(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｉ）コラーゲンを含む試料
ii）第１および第２のタンパク質分解酵素調製物、および
iii）還元剤
を準備し；
ｂ）前記コラーゲン試料を前記第１のタンパク質分解酵素調製物に曝して第１のコラーゲン溶液を製造し；
ｃ）前記第１のコラーゲン溶液を前記還元剤に曝して第２のコラーゲン溶液を製造し；
ｄ）前記第２のコラーゲン溶液を前記第２のタンパク質分解酵素に曝して精製コラーゲンを製造すること
を含む、コラーゲンの精製方法。
【請求項２】
前記第１のタンパク質分解酵素調製物がパパインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記還元剤が、硫化ナトリウム、ジチオトレイトール、グルタチオニン（glutathionine）、および水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記還元剤が、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、および水酸化カルシウムからなる群から選択されるアルカリをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｅ）前記精製コラーゲンを脱脂剤に曝して脱脂コラーゲンを製造する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記脱脂剤がクロロホルムおよびメタノールを含有する混合物を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｆ）前記脱脂コラーゲンを圧縮して圧縮コラーゲンを製造する工程；ｇ）前記圧縮コラーゲンを脱水して脱水コラーゲンを製造する工程；およびｈ）前記脱水コラーゲンを分散し、乾燥してコラーゲン繊維を形成させる工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記脱脂コラーゲンをリン酸化剤に曝してリン酸化コラーゲンを製造する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記リン酸化剤が、トリメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ウルトラリン酸ナトリウム、テトラメタリン酸ナトリウム、無水リン酸、および三塩化ホスホリルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記リン酸化剤がトリメタリン酸ナトリウムを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料を前記第１のタンパク質分解酵素調製物に曝す前に前記試料を脱上皮化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ａ）ｉ）コラーゲンを含む試料、
ii）第１および第２のタンパク質分解酵素調製物、
iii）還元剤、
iv）脱脂剤、および
ｖ）リン酸化剤
を準備し；
ｂ）前記コラーゲン試料を前記第１のタンパク質分解酵素調製物に曝して第１のコラーゲン溶液を製造し；
ｃ）前記第１のコラーゲン溶液を前記還元剤に曝して第２のコラーゲン溶液を製造し；
ｄ）前記第２のコラーゲン溶液を前記第２のタンパク質分解酵素調製物に曝してタンパク質分解コラーゲン溶液を製造し；
ｅ）前記タンパク質分解コラーゲン溶液を前記脱脂剤に曝して脱脂コラーゲンを製造し；そして
ｆ）前記脱脂コラーゲンを前記リン酸化剤に曝してリン酸化コラーゲンを製造すること
を含む、生体適合性コラーゲンの製造方法。
【請求項１３】
前記第１のタンパク質分解酵素調製物がパパインを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記還元剤が硫化ナトリウム、ジチオトレイトール、グルタチオニン、および水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記脱脂剤がクロロホルムおよびメタノールの混合物を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記リン酸化剤が、トリメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ウルトラリン酸ナトリウム、テトラメタリン酸ナトリウム、無水リン酸、および三塩化ホスホリルからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸化剤がトリメタリン酸ナトリウムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料を前記第１のタンパク質分解酵素調製物に曝す前に前記試料を脱上皮化する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記脱脂コラーゲンを前記リン酸化剤に曝してリン酸化コラーゲンを製造する前に、前記脱脂コラーゲンをフィルター滅菌する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記脱脂コラーゲンをリン酸化する前に、前記脱脂コラーゲンを圧縮して圧縮コラーゲンを製造する工程；前記圧縮コラーゲンを脱水して脱水コラーゲンを製造する工程；および前記脱水コラーゲンを分散し、乾燥してコラーゲン繊維を形成させる工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ヒトおよびその他の動物の組織からコラーゲンを調製する方法に関する。特に、本発明は、生物医学的用途、獣医学的用途、およびその他の用途に適したコラーゲンの調製方法を提供する。
発明の背景
コラーゲンは、動物における最も豊富なタンパク質である（Goldsteinの米国特許第5,043,426号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れるものである。）。実際、コラーゲンは人体の乾燥重量の30％に相当する（L.C.JunqueiraおよびJ.Carneiro, Basic Histology, 第４版, Lange Medical Publications, Los Altos, CA, [1983], pp.89-119を参照されたい。）。脊椎動物コラーゲンは、実際に、いくつかの細胞型によって産生されるタンパク質のファミリーである。このタンパク質ファミリーにおいて、コラーゲン型はそれらの化学組成、異なる形態学および病理学的特徴、組織内の分布およびそれらの機能によって区別できる。コラーゲンについては多くの型が記載されているが、５個の主要な型が認知されている。
Ａ．コラーゲンの形
Ｉ型コラーゲンは、身体内に広範に分布している最も豊富なコラーゲンの形である。Ｉ型コラーゲンは、骨、象牙質、腱、筋膜、強膜、器官、真皮、繊維性軟骨などを形成する「コラーゲン繊維」と伝統的に呼ばれている構造で組織内に存在する。Ｉ型コラーゲンの主な機能は引っ張りに対する抵抗性である。顕微鏡で観察すると、Ｉ型コラーゲンは、密集しており、厚く、非銀親和性であり、強複屈折の赤色または黄色繊維のように見える。その超微細構造は、著しく径が異なる高密度に密集した厚い原繊維として特徴付けられる。Ｉ型コラーゲンは、繊維芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞および軟骨芽細胞によって産生される。
II型コラーゲンは、主に、軟骨（例えば、硝子軟骨および弾性軟骨）で見出される。II型コラーゲンの主な機能は間欠性圧力に対する抵抗性である。顕微鏡で観察すると、II型コラーゲンは、ピクロシリウス（picrosirius）染色および偏光顕微鏡検査法でのみ可視化する緩い、コラーゲン性ネットワークのように見える。超微細構造的には、II型コラーゲンは、繊維を有していないが、豊富な基質に包埋された非常に薄い原繊維を有するように見えるものとして特徴付けられる。II型コラーゲンは、軟骨芽細胞によって産生される。
III型コラーゲンは、通常、組織内でＩ型コラーゲンと会合しており、細網繊維のコラーゲン性成分であり得る。III型コラーゲンは、平滑筋、神経内膜、動脈、子宮、肝臓、脾臓、腎臓、肺組織に存在する。III型コラーゲンの主な機能は、膨張性器官の構造の維持である。顕微鏡で観察すると、III型コラーゲンは、薄く、銀親和性（argyrophilic）であり、弱複屈折の緑色の繊維のゆるいネットワークのように見える。超微細構造的には、III型コラーゲンは、かなり均一な径を有する、緩やかに集まった薄い原繊維として特徴付けられる。III型コラーゲンは、平滑筋繊維芽細胞、細網細胞、シュワン細胞および肝細胞によって産生される。
IV型コラーゲンは、上皮および内皮基底層ならびに基底膜に見られる。IV型コラーゲンの主な機能は、支持および濾過が関与する。顕微鏡で観察すると、IV型コラーゲンは、薄く、非晶質の弱複屈折膜のように見える。超微細構造的には、IV型コラーゲンは、繊維、原繊維のいずれも有さないように見える。
Ｖ型コラーゲンは、胚膜、血管、胎盤基底膜に見出され、その他の組織に少量見出される。この型のコラーゲンは、あまり特徴付けされていない。
Ｂ．コラーゲンの構造
コラーゲン中に見出される主なアミノ酸は、グリシン、プロリンおよびヒドロキシプロリンである。ヒドロキシリジンもコラーゲンに特徴的である。これらのヒドロキシアミノ酸は、コラーゲン合成中の新生コラーゲンポリペプチドに存在するプロリンおよびリジンのヒドロキシル化の結果である。組織中のコラーゲン含量は、そのヒドロキシプロリン含量の測定によって決定することができる。
コラーゲンは、「α」と呼ばれるポリペプチド鎖から構成される。α鎖には、「アルファ−１」（「α１」）および「アルファ−２」（「α-２」）と呼ばれる、２つの型がある。α１鎖の最も重要な型は、α１（I）、α１（II）、α１（III）およびα１（IV）であり、これらは種々の組み合わせで凝集してＩ、II、III、IVおよびＶ型の三重らせんを産生する。Ｉ型コラーゲンは、２本のα１鎖および１本のα２鎖から構成される。その式は、（α1[I]）2α２である。II型コラーゲンについての式は（α1[II]）3であり、一方、III型コラーゲンについての式は（α1[III]）3であり、IV型は（α1[IV]）3である。
「トロポコラーゲン」は、詰め込まれた微小繊維サブユニットの凝集体に重合して「コラーゲン原繊維」を形成するタンパク質ユニットである。水素結合および疎水性相互作用は、この凝集および詰め込みにおいて重要である。共有結合の架橋は、コラーゲン原繊維の構造を補強する。コラーゲン原繊維は薄く、細長く、径が可変であり、64nmという特有の周期の横紋を有する。この横紋は、サブユニットトロポコラーゲン分子の重複組織化（overlapping organization）によって産生される。Ｉ型およびIII型コラーゲンにおいては、これらの原繊維が会合してコラーゲン「繊維」を形成する。Ｉ型コラーゲンにおいては、コラーゲン「束」が繊維の会合によって形成され得る。II型コラーゲンは原繊維として観察されるが繊維を形成せず、一方、IV型およびＶ型は原繊維も繊維も形成しない。
コラーゲン繊維は、結合組織に見出される最も豊富な繊維である。それらの非弾性性および分子立体配置は、コラーゲン繊維に鋼鉄よりも大きな引っ張り強度を付与する。したがって、コラーゲンは、そのコラーゲンが存在する組織に対して柔軟性および強度の組み合わせを付与する。身体の多くの部分において、コラーゲン繊維は平行配列に組織化されてコラーゲン「束」を形成している。
新鮮な場合、コラーゲン繊維は無色の鎖のように見えるが、多数の繊維が存在する場合、それらのコラーゲン繊維はそれらが存在する組織を白色にする（例えば、腱および腱膜）。繊維における細長いトロポコラーゲンの組織化は、繊維を複屈折性にする。一定の酸性染料（例えば、シリウスレッド（Sirius red））による染色は、この複屈折性を増大させる。この複屈折性の増大は定方向コラーゲン構造においてのみ観察されるので、組織におけるコラーゲンの存在を検出する方法として有用である。
Ｃ．コラーゲンの特性および用途
コラーゲンには、インプラント（implants）、トランスプラント（transplants）、器官代替物、組織等価物、硝子代替物、形成および美容外科学、外科的縫合、創傷、熱傷用外科的包帯などの種々の医学用途に関して、コラーゲンを魅力的な物質にならしめる多くの特性がある（例えば、米国特許第5,106,949号、5,104,660号、5,081,106号、5,383,930号、4,485,095号、4,485,097号、4,539,716号、4,546,500号、4,409,332号、4,604,346号、4,835,102号、4,837,379号、3,800,792号、3,491,760号、3,113,568号、3,471,598号、2,202,566号および3,157,524号（これらは全て参照により本明細書に組み入れるものである。）；J.F.Prudden,Arch. Surg. 89:1046-1059[1964];ならびにE.E.Peacockら, Ann. Surg., 161:238-247[1965]を参照されたい。）。例えば、少なくとも一部にはコラーゲン構造内における潜在的な抗原決定基がマスキングされていることにより、単独では、コラーゲンは比較的弱い免疫原である。また、そのヘリックス構造のためにタンパク質分解に対して抵抗性もある。さらに、コラーゲンは、細胞接着、および筋骨格系の主要な耐伸張荷重性成分に関する天然物質である。したがって、医学ならびに獣医学用途における使用に適したコラーゲン繊維および膜の製造に大きな努力が向けられている。
