(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞の花糸組織から誘導したカルスと予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウムとをアンモニウムイオン成分を可及的に除いた共存培養培地で共存培養することにより、前記カルスに前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項２】
アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞の花糸組織から誘導したカルスと予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウムとをアンモニウムイオン成分を完全に除いた共存培養培地で共存培養することにより、前記カルスに前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項３】
アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞の花糸組織から誘導したカルスと予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウムとをＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを可及的に除いた共存培養培地で共存培養することにより、前記カルスに前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項４】
アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞の花糸組織から誘導したカルスと予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウムとをＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを完全に除いた共存培養培地で共存培養することにより、前記カルスに前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記共存培養期間は、一週間程度であることを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記カルスに前記遺伝子を導入した後、オーキシン及びサイトカイニンを添加した増殖培養培地を用いて前記カルスを増殖培養することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項７】
請求項６記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記増殖培養期間は、三ヶ月程度であることを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項８】
請求項６，７いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記オーキシンとサイトカイニンとの重量割合を、８〜１２：１に設定したことを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項９】
請求項６，７いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記オーキシンとサイトカイニンとの重量割合を、１０：１に設定したことを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項１０】
請求項６〜９いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記オーキシンは、ピクロラム（ｐｉｃｌｏｒａｍ）であり、前記サイトカイニンは、ベンジルアデニン（ＢＡ）であることを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面に前記カルスを当接させ該カルス中の植物細胞の表面に傷を付けた後、この表面に傷が付いた植物細胞に前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物細胞に外来の遺伝子を導入して遺伝子操作をする技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
植物細胞に外来の遺伝子を導入することによって、交雑育種では付加できない有用な形質を植物に付与することは、今後の農作物の改良と農業の発展に極めて意義がある。
【０００３】
