(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部及び外部細胞膜を有する細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法であって、
（ａ）所望のタンパク質をコードするDNA配列に融合したアクロモバクター・ライチカス（Achromobacter lyticus）プロテアーゼＩをコードする遺伝子によりコードされるポリペプチドの残基１−205に対応する、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＮ−末端プレプロペプチドをコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体であって、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＣ−末端プロペプチドをコードするDNA配列を含まないもの、を含む組換えベクターを用意し；
（ｂ）段階（ａ）の組換えベクターにより、内部及び外部細胞膜を有する細菌の細胞を形質転換し；
（ｃ）前記DNA挿入体の発現、及び所望のタンパク質に融合された前記プロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で、前記段階（ｂ）の形質転換された細胞を培養し；そして
（ｄ）前記培地からその得られるタンパク質を回収する；
ことを含んで成る方法。
【請求項２】
前記所望のタンパク質に融合されたプロペプチドが、前記内部及び外部細胞膜の両者を通しての分泌により細胞から輸送される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記所望のタンパク質に融合されたプロペプチドが、前記内部及び外部細胞膜の両者を通してのトランスロケーションにより細胞から輸送される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記所望のタンパク質に融合されたプロペプチドが、ペリプラズム空間への前記タンパク質の輸送、続く外部膜の溶解により細胞から輸送される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記外部膜の溶解が部分的溶解である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記DNA構造体が、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの180アミノ酸のＣ−末端プロペプチドではない少なくとも一部をコードするDNA配列をさらに含んで成る請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記更なるDNA構造体が、十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ａ．ライチカスプロテアーゼＩが活性形で存在する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ａ．ライチカスプロテアーゼＩが不活性形で存在する請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記所望のタンパク質をコードするDNA配列が、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質、グルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経路インヒビター、アプロチニン、トリプシン又はインスリン、又はインスリン前駆体又は類似体をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌がグラム陰性細菌である、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記グラム陰性細菌がＥ．コリである請求項11に項記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞外生成されるタンパク質が成熟過程にゆだねられる請求項１〜12のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
所望のタンパク質をコードするDNA配列に先行し且つそれに融合したアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩをコードする遺伝子の残基１−205に対応するＮ−末端プレプロペプチドをコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体であってアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＣ−末端プロペプチドをコードするDNA配列を含まないもの、を含む組換え発現ベクター。
【請求項１５】
前記DNA構造体が、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの180アミノ酸のＣ−末端プロペプチドではない少なくとも一部をコードするDNA配列をさらに含んで成る請求項14に記載のベクター。
【請求項１６】
前記更なるDNA構造体が、十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質をコードする、請求項15に記載のベクター。
