Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒｓ等（ｅｄｓ）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｏ．、ＮＹ、ＮＹ、（１９８９）１２１５−１２５０頁］。
他の代謝異常は、心筋梗塞の生存者及びその親戚における高脂血症と最初関係した家族性複合（ｃｏｍｂｉｎｅｄ）高脂血症（ＦＣＨ）である。ＦＣＨ患者は、通常、３つの表現型、すなわち、（１）高いレベルのＶＬＤＬ、（２）高いレベルのＬＤＬ、または（３）血漿中の両リポタンパク質のレベルの増加の一つを有する。ＦＨと異なり、ＦＣＨは、通常、高トリグリセリド血症の形態（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）において、幼少期における患者の１０ないし２０％のみに現れる。この形質に対するホモ接合性は、重い高トリグリセリド血症をもたらすことができる。［Ｊ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等、「Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅの第４４Ｂ章、第６版、Ｃ．Ｒ．Ｓｃｒｉｖｅｒｓ等（ｅｄｓ）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｃｏ．、ＮＹ、ＮＹ、（１９８９）１１５５−１１５６頁］。この疾患はまた、多数の個体において、グルコース過敏症及び肥満の出現と関係する。
ＦＣＨの最も顕著な異常は、血漿のＶＬＤＬ含有量の著しい上昇である。ＶＬＤＬの増加した生産は、ある個体においてはＶＬＤＬの膨らんだ血漿プールをもたらすが、より効率よい脂質分解を有する個体においては、増加したレベルのＬＤＬをもたらす。ＦＣＨは、ＬＤＬレセプターの遺伝的欠陥よりむしろＬＤＬの過剰生産により特徴づけられる。培養した繊維芽細胞のＬＤＬレセプターは、ＦＣＨ患者において正常であるようにみえる。
臨床経験は、ＦＣＨが、北アメリカ人口の約１％に生じ、ＦＨより少なくとも５倍一般的であることを示す。この疾患にかかった患者の間の冠動脈性心疾患への偏向は、それを早期アテローム硬化症の最も顕著な既知の代謝原因にする［上に引用したＪ．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ等］。
ＦＨにおけるようにＬＤＬレセプターに欠陥がある（図１Ｂ参照）か、またはＦＣＨにおけるように過剰のＶＬＤＬのために過剰のＬＤＬが生産される場合、肝臓による血漿からのＬＤＬの効率よい除去が減少し、ＬＤＬのレベルが、レセプター数に逆比例して上昇する。過剰の血漿ＬＤＬは、結合組織においてそして清掃細胞において沈着され、いずれかの疾患の症状をもたらす。
現在、ＦＨ及びＦＣＨの治療は、薬剤の投与、すなわち、ＦＨの治療のための胆汁酸結合樹脂及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素の複合投与、並びにＦＣＨの治療のためのナイアシンによりＬＤＬの血漿レベルを下げることに向けられている。しかしながら、２つの非機能遺伝子を有するＦＨホモ接合体は、ＬＤＬレセプターを刺激することにより働く薬剤に耐性である。同様に、そのような薬剤は、ＦＣＨにおいて特に効果がない。ＦＨホモ接合体において、血漿ＬＤＬレベルは、物理的または外科的手段によってのみ下げられることができる。
アデノウイルスベクターを用いた遺伝子治療による正常なＬＤＬレセプター遺伝子の投与が、ＦＨの治療に対して意図されている。アデノウイルスベクターは、分裂状態にかかわらず、実質的に全ての細胞型への非常に高いレベルの導入遺伝子の運搬を提供することができる。遺伝的不均衡を補う治療導入遺伝子をインビボで運搬することにおけるこの系の効率は、様々な疾患の動物モデルにおいて示されている［Ｋ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：４４９−４５８（１９９３）（「Ｋｏｚａｒｓｋｙ Ｉ」）；Ｋ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３６９５−１３７０２（１９９４）（「Ｋｏｚａｒｓｋｙ II」）；Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、３６：２６１−２６８（１９８６）；Ｋ．Ｔａｎｚａｗａ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１１８（１）：８１−８４（１９８０）；Ｊ．Ｌ．Ｇｏｌａｓｔｅｎ等、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３０９：２８８−２９６（１９８３）；Ｓ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：８８３−８９３（１９９３）；及びＳ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９３：１８８５−１８９３（１９９４）］。インビボで肝細胞へ遺伝子を形質導入することにおけるアデノウイルスベクターの使用は、齧歯類動物及びウサギにおいて以前示されている［例えば、上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ II及びＳ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：８８３−８９３（１９９３）を参照］。
最近の研究は、ＦＨの状態によく似たＬＤＬレセプターに欠陥のあるワタナベ遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギの肝臓へのヒトＬＤＬレセプター（「ＬＤＬＲ」）ｃＤＮＡをコードしている組み換えアデノウイルスの導入が、血漿コレステロールにおける大きい一時的な減少をもたらすことを示している。大部分の状態における組み換えアデノウイルスの効果の一時的な性質は、ウイルスが感染した細胞に対する細胞性免疫の発生及びそれに続くこれらの除去のためであると考えられる。免疫がもたらす除去の抗原標的は、組み換えウイルスゲノムから発現されるウイルスタンパク質及び／または導入遺伝子の産物、この場合、ＬＤＬレセプタータンパク質である［Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：４４０７−４４１１（１９９４年５月）；Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｉｍｍｕｎ．、１：４３３−４４２（１９９４年８月）］。
さらに、ＬＤＬＲ遺伝子を含んでいるアデノウイルスの繰り返された再注入は、中和抗アデノウイルス抗体の発生のために、同様の続いて起こるコレステロールの減少を生じなかった［引用することにより全て本明細書に取り込まれる、上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びＫｏｚａｒｓｋｙ II；Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｉｍｍｕｎ．、１：４３３−４４２（１９９４年８月）も参照］。
当該技術分野において、ＦＨ及びＦＣＨ、並びにリポタンパク質の代謝における他の欠陥の効果的な治療及び／または予防を可能にする治療組成物及び遺伝子治療法に対する必要性が残っている。
発明の要約
一つの態様において、本発明は、アデノウイルスのゲノムの少なくとも一部で、肝細胞に感染することのできる部分のＤＮＡまたはそれに対応するＤＮＡ、及び発現を誘導する調節配列に適切に連結されたヒトＶＬＤＬレセプター（「ＶＬＤＬＲ」）遺伝子を含んでなる組み換えウイルスベクターを提供し、このベクターは、インビボまたはインビトロで肝細胞においてＶＬＤＬＲ遺伝子産物を発現することができる。
他の態様において、本発明は、上記のウイルスベクターで感染させた哺乳類細胞を提供する。
さらなる態様において、本発明は、上記の組み換えウイルスベクターの有効量を哺乳類の肝細胞に導入することを含んでなる、ＶＬＤＬＲ遺伝子を運搬し、そして該細胞の染色体に安定に組み込むための方法を提供する。
本発明の他の態様は、正常なＶＬＤＬＲ遺伝子を含んでいる上記のベクターの有効量を適当な経路により患者に投与することを含んでなる、代謝異常にかかっている患者を治療するための方法であり、その際、該ＶＬＤＬＲ遺伝子は、該患者の肝細胞の染色体に組み込まれ、そして該レセプターは、通常発現されない体内の位置でインビボで安定に発現される。
本発明の他の態様及び利点は、その好ましい態様の以下の詳細な説明においてさらに記述される。
【図面の簡単な説明】
図１Ａは、正常なヒト及びウサギのリポタンパク質の代謝の概略図である。アポリポタンパク質は、Ｂ４８、Ｂ１００、Ｃ−II、及びＥとして表される。ＬＤＬ及びＶＬＤＬが識別される。
図１Ｂは、ＦＨ患者及びＷＨＨＬウサギにおけるリポタンパク質の代謝の概略図である。省略形は、図１Ａにおいて記述されたようである。
図１Ｃは、本発明による組み換えＶＬＤＬＲ遺伝子を注入されたウサギにおけるリポタンパク質の代謝の概略図である。
図２は、アデノウイルス地図単位０−１（Ａｄ ０−１）、及びそれに続くサイトメガロウイウスのエンハンサー／プロモーター（ＣＭＶ ｅｎｈ／ｐｒｏｍ）、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子、ポリＡシグナル（ｐＡ）、アデノウイルス地図単位９−１６（Ａｄ ９−１６）、並びに複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＡＴ１５３からのプラスミド配列を含むプラスミドｐＡｄ．ＣＭＶＶＬＤＬＲの概略図である。
図３は、０ないし１００がアデノウイルス５型（ジーンバンク登録番号Ｍ７３２６０）の地図単位を表し、そしてｐＡｄ．ＣＭＶＶＬＤＬＲのＣＭＶ／ＶＬＤＬＲ／ｐＡミニカセットがアデノウイルス地図単位１及び９の間に挿入され、残りのＡｄ５地図単位９−１００が地図単位約７８．５及び約８４．３の間に部分的なＥ３遺伝子の欠失を有する、組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲの概略図である。
図４Ａは、組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを与えられる前後の日数の関数として、ＷＨＨＬウサギに対してｍｇ／ｄｌ単位で血漿コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は個々の動物を表す。実施例３を参照。
図４Ｂは、組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを与えられる前後の日数の関数として、ＷＨＨＬウサギに対してｍｇ／ｄｌ単位で血漿コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は４匹の個々の動物の反応を表す。実施例３を参照。
図５は、組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ（ｌａｃＺ）、組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲ、及び組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを注入したマウスにおける（注入前％として測定された）コレステロールレベルを表している棒グラフである。点々を打った棒は、注入前のレベルを表し、詰まった棒は、注入後のレベルを表す。実施例４を参照。
図６は、組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ（ｌａｃＺ）、組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲ、及び組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを注入したマウスにおけるコレステロールレベル、特に（ｍｇ／フラクションとして測定された）血漿リポタンパク質のフラクションのレベルを表している棒グラフである。詰まった棒は、密度（ｄ）＞１．２１以内に当たるタンパク質またはフラグメントを表し、密に網目線を描いた棒はＨＤＬを表し、緊密に網目線を描いた棒はＬＤＬを表し、間隔を離した斜め線を引いた棒は中間密度リポタンパク質（ＩＤＬ）を表し、そして白い棒は、ＶＬＤＬレベルを表す。実施例４を参照。
図７Ａは、Ｈ５．０１０ＣＭＶＬａｃＺを注入したＬＤＬレセプターノツクアウトマウスに対して注入前後の日数の関数として、（ｍｇ／ｄｌ単位で測定された）コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は、個々の動物の反応を表す。実施例５を参照。
図７Ｂは、Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを注入したＬＤＬレセプターノツクアウトマウスに対して注入前後の日数の関数として、（ｍｇ／ｄｌ単位で測定された）コレステロールレベルにおける変化を表しているグラフである。記号は、図７Ａに対するものと同じである。実施例５を参照。
図７Ｃは、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したＬＤＬレセプターノツクアウトマウスに対して（ｍｇ／ｄｌ単位で測定された）コレステロールレベル対注入前後の日数における変化を表しているグラフである。記号は、図７Ａに対するものと同じである。実施例５を参照。
図７Ｄは、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ（ｎ＝９）またはＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲ（ｎ＝１０）を注入したＬＤＬレセプターノツクアウトマウスに対して、２回の実験からの平均結果±標準偏差を与えているグラフである。平均の注入前コレステロールレベルは、それぞれ８７０ｍｇ／ｄｌ及び９４６ｍｇ／ｄｌであった。アステリスクは、ｐ＜０．０５を示す。
図８Ａ−８Ｆは、上に引用したＧａｆｖｅｌｓ等により報告された、ヒトＶＬＤＬレセプター遺伝子のコードされるアミノ酸配列［配列番号２］を含むＤＮＡ配列［配列番号１］である。
図９Ａ−９Ｉは、Ａｄ ０−１がヌクレオチド１２−３６４にわたり、ＣＭＶ ｅｎｈ／ｐｒｏｍがヌクレオチド３８１−８６２にわたり、ヌクレオチド９６６−４１０７がＶＬＤＬＲをコードし、ｐＡがヌクレオチド４１９２−４３９０にわたり、Ａｄ ９．２−１６．１がヌクレオチド４４１７−６８８０にわたり、そしてヌクレオチド６８８１−９５９２がｐＡＴ１５３配列である、ｐＡｄ．ＣＭＶＶＬＤＬＲ［配列番号３］のＤＮＡ配列である。
図１０Ａは、２５：１のエフェクター：標的細胞比で測定されたＣＴＬ活性（平均±標準偏差）を示している棒グラフである。＊＊＝ｐ＜０．００５；＊＝Ｐ＜０．０５。
図１０Ｂは、様々なエフェクター：標的比に対して測定されたＣＴＬ活性を示している折れ線グラフである。
図１１Ａは、実施例９において記述されるように、０日にアデノウイルスを感染させ、そして２８日に壊死させたＣ５７ＢＬ／６マウスのＢＡＬサンプル中に存在する中和抗体価を要約しているグラフである。コントロールは、正常なマウスを表し（「コントロール」）、ＣＤ４ ｍＡＢは、ＣＤ４+細胞を枯渇させたマウスを表し、ＩＬ−１２は、ＩＬ−１２で処理したマウスを表し、ＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−γで処理したマウスを表す。
図１１Ｂは、ＢＡＬサンプル中に存在するＩｇＧの相対量（ＯＤ405）を要約しているグラフである。記号は、図１１Ａにおいて記述されたようである。
図１１Ｃは、ＢＡＬサンプル中に存在するＩｇＡの相対量（ＯＤ405）を要約しているグラフである。記号は、図１１Ａにおいて記述されたようである。
発明の詳細な記述