コラーゲンは、従来使用されているパラフィン、ワセリン、植物油、ラノリン、蜜ろう、およびシリコーンの代替物として、軟組織増強の分野において使用されている（例えば、米国特許第5,002,071号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れるものである。）。しかしながら、インプラントにおいてはコラーゲンの使用に関係する問題がある。不純コラーゲン調製物中に存在する非コラーゲン性タンパク質はコラーゲンよりもより強力な免疫原であり、炎症応答を刺激し得るものであるので、高純度のコラーゲンを使用することが重要である。炎症カスケードが刺激されると、コラゲナーゼを含む浸潤炎症細胞（例えば、マクロファージおよび顆粒球）によるコラーゲンの吸収が生じ、コラーゲンの消化が引き起こされる。さらに、コラーゲン自体走化性であり、より小さなペプチド断片に分解されるにつれてますます走化性になる。また、非ヒトコラーゲンの使用に関係した懸念もある。例えば、生物材料としてのウシコラーゲンの使用に関係した繰り返し文献で報告されている問題は、そのインプランテーション（implantation）または使用後に顕れる一貫した慢性細胞性炎症反応である。この炎症により、残存性搬痕組織形成、接着形成、皮膚辺縁（skin edges）の治癒の妨害、偽内膜形成、偽横隔膜形成、吻合の破壊、一過性低熱、動脈瘤、またはその他の問題が生じ得る。
Ｄ．コラーゲンの調製
コラーゲン調製物は、典型的には、皮膚、腱（例えば、ウシアキレス腱、尾腱、および伸筋腱）、皮またはその他の動物の一部から酸および／または酵素抽出を含む操作によって調製される。基本的には、コラーゲン調製法は、希有機酸による抽出、塩による沈殿、任意のゲル化および／または凍結乾燥、接線（tangential）濾過などによるコラーゲンの精製を含む。筋膜、脂肪および不純物を分離した後、組織をペプシンなどのタンパク質分解酵素による適度に消化させ、次いでコラーゲンを中性pHで沈殿させ、再溶解させて残留不純物を酸性pHで沈殿させる。次に、組織を強アルカリで消化し、その後酸に曝して膨潤を促進する。続いて、コラーゲン繊維を塩または有機溶媒で沈殿させ、コラーゲン繊維を脱水する（例えば、米国特許第5,028,695号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れるものである。）。最終的に、湿潤コラーゲンをアセトンで処理して水を除去し、遠心分離してコラーゲンの固体状の塊を得て、乾燥中、コラーゲンを脱会合させることによって、抽出されたコラーゲンは細かく分割した繊維コラーゲンに変換され得る（例えば、米国特許第4148664号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れるものである。）。次いで、コラーゲン調製物を中性pHに戻して繊維の状態で乾燥することができる。完全に透明な生理学的なおよび血液適合性のゲル、コラーゲンフィルムおよび溶液が調製され得る。このような形のコラーゲンは、その後、コンタクトレンズおよびインプラントの製造に使用することができる。
ペプシンによる処理の利点の一つは、コラーゲン調製物を部分的に消化し得る（すなわち、抽出酵素がコラーゲン分子を末端非ヘリックス領域（この領域はコラーゲン間架橋を含む）で切断する）ということである。実際、ペプシンを用いて抽出されたコラーゲンにより、一定の用途、特に、コラーゲン調製物の実質的な機械操作が必要な用途に対して軟弱すぎる調製物が得られるということが分かっている。
また、いくつかの酸処理も欠点を有する。例えば、Chvapil（M.Chvapilら, Intl. Rev. Connective Tiss. Res., 6:1-55[1979]）によって記載された酸プロセスは、ウシ腱コラーゲンを酸可溶化することによってコラーゲン懸濁液を製造することを含む。次いで、この懸濁液を生理的食塩水中で透析または沈殿させて非原繊維性変性コラーゲンを含む非晶質沈殿物を得る。この方法にしたがって調製されたコラーゲンは、湿った媒体中では引っ張り強度が無く、生組織に適用した場合に酵素分解に対してほとんど抵抗性を持たないので、一般的に、医学目的には直接は適していない。さらに、変性コラーゲンまたは物理的および生物学的特性を改質してin vivoでのコラーゲンに近づけるための処理を行ったコラーゲンは、満足いくものでないことが多い。このコラーゲンはin vivo組織化構造を欠く（すなわち、コラーゲン繊維がこの人工コラーゲンには存在しない）ので、湿性包帯に必要な機械特性が欠けていることが多い。
したがって、現在のコラーゲン調製方法は満足のいくものではない。明らかに、医学的処置における使用に適した高品質のコラーゲンを大量生産するための改良方法の開発が必要とされている。
発明の概要
本発明は、ヒトおよびその他の動物からコラーゲンを調製する方法に関する。特に、本発明は、生物医学的用途に適したコラーゲンの調製方法を提供する。
本発明は、コラーゲンの精製のための多数の実施態様を提供する。本発明の一の実施態様にしたがって精製されたコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンであることが特に好ましい。
一の実施態様においては、本発明は、コラーゲンを含む試料、第１および第２のタンパク質分解酵素調製物、および還元剤を準備し；コラーゲン試料を第１のタンパク質分解酵素調製物に曝して第１のコラーゲン溶液を製造し；第１のコラーゲン溶液を還元剤に曝して第２のコラーゲン溶液を製造し；第２のコラーゲン溶液を第２のタンパク質分解酵素調製物に曝して精製コラーゲンを製造することを含む、コラーゲンの精製方法を提供する。
一の別の実施態様においては、本発明の方法は、試料を第１のタンパク質分解酵素調製物に曝す前に試料を脱上皮化する（de-epithelializing）工程をさらに含む。
好ましい実施態様においては、第１および／または第２のタンパク質分解酵素調製物はシステインクラスの酵素を含む。特に好ましい実施態様においては、第１および／または第２のタンパク質分解酵素調製物はパパインを含む。
本発明の方法の別の実施態様においては、還元剤は、硫化ナトリウム、ジチオトレイトール、グルタチオニンおよび水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択される。好ましい実施態様においては、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムを含む。
さらに別の実施態様においては、本発明の方法は、精製コラーゲンを脱脂剤に曝して脱脂コラーゲンを製造する工程をさらに含む。この方法の好ましい実施態様においては、脱脂剤はクロロホルムおよびメタノールを含有する混合物を含む。
特に好ましい実施態様においては、本発明の方法は、脱脂コラーゲンを圧縮して圧縮コラーゲンを製造する工程；圧縮コラーゲンを脱水して脱水コラーゲンを製造する工程；および脱水コラーゲンを分散し、乾燥してコラーゲン繊維を形成させる工程をさらに含む。したがって、本発明の方法のこの実施態様においては、コラーゲン繊維が乾燥される。
別の実施態様においては、本発明の方法は、脱脂コラーゲンをリン酸化剤に曝してリン酸化コラーゲンを製造する工程を含む。好ましい実施態様においては、リン酸化剤はトリメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ウルトラリン酸ナトリウム、テトラメタリン酸ナトリウム、無水リン酸、および三塩化ホスホリルからなる群から選択される。特に好ましい実施態様においては、リン酸化剤はトリメタリン酸ナトリウムを含む。別の好ましい実施態様においては、精製コラーゲンはコラーゲンＰＲＯTM（商品名）を含む。
一の実施態様においては、本発明は、コラーゲンを含む試料、第１および第２のタンパク質分解酵素調製物、ならびに還元剤を準備する工程；コラーゲン試料を第１のタンパク質分解酵素調製物に曝して第１のコラーゲン溶液を製造する工程；第１のコラーゲン溶液を還元剤に曝して第２のコラーゲン溶液を製造する工程；第２のコラーゲン溶液を第２のタンパク質分解酵素調製物に曝して精製コラーゲンを製造する工程によって精製された精製コラーゲンを提供する。
さらに、精製コラーゲンが、限定するものではないが、抗菌剤、抗ウイルス剤、増殖因子、抗脱水化合物、防腐剤、または生物医学および／または獣医学的用途に適したその他の化合物などのさらなる化合物を含んでなることも考えられる。
また、本発明は、コラーゲンを含む試料、第１および第２のタンパク質分解酵素調製物、還元剤、脱脂剤、およびリン酸化剤を準備し；コラーゲン試料を第１のタンパク質分解酵素調製物に曝して第１のコラーゲン溶液を製造し；第１のコラーゲン溶液を還元剤に曝して第２のコラーゲン溶液を製造し；第２のコラーゲン溶液を第２のタンパク質分解酵素調製物に曝してタンパク質分解コラーゲン溶液を製造し；タンパク質分解コラーゲン溶液を脱脂剤に曝して脱脂コラーゲンを製造し；そして脱脂コラーゲンをリン酸化剤に曝してリン酸化コラーゲンを製造することを含む、生体適合性コラーゲンの製造方法を含む別の実施態様も提供する。
別の実施態様においては、本発明の方法は、試料を第１のタンパク質分解酵素調製物に曝す前に試料を脱上皮化する工程をさらに含む。
好ましい実施態様においては、この方法の第１および／または第２のタンパク質分解酵素調製物はシステインクラスの酵素を含む。特に好ましい実施態様においては、第１および／または第２のタンパク質分解酵素調製物はパパインを含む。
本発明の方法の別の実施態様においては、還元剤は、硫化ナトリウム、ジチオトレイトール、グルタチオニンおよび水素化ホウ素ナトリウムからなる群から選択される。好ましい実施態様においては、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムを含む。
別の実施態様においては、脱脂剤はクロロホルムおよびメタノールの混合物を含む。さらに別の実施態様においては、リン酸化剤はトリメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ウルトラリン酸ナトリウム、テトラメタリン酸ナトリウム、無水リン酸、および三塩化ホスホリルからなる群から選択される。特に好ましい実施態様においては、リン酸化剤はトリメタリン酸ナトリウムを含む。
さらなる実施態様においては、本発明の方法は、脱脂コラーゲンを圧縮して圧縮コラーゲンを製造する工程；圧縮コラーゲンを脱水して脱水コラーゲンを製造する工程；および脱水コラーゲンを分散し、乾燥してコラーゲン繊維を形成させる工程をさらに含む。したがって、本発明の方法のこの実施態様においては、コラーゲン繊維が乾燥される。
特に好ましい実施態様においては、この方法は、脱脂コラーゲンをリン酸化剤に曝してリン酸化コラーゲンを製造する前に、脱脂コラーゲンをフィルター滅菌する工程をさらに含む。
また、本発明は、コラーゲンが生体に適合するように精製されたコラーゲンも提供する。この実施態様においては、生体適合性コラーゲンは、コラーゲンを含む試料、第１および第２のタンパク質分解酵素調製物、還元剤、脱脂剤、およびリン酸化剤を準備し；コラーゲン試料を第１のタンパク質分解酵素調製物に曝して第１のコラーゲン溶液を製造し；第１のコラーゲン溶液を還元剤に曝して第２のコラーゲン溶液を製造し；第２のコラーゲン溶液を第２のタンパク質分解酵素調製物に曝してタンパク質分解コラーゲン溶液を製造し；タンパク質分解コラーゲン溶液を脱脂剤に曝して脱脂コラーゲンを製造し；そして脱脂コラーゲンをリン酸化剤に曝してリン酸化コラーゲンを製造する方法によって製造される。一の好ましい実施態様においては、リン酸化コラーゲンはコラーゲンＰＲＯTMを含む。
別の好ましい実施態様においては、生体適合性コラーゲンはフィルムまたは膜を形成し、さらに別の好ましい実施態様においては、生体適合性コラーゲンは固体のものを含み、さらに別の好ましい実施態様においては、生体適合性コラーゲンは溶液のものを含む。その他の実施態様においては、生体適合性コラーゲンは、その使用前に水和される乾燥フィルムである。
さらに、生体適合性コラーゲンは、限定するものではないが、抗菌剤、抗ウイルス剤、増殖因子、抗脱水化合物、防腐剤、または生物医学および／または獣医学的用途に適したその他の化合物などのさらなる化合物を含んでなることも考えられる。
また、本発明は、精製コラーゲンおよび／または上記のようにして精製した生体適合性コラーゲン、ならびに出血創傷を準備し；そして精製コラーゲンおよび／または生体適合性コラーゲンを出血創傷に当てることを含む、止血を達成するための方法も提供する。