【請求項１７】
前記所望のタンパク質をコードするDNA配列が、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質、グルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経路インヒビター、アプロチニン、トリプシンもしくはインスリン、又はインスリン前駆体又は類似体をコードする請求項14に記載のベクター。
【請求項１８】
所望のタンパク質をコードするDNA配列に先行し且つそれに融合したアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩをコードする遺伝子によりコードされるポリペプチドの残基１−205に対応するＮ−末端プレプロペプチドをコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体であって、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＣ−末端プロペプチドをコードするDNA配列を含まないもの。
【請求項１９】
Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの180アミノ酸のＣ−末端プロペプチドではない少なくとも一部をコードするDNA配列をさらに含んで成る、請求項18に記載のDNA構造体。
【請求項２０】
前記更なるDNA配列が、十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質をコードする、請求項19に記載のDNA構造体。
【請求項２１】
前記所望のタンパク質をコードするDNA配列が、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質、グルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経路インヒビター、アプロチニン、トリプシン又はインスリン、又はインスリン前駆体又は類似体をコードする請求項18に記載のDNA構造体。
【請求項２２】
内部及び外部細胞膜を有する細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法であって、内部及び外部細胞膜を有する細菌を、所望のタンパク質をコードするDNA配列に融合したアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩをコードする遺伝子によりコードされるポリペプチドの残基１−205に対応するアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＮ−末端プレプロペプチドをコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体であってアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＣ−末端プロペプチドをコードするDNA配列を含まないもの、を含む組換えベクターにより形質転換し、前記DNA挿入体の発現、及び所望のタンパク質に融合された前記プロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で培養し、そして得られるタンパク質を前記培地から回収する、ことを含んで成る方法。
【請求項２３】
内部及び外部細胞膜を有する細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法であって、内部及び外部細胞膜を有する細菌を、所望のタンパク質をコードするDNA配列に融合したアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩをコードする遺伝子によりコードされるポリペプチドの残基１−205に対応するアクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＮ−末端プレプロペプチドをコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体であって、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩのＣ−末端プロペプチドをコードするDNA配列を含まないもの、を含む組換えベクターにより形質転換し、前記DNA挿入体の発現、及び所望のタンパク質に融合された前記プロペプチドの、前記内部及び外部細胞膜を通しての分泌による、又はペリプラズム空間へのタンパク質の輸送、続く外部膜の一部の溶解による細胞からの輸送を通しての、培養培地中への漏出を可能にする条件下で培養し、そして得られるタンパク質が前記培地から回収されることを含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法、並びに前記タンパク質をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体及び組換えベクターに関する。
発明の背景
内部及び外部の両細胞膜を有する原核生物、たとえばグラム陰性細菌は、周囲培地中に細胞からタンパク質を分泌するのはまれである。細胞質中に残存しないそのようなタンパク質は通常、細胞質膜を通してペルプラズム空間に送られるが、しかし外部細胞膜を通しては送られない。しかしながら、つい最近、グラム陰性細菌から真に分泌されるタンパク質の例が見出されている。