本発明は、ヒト血漿中のＬＤＬの蓄積により特徴づけられる、ＦＨ及びＦＣＨのような代謝異常の治療処置を可能にする新規の組成物及び方法を提供する。本発明は、哺乳類において通常発現される遺伝子、すなわち、超低密度リポタンパク質に対する正常なレセプターをコードしている遺伝子（ＶＬＤＬＲ）を、その遺伝子が本来存在しない体内の位置、すなわち、肝臓に導入し、そして安定に発現するためのウイルスベクターの使用を提供する。
本発明の方法及び組成物は、ＬＤＬレセプターに欠陥のある個体の遺伝子治療処置において以前同定された問題を克服する。以下に詳細に記述されるように、肝臓の細胞を標的とすることができるウイルスベクターの使用により、ＶＬＤＬレセプターが肝臓細胞に導入され、そこで安定に発現される。本発明は、ＶＬＤＬレセプタータンパク質が、ＬＤＬレセプターに欠陥のある個体、例えば、マクロファージにおいて正常に発現される点において、直接的な遺伝子置換と異なる。従って、ＶＬＤＬＲ遺伝子を保有している肝臓へのウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、新しい遺伝子産物の発現をもたらすのではなく、むしろ、その遺伝子産物をさもなければ発現しない器官における新規発現をもたらす。重要なことには、ベクターが運ぶＶＬＤＬＲ遺伝子は、異種抗原として認識されず、トランスフェクトされた細胞のＣＴＬがもたらす除去の誘導がないので、患者は、肝臓において発現されたＶＬＤＬＲ遺伝子産物に対して免疫反応を高めない。それに反して、ＬＤＬＲ遺伝子がＦＨにかかったＬＤＬＲに欠陥のある個体に投与される場合、ウイルスベクターのＣＴＬがもたらす除去は問題である［例えば、上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びIIを参照］。
患者の免疫系によるＶＬＤＬＲ遺伝子の既知の遺伝子としてのこの認識のために、そして肝細胞が循環において長い寿命を有する傾向のために、ＶＬＤＬＲ遺伝子を発現する本発明のベクターでトランスフェクトした肝細胞は安定である傾向にあり、そしてＶＬＤＬＲ発現は一時的ではない。トランスフェクトされた肝細胞におけるＶＬＤＬＲ遺伝子の発現は、肝細胞の寿命の期間中起こる。リポタンパク質の代謝異常は、ウイルスベクターを再注入する必要なしにより長期間治療されることができ、従って、ウイルスの提示回数及びベクターにコードされるウイルスタンパク質に対する免疫反応を制限する。
本発明のベクター及び方法は、リポタンパク質代謝異常を治療するそして／またはこれらに対する現在の治療を補足するために有用な遺伝子治療を提供することができる。本発明によるトランスフェクトされた肝細胞におけるＶＬＤＬレセプター遺伝子の存在は、肝臓の部位での血漿からのＬＤＬの前駆物質、ＶＬＤＬの結合を可能にし、それにより、血漿中のＶＬＤＬの量を減少させる。血漿中のＶＬＤＬの減少は、結果として、血漿ＬＤＬの生産を減少させる。
例えば、ＦＨにおいて、この血漿ＬＤＬの減少は、肝臓における欠陥のあるＬＤＬレセプターを埋め合わせることができる。ＦＣＨにおいて、このＶＬＤＬからの血漿ＬＤＬの減少した生産は、肝臓における正常なＬＤＬレセプターが、過剰なＬＤＬにより負担をかけすぎられるようになることを防ぎ、そしてこの疾患に寄与する過剰のＶＬＤＬを減少させる。例えば、脂質の代謝の正常な作用の概略図（図１Ａ）をＦＨにより引き起こされる異常な代謝（図１Ｂ）と、そして次に、本発明の方法（図１Ｃ）と比較。
Ｉ．遺伝子治療ベクターとしての組み換えウイルス粒子
本発明の組成物は、肝細胞へ機能的な正常ＶＬＤＬレセプター遺伝子を運びそして安定に組み込むことができる、望ましい遺伝子治療ベクターの構築に関する。そのような遺伝子治療ベクターは、望ましくは一つまたはそれより多いウイルス遺伝子において欠失した、選択したウイルスベクター、調節配列の制御下にＶＬＤＬＲ遺伝子を含んでいるミニ遺伝子、及び場合によってはヘルパーウイルス、及び／または欠失したウイルス遺伝子のあらゆる必要な産物をウイルスベクターに供給するパッケージング細胞系含む。
ベクターに用いられるウイルス配列、必要な場合、ヘルパーウイルス、及び組み換えウイルス粒子、及び本明細書において記述されるベクターの構築において用いられる他のベクター成分及び配列は、以前に発表され、記述された配列に基づいて、市販または学術の供給者から得られる。これらのウイルス成分はまた、個々の患者から得られることもできる。ウイルス配列及びベクター成分は、当該技術分野において熟練した者により既知であり行われる標準的な組み換え分子クローニング技術と一緒に、本明細書に含まれる教示及び参考文献の方法を用いることにより作られることができる。本明細書により教示される配列の欠失、挿入、及び他の突然変異を含む、ベクターを形成する存在している核酸配列の修正は、標準的な技術を用いて作られることができる。
ベクター、ＶＬＤＬＲ「ミニ遺伝子」のクローニング及び構築、及び所望されるウイルスベクターへのその挿入において有用なウイルス配列の選択、並びにヘルパーウイルス等の使用による組み換え感染性ウイルス粒子の生産のために用いられる方法は、本明細書において提供される教示を考慮すると当該技術分野における技術の範囲内である。
Ａ．「ミニ遺伝子」の構築
「ミニ遺伝子」は、ＶＬＤＬＲ遺伝子、及びインビボで遺伝子を転写し、遺伝子産物を発現するために必要な他の調節成分の組み合わせを意味する。ヒトＶＬＤＬレセプター配列は提供されている［上にした引用Ｇａｆｖｅｌｓ等；配列番号１及び２］。通常、このレセプター配列の全コーディング領域がミニ遺伝子において用いられ、すなわち、配列番号１の５’及び３’非翻訳配列はミニ遺伝子に必須ではない。他の哺乳類の起原、例えば、ウサギ、サルなどのＶＬＤＬレセプター遺伝子も、本発明において有用であることができる。
ＶＬＤＬレセプター遺伝子（ＶＬＤＬＲ）は、その転写を可能にするように調節成分に適切に連結される。そのような成分は、ウイルスベクターでトランスフェクトした細胞においてＶＬＤＬ導入遺伝子の発現を誘導するのに必要な通常の調節成分を含む。従って、ミニ遺伝子はまた、導入遺伝子に連結され、そして他の調節成分と共に、組み換えベクターの選択したウイルス配列内に位置される選択したプロモーターも含む。
プロモーターの選択は、慣例になっていることで、本発明の制限ではない。有用なプロモーターは、発現される導入遺伝子の量を制御できる、構成的プロモーターまたは調節的（誘導性）プロモーターであることができる。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウイルスの即時型初期プロモーター／エンハンサー［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ等、Ｃｅｌｌ、４１：５２１−５３０（１９８５）を参照］のものである。他の望ましいプロモーターは、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲプロモーター／エンハンサーを含む。さらに他のプロモーター／エンハンサー配列は、ニワトリ細胞質β−アクチンプロモーター［Ｔ．Ａ．Ｋｏｓｔ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１１（２３）：８２８７（１９８３）］である。他の適当なプロモーターは、当該技術分野において熟練した者により選択されることができる。
ミニ遺伝子はまた、望ましくは、転写物の効率よいポリＡ付加のために必要なシグナルを与える配列（ポリＡまたはｐＡ）並びに機能的なスプライスドナー及びアクセプター部位を有するイントロンを含むウイルスベクター配列に非相同の核酸配列を含む。本発明の典型的なベクターにおいて用いられる一般的なポリＡ配列は、パポバウイルスＳＶ４０由来のものである。ポリＡ配列は、通常、導入遺伝子配列の後、そしてウイルスベクター配列の前でミニ遺伝子に挿入される。一般的なイントロン配列もまた、ＳＶ４０由来であり、ＳＶ４０ Ｔイントロン配列と言われる。本発明のミニ遺伝子はまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列及び導入遺伝子の間に位置されたそのようなイントロンを含むこともできる。これら及び他の一般的なベクター成分の選択は慣例であり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）及び本明細書において引用した参考文献を参照］、多数のそのような配列が、市販及び産業の供給者から、並びにジーンバンクから入手できる。
上に述べたように、ミニ遺伝子は、ウイルスベクターにおけるあらゆる選択した欠失の部位に位置される。以下の実施例１を参照。
Ｂ．ウイルスプラスミドベクターの構築
多数のウイルスベクターが遺伝子治療のために提案されているけれども、本発明の目的のために最も望ましいベクターは、組み換えアデノウイルスベクターまたはアデノ関連ベクターである。以下に記述されるように、アデノウイルスベクターは、大量に精製され、そして非常に濃縮されることができ、そしてこのウイルスは非分裂細胞へ遺伝子を形質導入することができるので、アデノウイルスベクターが好ましい。しかしながら、他のアデノウイルス、またはレトロウイルス、ワクシニア、または他のウイルスベクターでさえが同様に構築されることは、当該技術分野の技術の範囲内である。
アデノウイルスは、様々な細胞型へ治療またはレポーター導入遺伝子を効率よく運ぶように修飾されることができる真核生物のＤＮＡウイルスである。ヒトアデノウイルスは、各３６０ｂｐの長さである１００の地図単位（ｍ．ｕ．）に分割される、直鎖状の約３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを含んでなる。このＤＮＡは、ウイルスＤＮＡの複製のために必要である短い逆末端反復（ＩＴＲ）をゲノムの各末端に含む。遺伝子産物は、ウイルスＤＮＡ合成の開始前または後の発現に基づき、初期（Ｅ１からＥ４まで）及び後期（Ｌ１からＬ５まで）領域にまとめられる［例えば、Ｈｏｒｗｉｔｚ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、ｅｄ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）を参照］。一般的なアデノウイルス２及び５型（それぞれ、Ａｄ２及びＡｄ５）はヒトの悪性腫瘍と関係しない。
遺伝治療において有用である適当なアデノウイルスベクターは、よく知られている［例えば、Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ等、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、１７１２頁、ｅｄ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ等、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）；Ｍ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、Ｃｅｌｌ、６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｎｄｔ等、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔ．Ｔｈｅｒ．、４：７５９−７６９（１９９３）；Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、７：３６２−２６９（１９９４）；Ｊ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：６９１−６９２（１９９３年１０月）；Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ」中、ｅｄ．Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１５５−１６８頁（１９９０）を参照］。アデノウイルス型の選択は、以下の発明を制限すると思われない。
本発明において有用なアデノウイルスベクターは、多数のアデノウイルス型のＤＮＡ配列を含む。本明細書において記述されるベクターにおいて有用なアデノウイルスの配列は、現在同定された４１のヒト型［例えば、上に引用したＨｏｒｗｉｔｚを参照］を含むあらゆる既知のアデノウイルス型から得られることができる。アデノウイルス５型の株の配列は、ジーンバンク登録番号Ｍ７３２６０から容易に得られることができる。同様に、他の動物に感染することが知られているアデノウイルスもまた本発明のベクター構築物において用いられることができる。様々なアデノウイルス株が、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄから入手でき、または様々な市販及び研究所の供給者から請求により入手できる。
本発明において有用なアデノウイルスベクターは、場合によっては他の突然変異、例えば、温度感受性突然変異、欠失を保有している組み換え欠損アデノウイルス、及びアデノウイルス／アデノ関連ウイルス配列で形成されたハイブリッドベクターを含む。適当なベクターは、発表された文献において記述されている［例えば、上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びII、並びに本明細書において引用された参考文献、米国特許番号第５，２４０，８４６号、及び以下の引用することにより本明細書に取り込まれる同時出願中の明細書を参照］。
肝臓へのＶＬＤＬＲ遺伝子の運搬のために有用なアデノウイルスベクター、最小のアデノウイルス核酸配列がベクターを作製するために用いられることができ、その場合、ハイブリッドウイルス粒子を作るためのヘルペーウイルスの使用が必要とされる。代わりに、一つまたはそれより多いアデノウイルス遺伝子の選択した欠失のみが、ウイルスベクターの構築のために用いられることができる。欠失した遺伝子産物は、失われた遺伝子産物を供給する選択したパッケージング細胞系を用いることにより供給されることができる。
１．組み換え最小アデノウイルス
本発明において有用な望ましいアデノウイルス（Ａｄ）ベクターは、これらのベクターを記述する目的のために、引用することにより本明細書に取り込まれる、同時係属中で共同所有する米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ番号第０８／３３１，３８１号において詳細に記述される。
簡潔に要約すると、最小Ａｄウイルスは、複製及びビリオンをキャプシドで包むために必要なアデノウイルスのシス成分のみを含んでいるが、そうでなければ、全てのアデノウイルス遺伝子を欠失したウイルス粒子である。すなわち、このベクターは、（複製起点として機能する）シスに作用するアデノウイルスの５’及び３’逆末端反復（ＩＴＲ）配列、並びに直鎖状のＡｄゲノムをパッケージングするために必要な配列及びＥ１プロモーターのためのエンハンサー成分を含む天然の５’パッケージング／エンハンサー領域のみを含む。これは、通常の公表されたＡｄ５アデノウイルスゲノムのｂｐ１ないし約３６０にわたり、ウイルスゲノムの地図単位０−１とも呼ばれるＡｄ５ゲノムの末端（５’）配列を残し、通常約３５３から約３６０までのヌクレオチドの長さである。この配列は、５’ＩＴＲ（アデノウイルスゲノムのｂｐ１ないし約１０３）及びパッケージング／エンハンサー領域（アデノウイルスゲノムのｂｐ約１９４ないし約３５８）を含む。アデノウイルスベクターの最小３’アデノウイルス配列は、アデノウイルスゲノムのｂｐ約３５，３５３ないし末端、または地図単位〜９８．４−１００にわたるアデノウイルスゲノムの右末端（３’）ＩＴＲ配列を含むことができる。この配列は、通常、約５８０ヌクレオチドの長さである。上記のように、そのような配列の間に、ＶＬＤＬＲミニ遺伝子が挿入される。