さらに、本発明は、精製コラーゲンおよび／または生体適合性コラーゲン、ならびにトランスプランテーション（transplantation）部位を準備し；そして精製コラーゲンおよび／または生体適合性コラーゲンをトランスプランテーション部位に当てることを含む、トランスプランテーション方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、二回処理プロセス（Twice Treatment Process）TM（ＴＴＰTM）の一の実施態様のフローチャートである。
図２は、セリンのホスホセリンへのリン酸化を示す概略図である。
図３は、種々のコラーゲン調製物の創傷治癒特性を示す棒グラフである。
図４は、種々の調製物の創傷治癒特性および血液凝固時間を示すグラフである。
発明の説明
本発明は、ヒトおよびその他の動物の組織からコラーゲンを調製する方法に関する。特に、本発明は、生物医学、獣医学、およびその他の用途に適したコラーゲンを調製する方法を提供する。
本発明は、一般に使用されているコラーゲン調製物によってもたらされる問題に取り組むために開発された。本発明は、一部は、コラーゲンが、天然の分子四次構造およびコラーゲンに特徴的なその他の特徴（例えば、上記のような長さ、直径およびＩ型コラーゲン原繊維の周期性）を維持しながら、非コラーゲン性材料が全て除去される手法で調製され得るという発見に基づくものである。本発明の方法は、天然のコラーゲン分子をそれらのもともとの繊維形態に保ちながら全ての外来物質の酵素的除去を促進する。本発明の方法を用いることによって種々の動物源（ヒトを含む）から高度に精製されたコラーゲンを調製することができ、全てではないがほとんど、起源コラーゲンに混入している複合したプロテオリピドおよびリン脂質は有機溶媒の特定の混合物の使用によって除去される。種々の実施態様において、本発明の調製コラーゲンは以前に開発されたコラーゲン調製物よりも良好な創傷治癒および止血特性を有する。
従来より報告されているコラーゲン調製にパパインを用いる酵素的方法（例えば、米国特許第3,529,530号および5,316,942号。これらはこれは参照により本明細書に組み入れるものである。）とは異なり、本発明の方法は二段階酵素処理プロセスを利用するものである。一の実施態様においては、本発明の二段階処理プロセス（「二回処理プロセスTM」または「ＴＴＰTM」は、パパインまたはその他のタンパク質分解酵素を酸化剤および還元剤とともに用いるプロセスによってコラーゲンポリマーを非炎症性にする。「二回処理」とは、第１のタンパク質分解処理を行った後、還元剤で処理し、次いで第２のタンパク質分解処理を行う２工程でのタンパク質分解酵素の使用を意味する。特に好ましい実施態様においては、このプロセス後、クロロホルムとメタノールの溶液を用いてプロテオリピドおよびリン脂質の除去を行う。さらなる実施態様においては、コラーゲンは種々の制御されたリン酸化度によって生物活性化される。
パパインは、伝統的に食品工業において、および創傷清浄剤との関連で用いられているので、パパインの使用は、ヒト使用を目的としたコラーゲン処理に関する安全な手段を提供するものと考えられた。生物医学的用途のためのコラーゲンの調製に最も一般的に用いられている酵素であるペプシンと比較すると、パパインを用いることにより免疫原性の低減に関して良好な結果が得られた。パパインは、パパイヤから抽出された酵素であり、システインのジスルフィド結合を切断することが知られている。多くの免疫原性分子はシステインジスルフィド結合を含んでいるので、パパインを用いることによりこれらの分子を分解してそれらを非免疫原性にすることができる。例えば、パパインは非常に多くの天然タンパク質およびペプチド、ならびにベンゾイルアミノ酸エステルを消化する能力を有する（例えば、SmithおよびKimmel, Enzymes. The. 第４巻, 第２版, Academic Press, ニューヨーク, 第138頁[1960]を参照されたい）。さらに、パパインは、精製コラーゲンから除去することが困難な不純物の一つであるエラスチンの分解作用を有することが報告されている（例えば、Coulson. Biochim. Biophys. Acta 237:378[1971];およびSmithら, Nature 198:1311[1963]を参照されたい）。
コラーゲンから免疫原性部位を除去するための一段階パパイン処理を含む最初の実験は、精製コラーゲンのin vivo挙動を変更させることにおいてあまりうまくいかなかった（下記の実施例３を参照されたい）。これらの観察結果から、本発明の方法（この方法によりコラーゲン繊維の天然架橋（例えばアルドール縮合）の切断および緩和が得られる）が開発された。この手法において、第２の処理において使用されるパパイン（すなわち、パパインは２つの処理工程で用いられる）は、全てではないがほとんどの場合、コラーゲン分子の表面に接近し、コラーゲン調製物からのトラップされた免疫原性部位の放出を促進する。これらの開発の結果、本発明の一の実施態様が得られ、この実施態様においてはパパインがこのプロセスの２つの特異的な段階（すなわち、還元剤および／または変性剤（unfolding agent）によるコラーゲンの処理の前後）で用いられる。したがって、これらの方法は、非免疫原性の高度に精製されたコラーゲンを製造する手段を提供する。
好ましい実施態様においては、脱脂プロセスが企図され、この脱脂プロセスでは溶媒を用いてプロテオリピドおよびリン脂質を除去する。エーテル、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールなどの単独の有機溶媒を用いてコラーゲンからこれらの化合物を除去するという初期の試みは、プロテオリピドまたはプロテオリピド様複合脂質の全てを除去することにおいて効果的ではなかった（実施例４参照）。したがって、クロロホルム：メタノールの３：１v/v混合物を用いてプロテオリピドおよびリン脂質の全てを除去する独特の技術を開発した。
好ましい実施態様においては、精製コラーゲンは、実施例６に示されたように、リン酸エステルをヒドロキシル化アミノ酸のヒドロキシル基に共有結合させることによって化学修飾することができる。必ずしも本発明を理解する必要はないが、この反応は、リン酸エステルをセリン、チロシンおよび／またはトレオニン、ヒドロキシリジンならびにヒドロキシプロリンのヒドロキシル基に共有結合させることが関係している。この反応は、反応の程度を制限するために制御される。この工程の完了時に、コラーゲンに潜在的に残留している反応性基をいずれもトリメタリン酸塩またはその他の活性剤に曝すことによってホスホリル、ヒドロキシル、またはスルホニル基に完全に転化することができる。種々の程度の化学修飾を有する最終生成物または化学修飾されていない最終生成物は、生理学的緩衝液に可溶または不溶であり、多くの用途に適している。この手法において、精製された生成物は特定の用途に合わせて仕様変更することができる。例えば、生物活性応答には、アルカリpHでコラーゲンを鎖状または環状ポリリン酸と反応させることが好都合である。
最終コラーゲン生成物は溶液または固体として用いられ得るものであり、限定するものではないが、生物学的インプラント、グラフト（grafts）、トランスプラント、および薬物送達などの種々の目的に有用であることが示されている。さらに、最終コラーゲン生成物はトランスプラント手術中の外科的アジュバントとして、および術後のグラフトの転位を防止するために、止血剤として、軟組織を補強するために、そしてin vitro細胞増殖（すなわち細胞培養）の支持体として有用であると考えられる。
止血剤として用いられる場合、本発明の方法にしたがって調製されたコラーゲンは、表面、とりわけ大表面からの出血の制御に特に適用可能である。例えば、本発明のコラーゲンは、切断されたまたは裂けた骨、器官（例えば、外科的または外傷的に切断された脾臓、肝臓または腎臓）、小血管が支配的に集合している中枢神経系、補てつ手術、壊死性組織の外科的除去により生じたじくじくしている表面、美容手術、および１以上の小さな源（例えば、顔面の切り傷）から血液が滲み出ている任意の表面における止血剤として用いることができる。この止血用コラーゲン調製物は、種々の状態で適用され得る（例えば、表面に直接適用される粉末；鉛筆状の止血薬；ゲル、スポンジまたは布状）。利用される止血コラーゲン調製物の量は、出血の程度、治療する表面積、および血流の重篤度により変化し、唯一の要求は所望の制御を達成することである。
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下記に定義する。
「標本」または「試料」という用語は、本明細書および特許請求の範囲において区別なく用いられ、その最も広範な意味で使用される。一方、それらの用語は、臨床上の標本（すなわち試料）または培養物（例えば、微生物学的培養物）を含むものである。また、生物学的試料および環境試料の両方を含むものである。生物学的試料は、ヒトなどの動物、液体または組織、食品および食品成分などであり得る。しかしながら、これらの例は、本発明に適用可能な試料の型を限定するものと解釈されてはならない。
本発明の「非ヒト動物」とは、ヒト以外の任意の動物を含む。そのような非ヒト動物としては、齧歯動物、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類などの脊椎動物が挙げられる。本発明は、任意の特定の動物に限定されるものではないが、好ましい非ヒト動物は、ウシおよびヒツジのような家畜から選択される。
「プロコラーゲン」という用語は、本明細書で用いられる場合、細胞外マトリックス内で切断されてコラーゲンを形成する前駆体タンパク質に関して用いられる。特に、プロコラーゲンは、コラーゲンα鎖の前駆体である「プロ−α鎖」に関して用いられる。プロ−α鎖は、プロコラーゲンの三重らせん形成に重要である「プロペプチド」を含むものとして特徴付けられる。
「コラーゲン」という用語は、本明細書で用いられる場合、その堅い三重鎖らせん構造によって特徴付けられる繊維性タンパク質の細胞外ファミリーに関して用いられる。３本のコラーゲンポリペプチド鎖（「α−鎖」）は、互いに巻き付いてこのらせん分子を形成する。また、この用語は、種々の型のコラーゲンをも含むものであるが、好ましい形はＩ型コラーゲンである。
「コラーゲン試料」という用語は、本明細書で用いられる場合、限定するものではないが、皮、皮膚、腱、血管、腸、肝臓、脾臓、心臓弁、骨などの任意のコラーゲン源を意味する。コラーゲン試料源は、特定の組織源または種類に限定されるものではない。唯一の必要条件は、コラーゲン試料が、精製される興味の対象である型のコラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン）を含むということである。しかしながら、本発明は、いずれかの特定の型の精製コラーゲンに限定されるものではない。
「コラーゲン原繊維」という用語は、本明細書で用いられる場合、「コラーゲン繊維」と呼ばれる束に分類される、長くて細いコラーゲンのポリマーに関して用いられる。「コラーゲンマトリックス」とは、電子顕微鏡によって見られ得る特徴的な周期性交差線紋を有するコラーゲンの細胞外マトリックスを意味するものである。特徴的には、正常なコラーゲン分子が、電子顕微鏡によって67ナノメートルの線紋として見える三次元構造において４分の１ジグザグ配列（a quarter stagger array）で集まる場合に、コラーゲンマトリックスは形成される。
「圧縮コラーゲン」という用語は、本明細書で用いられる場合、圧力を加えることによって圧縮されたコラーゲン試料を意味する。好ましい実施態様においては、圧縮されるコラーゲンは湿った、ＴＴＰTM処理された、脱脂コラーゲンである。この圧縮は任意の手段（すなわち、手動プレスまたは機械プレス）によって行われるものである。この圧縮は、試料の１平方インチ当たり5,000〜50,000ポンド（psi）の圧力の範囲を含むものである。好ましい実施態様においては、印加される圧力は、約9,000であり、別の好ましい実施態様においては、印加される圧力は、約30,000である。特に好ましい実施態様においては、圧縮コラーゲンはケークの状態にある。
「脱水コラーゲン」という用語は、本明細書で用いられる場合、当技術分野で一般的に公知の任意の方法を用いて脱水されたコラーゲン試料を意味する。好ましい実施態様においては、脱水コラーゲンは凍結乾燥または乾燥保存によって製造される。
「乾燥」という用語は、本明細書で用いられる場合、試料から水分を除去するための任意の方法を意味する。この用語は、限定するものではないが、空気乾燥および加熱などの方法を含むものである。
「分散」という用語は、本明細書で用いられる場合、試料の機械的分離を意味する。例えば、この用語は、圧縮コラーゲンのケーク内に含まれる成分の分離を含むものである。この実施態様においては、圧縮ケークの成分は繊維状に分散される。好ましい実施態様においては、コラーゲンは、液体内に攪拌および懸濁される。これらの繊維は、上記のコラーゲン繊維（すなわち、コラーゲン原繊維の束）を含む。したがって、天然、ならびに乾燥コラーゲン繊維はこの定義に含まれるものである。
「止血剤」という用語は、本明細書で用いられる場合、血液の流れを停止させるか、遅延させる作用物質を意味する。