この遺伝子導入法としては、物理的に植物細胞の一部に穴を空け、この穴から植物細胞に遺伝子を導入する物理的方法と、微生物の遺伝子導入能力を利用した生物的方法とがある。物理的方法の代表例としては、微小な金属粒子に外来の遺伝子を付着しておき、この金属粒子を空気銃で植物細胞に打ち込むパーティクルガン法（特表平５−５０８３１６号）、生物的方法の代表例としては、土壌細菌であるアグロバクテリウムの感染作用を利用したアグロバクテリウム法（特許第１６３３５４６号、特開昭６０−７００８０号、特開平６−２０９７７９号）が知られている。
【０００４】
ところで、物理的方法には、遺伝子の断片が過剰に植物細胞に組み込まれ、これにより目的の遺伝子の発現が妨げられてしまうという問題点がある。従って、植物細胞に遺伝子を導入する際には、生物的方法、特にアグロバクテリウム法が採用される場合が多い。
【０００５】
このアグロバクテリウム法について説明する。
【０００６】
先ず、遺伝子導入能力を持つアグロバクテリウムに物理的方法によって目的の遺伝子を導入しておく。
【０００７】
一方、遺伝子を導入したい植物細胞にメス等で傷を付けておく。この傷は植物の細胞壁を損傷させる程度としておく。
【０００８】
続いて、アグロバクテリウムと植物細胞とを一緒に培養する。この際、前記植物細胞の傷にアグロバクテリウムが接近して感染し、該植物細胞の細胞膜を通して内部の染色体に目的の遺伝子が組み込まれる。
【０００９】
これにより、植物細胞の遺伝子に目的の遺伝子を導入することができ、よって、植物の改良（植物の形質転換）が達成される。
【００１０】
しかし、このアグロバクテリウム法であっても、アグロバクテリウムに感染しにくい植物、例えば、ユリ属植物の場合、当然ながら、目的の遺伝子を導入することができないという問題点がある。
【００１１】
また、パーティクルガン法によってユリ属植物に遺伝子を導入することに成功した例が報告されているが（Ｗａｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｍｉｃｒｏｐｕｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
【００１２】
ｏｆ  ｌｏｎｇｉｆｌｏｒｕｍ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １７，２６２−２６７）、この報告例は導入効率が悪く、非実用的である（遺伝子導入の成功率は１％。唯、目的通りに遺伝子導入できないことも多く、実質的な成功率は非常に低い。）。
【００１３】
本発明は、上記問題点を解決するもので、アグロバクテリウムに感染しにくいユリ科ユリ属植物であってもアグロバクテリウム法により遺伝子を高効率で良好に導入できる実用性に秀れたユリ科ユリ属植物細胞への遺伝子導入技術を提供するものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
添付図面を参照して本発明の要旨を説明する。
【００１５】
アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞１の花糸組織から誘導したカルス８と予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウム９とをアンモニウムイオン成分を可及的に除いた共存培養培地12で共存培養することにより、前記カルス８に前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１６】
また、アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞１の花糸組織から誘導したカルス８と予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウム９とをアンモニウムイオン成分を完全に除いた共存培養培地12で共存培養することにより、前記カルス８に前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１７】
また、アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞１の花糸組織から誘導したカルス８と予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウム９とをＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを可及的に除いた共存培養培地12で共存培養することにより、前記カルス８に前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１８】
また、アグロバクテリウム法によりユリ科ユリ属植物の植物細胞１に遺伝子を導入する方法であって、前記植物細胞１の花糸組織から誘導したカルス８と予め遺伝子を導入してあるアグロバクテリウム９とをＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウムを完全に除いた共存培養培地12で共存培養することにより、前記カルス８に前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００１９】