この最小Ａｄウイルスベクターからの感染性粒子の生産は、以下に説明するように、ヘルパーウイルスの補助を伴う。上に含まれた参考文献においても開示された第二の型の最小ベクターは、３’末端配列に対して５’Ａｄ末端配列を同じ向きに配置する。ヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞系と共感染させた最小Ａｄベクターは、ＶＬＤＬＲミニ遺伝子を含んでいる感染性の組み換えウイルス粒子を生産するために必要なウイルス遺伝子産物の全てを提供する。代わりに、このベクターは、次にヘルパーウイルスにより供給されることが必要とされない、付加的なアデノウイルス遺伝子配列を含むことができる。
２．他の欠損アデノウイルス
本発明の遺伝子治療のために有用な組み換えの複製能力を欠いたアデノウイルスは、上に定義した最小アデノウイルス配列以上を含んでいることにより特徴づけられることができる。これらの他のＡｄベクターは、ウイルスの遺伝子領域の様々な部分の欠失、並びに場合によってはヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞系の使用により形成される感染性のウイルス粒子により特徴づけられることができる。適当な欠損アデノウイルスは、引用することにより本明細書に全て取り込まれる、Ｋｏｚａｒｓｋｙ及びＷｉｌｓｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌ．、３：４９９−５０３（１９９３）；上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びII、及び本明細書に引用された参考文献においてより詳細に記述される。
一つの例として、適当なベクターは、正常な生物学的機能を除去するように、アデノウイルスの（ｍｕ１．３ないし４．５にわたる）初期即時型初期遺伝子Ｅ１ａ及び（ｍｕ４．６ないし１１．２にわたる）遅延型初期遺伝子Ｅ１ｂの全てまたは十分な部分を欠失させることにより形成されることができる。これらの複製能力を欠きＥ１を欠失したウイルスは、トランスに対応する遺伝子産物を提供する機能的なアデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を含んでいる、アデノウイルスで形質転換された相補性ヒト胚腎臓細胞系、２９３細胞［ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３］において生育されると、複製し、そして感染性のウイルスを生産することができる。得られたウイルスは、多数の細胞型に感染することができ、そして導入遺伝子（すなわち、ＶＬＤＬＲ遺伝子）を発現することができるが、非常に高い感染多重度で細胞が感染されなければ、Ｅ１領域ＤＮＡを保有しない大部分の細胞において複製できない。動物における詳細な経験は、有害な細胞性免疫反応を引き起こす低いレベルのウイルスタンパク質が発現されるので、Ｅ１を欠失したベクターは遺伝子治療のために特に望ましいものではないことを示す。
好ましい例として、（ｍｕ７６．６ないし８６．２にわたる）アデノウイルス遅延型初期遺伝子Ｅ３の全てまたは一部が、ハイブリッド構築物の一部を形成するアデノウイルス配列から除かれることができる。Ｅ３の機能は、組み換えウイルス粒子の機能及び生産に関係がない。例えば、Ａｄベクターは、既知の突然変異体Ａｄ５ ｓｕｂ３６０バックボーン［Ｊ．Ｌｏｇａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３６５５−３６５９（１９８４）］またはＡｄ５突然変異体ｄ１７００１バックボーン［Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｗｏｌｄ、ワシントン大学、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ］のＥ１を欠失した領域に挿入された治療ミニ遺伝子で構築されることができる。両突然変異体ウイルスはまた、アデノウイルスゲノムのＥ３領域において、すなわち、ｓｕｂ３６０においては７８．５ないし８４．３ｍｕで、そしてｄ１７００１においては７８．４ないし８６ｍｕで欠失を含む。ｓｕｂ３６０及びｄ１７００１の両方の生活環は、野生型の特徴を示す。
より好ましいアデノウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子、Ｅ３領域の少なくとも一部の欠失、及びＶＬＤＬＲミニ遺伝子を受け入れるためのＥ１及びＥ３以外のアデノウイルス遺伝子内の付加的な欠失、並びに／またはアデノウイルスタンパク質の減少した発現及び／または減少したウイルス複製をもたらす他の突然変異を有して構築されることができる。例えば、（ｍｕ６７．９ないし６１．５にわたる）アデノウイルス遅延型初期遺伝子Ｅ２ａの全てまたは一部が、アデノウイルスベクターから除かれることができる。他の遅延型初期遺伝子（ｍｕ２９ないし１４．２にわたる）Ｅ２ｂ及び（ｍｕ９６．８ないし９１．３にわたる）Ｅ４もまた、アデノウイルスベクターから除かれることができることが予想される。
欠失はまた、アデノウイルスゲノムのｍｕ１６．４５ないし９９にわたる後期遺伝子Ｌ１からＬ５までのいずれにおいてもなされることができる。同様に、欠失は、（ｍｕ９．８及び１１．２の間に位置する）中間遺伝子IX及び（１６．１ないし１１．１の間に位置する）ＩＶａ2において有用であることができる。他の有用な欠失は、他の構造または非構造アデノウイルス遺伝子においてもなされることができる。
本発明における使用のためのアデノウイルス配列は、Ｅ１のみに欠失を含むことができる。代わりに、生物学的活性を消失させるのに効果のある全遺伝子または部分の欠失は、あらゆる組み合わせにおいて用いられることができる。例えば、ある典型的なベクターにおいて、アデノウイルス配列は、Ｅ３の欠失と共にまたはこれなしに、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子の、またはＥ１、Ｅ２ａ、及びＥ３遺伝子の、またはＥ１及びＥ４遺伝子の、またはＥ１、Ｅ２ａ、及びＥ４遺伝子のなどの欠失を含むことができる。
ベクターはまた、ウイルス複製に必要な遺伝子に付加的な突然変異を含むこともできる。アデノウイルスベクターは、温度感受性（ｔｓ）ウイルスを生産する突然変異を含むことができる。そのような突然変異の中に、６２．５ｍｕでＡｄ５ Ｈ５ｔｓ１２５株［Ｐ．Ｖａｎｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１５：３４８−３５４（１９７５）］において見いだされたＥ２ａ領域におけるミスセンス温度感受性突然変異体の包含を含む。この株においてＥ２ａ遺伝子から生産される７２ｋｄタンパク質（ＤＢＰ）のカルボキシ末端（６２．５ｍｌｕ）での単一アミノ酸置換は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であり、そしてアデノウイルスゲノムＤＮＡの複製に関与するタンパク質産物を生産する。許容温度（約３２℃）では、ｔｓ株は、ＨｅＬａ細胞において生育される完全な生活環ができ、一方、非許容温度（約３８℃）では、アデノウイルスＤＮＡの複製は見られない。加えて、非許容温度では、減少した免疫反応性の７２ｋｄタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において見られる。
本発明における使用のための典型的なベクターは、例えば、ｓｕｂ３６０またはｄ１７００１、Ｈ５ｔｓ１２５、及び治療ミニ遺伝子に対して５’に置かれたＥ１ａ配列を有するｃＤＮＡプラスミドを含む、３つの独立したＤＮＡ構築物からのフラグメントを組み合わせることにより得られることができる。この型のベクターは、例えば、全て引用することにより本明細書に取り込まれる、Ｊ．Ｆ．Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：６１９６−６２００（１９９４年６月）；Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、７：３６２−３６９（１９９４年７月）、及び本明細書において引用される参考文献により記述されている。ベクター中の突然変異のために、減少したウイルス複製、発現されるタンパク質の減少、及び導入遺伝子発現の持続性の増加がある。他の好ましいアデノウイルスベクターは、ｓｕｂ３６０及びｄ１７００１のＥ３欠失に加えて、Ｈ５ｔｓ１２５突然変異を含む。導入遺伝子としてＶＬＤＬＲを含んでいるミニ遺伝子は、選択したＡｄウイルスのあらゆる欠失領域に挿入されることができる。
本発明を例示するために用いられる典型的なＡｄウイルスベクターは、Ｅ３における小さい欠失を有して、アデノウイルス配列Ａｄ ｍ．ｕ．０−１、及びそれに続くＶＬＤＬＲミニ遺伝子、及び配列Ａｄ ｍ．ｕ．９ないし１００を含む欠損アデノウイルスベクターＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲである。以下に記述される図３を参照。組み換えアデノウイルスは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂを完全に欠失され、Ｅ３を部分的に欠失された。この組み換えウイルスベクターは、実施例１において詳細に記述される。
３．Ａｄ／ＡＡＶハイブリッドベクター
他の好ましいベクターは、引用することにより本明細書に取り込まれる、同時に所有され、同時に係属中である米国特許出願番号第０８／３３１，３８４号の主題であるハイブリッドＡｄ／ＡＡＶベクターである。
最小で、本発明のハイブリッドベクターに用いられるアデノウイルス核酸配列は、上記のように、前もって形成されたキャプシドヘッドにアデノウイルスゲノムＤＮＡをパッケージングするために必要な最小のアデノウイルスゲノム配列である。５’ＩＴＲ及びパッケージング／エンハンサー領域を含んでいる全アデノウイルス５’配列は、ハイブリッドベクターにおける５’アデノウイルス配列として用いられることができる。ベクターの３’アデノウイルス配列は、上に説明したアデノウイルスゲノムの右末端（３’）ＩＴＲ配列を含む。生物学的機能に不都合に影響しないこれらの配列に対するいくつかの修飾が許容されることができる。
本発明のハイブリッドベクターの部分はまた、アデノ関連ウイルスの配列である。ハイブリッドベクターにおいて有用なＡＡＶ配列は、ｒｅｐ及びｃａｐポリペプチドをコードしている配列が欠失されるウイルス配列である。より詳細には、用いられるＡＡＶ配列は、シスに作用する５’及び３’逆末端反復（ＩＴＲ）配列［例えば、上に引用したＢ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒを参照］である。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、約１４３ｂｐの長さである。これらの配列のある程度のわずかな修飾が、本使用のために許容できると予想されるけれども、実質的にＩＴＲをコードしている全配列が、ベクターに用いられる。これらのＩＴＲ配列を修飾する技量は、当該技術分野の技術の範囲である。例えば、上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等を参照。
Ａｄ／ＡＡＶハイブリッドベクター構築物において、ＡＡＶ配列は、上に説明したアデノウイルス配列により隣接される。５’及び３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、上記のように、これら自体、ＶＬＤＬＲミニ遺伝子配列に隣接する。従って、ＶＬＤＬＲミニ遺伝子及び隣接する５’及び３’ＡＡＶ配列により形成される配列は、ベクターのアデノウイルス配列中のあらゆる欠失部位に挿入されることができる。例えば、ＡＡＶ配列は、望ましくは、アデノウイルスの欠失したＥ１ａ／Ｅ１ｂ遺伝子の部位、すなわち地図単位１の後に挿入される。代わりに、ＡＡＶ配列は、Ｅ３欠失、Ｅ２ａ欠失などに挿入されることができる。アデノウイルス５’ＩＴＲ／パッケージング配列及び３’ＩＴＲ配列がベクターに用いられるなら、ＡＡＶ配列はこれらの間に挿入される。
最小アデノウイルス配列に関して上に記述されたように、ハイブリッドベクターのアデノウイルス部分に存在しない遺伝子配列は、組み換えハイブリッドウイルス粒子を作るために、パッケージング細胞系及び／またはヘルパーアデノウイルスのいずれかにより供給されなければならない。細胞によるこのハイブリッドウイルスの取り込みは、アデノウイルス及びＡＡＶ配列によるベクターに起因する感染能力によりもたらされる。いったんウイルスまたはウイルスコンジュゲートが細胞により取り込まれると、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接する導入遺伝子は、母体のアデノウイルスバックボーンから解放されなければならない。導入遺伝子の解放は、感染した細胞にＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を与えることによる。
ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、上に含まれた応用において記述されたいくつかの方法によりハイブリッドウイルスに与えられることができる。トランスにｒｅｐタンパク質を与えるための一つの態様は、ハイブリッドベクターで前もって感染させた細胞の標的単層へ、ＡＡＶ Ｐ５プロモーターの制御下にＡＡＶ ｒｅｐ７８ｋＤａ及び５２ｋＤａタンパク質をコードしている遺伝子を含むリポソームで包んだプラスミドをトランスフェクトすることによるものである。インビボでの使用のためにより好ましくは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子はハイブリッドウイルスの一部として運ばれることもできる。この単一粒子の概念の一つの態様は、ハイブリッドウイルスのポリカチオンコンジュゲートにより与えられる。この修飾したウイルスコンジュゲートの感染は、上に同定されたものと同様に、そして同じ標的細胞に関して達成される。しかしながら、ｒｅｐ７８及び５２タンパク質をコードするプラスミドが直接複合体を形成されるハイブリッドウイルスのポリリジンコンジュゲートは、機能的成分の全てを単一粒子構造にまとめる。従って、ハイブリッドウイルスコンジュゲートは、治療用途のためにかなりより望ましい、細胞への単一粒子の運搬を可能にする。他の態様において、ハイブリッドウイルスは、ハイブリッドベクターのアデノウイルスゲノム部分へｒｅｐ ｃＤＮＡを直接クローニングすることにより修飾される。
このハイブリッドベクターのこれらのそしてさらなる特徴は、参考応用により上に含まれるものにより提供される。
Ｃ．組み換えウイルス粒子の生産
１．ヘルパーウイルス／パッケージング細胞系
ＶＬＤＬＲミニ遺伝子を運ぶために用いられるプラスミドベクターのアデノウイルス遺伝子の量により、パッケージング細胞系またはヘルパーアデノウイルスまたは両方が、ＶＬＤＬＲミニ遺伝子を含んでいる感染性組み換えウイルス粒子を生産するために必要な、十分なアデノウイルス遺伝子配列を提供するために必要であることができる。
有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクター構築物に存在しない、またはベクターがトランスフェクトされる細胞系により発現されない選択したアデノウイルスの遺伝子配列を含む。好ましいヘルパーウイルスは、望ましくは複製能力を欠き、上記の修飾した配列に加えて様々なアデノウイルス遺伝子を含む。この状態において、ヘルパーウイルスは、望ましくは、アデノウイルス遺伝子を安定に発現するパッケージング細胞系と組み合わせて用いられる。ヘルパーウイルスはまた、引用することにより本明細書に取り込まれるＷｕ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：１６９８５−１６９８７（１９８９）；Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２９９：４９（１９９４年４月１日）、及び米国特許出願番号第０８／３３１，３８１号において記述されたように、ポリカチオンコンジュゲートに形成されることもできる。