「タンパク質分解剤」と言う用語は、本明細書で用いられる場合、タンパク質を加水分解または切断する能力を有する任意の酵素（単独または酵素の混合物の状態）を意味する。この用語は、限定するものではないが、それらの基質にあるシステイン部分と反応するシステインクラスの酵素などのタンパク質分解特性を有する任意の酵素を含むものである。このクラスの酵素としては、限定するものではないが、グリセルアルデヒド−ホスフェートデヒドロゲナーゼおよびパパインが挙げられる。
特に、この用語は、Ｉ型コラーゲンをその天然の立体配置の状態にしたまま、コラーゲンに会合したタンパク質を分解する能力を有する酵素を意味するものと考えられる。しかしながら、いくつかの実施態様においては、タンパク質分解剤は、コラーゲン中のコラーゲン繊維に関連した架橋を切断するものと考えられる。この様式において、繊維内の鎖間の架橋は繊維がその基本的形態を維持するように緩められるが、コラーゲン繊維構造内に通常トラップされる分子が除去され得るのに十分な空間が繊維間に付与される。
「タンパク質分解コラーゲン」という用語は、本明細書で用いられる場合、少なくとも１種のタンパク質分解酵素で処理されたコラーゲンを意味する。
「精製された」という用語は、本明細書で用いられる場合、試料からの不純物の除去を意味する。例えば、この用語はタンパク質分解コラーゲンを含むものである。この用語は、任意の特定レベルの純度に限定されるものではない。しかしながら、好ましい実施態様においては、精製試料はタンパク質分解酵素で処理される。特に好ましい実施態様においては、精製された試料に、限定するものではないが、脱脂および／またはリン酸化などのその後の処理を行った。
「還元剤」という用語は、本明細書で用いられる場合、別の化合物を還元する能力を有する任意の化合物または化合物の混合物を意味する。このプロセスにおいては、酸素の割合が減少し、多重結合の数が減少する一方で水素の割合が増大する。特に、この用語は、ジスルフィド結合を切断することによってタンパク質をその天然の立体配置から展開させる能力を有する任意の作用物質を含むものである。そのような作用物質としては、限定するものではないが、硫化ナトリウム、ジチオトレイトール、グルタチオニンおよび水素化ホウ素ナトリウムなどの化合物が挙げられる。「還元コラーゲン」という用語は、少なくとも１種の還元剤に曝されたか、処理されたコラーゲンを意味する。
「リン酸化剤」という用語は、本明細書で用いられる場合、別の化合物をリン酸化する能力を有する任意の化合物または化合物の混合物を意味する。そのような化合物としては、限定するものではないが、トリメタリン酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、ウルトラリン酸ナトリウム、テトラメタリン酸ナトリウム、無水リン酸、および三塩化ホスホリルが挙げられる。
「リン酸化コラーゲン」という用語は、本明細書で用いられる場合、コラーゲン分子内のリン酸化アミノ酸の数が増大するように処理されたコラーゲンを意味する。この用語は、最小リン酸化度（すなわち、１個のアミノ酸のみがリン酸化されている）から最大リン酸化度（すなわち、リン酸化に利用でき、適用可能なアミノ酸全てがリン酸化されている）までのリン酸化の範囲、またはこの範囲内の任意のリン酸化度を含むものである。
「脱脂剤」という用語は、脂質部分を除去する（すなわち脱脂する）能力を有する任意の化合物または化合物の混合物を意味する。特に、この用語は、限定するものではないがリン脂質、中性脂質、プロテオリピド、および糖脂質などの分子をコラーゲンから除去する能力を有する物質を含むものである。そのような物質としては、クロロホルムおよびメタノールなどの有機溶媒が挙げられる。「脱脂コラーゲン」という用語は、少なくとも１種の脱脂剤に曝されたか、または処理されたコラーゲンを意味する。特に好ましい実施態様においては、脱脂剤は、クロロホルムとメタノールの３：１混合物である。
「アルカリ」とは、本明細書で用いられる場合、アルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムおよびフランシウム）の１つの水酸化物を意味する。また、アルカリは、アルカリ性水溶液（pH＞７）をもたらす物質も含むものである（例えば、CaO、Ca（OH）2、およびNa2CO3）。
「修飾コラーゲン」とは、本明細書で用いられる場合、リン酸化、フッ素化、ハロゲン化（例えば、塩素化）、スルホン化、および／またはヒドロキシル化などによって化学的に修飾されたコラーゲンを意味する。
「フィルター滅菌」試料という用語は、本明細書で用いられる場合、試料から細菌などの望ましくない混入物を除去するためにフィルターにかけられた試料を意味する。
「脱上皮化」とは、本明細書で用いられる場合、上皮組織および／または細胞を試料から除去するプロセスを意味する。「上皮の」という用語は、上皮、体内および体外表面の細胞被膜に関係するものである。
「生体適合性コラーゲン」とは、本明細書で用いられる場合、限定するものではないが、グラフト、インプラントなどの生物医学的用途または獣医学的用途に適するコラーゲンを意味する。
「生体分子」とは、本明細書で用いられる場合、生物医学的用途または獣医学的用途を有する任意の分子を意味する。例えば、コラーゲン、合成ポリマー、またはインプランテーション、トランスプランテーションおよび／またはグラフティング（grafting）に有用なその他の材料などの種々の化合物および物質を含むものである。
「グラフト」という用語は、インプランテーションまたはトランスプランテーション用の任意の組織または器官、ならびにそのような組織のインプランテーションまたはトランスプランテーションのプロセスを意味する。例えば、皮膚グラフトは、皮膚の喪失部分を置換するためにトランスプラントされる皮膚またはその他の組織の一部、または材料である。この用語は、喪失した、または損傷した組織または器官の代替物に有用な精製コラーゲンまたはその他の適切な生体適合性物質などの材料を含むものである。特に、「グラフト」という用語は、皮膚もしくはその他の組織または周囲環境に曝されている器官の代替物に関して用いられる。例えば、この用語は、皮膚、皮膚組織、粘膜、結膜などの組織に関して用いられ得る。しかしながら、この用語は、任意の特定の型の組織に限定されるものではない。
「トランスプラント」という用語は、グラフティング、インプランティング（implanting）、もしくはトランスプランティング（transplanting）、ならびに身体の一部から別の部分への組織の移転、または一の個体から別の個体への組織の移転、または身体内もしくは身体上への生体適合性材料の導入に用いられる組織を意味する。「トランスプランテーション」という用語は、身体の一部から別の部分、または別の個体への組織のグラフティングを意味する。しかしながら、トランスプランテーションまたはグラフティングに用いられる組織または器官は、本発明の方法にしたがって精製されたコラーゲンなどの材料も含んでなるものである。したがって、グラフトまたはトランスプラントは、天然組織に限定されるものではない。
「インプランテーション」という用語は、本明細書で用いられる場合、身体における新規部位の器官または組織の挿入、ならびに任意の生体適合性材料、生物学的材料、生材料、不活性材料、または放射性材料の身体への挿入を意味する。「インプラント」という用語は、組織、不活性材料、生材料、放射性材料、または生体適合性材料の無傷の組織または体腔への挿入またはグラフティングのプロセス、ならびにそのようにして挿入またはグラフトされる材料を意味する。
「弁」という用語は、本明細書で用いられる場合、グラフティング用の組織の塊を意味し、通常、身体の別の部位、または別の個体への移転中にそれ自身の血液供給を維持するように身体の一部から部分的に除去される皮膚が挙げられる。この用語は、グラフティングまたはインプランテーション前にin vitro培養されたグラフティングまたはインプランテーション用組織の塊も含むものである。
実験
下記の実施例は、本発明の一定の好ましい実施態様および様相を示し、さらに説明するために提示され、本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実験の開示において、下記の略語が適用される：eq（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定度）；mol（モル）；mmol（ミリモル）；μmol（マイクロモル）；nmol（ナノモル）；ｇ（グラム）；mg（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；ng（ナノグラム）；ｌまたはＬ（リットル）；ml（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；cm（センチメートル）；mm（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；nm（ナノメートル）；Å（オングストローム）；xgまたは×ｇ（×重力）；w/w（重量／重量）；w/v（重量／容量）；℃（セ氏温度）；rpm（回転／分）；標準生理的食塩水（0.9%NaCl溶液、pH6.2±0.3）；Harlan Sprague Dawley（Harlan Sprague Dawley社、マディソン、WI）；Fisher（Fisher Scientific、ピッツバーグ、PA）；Sigma（Sigma Chemical社、セントルイス、MO）；Aldrich（Aldrich Chemical Company社、ミルウォーキー、WI）；Spectrum（Spectrum Chemicals社、ガーデナ、CA）；American（American Dade、American Hospital Supply社の事業部、デイド、FL）；PDL（Protein Design Laboratories、マウンテンヴュー、CA）；Nitabell Rabittry（Nitabell Rabittry、ヘイワード、CA）；Axygen（Axygen社、ヘイワード、CA）；Arizona Health Science（Arizona Health Sciences Center、トゥーソン、AZ）；Collaborative Research（Collaborative Research社、ベッドフォード、MA）；Medchem Products（Medchem Products、ウォーバーン、MA）；Collatek（Collatek社、プレーンズボロ、NJ）；Boehringer Mannheim（Boehringer Mannheim、インディアナポリス、IN）；J & J Medical（J & J Medical社、アーリントン、TX）；Axygen（Axygen社、ヘイワード、CA）；Papain Products（Papain Products、タミルナドゥ、インド）；Beckman（Beckman Instruments社、フラートン、CA）；およびBrinkmann（Brinkmann Instruments社、ウェストペリー、NY）。
特に示さない限り、全ての化学薬品はSigma、Fisher、またはSpectrumなどの供給業者から入手した。これらの実施例で使用した溶媒は全てSpectrum Chemicalsから入手したものであり、分光光度測定的グレードまたは試薬グレードのものであった。これらの実施例で使用したパパインは、SigmaまたはPapain Productsから入手した。
実施例１
パパインによるコラーゲンの単離および精製
本実施例では、脱毛したウシ皮から一段階酵素処理法を用いてコラーゲンを精製した。
まず、地元の屠殺場から入手した清浄な脱毛ウシ皮100ｇを、切り刻み又は薄く切り取り厚さ約１cm、長さ約10cmの薄片にした。切り取った薄片を30ｇのNaCl、３ｇのZnCl、4.5ｇのメチルパラベン、0.9ｇのプロピルパラベンを含む２回蒸留した蒸留水を含有する洗浄緩衝液３リットル中で洗浄した。いくつかの実験においては、洗浄緩衝液に、30.0ｇのNaCl、３ｇのZnCl、4.5ｇのメチルパラベン、および1.5ｇのトリクロロフェナートまたは３ｇの次亜塩素酸塩を含有せしめた。こうした異なる洗浄緩衝液を用いた場合、精製コラーゲン調製物には違いは観察されなかった。回転器（モデル#4140、American）を用いて、５〜15℃、一定攪拌下で６〜８時間洗浄を行った。洗浄操作は２回繰り返した。各洗浄後、液体を固体からデカントした。繰り返し洗浄することにより、通常、試料の乾燥重量の約１〜５％を構成するアルブミンおよびグロブリンの大部分が除去された。
酵素処理の適用前に、試料の脱上皮化を行った。このプロセスにおいては、24ｇのNaOHおよび56ｇの酸化カルシウムを含む冷脱イオン水を含有する１リットルの冷脱上皮化緩衝液を先に洗浄した試料に加え、5,000×ｇで15分間遠心分離して、固体チャンク（chunk）の材料を得た。試料を、15℃で、回転器にて80〜100rpmで48時間攪拌した。脱上皮化溶液は16時間毎に交換した。48時間後、チャンクを３リットルの脱イオン水中に80〜100rpmで攪拌しながら２時間浸漬し、固体を5,000×ｇで１５分間遠心分離することによって回収した。４℃に予備冷却した３リットルの脱イオン水に100ｇのホウ酸を溶かした溶液を加え、試料を４℃で16時間攪拌した。pHを測定して、約8.3に調節した。試料を３リットルの脱イオン水で２回、各2時間洗浄し、上記のような遠心分離によって固体を回収した。こうした方法を本実施例で用いたが、試料の脱上皮化を行うための種々の方法が利用可能であり、当業者に公知である。当業者に利用可能なこれらの標準方法のどれを用いても所望の脱上皮化がうまく行われるものと考えられる。