すなわち、リソバクター・エンザイモゲネス（Lysobacter enzymogenes）は、アルカリホスファターゼ（S. Auなど., J. Bacteriol. 173（15）, 1991, 4551-4557pを参照のこと）及びα−溶菌プロテアーゼを分泌する。Ｅ．コリにおいてα−溶菌プロテアーゼを発現する試みは、細胞内における及び細胞外培地における酵素の製造をもたらした（J. L. Silenなど., J. Bacteriol. 171（3）, 1989, 1320-1325pを参照のこと）。
同様に、アクロモバクター・ライチカス（Achromobacter lyticus）は、細胞外プロテアーゼを生成し、この一次構造はS. Tsunasawaなど., J. Biol. Chem. 264（7）, 1989, 3832-3839pから明白である。Ａ．ライチカス  プロテアーゼＩをコードする遺伝子がＥ．コリにおいてクローン化され、ここで酵素が培養培地中に分泌されるよりもむしろペリプラズムに輸送されている（T. Oharaなど., J. Biol. Chem. 264（34）, 1989, 20625-20631を参照のこと）。
発明の要約
細胞からタンパク質を容易に転移しない異種宿主細菌からタンパク質の細胞外生成を得ることが可能であることが見出された。そのような細胞外生成は、一定の細菌の細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部により達成される。
従って、本発明は、内部及び外部細胞膜を供えた細菌において細胞外タンパク質を製造するための方法に関し、ここでこの方法は、
（ａ）所望のタンパク質をコードするDNA配列の先に且つそれに作用可能的に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体を含む組換えベクターを用意し、
（ｂ）段階（ａ）の組換えベクターにより、内部及び外部細胞膜を供えた細菌の細胞を形質転換し、
（ｃ）前記DNA挿入体の発現、及び所望のタンパク質に融合された細菌性細胞外プロテアーゼプロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で、前記段階（ｂ）の形質転換された細胞を培養し、そして
（ｄ）前記培地からその得られるタンパク質を回収する、
ことを含んで成る。
本発明において、用語“内部及び外部細胞膜を供えた細菌”とは、細胞の細胞質を取り囲む内部膜又は細胞質膜、及び外部膜、並びに、内部膜と外部膜との間のペリプラズム空間を有する細胞を示すことを意図される。ほんどのそのような生物においては、外部膜を通してのタンパク質の分泌はまれであるが、内部膜を通してペリプラズム空間への発現された遺伝子生成物のトランスロケーションを可能にする機構（シグナル配列を含む）が存在する。用語“異種”とは、宿主細胞に適用される場合、その宿主細胞が自然において、注目のタンパク質を生成しない細胞であることを示すことを意図される。
用語“プレプロペプチド”とは、シグナルペプチド（プレペプチド）、及び生成されるべきタンパク質の前駆体形上に存在する１又は複数のペプチド配列から構成されるペプチドを示すことを意図される。プレプロペプチドの一部（又はフラグメント）が本発明の方法に使用される場合、それは、対象のタンパク質の細胞外生成をもたらす十分に長いプレプロペプチドの能力を保持するのに十分な長さであるべきである。
用語“細菌性細胞外プロテアーゼ”とは、細菌において生産され、そして細菌細胞から分泌されるタンパク質分解性酵素を示すことを意図する。適切な細菌性細胞外プロテアーゼの例は、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ及びバチルスセリンプロテアーゼ、たとえばズブチリシンである。
用語“作用可能的に連結された”とは、プレプロペプチドをコードするDNA配列が、所望のタンパク質をコードするDNA配列と一緒に転写されることを示すことを意図される。
本発明の方法により製造されるタンパク質は、プレプロペプチドに対してもしくは宿主細胞に対して、又はその両者に対して同種性又は異種性であってよい。すなわち、注目のタンパク質をコードするDNA配列の先に、該タンパク質を天然において生産しない宿主細菌において発現される前記タンパク質をコードするDNA配列に連結されたプレプロペプチドをコードするDNA配列が存在することは認識され得る。他方、注目のタンパク質をコードするDNA配列の先に、天然において前記タンパク質を生産する宿主細菌において発現される前記タンパク質をコードするDNA配列に天然において連結されていないプレプロペプチドをコードするDNA配列が存在し得る。さらに、注目のタンパク質をコードするDNA配列の先に、天然において該タンパク質を生成しない宿主細菌において発現される前記タンパク質をコードするDNA配列に天然において連結されていないプレプロペプチドをコードするDNA配列が存在し得る。
用語“漏出”とは、本発明により製造されるタンパク質が、分泌、すなわち内部及び外部細胞膜を通してのトランスロケーションにより、又はペリプラズム空間へのタンパク質の輸送、続く外部膜の溶解により、細胞から輸送されることを示すことを意図する。外部膜の溶解は、完全でも又は部分的でもあり得、又は本発明により製造されるタンパク質は、ペリプラズム空間へのタンパク質の輸送及びそれに続く外部細胞膜を通しての開放により細胞から輸送される。