ヘルパーウイルスは、場合によっては、第二のレポーターミニ遺伝子を含む。多数のそのようなレポーター遺伝子が、当該技術分野において既知である。アデノウイルスベクター上の導入遺伝子と異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Ａｄベクター及びヘルパーウイルスの両方が独立してモニターされることを可能にする。この第二のレポーターは、精製の際に、得られた組み換えウイルス及びヘルパーウイルス間の分離を可能にするために用いられる。望ましいヘルパー細胞の構築は、当該技術分野の技術の範囲内である。
一つの例として、ウイルスベクターを生産するために用いられる細胞系が、パッケージング細胞系でなく、そしてベクターが上に同定された最小アデノウイルス配列のみを含む場合、ヘルパーウイルスは、必要なアデノウイルス初期遺伝子Ｅ１、Ｅ２ａ、Ｅ４、及び全ての残りのアデノウイルスゲノムの後期、中間、構造、及び非構造遺伝子を与える野生型Ａｄベクターであることができる。しかしながら、この状態において、Ｅ１タンパク質を与えるパッケージング細胞系が２９３である場合、ヘルパー細胞系は、Ｅ１遺伝子を含む必要はない。
他の態様において、アデノウイルスベクター構築物が、複製能力を欠き（Ｅ１遺伝子がなく、そして場合によってはＥ３遺伝子がない）、そして２９３細胞系が用いられる場合、ハイブリッドウイルスの生産のためにヘルパーウイルスは必要ない。Ｅ３遺伝子産物は、機能するウイルス粒子の形成のために必要ないので、Ｅ３は、ヘルパーウイルスから除かれることができる。
好ましくは、精製を容易にし、ヘルパーウイルスとウイルスベクター粒子の汚染を減らすために、効率よいパッケージングを導くヘルパーウイルスの天然のアデノウイルス遺伝子配列を、ヘルパーウイルスのパッケージング機能またはその複製能力を実質的に奪うまたは「損なう」ように修飾することが有用である。
望ましい「損なわれた」アデノウイルスは、複製された直鎖状アデノウイルスゲノムの効率よいパッケージングのために必要な、少なくとも７つの異なるが機能的に重複した配列（「ＰＡＣ」配列）を通常含む、５’ＩＴＲパッケージング／エンハンサー領域において修飾される。Ａｄ５ゲノムのｂｐ１９４−３５８からの一続きのヌクレオチド配列内に、これらのＰＡＣ配列の５つ、すなわち、ｂｐ２４１−２４８でＰＡＣＩまたはその相補鎖［配列番号４］、ｂｐ２６２−２６９でＰＡＣ IIまたはその相補鎖［配列番号５］、ｂｐ３０４−３１１でＰＡＣ IIIまたはその相補鎖［配列番号６］、ｂｐ３１４−３２１でＰＡＣ IVまたはその相補鎖［配列番号７］、そしてｂｐ３３９−３４６でＰＡＣ Ｖまたはその相補鎖［配列番号８］が位置される。突然変異または欠失は、望ましい損なわれたヘルパーウイルスを作るために、アデノウイルスヘルパーウイルス中の一つまたはそれより多いこれらのＰＡＣ配列に作られることができる。この領域の修飾は、連続したまたは非連続のＰＡＣ配列の欠失を含む、５つ全てより少ない天然のアデノウイルスＰＡＣ配列を含む５’アデノウイルス配列を含むことができる。代わりの修飾は、５つの天然のＰＡＣ配列の最も頻繁に使われるヌクレオチドを含んでいる共通配列の一つまたはそれより多い反復での、一つまたはそれより多い天然のＰＡＣ配列の置換であることができる。代わりに、このアデノウイルス領域は、一つまたはそれより多い天然のＰＡＣ配列を分断する故意に挿入した突然変異により修飾されることができる。当該技術分野において熟練した者は、ヘルパーウイルスのパッケージング効率を所望するレベルまで減少する効果を同様に達成するために、ＰＡＣ配列をさらに操作することができる。
この情報を考慮すれば、当該技術分野において熟練した者が、ベクター構築物におけるアデノウイルス欠失を補足し、組み換えウイルス粒子の生産を可能にするために、他のヘルパーウイルスを設計したり、または他のパッケージング細胞系を開発できることに留意しなければならない。従って、あらゆる特定のヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系の使用または記述は、制限的ではない。
Ｅ１に加えてアデノウイルスタンパク質を与えることのできる他のパッケージング細胞系の存在下で、ヘルパーウイルスは、従って、これらのアデノウイルスタンパク質をコードしている遺伝子を欠失されることができる。そのようなさらに欠失されたヘルパーウイルスはまた、望ましくは、上記のような損なう修飾も含む。
ヘルパーウイルス中に存在しない、他のアデノウイルス遺伝子を含んでいるプラスミドと会合されることのできるポリカチオンヘルパーウイルスコンジュゲートも有用である。上記のヘルパーウイルスは、アデノウイルス−ポリリジンコンジュゲート技術の方法によりさらに修飾されることができる。例えば、上に引用したＷｕ等及び上に引用したＫ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ及びＪ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎを参照。
この技術を用いて、好ましくは後期アデノウイルス遺伝子を含んでいるヘルパーウイルスは、ヘルパーウイルスのキャプシドの周りに分配されたポリカチオン配列の付加により修飾される。好ましくは、ポリカチオンは、外側の陽性電荷を形成するために陰性に荷電したベクターの周りに付着するポリリジンである。次に、プラスミドが、ヘルパーウイルス中に存在しないアデノウイルス遺伝子、例えば、Ｅ１、Ｅ２、及び／またはＥ４遺伝子を発現するように設計される。このプラスミドは、ポリリジン配列上の電荷を通してヘルパーウイルスコンジュゲートに会合する。このコンジュゲートは、さらなるアデノウイルス遺伝子が、ヘルパーウイルスから除かれ、そして組み換えウイルスベクターの生産中にウイルスに組み込まれるようにならないプラスミド上に存在することを可能にする。従って、汚染の影響がかなり減少される。
２．ウイルス粒子の組み立て及び細胞系の感染
アデノウイルス、ＡＡＶ、及びレポーター遺伝子または治療遺伝子、及び他のベクター成分の選択したＤＮＡ配列のハイブリッドベクターへの組み立て、並びにハイブリッドウイルス粒子を生産するためのハイブリッドベクターの使用は、通常の技術を用いる。そのような技術は、指定研究書［上に引用したＳａｍｂｒｏｏｋ等］において記述されるようなｃＤＮＡの通常のクローニング技術、アデノウイルス及びＡＡＶゲノムの重複しているオリゴヌクレオチド配列の使用、ポリメラーゼ連鎖反応、及び所望するヌクレオチド配列を与えるあらゆる適当な方法を含む。標準的なトランスフェクション及び同時トランスフェクション技術、例えば、相補性２９３細胞系を用いたＣａＰＯ4トランスフェクション技術が用いられる。他の用いられる常法は、ウイルスゲノムの相同組み換え、寒天オーバーレイ中のウイルスのプラーク形成、シグナル生成を測定する方法などを含む。
例えば、所望するミニ遺伝子を含んでいるプラスミドベクターの構築及び組み立ての後に、このベクターを、適切なヘルパーウイルス及び／またはパッケージング細胞系の存在下で、インビトロで感染させる。ベクター中のアデノウイルス−導入遺伝子配列が複製され、ビリオンキャプシドにパッケージされることを可能にする、ヘルパー及びベクター間の相同組み換えが起こり、組み換えベクターウイルス粒子をもたらす。そのようなウイルス粒子を生産するための現在の方法は、トランスフェクションに基づく。簡潔に言えば、ヘルパーウイルスが、パッケージング細胞系ヒトＨＥＫ２９３のような細胞を感染するために用いられ、この細胞は、次に、常法により、ＶＬＤＬＲ導入遺伝子を含んでいるアデノウイルスプラスミドベクターで続いてトランスフェクトされる。トランスフェクション後、約３０またはそれより長い時間に、細胞は集められ、抽出物が調製され、ＶＬＤＬＲ導入遺伝子を含んでいる組み換えウイルスベクターが、ＣｓＣｌ勾配中の浮遊密度超遠心により精製される。
導入するウイルス粒子の収量は、主として、プラスミドでトランスフェクトされる細胞の数により決まり、これを、高い効率を有するトランスフェクションプロトコルを用いるために望ましくしている。一つのそのような方法は、上記のようなポリ−Ｌ−リジン化したヘルパーアデノウイルスの使用に関する。ＶＬＤＬＲミニ遺伝子を含んでいるプラスミドは、次に、陽性に荷電したヘルパーウイルスキャプシドに直接複合され、プラスミドベクター及びヘルパーウイルスのヘルパー機能を含んでいる単一のトランスフェクション粒子の形成をもたらす。
II．遺伝子治療における組み換えウイルスベクターの使用
上記のように、アデノウイルスベクター及びヘルパーウイルス、またはアデノウイルスベクター及びパッケージング細胞系の協力により生産された、ＶＬＤＬＲミニ遺伝子を含んでいる得られた組み換えアデノウイルスベクターは、従って、ＶＬＤＬＲ遺伝子をインビボまたはエクスビボで患者に運び、そして肝臓細胞への遺伝子の組込みを与えることができる、効率よい遺伝子導入媒体を提供する。
上記の組み換えベクターは、遺伝子導入のための常法においてヒトに投与され、ＬＤＬレセプター欠損症または他のリポタンパク質代謝異常に対する代わりのまたは補足の遺伝子治療として働く。ＶＬＤＬＲ遺伝子を保有しているウイルスベクターは、好ましくは、生物学的に適合する溶液または製薬学的に受容しうる運搬媒体中に懸濁されて患者に投与されることができる。適当な媒体は、滅菌した食塩水を含む。製薬学的に受容しうる担体であると知られた、そして当該技術分野において熟練した者によく知られた他の水性及び非水性の等張の滅菌注入溶液、並びに水性及び非水性の滅菌懸濁液が、この目的のために用いられることができる。
ウイルスベクターは、医学の当該技術分野において熟練した者により決定されることのできる過度に不都合でないかまたは医学的に受容しうる生理学的効果を有する治療利益を提供するために、肝臓細胞をトランスフェクトし、そしてＶＬＤＬＲ遺伝子の十分なレベルの導入及び発現を与えるために十分な量において投与される。通常のそして製薬学的に受容しうる投与経路は、肝臓への直接運搬、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口投与経路を含む。所望される場合、投与経路は、組み合わされることができる。
ウイルスベクターの服用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、及び健康のような因子により決まり、従って、患者間で変わり得る。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト服用量は、通常、約１ ｘ １０9から１ ｘ １０11ｐｆｕ／ｍｌまでのウイルスベクターの濃度を含む約２０から約１００ｍｌまでの食塩水溶液の範囲である。好ましい成人ヒト服用量は、２ ｘ １０10ｐｆｕ／ｍｌで約５０ｍｌの食塩水溶液であると概算される。服用量は、あらゆる不都合な副作用と治療利益を比較検討して調整される。ＶＬＤＬＲ遺伝子の発現レベルは、服用量投与の頻度を決定するためにモニターされることができる。
場合によっては方法工程は、ウイルスベクターの投与と同時または前または後のいずれかで、好ましくは短時間作用形である免疫調節剤の適当量を患者へ共投与することを伴う。本明細書において、選択される免疫調節剤は、本発明の組み換えベクターの産物に対して誘導される中和抗体の形成を阻害することができ、そして／またはベクターを含んでいる細胞の細胞溶解性Ｔリンパ細胞（ＣＴＬ）除去を防ぐことができる試剤として定義される。免疫調節剤は、中和抗体形成を防ぐためにＴヘルパーサブセット（ＴH1またはＴH2）及びＢ細胞間の相互作用を妨げることができる。代わりに、免疫調節剤は、ベクターのＣＴＬ除去の発生を減少させるためにＴH1細胞及びＣＴＬ間の相互作用を妨げるように選択されることができる。より明確には、免疫調節剤は、望ましくは、ＣＤ４ Ｔ細胞の機能を妨げるまたは阻止する。
中和抗体形成を防ぐことにおける使用のための免疫調節剤は、ＶＬＤＬＲを含んでいるアデノウイルスベクターに対する反応において生産されるあらゆる中和抗体の免疫グロブリンサブタイプの決定に基づいて選択されることができる。例えば、中和抗体がＩｇＡのようなＴH2が仲介する抗体である場合、免疫調節剤は、望ましくは、Ｂ細胞とＴH2細胞の相互作用を抑制または防害する。代わりに、誘導される中和抗体がＩｇＧ2AのようなＴH1が仲介する抗体である場合、免疫調節剤は、望ましくは、Ｂ細胞とＴH1細胞の相互作用を抑制または防害する。
本発明のウイルスベクターの投与に対する反応において生じる中和抗体は、しばしば、ベクターを運ぶために何の媒体が用いられるか、及び／または運搬位置に基づくことができる。例えば、肺を経由したアデノウイルスベクターの投与は、通常、ＩｇＡ中和抗体の生産を誘導する。血液を経由したアデノウイルスベクターの投与は、通常、ＩｇＧ1中和抗体を誘導する。中和抗体の決定は、動物モデルにおける選択したウイルスベクターの試験において容易に決定される。ウイルスベクターのＣＴＬ除去の減少が所望される場合、免疫調節剤は、インビトロでのウイルスベクターの延長した耐性を可能にするためのＣＤ４+ＴH1細胞を抑制または阻止する能力に関して選択される。
従って、免疫調節剤の選択は、妨げられるまたは阻止されるために要求される機構に基づくことができる。免疫調節剤は、サイトカイン及びモノクローナル抗体を含む、可溶性のタンパク質または天然に生じるタンパク質であることができる。免疫調節剤は、通常の製薬であることができる。本明細書において同定される免疫調節剤は、単独または互いに組み合わせて用いられることができる。例えば、シクロホスファミド及びより特異的な免疫調節剤抗ＣＤ４モノクローナル抗体が、共に投与されることができる。そのような場合、シクロホスファミドは、ＴH1活性化を阻止し、そして一時的な免疫遮断の期間を越えて導入遺伝子発現を安定させる試剤として働く。
免疫調節剤の適当な量または服用量は、主に、患者に最初に投与されるＶＬＤＬＲ遺伝子を保有している組み換えベクターの量、及び選択される免疫調節剤の型による。患者の治療される状態、年齢、体重、一般的な健康、及び免疫状態のような他の二次的な因子もまた、患者に与えられる免疫調節剤の服用量を決定する際に医師により考慮されることができる。
通常、例えば、治療的に有効なヒト服用量のサイトカイン免疫調節剤、例えば、ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γは、約１ ｘ １０7ｐｆｕ／ｍｌウイルスベクター当たり約０．５μｇから約５ｍｇまでの範囲に通常ある。様々な服用量が、あらゆる副作用と治療利点を比較検討するために、当該技術分野において熟練した者により決定されることができる。
Ａ．モノクローナル抗体及び可溶性タンパク質
好ましくは、遺伝子治療ベクターに対する不都合な免疫反応を防ぐ方法は、ＣＤ４+細胞の非特異的な不活性化に関する。好ましくは、そのような阻止抗体は、レシピエントが阻止抗体に対する免疫反応を高めるのを防ぐように「ヒト化」される。「ヒト化抗体」は、非ヒトドナーの免疫グロブリン由来の相補性決定部位（ＣＤＲ）、並びに／あるいはＬ及び／またはＨ可変領域構成部の他の部分を有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が、一つまたはそれより多いヒト免疫グロブリンに由来する抗体をいう。そのような抗体はまた、ドナーまたはアクセプターの被修飾Ｌ鎖またはキメラのＬ鎖と結合したヒト化したＨ鎖、あるいはその逆により特徴づけられた抗体も含むことができる。そのような「ヒト化」は、当該技術分野において既知の方法により達成されることができる。例えば、引用することにより本明細書に取り込まれる、Ｇ．Ｅ．Ｍａｒｋ及びＥ．Ａ．Ｐａｄｌａｎ、「第４章  Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第１１３巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、１０５−１３３頁を参照。
他の適当な抗体は、細胞表面のＣＤ４に対して誘導された抗体のようなＣＤ４+細胞を特異的に阻害または枯渇させるものを含む。ＣＤ４+細胞の枯渇は、ウイルスベクターのＣＴＬ除去を防ぐことが発明者等により示されている。そのような調節剤は、抗−ＯＫＴ３＋［例えば、米国特許番号第４，６５８，０１９号；欧州特許出願番号第５０１，２３３号、１９９２年９月２日公表、を参照］のような抗Ｔ細胞抗体を含むが、これらに制限されない。ＣＤ４+細胞を枯渇させるために市販されている抗体ＧＫ１．５（ＡＴＣＣ登録番号ＴＩＢ２０７）を用いる、以下の実施例２を参照。