洗浄後、試料を１段階酵素処理にてパパインで処理した。このプロセスにおいては、試料をさらに３リットルのパイロジェンフリー脱イオン水で室温で２時間洗浄した。試料を5,000×ｇで15分間遠心分離し、デカントした。次いで、１リットルの標準生理的食塩水を試料に加えた。パパイン（SigmaまたはPapain Products）を総容量（すなわち１リットル）の１mlにつき１〜２mgの割合で攪拌を継続しながら加えた。パパインを加えた後、溶液を、37℃で、回転器を用いて80〜100rpmの攪拌下で約16時間インキュベートした。
この第１の酵素処理後、過剰の水を排出し、固体を２リットルの脱イオン水で３回洗浄した。次いで、１リットルの0.2Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを洗浄した固体に加えた。固体を攪拌器を用いて80〜100rpmの攪拌下で３時間インキュベートした。過剰の水を排出し、固体を２リットルの脱イオン水で３回洗浄した。
強壮処理（robust treatment）
上記のように標準的酵素処理後還元処理を行って、さらに、「強壮処理」も試験した。この処理においては、「標準的」処理と比べて多数倍のインキュベーション時間および酵素濃度が用いられた。残りの工程は標準的処理について記載したものと同じであるが（すなわち、「強壮処理」で用いられるコラーゲンは同一のウシ皮、切断工程および洗浄工程を用いて調製された。）、強壮処理においては、溶液１ml当たり１mgのパパインを用い、酵素処理でインキュベーションを16時間行う代わりに、溶液１ml当たり４mgのパパインを加え、酵素処理でインキュベーションを24時間行った。
この調製物中の残留混入物およびコラーゲンの量を測定し、実施例２に記載した方法を用いて得られた結果と比較した。
実施例２
Ｉ型コラーゲンの単離および精製
本実施例は、本発明の一の実施態様である「二回処理プロセスTM」（ＴＴＰTM）の方法および更なる態様を記載するものである。
本実施例では、「２回処理プロセスTM」（ＴＴＰTM）を記載する。本実施例では、Ｉ型コラーゲンを脱毛ウシ皮から精製した。まず、地元の屠殺場から入手した清浄な脱毛ウシ皮100ｇを、厚さ約１cm、長さ約10cmに切り刻むか、薄く切り取った。切り取った薄片を30ｇのNaCl、３ｇのZnCl、4.5ｇのメチルパラベン、0.9ｇのプロピルパラベンを含む２回蒸留した蒸留水を含有する洗浄緩衝液３リットル中で洗浄した。いくつかの実験においては、洗浄緩衝液に、30.0ｇのNaCl、３ｇのZnCl、4.5ｇのメチルパラベン、および1.5ｇのトリクロロフェナートまたは３ｇの次亜塩素酸を含有せしめた。こうした異なる洗浄緩衝液を用いた場合、精製コラーゲン調製物には違いは観察されなかった。回転器（モデル#4140、American）を用いて80〜100rpmの一定攪拌下にて、５〜15℃で６〜８時間洗浄を行った。洗浄操作は２回繰り返した。各洗浄毎に5,000×ｇで15分間遠心分離し、上清をデカントした。繰り返し洗浄することにより、通常、試料の乾燥重量の約１〜５％を構成するアルブミンおよびグロブリンの大部分が除去された。
酵素処理の適用前に、試料の脱上皮化を行った。このプロセスにおいては、24ｇのNaOHおよび56ｇの酸化カルシウムを含む冷脱イオン水を含有する１リットルの冷脱上皮化緩衝液を、先に洗浄した試料に加え、5,000×ｇで15分間遠心分離して、固体チャンクの材料を得た。試料を、15℃で、回転器にて80〜100rpmで48時間攪拌した。脱上皮化溶液は16時間毎に交換した。48時間後、チャンクを３リットルの脱イオン水中に80〜100rpmで攪拌しながら２時間浸漬し、固体を5,000×ｇで15分間遠心分離することによって回収した。４℃に予備冷却した３リットルの脱イオン水に100ｇのホウ酸を溶かした溶液を加え、試料を４℃で16時間攪拌した。pHを測定して、約8.3に調節した。試料を３リットルの脱イオン水で２回、各２時間洗浄し、上記のような遠心分離によって固体を回収した。こうした方法を本実施例で用いたが、試料の脱上皮化を行うための種々の方法が利用可能であり、当業者に公知である。当業者に利用可能なこれらの標準方法のどれを用いても所望の脱上皮化がうまく行われるものと考えられる。
洗浄後、試料をＴＴＰTMで処理した。このプロセスにおいては、試料をさらに３リットルのパイロジェンフリー脱イオン水で室温で２時間洗浄し、水をデカントした。次いで、１リットルの標準生理的食塩水を試料に加えた。パパインを総容量（すなわち１リットル）の１mlにつき１〜２mgの割合で攪拌を継続しながら加えた。パパインを加えた後、溶液を、37℃で、回転器を用いて80〜100rpmの攪拌下で約16時間インキュベートした。
この第１の酵素処理後、過剰の水を排出し、固体を２リットルの脱イオン水で３回洗浄した。次いで、１リットルの0.2Ｍ水素化ホウ素ナトリウムを洗浄した固体に加えた。固体を回転器を用いて80〜100rpmの攪拌下で３時間インキュベートした。過剰の水を排出し、固体を２リットルの脱イオン水で３回洗浄した。次いで、第１の酵素処理について上記したものと同一の手順を用いて、この固体に第２の酵素処理を行った。強還元剤が必須であることが分かった。本発明を理解または使用することは必須ではないが、この強還元剤が第１の酵素処理後に残っている可能性のある任意の可逆反応性基を安定化するものであり得る。また、この工程はアルドール縮合反応（すなわち、２つのアルデヒド基間の反応）またはシッフ塩基反応（すなわち、アルデヒド基とアミノ基間の反応（例えば、Nimniら，"Bioprosthesis derived from crosslinked and chemically modified collagenous tissues", Collagen, 第３巻, M.E.Nimniら, CRC Press社, Boca Raton, FL[1988], p.5を参照されたい）に潜在的に関与するアルデヒドの量も低下させる。また、この工程は、III型コラーゲンにおいてのみ存在する同一分子のらせん領域にある鎖間ジスルフィド結合も減少させ得る（例えば、D.Amielら，"Biochemistry of tendon and ligament", Collagen, 第３巻, p229（上記同様）を参照されたい）。
第２の酵素処理後、過剰の水を排出し、固体を２リットルの脱イオン水で３回洗浄した。必ずしも本発明を理解する必要はないが、第１の酵素処理は、コラーゲンを膨潤させるためのアルカリ化合物を用いて、または用いずに還元剤（例えば、硫化ナトリウム、チオトレイトール、ジチオトレイトール、グルタチオンまたは水素化ホウ素ナトリウム）によってさらなる攻撃を受けやすい程度まで調製物内のコラーゲンを遊離させる。化学処理後、残留非コラーゲン性混入物（例えば、間質性エラスチン）の全てを完全に除去するためにパパインによる第２の処理を行った。
二段階酵素処理にしたがって調製されたコラーゲン、ならびに実施例１に記載した一段階酵素処理にて調製したコラーゲンを、実施例３に記載したように非コラーゲン性繊維性タンパク質（例えば、エラスチン）の除去の程度を測定するために試験した。
実施例３
不溶性非コラーゲン性タンパク質（エラスチン）含量
本実施例では、コラーゲン調製物の種々の試料を、Soskelら（N.T.Soskelら，Meth. Enzymol., 144:199[1952]）によって記載された方法を用いて存在する非コラーゲン性不溶性タンパク質の量について試験した。本実施例で試験した試料は下記のようにして処理した。
簡単に言うと、約25ｇの湿性試験試料を２：１のクロロホルム：メタノール（v/v）を用いて脱脂した。試料を液体窒素中で凍結させ、破砕した。次いで、破片を100％イソプロピルアルコールに入れて細菌の増殖を防止した。次に、破片を5,000×ｇで15分間遠心分離し、上清をデカントし、ペレットを60℃で空気乾燥した。続いて、乾燥した試料をデシケーター内で室温にもどし、約10ｇの各試料を200mlのポリプロピレンチューブに入れた。100mlの0.1Ｎ NaOHを４℃で各チューブに加え、内容物を混合した。次いで、チューブを45分間沸騰水浴に入れた。エラスチン分解は60分後に発生し始めたので、45分後に沸騰水浴からチューブを取り出すことは重要であることが確定された。次いで、試料を冷0.1Ｎ NaOHで洗浄し、その後２回蒸留した冷蒸留水で洗浄した。重量測定値が高くなる原因である試料中の水分の包含を回避するために、試料をP2O5上で乾燥するか、凍結乾燥した。試料は、使用するまでデシケーター内に保持した。試料を重量測定のために一定重量にさせた（すなわち、試料を、その重量がそれ以上変化しなくなるまで繰り返し計量した）。
表１に、結果を乾燥出発試料10ｇからのパーセント乾燥重量として示す。この表では、「標準」および「強壮（robust）」パパイン酵素処理（すなわち、実施例１に記載した強壮処理）を用いて調製された試料から得られた結果を示す。この表において、「酵素単独」とは実施例１に記載された方法にしたがって処理された試料を意味するものである（すなわち、どの還元剤も用いずに処理され、第１の酵素処理を行って、この処理プロセスで停止した）。
この実験では、上記のようなＴＴＰ法にしたがって調製された試料ならびに実施例１に記載された「強壮処理」にしたがって調製された試料が試験された。さらに、２つのその他の試料を標準処理および強壮処理の両方を用いて試験した。「酵素→還元剤」試料とは、一の酵素処理および一の還元工程後（すなわち、実施例２の第１の酵素処理を行った後、実施例２の還元工程を行った）に試験される試料を意味する。
「還元剤→酵素」と示された試料は、一の還元工程後、一の酵素処理を行った後に試験される試料を意味するものである。この「還元剤→酵素」試料は、実施例１および２に記載されたようにして同一のコラーゲン源から調製し、切断し、洗浄した。試験試料を、まず実施例２に記載した還元法を用いて、第１の酵素処理を行わずに還元した。この還元工程後、第１の酵素処理について記載した方法を還元試料について行った。
「ＴＴＰTM処理された」と示された試料は、実施例２の方法にしたがって調製した試料である。標準的なＴＴＰTM処理方法を用いた場合、不溶性非コラーゲン性タンパク質は検出されなかったので、このプロセスの強壮バージョンは行わなかった。このＴＴＰTM処理試料の特性は、下記の実施例５でより詳細に論じる。
非処理対照には、非コラーゲン性不溶性タンパク質が乾燥重量基準で1.24±0.190パーセント含まれていたが、ＴＴＰプロセスによって調製された試料には検出可能な乾燥重量の非コラーゲン性不溶性タンパク質は含まれていなかった。これらの結果は、この実験においては、実施例１に記載されたような一の酵素処理工程のみで調製されたコラーゲンと比べて、外来非コラーゲン性タンパク質の除去の程度がかなり大きいということを示すものである。
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実施例４
ＴＴＰTM処理コラーゲンの脱脂
本実施例においては、実施例２に記載したようなＴＴＰTMで処理されたコラーゲンを、ＴＴＰTM処理コラーゲンからさらなる潜在的免疫原性部位を除去するために、脱脂した。
分別塩沈殿
まず、ＴＴＰTM処理Ｉ型コラーゲンを、HillおよびHarper（R.J.HillおよびE.Harper, Anal. Biochem., 141:83-93[1984]）によって記載されたようにして分別NaCl塩沈殿によって分離した。簡単に言うと、酵素処理コラーゲンを、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液）に溶かした0.5ＭのNaCl溶液にpH7.4で溶解した。次いで、NaCl濃度を1.7Ｍまで増大させた。溶液を混合し、10,000×ｇ、０〜４℃で１時間遠心分離した。脱水した沈殿物を混合し、0.5Ｍの酢酸で可溶化し、pHを7.0に調節した。塩化ナトリウムを最終濃度2.5Ｍになるまで加えて、沈殿物をさらに上記のような遠心分離によって集めた。
続いて、コラーゲン試料中の脂質含量の定量分析のために脱脂前に沈殿コラーゲンを脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥した。
後者の実験において、この分別塩沈殿はＴＴＰTM処理Ｉ型コラーゲンプロトコルの精製のレベルには影響を及ぼさないので必要ないことが多いということが分かった。しかしながら、この工程は、脱脂前に行われ得ることが意図されている。
脱脂
次いで、コラーゲン調製物をFolchらの方法（Folchら，J. Biol. Chem., 226:497-509[1957]）に改良を加えた方法を用いて脱脂した。この工程には、ガングリオシドおよびホスホイノシチドなどの全脂質の溶媒抽出が含まれていた。簡単に言うと、コラーゲン調製物をクロロホルムとメタノールの混合物（２：１，v/v）中で攪拌した。クロロホルム：メタノールの容量はコラーゲン試料の20倍であった（すなわち、コラーゲン試料１部にクロロホルム：メタノール混合物20部を加えた。）。これを加える間は試料を十分に攪拌し、40〜45℃で１時間激しく振とうさせた。