また、請求項１〜４いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記共存培養期間は、一週間程度であることを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２０】
また、請求項１〜５いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記カルス８に前記遺伝子を導入した後、オーキシン及びサイトカイニンを添加した増殖培養培地13を用いて前記カルス８を増殖培養することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２１】
また、請求項６記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記増殖培養期間は、三ヶ月程度であることを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２２】
また、請求項６，７いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記オーキシンとサイトカイニンとの重量割合を、８〜１２：１に設定したことを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２３】
また、請求項６，７いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記オーキシンとサイトカイニンとの重量割合を、１０：１に設定したことを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２４】
また、請求項６〜９いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、前記オーキシンは、ピクロラム（ｐｉｃｌｏｒａｍ）であり、前記サイトカイニンは、ベンジルアデニン（ＢＡ）であることを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２５】
また、請求項１〜１０いずれか１項に記載のユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法において、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２に前記カルス８を当接させ該カルス８中の植物細胞１の表面に傷７を付けた後、この表面に傷７が付いた植物細胞１に前記遺伝子を導入することを特徴とするユリ科ユリ属植物への遺伝子導入方法に係るものである。
【００２６】
【発明の作用及び効果】
本発明は繰り返した実験の結果、得られた効果を請求項としてまとめたものである。
【００２７】
ユリ科ユリ属植物（Ｌｉｌｉｕｍ）のようにアグロバクテリウムに感染しにくい植物であっても、花器組織や花柄組織から誘導したカルス８には、アグロバクテリウム法によって遺伝子を良好に導入することができた。特に花糸組織から、誘導したカルス８を共存培養する際、アンモニウムイオン成分を除いた共存培養培地ほど遺伝子の導入効率が高かった。
【００２８】
本発明は上述のようにするから、アグロバクテリウムが感染しにくいユリ科ユリ属植物であってもアグロバクテリウム法により遺伝子を高効率で良好に導入できる実用性に秀れたユリ科ユリ属植物細胞への遺伝子導入技術となる。
【００２９】
【発明の実施の形態】
図面は本発明の実施例を図示したものであり、以下に説明する。尚、ｐｐｍ及び％は、いずれもｗ／ｖである。
【００３０】
先ず、ユリ科ユリ属植物の花器組織若しくは花柄組織を培地で培養し、該断片からカルス８（ユリ科ユリ属植物細胞１の塊）を誘導する。
【００３１】
このカルス８の誘導の際、ユリ科ユリ属植物の花器組織中の花糸組織を選択し、該花糸組織からカルス８を誘導すると最も良い。花糸組織の断片を選択した場合、最も良好にカルス８が誘導される。
【００３２】
尚、図１は、花糸組織から誘導したカルス８を用いた場合を図示している。
【００３３】
アグロバクテリウムに感染しにくい植物であるユリ科ユリ属植物の構造の一例（テッポウユリ）を図２に図示する。符号21は花器（ｆｌｏｗｅｒ  ｏｒｇａｎ）の部分、22は花柄（ｐｅｄｕｎｃｌｅ）、23は花糸（ｆｉｌａｍｅｎｔ）、24は外花被（ｏｕｔｅｒ  ｐｅｒｉａｎｔｈ）、25は内花被（ｉｎｎｅｒ  ｐｅｒｉａｎｔｈ）、26は花柱（ｓｔｙｌｅ）、27は柱頭（ｓｔｉｇｍａ）、28は葯（ａｎｔｈｅｒ）、29は子房（ｏｖａｒｙ）、30は苞（ｂｒａｃｔ）である。
【００３４】
上記培地は、公知の植物培養用の培地、例えば、２ｐｐｍ  オーキシン、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含んだＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６２）を採用する。