代わりに、ＴH細胞によるＢ細胞の活性化のために必要な相互作用、従って中和抗体の生産を妨げるまたは阻止するあらゆる薬剤が、これらの方法の免疫調節剤として有用である。例えば、Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化は、Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原へのＴヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドの結合、並びにＢ細胞上のＢ７抗原へのＴ細胞上のＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ４リガンドの結合のようなある種の相互作用が起こることを必要とする［Ｆ．Ｈ．Ｄｕｒｉｅ等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１５（９）：４０６−４１０（１９９４）］。両方の相互作用なしに、Ｂ細胞は、中和抗体の生産を誘導するように活性化されることはできない。
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）−ＣＤ４０相互作用は、Ｔヘルパー細胞の活性化及び機能の両方におけるその広い活性、並びにそのシグナリング経路における重複がないために、遺伝子治療ベクターに対する免疫反応を阻止するための望ましい地点である。従って、本発明の一般に好ましい方法は、アデノウイルスベクターの投与時にＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用を一時的に阻止することに関する。このことは、ＴH細胞上のＣＤ４０リガンドをふさぎ、Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原とＴヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドの正常な結合を妨げる試剤で処理することにより達成されることができる。ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０の相互作用を阻止することは、導入遺伝子の安定性及び再投与に関する問題に寄与するＴヘルパー細胞の活性化を防ぐ。
従って、ＣＤ４０リガンドに対する抗体（抗ＣＤ４０Ｌ）［Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏから入手できる；例えば、欧州特許出願第５５５，８８０号、１９９３年８月１８日公表を参照］または可溶性のＣＤ４０分子が、この方法において選択される免疫調節剤であることができる。
代わりに、Ｔヘルパー細胞上に存在するＣＤ２８及び／またはＣＴＬＡ４リガンドをふさぐ試剤は、Ｂ細胞上の抗原Ｂ７とこれらのリガンドの正常な結合を妨げる。従って、Ｂ７の可溶性型またはＣＤ２８もしくはＣＴＬＡ４に対する抗体、例えば、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ［Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏから入手できる；例えば、欧州特許出願第６０６，２１７号、１９９４年７月２０日公表を参照］］が、本発明の方法において選択される免疫調節剤であることができる。この方法は、異種抗原に対する細胞性及び体液性の両方の免疫反応に向けられるので、以下に記述されるＴH2活性化を防ぐためのサイトカインの投与より優れた利点を有する。
Ｂ．サイトカイン
ＴH細胞機能を阻害するさらに他の免疫調節剤が、本発明において用いられることができる。
従って、一つの態様において、ＣＤ４+Ｔヘルパー細胞のＴH1サブセットの機能を選択的に阻害する免疫調節剤が、ウイルスベクターの最初の投与時に投与されることができる。一つのそのような免疫調節剤は、インターロイキンー４（ＩＬ−４）である。ＩＬ−４は、ＴH1細胞機能を犠牲にして、ＴH2細胞の抗原特異的活性を増大する［例えば、Ｙｏｋｏｔａ等、Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８３：５８９４−５８９８（１９８６）；米国特許番号第５，０１７，６９１号を参照］。ＴH1細胞機能を阻害できる他の免疫調節剤もまた、本発明の方法において有用であることが予見される。
他の態様において、免疫調節剤は、Ｔヘルパー細胞のＴH2サブセットの活性化を防ぐサイトカインであることができる。この方法の成功は、ＴH2依存性Ｉｇイソタイプがウイルス中和において果たす相対的な寄与により決まり、そしてその概要は、株、動物の種類、並びにウイルス運搬の方法及び標的器官により影響され得る。
ウイルスベクターの最初の投与時にＣＤ４+Ｔ細胞サブセットＴH2機能を選択的に阻害する望ましい免疫調節剤は、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）を含む。ＩＬ−１２は、ＴH2細胞機能を犠牲にして、ＴH1細胞の抗原特異的活性を増大する［例えば、欧州特許出願番号第４４１，９００号；Ｐ．Ｓｃｏｔｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：４９６−４９７（１９９３）；Ｒ．Ｍａｎｅｔｔｉ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：１１９９（１９９３）；Ａ．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：１３８７（１９９２）を参照］。本発明における使用のためのＩＬ−１２は、好ましくは、タンパク質の形態にある。ヒトＩＬ−１２は、既知の技術を用いて組み換え体として作られることができ、または購入されることができる。代わりに、ＩＬ−１２は、（場合によっては、導入遺伝子を発現するために用いられるものと同じであることができる）ウイルスベクター中に設計され、インビボまたはエクスビボで標的細胞中において発現されることができる。
ＩＬ−１２でのＴH2特異的除去は、ＩｇＡが中和抗体の主な源である肺への遺伝子治療において特に効果的である。肝臓への遺伝子治療においては、ＴH1及びＴH2細胞の両方がウイルス特異的抗体の生産に寄与する。しかしながら、中和抗体の全量は、ＩＬ−１２で減少されることができる。
同様の機能を果たす他の選択される免疫調節剤は、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）である［Ｓ．Ｃ．Ｍｏｒｒｉｓ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：１０４７−１０５６（１９９４）；Ｆ．Ｐ．Ｈｅｉｎｚｅｌ等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：１５０５（１９９３）］。ＩＦＮ−γは、活性化マクロファージ及びＴヘルパー細胞の分泌を介して、多数のＩＬ−１２の生物学的効果をもたらすと思われている。ＩＦＮ−γはまた、ＩＬ−４が刺激するＴH2の活性化を部分的に阻害する。ＩＦＮ−γはまた、様々な市販品から得られることができる。
代わりに、ＩＦＮ−γは、既知の遺伝子工学技術を用いて、ウイルスベクター中に設計され、インビボまたはエクスビボで標的細胞中において発現されることができる。
好ましくは、そのようなサイトカイン免疫調節剤は、ヒト組み換えタンパク質の形態にある。これらのタンパク質は、当該技術分野において存在する方法により作られることができる。中和抗体がＴH2によりもたらされる場合、これらのタンパク質のＴH2阻害機能を共有する、ＩＬ−１２またはγ−インターフェロンのような、本明細書において記述された既知の免疫調節剤の活性ペプチド、フラグメント、サブユニット、または類似体もまた、本法において有用である。
Ｃ．他の製薬
免疫機能を非特異的に阻害する他の免疫調節剤または試剤、すなわち、サイクロスポリンＡまたはシクロホスファミドもまた、本発明の方法において用いられることができる。例えば、短いクールのシクロホスファミドは、肝臓へのウイルス運搬時のアデノウイルスキャプシドタンパク質に対するＣＤ４及びＣＤ８の両方のＴヘルパー細胞の活性化をうまく妨げることが示されている。その結果、導入遺伝子の発現は引き延ばされ、そしてより多い服用量で中和抗体の形成が防がれ、成功したベクターの再投与が可能であった。肺においては、シクロホスファミドは、全ての服用量で中和抗体の形成を防ぎ、多い服用量で導入遺伝子の発現を安定化した。
Ｄ．免疫調節剤の投与
場合によっては選択した免疫調節剤の投与は、（例えば、ＬＤＬレベルによりモニターされるように）ＶＬＤＬＲ遺伝子が発現される期間の間、ヒトＶＬＤＬＲ遺伝子を保有している組み換えアデノウイルスベクターでの治療中、または組み換えベクターのあらゆるブースターと共に繰り返されることができる。
従って、本発明の組成物及び方法は、ヒト肝細胞におけるＶＬＤＬＲ遺伝子の安定な発現を与えることによるＬＤＬ代謝における欠陥に対する望ましい治療、及び患者による望ましくない免疫反応を招くことなしに所望されるようにベクターを再投与する技能を提供する。
以下の実施例は、本発明のウイルスベクター及びＶＬＤＬレセプター遺伝子インサートの構築及び試験、並びに代謝異常の治療におけるこれらの使用を例示する。ヒトＶＬＤＬレセプターをコードしている典型的な組み換えアデノウイルスは、以下の実施例１において記述されるように構築された。これらの実施例は、例証であるだけであり、本発明の範囲を制限しない。
実施例１−Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲの構築及び精製
ヒト超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）レセプターのｃＤＮＡ［上に引用したＭ．Ｅ．Ｇａｆｖｅｌｓ等；配列番号１］を（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．から得た）プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶのポリリンカー領域に挿入した。得られたプラスミド、ｐＲｃ／ＣＭＶＶＬＤＬＲを制限酵素、ＳｎａＢＩ及びＮｏｔＩで消化し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時−初期プロモーター及びＶＬＤＬレセプターｃＤＮＡを含んでいる４ｋｂフラグメントを単離した。
プラスミドｐＡｄ．ＣＭＶｌａｃＺ［上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ II］をＣＭＶプロモーター及びｌａｃＺ ｃＤＮＡを除くためにＳｎａＢＩ及びＮｏｔＩで消化し、５．６ｋｂバックボーンを単離した。ｐＡｄ．ＣＭＶＶＬＤＬＲ（図２及び９；配列番号３）を作製するために、２つのフラグメントを連結した。ｐＡｄ．ＣＭＶＶＬＤＬＲをＮｈｅＩで直鎖状にし、以前記述された［上に引用したＫ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びII］ようにＸｂａＩ及びＣｌａＩで消化した（アデノウイルス５型由来の）ｓｕｂ３６０ＤＮＡと共に２９３細胞に同時にトランスフェクトした。
Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲと呼ばれる、得られた組み換えアデノウイルスは、Ｅ３遺伝子に小さい欠失を有して、ｐＡｄ．ＣＭＶＶＬＤＬＲのヌクレオチド約１２から約４３９０までの配列及びＡｄ．５地図単位９−１００を含む（ジーンバンク登録番号Ｍ７３２６０及び図３の説明を参照）。この組み換えアデノウイルスを、２回のプラーク精製後に単離した。Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを２９３細胞において生育させ、以前に記述された［上に引用したＫ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びII］ように２回の塩化セシウム密度遠心により精製した。リン酸緩衝食塩水で平衡化したＢｉｏＲａｄ １０ＤＧ脱塩カラム上に通すことにより、塩化セシウムを除いた。
ウサギ実験のためには、新しく精製したウイルスを用い、マウス実験のためには、新しいウイルスを用いるか、またはカラム精製後にグリセロールを１０％（ｖ／ｖ）の最終濃度に加え、そして使用まで−７０℃でウイルスを保存した。
以下の実施例において記述されるように、ＶＬＤＬレセプターのインビボ機能を決定し、そしてＬＤＬレセプター欠損症に対する代わりのまたは補足的な遺伝子治療としての有用性を決定するために、この組み換えアデノウイルスベクターをＷＨＨＬウサギの肝臓及びＬＤＬレセプターノックアウトマウスの肝臓へ導入した。
実施例２−他の組み換えアデノウイルス
ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下にｌａｃＺ遺伝子をコードしているＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ、ＣＭＶがエンハンスしたニワトリβ−アクチンプロモーターの制御下にヒト低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターｃＤＮＡをコードしているＨ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを、以前記述されたように調製した［上に引用したＫ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びII］。
実施例３−ＷＨＨＬウサギにおけるＶＬＤＬレセプターの肝臓発現の効果
実施例１及び２において記述されたようにして得られたＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲまたは（β−ガラクトシダーゼをコードしている）Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを、以下のように、ＷＨＨＬウサギ［Ｃａｍｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ］に静脈内に注入した。０日に、ウサギに７．５ ｘ １０12粒子のいずれかの組み換えアデノウイルスを縁耳静脈を通して注入した。加えて、２匹のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ（ＮＺＷ）ウサギ［Ｈａｚｌｅｔｏｎ、Ｉｎｃ．］に各ウイルスを注入し、肝臓への遺伝子導入の程度を実証するために注入後５日目に殺した。
１１：００ａｍ頃に各日運ばれるピューリナ研究所食事の規定食で１２時間の明／暗周期においてウサギを維持した。示した日の１０：００ａｍ頃に縁耳静脈から静脈サンプルを得た。
Ａ．血漿分析
コレステロールＨＰキット及びＰｒｅｃｉｓｅ標準（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、全コレステロールに関して血漿サンプルを分析した。簡潔に言えば、ＦＰＬＣカラムバッファー（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中２５０μｌの容量に調整した、個々のマウスからの５０μｌの血漿に対してＦＰＬＣ分析を行った。希釈したサンプル（２００μｌ）を０．４ｍｌ／分の流速で連続した２本のＳｕｐｅｒｏｓｅ ６カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に添加し、１ｍｌのフラクションを集めた。１００μｌサンプルに対してマイクロプレートアッセイにおいてコレステロール含有量を分析した。５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ、ｐＨ ６．９、７．８ｇ／Ｌ ＨＤＣＢＳ、０．５１ｇ／Ｌ ４−ＡＡＴ、１．２７ｇ／Ｌコール酸、０．２４５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、７．３１ｇ／Ｌ ＫＣｌを含み、１．２２Ｕ／ｍｌコレステロールオキシダーゼ、７．６４Ｕ／ｍｌコレステロールエステラーゼ、及び２４５Ｕ／ｍｌペルオキシダーゼを補足した１００μｌの新しく調製した溶液をサンプルに加え、室温で一晩インキュベートし、そして４９０ｎｍでＯ．Ｄ．を測定した。