ホモジネートをバイアルに移し、0.2容量の0.88%KClを加えた。２相の混合物を分液漏斗で分離した。主要脂質を含む下相を除去し、コラーゲンを含む上相を３：48：47（v/v）のクロロホルム：メタノール：水の混合物で２回洗浄した。次いで、コラーゲン調製物を同一成分（すなわちクロロホルム：メタノール：水）の５：80：15（v/v）の混合物で洗浄し、手動プレスを用いて9,000±1000psiの圧力で脱水した。これによってコラーゲン調製物から水が搾り出されて脱水塊が得られた。しかしながら、約8000〜30,000psiの圧力がこの工程における使用に適しているものと考えられる。8000psiの圧力を加えることによって、分子の外部から外因性の水が全て除去され、一方、約30,000psiを加えると分子内の水さえ除去される。しかしながら、本発明はこれらの特定の圧力に限定されるものではない。
次に、コーヒーミルを用いて圧縮ケークを分散させ、通気乾燥炉内で40〜45℃にて空気乾燥した。続いて、脱脂試料の純度を、下記のようにしてリン脂質、中性脂質および糖脂質について試験した。
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）をSkipskiら（Skipskiら，Biochem. J., 90:374-378[1964]）によって記載されたようにして使用することにより試料中のリン脂質を検出した。簡単に言うと、10ｇの脱脂試料をシリカゲルＴＬＣ法を用いて試験した。まず45ｇのシリカゲルＨ（Spectrum）を65mlの脱イオン水に加えたスラリーを調製することによってＴＬＣ板を調製した。スラリーを清浄なガラス板（20cm×20cm）上に厚さ0.5mmで注ぎ、60℃で60分間、空気乾燥し活性化し（すなわち硬化し）、室温まで冷却してすぐに用いた。既知量の抽出脂質（200μｌ）を、板の下端から約２cmのところの乾燥シリカゲルにすじ状に塗布した。試料を空気乾燥させ、次いでガラスチャンバー内の、クロロホルム：メタノール：アンモニア水（28％）を65：25：５（v/v）の割合で含む注流（irrigating）媒体中に入れた。溶媒の先端が板の上端付近に到達したら、板をガラスチャンバーから取り出して空気乾燥させた。次いで、板をヨウ素の蒸気で展開させた。黄色がかった褐色のスポットがリン脂質が存在する位置に現れた。存在するリン脂質の定量を、下記の実施例７に記載したように、FiskeおよびSubbarowの方法を用いて行った。その結果を下記の表２に示す。
ＴＴＰTM処理コラーゲン中の中性脂質および糖脂質の存在は、Rouserら（G.Rouserら, Lipids 2:37-40[1967]）によって記載されたような、ケイ酸カラムクロマトグラフィー法を用いて測定された。簡単に言うと、ケイ酸（Spectrum）を含むカラム（10mm×20mm）を調製し、10ｇの脱脂コラーゲンを、２ｇずつ連続的にカラムに加えた。したがって、全10ｇの試料はカラム上で５つの流れに分けられ、溶出試料は全てプールされた。試料を160mlのクロロホルム：アセトン（１：１、v/v）で溶出し、その後一連のアセトンおよびアセトン：水溶液で溶出した。溶離した中性脂質および糖脂質をカラムから回収し、空気乾燥して、重量を測定した。その結果を表２に示す。
比較のために、上記の脱脂工程前に調製した凍結乾燥コラーゲン試料の多数の試料を種々の有機溶媒を用いる脂質抽出にかけた。15ｇの乾燥試料を多数の容器に入れた。次いで、各溶媒を100mlずつ各容器に加えた（すなわち、１種類の溶媒を各試料に加えた。）。本実験で用いられた溶媒は、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトンおよびクロロホルム：メタノール（２：１）であった。容器をオービタル回転器を用いて100rpmで攪拌しながら約40℃で６時間インキュベートした。次いで、溶媒を遠心分離および蒸発によってコラーゲン試料から分離させた。種々の溶媒で処理した脱脂および乾燥試料の各10ｇを上記のような脂質評価に用いた。その結果を下記の表２に示す。この表において、割合は、コラーゲンの全乾燥試料重量のパーセントとして示す。
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表２に示したように、上記のようにして製造したクロロホルム：メタノール抽出試料においては検出可能な量のリン脂質、中性脂質または糖脂質は含まれていなかった。それとは対照的に、脱脂を伝統的な方法（例えば、エーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ベンゼン、クロロホルム、またはアセトンなどの単独の溶媒を用いる方法）で行った場合、同様のタンパク質試料は検出可能な量のリン脂質、中性脂質および／または糖脂質を含んでいた。これらのリン脂質、中性脂質および／または糖脂質は、室温またはわずかに高い温度（例えば50℃）での長時間抽出（例えば、数日間）後でさえこれらの試料において検出可能であった。
実施例５
ＴＴＰTM処理コラーゲンのシステイン、ヒドロキシプロリンおよびヘキソサミンならびにエラスチン（不溶性非コラーゲン性タンパク質）含量
本実施例では、脱脂ＴＴＰTM処理コラーゲンのシステイン、ヒドロキシプロリン、ヘキソサミン、およびエラスチン含量を測定した。ヒドロキシプロリン含量は、試料中に存在するコラーゲンの量の測定として認知される。
脱脂脱水Ｉ型コラーゲン試料を、0.1Ｍの酢酸中で0.3％（w/v）の濃度まで戻した。製造業者の指示にしたがってBeckmann6300アミノ酸分析装置を用いてそのアミノ酸含量を測定するＨＰＬＣによってコラーゲンの純度を評価した。実施例６に記載されたような「低リン酸化」のコラーゲン調製物のシステイン含量のようにして試料のシステイン含量を測定した。これらの結果は、ＴＴＰTM処理コラーゲンおよび「低リン酸化コラーゲン」の両方のモルパーセントが0.09であることを示していた。
さらに、ＴＴＰTM処理コラーゲンの不溶性非コラーゲン性タンパク質（すなわちエラスチン）含量を、コラーゲンの不溶性非コラーゲン性タンパク質含量の試験に関する実施例３に記載された方法を用いて測定した。エラスチンは、ＴＴＰTM処理Ｉ型コラーゲン調製物に残留している可能性のある唯一の非コラーゲン性タンパク質であるので、その他の方法を用いて処理したコラーゲン（例えば、実施例６のリン酸化コラーゲン）と比較してこの調製物のエラスチン含量を測定することは重要であると考えられる。これらの実験の結果を下記の表３に示す。これらの結果は乾燥重量基準のパーセント（wt/wt）として示す。
脱脂脱水Ｉ型コラーゲン、ならびに米国特許第5,374,539号に記載された方法にしたがって調製されたコラーゲンおよび実施例６に記載された２つのリン酸化コラーゲン試料（「高リン酸化」および「低リン酸化」）のヒドロキシプロリンおよびヘキソサミン含量を下記の実験で試験した。
ヒドロキシプロリン濃度の測定
脱脂脱水Ｉ型コラーゲン、ならびに米国特許第5,374,539号に記載された方法にしたがって調製されたコラーゲンおよび実施例６に記載された２つのリン酸化コラーゲン試料（「高リン酸化」および「低リン酸化」）のヒドロキシプロリン含量を、Stegeman（H.Stegeman, J. Physiol. Chem., 311:41[1958]）によって記載された方法を用いて評価した。本実施例で用いた0.03ＭのクロラミンＴは、20mlの水、30mlのプロパノールおよび50mlのpH６クエン酸塩−酢酸塩緩衝液からなる緩衝液100mlに0.845ｇのクロラミンＴを加えることによって調製した。クエン酸塩−酢酸塩緩衝液（pH６）は、50ｇのクエン酸（１H2O）、12mlの氷酢酸、120ｇの酢酸ナトリウム（３H2O）、および34ｇのNaOHを500mlの水に加えることによって調製した。容量を１リットルに調節し、pHを６に調節した。過塩素酸（３Ｍ）を22.5mlの70％HClO4中で調製し、容量を水で100mlに調節した。ヒドロキシプロリン保存溶液は、水１ml当たり５μｇのヒドロキシプロリンを含んでいた。ヒドロキシプロリン標準を、水100ml当たり20mgのヒドロキシプロリンおよび0.05mlの濃HClを加えることによって調製した。
ヒドロキシプロリン濃度を下記のようにして測定した。各試料１mlおよび２〜５μｇのヒドロキシプロリンを含む標準溶液１mlを別々のチューブ内の１mlのクロラミン溶液に加え、室温で20分間混合した。次いで、１mlの過塩素酸をチューブに加えて、室温で５分間混合した。５％のp-ジメチルアミノベンズアルデヒドを含むプロパノール１mlを各チューブに加え、60℃の水浴中で18分間混合した。チューブを20℃まで冷却し、550nmにおける光学濃度を読み取った。その結果を下記の表３に示す。
ヘキソサミン濃度の測定
脱脂脱水Ｉ型コラーゲン、ならびに米国特許第5,374,539号に記載された方法にしたがって調製されたコラーゲンおよび実施例６に記載された２つのリン酸化コラーゲン試料（「高リン酸化」および「低リン酸化」）の全ヘキソサミン濃度も、Blumenkrantzら（N.BlumenkrantzおよびG.Absoe-Hansen, Clin. Biochem., 9:269[1976]）によって記載された方法を用いて評価した。
この実験に用いられるリン酸三ナトリウム−四ホウ酸カリウム溶液は、98mlの１Ｎ三塩基性リン酸ナトリウムと0.5Ｎ四ホウ酸カリウムを混合することによって調製した。次いで、このリン酸三ナトリウム−四ホウ酸カリウム溶液を、試料中のヘキソサミンの測定用のアセチルアセトン混合物のための溶媒として用いた。アセチルアセトンＩは、リン酸ナトリウム−ホウ酸カリウム緩衝液の3.5％（v/v）溶液として調製した。アセチルアセトンIIは、0.5Ｎの四ホウ酸カリウムの3.5％（v/v）溶液として調製した。これらの実施例で用いたErlich's試薬は、3.2ｇのp-ジメチルアミノベンズアルデヒドを、210mlの2-プロパノールで希釈した30mlの12Ｎ HClに加えることによって調製した。
簡単に言うと、脱脂試料をチューブに入れ、６Ｎ HClを試料に混合し、試料を120℃で30分間（または100℃で12〜14時間）加水分解した。次いで、試料を蒸発乾固した。同時に、グルコサミンおよびガラクトサミン（それぞれ2.5〜40μｇ）の標準を同じ方法を用いて加水分解し、蒸発乾固した。試料および標準を２回蒸留した蒸留水に再懸濁した。
全ヘキソサミンの量を測定するためのアッセイにおいては、0.8mlの試料または標準を別々の試験管内の0.6mlの3.5％アセトンＩに加えて混合した。試験管を100℃で30分間加熱し、冷却した。次いで、２mlのErlich's試薬を各試験管に加えて混合した。試験管を５分間インキュベートし、535nmにおける光学濃度を測定した。
グルコサミンとガラクトサミンを区別するためのアッセイにおいては、0.8mlの試料または標準を別々の試験管内の0.6mlの3.5％アセチルアセトンIIに加えて混合した。試験管を粉砕した氷中に２時間放置し、その後50℃で15分間加熱した。次いで、２mlのErlich's試薬を試験管に加えて混合した。試験管を室温で30分間インキュベートし、530nmにおける光学濃度を測定した。その結果を下記の表３に示す。結果は、乾燥重量基準でのパーセント（wt/wt）として示す。
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実施例６
フィルター滅菌Ｉ型コラーゲンの化学修飾
本実施例では、実施例５に記載された方法にしたがって調製されたＴＴＰTM処理コラーゲンをさらに処理して「コラーゲンＰＲＯTM」を製造した。したがって、コラーゲンＰＲＯTMが本発明で用いられる場合、「コラーゲンＰＲＯTM」とは、リン酸化されている精製コラーゲンを意味する。
コラーゲンＰＲＯTMは、実施例５に記載された方法にしたがって調製されたＴＴＰTM処理コラーゲンから調製した。まず、ＴＴＰTM処理コラーゲンを、その調製物を30mlの注射器に取り付けた0.22μフィルターを通過させることによってフィルター滅菌した。その後、フィルター滅菌されたコラーゲン懸濁液を使用するまで４℃で保存した。これらのフィルター滅菌されたコラーゲン調製物を、生物医学的用途に適した精製コラーゲンの製造のための最適修飾を決定するために化学的に修飾した。予備滅菌した成分およびパイロジェンフリーの無菌水を用いて滅菌条件下で全操作を行った。
まず、0.1Ｍの酢酸に加えたコラーゲンの0.3％溶液100mlを、pHが11.5になるまで５ＮのNaOHで４℃にて処理した。次いで、トリメタリン酸ナトリウムを最終濃度0.03Ｍまで加えた。コラーゲンを、室温に保持した無菌フード内でオービタル回転器を用いて160rpmにて攪拌しながら約３時間反応させた。この修飾コラーゲンを４℃にて脱イオン水に対して透析することによって残留イオンがコラーゲン試料から浸出されるまで洗浄した。修飾コラーゲンの一部を当業者に一般的に公知の方法を用いて凍結乾燥（すなわちフリーズドライ）によって乾燥した。凍結乾燥した試料は、さらなる試験を行う前に最低５日間デシケーター内に保存した。