もう１つの観点においては、本発明は、内部及び外部細胞膜を供えた細菌において細胞外タンパク質を生成するための方法に関し、この方法においては、内部及び外部細胞膜を供え、所望のタンパク質をコードするDNA配列の先に且つそれに作用可能的に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体を含む組換えベクターにより形質転換された細菌が、前記DNA挿入体の発現、及び所望するタンパク質に融合される細菌性細胞外プロテアーゼプロペプチドの培養培地中への漏出を可能にする条件下で培養され、そして得られるタンパク質が培地から回収される。
さらなる観点において、本発明は、所望のタンパク質をコードするDNA配列の先に且つそれに作用可能的に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体を含む組換え発現ベクターに関する。前記ベクターは、上記発明の方法による適切な宿主微生物の形質転換のために有用である。
さらなる観点においては、本発明は、所望のタンパク質をコードするDNA配列の先に且つそれに作用可能的に連結された、アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩ、バチルスメタロプロテアーゼ、及びバチルスセリンプロテアーゼから成る群から選択された細菌性細胞外プロテアーゼのプレプロペプチド又はその一部をコードするDNA配列を含んで成るDNA構造体に関する。前記DNA構造体は、上記に示されるように、組換えベクター中に適切に挿入され得る。
発明の詳細な記載
アクロモバクター・ライチカスのゲノムにおいては、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩをコードする遺伝子が653個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする。これは、20個のアミノ酸のシグナル（又はプレ）ペプチド、185個のアミノ酸のＮ−末端プロペプチド、活性プロテアーゼである268個のアミノ酸のコアタンパク質、及び180個のアミノ酸のＣ−末端プロペプチドを図11に示されるように含む（T. Oharaなど., J. Biol. Chem. 264, 1989, 20625-20630pを参照のこと）。
本発明の好ましい態様においては、DNA構造体は、プレペプチド、及びＡ．ライチカスプロテアーゼＩの185個のアミノ酸のＮ−末端プロペプチド（但し、180個のアミノ酸のＣ−末端プロペプチドではない）をコードするDNA配列を含んで成る。所望のタンパク質の細胞外生成を得ながら、Ｃ−末端プロペプチドを削除することが、驚くべきことに可能であることが見出された。Ｃ−末端プロペプチドの削除は、たとえば、Ｃ−末端プロペプチドが存在する場合に得られる異種生成物よりも、より容易に精製することができる均一な細胞外生成物の形成をもたらす。DNA構造体はさらに、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩの少なくとも一部をコードするDNA配列、たとえば宿主細胞からの所望のタンパク質の輸送を促進することが見出された配列を含んで成ることができる。そのようなDNA配列が構造体に包含される場合、それは十分な長さのＡ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質をコードすることができる。プロテアーゼは、活性形で存在することができ、又はそれは、たとえばプロテアーゼのＣ−末端での１又は複数のアミノ酸の欠失により、又は触媒試験のアミノ酸の１又は複数のアミノ酸の置換（His 57, Asp 113及びSer 194）により不活性化され得る。たとえば、Ser 194がAlaにより適切に置換され得る。
所望のタンパク質の例は、Ａ．ライチカスプロテアーゼＩコアタンパク質、グルカゴン様ペプチド−１、成長ホルモン、組織因子経路インヒビター、アプロチニン、トリプシン、インスリン又はインスリン前駆体又は類似体、又は酵素、たとえばリパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ又はプロテアーゼなどである。
所望のタンパク質をコードする本発明のDNA構造体は、ゲノム又はcDNA起原のものであり、たとえばゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そして標準的技法に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてのハイブリダイゼーションにより、ポリペプチドのすべて又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって得られる（Sambrookなど.,前記を参照のこと）。
所望のタンパク質をコードする本発明のDNA構造体はまた、確立された標準技法、たとえばBeaucage and Caruthers, Tetrahedron Letters 22（1981）, 1859-1869により記載されるホスホアミジット法、又はMatthesなど.,EMBO Journal 3（1984）, 801-805により記載される方法により合成的に調製され得る。ホスホアミジット法によれば、オリゴヌクレオチドが、たとえば自動DNA合成機により合成され、精製され、アニールされ、連結され、そして適切なベクターにおいてクローン化される。