組み換えアデノウイルスを与えられる前後のＷＨＨＬウサギの各々に対して、血漿コレステロールレベルを評価した。図４は、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを注入したウサギがコレステロールレベルにおける何の著しい変化も有さないことを示す。しかしながら、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入後、コレステロールレベルは、１４０から４２０ｍｇ／ｄｌまでに及ぶ最大の減少を有して下がった（図４Ｂ）。このことは、ＶＬＤＬレセプターの発現が、ＬＤＬレセプター欠損ウサギにおいて減少したコレステロールレベルをもたらすことを示した。
Ｂ．組織化学分析
肝臓の一部をパラフィンで包埋し、切片にし、そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ある部分を新しく凍結し、切片にし、グルタルアルデヒド中で固定し、Ｘ−ｇａｌで染色し、そしてヘマトキシリンで軽く対比染色した。ある新しく凍結した切片をメタノール中で固定し、次に、以前記述したように［上に引用したＫ．Ｆ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びII］、ポリクローナル抗β−ガラクトシダーゼ抗体（５’−３’）、ポリクローナル抗ヒトＬＤＬレセプター抗体、またはポリクローナル抗ＶＬＤＬレセプター抗体のいずれかで、続いて、フルオレセインイソチオシアナートを結合した抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）により染色した。３７％ホルムアルデヒド中で１分間固定し、次にすすぎ、そしてＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（イソプロピルアルコール中０．５％のＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ ３／水２）中で１０分間染色した新しく凍結した切片に対してＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行った。スライドガラスをヘマトキシリン中で対比染色し、水溶液中にｍｏｕｎｔした。
注入されたウサギの免疫蛍光分析は、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを注入したウサギからの約５０％の肝細胞がβ−ガラクトシダーゼを発現し、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したウサギからの肝臓組織がわずかに高い割合のＶＬＤＬレセプターを発現している肝細胞を有することを示した。ＶＬＤＬレセプターｍＲＮＡ発現がほとんどまたは全くないことを示すノーザンブロット分析［上に引用したＭ．Ｅ．Ｇａｆｖｅｌｓ等］と一致して、ｌａｃＺを注入したウサギからの肝臓は、抗ＶＬＤＬレセプター抗体で何の反応性も示さなかった。
実施例４−ＬＤＬレセプターノックアウトマウスにおけるＶＬＤＬレセプターの短期間の肝臓発現の効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＬＤＬレセプターノックアウトマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）に、尾の静脈を通して０．５または１．０ ｘ １０10粒子の組み換えアデノウイルスを静脈内に注入し、注入前後でコレステロールレベルをモニターした。
明確には、各３匹のマウスに、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲ、または（ヒトＬＤＬレセプターｃＤＮＡをコードしている）Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを注入した。発表された結果［上に引用したＫｏｚａｒｓｋｙ Ｉ及びII］を確認するために、この最後のウイルスをコントロールとして含んだ。ヘパリン化した毛細管を用いてｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ出血により血漿サンプルを得た。実験を開始する前の離乳直後少なくとも３週間、１．２５％コレステロール、７．５％ココアバター、７．５％カゼイン、及び０．５％コール酸塩で補足したピューリナマウス食事からなる高コレステロール規定食（１．２５％コレステロール規定食）で、ＬＤＬレセプターノックアウトマウスを維持した。注入後５日目に、マウスを殺した。
実施例３において記述された技術による導入遺伝子の発現に対する免疫蛍光により肝臓組織を分析し、そして同様に記述されたように、血漿コレステロールレベルを測定した。リポタンパク質の分別のために、３倍のＬＤＬレセプターノックアウトマウスからの血漿をプールし、密度超遠心に供し、フラクションを集め、そして常法によりコレステロール含有量を測定した。
免疫蛍光分析は、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを注入したマウスにおける適度なレベルのβ−ガラクトシダーゼ発現を、そしてＨ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲ及びＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したマウスにおける高いレベルのヒトＬＤＬレセプター及びＶＬＤＬレセプター発現のいずれかをそれぞれ示した。
おそらく、マウスにおいて肝毒性を生じることのできる、組み換えアデノウイルスの注入の非導入遺伝子に関係する効果のために［Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１：４４０７−４４１１（１９９４年５月）、コントロールのＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを注入したマウスにおいてコレステロールレベルは、わずかに減少した（図５）。しかしながら、コントロールマウスにおいて観察された減少と対照的に、注入後５日目にＨ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを注入したマウスにおいて、コレステロールレベルは注入前の５０％まで著しく減少した。Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したマウスにおけるコレステロールレベルもまた、注入前レベルの約６０％まで減少した。血漿リポタンパク質のさらなる分析は、Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲで処理したマウスにおいて、ＩＤＬ及びＶＬＤＬフラクションにおける付加的な減少と共に、ＬＤＬレベルが急に落ちることを示した（図６）。Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したマウスは、ＶＬＤＬフラクションのより大きい減少をＬＤＬのより小さい減少と共に示した。
一緒に、これらのデータは、ＶＬＤＬレセプターの肝臓発現は、血漿からのＶＬＤＬの増加した排除をもたらし、ＶＬＤＬが前駆物質であるリポタンパク質（すなわち、ＩＤＬ及びＬＤＬ）の量の減少及び全血漿コレステロールの全般的な減少をもたらした。
実施例５−ＬＤＬレセプターノックアウトマウスにおけＶＬＤＬレセプターの長期間の肝臓発現の効果
ＦＨ患者及びＷＨＨＬウサギの両方において観察されるコレステロールレベルに近いものを得るために、ＬＤＬレセプターノックアウトマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を０．２％コレステロール、１０％ココナッツオイル、及び０．０５％コール酸塩で補足したピューリナマウス食事からなる高コレステロール規定食（０．２％コレステロール規定食）で維持した。これらのマウスにおけるコレステロールレベルは、９３０から１５５０ｍｇ／ｄｌにおよび、一方、１．２５％コレステロール規定食のマウス（実施例４）は、１９００ないし３１００ｍｇ／ｄｌのレベルを有した。
ウイルスを使用直前に解かし、１ ｘ １０12粒子／ｍｌの濃度にＰＢＳで希釈した。３匹のマウスに各々、β−ガラクトシダーゼ（Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ）またはヒトＬＤＬレセプター（Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲ）のいずれかをコードしている１ ｘ １０11粒子のＥ１を欠失した組み換えアデノウイルスを含んでいる０．１ｍｌのウイルスを静脈内に注入し、血清脂質を時間にわたって精察した。示した日に、マウスをメトキシフルランで麻酔にかけ、レトロ・オービタル（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）静脈集網叢の穿刺によりヘパリン化毛細管に集めた。
免疫蛍光染色は、大部分の肝細胞が、β−ガラクトシダーゼ、ヒトＬＤＬレセプター、またはＶＬＤＬレセプターのいずれかの導入遺伝子産物を発現したことを示した。肝臓切片のヘマトキシリン及びエオシン染色は、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを注入したマウスにおける本質的に正常な形態を示した。しかしながら、Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲ及びＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したマウスの両方に対して、肝細胞は内部液胞を有しているように見えた。組織を中性脂質に対する染色であるＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色で分析した時、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを注入したコトロールと比較すると、レセプターを注入した動物からの肝臓は、大きな脂肪滴の蓄積を明らかに示した。このことは、これらのＬＤＬレセプター欠損マウスにおけるＬＤＬレセプターまたはＶＬＤＬレセプターの短期間の高いレベルの発現が、脂質の細胞内蓄積をもたらすことを示唆した。
導入遺伝子産物の生物学的活性を確かめるために、血漿コレステロールレベルを組み換えアデノウイルスの投与の前後で精察した。図７Ａは、Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを注入したマウスにおける血清コレステロールレベルが、全てのリポタンパク質フラクション（ＨＤＬ、ＩＤＬ／ＶＬＤＬ、及びＬＤＬ）の小さい変化に反映される、特徴的であるが、時間にわたって著しくない変動を示したことを示す。それに反して、Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを注入したマウスは、コレステロールの大きいが一時的な減少を有する（図７Ｂ参照）。特に、これらのマウスは、約２週間続く大きい血漿コレステロールの減少を示した。コレステロールレベルは、３倍（９６６から３５３ｍｇ／ｄｌまで）及び７倍（１５５４から２１９ｍｇ／ｄｌまで）減少し、注入後３週までに基準まで戻った。血清コレステロールの減少は、血清ＬＤＬの同等の減少に反映される。免疫調節剤が同等に投与されない場合のこのアデノウイルス注入の非特異的な効果は、以前に記述されており、そして関連した炎症の結果として起こる肝機能における変化のためであると思われる。Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したマウスは、４倍以上（１１８６から２８８ｍｇ／ｄｌまで及び１４５３から２９９ｍｇ／ｄｌまで）の最大の減少を伴って、Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲを注入したマウスにおいて見られるものと大きさにおいて類似した血漿コレステロールの大きい減少を示した。意外なことに、血漿コレステロールレベルは、注入後３週までに基準まで戻らなかった。Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したマウスにおける血漿コレステロールレベルの変化（図７Ａ）は、注入後の９週（現在の実験期間）にわたって統計的に有意（ｐ＜０．０５）であった。
リポタンパク質フラクションに対するＶＬＤＬレセプター発現の効果を確認するために、個々のマウスからの血清を、ＦＰＬＣにより分析した。注入後３日に、ＶＬＤＬ及びＬＤＬフラクションは検出できず、注入後１０週でさえ、ＬＤＬのピークの高さはＨＤＬのピークの高さよりわずかに低かったけれども、時間にわたって、ＬＤＬフラクションはゆっくりと回復した。コレステロールアッセイの感度における制限のために、小さな変化は検出から逃れるかもしれないけれども、ＶＬＤＬは検出できないままであった。ＬＤＬのピークは、全血漿コレステロールレベルを反映し、血漿コレステロールの長く続く低減が、ＶＬＤＬ及びＬＤＬレベルの持続した減少により伴われることを確認した。これらのデータは、肝臓におけるＶＬＤＬレセプターの発現が、高コレステロール血症のための有効な治療であることを示唆する。
ＬＤＬレセプターノックアウトマウスの注入と同時に、正常なＶ５７ＢＬ／６マウスに組み換えアデノウイルスの各々を注入した。これらのマウスを注入後様々な時に殺し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現を検出するためのＸ−ｇａｌ組織化学及びＬＤＬレセプター発現を測定するために行われる免疫蛍光を用いた導入遺伝子発現の直接分析のために、肝臓組織を集めた。ウイルスの注入後３日目に集めた組織は、少なくとも８０％の肝細胞においてβ−ガラクトシダーゼまたはヒトＬＤＬレセプターのいずれかの発現を示した。
各実験において、ベクター特異的なシグナルは、遺伝子導入前または関係のない遺伝子を発現している同量のアデノウイルスの注入後の動物において見られるものよりかなり高かった。ｌａｃＺ及びＬＤＬレセプターの両方に対して、導入遺伝子の発現は、２１日までに検出できないレベルまで減少し、１０日目に最大量に達する肝臓における自己限定性の単核浸潤物の発生と関係した。この浸潤物は、小食片の存在により伴われた、門脈並びに小葉の炎症からなった。ＬａｃＺ及びＬＤＬレセプターを注入したマウス間で、病変の程度は区別できなかった。ＬＤＬレセプターの発現の時間経過は、血漿コレステロールの最初の大きな減少及びそれに続く基準への回復と一致する。
対照的に、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入した２匹のマウスは、高いレベルでＶＬＤＬレセプターを発現した、肝細胞の割合は５日のマウスに比較してわずかに減少したかもしれない。これらのデータは、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入したマウスにおける血漿コレステロールレベルの持続した減少は、ＶＬＤＬレセプターの持続した発現によったことを示唆する。
実施例６−回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）の研究
リポタンパク質代謝に対する肝臓ＶＬＤＬレセプター発現の効果をさらに特徴づけるために、以下のように回転の研究を行った。