【００３５】
尚、その他の植物培養用の培地、例えば、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ，１９６５）、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇら，１９６８）、Ｒ２培地（Ｏｈｉｒａら，１９７３）、Ｎ６培地（Ｃｈｕら，１９７５）を採用しても良い。
【００３６】
続いて、誘導されたカルス８中の植物細胞１の表面に傷７を付ける。この傷７は、植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７とする。具体的には、植物細胞１の表面に存在する細胞壁10には傷７が付き、この細胞壁10の内側に存在する細胞膜11には傷７が付かない程度に設定する。
【００３７】
また、植物細胞１の表面に傷７を付ける際には、鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２にカルス８を擦り付けることで前記植物細胞１の表面に傷７を付ける方法を採用すると良い。
【００３８】
また、植物細胞１の表面に傷７を付ける際には、以下に説明する植物細胞処理装置を使用すると良い（図３〜５参照）。
【００３９】
この植物細胞処理装置は、開口部５を有する容器３の内壁には鋭利な微細凹凸を有する微細凹凸面２が設けられているものである。
【００４０】
容器３は筒状のものが採用されている。
【００４１】
また、容器３の開口部５には、該開口部５を閉塞する蓋体６が螺着脱自在に設けられている。
【００４２】
微細凹凸面２は容器３の内壁に紙ヤスリ４が付設されることで形成されている。
【００４３】
この紙ヤスリ４は、耐水性のものを採用すると良い。また、この紙ヤスリ４は＃１５０乃至８００程度のもの採用すると良い。また、傷７を付けようとする植物細胞１の細胞壁10の厚さに対応して使用する紙ヤスリ４を適宜選択すると良い。
【００４４】
植物細胞１に傷７を付ける際には、前記容器３にカルス８と培養液とを収納し、蓋体６を取り付けた後、震盪することにより、前記微細凹凸面２にカルス８中の植物細胞１を擦り付ける方法を採用すると良い。この方法によれば、培養液の存在により、植物細胞１が微細凹凸面２に強く擦り付けられることがなく、植物細胞１の表面に該植物細胞１が細胞分裂可能な程度の浅い擦り傷７が多数良好に付けられることになる。
【００４５】
また、震盪の際には、試験管ミキサー等の撹拌装置を用いると良い。また、震盪時間は、植物細胞１やカルス８によって適宜設定する。
【００４６】
続いて、植物細胞１の表面に傷７を付けた後、このカルス８とアグロバクテリウム９（遺伝子導入されたもの）とを一緒に培養（共存培養）して該植物細胞１にアグロバクテリウム９を感染させ、該植物細胞１の染色体に遺伝子を導入する。
【００４７】
共存培養の際に使用する培地は、アンモニウムイオン成分を可及的に含まない共存培養培地12、例えば、ＭＳ培地から培地の構成成分である硝酸アンモニウム（ＮＨ4ＮＯ3）を可及的に除いた共存培養培地12、望ましくは、硝酸アンモニウムを完全に除いた共存培養培地12を採用する。共存培養培地12中のアンモニウムイオン成分の量が通常量より少ない程、多くのユリ科ユリ属植物の植物細胞１に遺伝子が導入されることを実験により確認している（図６参照）。
【００４８】
また、ＭＳ培地は、例えば、２ｐｐｍ  オーキシン、２０ｐｐｍ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含むものを採用すると良い。
【００４９】
尚、Ｂ５培地、Ｒ２培地、Ｎ６培地のようにアンモニウムイオン成分が硫酸アンモニウム（（ＮＨ4）2ＳＯ4）として含まれている場合、該硫酸アンモニウムを除いて採用する。
【００５０】
共存培養期間は１週間程度とする。
【００５１】
続いて、植物細胞１に遺伝子を導入した後、該植物細胞１（カルス８）を培養して増殖させる。
【００５２】
増殖培養の際に使用する培地は、遺伝子が導入されたユリ科ユリ属植物細胞１が選択的に増殖される物質（ユリ科ユリ属植物細胞１に導入された選択マーカー遺伝子に対応する適当量の抗生物質。例えば、ハイグロマイシン等。）を含む増殖培養培地13を採用する。また、この増殖培養培地13は、植物の増殖を良好に行う為、０．１ｐｐｍ  オーキシン、０．０１ｐｐｍ  サイトカイニン、３００ｐｐｍ  ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含むＭＳ培地を採用する。
【００５３】
オーキシンは、ピクロラム（ｐｉｃｌｏｒａｍ）を採用すると良い。また、サイトカイニンは、ベンジルアデニン（ＢＡ）を採用すると良い。
【００５４】
このオーキシンとサイトカイニンの重量割合は重要であり、１２：１乃至８：１が良いことが実験により確認されている。尚、１０：１が最も良い。
【００５５】