さらに、DNA構造体は、混合された合成及びゲノム、混合された合成及びcDNA、又は混合されたゲノム及びcDNA起原のものであり、標準技法に従って、合成、ゲノム又はcDNA起原のフラグメント（適切な場合）、すなわち完全な核酸構造体の種々の部分に対応するフラグメントを連結することによって調製され得る。
DNA構造体はまた、たとえばPCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAに記載されるように、特定のプライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応により調製され得る。たとえば、プレプロペプチドをコードするDNA配列は、そのプレプロペプチドが由来する種の染色体DNAのPCR増幅により調製され得ることが認識され得る。同様に、所望のタンパク質をコードするDNA配列は、前記タンパク質が由来する種からの染色体DNAのPCR増幅により、又はたとえば、上記のようにしてオリゴヌクレオチドによりゲノム又はcDNAライブラリーをスクリーンすることにより調製され得る。
本発明のDNA構造体が挿入される組換えベクターは、組換えDNA法に便利にゆだねられ得るいづれかのベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体外存在物として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得、ここで前記複製は染色体複製には無関係である。他方、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれた染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
ベクターは好ましくは、所望のタンパク質をコードするDNA配列がDNAの転写のために必要とされる追加のセグメントに作用可能的に連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターはプラスミドもしくはウィルスDNAに由来し、又は両者の要素を含むことができる。用語“作用可能的に連結された”とは、セグメントが、それらの意図された目的のために正しく機能し、たとえば転写がプロモーターにより開始され、そしてタンパク質をコードするDNA配列を通して進行するよう配置されることを意味する。
プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいづれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して同様性又は異種性であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。プロモーターは、好ましくは、誘導可能なプロモーターであり、そしてより特定には、プロモーターからの発現が非誘導条件下でリプレッサーにより止められ得るプロモーターであり得る。誘導可能なプロモーターの例は、ファージλＰR又はＰLプロモーター、又はＥ．コリlac, trp又はtacプロモーターを包含する。
ベクターはまた、選択マーカー、すなわち、その生産物たとえば薬物、たとえばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子を含むことができる。
所望のタンパク質をコードするDNA配列、プロモーター及びプレプロ配列をそれぞれ連結し、そして複製のための必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrookなど., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USAを参照のこと）。
本発明のDNA構造体又は組換えベクターが導入される細菌宿主細胞は、所望のタンパク質を細胞外的に生成することができるいづれかの細胞であり、そしてグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリ又はプソイドモナス属（Pseudomonas）を包含する。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換により、又はコンピテント細胞を用いることにより、それ自体既知の手段でもたらされ得る（Sambrookなど.,前記を参照のこと）。
細胞を培養するために使用される培地は、宿主細胞を増殖するために適切ないづれかの従来の培地、たとえば適切な補充物を含む最少又は複合培地であり得る。適切な培地は、市販されており、又は公開されたレセピーに従って調製され得る（たとえば、American Type Cultur Collectionのカタログに従って）。次に、細胞により生成されるタンパク質は、従来の方法、たとえば遠心分離又は濾過により培地から宿主細胞を分離し、その上清液又は濾液のタンパク質性成分を塩、たとえば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、問題のタンパク質のタイプに依存して、種々のクロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものにより精製することによって、培養培地から回収され得る。