ＬＤＬレセプターノックアウトマウスに、実施例４において記述されたように高コレステロールの規定食で３週後、組み換えアデノウイルスを注入した。各３匹のマウスに、ＬａｃＺ及びＬＤＬレセプターアデノウイルスを注入し、１匹のマウスにはＬＤＬレセプターアデノウイルスを注入した。注入後５日に、マウスに尾の静脈を通して、０．２ｍｌの全量中約８ ｘ １０6ｃｐｍの125Ｉ標識したヒトＬＤＬ及び１．６ ｘ １０5ｃｐｍの125Ｉ標識したヒトＶＬＤＬを注入した。血液サンプルを放射性標識の注入後１分に得、「時間０」サンプルと呼んだ。示した時間にヘパリン化毛細管に血液を集め、残っている放射能をガンマカウンターを用いて測定した。
ＬＤＬレセプターアデノウイルスの注入は、ＬＤＬレセプターノックアウトマウスにおける以前の研究［Ｓ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：８８３−８９３（１９９３）］と一致する、ｌａｃＺアデノウイルスの注入に比較して加速されたＬＤＬの排除をもたらした。同様に、ＶＬＤＬの排除は、ｌａｃＺを注入したマウスに比較して、ＬＤＬレセプターで処理したマウスにおいて加速された。ＶＬＤＬレセプターを注入したマウスにおけるＬＤＬの回転は、ｌａｃＺを注入したマウスと区別できず、これは、ＬＤＬがＶＬＤＬレセプターに対するリガンドでないことを示すインビトロのデータ［Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３：１４４−１４８（１９９３）；Ｆ．Ｂａｔｌｅｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：２３２６８−２３２７３（１９９４）］と一致する。ＶＬＤＬレセプターを注入したマウスにおけるＶＬＤＬの排除は、ｌａｃＺを注入したマウスよりわずかに速かったが、ＬＤＬレセプターを注入したマウスにおけるより著しく遅かった。
上に説明したように、ＶＬＤＬレセプターアデノウイルスを注入したマウスにおけるＶＬＤＬの回転は、その効果の大きさが、ＬＤＬレセプターウイルスで処理した動物において見られるものよりはるかに低かったけれども、ｌａｃＺを注入したマウスにおけるより著しく速かった。このことは、循環しているＶＬＤＬのＶＬＤＬレセプターが介在する排除が、減少した血清ＶＬＤＬをもたらす唯一の経路ではないかもしれないことを示唆する。一つの可能な機構は、キロミクロン残存物の肝臓の取り込みと共に起こる分泌−再捕獲［Ｔ．Ｗｉｌｌｎｏｗ ＆ Ｊ．Ｈｅｒｚ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７３：２１３−２２０（１９９５）；Ｈ．Ｓｈｉｍａｎｏ等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９３−２２１５−２２２３（１９９４）］であり、ＶＬＤＬの減少した分泌及び血漿ＶＬＤＬの減少したレベルをもたらす。第二の機構は、明らかにレセプターが細胞表面に達する前のリガンドの結合を防ぐために、細胞内で様々なレセプターと相互作用する［Ｇ．Ｂｕ等、ＥＭＢＯ  Ｊ、１４：２２６９−２２８０（１９９５）］レセプター結合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質（ＲＡＰ）［上に引用したＢａｔｔｅｙ；Ｈ．Ｍｏｋｕｎｏ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３２３８−１３２４３（１９９４）］とＶＬＤＬレセプターの相互作用に関するかもしれない。アデノウイルスを注入したマウスの肝臓において発現された高レベルのＶＬＤＬレセプターは利用できるＲＡＰを圧倒し、その結果、細胞内でＶＬＤＬレセプターが新しく合成されたリガンド（ａｐｏＥ、遊離または脂質と会合のいずれか）に結合し、その血漿への分泌を防いでいる可能性がある。全血漿コレステロール並びにリポタンパク質コレステロールレベルに対する肝臓ＶＬＤＬレセプター発現の影響は、ＶＬＤＬレセプターがインビボでリポタンパク質代謝において主要な役割を果たすことができることを示す。
実施例７−ＶＬＤＬレセプターの発現の安定性
本実験は、マウスにおける相対的な導入遺伝子の持続性を示す。
ＬＤＬレセプターノックアウトマウスに、０日に１ ｘ １０11粒子のＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ、Ｈ５．０１０ＣＢｈＬＤＬＲ、またはＨ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを静脈内に注入した。注入後の示した日（３、１０、または２１）にマウスを殺し、肝臓の新しく凍結した切片をそれぞれ、ｌａｃＺ遺伝子の発現を検出するためにＸ−ｇａｌで、ＬＤＬレセプター及びＶＬＤＬレセプターを検出するために抗ＬＤＬレセプター抗体または抗ＶＬＤＬレセプター抗体、及びそれに続くフルオレセインを結合した二次抗体で染色した。
ウイルスの注入後３日目に集めた肝臓の分析は、＞８０％の肝細胞においてＶＬＤＬレセプタータンパク質を示し、細胞の周辺に局在化した明るい蛍光シグナルは、遺伝子導入前及びｌａｃＺまたはＬＤＬレセプターを含んでいるアデノウイルスを注入した動物の組織にはなかった。ＶＬＤＬレセプタータンパク質の発現は著しく安定で、ウイルスの注入後１０５日目に集められた組織からの約５ないし１０％の肝細胞において組み換えタンパク質が検出された。このことは、導入遺伝子の発現が、遺伝子導入の３週以内に検出できないレベルまで消失したｌａｃＺ及びＬＤＬレセプターアデノウイルスで得られた結果に対して際立って対照的である。ＶＬＤＬレセプターの発現は、実験の期間（２２週）を通して検出可能なままであった。
ゲノムＤＮＡをマウス肝臓から単離し、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてアデノウイルスＤＮＡ配列の時間にわたる存在をモニターするためにサザンブロッティング［Ｋ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３６９５−１３７０２（１９９４）］に供した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍからのＧｅｎｉｕｓキット及びそれに続く化学発光検出を用いて、アデノウイルス配列を検出した。ｌａｃＺアデノウイルスを注入したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ウイルスＤＮＡは時間と共に迅速に減少し、注入後７０日を通してわずかに検出できるレベル（〜０．０５コピー／細胞）の安定基準に達した。ＶＬＤＬレセプターを注入したマウスは、わずかにより高い最初のＤＮＡレベルであるが、同様の時間経過のアデノウイルス配列の喪失を有した。さらなるＤＮＡハイブリダイゼーション研究は、肝臓へ最初に運ばれたアデノウイルスＤＮＡの大部分が、マウスゲノムに組み込まれないことを示した（データは示さない）が、しかしながら、このアッセイは、あるレベルの組み込みを排除することはできない。
ＶＬＤＬレセプターウイルスを注入したマウスからの肝臓組織の組織病理分析は、初期の時点での炎症及びアポプトーシス細胞を示した。病理結果のタイミング及び程度は、ｌａｃＺ及びＬＤＬレセプターウイルスを注入したマウスの肝臓組織と区別できなかった。しかしながら、注入後１５及び２２週で、ＶＬＤＬレセプターを注入したマウスからの肝臓組織は、ヘマトキシリン及びエオシン並びにｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色により示されたような、中性脂質の識別できる蓄積を示した。同様な変化が、ＰＢＳ、ＬＤＬレセプター、及び／またはｌａｃＺアデノウイルスを注入したＬＤＬレセプターノックアウトマウスにおいてまれに観察された。ＬＤＬレセプターノックアウトマウスにおいて観察されたものと区別できない長期間の遺伝子発現にもかかわらず、ＶＬＤＬレセプターウイルスを注入した正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝臓においては、何の脂質の蓄積も観察されなかった。このことは、ＶＬＤＬレセプター発現だけでは、ＬＤＬレセプターノックアウトマウスにおいて観察された脂質の蓄積における変化のために十分ではなく、その代わりに、≧１８週間高コレステロールの規定食で維持されたＬＤＬレセプターノックアウトマウスにおいて、長く続くＶＬＤＬレセプター発現により加速される何らかの脂質の蓄積があることを示す。
ＶＬＤＬレセプターアデノウイルスを注入したマウスからの血漿サンプルを、ＶＬＤＬレセプタータンパク質に対して誘導された抗体の存在に関して分析した。１２匹のうち１匹のみが、ウイルスを与えられた各動物におけるアデノウイルスキャプシドタンパク質に対する高レベルの抗体の存在にもかかわらず、ＶＬＤＬレセプターに対して抗体を生じた。ＶＬＤＬレセプターアデノウイルスを注入した動物は、ｌａｃＺまたはＬＤＬレセプターアデノウイルスのいずれかを注入した動物から得られたものと区別できないアデノウイルスタンパク質にたいするＣＴＬ反応を高めた。しかしながら、これらのマウスは、ＶＬＤＬレセプタータンパク質に対するＣＴＬ反応を高めなかった。従って、組み換えアデノウイルスの注入後の導入遺伝子に対するＣＴＬ反応の発生は、処理した動物における特定の導入遺伝子の抗原性による。
実施例８−アデノウイルス及び導入遺伝子に対する体液性及び細胞性免疫反応
Ａ．体液性免疫反応
２匹のＬＤＬレセプターノックアウトマウス（Ｋ０２０及びＫ０２７）または２匹の正常Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、尾の静脈を通して、０日に１ ｘ １０11粒子のＨ５．０１０ＢｈＬＤＬＲを注入し、ノックアウトマウスに対しては注入前（ｐｒｅ）、及び注入後１０、２４、３９、５２、及び７０日の両方に、そしてＣ５７ＢＬ／６マウスに対しては２１日に血清サンプルを集めた。以前に記述された［Ｋ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９：１３６９５−１３７０２（１９９４）；Ｋ−Ｋｏｚａｒｓｋｙ等、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．、１９：４４９−４５８（１９９３）］ように、ウェスタンブロッティングを行った。抗アデノウイルス抗体を検出するために、精製したアデノウイルスを抗原として用いた。陽性コントロール（＋）は、精製したＨ５．０１０ＢｈＬＤＬＲの静脈内注射後に単離したウサギ抗血清であった。陰性コントロール（−）は、免疫前のウサギ血清であった。陽性コントロールとしてβ−ガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）に特異的なモノクローナル抗体と共に精製したタンパク質（Ｓｉｇｍａ）を用いて、β−ガラクトシダーゼでのウェスタンブロットを行った。
ヒトＬＤＬレセプターに対して誘導された抗体を、ヒトＬＤＬレセプターをコードしているレトロウイルスを形質導入した３Ｔ３細胞系、２４−２３細胞から調製したライセートを用いて検出した。抗ＶＬＤＬレセプター抗体の検出のために、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲを注入後２日目のＨｅＬａ細胞からライセートを調製した。
１ ｘ １０11粒子の組み換えアデノウイルスを注入した全てのマウスは、ヘキソン、ペントン、及び繊維に対応する主要なバンドと共に、アデノウイルスキャプシドタンパク質に対する抗体を発生した。Ｈ５．０１０ＢｈＬＤＬＲを注入した全てのマウスは、ヒトＬＤＬレセプタータンパク質に対する抗体を発生し、ＬＤＬレセプターノックアウトマウスは、一貫して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスより高い力価の抗体を発生した。ＬＤＬレセプターノックアウトマウスからの抗体は、マウスＬＤＬレセプタータンパク質と交差反応し、一方、（正常なマウスＬＤＬレセプターを発現する）Ｃ５７ＢＬ／６マウスからの抗体は、交差反応しなかった。
このことは、ヒト及びマウスでない配列を用いたけれども、ＶＬＤＬレセプターがこれらのマウスにおいて免疫原性でなかったことを示す。ヒト及びマウスＬＤＬレセプターのアミノ酸配列は約７８％同一であり、一方、ヒト及びマウスＶＬＤＬレセプターは＞９４％同一である。この増加した配列の類似性は、Ｈ５．０１０ＣＭＶＶＬＤＬＲの注入の結果としてのマウス肝臓における高いレベルの発現にもかかわらず、ヒトＶＬＤＬレセプターに対する抗体の発生がないことを説明するように思われる。
これらのデータは、動物が、導入遺伝子産物並びに注入したアデノウイルス上にコードされたウイルスタンパク質に特異的な体液性免疫を生じることができるを示す。また、成熟した、抗体を分泌しているＢ細胞の発達のために通常必要とされる、Ｔヘルパー細胞の抗原特異的な活性化の間接的な証拠も提供する。
Ｂ．細胞性免疫反応
この研究は、ウイルス抗原及び導入遺伝子産物であるヒトＬＤＬレセプターの両方に対するＣＴＬの活性化に関して、ＬＤＬレセプターアデノウイルスの注入後の動物を分析した。
Ｙ．Ｙａｎｇ等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１：４３３−４４２（１９９４）において記述されたように、ＣＴＬアッセイを行った。以下のように作製された組み換えワクシニアで感染させることにより、組み換えワクシニアタンパク質を発現している標的細胞を作った。（ｐＲＣ／ＣＭＶプラスミド中の）ＶＬＤＬレセプターｃＤＮＡをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＨｉｎｄIII部位にサブクローン化した。ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ［Ｊ．Ｒ．Ｒｉｏｒｄａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４５：１０６６−１０７３（１９８９）］をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＰｓｔＩ部位にクローン化した。ｐＵＣ１９ベクター中のＬＤＬレセプターｃＤＮＡ［Ｔ．Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ｃｅｌｌ、３９：２７−３８（１９８４）］を制限酵素ＨｉｎｄIII及びＳａｃＩで切り出し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋のＨｉｎｄIII及びＳａｃＩ部位に連結した。これらのｃＤＮＡの各々を次に、酵素ＳａｃII及びＫｐｎＩを用いて切り出し、ワクシニア発現ベクターｐＳＣ１１［Ｓ．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３４０３−３４０９（１９８５）］の改変形のＳａｃII及びＫｐｎＩ部位にクローン化した。コントロール組み換えワクシニア、ＶＲＧは、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現し、Ｔ．Ｗｉｋｔｏｒ等、Ｐｏｒｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：７１９４−７１９８（１９８４）において記述されたように調製された。