いくつかの実験に対して、種々のリン酸化度の精製コラーゲンを含有せしめることは興味深い。実施例において「高リン酸化コラーゲン」と呼ばれるより多量にリン酸化されたコラーゲンを有する試料については、コラーゲン内の利用できる修飾可能部位の約40％がリン酸化された。リン酸化度が低い試料については、この調製物は実施例において「低リン酸化コラーゲン」と呼ばれる。低リン酸化の精製コラーゲンを得るために、リン酸化工程に0.03Ｍのトリメタリン酸ナトリウムを用いる代わりに0.01Ｍのトリメタリン酸ナトリウムを用いた。さらに、インキュベーション時間は、0.03Ｍのトリメタリン酸ナトリウムを用いた場合の３時間の代わりに１時間であった。
増殖因子（例えばＥＧＦ）、インターロイキン（例えばＩＬ１）およびその他の生物学的に活性な分子などの生体分子のリン酸化は有益であると考えられる。ＥＧＦのリン酸化に関して、pH11.5に調節した0.1％ＥＧＦ１mlを、上記と同一の濃度および条件（例えば、攪拌および温度）下で0.2mlのトリメタリン酸ナトリウムに加えた。次いで、試料は塩を除去するために透析され、リン酸化ＥＧＦは適宜使用され得る。
実施例７
共有結合リンの試験
実施例では、洗浄したコラーゲン試料を共有結合リンの存在についてFiskeおよびSubbarow（C.H.FiskeおよびY.Subbarow, J. Biol. Chem., 66:375-400[1925]）によって記載された操作を用いて試験した。簡単に言うと、実施例６にしたがって調製し、凍結乾燥した乾燥修飾コラーゲン１mgを１mlの72％過塩素酸と混合し、その後200℃で20分間消化した。脱イオン水を消化試料に加えて容量を４mlに調節した。次いで、下記の試薬を連続して添加し、十分に混合した。まず、３Ｎ硫酸にモリブデン酸アンモニウムを2.5％加えた溶液0.4mlを加えた。この混合物に、還元剤1-アミノ-2-ナフトールスルホン酸を0.2ml加えた。次に、このコラーゲン混合物を100℃で10分間インキュベートし、分光光度計（Beckman DU-2）にて600nmで測定して発色を観察した。一リン酸二水素カリウムをリン標準として用いた。実施例２にしたがって調製した非修飾コラーゲンを対照として用いた。
一リン酸二水素カリウム標準を用いて得られた結果をグラフにすることによってリン含量を評価した。この実験では、非結合リンをＴＴＰTM処理試料において検出した。高リン酸化コラーゲン（すなわち、コラーゲン内の利用できる修飾可能部位の40％がリン酸化されている）を有する試料に対して、2.5％（wt/wt、乾燥重量基準）の結合リンが検出された。低リン酸化の試料に対しては、0.8％（wt/wt、乾燥重量基準）の結合リンが検出された。
これらの結果から、修飾コラーゲンのリン含量は非処理対照と比べて有意に増大していることが分かった。非処理コラーゲン対照試料においては、測定可能な量のリンは検出されなかった。かなりの数のヒドロキシアミノ酸（例えば、セリンおよびチロシン）が不可逆的にリン酸化されてリン酸エステル結合を形成するものと評価された。必ずしも本発明を理解することは必要ではないが、図２は、このリン酸化中に起こり得る反応を示すものである。
この修飾コラーゲンは、実施例１０〜１５に記載されているように、改良された生物学的特性を有することが示された。しかしながら、不純コラーゲン調製物に存在する不純物は混入タンパク質（例えばエラスチン）のリン酸化により好ましくない生物学的反応を生じさせ得るので、コラーゲンの精製には注意を払う必要があることが確認された。
重要なことに、修飾の量は、コラーゲンに存在する修飾可能なアミノ酸の０から最大約40％までの範囲で調節することができる。反応が生じるpH条件は、所望の修飾の量に依存して８〜13で変動させることができる。さらに、反応温度は、４〜45℃の範囲とすることができる。その他の実験において、試料は４℃未満の温度で凍結する傾向があり、一方、45℃以上の温度ではコラーゲンは変性され得るということが観察された。
コラーゲンとの反応に用いられる化学物質は、限定するものではないが、ヘキサンなどの非極性有機溶媒に可溶化した種々のポリリン酸塩（例えば、ヘキサメタリン酸ナトリウム、超リン酸ナトリウム、およびテトラメタリン酸ナトリウム）、無水リン酸、および三塩化ホスホリルを含む群から選択され得る。
また、種々の生物学的用途のためのその他の非コラーゲン性生物材料も同様の手法で化学的に修飾されるものと考えられる。また、限定するものではないが、フッ素化、ハロゲン化（例えば塩素化）、スルホン化、および／またはヒドロキシル化などの、細胞培養またはin vivo用途において用いるためのコラーゲンを調製するのに有用なその他の修飾も、実施例２の方法にしたがって調製されたコラーゲン、ならびに上記の方法にしたがって調製されたリン酸化コラーゲンにおいて行うことができる。これらの修飾は、組み合わせて（すなわち、同一の調製物について複数の修飾操作を行い得る）、ならびに別個に行われるものと考えられる。
実施例８
修飾コラーゲンの溶解度
本実施例では、実施例６に記載したようにして修飾した精製Ｉ型コラーゲンの溶解度を測定し、天然コラーゲンの溶解度と比較した。
本実施例では、非修飾（すなわち天然）コラーゲンおよび修飾コラーゲンの0.3％溶液10mlを0.1Ｍ酢酸中で調製した。各溶液の光学濃度を450nmで測定した。少量の0.5Ｍ NaOHを各溶液に注意深く加えてpHを中性（すなわち７）に調節した。再び450nmで光学濃度を測定した。下記の表にこれらの試料の光学濃度の値を示す。天然コラーゲンの光学濃度の増大から、この試料には修飾コラーゲンと比べてより多量の不溶性タンパク質が存在しているということが分かった。したがって、修飾コラーゲンは、中性条件下においてより良好な溶解度特性を有するということも分かった。必ずしも本発明を理解する必要はないが、この観察は、コラーゲンの等電点のシフトの結果であり得る。
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実施例９
コラーゲンＰＲＯTMフィルムの調製
本実施例では、実施例６に記載された方法にしたがって調製された、化学的に処理され、フィルター滅菌されたコラーゲン（すなわちコラーゲンＰＲＯTM）のフィルム（すなわち膜）をin vivoおよびin vitro実験での使用のために調製した。いくつかの実験においては、コラーゲンを、ウシ皮ではなくてウシアキレス腱から調製した。いずれのコラーゲン源も下記の実施例における使用に満足いくものであることが分かった。
まず、懸濁液を15×２cmの無菌ペトリ皿に深さ約８mmまで注いだ。このペトリ皿にカバーをして、均一な初期ゲル化を促進させるために37℃の一定温度で48時間保存した。これは、フィルムの場合、乾燥していることが視覚的に分かるまで３〜５日間要することが多かった。48時間の初期ゲル化期後、ペトリ皿のカバーを取り、乾燥を化学換気フード内で室温にて継続させた。乾燥後、コラーゲンフィルムを酸化エチレンガスで滅菌し、動物インプランテーション、トランスプランテーション、グラフティング、またはその他の実験に用いた。これらのフィルムはその後の実験にも使用した。
実施例１０
化学修飾コラーゲンの皮膚トランスプラントにおけるin vivo評価
本実施例では、実施例６に記載されたようにして製造した化学修飾Ｉ型コラーゲン、実施例２に記載されたようにして調製された非修飾コラーゲンのin vivo用途に対する適合性および生体適合性を測定した。実施例９に記載されたようにして得られた精製され、洗浄されたコラーゲン試料を、厚さ0.3mmの薄膜の状態で乾燥させた。
本実施例では、16匹の成体雄スイスアルビノマウスを用いてこれらのコラーゲン調製物の適合性および生体適合性を試験した。まず、動物の背面から皮膚の径１cmの円形領域を外科的に切除した。次いで、これらの領域を無菌条件下で試験または対照コラーゲンフィルムで被覆した（すなわちグラフトした）。本実施例で用いられたコラーゲンは、酸化エチレンに曝すことによって滅菌した。動物を炎症の全体の指標（すなわち、赤み、膨化、熱など）について３週間観察した。どの動物にも有害な応答は認められなかった。次いで、コラーゲンフィルムのグラフティングの３週間後、動物を屠殺した。
グラフトしたコラーゲンを含む皮膚弁全体を各動物の手術部位から切除して、当技術分野で公知の方法を用いて70％アルコールに固定し、脱水し、ろうに包埋した。包埋された試料を厚さ５ミクロンの切片にカットし、当技術分野で公知の方法を用いて、Goldner's一段階トリクローム染色（ＯＳＴ）、ならびにヘマトキシリンおよびエオシン（H & E）で染色した。
組織学的結果から、２つの実験群のいずれも有害な応答が無いことが分かった。細胞浸潤および新上皮形成（すなわち、グラフトの中心方向への上皮細胞浸潤）の速度は、どの試験グラフト材料によっても影響されなかった。それとは対照的に、対照試料では、コラーゲンフィルムに著しい数の異物巨細胞が付着していた。さらに、図２に示したように、対照では上皮形成の速度の遅延が観察された。
実施例１１
化学修飾コラーゲンのインプラントにおけるin vivo評価
本実施例では、ウシ腸（地元の市場から入手したもの）の組織試料から得られたＩ型コラーゲンを精製し、実施例６の方法を用いて化学修飾した。次いで、本発明の方法にしたがって調製されたコラーゲンの適合性および生体適合性を測定するために、これらの試料をウサギにインプラントした。これらの実験では、実施例２に記載された方法にしたがって調製された対照コラーゲンも使用した。
Nitabell Rabittryから入手した約3.5〜４kgの成体雄ニュージーランド白色ウサギを本実施例で使用した。動物をまず適切な用量のケタミンで鎮静させ、小手術のために適宜ケタミン／キシラキシン（ＰＤＬ）で麻酔した。動物の背面の毛を剃って、ベータジンスクラブ（betadine scrub）および70％アルコールふき取りで手術の準備をした。動物をそれぞれ２匹ずつ３群に分けた。各動物の皮膚に小切開を行って皮下ポケットを作った。各群のウサギに４つのインプランテーションを行った。６匹のウサギ（24部位）を、背側中線の両側にインプラントを配置するように左右相称に手術した。50mgの乾燥コラーゲンを含む各インプラントを円形に近い球体に丸めて、各部位の皮下に配置した。
動物を、炎症の全体の指標（すなわち、赤み、膨化など）について３週間観察した。どの動物にも有害な応答は観察されなかった。３週間後、動物を屠殺して、インプラントを外科的に切除して、当技術分野で一般的に公知の方法を用いて70％アルコール中に固定し、脱水し、パラフィンに包埋した。厚さ５ミクロンの切片を切り出し、当技術分野で一般的に公知の方法を用いてＯＳＴおよびＨ＆Ｅで染色した。
この結果により、両実験群においてより多量の血管新生および繊維芽細胞内殖が示された。対照試料は血管新生、ならびに多核巨細胞の普及が比較的乏しく、このことはこれらの試料は生体適合性が低いということを反映するものである。
実施例１２
アルカリホスファターゼ活性
本実施例では、実施例９に記載されたようにして試験したコラーゲンインプラントをそのアルカリホスファターゼ活性について分析した。アルカリホスファターゼ活性は、この酵素が組織形成および石灰化に関与すると仮定されているので興味深い。本実施例で用いたアッセイは、BradenbergerおよびHanson（H.BradenbergerおよびR.Hanson, Helv. Chim. Acta 36:900[1953]）ならびにHofstee（B.H.Hofstee, Arch. Biochem. Biophys., 51:139[1954]）の方法に基づくものである。この比色分析法においては、o-カルボキシ−フェニルホスフェートの加水分解におけるアルカリホスファターゼの作用が測定される。
簡単に言うと、実施例１０から採取したコラーゲンインプラント各約10mgの試料を、１mlのトリス緩衝液（0.1Ｍトリス、pH8.5）に１mgの割合で５分間分散させた。アッセイ操作前に酵素反応が起きるのを防ぐために、分散試料の温度を０〜５℃に維持するように注意した。膜結合酵素の放出を促進するために、少量の界面活性剤（最終濃度0.1Ｍのデオキシコール酸ナトリウム）を分散試料に加えた。次いで、分散試料をPolytronホモジナイザー（Brinkmann）で氷浴で冷却しながら30秒間混合した。
各試料について、酵素を活性化させるために溶液を水浴中で25℃にて20〜30分間インキュベートした。２mlのグリシン（0.2Ｍ、pH8.8）、１mlの3.65mM o-カルボキシフェニルホスフェート（ＯＣＣＰ）、および0.5mlの0.05Ｍ MgCl2を含んでなる試験溶液をキュベットに入れ、25℃で３〜４分間インキュベートした。コラーゲン試験試料（0.1ml、５mlの注射器に取りつけた0.22ミクロンフィルターを用いて予備濾過したもの）をキュベット内の溶液に加えた。次いで、キュベットの内容物の300nmにおける光学濃度を室温で測定した。
活性は、25℃で、上記のような条件下のpHにて１分間あたりに加水分解されたＯＣＣＰのマイクロモル数に基づいて、組織１mgあたりの単位で示す。
その結果により、修飾コラーゲンインプラントにおいては、非修飾コラーゲンと比べてアルカリホスファターゼ活性の量が有意に上昇していることが示された（34％増大；ｐ＜0.0005）。
実施例１３
創傷治癒のためのコラーゲンＰＲＯTMの使用