本発明の方法の段階（ｄ）で回収されたタンパク質は、前駆体形で存在し、すなわちそれは、所望のタンパク質に融合されたプロペプチドを含んで成るポリペプチドとして回収される。この場合、前駆体は続いて、特に、当業界において知られている酵素処理方法により成熟処理にかけられ得る。成熟のために使用される酵素は通常、それが所望する切断部位でアミノ酸残基に対して特異的であるように選択される。そのような酵素の例は、トリプシン、フサリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（WO89/6270）に由来するトリプシン様プロテアーゼ、クロストリパイン（W. M. Mitchellなど., Methods Enzymol. 19, 1970, 635P）、マウス顎下腺プロテアーゼ（M. Levyなど., Methods Enzymol. 19, 1970, 672p）、血液凝固カスケードのトロンビン又は他のタンパク質分解性酵素（たとえば第Xa因子）、ウシエンテロキナーゼ、スタフィロコーカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）V8プロテアーゼ、又はバチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）Glu/Asp−特異的セリンプロテアーゼである。適切な切断部位が前駆体ポリペプチドに存在しない場合、それは、たとえば所望のアミノ酸残基を特定する１又は複数のコドンを導入するために前駆体をコードするDNA配列の特定部位突然変異誘発により供給され得る。
本発明は次の例によりさらに例示されるが、それらは本発明を限定するものではない。
例１．
アクロモバクター・ライチカスプロテアーゼＩをコードする遺伝子の公開された配列（Oharaなど., （1989）, J. Biol. Chem. 264, 20625-20631）に基づいて、PCR反応において鋳型としてアクロモバクター・ライチカスＭ497−１染色体DNAを用いる場合、初めの半分、後の半分、又は完全な遺伝子のいづれかを増幅するために、PCRプライマーが合成された。
染色体DNAを、Kamelendu Nath （Nucleic Acids Res. 18（21）, 1990, 6442p）の方法に従って、50mlの出発体積の一晩のLB培養物を伴って、アクロモバクター・ライチカスＭ−497−１から調製した。
遺伝子のフラグメントを、下記２種のプライマーを用いて増幅した：
0003920331.tif 000002
（遺伝子のシグナル配列コード部分にPstＩ部位を導入する）
0003920331.tif 000003
（成熟酵素をコードする領域の中間部分にKpmＩ部位を導入する）
反応混合物：
10μｌの10×PCR緩衝液
８μｌの2.5mMのdNTP
10μｌの10ｐモル／μｌのプライマーMHJ783
10μｌの10ｐモル／μｌのプライマーMHJ782
0.5μｇのＡ．ライチカスＭ497−１DNA
59.5μｌの水
0.5μｌのTaqポリメラーゼ（95℃で添加される）
反応は次の条件下で30回のサイクルで実施された：
変性              95℃        １分
アニーリング      72℃        １分
重合              72℃        ２分
反応混合物５μｌを１％アガロースゲル上で展開し、そして正しいサイズ（997bp）のバンドを観察した。
DNAを、プロテアーゼ遺伝子について予想されるように、AscＩ，NotＩ，SalＩ及びXhoＩにより消化した。
反応混合物50μｌを、PstＩ及びKpnＩにより消化し、アガロースゲルから単離し、そして同じ酵素により消化されたpUC19（C. Yanisch-Perronなど., Gene 33, 1985, 103-119p）中に連結した。その連結混合物を用いてＥ．コリ803−９を形質転換し、そしてプラスミドを調製した。
この態様においては、遺伝子の最初の半分が増幅された。これを、プライマーの端に導入されたPstＩ及びAspＩ部位を用いてpUC19中にクローン化した。配列決定は、それがクローン化された正しいDNAであることを示し、そしてそのフラグメントをα−32Ｐ−dATPと共にランダムヘキサマーのプライマーを用いて標識し、そこで、サザンハイブリダイゼーションが、種々の制限エンドヌクレアーゼにより切断されたＡ．ライチカス染色体DNAに対して行なわれた。これは、遺伝子が約2.1kbのSphＩ−NcoＩフラグメント上に位置していることを示した。
ライブラリーを、約2100bpの大きさのSphＩ−NcoＩ消化されたＡ．ライチカスDNAから製造し、そしてSphＩ−NcoＩ消化されたpSX54（pUC18（Yanisch-Perronなど.,前記）由来のクローニングベクター）中にクローン化した。６個のプレート上の約10,000個のコロニーを、Whatman 540アッシュレスフィルター上に持ち上げ、そして上記プローブと65℃でハイブリダイズせしめた（Sambrookなど．（1989）, Molecular Cloning, Cold Harbor Laboratory Press）。フィルターを同じ温度で洗浄し、そしてＸ線フィルム上に配置した。照射の後、約１％のコロニーが陽性であることがわかった。25のコロニーを再単離し、そしてプラスミドを調製した。それらをPstＩ及びEcoRＩにより切断し、そして３個は予測される制限パターンを有することがわかった。それらの１つ（pSX494、図１）を、NcoＩにより消化し、クレノウポリマラーゼ及び４種のdNTPによりフィルアウトし、そしてSphＩにより消化した。2.1kbのバンドをアガロースゲルから単離し、脱リン酸化されたSphＩ−SmaＩ消化のpUC19中に連結し、pSX512を生ぜしめた（図２）。そのプラスミドを用いて、Ｅ．コリW3110 laclqを形質転換した（Ｅ．コリW3110は初期単離物であり、そしてＫ−12株のための先祖ストックとして広範に使用されて来た（B. Bachman, Bacteriol. Rev. 36, 1972）。本発明に使用されるW3110株が、Rlacからの発現をより完全に止めるLacリプレッサーを過剰生成するためにlaclqにされた）。得られる株は、IPTG又はラクトースのいづれかにより誘導される場合、Ｚ−lys（ベンゾイルーリシル−pNA）を加水分解することが示された。ウェスターンブロット分析（WAKO Co.から入手できるAchapＩに対して生ぜしめられた抗体による）は、誘導された株が既知の酵素に比較されるほど大きなタンパク質を生成したことを示した。