ＭＨＣ適合標的細胞を単一の関係する遺伝子産物を発現する組み換えアデノウイルスまたはワクシニアウイルスのいずれかで感染させた、標準的な51クロム（51Ｃｒ）放出アッセイにおいて、特定の標的に対するＣＴＬを検出した。図１０は、％特異的な溶解が、増加するエフェクター対標的比の関数として測定される51Ｃｒ放出アッセイの実施例（図１０Ｂ）、並びに累積的なデータの要約（図１０Ａ）の両方を示す。ヒトＬＤＬレセプターまたはヒトＣＦＴＲのいずれかを含んでいる組み換えアデノウイルスを注入したＣ５７ＢＬ／６マウスからの脾臓細胞を、ウイルスタンパク質に対する活性を測定するために組み換えアデノウイルス、またはＬＤＬレセプタータンパク質に対する活性を測定するためにＬＤＬレセプターを含んでいるワクシニアウイルスのいずれかで感染させた標的を溶解する能力に関して評価した。同じウイルスで感染させた細胞を標的とするＬＤＬレセプターウイルスを感染させた動物からのリンパ細胞で細胞溶解活性を示した。擬似感染させた標的に対しては何の細胞溶解も検出されず、このことは、アッセイの特異性を裏づける。これらの同じエフェクター細胞は、コントロールワクシニアで感染させた時に存在しなかった、ＬＤＬレセプターワクシニアウイルスで感染させた標的に対する著しい細胞溶解活性を示した。これらの実験は、遺伝子治療後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるヒトＬＤＬレセプターに対する活性化されたＣＴＬの存在に対する有力な証拠を提供する。
実施例９−マウス肺におけるＩＬ−１２及びＩＦＮ−γによる第二の投与の際のアデノウイルスが媒介する遺伝子導入の向上
組み換えアデノウイルスＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ及びＨ５．０１０ＣＢＡＬＰ（ｓｕｂ３６０バックボーンにおいてＣＭＶがエンハンスしたβ−アクチンプロモーターから発現されるアルカリホスファターゼ遺伝子）をこの実験に用いた。各類似したウイルスは、発現を最初のレポーター遺伝子のものから識別することのできる異なるレポーター遺伝子を発現する。
０日にＨ５．０１０ＣＢＡＬＰ（５０μｌのＰＢＳ中１ ｘ １０9ｐｆｕ）の懸濁液を気管を通して、そして２８日にＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを同様に、メスのＣ５７ＢＬ／６マウス（６−８週年齢）に注入した。そのようなマウスの一群をコントロールとして用いた。別の群のマウスは、最初の遺伝子治療時（−３、０、及び＋３日）に、ＣＤ４+細胞に対する抗体（ＧＫ１．５；ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ２０７、腹水の１：１０希釈）のｉ．ｐ．注射によりＣＤ４+細胞を急激に枯渇させた。第三群のマウスには、ウイルスの一回目の投与時（０及び＋１日）に、ＩＬ−１２（１μｇの気管内または２μｇのＩ．ｐ．注射）を注入した。第四群のマウスには、ウイルスの一回目の投与時（０及び＋１日）に、γ−インターフェロン（１μｇの気管内または２μｇのＩ．ｐ．注射）を注入した。
続いて、３、２８、または３１日でマウスを安楽死させ、検死解剖した時に、肺組織を凍結切片用に調製し、一方、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び縦隔リンパ節（ＭＬＮ）を免疫学的アッセイのために集めた。
Ａ．凍結切片
肺組織を、上に引用したＹ．Ｙａｎｇ等の方法に従って、組織化学染色によりアルカリホスファターゼ発現に関して評価した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの全ての群の気道へのアルカリホスファターゼウイルス（１０9ｐｆｕ）の注入は、２８日までに検出できないレベルまで減少する伝達（ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ）気道の大部分における高いレベルの導入遺伝子の発現をもたらした。導入遺伝子発現の喪失は、遺伝子的に修飾された肝細胞のＣＴＬがもたらす除去のためであることが示された［上に引用したＹ．Ｙａｎｇ等］。
コントロールマウスにおいては、ウイルスの２回目の投与後３日目、すなわち、３１日目で、何の組み換え遺伝子発現も検出されなかった。
ＣＤ４+を枯渇させた動物へのウイルスの投与は、１カ月間安定である高いレベルの組み換え導入遺伝子の発現と関係した。第二のウイルスの発現は、３１日に検出できた。
最初の高いレベルの遺伝子導入は、ＩＬ−１２で処理したマウスにおいて約１か月後に減少したが、しかしながら、コントロールと対照的に、３１日の結果において見られるように、２８日にＩＬ−１２で処理した動物へウイルスを再投与し時、気道上皮細胞への高いレベルの遺伝子導入が得られた。
γ−インターフェロン処理した動物は、ウイルスの２回目の投与の際に効率よい遺伝子導入が達成された点において、ＩＬ−１２で処理した動物と実質的に区別できなかった。
Ｂ．免疫学的アッセイ−ＭＬＮ
Ｈ５．０１０ＣＢＡＬＰの投与後２８日目に集めたＣ５７ＢＬ／６マウスのコントロール群及びＩＬ−１２処理群のＭＬＮからのリンパ細胞を、１０粒子／細胞でＵＶで不活性化したＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺでインビトロで２４時間再刺激した。無細胞上清を、ＨＴ−２細胞（ＩＬ−２またはＩＬ−４依存性細胞系）においてＩＬ−２またはＩＬ−４の存在に関してアッセイした［上に引用したＹ．Ｙａｎｇ等］。同じリンパ細胞培養上清中のＩＦＮ−γの存在を記述された［上に引用したＹ．Ｙａｎｇ等］ようにＬ９２９細胞において測定した。ウイルスで再刺激したリンパ細胞の上清中で培養したＨＴ−２細胞へ取り込まれた3Ｈ−チミジンｃｐｍを抗原を含まない培地中でインキュベートしたリンパ細胞の上清中で培養したＨＴ−２細胞へ取り込まれたもので割ることにより、刺激指標（Ｓ．Ｉ．）を計算した。
これらの結果を以の表Ｉに示す。
0003868489.tif 000002
両組み換えアデノウイルスでの局所（ｒｅｇｉｏｎａｌ）リンパ節からのリンパ細胞の刺激は、Ｔヘルパー細胞のＴH1（すなわち、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γ）及びＴH2（すなわち、ＩＬ−４）サブセットの両方の活性化に特異的なサイトカインの分泌をもたらした（表Ｉ）。
ウイルスでインビトロで刺激したＩＬ−１２処理した動物からのリンパ細胞の分析は、ＩＬ−１２を与えられなかった動物と比較して、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γの増加した分泌、並びにＩＬ−４の相対的に減少した生産を示した（すなわち、ＩＬ−１２を用いた場合、ＩＬ−２／ＩＬ−４の割合は３から６まで増加した；表Ｉ）。
Ｃ．免疫学的アッセイ−ＢＡＬ
組み換えウイルスに対する最初の提示後２８日目の動物から得たＢＡＬサンプルを、以下のようにアデノウイルスに対する中和抗体及び抗アデノウイルス抗体のイソタイプに関して評価した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの同じ４群、すなわち、コントロール、ＣＤ４+枯渇、ＩＬ−１２処理、及びＩＦＮ−γ処理をＨ５．０１０ＣＢＡＬＰで感染させた。Ｈ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺ（２０μｌ中に１ ｘ １０6ｐｆｕ）と混合し、３７℃で１時間インキュベートし、そして９６穴プレート中８０％融合したＨｅｌａ細胞（ウェル当たり２ ｘ １０4細胞）に添加した、連続希釈したＢＡＬサンプル（１００μｌ）において中和抗体を測定した。３７℃で６０分のインキュベーション後、２０％ＦＢＳを含んでいる１００μｌのＤＭＥＭを各ウェルに加えた。細胞を固定し、次の日にβ−ガラクトシダーゼ発現に対して染色した。
抗アデノウイルス抗体の非存在下で、全ての細胞がｌａｃＺ陽性であった。
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、アデノウイルス特異的抗体のイソタイプをＢＡＬにおいて決定した。簡潔に言えば、９６穴プレートを５ ｘ １０9粒子のＨ５．０１０ＣＭＶｌａｃＺを含んでいる１００μｌのＰＢＳで４℃で１８時間被覆した。これらのウェルをＰＢＳで５回洗浄した。ＰＢＳ中２％のＢＳＡ２００μｌでブロッキングした後、プレートをＰＢＳで１回すすぎ、そして１：１０希釈したＢＡＬサンプルと共に４℃で９０分間インキュベートした。その後、ウェルをよく洗浄し、１００μｌの１：１０００希釈したアルカリホスファターゼを結合した抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡ（Ｓｉｇｍａ）で再び満たした。プレートをインキュベートし、続いて５回洗浄し、そして１００μｌの基質溶液（ｐ−ニトロフェニルリン酸塩、ＰＮＰＰ）を各ウェルに加えた。５０μｌの０．１Ｍ ＥＤＴＡの添加により基質の転換を停止した。プレートを４０５ｎｍで読み取った。
これらの結果を、中和抗体価、並びにＢＡＬサンプル中に存在するＩｇＧ及びＩｇＡの相対量（ＯＤ405）を要約する、図１１Ａから１１Ｃまでに図式的に示す。各サンプルに対する中和抗体の力価を、５０％未満の細胞が青色に染色される最も高い希釈として報告した。
図１１Ａから１１Ｃまでの第一の棒において示されるように、上の表１において同定されたサイトカインは、１：８００希釈までのインビトロアッセイにおいてヒトＡｄ５組み換えベクターを中和することのできるＩｇＧ及びＩｇＡの両方のイソタイプのＢＡＬ中のアデノウイルスタンパク質に対する抗体の出現にコントロールマウスにおいて関係した。
図１１Ａから１１Ｃまでのグラフの第二の棒において示されるように、一時的なＣＤ４+細胞の枯渇は、中和抗体（図１１Ａ）及びウイルス特異的なＩｇＡ抗体（図１１Ｃ）の形成を８０倍まで抑制し、それによりウイルスの２回目の投与後に効率よい遺伝子導入が起こることを可能にした。図１１Ｂは、同様にＩｇＧのわずかな抑制を示す。
より重要なことには、３つのグラフの第３の棒において示されるように、ＩＬ−１２は、ＩｇＧの形成に対して著しく影響を与えずに（図１１Ｂ）、抗原特異的なＩｇＡの分泌を選択的に阻止した（図１１Ｃ）。このことは、中和抗体の３２倍の減少（図１１Ａ）と同時に起こった。
γ−インターフェロンで処理した動物（図１１Ａから１１Ｂまでの第４の棒）は、ウイルス特異的なＩｇＡ（図１１Ｃ）及び中和抗体（図１１Ａ）がサイトカインで処理されなかったコントロール動物に比べて減少する点においてＩＬ−１２で処理した動物と実質的に区別できないが、ＩＬ−１２で処理したもので得られたほどではなかった。
これらの研究は、ウイルスへの最初の提示時のＣＤ４+機能の阻害が、阻止抗体の形成を防ぐのに十分であることを示す。抗ウイルスＩｇＡと中和抗体の一致した減少は、ＩｇＡサブタイプの免疫グロブリンが、主に、遺伝子導入に対する妨害の原因であることを示唆する。
上に再び引用した全ての参考文献は、参考文献により本明細書に含まれる。本発明の多数の修正及び変形が上に同定された明細書中に含まれ、そしてこれらは当該技術分野において熟練した者にとって明らかであると思われる。ＶＬＤＬＲ遺伝子を運ぶために選択されたアデノウイルスベクターの異なる修飾の選択、あるいはベクターまたは免疫調節剤の選択または服用量のような本発明の組成物及び方法に対するそのような修正及び改変は、本明細書に付加した請求の範囲内であると考えられる。
配列表
（１）一般情報
（ｉ）出願人：ペンシルバニア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）の受託者（ｔｒｕｓｔｅｅｓ）
Ｗｉｌｓｏｎ、Ｊａｍｅｓ  Ｍ．
Ｋｏｚａｒｓｋｙ  Ｋａｒｅｎ  Ｆ．
Ｓｔｒａｕｓｓ、Ｊｅｒｏｍｅ  Ｆ．
（ｉｉ）発明の名称：リポタンパク質代謝における欠陥の治療のための遺伝子治療の方法及び組成物
（ｉｉｉ）配列数：８
（ｉｖ）通信住所
（Ａ）受信人：Ｈｏｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｈｏｗｓｏｎ
（Ｂ）通り：スプリングハウスコーポレートセンター（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｃｎｔｒ．）、私書箱４５７（
Ｃ）市：スプリングハウス（Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｕｓｅ）
（Ｄ）州：ペンシルバニア（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）
（Ｅ）国：米国（ＵＳＡ）
（Ｆ）郵便番号：１９４７７
（ｖ）コンピューター可読形態
（Ａ）媒質のタイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ  ＰＣ  互換性
（Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎ  リリース＃１、バージョン＃１
（ｖｉ）現在の出願データ
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）申請日：
（Ｃ）分類：
（ｖｉｉ）先行する出願データ
（Ａ）出願番号：ＵＳ０８／３９３，７３４
（Ｂ）申請日：１９９５年２月２４日
（ｖｉｉｉ）弁護士／代理人の情報
（Ａ）氏名：Ｂａｋ、Ｍａｒｙ  Ｅ．
（Ｂ）登録番号：３１，２１５
（Ｃ）証明書番号：ＧＮＶＰＮ００９ＣＩＰｌ．ＰＣＴ
（ｉｘ）遠距離通信の情報
（Ａ）電話：２１５−５４０−９２００
（Ｂ）ファックス：２１５−５４０−５８１８
（２）配列番号１の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：３６５６塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｉｘ）特徴
（Ａ）名称／ＫＥＹ：ＣＤＳ
（Ｂ）位置：３９２．．３０１０
（ｘｉ）配列：配列番号１
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２）配列番号２の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：８７３アミノ酸
（Ｂ）配列の型：アミノ酸
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ｉｉ）配列の種類：タンパク質
（ｘｉ）配列：配列番号２
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（２）配列番号３の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：９５９２塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ｘｉ）配列：配列番号３
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（２）配列番号４の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列番号４
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（２）配列番号５の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列番号５
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（２）配列番号６の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列番号６
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（２）配列番号７の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列番号７
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（２）配列番号８の情報
（ｉ）配列の特徴
（Ａ）配列の長さ：１４塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数：二本鎖
（Ｄ）トポロジー：不明
（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
（ｘｉ）配列：配列番号８
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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