また、オーキシンの量は、最大２ｐｐｍまでとする。サイトカイニンの量は、オーキシンの量により決定する。
【００５６】
ＭＳ培地の代わりに、ＬＳ培地、Ｂ５培地、Ｒ２培地、Ｎ６培地等の他の植物培養用の培地を採用しても良い。
【００５７】
この増殖培養は、約３カ月程度行う。この増殖によって成長したカルス８からは、芽32が再分化することが可能となる。
【００５８】
芽32が再分化したら、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含む培地（例えばＭＳ培地）にカルス８から再分化した芽32を置いて発根を促進し、その後に土壌に植えて植物を成長させる。
【００５９】
以上の方法により、アグロバクテリウム法での遺伝子導入が困難といわれていたユリ科ユリ属植物細胞１への遺伝子導入を実験してみたところ、２００個のカルス８から６個の遺伝子導入されたカルス８が得られた。また、得られたカルス８から良好に発芽及び発根が行われることが確認された。
【００６０】
本実施例は上述のようにするから、ユリ科ユリ属植物のようにアグロバクテリウム９が感染しにくい植物であってもアグロバクテリウム法により遺伝子を実用上十分な高効率で良好に導入できる実用性に秀れたユリ科ユリ属植物細胞への遺伝子導入技術となる。
【００６１】
以下、本実施例の効果を確認した実験例について説明する。
【００６２】
Ａ  実験例１：ユリへの遺伝子導入（図１参照）
１．植物細胞処理装置の作製
＃１５０の耐水性紙ヤスリを縦８．５ｃｍ横９ｃｍに切断して円筒状とし、遠沈      管（容量５０ｍｌ）の内壁に配設した。
【００６３】
２．導入遺伝子とアグロバクテリウム
遺伝子導入用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、イントロンを含んだβ−      ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ遺伝子（以下、ＧＵＳという）及びハイグロマイシン      耐性遺伝子を植物に導入される部位に含むｐＩＧ１２１-Ｈｍを用いた（図７参照
）。このベクターを保持するアグロバクテリウム  ツメファンエンス（ＥＨＡ１０      １株）を用いて遺伝子操作を行った。
【００６４】
３．花糸からのカルス誘導
開花前のユリ（Ｌｉｌｉｕｍ  ｏｒｉｅｎｔａｌ  ｈｙｂｒｉｄ  ｃｖ．Ａｃａ      ｐｕｌｃｏ）のつぼみより花糸を切り出し、オーキシンとして２ｐｐｍ  ｐｉｃｌ      ｏｒａｍ及び０．３％  Ｇｅｌｌａｎ  Ｇｕｍを含むＭＳ培地上に置き、カルスを      誘導した。
【００６５】
４．カルスの傷つけ
上記３．で誘導したカルス２０個（直径約１ｃｍ）を、２ｐｐｍ  ｐｉｃｌｏｒ      ａｍ、２０ｐｐｍ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎ、７００ｐｐｍ  アスパラギン水      和物、７００ｐｐｍ  グルタミンを含むＭＳ液体培地（２０ｍｌ）と共に前記１．      で作製した植物細胞処理装置に入れ、試験管ミキサーを用いて１０秒間激しく攪拌      震盪した。
【００６６】
５．アグロバクテリウムとカルスの共存培養
前記４．で傷を付けたカルスを前記２．で得たアグロバクテリウムと混合し、オ      ーキシンとして２ｐｐｍ  ｐｉｃｌｏｒａｍ、２０ｐｐｍ  ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎ      ｇｏｎｅ、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含み、硝酸アンモニウムの濃度を、      ２０ｍＭ、５ｍＭ、０．５ｍＭ、０．０５ｍＭ、０ｍＭとしたＭＳ培地上に置き、      ７日間培養した。
【００６７】
６．ＧＵＳ染色
前記５．の共存培養後、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  ｅ      ｔ  ａｌ．(１９８７）ＧＵＳ-ｆｕｓｉｏｎ：β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ        ａｓ  ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓ      ｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ．  ＥＭＢＯ  Ｊ．６      ，３９０１-３９０７）により、カルスの染色を行った。その結果、アグロバクテ
リウムのユリへの感染に最適な硝酸アンモニウムの濃度は、０ｍＭであることが判      明した（下記表１参照）。
【００６８】
【表１】
0003940768.tif 000002
【００６９】
７．遺伝子が導入された細胞の選抜