例２．
新規DNA構造体を製造し、ここでコード領域の３’端を欠失しており、これは、得られるタンパク質が元のＡ．ライチカス株において切断されるＣ−末端拡張部を欠いていることを意味する。２つのUGA停止コドン及びHindIII部位を、成熟酵素をコードする遺伝子の部分が終結する部位でＡ．ライチカス遺伝におけるPCRにより導入した。このHindIII部位を続いて、クレノウポリメラーゼによりフィルアウトし、そしてpSX512上のAsp7181部位（また、フィルアウトされている）に連結し、pSX547をもたらした（図３）。このプラスミドを用いて、Ｅ．コリW3110 laclqを形質転換し、そして200μｇ／mlのアンピシリンを含むLP−プレート上にプレートした（J. H. Miller（1972）, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory）。
得られる株を、0.4％のラクトースを含む液体LB培地において26℃で44時間、増殖し、この後、培養物を遠心分離し、そして上清液をベンゾイル−リシル−pNAによりリルシ−エンドペプチダーゼ活性について試験した。この結果は陽性であり、そしてウェスターンブロット分析（上記を参照のこと）は、この株から生成される酵素が市販の製品（AchapＩ）と正確に同じ大きさを有したことを示した。酵素はまた、同じ比活性を有することが示された。
例３．
ヒュミコルス・インソレンス（Humicols insolens）リパーゼ遺伝子がサビナーゼ（ズブチリシン309）シグナル配列に融合されている構造体を製造し、そしてその発現はキシラーゼによる制御にあった。
pSX92（WO89／06279）を、HindIIIにより切断し、クレノウポリマラーゼ（ヌクレオチド）によりブラント末端化し、そして次に、ClaＩにより切断した。大きなフラグメントを単離した（Ａ）。pHLL（EP305,216、図３及び４を参照のこと）をBamHＩにより切断し、上記のようにしてブラント末端化し、そして次に、XhoIIにより切断した。リパーゼ遺伝子の成熟部分を含むフラグメントを単離した（B, 818bp）。
Ａ及びＢを、成熟リパーゼの最初の４個のアミノ酸に融合されるサビナーゼシグナルにおける最後の５個のアミノ酸をコードする合成リンカーにより一緒に連結した（図４ａ）。上方鎖における最後のＡは、リパーゼ遺伝子におけるXhoII部位をBglII部位に変化せしめる：
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得られるプラスミドpSX167をPmeＩ及びBamHＩにより切断し、そしてサビナーゼ−リパーゼ融合体及びBSターミネーターを含むフラグメントを単離した（1769bp）。このフラグメントを、HincII-BamHI切断のpUC19（Yanish-Perronなど．（1985）GENE33, 103-l19）中に連結し、pSX578を生ぜしめた（図４ｂ）。
Ａ．ライチカスプロテアーゼ遺伝子のプレプロ−部分を、Hortonなど．（1989）GENE77, 61-68に記載されるPCR技法“オーバーラップ拡張によるスプライシング”を用いてリパーゼに融合した。
Ａ．ライチカスプロテアーゼＩプレプロ−成熟Ｈ．インソレンスリパーゼ融合のためのプライマー：
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２種のPCR生成物を製造した：鋳型としてpSX547を用いてMHJ3799/MHJ3852及び鋳型としてpSX578を用いてMHJ3829/MHJ3800を製造した。それらの２種の生成物を混合し、変性し、そして連結されたPCR生成物を、プライマーとしてMHJ3799及びMHJ3800を用いて製造した。これをAscＩ及びBstＸＩにより切断し、そしてpSX579の構成に使用した（図４ｃ）。このプラスミドを用いて、Ｅ．コリW3110  laclqを形質転換し、そしてその株を例２に記載されるようにして培養した。
例４．
Ｂ．サブチリス（B. subtilis）サビナーゼ遺伝子（ズブチリシン309）のプレプロ−部分を、次のプライマーを用いて、上記と同じ手段によりリパーゼ遺伝子の成熟部分に融合した：
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PCR生成物を、それらのプライマー及び鋳型としてのpSX92を用いて製造した（MHJ3790は、サビナーゼ開始コドンの前のリボソーム結合部位で正確にHindIII部位を導入する）。これを上記からのMHJ3829／MHJ3800生成物と共に混合し、変性し、そして連結された生成物を、プライマーとしてMHJ3790及びMHJ3800を用いて製造した。これをHindIII及びBstＸＩにより切断し、そしてpSX580の構成に使用した（図４ｂ）。このプラスミドを用いて、Ｅ．コリW3110 laclqを形質転換し、そしてその株を例２に記載のようにして培養した。