本実施例では、Ｉ型コラーゲンをウシアキレス腱（地元の市場から入手）から抽出し、実施例９に記載されたようにして均一に薄い乾燥フィルムを製造した。対照フィルムを米国特許第5,374,539号（これは参照により本明細書に組み入れるものである）に記載された標準ペプシン酵素処理法を用いて調製した。実施例９に記載されたコラーゲンＰＲＯTMに加えて、米国特許第5,374,539号に記載されたようにして調製した天然Ｉ型ウシコラーゲンおよびグルタルアルデヒドで架橋したウシコラーゲン（かかる特許に記載されている）を試験した。これらの試料は全て0.5mlの水でもとに戻した上皮増殖因子（ＥＧＦ；Collaborative Research社）（１μｇ／３ml ＰＢＳ）の存在下で、ならびにＥＧＦを添加せずに試験した。
本実施例に対して上皮細胞培養物を選択した。というのは、かかる培養物は、表面上皮欠損の閉鎖を制御する事象を調査するため、およびこれらの事象における外因性作用物質の作用をアッセイするためのモデル系を提供するからである。これらの方法は、創傷閉鎖のin vivoモデルと比べていくつかの利点をもたらす。例えば、細胞培養系においては細胞外環境を操作することが非常に容易である。以前の報告により、in vitro上皮応答はin vivoで観察される応答と類似しており、容易に定量することができるということが示されている（例えば、S.Gunasekaranら, Proc. Soc. Biomater., 20:311[1994];およびS.Simmonsら, Toxicol. Appl. Pharmacol., 88:13-23[1987]を参照されたい。）。本実験は、創傷閉鎖用の種々のコラーゲン基質の相対的な適合性を説明するために計画された。特に、コラーゲン基質およびＥＧＦの相互作用を調査した。
一次細胞培養物を屠殺したニュージーランド白色ウサギ（1.5〜2.5kg）から外科手術的に切除した角膜から確立した。外科手術的に単離した角膜を加湿CO2インキュベーター内でDispaseII（Boehringer Mannheim）中で37℃にてインキュベートした。１時間後、角膜を、５％ウシ胎児血清、0.5％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、50ng／mlゲンタマイシン、146μｇ／ml L-グルタミン、５μｇ／ml インスリン、および10μｇ／ml ＥＧＦを富化したダルベッコ修飾イーグル（Eagle）培地を含んでなる一次細胞培養培地に移した。角膜上皮シートの全層を角膜試料から静かにはがして、トリプシンに入れ、穏やかに混合し、2,000×ｇで４℃にて５分間遠心分離した。上清を除去して、６個の角膜由来の細胞をいっしょにして新鮮な一次培養培地に再懸濁し、６個の35mm培養皿で平板培養した。培養物を加湿CO2インキュベーター内で37℃にて放置した。培養培地は週に３回交換した。
インキュベーションの７日目まで一次培養物を融合するまで増殖させ、５〜10分間トリプシン処理した。細胞を培養皿からピペットで取りだし、2000×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去した。対照培養培地は上記のダルベッコ修飾イーグル培地（ただしＥＧＦを除いて）を含んでいた。細胞をピペットで取り出して単一細胞の懸濁液を得て、赤血球計を用いて計数した。24ウェルマルチプレート（well multiplates）にウェル（well）当たり１mlの培地で、３〜４×104細胞／ウェルで接種した。二次培養細胞を７日間増殖させた。この期間中、３回培地を交換した。
二次培養の７日目に４つのウェルに含まれる細胞を計数し、各ウェルが少なくとも1.6×105細胞を有していることを確認した。JumblattおよびNeufeld（M.JumblattおよびA.Neufeld, Invest. Ophthamol. Visual Sci., 15:4-14[1986]を参照されたい。）によって記載されたようにしてフィルターディスク（直径７mm）を用いて細胞層を傷つけた。簡単に言うと、ウェルから細胞培養培地を除去し、フィルターを細胞層の頂部においてプランジャー（直径７mm）で圧迫した。予備冷却した、直径６mmの鋼鉄性プローブを各ディスクのすぐ下にあるウェルの底部に５秒間保持した。次いで、死細胞が接着したディスクを各ウェルから取り出した。対照培地を加える前に、試験材料（実施例９に記載された方法にしたがって調製されたコラーゲン）（コラーゲンＰｒｏTM）、ならびに天然Ｉ型ウシコラーゲンおよび架橋Ｉ型ウシコラーゲン（米国特許第5,374,539号にしたがって調製）を各ウェルに加えた。「傷ついた」細胞層および試験コラーゲンを含むマルチプレートを24時間再インキュベートして傷ついた領域に細胞を増殖させた。24時間の増殖期間中、ウェルを時々観察してディスクによって傷つけられた細胞層の領域を測定した。これらの測定値は、顕微鏡を用いて０、12、18、および24時間間隔で記録した。
ウェル内の細胞層の傷ついた領域の閉鎖を、10％中性緩衝化ホルマリンを用いて少なくとも10分間細胞層およびコラーゲン試験試料を固定することによって停止させた。次いで、細胞を少なくとも10分間ギムザ保存溶液で染色し、10％中性緩衝化ホルマリンですすぎ、空気乾燥した。マイクロプレートに含まれる染色したウェルを、顕微鏡を用いて観察し、傷ついた領域を測定した。
図３は、本実施例で得られたin vitro創傷閉鎖結果を示す棒グラフである。この図において、「ＳＣ」はコラーゲンＰｒｏTMを示し、「ＮＣ」は天然コラーゲンを示し、「ＸＣ」は架橋Ｉ型ウシコラーゲンを示し、「ＧＦ」はＥＧＦを示すものである。これらの結果から、コラーゲン調製物が同一様式で挙動しないことがわかる。ＥＧＦを用いた場合と用いない場合のコラーゲンＰｒｏTMの結果から、その他のコラーゲン調製物で得られた結果と比べて創傷閉鎖速度が速いことが分かった。実施例１０および１１に記載されたin vivo実験により、増殖因子の送達は、コラーゲンＰｒｏTMによって送達した場合、米国特許第5,374,539号の方法にしたがって調製された天然Ｉ型コラーゲンと比べて効率的であることが示された。さらに、これらの結果により、一般的にコラーゲンの架橋は上皮形成を助けるものではないということが示された。
実施例１４
in vitro止血試験
本実施例では、実施例６に記載されたようにして調製されたコラーゲンをさらなる試験に用いて、止血剤としてのin vivoにおける有用性を測定した。
止血（すなわち、血液凝固）は、正常な創傷修復に関与する工程中の主要な事象である。コラーゲンは、ほとんど全ての組織に存在し、正常な創傷治癒に必須の細胞および増殖因子に対して特異的な親和性を有するようにも見える天然の止血剤である（例えば、Gunasekaran, in Encyclopedia of Biomaterials and Bioengineering, 2（37）:2293-2310[1995]を参照されたい。）。その他の材料は止血を助け得るが、コラーゲンと異なり、創傷治癒の速度を最適化しない可能性がある。本実施例の目的は、種々の化合物および物質の止血能力および創傷治癒能力を測定することであった。本実施例では、コラーゲン繊維（Medchem Productsから入手したAvitene）、スポンジ（Collatekから入手したHelistat）、およびゼラチン（Arizona Health Sciencesから入手したGelfoam）、ならびに下記のようにして調製したゼラチン断片を試験した。トロンビン（例えば、ThrombinarおよびThromostat）およびセルロース（例えば、SurgicelおよびOxycel、J & J Medical）のような以前から止血剤として用いられている別の物質はこれらの実験では用いなかった。トロンビンは、免疫学的問題および局所送達の問題を有し得るので用いなかった。
天然Ｉ型ウシコラーゲンを実施例２に記載されたようにして調製した。Avitene、HelistatおよびGelfoamは、それらのそれぞれの供給業者から購入した。ゼラチン断片は、ゼラチン（Sigma）の限定的な非特異的プロテアーゼ処理によって調製した。次いで、ゼラチン断片を、Multi-Spinカラム（Axygen）中のSephadex G-50およびG-100ゲルにおけるサイズ排除カラムクロマトグラフィーによって製造業者が記載したとおりに精製した。２群の断片を単離し、精製した。１群を「高分子量ゼラチンペプチド」と呼んだ。この群は、50〜100kDの範囲の分子量のペプチドを含んでいた。その他の断片群を「低分子量ゼラチンペプチド」と呼んだ。この群は、30〜50kDの範囲の分子量を有するペプチドを含んでいた。
血液学の分野の当業者に一般的に公知の標準リー−ホワイト凝固法を、Brown（B.A.Brown,Hematology: Principles and Practice, 第３版, Lea & Febiger, フィラデルフィア, [1980］, 125-126頁）によって記載されたようにして本実施例に用いた。この方法を用いて多数の実験を行った。この実験において、試験される血液の量は0.5mlまたは１mlのどちらかであった（そしてその他の試薬は適正な割合に維持した）。このような異なる容量で行った試験間では違いは観察されなかったので、大部分の実験において0.5mlの血液を用いた。簡単に言うと、予めデシケーター内に保存した各試料３mgを注意深く測定し、それぞれを長さ10cmの清浄なポリプロピレンバイアルに別々に入れた。健康なヒトから静脈穿刺によって新鮮な血液（５ml）を採取し、血液採取の時間を記録した。各チューブに、0.5mlの血液を加え、凝血塊が形成されるまで30秒毎に穏やかに攪拌した。最初の凝血塊形成の時間を記録した。
これらの実験の結果を図４に示す。この図に示したように、凝固時間は低分子量ゼラチンペプチド断片（「ＬＭＷゼラチンペプチド」）が最も長く、コラーゲンＰｒｏTM（図中「Native Coll.」と示した）が最も短かった。高分子量ゼラチンペプチド断片（ＨＭＷゼラチンペプチド」）の時間は、低分子量ゼラチンペプチドとほとんど同じ位長かった。Aviteneから得られたコラーゲン繊維（「Avitene」）は、２番目に短い凝固時間を有しており、一方、Helistat調製物（「Helistat」）およびGelfoam調製物（「Gelfoam」）は、それぞれその次に短い時間を有していた。図４に示されたように、Gelfoamの凝固時間は、高分子量ゼラチンペプチド断片よりもほんのわずか短いだけであった。
実施例１５
in vivo止血
先の実施例の継続である本実施例は、実施例９で用いたコラーゲンおよびその他の調製物のin vivoでの止血能力を評価するために行った。
本実施例では、成体雄Sprague-Dawleyラットを用いた。全層皮膚の円形領域（２cm）を実施例１０に記載されたようにして麻酔した動物の背面から外科手術によって切除した。露出した領域を実施例１３に記載されたコラーゲン調製物で無菌的に被覆した（すなわちグラフトした）。３週間後、動物を屠殺してグラフトを外科手術的に切除し、当技術分野で一般的に公知の方法を用いて70％アルコールに固定し、脱水してパラフィンに包埋した。厚さ５ミクロンの切片を切り出し、当技術分野で一般的に公知の方法を用いてＯＳＴおよびＨ＆Ｅで染色した。
新上皮形成および創傷治癒の相対的な程度を組織学的に観察し、評価した。動物の背面のグラフト領域内、またはその周辺には炎症の全体の徴候は見られなかった。この実験の結果を図４に示す。この図に示したように、コラーゲンＰＲＯTMフィルムは他の試料と比べて創傷治癒速度および血液凝固時間が有意に速くなっており、Avetineは２番目に速く、Helistatが３番目に速かった。創傷治癒の割合および血液凝固時間の結果を図４に示す。
以前に記載されているように、これらの種々の物質は、生物学的システムに種々の結果をもたらす。必ずしも本発明を理解する必要はないが、ゼラチンおよびゼラチンペプチドの挙動が相対的に不十分であることから、コラーゲンの構造が止血および創傷治癒のプロセスにおいて重要であることが示され得る。
上記のことから、本発明の方法にしたがって調製されたコラーゲンの種々の実施態様は非炎症性コラーゲンを必要とする種々の生物医学的用途に適していることは明白である。本発明の非炎症性コラーゲンは、限定するものではないが、非炎症性コラーゲン縫合糸、創傷および熱傷被膜などのコラーゲン軟組織代替物、動脈血管代替物、止血剤、薬剤送達マトリックス、眼科学的治療用の硝子体代替物、歯内治療学的治療、細胞培養支持体などの多くの設定および多数の用途に対して用いられるものと考えられる。さらに、本発明の種々の実施態様は、限定するものではないが、繊維性または膜フィルム、バッグ、スポンジ、縫合糸、および水性懸濁液、ならびに複合材料などの任意の形態で使用されることも考えられる。その上、本発明にしたがって調製されたコラーゲンは、所望の用途に必要な場合や、生物活性応答を向上させるためにさらに修飾され得るものである。また、本発明の方法は、その他の生体分子ならびにコラーゲンの調製にも適用可能であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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