前記５．の共存培養後、３００ｐｐｍ  ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ、５０ｐｐｍハイ      グロマイシン、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含み、オーキシンとしてｐｉｃ      ｌｏｒａｍ  ２ｐｐｍ、あるいは、オーキシンとしてｐｉｃｌｏｒａｍ  ０．１ｐ      ｐｍ、サイトカイニンとしてＢＡ  ０．０１ｐｐｍを加えたＭＳ培地上で、カルス      を３ヶ月培養した。その結果、オーキシンとしてｐｉｃｌｏｒａｍ  ０．１ｐｐｍ      、サイトカイニンとしてＢＡ  ０．０１ｐｐｍ加えた培地を用いた場合に遺伝子が      導入された芽が６個体得られた（下記表２参照）。
【００７０】
【表２】
0003940768.tif 000003
【００７１】
８．植物体の再生
前記７．で選抜されてきた芽を切り取り、０．３％  ｇｅｌｌａｎ  ｇｕｍを含      むＭＳ培地上に置くことによって発根を促し、ユリの植物体を得た。得られたユリ      は良好に生育した。
【００７２】
Ｂ  比較例：従来法によるユリへの遺伝子導入（図８参照）
一般的に植物の遺伝子導入を行う場合と同様、ユリのリン片（図中符号20）から
カルスを誘導して遺伝子操作を行った。
【００７３】
また、ユリ科ユリ属植物の植物細胞に傷を付ける方法は、メスで傷を付ける方法を    採用した。
【００７４】
また、カルスとアグロバクテリウムとを共存培養する際の培地（図中符号14）は
、硝酸アンモニウムを通常通り含むＭＳ培地を採用した。
【００７５】
また、遺伝子導入されたカルスを培養する際の培地（図中符号15）は、オーキシ
ン及びサイトカイニンを含まない培地を採用した。
【００７６】
比較例では、遺伝子導入されなかった。
【００７７】
Ｃ  実験例２：カルスの由来による影響
実験例１の３．と同様の方法により、ユリの各部位からカルスの誘導及び増殖を行    った。結果を下記表３に示す。一般に行われているリン片からでは、カルスの増殖量    は少なく、花器組織及び花柄組織からカルスを誘導した方が増殖量が多いことが確認    された。
【００７８】
【表３】
0003940768.tif 000004
【００７９】
従って、カルスの増殖量が多いことから、花器組織及び花柄組織からカルスを誘導    し、遺伝子導入を行った方が良いと思われた。尚、花糸を用いた場合が、最も増殖量    が多かった。
【００８０】
Ｄ  実験例３：アンモニウムイオン成分及び硝酸イオン成分の影響
実験例１及び図６から、アグロバクテリウムを感染させる際、硝酸アンモニウムが    少ない方が良いことは確認されたが、硝酸アンモニウムの内のアンモニウムイオン成    分が少なければ良いのか、硝酸イオン成分が少なければ良いのかは不明であった。そ    こで、ＭＳ培地に依然として残っている硝酸カリウム（ＫＮＯ3）の量を減らし、実
験例１と同様に遺伝子導入を試みた。
【００８１】
遺伝子導入の成否は、実験例１と同様、ブルースポットによって確認した。
【００８２】
硝酸アンモニウムと硝酸カリウムの双方の量を少なくした場合、実験例１と同様の    結果が得られた。一方、硝酸カリウムだけを少なくした場合、カルスが青に変色せず    、遺伝子の導入は成功しなかった。
【００８３】
従って、アグロバクテリウムの感染には、硝酸イオン成分の影響はなく、アンモニ    ウムイオン成分が該感染を阻害することが確認された。
【００８４】
以上の各実験例によれば、本実施例を採用することにより、これまでアグロバクテリウム法での遺伝子導入が困難であったユリ科ユリ属植物であっても遺伝子導入を高効率で良好に行うことができ、ユリ科ユリ属植物の形質転換体を作出できることが確認された。
【００８５】
従って、本実施例によれば、これまでよりも多くのユリ科ユリ属植物に外来の遺伝子を導入し、これにより交雑育種では得られない新規な有用形態（新規花色や耐病性等）を付与することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本実施例の説明工程図である。
【図２】  本実施例のユリの構造の説明図である。
【図３】  本実施例の植物細胞の説明図である。
【図４】  本実施例の植物細胞処理装置の説明側断面図である。
【図５】  本実施例の植物細胞処理装置の説明平断面図である。
【図６】  本実施例の共存培養培地に含まれるＮＨ4ＮＯ3の量とアグロバクテリウム９の感染効率との関係を示すグラフである。
【図７】  ｐＩＧ１２１−Ｈｍのマップである。
【図８】  従来のアグロバクテリウム法の説明工程図である。
【符号の説明】
１  植物細胞
２  微細凹凸面
７  傷
８  カルス
９  アグロバクテリウム
12  共存培養培地
13  増殖培養培地
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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