例５．
Ａ．ライチカスプロテアーゼプレプロ−領域に融合されるグルカゴン様ペプチドＩのＥ．コリにおける発現
Ａ．ライチカスアルカリプロテアーゼ（AchapＩ）に融合されるグルカゴン様ペプチドＩ（GLP−１）のための発現ベクターの構成は、図５〜６に概略されている。プロテアーゼシグナルペプチド、及びプロ−領域における最初の29個のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドリンカーは、次の配列を有する：
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Ｅ．コリにおける最良のコドン使用のために最適化されるリンカー配列を、ClaＩ及びSalＩにより切断された可変性ベクターpHD414（WO92/16634に記載されている）中にサブクローン化した。アミノ酸30−185からのプロ−領域のＣ−末端部分を、
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及びオリゴヌクレオチドリンカー：
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によるPCRプライミングのためにpSX512（図２）を用いて、SalＩ−BamHＩ切断されたpUC19中にサブクローン化した。
位置185で、リシン残基がアルギニンにより置換されている。Ａ*を2591においてＣの代わりに導入し、BspE１部位を創造する。
図６に示される発現ベクターは、lacプロモーターを含むpUC19である。Tetプロモーターのために、また適合されるHindIII−ClaＩリンカーを、pBR322からのClaＩ−BamHＩスペーサーフラグメントを用いて、pUC19中にサブクローン化した。前記リンカーは次の通りである：
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プロモーター及びリンカーを、pHW1163におけるAchapＩプレプロ−領域に連結し、ここでGLP−１遺伝子が、遺伝子（DK 1440/93に記載されるようにして合成的に調製された）のモノマー及びテトラマーにそれぞれ対応する、250bp及び550bpのBamHＩ−EcoRＶフラグメントとして挿入されている。得られる発現プラスミドpHW1166及びpHW1167を用いて、Ｅ．コリW3110 laclqを形質転換し、そしてGLP−１発現を、特異的抗体を用いて、ウェスターンブロット分析により上清液から測定した。処理された及び処理されていない物質を上清液において検出した。
例６．
切断により不活性化されたＡ．ライチカスプロテアーゼプレ−プロ−コア領域に融合されたGLP−１のＥ．コリにおける発現
コア領域は、切断により不活性化され得る成熟酵素をコードする。これを、図７に示されるような２種の手段で行なわれた。下記BsgＩ−BamHＩリンカー：
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を用いて、60個のＣ−末端アミノ酸のコア領域を欠失せしめ、そして図10に示されるようにして、触媒三回対称軸における、セリンを包含する12個のアミノ酸の追加の欠失を行なう。
下記PstＩ−BamHＩリンカー：
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を用いて、45個のＣ−末端アミノ酸のコア領域を欠失せしめ、生来のコアに見出されるすべての３個の硫黄架橋の創造の可能性を残す。
前記リンカーを、前記のようにして、SalＩ−部位から開始するAchapＩ遺伝子のほとんどに連結し、pHW1158及びpHWl159を創造した。それから、プロモーター、すなわちモノマー及びテトラマーとしてのAchapＩ遺伝子及びGLP−１遺伝子のＮ−末端部分を付加する方法は、図８に示される。それは、プレプロ−構成のために図６に記載されるのと同じパターンに従う。発現プラスミドpHW1168-1171を、例５に記載されるようにして分析した。処理された及び処理されていない物質が培養上清液に検出された。
例７．
突然変異誘発により不活性化されたＡ．ライチカスプロテアーゼプレプロ−コア領域に融合されるGLP−１のＥ．コリにおける発現
欠失を伴わない突然変異は、コア領域の折りたたみに関して天然の情況を模倣し、そして生成物の触媒をさらに妨げる最良の手段である。本発明者は、鋳型としてpSX512及び次のプライマーを用いて、PCRフラグメントをＣ−末端に導入することによって活性セリン残基をアラニンに変異誘発するよう選択した：
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前記方法は図９に示される。GLP−１モノマーを含む得られるプラスミドpHW1172及びGLP−１テトラマーを含むpHW1173を、他の構造と共に記載のようにして分析した。処理された及び処理されていない物質を、培養上清液において検出した。例５〜７のすべての構成は、図10に要約されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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